Biologia Molecular e Forence Atv1

Questão 1 A eletroforese em gel de agarose é a maneira mais eficaz de separar fragmentos de DNA de tamanhos variados de 100 pb a 25 kb A agarose é isolada dos gêneros de algas marinhas Gelidium e Gracilaria e consiste em subunidades repetidas de agarobiose L e D galactose Durante a gelificação os polímeros de agarose se associam de forma não covalente e formam uma rede de feixes cujos tamanhos de poros determinam as propriedades de peneiramento molecular de um gel O uso da eletroforese em gel de agarose revolucionou a separação de DNA Antes da adoção dos géis de agarose o DNA era separado principalmente usando centrifugação em gradiente de densidade de sacarose que fornecia apenas uma aproximação do tamanho Para separar o DNA usando eletroforese em gel de agarose o DNA é carregado em poços prémoldados no gel e uma corrente é aplicada A estrutura de fosfato da molécula de DNA e RNA é carregada negativamente portanto quando expostos a um campo elétrico os fragmentos de DNA migrarão para o ânodo carregado positivamente Como o DNA possui uma relação massacarga uniforme as moléculas de DNA são separadas por tamanho dentro de um gel de agarose em um padrão tal que a distância percorrida é inversamente proporcional ao logaritmo de seu peso molecular Fonte Disponível em httpspmcncbinlmnihgovarticlesPMC4846332 Acesso em 09 abr 2024 Figura 1 Eletroforese em gel de agarose 1 a 16 amostras CN controle negativo CP controle positivo PPM padrão de peso molecular 100pb Fonte a autora A Figura 1 apresenta o resultado da eletroforese em gel de agarose 053 com brometo de etídio 10 µgml sob luz ultravioleta realizada para investigação de bactérias contendo o gene de resistência a antibióticos carbapenêmicos identificado por um fragmento de 300 pb pares de base Com base na figura 1 no conteúdo da disciplina e nos materiais complementares responda 1 EXPLIQUE qual a função do CN controle negativo CP controle positivo e PPM padrão de peso molecular 100pb 2 IDENTIFIQUE em quais amostras o gene de resistência a antibióticos carbapenêmicos está presente JUSTIFIQUE sua resposta Materiais complementares Disponível em httpswwwufrgsbreducienciarepositorioproedueletroforese20 20cartilha20do20estudante2020educienciapdf Acesso em 09 abr 2025 Questão 1 A eletroforese em gel de agarose é a maneira mais eficaz de separar fragmentos de DNA de tamanhos variados de 100 pb a 25 kb A agarose é isolada dos gêneros de algas marinhas Gelidium e Gracilaria e consiste em subunidades repetidas de agarobiose L e D galactose Durante a gelificação os polímeros de agarose se associam de forma não covalente e formam uma rede de feixes cujos tamanhos de poros determinam as propriedades de peneiramento molecular de um gel O uso da eletroforese em gel de agarose revolucionou a separação de DNA Antes da adoção dos géis de agarose o DNA era separado principalmente usando centrifugação em gradiente de densidade de sacarose que fornecia apenas uma aproximação do tamanho Para separar o DNA usando eletroforese em gel de agarose o DNA é carregado em poços prémoldados no gel e uma corrente é aplicada A estrutura de fosfato da molécula de DNA e RNA é carregada negativamente portanto quando expostos a um campo elétrico os fragmentos de DNA migrarão para o ânodo carregado positivamente Como o DNA possui uma relação massacarga uniforme as moléculas de DNA são separadas por tamanho dentro de um gel de agarose em um padrão tal que a distância percorrida é inversamente proporcional ao logaritmo de seu peso molecular Fonte Disponível em httpspmcncbinlmnihgovarticlesPMC4846332 Acesso em 09 abr 2024 Figura 1 Eletroforese em gel de agarose 1 a 16 amostras CN controle negativo CP controle positivo PPM padrão de peso molecular 100pb Fonte a autora A Figura 1 apresenta o resultado da eletroforese em gel de agarose 053 com brometo de etídio 10 µgml sob luz ultravioleta realizada para investigação de bactérias contendo o gene de resistência a antibióticos carbapenêmicos identificado por um fragmento de 300 pb pares de base Com base na figura 1 no conteúdo da disciplina e nos materiais complementares responda 1 EXPLIQUE qual a função do CN controle negativo CP controle positivo e PPM padrão de peso molecular 100pb 2 IDENTIFIQUE em quais amostras o gene de resistência a antibióticos carbapenêmicos está presente JUSTIFIQUE sua resposta Materiais complementares Disponível em httpswwwufrgsbreducienciarepositorioproedueletroforese20 20cartilha20do20estudante2020educienciapdf Acesso em 09 abr 2025 Respostas 1 Para garantir a qualidade confiabilidade e reprodutibilidade do método de eletroforese em gel é necessário que as amostras testadas sejam comparadas a uma amostra sabidamente negativa e uma positiva O controle positivo é realizar a confirmação que todo o processo de eletroforese como a extração e amplificação ocorreu de forma adequada Ou seja validação do protocolo e do seu processo técnico Como pode ser visto na imagem o controle positivo para o gene de resistência a carbapenêmicos 300pb foi visualizado ratificando um bom processo Por outro lado o controle negativo como informado é uma amostra que sabemos que não tem aquela sequência de DNA procurado no caso o gene de resistência à carbapenêmicos ele tem o objetivo de comprovar a ausência de contaminação dos reagentes e no processo que pode ser oriundo do ambiente de trabalho Se por algum motivo aparecer alguma banda no controle negativo isso pode sinalizar uma contaminação na técnica Na imagem vimos que o controle negativo não foi visualizado a presença do gene de 300pb Já o padrão de peso molecular consiste em uma mistura de fragmento de DNA de tamanhos previamente conhecidos neste caso 100 pb o que facilita a visualização de uma amostra de 300pb Ele é usado como uma régua para estimar o tamanho dos fragmentos de DNA comparando sua corrida no gel com o padrão 2 De acordo com a imagem a amostra 14 contém um fragmento de gene com corrida e peso semelhante ao controle positivo 300pb gene de resistência à carbapenêmicos indicando que possivelmente a bactéria da amostra 14 não será responsiva ao classe de carbapenêmicos Referências Smith C J Osborn A M 2009 Advantages and limitations of quantitative PCR QPCR based approaches in microbial ecology FEMS Microbiology Ecology 671 620 httpsdoiorg101111j15746941200800629x He M et al 2019 Polymerase chain reaction and gel electrophoresis for DNA analysis Methods in Molecular Biology 1906 123132 doi10100797814939896668 Corrrea E Possik P A ANÁLISE DE DNA POR ELETROFORESE Disponivel em httpswwwciencianewscombrarquivosACETIMAGENSbiologiamolecular testesgeneticospdf Acesso em 11062025 as 1605h