Resumo Completo Tecnicas Moleculares e Citogenetica Molecular - Clonagem, Mutacao, Enzimas e PCR

Olá gostaria de um resumo bem rico e didático sobre TÉCNICAS MOLECULARES E CITOGENÉTICA MOLECULAR com os assuntos abaixo para estudar para a prova Gostaria também de alguns exercícios com gabarito para melhor fixação do conteúdo Clonagem Mutação Enzimas PCR MeuGuru Biologia Molecular Pedido mjLoWPwP4 Objetivo Resumo de forma didática e resumido sobre técnicas moleculares e citogenética molecular Além disso exercícios com gabarito para fixação GURU ALINE Caro a aluno a estou entregando a sua atividade concluída Espero ter ajudado Como sou nova na plataforma gostaria de pedir se possível que dê a sua avaliação sobre meu trabalho na plataforma caso tenha ficado satisfeito a com ele GRATA PELA ATENÇÃO E POR TER ACEITADO MINHA ASSISTÊNCIA IMPORTANTE o gabarito dos exercícios de fixação estão em formato de texto oculto dentro da própria pergunta para saber como exibilos entrar neste link httpscanaltechcombrsoftwarecomoocultaremostrartextoocultonoword onde explica certinho o passoapasso TÉCNICAS MUTAÇÃO Antes de explicar o que vem a ser mutação é preciso ter em mente o que é o material genético DNA Existem dois tipos A DNA nuclear envolvido pelo envoltório nuclear B DNA mitocondrial O DNA nuclear possui a combinação do material genético tanto da genitora quanto do genitor da prole todavia com relação ao DNA mitocondrial este é composto apenas pelo material genético da genitora Isso se dá porque na fecundação do espermatozoide é perdida a cauda que contém a mitocôndria paterna apenas restando o material genético materno nessas organelas Diferentemente do DNA mitocondrial que possui sua conformação de maneira circular o DNA nuclear está estruturado por meio de nucleotídeos que formam uma ligação entre bases púricas e pirimídicas gerando em uma dupla hélice que se contorce firmando um espiral A compactação desta está principalmente associada ao enovelamento por meio das proteínas histonas que são de extrema importância no processo de compactação O DNA mitocondrial possui um cromossomo de conformação circular com um peso de aproximadamente 165kb diferentemente do DNA nuclear que é muito mais denso O armazenamento do DNA mitocondrial é localizado em uma organela citoplasmática conhecida como mitocôndria como o próprio nome já ressalta já o DNA nuclear fica em outra organela conhecida como núcleo que é o local onde é encontrado a maior porção do DNA humano As doenças que resultam de mutações exibem um padrão distintivo de herança devido a três características incomuns da mitocôndria segregação replicativa homoplasmia e heteroplasmia e herança materna Estruturas que um gene precisa apresentar para ser funcional Definese um gene como uma sequência de DNA no genoma que é necessária para a produção de um produto funcional seja um polipeptídio ou uma molécula de RNA funcional Um gene inclui não apenas a sequências codificadoras reais mas também sequências adjacentes de nucleotídeos necessárias para a própria expressão do gene a saber 5 Região promotora Ilhas CpG ou box CAT e box TATA Região 5 não traduzida Códon de iniciação metionina ATG Íntrons e éxons Códons de parada Região 3 nãotraduzida Sinal para adição da cauda poliA TAAA 3 Figura 1 ilustração das regiões da molécula de DNA Figura retirada do livro ThompsonThompson Genética Médica 7 ed Tendo a definição de DNA e os seus tipos em mente valese saber o conceito de mutação Na codificação do código genético a leitura é baseada em trincas três bases que são lidas formando o que conhecemos como códons que posteriormente serão aminoácidos que irão compor uma proteína A mutação desses códons pode gerar formas alternativas da cadeia como serão descritas a seguir a Mutação de término de cadeia stop codon Mutação que gera uma troca na base do códon alterando o aminoácido em questão para um códon de parada ou também conhecido como Stop Codon Tratase de um códon que finaliza a leitura na formação da proteína por isso em geral quando a proteína sofre esse erro ela terá sua confecção parada prematuramente podendo gerar sérios danos como perda de função e até mesmo degradação por conta da instabilidade Os códons de parada podem ser UAA UAG e UGA b Mutação de matriz de leitura frameshift São pequenas inserções ou deleções de bases que atuam na sequência sendo que estas não são múltiplos de três dessa forma desalinhando completamente a sequência inicial resultando na formação de outros aminoácidos Quando isso acontece a sequência é alterada a partir do ponto de pequena inserção ou deleção de bases pois será mudado completamente a matriz de leitura inicial Em geral são graves e não perpetuam uma proteína saudável em contraste com a deleção completa de um códon que em geral pode não ter relevância para a produção da proteína ainda mais porque não irá alterar as sequências adjacentes c Mutação de sentido trocado missense Mutação que promove uma troca de uma das bases do códon promovendo a formação de outro aminoácido deste surge o termo sentido trocado pois sua leitura promoverá uma forma alterada do usual podendo ser prejudicial para a função da proteína ou não d Mutação silenciosa Mutação que mesmo após ocorrer uma troca de base ela promove a formação do mesmo aminoácido O código genético por possuir o mesmo aminoácido formado por diferentes códons em alguns casos é conhecido como redundante uma vez que nem sempre uma mutação é maligna para o afetado sendo que as vezes a pessoa após sofrer essa mutação não sente nenhuma diferença em suas atividades genéticas o que chamamos de mutação silenciosa Qual a importância dos mecanismos de reparo de DNA para a saúde humana Constantemente estamos entrando em contato com verdadeiros perigos biológicos mas nem mesmo nos lembramos ou sabemos dos danos que podem ser causados por eles O sol agentes químicos ondas radioativas dos mais variados tipos que podem atravessar nosso tecido e chegar até nosso código genético esses são apenas alguns dos inúmeros exemplos portanto o cuidado pessoal e o simples fato de se evitar tais agressores de bases genéticas já são um grande passo para resguardar a estrutura e função do nosso DNA É natural e esperase que haja mutações não apenas nesses contatos exógenos mas até mesmo no simples fato de replicarmos nosso DNA contato endógeno porém se acumulássemos cada erro que é gerado certamente teríamos um encontro adiado com a morte Para isso nosso corpo conta com um forte arcabouço projetado para identificar e corrigir tais defeitos para que não elaboremos a formação de um câncer por exemplo Esses mecanismos fazem a substituição de uma determinada sequência afetada promovendo sua integridade novamente para que assim possamos nos manter livres de doenças e erros que são naturais de acontecer todavia que não devem permanecer no nosso organismo Quando uma mutação intrônica pode levar a uma alteração funcional de um gene As regiões intrônicas podem conter o que conhecemos como elementos reguladores acentuadores silenciadores e regiões de controle de locus que quando mutadas podem interferir aumentando ou diminuindo a expressão de um gene específico Os dinucleotídeos GT e AG importantes para a recomposição do RNA às junções íntronéxon e o sinal AATAAA importante para a adição da cauda poliA também estão em destaque sendo que caso haja qualquer tipo de mutação nessas áreas a recomposição pode ser modificada sendo passado para a síntese proteica uma sequência diferente da esperada por conta das excisões que deveriam ser realizadas ENZIMAS As reações acontecem naturalmente quando termodinamicamente favorável ou seja quando a reação acontece e libera alta quantia de energia livre No entanto as reações que ocorrem naturalmente são muito lentas e por isso o organismo evolutivamente conseguiu otimizar tal reação através de um catalisador biológico as enzimas A maioria das enzimas é proteína com exceção do pequeno grupo de RNA que exercem atividade enzimática As enzimas apresentam um alto grau de especificidade com o seu substrato Especificamente as enzimas de restrição conhecidas também como endonucleases de restrição têm como sua função natural proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno de fora tal como acontece quando a bactéria é infectada por um vírus As enzimas de restrição clivam o material genético viral impedindo a infecção Entretanto hoje em dia é fortemente utilizado em técnicas laboratoriais de engenharia genética e biotecnologia para geração de DNA recombinante Mas qual o mecanismo de ação de tal enzima Antes de adentrar no mecanismo de ação das enzimas de restrição alguns conceitos devem ser explicados tais como A DNA recombinante B vetor C clonagem molecular Conceito de DNA recombinante é uma molécula de DNA formada artificialmente pela ligação de duas ou mais moléculas de origens diferentes Sendo assim tal método envolve a manipulação do DNA Conceito de clonagem molecular é um dos passos utilizados durante a síntese do DNA recombinante Baseiase no isolamento dos genes de interesse pela indução da amplificação de tal gene através de um vetor Conceito de vetor molecular um vetor é uma molécula de DNA advindo de um microorganismo tal como bactérias capazes de se replicar de forma autônoma objetivando a clonagem molecular Neste sentindo o vetor é o que carrega o fragmento de DNA para dentro de uma célula hospedeira na qual ele conseguirá se replicar Tendo em mente tais conceitos enzimas de restrição reconhecem sítios específicos da molécula de DNA e o clivam no ou perto do sítio de reconhecimento Tais sítios de reconhecimento são sequências de bases nitrogenadas e está presente em ambas as fitas A clivagem então ocorre gerando fragmentos de DNA de fita simples Na engenharia genética posteriormente a clivagem ocorre ligação covalente entre o DNA fragmentado e fragmento de DNA exógeno através da enzima DNA ligase Figura 2 Ilustrações esquemáticas do mecanismo de ação das enzimas de restrição A enzima de restrição bacteriana Escherichia coli EcoR1 atuando sobre a molécula de DNA B como se forma um DNA recombinante sendo a primeira reação catalisada por enzimas de restrição A síntese da insulina artificial atualmente se baseia na inserção do fragmento de DNA humano que codifica o hormônio insulina em bactérias Escherichia coli cultivadas in vitro em laboratórios Após a sua inserção na bactéria enzimas de restrição atuam sobre os DNAs e ocorre uma recombinação do DNA bacterial plasmídeo DNA circular com o DNA humano O plasmídeo é o vetor que é inserido em outra bactéria que irá a partir de então se replicar formando colônias de bactérias capazes de sintetizar insulina devido a replicação do DNA recombinante Posteriormente a insulina é isolada e processada para ser comercializada A B Figura 3 Tabela com exemplos de enzimas de restrição e as sequencias de bases nitrogenadas de reconhecimento para a clivagem Figura retirada do livro ThompsonThompson Genética Médica 6 ed CLONAGEM Conceito de clone uma molécula de DNA recombinante contendo um gene ou outra sequência de DNA de interesse Existem muitos tipos de clonagem A reprodutiva B terapêutica C natural D induzida Clonagem reprodutiva Através de manipulação células somáticas que compõem os tecidos e órgãos ou gaméticas se replicam produzindo células filhas clones Adentrando o núcleo pertencente a uma célula gamética é retirado e inserido em uma célula somática ou célula gamética Após ocorre a inserção destas células com núcleo trocado no útero para que ocorro as clivagens que pertencem a formação do feto Geralmente as estas células clones envelhecem de forma precoce e por conseguinte morrem Além disso podem apresentar anomalias em virtude de falhas genéticas À exemplo temos a ovelha Dolly PASSOAPASSO 1 Células somáticas ou gaméticas são retiradas de um doador célula original 2 Essas células são mantidas in vitro 3 Posteriormente quando estão estabelecidas e estabilizadas seus núcleos são removidos 4 O núcleo de uma célula gamética é inserido nesta célula cultivada in vitro 5 A célula passa então a ter o novo material genético 6 A célula é mantida em in vitro até a formação da fase de blástula sendo inserida no útero in vivo após atingir esta fase 7 Ocorre o desenvolvimento do feto Clonagem terapêutica Similar a clonagem reprodutiva a célula que foi clonada não é inserida no útero Tais células se desenvolvem gerando células troncos que possuem a capacidade de se diferenciarem em vários tipos diferentes de células Neste contexto a clonagem terapêutica é utilizada no tratamento de doenças que degeneram ou agridem de forma irreversível tecidosórgãos de pacientes uma vez que a célula clonada tem origem do paciente Como as células troncos se diferenciam em qualquer tipo de células estas poderiam substituir os tecidosórgãos evitando rejeições Clonagem natural É o processo que ocorre como o próprio nome sugere naturalmente na fauna e flora Deste modo através de reprodução assexuada fissão binaria dentre outros alguns animais plantas e bactérias se reproduzem Além disso é o que acontece durante a gravides de gêmeos univitelinos que são formados de um único embrião que posteriormente se divide ao meio Clonagem induzida Este tipo de clonagem consiste na indução das células de se clonar duplicarmitose célula original formando duas células filhas de forma artificial em condições controladas Um exemplo seria o que acontece com a clonagem molecular explicada no tópico de ENZIMAS para a síntese de insulina PCR A Reação em Cadeia da Polimerase PCR é uma técnica utilizada para amplificar uma ou mais cópias de uma determinada sequência de DNA Este processo é baseado na replicação do DNA que acontece nas células presentes no organismo É uma técnica complexo e que é composta por três etapas 1 desnaturamento da molécula de DNA 2 anelamento dos primers nas regiões específicas do DNA 3 extensão do DNA Sendo assim a técnica em si começa com a desnaturação da porção do DNA de interesse Para tal a amostra deve ser submetida a elevada temperatura aproximadamente 95ºC durante ciclos de determinado período Isto é necessário para que as fitas de DNA desassociam tornandose fita única Em seguida um primer é adicionado O primer corresponde a uma determinada sequência de DNA especifica para o DNA de seu interesse Então o primer irá se ligar as fitas que se tornaram únicas no processo de desnaturamento a esse ligamento dáse o nome de anelamento Este processo ocorre em temperatura específica por um determinado tempo Na sequência a enzima DNApolimerase vem adicionando as bases nitrogenadas complementares formando então uma nova fita de DNA Os seguintes reagentes são utilizados em todas as reações de PCR primer na concentração de 20pmoles construído de acordo com o DNA de interesse tampão da enzima MgCl2 50mM nucleotídeos dATP dCTP dTTP dGTP enzima Taq DNA polimerase DNA genômico de seu interesse Com relação as temperaturas cada etapa requer uma temperatura específica para que a reações aconteçam Além disso a PCR é caraterizada pela presença de ciclos em cada etapa Ao final da PCR se faz necessário a detecção do produto de amplificação Para tal se as amostras são submetidas a eletroforese Sendo assim uma determinada quantia do produto da PCR é combinado a tampão de corrida azul de bromofenol e submetidos à eletroforese em gel de agarose 15 corado com brometo de etídeo sendo posteriormente revelados sob exposição à iluminação ultravioleta UV para confirmação da qualidade e especificidade dos produtos Quais as vantagens da PCR sobre o Southern Blot O Southern precisa de uma sondaprobe que muitas das vezes são radioativas o que torna a técnica muito mais perigosa hoje se utilizam mais sondas de quimiluminescência mas que ainda torna a técnica mais complexa de ser executada Para uma mutação de ponto essa era considerada uma técnica muito longa Southern podendo demorar de uma semana até 10 dias para sua completa execução em contraponto a PCR em muito menos tempo evidencia a variação Por conta da enorme extensão da técnica ficava muito difícil fazer um controle passo a passo pois em qualquer ponto seria passível uma contaminação ou artefato que pudesse prejudicar os resultados já na PCR por esta ser muito rápida e em poucas etapas esse viés tornase diminuto No Southern precisase de uma grande quantidade de DNA para começar a técnica por consequência também será necessária uma grande quantidade de enzima de restrição para a execução de tal já na PCR com poucas quantidades de DNA se a qualidade da mesma for minimamente viável podese realizar a técnica sem grandes preocupações Na PCR a procura pelo gene não precisa ser baseada em todo o genoma como é no caso do Southern pois com os primers podese restringir a região de interesse amplificandoa para posterior estudo o que gera muito mais precisão na análise em questão Por conta desse grande número de etapas e quantidades que o Southern apresenta tornase muito mais caro e perigoso tanto do ponto de vista da pesquisa quando do ponto de vista de periculosidade realizar esta técnica em vez da de PCR que além de ser mais barata é mais segura Mas ainda se utiliza bastante nos laboratórios a técnica de Southern principalmente para deleções de fragmentos onde são utilizadas enzimas que clivam em regiões que intercalam genes ou que intercalam algumas deleções conhecidas que podem ser facilmente identificadas pelos padrões observados EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 1 Adaptado de ADMTEC2019 e IBADE2019 Leia as afirmativas a seguir I As proteínas são compostas orgânicos relacionados ao metabolismo de construção II Através da mitose uma célula tem o seu número de cromossomos reduzido pela metade III O fator que permite o surgimento de variabilidade genética é a mutação São corretas as afirmações A I apenas B II apenas C III apenas D I e II apenas E I II e III 2 As leis de Mendel evidenciaram caracteres altamente diferenciados que são denominados genes Com respeito a essas leis julgue o item a seguir I As células humanas são formadas pela fertilização do óvulo pelo espermatozoide que origina uma célula diploide denominado zigoto A diploidia consiste na organização de 23 pares de cromossomos homólogos que se tornam visíveis na divisão celular 3 UFG 2020 De acordo com as conclusões de um estudo publicado na revista científica Lancet um problema exclusivo no cromossomo Y que determina que o bebé seja do sexo masculino parece estar na origem de algumas doenças cardíacas hereditárias No estudo pesquisadores investigaram o DNA de mais de 3000 homens e identificaram que uma determinada variação do cromossomo Y aumenta o risco de doença arterial coronária Disponível em httpswwwpublicopt20120209sociedadenoticia15329 69 Acesso em 24 out 2019 Adaptado Considerando as leis da hereditariedade a doença referida no texto é herdada a partir A da mãe por seus descendentes do sexo feminino e masculino B do pai por seus descendentes do sexo feminino e masculino C do pai e da mãe por seus descendentes do sexo masculino D do pai por seus descendentes do sexo masculino E das filhas e por suas netas INSTITUTO AOCP2019 O código genético do DNA se expressa por trincas de bases que são denominadas A aminoácidos B bases nitrogenadas C códons D primers Os ácidos ribonucleico e desoxirribonucleico RNA e DNA respectivamente fazem parte fundamental do Dogma Central da Biologia Molecular descrito por Francis Crick em 1956 Ambos resultam da polimerização de unidades chamadas nucleotídeos unidos por um tipo de enlace característico a ligação fosfodiéster Essas duas moléculas embora sejam parecidas apresentam uma série de diferenças características Sobre os ácidos nucléicos e o gene assinale a alternativa correta A A estrutura química dos ácidos nucleicos é simples e não varia entre os diversos organismos Esses ácidos nucleicos são constituídos de sequências de proteínas Cada proteína é formada por uma base nitrogenada purina um açúcar e um grupo fosfato B De acordo com a pentose que apresentam os ácidos nucleicos são de três tipos DNA ácido desoxirribonucleico que contém desoxirribose e o RNA ácido ribonucleico e os cromossomos que contêm ribose C Cada nucleotídeo é formado por uma base nitrogenada que pode ser uma purina adenina ou guanina ou uma pirimidina uracil ou citosina no DNA timina ou citosina no RNA D O DNA e o RNA encontramse principalmente nos cromossomos entretanto o RNA é encontrado em pouca quantidade no nucléolo estrutura nuclear e no citoplasma E O gene referese ao segmento de DNA que codifica uma cadeia polipeptídica e inclui regiões flanqueadoras que antecedem sequêncialíder e que seguem cauda a região codificadora bem como sequências que não são traduzidas íntrons e que se intercalam com as sequências codificadoras individuais éxons 4 Ufpe 2005 Na figura a seguir é ilustrado um processo muito importante para a vida Analiseo e assinale a alternativa que indica corretamente qual é este processo a Produção de proteína b Transcrição do RNA c Produção de RNAribossômico d Helicoidização do DNA e Replicação do DNA 5 Assinale qual a ordem correta das etapas principais para a produção de uma proteína recombinante a Isolamento e preparo do gene de interesse Escolha do sistema de expressão Introdução do gene de interesse no vetor de expressão Seleção das células que incorporaram o gene recombinante Expressão e purificação das proteínas recombinantes b Escolha do sistema de expressão Isolamento e preparo do gene de interesse Introdução do gene de interesse no vetor de expressão Seleção das células que incorporaram o gene recombinante Expressão e purificação das proteínas recombinantes c Escolha do sistema de expressão Introdução do gene de interesse no vetor de expressão Isolamento e preparo do gene de interesse Seleção das células que incorporaram o gene recombinante Expressão e purificação das proteínas recombinantes d Isolamento e preparo do gene de interesse Introdução do gene de interesse no vetor de expressão Escolha do sistema de expressão Seleção das células que incorporaram o gene recombinante Expressão e purificação das proteínas recombinantes Sobre a aplicação da técnica de DNAProteínas Recombinantes assinale VERDADEIRO ou FALSO e escolha a alternativa correta I Produção de Insulina II Produção de anticorpos III Produção de enzimas para degradar celulose do bagaço de cana A F F F B V V F C V V V D F V V Nomeie o passo 2 e diga qual aplicação da técnica de recombinação está representada na figura wwwrepositoriouniceubbr adaptado 1 Coleta e cultivo in vitro das células do paciente 2 3 Seleção e expansão das células com gene terapêutico 4 Reintrodução das células modificadas no paciente A Transdução com vetor carregando o gene terapêutico Terapia gênica B Transdução com vetor carregando o gene terapêutico Clonagem C Superexpressão do geneproteína alvo Clonagem D Superexpressão do geneproteína alvo Terapia gênica Quais são em ordem os 4 passos da produção de enzimas recombinantes em procariotos a Transformação Extração de DNA Purificação Expressão b Extração de RNA Transformação Expressão Purificação c Clonagem e Preparação do Plasmídeo Transformação Expressão Purificação d Extração de DNA Clonagem e Preparação do plasmídeo Transformação Expressão e Clonagem e Preparação do Plasmídeo Expressão Transformação Purificação 6 Defina o que é e as etapas da PCR No que consiste a clonagem molecular 7 Quais são as etapas da clonagem