Slide - Aula 15 Espectroscopia Molecular e Fluorescência 2021-1

1 1 Profa. Dra. Djenaine de Souza UNIVERSIDADE FEDERAL UBERLÂNDIA CAMPUS DE PATOS DE MINAS QUÍMICA ANALÍTICA 2 1) O que é a Espectroscopia Molecular 2) Espectroscopia de Absorção Molecular no Ultravioleta e Visível a) Instrumentação; b) Espécies Absorventes; c) Aplicações qualitativas; d) Aplicações quantitativas; e) Titulações fotométricas e espectrofotométricas. 3) Espectroscopia de Absorção no Infravermelho a) Espectros de Absorção; b) Instrumentação; c) Análise qualitativa. 4) Espectroscopia de Fluorescência a) Teoria da Fluorescência Molecular; b) Instrumentação; c) aplicações dos Métodos Fluorescência. 5) Espectroscopia de Fosforescência molecular 6) Métodos de Quimiluminescência. 3 1 2 3 2 4 5 1 – O QUE É A ESPECTROSCOPIA MOLECULAR? A Espectroscopia Molecular baseada na radiação ultravioleta, visível e infravermelho é empregada para a identificação e determinação de muitas espécies inorgânicas, orgânicas e bioquímicas. A espectroscopia de absorção de infravermelho é uma ferramenta poderosa para se determinar a estrutura de compostos inorgânicos e orgânicos. A espectroscopia de absorção ultravioleta/visível é utilizada principalmente para análises quantitativas e é provavelmente aplicada nos laboratórios químicos e clínicos ao redor do mundo mais que qualquer outro método. 6 Na ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO, medimos a quantidade de luz absorvida em função do comprimento de onda. Isso pode fornecer tanto as informações qualitativas como quantitativas sobre a amostra. A RADIAÇÃO DE COMPRIMENTO DE ONDA SELECIONADO ATRAVESSA A AMOSTRA E A RADIAÇÃO TRANSMITIDA É MEDIDA NA UNIDADE DE DETECÇÃO/PROCESSAMENTO DE SINAL/LEITURA. 4 5 6 3 7 1 – Átomos do analito são excitados por uma fonte de radiação externa na forma de calor ou energia elétrica. 2 – Antes de aplicar o estímulo a amostra se encontra no estado de mais baixa energia = ESTADO FUNDAMENTAL. 3 – A energia da fonte de radiação externa leva os átomos momentaneamente ao seu estado de maior energia = ESTADO EXCITADO. Transição de um orbital molecular para outro de maior energia. 4 – A interação entre os fótons e as partículas da amostras diminuem a potência radiante do feixe. 5 – Ao retornar ao seu estado fundamental, a energia absorvida é liberada. Energia é proporcional à concentração das espécies de interesse. Na Espectroscopia Molecular tem-se as transições rotacionais, vibracionais e eletrônicas. 2) ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO MOLECULAR UV/VIS 88 Como relacionar a absorção da radiação com a concentração da espécie de interesse A = εεεε.b.C = log P0 / P A: absorvância a: absortividade b: percurso ótico c: concentração “A absorbância é diretamente proporcional à concentração da espécie absorvente, em determinadas condições” P0 P T = 0 log P P A − = Relação de Absorbância com concentração 9 a) Instrumentação MONOCROMADOR ou um filtro para isolar a banda de comprimento de onda desejada de forma que somente essa banda de interesse é detectada e medida. Rede de reflexão ou prisma 7 8 9 4 10 b) Espécies Absorventes As moléculas sofrem três tipos diferentes de transições quantizadas quando excitadas pela radiação ultravioleta, visível e infravermelha. Para a radiação ultravioleta e visível, a excitação envolve a promoção de elétrons presentes em um orbital molecular ou atômico de baixa energia para um orbital de maior energia. Além das transições eletrônicas, as moléculas exibem dois tipos adicionais de transições induzidas por radiação: transições vibracionais e transições rotacionais. - Compostos orgânicos - Compostos inorgânicos - Absorção por transferência de carga 11 A absorção de radiação por moléculas orgânicas na região de comprimento de onda entre 180 e 780 nm resulta das interações entre fóton e elétrons que estão participando diretamente da formação de uma ligação química (e são, assim associados a mais de um átomo) ou estão localizadas sobre átomos como os de oxigênio, enxofre, nitrogênio e halogênios O COMPRIMENTO DE ONDA NO QUAL UMA MOLÉCULA ABSORVE DEPENDE DE QUÃO FORTEMENTE OS ELÉTRONS ESTÃO LIGADOS Nos compostos moleculares existem os orbitais moleculares que descrevem a distribuição dos elétrons em um átomo. 12 Elétrons em ligações duplas e triplas (orbitais ππππ) estão menos fortemente ligados, sendo portanto fácies de serem excitados pela radiação. Os compostos orgânicos saturados contendo heteroátomos (N, S, O e halogênios) apresentam elétrons não-ligantes que podem ser excitados por radiação. 10 11 12 5 14 A posição dos máximos de absorção podem ser empregados para identificação aproximada dos compostos. Os máximos de absorção são influenciados pelo efeito dos solventes, e pela conjugação de dois ou mais cromóforos. Efeitos vibracionais alargam os picos de absorção tornando difícil a determinação precisa do máximo de absorção. 15 Compostos orgânicos contendo heteroátomos absorvem na região de 170 a 250 nm. Álcoois e éteres usados como solventes impedem a medida de absorção de analitos dissolvidos nestes solventes. De 170 a 250 nm é uma região empregada na análise de compostos orgânicos contendo halogênios e enxofre. 13 14 15 6 16 17 Os íons e os complexos dos elementos das primeiras duas series de transição absorvem as bandas largas da radiação visível em pelo menos um de seus estados de oxidação e são, como resultado, coloridos. A absorção envolve a transição entre os orbitais d preenchidos e não- preenchidos com energias que dependem dos ligantes dos átomos metálicos. Como resultado, as bandas tendem a ser estreitas e, de forma relativa, não são afetadas pelas espécies ligadas aos elétrons externos. Os elétrons responsáveis pela absorção por esses elementos estão blindados de influências externas por elétrons que ocupam orbitais com número quântico principal maior. 18 16 17 18 Absorção por transferência de carga - A absorção por transferência de carga é particularmente importante porque as absorvâncias molar são geralmente altas, o que leva a uma alta sensitividade. - Um complexo de transferência de carga consiste em um grupo doador ligado a um receptor de elétrons. - Quando esse produto absorve radiação, um elétron do doador é transferido para um orbital que está altamente associada com o receptor. Complexo colorido Figura 24: Exemplo de absorção de complexos avançados de transferência de carga. 19 8 22 Um solvente para a espectroscopia ultravioleta visível deve ser transparente na região do espectro na qual o soluto absorve e deve poder dissolver uma quantidade suficiente do soluto para originar um espectro bem definido do analito. 23 As alturas dos picos e suas separações são distorcidas quando se emprega larguras de fenda maiores. 24 O Efeito da radiação espalhada nos comprimentos de onda extremos de um espectrofotômetro = LUZ ESPÚRIA = Desvio instrumental 22 23 24 9 d) Aplicações Quantitativas 1 - Aplicabilidade ampla: número enorme de espécies inorgânicas, orgânicas e bioquímicas absorve radiação ultravioleta ou visível sendo assim receptivas para uma determinação quantitativa direta. 2 - Alta sensibilidade: Os limites de detecção para a espectroscopia estão na faixa de 10-4 a 10-5 mol L-1. 3 - Seletividade entre moderada e alta: Com freqüência, pode-se encontrar um comprimento de onda no qual somente o analito absorve, tornando, assim, qualquer separação preliminar desnecessária. 4 - Boa exatidão: Os erros relativos em concentração observadas para os procedimentos espectrofotométricos ou fotométricos empregando-se a radiação ultravioleta e visível estão na faixa de 1% a 5%. 5 - Facilidade e conveniência: As medidas espectrofotométricas e fotométricas são realizadas de forma fácil e rapidamente com os instrumentos modernos. 26 27 As medidas fotométricas e espectrofotométricas são úteis para se localizar os pontos de equivalência de titulação. Essa aplicação das medidas de absorção requer que um ou mais reagentes ou produtos absorvam a radiação ou que um indicador absorvente seja adicionado à solução do analito. Uma curva de titulação fotométrica é uma gráfico de absorbância em função do volume do titulante. Para obter-se as curvas de titulação com porções lineares que possam ser extrapoladas, os sistemas absorventes devem obedecer á lei de Beer. Titulações espectrofotométricas 25 26 27 10 28 28 É excelente para a determinação da composição de íons complexos em solução, pois essa técnica possui o poder de que medidas de absorção quantitativas podem ser realizadas sem perturbar o equilíbrio sob consideração. 29 30 FIA para determinação espectrofotométrica de cafeína 28 29 30 11 31 3) ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO IV A energia da radiação infravermelha pode excitar transições vibracionais e rotacionais, porém é insuficiente para excitar transições eletrônicas. A absorção no IV não ocorre somente com as moléculas orgânicas, mas também com complexos metálicos ligados covalentemente, os quais são geralmente ativos na região do infravermelho de comprimento de onda mais longo. Quase todas as moléculas contendo ligações covalente mostram um grau de absorção no infravermelho com exceção dos elementos diatômicos H2, N2, O2. Os espectros infravermelhos exibem bandas de absorção estreitas, próximas uma das outras, resultantes das transições entre os vários níveis quânticos vibracionais. A espectrofotometria no infravermelho oferece potencial para a determinação de um número grande e não usual de substâncias porque quase todas as espécies moleculares absorvem na região do infravermelho. a individualidade do espectro infravermelho provê um grau de especificidade que é igualado ou excedido por relativamente poucos métodos analíticos. 32 Deformação axial simétrica/assimétrica Angular simétrica no plano (tesoura) Angular simétrica fora do plano (torção) Angular assimétrica fora do plano (abano) Angular assimétrica no plano (balanço) A energia de radiação infravermelha pode excitar transições vibracionais e rotacionais, porem é insuficiente para excitar transições eletrônicas . 33 33 Estiramento C-H sp3 Estiramento C=O Uma vez que cada tipo de ligação covalente apresenta uma diferente frequência de vibração natural, então duas moléculas diferentes não deverão apresentar um idêntico comportamento de absorção no infravermelho. Determinar informações estruturais sobre uma molécula. As absorções de cada tipo de ligação,(p. ex. N-H; C-O; O-H; C-X; C=O;C-O; C-C; C=C; C C; C N), são comumente encontradas em uma pequena porção da região do infravermelho. 31 32 33 12 34 35 n-Butanal A identificação de um grupo funcional de uma molécula raramente é suficiente para reconhecer positivamente o composto e todo o espectro. Devido a isso eles são comparados com compostos conhecidos ,através das bibliotecas de espectros disponíveis para esta finalidade. 36 4) ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA A fluorescência é um processo de fotoluminescência no qual os átomos ou moléculas são excitados por absorção de radiação eletromagnética. As espécies excitadas então relaxam ao estado fundamental, liberando seu excesso de energia como fótons. Na ESPECTROSCOPIA DE FOTOLUMINESCÊNCIA a emissão de fótons é medida após a absorção. As formas mais importantes de fotoluminescência para os propósitos analíticos são as espectroscopias de fluorescência e fosforescência. A emissão de curta duração que ocorre é chamada fluorescência, enquanto a luminescência de maior duração é denominada fosforescência. 34 35 36 Vantagens 1 - Técnica muito sensível (uma única molécula pode ser quantificada). 2 - Ampla faixa linear de concentração. Desvantagens 1 - São muito menos aplicados que os métodos de absorção em razão do número limitado de sistemas químicos que fluorescem com intensidade apreciável. 2 - Estão também sujeitos a muitos outros efeitos de interferência ambiental que os métodos de absorção. 37 14 40 A irradiação dessa espécie com a radiação de banda de λ1 a λ5 resulta na população momentânea dos cinco níveis vibracionais do primeiro estado eletrônico excitado, E1. Perda do excesso de energia A relaxação vibracional envolve a transferência do excesso de energia de uma espécie excitada vibracionalmente para as moléculas do solvente. A conversão interna é um tipo de relaxação que envolve a transferência do excesso de energia das espécies presentes no estado vibracional de mais baixa energia de um estado eletrônico excitado para as moléculas do solvente e a conversão das espécies excitadas para um estado eletrônico mais baixo. a fluorescência é observada a partir do estado excitado eletrônico mais baixo E1 para o estado fundamental E0.Também, geralmente, a fluorescência ocorre somente do nível vibracional mais baixo de E1 para vários níveis vibracionais de E0. Isto porque os processos de conversão interna e a relaxação vibracional são muito rápidos quando comparados com a fluorescência 41 as diferenças de energia entre os estados excitados vibracionais serem as mesmas para ambos os estados fundamental e excitado, o espectro de absorção, ou espectro de excitação, e o espectro de fluorescência para um composto frequentemente se mostram como imagens aproximadamente especulares (de espelho) um do outro com sobreposição ocorrendo próximo à transição de origem (nível vibracional 0 de E1 para o nível vibracional 0 de E0). 42 A fluorescência é um dos muitos mecanismos pelos quais a molécula retorna ao seu estado fundamental original após ter sido excitada pela absorção de radiação. Todas as moléculas absorventes apresentam potencial para fluorescerem, contudo, muitos compostos não o fazem porque suas estruturas provêem caminhos para a relaxação não-radiativa mais rápida que a emissão fluorescente. O rendimento quântico de fluorescência molecular é simplesmente a razão entre o número de moléculas que fluorescem e o número total de moléculas excitadas, ou a razão entre os fótons emitidos e os fótons absorvidos. em que kF é a constante de velocidade de primeira ordem para a relaxação por fluorescência e knr corresponde à constante de velocidade para a relaxação não-radiativa. 40 41 42 15 43 Espécies Fluorescentes Os compostos que contêm anéis aromáticos apresentam emissão fluorescente mais intensa e mais útil. Enquanto certos compostos carbonílicos alicíclicos e alifáticos, bem como as estruturas de ligações duplas altamente conjugadas, também fluorescem, existem muito pouco desses compostos comparando-se com o número de compostos que contêm anéis aromáticos e que fluorescem. Compostos heterocíclicos simples não fluorescem A fluorescência é mais intensa em compostos contendo grupos aromáticos conjugados 44 O aumento da rigidez é causado pelo grupo metileno no fluoreno. A influência da rigidez também explica o aumento da fluorescência de certos agentes orgânicos quelantes quando estes são complexados com íons metálicos. Em muitas moléculas, a eficiência quântica da fluorescência decresce com o aumento da temperatura, porque, a temperaturas elevadas, o aumento da freqüência de colisões leva à maior probabilidade de relaxação colisional. 45 b) Instrumentação para Fluorescência Molecular 43 44 45 16 46 c) Aplicações da Fluorescência Molecular A estrutura vibracional dos hidrocarbonetos policíclicos permite a identificação de componentes de petróleo. Os métodos de fluorescência são empregados para se estudar equilíbrios químicos e cinética da mesma forma que os métodos espectrométricos de absorção. Compostos nos quais a monitoração da fluorescência não é possível, as sondas fluorescentes ou marcadores podem ser ligados covalentemente a sítios específicos em moléculas, como as proteínas, tornando-as assim detectáveis via fluorescência. Os marcadores de fluorescência podem ser utilizados para fornecer informações sobre a energia de processos de transferência, sobre a polaridade da proteína e sobre a distância entre os sítios reativos. 47 Os métodos quantitativos baseados em fluorescência têm sido desenvolvidos para as espécies inorgânicas, orgânicas e bioquímicas. Os métodos fluorescentes inorgânicos podem ser divididos em duas classes: métodos diretos, que são baseados na reação do analito com um agente complexante para formar um complexo fluorescente; e indiretos, que dependem do decréscimo da fluorescência, também denominado supressão (quenching), resultante da interação do analito com o reagente fluorescente. Em razão de sua sensibilidade, a fluorescência é amplamente empregada como técnica de detecção em métodos de cromatografia líquida. 48 46 47 48 17 49 50 adenina, ácido antranílico, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, cisteína, guanina, isoniazida, naftóis, gases de nervo sarin e tabun, proteínas, ácido salicílico, escatol, triptofano, ácido úrico e varfarina (Coumadin). Muitos agentes medicinais que podem ser determinados fluorimetricamente são listados, incluindo a adrenalina, morfina, penicilina, fenobarbital, procaína, reserpina e ácido lisérgico dietilamida (LSD). 51 49 50 51 18 52 5) ESPECTROSCOPIA DE FOSFORESCÊNCIA MOLECULAR Um estado eletrônico molecular no qual todos os spins dos elétrons estão emparelhados é denominado estado singleto. Quando um elétron de um par de elétrons é excitado em uma molécula para um nível de energia mais alto, um estado singleto ou tripleto pode ser produzido. No estado excitado singleto, o spin do elétron promovido é ainda oposto àquele do elétron que permaneceu no nível fundamental. No estado tripleto, contudo, os spins dos dois elétrons tornam-se desemparelhados, sendo então paralelos. 53 A fluorescência em moléculas envolve a transição de um estado excitado singleto para o estado fundamental singleto. Essa transição é altamente provável e, assim, o tempo de vida do estado excitado singleto é muito curto (10-5 s ou menos). A fosforescência molecular, por outro lado, envolve a transição de um estado excitado tripleto para o estado fundamental singleto. Em virtude de essa transição alterar o spin eletrônico, ela é menos provável. Portanto, um estado tripleto apresenta um tempo de vida mais longo (tipicamente, 10-4 a 104 s). Por causa de sua fraca intensidade e do longo tempo, a fosforescência é muito menos aplicada que a fluorescência. 54 6) MÉTODOS DE QUIMILUMINESCÊNCIA Fenômeno que se obtém energia luminosa a partir de uma reação química. A energia química gerada como resultado da dissociação de ligações fracas produz compostos intermediários em um estado eletronicamente excitado que, quando retornam ao estado de energia inicial emitem luz que é medida. 52 53 54 Esquema do Luminômetro - Detectores de luz - Fotomultiplicador - Bomba - Reativo 1 - Reativo 2 55