Acqa de Microbiologia

Descreva as etapas principais do processo de cultivo bacteriano em um laboratório de microbiologia UNIVERSIDADE INSTITUTO CAMPUS DISCIPLINA DE PROF Estudante Aula Prática PROCESSO DE CULTIVO MICROBIANO 1 Introdução O cultivo de microorganismos é um processo importante para manutenção das atividades diárias de um laboratório de microbiologia seja de prestação de serviços ou de pesquisa obter e manter células viáveis estocadas para comparações confirmações observações e atividades de ensino é um processo que demanda específicos cuidados e equipamentos O processo se inicia antes mesmo do trabalho com a amostra partindo de planos e protocolos de amostragem de lotes da definição da unidade analítica até a separação e preparação do material necessário como frascos e utensílios reagentes e diluentes e equipamentos usualmente tendo que passar por etapas de desinfecção em luz UV Ultravioleta ou esterilização em autoclave da SILVA et al 2017 2 Etapas do cultivo microbiano O cultivo de microorganismos em laboratório é extremamente rico e diversificado no que tange os materiais meios de cultura e soluções visto a grande diversidade de fatores de crescimento que microorganismos apresentam como crescimento em diferentes concentrações de oxigênio resistência a pH ácidos resistência a bacteriostáticos e agente antimicrobianos suplementações de meios de cultura temperaturas ideais de crescimento TORTORA 2012 No entanto apesar dessa diversidade há etapas e técnicas que são empregadas no modo geral em atividades laboratoriais e estas serão o foco deste trabalho 21 Homogeneização e retirada da unidade analítica Uma unidade analítica é a quantidade de material retirado da amostra para ser utilizado na realização de um ou mais ensaios O número de unidades analíticas que devem ser retiradas e a quantidade de material dependem do número e tipos de ensaios que serão realizados De maneira geral podemos dividir esse procedimento das seguintes maneiras unidade analítica de produtos líquidos de produtos sólidos ou líquidos concentrados pela técnica do esfregaço em superfície e por lavagem superficial No caso de amostras líquidas viscosidade não maior que a do leite elas devem ser acondicionadas em frascos com espaço suficiente para agitação inverter a embalagem 25 vezes se o frasco apresentar mais de 23 do espaço preenchido inverter 25 vezes num arco de 30cm em sete segundos caso não haja espaço a amostra deve ser transferida para um outro frasco estéril repetindo esse processo três vezes da SILVA et al 2017 UNIVERSIDADE INSTITUTO CAMPUS DISCIPLINA DE PROF Para amostras sólidas recomendase que a incerteza da medição do peso da mesma seja inferior a 01g e que a retirada da unidade analítica não deve passar de 15 minutos TAYLOR et al 2015 Além disso os autores descrevem técnicas específicas para amostras congeladas como tempo e temperatura de descongelamento dependendo da matriz analítica Também pode ser empregado banho com temperatura controlada e agitação desde que a matriz seja alimentos em sua embalagem original A técnica do esfregaço em superfície é aplicada com o uso de um utensílio conhecido como swab caracterizado por uma haste usualmente de plástico de 15 cm com uma bucha de algodão de 2cm por 5mm de diâmetro em uma das pontas devido ao seu baixo custo é comumente adquirido no comércio especializado pois como são embalados assepticamente são prontos para uso São recomendados principalmente para coleta de amostras com contaminação superficial como mesas equipamentos utensílios e embalagens da SILVA et al 2017 Por fim a técnica da lavagem superficial aplicase a alimentos de contaminação predominantemente superficial como carcaças de animais ovos grãos e sementes Essas amostras podem ser mergulhadas em diluente adequado contido em uma bolsa estéril que podem ser fechadas e agitadas com um diluente em seu interior para lavagem e coleta da contaminação da SILVA et al 2017 Um equipamento muito comum nessa prática é o Stomacher usado para transferir os microorganismos da amostra para o diluente 22 Diluente O diluente usado para a coleta e manipulação de microorganismos pode ser tão variado quanto a demanda analítica ou seja dependendo da especificidade da análise pode se adicionar suplementar e acondicionar o diluente de diferentes maneiras dado o conhecimento dos padrões bioquímicos e fatores de crescimento do grupo do microorganismo alvo podese favorecer seu crescimento em detrimento das demais espécies presentes na microbiota Por exemplo podese adicionar um tampão de pH ácido para favorecer a atividade de bactérias ácidoláticas ou adicionar cloreto de sódio para favorecer o crescimento de microbiota halofílica ao inibir a proliferação de microorganismos sensíveis a presença de sais TORTORA 2012 Usualmente o diluente mais empregado é a água peptonada 01 Obtida a partir da diluição seguida de esterilização de água destilada ou deionizada com peptona Esse diluente promove sua função de solvente como também prove aos microorganismos um mínimo de proteínas necessárias a sua atividade celular para que permaneçam viáveis até o momento do processamento da amostra da SILVA et al 2017 TORTORA 2012 UNIVERSIDADE INSTITUTO CAMPUS DISCIPLINA DE PROF 23 Diluição seriada Em matriz analítica onde o analista espera que encontre uma grande contaminação microbiana ao menos 103 UFC por grama ou mL e se deseja realizar uma contagem de colônias posteriormente é comum o emprego da diluição seriada Essa técnica consiste em transferir assepticamente 1 mL de uma amostra em tubo de ensaio contendo o diluente para um segundo tubo de ensaio contendo 9mL do diluente formando no segundo tubo 10 mL total Ao adicionar 1 mL de amostra em 9mL de diluente assumimos que foi realizada uma diluição de 10 vezes da SILVA et al 2017 Portanto ao inocular a partir deste segundo tubo este terá uma concentração de microorganismos 10x menor que o tubo contendo a amostra mais concentrada Esse procedimento pode ser repetido quantas vezes for necessário dependendo o foco da análise do microorganismo a ser analisado e do objetivo da técnica Podese citar como exemplos diluições seriadas em alimentos são aplicadas em sua maioria até 103 análises de qualidade sanitária de até 105 e produtos altamente contaminados oriundos de fermentações podese empregar diluição seriada na ordem de 109 da SILVA et al 2017 JAY 2005 24 Plaqueamento em profundidade pour plate O procedimento padrão de plaqueamento em profundidade tem limite de detecção de 10 UFCg para produtos sólidos ou 1 UFCmL para produtos líquidos A principal limitação dessa técnica é a necessidade de fusão do meio de cultura antes do uso no qual implica que alguns meios suplementados com componentes sensíveis ao calor depois da esterilização não podem ser reaquecidos para fusão do ágar antes do uso A técnica consiste em primeiramente observar as condições de assepsia durante toda sua execução e então passase a identificação dos tubos e placas que serão inoculados com o código da amostra a diluição e a sigla do meio de cultura contido Procedese a fusão dos meios de cultura em banho com água fervente mantendo a fervura apenas o tempo necessário para a fusão do ágar Resfriase imediatamente em água fria e mantemse à temperatura de 44 a 46C até o momento do suo em banho termostático ou estufa com temperatura controlada A não observação dessa temperatura irá implicar na solidificação do ágar da SILVA et al 2017 Para o plaqueamento de modo geral a amostra líquida é adicionada no fundo da placa e o ágar fundido é vertido assepticamente por cima da amostra Uma das vantagens dessa técnica é a limitação da disponibilidade de oxigênio para os microorganismos favorecendo os microaerófilos 25 Plaqueamento em superfície spread plate UNIVERSIDADE INSTITUTO CAMPUS DISCIPLINA DE PROF A principal diferença desta técnica para o pour plate é que nesta a amostra é inoculada assepticamente na superfície do ágar já solidificado na placa A inoculação superficial é considerada vantajosa sob alguns aspectos pois não expõe os microorganismos ao calor do meio fundido permite a visualização de características morfológicas das colônias facilita a transferência de colônias permite a utilização de meios de cultura que não podem ser reaquecidos após esterilização e não exige que os meios sejam translúcidos pois as colônias crescerão na superfície da SILVA et al 2017 O volume de inóculo é usualmente menor de 01 mL e podese aplicar técnicas de espalhamento na superfície com alça de Drigalski esterilizada O plaqueamento em superfície é usualmente combinado com a diluição seriada quando o intuito é obter contagem de UFC na amostra Cabe ressaltar a importância do preparo da amostra e da redução do erro de pesagem da mesma pois todos os cálculos de contagem serão expressos em função do peso ou volume da amostra 26 Filtração por membrana A filtração por membrana consiste em utilizar em ambiente asséptico uma filtração à vácuo da amostra em diluente A membrana usada possui poros de 045 µm suficiente para reter células de interesse enquanto permite a passagem dos demais componentes do meio Apesar de eficiente a filtração por membrana somente deve ser aplicada a amostras líquidas límpidas de forma que partículas sólidas não sejam retidas no filtro da SILVA et al 2017 De forma análoga a maior vantagem da filtração por membranas é que meios de cultura com componentes termolábeis podem ser previamente esterilizados sem o emprego de calor o que garante a integridade e biodisponibilidade de seus constituintes permitindo meios com alta especificidade para serem usados em testes bioquímicos de identificação microbiana TORTORA 2012 27 Incubação Após a inoculação sob assepsia as placas ou tubos dependendo da técnica sendo executada devem ser levadas a um ambiente com temperatura controlada normalmente estufas ou banhos termostáticos A importância da incubação se dá pela importância do controle de crescimento microbiano regido pela temperatura Assim como os componentes do meio a temperatura de incubação deve ser tal qual a necessária para manter as placas sob um ambiente ótimo de crescimento para os microorganismos de interesse enquanto inibese o crescimento de outros contaminantes TORTORA 2012 Por exemplo quando se deseja analisar a presença ou contagem de microorganismos termófilos como a Escherichia coli devemos realizar a incubação a 45C 01C pois essa é a temperatura ideal para seu crescimento Contudo é importante ter em mente o conceito de UNIVERSIDADE INSTITUTO CAMPUS DISCIPLINA DE PROF tempo de geração não basta somente incubar uma série de placas ou tubos na temperatura adequada mas também é necessário manter esse ambiente por um determinado tempo variando conforme o microorganismo em questão De modo geral o tempo mínimo de incubação é de 24h podendo chegar 72h para a maioria das bactérias 96h para leveduras e um período de até 14 dias se a análise visa o crescimento de actinomicetos TORTORA 2012 de OLIVEIRA 2003 28 Armazenamento e manutenção de cepas No intuito de manter cepas identificadas viáveis prontas para uso podese aplicar o uso de liofilizador e ultrafreezer de forma a manter células em estase Contudo o uso desses equipamentos é restrito a muitos laboratórios e instituições devido a um elevado custo para sua aquisição A prática tradicional para manutenção de cepas é a inoculação de colônias previamente isoladas e identificadas em tubos de ensaio contendo ágar padrão podendo ou não ser tamponado e suplementado e armazenadas sob refrigeração 4C da SILVA et al 2017 Contudo como sob essas condições as cepas têm sua atividade metabólica somente reduzida ao invés de paralisadas as células seguirão consumindo o substrato presente no meio de cultura podendo sofrer injúrias Esse fenômeno pode afetar principalmente suas características morfológicas reduzindo produtividade de metabólitos de interesse Por isso o repique semanais de colônias armazenadas sob essas condições devem ser feitos podendo chegar até o mínimo de um repique a cada 30 dias dependendo do metabolismo das espécies em questão SOLA et al 2012 3 Considerações Finais A partir deste trabalho foi possível discutir e descrever as principais etapas do processo de cultivo bacteriano em um laboratório de microbiologia Referências JAY JM Microbiologia de Alimentos 6ª Ed Editora Artmed Porto Alegre 2005 da SILVA N et al Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos e Água 5ª Ed Editora Blucher São Paulo 2017 de OLIVEIRA MF Identificação e caracterização de actinomicetos isolados em processos de compostagem Dissertação de mestrado Programa de Pósgraduação em Microbiologia Agrícola e do Meio Ambiente Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS 140p 2003 UNIVERSIDADE INSTITUTO CAMPUS DISCIPLINA DE PROF SOLA MC de OLIVEIRA AP FEISTEL JC MINAFRA E REZENDE CS Manutenção de microrganismos conservação e viabilidade Enciclopédia Biosfera V8 n14 p13981418 2012 TAYLOR TM SOFOS JN BODNARUK P ACUFF GR Sampling plans sample collection shipment and preparation for analysis Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods 5ª Ed American Public Health Association 2015 TORTORA GJ Microbiologia 10ª Ed Editora Artmed Porto Alegre 2012