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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIAS NOVAS TECNOLOGIAS EM VACINAS DE ANIMAIS DE COMPANHIA Maria da Graça Uarth Caetano Porto Alegre 2011 2 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIAS NOVAS TECNOLOGIAS EM VACINAS DE ANIMAIS DE COMPANHIA Maria da Graça Uarth Caetano Monografia apresentada à Faculdade de Veterinária como requisito parcial para obtenção do grau de Especialista em Análises Clínicas Veterinárias Orientador Itabajara da Silva Vaz Junior Porto Alegre 2011 3 UNIVARSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA CURSO DE ESPECIALISTA EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIAS Aluna Maria da Graça Uarth Caetano Monografia apresentada como parte integrante dos requisitos de avaliação do Curso de Especialista em Análises Clínicas Veterinárias Aprovado por Professor Orientador Itabajara da Silva vaz Junior Professora Membro da Banca Adriana Seixas Professor Membro da Banca Claudio W Canal Porto Alegre 2011 4 Resumo Avanços na tecnologia de produção das vacinas têm modificado a forma de abordagem da prevenção de doenças em animais de companhia não apenas pelo surgimento de doenças emergentes que requererão nossa atenção mas os métodos tradicionais de imunização deverão ser submetidos a um olhar crítico O modo como a tecnologia de produção vacinal tem evoluído ao longo dos anos forçará os Médicos Veterinários a reverem seus conceitos de seleção e uso de vacinas Assim como a ciência continua a redefinir nossa abordagem na prevenção de doenças a tecnologia vacinal continuará como uma área de pesquisa inovadora e desafiadora dos próximos anos Palavraschaves recombinante canino felino vacina imunidade Abstract Advances in production of vaccines have modified the approach to prevention of diseases in pets Not only the appearance of emerging diseases that require our attention but traditional methods of immunization must undergo a careful look The vaccine production methods have been improved and it will induce veterinarians to review the concepts of selection and use of vaccines The science continues to redefine our approach to disease prevention and the vaccine technology will continue as an important area research area Keywords recombinant canine feline vaccination 5 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 07 2 IMUNIDADE 08 21 Imunizações Ativa e Passiva 12 3 HISTÓRIA DA PRIMEIRA VACINA 14 31 Revolução da Ciência 15 4 OBJETIVO DAS IMUNIZAÇÕES 17 5 COMPONENTES DA VACINA 19 51 Processamentos de vacinas 19 52 Vacinas para animais de companhia 21 521 Vacinas atenuadas vivas modificadas 22 522 Vacinas inativadas mortas 23 523 Vacinas recombinantes 25 5231 Vacinas recombinantes de subunidade 26 5232 Vacinas recombinantes de gene deletado 30 5233 Vacinas recombinantes vetoriais 31 5234 Vacinas de DNA 35 6 CONCLUSÃO 39 REFERÊNCIAS 40 6 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Células fagocitárias do sistema imunológico Neutrófilo Mastócito Macrófago 08 Figura 2 Diapedese 09 Figura 3 Estrutura Anticorpos IgG IgA IgE IgD e IgM 10 Figura 4 Linfócito B 11 Figura 5 Linfócito T 11 Figura 6 Memória Imunológica 12 Figura 7 Jenner inoculando Phipps 14 Figura 8 Produção de vacinas 21 Figura 9 Vacina atenuada 23 Figura 10 Vacina inativada 24 Figura 11 Esquema de produção de vacina recombinante de subunidade 29 Figura 12 Vacina recombinante vetorial 33 Figura 13 Esquema de produção de vacina recombinante vetorial 34 Figura 14 Vacina de DNAEquinos 38 7 1 INTRODUÇÃO Nos tempos atuais buscar informações sobre novos rumos na Medicina Veterinária se faz necessário uma vez que os animais de companhia são cada vez mais introduzidos nos grupos familiares Neste aspecto o papel do veterinário é fundamental como veículo de auxílio médico assim como orientador e informador dos males que podem afetar os animais e indiretamente os humanos A gama de doenças que envolvem os animais de companhia é extensa e precisa ser tratada com seriedade e responsabilidade uma vez que a desinformação sobre prevenção de tais doenças por parte dos proprietários pode contribuir para a disseminação das doenças Além dos aspectos clínicos tratamentos e também a prevenção de doenças infecciosas através das imunizações contribuem para o controle efetivo de doenças nos animais de companhia As novas tecnologias em produção de vacinas seguras e eficazes num futuro próximo substituirão de forma efetiva as vacinas tradicionais Apesar disso ainda se utilizam as vacinas atenuadas e inativadas na grande maioria das atividades rotineiras das clínicas veterinárias poucas utilizam uma vacina de tecnologia mais avançada a vacina recombinante As vacinas tradicionais desempenham seu papel e conferem uma boa resposta imunológica desde que o hospedeiro esteja apto para responder satisfatoriamente através de um sistema imunológico competente Efeitos adversos podem ser esperados uma vez que a produção destas vacinas necessita de adjuvantes e a presença do agente infeccioso vivo atenuado ou morto inativado As vacinas recombinantes através de sua tecnologia de fabricação que utiliza a biologia molecular confere a vacina uma segurança efetiva uma vez que o agente infeccioso sofre vários processos de neutralização do seu potencial infeccioso e com isso impossibilita o desenvolvimento da doença Portanto na retomada de seus conceitos Médicos Veterinários devem reformular seus protocolos vacinais uma vez que com isso certamente estarão contribuindo para uma geração de animais de companhia mais saudáveis e resistentes às doenças 8 2 IMUNIDADE O termo imunidade é derivado da palavra latina Immunitas que se refere à proteção contra processos legais que os senadores romanos sofriam durante seu mandato Historicamente imunidade significava proteção contra doenças em particular contra doenças infecciosas As células e moléculas responsáveis pela imunidade formam o sistema imunológico e a sua resposta coletiva e coordenada à introdução de substâncias estranhas é chamada de resposta imunológica ABBAS et al 2008 A imunologia em sua forma moderna é uma ciência experimental em que as explicações dos fenômenos imunológicos são baseadas na observação de experimentos A evolução da imunologia como uma disciplina ligada a pesquisas dependeu de nossa habilidade em manipular as funções do sistema imunológico em condições controladas A primeira linha de defesa são as barreiras mecânicas compreendendo a pele e as mucosas A pele é queratinizada impedindo a entrada da maioria dos microrganismos já as mucosas além de possuírem uma defesa em nível celular eliminam secreções que irão combater e eliminar a maioria dos agentes patogênicos Porém devido a algumas injúrias na pele essa barreira mecânica é quebrada entrando em ação a segunda linha de defesa que é a linha dos fagócitos Os fagócitos são células com grande capacidade de fagocitose ou seja de englobar uma partícula para destruíla GUYTON HALL 1996 Existem principalmente duas células fagocitárias os macrófagos e os neutrófilos Figura 1 Os macrófagos são células fagocitárias do tecido conjuntivo propriamente dito tem origem nos monócitos Figura 1 sanguíneos que migram para o tecido conjuntivo propriamente dito crescem e vão constituir a segunda linha de defesa USP 2004 1 2 Figura 1 Células fagocitárias do sistema imunológicoNeutrófilo 1Mastócito 2 Macrófago 3 Fonte UNIFESPEscola Paulista de Medicina httpwwwvirtualempbrmaterialtiscurrbiotrab20042anoimunoindexhtm 9 Quando os macrófagos teciduais necessitam de auxílio contra o agente invasor os neutrófilos que são sanguíneos migram em defesa do macrófago atravessando as paredes dos vasos por um processo conhecido como diapedese Figura 2 Neste processo inflamatório há uma resposta de defesa do organismo para que possa ocorrer a migração das células sanguíneas para o tecido conjuntivo Durante sua função os mastócitos liberam entre outras moléculas a histamina que é vasodilatadora provocando a dilatação dos capilares e com isso favorecendo a saída dos neutrófilos para a região onde está ocorrendo à inflamação A dilatação dos capilares facilita o extravasamento plasmático que dificulta para o agente agressor penetrar mais profundamente nos tecidos GUYTON HALL 1996 Figura 2 Diapedese FonteIvan Roitt Fundamentos da Imunologia A imunidade humoral é mediada pelas moléculas presentes no sangue e nas secreções das mucosas chamadas de anticorpos que são produzidas pelos linfócitos B Figura 3 também chamados de células B Os anticorpos Ac reconhecem antígenos microbianos neutralizam a infecciosidade dos microrganismos e os preparam para serem eliminados por diversos mecanismos efetores A imunidade humoral é o principal mecanismo de defesa contra microrganismos extracelulares e suas toxinas pois os anticorpos podem se ligar a eles e ajudar na sua eliminação Os próprios anticorpos são especializados e diferentes tipos de anticorpos podem ativar mecanismos efetores diferentes Abbas et al 2008 Neutrófilo Vaso Sanguíneo Sítio de infecção Oligossacarídeo específico Célula endotelial Lectina 10 Figura 3 Linfócito B Fonte UNIFESPEscola Paulista de Medicina httpwwwvirtualempbrmaterialtiscurr biotrab20042anoimunoindexhtm Os anticorpos combatem microrganismos que tenham ultrapassado a barreira mecânica e escapado da resposta imune inata Uma molécula de anticorpo possui uma estrutura básica composta de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas Tanto as cadeias leves quanto as pesadas contêm uma série de unidades repetidas cada uma com aproximadamente 110 aminoácidos que se dobram em uma forma globular chamada de domínio da Ig Alguns aminoácidos dessas alças são críticos para o reconhecimento do antígeno Ambas as cadeias leves e pesadas possuem uma região aminoterminal variável V que participa no reconhecimento do antígeno e de regiões constantes HA carboxiterminais as regiões C das cadeias pesadas possuem as funções efetoras Abbas et al 2008 Antígeno é toda partícula seja ela vírus bactéria protozoário substâncias químicas qualquer substância estranha ao organismo que seja capaz de estimular o sistema imunológico Quando um agente infeccioso penetra em um organismo existem vários detectores que irão desencadear a secreção de anticorpos específicos para este agente O fato de que para cada antígeno existe um anticorpo específico é chamada especificidade GUYTON HALL 1996 Existem cinco classes de anticorpos as imunoglobulinas IgM IgG IgA IgD e IgE Figura 3 A imunoglobulina IgG compreende 75 dos anticorpos séricos de um animal normal e a IgE que constitui uma pequena porcentagem dos anticorpos mas está envolvido com a alergia A classe IgM também é importante porque uma grande parte dos anticorpos produzidos durante a resposta primária é deste tipo Estes anticorpos possuem 10 sítios de ligação o que os torna eficazes na proteção do organismo contra invasores GUYTON HALL 1996 11 Figura 4 Estrutura de Anticorpos IgG IgA IgE IgD e IgM Fonte Ivan Roitt Fundamentos da Imunologia Muitas vezes as células são invadidas por microrganismos porém existe uma célula chamada de linfócito T citotóxico ou CD8 Figura 5 que monitora estas invasões Quando a célula CD8 reconhece uma célula que tenha sido invadida por um vírus ou que esteja alterada no caso de um tumor o linfócito T se liga a esta célula e a destrói Logo a finalidade da célula CD8 é identificar células que não pertencem ao organismo que tenham sido alteradas ou que sofreram uma infecção viral UNIFESP 2004 Figura 5 Linfócito T Fonte UNIFESPEscola Paulista de Medicina httpwwwvirtualempbrmaterialtiscurr biotrab20042anoimunoindexhtm A exposição do sistema imunológico a um antígeno estranho aumenta sua habilidade em responder novamente àquele antígeno Respostas à exposição posteriores ao mesmo antígeno chamadas de respostas imunológicas secundárias em geral ocorrem mais rapidamente são de maior intensidade e com frequência são qualitativamente diferentes da primeira resposta ou 12 resposta imunológica primária ao antígeno Figura 6 A memória imunológica é específica pois cada exposição ao antígeno expande o clone de linfócitos específicos para cada antígeno Além disso a estimulação de linfócitos inativos pelos antígenos gera células de memória de longa duração Essas células de memória possuem características especiais que as tornam mais eficientes na eliminação do antígeno do que os linfócitos naive que ainda não foram expostos ao antígeno GUYTON HALL 1996 Figura 6 Esquema da memória imunológica Fonte Abbas Imunologia Molecular e Celular 21 IMUNIZAÇÕES ATIVA E PASSIVA Imunização ativa acontece quando há o contato direto com o antígeno e esta induz a resposta imune A imunização pode ser natural ou artificial A imunização é ativa natural porque houve contato direto com o antígeno que causa a doença Imunização ativa artificial é o contato induzido pelo homem em geral com o antígeno não patogênico Um antígeno inofensivo não patogênico contém epítopos semelhantes aos apresentados por um patógeno que pode ser por exemplo um vírus ou bactéria que seja incapaz de causar doença Sendo assim uma reação é induzida no sistema imunológico contra epítopos inoculados Quando um antígeno não atenuado entra em contato com o organismo que recebeu o antígeno atenuado desenvolverá uma resposta imunológica mais rápida evitando assim que desenvolva a doença 13 porque já apresenta memória Este é o princípio da vacinação A vacinação é uma medida profilática porque faz com que o organismo combata o antígeno antes que este seja capaz de efetivamente provocar doença NELSON COUTO 2006 Imunização passiva é aquela em que o anticorpo é fornecido antes do animal ter contato com o Ag por exemplo no contato com veneno de um animal peçonhento neste caso não a tempo do organismo reconhecer o antígeno e produzir os anticorpos logo é administrado o soro que é uma solução de anticorpos que foi produzido por outro animal O antígeno atenuado é injetado em animais de laboratório e o sistema imune deste animal produz os anticorpos Esses anticorpos são retirados e purificados e é produzido o soro que com esses anticorpos dará combate imediato ao antígeno peçonhento Neste caso o organismo não é capaz de produzir células de memória GUYTON HALL 1996 A imunização passiva natural pode tornar um indivíduo imune pela transferência de plasma é um método eficaz para conferir resistência rapidamente sem que haja a necessidade de se esperar uma resposta imunológica ativa Um exemplo de imunidade passiva é a transferência de anticorpos maternos para o feto o que possibilita que os neonatos combatam infecções antes que adquiram a habilidade de produzir anticorpos Esta imunidade passiva é conferida via amamentação e também passagem de anticorpo via placenta que protegerá o neonato até o final da lactação momento em que já está desenvolvendo seu sistema imunológico Esta imunização dura um curto espaço de tempo suficiente para proteger o organismo do neonato NELSON COUTO 2006 14 3 HISTÓRIA DA PRIMEIRA VACINA Em 1796 Edward Jenner um médico inglês num período de epidemia observou que um número expressivo de pessoas mostravase imune a varíola Todas eram ordenhadoras e tinham se contaminado com o cowpox uma doença do bovino semelhante à varíola pela formação de pústulas mas que não causava a morte dos animais Após uma série de experiências constatou que estes indivíduos mantinhamse refratários à varíola mesmo quando inoculados com o vírus Neste período Jenner inoculou Jammes Phipps um menino de oito anos com o pus retirado de uma pústula de Sarah Nelmes uma ordenhadora infectada com o cowpox O garoto contraiu uma infecção extremamente benigna e dez dias depois estava recuperado Meses depois Jenner inoculava Phipps com pus varioloso Figura 7 O menino não adoeceu Era a descoberta da vacina A partir de então Jenner começou a imunizar crianças com material retirado diretamente das pústulas dos animais Em 1798 divulgava sua descoberta no trabalho Um Inquérito sobre as Causas e os Efeitos da Vacina da Varíola ABBAS et al 2008 Figura 7 Jenner inoculando Phipps Fonte httpptarscurandiwikiacom Jenner enfrentou várias resistências A classe médica demonstrava ceticismo Os variolizadores que na época tentavam provocar a doença de forma mais branda fazendo com que os nãodoentes tivessem contato com roupas íntimas e objetos de pessoas doentes fizeram ferrenha oposição Grupos religiosos alertavam para o risco de degeneração da raça 15 humana pela contaminação com material bovino a vacalização ou minotaurização como foi chamada Mas em pouco tempo a vacina conquistou a Inglaterra Em 1799 era criado o primeiro instituto vacínico em Londres e em 1802 sob os auspícios da família real fundava se a Sociedade Real Jenneriana para a Extinção da Varíola PLOTKIN 2005 A descoberta de Jenner logo se espalhou pelo mundo A partir de 1800 a Marinha Britânica começou a adotar a vacinação Napoleão Bonaparte introduziua em seus exércitos e fez imunizar seu filho Nas Américas chegou pelas mãos do médico Benjamin Waterhouse de Harvard popularizandose a partir de 1801 quando o presidente Thomas Jefferson foi vacinado SAÚDE 2011 O imunizante chegou a Portugal em 1799 dentro de um pequeno frasco D Pedro futuro imperador do Brasil e seu irmão foram inoculados Em 1804 o marquês de Barbacena trouxe a vacina para o Brasil transportandoa pelo Atlântico por seus escravos que iam passando a infecção vacinal um para o outro braço a braço durante a viagem SAÚDEgov 2011 A oposição à vacina jamais cessou Camponesas francesas recusavamse a imunizar seus filhos na esperança de que a varíola lhes trouxesse tal degradação física que os tornasse inaptos para o serviço militar e portanto para a guerra Vacinadores eram obrigados a pagar para conseguir voluntários que se deixassem inocular conservando o vírus vacinal Para muitos a imunização causava repulsa porque o fluido vacinal era conservado em jovens confiados a caridade pública muitos portadores de doenças venéreas e outras moléstias Foram registrados casos de sífilis eripsela e hepatite B está última doença ainda desconhecida associados à vacina Mas nada contribuiu tanto para a resistência a vacinação quanto as epidemias de varíola na década de 1820 quando um grande número de imunizados adoeceu Descobriuse então que a proteção não era eterna Era preciso revacinarse Além disso a conservação da linfa braço a braço não só adulterava o fluido vacinal como com o tempo fazia com que este perdesse sua potência A solução foi retornar ao vírus original o da cowpox ou varíola das vacas Apesar de toda a oposição a vacinação aos poucos foi se generalizando mesmo que sob pressão governamental Ela se tornou obrigatória na Baviera em 1807 na Dinamarca em 1810 na Suécia em 1814 em vários estados germânicos em 1818 na Prússia em 1835 e finalmente na Inglaterra em 1853 SAÚDEgov 2011 31 REVOLUÇÃO NA CIÊNCIA Em julho de 1885 chegava ao laboratório de Louis Pasteur um menino alsaciano de nove anos Joseph Meister que havia sido mordido por um cão raivoso Pasteur que vinha desenvolvendo pesquisas na atenuação do vírus da raiva injetou na criança material proveniente da medula de um coelho infectado Ao todo foram 13 inoculações cada uma com material mais virulento Meister não chegou a contrair a doença Em 26 de outubro o 16 cientista francês comunicava a Academia de Ciências a descoberta do imunizante contra a raiva que chamou de vacina em homenagem a Jenner SAÚDEgov 2011 Louis Pasteur já era famoso quando salvou Meister Desenvolvera pesquisa sobre fermentação elaborando um método para a conservação da cerveja a pasteurização Formulou a teoria da origem microbiana das doenças Comprovou que o carbúnculo era causado por um microrganismo e descobriu o estafilococo Desenvolveu imunizações contra a cólera das galinhas e o carbúnculo no gado As vacinas de Pasteur foram às primeiras obtidas seguindo uma metodologia científica Portanto o desenvolvimento racional de vacinas seguras e eficazes foi dado por Louis Pasteur e seus colaboradores Pasteur observou que as bactérias de uma cultura de aviseptica Pasteurella parecia menos virulenta sobre o cultivo prolongado e que os animais inoculados com esta cultura estavam protegidos contra a cepa virulenta Desde então o princípio geral tornouse para adaptar o patógeno em uma cultura in vitro e posteriormente testar sua eficácia e segurança através da vacinação de animais de laboratório Quase que imediatamente após a descoberta de que utilizando bactérias atenuadas poderiam ser usadas como vacinas se descobriu que em alguns casos bactérias mortas pelo calor também eram eficazes Estes foram os pilares para o desenvolvimento de vacinas e muitas das vacinas atuais são baseadas nestes princípios SCHTTERS 2008 17 4 OBJETIVOS DAS IMUNIZAÇÕES Schatzmayr 2003 relata que os objetivos principais das imunizações são prevenir o desenvolvimento do quadro clínico do indivíduo e ao se alcançar um nível de imunidade elevado em grandes segmentos da população se obter o controle ou mesmo a eliminação de determinada doença Em relação ao ser humano essa eliminação foi alcançada nas Américas com a varíola e poliomielite O desenvolvimento de vacinas depende fundamentalmente do conhecimento dos mecanismos imunológicos envolvidos na resposta às infecções bem como dos mecanismos de patogênese das infecções As vacinas e kits de diagnóstico são importantes ferramentas para diagnóstico e prevenção de um grande conjunto de doenças que afetam a espécie humana e as espécies animais Existem ainda diversos soros para tratamento como os antiofídicos antirrábico e antitetânico Ao conjunto de vacinas e kits de diagnóstico denominamos produtos imunobiológicos Sempre que seja tecnicamente possível e os estudos epidemiológicos demonstrarem a importância de uma dada doença ou um dado agente etiológico a melhor forma de enfrentar o problema é por medidas profiláticas CRAVEIRO 2008 Toxóides induzem a imunidade humoral mas pouca ou nenhuma imunidade celular Vacinas de vírus morto contêm componentes imunogênicos e as respostas imunes contra os componentes não imunogênicos são inteiramente irrelevantes para a prevenção de infecções e pode mesmo interferir e reduzir a resposta imunológica aos componentes imunogênicos Podem também causar efeitos colaterais adversos devido aos componentes indesejáveis tais como endotoxinas WEGENER apud SHAMS 2005 Vacinas de vírus vivos atenuados e modificados são capazes de induzir imunidade humoral e celular mediada por respostas imunes e nos últimos anos tem havido uma grande quantidade de pesquisas e debates sobre o atual protocolo e recomendações para a vacinação com vacinas de vírus vivos modificados SHAMS 2005 Em veterinária os estudos sobre vacinação abordam um amplo espectro de objetivos Fornecer abordagens de custo eficaz para prevenir e controlar as doenças infecciosas em animais para melhorar o seu bemestar e para diminuir o custo de produção são os objetivos primários Também a vacinação em massa de animais tem sido considerada como um meio de prevenir a incidência de zoonoses Além disso devido aos programas de vacinação em massa o consumo de diferentes medicamentos veterinários tem sido reduzido 18 significativamente Com a vacinação além de melhorar o setor de saúde animal em si também tem melhorado substancialmente a saúde pública Embora o uso generalizado das vacinas contribui consideravelmente para a melhoria da saúde pública e animal em todo o mundo há deficiências graves e estão longe de ser perfeitas Vacinas convencionais são geralmente onerosas para produzir necessitam de adjuvantes e múltiplas doses para induzir imunidade ideal pode interferir com os anticorpos maternos e consequentemente conferem pouca ou nenhuma proteção em recémnascidos CHAPPUIS apud SHAMS 2005 Atualmente o uso de vacinas em animais pode ser dividido nas seguintes classes 1 vacinas para animais de produção aqui se incluem vacinas aplicadas na forma injetável típica para bovinos suínos ovinos e caprinos vacinas injetáveis ou administradas na água para peixes vacinas administradas na água ou via aspersão para aves 2 vacinas para animais de companhia onde se incluem cães gatos e equinos são usualmente injetáveis mas existem também de aplicação intranasal 3 vacinas para controle de animais silvestres que possam ser reservatório de microorganismos patogênicos para o homem como é o caso da raposa em relação à raiva CRAVEIRO 2008 19 5 COMPONENTES DA VACINA Uma vacina é composta por diversos componentes Antígeno responsável por promover a resposta imune no organismo a ser protegido É muito comum uma vacina conter diversos antígenos de modo que com um manejo simplificado dos animais podemos deixá los protegidos contra diversas doenças Adjuvante é uma substância como hidróxido de alumínio ou saponina que aumenta a resposta imune Conservantes ou estabilizantes como por exemplo o fenol e o timerosal O timerosal é um conservante que contém mercúrio é mais eficaz contra as bactérias durabilidade melhor em prateleira melhora a estabilidade da vacina apresenta potência e segurança CRAVEIRO 2008 51 PROCESSAMENTO DE VACINAS A produção industrial de vacinas envolve uma série de etapas Para que se tenha uma produção eficiente cada uma dessas etapas deve ser otimizada para que o processo industrial resulte numa vacina com qualidade e preço competitivo Figura 8 1 Cepas é essencial disporse de cepas eficientes ou seja que sejam produtoras dos antígenos de interesse Essas estirpes devem passar por programas de melhoramento genético para serem cada vez mais eficientes É fundamental estruturar de modo adequando o Banco de Cepas de modo a não perder as características requeridas dos microorganismos visto que eles representam um patrimônio da empresa 2 Cultivo em escala de bancada nesta etapa estabelecemse as melhores condições ambientais para o máximo crescimento celular ou de produção do antígeno de interesse proteína As condições a serem otimizadas a depender do processo ser conduzido na presença de oxigênio aeróbio ou na sua ausência anaeróbio são temperatura pH potencial redox concentração da fonte de carbono concentração de macro nutrientes concentração de micronutrientes Algumas substâncias geradas no metabolismo microbiano ao longo do processo fermentativo também podem precisar ter suas concentrações controladas pois podem ser fontes inibidoras dos processos aqui se inclui o amônio o lactato etc Para que se alcance altas taxas de conservação dos substratos no produto desejado o tipo de biorreator onde será conduzido o processo também pode ser um fator determinante da viabilidade do processo Buscase um comportamento cinético que assegure a máxima produção do produto de interesse bem como que tal ocorra no menor 20 tempo possível isso é importante para que o volume dos equipamentos de produção bem como o gasto com insumos sejam os menores possíveis de forma a contribuir para o menor custo de produção possível Os biorreatores podem ser muito diferentes principalmente quando se compara a produção das vacinas virais com as bacterianas Biorreatores dotados de sistemas de agitação são normalmente empregados para produção de vacinas bacterianas A produção de vacinas virais é mais complexa pois se tem que inicialmente produzir as células de mamífero tipo BHK ou de insetos como de Spodoptera frugiperda para posteriormente infectar e promover a produção massiva de vírus Diversos sistemas podem ser utilizados desde biorreatores dotados de sistema de agitação quando as células não precisam ficar ancoradas caso da vacina antiaftosa ou sistemas ancorados caso dos antígenos da vacina para proteção contra doenças do complexo respiratórioreprodutivo como garrafas roller bandejas cell factories cubos cell cubes e biorreatores com microcarregadores 3 Cultivo em escala industrial nesta etapa fazse ajustes do processo para que o aumento de escala efetuado não implique em perda de eficiência Para tanto o próprio projeto do biorreator industrial deve ser feito mediante critérios adequados de escalonamento considerando relações geométricas coeficientes de transferência de oxigênio potência para a agitação fornecida ao meio líquido por unidade de volume etc 4 Inativação do agente para vacinas inativadas é necessário proceder à inativação do agente o que pode ser feito por via química ou térmica Em ambos os casos é necessário determinar a cinética de inativação de forma a ter uma vacina inócua 5 Separação purificação e concentração do produto não basta produzir bem os antígenos de interesse é necessário que as operações unitárias utilizadas no processo sejam eficientes para que não se perca parte do antígeno nessas operações subsequentes 6 Formulação Esta última etapa consiste em se adicionar o adjuvante e eventuais preservantes de modo que a vacina tenha a máxima eficiência e seja estável por longos períodos de armazenamento As condições de armazenamento são de 2 a 8C Existem vários tipos de adjuvantes comerciais utilizados em vacinas aquosas ou vacinas em emulsão Alguns deles são de tal modo eficientes que podese obter a resposta imune desejada mesmo com quantidades muito pequenas de antígeno isto tem evidentemente um grande impacto no custo da vacina produzida 7 Controle de qualidade Os controles de qualidade são efetuados durante o processo de produção e também no produto final obtido Os controles de processo incluem o pH confirmação de inativação quantificação do antígeno e pureza ou seja a ausência de outros microorganismos contaminantes No produto final fazse controle do pH aspectos visuais esterilidadepureza inocuidade e teste de potência O teste de potência é feito através de métodos imunoquímicos in vivo realizado em animais de biotério camundongos cobaios e coelhos e nas espéciesalvo para as quais a vacina é indicada in vitro ELISAs soroneutralização Lf ToBI etc CRAVEIRO 2008 21 Figura 8 Produção de vacinas Fontewwwaenprgovbr 52 VACINAS PARA ANIMAIS DE COMPANHIA As vacinas disponíveis comercialmente para uso veterinário são para combate de doenças virais e bacterianas quando se refere aos parasitas ainda não foram verificados produtos eficientes CRAVEIRO 2008 Nelson Couto 2006 relatam que vacinas estão disponíveis para algumas doenças infecciosas de cães e gatos e podem ser administradas para prevenir infecções ou limitar a doença A vacinação estimula as respostas imunes humoral mucosal ou mediada por células A resposta imune humoral é caracterizada pela produção de anticorpos das classes IgM IgG e IgA que são produzidos pelos linfócitos B ou plasmócitos após a apresentação de antígenos pelas células apresentadoras de antígenos A ligação do anticorpo com o agente infeccioso ou sua toxina auxilia na prevenção de infecções ou de doenças porque facilita a aglutinação dos vírus melhora fagocitose devido à opsonização que é o processo que facilita a ação do sistema imune por fixar opsoninas ou fragmentos do complemento na superfície bacteriana permitindo a fagocitose neutraliza toxinas bloqueia a ligação na superfície celular inicia a cascata de complemento é composto por proteinas de membrana plasmática e solúveis no sangue e participam das defesas inatas e adquiridas e promove a toxicidade celular dependente de anticorpos As respostas dos anticorpos são mais eficazes no controle de agentes infecciosos durante a replicação extracelular ou a produção de toxinas A resposta imune mediada por células depende principalmente dos linfócitos T Os linfócitos específicos para o antígeno podem mediar à destruição dos agentes infecciosos ou a eliminação dos antígenos pela produção de citocinas que estimulam os outros leucócitos incluindo macrófagos neutrófilos e células NK A imunidade mediada por células é necessária para o controle da maioria das infecções associadas a células 22 521 VACINAS ATENUADAS vivas modificadas Os processos de atenuação de virulência tradicionalmente utilizados para a obtenção de vacinas vivas se baseiam na passagem dos vírus em células de hospedeiros diversos e em diferentes condições e temperaturas levando a seleção de mutantes menos virulentos sendo frequentemente difícil definir com clareza os mecanismos dessa atenuação Assim por exemplo nunca foi possível reproduzir as mutações que geraram a vacina contra a febre amarela apesar de serem utilizadas as mesmas condições experimentais O avanço da biologia molecular permitiu reconhecer algumas mutações envolvidas com a modificação de virulência de alguns vírus como o da poliomielite sendo este o mais bem estudado desse ponto de vista O contínuo progresso da biologia molecular deverá permitir o desenvolvimento de partículas virais com modificações dirigidas que levem à criação de partículas atenuadas e estáveis em condições de serem aplicadas como imunizantes SCHATZMAYR 2003 Vacinas atenuadas geralmente apresentam uma massa antigênica baixa e raramente induzem reações no local de aplicação da vacina podem ser administradas localmente p Ex vacina intranasal de Bordetella brochiseptica atenuada ou parenteralmente pex vacina para cinomose canina com vírus atenuado Entretanto essas vacinas são vivas e precisam se replicar no hospedeiro para estimular uma resposta imune NELSON COUTO 2006 Os autores também descrevem sobre as vantagens das vacinas atenuadas que se referem a proteção rápida imunidade prolongada podem requerer apenas uma dose adjuvantes não são necessários baixo custo de produção induzem boa resposta mediada por células induzem potencialmente respostas com IgA importante na proteção de mucosas e podem estimular a produção de interferon uma proteína produzida por todos os animais vertebrados para defendêlos de agentes externos como vírus bactérias e células de tumores as desvantagens estão relacionadas à reversão potencial da virulência virulência potencial para os imunossuprimidos potencialmente imunodepressoras e efeitos adversos fatais conservação mais difícil Azevedo 2002 descreve que neonatos são capazes de reagir imunologicamente a antígenos porém a resposta é menor e lenta O título de anticorpos maternos do neonato dependerá do título da mãe sendo a principal rota de transferência de imunoglobulinas o colostro e a gema nas aves Existem 2 a 18 de transferência de imunoglobulinas pela placenta em carnívoros Este título protege por algumas semanas porém inativa as vacinas O colostro deixa o neonato com títulos de anticorpos quase iguais aos da mãe com o tempo perdemse em ordem IgA IgM e IgG Quanto maior a ninhada menor a quantidade de imunoglobulinas que cada um recebe O autor coloca que veterinários podem utilizar doses repetidas de vacinas com 2 a 4 semanas de intervalo para suplementar o bloqueio dos anticorpos colostrais isso porém depleta mais rapidamente o nível de anticorpos circulantes A indicação de vacinas atenuadas é em surtos para a produção de imunidade de mucosa e 23 para rotina de vacinação Vacinas atenuadas existem contra parvovirose cinomose hepatite infecciosa bordetelose parainfluenza panleucopenia calicivirose rinotraqueíte e raiva Figura 9 Figura 9 Vacina Atenuada Fonte Pfizer Saúde Animal 522 VACINAS INATIVADAS mortas As vacinas inativadas incluem vírus mortos bactérias mortas bacterinas e vacinas de subunidades são produzidas da mesma forma que as atenuadas porém os agentes são desnaturados sem destruir a imunogenicidade De modo geral as vacinas inativadas requerem uma massa antigênica maior do que as vacinas atenuadas para estimular a resposta imune uma vez que elas não se replicam no hospedeiro As vacinas inativadas estimulam resposta imune de menor magnitude e menor tempo de duração do que vacinas atenuadas a menos que sejam adicionadas adjuvantes Os adjuvantes melhoram a resposta imune ao estimular a captação dos antígenos pelos macrófagos que os processam e apresentam aos linfócitos Os adjuvantes podem causar ou potencializar os efeitos adversos da reação à vacina a indução de sarcomas associados à vacina ou ao sítio da injeção pode ser um exemplo A maioria das vacinas com adjuvantes estudadas em gatos induz reações piogranulomatosas que podem passar por transformação maligna para sarcoma nos tecidos moles NELSON COUTO 2006 O sarcoma pósvacinal felino também chamado sarcoma das partes moles sarcoma de locais de injeção é uma patologia de ocorrência crescente na clínica de pequenos animais e é um desafio para os médicos veterinários pois é de difícil tratamento e potencialmente 24 evitáveis Desenvolvese após a aplicação de substâncias injetáveis principalmente vacinas A formação de um nódulo no local da aplicação em geral é decorrente de uma resposta inflamatória desencadeada pela vacina sendo considerada normal e até esperada em até 3 dos animais Os nódulos pósvacina costumam desaparecer em 15 dias a não ser que evoluam para a formação de um granuloma reação de hipersensibilidadede tipo IV ou tardia no local da aplicação Considerese normal a persistência de um pequeno granuloma no local de aplicação por um período de três meses desde que não evolua em tamanho e a partir de então preconizase a realização de medidas diagnósticas precisas como biópsia incisional e excisional MARTINS 2008 No momento da fabricação das vacinas inativadas os vírus ou bactérias são mortos utilizandose um elemento químico geralmente a formalina ou fenol Fragmentos mortos de microrganismos que causam a doença geralmente bactérias e vírus são colocados na vacina Como os antígenos estão mortos a potência vacinal o tempo é menor resultando em imunidade com menor duração Então várias doses de vacinas são geralmente necessárias para fornecer a melhor proteção ANDRADE et al 2003 Para Azevedo 2002 calor e luz costumam destruir a antigenicidade das vacinas inativadas As vantagens da vacina inativada em relação às atenuadas é o fato de não reverter à virulência tem sua atividade aumentada com adjuvantes e maior estabilidade na estocagem Como desvantagem a vacina inativada precisa de no mínimo duas doses para conferir proteção aumenta o risco de alergias pela maior massa antigênica duração da imunidade é mais curta restrita às vias parenterais e frequentemente necessita de adjuvantes Segundo Azevedo está indicada na prenhez animais debilitados ou imunossuprimidos e neonatos privados de colostro que não receberam soroterapia Vacinas inativadas existem contra coronavirose parvovirose hepatite infecciosa bordetelose leptospirose panleucopenia calicivirose rinotraqueíte leucemia viral felina e raiva Figura 10 Figura 10 Vacina Inativada Fonte Merial do Brasil 523 VACINAS RECOMBINANTES 25 As práticas convencionais de desenvolvimento de vacinas têm sido com o passar dos anos substituídas por uma nova metodologia que aperfeiçoa as a produção de vacinas tendo como base a identificação de alvos potenciais formas mais eficazes de administração dos antígenos e apresentação destes as células do sistema imune As vacinas convencionais baseadas no patógeno inteiro podem apresentar alguns riscos na administração como o desenvolvimento da doença Neste sentido a engenharia genética vem despontando como alternativa para o melhoramento das vacinas já existentes e no desenvolvimento de novas vacinas as chamadas vacinas recombinantes Estas vacinas podem ser desenvolvidas de diversas maneiras dependendo do antígeno em questão e do tipo de resposta imune que se busca desencadear contra ele HARTWIG 2006 Para Juliano 2004 com os avanços científicos uma nova geração de vacinas conhecidas como recombinantes decorrentes de manipulação genética tem sido implementadas Como estas vacinas não apresentam o patógeno íntegro elas são altamente seguras e são capazes de centralizar a resposta do sistema imune em antígenos específicos que estão relacionados com a proteção imunológica contra a doença ou seja não é necessário expor o sistema imune a uma série de antígenos Além disso as vacinas recombinantes permitem diversas rotas de administração Podem também funcionar como vacinas marcadoras ou seja podem ser usadas em conjunto com um teste diagnóstico que permite diferenciar o animal vacinado do animal que entrou em contato com o patógeno Conforme o autor com o objetivo de regulamentar o uso das vacinas recombinantes o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos USDA United States Departament of Agriculture as classificou em três categorias de acordo com a tecnologia utilizada Categoria I Vacinas recombinantes de subunidade Categoria II Vacina de genes deletados Categoria III Vacinas vetoriais Além disso a tecnologia recombinante também compreende as vacinas de DNA que estão sendo amplamente pesquisadas para uso tanto em humanos quanto em animais JULIANO 2004 Nos dias atuais vacinas recombinantes indicadas com um r antecedendo o antígeno pex rCDV para o vírus da cinomose canina encontramse autorizadas e disponíveis para administração a várias espécies incluindo cães gatos cavalos furões e humanos Diferentemente das vacinas com vírus morto ou com vírus vivomodificado pelo fato do agente patogênico não estar presente na vacina não há possibilidade das vacinas recombinantes dos tipos I ou III induzirem a doença que pretendem prevenir Fundamentalmente o que distingue uma vacina recombinante das convencionais vírus morto e MLV é a habilidade da vacina recombinante em induzir uma resposta protetora utilizando apenas frações selecionadas do vírus ou bactéria patogênica Na realidade vírus vivos modificados pex CDV e bactérias pex B bronchiseptica replicamse no paciente e são capazes de causarem os sinais de infecção que a vacina pretendia prevenir Além disso a vacina de vírus vivo atenuado pex cinomose replicase no interior do hospedeiro e pode aparecer em locais distantes daquele onde fora inoculado FORD 2009 A obtenção de uma molécula de DNA recombinante através da ligação de um fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor é um processo relativamente simples Entretanto problemas especiais surgem quando o fragmento de interesse constitui uma fração pequena de DNA total Este é o caso encontrado comumente quando o objetivo é o isolamento de genes presentes em uma única cópia num genoma complexo ou quando o objetivo é o isolamento de clones portadores do DNA complementar à RNA mensageiro raro Deste modo é claro que quando queremos clonar um determinado gene ou DNA complementar da mensagem ou mensagens por ele codificados é necessário à obtenção de coleções de clones recombinantes portadores de moléculas representantes de todo genoma ou de coleções de clones de cDNAs derivados de toda a população de mensageiros da célula ou do tecido de interesse Essas coleções de clones de DNA recombinante são chamadas de bibliotecas Biblioteca Genômica no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genômico ou Biblioteca cDNA no caso dos clones terem sido construídos a partir de DNA complementar NASCIMENTO et al 2003 Conforme os mesmos autores o DNA de organismos superiores é bastante complexo por exemplo o genoma infoide do mamífero é composto de aproximadamente 3x10⁹ pares de base Portanto se o fragmento de interesse tiver 3000 pb ele compreenderá somente uma parte em 10⁶ de uma preparação do DNA total De modo similar uma espécie de RNAm particularmente rara pode compreender somente uma parte em 10⁵ ou 10⁶ da fração de RNA mensageiro de uma célula Deste modo para que seja garantida a presença na biblioteca de pelo menos uma versão de todas as sequências da população alvo um dos pontos principais na construção de bibliotecas úteis é a obtenção de grande quantidade de clones Embora a solução deste problema envolva estratégias específicas no preparo do DNA alvo e na escolha do vetor de clonagem em linhas gerais a construção de bibliotecas genômicas e de cDNAs segue um procedimento básico bastante semelhante 5231 VACINAS RECOMBINANTES DE SUBUNIDADES As vacinas de subunidades podem ser superiores às vacinas inativadas que utilizam o microrganismo inteiro porque somente as partes imunogênicas dos microrganismos são usadas Isso reduz o potencial de reações vacinais Produzidas por técnicas de biologia molecular reduzem a alergenicidade Essas vacinas contêm apenas os antígenos importantes para conferir imunidade As vantagens da vacina de subunidade é que não provoca doença pósvacinal contém reduzida quantidade de proteína estranha e é mais potente As desvantagens estão relacionadas à produção onerosa e dificuldades na manufatura São especialmente indicadas em prenhez animais debilitados ou imunossuprimidos e para diminuir a alergenicidade de vacinas inativadas ou quando as vacinas vivas causam doenças 27 Vacinas de subunidade existem contra leptospirose envelope bacteriano bordetelose antígeno de parede celular leucemia viral glicoproteína gp70 e antígeno P45 e raiva glicoproteína G AZEVEDO 2002 As vacinas de subunidade são baseadas em frações do microrganismo e estão entre as mais produzidas e administradas para prevenção de uma ampla gama de enfermidades Atualmente o exemplo clássico de vacina de subunidade é a vacina contra hepatite B humana que vem sendo utilizada há vários anos A substituição das purificações convencionais mais trabalhosas e complexas pela produção de proteínas recombinantes heterólogas que apresentam maior rentabilidade com um custo menor tem sido cada vez mais comum HARTWIG 2006 As proteínas recombinantes heterólogas são produzidas tanto em organismos procariotos como em eucariotos e uma vez expressas podem ser rapidamente purificadas e administradas aos animais em altas concentrações Isto somado a novas estratégias de apresentação de antígeno e a uma nova geração de adjuvantes aumentará significativamente o potencial destas subunidades de antígenos de induzirem uma imunidade celular e humoral CLARK CASSIDYHANLEY apud HARTWIG 2006 A bactéria E coli é um importante microrganismo utilizado na expressão de proteínas recombinantes Uma ampla variedade de antígenos já foi expressa neste microrganismo No entanto em alguns casos a estimulação do sistema imune por estes antígenos pode ser variável pois uma série de fatores pode intervir tais como características peculiares do antígeno formas de apresentação destes ao sistema imune e via de imunização utilizada Sistemas de expressão de proteínas baseadas em E coli ou em leveduras podem gerar uma conformação incorreta da proteína acarretando ausência de epítopos conformacionais requeridos na produção de anticorpos neutralizantes e protetores no hospedeiro Similarmente a formação de agregados proteicos corpúsculo de inclusão comumente formados devido a níveis muito elevados de expressão compromete a estrutura tridimensional nativa das proteínas Em contraste níveis baixos de expressão podem estar relacionados com a degradação das proteínas por proteases do hospedeiro frequência de códon e toxicidade da proteína recombinante para a célula hospedeira e além disso a incapacidade destes sistemas de expressão efetuar modificações póstraducionais e a dificuldade de expressarem estas proteínas para o sobrenadante do cultivo HARTWIG 2006 Para sua fabricação primeiramente devese conhecer os antígenos ou seja as proteínas imunoprotetoras do patógeno Dentre estas devese escolher aquela que seja crucial para a sobrevivência do microrganismo para que a proteção adquirida com a vacina não seja prejudicada por mutações no patógeno Com a escolha do antígeno o DNA que codifica deve ser isolado e inserido em outro microrganismo que sintetizará a proteína antigênica O antígeno é posteriormente purificado e inoculado no animal onde desencadeará uma resposta imune protetora VAN KAMEM apud JULIANO 2004 Uma série de vacinas de subunidade baseadas no método recombinante vem sendo testadas na imunização contra vários patógenos tanto na área médica quanto veterinária A 28 proteína MPB83 de Mycobacterium bovis foi clonada e expressa em E coli para desenvolvimento e avaliação de uma vacina de subunidade contra tuberculose bovina A imunização via oral de suínos com a proteína recombinante FaeG obtida de E coli enterotoxigênica ETEC foi capaz de induzir imunidade sistêmica e de mucosas específicas contra a proteína heteróloga HARTWIG 2006 Um exemplo de tecnologia de subunidade se refere À vacina RECOMBITEK Lyme MERIAL que protege cães contra Borrelia burgdorferi causadora da doença de Lyme transmitida por carrapatos composta pela proteína OspA da Borrelia burgdorferi em E coli Age como vacina inativada e o processo de produção de uma vacina de subunidade é semelhante ao utilizado para produção de insulina recombinante para o tratamento de diabetes e fatores de coagulação Este processo de produção é realizado obtendose DNA de Borrelia burgdorferi com parte que codifica para a proteína de superfície A OspA este DNA é inserido no plasmídeo criando um plasmídeo recombinante que é inserido em uma E coli A E coli é multiplicada em cultura e o plasmídeo recombinante proporciona a produção de OspA pela E coli que é lisada se extraindo a OspA A OspA é utilizada para produzir a RECOMBITEK Lyme sem adjuvante Figura 1 SIMSON 2009 29 Figura11 Esquema de produção da vacina recombinante de subunidade Fonte Simson As bactérias são muito utilizadas para sintetizar o antígeno recombinante de interesse pois muitas delas já estão bem caracterizadas e apresentam um baixo custo de manutenção Algumas vezes o sistema de expressão bacteriano não é recomendado quando o objetivo é a produção de vacinas de subunidade virais pois células procarióticas não fazem as modificações póstranslacionais necessárias para a síntese de proteínas virais fazendo com que as proteínas recombinantes produzidas tenham uma estrutura diferente das proteínas do patógeno e por isso não sejam capazes de induzir uma resposta protetora no animal BABIUK 1999 30 Existem estratégias para aperfeiçoar a produção de uma proteína recombinante como por exemplo promotores que aumentam os níveis de proteína sintetizada sequências sinalizadas que fazem com que a proteína recombinante seja excretada pela célula facilitando a purificação do produto e técnicas que minimizam a degradação proteolítica da molécula de interesse É também possível através dessa técnica desenvolver proteínas quiméricas contendo epítopos importantes de diferentes patógenos ou proteínas quiméricas contendo imunomoduladores como citocinas que podem aumentar a resposta imune desencadeada com a vacina de subunidade BABIUK 1999 A Leucogen VIRBAC batch k242 outra vacina de subunidade disponível comercialmente apresenta um antígeno que é uma proteína não glicosilada derivada da glicoproteína de envelope do vírus da leucemia felina do subgrupo A expresso também em E coli e administrado com adjuvante Essa vacina pode proteger contra três subtipos do vírus da leucemia felina de forma eficaz JARRET CANIERE apud JULIANO 2004 As principais vantagens da vacina de subunidade é a segurança menor competição antigênica já que poucos componentes imunogênicos são encontrados na vacina e a possibilidade de produzir vacinas contra proteínas importantes comuns para vários membros da mesma família de vírus BABIUK 1999 5232 VACINA RECOMBINANTE DE GENE DELETADO Deleções representam a retirada de um segmento genômico da partícula viral com a consequente eliminaçãoda sntese de uma ou mais proteínas reduzindo na atenuação da amostra para o hospedeiro Essas proteínas podem ser responsáveis pela virulência da amostra ou por um mecanismo de fuga do sistema imunológico Como muitas dessas deleções são de difícil restauração pelos vírus considerase que constituem um mecanismo seguro de se obter mutantes ainda imunizantes porém de mais baixa virulência BABIUK 1999 As deleções têm sido mais facilmente obtidas em vírus maiores nos quais ocorrem regiões não essenciais para a replicação SCHATZMAYR 2003 Atualmente não existem vacinas comerciais atenuadas pela deleção de genes para animais de companhia porém pesquisas estão sendo feitas com sucesso usandose esta tecnologia na tentativa de se proteger contra diversas doenças nestes animais como por exemplo contra coronavírus felino e herpes vírus felino tipo 1 HAIJEMA et al 2004 Outra razão para se deletar genes de um organismo é a necessidade diferenciar animais vacinados de animais infectados como no caso da vacina IBRAXION IBRV inativada MERIAL Muito útil em programas de erradicação essa vacina é composta por um herpesvírus bovino tipo 1 cepa ST do qual foram deletados os genes que codificam para a proteína gE Essa vacina induz a produção de anticorpos seroneutralizantes contra herpesvírus protegendo os animais da doença porém não induz produção de anticorpos antigE Isso permite que com um simples teste de 31 anticorpos antigE os animais infectados sejam identificados como positivos e os vacinados não positivos SIMSON 2009 5233 VACINAS RECOMBINANTES VETORIAIS As vacinas recombinantes em sua maioria utilizadas em medicina de animais de companhia são classificadas pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos como vacinas de categoria III também chamadas de vacinas por vetor Esses produtos são caracterizados pelo fato de segmentos definidos de DNA isolados do genoma de um vírus patogênico sejam recombinados com o DNA de um vírus vetor O vírus vetor que carrega o DNA recombinante é em seguida administrado tais quais as vacinas de vírus Apesar do vírus vetor não ter um papel destacado na imunização do paciente contra o vírus patogênico desejado ele é efetivamente capturado pelas células apresentadoras de antígenos pex macrófagos e células dentríticas que processam o antígeno recombinante e apresentam aminoácidos fundamentais proteínas a linfócitos A ativação subsequente de linfócitos B e T culminam uma resposta imune humoral e celular direcionada especificamente contra as proteínas do vírus patogênico FORD 2009 Os vetores podem ser tanto homólogos nos quais a espécie alvo da vacina é um hospedeiro natural para o vírus vetor ou heterólogos quando a espécie alvo da vacina não é o hospedeiro natural para o vetor Essas proteínas do patógeno que são secretadas pelo vetor estimulam a produção de anticorpos ou são quebradas em pequenos peptídios que são transportados para a superfície celular levando a uma resposta celular por linfócitos T citotóxicos CD8 O sinal imunogênico pode ser ampliado quando o vetor vivo inicia múltiplos ciclos de replicação ELLIS apud JULIANO 2004 Diversos tipos diferentes de vírus vetores de vacinas recombinantes estão sendo estudados neste momento Retrovírus adenovírus e herpesvírus além de diversos poxvírus são exemplos de vírus conhecidos para a atuação no papel de vetores vacinais Hoje o único vírus vetor utilizado em vacinas de animais de companhia é o vírus canaripox Em geral poxvírus são apropriados como vetores vacinais pois o genoma destes é extenso e pode acomodar em diferentes porções múltiplas inserções de DNA de um organismo não relacionado No entanto é importante notar que nem todos os vírus vetores são iguais Da mesma forma nem todos poxvírus vetores partilham as mesmas características este é um ponto importante considerando as semelhanças das vacinas com novos vetores de poxvírus que estão em estudo e que podem ser introduzidas na medicina de animais de companhia em um futuro próximo FORD 2009 Os vetores bacterianos apresentam um custo relativamente baixo são de fácil manuseio e seguros pois cepas bacterianas não patogênicas têm sido desenvolvidas e continuam atenuadas mesmo quando inoculadas em animais imunossuprimidos Além disso o tratamento com antibióticos é possível se alguma reação adversa acontecer durante os testes clínicos Muitas vezes esse tipo de vetor permite que a vacina seja administrada oralmente e o tropismo de bactérias entéricas para o tecido infoide associado às mucosas intestinais permite o desenvolvimento de imunidade de mucosa SHATA et al 2000 É importante que os médicos veterinários entendam as vantagens clínicas por trás do uso de vacinas recombinantes em vez de mortas ou vivas atenuadas Porém é também importante entender as diferenças entre os vários tipos de vacinas recombinantes Por exemplo o vírus canarypox representa particularmente um vetor único quanto à segurança e eficácia Desta forma obteve a licença para uso em vacinas para equinos caninos felinos e furões O fato importante é que se comparado com vacina ou poxvírus de guaxinim o vetor canarypox não possui a capacidade de se replicar em mamífero O vírus canarypox é designado como um vetor não replicante Desta maneira não é esperado o desenvolvimento de anticorpos contra este vetor com o decorrer das vacinações Além disso vacinas com vetor canarypox mostraram a habilidade de promoverem uma resposta de reforço em cães e cavalos previamente vacinados com vacinas convencionais FORD 2009 Bactérias e vírus têm sido muito estudados para sua utilização como vetores Os vírus são excelentes vetores pois infectam as células de forma eficiente incluindo as células apresentadoras de antígeno APCs evitando portanto a necessidade de apresentação cruzada Além disso as proteínas do vetor podem atuar como potentes adjuvantes na imunização A principal desvantagem decorre dos animais que são imunes ao vetor onde a memória imunológica limita a sua replicação reduzindo a resposta imune contra a proteína recombinante Isto pode ser parcialmente contornado escolhendose um vetor o qual o hospedeiro não foi previamente exposto BABIUK 1999 A escolha do vetor viral é determinada por muitos fatores dentre os quais o grupo de hospedeiros do vetor replicação no alvo animal expressão de antígenos estranhos tamanho do genoma indução da imunidade protetora duração de imunidade custo de produção segurança e estabilidade do vírus recombinante são alguns dos mais importantes YOKOYAMA et al 1997 Tanto as vacinas vivas atenuadas quanto as vacinas recombinantes vetoriais induzem a formação de imunidade humoral e celular Para alguns agentes infecciosos como o vírus da cinomose canina a intensidade da produção de anticorpos pósvacinais apresenta boa correlação com o nível de proteção do indivíduo imunidade Para outros a concentração sérica de anticorpos não se correlaciona bem com o nível de proteção como no caso da leucemia viral felina FeLV Esta é uma das razões pela qual a determinação da concentração sérica de anticorpos e interferências sobre a imunidade do indivíduo deve ser analisada com cautela na dependência do agente infeccioso em questão Por este motivo estudos de imunização de indivíduos devem ser realizados com testes de desafio do microrganismo virulento de modo a determinar de modo efetivo o grau de proteção conferido pela vacina BRANDÃO 2008 Como exemplo a vacina RECOMBITEK Cinomose Figura12 Nesta vacina o vírus da cinomose tem seu RNA purificado codificandose para proteína Ffusão e proteína HA hemaglutinina na sequência o RNA é reversamente transcrito para cDNA Este cDNA é inserido no genoma do vírus da bouba de canário ALVAC criando a semente da vacina 33 recombinante de cinomose O vírus recombinante é multiplicado em cultivo celular e após o cultivo este vírus recombinante é adicionado aos demais antígenos para produzir a vacina Após a aplicação da vacina no cão por via subcutânea o vírus penetra nas células do animal sendo o DNA viral transcrito e ao tentar se replicar na célula inicia a produção das proteínas HA e F que são expressas pela célula do cão As células do sistema imune do cão fagocitam as proteínas estranhas HA e F e as apresentam aos linfócitos sendo assim o cão desenvolve imunidade aos antígenos HA e F ficando protegido contra cinomose Figura13 SIMSON 2004 Figura 12 Vacina recombinante vetorial Fonte Merial 34 Figura13 Esquema de produção de vacina recombinante vetorial Fonte Simson As vacinas vetoriais foram desenvolvidas na tentativa de buscar a eficácia e segurança testadas em várias espécies de mamíferos baixa imunidade ao vetor boa capacidade para inserção de vários genes adicionais espectro estreito em hospedeiros baixo risco ciclo de replicação intracitoplasmático e termoestável Como exemplo temos a PUREVAX MERIAL a nova vacina contra raiva para gatos é uma vacina sem adjuvante composta pelo vetor ALVAC que expressa o gene do vírus da raiva com ótimos níveis de segurança e proteção para os animais vacinados JULIANO 2004 35 A EURIFEL FeLV MERIAL contra o vírus da leucemia felina leva a imunidade protetora que se desenvolve a partir da expressão de antígenos env e gag num vetor ALVAC sem a necessidade da administração simultânea de adjuvante Essa vacina mostrouse eficiente para proteger animais expostos a cepas altamente virulentas Além disso ela pode ser associada a outras vacinas felinas sem interferir em sua eficácia como é o caso da vacina EURIFEL RCCP FeLV MERIAL POULET et al apud JULIANO 2004 As vacinas baseadas em vetores têm suas limitações pois tem como base os microrganismos vivos Os vírus por exemplo utilizados como vetores neste tipo de vacina apresentam problemas quanto à proliferação pois o crescimento de grandes quantidades destes organismos fora do corpo do indivíduo não é fácil Bactérias também podem ser usadas como vetores vacinais Neste caso o material genético inserido provoca a exibição de antígenos de outros microrganismos na superfície bacteriana induzindo resposta imune No entanto são necessários vários ensaios com estes organismos para garantir a segurança na sua administração em humanos e animais pois o principal problema das vacinas vetorizadas é a imunidade contra o vetor vírus ou bactéria HARTWIG 2006 5234 VACINAS DE DNA Em 1990 Wolff e seus colegas foram os primeiros a relatarem a expressão bem sucedida de DNA plasmidial no tecido muscular de camundongos Alguns anos mais tarde foi relatado que a injeção de DNA codificando uma proteína antigênica do vírus da gripe conferiu imunidade camundongos Vários trabalhos têm descrito e discutido a imunidade protetora induzida pelo DNA contra a grande variedade de vírus bactérias e protozoários Também tem sido investigada para o tratamento do câncer doenças autoimunes A administração de um simples plasmídeo pode induzir a um amplo espectro de respostas imunes Eles incluem a ativação de linfócitos T CD8 implicado na defesa do hospedeiro contra patógenos intracelulares através de linfócitos T citotóxicos e os linfócitos CD4 que secretam citocinas desempenhando papel na produção de células B de anticorpos específicos DUFOUR 2001 Na última década o grande avanço da biologia molecular permitiu a introdução de novas estratégias para a obtenção e a produção de antígenos e foram aprimoradas novas maneiras de se administrar e apresentar esses antígenos para as células do sistema imune As vacinas gênicas ou de terceira geração surgiram com a introdução de genes que codificam antígenos potencialmente imunogênicos em vetores virais ou em DNA plasmidial RODRIGUES 2004 O gene que codifica o antígeno de interesse é inserido num plasmídeo que é purificado e injetado por diversas vias no organismo sendo que a mais comum é a intramuscular O DNA é incorporado pelas células do animal vacinado e entra para o núcleo onde o gene do antígeno é transcrito o mRNA é transportado para o citoplasma e consequentemente o antígeno é sintetizado secretado e apresentado associado à molécula de MHC de classe I na superfície 36 celular para os linfócitos T de modo a desenvolver uma resposta imune protetora ELLIS 2001 Um estudo avaliou fatores que determinam a eficiência da transferência do gene e da imunogenicidade conferida pela inoculação do plasmídeo Posteriormente a inoculação de DNA que codifica uma proteína imunogênica do vírus influenza conferiu imunidade protetora em camundongos Kano et al 2007 A partir destes resultados o entendimento sobre o mecanismo imunológico induzido por este tipo de vacina despertou interesse da comunidade científica O sucesso com imunização com DNA depende principalmente da natureza dos antígenos da frequência e via de administração da concentração de DNA administrada da localização celular do antígeno codificado pelo plasmídeo secretado ligado à membrana ou citoplasmático da idade do hospedeiro e da espécie dos animais vacinados RAINCZUK 2003 As vacinas de DNA oferecem uma série de vantagens quando comparadas às vacinas clássicas em termos econômicos e técnicos O custo de produção das vacinas gênicas em larga escala é consideravelmente menor ao custo da produção das vacinas compostas de fração subcelular proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos WHALEN 1996 O controle de qualidade é mais fácil a comercialização não necessita de uma refrigeração pois estas vacinas são estáveis à temperatura ambiente e podem ser liofilizadas WAINE 1995 Estes fatores facilitam o transporte a distribuição e o estabelecimento de amplos programas de imunizações em regiões de difícil acesso o que seria interessante para a realidade brasileira e de outros países em desenvolvimento AZEVEDO 1999 A principal vantagem da vacina de DNA é que assim como as vacinas atenuadas ela induz a produção de anticorpos e de resposta imune celular tanto de linfócitos T auxiliares CD4 quanto T citotóxico CD8 Adicionalmente as vacinas gênicas não são afetadas pelos anticorpos maternos não apresentam risco de reversão da atenuação e podem ser produzidas contra agentes infecciosos de difícil cultivo e atenuação A vacina pode ainda ser coadministrada para multiagentes ou multiepitopos de um determinado agente infeccioso HAN 1999 Um dos vetores utilizados nas vacinas de DNA é o plasmídeo bacteriano desenvolvido originalmente para expressão in vitro de proteínas em células de mamíferos Os plasmídeos apresentam maior segurança biológica baixo custo fácil produção relativa estabilidade e capacidade genômica de 2 a 19 kilobase que podem ser transferidos para as células musculares ULMER 2006 Os plasmídeos utilizados como vacinas devem conter os seguintes elementos essenciais Um promotor de expressão para células de mamíferos Sinal de poliadenilação poliA do transcrito mRNA Um marcador de seleção 37 Uma origem de replicação procariótica Sítio de múltipla clonagem onde é inserido o gene de interesse Outras sequências também são importantes como intron que aumenta atividade do promotor peptídio sinal e sequência de seis nucleotídeos com função imunoestimulatória GLENTING 2005 A tecnologia DNA recombinante permite modificações nas sequências gênicas objetivando a melhoria na resposta imunológica do hospedeiro tais como incorporações de sequências imunoestimulatórias ISS sequências de genes que codificam interleucinas e gene virais que codificam proteínas que melhoram a propagação em células KANO et al 2007 Apesar deste tipo de vacina ser eficiente em levar a formação de uma resposta imune celular ela normalmente não desencadeia uma grande produção de anticorpos específicos Esta técnica ainda é nova e mais estudos são necessários para que se entenda como o plasmídeo é agregado e como as células apresentadoras de antígeno estariam envolvidas Um ponto que ainda está em discussão neste tipo de vacinação é a possibilidade do plasmídeo integrarse ao genoma da célula do hospedeiro levando a consequências indesejáveis como por exemplo a ativação de oncogenes inativação de genes supressores de tumores mutações e alterações nos cromossomos LILJEQVIST STAHL apud JULIANO 2004 Poderá haver riscos gerados com as vacinas de DNA como a integração do plasmídeo ao genoma hospedeiro gerando mutagênese pela ativação protoconcogenes ou pela inativação de genes supressores de tumor estão sendo avaliados Estudos têm mostrado baixa probabilidade de ocorrer integração do plasmídeo Outros riscos incluem a indução de tolerância devido à apresentação do antígeno em longo prazo ou reações autoimunes devido à indução de anticorpos antiDNA Os níveis destes anticorpos têm aumentado de 2030 em seres humanos mas não induzem qualquer doença com os títulos apresentados ao contrário do aumento de 1001000 vezes detectado em pacientes com doenças autoimunes HENKE apud KANO 2007 A vacina de DNA no que se refere a recentes avanços para aumentar sua imunogenicidade tem apresentado baixa imunogenicidade em primatas entretanto duas vacinas foram recentemente licenciadas para animais uma contra o vírus da febre do Nilo em equinos WEST NILEINNOVATORDNA Figura14 e a outra contra vírus da necrose hematopoiética em salmão APEXIHN ULMER et al apud KANO 2007 38 Figura14 Vacina de DNAEquinos FonteFort Dodge Provavelmente a falha de várias vacinas de DNA em induzir forte resposta imune é a pequena produção de antígenos a liberação celular do DNA plasmidial e a estimulação ineficiente Os esforços para aumentar estes aspectos da vacina de DNA aumentam sua eficácia em animais ULMER et al 2006 Portanto a vacina de DNA é um dos mais novos e mais promissores tipos de vacinas apesar de não ter ainda resultados em seres humanos Experimentos com animais mostram que a injeção intramuscular de plasmídeo contendo DNA nu resulta na produção da proteína modificada por esse DNA Essas proteínas permanecem no organismo receptor e desencadeiam uma resposta imune A segurança desse tipo de vacina é incerta mas estão sendo consideradas muitas aplicações especialmente contra câncer e vírus que possuem altas taxas de mutação como influenza e HIV ANDRADE apud KANO 2007 39 6 CONCLUSÃO Quando se fala em evolução nos reportamos a mudanças de estilo de conceitos Para que as novas visões em todas as áreas do mundo sejam alcançadas se faz necessário a mudança individual e coletiva dos indivíduos no que se refere ao desapego aos parâmetros convencionais Na medicina humana assim como na medicina veterinária avanços significativos foram atingidos ao longo de décadas demonstrando através das pesquisas e descobertas novas formas de tratamento de muitas doenças até então consideradas como incuráveis ou intratáveis O avanço tecnológico principalmente dos produtos farmacêuticos tanto para humanos quanto para animais representa papel fundamental na cura e prevenção de doenças Neste aspecto as novas gerações de vacinas produzidas através da biologia molecular estão despontando como proposta fundamental e promissora na prevenção de doenças infectocontagiosas As vacinas de tecnologia tradicional são ainda as mais utilizadas nos animais de companhia Provavelmente esta conduta protocolar esteja alicerçada a desinformação das novas propostas vacinais Resta portanto estimular aos profissionais a busca de novos conhecimentos a respeito dos avanços tecnológicos e seus benefícios visando o bemestar animal 40 REFERÊNCIAS ABBAS AK et al Imunologia Celular e Molecular 6ed USA Saunders 2008 ANDRADE RV ET AL Vacinas Novos Desafios Farmacêuticos V1 n1 janmar 2003 Disponível em httpwwwsaudeemmovimentocombrrevistaartigoscienciafarmaceuticav1n1a7pdf Acesso em 21 mar 2001 AZEVEDO João Sérgio Coussirat Caderno de Medicina de Cães e Gatos Canoas 2002 p 127141 AZEVEDO V LEVITUS G MIYOSHI A CÂNDIDO AL GÓES A M OLIVEIRA S C Mainfeatures of DNA based immunization vectores Brazilian Journal of Medical and Biology Research Ribeirão Preto v32 n2 p147153 nov 1999 BABIUK Lorne Broadenig the approaches to developing more 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