Cinética Enzimática: Propriedades e Fatores que Afetam a Velocidade das Reações

Conteúdo BIOQUÍMICA GERAL Rodrigo Binkowski de Andrade Cinética enzimática Objetivos de aprendizagem Ao final deste texto você deve apresentar os seguintes aprendizados Descrever as principais propriedades das enzimas Enumerar os fatores que afetam a velocidade das reações catalisadas por enzimas Identificar os parâmetros cinéticos de Km e Vmax e sua aplicação sobre a inibição de enzimas Introdução Neste texto você será apresentado à cinética e às propriedades das enzimas Você vai conhecer as diversas abordagens possíveis utilizadas no estudo do mecanismo de ação das enzimas e da sua contribuição na velocidade das reações Principais propriedade das enzimas A cinética enzimática estuda a velocidade das reações catalisadas pelas enzimas e o modo pelo qual certos fatores conseguem modificar a velocidade destas reações A velocidade v de uma reação pode ser definida pela quantidade de produto formado ou pela quantidade de substrato transformado pela unidade de tempo E SP E Onde S substrato P produto E enzima A atividade de uma enzima pode assim ser medida pela velocidade da reação que ela é capaz de catalisar Não é possível medir a atividade enzimática pela dosagem de uma enzima por método direto semelhante a um teste de coloração Recorrese à medida da atividade expressa em unidades enzimáticas As unidades enzimáticas mais empregadas são arbitrária internacional e Katal As unidades arbitrárias são expressas em bases empíricas usu almente envolvendo a quantidade de substrato transformado em um tempo de incubação definido e sob condições padronizadas de pH temperatura concentrações e etc Esta unidade chamase arbitrária por ser estabelecida pelo pesquisador sem a obediência de um critério técnico ou científico A unidade internacional é definida pelo número de micromols de substrato desdobrado ou de produto formado por um mililitro da solução em um minuto em condições padronizadas de pH e temperatura Já o Katal é a unidade enzimática definida pelo número de mols de substrato desdobrado ou de produto formado por litro de solução em um segundo em condições padro nizadas de pH e temperatura Quando se trabalha com purificação de enzimas costumase expressar os resultados da medida da atividade enzimática em atividade específica A atividade específica é o número de unidades internacionais UI por miligrama de proteínas num mililitro de material biológico que está sendo examinado A velocidade máxima da reação enzimática está relacionada com o número de renovação de uma enzima que expressa o poder catalítico da enzima O número de renovação de uma enzima é o número de mols do substrato trans formado em produto por mol de enzima na unidade de tempo As unidades do número de renovação são segundos1 ou unidade de tempo1 Para você entender mais sobre a aplicação da cinética enzimática nas nossas vidas leia o box Saiba Mais Cinética enzimática 2 Para começar vamos considerar a chamada especificidade estereoquímica A maioria das substâncias formadas ou destruídas nos processos metabólicos são oticamente ativas porém um dos membros da parelha de isômeros óticos encontrase em grande quantidade na natureza A maior parte das enzimas apresenta especificidade para um dos isômeros e nisto consiste a especificidade estereoquímica A desidrogenase do ácido lático existente no músculo catalisa a desidrogenação do ácido Llático Da mesma forma a hexoquinase atua sobre a Dglicose e não sobre a Lglicose A glicoquinase e a hexoquinase no hepatócito têm diferenças na atividade de suas enzimas devido às suas funções metabólicas Essas duas enzimas isoenzimas fosforilam a glicose no carbono 6 A glicoquinase tem um Km maior para glicose do que a hexoqui nase Isto indica que a glicoquinase só atua quando a glicose atinge uma concentração relativamente alta que ultrapassa a capacidade fosforilante da hexoquinase As principais propriedades das enzimas Os catalisadores atuam em reações que em sua ausência seriam muito len tas As enzimas produzem resultados apreciáveis em concentrações ínfimas e aceleram as reações químicas sem modificar o estado de equilíbrio por agirem nos dois sentidos da reação Os catalisadores não são consumidos nem transformados durante a reação química As enzimas são catalisadoras porque apresentam as mesmas características dos catalisadores em geral Por exemplo as ligações peptídicas in vitro só podem ser hidrolisadas por ácidos ou bases fortes e em temperaturas muito elevadas In vivo por ação enzimá tica o rompimento dessas ligações se faz com relativa rapidez Apenas uma quantidade mínima uma molécula da enzima catalase decompõe 5 milhões de moléculas de água oxigenada em um minuto em pH 68 A renina faz coagular 723 milhões de vezes o seu peso de leite desengordurado em 10 minutos em pH 58 e a 40C de temperatura 3 Cinética enzimática Ao contrário porém dos catalisadores inorgânicos as enzimas apresen tam especificidades para determinadas reações ou grupos de reações As proteínas os triacilgliceróis e o glicogênio podem ser hidrolisados in vitro inespecificamente com ácido clorídrico a quente isto é em condições não fisiológicas de temperatura e pH A hidrólise desses compostos praticamente não ocorre espontaneamente em pH 73 e temperatura de 37C As células em virtude de possuírem catalisadores especiais chamados de enzimas são capazes de realizar o mesmo trabalho em condições fisiológicas de pH 734 e temperatura de 37C Quando se adiciona ácido clorídrico a uma mistura aquecida de proteína triacilglicerol e glicogênio ocorre hidrólise dos três compostos a proteína libera aminoácidosos triacilgliceróis formam glicerol e ácidos graxos e o glicogênio produz glicose Tal fato não ocorre quando se adiciona à mesma mistura uma enzima capaz de catalisar seletivamente a hidrólise do glicogênio Neste caso as proteínas e os triacilgliceróis permanecem inalterados enquanto que o glicogênio é totalmente degradado Os fatores que afetam a velocidade das reações catalisadas por enzimas Diversos fatores influem na atividade das enzimas Dois deles decorrem da natureza proteica da molécula da enzima e dois são consequência da formação do complexo enzimasubstrato 1 Fatores decorrentes da natureza proteica das enzimas a pH do meio onde atua a enzima b temperatura do meio em que se desenvolve a reação enzimática 2 Fatores decorrentes da formação do complexo enzimasubstrato a concentração do substrato b concentração da enzima Influência do pH do meio na atividade de uma enzima Quando uma mesma quantidade de enzimas atua sobre uma mesma concen tração de substrato em diferentes valores de pH do meio onde a reação se efetua há uma região na qual a atividade da enzima é máxima Esta região é denominada de pH ótimo da atividade Em muitas enzimas o pH ótimo é Cinética enzimática 4 fixo e determinado enquanto que em outras o pH ótimo se encontra dentro de um intervalo mais ou menos extenso A estrutura proteica das enzimas explica a influência do pH As variações de pH afetam profundamente a ionização dos grupos amino e carboxílicos dos radicais dos aminoácidos colaboradores auxiliares e de contato Essas modificações do caráter iônico dos radicais determina uma pronunciada alteração no efeito catalítico da enzima por mudança de conformação da proteína enzimática Em adição às modificações puramente iônicas a molécula proteica pode sofrer também desnaturação com consequente perda da atividade A des naturação pode ocorrer quando o pH do meio se tornar muito baixo ou muito alto Quando uma enzima atua sobre dois ou mais substratos que também modificam a ionização de suas moléculas de acordo com as variações de pH a enzima pode apresentar um pH ótimo diferente para cada substrato Figura 1 Figura 1 Efeito do ph sobre reações catali sadas por enzimas Fonte Harvey e Ferrier 2012 Influência da temperatura na atividade da enzima Quando uma mesma quantidade de enzimas atua sobre uma mesma concentra ção de substrato no pH ótimo mas em temperaturas diferentes há um ponto onde a atividade da enzima é máxima essa região é denominada temperatura ótima da atividade enzimática 5 Cinética enzimática Muitas enzimas não revelam atividade a 0C Com a elevação da tempera tura a enzima passa a funcionar e a atividade cresce à medida que a temperatura aumenta Existe um determinado ponto no qual o aumento de temperatura ao invés de aumentar a atividade enzimática causa uma diminuição e até completa inativação O gráfico apresenta como na curva de pH uma forma de sino assimé trico com o ramo esquerdo geralmente menos inclinado que o da direita Ele é explicado pela estrutura proteica das enzimas O ramo direito da curva é justificado pelo aumento natural da velocidade de uma reação pela temperatura Figura 2 O aumento da temperatura determina também a desnaturação da proteína Figura 2 Efeito da temperatura sobre uma reação catalisada por enzima Fonte Harvey e Ferrier 2012 A partir de 45C a desnaturação da enzima se faz rapidamente aos 55C a desnaturação é acelerada e acima deste valor a enzima chega à completa inativação Portanto a curva obtida em forma de sino é a soma de duas outras curvas que representam um aumento da atividade enzimática pela elevação da temperatura e a desnaturação térmica As enzimas das bactérias que vivem em ambientes naturais quentes bactérias termófilas podem conservar a atividade em temperaturas superiores a 85C Cinética enzimática 6 Influência da concentração do substrato Quando se faz variar a concentração do substrato mantendose a mesma concen tração da enzima e a temperatura e o pH ótimos observase que a velocidade da reação aumenta segundo uma reação linear Porém no momento em que esta concentração ultrapassa um determinado valor a velocidade de reação permanece independente da concentração do substrato Se a concentração do substrato for grande a concentração do complexo enzimasubstrato será maior e consequentemente maior será a velocidade de reação Com a adição de novas moléculas de substrato chegará um momento em que todas as moléculas da enzima estarão sob a forma de enzimasubstrato e neste ponto o acréscimo de maior quantidade de substrato não aumenta a concentração do complexo enzimasubstrato e portanto a velocidade per manece constante Além dos fatores já mencionados a atividade das enzimas depende também da concentração dos cofatores Quando uma enzima requer um fator dissociável a velocidade da reação varia com a concentração do cofator Em muitos casos é encontrado um limite para a concentração do cofator como já foi visto quando analisada a influência da concentração do substrato A explicação para este caso é semelhante os locais do centro catalítico da enzima reservados aos cofatores ficam saturados em presença de um excesso de cofator Influência da concentração da enzima Fazendose variar a concentração da enzima mantendose fixa uma alta concentração de substrato na temperatura e no pH ótimos verificase que a velocidade da reação aumenta linearmente com a concentração da enzima A influência da concentração da enzima deve ser medida em presença de uma elevada concentração de substrato Além da influência do pH da temperatura da concentração da enzima e da concentração do substrato a velocidade de uma reação enzimática de pende também da afinidade da enzima pelo substrato e do poder catalítico da enzima Entendese por afinidade da enzima pelo substrato a maior ou a menor capacidade da enzima de se ligar ao substrato Já o poder catalítico é a capacidade de uma enzima em transformar o substrato ligado no com plexo enzimasubstrato ES em produto Todos esses fatores que influem na 7 Cinética enzimática velocidade das reações enzimáticas são responsáveis por dois grandes tipos de cinética denominados cinética michaeliana e cinética não michaeliana Na cinética michaeliana a afinidade da enzima pelo substrato e o poder catalítico da enzima permanecem constantes quando se faz variar a concentra ção do substrato A hipérbole observada no gráfico já estudado que representa a influência da concentração do substrato sobre a atividade de uma enzima é característica da cinética michaeliana Na cinética não michaeliana a afinidade da enzima pelo substrato ou o poder catalítico da enzima sofrem modificações em função da concentração do substrato ou outros modificadores da velocidade efetores Os parâmetros cinéticos de Km e Vmáx e sua aplicação sobre a inibição de enzimas A cinética michaeliana foi descoberta em 1913 Michaelis e Menten represen taram a reação enzimática em duas etapas Na maioria dos casos a etapa A é mais rápida do que a B que será assim a etapa limitante No estado inicial da reação a concentração do produto P é ainda muito pequena para possibilitar uma inversão de sentido ESE P Concluise então que Km é igual à concentração do substrato quando a velo cidade da reação for igual à metade da velocidade máxima O Km da enzima é expresso pela concentração do substrato em moles por litro Significado de Vmáx velocidade máxima e de Km A velocidade máxima de uma reação catalisada por uma enzima está na dependência do complexo ES A decomposição deste complexo ES em enzima E e produto P está na dependência do poder catalítico da enzima E A velocidade será máxima Vmáx quando toda a enzima et estiver sob a forma de ES ou seja quando não existir enzima livre O Km é diretamente proporcional a K2 o que nos mostra que quanto maior a afinidade da enzima pelo substrato maior será K1 e consequentemente o Km será menor O Km está relacionado com a afinidade da enzima pelo substrato quanto maior o Km menor a afinidade da enzima pelo substrato Figura 3 Cinética enzimática 8 Figura 3 Efeito da concentração do subs trato sobre a velocidade de reação para duas enzimas enzima 1 com Km menor e enzima 2 com Km maior Fonte Harvey e Ferrier 2012 É importante conhecer o valor de Km pelas seguintes razões 1 A concentração do substrato na célula não pode ser muito menor do que o Km pois neste caso um pequeno aumento do nível intracelular do substrato acarretaria um grande incremento na velocidade da reação e haveria um verdadeiro desperdício de enzima Uma concentração muito elevada do substrato não iria trazer nenhum benefício pois com S 1000 Km a velocidade da reação seria apenas duas vezes maior que no Km 2 O Km é uma constante diferente para cada enzima quando atua sobre um substrato específico O valor numérico do Km permite verificar se duas amostras de uma mesma enzima de origens diferentes podem ser consideradas idênticas 3 O Km também permite explicar porque uma mesma enzima pode em certos tecidos catalisar uma reação em um sentido e em outros tecidos em sentido contrário Isto ocorre com isoenzimas por exemplo 9 Cinética enzimática 4 Do mesmo modo esta constante torna possível interpretar a razão da existência de duas enzimas diferentes que catalisam exatamente a mesma reação em um mesmo tecido veja o box Fique Atento 5 O substrato sobre o qual a enzima atua melhor é aquele que apresenta um valor mais elevado para a relação VmáxKm Especificidade da ação enzimática Uma das propriedades mais características das enzimas é a especificidade Entendese por especificidade a propriedade das enzimas de catalisarem exclusivamente um grupo restrito de reações ou em alguns casos uma única reação veja o box Fique Atento Para entender um pouco mais sobre a cinética enzimática acesse o link abaixo e assista a um vídeo detalhado sobre o conteúdo FIRESTONE 2017 httpsgooglCZghWx Os inibidores enzimáticos são largamente empregados no estudo de vias metabólicas e em terapêutica para o tratamento de algumas enfermidades As sulfas por exemplo por apresentarem semelhança estrutural com o ácido paraaminobenzoico PABA que é uma substância indispensável para o crescimento bacteriano são utilizadas no tratamento de certas infecções Elas funcionam como inibidor competitivo da enzima que sintetiza uma coenzima bacteriana que possui a PABA em sua estrutura A coenzima não sendo sintetizada a bactéria fica impossibilitada de se multiplicar Cinética enzimática 10 FIRESTONE R An introduction to enzyme kinetics Khan Academy Mountain View 2017 Disponível em httpswwwkhanacademyorgtestprepmcatbiomolecules enzymekineticsvanintroductiontoenzymekinetics Acesso em 22 set 2017 HARVEY R A FERRIER D R Bioquímica Ilustrada 5 ed Porto Alegre Artmed 2012 Leitura recomendada NELSON D L COX M M Princípios de bioquímica de Lehninger 6 ed Porto Alegre Artmed 2014 11 Cinética enzimática Conteúdo sa GAH SOLUÇÕES EDUCACIONAIS INTEGRADAS