Biologia Molecular - Fundamentos e Técnicas Essenciais

Indaial 2020 Molecular Profª Letícia da Silva Pereira Fernandes 1a Edição Biologia Elaboração Profª Letícia da Silva Pereira Fernandes Copyright UNIASSELVI 2020 Revisão Diagramação e Produção Equipe Desenvolvimento de Conteúdos EdTech Centro Universitário Leonardo da Vinci UNIASSELVI Ficha catalográfica elaborada pela equipe Conteúdos EdTech UNIASSELVI Impresso por F363b Fernandes Letícia da Silva Pereira Biologia molecular Letícia da Silva Pereira Fernandes Indaial UNIASSELVI 2020 180 p il ISBN 9786556633459 ISBN Digital 9786556633466 1 Biologia molecular Brasil II Centro Universitário Leonardo da Vinci CDD 575173 Olá acadêmico Seja bemvindo ao Livro Didático Biologia Molecular Este livro está dividido em três unidades as quais apresentam o principal objetivo de apresentar conceitos básicos e um pouco da história por trás dos avanços nas técnicas de biologia molecular Lembrese que a biologia molecular é um campo que está constantemente inovando e em busca de soluções para os estudos que focam em DNA RNA proteínas e outras biomoléculas A biologia molecular trata de componentes essenciais à vida e de muita importância para as áreas biológicas e da saúde por isso a aplicação dessas técnicas está cada vez mais presente no dia a dia da medicina diagnóstica e da pesquisa básica na busca por tratamento e cura para as mais diversas doenças e portanto no entendimento da complexidade da vida Na primeira unidade nosso foco será voltado à origem e explanação de técnicas básicas de biologia molecular como o isolamento clonagem e sequenciamento de DNA e a reação em cadeia da polimerase PCR as quais serão de extrema importância para o entendimento das demais técnicas abordadas ao longo do livro Na Unidade 2 avançaremos para uma área mais complexa da Biologia Molecular e aprenderemos sobre as chamadas ciências ômicas Nessa unidade trataremos de um dos maiores avanços científicos dos últimos anos o Projeto Genoma Humano PGH e veremos como esse projeto contribuiu para avanços que culminaram na era ômica com o desenvolvimento de técnicas avançadas de estudo do genoma do proteoma do mataboloma e de outros omas Por fim com todo o conhecimento adquirido ao longo das duas primeiras unidades na terceira unidade deste livro trataremos da aplicação prática das técnicas abordada Você será apresentado a um dos campos de atuação do biomédico em que essas técnicas avançadas de biologia molecular podem ser aplicadas Entre elas estão os testes diagnósticos moleculares e a melhora da qualidade de vida de pacientes por meio das investigações voltadas ao desempenho esportivo e nutricional De maneira geral o conteúdo abordado neste livro é apresentado de maneira prática e direcionado para que você futuro biomédico esteja preparado para conhecer e atuar aplicando a biologia molecular ou desenvolvendo novas metodologias nesta fantástica área Bons estudos Profa Letícia da Silva Pereira Fernandes APRESENTAÇÃO Olá acadêmico Para melhorar a qualidade dos materiais ofertados a você e dinamizar ainda mais os seus estudos nós disponibilizamos uma diversidade de QR Codes completamente gratuitos e que nunca expiram O QR Code é um código que permite que você acesse um conteúdo interativo relacionado ao tema que você está estudando Para utilizar essa ferramenta acesse as lojas de aplicativos e baixe um leitor de QR Code Depois é só aproveitar essa facilidade para aprimorar os seus estudos GIO QR CODE Olá eu sou a Gio No livro didático você encontrará blocos com informações adicionais muitas vezes essenciais para o seu entendimento acadêmico como um todo Eu ajudarei você a entender melhor o que são essas informações adicionais e por que você poderá se beneficiar ao fazer a leitura dessas informações durante o estudo do livro Ela trará informações adicionais e outras fontes de conhecimento que complementam o assunto estudado em questão Na Educação a Distância o livro impresso entregue a todos os acadêmicos desde 2005 é o materialbase da disciplina A partir de 2021 além de nossos livros estarem com um novo visual com um formato mais prático que cabe na bolsa e facilita a leitura preparese para uma jornada também digital em que você pode acompanhar os recursos adicionais disponibilizados através dos QR Codes ao longo deste livro O conteúdo continua na íntegra mas a estrutura interna foi aperfeiçoada com uma nova diagramação no texto aproveitando ao máximo o espaço da página o que também contribui para diminuir a extração de árvores para produção de folhas de papel por exemplo Preocupados com o impacto de ações sobre o meio ambiente apresentamos também este livro no formato digital Portanto acadêmico agora você tem a possibilidade de estudar com versatilidade nas telas do celular tablet ou computador Preparamos também um novo layout Diante disso você verá frequentemente o novo visual adquirido Todos esses ajustes foram pensados a partir de relatos que recebemos nas pesquisas institucionais sobre os materiais impressos para que você nossa maior prioridade possa continuar os seus estudos com um material atualizado e de qualidade ENADE LEMBRETE Olá acadêmico Iniciamos agora mais uma disciplina e com ela um novo conhecimento Com o objetivo de enriquecer seu conheci mento construímos além do livro que está em suas mãos uma rica trilha de aprendizagem por meio dela você terá contato com o vídeo da disciplina o objeto de aprendizagem materiais complementa res entre outros todos pensados e construídos na intenção de auxiliar seu crescimento Acesse o QR Code que levará ao AVA e veja as novidades que preparamos para seu estudo Conte conosco estaremos juntos nesta caminhada Acadêmico você sabe o que é o ENADE O Enade é um dos meios avaliativos dos cursos superiores no sistema federal de educação superior Todos os estudantes estão habilitados a participar do ENADE ingressantes e concluintes das áreas e cursos a serem avaliados Diante disso preparamos um conteúdo simples e objetivo para complementar a sua compreensão acerca do ENADE Confi ra acessando o QR Code a seguir Boa leitura 18 SUMÁRIO UNIDADE 1 O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO 1 TÓPICO 1 ISOLAMENTO E CLONAGEM 3 1 INTRODUÇÃO 3 2 ISOLAMENTO DE DNA OU RNA 5 21 ELETROFORESE EM GEL 6 22 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO 7 23 HIBRIDIZAÇÃO 9 3 CLONAGEM DE DNA 13 RESUMO DO TÓPICO 1 16 AUTOATIVIDADE 17 TÓPICO 2 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PCR 19 1 INTRODUÇÃO 19 2 PCR PASSO A PASSO 21 3 TRANSCRIÇÃO REVERSA 23 4 PCR QUALITATIVO VS PCR QUANTITATIVO 25 RESUMO DO TÓPICO 2 28 AUTOATIVIDADE 29 TÓPICO 3 BIBLIOTECAS DE DNA E CDNA 31 1 INTRODUÇÃO 31 2 BIBLIOTECA DE DNA OU GENÔMICA 32 3 BIBLIOTECA DE CDNA 34 RESUMO DO TÓPICO 3 36 AUTOATIVIDADE 37 TÓPICO 4 SEQUENCIAMENTO DE DNA 39 1 INTRODUÇÃO 39 2 MÉTODOS DE SANGER E SANGER AUTOMATIZADO 40 3 SEQUENCIAMENTO SHOTGUN 45 4 SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO NEXT GENERATION SEQUENCING NGS 46 5 SEQUENCIAMENTO DE TERCEIRA GERAÇÃO 52 6 SEQUENCIAMENTO PORTÁTIL 53 LEITURA COMPLEMENTAR 54 RESUMO DO TÓPICO 4 57 AUTOATIVIDADE 58 REFERÊNCIAS 59 UNIDADE 2 GENÔMICA E AS DEMAIS ÔMICAS 61 TÓPICO 1 GENÔMICA 63 1 INTRODUÇÃO 63 2 GENÔMICA ESTRUTURAL 64 3 MAPAS CROMOSSÔMICOS DE ALTA RESOLUÇÃO 67 4 MAPAS CROMOSSÔMICOS FÍSICOS 70 5 GENÔMICA FUNCIONAL 72 6 POLIMORFISMO GENÉTICO 81 RESUMO DO TÓPICO 1 86 AUTOATIVIDADE 87 TÓPICO 2 PROJETO GENOMA HUMANO 89 1 INTRODUÇÃO 89 2 PGH 90 RESUMO DO TÓPICO 2 95 AUTOATIVIDADE 96 TÓPICO 3 AS DEMAIS ÔMICAS 97 1 INTRODUÇÃO 97 2 TRANSCRIPTÔMICA 98 3 PROTEÔMICA 103 4 METABOLÔMICA 113 LEITURA COMPLEMENTAR 116 RESUMO DO TÓPICO 3 122 AUTOATIVIDADE 123 REFERÊNCIAS 124 UNIDADE 3 DIAGNÓSTICO E OUTRAS APLICAÇÕES DAS DIVERSAS TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR POTENCIAIS ÁREAS DE ATUAÇÃO DO BIOMÉDICO 125 TÓPICO 1 TESTES PRÉNATAIS NEONATAIS E EM PRODUTOS DA CONCEPÇÃO 127 1 INTRODUÇÃO 127 2 TRIAGEM PRÉNATAL NÃO INVASIVA NIPT 128 3 TESTE DO PEZINHO TRIAGEM NEONATAL 129 31 DOENÇA DA URINA DE XAROPE DE BORDO OU LEUCINOSE MSUD 132 4 PERFIL METABÓLICO ASSOCIADO AOS ERROS INATOS DO METABOLISMO 133 41 ÁCIDOS ORGÂNICOS URINÁRIOS 133 42 ACILCARNITINAS E AMINOÁCIDOS 134 5 SURDEZ GENÉTICA OU SURDEZ HEREDITÁRIA 134 6 SEQUENCIAMENTO DE PRODUTO DE CONCEPÇÃO 135 RESUMO DO TÓPICO 1 137 AUTOATIVIDADE 138 TÓPICO 2 TESTES ONCOLÓGICOS 139 1 INTRODUÇÃO 139 2 CÂNCER DE MAMA E DE OVÁRIO 140 3 POLIPOSE ADENOMATOSA FAMILIAR 141 4 CÂNCER COLORRETAL 142 5 PESQUISA DE CÂNCER HEREDITÁRIO 142 6 BIÓPSIA LÍQUIDA 144 RESUMO DO TÓPICO 2 145 AUTOATIVIDADE 146 TÓPICO 3 DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS E OUTROS TESTES 147 1 INTRODUÇÃO 147 2 DOENÇAS MITOCONDRIAIS 147 3 PERFIL GENÉTICO PARA DOENÇAS CARDIOVASCULARES 148 4 ANÁLISE CROMOSSÔMICA POR MICROARRANJO 149 5 INTOLERÂNCIA À LACTOSE 150 6 SEQUENCIAMENTO DO EXOMA 151 61 EXOMA DO RECÉMNASCIDO 153 7 TESTE DE DNA OU TESTE DE PATERNIDADE 153 8 SAÚDE ENDOMETRIAL ENDOMETRITE CRÔNICA 156 81 ALICE ANÁLISE DE ENDOMETRITE CRÔNICA INFECCIOSA 157 82 EMMA ANÁLISE METAGENÔMICA DO MICROBIOMA ENDOMETRIAL 158 9 PLANEJAMENTO DE GRAVIDEZ ACONSELHAMENTO GENÉTICO 160 10 ANCESTRALIDADE JUDAICA ASHKENAZI 162 11 TRIMETILAMINÚRIA TMAU1 163 12 HIV E HEPATITES 164 13 INFECÇÕES RESPIRATÓRIAS 164 14 TROMBOFILIA 166 15 INFECÇÕES SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS IST 166 151 PAPILOMAVÍRUS HUMANO HPV 167 16 FARMACOGENÉTICA 167 17 AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL 169 18 NUTRIGENÉTICA 170 19 PERFIL GENÉTICO DESEMPENHO ESPORTIVO 170 20 SEQUENCIAMENTO COMPLETO DO GENOMA WGS 171 LEITURA COMPLEMENTAR 173 RESUMO DO TÓPICO 3 177 AUTOATIVIDADE 178 REFERÊNCIAS 179 1 UNIDADE 1 O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO OBJETIVOS DE APRENDIZAGEM PLANO DE ESTUDOS A partir do estudo desta unidade você deverá ser capaz de investigar a origem do desenvolvimento de diversas técnicas de biologia molecular identifi car técnicas de isolamento e clonagem de fragmentos de DNA ilustrar o funcionamento da técnica de PCR e suas principais aplicações apontar como são formadas as bibliotecas de DNA e cDNA e seus diferentes objetivos examinar as principais técnicas de sequenciamento de DNA Esta unidade está dividida em quatro tópicos No decorrer dela você encontrará autoatividades com o objetivo de reforçar o conteúdo apresentado TÓPICO 1 ISOLAMENTO E CLONAGEM TÓPICO 2 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PCR TÓPICO 3 BIBLIOTECAS DE DNA E CDNA TÓPICO 4 SEQUENCIAMENTO DE DNA Preparado para ampliar seus conhecimentos Respire e vamos em frente Procure um ambiente que facilite a concentração assim absorverá melhor as informações CHAMADA 2 CONFIRA A TRILHA DA UNIDADE 1 Acesse o QR Code abaixo 3 ISOLAMENTO E CLONAGEM 1 INTRODUÇÃO Caros acadêmicos antes de adentrarmos no universo das técnicas avançadas de biologia molecular é preciso relembrar a origem e alguns conceitos básicos sobre a molécula de ácido desoxirribonucleico o DNA pois a partir desses conhecimentos que as técnicas conhecidas atualmente como técnicas de biologia molecular foram desenvolvidas Embora atualmente seja comum o conhecimento de que o DNA é a molécula que possui as informações genéticas até meados do século XX sabiase apenas da importância dessas informações já denominadas de genes para a manutenção da vida No entanto não havia clareza de qual molécula biológica poderia ser responsável por tão importante e complexa função Com a descoberta na década de 1950 por James Watson Francis Crick Maurice Wilkins e Rosalind Franklin da estrutura de dupla hélice complementar do DNA Figura 1 foi possível entender como a complexidade das informações contidas nos genes poderia ser replicada ou transmitida para outras células FIGURA 1 ESTRUTURA EM DUPLA HÉLICE DO DNA DRDESOXIRRIBOSE AADENINA TTIMINA CCITOSINA GGUANINA PFOSFATO FONTE Junqueira e Carneiro 2012 p 57 TÓPICO 1 UNIDADE 1 4 Assim após o conhecimento de que a estrutura de dupla hélice do DNA é formada por duas fitas lineares compostas por uma sequência complementar formada por quatro nucleotídeos adenina citosina guanina e timina ou A C G e T respectivamente Figura 1 foi possível entender como a sequência de nucleotídeos de um determinado gene presente no DNA é responsável pela codificação da sequência complexa de aminoácidos que deverão ser sintetizados para formar uma determinada proteína Por fim embora fosse conhecido que os genes presentes no DNA codificassem para a síntese de proteínas observouse que a síntese ocorria essencialmente onde o DNA não estava presente no citosol Dessa forma veio à tona a descoberta do RNA uma molécula semelhante ao DNA que também é formada por nucleotídeos porém em uma única fita na qual em vez de timina é encontrado o nucleotídeo uracila Figura 2 Essa é molécula capaz de carregar as informações contidas no DNA para fora do núcleo transcrição servindo de molde para a síntese de proteínas tradução Figura 3 FIGURA 2 ESTRUTURA DO RNA C CITOSINA A ADENINA UURACILA GGUANINA FONTE Adaptado de Alberts et al 2008 5 FIGURA 3 ESQUEMA DNA RNA PROTEÍNA FONTE Adaptado de Alberts et al 2008 Em posse do conhecimento sobre estas importantes macromoléculas o DNA o RNA e as proteínas e da sua íntima relação umas com as outras iniciaramse os estudos relativos aos processos intracelulares de manutenção reparo e síntese desses componentes e das demais moléculas envolvidas nestes processos Esses estudos estão englobados em áreas conhecidas como genética molecular ou biologia molecular e incluem a aplicação de técnicas e modelos baseados no entendimento de como os processos intracelulares ocorrem Tais técnicas incluem o isolamento de moléculas como um gene a clonagem a amplificação e o sequenciamento de um fragmento de DNA metodologias que serão abordadas com mais detalhes nesta unidade 2 ISOLAMENTO DE DNA OU RNA Para que seja possível investigar uma molécula um fragmento de DNA ou mesmo um gene específico é preciso isolála dos demais componentes celulares e das demais moléculas de DNA ou dos demais genes pois mesmo que seja feita a extração do DNA de uma determinada amostra celular ou tecidual todo o DNA presente na amostra será extraído em conjunto e assim será necessário que alguma técnica de isolamento seja aplicada para que apenas o fragmento de DNA de interesse seja isolado dos demais 6 21 ELETROFORESE EM GEL A técnica mais simplificada de separação aplicável a moléculas de DNA RNA ou até mesmo a proteínas é pelo tamanho da molécula e se dá por meio de uma eletroforese em gel o qual pode ser composto por poliacrilamida ou agarose Nessa técnica de isolamento uma corrente elétrica é transmitida através do gel o qual se encontra imerso em solução tampão do polo negativo cátodo para o polo positivo ânodo e por meio das cargas negativas presentes nas moléculas de DNA elas são carreadas por afinidade para o polo positivo do gel Figura 4 Esse carreamento acontece porque o gel utilizado na técnica possui a porosidade necessária para que as moléculas se movimentem por ele Dessa forma moléculas maiores tendem a apresentar maior dificuldade de migrar pelo gel enquanto moléculas menores apresentam maior facilidade para essa movimentação Assim as moléculas são separadas em populações contendo moléculas de tamanho semelhante o que posteriormente será visualizado em um formato que chamamos de bandas no gel formando um gradiente sendo as menores encontradas mais próximas ao polo positivo e as maiores permanecendo próximas ao polo negativo FIGURA 4 ELETROFORESE EM GEL A APARATO PARA ELETROFORESE VERTICAL B APARATO PARA ELETROFORESE HORIZONTAL FONTE A Adaptado de Alberts et al 2008 B Adaptado de Watson et al 2015 Após a separação no gel ele deve ser corado com corantes fluorescentes que se ligam ao DNA possibilitando a visualização das bandas formadas pelas populações da molécula O corante fluorescente mais conhecido e aplicado em géis de eletroforese de DNA e RNA é o brometo de etídio que após a coloração permite que as bandas sejam visualizadas sob luz ultravioleta UV 7 Um detalhe dessa técnica é a escolha de agarose ou poliacrilamida como matriz do gel Embora ambas sejam aplicáveis para o isolamento de moléculas de acordo com seu tamanho é importante ressaltar que a escolha depende do tamanho da molécula a ser isolada e do objetivo do isolamento A poliacrilamida forma um gel de maior resolução ou seja fragmentos de DNA com até mesmo uma única base nitrogenada de diferença podem ser separados No entanto uma menor faixa de tamanho das moléculas pode se movimentar nesse tipo de matriz A agarose por sua vez apresenta menor resolução o que signifi ca que cada banda presente no gel representa um agrupamento de moléculas de tamanho semelhantes No entanto fragmentos maiores de DNA podem facilmente migrar por essa matriz Ainda assim vale lembrar que uma única molécula de DNA íntegra pode conter milhares de genes e portanto apresentar centenas de milhares de pares de bases nitrogenadas o que inviabiliza seu carreamento adequado em uma eletroforese mesmo em um gel de matriz de agarose Além disso o maior interesse nos estudos relacionados ao DNA se dá por fragmentos ou genes específi cos que possam ser facilmente manipulados e por conta disso ferramentas mais precisas como as endonucleases de restrição têm sido utilizadas com o objetivo de fragmentar e manipular o DNA e seus fragmentos para a aplicação em estudos específi cos 22 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO Diversas bactérias produzem naturalmente endonucleases como mecanismo de proteção contra infecções virais já que essas enzimas quebram o DNA viral impedindo o vírus de agredir a bactéria Foi a partir da observação e estudo desse mecanismo de defesa que as endonucleases foram descobertas e desde então essas enzimas passaram a ser isoladas e purifi cadas a partir de colônias de diferentes bactérias sendo aplicadas como enzimas de restrição na manipulação do DNA São diversas as endonucleases isoladas pois cada bactéria apresenta uma específi ca Assista a um esquema exemplifi cando uma eletroforese em gel de agarose em httpswwwyoutubecomwatchvB2KLuzDsuQ Você também pode assistir a uma prática demonstrativa através do link httpswwwyoutubecom watchv08wqFHbFMtg DICA 8 De maneira simplificada a utilização de endonucleases de restrição permite a manipulação do DNA para que ele seja fragmentado em regiões específicas viabilizando que um determinado fragmento seja isolado dos demais fragmentos do DNA Essas enzimas clivam a molécula de DNA em regiões predeterminadas compostas por uma sequência específica de 4 a 8 nucleotídeos chamados de sequência de reconhecimento Um exemplo desse caso é a enzima de restrição chamada EcoRI a qual é amplamente utilizada e cuja sequência de reconhecimento é composta por apenas quatro nucleotídeos 5AATT3 Figura 5 Cada endonuclease de restrição apresenta uma região de clivagem conhecida e específica permitindo o controle dos sítios de clivagem e a previsão do tamanho dos fragmentos que serão originados FIGURA 5 EXEMPLO DE RESTRIÇÃO REALIZADO COM A ENDOCNUCLEASE DE RESTRIÇÃO ECORI E A SEPARAÇÃO POR ELETROFORESE EM GEL DOS FRAGMENTOS OBTIDOS FONTE Watson et al 2015 p 150 Após o tratamento das amostras de DNA com uma ou mais endonucleases de restrição é possível submeter a amostra a uma separação por eletroforese em gel como previamente descrito promovendo a identificação mais precisa pela quantidade de bases nitrogenadas e o isolamento do fragmento de interesse a ser avaliado Figura 5 9 23 HIBRIDIZAÇÃO Antes de discutirmos sobre o que é a hibridização e como ela é aplicada no isolamento de fragmentos de DNA é preciso que mais alguns conceitos básicos relativos a essa tão importante molécula sejam relembrados Como já discutimos anteriormente o DNA é composto por duas fitas que quando ligadas formam uma estrutura em dupla hélice Cada uma dessas fitas é complementar a outra e é formada por uma sequência composta pelos quatro nucleotídeos A T C e G O que ainda não discutimos neste livro é que essas duas fitas embora sejam complementares e ligadas formando a dupla hélice podem ter suas ligações entre os nucleotídeos também chamados de pares de bases rompidas quando em condições adequadas de salinidade temperatura e pH disponibilizando duas fitas simples Esse processo é chamado de desnaturação No entanto as bases nitrogenadas mesmo após a desnaturação tendem a se ligar novamente com suas bases complementares ou seja A se liga com T e C se liga com G em um processo chamado de anelamento o qual promove a renaturação do DNA restaurando a dupla fita Essa possibilidade de desnaturação e reanelamento dos pares de bases de um fragmento de DNA permitiu que algumas manipulações em prol do isolamento e identificação desses fragmentos fossem desenvolvidas Assim foi elaborada a técnica de hibridização a qual se resume à promoção do anelamento entre duas fitas simples de origem distintas sejam elas fitas de DNA ou RNA inclusive podendo ser a hibridização entre uma fita de RNA com uma de DNA Mas você pode se perguntar como o processo de hibridização poderia promover o isolamento e identificação de algum fragmento específico Pois bem para esse propósito são utilizadas as chamadas sondas que são fitas de DNA com uma sequência de nucleotídeos complementar ao gene ou fragmento de interesse mas que carregam em sua estrutura um marcador que pode ser radioativo ou químico Desta forma em condições adequadas a sonda é capaz de detectar a região da fita desnaturada do DNA da amostra que é complementar à sua sequência e então anelarse a ela permitindo que por meio do marcador seja visualizada a presença do fragmento de interesse Figura 6 As principais aplicações da técnica de hibridização são chamadas de hibridização in situ Northern e Southernblotting 10 FIGURA 6 ESQUEMA DO PROCESSO DE LIGAÇÃO DA SONDA DE HIBRIDIZAÇÃO COM UMA FITA SIMPLES DE DNA FONTE Adaptado de Alberts et al 2008 Na hibridização in situ as sondas de ácidos nucleicos quimicamente marcadas são aplicadas como o próprio nome diz no local em que a molécula de interesse deve ser encontrada Assim é possível determinar a presença de uma determinada sequência de DNA ainda nos cromossomos ou verificar a existência de um RNA específico dentro de uma célula sem que para isso a amostra seja homogeneizada e o material de interesse extraído evitando assim a perda ou degradação das fitas de nucleotídeos durante esses processos Figura 7 Nesse caso específico a amostra é submetida a uma elevação de pH que permite a separação da fita dupla de DNA e consequentemente o pareamento da sonda de ácidos nucleicos que foi aplicada A hibridização in situ pode ainda ser aplicada para determinar a localização de um RNA específico em um tecido célula ou até mesmo em pequenos organismos ou seja os padrões de expressão diferencial do gene Para esse objetivo no entanto o tecido de interesse deve ser fixado de uma forma específica que envolve por exemplo o tratamento com proteinases e detergentes para a quebra de estruturas celulares que possam impedir a penetração das sondas de hibridização 11 FIGURA 7 HIBRIDIZAÇÃO IN SITU REALIZADA EM UM CROMOSSOMO FONTE Alberts et al 2008 p 537 Para a aplicação da técnica de hibridização northernblotting assim como para a southernblotting um fracionamento prévio por meio de eletroforese em gel deve ser aplicado para a separação em bandas dos RNAs no caso da northern ou dos fragmentos de DNA para a aplicação da southern Na northernblotting a população de RNA mensageiros mRNAs extraída da amostra de interesse é submetida à eletroforese em gel e na sequência as bandas formadas são transferidas para uma membrana normalmente de nitrocelulose permitindo que o padrão de bandas formado no gel gere uma impressão na membrana e disponibilizando as moléculas de mRNA para a ligação com as sondas de hibridização Esse processo de impressão é chamado de blotting Assim após o blotting na membrana ela é incubada com a sonda de DNA marcada formada pela sequência molde do gene de interesse a ser avaliado promovendo assim a hibridização Nesse processo após incubação se a sequência complementar à sonda aplicada estiver presente na amostra ela será marcada e sua presença será identificada por meios químicos ou de autorradiografia dependendo da marcação presente na sonda utilizada Figura 8 Além disso é possível determinar o tamanho da sequência uma vez que durante o processo podem ser aplicadas no gel e transferidas para a membrana amostras que contenham RNAs de tamanhos conhecidos os chamados padrões de RNA Essa técnica normalmente é aplicada quando se busca comparar situações distintas por exemplo utilizando amostras controle que sirvam como padrão para a expressão do gene de interesse Assim após o processo de hibridização pode ser avaliado por exemplo se o gene de interesse se encontra expresso em ambas as amostras bem como se a quantidade e o tamanho das moléculas de mRNA são diferentes entre elas elucidando por vezes a participação de tal gene em uma determinada condição patológica 12 FIGURA 8 REPRESENTAÇÃO DA IDENTIFICAÇÃO DE UM FRAGMENTO DE DNA ALVO POR MEIO DE HIBRIDIZAÇÃO EM MEMBRANA BLOTTING FONTE Watson et al 2015 p 152 Similarmente ao northernblotting o southernblotting utiliza sondas de DNA molde as quais são marcadas quimicamente ou com radiação No entanto nessa técnica são avaliados os padrões das sequências de nucleotídeos de genes no DNA ou seja ela identifica o tamanho do fragmento de um gene e não o seu padrão de expressão como no northernblotting Como dito anteriormente o DNA é uma fita dupla polinucleotídica e bastante extensa que contém a informação dos genes Assim para que seja possível a sua movimentação em gel por meio da eletroforese ela deve ser clivada em fragmentos menores portanto as endonucleases de restrição são as ferramentas mais adequadas a serem utilizadas Após a clivagem o DNA é submetido à eletroforese em gel e assim os fragmentos obtidos serão fracionados de acordo com seu tamanho Antes do processo de transferência para a membrana ou blotting os fragmentos de DNA presentes no gel devem ser submetidos ao processo de desnaturação o qual se dá normalmente pela imersão do gel em solução alcalina Dessa forma os fragmentos de DNA estarão prontos para a transferência para a membrana de nitrocelulose onde serão incubados com as sondas de hibridização e posteriormente identificados quanto à sua presença e tamanho como previamente descrito para o northernblotting Com a aplicação da técnica southernblotting é possível caracterizar a estrutura de um gene por meio da comparação dos fragmentos obtidos e marcados na amostra de interesse com mapas de restrição previamente determinados para o mesmo gene ou seja é possível identificar a ocorrência de alguns tipos de alterações na sequência do gene dos organismos que estão sendo testados como por exemplo a inserção ou deleção de pequenas sequências de nucleotídeos as quais podem estar associadas a condições deletérias ou doenças 13 3 CLONAGEM DE DNA Como já observamos as técnicas de biologia molecular permitem a manipulação e a investigação das moléculas de DNA dos genes da expressão desses genes entre outras tantas aplicações No entanto o isolamento de fragmentos de DNA de interesse presentes em uma amostra fornece apenas pequenas quantidades muitas vezes ínfimas quando se trata de amostras raras de material para as manipulações subsequentes Nesse sentido o desenvolvimento de técnicas de clonagem permitiu que rapidamente fossem obtidas cópias idênticas do fragmento de interesse fornecendo a quantidade de material adequado para a aplicação em outras análises Conceitualmente a clonagem de DNA se refere à produção dentro de uma célula de diversas cópias de uma sequência específica de um fragmento de DNA A clonagem de DNA depende da utilização de um vetor do fragmento de DNA e posteriormente de um organismo hospedeiro Para iniciar o processo de clonagem o fragmento de DNA de interesse deve ser inserido em uma molécula de DNA genômico com capacidade de autorreplicação ou seja o DNA do vetor A nova molécula de DNA formada pela junção do fragmento de interesse com o DNA do vetor é chamada de DNA recombinante Para a formação do DNA recombinante é necessária a atuação de enzimas de restrição e de enzimas de ligação A partir da clivagem de uma molécula de DNA por uma enzima de restrição cuja sequência de clivagem é conhecida formamse os fragmentos de DNA que podem ser selecionados e ligados ao DNA do vetor em que pela ação da enzima DNA ligase ficarão inseridos e formarão o DNA recombinante Os vetores mais comumente utilizados são os vetores plasmidiais pequenas moléculas de DNA circular capazes de se autorreplicar que contêm sítios conhecidos de ligação a determinadas enzimas de restrição o que permite manipulações específicas na fita de DNA Esses pequenos DNA circulares atualmente utilizados como vetores foram desenvolvidos a partir de moléculas maiores de DNA circular que podem estar naturalmente presentes em bactérias inclusive conferindo a elas a resistência a antibióticos além de apresentarem capacidade de replicação de forma independente da replicação da bactéria estando muitas vezes presentes em várias cópias dentro de uma única bactéria Outro tipo de vetor por vezes também utilizado para a clonagem de DNA são os fagos ou vírus bacterianos que devido à sua capacidade de infectar bactérias inserindo seu material genético nelas foram manipulados modificados e adaptados para a aplicação na biologia molecular Para a inserção do fragmento de interesse do DNA clivado por uma enzima de restrição em um vetor o DNA circular do vetor deve ser clivado com a mesma enzima de restrição formando uma fita linear em que o fragmento de interesse possa se ligar às extremidades Dessa forma por meio da atividade da enzima DNA ligase o DNA 14 vetorial e o fragmento inserido são ligados covalentemente formando novamente uma molécula de DNA circular mas desta vez recombinante No entanto como já falamos a clonagem deve acontecer dentro de uma célula ou seja em um organismo hospedeiro O processo de inserção do vetor no organismo hospedeiro é chamado de transformação e ocorre naturalmente em diversas bactérias que apresentam competência genética ou seja que apresentam a capacidade de incorporar fragmentos ou moléculas de DNA presentes no meio externo chamadas de bactérias competentes No entanto o organismo hospedeiro mais comumente utilizado no processo de clonagem é a bactéria Escherichia coli a qual diferentemente da maioria das outras bactérias não apresenta essa capacidade ou seja não é uma bactéria naturalmente competente Porém mesmo não apresentando naturalmente a habilidade de internalização de material genético externo a E coli pode ser manipulada para que o vetor plasmidial seja internalizado por ela Após a transformação devido à capacidade de autorreplicação do vetor associada às elevadas taxas de replicação bacteriana o fragmento de DNA inserido no vetor será rapidamente multiplicado durante o processo de crescimento bacteriano em meio de cultivo produzindo assim os clones do fragmento de DNA Figura 9 FIGURA 9 PROCEDIMENTO PARA CLONAGEM DE UM FRAGMENTO DE DNA FONTE Adaptado de Alberts et al 2008 15 Outros detalhes da técnica de clonagem podem ser encontrados em httpskasvicombrclonagemmoleculardnarecombinante DICA Embora a taxa de clonagem e multiplicação celular seja elevada o processo de transformação no entanto não apresenta elevada efi ciência portanto apenas algumas das células bacterianas internalizarão o vetor plasmidial Dessa forma após a multiplicação celular inicial é necessário que seja feito um processo de seleção das bactérias que contêm o vetor plasmidial Para tanto as bactérias são transferidas para um meio de cultivo na presença de antibiótico e neste caso aquelas que internalizaram o vetor apresentarão resistência ao antibiótico e permanecerão se multiplicando enquanto aquelas que não internalizaram o vetor não se propagarão Uma importante aplicação da clonagem de DNA é a formação das bibliotecas de DNA as quais serão discutidas com mais detalhes ainda nesta unidade Além das bibliotecas de DNA a clonagem precede diversas análises de biologia molecular pois após a execução de todas as etapas descritas anteriormente as moléculas de DNA recombinante podem ser extraídas Esse processo fornece grande quantidade de material do qual os clones do fragmento de DNA de interesse podem ser isolados e na sequência aplicados em outras análises como por exemplo a caracterização do fragmento inserido por meio do sequenciamento dos nucleotídeos presentes nele 16 Neste tópico você adquiriu certos aprendizados como A partir dos estudos sobre a molécula de DNA sua estrutura em dupla hélice e dos mecanismos celulares envolvidos nos processos de replicação do DNA e expressão gênica as técnicas avançadas de biologia molecular começaram a ser desenvolvidas Para o estudo do DNA devido à complexidade diversas manipulações podem ser empregadas como o isolamento a clonagem e o sequenciamento O isolamento de fragmentos de DNA pode ser realizado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida Ainda podem ser usadas técnicas mais complexas como a hibridização para a identificação de um fragmento ou gene específico A clonagem de DNA envolve a utilização de enzimas de restrição vetores e um organismo hospedeiro como a bactéria Escherichia coli Através dessa técnica rapidamente podem ser obtidas muitas cópias ou clones de um mesmo fragmento de DNA RESUMO DO TÓPICO 1 17 1 Quais são os princípios físicos que permitem que a eletroforese em gel seja aplicada no isolamento de fragmentos de DNA a Cargas negativas dos fragmentos de DNA corrente elétrica e polaridade do gel b Cargas positivas dos fragmentos de DNA corrente elétrica e porosidade da matriz do gel c Cargas negativas dos fragmentos de DNA corrente elétrica e porosidade da matriz do gel d Cargas negativas do gel elevação de temperatura e corrente elétrica 2 Com relação à clonagem explique como é formado o DNA recombinante e descreva as principais etapas do processo de formação dos clones 3 Descreva brevemente as principais diferenças das técnicas de hibridização in situ southern e northernblotting 4 Quais as principais características que um vetor e uma célula hospedeira devem conter para que possam ser utilizadas no processo de clonagem AUTOATIVIDADE 30 19 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PCR 1 INTRODUÇÃO Para entendermos com clareza como a técnica de reação em cadeia da polimerase a chamada PCR acontece é preciso antes relembrar como a fita de DNA se replica in vivo pois foi a partir desse entendimento que enzimas e moléculas foram manipuladas permitindo que um processo bastante similar de replicação fosse realizado dentro de um tubo de ensaio in vitro O primeiro conceito a ser relembrado é que a replicação do DNA é semiconservativa ou seja cada nova cadeia dupla de DNA é formada por uma fita da cadeia original a fita conservada e uma fita nova que foi sintetizada utilizando a fita conservada como molde Figura 10 Esse processo é relativamente simples de entender no entanto existem diversas outras moléculas além dos nucleotídeos que são importantes e requisitados para que a replicação do DNA ocorra FIGURA 10 DUPLICAÇÃO SEMICONSERVATIVA DA FITA DUPLA DE DNA FONTE Junqueira e Carneiro 2012 p 182 UNIDADE 1 TÓPICO 2 20 A principal molécula envolvida no processo de replicação do DNA é uma enzima chamada DNA polimerase que como o próprio nome indica é responsável pela polimerização da nova fita de DNA sendo a enzima que alinha os novos nucleotídeos de acordo com a sequência obtida a partir da fita molde formando assim uma nova fita de DNA Aqui vale ressaltar que o sentido de síntese da fita de DNA se dá sempre de 5 para 3 ou seja o novo nucleotídeo sempre será inserido na terminação 3 da fita que está sendo moldada por meio da ligação covalente promovida por moléculas de fosfato entre o carbono 3 da desoxirribose que já está na fita e o carbono 5 da desoxirribose do próximo nucleotídeo a ser inserido na fita Outra informação importante é que a DNA polimerase necessita de uma extremidade 3 disponível para a inserção do novo nucleotídeo o que nos leva ao conceito de primer ou iniciador No processo de replicação realizado in vivo existem enzimas que são capazes de formar pequenas sequências de nucleotídeos conhecidas como sequências iniciadoras utilizando a fita molde de DNA sem a necessidade de uma extremidade 3 para isso Essas enzimas denominadas primases são de extrema importância no processo de replicação pois são responsáveis por fornecer um sítio de ação para a DNA polimerase iniciar o processo de replicação do restante da fita Entendido esse conceito as técnicas de biologia molecular lançaram mão de primers artificialmente sintetizados também chamados de oligonucleotídeos sintéticos que podem ser facilmente sintetizados e utilizados como iniciadores no processo de amplificação in vitro Além dos componentes citados fita molde de DNA desoxirribonucleotídeos enzimas sintetizadoras de primers e DNA polimerase o processo de replicação ainda depende de outras enzimas e cofatores como por exemplo as enzimas que farão a abertura da cadeia dupla e o desenrolamento da dupla hélice como a DNA helicase e a topoisomerase Com o entendimento de que o processo de replicação do DNA acontecia naturalmente e o conhecimento da estrutura química da molécula de DNA foi possível aplicar os mesmos conceitos utilizando por exemplo DNA polimerases isoladas de bactérias primers sintetizados e manipulações de pH salinidade e temperatura para promover a replicação do DNA em ciclos sucessivos com uma ou poucas moléculas de DNA sendo utilizadas como molde dando origem assim ao que hoje conhecemos como a técnica de PCR PCR é uma sigla que vem do inglês Polymerase Chain Reaction que significa reação em cadeia da polimerase O termo se refere à técnica base para a rápida replicação também chamada de amplificação de um fragmento de DNA Essa técnica permitiu que fragmentos específicos de uma molécula de DNA fossem amplificados com grande eficácia e rapidez dentro de um tubo de ensaio em poucas horas Um processo similar apenas era possível com a utilização da técnica de clonagem no entanto embora a clonagem seja eficiente ela requer no mínimo um vetor e um organismo hospedeiro para a replicação além de alguns dias para que o crescimento do hospedeiro produza quantidade suficiente de material replicado 21 Com a utilização da PCR em apenas alguns minutos é possível multiplicar de maneira expressiva a quantidade do fragmento de DNA que se deseja estudar tornando a amostra repleta desse fragmento e possibilitando uma série de análises subsequentes como por exemplo a quantificação da expressão de um gene em diferentes indivíduos ou tecidos o sequenciamento dos nucleotídeos que compõem a molécula de interesse ou a comparação entre a expressão de um determinado gene em amostras provenientes de diferentes condições 2 PCR PASSO A PASSO Para que seja realizada uma PCR de um fragmento específico de DNA por exemplo um gene o primeiro passo é conhecer a sequência de nucleotídeos desse gene ou parte da sequência pois como dito anteriormente para que o processo de replicação aconteça é necessário que seja utilizado um primer ou oligonucleotídeo sintético Esse primer deve ser uma sequência curta com cerca de 18 a 22 nucleotídeos que seja complementar ao gene de interesse Para a aplicação em PCR é utilizado um par de primers cada um para uma das duas fitas de DNA sempre em sentido 53 Obter um par de primers específico para o gene de interesse assegura que nas etapas seguintes do processo o material correto seja amplificado promovendo uma purificação da amostra para a fragmento de interesse Após a síntese dos primers e a extração do material genético da amostra de interesse é iniciada a PCR em si Nessa reação são adicionados os primers um coquetel contendo os quatro desoxinucleotídeos dNTPs A T G e C a enzima DNA polimerase cofatores enzimáticos como o magnésio Mg e o material extraído dando início ao processo de amplificação Devido à afinidade entre os nucleotídeos A e T e C e G os primers tendem a se ligar à sua sequência complementar no fragmento de DNA No entanto para que isso ocorra é necessário que haja a abertura da dupla fita liberando os nucleotídeos de cada uma das fitas simples que serão originadas a se ligarem aos seus primers correspondentes Para que esse processo ocorra o DNA é desnaturado sendo submetido por um curto período a uma alta temperatura o que permite a separação das fitas e a ligação dos primers em suas sequências complementares em cada uma das fitas processo chamado de anelamento de primers Após a ligação dos primers a cada uma das fitas simples de DNA é formada uma pequena região de fita dupla composta pela fita molde do DNA desnaturado e do pequeno fragmento do primer Assim uma extremidade 3 do primer fica disponível para que a DNA polimerase possa iniciar o processo de inserção dos dNTPs correspondentes à fita molde ou como comumente chamado o processo de extensão formando uma nova fita dupla ao fim composta pela fita molde e uma nova fita recém polimerizada e complementar ao molde 22 Esse simples processo de desnaturação anelamento e extensão em apenas alguns minutos duplica a quantidade de DNA disponível na amostra pois de acordo com o princípio semiconservativo cada uma das duas fitas formadoras da cadeia dupla do DNA após o processo de replicação dará origem a uma nova fita dupla composta pela fita conservada e uma nova fita Ou seja a cada ciclo da PCR a amplificação duplica o material disponibilizado pelo ciclo anterior sendo normalmente necessário cerca de 20 a 40 ciclos de amplificação para a obtenção de uma grande quantidade de cópias provenientes de apenas um fragmento de DNA Fazendo um simples cálculo partindo de um único fragmento ao final do primeiro ciclo de amplificação seriam obtidos dois fragmentos idênticos após o segundo ciclo seriam obtidos quatro fragmentos no terceiro ciclo estariam disponíveis oito fragmentos e assim sucessivamente Figura 11 FIGURA 11 ESQUEMA DA RÁPIDA AMPLIFICAÇÃO DE UMA FRAGMENTO DE DNA DURANTE A PCR FONTE Watson et al 2015 p 159 23 Um detalhe interessante é que como falamos o método de desnaturação do DNA se dá por meio da elevação da temperatura chegando a cerca de 95 ºC Por vezes esse processo pode inviabilizar a ação de enzimas como a DNA polimerase sendo necessária a utilização de uma DNA polimerase que seja termoestável e termoresistente Nesse sentido os avanços na biologia e biotecnologia proporcionaram já nos anos 80 a obtenção da DNA polimerase presente na bactéria Thermus aquaticus um organismo que vive em temperaturas elevadas e com sua DNA polimerase adaptada para resistir a essas temperaturas A DNA polimerase obtida desse organismo é a chamada Taq polimerase e é uma das DNA polimerases mais utilizadas nas reações de PCR Outra informação interessante é que embora a PCR pareça um processo simples e rápido em sua origem ela era executada por meio de mudanças de temperatura promovidas em banhomaria sendo necessário que o pesquisador cronometrasse o tempo de elevação e retomada de temperatura em cada ciclo e mudasse os tubos de ensaio entre os banhomaria com as diferentes temperaturas necessárias por volta de 95 ºC para desnaturação 6065 ºC para anelamento e 72 ºC para extensão Porém atualmente todo esse processo foi automatizado e é realizado em um equipamento chamado termociclador que como o próprio nome indica é um equipamento capaz de mudar rapidamente de temperatura elevando ou diminuindo a temperatura em segundos além de apresentar opções de programação para que os ciclos sejam repetidos pela quantidade de vezes necessária Então resumidamente o conceito básico da técnica de PCR é baseado na desnaturação do fragmento de DNA seguido do anelamento dos primers nas fitas desnaturadas e da extensão da nova fita pela DNA polimerase sendo todo o processo realizado em ciclos repetidos uma reação em cadeia que proporcionam a amplificação da quantidade de fragmentos iguais ao fragmento de interesse para o estudo Figura 11 Diante disso você pode se perguntar como essa quantidade de material genético amplificado pode ser analisada em quais aplicações a técnica de PCR pode ser aplicada que tipo de informações a amplificação de um fragmento de DNA pode fornecer entre outras tantas questões que tentaremos discutir ao longo deste tópico 3 TRANSCRIÇÃO REVERSA Uma das técnicas de biologia molecular bastante utilizada na pesquisa de expressão diferencial de genes é uma adaptação da PCR chamada de RTPCR que na verdade é simplesmente uma reação de transcrição reversa seguida de uma PCR Ainda não falamos sobre a transcrição reversa mas não vai ser tão difícil entender como ela funciona se lembrarmos que para que um gene seja expresso ele deve ser transcrito em mRNA o qual por sua vez carregará a informação contida no gene para que seja traduzida no citoplasma proporcionado a síntese proteica Esta é a chave da 24 questão se desejamos avaliar a expressão diferencial de um gene por exemplo em diferentes tecidos de um mesmo organismo é preciso que se avalie o mRNA contido nesse tecido pois é ele que será traduzido em proteínas e não o DNA genômico já que o DNA genômico carrega a informação de todos os genes de um organismo e em todas as suas células não sendo representativo da expressão de algum gene específico Para a avaliação da expressão diferencial é preciso avaliar o mRNA Podese pensar que basta proceder com a extração do mRNA de interesse e prosseguir com sua amplificação na PCR mas precisamos entender e relembrar que a DNA polimerase utilizada na PCR não consegue atuar em uma molécula de fita simples como a de um RNA para executar a extensão Sendo assim para que ocorra a síntese de uma fita dupla que possa servir de molde para a DNA polimerase deve ser executada a reação de transcrição reversa Portanto a transcrição reversa é um passo essencial quando se objetiva amplificar na PCR um fragmento de polinucleotídeos oriundo de uma fita simples de RNA A transcrição reversa é uma reação que ocorre pela ação da enzima transcriptase reversa ou RT Essa enzima é uma DNA polimerase dependente de RNA ou seja ela é capaz de sintetizar uma fita de DNA utilizando como molde a fita simples de RNA Sua descoberta se deu a partir da observação de que quando os retrovírus cujo material genético é um RNA infectam um hospedeiro o RNA viral é convertido em DNA A reação de transcrição reversa é bastante similar àquela descrita na PCR sendo necessário para tanto a adição de oligonucleotídeos sintéticos da enzima transcriptase reversa do coquetel contendo os quatro dNTPs da amostra de RNA e de cofatores enzimáticos Para a reação de RT Figura 12 todo o conteúdo de RNA deve ser extraído da amostra de interesse Para que o gene de interesse seja estudado todo o conteúdo de RNAs deve ser retrotranscrito em DNA formando o chamado DNA complementar ou cDNA Ou seja toda a população de RNAs expressa naquela amostra naquele momento será convertida em cDNA Para tanto os oligonucleotídeos adicionados ou primers devem apresentar a capacidade de se anelar à maior parte das moléculas de RNA disponíveis na amostra permitindo assim que a transcriptase reversa forme a dupla fita baseada no molde desses RNAs Um exemplo desses oligonucleotídeos são os chamados oligodT que são fitas polinucleotídicas curtas formadas pelo nucleotídeo T capazes de se anelar à cauda poli A presente na maioria dos mRNAs A transcrição reversa assim como a PCR depende da submissão das amostras à temperatura ideal para o anelamento dos primers e extensão das fitas No entanto ela não é realizada em ciclos pois é necessário que apenas uma fita de cDNA correspondente a cada mRNA seja polimerizada Assim a partir do momento em que o RNA está convertido em cDNA ele já pode ser utilizado na PCR e nessa etapa com a utilização dos primers específicos para o gene de interesse apenas o cDNA formado a partir do mRNA desse gene será amplificado 25 FIGURA 12 TRANSCRIÇÃO REVERSA FONTE Adaptado de Alberts et al 2008 4 PCR QUALITATIVO VS PCR QUANTITATIVO Agora que você já sabe que a técnica de PCR produz uma série de cópias de um determinado fragmento de DNA ou cDNA de uma maneira bastante rápida e eficiente vamos discutir um pouco sobre como essa reação pode fornecer dados que serão avaliados em uma pesquisa Nesse sentido a primeira pergunta a se fazer é qual o objetivo da pesquisa Por exemplo se você estiver estudando a expressão de um gene é importante saber se ele apenas está sendo expresso em determinado tecido ou tipo celular ou se é necessário que se obtenha a informação do quanto esse gene está expresso diferente nessas amostras Respondendo a essa pergunta é possível definir se a PCR que melhor se aplica ao seu objetivo é qualitativa ou quantitativa Uma PCR qualitativa é aquela que vai indicar a presença de um fragmento específico de DNA ou cDNA em uma amostra sem fornecer dados numéricos relativos ao quanto o gene estava expresso Essa técnica é bastante simples e basicamente se resume à execução dos ciclos de desnaturação anelamento e extensão já descritos em maiores detalhes e posteriormente a visualização do produto resultante da amplificação Para a visualização das cópias obtidas é necessário submeter as amostras a uma eletroforese em gel e corálas para a visualização por exemplo utilizando o brometo de etídio Dessa forma é possível observar se as amostras em estudo apresentam o gene que se buscou amplificar Ainda de maneira indireta é possível de certa forma comparar a expressão de um gene em diferentes condições ou amostras por meio da visualização das bandas no gel Existem programas computacionais capazes de mensurar a área que cada uma 26 das amostras ocupa no gel e assim comparálas indicando possíveis aumentos ou diminuições na expressão do gene No entanto para uma avaliação mais confiável da diferença nos níveis de expressão de um gene utilizamos uma técnica mais eficiente e tão simples quanto a PCR qualitativa a PCR quantitativa também conhecida como PCR em tempo real cuja sigla correta é qPCR A qPCR é similar à PCR qualitativa No entanto ela fornece informações precisas relativas à quantidade de expressão da um gene permitindo comparações entre amostras provenientes de diferentes condições como por exemplo associadas a doenças podendo até mesmo fornecer informações quanto ao número exato de cópias de um determinado fragmento de DNA ou cDNA que foram replicadas No entanto embora a reação da PCR seja igual àquela previamente descrita o equipamento necessário para a qPCR é um termociclador associado a um detector capaz de quantificar a amplificação dos fragmentos de DNA ao final de cada ciclo ou seja em tempo real justificando assim o motivo dessa técnica ser conhecida como PCR em tempo real Para que o equipamento detecte o produto da amplificação são adicionados corantes fluorescentes ou sondas específicas capazes de emitir fluorescência quando se encontram ligados ou intercalados à fita de DNA no meio de reação da PCR Dessa forma a cada nova fita formada a fluorescência emitida pela amostra é detectada sendo proporcional à quantidade de material disponível para iniciar a amplificação Assim após a detecção ao longo de sucessivos ciclos é possível visualizar por meio das curvas de amplificação e numericamente comparar a expressão do gene de interesse por meio dos Cts do inglês cycle threshold Após a estabilização da reação o equipamento é capaz de determinar em que momento a fluorescência detectada é apenas proveniente das amostras que estão sendo amplificadas ignorando o ruído chamado de background e assim determinar a linha de corte ou threshold Assim quando em qual ciclo de amplificação a fluorescência emitida por uma amostra alcança a fluorescência determinada pela linha de corte demonstrando o momento em que a fluorescência apresentada está livre de ruídos sendo essencialmente a representação da amplificação da amostra teste é determinado o Ct desta amostra Dessa forma observando as curvas de amplificação é possível determinar em qual ciclo de amplificação cada uma das amostras atingiu o threshold De maneira simplificada quanto menor o Ct de uma amostra maior a quantidade de material estava disponível para iniciar a amplificação do fragmento de interesse Figura 13 Você sabia que um dos primeiros testes diagnósticos para a detecção do coronavírus COVID19 é uma PCR mais especificamente uma RTqPCR Saiba mais consultando httpswwwyoutubecomwatchv8kitVdVO1Et16s e httpswwwuolcombrvivabemnoticiasredacao20200317saibacomo funcionaopcroexamequedetectaonovocoronavirushtm DICA 27 FIGURA 13 CURVA DE AMPLIFICAÇÃO DA PCR QUANTITATIVA QPCR CT CYCLE THRESHOLD FONTE A autora Mais detalhes sobre as técnicas da PCR e qPCR podem ser facilmente encontrados em artigos científi cos como Bustin et al 2009 Moreira 2015 Pabinger et al 2014 e Pfaffl 2004 DICA 28 RESUMO DO TÓPICO 2 Neste tópico você adquiriu certos aprendizados como O princípio que norteou o desenvolvimento da técnica da PCR foi a observação de como o processo de replicação ocorre in vivo sendo considerado o princípio da replicação semiconservativa do DNA e a ação de diversas enzimas como a DNA polimerase Para que ocorra a PCR é necessário que a fita dupla de DNA seja desnaturada que os primers se anelem às fitas simples e que a DNA polimerase faça a extensão da nova fita por meio da inclusão dos dNTPs complementares à fita molde A transcrição reversa é uma reação de formação de uma fita dupla de DNA a partir do molde uma fita simples de RNA o DNA formado é chamado de DNA complementar ou cDNA e a DNA polimerase responsável pela reação é a Transcriptase reversa Existem diferentes tipos de PCR a qualitativa ou convencional e a quantitativa ou qPCR Na qualitativa o material amplificado pode ser observado apenas ao final da reação por meio de eletroforese em gel enquanto na quantitativa a amplificação é detectada em tempo real por meio de fluorescência e fornece dados numéricos relativos à quantidade de material que está sendo amplificado na reação 29 1 Explique como ocorre cada uma das etapas da PCR e sua função para a reação como um todo 2 Quais componentes são indispensáveis para a PCR a Fita molde de DNA oligodT Transcriptase reversa e dNTPs b Fita molde de RNA oligodT Transcriptase reversa e dNTPs c Fita molde de RNA primers DNA polimerase e dNTPs d Fita molde de DNA primers DNA polimerase e dNTPs 3 Por que a reação de transcrição reversa é importante para estudos de expressão de um gene 4 Explique como acontece a qPCR e qual sua principal diferença em relação à PCR qualitativa AUTOATIVIDADE 30 31 TÓPICO 3 BIBLIOTECAS DE DNA E CDNA 1 INTRODUÇÃO Como você deve se lembrar discutimos no Tópico 1 sobre o isolamento de DNA É relativamente simples isolar um determinado fragmento de DNA que contenha o gene de interesse simplesmente utilizando algumas das ferramentas e técnicas já abordadas como a clivagem do DNA genômico com enzimas de restrição e posteriormente isolando e purificando o fragmento de interesse dos demais fragmentos por meio de uma eletroforese em gel Realmente esse processo é simples quando se trata do isolamento de um gene pertencente a um organismo com o DNA genômico pequeno composto por alguns milhares de nucleotídeos pois nesse caso a aplicação de enzimas de restrição produziria poucos fragmentos facilmente separáveis No entanto quando se trata de organismos com o genoma mais complexo compostos por centenas de milhares de nucleotídeos com sequências codificantes para uma infinidade de diferentes genes a fragmentação desses DNAs genômicos com enzimas de restrição produz uma quantidade tão grande de fragmentos que mesmo em um gel bastante extenso torna se inviável o isolamento e a purificação de apenas um gene específico Você já deve estar ciente de que atualmente diversos organismos incluindo os seres humanos têm seus genes estudados por diversos grupos de pesquisa o que inclusive tem trazido avanços significativos por exemplo para as áreas da biologia e da medicina elucidando mecanismos e causas de diversas síndromes e doenças Nesse sentido fica fácil imaginar que o problema da fragmentação e isolamento de genes provenientes de um DNA genômico complexo foi resolvido Isso foi possível com o advento das chamadas bibliotecas de DNA pois com essa técnica houve a simplificação do processo de isolamento e purificação de um gene presente em uma população de fragmentos de DNA O termo biblioteca se aplica perfeitamente ao processo pois com essa técnica é produzida uma coleção de fragmentos facilmente identificáveis nos quais podese fazer uma busca por um gene específico e prosseguir com a amplificação e outros estudos com uma amostra purificada para tal gene Assim podese dizer que a construção de uma biblioteca de DNA pode ser o primeiro passo para o isolamento de um gene específico UNIDADE 1 32 2 BIBLIOTECA DE DNA OU GENÔMICA Para a construção de uma biblioteca de DNA são aplicadas as técnicas de clivagem com enzimas de restrição e clonagem em vetor as quais já foram discutidas no Tópico 1 no entanto com uma abordagem um pouco diferenciada como iremos descobrir O primeiro passo para formar uma biblioteca de DNA é extrair e isolar o DNA genômico de uma célula tecido ou até mesmo de um organismo Em seguida o DNA extraído é clivado com uma enzima de restrição formando centenas a milhares de fragmentos de DNA os quais por sua vez são inseridos em vetores idênticos que foram clivados com a mesma enzima permitindo assim que as extremidades complementares dos fragmentos de DNA e dos vetores sejam unidas por meio da ação da enzima DNA ligase Nessa etapa do processo esperase que cada fragmento formado pela clivagem se ligue a um vetor formando uma grande população de vetores cada um contendo um diferente fragmento originado do DNA genômico isolado Após a ligação com o vetor a biblioteca em si é formada por meio da transformação ou seja da inserção desses vetores em células hospedeiras como em células da bactéria E coli procedendo com a clonagem dos diferentes fragmentos Figura 14 FIGURA 14 ESQUEMA DA FORMAÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE DNA FONTE Adaptado de Alberts et al 2008 33 Sabese que em geral cada bactéria internaliza apenas um vetor Assim após a diluição das bactérias e sua aplicação em placas de cultivo cada colônia formada terá apenas células contendo um dos fragmentos de DNA Desse modo por meio do rápido processo de multiplicação celular da E coli em poucas horas serão formados diversos clones dos fragmentos inseridos sendo cada um encontrado em uma diferente colônia de crescimento Com a formação das diversas colônias bacterianas cada uma contendo um dos diferentes fragmentos de DNA a biblioteca estará formada e nela poderão ser buscados fragmentos específicos de DNA utilizando por exemplo a técnica de hibridização A identificação de uma colônia de bactérias que contenha um fragmento específico de DNA por meio da hibridização aqui chamada de hibridização em colônia é bastante semelhante às técnicas previamente descritas do Southern e Northern blot Basicamente após o crescimento das colônias bacterianas em placas de cultivo contendo meio sólido uma membrana é utilizada para coletar uma pequena porção das células presentes em cada uma das colônias Nessa etapa a membrana é colocada em contato com as colônias na placa sendo que algumas das células presentes em cada uma dessas colônias se aderem à membrana formando uma espécie de impressão das colônias presentes na placa Essas células aderidas à membrana sofrem um processo de lise celular para que o DNA seja liberado porém permaneça ainda aderido à membrana em posição relativa àquela da sua colônia de origem na placa Após a exposição do DNA a membrana é incubada com sondas de hibridização marcadas complementares à uma porção do gene de interesse as quais permitirão a visualização da posição dos clones que contenham o fragmento de interesse na membrana e consequentemente a posição da colônia que contenha esse gene na biblioteca de DNA Figura 15 FIGURA 15 HIBRIDIZAÇÃO EM COLÔNIA FONTE Adaptado de Watson et al 2015 34 Com o uso da biblioteca de DNA fragmentos de um mesmo DNA genômico podem ser mantidos por tempo indefinido clonados identificados e isolados para diversas aplicações como por exemplo o sequenciamento de todo o genoma No entanto quando o objetivo do estudo é a avaliação das sequências codificantes de um DNA ou seja dos genes uma biblioteca de DNA pode apenas ser adequada para estudos em organismos cujo DNA apresente pequenas porções de DNA não codificante pois caso contrário muitos dos fragmentos contidos na biblioteca não conterão sequências codificantes Isso acontece pois com a clivagem do DNA genômico são formados fragmentos de forma aleatória e portanto muitos deles apenas serão formados por sequências não codificantes dificultando a identificação do gene de interesse Assim para que se obtenha uma biblioteca rica em fragmentos codificantes ela deverá ser formada por cDNAs 3 BIBLIOTECA DE CDNA A principal vantagem da utilização de bibliotecas de cDNA é justamente o fato de ela ser uma grande coleção de clones formados por genes ou seja todas as colônias de bactérias apresentam vetores com fragmentos codificantes FIGURA 16 PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE UMA BIBLIOTECA DE DNA E UMA BIBLIOTECA DE CDNA FONTE Adaptado de Alberts et al 2008 35 A montagem de uma biblioteca de cDNA é bastante semelhante à montagem da biblioteca de DNA No entanto em vez de iniciar o processo com o DNA genômico neste caso o material a ser clonado é o mRNA Assim o primeiro passo para a formação da biblioteca de cDNA é a extração dos mRNAs sendo expressos em determinado tipo celular tecido ou organismo Posteriormente essa população de mRNAs deve ser retrotranscrita em cDNA como já vimos no item 3 do Tópico 2 Após a formação do cDNA a amostra está pronta para seguir com o processo de inserção no vetor com a posterior transformação em bactéria E coli formando os clones de cDNA Novamente assim como nas bibliotecas de DNA cada bactéria formará uma colônia de clones de um determinado cDNA os quais podem ser também identificados e isolados Uma grande diferença da biblioteca de cDNA em relação à de DNA é que a biblioteca de DNA é formada por fragmentos aleatórios do DNA de um organismo tecido ou célula sendo que via de regra independentemente da célula ou tecido de um organismo o DNA a ser fragmentado será idêntico Por outro lado como a biblioteca de cDNA é formada por mRNAs cada tecido ou célula pode formar uma biblioteca diferente pois cada um pode expressar diferentes genes de acordo com sua função Assim bibliotecas de cDNA originadas de células especializadas na produção de uma determinada proteína possivelmente apresentarão muitas colônias formadas pelo gene que codifica para ela Por exemplo uma biblioteca de cDNA produzida a partir de eritrócitos humanos será composta por muitas colônias de E coli contendo vetores com o gene da hemoglobina Essa abundância de determinado gene em uma biblioteca de cDNA inclusive tornase uma vantagem no processo de identificação da colônia que contenha o cDNA que codifica para o gene de interesse Outra característica importante das bibliotecas de cDNA é que como já mencionado os clones formados por ela apenas contêm regiões codificantes do DNA ou seja apenas são formados pelas sequências nucleotídicas dos éxons dos genes que estão sendo expressos Figura 16 Essa característica é bastante explorada e utilizada para estudos que buscam a dedução das sequências de aminoácidos das proteínas codificadas por esses genes Além disso os clones formados em uma biblioteca de cDNA podem fornecer material para a síntese de grandes quantidades de uma determinada proteína por meio da manipulação de bactérias ou leveduras com a capacidade de expressar o gene de interesse 36 RESUMO DO TÓPICO 3 Neste tópico você adquiriu certos aprendizados como Bibliotecas de DNA ou cDNA são grandes coleções de material genético mantidas em colônias de bactérias nas quais um fragmento específico de DNA ou um gene podem ser procurados Uma biblioteca de DNA é formada por fragmentos originados a partir de um DNA genômico Uma biblioteca de cDNA é formada por sequências codificantes dos genes que estavam expressos na forma de mRNA em uma determinada amostra A formação das bibliotecas de DNA e cDNA permite que fragmentos clonados sejam mantidos e replicados por tempo indeterminado 37 1 Explique como o termo biblioteca se adéqua às técnicas de biblioteca de DNA e de cDNA 2 Qual a principal diferença entre as bibliotecas de DNA e de cDNA 3 Assim como no processo de clonagem descrito no Tópico 1 quais componentes são essenciais para a formação das bibliotecas de DNA a DNA enzimas de restrição DNA ligase vetores e células hospedeiras b mRNA enzimas de restrição transcriptase reversa termocicladores e células hospedeiras c DNA enzimas de restrição DNA polimerase vetores e primers d mRNA enzimas de restrição DNA polimerase vetores e células hospedeiras 4 Como as técnicas de clonagem e de bibliotecas de DNA ou cDNA podem ser diferenciadas Você consegue imaginar alguma diferença entre elas e entre suas aplicações AUTOATIVIDADE 38 39 TÓPICO 4 SEQUENCIAMENTO DE DNA 1 INTRODUÇÃO A definição de sequenciamento de DNA está bastante explicita no próprio nome ou seja esse é o processo em que é determinado qual nucleotídeo ocupa cada posição na fita de uma molécula ou de um fragmento de DNA De maneira mais simples é o método que determina a sequência dos nucleotídeos presentes em uma fita de DNA As primeiras técnicas de sequenciamento de DNA começaram a ser aplicadas ainda na década de 70 com o advento da técnica proposta por Sanger atualmente conhecida como método de Sanger Com o passar dos anos esse método foi aprimorado e automatizado sendo chamado de método de Sanger automatizado Assim os métodos de Sanger são atualmente chamados de técnicas de sequenciamento de primeira geração Com base nos princípios desse método pioneiro na década seguinte foram desenvolvidos outros métodos de sequenciamento como o método Shotgun ainda considerados de primeira geração De maneira geral eles aumentaram a eficiência e agilidade do processo para que fragmentos maiores de DNA pudessem ser sequenciados especialmente com os objetivos de otimizar e acelerar o projeto genoma Já nos anos 2000 os métodos de sequenciamento alcançaram um novo nível de avanço com o surgimento dos chamados métodos de sequenciamento de próxima geração do inglês Next Generation Sequencing NGS ou métodos de segunda geração os quais já não são mais baseados na técnica proposta por Sanger Atualmente já existem também os métodos conhecidos como sequenciamento de terceira geração os quais são inovadores pois são capazes de realizar o sequenciamento de apenas uma molécula de DNA sem que seja necessário amplificar a molécula a ser analisada Por fim podese considerar que também estamos diante das tecnologias de sequenciamento de quarta geração a qual compreende o desenvolvimento de equipamentos portáteis e de menor custo tornando a tecnologia do sequenciamento mais acessível para diversas áreas de atuação nas ciências biológicas e da saúde inclusive em campo UNIDADE 1 40 Embora as técnicas de sequenciamento tenham rapidamente avançado nas últimas décadas é importante ressaltar que todas as técnicas supracitadas são amplamente utilizadas inclusive nas áreas de pesquisa e diagnóstico pois cada uma delas apresenta distintos benefícios e aplicações Ainda os avanços nas técnicas e estratégias de sequenciamento permitiram que além do estudo dos genomas sua utilização também fosse expandida ao campo das proteínas Dessa forma como facilmente tornouse possível obter a sequência de nucleotídeos de um determinado gene podese de maneira indireta determinar a sequência de aminoácidos aa da proteína codificada por esse gene No entanto é importante relembrar que no DNA dos eucariotos a sequência de nucleotídeos que codifica um gene contém éxons e íntrons sendo os éxons as sequências codificantes do gene e os íntrons as sequências não codificantes presentes entre éxons o que indica que outra abordagem é necessária para a obtenção da sequência codificante para a proteína Essa abordagem pode ser por meio da utilização do sequenciamento dos mRNAs RNA mensageiro transformados em DNA complementar cDNA termo que será abordado mais adiante neste livro para que apenas a sequência codificante para a proteína ou seja a sequência composta apenas pelos éxons seja sequenciada Dessa forma em conjunto os sequenciamentos de cDNAs provenientes de mRNAs e do DNA genômico permitem uma investigação completa das características do gene em estudo Como já mencionado com a sequência de nucleotídeos disponível é possível indiretamente decodificar essa informação em uma sequência de aa e assim obter a sequência de aa da proteína codificada pelo gene de interesse Essa decodificação é simples pois como você deve lembrar cada códon ou seja cada sequência de três nucleotídeos é responsável pela tradução da informação para a síntese de um aa que formará a proteína Atualmente é fácil encontrar informações sobre quais códons codificam para quais aa além de programas computacionais que conseguem fazer essa leitura rapidamente A partir disso diversas outras avaliações podem ser feitas com esses sequenciamentos como por exemplo comparando a mesma sequência de aa ou de nucleotídeos entre diferentes organismos o que permite a identificação de proteínas conservadas durante o processo evolutivo ou comparando diferentes condições patológicas em que podem ser observadas diferenças nas sequências de aa que possam estar relacionadas à perda de função na proteína entre outras tantas abordagens que serão discutidas em outros tópicos deste livro 2 MÉTODOS DE SANGER E SANGER AUTOMATIZADO Para que fique claro como ocorre o processo de sequenciamento de nucleotídeos pelo método de Sanger vamos novamente relembrar alguns detalhes estruturais da molécula de DNA Como já discutido anteriormente o DNA é formado por uma cadeia dupla de nucleotídeos sendo cada nucleotídeo formado por uma base nitrogenada A T C ou G ligada a um açúcar desoxirribose A ligação entre nucleotídeos de uma 41 mesma fita é covalente por meio de uma cadeia de fosfatos que liga o carbono 3 de uma desoxirribose ao carbono 5 da desoxirribose do próximo nucleotídeo Figura 17 As duas fitas simples de DNA são complementares uma a outra e estão dispostas de maneira antiparalela ou seja em sentidos opostos uma 5 3 e a outra 3 5 permitindo que os nucleotídeos complementares se liguem por meio de pontes de hidrogênio formando a estrutura em dupla hélice FIGURA 17 ESQUEMA SIMPLIFICADO DA INSERÇÃO NA EXTREMIDADE 3 DOS DESOXIRRIBOBUCLEOTÍDEOS QUE FORMARÃO A NOVA FITA DE DNA FONTE Adaptado de Alberts et al 2008 Para o sequenciamento com o método de Sanger também conhecido como método terminador de cadeia são sintetizadas in vitro com a utilização de primer ou iniciadores diversas fitas de DNA réplicas da mesma fita molde portanto com a mesma extremidade 5 No entanto cada uma dessas fitas apresenta diferentes terminações 3 decorrentes do processo de inserção de um nucleotídeo terminador de cadeia os 42 didesoxinucleotídeos ddNTP ddATP ddTTP ddCTP e ddGTP Figura 18 A durante a síntese das novas fi tas Em um processo normal de cópia ou amplifi cação de uma fi ta molde de DNA os nucleotídeos formadores da nova fi ta são adicionados e ligados uns aos outros até o fi m da fi ta molde porém com a utilização dos nucleotídeos terminadores de cadeia Os ddNTPs são incorporados durante o processo de cópia da fi ta molde e após a sua inserção é cessada a síntese desta nova fi ta Dessa forma ao fi nal do processo de amplifi cação fi tas de DNA de diferentes tamanhos e com diferentes extremidades 3 estarão disponíveis Figura 18 B Esse mesmo procedimento pode ser executado em uma reação com a presença dos quatro ddNTPs ou podem ser realizadas quatro reações isoladas cada uma contendo apenas um dos quatro nucleotídeos modifi cados A escolha do processo a ser adotado na amplifi cação implica diretamente no modo em que o sequenciamento em si deverá ser abordado No caso da amplifi cação em quatro reações distintas cada uma contendo apenas um dos quatro didesoxinucleotídeos o sequenciamento deve ser realizado por meio da separação dos fragmentos de diferentes tamanhos em um gel de poliacrilamida Nesse método cada uma das quatro reações deverá ser submetida a uma eletroforese podendo ser no mesmo gel mas com cada reação em uma canaleta na qual os fragmentos amplifi cados serão separados em um gradiente de acordo com seu tamanho Figura 18 C Após a separação por tamanho é possível defi nir as posições dos nucleotídeos presentes em cada reação Por exemplo realizando a eletroforese da reação contendo o nucleotídeo ddGTP é possível defi nir em quais posições esse nucleotídeo se encontra na fi ta executando o mesmo processo para as amplifi cações com os demais nucleotídeos Assim as informações de localização de cada um deles podem ser interpoladas formando a sequência completa da fi ta Esse método embora efi caz é bastante moroso o que permite apenas o sequenciamento de pequenos fragmentos de DNA Consulte o vídeo disponível no link httpswwwyoutubecom watchvUma54mKcR40 para a visualização das etapas do processo de sequenciamento pelo método de Sanger DICA 43 FIGURA 18 SEQUENCIAMENTO DE SANGER A DIFERENÇA ENTRE UM DESOXINUCLEOTÍDEO E UM NUCLEOTÍDEO TERMINADOR DE CADEIA OU DIDESOXINUCLEOTÍDEO B ESQUEMA DOS FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMANHOS AMPLIFICADOS EM UMA REAÇÃO CONTENDO DDGTP C ESQUEMA DA APLICAÇÃO DE ELETROFORESE PARA O SEQUENCIAMENTO UTILIZANDO DIDESOXINUCLEOTÍDEOS DATP DCTP DGTP DTTP DESOXINUCLEOTÍDEOS DNTPS DDATP DDCTP DDGTP DDTTP DIDESOXINUCLEOTÍDEOS DDNTPS FONTE Adaptado de Watson et al 2015 44 Um método muito similar ao descrito anteriormente chamado de Sanger automatizado aplicável a fragmentos maiores de DNA utiliza apenas uma reação contendo os quatro didesoxinucleotídeos para a amplificação do fragmento de DNA de interesse no entanto cada um desses nucleotídeos terminadores de cadeia é marcado com um fluoróforo distinto dos demais Dessa forma após a amplificação novamente serão formadas fitas com tamanhos distintos de acordo com a posição de interrupção da fita Por meio de cromatografia em coluna todas as fitas formadas podem ser separadas de maneira sequencial de acordo com seu tamanho Devido aos diferentes fluoróforos cada um dos didesoxinucleotídeos é detectado e identificado de acordo com a sua cor Assim obtémse a posição de cada nucleotídeo presente na sequência do fragmento analisado Figura 19 FIGURA 19 CROMATOGRAMA DE UM SEQUENCIAMENTO REALIZADO SEGUNDO O MÉTODO DE SANGER AUTOMATIZADO FONTE A autora Esse método de sequenciamento depende do uso de máquinas de sequenciamento automatizadas chamadas de sequenciadores as quais são capazes de fazer a leitura de fragmentos de cerca de 800 pares de base pb Porém devido ao rápido processamento dessas reações centenas a milhares de nucleotídeos podem ser identificados em um curto período de tempo por exemplo em horas o que proporcionou um grande avanço no sequenciamento de genes de diversos organismos além de avanços nos projetos de sequenciamento de genomas complexos 45 3 SEQUENCIAMENTO SHOTGUN Outro tipo de sequenciamento de primeira geração é o método de sequenciamento Shotgun o qual é aplicado como estratégia para o sequenciamento de grandes sequências de nucleotídeos especialmente genomas inteiros dos mais diversos organismos Esse método foi primeiramente testado para o sequenciamento do genoma de uma espécie de bactéria que possui o genoma relativamente pequeno cerca de 18 pares de megabases Mb a Hemophilus influenzae e se mostrou bastante promissor para a aquisição e análise de dados de sequenciamento de genomas maiores Devido à sua ampla utilização no sequenciamento de genomas o aprofundamento dessa técnica será abordado na Unidade 3 quando estudaremos o projeto genoma Mas em resumo para a aplicação do sequenciamento shotgun o material genético que será sequenciado deve ser fragmentado em porções menores e clonado em vetores de DNA formando uma biblioteca de DNA recombinante Os fragmentos de DNA das colônias dessa biblioteca são preparados separadamente utilizando o método de inserção dos didesoxinucleotídeos fluorescentes ou nucleotídeos terminadores de cadeia e sequenciados em sequenciadores automatizados Dessa forma são obtidas sequências aleatórias do material genético de interesse Na técnica Shotgun o material clonado é sequenciado diversas vezes fornecendo uma quantidade de dados de sequenciamento equivalente a aproximadamente 10 vezes o tamanho do material genético que está sendo estudado Esse volume de reações e leituras de sequências de nucleotídeos deve ser realizado para assegurar que todos os nucleotídeos presentes no material genético sejam detectados e inseridos na sequência final do DNA Devido ao grande volume de informação gerado por esse procedimento é necessário que programas computacionais sofisticados sejam utilizados para a determinação da sequência do material em estudo Esse procedimento computacional realiza uma espécie de alinhamento entre as sequências determinadas para os fragmentos clonados por meio dos nucleotídeos que se repetem entre elas e dessa forma essas sequências podem ser unidas formando sequências de fragmentos maiores de DNA chamadas de contigs As contigs por sua vez podem posteriormente também ser unidas formando a estrutura complexa e completa da sequência de nucleotídeos do material genético que está em avaliação Figura 20 46 FIGURA 20 ESQUEMA SIMPLIFICADO DO SEQUENCIAMENTO SHOTGUN FONTE Watson et al 2015 p 165 4 SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO NEXT GENERATION SEQUENCING NGS O grande advento alcançado com as tecnologias de sequenciamento de nova geração foi que elas não mais são dependentes da utilização dos nucleotídeos terminadores de cadeia o que permitiu com que as plataformas criadas na segunda geração de sequenciamento fossem mais eficientes e rápidas capazes de sequenciar moléculas muito maiores do que era possível com os métodos de Sanger e ainda em um curto período de tempo Alguns desses métodos incluem o pirossequenciamento o sequenciamento por síntese SBS do inglês sequencebysynthesis sequenciamento por terminação de cadeia reversível sequenciamento por hibridização e ligação SBL do inglês sequencebyligation entre outros Embora o pirossequenciamento seja um sequenciamento que apenas é realizado com base na síntese da nova fita de DNA o método base para a detecção dos nucleotídeos é a formação de pirofosfato a cada novo nucleotídeo adicionado à nova fita Nesse método o pirofosfato sintetizado é convertido pela ação da enzima sulforilase em adenosina trifosfato ATP a qual por sua vez é utilizada pela enzima luciferase gerando luminescência Desta forma mesmo sem a utilização de nucleotídeos modificados com fluoróforos ou radioisótopos ainda é possível detectar a inserção de um novo nucleotídeo Para que seja determinado qual nucleotídeo está sendo inserido cada um dos quatro dNTPs é adicionado à reação individualmente e posteriormente lavado da reação antes que o próximo dNTP seja adicionado à reação Esse processo se dá repetidamente enquanto em tempo real a luminescência é detectada e registrada para que o sequenciamento seja realizado Plataformas para a aplicação do método de pirossequenciamento foram desenvolvidas e aprimoradas sendo a principal delas a 454 da empresa Roche Ela aprimorou o método permitindo a leitura em paralelo de diversas reações possibilitando o sequenciamento de grandes sequências de DNA ao mesmo tempo Na 47 plataforma 454 são utilizadas esferas sólidas beads nas quais são ligados por meio de sequências adaptadoras os fragmentos do DNA a ser sequenciado formando uma biblioteca de DNA Posteriormente essas esferas são envoltas em gotículas oleosas em que ocorre uma PCR em emulsão emPCR para que toda a superfície da esfera seja recoberta com clones provenientes da amplificação do fragmento que inicialmente se encontrava ligado a ela Essas esferas são dispostas em placas em que apenas uma esfera consegue ocupar cada poço Assim a placa é sequencialmente lavada com cada um dos dNTP e enzimas necessárias à reação sendo então detectados os picos de luminescência produzidos em cada um dos poços Tal informação é utilizada para a interpretação da sequência do fragmento de cada um dos poços e posteriormente por meio de ferramentas de bioinformáticas essas sequências podem ser unidas formando a sequência do DNA original conforme a Figura 21 FIGURA 21 ESQUEMA DO PROCESSO DE PIROSSEQUENCIAMENTO EM UMA PLATAFORMA 454 A PREPARO DA AMOSTRA B PCR EM EMULSÃO C SEQUENCIAMENTO FONTE Adaptado de Moreira 2015 48 Outro método de sequenciamento de segunda geração é o método empregado na plataforma Illumina Nesse método o DNA a ser sequenciado é fragmentado por nebulização e os fragmentos são acoplados a uma placa de vidro por meio de primers adaptadores formando uma biblioteca de DNA a qual será submetida a uma PCR Novamente nesse caso o sequenciamento será realizado durante a síntese da nova fita de DNA ou seja também é um método SBS Esse método é conhecido por promover a amplificação em arco ou em ponte pois durante o processo inicial de amplificação que dura cerca de 35 ciclos a fita de DNA fica arqueada durante a polimerização da nova fita devido à ligação entre os primers adaptadores Esse processo de arqueamento permite que clones de um mesmo fragmento ocupem posições próximas na placa de amplificação formando populações ou clusters de fragmentos idênticos Por fim para o sequenciamento na plataforma Illumina após a formação dos clusters são adicionados dNTPs modificados com terminadores reversíveis contendo fluoróforos na posição 3 um diferente fluoróforo para cada dNTP o que significa que quando um dNTP é adicionado à nova fita ele impede que o próximo dNTP seja adicionado pela DNA polimerase No entanto esse dNTP modificado pode ter seu fluoróforo retirado permitindo que o próximo dNTP seja incorporado à fita A cada novo ciclo de polimerização ou seja de adição de um novo dNTP a fluorescência é detectada e registrada assim de maneira sincronizada um novo dNTP é adicionado sua fluorescência detectada seu fluoróforo cortado e um novo dNTP é adicionado à fita dando início a um novo ciclo de fluorescência detecção e remoção de fluoróforo Figura 22 Com esse processo fragmentos do DNA de interesse são sequenciados simultaneamente e posteriormente com ferramentas de bioinformática as leituras são sobrepostas e formam os contigs que irão compor a sequência final da molécula em avaliação Na imagem a seguir temos a ilustração de como ocorre o sequenciamento na plataforma Illumina Figura 22 O painel A representa a fragmentação do DNA por nebulização e ligação aos adaptadores o painel B ilustra a fixação dos fragmentos na placa de vidro contendo adaptadores complementares àqueles ligados aos fragmentos o painel C exemplifica a amplificação dos fragmentos com a incorporação de dNTPs não marcados com fluorescência o painel D representa a estrutura em ponte decorrente da ligação complementar entre os adaptadores o painel E ilustra a desnaturação da dupla fita resultante da amplificação o painel F por sua vez demonstra um novo ciclo de amplificação com adaptadores livres se ligando aos seus complementares presentes na placa o painel G ilustra a formação do cluster composto por cópias do mesmo fragmento o painel H representa a adição dos dNTPs modificados terminadores reversíveis contendo fluoróforos e da DNA polimerase o painel I demonstra o registro da fluorescência emitida pelos dNTPs modificados que foram incorporados à nova fita os painéis J e K representam novo ciclo de incorporação de dNTPs modificados com detecção da fluorescência e o painel L ilustra a decodificação das imagens obtidas em cada ciclo de inserção dos dNTPs modificados para a determinação da sequência de nucleotídeos presente em cada cluster da placa de vidro 49 FIGURA 22 PRINCÍPIO DA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO APLICADA NA PLATAFORMA ILLUMINA A L INDICAM ETAPAS DO PROCESSO DE SEQUENCIAMENTO FONTE Adaptado de Moreira 2015 Embora existam muitos outros métodos de sequenciamento de segunda geração associados a outras plataformas como a Ion Torrent e a HelisCope a última plataforma que iremos tratar neste item é a SOLiD O método de sequenciamento aplicado nessa plataforma diferentemente dos demais que utilizam a DNA polimerase como principal enzima no processo na síntese da nova fita utilizada para a detecção utiliza as técnicas de hibridização e ligação para a detecção da sequência de nucleotídeos Para iniciar o procedimento assim como na plataforma Illumina o DNA a ser sequenciado é fragmentado e seus fragmentos ligados a adaptadores Os fragmentos unidos aos adaptadores são acoplados às esferas beads formando uma biblioteca de DNA As esferas contendo os fragmentos são submetidas a uma emPCR PCR em emulsão Após essa etapa de amplificação as esferas são dispostas em placas de vidro onde serão submetidas aos procedimentos do sequenciamento Para o sequenciamento no SOLiD são realizadas cinco etapas de hibridização e ligação As sondas utilizadas para o processo de hibridização são formadas por dois nucleotídeos dinucleotídeos informativos aqueles que serão detectados para o sequenciamento 6 nucleotídeos degenerados com capacidade de se ligar a qualquer base presente na fita molde e um fluoróforo O primeiro ciclo do sequenciamento inicia com a ligação de um primer complementar ao adaptador que foi adicionado 50 ao fragmento Após a ligação do primer a sonda de hibridização contendo os dois nucleotídeos complementares à sequência da fita molde pode se ligar ao primer em sua extremidade 5 por meio da ação da enzima DNA ligase e as duas bases complementares na fita molde Nessa etapa a fluorescência da sonda é registrada e convertida em cor por meio de softwares específicos Após a emissão da fluorescência ocorre uma quebra da sonda liberando suas três últimas bases e o fluoróforo deixando uma extremidade 5 disponível para que uma nova sonda seja hibridizada e ligada por meio da ação da DNA ligase Dessa forma sucessivamente novas sondas são hibridizadas e a fluorescência detectada até que todo o fragmento esteja recoberto por sondas de hibridização ou seja toda a fita molde estará coberta por sequências de dois nucleotídeos informativos seguidos de três nucleotídeos não informativos Para que seja iniciada a segunda etapa a fita dupla formada na primeira etapa é desnaturada e um novo primer é ligado ao fragmento de DNA Porém desta vez um primer com uma base menor n1 que o utilizado na primeira etapa Na sequência todos os ciclos de hibridização ligação detecção de fluorescência e clivagem são repetidos como descrito na etapa 1 Assim devido à posição de anelamento do primer n1 os nucleotídeos informativos estarão localizados em uma posição anterior a dos nucleotídeos incorporados na etapa 1 Para o completo sequenciamento são realizadas mais três etapas de hibridização e ligação com primers de tamanho n2 n3 e n4 sendo utilizados em cada uma delas Ao fim do processo cada base é sequenciada duas vezes e o que se obtém são esquemas de cores representativos dos dinucleotídeos incorporados que devem ser decodificadas na sequência de nucleotídeos que compõem os fragmentos avaliados 51 FIGURA 23 ESQUEMA DA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO POR HIBRIDIZAÇÃO E LIGAÇÃO COMO A APLICADA NA PLATAFORMA SOLID DE SEQUENCIAMENTO FONTE Adaptado de Voelkerding Dames e Durtschi 2009 O sistema de cores utilizado pelo SOLiD consiste em quatro cores sendo cada uma representativa de quatro combinações diferentes de dinucleotídeos Com esse esquema de cores conhecendo o primeiro nucleotídeo do fragmento correspondente ao último nucleotídeo do primer n1 e sabendo que cada nucleotídeo é sequenciado duas vezes durante o processo é possível decodificar a sequência de cores pois a segunda base do primeiro nucleotídeo essencialmente deve ser a igual à primeira base do segundo dinucleotídeo e assim sucessivamente como pode ser observado na Figura 23 52 FIGURA 24 CÓDIGO DE CORES UTILIZADO PELA PLATAFORMA SOLID E DECODIFICAÇÃO DO SINAL EMITIDO POR UM FRAGMENTO SEQUENCIADO ATGGA CUJA BASE DE NÚMERO 1 SABESE QUE ERA UMA ADENINA A FONTE Adaptado de Moreira 2015 5 SEQUENCIAMENTO DE TERCEIRA GERAÇÃO Trazendo avanço substancial ao campo do sequenciamento de DNA os métodos de terceira geração inovam por não necessitar que o DNA a ser sequenciado seja previamente amplificado por PCR etapa comum aos métodos de primeira e segunda geração Assim essas novas tecnologias são chamadas de sequenciamento de única molécula SNS do inglês single molecule sequencing Uma das plataformas de sequenciamento de terceira geração mais utilizada é a que aplica a técnica do sequenciamento em tempo real de uma única molécula chamada SMRT do inglês single molecule real time capaz de sequenciar por exemplo todo o genoma humano em uma única corrida devido à sua extrema eficiência na geração de dados Nesse método o DNA a ser sequenciado é fragmentado e por meio de adaptadores é transformado em fragmentos de DNA circular Estas moléculas de DNA circular serão replicadas em uma placa metálica chamada de chip contendo nano poços Em cada um destes nanopoços é encontrada uma DNA polimerase fixada 53 ao fundo Dado o início da replicação a adição de nucleotídeos modificados com fluoróforos pela ação da DNA polimerase promove a liberação do fluoróforo e portanto a emissão de fluorescência a qual é detectada em tempo real a cada novo nucleotídeo que é adicionado à nova fita Figura 25 FIGURA 25 ESQUEMA DA REAÇÃO QUE ACONTECE DENTRO DE UM NANOPOÇO APLICADO NA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO EM TEMPO REAL DE UMA ÚNICA MOLÉCULA SMRT FONTE Adaptado de Heather e Chain 2016 6 SEQUENCIAMENTO PORTÁTIL O mais recente avanço no campo do sequenciamento de DNA foi o desenvolvimento de plataformas portáteis capazes de sequenciar grandes moléculas de DNA em pequenos equipamentos semelhantes a pen drives Uma dessas plataformas é a MinION que utiliza nano poros para a leitura de variações na corrente elétrica promovidas pela passagem de um determinado nucleotídeo registrando em tempo real a sequência de nucleotídeos da molécula de DNA que está sendo analisada Para que seja realizado o sequenciamento por meio dessa plataforma as amostras a serem sequenciadas são ligadas a enzimas de processamento Essas enzimas induzem o fragmento de DNA a passar pelo nano poro onde as variações da corrente elétrica são detectadas Sendo conhecidas as variações características de cada nucleotídeo a sequência de nucleotídeos é formada rapidamente As informações obtidas pelo sequenciamento podem posteriormente ser facilmente transferidas para um computador para que outras avaliações sejam realizadas Dessa forma a maior vantagem dessa nova tecnologia foi a possibilidade de realizar ensaios de sequenciamento ainda em campo e sem a necessidade de uma complexa preparação da amostra antes do sequenciamento o que diminuiu consideravelmente o custo e o tempo de sequenciamento 54 PESQUISADORES BRASILEIROS AVANÇAM NO SEQUENCIAMENTO DA COVID19 Correio Braziliense O sequenciamento genético é importante para entre outras respostas identificar possíveis mutações cadeias de transmissão e origem da chegada do vírus a uma região específica Foto Liana CollUnicamp Pesquisadores da Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ da Universidade Federal de Minas Gerais UFMG e do Laboratório Nacional de Computação Científica LNCC avançaram no sequenciamento genético da Covid19 que circula no Brasil Em tempo recorde de 48 horas o estudo sequenciou no último fim de semana 19 amostras de pacientes do Rio Minas Goiás Rio Grande do Sul e São Paulo ampliando a vigilância sobre as características genéticas do causador da pandemia de coronavírus O sequenciamento genético é importante para entre outras respostas identificar possíveis mutações cadeias de transmissão e origem da chegada do vírus a uma região específica O estudo realizado no LNCC pôde confirmar que a maioria das amostras é descendente de vírus que vieram da Europa enquanto uma pequena parte chegou ao país diretamente da China A coordenadora do Laboratório de Bioinformática do LNCC Ana Tereza Vasconcelos explicou que a principal conclusão obtida é a confirmação da transmissão comunitária o que se deu com a constatação de que o vírus coletado no Brasil já apresenta características próprias que o diferenciam geneticamente dos casos na Europa e Ásia LEITURA COMPLEMENTAR 55 O vírus por onde vai passando vai mudando naturalmente É normal que tenha saído da Ásia com uma característica chegado na Europa e mudado explica ela que afirma que o mesmo já ocorreu no Brasil Não é mais um vírus que está vindo de fora Agora é transmissão comunitária passando de um para o outro Por isso o isolamento social é um fator importante nesse momento Não é mais necessário que venha alguém de fora para trazer o vírus A coordenadora do laboratório explica que confirmar a mutação do vírus não indica que a doença causada por ele pode ter se tornado mais ou menos perigosa Não há nenhuma conclusão em relação a isso Ele está mudando como era de se esperar diz ela que prevê que a continuidade do trabalho de sequenciamento vai poder identificar futuramente o impacto de condições geográficas nessa mutação O sequenciamento contou com a capacidade de processamento do supercomputador Santos Dumont e com a colaboração de estudantes de pós graduação Muito dessa forçatarefa que está nos laboratórios trabalhando é de alunos de pósgraduação e de pósdoutores Eles são o braço da gente para dar conta de tantos projetos e tantas análises destaca ela A pesquisa utilizou amostras coletadas de pacientes atendidos pela UFRJ e pelos laboratórios privados Hermes Pardini e Símile com unidades em diferentes estados brasileiros O trabalho se deu também com a colaboração da equipe que realizou o primeiro sequenciamento da Covid19 no país em São Paulo A pesquisadora Ester Sabino foi uma das coordenadoras do trabalho pioneiro no país e comemora que a pesquisa esteja se descentralizando Acho que o principal avanço foi começar a já montar redes e as pessoas trabalharem em vários locais e não ficar centralizado só em um único laboratório disse ela que explicou que os pesquisadores devem juntar um número maior de amostras sequenciadas para fazer uma análise mais detalhada da história genética do vírus no país Esse trabalho nacional de sequenciamento será articulado pela Coronaômica BR uma iniciativa do comitê de especialistas Rede Vírus que foi formado pelo Ministério de Ciência Tecnologia Inovações e Comunicações Professor da Feevale e presidente da Sociedade Brasileira de Virologia Fernando Spilki é o coordenador da Coronaômica BR que já reúne 16 instituições nas cinco regiões do país O pesquisador explica que o sequenciamento em larga escala permitirá acompanhar a circulação do vírus e identificar se haverá mutações Isso tem aplicações que vão além da epidemiologia molecular e podem auxiliar no manejo da prevenção da infecção no diagnóstico e na terapêutica conta ele que acrescenta que a estruturação dessa rede deixará o país mais preparado para epidemias futuras e contribuirá com a formação de jovens pesquisadores que estarão envolvidos no projeto 56 Temos o plano de sequenciar centenas de amostras no Brasil inteiro e mais que isso fazer novos esforços ao longo do tempo acompanhando se com o avançar da pandemia vamos encontrar alterações no genoma viral ou não FONTE CORREIO BRAZILIENZE Pesquisadores brasileiros avançam no sequenciamento da Covid19 2020 Disponível em httpswwwcorreiobraziliensecombrappnoticiacienciaesaude20200327 internacienciasaude840775pesquisadoresbrasileirosavancamnosequenciamentodacovid19shtml Acesso em 21 abr 2020 57 RESUMO DO TÓPICO 4 Neste tópico você adquiriu certos aprendizados como Para conhecer a sequência de nucleotídeos de um determinado fragmento de DNA ou até mesmo todo o genoma de um organismo é preciso aplicar as técnicas de sequenciamento sendo essas técnicas importantes e aplicáveis também a estudos comparativos entre amostras de diferentes condições como por exemplo em condições patológicas associadas a mutações em algum gene Diversas técnicas de sequenciamento de DNA foram desenvolvidas nas últimas décadas podendo ser divididas em sequenciamento de primeira segunda terceira e até mesmo de quarta geração Os métodos conhecidos como sequenciamento de primeira geração utilizam a técnica dos nucleotídeos terminadores de cadeia como proposto pelo método de Sanger Os métodos de sequenciamento de segunda geração ou de nova geração são aqueles que essencialmente não utilizam os nucleotídeos terminadores de cadeia para o processamento das amostras e são conhecidos como NGS do inglês Next Generation Sequencing Os métodos mais recentes de sequenciamento chamados de terceira geração trouxeram a possibilidade de análise da sequência de nucleotídeos de uma única molécula de DNA sem a necessidade de amplificação desta molécula O desenvolvimento de equipamentos portáteis de sequenciamento dá início ao desenvolvimento dos métodos de sequenciamento de quarta geração possibilitando o sequenciamento de amostras em campo a um custo reduzido 58 1 Sabendo que os didesoxinucleotídeos são nucleotídeos terminadores de cadeia ou seja modificados para interromper o processo de extensão durante a amplificação de um fragmento de DNA discorra sobre como a utilização desses nucleotídeos marcados com fluoróforos são utilizados para o sequenciamento Sanger em sequenciadores automatizados 2 Aponte as principais diferenças entre os sequenciamentos de primeira segunda e terceira geração 3 Os métodos de sequenciamento de segunda geração discutidos neste tópico apresentam como similaridade a utilização de a Adaptadores b PCR em emulsão c Placa de vidro d Esferas e Fluorescência 4 De acordo com as técnicas de sequenciamento apresentadas os métodos a seguir podem ser empregados para a detecção e sequenciamento de nucleotídeos exceto a Luminescência b Fluorescência c Absorbância d Corrente elétrica AUTOATIVIDADE 59 REFERÊNCIAS ALBERTS B et al Molecular biology of the cell 5 ed Nova Iorque Garland Science 2008 BUSTIN S A et al The MIQE guidelines Minimum information for publication of quantitative realtime PCR experiments Clinical Chemistry v 55 n 4 p 611 622 2009 HEATHER J M CHAIN B The sequence of sequencers the history of sequencing DNA Genomics v 107 n 1 p 18 2016 JUNQUEIRA L C CARNEIRO J Biologia celular e molecular 9 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2012 MICKLOS D A FREYER G A CROTTY D A A ciência do DNA 2 ed Porto Alegre Artmed 2005 MOREIRA L M Ciências genômicas fundamentos e aplicações Ribeirão Preto Sociedade Brasileira de Genética 2015 PABINGER S et al A survey of tools for the analysis of quantitative PCR qPCR data Biomolecular Detection and Quantification v 1 n 1 p 2333 2014 PFAFFL M W Quantification strategies in realtime polymerase chain reaction In BUSTIN S A AZ of Quantitative PCR La Jolla International University Line 2004 p 87112 VOELKERDING K V DAMES S A DURTSCHI J D Nextgeneration sequencing from basic research to diagnostics content Clinical Chemistry v 658 n 1 p 641 658 2009 WATSON J D et al Biologia molecular do gene Porto Alegre Artmed 2015 60 61 GENÔMICA E AS DEMAIS ÔMICAS UNIDADE 2 OBJETIVOS DE APRENDIZAGEM PLANO DE ESTUDOS A partir do estudo desta unidade você deverá ser capaz de distinguir as diferentes ciências chamadas de ômicas comparar os objetivos da genômica estrutural e da genômica funcional investigar o Projeto Genoma Humano identifi car os métodos aplicados na análise transcriptômica examinar as diferentes tecnologias aplicadas à análise do proteoma entender os objetivos e restrições atrelados às análises metabolômicas Esta unidade está dividida em três tópicos No decorrer dela você encontrará autoatividades com o objetivo de reforçar o conteúdo apresentado TÓPICO 1 GENÔMICA TÓPICO 2 PROJETO GENOMA HUMANO TÓPICO 3 AS DEMAIS ÔMICAS Preparado para ampliar seus conhecimentos Respire e vamos em frente Procure um ambiente que facilite a concentração assim absorverá melhor as informações CHAMADA 62 CONFIRA A TRILHA DA UNIDADE 2 Acesse o QR Code abaixo 63 TÓPICO 1 GENÔMICA UNIDADE 2 1 INTRODUÇÃO Caro acadêmico você deve se lembrar de que na Unidade 1 deste livro tratamos sobre algumas técnicas relacionadas à manipulação da molécula de DNA como isolamento amplificação clonagem e sequenciamento Com o avanço de tais técnicas em especial àquelas desenvolvidas para aperfeiçoar o sequenciamento de moléculas e fragmentos de DNA surgiu a possibilidade de se conhecer ou seja de sequenciar todo o genoma de um organismo Em resumo conhecer o genoma de um organismo significa conhecer a sequência de nucleotídeos de todo o DNA presente em todos os cromossomos desse organismo No caso dos seres humanos o genoma compreende a sequência de nucleotídeos presentes nos 22 pares de cromossomos autossômicos nos dois cromossomos sexuais X e Y e na pequena molécula de DNA mitocondrial Dessa forma com a possibilidade de estudar genomas completos surge o ramo da genética molecular hoje denominado de genômica Brevemente podese dizer que os primeiros genomas foram sequenciados ainda na década de 70 principalmente com a utilização do método de sequenciamento proposto por Sanger ou suas modificações No entanto os organismos que tiveram seus genomas sequenciados foram bacteriófagos e outros vírus os quais contêm genomas significativamente pequenos Já no final da década de 80 e início da década de 90 com o avanço do sequenciamento de genomas completos cada vez maiores iniciaramse os procedimentos para o sequenciamento de grandes genomas de organismos eucariotos Um dos primeiros organismos eucariotos a ter o sequenciamento do seu genoma foi a levedura Saccharomyces cerevisiae no ano de 1989 No ano seguinte em 1990 duas instituições norteamericanas US Department of Energy Departamento de Energia dos Estados Unidos e o National Institute of Health Instituto Nacional de Saúde lançaram a proposta do Projeto Genoma Humano Tanto o sequenciamento do genoma da levedura quanto o Projeto Genoma Humano seguiram adiante e durante seu desenvolvimento grande avanço nas técnicas de sequenciamento foi alcançado Contudo foi apenas em 1997 que o genoma da Saccharomyces cerevisiae composto por aproximadamente 12000000 12 milhões de pares de bases e com cerca de 5800 genes veio a público Nesse mesmo ano e nos anos seguintes os genomas de outros organismos modelos como a bactéria Escherichia coli a mosca da fruta Drosophila melanogaster e o camundongo Mus musculus foram 64 sequenciados representando um extremo avanço para a área da biologia molecular De maneira geral todo esse avanço só foi alcançado por meio de consórcios e redes de pesquisas formadas entre diferentes países e laboratórios O Projeto Genoma Humano representa um marco de extrema relevância nas ciências da saúde e biológicas e portanto será tratado com detalhes adiante Contudo antes de tratarmos dele é preciso deixar claro que a genômica se expandiu muito além do que se esperava Como já abordamos o conceito de genômica está atrelado ao conhecimento do genoma ou seja conhecer as sequências de nucleotídeos que compõem o DNA quantos genes um determinado organismo possui e onde cada um desses genes se encontra no universo cromossômico Porém a genômica se tornou um universo muito mais amplo Desse modo hoje não apenas basta conhecer os genes sua localização e como são realizados na chamada genômica estrutural mas também é preciso entender como esses genes interagem no e com o organismo por meio da genômica funcional e aplicar os conhecimentos de genômica com a genética médica personalizando o tratamento médico com fundamento no genoma do paciente entre outras aplicações e evoluções derivadas da possibilidade de se conhecer o genoma de um indivíduo Em resumo a genômica abriu as portas para que uma relação direta entre o genótipo e o fenótipo de um organismo pudesse ser definida Além dos avanços supracitados vale ressaltar que a genômica deu início à era das ômicas e atualmente as ciências médicas e biológicas contam com avanços expressivos nas áreas de proteômica transcriptômica e metabolômica entre outras ômicas associados à grande evolução da bioinformática necessária para a interpretação dos dados em larga escala obtidos por essas ciências 2 GENÔMICA ESTRUTURAL A genômica estrutural é o estudo da estrutura propriamente dita do genoma sendo seu principal objetivo atrelado à possibilidade de manipulação de fragmentos do DNA ou de seus genes in loco Assim sabendo a localização de cada componente do DNA tornase mais fácil executar manipulações em genes específicos como a clonagem Vale ressaltar que cada gene possui um local fixo de ocorrência em um cromossomo específico chamado de locus ou no plural loci e dessa forma a genômica estrutural busca determinar qual é esse local e onde estão os marcadores associados a cada um dos genes encontrados Essa parte da genômica acontece em etapas Primeiramente são determinados quais genes e marcadores estão em cada cromossomo determinando os mapas cromossômicos de baixa resolução Posteriormente esses elementos são mapeados no cromossomo ou seja sua localização dentro do cromossomo é determinada formando 65 os mapas cromossômicos de alta resolução Por fim é determinado um mapa físico do genoma e ocorre o sequenciamento Em cada uma dessas etapas diferentes técnicas são aplicadas algumas das quais serão discutidas brevemente neste item Antes de descrever tais técnicas vamos relembrar alguns termos e definições utilizados na genética que serão abordados a seguir O primeiro deles como já mencionado é o termo locus ou loci plural o qual se refere ao local ou posição ocupada por um gene em um determinado cromossomo outro termo importante é alelo referindose a uma das formas em que um gene pode ser encontrado em um cromossomo Lembrando que os cromossomos ocorrem aos pares ou seja um par de cromossomos homólogos cada um desses cromossomos deve apresentar os mesmos genes nos mesmos loci No entanto cada um desses genes ou alelos embora codifiquem para a mesma característica podem apresentar diferenças entre si FIGURA 1 CROMOSSOMOS HOMÓLOGOS E O LOCUS GÊNICO FONTE A autora a MAPAS CROMOSSÔMICOS DE BAIXA RESOLUÇÃO Para a realização da primeira etapa ou seja determinar em qual cromossomo o gene em questão se encontra podem ser aplicadas técnicas como a determinação por ligação a algum locus conhecido a eletroforese em gel de campo pulsado ou ainda podem ser utilizados híbridos de células somáticas 66 A determinação por ligação a um locus conhecido se baseia na ocorrência de um alelo ainda desconhecido ou seja não presente no mapa cromossômico em uma região com marcadores conhecidos e portanto mapeados Dessa forma devido à proximidade com regiões ou marcadores mapeados podese definir em qual cromossomo aquele novo alelo ocorre Na eletroforese em gel de campo pulsado similarmente à técnica básica de eletroforese em gel descrita na Unidade 1 deste livro é possível isolar fragmentos de DNA de diferentes tamanhos No entanto devido à utilização de uma corrente elétrica que se alterna perpendicularmente ao gel o chamado campo pulsado essa técnica é capaz de separar grandes fragmentos de DNA maiores que 50000 pares de base ou 50 kb Desse modo com a utilização dessa técnica é possível que pequenos cromossomos sejam isolados em bandas no gel e pelos seus tamanhos se esse dado for conhecido ou por meio de hibridização com sondas marcadas para regiões conhecidas deve ser determinado qual cromossomo ocupa cada banda do gel Posteriormente aplicando a técnica do Southern blot essas bandas devem ser transferidas para uma membrana onde serão submetidas à hibridização com uma sonda formada pela sequência do gene em investigação Assim ocorrendo a hibridização será possível determinar em qual cromossomo o gene está localizado A terceira técnica aplicada para a determinação de qual cromossomo carrega determinado gene é a utilização de híbridos de células somáticas Nessa técnica células somáticas de dois organismos diferentes por exemplo células somáticas humanas e de camundongo são fundidas in vitro Nesse caso específico mesmo após a fusão dos núcleos facilmente podese distinguir os cromossomos de cada uma das espécies devido à sua morfologia e padrões de bandas serem diferentes Após a multiplicação dessas células híbridas apenas alguns cromossomos humanos são mantidos em cada uma delas os quais serão mantidos de forma relativamente estáveis ao longo das demais divisões que as células híbridas serão submetidas Para otimizar a manipulação dessas células hibridas normalmente são usadas células somáticas de camundongos com cromossomos mutantes para determinada característica pois para que a célula híbrida que será formada seja estável e viável ela deverá manter o cromossomo humano que contém o alelo selvagem para a característica mutante no camundongo a fim de que a função perdida pela mutação seja mantida 67 FIGURA 2 ESQUEMA SIMPLIFICADO DA TÉCNICA DE HIBRIDAÇÃO DE CÉLULAS SOMÁTICAS FONTE A autora Utilizando a técnica das células híbridas os diferentes híbridos formados cada um contendo certo número de determinados cromossomos humanos podem ser cultivados separadamente formando um banco de linhagens híbridas as quais em conjunto apresentam todos os cromossomos humanos Após a formação do banco de células híbridas é possível investigar a presença ou ausência de marcadores moleculares para características específicas conferidas a um determinado gene humano em cada uma das linhagens e assim determinar em qual cromossomo o gene relativo àquele marcador se encontra 3 MAPAS CROMOSSÔMICOS DE ALTA RESOLUÇÃO A segunda etapa da genômica estrutural procura determinar a posição dos genes ou marcadores dentro de cada cromossomo fornecendo informações mais precisas consideradas de alta resolução sobre a disposição desses genes e marcadores no genoma Uma das estratégias utilizadas para a formação dos mapas cromossômicos de alta resolução se baseia na frequência de recombinação meiótica Se nos relembrarmos durante o processo de meiose é possível que ocorra a recombinação entre os genes presentes nos cromossomos homólogos ou seja que eles mudem de posição formando gametas com novas combinações alélicas dos genes presentes no cromossomo Sabe se que durante a meiose genes que se encontram em cromossomos diferentes sofrem segregação independente ao passo que aqueles que estão no mesmo cromossomo são segregados em conjunto ou seja apresentam ligação gênica Além disso é preciso conhecer o genótipo e a posição relativa de cada gene no par de cromossomos 68 homólogos Sabendo apenas o genótipo ou seja se o indivíduo é homozigoto ou heterozigoto para determinados genes não é possível determinar a frequência de recombinação que esses genes podem sofrer No caso dos genes homozigotos sabese que ainda que ocorra a recombinação não será gerada uma nova conformação de alelo uma vez que ambos os alelos são iguais No entanto para os indivíduos heterozigotos a localização de cada um dos alelos é crucial para a determinação dos gametas que poderão ser formados Por exemplo se o indivíduo é heterozigoto para dois genes que se apresentam em ligação gênica ele pode apresentar os alelos dominantes para ambos os genes em um dos cromossomos homólogos e portanto os dois alelos recessivos no outro sendo chamado assim de heterozigoto cis representados como ABab No entanto esses mesmos genes podem ser heterozigotos trans ou seja em cada um dos cromossomos homólogos se encontra o alelo dominante de um dos genes e o alelo recessivo do outro representados como AbaB Conhecendo esses conceitos básicos e sabendo que o processo de recombinação gênica que acontece na meiose é um processo ordenado em eucariotos é possível inferir a frequência em que essa recombinação ocorre para cada um dos genes e assim determinar sua posição relativa no cromossomo Um dos princípios básicos que determinam a frequência de recombinação é a própria distância relativa entre os genes pois quanto maior a distância entre dois genes maior será sua frequência de recombinação Ao passo que quanto menor sua distância menor será essa frequência já que eles tendem a ser recombinados juntos Assim sabendo da frequência de recombinação dos genes presentes em um mesmo cromossomo é possível indiretamente inferir a distância relativa entre eles Em organismos com genoma compacto ou seja que apresentam apenas pequenas regiões não codifi cadoras esse processo é bastante efi ciente como no caso da moscadafruta Drosophila melanogaster Nesses organismosteste mapas cromossômicos são determinados com base em experimentos de cruzamento controlado e dessa forma genes que codifi cam para características fenotípicas conhecidas são facilmente mapeados pela frequência de ocorrência da característica na prole No entanto em organismos como os seres humanos tais inferências não podem ser realizadas devido a fatores como o grande tamanho do genoma e a pequena progênie disponível associada a um determinado genótipo por exemplo Ainda assim Para melhor visualização do processo de recombinação gênica acesse o vídeo httpswwwyoutubecomwatchviLwHBzxUSA0 DICA 69 mesmo para genes ligados a alguns fenótipos conhecidos em humanos quando se avaliava a frequência de recombinação e as distâncias obtidas ficou evidente que uma grande quantidade de DNA deveria estar presente entre cada um desses genes Com avanços no mapeamento descobriuse a possibilidade de utilizar marcadores moleculares para detectar a frequência de recombinação dessas regiões de DNA presentes entre os genes chamadas de DNA neutro Essas regiões de DNA neutro não apresentam nenhuma influência fenotípica Neste caso as frequências de recombinação em regiões heterozigotas do DNA neutro podem ser utilizadas como marcadores de localização no cromossomo auxiliando na determinação da posição relativa dos genes O segundo método aplicável para a determinação dos mapas cromossômicos de alta resolução é a utilização da técnica de hibridização in situ descrita na Unidade 1 deste livro Neste caso específico é utilizado um gene clonado como sonda para a hibridização a qual pode estar marcada com fluorescência ou radioatividade Deste modo a ligação da sonda a uma determinada região do cromossomo associado aos padrões de banda e tamanho que possibilitam a identificação de cada um dos cromossomos é possível determinar em qual cromossomo o gene se encontra e a sua posição aproximada no mesmo A utilização dessa técnica pode ser aprimorada e com o gene de posição desconhecida podem ser adicionados marcadores para genes ou regiões previamente mapeadas Dessa forma é possível definir com maior precisão a posição do gene em avaliação Outra técnica aplicável à produção de mapas de alta resolução é uma adaptação da técnica de células híbridas de roedoreshumanos chamada de mapeamento por híbridos de radiação Neste caso os híbridos são formados após a fragmentação dos cromossomos humanos por meio de irradiação das células com raiosX propiciando que os híbridos formados contenham fragmentos de cromossomos humanos Após a formação dos híbridos é calculada a frequência de ocorrência de marcadores individuais e de pares de marcadores Assim baseadas nas premissas de que marcadores próximos são incorporados em maiores frequências uma vez que a probabilidade de quebra por raiosX em seus loci seja diminuída e de que marcadores presentes em diferentes cromossomos ou distantes no mesmo cromossomo apresentem frequências de transferência similares são determinadas as distâncias 70 FIGURA 3 ESQUEMA DA FORMAÇÃO DAS CÉLULAS HIBRIDAS POR RADIAÇÃO FONTE Adaptado de Griffiths et al 2000 4 MAPAS CROMOSSÔMICOS FÍSICOS Embora as técnicas apresentadas anteriormente para a produção dos mapas cromossômicos de alta e baixa resolução sejam bastante eficientes e úteis esses mapas geralmente apresentam diferenças de distâncias entre seus marcadores e genes já que ambos são baseados na determinação das posições relativas desses genes e marcadores Desse modo com o mapeamento físico do cromossomo ou de todo o genoma é possível preencher as lacunas presentes nos mapas anteriores Para a produção dos mapas físicos o próprio DNA é sequenciado e dado o fator limitante do tamanho do DNA em um cromossomo e ainda mais limitante no caso do genoma todo as técnicas de sequenciamento aplicadas normalmente envolvem a clonagem de fragmentos do DNA No caso dos estudos de genômica os vetores mais adequados são aqueles capazes de se ligar a grandes fragmentos de DNA como o BAC cromossomo artificial bacteriano o YAC cromossomo artificial de levedura e o PAC cromossomo artificial baseado no fago P1 todos capazes de se ligar a fragmentos maiores que 100kb Esses vetores com os insertos a serem sequenciados devem ser clonados em células hospedeiras e seu inserto sequenciado utilizando alguma das metodologias previamente apresentadas Suas sequências então deverão ser ordenadas o que ocorre especialmente por sobreposição de fragmentos sequenciados formando os contigs os quais em dado momento irão ser agrupados e formarão a sequência de nucleotídeos do genoma ou do cromossomo em avaliação 71 Embora a descrição dos passos a serem executados seja relativamente simples a formação de um mapa cromossômico físico representa um árduo trabalho uma vez que em um genoma a quantidade de material a ser sequenciado é de grandes proporções o que representa de centenas a milhares de clones e contigs a serem ordenados Nesse sentido existem algumas estratégias que devem ser aplicadas para facilitar o processo e preservar a qualidade do mapa que será obtido Uma dessas estratégias é a formação de bibliotecas individuais para cada cromossomo Para tanto os cromossomos devem ser individualizados antes da inserção no vetor e clonagem No caso de cromossomos pequenos eles podem facilmente ser separados por uma eletroforese em gel de campo pulsado Já para cromossomos maiores podem ser utilizadas enzimas de restrição que efetuem cortes em regiões muito distantes formando grandes fragmentos de DNA ou ainda os cromossomos podem ser isolados pela chamada classificação em fluxo ou FACS seleção de cromossomos ativada por fluorescência do inglês fluorescenceactivated chromosome sorting Nessa última técnica os cromossomos ainda nas células são marcados com duas fluorescências diferentes uma que se liga às regiões ricas em AT e outra nas regiões ricas em CG Após o rompimento das células os cromossomos são liberados em uma suspensão líquida a qual por sua vez dá origem a um spray cuja concentração contém apenas um cromossomo por gota formada Esse spray é submetido a raios laser e por meio da fluorescência emitida por cada gota os diferentes cromossomos são fracionados em diferentes tubos Porém diante do grande volume de informações obtidas dos clones de cromossomos é preciso ordenar essas sequências para a formação dos contigs especialmente sobrepondo os clones que apresentam sequências idênticas Para esse propósito algumas técnicas que auxiliem na ordenação dos clones sequenciados podem ser aplicadas Por exemplo se existirem marcadores genéticos conhecidos para cada cromossomo a sequência dos clones obtidos com os vetores pode ser determinada por ordenálos a partir da detecção destes marcadores por meio da aplicação da hibridização in situ indicando a ordem em que os fragmentos sequenciados devem ser alinhados e facilitando o processo de formação dos contigs Dessa forma ordenando os insertos sequenciados e formando os contigs que gradativamente serão unidos e formarão toda a sequência de nucleotídeos do genoma estará sendo formado o mapa físico do mesmo o qual poderá então ser confrontado com os mapas cromossômicos de baixa e alta resolução agregando informações relativas à localização e tamanho dos genes marcadores regiões reguladoras e sequências não codificantes que compõem o genoma que está sendo investigado 72 5 GENÔMICA FUNCIONAL Agora que já conhecemos como a área da genômica estrutural obtém e processa os dados em larga escala obtidos dos sequenciamentos de genomas podemos adentrar em como essas informações podem ser interpretadas no âmbito da funcionalidade das sequências codificadoras encontradas A chamada genômica funcional é a área que trata desse tipo de interpretação De maneira geral a genômica funcional pode ser definida como a área da genômica que investiga as funções e interações associadas aos genes descritos pela genômica estrutural Desse modo alguns autores consideram que a genômica funcional trabalha de forma dinâmica na avaliação dos genes transcritos proteínas e suas interações fornecendo informações importantes sobre como os genes atuam em processos biológicos Uma das abordagens efetuadas pela genômica funcional se trata da atribuição de anotações funcionais para os possíveis genes encontrados nos genomas Para tanto o genoma é vasculhado em busca de regiões que possivelmente codifiquem para proteínas Nesse sentido com a utilização de softwares o DNA é inspecionado em seus seis quadros de leitura em busca de códons de início Para que fique mais claro vamos primeiro entender por que o DNA apresenta seis quadros de leitura e do que se trata o códon de início Avaliando um exemplo de uma sequência de nucleotídeos presentes no DNA temos uma sequência como 5ATTGGCTAC3 em uma das fitas enquanto consequentemente a sua fita complementar será composta pela sequência 5GTAGCCAAT3 Se a leitura da primeira fita começar no primeiro nucleotídeo teremos os seguintes códons ATT GGC TAC No entanto se a leitura for iniciada pelo segundo nucleotídeo os códons serão TTG GCT ao passo que se a leitura iniciar pelo terceiro nucleotídeo os códons serão TGG CTA Cada uma dessas possibilidades representa um diferente quadro de leitura ou seja em cada fita simples de DNA os códons podem ser lidos em três distintos quadros o que representa seis diferentes quadros de leitura na dupla fita de DNA três quadros no sentido 5 3 e outros três no sentido 3 5 A importância de avaliar cada um dos diferentes quadros de leitura está no fato de que um deles codifica para uma diferente sequência de aminoácidos que irá compor a proteína codificada pelo possível gene Lembrando que existem menos aminoácidos do que códons o que indica que há mais de um códon de leitura para cada aminoácido Dessa forma ao realizar a varredura nos seis quadros de leitura possíveis podem ser encontrados códons de início ATG e de parada TAA TAG ou TGA definindo as chamadas fases de leitura aberta ou ORF do inglês open reading frame Assim ORFs que contenham 100 ou mais códons podem ser indicadas como possíveis genes presentes no genoma que está sendo avaliado Vale ressaltar que a presença do códon 73 de início no genoma é um indicativo de um gene funcional pois essa mesma sequência quando encontrada no RNA ou seja na forma AUG indica o local de início do processo de tradução da proteína codificada pelo RNA QUADRO 1 CÓDIGO GENÉTICO CÓDONS DE NUCLEOTÍDEOS PRESENTES NOS TRANSCRITOS E OS RESPECTIVOS AMINOÁCIDOS QUE ELES CODIFICAM EM CINZA O CÓDON DE INÍCIO METIONINA E EM PRETO OS CÓDONS DE PARADA 2ª base U C A G 1ª base U UUU Fenilalanina UCU Serina UAU Tirosina UGU Cisteína UUC Fenilalanina UCC Serina UAC Tirosina UGC Cisteína UUA Leucina UCA Serina UAA Códon de parada UGA Códon de parada UUG Leucina UCG Serina UAG Códon de parada UGG Triptofano C CUU Leucina CCU Prolina CAU Histidina CGU Arginina CUC Leucina CCC Prolina CAC Histidina CGC Arginina CUA Leucina CCA Prolina CAA Glutamina CGA Arginina CUG Leucina CCG Prolina CAG Glutamina CGG Arginina A AUU Isoleucina ACU Treonina AAU Asparagina AGU Serina AUC Isoleucina ACC Treonina AAC Asparagina AGC Serina AUA Isoleucina ACA Treonina AAA Lisina AGA Arginina AUG Metionina ACG Treonina AAG Lisina AGG Arginina G GUU Valina GCU Alanina GAU Ácido aspártico GGU Glicina GUC Valina GCC Alanina GAC Ácido aspártico GGC Glicina GUA Valina GCA Alanina GAA Ácido glutâmico GGA Glicina GUG Valina GCG Alanina GAG Ácido glutâmico GGG Glicina Legenda Uuracila Ccitosina Aadenina e Gguanina FONTE A autora Após a varredura dos seis quadros de leitura e da identificação das ORFs como possíveis genes essas ORFs devem ser investigadas na busca por outros indicativos da funcionalidade do gene Uma das estratégias utilizadas para isto é a realização de análises comparativas em busca de semelhanças entre a sequência da ORF e sequências de RNA ou cDNA de genes conhecidos ou entre a sequência de aminoácidos codificada pela ORF tradução simulada da proteína e sequências de aminoácidos de proteínas já conhecidas Esse tipo de análise é realizado com o auxílio de softwares 74 capazes de pesquisar a porcentagem de homologia entre a nova ORF encontrada e genes ou proteínas presentes em banco de dados A partir dessa análise no caso de genes que apresentem semelhanças com outros já descritos é possível que sejam feitas anotações Assim algumas informações como a possível proteína codificada e sua função podem ser atribuídas ao novo gene No entanto para que essa informação seja confiável os genes ou proteínas devem conter no mínimo 60 de similaridade Embora a comparação das ORF com genes e proteínas já disponíveis nos bancos de dados possa ser útil na indicação da função de novos genes e portanto gerem anotações funcionais deles de maneira geral essa análise é apenas uma inferência de funcionalidade a qual idealmente deveria ser avaliada diretamente Uma maneira de avaliar diretamente a função de um gene é por meio da realização de mutações in vitro para a promoção de nocautes em cada uma das ORFs que se deseja avaliar Nesse processo a ORF que está em avaliação é mutada e clonada em algum organismo hospedeiro sendo assim avaliadas as alterações fenotípicas que o nocaute possa ter promovido no hospedeiro Essas informações obtidas auxiliam na determinação da função das ORFs e têm sido utilizadas em avaliações sistemáticas das ORFs encontradas nos genomas que já foram sequenciados No entanto com a aplicação dessa técnica temse observado que a maior parte das ORFs encontradas em um determinado genoma não apresentam alterações fenotípicas Outra estratégia importante na avaliação funcional do genoma é a investigação das interações em que ele possa estar envolvido ou seja avaliando interações entre dois ou mais genes ou ainda entre proteínas e os genes A primeira interação citada ou seja entre dois ou mais genes baseiase no conceito de epistasia a qual demonstra que o fenótipo de diversos genes apenas se expressa quando interações específicas com outro ou outros genes acontecem o que pode ser chamado de contexto genético Nesse sentido a interação pode apresentar diferentes resultados de epistasia também chamada de mutação epistática podendo ser um efeito aditivo da ação de cada um dos genes um efeito deletério da ação de um ou de ambos ou um efeito diferente de cada um dos genes da interação podendo nesse caso apresentar um efeito positivo ou negativo no fenótipo Para que essas interações gênicas possam ser mapeadas são promovidas deleções ou inibições dos genes em pares para que as funções relacionadas às suas interações possam ser avaliadas Além disso atualmente existem softwares computacionais capazes de analisar o genoma elencar e caracterizar possíveis genes candidatos a epistasia A segunda interação de extrema relevância para a genômica funcional é a interação entre proteínas e o DNA especialmente pelo fato de que diversas proteínas são reguladoras da expressão gênica Para a avaliação desse tipo de interação é necessário que se conheça com quais sequências de DNA essas proteínas reguladoras interagem Para a identificação desses locais de interação diversas técnicas que aplicam clivagem da fita e sequenciamento podem ser aplicadas como por exemplo o sequenciamento CUT RUN e o sequenciamento ChIP ChIPseq 75 Para a execução do sequenciamento CUT RUN uma nuclease específica a MNase nuclease microcócica capaz de clivar o DNA em pequenos fragmentos é modificada com a adição de uma proteína a proteína A pA A pA por sua vez é capaz de localizar e se ligar a um anticorpo permitindo que a MNase acesse um sítio específico Assim conhecendo a proteína cuja interação com o DNA desejase avaliar são adicionados anticorpos específicos para essa proteína na amostra contendo os núcleos celulares Quando adicionada a MNase modificada com a pA haverá a ligação entre pA e a proteína de interesse ativando a MNase que realizará a clivagem do DNA no entorno da proteína Após a clivagem os fragmentos oriundos poderão ser isolados e sequenciados formando uma biblioteca da qual poderá ser obtida a sequência do DNA com a qual a proteína de interesse interagiu FIGURA 4 ESQUEMA SIMPLIFICADO DA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO CUT RUN FONTE Adaptado de httpscommonswikimediaorgwindexphpcurid66957797 Acesso em 4 jan 2020 76 No sequenciamento ChIP a proteína de interesse é reticulada ao DNA ou seja são formadas ligações covalentes entre a proteína e o DNA por meio da adição de anticorpos específicos para essa proteína Assim as regiões de interação entre a proteína e o DNA podem ser imunoprecipitadas imunoprecipitação da cromatina ChIP do inglês chromatin immunoprecipitation Dessa forma obtémse uma amostra rica em precipitados de regiões de interação da proteína de interesse com o DNA Pequenos adaptadores ou primers são adicionados à reação para que seja realizado o sequenciamento dos fragmentos de DNA com os quais às proteínas precipitadas interagiam e por meio da utilização de softwares essas sequências obtidas podem ser localizadas no genoma do organismo FIGURA 5 ESQUEMA SIMPLIFICADO DA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO POR IMUNOPRECIPITAÇÃO DE CROMATINA CHIP FONTE Adaptado de httpscommonswikimediaorgwindexphpcurid17890854 Acesso em 4 jan 2020 77 Vale ressaltar que essas e outras tantas técnicas utilizadas para a determinação dos locais de interação de proteínas com o DNA visam especialmente à elucidação dos mecanismos associados à influência dessas proteínas as quais atuam como fatores de transcrição na promoção de um fenótipo específico associado à transcrição de um determinado gene por exemplo relacionado a uma doença Além da interação com as proteínas a função do genoma pode ser investigada por meio da supressão da função gênica e para tanto algumas técnicas podem ser aplicadas como por exemplo a promoção de mutações gênicas diretamente no DNA a interferência na expressão gênica com a utilização de RNA de interferência iRNA ou editando o genoma utilizando técnicas como o CRISPRCas9 De maneira simplificada com a mutação de um gene a sua função pode ser estudada nos organismos por meio da investigação das características resultantes do nocaute do gene Desse modo avaliando o resultado da ausência da expressão de um gene podese inferir características relacionadas à sua função Esse tipo de abordagem pode ser promovido por exemplo de maneira sistemática no genoma de uma determinada linhagem celular nocauteando um gene de cada vez por meio da inserção de um ou mais pares de bases no DNA e posteriormente avaliando o fenótipo resultante de cada um dos genes mutados Similarmente ao processo de mutação a utilização dos iRNAs também permite a avaliação dos fenótipos resultantes da interferência para a caracterização das funções dos genes que sofreram a interferência No entanto nesse caso com a utilização dos iRNA a modificação promovida na expressão gênica não afeta diretamente o DNA e sim a expressão ou tradução do gene em questão sendo portanto considerada uma modificação transitória Nessa técnica pequenas moléculas de RNA os microRNAs miRNA ou os pequenos RNA interferentes siRNA são aplicados e se ligam a moléculas específicas de mRNA sinalizando para que complexos proteicos degradem o mRNA Além disso esses iRNAs também podem se ligar a determinadas regiões do DNA sinalizando para que ocorra o processo de metilação do DNA nessas regiões impedindo que ocorra a transcrição do gene Em ambos os processos o efeito final é a inibição ou a supressão da expressão do gene marcado e consequentemente poderá ocorrer alteração fenotípica em decorrência dessa interferência a qual poderá ser avaliada A aplicação de iRNA é uma técnica que apresenta vantagens já que a interferência pode ser promovida em conjuntos de genes concomitantemente Assim essa técnica é bastante aplicada em linhagens celulares e em organismos modelos como o Caenorhabditis elegans Por fim uma das técnicas mais avançadas e mais recentes para a avaliação da genômica funcional por meio da manipulação da função gênica é a aplicação da edição gênica na qual a utilização de nucleases modificadas torna capaz a promoção da remoção substituição ou inserção de elementos no genoma Uma tecnologia para a aplicação da técnica de edição de genoma é a CRISPRCas9 o qual foi adaptado a partir de um sistema de edição gênica já existente em bactérias 78 A sigla CRISPR vem do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats e pode ser traduzida como grupos de repetições palindrômicas curtas e regularmente interespaçadas Já o Cas 9 se refere à nuclease que se encontra associada ao sistema CRISPR Nesse sistema CRISPRCas9 uma molécula de RNA guia gRNA é inserida em uma sequência maior de RNA Quando em contato com o DNA o gRNA se liga uma a sequência específica do DNA indicando para a enzima Cas9 onde o DNA deve ser cortado Quando ocorre o corte da fita de DNA o próprio mecanismo de reparo de DNA presente na célula é ativado e utilizado para a inserção exclusão de pares de bases do DNA ou para efetuar a substituição de segmentos inteiros de DNA por segmentos de DNA personalizados para a pesquisa A maioria dos estudos que utiliza a tecnologia CRISPRCas9 tem avaliado os efeitos da edição do genoma em células e animais experimentais pois essa ferramenta se mostra bastante promissora para o tratamento de doenças relacionadas a determinados genes como a fibrose cística e a hemofilia e para auxiliar no tratamento de outras doenças como o câncer No entanto embora potencialmente a metodologia possa ser aplicada em qualquer organismo a questão ética sobre a sua utilização em genomas humanos é um ponto de bastante discussão Sua aplicação em células somáticas apenas promove efeitos no indivíduo em tratamento e pontualmente em algum tipo celular ou tecido No entanto caso a tecnologia seja aplicada em células germinativas as características alteradas com a edição do genoma seriam transferidas às próximas gerações Neste sentido discussões éticas acerca da utilização da edição de genoma para o melhoramento de características humanas como altura ou resistência a doenças por exemplo ainda estão em aberto e desse modo em muitos países a utilização desses sistemas de edição do genoma como o CRISPR Cas9 em células germinativas e em embriões se encontram proibidas A técnica de edição de genoma conhecida como CRISPR foi aplicada em 2018 em gêmeas chinesas O procedimento tinha como objetivo conferir a elas a imunidade ao vírus HIV No entanto acreditase que o procedimento não tenha sido completamente eficaz além de ter promovido outras alterações gênicas de forma não controlada Uma série de questões éticas foi levantada com esse acontecimento já que a edição gênica em embriões humanos viáveis não é eticamente permitida e nem mesmo apresenta evidências científicas suficientes que suportem sua aplicação Mais informações sobre esse acontecimento podem ser encontradas nos links httpscanaltechcombrsaude polemicagemeaseditadasgeneticamentepodemsofrermutacoes inesperadas157147 e httpsbrasilelpaiscombrasil20181126 ciencia1543224768174686html entre outros CURIOSIDADE 79 Outra abordagem que pode ser considerada em avaliações de genômica funcional é a chamada genética reversa ou genética inversa O uso do termo reversa se deve ao fato de que com essa abordagem diferentemente da abordagem genética convencional na qual a partir da observação de um fenótipo se busca a determinação do DNA e das proteínas associadas a ele o processo se dá a partir da observação de um DNA ou de uma proteína que não se saiba qual a origem genética ou seja que não se tenha informação sobre os genes associados Nesse sentido na genética reversa a função de uma proteína desconhecida pode ser investigada de maneira reversa ao processo de síntese proteica Desse modo a partir da proteína podese determinar a sequência de aminoácidos que a compõem e consequentemente podem ser obtidas as sequências de nucleotídeos capazes de codificar tais aminoácidos Essa sequência de nucleotídeos decodificada pode ser utilizada para a síntese de uma sonda de hibridização capaz de se ligar à região do cromossomo onde se encontra o gene responsável pela síntese da proteína que deu início ao processo Tanto os genes encontrados a partir da engenharia reversa descrita quanto aqueles possíveis genes determinados pela observação das ORFs em uma sequência de DNA podem ser submetidos a experimentos de mutagênese in vitro para a investigação de outras informações relativas à funcionalidade que pode ser obtida pelo fenótipo que será expresso Uma importante aplicação da genética reversa é a direta manipulação do genoma de vírus auxiliando na elucidação do ciclo viral do envolvimento dos genes nesse ciclo e nos efeitos danosos provocados pelo vírus em seu hospedeiro além de auxiliar na determinação de mecanismos que possam ser utilizados para a produção de drogas antivirais e vacinas Relembrando de maneira resumida a genômica funcional busca conhecer e entender como as variações genéticas presentes no genoma se refletem em características fenotípicas em diferentes níveis de organização como o molecular o celular e até mesmo no organismo como um todo Nesse contexto diversos projetos similares ao Projeto Genoma Humano foram iniciados com o objetivo de unir esforços formando consórcios e avançando nas pesquisas da área da genômica funcional Um desses projetos é o ENCODE enciclopédia de elementos do DNA do inglês encyclopedia of DNA elements cujo início aconteceu em 2003 logo após a finalização do Projeto Genoma Humano O principal objetivo do ENCODE é identificar todos os elementos funcionais do genoma humano ao nível de DNA mas também ao nível de proteínas RNA e outros elementos que atuem em algum momento de ativação dos genes No início do projeto foi executado um piloto que focou apenas na identificação dos métodos de análise do genoma que melhor se adequassem às análises subsequentes e apresentassem também um custo adequado ou seja que apresentassem o melhor custobenefício diante do objetivo a ser atingido Na fase seguinte muitos dos trabalhos realizados no ENCODE foram com linhagens celulares imortalizados e por fim nas fases mais recentes amostras de diversas fontes como célulastronco células primárias diferentes tecidos entre 80 outros Dessa forma atualmente o ENCODE possui um banco de dados composto pelos resultados de aproximadamente 12000 ensaios realizados pelos pesquisadores que compõem o consórcio Tais resultados obtidos com a aplicação de técnicas como o sequenciamento de ChIP ajudaram a encontrar e compreender diversos elementos funcionais do genoma humano como os próprios genes polimorfi smos de nucleotídeo único regiões de transcrição e de ligação a proteínas elementos de DNA conservados e informações sobre a montagem e modifi cação de cromatina Outros projetos também foram desenvolvidos com o objetivo de avaliar a genômica funcional dos genomas de outros organismos como o modENCODE e o mouse ENCODE os quais focaram os esforços na avaliação funcional do genoma de organismos modelo como a Drosophila melanogaster o Caenorhabditis elegans e o Mus musculus Além disso a partir do ENCODE foi lançado o projeto GENCODE cujo objetivo primário era determinar as características de cada gene presente no genoma humano fornecendo as anotações funcionais desses elementos Posteriormente o objetivo do GENCODE foi expandido para que as mesmas anotações fossem obtidas para o genoma do camundongo Atualmente o GENCODE se encontra em uma fase de duração prevista até o ano de 2021 cujo objetivo está atrelado aos genomas humano e do camundongo visando à ampliação da cobertura e da qualidade das anotações realizadas para ambos os genomas Similar a esses grandes projetos e visando estudos sobre a genômica funcional outros projetos também foram iniciados estando alguns ainda em desenvolvimento como o FANTOM o Roadmap Epigenomics o GTEx e o Human Protein Atlas HPA Alguns deles inclusive avançaram expressivamente no entendimento da genômica funcional por meio da inclusão de análises em tecidos de doadores postmortem amostras de sangue cultivo celular primário entre outras metodologias de obtenção de amostras que auxiliam na expansão do conhecimento que anteriormente era principalmente investigado em linhagens celulares imortalizadas as quais não refl etem as condições de variabilidade genética de diferentes populações Conheça mais sobre a genômica funcional do genoma humano acessando os sites dos projetos ENCODE e GENCODE httpswwwencodeprojectorg e httpswwwgencodegenesorg DICA 81 6 POLIMORFISMO GENÉTICO Como era de se esperar o genoma humano assim como o de outros organismos apresenta uma similaridade extremamente grande entre os diferentes indivíduos No entanto variações no código genético eventualmente ocorrem algumas delas inclusive apresentando efeito deletério estando por exemplo associadas a doenças Porém muitas dessas variações representam alterações neutras ou até mesmo benéficas ao organismo Embora a frequência de variações no genoma não seja alta quando uma determinada variação ocorre em pelo menos cerca de 1 da população o que a torna uma variação comum essa variação passa a ser tratada como um polimorfismo genético Por outro lado as variações que ocorrem em uma porcentagem menor da população são chamadas de variações raras Independentemente de ser um polimorfismo genético ou uma variação rara é importante ressaltar que não há até o presente momento relação comprovada entre a frequência de ocorrência de uma variação e atividade que essa variação pode representar ou seja embora de maior frequência existem polimorfismos genéticos associados a doenças graves enquanto também existem variações raras que representam efeito nulo para o indivíduo Apesar de ambas as variações poderem apresentar importante modificação para o indivíduo os polimorfismos genéticos têm se mostrado uma importante descoberta o que despertou um grande interesse no mapeamento desse tipo de variação bem como no estudo das associações genótipofenótipo em que elas possam estar envolvidas Por esse motivo o estudo dos polimorfismos pode ser considerado um estudo de genômica funcional Assim o estudo dos polimorfismos genéticos tem permitido que diferentes fenótipos por exemplo associados a doenças ou até mesmo a comportamentos sejam associados a um ou vários polimorfismos nos alelos de um cromossomo elucidando os mecanismos envolvidos na determinação do fenótipo Entre as variações que podem originar os polimorfismos genéticos estão a mudança a deleção ou a multiplicação de apenas um ou de vários pares de bases nitrogenadas na sequência do DNA Tais variações podem ocorrer na região codificadora éxon na região não codificadora íntron de um gene ou em uma região promotora de transcrição do mRNA o que diretamente implica no processo celular que a variação estará atuando Desse modo polimorfismos que ocorrem em um íntron normalmente não afetarão a expressão do gene em questão e possivelmente serão apenas detectadas em avaliações do DNA ao passo que os polimorfismos encontrados em um éxon podem diretamente promover alterações no fenótipo do indivíduo já que variações na proteína codificada poderão ser observadas Ainda polimorfismos em regiões reguladoras também podem diretamente afetar o fenótipo por meio de alterações que podem ocorrer na transcrição do mRNA 82 Os polimorfi smos podem ser diferentes tipos como polimorfi smos de nucleotídeo único SNP ou polimorfi smos promovidos por inserções ou deleções no DNA chamadas de polimorfi smos indel os quais podem ser do tipo polimorfi smo no número de cópias CNP polimorfi smo repetido em tandem curta STRP ou polimorfi smo de repetição em tandem de número variável VNTR No polimorfi smo de nucleotídeo único SNP como o próprio nome já indica o polimorfi smo ocorre em apenas um nucleotídeo Assim na maioria da população uma determinada posição do genoma é ocupada pelo nucleotídeo A No entanto para uma pequena parte da população maior que 1 essa mesma posição é ocupada pelo nucleotídeo C caracterizando uma SNP Esse tipo de polimorfi smo pode ocorrer tanto nos éxons quanto nos íntrons de um gene ou nas regiões entre um gene e outro sendo que a sua ocorrência em cada uma dessas regiões pode estar atrelada a um diferente efeito observado no indivíduo fenótipo podendo inclusive não representar alteração fenotípica É importante também relembrar que mesmo que a SNP ocorra na região codifi cadora de um gene ela pode não apresentar alteração fenotípica já que o código genético é degenerado e portanto diferentes códons podem codifi car para um mesmo aminoácido na proteína que será traduzida As SNPs presentes na região codifi cadora do gene mas que não afetam a sequência de aminoácidos são chamadas de SNP sinônimas enquanto aquelas que afetam a sequência são as não sinônimas Além da direta infl uência na síntese proteica que as SNPs presentes na região codifi cadora do gene podem apresentar as SNPs presentes fora dessa região podem representar alterações na expressão gênica por meio de modifi cações que afetam a degradação do mRNA os fatores de transcrição do gene entre outros As SNPs constituem o mais frequente tipo de variação encontrada no genoma humano e ocorrem principalmente nas regiões não codifi cadoras do DNA Algumas SNPs são comuns a certas subpopulações humanas podendo por exemplo estar relacionadas a alguma característica étnica Nesse sentido algumas SNPs são consideradas marcadores informativos ancestrais e utilizados em estudos sobre a origem humana auxiliando na obtenção de informações relativas ao fl uxo gênico dos nossos ancestrais e das possíveis rotas de migração que ocorreram durante a ocupação do globo Talvez você ainda não saiba mas a palavra tandem aplicada ao contexto da biologia molecular indica que as sequências de DNA que se repetem estão umas atrás das outras ou seja são repetições adjacentes NOTA 83 As SNPs consideradas marcadores ancestrais podem ser utilizadas para a identificação de características étnicas de um indivíduo a partir apenas de uma amostra de DNA auxiliando por exemplo investigações forenses na busca de pistas sobre um determinado criminoso Embora a maioria das SNPs não esteja diretamente relacionada como causa de uma doença ou condição sua presença pode indicar características relacionadas à propensão ou não ao desenvolvimento de algumas doenças bem como a maneira com que o indivíduo responde a determinados medicamentos patógenos vacinas entre outros Por esses e outros motivos o estudo dos SNPs é de extrema importância para a área da medicina personalizada A detecção das SNPs atualmente pode ser facilmente alcançada com a aplicação de técnicas mais recentes e avançadas de sequenciamento de DNA como o aplicado pela plataforma SOLiD Com a facilidade no sequenciamento desse tipo de polimorfismo atualmente já existem bancos de dados deles e com base nessas informações também estão disponíveis softwares capazes de fazer a predição in silico do efeito promovido por uma SNP em proteínas informações que posteriormente podem ser comprovadas com experimentos in vivo Outro tipo de polimorfismo é o CNP ou polimorfismo no número de cópias sendo um dos tipos de polimorfismos mais recentemente descoberto e assim como os demais tipos de polimorfismo ainda pouco elucidado quanto à sua influência ocorrência em condições de doenças ou na susceptibilidade a elas Esse tipo de polimorfismo pode ser resumido como uma variação no número de cópias de segmentos relativamente extensos do DNA entre 200 pb até cerca de 2 Mb os quais podem estar ausentes ou presentes em um determinado alelo ou podem estar presentes em variados números de cópias em tandem em cada um dos alelos representando uma vasta gama de alelos possíveis com esse tipo de variação Uma das técnicas utilizadas para a detecção e caracterização dos CNPs é a hibridização comparativa do genoma Com essa técnica o DNA de uma amostra referência e da amostra que será testada é isolado sendo cada um desses DNAs marcados com fluoróforos de cores diferentes Em seguida eles são desnaturados e hibridizados em uma placa contendo milhares de diferentes oligonucleotídeos sintetizados a partir de sequências únicas do genoma Assim de maneira bastante simplificada a partir da hibridização do DNA teste e do DNA referência pode ser avaliado por meio das cores emitidas se o tamanho das regiões hibridizadas é igual nas amostras teste e referência maior na amostra de referência ou maior na amostra teste indicando que não há polimorfismo no número de cópias deleção de número de cópias na amostra teste ou aumento no número de cópias na amostra teste respectivamente O terceiro tipo de polimorfismo que iremos conhecer é o polimorfismo repetido em tandem curta STRP também conhecido como microssatélites Esse tipo de polimorfismo é caracterizado por sequências curtas de DNA entre 2 e 4 nucleotídeos que podem estar repetidas em tandem até algumas dezenas de vezes sendo essas sequências chamadas de microssatélites Diferentemente dos SNPs que apenas 84 apresentam 2 alelos diferentes as regiões de microssatélites podem apresentar múltiplos alelos diferentes uma vez que cada alelo é determinado pela quantidade de cópias em tandem Uma grande quantidade de microssatélites já foi mapeada no genoma humano sendo a maior parte encontrada em regiões não codificadoras No entanto quando os microssatélites se encontram em regiões reguladoras ou codificadoras do DNA mutações nessas regiões podem estar diretamente relacionadas à fenótipos de doenças como as doenças caracterizadas como distúrbios de repetição trinucleotídica Nessas doenças mutações no número de repetições de uma sequência de três nucleotídeos tornam o DNA instável promovendo alterações na função ou expressão de proteínas na regulação da expressão gênica entre outras possíveis alterações danosas Um exemplo de doença desse tipo é a síndrome do X frágil que se caracteriza pela mutação no número de repetições CGG no cromossomo X sendo que indivíduos sem a doença apresentam cerca de 50 repetições nesse microssatélite indivíduos portadores da doença apresentam de 60 a 230 repetições enquanto aqueles que expressam a doença podem apresentar até 2000 repetições dessa sequência trinucleotídica Os STRP ou DNA microssatélites não podem ser facilmente sequenciados pelos métodos que utilizam o alinhamento de diferentes fragmentos para a montagem de contigs pois com esse tipo de método as sequências repetidas seriam sobrepostas e o resultado obtido possivelmente não iria representar o real tamanho do microssatélite sequenciado Por esse motivo a técnica mais aplicada para o estudo de microssatélites é a amplificação por PCR utilizando primers complementares às regiões flanqueadoras do polimorfismo seguida da aplicação do material para a resolução em eletroforese de gel de acrilamida ou agarose no qual as amostras podem ser coradas e o tamanho dos fragmentos amplificados pode ser determinado Em muitos casos o material amplificado na PCR pode também ser submetido ao sequenciamento pelo método de Sanger para que seja conhecida a sequência de nucleotídeos e o exato número de cópias que compõem o microssatélite No entanto mesmo com aplicação da PCR e do sequenciamento de Sanger existem algumas limitações na avaliação de DNAs microssatélites pois tanto a PCR quanto o sequenciamento Sanger apresentam limitações quanto ao tamanho dos fragmentos que podem ser amplificados e sequenciados respectivamente 85 FIGURA 6 AVALIAÇÃO DE DNA MICROSSATÉLITE STRP POR ELETROFORESE EM GEL REPRESENTAÇÃO DO MATERIAL GENPETICO AMPLIFICADO DE QUATRO INDIVÍDUOS APRESENTADOS EM UM HERODOGRAMA REPRESENTANDO A HERANÇA DO POLIMORFISMO DE CÓPIAS EM TANDEM DO DINUCLEOTÍDEO AC NÚMEROS AO LADO DOS PARÊNTESES INDICAM O NÚMERO DE CÓPIAS DO DINUCLEOTÍDEO AC EM CADA UM DOS INDIVÍDUOS FONTE Adaptado de Nussbaum et al 2008 Outro polimorfismo também do tipo indel bastante similar ao STRP é o chamado polimorfismo de repetição em tandem de número variável VNTR também chamado de DNA minissatélite Nesse caso os DNA minissatélites são formados por sequências um pouco maiores com cerca de 10 até 100 nucleotídeos repetidos em tandem por centenas a milhares de vezes Assim como nos microssatélites as regiões de DNA minissatélite apresentam uma vasta gama de alelos diferentes em decorrência dos diferentes números de repetições Desta forma demonstrase que apenas indivíduos que sejam gêmeos idênticos podem apresentar os mesmos alelos para diferentes minissatélites Sabendo dessa vasta diferença entre diferentes indivíduos a caracterização simultânea de alguns polimorfismos do tipo minissatélite por meio de PCR e eletroforese em gel pode ser utilizada como uma ferramenta para a determinação do fingerprinting de DNA de cada indivíduo ou seja uma espécie de digital genômica Tal tecnologia inclusive pode ser aplicada para determinar se amostras obtidas em cenas de crime por exemplo pertencem a um ou mais indivíduos 86 RESUMO DO TÓPICO 1 Neste tópico você adquiriu certos aprendizados como A genômica surgiu a partir dos avanços alcançados especialmente nas técnicas de sequenciamento de DNA Genômica se refere ao estudo de todo o genoma de um organismo Diversos organismos modelos tiveram seus genomas sequenciados ainda durante o período do Projeto Genoma Humano e a área da genômica ainda se mantém em expansão devido a tantos outros organismos que estão tendo seu genoma sequenciado A genômica representa uma área de investigação bastante complexa especialmente devido à geração de dados em larga escala a qual pode ser subdividida em genômica estrutural na qual são construídos os mapas cromossômicos de baixa e alta resolução bem como os mapas físicos os quais indicam a posição de cada gene dentro de um cromossomo genômica funcional na qual são investigadas as funcionalidades dos genes e outros elementos do código genético que foram mapeados na genômica estrutural bem como suas interações com outros componentes celulares como as proteínas Assim como o Projeto Genoma Humano atuou na genômica estrutural do DNA humano outros projetos foram lançados e alguns inclusive ainda estão em curso como objetivo de expandir o conhecimento sobre a genômica funcional como o ENCODE o GENCODE o FANTOM o Roadmap Epigenomics o GTEx e o Human Protein Atlas HPA Variações genéticas como os polimorfismos são componentes estudados e avaliados dentro da genômica funcional Os grandes avanços rapidamente alcançados pela genômica na chamada era genômica deram início a era pósgenômica com o desenvolvimento e expansão de outras ciências ômicas como a proteômica a transcriptômica e a metabolômica 87 RESUMO DO TÓPICO 1 1 Descreva o que conhecer o genoma de um organismo pode representar 2 A genômica estrutural pode ser dividida em diferentes etapas a Mapas cromossômicos de baixa resolução análise de polimorfismos e sequenciamento b Mapas cromossômicos de baixa resolução mapas cromossômicos de alta resolução e mapas cromossômicos físicos c Mapas cromossômicos de alta resolução eletroforese e sequenciamento 3 Uma das abordagens utilizadas pela genômica funcional é a busca por quadros abertos de leitura ou ORFs no genoma sequenciado Explique o que caracteriza uma ORF e por que ela se aplica aos estudos de genômica funcional 4 O que caracteriza um polimorfismo genético Qual área da genômica estuda esse tipo de variação genética Cite e descreva pelo menos três tipos de polimorfismo AUTOATIVIDADE 88 89 PROJETO GENOMA HUMANO 1 INTRODUÇÃO Atualmente está claro que sequenciar o genoma humano assim como o de outras espécies constitui uma ferramenta importante e um grande avanço para a ciência No entanto se nos remetermos às décadas de 80 e 90 quando surgiu a possibilidade técnica e o interesse em executar tamanha façanha muitos foram os questionamentos sobre a necessidade e os reais interesses por trás dessa empreitada Uma grande questão estava relacionada à audaciosa empreitada que sequenciar o genoma humano representava e todo o custo atrelado a isso pois já havia evidências de que o DNA humano seria composto por milhões de pares de bases havendo uma estimativa de custo de cerca de um dólar para cada nucleotídeo que fosse sequenciado Assim com o alto custo estimado muitas perguntas foram feitas em relação a como o projeto seria financiado A melhor alternativa e talvez a única viável foi a organização de consórcios de cooperação entre laboratórios interessados em participar do Projeto Genoma Humano Dessa forma começou uma era de interação entre a pesquisa acadêmica e a pesquisa comercial o que inclusive trouxe à tona ainda mais questionamentos sobre como o projeto seria desenvolvido e se de fato ele representaria algum avanço para as ciências biológicas Outra questão que foi levantada no início do projeto era em relação ao tempo que levaria para finalizálo visto que havia uma estimativa de cerca de 15 anos para a sua finalização Ainda mais relevante do que o tempo questionouse sobre a necessidade de sequenciar todo o genoma sendo sugerido por muitos cientistas que fossem sequenciadas apenas as regiões codificadoras de gene Antes de se conhecer o genoma humano já se sabia que a maior parte do DNA era composta por sequências não codificadoras e portanto sem interesse científico Assim iniciouse a discussão se o sequenciamento deveria ser feito em todo o DNA ou apenas nas regiões codificadoras e pelo que se sabe embora o sequenciamento tenha sido completo nunca se chegou a uma conclusão sobre esse debate UNIDADE 2 TÓPICO 2 90 2 PGH Após o surgimento da ideia do Projeto Genoma Humano rapidamente iniciou se uma corrida por financiamentos e desenvolvimento de tecnologias que pudessem acelerar o processo Diante de tantos interessados surgiu uma organização internacional chamada HUGO do inglês Human Genome Organization com a finalidade de ordenar e agrupar os resultados obtidos nos mais diversos laboratórios ao redor do mundo centralizando as informações em um banco de dados chamado Genome Database Vale ressaltar que o objetivo inicial do PGH não era necessariamente sequenciar cada base que compõe o DNA humano mas sim mapear o genoma detalhando a localização dos genes em cada um dos cromossomos para determinar por exemplo a localização de genes associados a doenças e marcadores específicos para essas regiões No entanto como já mencionado durante o desenvolvimento do PGH houve grande avanço nas técnicas e metodologias de sequenciamento de nucleotídeos e na bioinformática associada ao sequenciamento ou seja nos sistemas de informação e algoritmos utilizados para o pareamento e interpretação do grande volume de sequências de nucleotídeos obtidas com os sequenciamentos em larga de escala Tais avanços biotecnológicos e de bioinformática foram os principais responsáveis pelo rápido progresso obtido no PGH Com tanto avanço em 1999 foi divulgado o sequenciamento completo do cromossomo 22 trazendo à tona à possibilidade inédita de localizar cada um dos genes presentes em um cromossomo de vertebrado Logo em seguida em 2001 foi publicado o primeiro esboço do genoma humano completo indicando a localização dos genes em cada um dos cromossomos No entanto embora parecesse que o PGH havia alcançado seu objetivo com a quantidade de informação obtida até esta etapa ficou claro que ainda levaria muitos anos para que toda essa informação fosse interpretada Diante dos genomas que já haviam sido sequenciados o genoma humano apresentou proporções numéricas sem precedentes com aproximadamente 32 milhões de pares de bases e cerca de 30 mil genes Embora o esboço do genoma humano tenha sido publicado em 2001 pelos pesquisadores Francis Collins e Craig Venter o Projeto Genoma Humano foi de fato considerado concluído apenas em 2003 Durante o projeto duas grandes frentes de trabalho independentes foram organizadas uma formada por cerca de 5000 cientistas em um consórcio público e a segunda por meio da iniciativa privada da empresa Celera Genomics cujo objetivo era patentear os genes sequenciados Cada uma dessas frentes de trabalho abordou o objetivo comum de sequenciar o genoma humano de maneira distinta 91 O consórcio público aplicou a técnica do sequenciamento shotgun hierárquico enquanto a Celera Genomics abordou o sequenciamento de maneira global aplicando o shotgun de genoma inteiro Com o shotgun hierárquico cada cromossomo foi sequenciado individualmente por meio da fragmentação do DNA em grandes fragmentos cerca de 150 mil pares de bases correspondendo à aproximadamente um cromossomo Cada um desses grandes fragmentos foi inserido em vetor apropriado Nesse caso o vetor utilizado foi o BAC cromossomo artificial de bactéria pois ele permite a inserção de grandes fragmentos de DNA e é clonado para a formação da biblioteca de DNA Após essa primeira etapa de clonagem cada um desses clones teve seu inserto clivado e submetido a uma nova fragmentação Desta vez os fragmentos menores foram inseridos em vetores plasmidiais clonados e suas extremidades sequenciadas Por fim por sobreposição de sequências localizadas na extremidade dos fragmentos as quais se encontravam ligadas ao vetor foi realizada a montagem dos contigs e posteriormente a organização desses contigs formou a sequência completa do DNA No shotgun de genoma inteiro a estratégia utilizada pela Celera Genomics o DNA total foi fragmentado e clonado a partir de diferentes tamanhos de fragmentos formando três bibliotecas de DNA uma com fragmentos de 2 mil outra com fragmentos de 10 mil e uma terceira com fragmentos de 130 mil pares de base As extremidades dos insertos de cada uma das diferentes bibliotecas foram sequenciadas e novamente por sobreposição das sequências foram determinados os contigs e também os scaffolds sequências maiores obtidas a partir do alinhamento dos contigs 92 FIGURA 7 ESQUEMA DOS SEQUENCIAMENTOS DO TIPO SHOTGUN HIERÁRQUICO E DE GENOMA INTEIRO UTILIZADOS NO PROJETO GENOMA HUMANO FONTE Adaptado de Moreira 2015 Ainda mais intrigante do que o tamanho e a quantidade de genes que formam o genoma humano é saber que apenas uma pequena porcentagem estimase que apenas cerca de 3 de toda essa informação representa as sequências codificadoras ou seja as sequências que compões os éxons Outra observação intrigante foi que em média um gene humano apresenta 27 mil pares de bases No entanto para que uma proteína de tamanho médio cerca de 430 aminoácidos seja codificada são necessárias cerca de apenas 1300 pares de bases indicando que a grande maioria dos nucleotídeos que compõem cada um dos genes humanos representa as sequências não codificadoras de proteínas ou seja os íntrons 93 Além de informações sobre os éxons e os íntrons de cada gene o PGH também forneceu informações importantes sobre as sequências reguladoras presentes no DNA Tais sequências são de extrema importância pois são elas que regulam quando quanto e onde o gene será expresso Ou seja essas sequências determinam o tipo celular em que determinado gene deve ser expresso em que momento o gene será necessário e quais os níveis de expressão são adequados ao momento Um dos grandes desafios na interpretação dos dados de sequenciamento do genoma humano foi justamente o fato de que maior parte das informações sequenciadas não são codificadoras Devido à chamada desorganização em que o genoma humano se apresenta as poucas sequências de DNA codificador além de pequenas contendo em média 150 pares de nucleotídeos encontramse dispersas em meio a sequências aleatórias e maiores de DNA não codificante dificultando consideravelmente a investigação do tamanho real do conjunto de éxons suas localizações bem como as regiões de início e o fim de cada gene Sabese que as regiões codificadoras e reguladoras de DNA ou seja as regiões que apresentam uma função são geralmente conservadas entre as espécies Assim uma das estratégias utilizadas para conhecer as sequências codificadoras do genoma humano é baseada na sua comparação com o genoma de outras espécies que sejam evolutivamente relacionadas aos seres humanos como por exemplo o de outros mamíferos como camundongos A partir dessa estratégia podem ser definidas as regiões conservadas entre duas espécies o que indica que essas regiões apresentam função biológica e portanto estiveram menos sujeitas a mutações ao longo do processo evolutivo Diante de todo o conhecimento alcançado pelo PGH houve um considerável avanço na área dos estudos biomédicos visto que se tornou possível conhecer o fator genotípico associado a diversas doenças com o conhecimento do DNA humano seus genes e suas funções Embora toda essa informação inegavelmente represente um extremo avanço não se pode deixar de considerar as questões éticas que permeiam o sequenciamento do genoma humano Alguns cientistas mesmo durante o decorrer do PGH já haviam apontado algumas dessas questões éticas a serem consideradas Entre elas especial atenção deve ser dada a como a informação sobre sequências de DNA associadas às doenças poderiam gerar discriminação e segregação pois sabese que embora o componente genético seja de extrema relevância para determinadas doenças em muitos casos o fenótipo associado a essas doenças apenas se desenvolve em decorrência de fatores ambientais por exemplo Dessa forma utilizar o sequenciamento de DNA para elencar predisposição a doenças poderia levar a uma errônea segregação de populações ou indivíduos predispostos a determinadas doenças Tão importante quanto o ponto citado outro conflito ético muito bem apontado está no fato de que mesmo com a descoberta de genes e suas associações com várias doenças isso não representa melhora na terapêutica para tais doenças Grande evidência 94 da importância dessa questão foi a descoberta do gene associado à anemia falciforme a qual foi uma das primeiras doenças a ter seu gene identificado e portanto ser declarada uma doença genética Mesmo com essa descoberta pouco ou nenhum avanço no tratamento da doença foi alcançado com a ajuda do conhecimento genético sobre ela Por fim a questão ética mais relacionada a como as informações do genoma humano poderiam ser utilizadas e interpretadas foi a questão do patenteamento dos genes humanos Houve o interesse especialmente por parte da empresa Celera Genomics em patentear os genes humanos sequenciados por ela Dessa forma a empresa capitalizaria essas informações o que poderia inclusive inviabilizar ou encarecer o custo da pesquisa e o desenvolvimento dos tratamentos para as doenças associadas a esses genes Diante dessa preocupação antes da finalização do PGH diversas entidades e governantes como a Organização das Nações Unidas UNESCO a HUGO o então presidente dos Estados Unidos Bill Clinton e o primeiro ministro do Reino Unido na época Tony Blair fizeram declarações e apelos para que as informações do genoma humano fossem mantidas públicas inclusive como apontado pela UNESCO pelo fato de que o genoma humano deve ser considerado um patrimônio da humanidade e portanto não um bem privado Transpassadas as questões técnicas e éticas do PGH é inegável a sua importância para as ciências biológicas e biomédicas Nas ciências biológicas o decorrer do PGH motivou e permitiu o sequenciamento de genomas de diversos outros organismos enquanto nas ciências biomédicas o PGH proporcionou o conhecimento dos genes associados a diversas doenças motivou e impulsionou avanços biotecnológicos e farmacológicos associados aos tratamentos de muitas dessas doenças 95 RESUMO DO TÓPICO 2 Neste tópico você adquiriu certos aprendizados como Com os avanços na genômica foi lançado o Projeto Genoma Humano PGH ainda na década de 90 no qual o DNA humano foi sequenciado em menos de 15 anos de estudo o que só foi possível devido à formação de consórcios interlaboratoriais Embora o PGH tenha atualmente uma reconhecida importância para o avanço científico e biotecnológico questões como custo necessidade e tempo foram levantadas quando do início de seu desenvolvimento A grande quantidade de sequências não codificadoras presentes no DNA humano foi um grande desafio para a interpretação dos dados obtidos do sequenciamento do genoma Para que as regiões codificadoras do DNA humano sejam reconhecidas uma das técnicas aplicadas é a busca por regiões conservadas no genoma de outros mamíferos pois no geral a presença de regiões conservadas está relacionada à funcionalidade dessas regiões 96 1 Embora o sequenciamento do genoma humano proposto e executado pelo Projeto Genoma Humano tenha sido um feito de extrema relevância para diversas áreas das ciências a sua necessidade foi questionada inúmeras vezes Enumere alguns dos motivos elencados pelos cientistas ainda na década de 90 como justificativa para a não execução do sequenciamento completo do DNA humano 2 Os dois principais executores do Projeto Genoma Humano foram a Celera Genomics e o consórcio público formado por diversos laboratórios ao redor do mundo Cada um deles abordou o sequenciamento de maneira distinta a Celera Genomics utilizou o método de sequenciamento por shotgun de genoma inteiro enquanto o consórcio público utilizou o sequenciamento por shotgun hierárquico Descreva brevemente ambos os métodos apontando suas principais diferenças 3 Além do conhecimento do genoma em si cite outros avanços e benefícios que o PGH trouxe para as ciências 4 São exemplos de questões éticas que foram levantadas devido ao Projeto Genoma Humano exceto a O patenteamento das informações do genoma humano poderia inviabilizar os avanços nas pesquisas de doenças relacionadas a alterações no DNA b A relação de uma sequência no DNA a uma determinada doença não representa aumento do conhecimento para a sua cura ou tratamento c A formação de consórcios interlaboratoriais para o sequenciamento do genoma humano e Discriminação e segregação de indivíduos devido ao conhecimento da predisposição a doenças AUTOATIVIDADE 97 TÓPICO 3 AS DEMAIS ÔMICAS UNIDADE 2 1 INTRODUÇÃO No Tópico 1 desta unidade abordamos um pouco sobre a genômica uma área da biologia molecular de extrema importância por se dedicar ao conhecimento do genoma dos mais diversos organismos e com aplicações que vão desde o conhecimento da sequência do DNA até a elucidação de mecanismos associados a doenças Para muitos pesquisadores a genômica é uma área de estudo tão ampla que por vezes é considerado que o estudo de outras ômicas seja apenas uma parte da genômica especialmente da área da genômica funcional já que a funcionalidade dos diferentes elementos do genoma está diretamente atrelada à expressão de RNAs e proteínas os quais são objetos de estudo das áreas da transcriptômica e da proteômica respectivamente No entanto embora concordando que as diferentes ciências ômicas estejam intimamente relacionadas entre elas e especialmente com a genômica neste livro para fins didáticos trataremos da transcriptômica proteômica metabolômica lipidômica entre outras ômicas de maneira individualizada FIGURA 8 RELAÇÃO ENTRE AS CIÊNCIAS ÔMICAS FONTE Adaptado de Moreira 2015 98 Em geral todas as áreas chamadas de ômicas representam um extremo avanço nas áreas médicas biológicas e biomédicas sendo resultado dos avanços nas pesquisas da era pósgenômica Com essas biotecnologias é possível analisar todo o conjunto de RNAs transcritos transcriptômica proteínas proteômica metabólitos metabolômica ou lipídeos lipidômica que estejam sendo expressos em um determinado tipo celular ou em um tecido especifico nas diferentes fases de desenvolvimento de um organismo ou em uma determinada condição patológica entre outras tantas possibilidades A partir dos resultados ômicos podem ser obtidas informações relativas por exemplo à progressão de doenças como o câncer à influência de fatores ambientais sobre os processos biológicos que estejam sendo investigados ou ainda podem ser determinados biomarcadores específicos para uma determinada condição como o aumento da expressão de uma proteína que seja indicativo da presença ou do estágio de avanço de uma determinada doença Assim podese dizer que com o desenvolvimento e aplicação das ômicas é possível obter informações ou dados em larga escala capazes de elucidar respostas biológicas complexas 2 TRANSCRIPTÔMICA Já mencionamos que a trancriptômica é a ciência que estuda o transcriptoma e de maneira mais específica a transcriptômica estuda de forma quali e quantitativa o transcriptoma Agora neste item vamos entender o que de fato é o transcriptoma também chamado de transcritoma e quais as técnicas e aplicações deste tipo de estudo Transcriptoma pode ser definido como todo o conjunto de transcritos que uma célula tecido ou até mesmo um organismo está expressando em um determinado momento Sendo assim o transcriptoma compreende os RNA mensageiros mRNA os RNA ribossomais os RNA transportadores e os microRNAs Embora os mRNA possam ser considerados os principais RNAs para a compreensão da função celular pois são eles que codificam para a síntese de proteínas é importante ressaltar que o grupo dos microRNAs também representa uma importante parcela de influência na resposta celular já que são capazes de regular a expressão póstranscricional dos mRNAs impedindo a tradução do mRNA em proteína Dessa forma os estudos da transcriptômica focam especialmente na avaliação do conjunto de mRNA e microRNAs que estão sendo expressos Diferentemente do genoma que é idêntico em todas as células somáticas de um mesmo organismo uma importante característica do transcriptoma é ser específico em cada tipo celular e ser apresenta de maneira bastante variável a diferentes condições refletindo efeitos de diferentes estímulos sejam eles químicos fisiológicos patológicos entre outros Assim a avaliação de transcriptomas permite a quantificação da expressão gênica diferencial por exemplo entre os diversos tecidos de um mesmo organismo ou entre diferentes organismos da mesma espécie sob distintas condições de estresse 99 podendo assim associar a expressão gênica a doenças fornecendo dados que auxiliam no entendimento da expressão gênica e sua regulação culminando na compreensão de processos biológicos mais complexos Historicamente os primeiros esforços em se estudar o transcriptoma se iniciaram ainda na década de 90 com os avanços na elucidação dos genomas Mas apenas com as técnicas mais modernas como os microarrays e o RNAseq que tiveram expressivo avanço já nos anos 2000 e 2010 respectivamente e otimizaram em tempo e eficiência a avaliação do transcriptoma é que a transcriptômica teve seu momento de notável expansão Antes de começarmos a descrever algumas das principais metodologias utilizadas pela transcriptômica é preciso relembrar que a molécula de RNA é uma molécula bastante sensível à degradação durante a sua manipulação Assim é necessário que antes da avaliação do transcriptoma todo o RNA alvo seja convertido em cDNA por meio da reação de trancrição reversa como previamente descrito na Unidade 1 deste livro Uma metodologia aplicada ao estudo do transcriptoma é o chamado sequenciamento EST etiquetas de sequências expressas do inglês expressed sequence tags Com essa metodologia os cDNA provenientes da retrotranscrição com oligonucleotídeos sintéticos complementares à cauda poliA dos RNA são clonados em vetores específicos formando as chamadas bibliotecas de EST e têm suas extremidades sequenciadas Desta forma obtémse sequências de até 500 nucleotídeos de cada cDNA clonado sendo essas sequências chamadas de ESTs Mesmo com o cDNA não sendo todo sequenciado com base nessas pequenas sequências obtidas o RNA que originou o cDNA quase sempre pode ser identificado por meio da comparação da EST com sequências depositadas em bancos de dados buscando similaridades entre elas Para tanto ferramentas gratuitas como o BLAST Basic Local Alignment Tool devem ser adotadas Com a formação e comparação de diferentes bibliotecas de EST podem ser avaliadas diferenças na expressão dos transcritos presentes em diferentes organismos a presença de um transcrito específico a uma determinada condição fisiológica ou patológica entre outras aplicações Outra metodologia relativamente semelhante ao sequenciamento EST é o sequenciamento ORESTES ESTs de quadro de leitura aberto do inglês open reading frame EST O sequenciamento ORESTES surge como um aprimoramento da técnica de EST pois aplica o sequenciamento de regiões internas do cDNA fornecendo informações sobre a região codificadora do gene ampliando a busca por informações relativas às funções dos transcritos Para a montagem das bibliotecas ORESTES antes da etapa de clonagem o cDNA é submetido a uma PCR usando um conjunto de primers degenerados capazes de se ligar a regiões aleatórias do cDNA possibilitando a formação de clones com sequências obtidas das regiões internas dos genes Desse modo o produto da PCR é clonado formando a biblioteca ORESTES Posteriormente o sequenciamento e análise 100 se dão de forma similar ao descrito para o sequenciamento EST com pequenas regiões tendo seus nucleotídeos sequenciados as quais serão suficientes para a identificação dos genes correspondentes por meio da comparação com bancos de dados disponíveis Uma das vantagens do sequenciamento ORESTES é que devido à etapa da PCR em que ocorre a amplificação dos cDNAs presentes na reação genes raros ou pouco expressos têm sua probabilidade de detecção e identificação aumentada em relação ao sequenciamento EST Uma das técnicas mais modernas e amplamente aplicadas na análise do transcriptoma é a análise de microarray ou microarranjos de DNA a qual permite a obtenção de um grande volume de dados de forma mais rápida que as demais técnicas já descritas Nessa técnica o cDNA sintetizado a partir do transcriptoma de diferentes amostras cada uma com um fluoróforo de cor distinta é hibridizado com sondas de DNA presentes em uma superfície sólida por vezes chamada de chip como uma lâmina de vidro Nela as sequências hibridizadas emitem fluorescência que pode ser detectada e fornecerá a informação sobre o gene expresso e em que quantidade relativa de acordo com a intensidade da fluorescência emitida FIGURA 9 ESQUEMA DA EXPRESSÃO DIFERENCIAL OBSERVADA POR MEIO DA FLUORESCÊNCIA EMITIDA ATRAVÉS DA HIBRIDIZAÇÃO DO CDNA COM AS SONDAS PRESENTES NO CHIP DE MICROARRANJO DE DNA FONTE Adaptado de Moreira 2015 Como você deve ter percebido no microarranjo de DNA é necessário que sondas específicas sejam previamente sintetizadas ou seja os microarranjos são preparados com sondas provenientes de genes conhecidos formando arranjos desses genes Sendo assim para a aplicação dessa técnica é necessário que se tenha um genoma de referência com anotações para que se obtenha as informações indispensáveis para a produção das sondas necessárias ao microarranjo que se deseja avaliar Notase que além da necessidade do genoma referência a análise de microarranjo apresenta uma limitação quanto aos genes que serão avaliados não representando portanto a expressão de todo o transcriptoma da amostra em avaliação Essa técnica é bastante aplicada e útil para a avaliação da expressão diferencial de genes envolvidos em determinados processos biológicos entre indivíduos expostos a diferentes condições 101 Atualmente existem muitos chips de microarranjos comercialmente disponíveis para diversas aplicações e com os avanços tecnológicos na área cada vez mais sondas podem ser acopladas a um mesmo chip A última técnica aplicada ao estudo da transcriptômica que iremos conhecer é chamada de RNAseq e se trata basicamente da aplicação de técnicas de sequenciamento de nova geração NGS com o objetivo de caracterizar e quantificar o transcriptoma de uma determinada amostra A grande vantagem da utilização do RNA seq é que nesta tecnologia não é necessário que se tenha prévio conhecimento do genoma ou dos transcritos que serão avaliados Algumas das aplicações relacionadas a essa técnica são a avaliação da expressão gênica diferencial análise do perfil do transcriptoma e a investigação de SNPs O primeiro passo que deve ser aplicado para a avaliação do transcriptoma utilizando o método de RNAseq é o isolamento e fragmentação do RNA a ser sequenciado Nesse sentido podem ser aplicadas técnicas que isolem apenas uma determinada população de RNAs como os mRNAs ou os rRNA RNA ribossomais Na sequência esses RNAs devem ser convertidos em cDNA os quais irão compor uma biblioteca de cDNA Após a formação da biblioteca de cDNA as moléculas devem ser fragmentadas por ação de enzimas de restrição sonicação ou nebulização formando pequenos fragmentos que serão ligados a adaptadores Os adaptadores são pequenas sequências de nucleotídeos que irão indicar onde o sequenciamento deve ser iniciado em cada molécula Assim podem ser ligados adaptadores apenas em um dos lados de cada fragmento ou de ambos o que implica no sequenciamento ser realizado apenas em uma das extremidades dos fragmentos de cDNA ou em ambas Após esse processo diversos métodos de sequenciamento NGS como os previamente apresentados na Unidade 1 deste livro podem ser aplicados para o sequenciamento de pequenas porções normalmente compostas de 30 até 400 pb de cada um dos fragmentos Após o sequenciamento em massa dos numerosos fragmentos de cDNA as sequências obtidas podem ser alinhadas à sequência de um genoma ou transcriptoma de referência e por meio do auxílio de softwares os RNAs poderão ser identificados No entanto com o método RNAseq mesmo sem um genoma ou transcriptoma de referência essas sequências obtidas podem ser montadas novamente formando o transcriptoma em avaliação e indicando os níveis de expressão desses RNAs A tecnologia de RNAseq também se destaca em relação às demais tecnologias de avaliação de transcriptoma pois com esse método a cobertura de detecção é expandida e tem maior acurácia na detecção tanto de genes pouco expressos quanto daqueles expressos em abundância diferentemente dos demais métodos descritos que não apresentavam eficiência adequada especialmente para genes pouco expressos Uma adaptação dessa metodologia que tem sido avaliada e aplicada é o sequenciamento direto do RNA sem que seja necessário o seu processo de transcrição reversa A maior justificativa para o desenvolvimento e aprimoramento dessa nova 102 abordagem se deu pela observação de que o processo de manipulação do RNA que forma o cDNA as bibliotecas e os fragmentos pode inserir vieses nas análises do transcriptoma o que facilmente seria evitado por meio do sequenciamento direto do RNA Tal abordagem tem sido explorada mas ainda não substituiu o método clássico com a utilização dos cDNA que são moléculas mais estáveis que o RNA Outra evolução do RNAseq é a aplicação do método para a avaliação do perfil de expressão gênica de uma única célula chamado de scRNAseq Essa abordagem é bastante interessante pois quando se avalia o transcriptoma de amostras formadas por diferentes tipos celulares os resultados obtidos podem mascarar algum processo biológico específico de um dos tipos celulares que compõem a amostra Assim aplicando o scRNAseq a relação do processo biológico determinado pela avaliação do perfil de expressão gênica da célula em avaliação se dá de maneira direta A limitação do método ocorre justamente porque ele é capaz apenas de avaliar o perfil de expressão e não o transcriptoma completo da célula pois a quantidade de material disponível é bastante reduzida O fluxo de trabalho para a aplicação do scRNAseq é bastante semelhante ao previamente descrito para o RNAseq porém envolve a separação das células antes do processo de extração e isolamento do RNA As células separadas são encapsuladas individualmente em gotículas nas quais ocorre o processo de trancrição reversa sendo que nesse processo cada cDNA recebe uma marcação única como um rótulo identificando cada cDNA de cada célula Após o processo de retrotranscrição com rotulagem os cDNAs de diferentes células podem ser agrupados para o sequenciamento pois devido à marcação eles podem ser identificados e separados após a obtenção do perfil de expressão gênica nas diferentes células 103 FIGURA 10 FLUXO DE ANÁLISE DE SEQUENCIAMENTO DE RNA DE ÚNICA CÉLULA SCRNASEQ RT TRANSCRIÇÃO REVERSA PCRREAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE FONTE Adaptado de httpsenwikipediaorgwikiFileRNASeqworkflow5pdf Acesso em 14 dez 2019 3 PROTEÔMICA Até aqui já vimos como o genoma de um organismo pode ser avaliado como o transcriptoma de um organismo tecido ou até mesmo de uma célula pode ser investigado e agora analisaremos como trabalhar com o produto principal da transcrição gênica as proteínas por meio da avaliação do proteoma Como nos demais omas já mencionados o proteoma representa todo o conjunto de proteínas expressas em determinado momento em um determinado organismo tecido célula ou até mesmo em biofluidos como o plasma ou muco Por meio da avaliação proteômica é possível conhecer as proteínas que compõem esse proteoma bem como os processos biológicos em que elas possam estar envolvidas Uma interessante informação é que embora os genes apresentem a informação genética para que a síntese proteica ocorra existe um número muito maior de proteínas conhecidas do que genes que codifiquem para elas Esse fato se dá por meio de diferentes processos celulares capazes de culminar na síntese de uma proteína diferente daquela inicialmente codificada pelo gene como os processos de alterações póstraducionais os quais podem alterar as moléculas de proteína e sua função 104 Devido às modificações póstraducionais como fosforilação metilação acetilação ubiquitinação além de outros processos celulares que podem influenciar a expressão proteica foi constatado que apenas a avaliação da expressão gênica seja ela por RTqPCR ou pela avaliação do transcriptoma não reflete diretamente o perfil de proteínas expressas em uma determinada condição e suas quantidades Dessa forma houve o aumento do interesse em se investigar diretamente o proteoma para a avaliação dos processos biológicos que estejam ocorrendo nos diferentes tecidos e células em vez de avaliar apenas o seu transcriptoma Assim notase que avaliação do proteoma teve maior expansão que a avaliação do transcriptoma No entanto como pode ser observado a avaliação integrada de ambos é uma estratégia bastante eficiente e de maior confiabilidade para a avaliação de processos biológicos embora nem sempre possa ser adotada devido ao custo elevado de ambas as análises e das quantidades de amostras disponíveis Antes de iniciarmos a explanação sobre as diferentes técnicas e abordagens de avaliação proteômica vale ressaltar que o proteoma assim como outros componentes celulares está sujeito a alterações devido a influência de fatores externos como pH temperatura fármacos e outros compostos além do próprio estado nutricional da célula ou tecido em questão O método clássico para a avaliação de proteínas consiste na aplicação da técnica de eletroforese bidimensional em gel de acrilamida 2DE o qual se aplica para a análise da expressão diferencial das proteínas entre duas amostras distintas Nesse método após a extração proteica das amostras as proteínas são submetidas a uma eletroforese unidimensional para a focalização isoelétrica IEF para que as proteínas sejam separadas de acordo com seu ponto isoelétrico pI Essa separação é possível pois o pI das proteínas é influenciado pelo pH em que elas se encontram De maneira resumida se em determinado pH uma proteína apresenta pI igual a zero em pH mais elevado ela se encontrará carregada negativamente Do mesmo modo se ela estiver em um pH reduzido ela se encontrará carregada positivamente Dessa forma com a aplicação do extrato proteico em um gel com um gradiente de pH submetido a uma corrente elétrica proteínas com carga líquida soma de todas as cargas positivas e negativas das cadeias de aminoácidos que compõem a proteína negativas migrarão para o polo positivo no gel No entanto quando elas alcançarem a porção do gel com o pH que lhes confira pI igual a zero não estarão mais sujeitas à corrente elétrica que passa pelo gel e portanto ficarão estagnadas na posição em que seu pI é igual a zero Dessa forma o primeiro gel é considerado o gel de primeira dimensão 105 FIGURA 11 REPRESENTAÇÃO DO MÉTODO DE SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS DE ACORDO COM SEU PONTO ISOELÉTRICO IEF FONTE Adaptado de Buyukköroğlu et al 2018 Após a separação das proteínas no gel de primeira dimensão elas são submetidas a um processo de desnaturação e posteriormente de separação de acordo com a sua massa molecular Isso ocorre por meio da aplicação do gel de primeira dimensão em um gel do tipo SDSPAGE considerado portanto um gel de segunda dimensão Assim ao fim do processo as proteínas presentes na amostra estarão distribuídas no gel de acordo com seu ponto isoelétrico e sua massa molecular Com esse procedimento considerando um gel de cerca de 20 cm x 20 cm aproximadamente 10000 proteínas podem ser resolvidas separadas Após a separação bidimensional as proteínas no gel podem ser coradas com corantes como azul de coomassie ou com prata para que suas posições sejam identificadas 106 FIGURA 12 ESQUEMA DA ELETROFORESE BIDIMENSIONAL 2DE PARA A SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS FONTE Adaptado de Buyukköroğlu et al 2018 Uma adaptação baseada no método da eletroforese bidimensional 2DE é a eletroforese de fluorescência diferencial em gel 2D 2DDIGE Com essa técnica tornouse possível a avaliação concomitante das proteínas presentes em duas ou mais amostras executando as corridas no mesmo gel Diferentemente do método 2DE em que as proteínas são coradas apenas após a corrida no gel de segunda dimensão nessa nova metodologia as amostras são marcadas com diferentes fluoróforos capazes de se ligar covalentemente aos resíduos de lisina já no processo de preparação da amostra Dessa forma ao final da corrida no gel de segunda dimensão os pontos spots ocupados por cada proteína podem ser avaliados diferencialmente de acordo com a razão entre a intensidade da fluorescência dos fluoróforos exclusivos de cada uma das amostras 107 FIGURA 13 ESQUEMA REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DE PROTEÍNAS SEGUNDO O MÉTODO DE ELETROFORESE DE FLUORESCÊNCIA DIFERENCIAL 2DDIGE FONTE Adaptado de Minden 2012 Embora os métodos 2DE e 2DDIGE sejam bastante eficientes e apresentem alta reprodutibilidade com eles apenas é possível avaliar a expressão diferencial das proteínas presentes em diferentes amostras sem no entanto conhecer a sequência de aminoácidos que compõem essas proteínas Dessa maneira a partir dos géis de corrida de proteínas foram desenvolvidas metodologias que pudessem analisar a sequência de aminoácidos de proteínas selecionadas por meio da excisão da fração do gel que contivesse as proteínas de interesse com posterior preparo digestão in gel e análise por espectrometria de massas MS De maneira resumida no processo de digestão in gel os spots contendo as proteínas de interesse são submetidos a um processo de hidrólise química alquilação e redução dos resíduos de cisteína e enzimática normalmente com emprego da enzima tripsina Nesse processo de hidrólise a proteína encerrada no gel é clivada em fragmentos peptídicos menores capazes de migrar pela malha do gel e se difundir no sobrenadante formando a amostra a ser analisada por MS 108 FIGURA 14 ETAPAS DO PROCESSO DE DIGESTÃO IN GEL FONTE Adaptado de Moreira 2015 As amostras destinadas à análise por espectrometria de massas podem também ser obtidas após a digestão in gel de proteínas submetidas a uma corrida apenas unidimensional por exemplo em um gel SDSPAGE em que as proteínas são apenas separadas de acordo com sua massa molecular embora nesse caso as bandas obtidas do gel representem populações de proteínas com massas similares Além disso as amostras obtidas por digestão in gel ou por digestão direta da amostra sem a etapa de eletroforese podem ser submetidas a outro fracionamento prévio à análise por MS com o objetivo de reduzir a complexidade da amostra ou apenas complementar o fracionamento já realizado na eletroforese Um dos métodos de fracionamento mais aplicado é através de cromatografia líquida LC Com esse método os peptídeos presentes na amostra são dissolvidos em uma fase líquida com a qual eles não interagem Essa fase então é bombeada para passar por uma fase estacionária na qual cada um dos peptídeos presentes na fase líquida irá interagir quimicamente porém de maneira diferenciada o que permite que eles sejam fracionados As diferentes frações de peptídeos podem então ser diretamente direcionadas para as etapas seguintes de análise por MS Para a análise subsequente no espectro de massas os peptídeos devem ser ionizados para que sua carga líquida se torne positiva permitindo que essas moléculas sejam manipuladas por um campo elétrico no espectro de massas e detectadas quanto à sua razão massacarga mz No processo de ionização os peptídeos são transferidos da fase líquida amostra para a fase gasosa a qual é submetida ao campo elétrico Dessa forma os peptídeos presentes na fase gasosa são conduzidos pelo campo elétrico até o detector de mz presente no equipamento No detector as moléculas são 109 separadas de acordo com a sua mz e são registradas as abundâncias em que essas mz são detectadas As informações obtidas no detector são então apresentadas na forma de um espectro de massas FIGURA 15 ESQUEMA SIMPLIFICADO DO FLUXO DE TRABALHO PARA A DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO PROTEICO POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS FONTE Adaptado de Vaz e Tanavde 2019 110 Existem diferentes técnicas de ionização que podem ser aplicadas aos peptídeos sendo as principais delas a ionizaçãodessorção a laser assistida por matriz MALDI e a ionização por eletro spray ESI A técnica de ionização por MALDI é considerada uma técnica de ionização branda aplicável a moléculas sensíveis como DNA e proteínas pois evita que elas sejam degradadas durante o processo Nessa técnica as moléculas são dissolvidas em uma matriz orgânica o solvente é evaporado e ocorre a cocristalização dos peptídeos com a matriz Esses cristais são bombardeados por laser sendo sublimados convertidos em fase gasosa e ionizados durante o processo formando os íons peptídicos Já no processo de ionização ESI também considerado brando por preservar as amostras peptídicas os peptídeos ainda em solução fase líquida são passados por uma agulha capilar a um fluxo bastante reduzido sob um campo eletrostático de alta tensão formando um aerossol de gotículas carregadas de íons e contendo os peptídeos da amostra Essas gotículas são submetidas a um fluxo de gás inerte e aquecido o qual promove a evaporação do solvente liberando os peptídeos ionizados Após a ionização das moléculas elas são submetidas aos analisadores de mz os quais podem ser de diferentes tipos como o TOF tempo de voo do inglês time of flight o quadrupolo e a armadilha de íons IT do inglês ion trap No analisador TOF simplificadamente os íons são transportados até o detector por um tubo de vácuo Sabendo que a massa de um íon é inversamente proporcional à velocidade com que ele atravessa o tubo no detector é registrado o tempo que o íon demorou no trajeto entre a ionização e o detector transformando essa informação em mz e formando o espectro de massas O outro tipo de analisador o quadrupolo consiste em quatro eletrodos em forma de bastões capazes de filtrar os íons de acordo com sua mz permitindo que apenas íons com determinada mz passem até o detector em cada etapa de filtragem O terceiro tipo de analisador que iremos tratar é o IT capaz de filtrar e reter em um campo elétrico tridimensional armadilha determinados tipos de íons os quais gradativamente são liberados para a detecção de acordo com sua mz em ordem crescente Devemos chamar a atenção para o fato de que com os processos descritos até este momento os detectores de MS apenas são capazes de gerar informações relativas à mz dos diferentes peptídeos originados do processo de digestão proteica No entanto é de grande interesse dos estudos proteômicos que as sequências de nucleotídeos que compõem as proteínas sejam também identificadas Para tal propósito um segundo ciclo de MS pode ser aplicado Nesse segundo ciclo os íons peptídicos são fragmentados pelo processo de dissociação induzida por colisão CID ou por transferência de elétrons ETD formando íons de menor massa molecular que são destinados a um segundo detector de mz Nele será gerado um espectro de massas proveniente da detecção de diferentes íons que diferem entre si apenas pela mz correspondente à massa de um aminoácido sendo esse espectro denominado de MSMS ou MS2 No processo de fragmentação dos íons peptídicos são utilizadas técnicas que favorecem a formação de fragmentos que sejam opostos e complementares como os íons de classe y e b os quais são formados a partir de fragmentos de peptídeos que preservem a carga nas 111 regiões C e N terminais dos peptídeos respectivamente Dessa forma a sequência de aminoácidos dos peptídeos pode ser deduzida sendo esse processo executado por softwares apropriados e chamado novamente de sequenciamento Posteriormente os peptídeos sequenciados podem formar a sequência completa da proteína Várias das etapas e técnicas apresentadas podem ser utilizadas em conjunto como a ionização MALDI seguida da detecção TOF MALDITOF ou o fracionamento por cromatografia líquida seguido da espectrometria de massas LCMSMS entre outras tantas combinações e associações possíveis formando o fluxo de trabalho da espectrometria de massas Após a obtenção dos espectros mz e sequenciamento dos peptídeos por meio de métodos de bioinformática as sequências obtidas são identificadas com base na homologia com sequências disponíveis em banco de dados de genoma ou transcriptoma identificando a proteína que deu origem àquele peptídeo Esse processo se dá com a simulação in silico da fragmentação de sequências obtidas em bancos de dados com as mesmas condições realizadas experimentalmente ou seja considerando por exemplo a enzima utilizada na digestão proteica o tipo de ionização aplicada aos peptídeos entre outras Dessa forma o software gera um banco de dados com os possíveis fragmentos que poderiam ser originados pelo processo utilizado e os confronta com os fragmentos obtidos das leituras de mz identificando por similaridade os diferentes peptídeos que compõem as proteínas presentes na amostra e relacionando com suas quantidades relativas Observase que as avaliações proteômicas especialmente por MS ou MSMS representam avaliações em larga escala No entanto até os métodos apresentados revelam certas limitações especialmente associadas à perda de moléculas que possuam incompatibilidade por eletroforese em gel Nesse sentido os métodos descritos foram adaptados para a utilização na chamada proteômica shotgun a qual se destaca pela ausência da digestão em gel Assim nesse fluxo de trabalho o extrato proteico todo é submetido à digestão e portanto todos os seus componentes são hidrolisados incluindo aquelas proteínas incompatíveis com a eletroforese em gel Assim obtémse um extrato complexo repleto de peptídeos o que implica que para que seja possível a detecção por MS são necessários métodos de purificação dos peptídeos para a retirada de substâncias interferentes seguido de métodos de fracionamento como a cromatografia líquida que são obrigatoriamente aplicados em conjunto aos sistemas de ionização e detecção 112 FIGURA 16 ESQUEMA SIMPLIFICADO DO FLUXO DE TRABALHO ADOTADO NA PROTEÔMICA SHOTGUN FONTE Adaptado de Moreira 2015 Em conjunto todas essas técnicas abordadas associadas a outras tantas derivações têm sido amplamente utilizadas em diferentes contextos na análise de proteínas seja na área da proteômica estrutural da proteômica funcional da análise quantitativa da expressão proteica entre outras tantas vertentes da proteômica De maneira geral as análises proteômicas representam um expressivo avanço na avaliação de processos biológicos complexos associados a doenças ou outras condições e na busca por biomarcadores específicos que possam ser aplicados nas áreas biomédicas biológicas e da saúde 113 4 METABOLÔMICA A metabolômica é a ciência que vem agregar informação às avaliações dos complexos sistemas biológicos que ocorrem em um organismo tecido célula ou biofluido de certa maneira complementando as avaliações do transcriptoma e do proteoma Essa ciência avalia o complexo universo das substâncias produzidas durante os processos celulares os metabólitos também conhecidos como micromoléculas os quais incluem açúcares ácidos orgânicos aminoácidos entre outros que em conjunto formam o metaboloma da célula Algumas das aplicações em que a análise do metaboloma pode ser útil incluem a classificação de amostras de acordo com o seu perfil metabolômico Por exemplo células cancerígenas com diferentes perfis metabólicos podem ser direcionadas a diferentes terapias farmacológicas para cada um dos perfis Ainda por meio desse tipo de avaliação pode ser elucidada a presença de algum composto exclusivo de determinado tipo celular ou associado a uma doença fornecendo informações importantes para as áreas de desenvolvimento de drogas com alvo específico de diagnóstico e de monitoramento de doenças Dentre as abordagens que podem ser aplicadas na avaliação do metaboloma estão a abordagem de cima para baixo topdown approach na qual a partir de informações obtidas dos genomas transcriptomas ou proteomas são automaticamente gerados esboços do metaboloma que deveria compor a amostra em análise a abordagem de baixo para cima bottomup approach na qual experimentalmente são avaliados todos os metabólitos presentes na amostra e por fim a abordagem conjunta que integra as abordagens topdown e bottomup por meio de recursos de bioinformática Devido à grande variedade de compostos metabólicos que uma célula pode produzir muitos estudos de metabolômica focam esforços apenas em uma ou em algumas dessas classes de compostos recebendo nomes específicos como a glicômica que avalia os açúcares carboidratos a lipidômica que avalia os compostos lipídicos e a peptidômica que avalia metabólitos peptídicos como os presentes por exemplo na peçonha de serpentes De maneira geral no estudo metabolômico necessitase da comparação do perfil de metabólitos entre distintas amostras o que implica que uma série de cuidados especiais sejam tomados para que se evite a influência dos processos da metodologia aplicada na degradação ou extração dos compostos metabólicos devendose padronizar os processos de obtenção de amostra Nesse processo inclusive deve ser incluída uma etapa de interrupção do processo metabólico por exemplo desnaturando as proteínas e enzimas Após a interrupção dos processos metabólicos as moléculas que compõem o metaboloma devem ser separadas dos demais componentes celulares o que se dá por processos de centrifugação ou filtração A extração dos metabólitos é um processo um tanto quanto complexo uma vez que não há um solvente capaz de 114 solubilizar toda a gama de compostos que compõem o metaboloma visto que cada classe de compostos apresenta características distintas como os carboidratos que são hidrossolúveis e os lipídeos que são hidrofílicos Sendo assim é necessário que o objetivo do estudo seja previamente definido para direcionar a extração quando ela for necessária especialmente nos casos em que se deseja quantificar os metabólitos pois cada solvente irá extrair um perfil diferenciado de metabólitos Nesse caso inclusive podem ser aplicados diferentes solventes para a extração de uma mesma amostra com o objetivo de ampliar a gama de compostos que está sendo extraída Após a extração o solvente ou os solventes devem ser evaporados da amostra para que os metabólitos sejam concentrados e seja evitada a contaminação por compostos que possam interferir nas etapas seguintes de fracionamento detecção e quantificação Assim como também vislumbrado na proteômica para a análise do metaboloma é necessário que seja realizado o fracionamento da amostra o qual pode ser realizado por meio de cromatografia Contudo nesse caso tanto a cromatografia líquida LC quanto a cromatografia gasosa GC podem sem aplicadas por eletroforese capilar CE ou pela combinação de mais de uma dessas técnicas expandindo a cobertura de análise do metaboloma A GC é mais indicada para o fracionamento de compostos apolares e de menor peso molecular enquanto a LC é indicada para compostos polares de maior peso molecular ou que não possam ser submetidos ao aumento de temperatura requisitado na GC Como visto nas demais ômicas na metabolômica também é necessário que uma grande quantidade de metabólitos seja detectada e identificada sendo portanto necessária a aplicação de biotecnologias de alto rendimento como a espectrometria de massas No item anterior tratamos da espectrometria de massas no âmbito da proteômica mas essa tecnologia é capaz de detectar e rapidamente mensurar a massa molecular e as quantidades de uma vasta gama de substâncias o que a torna adequada também para a aplicação na área da metabolômica Dessa forma a maioria dos estudos de metabolômica utiliza o conjunto LC MS ou CGMS sempre com algum método de ionização entre um e outro Com esses métodos é possível obter uma espécie de impressão digital dos fragmentos dos metabólitos disponíveis na amostra e assim essas impressões podem ser identificadas por meio da utilização de bancos de dados de metabólitos os quais podem inclusive apresentar os diferentes fragmentos que um determinado metabólito pode gerar Outra técnica empregada para a análise do metaboloma é a espectroscopia de ressonância magnética nuclear RMN Com a aplicação dessa técnica podem ser detectados ao mesmo tempo os diferentes tipos de metabólitos Além disso o RMN não degrada as moléculas permitindo que a amostra seja recuperada para análises posteriores No entanto a sensibilidade do RMN é bastante inferior à do MS 115 Por fim seja por CGMS LCMS ou RMN o objetivo primário da metabolômica é analisar as diferenças no metaboloma de amostras provenientes de situações distintas Com ambas as tecnologias descritas associadas à programas de bioinformática capazes de confrontar o grande volume de dados obtidos com os bancos de dados disponíveis esse objetivo tem sido alcançado Porém a metabolômica ainda é considerada uma ciência em desenvolvimento e a biotecnologia tem empregado grande esforço na busca por novas tecnologias capazes de ampliar a confiabilidade e a reprodutibilidade nos estudos de larga escala com metabólitos 116 CONSEGUIREMOS ALGUM DIA CURAR AS DOENÇAS QUE MAIS MATAM BBC News FONTE Getty ImagesBBC News 2018 A busca para entender como nossos genes funcionam começou em meados do século XIX quando o biólogo e monge Gregor Mendel chegou a uma conclusão surpreendente sobre as características das plantas Mendel cruzou pés de ervilha de flores roxas com outros de flores brancas e verificou que os pés resultantes possuíam flores roxas Por outro lado surpreendeuse ao descobrir que a terceira geração apresentava flores de ambas as cores Isso revelou uma característica importante sobre as plantas a de que as cores podem ser herdadas porém uma pode ser mais dominante do que a outra De certa forma Mendel descobriu como os genes atuam Mas não o que eram ou ao que se pareciam Tal resposta chegou muito mais tarde Foi apenas no século seguinte que a própria estrutura do DNA foi descoberta Em 1953 com base no trabalho de Rosalind Franklin e Maurice Wilkins os cientistas James Watson e Francis Crick descobriram que nosso DNA é formado por uma estrutura em dupla hélice Foi um avanço significativo Conhecer essa estrutura ajudou a revelar mais segredos Quando o DNA é replicado essa hélice se divide em duas Isso significa que mutações podem acontecer à medida que nossas células se dividem Mesmo um pequeno defeito genético pode assim causar uma doença devastadora LEITURA COMPLEMENTAR 117 Em outras palavras o livro que representa cada um de nós pode ser impresso ou reescrito com erros Mas agora temos as ferramentas incluindo a capacidade de analisar grandes conjuntos de dados para ler esse livro mais rápido mais barato e até mesmo interagir com ele Editando Genes Cientistas já são capazes de editar genes de organismos e essa edição vem sendo usada para tratar algumas doenças devastadoras com grande sucesso No entanto o processo é muitas vezes demorado e dispendioso Apenas cinco anos atrás uma forma de edição de genes foi descoberta com grande pompa É chamada CRISPR Cas9 ou apenas CRISPR Em outras palavras a CRISPR usa tesouras moleculares para alterar um trecho muito específico de DNA cortandoo substituindoo ou aperfeiçoandoo Atualmente a técnica é usada em laboratórios de todo o mundo a partir da alteração e manipulação dos genes de plantas e animais A expectativa é de que ela possa ser usada em breve para tratar numerosas doenças humanas O que interessa à opinião pública é a possibilidade de usar a edição de genes CRISPR para fins terapêuticos diz o professor Robin Ali da Sociedade Europeia para Genética e Terapia Celular Isso pode acontecer dentro da próxima década se estudos iniciais forem promissores Os primeiros testes em humanos já estão em andamento na China e receberam aprovação para serem conduzidos nos EUA Nesses experimentos cientistas injetaram células modificadas em pacientes que haviam sido previamente removidas em vez de editar células dentro deles diretamente Se as células fossem diretamente modificadas dentro do próprio corpo muitos outros distúrbios genéticos poderiam ser tratados Apesar disso eles continuam entusiasmados com a tecnologia que poderia fornecer tratamentos efetivos para condições atualmente ainda não tratáveis como a doença de Huntington e a fibrose cística para citar apenas duas Em teoria a CRISPR poderia oferecer tratamentos rapidamente em questão de dias ou semanas em vez de meses Há muito poucos exemplos em que uma nova tecnologia se disseminou em laboratórios em todo o mundo onde é implementada para fazer coisas extremamente difíceis de fazer diz Ali O uso da CRISPR não será no entanto instantânea alerta o pesquisador Segundo Ali serão necessários vários anos para que a tecnologia seja usada clinicamente A Intellia Therapeutics é uma das várias companhias que desenvolvem essa tecnologia para uso em seres humanos O CEO da empresa Nessan Bermingham acredita que a CRISPR tem o potencial de revolucionar completamente a medicina A expectativa é de que a técnica poderia ser usada em doenças causadas por apenas um gene defeituoso bem como doenças causadas por mais de uma mutação genética Essa tecnologia tem o potencial de nos permitir atuar sobre vários trechos de DNA ao mesmo tempo diz Bermingham Segundo ele estudos realizados pela Intellia revelaram que uma única injeção em um animal pode retardar a produção de uma proteína tóxica em 97 118 Antes que possa ser usada em humanos no entanto qualquer droga terá que ser amplamente testada e regulamentada pelas autoridades Até então será principalmente uma ferramenta de pesquisa no laboratório Sem dúvida o poder do CRISPR é sua facilidade para editar genomas diz Ali Muitas questões científicas ainda precisam ser respondidas antes que a Intellia possa buscar aprovação para testes clínicos em humanos Por esse motivo Bermingham hesita em propor uma data específica O dinheiro por outro lado continua a fluir Embora a Intellia esteja atualmente envolvida em uma batalha para obter a patente da CRISPR Bermingham diz que isso não afastou investidores Do ponto de vista do investidor do ponto de vista científico as pessoas estão analisando essas descobertas e dizendo agora temos a ferramenta estamos prontos para seguir adiante destaca O procedimento também desperta polêmica Especialmente no que se refere aos chamados bebês sob medida Apesar disso é importante notar que alterar o DNA de um indivíduo só vai alterar os genes específicos que estão sendo editados A mudança não será transmitida a seus descendentes Esse processo é conhecido como edição somática A polêmica surge no entanto quando se editam embriões humanos unicelulares caso resultem em gravidez Testes desse tipo já estão ocorrendo mas apenas para fins de pesquisa A Intellia se concentra por sua vez na edição de genes somáticos Qualquer discussão sobre a edição de linha germinativa nas quais essas células ou essas edições são passadas para seus filhos e filhos de seus filhos é prematura diz Bermingham Daqui a algum tempo será possível analisar quão bemsucedidos os testes em humanos serão Só então entenderemos se a CRISPR será um divisor de águas para doenças humanas como se prevê Tratamentos inteligentes Enquanto a CRISPR pode ser usada para tratar uma série de doenças genéticas incluindo o câncer existem muitas outras empresas de olho em tipos específicos de câncer Há atualmente mais de 200 tipos de câncer o que torna muito difícil seu tratamento Mas uma tecnologia recémlançada vem usando o próprio sistema imunológico do paciente para combater a doença Nosso sistema imunológico é muito eficiente em enfrentar infecções Na linha de frente estão as células brancas chamadas células T que buscam especificamente por sinais de infecção Ao detectarem um vírus elas se multiplicam e o atacam O problema é que as células T não reconhecem mutações cancerosas como inimigos invasivos pois são em última análise versões mutantes das próprias células do paciente Há muito tempo a medicina queria reorientálas para aniquilar tumores explica Martin Pule da University College de Londres Pule e seus colegas já conseguiram fazer isso alterando geneticamente as células T para reconhecer e atacar o câncer Uma 119 dessas terapias chamada CART já foi licenciada para uso nos EUA com um custo de US 475 mil R 15 milhão por paciente O tratamento personalizado se volta para crianças e jovens com leucemia linfoblástica aguda Segundo o laboratório farmacêutico Novartis que fabricou a droga a taxa de remissão é de 83 Nunca houve nada do tipo na história recente diz Pule Ele vê esse tipo de tratamento como o futuro da oncologia com nove testes clínicos atualmente em andamento na University College de Londres Várias empresas também estão trabalhando em tratamentos que aproveitam o poder das células T entre elas a Autolus e a Immunocore ambas no Reino Unido e a Novartis nos EUA A Immunocore sediada em Oxford na Inglaterra usa uma tecnologia chamada terapia TCR a partir da qual uma pequena molécula atrai as células T e as cancerosas Uma vez que ambas as células estão conectadas permite que as células T liberem toxinas para matar o câncer Essa molécula foi desenvolvida para tratar um tipo raro de câncer que pode se espalhar rapidamente para o fígado Quando isso acontece os pacientes têm pouco tempo de vida O medicamento visa tratar portanto tumores hepáticos Já foram 180 pacientes tratados com resultados promissores segundo a Immunocore EvaLotta Allan CEO da empresa espera que o medicamento chegue às farmácias nos próximos dois anos Aumentamos a taxa de sobrevivência após um ano de tratamento em quase quatro vezes em comparação com outros tratamentos lá fora hoje diz Se for eficaz a tecnologia também pode ser usada para tratar doenças infecciosas como o HIV a tuberculose e doenças autoimunes Allan conta que muitos dos investidores da Immunocore incluindo a Fundação Bill e Melinda Gates e vários laboratórios farmacêuticos permitiram à empresa passar muitos anos trabalhando na fabricação de uma droga para tratar um tipo tão raro de câncer dado que apenas 4 mil pacientes são diagnosticados a cada ano com a doença o que poderia acabar por inibir o investimento Grandes laboratórios farmacêuticos com uma perspectiva exclusivamente comercial podem pensar que o investimento não vale a pena Arma contra a malária E não são apenas mutações genéticas que podem causar uma série de doenças mas também invasores estrangeiros A malária por exemplo mata quase meio milhão de pessoas por ano em todo o mundo Há várias cepas da doença que devido à sua constante mutação acabam tornando mais difícil o tratamento Para entender como o parasita da malária criou resistência a medicamentos os cientistas costumam analisar sua diversidade genética Agora esse tipo de análise também é possível em áreas remotas com um dispositivo manual de sequenciamento chamado Nanopore MinION 120 Jane Carlton professoraadjunta do Departamento de Microbiologia da Universidade de Nova York recorre a um deles para ajudála a entender como a malária leva a melhor sobre o tratamento Usando apenas um laptop e o Minion que é do tamanho de um telefone celular e custa US 1 mil R 32 mil Carlton pode sequenciar o genoma do parasita da malária em algumas horas Tratase do mesmo resultado obtido a partir das imensas máquinas de sequenciamento do tamanho de geladeiras que ela possui em seu laboratório que exigem maior manutenção Isso sem falar no vai e vem das amostras A tecnologia permite a Carlton entender rapidamente se o parasita será ou não resistente a certas drogas Usando o dispositivo ela conseguiu por exemplo identificar mutações resistentes a medicamentos no mesmo dia em que os pacientes foram diagnosticados com a malária O MinION pode ser usado para sequenciar qualquer organismo vivo tornandoo extremamente útil para estudar rapidamente doenças devastadoras fora do laboratório Isso ajudou os cientistas a entender mais sobre os vírus Ebola e Zika O dispositivo chegou a ser usado inclusive para sequenciar o genoma humano Outra pesquisadora que se beneficiou do aparelho é Kim Judge cientista de estatísticas sênior do Wellcome Trust Sanger Institute nos Estados Unidos Ela diz que seu valor é inestimável no campo dada sua portabilidade Atualmente o MinION é licenciado para fins de pesquisa mas testes estão em andamento para ver como ele poderia diagnosticar doenças mais rapidamente do que os métodos existentes FONTE Getty ImagesBBC News 2018 Já o professor Yutaka Suzuki da Universidade de Tóquio no Japão descobriu o potencial do MinION como ferramenta para países em desenvolvimento Ele e sua equipe vem usando o dispositivo em clínicas e hospitais na província de Sulawesi do Norte na Indonésia 121 Suzuki diz que pode fazer em cinco horas o que os sequenciadores anteriores demandavam cinco dias Isso permite aos médicos um diagnóstico rápido e preciso Normalmente o paciente não pode esperar especialmente quando infectado com perigosos agentes patogênicos eles precisam de decisões imediatas diz E as estratégias de tratamento podem ser diferentes dependendo dos agentes patogênicos ou se eles são resistentes a medicamentos ou não FONTE Adaptado de BBC NEWS Conseguiremos algum dia curar as doenças que mais matam 2018 Disponível em httpswwwbbccomportuguesegeral42859743 Acesso em 15 jun 2020 122 RESUMO DO TÓPICO 3 Neste tópico você adquiriu certos aprendizados como Além da genômica existem outras ciências chamadas de ômicas que tratam da avaliação do conjunto de transcritos de proteínas ou de metabólitos sendo chamadas de transcriptômica proteômica e metabolômica Diferentemente do genoma que se apresenta de maneira idêntica em todas as células somáticas de um mesmo indivíduo o transcriptoma o proteoma e o metaboloma são conjuntos de moléculas biológicas que sofrem influência de diferentes estímulos sejam químicos fisiológicos ou patológicos Eles são portanto representativos de um tipo celular específico ou de uma determinada condição em que o organismo se encontra O estudo desses conjuntos de moléculas pode ser utilizado na avaliação diferencial de organismos ou células expostos a diferentes condições como uma doença aplicados na busca por biomarcadores que possam ser utilizados no diagnóstico de doenças para o direcionamento de tratamentos específicos ou para o desenvolvimento de fármacos com alvo direcionado De maneira geral os estudos das ciências ômicas têm como objetivo comum a elucidação de mecanismos e moléculas envolvidas em processos biológicos complexos de maneira global o que sem a geração de dados em larga escala com a posterior aplicação de processos avançados de bioinformática para a interpretação destes dados era bastante laborioso e feito de maneira pontual Ou seja cada componente de uma via ou processo tinha que ser investigado de maneira individualizada A transcriptômica e a proteômica compreendem ramos da ciência que se encontram bastante desenvolvidos e com suas aplicações e metodologias bem definidas embora novos avanços sejam alcançados como o melhoramento das técnicas e equipamentos A metabolômica por sua vez representa uma área mais recente ainda em desenvolvimento e expansão especialmente em decorrência da grande dificuldade em se avaliar pequenas moléculas tão distintas quanto os metabólitos os quais compreendem uma série de tipos diferentes de moléculas como carboidratos ácidos orgânicos lipídios aminoácidos entre outros 123 1 Entre as demais ômicas podem ser citadas a transcriptômica a proteômica e a metabolômica Explique quais moléculas cada uma dessas ciências se dedica a compreender e qual a relação entre essas ciências 2 Elenque e explique brevemente pelo menos três metodologias aplicadas à análise transcriptômica 3 Sabendo que os mRNAs expressos compreendem o material genético responsável pela síntese de proteínas explique porque apenas a análise da expressão gênica diferencial seja por RTqPCR ou pela análise do transcriptoma não pode ser diretamente relacionada com a expressão proteica no tecido ou célula em avaliação 4 No método de proteômica shotgun podem ser citadas as seguintes etapas exceto a Hidrolise proteica b Ionização dos peptídeos c Detecção da razão mz d Digestão in gel 5 Por que o solvente utilizado no processo de extração dos metabólitos de uma amostra pode ser crucial para a análise do metaboloma 6 A metabolômica pode ser avaliada por meio de subdivisões como a lipidômica a glicômica e a peptidômica as quais avaliam respectivamente o conjunto de a Lipídeos genes e peptídeos b Açúcares lipídeos e proteínas c Lipídeos carboidratos e peptídeos AUTOATIVIDADE 124 REFERÊNCIAS BUYUKKÖROĞLU G et al Techniques for protein analysis In BARH D AZEVEDO V Omics technologies and bioengineering Londres Academic Press 2018 GOLDIM J R MATTE U Projeto Genoma Humano 1997 Disponível em httpswwwufrgsbrbioeticagenomahtm Acesso em 15 jun 2020 GRIFFITHS A J F et al An introduction to genetic analysis 7 ed Nova Iorque W H Freeman 2000 MINDEN J S TwoDimensional Difference Gel Electrophoresis 2D DIGE In CONN P M Laboratory methods in cell biology 2012 Disponível em http dxdoiorg101016B9780124059146000068 Acesso em 15 jun 2020 MOREIRA L M Ciências genômicas fundamentos e aplicações Ribeirão Preto Sociedade Brasileira de Genética 2015 NUSSBAUM R L et al Thompson Thompson genética médica 7 ed Rio de Janeiro Elsevier Health Sciences Brazil 2008 VAZ C TANAVDE V Proteomics In ARIVARADARAJAN P MISRA G Omics approaches technologies and applications Singapore Springer 2019 125 DIAGNÓSTICO E OUTRAS APLICAÇÕES DAS DIVERSAS TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR POTENCIAIS ÁREAS DE ATUAÇÃO DO BIOMÉDICO UNIDADE 3 OBJETIVOS DE APRENDIZAGEM PLANO DE ESTUDOS A partir do estudo desta unidade você deverá ser capaz de identifi car como diferentes conhecimentos de biologia molecular podem ser utilizados pelo biomédico investigar testesdiagnósticos desenvolvidos com base em técnicas da biologia molecular despertar a curiosidade e o interesse pelo avanço alcançado no diagnóstico de doenças com os testes moleculares ilustrar como as técnicas da biologia molecular podem ser aplicadas em avaliações que objetivem o melhoramento da qualidade de vida do paciente seja na busca de um diagnóstico ou na investigação do potencial relacionado ao esporte e nutrição Esta unidade está dividida em três tópicos No decorrer dela você encontrará autoatividades com o objetivo de reforçar o conteúdo apresentado TÓPICO 1 TESTES PRÉNATAIS NEONATAIS E EM PRODUTOS DA CONCEPÇÃO TÓPICO 2 TESTES ONCOLÓGICOS TÓPICO 3 DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS E OUTROS TESTES Preparado para ampliar seus conhecimentos Respire e vamos em frente Procure um ambiente que facilite a concentração assim absorverá melhor as informações CHAMADA 126 CONFIRA A TRILHA DA UNIDADE 3 Acesse o QR Code abaixo 127 TÓPICO 1 TESTES PRÉNATAIS NEONATAIS E EM PRODUTOS DA CONCEPÇÃO UNIDADE 3 1 INTRODUÇÃO Nas unidades anteriores deste livro tratamos das várias técnicas aplicadas e desenvolvidas na grande área de estudo chamada de biologia molecular Como futuro biomédico é importante que você se questione sobre como essas tantas técnicas previamente apresentadas podem ser aplicadas no seu campo de trabalho O biomédico pode atuar em diversas áreas que permeiam as ciências biológicas e médicas Assim uma das habilitações disponíveis ao profi ssional biomédico é a biologia molecular permitindo ao biomédico inclusive a atuação na coleta e análise de amostras a serem avaliadas na interpretação dos resultados e na emissão e assinatura de laudos e pareceres técnicos Além da área específi ca relacionada à biologia molecular o biomédico pode ainda atuar em outras áreas nas quais as técnicas de biologia molecular são também utilizadas e constantemente aprimoradas como nas áreas da genética e da indústria nas quais o biomédico pode atuar aplicando as técnicas de biologia molecular em exames de citogenética humana e genética humana molecular ou desenvolvendo soros vacinas e reagentes respectivamente Diferentemente das análises clínicas as quais são amplamente difundidas e aplicadas no diagnóstico médico muitas das análises envolvendo técnicas de biologia molecular ainda são pouco conhecidas e aplicadas Esse fato se deve especialmente ao elevado custo que essas análises apresentam e ao número de laboratórios que dispõem de tais análises ser reduzido No entanto é importante frisar que embora sejam de alto custo tais exames apresentam efi cácia diagnóstica elevada sendo cruciais para o correto diagnóstico de diversas doenças Consulte mais informações sobre a profi ssão de biomédico e suas habilitações no site do Conselho Federal de Biomedicina CFBM https cfbmgovbr DICA 128 Além da aplicação no diagnóstico de doenças existem exames moleculares que oferecem outros tipos de avaliação como o rastreio de genes que conferem habilidades físicas ou metabólicas diferenciadas indicado especialmente para a avaliação em atletas ou a avaliação molecular destinada à medicina personalizada na qual tratamentos farmacológicos são definidos com base nas informações gênicas do paciente otimizando o tratamento Diante da vasta gama de aplicações que a biologia molecular apresenta e considerando os campos de diagnóstico e de desenvolvimento de biotecnologias de grande relevância para a área biomédica nesta unidade trataremos com mais detalhes de alguns dos testes diagnósticos que se utilizam dessas técnicas e nos quais o profissional biomédico está habilitado a atuar No entanto é importante reforçar que além de atuar na execução dos testes e exames que serão apresentados a seguir o conhecimento de biologia molecular apresentado ao biomédico permite que futuros profissionais atuem no desenvolvimento de novos testes aplicados ao diagnóstico de doenças e condições ainda não elucidadas auxiliando no desenvolvimento do conhecimento científico nessa área e produzindo informações pertinentes para a etapa de diagnóstico e para o desenvolvimento das pesquisas na área do prognóstico Uma série de doenças e condições pode representar potencial risco à sobrevivência eou ao desenvolvimento de um feto ou recémnascido Dessa forma a aplicação de testes prénatais e neonatais é uma ferramenta importante pois com eles diversas doenças podem ser detectadas inclusive antes de apresentarem seus primeiros sintomas clínicos Em muitos casos o diagnóstico precoce favorece uma intervenção prévia capaz de melhorar o tratamento e reduzir ou evitar sequelas futuras Além disso em casos de abortos sem causa conhecida os exames diagnósticos moleculares são capazes de auxiliar na determinação da causa do aborto e permitem a tomada de decisões para que novas abordagens sejam adotadas a fim de evitar um aborto futuro 2 TRIAGEM PRÉNATAL NÃO INVASIVA NIPT Os testes chamados de triagem prénatal não invasiva NIPT são exames capazes de detectar alterações cromossômicas fetais a partir de amostras de sangue materno O princípio da amostragem está no fato de que no plasma sanguíneo materno é possível encontrar DNA livre tanto materno quanto fetal Após a coleta da amostra o DNA materno e fetal é extraído amplificado e sequenciado por métodos de sequenciamento NGS Next Generation Sequencing Desse modo com o sequenciamento do material genético isolado da amostra é possível distinguir o DNA fetal do DNA materno e portanto selecionálo para realizar as avaliações específicas 129 Dentre as avaliações possíveis com esse método estão as trissomias dos cromossomos 13 18 e 21 ou seja as síndromes de Patau de Edwards e de Down respectivamente a monossomia do cromossomo X síndrome de Turner e a síndrome de Klinifelter XXY Além disso auxilia na determinação do sexo do feto já que a presença de um cromossomo Y indica sexo masculino e a sua ausência indica sexo feminino Alguns laboratórios disponibilizam a opção de avaliação de algumas síndromes promovidas por microdeleções cromossômicas como a perda de pequenas porções de DNA no cromossomo Dentre as microdeleções possíveis de serem detectadas por NIPT estão as que promovem as síndromes de DiGeorge PraderWilli WolfHirschhorn Cri duChat Algelman e a deleção 1p36 também chamada de monossomia 1p36 Este tipo de avaliação é indicado em fetos a partir da décima semana de gestação sendo todos os testes citados aplicáveis a gestações únicas e alguns deles também às gestações múltiplas gemelares Embora as avaliações previstas nos testes NIPT apresentem elevada precisão uma pequena porcentagem dos resultados pode representar falso negativo ou falso positivo Assim em alguns casos de resultado positivo exames complementares como de imagem fetal podem ser recomendados para a confirmação do diagnóstico 3 TESTE DO PEZINHO TRIAGEM NEONATAL O exame chamado de triagem neonatal popularmente conhecido como teste do pezinho é como o próprio nome indica uma avaliação realizada em recémnascidos entre o terceiro e o quinto dia de vida O nome oficial para o teste realizado com a amostra de sangue normalmente coletada do calcanhar do recémnascido é o teste de Guthrie em homenagem ao médico Robert Guthrie Esse médico desenvolveu e disseminou o diagnóstico precoce da fenilcetonúria doença causada por uma mutação no gene da enzima responsável pela conversão da fenilalanina em tirosina promovendo deficiência ou ausência da atividade dessa enzima a partir da análise de amostras de sangue coletadas em cartões contendo papelfiltro cartão de Guthrie Figura 1 Logo o paciente que apresentasse o diagnóstico para fenilcetonúria ainda que apresentasse os sinais clínicos da doença poderia ser precocemente tratado reduzindo a gravidade da condição 130 FIGURA 1 COLETA DE SANGUE DO RECÉMNASCIDO EM PAPELFILTRO FONTE Brasil 2016 p 25 O teste aplicado para a triagem da fenilcetonúria não é um teste molecular embora a doença seja promovida por uma mutação gênica mas um teste realizado por meio da avaliação do crescimento de uma cepa bacteriana Bacillus subtilis submetida à amostra sendo que essa bactéria apresenta crescimento elevado na presença de compostos como a fenilalanina e o fenilpiruvato Assim havendo crescimento bacteriano há o indicativo da presença de elevadas concentrações desses compostos na amostra condição que está associada à fenilcetonúria Embora o teste para a fenilcetonúria tenha sido o primeiro a ser executado na triagem neonatal o método de coleta de uma pequena quantidade de amostra em papel filtro associado à grande vantagem do diagnóstico precoce de doenças potencialmente graves e ao tratamento também precoce com significativa melhora na condição do paciente alavancou a descoberta e implementação de novos testes baseados em uma extensa gama de técnicas e metodologias de avaliação que pudessem ser incluídas na triagem prénatal Inclusive muitos desses testes só foram possíveis devido aos avanços biotecnológicos na área da biologia molecular Atualmente a triagem neonatal é ofertada de maneira gratuita e obrigatória a todos os recémnascidos em muitos países como é o caso do Brasil Aqui inclusive nós temos instituído o dia 6 de junho como o Dia Nacional do Teste do Pezinho Embora a triagem neonatal seja amplamente difundida pelo mundo não há unificação em nível mundial dos testes que compõem essa triagem ficando a cargo de cada país a 131 determinação de quais testes devem ser realizados No Brasil o Ministério da Saúde fornece a triagem neonatal para 6 doenças sendo elas a fenilcetonúria a deficiência da biotinidase a anemia falciforme a hiperplasia adrenal congênita o hipotireoidismo congênito e a fibrose cística Além dos testes gratuitamente ofertados pelo Ministério da Saúde laboratórios privados disponibilizam diferentes painéis de triagem neonatal os quais podem avaliar mais de cem doenças eou outras condições Uma grande expansão no painel de testes foi alcançada especialmente pela inserção da técnica de espectrometria de massas em tandem EMT o que possibilitou a triagem de uma série de doenças metabólicas hereditárias capazes de promover os chamados erros inatos do metabolismo por meio da avaliação quali ou quantitativa de aminoácidos e acilcarnitinas Entre as doenças e condições metabólicas que podem ser detectadas com a aplicação da EMT na triagem neonatal estão os distúrbios do ciclo da ureia e da beta oxidação dos ácidos graxos aminoacidopatias acidemias orgânicas e algumas doenças lisossômicas como as doenças de Gaucher de Pompe e de Fabry É importante ressaltar que muitos dos resultados obtidos por esses testes indicam a possibilidade da doença em investigação mas não o diagnóstico em si embora os testes sejam bastante específicos Assim em muitos casos em que há a suspeita da positividade para uma determinada doença presente no painel de triagem será necessária a complementação com outros testes e exames para a confirmação do diagnóstico Apesar do avanço nas tecnologias e da possibilidade de expansão da quantidade de enfermidades testadas nos painéis de triagem neonatal existe uma série de controvérsias em relação à importância de todos esses testes serem aplicados O objetivo primário da triagem neonatal é a investigação de doenças ou condições tratáveis cuja detecção precoce contribua para o aumento da eficácia do tratamento e consequentemente da qualidade de vida do paciente No entanto atualmente muitos dos testes que podem ser incluídos nos painéis de triagem neonatal são para doenças ou condições que não foram totalmente esclarecidas quanto à sua severidade quanto ao benefício do diagnóstico precoce para seu tratamento Além disso em muitos casos são para doenças que ainda não apresentam tratamento disponível Assim dentro da bioética discutese sobre a real importância e necessidade da expansão dos testes realizados na triagem neonatal especialmente devido a problemas que possam decorrer desses diagnósticos ou dos resultados falsopositivos os quais afetam a família do neonato e portanto carecem de acompanhamento posterior Outra questão ética acerca da triagem neonatal se refere ao armazenamento das manchas de sangue contidas nos cartões de Guthrie e a utilização dessas amostras para outros testes que não aqueles autorizados pelos pais na triagem neonatal Em alguns países como os Estados Unidos houve situações em que as amostras coletadas para a triagem neonatal foram utilizadas por agências governamentais para a realização 132 de testes genéticos que forneceriam informações para a criação de um banco de dados de DNA desses recémnascidos No caso dos Estados Unidos processos judiciais foram movidos e sabese que em alguns casos foi decretado que as amostras de sangue deveriam ser destruídas pois a sua utilização sem o consentimento dos pais implicava em violação da lei de privacidade genética No Brasil para que as amostras humanas sejam destinadas à pesquisa devese apresentar ao paciente ou ao seu responsável legal o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TCLE o qual deve conter informações importantes sobre a pesquisa que será desenvolvida como a amostra em questão será utilizada além de esclarecimentos sobre confidencialidade e anonimato Assim apenas a partir da assinatura do TCLE a amostra poderá ser utilizada para a pesquisa sem que haja conflito ético 31 DOENÇA DA URINA DE XAROPE DE BORDO OU LEUCINOSE MSUD A leucinose é uma doença metabólica hereditária causada por uma alteração genética capaz de afetar o complexo multienzimático responsável pelo metabolismo dos aminoácidos leucina valina e isoleucina Sabese que mutações em pelo menos quatro diferentes genes podem promover essa doença Assim pacientes que apresentem a doença acumulam esses aminoácidos e outros metabólitos produzidos pelas vias metabólicas alteradas em concentrações consideradas tóxicas capazes de promover efeitos neurotóxicos Essa doença também é chamada de doença da urina de xarope de bordo devido ao odor adocicado característico da urina dos pacientes que apresentam a doença A avaliação para a leucinose pode ser incluída na triagem neonatal com espectrometria de massas em tandem Devido à ocorrência de resultados falsopositivos normalmente promovidos por interferentes nutricionais jejum prolongado nutrição específica entre outros é adequado que quando o perfil característico para a leucinose ocorra nessa triagem seja realizada a quantificação específica da aloisoleucina como um teste de segundo nível A aloisoleucina é considerada um marcador específico para leucinose pois sua ocorrência em pacientes sem a doença é bastante reduzida Logo por meio de cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massas e utilizando padrões internos são quantificados os aminoácidos aloisoleucina leucina valina e isoleucina Os valores obtidos são confrontados com os valores de referência determinados para que seja feita a confirmação do diagnóstico Além da confirmação do diagnóstico da leucinose a quantificação desses aminoácidos também é adequada para o monitoramento do tratamento de pacientes diagnosticados com a doença 133 4 PERFIL METABÓLICO ASSOCIADO AOS ERROS INATOS DO METABOLISMO As doenças chamadas de erros inatos do metabolismo estão normalmente associadas a alterações genéticas capazes de alterar a cinética de metabólitos e outras moléculas no organismo alterando sua síntese transporte metabolismodegradação eou armazenamento Dessa forma em muitos casos o diagnóstico precoce ou seja antes da apresentação do quadro clínico sintomático pode evitar a ocorrência de efeitos tóxicos de certos metabólicos no recémnascido evitando ou reduzindo a mortalidade promovida por esses erros e as sequelas que possam ocorrer devido à ausência ou excesso de certos metabólitos como danos neurológicos 41 ÁCIDOS ORGÂNICOS URINÁRIOS Além da metodologia citada anteriormente para a análise das doenças metabólicas relacionadas ao metabolismo de ácidos orgânicos por meio da espectrometria de massas em tandem realizada em amostras de sangue coletadas em papelfiltro existem também testes capazes de avaliar os produtos decorrentes dos erros inatos do metabolismo nas vias dos ácidos orgânicos por meio da avaliação desses compostos na urina De maneira geral essas doenças também conhecidas como acidúrias orgânicas ou acidemias são decorrentes de alterações genéticas capazes de promover danos em vias metabólicas de carboidratos ácidos graxos e aminoácidos Os metabólitos característicos das vias alteradas assim como aqueles provenientes de vias metabólicas não alteradas tendem a apresentar a via renal como via de excreção Dessa forma metabólitos específicos de determinadas alterações podem ser detectados na urina de pacientes Uma das metodologias aplicadas para a detecção dos ácidos orgânicos presentes na urina se baseia na cromatografia gasosa associada à espectrometria de massas o que a torna bastante eficaz na determinação do perfil de ácidos orgânicos presentes na urina do paciente Assim permitese que o perfil encontrado seja confrontado com as doenças metabólicas em investigação favorecendo a determinação do diagnóstico As indicações para que o perfil de ácidos orgânicos urinários seja determinado por espectrometria de massas podem partir de resultados encontrados na triagem neonatal na busca da confirmação de um resultado positivo ou em pacientes que apresentem sintomas neurológicos sem causa definida já que os ácidos orgânicos formados a partir do metabolismo alterado podem promover toxicidade aos pacientes 134 42 ACILCARNITINAS E AMINOÁCIDOS Assim como o perfil de ácidos orgânicos urinários previamente descrito o perfil de acilcarnitinas e aminoácidos também pode ser realizado em complementação à avaliação do perfil metabólico do paciente Nesse caso o perfil deve ser avaliado em amostras de sangue coletadas em papelfiltro como realizado para a triagem neonatal A avaliação do perfil metabólico no sangue de pacientes neonatos ou não é uma ferramenta auxiliar porém bastante relevante para o correto diagnóstico das doenças associadas aos erros inatos do metabolismo Em diversas situações tais doenças apresentam quadro clínico agudo ou crônico o qual dificilmente está associado a apenas uma determinada condição e por vezes não é responsivo aos tratamentos adotados Porém há indicações sobre a possibilidade de que a enfermidade esteja associada a erros inatos do metabolismo por exemplo alterações em exames laboratoriais de dosagem de alguns marcadores metabólicos como a glicose o lactato e a amônia A avaliação do perfil metabólico em sangue por meio da espectrometria de massas auxilia na conclusão do diagnóstico atuando na melhora do prognóstico já que o tratamento adequado pode ser rapidamente iniciado evitando maiores danos ao paciente em decorrência da presença de metabólitos que possam apresentar toxicidade a ele 5 SURDEZ GENÉTICA OU SURDEZ HEREDITÁRIA A surdez é uma condição bastante comum havendo uma estimativa de que cerca de 4 em cada 1000 crianças nasçam com algum nível de perda auditiva Alguns dos principais fatores ambientais ou seja fatores não genéticos associados a esse índice são a falta de oxigenação durante o parto a ocorrência de doenças como a toxoplasmose a rubéola o citomegalovírus e a herpes durante o período prénatal ou ainda doenças como a meningite e outras infecções bacterianas durante o período pós natal No entanto sabese que parte dos indivíduos que apresentam surdez manifesta essa condição devido à herança genética A surdez hereditária pode se apresentar devido a mutações que apresentem padrão de herança autossômica recessiva ou autossômica dominante além de mutações no cromossomo X ou no DNA mitocondrial Embora já se conheça vários genes cujas mutações estão associadas à surdez genética sabese que grande parte da ocorrência dessa condição está associada à mutação dos genes GJB2 e GJB6 responsáveis pela expressão das proteínas conexina 26 e conexina 30 respectivamente 135 A conexina 26 está especialmente relacionada com a comunicação celular na cóclea sendo responsável por atuar na homeostase do íon potássio atuando portanto na manutenção do potencial elétrico e na manutenção da recepção e percepção do estímulo sonoro Uma mutação relacionada à surdez genética de alta frequência na população é a mutação chamada de 35delG a qual acontece no gene GJB2 ou seja no gene codificador da proteína conexina 26 Dessa forma indicase que na ausência de causa aparente para a surdez essa mutação deve ser a primeira a ser investigada Nesse sentido pesquisadores da Universidade Estadual de Campinas UNICAMP desenvolveram um teste rápido e de baixo custo para a investigação da surdez relacionada a essa mutação O teste pode ser realizado com a mesma amostra de sangue em papelfiltro obtida para o teste do pezinho triagem neonatal mas caso essa abordagem não seja possível uma nova amostra de sangue pode ser providenciada para a realização do exame O exame pode ser aplicado em crianças fora do período neonatal e em adultos que apresentem indicativo de surdez hereditária O teste é realizado por meio de uma PCR na qual o gene GJB2 é amplificado a partir do material genético obtido da amostra de sangue coletada Em casos suspeitos de surdez genética é indicado que o exame seja realizado ainda no período neonatal ou o mais rápido possível para que o diagnóstico seja realizado antes do 3º mês de vida do paciente e para que a intervenção adequada seja realizada antes do 6º mês Sabese que na maioria dos casos a surdez é apenas detectada em crianças a partir de 2 anos de idade já que antes dessa idade dificilmente são observados sintomas relativos à condição de surdez No entanto é também nessa fase da primeira infância que a ausência de estímulos neurológicos relacionados à fala pode promover prejuízos ao desenvolvimento cerebral desses pacientes o que torna extremamente relevante o diagnóstico e intervenção precoce para a manutenção do desenvolvimento neurológico adequado da criança 6 SEQUENCIAMENTO DE PRODUTO DE CONCEPÇÃO O sequenciamento de produtos de concepção também conhecido como sequenciamento de restos ovulares de produtos de aborto ou de restos fetais é um exame capaz de avaliar a presença de alterações cromossômicas em amostras obtidas após um aborto Por meio de sequenciamento NGS esse exame é capaz de avaliar a presença de alterações em algum dos cromossomos Devido à grande incidência de abortos promovidos pela presença de alterações cromossômicas no embrião esse exame é indicado para a avaliação de amostra de primeiro aborto especialmente em casos de abortos repetidos e de aborto em gestações assistidas por tratamento pois com o resultado obtido pode ser iniciado o aconselhamento reprodutivo adequado para que seja evitado o aborto espontâneo ou a concepção de fetos com tais alterações cromossômicas 136 O material obtido do aborto deve ser destinado para a análise juntamente com uma amostra de sangue materna Nesse caso o sangue materno é necessário para que seja feita a confirmação de que a amostra que será avaliada quanto às alterações cromossômicas é a amostra proveniente do produto da concepção e não uma amostra de tecido materno Essa confirmação é realizada por meio da avaliação da impressão digital do DNA materno e do produto da concepção utilizando a detecção de marcadores de variações no DNA como sequências repetidas em tandem por exemplo Após a confirmação da amostra a ser sequenciada o DNA obtido é amplificado e submetido ao sequenciamento NGS que fornecerá as informações relativas à condição cromossômica da amostra indicando a presença ou ausência de alterações 137 RESUMO DO TÓPICO 1 Neste tópico você adquiriu certos aprendizados como Diversos testes genéticos realizados por meio de PCR ou sequenciamento de DNA podem ser realizados para o diagnóstico de doenças em indivíduos inclusive antes do nascimento testes prénatais logo após o nascimento testes neonatais e também em produtos da concepção como em amostras provenientes de um aborto Testes moleculares em amostras de sangue e urina podem ser aplicados para a detecção de compostos metabólitos característicos de diversas doenças A espectrometria de massas em tandem EMT é uma ferramenta de biologia molecular também aplicada ao diagnóstico e confirmação de doenças ou outras condições Embora os testes moleculares apresentem elevada eficácia é necessário muitas vezes que sejam realizados exames complementares para a confirmação do diagnóstico 138 1 Porque o teste NIPT teste prénatal não invasivo é considerado não invasivo Qual princípio justifica esse tipo de amostragem 2 Com os crescentes avanços em biotecnologias o painel de doenças possíveis de serem testadas na triagem neonatal ou teste do pezinho aumentou expressivamente No entanto algumas discussões bioéticas apontam motivos que contrapõem a necessidade de expansão desses testes entre elas a Ainda é desconhecida a severidade de muitas das doenças testadas b O conhecimento precoce de diversas doenças representa avanços nos seus tratamentos c O diagnóstico precoce de muitas doenças não representa melhora no tratamento d Ausência de tratamento disponível para várias doenças testadas 3 Complete as lacunas da seguinte frase O teste de diagnóstico rápido para a surdez hereditária é realizado com a técnica de para a avaliação de uma mutação no gene a sequenciamento GJB2 b PCR conexina 30 c PCR GJB2 d Espectrometria de massas conexina 30 4 Explique brevemente o que é avaliado no sequenciamento de produtos da concepção e por que esse teste deve ser indicado especialmente em casos de abortos repetidos AUTOATIVIDADE 139 TESTES ONCOLÓGICOS 1 INTRODUÇÃO Sabese que os cânceres são promovidos por mutações gênicas normalmente associadas a fatores ambientais que culminam no desenvolvimento da doença Porém embora se trate de alterações em genes tais mutações podem tanto vir a ocorrer tanto ao longo da vida do indivíduo quanto serem herdadas Vale ressaltar que mesmo que uma mutação gênica relacionada ao risco aumentado de câncer seja de origem hereditária isso não significa que o indivíduo que a apresente irá necessariamente desenvolver a doença associada Ainda assim estudos relatam que até 10 dos casos de câncer diagnosticados são cânceres de origem hereditária sendo os demais 90 considerados cânceres esporádicos ou seja que não apresentam herança genética associada Nesse contexto é importante destacar que ainda que uma família apresente múltiplos casos de câncer entre seus indivíduos na maioria dos casos esses cânceres são de origem esporádica pois o câncer atualmente é considerado uma doença relativamente comum devido à alta taxa de ocorrência em que ele se apresenta Embora considerado comum existem relatos de diferentes tipos de cânceres cada um deles associado a prognósticos que diferem em severidade e possibilidade de tratamento Muitos desses cânceres têm sido extensivamente estudados o que possibilitou a descoberta de muitos genes e mutações associados à sua probabilidade de ocorrência sendo atualmente possível investigar tais mutações para a realização de diagnóstico preciso em pacientes com suspeita de algum tipo específico de câncer ou para a análise de risco em indivíduos com histórico familiar de câncer hereditário Vale ressaltar que a investigação do risco aumentado para a ocorrência ou o diagnóstico precoce de um tipo específico de câncer pode ser crucial para o tratamento precoce e portanto é uma importante ferramenta para a melhora do prognóstico e do paciente culminando inclusive no aumento da taxa de sobrevivência em determinados casos UNIDADE 3 TÓPICO 2 140 2 CÂNCER DE MAMA E DE OVÁRIO Tanto o câncer de mama quanto o de ovário estão relacionados a uma série de mutações sendo mais de 1000 e mais de 800 mutações já descritas nos genes BRCA1 e BRCA2 respectivamente Dessa forma a avaliação dessas mutações é de especial importância em pacientes com histórico familiar desses tipos de cânceres pois a presença de mutação em apenas um desses genes já representa um risco aumentado em mais de 80 e de cerca de 55 de desenvolvimento do câncer de mama e de ovário respectivamente Esses dois genes são responsáveis pela síntese das proteínas BRCA1 e BRCA2 as quais atuam no reparo celular de quebras de DNA que possam ocorrer durante o processo de recombinação homóloga Dessa forma mutações nesses genes promovem a síntese de proteínas com perda de função ou até mesmo impedem a síntese dessas enzimas Sem essas proteínas de reparo a célula pode crescer e se multiplicar de maneira descontrolada dando origem ao processo de desenvolvimento tumoral Das centenas de mutações descritas para esses genes três apresentam incidência aumentada em descendentes de Judeus Ashkenazi especificamente duas no gene BRCA1 e uma no gene BRCA2 A incidência dessas mutações nessa população pode chegar a uma frequência de 140 indivíduos Tal aumento na frequência de ocorrência dessas mutações para esses indivíduos representa um aumento na incidência desses dois cânceres chegando a mais de 50 para o câncer de mama e 15 para o câncer de ovário Ainda esse risco se eleva mais nos indivíduos dessa população cuja família apresenta histórico de incidência desses tipos de câncer Dada a importância das mutações nesses dois genes para a incidência de câncer de mama e ovário existem exames que a partir do material genético extraído de uma amostra de sangue podem detectar por meio de sequenciamento NGS as mutações presentes nesses genes e até sequenciar os genes completos No caso de descendência Ashkenazi podese realizar apenas a avaliação das três mutações de alta incidência nessa população Ainda de maneira mais abrangente pode ser realizada a avaliação de outros genes além do BRCA 1 e do BRCA2 os quais também apresentam mutações relacionadas à incidência de câncer de mama e de ovário Dessa forma nessa investigação expandida cerca de 25 genes são avaliados por meio de sequenciamento NGS Além do sequenciamento dos genes por NGS outra técnica de biologia molecular comumente aplicada para a avaliação da presença de diversas mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 é a amplificação multiplex de sondas dependentes de ligação ou simplesmente MLPA Essa técnica de maneira simplificada é uma adaptação da PCR multiplex sendo necessário na MLPA apenas um par de iniciadores para cada região do gene a ser avaliada Na MLPA cada par de iniciadores quando hibridizados à sua região de anelamento específica forma uma sonda sonda dependente de ligação Após a ligação e formação da sonda ela é capaz de emitir fluorescência Dessa forma aplicando a MLPA é possível que sejam evidenciadas alterações como deleções ou duplicações 141 em genes e regiões específicas de um cromossomo as quais são evidenciadas por meio da identificação de picos de fluorescência sendo eles comparados com picos provenientes da reação em amostra controle Figura 2 FIGURA 2 EXEMPLO DE RESULTADO OBTIDO POR AMPLIFICAÇÃO MULTIPLEX DE SONDAS DEPENDENTES DE LIGAÇÃO MLPA EM QUE ESTÁ DEMONSTRADA A AUSÊNCIA DO EXON46 AUSÊNCIA DE PICO DE FLUORESCÊNCIA DO GENE EM AVALIAÇÃO INDICANDO UMA DELEÇÃO DESSA REGIÃO DO GENE FONTE Adaptado de httpscommonswikimediaorgwikiFileMLPAinGeneMarkerjpg Acesso em 9 fev 2020 3 POLIPOSE ADENOMATOSA FAMILIAR A polipose adenomatosa familiar é uma doença caracterizada pelo crescimento de centenas de pólipos no intestino grosso Inicialmente esses pólipos são considerados benignos mas com o passar do tempo eles podem progredir para um quadro maligno de adenocarcinoma Sua ocorrência está relacionada a mutações ou deleções no gene APC Esse gene é considerado um gene supressor de tumor já que atua na manutenção de diversos processos celulares como crescimento divisão adesão entre outros Dessa forma alterações nesse gene promovem o crescimento celular desordenado culminando em pólipos e posteriormente na ocorrência de câncer colorretal Essa doença apresenta origem hereditária com padrão de herança autossômica dominante e diferentes níveis de gravidade sendo a situação mais grave associada à deleção do gene APC e a de menor severidade associada às mutações nesse gene O diagnóstico dessa doença se inicia com exames do intestino tais como endoscopia e colonoscopia Porém para o diagnóstico e prognóstico preciso a avaliação molecular das mutações ou até mesmo do gene APC completo é de grande importância A avaliação dessa condição pode ser realizada pelo sequenciamento NGS do gene APC ou pela aplicação da técnica de MLPA para a avaliação da deleção do gene 142 4 CÂNCER COLORRETAL O câncer colorretal está entre os tipos de câncer mais comuns e mais frequentes tanto em homens quanto em mulheres Boa parte dos casos de câncer colorretal apresenta componente hereditário estando associados à ocorrência de polipose adenomatosa familiar ou à síndrome de Lynch também conhecida como câncer colorretal hereditário não poliposo A polipose adenomatosa familiar já foi discutida no item anterior e devemos nos lembrar de que ela está associada a mutações ou deleção do gene APC A síndrome de Lynch por sua vez está associada a mutações nos genes MLH1 PMS2 MSH2 e MSH6 Esses genes estão associados a processos de reparação de DNA durante o processo de divisão celular portanto alterações neles são capazes de promover o crescimento e multiplicação de células com DNA alterado culminando na presença de tumores Nesse sentido para uma completa investigação em casos de indivíduos com histórico familiar de câncer colorretal ou naqueles que estão em busca do diagnóstico de um possível câncer colorretal a investigação de alterações nos genes MLH1 MSH2 e MSH6 pode ser realizada em amostras de sangue por meio do sequenciamento de um desses genes ou de todos eles 5 PESQUISA DE CÂNCER HEREDITÁRIO Assim como o câncer colorretal diversos outros tipos de câncer apresentam componentes hereditários associados a mutações ou deleções de diversos genes Nesse sentido em uma mesma amostra de material genético podem ser sequenciados diversos genes e variantes descritas na literatura como associadas a um ou mais tipos de câncer Tais sequenciamentos são realizados e os resultados validados de acordo com as alterações encontradas sendo descritas aquelas que representam risco de desenvolvimento de câncer possível risco e até mesmo as variantes de significado inserto A Tabela 1 mostra um exemplo dos genes avaliados em um painel de avaliação de câncer hereditário e os cânceres a que eles estão relacionados Tal painel é um exame ofertado pelo laboratório DB Molecular 143 TABELA 1 PAINEL DE GENES RELACIONADOS A DIFERENTES CÂNCERES HEREDITÁRIOS OS QUAIS PODEM SER AVALIADOS EM UM EXAME DE TRIAGEM DE RISCO PARA ESTES CÂNCERES Diretrizes de pesquisa e avaliação de genes associados ao câncer de próstata hereditário ainda são recentes São analisadas apenas posições que conhecidamente impactam o risco de câncer CDK4 apenas chr12g5814542958145431 códon 24 é analisado EPCAM apenas grandes deleções e duplicações incluindo a extremidade 3 do gene são analisadas GREM1 apenas duplicações na região reguladora a montante são analisadas MITF apenas chr3g70014091 incluindo c952GA é analisado POLD1 apenas chr19g50909713 incluindo c1433GA é analisado POLE apenas chr12g133250250 incluindo c1270CG é analisado PMS2 Os éxons 1215 não são analisados FONTE httpsbitly3tpnDXm Acesso em 9 fev 2020 144 Quando necessário os resultados obtidos nesses painéis de avaliação são validados por meio da aplicação de outras técnicas de biologia molecular como o MLPA o sequenciamento Sanger os microarranjos entre outras 6 BIÓPSIA LÍQUIDA Ainda dentro do campo da biologia molecular aplicada como ferramenta para o diagnóstico de doenças oncológicas ou da avaliação de risco para tais doenças um grande avanço foi alcançado com a possibilidade de realização do exame chamado de biópsia líquida o qual atua especialmente como auxiliar no monitoramento da evolução do tratamento em pacientes oncológicos Contrapondo a biópsia convencional que depende de procedimentos invasivos e dolorosos e por vezes com risco para a obtenção de amostra proveniente do tumor para a realização dos exames moleculares a biópsia líquida se baseia na avaliação molecular em amostra de material genético proveniente do sangue do paciente ou seja a coleta do material se dá de maneira minimamente invasiva com risco e dor reduzidos A possibilidade de avaliação molecular tumoral baseada na coleta de amostra de sangue só é possível devido a técnicas avançadas de análise do DNA livre circulante ctDNA de origem tumoral Com o exame de biópsia líquida é possível investigar diferentes tipos de alterações incluindo polimorfismos deleções e inserções em até 120 genes relacionados a tumores A metodologia utilizada para a detecção dessas alterações se baseia no sequenciamento NGS desses genes Esse exame apresenta especial vantagem no monitoramento de pacientes em tratamento já que as células tumorais podem apresentar novas mutações ao longo do tratamento implicando por exemplo no crescimento tumoral e na ineficácia do tratamento adotado Dessa forma com os resultados obtidos pela biópsia líquida é possível antever um quadro de evolução da doença e assim determinar a intervenção adequada melhorando o prognóstico do paciente Esse tipo de exame também pode ser utilizado para a realização de exames moleculares específicos focando na avaliação de genes reconhecidamente relacionados à resistência tumoral a determinados fármacos 145 RESUMO DO TÓPICO 2 Neste tópico você adquiriu certos aprendizados como O diagnóstico do câncer inclusive de maneira precoce e precisa como promovido com os diagnósticos moleculares é de grande importância para o tratamento adequado e melhora do prognóstico do paciente Avanços constantes nos estudos dos mais diversos tipos de cânceres propiciaram a descoberta de mutações gênicas associadas ao aumento do risco de sua ocorrência Como exemplo podem ser citadas as mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 relacionadas à ocorrência de câncer de mama e ovário Por meio de sequenciamento em apenas uma amostra de sangue é possível realizar a avaliação da presença de mutações gênicas associadas ao risco de ocorrência de diversos cânceres hereditários Por meio da avaliação do DNA livre circulante de origem tumoral é possível realizar o exame chamado de biópsia líquida o qual auxilia no acompanhamento da evolução do tratamento de pacientes oncológicos 146 1 Uma das técnicas de biologia molecular aplicável ao teste diagnóstico de mutações relacionadas a diversos tipos de cânceres é a amplificação multiplex de sondas dependentes de ligação ou MLPA Explique brevemente como essa técnica é capaz de detectar deleções ou duplicações de regiões gênicas 2 Sabese que grande parte dos casos de câncer colorretal apresentam um componente hereditário Dessa forma a investigação de mutações em genes como o MLH1 MSH2 e MSH6 pode ser indicada para pacientes com o histórico familiar desse tipo de câncer Nesse sentido qual técnica de biologia molecular é comumente aplicada para a avaliação de alterações nesses genes a PCR b qPCR c MLPA d Sequenciamento 3 A biópsia líquida é uma ferramenta que pode ser aplicada no monitoramento da evolução do tratamento de pacientes oncológicos Quais os benefícios que essa técnica apresenta em relação à biópsia convencional e qual o princípio amostral que possibilita a aplicação dessa técnica 4 Cite exemplos de alterações gênicas que podem ser detectadas no DNA tumoral por meio da biópsia líquida e qual a metodologia aplicada para a análise dessas alterações AUTOATIVIDADE 147 TÓPICO 3 DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS E OUTROS TESTES UNIDADE 3 1 INTRODUÇÃO Além da grande importância dos avanços da biologia molecular voltados ao diagnóstico de diversos cânceres e dos testes diagnósticos prénatais e neonatais o universo de atuação das diferentes técnicas de biologia molecular previamente apresentados nas Unidades 1 e 2 deste livro apresentase ainda mais vasto Dentre as muitas outras possibilidades de aplicação dessas técnicas estão o diagnóstico de centenas de doenças e outras condições sejam de origem genética como o caso das doenças recessivas ou promovidas por outros organismos como vírus e bactérias o aconselhamento genético familiar a determinação de paternidade entre outros Ainda curiosamente a avaliação genética de um indivíduo pode ser aplicada para a investigação de condições não necessariamente associadas ao diagnóstico de doenças Esse é o caso da farmacogenética a qual busca o melhoramento da terapêutica aplicada ao paciente da nutrigenêtica a qual avalia a influência do componente genético nas variações fisiológicas diante da presença de determinados nutrientes e da avaliação do perfil genético voltado ao desemprenho esportivo que busca relações entre o componente genético e as aptidões esportivas do indivíduo 2 DOENÇAS MITOCONDRIAIS Mitocôndrias são organelas citoplasmáticas responsáveis pela produção de energia química em forma de adenosina trifosfato ATP a partir de nutrientes como a glicose por exemplo Essas organelas apresentam características bastante específicas como seu próprio DNA o mtDNA o qual apenas pode ser alterado pelo processo de mutação já que por serem organelas virtualmente herdadas apenas do citoplasma do ovócito o mtDNA não pode sofrer recombinação são distribuídas de maneira aleatória durante o desenvolvimento do embrião o que acarreta na possibilidade de ocorrência de mitocôndrias com diferenças no DNA aleatoriamente dispersas nos diferentes tecidos de um mesmo indivíduo além disso apresentam também abundância desigual entre os diferentes tecidos estando normalmente em maior abundância em órgãos que apresentem elevada necessidade energética como o sistema nervoso coração fígado e o sistema muscular 148 Como se pode imaginar as doenças mitocondriais são aquelas que afetam a atividade de produção energética desempenhada pelas mitocôndrias Tais doenças ocorrem devido à ocorrência de mutações diretamente em genes presentes no mtDNA ou devido à mutações em genes presentes no DNA nuclear com relevância para a atividade mitocondrial Dessa forma observase que doenças mitocondriais causadas por mutações no DNA nuclear podem ser transmitidas hereditariamente de pais pai e ou mãe para filhos de ambos os sexos ao passo que aquelas causadas por mutações no mtDNA podem ser transmitidas por herança materna ou seja da mãe para os filhos de ambos os sexos No entanto é importante ressaltar que o mtDNA apresenta uma alta taxa de mutação sendo possível que doenças mitocondriais detectadas estejam ocorrendo pela primeira vez ou seja não apresentem herança genética familiar relacionada Diante do exposto as doenças mitocondriais apresentam uma grande variação de condições clínicas associadas as quais de maneira geral envolvem prejuízo na produção energética mitocondrial Tais variações ocorrem em decorrência do gene mutado do tecido afetado e da quantidade de mitocôndrias com DNA mutado em relação à quantidade de mitocôndrias que apresentem DNA normal sendo que essas variações podem determinar a gravidade da alteração encontrada para o quadro clínico apresentado pelo paciente Entre as ferramentas utilizadas para o diagnóstico das doenças mitocondriais está o sequenciamento do DNA mitocondrial e dos genes nucleares associados às mitocôndrias realizados em amostras de pequenos fragmentos teciduais obtidos por biópsia dos órgãos que possam apresentar as disfunções observadas nos sintomas clínicos ou até em amostras de sangue Apesar da possibilidade do sequenciamento do DNA é adequado que outros exames especialmente bioquímicos para a realização de dosagem de metabólitos provenientes da atividade mitocondrial sejam realizados em conjunto para a determinação do diagnóstico adequado 3 PERFIL GENÉTICO PARA DOENÇAS CARDIOVASCULARES De acordo com levantamento da Organização Mundial da Saúde OMS as doenças cardiovasculares estão entre as principais causas de morte em todo o mundo OPAS 2017 Embora sua prevalência seja em indivíduos adultos e idosos a ocorrência em jovens tem aumentado significativamente ao longo do tempo Sabese que tais doenças apresentam dois grandes grupos de fatores de risco os comportamentais e os genéticos Tais fatores associados a outras informações compõem a avaliação de risco cardiovascular na qual o paciente pode ser considerado de baixo médio alto ou muito alto risco cardiovascular Os principais fatores comportamentais associados ao aumento da incidência de doenças cardiovasculares são o sedentarismo o tabagismo o excesso de consumo de álcool e dieta pouco ou não saudável Esses fatores são considerados mutáveis pois o indivíduo pode readequálos para melhorar sua condição e assim diminuir o risco 149 cardiovascular No entanto o componente genético apresenta característica imutável assim como idade e sexo ou seja quando presente a alteração genética relacionada ao aumento do risco de desenvolvimento de doença cardiovascular esse componente não pode ser alterado sendo portanto necessário que o componente comportamental seja ajustado para prevenir a ocorrência da doença Além disso sem a avaliação do componente genético estimase que a avaliação de risco cardiovascular possa subestimar o risco real ao qual o paciente está sujeito o que justificaria a grande incidência de casos de doenças cardiovasculares que acometem indivíduos classificados como de baixo e médio risco Dessa forma com a avaliação do perfil genético para doenças cardiovasculares é possível que seja realizada uma estimativa mais realista do risco cardiovascular do paciente culminando na adequação da intervenção terapêutica O perfil genético para doenças cardiovasculares compreende a avaliação de um painel de mutações e polimorfismos em genes associados aos fatores de risco cardiovascular Para tanto a análise de tais mutações pode ser realizada em amostras de sangue ou de raspado de mucosa oral através da técnica PCR multiplex na qual os vários genes de interesse são amplificados simultaneamente Algumas das variações que são investigadas nesse painel são mutação no fator V de Leiden responsável pelo aumento de cerca de 80 vezes no risco de trombose em indivíduos homozigotos mutação no gene da protrombina fator II capaz de promover prejuízos à coagulação sanguínea mutações no gene da metilenotetrahidrofolato redutase MTHFR enzima responsável pela quebra do aminoácido homocisteína sendo o aumento desse aminoácido na circulação sanguínea capaz de promover a formação de trombos e danos ao endotélio vascular e polimorfismo de inserção ou de deleção no gene da enzima conversora de angiotensina ECA sendo o duplo polimorfismo de deleção o genótipo de maior risco cardiovascular Além dessas mutações e polimorfismos citados uma série de outras variações associadas ao aumento do risco de doença cardiovascular também podem ser avaliadas nesse exame 4 ANÁLISE CROMOSSÔMICA POR MICROARRANJO Diferentemente da análise do cariótipo que é capaz de indicar a presença de alterações cromossômicas por meio da avaliação das bandas cromossômicas na análise cromossômica por microarranjo é possível identificar microalterações cromossômicas referentes ao número de cópias de diferentes regiões dos cromossomos Por meio da análise comparativa do material a ser examinado com o material proveniente de uma amostra controle nesse teste podem ser detectadas deleções ou duplicações no DNA 150 A metodologia aplicada consiste na utilização de sondas de hibridação capazes de se ligar a regiões marcadoras do DNA polimórficas ou não Nesse sentido de acordo com o objetivo e a necessidade da avaliação diferentes sondas podem ser utilizadas Atualmente já existem opções de microarranjos com mais de 400000 sondas de regiões marcadoras de todo o genoma A partir da análise do microarranjo comparativo controle x teste é possível por meio de softwares específicos determinar as diferenças presentes no genoma Esse exame pode ser realizado em amostras de sangue em EDTA sangue em papelfiltro raspado da mucosa oral ou em amostras obtidas de produtos da concepção e líquido amniótico O exame pode ser indicado para a avaliação de pacientes que apresentem indicativos de doença genética sem relação direta com alguma síndrome já descrita déficits motores ou intelectuais não associados à condição conhecida produto da concepção de gestação interrompida cujo diagnóstico associado à causa da interrupção não pode ser concluído apenas com a análise do cariótipo investigação dos cromossomos de fetos que tenham apresentado malformações em exames de imagem ou cujo histórico genético dos pais possa indicar risco de incidência de alterações cromossômicas entre outras situações 5 INTOLERÂNCIA À LACTOSE A lactose é o açúcar mais abundante presente na constituição do leite e de seus derivados Para que sua absorção intestinal ocorra é necessário que essa molécula seja hidrolisada em glicose e galactose o que se dá pela ação da enzima lactase presente no intestino No entanto uma condição bastante comum ocorre devido à ausência ou deficiência da ação dessa enzima promovendo a chamada intolerância à lactose Indivíduos que apresentam essa condição possuem sintomas clínicos associados ao sistema digestivo como diarreia aumento da produção de gases intestinais e desconforto abdominal Existem exames não genéticos disponíveis para auxiliar no diagnóstico dessa doença como o exame de ingestão oral de lactose no qual após a ingestão de determinada quantidade de lactose é monitorado no paciente o aumento da concentração de glicose Dessa forma o paciente que apresenta o quadro de intolerância à lactose não apresentará aumento na concentração de glicose após a ingestão de lactose Embora disponível o teste apresenta uma taxa de erro em decorrência das variações interindividuais de metabolismo além de representar desconforto aos pacientes pois são necessárias várias coletas de sangue ao longo do exame Ainda nos pacientes que apresentam a intolerância os sintomas podem se manifestar ao longo do período do exame e posteriormente devido à ingestão de uma alta dose de lactose 151 A intolerância à lactose pode se apresentar de três formas distintas a congênita a primária e a secundária A mais rara porém mais grave é a congênita Nesse caso o indivíduo apresenta uma alteração no gene da lactase resultando na ausência total de produção da enzima Esse tipo de intolerância é bastante grave pois seus sintomas são manifestados já nos primeiros dias de nascimento e pode promover diarreias expressivas em recémnascidos levando ao óbito devido à desidratação severa A intolerância primária por sua vez manifestase ao longo da vida do indivíduo com sintomas mais brandos que aqueles apresentados na condição congênita No caso a intolerância à lactose ocorre por uma modulação na expressão gênica da enzima a qual se dá normalmente próximo ao início da fase adulta sendo considerada inclusive uma condição associada à evolução humana já que historicamente após a fase de amamentação o consumo de leite era cessado e portanto não havia necessidade de manutenção da atividade da lactase Na intolerância primária a redução da atividade da lactase ocorre devido a uma modulação gênica promovida pelo gene MCM6 Por fim na condição chamada de intolerância à lactose secundária a atividade da enzima lactase é prejudicada normalmente de maneira temporária por alguma condição secundária associada ao trato gastrointestinal como a doença celíaca a doença de Crohn e as enterites Atualmente sabese da existência de alguns fatores genéticos associados à persistência da produção de lactase na vida adulta dentre eles algumas mutações no próprio gene da lactase ou em sua região promotora ou no gene MCM6 Dessa forma o diagnóstico da intolerância à lactose pode ser determinado com o auxílio da avaliação da presença dessas alterações em ambos os genes Para tanto a presença dessas variações pode ser avaliada em amostras de sangue ou de rapado da mucosa oral por meio da utilização da técnica de PCR quantitativo qPCR evitando o desconforto do exame com a ingestão de lactose e a coleta múltipla de amostras de sangue 6 SEQUENCIAMENTO DO EXOMA Assim como os demais omas o exoma compreende todo o conjunto de éxons presentes no DNA de um indivíduo ou seja as frações do DNA que codificam para os aminoácidos que irão formar as proteínas Figura 3 Por compreender a região codificadora de proteínas no DNA sabese que no exoma está localizada a maior quantidade de mutações capazes de promover doenças de origem genética 152 FIGURA 3 ESQUEMA INDICANDO A LOCALIZAÇÃO DOS ÉXONS QUE COMPÕEM O EXOMA E SUA FUNÇÃO CODIFICADORA PARA A SÍNTESE PROTEICA FONTE httpsdlecombrbiologiamoleculargeneticahumanasequenciamentocompletodoexoma Acesso em 11 fev 2020 Dessa forma por meio do sequenciamento do exoma através da NGS da amostra de DNA proveniente do sangue do paciente é possível que seja avaliada a presença de mutações nas regiões codificadoras simultaneamente nos mais de 20000 genes presentes no genoma humano otimizando o diagnóstico de doenças genéticas Devido ao grande volume de dados gerados pelo sequenciamento do exoma uma série de etapas são necessárias para a indicação das mutações e suas possíveis relações como o quadro clínico sendo imprescindível o uso de ferramentas avançadas de bioinformática e de bancos de dados atualizados bem como a constante atualização do corpo técnico responsável pela emissão do laudo quanto aos avanços nas pesquisas relativas às doenças genéticas Esse exame é considerado de alto custo Portanto em caso de quadros clínicos que apresentem relação aparente com alguma doença genética específica pode ser indicada a avaliação pontual de alguns genes reduzindo assim o custo associado No entanto o sequenciamento do exoma pode ser de grande relevância para o diagnóstico de pacientes que já tenham realizado outros exames moleculares sem diagnóstico conclusivo ou cujo diagnóstico suspeito seja de doenças causadas por múltiplas alterações gênicas Esse exame pode ainda ser indicado para a avaliação genética de casais que apresentem consanguinidade O resultado obtido por meio do sequenciamento do exoma fornece informações que deverão ser cuidadosamente interpretadas já que diversas mutações podem ser encontradas embora muitas possam não apresentar relação com o quadro clínico do paciente Assim os resultados obtidos podem ser avaliados também em relação aos achados não relacionados ao fenótipo indicando quais podem ter relação com outras doenças que apresentem relevância 153 Muitas das alterações encontradas no sequenciamento do exoma podem não apresentar relação com patologias não sendo indicativas de risco até o momento No entanto devido ao extenso avanço nessa área das ciências os resultados obtidos no exame de sequenciamento de exoma podem ser futuramente reavaliados à luz de novos avanços científicos ou de novos quadros sintomáticos apresentados pelo paciente Ainda devido à grande complexidade e aos fatores éticos envolvidos nos resultados encontrados no sequenciamento do exoma o resultado apresentado no laudo será apenas relativo às mutações indicadas na solicitação médica sendo as demais mutações encontradas apenas comunicadas quando posteriormente solicitadas 61 EXOMA DO RECÉMNASCIDO Como complementação ao teste do pezinho o sequenciamento do exoma do recémnascido pode ser realizado na busca por variações no DNA relacionadas a mais de 300 doenças Algumas das patologias que podem ser detectadas incluem doenças metabólicas endócrinas neurológicas e genéticas Muitas delas não são clinicamente detectáveis na primeira infância e portanto o seu diagnóstico no recémnascido pode auxiliar no tratamento precoce No entanto outras são doenças conhecidas ou comuns porém sem tratamento Esse exame pode ser realizado em amostras de DNA provenientes do sangue do recémnascido ou do cordão umbilical ou de amostra de saliva Os resultados relatados são apenas aqueles relativos às doenças previstas na avaliação não sendo relatadas no laudo outras mutações encontradas Além disso quando detectada uma mutação relacionada a uma doença ou possivelmente relacionada tal condição é confirmada com um segundo sequenciamento dessa vez pelo método de Sanger 7 TESTE DE DNA OU TESTE DE PATERNIDADE Embora popularmente conhecido como teste de paternidade em virtude da sua maior aplicação para a confirmação de paternidade esse teste pode também ser aplicado para a determinação de maternidade Considerando que cada indivíduo recebe 50 do seu DNA da sua mãe e os outros 50 do seu pai por meio da avaliação do seu material genético com o doa suspeitoa pai ou mãe é possível confirmar com uma segurança bastante elevada próxima a 100 a suspeita em questão Para a determinação da paternidade são avaliados diversos marcadores presentes no DNA dos indivíduos sendo os padrões desses marcadores contrastados em busca de similaridades determinado a presença ou ausência de vínculo genético e portanto biológico entre os indivíduos A técnica aplicada para esse exame consiste na 154 PCR multiplex pois diversos fragmentos são amplificados simultaneamente realizada em amostras de DNA dos indivíduos envolvidos na confirmação da paternidade seguida de sequenciamento Nessa PCR são avaliados diversos marcadores de DNA os quais são variações inerentes a cada indivíduo presentes no DNA como marcas únicas no DNA exceto no caso de gêmeos univitelinos os quais apresentarão as mesmas variações No teste de paternidade são avaliadas dezenas de variações sendo comumente utilizados os polimorfismos do tipo STR short tandem repeat também conhecidos como marcadores microssatélites Essas variações se encontram em regiões não codificadoras do DNA e compreendem pequenas sequências de 1 a 8 nucleotídeos os quais se repetem sequencialmente por um número variável de vezes Assim levando em conta a herança genética dos pais quando comparada com as regiões de DNA que contenham esses marcadores esperase que o padrão de repetição número de nucleotídeos e quantidade de vezes que a sequência se repete em cada um dos cromossomos homólogos seja um herdado da mãe e outro herdado do pai o que será confirmado pelo padrão dos diversos marcadores avaliados De maneira resumida existem kits disponíveis para a realização da PCR multiplex para diferentes marcadores de DNA ou para as diferentes STRs Nessa PCR cada marcador apresentará uma fluorescência diferente a qual poderá ser detectada e reconhecida Também após a amplificação na PCR o material obtido pode ser submetido a uma eletroforese a qual pode ocorrer em capilar ou em um gel de acrilamida em que os alelos para cada STR serão separados de acordo com o seu tamanho Assim comparando o padrão de bandas apresentado para cada STR na amostra do filho com o padrão de bandas da amostra do suposto pai e da mãe biológica quando essa amostra está disponível em caso de paternidade positiva obrigatoriamente um dos alelos do filho deve ser do mesmo tamanho de um dos alelos da mãe ao passo que o outro deve ser igual a um dos alelos presentes no pai Figura 4 Desse modo por meio da avaliação conjunta de diversas STR e da aplicação de cálculos estatísticos associados ao teste de paternidade pode ser calculada com segurança a probabilidade de vínculo genético entre os indivíduos testados No caso da Figura 4 há indicativo de vínculo genético já que o padrão de bandas dos alelos para a STR A sequência curta repetidas em tandem no suposto filho apresenta um alelo igual ao do suposto pai e outro igual ao da mãe 155 FIGURA 4 ESQUEMA DO PADRÃO DE BANDAS EM TESTE DE VÍNCULO GENÉTICO FONTE A autora Embora o teste possa ser realizado apenas com amostras dos supostos pai e filho recomendase que se possível seja realizada a comparação com a amostra de DNA proveniente da mãe pois assim podese identificar a parte do conteúdo genético do filho que foi herdado da mãe simplificando a comparação com o do suposto pai e portanto tornando o resultado ainda mais confiável Além da determinação da mãe ou do pai com a participação deles podese aplicar o teste de DNA para a comprovação de vínculo genético em casos de pai falecido ou ausente sendo nesses casos necessário que seja feita a avaliação com o material genético de pelo menos dois parentes de primeiro grau do suposto pai Desse modo o exame buscará a reconstrução do perfil genético do pai baseado no perfil genético dos parentes Outra situação semelhante se aplica à comprovação de vínculo materno No entanto no caso de mãe falecida ou ausente o exame só poderá reconstituir o perfil do DNA da suposta mãe a partir do DNA tanto do pai quanto da mãe biológica dela Ainda o exame de DNA pode ser aplicado como teste de paternidade prénatal sem que haja a necessidade de procedimento invasivo para a coleta de amostra fetal Nesse caso o exame pode ser realizado a partir da 11ª semana de gestação sendo o material utilizado o DNA fetal livre que pode ser encontrado no sangue materno Assim o perfil genético do DNA do feto pode ser isolado e comparado com o DNA materno e dos supostos pais A determinação da paternidade prénatal apenas não deve ser aplicada no caso de gestações gemelares ou em caso de testes com mais de um suspeito à paternidade que apresentem vínculo biológico de primeiro ou segundo grau 156 8 SAÚDE ENDOMETRIAL ENDOMETRITE CRÔNICA A endometrite crônica a qual pode desencadear sintomas como dor pélvica sangramento eou corrimento vaginal e febre embora frequentemente se apresente de forma assintomática é uma condição da saúde da mulher que apresenta uma relação direta com o aumento da probabilidade de insucesso de uma gravidez estando relacionada à infertilidade aborto espontâneo parto prematuro e falha na implantação do embrião Essa doença é caracterizada por uma inflamação crônica na mucosa endometrial ou seja na mucosa de revestimento uterino promovida por uma infecção bacteriana que entre outras fontes pode ser originária de uma infecção sexualmente transmissível IST ou da colocação de um dispositivo intrauterino DIU As principais bactérias capazes de promover este tipo de inflamação são as bactérias patogênicas dos gêneros Enterococcus Streptococcus Mycoplasma Ureaplasma e Staphylococcus ou da família Enterobacteriaceae Estudos apontam a importância dessa doença em mulheres que apresentam dificuldade para engravidar pois há relatos de que ela acomete mais de 50 das mulheres que apresentam aborto de repetição em torno de 40 das que apresentam infertilidade e quase 70 daquelas que apresentam repetidas falhas de implantação Até recentemente o diagnóstico da endometrite crônica era realizado com o auxílio de exames de imagem como a histeroscopia acompanhado de histologia e cultivo microbiano de amostra obtida de biópsia do endométrio Tais metodologias se apresentam com uma série de ressalvas já que para a realização e correta interpretação da histeroscopia há a necessidade de se atentar para o período do ciclo menstrual que a mulher se encontra além de não haver a possibilidade de correlação direta do diagnóstico de inflamação intrauterina com o diagnóstico de endometrite bacteriana Ainda mesmo associando o cultivo microbiológico para a confirmação do agente patogênico promotor da inflamação tal cultivo não se apresenta eficaz para a proliferação e portanto detecção de muitas das bactérias causadoras da condição impossibilitando a obtenção de informações importantes para o diagnóstico adequado da doença Nesse sentido com os avanços científicos associados à demanda de um diagnóstico adequado para a endometrite crônica pesquisadores recentemente desenvolveram dois novos testes baseados em tecnologias de biologia molecular aplicados ao diagnóstico desta doença o ALICE do inglês Analysis of Infectious Chronic Endometritis e o EMMA do inglês Endometrial Microbiome Metagenomic Analysis 157 81 ALICE ANÁLISE DE ENDOMETRITE CRÔNICA INFECCIOSA Como previamente apontado a ocorrência de endometrite crônica é um fator bastante relevante associado ao insucesso reprodutivo da mulher estando associado às altas taxas de aborto de repetição e insucesso de implantação do embrião Desse modo o teste ALICE análise de endometrite crônica infecciosa ou análise molecular da endometrite crônica é um exame indicado na avaliação da saúde endometrial para a investigação de um possível diagnóstico de endometrite crônica podendo também ser uma ferramenta bastante útil aplicável a mulheres que embora não tenham a suspeita de endometrite apresentam insucesso reprodutivo devido à ocorrência de abortos espontâneos eou repetidas falhas de implantação de embrião Com a realização do exame tornase possível conhecer a microbiota que compõe o ambiente uterino no qual o embrião será implantado Para a realização do exame é necessário obter uma amostra do endométrio por meio de biópsia uterina Essa amostra deve ser adequadamente armazenada em solução preservante de RNA sendo a etapa de preservação do material de extrema importância para que o resultado obtido seja confiável e adequado Posteriormente é realizada a extração do material genético da amostra no qual será realizado o sequenciamento por tecnologia NGS da subunidade 16S do RNA ribossomal rRNA bacteriano Considerando que a subunidade 16S compõe o ribossomo de procariotos é possível com o seu sequenciamento identificar as cepas de bactérias presentes no material avaliado bem como a abundância de cada uma das cepas detectadas Assim o teste ALICE foi desenvolvido para identificar as principais bactérias promotoras de endometrite crônica inclusive aquelas que não apresentam crescimento nos exames envolvendo o cultivo bacteriano e dessa forma esse teste permite que seja indicado o tratamento antibiótico mais adequado de acordo com o resultado obtido otimizando o tratamento e o prognóstico da paciente Vale ressaltar que a microbiota endometrial pode ser afetada por diversos fatores Assim intervenções intrauterinas promovidas após a realização do teste ALICE podem alterar a microbiota e esta não refletir mais o resultado emitido no laudo sendo recomendada a repetição do teste Visto que o exame avalia a presença de bactérias no endométrio o uso de antibióticos por qualquer outra razão pode interferir no resultado obtido no teste ALICE Além disso esse teste apenas identifica bactérias associadas à endometrite e geralmente associadas à ISTs como a Clamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae Assim é importante frisar que mesmo com indicação da ausência dessas bactérias no laudo emitido não há a confirmação da ausência de outras bactérias patogênicas pois elas não foram avaliadas De forma resumida o teste ALICE investiga a presença das principais bactérias causadoras da endometrite crônica fornecendo diagnóstico para a doença e em caso de positividade indica o melhor tratamento antibiótico de acordo com as bactérias detectadas 158 82 EMMA ANÁLISE METAGENÔMICA DO MICROBIOMA ENDOMETRIAL A análise metagenômica Figura 5 do microbioma endometrial ou simplesmente teste EMMA similarmente ao teste ALICE investiga a presença de microorganismos no tecido endometrial No entanto neste caso por ser tratar de uma avaliação metagenômica não apenas as bactérias relacionadas à endometrite crônica são avaliadas sendo feita uma avaliação geral de todos os microorganismos que compõem esse microbioma Em todo o caso a varredura realizada pelo teste ALICE está incluída no teste EMMA Assim como já mencionado a ocorrência de endometrite crônica está associada ao insucesso reprodutivo feminino porém em contrapartida existem estudos que relacionam a presença de outros microorganismos com o sucesso reprodutivo Nesse sentido o teste EMMA foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a microbiota intrauterina fornecendo a informação sobre a abundância relativa também das bactérias benéficas à saúde endometrial além de informações pertinentes para o diagnóstico da endometrite crônica 159 FIGURA 5 ESQUEMA REPRESENTATIVO DA METAGENÔMICA A AMOSTRAS DE MICROORGANISMOS OBTIDOS DO AMBIENTE B EXTRAÇÃO CÓPIA E FRAGMENTAÇÃO DO DNA DAS AMOSTRAS C SEQUENCIAMENTO DOS FRAGMENTOS DE DNA D MONTAGEM EM UM COMPUTADOR DAS SEQUÊNCIAS DOS FRAGMENTOS OBTENDOSE AS SEQUÊNCIAS DAS MOLÉCULAS DE DNA ORIGINAIS FONTE Adaptado de httpsbitly2IDf8l5 Acesso em 11 fev 2020 Dessa forma o teste EMMA é realizado com o mesmo tipo de amostragem e preparação já descrito para o teste ALICE e por meio do sequenciamento NGS o metagenoma obtido da amostra é sequenciado normalmente em regiões conservadas evolutivamente como é o caso da subunidade 16S do rRNA de procariotos Após é submetido a análises por ferramentas de bioinformática capazes de fazer o reconhecimento dos organismos cujo material genético compõem esse metagenoma Assim a análise do metagenoma endometrial identifica os principais microrganismos presentes fornecendo um indicativo da saúde intrauterina por meio da avaliação do equilíbrio microbiológico que o endométrio apresenta Esse teste é indicado como auxiliar no prognóstico de sucesso reprodutivo feminino pois conhecer o microbioma no qual o embrião será implantado fornece informações úteis para mulheres que pretendem engravidar seja por fertilização in vitro ou não 160 9 PLANEJAMENTO DE GRAVIDEZ ACONSELHAMENTO GENÉTICO Doenças genéticas recessivas são doenças promovidas pela presença de dois alelos mutantes para um determinado gene Assim pessoas que apresentam apenas um alelo mutante normalmente não apresentam fenótipo associado a doenças embora sejam portadores do gene mutante Dessa forma ainda que as doenças recessivas não se manifestem nos portadores a sua avaliação se torna relevante considerando que nas doenças recessivas monogênicas ou seja as doenças nas quais a mutação nos dois alelos de apenas um gene está relacionada ao fenótipo da doença o padrão de hereditariedade da doença segue as leis mendelianas e portanto o alelo mutado pode ser transmitido para a prole existindo uma probabilidade de 25 da doença se manifestar nos descendentes do portador Figura 6 A Organização Mundial da Saúde OMS indica que a prevalência de doenças monogênicas recessivas é de 1 ou seja a cada 1000 crianças nascidas 10 apresentam doenças monogênicas recessivas Algumas das doenças genéticas recessivas também conhecidas como doenças mendelianas são a anemia falciforme a doença de Batten a distrofia muscular de Duchenne a síndrome do Xfrágil a hemofilia a fenilcetonúria a fibrose cística a doença de Huntington entre outras O que é metagenômica De forma resumida é a ciência que estuda o material genético proveniente de uma amostra ambiental sendo que esse ambiente pode ser por exemplo uma amostra de solo ou de um tecido humano Figura 5 O grande avanço na avaliação de microorganismos por meio do metagenoma foi a possibilidade de identificação daqueles que não poderiam ser identificados por cultivo pois não apresentavam crescimento em condições laboratoriais Para mais informações sobre metagenômica e sua aplicação consulte o artigo de Silva Caruso e Maia 2015 DICA 161 FIGURA 6 PADRÃO DE HERANÇA DE DOENÇA RECESSIVA FONTE httpsunidospelavidaorgbrdiamundialdasdoencasraras Acesso em 4 fev 2020 Nesse sentido dois testes podem ser indicados para a avaliação das doenças recessivas o teste de portador e o teste de compatibilidade Em ambos os testes podem ser avaliadas cerca de 500 doenças recessivas por meio da avaliação de mais de 500 genes e de cerca de 6000 mutações O método utilizado para a avaliação se baseia no sequenciamento NGS desses genes e mutações a partir do material genético extraído de amostras de sangue Ainda se necessário podem ser complementarmente avaliados os genes da hemofi lia da hiperplasia suprarrenal congênita da síndrome do Xfrágil da atrofi a muscular espinhal e da alfa talassemia por meio da aplicação de diferentes tipos de PCR como o QFPCR do inglês quantitative fl uorecentPCR e o TPPCR do inglês triplet repeat primedPCR Você pode aprender um pouco mais sobre a aplicação da QFPCR e da TP PCR lendo os trabalhos de Moraes 2016 e Ciotti et al 2004 DICA 162 No teste de portador é observada a ocorrência de alguma das mutações relacionadas às doenças avaliadas no indivíduo que se encontra em teste Já no teste de compatibilidade genética tal ocorrência também é avaliada porém nos dois indivíduos ou seja no casal Dessa forma se houver a ocorrência de mutações será indicado se elas encontramse nos mesmos genes em ambos os indivíduos Caso isso ocorra devido ao padrão de herança mendeliano existe a probabilidade de 25 de que um dos filhos do casal apresente a doença Além da indicação para a avaliação de casais que estão planejando uma gravidez seja por fecundação natural ou assistida o teste de compatibilidade também é indicado para casos em que a fecundação será realizada com óvulo ou sêmen proveniente de um doador Em ambos os casos ocorrendo a positividade para uma mesma mutação nos dois indivíduos ou entre o indivíduo e o doador de gametas é necessário que seja feito o aconselhamento com médico especialista para que não ocorra a gestação de um feto portador da doença Assim algumas das opções que podem ser apresentadas incluem a avaliação genética do óvulo fecundado préimplantação e a escolha de um novo doador de gametas 10 ANCESTRALIDADE JUDAICA ASHKENAZI Algumas doenças autossômicas recessivas apresentam uma frequência elevada na população de descendente dos judeus Ashkenazi Entre elas estão a fibrose cística a doença da urina de xarope de bordo a síndrome de Bloom entre outras Elas são consideradas graves e podem inclusive representar reduzida longevidade com diversas complicações à saúde dos indivíduos que apresentam a doença Essas doenças estão relacionadas à cerca de 50 variações presentes em 16 genes Nesse sentido por meio do sequenciamento desses genes no DNA proveniente de uma amostra de sangue pode ser determinado se o paciente apresenta heterozigose para alguma dessas variantes patogênicas dos genes Nesse sentido o resultado do exame deve ser considerado como ferramenta para o aconselhamento genético de indivíduos que pretendem ter filhos já que assim como as demais doenças autossômicas recessivas se ambos os pais forem portadores do gene mutado ou seja heterozigotos há a probabilidade de os filhos apresentarem a doença ou serem portadores dela Além disso a avaliação das variantes gênicas presentes em maior frequência na população judaica Ashkenazi pode ser utilizada como indicativo para a confirmação de tal ancestralidade 163 11 TRIMETILAMINÚRIA TMAU1 A trimetilaminúria em sua forma primária também chamada de Tmau1 é uma condição promovida pela mutação do gene FMO3 Este gene é responsável pela codificação da enzima responsável pela oxidação da trimetilamina em Nóxido de trimetilamina Assim diversas mutações nesse gene podem promover a deficiência nesse processo de oxidação sendo atualmente conhecidas mais de 30 mutações capazes de alterar a atividade da enzima Dessa forma o diagnóstico da Tmau1 pode ser realizado por meio do sequenciamento completo do gene FMO3 localizado no cromossomo 1 em busca de uma das possíveis mutações causadoras da condição O material genético para a realização desse exame pode ser obtido de amostras de sangue ou de raspado da mucosa oral Tal condição não apresenta risco à saúde de seu portador No entanto normalmente representa fonte de estresse e constrangimento pois a Tmau é clinicamente caracterizada pelo mau odor apresentado pelo indivíduo normalmente associado ao cheiro de peixe o que inclusive fez com que essa condição também fosse conhecida como síndrome do odor de peixe O mau odor ocorre porque após a ingestão de alimentos contendo colina e carnitina presentes por exemplo em ovos carne vermelha e peixes a sua digestão produz a trimetilamina a qual se apresenta na forma de um gás com odor forte semelhante a peixe Em condições metabólicas adequadas ela deveria ser oxidada formando um metabólito inodoro no entanto indivíduos que apresentam a Tmau não metabolizam adequadamente a trimetilamina que acaba sendo excretada principalmente pelo suor hálito e urina conferindo ao indivíduo um forte odor associado a essa excreção Normalmente a condição é mais severa em indivíduos que apresentam mutações nos dois alelos do gene FMO3 Contudo episódios intermitentes e de menor intensidade podem ocorrer em indivíduos que apresentam apenas um dos alelos mutados Ainda embora a Tmau seja conhecida pelo odor de peixe indivíduos que apresentam essa condição podem ter outros odores como o de lixo ou de fezes Essa condição é pouco conhecida e sem cura No entanto com o correto diagnóstico podem ser tomadas medidas que minimizem o impacto da doença sobre o indivíduo por exemplo alterando a dieta para que seja evitada a formação de trimetilamina e fornecendo auxilio psicológico para que a pessoa possa lidar com a sua condição diminuindo os riscos de depressão associados a ela 164 12 HIV E HEPATITES Com o auxílio de técnicas de biologia molecular tanto o diagnóstico quanto o tratamento ou acompanhamento de algumas doenças virais pôde ser aprimorado como é o caso dos vírus HIV e das hepatites B HBV e C HCV Embora ainda não se conheça a cura para a síndrome da imunodeficiência adquirida AIDS promovida pelo vírus HIV o seu diagnóstico precoce é bastante importante para que a manutenção adequada da doença possa ser realizada Desse modo por meio da aplicação da qPCR é possível detectar a presença do RNA viral em amostras de sangue do paciente bem como quantificar a carga viral que ele apresenta Além disso com o auxílio da técnica de qPCR pode ser realizada a genotipagem viral em busca de mutações virais responsáveis por fornecer resistência à terapia farmacológica utilizada no tratamento Desse modo notase que a utilização destes exames é de extrema relevância para o acompanhamento da eficácia terapêutica na manutenção dos níveis de carga viral bem como para auxiliar na tomada de decisão quanto à melhor estratégia terapêutica a ser adotada em cada fase do tratamento De forma semelhante tanto o vírus da hepatite B quanto da hepatite C são capazes de promover uma infecção crônica nos indivíduos expostos a eles sendo ambas as doenças possíveis de serem diagnosticas e o tratamento acompanhado por meio de exames que empreguem técnicas de biologia molecular também em amostras de sangue obtidas do paciente Nesses casos tanto o RNA viral no caso da hepatite C quanto o DNA viral no caso da hepatite B podem ser detectados além da carga viral quantificada por qPCR e da possibilidade de determinação do genótipo também por qPCR no HCV ou por sequenciamento de DNA no HBV Tais informações assim como no caso do vírus HIV podem ser úteis no diagnóstico determinado pela presença do material genético viral no monitoramento da eficácia do tratamento utilizado por meio da quantificação da carga viral ao longo do tratamento e na determinação da estratégia terapêutica por meio da genotipagem viral especialmente em pacientes com diagnóstico para a hepatite C pois nesse caso o protocolo terapêutico recomendado difere de acordo com o genótipo do HCV 13 INFECÇÕES RESPIRATÓRIAS As infecções respiratórias de origem viral são doenças com potencial de acometer qualquer indivíduo que teve contato com alguém infectado sendo que a transmissão do vírus pode ocorrer pelo contato direto com objetos utilizados pelo portador do vírus especialmente por meio da contaminação das mãos e posterior contato com as mucosas oral e nasal ou simplesmente pela presença do vírus no ambiente o que ocorre devido a tosses e espirros que difundem o vírus em uma determinada área Assim apenas por inalação é possível que ocorra o contágio 165 Os principais vírus causadores de doenças respiratórias incluem o influenza o parainfluenza o rhinovírus o vírus sincicial respiratório o adenovírus o coronavírus entre outros De maneira geral todos esses vírus podem causar sintomas bastante semelhantes como tosse espirros febre dores congestão das vias respiratórias entre outros os quais podem culminar em um quadro de sintomas leves moderados ou severos inclusive levando ao desenvolvimento de pneumonias e outras complicações Embora na maioria dos casos os sintomas apresentados sejam considerados leves todas essas infecções respiratórias virais apresentam o potencial risco de complicações especialmente em pacientes de grupos mais sensíveis como crianças e idosos e naqueles que apresentam outras comorbidades associadas ao sistema respiratório como asma e doença pulmonar obstrutiva crônica além de pacientes imunossuprimidos como os transplantados e aqueles com AIDS o que representa inclusive risco de morte para esses pacientes Nesse sentido já que os sintomas dessas doenças não apresentam especificidade sendo inclusive semelhantes aos sintomas apresentados em infecções bacterianas os testes diagnósticos que utilizam tecnologias de biologia molecular permitem o diagnóstico rápido e específico do patógeno ou dos patógenos causadores da doença auxiliando na decisão do tratamento farmacológico adequado e evitando por exemplo a indicação do uso de antibióticos nos casos em que o medicamento adequado seria um antiviral O exame para a identificação dos patógenos causadores das doenças respiratórias é realizado com amostra da mucosa oral coletada através do auxílio de um swab estéril Nessa amostra por meio da técnica de qPCR é avaliada a presença de cerca de vinte cepas virais indicando como resultado em qualis cepas estáo presentes e portanto auxiliando na melhor decisão de tratamento Recentemente a China apresentou um surto de doença respiratória viral promovida por uma cepa do vírus coronavírus chamado de novo coronavírus De maneira geral seus sintomas são considerados leves embora vários casos letais tenham sido relatados devido à rápida progressão da infecção que culmina em um quadro grave de pneumonia Medidas de contenção foram DICA aplicadas para conter a disseminação do vírus no entanto devido à possibilidade de um surto viral em escala global diversos estudos foram e estão sendo desenvolvidos nas áreas de diagnóstico e tratamento para essa doença Um desses estudos foi realizado no Brasil pelo laboratório de diagnóstico DB Molecular localizado em Curitiba Paraná Esse estudo foi responsável pelo desenvolvimento de um novo teste de diagnóstico molecular destinado à identificação rápida e precisa do novo coronavírus O teste desenvolvido pelo laboratório rapidamente foi disponibilizado em todo o país Consulte também nos links httpswwwbemparanacombrnoticia laboratoriocuritibanodesenvolveexameexclusivoparaidentificacaodonovo coronavirusXjoEwv5KjIU e httpspanoramafarmaceuticocombr20200203db moleculardesenvolveexameparaidentificacaodocoronavirus 166 14 TROMBOFILIA A trombofilia é uma condição caracterizada por risco aumentado de desenvolvimento de trombose em decorrência de alterações genéticas capazes de afetar a manutenção da hemostasia Alguns dos fatores genéticos associados a essa doença incluem a mutação em alguns genes como por exemplo no gene do fator V de Leiden no gene da protrombina no gene da enzima conversora de angiotensina entre outros Tais mutações podem ocorrer isoladas ou em conjunto aumentando o risco de trombose nos pacientes que apresentam essas mutações Além disso alguns fatores ambientais representam risco aumentado de desenvolvimento de trombose como o uso de contraceptivos orais o que indica risco ainda maior para mulheres que apresentem mutações ou polimorfismos associados à trombofilia Dessa forma sabese que muitos casos de mulheres que apresentam quadros de abortos de repetição estão relacionados à trombofilia Nesse sentido a partir de amostras de sangue as mutações e polimorfismos dos genes associados aos fatores hemostáticos podem ser avaliados por meio de sequenciamento seja ele dos genes completos ou apenas da mutação ou polimorfismo em investigação Tal investigação é recomendada para mulheres que apresentem abortos de repetição sem causa definida e em indivíduos com histórico familiar de trombose 15 INFECÇÕES SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS IST As Infecções Sexualmente Transmissíveis IST previamente conhecidas também como Doenças Sexualmente Transmissíveis DST são infecções causadas por vírus bactérias protozoários ou fungos transmitidas sexualmente seja por via oral anal ou vaginal quando há relação entre um indivíduo contaminado e um não contaminado sem a utilização de preservativos seja masculino ou feminino Em menor proporção pode ocorrer a transmissão dessas infecções de mãe para filho durante a gestação o parto ou a amamentação Devido à grande variedade de patógenos causadores dessas infecções e sendo muitas delas assintomáticas o diagnóstico preciso do patógeno auxilia no tratamento adequado interrompendo inclusive o ciclo de transmissão da doença Nesse sentido diversos organismos causadores de IST podem ser detectados por meio de exames moleculares em amostras de secreção vaginal endocervical ou uretral além de urina Em alguns casos como da AIDS e da hepatite podem também ser utilizadas amostras de sangue A principal técnica utilizada é a PCR por meio da qual pode ser identificada com a utilização de iniciadores específicos para cada patógeno a presença dos microorganismos causadores por exemplo da gonorreia Neisseria gonorrhoeae da sífilis Treponema pallidum da tricomoníase Trichomonas vaginalis AIDS HIV herpes genital vírus herpes verrugas genitais papilomavírus humano HPV candidíase Candida albicans entre outros 167 151 PAPILOMAVÍRUS HUMANO HPV O papilomavírus humano ou HPV é um vírus responsável por promover uma infecção sexualmente transmitida resultando em um quadro clínico assintomático na maioria dos casos ou que evolui para o aparecimento de verrugas genitais Essa infecção é de extrema relevância pois existe uma relação bastante expressiva entre a ocorrência de infecções persistentes por HPV e o desenvolvimento de câncer cervical ou câncer de colo do útero Existem evidências que indicam que a maior parte dos casos de câncer de colo do útero são originados por uma infecção persistente de alguma cepa de HPV considerada de alto risco Nesse sentido a avaliação molecular da amostra proveniente da mucosa endocervical por meio da aplicação da técnica de hibridação in situ permite a detecção de regiões do RNA viral responsáveis pela síntese de algumas proteínas reconhecidamente oncogênicas ou oncoproteínas Após a hidridação in situ a amostra é submetida a uma análise por citometria de fluxo a qual permite a detecção e quantificação das células que contenham HPV capazes de expressar essas oncoproteínas Dessa forma com o resultado obtido é possível avaliar o risco oncogênico relacionado à cepa de HPV promotora da infecção Além disso o vírus HPV pode também ser detectado em amostra da mucosa endocervical por meio da aplicação da técnica de PCR No entanto nesse caso o exame é aplicado como uma triagem de patógenos suspeitos de promover uma infecção sexual clinicamente detectada 16 FARMACOGENÉTICA Como já discutimos anteriormente em outros tópicos deste livro as diferenças genotípicas entre os indivíduos muitas vezes refletem em diferenças fenotípicas entre eles Esse conceito se aplica também no que se refere a diferentes respostas a fármacos pois tanto a farmacocinética quanto a farmacodinâmica estão associadas à ação de diferentes enzimas e proteínas as quais por sua vez são codificadas por genes que podem conter diferenças entre os diferentes indivíduos Tais diferenças podem representar fator determinante para a eficácia de um medicamento ou ainda a probabilidade da ocorrência de efeitos colaterais e até mesmo tóxicos tornandose interessante conhecer tais diferenças na busca pela aplicação da medicina personalizada Sabese que muitos fármacos dependem de enzimas de metabolização para que apresentem a eficácia adequada ao passo que para o processo adequado de excreção e eliminação deles do organismo também são requisitadas as enzimas de metabolização Nesse sentido as principais enzimas atuantes na metabolização de fármacos são as enzimas da família do citocromo P450 ou CYP450 Assim alterações em enzimas pertencentes a essa família influenciam diretamente na ação de diferentes fármacos 168 Tais alterações são responsáveis pelas diferentes respostas observadas para um mesmo fármaco em diferentes indivíduos pois em alguns por exemplo o medicamento pode apresentar eficácia terapêutica com efeitos tóxicos exacerbados enquanto em outros o medicamento pode não apresentar efeito terapêutico ou tóxico Figura 7 FIGURA 7 REPRESENTAÇÃO DE GRUPOS DE PACIENTES QUE APRESENTAM DIFERENTES RESPOSTAS A UM MESMO FÁRMACO DE ACORDO COM SUAS VARIAÇÕES FARMACOGENÉTICAS FONTE httpsmuseudinamicointerdisciplinarwordpresscom20140531farmacogeneticaterapia individualizada Acesso em 11 fev 2020 Diante disso a avaliação farmacogenética torna possível investigar em amostras de sangue ou raspado da mucosa oral dezenas de variações presentes em genes relacionados ao metabolismo ação e excreção de diversos fármacos A técnica utilizada se baseia da extração do DNA genômico presente na amostra e posterior construção de bibliotecas genômicas para o sequenciamento por meio de NGS dos genes de interesse Em alguns casos específicos também pode ser aplicada a PCR para a análise de algumas variações Diante das variações encontradas no sequenciamento o exame farmacogenético permite que seja feita uma varredura para a determinação da correlação dessas variações com os efeitos esperados para uma série de fármacos indicando inclusive quais seriam os mais adequados para cada paciente Atualmente é possível realizar a avaliação farmacogenética para fármacos de diversas classes e mecanismos de ação como antineoplásicos antibióticos antidepressivos ansiolíticos medicamentos para doenças como Parkinson Alzheimer e Transtorno do Déficit de Atenção com Hiperatividade TDAH entre tantos outros Grupo de Pacientes Droga tóxica mas benéfica Droga tóxica mas não benéfica Mesmo diagnóstico mesma precisão Droga tóxica e benéfica Droga não tóxica e não benéfica 169 Ainda de forma mais específica é possível realizar o teste de perfil farmacogenético buscando a avaliação de grupos de fármacos destinados a uma condição específica como fármacos relacionados ao sistema nervoso central ao sistema cardiovascular ao tratamento de tumores entre outros 17 AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL A microbiota por vezes referida como microbioma pode ser definida como o conjunto de microorganismos presentes em determinado microambiente o que inclui por exemplo diferentes regiões do corpo humano como a boca o intestino o trato genital entre outros Esses microorganismos constituem importante fator simbiótico atuante na fisiologia humana ou seja quando a diversidade e abundância de microorganismos estão em equilíbrio isso resulta em benefício fisiológico ao ser humano ao passo que quando em desequilíbrio ou seja quando há maior abundancia de microorganismos patogênicos o organismo humano tende a apresentar alterações fisiológicas quadro conhecido como disbiose Um microbioma de grande interesse médicocientífico é o microbioma intestinal Quando em equilíbrio esse microbioma tem sido relacionado a diversos benefícios ao organismo já que os microorganismos que o compõem são capazes de produzir e liberar no trato gastrointestinal uma série de metabólitos atuantes também em processos fisiológicos do organismo hospedeiro Alguns exemplos desses processos são a modulação do sistema imune a síntese de vitaminas e por vezes até de neurotransmissores a digestão de diversos componentes da alimentação além da manutenção do equilíbrio intestinal por meio da prevenção da proliferação de organismos patogênicos Ainda sabese que alterações na microbiota intestinal podem estar relacionadas a doenças como diabetes doença de Crohn entre outras Diante disso por meio da aplicação de técnica de sequenciamento é possível analisar o DNA presente em uma amostra de fezes e posteriormente com ferramentas de bioinformática identificar o metagenoma intestinal e apontar quais micro organismos compõem esse microbioma bem como quantificar a abundância de cada um deles Dessa forma a avaliação da microbiota intestinal pode ser realizada para auxiliar no diagnóstico de doenças inflamatórias intestinais na conduta de prescrição de probióticos ou antibióticos no monitoramento de pacientes em tratamento com quimioterápicos ou outros fármacos que atuem na microbiota intestinal entre outras aplicações por exemplo as voltadas a estudos nutricionais 170 18 NUTRIGENÉTICA A nutrigenética é uma área do diagnóstico molecular que atua na identificação das relações entre diversos genes e os nutrientes provenientes da dieta Atualmente sabese que diversas variações gênicas especialmente do tipo polimorfismos em aproximadamente cem genes distintos modulam a maneira com que o indivíduo reage fisiologicamente à presença de certos nutrientes Tais diferenças individuais nessas variações podem estar relacionadas a uma propensão aumentada para o desenvolvimento de doenças associadas ao metabolismo ou então para a presença de fator aumentado de proteção a essas doenças Assim a avaliação nutrigenética pode investigar genes relacionados ao metabolismo de lipídios vitaminas e outros compostos obesidade intolerância alimentar hipertensão entre outros os quais estão relacionados ao desenvolvimento de doenças cujo componente nutricional é um fator importante Por meio do sequenciamento desses genes no DNA isolado de uma amostra de sangue e da posterior identificação dos polimorfismos é possível determinar fatores alimentares que representem risco ao desenvolvimento de diversas doenças inclusive apontando qual o perfil nutricional adequado ao paciente auxiliando assim na determinação de uma dieta alimentar que vise por exemplo à perda de peso eou à melhora da condição de saúde global do indivíduo 19 PERFIL GENÉTICO DESEMPENHO ESPORTIVO Sabese que o desempenho esportivo está bastante relacionado a fatores como treinamento e dieta No entanto pouco se discute sobre o papel da herança genética nesse desempenho Atualmente muitos estudos têm demonstrado que polimorfismos em diferentes genes estão diretamente relacionados ao desempenho esportivo por exemplo genes relacionados à condição cardiovascular e à função muscular Alguns estudos apontam que o fator genético pode representar até 50 das diferenças nas performances esportivas apresentadas por diferentes indivíduos Na avaliação do perfil genético para a investigação do desempenho esportivo podem ser avaliados mais de cem diferentes polimorfismos em diversos genes a partir de uma amostra de DNA salivar Com base no perfil encontrado pode ser indicado por exemplo se o indivíduo apresenta um perfil genético compatível com determinada prática esportiva quais ajustes podem ser realizados para a melhora no desempenho esportivo qual o perfil nutricional e metabólico do indivíduo indicando a capacidade de perda de peso qual a propensão ao desenvolvimento de lesões associadas ao esporte e se o perfil genético favorece o melhor desempenho em esportes de velocidade explosão resistência ou 171 uma combinação desses fatores Dessa forma o resultado obtido com o perfil genético pode ser a base para o desenvolvimento de um plano de ação envolvendo exercício adequado e nutrição para a melhora global do desempenho do atleta Esse teste é indicado para a avaliação de indivíduos inclusive crianças para um direcionamento em relação ao esporte que mais se adeque às habilidades físicas do indivíduo e como ferramenta para a melhoria do plano de desenvolvimento de atletas de alto rendimento 20 SEQUENCIAMENTO COMPLETO DO GENOMA WGS Como uma união de vários dos exames já descritos ao longo desse tópico a opção da avaliação do genoma completo WGS do inglês whole genome sequencing traz um novo panorama em relação à possibilidade de conhecer e rastrear diversas doenças condições e predisposições relacionadas às variações no genoma de um indivíduo O exame mais próximo ao WGS é o sequenciamento completo do exoma e nesse sentido o WGS apresenta a vantagem de avaliar as regiões codificadoras do DNA e as reguladoras da expressão gênica as quais podem apresentar variações responsáveis pelo desenvolvimento de condições desfavoráveis à saúde do paciente Após o sequenciamento completo do DNA por meio de sequenciamento NGS obtido em uma amostra salivar o resultado do WGS deverá ser cuidadosamente interpretado por especialistas seguindo os avanços mais recentes da literatura sobre as relações entre as variações observadas no DNA e condições patológicas ou não Essa interpretação pode conter informações sobre i genes e outras variações no DNA relacionados a doenças recessivas trazendo informações importantes para uma abordagem envolvendo aconselhamento genético ii variações relativas ao metabolismo energético nutrição e desempenho esportivo iii avaliação farmacogenética iv variações relacionadas aos sistemas cardíaco imunológico endócrino neurológico e metabólico fornecendo avaliação de risco de desenvolvimento de doenças relacionadas a esses sistemas v risco oncológico com a avaliação dos genes e variações atualmente relacionados a diversos tipos de câncer vi genes e polimorfismos associados à ancestralidade judaica Ashkenazi entre outras informações que venham a ser pertinentes ou que estejam de acordo com o requisitado quando da contratação do serviço de interpretação De maneira geral a avaliação completa do genoma é um exame de custo bastante elevado sendo portanto apenas recomendado como uma abordagem subsequente a outros exames moleculares em casos de diagnósticos inconclusivos de condições doenças com grande potencial de origem genética No entanto devido ao seu aspecto 172 de avaliação global da condição do indivíduo pessoas interessadas em conhecer a sequência de seu genoma podem se beneficiar dos resultados desse exame por meio da avaliação das interpretações fornecidas de maneira a melhorar sua qualidade de vida por exemplo mudando hábitos que potencializem riscos apresentados pela sua condição genética o que pode resultar em longevidade saudável 173 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR SÃO USADAS CADA VEZ MAIS EM UM NÚMERO MAIOR DE EXAMES Cristina Sanches A partir dos anos 1950 com a descoberta da estrutura do DNA ácido desoxirribonucleico surgiu uma nova ciência a biologia molecular que se revelou uma ferramenta útil no diagnóstico de doenças infecciosas Nos últimos anos ela vem se tornando mais conhecida dos pacientes e ganhando destaque nos laboratórios clínicos sendo usada tanto para o diagnóstico quanto para a prevenção de doenças Os exames realizados por biologia molecular funcionam basicamente pela amplificação do DNA do material a ser estudado o que torna possível detectar quantidades mínimas de um vírus por meio da sua amplificação Uma das suas grandes vantagens está em tornar os exames realizados por técnicas convencionais mais específicos O uso dos testes moleculares no laboratório clínico tem revolucionado o diagnóstico O sequenciamento de próxima ou nova geração NGS sigla em inglês para nextgeneration sequencing e sua utilização no genoma humano os aperfeiçoamentos da metodologia de PCR polimerase chain reaction em português reação em cadeia da polimerase e os refinamentos da espectrometria de massas trouxeram uma nova dimensão e inúmeras possibilidades para o diagnóstico clínico A medicina de precisão fruto das análises individualizadas que essas metodologias permitem tornouse possível e tem contribuído para tratamentos personalizados e com melhores resultados para diversas patologias Ainda estamos em um momento inicial desta nova fronteira diagnóstica mas o futuro se mostra bastante promissor e com potencial disruptivo analisa Cláudio Pereira diretorgeral do CerbaLCA De forma geral as técnicas moleculares são mais precisas sensíveis e específicas podendo resultar em valores preditivos positivos e valores preditivos negativos muito elevados dependendo da prevalência das doenças pesquisadas na população estudada Segundo Danielle Alves Gomes Zauli da área de Pesquisa e Desenvolvimento do Grupo Hermes Pardini os métodos convencionais de diagnóstico normalmente são laboriosos exigindo uma estrutura laboratorial complexa e de difícil execução Já as técnicas de biologia molecular apresentam algumas vantagens tais como facilidade na execução maior sensibilidade especificidade e reprodutibilidade menor tempo de execução possibilidade de automação e menor prazo de marcação do resultado para o paciente LEITURA COMPLEMENTAR 174 Aplicações diversas Segundo Pereira os testes moleculares têm aplicações diversas Eles formam o core quando falamos de medicina preditiva preventiva e personalizadade precisão A medicina curativa tradicional tem perdido espaço e os recursos têm sido direcionados para essas novas perspectivas da área médica Os tratamentos genéricos e não individualizados têm sido substituídos pelos personalizados e um grande facilitador disso são os testes de tipagem molecular Doenças como o câncer doenças infecciosas e doenças genéticas hereditárias têm sido o foco destes esforços explica O CerbaLCA oferece uma grande extensão de testes baseados nas metodologias moleculares desde aqueles com foco no diagnóstico de doenças infecciosas até desordens genéticas hereditárias e câncer Dentre os testes mais novos a oferta de biópsia líquida e a pesquisa de células tumorais circulantes para o diagnóstico a distância de neoplasias malignas tem se destacado Pereira conta que são ofertados mais de quatro mil testes moleculares que em termos de volume ainda são bem menos numerosos do que os testes de química clínica mas em termos de receita essa tem se mostrado significativa e crescente o que justifica os altos valores investidos em equipamentos instalações e formação de recursos humanos Já no laboratório Hermes Pardini as técnicas de biologia molecular são utilizadas no setor de genética molecular que oferece em média trezentos tipos de exames diferentes que incluem entre os mais solicitados tipagem HLA fator V da coagulação carga viral de HIV detecção de agentes causadores de ISTs e detecção de HPV por captura híbrida Também são oferecidos testes para detecção de agentes infecciosos como zika vírus vírus chikungunya vírus da dengue e para detecção de vírus raros como o vírus do Nilo Ocidental De acordo com a estratégia corporativa da empresa e seu caráter inovador e pioneiro na área de medicina diagnóstica atualmente se encontra em fase final de desenvolvimento exames para detecção molecular de vírus que possam ser causas de possíveis epidemias no país tais como os arbovírus Mayaro e Oropouche Atualmente o Hermes Pardini também oferece exames preditivos que envolvem as áreas de nutrigenética e ciência do esporte explica Danielle Outro laboratório o DB Diagnósticos do Brasil também oferece uma gama variada de exames Dos cerca de 25 mil testes realizados por mês 75 são testes genéticos principalmente exames de sexagem fetal para investigação do sexo do bebê e de intolerância à lactose e 25 são exames para detecção de doenças infecciosas Segundo Nelson Gaburo gerentegeral da unidade de biologia molecular alguns dos exames como os de intolerância à lactose podem também ser realizados pelos métodos convencionais mas com a biologia molecular eles se tornaram mais simples e rápidos Isso também acontece com o exame de sexagem fetal em que a biologia molecular tem maior sensibilidade com oito semanas de gestação já é possível distinguir o sexo do bebê do que o exame de ultrassonografia que precisa de 12 semanas para que a imagem possa ser vista com clareza 175 Os testes de biologia molecular oferecem maior sensibilidade e acessibilidade em qualquer momento em que a doença seja investigada Porém os exames convencionais não serão substituídos pois cada um tem sua utilidade E ele cita como exemplos o hemograma e o exame de urina Caso um exame de rotina apresente alguma alteração o passo seguinte é a realização de exames mais complexos Assim podemos lançar mão da biologia molecular para uma investigação mais detalhada comenta Gaburo Capacitação profissional Um laboratório de biologia molecular precisa ter uma estrutura que permita um perfeito fluxo de trabalho com áreas dedicadas e separadas fisicamente Como as técnicas são diferentes entre os exames de biologia molecular e os convencionais os profissionais que atuam nessa área possuem mais frequentemente titulações acadêmicas e experiência em pesquisa básica e aplicada O grande desafio é a aplicação de todo esse conhecimento adquirido em anos de formação ao diagnóstico clínico A aplicação de quaisquer novas metodologias no laboratório exige um esforço adicional em adequação às boas práticas atendimento às necessidades dos clientes e dos médicos prescritores e cumprimento de prazos e outros requisitos demandados explica Pereira Para Gaburo exigese desse profissional maior capacitação e conhecimento técnico específico pois são exames de alta complexidade com processos manuais de análises diferentemente do que ocorre nos exames de análises clínicas convencionais geralmente feitos em batelada Os exames que utilizam as técnicas de biologia molecular estão mais sujeitos a erro Por isso há uma preocupação ainda maior com a capacitação profissional e com a qualidade de todo o processo Todos os testes de biologia molecular passam por dupla conferência sendo analisados por profissionais diferentes Segundo ele ainda a meta dos laboratórios que prestam serviços nessa área deve ser o desenvolvimento de uma política de qualidade que faça com que o número de erros tenda a zero e que os laudos emitidos sejam compreensíveis pelos profissionais que atuam junto ao paciente No Hermes Pardini as equipes responsáveis pela realização dos testes moleculares são constantemente incentivadas a participar de cursos workshops congressos científicos nacionais e internacionais com apresentação de trabalhos desenvolvidos pelos próprios colaboradores Testes in house Grande parte do foco de atenção nos últimos anos tem sido o surgimento e uso crescente dos LDTs sigla em inglês para laboratory developed tests em português testes desenvolvidos em laboratório complexos baseados em tecnologias como reação em cadeia da polimerase PCR sequenciamento de próxima geração ou outras tecnologias complexas Para gerar resultados de testes que não eram possíveis anteriormente os LDTs estão sendo desenvolvidos e usados em muitas aplicações 176 diferentes Os maiores segmentos desse mercado estão em oncologia distúrbios genéticos herdados e doenças infecciosas mas esses testes podem ser desenvolvidos e usados para praticamente todas as patologias Pereira do CerbaLCA explica que os LDTs foram muito importantes no começo do desenvolvimento e aplicação da biologia molecular no laboratório clínico Atualmente muitos dos testes passaram a ser oferecidos pelos grandes fornecedores do segmento Ainda há espaço para os LDTs em especial nos testes mais inovadores e de demanda mais baixa Danielle do Hermes Pardini conta que laboratório possui um setor de pesquisa e desenvolvimento responsável pelo desenvolvimento de novos exames incluindo as metodologias de LDTs Algumas das técnicas de biologia molecular mais comumente usadas são a eletroforese e a PCR A eletroforese é um processo que separa moléculas como DNA ou proteínas de acordo com seu tamanho Seu uso identifica determinadas moléculas ou fragmentos de moléculas Já a PCR é um processo utilizado para amplificar quantidades muito pequenas de DNA É usado como uma ferramenta básica na biologia molecular para assegurar que o DNA seja suficiente para realizar técnicas adicionais como o diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas Conheça alguns dos exames realizados pelos laboratórios painel cardiovascular prevenção de doenças cardíacas painel nutrigenético avalia variação genética e alimentação Indicado para prevenção de doenças como obesidade diabetes e hipertensão entre outras avaliação genética do rendimento esportivo usada para otimização dos treinamentos e melhora de rendimento intolerância à lactose intolerância ao glúten determinação do sexo do feto através do exame de sangue avaliação do feto através do sangue da mãe oferece a possibilidade de pesquisar com antecedência alterações cromossômicas no bebê como a síndrome de Down painel de doenças sexualmente transmissíveis FONTE SANCHES C Técnicas de biologia molecular são usadas cada vez mais em um número maior de exames 2018 Disponível em httpswwwlabnetworkcombrespeciaistecnicasdebiologia molecularsaousadascadavezemumnumeromaiordeexames Acesso em 26 abr 2020 177 RESUMO DO TÓPICO 3 Neste tópico você adquiriu certos aprendizados como Técnicas de biologia molecular são utilizadas para a realização de exames diagnósticos e outras análises de condições específicas do paciente As análises moleculares não necessariamente devem ser realizadas no DNA do paciente para que ocorra o diagnóstico de certas doenças Isso ocorre no caso de doenças infecciosas sexualmente transmissíveis como AIDS e HPV e doenças virais do trato respiratório e infecções bacterianas como a endometrite Além da investigação de doenças as técnicas de biologia molecular podem ser utilizadas para o estudo de genes específicos ou do genoma completo de um indivíduo em uma análise voltada para a melhora da qualidade de vida desempenho físico esportivo nutrição metabolismo entre outros 178 1 Qualis das seguintes técnicas de biologia molecular podem ser aplicadas como ferramenta no diagnóstico de doenças a Sequenciamento NGS b Sequenciamento Sanger c qPCR d PCR e Espectrometria de massas 2 Explique em linhas gerais como o sequenciamento do DNA auxilia no diagnóstico de doenças autossômicas recessivas em indivíduos portadores e pode ser uma ferramenta para o aconselhamento genético 3 Considerando as etapas envolvidas na utilização das técnicas de biologia molecular para o diagnóstico e outros exames qual das seguintes opções não pode ser executada pelo biomédico a Coleta de amostra biológica sangue saliva urina etc b Preparação do material genético extração amplificação clonagem etc c Execução e desenvolvimento de testes moleculares PCR sequenciamento microarranjo hibridação etc d Emissão de laudos referentes aos exames executados e Confirmação do diagnóstico da doença em conjunto com a avaliação clínica do paciente 4 Ao tratarmos dos exames que realizam a identificação de microorganismos presentes no endométrio e no trato gastrointestinal falamos sobre a análise do metagenoma Sucintamente descreva do que se trata uma análise metagenômica AUTOATIVIDADE 179 REFERÊNCIAS BRASIL Ministério da Saúde Triagem neonatal biológica manual técnico Brasília Ministério da Saúde 2016 Disponível em httpsbvsmssaudegovbr bvspublicacoestriagemneonatalbiologicamanualtecnicopdf Acesso em 11 ago 2020 CAVALCANTI M P C et al Avanços biotecnológicos para o diagnóstico das doenças infecciosas e parasitárias Revista de Patologia Tropical v 37 n 1 p 114 2008 Disponível em httpswwwrevistasufgbriptsparticle download40263601 Acesso em 11 jul 2020 CIOTTI P et al Triplet repeat primed PCR TP PCR in molecular diagnostic testing for Friedreich ataxia The Journal of Molecular Diagnostics v 6 n 4 p 285289 2004 Disponível em httpswwwsciencedirectcomsciencearticlepii S1525157810605235 Acesso em 11 jul 2020 MATTAR R MAZO D F C Intolerância à lactose mudança de paradigmas com a biologia molecular Revista da Associação Médica Brasileira v 56 n 2 p 230236 2010 Disponível em httpsbitly3aCYZfi Acesso em 11 jul 2020 MORAES R W Validação de teste de reação em cadeia da polimerase fluorescente quantitativa QFPCR para detecção de aneuploidias fetais 2016 Disponível em httpswwwtesesuspbrtesesdisponiveis55139tde 07032017143706enphp Acesso em 11 ago 2020 MORENO I et al The diagnosis of chronic endometritis in infertile asymptomatic women a comparative study of histology microbial cultures hysteroscopy and molecular microbiology American Journal of Obstetrics and Gynecology v 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