Utiliza ribonucleotídeos (rNTPs) para interromper a síntese de DNA em pontos específicos.
Atualmente, o processo da técnica de Sanger utiliza quatro tubos de ensaio, um para cada base nitrogenada (A, T, G, U).
A reação de Sanger consiste na ação da DNA polimerase, que adiciona os nucleotídeos complementares à fita-molde de RNA.
Depende da incorporação de didesoxinucleotídeos (ddNTPs) que não possuem grupo hidroxila na posição 3' do açúcar (desoxirribose).
Nessa reação, a quantidade de desoxinucleotídeos trifosfatos (dNTP-nucleotídeos normais contendo o grupamento 3'hidroxila) comparada ao ddNTP é menor.