Meios de Cultura e Identificacao de Bacterias Apresentacao Completa

Meios de cultura e características bacterianas Apresentação Os meios de cultura reproduzem as condições nutricionais de que as bactérias necessitam para crescer o que permite cultivar bactérias em laboratório Alguns meios de cultura utilizam indicadores de pH o que é útil para a identificação de características bioquímicas das bactérias como a fermentação de carbohidratos por exemplo Outros meios permitem visualizar a motilidade bacteriana e a produção de sulfeto de hidrogênio Esses são alguns exemplos em que os meios de cultura podem ser utilizados para a identificação de espécies bacterianas por meio das características que elas adquirem no meio de cultura Outra questão relacionada é a forma adequada de semear a bactéria no meio de cultura pois ela influencia no tipo de resultado que se deseja obter Nesta Unidade de Aprendizagem você conhecerá os principais meios de cultura utilizados na bacteriologia clínica saberá escolher os meios de cultura adequados para a realização de testes de identificação de bactérias bem como conseguirá interpretálos e saberá realizar a técnica de semeadura adequada para cultivo bacteriano em diferentes situações Bons estudos Ao final desta Unidade de Aprendizagem você deve apresentar os seguintes aprendizados Reconhecer os diferentes meios de cultura utilizados na bacteriologia clínica Diferenciar os métodos de identificação de bactérias a partir dos meios de cultura Definir as diferentes técnicas de semeadura para cultivo bacteriano Desafio As enterobactérias pertencentem à família Enterobacteriaceae sendo alguns membros as espécies Escherichia coli Salmonella typhimurium Citrobacter freundii Shigella flexneri Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae e Proteus mirabilis Caracterizamse por serem bacilos Gramnegativos anaeróbios facultativos fermentadores de glicose oxidasenegativos e redutores de nitratos a nitritos Essas características as diferenciam de outros grupos de bactérias Entretanto para se fazer a distinção entre as espécies dessa família é necessário realizar testes bioquímicos específicos Por exemplo o ágar tríplice açúcar ferro TSI utilizado para diferenciação de bacilos Gramnegativos permite analisar o perfil de fermentação dos carbohidratos glicose lactose e sacarose e a capacidade da bactéria de produzir sulfeto de hidrogênio H2S e gás carbônico CO2 Veja a seguinte situação Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar A partir dos resultados encontrados e da tabela do perfil bioquímico das três bactérias responda às seguintes perguntas a Qual técnica de semeadura você utilizou na inoculação das bactérias no ágar TSI b Os tubos A B e C continham quais espécies de bactérias Justifique sua resposta Infográfico Existem diversos meios de cultura utilizados na bacteriologia clínica Alguns como o ágar sangue são utilizados para a maioria dos microrganismos enquanto outros como o ágar MacConkey permitem o crescimento de somente alguns grupos de microrganismos É fundamental que o microbiologista saiba para que serve cada um dos meios de cultura pois o sucesso do crescimento bacteriano e da análise do microrganismo de interesse depende dessa escolha No Infográfico a seguir você verá um resumo dos principais meios de cultura utilizados na bacteriologia clínica incluindo informações sobre composição classificação utilizações e algumas características especiais Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar This page is blank and contains no text Conteúdo do livro As bactérias podem ser cultivadas e identificadas em laboratório por intermédio dos meios de cultura Não existe um meio de cultura universal para o crescimento bacteriano pois as necessidades nutricionais variam entre as espécies Assim foram desenvolvidos meios de cultura apropriados para cada situação Ainda existem meios de cultura utilizados especificamente para a realização de testes bioquímicos os quais permitem a identificação de grupos ou espécies bacterianos pelas características visuais que os meios adquirem após o inóculo da bactéria Aliás o inóculo bacteriano deve ser realizado mediante a técnica de semeadura adequada o que garante o sucesso da análise No capítulo Meios de cultura e características bacterianas da obra Bacteriologia clínica você conhecerá os diferentes meios de cultura utilizados na bacteriologia clínica saberá diferenciar os métodos de identificação bioquímicos de bactérias a partir dos meios de cultura e saberá definir as diferentes técnicas de semeadura para cultivo bacteriano Bons estudos Bacteriologia Clínica Margarida Neves Souza Meios de cultura e características bacterianas Objetivos de aprendizagem Ao final deste texto você deve apresentar os seguintes aprendizados Reconhecer os diferentes meios de cultura utilizados na bacteriologia clínica Diferenciar os métodos de identificação de bactérias a partir dos meios de cultura Definir as diferentes técnicas de semeadura para cultivo bacteriano Introdução Uma das práticas mais rotineiras de um laboratório de bacteriologia clínica é o cultivo de bactérias em meios de cultura Os meios de cultura podem servir para a estocagem e a manutenção de culturas bacterianas o que pode ser interessante para manter uma coleção de bactérias no laboratório por exemplo para identificar e diferenciar grupos ou espécies de bactérias o que auxilia no diagnóstico e para realizar testes de sensibilidade aos antibióticos Além de saber escolher o meio de cultura adequado para cada situação e interpretar corretamente os resultados do cultivo bacteriano de acordo com as características apresentadas pelas colônias bacterianas é essencial que o profissional saiba inocular as bactérias nos meios de cultura utilizando as técnicas de semeadura adequadas Neste capítulo você vai reconhecer os principais meios de cultura utilizados na bacteriologia clínica e suas finalidades além de saber identificar as características bacterianas a partir de meios de cultura utilizados em testes bioquímicos e aprender a utilizar a técnica de semeadura adequada para o cultivo bacteriano Meios de cultura As bactérias requerem fontes de nutrientes adequadas para crescerem como por exemplo carbono obtido a partir de compostos orgânicos nitrogênio enxofre e fósforo Em laboratório as bactérias podem crescer in vitro em placas ou tubos que contenham meio de cultura também chamado de meio de cultivo os quais devem reproduzir as condições nutricionais necessárias Entretanto os tipos de nutrientes necessários variam muito entre as espécies logo não existe um meio de cultura universal Foram portanto desenvolvidos vários meios de cultura cada um com uma composição diferente de nutrientes de modo a permitir o crescimento da maioria dos microrganismos de grupos ou de espécies bacterianas específicas Porém é importante destacar que os meios de cultura não servem apenas para obter o isolamento das colônias bacterianas muitas vezes eles possibilitam a identificação das bactérias seja de um grupo específico ou até mesmo a identificação de uma espécie MADIGAN et al 2016 Algumas espécies bacterianas podem apresentar características específicas de suas colônias em meios de cultura o que permite a sua identificação Algumas cepas da bactéria Pseudomonas aeruginosa por exemplo podem produzir os pigmentos piocianina e pioverdina que tornam suas colônias cor azulesverdeadas no ágar característica dessa espécie Além disso elas têm um odor de fruta parecido com uva característico Outro exemplo a ser citado é a bactéria Staphylococcus aureus A maioria das cepas dessa espécie produz um pigmento que deixa suas colônias com uma cor característica de amarelodouradas Fontes Brooks et al 2014 e Tortora Funke e Case 2017 É importante que você saiba reconhecer os diferentes meios de cultura e para o que são utilizados para dessa forma poder escolher o mais adequado de acordo com a natureza da investigação bacteriana Os meios de cultura utilizados na bacteriologia podem ser agrupados em duas grandes classes meios definidos e meios complexos Meios de cultura e características bacterianas 2 Meios definidos ou meios sintéticos são aqueles que se sabe exatamente a composição química qualitativa e quantitativamente conhecida pois são preparados com quantidades exatas de compostos químicos orgânicos e inorgânicos sendo utilizados normalmente em trabalhos experimentais ou para o crescimento de bactérias autotróficas as que produzem o seu próprio alimento Meios complexos são os que não se sabe exatamente a composição mas que utilizam variadas fontes de nutrientes como extratos de leveduras de carnes de soja ou de plantas componentes de produtos microbianos proteína do leite caseína entre outras sendo estes os mais utilizados rotineiramente MADIGAN et al 2016 TORTORA FUNKE CASE 2017 Os meios de cultura também podem ser classificados como meios de transporte e conservação meios para teste de sensibilidade aos antimicrobianos meios seletivos meios diferenciais e meios de enriquecimento BRASIL 2004a MADIGAN et al 2016 TORTORA FUNKE CASE 2017 Meios de transporte e conservação são aqueles que contêm um agente redutor mas não têm nutrientes Esses meios são utilizados para tornar o ambiente viável prevenir desidratação e oxidação enzimática e manter as culturas vivas Exemplos Cary Blair Salina Tamponada Meio Stuart e ágar nutriente Meios para teste de sensibilidade aos antimicrobianos são os usados para se fazer antibiograma Exemplos HTM do inglês haemophilus test medium Agar Mueller Hinton e Agar Mueller Hinton Sangue Meios seletivos são aqueles que inibem de forma seletiva o crescimento de alguns microrganismos e favorecem o crescimento dos microrganismos de interesse clínico Exemplos Ágar ThayerMartin e Ágar Salmonella Shigella SS Meios diferenciais são os meios que diferenciam as bactérias pelas características especiais das colônias bacterianas de interesse como diferentes colorações Exemplos ágarEMB e ágarsangue Meios de enriquecimento são aqueles utilizados para isolar microrganismos fastidiosos ou seja que são nutricionalmente exigentes cujo crescimento pode ser inibido se outras bactérias estiverem presentes em maior número Os meios de enriquecimento também são considerados meios seletivos já que utilizam substâncias altamente nutritivas que favorecem o crescimento dos microrganismos fastidiosos e inibem o crescimento de outros A sua utilização mais frequente é em amostras de fezes e de solo Exemplos ágarChocolate caldo Selenito e caldo tetrationato Ágarsangue O ágarsangue é um meio de cultura sólido composto principalmente por sangue desfibrinado de carneiro ou de coelho e uma mistura de peptonas Tratase de um meio de cultura rico em nutrientes que permite o crescimento da maioria dos microrganismos com exceção de alguns fastidiosos logo não é um meio seletivo Ele é considerado um meio diferencial por ser na identificação presuntiva de Haemophilus spp e na análise diferencial de produção de hemólise pelas bactérias Streptococcus spp e Staphylococcus spp BRASIL 2004a O Haemophilus pode ser identificado pela prova do satelitismo Essa prova consiste em semear no ágarsangue uma suspensão de bactéria suspeita de ser Haemophilus e fazer um inóculo em forma de estria da bactéria Staphylococcus aureus a qual secreta a enzima NAD Fator V que é liberada no meio A bactéria Haemophilus necessita do Fator V para crescer sendo assim se essa bactéria estiver presente na amostra semeada ela irá crescer em forma de satélite ao redor da estria de S aureus Figura 1 TRABULSI ALTERTHUM 2008 Figura 1 Prova do satelitismo Teste presuntivo de identificação de Haemophilus spp realizado em ágarsangue As colônias de Haemophilus crescem ao redor da S aureus que produz o Fator V o qual é essencial para o crescimento de Haemophilus Fonte MyFavoriteTimeShutterstockcom Algumas espécies de Streptococcus e Staphylococcus causam hemólise destruição de hemácias o que pode ser observado no ágarsangue que contém hemácias A αhemólise produz uma lise parcial formando colorações verdes ao redor das colônias exemplos de bactérias αhemolíticas Streptococcus viridans e Streptococcus pneumoniae enquanto a βhemólise produz lise total formando halos transparentes e luminosos em volta das colônias exemplos de bactérias βhemolíticas Streptococcus pyogenes e S aureus BRASIL 2004a TORTORA FUNKE CASE 2017 5 Meios de cultura e características bacterianas Ágar MacConkey O ágar MacConkey é um meio de cultura sólido composto principalmente por cristal violeta sais biliares e peptonas Este é um meio seletivo pois nele crescem somente as bactérias gramnegativas já que o cristal violeta inibe o crescimento das bactérias grampositivas O ágar MacConkey também é con siderado um meio diferencial pelo fato de diferenciar bactérias gramnegativas fermentadoras de lactose produzem colônias rosas como a Escherichia coli das não fermentadoras que produzem colônias incolores ou beges como a Pseudomonas aeruginosa Ele é usado principalmente para isolar e identificar enterobactérias e fazer a contagem de coliformes fecais a partir de diferentes tipos de amostras como amostras biológicas pex fezes água e alimentos BRASIL 2004a Ágarchocolate O ágarchocolate que recebe esse nome pela sua cor marrom é um meio de cultura sólido composto basicamente por sangue lisado de coelho cavalo ou carneiro As hemácias do sangue são lisadas pelo calor e então liberam os compostos hemina e hematina que são necessários para o crescimento de mi crorganismos fastidiosos como Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Haemophilus spp e Moraxella spp sendo portanto esse meio classificado como um meio de enriquecimento Não se trata de um meio seletivo pois ele também permite o crescimento de outros microrganismos não fastidiosos embora o meio possa ser suplementado com o antibiótico vancomicina que inibe alguns microrganismos de modo a favorecer o crescimento dos fastidiosos BRASIL 2004a MADIGAN et al 2016 Ágar ThayerMartin chocolate O ágar ThayerMartin chocolate é uma modificação do ágarchocolate com a diferença de ser suplementado com antibióticos colistina nistatina tri metropina e vancomicina que inibem o crescimento da microbiota normal e favorecem o crescimento das bactérias N gonorrhoeae e N meningiti dis o que o torna um meio seletivo e de enriquecimento BRASIL 2004a MADIGAN et al 2016 Meios de cultura e características bacterianas 6 Ágar SS O ágar SS é um meio de cultura sólido composto principalmente por sais biliares verde brilhante citrato de sódio tiossulfato de sódio e citrato férrico Tratase de um meio seletivo já que os compostos sais biliares verde brilhante e citrato de sódio inibem o crescimento de microrganismos grampositivos Ele também é considerado um meio diferencial por diferenciar as bactérias fermentadores de lactose produzem colônias rosas ou vermelhas das não fermentadoras produzem colônias incolores O ágar SS é utilizado para isolar Salmonella produz colônias com centro negro devido à detecção de H2S ou incolores e Shigella produz colônias incolores a partir de amostras biológicas p ex fezes e urina e alimentos BRASIL 2004a MBIOLOG DIAGNÓSTICOS 2014 Ágar LöwensteinJensen O ágar LöwensteinJensen é um meio de cultura sólido composto por ovos de galinha fécula de batata verde malaquita asparagina fosfato e sais de mag nésio Este é um meio seletivo pois permite o crescimento de micobactérias como Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae por exemplo BRASIL 2004a Métodos de identificação de bactérias Você acabou de aprender os principais meios de cultura utilizados na bacte riologia clínica para o crescimento bacteriano Alguns deles permitem a iden tificação presuntiva de grupos ou espécies bacterianas como a diferenciação de bactérias gramnegativas fermentadoras de lactose das não fermentadoras nos meios ágar MacConkey e ágar SS Porém existem ainda outros meios de cultura utilizados na realização de provas bioquímicas também chamados de testes bioquímicos os quais permitem identificar as espécies bacterianas pela pesquisa das enzimas metabolizadoras dos produtos metabólicos e catabólicos e da sensibilidade a diferentes compostos haja vista que cada bactéria tem um perfil bioquímico único 7 Meios de cultura e características bacterianas Fique atento Alguns testes bioquímicos não utilizam meios de cultura apesar disso também serão descritos aqui devido à sua importância laboratorial TRABULSI ALTERTHUM 2008 Exemplo Cada microrganismo tem um perfil bioquímico diferente o que permite identificálos por meio de provas bioquímicas O gênero Staphylococcus por exemplo tem as seguintes características catalase positiva motilidade negativa NaCl 65 oxidase aeróbio estrito tétrade variável V É possível ainda diferenciar espécies desse gênero a S aureus é DNAse PYR novobiocina sensível S ureia V polimixina resistente R ao passo que a S epidermidis é DNAse e ureia Fonte Brasil 2004b O Quadro 1 apresenta um resumo dos principais meios de cultura utilizados no crescimento bacteriano e na realização das provas bioquímicas Quadro 1 Principais meios de cultura utilizados na bacteriologia clínica Meio de cultura Utilização Aspectos dos meios de cultura ágarsangue Crescimento da maioria dos microrganismos Prova de satelitismo Haemophilus spp Visualização da hemólise de Streptococcus e Staphylococcus S aureus βhemolítica e S pyogenes αhemolíticarespectivamente Fonte SiriratShutterstockcom Continua Quadro 1 Principais meios de cultura utilizados na bacteriologia clínica Meio de cultura Utilização Aspectos dos meios de cultura Ágar MacConkey Isolamento de bactérias gramnegativas Diferenciação da gramnegativas fermentadoras de lactose das não fermentadoras Identificação de enterobactérias Fermentadora e não fermentadora de lactose respectivamente Fonte MyFavoriteTimeShutterstockcom Ágarchocolate Isolamento de microrganismos fastidiosos como N gonorrhoeae N meningitidis Haemophilus spp e Moraxella spp Fonte Jarun OntakraiShutterstockcom Ágar SS Inibição das bactérias grampositivas Diferenciação das gramnegativas fermentadoras de lactose das não fermentadoras Isolamento e diferenciação de Salmonella e Shigella A E coli B Shigella C Salmonella Fonte OneMashiShutterstockcom Continua Quadro 1 Principais meios de cultura utilizados na bacteriologia clínica Meio de cultura Utilização Aspectos dos meios de cultura Ágar citrato Simmons Diferenciação de espécies de enterobactérias que utilizam o citrato como única fonte de carbono para obter energia das que precisam de outras fontes Citrato e citrato respectivamente Fonte OneMashiShutterstockcom Ágar triplo açúcar Ferro TSI Diferenciação dos bacilos gramnegativos Fermentação dos carboidratos glicose lactose e sacarose Produção de CO2 e H2S Vários resultados do ágar TSI Fonte MyFavoriteTimeShutterstockcom Descarboxilação de lisina e ornitina Identificação das enterobactérias Verificação da descarboxilação da lisina ou da ornitina Utilização de Caldo Base de Moeller ou os dos meios MIO motilidade indol ornitina ou MILi motilidade indol lisina ou LIA lisina H2S Descarboxilação Fonte MyFavoriteTimeShutterstockcom Quadro 1 Principais meios de cultura utilizados na bacteriologia clínica Meio de cultura Utilização Aspectos dos meios de cultura Ágar de Christensen Diferenciação das bactérias produtoras da enzima urease das não produtoras Urease e urease respectivamente Fonte OneMashiShutterstockcom Prova da coagulase A prova da coagulase é utilizada para diferenciar a Staphylococcus aureus coagulase positiva de outras espécies de estafilococos coagulase negativas A S aureus contém uma enzima coagulase em sua parede celular que coagula o fibrinogênio do plasma convertendoo em fibrina Essa prova pode ser realizada em lâmina adicionase a colônia emulsionada em solução salina na lâmina em seguida colocase uma gota de plasma e se aguarda o período de 10 s ou em tubo de ensaio incubase por uma noite a colônia suspeita em tubo de ensaio contendo BHI caldo infusão cérebro coração do inglês brain heart infusion broth e plasma depois é incubado a 35ºC por 4 h sendo o resultado positivo para S aureus se houver formação de coágulo BRASIL 2004b BROOKS et al 2014 Teste da novobiocina Prova utilizada para diferenciar a bactéria Staphylococcus saprophyticus de outros estafilococos coagulase negativos A S saprophyticus é resistente ao antibiótico novobiocina enquanto os outros estafilococos coagulase negativos são sensíveis O teste de resistência é feito ao adicionar um disco de papel impregnado com 5 µg de novobiocina em placa de Petri contendo ágar Mueller Hinton Halos de 6 a 12 mm são resistentes positivo para S saprophyticus enquanto halos de 16 mm ou mais são sensíveis BRASIL 2004b TRABULSI ALTERTHUM 2008 Teste da bacitracina Teste utilizado para a identificação presuntiva de estreptococos βhemolíticos do grupo A S pyogenes já que estes são sensíveis ao antibiótico bacitra cina enquanto os estreptococos βhemolíticos do grupo B S agalactiae são resistentes O teste de sensibilidade é feito ao adicionar um disco de papel impregnado com 004 U de bacitracina em placa de Petri contendo ágarsangue e então é verificado o tamanho do halo BRASIL 2004a TRABULSI AL TERTHUM 2008 Meios de cultura e características bacterianas 12 Teste da optoquina Teste utilizado para a diferenciação presuntiva entre Streptococcus pneumoniae e outros estreptococos αhemolíticos já que a optoquina inibe o crescimento da S pneumoniae ie é sensível à optoquina O teste de sensibilidade é feito ao colocar um disco de papel impregnado com 5 µg de optoquina em placa de Petri contendo ágarsangue Em seguida verificase o tamanho do halo halos maiores que 14 mm identificam S pneumoniae BRASIL 2004b TRABULSI ALTERTHUM 2008 Ágar bileesculina O ágar bileesculina é um meio sólido inclinado ou em placa utilizado na identificação presuntiva de Streptococcus do grupo D S bovis e S equinus e de espécies de Enterococcus bileesculina positivas pex E faecalis Essas bactérias são capazes de hidrolisar a esculina um derivado da cumarina glicosídica em presença de sais biliares formando a esculetina que reagem com íons férricos do meio de modo a formar um complexo preto Assim os resultados positivos são pretos enquanto os resultados negativos permanecem com a coloração original do meio amarelo acinzentado BRASIL 2004a Ágar citrato Simmons O ágar citrato Simmons é um meio sólido inclinado ou em placa utilizado na diferenciação de espécies de enterobactérias O teste se baseia na capacidade de algumas espécies de enterobactérias utilizarem o citrato como única fonte de carbono para a obtenção de energia O ágar é originalmente verde e per manece dessa cor em caso de bactérias citratonegativo pex E coli mas muda para a cor azul em caso de bactéria citratopositivo pex Enterobacter e Klebsiella BRASIL 2004a TRABULSI ALTERTHUM 2008 13 Meios de cultura e características bacterianas Produção de sulfeto de hidrogênio H2S Esse teste se baseia na habilidade que algumas bactérias têm de produzir H2S a partir de aminoácidos ou compostos que contenham enxofre Meios de cultura utilizam sais de sulfeto com metais pesados geralmente o ferro Em caso positivo na formação de H2S é gerada uma coloração negra no meio BROOKS et al 2014 Fermentação de carboidratos Os testes de fermentação de carboidratos são baseados na capacidade que algumas bactérias têm de produzir metabólitos ácidos a partir de carboidratos pex glicose lactose sacarose manitol xilol arabinose entre outros em situações de anaerobiose via fermentativa ou oxidativa Com a formação de ácidos orgânicos há uma diminuição do pH o que pode mudar a coloração dos meios por intermédio de indicadores de pH BRASIL 2004a BROOKS et al 2014 TRABULSI ALTERTHUM 2008 O ágar triploaçúcarferro TSI é um meio sólido inclinado utilizado para diferencia ção de bacilos gramnegativos baseado em testes de fermentação de carboidratos produção de CO2 e de H2S O ágar TSI contém os açúcares glicose lactose e sacarose além do indicador de pH vermelho de fenol em caso de fermentação de carboidratos o meio muda de vermelho para amarelo e de sulfato de ferro utilizado na detecção da produção de H2S O meio é preparado de forma que a superfície do ágar seja aeróbia e a base anaeróbia Interpretações a superfície e base vermelhas bacilo gramnegativo não fermentador de carboidrato ou bactéria grampositiva b superfície vermelha e base amarela fermentação positiva apenas para glicose c superfície e base amarelas fermentação positiva para glicose e lactose eou sacarose d produção de gás CO2 em caso positivo há formação de bolhas com possibilidade de o meio fragmentar e Produção de H2S em caso positivo há formação de um precipitado negro Fonte Brasil 2004a Meios de cultura e características bacterianas 14 Descarboxilação de lisina e ornitina É um teste no qual se utiliza o caldo base de Moeller sendo ele utilizado principalmente para a identificação de enterobactérias Esse teste se baseia na capacidade de algumas bactérias descarboxilarem os aminoácidos lisina p ex Klebsiella pneumoniae e Enterobacter aerogenes e ornitina p ex Enterobacter cloacae e Serratia marcescens em meio anaeróbio formando os compostos aminas alcalinos cadaverina e putrescina respectivamente É utilizado o indicador de pH púrpura de bromocresol sendo a cor original do meio púrpura Dois tubos para reação são utilizados sendo um tubo controle sem aminoácido e o outro tubo com aminoácido Caso o tubo controle fique amarelo e turvo e o tubo com aminoácido fique púrpura e turvo o resultado é positivo para a descarboxilação porém se os dois tubos permanecerem púrpura o resultado é negativo BRASIL 2004a Produção de indol O teste se baseia no fato de algumas bactérias terem a enzima triptofanase que metaboliza o aminoácido triptofano produzindo indol benzopirrol ácido pirúvico e amônia Para isso utilizase um o caldo triptona rico em triptofano e se adiciona o reagente pdimetilaminobenzaldeído reagente de Kovacs ou de Ehrlich Caso ocorra a formação de indol este reage com o reagente de Kovacs ou de Ehrlich e forma uma coloração vermelha em forma de anel na superfície BROOKS et al 2014 TRABULSI ALTERTHUM 2008 Teste de motilidade Teste realizado em meios semissólidos visando a verificar se a bactéria é móvel ou não Devese fazer uma inoculação por picagem no meio semissólido Caso a motilidade seja positiva as bactérias se difundem no meio a partir da linha do inóculo deixando o meio turvo Porém se a motilidade for negativa o meio continua límpido sendo o crescimento bacteriano concentrado na linha do inóculo BRASIL 2004a TRABULSI ALTERTHUM 2008 15 Meios de cultura e características bacterianas Fique atento Existem alguns meios comerciais utilizados na identificação de enterobactérias que analisam mais de uma característica bioquímica ao mesmo tempo como os meios semissólidos SIM MIO MILi e LIA SIM analisa Sulfeto de hidrogênio produção de Indol e Motilidade Os resultados devem ser avaliados como se fossem testes isolados produção de cor negra formação de anel vermelho e amostra turva em volta da linha do inóculo respectivamente MIO analisa Motilidade produção de Indol e descarboxilação da Ornitina Em caso de amostra positiva para descarboxilação da ornitina todo o meio muda de amarelo para roxo enquanto as amostras negativas permanecem amarelas ou amarelas com uma faixa roxa na superfície Devese observar a motilidade pela turvação do meio e indol pela formação de anel vermelho no topo MILi analisa Motilidade produção de Indol e descarboxilação da Lisina Em caso de amostra positiva para descarboxilação da lisina todo o meio muda de amarelo para roxo enquanto as amostras negativas permanecem amarelas com uma faixa roxa na superfície Observar a motilidade pela turvação do meio e indol pela formação de anel vermelho no topo LIA ou ágar lisina ferro analisa a descarboxilação da lisina e a produção de sulfeto de hidrogênio Em caso de amostra positiva para descarboxilação da lisina o meio adquire coloração roxa na base enquanto as amostras negativas ficam amarelas A cor negra indica produção de sulfeto de hidrogênio Fonte Brasil 2004a e LABORCLIN 2019 Fenilalanina desaminase Teste utilizado na identificação das espécies Proteus Morganella e Providencia pois somente essas espécies entre as enterobactérias têm a enzima fenilalanina desaminase que converte a fenilalanina em ácido fenilpirúvico Utilizase então o Ágar Fenilalanina meio sólido inclinado e caso haja a formação do ácido fenilpirúvico resultado positivo a superfície do meio originalmente amarela adquire uma coloração verde escura BRASIL 2004a TRABULSI ALTERTHUM 2008 Prova de oxidase Esse teste se baseia na detecção da enzima citocromo oxidase C presente em algumas espécies bacterianas e pode ser realizado em tiras de papel filtro impregnadas com o corante cloridrato de pfenilenodiamina Caso a bactéria seja oxidase positiva presença de citocromo oxidase a reação fica roxa porém se for negativa não há mudança na cor do papel reagente permanece transparente BRASIL 2004a TRABULSI ALTERTHUM 2008 Prova de urease Teste que diferencia bactérias produtoras da enzima urease pex Proteus vulgaris das não produtoras pex E coli por meio do Ágar de Christensen meio sólido inclinado A urease hidrolisa a ureia em amônia e dióxido de carbono Como a amônia é uma substância alcalina ela eleva o pH do meio de cultura que contém um indicador de pH Assim em caso positivo o meio originalmente amarelo tornase rosa pink Resultados fracamente positivos ficam com superfície do meio pink e o restante permanece amarelo BRASIL 2004a TRABULSI ALTERTHUM 2008 Técnicas de semeadura As técnicas de semeadura servem para inocular o microrganismo nos meios de cultura A técnica adequada deve ser escolhida de acordo com o tipo de meio sólido semissólido ou líquido o tipo de recipiente que contém o meio de cultura placa de Petri ou tubo se o meio em tubo é inclinado ou não e que tipo de análise se deseja fazer isolamento de cultura ou quantificação bacteriana HÖFLING GONÇALVES 2008 Além dos meios de cultura são necessárias alças extremidade em forma de 0 ou fios extremidade reta de platina também podem ser utilizadas alças plásticas descartáveis e estéreis os quais são utilizados para os inóculos nos meios de cultura e bico de Bunsen que serve para esterilização por calor Antes de iniciar o procedimento de semeadura é necessário realizar algumas etapas de assepsia Figura 2 para evitar a contaminação da amostra HÖFLING GONÇALVES 2008 MADIGAN et al 2016 1 flambar a alçafio de platina com a chama do bico de Bunsen essa etapa é eliminada caso sejam utilizadas alças descartáveis estéreis 2 abrir os recipientes tubos de ensaio ou placas de Petri perto da chama Se for utilizado tubo de ensaio manter a tampa ou bucha de algodão na mão durante a inoculação nunca colocar na bancada pois contamina Caso seja utilizada a placa de Petri devese deixar a parte externa da tampa encostada na bancada 17 Meios de cultura e características bacterianas 3 passar a boca do tubo de ensaio na chama para esterilizar etapa não realizada se o recipiente for placa de Petri 4 resfriar a alçafio de platina na parte interna do recipiente antes de encostar na amostra 5 fazer o inóculo no recipiente de acordo com a técnica de semeadura apropriada 6 aquecer novamente o tubo de ensaio na chama não se aplica para placa de Petri e flambar a alçafio de platina se for alça descartável flambar e colocar no lixo 7 fechar o tubo de ensaio ou a placa de Petri Figura 2 Técnica asséptica para semeadura de bactérias em meios de cultura Fonte Madigan et al 2016 p 78 Semeadura em meio líquido Nessa técnica utilizase uma alça bacteriológica para se transferir uma amostra de cultura líquida ou sólida para um meio líquido pex transferência para o BHI Em seguida agitase delicadamente a alça no meio líquido transferido para homogeneização É possível observar o crescimento de colônias por intermédio da turvação do meio da formação de película ou de depósito HÖFLING GONÇALVES 2008 Semeadura em meio sólido inclinado ou em placa Técnica de esgotamento simples feita em meio sólido inclinado pex ágar nutriente ágar citrato Simmons ágar bileesculina ou em placas É feito um movimento em estria ziguezague com a alça bacteriológica na superfície do meio Essa técnica é utilizada na estocagem das bactérias em provas bioquímicas que utilizam meio sólido inclinado e na avaliação de crescimento bacteriano exceção o meio sólido inclinado TSI deve ser semeado com fio Meios de cultura e características bacterianas 18 de platina por picagem até o fundo do tubo e depois é estriada a superfície BRASIL 2004a HÖFLING GONÇALVES 2008 Semeadura em meio semissólido em tubo picagem profunda Técnica utilizada em meio semissólido pex meios SIM MIO e MILi em tubo para verificar a motilidade da bactéria Com um fio de platina é feita uma picada no centro do meio até 23 da altura do tubo HÖFLING GON ÇALVES 2008 Semeadura em meio sólido em placa semeadura por esgotamento Também chamada de técnica Streak a técnica de semeadura por esgotamento é utilizada para a obtenção de culturas puras isolamento de colônias em placas de Petri contendo meio sólido Primeiro depositase o material em um ponto da superfície do meio com alça bacteriológica depois distendese em movimento de estrias com o auxílio da alça rotacionase e por fim repete se o processo em mais dois ou três setores da placa sem recarregar a alça com o material de maneira que o número de bactérias diminua e apareçam colônias isoladas Figura 3 HÖFLING GONÇALVES 2008 XAVIER DORA BARROS 2016 Figura 3 Semeadura por esgotamento Essa técnica é utilizada para obter colônias bacterianas puras e isoladas em placa de Petri que contenha meio sólido As setas indicam a direção do esgotamento Fonte Tortora Funke e Case 2017 p 163 19 Meios de cultura e características bacterianas Semeadura em profundidade pourplate Técnica de semeadura em placa utilizada para obter colônias isoladas ou para realizar a contagem do crescimento bacteriano em placa número de colônias É necessário preparar uma suspensão que contenha as células bacterianas e misturar com o ágar fundido após colocase nas placas de Petri e então se espera que solidifique Assim as bactérias são imobilizadas no ágar e crescem em colônias isoladas BROOKS et al 2014 HÖFLING GONÇALVES 2008 Semeadura para quantificação Técnica utilizada para fazer a quantificação do crescimento bacteriano em placa Fazse uma única estria em toda a superfície do ágar com uma alça bacteriológica calibrada é feita uma semeadura de quantidade conhecida e em seguida um estriamento lembra o osso de um peixe por isso também é conhecida como semeadura estria de peixe Figura 4 Essa técnica permite quantificar as unidades formadoras de colônia por mL UFCmL já que as colônias bacterianas ficam dispersas o que facilita a contagem XAVIER DORA BARROS 2016 Figura 4 Semeadura para quantificação Técnica utilizada para a contagem do crescimento bacteriano em placa Fonte SiriratShutterstockcom Meios de cultura e características bacterianas 20 ACUMEDIA Ágar eosina azul metileno holt eosin methylene blue agar PI7134 rev 3 2011 Disponível em httpsfoodsafetyneogencompdfacumediapi7134ptpipdf Acesso em 27 out 2019 BRASIL Agência Nacional de Vigilância Sanitária Descrição dos meios de cultura em pregados nos exames microbiológicos módulo IV Brasília DF 2004a Disponível em httpwwwanvisagovbrservicosaudemanuaismicrobiologiamod42004pdf Acesso em 27 out 2019 BRASIL Agência Nacional de Vigilância Sanitária Detecção e identificação de bactérias de importância médica módulo V Brasília DF 2004b Disponível em httpwww anvisagovbrservicosaudemicrobiologiamod52004pdf Acesso em 27 out 2019 BROOKS F et al Microbiologia médica de Jawetz Melnick e Adelberg 26 ed Porto Alegre AMGH 2014 Lange HÖFLING J F GONÇALVES R B Microscopia de luz em microbiologia morfologia bac teriana e fúngica Porto Alegre Artmed 2008 LABORCLIN LIA AGAR LB 172133 Pinhais 2019 Disponível em httpswwwlaborclin combrwpcontentuploads201906LIApdf Acesso em 27 out 2019 MADIGAN M T et al Microbiologia de Brock 14 ed Porto Alegre Artmed 2016 MBIOLOG DIAGNÓSTICOS Ágar Salmonella Shigella instruções de uso Contagem 2014 Disponível em httpwwwmbiologcombrwebsitewpcontentuploads201902 BulaAgarSalmonellaShigellavs02pdf Acesso em 27 out 2019 TORTORA G J FUNKE B R CASE C L Microbiologia 12 ed Porto Alegre Artmed 2017 TRABULSI L R ALTERTHUM F Microbiologia 5 ed São Paulo Atheneu 2008 XAVIER R M DORA J M BARROS E Laboratório na prática clínica 3 ed Porto Alegre Artmed 2016 21 Meios de cultura e características bacterianas Encerra aqui o trecho do livro disponibilizado para esta Unidade de Aprendizagem Na Biblioteca Virtual da Instituição você encontra a obra na íntegra Conteúdo SAGAH SOLUÇÕES EDUCACIONAIS INTEGRADAS Dica do professor A qualidade da água potável deve ser monitorada pelo teste de coliformes totais e fecais Esse teste é baseado na capacidade dos coliformes de fermentarem a lactose Existem vários meios de cultura seletivos e diferenciais que podem ser utilizados na análise dos coliformes totais e fecais Na Dica do Professor você verá como a análise de coliformes é realizada utilizandose meios de cultura Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar Na prática A rotina laboratorial de um setor de microbiologia envolve vários processos e análises como cultivo em meios de cultura e testes bioquímicos Um dos principais objetivos desse setor é identificar as espécies envolvidas em infecções ou intoxicações A observação dos aspectos visuais que as colônias adquirem nos meios de cultura e do perfil bioquímico da bactéria é uma etapa fundamental nesse processo pois pode guiar demais análises laboratoriais ou até mesmo definir a espécie bacteriana por meio de características microbiológicas e bioquímicas únicas Veja Na Prática dois casos clínicos de cistite cujas análises em meios de cultivo e testes bioquímicos mostraram ser causados por espécies diferentes Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar Saiba Para ampliar o seu conhecimento a respeito desse assunto veja abaixo as sugestões do professor Ágar sangue O ágar sangue é um meio de cultura utilizado para o crescimento da maioria dos microrganismos exceto alguns fastidiosos É um meio diferencial já que é usado para a identificação presuntiva de Haemophilus e para a análise diferencial de produção de hemólise pelas bactérias Streptococcus spp e Staphylococcus spp Veja neste vídeo um aprofundamento teórico sobre o ágar sangue e as características que as colônias adquirem no meio Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar Concordância dos resultados do sistema BD Phoenix com provas bioquímicas manuais na identificação de enterobactérias em amostras clínicas Provas bioquímicas em meios de cultura são rotineiramente utilizadas na bacteriologia clínica para se identificar as bactérias e podem ser realizadas manualmente ou automaticamente Veja no artigo de Allgayer e colaboradores 2015 uma comparação das provas bioquímicas manuais com o sistema automatizado BD Phoenix para a identificação de enterobactérias Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar Como fazer semeios em meio de cultura Existem diferentes técnicas de semeadura em meios de cultivo as quais devem ser escolhidas de acordo com os tipos de meios recipientes e análise desejados Veja neste vídeo demonstrações práticas de como semear adequadamente em meios de cultura além de dicas de cuidados assépticos que devem ser seguidos para se evitar a contaminação da amostra Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar