Extrato de Dna Genética

Detergente Curso de Biomedicina Disciplina Biologia Molecular e Biotecnologia Profa Dra Juliana V Raimondi EXTRACAO DNA Os protocolos para extracao de DNA envolvem 3 etapas basicas lise das membranas limpeza de contaminantes proteinas e outras macromoleculas e a precipitacao do DNA A solucao de lise permite o rompimento da membrana das celulas Como as plantas tem parede celular e membrana de fosfolipedeos que sao como gorduras o detergente pode ser utilizado para quebralas Uma solucao com agua detergente e um pouco de sal vai fazer com que o rompimento da membrana e parede sejam eficientes A funcao do detergente e desestruturar as moleculas de lipidios das membranas biologicas Desta maneira as membranas sofrem ruptura e todo o conteudo celular inclusive o DNA fica disperso na solucao A maceracao com essa solucao e fundamental permitindo a liberacao do DNA o qual ficara diluido na agua com todo o resto celular Para separar o DNA de toda essa mistura e necessario filtrar A molecula de DNA e constituida de fosfato acucar base nitrogenada O fosfato que fica mais externo tem carga negativa dando a molecula uma polaridade Como a molecula de agua tambem e polar o DNA acaba ficando muito bem diluido na agua e invisivel O sal adicionado na solucao de lise vai ajudar na separacao do DNA fazendo com que ele nao fique tao solvel em agua O sal misturado a agua foi utilizado para neutralizar o DNA que precipitará com o alcool gelado O alcool gelado em solucao salina proporciona uma solucao heterogenea e faz com que as moleculas de DNA se aglutinem formando a massa filamentos e esbranquiçada O sal tambem ajuda a manter as proteinas dissolvidas no liquido extraido impedindo que elas precipitem com o DNA Para finalizar a separacao do DNA utilizase o alcool o qual ira desidratar o DNA e desta forma menor quantidade de agua havera disponivel para diluir o DNA Ao adicionar o alcool vagarosamente e possivel observar o DNA precipitando CURSO BIOMEDICINA CURSO DE FARMÁCIA Disciplina Biologia Molecular e Biotecnologia Nome do aluno as Ordem alfabética quando for mais de 1 autor RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA Extração DNA Balneário Camboriú 20211 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO4 11 OBJETIVO4 2 CONTEXTUALIZAÇÃO5 3 DESCRIÇÃO DA ATIVIDADE PRÁTICA6 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES7 6 CONCLUSÕES E SUGESTÕES8 7 REFERÊNCIAS9 4 1 INTRODUÇÃO É o momento onde se dá uma visão geral do conteúdo do relatório Deve conter a importância e a justificativa do trabalho 11 OBJETIVO Descrever suscintamente o objetivo da atividade prática realizada de forma clara e sucinta 5 2 CONTEXTUALIZAÇÃO Apresentação do conhecimento da literatura básica e desenvolvimento do assunto Revisão Bibliográfica Compõese de escrita do assunto a ser tratado no relatório relato do fato informação que se queira descrição de norma e do procedimento Apresentar somente assuntos que tenham relação direta e específica com o trabalho Todo material citado deve constar nas referências Deve ser apresentada preferencialmente em ordem cronológica 6 3 DESCRIÇÃO DA ATIVIDADE PRÁTICA Neste item deve ser descrito como foi realizado a atividade prática Também deve ser incluído neste capítulo os equipamentos e materiais necessários para o desenvolvimento da atividade 31 MATERIAIS Descrever os materiais utilizados de acordo com a especificação técnica e quantidade conforme atividade a ser realizada 32 MÉTODO Descrever as etapas PROCEDIMENTO da atividade prática Devem ser apresentadas as equações e fotos da atividade prática desenvolvida Não deve conter os resultados do trabalho As figuras no trabalho devem ser anunciadas no texto centralizada e o nome da figura deve ser colocado em cima da mesma com letra Arial 12 espaçamento entre linhas simples A fonte deve ser colocada embaixo da figura com letra Arial 10 espaçamento simples entre linhas Veja por exemplo a Figura 1 Figura 1 Ciclo da tecnologia e a transformação das organizações Fonte ABREU 1995 p 62 Quando se colocam quadros ou tabelas estes também devem ser centralizados As tabelas e quadros devem ser de boa qualidade inseridas no texto 7 A indicação da fonte é feita na parte inferior da tabelaquadro As tabelas contêm números e os quadros somente texto Ver por exemplo a Tabela 1 Tabela 1 Tipo de colaboração e respectivos números de palavras Tipo de colaborações submetidas Número de palavras Artigos originais 5000 a 8000 Temas em Debate 1500 a 3000 Notas e Informações 700 a 1500 Relatos de experiências 2000 a 3500 Resenhas 1500 a 3000 Destaque Editorial 600 a 800 Fonte SOUZA 2010 p20 No Quadro 1 mostramse os tipos de colaborações submetidas xxx Quadro 1 Tipo de colaboração Tipo de colaborações submetidas Artigos originais Temas em Debate Notas e Informações Fonte SOUZA 2010 p20 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES Os resultados podem ser apresentados em forma de tabelas fotos ou gráficos sendo numerados sequencialmente e discutidos antes de serem colocados Quando possível os resultados experimentais obtidos devem ser comparados com dados de literatura e suas diferenças quando houver discutidas 8 6 CONCLUSÕES E SUGESTÕES Esta é a parte final do Relatório na qual o aluno deve apresentar as principais conclusões alcançadas com a atividade desenvolvida Deve expor como a atividade foi importante para sua formação técnica profissional e ressaltar de que maneira os conhecimentos práticos advindos da atividade desenvolvida contribuirão para o conhecimento teórico a ser obtido no curso Com base no trabalho corrente poderão ser indicados assuntos de relevância significativa para serem abordados em projetos posteriores sugestões 9 7 REFERÊNCIAS Se forem consultados materiais as referências devem ser colocadas nesse capítulo Seguir as normas ABNT As referências dos documentos citados no texto devem ser apresentadas em ordem alfabética ao final do trabalho A fonte do texto deve ser Arial tamanho 12 Espaçamento entre linhas simples Texto alinhado à esquerda Os elementos fundamentais ou essenciais são autor título edição local de publicação editora e ano de publicação As orientações a seguir abrangem a maioria dos casos a Livros e folhetos SOBRENOME Nome Título subtítulo Edição Cidade de publicação Editora ano da publicação b Artigos de publicações periódicas SOBRENOME Nome Título do artigo Título do periódico cidade de publicação número do volume número do fascículo páginas inicialfinal mês e ano c Artigo de jornal SOBRENOME Nome Título do artigo Título do jornal cidade data Número ou título do caderno seção ou suplemento páginas inicialfinal d Fontes via Internet Anotar o endereço eletrônico do autor ou o endereço URL site e a data de acesso SOBRENOME nome Ano Título do trabalho Edição Tipo de mídia Produtor opcional identificador data de acesso Ex GRAEFF Clóvis 1996 Modelagens para o Gerenciamento Financeiro da Produção Online httpwwwwepsefscbrteses96graeffindexhtm 1997 Dez 10 Observações 1 O nome do autor deve ser iniciado pelo seu último sobrenome exceto para sobrenomes compostos como por ex LIMA SOBRINHO CASTELO BRANCO e SILVA JÚNIOR em letras maiúsculas seguido dos prenomes exatamente como na publicação 10 2 Para publicação elaborada por até três autores mencionase os nomes de todos os autores na mesma ordem de publicação separados por vírgula ou ponto e vírgula 3 Para publicação elaborada por mais de três autores indicase o primeiro ou o organizador ou coordenador seguindose da expressão et al 4 Usamse as abreviações p para páginas v para volumes ed Para edição A primeira edição não é colocada No text found uniAvan Curso de Biomedicina Disciplina Biologia Molecular e Biote Profa Dra Juliana V Raimondi MATERIAL NECESSÁRIO 2 a 3 morangos 15 mL Detergente 15 mL Água destilada 15 mL Álcool acima de 76 gelado 1g Sal Cadinhos para maceração Beckers de 50 mL Peneira e gaze Faca descartavel Saco plastico PROCEDIMENTO 1 Preparar a solução de lise 15 mL de água 15 mL meia colher café de detergente 1g de sal 2 Cortar um morango em fatias 3 No cadinho colocar o morango solução lise e macerar bem 4 Filtrar 5 Adicionar álcool vagarosamente 250 APPROX 200 150 250 ml 100 50 100 APPROX 80 60 40 20 200 150 100 50 100 ml 80 60 40 20 Embrapa Pecuária Sudeste Rodovia Washington Luiz km 234 Caixa Postal 339 Fone 16 33615611 Fax 16 33615754 Home page httpwwwcppseembrapabr Endereço eletrônico saccppseembrapabr Comitê de Publicações da Unidade Presidente Alberto C de Campos Bernardi SecretárioExecutivo Edison Beno Pott Membros Carlos Eduardo Silva Santos Maria Cristina Campanelli Brito Odo Primavesi Sônia Borges de Alencar Revisor de texto Edison Beno Pott Normalização bibliográfica Sônia Borges de Alencar Capa Maria Cristina Campanelli Brito Editoração eletrônica Maria Cristina Campanelli Brito Todos os direitos reservados A reprodução nãoautorizada desta publicação no todo ou em parte constitui violação dos direitos autorais Lei no 9610 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação CIP Embrapa Pecuária Sudeste Fundamentos téoricopráticos e protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio de reação em cadeia da polimerase recurso eletrônico Márcia Cristina de Sena Oliveira et al São Carlos Embrapa Pecuária Sudeste 2007 Modo de Acesso httpwwwcppseembrapabrservicospublicacaogratuita ebooksLVFundDNApdf Publicações gratuitas acesso em 102007 Disponível também em CDROM 500 exemplares ISBN 9788586764127 1 DNA Extração Polimerase 2 DNA Amplificação Polimerase I Oliveira Márcia C de Sena II Título CDD 5918 Embrapa 2007 Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificação de dna por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Pecuária Sudeste Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase Embrapa Pecuária Sudeste São Carlos SP 2007 7 PROTOCOLOS EMPREGADOS NA ROTINA DE EXTRAÇÃO DE DNA DE AMOSTRAS DE SANGUE Existem muitos tipos de protocolos e muitos kits comerciais para a extração de DNA que se adaptam a diversos tipos de amostras Para cada tipo de tecido podem ser testadas adaptações de acordo com as características de cada espécime a ser analisado A extração de DNA a ser empregada na PCR com fins de diagnóstico deve seguir um protocolo em que a obtenção de amostras de alta pureza é fundamental O volume a ser submetido à extração é muito importante mesmo porque em alguns procedimentos ele é extremamente restrito amostras podem ser colhidas com swabs ou de esfregaços de sangue e de cortes histológicos A grande dificuldade verificada em alguns casos é que quando se extrai DNA de uma amostra existe a mistura de ácidos nucléicos do hospedeiro e de ácidos nucléicos de outros microrganismos que podem estar presentes no tecido Para exemplificar a extração do DNA de sangue de um bovino para pesquisa de hemoparasitas produz a mistura de DNA que contém o ácido nucléico do hospedeiro e o ácido nucléico de todos os microrganismos presentes na amostra de sangue O genoma de qualquer microrganismo é muito menor do que o de um mamífero e para que se consiga a amplificação adequada é preciso obter amostras muito puras Existem vários métodos para extração de ácidos nucléicos que podem ser usados no estudo de parasitas no entanto em razão da pequena quantidade de DNA algumas vezes presente nesses agentes é necessária a otimização do processo Nos protocolos de extração de DNA com a finalidade de amplificação por meio da técnica de PCR são usados como anticoagulantes o citrato de sódio e o ácido etilenodiaminotetracético EDTA A heparina não é indicada como anticoagulante por causa da sua propriedade inibitória sobre a PCR O sangue colhido com citrato de sódio ver Apêndice ou com EDTA pode ser armazenado por cerca de sete dias a 4C ou durante vários anos a 80C 71 Extração de DNA de amostras de sangue com a utilização de colunas de extração Este protocolo foi adaptado para extração de DNA de amostras de sangue de bovinos para o diagnóstico da tristeza parasitária dos bovinos no Laboratório de Sanidade Animal da Embrapa Pecuária Sudeste Vários kits disponíveis no mercado por exemplo o GFX GE Healthcare podem ser empregados A purificação do DNA é feita por meio do uso de uma coluna que contém fragmentos de sílica coluna de purificação Inicialmente o DNA se liga à membrana da coluna de extração e depois Autores Márcia Cristina de Sena Oliveira Médica Veterinária Dra Embrapa Pecuária Sudeste Rod Washington Luiz km 234 Caixa Postal 339 CEP 13560970 São Carlos SP Endereço eletrônico marciacppseembrapabr Luciana Correia de Almeida Regitano Médica Veterinária Dra Embrapa Pecuária Sudeste Rod Washington Luiz km 234 Caixa Postal 339 CEP 13560970 São Carlos SP Endereço eletrônico lucianacppseembrapabr Alexandre Dinnys Roese Engenheiro Agrônomo Mestre Embrapa Trigo Rod BR 285 km 294 Caixa Postal 451 CEP 99001970 Passo Fundo RS Endereço Eletrônico alexcnptembrapabr Denilson Gouvêa Anthonisen Bacharel em Química Mestre Embrapa Clima Temperado Rod BR 392 km 78 9º Distrito Monte Bonito Caixa Postal 403 CEP 96001970 Pelotas RS Endereço Eletrônico denilsoncpactembrapabr Epaminondas do Patrocínio Bacharel em Química Embrapa Mandioca e Fruticultura Rua Embrapa sn Caixa Postal 007 CEP 44380000 Cruz da Almas BA Endereço Eletrônico epamicnpmfembrapabr Márcia Maria Parma Bacharel em Química Embrapa Meio Ambiente Rod SP 340 km 127m5 Tanaquinho Velho Caixa Postal 69 CEP 13820000 Jaguariúna SP Endereço Eletrônico mmparmacnpmaembrapabr Sandra Maria Mansur Scagliusi Bióloa Mestre Dra Embrapa Trigo Rod BR 285 km 294 Caixa Postal 451 CEP 99001970 Passo Fundo RS Endereço Eletrônico mansurcnptembrapabr Wilston Henrique Belem Timóteo Licenciado em Matemática Mestre Embrapa Milho e Sorgo Rod MG 424 km 45 Caixa Postal 151 CEP 35701970 Sete Lagoas MG Endereço Eletrônico wilstoncnpmsembrapabr Silvia Neto Jardim Bióloga Dra Embrapa Milho e Sorgo Rod MG 424 km 45 Caixa Postal 151 CEP 35701970 Sete Lagoas MG Endereço Eletrônico silviacnpmsembrapabr SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 1 2 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS 2 3 OBTENÇÃO DE AMOSTRAS PARA EXTRAÇÃO DE DNA3 4 CUIDADOS DURANTE E APÓS A EXTRAÇÃO DE DNA4 5 MATERIAL NECESSÁRIO PARA EXTRAÇÃO DE DNA4 6 EXTRAÇÃO DE DNA DE AMOSTRAS DE TECIDOS DE MAMÍFEROS5 61 Material ver Apêndice 5 62 Digestão da amostra 5 63 Extração do DNA com fenol5 64 Purificação do DNA por meio de precipitação com etanol6 7 PROTOCOLOS EMPREGADOS NA ROTINA DE EXTRAÇÃO DE DNA DE AMOSTRAS DE SANGUE7 71 Extração de DNA de amostras de sangue com a utilização de colunas de extração7 72 Protocolo de extração de DNA de sangue mediante precipitação com sal 8 73 Extração de DNA de amostras congeladas de sangue10 8 PROTOCOLOS EMPREGADOS NA EXTRAÇÃO DE DNA DE AMOSTRAS DE ARTRÓPODES COM UTILIZAÇÃO DE COLUNAS DE PURIFICAÇÃO 11 81 Protocolo para extração de DNA de amostras de carrapatos com colunas de purificação11 82 Protocolo de extração de DNA de ovos de carrapatos com a utilização de colunas de purificação12 9 EXTRAÇÃO DE DNA DE AMOSTRAS DE SÊMEN 13 10 EXTRAÇÃO DE DNA DE PLANTAS14 11 LEITURA DA CONCENTRAÇÃO DE DNA NAS AMOSTRAS 16 12 INTRODUÇÃO À TECNICA DE PCR 16 13 ESCOLHA DOS PRIMERS OU INICIADORES19 14 PCR MULTIPLEX 20 15 NESTEDPCR 20 16 PCR QUANTITATIVA 21 17 ELETROFORESE DE ÁCIDOS NUCLÉICOS21 171 Eletroforese em gel de agarose22 172 Variáveis que afetam a migração do DNA através do gel de agarose 23 18 PROTOCOLO PARA ANÁLISE DE PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO E FRAGMENTOS DE DIGESTÃO EM GEL DE AGAROSE25 19 ELETROFORESE EM SISTEMA CAPILAR 26 20 PROTOCOLO PARA ANÁLISE DE PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO EM SISTEMA CAPILAR 28 21 PROTOCOLOS DE AMPLIFICAÇÃO DE DNA PARASITÁRIO28 211 PCR para Babesia bigemina28 212 NestedPCR para Babesia bigemina29 22 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE PARA VISUALIZAÇÃO DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS31 23 APÊNDICE 33 24 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS37 25 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA37 Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 1 FUNDAMENTOS TEÓRICOPRÁTICOS E PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO E DE AMPLIFICAÇÃO DE DNA POR MEIO DA TÉCNICA DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE1 1 INTRODUÇÃO A extração e a purificação de ácidos nucléicos a partir de diversas amostras experimentais bactérias fungos tecidos vegetais e tecidos animais é uma etapa fundamental para se obter alta eficiência de amplificação nos protocolos que usam a reação em cadeia da polimerase PCR Essa técnica tem sido amplamente empregada em estudos moleculares em razão da facilidade relativa com que é possível amplificar in vitro regiões específicas do genoma de qualquer organismo A PCR possibilita a amplificação de seqüências de DNA que estejam presentes em misturas complexas e permite estudos de natureza variada tais como desenvolvimento de métodos de diagnóstico altamente sensíveis e específicos obtenção de grandes quantidades de DNA para seqüenciamento e análises sobre a diversidade genética de populações Apesar da facilidade de amplificação de DNA possibilitada pela técnica de PCR existe a necessidade da adequada padronização dos protocolos a serem utilizados em todas as fases dos procedimentos desde a obtenção do ácido nucléico até a reação de amplificação propriamente dita O DNA em sua forma original de dupla fita apresenta alta estabilidade e é muito resistente e se mantém inalterado em várias condições de meio No entanto alguns cuidados são aconselháveis para que seja evitada a degradação das amostras obtidas em laboratório A extração de DNA inclui basicamente dois procedimentos principais a lise das células presentes na amostra e a purificação do DNA Após a lise das células o DNA deve ser separado dos restos celulares e das proteínas precipitado e suspenso em volume adequado de água ultrapura ou soluçõestampão adequadas As amostras de DNA podem também ser submetidas a processos de concentração e de purificação com a finalidade de se obter melhores resultados nas amplificações Para cada tipo de amostra vários protocolos podem ser testados adaptados e otimizados de maneira a se conseguir DNA de boa qualidade Neste manual apresentamse de maneira simples alguns fundamentos da análise de DNA 1 Polimerase chain reaction PCR Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 2 2 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS As células vivas são capazes de preservar e de transferir a informação genética para as novas gerações por meio da complementaridade estrutural das moléculas de ácidos nucléicos o DNA e o RNA A unidade básica tanto do DNA como do RNA são polímeros de subunidades monoméricas denominadas nucleotídeos que estão arranjados em seqüência precisa Em organismos eucarióticos cujas células apresentamse organizadas com membrana citoplasma e núcleo o DNA é encontrado no núcleo das células e também nas mitocôndrias e nos cloroplastos As moléculas de DNA e de RNA consistem de apenas quatro tipos de nucleotídeos Os nucleotídeos são compostos precursores da síntese dos ácidos nucléicos que contém um grupo fosfato uma pentose molécula de açúcar com cinco carbonos e uma base nitrogenada Durante o processo de polimerização do ácido nucléico a ligação de um nucleotídeo à cadeia em extensão ocorre pela ação nucleofílica de uma hidroxila da pentose 3OH do resíduo de nucleotídeo mais externo da cadeia sobre o fosfato α ligado ao carbono 5 da pentose 5PO4 do nucleotídeo que será incorporado resultando na liberação de um íon difosfato A pentose que compõe o RNA é sempre a ribose e o DNA a desoxirribose As bases adenina guanina e citosina são encontradas tanto nas moléculas de DNA como de RNA enquanto timina aparece exclusivamente nas moléculas de DNA e uracila nas de RNA Tanto o DNA quanto o RNA são utilizados na pesquisa dependendo principalmente do objetivo de cada trabalho O DNA apresenta diferentes seqüências de nucleotídeos que formam diferentes unidades conhecidas por genes O gene é definido como o segmento de DNA que codifica a informação requerida para a produção de determinado polipeptídeo ou de um segmento de RNA Formas alternativas dos genes são denominados alelos e a totalidade do DNA presente na célula é chamada de genoma Os genes estão organizados em cromossomos e a sua posição no cromossomo é denominada lócus Na maioria dos organismos chamados diplóides cada célula contém duas cópias de cada tipo de cromossomo Nestes organismos cada indivíduo possui dois alelos para cada lócus um originário da mãe e outro do pai Se os dois alelos de um lócus não podem ser diferenciados pela sua seqüência de nucleotídeos ele é chamado de homozigoto para o lócus considerado e caso contrário ele é denominado heterozigoto O princípio da segregação estabelece que cada célula reprodutiva originária de indivíduos heterozigotos contém apenas um dos dois alelos enquanto as demais células contém os dois alelos em igual freqüência Em seu estado nativo o Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 3 DNA apresentase arranjado em dupla hélice com as fitas das seqüências complementares ligadas entre si por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas O DNA de todas as bactérias organismos procarióticos e de muitos vírus são arranjados de forma circular O cromossomo da Escherichia coli contém cerca de 00044 picogramas de DNA cerca de 4 x 106 pares de bases que codificam cerca de 3300 proteínas diferentes Os seres humanos apresentam ao redor de três bilhões de pares de bases que codificam de 50 a 100 milhares de genes em 24 cromossomos Os vírus apresentam quantidade reduzida de informação genética quando comparados aos organismos celulares porque usam recursos da célula hospedeira para se reproduzir Apesar do tamanho relativamente pequeno da informação genética contida em bactérias e vírus o DNA desses organismos precisa ser compactado para que possa ser contido nessas células Com base nas características estruturais dos ácidos nucléicos algumas técnicas moleculares são utilizadas na manipulação do DNA dos organismos A hibridização é a técnica que se baseia na complementaridade entre as fitas de DNA Um fragmento de DNA marcado por uma substância radioativa é usado como sonda para determinar a presença da fita complementar em uma amostra específica Essa técnica foi muito utilizada em testes de diagnóstico porém atualmente em conseqüência de sua baixa sensibilidade e de problemas advindos do uso de radioatividade ela caiu em desuso A clivagem é outra técnica que pode facilitar a manipulação do DNA Para esse fim existem as chamadas enzimas de restrição que são capazes de cortar o DNA em sítios específicos definidos geralmente pela seqüência de bases distribuídas ao longo da molécula produzindo fragmentos de comprimento menor As enzimas de restrição são sintetizadas naturalmente por muitas bactérias e centenas com especificidade para diferentes sítios de restrição estão disponíveis comercialmente Outros tipos de manipulação de DNA incluem a amplificação utilizando a técnica de PCR e a eletroforese que serão apresentados em detalhe 3 OBTENÇÃO DE AMOSTRAS PARA EXTRAÇÃO DE DNA As amostras perecíveis devem ser acondicionadas de forma adequada até o momento de serem submetidas à extração do DNA Amostras de sangue e de outros tecidos animais devem ser refrigeradas até chegarem ao laboratório Amostras de tecidos vegetais também devem ser cuidadosamente colhidas armazenadas e refrigeradas As partes da planta devem ser lavadas e enxaguadas com água destilada Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 4 ou submetidas a processo de esterilização superficial de acordo com o objetivo dos estudos a serem realizados Para melhor conservação as amostras devem ser mantidas em temperatura de 20C a 80C dependendo do tempo de armazenamento Para utilização de amostras conservadas em estoque é interessante o fracionamento em pequenas alíquotas para que o material não sofra descongelamentos sucessivos que poderiam contribuir para a oxidação do tecido e para a degradação do DNA O manuseio dessas amostras deve ser feito preferencialmente com o uso de luvas para que uma parte dos ácidos nucléicos não sejam degradados por nucleases enzimas que normalmente estão presentes nos fluidos corporais liberados principalmente nas mãos das pessoas 4 CUIDADOS DURANTE E APÓS A EXTRAÇÃO DE DNA Com a finalidade de se obter amostras de DNA adequadas aos protocolos de amplificação é importante que exista uma sala exclusiva para esse fim O DNA apresenta grande afinidade pelo vidro e pode ser adsorvido na presença de alguns sais por isso esse material não deve ser empregado durante o processo de extração Todo o material plástico polipropileno utilizado deve ser esterilizado e novo não deve ser usado material reciclado para que as amostras apresentem boa qualidade e para que se diminuam os riscos de contaminação entre amostras no momento da análise 5 MATERIAL NECESSÁRIO PARA EXTRAÇÃO DE DNA Para executar os protocolos de extração de DNA é necessário que o laboratório tenha os equipamentos básicos o material plástico e todas as soluções utilizadas nos procedimentos O material mínimo necessário é o seguinte a Centrífuga com rotor para vários tipos de tubos ou para o tipo de tubo empregado no laboratório É aconselhável que a centrífuga tenha controle de refrigeração b Capelas de exaustão c Banhomaria com termostato ou com termômetro para aferição da temperatura d Vidraria para preparo das amostras provetas pipetas bastões de vidro e Microtubos de polipropileno f Micropipetas automáticas para volumes diversos com ponteiras g Gelo e nitrogênio líquido quando necessário Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 5 6 EXTRAÇÃO DE DNA DE AMOSTRAS DE TECIDOS DE MAMÍFEROS 61 Material ver Apêndice a Tampão de digestão 1 b Solução de fenol clorofórmio e álcool isoamílico 25241 para essa solução usar fenol tamponado c Acetato de amônio 75 M d Etanol absoluto e Etanol a 70 f Tampão TE trisHCl 10 mM EDTA 1 mM com pH 80 tris hidroximetilaminometano g Solução de dodecilsulfato de sódio SDS a 01 h Nitrogênio líquido i Frascos e bastões esterilizados j Microtubos de polipropileno 62 Digestão da amostra As amostras de tecidos de origem animal ou vegetal que serão submetidas à extração de DNA devem sofrer fragmentação e digestão enzimática das proteínas Para produzir a fragmentação as amostras podem ser cortadas submetidas a congelamento em nitrogênio líquido e rapidamente pulverizadas por processo manual utilizando um bastão ou mecânico utilizando equipamentos para esse fim Quantidades da amostra entre 200 mg e 1 g são adicionadas a uma soluçãotampão de digestão na proporção de 12 mL de tampão para cada 100 mg de tecido e colocadas em banhomaria em temperatura próxima a 50C para que ocorra a digestão O tempo de incubação pode variar entre oito e dezesseis horas ou até que a amostra se apresente totalmente digerida ou seja apresente aspecto viscoso 63 Extração do DNA com fenol O método mais utilizado para purificação do DNA é a extração com fenol tamponado que provoca a desnaturação das proteínas de maneira eficiente O clorofórmio também é usado como agente desnaturante das proteínas contidas na amostra A mistura de fenol e de clorofórmio é muito eficiente para desproteinizar e sua ação se fundamenta na propriedade hidrófoba das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos O álcool isoamílico previne a formação de espuma quando a Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 6 mistura é agitada o que torna mais fácil a separação da fase orgânica e da fase aquosa A proteína que foi desnaturada pelo tratamento com fenol e clorofórmio forma uma camada na interface das duas fases separandose do DNA que se mantém na fase aquosa Para extrair o DNA de uma amostra usar igual volume de solução de fenol de clorofórmio e de álcool isoamílico 25241 A extração com o fenol é dependente do pH O fenol empregado nas extrações de DNA deve ter o pH próximo de 80 fenol tamponado já que faixas mais baixas de pH deslocam o DNA para a interface na hora da centrifugação Em pH 70 ou acima o DNA permanece na fase aquosa e em pH abaixo de 70 ele é desnaturado e migra para a fase orgânica Nesse último caso o RNA permanece na fase aquosa Metodologia para tamponamento do fenol está descrita no Apêndice Após a adição da solução de extração centrifugar a amostra por dez minutos a 1700 g e transferir o sobrenadante para um novo tubo Cuidado A manipulação de soluções que contêm fenol exige cuidado pelo fato de serem extremamente cáusticas voláteis e irritantes para as mucosas 64 Purificação do DNA por meio de precipitação com etanol A precipitação do DNA é feita por meio da utilização de etanol absoluto associado a uma solução com alta concentração de um sal catiônico O etanol induz a transição estrutural nas moléculas de ácido fazendoas se agregarem com conseqüente precipitação A precipitação com etanol absoluto além de concentrar o DNA ajuda a remover resíduos de fenol e de clorofórmio presentes na amostra O etanol a 70 é utilizado para remover resíduos de sais Embora tanto o cloreto de sódio como o acetato de sódio e o acetato de amônio sejam eficazes na precipitação do DNA é mais difícil remover o cloreto de sódio em razão da sua menor solubilidade em etanol Procedimento Adicionar meio volume de solução de acetato de amônio 75 M e dois volumes de etanol absoluto Centrifugar a 1700 g por cerca de dois minutos o tempo deve ser ajustado de acordo com a amostra Eliminar a solução alcoólica e preservar o pellet de DNA Ressuspender o pellet em etanol a 70 para eliminar impurezas presentes na amostra centrifugar novamente a 1700 g por dois minutos Descartar o sobrenadante e deixar secar o pellet de DNA Ressuspender o DNA em tampão TE ver item 61f Para facilitar a completa dissolução do DNA nesse tampão as amostras podem ser incubadas em agitador a 65C por algumas horas Image does not contain text to extract Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 8 ele é lavado até que apresente alta pureza No final do protocolo o DNA é eluído com água quente ou com tampão TE A utilização de kits permite a purificação do DNA nas amostras de maneira homogênea e rápida Procedimento a Colocar 300 µL de sangue e 900 µL de solução de lise em microtubo de 15 mL b Homogeneizar e centrifugar a 20800 g por cinco minutos e descartar o sobrenadante deixando cerca de 50 µL c Homogeneizar a amostra e adicionar 500 µL de solução de extração d Incubar por cinco minutos em temperatura ambiente e transferir o conteúdo do microtubo para a coluna de extração Acoplar a coluna de extração ao tubo coletor e Centrifugar a 5000 g por um minuto descartar o conteúdo do tubo coletor f Adicionar à coluna 500 µL de solução de extração e centrifugar a 5000 g por um minuto descartar o conteúdo do tubo coletor g Adicionar à coluna 500 µL de solução de lavagem e centrifugar a 20800 g por três minutos descartar o conteúdo do tubo coletor h Transferir a coluna para um microtubo de 15 mL limpo e livre de enzimas que decomponham o DNA i Adicionar 100 µL de água ultrapura autoclavada e aquecida a 70ºC incubar por um minuto em temperatura ambiente e centrifugar a 5000 g por um minuto obtendo se assim a solução de DNA O DNA pode ser eluído em tampão TE também aquecido a 70C 72 Protocolo de extração de DNA de sangue mediante precipitação com sal Este protocolo adaptado de Olerup Zetterquist 1992 é usado no Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Pecuária Sudeste e pode ser empregado com volumes pequenos de sangue Soluções Solução A tampão de hemólise para cada amostra de 25 mL a TrisHCl 1 M com pH 76 concentração final de 10 mM 250 µL b MgCl2 05 M concentração final de 5 mM 250 µL c NaCl 5 M concentração final de 10 mM 50 µL d Completar com água ultrapura qsp 25 mL Solução B para cada amostra de 500 µl a TrisHCl 1 M com pH 80 concentração final de 10 mM 5 µL b NaCl 5 M concentração final de 100 mM 10 µL c EDTA 05 M com pH 80 concentração final de 10 mM 10 µL d Dodecilsulfato de sódio a 20 concentração final de 05 125 µL e Proteinase K concentração final de 20 mgmL 20 µL f H2O ultrapura 4605 µL Para a precipitação do DNA a Etanol absoluto gelado manter a 5 C b Etanol a 70 gelado manter a 5 C Obtenção de leucócitos a Colher 5 mL de sangue em tubos com anticoagulante EDTA Acertar os volumes dos tubos completando com solução salina solução de cloreto de sódio 09 M b Centrifugar durante cinco minutos a 390 g e descartar o plasma usando pipeta com cuidado para não descartar as células brancas esta etapa é opcional c Lisar os glóbulos vermelhos com 10 mL 5 mL no tubo de colheita e 5 mL em tubo de polipropileno com capacidade para 15 mL da solução A e homogeneizar misturando bem por inversão ou agitando os tubos no vortex d Centrifugar durante dez minutos a 700 g na temperatura de 4 C e Dispensar o sobrenadante Se o pellet for muito pequeno centrifugar novamente f Ressuspender o pellet em 5 mL do tampão de hemólise Para isso tampar os tubos com Parafilm e misturar bem por inversão e se preciso usar o vortex Centrifugar a 2000 rpm por dez minutos a 4ºC g Repetir a lavagem até obter somente células brancas h Ressuspender o pellet em 500 µL de tampão de hemólise solução A e passar para microtubos de 15 mL Centrifugar por um minuto a 16000 g e descartar o sobrenadante i O pellet pode ser conservado a 20 C ou em temperatura menor por vários meses Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 10 Obtenção do DNA a Ressuspender o pellet em 500 µL de solução B e misturar no vortex Obs destruir bem o pellet antes de incubar b Incubar a 55C até dissolver o pellet durante quatro a seis horas ou de um dia para o outro De vez em quando misturar as amostras no vortex para que o pellet fique bem dissolvido c Ajustar o volume para 760 µL com tampão TE 210 µL Acrescentar 240 µL de NaCl 5 M d Incubar por quinze minutos em gelo e Agitar os tubos por inversão até formar pequenos coágulos de proteína Centrifugar por quinze minutos a 16000 g f Dividir todo o sobrenadante em dois tubos novos devidamente marcados 500 µL em cada um g Ligar o banhomaria a 37ºC Adicionar 1 mL de etanol absoluto gelado e inverter o tubo várias vezes Centrifugar por quinze minutos a 16000 g Descartar o sobrenadante Secar com papel com cuidado h Lavar com 500 µL de etanol a 70 gelado Revolver o tubo Centrifugar por cinco minutos a 16000 g Descartar e colocar a secar temperatura máxima de 40ºC Adicionar 250 µL de tampão TE solução de enzima que degrada RNA RNAse 10 µg por mL de amostra e incubar por uma hora a 37ºC 73 Extração de DNA de amostras congeladas de sangue Soluções utilizadas Ver Apêndice Tampão PBS Tampão de lise 1 Solução de proteinase K 20 mgmL Solução de acetato de amônio 10 M Etanol absoluto Tampão TE com pH 80 Procedimento a Descongelar a amostra de sangue em temperatura ambiente e adicionar igual volume de tampão PBS b Centrifugar a 3500 g por quinze minutos a 4 C c Remover o sobrenadante e suspender o pellet em 15 mL de tampão de lise incubar por cerca de uma hora a 37 C d Transferir o lisado para tubos de centrifugação em quantidade que ocupe apenas 13 do tubo e Adicionar solução de proteinase K de modo a obter a concentração final de 100 µgmL e misturar f Incubar a 50 C por três horas misturando algumas vezes g Adicionar igual volume de fenol tamponado Misture duas fases invertendo o tubo várias vezes h Centrifugar a 5000 g por quinze minutos i Transferir o sobrenadante para um tubo limpo com cuidado j Repetir a extração com fenol por mais duas vezes k Adicionar à fase aquosa dois décimos de volume de solução de acetato de amônio 10 M e dois volumes de etanol absoluto l Retirar com uma alça o DNA desidratado que se apresenta em suspensão na solução aquosa e transferir para outro microtubo ou então centrifugar a 5000 g por cinco minutos e descartar o sobrenadante m Deixar evaporar todo o etanol residual n Adicionar 1 mL de tampão TE com pH 80 para cada 01 mL de células extraídas 8 PROTOCOLOS EMPREGADOS NA EXTRAÇÃO DE DNA DE AMOSTRAS DE ARTRÓPODES COM UTILIZAÇÃO DE COLUNAS DE PURIFICAÇÃO A preparação de amostras de artrópodes para extração de DNA exige boa digestão de todo o material por período de tempo variável que dependerá basicamente do peso da amostra Uma limitação dos kits que possuem a membrana de sílica é que as amostras devem apresentar peso limitado à capacidade máxima indicada no manual Como regra cerca de 20 mg de tecido de carrapato macerado são usados para extração Outros artrópodes menores podem ser processados inteiros 81 Protocolo para extração de DNA de amostras de carrapatos com colunas de purificação Nesse protocolo foi empregado o kit GFX GE Healthcare Soluções que não estão no kit ver o Apêndice a Solução de proteinase K 20 mgmL b Tampão de digestão 2 Procedimento a Pesar 20 mg da amostra e colocar em um microtubo de 15 mL b Macerar com a ponta cônica de um bastão As amostras podem ser mergulhadas em pequenas quantidades de nitrogênio líquido para serem congeladas rapidamente O congelamento facilita a maceração das amostras que se tornam mais quebradiças c Adicionar 10 µL de tampão lisozima e incubar por quinze minutos em temperatura ambiente d Adicionar 15 µL de solução de proteinase K e incubar de um dia para o outro na temperatura de 56 C e Adicionar 500 µL de solução de extração e incubar por quinze minutos em temperatura ambiente f Centrifugar a 5000 g por dois minutos g Recolher o sobrenadante colocar na coluna de extração e centrifugar a 5000 g por um minuto Descartar o conteúdo do tubo coletor h Novamente adicionar 500 µL de solução de extração e incubar por quinze minutos em temperatura ambiente Centrifugar a 5000 g por um minuto Descartar o conteúdo do tubo coletor i Adicionar 500 µL de solução de lavagem e centrifugar novamente a 20000 g por cinco minutos Descartar o tubo coletor e colocar a coluna em um microtubo de 15 mL novo e livre de enzimas que possam atuar sobre DNA e RNA j Para eluição do DNA adicionar 100 µL de água ultrapura aquecida a 70 C incubar por um minuto e centrifugar a 5000 g por um minuto 82 Protocolo de extração de DNA de ovos de carrapatos com a utilização de colunas de purificação O mesmo protocolo utilizado para extração de DNA de carrapato foi adaptado para extração de DNA de alíquotas de ovos de carrapatos kit GFX GE Healthcare Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 13 Procedimento a Pesar 20 mg da amostra e colocar em um microtubo de 15 mL b Macerar com a ponta cônica de um bastão A maceração pode ser feita após congelamento com nitrogênio líquido c Adicionar 10 µL de tampão de digestão 2 e incubar por quinze minutos em temperatura ambiente d Adicionar 15 µL de proteinase K 20 mgmL e incubar por quatro horas na temperatura de 56C e Adicionar 500 µL de solução de extração incubar por quinze minutos em temperatura ambiente f Centrifugar a 5000 g por dois minutos g Recolher o sobrenadante colocar em coluna de extração e centrifugar a 5000 g por um minuto Descartar o material do tubo coletor h Novamente adicionar 500 µL de solução de extração e incubar por quinze minutos em temperatura ambiente Centrifugar a 5000 g por um minuto i Adicionar a solução de lavagem e centrifugar a 20000 g por três minutos 16000 rpm j Transferir a coluna para um tubo limpo de 15 mL e colocar 100 µL de água a 70C ou tampão TE Após um minuto centrifugar o tubo com a coluna a 5000 g por um minuto 9 EXTRAÇÃO DE DNA DE AMOSTRAS DE SÊMEN Soluções utilizadas ver Apêndice Tampão PBS Tampão de lise 2 Procedimento a Descongelar uma palheta de sêmen cerca de 054 mL e colocar em um microtubo de 15 mL b Centrifugar durante oito minutos a 16000 g c Lavar o pellet quatro vezes em 1 mL de tampão PBS a cada lavagem passar no vortex e centrifugar novamente d Ressuspender em 100 µL de tampão PBS nesta fase a amostra pode ser armazenada no freezer Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 14 e Adicionar 400 µL de tampão de lise 2 e incubar por trinta minutos a 50C para dissolver o pellet f Adicionar solução de proteinase K a 200 µgmL 100 µg 5 µL da solução de estoque de 20 mgmL Agitar no vortex até dissolver Incubar por dezesseis horas a 50ºC g Dividir as amostras em dois tubos colocando 250 µL em cada tubo h Adicionar 80 µL de NaCl 5 M por tubo Agitar vigorosamente por inversão Centrifugar a 16000 g por cinco minutos i Transferir o sobrenadante para tubos limpos Acrescentar 1 mL de etanol absoluto a cada tubo e agitar por inversão Centrifugar a 16000 g por cinco minutos j Desprezar o sobrenadante Acrescentar 100 µL de etanol a 70 a cada tubo não agitar no vortex k Centrifugar a 16000 g por cinco minutos Desprezar o sobrenadante Secar o pellet e suspender em 100 µL de tampão TE enzima que atue sobre RNA 10 µgmL de amostra l Incubar por uma hora em temperatura ambiente 10 EXTRAÇÃO DE DNA DE PLANTAS A extração de DNA de plantas envolve a lise das células vegetais por meio do tratamento com detergente e posterior separação e precipitação do DNA A preparação do DNA das plantas pela técnica de centrifugação em gradiente de cloreto de césio produz DNA de alta pureza Outro protocolo que tem sido largamente utilizado por sua facilidade e rapidez é aquele que usa o detergente CTAB brometo de cetiltrimetilamônio que libera o DNA celular e se complexa a ele Posteriormente o DNA é separado por meio do tratamento com isopropanol e etanol Este protocolo pode ser adaptado de várias maneiras para diversos tipos e para várias quantidades de amostra Protocolo que emprega o detergente CTAB Soluções ver Apêndice a soluçãotampão de extração vegetal b Solução de clorofórmio e álcool isoamílico a 241 c Isopropanol d Etanol a 95 e Tampão TE Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 15 Procedimento a Pesar 300 mg do tecido vegetal a quantidade de tecido vegetal pode chegar a até 3 g b Macerar com auxílio de nitrogênio líquido até que a amostra esteja pulverizada c Colocar a amostra em microtubo de 2 mL e adicionar 700 µL de soluçãotampão de extração vegetal e homogeneizar durante dez minutos por inversão d Incubar as amostras em banhomaria a 65ºC por uma hora homogeneizando algumas vezes e Retirar do banhomaria e deixar a temperatura da amostra se igualar à temperatura ambiente f Adicionar 700 µL de solução de clorofórmio e de álcool isoamílico 241 e homogeneizar suavemente g Centrifugar a 5000 g por dez minutos em temperatura ambiente para separar a fase orgânica e a fase aquosa h Remover a fase aquosa superior para um novo microtubo evitando tocar a interface com a ponta da ponteira i Repetir a extração com solução de clorofórmio e álcool isoamílico 241 mais uma ou duas vezes considerando que maior número de extrações pode purificar mais o DNA porém com alguma perda j Após a remoção final do sobrenadante adicionar 450 µL de isopropanol gelado equivalente a aproximadamente 23 do volume coletado Homogeneizar suavemente k Manter a 20ºC por dois minutos para evitar a precipitação de polissacarídeos l Centrifugar a 8600 g por dez minutos m Descartar o sobrenadante n Lavar o pellet uma vez com etanol a 70 o Lavar novamente o pellet com etanol a 95 p Deixar secar por uma hora q Ressuspender em 50 a 100 µL de tampão TE podese adicionar RNAse na concentração final de 10 µgmL de amostra r Incubar a 37ºC por uma hora s Manter a 20ºC Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 16 11 LEITURA DA CONCENTRAÇÃO DE DNA NAS AMOSTRAS Todas as amostras de DNA obtidas no laboratório podem ser avaliadas quanto à sua concentração e à sua pureza por meio da análise da densidade óptica DO em espectrofotômetro O DNA absorve luz no comprimento de onda de 260 nm e as proteínas de 280 nm Diluições das amostras de DNA são preparadas com água ultrapura Pequenas alíquotas de 10 µL diluição 150 ou 5 µL diluição 1100 são misturadas com 490 ou 495 µL de água ultrapura e lidas em espectrofotômetro nos comprimentos de onda citados Para estimar a concentração de DNA utilizase a seguinte relação 1 DO260 50 µg de DNA de dupla hélice A concentração de DNA na amostra pode ser obtida pelo seguinte cálculo Concentração de DNA leitura da DO260 x 50 x fator de diluição usado na leitura A relação entre a quantidade de DNA e de proteína é usada como parâmetro para avaliação da qualidade do DNA extraído e desse modo a relação DO260DO280 pode ser usada para esse fim Amostras cujos valores dessa relação são inferiores a 18 apresentam contaminação com proteínas O DNA pode ser quantificado e analisado quanto à sua qualidade por meio da análise em gel de agarose Para esse fim um gel de agarose entre 08 e 1 é preparado e com as amostras de DNA é aplicada também uma amostra cuja concentração é conhecida O DNA do bacteriófago Lambda em concentrações conhecidas de 20 50 100 e 200 ngµL é geralmente utilizado Após a eletroforese o gel é corado com brometo de etídio visualizado em luz ultravioleta e as amostras são comparadas aos padrões determinandose dessa maneira as concentrações aproximadas de DNA em cada amostra 12 INTRODUÇÃO À TECNICA DE PCR A PCR apresenta ampla gama de aplicações em vários ramos da pesquisa científica Essa reação possibilita que determinada região do genoma de qualquer organismo seja multiplicada em milhões de cópias o que facilita a análise genética e permite o desenvolvimento de técnicas de diagnóstico muito mais sensíveis e mais específicas do que as tradicionalmente utilizadas A alta sensibilidade a especificidade a facilidade de execução e a análise de grande número de amostras simultaneamente fazem dessa técnica uma opção atrativa para estudos epidemiológicos e para Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 17 caracterização de microrganismos causadores de doenças Para que se possa amplificar dado segmento de DNA é necessário que as partes finais da seqüência sejam conhecidas Os elementos envolvidos nessa reação são basicamente os mesmos componentes do processo de replicação que ocorre nas células vivas A solução em que ocorre a reação master mix é preparada em banho de gelo e colocada em microtubos de plástico esterilizados São componentes da PCR a Amostra de DNA que contém o segmento a ser amplificado DNA extraído de amostras de sangue de culturas de microrganismos de espécimes clínicos de plantas etc b Mistura que contenha os nucleotídeos dNTPs dATPs dTTPs dCTPs e dGTPs necessários para a síntese das novas fitas de DNA c Enzima DNApolimerase que é responsável pela síntese das novas fitas de DNA TaqDNApolimerase em soluçãotampão d Cloreto de magnésio cofator da reação e Dois iniciadores ou primers que são pequenas seqüências conhecidas de DNA oligonucleotídeos que delimitam e são complementares à regiãoalvo de amplificação Os primers são sintetizados em laboratórios especializados sob encomenda e após a sua diluição são mantidos a 20C A PCR pode ser feita em tubos de 05 µL ou de 02 µL ou em placas empregandose volume total de 25 µL sendo 20 µL de master mix e 5 µL da amostra de DNA a ser analisada Outras variações de volume têm sido utilizadas em diferentes trabalhos científicos como 10 µL de master mix e 25 µL de DNA O volume das reações pode ser reduzido desde que as concentrações adequadas de todos os componentes da reação sejam mantidas a 147 µL de água ultrapura esterilizada b 25 µL de tampão 10 X concentrado trisHCl 10 mM KCl 500 mM MgCl2 15 mM c 025 µL de solução 20 mM de nucleotídeos dNTPs d 10 µL de primer 10 µM sense e 10 µL de primer 10 µM antisense f 03 µL de TaqDNApolimerase 5 UµL A água a ser empregada no master mix deve ser a ultrapura que apresenta baixa condutividade elétrica O tampão 10 X utilizado para o preparo do master mix é comprado com a TaqDNApolimerase Algumas marcas comerciais de polimerases Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 18 trazem o tampão 10 X já adicionado de cloreto de magnésio outras trazem essa solução separada Nesses casos a solução deve ser adicionada ao master mix logo após o tampão 10 X e o volume total deve ser ajustado com água O íon magnésio não pode faltar no master mix porque ele é essencial para a ação da enzima DNA polimerase Para que ocorra a amplificação com a síntese de novas fitas de DNA as amostras devem ser submetidas à combinação adequada de temperatura e de tempo Cada ciclo da PCR apresenta três fases fundamentais que são desnaturação anelamento e extensão Essas fases ocorrem em temperatura diferente e são programadas no aparelho chamado termociclador onde as amostras são incubadas Na hora de preparar o programa para a amplificação devem estar estabelecidos a temperatura e o tempo exato de cada uma dessas fases e também o número de repetições dos ciclos a Desnaturação é a fase na qual o DNA perde sua estrutura de dupla hélice por meio da elevação da temperatura para cerca de 94C a 95C A desnaturação permite que os primers se liguem à região complementar à sua seqüência na amostra de DNA Desnaturação mais longa hot start no primeiro ciclo pode ser utilizada com a finalidade de otimizar essa fase permitindo o melhor anelamento dos primers O DNA genômico permanece desnaturado por todos os ciclos subseqüentes porque as fitas complementares estão em concentrações muito baixas o que impede a sua reunião Os oligonucleotídeos ou primers por sua vez estão em concentrações muito altas no master mix fato que facilita o encontro das regiões complementares anelamento b Anelamento Uma vez desnaturado o DNA a temperatura da reação é reduzida a temperatura de anelamento é sempre específica para cada par de primers Dessa forma cada primer se encaixa nas respectivas seqüências complementares à regiãoalvo da amplificação A determinação da temperatura de anelamento para um par ou conjunto de primers pode ser feita com o auxílio de programas de computador específicos para essa finalidade A temperatura de anelamento depende entre outros fatores do tamanho do primer e de sua seqüência de nucleotídeos c Extensão A temperatura é elevada até cerca de 72C para que a enzima DNA polimerase TaqDNApolimerase se posicione junto aos primers que se anelaram anteriormente e com o auxílio do magnésio seja iniciada a síntese da nova fita A síntese da nova fita de DNA se inicia a partir dos primers ou iniciadores A síntese Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 19 se dá por meio da utilização dos nucleotídeos dNTPs que foram adicionados ao tampão e que são sempre complementares à fitamolde Dessa maneira são formadas novas fitas de DNA de dupla hélice correspondente a regiãoalvo de amplificação delimitada pelos primers Após o término de um ciclo desnaturação anelamento e extensão todo o processo é repetido várias vezes 40 vezes em média até que se obtenha grande quantidade do DNA a ser amplificado A cada ciclo de amplificação o número de cópias da seqüênciaalvo é duplicado e com a evolução dos ciclos da reação ocorre aumento exponencial do número dessas seqüências O aumento do número de ciclos não é aconselhado em decorrência da redução da especificidade da reação 13 ESCOLHA DOS PRIMERS OU INICIADORES Algumas técnicas podem ser utilizadas para o desenvolvimento de primers ou seqüências iniciadoras de PCR Para fins de diagnóstico a seqüência do gene rDNA é rotineiramente utilizada em razão da sua disponibilidade para grande número de protozoários e outros parasitas Os iniciadores podem ser designados a partir dessas seqüências porém em virtude da grande conservação observada nesses genes reações cruzadas com outros organismos que não são alvo de interesse podem ocorrer Um método alternativo é a construção de bibliotecas de DNA genômico em que certas regiões do genoma do microrganismo obtidas por meio da digestão enzimática são amplificadas por PCR e seqüenciadas Esse método é caro e demanda tempo e grande quantidade de DNA que pode ser difícil de se obter dependendo do microrganismo em questão O uso da técnica de amplificação de DNA ao acaso RAPD tem sido uma opção simples a ser utilizada Essa técnica detecta polimorfismos em seqüências de nucleotídeos de diferentes organismos isolados sem a necessidade de informação prévia sobre a seqüência analisada Como é uma técnica baseada em PCR pequenas quantidades de DNA são suficientes para a análise Muitos dos produtos gerados pela RAPDPCR são derivados de seqüências repetitivas do DNA portanto espécieespecíficas e dessa maneira adequados para o delineamento de técnicas de diagnóstico As bandas de DNA geradas por RAPDPCR podem ser eluídas do gel e seqüenciadas para que seqüências que tenham potencial de uso como primers sejam selecionadas analisadas e sintetizadas com base nos parâmetros de especificidade e de anelamento com a seqüênciaalvo Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 20 14 PCR MULTIPLEX A técnica de multiplex foi desenvolvida com a finalidade de com um único teste altamente específico promover a diferenciação entre várias espécies ou entre vários gêneros simultaneamente Essa forma de PCR envolve a amplificação simultânea de mais de uma seqüênciaalvo por reação pela mistura de vários pares de primers Essa técnica é especialmente útil para análise de amostras que contenham parasitas cuja distinção morfológica é difícil ou que se apresentem em número muito baixo Desse modo primers altamente específicos são usados para amplificar seqüências conhecidas do DNA produzindo padrões únicos para cada espécie Essa técnica também pode ser utilizada em análises genômicas 15 NESTEDPCR A PCR possibilita a amplificação de seqüências específicas contidas em uma mistura complexa de DNA Podese utilizar primers para amplificar um único lócus de um genoma inteiro A partir de uma única cópia do DNA contida na amostra é possível produzir rapidamente cerca de um bilhão de cópias de produtos de PCR No entanto a capacidade de amplificar todas essas cópias aumenta a possibilidade de amplificação de DNA que não seja o desejado A especificidade da reação é determinada pela especificidade dos primers Por exemplo se os primers usados se ligam a mais de um lócus mais segmentos de DNA podem ser amplificados Para contornar esses problemas primers internos nested são desenhados e empregados para testar a especificidade o segmento de PCR que foi amplificado era realmente o que se desejava amplificar Nessa reação ou sucessão de reações dois pares de primers amplificam uma região conhecida do genoma de um organismo qualquer O primeiro par de primers amplifica determinada região com número conhecido de pares de bases O segundo par nested primers se liga a região dentro do primeiro produto produzindo um segundo produto de PCR que será menor do que o primeiro Dessa maneira se o primeiro lócus a ser amplificado não for a seqüência esperada a probabilidade de o segundo par de primers funcionar é muito baixa Essas reações também servem para aumentar a sensibilidade das reações em cadeia já que a segunda reação nestedPCR pode aumentar em cerca de 100 vezes a sensibilidade das reações Elas têm sido muito usadas para o diagnóstico de microrganismos em amostras de DNA extraídas de espécimes clínicos diversos Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 21 No teste de PCR para diagnóstico de Babesia bigemina a sensibilidade estimada para as reações foi de 6 x 103 eritrócitos parasitados em 18 x 106 eritrócitos que corresponde à parasitemia de 000003 Na nestedPCR a sensibilidade estimada foi de 00000003 16 PCR QUANTITATIVA A análise quantitativa por meio do estudo cinético da PCR pode ser feita adicionandose um corante fluorescente à reação Com isso conforme a reação progride a amplificação produz quantidades crescentes de DNA de dupla fita que se liga ao corante resultando em aumento da fluorescência Se for colocado em um gráfico o aumento da fluorescência em relação ao número de ciclos podese obter o panorama completo da PCR inclusive a quantidade inicial do DNAalvo Vários equipamentos que realizam esse tipo de análise estão disponíveis comercialmente As reações quantitativas são muito utilizadas na determinação da expressão de genes específicos e também em técnicas de diagnóstico em que se pretende saber a quantidade inicial de DNA presente na amostra 17 ELETROFORESE DE ÁCIDOS NUCLÉICOS Eletroforese é um método simples e muito eficiente para separar para identificar e para purificar fragmentos de DNA e de proteínas Ela consiste na separação de moléculas ionizadas aminoácidos peptídeos proteínas incluindo lipoproteínas e glicoproteínas nucleotídeos ácidos carboxílicos e outras substâncias de relevância biológica de acordo com sua carga elétrica e seu peso molecular Moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo ânodo e moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo cátodo Para haver migração é preciso desequilibrar eletricamente duas regiões extremas de um meio que contenha eletrólitos no qual esteja dissolvida ou dispersa uma substância com potencial para migrar Para tanto é estabelecida a diferença de potencial entre dois eletrodos ligados aos terminais de uma fonte de corrente contínua e dispostos em dois compartimentos catódico e anódico ambos os compartimentos contém em geral uma soluçãotampão O meio físico de separação igualmente tamponado se comunica através de suas extremidades com as soluçõestampão dos eletrodos fechando assim o circuito elétrico A corrente elétrica ao passar pelo meio conduzida pelos pequenos íons presentes na solução dá ensejo ao deslocamento por Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 22 exemplo de partículas protéicas carregadas para determinado pólo Pelo fato de as proteínas serem substâncias anfóteras ou seja capazes de adquirirem carga positiva ou negativa de acordo com o pH é indispensável manter constante o pH do meio durante a eletroforese por meio do uso de soluçõestampão Os ácidos nucléicos por possuírem carga total negativa em decorrência do grupamento fosfato migram sempre em direção ao polo positivo ânodo O sistema tampão usado consiste em duas partes o tampão usado na preparação do gel e o tampão da cuba eletrolítica na qual se encontram os eletrodos ânodo e cátodo Nos tampões das cubas e do gel a corrente elétrica é conduzida por íons e nos eletrodos por elétrons Na presença de um sistema tampão adequado a hidrólise da água que se dá na superfície dos eletrodos permite a troca entre elétrons e íons O sistema tampão pode ser contínuo o mesmo tampão é utilizado no gel e nos eletrodos ou descontínuo quando diferentes composições ou concentrações de tampão são utilizadas no gel e nos eletrodos O principal fator a ser considerado na escolha do tampão é a sua capacidade de tamponamento Os dois tampões mais usados na separação eletroforética de moléculas de DNA são TAE tampão trisacetatoEDTA e TBE tampão trisborato EDTA Esses dois tampões possuem efeito ligeiramente diferente na mobilidade do DNA Apesar de o TAE ser mais utilizado ele é mais facilmente exaurido durante reações longas ou com alta voltagem O TBE tem melhor capacidade tamponante mas deve ser evitado para purificação de DNA de géis A eletroforese pode ser conduzida em solução com gradiente de densidade ou em diferentes meios de suporte tais como papelfiltro sílicagel membranas de acetato de celulose gel de agarose amido ou poliacrilamida O suporte deve ser química e fisicamente inerte de modo a não interferir na mobilidade das moléculas Em relação aos géis de agarose ou à poliacrilamida a porosidade do gel determina o poder de resolução das bandas e este geralmente é decorrente do grau de polimerização entre os monômeros 171 Eletroforese em gel de agarose Quanto ao gel de agarose o protocolo pode ser dividido em três estágios a O gel é preparado com agarose na concentração adequada ao tamanho dos fragmentos de DNA a serem separados b As amostras de DNA são aplicadas nos pocinhos do gel A voltagem e o tempo são estabelecidos de modo a propiciar a separação ideal das amostras Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 23 c O gel é corado e se o brometo de etídio tiver sido incorporado as seqüências de DNA serão visualizadas na presença de luz ultravioleta 172 Variáveis que afetam a migração do DNA através do gel de agarose 1721 Concentração de agarose Moléculas de DNA de fita dupla linear migram através da matriz de gel à taxa inversamente proporcional ao logaritmo base 10 do seu peso molecular O peso molecular do fragmento de interesse pode ser determinado por meio da comparação entre a sua mobilidade e a mobilidade de padrões de DNA de peso molecular conhecido Essa é a característica mais importante da eletroforese em gel de agarose Ela propicia a caracterização dos fragmentos de DNA por tamanho reprodutível e de forma acurada A concentração de agarose participa de modo importante na separação eletroforética porque é ela que determina a faixa de tamanho das moléculas de DNA que podem ser separadas As relações entre concentração de agarose e resolução de moléculas lineares de DNA são apresentadas na Tabela 1 Tabela 1 Limites de eficiência da separação de DNA em diferentes concentrações de agarose Concentração de agarose no gel Separação de moléculas de DNA Kb Limites de eficiência 03 60 50 06 20 10 07 10 08 09 7 05 12 6 04 15 4 02 20 01 Fonte Maniatis et al 1982 1722 Conformação do DNA Moléculas de DNA de mesmo peso mas com conformação diferente possuem taxas de migração diferente Na ausência de brometo de etídio moléculas de DNA circulares superenoveladas como o dos plasmídios migram mais rapidamente do que Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 24 moléculas lineares de mesmo peso molecular O superenovelamento faz com que as moléculas tenham mais facilidade para migrar através da matriz de gel O corante brometo de etídio é comumente adicionado ao gel ou ao tampão de reação mas pode também ser adicionado em uma solução para corar o gel após a eletroforese O corante reduz a mobilidade dos dúplices lineares e tem efeito pronunciado na mobilidade de moléculas de DNA circulares fechadas Com o aumento da concentração de brometo de etídio os superenovelamentos negativos são gradualmente removidos causando a diminuição na mobilidade do DNA Isso ocorre até a concentração crítica de corante livre na qual não há mais superenovelamento geralmente entre 01 e 05 µgmL A partir desse ponto a adição de brometo de etídio acarreta a formação de superenovelamento positivo causando aumento na mobilidade das moléculas Quando na reação existe gel com diferentes concentrações de brometo as moléculas de DNA circulares fechadas podem ser facilmente distinguidas dos seus topoisômeros O brometo de etídio é usado comumente para visualização direta do DNA nos géis O corante é intercalado entre as bases empilhadas dos ácidos nucléicos e emite fluorescência vermelhoalaranjada 560 nm quando iluminado com luz ultravioleta 260 a 360 nm Isso possibilita que sejam detectadas quantidades muito pequenas de DNA menos de 5 ng 1723 Intensidade de corrente Em geral fragmentos de DNA migram através do gel à taxa de migração proporcional à voltagem aplicada O aumento de voltagem faz com que a taxa de migração de grandes fragmentos de DNA seja maior do que a de pequenos fragmentos Conseqüentemente voltagens maiores são menos efetivas na separação de grandes fragmentos de DNA Para separar fragmentos de DNA grandes o ideal é realizar eletroforese com baixa concentração de agarose e sob baixa voltagem 1 Vcm em 05 de agarose A intensidade da corrente elétrica i a resistência do meio à migração R e a diferença de potencial ddp ou a voltagem V são variáveis importantes no processo eletroforético A fonte de corrente contínua produz força eletromotriz que é medida em volts A diferença de potencial em volts entre os eletrodos ou melhor o gradiente de voltagem do meio voltsm é o resultado da multiplicação da resistência em ohms do meio pela intensidade de corrente em ampères que flui por esse meio A potência P em watts desse sistema é o produto da voltagem volts e da intensidade de corrente em ampères Para ocorrer migração eletroforética deve haver compromisso entre a intensidade de corrente i e a voltagem do meio V Em resumo V Ri e P Vi ou Ri2 Outras equações da eletricidade são de ajuda no entendimento da eletroforese Assim a resistência de um sistema condutor é igual à sua resistividade θ multiplicada pela razão 1S em que 1 é o comprimento do condutor e S é a área da sua seção reta Por sua vez a resistividade é função inversa da condutividade χ Daí surge V Ri li χ S Esta equação mostra como a condutividade de um meio função da concentração eletrolítica influencia a ddp V de um meio ou melhor como influencia o gradiente de voltagem desse meio ou a intensidade de campo elétrico E V1 18 PROTOCOLO PARA ANÁLISE DE PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO E FRAGMENTOS DE DIGESTÃO EM GEL DE AGAROSE Para a análise dos produtos de PCR em géis de agarose a concentração do gel deve ser escolhida de acordo com o tamanho do produto amplificado ver Tabela 2 Gel a 1 03 g de agarose para 30 mL de gel que deve ser preparado com tampão trisboratoEDTA 1 X Para isso aplicar 5 µL de produto de amplificação 1 µL de loading buffer tampão de corrida Gel a 3 09 g de agarose de baixo ponto de fusão para 30 mL de gel que deve ser preparado com tampão trisboratoEDTA 1 X É utilizado para analisar o resultado das digestões com enzimas de restrição Aplicar todo o produto da digestão 13 µL 26 µL de loading buffer Procedimento a Pesar a agarose b Colocála em um erlenmayer que contenha o volume necessário de tampão TBE 1 X c Aquecer no forno de microondas até iniciar a ebulição aproximadamente trinta segundos em potência média para gel de 30 mL Agitar o frasco e retornar ao forno de microondas por mais alguns segundos d Aguardar a redução da temperatura para aproximadamente 60 ºC e adicionar brometo de etídio na quantidade indicada para cada gel Pode ser necessário acrescentar água destilada para repor aquela perdida por evaporação e Verter no molde previamente nivelado e colocar os pentes f Após a solidificação colocar o gel na cuba de eletroforese e cobrir com tampão TBE 1 X g Aplicar as amostras acrescidas de tampão de corrida e estabelecer a corrente de acordo com o tamanho do gel h A eletroforese deve ser realizada em TBE 1 X em voltagem constante na faixa de 2 a 5 Vcm considerando a distância entre os eletrodos Caso o fundo do gel esteja muito corado podese lavar o excesso de brometo por submersão em TBE 1 X por cinco a dez minutos CUIDADOS O brometo de etídio é um potente agente mutagênico Usar luvas e máscara para preparar a solução de estoque e para manipular os géis A luz ultravioleta produz queimaduras severas Usar máscara e óculos de proteção adequados 19 ELETROFORESE EM SISTEMA CAPILAR Durante décadas a eletroforese em placas de gel de poliacrilamida ou de agarose foi intensamente utilizada como uma das ferramentas mais importantes dos laboratórios de biotecnologia e de bioquímica para a análise de macromoléculas Nos últimos anos porém a eletroforese capilar tem apresentado vantagens em relação à técnica de eletroforese em placas Para a análise simultânea de amostras instrumentos de eletroforese capilar com arranjo de capilares são os mais utilizados Existem aparelhos que possuem desde um único capilar até 384 capilares possibilitando a maximização do tempo necessário para as mais diferentes análises desde detecção de resíduos de drogas até testes de paternidade A separação das macromoléculas é conduzida em tubos com dimensões de 15 a 100 µm de diâmetro interno e 36 a 100 cm de comprimento preenchidos com um eletrólito O uso do capilar fornece vantagens sobre as placas de gel por razões geométricas há elevada relação entre a área superficial e o volume interno o que permite a dissipação eficiente do calor gerado pela corrente elétrica e possibilita a Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 27 aplicação de campos elétricos elevados 100 a 500 Vcm Isso resulta em separações de alta eficiência em alto poder de resolução e em reduzido tempo de análise Em geral um aparelho de eletroforese capilar básico consiste de uma fonte de alta tensão capilares geralmente de sílica fundida eletrodos de platina normalmente e um detector apropriado A fonte de alta tensão é aplicada nos eletrodos de platina situados nos reservatórios com solução eletrolítica apropriada As extremidades do capilar são imersas nos reservatórios da solução para completar o contato elétrico As amostras normalmente são introduzidas no capilar por métodos eletrocinéticos nos quais uma diferença de potencial é estabelecida entre o capilar e o recipiente que contém a amostra durante um tempo predeterminado O detector localizase em algum ponto do capilar próximo ao reservatório de saída A eletroforese capilar em gel é utilizada exclusivamente para separação de macromoléculas tais como oligonucleotídeos fragmentos de DNA e proteínas Essa técnica teve início com a aplicação nas separações de DNA por tamanho molecular por meio de colunas preenchidas com gel denominados géis químicos um capilar é tratado com um reagente que estabiliza o gel junto à parede do capilar através de ligações covalentes Esse método foi descartado dado o grande número de problemas que surgiram tais como aparecimento de bolhas perda de condutividade introdução limitada de amostra retenção de fragmentos com alto peso molecular e degradação do gel por hidrólise Tais problemas levaram à formulação de novos sistemas e que foram denominados géis físicos Géis físicos são matrizes poliméricas hidrofílicas dissolvidas em tampão apropriado que não são ligados à parede do capilar Assim eles podem ser substituídos a cada separação o que permite o aproveitamento do mesmo capilar por centenas de vezes sem perda de eficiência A uma dada concentração de polímero as fitas poliméricas individuais começam a interagir umas com as outras e formam uma estrutura em rede dentro do capilar o que possibilita a separação dos fragmentos de DNA A concentração polimérica ótima depende do tamanho do DNA a ser separado 20 PROTOCOLO PARA ANÁLISE DE PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO EM SISTEMA CAPILAR Antes da injeção no capilar as amostras são desnaturadas em presença de formamida para evitar que a formação de estruturas secundárias afete a velocidade de migração Um padrão com fragmentos de tamanho conhecido é aplicado com as amostras para permitir a estimativa do tamanho dos fragmentos analisados Esse protocolo é utilizado no equipamento lBI 3100 Avant Applied Biosystems Procedimento a Preparar a mistura de formamida e o padrão interno com fragmentos de tamanho conhecido para cada amostra colocar 885 µL de formamida HiDy e 015 µL de padrão GS 500 ROX b Aplicar esses 9 µL de mistura em um poço da placa de corrida c Aplicar 1 µL de produto de PCR da sua amostra por poço d Desnaturar as amostras já na placa de corrida durante cinco minutos a 95ºC e Colocar as amostras imediatamente no gelo após a desnaturação e manter aí por cinco minutos f Preparar a injeção das amostras no analisador e a obtenção dos dados no computador com o software Data Collection Applied Biosystems 21 PROTOCOLOS DE AMPLIFICAÇÃO DE DNA PARASITÁRIO 211 PCR para Babesia bigemina a Separar as amostras de DNA preparar o banho de gelo para os microtubos e retirar os reagentes do master mix do congelador As amostras de DNA não devem ter contato com os reagentes do master mix b Limpar a bancada com álcool c Lavar as mãos e colocar luvas novas d Marcar os microtubos para PCR microtubo de 02 µL e Preparo do master mix para PCR H2O ultrapura 71 µL Tampão 10 X 125 µL MgCl2 0375 µL DNTP 20 mM 0125 µL BilA 10 µM 05 µL BilB 10 µM 05 µL Taq 5 UµL 015 µL f Distribuir 10 µL do master mix por microtubo de 02 µL PCR g Adicionar 25 µL de DNA por tubo com o master mix em local isolado para evitar contaminações h Preparar o programa no termociclador indicando as temperaturas de desnaturação de anelamento e de extensão e incubar as amostras de acordo com o esquema da Fig 1 Fig 1 Demonstração esquemática da programação dos ciclos da PCR com temperatura C e tempo de desnaturação de anelamento e de extensão 212 NestedPCR para Babesia bigemina a Preparar o banho de gelo e retirar os reagentes do master mix do congelador b Limpar a bancada com etanol c Lavar as mãos e colocar luvas novas H2O ultrapura 86 µL Tampão 10 X 125 µL MgCl2 0375 µL DNTP 20 mM 0125 µL BilAN 10 µM 05 µL BilBN 10 µM 05 µL Taq 5 UµL 015 µL d Marcar os microtubos para PCR e Preparar o master mix para nestedPCR em tubo de 15 mL f Distribuir 115 µL do master mix em cada tubo de PCR g Adicionar 10 µL da PCR aos tubos com o master mix em local isolado para evitar contaminações h Preparar o programa no termociclador e incubar as amostras de acordo com o esquema da Fig 2 Fig 2 Demonstração esquemática da programação dos ciclos da PCR com temperatura C e tempo de desnaturação de anelamento e de extensão Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 31 A Tabela 2 mostra a seqüência dos primers de PCR e de nestedPCR de Babesia bigemina e o tamanho dos produtos amplificados Tabela 2 Seqüência dos primers de PCR e de nestedPCR de Babesia bigemina e tamanho dos produtos amplificados Seqüência Primer Oligonucleotídeos 5 3 Produto pb BiIA CATCTAATTTCTCTCCATACCCCTCC PCR BiIB CCTCGGCTTCAACTCTGATGCCAAAG 278 BiIAN CGCAAGCCCAGCACGCCCCGGTGC NestedPCR BiIBN CCGACCTGGATAGGCTGTGTGATG 170 Seqüência amplifica a região do fragmento de restrição denominado SpelAval de Babesia bigemina Fonte Figueroa et al 1993 22 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE PARA VISUALIZAÇÃO DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS Gel de agarose a 15 O gel de agarose é preparado na concentração de 15 para a visualização dos produtos da PCR com aproximadamente 278 e 170 pares de bases Procedimento a Pesar 045 g de agarose em um erlenmayer b Dissolver em 30 mL de tampão trisboratoEDTA TBE 1 X c Aquecer no forno de microondas até iniciar a ebulição aproximadamente trinta segundos d Agitar o frasco com cuidado a agarose em ebulição tem tendência a transbordar e Retornar ao forno de microondas por mais dois a três segundos f Aguardar a redução da temperatura para aproximadamente 60C e adicionar brometo de etídio acrescentar 1 µL de brometo para cada 10 mL de gel g Verter no molde previamente nivelado e colocar os pentes h Após a solidificação o gel se torna opaco colocar na cuba de eletroforese e cobrir com tampão TBE 1 X também pode ser utilizado tampão 05 X i Aplicar 8 µL de amostra acrescidos de 2 µL de loading buffer tampão da amostra j Ligar a fonte e manter a 80 V por cerca de uma hora k Visualizálo em transiluminador sob luz ultravioleta Fig 3 CUIDADOS O brometo de etídio é um potente agente mutagênico Utilizar luvas e máscara para preparar a solução de estoque e para manipular os géis Não olhar diretamente para a luz ultravioleta Fig 3 Eletroforese dos produtos de amplificação de DNA de Babesia bigemina pelas técnicas de PCR poços 2 e 3 e de nestedPCR poços 4 a 8 1 Padrão de pares de bases 2 DNA de sangue de bovino 3 Controle positivo de B bigemina 4 DNA de sangue bovino 5 DNA de carrapato Rhipicephalus Boophilus microplus 6 DNA de ovos de R B microplus 7 Controle positivo de B bigemina 8 Controle negativo da reação água ultrapura esterilizada Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 33 23 APÊNDICE Preparo do fenol tamponado a Colocar 250 mL de fenol líquido ou 250 g de cristais de fenol fundido em banho maria a 65C em um frasco de vidro b Adicionar 025 g de 8hidroxiquinolina antioxidante c Adicionar 250 mL de trisbase hidroximetilaminometano 50 mM d Agitar em temperatura ambiente por cerca de quinze minutos usar agitador magnético Deixar repousar a 4C até a separação das fases Aspirar a fase aquosa com cuidado e Adicionar 250 mL de solução trisHCl 50 mM com pH 80 e novamente repetir os procedimentos dos itens c e d Verificar o pH da fase fenólica para isso pode ser usado o papel indicador e repetir itens c e d até que o fenol atinja o pH 80 f Finalmente recuperar a fase fenólica adicionar 125 mL de solução trisHCl 50 mM com pH 80 ou tampão TE trisHCl 10 mM EDTA 1mM com pH 80 e estocar em frascos escuros a 4C para uso por até dois meses g Nos protocolos de extração utilizar a fase fenólica amarelada da solução de estoque Solução anticoagulante com ácido cítrico a Ácido cítrico 048 g b Citrato de sódio 132 g c Glicose 147 g d Água ultrapura 100 mL e Usar 35 mL para cerca de 20 mL de sangue Solução de estoque TBE trisboratoEDTA concentrada 10 X Trisbase 108 g Ácido bórico 55 g EDTA 05 M com pH 80 40 mL Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 34 Solução de EDTA ácido etilenodiaminotetracético 05 M pH 80 a Dissolver 1861 g de Na2EDTA2H20 em 700 mL de água b Ajustar o pH para 80 com solução de NaOH 10 M c Adicionar água ultrapura qsp 1000 mL d Esterilizar em autoclave a 121C por quinze minutos Observações 1 O EDTA é um agente quelante que impede a ação de enzimas sobre o DNA 2 O EDTA é insolúvel em pH inferior a 80 por essa razão é importante ajustar o pH antes de completar o volume Soluçãotampão trisHCl hidroximetilaminometanoácido clorídrico 1 M a Dissolver 121 g de trisbase em 800 mL de água ultrapura b Ajustar o pH com HCl concentrado Cerca de 70 mL de HCl são necessários para pH 74 e 42 mL para pH 80 c Adicione água ultrapura até completar 1000 mL d Autoclavar a 121C por quinze minutos Obs O tris tem a função de manter constante o pH das soluções Soluçãotampão TE trisEDTA a TrisHCl 10 mM com pH 74 75 ou 80 b EDTA 1mM Tampão de corrida da amostra 6 X concentrado estocar a 4ºC Azul de bromofenol a 025 25 mg Xileno cianol a 025 25 mg Solução aquosa de glicerol a 30 10 mL Tampão de lise 1 TrisHCl com pH 80 10 mM EDTA com pH 80 10 mM Dodecilsulfato de sódio SDS 05 Solução de RNAse adicionar no momento do uso 20 µgmL Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 35 Tampão de lise 2 2mercaptoetanol 2 TrisHCl com pH 80 10 mM NaCl 100 mM EDTA com pH 80 10 mM SDS 05 Obs Preparar no momento do uso Soluçãotampão de fosfato PBS KCl 27 mM KH2PO4 15 mM NaCl 137 mM Na2HPO4 8 mM pH 70 Solução de proteinase K 20 mgmL Proteinase K 100 mg TrisHCl 10 mM pH 75 5 mL Cloreto de cálcio 20 mM Glicerol 50 Obs Estocar a 20C Tampão de digestão 1 NaCl 100 mM TrisHCl com pH 80 10 mM EDTA com pH 80 25 mM SDS 05 Proteinase K 01 mgmL Tampão de digestão 2 TrisHCl 10 mM EDTA com pH 85 1mM Triton X100 5 Obs Estocar a 4C Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 36 Solução de RNAse 1 10 mgmL RNAse 10 mg TrisHCl com pH 75 10 mM NaCl 15 mM Obs Estocar a 20C Solução de RNAse 2 10 mgmL RNAse 10 mg Acetato de sódio CH3COONa 001 M com pH 52 1 mL TrisHCl 1 M com pH 74 01 mL Obs Estocar a 20C Solução de acetato de sódio 001 M Acetato de sódio CH3COONa 0082 g Água ultrapura 100 mL Solução de CTAB a 10 CTAB brometo de cetiltrimetilamônio 10 g Água ultrapura 100 mL Solução de NaCl 5 M NaCl 29225 g Água ultrapura 1000 mL Soluçãotampão para extração vegetal Soluções e reagentes Concentração final Volume final 10 mL CTAB a 10 2 20 mL NaCl 5 M 14 M 28 mL TrisHCl 1 M com pH 80 01 M 10 mL EDTA 05 M 20 mM 400 µL 2mercaptoetanol 04 40 µL Polivinilpirrolidona 10 01 g Água ultrapura 376 mL Fundamentos teóricopráticos e protocolos de extração e de amplificaçãode DNA por meio da técnica de Reação em cadeia da polimerase 37 24 REFERÊNCIAS FIGUEROA J V CHIEVES L P JOHNSON G S BUENING G M Multiplex polymerase chain reaction based assay for the detection of Babesia bigemina Babesia bovis and Anaplasma marginale DNA in bovine blood Veterinary Parasitology v 50 p 6981 1993 MANIATIS T FRITSCH E F SAMBROCK J Molecular cloning a laboratory manual New York Cold Spring Harbor Laboratory 1982 545 p OLERUP O ZETTERQUIST H HLADR typing by PCR amplification with sequence specific primers PCRSSCP in 2 hours An alternative to serological DR typing in clinical practice including donorrecipient matching in cadaveric transplantation Tissue Antigens v 39 p 225235 1992 25 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA AUSUBEL F M BRENT R KINGSTON R E MOORE D D SEIDMAN J G SMITH J A STRUHL K Current protocols in Molecular Biology New York Wiley Sons 1996 4800 p BRAMMER S P Atualizações em técnicas celulares e moleculares aplicadas ao melhoramento genético 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