Relatório

1 CENTRO UNIVERSITÁRIO SÃO LUCASAFYA FARMÁCIA MICROBIOLOGIA NOME DO ALUNO COMPLETO EM NEGRITO E CAIXA ALTA RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DE MICROBIOLOGIA Porto VelhoRO 20241 2 NOME DO ALUNO COMPLETO EM NEGRITO E CAIXA ALTA RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DE MICROBIOLOGIA Atividade apresentada à disciplina de microbiologia do curso de Farmácia do Centro Universitário São Lucas como requisito parcial a obtenção de nota para compor a nota de N1 Docente Profª MsC Gabriella Sgorlon Oliveira Porto VelhoRO 20241 3 SUMÁRIO AULA 1 MEIO DE CULTURA EXEMPLO 1 INTRODUÇÃO 3 2 OBJETIVO5 3 METODOLOGIA5 31 MATERIAL UTILIZADO6 4 RESULTADOS10 4 AULA 1 TÍTULO DA AULA MEIO DE CULTURA 1 INTRODUÇÃO Neste tópico você realizará uma introdução de no mínimo 1 página a no máximo 2 páginas sobre o tema central da aula prática Lembrando sempre da formatação de um parágrafo Recuo de 125 cm da margem para o início espaçamento entre linhas de 15cm fonte padrão Arial 12 ou Times 12 texto justificado com no mínimo 5 linhas e no máximo 8 2 OBJETIVO Aqui você irá descrever o objetivo principal da aula Exemplo Preparar diferentes meios de cultura a serem utilizados para o cultivo de microrganismos 3 METODOLOGIA Um dos tópicos mais importantes do relatório dedicado a demonstração da técnica realizada na aula prática Deve ser escrito com riqueza de detalhes a MATERIAL UTILIZADO Este tópico faz parte da metodologia e servirá como uma lista do que utilizamos na aula prática Exemplo Vidrarias laminas placa de petri bico de Bunsen e etc 4 RESULTADOS Assim como o tópico de metodologia este deverá ser escrito base na aula realizada e registros realizados Exemplo Nesta descrição você poderá utilizar texto e registros da aula prática O tópico de Resultados será escrito somente para aqueles que vieram a aula prática e fizeram as técnicas Dessa forma a aula que o aluno faltou ele não poderá descrever os resultados Avaliações individuais serão realizadas para aqueles alunos que não vieram nos dias das aulas práticas Alunos que faltarem por motivos prévios e com comprovação imediata serão avaliados 5 NORMAS ABNT BÁSICAS AVALIADAS Formatação das margens página e parágrafos Inserir as referências utilizadas para a introdução de cada tópicos Entregar dia 05042024 através da postagem no canvas em formato PDF Aula do dia 27022024 as dúvidas poderão ser retiradas 6 REFERÊNCIAS Dedicada em uma lauda separada com a formatação conforme os padrões ABNT CENTRO UNIVERSITÁRIO SÃO LUCASAFYA FARMÁCIA MICROBIOLOGIA NOME DO ALUNO NOME DO ALUNO RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DE MICROBIOLOGIA Porto VelhoRO 20241 RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DE MICROBIOLOGIA Atividade apresentada à disciplina de microbiologia do curso de Farmácia do Centro Universitário São Lucas como requisito parcial a obtenção de nota para compor a nota de N1 Docente Profª MsC Gabriella Sgorlon Oliveira Porto VelhoRO 20241 SUMÁRIO 1 AULA 1 PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA3 11 INTRODUÇÃO3 2 OBJETIVO4 3 METODOLOGIA5 31 Material Utilizado9 4 RESULTADOS10 5 AULA 2 MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM11 51 INTRODUÇÃO11 6 OBJETIVOS12 7 METODOLOGIA13 71 Materiais Utilizados15 8 RESULTADOS16 9 AULA 3 TÉCNICA DE SEMEADURA MEIO SÓLIDO EM PLACAS DE PETRI20 91 INTRODUÇÃO20 10 OBJETIVOS21 11 METODOLOGIA21 111 Materiais Utilizados24 12 RESULTADOS25 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS26 1 AULA 1 PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA 11 INTRODUÇÃO A prática laboratorial de preparação de meios de cultura é um pilar fundamental na formação acadêmica de estudantes da área de farmácia biologia e ciências afins Essa atividade prática permite aos alunos compreender a importância crítica dos meios de cultura no isolamento identificação e estudo de microorganismos A cultura de microorganismos é a técnica mais primordial na microbiologia sendo essencial não apenas para o diagnóstico e pesquisa mas também para aplicações industriais e ambientais O cuidadoso preparo de meios de cultura sólidos líquidos e diferenciadores é indispensável para uma caracterização apropriada dos organismos presentes em amostras clínicas alimentares ambientais e outras A aula prática abordará desde a seleção de materiais adequados como ágar e outros nutrientes essenciais até a esterilização e dispensação do meio em placas de Petri Essas placas fornecerão a superfície para que os microorganismos cresçam sob condições controladas Compreender o processo de hidratação do meio sua dissolução esterilização em autoclave e os cuidados subsequentes com a temperatura é vital para garantir a viabilidade do meio e a segurança no manuseio Adicionalmente o treinamento em identificar alterações físicas inadequadas no meio de cultura e saber quando descartálo é crucial para evitar resultados experimentais incorretos ou contaminados A capacidade de preparar meios de cultura que possam diferenciar entre microorganismos com base em suas características bioquímicas e morfológicas é uma habilidade valiosa que permite aos futuros profissionais não só executar tarefas rotineiras em laboratórios clínicos ou de pesquisa mas também desenvolver novos protocolos para investigar patógenos emergentes ou realizar análises microbiológicas de novos produtos Esta prática também serve como uma introdução ao rigor e precisão exigidos em experimentos científicos inculcando nos alunos o respeito pelos protocolos e pela metodologia científica Portanto esta sessão de laboratório não é apenas um exercício técnico mas também uma lição em responsabilidade e o papel do cientista na manutenção da integridade do conhecimento científico Os meios de cultura são a tela sobre a qual se desenham os micróbios assim como um pintor escolhe sua tela e tintas com cuidado também o estudante deve aprender a selecionar e preparar os meios de cultura com atenção meticulosa e respeito pela arte da microbiologia 2 OBJETIVO O principal objetivo desta aula prática consistiu em preparar diferentes meios de cultura a serem utilizados para o cultivo de microorganismos Este processo é crucial para entender como os microrganismos crescem em condições laboratoriais controladas e como suas características podem ser observadas e estudadas Os meios de cultura são fundamentais para isolar e identificar patógenos em amostras clínicas na produção de antibióticos na pesquisa científica e em várias outras aplicações industriais e ambientais Além disso esta prática visou aprimorar as competências técnicas dos alunos em A seleção correta dos materiais necessários para a criação de um ambiente propício ao crescimento microbiano A compreensão da importância da proporção e solubilidade dos componentes do meio a fim de fornecer os nutrientes essenciais para a cultura específica O domínio do uso de equipamentos de esterilização como a autoclave para garantir a ausência de agentes contaminantes que possam interferir nos resultados experimentais O desenvolvimento da capacidade de manter a integridade dos meios preparados por meio de práticas adequadas de armazenamento A habilidade de reconhecer qualquer desvio na qualidade do meio preparado como alterações físicas que indicam a necessidade de descarte e repetição do procedimento 3 METODOLOGIA A prática laboratorial iniciouse com a preparação cuidadosa do espaço de trabalho e dos materiais necessários As bancadas foram meticulosamente limpas com etanol 70 e cobertas com papel toalha estéril para manter a área de trabalho asséptica Todos os equipamentos e materiais incluindo tampões copos de precipitação frascos de meio de cultura pipetas e ponteiras foram devidamente esterilizados e dispostos de maneira organizada para facilitar o acesso e evitar contaminação cruzada Figura 1 Organização dos materiais da prática Para a preparação dos meios de cultura primeiramente mediuse a quantidade exata de água destilada necessária utilizandose uma pipeta graduada com precisão de 01 mL e transferiuse para um copo de precipitação estéril Seguindo a formulação indicada pelo fabricante pesaramse os componentes sólidos dos meios de cultura em uma balança analítica com precisão de 0001 g evitandose o contato direto com as substâncias e utilizando papel manteiga estéril para tal fim A água destilada foi adicionada aos componentes sólidos sob agitação constante para garantir a homogeneidade da solução Figura 2 Adição da água aos componentes sólidos Após a completa dissolução dos sólidos procedeuse ao ajuste do pH dos meios de cultura Para esta etapa foi necessário calibrar o pHmetro usando soluções tampão padrão de pH 40 e 70 A calibração foi realizada em triplicata para garantir a acurácia do instrumento Utilizandose uma micropipeta calibrada adicionouse lentamente a solução tampão de HCl 1N ou NaOH 1N conforme necessário monitorandose constantemente o pH até alcançar o valor desejado para o crescimento ótimo dos microrganismos de interesse Este processo foi feito com muita atenção dado que variações mínimas no pH podem afetar significativamente o crescimento microbiano Figura Realização da Pesagem Com os meios de cultura já no pH correto o próximo passo foi a autoclavagem Os meios foram transferidos para frascos de meio de cultura os quais foram tampados com algodão e papel alumínio para permitir a expansão do ar durante a esterilização sem risco de contaminação A autoclave foi previamente testada para assegurar que sua câmara estava limpa e funcional Os meios foram autoclavados a 121C sob pressão de 15 psi durante 15 minutos Após a conclusão da autoclavagem os meios foram cuidadosamente removidos utilizando pinças esterilizadas e luvas térmicas colocados em uma área de resfriamento livre de correntes de ar e contaminação Observouse a ausência de bolhas e a clareza dos meios indicativos de uma autoclavagem bemsucedida Uma vez resfriados a uma temperatura que permitisse o manuseio seguro aproximadamente 50C os meios foram finalmente prontos para a inoculação com as cepas bacterianas e fúngicas específicas da nossa pesquisa Em cada passo da metodologia práticas rigorosas de assepsia foram seguidas Ferramentas como laços de inoculação foram esterilizados na chama do bico de Bunsen antes e após cada transferência de cultura e todas as transferências de meios e culturas foram realizadas dentro de uma capela de fluxo laminar para minimizar o risco de contaminação ambiental 31 Material Utilizado Bancada de Trabalho Papel toalha estéril Etanol 70 para desinfecção Preparação de Meios Balança analítica com precisão de 0001 g Pipetas graduadas de diferentes capacidades Micropipetas calibradas com ponteiras estéreis Copos de precipitação estéreis e autoclavados Frascos de meio de cultura com tampas adequadas Soluções de água destilada Solução Fisiológica 09 Óleo de Imersão Meios de cultura sólidos agar caldo etc Soluções tampão de HCl 1N e NaOH 1N para ajuste de pH Soluções tampão padrão de pH 40 e 70 para calibração de pHmetro Medição e Ajuste de pH pHmetro devidamente calibrado Espátulas estéreis Barras de agitação magnética e placa de agitação Esterilização Autoclave com indicadores de pressão e temperatura Algodão e papel alumínio para tampar os frascos Pinças esterilizadas Luvas térmicas Manutenção da Assepsia Bico de Bunsen Capela de fluxo laminar Laços de inoculação estéreis 4 RESULTADOS Na aula realizada a aplicação metodológica para a preparação de meios de cultura microbiológicos resultou em conclusões positivas evidenciadas pela correta formação e esterilidade dos meios preparados O Agar Mueller Hinton e o Caldo Brain Heart Infusion BHI ambos essenciais para a execução de testes microbiológicos foram sintetizados com êxito seguindo os protocolos laboratoriais estabelecidos Durante a preparação a solubilidade dos meios de cultura em água destilada mostrou se completa não se observando quaisquer resíduos ou partículas insolúveis Isso foi um indicativo da precisão das pesagens e da correta manipulação dos materiais durante a preparação da solução A atenção dada ao processo de dissolução resultou em uma mistura homogênea preparada para a próxima fase de ajuste de pH O ajuste de pH foi conduzido com a máxima atenção aos detalhes utilizandose um pHmetro previamente calibrado com soluções tampão de pH conhecido Os valores de pH obtidos após a correção ficaram dentro da faixa ótima para o crescimento microbiano proposto pela literatura científica sendo 72 para o Agar Mueller Hinton e 68 para o Caldo BHI Esses resultados refletem a exatidão e a precisão das técnicas empregadas para o ajuste do pH o que é crucial para o desenvolvimento adequado dos microrganismos Com a conclusão do processo de esterilização em autoclave realizada sob as condições de pressão e temperatura recomendadas observouse que os meios de cultura permaneceram límpidos e isentos de qualquer sinal de contaminação A esterilidade foi confirmada pela ausência de crescimento microbiano não planejado após o período de incubação indicando que a esterilização por autoclave foi eficiente e que a integridade dos meios de cultura foi mantida A observação subsequente do Agar Mueller Hinton após o período de resfriamento revelou uma superfície lisa e homogênea condição essencial para a realização de ensaios de difusão em disco para testes de sensibilidade antimicrobiana O Caldo BHI por sua vez mantevese límpido e incolor preparado para o cultivo de microrganismos A inoculação dos meios com as cepas bacterianas selecionadas para estudo ocorreu sem intercorrências e o crescimento observado nos dias seguintes estava de acordo com os padrões esperados para cada tipo de meio confirmando a viabilidade do Caldo BHI para culturas líquidas e do Agar Mueller Hinton para culturas sólidas 5 AULA 2 MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM 51 INTRODUÇÃO A coloração de Gram é um marco na microbiologia uma técnica distintiva que abriu as portas para uma compreensão mais profunda da diversidade bacteriana e suas implicações em contextos clínicos e ambientais Desenvolvida em 1884 essa técnica tem sido a pedra angular para o estudo de bactérias fornecendo insights cruciais sobre a composição e as características das paredes celulares bacterianas A capacidade de diferenciar as bactérias em Grampositivas e Gramnegativas baseiase em suas respostas fisiológicas únicas ao processo de coloração que refletem diferenças estruturais fundamentais nas suas paredes celulares Grampositivas com suas espessas camadas de peptidoglicano retêm o corante violeta de cristal tornandose visíveis sob um microscópio em tons de roxo Por outro lado as bactérias Gramnegativas com uma fina camada de peptidoglicano e uma membrana externa lipopolissacarídica não retêm o corante primário e são contracoradas para exibir uma coloração rosa ou vermelha A relevância deste método transcende a simples coloração fornecendo uma base para o diagnóstico diferencial em infecções bacterianas e ajudando a orientar a terapia antimicrobiana A técnica também serve como uma ferramenta preliminar na caracterização de novas espécies bacterianas contribuindo para o campo da taxonomia bacteriana Além disso o método de Gram é fundamental no ensino da microbiologia introduzindo aos estudantes os conceitos básicos de morfologia bacteriana e as práticas de laboratório associadas à visualização de microrganismos Na prática laboratorial realizada procuramos não apenas aplicar a técnica para observar a coloração característica das bactérias mas também entender e apreciar sua aplicação no contexto mais amplo da microbiologia A execução cuidadosa do método de Gram seguindo rigorosamente os passos padronizados permite não apenas uma identificação precisa das bactérias com base na coloração mas também instila nos estudantes uma apreciação pela precisão e pelo detalhe necessários em investigações microbiológicas Esta prática portanto não é apenas um exercício técnico mas também uma ponte para a apreciação da complexidade biológica e da história da ciência microbiológica 6 OBJETIVOS Preparação de Esfregaços Bacterianos O primeiro objetivo foi capacitar os alunos a preparar esfregaços a partir de culturas bacterianas Isso envolveu o manuseio seguro e higiênico de amostras microbianas bem como o desenvolvimento de competência na realização de esfregaços que proporcionam uma camada uniforme de células essencial para a obtenção de resultados claros e interpretáveis na coloração Execução da Coloração de Gram Em seguida o foco foi em instruir os alunos na execução precisa do método de coloração de Gram seguindo uma sequência de passos que incluem a aplicação do corante violeta de cristal o lugol como mordente a descoloração e a contracoloração O objetivo era familiarizar os alunos com as propriedades químicas e os procedimentos que diferenciam as bactérias Grampositivas das Gramnegativas Observação e Interpretação Microscópica Por fim o objetivo foi a observação das lâminas coradas sob microscópio óptico utilizando a imersão em óleo para aumentar a resolução O intuito foi não apenas visualizar as bactérias mas também interpretar corretamente suas características morfológicas e sua reação ao método de coloração de Gram permitindo a diferenciação entre as bactérias Grampositivas e Gramnegativas 7 METODOLOGIA Inicialmente cada aluno recebeu uma lâmina de microscópio limpa e seca cuja limpeza foi assegurada através da rápida passagem pela chama do bico de Bunsen Este procedimento não só removeu eventuais partículas e resíduos orgânicos como também promoveu a aderência das células bacterianas ao vidro A identificação da área de esfregaço foi marcada sutilmente com um lápis de cera na extremidade da lâmina evitando o uso de marcadores à base de álcool que poderiam interferir na coloração subsequente Figura Materiais Utilizados Após a flambagem da alça bacteriológica permitiuse que a mesma esfriasse por alguns segundos antes de tocar a superfície da colônia bacteriana em meio sólido de cultura Uma pequena quantidade de cultura foi emulsionada em uma gota de solução salina fisiológica depositada na lâmina espalhandose com movimentos rotatórios suaves da alça bacteriológica para obter um esfregaço fino e uniforme O esfregaço foi então fixado passando rapidamente a lâmina pela chama do bico de Bunsen evitando superaquecer ou quebrar a lâmina Figura Etapa de coloração sendo cronometrada Após a fixação a lâmina foi recoberta completamente com a solução de cristal violeta por um minuto proporcionando a cor primária às células bacterianas A lâmina foi então lavada com água destilada suavemente para remover o excesso de corante Aplicouse cuidadosamente a solução de lugol como mordente para formar um complexo corante peptidoglicano e após um minuto a lâmina foi novamente lavada com água destilada para retirada do mordente Figura Corantes Utilizados O próximo passo crítico foi a descoloração onde álcoolacetona foi gotejado sobre o esfregaço até que o corante parasse de escorrer O álcoolacetona foi então lavado rapidamente com água corrente para cessar a ação descolorante Para a contracoloração cobriuse a lâmina com fucsina de Gram por trinta segundos proporcionando o contraste necessário para identificar as bactérias Gramnegativas após a lavagem final com água destilada A lâmina corada foi cuidadosamente seca sem esfregar para evitar a remoção ou distorção das células fixadas Uma gota de óleo de imersão foi então aplicada e a lâmina foi observada ao microscópio com objetivo de imersão 100X ajustando o foco e a intensidade da luz para visualizar claramente a morfologia e a coloração das células bacterianas 71 Materiais Utilizados Lâminas de microscópio limpas e secas Bico de Bunsen para esterilização e fixação de esfregaços Alça bacteriológica estéril para preparação de esfregaços Solução salina fisiológica para emulsão da amostra bacteriana Solução de cristal violeta para coloração primária Solução de lugol como mordente Álcoolacetona para descoloração Fucsina de Gram ou safranina para contracoloração Água destilada para lavagem dos esfregaços Papel absorvente para secagem das lâminas Óleo de imersão para observação microscópica Microscópio óptico com objetivas incluindo a objetiva de imersão 100X Luvas de procedimento para manuseio seguro das amostras Lápis de cera ou marcador resistente ao calor para identificação da lâmina Pinça para manipulação das lâminas Placas de Petri contendo culturas bacterianas para a realização dos esfregaços não serão utilizadas diretamente no processo de coloração mas são a fonte das amostras bacterianas 8 RESULTADOS A prática de laboratório conduzida para a coloração de Gram rendeu resultados precisos e distintos que corroboram com os princípios teóricos da microbiologia Os esfregaços preparados a partir das culturas bacterianas apresentaram uma distribuição uniforme de células o que foi essencial para a clareza das observações microscópicas A aplicação do corante violeta de cristal resultou em uma intensa coloração inicial das células bacterianas as quais foram devidamente fixadas na lâmina e prontas para as etapas subsequentes de coloração Figura Lâminas coradas Após o processo de mordentação com lugol e a subsequente descoloração com álcool acetona foi possível observar a diferenciação esperada entre as bactérias Grampositivas e Gramnegativas As bactérias Grampositivas mantiveram a coloração roxa característica indicando a retenção do complexo corantepeptidoglicano Por outro lado as bactérias Gram negativas perderam o corante violeta após o tratamento descolorante o que facilitou a absorção da fucsina de Gram ou safranina durante a contracoloração resultando em uma coloração rosa ou vermelha Esse contraste proporcionou uma visualização clara das diferenças estruturais entre os dois tipos de bactérias quando examinadas sob o microscópio óptico com aumento de 1000x usando óleo de imersão Figura Visualização no Microscópio Ao longo da observação microscópica não apenas a coloração das células bacterianas foi avaliada mas também a morfologia As células Grampositivas mostraramse como cocos ou bacilos em agrupamentos específicos ou cadeias conforme esperado As células Gram negativas igualmente seguiram o padrão morfológico típico de sua classificação com formas que variavam desde bacilos delgados até formas espiraladas mais complexas A precisão na realização do procedimento permitiu uma observação detalhada da morfologia celular e a integridade da forma das bactérias porém ainda foram observados artefatos de coloração ou fixação que pudessem interferir na interpretação dos resultados Figura Presença de artefatos de imagem Os resultados obtidos demonstram a importância da rigorosidade na prática da coloração de Gram e confirmam a utilidade desta técnica não apenas como um método de diferenciação entre bactérias Grampositivas e Gramnegativas mas também como uma ferramenta valiosa para o estudo da morfologia bacteriana 9 AULA 3 TÉCNICA DE SEMEADURA MEIO SÓLIDO EM PLACAS DE PETRI 91 INTRODUÇÃO A semeadura em meio sólido é uma das técnicas mais versáteis e informativas no estudo microbiológico crucial para isolamento contagem e observação do crescimento bacteriano A compreensão e aplicação destas técnicas são vitais para qualquer microbiologista e a prática laboratorial se concentra em três métodos específicos a técnica de semeadura quantitativa a técnica de esgotamento e a técnica de spread plate cada uma com sua finalidade e aplicação dentro da pesquisa microbiológica A técnica de semeadura quantitativa é tradicionalmente utilizada para a contagem de colônias permitindo determinar a concentração de bactérias em uma amostra Este método envolve a transferência de um volume conhecido de uma cultura bacteriana para uma placa de Petri contendo ágar onde a amostra é então espalhada de maneira uniforme Após a incubação as unidades formadoras de colônia UFC podem ser contadas fornecendo uma estimativa precisa da quantidade de bactérias viáveis na amostra Esta técnica é especialmente útil em aplicações industriais e clínicas onde a carga bacteriana precisa ser quantificada Já a técnica de semeadura por esgotamento considerada semiquantitativa é ideal para obter colônias isoladas a partir de uma amostra densa de microrganismos Ela consiste em estriar a amostra em séries de diluição em uma única placa de ágar reduzindo progressivamente a concentração de bactérias com cada série de estrias Este método é fundamental para a identificação de espécies bacterianas pois fornece colônias separadas que podem ser subcultivadas e analisadas posteriormente Por fim a técnica de spread plate ou dispersão é empregada para distribuir uniformemente uma amostra líquida por toda a superfície do ágar Utilizando um instrumento estéril como uma alça de Drigalski ou um espalhador de células a amostra é espalhada para formar um biofilme que cobre toda a placa Esta técnica é comumente usada para avaliar o efeito de antibióticos antissépticos ou outros agentes antimicrobianos assim como para a contagem de colônias em amostras diluídas 10 OBJETIVOS Dominar a Técnica de Semeadura Quantitativa Familiarizar os alunos com os procedimentos de diluição e espalhamento para contagem de unidades formadoras de colônia UFC Desenvolver habilidades práticas para estimar a densidade bacteriana em culturas e amostras Aperfeiçoar a Técnica de Semeadura por Esgotamento Aprender a técnica de esgotamento para isolar colônias bacterianas individuais Capacitar os alunos a realizar estrias sequenciais para obter colônias puras a partir de culturas mistas Aplicar a Técnica de Spread Plate Instruir sobre a técnica de espalhamento de amostras líquidas em placas de ágar para formar uma monocamada celular Treinar a destreza manual no uso de espalhadores de células e a importância da homogeneidade na distribuição da amostra sobre o meio de cultura Compreender as Aplicações das Técnicas de Semeadura Discutir como as técnicas de semeadura são aplicadas no contexto de pesquisas clínicas e ambientais na indústria de alimentos e em controle de qualidade Relacionar as técnicas aprendidas com seus usos práticos e implicações em diferentes áreas da microbiologia 11 METODOLOGIA A metodologia empregada na aula prática foi cuidadosamente planejada para garantir o domínio das técnicas de semeadura em meios sólidos pelos alunos A aula foi estruturada em etapas progressivas cada uma delas dedicada a uma técnica específica de semeadura permitindo aos alunos uma compreensão prática de suas aplicações e resultados esperados A sessão iniciouse com a técnica de semeadura quantitativa onde os alunos foram orientados a utilizar uma alça de inoculação para transferir um volume conhecido de suspensão bacteriana para o centro de uma placa de ágar previamente identificada Sob condições assépticas uma alça esterilizada foi imersa na suspensão bacteriana e utilizada para inocular a superfície do ágar Em seguida utilizando uma lâmina esterilizada ou espalhador de células os alunos espalharam cuidadosamente o inóculo em movimentos espirais para assegurar a dispersão uniforme A precisão do volume inoculado e a técnica de espalhamento foram enfatizadas para permitir uma contagem fidedigna de UFC após a incubação Figura Tubo de ensaio com microorganismo Posteriormente os alunos praticaram a técnica de semeadura por esgotamento Esta técnica começou com a imersão da alça de inoculação em uma cultura densa de microrganismos A alça foi então arrastada através do ágar formando estrias sequenciais que se afastavam do inóculo inicial Entre cada série de estrias a alça foi esterilizada e esfriada para evitar a transferência excessiva de microrganismos promovendo o esgotamento progressivo da amostra e o isolamento de colônias Os alunos aprenderam a importância de angulação e pressão corretas durante o processo para maximizar as chances de obter colônias isoladas Figura Método de Semeadura por esgotamento Na fase final da aula prática os estudantes foram instruídos na técnica de spread plate A técnica foi iniciada com a pipetagem de um volume calibrado de suspensão bacteriana na superfície do meio de cultura Com movimentos suaves e contínuos utilizando um espalhador esterilizado os alunos distribuíram o inóculo uniformemente por toda a placa garantindo que a suspensão se espalhasse adequadamente A técnica de spread plate foi particularmente enfatizada pela sua relevância em testes de sensibilidade antimicrobiana e pela sua habilidade de produzir um lawn bacteriano uniforme Em cada fase a assepsia foi rigorosamente mantida com a chama do bico de Bunsen utilizada não apenas para esterilizar a alça entre as transferências mas também para criar uma corrente de convecção que minimizasse a contaminação A metodologia aplicada foi planejada para reforçar a prática de técnicas microbiológicas essenciais e para desenvolver nos alunos a competência técnica necessária para a realização de procedimentos microbiológicos padronizados Figura Preparação dos materiais 111 Materiais Utilizados Placas de Petri contendo meio de ágar Tubo de ensaio com microorganismo Staphylococcus aureus Alça de inoculação loop esterilizável Espalhador de células Drigalski Bico de Bunsen para esterilização Pipetas calibradas e ponteiras estéreis Suspensão bacteriana padronizada Solução salina estéril Álcool 70 ou chama para esterilização da alça de inoculação Cronômetro ou relógio para o controle de tempo de exposição aos corantes Marcadores permanentes para identificação das placas Forno de incubação ajustado para a temperatura apropriada Luvas de procedimento para manipulação segura Fita adesiva ou parafilme para selar as placas após a semeadura Lâminas esterilizadas para espalhamento na técnica quantitativa 12 RESULTADOS Na execução da técnica de semeadura quantitativa observouse que não houve crescimento bacteriano evidente Esta ausência de crescimento pode ser atribuída a uma série de fatores incluindo a possibilidade de uma diluição excessiva da suspensão bacteriana ou uma quantidade insuficiente de inóculo transferido para a placa de ágar Alternativamente este resultado também pode ter sido consequência da utilização de um reagente inadequado seja por estar além de seu prazo de validade ou por um erro no processo de preparação da suspensão bacteriana como um erro de cálculo na diluição Figura Semeadura Quantitativa não apresentou crescimento A técnica de semeadura por esgotamento entretanto proporcionou resultados mais promissores Apesar do crescimento não tão intenso quanto esperado foi possível observar uma diminuição progressiva na densidade de colônias à medida que as estrias avançavam sugerindo um esgotamento bemsucedido da amostra bacteriana Este resultado parcialmente bemsucedido evidencia a técnica correta de estrias sequenciais e de esterilização entre as passagens da alça de inoculação Ainda assim a densidade reduzida de colônias sinaliza a necessidade de ajustes na técnica ou na preparação da amostra para otimizar o crescimento bacteriano nas próximas tentativas Na aplicação da técnica de spread plate os resultados foram conforme o esperado O espalhamento do inóculo resultou em um biofilme bacteriano homogêneo e uniforme Esse crescimento uniforme na superfície do meio de cultura é indicativo de uma técnica de dispersão adequada e de uma concentração apropriada da suspensão bacteriana O sucesso desta técnica reforça sua utilidade em estudos que requerem a formação de um lawn bacteriano para análises subsequentes como a avaliação de substâncias antimicrobianas REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 TORTORA Gerard J FUNKE Berdell R CASE Christine L Microbiologia 12 ed Porto Alegre Artmed 2017 2 MADIGAN Michael T MARTINKO John M BENDER Kelly S BUCKLEY Daniel H STAHLM David A BROCK Thomas Brock Biologia dos Microorganismos 14 ed São Paulo Pearson 2016 3 PELCZAR Michael J CHAN ECS KRIEG Noel R Microbiologia Conceitos e Aplicações 2 ed São Paulo Makron Books 1996