Biologia Molecular e Doenças Hereditárias: Compreensão e Prevenção - Estudo Genético

85 A biologia molecular contribuindo para a compreensão e a prevenção das doenças hereditárias Molecular biology contribution to the understanding and prevention of genetic disorders 1 Departamento de Biologia Instituto de Biociências Universidade de São Paulo IBUSP Rua do Matão 277 Cidade Universitária 05508900 São Paulo SP mayazatzuspbr Mayana Zatz 1 Abstract The sequencing of the human genome raised many questions such as How the human genome project will influence our lives How the medicine will benefit from the study of genes What are the application in practice and what can we expect from the fu ture What are the ethical implications This chapter illustrates how genetic diseases such as neuromuscular disorders are contributing to our understanding of the human genome It helps us to start to understand how our genes work and why they cause diseases when mu tated One of the practical application of study ing genes is the improvement of molecular di agnosis for a growing number of disorders which is of utmost importance to avoid other invasive exams identify at risk couples and prevent the birth of new cases through genet ic counseling and prenatal diagnosis Potential new treatments for neuromuscular and other genetic disorders including therapeutic cloning the use of stem cells and the ethical implica tion of genetic tests are also discussed The ben efit of each test in particular for disorders of late onset for which there is still no treatment have to be exhaustively discussed with the con sulents before their application Key words Human genome Molecular diag nosis Neuromuscular disorders Therapeutic cloning Stem cells Ethical issues Resumo O fim do seqüenciamento do geno ma humano levanta inúmeras questões Como o projeto genoma humano vai influenciar nos sas vidas Como a medicina tem se beneficia do do estudo dos genes Quais são as aplica ções práticas imediatas e o que se espera para o futuro Quais são as implicações éticas Este capítulo ilustra como as doenças genéticas têm contribuído para a compreensão do genoma humano Ajudanos a entender como nossos genes funcionam quando normais e por que causam doenças quando alterados Do ponto de vista prático o estudo dos genes tem permi tido o diagnóstico molecular para um núme ro crescente de patologias o que é fundamen tal para evitar outros exames invasivos iden tificar casais em risco e prevenir o nascimen to de novos afetados Além disso discutese quais são as perspectivas futuras em relação ao tratamento destas e de outras patologias gené ticas incluindo a clonagem para fins terapêu ticos e a utilização de célulastronco Final mente aborda as implicações éticas relaciona das ao uso de testes genéticos Os benefícios de cada teste principalmente para doenças de iní cio tardio para as quais ainda não há trata mento têm que ser discutidos exaustivamen te com os consulentes antes de sua aplicação Palavraschave Genoma humano Diagnós tico molecular Doenças neuromusculares Clo nagem terapêutica Célulastronco Aspectos éticos 86 Introdução O grande acontecimento do ano 2001 foi sem dúvida o anúncio de que o sequenciamento do Genoma Humano está quase completo A mí dia não se cansou de repetir que os conheci mentos gerados irão revolucionar a medicina Entretanto falase muito pouco a respeito das aplicações imediatas deste grande feito científi co Como o projeto Genoma Humano vai in fluenciar nossas vidas Como a medicina tem se beneficiado do estudo dos genes O que existe de prático e o que se espera para o futu ro Quais são as implicações éticas Na realidade o anúncio do sequenciamento do genoma humano ainda não trouxe respos tas para questões fundamentais como Quan tos genes temos na realidade Será que são real mente 30000 ou mais Quantas proteínas são codificadas por estes genes Como os genes in teragem entre si e com o ambiente Quanto os nossos genes determinam a nossa personalida de e o nosso comportamento Cada questão respondida abre um leque de novas questões inclusive do ponto de vista ético como vere mos a seguir com o exemplo das doenças neu romusculares Ainda estamos na ponta do ice berg mas a aventura promete ser fascinante Por outro lado a biologia molecular tem contribuído de maneira significativa para a compreensão de como nossos genes funcio nam quando normais e por que causam doen ças quando alterados Além disso o diagnósti co molecular para um número crescente de pa tologia tem sido fantástico para evitar outros exames invasivos identificar casais em risco e prevenir o nascimento de novos afetados a par tir do aconselhamento genético e do diagnósti co prénatal Entender como nossos genes funcionam é o primeiro passo para o trata mento dessas patologias Mas enquanto busca mos a prevenção e obviamente a cura temos também um compromisso ético em relação ao uso de testes genéticos que devem ser discuti dos com os consulentes antes de serem realiza dos As distrofias musculares progressivas As distrofias musculares progressivas consti tuem um grupo de doenças caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética e que tem sido objeto de muitas pesquisas Já foram mapeados genes responsáveis por mais de 30 formas de distro fia cuja herança pode ser autossômica domi nante autossômica recessiva e ligada ao X Além disso sabese que existem formas ainda não identificadas Os avanços da biologia mo lecular na última década revolucionaram nos sos conhecimentos e começam a responder perguntas fundamentais tais como Qual é o defeito básico O que leva os músculos a dege nerar Como explicar a heterogeneidade gené tica isto é como mutações em genes diferentes podem resultar em um mesmo fenótipo Ou ao contrário como mutações em um mesmo gene podem levar a quadros clínicos diferen tes Por outro lado a análise molecular levan tou outras questões intrigantes Por exemplo temse observado em um número crescente de doenças que pacientes com a mesma mutação podem ter quadros clínicos totalmente dife rentes McNally et al 1996 PassosBueno et al 1999 ou que alguns genes autossômicos afetam mais um sexo do que o outro Ikeuchi et al 1996 Iughetti et al 1996 Zatz et al 1997 1998 A explicação para estas observa ções além de fascinante será extremamente importante para futuros tratamentos As distrofias de Duchenne e Becker Dentre as diferentes miopatias a distrofia de Duchenne DMD de herança recessiva ligada ao cromossomo X é a mais comum com uma incidência de 1 em cada 3000 nascimentos de sexo masculino Emery 1993 Já a distrofia ti po Becker DMB alélica à DMD isto é loca lizada no mesmo loco que a DMD é cerca de 10 vezes mais rara A diferença entre essas duas formas está na idade de início e velocidade de progressão Na DMD os sinais clínicos ini ciamse entre 35 anos de idade com quedas freqüentes dificuldades para subir escadas correr e levantar do chão o confinamento à cadeira de rodas se dá até os 12 anos de idade e os afetados raramente sobrevivem após a ter ceira década Já na DMB os sintomas iniciam se em geral na segunda década os afetados sempre andam após os 16 anos e a velocidade de progressão é extremamente variável Cerca de 3050 dos pacientes com DMD têm retar do mental cujas causam ainda estão sendo in vestigadas Rapaport 1991 Rapaport et al 1992 Pacientes com DMD e DMB têm um au mento significante até 2000 vezes os valores normais da enzima creatinoquinase CK no soro sanguíneo que é liberada do músculo dis trófico mesmo antes do aparecimento dos si nais clínicos Zatz et al 1976 2001 Entretan to até a década de 1980 não se tinha idéia acer ca do mecanismo molecular que causava estas distrofias e nem se a forma grave de Duchenne e a variante mais leve de Becker eram causadas por um único gene ou dois independentes Após a localização do gene da DMDDMB no braço curto do cromossomo X em 1981 do qual nosso grupo participou Zatz et al 1981 descobriuse em 1984 que os genes da DMD e DMB eram alelos isto é ocupavam o mesmo loco no cromossomo X Mas foi só após a clo nagem do gene DMDDMB em 1987 Koenig et al 1987 1989 que o produto gênico foi identificado uma proteína do citoesqueleto da membrana que foi denominada distrofina Hoffman et al 1987 1988 e cuja função mais provável seria o de manter a estabilidade da membrana da célula muscular Hoje sabese que as mutações que causam DMD ou DMB são deleções no gene da distrofi na em cerca de 60 dos casos duplicações em 56 dos casos e mutações de ponto em uma única base ou nucleotídeo do DNA nos casos restantes Koenig et al 1989 Lindlöf et al 1989 A diferença entre a DMD e a DMB de pende da manutenção ou não do quadro de leitura do RNA mensageiro RNAm Na DMB a deleção é em fase isto é o quadro de leitura do RNAm é mantido e temse como re sultado uma proteína quantitativamente redu zida ou deletada internamente mas em parte funcional Já na DMD a deleção é fora de fase isto é o quadro de leitura do RNAm não é mantido temse uma proteína severamente truncada e que é rapidamente destruída pela célula Monaco et al 1988 O estudo de mais de 1000 pacientes com DMDDMB em nosso laboratório Takata 1995 mostrou que cerca de 60 dentre eles tanto os casos de DMD como de DMB têm deleções no gene da distrofina Além da manu tenção do quadro de leitura do RNAm o sítio da deleção é muito importante na determina ção da severidade do quadro clínico Por exemplo deleções nas regiões de ligação da distrofina a outras proteínas regiões C termi nal e Nterminal resultam na maioria dos ca sos em quadro mais grave Vainzof et al 1990 1993a 1993b A região C terminal em parti cular é fundamental porque constitui o ponto de ligação da distrofina com glicoproteínas as 87 sociadas à membrana e portanto deleções nessa região levam quase sempre a um quadro grave de DMD Por outro lado deleções de até 50 do gene podem estar associadas a um quadro benigno desde que estejam restritas à região central do gene PassosBueno et al 1994 O quadro leve explicase porque se a de leção está restrita ao domínio em bastão da dis trofina mesmo que se tenha um encurtamento dessa proteína os sítios de ligação não ficam alterados permitindo uma função parcial Este estudo de correlação genótipofenótipo dentro do gene da distrofina e a caracterização da fun ção de cada domínio da proteína tem sido fun damental para futuras tentativas em terapia gê nica utilizandose minigenes funcionais Aspectos genéticos Cerca de 13 dos casos de DMD são causados por mutações novas Zatz et al 1977 e os res tantes 23 são herdados de mães portadoras A maioria mais de 90 das mulheres portado ras de mutações no gene da distrofina é assin tomática Emery 1993 Entretanto tem um risco de 50 de passar o gene defeituoso para a sua descendência isto é metade dos filhos pode ser afetada e metade das filhas portado ras porém clinicamente normais Outro aspec to importante observado por nosso grupo e pesquisadores da Holanda é o mosaicismo go nadal Isto é aproximadamente 10 das mães de casos isolados de DMD nas quais não foi detectada mutação no sangue periférico po dem ser portadoras da mutação na linhagem germinativa PassosBueno et al 1990 1992 Estas mulheres têm um risco aumentado de vir a ter filhos afetados pela DMD Diagnóstico e aconselhamento genético Diagnóstico O exame de DNA em sangue periférico ou em raspado de mucosa bucal tem sido muito importante para o diagnóstico evitando em muitos casos a realização de exames invasivos como a biopsia muscular ou a eletroneuromio grafia que além de ser um exame doloroso não auxilia no diagnóstico diferencial entre as vá rias formas de distrofias Do ponto de vista prático em casos suspeitos os passos a serem seguidos para o diagnóstico são os seguintes 88 1 Dosagem de CK no soro se aumentado sugere o diagnóstico de distrofia muscular Zatz et al1976 2 Análise de DNA pesquisa de deleção no gene da distrofina se for encontrada deleção confirmase o diagnóstico de DMDDMB 3 Biopsia muscular é indicada se não for encontrada deleção no gene da distrofina se não houver história familiar de herança reces siva ligada ao cromossomo X ou em crianças que são casos isolados nas fases iniciais para um diagnóstico diferencial entre DMD e DMB A primeira proteína a ser pesquisada é a distro fina pela técnica de imunofluorescência e wes tern blot Vainzof et al 1990 1993a Os pos síveis resultados são a distrofina ausente confirmase o diag nóstico de distrofia de Duchenne b distrofina quantitativamente diminuída ou com peso molecular diminuído através de análise por western blot o diagnóstico de dis trofia tipo Becker é o mais provável c distrofina normal pode tratarse de dis trofia tipo cinturas ou outra forma de distrofia muscular O passo seguinte é analisar as dife rentes proteínas associadas às formas autossô micas recessivas tais como as sarcoglicanas a calpaina3 a disferlina a teletonina em biopsia muscular Anderson et al 1998 1999 Spencer et al 1997 Vainzof et al 1996 Estimativas de riscos genéticos Para identificação de portadoras e estimati vas de riscos genéticos os passos a serem segui dos são 1 O paciente é caso isolado e tem deleção no gene da distrofina a Se a mãe eou irmã do afetado for por tadora da deleção confirmase que é são hete rozigotas Neste caso há risco de 50 de vir a ter filhos afetados e filhas portadoras É possí vel realizar diagnóstico prénatal de certeza através da análise de DNA extraído de vilosida des coriônicas ao redor de 10 semanas de ges tação b Se a mãe não tiver deleção em sangue periférico existe ainda um risco de mosaicismo gonadal que varia de acordo com o sítio da de leção PassosBueno et al 1992 Se for no iní cio do gene o risco para um feto de sexo mas culino é de cerca de 15 se for na região cen tral do gene o risco para um feto de sexo mas culino é de cerca de 2 c Se uma irmã de afetado não tiver deleção em sangue periférico o risco de que seja porta dora é desprezível 2 O paciente é caso isolado e não tem de leção no gene da distrofina Nestes casos comparase o cromossomo X através de marcadores polimórficos de DNA ao longo do gene da distrofina do afetado com outros indivíduos da genealogia As pessoas a serem analisadas e a estimativa de risco genéti co dependem da estrutura da família 3 Existe história familiar compatível com herança ligada ao X Nesta situação todas as mães de afetados são portadoras certas do gene risco de 50 para descendentes de sexo masculino e todas as irmãs têm risco de 50 de serem portadoras Zatz et al 1989 O exame de DNA a ser rea lizado vai depender da presença ou não de de leção no afetado Distrofias tipo cinturas As distrofias tipo cinturas limbgirdle mus cular dystrophies constituem um grupo he terogêneo de doenças caracterizadas por uma fraqueza proximal das cinturas dos membros cintura pélvica e escapular e do tronco sem comprometimento dos músculos faciais ou da inteligência Já foram identificados 15 genes responsáveis por este quadro clínico seis com herança autossômica dominante e nove com herança autossômica recessiva Bushby 1999 Moreira et al 1997 Neuromuscular Disor ders 2000 Weiler et al 1998 É um exemplo de heterogeneidade genética nãoalélica isto é genes diferentes resultando em um fenótipo se melhante As formas dominantes são relativa mente raras e constituem menos de 10 dos casos Bushby 1999 PassosBueno et al 1999 Zatz et al 2000 Dentre as formas recessivas distinguese um subgrupo as sarcoglicanopatias normal mente associadas a um quadro clínico em ge ral mais severo semelhante à forma Duchen ne Por este motivo estas formas também são classificadas como Duchennelike Azibi et al 1993 PassosBueno et al 1999 Existem quatro formas de sarcoglicanopatias causadas por mutações nos genes que codificam quatro glicoproteinas associadas a distrofina forman do o complexo distrofinaglicoproteinas asso ciadas São elas a LGMD2C que codifica a γ sarcoglicana a LGMD2D que codifica a αsar coglicana a LGMD2E que codifica a βsarco 89 glicana e a LGMD2F que codifica a δsarcogli cana Azibi et al 1993 Ben Othmane et al 1992 Bonnemann et al 1995 Lim et al 1995 McNally et al 1996 Nigro et al 1996 Passos Bueno et al 1995 1996 Roberds et al 1994 Como estas quatro proteínas estão interligadas Ervasti Campbell 1991 Vainzof et al 1996 1999b uma mutação que cause ausência de qualquer uma das sarcoglicanas provoca uma desagregação de todo o complexo resultando geralmente em um quadro severo de distrofia Esta observação explica como mutações em ge nes diferentes podem causar um mesmo qua dro clínico Com exceção da forma LGMD2D cujo quadro clínico é muito variável as outras três sarcoglicanopatias geralmente mostram uma evolução rápida e os pacientes dificilmente conseguem andar após os 16 anos de idade Moreira et al 1998 PassosBueno et al 1995 1996 Zatz et al 2000 Entretanto existem ex ceções e já foram identificados pacientes com um quadro mais benigno pertencentes a qual quer uma das sarcoglicanopatias A enzima CK também se apresenta muito elevada no soro principalmente nas fases iniciais A maioria dos pacientes tem hipertrofia de panturrilhas quando na fase ambulatória Quando o pacien te é do sexo masculino e não existe história fa miliar o diagnóstico clínico é indistinguível da forma Duchenne ligada ao cromossomo X Por outro lado em meninas afetadas que são casos isolados deve excluirse uma distrofinopatia Em todos esses casos a confirmação do diag nóstico depende da análise das proteínas dis trofina e sarcoglicanas em biopsia muscular e da análise de DNA Nas distrofias tipo cinturas nãosarcoglica nas o quadro clínico geralmente é mais benig no e a maioria dos afetados consegue deambu lar após os 16 anos PassosBueno et al 1996 Zatz et al 2000 embora o quadro também se ja muito variável As formas já mapeadas são 1 LGMD2A no braço longo do cromosso mo 15 Beckmann et al 1991 que codifica a enzima calpaina3 também denominada cal painopatia CAPN3 A maioria dos pacientes tem hipertrofia de panturrilhas e consegue an dar nas pontas dos pés mas não nos calcanha res nas fases iniciais do processo A enzima sé rica CK apresenta um aumento médio de 19 vezes variando entre 2 e 93 Zatz et al 2001 As calpainas são proteases e a forma especí fica do músculo a calpaina3 é uma protease ativada pelo cálcio Richard et al 1995 Spen cer et al 1997 Baghdiguian et al 1999 Den tre as distrofias de cinturas de herança AR a LGMD2A é a única forma descrita até o mo mento cujo produto gênico é uma proteína com propriedades enzimáticas e não uma pro teína estrutural A função da calpaina3 ainda não está completamente esclarecida mas tra balhos recentes sugerem que ela poderia estar associada a uma cadeia de eventos levando à apoptose O gene da calpaina tem 24 exons re giões codificadoras do DNA isto é que são traduzidas em proteínas e até o presente já fo ram descritas cerca de 100 mutações patogêni cas que causam a LGMD2A Richard et al 1999 A maioria delas 70 são únicas em cada família o que torna extremamente difícil o diagnóstico desta forma de distrofia a partir do estudo molecular em casos isolados Entre tanto a análise molecular de pacientes brasilei ros realizada no nosso laboratório dados ain da não publicados tem mostrado que existem mutações recorrentes e que a análise de 5 exons permite confirmar o diagnóstico em mais de 70 dos casos De Paula e col manuscrito em preparação Além da importância prática o estudo da origem das mutações para diferentes doenças genéticas tem sido muito importante em genética de populações Além disso a pos sibilidade recente de se estudar a expressão da calpaina3 em biopsia muscular tem sido va liosa para confirmação clínica e estudos de cor relações genótipofenótipo Estudos realizados em nossos pacientes Mariz Vainzof comuni cação pessoal mostraram que a calpaina en contrase totalmente deficiente em cerca de 70 dos pacientes com LGMD2A e parcial mente deficiente nos outros 30 Entretanto um fato intrigante é que embora haja uma correlação entre tipo de mutação presença ou não da proteína calpaina e gravidade do qua dro clínico há sempre exceções Isto indica cla ramente a existência de outros fatores que mo dificam a ação primária dos genes 2 LGMD2B em 2p no braço curto do cromossomo 2 codifica a proteína disferlina é também classificada como disferlinopatia DYSF Bashir et al 1998 Liu et al 1998 Anderson et al 1999 Clinicamente esta for ma de distrofia é em geral mais benigna mas também apresenta grande variabilidade inter e intrafamilial A hipertrofia de panturrilhas é rara nesta forma de distrofia e observase co mumente uma atrofia distal Uma observação interessante é que freqüentemente os pacientes perdem a capacidade para andar nas pontas 90 dos pés antes de perder a capacidade para an dar nos calcanhares Os níveis séricos da enzi ma CK podem estar muito elevados em média 36 vezes acima do normal variando entre 3 e 211 vezes principalmente nos estágios iniciais Zatz et al 2000 2001 A função da proteína disferlina na patolo gia da distrofia tipo 2B permanece desconheci da No músculo esquelético humano a disferli na localizase na membrana da fibra muscular e mostrouse deficiente em pacientes afetados por esta forma de distrofia O gene da disferli na é muito grande tem cerca de 55 exons o que torna do mesmo modo que na LGMD2A o diagnóstico molecular extremamente difícil através da análise de DNA em pacientes isola dos Portanto hoje o diagnóstico diferencial desta forma de distrofia baseiase no estudo da proteína disferlina em biópsias musculares 3 LGMD2G mapeada em 17q Moreira et al 1997 Esta forma de distrofia foi mapeada em uma família brasileira O quadro clínico é bastante variável com a idade de início varian do de 9 a 15 anos e aumento da enzima sérica CK de 10 a 30 vezes acima do normal Os afe tados apresentam uma fraqueza importante na musculatura proximal e podem ou não ter atrofia distal Isto é clinicamente o fenótipo pode ser semelhante à forma LGMD2A ou LGMD2B Zatz et al 2000 Recentemente o produto gênico foi identi ficado também no nosso laboratório Tratase da proteína sarcomêrica telotonina cuja fun ção também ainda não é conhecida Moreira et al 1998 O gene da telotonina é pequeno tem só dois exons e portanto é viável em casos suspeitos fazer uma triagem de mutações para confirmação de diagnóstico Diagnóstico diferencial entre distrofias tipo cinturas e atrofia espinhal progressiva AEP As atrofias espinhais progressivas AEP de herança autossômica recessiva constituem a forma mais comum de doença do neurônio motor em crianças e jovens adultos Sua inci dência é de cerca de 110000 e a freqüência de heterozigotos de cerca de 150 As AEPs são classificadas em três grupos tipo I ou Werd nigHoffmann WH que é a mais severa tipo II ou forma intermediária tipo III ou Kugel bergWelander KW que é a menos grave As três formas são condicionadas por um mesmo gene SMN1 survival motor neuron O gene SMN1 e uma cópia quase idêntica SMN2 es tão localizados em 5p13 e codificam proteínas idênticas Entretanto a cópia SMN2 sofre um processamento alternativo do exon 7 levando a produção de uma proteína truncada A maio ria dos pacientes tem deleções nos exons 7 e ou 78 do gene SMN1 e aparentemente a seve ridade do fenótipo é modulada pelo número de cópias de SMN2 O estudo molecular do gene SMN1 em 281 pacientes brasileiros com diagnóstico de AEP mostrou a seguinte freqüência de deleções 34 em 43 80 no grupo I 51 em 101 50 no grupo II e 23 em 54 426 no grupo III Além disso a análise de DNA extraído de vilo sidades coriônicas em 16 casos encaminhados para o nosso laboratório para diagnóstico pré natal mostrou que quatro fetos eram portado res de deleção no gene SMN Pacientes afetados por DMC e AEP podem ter um quadro clínico muito semelhante prin cipalmente nas formas adultas Além disso a atividade da enzima sérica CK pode apresen tarse aumentada nas AEPs com valores seme lhantes aos encontrados nas DMC Na prática a análise molecular do gene SMN tem se mos trado extremamente importante para confir mação do diagnóstico clínico e diagnóstico di ferencial sem necessidade de exames mais in vasivos Diagnóstico diferencial nas DMPs e Aconselhamento Genético Em pacientes isolados nos quais o estudo de DNA exclui uma distrofinopatia o estudo de proteínas musculares é fundamental para dife renciar este grupo de distrofias das formas de herança ligada ao X para o aconselhamento genético como exemplificado abaixo 1 Nas formas AR pais de crianças afetadas têm um risco de 25 de vir a ter outro descen dente afetado independentemente do sexo enquanto nas distrofinopatias ligadas ao X só existe risco para descendentes de sexo masculi no 2 O risco para a descendência de irmãs normais de afetados nas formas AR é desprezí vel desde que não se casem com consangüí neo e pode ser de até 50 na DMDDMB in dependentemente de casamento se a irmã for portadora da mutação presente no seu irmão 3 No caso de herança AR só existe risco 91 para aquele casal enquanto na DMDDMB se a mãe do afetado for portadora o risco para a sua futura prole independe do casamento Distrofia fácioescápulohumeral DFSH Essa forma de distrofia de herança autossômi ca dominante caracterizase por um envolvi mento predominante da musculatura facial e da cintura escapular com uma grande variabili dade inter e intrafamilial Van Deutekom 1996 Alguns pacientes têm uma forma extrema mente leve que pode se limitar a uma fraqueza na face ou na cintura escapular durante a vida toda enquanto outros podem ter início na in fância e uma progressão rápida com perda pre coce da ambulação Em média entretanto a progressão é muito lenta e a maioria dos pa cientes tem uma sobrevida normal O gene da DFSH foi localizado no cromos somo 4 mas o mecanismo molecular ainda não é conhecido Nos pacientes afetados ocor re uma deleção de seqüências repetidas de 33kb Existe uma correlação entre o tamanho da deleção e a severidade do quadro clínico embora numa mesma família todos os afetados tenham a mesma deleção Lunt et al 1995 Wijmenga et al 1990 1992 Pesquisas em famílias brasileiras com FSHD mostraram que a cerca de 13 dos casos são resultantes de mutações novas b a análise de famílias com duas ou mais gerações sugere que a antecipação agravamento do quadro clínico em gerações subseqüentes pode ocorrer nesta forma de distrofia c os casos mais graves são geralmente resultantes de mutações novas ou de herança materna Zatz et al 1995 1998 Outro achado intrigante é que apesar de se tratar de um gene autossômico dominante e que portanto deveria afetar igualmente os dois sexos observamos que o sexo masculino é mais freqüentemente e em média mais severamen te afetado do que o sexo feminino Zatz et al 1998 O estudo molecular de pacientes brasi leiros mostrou que esta diferença sexual na fre qüência de afetados é devida a uma proporção significantemente maior de mulheres portado ras da deleção e que permanecem assintomáti cas Ainda não se tem uma explicação para es tes achados mas compreender por que as mu lheres são em média menos afetadas do que os homens vai ser muito importante para futu ros tratamentos Apesar do gene responsável pela DFSH ain da não ter sido isolado o mecanismo molecu lar proposto para explicar esta miopatia seria uma deleção de um número integral de cópias de uma seqüência de 33kb em tandem Su gerese que a função do gene FSHD poderia es tar alterada ou aumentada devido a um efeito de posição ou à perda das repetições de 33kb Nesse sentido deleções maiores leva riam a uma desativação desse gene proximal em uma proporção maior de células É possível também que o gene estrutural da DFSH pro duza transcritos alternativos distintos em dife rentes tecidos musculares ou de acordo com a idade Van Deutekom1996 Do ponto de vista prático de aconselha mento genético é importante salientar que en quanto o gene não for clonado a análise do fragmento 4q35 só é possível a em famílias com múltiplos afetados ou b nos casos isola dos quando for possível confirmar que um fragmento de tamanho reduzido encontrado no probando está ausente nos seus pais Por outro lado sabese que pacientes afetados têm um risco de 50 de passar o gene defeituoso para a sua descendência Entretanto o aconse lhamento genético nas famílias em risco é complexo pois deve levarse em conta a possi bilidade de antecipação clínica e também a di ferença de manifestação de acordo com o sexo do afetado Isto é não é possível prever a seve ridade do quadro clínico em crianças portado ras da mutação Por este motivo do ponto de vista ético a conduta tem sido de não testar crianças assintomáticas em risco enquanto não houver um tratamento preventivo Distrofia miotônica de Steinert A distrofia miotônica de Steinert DMS uma patologia multissistêmica é a forma mais co mum de distrofia muscular do adulto com uma incidência estimada em 1 em cada 8500 indivíduos A herança é autossômica dominan te e a idade de início pode variar desde o nasci mento distrofia miotônica congênita até após os 60 anos de idade com quadro clínico extre mamente variável Uma característica impor tante é a presença de antecipação clínica isto é em genealogias com várias gerações observase um aparente aumento de severidade eou ida de de início mais precoce em gerações sucessi vas 92 De acordo com a idade de início e os sinto mas os afetados são classificados em diferentes subgrupos Harper Dyken 1972 Harper 1989 a seguir discriminados 1 Forma tardia leve ou senil com início geralmente após os 50 anos Os sinais clínicos podem limitarse a uma catarata calvície fron tal com um mínimo ou sem comprometimen to muscular 2 Forma clássica com início na adolescên cia ou na terceira década caracterizada por fra queza e atrofia muscular da musculatura es quelética fenômeno miotônico dificuldade para relaxar os músculos quando contraídos particularmente abrir as mãos calvície frontal precoce principalmente no sexo masculino atrofia testicular podendo haver comprometi mento intelectual Os sinais clínicos neste sub grupo são extremamente variáveis podendo ocorrer diabete e comprometimento da mus culatura lisa com envolvimento gastrointesti nal e do trato urinário Complicações cardía cas particularmente defeitos de condução e ar ritmias são freqüentes e constituem uma causa importante de óbito Cerca de 8085 dos pa cientes com a forma clássica ou precoce têm al terações no eletrocardiograma 3 Forma severa infantil com início na pri meira década com fraqueza facial retardo men tal importante e comprometimento muscular importante 4 Forma congênita grave com hipotonia grave ao nascimento dificuldades respiratórias e de deglutição retardo mental importante e atraso no desenvolvimento motor É interes sante observar que geralmente a hipotonia e a função motora melhoram durante a primeira infância mas os sintomas clássicos de distrofia miotônica tendem a reaparecer na segunda dé cada Existem também casos atípicos onde se ob serva na primeira década somente retardo mental importante sem outros sinais clínicos indicando portanto a importância de se testar este gene em casos onde foram excluídas ou tras causas de retardo mental O mecanismo molecular responsável pela DMS cujo gene foi mapeado em 19q é uma ex pansão de um trinucleotídeo CTGn na região 3 nãotraduzida do gene que codifica uma proteína quinase ou DMPK Aslanidis et al 1992 Brewster et al 1998 Brook et al 1992 Buxton et al 1992 Fu et al 1992 Harley et al 1992a Mahadevan et al 1992 Novelli et al 1993a Indivíduos normais podem ter de 5 até 37 repetições CTGn Pacientes afetados po dem ter de 50 até 8000 repetições e existe uma correlação entre o tamanho da expansão em DNA de sangue periférico e a severidade do quadro clínico Este tipo novo de mutação foi denominado mutação dinâmica e hoje se co nhecem várias doenças que são causadas por este mecanismo patológico isto é por genes dinâmicos como a Coréia de Huntington as várias formas de ataxias espinocerebelares e a doença de Kennedy entre outras Quando o gene se torna instável existe uma tendência para um aumento da expansão em gerações sucessivas o que fornece uma ex plicação biológica para o fenômeno da anteci pação Ashizawa et al 1992a 1992b Harley et al 1992 Fu et al 1992 Esta variabilidade no tamanho das expan sões explica as diferenças na severidade clínica observada na DMS isto é como uma mutação em um mesmo loco pode resultar em fenóti pos tão distintos Entretanto é importante sa lientar que a correlação não é linear e portan to o tamanho da expansão CTG em sangue pe riférico não pode ser utilizado como prognós tico da severidade clínica Além disso o estudo de fetos portadores da mutação mostrou uma grande variabilidade no tamanho da expansão em diferentes tecidos que confirma a heterogeneidade somática An vret et al 1993 Ashizawa et al 1993 Em pa cientes afetados inclusive da população brasi leira observouse que a expansão é sempre maior no músculo e fibroblastos Thornton et al 1994 PassosBueno et al 1995 Zatz et al 1995b 1996 do que no sangue Entretanto os mecanismos que levariam a uma expansão te cidoespecífica diferencial não são conhecidos Além disso não observamos principalmente em adultos uma correlação entre o tamanho da expansão no músculo e a expansão CTG no sangue ou com a severidade do quadro clínico Observouse também que existe uma expansão CTGn contínua com a idade Martorel et al 1995 mas ainda não se sabe se esta explicaria o porquê da progressão da doença De qual quer modo esta heterogeneidade do tecido es pecífica explica porque o tamanho da expan são em sangue periférico não pode ser usado como prognóstico clínico A partir de experimentos em nível de DNA RNA e proteína várias hipóteses foram pro postas para explicar os mecanismos patológi cos resultantes da expansão CTG tais como a a expansão CTG levaria a um efeito de dose 93 monogênico isto é afetando somente a ex pressão da DMPK b a expansão afetaria a ex pressão de vários genes simultaneamente isto é seria uma síndrome causada por genes con tíguos c a expansão CTG teria efeitos trans dominantes em nível de RNA d a expansão CTG teria efeitos detrimentais na função celu lar e na replicação celular Existe entretanto muitos resultados conflitantes já que estudos diferentes em pacientes afetados já descreve ram um aumento uma diminuição ou uma ex pressão inalterada dos níveis de RNA do gene DMPK Uma possível explicação para estes achados disparatados é a grande dificuldade de se comparar pacientes com mesma idade sexo e grau semelhante de degeneração muscular Aspectos genéticos transmissão e antecipação A herança é autossômica dominante na DMS e mutações novas são raras sugerindo um efeito ancestral fundador A penetrância entretanto não é completa pois alguns indi víduos com a mutação podem permanecer as sintomáticos ou quase durante toda a vida Curiosamente existe diferença na trans missão de acordo com o sexo Ashizawa et al 1994a 1994b Carey et al 1994 Chakraborty et al 1996 Cobo et al 1993 Gennarelli et al 1994 Jansen et al 1994 Lavedan et al 1993b Zatz et al 1997 Uma delas é que a forma congênita grave é transmitida quase que exclu sivamente pelo sexo feminino Por outro lado existe um excesso significante de afetados do sexo masculino o que também foi confirmado por nós na população brasileira Além disso esta distorção de segregação é mais evidente para descendentes de homens do que mulheres com DMS A observação de que o alelo muta do é mais freqüentemente transmitido para o sexo masculino do que para o feminino fornece uma explicação para o excesso de homens nas famílias de afetados Outro achado interessan te é a baixa incidência da DMS observada por nós na população brasileira de origem africana em comparação com a população caucasóide ou oriental Esta observação suporta os acha dos de Goldman et al 1994 que não identifi caram pacientes com DMS na população ne gróide da África do Sul De acordo com estes autores a ausência de DMS nessa população explicase porque o número máximo de repeti ções CTGn encontrada na população normal foi de 22 Isto é estaria abaixo do limite de 37 repetições quando aparentemente o gene co meça a mostrarse instável com tendência a ex pandirse O estudo da transmissão do gene da DM em genealogias com várias gerações mostrou que em cerca de 80 dos casos observase an tecipação clínica isto é o início é mais precoce e o quadro mais severo acompanhada por um aumento médio da repetição CTG no sangue periférico em gerações sucessivas Além disso os maiores aumentos são geralmente transmi tidos pela mãe o que explicaria porque a for ma congênita é quase exclusivamente de ori gem materna Por outro lado já foram descritos exem plos em que o tamanho da expansão no sangue periférico era menor nos descendentes afeta dos do que na geração parental isto é há uma contração da expansão Abeliovich et al 1993 Ashizawa et al 1993 Brunner et al 1993a Observouse também que as contrações ocor rem mais freqüentemente na transmissão de origem paterna cerca de 10 do que de ori gem materna cerca de 3 Além disso as maiores expansões paternas têm maior tendên cia a se contrair durante a transmissão Os dados sugerem que existe um limite no número de repetições CTG em espermatozói des viáveis isto é haveria uma seleção contra espermatozóides com expansões acima de um determinado tamanho Jansen et al 1994 Is to explicaria porque descendentes de pais com expansões maiores do que 15kb tendem a ter expansões menores do que seus pais afetados Além disso homens com expansões grandes são freqüentemente estéreis impedindo por tanto a transmissão destas para as gerações su cessivas Heterogeneidade genética Na maioria das famílias cerca de 98 com afetados pela DMS o estudo molecular confirma tratarse do gene DMPK Entretan to já foi mapeado um outro gene em 3q em uma família com vários afetados e quadro clí nico muito semelhante a DMS Este gene foi classificado como DM2 ou DMS2 ou PROMM Ranum et al 1998 Embora seu produto ain da não tenha sido identificado a observação de antecipação clínica sugere tratarse também de um gene dinâmico o que acaba de ser confir mado Ranum et al 2001 comunicação em congresso Portanto em afetados nos quais não for en contrada expansão CTG no gene DMPK é 94 importante suspeitarse de heterogeneidade genética e testar o gene DMS2PROMM Outras doenças em que ocorre miotonia in cluem a miotonia de Thomsen e a paramioto nia congênita mas o diagnóstico diferencial é muitas vezes possível por meio de estudos clíni cos eou pelo modo de herança Moxley 1996 Diagnóstico molecular e Aconselhamento Genético Em indivíduos clinicamente afetados o diagnóstico molecular só pode ser confirmado por técnica de Southern blot pois expansões grandes não são visíveis através de PCR rea ção em cadeia da polimerase Nas pessoas em risco assintomáticas o diagnóstico molecular pode ser iniciado por técnica de PCR e de acor do com os resultados confirmado através de técnica de Southern blot Por exemplo em in divíduos normais que são heterozigotos para o número de repetições CTG observamse duas bandas nítidas através de técnica de PCR En tretanto uma única banda pode ser observada tanto em indivíduos normais homozigotos is to é onde os dois alelos têm o mesmo número de repetições CTG como em indivíduos afeta dos pois alelos expandidos não são visualiza dos pela técnica de PCR Portanto toda vez que for observada uma única banda em um caso suspeito o resultado precisa ser confirmado por técnica de Southern blot O aconselhamento genético em famílias de afetados é complexo pois a confirmação do diagnóstico principalmente em indivíduos as sintomáticos ou pouco afetados é dificilmente aceita e o apoio psicológico é muitas vezes ne cessário Por outro lado o diagnóstico precoce é importante para prevenir as complicações cardíacas que são freqüentes nos afetados Além disso é importante alertar mulheres portadoras do alelo mutado em relação ao maior risco de ter descendentes com a forma congênita grave O diagnóstico prénatal também é possível através da análise da expansão CTG em DNA extraído de vilosidades coriônicas Entretanto não é possível prever qual será a gravidade do quadro clínico em um feto portador da muta ção particularmente levandose em conta a grande heterogeneidade somática no tamanho da expansão Perspectivas futuras e aspectos éticos O uso de célulastronco e clonagem terapêutica Como acabamos de ver o estudo do Geno ma Humano vai nos ajudar a entender como nossos genes funcionam quando normais e pa tológicos como interagem entre si e com o ambiente Vai ser fundamental para o desen volvimento de novos tratamentos A terapia gênica isto é a substituição de um gene defei tuoso por sua cópia normal talvez demore um pouco Entretanto recentemente descobriuse que células ainda nãodiferenciadas stem cells ou célulastronco presentes por exemplo na medula óssea ou no cordão umbilical de um recémnascido podem manter a capacidade de diferenciarse em outros tecidos como o mus cular ou nervoso Esta descoberta abre novas esperanças de tratamento para inúmeras doen ças hematológicas e degenerativas como as doenças neuromusculares pois permitirá que células normais de um doador externo trans plante heterólogo ou que células modificadas do próprio indivíduo doentes transplante au tólogo sejam capazes de atingir todos os ór gãos e tecidos afetados através da corrente san güínea Portanto estabelecer bancos de cor dões em vários estados brasileiros é hoje uma prioridade principalmente considerandose a sua importância e utilidade já comprovada no caso de doenças hematológicas Entretanto o uso de embriões para obten ção de célulastronco clonagem terapêutica tem gerado muitas discussões As pesquisas com embriões de até 14 dias para clonagem te rapêutica foram permitidas na Grã Bretanha É importante salientar que ao contrário da clonagem reprodutiva estes embriões nunca serão implantados no útero mas sim direcio nados para fabricar tecidos ou órgãos e não no vas vidas humanas Sabemos que milhares de embriões gera dos por casais que procuram clínicas de fertili zação são descartados todo ano Por que não utilizálos para tentar salvar vidas Pesquisas recentes mostram resultados que parecem muito promissores Um grupo israe lense mostrou recentemente Kehat et al 2001 que células embrionárias em cultura conseguem transformarse em células cardía cas o que abre possibilidades terapêuticas enormes tanto para patologias genéticas como para doenças adquiridas 95 Entretanto os argumentos contra o uso de embriões para clonagem terapêutica são Pode abrir caminho para clonagem repro dutiva humana Pode gerar um comércio de embriões que seriam fabricados apenas para esta finalidade Destruir embriões significa destruir vidas A questão ética que se coloca então é Quan do começa a vida No momento da fertilização Nesse sentido é importante lembrarmos que a chance de que um embrião fertilizado implantado em um útero materno se transfor me em vida é menor do que 10 Por outro la do a chance de que um embrião fertilizado em um laboratório que não foi implantado se transforme em vida é ZERO Não se pode des truir uma vida para salvar outra dizem os reli giosos Mas se não utilizarmos embriões que são normalmente descartados para tentar sal var vidas não estaremos destruindo duas vi das Testes genéticos e testes preditivos Quem deve ser testado Uma das aplicações práticas mais impor tantes do projeto Genoma Humano como vi mos é o desenvolvimento de testes genéticos para diagnóstico e para prevenção a partir da identificação de casais em risco O diagnóstico molecular tem sido possível para um número crescente de doenças genéti cas o que em muitos casos tem sido muito útil pois permite confirmar o diagnóstico evi tando outros exames que podem ser invasivos e pouco informativos Além disso a identifica ção de mutações patogênicas em indivíduos as sintomáticos contribui para prevenir o nasci mento de novos afetados o que é fundamental para doenças graves ainda incuráveis Entre tanto como veremos abaixo existem três si tuações muito distintas do ponto de vista ético em relação a pessoas clinicamente normais que se submetem a testes genéticos 1 Portadores de mutações que têm risco de vir a ter descendentes afetados mas que per manecerão assintomáticos durante toda a vida 2 Portadores de mutações em indivíduos ainda assintomáticos mas com risco de vir a ser afetados por doenças de manifestação tar dia ainda sem tratamento e além disso de transmitir a mutação para seus descendentes 3 Indivíduos com risco aumentado de vir a ser afetados por doenças de manifestação tar dia potencialmente tratáveis Na primeira situação a identificação de ca sais em risco permite que ele planeje a sua fu tura prole e evite o nascimento de um afetado Entretanto questões éticas que surgem em si tuações reais são Quando oferecer testes Co mo evitar os interesses puramente comerciais Por exemplo é comum casais de primos se rem encaminhados para um serviço de genéti ca Se o levantamento da genealogia não reve lar a existência de doenças recessivas na famí lia não há motivo para se realizar testes genéti cos porque o risco empírico de 1012 não se rá alterado com a realização desses testes É im portante salientar que quanto mais comum a doença na população como por exemplo a fibrose cística ou a anemia falciforme menor é a influência relativa da consangüinidade Real mente em um estudo recente de 227 casais que tiveram filhos afetados por fibrose cística Ber nardino et al 2000 observamos que 92 dos casos tinham nascido de pais nãoconsangüí neos Além disso uma criança afetada filha de primos em primeiro grau tinha herdado duas mutações diferentes Outras questões eticamente importantes são Até onde vai nosso direito de interferir Se for descoberto por acaso uma falsa paternida de no caso de um casal que procura o aconse lhamento genético porque teve uma criança afetada devemos contar Quando contar Po demos negar a fazer um teste genético O prin cípio da confidencialidade que é uma das regras do aconselhamento genético protege quem A segunda situação é sempre mais compli cada principalmente no caso de doenças domi nantes de manifestação tardia ainda sem trata mento como a Coréia de Huntington ou as degenerações espinocerebelares Nesses casos os portadores da mutação deletéria além do risco de 50 de transmitila a sua prole tam bém serão afetados Isto é são testes também preditivos Após várias discussões éticas a res peito o consenso internacional é de não reali zar estes testes em crianças assintomáticas para doenças de início tardio para as quais ainda não há tratamento Isto porque ao aplicar um teste em uma criança estamos tirandolhe o direito de decidir mais tarde se quer ou não ser testada Mas e no caso de adultos qual é o benefí cio do teste preditivo Se o consulente já pas sou da idade reprodutiva e continua assinto mático por que saber de antemão que será afe tado se nada pode ser feito a respeito É impor 96 tante lembrar que com raras exceções as pes soas querem ser testadas na expectativa de um resultado negativo isto é que o teste revele que não são portadoras da mutação Já no caso de jovens o resultado de um tes te pode ser extremamente importante para pla nejar a sua futura prole e cada caso precisa ser discutido na tentativa de avaliar se o consulente está preparado para um resultado desfavorável Na terceira e última situação saber que te mos predisposição genética risco aumentado para doenças potencialmente tratáveis como certos tipos de câncer hipertensão ou diabete pode ser muito importante para futuros trata mentos Nesse sentido uma outra área que promete revolucionar a medicina será a farma cogenética que estuda por que temos reações tão diferentes a drogas indo desde uma ausên cia de resposta até reações tão adversas que po dem causar óbito É o caso por exemplo da hipertermia maligna uma reação violenta a certos anestésicos que causa uma morte rápida se não houver uma intervenção imediata No futuro próximo em vez de sermos cobaias ca da vez que experimentamos uma medicação nova os remédios serão receitados de acordo com o perfil genético de cada um Mas novamente a aplicação destes testes abre questões éticas muito importantes Por exemplo já foram identificados dois genes o BRCA1 e o BRCA2 responsáveis pelas formas hereditárias de câncer de mama Mulheres com mutações em um destes genes têm um risco de 8090 de chance de vir a desenvolver câncer e portanto o teste é importante para aquelas que tem vários casos na família principalmen te de início precoce Entretanto o risco life ti me risk de que qualquer mulher venha a de senvolver câncer de mama durante a vida é de 10 Portanto se uma mulher sem história fa miliar de câncer de mama for testada para os genes BRCA1 e BRCA2 e se nenhuma mutação for detectada o seu risco de vir a desenvolver câncer de mama continua praticamente o mes mo A questão ética é será que as pessoas tes tadas sabem disso Tirar o sangue de uma pessoa pode levar um minuto Entretanto devemos sempre lem brar que os resultados de um teste genético não mudam com o tempo e seu impacto pode in fluenciar o futuro de uma pessoa ou de toda uma família Por isso antes de um exame a pessoa deve ser informada 1 Para o que está sendo testada 2 O que significa um resultado positivo 3 O que significa um resultado negativo 4 Qual é a vantagem em ser testado 5 O que pode ser feito a respeito Esta discussão pode levar horas mas ela de ve estar acima de qualquer interesse comercial Diagnóstico prénatal e interrupção da gestação Casais ou famílias que já tiveram filhos ou parentes afetados por uma doença genética po dem por meio de testes genéticos saber se cor rem o risco de vir a ter outros descendentes com o mesmo problema e planejar a sua futura prole Os casais em risco que desejam ter seus próprios filhos podem se submeter ao diagnós tico prénatal DPN Este permite diagnosti car ao redor da décima semana de gestação se o feto herdou o gene mutado Ao contrário do que se imagina a nossa experiência tem mos trado que o DPN de certeza tem salvado mui tas vidas normais no caso de casais que opta riam por interromper uma gestação no caso de dúvida Por outro lado se for descoberto que o feto é portador de uma mutação responsável por uma doença grave e irreversível incompa tível com uma vida normal é justo condenála a nascer para uma vida de sofrimento Deve mos nos conformar ou batalhar para que a nossa legislação acompanhe os avanços cientí ficos Isto é que apóie a interrupção médica da gestação em casos de fetos com doenças gené ticas graves e irreversíveis desde que este seja o desejo dos pais Em resumo devemos sempre lembrar que os resultados de um teste genético não mudam com o tempo e seu impacto pode influenciar o futuro de uma pessoa ou de toda uma família Por isso estes e outras questões éticas devem ser discutidas com toda a sociedade 1 Quem deve regular a produção de testes genéticos a sua qualidade e o acesso à popula ção 2 Quem deve ser responsável pela inter pretação dos resultados e pelo aconselhamento genético 3 Quando oferecer testes 4 Quem vai controlar a confidencialidade dos resultados Empregadores e companhias de segurosaúde terão acesso às informações 97 Agradecimentos Gostaríamos de expressar nossos profundos agradeci mentos pela inestimável colaboração convívio e compa nheirismo de muitos anos às seguintes pessoas dra Ma riz Vainzof dra Maria Rita PassosBueno dra Rita de Cássia Pavanello dr Ivo Pavanello Antônia Cerqueira Marta Canovas e Constancia Urbani Este trabalho foi fi nanciado pela FAPESP CNPq e PRONEX Referências bibliográficas Abe K et al 1994 Involvement of central nervous system in myotonic dystrophy J Neurol Sci 127179185 Abeliovich B et al 1993 Negative expansion of the my otonic dystrophy unstable sequence Am J Hum Genet 5211751181 Anderson LVB et al 1998 Characterization of mono clonal antibodies to calpain 3 and protein expression in muscle from patients with limbgirdle musclar dystrophy type 2A Am J Pathol 15311691179 Anderson LVB et al 1999 Dysferlin is a plasma mem brane protein and is expressed early in human de velopment Hum Molec Genet 8855861 Anvret M et al 1993 Larger expansions of the CTG re peat in muscle compared to lymphocytes from pa tients with myotonic dystrophy Hum Mol Genet 213971400 Ashizawa T et al 1992a Anticipation in myotonic dys trophy I Statistical verification based on clinical and haplotype findings Neurology 4218711877 Ashizawa T et al 1992b Anticipation in myotonic dys trophy II Complex relationships between clinical findings ans structure of the GCT repeat Neurology 4218771883 Ashizawa T Dubel JR Harati Y 1993 Somatic instabil ity of CTG repeat in myotonic dystrophy Neurology 4326742678 Ashizawa T et al 1994a Characteristics of intergenera tional contractions of the CTG repeat in myotonic dystrophy Am J Hum Genet 54414423 Ashizawa T et al 1994b Effects of the sex of myotonic dystrophy patients on the unstable triplet repeat in their affected offspring Neurology 44120122 Aslanidis C et al 1992 Cloning of the essential myotonic dystrophy region and mapping of the putative de fect Nature 355548551 Azibi K et al 1993 Severe childhoood autosomal reces sive muscular dystrophy with the deficiency of the 50 kDa dystrophinassociated glycoprotein maps to chromosome 13q12 Hum Mol Genet 214231428 Baghdiguian S et al 1999 Calpain 3 deficiency is associ ated with myonuclear apoptosis and profound per turbation of the IkBaNFKB pathway in limbgirdle musculardystrophy type 2 Nature Medicine 5503 511 Bashir R et al 1998 A novel mammalian gene related to the C elegans spermatogenesis factor fer1 is mutat ed in patients with limbgirdle muscular dystrophy type 2B LGMD2B Nature Genet 203742 Beckmann JS et al 1991 A gene for limbgirdle muscular dystrophy maps to chromosome 15 by linkage C R Acad Sci Paris t 312 série III141148 Ben O et al 1992 Linkage of Tunisian autosomal reces sive Duchennelike muscular dystrophy to the peri centromeric region of chromosome 13q Nature Genet 2315317 Bernardino ALF et al 2000 Molecular analysis in Brazil ian cystic fibrosis patients reveals five novel muta tions Genetic testing 46974 Bonnemann et al 1995 bsarcoglycan A3b mutations cause autosomal recessive muscular dystrophy with loss of the sarcoglycan complex Nature Genet 11 266273 Brewster B Groenen P Wieringa B 1998 Myotonic dy strophy clinical and molecular aspects In Emery AEH ed Neuromuscular disorders clinical and molecular genetics John Wiley Sons Nova York Brook JD et al 1992 Molecular basis of myotonic dystro phy expansion of a trinucleotide CTG repeat at the 3end of transcript encoding a protein kinase family member Cell 68 799808 Brunner HG et al 1993a Influence of sex of the trans mitting parent as well as of parental allele size on the CTG expansion in myotonic dystrophy DM Am J Hum Genet 5310161023 Bushby K 1999 Making sense of the limbgirdle muscu lar dystrophies Brain 12214031420 Buxton J et al 1992 Detection of an unstable fragment of DNA specific to individuals with myotonic dys trophy Nature 355547548 Carey N et al 1994 Meiotic drive at the myotonic dys trophy locus Nature Genet 61718 Chakraborty R et al 1996 Segregation distortion of the CTG repeats at the myotonic dystrophy locus Am J Hum Genet 39109118 Cobo AM et al 1993 Sexrelated difference in intergen erational expansion of myotonic dystrophy gene Lancet 34111591160 Emery AEH 1993 Duchenne muscular dystrophy 2nd ed Oxford University Press Oxford e Nova York pp 2545 Ervasti JM Campbell KP 1991 Membrane organiza tion of the dystrophinglycoprotein complex Cell 66120 Fu YH et al 1992 An unstable triplet repeat in a gene re lated to myotonic muscular dystrophy Science 255 12561258 98 Gennarelli M Dallpaiccola B Baiget M Martorell L Novelli G 1994 Meiotic drive at the myotonic dys trophy locus J Med Genet 31980 Goldman A Ramsay M Jenkins T 1994 Absence of myotonic dystrophy in southern African Negroids is associated with a significantly lower number of CTG trinucleotide repeats J Med Genet 313740 Harley HG et al 1992a Expansion of an unstable DNA region and phenotypic variation in myotonic dystro phy Nature 355 545546 Harper PS Dyken PR 1972 Early onset dystrophia my otonica evidence supporting a maternal environ mental factor Lancet 25355 Harper PS 1989 Myotonic dystrophy 2nd ed WB Saunders Co Londres Filadélfia Toronto Sidney Tóquio Harper PS Harley HG Reardon W Shaw DJ 1992 Anticipation in myotonic dystrophy new light on an old problem Am J Hum Genet 511016 Hoffman EP Brown RH Kunkel LH 1987 Dystrophin the protein product of the Duchenne muscular dys trophy locus Cell 51919928 Hoffman EP et al 1988 Characterization of dystrophin in musclebiopsy specimens from patients with Duchennes or Beckers muscular dystrophy N En gl J Med 31813631368 Ikeuchi T et al 1996 NonMendelian transmission in dentatorubralpallidoluysian atrophy and Machado Joseph disease the mutant allele is preferentially transmitted in male meiosis Am J Hum Genet 58 730733 Iughetti P Zatz M PassosBueno MR Marie SK 1996 Different origin of mutations for the Machado Joseph Locus MJD1 J Med Genet 33439440 Jansen G et al 1994 Gonosoal mosaicism in myotonic dystrophy patients involvement of mitotic events in CTGn repeat variation and selection against extreme expansion in sperm Am J Hum Genet 5575585 Kehat I et al 2001 Human embryonic stem cells can dif ferentiate into myocytes with structural and func tional properties of cardiomyocytes J Clin Invest 1083407414 Koenig M et al 1987 Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy DMD cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals Cell 50509517 Koenig M Beggs AH Moyer M Scherpf S 1989 The molecular basis for Duchenne versus Becker muscu lar dystrophy Correlation of severity with type of deletion Am J Hum Genet 45498506 Lavedan C et al 1993b Myotonic dystrophy size and sexdependent dynamics of CTG meiotic instabiliy and somatic mosaicism Am J Hum Genet 52 875 883 Lim LE et al 1995 bsarcoglycan 43 DAG characteri zation and involvement in a recesssive form of limb girdle muscular dystrophy linked to chromosome 4q12 Nature Genet 11257265 Lindlöf M et al 1989 Gene deletions in Xlinked muscu lar dystrophy Am J Hum Genet 44 496503 Liu J et al 1998 Dysferlin a novel skeletal muscle gene is mutated in Miyoshi myopathy and limbgirdle muscular dystrophy Nat Genet 20 3136 Lunt PW et al 1995 Correlation between fragment size at D4f104S and age at onset or at wheelchair use with a possible generational effect accounts for much phenotypic variation in 4q35facioscapulohumeral muscular dystrophy FSHD Hum Molec Genet 4951958 Mahadevan M et al 1992 Myotonic dystrophy muta tion an unstable CTG repeat in the 3untranslated region of the gene Science 25512531255 Martorell L et al 1995 Comparison of CTG repeat length expansion and clinical progression of my otonic dystrophy over a five year period J Med Genet 32593596 McNally E et al 1996 Mild and severe muscular dystro phy caused by a single gsarcoglycan mutation Am J Hum Genet 5910401047 Monaco A Bertelson C LiechtiGallati SHM Kunkel LM 1988 An explanation for the phenotipic differ ences between patients bearing partial deletions of the DMD locus Genomics 29095 Moreira ES Vainzof M Marie SK Sertié A Zatz M PassosBueno MR 1997 The seventh form of auto somal recessive limbgirdle muscular dystrophy LGMD2G is mapped at 17q1112 Am J Hum Genet 61151159 Moreira ES Vainzof M Marie SK Nigro V Zatz M PassosBueno MR 1998 A first missense mutation in the dsarcoglycan gene associated with a severe phenotype and frequency of limbgirdle muscular dystrophy type 2F LGMD2F among Brazilian sarcoglycanopathies J Med Genet 35951953 Moreira ES et al 2000 Limbgirdle muscular dystrophy type 2G LGMD2G is caused by mutations in the gene encoding the sarcomeric protein telethonin Nature Genet 24163166 Moxley RT 1996 Proximal myotonic myopathy mini re view of a recently delineated clinical disorder Neu romusc Disord 68793 Neuromuscular Disorders 10 2001 IVIII Nigro V et al 1996 The 5q autosomal recessive limb girdle muscular dystrophy LGMD2F is caused by a mutation in the dsarcoglycan gene Nat Genet 14 195196 Novelli G et al 1993a CTGn triplet mutation and phe notype manifestations in myotonic dystrophy pa tients Biochem Med Metab Biol 508592 PassosBueno MR Lima MABO Zatz M 1990 Esti mate of germinal mosaicism in Duchenne muscular dystrophy J Med Genet 27727728 PassosBueno MR et al 1992 Mosaicism for Duchenne muscular dystrophy mutations new recurrence risk estimates based on the deletion site in the gene Am J Human Genet 5111501155 PassosBueno MR Vainzof M Marie SK Zatz M 1994 Half the dystrophin gene is apparently enough for a mild clinical course confirmation of its potential use for gene therapy Hum Molec Genet 3919922 PassosBueno MR Cerqueira A Vainzof M Marie SK Zatz M 1995 Myotonic dystrophy genetic clinical and molecular analysis of patients from 41 Brazilian families J Med Genet 321419 PassosBueno MR et al 1996 Main clinical features for the three mapped autosomal recessive limbgirdle muscular dystrophies and estimated pr d Brazilian families with a relatively mild form of autosomal re cessive limbgirdle muscular oportion of each form in 13 Brazilian families J Med Genet 33 97102 99 PassosBueno MR et al 1995 A common missense mu tation in three unrelate dystrophy Hum Molec Genet 411631167 PassosBueno MR Moreira ES Vainzof M Marie SK Zatz M 1996 Linkage analysis in autosomal reces sive muscular dystrophy AR LGMD maps a sixth form to 5q3334 LGMD2F and indicates that there is at least one more subtype of ARLGMD Hum Molec Genet 5 815820 PassosBueno MR Vainzof M Moreira ES Zatz M 1999 The seven autosomal recessive limbgirdle muscular dystrophies LGMD from lgmd2a to lgmd2g Am J Med Genet 82392398 Ranum LPW Rasmussen PF Benzow KA Koob MD Day JW 1998 Genetic mapping of a second myoton ic dystrophy locus Nature Genet 19196198 Rapaport D 1991 Apparent association of mental retar dation and specific patterns of deletions screened with probes cf56a e cf23a in Duchenne muscular dy strophy Am J Med Genet 39 437441 Rapaport D et al 1992 A deletion including the brain promoter of the Duchenne muscular dystrophy gene is not associated with mental retardation Neuromus cular Disorders 2117120 Richard I et al 1995 Mutations in the proteolytic en zyme calpain 3 cause limbgirdle muscular dystro phy type 2A Cell 812740 Richard I et al 1999 Calpainopathya survey of muta tions and polymorphisms Am J Hum Genet 64 15241540 Roberds SL et al 1994 Missense mutations in the ad halin gene linked to autosomal recessive muscular dystrophy Cell 78625633 Spencer MJ et al 1997 Absence of calpain 3 in a form of limbgirdle muscular dystrophy LGMD2A J Neu rol Sci 146 173178 Takata R Estudos de deleções moleculares com sondas de cDNA ao longo do gene da distrofina Memória de Mestrado Universidade de São Paulo São Paulo 1995 Thornton CA Johnson K Moxley RT 1994 Myotonic dystrophy patients have larger CTG expansions in skeletal muscle than in leukocytes Ann Neurol 35104107 Vainzof M et al 1990 Dystrophin immunostaining in muscles from patients with different types of muscu lar dystrophy a Brazilian study J Neurol Sci 98 221233 Vainzof M PassosBueno MR Takata RI Pavanello RCM Zatz M 1993a Intrafamilial variability in dy strophin abundance correlated with difference in the severity of the phenotype J Neurol Sci11938 Vainzof M PassosBueno MR Takata RI Pavanello RCM Zatz M 1993b Is the maintainance of the C terminus domain of dystrophin enough to ensure a milder Becker muscular dystrophy phenotype Hum Mol Genet 213942 Vainzof M et al 1996 The sarcoglycan complex in the six autosomal recessive limbgirdle muscular dystro phies Hum Molec Genet 5 1219631970 Vainzof M et al 1999a Sarcoglycanopathies are responsi ble for 68 of severe autosomal recessive limbgir dle muscular dystrophy in the Brazilian population J Neurol Scienc 1644449 Vainzof M et al 1999b Further evidences for the organi zation of the four sarcoglycans proteins within the dystrophinglycoprotein complex European Journal of Human Genetics 72251254 Van Deutekom JCT 1996 PhD Thesis University of Leiden Leiden Holanda Weiler T et al 1998 A gene for autosomal recessive limb girdle muscular dystrophy in Manitoba Hutterites maps to chromosome region 9q3133 evidence for another limbgirdle muscular dystrophy locus Am J Hum Genet 63140147 Wijmenga C et al 1990 Location of fascioscapulohumer al muscular dystrophy gene on chromosome 4 Lancet 336651653 Wijmenga C et al 1992 Chromosome 4q DNA re arrangements associated with fascioscapulohumeral muscular dystrophy Nature Genet 22630 Zatz M PassosBueno MR Rapaport D 1989 Estimate of the proportion of Duchenne muscular dystrophy with autosomal inheritance Am J Med Genet 32 407410 Zatz M FrotaPessoa O Levy JA Peres CA 1976 Crea tinephosphokinase CPK activity in relatives of pa tients with Xlinked muscular dystrophies a Brazil ian study J Genet Hum 242153168 Zatz M Lange K Spence MA 1977 Frequency of Duchenne muscular dystrophy carriers Lancet I 759 Zatz M ViannaMorgante AM Campos P Diament AJ 1981 Translocation X6 in a female with Duchenne muscular dystrophy implications for the localisation of the DMD locus J Med Genet186442447 Zatz M et al 1995a High proportion of new mutations and possible anticipation following genetic molecu lar studies in Brazilian facioscapulohumeral muscu lar dystrophy FSHD families Am J Hum Genet 5699105 Zatz M et al 1995b Analysis of CTG repeat in skeletal muscle of myotonic dystrophy young and adult pa tients when does the expansion occur Hum Molec Genet 4 401406 Zatz M PassosBueno MR Cerqueira A Vainzof M 1996 CTG repeat length in muscle from patients with myotonic dystrophy J Med Genet 33173176 Zatz M Cerqueira A Vainzof M PassosBueno MR 1997 Segregation distortion of the CTG repeats at the myotonic dystrophy DM locus new data from Brazilian DM families J Med Genet 34790791 Zatz M et al 1998 The fascioescapulohumeral muscular dystrophy FSHD1 gene affects more severely and more frequently males than females Am J Med Genet 77155161 Zatz M Vainzof M PassosBueno MR 2000 Limbgirdle muscular dystrophy one gene with different pheno types one phenotype with different genes Current Opinion in Neurology 13511517 Zatz M Vainzof M PassosBueno MR 2001 Serum Cre atineKinase CK In Bushby K Anderson L eds Progressive Muscular Dystrophies in methods in molecular medicine Human Press Twota Nova Jersey pp 3153