Processamento do Rna

CAPÍTULO 14\nProcessamento do RNA\nA SEQUÊNCIA CODIFICADORA DE UM GENE CODIFICADOR DE PROTEÍNAS é uma série de códons, compostos por três nucleotídeos (trinucos), que especifica a sequência linear dos aminoácidos no produto polipeptídico. Até aqui, assumiu-se que a sequência codificadora é contínua: o códon correspondente a um aminoácido está imediatamente adjacente ao códon do aminoácido seguinte na cadeia polipeptídica. Isso é verdadeiro para a grande maioria das bactérias e seus fagos. No entanto, raramente isto é verdadeira para os genes eucarióticos. Nestes casos, em geral, a sequência codificadora é periodicamente interrompida por segmentos com sequências não codificadoras.\n\nMuitos genes eucarióticos são, portanto, mosaicos compostos por blocos com sequências codificadoras separadas por os chamados éxons e sequências intercaladas, não codificadoras, os senhores. Ao serem transcritos em uma molécula de RNA, os introns devem ser removidos e os éxons, unidos para criar um mRNA para o gene. Nele, geralmente, o termo aplica-se a qualquer região mantida em um mRNA maduro, sendo ou não codificadora. Éxons não codificadores incluem as sequências 5’ e 3’ não traduzidas do mRNA; todas as regiões de RNAs não codificadores extensivos e reguladores da atividade do cromossomo X, Xist (Cap. 20); e regiões que dão origem a RNAs funcionais, como os micro-RNAs que serão encontrados no Capítulo 20.\n\nA Figura 14.1 apresenta um gene eucariótico típico no qual a região codificadora é interrompida por três introns que fragmentam o gene em quatro éxons. O número de introns contido em um gene varia muito – desde um, até a maioria dos genes contendo introns em levedura (alguns poucos genes humanos), às vezes, algo como o do colágeno de galinha, prova 2, e chegando a 363 no caso do gene humano Titin. A Figura 14-2 mostra o número médio de introns por gene em uma variedade de organismos. Fica claro que em organismos tão simples, como as leveduras, para organismos mais complexos, como vermes e moscas, até os humanos.\n\nNo entanto, os éxons e introns também é variável. Muito frequentemente, os introns são bem mais longos do que os éxons que eles separam. Assim, por exemplo, os éxons podem possuir cerca de 150 nucleotídeos, enquanto os introns – embora também possam ser curtos – podem ter 800.000 nucleotídeos (800 kb). Como outro exemplo, o gene da enzima di-hidrofolato redutase em mamíferos tem apenas 31 kb de comprimento, contendo seus éxons dispersos que, juntos, correspondem a 2 kb do mRNA. Assim sendo, neste caso, a região codificadora do gene corresponde a < 10% de seu comprimento total. FIGURA 14.1 – Um típico gene eucariótico. Os genes estavam contidos em quatro éxons separados por três introns. A transcrição a partir do promotor gera o pré-mRNA, através da linha intermedia, que contém códigos em éxons e introns. O processamento removendo os introns e unindo os éxons, formando o mRNA maduro, que continua sendo mediificado (ver adenilatório, Cap. 13) e exportado; de polipeptídeo, para ser traduzido em um produto proteico. Recentemente, as regiões 5’ líder e 3’ não codificadoras também estavam sob pressão dos exons não codificadores.\n\nFIGURA 14-2 – Número de introns por gene em organismos eucarióticos. O número médio de introns por gene varia entre os organismos e species e é bastante variável. Os mesmos são exemplificados os dois os organismos exemplares constituintes (Apêndice 1): leveduras (Saccharomyces cerevisiae), mosca-da-fruta (Drosophila melanogaster), medidor (Caenorhabditis elegans), planta (Arabidopsis thaliana) e camundongo (Mus musculus). As outras espécies apresentadas são: Anopheles gambiae; Aspergillus nidulans; Noclamorodeo de Bigeorwelliae ratnas; Ceanorhabditis briggesi; Cadida albicans; Chlamydomonas reinhardtii; Ciona intestinalis; Cryptococcus neoformans; Cryptosporidium parvum; Cyanidioschyzon merolae; Didymium discoideum; Equinopelitalo quinquillaris; Giardia lamblia; Talaromyces stipitatus; Homo sapiens; Leishmania major; Necrospora crassa; Oryza sativa; Pramecium aurelia; Phanerochaete chrisosporium; Plasmodium falciparum; Plasmodium vivax; Schizosaccharomyces pombe; Takifugu rubripes; Thalassiosira pseudonana; e Trichomonas vaginalis. (Redesenhada com permissão, de Roy S. W. Gilbert W. 2006. Nat. Rev. Genet. 7: 212, Fig. 1. Macmillan). Capítulo 14 Processamento do RNA 469\nQUÍMICA DO PROCESSAMENTO DE RNA\nSequências no RNA determinam onde ocorrem o processamento\n\nAgora, serão discutidos quais mecanismos moleculares da receita de processamento são possivelmente e como isso se distingue entre si? Como os introns são removidos? Como os éxons são emendados com alta precisão? As fronteiras entre introns e éxons estão marcadas por sequências nucleotídicas específicas presentes nos pré-mRNAs. Essas sequências determinam onde o processamento ocorrerá. Assim, como demonstra a Figura 14-3, a fronteira éxon-intron é marcada pela extremidade 5’ de um intron – e marcada por uma sequência chamada sítio de processamento 5’ (ou sítio 5’ de splice). A fronteira intron-exon na extremidade 3’ do intron é marcada como sítio de processamento 3’ (ou sítio 3’ de splice). (Os sítios de processamento 5’ e 3’ são algumas vezes referidos, respectivamente, como sítios doador e receptor, nas atualidades essa nomenclatura é pouco utilizada).\n\nA Figura 14-3 mostra uma sequência necessária para o processamento. Ela é chamada de sítio do ponto de ramificação (ou sequência do 470\nParte 4 Expressão do Genoma\n\nponto de ramificação) e localiza-se inteiramente dentro do intron, gradientes.\n\nna próxima sua extremidade 3', sendo seguida por serem primordiais\no traço de polimerização do rabo Y.\n\nA sequência comum para cada um desses elementos é mostrada na Figura 14.3. As sequências mais bem conservadas são GU no sítio de processamento 5', AG no sítio de processamento 3' e C no sítio de ramificação. Todos esses nucleotídeos alçam constantes que encontramos no próprio intron – o que não surpreende, uma vez que as exigências da maioria dos exons, ao contrário dos introns, são limitadas pela necessidade de codificar os aminoácidos específicos de um produto proteico.\n\nA medida que exons adjacentes são unidos, o intron é removido na forma de laço.\n\nInicia-se considerando a química do processamento. Um intron é removido por meio de duas reações sucessivas de transesterificação, as quais ligam os dois exões flanqueadores do pré-mRNA às divididas, e novas ligações fosfodiéster do pré-mRNA. A primeira reação é desencadeada pela 2'-OH da conservada no sítio de ramificação. Este grupo atua como nucleófilo que ataca o fosfato do junção 5' entre o intron e o exon 5' e liberada do intron é unido à do sítio de ramificação. Assim, ambos lugares 5' e 3' do esqueleto, uma terceira ligações fosfodiéster, de 2'-OH do, A origem da união tríplice está ligado independentemente do ramificar. A estrutura do junção tríplice ilustrada na Figura 14.5.\n\nPrimeiro, A segunda reação, o exon em 5' (mais precisamente, a extremidade 3'-OH que recém-liberada do 5' rever-se numa um núcleo que atua como o primeiro estado o processamento 3' (fig. 14.4).\nEsta segunda reação é suas consequências. A primeira, é mais importante, de que ela como exões de 5' e 3' pontos, estas são \"unidas.\" A origem que libera um intron, como grupo de saída. Como a extremidade 5' do intron foi ligada ao do sítio de ramificação na primeira reação de transesterificação, o intron recém-liberado tem o formato de um laço.\n\nNessas duas etapas de reação, não há ganho líquido no número de ligações químicas - duas ligações fosfodiéster são rompidas a duas novas são\n\nF IGURA 14.4 Reação de processamento. As duas etapas da reação de processamento descritos no texto são mostradas. Na primeira etapa, o RNA forma uma estrutura em laço, apresentada em detalhe na figura seguinte. Capítulo 14 Processamento do RNA \n471\nF IGURA 14.5 Estrutura da junção tripla formada durante a reação de processamento.\n\nX E X P E R I M E N T O S - C H A V E\nQuadro 14-1 - Os adenovírus e a descoberta do processamento\n\nEstudos em bactérias e em seus fagos levaram a descoberta do vírus, com troca a sequência de nucleotídeos, e mRNA um réplica cada da onde que do transcrito vez Cap. 16. Por isso, em 1977, é descoberta que que alguns de como sabe hoje, a maioria mRNAs de acrílicos podem ser tecidos relacionados, um trabalho de \"corte e colagem\", a partir de transcritos primários muito longos, causou separado que foi surpreendentemente descoberto faz feita.\n\nNa tentativa de entender a transcrição gência em eucariotos, as entidades diferentes seria um universo de DNA humano, endocentrados. A razão era que o núcleo desde servir como modelo para entender a biologia molecular dos genes eucarióticos, assim como os fases 14 e haviam servido para expensar vários proteínas diferentes.\n\ncodificados por eles, e os mRNAs para as proteínas foram purificadas, na expectativa de que suas extremidades se transformem precisamente em sítios de disco da transcrição de cada gene do genoma viral. Em vez disso, nos mRNAs, eram codificadores proteínas diferentes, afastados, nem mesmo, a mesma sequência. S. Hoje se sabe que exons do mRNAs de proteínas do virais do adenovírus dariam um formato único, conhecido como promoter tadinho principal, o início de partir desse promotor produzido longos transcritos que incluem as sequências codificadoras de várias proteínas (fig. 1 deste quadro). Porém, este transcrito sofre processamento antes de se tornar mRNAs transportados para componentes do vírus individuais, como a proteína hóspede é flúida. Todos os o sequências curtas que sua seqüência estudam proteínas, conhecida como sequências-lider tripartida. A líder sofre processamento alternativo às sequências codificadoras do hexôn, das fibras e outras proteínas do virion, gerando cada um dos produtos mRNAs virais.\n\nA demonstração de que esses mensagens são processados pelo RNA que surgiram em diferentes regiões deu-se o conhecimento como mapeamento pela RNA e figura 2. 472\nParte 4 Expressão do Genoma\n\nQuadro 14-1 (Continuação)\n\nQUADRO 14-1 FIGURA 1 Mapa do genoma do adenovírus-2 humano. O mapa apresenta os padrões de transcrição dos mRNAs tardios, incluindo o transcrito primário (representado pela seta longa em verde-escuro na parte superior); as sequências-líder tripartidas encontradas nas posições 16.6, 19.6 e 26.6 (representadas como barras verdes); e as posições no mapa de sequências de DNA que codificam os vários mRNAs tardios (representados pelas setas curtas em verde-escuro).\n\na\n\nDNA clivado com enzimas de restrição\n\nmRNA com cauda poli(A)\n\n\n\nincubação com aquecimento\n\nb\n\n\n\nfigura de DNA desdobrada\n\n\n\nRNA-DNA\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\nQUADRO 14-1 FIGURA 2 Mapeamento de alça R dos mRNAs tardios do adenovírus-2. (a) A representação esquemática mostra a formação de uma estrutura de alça R. O fragmento de DNA de dupla-fita preparado por digestão com endonuclease de restrição é incubado com mRNA e aquecido um pouco acima da temperatura de desnaturação do DNA, em 80% de formação. O híbrido formado entre o mensageiro e sua sequência complementar DNA causa o deslocamento da segunda fita do DNA. Observe-se ao quadro poli(A) do mRNA (não codificado pelo DNA) (ver p. 121) projetado a partir do fim do duplex híbrido. (b) Micrografia eletrônica e diagrama esquemático de uma alça R observe-se o DNA complementar da região tardia do genoma do adenovírus-2. Observe-se as extremidades 5' e 3' no monossoma. (linhas claras) (D). (linhas verdes) (A). (Reproduzido, com permissão, de Berget S.M. et al. 1977. Proc Natl Acad. Sci. 74: 3171-3715. © National Academy of Sciences). (c) Micrografia eletrônica e diagrama esquemático de uma alça R observada após a incubação do mRNA de fibra (fibrina) com dois DNAs, o complemento e uma fragmento de endonuclease de restrição derivado de uma região inicial do genoma. (reproduzida, com permissão, de Chow L.T. et al. 1977. Cell 12: 1-8, p. 2. © Elsevier). Capítulo 14 Processamento do RNA 473\n\nMAQUINARIA DO SPLICEOSSOMO\nO processamento do RNA é executado por um grande complexo chamado spliceossomo. Este complexo compreende cerca de 150 proteínas e cinco RNAs e seu tamanho equivale ao de um ribossomo, a \"máquina\" que traduz o mRNA em proteína (Cap. 15). Para dividir o processamento em etapas, o spliceossomo utiliza vários moléculas de ATP, surpreendentemente, acredita-se que muitas funções do spliceossomo são realizadas pelos RNAs que o compõem e não pelas proteínas. Os cinco RNAs (U1, U2, U4, U5 e U6) chamados, conjuntamente, de pequenos RNAs nucleares (snRNAs, small nuclear RNAs). Cada um dos snRNAs contém um conjunto de núcleos de sequências que se estende para várias proteínas. Esses complexos RNA-proteínas são chamados de pequenos ribonucleoproteínas (snRNPs, small nuclear ribonucleoproteins), e cada snRNA é ligado a umas das proteínas da snRNP U1 (Fig. 6-18).\n\nO spliceossomo é o grande complexo formado pelos snRNPs, na sua constituição existe diferença entre os estágios distintos da reação de processamento: diferentes snRNPs têm com períodos diferentes, cada uma delas realizando funções específicas na reação. No spliceossomo, também existem várias proteínas que fazem parte das snRNPs, e outras ligadas fracamente ao complexo.\n\nAs snRNPs desempenham três funções no processamento: elas reconhecem o sítio de processamento 5' e o sítio de ramificação; aproximam esses sítios, quando necessário; e catalisam (ou auxiliam a catalisar) a clivagem do RNA e reacto de ligação. As interações RNA-RNA, RNA-proteína e proteína-proteína são importantes para a realização dessas funções. Inicialmente considerando algumas das interações RNA-RNA. Essas interações estão prevalentes entre snRNPs diferentes e entre snRNPs e pré-mRNA.\nA Figura 14-6, por exemplo, mostra o interagido, por meio de paramento de bases complementares, entre o snRNA U1 e o sítio de processamento 5' do pré-mRNA. Na continuidade da reação, esse sítio de processamento é reconhecido pelo snRNA U6. Outro exemplo, representado na Figura 14-6, mostra o sítio de ramificação sendo reconhecido pelo snRNA U2. Um terceiro exemplo, na Figura 14-6, mostra um interato entre snRNAs U2 e U6. Esta aproxima o sítio de processamento 5' e o sítio de ramificação. São essas interações e outras entre as proteínas que de várias resultam, que promovem a reação de processamento para contribuir para sua precisão, com ver sido dito.\n\nComo mencionado anteriormente, algumas não snRNPs estão envolvidos no processamento. Um exemplo disso, a U2AF (fator auxiliar U2), reco Capítulo 14 Processamento do RNA 474\n\nFIGURA 14-6 Alguns híbridos RNA-RNA formados durante a reação de processamento. Em alguns casos, (A) diferentes snRNPs reconhecem as mesmas sequências, mas sequências sobrepostas no pré-mRNA, em diferentes fases da reação de processamento, como mostrado aqui para o reconhecimento do sítio de processamento 5' pelo U1 e U6. (B) snRNP U2 faz o reconhecimento do sítio de ramificação. (C) O parâmetro RNA-RNA das snRNPs U2 e U6 é mostrado. (D) Por fim, a mesma sequência em um pré-mRNA é reconhecida por uma proteína (ainda que faça parte da snRNP) em uma etapa a ser substituída por uma snRNP em outra. Cada uma dessas interações é acompanhada pelos reguladores dos componentes do spliceossomo e a razão estrutural necessária para a continuação da reação de processamento. As sequências nesta figura só se levedure. Capítulo 14 Processamento do RNA 475\n\nFIGURA 14-7 Etapas da reação de processamento mediada pelo spliceossomo. A tradução é a adaptação de spliceossomo estilo ilustrados, e os detalhes da cada etapa estão descritos no texto. Determinados componentes da maquinaria de processamento entendem ao mesmo tempo a cada etapa, e esses elementos associados às rearranjos estruturais necessários para a sequência da reação de processamento. Observa-se que o nome da cada complex é mostrado à direita. As evidências sugerem que alguns dos componentes mostrados não são mais especificamente nesses figura, eles podem, por exemplo, assumir responsabilidades complementares, executando essas funções como se fossem diferentes em ver a sua solicitação. Também não é possível reter da ordem de algumas delas o movimento, sobre como a estrutura de várias etapas, nem as subunidades também podem mudar. A estrutura pode assumir duas alturas, ao ser próximo a U4 e ligando a U2. Aparecem ideias interessantes, e como reiniciam a reação de processamento que ocorrem durante a reação do spliceossomo e desencadeiam a sua desmontagem. Então, a snRNP U2 liga-se ao sítio de ramificação, como o atividade do U4 e desloca a SRB (SFI). Este arranjo é chamado complexo A. O par de bases entre a snRNA U2 e o sítio de ramificação é tal que o resíduo da 5’ de ramificação é exposto ao núcleo resultante de RNA-dedilhado como uma proteína-chave do nucleocetido único, como mostrado na figura 1. O resíduo não será parado, portanto, disponível para reagir com o sítio de processamento da 5’. A próxima etapa é o rearranjo do complexo A para continuar os estágios de processamento. Isso é realizado da seguinte maneira: as snRNPs U4 e U6, juntamente com a snRNP U5, unem-se ao complexo. Juntas, estas snRNPs são chamadas de particulas tri-snRNP. Na página, as snRNPs U4 e U6 são mantidas em função de parâmetros complementares das bases dos RNAs que as compõem, e a snRNA U5 está associada mais frequentemente, por meio de interações proteína-proteína. O complexo A é convertido em complexo B. Na etapa seguinte, U1 deixa o complexo U6 e substitui o sítio de processamento 5’. Isso exige ruptura do parâmetro de base entre o snRNA U1 e o pré-mRNA, permitindo que o RNA U6 se hibridize na essência da sequência (na verdade, é uma sequência sobressalente, como visto na figura 1). Essas etapas completam a fase de formação. O rearranjo liberada em seguida desta interação de U6 e U2 promove o parâmetro de base sendo libertado na Fig. 14-6c. Esse arranjo, chamado complexo C, produz o sítio ativo. Isto é, recuperar redireciona os spliceossomos estes componentes para evitar mais rejeitores exclusivos dos RNAs U2 e U6 e, juntas, formam o sítio. O mesmo rearranjo também assegura que o RNA substrato esteja adequadamente posicionado para ser utilizado. E surpreendentemente, que não apenas o sítio é formado basicamente por RNA, mas tudo isso permite a expansão nesta fase da formação do spliceossoma. Por enquanto, esta estratégia diminui a probabilidade de processamento adversantes. Visivelmente, a formação do sítio ativo também requer que a maquinaria seja continuamente montada, que pode assegurar um interessante padrão para usar a sequência de corte de um exon. A formação do sítio ativo aproxima a reação de transesterificação. A segunda reação, entre os sítios de processamento 3’ e 5’, facilita pela snRNP U5, que ajuda a aproximar os dois exons. A etapa final é a liberação do produto RNA das snRNPs. Inicialmente, as snRNPs continuam ligadas ao laço, sendo recalcadas após a rápida degradação deste fragmento de RNA.\n\nA formação do spliceossomo é dinâmica e variável, e sua desmontagem garante que a reação de processamento não seja reversível na célula. É importante enfatizar que a via recém-descrita - a ordem das etapas necessárias para a formação do spliceossomo - é de verdade única. De fato, o processo pode ser menos rigidamente regulamentado do que se descrever sugere. A imagem apresentada mostra a maquinaria sendo montada em torno do intron a ser removido. Na verdade, é possível que mais frequentemente a maquinaria seja inicialmente montada em torno do exon, processo frequentemente chamado de definição de exon (serão descritos mais adiante sobre isso quando forem consideradas as etapas dos eventos provavelmente variam em algumas extensões - por exemplo, o parâmetro do tri-snRNP: os detalhes dependentes de ocorrer antes ou após o recrutamento de tri-snRNP: os detalhes dependentes das sequências de RNA e de fatores de limitação de taxas em um caso qualquer. Além disso, muitas etapas durante a formação do spliceossomo podem ser revertidas.