Impressao Digital do DNA e DNA Forense - Fundamentos e Aplicacoes

CAPÍTULO 16 Impressão Digital Fingerprinting do DNA e DNA Forense Michael Anthony Williams tem 41 anos de idade Ele não aprendeu a dirigir nunca teve um telefone celular nem um computador ou um iPod Williams perdeu as experiências da maioria dos adolescentes e dos jovens porque foi preso quando tinha 16 anos na penitenciária do Estado de Louisiana Angola onde permaneceu preso por 24 anos acusado por um crime que não cometeu Ele não cumpriu toda a pena não tinha sequer liberdade condicional por causa de um dos mais importantes desenvolvimentos que aflorou do nosso conhecimento sobre o DNA a genética humana e por causas das modernas técnicas da análise genômica Williams foi libertado depois que a comparação de seu DNA com um DNA isolado da cena do crime mostrou conclusivamente que ele não poderia ter praticado o crime O perfil do DNA conhecido como impressão do DNA DNA fingerprinting foi desenvolvido a partir da pesquisa básica das unidades repetitivas Capítulo 5 e transformou o processo de identificação seja em casos forenses de pessoas desaparecidas de desastres envolvendo várias pessoas ou em testes de paternidade A velocidade com que isso aconteceu é extraordinária A impressão do DNA foi utilizada pela primeira vez em 1985 e em 20 anos se tornou um teste exigido por imposição da lei e um assunto de destaque tanto nas séries televisivas como em filmes Na investigação criminal ele é usado para excluir indivíduos suspeitos de crime em julgamentos pode convencer um júri sobre a culpa de um indivíduo e em casos como o de Michael Anthony Williams pode corrigir uma grande injustiça A impressão do DNA é usada tanto para determinação de paternidade como para estabelecer relações muito distantes de parentesco traçando assim a ancestralidade Na identificação de vítimas ele pode acabar com a ansiedade daqueles que perderam parentes e amigos em grandes tragédias 432 Capítulo 16 Neste capítulo revisaremos as bases moleculares e as técnicas da impressão digital do DNA e em seguida faremos uma revisão de como essas técnicas têm sido usadas Discutiremos também alguns dos problemas potenciais que podem advir como consequência das rápidas aplicações da tecnologia do DNA recombinante na sociedade humana Loci Hipervariáveis ou Variabilidade das Repetições em Tandem Podem Ser Usados para Identificar Indivíduos Até 15 a 20 anos atrás a técnica utilizada para identificar indivíduos era baseada em polimorfismos de proteína por exemplo o ABO familiar e outros grupos sanguíneos Tais testes podem mostrar definitivamente que duas amostras são diferentes um esfregaço de um sangue tipo O não pode ser originado de um suspeito do grupo AB mas esses testes raramente estabelecem com certeza que duas amostras vieram da mesma fonte ou do mesmo indivíduo A impressão digital do DNA utiliza loci altamente polimórficos escolhidos de tal maneira que existe uma probabilidade muito pequena de que duas amostras com a mesma impressão digital possam por exemplo ser originadas de indivíduos diferentes Os polimorfismos mais usados para propósitos forenses são aqueles denominados loci hipervariáveis Os loci hipervariáveis mais informativos são aqueles constituídos de um número variável de sequências a Éxon 1 Intron Éxon 2 Intron Éxon 3 Gene da mioglobina Quatro repetições em tandem CTAAAGCTGGAGGTGGGCAGGAAGGACCGAGGT Repetições de 33 pb b Indivíduo A Indivíduo B Indivíduo C VNTR I VNTR II VNTR III FIGURA 161 Lócus de número variável de repetições em tandem VNTR Variable Number of Tandem Repeats a O lócus de VNTR no intron do gene da mioglobina é composto de quatro repetições de uma sequência de 33 pb A sequência do núcleo é mostrada em negrito b A variabilidade do número de VNTR pode gerar diversidade suficiente para identificar indivíduos Entre duas e oito repetições em tandem de três diferentes loci de VNTR I III têm sido detectadas pelo uso de uma sonda hipervariável Embora diferentes indivíduos possam ter alguns fragmentos em comum a chance de dois indivíduos terem todos os fragmentos em comum é muito baixa Os sítios para enzimas de restrição estão indicados por setas vermelhas Alelo 1 12 2 5 3 4 14 9 15 2 1 12 6 11 10 1 17 Alelo 2 16 10 16 17 7 16 14 19 3 8 15 15 13 14 4 18 FIGURA 162 Impressão digital usando sondas para número variável de repetições em tandem VNTR A sonda pYNH24 detecta 19 alelos em 16 indivíduos não relacionados Os alelos são marcados do maior 1 para o menor 18 Dois indivíduos nunca têm o mesmo padrão de fragmentos idênticas ligadas em tandem Figura 161 Quando o DNA é digerido com uma endonuclease de restrição que corta as sequências que flanqueiam o lócus da região hipervariável ou com número variável em repetições em tandem VNTR os comprimentos dos fragmentos de DNA produzidos em diferentes indivíduos dependem do número de repetições no lócus este número tipicamente varia de 15 a 70 Existe uma variedade de diferentes loci de VNTR no genoma de tal maneira que o padrão de fragmentos produzidos pelos diferentes loci de VNTR é essencialmente único para um indivíduo As primeiras sondas de regiões altamente variáveis que foram usadas para a identificação de um indivíduo foram idealizadas por Alec Jeffreys durante seus estudos do gene da mioglobina humana Essas primeiras sondas produziram padrões muito complicados pois hibridizavam com fragmentos de diferentes loci de VNTR no DNA de um mesmo indivíduo Em contraste uma sonda de um único lócus é específica para um único lócus de VNTR e detecta somente um homozigoto ou dois heterozigoto fragmentos por lócus ou marcador no DNA do indivíduo Entretanto existe uma grande variedade de tamanhos de fragmentos para cada lócus Por exemplo uma dessas sondas detecta um mínimo de 77 alelos em um lócus com repetições que podem variar de 44 a mais de 500 Os fragmentos detectados pela sonda de um VNTR e seu padrão de hereditariedade são mostrados na Figura 162 As sondas de DNA foram logo colocadas em uso em 1985 quando em um caso de imigração foi necessário determinar se um menino era filho ou sobrinho de uma mulher que alegava ser sua mãe Os testes convencionais usando polimorfismos de 17 proteínas demonstraram que o menino e a mulher eram parentes mas não foi possível determinar precisamente o grau de parentesco Para isso analisaramse amostras de DNA da mulher de duas de suas irmãs e do menino Apesar de não se ter a amostra do pai existia alguma dúvida com relação à paternidade foi possível mostrar que o menino e a mulher eram relacionados e que essa relação era de filho e mãe Tabela 161 O uso dessas sondas desse modo contribuiu para reunir muitas famílias que de outra forma poderiam estar separadas O potencial dessas sondas em estabelecer identidades em casos da ciência forense era óbvio e Jeffreys escolheu o termo DNA fingerprinting impressão digital do DNA deliberadamente para fazer uma analogia entre a identificação com a impressão digital convencional e a que utiliza o DNA O poder dessa técnica de traçar o perfil do DNA foi demonstrado já em um dos primeiros casos de homicídio em que ela foi usada o qual envolvia dois assassinatos cometidos entre 1983 e 1986 em Narborough na Inglaterra Um homem confessou ter cometido o segundo assassinato mas não o primeiro Jeffreys TABELA 161 A análise de DNA é usada para determinação de parentesco Questão Número de fragmentos compartilhados Probabilidadea O menino está relacionado com esta família 61 7 x 1022 Poderia uma mulher não relacionada ser a mãe 25 2 x 1015 Poderia a irmã da mulher ser a mãe 25 6 x 106 a As probabilidades são estimativas da chance que as relações mostradas pelo perfil de DNA teriam de ser obtidas ao acaso Por exemplo a probabilidade de o menino ter ao acaso 61 desses fragmentos em comum com a família é de 7 x 1022 foi chamado pela polícia e mostrou que assim como a polícia suspeitava um único homem estava envolvido nos dois casos Entretanto a polícia ficou surpresa ao saber que o seu suspeito não era o assassino Não acreditando no resultado o processo de impressão digital do DNA teve de ser repetido várias vezes antes da liberação do suspeito Acidentalmente o assassino verdadeiro foi encontrado graças a um cuidadoso trabalho da polícia e a impressão digital do DNA confirmou a identificação A Repetição Curta em Tandem Tornase o Padrão para as Aplicações Forenses Existem muitas outras sequências repetitivas no genoma humano e sequências repetitivas em tandem com repetições entre dois a sete pares de bases são chamadas repetições curtas em tandem STRs short tandem repeats Essas repetições são altamente variáveis e por causa de seu tamanho em cada alelo podese usar a PCR para amplificar os alelos usando iniciadores que hibridizam com sequências de cada lado dos alelos O uso da PCR tem trazido vantagens para o trabalho forense pois mesmo amostras restritivas encontradas na cena do crime freqüentemente com DNA degradado poderiam ser analisadas com sucesso Contudo nem todas as STRs são adequadas Apesar da ocorrência muito rara microvariantes alelos que diferem de tamanho em relação ao alelo verdadeiro podem complicar a análise É especialmente importante que a amplificação por PCR das STRs não tenha artefatos que possam confundir ou complicar a interpretação uma vez que a liberdade e algumas vezes a vida do acusado dependem dessa análise O Federal Bureau of Investigation FBI implantou a impressão digital do DNA em 1988 e por volta de 1997 selecionou uma série de 13 núcleos STRs para ser usada como um painel padronizado com propósitos investigativos Tabela 162 Essas STRs são distribuídas através de 12 autossomos e variam de 5 repetições até mais de 30 Um sonda adicional para o gene da amelogenina é incluída no painel Esse gene codifica para o esmalte do dente e é encontrado em uma região do cromossomo Y que tem homologia com o X mas não recombina com o cromossomo X O gene da amelogenina no cromossomo X tem uma deleção de 6 pb no intron 1 A amplificação por PCR do intron em DNA de homens produz dois fragmentos de 112 e 106 pb de comprimento provenientes respectivamente dos cromossomos Y e X O DNA da mulher produz somente o fragmento de 106 pb Outras agências oficiais em todo o mundo adotaram marcadores semelhantes Tabela 162 Amplificação com PCR Multiplex e Marcadores Fluorescentes Estão Sendo Usados para Análise de STRs Forenses As STRs amplificadas por PCR utilizam pares de iniciadores que flanqueiam as sequências de STRs em que cada par carrega uma das quatro etiquetas fluorescentes Após a PCR máquinas semelhantes às usadas para o seqüenciamento de DNA determinam o comprimento das STRs Os fragmentos são detectados quando eles passam pelo laser e um programa computacional determina o tipo de etiqueta fluorescente associada a cada STR produzindo tabelas e gráficos TABELA 162 Repetições curtas em tandem STRs short tandem repeats usadas pelo FBI Federal Bureau of Investigation pelo Serviço de Ciências Forenses FSS Forensic Science Service Reino Unido e pela Interpol Europa para definição do perfil de DNA forense Repetições Nº de alelos FBI FSS Interpol D25 1338 TGCCTTCC 20 D35 1358 TCTGTTCA 10 D55818 AGAT 10 D7S820 GATA 11 D8S1179 TCTATCTG 10 D13S317 TATC 8 D165539 GATA 8 D18S51 AGAA 15 D195433 AAGC 19 D21S11 TCTATCTG 69 CSF1PO TAGA 15 FGA CTTT 19 TH01 TCAT 7 TPOX GAAT 7 vWA TCTGTTCA 10 Amelogenina 106 bp112 bp 2 O gene da amelogenina é usado para determinação de sexo O gene está na região homóloga dos cromossomos X e Y e portanto está presente em duas cópias tanto no homem como na mulher O produto da PCR do cromossomo Y tem 112 pb e o do cromossomo X tem 106 pb A sequência entre colchetes indica STRs com um padrão complexo de repetições dos dados obtidos Com uma seleção cuidadosa dos tamanhos das regiões amplificadas as STRs múltiplas podem ser amplificadas com uma única reação utilizando kits comerciais que detectam todas as 13 STRs exigidas pelo FBI o gene da amelogenina e duas STRs adicionais usadas no Reino Unido cobrindo um total de 16 regiões Figura 163 Além disso hoje estão disponíveis os chamados allelic ladders com os alelos mais comuns do lócus Eles são usados para calibração e para o controle de qualidade Figura 164 Um allelic ladder é incluído em uma linha separada em cada corrida e pelo fato de o gel no capilar ser alterado com o tempo é recomendável injetar os allelic ladders a cada 10 a 15 corridas de amostras para recalibração A amplificação por PCR pode produzir uma série de artefatos com potencial para complicar a análise Por exemplo a DNA polimerase tende a produzir um fenômeno denominado ratear stutter quando se move ao longo da sequência repetitiva de tal maneira que pode FIGURA 163 Perfil de STR usando o painel padrão do FBI obtido no PowerPlex 16 Promega Inc As curvas são os resultados oriundos do analisador de fluorescência O painel superior a é uma sobreposição dos quatro painéis de baixo be O painel e corresponde a uma série de padrões de peso molecular PM Cada pico é um alelo do lócus Esse indivíduo é homozigoto para aqueles loci onde existe somente um pico p ex D18S51 e CSF1PO e heterozigoto para aqueles loci com dois picos p ex D21511 e FGA A amostra de DNA é originada de um homem os dois alelos com 106 e 112 pb da amelogenina estão presentes Penta E e Penta D não fazem parte do núcleo do painel de STR do FBI N de T Allelic ladders são marcados de peso molecular contendo a mesma massa molecular e a mesma sequência nucleotídica se forma repetitiva Promega adicionar ou saltar sobre uma repetição e formar um produto com uma repetição a mais ou uma repetição a menos em relação ao verdadeiro comprimento do alelo Estes aparecem como pequenos picos flanqueando os picos maiores que representam o verdadeiro produto Figura 165 Para as STRs usadas na análise forense o ratear está tipicamente presente como uma repetição menor do que o alelo verdadeiro Para a série padrão de STRs o ratear representa menos do que 2 do verdadeiro pico e não mais do que 15 dependendo da STR do comprimento do alelo e da quantidade de DNA analisado Geralmente esses picos podem ser ignorados se representarem menos do que 15 do verdadeiro pico Entretanto o ratear pode ser um problema na interpretação dos produtos da PCR em amostras mistas de DNA nas quais em algumas circunstâncias podem ser considerados picos verdadeiros fornecidos por uma das amostras da mistura Outros problemas podem ser vistos no gráfico ou traçado que sai da máquina Por exemplo se a amostra é aplicada em excesso pequenos picos podem aparecer provenientes de outros canais diferentes daquele que está sendo usado para a detecção das STRs Figura 165 Isso se deve à superposição no espectro dos corantes fluorescentes Esses picos encurtados pullup peaks são geralmente pequenos e quando maiores podem ser manualmente excluídos Qualquer edição de um gráfico deve ser sempre registrada Amostras mistas podem ser facilmente de Impressão Digital Fingerprinting do DNA e DNA Forense 437 a D3S1358 VWA FGA SP SP Amelogenina D8S1179 D21S11 D18S51 PP PP PP D5S818 D135317 D7S820 b Replicação normal 5 GATA GATA GATA GATA GATA GATA 3 3 CTAT CTAT CTAT CTAT CTAT CTAT 5 Inserção causada por deslizamento atrasado 5 GATA GATA GATA GATA GATA GATA 3 3 CTAT CTAT CTAT CTAT CTAT CTAT 5 Deleção causada por deslizamento adiantado 5 GATA GATA GATA GATA 3 3 CTAT CTAT CTAT CTAT 5 FIGURA 165 Picos de rateio stutter e picos encurtados pullup a Os três gráficos são os resultados dos canais azul verde e vermelho do analisador Applied Biosystems Os nomes dos loci estão colocados logo acima da série de picos Cada pico corresponde a um forte sinal no canal azul Os picos marcados SP são exemplos de picos de rateio stutter resultantes de um deslizamento da DNA polimerase e da síntese de um produto de PCR com uma repetição mais curta do que o alelo Os três pequenos picos marcados como PP no canal verde são picos encurtados pullup b A DNA polimerase está sintetizando a fita superior utilizando a fita inferior com repetições CTAT como fita molde Ocasionalmente a DNA polimerase desliza atrasadamente adicionando uma repetição extra 2 A polimerase pode também deslizar adiantada perdendo a repetição 4 e produzindo um produto de PCR com uma repetição a menos do que o alelo verdadeiro 438 Capítulo 16 TH01 D13S317 D3S1358 D16S539 D2S1338 FIGURA 166 Mistura de amostras podem ser detectadas durante a análise Deve existir somente um ou dois alelos por locus dependendo de o indivíduo ser homozigoto ou heterozigoto naquele lócus mas nesse caso existem alelos múltiplos em alguns lócus Por exemplo existem claramente quatro alelos no lócus D16S539 mostrando que essa é uma amostra com contribuição de dois indivíduos tectadas por análise doa gráfico Em vez de dois picos representando o lócus dos dois cromossomos podem existir três ou quatro se dois genomas estiverem presentes na amostra biológica coletada na cena do crime Figura 166 Atenção especial deve ser dada ao número baixo de cópias LCN low copy number no perfil do DNA no qual um maior número de ciclos de PCR é realizado porque a quantidade de DNA de partida é muito do menor que 100 pg o que corresponde a um extrato extraído de aproximadamente 16 células 1 pg 1012 g De onde veio essa quantidade mínima de DNA Quando tocamos uma superfície deixamos não somente a nossa impressão digital destacada pelo suor e pela oleosidade de nossa pele mas também células de nossa pele É possível obter amostras de DNA das superfícies tocadas mesmo com as impressões digitais que foram tratadas com o pó utilizado para impressão digital ou cianoacrilato substância utilizada para evidenciar a impressão digital O cianoacrilato reage com materiais biológicos da pele produzindo uma substância branca Entretanto a amplificação dessas quantidades mínimas de DNA exige a utilização de 34 ciclos de PCR seis vezes mais do que é recomendado na análise de rotina Esse procedimento pode levar a um desequilíbrio alélico em um lócus heterozigoto de tal maneira que este pode parecer homozigoto Por exemplo nos primeiros ciclos um alelo pode ser mais amplificado do que o outro e assim ter um predomínio na mistura de reação nos ciclos subseqüentes A contaminação é também outro item particular de preocupação em qualquer amplificação de PCR e em especial para a análise LCN É possível a ocorrência de uma transferência secundária isto é células da pele de um indivíduo A para B e então via B para a arma ou outro objeto A presença de DNA de A na arma poderia não estar relacionada ao crime A Individualidade do Perfil de DNA É Calculada Usando a Frequência dos Alelos STR Para determinar se um perfil particular a série de alelos STR para um indivíduo é único seria necessário determinar os perfis de todos os indivíduos do mundo Como isso é impossível os cientistas forenses precisam fazer uma estimativa estatística da probabilidade que um determinado perfil tem de ser encontrado em uma população Isso é feito de acordo com o princípio de equilíbrio de HardyWeinberg Se a frequência de dois alelos A e a de um marcador são p e q as frequências de AA Aa e aa são respectivamente p2 2pq e q2 considerando que os alelos são herdados de forma independente Por exemplo para o lócus D5S818 os comprimentos de 12 e 13 ocorrem com frequências de 03539 e 01462 de modo que a frequência combinada seria 2pq de 01035 ou 1 em 966 Se o alelo 12 fosse homozigoto então a frequência combinada seria p2 03539 x 03539 ou 01252 A frequência para o perfil completo das 13 STRs é calculada multiplicandose todas as frequências de cada STR No exemplo mostrado na Tabela 163 a probabilidade total de descobrir um perfil igual em indivíduos não relacionados seria por exemplo de 1 em 156 x 1015 uma possibilidade extremamente pequena Com uma população global em torno de 65 x 109 e considerandose que a análise foi realizada corretamente o painel do FBI das STRs fornece uma forte evidência para a identificação excluindo os gêmeos monozigóticos As frequências de alelos divergem em diferentes populações Tabela 164 A frequência do alelo 9 do lócus TH01 é semelhante entre brancos afroamericanos e hispânicos a frequência do alelo 93 é duas vezes maior em hispânicos e três vezes maior em brancos do que nos afroamericanos Essas diferenças estão sendo utilizadas para fazer predições em relação às características físicas de um indivíduo a partir da análise de DNA Tais predições são altamente controversas tanto no aspecto ético como no embasamento científico como discutiremos adiante neste capítulo Bancos de Dados Contêm Milhões de Perfis de DNAs Computadores e bancos de dados são essenciais para armazenar e recuperar dados de seqüências de DNA e isso também é verdadeiro para os perfis de DNA Da mesma maneira que um geneticista irá comparar uma seqüência desconhecida contra o GenBank um cientista forense pesquisará um dos bancos de dados forenses para encontrar uma seqüência comparável a um perfil desconhec Impressão Digital Fingerprinting do DNA e DNA Forense 439 TABELA 163 Cálculo da probabilidade de emparelhamento para os 13 perfis STR do CODIS Lócus Alelo Frequência p Alelo Frequência q Combinada 2pq Frequência acumulada Acumulada 1 in D3S1358 16 02533 17 02152 01091 1091 x 101 9 VWA 17 02815 18 02003 01127 1230 x 102 81 FGA 21 01854 22 02185 0081 9963 x 104 1005 D8S1179 12 01854 14 01656 00614 6117 x 105 16364 D21S11 28 01589 30 02782 00884 5407 x 106 184922 D18S51 14 01374 16 01391 00382 2086 x 107 4838866 D5S818 12 03841 13 01407 01081 2234 x 108 4762757 D13S317 11 03394 14 00480 00326 7282 x 1010 1373098259 D7S820 9 01772 00314 2286 x 1011 43744531933 D16S539 9 01126 11 03212 00723 1653 x 1012 605 x 1011 TH01 6 02318 00537 8876 x 1014 113 x 1013 TPOX 8 05348 02860 2537 x 1014 394 x 1013 CSF1PO 10 02169 00470 6192 x 1015 839 x 1014 Baseada nos dados de STRBase htppwwwnistgovbiotechstrbase Estão listados os alelos para um indivíduo tipados com as 13 STRs usadas pelo FBI Onde o campo do segundo alelo foi deixado em branco significa que o indivíduo foi homozigoto para o alelo testado A frequência encontrada em cada um dos alelos é mostrada A frequência combinada dos dois alelos é 2pq ou p2 para o lócus de homozigoto e a frequência cumulativa é calculada multiplicandose as sucessivas frequências combinadas A última coluna expressa a freqüência em termos de quão freqüente a série de alelos é comumente observada A série completa destes alelos poderia ser encontrada em 1 de 839 trilhões de indivíduos CODIS Combined DNA Index System Estados Unidos STR repetições curtas em tandem do O Sistema de Índice de DNA Combinado CODIS Combined DNA Index System do FBI têm 3275000 perfis e o National DNA Database NDNAD do Serviço de Ciência Forense FSS Forensic Science Service do Reino Unido tem 3500000 perfis Essa série de perfis representa aproximadamente 1 e 52 respectivamente da população dos Estados Unidos e do Reino Unido e esses bancos de dados continuam crescendo rapidamente Figura 167 O CODIS contém cinco tipos de perfis no banco de dados de infratores condenados de amostras de DNA de cenas de crime de pessoas desaparecidas e de sobreviventes de parentes de pessoas desaparecidas e banco de dados da população para avaliação da raridade de ocorrência de um perfil de DNA O CODIS é organizado de uma forma hierárquica o National DNA Index System é o de maior nível seguido por bancos de dados estaduais e locais O Armed Forces Repository of Specimen Samples for the Identification of Remains AFRSSIR não mantém os dados dos perfis mas armazena as amostras de DNA dos membros dos serviços caso uma identificação seja necessária Realmente faz sentido determinar o perfil desses indivíduos somente quando necessário visto que o AFRSSIR contém mais de 4800000 amostras 2006 mas é requisitado para analisar menos de 2500 baixas militares a cada ano Utilidade das Variantes de DNA Mitocondrial O genoma mitocondrial humano foi seqüenciado em 1981 por Fred Sanger e seus colegas em Cambridge Eles mostraram que o genoma tem 16569 nucleotídeos e essa seqüência depositada no GenBank tornouse a seqüência padrão de referência para o genoma mitocondrial Interessantemente quando o material original de 1981 placenta humana foi reseqüenciado em 1999 somente 11 diferenças foram encontradas entre as duas seqüências um testemunho da alta qualidade do seqüenciamento original que naquela época utilizou técnicas que hoje consideraríamos primitivas Esta Seqüência de Referência de Cambridge aprimorada de 1999 é agora o padrão com o qual as outras seqüências mitocondriais humanas são comparadas Sob o aspecto evolutivo muitos genes mitocondriais originais moveramse para o genoma nuclear mas a mitocôndria humana ainda mantém 37 genes fortemente TABELA 164 Frequência de alelos TH01 em grupos de brancos afroamericanos e hispânicos nos Estados Unidos Branco n 302 Afroamericano n 258 Hispânico n 140 Alelo 5 000166a 000388a 6 023179 012403 021429 7 019040 042054 027857 8 008444 019380 009643 9 011424 015116 015000 93 036755 010465 024643 10 000828 000194a 001429a 11 000166a Fonte Butler JM 2005 Forensic DNA Typing Biology Technology Genetics of STR Markers Appendix 2 Elsevier Amsterdam Nem todos os alelos são encontrados em todas as populações aAlelos cuja freqüência é considerada muito baixa para uso forense FIGURA 167 Os bancos de dados de perfis de DNA têm aumentado rapidamente de tamanho O Banco de Dados Nacional do Reino Unido aumentou de 36000 perfis em 1996 para mais de 3000000 em 2005 O aumento significativo observado a partir de 2000 deveuse à implantação do Home Office DNA Expansion Program e a uma legislação pertinente que aumentou a coleção de amostras de DNA FIGURA 168 SNPs mitocondriais são úteis para comparações usando DNA degradado Um esqueleto foi encontrado e poderia ser de Jones ou de Smith O DNA foi extraído dos ossos e o perfil de DNA foi obtido usando SNPs mitocondriais O estado degradado do DNA do osso é evidenciado pelos pequenos picos obtidos de muitos loci Amostras de tecidos sabidamente originadas dos dois homens foram obtidas o DNA foi extraído e o mesmo perfil de SNP foi determinado A marcação de cada SNP e a base presente são mostradas A amostra de Jones difere da amostra do osso em dois loci 477 e 3010 asterisco Nesses dois loci o esqueleto e a amostra de Smith são idênticos tendo as mesmas mutações da Sequência de Referência de Cambridge T e C em 477 e A e G em 3010 Pela análise de SNP mitocondrial amostras que diferem em dois loci são consideradas diferentes de tal forma que os restos mortais são de Smith primento A primeira ocorre quando os genomas de duas populações de mitocôndrias diferem em uma única posição na seqüência de DNA A mutação no comprimento da heteroplasmia aparece como uma variação no comprimento da região de policitosinas encontradas na região de controle de HV1 e HV2 Acreditase que a heteroplasmia aparece devido à grande taxa de mutação do DNA mitocondrial Mitocôndrias com diferentes mutações são submetidas a uma força seletiva dentro das células de tal maneira que algumas são mantidas e outras são eliminadas Diferentes tecidos diferem quanto ao grau de heteroplasmia Por exemplo em um estudo a heteroplasmia foi detectada com uma frequência de 17 no sangue 86 nos ossos e 97 nos cabelos A heteroplasmia pode ser confundida com mistura de amostras mas quando se tem uma mistura de amostras freqüentemente há diferenças em diversas posições Realmente em vez de causar confusão a heteroplasmia pode ser de grande valor forense O caso mais famoso envolvendo heteroplasmia de DNA mitocondrial ocorreu durante a identificação de restos mortais provenientes de uma escavação em 1991 em uma floresta da Sibéria Suspeitouse que os restos mortais pertencem ao Czar Nicholas II e sua família que foram assassinados na revolução Bolchevista de 1918 Peter Gill obteve os perfis do DNA mitocondrial dos restos mortais e mostrou que três deles estavam relacionados e que três deles eram do sexo feminino Um foi identificado como a Czarina Imperatriz Alexandra como mostrado pela comparação do seu perfil do DNA mitocondrial com uma parente viva O Príncipe Philip Duque de Edinburgh marido de Elizabeth II é sobrinhoneto de Alexandra e seu perfil coincidiu com o dela A melhor fonte de referência de DNA para comparação com o pressuposto corpo do Czar seriam os restos mortais de seu irmão mais novo o grãoduque Georgij Romanov mas as autoridades russas mostraramse avessas a abrir a tumba alegando que se correria um risco de danificar o sarcófago de mármore que contém o seu corpo Assim parentes mais distantes foram descobertos e os perfis mitocondriais obtidos coincidiram com os corpos do sexo masculino encontrados na floresta Entretanto os perfis não foram exatamente os mesmos O perfil do Czar mostra uma variação de seqüência um C na posição 16169 no lugar do T observado na análise de seus parentes vivos Além disso análises posteriores mostraram evidências de heteroplasmia a amostra do Czar tem DNA mitocondrial tanto com C como com T Isso poderia deverse a uma contaminação mas quando o sarcófago de mármore foi finalmente aberto e a amostra dos restos mortais de Georgij Romanov foi obtida observouse que ele também portava a mesma heteroplasmia para essa seqüência mostrando uma forte evidência de que os restos mortais encontrados eram realmente do Czar Nicholas Figura 169 O Perfil de DNA Mitocondrial Reabre o Caso do Estrangulador de Boston No início de 1960 os cidadãos de Boston ficaram aterrorizados com um assassino que abusava sexualmente de suas vítimas e então as assassinava por estrangulamento O primeiro assassinato ocorreu em junho de 1962 e o corpo da 13ª e última vítima Mary Sullivan foi encontrado em janeiro de 1964 A polícia não encontrou o assassino mas em 1965 Alberto DeSalvo detido na prisão estadual de Walpole por roubos e múltiplos estupros confessou o assassinato de Sullivan e por associação os outros assassinatos atribuídos ao Estrangulador de Boston Entretanto ele nunca foi submetido às provas para confirmar esses assassinatos e ele próprio foi assassinado em 1973 A irmã de Sullivan e o filho dela não acreditaram que DeSalvo havia matado Sullivan e persuadiram James Starrs a reinvestigar o caso Starrs comparou a confissão de DeSalvo com depoimentos posteriores e descobriu várias discrepâncias Com a cooperação da irmã de Sullivan do sobrinho e do irmão de DeSalvo Starrs e David Foran um cientista forense exumaram o corpo de Mary Sullivan O exame do corpo revelou traços de material biológico nos cabelos nos pêlos púbicos e nas peças íntimas obtidos da autópsia original Os pesquisadores foram unânimes em afirmar que somente o DNA mitocondrial era capaz de sobreviver 36 anos sem modificação e que a amplificação por PCR aninhado nested PCR tinha de ser usada para obter o perfil de DNA de Sullivan Nesse caso a amplificação foi inicialmente realizada com 20 a 30 ciclos e posteriormente a amostra dessa reação foi submetida novamente a 20 ciclos usando nessa etapa iniciadores internos da primeira série de reações A contaminação por fontes externas sempre foi um sério problema quando se utilizam muitos ciclos de amplificações de modo que se teve cuidado extremo para evitar neste caso uma contaminação dos tecidos de Sullivan Todos os membros envolvidos na exumação na autópsia e toda a equipe do laboratório trabalharam protegidos com avental luvas e máscara No laboratório todas as superfícies e soluções foram tratadas com luz ultravioleta de baixo comprimento de onda para destruir DNA O isolamento do DNA e a amplificação por PCR foram realizados em salas diferentes para evitar qualquer possibilidade de contaminação O DNA foi amplificado com sucesso utilizando as roupas íntimas e os pêlos púbicos As seqüências do DNA Impressão Digital Fingerprinting do DNA e DNA Forense 443 a Duke de Fife T Georgij Romanov CT Czar Nicholas II CT Xenia CheremeteffSfiri T b Czar Nicholas II c Georgij Romanov d Xenia CheremeteffSfiri Figura 169 Heteroplasmia na família do Czar Nicholas II a A árvore da família do Czar Nicholas II Símbolos laranja indicam a linha maternal b A sequência revela que o Czar foi heteroplásmico no nucleotídeo 16169 tendo o T e o C mostrando que ele tinha duas populações de mitocôndrias Isso não se observou nos parentes distantes do Czar que foram testados Alguns usaram essas observações para argumentar que a análise devia ser desconsiderada c A amostra do DNA mitocondrial foi posteriormente analisada com a amostra de Georgij Romanov irmão do Czar Ele também apresentava a mesma heteroplasmia confirmando assim a identidade do Czar d Xenia CheremeteffSfiri é a tataraneta da mãe do Czar e como ela está na linha maternal direta ela também teria heteroplasmia Similarmente o Duque de Fife também na linha maternal apresentaria heteroplasmia Considerado no curso de quatro gerações em nenhuma delas as populações de mitocôndrias segregaram para a homoplasmia mitocondrial foram diferentes a proveniente das roupas íntimas diferiu da Sequência de Referência de Cambridge em quatro bases enquanto a proveniente dos pêlos púbicos diferiu somente em uma única posição Além disso esses DNAs não vieram de Mary Sullivan e não eram contaminantes provenientes de qualquer um dos membros da equipe de investigação A comparação com sequências oriundas do irmão de DeSalvo o irmão de DeSalvo foi mantido em um prédio separado até a finalização de todos os testes nas amostras comprobatórias excluiu DeSalvo como a fonte de DNA O corpo de Albert DeSalvo foi exumado e a exclusão foi confirmada depois de uma comparação direta do DNA mitocondrial isolado de uma amostra retirada do osso de DeSalvo Que conclusões podem ser tiradas dessa informação Tudo o que pode ser dito é que nenhum perfil de DNA das provas pode associar Albert DeSalvo com o corpo de Mary Sullivan tornando extremamente improvável que ele seja o assassino Entretanto nada pode ser dito sobre a origem dos dois DNAs mitocondriais A fonte poderia advir de muitas pessoas os detetives que investigaram a cena do crime os patologistas que fizeram a autópsia ou os agentes funerários que prepararam o corpo para o sepultamento A questão ainda permanece quem foi o Estrangulador de Boston 444 Capítulo 16 STRs do Cromossomo Y Têm a Vantagem de Ser Específicas para o Homem Como muitos crimes são cometidos por pessoas do sexo masculino as interpretações dos perfis de DNA em casos de estupros e assassinatos seriam simplificadas se marcadores específicos para os homens pudessem ser usados Por exemplo no caso de estupro em que o criminoso tem uma contagem baixa de espermatozóides uma quantidade mínima de amostra poderia ser misturada com uma grande quantidade de amostra feminina possivelmente fazendo uma análise de exclusão usando loci padronizados Nesse caso os marcadores do cromossomo Y podem ser analisados independentemente das contribuições do DNA feminino Infelizmente os loci do cromossomo Y têm algumas limitações para a obtenção de perfil Primeiro os loci do cromossomo Y não são independentes porque não são submetidos à recombinação de modo que a probabilidade para os marcadores do cromossomo Y não pode ser calculada multiplicandose as frequências dos loci Segundo assim como o genoma mitocondrial é herdado pela linhagem maternal o cromossomo Y é patrilineal todos os homens da mesma linhagem terão os mesmos cromossomos Y Assim os fatores que fazem o cromossomo Y ser tão popular para traçar a ancestralidade masculina nos estudos de genealogia também tornam impossível a distinção entre irmãos e entre pais e filhos Todavia as vantagens dos loci específicos no cromossomo Y se sobrepõem às desvantagens e os marcadores do cromossomo Y são utilizados rotineiramente nas análises forenses em combinação com outras análises Se as probabilidades não podem ser calculadas multiplicandose as frequências das diferentes STRs do cromossomo Y como elas seriam então calculadas O procedimento é semelhante àquele usado para os marcadores mitocondriais Isto é a comparação entre o perfil de uma prova comprobatória com o perfil obtido do suspeito utilizando os mesmos loci resultará em exclusão inclusão ou em um resultado inconclusivo Entretanto a inclusão de que duas amostras são suficientemente similares de modo que devem vir de um mesmo indivíduo precisa ser condicionada a um relatório de que o resultado encontrado se aplica também a todos os parentes homens que pertencem à mesma linha familiar patrilinear O DNA Degradado É Analisado Usando MiniSTRs Uma mancha de sangue de um arranhão em uma cerca sêmen em uma roupa de estupro guardada por 10 anos ou partes de tecidos provenientes de um desastre aéreo não são fontes ideais para o isolamento de DNA Tipicamente tais DNAs apresentam um maior ou menor grau de degradação de modo que somente uma pequena quantidade de DNA pode ser isolada e o DNA resuperado normalmente se apresenta em forma de segmentos muito curtos Realizar ciclos extras de PCR para amplificação aumenta a proporção de moléculas de DNA com erros além de aumentar também a probabilidade de amplificar DNA contaminante Analisar DNA mitocondrial pode ser de grande utilidade pois a célula humana tem centenas a milhares de mitocôndrias cada uma com várias cópias do genoma Assim seriam disponibilizadas por célula milhares de cópias do genoma mitocondrial em vez de somente duas cópias do genoma nuclear Os comprimentos dos alelos amplificados para as 13 STRs padrão do FBI variam de 106 a 360 pb e alguns dos alelos mais longos não se amplificam quando o DNA está muito danificado Figura 1610 No entanto para alguns loci os iniciadorespadrão se posicionam um pouco distante das unidades repetitivas sendo possível desenhar iniciadores que se ligam mais próximo do segmento repetitivo Essas miniSTRs podem amplificar fragmentos menores e perfis podem ser obtidos de DNAs degradados os quais seriam impossíveis de ser obtidos se fosse considerada a sequência completa das STRs Figura 1610 Fazer os fragmentos de DNA tão curtos quando possível levaos a se aglomerarem em uma faixa de tamanhos similares Para assegurar que os pequenos produtos possam ser distinguidos uns dos outros poucas STRs são analisadas em uma única reação MiniSTRs têm sido testadas em amostras reais em vez de DNAs degradados artificialmente O Centro de Antropologia Forense FAC Forensic Anthropology Center na Universidade de Tennessee em Knoxville mantém o Williams M Bass Donated Skeletal Collection mais popularmente conhecido como Body Farm Fazenda de Corpos Nessa fazenda os cadáveres humanos são expostos ao ambiente natural onde sofrem decomposição sob uma variedade de condições ambientais incluindo o de servirem de alimentos para insetos pássaros e outros animais O Body Farm fornece dados acerca da velocidade e da natureza de decomposição dos corpos humanos dados que são utilizados para a interpretação de casos reais Os cientistas forenses usaram amostras do Body Farm para determinar se os iniciadores das miniSTRs amplificariam alelos que não são normalmente amplificados com os iniciadores convencionais Eles extraíram DNA do fêmur humano que ficou enterrado por 36 meses e guardado por mais um mês antes de ser processado Os iniciadores convencionais não foram capazes de detectar alelos em que o produto da PCR era maior do que 275 pb Esses mesmos alelos foram detectados com iniciadores desenhados para amplificar produtos de PCR bem mais curtos 100 pb Figura 1611 13 Impressão Digital Fingerprinting do DNA e DNA Forense 445 a Padrão de peso molecular PM DNA controle Tratamento com DNAse 2 min 5 min 10 min 15 min 20 min 30 min 2645 pb 1605 pb 1198 pb 1198 pb 676 pb 517 pb 460 pb 396 pb 350 pb 6761198 pb 460517 pb 350460 pb 222350 pb 222 pb 179222 pb 179 pb 126 pb 126 pb b PowerPlex 16 locus FGA 4000 Unidade de fluorescência relativa 3000 2000 1000 0 1198 676460 350 222 179 1198 517 460 350 222 222 126 Tamanho dos moldes pb c Big Miniplex locus FGA 4000 Unidade de fluorescência relativa 3000 2000 1000 0 1198 676 460 350 222 179 126 1198 517 460 350 222 222 Tamanho dos moldes pb Figura 1610 MiniSTRs são desenvolvidas para amplificar loci de DNA degradados a Amostras de DNA foram incubadas em diferentes tempos com DNAse I para estimular a degradação que ocorre com a degeneração do tecido O controle contém uma amostra de DNA não tratado de alto peso molecular que quase não migra no gel Amostras tratadas com DNAse I são gradativamente cortadas em pequenos fragmentos como mostrado pelo aumento de migração Seções do gel contendo fragmentos de DNA de diferentes tamanhos foram cortadas do gel e o DNA extraído b Os DNAs retirados do gel foram testados com duas séries de iniciadores para observar a amplificação do locus FGA A primeira série de colunas do PowerPlex 16 Promega Inc é o padrão usado para os perfis forenses enquanto a segunda série foi para as miniSTRs Os iniciadores convencionais produzem fragmentos entre 308 a 464 dependendo do comprimento do alelo Esses iniciadores não amplificam o locus com DNA de tamanho médio entre 350 e 460 pb c As miniSTRs que amplificam fragmentos na faixa de 125 a 281 pb são eficientemente produzidas exceto com um DNA muito degradado As duas barras em e c são dois alelos do locus FGA nessa amostra a PowerPlex 16 D3 D5 D8 D7 D21 TPOX Amel VWA TH01 D13 Alelos muito grandes não são amplificados 200 100 Unidades de fluorescência relativa 0 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 Tamanho do produto da PCR b Miniplex 01 Unidades de fluorescência relativa 800 600 400 200 D14S1434 D22S1045 D10S1248 0 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 Tamanho do produto da PCR c Miniplex 02 Unidades de fluorescência relativa 600 400 200 D4S2364 D25441 Stutter D1S1677 0 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 Tamanho do produto da PCR FIGURA 1611 Teste de miniSTRs em DNAs isolados de corpos deixados por 36 meses na Universidade Forense de Tennessee Body Farm a A amostra de DNA preparada de uma amostra de osso degradado foi amplificada utilizando o kit padrão de perfis PowerPlex 16 Promega Inc Alelos de até 260 pb são amplificados mas todos os outros maiores são perdidos Os nomes dos alelos foram abreviados b c Amplificações usando os iniciadores Miniplex 01 e Miniplex 02 que geram produtos de PCR muito mais curtos amplificam os alelos perdidos de forma bastante eficiente Polimorfismos de um Único Nucleotídeo São uma Promessa para Aplicações Forenses Os SNPs são as variantes genéticas mais comuns no genoma humano e fornecem um inesgotável suprimento de marcadores Assim como os outros tipos de variabilidade genética os SNPs podem ser usados para distinguir indivíduos mas têm algumas desvantagens para aplicações forenses Em primeiro lugar os SNPs têm somente dois alelos em contraste com os vários alelos das STRs sendo necessários pelo menos 50 SNPs para encontrar o mesmo poder estatístico que a série de 13 STRs do painel do FBI Em segundo lugar a presença de somente dois alelos torna mais difícil a detecção de misturas de amostra Suponhamos que dois alelos para um dado SNP são 1 e 2 Se um indivíduo A é 1 e 2 mas a amostra foi misturada com um DNA de um indivíduo B que é 1 e 1 a presença do DNA do indivíduo B não pode ser detectada exceto através de uma análise quantitativa isto é pela determinação de que existem três cópias de 1 e somente uma cópia de 2 Em terceiro lugar quatro vezes mais ampliações por PCR são necessárias para analisar 50 SNPs do que o necessário para amplificar 13 STRs levando a um aumento do custo Tal análise também requer o desenho de iniciadores para amplificar os 50 SNPs para uma PCR multiplex em que todos os 50 produtos podem ser distintos Isso ainda não foi completamente acertado mas sistemas multiplex têm sido projetados para realizar reações de extensão de uma única base para os 52 SNPs em dois grupos respectivamente com 23 e 29 pares de iniciadores Por que com todas essas desvantagens os SNPs ainda são atrativos para uma análise forense A maior vantagem é que a análise de SNPs pode ser realizada usando DNAs degradados nos quais a análise de STRs falha completamente O DNA a ser amplificado precisa conter somente o SNP e uma pequena sequência que o flanqueia para que o iniciador possa se anelar Definir Características Físicas a Partir dos Perfis de DNA É Controverso A análise de DNA tornouse popular no mundo da genealogia por sugerir a origem ancestral Existem várias empresas oferecendo a análise do cromossomo Y e do DNA mitocondrial para determinar por exemplo à qual das antigas tribos da GrãBretanha um homem pertence ou se um homem ou uma mulher têm haplótipos africanos nativoamericanos ou célticos Seria possível usar também o perfil do DNA forense para determinar a origem étnica ou geográfica de um indivíduo de acordo com o seu DNA Isso poderia fornecer uma informação adicional e ser usada para restringir o número de potenciais suspeitos Contudo existem controvérsias científicas sobre até que ponto essas análises genéticas usando marcadores como SNPs sequências Alu e microssatélites podem distinguir grupos de seres humanos Um estudo analisando 100 inserções Alu em centenas de indivíduos mostrou que quando todos os 100 polimorfismos Alu foram usados o continente de origem pode ser determinado com uma precisão de 99 a 100 Entretanto em um outro estudo com 1330 indivíduos que combinou dados de 21 polimorfismos de Alu com dados de polimorfismos de cromossomo Y e βglobina a definição da origem não pode ser feita com mais do que 70 de precisão Esses resultados conflitantes podem ser devidos em parte à maneira como as amostras foram coletadas Um estudo por exemplo constatou que amostragens do mundo inteiro baseadas na localização geográfica sem considerar a raça demonstraram uma mudança gradual na frequência dos alelos nos continentes isto é não existe um agrupamento significativo de alelos baseado na localização Existe uma considerável controvérsia sobre como decidir o que constitui uma população Em muitos casos a identidade racial ou étnica é autorelatada e essas populações contêm indivíduos de diversas formações genéticas Na verdade as análises mostram que o grau de miscigenação o grau em que a formação genética de um indivíduo é originada de diferentes grupos é considerável em muitas populações E muitos indivíduos ficam surpresos quando a análise revela que eles têm uma diversidade de ancestralidade muito maior do que suspeitavam O conceito de que a origem étnica pode ser usada como uma alternativa do estudo baseado nas variações genéticas é objeto de caloroso debate Por exemplo a droga BiDil é especialmente eficiente para o tratamento de insuficiência cardíaca em afroamericanos e existe presumivelmente uma base genética para isso Várias críticas censuraram a aprovação pelo FDA do BiDil sobretudo para o tratamento de afroamericanos eles disseram que isso sugere uma aprovação governamental levandose em conta o conceito biológico de raça A análise de SNPs dentro de genes que codificam características físicas pode permitir que se façam correlações entre SNPs e a aparência do indivíduo Um estudo examinou a associação de 754 SNPs com a pigmentação da íris em 851 indivíduos de descendência européia Aqui 335 dos SNPs foram encontrados em genes que estão associados com pigmentação como o gene Tyr Este gene codifica para tirosinase uma enzima que catalisa a conversão de tirosina em dopaquinona a primeira etapa da síntese de melanina Vinte desses SNPs estavam associados com a cor da íris mas a conclusão geral do estudo foi de que a cor da íris não pode ser prevista com base na sequência de um simples gene qualquer A herança da cor vermelha dos cabelos está associada com variantes no gene receptor da melanocortina 1 MCR1 melanocortin 1 receptor gene e parece ser uma característica autossômica recessiva Entretanto existem múltiplos alelos do MCR1 e diferentes combinações conduzem a diferentes tonalidades Por exemplo um estudo mostrou seis variantes de MCR1 associadas com o cabelo vermelho e constatou que indivíduos heterozigotos para dois deles R151C e 537InsC tinham significativamente maior tendência a ter cabelos vermelhos Outro estudo examinou 12 variantes e mostrou que indivíduos heterozigotos para qualquer um dos dois tinham uma tendência a ter cabelos vermelhos e contrariamente a ausência de qualquer variante indicaria que o indivíduo não teria cabelo vermelho Atualmente definir características físicas por meio da análise de amostras de DNA não é uma práticapadrão e tem sido usada somente sob condições cuidadosamente supervisionadas pelo Serviço de Ciência Forense FSS Forense Science Service no Reino Unido Evidências de DNA Precisam Ser Coletadas Cuidadosamente no Local do Crime A importância do procedimento adequado na coleta de amostras da cena do crime foi dramaticamente demonstrada pelo julgamento de OJ Simpson A equipe de defesa desviou a atenção de como a polícia e outros agentes da execução das leis coletaram manusearam e guardaram a prova que forneceu a amostra de DNA usada para incriminar Simpson A defesa teve a habilidade de levantar dúvidas em relação à validade das amostras e portan to impediu o julgamento do caso persuadindo o júri de que existia uma dúvida razoável de que Simpson cometeria os crimes apesar do seu perfil de DNA ter coincidido com a prova obtida no local do crime Precauções especiais devem ser tomadas na hora de coletar a evidência biológica no local do crime Amostras contendo o DNA podem estar espalhadas na cena do crime pois o DNA pode ser encontrado no sangue na saliva em células da pele no cabelo na caspa no sêmen e no suor O DNA pode ser encontrado também em objetos como empunhadura da arma roupa suja cigarro usado ou a aba lambida de um envelope Pequenas manchas de sangue mesmo em áreas limpas podem ser visualizadas aplicandose um composto luminescente como o luminol dissolvido em soluções contendo peróxido de hidrogênio O átomo de ferro da hemoglobina atua como um catalisador para a reação na qual o luminol é oxidado e quando isso acontece ele luminesce tornando visíveis as manchas de sangue Apesar de o luminol revelar a presença de sangue pode detectar quantidades tão pequenas como 1 parte em 1 milhão a quantidade pode não ser suficiente para a extração do DNA O DNA é suscetível à degradação por bactéria e fungos e portanto todas as amostras devem ser secadas ao ar para minimizar o crescimento microbiano Por essa mesma razão provas amostrais devem ser guardadas em sacos de papel em vez de sacos plásticos pois estes retêm umidade Amostras adicionais àquelas provenientes do infrator e da vítima estarão presentes na cena do crime Assim como a impressão digital os oficiais devem coletar amostras de tal forma a eliminar DNAs de indivíduos não associados com o crime e que possam ser distinguidos do DNA do possível suspeito Os oficiais de investigação devem tomar cuidado para não contaminar a cena do crime com seu próprio DNA por meio de espirro manipulação das amostras sem luvas ou mesmo conversa Tais contaminações podem ser detectadas na investigação laboratorial mas tornam a análise desnecessariamente mais complexa Um componente essencial a todo o trabalho forense é a cadeia de custódia A integridade das provas de qualquer tipo coletadas no local do crime será um dos principais fatores se a investigação for a julgamento Tanto acusação quanto a defesa utilizarão as provas para sustentar seu caso e o júri atribui um grande peso às evidências físicas Dada as consequências de veredito de culpado e não culpado as provas precisam ser salvaguardadas em todas as etapas para assegurar que elas não sejam perdidas ou alteradas A cadeia de custódia é o processo pelo qual as provas estão sempre sob o cuidado de um indivíduo conhecido Um documento acompanha a amostra e quando ela é transferida de um indivíduo para o próximo o último assina o documento anotando a data e a hora da transferência A prova é mantida selada e quando não está sendo examinada fica trancada a chave O Perfil de DNA Permite uma Identificação Cold Hit do Infrator Os bancos de dados dos perfis de DNA têm crescido de forma a incluir milhões de perfis possibilitando o aumento do número de cold hits quando o perfil de DNA obtido no local do crime coincide com um perfil do banco de dados não havendo nenhuma outra evidência que correlacione os dois Nesses casos uma amostra que serve como evidência não é comparada com o perfil de um determinado suspeito que foi identificado por meio de outras investigações como por exemplo uma testemunha ocular que tenha visto o infrator vendendo objetos roubados Em vez disso o perfil da prova de evidência é comparado com todos os perfis do banco de dados como o US National DNA Index System ou o UK National DNA Database A taxa de sucesso alcançada na identificação tem aumentado porque os bancos de dados possuem um grande número de perfis de criminosos condenados muitos deles em situações de novamente cometer um crime Por exemplo a pesquisa mais recente de reincidentes nos Estados Unidos mostrou que de todos os criminosos libertados em 1994 272111 675 foram presos novamente no espaço de três anos Devido a essa lamentável conclusão muitos estados têm sancionado leis que obrigam todos os criminosos condenados a doarem uma amostra de sangue ou uma amostra das células bucais removida por raspagem da parte interna da bochecha para obtenção de perfil do DNA No Estado de Nova York amostras são coletadas de todos os indivíduos que cometeram qualquer um de uma lista de 100 diferentes delitos O Reino Unido adotou uma legislação mais radical amostras de sangue são coletadas de todos os indivíduos presos por um delito registrado mesmo antes de serem condenados pela justiça Indivíduos que não foram condenados podem solicitar que sua amostra de DNA seja destruída mas na falta do requerimento a amostra é retida indefinidamente Essas medidas têm gerado debates sobre a liberdade civil mas o número de casos solucionados por meio de cold hits demonstra a importância desses bancos de dados Como as amostras são coletadas de indivíduos envolvidos nas mais diferentes atividades criminosas os perfis de DNA estão se mostrando muito úteis para a solução de uma grande variedade de crimes Uma evidência biológica capaz de fornecer DNA para obtenção do perfil pode ser deixada por exemplo em uma janela quebrada quando o arrombador força a entrada na casa Na verdade a principal utilidade dos perfis de DNA no Reino Unido é para a solução de arrombamentos e furto de veículos As Pesquisas da Origem Familiar Podem Identificar Suspeitos O que pode ser feito se um perfil de uma prova é incompleto e não pode ser confrontado com um perfil do banco de dados Ou se existe um perfil completo mas não existe um perfil semelhante no banco de dados O FSS no Reino Unido tem explorado o fato de que um indivíduo que deixa para trás alguma amostra biológica compartilhará mais alelos com um parente do que alguém tirado aleatoriamente de uma população Portanto em vez de buscar um perfil igual entre uma amostra de uma prova com o perfil do NDNAD a estirigência do pareamento é diminuída um alelo por vez Perfis podem ser identificados por meio de comparação com o de parente aparentado ou filho do indivíduo que deixou a prova biológica no local do crime Desde 2005 o FSS usou essa estratégia para investigar cerca de 20 casos e descobriu informações úteis em aproximadamente um quarto delas Tomemos por exemplo os casos de Pauline Floyd Geraldine Hughes e Sandra Newton Essas três jovens foram violentadas e assassinadas em 1973 Naquela época aparentemente não existia conexão entre os casos e apesar do grande esforço da polícia ninguém foi preso Vinte e sete anos mais tarde o FSS obteve o perfil de DNA de uma mancha nas roupas de Floyd e Hughes Entretanto não existia nenhum perfil coincidente no banco de dados em agosto de 2000 e a polícia começou a coletar amostras de DNA de centenas de homens Nenhum dos perfis coincidiam com o perfil da prova obtida Em outubro de 2001 um perfil de uma amostra biológica de Newton mostrou que ela havia sido assassinada pelo mesmo homem que matara Floyd e Hughes Os cientistas forenses redobraram seus esforços e decidiram usar o perfil da amostra que serviu como prova para ver se eles poderiam identificar indivíduos que poderiam ter algum grau de parentesco com o assassino Eles compararam o perfil da prova com perfis já existentes no NDNAD usando uma menor estirigência para o emparelhamento e descobriram 100 indivíduos que poderiam estar relacionados com o assassino Um deles Paul Kappen chamou a atenção dos detetives Seu pai Joseph Kappen estava na lista dos suspeitos investigados no ano anterior mas veio a falecer em 1989 e portanto nenhuma amostra de seu DNA foi testada Usando perfis da esposa de Joseph Kappen e de sua filha os cientistas forenses puderam derivar possíveis perfis para Kappen Os alelos presentes na filha e ausentes na mãe naturalmente vieram do pai Joseph Os investigadores mostraram que um dos perfis derivados emparelhava com o perfil gerado do DNA recuperado dos corpos dos jovens assassinadas Em 15 de maio de 2002 os coveiros começaram a exumar o corpo de Joseph Kappen cujos dentes e fêmur foram removidos Os perfis obtidos a partir desses tecidos mostraram conclusivamente que Joseph Kappen era o assassino Mandado de Prisão É Emitido com Base Somente no Perfil de DNA A detetive Lori Gaglione e o Procurador Assistente Distrital Norman Gahn do Condado de Milwaukee Wisconsin enfrentaram esse problema Os detetives foram convencidos de que três estupros brutais ocorridos em 1993 haviam sido cometidos pelo mesmo homem pois o perfil de DNA confirmou as suspeitas Entretanto pelo estatuto de prescrição que rege as leis de Wisconsin o crime por estupro prescreve em seis anos e nesse caso a data de prescrição estava se aproximando rapidamente O estatuto de prescrição tem como objetivo proteger os indivíduos contra casos que são resgatados muitos anos após o crime ter sido cometido quando a memória das testemunhas oculares enfraqueceu ou se modificou por experiências subsequentes Gaglione e Gahn reconheceram que em Wisconsin o mandato tinha de ter ou o nome do suspeito ou designar a pessoa a ser presa com uma descrição pela qual a pessoa possa ser identificada com razoável certeza Qual era a garantia de que um perfil de DNA seria uma prova suficiente se fosse emitido antes do estatuto de prescrição expirar Eles argumentaram o que poderia identificar uma pessoa com razoável certeza se não o perfil de DNA Dessa forma o mandado de prisão foi decretado em nome de Fulano de Tal homem desconhecido devido à coincidência do perfil de DNA nas seguintes localizações genéticas D1S7 D2S44 D5S110 D1OS28 e D17S79 Figura 1612 Essa estratégia foi imediatamente contestada no caso da Califórnia no qual mais tarde Fulano de Tal foi identificado seu nome foi colocado no mandado julgado e condenado O júri da Corte Superior do Estado da Califórnia sustentou o mandado escrevendo que o DNA parece ser o que temos de melhor como identificador de uma pessoa Os estatutos de prescrição têm sido submetidos a mudanças em resposta a tais casos Alguns Estados também decidiram eliminar o estatuto de prescrição nos casos em que a prova biológica está disponível Em 2004 o Congresso dos Estados Unidos aprovou a Justiça para Todos os Atos que atualizou a legislação em relação às consequências dos perfis de DNA O ato declara que o estatuto de prescrição começa a contar assim que alguém é identificado pelo perfil de DNA e não a partir da data em que o crime foi cometido Então a Justiça para Todos os Atos reconhece que a prova fornecida pelo perfil do DNA é muito diferente em relação às outras formas de testemunho Entretanto críticos do ato alegam que outras fontes de prova incluindo a narrativa da testemunha ocular deverão ser usadas na corte e que essas ainda estarão sujeitas aos assuntos levantados pela legislação do estatuto de prescrição Liberação dos Perfis de DNA de Pessoas Condenadas Erradamente Pensamos no perfil de DNA como um meio para capturar criminosos mas na realidade a análise de DNA é também utilizada para excluir indivíduos de investigação e libertar aqueles que foram condenados injustamente Na verdade foi estimado que aproximadamente 30 dos suspeitos de um crime são descartados depois da investigação baseada no DNA evitando assim muitas horas de investigação Barry Scheck e Peter Neufeld são advogados na cidade de Nova Iorque que têm defendido os réus indigentes No final de 1980 quando a impressão digital do DNA foi usada pela primeira vez nos Estados Unidos a determinação de perfil foi realizada em laboratórios forenses associados a agências oficiais Scheck e Neufeld estavam preocupados com o fato de que não haveria análise de DNA pois muitos dos acusados não teriam como pagar por ela Além disso nessa época existia uma séria preocupação quanto à qualidade da análise executada por laboratórios que ainda não estavam familiarizados com as técnicas de genética molecular Em 1992 como consequência de suas experiências anteriores Scheck e Neufeld estabeleceram o Projeto Inocente o qual investigava condenações em que a determinação do perfil de DNA poderia inocentar os condenados injustamente O exemplo típico foi o de Michael Anthony Williams que abriu este capítulo Em mais da metade dos casos em que a condenação foi revertida a condenação havia sido baseada em testemunhas oculares normalmente de um único indivíduo sem nenhuma prova contundente E um terço de condenações foi baseado em confissões falsas dadas quando o discernimento do suspeito está prejudicado pelo uso de drogas ou álcool ou sob coação ou porque o suspeito tem uma doença mental O Projeto Inocente ou organizações semelhantes agora existem em muitos Estados e desde setembro de 2006 184 indivíduos alguns após 27 anos de prisão já foram libertados pela ação dessas organizações O perfil de DNA tem sido usado para resolver casos em que ainda permanece dúvida sobre a culpa do assassino que foi condenado Na Inglaterra James Hanratty foi considerado culpado por dois homicídios e enforcado sendo esta a última execução do Reino Unido Ele morreu afirmando sua inocência e sua família fez uma campaha para obter seu perdão Celebridades foram atra ídas pela causa e finalmente o perfil de DNA foi realizado no DNA extraído do sêmen das roupas íntimas da vítima e das células do lenço que o atacante usou para encobrir o rosto Esses resultados foram comparados com os perfis de DNA do irmão e da mãe de Hanratty e mostraram que Hanratty havia sido o agressor A família insistiu no fato de que o perfil estava errado e assim o corpo de Hanratty foi exumado para que uma comparação direta pudesse ser feita Mas o perfil de DNA de tecidos de Hanratty confirmou o achado anterior O Lorde Chefe da Justiça Woolf declarou a prova de DNA estabelece sem nenhuma dúvida que James Hanratty era o assassino O Perfil de DNA Enfrenta Desafios na Sala do Tribunal Provas científicas têm mantido por muito tempo uma posição ambígua nas cortes de justiça dos Estados Unidos pois ciência e lei têm diferentes procedimentos e objetivos que podem leválas ao conflito Por um lado a análise científica parece oferecer provas incontestáveis para a realidade do fato resolvendo ambigüidades ou contradições apresentadas em diferentes versões pelos advogados de acusação e defesa Ao mesmo tempo juízes e advogados têm sido geralmente muito cautelosos com a prova científica e o testemunho do especialista em parte porque isso pode ter uma influência desproporcional junto aos jurados A lei está preocupada não somente com a veracidade de um fato em particular mas também com sua relevância e admissibilidade para o caso Cabe ao juiz decidir se a prova é relevante e admissível ou não pois podem existir casos em que a prova mesmo quando relevante é inadmissível No sistema de corte antagonista é responsabilidade do advogado de acusação e de defesa promoverem sua própria argumentação e argüirem o outro lado Este não é um processo familiar para os cientistas o que faz com que eles se sintam desconfortáveis Nos Estados Unidos o padrão de julgamento se uma prova científica deve ou não ser considerada vem sendo adotado desde 1923 quando se discutiu o caso Frye versus United States A corte reconheceu que existiam situações em que o depoimento de um especialista era necessário e apropriado mas era também necessário determinar a qualidade da ciência que estava sustentando a prova O juiz precisa julgar se o princípio científico foi suficientemente estabelecido para ter uma aceitação geral no campo ao qual ele pertence Em Frye a corte recusou admitir como prova um teste de detector de mentira argumentando que o teste de detector de mentira por medição da pressão sistólica não segue o padrão estabelecido Setenta anos após o caso Frye a Suprema Corte reconsiderou a admissibilidade da prova científica no caso Daubert versus Merrell Dow Pharmaceuticals A corte sugeriu quatro questões básicas que o juiz deveria considerar antes de permitir que o júri examine ou não uma prova científica A técnica científica foi testada para determinar sua validade A teoria ou a técnica científica foi submetida a revisores da área e publicada Qual é a taxa de erro potencial ou conhecida da técnica científica Qual é o grau de aceitação dentro da comunidade científica Isso aumenta a função legislativa do juiz ao decidir se uma prova científica deve ou não ser admitida na corte federal atualmente mais da metade dos Estados seguem o padrão Daubert O perfil de DNA levantou preocupações especiais e muitas controvérsias apareceram quando ele foi introduzido pela primeira vez Uma das controvérsias levantadas era com que acuidade uma amostra tinha sido analisada pois estava claro que as performances de alguns laboratórios deixavam a desejar O FBI estabeleceu grupos de trabalho para examinar a experiência do laboratório e introduziu regras para certificar sua credibilidade e qualidade Outra controvérsia estava relacionada com a variabilidade nos resultados das análises O primeiro perfil forense dos Estados Unidos foi realizado usando sondas que detectavam fragmentos de restrição obtidos devido ao polimorfismo de um único lócus A variabilidade nas eletroforeses tornou difícil determinar se a banda obtida na amostra usada como prova era idêntica à banda da amostra de referência A mudança para as STRs múltiplas solucionou esse problema Muitas outras controvérsias se referem à genética de populações que é fundamentada nos cálculos estatísticos Inicialmente as cortes rejeitaram as aparentemente astronômicas probabilidades de duas amostras estarem emparelhadas Foi ainda questionado se classificações como branco negro e hispânico que aparecem no censo por exemplo são baseadas em uma genética de população diversificada Essa subestrutura genética que tem sido questionada invalida as estimativas de frequência de alelos Entretanto 20 anos de experiência e o contínuo acúmulo de dados têm validado o perfil de DNA Vítimas de Desastres em Massa São Identificadas por Perfil de DNA Por muitos anos a identificação de uma vítima dependia de se descobrir pertences pessoais associados com o corpo comparando impressões digitais com os dados do FBI ou de outro banco de dados e usando registros dentais ou outro dado antropológico Quando se suspeitava que o corpo encontrado era da pessoa desaparecida então no caso da recuperação do corpo intacto o esqueleto remanescente dentes e características como uma cicatriz podiam ser comparadas com aquelas da pessoa desaparecida Entretanto em algumas circunstâncias existe um grande número de corpos ou as mortes foram provocadas por uma calamidade catastrófica como por exemplo um desastre aéreo Nesse caso a força do impacto causa uma grande fragmentação dos corpos misturando os cadáveres Pelo fato de o perfil do DNA poder ser realizado em pequenos pedaços de tecidos tais perfis podem ser utilizados para determinar qual fragmento de tecido seria originado de qual indivíduo A identificação exige amostras de referência isto é amostras oriundas de pessoas que estavam envolvidas no desastre Essas amostras de referência de DNA podem ser originadas de cabelos em um pente células da pele nas roupas ou no cartão de crédito ou mesmo no cartão Guthrie que carrega uma gota de sangue recolhida após o nascimento para os testes de fenilcetonúria ou outra doença metabólica hereditária Existem muitas situações nas quais as amostras de referência não estão disponíveis Nessas circunstâncias pode ser possível deduzir a identidade dos cadáveres a partir dos perfis de parentes biológicos A requisição de tais amostras precisa ser feita com a aprovação e a compreensão por parte de seus parentes e com o reconhecimento de que a análise familiar desse tipo pode descobrir relações inesperadas Assim como acontece na análise de ligação em genética clínica adoções e a nãopaternidade e às vezes a nãomaternidade podem ser reveladas É importante que a privacidade seja mantida e que as respostas fornecidas sejam relevantes para as questões que estão sendo levantadas O perfil de DNA foi inicialmente usado dessa maneira em 1993 após a tragédia de Waco no Texas em que 82 membros de um grupo religioso da Ramificação Davidiana incluindo 25 crianças morreram Muitos dos corpos foram danificados pela destruição dos prédios e pelo incêndio que se seguiu Cientistas forenses do Instituto de Patologia das Forças Armadas dos Estados Unidos e o FSS do Reino Unido foram chamados para identificar os corpos Usando sequenciamento do DNA mitocondrial STRs e outros marcadores de DNA eles fizeram cerca de 3000 comparações entre perfis de DNA recuperados daqueles que morreram com amostras de referências Os cientistas forenses conseguiram identificar os mortos muitos dos quais seriam impossíveis de identificar usando métodos convencionais O perfil de DNA foi usado em uma escala muito maior para identificar pessoas que morreram no desastre do voo 111 da Swissair que partia de Nova Iorque em direção a Genebra Logo depois de levantar vôo em 2 de setembro a tripulação detectou um cheiro anormal mas atribuiu isso ao sistema de arcondicionado Quando observaram que era fumaça a tripulação forçou uma tentativa de pouso em Halifax Nova Scotia Canadá mas o avião chocouse com o mar na Enseada de Peggy Nova Scotia Os corpos foram resgatados a 190 pés de profundidade A identificação forense foi necessária para todas as 229 pessoas que estavam a bordo As limitações da impressão digital convencional eram evidentes nesse caso Apesar de as impressões digitais terem sido obtidas de 1020 dedos a impressão digital de somente 43 indivíduos pôde ser registrada e usada para identificação Nos casos do desastre aéreo existe uma lista completa daqueles que embarcaram de forma que uma série completa de amostras de referência das vítimas e de parentes pode ser coletada Apesar disso o recolhimento das amostras foi difícil pois os passageiros eram de 21 países diferentes Mais de 1200 restos mortais foram submetidos à análise de perfil de DNA e neste caso 500000 comparações foram realizadas entre os restos mortais e amostras de referência Notavelmente para tão complexa operação todos os 229 ocupantes foram definitivamente identificados em três meses O grande desafio da análise de perfil de DNA veio com o ataque terrorista de 11 de setembro de 2001 É difícil imaginar a tarefa monumental que os cientistas forenses e os patologistas enfrentaram como consequência dos ataques ao Pentágono ao World Trade Center e na queda do vôo 93 da United no Condado de Somerset Pensilvânia Foram 189 assassinatos no Pentágono e 45 no Condado de Somerset todos eles identificados com exceção de cinco indivíduos do Pentágono cujos corpos nunca foram encontrados A responsabilidade pela identificação dos corpos relacionados à queda das Torres Gêmeas do World Trade Center ficou por conta da New York City Office of the Chief Medical Examiner OCME Sabese hoje que em torno de 3000 corpos foram soterrados com 15 milhão de toneladas de fragmentos de pedra e que esses corpos foram submetidos a um intenso calor oriundo do desabamento e do incêndio que ardeu nos destroços do concreto por cerca de três meses A OCME reconheceu que era necessária ajuda para a análise das amostras de DNA e para curar as amostras e manipular o fluxo de dados A OCME organizou um consórcio de instituições públicas e companhias privadas para trabalhar juntos nesse projeto Além de usar a série convencional das STRs do FBI os investigadores usaram o sequenciamento do DNA mitocondrial miniSTRs e SNPs para traçar o perfil desses DNAs degradados No ataque do World Trade Center acreditase que 2749 indivíduos perderam suas vidas Até setembro de 2005 21120 fragmentos de tecidos haviam sido recuperados do local e de prédios da vizinhança Dos 1594 indivíduos identificados 850 das identificações foram baseadas somente na análise de DNA com a geração de 52000 STRs 44000 DNAs mitocondriais e 17000 SNPs N de RT Cartas absorvente no qual são colocadas pequenas gotas de sangue de recémnascidos para posterior análise 22 O Perfil de DNA Resolve um Caso de Suspeita de Fraude Científica Em 1997 o mundo ficou estarrecido com o anúncio de que cientistas da Escócia conseguiram com sucesso a clonagem de uma ovelha Dolly Isso foi uma surpresa para os biologistas pois tal clonagem era considerada impossível e esse resultado surpreendente para o mundo pareceu apontar para o conceito de uma sociedade constituída de Alfas Betas e Ipsilons preconizado por Aldous Huxley no livro Admirável Mundo Novo Entretanto a clonagem pela transferência nuclear mostrouse difícil na maioria das espécies e até aquela data aparentemente impossível em algumas Assim WooSuk Huang e seus colegas na Coréia do Sul maravilharam o mundo quando em 2001 anunciaram que haviam produzido um clone de cachorro que eles denominaram Snuppy Para esse objetivo a biópsia da pele foi realizada em Tai um cachorro da raça Afegão e colocada em cultura O fibroblasto dessa cultura foi fusionado com um ovo anucleado de um cachorro de linhagem mista e após cultivo o blastocisto foi transferido para uma mãe de aluguel Figura 1613 Três anos mais tarde esse grupo sulcoreano criou também um grande sensacionalismo público quando anunciou que havia criado 11 linhagens de células embrionárias derivadas de blastocistos obtidas pela transferência de células de ovos doadores para seus próprios ovos anucleados Mas somente um ano depois descobriuse que esse trabalho era fraudulento o que colocou em dúvida todos os trabalhos desenvolvidos por esse laboratório Como parte das investigações dois laboratórios usaram o perfil de DNA para determinar a origem de Snuppy Existiam três possibilidades Snuppy poderia ser um descendente da suposta mãe de aluguel e não um clone do cachorro doador Tai Snuppy seria geneticamente relacionado a Tai porque seriam gêmeos idênticos ou seja FIGURA 1613 Como Snuppy foi clonado Um oócito foi removido de uma fêmea mestiça e seu núcleo removido Uma biópsia da pele do ouvido foi realizada em Tai um cão Afegão As células da pele foram crescidas em cultura e uma dessas células foi injetada abaixo da membrana perivitelina do óvulo anucleado Este foi então submetido por um breve período a um pulso elétrico de alta voltagem para forçar as células de Tai a se fundirem com o óvulo Este agora tem um núcleo diplóide como se ele tivesse sido fertilizado e mitocôndrias oriundas tanto da mãe como da célula de Tai ao contrário de uma célula fertilizada em que o zigoto teria somente a mitocôndria da mãe Após cultura in vitro por alguns dias o blastocisto foi implantado em uma cadela da raça Labrador que serviu como mãe de aluguel Nove semanas depois nasceu Snuppy Doador do óvulo Fêmea mestiça Recuperação do oócito por laparoscopia Remoção do núcleo Cultura do embrião in vitro Implantação do embrião na mãe de aluguel uma cadela Labrador Nascimento de Snuppy cão Afegão clonado Doador de célula Tai cão macho Afegão Biópsia da pele do ouvido Cultura de células Tripsinização das células Remoção de uma célula da pele Inserção da célula da pele no oócito do espaço perivitelino Fusão do oócito e da célula da pele por estimulação elétrica 23 um único blastômero tendo sido dividido para produzir Tai e Snuppy ou como preconizado Snuppy era um clone de Tai tendo DNA nuclear de Tai e DNA mitocondrial do óvulo doador Primeiro a relação genética entre Snuppy e Tai foi determinada usando uma combinação total de 24 microssatélites repetitivos de um loci Tabela 165 Existiu uma concordância completa entre os marcadores para os dois cachorros Além disso não existia nenhuma relação entre Snuppy e sua mãe de aluguel Segundo a variação da alça do DNA mitocondrial mostrou que a mitocôndria de Snuppy diferiu daquela de Tai como seria esperado se somente o núcleo tivesse sido removido das células de Tai Tabela 166 Terceiro a análise da alça de DNA também determinou a origem do ovo que produziu Snuppy O DNA mitocondrial de Snuppy foi diferente da mãe de aluguel mas foi idêntico àquele do óvulo doador A conclusão é que Snuppy é de fato um clone criado com o núcleo de Tai e um óvulo do doador O perfil de DNA é o desenvolvimento forense mais significativo desde a introdução da impressão digital há mais de 100 anos e agora em uso em todo o mundo Entretanto o perfil de DNA é ainda motivo de preocupação para muitos O rápido aumento da coleção de amostras de DNA a retenção das amostras o tamanho e a interconexão dos bancos de dados e a probabilidade de que muitas informações pessoais podem ser derivadas do DNA aumentam a disputa relacionada à liberdade civil e privacidade genética Por exemplo a composição étnica do banco de dados de perfil de DNA sugere que aqueles que são minoritários poderão ser discriminados A solução de Alce Jeffrey é que o melhor caminho para impedir a discriminação seria se todos os cidadãos fornecessem uma amostra de DNA e que regras rígidas fossem impostas para impedir seu uso inapropriado O perfil de DNA é a ferramenta forense mais poderosa que pode libertar um inocente assim como condenar um culpado Mas nossa genética faz dele uma exposição tão grande do nosso íntimo e de nossa privacidade que teríamos de ser vigilantes para nos proteger contra o seu mau uso TABELA 165 Perfis de STRs de Snuppy clone Tai doador do núcleo e da mãe de aluguel Tai 246 186 288 130 124 199 252 294 153 300 246 194 288 138 132 199 252 298 153 326 Snuppy 246 186 288 130 124 199 252 294 153 300 246 194 288 138 132 199 252 298 153 326 Doador do óvulo 250 170 292 138 120 198 256 298 145 285 254 170 296 138 124 203 256 298 153 297 Fonte Parker et al 2006 Nature 440 E1E2 Esta tabela mostra os alelos de dez STRs nucleares caninas testadas em Snuppy clone Tai doador do núcleo e na mãe de aluguel Labrador Está claro que Tai e Snuppy têm um emparelhamento perfeito pelas suas STRs e que a mãe de aluguel Labrador não está relacionada com Snuppy mais de 100 anos e agora em uso em todo o mundo Entretanto o perfil de DNA é ainda motivo de preocupação para muitos O rápido aumento da coleção de amostras de DNA a retenção das amostras o tamanho e a interconexão dos bancos de dados e a probabilidade de que muitas informações pessoais podem ser derivadas do DNA aumentam a disputa relacionada à liberdade civil e privacidade genética Por exemplo a composição étnica do banco de dados de perfil de DNA sugere que aqueles que são minoritários poderão ser discriminados A solução de Alce Jeffrey é que o melhor caminho para impedir a discriminação seria se todos os cidadãos fornecessem uma amostra de DNA e que regras rígidas fossem impostas para impedir seu uso inapropriado O perfil de DNA é a ferramenta forense mais poderosa que pode libertar um inocente assim como condenar um culpado Mas nossa genética faz dele uma exposição tão grande do nosso íntimo e de nossa privacidade que teríamos de ser vigilantes para nos proteger contra o seu mau uso TABELA 166 Análise de STRs mitocondrial citocromo oxidase b e 16S RNA de Snuppy clone Tai doador do núcleo doador do óvulo e da mãe de aluguel Tai Snuppy Doador do óvulo Mãe de aluguel 170 175 195 343 354 455 498 546 568 426 1117 1145 G C A T A C C A G T A T A T A C G T T G T A G C C G C C T A C T A T G G C A Fonte Seoul National University Investigation Committee et al 2006 Nature 440 E2E3 Snuppy e o doador de óvulo apresentam perfis idênticos como seria de se esperar e os dois são diferentes de Tai e da mãe de aluguel Quando estes dados são considerados junto com os dados da Tabela 165 mostram que Snuppy é um clone de Tai