Resumo Completo Biologia Molecular: Clonagem, PCR, Enzimas e Genética - Preparatório para Provas

Olá Preciso de um resumo bem didático sobre esses assuntos para estudar para a prova Gostaria também de umas questões com gabarito para a melhor fixação do conteúdo Os assuntos são Clonagem Mutação Enzimas PcR Identificação de cromossomo Divisão celular Polimorfismo genético Identificação humana Clonagem sequenciamento PCR convencional PCR em tempo real enzima de restrição estudar o fundamento de cada uma delas Estudar sobre o exame de paternidade Resumo sobre clonagem A clonagem não ocorre apenas naturalmente ela também é realizada por meio de processos laboratoriais Esses processos produzem tudo desde cópias idênticas de algumas moléculas como DNA até organismos Um dos casos mais emblemáticos de clonagem de organismos foi realizado em 1996 dando origem à ovelha Dolly Tipos de clonagem Reprodutiva objetiva a produção do organismo idêntica com a ao do genitor É realizada através de uma técnica chamada transferência nuclear onde se retira o núcleo de uma célula adulta e a introduz em um ovulo que foi retira o núcleo não apresentando material genético Depois essa célula é transferida para o útero do organismo onde dará continuidade para o desenvolvimento do embrião Entretanto esse tipo de clonagem apresenta alguns problemas como a morte precoce dos clones e a presença de anormalidades provocadas possivelmente por falhas na reprogramação do genoma A clonagem reprodutiva mostrase mais eficaz quando realizada por meio da transferência de núcleos de células embrionárias em vez de núcleos de células adultas Ovelha Dolly Clonagem terapêutica A clonagem terapêutica é realizada por meio de um procedimento semelhante ao da clonagem reprodutiva no qual o DNA de uma célula adulta é retirado e introduzido em um óvulo sem a presença de material genético No entanto diferentemente da clonagem reprodutiva a célula não é introduzida em um útero para se desenvolver Após algumas divisões as células tronco células com grande capacidade de divisão e diferenciação podendo assim tornarse outros tipos celulares são direcionadas para a formação de tecidos idênticos aos do doador A clonagem terapêutica poderia ser utilizada no tratamento de algumas doenças como problemas cardíacos de forma a substituir um tecido cardíaco após um infarto ou em transplantes Com essa técnica seriam reduzidos os problemas de rejeição já que o material utilizado no tratamento teria sido produzido a partir do organismo doente Alguns pontos todavia merecem atenção Se o doente apresenta alguma doença genética por exemplo ele não poderia ser o seu doador já que a mutação causadora da doença estaria presente em todas as células No caso da utilização de células provenientes de outro doador o receptor poderia apresentar rejeição levando o organismo a produzir anticorpos contra essas células Algumas técnicas como a clonagem terapêutica ainda necessitam de mais estudos para que possam ser aplicadas no tratamento clínico A utilização de células embrionárias em alguns processos é um dos principais problemas enfrentados pois muitos consideram que células estão sendo retiradas de pessoas potenciais A clonagem reprodutiva por exemplo é rejeitada praticamente em todo o mundo Resumo sobre mutações Mutação é uma alteração que ocorre no material genético dos indivíduos Podem originarse de forma natural durante os processos de mitose meiose ou síntese proteica ou ser decorrente da ação de algum agente mutagênico Também podem ocorrer em três níveis 1 Molecular pode também ser chamada de mutação genética ou pontual afeta um nucleotídeo ou um grupo de nucleotídeos do DNA 2 Cromossômica ocorre em mais de um gene afetando assim a estrutura do cromossomo 3 Genômica altera o conjunto do genoma podendo afetar o número total de cromossomos ou os cromossomos presentes nos pares de forma individual Esse tipo de mutação é responsável por causar algumas síndromes como a síndrome de Down As mutações surgem de forma natural ou podem ser induzidas por agentes mutagênicos isto é substâncias químicas ou de natureza física que podem induzir as mutações como os raios ultravioleta e raios X bebidas alcoólicas substâncias derivadas do tabaco bem como alguns medicamentos As mutações ocorrem em virtude de alterações que surgem nos nucleotídeos do DNA podendo ocorrer por meio de alterações químicas nas bases nitrogenadas erros na incorporação de nucleotídeos inserção de uma base nitrogenada no lugar de outra adição ou deleção de bases nitrogenadas alterações na estrutura e no número de cromossomos entre outros fatores Muitas vezes algumas dessas alterações que surgem são corrigidas antes da replicação do DNA Quando isso não ocorre surge uma nova molécula com a alteração e ela pode reproduzirse perpetuando a mutação As mutações podem ocorrer em células somáticas ou germinativas Quando surgem nas células somáticas células do corpo exceto as reprodutivas elas geralmente não são herdáveis podendo causar problemas como o desenvolvimento de tumores envelhecimento precoce malformações quando ocorre no período embrionário entre outros Quando ocorrem em células germinativas células que originam os gametas essas mutações são passadas aos descendentes podendo causar diversas desordens genéticas o surgimento de síndromes malformações e aborto As mutações podem ser classificadas de diferentes maneiras Anteriormente destacamos a sua classificação conforme o local onde ocorrem Agora apresentamos alguns tipos de mutações conforme o efeito que elas causam Mutação silenciosa é um tipo de mutação molecular cuja mudança no nucleotídeo do DNA não altera o aminoácido sintetizado Mutação com alteração ou perda de sentido é também um tipo de mutação molecular no entanto a mudança no nucleotídeo causa uma alteração que leva à síntese de um aminoácido diferente do esperado Mutação sem sentido nonsense mutação molecular cuja alteração no nucleotídeo causa o surgimento de um códon sequência de três bases nitrogenadas de término indicando o fim da cadeia de aminoácidos Assim a proteína que está sendo sintetizada é cortada prematuramente Mutação frameshift a inserção ou deleção de bases nitrogenadas altera a sequência de códons o que gera uma sequência diferente de aminoácidos ou até mesmo um códon de término Duplicação mutação cromossômica na qual surgem cópias de determinado trecho do cromossomo podendo alterar a sequência de códons Geralmente está relacionada com a perda desse trecho deleção no cromossomo homólogo Deleção perda de um segmento de cromossomos seja na extremidade seja em seu interior Esse tipo de mutação cromossômica também pode ocasionar mudança na sequência de códons As mutações muitas vezes são relacionadas a algo ruim principalmente por estarem ligadas ao surgimento de alguns tipos de tumores e síndromes Entretanto as mutações podem criar alelos e novos genes contribuindo para uma maior variabilidade genética A variabilidade genética amplia a capacidade das populações de lidarem com mudanças ambientais e está sujeita à seleção natural que eliminará ou preservará um determinado fenótipo conjunto de características observáveis em um organismos gerado por um determinado genótipo sendo um fator essencial no processo evolutivo Geralmente quando a mutação faz surgir uma característica que confere uma determinada vantagem ao indivíduo ela é preservada O genótipo das espécies é fruto de mutações vantajosas que foram preservadas ao longo do tempo pela seleção natural Denominamos de mutação as alterações que ocorrem na estrutura do material genético Uma dessas alterações é a troca de uma base nitrogenada por outra uma alteração estrutural no cromossomo conhecida por a Deleção b Inserção c Adição d Substituição e Inversão As mutações podem ocorrer naturalmente quando o DNA não se replica de maneira adequada Entretanto algumas influências externas também podem causar mutações como é o caso da radiação As radiações podem ocasionar a perda de trechos de DNA um tipo de mutação conhecido por a Adição b Inserção c Deleção d Substituição e Inversão Gabarito 1 Alternativa d Denominase de substituição a mutação em que ocorre a troca de uma base nitrogenada por outra Essa troca de base no DNA pode por exemplo levar a mudanças na proteína a ser produzida ou desencadear uma produção incompleta da proteína 2 Alternativa c Na deleção ocorre a perda de parte do DNA o que prejudica toda a síntese proteica PCR A reação em cadeia da polimerase ou PCR é uma técnica para fazer muitas cópias de uma região específica do DNA in vitro em um tubo de ensaio ao invés de um organismo A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável a Taq polimerase e requer primers de DNA projetados especificamente para a região de interesse do DNA Na PCR a reação é repetida ciclicamente através de uma série de alterações de temperatura o que possibilita a produção de muitas cópias da região de interesse A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa Ela é rotineiramente usada em clonagens de DNA diagnósticos médicos e análises forenses de DNA A reação em cadeia da polimerase PCR é uma técnica rotineira de laboratório usada para fazer muitas cópias milhões ou bilhões de uma região específica do DNA Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador Por exemplo pode haver um gene cuja função o pesquisador queira compreender ou um marcador genético usado pelos cientistas forenses para correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos Tipicamente o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de interesse do DNA de modo que essa possa ser analisada e utilizada de alguma outra maneira Por exemplo DNA amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento visualizado por eletroforese em gel ou clonado em plasmídeo para futuros experimentos A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina incluindo pesquisa em biologia molecular diagnósticos médicos e mesmo alguns ramos da ecologia Taq polimerase Assim como a replicação de DNA em um organismo a PCR requer uma enzima DNA polimerase que faça novas fitas de DNA usando as existentes como moldes A DNA polimerase tipicamente usada na PCR é chamada de Taq polimerase em homenagem à bactéria resistente ao calor da qual ela foi isolada Thermus aquaticus T aquaticus vive em fontes termais e de água quente Sua DNA polimerase é bastante estável ao calor e é mais ativa à 70 ext C70C70 start text C end text temperatura em que as DNA polimerases humanas ou de E coli seriam disfuncionais Essa estabilidade ao calor torna a Taq polimerase ideal para PCRs Como veremos a alta temperatura é usada repetidamente na PCR para desnaturar o DNA molde isto é separar suas fitas Primers de pcr Como outras DNA polimerases a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe é dado um primer uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA Em uma reação de PCR o pesquisador determina a região do DNA que será copiada ou amplificada pelos primers que ela ou ele escolher Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples geralmente por volta de 202020 nucleotídeos de comprimento Dois primers são usados para cada reação de PCR e eles são projetados de modo que englobem a região de interesse região que deve ser copiada Isto é são dadas sequências que os farão se ligar a fitas opostas do DNA molde bem nas extremidades da região a ser copiada Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases complementares DNA molde 5 TATCAGATCCATGGAGTGAGTACTAGTCCTATGAGT 3 3 ATAGTCTAGGTACCTCACTCATGATCAGGATACTCA 5 Primer 1 5 CAGATCCATGG 3 Primer 2 Quando os primers são ligados ao molde eles podem ser estendidos pela polimerase e a região que está entre eles será copiada Etapas da pcr Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase primers DNA molde e nucleotídeos blocos que compõem o DNA Os ingredientes são reunidos em um tubo juntamente com cofatores de que a enzima precisa e passam por repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento que permitem que o DNA seja sintetizado As etapas básicas são 1 Desnaturação 96 ext C96C96 start text C end text Aquece fortemente a reação para separar ou desnaturar as fitas de DNA Isso proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa 2 Anelamento 555555 656565 ext CC start text C end text Resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples 3 Extensão 72 ext C72C72 start text C end text Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers sintetizando novas fitas de DNA Este ciclo se repete 252525 353535 vezes em uma reação típica de PCR que geralmente ocorre em 222 444 horas dependendo do comprimento da região de DNA a ser copiada Se a reação for eficiente funcionar bem a região de interesse pode gerar de uma ou poucas cópias até bilhões Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada vez Ao invés o novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na próxima rodada de síntese de DNA Há muitas cópias dos primers e muitas moléculas de Taq polimerase flutuando pela reação então o número de moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar a cada rodada do ciclo Esse padrão de crescimento exponencial é mostrado na imagem abaixo Uso da eletroforese em gel para visualizar os resultados da pcr Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados tornamse visíveis através do uso da eletroforese em gel Eletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos de DNA são puxados por uma corrente elétrica através de uma matriz de gel e que separa os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho Um padrão ou escada de DNA é tipicamente incluído para que o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma banda no gel que pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA Por exemplo uma reação de PCR produzindo um fragmento de 400400400 pares de bases pb apareceria desta maneira no gel Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias da região de interesse do DNA não apenas uma ou algumas cópias Como o DNA é microscópico muitas cópias têm de estar presentes antes que possamos vêlas a olho nu Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser uma ferramenta importante ela produz cópias suficientes de uma sequência de DNA de modo que possamos ver ou manipular aquela região de DNA Aplicações da pcr Através da PCR uma sequência de DNA pode ser amplificada milhões ou bilhões de vezes produzindo cópias suficientes de DNA para serem analisadas por outras técnicas Por exemplo o DNA pode ser visualizado por eletroforese em gel enviado para sequenciamento ou digerido por enzimas de restrição e clonado em um plasmídeo A PCR é usada em muitos laboratórios de pesquisa e tem aplicações práticas em ciências forenses testes genéticos e diagnósticos Por exemplo a PCR é utilizada para amplificar genes associados a desordens genéticas a partir do DNA de pacientes ou do DNA fetal nos casos de teste prénatal A PCR também pode ser utilizada para testar se há DNA bacteriano ou viral no corpo de um paciente se o patógeno estiver presente pode ser possível amplificar regiões de seu DNA a partir de uma amostra de sangue ou tecido Amostraproblema A pcr nas ciências forenses Suponha que você esteja trabalhando em um laboratório de ciências forenses Você acabou de receber uma amostra de DNA de um cabelo deixado em uma cena de crime juntamente com amostras de DNA de três possíveis suspeitos Seu trabalho é examinar um marcador genético em particular e verificar se algum dos três suspeitos coincide com o DNA do cabelo para esse marcador O marcador vem em dois alelos ou versões Um deles contém uma única repetição região marrom abaixo enquanto o outro contém duas cópias da repetição Em uma reação PCR com primers que atuam na região de repetição o primeiro alelo produz um fragmento de DNA de 200200200 extbpbpstart text b p end text enquanto o segundo produz um fragmento de DNA de 300300300 extbpbpstart text b p end text Marcador do alelo 1 primers que atuam na região de repetição amplificam um fragmento de DNA de 200 pb Marcador do alelo 2 primers que atuam na região de repetição amplificam um fragmento de DNA de 300 pb Você faz uma PCR nas quatro amostras de DNA e visualiza os resultados por eletroforese em gel como representado abaixo 11 Classifique como verdadeiras ou falsas as seguintes afirmações a Na técnica de PCR a etapa de emparelhamento é essencialmente uma hibridação b Em geral as experiências de PCR requerem um único primer c A técnica de PCR é constituída por diversas etapas que se repetem por 3 ciclos d Na reação de PCR durante o processo de polimerização o DNA neosintetizado pode sofrer mutações e Existem diferentes tipos de DNAs polimerases termoestáveis que podem ser utilizadas indiscriminadamente nas reações de PCR Qual das seguintes alíneas é falsa relativamente aos requisitos da reação de PCR i o PCR é uma reação de polimerização em cadeia ii o PCR utiliza curtos primers sintéticos iii o PCR usa uma DNA polimerase para sintetizar o DNA iv o PCR pode ser utilizado para obter grandes quantidades de uma sequência particular de DNA v o PCR não requer conhecimento das sequências de DNA nas regiões que ladeiam a sequência a ser amplificada Gabarito 1 v f f v f 2 v Enzimas Enzimas são catalisadores biológicos responsáveis por aumentar a velocidade de uma determinada reação química Geralmente as enzimas são proteínas mas existem alguns ácidos ribonucleicos que atuam como enzimas sendo chamados de ribozimas Para que possam aumentar a velocidade de uma reação as enzimas devem se ligar a reagentes os quais são conhecidos como substratos Por muito tempo acreditouse que essa ligação ocorria de maneira bastante rígida um modelo conhecido como chavefechadura Atualmente no entanto aceitase o modelo conhecido como encaixe induzido o qual admite que leves mudanças ocorrem na forma da enzima à medida que o substrato entra no sítio ativo As enzimas são biomoléculas que atuam como catalisadores ou seja são substâncias capazes de acelerar a velocidade das reações químicas que ocorrem nos seres vivos sem que sejam consumidas durante essas reações Sem a ação das enzimas algumas reações seriam muito lentas o que prejudicaria o metabolismo As enzimas aceleram as reações de forma seletiva sendo portanto catalisadores muito específicos As enzimas são capazes de acelerar uma reação mediante a diminuição da energia de ativação ou seja elas reduzem a quantidade de energia que deve ser adicionada para que uma reação tenha início Apesar de serem frequentemente definidas como catalisadores biológicos de natureza proteica nem toda enzima é uma proteína Há alguns RNAs que funcionam como enzimas os chamados ribozimas A maioria das enzimas no entanto são proteínas sendo formadas portanto por aminoácidos A composição de aminoácidos dessas biomoléculas define a estrutura tridimensional que ela irá adquirir Complexo enzimasubstrato Denominase de substrato o reagente sobre o qual uma enzima age Quando uma enzima se liga ao seu substrato formase o complexo enzimasubstrato Essa ligação acontece em uma região específica chamada de sítio ativo Quando falamos das enzimas de natureza proteica o sítio ativo corresponde a apenas alguns poucos aminoácidos sendo o restante da molécula responsável por determinar a configuração do sítio ativo A forma do sítio ativo bem como a forma do substrato estão relacionadas à especificidade da enzima uma vez que eles devem ser complementares Modelo chavefechadura O modelo chavefechadura considera que as enzimas e substratos apresentam um encaixe perfeito como uma chave e uma fechadura O modelo chavefechadura proposto por Emil Fischer é bastante difundido para explicar a interação entre enzima e substrato De acordo com esse modelo há uma complementaridade rígida entre a enzima e o substrato assim como uma chave e uma fechadura O sítio ativo da enzima teria um formato complementar ao substrato o qual se encaixaria perfeitamente Outras moléculas portanto não teriam acesso a esse sítio o que garantiria a especificidade da enzima Assim como uma chave abre apenas uma fechadura uma enzima só se ligaria a um substrato Hoje sabemos no entanto que esse modelo não está correto uma vez que as enzimas não são estruturas rígidas como se pensava Modelo do encaixe induzido Atualmente o modelo mais aceito para explicar a ligação entre uma enzima e o seu substrato é o do encaixe induzido proposto inicialmente por Koshland e colaboradores O sítio ativo e o substrato não funcionam de maneira rígida como uma chave e fechadura Pesquisas mostram que à medida que o substrato entra no sítio ativo a enzima sofre uma leve modificação a qual favorece o ajuste entre o sítio ativo e o substrato Para compreender melhor esse modelo podemos pensar na interação da enzima e substrato como um aperto de mão o qual vai se tornando mais firme após o primeiro contato Cofatores Grande parte das enzimas precisa de moléculas auxiliares para realizar a sua ação catalítica chamadas de cofatores Os cofatores podem estar ligados permanentemente à enzima ou podem se ligar ao substrato de maneira fraca e reversível Eles também podem ser inorgânicos ou orgânicos Quando os cofatores são moléculas orgânicas são denominadas coenzimas Algumas vitaminas atuam como coenzimas sendo esse o caso por exemplo da riboflavina também conhecida como vitamina B2 Como exemplos de cofatores inorgânicos podemos citar o ferro e zinco na sua forma iônica Classificação das enzimas As enzimas podem ser classificadas em seis grupos utilizandose como critério o tipo de reação que catalisam Oxidoredutases enzimas relacionadas com as reações de oxirredução Transferases catalisam a transferência de grupos de um composto para outro Hidrolases catalisam reações de hidrólise Liases atuam na adição de grupos a ligações duplas ou remoção de grupos formando uma ligação dupla Isomerases catalisam reações de isomerização Ligases enzimas que provocam a degradação da molécula de ATP usando a energia liberada nessa reação para a formação de novos compostos Fatores que regulam a atividade enzimática A atividade de uma enzima é influenciada por fatores sendo os principais a temperatura e o pH Geralmente a temperatura exerce um papel positivo nas reações químicas aumentando a taxa de uma reação enzimática Porém quando a temperatura aumento acima das condições ótimas a velocidade da reação cai consideravelmente Isso ocorre porque se observa a desnaturação das proteínas A maioria das enzimas dos seres humanos apresenta uma temperatura ótima entre 35 e 40 ºC Além da temperatura o pH também influencia a atividade enzimática existindo também um valor ótimo Para a maioria das enzimas o valor ótimo de pH está na faixa de 6 a 8 1 Sabemos que as enzimas possuem papel fundamental nas reações químicas que ocorrem em nosso corpo Marque a alternativa que indica corretamente a função dessas substâncias orgânicas nas reações do nosso organismo a As enzimas atuam retardando a velocidade de uma reação b As enzimas atuam aumentando a velocidade de uma reação c As enzimas não atuam na velocidade de uma reação d As enzimas atuam apenas degradando substâncias 2 Sabemos que cada enzima atua somente em determinadas reações biológicas pois cada uma é muito específica Observe o desenho a seguir e marque a alternativa que indica o nome do modelo utilizado para explicar o funcionamento enzimático Observe o esquema exemplificando a especificidade da enzima a modelo do mosaico fluido b modelo de encaixe c modelo chavefechadura d modelo da porcaparafuso e modelo ácidobase Gabarito 1 Alternativa b As enzimas atuam aumentando a velocidade de uma reação e por isso são consideradas catalisadores biológicos 2 Alternativa c O modelo chavefechadura é usado para explicar a especificidade da enzima pois assim como apenas uma chave é capaz de abrir uma fechadura a enzima atua apenas em reações específicas Divisão celular A divisão celular é o processo pelo qual uma célulamãe origina célulasfilhas Através deste processo as células unicelulares se reproduzem e as multicelulares se multiplicam A frequência de divisões celulares varia com o tipo e estado fisiológico de cada célula No organismo humano por exemplo algumas células estão em constante multiplicação Um exemplo são as células da epiderme e da medula óssea que se multiplicam para repor as células que morrem Entretanto alguns tipos de células mais especializadas como os neurônios hemácias e células musculares nunca se dividem Ciclo celular É o período que se inicia com a origem da célula a partir de uma divisão celular e termina quando está se divide em duas célulasfilhas O ciclo celular é dividido em duas etapas a interfase e a divisão celular Nos eucariontes existem dois tipos de divisão celular a mitose e a meiose Interfase É a fase em que a célula não está se dividindo É o período mais longo do ciclo celular aproximadamente 95 do tempo Neste momento ocorrem diversos fatos que possibilitam a divisão celular como a replicação do DNA a divisão dos centríolos e a produção de proteínas A interfase é subdividida em três fases G1 S e G2 Na fase G1 que antecede a duplicação do DNA as células aumentam de tamanho produzem RNA e sintetizam proteínas Na fase S ocorre a síntese de DNA A quantidade de DNA no núcleo da célula é replicada Lembrese que replicação significa o processo de duplicação da molécula de DNA Antes de qualquer divisão celular há duplicação do DNA durante a interfase A fase G2 corresponde ao intervalo entre a síntese de DNA e a mitose A célula continua crescendo e produzindo proteínas Tipos de divisão celular Mitose É o tipo de divisão celular que a célulamãe haploide n ou diploide 2n origina 2 célulasfilhas com o mesmo número de cromossomos da célulamãe É uma divisão equacional A mitose é realizada quando há reprodução assexuada Funções da mitose Crescimento e regeneração de tecidos Cicatrização Formação de gametas em vegetais Divisões do zigoto durante o desenvolvimento embrionário Meiose É o tipo de divisão celular em que a célula mãe sempre diploide 2n com cromossomos duplos origina através de duas divisões sucessivas quatro células filhas com metade do número de cromossomos da célula mãe É uma divisão do tipo reducional Funções da Meiose Formação dos gametas em animais Formação dos esporos nos vegetais Exercicios Nos seres multicelulares a mitose é um processo que tem como principal função a o movimento celular b a produção de gametas c a produção de energia d a expressão gênica e o crescimento Mitose e Meiose são tipos de divisões celulares que apresentam as seguintes características diferenciais a a mitose ocorre exclusivamente nas células somáticas nunca no plasma germinativo b a meiose possibilita a recombinação genética ingrediente constituinte da variabilidade genética c mitose e meiose se alternam no processo de reprodução assexuada dos seres unicelulares d mitose e meiose sempre ocorrem num mesmo organismo vivo Gabarito 1e o crescimento 2b a meiose possibilita a recombinação genética ingrediente constituinte da variabilidade genética Enzimas de restrição Enzimas de restrição são enzimas que cortam o DNA Cada enzima reconhece um ou mais sequências alvo e corta o DNA nestas sequências ou perto delas Muitas enzimas de restrição fazem cortes escalonados produzindo terminações com DNA fita simples No entanto algumas produzem extremidades rombas DNA ligase é uma enzima de adesão de DNA Se dois pedaços de DNA tiverem terminações complementares a ligase pode ligálas para formar uma molécula de DNA única e contínua Na clonagem de DNA enzimas de restrição e DNA ligases são utilizadas para inserir genes e outras frações de DNA em plasmídeos Como cortar e colar um DNA Na clonagem de DNA pesquisadores fazem muitas cópias de um pedaço de DNA tais como um gene Em muitos casos a clonagem envolve a inserção do gene em um pedaço de DNA circular chamado de plasmídeo que pode ser copiado em bactérias Como podem pedaços de DNA de diferentes fontes tais como um gene humano e um plasmídeo bacteriano serem unidos para formar uma única molécula de DNA Um método comum baseiase em enzimas de restrição e DNA ligase Uma enzima de restrição é uma enzima que corta DNA que reconhece locais específicos no DNA Muitas enzimas de restrição fazem cortes escalonados no local de seus sítios de reconhecimento ou perto deles produzindo terminações de fita simples Se duas moléculas de DNA têm terminações que se correspondem elas podem ser unidas pela enzima DNA ligase A DNA ligase sela o vão entre as moléculas formando um único pedaço de DNA Enzimas de restrição e DNA ligase são frequentemente usadas para inserir genes e outros pedaços de DNA em plasmídeos durante a clonagem de DNA Enzimas de restrição Enzimas de restrição são encontradas em bactérias e outros procariontes Elas reconhecem e se ligam a sequências específicas de DNA chamadas sítios de restrição Cada enzima de restrição reconhece apenas um ou alguns sítios de restrição Quando ela encontra suas sequências alvo a enzima de restrição fará um corte na dupla hélice da molécula de DNA Normalmente o corte é no sítio de restrição ou próximo a ele e ocorre em um padrão arrumado previsível Como um exemplo de como uma enzima de restrição reconhece e corta uma sequência de DNA vamos considerar Eco RI uma enzima de restrição comum usada em laboratórios Eco RI corta no seguinte sítio 5GAATTC3 3CTTAAG5 Sítio da EcoRI Quando EcoRI reconhece e corta este sítio ela sempre faz isso em um padrão muito específico que produz extremidades com DNA fita simples Uma enzima EcoRI se liga a um sítio EcoRI em uma parte do DNA e faz um corte em ambas as fitas do DNA O padrão de corte é 5GAATTC3 3CTTAAG5 Portanto isso produz uma saliência de 5AATT3 em cada extremidade do corte do DNA Se outro pedaço de DNA tiver terminação correspondente por exemplo porque ele também foi cortado pela EcoRI as terminações podem se juntar por pareamento de bases complementares Por esta razão dizse que enzimas que deixam terminações de fita única produzem extremidades pegajosas Extremidades pegajosas são úteis em clonagem porque seguram dois pedaços de DNA que podem ser ligados pela DNA ligase Nem todas as enzimas de restrição produzem extremidades adesivas Algumas são cortadoras bruscas que cortam no meio de uma sequência alvo e não deixam terminação A enzima de restrição SmaI é um exemplo de enzima que faz cortes bruscos A enzima SmaI se liga ao sítio de restrição SmaI que é 5CCCGGG3 3GGGCCC5 Isso faz um corte bem no meio desta sequência em ambas as fitas produzindo extremidades arredondadas Os locais do corte são 5CCCGGG3 3GGGCCC5 Fragmentos com corte perpendicular sem terminações de fita única podem ser unidos um ao outro pela DNA ligase No entanto fragmentos deste tipo são mais difíceis de se ligarem a reação de ligação é menos eficiente e mais propensa a falhar porque não há terminações de fita única para manter as moléculas de DNA na posição DNA ligase Se você aprendeu sobre replicação de DNA você já pode ter encontrado a DNA ligase Na replicação de DNA o trabalho das ligases é unir fragmentos de DNA recém sintetizados para formar uma fita sem emenda As ligases usadas na clonagem de DNA fazem basicamente a mesma coisa Se dois pedaços de DNA tiverem terminações complementares a DNA ligase pode juntálas para fazer uma molécula intacta Fragmento 1 do DNA 5G 3CTTAA Fragmento 2 do DNA AATTC3 G5 As regiões de fita simples de DNA das duas moléculas podem se juntar através de ligações de hidrogênio mas ainda existem aberturas na estrutura 5GAATTC3 3CTTAAG5 O DNA ligase sela as aberturas para fazer uma molécula de DNA intacta 5GAATTC3 3CTTAAG5 Como a DNA ligase faz isso Usando o ATP como fonte de energia a ligase catalisa uma reação em que o grupo fosfato terminal da extremidade 5 de uma fita de DNA é ligado ao grupo hidroxila terminal da extremidade 3 da outra Esta reação produz um esqueleto intacto de açúcarfosfato Exemplo construção de um plasmídio recombinante Vamos ver como a digestão por restrição e a ligação podem ser usadas para inserir um gene em um plasmídeo Suponha que temos um gene alvo ladeado com sítios de reconhecimento da EcoRI e um plasmídeo contendo um único sítio EcoRI Nós começamos com um gene alvo e um plasmídeo circular O gene alvo tem dois sítios de restrição deEcoRI próximos a suas extremidades O plasmídeo tem um sítio EcoRI situado logo após o promotor que guia a expressão na bactéria A sequência dos sítios daEcoRI é 5GAATTC3 3CTTAAG5 Nosso objetivo é usar a enzima EcoRI para inserir o gene no plasmídeo Primeiro nós separadamente digerimos cortamos o fragmento do gene e o plasmídeo com EcoRI Este passo produz fragmentos com extremidades adesivas Nós digerimos cortamos separadamente o fragmento de gene e o plasmídeo com EcoRI Esta etapa produz fragmentos com extremidades adesivas Todas as extremidades têm uma saliência de quatro nucleotídeos com a sequência 5AATT3 Isso porque o padrão de corte da EcoRI é 5GAATTC3 3CTTAAG5 Em seguida pegamos o fragmento de gene e um plasmídeo linearizado aberto e os combinamos com a DNA ligase As extremidades adesivas dos dois fragmentos unem se por pareamento de bases complementares Em seguida tomamos o fragmento do gene e o plasmídeo linearizado aberto e os combinamos com a DNA ligase As extremidades adesivas dos dois fragmentos unem se por pareamento de bases complementares Entretanto ainda existem aberturas no esqueleto do açúcarfosfato da dupla hélice de DNA nos sítios de junção onde o gene e o DNA do plasmídeo se encontram Uma vez que eles foram unidos pela ligase os fragmentos se tornam um único pedaço de DNA intacto O gene alvo agora está inserido no plasmídeo fazendo um plasmídeo recombinante Uma vez que são unidos pela ligase os fragmentos se tornam um único pedaço de DNA intacto O gene alvo agora foi inserido no plasmídeo constituindo um plasmídeo recombinante No plasmídeo o gene é agora ladeado por dois sítios de EcoRI que foram gerados quando as extremidades de corte foram unidas Digestões por restrição e ligações envolvem muitas moléculas de DNA No exemplo acima nós vimos um resultado de uma ligação entre um gene e um plasmídeo cortado com EcoRI No entanto outros resultados poderiam acontecer nesta mesma ligação Por exemplo o plasmídeo cortado poderia recircularizar fechandose sem absorver o gene Da mesma forma o gene poderia entrar no plasmídeo mas virado para trás uma vez que as duas extremidades adesivas da EcoRI são idênticas Esquerda plasmídeo recombinante produzido quando o gene entra pela frente apontando para longe do promotor que já se encontra no plasmídeo Meio plasmídeo nãorecombinante produzido quando o plasmídeo cortado simplesmente se fecha suas extremidades se ligam uma à outra Direita plasmídeo recombinante produzido quando o gene entra por trás apontando na direção do promotor que já se encontra no plasmídeo Digestões por restrição e ligações como essa são executadas usando muitas cópias de DNA do plasmídeo e do gene Na verdade bilhões de moléculas de DNA são utilizadas em uma única ligação Estas moléculas colidem aleatoriamente umas com as outras e com a DNA ligase em diferentes maneiras Portanto se múltiplos produtos podem ser feitos todos eles serão feitos com alguma frequência incluindo aqueles que não queremos Como podemos evitar plasmídeos ruins Quando nós transformamos bactérias com DNA de uma ligação cada uma pega um pedaço diferente do DNA Nós podemos checar as bactérias após a transformação e usar somente as que possuem o plasmídeo correto Em muitos casos o plasmídeo de bactérias modificadas é analisado utilizando outra digestão por restrição para ver se ele contém a inserção certa na orientação certa Exames de paternidade O que é o teste de paternidade O teste de paternidade é um exame que utiliza a comparação do material genético DNA de duas ou mais pessoas a fim de encontrar perfis de similaridade que confirmem ou refutem o vínculo genético investigado É importante relembrar que metade das informações genéticas de um indivíduo é herdada de sua mãe biológica e outra metade de seu pai biológico por isso a determinação das relações de vínculo genético entre as partes envolvidas no teste é possível a partir da comparação entre os perfis genéticos dos indivíduos Quais são os principais tipos de teste de paternidade Confira abaixo alguns dos testes disponibilizados pelo DB Molecular para investigação de vínculo genético Paternidade Trio No teste trio o suposto filhoa tem seu DNA comparado a outras duas pessoas o suposto pai e a mãe biológica Este cenário onde têmse a participação da mãe biológica é o ideal pois torna o caso mais resolutivo uma vez que permite isolar o material genético do filho requerente herdado dela A ausência da mãe pode gerar maior dificuldade na análise já que não haverá essa premissa favorável Paternidade Duo O teste duo é feito apenas com o suposto pai paternidade ou suposta mãe maternidade e o filhoa requerente Ou seja apenas duas pessoas têm seus materiais genéticos comparados Os testes de maternidade são mais recorrentes em casos de adoção ou troca de bebês Prénatal No teste de paternidade prénatal o material coletado vem do próprio feto por meio da amostra de líquido amniótico ou vilo corial coletada por um ginecologista ou obstetra Para realização desse exame recomendase coletar o vilo corial no período entre 11ª13ª semana enquanto para o líquido aminiótico o período gestacional ideal é entre 14ª 28ª É importante avaliar a possibilidade de se fazer o teste pré natal não invasivo ou então aguardar até o nascimento do bebê para realizar o teste de paternidade uma vez que esta coleta é invasiva e pode apresentar riscos mesmo que mínimos para o desenvolvimento gestacional Prénatal não invasivo O teste prénatal não invasivo possibilita a detecção do DNA fetal diretamente através do sangue materno e pode ser feito a partir da 11ª semana gestacional Ele tem esse nome justamente porque a coleta do material genético do feto é feita de forma indireta sem riscos para a mãe ou para o bebê Entretanto em gestações gemelares ou casos em que há grau de parentesco entre a mãe e o suposto pai não é possível a realização desse exame Também não é indicado para mães que receberam transfusão sanguínea nos últimos 3 meses ou que realizaram transplante de medula Espólios Em situações onde o suposto pai é falecido ou ausente casos judiciais o exame para identificação do vínculo genético recebe o nome de Espólio ou Reconstrução O grau de complexidade para este exame é maior uma vez que é necessário realizar a reconstrução dos genótipos da pessoa falecida a partir do perfil genético dos seus parentes de primeiro grau Conforme mais próxima a relação genética e havendo a possibilidade de participação no teste tornase crucial a coleta de material biológico do pai eou da mãe biológicos de filhosas biológicosas ou de seus irmãos biológicos nessa ordem de importância Também é possível aplicar a reconstrução para os casos de suposta mãe falecidaausente Como é feito o teste É necessário coletar amostras biológicas para execução do exame que pode variar de acordo com o tipo de exame a ser feito bem como com as recomendações do laboratório escolhido As amostras comumente utilizadas nos exames Duo Trio e Espólios são basicamente saliva ou swab bucal bem como uma pequena quantidade de sangue que são depositados em um kit de coleta apropriado Já nos casos do teste de paternidade prénatal é necessário fazer a coleta do material do feto por meio do líquido amniótico ou vilo corial conforme já mencionado anteriormente Para o teste prénatal não invasivo é necessário solicitar um kit de coleta específico ao DB Molecular Com a finalidade de garantir a credibilidade do exame assim como as informações evidenciadas tornase necessário o respaldo através de documentações que comprovem o cenário para a realização do teste de paternidade É necessário confirmar com o laboratório quais são os documentos válidos para cada situação Usando sofisticadas técnicas de laboratório o DNA das amostras é isolado e então é realizado o sequenciamento de todo material genético para posterior análise comparativa Para assegurar maior confiabilidade do teste o setor de Vínculo Genético do DB Molecular possui restrição de acesso além de profissionais específicos para o processamento e análise dos testes de paternidade É importante reforçar que todos os testes com resultados de exclusão são reprocessados para confirmação Esta nova rotina é executada por um analista diferente do que realizou a primeira vez assegurando assim a veracidade do resultado A análise de cada caso é dependente das informações fornecidas pelos envolvidos no momento da coleta do material biológico O resultado e a conclusão do exame são classificados com base na análise dos marcadores genéticos e nos valores da Probabilidade Paterna Logo é possível dois cenários distintos Exclusão de Paternidade Probabilidade paterna igual a 0 Isto leva à conclusão de que não há vínculo genético de filiação entre o indivíduo requerente e o suposto pai Inclusão de Paternidade Probabilidade paterna maior de 9999 do suposto pai ser de fato o pai biológico do indivíduo Em quais situações o teste de paternidade é necessário O teste de paternidade ou de maternidade é um exame que pode ser solicitado por qualquer pessoa A submissão ao teste pode ser motivada por vários fatores pois existem incontáveis situações nas quais uma pessoa pode não ter certeza de quem são seus pais biológicos Alguns casos estão relacionados a ações judiciais onde o objetivo geralmente é esclarecer questões como herança pensão alimentícia ou guarda