Biologia Molecular e Forense - Professora Dra. Ana Luisa Monezi Lucena

ACESSE AQUI O SEU LIVRO NA VERSÃO DIGITAL PROFESSORA Dra Ana Luisa Monezi Lucena Biologia Molecular e Forense FICHA CATALOGRÁFICA C397 CENTRO UNIVERSITÁRIO DE MARINGÁ Núcleo de Educação a Distância LUCENA Ana Luisa Monezi Biologia Molecular e Forense Ana Luisa Monezi Lucena Maringá PR Unicesumar 2021 Reimpresso em 2023 224 p ISBN 9786556157108 Graduação EaD 1 Forense 2 Biologia 3 Molecular EaD I Título Impresso por Bibliotecário João Vivaldo de Souza CRB 91679 Pró Reitoria de Ensino EAD Unicesumar Diretoria de Design Educacional NEAD Núcleo de Educação a Distância Av Guedner 1610 Bloco 4 Jd Aclimação Cep 87050900 Maringá Paraná wwwunicesumaredubr 0800 600 6360 PRODUÇÃO DE MATERIAIS DIREÇÃO UNICESUMAR NEAD NÚCLEO DE EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA Reitor Wilson de Matos Silva ViceReitor Wilson de Matos Silva Filho PróReitor de Administração Wilson de Matos Silva Filho PróReitor Executivo de EAD William Victor Kendrick de Matos Silva PróReitor de Ensino de EAD Janes Fidélis Tomelin Presidente da Mantenedora Cláudio Ferdinandi Diretoria Executiva Chrystiano Mincoff James Prestes Tiago Stachon Diretoria de Graduação e Pósgraduação Kátia Coelho Diretoria de Cursos Híbridos Fabricio Ricardo Lazilha Diretoria de Permanência Leonardo Spaine Diretoria de Design Educacional Paula Renata dos Santos Ferreira Head de Graduação Marcia de Souza Head de Metodologias Ativas Thuinie Medeiros Vilela Daros Head de Tecnologia e Planejamento Educacional Tania C Yoshie Fukushima Gerência de Planejamento e Design Educacional Jislaine Cristina da Silva Gerência de Tecnologia Educacional Marcio Alexandre Wecker Gerência de Produção Digital Diogo Ribeiro Garcia Gerência de Projetos Especiais Edison Rodrigo Valim Supervisora de Produção Digital Daniele Correia Coordenador de Conteúdo Sidney Edson Mella Junior Designer Educacional Vanessa Graciele Tiburcio Curadoria Gisele da Silva Porto Revisão Textual Cindy Mayumi Okamoto Luca Editoração Juliana Duenha Lucas Pinna Silveira Lima Ilustração André Azevedo Realidade Aumentada Maicon Douglas Curriel Fotos Shutterstock CDD 22 ed 5748 AVALIE ESTE LIVRO ACESSE O QRCODE CRIAR MOMENTOS DE APRENDIZAGENS INESQUECÍVEIS É O NOSSO OBJETIVO E POR ISSO GOSTARÍAMOS DE SABER COMO FOI SUA EXPERIÊNCIA Conta para nós leva menos de 2 minutos Vamos lá DIGITE O CÓDIGO 02511138 RESPONDA A PESQUISA Aqui você pode conhecer um pouco mais sobre mim além das informações do meu currículo Profa Dra Ana Luisa Monezi Lucena Meu nome é Ana Luísa e sou bióloga Despertei o meu interesse pela área quando iniciei o Ensino Médio Quando uma profes sora de Biologia trazia à sala de aula materiais ilustrativos do conteúdo eu achava fantástico O ingresso na graduação e a participação em projetos de pesquisa me trouxeram indepen dência pois comecei a me organizar em relação aos estudos e à aplicabilidade financeira do pouco que ganhava com as bolsas de estudo O mestrado e o doutorado foram ainda mais moti vadores A pesquisa era como uma busca de descobertas para o bem da humanidade As oportunidades de estudo que a vida me deu têm trazido muitos privilégios No entanto às vezes acredito que não dou o real valor pois penso ser um pouco insignificante diante dos sonhos que ainda não alcancei Por outro lado orgulhome visto que aqueles que buscam chegar até aqui refletem admiração por mim Além da profissional da educação que me tornei tenho planos que fogem um pouco desse contexto Adoro fazer exercícios Se o tempo me permitir serei uma atleta amadora de triathlon já que eu adoro nadar correr e andar de bicicleta Não sou competitiva diria que sou resisten te Essa resistência me apoia em muitas situações Sou aquelas que quando começa alguma coisa não pára até que seja fina lizada Entretanto a resistência me abandona em momentos de emoção Sou emotiva e vivo o momento do outro seja de tristeza seja de alegria Adoro conversar com os idosos Co municome com os olhos verdadeiros de um cão e me fascina aprender novas tecnologias Sou muito eclética quanto aos gostos musicais mas a pre ferência é dada ao pagode e ao pop rock Acreditava que tinha talento à área musical durante a minha adolescência quando gravei algumas músicas com meu irmão e meu primo no es túdio do meu tio Acredito que a minha maior habilidade é ser professora Às vezes vejome como policial e perita Talvez tenha sido a maior motivação de escrever este livro um modo de mostrar a área da biologia na investigação forense Meu currículo httplattescnpqbr0115131128803059 Quando identificar o ícone de QRCODE utilize o aplicativo Unicesumar Experience para ter acesso aos conteúdos online O download do aplicativo está disponível nas plataformas Google Play App Store Ao longo do livro você será convidadoa a refletir questionar e transformar Aproveite este momento PENSANDO JUNTOS EU INDICO Enquanto estuda você pode acessar conteúdos online que ampliaram a discussão sobre os assuntos de maneira interativa usando a tecnologia a seu favor Sempre que encontrar esse ícone esteja conectado à internet e inicie o aplicativo Unicesumar Experience Aproxime seu dispositivo móvel da página indicada e veja os recursos em Realidade Aumentada Explore as ferramentas do App para saber das possibilidades de interação de cada objeto REALIDADE AUMENTADA Uma dose extra de conhecimento é sempre bemvinda Posicionando seu leitor de QRCode sobre o código você terá acesso aos vídeos que complementam o assunto discutido PÍLULA DE APRENDIZAGEM Professores especialistas e convidados ampliando as discussões sobre os temas RODA DE CONVERSA EXPLORANDO IDEIAS Com este elemento você terá a oportunidade de explorar termos e palavraschave do assunto discutido de forma mais objetiva BIOLOGIA MOLECULAR E FORENSE A biologia molecular área de extensão da biologia aproxima você do entendimento específico das ações feitas pelo detentor da informação genética o DNA e das estratégias usadas para manipular essa e outras moléculas biológicas Você já pensou na importância do papel do estudo da biologia molecular para o seu aprimoramento profissional futuroa profissional de saúde Qual seria a aplicabilidade desse estudo para sua carreira Com certeza você já se deparou com casos envolvendo a aplicabilidade dos conhecimentos da biologia molecular e não refletiu sobre o fato O que acha de começar agora Imagine um caso em que uma mulher a Maria teve um relacionamento com João Desse relacionamento nasceu José que aos três anos de idade começou a apresentar alguns sintomas preocupantes e que dificulta va o dia a dia dele ao respirar apresentava cansaço constante Foi detectado que ele tinha uma doença genética grave que demandava cuidados diários da mãe e transfusões sanguíneas a cada 20 dias No entanto há três semanas Maria adoeceu e estava com dificuldades de cuidar de José Sem notícias de João por pelo menos 10 anos Maria foi em busca do paradeiro dele Com a ajuda de algumas pessoas Maria entrou em contato com João que não aceitou a ideia de ser o pai de José Em busca da justiça Maria foi aconselhada a levar o filho para fazer alguns exames que ajudassem a comprovar a paternidade de José Certamente você já deve ter ouvido alguém falar sobre o teste de paternidade Você sabia que exames de DNA envolvem a compreensão dos estudos da biologia molecular Sabia que as meto dologias utilizadas para fazer testes como esse provêm dos estudos desta disciplina Por que seria importante o entendimento dos conceitos desta disciplina Apesar de os testes de paternidade utilizando o DNA começarem a ser divulgados no Brasil apenas no final do século XX principalmente a partir de programas populares de televisão que o ofereciam a camadas sociais de baixa renda o exame já era utilizado no meio científico desde meados do século passado A popularização do teste de DNA resultou no aumento da demanda do exame A utilização do teste de DNA constitui uma forma de provar por intermédio de métodos confiá veis a legitimidade do parentesco entre pessoas A utilização dele é importante como um meio de produção de prova no processo civil especificamente em relação ao Direito de Família Além disso esse tipo de exame para ser validado precisa ser feito por laboratórios autorizados e assinado por profissional especializado que tem competência e respaldo legal para a realização A prática é a melhor maneira de compreender os conceitos de um tema Dessa forma para melhor entendimento da biologia molecular pesquise em sites confiáveis e em artigos científicos dados a respeito da busca da paternidade a partir do exame de DNA no Brasil será que temos uma faixa etária determinante dos pais que procuram pela confirmação da paternidade Existe uma predo minância dessa busca em relação a alguma classe social específica Como pode ser comprovada a confiabilidade dessa técnica Em casos de supostos pais não encontrados ou que tenham falecido como pode ser procedido o processo de reconhecimento Agora que você colocou a mão na massa quais foram os resultados de sua pesquisa Será que a técnica é 100 confiável Quais foram as suas conclusões Em relação à situação hipotética apresentada inicialmente comprovar a paternidade da criança poderia contribuir como um modo de investigação da doença de José Pense no quanto é importante a sua atuação profissional na vida de José e de tantos outros Para iniciar a nossa narrativa sobre a biologia molecular e forense realizaremos uma revi são geral sobre a estrutura e as bases das informações moleculares Também exporemos o controle de qualidade necessário em laboratórios de biologia molecular Posteriormente serão apresentadas as tecnologias de estudo dos ácidos nucleicos e das proteínas responsáveis pela manutenção do material genético eou atividades celulares sendo elas identificação manipu lação amplificação e análise dos funcionamentos utilizados hoje Além disso serão explicadas as combinações das técnicas com a biotecnologia de DNA recombinantes para produção de produtos comerciais na área da saúde Para finalizar você aplicará todos os conhecimentos aprendidos sobre a biologia molecular no uso da chamada ciências forenses São muitas curiosidades Você não vai perder né Antes que eu me esqueça mais um spoiler para você ao longo de cada unidade de aprendizagem há podcasts interessantes e que complementam o conteúdo de cada ciclo ao trazerem curiosidades envolventes Depois de finalizar esta disciplina você perceberá que são muitas as esferas em que poderá atuar Quem sabe em um laboratório onde você seja responsável por fazer exames e interpretar os resultados de análises clínicas Em um laboratório que tenha a ação de diagnosticar doenças Fazer análises bromatológicas para verificar contaminações em alimentos Pesquisar e desen volver produtos obtidos por biotecnologias tais como medicamentos e vacinas Você poderá ainda elucidar crimes por meio da análise de vestígios na Polícia Federal ou Civil Mergulhe nesta jornada e não perca tempo E você O que espera com este estudo Já pensou a respeito de qual área você mais gosta e como poderá aplicar todo o conhecimento Convido você a mergulhar nesta busca Venha conhecer uma das fascinantes áreas da biologia a biologia molecular e forense 3 1 2 4 5 6 APRENDIZAGEM CAMINHOS DE 11 53 37 81 REVISÃO GERAL DA ESTRUTURA E DAS BASES DAS INFORMAÇÕES MOLECULARES 125 MARCADORES MOLECULARES QUE DETERMINAM E ANALISAM O DNA E AS APLICAÇÕES DELE NA PESQUISA NA ÁREA BIOMÉDICA FERRAMENTAS DE MANIPULAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO CONTROLE DE QUALIDADE EM LABORATÓRIOS DE BIOLOGIA MOLECULAR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE E SUAS APLICAÇÕES MÉTODOS DE SEQUENCIAMENTO DE DNA 103 7 8 9 149 167 A BIOINFORMÁTICA APLICADA AOS ESTUDOS DA PESQUISA E AO DIAGNÓSTICO MOLECULAR BIOTECNOLOGIAS PARA A PRODUÇÃO DE VACINAS FÁRMACOS TESTES GENÉTICOS E TERAPIA GÊNICA 185 BIOLOGIA FORENSE E AS APLICABILIDADES NA ÁREA DA SAÚDE 1 Nesta unidade você relembrará a composição a estrutura e a fun ção do DNA ácido desoxirribonucleico Também compreenderá como as informações moleculares do DNA são passadas entre as gerações e transformadas em características extremamente com pletas e diversas Por fim conhecerá os ajudantes do DNA nessa jornada incluindo as enzimas e as proteínas de ação Revisão geral da estrutura e das bases das informações moleculares Dra Ana Luisa Monezi Lucena 12 UNICESUMAR Nós já sabemos que somos gerados por células reprodutoras espermatozoide e óvulo Todavia você já pensou naquilo que essas células contêm e que nos tornam tão completos Temos por exemplo órgãos sexuais que nos diferenciam em relação às aparências e às funções reprodutoras Temos um cérebro que capta e emite informações e ideias Também há um corpo que nos permite efetuar as nossas vontades Talvez a sua resposta seria o DNA Contudo você já imaginou como células tão pequenas e únicas como as reprodutoras armazenam as informações do DNA e são capazes de desenvolver estruturas e habilidades corporais tão complexas Em que aspecto diferencia o DNA de cada um de nós visto que somos tão diversos e ao mesmo tempo iguais em outros aspectos Nós compreenderemos primeiramente a jornada das etapas que ocorrem no interior das células reprodutoras dos pais com o intuito de entendermos como a molécula de DNA que é proveniente deles emite informações que a desenvolvem Você compreenderá que existem diferenças na expressão do DNA Por exemplo pense em um irmão como ele é diferente do outro irmão se o DNA é proveniente dos mesmos pais Essas e outras respostas você recordará e responderá nesta unidade Entender que a informação necessária para nos formar é proveniente dos conhecimentos relativos à composição à estrutura e à função da molécula de DNA é reconhecer que as células iniciais carre gam essas informações Os gametas passam por etapas ordenadas de eventos pois logo após a união das células gaméticas masculinas e femininas há a formação de uma nova e única célula a qual está condicionada ao desenvolvimento de inúmeras células por divisões sucessivas formando os tecidos e os órgãos do corpo Todos os comandos para efetuar essas ações são dados pelas informações contidas no DNA os genes que são multiplicados a cada nova célula que se forma Esses genes são regulados de modo a estimular ou a inibir a ação de acordo com a localização corporal e as vias biológicas existentes Na ambientação dessas etapas que chegam a traduzir a informação genética contida no DNA podem ocorrer raras alterações que refletem em variações no funcionamento ou em características do corpo Alguns exemplos incluem o nascimento de Um diabético o qual não produz insulina Uma criança com fissura labial Um indivíduo albino Um sujeito com problemas no fígado Dessa forma há diversas razões para que os profissionais da saúde compreendam o magnetismo que abrange a molécula de DNA uma vez que ele fornece a base para a compreensão dos fundamentos biológicos que levam a formação do indivíduo Isso gera consequentemente o melhor entendimento do processo de doenças o qual em alguns casos pode promover a prevenção e encontrar tratamentos Em meio à compreensão das particularidades da molécula de DNA muitas pesquisas surgiram para tentar entender as doenças e impedir o progresso delas Para algumas situações foram desen volvidos fármacos Para outras foram feitas vacinas e técnicas laboratoriais tais como a radioterapia e a quimioterapia Diante disso pesquise em bancos de dados confiáveis três descobertas feitas pela biologia molecular para a criação de soluções ações tratamento e prevenção de doenças o que se deu 13 UNIDADE 1 a partir do conhecimento da composição da estrutura e do funcionamento do DNA Verifique quais foram os procedimentos adotados nas descobertas dos pesquisadores Os avanços científicos da biologia molecular se perpetuam seguramente desde os anos 50 após determinação da estrutura da DNA por James Watson e Francis Crick A partir disso progressos grandiosos aconteceram nessa área Diante do exposto você concorda que há melhorias trazidas com o estudo da molécula de DNA Por que a variação dos genes da molécula de DNA pode modificar a funcionalidade e as características do nosso corpo Você reconhece que entender as particularidades da estrutura da molécula de DNA foi o primeiro passo para diversas ações Quais são os outros procedimentos que deveriam ser adotados para con cretizar as ações benéficas destinadas ao tratamento de doenças Já sabemos que nascemos a partir do encontro de duas células reprodutoras e que elas são os veículos de transporte das nossas características genéticas armazenadas em forma de DNA Agora pensemos microscopicamente no DNA no interior dessas células Considere que dentro do espermatozoide de seu pai e no óvulo de sua mãe há uma estrutura chamada núcleo que será o local de endereço do DNA Quando ocorre a junção das células gaméticas os DNAs de ambas as células se encontram para gerar o seu próprio DNA que te acompanhará ao longo da vida Entre 1952 e 1953 os pesquisadores James Watson e Francis Crick decifraram a estrutura da molécula de DNA contida no interior das nossas células A partir de então deuse como marco o nascimento da biologia molecular ao decifrar e ao desvendar as habilidades e as competências do carregador das informações genéticas De acordo com os pesquisadores a estrutura do DNA seria uma dupla fita DIÁRIO DE BORDO 14 UNICESUMAR disposta na forma de uma hélice Essa conclusão foi conseguida com base na análise de padrões de um raio X realizado por duas pesquisadoras Rosalind Franklin e Maurice Wilkins além da contribuição de Erwin Chargaff no que diz respeito à análise dos constituintes dessas fitas LODISH et al 2014 Se fôssemos retirar o DNA do interior do núcleo da célula gerada após a fecundação dos gametas observaríamos com a utilização da técnica de difração de raio X determina a estrutura atômica tri dimensional de uma molécula a molécula de DNA na forma de duas fitas enroladas em hélice assim como pode ser observado na Figura 1 Você também perceberia que cada uma dessas fitas é constituída por várias unidades específicas chamadas nucleotídeos e que se diferenciam em quatro tipos Eles se associam para constituir as duas fitas de polinucleotídeos Os nucleotídeos podem ser comparados a tijolos para construir a fita de DNA enquanto o cimento seria representado pelas ligações entre um nucleotídeo e outro as quais são chamadas de fosfodiéster É importante ressaltar que é apenas nas células eucariontes que o DNA está no interior do núcleo Essas células carregam outros diferenciais como a presença de organelas Observe a seguir na Realidade Aumentada a representação de uma célula eucarionte com núcleo e organelas Veja a animação a seguir a qual mostra como é a estrutura do DNA Para acessar use seu leitor de QR Code REALIDADE AUMENTADA Citoplasma de uma célula eucarionte 15 UNIDADE 1 A B C D Descrição da Imagem figura evidencia em A os nucleotídeos que são compostos por um açúcarfosfato ligado covalentemente a uma base guanina G formando um nucleotídeo Em B é representada parte da fita 5 3 de DNA com as bases G ligadas à C que está vinculada à A que está ligada à T Em C mostrase a fita dupla de DNA completa de forma filamentar Nela as bases nitrogenadas estão associadas por ligações de hidrogênio G faz três ligações de hidrogênio com C enquanto T faz duas ligações de hidrogênio com A No total a dupla fica representada com 10 pares de bases de cada lado Na imagem D a molécula de DNA está representada em forma de hélice com as mesmas 10 bases mostradas em C Figura 1 Representação da composição do DNA Fonte Alberts et al 2017 p 173 16 UNICESUMAR O diferencial dos nucleotídeos está nos elementos constituintes Cada um é composto por uma base nitrogenada um grupo fosfato e um carboidrato do tipo desoxirribose constituído por seis átomos de carbono sendo que um deles apresenta um hidrogênio na posição 2 A principal distinção está nas bases nitrogenadas que são de quatro tipos Adenina A Guanina G Citosina C e a Timina T As duas primeiras são quimicamente constituídas por dois anéis e chamadas de bases purinas enquanto as duas últimas apresentam apenas um anel e são designadas como bases pirimidinas Figura 2 Em cada nucleotídeo uma das quatro bases diferentes estará ligada ao carbono 1 do carboidrato en quanto o grupo fosfato estará no carbono 5 Figura 3 TIMINA ADENINA GUANINA CITOSINA Descrição da Imagem a figura mostra as quatro bases nitrogenadas usualmente encontradas no DNA As purinas A adenina e G guanina são representadas com a constituição de dois anéis As pirimídicas C citocina e T timina carregam apenas um anel Também é demonstrada a complementaridade A T e C G Figura 2 Bases nitrogenadas usualmente encontradas no DNA 17 UNIDADE 1 O importante é imaginar as duas fitas de DNA construídas por nucleotídeos e ligadas entre si por meio de ligações fosfodiéster As ligações entre os nucleotídeos da fita acontecem entre o carbono 3 do carboidrato desoxirribose e o grupo fosfato do outro nucleotídeo localizado no carbono 5 Dessa maneira duas fitas ficam dispostas de forma antiparalela identificadas como 5 3ou 3 5 de acordo com as extremidades que ficam livres ou seja sem ligação química no início ou no final de cada fita Figura 4 ALBERTS et al 2017 CITOSINA ÁCIDO FOSFÓRICO BASE FOSFATO AÇÚCAR DESOXIRRIBOSE AÇÚCAR E FOSFATO VOLTADO AO LADO DE FORA NUCLEOTÍDEO Descrição da Imagem a figura mostra a estrutura do nucleotídeo Indicados por setas estão o ácido fosfórico a base exemplificada como a citosina e o carboidrato desoxirribose A união desses componentes é observada na parte inferior visto que o carboidrato localizado no centro associa na posição 5 o ácido fosfórico e na posição 1 a base nitrogenada não mostrando os números 1 e 5 das posições do carbono Figura 3 Nucleotídeo de DNA 18 UNICESUMAR Para finalizarmos a construção da fita de DNA é preciso ligar as duas fitas e realizar uma torção voltada ao lado direito a fim de formar a hélice observada na Figura 1 Para isso é preciso ligar as fitas entre si Nesse caso as bases dos nucleotídeos de cada uma das fitas se associam por intermédio de uma ligação denominada ligação de hidrogênio No entanto a combinação delas entre as fitas é específica a adenina sempre se pareia com a timina enquanto a guanina sempre se pareia com a citosina ALBERTS et al 2017 NUCLEOTÍDEO NUCLEOSÍDEO PENTOSE RESÍDUO DE ÁCIDO FOSFATO L LIGAÇÃO DE HIDROGÊNIO BASE NITROGENADA Descrição da Imagem na figura é mostrada uma dupla fita de DNA antiparalela Assim do lado esquerdo há a fita 5 3 enquanto do lado direito há a fita 3 5 A união das fitas antiparalelas é observada a partir da associação complementar das bases nitrogenadas de cada nucleotídeo na parte central AT e CG Figura 4 Dupla fita de DNA antiparalela Você já se perguntou qual é o tamanho do DNA em nossas células 19 UNIDADE 1 Segundo Naoum 2010 em cada célula do organismo o filamento estendido de DNA chega a ter cerca de dois metros Nesse sentido se pensarmos que em nosso corpo há cerca de 10 trilhões de células teríamos uma ideia da enormidade de DNA que temos Você seria nada mais que um proprietário de 20 milhões de quilômetros de DNA Já entendemos como é a constituição e a forma do DNA que está no interior das células Agora é preciso compreender como essa molécula expressa as características comentadas no início da unidade O principal aspecto é a leitura das sequências de nucleotídeos da fita de DNA o que servirá de código para determinar cada característica Essas sequências são chamadas de genes e carregam as instruções para a produção de proteínas Pode surgir a seguinte dúvida qual é a relação entre as proteínas e as características As proteínas representam as macromoléculas biológicas mais abundantes no corpo ocorrendo em todas as célu las e em todas as partes dela Estruturalmente e metabolicamente elas te acompanham e efetuam o funcionamento eficaz do seu corpo Por exemplo a insulina é uma proteína responsável por regular a taxa de glicose no sangue No fígado há uma variedade de enzimas e hormônios que são proteínas que participam de várias funções específicas tais como a conversão de gorduras carboidratos e de proteínas em nutrientes e em energia NELSON COX 2014 Agora você entenderá como o DNA exerce ações para expressar a informação genética em forma de proteínas Após a descoberta da estrutura do DNA revelouse que ele era capaz de formar uma molécula intermediária o RNA ácido ribonucleico Também foi descoberto que a partir dela ocorria a tradução das informações contidas no DNA em aminoácidos formando as proteínas Acontecimentos como esses marcaram a biologia molecular consagrando como o dogma central da biologia molecular Figura 5 ALBERTS et al 2017 20 UNICESUMAR O dogma central corresponde aos passos que o DNA procede a fim de transmitir a informação final que é a produção de RNAs e proteínas No entanto para que esses eventos aconteçam é preciso entender como é o RNA em que local ele é encontrado e quais são os ajudantes do DNA para efetuar essas ações A molécula de RNA assim como o DNA é denominada ácidos nucleicos Ambos são encontrados no núcleo da célula formada após a fecundação dos gametas e em todas as células que surgirem por multiplica ções sucessivas Contudo além de ser encontrado no núcleo o RNA está no citoplasma das células local que intermedeia o núcleo e processa a formação das proteínas mediante as instruções trazidas pelos RNAs Faço uso do plural os RNAs porque para desencadear essa ação são formados três tipos principais de RNAs o RNAm RNA mensageiro o RNAt RNA transportador e o RNAr RNA ribossômico ALBERTS et al 2017 DNA DNA RNA PROTEÍNA Aminoácidos Síntese de DNA REPLICAÇÃO Nucleotídeos Síntese de RNA TRANSCRIÇÃO Síntese de proteína TRADUÇÃO Descrição da Imagem tratase de um esquema que representa o dogma central da biologia molecular Assim são expressos o pro cesso de replicação da molécula de DNA a transcrição em que o DNA forma o RNA e a tradução momento em que o RNA expressa a informação genética e forma a proteína com os aminoácidos Figura 5 Dogma central da biologia molecular Fonte Alberts et al 2017 p 3 21 UNIDADE 1 Estruturalmente o RNA na forma primária assemelhase ao DNA com duas diferenças o carboi drato que compõe o RNA a ribose tem um grupo hidroxila na posição 2 e a base dos nucleotídeos de timina do DNA é substituída pela uracila U Quanto à forma a maioria dos RNAs celulares é de fita simples e exibe uma variedade de conformações LODISH et al 2014 Ácido Desoxirribonucleico Ácido Ribonucleico Fita dupla açúcar fosfato desoxirribose Pares de bases Nucleobases Bases únicas Fita única açúcar fosfato ribose Timina Citosina Adenina Uracila Guanine Descrição da Imagem na figura o RNA apresenta uma fita simples e o DNA contém uma fita dupla Paralelo a cada ácido nucleico no DNA o carboidrato contém um átomo de hidrogênio H no carbono 2 enquanto no RNA é mostrado o grupo hidroxila OH na mesma posição Na parte inferior da imagem estão as bases nitrogenadas comuns entre colchetes C G A Já as específicas estão isoladas timina do DNA e uracila do RNA Figura 6 Diferenças entre as moléculas de DNA e RNA 22 UNICESUMAR Voltando à célulaovo que se formou depois da fecundação dos gametas imagine o DNA no interior e como se prossegue a transmissão da informação genética A princípio é necessário que se formem os RNAs processo chamado de transcrição uma vez que transcreve parte das informações que estão no DNA para o RNA Você se lembra que as sequências de nucleotídeos seriam códigos denominados genes e corresponderiam a uma característica Desse modo cada gene será uma unidade do DNA que conterá as informações com o intuito de sintetizar um dos RNAs funcionais As cópias de RNAs são os codificadores de proteínas mais precisamente o RNAm LODISH et al 2014 Durante a transcrição uma sequência de nucleotídeos de uma das fitas de DNA servirá como modelo para formar o RNA A sequência específica da linguagem das quatro bases dos nucleotídeos do DNA é copiada na linguagem das quatro bases do RNA modificando a timina por uracila No entanto você pode estar se perguntando em que local esses nucleotídeos estão para formar o RNA Eles estão dispersos no núcleo celular e são capturados por uma enzima específica responsável por fazer a transcrição o RNA polimerase ALBERTS et al 2017 Observe a Figura 7 para realizar a transcrição o RNA polimerase reconhece no DNA um sítio de ligação específico chamado de promotor Em seguida iniciase a separação das fitas O RNA polime rase pareia os nucleotídeos complementares ao DNA de modo que a associação e a construção da fita de RNA seguem o que está descrito no DNA mais precisamente na fita 3 5 do DNA O pareamento ocorrerá de modo que quando houver um nucleotídeo de base A adenina o RNA polimerase ligará uma U uracila Quando for T timina ligará A adenina e quando for G guanina ligará C citosina As combinações seguem até finalizar o gene correspondente ao RNA Além disso o RNA polimerase realizará as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos do RNA formador e depois reconhecerá um local de parada em que o RNA recémformado de fita simples 5 3 dissociará do DNA e liberará o RNA polimerase LODISH et al 2014 23 UNIDADE 1 INICIAÇÃO 1 A polimerase ligase à sequencia promotora no dúplex de DNA Complexo fechado 2 3 A polimerase dissocia o dúplex de DNA próximo ao sítio de início da transcrição formando uma bolha de transcrição Complexo aberto A polimerase catalisa a ligação fosfodiéster de dois rNTPs iniciais 4 5 ALONGAMENTO A polimerase avança na direção 3 5 da ftamolde dissociando o dúplex de DNA e adicionando rNTPs ao RNA crescente TERMINAÇÃO No sítio de parada da transcrição a polimerase libera o RNA completo e dissociase do DNA RNApolimerase Sítio de início na ftamolde Sítio de parada na ftamolde Promotor Bolha de transcrição RNA nascente Região híbrida de DNARNA Fita de RNA completa 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 3 Descrição da Imagem tratase de um esquema que mostra o processo de transcrição Nele o RNA polimerase representado pela cor amarela adiciona os nucleotídeos que são complementares ao DNA formando a fita de RNAm em progresso Além disso é mostrado o processo de transcrição em três etapas Iniciação acontece no reconhecimento do sítio promotor pelo RNA polimerase e na adição dos primeiros ribonucleotídeos Alongamento crescimento da fita de RNA Terminação ocorre quando o RNA polimerase identifica o sítio de parada da transcrição dissociandose e completando a formação do RNA Figura 7 Processo de transcrição Fonte Lodish et al 2014 p 126 24 UNICESUMAR Já sabemos que o processo de transcrição forma diferentes tipos de RNA Três deles são os principais participantes da expressão da informação genética do DNA O RNAm codifica as informações do gene que dirigirá a síntese de uma proteína o RNAr forma o núcleo estrutural e o catalítico dos ribossomos que traduz os RNAm em proteínas enquanto os RNAt atuam como adaptadores que selecionam os aminoácidos específicos e os posiciona adequadamente sobre os ribossomos com o objetivo de que eles sejam incorporados em uma proteína ALBERTS et al 2017 Partindo do imaginário do interior da célula você sabe que no núcleo há a transcrição do DNA para RNA Neste momento acredito que você pen se que o RNA já está pronto para traduzir a informação do DNA e produzir a tão esperada característica na forma de proteínas Pelo contrário esses RNAs ainda passarão por modificações fato que foi reconhecido porque pesquisadores compararam as sequências de nucleotídeos do RNAm com o do DNA utili zado como modelo Eles admiraram que as sequências de nucleotídeos que estabeleciam os aminoácidos da proteína do RNA não correspondiam às sequências do DNA codificador LODISH et al 2014 Dessa maneira é preciso compreender mais uma etapa antes de finalizar a expressão das informações do DNA As sequências não encontradas no RNAm pelos pesquisadores foram chamadas de introns Eles detectaram que essas sequên cias eram removidas ficando apenas as sequências codificadoras chamadas de éxons Coincidentemente elas correspondiam aos nucleotídeos que conferem os aminoácidos da proteína compa rada ao RNA analisado A partir dessa modificação observaram mais duas alterações uma na extremidade 5 do RNAm em que é adicionado um grupo 7 metilguanilato denominado cap 5 o qual funcionalmente está envolvido na proteção do RNAm da degradação enzimática e auxilia na exporta ção ao citoplasma A segunda alteração está na extremi dade 3 na qual se adiciona uma fita de resíduos de ácido adenílico em torno de 100 a 250 bases A pela enzima poli A polimerase LODISH et al 2014 25 UNIDADE 1 As modificações ocorridas com a transcrição foram somente para o RNAm visto que há mais detalhes No entanto é sabido que ocorrem outros modos de processamento em RNAt e RNAr os quais não são muito relatados em livros Para finalizar a expressão da informação do DNA você compreenderá como uma sequência de nucleotídeos do RNA formará os aminoácidos de uma proteína processo chamado de tradução Considerando a célulaovo formada no começo da nossa discussão podemos afirmar que o processo de tradução no início do desenvolvimento é bem frequente uma vez que é necessário produzir uma grande quantidade de proteínas e enzimas que influenciam no crescimento do indivíduo Desse modo é importante entender que a transcrição de um gene e a consequente tradução só ocorrerão se for preciso CITOPLASMA Núcleo DNA Íntrons Éxons Unidade de transcrição Transcrito primário de RNA TRANSCRIÇÃO CAPEAMENTO 5 SPLICING DO RNA POLIADENILAÇÃO 3 PROCESSAMENTO DO RNA Quepe do RNA mRNA AAAA 5 3 EXPORTAÇÃO AAAA mRNA TRADUÇÃO Proteína Descrição da Imagem na figura é exposto no interior do núcleo o DNA com os éxons e os introns Em seguida o RNAm transcrito em conjunto com os éxons e os introns passa pelo processo de modificação em que são retirados os introns e feita a junção dos éxons Ao mesmo tempo são modificadas as extremidades 5 com a introdução da CAP5 e a 3 com a introdução das poliadeninas Figura 8 Mecanismos de modificação do RNAm Fonte Alberts et al 2017 p 238 26 UNICESUMAR A tradução em células eucariontes como a célulaovo ocorre no interior do citoplasma Assim após a transcrição e o processamento dos RNAs eles passam pelo poro nuclear e chegam até o citoplasma para iniciar a tradução Esse processo inclui a participação dos três RNAs ALBERTS et al 2017 O RNAm terá a sequência dos nucleotídeos de um gene específico do DNA a fim de produzir a proteína Uma proteína será formada a partir da combinação de até 20 tipos diferentes de aminoácidos Talvez possa surgir a seguinte dúvida qual é a relação entre os nucleotídeos e os aminoácidos Depois de vários experimentos foi detectado que a sequência de cada três nucleotídeos do RNAm também chamada de códons corresponderia a um aminoácido Os vários tripletes que podem ser formados na combinação dos quatro tipos de nucleotídeos do RNAm foram determinados como código genético Dos 64 códons possíveis no código genético 61 especificam aminoácidos individuais sendo três desses códigos de finalização Como temos apenas 20 tipos de aminoácidos consideramos que existem mais códons que especificam um mesmo aminoácido Se você observar a Figura 9 perceberá que apenas dois a metionina met e o triptofano trp têm um único códon LODISH et al 2014 SEQUENCIA DOS CÓDIGOS DE AMINOÁCIDOS Segunda letra Primeira Letra Terceira letra Parada Parada Parada Descrição da Imagem a figura mostra os 64 códons possíveis Assim podem ser observados vários códons que identificam o mesmo aminoácido Um exemplo é a Arg arginina que pode ter até seis codons que identificam ela CGU CGC CGA CGG AGA e AGG além dos códons de iniciação met metionina AUG e dos códons de finalização UAA UAG UGA Figura 9 Código genético 27 UNIDADE 1 Para que ocorra a tradução é necessário fazer a leitura de três em três nucleotídeos do RNAm Contu do o primeiro código a ser lido enquanto início da construção da expressão gênica é o triplete AUG independentemente se tiverem outros que não sejam eles O códon AUG especifica o aminoácido metionina e quem levará esse aminoácido até o RNAm será o RNAt O RNAt apresenta uma confir mação que permite associar exatamente com o códon do RNAm pois a estrutura dele apresenta duas extremidades uma que se complementa ao códon denominada anticódon e outra que carrega o aminoácido específico ao códon que se associará ALBERTS et al 2017 Os aminoácidos são encontrados livres no citoplasma Para que eles façam parte da proteína eles precisam ser carregados pelo RNAt até o mensageiro Todavia para que o aminoácido seja associa do ao RNAt é necessária a presença de uma enzima denominada aminoaciltRNA sintetase Ela é específica para cada aminoácido ligado ao RNAt ou seja há 20 tipos dessa enzima Depois de ativados os RNAt estão prontos para estabelecer contato com o RNAm Entretanto ainda temos um colaborador imprescindível para isso o RNAr Ele permite que a polimerização dos aminoácidos seja eficiente e rápida à medida que os códons são lidos pelos RNAt sucessivos LODISH et al 2014 Dos três RNAs participantes da tradução o RNAr é aquele que inicia a síntese Composto por de zenas de proteínas e várias moléculas de RNA está estruturalmente modelado por duas unidades uma menor e outra maior A função dele é ajudar o RNAt a identificar o código de iniciação e deslizar sobre o RNAm fazendo a leitura dos sucessivos códons e consequentemente a ligação dos aminoácidos trazidos por cada RNAt ALBERTS et al 2017 Para ordenar a síntese o RNAr distribui os papéis às subunidades No início do processo as subu nidades estão separadas a menor será a responsável por capturar o RNAt com o aminoácido iniciador metionina e colocálo em um local específico chamado de sítio P Posteriormente essa subunidade menor se liga à extremidade 5 de um RNAm e se move para frente junto ao RNAt até identificar o primeiro códon AUG Após identificálo libera outros dois locais na estrutura os chamados sítio A e sítio E paralelos à P O sítio A é o local de contato com o próximo RNAt correspondente ao códon de leitura do mensageiro No entanto antes de ligar o próximo RNAt da subunidade maior do ribossomo se associa à menor e completa a estrutura dele ALBERTS et al 2017 O código genético por muito tempo foi considerado universal ou seja os códons seriam iguais para qualquer organismo vivo Diante da leitura de que cada três nucleotídeos do RNAm correspondem a um aminoácido os códons não mudariam entre as espécies No entanto em algumas espécies de fungos e protozoários foram encontradas variações Outras alterações também foram observadas no RNAm de mitocôndrias mas foram consideradas mínimas se comparadas ao código todo Fonte adaptado de Lodish et al 2014 28 UNICESUMAR O mecanismo da tradução que na nossa discussão iniciase pela primeira vez na célulaovo passa por um ciclo de quatro etapas o qual é repetido até encontrar um dos códons finalizadores UAA UAG UGA Figura 9 A primeira etapa inicia após a montagem completa do ribossomo mais a ligação do primeiro RNAt no sítio P Dessa forma seguirá com a entrada do próximo RNAt que carrega o aminoácido correspondente ao códon do RNAm o qual se associa ao sítio A Esse aminoácido fará parte da cadeia da proteína a ser formada AL BERTS et al 2017 A segunda etapa é marcada pela ligação entre os aminoácidos a qual é catalisada na subunidade maior do RNAr Os primeiros aminoácidos a se associar serão aqueles acoplados ao RNAt locali zado no sítio A com o aminoácido metionina do RNAt iniciador Desse modo o RNAt do sítio A ficará com dois aminoácidos e o do sítio P ficará vazio Já a terceira etapa consiste no deslizamen to da subunidade maior do RNAr Nesse sentido ocorre a troca das localizações dos RNAts aquele que estava no sítio A vai para o P e o que estava no sítio P vai para o E Na quarta etapa a subunidade menor do ribos somo acompanha a maior movese e faz a leitura de mais três nucleotídeos agora localizados no sítio A Por conseguinte reiniciase todo o ciclo de ligação Mais um RNAt se combina com o aminoá cido específico faz a ligação com os aminoácidos do RNAt presentes no sítio P e por consequência ocorre mais um movimento do RNAr liberando o RNAt vazio localizado no sítio E ao citoplasma da célula Figura 10 ALBERTS et al 2017 H2N Segmento terminal do mRNA 5 3 H2N 5 LIGAÇÃO DO FATOR DE LIBERAÇÃO AO SÍTIO A 3 Liberação da cadeia polipeptídica H2O COOH TERMINAÇÃO NH2 5 3 5 3 DISSOCIAÇÃO DO RIBOSSOMO E A E UAG UAG A UAG UAG Descrição da Imagem a figura mostra o momento em que o RNAt com a metionina se liga à subunidade menor do ri bossomo A subunidade menor se direciona ao RNAm que se desloca até chegar no códon de iniciação AUG É possível ver ainda a subunidade maior se conectando à menor Depois que acontece a montagem completa do RNAr dáse início ao desenvolvimento da tradução quando ocorre a dissociação do RNAr e a liberação da proteína formada Figura 10 Processo de tradução Fonte Alberts et al 2017 p 247248 29 UNIDADE 1 A síntese da maior parte das moléculas proteicas leva entre 20 segundos e alguns minutos No entanto na mesma molécula de RNAm podem ser associados vários ribossomos os chamados polirribossomos Isso possibilita a realização da tradução e da formação daquela proteína em grande escala Quando a formação da proteína é finalizada é possível concluir que a informação do DNA foi expressa Contu do após a tradução muitas proteínas ainda sofrem modificações adquirindo formas tridimensionais definidas que lhe atribuíram funções específicas ALBERTS et al 2017 Agora que você já compreendeu como a informação genética codificada na sequência de nucleotídeos do DNA é traduzida em proteínas pense novamente na célulaovo aquela gerada pela junção dos gametas Depois de formada essa célula já tem o próprio DNA capaz de desencadear os processos citados No entanto você não é constituído por uma única célula Após a fecundação o DNA da célu laovo produz enzimas capazes de induzir a reprodução formando outras células o que desencadeará a formação dos tecidos do corpo os órgãos e os sistemas como um todo ALBERTS et al 2017 Considerando que uma célula nova se forma devemos pressupor que uma nova molécula de DNA deve ser formada Dentre os processos incluídos no dogma central feito pelos pesquisadores da biologia molecular destacase a replicação mecanismo pelo qual o DNA é capaz de fazer cópias de si mesmo toda vez que uma nova célula se formará A replicação acontece no interior do núcleo da célula que sofrerá divisão e a própria molécula de DNA existente servirá de molde para formar uma nova As duas fitas de DNA serão copiadas para formar cada uma uma nova O processo é caracterizado como semiconservativo uma vez que as fitas do DNA modelo se separam permanentemente e cada uma delas forma uma molécula dupla com a fitafilha nova pareada a ela Figura 11 LODISH et al 2014 Certamente em algum momento de sua vida você já fez uso de an tibióticos talvez por uma infecção na garganta ou um desconforto intestinal Os antibióticos são utilizados para o tratamento de doen ças causadas por invasão de bactérias Os mecanismos de ação de alguns antibióticos estão relacionados à inibição da síntese proteica Venha conferir os detalhes 30 UNICESUMAR Para iniciar a replicação uma série de enzimas e proteínas é necessária Apresento a você a primeira delas o DNA polimerase DNApol enzima essencial para adicionar os nucleotídeos complementares a cada uma das fitas Para adicionar os nucleotídeos o DNApol precisa que uma pequena sequência de nucleotídeos seja adicionada às fitas modelos o que é feito pela primase Essa segunda enzima é um tipo de RNA polimerase especializado em adicionar esses primers Além dessa temos outra enzima que será necessária para a separação das fitas para que os nucleotídeos possam ser lidos Quem faz essa separação é uma enzima chamada helicase A helicase tem a função de quebrar de forma gradual as ligações de hidrogênio que ligam cada uma das fitas de DNA à medida que o DNA polimerase acresce os nucleotídeos Figura 12 ALBERTS et al 2017 O DNA polimerase tem a capacidade de adicionar nucleotídeos para formar a nova fita apenas na leitura dos complementares da direção 3 5da fita modelo uma vez que só consegue construir fitas comple mentares 5 3 Como ambas as fitas são moldes para resolver a situação da fita modelo 5 3 é possível utilizála como molde para a polimerase com a adição de vários primers permitindo que seja feita a leitura de trás para frente o que é citado por autores como modo de costurar para trás Dessa forma é dito que a síntese da molécula de DNA é feita de maneira contínua sem interrupção em uma direção e na outra é descontínua formando fragmentos denominados fragmentos de Okasaki LODISH et al 2014 Os fragmentos separados na fita descontínua no final da replicação são unidos por uma proteína chamada de DNA ligase Contudo antes são retirados os primers de RNA por uma nuclease e adi cionado o DNA substituinte pela polimerase de reparo Também temos outras enzimas que participam do processo de replicação como a topoisomerase que se posiciona na extremidade oposta da helicase À medida que a helicase abre a fita em uma das extremidades na oposta a topoisomerase se associa a fim de diminuir a tensão e impedir o superenrolamento do DNA Há ainda as proteínas ligadoras Descrição da Imagem na figura há um modelo de DNA que contém as fitas originais as quais são representadas em azul À medida que abrem são construídas as fitas de cor laranja ligadas às originais azul No final do processo são geradas duas moléculas de DNA cada uma contendo uma fita nova e outra que serviu como modelo Por isso o processo é chamado de semiconservativo Figura 11 Replicação processo semiconservativo 31 UNIDADE 1 que impedem que a fita de DNA separada volte a se associar Outras são as proteínas chamadas gram po deslizante que mantêm a DNA polimerase presa ao molde à medida que há a síntese da fita nova Figura 12 ALBERTS et al 2017 A diversidade na aparência e às vezes nas fragilidades de ter algumas doenças ou de ser mais forte em outros aspectos está condicionada às alterações que podem ocorrer no DNA ou na molécula de RNA No que diz respeito ao DNA é mais preocupante tendo em vista que toda vez que se replicar passará o erro à nova célula que se formar Já em relação ao RNA como ele é formado a partir do DNA não serão traduzidos erros por muito tempo visto que ele é degradado após fazer algumas sínteses As alterações no DNA quando permanentes são chamadas de mutações que ocorrem por equívocos no processo de replicação A maioria dos danos no DNA é uma consequência não intencional do vasto número de reações químicas que ocorrem no interior da célula A grande maioria dos danos ao DNA é temporária uma vez que são imediatamente corrigidos pelos processos de reparo do DNA LODISH et al 2014 Os danos que podem ser encontrados no DNA incluem aqueles ocasionados espontaneamente como os que podem ocorrer nos processos de replicação em que o próprio DNA polimerase pode incluir um nucleotídeo incorreto ou seja não complementar a fita Não só mas também abrangem os danos influenciados por agentes ambientais como a radiação ultravioleta e ionizante que pode ocasionar a associação de bases incorretas formação de dímeros de timina ou a quebra da associação das fitas de DNA De outro modo também pode ocorrer a retirada de bases púricas e pirimídicas ou causar defeitos nos nucleotídeos incluindo a desaminação PIERCE 2013 No entanto cada uma das células apresenta um sistema de reparo que permite a correção da maioria das mutações e elas não se perpetuam Um dos participantes na correção dos erros é o DNA polime DNA polimerase DNA original Topoisomerase Fita descontínua Fita contínua Fragmento de Okazaki Primer de RNA Primase Helicase DNA parental Descrição da Imagem na figura é mostrado o processo de replicação do DNA o qual foi parcialmente aberto pela enzima helicase São mostrados ainda DNA polimerase RNA primers e topoisomerase Uma das fitas que formam os fragmentos de Okasaki também é evidenciada Figura 12 Replicação do DNA 32 UNICESUMAR rase que tem a capacidade de fazer revisões e efetuar as correções Outras as glicosilases específicas reparam os erros fazendo as retiradas de pareamentos incorretos como GT Após a retirada dos erros de pareamento o DNA ligase será mais uma enzima que atuará ligando as fitas LODISH et al 2014 Apesar de raro o processo de reparo pode ter falhas e as mutações podem permanecer As mutações relacionadas às células germinativas mutações que venham a ocorrer nas células dos gametas são as mais preocupantes uma vez que são transmitidas às gerações que a formam como a célulaovo Já no caso das mutações em células do corpo com exceção das gaméticas em indivíduos completamente formados os erros trazem prejuízos apenas individuais e não aos filhos como o câncer LODISH et al 2014 As mutações podem ser analisadas ainda a nível gênico alteração de apenas um gene quando as mudanças de nucleotídeos modificam as sequências de códons que passam pela transcrição ou a nível cromossômico quando alteram vários genes PIERCE 2013 Inicialmente foi exposta a seguinte pergunta em quais aspectos há uma diferenciação no DNA de cada um de nós que nos torna tão diversos entre si e ao mesmo tempo iguais em outras características Essas diferenças podem ser supostas após as abordagens feitas nesta unidade Pense nas variedades de mutações que podem ocorrer seja em um único gene seja em vários Considere os gametas sendo formados em cada divisão celular Durante esses processos ocorre variabilidade genética No entanto nesta unidade você entendeu que independentemente das diferenças somos muito parecidos quando levamos em consideração a forma de produzir essas características Todos temos um DNA que forma um RNA o qual se traduz em proteínas pelo processo chamado dogma central da biologia Recentemente os avanços no desenvolvimento de fármacos vacinas e tratamentos de doenças são dependentes de achados sobre o conhecimento atribuído à maquinaria de enzimas proteínas e distinções de funções de genes Para você futuroa profissional da saúde esse domínio permitirá a compreensão das várias técnicas criadas pela biologia molecular em relação às múltiplas ações feitas com a manipulação da molécula de DNA Um exemplo é o desenvolvimento de uma substância de valor econômico como a produção de insulina Atualmente essa molécula já é produzida pelas técnicas de biologia molecular em que são feitas manipulações de bactérias geneticamente modificadas Dessa forma entender que o DNA é uma herança das células gaméticas e que os processos básicos que sustentam essa molécula química contro lam a expressão das diferentes características que governam o teu o meu e o corpo de várias espécies de organismos é primordial para acompanhar e atuar nas várias aplicações que esses processos englobam Você percebeu o quão a expressão da informação genética é importante Ela não é relevante apenas à formação das proteínas para delimitar as características externas do corpo como a textura da pele cabelo ou cor Ela também é essencial para todo o funcionamento celular na formação dos seguintes elementos enzimas que completam a replicação do DNA enzimas envolvidas na transcrição e RNAs participantes da tradução 33 Após uma breve revisão das características e das funcionalidades da molécula de DNA convido você a fazer uma avaliação do seu desempenho Você deverá preencher o mapa mental a seguir e se necessário poderá ampliálo Complete os quadros que não estão preenchidos Deixo como dica a seguinte afirmação ao estudar e realizar a leitura do livro grife as palavraschave que você considera importantes GAMETAS DNA Materno Nucleotídeos A T C G Ligações de hidrogênio Estrutura e composição Várias enzimas DNA polimerase helicases topoisomerases Replicação do DNA Semiconservativo Reparo do DNA Transcrição RNA Ligações fosfodiéster RNA polimerase RNAm RNAt e RNAr Aplicações na biotecnologia vacinas melhoramentos prevenção de doenças 34 1 Após uma das primeiras aulas de Biologia Molecular a professora apresentou uma tarefa Nela os alunos deveriam construir uma fita de DNA fictícia Portanto deveriam levar em consideração as características básicas da constituição do DNA De acordo com os conceitos aprendidos como deveria ser constituída a fita de DNA a A molécula de DNA deveria ser representada por uma dupla fita constituída por nu cleotídeos ligados entre si por ligações fosfodiéster As bases nitrogenadas estariam associando as duas fitas de forma complementar AT e CG por ligações de hidrogênio b A estrutura do DNA deveria ser representada por uma única fita constituída por nu cleotídeos ligados entre si por ligações fosfodiéster As bases nitrogenadas estariam ligadas de forma complementar AT e CG por ligações de hidrogênio c A molécula de DNA representada pelo estudante deveria ser formada por uma dupla fita constituída por nucleotídeos ligados entre si por ligações de hidrogênio As bases nitrogenadas estariam associando as duas fitas de forma complementar AT e CG por ligações fosfodiéster d O DNA deveria ser representado por uma fita simples constituída por nucleotídeos ligados entre si por ligações fosfodiéster As bases nitrogenadas estariam associando as duas fitas de forma complementar AU e CG por ligações de hidrogênio e A molécula de DNA deveria ser representada por uma dupla fita constituída por nu cleotídeos ligados entre si por ligações fosfodiéster As bases nitrogenadas estariam associando as duas fitas de forma não complementar AG e CT por ligações de hidrogênio 2 O processo de transcrição da molécula de DNA abrange o momento em que são trans mitidas as informações a partir da formação de uma molécula intermediária o RNA Sabese que para que esse processo aconteça muita energia é gasta Justifique o motivo pelo qual o DNA não traduz a informação genética diretamente ao contrário de produzir uma molécula intermediária Explique a vantagem de transmitir a informação ao RNA 35 3 A maioria dos produtos finais da informação genética provinda do DNA é finalizada com a tradução produzindo proteínas Em relação às características do processo de tradução assinale a alternativa correta a Os RNAr participantes da tradução são específicos ou seja podem fazer apenas um tipo de proteína b As subunidades do RNAr sempre ficam unidas independentemente de estarem pro cessando a tradução c Um RNAm pode conter a sequência UTTACCGUCAT d Uma vez que as duas fitas de DNA são complementares o RNAm de um dado gene pode ser sintetizado por meio de qualquer uma das duas fitas e O RNAm passa por processamentos durante a transcrição tais como a retirada de introns junção de éxons e modificação da extremidade 5 com a cap e da 3com a poliadenilação 4 A capacidade de replicação do DNA é primordial Toda vez que uma nova célula é formada esse processo ocorre uma vez que individualmente cada célula precisa da informação genética contida no DNA para efetuar as funções dela Em relação ao processo de replicação analise as afirmativas a seguir I O DNA polimerase é a enzima responsável pela construção da fita nova Ele adiciona os nucleotídeos complementares em cada uma das fitas II A sequência das etapas da replicação consiste em quebra das pontes de hidrogênio que unem as bases pela helicase adição dos nucleotídeos complementares pelo DNA polimerase e adição dos primers III Ao final da replicação as fitas que serviram de molde se voltam a unir e as fitas novas se associam IV A replicação é o processo de formação de uma nova molécula de DNA No caso das células eucariontes ocorre no interior do núcleo celular É correto o que se afirma em a I e II b I II III e IV c I e IV d I e III e IV 36 5 As alterações no DNA quando permanentes são chamadas de mutações A maio ria dos danos do DNA é uma consequência não intencional tendo em vista o grande número de reações químicas que ocorrem no interior da célula Além do mais esses danos em grande parte são temporários uma vez que são imediatamente corrigidos pelos processos de reparo Se fôssemos classificar a melhor etapa do dogma central para acontecer o sistema de reparo qual você escolheria Justifique 6 Vários avanços na biologia molecular foram conquistados com o conhecimento da estrutura composição e função do DNA Hoje muitos fármacos e vacinas foram de senvolvidos devido ao entendimento da expressão de determinados genes e das várias enzimas envolvidas Suponha que um pesquisador busque criar um remédio contra um vírus que ataca o sistema pulmonar humano Considerando a situação apresentada no enunciado assinale a alternativa que corres ponde ao nível que o pesquisador poderia se amparar para destruir o vírus a Produzir um fármaco que atinge o processo de replicação do DNA viral b Criar uma ação que destrua as proteínas fabricadas pelo vírus c Desenvolver um fármaco que age de forma a impedir a transcrição dos genes dos órgãos dos hospedeiros ou seja das células pulmonares d Desenvolver uma ação que ative a replicação viral na célula e Produzir um fármaco de ação ativadora da transcrição da célula hospedeira a fim de atingir o vírus 2 Nesta unidade compreenderemos a importância da atenção dada ao controle de qualidade em laboratórios de biologia molecular forense Também conheceremos o fundamento deles e os proce dimentos para alcançar resultados seguros e confiáveis Entendere mos que o manuseio de materiais das análises laboratoriais requer padrões a serem seguidos a fim de aferir a condição de excelência e confiabilidade das pesquisas feitas Compreenderemos as fases que exigem atenção durante a análise para alcançar a qualidade e assi milaremos de forma geral as características necessárias para um laboratório ter um selo de excelência pelo processo de acreditação Controle de qualidade em laboratórios de biologia molecular Dra Ana Luisa Monezi Lucena 38 UNICESUMAR Suspeito de matar Rachel Genofre é identificado quase 11 anos depois do crime Esse é título de uma reportagem publicada no G1 em setembro de 2019 Talvez você já tenha ouvido a história de uma menina que foi encontrada morta e enrolada entre lençóis dentro de uma mala localizada na rodoviária de Curitiba no Paraná Rachel tinha nove anos e foi vista pela última vez na frente da escola onde estudava no dia 3 de novembro de 2008 O suspeito de matar a menina foi identificado quase 11 anos depois do crime A identificação do suspeito ocorreu após a coleta do DNA de diversos suspeitos Foi feita a compara ção do material genético encontrado nos lençóis e na Rachel A princípio os dados do DNA dos vários suspeitos foram armazenados em um Banco Nacional de Perfis Genéticos Posteriormente cruzaram os dados disponíveis com o material genético colhido no corpo de Rachel Um dos suspeitos o qual se encontrava preso apresentou uma correlação positiva em 100 em relação ao material genético encontrado em Rachel De acordo com o Ministério da Justiça a coleta colaborou com o cruzamento de dados do Banco Nacional de Perfis Genéticos que conta com 30 mil perfis de condenados cadas trados PADRONIZAÇÃO 2021 Você já pensou no quão é importante a elaboração de metodologias adequadas para a identificação do DNA de suspeitos Já refletiu sobre as consequências que podem ser acarretadas devido à existência de erros nos procedimentos adotados Coloquese no lugar do profissional do laboratório que analisou o DNA do suspeito de Rachel Agora imagine o quão será importante o seu entendimento sobre o tema controle de qualidade na manipulação de materiais em laboratórios clínicos A utilização de tecnologias de análises forenses com o objetivo de identificar tem sido feita com con siderável sucesso nos últimos anos Isso acontece devido ao acelerado avanço das técnicas de biologia molecular e dos métodos de tipagem de DNA Atualmente existem bancos de dados de DNA em diversos países No entanto para compartilhar informações com esses bancos devese levar em consideração o conhecimento da manipulação da técnica principalmente em relação às normas à padronização ao controle de qualidade e aos cuidados na coleta e na preservação das amostras biológicas uma vez que consequências éticas e sociais podem vir à tona impedindo o compartilhamento de informações Se fôssemos associar os fundamentos éticos expressos com o caso abordado imagine como seria constrangedor se fossem identificados resultados diferentes Isso aconteceria se um laboratório testasse positivo e outro negativo ambos utilizando a mesma amostra Agora que você já tem algumas informações relevantes e que mostram a importância do uso das tecnologias forenses proponho uma atividade Em bancos de dados online confiáveis pesquise os objetos de investigação da análise forense Depois identifique pelo menos três resultados alcançados pelos pesquisadores na utilização das técnicas forenses Por fim procure casos em que a técnica não foi satisfatória em detrimento da má adequação dos procedimentos metodológicos Organize e anote todos os seus resultados no diário de bordo Diante da pesquisa efetuada o que você identificou como características semelhantes entre os ob jetos de pesquisa da análise forense Os resultados procurados com o auxílio das técnicas de biologia molecular estão voltados apenas às características de identificação O quão é importante adotar um método de análise de qualidade para investigação 39 UNIDADE 2 A aplicação da tecnologia do DNA em investigações forenses cresceu rapidamente nos últimos anos As principais amostras utilizadas como objeto de estudo das aplicações forenses é o DNA cole tado do sangue o líquido seminal a medula óssea o cérebro os músculos a pele a polpa dentária e as manchas secas de sangue em tecido ou em outra superfície LEE LADD 2001 Contudo muitas são as evidências de DNA que não são apropriadamente coletadas documentadas reconhecidas e preservadas invalidando uma investigação Pense nos aspectos principais da situaçãoproblema proposta e anote as suas ideias reflexões dis cussões e argumentos no diário de bordo 1 Qual é a importância da coleta de materiais de qualidade para as análises forenses 2 O quanto é relevante ter atenção na execução das técnicas em relação à adequação do labora tório para efetivar um resultado de qualidade 3 Quais são as consequências dos erros de um procedimento mal executado Os exames de DNA adotados em várias situações registradas na literatura têm sido eficazes e confiáveis ao longo dos anos uma vez que os sistemas de qualidade têm sido aprimorados cons tantemente em todas as etapas de análise Na área forense a qualidade dos exames de DNA é DIÁRIO DE BORDO 40 UNICESUMAR importante para descrever os laudos periciais que suprem as necessidades das análises da justiça GARRIDO GIOVANELLI 2011 Alec Jeffreys foi o primeiro pesquisador que utilizou a leitura do DNA em um laboratório forense com sucesso Ele descreveu que certas regiões do DNA continham repetições de sequência também conhecidas como Variable Number Of Tandem Repeats VNTR as quais variam em comprimento de indivíduo para indivíduo o que foi designado como DNA fingerprint impressão digital de DNA em português Jeffreys percebeu que essa variação seria um diferencial para identificar a individuali zação das pessoas tornando uma arma extremamente poderosa para o domínio forense o que até o momento revelavase como o mais robusto mecanismo de individualização DALE BECKER 2007 A investigação da morte de Rachel obteve elucidação pela justiça a partir do exame de DNA Se posicio ne como gerenciador da execução dos procedimentos adotados para fazer o exame de DNA dos suspeitos e do material encontrado em Raquel A primeira atitude a ser compreendida é o reconhecimento de que para ter um resultado satisfatório é necessário um rigoroso controle de qualidade o qual se estende desde a coleta do material identificação e posterior processamento OGA CAMARGO BATISTUZZO 2014 A Academia Americana de Ciências Forense exige que sejam seguidas normas para a análise de mate riais biológicos OGA CAMARGO BATISTUZZO 2014 No caso do sêmen encontrado em Rachel o laboratório que estivesse sob responsabilidade deveria realizar a construção de uma documentação para rastrear todo o processo de análise do material biológico incluindo coleta transporte análise descarte ou estocagem a fim de evitar erros na identificação do material do doador ou da vítima Essa documentação é denominada cadeia de custódia Figura 1 Nela deverão conter informações relacionadas ao manu seador da amostra ao local onde foi obtida e ao momento em que foi realizado o manuseio Costumase separar a cadeia de custódia em duas etapas a cadeia de custódia externa e a interna Descrição da Imagem na Figura 1 a são expressas algumas evidências coletadas na cadeia de custódia Assim em um piso de madeira estão dispostos os objetos deixados na cena de um crime como drogas dinheiro carteira e pinça Na Figura 1 b há duas placas amarelas com os números 5 e 6 e um documento com as digitais registradas Sobre o documento há uma munição dentro de um saco plástico e uma pinça Figura 1 a Evidências coletadas na cadeia de custódia b Outras evidências coletadas na cadeia de custódia A B 41 UNIDADE 2 A primeira etapa que você deve entender compreende o momento de coleta do material e o transporte até o laboratório denominada de cadeia de custódia externa Por outro lado a cadeia de custódia interna será o momento em que a amostra chegará ao laboratório Nele são feitos os registros os exa mes o armazenamento o descarte ou a devolução Assim os laboratórios de análises forenses devem seguir normas e diretrizes que englobam a coleta a cadeia de custódia o processamento da amostra e os testes confirmatórios por exemplo CASTELARI et al 2018 Na fase de custódia externa que inclui a coleta de material estão disponíveis recursos que ajudarão a identificar os vestígios deixados Caso haja um perito ele colherá o material na cena do crime Em relação à coleta do sêmen encontrado junto a Rachel provavelmente ele estava com coloração ama relada e consistência seca uma vez que foi encontrado dois dias depois Nessa fase inicialmente é feita a identificação Os peritos detectarão se a mancha que contém sêmen tem a probabilidade ou certeza de ser um material suspeito Uma das provas de probabilidade muito usada pelos profissionais é a luz ultravioleta lâmpada de Wood com a finalidade de detectar a fluoresceína tem tom brancoazulado e com o passar do tempo tende a ter uma cor amarela que se encontra presente no espermatozoide Todavia não está presente somente nele mas em outros fluidos biológicos tais como urina muco vaginal e nasal Por esse motivo é considerado teste de orientação e não de certeza Figura 2 Os cristais de florence ou cristais de picrato de espermina também são elementos que indicam a presença de esperma Esses cristais podem ser encontrados em diversas secreções o que o tornam um teste de probabilidade DELCAMPO 2008 A prova de certeza conseguida no caso de Rachel certamente aconteceu quando os peritos coletaram os espermatozoides presentes na secreção vaginal e então foram feitas a recuperação pela coloração e o procedimento do esfregaço cérvicovaginal mais conhecido como papanicolau TÁMARA 2013 Descrição da Imagem na Figura 2 a há um perito abaixado Ele usa luvas e um traje descartável e branco dos pés à cabeça Em uma das mãos está a luz ultravioleta luz negra enquanto a outra coleta com o swab os vestígios deixados no piso Na Figura 2 b um equipamento de emissão de luz ultravioleta é colocado próximo a uma superfície que contém digitais Na Figura 2 c é utilizada uma lanterna de emissão de luz ultravioleta a fim de identificar no chão uma pegada que é demarcada por uma placa com o número 3 Figura 2 a Perito fazendo uso de luz ultravioleta b Equipamento de emissão de luz ultravioleta c Luz ultravioleta demarcando uma pegada A B C 42 UNICESUMAR Neste momento você pode estar se perguntando como são feitas a coleta e a preservação do ma terial até a chegada ao laboratório Como a amostra de espermatozoide foi buscada nas secreções vaginais O procedimento adotado para essa coleta é o uso de swab um cotonete estéril utilizado para apanhar e transportar múltiplos tipos de materiais biológicos Na Figura 2 a é possível ob serválo em uma das mãos do perito De maneira geral a sobrevida dos espermatozoides na cavidade vaginal é de poucas horas variando em função das hostilidades químicas ambientais No entanto quando colhidos a tempo ainda podem ser vistos a fresco com movimentos No caso de Rachel como haviam passado dias a possibilidade era de encontrálos mortos mas ainda era possível aplicar uma técnica de coloração Com ela eles podem ser identificados até cerca de quatro dias após a deposição INTERPOL 2009 TAMAI 2015 As Figura 2 a e 3 mostram que para efetuar as coletas é necessário o uso de equipamentos indi viduais de proteção os chamados EPIs de modo que se assegure a preservação da amostra e evite a contaminação do manipulador durante a coleta Por isso é fundamental o uso de luvas descartáveis máscara e sapato fechado Não é permitido beber ou comer no local da coleta Além disso o material descartável utilizado deve ser colocado em sacos de resíduos biológicos e posteriormente devem ser descartados em locais adequados BEZERRA 2004 SILVEIRA 2009 Descrição da Imagem na figura é representada uma pessoa utilizando os equipamentos de proteção individual EPIs Ela está posi cionada com as mãos paralelas ao rosto a fim de evidenciar as luvas brancas que prendem as mangas de um jaleco azul feito de TNT A pessoa também usa óculos de proteção transparentes viseira de proteção facial touca e máscara Figura 3 Representação dos equipamentos de proteção individual 43 UNIDADE 2 Clique no QR Code e conheça a importância do uso de EPIs de forma adequada em laboratórios de biologia molecular Tendo os recipientes com as amostras a abertura acontecerá quando for iniciada a análise Cada recipiente deve ser identificado por meio de autoadesivos que devem ser invioláveis a fim de segurar a cadeia de custódia Na identificação são incluídos o número identificador institucional do caso ou o número do pedido o nome da vítima ou algum tipo de identificação a data e a hora da coleta o tipo de amostra biológica e assinatura do responsável pela coleta Findada a etapa de coleta em seguida as amostras devem ser encaminhadas ao laboratório LISBOA 2016 REALIDADE AUMENTADA Principais EPI usados em laboratórios de biologia molecular e sua importância A recolha dos vestígios é fundamental para a averiguação de um crime Outro método utilizado para melhorar não só a qualidade do trabalho no local do crime mas também a interligação com a investigação criminal é a utilização da lofoscopia método de análise de digitais De modo geral a lofoscopia é a ciência forense que estuda os desenhos dermopapilares que existem na ponta dos dedos nas palmas das mãos e nas plantas dos pés Esse desenho digital é visível desde o sexto mês de gestação e só desaparece com a putrefação O uso desse vestígio é interessante porque não existem duas impressões digitais iguais no mundo mesmo em gêmeos homozigotos Para a detecção das digitais é feita a utilização de produtos químicos em forma em pó São empregados o carbonato de chumbo pó branco de extrema leveza e ótima aderência ao suor e à gordura o dragon blood pó avermelhado usado em quase todas as superfícies mas especialmente em veículos ferro plásticos e celofane o caput mortuum pó de óxido preto aplicável em cartões madeira vidro e plásticos e pós magnéticos e fluorescentes No caso dos reagentes líquidos há a ninidrina substância que se apresenta sob a forma de cristais brancosesverdeados e reage com o componente do aminoácido da impressão digi tal Além da ninidrina componentes de violeta de genciana e negro de amido são utilizados Detectadas as impressões com o uso desses materiais elas são direcionadas a uma base de dados em que são introduzidas imagens de impressões digitais e os respectivos pontos carac terísticos Então é feita uma comparação para encontrar uma possível presença dos suspeitos Fonte adaptado de Pinheiro 2008 e Duarte 2009 44 UNICESUMAR Agora são iniciados os preparativos para a etapa de custódia interna momento em que a amostra chega no laboratório Primeiramente é necessário entender o objetivo proposto ou seja estar consciente da situação ocorrida Posteriormente devese verificar se a metodolo gia equipamentos reagentes e insumos estão disponíveis e em prazo de validade Outro requisito é detectar se será possível atender à demanda e realizála no tempo oportuno Também é preciso averiguar se o material encaminhado é adequado e se o laboratório dispõe de recursos para o correto acautelamento GARRIDO ARAUJO 2014 Em laboratórios forenses muitas vezes as amostras necessitam passar por um preparo prévio Para um processo de limpeza no caso da análise de tecidos pode ter a necessidade de fazer cortes no tecido biológico como ossos e músculos e separação de swab Em re lação ao crime que você acompanha nesta unidade na amostra quando recémchegada foi utilizado o swab com a necessidade de separar o material Nessa fase é necessário fazer as escolhas quantitativa e qualitativa das amostras incluindo o modo de realizar a limpeza homogeneização e retirada das alíquotas Para executar os procedimentos relacionados ao manuseio de equipamentos e as técnicas do ensaio é preciso seguir os procedimentos operacionais padronizados pelo laboratório e controlados por profissionais competentes Esses procedimentos não são imutáveis e precisam sofrer revisões sempre que for conveniente ou necessário Eles também precisam ter os respectivos registros De acordo com o Ministério da Justiça as demandas da padronização de exames de DNA em perícias criminais devem utilizar um mínimo de marcadores moleculares e fazer a análise estatística dos resultados PA DRONIZAÇÃO 2021 GARRIDO ARAUJO 2014 Em exames interlaboratoriais e bancos de dados a padronização dos exames de DNA deve usar no mínimo treze marcadores moleculares definidos pelo CODIS TPOX D3S1358 D5S818 FGA CSF1PO D7S820 D8S1179 TH01 vWA D13S317 D16S539 D18S51 e D21S1 e a amelogenina Normalmente esses marcadores são disponibiliza dos em kits comerciais multiplex ou quando não comerciais devem ser kits validados Os laboratórios em relação aos exames rotineiros podem estabelecer os marcadores necessários para a execução dos laudos periciais No entanto recomendase a utilização dos treze marcadores mínimos PADRONIZAÇÃO 2021 Após a passagem da análise do material no laboratório outra grande preocupação é se a certificação e a publicação dos resultados estão dispostos de forma clara e objetiva Além disso é importante disponibilizar meios para dirimir eventuais dúvidas e proceder os exames de contraprova Além dos aspectos analíticos citados dentro da cadeia de custódia é de grande valia dar atenção à etapa pósanalítica na qual são considerados os resíduos produzidos O mínimo possível e a realização correta da disposição final são essenciais Nessa etapa é preciso realizar um perfeito gerenciamento dos documentos e garantir a adequabilidade e a segurança do sistema de informação em especial do banco de dados de perfis genéticos GARRIDO ARAUJO 2014 45 UNIDADE 2 Para oferecer um produto de qualidade é importante se atentar à trajetória da cadeia de custódia Dessa forma empregar um sistema de gestão da qualidade em laboratórios é um passo valioso De acordo com a Organização Mundial da Saúde o fluxo de trabalho com qualidade em um laboratório deve estar baseado em doze elementos essenciais INFORME 2013 Esses elementos se pautam na organização dos profissionais na disponibilidade de equipamentos nas compras no controle de pro cessos na gestão da informação no registro de documentos na gestão das ocorrências na avaliação na melhoria dos processos no atendimento ao cliente nas instalações e na segurança INFORME 2013 GARRIDO ARAUJO 2014 Um sistema de gestão da qualidade tem o intuito de fornecer uma base sólida à qualidade nos laboratórios contribuindo para as ações preventivas ALLEN 2013 Resíduos potencialmente infectantes sondas curativos luvas de procedimentos bolsa de colostomia Devem ser descartados em lixeiras revestidas com sacos brancos Resíduos químicos reveladores fxadores de raio x prata Devem ser descartados em galões coletores específcos Resíduos radioativos cobalto lítio Devem ser descartados em caixas blindadas Resíduos comuns fraldas frascos e garrafas pets vazias marmitex copos papel toalha Devem ser descartados em lixeiras revestidas com sacos pretos Resíduos perfurocortantes agulhas laminas de bisturi frascos e ampolas de medicamentos Devem ser descartados em coletor especifco A B C D E Descrição da Imagem na figura é mostrado o sistema de classificação dos resíduos dos materiais produzidos na área da saúde As sim é indicada por meio de cinco colunas a distribuição da classificação dos resíduos A B C D E Abaixo das colunas são descritos os tipos de resíduos os potencialmente infectantes os resíduos químicos os radioativos os resíduos comuns e os perfurocortantes São expostos ainda os exemplos de cada tipo e mostrados os locais de descarte na coluna A são mostrados sacos de lixos na cor branca e vermelha na coluna B há um frasco azul de plástico com a tampa preta na coluna C há um frasco de alumínio com o sinal de radiação desenhada em preto na coluna D há um saco preto e na coluna E encontramse caixas de papelão de cor amarela Nelas está escrito em preto a palavra Perfurocortantes e o sistema de cores de identificação Figura 4 Sistema de classificação dos resíduos dos materiais produzidos na área da saúde Fonte Brasil 2004 apud VIANA 2018 p 15 46 UNICESUMAR Segundo Souza e Queiroz 2013 o sistema de gestão para o setor da saúde não se difere da filosofia da qualidade aplicada em indústrias Dessa maneira muitas descrições de gestão de qualidade atri buídas ao setor industrial foram utilizadas e complementadas para a área da saúde Você já pensou nos benefícios de seguir um padrão que se adequa ao sistema de gestão de qualidade Uma quali dade adquirida pelo sistema de gestão de qualidade pode assegurar que o serviço que você presta resulta em benefício para aqueles que os solicitam Além disso pode aumentar a sua segurança e tranquilidade quando você realiza o seu trabalho de contribuição diagnóstica Quando surgirem questionamentos você terá a convicção em assegurar aos clínicos o valor do resultado do teste Desse modo em questionamentos judiciais você terá um respaldo legal Outro grande benefício é o fato de poder preencher requisitos exigidos em programas de acreditação obtendo o selo da qualidade e vantagem competitiva no mercado Para implantar o Sistema de Qualidade SQ em laboratório é preciso zelar pela organização interna Assim os procedimentos das atividades a serem executadas deverão estar descritos em um documen to denominado Manual de Sistema da Qualidade Esse documento apresentará toda a estrutura do funcionamento do laboratório os objetivos e a política do SQ Além disso terá a descrição da estrutura da documentação e as responsabilidades da alta administração gerente técnico gerente da qualidade e outras pessoas essenciais Nessa seara para que um resultado seja satisfatório antes de qualquer exame os laboratórios devem aplicar o SGQ à formação do corpo técnico e às aquisições de suprimentos e serviços como a manutenção e a calibração dos equipamentos GARRIDO ARAUJO 2014 Quanto à qualificação profissional é importante garantir a capacitação técnica de todos aqueles que direta ou indiretamente possam influenciar na qualidade do trabalho desenvolvido Dessa for ma disponibilizar cursos que os preparem para os procedimentos da rotina do laboratório seja no âmbito administrativo seja no âmbito técnico é de extrema importância para se atingir a qualidade GARRIDO ARAUJO 2014 De acordo com o Ministério da Justiça em relação aos laboratórios estatais de genética forense como aquele que atendeu ao caso de Rachel é exigida uma qualificação mínima dos profissionais sejam os Pensar na área da gestão dentro de um laboratório é assumir o controle de uma situação a fim de determinar e orientar o caminho a ser seguido para atingir objetivos e metas Quando se associa às características de qualidade e de gestão remetese à ação de executar os objetivos de forma a atingir a excelência No entanto o controle de qualidade em laboratórios não se concentra apenas no resultado do produto a ser entregue mas também está relacionado com a qualidade de vida daqueles que convivem no ambiente e com a proteção do meio ambiente Portanto avaliar os resulta dos que não atingiram o esperado também faz parte de um sistema de gestão de qualidade 47 UNIDADE 2 concursados sejam os terceirizados PADRONIZAÇÃO 2021 A comunidade científica brasileira da área de genética forense estabelece que o perito dessa área deve ter formação superior em Ciências Biológicas Ciências da Saúde ou áreas afins Quando não apresentar essa formação deve ser pósgra duado em Genética ou em área correlata GARRIDO ARAUJO 2014 PADRONIZAÇÃO 2021 Por fim o SGQ deve ser monitorado por auditorias uma ferramenta que permite aferir se os con troles internos correspondem aos objetivos propostos e se os recursos disponibilizados estão sendo utilizados com eficiência e eficácia INFORME 2013 De acordo com Souza e Queiroz 2013 as auditorias podem ser de Primeira parte realizadas pela própria organização Segunda parte realizadas por clientes Terceira parte realizadas por organizações externas e independentes As auditorias realizadas por organizações externas compreendem a verificação dos procedimentos adotados de acordo com as normas instituídas para alcançar determinadas certificações Elas serão avaliadas por órgãos que fazem as acreditações No Brasil a Agência Nacional de Saúde Suplementar ANS disponibiliza programas para fazer as acreditações e quando alcançadas as exigências é possível adquirir um selo de qualidade Dessa forma a acreditação é um documento que comprova que o labo ratório tem a aprovação formal de excelência dada por órgãos específicos Isso atesta a capacidade dele de se manter atualizado sobre os requisitos necessários para a segurança e a qualidade no atendimento A Agência Nacional de Saúde Suplementar ANS estabelece por intermédio da Resolução da Di retoria Colegiada RDC nº 3022005 os critérios para avaliar a qualidade dos serviços prestados pelos laboratórios de análises clínicas MINISTÉRIO DA SAÚDE 2005 Essa análise certifica os serviços prestados pela chamada QUALISS ou seja o programa de qualificação de prestadores de serviços de saúde estabelecido pela RN nº 405 de maio de 2016 que determina os atributos de qualificação rele vantes para o aprimoramento da qualidade assistencial oferecida pelos prestadores de serviços ANS 2016 Para a execução do QUALISS a ANS conta ainda com entidades participantes que contribuem não só na elaboração de critérios mas também na coleta e na consolidação de dados ACREDITADORES Organização Nacional de Acreditação ONA IQG Serviço de Acreditação em Saúde Colégio Brasileiro de Radiologia e Diagnóstico por Imagem CBR DICQ Sistema Nacional de Acreditação LTDA Consórcio Brasileiro de Acreditação CBA Soc Bras de Patologia Clínica Medicina Laboratorial SBPCML PALC A4Quality Services Auditoria e Certificação LTDA Instituto Brasileiro para Excelência em Saúde IBES Quadro 1 Entidades que fazem o processo de acreditação Fonte adaptado de QUALISS 2021 48 UNICESUMAR Especialistas em acreditação para laboratórios de análises clínicas apontam que dentre os padrões estabelecidos pela ISO International Organization for Standardization a ABNT NBR ISO 9001 a ABNT NBR ISOIEC 17025 e a ABNT NBR NM ISO 15189 atendem mesmo que parcialmente aos requisitos estabelecidos pela ANS As normas apresentam similaridades ou sobreposição de requisitos por exemplo quando se descreve o sistema de gerenciamento da qualidade o controle de documentos e o atendimento às reclamações de clientes às ações corretivas e preventivas e às diferenças no que diz respeito aos requisitos técnicos SOUZA QUEIROZ 2013 Por essas razões não é fácil adquirir o selo de qualidade Muitas empresas justificam que a auditoria ne cessária para se atingir a acreditação gera custos por exemplo na aquisição dos equipamentos para manter a qualidade Fatores burocráticos documentais são exigidos e muitos reportam ser um tanto desgastante o entendimento dos conceitos da norma Por essas razões muitos exames interlaboratoriais e testes de pro ficiência são realizados por órgãos independentes ou seja que não estão diretamente vinculados à ANS Apesar disso as análises se caracterizam pela importância de adotar as ferramentas que garantem a qualidade do serviço prestado Um documento publicado pelo Ministério da Justiça e que padroniza exames de DNA em perícias criminais demanda que além de controles internos de qualidade os la boratórios participem de controles nacionais e internacionais como os testes patrocinados pelo GEP Grupo Espanhol Português e GITAD Grupo Iberoamericano de Trabalho em Análise de DNA PADRONIZAÇÃO 2021 Há também exercícios propostos pela Sociedade Latino Americana de Genética Forense GARRIDO ARAUJO 2014 Você sabia que de acordo com a Sociedade Brasileira de Patologia Clínica e Medicina Laboratorial SBPCML por ano a justiça brasi leira movimenta mais de 1500 processos contra laboratórios Ouça mais um podcast e entenda os principais erros apontados e come tidos por laboratórios Acompanhe também uma breve apresenta ção das notícias publicadas em jornais e em revistas sobre os proce dimentos mal efetuados na verificação e comparação de DNA 49 UNIDADE 2 Partimos de uma história real do crime de estupro seguido de morte e ocultação de cadáver da menina Rachel para compreender o principal método utilizado para desvendar o ocorrido após onze anos Você pôde compreender que o uso da técnica de comparação dos DNAs coletados da vítima e dos suspeitos foi o responsável pela elucidação do crime No progresso desse entendimento soube que para validar o uso da técnica de elucidação de um crime é de extrema importância se atentar às etapas de coleta de material ao uso de equipamentos de segurança à disponibilidade de profissionais adequados e de materiais para executar a análise de forma precisa Portanto o futuro profissional de saúde pode ser perito durante as fases de coleta e de análise de DNA requerendose uma atuação técnica e de qualidade Você pode se posicionar na situação e nos procedimentos descritos assimilando o quanto é importante proceder essas ações de forma competente pois o uso da técnica envolve resultados que comprometem a vida daqueles que esperam uma conclusão Nesse aspecto agir de modo ético moral profissional e responsável é importante para o sucesso da elucidação de um crime como o de Rachel Além disso o comprometimento a organiza ção e uma gestão de qualidade nos laboratórios que efetuam a técnica forense de DNA são essenciais para completar o êxito da solução Você já conhece o Programa de Acreditação de Laboratórios Clínicos PALC Te convido a assistir a este vídeo curto sobre os caminhos do processo de acreditação dos laboratórios Observe que nele são apresentadas declarações de empresas certificadas que atestam os benefícios alcançados Para acessar use seu leitor de QR Code 50 Para melhor fixação do tema abordado nesta unidade complete o mapa mental a seguir Nele estão disponíveis palavraschave correspondentes às informações descritas durante o desen volvimento do conteúdo As propostas do tema central são qualidade laboratório e resultado QUALIDADE RESULTADO LABORATÓRIO Consequências Positivas e Negativas Profssionais Objetos de Estudo Etapas da Custódia SGQ Características Acreditação 51 1 Pensar na gestão de um laboratório é assumir o controle de uma situação a fim de determinar e orientar o caminho a ser seguido para o atingimento de objetivos e metas Atentarse em um sistema de gestão de qualidade aos procedimentos efetuados por labora tórios forenses é a Apresentar um resultado de qualidade no procedimento identificatório forense Ter profissionais formados e capacitados para a função Ter equipamentos e insumos para efetuar a análise Considerar a qualidade de vida daqueles que convivem no ambiente Abranger a proteção do meio ambiente b Mostrar resultados de qualidade na identificação forense Ter profissionais capacitados para a função Considerar a qualidade de vida daqueles que convivem no laboratório mas não do meio ambiente c Apresentar resultados de qualidade no procedimento identificatório forense Ter profissionais formados e capacitados para a função Ter equipamentos razoáveis para efetuar a análise d Identificar um profissional formado e capacitado para a função Pedir para que os profissionais levem os equipamentos e os insumos para efetuar a análise Considerar a qualidade de vida daqueles que convivem no clínico e Considerar somente a qualidade de vida daqueles que convivem no ambiente e a proteção do meio ambiente 2 Muitos são os objetivos do uso da técnica forense de DNA e um deles foi expresso na história de Rachel a fim de detectar a identidade genética e apontar o criminoso Contudo essa técnica é uma ferramenta que diante de limitações podem tornar o uso inviável Descreva de forma resumida as consequências da inadequação de um laboratório forense na efetuação dos procedimentos de identificação do crime 52 3 A Agência Nacional de Saúde Suplementar ANS estabelece critérios para avaliar a qualidade dos serviços prestados pelos laboratórios de análises clínicas Essa análise certifica os serviços prestados pela chamada QUALISS ou seja o programa de qualifi cação de prestadores de serviços de saúde Para a execução do QUALISS a ANS conta ainda com entidades participantes que contribuem não só na elaboração de critérios mas também na coleta e na consolidação de dados Dentre as entidades aquela que está relacionada com a fiscalização e efetua o processo de acreditação fazendo com que o laboratório possa receber um selo de eficiência seria a CredISO Confederação de Recursos da Organização de Laboratórios Internacionais b Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária c ISO Organização Suplementar Isonômica d SBPCML PALC Sociedade Brasileira de Patologia Clínica Medicina Laboratorial e APLAB Associação dos Laboratórios Brasileiros 4 Para se obter um resultado de qualidade nos procedimentos de análise forense a fase de atenção essencial é a denominada cadeia de custódia Assinale a alternativa que melhor a defina a A cadeia de custódia abrange duas etapas a externa e a interna iniciando pela etapa interna b A cadeia de custódia tem duas etapas Nelas compreendese a coleta do material o transporte até o laboratório as cadeias de custódia interna e externa e o momento em que a amostra chegará até no laboratório e passará pelos registros exames testes armazenamento e descarte c A cadeia de custódia é etapa que junta as provas de um crime Nesse momento ainda não é necessário uso de EPIs d A cadeia de custódia abrange duas etapas porém é somente na segunda etapa cha mada de externa devem constar as informações do manuseador da amostra do local onde ela foi obtida e do momento em que foi realizado o manuseio e A cadeia de custódia compreende duas etapas Em uma constam o momento de coleta do material e o transporte até o laboratório a chamada custódia externa A outra etapa é a cadeia de custódia interna momento em que a amostra chega ao laboratório e são feitos os registros os exames os testes o armazenamento o descarte ou a devolução 3 Nesta unidade você terá a oportunidade de compreender as bases técnicas utilizadas para manipulação do DNA Você verá os métodos utilizados para produção de moléculas de DNA in vitro e conhecerá as etapas e os fatores necessários para efetuar a manipulação Ferramentas de manipulação do material genético Dra Ana Luisa Monezi Lucena 54 UNICESUMAR Inicio esta unidade com uma palavra muito pronunciada pelo menos nos últimos 10 anos tecnologia No dicionário descrevese que essa palavra tem origem do grego tekhne que significa técnica arte ofício em conjunto com o sufixo logia que significa estudo Diria que é o produto da ciência e da engenharia o que envolve um conjunto de instrumentos métodos e técnicas que visam a inovação na resolução de problemas em diferentes áreas MICHAELIS 2016 Recentemente as tecnologias envolvendo a ciência foram voltadas ao desenvolvimento e ao apri moramento em tempo recorde da vacina contra a Covid19 Essa possibilidade foi alcançada com os avanços das ferramentas utilizadas para a investigação das moléculas de ácidos nucleicos foco de nosso estudo Suponha que você futuroa biomédicoa pesquisadora deseja desenvolver um composto que age diretamente em células cancerígenas efetuando a inativação da multiplicação dessas células Para efetuar essa ação algumas questões devem ser levantadas como parte do planejamento da pro dução deste composto São elas Para compreender como proceder em cada uma das etapas sugeridas é preciso entender os mecanismos e as técnicas envolvidas para investigar as células alteradas ou cancerosas e as maneiras de modificá las Nessas etapas é crucial entender as tecnologias desenvolvidas para manipulação do DNA uma vez que o material genético contém as informações que poderiam estar envolvidas na manifestação de uma ação que não foi coerente Considere que manipular o DNA por meio das tecnologias a serem estudadas não está apenas as sociado à produção de novos compostos mas também à compreensão do funcionamento das células e das consequências em casos de erros malformação ou resposta que não seja ideal Foi com o intuito de compreender esse funcionamento que surgiu a biologia molecular que é continuamente reforçada por novas tecnologias As tecnologias são utilizadas para a produção de componentes importantes e que envolvem a resolução de problemas de saúde a complementação de produtos comerciais o entendimento do fun cionamento humano além de facilitarem a detecção de várias doenças O que você acha de pesquisar os medicamentos biológicos que foram descobertos com o auxílio da tecnologia de manipulação da molécula de DNA Faça uma breve pesquisa na internet em endereços de associações governamentais instituições de pesquisa artigos científicos ou reportagens de divulgação científica Organize e anote todos os resultados no diário de bordo A biologia molecular é a área da ciência que envolve o estudo e a manipulação das moléculas que constituem o material genético dos organismos Os avanços desse estudo iniciaram após o auge da Como atuam as células cancerígenas Em qual local se origina a ação descontrolada de divisão das células cancerígenas Como desenvolver um composto que controle a divisão celular tornandoa normal Como desenvolver um componente que associe as células cancerígenas e as inativam 55 UNIDADE 3 identificação da estrutura e da função do ácido desoxirribonucléico DNA Posteriormente outras técnicas moleculares foram se desenvolvendo a fim de isolar partes do DNA os genes e reproduzir várias cópias com o intuito de estudar o funcionamento Dentre as técnicas e as análises construídas ao longo das últimas décadas surgiram novas possibilidades de pesquisas o que aumentou o conhe cimento sobre o funcionamento gênico e os fatores envolvidos na regulação propiciando avanços tecnológicos importantes em diferentes áreas Seguem aspectos importantes para reflexão antes de entendermos como chegar a tais ações Entender que há possibilidades de estudo do funcionamento da molécula de DNA Compreender que as tecnologias são formas utilizadas para entender o funcionamento do organismo Observar que as tecnologias ajudam no desenvolvimento de novos compostos como vacinas medicamentos hormônios alterações gênicas na produção de transgênicos identificação de doenças paternidade etc Anote as suas ideias reflexões discussões e argumentos no diário de bordo DIÁRIO DE BORDO 56 UNICESUMAR A ideia de produzir medicamentos vacinas ou métodos que possam curar os diferentes tipos de câncer é buscada por vários pesquisadores No entanto para entender como desenvolver esses produtos é necessário conhecer os processos biológicos envolvidos no funcionamento das células cancerígenas Dessa forma você terá que pensar na molécula essencial que armazena as informações da célula o DNA Você já sabe que o DNA é uma molécula que contém todas as informações genéticas que podem ser expressas para funcionar nos diferentes ambientes de um corpo O conjunto de todas as informações específicas do organismo é chamado de genoma Para analisar a atividade de uma célula por exemplo a célula cancerígena que se multiplica de for ma descontrolada os pesquisadores direcionam a atenção aos fatores que envolvem a divisão celular ou seja os genes específicos envolvidos No entanto como analisar um gene ou poucos genes entre dezenas de milhares de genes aninhados aos milhões de pares de bases de um genoma humano A resposta surgiu em 1970 momento em que cientistas de várias áreas da biologia contribuíram com a geração de técnicas de localização isolamento preparação e estudo de pequenos segmentos de DNA derivados de cromossomos maiores PIERCE 2013 COX DOUDNA ODONNELL 2012 A primeira etapa dessa jornada é identificar em qual órgão a célula não está funcionando nor malmente Pense em um tipo de câncer e imagine que as células contidas neste órgão estão com uma divisão celular descontrolada Essa seria a célula de interesse Agora o próximo passo é averiguar o DNA dessa célula Para isso é importante fazer a seguinte pergunta quais são os genes do DNA envolvidos na divisão celular Identificar esses genes é considerado um dos progressos alcançados pela biologia molecular Atualmente é possível isolar os diferentes tipos de genes e analisar a expressão de cada um Técnicas descobertas ao longo de vários estudos permitem identificar características físicas que marcam o começo e o fim de um gene Assim o passo seguinte é isolar o gene responsável pela ação de multi plicação para então estudálo e chegar a objetivos maiores como a cura da doença PIERCE 2013 57 UNIDADE 3 Dessa forma para iniciar a análise do gene o primeiro passo é isolar os genes envolvidos no erro da divisão celular e fazer cópias deles para que sejam estudados Os métodos utilizados para realizar essa e outras tarefa relacionadas são conhecidos como tecnologia do DNA recombinante Um grande marco na história foi a descoberta de um método possível de isolar sequências específicas do DNA as chamadas endonucleases de restrição que são enzimas capazes de reconhecer e fazer cortes bifilamentares do DNA em sequências específicas Essa técnica é em parte utilizada para isolar o gene de interesse ou seja aquele que tem alterado os hábitos celulares de divisão responsável pelo câncer PIERCE 2013 COX DOUDNA ODONNELL 2012 Após décadas de pesquisa sobre o metabolismo dos ácidos nucleicos nos anos 60 foram identifica das enzimas de restrição em bactérias que eram utilizadas por organismos para defesa contra o vírus Atualmente elas são rotineiramente utilizadas nos laboratórios para separar fragmentos específicos de DNA de interesse São conhecidos três tipos de endonucleases de restrição identificadas com os algarismos romanos I II e III Esses tipos se diferem quanto à complexidade e à distância típica entre a sequência de reconhecimento do sítio de clivagem Descrevese na literatura que existem mais de 800 enzimas de restrição as quais reconhecem e cortam o DNA em mais de 100 sequências diferentes reconhecidas por elas Muitas delas são disponibilizadas comercialmente assim como pode ser obser vado na Figura 1 PIERCE 2013 COX DOUDNA ODONNELL 2012 Não é difícil perceber que existem diferentes tipos de câncer que afetam a humanidade Den tre os mais frequentes temos o câncer de mama nas mulheres e o de próstata nos homens Normalmente são feitos exames sanguíneos que identificam as alterações como a produção de proteínas anormais que não são regularmente encontradas nas amostras sanguíneas as chamadas marcadores tumorais Alguns marcadores são específicos para determinados tipos de câncer enquanto outros são encontrados em vários tipos da doença Um marcador bem conhecido para identificar o câncer de próstata é o PSA antígeno prostático específico Por outro lado é possível em alguns tipos de câncer como o de mama fazer exames que rastreiam as mutações ou as mudanças que tenham ocorrido no DNA da célula os quais mostram o risco de desenvolvimento do câncer Os genes conhecidos como BRCA1 e BRCA2 são exemplos de mutações relacionadas ao risco genético de câncer de mama e câncer de ovário Fonte adaptado de Lopes 2020 58 UNICESUMAR O passo crucial para iniciar o isolamento do gene de interesse a fim de estudar o câncer é utilizar uma enzima de restrição Essas enzimas agem como uma tesoura visto que reconhecem uma sequência de tamanhos de DNA de 4 a 8 pb pares de bases Uma particularidade do reconhecimento é a identificação das sequências palindrômicas que podem ser lidas do mesmo modo em relação à frente e ao inverso Figura 2 Enzima Sequencia de reconhecimento e clivagem Padrão de clivagem Fonte EcoRI HindIII BamHI TaqI AluI HoeIII BalI Sou3AI Escherichia coli R Haemophilus infuenzae Rd Bacilus amyloliquefaciens H Thermus aquaticus Anthobacter luteus Haemophicus aegypticus Brevibacterium albidum Staphylococcus aureus 3A GAATTC CTTAAC G CTTAA AATTC G AAGCTT TTCGAA A TTCGA AGCTT A GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G TCGA AGCT T AGC CGA T AGCT TCGA AG TC CT GA GGCC CCGG GG CC TGGCCA ACCGGT TGG ACC CCA CC GG GGT GATC CTAG CTAG GATC Descrição da Imagem na figura estão distribuídas quatro colunas Na primeira à esquerda estão os tipos de enzimas de restrição usualmente utilizados EcoRI Hind III BamHI TaqI AluI HaeIII BalI Sou3AI A segunda coluna mostra a sequência de reconhecimento e clivagem de cada uma dessas enzimas Já a terceira coluna ilustra os padrões de clivagem As quatro primeiras enzimas e a última fazem cortes coesivos enquanto AluI HaeIII e BalI fazem cortes cegos Por fim na quarta coluna são descritos os nomes dos organis mos extraídos de cada enzima Figura 1 Tipos de enzimas de restrição e os modos de identificação de sequências de clivagem Fonte Klug et al 2010 p 13 59 UNIDADE 3 As maneiras de cortes das enzimas de restrição podem variar sob duas formas pois nem sempre os cortes são efetuados de forma simétrica entre a dupla fita de DNA Quando é feita de forma simétrica não deixa pares de bases não pareados nas extremidades formando pontas robustas ou extremidades cegas No entanto o corte também pode ser feito de forma assimétrica deixando as extremidades da fita cortada de 2 a 4 nucleotídeos não pareados apresentando extremidades chamadas de coesivas Figura 1 O número de fragmentos disponíveis depois do corte efetuado pela enzima varia de acordo com o tamanho dele Quando se tem a formação de sequências curtas há um maior número de fragmentos O contrário acontece quando as sequências são longas visto que a quantidade é menor Segundo Cox Doudna e ODonnell 2012 o tamanho do fragmento pode ser aumentado com o auxílio de uma endonuclease especial chamada homing que reconhece e cliva as sequências muito mais longas 12 a 40pb PIERCE 2013 COX DOUDNA ODONNELL 2012 Visto que vários fragmentos são produzidos depois da ação da endonuclease o próximo objetivo é selecionar aquele de interesse ou seja o responsável por estar prejudicando o funcionamento normal da divisão das células Dessa maneira o próximo passo é identificar esses fragmentos dentre o conjunto de DNA ALBERTS et al 2017 A eletroforese em gel é um método que auxilia na determinação das quantidades de fragmentos ge rados após a ação da enzima e no tamanho dos fragmentos O princípio da ação dessa técnica é separar 5 3 3 5 CLIVAGEM EXTREMIDADE COESIVA 5 3 EXTREMIDADE COESIVA 3 5 G A A T T C C T T A A A A T T C G G C T T A A G Descrição da Imagem a figura mostra uma sequência de corte de uma enzima de restrição EcoRI Na horizontal é mostrada uma dupla fita de DNA a fita 5 3 como a superior e a 3 5como a inferior no formato de traço na cor cinza Na cor azul são evidencia das as sequências de bases de corte pela enzima EcoRI por um contorno vermelho na forma de seta delimitando a região do corte da enzima Abaixo da imagem por meio de uma seta na vertical e na cor preta indicase a representação da fita de DNA separada na região de corte pela enzima EcoRI A clivagem acontece sobre as duas fitas de DNA originando extremidades 5 soltas denominadas extremidades coesivas É possível ainda observar que a sequência cortada representa palíndromos GAATTC CTTAAG Figura 2 Representação do sítio de clivagem feita pela enzima de restrição EcoRI de corte coesivo Fonte Watson et al 2015 p 7 60 UNICESUMAR moléculas com base no tamanho e na carga elétrica Como o DNA contém o fosfato na constituição dos nucleotídeos e este carrega carga negativa os fragmentos são separados apenas com base no tama nho já que todos irão em direção à carga positiva Figura 3 PIERCE 2013 ALBERTS et al 2017 Dessa forma a técnica de eletroforese em gel se baseia na preparação de uma solução que tem como um dos constituintes principais a agarose ou poliacrilamida que é preparada na consistência de um gel semelhante a uma gelatina dura Ele se apresenta na forma de rede de tramas de poros microscó picos em que em uma das extremidades são formados poços com pentes colocados no gel antes da polimerização É nesses poços que é aplicada a mistura dos fragmentos DNA que foram cortados E B A D CFG Tamanho menor C A B C D E F G Sítios de EcoRI B A B B A Eletrodos A Cuba de eletroforese Soluçãotampão Fragmentos de DNA Gel de agarose Eletrodo cátodo Eletrodo ânodo Eletrodo cátodo Eletrodo ânodo Os fragmentos de DNA menores deslocamse mais rápido ao longo do gel do que os fragmentos maiores Descrição da Imagem a figura é dividida em A B e C Em A esquematizase uma cuba recipiente em que são colocados um tampão e o gel de poliacrilamida Na extremidade dela há um fio de voltagem que é submetido a uma corrente elétrica São mostrados os fragmentos de DNA aplicados na extremidade superior do gel que se desloca para a extremidade positiva e inferior do gel Em B é mostrado o esquema do gel visto de cima com poços ou canaletas representados como retângulos brancos As setas mostram a di reção da partida dos fragmentos para os polos positivos do gel Na imagem C são evidenciados um esquema de DNA e os pontos de cortes da enzima de restrição EcoRI Na parte inferior da figura C há outro desenho que mostra os fragmentos no gel os quais após serem submetidos a uma corrente elétrica separamse e assumem posições diferentes devido à diferença dos pesos moleculares com disposição do maior para o menor na direção do polo positivo da cuba Figura 3 Eletroforese em gel de poliacrilamida Fonte Watson et al 2015 p 7 61 UNIDADE 3 Após a aplicação da mistura o gel contido em uma cuba estrutura que acomoda o gel junto a uma soluçãotampão é ligado a uma corrente elétrica Nesse momento iniciase a movimentação dos fragmentos que são separados pelo tamanho Os mais curtos passam mais facilmente pela barreira do gel migrando mais rapidamente em direção ao polo positivo enquanto os fragmentos grandes e por consequência mais pesados apresentam maior resistência à migração Figura 3 PIERCE 2013 ALBERTS et al 2017 Conheça a técnica de eletroforese em gel com apenas um clique no QR Code a seguir Após a finalização da eletroforese ainda não é possível visualizar os fragmentos O modo mais utilizado para tornálos visíveis é corar um gel com um corante específico que se associa ao DNA O mais usado é o brometo de etídio que age intercalando as bases de DNA e fluoresce em laranja quando exposto à luz ultravioleta Figura 4 Outra forma de visualização dos fragmentos é tratálos com marcadores radioativos ou químicos antes de serem colocados no gel Um exemplo é a incorporação de um radioisótopo 32P nos fosfatos das moléculas de DNA Para visualizar os fragmentos marcados é usada uma técnica chamada au torradiografia Nela um pedaço de filme de raio X é colocado em cima do gel A radiação do DNA marcado expõe um filme fotográfico em uma câmera que revela os fragmentos do gel como uma banda escura PIERCE 2013 ALBERTS et al 2017 REALIDADE AUMENTADA Técnica de Eletroforese em Gel 62 UNICESUMAR Efetuadas todas etapas em que o DNA foi tratado com as enzimas de restrição separado por eletro forese e visualizado em gel ainda não é possível identificar exatamente a sequência específica Para tanto rotineiramente é utilizada uma sonda com uma molécula de DNA ou RNA com sequência de bases complementares a qual se ligará ao fragmento da sequência do gene de interesse ou seja ela terá exatamente a sequência de nucleotídeo do gene responsável pela alteração das condições de divisão da célula cancerígena a ser investigada PIERCE 2013 ALBERTS et al 2017 O uso de sondas necessita que os fragmentos de DNA separados na técnica de eletroforese sejam desnaturados de modo que a dupla fita de DNA se separe Após a desnaturação os fragmentos são transferidos para um meio sólido uma espécie de papel de nitrocelulose ou membrana de náilon Essa técnica é conhecida como transferência de Southern Southern blot Após a transferência o meio que contém os fragmentos é colocado em uma solução de hibridização que carrega as sondas Para facilitar a visualização quando a sonda se associa ao DNA específico de interesse é marcada ra dioativamente Finalizado o processo de complementação das sondas aos fragmentos o meio sólido é lavado para remover qualquer sonda não ligada e em seguida partese para o processo de detecção por autorradiografia ou outro método Figura 5 PIERCE 2013 ALBERTS et al 2017 Descrição da Imagem na figura mostrase a revelação de géis de eletroforese Foi utilizado o brometo de etídio que se intercala nas bases de DNA Na Figura 4 a os fragmentos revelados são fluorescentes em laranja quando expostos à luz ultravioleta Na Figura b o gel revela que os fragmentos menores migram mais rapidamente e mais longe do que os maiores Figura 4 a Fragmentos fluorescentes b Gel mostrando a migração dos fragmentos menores Fonte Klug et al 2010 p 13 63 UNIDADE 3 1 Amostras de DNA cortadas com enzima de restrição são aplicadas em gel de agarose para eletroforese Canaleta 1 Marcadores radioativos de tamanho Canaleta 2 DNA cortado com enzima de restrição A Canaleta 3 DNA cortado com a enzima de restrição B 2 DNA é separado por eletroforese DNA é desnaturado Gel é colocado sobre mecha de esponja 1 2 3 3 O fltro de ligação ao DNA as toalhas de papel e o peso são colocados sobre o gel o tampão atravessa a esponja por ação capilar transferindo o fragmento de DNA ao fltro Peso Tolhas de papel Gel Mecha esponja Tampão 4 Após a desnaturação do DNA o fltro é colocado no saco selado termicamente com solução que contém a sonda marcada a sonda hibridizada com as sequencias complementares 5 O fltro é lavado para remover a sonda não ligada depois é secado o flme de raio X é aplicado para a autorradiografa Autorradiografa Coloque o flme de raio x sobre o fltro Autorradiografa todos os marcadores de tamanho se mostram porque são radioativos nas canaletas 2 e 3 somente as bandas que hibridizam com a sonda são visíveis Sonda radioativa 1 2 3 1 2 3 Descrição da Imagem na figura é representada uma série de figuras que demonstram as etapas para identificação de fragmentos específicos pela técnica de transferência de Southern Representando a etapa 1 e a etapa 2 é mostrado o processo de eletroforese Nele o gel é aplicado nos fragmentos resultantes da ação da enzima de restrição e há outro gel etapa 2 com os fragmentos em posições diferentes após a corrida Na etapa 3 é evidenciada a técnica de Southern Nela é prensado e transfere os fragmentos para a membra na de nitrocelulose Na etapa 4 a membrana com os fragmentos transferidos é colocada em um saco plástico vedado contendo uma solução com a sonda radioativa Na etapa 5 a membrana é lavada para retirar as sondas não ligadas e posteriormente são revelados os fragmentos específicos com traços após colocar um filme de raio X sobre a membrana Figura 5 Identificação de fragmentos específicos pela técnica de transferência de Southern Southern blot Fonte Klug et al 2010 p 13 64 UNICESUMAR Findada a identificação do gene de interesse pelas sondas para prosseguir com um estudo detalhado da estrutura e da função desse gene será necessária a cópia de grandes quantidades do gene individual purificado Para isso é disponível uma variedade de técnicas que permitem preparar grande número de moléculas de DNA idênticos Um mecanismo muito utilizado é a inserção dos fragmentos do DNA de interesse em vetores de clonagem Esses vetores serão capazes de replicar o DNA inserido Segundo Nel son e Cox 2014 são considerados três vetores populares de clonagem que utilizam a E coli e leveduras plasmídeos cromossomos artificiais de bactérias e cromossomos artificiais de leveduras Figura 6 A origem de uma sonda depende do que se conhece sobre o gene que está sendo investigado Às vezes pode ser utilizado um gene homólogo clonado de outra espécie o qual permite cons truir uma sonda adequada Outro modo utilizado é purificar o produto proteico de um gene e criar sondas trabalhando de trás para frente a partir da sequência de aminoácidos deduzindo a sequência de DNA que o codificaria Atualmente os pesquisadores obtêm informações da sequência do DNA a partir das bases de dados de sequências que detalham a estrutura de milhões de genes de uma gama de organismos Fonte adaptado de Nelson e Cox 2014 Descrição da Imagem a figura representa os vetores plasmidiais usados para clonar DNA os quais são mostrados em amarelo por uma fotomicrografia eletrônica de coloração acentuada Estão dispostas várias moléculas de plasmídeos circulares isoladas de E coli Figura 6 Vetores plasmidiais Fonte Klug et al 2010 p 13 65 UNIDADE 3 Os vetores para os pesquisadores seriam como o combustível de um carro que faz o transporte Por outro lado o gene inserido o carona presente no interior do carro utiliza o combustível para deslocamento O gene que utiliza o combustível seria o metabolismo do vetor para se multiplicar Os vetores de clonagem oferecem várias alternativas de estudo dependendo do objetivo do pesquisador que pode variar entre a identificação da sequência de nucleotídeos do DNA de interesse a observação da expressão gênica para purificação de proteínas os efeitos da mutação ou a criação de vários tipos de alterações genéticas COX DOUDNA ODONNELL 2012 No início desta unidade descrevi a importância de se estudar os genes envolvidos nos processos de divisão celular para melhor entender as ações das células cancerígenas visto que compreendendo a ação desses genes seria possível desenvolver produtos ou técnicas para inibir a divisão descontrolada que o gene pode estar envolvido Diante disso o intuito do uso do vetor é reproduzir várias cópias do gene e estudar os efeitos da mutação para posteriormente adequarse e desenvolver algo que a venha agir de maneira a impedir o progresso da perpetuação da célula mutada O plasmídeo um dos vetores utilizados para reproduzir cópias do DNA de interesse está presente no interior de bactérias Tratase de moléculas circulares de DNA bacteriano que se encontram fora do DNA cromossomal Para as bactérias as sequências de gene contidos nesse DNA plasmidial conferem a elas algumas funções como a resistência a antibióticos Outra possibilidade é elas apresentarem características que permitem a colonização de células hospedeiras sem serem prejudicadas No laboratório esses plasmídeos são modi ficados a partir da retirada de porções desnecessárias de plasmídeos naturais a fim de que sejam utilizados como vetores no interior de bactérias Assim toda vez que a bactéria se reproduzir serão formadas novas cópias do DNA inserido no plasmídeo COX DOUDNA ODONNELL 2012 NELSON COX 2014 Para prosseguir a cópia de segmentos gênicos específicos como o gene de interesse iso lado é utilizada primeiro uma das enzimas já citadas as endonucleases de restrição Elas serão utilizadas para cortar tanto a sequência de DNA que será alvo da clonagem quanto o DNA plasmidial Após submeter a digestão pela enzima de restrição os DNAs citados são colocados em contato com outra enzima o DNA ligase que será o responsável por ligar os fragmentos cortados que se deseja clonar com as regiões dos espaços deixados pelos cortes feitos pela endonuclease no DNA plasmidial Posteriormente eles são transferidos do vetor recombinado para o interior de um hospedeiro no caso a bactéria Figura 7 O processo de transferência é chamado de transformação Ele pode ocorrer naturalmente quando as bactérias captam os plasmídeos modificados ou sinteticamente quando tratados com cloreto de cálcio e choques térmicos ou pulsos de alta voltagem os quais induzem a entrada do plasmídeo No interior da bactéria o plasmídeo alterado terá a maquinaria enzi mática completa para fazer a replicação do DNA de interesse Figura 7 COX DOUDNA ODONNELL 2012 NELSON COX 2014 LODISH et al 2014 66 UNICESUMAR DNA hospedeiro 4 O DNA é introduzido na célula hospedeira 5 Vetor recombinante DNA Girase 3 2 Cromossomo eucariótico Os fragmentos de DNA de interesse é obtido pela clivagem dos cromossomos com uma endonuclease de restrição A propagação clonagem da célula transformada produz várias cópias do DNA recombinante O vetor de clonagem é clivado pela endonuclease de restrição 1 Vetor de clonagem plasmídeos Os fragmentos são ligados aos vetores de clonagem preparados Descrição da Imagem a figura representa as etapas de inserção do fragmento do DNA específico ao vetor plasmidial Observase o vetor de clonagem plasmídeo totalmente na cor amarela e o cromossomo eucariótico emaranhado de fios azuis com uma pequena extremidade em vermelho com a sequência de interesse destacada em vermelho Tanto o vetor de clonagem quanto o DNA eucariótico são tratados com a enzima de restrição Posteriormente a enzima DNA ligase associa o fragmento de interesse fragmento vermelho ao vetor plasmidial Em seguida o vetor recombinante na cor amarela com parte de um fragmento em vermelho é inserido na célula hospedeira neste caso uma bactéria É mostrada a propagação da célula bacteriana transformada replicando os vetores recombi nantes inseridos Figura 7 Inserção do fragmento do DNA específico no vetor plasmidial Fonte Nelson e Cox 2019 p 304 67 UNIDADE 3 Depois de vários ciclos de reprodução é então feita a seleção das células hospedeiras que contêm o DNA recombinante Essa seleção pode ser realizada a partir das características do próprio vetor que carrega marcadores de seleção Os marcadores são genes que se expressam quando submetidos às condições con troladas Portanto as células que contêm o vetor são selecionadas nesse meio Outra maneira de detectar os vetores modificados após sucessivas replicações é por meio do uso de sondas de hibridização Essas sondas radioativas depois de se ligarem ao DNA de interesse são visualizadas na autorradiografia das colônias de bactérias marcadas Figura 8 NELSON COX 2014 COX DOUDNA ODONNELL 2012 Descrição da Imagemtratase de uma representação do processo de identificação das colônias de bactérias por meio de sondas que foram inseridas no fragmento de interesse 1 Para a identificação dos fragmentos de interesse é colocado um filtro papel sobre a placa de Petri contendo as bactérias pontos representados em azul dispersos no meio de cultura de cor laranja que foram transfor madas 2 Após a transferência das colônias ao filtro 3 Ele é colocado em um saco fechado em que foi vertido o conteúdo de um tubo de ensaio contendo a solução com as sondas uma solução laranja com pontos pequenos na cor azul de hibridização 4 Em seguida o filtro é lavado para retirar as sondas não hibridizadas e é colocado sobre ele um filme de raio X para a autorradiografia 5 Mostrase uma colônia da placa original que reagiu positivamente com a sonda fazendo a indicação com uma ponteira um cabo alongado marrom com uma ponta fina azul 6 Depois é exposto um recipiente com um meio nutritivo Erlenmeyer com solução nutritiva laranja em seu interior em que é colocada a colônia que hibridiza com a sonda que será analisada Figura 8 Identificação das colônias de bactérias por sondas Fonte Klug et al 2010 p 13 1 As colônias das bibliotecas são cobertas por fltro de ligação ao DNA 2 As colônias são transferidas ao fltro depois são lisadas e o DNA é desnaturado 3 O fltro é colocado em um saco selado termicamente com uma solução que contém a sonda marcada essa sonda é hibridizada com o DNA desnaturado das colônias 4 O fltro é lavado para remover o excesso de sonda depois secado o flme de raiox é colocado sobre o fltro para a autorradiografa Filme 5 Usando a placa original são selecionadas as células da colônia que hibridizou com a sonda 6 As células são transferidas a um meio nutritivo para multiplicação e posterior análise Hibridização da sonda com uma colônia da placa original é indicada por um ponto no flme de raio X 68 UNICESUMAR Há alguns marcadores selecionáveis que são introduzidos no plasmídeo junto ao DNA a ser clonado São chamados de marcadores de rastreamento e nada mais são do que um gene que codifica para uma proteína que faz com que a célula produza uma molécula colorida ou fluorescente Um tipo muito utilizado é o gene lacZ introduzido ao plasmídeo junto ao DNA a ser clonado A identificação se deve à expressão ou não Quando não ocorre a inserção do DNA de interesse o gene lacZ é ativo e produz ß Galactosidase que mostra as bactérias na colônia em uma coloração azul No entanto quando um DNA exógeno é inserido junto ao lacZ ele perturba a ação de lacZ que não produz ß Galactosidade permanecendo branca a cultura Figura 9 PIERCE 2014 A B Sítio de policlonagem Gene lacZ Resistência à ampicilina 3 3 5 5 Gene lacZ Gene lacZ Resistência à ampicilina 5 3 DNA a ser clonado clivado com a mesma enzima de restrição Inserção de DNA causa a interrupção do gene lacZ Gene lacZ Gene lacZ Resistência à ampicilina Plasmídeo recombinante não pode metabolizar Xgal e formará colônia branca Corte no sítio de policlonagem com enzima de restrição Gene lacZ intacto do plasmídeo pUC18 pode metabolizar Xgal e formará colônia azul Descrição da Imagem tratase de uma representação do vetor plasmidial pUC18 com um marcador selecionável lacZ Na Figura 9 a temos três vetores À esquerda temos um vetor plasmídeo azul com dois fragmentos na cor roxa um representando a parte do gene que proporciona a resistência à ampicilina e outra parte indicando o gene lacZ Ele não é não associado com o fragmento de interesse Dessa forma o lacZ ficou intacto e formará colônia de bactérias com a coloração azul O plasmídeo representado no centro demonstra o local do gene lacZ uma parte do fragmento roxo retirado que corresponde ao corte da enzima de restrição e consequentemente à área que se ligará ao fragmento específico na cor laranja e cortado com a mesma enzima de restrição O plasmídeo da extremidade direita com a cor azul mesclando duas regiões na cor roxa mostra o fragmento de interesse ligado ao lacZ o que causa a interrupção impedindo o plasmídeo de metabolizar o composto Xgal Isso desencadeia a cor azul Dessa forma as colônias com o fragmento são vistas com a coloração branca Na Figura 9 b há uma placa de Petri com as colônias bacterianas azul e branca representadas por pontos em um meio de cultura transparente opaca ou seja sem e com o fragmento de interesse respectivamente Figura 9 a Três vetores b Placa de Petri com as colônias bacterianas Fonte Klug et al 2010 p 13 69 UNIDADE 3 Os plasmídeos não são os únicos vetores de clonagem Outros como os vírus que atacam bactérias chamados de bacteriofágos também são frequentemente utilizados assim como cromossomos bacterianos artificiais BACs e cromossomos artificiais de leve duras YACs Tais vetores apresentam uma característica muito importante não encontrada nos plasmídeos de bactérias que é a capacidade de clonar segmentos muito longos de DNA Essa característica é vista como uma das limitações dos plas mídeos que podem carregar apenas DNA com menos de 15Kb de tamanho sendo instáveis quando introduzidos tamanhos maiores Figura 10 PIERCE 2013 NELSON COX 2014 Além disso o DNA clonado em YAC pode ser alterado para se estudar a função de sequências especializadas no metabolismo dos cromossomos os mecanismos de regulação e expressão gênica e outros problemas da biologia eucariótica COX DOUDNA ODONNELL 2012 UNICESUMAR Figura 10 Vetor de clonagem do tipo BAC Fonte Nelson e Cox 2019 p 309 Descrição da Imagem a figura representa o processo de recombinação de um grande fragmento que pode ser inserido em vetores artificiais de bactérias BAC É mostrado que o vetor BAC contém o sítio de clonagem com lacZ plasmídeo colorido com diferentes cores em que parte é a sequência lacZ representada por um fragmento vermelho após ser submetido ao tratamento com a enzima de restrição e DNA ligase é possível fazer a associação desse grande fragmento de DNA fita azul com as extremidades na cor vermelha representando a parte que se ligará ao vetor a ele Em seguida uma bactéria com o vetor recombinante plasmídeo em cinza contendo o fragmento azul com as pontas vermelhas inseridas no interior conseguido pelo processo de eletroporação Por último é representada uma placa de Petri com solução nutritiva cor laranja e as colônias pontos que se associaram ao fragmento pontos na cor branca e que não se associaram pontos na cor azul 71 UNIDADE 3 As ferramentas apresentadas são as bases para a expansão de outras metodologias da biologia molecular que ajudam a entender e a encontrar modos de interferir nos problemas que anseiam a humanidade Aos poucos são publicadas por pesquisadores de todo o mundo ferramentas que têm a capacidade de alterar o material genético para condições desejáveis ou desenvolver medicamentos que inativam ou impedem a ação de genes não favoráveis O intuito é desenvolver algum produto ou técnica capaz de alterar as células cancerígenas Emilly Mullin 2019 em uma reportagem concedida à revista One Zero explica que a grande maio ria dos medicamentos existentes são para tratar apenas os sintomas da doença e não a causa Assim apresenta uma tecnologia que vai muito além do simples tratamento de doenças e mostra uma técnica capaz de editar genes o que permite que os cientistas ajustem o DNA e promovam curas definitivas em um futuro não muito distante A técnica descrita na reportagem se refere ao CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Pa lindromic Repeats uma poderosa ferramenta de edição de genes que pode revolucionar a medicina O primeiro estudo publicado sobre o CRISPR foi em 2013 Nele cientistas apresentaram a capacidade da técnica de cortar e colar o DNA em células humanas vivas in vitro em um laboratório Figura 11 Atualmente algumas empresas de biotecnologia dos Estados Unidos Alemanha e China estão testando essa ideia em pacientes humanos Muitas possibilidades foram trazidas com o avanço das tecnologias desenvolvidas da biologia molecular Uma reportagem publicada pela revista Superinteressante em março de 2020 mostra um novo exame de sangue que pode detectar até 50 tipos de câncer Para acessar use seu leitor de QR Code 72 UNICESUMAR De forma geral o maior benefício do CRISPR é a possibilidade de retirar fragmentos errados do DNA ou alterar os genes não funcionais ou com problemas de expressão Há relatos de que nos primeiros testes dessa técnica os profissionais buscaram trocar genes não funcionais por novos No entanto na prática sabese que é uma tarefa minuciosa e provavelmente só será validada após serem feitos testes em animais enzima Cas9 RNA guia CLIVAGEM Fita de DNA CLIVAGEM reparação inserção Descrição da Imagem a imagem representa a técnica de CRISPR Nela são feitos cortes indicados por duas setas na cor rosa em regiões específicas do DNA dupla fita de DNA representado pela cor azul na direção horizontal e a inserção de sequências de interes se O RNA guia representado pela cor laranja se associa à fita dupla de DNA dupla fita na cor azul juntamente com a enzima Cas9 estrutura em cinza que recobre toda a parte do DNA a ser clivado juntamente com o RNA guia A enzima Cas9 direcionada pelo RNA guia provoca o corte duas setas rosas em uma parte específica da dupla fita de DNA Em seguida é mostrado o DNA dupla fita azul na direção horizontal cortado e separadas as duplas fitas Logo abaixo está representado o DNA reparado e inserido o gene de interesse em verde Figura 11 Técnica de CRISPR 73 UNIDADE 3 Outra técnica proveniente das bases da biologia molecular é o desenvolvimento de vacinas que agem diretamente no DNA também conhecidas como vacinas gênicas São fragmentos normalmente uma proteína de microorganismo que desencadeia no organismo humano a resposta imunológica prote tora Nesse caso o indivíduo não recebe a vacina pronta mas apenas a mensagem de produção Assim o próprio DNA passa a produzir a vacina no organismo O imunoterápico de DNA está sendo usado em um estudo clínico com pacientes acometidos pelos cânceres de cabeça e de pescoço e tem apre sentado respostas contra determinadas infecções e alguns tipos de tumores VASCONCELOS 2006 Para o sucesso da terapia de ambas as técnicas apresentadas é essencial a produção do material genético Em relação ao CRISPR é necessário produzir um RNA guia que se ligará ao DNA de forma complementar e junto a ele uma proteína que auxiliará na quebra das fitas de DNA para então pos teriormente ligar o gene funcional correto No que diz respeito à imunoterapia de DNA é essencial a produção da proteína recombinante com grau de pureza que atenda às exigências dos órgãos regula dores Para desenvolver esses processos são importantes as técnicas básicas da biologia molecular e o conhecimento do funcionamento das endonucleases de restrição das enzimas de ligação da revelação da transferência da identificação de fragmentos específicos e da amplificação As técnicas da biologia molecular abriram espaço para o estudo e o desenvolvimento de outras metodologias Uma delas é o CRISPR técnica capaz de modificar o funcionamento do DNA pois por meio dela é possível editálo Acompanhe o vídeo disposto no QR Code a seguir para conhecer como essa técnica surgiu e as possibilidades que ela poderá trazer para o futuro Para acessar use seu leitor de QR Code 74 UNICESUMAR As tecnologias da biologia molecular apresentadas nesta unidade representam uma das ferramentas de maior potencial para a realização de pesquisas na área médica tanto em nível clínico quanto epidemio lógico e para a possibilidade de aplicação dessas ferramentas na investigação identificação prevenção e alteração da manifestação de um número amplo de doenças Em consequência um grande interesse é despertado nessa área e é observado um número cada vez maior de profissionais da área de saúde motivados em aprofundar os conhecimentos e produção científica Provavelmente você terá a oportunidade de fazer parte dessa busca do melhoramento da vida humana com o uso das técnicas de biologia molecular e terá condições de iniciar a sua interpretação a partir daqui Com os conhecimentos adquiridos nesta unidade você será capaz de entender que os princípios da biologia molecular te auxiliarão na trajetória a fim de encontrar uma possibilidade de cura para doenças Apesar de saber que ainda não há uma resposta definitiva para muitas pesquisas diante dos vários testes realizados uma vez que muitas questões éticas devem ser levadas em conside ração o importante neste primeiro momento é entender que existem maneiras de fazer investigação Apesar das questões éticas envolvidas toda vez que uma nova téc nica da biologia molecular é utilizada para transformar criar ou con sertar moléculas vários benefícios trazidos com o uso são marcados ao longo dos anos e modificam vidas preservando e oferecendo condições melhores Vários exemplos já foram citados no decorrer desta unidade como as vacinas os remédios as plantas e os ani mais No podcast desta unidade você conhecerá a primeira droga do mundo fabricada a partir da tecnologia do DNA recombinante Aperte o play que a história vai começar 75 Vamos sintetizar o que você aprendeu nesta unidade A seguir é representado um mapa conceitual dos principais tópicos abordados sobre a tecnologia de manipulação do DNA Siga as informações descritas em cada um dos balões e preencha os que estão vazios com a descrição correta Componentes comerciais provindos do auxilio das ferramentas da biologia molecular Ferramenta promissora para edição de genes O gel é pressionado sob um membrana de nitrocelulose fazse a desnaturação do DNA e a membrana é colocada em contato com a sonda Técnica de visualização dos fragmentos de acordo com seu tamanho TECNOLOGIA DA MANIPULAÇÃO DO DNA Fragmentos menores se locomovem mais rápido que os maiores Identifcação de fragmentos específcos por sondas Enzima que corta sequências específcas de DNA É uma defesa contra vírus para as Bactérias Ligam sequências de DNA específcas em Vetores Tipos de vetores de amplifcação de DNA Multiplicam sequências de interesse 76 1 As tecnologias para manipular o DNA são aplicadas na biologia para a produção de novas técnicas materiais e compostos de uso farmacêutico médico e agrícola por exemplo Em relação às tecnologias para manipular o DNA assinale a alternativa correta a A tecnologia de manipulação do DNA se baseia na troca de pedaços de genes entre organismos de mesma espécie formando um ser recombinante b Todos os vetores utilizados para amplificação de DNA de interesse são capazes de carregar sequências de tamanhos variados c As enzimas de restrição são especializadas em cortar fragmentos de DNA em sítios aleatórios da molécula d Dependendo do tipo as enzimas de restrição podem efetuar dois tipos de cortes Quando o corte é efetuado de forma simétrica entre a dupla fita de DNA não deixa pares de bases não pareados nas extremidades formando pontas robustas ou ex tremidades cegas e Plasmídeos são moléculas circulares de DNA com função desconhecida presentes no material genético de algumas bactérias 77 2 A biologia molecular é a área da ciência que envolve o estudo e a manipulação das moléculas que constituem o material genético dos organismos Os avanços desse estudo se iniciaram após o auge da identificação da estrutura e da função do ácido desoxirribonucléico DNA Em relação às ferramentas de manipulação do material genético associe corretamente as colunas a seguir Coluna I a Enzima de restrição b Plasmídio c Vetor d Eletroforese Coluna II Tem propriedade de cortar o DNA em pontos específicos Foi identificada pela primeira vez em células bacterianas tendo como papel biológico natural protegêlas contra os vírus Moléculas circulares duplas de DNA capazes de se reproduzir independentemente do DNA cromossômico Ocorrem geralmente em bactérias Técnica usada para separar fragmentos de DNA de acordo com o tamanho As amos tras de DNA são submetidas a uma corrente elétrica separando fragmentos DNA que se movem na direção do eletrodo positivo Organismos que têm as condições necessárias para clonagem molecular das molécu las de DNA São capazes de formar centenas de cópias da informação genética que neles foi inserida Diferemse quanto ao tamanho de fragmentos que podem replicar Assinale a sequência correta a ACDB b CADB c BCDA d DABC e ABDC 78 3 Em um experimento um pesquisador deseja isolar dois fragmentos de interesse de igual tamanho correspondente a um gene identificado por ele por A e a Para isso ele utilizou uma enzima de restrição capaz de clivar cortar o segmento de DNA que corres ponde ao gene A em duas partes de diferentes tamanhos medidos em pares de bases pb Todavia a mesma enzima não foi capaz de clivar o segmento de DNA do gene a Ele utilizou células de três indivíduos 1 2 e 3 e obteve o trecho de DNA que corres ponde ao gene citado Tais sequências foram misturadas com a enzima de restrição e após o procedimento o material foi submetido a uma eletroforese em gel de agarose O resultado da digestão revelado pela eletroforese é representado no esquema a seguir As faixas claras horizontais representam o tamanho dos fragmentos do DNA obtido Com base nos resultados analise as afirmativas a seguir I Provavelmente o indivíduo 01 tem apenas o gene a visto que é mais pesado e se localiza no gel na extremidade próxima do polo negativo II O indivíduo 02 possui duas cópias do gene a III O indivíduo 03 possui um gene a e um gene A IV O indivíduo 03 possui um gene a clivado posicionado entre os pesos de 400pb e 300pb e um alelo A com aproximadamente 700pb V O gene A quando clivado origina dois fragmentos com cerca de 700pb VI O gene A após ser clivado possui um tamanho de aproximadamente 400pb e 300pb VII Os fragmentos maiores do gene A ficam mais próximos do pólo positivo É correto o que se afirma em a I II III IV VI e VII b I II V e VII c I II III IV e VI d III IV V e VII e I III e VI 79 4 Os marcadores moleculares são utilizados para detecção da localização e identificação de compostos orgânicos tais como ácidos nucleicos e proteínas O uso deles permite o monitoramento de processos biológicos Em geral são produzidos laboratorialmente e amplamente utilizados em pesquisas da área da biologia molecular Sobre os marcadores moleculares utilizados para rastrear informações de interesse assinale a alternativa correta a Um marcador de rastreabilidade utilizado na técnica de Southern blot são as sondas Elas são constituídas por duas estruturas uma biologicamente ativa responsável por se ligar a uma molécula de interesse e outra porção contendo um grupo funcional fluorescente responsável pela emissão luminosa b As sondas se referem a um fragmento de RNA de cadeia dupla que é muito utilizado como marcador de rastreabilidade usado na técnica de Southern blot c As sondas se referem a um fragmento de DNA de cadeia dupla que é muito utilizado como um marcador de rastreabilidade na identificação de bactérias transformadas d O LacZ é uma sonda de rastreabilidade que emite coloração azul quando é detectada a associação do gene de interesse e Um marcador de rastreabilidade utilizado em culturas de bactérias transformadas é o Southern blot que representa as sondas que contêm uma porção fluorescente responsável pela emissão luminosa 80 5 A empresa Editas Medicine em parceira com a farmacêutica Allergan anunciou em julho de 2019 que em breve testarão o CRISPR em pacientes com uma forma heredi tária de cegueira chamada amaurose congênita de Leber um tipo de perda de visão que começa na primeira infância Essa enfermidade se deve a uma mutação no gene CEP290 que faz com que os fotorreceptores células sensoriais à luz e que possibilitam a visão se deteriorem com o tempo MULLIN E Scientists are using CRISPR in attempts to restore vision cure blood disor ders and more OneZero 2 ago 2019 Disponível em httpsonezeromediumcom scientistsareusingcrisprinattemptstorestorevisioncureblooddisordersandmo re860e4be91fd9 Acesso em 19 nov 2021 Considerando as informações apresentadas avalie as asserções a seguir e a relação proposta entre elas Acreditase que técnica de CRISPR reparará os fotorreceptores restantes e restaurará a visão PORQUE É uma ferramenta capaz de fazer a edição de genes cortando os fotorreceptores res tantes e substituindo por novos sem a mutação Assinale a alternativa correta a As duas asserções são proposições verdadeiras e a segunda é uma justificativa correta da primeira b As duas asserções são proposições verdadeiras mas a segunda não é uma justificativa correta da primeira c A primeira asserção é uma proposição verdadeira e a segunda uma proposição falsa d A primeira asserção é uma proposição falsa e a segunda uma proposição verdadeira e Tanto a primeira quanto a segunda asserção são proposições falsas 4 Nesta unidade você terá a oportunidade de conhecer mais uma metodologia da biologia molecular Ela é capaz de amplificar as se quências gênicas de interesse Tratase da PCR reação em cadeia de polimerase Assim você compreenderá como a PCR é desenvolvida entenderá as vantagens e as desvantagens dela além dos tipos de variações da PCR e as aplicações nas análises forenses Reação em cadeia da polimerase e suas aplicações Dra Ana Luisa Monezi Lucena 82 UNICESUMAR Em 26 de fevereiro de 2020 foi registrado o primeiro caso de Covid19 em território nacional O registro foi de um homem de 61 anos que mora no estado de São Paulo No entanto na ocasião foi informado que ele havia estado na Itália país no qual já tinham sido identificados mais de 100 casos do vírus SARS CoV2 Passados dez meses do primeiro infectado no Brasil além de muitos afetados foi encontrada uma nova variante do vírus a chamada B117 já identificada em mais de 17 países e considerada 56 mais contagiosa Você já pensou na forma como é detectado o vírus da Covid19 Será que os testes disponíveis são eficazes para a verificação da nova variante Será que existe alguma tecnologia da biologia molecular considerada padrãoouro para o diagnóstico da Covid19 Nesta unidade você compreenderá algumas tecnologias da biologia molecular e as aplicabilidades delas Segundo a Associação Brasileira de Medicina Diagnóstica ABRAMED devido ao aumento de casos da Covid19 e das mortes a procura por testes para detectar o vírus na rede particular de saúde no Brasil tem aumentado continuamente desde dezembro de 2020 MEDICINA 2021 De acordo com especialistas a procura pelos testes foi alta devido aos avanços dos casos e das festas de fim de ano e feriados nacionais Renata Pires 2020 relata a importância da busca por testes tendo em vista vez que no momento a pandemia deflagrada pela Covid19 continua avançando no Brasil e no mundo Assim o diagnóstico preciso e correto é fundamental para propor quaisquer medidas relacionadas à prevenção e ao prognóstico da infecção Além do mais a Organização Mundial da Saúde OMS 2021 online¹ orienta a relevância da realização em larga escala de exames combinado com o isolamento social Esse é o caminho ideal para proteger a população da pandemia evitando assim a disseminação em massa da doença Diante das informações citadas e que estão vinculadas ao nosso cotidiano e ao profissional biomé dico é importante que você enquanto futuroa profissional compreenda como é feita a detecção de doenças a partir do uso das técnicas de biologia molecular já que é fundamental para o crescimento da sua qualidade profissional Essas metodologias são rotineiramente utilizadas em laboratórios que futuramente poderão ser o seu ambiente de trabalho De acordo com Ministério da Saúde em março de 2021 o Brasil bateu o recorde de mortes por Covid19 situando no ranking mundial o segundo lugar com mais mortes atrás apenas dos Estados Unidos 511 mil óbitos Informações como essa mostram a importância que deve ser dada ao uso das metodologias desenvolvidas pela biologia molecular para que haja a identificação de doenças em estágios iniciais como a Covid19 Partindo desse princípio faça uma breve pesquisa em alguma revista de circulação online tais como G1 Veja Exame e Uol sobre os exames de detecção mais utilizados para a identificação de vírus como a Covid19 Relacione os métodos e os diferencie quanto ao tempo de espera do resultado ao tipo de coleta e à confiabilidade dos resultados Organize e anote todos os seus resultados no diário de bordo Haja vista que o grande número de doenças é causado por seres microscópicos podemos considerar que foi extraordinária a contribuição dos estudos da biologia molecular posto que é capaz de detectar a nível molecular os fatores causadores de doença Antes do advento dessa ciência muitas vezes eram apenas estudados por meio de observações macroscópicas os sintomas e o progresso da enfermidade 83 UNIDADE 4 As metodologias da biologia molecular tal como a PCR e a reação da transcriptase reversa seguida pela reação em cadeia da polimerase RTPCR do inglês Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction utilizadas para detectar um vírus carregam variações devido ao tipo de ácido nucleico a ser analisado dado que há vírus com DNA e outros com RNA Atualmente essas metodologias permitem não só a verificação da presença de um vírus em um corpo mas também de outras doenças causadas por outros organismos Além disso ajudam no estudo de testes de medicamentos resquícios de DNA deixados na cena de crime ou de DNAs de restos fósseis para exploração da evolução Como aspectos fundamentais para a reflexão da abordagem desta unidade encontramse A importância da identificação da circulação de doenças na população A aplicabilidade da biologia molecular na identificação de doenças e outras abordagens eficazes Em outro momento deste livro falamos que a molécula de DNA detentora da informação gené tica é capaz de fazer cópias de si mesma O mecanismo de replicação responsável por essa ação também está envolvido na produção de RNA por meio do processo chamado de transcrição O RNA formado proporciona a tradução da informação genética o que na maioria das vezes resulta na formação de proteínas DIÁRIO DE BORDO 84 UNICESUMAR Esses processos ocorrem de forma natural no interior das células ou seja no momento em que há a necessidade de formar células o DNA se replica e no instante que precisa de certa proteína a trans crição do RNA específico começa Em detrimento do avanço da tecnologia da biologia molecular hoje é possível providenciar o desenvolvimento desses eventos in vitro Evidenciaremos nesta unidade um desses processos o da replicação que pode ser feito por intermédio do uso da técnica de PCR reação em cadeia de polimerase também conhecida como a técnica de amplificação da sequência de DNA ou reação em cadeia da polimerase A replicação de um material genético de forma artificial teve início com a utilização dos plasmídeos de bactérias e posteriormente foram desenvolvidos outros vetores para esse ofício No decorrer dos anos as técnicas utilizadas para manipular os plasmídeos de bactérias foram sendo aplicadas artificialmente no próprio laboratório em conjunto com o uso das enzimas envolvidas no processo de replicação do DNA O objetivo era formar moléculas de ácidos nucleicos in vitro Apesar de ainda ser usada a técnica de clonagem de DNA com o uso de plasmídeos hoje a inovação dos estudos permitiu o surgimento da técnica de PCR A PCR reação em cadeia de polimerase foi desenvolvida em abril de 1983 por Kary Mullis A técnica de PCR teve o primeiro relato em 1985 em um artigo na revista Science Ela foi descrita como uma nova tecnologia para a detecção da mutação da hemoglobina que causa a anemia falciforme A PCR permite que os fragmentos de DNA sejam amplificados um bilhão de vezes em poucas horas e é caracterizada como uma técnica rápida totalmente automatizada e sem a necessidade de uso de células COX DOUDNA ODONNELL 2012 BORGESOSÓRIO ROBINSON 2013 Para iniciar uma PCR é necessário ter a molécula de DNA que se deseja amplificar ou seja fazer cópias Dessa forma é válido lembrar que para se obter a molécula de DNA é preciso extraíla do interior da célula obtendoa de maneira íntegra e pura a fim de garantir um bom resultado da PCR Por que amplificar o DNA in vitro De forma natural a replicação ocorre no interior da célula toda vez que uma nova célula se formará Um exemplo é a renovação das células bucais e intestinais que ocorre diariamente Uma replicação ainda pode acontecer apenas por um período da vida como na formação das células nervosas e musculares ou ainda ser induzida por lesões como no caso de traumas em determinados tecidos Todavia de forma manual fora da célula a metodologia de replicar parte do material genético é bastante corriqueira para estudos voltados à funcionalidade de certos genes à multiplicação de genes que são encontrados em pequenas quantidades na cena de um crime ou à utilização desses genes para fabricação de medicamentos e vacinas O fato é que conseguir multiplicar in vitro uma pequena amostra de DNA em milhões delas em pouco tempo facilita muito a resolução de vários problemas principalmente na área forense 85 UNIDADE 4 Atualmente para se fazer a extração de DNA estão disponíveis vários kits e é escolhido aquele que se adequa ao objetivo a ser buscado como para fins diagnósticos ou para a prática de PCR CONHEÇA 2018 No entanto de forma geral a extração de DNA inclui duas fases muito importantes a de lise ou quebra da membrana celular para liberação do DNA e posteriormente a purificação De posse do material do qual se deseja extrair o DNA o primeiro passo é fazer a quebra lise das mem branas da célula Para isso são usados detergentes NLauroilSarcosino ou o Sodium DodecylSulphate SDS ou outros métodos como altas concentrações de glicose para bactérias ou nitrogênio líquido para a quebra das paredes celulares em amostra de vegetais Durante esse processo acontece a degradação dos com ponentes considerados contaminantes incluindo proteínas lipídeos e carboidratos que estejam nas células Dessa forma é adicionada uma soluçãotampão que contém enzimas que degradam esses contami nantes e garantem a liberação da molécula do ácido nucleico Após a lise o material é submetido a altas concentrações de sais tiocianato de guanidina ou a guanidinaHCl as quais inibem a formação de duplasfitas e impedem que o DNA ou RNA fique preso em restos celulares No caso das partículas virais a etapa de lise não ocorre os compostos de guanidina são suficientemente eficazes na quebra dos capsídeos VIEIRA 2021 Após a fragmentação do material é preciso acrescentar uma solução de fenol solvente orgânico que não se mistura à água mas é altamente solúvel em moléculas orgânicas como o DNA e o RNA Essa mistura é submetida a centrifugação na qual são obtidas pelo menos duas fases uma aquosa e outra fenólica A fase fenólica contém o DNA a aquosa após a centrifugação carrega o RNA Assim o material de interesse pode ser separado VIEIRA 2021 O processo é finalizado com a purificação do material Para isso é feita a lavagem e a precipitação dele Para a lavagem é utilizado o isopropanol para a recuperação de RNA Ainda é recomendada incubação durante a noite a 20º C para otimizar a precipitação Em relação ao DNA é feita a centri fugação por alguns minutos Descartase o isopropanol e é adicionado etanol preferencialmente 70 e gelado com a função de precipitar totalmente as cadeias de ácido nucléico durante a centrifugação Após a centrifugação é possível visualizar no tubo um pellet o qual varia do transparente ao branco Em seguida é retirado o etanol e o tubo contendo o DNA é levado para a secagem em temperatura ambiente Finalizada a secagem é adicionado um tampão TE tris EDTA para ressuspensão o que permite que o material seja armazenado em freezer por 20º C por meses ou até anos VIEIRA 2021 Para ilustrar como ocorre a extração do DNA e entender melhor como os componentes utilizados atuam no processo acesse o QR Code a seguir e compreenda como é feita na prática a extração de DNA de leucócitos Para acessar use seu leitor de QR Code 86 UNICESUMAR A obtenção de ácidos nucleicos de alta qualidade é essencial visto que promove o sucesso das etapas seguintes da PCR Existem diferentes tipos de reação que se adequam de acordo com o material a ser utilizado para a extração as características quanto à concentração de reagentes e as condições de temperatura Em PCR essa escolha é decisiva visto que a sensibilidade de detecção é diferente e a demora em algumas etapas pode aumentar a probabilidade de falha devido à manipulação alterando o resultado final CONHEÇA 2018 VIEIRA 2021 Finalizada a extração do DNA iniciase a condução voltada à técnica de PCR Contu do é sabível que a PCR é um processo artificial de replicação do DNA já que é dirigida por um sistema automatizado A partir disso pode emergir a seguinte dúvida como é possível reproduzir o ambiente celular e as reações fisiológicas dele em sistema automa tizado Para esse processo são disponibilizados alguns componentes da técnica de PCR tais como BORGESOSÓRIO ROBINSON 2013 Soluçãotampão para garantir o pH e concentrações iônicas adequados à reação Deoxinucleosídeos trifosfatos dATP dGTP dCTP dTTP Enzimas como a Taqpolimerase DNA polimerase que adicionará os nucleo tídeos na formação da fita Um molde de DNA Fita simples para que uma cópia de fita de DNA seja feita Iniciadores primers A partir deles novos nucleotídeos serão adicionados Artifícios de variação de temperatura que o termociclador fará e que o organismo realiza naturalmente em condições fisiológicas A PCR utiliza um DNA polimerase termoestável a denominada Taq polimerase derivada de uma bactéria a Thermus aquaticus que permanece ativa a cada reaquecimento e não precisa ser reposta NELSON COX 2019 O DNA conduzido para o processo de PCR percorre três etapas principais o que pode ser visualizado na Figura 1 Na etapa 1 o DNA isolado contendo o segmento a ser amplificado é submetido a uma desnaturação quando é exposto a um aumento da temperatura resultando na separação de fitas Em seguida é submetido a um resfriamento e são adicionados dois oligonucleotídeos primers em excesso que se ligam aos segmentos das extremidades do DNA a ser amplificado Na etapa 2 ocorre a hibridização dos oligonucleotídeos iniciadores As extremidades 3 são orientadas uma em direção a outra para iniciar a síntese do segmento do DNA desejado Já na etapa 3 os quatros desoxinucleotídeos trifosfato contendo o grupamento fosfato açúcar e uma das bases nitrogenadas A T C e G são adicionados e o segmento de DNA selecionado pelos iniciadores é replicado de modo seletivo NELSON COX 2019 87 UNIDADE 4 Os processos de aquecimento resfriamento e replicação são repetidos 25 a 30 vezes em al gumas horas de forma automá tica amplificando os segmentos de DNA entre os iniciadores NELSON COX 2019 Com o tempo o processo de automatização da PCR foi se desenvolvendo e gerando os termocicladores os quais substituíram a realização ma nual dos ciclos de temperatura Isso exigia que os tubos fossem submetidos a banhosmaria de temperaturas diferentes Em 1989 o DNA Thermal Cycler apareceu como o primeiro ter Ciclo 1 Ciclo 2 5 5 3 5 5 3 5 3 5 3 5 5 5 5 5 3 3 3 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 5 3 3 3 5 5 3 5 3 5 3 5 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 25 ciclos aumentam as cópias de DNA em 106 DNA a ser amplifcado Passo 1 desnaturar o DNA Passo 2 anelar os iniciadores Passo 3 estender os iniciadores O produto do primeiro ciclo dobra o número de moléculas de DNA Passos 1 e 2 Desnaturar e anelar novos iniciadores Passo 3 Estender os iniciadores O produto do segundo ciclo são quatro novas moléculas de DNA Iniciadores Descrição da Imagem a figura re presenta a sequência de etapas que ocorre para amplificar a amostra de DNA Na parte superior da imagem é apresentado o fragmento do DNA fita dupla forma de uma escada deitada que será amplificado Na sequência representando o passo 1 temos a desnaturação do DNA es cada deitada e separada ao meio de cada degrau quando submetida ao aumento da temperatura O passo 2 mostra as fitas de DNA desnatura das e o anelamento dos primers ou iniciadores são adicionadas partes primers que completam a extremi dade de cada degrau da escada que foi separada No passo 3 para ter minar o primeiro ciclo temos a de monstração da extensão da fita ou seja a formação da nova fita sobre a fita molde neste momento cada degrau da escada se refaz ação do DNA polimerase Logo abaixo temos uma continuação com a re petição de todo o processo nos três passos ciclo 2 com a obtenção de um total de quatro novas moléculas de DNA Após 25 ciclos é descrito que as cópias de DNA são maiores que 10 Figura 1 Representação do processo de PCR convencional Fonte adaptada de Klug et al 2010 88 UNICESUMAR mociclador automático Os termocicladores em sua maioria funcionam com o mes mo princípio aquecimento por resistências elétricas e refrigeração com ventoinhas e tubulações em serpentina preenchidas por etileno glicol Além disso os sistemas de contagem de tempo foram aplicados a fim de aumentar a confiabilidade das rea ções Em meados dos anos 90 surgiu o padrão Peltier cujo bloco de aquecimento é composto por uma liga metálica que aquece ou resfria de acordo com o sentido da corrente elétrica aplicada VIEIRA 2021 Os iniciadores chamados primers são os elementos fundamentais para iniciar o processo de amplificação via PCR O papel deles é o de se associar às regiões com plementares do DNA que há interesse em copiar De acordo com Cox Doudna e ODonnell 2012 por meio do desenho cuidadoso dos primers utilizados na PCR é possível modificálo nesse caso introduzindo sequências nos primers que não estão presentes no DNA a ser clonado No entanto após a PCR essas sequências são acopladas aos segmentos repli cados Apesar de não ser o original da sequência esse método pode ajudar na identificação por uma enzima de restrição Dessa forma posteriormente você teria a chance de utilizar essa endonuclease enzima de restrição para separar o clone de interesse Figura 2 Te convido a assistir a um vídeo que esclarece de forma breve a história da PCR reação em cadeia de polimerase e explica como foi identificada a Taq polimerase que ajudou na revolução do desenvol vimento da técnica Acesse por meio do seu leitor de QR Code Para acessar use seu leitor de QR Code 89 UNIDADE 4 Aquecimento para separação das ftas Anelamento dos iniciadores contendo regiões não complementares com sítio de clivagem para endonuclease da restrição 5GAATTC CTTAAG 5 Replicação 5GAATTC 5GAATTC CTTAAG 5 CTTAAG 5 PCR 3CTTAAG GAATTC 3 Endonuclease EcoRI G AATTC CTTAA G Clonagem por meio de inserção em um sitio para EcoRI em um vetor de clonagem 1 2 Descrição da Imagem no topo da figura encontrase o DNA em fita dupla Ele é representado por duas barras divididas em três partes A porção central de cada barra re presenta o fragmento de interesse em azul No processo 1 as fitas se separam enquanto no processo 2 os primers pequenos quadrados em amarelo próximos às extremida des do fragmento de interesse são anelados Os primers contêm além dos nucleotídeos complementares à fita uma sequência de nucleotí deos GAATTC e outro CTTAAG que não estão presentes no DNA a ser clonado mas que correspondem a uma sequência identificada por uma enzima de restrição É descrito no final da imagem que após a PCR os fragmentos são submetidos a ação da endonuclease EcoRI a qual permite separar o clone de interesse não mostrado Figura 2 Representação de primers modificados com sequências que são identificadas por enzimas de restrição Fonte adaptada de Cox Doudna e ODonnell 2012 90 UNICESUMAR A técnica de PCR é bastante sensível uma vez que pode detectar e amplificar uma pequena quan tidade de DNA de uma amostra como amostras antigas Relatase nos livros que foram possíveis a identificação e a amplificação do DNA de humanos e de animais extintos como o mamute peludo por amostras deixadas de fragmentos de DNA a 40000 anos NELSON COX 2019 Outros registros mostram que a PCR admite a habilidade de recuperar sequências de DNA de ossos e dentes expostos por algum tempo a uma variedade de condições ambientais tornandose uma ferramenta valiosa para a identificação de indivíduos desaparecidos e ossadas não identificadas LIMA MEDEIROS 2015 Apesar de a PCR ser utilizada em substituição à clonagem feita em vetores celulares e a aplicabilida de dela ser extensa para vários estudos ela apresenta algumas limitações No nível de construção dos primers o ideal é que se saiba pelo menos parte da sequência do DNAalvo apesar de ser eficiente na amplificação e na detecção de uma sequência disponível em pequenas quantidades Outra limitação está na alta probabilidade de contaminação da amostra Em casos de sequências muito pequenas elas podem ser contaminadas por pequenas quantidades de DNA do examinador como pele partículas de poeira ou bactérias que podem entrar no tubo de reação Esses contaminantes podem ser ampli ficados juntos com o DNAalvo e é extremamente importante o uso de controles de qualidade para evitar problemas BORGESOSÓRIO ROBINSON 2013 Mais uma limitação detectada na PCR está no uso da Taq Polimerase que não é bem vista pela capacidade de revisão correção de nucleotídeos colocados incorretamente uma vez que se compa rada ao DNA polimerase in vivo que faz as revisões sobre os nucleotídeos que são adicionados à fita complementar a Taq Polimerase extraída de bactérias não é capaz de fazer essas correções podendo adicionar nucleotídeos incorretos a cada 20000 pb Contudo já se conseguiu isolar outras DNA po limerases que são capazes de fazer revisões dando resultados mais precisos a essa técnica Destacase ainda a limitação do tamanho dos fragmentos que podem ser amplificados pois geralmente somente é possível amplificar fragmentos de até 50000 pb ou menos BORGESOSÓRIO ROBINSON 2013 O avanço da bioinformática permitiu o desenvolvimento de ferramentas a fim de desenhar primers para PCR A plataforma conhecida como NCBI The National Center for Biotechnology Information disponibiliza sequências genômicas já identificadas de organismos e necessárias para a criação de primers Dessa forma com o conhecimento do genoma é possível selecionar determinadas regiões a serem analisadas seja DNA seja RNA No manuseio do desenho de primers é preciso se atentar aos padrões de qualidade que determinarão a eficiência da ação de um primer Eles são efetuados por meio de programas computacionais e utilizada a plataforma primer BLAST oriunda do NCBI Fonte adaptado de Banaganapalli et al 2019 91 UNIDADE 4 A técnica de PCR não apenas permite detectar e amplificar fragmentos de DNA mas também de RNA No entanto algumas adaptações para efetuar essa análise repercutiram no desenvolvimento de diferentes tipos de PCR Dentre as principais técnicas resultantes de modificações da reação em cadeia da polimerase encontramse a PCR em tempo real a PCR multiplex e nested PCR e RTPCR converte o RNA da amostra em cDNA A PCR convencional inclui a necessidade de oligonucleotídeos iniciadores específicos desoxir ribonucleotídeos trifosfatados e a enzima DNA polimerase Além disso é preciso que as moléculas de DNA passem pelos ciclos de amplificações Normalmente a detecção dos fragmentos é feita pela técnica de eletroforese em gel de agarose na qual é possível visualizar os fragmentos amplificados por meio de um equipamento chamado de transiluminador a partir de bandas que são separadas de acordo com o peso molecular e corados com brometo de etídeo A PCR em tempo real também chamada de PCR quantitativo qPCR corresponde a uma mo dificação da técnica tradicional Ela é valorizada por identificar o DNAalvo com maior sensibilidade uma vez que a detecção da amplificação é feita por meio da captação de fluorescência Nesse caso o resultado é visualizado imediatamente por meio de um gráfico construído automaticamente por progra mas computacionais à medida que vai sendo amplificando Isso dispensa a eletroforese que é necessária para a PCR convencional Na qPCR à medida que o DNA é amplificado o nível de fluorescência cresce proporcionalmente pois junto aos oligonucleotídeos primers são inseridas sondas marcadas Elas emitem sinal de fluorescência quando clivadas pela enzima exonuclease 5 3 geralmente utilizase a Taq polimerase assim que vai sendo finalizada a adição dos nucleotídeos Figura 3 As sondas são específicas para o segmento gênico cuja expressão se deseja estudar Elas apresentam uma substância fluoróforo repórter na posição 5 da sonda capaz de absorver a energia luminosa emitida pelo equipamento e dissipála na forma de luz e calor em um comprimento de onda diferente do original No entanto na posição nativa toda a luz emitida por esse fluoróforo é absorvida por uma substância quencher presente na extremidade 3 da sonda PCR 2021 Para a captação da fluorescência o termociclador responsável por fazer qPCR fica acoplado a um sistema ótico para a excitação e a captura da emissão da fluorescência Um computador faz a aquisição dos resultados e a análise final da reação Como a amplificação e a detecção do DNA são realizadas simultaneamente em um só passo detectando a fluorescência eventualmente produzida pela amostra a reação e a apresentação dos resultados acontecem em tempo real HAAS TORRES 2016 NASCI MENTO SUAREZ PINHAL 2010 Em geral a PCR em tempo real é dividida em quatro fases A primeira em que o processo de amplifi cação ainda está baixo é denominada baseline A segunda é a exponencial quando a amplificação está ocorrendo com taxa máxima de eficiência e ocorre o aumento da fluorescência de acordo com o aumento do produto amplificado durante os ciclos De acordo com Haas e Torres 2016 a duração dessa etapa depende da qualidade e da concentração dos reagentes visto que é consumida a maior parte deles Na penúltima fase chamada de linear ocorre um decréscimo na eficiência de amplificação uma vez que os reagentes da reação foram consumidos na fase anterior Por fim a última fase denominada platô é alcan çada rapidamente no final da reação em que ocorrem os últimos ciclos da PCR HAAS TORRES 2016 92 UNICESUMAR Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real RT QPCR Sequência de cDNA A reação termociclador 40 ciclo ciclo 1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo 4 modelo cDNA oligonucleotídeos de DNA dessoxinucleotídeos trifosfato DNA polimerase Solução Butter sonda desnaturação anelamento Bloqueio de sinal de fuorescência sonda de hibridização luz elongação produtos sonda degradada sinal de fuorescência Leitura de fuorecência de cada ciclo quantidade inicial alto baixo Fluorescência relativa linha base de fuorescência número de ciclo Limiar de fuorescência Sem modelo de controle amostra fuoróforo repórter molécula silenciadora quencher Figura 3 Técnica de PCR em tempo real 93 UNIDADE 4 O acompanhamento gráfico da emissão luminosa efetuada a partir do contato da Taq polimerase com a sonda permite avaliar de forma quantitativa o número de segmentosalvos que estão sendo replicados em tempo real durante cada ciclo devido ao sistema de monitoramento da emissão de fluorescência Essa é uma grande inovação da técnica uma vez que com a PCR convencional não é possível observar a quantificação dos resultados mas somente é realizada a observação qualitativa das replicações por meio da análise dos géis submetidos à eletroforese que apresenta os resultados de detecção presença e ausência ou as bandas aparecem ou não no gel Já a qPCR determina a quantidade de produto amplificado Outro tipo é a PCR multiplex provinda de uma variação da PCR tradicional Nesse caso assim como o nome sugere é possível em uma única reação reproduzir várias regiões diferentes do DNA ao mesmo tempo Para isso são adicionados no mesmo recipiente vários pares de primers específi cos para cada sequência a ser identificada Figura 4 No entanto é importante que a temperatura de anelamento dos diferentes primers sejam semelhantes e os diversos fragmentos de DNA produzidos apresentem tamanhos distintos sendo possível o diagnóstico feito pela PCR multiplex LEAL et al 2018 Uma das vantagens da técnica é a maior rapidez na obtenção do resultado além de uma maior economia de reagentes quando comparada à realização de uma PCR para cada detecção de cada fragmento individualmente HASS TORRES 2016 O uso da PCR multiplex pode ser escolhido para detectar microrganismos por exemplo bactérias ou vírus de diferentes espécies em um único teste colocandoos em uma única amostra Poroca et al 2009 utilizaram essa técnica para identificar e diferenciar a espécie Mycobacterium tuberculosis de outras cepas do complexo Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium bovis e das micobactérias não tuberculosas de interesse para a saúde pública Assim foi relatado que a técnica de PCR multiplex possibilita a detecção de várias sequências de DNAalvo em uma única reação apresentando vantagens como rapidez especificidade e reprodutibilidade na detecção contribuindo com a identificação de focos primários de infecção por micobactérias de forma mais rápida Descrição da Imagem a figura mostra a técnica de PCR em tempo real Na primeira imagem no topo é mostrado o cDNAfita dupla representado por uma fita torcida na cor azul Em seguida são evidenciados os materiais que são utilizados para fazer a PCR parte do cDNA evidenciado a partir de uma linha com vários pontos coloridos provindos de um retângulo demarcado da imagem anterior do cDNA que será utilizado para cópia os dois primers fita curta com pontos coloridos que se associaram ao cDNA dNTs pontos coloridos DNA polimerase representada por um quadrado verdeescuro nas extremidades superiores e inferiores e no meio verdeclaro um tubo de eppendorf aberto com a soluçãotampão e a sonda representada por um traço com pontos coloridos e nas extremidades à esquerda há a luz fluorescente um retângulo invertido na cor verde Por outro lado na extremidade direita há uma pequena bola preta representado o silenciador Em um quadro maior é mostrado o processo da PCR A imagem do traço colorido do cDNA é desna turada Em seguida por meio de uma seta azul é mostrado o cDNA com adição do primer e uma sonda duplamente marcada com um fluoróforo repórter luz fluorescente em uma extremidade e um fluoróforo silenciador quencher na outra que anela especificamente na parte interna do segmento a ser amplificado entre os dois primers Além disso é mostrada mais uma seta azul indicando a ação da DNA polimerase fazendo o alongamento da fita recémsintetizada e construindo uma nova fita Nesse momento também é evidenciado o momento em que essa enzima exonucleásica 53 Taq DNA Polimerase degrada a sonda e os fluoróforos repórter e quencher são separados ocorrendo a emissão de fluorescência detectada e quantificada no gráfico Há um gráfico logo abaixo da imagem anterior indicado por uma seta verde o qual mostra a medição da fluorescência na vertical enquanto na horizontal é evidenciada a passagem dos ciclos de amplificação É desse modo que o sinal fluorescente é captado a cada ciclo até atingir um limiar threshold em azul No gráfico são observadas as etapas da visualização da amplificação A primeira é chamada de baseline e está do lado esquerdo de cor vermelha na extremidade horizontal eixo X do gráfico Nela a amplificação está abaixo do nível de detecção do instrumento pois ainda não se passaram muitos ciclos de amplificação A fase exponencial ocorre quando a amplificação está acontecendo com a taxa máxima de eficiência Já a fase linear acontece quando ocorre um decréscimo na eficiência de amplificação A quantidade de fluores cência gerada pela amplificação das amostras se torna significativamente maior 94 UNICESUMAR Sequência A Sequência B Sequência C Sequência D PCR com todos os quatro pares de primers em um único tubo Marcador 422 318 275 232 181 109 371 275 202 141 Descrição da Imagem são representadas quatro sequências de DNA A B C e D no interior de círculos pequenos Cada uma dessas sequências passou por um processo de amplificação com primers diferentes representados por fragmentos curtos coloridos As cores dos fragmentos estão na sequência A duplo traço preto em vermelho B duplo traço preto em azul C duplo traço preto em verde e D duplo traço preto em roxo Essas sequências são adicionadas em um tubo único o qual é submetido à amplificação Posteriormente é mostrado um esquema de um gel de eletroforese com a primeira coluna com as bandas pretas do marcador e a segunda coluna representando as bandas detectadas com as cores dos primers utilizados no processo de amplificação A banda com o primer verde está posicionada mais próxima da extremidade superior do gel com um peso de 371 A vermelha tem um peso de 275 e a roxa tem um peso de 202 Elas ficam na posição intermediária do gel enquanto a azul fica na extremidade inferior com 141 de peso molecular Figura 4 Técnica de PCR multiplex Fonte Premier Biosoft 2021 online² 95 UNIDADE 4 A nested PCR nPCR é outra variante da PCR convencional A base do processo de amplificação é o mesmo O que diferencia é a origem da amostra do material genético utilizado na reação O produto utilizado para iniciar a amplificação na nPCR é o de uma primeira PCR feita de forma tradicional Assim é utilizado como molde o produto de uma primeira PCR para a iniciar a segunda nPCR Além disso adicionase um par de primers internos ao par utilizado na primeira reação gerando um produto menor no final das duas etapas Figura 5 A vantagem dessa técnica é que o DNA da segunda PCR está em concentrações altíssimas e os pri mers têm menos chances de anelamento em sequências inespecíficas devido à redução do tamanho do molde DEMATHE et al 2010 Por outro lado a grande desvantagem é o aumento da probabilidade de contaminação com material genético endógeno pois os tubos de reação contendo concentrações altas de produtos da primeira PCR têm que ser abertos e manipulados para que a segunda amplifica ção seja realizada Além disso como o processo exige duas PCR consecutivas a técnica se torna cara devido ao uso de reagentes envolvidos na reação Nos casos em que as amostras utilizadas não são muito boas essa variação da PCR é utilizada para aumentar a sensibilidade e a especificidade ou seja detectar e amplificar exatamente o fragmento de interesse Quando repetido o processo os resultados são semelhantes Considerando que a técnica é amplamente utilizada para o diagnóstico de vários patógenos infectantes tanto de interesse veterinário e humano quanto no campo alimentício seria uma opção para evitar o aparecimento de resultados falsopositivos quando o teste é positivo e o indivíduo não tem a doença ou falsonegativos quando o teste é negativo e a pessoa tem a doença PCR primer F1 primer R1 Produto da PCR Tamanho 750 pb NESTED PCR primer F2 primer R2 Produto fnal Tamanho 600 pb Descrição da Imagem no canto superior à esquerda o DNA é representado por duas barras paralelas e vermelhas com uma pequena porção das extremidades em azul Nela os primers F1 e R1 representados por pequenas barras verdes estão ligados ao espaço interno das barras entre as fitas de DNA O primer F1 se liga à porção inicial da fita superior do DNA enquanto o R1 se liga à porção final da fita inferior de DNA Na parte inferior da figura ainda à esquerda temos os produtos amplificados da PCR sendo quatro fragmentos de DNA com tamanho de 750 pares de bases Eles são representados na figura por quatro barras vermelhas Por indicação de uma seta preta que direciona o produto da PCR as quatro barras vermelhas ao lado direito da imagem é mostrada a nested PCR Esse produto é representado por duas barras paralelas amarelas com uma pequena porção das extremidades em vermelho onde os primers F2 e R2 representados por pequenas barras pretas estão ligados ao espaço interno das barras entre as fitas de DNA O primer F2 se liga à porção inicial da fita superior do DNA enquanto o R2 se liga à porção final da fita inferior de DNA Na parte inferior da figura ainda à direita temos os produtos amplificados da PCR sendo quatro fragmentos de DNA com tamanho de 600 pares de bases representados na figura por quatro barras amarelas Figura 5 Esquema da PCR tradicional e da nested PCR Fonte adaptada de Weidner Cote e Weiss 2009 96 UNICESUMAR Para as situações em que a amostra fornece o RNA como ácido nucleico a ser amplificado está dispo nível outra variante de PCR a chamada RT PCR Ela inclui uma fase inicial adicional antes de fazer qualquer outro tipo de PCR PCR convencional qPCR PCR multiplex ou nPCR Na fase inicial a presença da enzima transcriptase reversa converte o RNA em um DNA complementar cDNA Após a formação do cDNA é continuada a PCR Para o teste de detecção do vírus SARSCov 2 a PCR em tempo real é a comumente utilizada Acompanhe o processo na Figura 6 Descrição da Imagem a figura apresenta as etapas da RTqPCR Inicialmente é mostrada uma fita de RNA que é convertida em cDNA após a ação da transcriptase reversa Em uma segunda etapa é mostrado o processo de desnaturação do Cdna e a adição do primers e da sonda duplamente marcada etapa em que inicia o processo de qPCR Na terceira etapa é mostrado o processo de anelamento da polimerase e da sonda Na quarta etapa é evidenciada a extensão Nela a polimerase vai adicionando os nucleotídeos e alongando o fragmento recémformado Ainda é mostrado o momento em que a polimerase encontra a sonda e a degrada emitindo a fluorescência Figura 6 Etapas da RTqPCR Fonte Labtest 2020 online 97 UNIDADE 4 O diferencial da técnica de RTqPCR é que a reação não parte de um molde de DNA diretamente ex traído da amostra mas de uma amostra de RNA que é convertido em cDNA Essa é uma ferramenta útil em estudos de expressão gênica pois avaliando o RNA mensageiro mRNA podese detectar quais proteínas estão sendo efetivamente expressas No entanto o estudo direto do RNA principalmente o mRNA é inviável devido à alta sensibilidade a vários fatores como as altas temperaturas Dessa maneira o primeiro passo da reação consiste na síntese de uma fita de DNA utilizando como molde uma fita de RNA em uma reação catalisada por uma transcriptase reversa As transcriptases mais utilizadas nesse processo são extraídas de vírus e incluem dois tipos principais a AMV Avian Mieloblastosis Virus e a MMuLV Moloney Murine Laeukemia Virus Além disso são utilizados primers e oligonucleotídeos compostos por várias timinas consecutivas 6 a 35 para que possam ser anelados às regiões PoliA do RNA ricas em adeninas Após esse ciclo obtémse o cDNA que será utilizado na PCR VIEIRA 2021 As variantes de tipos de PCR vieram para complementar a técnica tradicional e em algumas situações direcionar investigações específicas Atualmente a aplicabilidade da técnica é diversa Na área clínica a PCR em tempo real que faz o uso de sondas são as mais úteis uma vez que é possível visualizar em tempo real a presença ou não de um gene de interesse Nesse aspecto podese considerar a possibilidade em detectar uma mutação mesmo que seja de poucos nucleotídeos Como a técnica se baseia na utilização de primers e de sondas e ao finalizar a amplificação de um fragmento gênico há a degradação da sonda e a emissão de fluorescência a ausência da fluorescência corresponderia a presença de uma mutação Por outro lado a RTqPCR pode ser uma técnica utilizada para investigar a presença de produtos gênicos que estão sendo traduzidos no organismo uma vez que ela realiza a investigação a partir do RNA por exemplo Esse é um modo de investigação da expressão de determinado gene quando uma pessoa é tratada com um medicamento específico e pode ser detectada como sendo a resposta da expressão dos genes envolvidos NASCIMENTO SUAREZ PINHAL 2010 A RTqPCR também é o teste perfeito e utilizado para a investigação da Covid19 Por meio da técnica é possível detectar se o material genético do vírus RNA está sendo expresso no corpo do indivíduo O protocolo da RTPCR para a detecção do vírus SARSCoV2 foi padronizado logo após o sequenciamento do material genético do vírus uma vez que seria necessário saber os nucleotídeos contidos no material genético para poder detectálo Apesar das limitações do uso da técnica como a fácil degradação do RNA e os cuidados para não haver a contaminação da amostra na execução da coleta é possível detectar o produto gênico RNA do vírus no corpo LABTEST 2020 A aplicabilidade não se baseia somente nisso Na farmacogenética a técnica RTPCR pode ser utilizada para investigar o funcionamento de um medicamento no organismo incluindo a análise da expressão gênica sob a utilização do medicamento que pode ser visto por intermédio da PCR quando se investiga a resposta do tratamento devido à reação de transportadores ou de enzimas do metabolismo que estejam associados à distribuição ou à eliminação do fármaco Pode ainda auxiliar no teste de novos medicamentos e na verificação se a droga tem potencial mutagênico Além do mais é mostrada em artigos científicos a utilização da técnica para fazer a genotipagem do indivíduo e 98 UNICESUMAR determinar ou predizer o status metabólico dele e saber se apresentará o risco de ineficácia ou de toxicidade a um determinado medicamento que depende de uma determinada enzima para exercer a atividade NASCIMENTO SUAREZ PINHAL 2010 Em outros campos como na indústria alimentícia e na agricultura a PCR tem sido utilizada na identificação de micróbios parasitas ou organismos geneticamente modificados Na área forense talvez tenha tido a estreia mais marcante pois permite resultados de elevada sensibilidade especificidade e velocidade o que garante as investigações criminais Nelas o tempo é crucial para a solução do caso e a quantidade de amostra normalmente é limitada NASCIMENTO SUAREZ PINHAL 2010 Entender o mecanismo de desenvolvimento da técnica de PCR é compreender que não se trata apenas de obter um resultado para a reprodução de fragmentos gênicos de interesse mas visualizar que a PCR tanto a convencional quanto as variantes auxiliam na investigação de diferentes áreas Talvez você futuroa biomédicoa deparese no âmbito profissional com a necessidade da busca dessa técnica para ações investigativas A escolha da técnica permitiu a averiguação do causador da Covid19 por exemplo que gerou impactos não somente à saúde pública devido às taxas de morbidade mortalidade e prejuízos psi cológicos mas também causou impactos econômicos e sociais devido à circulação globalizada do vírus pandemia Nesse caso o uso da metodologia ajudou na indicação de métodos preventivos e na diminuição da disseminação da doença A pesquisa científica tem auxiliado muito na facilitação do dia a dia de diversos profissionais não é As curiosidades e as buscas por ino vações por parte dos pesquisadores têm apresentado grande valor ao longo da história Neste podcast você acompanhará as inovações que aprimoraram a técnica de PCR Vamos lá aperte o play e conhe ça essa trajetória de maneira divertida 99 Agora vamos fazer um feedback do que você aprendeu nesta unidade Observe o mapa mental a seguir que descreve as características da técnica de PCR e preencha os quadros que solicitam as complementações da técnica PCR Replicação de fragmentos gênicos Extracelular Automatizado Termociclador Desnaturação do segmento a ser amplifcado Alongamento da a fta em replicação pela Taq Polimerase Vantagens Limitações Conhecer parte da sequência a ser amplifcada Alta probabilidade de contaminação Tamanhos a ser amplifcados limitados Tipos de PCR Convencional PCR multiplex PCRNested RTPCR Observação da amplifcação em tempo real usase sonda que emitem fuorescência após serem degradadas Utilizase do produto de uma 1ª PCR para iniciar Aplicabilidade Identifcação de Vírus Farmacogenética Identifcação de mutações Princípio da Técnica em três etapas 100 1 A PCR é uma tecnologia que pode ser utilizada para a amplificação de segmentos gêni cos O propósito de replicar esses segmentos de interesse é variado incluindo a iden tificação de paternidade a análise de DNA de criminosos e a identificação da evolução de uma determinada espécie O processo de desenvolvimento da PCR convencional perpassa três etapas principais Uma delas é marcada pela hibridização dos primers Considerando a etapa marcada pela hibridização dos primers assinale a alternativa que descreve corretamente as características dos primers dessa técnica a É utilizado um par de primers que será alocado no início do fragmento a ser replicado b Na PCR convencional são necessários primers únicos para que o DNA polimerase faça o papel de introdução dos nucleotídeos complementares c Os primers serão adicionados na primeira etapa antes mesmo de iniciar o processo de desnaturação da molécula de DNA que será amplificada d Os primers no processo de PCR em pares reconhecem a sequência a que associará No entanto exige a identificação de pelo menos parte da sequência que se deseja amplificar e precisamente o início e o fim da sequência e Os oligonucleotídeos ou primers são adicionados aleatoriamente na amostra a ser amplificada Eles podem ou não ser aderidos a ela para replicar 2 A PCR foi desenvolvida em 1983 por Kary Mullis A técnica proporciona a amplificação de fragmentos de interesse um bilhão de vezes em poucas horas É caracterizada como uma técnica rápida totalmente automatizada e sem a necessidade de uso de células Em relação às vantagens e às limitações dessa técnica assinale a alternativa correta a É uma técnica sensível e que pode detectar e amplificar um fragmento de DNA que esteja em pequenas quantidades Todavia a contaminação deve ser evitada e inves tigada devido à sensibilidade b Umas das vantagens da técnica é a possibilidade de separar os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho mas ela se limita por não apresentar a visualização em tempo real c A sensibilidade da técnica é uma das vantagens mais apreciadas porém necessita de uma grande quantidade de amostras do fragmento a ser amplificado d A técnica é bastante exigente cara e trabalhosa Contudo em questão de minutos é possível ter um bilhão de sequências amplificadas e A maior desvantagem do uso da técnica é a sensibilidade dela que exige muitas concentrações de DNA para serem copiados Todavia o aspecto positivo é a baixa probabilidade de contaminação 101 3 A técnica de PCR foi um grande avanço da biologia molecular já que substituiu muitas vezes a clonagem feita por vetores de bactérias Em horas é possível amplificar frag mentos gênicos de interesse sem necessitar de células Sobre a aplicabilidade da técnica de PCR assinale a alternativa que descreve as aplicabilidades da técnica e as características dela a Permite identificar patógenos desde que faça previamente a realização de isolamento em cultura e crescimento b É possível utilizar a técnica para estudos de evolução pois como a PCR se baseia na amplificação de RNA apresenta maior estabilidade Ela permite utilizar amostras com mais de 40000 anos c É uma técnica que tem a possibilidade de identificar sequências de DNA presentes em vírus e em outros patógenos uma vez que os primers são desenhados para detectar e amplificar apenas os fragmentos desses organismos d Pode ser utilizada para a investigação da dosagem de medicamentos já que detecta os aminoácidos que estão sendo produzidos com o uso destes e Muito utilizada na investigação criminal baseiase no uso de primers RNA polimerase e enzimas de restrição 102 4 Desde o início da utilização da técnica de PCR algumas complementações ocorreram ou seja surgiram outras variedades de PCR Sobre os tipos de PCR e a aplicabilidade deles leia as afirmativas a seguir I A RTPCR tem como princípio a utilização de uma enzima a transcriptase reversa para converter o RNA em cDNA uma vez que a PCR utiliza o DNA como fonte de amplificação II A PCR multiplex é um tipo de PCR que inicia o ciclo de cópias a partir de um produto de uma amplificação já concluída III A PCR em tempo real é assim denominada dado que utiliza uma sonda que quando degradada pela DNA polimerase à medida que vão sendo adicionados os nucleotí deos complementares emite uma fluorescência que permite visualizar os fragmentos amplificados em tempo real IV A nested PCR é uma técnica que possibilita a amplificação de vários fragmentos de DNA ao mesmo tempo uma vez que são introduzidos vários primers na amostra É correto o que se afirma em a I e II b I II e III c II e IV d II III e IV e I e III 5 A técnica de biologia molecular conhecida como PCR permite o estudo das sequências de ácidos nucleicos O princípio da técnica abrange três etapas fundamentais que são repetidas em vários ciclos Em relação às etapas da técnica PCR assinale a alternativa que descreve corretamente a se gunda etapa a Ocorre a extensão ou polimerização com a ativação do Taq polimerase adicionando os nucleotídeos para a síntese de novas cadeias b Iniciase a desnaturação do DNA que é efetuada pelo aumento da temperatura que rompe as pontes de hidrogênio Assim permite a abertura da dupla fita c No posicionamento são determinadas as frações que são quantificadas por densito metria ou eluição em que é gerado um gráfico de forma que as bandas podem ser comparadas possibilitando qualquer sinal de desequilíbrio d O anelamento dos primers na região específica que se quer amplificar é definido pela redução da temperatura e Ligações de sondas e primers com o aumento da temperatura 5 Nesta unidade você conhecerá as técnicas para determinar as se quências de nucleotídeos presentes na estrutura de uma molécula de DNA de diversos organismos vivos a partir do método da biologia molecular chamado de sequenciamento Assim compreenderá os tipos de sequenciamentos utilizados tais como o método de San ger e os de Nova Geração NGS Além disso conhecerá o histórico de desenvolvimento e o aperfeiçoamento ao longo do tempo e entenderá as características necessárias para o desenvolvimento das técnicas e as diferenças de cada uma Por fim conhecerá a aplicabilidade das técnicas em diferentes áreas de estudo Métodos de sequenciamento de DNA Dra Ana Luisa Monezi Lucena 104 UNICESUMAR Vicente dono de uma conhecida indústria de produtos de panificação localizada na região Nordeste do Paraná produz um mix variado de produtos que atende mercados supermercados padarias e empó rios somando mais de 1400 pontos de venda em 127 cidades da região Tem entrega própria e rápida para garantir que o pão chegue fresco à mesa dos consumidores Nos últimos dias recebeu algumas reclamações dos clientes que afirmaram que o pão de hambúrguer não estava correspondente à data de validade pois ele estava sendo consumido por microrganismos antes do vencimento Preocupado com a qualidade dos produtos Vicente foi aconselhado a buscar ajuda a fim de analisar as causas da manifestação dos microrganismos antes da data prevista Para isso o dono da empresa buscou a solução do problema e orientado pela fiscalização procurou levar os produtos contaminados para fazer testes laboratoriais A representante do laboratório explicou a Vicente que as análises do alimento do ambiente de fabricação e dos ingredientes utilizados seriam importantes para identificar os problemas e forneceriam resultados analíticos sobre a qualidade ou o processo de produção para apoiar o controle O objetivo das análises foi identificar contaminantes em qualquer parte do processo de produção o que compreende desde a matériaprima até o produto final O laboratório prometeu utilizar uma tecnologia de biologia molecular chamada sequenciamento Você conhece essa tecnologia Você sabia que ela analisa o DNA dos microrganismos presentes na amostra Sabia que essa técnica dependendo do tipo utilizado apresenta resultados e gera laudos de análise com uma qualidade de dados robustos e conclusivos se comparada ao uso apenas da uma reação de PCR Você sabia que a metodologia de sequenciamento da biologia molecular poderia ser utilizada na análise de alimentos Nesta unidade entenderemos o sequenciamento uma tecnologia de biologia molecular Ela é utilizada em diversas áreas da biologia da agronomia da paleontologia da medicina veterinária da medicina humana da nutrição e da biotecnologia por exemplo Tratase de uma metodologia que lança mão da precisão das análises de DNA Devido ao importante papel do DNA para os seres vivos visto que nele estão contidas todas as informações funcionais do corpo ele é uma das moléculas mais estudadas do mundo Analisar di 105 UNIDADE 5 retamente a molécula de DNA de modo a identificar as sequências dos nucleotídeos presentes no organismo que se deseja investigar é uma das respostas que se pode alcançar com o sequenciamento de DNA O uso desse procedimento é efetivo para identificar diagnosticar e desenvolver tratamentos para doenças genéticas além de ser muito usado em pesquisas envolvendo patógenos nas quais é possível indicar os tratamentos ideais para doenças contagiosas Além disso a técnica pode ser usada para o estudo da contaminação de alimentos com o intuito de indicar uma ação de higienização mais eficaz incluindo produtos químicos ou conservantes espe cíficos de acordo com o tipo de organismo envolvido no contágio O emprego do sequenciamento na metagenômica tem sido regularmente utilizado para aprimorar estudos filogenéticos sobre o potencial biotecnológico de microrganismos Assim eles são analisados diretamente no ambiente natural não necessitando do isolamento e cultivo NEOPROSPECTA 2018 A técnica de sequenciamento genético tem colaborado consideravelmente para os avanços e as melho rias da vida humana principalmente na área de saúde na qual recebe mais destaque Contudo atualmente essa tecnologia é utilizada por muitas áreas assim como é o caso da indústria alimentícia inserida no problema anterior Diante disso também tem gerado ganhos significativos pela maior precisão e agilidade No caso de Vicente ele optou por investir no controle da qualidade dos alimentos por meio de análises do DNA um ganho para os consumidores que adquirem muito mais segurança no consu mo Partindo da análise de problemática exposta suponha que você seja o profissional que trabalha no laboratório de análise de alimentos e deseja mostrar ao cliente as diferenças entre os métodos de análise microbiológica e os métodos moleculares Para complementar os seus argumentos faça uma pesquisa sobre o método tradicional de diag nóstico de organismos contaminantes em alimentos e compare com o método molecular incluindo por exemplo o sequenciamento Destaque no seu estudo os seguintes fatores tempo de espera de resultados confiabilidade e número de amostras que podem ser exploradas Organize e anote todos os seus resultados no diário de bordo O sequenciamento do DNA de um determinado organismo é o ponto de partida para iniciar uma investigação independentemente de o intuito ser a classificação do genótipo ou a avaliação e a descri ção da função de um gene uma vez que a partir da sequência identificada é possível comparála com outras sequências de DNA presentes nos bancos de dados Dependendo do objetivo de estudo como os microrganismos causadores de doenças ou aqueles que causam a deterioração de alimentos é possível indicar estratégias específicas para tratamento e controle Entretanto a determinação da sequência de nucleotídeos também pode indicar um modo de encontrar possíveis alterações as quais podem estar vinculadas aos fatores que não são apenas maléficos mas também benéficos no organismo Dessa forma é importante destacar alguns pontos de reflexão O sequenciamento é uma técnica de reconhecimento da sequência de nucleotídeos presentes no genoma As sequências caso sejam detectadas poderão ser analisadas de acordo com a expressividade e o comportamento 106 UNICESUMAR O estudo da informação genética descrita na forma de códigos de nucleotídeos permitiu que a informa ção fosse lida e descrita de forma ordenada a partir do desenvolvimento da técnica de sequenciamento Essa técnica revela a sequência de nucleotídeos presente em um genoma Pesquisadores observaram uma possibilidade de identificar a partir da técnica elementos genéticos funcionais e diferenças entre os organismos que podem revelar a base molecular de doenças genéticas humanas ou características específicas de uma espécie COX DOUDNA ODONNELL 2012 Grandes avanços sucederam após a descoberta da estrutura tridimensional do DNA em 1953 por Watson e Crick tais como as contribuições com o intuito de elucidar a replicação do DNA e a tradução de ácidos nucléicos em proteínas No entanto a habilidade de sequenciar o DNA não acompanhou esses avanços Por muito tempo os métodos desenvolvidos para compreender a sequência de cadeias de proteínas não se adequavam à identificação das sequências nos ácidos nucleicos tendo em vista que as moléculas de DNA eram constituídas por inúmeras unidades similares o que gerava dificuldade em diferenciálas Assim os pesquisadores conseguiram mensurar a composição dos nucleotídeos mas não exatamente determinar a ordem deles HEATHER CHAIN 2016 DIÁRIO DE BORDO 107 UNIDADE 5 Até o final da década de 70 determinar a sequência de um ácido nucleico contendo até cinco ou dez nucleotídeos era muito trabalhoso Por volta de 1977 duas novas técnicas uma consolidada por Alan Maxam e Walter Gilbert e outra por Frederick Sanger possibilitaram o sequenciamento da molécula de DNA de grandes tamanhos com uma facilidade jamais pensada COX DOUDNA O DONNELL 2012 NELSON COX 2019 Ambas as técnicas foram acrescidas com conhecimentos da química dos nucleotídeos e do metabolismo do DNA além dos métodos eletroforéticos para a separação das cadeias de DNA Neles era possível distinguir a partir dos tamanhos dos fragmentos cada nucleotídeo que finaliza o segmento gerado Apesar de ambos os métodos apresentarem certas semelhanças o método de Sanger foi o mais difundido provando ser mais fácil tecnicamente COX DOUDNA ODONNELL 2012 Antes de iniciar o método de Sanger é preciso especificar o fragmento que se deseja sequenciar e é necessário conter uma grande quantidade desse fragmento Já sabemos que isso é possível somente a partir da clonagem do fragmento em vetores ou a partir do produto de uma PCR que amplifica o fragmento específico e disponibiliza uma quantidade o suficiente dele para ser sequenciada Em am bos os casos a qualidade da amostra é essencial para a obtenção de uma sequência de alta qualidade Dessa forma as amostras são primeiro analisadas por eletroforese em gel de agarose a fim de verificar se há degradação e para os produtos de PCR se somente uma banda está presente LAMEB 2021 Caso a PCR não seja específica já que múltiplas bandas se apresentam os produtos são conside rados inespecíficos o que pode interferir durante o sequenciamento Para solucionar a problemática as condições da PCR deverão ser modificadas até que apenas o produto desejado seja amplificado É possível extrair somente a banda desejada do gel usando kits comerciais de purificação específicos para esse fim No entanto a purificação dos produtos de PCR independentemente da presença de bandas inespecíficas deve ser realizada pois busca retirar dímeros de primer nucleotídeos não incorporados e demais produtos não utilizados durante a reação Finalizada a purificação os produtos da PCR devem ser quantificados com o objetivo de verificar a qualidade da amostra LAMEB 2021 Após a obtenção dos fragmentos de interesse purificados e quantificados eles estão prontos para iniciar a técnica de sequenciamento Contudo é interessante elucidar que a técnica de Sanger é um processo de amplificação que utiliza os mesmos materiais da PCR com exceção do didesoxinucleotídeo o qual foi adicionado por Sanger a fim de interromper a amplificação e gerar produtos de fragmentos curtos Dessa maneira os nucleotídeos presentes na fita podem ser lidos à medida que ela está sendo copiada Os fragmentos curtos gerados pela técnica de Sanger se devem ao fato de o pesquisador ter en contrado uma maneira de interromper a replicação de um mesmo DNA em pontos diferentes Dessa forma ele poderia juntar as fitas menores e elaborar a sequência completa do DNA O método de Sanger também conhecido como Método Didesóxi de Terminação de Cadeia faz uso do mecanismo de síntese de DNA os DNA polimerases uma fita de DNA complementar um iniciador marcado ra dioativamente desoxinucleotídeos trifosfatos dNTP nucleotídeos normais contendo o grupamento 3hidroxila e didesoxinucleotídeos ddNTPs que são nucleotídeos modificados que não têm o grupo OH livre no carbono 3 da pentose Figura 1 108 UNICESUMAR Fita do iniciador 5 5 P P P P P P G G G G A A A A A H ddATP dGTP OH OH T T T T T C C C C C Fita molde 3 a b Base O O O P O O O P O O O P O O H2C H H ddNTP ddATP interrompe a síntese porque o 3 H não pode atuar como nucleóflo na formação da ligação fosfodiéster Figura 1 a Estrutura química da fita de um iniciador b Estrutura química de didesoxinucleotídeos ddNTPs Fonte Nelson e Cox 2019 p 293 Descrição da Imagem a Figura 1 a mostra a estrutura química dos nucleotídeos da fita de um iniciador primer Nesse primer há cinco nucleotídeos cujas bases nitrogenadas G A T T e C estão representadas pelas seguintes cores verde G azul A amarela T e vermelha C A extensão está descrita como uma fita 5 3 Esse iniciador está conectado a uma fitamolde de DNA complementar 3 5 O primeiro nucleotídeo adicionado pelo DNA polimerase não mostrado associado ao iniciador e à fita complementar é o deso xinucleotídeo que carrega a base guanina dGTP O nucleotídeo com a guanina verde contém o grupamento OH livre na extremidade 3 do açúcar Próximo ao nucleotídeo adicionado há um didesoxinucleotídeo com a base adenina ddATP que é um tipo modificado de nucleotídeo que não contém o grupamento hidroxila OH na extremidade 3 razão que interrompe o progresso da replicação Por outro lado a Figura 1 b mostra a estrutura química de didesoxinucleotídeos ddNTPs Assim é evidenciado em vermelho na posição 3 do açúcar do nucleotídeo o hidrogênio H ao contrário do grupamento OH Acesse o QR Code a seguir e perceba como a técnica de sequencia mento de Sanger é interessante Você entenderá as diferenças entre os nucleotídeos utilizados e saberá como o mecanismo é processado de forma clara e divertida 109 UNIDADE 5 A reação de Sanger consiste na ação do DNA polimerase que adiciona os nucleotídeos complementares à fitamolde à medida que encontra um nucleotídeo com o grupamento 3OH livre No início da reação o primeiro a ser detectado é do iniciador primers O progresso da reação se perpetua até ser adicionado pelo DNA polimerase um ddNTP complementar presente na reação o qual interrompe a síntese de DNA por não possuir o grupamento 3hidroxila necessário para associar o próximo nucleotídeo dNTP Nessa reação a quantidade de dNTP comparada ao ddNTP é maior tendo portanto o grupo aná logo ddNTP uma menor probabilidade de associar a fita molde Contudo a quantidade adicionada garante que pelo menos um dos complementares à fita molde se associe e interrompa a replicação Figura 2 COX DOUDNA ODONNELL 2012 Iniciador 5 OH CTAAGCTCGACT Molde 3 dATP dCTP dGTP dTTP ddATP GATTCGAGCTGddA GATTCGddA GddA ddCTP GATTCGAGddC GATTddC ddGTP GATTCGAGCTddG GATTCGAddG GATTCddG ddG ddTTP GATTCGAGCd GATddT GaddT A C G T Autoradiograma do gel de eletroforese Sequência da fta complementar c 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 3 A G T C G A G C T T A G 5 Descrição da Imagem a figura mostra o processo de sequenciamento de acordo com o método de Sanger Assim são expostos os componentes necessários para o processo Um iniciador é representado por uma barra na cor laranja com o grupo OH livre o qual se encontra pareado com uma fitamolde simbolizada por uma barra de cor azul ligada às sequências CTAAGCTCGACT Além disso são mostrados os desoxinucleotídeos dATP dCTP dGTP dTTP e os didesoxinucleotídeos ddATP ddCTP ddGTP ddTTP De cada um dos ddNTPs partemse setas Em conjunto com os demais componentes citados são utilizadas as quatro reações preparadas Abaixo de cada um dos didesoxinucleotí deos é exposto um primer simbolizado por uma barra laranja que é ligado ao fragmento formado até ser interrompido à medida que a replicação acontece Para o ddATP são mostrados três fragmentos GATTCGAGC TGddA GATTCGddA e GddA Para o ddCTP dois fragmentos GATTCGAGddC e GATTddC Para o ddGTP quatro fragmentos GATTCGA GCTddG GATTCGAddG GATTCddG ddG e para o ddTTP três fragmentos GATTCGAG Cd ATddT e GaddT Uma seta é desenhada a partir de cada um dos didesoxinucleotídeos presentes em direção à um poço de um gel de eletroforese representado Nele temos na vertical os fragmentos que foram finalizados pelos didesoxinucleotídeos de A C G e T O gel na posição vertical com o polo negativo na parte superior e positivo na parte inferior mostra os fragmentos na forma de bandas barras de cor preta produzidos pela rea ção Os fragmentos mais curtos migram mais rapidamente para a extremidade positiva do gel enquanto os mais longos ficam mais próximos da superfície extremidade negativa do gel Do lado esquerdo são colocados os números de 1 a 12 de baixo para cima Eles serão utilizados para a análise dos fragmentos formados Do lado direito na mesma posição é exposta a sequência do DNA replicado e lido após a análise dos fragmentos do gel De cima para baixo 3AGTCGAGCTTAG 5 Figura 2 Processo de sequenciamento de acordo com o método de Sanger Fonte Nel son e Cox 2019 p 293 110 UNICESUMAR O processo da técnica de Sanger no passado era realizado utilizando quatro tubos de ensaio Cada um deles se diferenciava por ter um dos quatro ddNPs diferentes um para cada base nitrogenada A TGC Assim inseriase um ddCTP didesoxinucleotídeo com a citosina em um tubo ddGTP didesoxinucleotídeo com a guanina no segundo ddATP didesoxinucleotídeo com a adenina no ter ceiro e ddTTP didesoxinucleotídeo com a timina no quarto tubo Além deles eram adicionados os demais elementos para a reação DNA molde DNA polimerase primer e nucleotídeos Figura 2 Dentro de cada tubo a replicação terminava em lugares dife rentes Por exemplo a adição de um ddCTP a um dos tubos de reação fazia com que algumas fitas sintetizadas fossem terminadas de modo antecipado na posição onde normalmente um ddCTP seria adicionado em oposição ao nucleotídeo dGTP contendo a guanina do molde O resultado seria uma solução contendo uma mistura de fragmentos da fita de DNA de diferentes tamanhos Neles seriam posteriormente aplicados gel de poliacrilamida ou agarose dependendo do tamanho dos fragmentos poliacrilamida para fragmentos com até centenas de nucleotídeos e o de agarose para os fragmentos maiores e separados por tamanho Quanto ao posicionamento do gel quando feito com agarose normalmente é acondicionado em um recipiente cuba na forma horizontal Apresentamse os polos positivo e negativo e é adiciona da uma soluçãotampão Por outro lado em géis de poliacrilamida a eletroforese na forma vertical é a usualmente utilizada Os polos da cuba se encontram em um recipiente com tampão em níveis separados o negativo em cima e o positivo embaixo e conectados pelo gel Assim a partir da análise eletroforética os fragmentos me nores seriam observados mais embaixo e os maiores mais em cima considerando um gel na posição vertical A leitura é feita de baixo para cima para obter a sequência do DNA resultando em fragmen tos que se sobrepõem e formam a fita completa de DNA Figura 2 COX DOUDNA ODONNELL 2012 NELSON COX 2019 Com o passar dos anos o processo de sequenciamento foi atualizado mediante as ideias de Sanger A primeira variação dessa atualização em 1998 partiu da adição de didesoxinucleotídeos 111 UNIDADE 5 fluorescentes coloridos em cada um dos quatro tipos identificados por cores diferentes Figura 3 Além disso todos os elementos da reação inclusive os ddNTPs seriam adicionados juntos em um mesmo tubo Com o uso de um termociclador que desencadeia o processo de replicação em várias etapas ciclos disponibili zando a variação de temperaturas ideais repetidas várias vezes cada condição para os ciclos o resultado seria a formação dos fragmentos gerados durante a reação de sequenciamento No momento da adição de um ddNTP a extensão do fragmento seria interrompida e consequentemente marcada com o último didesoxinucleotídeo incorporado A leitura da sequência de cada nucleotídeo seria condiciona da aos diferentes ddNTPs marcados com fluoróforos distintos os quais são identificados em um sequenciador automático O sequenciador automático tem o papel de excitar por meio de um feixe de laser os fragmentos formados que emitem luz em diferentes comprimentos de onda correspondentes ao fluoróforo do ddNTP do final do fragmento os quais posteriormente são detectados por um fotomultiplicador Figura 3 A informação será transmitida a um computador que processa os dados Depois eles são restaurados em formato de eletroferograma ou de texto fasta seguidos da análise de bioinformática GIUSTI KETTE NER FUCHSFERRAZ 2016 Apesar de o método que utiliza o feixe de laser ser mais caro que as placas de vidro e os géis tradicionais essa nova máquina de sequenciamento Figura 4 demanda menos tempo e gera sequên cias de dados mais baratas que qualquer outro método tradicional Com essa tecnologia foi possível expandir a detecção de sequên cias de moléculas de DNA contendo milhares de nucleotídeos em poucas horas e genomas inteiros de centenas de organismos Um exemplo do uso dessa tecnologia voltado à saúde humana foi o sequenciamento completo do genoma pelo Projeto Genoma Humano realizado por Craig Venter e colaboradores com muito esforço entre 1990 e 2000 sequenciando os 32 bilhões de pares do DNA de uma célula humana COX DOUDNA ODONNELL 2012 HEATHER CHAIN 2016 NELSON COX 2019 112 UNICESUMAR Iniciador 3 Sonda de sequência desconhecida DNA polimerase Quadro dNTP Quadro ddNTP Desnaturação Segmentos de DNA marcados com corante fuorescente copiados do molde com sequência desconhecida Resultado gerado por computador após a passagem das bandas pelo detector Migração do DNA Segmento marcados com corante fuorescente aplicados a um gel capilar é submetido a eletroforese Detector Laser Feixe de laser 20 30 40 C C T G T T T G A T G G T G G T T C C G A A A T C G G Figura 3 Primeiras modificações do método de Sanger Fonte Nelson e Cox 2019 p 294 Descrição da Imagem a figura mostra uma das primeiras modificações do método de Sanger Nele são utilizados ddNTPs marca dos com fluorescência os quais mostram as cores dos didesoxinucleotídeos que terminam os fragmentos Além disso são expostas seis moléculas de DNA molde barra azul ligadas à iniciadores barra curta em amarelo Por meio de uma seta voltada para baixo é feita a indicação da adição do DNA polimerase dNTP e ddNTP descritos do lado esquerdo da seta Abaixo da indicação da seta são expostos os segmentos replicados barra azul na horizontal que é o DNA molde associado ao fragmento que está sendo replicado e em tamanhos diferentes ligados a uma barra curta e amarela a fim de simbolizar o primer Em cada um deles há pelo menos um dos ddNTPs contendo A C G ou T Os ddNTPs estão representados no interior de círculos contendo a inicial da base do ddNTP e as cores dos corantes que os representam a saber verde A azul C amarela G e vermelha T Há outra seta com a ponta voltada para baixo a qual mostra que os segmentos replicados passam por um processo de desnaturação Todavia agora são mostrados somente os fragmentos de tamanhos diferentes seis barras deitadas uma abaixo da outra Cada uma contém na extremidade esquerda uma barra curta em amarelo representando o primer a extensão simbolizada por uma barra azul e na extremidade direita os círculos com as cores de cada ddNTPs específicos os quais foram formados e identificados pelas cores dos didesoxinucleotídeos Do lado direito da figura há uma coluna de eletroforese de tubo capilar que contém no interior o equipamento de sequenciamento no qual são colocados os fragmentos replicados Eles são separados em um único tubo A observação das cores de cada fragmento gerado é detectada por um feixe de laser caixa que se encontra do lado direito da coluna do tubo de eletroforese e que emite uma linha vermelha o qual passa pela coluna à medida que as bandas passam pelo detector caixa situada no lado esquerdo paralelo ao feixe de luz Essas informações vão diretamente a um computador Por último é mostrado um gráfico com picos coloridos Na base de cada pico existe um nucleo tídeo representado pela letra e correspondendo à cor de cada um dos didesoxinucleotídeos detectados nos fragmentos replicados 113 UNIDADE 5 Figura 4 Representação de um equipamento de sequenciamento moderno Fonte Thermofisher 2021 online² Descrição da Imagem tratase da representação do equipamento analisador genético 3500xL que faz o processo de sequenciamento Ele está situado do lado direito e apresenta o formato de uma caixa quadrada nas cores azul e cinza Na frente dele há uma região de vidro transparente de formato retangular a qual ocupa a metade da parte superior do equipamento e é delineada ao redor pela cor azul na qual é possível visualizar o interior Um pouco abaixo do vidro encontrase uma faixa azul com os botões de comando Do lado esquerdo encontramse um monitor menor que o equipamento de sequenciamento com imagens de resultados do sequenciamento e um CPU Na frente do computador e do equipamento de sequenciamento estão as caixas com o software de coleta de dados e um disco de CD Outras caixas também estão presentes e são os kits de reagentes para a qualificação do sistema Após 30 anos cientistas dizem que DNA humano foi 100 sequenciado DUARTE 2021 online Esse é um título de uma reportagem publicada em 2 de junho de 2021 Há algum tempo pensávamos que já tivessem superado esse trabalho No entanto os resultados finais apresentados em abril de 2003 revelaram que ainda faltaram alguns pedaços algumas lacunas que somavam cerca de 8 do genoma humano Nesses 18 anos após a divulgação dos resultados do Projeto Genoma Humano PGH os estu dos genéticos não pararam Com o uso de novos métodos e tecnologias de sequenciamento genético inclusive de empresas do setor privado como a Pacific Biosciences PacBio da Cali fórnia EUA e a Oxford Nanopore do Reino Unido foi possível preencher todas as lacunas do histórico PGH As células utilizadas na pesquisa também foram cuidadosamente selecionadas A equipe sequenciou o DNA de uma linhagem celular chamada CHM13 proveniente de um tumor benigno no útero resultante de falha na fertilização de um óvulo Fonte adaptado de Duarte 2021 114 UNICESUMAR O maior passo dado na inovação das novas tecnolo gias de sequenciamento descritas como tecnologias NGS Sequenciamento de Nova Geração em inglês Next Generation Sequencing aparece inicialmente em 2005 quando a forma comercial é utilizada A partir disso essas tecnologias só evoluíram A grande vantagem delas está no fato de que todos os tipos pro movem o sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informações sobre milhões de pares de bases em uma única corrida Apesar de essas tecnologias apresentarem diferen ças consideráveis entre si todos os sequenciadores de NGS se baseiam no processamento paralelo massivo de fragmentos de DNA Dessa forma a principal dife rença se refere ao número de fragmentos processados Enquanto um sequenciador de eletroforese processa no máximo 96 fragmentos por vez os sequenciadores de nova geração podem ler até bilhões de fragmentos ao mesmo tempo NEOPROSPECTA 2016 O primeiro sequenciador lançado da nova geração foi apresentado pela empresa de biotecnologia 454 Roche Ele foi utilizado para sequenciar o genoma inteiro da bactéria Mycoplasma genitalium A base desse método é a incorporação de um nucleotídeo que traduz a emissão de luz a partir de um pirofosfato liberado na reação no momento em que cada nucleo tídeo específico é incorporado à molécula de DNA Esse método foi chamado de pirosequenciamento GOODWIN MCPHERSON MCCOMBIE 2016 O pirosequenciamento proposto por Mostafa Ronaghi em 1996 utiliza no sequenciamento uma combinação de reações enzimáticas que iniciam com a liberação de um pirofosfato oriundo da adição de um desoxinucleotídeo à cadeia Em seguida esse pi rofosfato é convertido em ATP pela ATP sulfurilase e utilizado pela luciferase para oxidar a luciferina pro duzindo um sinal de luz capturado por uma câmera CCD chargecoupled device acoplada ao sistema Figura 5 CARVALHO SILVA 2010 115 UNIDADE 5 A A A A A A A A A A A G G G G G G G G G G G T T T T T T C C C C C C C C P P P P P P S S Pulso de dATP 5 3 5 3 Sem fash de luz dATP degradado pela apirase Pulso de dGTP Incorporação da base liberação de pirofosfato A sulfurilase usa pirofosfato para converter adenosina5 fosfosulfato em ATP Flash de Luz Na presença de ATP a luciferase reage com luciferina a b Sequência de nucleotídeos A A GG T C G G TT C A G T C A G T C A G Nucleotídeo adicionado 2 1 Intensidade relativa da luz Descrição da Imagem a Figura a mostra uma fita de DNA molde representada por uma barra azul deitada Ela é ligada por uma linha curta e preta às bases nitroge nadas com a estrutura química representada por dois anéis para a A e G e um anel para T e C Cada uma delas estão representadas pelas seguintes cores A azul G ver de T amarela C vermelha A sequência é TCCAGCAAGT Acima da fita molde e associado a ela é exposto um seg mento curto primer com cinco nucleotídeos na seguinte sequência AGGTC Uma pequena seta acima dessa fita molde indica que está sendo adicionado um pulso dATP três estruturas químicas em forma de dois anéis da base adenina na cor azul Por meio de uma seta mais longa e com a ponta voltada para baixo do lado direito está escrito no interior de uma caixa de texto cinza Sem flash de luz e dATP degradado pela apirase Abaixo da ponta da seta está redigido Pulso de dGTP Em seguida por intermédio de uma seta curta é mostrada a imagem da estrutura química do dGTP dois anéis na cor verde com a letra G no interior de um deles a fim de representar a guanina A ponta da seta curta é direcionada à imagem repetida da fita molde ligada ao primer Abaixo da fita molde com o primer encontrase mais uma seta longa e descrita do lado direito da seguinte maneira Incorpora ção da base liberação de pirofosfato Como a próxima base da fita molde é a C citosina e o pulso efetuado pelo sistema foi de dGTP a base foi incorporada Seguindo o desenho abaixo da ponta da seta são expostos os grupos fosfatos sendo liberados no interior de um círculo com a letra P O processo ainda apresenta mais uma seta após a liberação dos grupos fosfatos liberados Do lado direi to dela está redigido A sulfurilase usa pirofosfato para converter adenosina 5 fosfosulfato em ATP Passase no meio da seta outra seta na forma de hélice Do lado esquerdo é evidenciada a entrada da enzima sulforila se S e a estrutura química da adenosina 5 fosfosulfato nucleotídeo contendo a adenina com o duplo anel em azul além da pentose e do grupamento fosfato no interior de um círculo com a letra P o qual está ligado à enzima sulfurilase que está no interior de um círculo com a letra S No lado direito no final da ponta da seta em forma de hélice é indicada a saída da enzima S por um círculo com a letra S no interior Na ponta a seta longa vertical está indicando a liberação da molécula de ATP estrutura quí mica com as bases adenina em azul pentose PPP Uma última seta abaixo da estrutura do ATP do lado direito apresenta a seguinte informação Na presença de ATP a luciferase reage com luciferina Abaixo da ponta da seta é apresentada uma luz amarela sendo emitida e no interior dela está escrito Flash de luz Aqui é evidenciado que na presença de ATP a enzima luciferase adicionada na reação reage com o ATP transformandose em luciferina e emite o flash de luz Ao lado direito encontrase a Figura 5 b um gráfico que evidencia os picos pela cor vermelha das sequências de dNTPs adicionados No eixo X estão as letras que representam os nucleotídeos adicionados Por outro lado no eixo y encontrase a medição da intensi dade de luz mostrada nos picos do gráfico Quando são adicionados dois nucleotídeos de bases iguais seguidas por exemplo duas citocinas C os picos são maiores que quando adicionada uma única base No entanto quando nenhum nucleotídeo é adicionado a linha vermelha fica na base como uma reta por exemplo Figura 5 a Fita de DNA molde b Gráfico dos picos das sequências de dNTPs adicionadas Fonte Nelson e Cox 2019 p 295 116 UNICESUMAR Atualmente vários métodos de nova geração surgiram ao mesmo tempo baseados na inde pendência da amplificação prévia da amostra e na detecção de uma única molécula Além disso já é possível fazer o sequenciamento de genomas completos de vários indivíduos simultaneamente diminuindo de maneira significativa o custo e o tempo das análises NEOPROSPECTA 2016 O sequenciamento feito pelo método de NGS é distribuído em quatro etapas principais Figura 6 A primeira etapa acontece quando a amos tra coletada é submetida à extração do DNA ou RNA Já a segunda etapa ocorre quando ela é conduzida à preparação de bibliotecas referese às coletâneas de fragmentos de DNA de origem genômica transcriptômica ou metagenômica Dessa maneira as amostras do material extraído são submetidas às fragmentações randômicas por métodos físicos ou químicos São exemplos de métodos físicos de fragmentação sonicação e nebulização Por outro lado são exemplos de métodos químicos enzimas de restrição Finalizada a segunda etapa a de fragmentação a amostra é submetida ao sequenciamento que é a terceira etapa Os aparelhos NGS sequenciam a amostra de DNA e geram milhões de fragmen tos curtos chamados de reads Para saber exa tamente onde essas sequências estão localizadas no genoma da amostra analisada os reads são comparados a um genoma de referência construí do no Projeto Genoma Humano Nesse sentido na quarta etapa são realizadas as análises dos da dos pela bioinformática A partir disso é possível investigar na literatura e nos bancos de dados a possível sequência de nucleotídeos extraídos e detectar se há a presença de variações KREMER 2019 ENTENDA 2020 117 UNIDADE 5 Amostra Extração de DNA Sequenciamento Preparação de Biblioteca A G T G C G T A A G G T C G T C G G G T C C C C G T G A C C A G T T G A C T A G A G A A C G T A A G C A T G T C T T C A Análise Bioinofrmática Abracadabra Index Figura 6 Principais etapas do Sequenciamento de Nova Geração NGS Fonte Entenda 2020 online O Sequenciamento de Nova Geração segunda terceira é coordenado por diferentes plataformas ou seja os equipamentos onde ocorrem o sequenciamento Existem diferentes plataformas disponíveis no mercado as quais se diferem em relação à tecnologia e ao método utilizado para o sequenciamento em massa Os métodos chamados de segunda geração incluem as plataformas Ion Torrent e Illumina Já os de terceira geração abrangem o Pacific Biosciences e o Oxford Nanopore que utilizam desde polimerases modificadas imobilizadas em uma superfície até nanoporos que detectam variações de corrente elétrica ou ainda a liberação de íons resultantes do processo de polimerização da molécula nascente como na tecnologia Ion Todas as plataformas desenvolvidas são frequentemente utilizadas nas rotinas de laboratório e cada uma apresenta as vantagens e as especificidades No quadro a seguir é possível fazer algumas comparações Esse Descrição da Imagem tratase de uma ilustração da ordem dos eventos necessários para sequenciar uma amostra utilizando o método de NGS No topo da figura são mostrados dois tubos Um tem uma tampa azul contendo o equipamento de coleta o swab e na extre midade externa há uma etiqueta de código de barras Já o outro tem uma tampa roxa e mostra no interior um conteúdo interno de cor vermelha ocupando 13 do frasco Por meio de uma seta na posição horizontal é mostrada a imagem de uma molécula de DNA dupla fita uma das fitas está na cor laranjaclaro enquanto a outra está na cor laranjaescuro Internamente elas estão unidas por traços na cor cinza lateralmente Após a representação do DNA está escrito Extração de DNA Dando continuidade às etapas mais uma seta indica a preparação da biblioteca de fragmentos Ela mostra uma placa no formato de um quadrado cheio de pontos laranja no interior Do lado direito da biblioteca é exposta uma molécula de DNA no interior de um círculo e abaixo dele há um código de barras com a palavra Index Mais uma seta transversal indica a imagem de um equipamento de sequenciamento o qual é representado por meio do formato de uma caixa na cor cinzaclaro com quatro faixas A primeira é cinzaescuro a segunda mais fina é verde e tem escrita a palavra Sequenciamento Separada por um espaço está mais uma faixa cinzaescuro com o nome do equipamento redigido na parte superior do lado direito Na base do sequenciador está a última faixa cinzaescuro Por outro lado na parte superior do equipamento é representada uma tela retangular com as letras das bases dos nucleotídeos distribuídos em cinco linhas e 12 colunas Uma última seta horizontal cuja ponta se volta ao lado esquerdo mostra um monitor de computador com as imagens de vários gráficos da análise do sequenciamento Na base do monitor está escrita a seguinte frase Análise bioinformática Abracadabra plataforma de análise da bioinformática 118 UNICESUMAR é um campo em constante desenvolvimento e aprimoramento Dessa forma a evolução de uma próxima geração facilitará a busca por uma maior quantidade de sequências com maior tamanho de fragmentos melhor qualidade e menor custo por base sequenciada SAFADY 2019 NEOPROSPECTA 2016 Plataforma Tamanho da sequência Capacidade Máxima Quantidade de Reads Tempo de corrida Taxa de Erro Sequenciamento por ligação SoliD 5075pb 80 32Gb 700M 14B 6 10d 01 Viés AT Sequenciamento por síntese com terminação reversível a cada ciclo Illumina MiniSeq 75 150pb 1 75Gb 14 50M 7 24h 1 substituição IlluminaMiSeq 36 300pb 540Mb 15Gb 12 50M 4 56h 01 substituição IlluminaNextSeq 75 150pb 16 120Gb 250 800M 11 26h 1 substituição IlluminaHiSeq 36 250pb 9 900Gb 300M 4B 7h 6d 01 substituição Sequenciamento por síntese com detecção de sinal na incorporação de nucleotídeo único 454GS 400 1000pb 35 700Mb 01 1M 10 23h 1 indel Ion PGM 200 400pb 30Mb 1Gb 04 55M 3 23h 1 indel Ion Proton até 200pb até 10Gb 60 80M 2 4h 1 indel Ion S5 200 400pb 600Mb 15Gb 3 80M 2 4h 1 indel Moléculas únicas em tempo real reads longos Pacific BioSciences 8 20Kb 500 Mb 7Gb 005 035M 1 6h 13 Oxford Nanopore até 200Kb até 4Tb 100000 até 48h 12 Quadro 1 Comparativo entre as plataformas de Sequenciamento de Nova Geração Solid Illumina 454 GS ION Pacific BioS ciences e Oxford Nanopore Fonte Goodwin Mcpherson e Mccombie 2016 p 341 O sequenciamento de Sanger era um método de sequenciamento muito utilizado até mesmo após a geração dos novos sequenciadores uma vez que a principal vantagem dele era a possibilidade de fazer leituras de um número maior tamanhos de fragmentos No entanto atualmente a tecnologia de NGS vem sendo aprimorada em relação ao tamanho médio dos fragmentos curtos de DNA gerados reads que podem alcançar o tamanho médio dos fragmentos obtidos pela técnica de Sanger ou seja 750 pares de bases Quanto ao custobenefício o método de Sanger apresenta como desvantagem a dependência de uma grande quantidade de material genético o que pode inviabilizar as análises em ampla escala GIUSTINI KETTENER FUCHSFERRAZ 2016 KWOK CHIANG 2016 As aplicabilidades da técnica de sequenciamento são variadas Se retornarmos ao início de nossa análise no caso da deterioração dos produtos de panificação da empresa de Vicente é possível prever a importância da técnica de sequenciamento e delimitar a técnica que seria possível utilizar para atingir os resultados de controle adequado Reflita sobre qual técnica escolher Muito provavelmente seria inte 119 UNIDADE 5 ressante optar pelo sequenciamento de nova geração NGS uma vez que para fazer a técnica de Sanger seria mais demorado Com o sequenciamento de DNA é possível identificar todos os microrganismos presentes nas cadeias produtivas além de rastrear os microrganismos encontrados saber onde estão os repositórios e entender como estão se espalhando na empresa para que se possa fazer o controle adequado caso se trate de bactérias deteriorantes e patogênicas por exemplo NEOPROSPECTA 2016 Além disso a técnica vem sendo utilizada no ramo alimentício para a detecção de fraudes Um exemplo foi uma operação que foi feita em 2017 pela Polícia Federal em frigoríficos do país Na época foi revelado que carne vencida e moída com papelão era vendida no Brasil Também houve um grande escândalo revelando a presença de carne de cavalo em produtos na Europa Em outro caso um DNA de porco foi encontrado em grande parte dos produtos identificados como bovinos Nesse aspecto o sequenciamento pode identificar segmentos específicos de DNA presentes nos alimentos os quais podem apontar claramente a composição deles O DNA dos alimentos sequenciado em plataformas de alto desempenho NGS revela os ingredientes animais ou vegetais que o compõem e auxilia no rastreamento de possíveis fraudes e adulterações NEOPROSPECTA 2016 O sequenciamento também pode ser aplicado à área de monitoramento ambiental Suponha que em um hospital tenha registrado casos frequentes de infecções em pacientes de uma determinada área Nesta situação é possível com o uso de swabs recolher uma amostra dos microrganismos presentes em equi pamentos eletrônicos cadeiras corrimão porta de banheiros torneiras mãos ou qualquer superfície que possa estar presente um microbioma A grande vantagem da técnica de sequenciamento é a possibilidade de identificar e conhecer por apenas uma pequena quantidade de uma amostra todos os microrganismos que estavam presentes no momento da coleta Uma análise do microbioma dá a oportunidade de apre sentar uma escolha específica em casos de contaminações microbiológicas ou disponibilizar métodos de controle em ambientes que precisam estar limpos e livres de contaminações NEOPROSPECTA 2018 Já imaginou poder sequenciar todos os seus genes Detectar a pro babilidade de ter a propensão de desenvolver uma determinada doença A atriz Angelina Jolie popularizou o feito após divulgar que optou por retirar os seios para prevenir o câncer de mama depois de realizar um sequenciamento genético que detectou a propensão para o desenvolvimento da doença Essas e outras ações podem ser feitas com o conhecimento do funcionamento dos genes Será que essa técnica está dis ponível no Brasil Qual é o custo Essas e outras curiosidades você verá nesta reportagem Acesse o QRCode e confira 120 UNICESUMAR Na área da medicina o sequenciamento pode monitorar o ambiente dos microrganismos presentes no nosso corpo Por exemplo amostras coletadas das fezes podem revelar algumas funções fisiológicas nossas Segundo Christoff et al 2019 por meio do sequenciamento da amostra é possível conhecer os hábitos e a saúde das pessoas medir a eficiência do uso de antibióticos fazer uma otimização e uma avaliação da eficácia de tratamentos probióticos e prebióticos conhecer os microrganismos patogêni cos presentes na flora intestinal além de fomentar estudos para diagnóstico e tratamento de doenças As funcionalidades do sequenciamento não são apenas essas Ele pode ser usado no estudo de genes e entender quais proteínas codificam assim como é possível observar o que levam as trocas nos genes Na biologia evolutiva o sequenciamento do DNA é útil para entender como diferentes organismos estão relacionados e na ciência forense é o corriqueiro meio de identificação de organismos e utilizado em testes de paternidade Você já ouviu alguém falar da medicina personalizada Tratase de uma forma revolucionária de investigação de uma doença Nela mostrase a possibilidade de encontrar o tratamento certo de forma individualizada e sobretudo no tempo certo A principal ferramenta utilizada para essa análise é a técnica de sequenciamento do DNA Ela permite obter diagnósticos precisos No podcast deste ciclo de aprendizagem apresento algumas informações e curiosidades so bre a medicina personalizada Não deixe de ouvir Não é por acaso que a biologia molecular é uma das disciplinas da sua grade curricular Entender a estrutura a funcionalidade e o processamento das moléculas de ácidos nucleicos como o DNA e o RNA é a base da biologia molecular Desse modo o estudo aprofundado com o uso das tecnologias existentes ajuda a compreender o funcionamento dos organismos vivos Por exemplo agora você sabe muito mais que simplesmente os conteúdos básicos das infor mações de DNA Nesta unidade você compreendeu que essas moléculas podem ser lidas ponto a ponto pelo método de sequenciamento e é possível aproveitar as informações a fim de detectar características genéticas como os patógenos os quais iniciaram a nossa discussão Vicente optou pela técnica de sequenciamento provavelmente sequenciamento em tempo real para detectar qual era o microrganismo que estava causando prejuízos Eventualmente ou frequentemente esse será um dos conhecimentos que você necessitará resgatar em algum período de sua trajetória profissional uma vez que a biomedicina apresenta um leque de aplicabilidades de investigações Essa pode ser uma delas 121 Chegou o momento de concluir este ciclo de aprendizagem fazendo uma verificação dos co nhecimentos adquiridos sobre o sequenciamento de DNA A seguir está disposto um mapa de empatia Nele você deverá preencher as lacunas vazias que definem as características que estão interligadas Vamos lá SEQUENCIAMENTO DE DNA 1 Aplicabilidade Detecção de microorganismos Monitoramento ambiental Detecção de fraude em alimentos 2 Em 1977 quando tudo começou Dois pesquisadores consolidaram o desenvolvimento do sequenciamento de DNA Alan Maxam e Walter Gilbert Frederick Sanger Baseia na utilização de ddNTPs que interrompe o processo de replicação 3 Sequenciamento convencional Componentes 5 DNA Polimerase ddNTPs A C G T Direcionados para a eletroforese 4 6 Sequenciamento automatizado de Sanger Utiliza sondas fuorescentes em cada ddNTP A reação é aplicada Separados em tamanhos Computador revela picos que mostram cada nucleotídeo Sequenciamento de NGS tipos 7 Pirosequenciamento Emitem luz 122 1 O sequenciamento é uma técnica que surgiu após os estudos relacionados à compreen são da molécula de DNA e os componentes dela Por volta de 1977 foi consolidada a primeira estreia de dois protocolos para aplicar a técnica Ela foi apresentada por dois pesquisadores Alan Maxam e Frederick Sanger Em relação à técnica de sequenciamento de DNA assinale a alternativa correta a É uma técnica capaz de identificar as sequências de aminoácidos presentes na molé cula de RNAm b O sequenciamento é uma técnica capaz de identificar os nucleotídeos de forma or denada presentes no genoma de um organismo c O sequenciamento permite a identificação de nucleotídeos de uma molécula de DNA mas não possibilita analisar a ordem d A técnica de sequenciamento corresponde ao modo com que a molécula de DNA pode se replicar durante o processo de reprodução celular e Sequenciar o DNA é o modo pelo qual os cientistas visualizam a estrutura geral e relaciona com a função gênica 2 Historicamente o sequenciamento de DNA foi iniciado em 1977 e o pesquisador que apresentou o processo mais aceito e fácil de desenvolver foi Frederick Sanger Dessa forma a metodologia foi chamada de sequenciamento de Sanger Assinale a alternativa que melhor descreve os elementos essenciais e utilizados no sequenciamento de Sanger e o processo de desenvolvimento dessa metodologia a O sequenciamento de Sanger consiste na utilização do DNA polimerase uma fita molde de DNA um iniciador desoxinucleotídeos e os didesoxinucleotídeos O evento se processa pelo término da replicação de um DNA em pontos diferentes que são visualizados e analisados por eletroforese b O sequenciamento de Sanger consiste na utilização do DNA polimerase uma fita molde de DNA um iniciador desoxinucleotídeos e enzimas de restrição O evento se processa pelo término da replicação de um DNA em pontos diferentes por meio da ação da enzima de restrição Depois são visualizados e analisados por eletroforese c O sequenciamento de Sanger consiste na utilização do DNA polimerase uma fita molde de DNA um iniciador desoxinucleotídeos e didesoxinucleotídeos O evento se processa pelo término da transcrição de um DNA em pontos semelhantes que são visualizados e analisados por autorradiografia d O sequenciamento de Sanger consiste na utilização do RNA polimerase uma fita molde de DNA um iniciador e desoxinucleotídeos O evento se processa pelo término da replicação de um DNA em pontos diferentes que são visualizados e analisados por eletroforese 123 e O sequenciamento de Sanger consiste na utilização do DNA polimerase uma fita molde de DNA um iniciador desoxinucleotídeos e didesoxinucleotídeos O evento se processa pelo início da replicação de um DNA em pontos diferentes que são marcados por sondas e visualizados por técnicas computadorizadas 3 O desenvolvimento da técnica de sequenciamento foi consolidado quando Sanger descobriu que se conseguisse interromper a replicação de um mesmo DNA em pontos diferentes ele poderia juntar essas fitas menores e formar a sequência completa do DNA O aspecto essencial para efetuar o término da replicação se deve ao uso de qual elemento na reação Assinale a alternativa correta a O elemento da reação que interrompe a replicação é o iniciador marcado radioati vamente pois não permite que mais nenhum nucleotídeo possa ser adicionado na replicação b O elemento que interrompe a síntese de DNA é representado pelos didesoxinucleotí deos ddNTPs por não terem o grupamento 3hidroxila necessário para permitir a associação do próximo nucleotídeo dNTP c O componente que não permite a continuação da replicação é a enzima de restrição que é colocada no processo a qual faz a quebra da fita e interrompe a síntese do DNA d O elementochave do sequenciamento de DNA é a introdução de grupamentos de pirofosfatos que emitem luz e permitem verificar o nucleotídeo replicado e O componente que cessa a replicação e permite visualizar o nucleotídeo final introdu zido durante a síntese são os nucleotídeos marcados radioativamente 4 Com o passar dos anos o processo de sequenciamento foi sendo atualizado a partir das ideias de Sanger Atualmente temos os Sequenciadores de Nova Geração NGS que são utilizados frequentemente nos laboratórios para análises diversas Quais são as vantagens e as desvantagens que essas inovações trouxeram em relação ao método de Sanger 5 O primeiro sequenciador lançado da nova geração foi apresentado pela empresa de biotecnologia 454 Roche A primeira aplicação divulgada foi para sequenciar o genoma inteiro da bactéria Mycoplasma genitalium Esse método foi chamado de pirosequen ciamento Sobre o pirosequenciamento assinale a alternativa correta a O pirosequenciamento diferentemente do método tradicional de Sanger não utiliza didesoxinucleotídeos ddNTPs Ao contrário adiciona um grupamento de pirofosfato 124 no desoxinucleotídeo combinação que ajuda no progresso de reações que fazem as enzimas presentes emitirem luz b O pirosequenciamento utiliza uma combinação de reações enzimáticas além dos di desoxinucleotídeos ddNTPs que liberam um pirofosfato Em seguida o pirofosfato é convertido em ATP Pela ATP sulforilase é realizada a luciferase a fim de oxidar a luciferina produzindo um sinal de luz c A sulforilase é uma das enzimas presentes no processo de pirosequenciamento que libera o grupamento pirofosfato e produz um sinal de luz capturado por uma câmera CCD chargecoupled device acoplada ao sistema d Os pirofosfatos liberados pelos nucleotídeos no processo de pirosequenciamento são convertidos em ATP pela ATP luciferase sendo esta utilizada pela sulforilase para produzir um sinal de luz capturado por uma câmera CCD chargecoupled device acoplada ao sistema e O pirosequenciamento assim como o método de Sanger utiliza como modo de visua lização a eletroforese para analisar as sequências de nucleotídeos lidos 6 De acordo com o professor Vasco Azevedo do Departamento de Biologia Geral do ICB UFMG há uma grande relevância dada aos sequenciamentos para a prevenção de grandes contaminações de patógenos como no atual caso do SARSCoV2 O do cente explica que o sequenciamento veio como uma facilidade para área da genética pois é possível analisar diretamente o ácido nucleico e comparar com outros com o intuito de verificar a evolução de uma determinada doença como o SARSCov2 CORONAVÍRUS entenda a importância do sequenciamento genético Fundep 16 mar 2020 Disponível em httpswwwfundepufmgbrcoronavirussequenciamen togenetico Acesso em 14 dez 2021 Sobre a aplicabilidade da técnica de sequenciamento descreva pelo menos outras cinco utilidades que esse método trouxe para a humanidade 6 Nesta unidade você saberá como identificar uma sequência de DNA que esteja alterada quando comparada ao estado normal Perceberá que a detecção das alterações de sequência gênica demonstra a variabilidade das características expressas nos in divíduos as quais podem estar associadas a elementos positivos ou negativos para o indivíduo Além disso conhecerá os tipos de metodologias utilizadas para identificar essas alterações tais como os biomarcadores e as características Verá ainda algumas aplicabilidades dessas técnicas na área da saúde Marcadores moleculares que determinam e analisam o DNA e as aplicações dele na pesquisa na área biomédica Dra Ana Luisa Monezi Lucena 126 UNICESUMAR Leia o estudo de caso a seguir Antônio há alguns anos vem exaustivamente passando por tratamentos para tentar impedir a disseminação de um câncer no fígado Mesmo depois de passar por três cirurgias por anos consecutivos ainda não foi possível eliminar o tumor Desde 2008 tem utilizado medicamen tos e feito investigações constantes a fim de obter uma melhor qualidade de vida Recentemente foi detectada por meio de exames clínicos uma alteração nas sequências de DNA presentes nas células do pulmão Isso revela uma possível metástase Diante do caso de Antônio você já imaginou como poderiam ser identificados os cânceres de fígado e do pulmão por exames moleculares Quais são as vantagens de se identificar uma determinada doença por meio de exames moleculares Como a medicina tem se beneficiado do estudo dos genes Quais são as aplicações e práticas imediatas O que se espera para o futuro Quais são as implicações éticas Suponha que uma característica é associada a uma doença manifestada ou é detectada a resistência do indivíduo a determinadas qualidades essas são situações condicionadas às informações presentes no DNA e aos fatores ambientais que determinam a expressão de tais características Atualmente com o advento da biologia molecular essas modificações podem ser identificadas de forma rápida e menos invasiva assim como acontece no problema de Antônio A importância da análise evidencia que é possível entender como os nossos genes funcionam quando estão normalizados e compreender os motivos pelos quais causam doenças quando alterados O diag nóstico molecular tem sido utilizado para um número crescente de patologias auxiliando no aconse lhamento genético e no diagnóstico prénatal com o intuito de evitar a proliferação de determinadas anomalias Devido ao entendimento do funcionamento de determinados genes na atualidade já se tem a possibilidade de identificálos antes ou após a manifestação deles e prever tratamentos específicos de maneira que se não for alcançada a cura possa ajudar no tratamento e no prolongamento da vida mesmo com a presença de alterações Considere que você trabalha em um laboratório e deseja indicar para um médico os exames mais modernos com o objetivo de detectar uma determinada doença e solucionar a interpretação de casos como o de Antônio Dessa forma você profissional da saúde teria a oportunidade de apresentar os métodos da biologia molecular capazes de revelar os resultados necessários sem serem tão invasivos 127 UNIDADE 6 A melhor maneira de iniciar a conversa é apresentar os métodos laboratoriais que identificam os genes alterados e que apontam tipos celulares e patologias específicas mostrando a participação dos marcadores que os identificam Para compreender ainda mais o assunto faça uma breve pesquisa sobre os biomarcadores moleculares mais recentes e confiáveis para a identificação de doenças ou outras características dos organismos Você pode utilizar os meios de circulação online tais como artigos científicos e sites de laboratórios clínicos Você já sabe a importância da detecção e da compreensão da funcionalidade da molécula de DNA em relação à manifestação de determinadas características no corpo e à atuação delas na vida Além disso você já percebeu que com o desenvolvimento das ferramentas de biologia molecular foi possível manipular a molécula de DNA e detectar as alterações que se relacionam a determinadas doenças Nesta unidade você entenderá que os aspectos descritos são essenciais para entender as facilidades que a biologia molecular trouxe para a detecção de sequências diferentes no material genético vin culadas às características incomuns Os biomarcadores moleculares são uma das otimizações nessa área Reflita como o avanço dessas ferramentas podem ser benéficas para pessoas como Antônio por exemplo Registre os pontos essenciais da sua reflexão sobre o advento dos biomarcadores DIÁRIO DE BORDO 128 UNICESUMAR A ideia de identificar as características marcantes nos organismos iniciou em meados dos anos 60 com os marcadores morfológicos Eles se baseavam na observação morfológica dos indivíduos tais como altura cor textura e reprodutibilidade No entanto em consequência desse tipo de marcador apresentar uma capacidade reduzida de análise morfológica e por vezes sofrer influência ambiental não foi considerado suficiente e seguro em determinadas situações Dessa forma houve a necessidade de estudar e desenvolver marcadores mais completos que vieram a aparecer após o lançamento das diferentes tecnologias de manipulação do DNA chamados de marcadores moleculares e que exa minam o material genético TURCHETTOZOLET et al 2017 Quando pensamos no significado da palavra marcador logo vem em mente algo que possa destacar um elemento de interesse Na biologia molecular para essa finalidade destacase o desenvolvimento de marcadores moleculares que revelam uma sequência de moléculas químicas que expressam as carac terísticas importantes dos organismos O surgimento dos marcadores moleculares aconteceu a partir da descoberta da estrutura e da funcionalidade da molécula de DNA passando pelas metodologias desenvolvidas para a manipulação como as enzimas de restrição o DNA polimerase a eletroforese as técnicas de PCR e o sequenciamento genético Esses avanços permitiram que o DNA antes entendido como uma molécula de difícil acesso fosse uma molécula de fácil manipulação Em 1980 o uso de marcadores moleculares passou a integrar rotineiramente a análise do DNA das mais diversas espécies como plantas animais microrganismos e humanos Desde então eles vêm sendo aperfeiçoados e evoluem em conjunto com os avanços voltados às técnicas de sequenciamento em larga escala A presença de vários tipos de marcadores moleculares e as diferenças de princípios metodologias e aplicações requerem uma consideração cuidadosa na escolha de um ou mais desses 129 UNIDADE 6 métodos de acordo com a aplicação e os recursos técnico financeiro equipamentos disponíveis em cada centro de estudo TURCHETTOZOLET et al 2017 Os marcadores moleculares são uma espécie de marcas digitais que podem ser localizadas em partes do DNA de qualquer organismo vivo Essas marcas são herdadas geneticamente e podem variar entre os indivíduos de uma espécie Além disso representam alterações na sequência de nucleotídeos da molécula de DNA denominadas polimorfismos Considere que o genoma é composto por aproximadamente 90 de sequências não codificadoras ou seja que carregam uma sequência de nucleotídeos que não será transcrita em RNA mensageiro nem traduzida em proteína correspondendo às sequências com funções regulatórias Há outras sem função conhecida No entanto também existem em pequena porcentagem mas com grande importância as se quências que podem ser transcritas e traduzidas Elas expressam uma determinada característica Portanto a maioria das alterações que ocorrem no DNA pode ser estável e não promover mudanças fenotípicas uma vez que o número de sequências não codificadoras é a maioria DIASSALMAN GIACHETTO MALAGO JR 2009 Quando as variações ocorrem elas são resultantes das mutações nas sequências de DNA decorrentes de inserções deleções e substituições de bases ou erros de replicação do material genético o que se transforma em uma leitura incorreta O desenvolvimento e o uso de marcadores moleculares para a detecção e a exploração desses polimorfismos do DNA constituem um dos avanços mais significativos no campo da genética molecular Isso se deve ao fato de que a utilização de marcadores localizados no DNA fornece um número praticamente ilimitado de informações distribuídas aleatoriamente ao longo do genoma PIERCE 2013 TURCHETTOZOLET et al 2017 As variações das sequências gênicas detectadas por marcadores constituem uma forma de entender as características herdadas e predizer comportamentos vantajosos ou não para determinada espécie Por isso os marcadores moleculares são extremamente valorizados por quem investiga as relações entre genótipo e fenótipo e pelas áreas que envolvem a genética a biologia molecular e a biotecnologia como a genética de populações a filogeografia a filogenia molecular o mapeamento genético o diagnóstico das doenças genéticas e os testes de paternidade TURCHETTOZOLET et al 2017 As variantes dos marcadores moleculares apresentam três características principais que os des tacam o modo de detecção a ação gênica e o rendimento de genes analisados Quando é considerado o modo de detecção são incluídos aqueles baseados em hibridização em reação em cadeia da polimerase PCR e por fim os marcadores calcados em sequenciamento Em relação à ação gênica os marcadores podem ser classificados de acordo com o tipo de herança alélica e podem ser dominantes ou codominantes Figura 1 Os marcadores codominantes possibilitam diferenciar os indivíduos homozigotos e heterozigotos o que não é possível por meio de marcadores dominantes Com eles apenas é possível identificar a presença ou a ausência de um determinado alelo Essa característica é muito importante dependendo do objetivo do estudo já que por exemplo não é possível realizar a análise de paternidade com marcador dominante 130 UNICESUMAR Por sua vez os marcadores moleculares baseados no rendimento são definidos de acordo com a quantidade de loci genotipados por vez considerando os de genotipagem de baixo rendimento que permitem identificar poucos loci por vez e os de genotipagem de alto rendimento que identificam milhares de loci simultaneamente TURCHETTOZOLET et al 2017 A A1 A2 A2 A1 A P1 P1 P2 F1 P1 P2 F1 P2 P1 P2 a a 150 pb 100 pb Dominante Codominante 150 pb 100 pb Figura 1 Representação das heranças alélicas dominante e codominante na diferenciação da expressão de alguns tipos de marcadores Fonte Marcadores 2021 sp Descrição da Imagem tratase de uma representação das sequências parentais P1 e P2 que estão classificadas de acordo com o tipo de herança alélica em dominante quatro sequências e um gel com o resultado da eletroforese localizados à esquerda da figura e co dominante quatro sequências e um gel com o resultado da eletroforese localizados à direita da figura Cada sequência é representada por duas barras de cor cinza Em relação aos marcadores dominantes das quatro sequências dois são P1 e dois P2 representando uma amplificação A identificação do alelo A se dá por meio de uma barra menor de cor vermelha Por outro lado o alelo a é representado por meio de uma marcação em azul Ambos estão localizados na parte interna da sequência Em P1 cada sequência apresenta uma barra vermelha na parte inicial da barra superior da sequência e outra na parte final e inferior da barra da sequência Em P2 cada sequência apresenta uma barra vermelha na parte inicial da barra superior da sequência enquanto na barra inferior a marcação azul é vista na porção final Após a eletroforese das três colunas do gel em P1 mostrase uma banda pequena barra retangular preta re presentando os fragmentos com o gene dominante AA enquanto a coluna contendo os fragmentos de P2 não apresenta uma banda já que os alelos são Aa e esse tipo de marcador é dominante não mostrando os heterozigotos A coluna com F1 apresenta a banda do alelo AA na mesma altura que a banda de P1 Desse modo fica demonstrado que não herdou a de P2 Para a classificação do tipo codominante as quatro sequências duas P1 e duas P2 apresentam as barras vermelhas representando os alelos A Em P1 são mostrados os alelos A1 nas duas sequências uma barra no início da barra superior de cada sequência e uma na parte final da barra inferior Ambas as sequências P1 apresentam 150 pares de base Em P2 os alelos A2 têm as mesmas localizações que P1 nas duas sequências mas os fragmentos de DNA carregam 100 pares de base cada um Na visualização do gel a coluna P1 mostra uma banda mais alta representando o fragmento maior 150pb P2 uma banda mais baixa representando o fragmento menor 100pb e F1 mostra as duas bandas observadas em P1 e P2 duas bandas com posições diferentes na mesma coluna de F1 150 pb e 100pb Em F1 fica evidente que a caracterização é feita por meio de um marcador codominante uma vez que foram expostos os dois tipos de variação herdadas dos pais sendo um indivíduo heterozigoto 131 UNIDADE 6 Os marcadores moleculares de DNA se expandiram com o desenvolvimento das técnicas de hibridi zação e PCR O primeiro tipo de marcador baseado no sistema de marcador genético de hibridização foi o polimorfismo no comprimento de fragmento de restrição RFLP do inglês Restriction Fragment Length Polymorphism inventado no início dos anos 70 Com base na propriedade de pareamento de bases complementares é um sistema que permitiu o desenvolvimento de métodos que utilizam pequenos fragmentos de DNA como sondas a fim de revelar polimorfismos apenas nas sequências homólogas a essa sonda TURCHETTOZOLET et al 2017 CHERIYYEDATH 2019 O procedimento do RFLP inicia a partir da extração do DNA Depois de separado ele é submetido à clivagem com as enzimas de restrição conhecidas as quais fazem o reconhecimento de geralmente quatro a seis pares de nucleotídeos sequências curtas em que um maior número de fragmento pode ser gerado Após clivagem e a geração de um número de fragmentos com diferentes tamanhos eles são aplicados em gel agarose ou em poliacrilamida e submetidos à eletroforese Assim os fragmentos são separados e geram diferentes bandas Depois da eletroforese o gel contendo os fragmentos passa pelo procedimento Você se lembra dos conceitos de alelo lócus dominância e codominância Eles estão inter relacionados e provêm das características herdadas Quando falamos de lócus estamos nos referindo ao local onde se encontra uma sequência de nucleotídeos de DNA que correspon derá a um gene responsável por uma determinada característica Por outro lado os alelos constituem a sequência de nucleotídeos alternativa de determinado gene Para que o nosso genoma esteja completo temos um par de alelos que herdamos um do pai e outro da mãe No entanto esses dois alelos não precisam ser idênticos Quando diferentes são chamados de heterozigotos e quando iguais são chamados de homozigotos A maneira de expressar essas características pode variar Diante disso adentrase no conceito de dominância Quando dois alelos diferentes estão presentes em um determinado genótipo do indivíduo talvez apenas as características codificadas por um deles sejam expressas Nesse contexto a característica que for identificada será considerada pertencente ao alelo dominante Quando a característica dos dois alelos em heterozigose são expressos ao mesmo tempo identificamos a herança como codominância No caso dos marcadores citados eles podem ser dominantes quando mostram apenas os alelos homozigotos enquanto os marcadores codominantes expressam tanto os alelos homozigotos quanto os heterozigotos 132 UNICESUMAR de Southern blot em que o DNA é desnaturado em fita simples e transferido para uma membrana de nitrocelulose Posteriormente é feita a hibridização da membrana com sondas radioativas as quais se associam aos fragmentos complementares Por fim com a ligação das sondas é possível aplicar uma autorradiografia e visualizar os fragmentos hibridi zados com a sonda pelo raio X Figura 2 BORÉM CAIXETA 2009 Na autorradiografia cada banda visualiza da corresponde a um determinado fragmento que de acordo com a posição evidencia que são de diferentes tamanhos Isso acontece devido às substituições de base única deleções muta ções inversões translocações ou transposições na sequência de reconhecimento da enzima de restrição alterando o padrão dos fragmentos de restrição resultantes CHERIYYEDATH 2019 133 UNIDADE 6 1 1 Amostras de DNA cortadas com enzima de restrição são aplicadas em gel de agarose para eletroforese 2 3 Canaleta 1 Marcadores radioativos de tamanho Canaleta 2 DNA cortado com enzima de restrição A Canaleta 3 DNA cortado com a enzima de restrição B 1 2 3 2 O DNA é separado por eletroforese DNA é desnaturado Gel é colocado sobre a mecha de esponja Peso Tolhas de papel Filtro de ligação ao DNA Gel Mecha esponja Tampão Sonda radioativa 3 O fltro de ligação ao DNA as toalhas de papel e o peso são colocados sobre o gel O tampão atravessa a esponja por ação capilar transferindo o fragmento de DNA ao fltro Autorradiografa Coloque o flme de raio x sobre o fltro 4 Após a transferência do DNA o fltro é colocado no saco selado termicamente com a solução que contém a sonda marcada A sonda é hibridizada com as sequências complementares 1 2 3 5 O fltro é lavado para remover a sonda não ligada Depois é secado O flme de raio X é aplicado à autorradiografa Autorradiografa todos os marcadores de tamanho se mostram porque são radioativos Nas canaletas 2 e 3 somente as bandas que hibridizam com a sonda são visíveis Figura 2 Representação da técnica utilizada para detectar marcadores do tipo RFLP Fonte adaptada de Klug et al 2010 Descrição da Imagem a figura mostra as etapas do processo de identificação dos fragmentos de RFLP De cima para baixo na etapa 1 é mostrado um gel agarose no formato retangular com três canaletas enumeradas da seguinte forma 1 2 e 3 Nelas são aplicados os marcadores radioativos de tamanho na canaleta 1 e as amostras de DNA cortadas com enzima de restrição A e B nas canaletas 1 e 2 respectivamente Na etapa 2 os fragmentos de DNA são separados por eletroforese Assim os fragmentos de cada canaleta são repre sentados por meio de degraus de escadas com diferentes distâncias entre eles Ainda nessa etapa o DNA presente no gel é desnaturado abertura das fitas Na etapa 3 assim como na técnica de Southern Blot a transferência dos fragmentos de DNA do gel para um filtro de ligação do DNA é feita Na figura essa etapa é representada por uma forma retangular preenchida com tampão líquido azul Nela são colocados os seguintes componentes de baixo para cima mecha de esponja representada em amarelo e em contato com o tampão gel de agarose com os fragmentos desnaturados filtro de ligação do DNA bloco de toalhas de papel representado por um retângulo bege e um peso simbolizado por um retângulo menor na cor alaranjada O tampão atravessa a esponja por ação capilar e transfere os fragmentos de DNA para o filtro Na etapa 4 a membrana com os fragmentos transferidos é colocada em um saco plástico vedado saco transparente com vedação superior selado termicamente e é preenchida com um líquido laranja com vários riscos pequenos vermelhos distribuídos sonda radioativa para que ocorra a hibridização da sonda com as sequências complementares Do lado direito do saco é mostrado o tubo de onde foi proveniente a sonda Na etapa 5 o filtro é lavado para remover as sondas não ligadas e depois de seco o filme de raio X é colocado sobre o filtro para autorradiografia Nesse momento todos os fragmentos marcados são visíveis por serem radioativos Na revelação são mostradas as três colunas na 1 todos os fragmentos são mostrados marcadores de tamanho na 2 há duas bandas e na coluna 3 há três bandas das quais duas de baixo para cima apresentam posições diferentes em relação à coluna 2 134 UNICESUMAR O RFLP foi um marcador utilizado para a construção do primeiro mapa molecular de humanos em 1980 e até hoje é empregado em diferentes abordagens de estudos como no mapeamento genético em plantas marcação gênica dinâmica populacional e relacionamento taxonômico TURCHETTO ZOLET et al 2017 Em detrimento de ser codominante e identificar um lócus homozigoto e outro heterozigoto proporciona um maior número de informações para os estudos genéticos e aumenta as possibilidades de aplicações BORÉM CAIXETA 2009 Dentre as desvantagens da técnica RFLP temos BORÉM CAIXETA 2009 Exige etapas numerosas e demora semanas para expor os resultados do rendimento Precisa de uma grande amostra do DNA O desenvolvimento das sondas usadas é considerado oneroso e laborioso O processo não permite automatização das etapas Na maioria das vezes não existe uma biblioteca de sondas para espécies de menor importância econômica Alguns autores afirmam que a utilização da técnica original do RFLP atualmente é bem menor em comparação às outras classes de marcadores baseados em PCR uma vez que com o advento da PCR o procedimento de detecção de fragmentos polimórficos se tornou relativamente mais simples e menos caro Todavia o RFLP é reconhecido por ter sido o ponto de partida para vários avanços subsequentes de marcadores relacionados CHAMBERS et al 2014 Diferentes técnicas para a análise de marcadores de DNA utilizando como modo de detecção a PCR estão disponíveis A PCR permitiu que a amplificação de uma grande quantidade de uma sequência específica de DNA seja feita em poucas horas sem a necessidade de clonagem começando com ape nas algumas moléculas da sequênciaalvo Uma vantagem dos métodos de marcadores baseados em PCR em comparação aos métodos de Marcadores baseados em hibridização é que o último requer o isolamento de grandes quantidades de DNA Vamos sintetizar o RFLP por meio de um vídeo explicativo e ilustra tivo Nele você compreenderá como é feita a técnica de RFLP e as aplicações dela de maneira dinâmica Acesse o QR Code e se envolva nesta abordagem 135 UNIDADE 6 Agora você conhecerá algumas características gerais dos marcadores baseados em PCR Com certeza um deles foi utilizado para a detecção do câncer de Antônio o per sonagem do estudo de caso do início desta unidade A inclusão da PCR nos métodos diagnósticos dos tipos de marcadores que serão apresentados facilita a detecção das sequências alteradas do DNA que venha influenciar o desenvolvimento de doenças tal qual como a de Antônio de maneira mais rápida Aqui será mostrada uma seleção dos marcadores baseados em PCR mais utili zados incluindo polimorfismo do DNA amplificado ao acaso RAPD sequências repetitivas de pares de bases do DNA ou SSR do inglês Simple Sequence Repeats segmentos entre sequências simples repetidas de DNA ou ISSR do inglês Inter Simple Sequence Repeats polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados ou AFLP do inglês Amplified Fragment Lenght Polymorphism O RAPD foi o primeiro marcador que surgiu após o desenvolvimento da PCR Em 1990 dois grupos de pesquisadores desenvolveram essa técnica baseada na utilização de um primer iniciador ou oligonucleotídeo mais curto que normalmente utilizado na PCR e de sequência arbitrária para realizar as amplificações Desse modo não é preciso ter o conhecimento prévio dos fragmentos a serem amplificados A amplificação ocorre quando o sítio do primer está presente no DNA alvo em orientação oposta dentro de aproximadamente 2000 bases Os polimorfismos RAPD resultam da variação da sequência nos locais de anelamento do primer eou da varia ção de comprimento da sequênciaalvo situada entre os locais de ligação do primer A detecção dos produtos da amplificação é feita normalmente em gel de agarose corado com brometo de etídio Eles são visualizados sob luz ultravioleta Figura 3 TURCHETTOZOLET et al 2017 BORÉM CAIXETA 2009 O RAPD DNA polimórfico amplificado aleatoriamente é uma técnica que não é radioativa requer uma pequena quantidade de DNA maior vantagem em relação à técnica de RFLP pode ser realizada em poucas horas não precisa de primers espe cíficos e pode ser automatizada Outra vantagem é o grande número de marcadores obtidos e distribuídos ao longo do genoma Entretanto o uso desse marcador é limitante por diversas características incluindo o baixo conteúdo de informações genéticas em cada loco dado que apenas um alelo é detectado pelo fragmento amplificado Além disso esse marcador se comporta como um marcador dominante e apresenta baixa reprodutibilidade entre diferentes laboratórios e experimentos principalmente associados ao uso de baixa temperatura de anelamento o que pode resultar em baixa especificidade ou no não anelamento do primer TURCHETTOZOLET et al 2017 BORÉM CAIXETA 2009 136 UNICESUMAR 5 5 3 RG AT AT TA TA TA TA TA TA TA TA TA TAGCAGTAGCCAAGT TGCGTACCCAARG TAGCGCCAAGT PCR RAPD 5 3 3 5 Figura 3 Demonstração da amplificação do DNA pela técnica de RAPD Fonte Marcadores 2021 sp Segundo Ferreira e Grattapaglia 1996 a técnica de RAPD pode servir de ferramenta para aplicações que incluem A obtenção de identificadores genômicos de indivíduos variedades e populações A análise da estrutura e diversidade genética em populações naturais O estabelecimento de relacionamentos filogenéticos entre diferentes espécies A construção de mapas genéticos de alta cobertura genômica para diagnósticos de doenças análise de pedigree construção de mapas de ligação e clonagem de genes de interesse Descrição da Imagem a figura mostra duas barras pretas horizontais paralelas as quais representam o fragmento de DNA dupla fita a ser amplificado pela técnica de RAPD Uma seta de cor verde e com a escrita PCR está abaixo das barras citadas e aponta para duas barras logo abaixo semelhantes as de cima mas separadas por um espaço entre elas com as extremidades 5 à esquerda na barra superior e à direita na barra inferior e 3 à direita na barra superior e à direita na barra inferior identificadas e os primers repre sentados por barras menores em vermelho e ligados às fitas de DNA em três locais diferentes isto é ligados aleatoriamente A partir dos primers ocorre a amplificação das partes do DNA Devido à posição contrária das extremidades 5e 3 a amplificação acontece do sentido 5para 3 sendo essa direção indicada por uma seta pontilhada e preta Abaixo das fitas após a representação da amplificação via PCR dois géis de eletroforese são mostrados O fundo é preto e as bandas dos fragmentos amplificados as quais foram geradas via PCR estão evidenciadas em branco 137 UNIDADE 6 Os microssatélites sequências repeti tivas de pares de bases do DNA ou SSR constituem mais um tipo de marcador que detecta sequências repetidas do ge noma Em geral é comum ter sequências simples de um a seis nucleotídeos repeti dos Os nucleotídeos que flanqueiam essas sequências repetidas são geralmente con servados entre os indivíduos da mesma espécie permitindo a seleção de primers específicos que amplificam essas regiões Figura 4 Dessa maneira por intermédio do método de PCR as pequenas sequên cias que se repetem em um número variá vel no genoma podem ser amplificadas O uso dessa técnica em humanos foi desenvolvida para a análise do mapea mento genético Desde então vêm sendo amplamente utilizada em diversas áreas da ciência LITT LUTY 1989 WEBER MAY 1989 Esse tipo de marcador ba seado na amplificação por PCR de re giões específicas do genoma utiliza um par de primers lócus específicos Os mi crossatélites apresentam grandes vanta gens por serem abundantes no genoma fáceis de automatizar codominantes multialélicos e reprodutíveis O padrão de polimorfismos apresen tado pelo SSR é um dos benefícios mais admirados quando comparado a qualquer outro sistema de marcador contemporâ neo O método de bibliotecas enriqueci das para busca por SSR tem sido o mais popular e divulgado na comunidade cien tífica TURCHETTOZOLET et al 2017 BORÉM CAIXETA 2009 138 UNICESUMAR Regiões fanqueadoras conservadas Figura 4 Demonstração do processo para a detecção de regiões repetidas do genoma SSR Fonte Marcadores 2021 sp Descrição da Imagem na figura são apresentadas quatro fitas duplas de DNA fita dupla na cor cinza na posição horizontal Em cada uma delas é representado um par de primers barras curtas de cor rosa específicos que flanqueiam as regiões repetidas do genoma setas azuis em uma fita indicando o sentido esquerda para a direita e na fita abaixo as setas azuis seguem a direção direita para a esquerda Cada um desses primers se ligam em distâncias diferentes evidenciando que as sequências repetidas se posicionam em regiões distintas e com tamanhos variados para cada uma das moléculas de DNA Abaixo desse esquema de representação das regiões em que os primers amplificaram é representado um gel de eletroforese em que os fragmentos depois de amplificados são aplicados no gel e demonstrada a disposição das bandas em branco com o fundo do gel em preto 139 UNIDADE 6 Outra técnica desenvolvida com o uso da PCR foi o marcador de segmentos entre sequências simples repetidas de DNA também conhecido como ISSR do inglês Inter Simple Sequence Repeats Ele incorporou aos benefícios do RAPD um grande número de marcadores obtidos e distribuídos sobre o genoma com o aumento da reprodutibilidade e da especificidade O ISSR é uma técnica baseada em SSR que envolve a amplificação de fragmentos de DNA presentes em uma distância amplificada entre dois SSRs ou microssatélites idênticos e repetidos em orientação oposta O protocolo de ISSR usa um único primer complementar às sequências SSR podendo ser não ancorado BENZAQUEM 2009 ou mais usualmente ancorado na extremidade 5 ou 3 com 1 ou 4 pares de bases degeneradas que são utilizadas para prevenir o deslizamento da polimerase durante a amplificação Isso torna o anelamento entre os primers e a extremidade do microssatélite mais específico e reproduzível Figura 5 A reprodutibilidade decorre do fato de serem utilizados primers mais longos para a amplificação por PCR em comparação ao RAPD e temperaturas de anelamento mais altas na PCR No caso dos RAPDs praticamente nenhum conhecimento prévio da sequênciaalvo é necessária aos ISSRs podendo ser apli cados com facilidade em espécies que não sejam modelos A ancoragem das sequências de iniciadores Uma biblioteca genômica é uma coleção de fragmentos de DNA de uma determinada espécie de organismo que foram obtidos a partir da ação de endonucleases de restrição ligados aos vetores apropriados e clonados após terem sido inseridos em um hospedeiro Sendo assim atualmente temos bibliotecas disponíveis para diferentes finalidades assim como é o caso das sequências repetidas de microssatélites de genes específicos de cDNA e até mesmo de mRNA Anteriormente as sequências das bibliotecas de marcadores de SSR e a possibilidade de projeção de primers nas regiões flanqueadoras eram determinadas pelo método de Sanger o que exigia um considerável investimento Hoje os microssatélites têm sido um dos marca dores mais beneficiados com os avanços das técnicas de sequenciamento em larga escala Com a disponibilidade de dados de sequências em domínio público e o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática a abordagem se tornou extremamente atrativa e conhecida Isso levou ao avanço de um número de softwares para a identificação dos motivos de SSR e predição do potencial polimórfico dos microssatélites identificados Fonte adaptado de TurchettoZolet et al 2017 140 UNICESUMAR com sequências não repetidas garante que a amplificação seja iniciada na mesma posição de nucleotídeo em cada ciclo ZIETKIEWICZ RAFALSKI LABUDA 1994 As amplificações são visualizadas em gel de agarose ou poliacrilamida A principal vantagem desse método é o fato de que esse tipo de marcador não requer etapas demoradas e caras apesar de os ISSRs apresentarem herança dominante Os ISSR são recomendados para as análises de espécies relacionadas evolutivamente Também são usados para a diferenciação rápida entre indivíduos aparentados pois apresentam resultados confiáveis devido à abundância edispersão por todo o genoma RODRIGUES 2010 ISSR 5 5 3 3 TA TA RG RG AT AT TA TA TA TA TA TA TA TA TA ATCGTCATCGGTTCA AT AT AT AT AT RGGCATGGGTTTG AT AT AT AT ATCGCGGTTCA microsatelite TAGCAGTAGCCAAGT TGCGTACCCAARG TAGCGCCAAGT Figura 5 Processo de amplificação das regiões que flanqueiam os SSR pela técnica ISSR Fonte Marcadores 2021 sp Dando sequência temos os marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmentos amplifica dos ou AFLP do inglês Amplified Fragment Lenght Polymorphism Ele é o resultado da combinação entre as técnicas utilizadas nos marcadores tipo RFLP e RAPD em que enzimas de restrição e amplificação por PCR são as bases da técnica O AFLP se baseia na amplificação seletiva por PCR de fragmentos de restrição gerados por enzimas de restrição específicas geralmente uma que gera extremidades coesivas e outra que gera extremidades cega e ligados a adaptadores oligonucleotídeos Figura 6 Descrição da Imagem a figura mostra uma dupla fita de DNA representada por duas barras paralelas na horizontal com as extremidades da fita identificadas como 5 extremidade esquerda da fita superior e extremidade direita da fita inferior e 3 extremidade direita da fita superior e extremidade esquerda da fita inferior As duas fitas têm fragmentos de cores diferentes Os fragmentos das extremidades e um fragmento do centro da fita estão coloridos de azul Entre esses fragmentos em azul há um fragmento vermelho que representa os microssatélites Dessa forma as fitas são divididas da esquerda para a direita da seguinte maneira azul vermelho azul vermelho e azul As fitas apresentam as bases nitrogenadas descritas da seguinte maneira fita superior 5ATCGTCATCGGTTCAATATATATATRGGCATG GGTTTGATATATATATCGCGGTTCA3 e fita inferior 3TAGCAGTAGCCAAGTATATATATATGCGTACCCAARGTATATATATAGCGCCAAGT5 As regiões com as bases ATATATATAT primeiros fragmentos vermelhos das duas fitas da esquerda para a direita e as regiões ATATATAT segundo fragmento vermelho de cada fita flanqueiam uma sequência de bases RGGCATGGGTTTG na fita 5 3 e TGCGTACCCAARG na fita 3 5 São mostrados ainda dois primers seta na cor amarela em direções contrárias e situadas na parte externa de cada fita associados com nucleotídeos repetidos TATA RG para a fita 5 3e ATAT RG para a fita 3 5 de forma complementar na região do DNA no DNA a sequência é AT no primer a sequência é TA Ao final é mostrado o resultado por meio de duas novas barras com a presença da região da dupla fita que foi reconhecida e amplificada Uma parte em vermelho representa a região repetida de bases posicionadas em cada uma das extremidades e no meio está a sequência que flanqueiam em azul 141 UNIDADE 6 Assim como o marcador RAPD o AFLP está distribuído ao longo do genoma e é adequado para a construção de mapas de ligação genética Contudo apresenta uma maior reprodutibilidade que os RAPDs tornandoos mais confiáveis para estudos de genética de populações por exemplo Por outro lado marcadores AFLPs mostram uma herança dominante e são identificados pela presença ou au sência das bandas ou alelos TURCHETTOZOLET et al 2017 Descrição da Imagem a figura é se parada em duas partes amplificação e disposição dos fragmentos no gel Na parte superior um fragmento de DNA em fita dupla é representado por duas barras de cor cinza na horizontal se paradas por um espaço entre elas Na primeira etapa duas fitas superiores são indicadas e distribuídas na super fície de cada fita pontas de setas na cor verdeescuro EcoRI e verdeclaro MseI Elas representam os pontos de corte das enzimas de restrição dessas enzimas Msel e EcoRI Em seguida direcionadas por uma seta preta as fi tas agora fragmentadas mostram os cortes gerados pela digestão do DNA com as enzimas EcoR I e Mse I Adap tadores de cada enzima são ligados nas extremidades de cada fragmento cortado Os fragmentos que apresen tam os adaptadores derivados de uma enzima de cada tipo nas extremidades um pequeno retângulo verdeclaro e um verdeescuro são préamplifica dos e representados por uma barra azul flanqueada pelos adaptadores Os fragmentos préamplificados são selecionados para outra amplificação a amplificação seletiva Os fragmentos re sultantes são ligados aos adaptadores e associados ao primer ENNN simboli zado por uma seta de cor verdeescuro associada na extremidade esquerda do fragmento com a ponta indicada para a direita e o primer RNNN simbolizado por uma setaverde clara associada na extremidade direita com a ponta da seta indicada para a esquerda Na últi ma parte da imagem é exposto um gel com vários fragmentos distribuídos pe las colunas 21 colunas Eles são vistos por bandas barras curtas na cor preta de diferentes tamanhos o indicador de tamanhos é mostrado em pb na coluna do lado direito do gel e descrito por nú meros geradas pelo processo de AFLP AFLP DNA genômico Digestão Msl EcoRI Ligação de adaptadores Pré amplifcação Amplifcação seletiva Primer ENNN 5 3 AFLP Primer M NNN Mi Mo F2 populações M Bp 1353 1078 872 603 310 287 271 234 184 Figura 6 Representação esquemática do processo de reconhecimento das sequências da técnica de AFLP Fonte Marcadores 2021 sp 142 UNICESUMAR Em relação aos custos essa técnica ainda é relativamente cara e requer trabalho intenso e conhecimento técnico A AFLP tem sido uma técnica popular para estudos ecológicos evolutivos e voltados à genética das populações e à diversidade Além disso foi a base para a descrição de metodologias de isolamento de outros marcadores como os SSR e SNPs TURCHETTOZOLET et al 2017 Por fim temos os marcadores que utilizam como base a técnica de sequenciamento de DNA que permite determinar a ordem das bases nitrogenadas presentes no material genético revelando a existência de trechos de DNA que se diferenciavam entre indivíduos da mesma espécie O poli morfismo de nucleotídeo único ou SNPs Single Nucleotide Polymorphisms é um tipo de marcador que detecta os polimorfismos específicos e as diferenças em uma única posição no genoma um único nucleotídeo gerado por substituição deleção ou inserção de bases Figura 7 TURCHETTOZO LET et al 2017 Figura 7 Identificação da alteração de um nucleotídeo único em uma sequência comparativa do genoma pela técnica de SNP Fonte Marcadores 2021 sp Descrição da Imagem a figura representa uma amostra que foi sequenciada Os fragmentos amplificados durante o sequenciamento estão contidos em um microtubo e são representados por um conteúdo azul desse microtubo Um zoom foi dado no conteúdo e à esquerda da imagem foram mostrados os fragmentos ligados aos respectivos ddNTPs didesoxinucleotídeos que na imagem estão representados por pontos vermelho terminou com um ddNTP adenina verde terminou com um ddNTP timina azul terminou com um ddNTP citosina e amarelo terminou com um ddNTP guanina em cada Após a leitura do material amplificado finalização do sequenciamento duas sequências coloridas e alinhadas são mostradas em um retângulo O alinhamento permitiu a comparação entre as duas sequências fita superior TCTGATTGGTGACCTTTTGCAATTGTGTAGGCTGTCGGAAAA e inferior TCTGATTGGTGACCTTTTGAAATTGTGTAGGCTGTCGGAAAA e a identificação de apenas uma base diferente em uma das sequências As bases iguais são mostradas por meio de asteriscos localizados em uma linha acima dos nucleotídeos da sequência superior de modo que no centro da figura um asterisco está faltando destacando o nucleotídeo diferente e consequentemente o sítio polimórfico Abaixo das sequências alinhadas estão dois retângulos que demonstram em forma de picos cada nucleotídeo representados pelas mesmas cores citadas cada um representa uma sequência Por comparação é possível ver o local em que o nucleotídeo foi modificado confirmando a leitura do SNP SNP Sequenciamento A G G A T A C C T G Alinhamento de sequências 143 UNIDADE 6 A maioria dos SNPs ocorre em regiões não codificadoras do genoma No entanto existe um impor tante subconjunto de sequências codificadoras detectadas de SNPs que corresponde às mutações em genes que estão associados a doenças ou outros fenótipos A principal vantagem dos SNPs é o elevado potencial para uma análise automatizada de alto rendimento a custo moderado O avanço nas plataformas de sequenciamento de alto rendimento tem contribuído para a descoberta de grande número de SNPs revolucionando projetos de avaliação da diversidade genética e estudos de associação genômica Independentemente do método de identificação de SNPs é fundamental o uso de ferramentas de bioinformática para auxiliar nesse processo Além disso é preciso realizar a validação experimental desses polimorfismos o que pode ser feito por microarranjos DHPLC cromatografia líquida de alta pressão desnaturante espectroscopia de massa PCR em tempo real e sequenciamento de única base por exemplo TURCHETTOZOLET et al 2017 Em relação aos benefícios o método SNP permite identificar milhares de loci simultaneamen te de forma a revelar a codominância de cada alelo Já no que diz respeito às desvantagens os SNPs não são multialélicos Portanto são limitados para os estudos direcionados à diversidade genética a nível de população e têm alto custo de desenvolvimento Contudo a aplicabilidade é constante em estudos de análise de genes e nas descobertas de base genética moleculares seleção assistida por marcadores mapeamento genético e de QTLs detecção de locos de características quantitativas CAETANO 2009 Certamente você percebeu ao longo da descrição de todas as técnicas que existe uma diversi dade de formas de identificação dos marcadores moleculares Esse fato é atribuído principalmente às descobertas da biologia molecular levando em consideração as expansões dos estudos nessa área É conclusivo perceber que essas técnicas representam o aumento das possibilidades de acessar a variação genética nos organismos e por consequência a detecção de fatores positivos ou negativos da expressão das características De acordo com Borém e Caixeta 2009 nem sempre o último marcador desenvolvido é o ideal para o trabalho A escolha depende de uma série de fatores como conhecer bem na teoria e na prática os tipos de marcadores moleculares as vantagens e as desvantagens inclusive adaptações e modificações verificar os marcadores que estão disponíveis para estudo de interesse averiguar a quantidade de DNA disponível para o experimento avaliar a disponibilidade de estrutura física recurso financeiro recursos humanos e equipamentos e analisar o objetivo do trabalho que será realizado pois as características dos marcadores podem ser vantajosas ou desvantajosas em função da finalidade do trabalho Dentre as diferentes técnicas para investigar um determinado marcador que tenha relação com a ex pressão de uma determinada doença surgem formas práticas de identificar os biomarcadores frequentes e que caracterizam patologias ou permitem analisar uma resposta terapêutica Esses biomarcadores quando acoplados à história clínica e ao exame físico do paciente são de grande valor para a determinação do prognóstico e da gravidade da enfermidade e podem auxiliar na escolha terapêutica Reflita sobre essas informações na prática Você se lembra do caso do Antonio O acompanhamento do histórico clínico de Antônio ajudou a determinar as escolhas das próximas ações como a procura pelo surgimento de câncer em outros órgãos do corpo indicada pelo exame laboratorial com o uso de marcador específico 144 UNICESUMAR Schriefer e Carvalho 2008 afirmam que os biomarcadores não devem ser utilizados isolada mente no diagnóstico de enfermidades e sim na monitorização clínica e terapêutica de pacientes e no acompanhamento clínico de indivíduos sadios que têm grande risco de desenvolvimento de uma determinada patologia O quadro a seguir expõe alguns biomarcadores existentes os quais confirmam o aparecimento de alterações que estejam vinculadas a certos órgãos e a significação deles Biomarcadores Doenças Anticorpo anti DNA Diagnóstico e atividade do Lúpus eritematoso sistêmico LES Anticorpo anti SSA e anti SSB Síndrome de Sjögren Anticorpo de anti citrulina Pior prognóstico de artrite reumatoide Antígeno prostático solúvel Câncer de próstata α feto proteína Câncer de fígado Antígeno cacino embrionário CEA Câncer de cólon CA 153 Câncer de mama CA 125 Câncer de ovário Quadro 1 Biomarcadores associados às doenças e as significações Fonte Schriefer e Carvalho 2008 p 48 São muitas as utilidades dos marcadores celulares Em casos de en fermidades humanas os marcadores proporcionaram a esperança de dias melhores principalmente para aqueles que apresentam respostas positivas no monitoramento da doença Isso promoveu perspectivas de soluções e chances de sucesso no tratamento de diferentes tipos de patologias Neste podcast conheceremos casos de êxito em que a tecnologia com o uso de marcadores contribuiu no prolongamento vidas Aperte o play As células armazenam no interior o material genético que é constituído por milhões de pares de bases Sabemos que uma alteração nessas bases sobretudo em regiões gênicas destacase por estar vinculada a diversas doenças como o câncer desenvolvido em Antônio Haja vista a relevância da atuação dos profis sionais de saúde nas análises laboratorial e clínica para a detecção de diferentes doenças você aprendeu que entender os marcadores moleculares é de grande valia para a interpretação de diferentes enfermidades Os diferentes tipos de marcadores têm sido uma das técnicas eficazes e especializadas em detectar as variações genéticas de diversos organismos Os profissionais preparados para o uso e interpretação das técnicas apresentam grandes vantagens visto que disponibilizam resultados mais confiáveis contribuindo para a rápida intervenção além de auxiliarem na melhoria do estilo de vida de indivíduos portadores de doenças 145 Entre em ação Faça um checklist dos conhecimentos adquiridos nesta unidade A seguir é dispo nibilizado um mapa mental das principais informações relacionadas aos marcadores moleculares Com atenção observe os quadros que não foram preenchidos e aqueles que estão com as letras na cor vermelha Descreva as características relacionadas com cada informação apresentada Marcadores Moleculares de DNA SSSMICROSSATÉLITES Regiões nãocodifcantes formadas por sequencias repetitivas Marcador baseado no sequenciamento Vantagens ampla distribuição genômica marcador codominante sequências específcas reproduzível MARCADORES MORFOLÓGICOS Relacionados a características fenotípicas Ex cor da pele altura enrolar a língua São caracterizados pela variação nos nucleotídeos da sequencia de DNA São herdados geneticamente e não são infuenciados pelo ambiente Características dos marcadores moleculares baseados no método de detecção Marcadores Moleculares baseados no modo de ação gênica Dominante só identifca homozigotos RAPD AFLP Serve para identifcar parentesco identifcação criminal estudos de flogenética e diversidade Vantagens codominância sequencias especifcas reproduzível Desvantagens Utilizase um único primer curto 10 e aleatório Etapas amplifcação de fragmentos aleatórios no genoma PCR eletroforese em gel agarose com brometo de etídio polimorfsmo presente nos locais de ligação ao primer são confrmados pela presença ou ausência de bandas especifcas Vantagens simplicidade técnica não requer conhecimento da sequência pouca quantidade de DNA analisado Desvantagens padrão de dominância baixa reprodutibilidade alta qualidade do DNA analisado AFLP Polimorfsmo de Comprimento de Fragmentos Amplifcados ALFP RAPD RFLP Vantagens alta reprodutibilidade grande quantidade de informações por reação não requer conhecimento de sequencia ou geração de sondas DESVANTAGENS Etapas extração do DNA digestão do DNA enzimas de restrição eletroforese Southern blot 146 1 O material genético de todos os organismos vivos contém sequências de nucleotídeos que correspondem a uma característica a ser expressa e que vincula uma determinada função ao organismo Cada indivíduo pode apresentar alterações nessas sequências e essas variações são chamadas de polimorfismo Em relação ao estudo das sequências assinale a alternativa correta a Os marcadores moleculares são metodologias de estudo para a identificação das varia ções genéticas entre indivíduos Baseiamse na observação morfológica dos indivíduos e detectam as variações b Os marcadores morfológicos são metodologias de estudo para a identificação das variações genéticas entre indivíduos c Os marcadores bioquímicos correspondem à metodologia de estudo para identifica ção das variações genéticas entre indivíduos uma vez que se baseiam na observação morfológica dos indivíduos e detectam as variações d Os marcadores digitais são a metodologia mais utilizada para esse estudo pois fazem a identificação das variações genéticas a partir da captura de imagens digitais e Os marcadores moleculares são metodologias de estudo para a identificação das variações genéticas entre indivíduos e se baseiam na identificação da sequência de nucleotídeos de DNA após a extração e análise das variações de diferentes modos 2 Nem sempre o último marcador desenvolvido corresponde ao ideal para o trabalho e a escolha depende de uma série de fatores BORÉM A CAIXETA E ed Marcadores moleculares Viçosa UFV 2009 Em relação à triagem necessária para a escolha do marcador ideal analise as assertivas a seguir I É importante que conhecer na teoria e na prática os tipos de marcadores molecu lares e as vantagens e desvantagens deles II É preciso estudar os marcadores que estão disponíveis para o estudo de interesse III De acordo com a sensibilidade de cada marcador não é preciso se preocupar com a quantidade de DNA disponível para o experimento IV É necessário avaliar a disponibilidade da estrutura física recurso financeiro recursos humanos e equipamentos para uso do marcador escolhido É correto o que se afirma em a II e III b IV 147 c I II III e IV d I II e IV e II e IV 3 O desenvolvimento das ferramentas da biologia molecular permitiu o aparecimento de diferentes metodologias de investigação do material genético Uma delas são os mar cadores moleculares que identificam sequências de interesse do DNA Os marcadores moleculares podem utilizar de metodologias diferenciadas para análise das sequências polimórficas em relação ao modo de detecção feita pelos diferentes marcadores Considerando o conteúdo apresentado no enunciado assinale a alternativa correta a O marcador denominado RAPD se baseia método de detecção de espectrofotometria b O RFLP é um marcador que se baseia no método de detecção das sequências polimór ficas da técnica de hibridização também chamada de Southern blot c O AFLP é uma técnica de identificação de regiões polimórficas que utiliza como método de identificação a hibridização d O ISSR é uma técnica de identificação de sequências altamente repetitivas do DNA que utiliza a detecção por hibridização e O SSR é uma técnica de identificação de alterações de sequências únicas no DNA que utiliza a detecção por hibridização e PCR ao mesmo tempo 4 As variantes dos marcadores moleculares apresentam três características principais modo de detecção ação gênica e rendimento de genes analisados Em relação ao modo de ação gênica assinale a alternativa correta a Marcadores moleculares dominantes possibilitam a identificação da presença ou da ausência de um determinado alelo b Marcadores moleculares codominantes não possibilitam diferenciar indivíduos ho mozigotos e heterozigotos c Marcadores moleculares codominantes possibilitam a identificação da presença ou da ausência de um determinado alelo Por isso identificam os indivíduos apenas ho mozigotos d Marcadores moleculares dominantes possibilitam diferenciar indivíduos homozigotos e heterozigotos diferentemente dos marcadores codominantes e Marcadores moleculares dominantes e codominantes possibilitam a identificação da presença ou da ausência de um determinado alelo e os diferenciam em homozigotos e heterozigotos 148 5 O SNP é um tipo de marcador que detecta os polimorfismos específicos e as diferen ças em uma única posição no genoma um único nucleotídeo gerado por substituição deleção ou inserção de bases A maioria dos SNPs ocorre em regiões não codificadoras do genoma mas também pode ser encontrado em regiões codificantes Em relação aos SNP analise as asserções a seguir e a relação entre elas I A principal vantagem dos SNPs é o elevado potencial para uma análise automatizada PORTANTO II Os SNPs permitem identificar milhares de loci simultaneamente de forma a revelar a codominância de cada alelo Assinale a alternativa correta a As duas asserções são proposições verdadeiras e a segunda é uma justificativa correta da primeira b As duas asserções são proposições verdadeiras mas a segunda não é uma justificativa correta da primeira c A primeira asserção é uma proposição verdadeira e a segunda é uma proposição falsa d A primeira asserção é uma proposição falsa e a segunda é uma proposição verdadeira e Tanto a primeira quanto a segunda asserção são proposições falsas 7 Nesta unidade você entenderá como as biotecnologias podem ser aplicadas na área da saúde a fim de produzir produtos ou serviços que promovam a saúde pública Além disso compreenderá a im portância das biotecnologias para o desenvolvimento de vacinas fármacos testes genéticos e terapia gênica Biotecnologias para a produção de vacinas fármacos testes genéticos e terapia gênica Dra Ana Luisa Monezi Lucena 150 UNICESUMAR Em 17 de janeiro de 2021 a enfermeira Mônica Calazans que atuava na linha de frente contra a Co vid19 foi a primeira pessoa a receber a vacina contra o vírus SarsCoV2 no Brasil Enquanto o país batia a marca de mais de 200 mil mortes por Covid19 um pouco de esperança despertava em muitos brasileiros pois o uso emergencial da Coronavac imunizante desenvolvido pela farmacêutica chinesa Sinovac e fabricado no Brasil pelo Instituto Butantan foi aprovado Você já pensou na forma como uma vacina é desenvolvida Como o uso de vacinas e medicamentos podem ajudar no tratamento de determinadas doenças Nesta unidade você compreenderá como a biotecnologia atua no desenvolvimento de vacinas e fármacos Além disso saberá como é e qual é a importância dos testes genéticos e da terapia gênica para a saúde Em 11 de março de 2020 a Organização Mundial da Saúde OMS declarou a pandemia defla grada pela Covid19 e pressionou que os governantes tomassem medidas de contenção ORGA NIZAÇÃO 2020 Essa declaração ocorreu em detrimento da alta capacidade de propagação do vírus e fez uma corrida contra o tempo começar tendo em vista que era preciso identificar o vírus e buscar uma forma de controle da doença Segundo Lima Almeida e Kfouri 2021 os impactos socioeconômicos e humanitários foram cruciais para impulsionar o desenvolvimento das pesquisas Além disso os avanços tecnológicos permitiram que os cientistas iniciassem rapidamente os primeiros testes clínicos e começassem a propor o uso emergencial das vacinas Dessa forma o mundo todo tentava de alguma maneira controlar a pandemia As informações citadas estão vinculadas ao nosso cotidiano e diretamente relacionadas ao campo da biomedicina Dessa forma é de extrema importância que você futuroa profissional compreenda como as biotecnologias são aplicadas à saúde pois os produtos e os serviços biotecnológicos são dia riamente usados na rotina do biomédico Em outras palavras em um futuro próximo as biotecnologias farão parte do seu ambiente de trabalho Segundo Schatzmayr et al 2002 o Brasil recebeu a certificação da interrupção da transmissão do vírus da poliomielite em 1994 Isso foi resultado das grandes campanhas de vacinação que ocorreram ao longo dos anos e mobilizou os profissionais da saúde e a população brasileira durante décadas Entretanto a Sociedade Brasileira de Medicina Tropical publicou uma nota em 2019 que tratava do alerta epidemiológico da OMS a respeito da reintrodução do vírus da poliomielite e outras doenças nas Américas o que ameaçaria o Brasil 151 UNIDADE 7 Dessa forma o controle da imunização das doenças deveria ser mais rigoroso com forte campa nha de vacinação para que a cobertura vacinal se mantenha adequada Partindo desse princípio faça uma breve pesquisa sobre as principais doenças erradicadas pela vacina no mundo Depois relacione a disseminação dessas doenças com a pandemia deflagrada pela Covid19 e busque compreender o risco de uma nova propagação Tendo em vista a importância da biotecnologia na prevenção de doenças podemos considerar que os avanços tecnológicos são fundamentais para o desenvolvimento da ciência visto que atualmente a agilidade das informações e as metodologias biomoleculares aceleram a criação de produtos ou serviços biotecnológicos que solucionam problemas como as doenças Além disso a biotecnologia contribui para a saúde pública e visa a uma maior qualidade de vida pois esse ramo atua não só no desenvolvimento de vacinas ou fármacos mas também ajuda no conhecimento e no mapeamento de genes com a aplicação de testes genéticos para a identificação de informações que podem ser úteis para a prevenção de doenças ou escolhas de tratamentos mais assertivos Os aspectos fundamentais que você deve refletir sobre a temática são os seguintes a importância da biotecnologia para a saúde e a aplicabilidade dos diferentes produtos e serviços biotecnológicos para a identificação e o tratamento de doenças DIÁRIO DE BORDO 152 UNICESUMAR A biotecnologia é a área de conhecimento que utiliza a tecnologia para explorar processos celulares e biomoleculares com o intuito de desenvolver produtos e serviços biotecnológicos que possam melhorar a qualidade de vida da população RESENDE 2015 Desde uma simples fermentação na indústria alimentícia até a seleção de enzimas de interesse esses processos utilizam ferramentas biotecnológicas para serem concluídos Assim como qualquer outra área da ciência a biotecnologia é uma área multidisciplinar com diversas aplicações Alguns exemplos são a indústria alimentícia produção de fermentados a agropecuária melhoramento genético de vegetais e produção de agrotóxicos e em especial a saúde humana Ao longo deste capítulo conheceremos mais aplicações da biotecnologia na saúde humana ÁREAS DA BIOTECNOLOGIA PRODUTOS DE INTERESSE Hormônios interferon fatores de crescimento antibióticos antifúngicos antitumorais e outros insumos hemoderivados biomateriais kits diagnósticos anticorpos monoclonais anticoagulantes como heparina medicamentos SAÚDE HUMANA AGROPECUÁRIA Plantas resistentes a fatores bióticos e abióticos biomoléculas a partir de animais e vegetais vacinas substancias bioativas da biodiversidade brasileira e bioindústria de transformação de produtos animais e vegetais INDUSTRIAL Etanol e biodiesel biopolímeros plásticos biodegradáveis inoculantes para fxação de N2 em gramíneas metano destinado à geração de energia elétrica combustão veicular e para síntese de outros produtos e produção de biohidrogênio AMBIENTAL Processos biológicos aplicáveis ao tratamento de efuentes industriais agropecuários e domésticos bioativos da biodiversidade brasileira e degradação de CO2 e metano residuais Fonte Brasil 2007 Descrição da Imagem a figura apresenta quatro quadros na vertical Em cada um deles estão descritos os componentes de interesse produzidos pelos processos da biotecnologia No primeiro estão aqueles relacionados à saúde humana Portanto há uma imagem de cápsulas de medicamen tos do lado esquerdo na parte superior Por outro lado do lado direito encontra uma imagem com ampolas de medicamentos No segundo quadro são expostos exem plos de elementos produzidos pela biotec nologia mas voltada à agroindústria Como imagem representativa na parte superior esquerda está um pesquisador segurando um tubo de ensaio com um líquido verde no interior Já do lado direito é mostrado um grupo de pesquisadores no interior de uma sala de vegetação Eles estão seguran do frascos de vidro em que contém plantas No terceiro quadro estão descritos os pro dutos provindos da biotecnologia e consi derados da área industrial Como imagem é inserida uma flor de girassol na parte su perior esquerda e abaixo dela uma bomba de combustível com uma mão abastecendo um carro Do lado direito é exposta uma sacola plástica biodegradável Já no quarto quadro são descritos os produtos advindos da biotecnologia na área ambiental Além das descrições temos as imagens repre sentativas do lado esquerdo superior há a mão de uma pessoa com uma luva verde Ela apanha produtos de poluição no meio ambiente Do lado direito também na par te superior temos uma folha de planta na cor verde Ao redor dela estão duas flechas em sentido circular com as setas em direção horária Abaixo do infográfico após o quar to quadro encontramse duas imagens a primeira é a de uma seringa Ao redor dela são expostas três imagens de vírus na cor azul e do lado direito como segunda ima gem há uma caixa amarela com um frasco de medicamentos Figura 1 Apresentação dos setores de in teresse que utilizam as técnicas da biotec nologia Fonte o autor 153 UNIDADE 7 Já sabemos que é possível fazer uma cópia do material genético pela clonagem resultando em inúmeras criações de fragmentos de um mesmo gene A clonagem está relacionada ao avanço da tecnologia pois atualmente contamos com ótimas metodologias biomoleculares como o uso de enzimas de restrição e ligação vetores marcadores genéticos e sequenciamento do ácido desoxirribonucleico DNA Esse processo usa a tecnologia do DNA recombinante e tem muito interesse científico e econômico pois é possível combinar esse processo com outras técnicas para solucionar problemas Nesta unidade expli caremos como são produzidas as vacinas os fármacos os testes genéticos e a terapia gênica utilizando as ferramentas biotecnológicas Você já pensou no modo como as vacinas são desenvolvidas As primeiras vacinas utilizavam os métodos de atenuação inativação ou purificação do patógeno Contudo ao longo dos anos sofreram aprimoramentos para aumentar a eficácia do imunizante Antes da biotecnologia os principais tipos de vacinas eram chamados de vacinas de primeira geração e de vacinas de segunda geração DINIZ FERREIRA 2010 RESENDE 2015 Ambas foram impactadas pela utilização dos recursos biotecno lógicos e serviram como suporte para o desenvolvimento das vacinas de terceira geração Figura 2 BRAZ et al 2014 VACINA 2021 Vacina de primeira geração vírus atenuado Vacina de segunda geração vacina de subunidades compostos de uma proteína ou fragmentos de um antígeno Vacina de terceira geração vírus atenuado recombinante vetor viral Reposicionamento de vacinas vacinas usadas para outras doenças Vacina genética DNA e RNA I II III Figura 2 Tipos de vacinas de acordo com o modo de produção Fonte Oliveira et al 2021 online Descrição da Imagem a figura apresenta cinco quadros ligados a figuras ilustrativas Na parte superior são representados três quadros Cada um contém na lateral uma seringa de cores diferentes Da esquerda para a direita a primeira seringa é azul e no quadro está escrito Vacina de primeira geração vírus atenuado ou inativo No segundo quadro há seringa laranja Também há um quadro em que está escrito Vacina de segunda geração vacina de subunidade compostos de uma proteína ou fragmentos de um antígeno Por sua vez no terceiro quadro há uma seringa verde Além disso há um quadro com a seguinte descrição Vacina de terceira geração vírus atenuado recombinante vetor viral Também há dois quadros da parte inferior da figura Da esquerda para direita temos o desenho de um vírus posicionado ao lado do quadro com o seguinte texto Reposicionamento de vacinas vacinas usadas para outras doenças Por fim o último quadro tem o desenho da estrutura do DNA posicionado ao lado do quadro com o seguinte texto Vacina genética DNA e RNA 154 UNICESUMAR As vacinas de primeira geração utilizam os agentes patogênicos atenuado ou inativado O último é incapaz de induzir o processo infeccioso mas mantém na estrutura a capacidade de induzir a produção de anticorpos Essas vacinas são as mais comuns e muito eficazes Como exemplos temos as vacinas da febre amarela poliomielite e sarampo Já as vacinas de segunda geração têm como alvo uma única substância que causa algum tipo de sintoma da doença ou permite uma melhor resposta imunológica com a neutralização e a eliminação do patógeno São exemplos uma toxina ou uma proteína DINIZ FERREIRA 2010 BRAZ et al 2014 Nesse grupo temos as vacinas da hepatite B meningite meningocócica e pneumonia Nelas a ate nuação ou a inativação do patógeno é feita com a inoculação em um hospedeiro não natural ou em outro que seja conveniente A biotecnologia e os novos recursos tecnológicos permitiram um apri moramento dessas vacinas tornandoas mais eficientes e seguras Isso foi possível pela manipulação genética que permitiu a obtenção de diversos mutantes atenuados por meio da clonagem gênica e da mutagênese DINIZ FERREIRA 2010 BRAZ et al 2014 Com a tecnologia do DNA recombinante uma terceira geração de vacina surgiu O imunizante contém fragmentos de DNA que codificam antígenos potencialmente imunogênicos em vetores virais ou em DNA plasmidial para assim induzir o organismo a expressar permanentemente a proteína exógena BRAZ et al 2014 Esse conceito de vacina surgiu em 1990 mas foi apenas em 1993 que foi comprovada a ação do método com uma vacina de DNA contra a Influenza A em ratos Você já ouviu alguém falar que quem tem alergia a ovo não pode tomar certas vacinas Isso acontece porque para prover o processo de produção da vacina utilizase o ovo embrionado para desencadear a atenuação do vírus A atenuação é um processo em que é diminuída a virulência do causador da doença e dessa forma posteriormente a vacinação pode ser con siderada segura para a aplicação clínica Para a obtenção de vírus atenuados é preciso promover infecções sequenciais de vírus pato gênicos em culturas celulares in vitro ou em ovos embrionados Depois da introdução reinci dente do vírus no ovo por exemplo são obtidas cepas virais menos virulentas chamadas de atenuadas mas que podem conter uma pequena quantidade da proteína do ovo Quando aplicado no corpo de um indivíduo o vírus atenuado é capaz de se replicar porém de maneira lenta sem causar maiores danos ao organismo No entanto para aqueles com alergias graves ao ovo pode haver coceira vermelhidão e até reações anafiláticas graves A imunização do indivíduo é desencadeada com a exposição prolongada do vírus em que a replicação viral lenta induz uma resposta imune Fonte adaptado de Vacinas 2019 155 UNIDADE 7 Os ratos receberam um inserto provindo de uma construção plasmidial que codificava uma nu cleoproteína de H1N1 via intramuscular Nesse trabalho os animais imunizados foram expostos a doses letais do vírus e 90 deles sobreviveram Essas vacinas ainda estavam em fase de testes porém a pandemia deflagrada pela Covid19 necessitou que a eficácia fosse comprovada com certa agilidade Talvez a falta de divulgação científica e a velocidade de compartilha mento de informações atualmente sejam os principais problemas que a ciência enfrenta em relação às vacinas Isso porque o movimento antivacina ou seja aqueles que são contrários à vacinação vêm ga nhando muita popularidade Com isso toda a população é afetada já que sem a vacinação al gumas doenças erradicadas podem voltar a acometer as pessoas BELTRÃO et al 2020 A seguir confira uma entrevista com o Dr Drauzio Varella e entenda como as falsas informa ções divulgadas pelo o movimento antivacina prejudicam toda a população Compreenda como os avanços tecnológicos permitiram a revolução da medicina com a chegada da vacina Outro exemplo é a vacina de RNAm da Pfizer que também é proveniente da expansão dos métodos vinculados à tecnologia utilizada para a manipulação do DNA e incluída entre as vacinas de terceira geração Nas vacinas de RNAm há a presença de fragmentos de RNAm sintetizados no laboratório que quando em contato com o sistema imunológico induzem o organismo a produzir antígenos antecipadamente caso venham a ter contato com o vírus Essa vacina teve a eficácia comprovada tornandose um marco histórico para a ciência BRAZ et al 2014 Figura 3 156 UNICESUMAR RNAm codifca proteína spike do vírus Nanopartícula lipídica CÉLULA HUMANA Tradução de proteínas Proteína spike Anticorpo Linfócito Resposta imune Tradução viral proteína spike Figura 3 Representação do modo de ação da vacina de RNAm Descrição da Imagem na figura é mostrado o vírus causador da SARS CoV2 Ele está na cor rosa tem forma circular e contém na superfície proteínas spike na forma de letra T de cor roxa Uma seta parte do vírus e indica uma proteína spike isolada do vírus Dessa proteína isolada parte outra seta indicando uma molécula de RNAm que codifica essa proteína envolta por uma capa de nanopartículas lipídicas círculo constituído por pequenas bolas de cor laranja Essas partículas capa contendo o RNAm no interior são sintetizadas em um laboratório a partir da manipulação do RNAm mensageiro do vírus e são elas que são inoculadas no corpo como vacina Ao centro da imagem uma célula humana é mostrada em contato com a partícula Esse contato permite a entrada do RNAm na célula Um quadro no interior da célula representa o processo de tradução de proteínas e à direita são evidenciadas as proteínas spike já produzidas pela célula Ainda à direita da célula são expostas as proteínas spike ligadas à membrana da célula de modo que são identificadas como an tígenos pelos anticorpos na figura representados em forma de Y e de coloração vermelha Ao lado dessas moléculas anticorpos está uma célula produtora de anticorpos o linfócito simbolizado por uma célula em forma de círculo em vermelho preenchido pela cor rosa com outro círculo mais escuro no interior Neste artigo você entenderá como as novas vacinas agem enquan to imunizantes para determinadas doenças e aprimoram vacinas já existentes para evitar a reintrodução de algumas doenças Além disso visualizará um panorama dos desafios atuais para lidar com o questionamento relacionado à eficiência da vacina e a aceitação dela Acesse o QR Code e descubra essas curiosidades 157 UNIDADE 7 De maneira semelhante às vacinas a biotecnologia revolucionou a descoberta dos fármacos Es ses medicamentos podem conter como princípio ativo um agente biológico obtido de qualquer ser vivo para ser sintetizado in vivo Dessa forma recebem o nome de biofármacos OLIVEIRA SILVA 2018 Os biofármacos quando comparados aos medicamentos convencionais têm alta complexidade especificidade e eficácia Quadro 1 SALERNO MATSUMOTO FERRAZ 2018 Principais diferenças entre medicamentos sintéticos e biológicos Fármacos sintéticos Biológicos Moléculas Pequenas Grandes Estrutura Simples Complexas Estabilidade Estáveis Instáveis Caracterização Simples e completa Difícil e incompleta Manufatura Previsível pelo processo químico Cópias idênticas podem ser feitas Variável produzido por sistemas vivos Impossível de realizar cópias idênticas Patentes Geralmente única Múltiplas Imunogenicidade Ocasional Frequente Quadro 1 Diferença entre os biofármacos e os medicamentos sintéticos Fonte adaptado de Entendendo 2012 Basicamente o desenvolvimento de um fármaco envolve pesquisas iniciais para identificar e otimizar as moléculas capazes de representar novas entidades químicas com potencial de desenvolvimento clínico Depois uma fase clínica é elaborada a fim de avaliar a eficácia e a toxicidade do fármaco GUIDO et al 2010 No caso dos biofármacos a revolução da biotecnologia fez com que novas áreas surgissem como as ômicas genômica proteômica metabolômica transcriptômica e citômica permitindo usar uma variedade de aplicações por meio do monitoramento de indicadores celulares ou bioquímicos Assim geram um grande impacto na saúde pois possibilitam novas opções de tratamentos para doenças complexas GUIDO ANDRICOPULO OLIVA 2010 OLIVEIRA SILVA 2018 Desse modo a escolha das moléculas de interesse é mais assertiva melhorando o potencial co mercial de determinado medicamento Após as pesquisas avaliativas é necessário registrar o fármaco como patente pois somente assim a indústria poderá produzilo em grande escala e comercializar Já a produção dos biofármacos é um pouco mais complexa afinal envolve organismos vivos por isso requer regras de produção mais rígidas tais como a bioética e a aplicação de mais testes SALERNO MATSUMOTO FERRAZ 2018 158 UNICESUMAR Você consegue imaginar como os biofármacos são produzidos A elaboração de um biofármaco envolve algumas etapas importantes a saber expansão celular upstream purificação downstream recuperação purificação e formulação final SÁNCHEZ 2020 Na Figura 4 a seguir você pode acompanhar os procedimentos que ocorrem para a produção de um biofármaco DNA fonte DNA alvo Sequência genética da proteína desejada identifcada Sequência de DNA funcional criada Sequência de DNA inserida em uma célula hospedeira p ex bactéria Fármaco purifcado a granel Proteína purifcada estabilizada e processada em um medicamento Proteína separada das células via fltraçãocentrifugação A linhagem de células que produz a proteína com mais efcácia é escolhida e cultivada em um biorreator Figura 4 Processo de produção dos medicamentos biológicos Fonte Medicamentos 2021 s p Segundo Sánchez 2020 primeiramente devese realizar a expansão celular upstream que consiste na aplicação de processos de fermentação bacteriana ou cultura celular para a obtenção do organismo produtor Depois dessa etapa é realizada a purificação downstream que produzirá uma molécula pura Nela apenas as atividades biológicas e terapêuticas são preservadas Na recuperação o material precisa passar por diversas técnicas como a centrifugação a precipitação a filtração e a ruptura celular Essa etapa tem como objetivo produzir uma matériaprima livre de impurezas Descrição da Imagem a figura representa as etapas da produção de medicamentos biológicos Assim há setas de cor laranja as quais representam a passagem de uma etapa para outra que se inicia à esquerda no topo da figura e termina à esquerda na base da figura Além disso é mostrada uma molécula de DNA enovelada na cor verde indicada por uma seta preta como DNA fonte Em um ponto um pouco abaixo da estrutura de DNA é indicado por meio de uma seta preta o DNA alvo pequeno retângulo verde Esse DNA alvo é descrito como uma sequência genética da proteína desejada identificada Na etapa seguinte ao centrotopo da figura encontrase uma sequência de DNA funcional criada a partir da inserção do DNA alvo Ela é representada por um círculo de cor verde e com um retângulo ligado à parte superior desse círculo Na etapa posterior um retângulo verdeclaro que representa uma bactéria tem no interior o DNA cromossômico enovelado e o DNA circular proveniente da etapa anterior Essa etapa foi identificada como uma sequência de DNA inserida em uma célula hospedeira Na próxima etapa agora mostrada da direita para a esquerda na base da figura está representado um biorreator por uma imagem que lembra uma autoclave Nela a linhagem de células que produz a proteína com mais eficácia é cultivada Na próxima etapa a proteína é separada das células via filtraçãocentrifugação representada por um aparelho quadrado com pés e tampa em forma de grade Por fim há um retângulo escrito Fármaco purificado a granel Ele representa a proteína purificada e processada em um medicamento 159 UNIDADE 7 Por outro lado na segunda purificação o processo é feito utilizando uma cromatografia líquida de imunoafinidade ou outras técnicas Por fim na última etapa o material deve ser condicionado e precisa passar por um processo a fim de obter um produto estável esterilizado e pronto para o enva se atendendo a todos os requisitos da indústria farmacêutica Veja a seguir o resumo das etapas do processo de produção de biofármacos Figura 5 Expansão celular upstream Purifcação downstream Recuperação Purifcação Formulação fnal e envase Figura 5 Resumo das etapas do processo de produção de biofármacos Fonte a autora Descrição da Imagem a figura representa um ordenamento vertical das principais etapas do processo de produção de um biofármaco Cada etapa está escrita dentro de um retângulo Também há setas abaixo de cada retângulo as quais representam a passagem de uma etapa para outra Na ordem de cima para baixo estão os seguintes retângulos expansão celular upstream purificação downstream recuperação purificação formulação final e envase Neste vídeo você compreenderá um pouco mais a história da desco berta do primeiro antibiótico a penicilina Esse medicamento salvou a vida de muitas pessoas e aumentou a expectativa de vida da época Além disso abriu caminho para as pesquisas de outros medicamentos possibilitando uma melhor qualidade de vida aos humanos 160 UNICESUMAR O que você acha de fazer um exame que permite saber se você tem os genes de determinadas doenças A genômica permitiu a realização de testes genéticos com informações genéticas detalhadas que via bilizam uma tomada de decisão em diferentes aspectos da vida Entretanto é importante lembrar que esses testes são relativamente caros e várias doenças são multifatoriais ou seja têm diferentes fatores que interferem no desenvolvimento STIVAL 2020 Já sabemos que o sequenciamento do DNA em específico os sequenciamentos mais modernos permitem conhecer o genoma de um determinado organismo Isso é possível tendo em vista que após a coleta de alguma amostra biológica ela será preparada em laboratório utilizando enzimas de restrição com o intuito de isolar apenas o DNA das células Assim o DNA estará pronto para a leitura e o reconhecimento dos nucleotídeos Neste vídeo você saberá como ocorre o processo de um teste ge nético Aproveite para revisar outros conteúdos estudados como as enzimas de restrição o processamento de DNA e as reações de cadeia polimerase Outra aplicabilidade da biotecnologia é a terapia gênica Ela ainda está em fase experimental mas é um potencial tratamento para algumas doenças como a fibrose cística a hemofilia o câncer e a AIDS A terapia gênica utiliza a tecnologia do DNA recombinante e tem capacidade de induzir a modificação genética por meio da correção de genes mutados com sítios específicos no DNA Em outras palavras um gene normal é inserido no genoma do paciente para substituir um gene causador de alguma doença Figura 6 NARDI TEIXEIRA SILVA 2002 LINDEN 2010 GONÇALVES PAIVA 2017 161 UNIDADE 7 As células são removidas do paciente Em vírus de laboratório alterado portanto não pode reproduzir Gene normal inserido no vírus O vírus alterado é misturado com a célula do paciente Entrada do novo gene no núcleo do paciente As células alteradas são injetadas no paciente A célula geneticamente alterada produz a proteína ou hormônio desejado 1 2 3 4 5 6 7 Figura 6 Representação do processo de funcionamento da terapia gênica Para Gonçalves e Paiva 2017 dentre os desafios utilizados nesse tratamento o principal seria escolher um bom vetor para fazer a liberação do gene na célulaalvo Isso porque o gene liberado não pode ser reconhecido pelo sistema imune mas deve ser produzido e disponibilizado em grande escala O uso do vetor é utilizado em outras técnicas mas o material genético viral no plasmídeo pode induzir uma resposta imune aguda Descrição da Imagem a figura apresenta em sete etapas a terapia gênica veiculada por um vírus À esquerda um perfil humano é mostrado em cinza Dele sai uma seta preta em direção ao centro da figura Essa seta mostra a primeira etapa etapa 1 em que células são retiradas do paciente Essas células são representadas por três círculos amarelos com outro círculo menor no interior de cada uma simbolizando o núcleo na cor roxa A etapa 2 no topo e à direita da figura mostra um vírion representado por um círculo rosa com estru turas na superfície em formato de haste com um círculo na ponta parecidos com alfinetes na cor azul Na parte interna do círculo está representada uma molécula de DNA em azul na qual se encontra parte uma ponta de uma seta que indica outra molécula de DNA em azul e cortada ao meio Ela após ser modificada não possui a capacidade de reproduzir Na etapa 3 o mesmo vírion é mostrado apenas com o DNA cortado ao meio no interior Ainda no centro da figura uma seta sai da etapa 1 e segue em direção a uma célula situada na base à direita da figura Essa célula está ligada à partícula viral proveniente da etapa 3 e juntas representam a etapa 4 em que o vírus alterado é misturado com a célula do paciente Na etapa 5 a célula tem agora no interior do núcleo um material genético hibridizado com o gene proveniente do vírus formando uma única fita de DNA dupla hélice helicoidal de cor azul nas pontas e vermelho no centro Outra seta indica a sexta etapa que representa o momento em que a célula alterada é injetada no paciente Na sétima e última etapa são expostas três células modificadas no interior do corpo do homem Dessas células partem setas de cor branca e em formato de hélice que indicam a produção posterior da proteína ou do hormônio desejado no processo de terapia gênica 162 UNICESUMAR Além disso as modificações genéticas que ocorrem nas células germinativas como no esperma tozóide e no óvulo são hereditárias Dessa forma os descendentes da linhagem modificada carregam os genes alterados tornando uma alternativa para minimizar as doenças genéticas e hereditárias De maneira oposta em um tratamento para determinada doença que utiliza a terapia gênica em células somáticas as modificações estariam restritas somente ao paciente submetido ao procedimento Em outras palavras não passaria aos descendentes os genes modificados GONÇALVES PAIVA 2017 Quais são os usos da terapia gênica A terapia gênica pode ser combinada com as célulastronco para gerar vetores de transferência gênica com o objetivo de criar célulastronco pluripotentes induzidas iPSCs Isso promove a diferenciação das células para proporcionar um fenótipo de interesse Quando combinada às células tronco e aos linfócitos T células de defesa a terapia gênica permite manipular e reprogramar as células imunes dos pacientes a fim de reconhecer e atacar as células tumorais NARDI TEIXEIRA SILVA 2002 LINDEN 2010 GONÇALVES PAIVA 2017 Título Seleção artificial Ano 2019 Sinopse da erradicação de doenças à escolha das características do bebê a edição genética permite alterar a biologia humana Saiba quem são os cientistas por trás de tudo isso Comentário assistir a esse documentário é uma ótima forma de com preender a tecnologia do CRISPR e a ética na manipulação genética Ao longo dos episódios os indivíduos se questionam se seria possível utilizar as biotecnologias para realizar as modificações biológicas de interesse mesmo sem compreender o impacto e a complexidade desse processo Está disponível na Netflix Uma importante ferramenta biotecnológica que pode mudar o rumo e os usos da terapia gênica e da biologia molecular é o CRISPRCaS9 CRISPR do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats significa repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas já CaS9 é a proteína capaz de cortar a fita dupla de DNA uma vez que ela consegue realizar edições genômicas pontuais e precisas Os primeiros testes com essa ferramenta com foco médico já apre sentaram otimizações nos sistemas de entrega e especificidade garantindo uma melhor segurança e efetividade GONÇALVES PAIVA 2017 163 UNIDADE 7 Entender o uso das biotecnologias aplicadas à saúde é compreender que a saúde humana é um resultado dos avanços tecnológicos que possibilitaram uma melhor qualidade de vida aos humanos Além disso compreender como alguns procedimentos e técnicas estudados são aplicados auxilia no seu preparo como profissional da saúde Afinal os conteúdos estudados nesta unidade farão parte da sua rotina de trabalho seja na área da pesquisa seja na área das análises clínicas seja na área médica Quantos avanços tecnológicos nós tivemos ao longo dos anos não é mesmo Na Biologia acompanhando a tecnologia surgiu uma nova área chamada Biotecnologia Você ouviu alguém falar sobre ela Ela está mais presente no nosso cotidiano que você imagina Aperte o play para conhecer o uso das biotecnologias aplicadas à saúde 164 Agora faremos uma revisão de tudo o que você aprendeu nesta unidade Observe o mapa mental a seguir que descreve as características das biotecnologias para a produção de vacinas fármacos testes genéticos e terapia gênica Preencha os quadros que pedem as complementações Vacinas Tipos de vacinas Terapia gênica Combinações Combina a tecnologia com os conhecimentos sobre os processos biológicos para criar produtos ou serviços para resolver problemas Fármacos Produção do biofármaco Diferenças entre biofármacos e fármacos Testes genéticos Técnicas e metodologias estudadas anteriormente que podem estar envolvidas A genômica permitiu a realização de testes genéticos detalhados que viabilizam uma tomada de decisão em diferentes aspectos da vida Biotecnologias Aplicadas 165 1 Nesta unidade você compreendeu a importância da biotecnologia para a saúde Com base nos textos e nas atividades complementares escreva um breve texto de até 10 linhas sintetizando os principais usos das biotecnologias e explique o impacto delas na sociedade Você pode focar em um tema específico ou sintetizar todo o conteúdo 2 As vacinas são imunizantes capazes de prevenir uma determinada doença pois indu zem o corpo a produzir anticorpos contra um agente patológico Ao longo dos anos algumas doenças foram erradicadas resultado de uma boa campanha de vacinação e conscientização da população Sobre as vacinas assinale a alternativa correta a As vacinas de primeira geração têm como alvo uma substância específica do patógeno seja uma toxina seja uma proteína b As vacinas de primeira e segunda geração são respectivamente aquelas que usam agente patogênico atenuado e inativado c De modo geral as vacinas de primeira geração sofreram um aprimoramento após os avanços tecnológicos mas atualmente não são mais utilizadas pois as vacinas de terceira geração são mais eficazes d As vacinas de terceira geração utilizam a tecnologia do DNA recombinante No entanto até o momento nenhuma vacina foi aprovada para usos em humanos e As vacinas de primeira e segunda geração foram aprimoradas após os avanços tecno lógicos tornandoas mais eficazes e seguras 3 Na produção de um biofármaco é preciso escolher a molécula de interesse Para isso é necessário realizar pesquisas avaliativas sobre a molécula a fim de ter conhecimento sobre os efeitos dela Depois é preciso realizar testes de toxicidade eficiência e segu rança com o intuito de garantir o sucesso do medicamento Sobre a produção de biofármacos leia as afirmativas a seguir I A produção de biofármacos é dividida em três etapas A primeira é a expansão celular em que ocorre a multiplicação do organismo produtor A segunda é a purificação que tem como objetivo deixar a matériaprima mais pura Por fim há a formulação final que finaliza o processo envasando e deixando o medicamento pronto II Existem duas etapas de purificação que são realizadas uma após a outra e tornam a matériaprima pura apenas com a proteína de interesse III A produção do biofármaco envolve o cultivo de organismos produtores Após esse cultivo eles são submetidos a outras etapas para a extração e a purificação da proteína de interesse IV A etapa de purificação é importante pois os elementos além da proteína de interesse podem interagir e comprometer a eficácia do medicamento 166 É correto o que se afirma em a I e II b I II e III c II III e IV d III e IV e IV 4 Leia o fragmento a seguir Terapia gênica é o tratamento baseado na introdução de genes sadios com uso de técnicas de DNA recombinante O primeiro teste clínico bemsucedido dessa técnica foi divulgado em 1990 Em que pese a ocorrência em certos estudos clínicos de efeitos adversos alguns dos quais graves laboratórios de pesquisa e empresas vêm continua mente desenvolvendo novos materiais e procedimentos mais seguros e eficazes Embora ainda em estágio experimental progressos recentes indicam oportunidades crescentes de investimento pela indústria bem como justificam a expectativa de que em alguns casos essa tecnologia poderá chegar à prática clínica dentro de poucos anos LINDEN R Terapia gênica o que é o que não é e o que será Estudos Avançados v 24 n 70 2010 p 69 Considerando o conteúdo exposto no enunciado leia as afirmativas a seguir I Utiliza seres multicelulares procariontes para induzir a resposta imunológica de um organismo II Um gene normal substitui um gene causador de alguma doença III É possível combinar a terapia gênica e fungos para produzir antibióticos mais eficientes IV Um grande potencial para a terapia gênica é a utilização do CRISPR uma ótima fer ramenta para a edição genômica V Os neutrófilos combinados com a terapia gênica permitem manipular e reprogramar as células imunes dos pacientes É correto o que se afirma em a I e II b I III e V c IV d II e IV e III IV e V 8 Nesta unidade você conhecerá as ferramentas que facilitaram o armazenamento de dados gerados pelo estudo da molécula de DNA do RNA e das proteínas Em uma os estudos da genômica e da proteômica se expandem com o apoio da bioinformática Você adquirirá os conhecimentos e as ferramentas utilizadas pela bioin formática na biologia molecular além de conhecer as aplicações e as perspectivas A bioinformática aplicada aos estudos da pesquisa e ao diagnóstico molecular Dra Ana Luisa Monezi Lucena 168 UNICESUMAR Mário foi detectado com uma anemia grave Após três internações e depois de muitas investigações foi concluído que ele era portador da talassemia uma doença que apresenta uma síntese ineficiente ou a ausência de uma proteína presente no sangue a hemoglobina que faz o transporte de oxigênio Hoje já habituado com os modos de tratamento da doença encontrase clinicamente estável em regime de hipertransfusão a cada duas semanas e tratamento quelante para a retirada de ferro excedente Os pais de Mário são primos de segundo grau e pretendem ter mais um filho Todavia optaram por fazer o estudo genotípico dos próprios genes e do filho Mário em relação ao tipo de anemia portada por Mário uma vez que eles apresentam um histórico familiar da anemia diagnosticada nos pais tios e primos paternos e maternos A equipe multidisciplinar que acompanha o caso decidiu analisar as amostras sanguíneas dos pais e de Mário utilizando a técnica molecular de sequenciamento que permite detectar as alterações da molécula de DNA que podem estar relacionadas com a anomalia da hemoglobina e comparar com os bancos de dados que possam ter registros desse quadro Desse modo posteriormente é possível explorar as razões da manifestação grave em Mário mas não nos outros familiares No caso de Mário por que seria interessante fazer o comparativo em bancos de dados das alterações genéticas das proteínas de hemoglobinas Qual é a importância da investigação da sequência genética dos pais já que neles a doença não foi relativamente manifestada O desenvolvimento de bancos de dados biológicos atingiu o progresso a partir da expansão das técnicas de sequenciamento Atualmente há dados armazenados das sequências de nucleotídeos de DNA e RNA além de amostras das sequências de aminoácidos e da estrutura de proteínas de diferentes organismos A princípio a criação dos bancos de dados biológicos tinha o objetivo de fazer a centra lização das sequências analisadas e facilitar o acesso das informações Atualmente em detrimento da elevada importância deles os bancos foram aprimorados e podem oferecer flexibilidade e portabilidade para outras ferramentas integrar muitos programas e ter aplicações voltadas às análises biológicas Diversas áreas da biologia utilizam a base de bancos de dados biológicos pois ela permite a verifi cação de sequências de diferentes genes incluindo de humanos microrganismos e vírus As próprias sequências detectadas no genoma humano foram armazenadas em bancos de dados e regularmente a alimentação dos bancos cresce com sequências que estão associadas às alterações vinculadas às doen ças humanas assim como é o caso da anemia detectada no Mário O comparativo de sequências pode ajudar a identificar as doenças mais graves e os métodos de tratamentos que estão sendo aplicados ou seja pode minimizar a exaustiva busca de informações Na evidência dessa revolução científica seria importante que você futuroa profissional da saúde explicasse como as inovações tecnológicas poderiam ser aproveitadas em todos os contextos No campo profissional não há dúvida de que será beneficiado com esses conhecimentos uma vez que elas são ferramentas frequentemente utilizadas na área biomédica Durante alguns anos a principal forma de detectar o caminho percorrido pelas doenças como a anemia era por meio de exames hematológicos Com o tempo o crescente número de dados de sequências moleculares de vários organismos abriu novas oportunidades para o entendimento da evolução das doenças 169 UNIDADE 8 Agora o desafio dos cientistas é entender as motivações teóricas e práticas que sustentam as novas técnicas e compreender como elas se diferem dos métodos precedentes utilizando para isso as aná lises comparativas de sequências Partindo desse princípio faça uma breve pesquisa em uma revista de circulação online e tente solucionar as seguintes questões onde podemos achar as sequências dos genes Como determinar o compartilhamento Por que comparar As grandes conquistas nos campos da biologia molecular são evidentes Diretamente ligada às eras genômica e pósgenômica a biologia molecular tem se destacado com a utilização da informática surgindo a bioinformática uma ferramenta emergente e essencial As ferramentas da bioinformática trabalham de forma online com todas as informações geradas Assim é possível obter armazenar classificar e interpretar os volumosos dados gerados por sequenciamento do DNA e proteínas ca racterizando as ômicas como a genômica e a proteômica Nesse sentido o foco principal da análise da nossa soluçãoproblema é entender os princípios da bioinformática como uma ferramenta para a detecção de problemas genéticos ou evolutivos de uma doença DIÁRIO DE BORDO 170 UNICESUMAR Os avanços da biologia molecular associados às técnicas da informática facilitaram o modo de entendi mento de como as características genéticas podem ser estudadas e possibilitaram a compreensão do motivo pelo qual por vezes elas não são manifestadas da maneira esperada Esses progressos são marcados no que tange à possibilidade de identificar e determinar as sequências de nucleotídeos de um material genético ou de aminoácidos de uma proteína proveniente de uma informação herdada Essa facilidade surgiu a partir da necessidade de armazenar essas informações para posterior análise e mediante a oportunidade de comparar e entender as variações genéticas nos organismos O apoio da informática à biologia tem sido fundamental no progresso e no desenvolvimento da área de onde surgiu a bioinformática A bioinformática surgiu na década de 80 a partir dos avanços na área de biologia molecular espe cialmente com o advento dos projetos genomas que geraram volumes intensos de informações que foram obtidas a partir do sequenciamento de fragmentos de ácido desoxirribonucleico DNA Quem diria que a bioinformática pudesse empregar ferramentas computacionais dentro da biologia para desenvolver estratégias a serem empregadas em investigações científicas Todavia nos últimos dez anos a adaptação e os avanços dos recursos tecnológicos especialmente na área das ciências da saúde têm sido uma prioridade para suprir determinadas carências como a criação de programas analíticos capazes de armazenar complexas sequências de genes De modo geral a bioinformática só teve expansão devido aos fatores decisivos incluindo a ajuda da internet e a produção de processadores mais rápidos e eficientes os quais consolidaram a possibilidade de com partilhamento de dados biológicos ARAÚJO et al 2008 Essa nova ciência tem origem nas ciências da computação na estatística e na biologia molecular Figura 1 e vem sendo desenvolvida especialmente para ordenar os resultados gerados nas iniciati vas de sequenciamento de genes as quais produzem uma quantidade cada vez maior de dados sobre as sequências de DNA e os produtos proteicos Com esses dados de sequência de proteínas e ácidos nucléicos de muitas espécies e de amostras populacionais é possível fornecer uma base para os estu dos que conduzem a novos entendimentos sobre a evolução e a história natural da vida e de doenças variadas Também é possível predizer a configuração tridimensional de proteínas identificar inibido res de enzimas organizar e relacionar informação biológica agrupar proteínas homólogas e analisar experimentos de expressão gênica por exemplo ARAÚJO et al 2008 Você sabe o que um bioinformata faz Considerada uma profissão do futuro você também pode fazer parte dessa equipe multidisciplinar Observe a dica Para acessar use seu leitor de QR Code 171 UNIDADE 8 De forma geral a bioinformática tem por função rastrear os dados extraindo informações úteis para estudos específicos Um exemplo de utilização é a identificação de possíveis diferenças nas sequências gênicas e aplicação dessas informações no desenvolvimento de ferramentas para melhor diagnosticar doenças e anomalias como as ferramentas estatísticas que ajudam na definição das possibilidades de adoecimento ou não dos indivíduos de uma população Considerase nesse âmbito que cada ser vivo se transforma em informações ou seja é dotado de instruções sobre o próprio processo de funcionamento Para tanto a bioinformática assegura a potencialidade dela por desenvolver bancos de dados pesquisa de algoritmos análises estatísticas no computador programas de previsão de genes e outras ferramentas analíticas que são usadas para dar sentido aos dados de DNA RNA e sequências de proteínas PIERCE 2013 ARAÚJO et al 2008 O reconhecimento da bioinformática como uma disciplina essencial para as áreas da biologia molecular biotecnologia e biologia de sistemas só foi consolidado após a multiplicação em tamanho e em número dos bancos de dados de sequências resultantes dos projetos genomas Atualmente há vários bancos de dados em que são adicionadas as sequências recémdescobertas e disponibiliza das pela internet aos cientistas e estudantes de todo o mundo Até o momento já estão disponíveis as sequências genômicas completas ou quase completas de mais de centenas de vírus bactérias leveduras vegetais camundongos humanos e representantes de 35 filos de metazoários Figura 2 LODISH et al 2014 ARAÚJO et al 2008 Bioinformática Ciências de dados Ciências da Computação Biologia computacional Biologia Bioestatística Estatística Descrição da Imagem na figura há três conjuntos representados por círculos coloridos interceptados por parte entre si Assim há um círculo vermelho à esquerda Nele encontrase a área da estatística Também há um círculo verde à direita que simboliza a ciência da computação Abaixo interceptando os outros dois está o círculo da biologia cor roxa As intercepções desses conjuntos mostram na parte central a bioinformática azulescuro e na região que interrelaciona com a biologia está a bioestatística cor roxoescuro junto ao campo da estatística e da biologia computacional azulclaro Por fim a ciência de dados verde musgo intercepta com a bioinformática a estatística azulescuro e a ciência da computação verdeclaro Figura 1 Representação das áreas de abrangência da bioinformática Fonte Kanbe 2020 online 172 UNICESUMAR O banco de dados é uma espécie de arquivo de armazenamento Nele é disponibilizado de maneira uniforme e eficiente várias informações que contemplam as áreas da biologia molecular Os bancos de dados objetivam organizar os dados em um conjunto de registros estruturados para permitir a recuperação de informações LORENZONI 2019 São caracterizados dois tipos de bancos de dados Ambos se diferenciam por um ter apenas a informação da sequência e outro conter análises da se quência Diante disso podem ser classificados em primário e em secundário Os bancos de dados primários contêm informações sobre a sequência em conjunto com as infor mações que descrevem a fonte da sequência e a determinação dela Já os bancos de dados secundários contêm os resultados de análises feitas nos dados primários de sequências como informações volta das aos padrões particulares de sequências variações mutações e relação evolutiva PIERCE 2013 Observe na figura 3 alguns bancos de dados mais utilizados pela bioinformática Descrição da Imagem tratase de uma ilustração de um DNA em túnel infinito na cor preta No início do túnel encontrase a repre sentação dos primeiros seres vivos Eles vão em direção à superfície Nas laterais são ilustradas as imagens de plantas e animais que foram surgindo ao longo da evolução O sequenciamento em preto apresenta os seguintes organismos bactérias protozoários insetos répteis peixes mamíferos e homem que fica na ponta superior do infinito Figura 2 Representação da diversidade de organismos que podem ser detectados pela diferença de sequência de proteínas e ácidos nucléicos 173 UNIDADE 8 Figura 3 Representação dos bancos de dados utilizados regularmente pela bioinformática Fonte adaptado de Pierce 2013 O uso dos bancos de dados para fazer as comparações e as análises se inicia após o DNA ser sequen ciado Contudo nem sempre os pesquisadores detectam todas as regiões gênicas e funcionais pois não existem características universais que marquem o início e o fim do gene É importante recordar que nem todos os nucleotídeos da estrutura da molécula de DNA codificam genes que formam proteínas Existem sequências que apresentam funções regulatórias por exemplo aquelas que são de reconhe cimento de enzimas que iniciam a transcrição Além disso temos muitas sequências repetitivas conservadas Estudos científicos demonstram que elas apresentam uma importância significativa ao funcionamento do organismo Há ainda sequências no DNA que não formam RNAs envolvidos diretamente na síntese de proteínas mas que carregam outras funções significativas como os micro RNAs por exemplo que têm um tamanho muito pequeno com 21 a 25 nucleo tídeos e podem se ligar a outros RNAs como o RNAm e modificar a continuidade de uma síntese proteica PIERCE 2013 Dessa forma é possível fazer o alinhamento de sequências tanto gênicas quanto não gênicas BANCOS DE DADOS COMUNS DE BIOINFORMÁTICA GENBANK BANCO 1 Informação primária da sequência de DNA mantida pela US National Institutes of Health EMBLBANK BANCO 2 Informação primária da sequência de DNA mantida por pesquisadores europeus DBEST BANCO 3 Banco de dados de EST de muitos organismos MMDB BANCO 4 Banco de dados de modelagem molecular estruturas macromoleculares tridimensionais de proteínas e nucleotídeos FLYBASE BANCO 5 Informação genética diversa sobre Drosophila melanogaster UNIPROT BANCO 6 Dados de sequência de proteínas e outras informações sobre proteínas de uma variedade de organismos 174 UNICESUMAR Os programas da bioinformática auxiliam no desenvolvimento de ferramentas de computação que rastreiam essa enorme quantidade de DNA em um genoma e encontram os genes dentro de uma se quência Existem duas maneiras de realizar esse processo a primeira é a chamada ab initio a qual varre as sequências na procura por características que estão geralmente dentro dos genes Por exemplo os genes codificantes de proteínas são caracterizados por matrizes de leitura aberta ORF do inglês Open Reading Frame que incluem um códon de início e um códon de fim na mesma matriz de leitura A segunda é a chamada enfoque comparativo que procura similaridades entre uma nova sequência e todos os genes conhecidos Se for encontrada uma correspondência então a nova sequência é consi derada um gene similar PIERCE 2013 A literatura relata que os programas de bioinformática que buscam identificar genes são menos precisos que quando utilizados para comparar sequências de aminoácidos de proteínas já conhecidas Devido à degeneração do código genético proteínas relacionadas exibem invariavelmente mais simi laridade de sequências que genes que as codificam Esse fato ocorre porque as sequências de DNA não contêm apenas regiões gênicas Como mencionado elas carregam a presença de vários íntrons que possibilitam após os splices a recombinação alternativa variando as sequências que determinam cada tipo de RNAm que será transcrito resultando em várias cópias de alguns genes Além disso a presença de muitos DNAs não codificante entre os genes pode dificultar a identificação precisa e a contagem dos genes por programas comparativos da bioinformática PIERCE 2013 LODISH et al 2014 Alinhar sequências pode revelar as características das formações funcional estrutural e evolutiva das sequências biológicas Por exemplo sequências muito parecidas provavelmente têm a mesma fun ção mesmo que extraídas de organismos diferentes Nesse caso elas são definidas como homólogas sequências de um mesmo ancestral Destacase também o uso dessa técnica para a análise de regiões conservadas e de regiões que sofreram mutações em sequências homólogas Tratase de uma meto dologia utilizada como ponto de partida para outras aplicações em biologia computacional como o estudo de estruturas secundárias de proteínas e a construção de árvores filogenéticas Dessa forma o alinhamento procura ao menos identificar homologias de sequências ou uma similaridade estatisti camente significante IOSTE 2016 Por certo tempo a parte do DNA não codificante foi chamada de DNA lixo Atualmente com a expansão dos estudos científicos essa região mostra a significância dela Leia uma reportagem publicada pela Revista Superinteressante sobre esse fato Para acessar use seu leitor de QR Code 175 UNIDADE 8 Os alinhamentos de sequências se dividem em três categorias alinhamentos simples versus múltiplos globais versus locais e heurísticos versus ótimos O alinhamento simples é realizado entre duas sequên cias de DNA ou proteínas Já o múltiplo é o alinhamento realizado por mais de duas sequências de DNA ou proteínas simultaneamente O alinhamento global é feito quando se compara uma sequência de aminoácidos ou nucleotídeos com outra enquanto o alinhamento local não é feito ao longo de toda extensão da sequência mas em pequenas regiões Uma das vantagens do alinhamento global é que o software utilizado consegue compreender um conjunto de algoritmos de comparação de sequências montado de forma a explorar toda a informação contida em bases de dados de DNA e proteínas com o máximo de velocidade O alinhamento ótimo produz o melhor resultado computacional e com maior precisão porém com maior gasto de tempo ideal quando se deseja comparar apenas duas sequências de DNA ou nucleotídeos Já o alinhamento heurístico produz um resultado o mais próximo possível do resultado ótimo Isso é feito de maneira muito veloz IOSTE 2016 Os programas de alinhamento assim que identificam o gene o anotam o que possibilita ligar a informa ção da sequência à outra informação voltada à função e à expressão como as proteínas são codificadas e a informação expressa em genes similares em outras espécies Para fazer isso a bioinformática utiliza diferentes softwares os quais variam de ferramentas simples a programas gráficos mais complexos e serviços da web independentes O programa mais utilizado para alinhar sequências é conhecido como BLAST do inglês Basic Local Alignment Search Tool Figura 3 Para fazer uma pesquisa com o BLAST é submetida uma sequência de indagação Depois o progra ma procura no banco de dados por outras sequências que tenham regiões de alta similaridade com a sequência de indagação Desse modo exibe todas as sequências nos bancos de dados que são similares em conjunto com as informações voltadas ao grau de similaridade e ao significado da correspondência PIERCE 2013 LODISH et al 2014 LORENZONI 2019 Quer entender como se identifica uma sequência de proteína nos bancos de dados Acesse o QR Code e aprenda a identificar uma sequência de proteína em um banco de dados da NCBI Para acessar use seu leitor de QR Code 176 UNICESUMAR Apesar de o BLAST ser a ferramenta padrão para identificar semelhanças de sequência em grandes conjuntos de dados diversos programas alternativos foram desenvolvidos para montar conjuntos de dados de sequência A preferência dependerá da disponibilidade do hardware do tamanho do conjunto de dados do formato dos dados e da estrutura genética do organismo LORENZONI 2019 Os programas computacionais da bioinformática encurtaram o caminho da pesquisa pois dispo nibilizadas as sequências genômicas elas podem ser comparadas caracterizadas e identificadas em relação às próprias características funcionais extinguindo o processo trabalhoso de isolar e caracterizar Nucleotídeo BLAST nucleotídeo nucleotídeo Proteína BLAST proteína proteína Blastx tradução de nucleotídeos proteína Tblastn proteína tradução de nucleotídeos Descrição da Imagem na figura estão representadas em quadros as funcionalidades da plataforma BLAST No primeiro quadro localizado à esquerda verdeclaro está desenhada uma molécula de DNA dupla fita na cor branca Nele também está redigido BLAST para a identificação de similaridade de sequências para nucleotídeos No centro da figura estão dois quadros menores Eles têm cor azul e forma de flecha um aponta para o lado direito e o outro para o lado esquerdo No primeiro quadro está redigida a palavra blastx que faz a tradução de nucleotídeos em proteínas Abaixo desse quadro está o segundo o tblastn que faz as proteínas serem traduzidas em nucleotídeos Por fim do lado direito está representado um quadro maior azulclaro No fundo dele encontrase a imagem de uma proteína na forma de hélice simples na cor branca com a informação BLAST proteínas para a identificação de sequências similares de proteínas Figura 4 Representação da interface do programa BLAST Fonte National Center for Biotechnology Information 2021 online¹ O programa BLAST divide a sequência de proteína em segmentos e a procura no banco de dados por correspondência com as sequências armazenadas O algoritmo gera uma pontuação a maior high core representa as sequências que apresentam maior similaridade enquanto a pontuação menor lower core acontece quando a correspondência entre os aminoácidos relacionados é pequena As características a serem analisadas incluem a presença de um aminoácido hidrofóbico po laridade e cargas positivas e negativas por exemplo Quando o programa completa a busca ele classifica os achados entre a proteína nova e as várias proteínas conhecidas de acordo com o valorp Esse parâmetro é a medida da probabilidade de se encontrar aquele grau de semelhança entre duas sequências proteicas ao acaso Quanto mais baixo for o valorp maior será a similaridade de sequência entre as suas proteínas Um valorp menor que 103 normal mente é considerado uma evidência significativa de que as duas proteínas descendem de um mesmo ancestral Fonte adaptado de Lodish et al 2014 177 UNIDADE 8 as proteínas individuais A chamada genômica funcional que inclui a identificação de todas as molé culas de RNA transcritas de um genoma transcriptoma de genoma e todas as proteínas codificadas pelo genoma de proteoma está diretamente ligada aos enfoques da bioinformática relacionados aos experimentos baseados em laboratórios PIERCE 2013 As citações da aplicabilidade da bioinformática são várias Os destaques são inseridos tanto nos avanços da pesquisa básica quanto na ciência aplicada promovendo a elucidação das bases molecu lares envolvidas em importantes eventos celulares Isso garante a aplicação direta nos mais variados setores tais como na medicina molecular na terapia de genes no desenvolvimento de drogas em es tudos evolutivos e filogenéticos na biotecnologia em estudos sobre mudanças climáticas em fontes de energia alternativa nos programas de melhoramento na análise forense na fitopatologia na melhoria da qualidade nutricional e nas ciências veterinárias LORENZONI 2019 ARAÚJO et al 2008 Dentro da área de desenvolvimento de fármacos a bioinformática tem sido utilizada para identificar sequências proteicas que em outras situações apresentaram o potencial de reagir diretamente com determinadas drogas Desse modo é testada a ação delas de minimizar os sintomas ou as causas de uma doença em pessoas com uma sequência parecida Além disso em consequência de o desenvolvimento de fármacos demorar anos o uso da bioinformática tem facilitado o reposicionamento de fármacos disponíveis ARAÚJO et al 2008 VITALINO 2020 O setor farmacêutico tem focalizado os esforços na seleção de potenciais moléculas visando à produ ção de novos medicamentos na área médica ou mesmo na agropecuária Dessa forma são identificadas moléculas que poderão atuar como princípio ativo na elaboração de produtos terapêuticos inibindo ou acelerando certas reações bioquímicas Isso promove efeitos vinculados à cura ou à atenuação de doenças ARAÚJO et al 2008 A utilização da bioinformática na área agropecuária tem proporcionado grandes feitos principal mente no campo do melhoramento A possibilidade de identificar sequências favoráveis para uma determinada espécie pode ser utilizada como objeto transformador para outras permitindo o desen volvimento de novos cultivares com melhor qualidade e custos econômicos e ambientais reduzidos Também é possível fazer transformações com o intuito de tornar os alimentos com uma melhor qualidade nutricional ou ainda tornálos resistentes a determinados patógenos Tudo isso de maneira bem mais acelerada que antes LORENZONI 2019 Na área médica os benefícios da bioinformática são evidenciados por meio dos avanços promovidos nas áreas de manipulação e terapia gênica com a identificação detalhada de novos genes e dos mecanismos regulatórios Um exemplo é o desenvolvimento de medidas terapêuticas ou preventivas contra tumores e agentes infecciosos No que se diz respeito à prevenção de doenças causadas por microrganismos as ferramentas computacionais podem permitir a detecção molecular de parasitas acarretando no emprego direto do diagnóstico e da epidemiologia de inúmeras patologias ARAÚJO et al 2008 O estudo da origem do SARSCoV2 Covid19 é um exemplo da aplicabilidade da bioinformática em estudos evolutivos Pesquisadores utilizaram do alinhamento de sequências do vírus encontradas em diferentes espécies com o objetivo de apresentar algumas evidências científicas sobre as possíveis origens do novo coronavírus e auxiliar na prevenção de futuros eventos zoonóticos Figura 4 Com 178 UNICESUMAR a bioinformática de alinhamento de sequência é possível traçar a história evolutiva de um conjunto de organismos e construir redes de interação de um determinado organismo tecido ou tipo celular Em outras palavras a sequência de DNA é dotada de marcas relacionadas ao modo como o processo evolutivo deu forma a história e ao tempo que passou durante esse processo VITALINO 2020 SARSCoV2 GD Pangolin CoV Bat CoV RaTG SARSCoV2 GD Pangolin CoV Bat CoV RaTG SARSCoV2 GD Pangolin CoV Bat CoV RaTG SARSCoV2 GD Pangolin CoV Bat CoV RaTG A A A 380 380 380 N N N I I I T T T N N N L L L C C C P P P F F F G G G E E E V V V F F F N N N A A A T T T R T T F F F A A A S S S V V V Y Y Y W W W N N N R R R K K K R R R I I I S S S N N N C C C V V V A A A D D D Y Y Y S S S V V V L L L Y Y Y N N N S S S A T T S S S F F F S S S T T T F F F X X X C C C Y Y Y G G G V V V S S S P P P T T T K K K L L L N N N D D D L L L C C C F F F T T T N N N V V V Y Y Y A A A D D D S S S F F F V V V I V I R R T G G G D D D E E E V V V R R R O O O I I I A A A P P P G G G O O O T T T G G G K K K I I I A A A D D D Y Y Y N N N Y Y Y X X X L L L P P P D D D D D D F F F T T T 430 430 430 G G G C C C V V V I I I A A A W W W N N N S S S N N K N N H L L I D D D S S A K K K V V E G G G G G G N N N F F F N N N Y Y Y L L L Y Y Y R R R L L L F F F R R R K K K S S A N N N L L L X X X P P P F F F E E E R R R D D D I I I S S S T T T E E E I I I Y Y Y Q Q Q A A A G G G S S S T T K P P P C C C 480 480 480 N N N G G G V V Q E E T G G G F F L N N N C C C Y Y Y F F Y P P P L L L Q Q Y S S R Y Y Y G G G F F F Q H Y P P P T T T N N D G G G V V V G G G Y Y Y O O O P P P Y Y Y R R R V V V V V V V V V L L L S S S F F F E E E L L L L L L H N N A A A P P P A A A T T T V V V 524 524 524 Descrição da Imagem o comparativo de sequência de aminoácidos é feito na região da proteína spike a qual tem RDB Receptor Bending D A figura representa um comparativo da sequência do domínio de ligação da proteína Spike no receptor RBD do SARSCoV2 encontrado em humanos morcegos e no pangolin mamífero asiático Os aminoácidos são mostrados nas colunas e representados por letras N I T L C P V F A R S Y W K I D G E Q H e cores As três sequências SARSCoV 2 GD Pangolin CoV e Bat CoV RaTG são apresentadas em quatro blocos Em cada bloco os três nomes das sequências se repetem De cima para baixo as três primeiras sequên cias contêm 50 aminoácidos enquanto a última carrega apenas 44 aminoácidos À direita de cada bloco de sequências são mostrados os números que representam a posição do último aminoácido sendo 380 no primeiro bloco de sequências 430 no segundo 480 no terceiro e 524 no quarto Os cinco resíduos críticos para ligação entre SARSCoV2 RBD e proteína ACE2 proteínas que fazem contato entre a proteína Spike do vírus com o receptor são indicados em caixas vermelhas encontradas nos dois últimos blocos de sequências Por outro lado os resíduos em contato com ACE2 são indicados em caixas amarelas e são vistos nos três últimos blocos de sequências Figura 5 Representação da comparação de sequências de aminoácidos do genoma do vírus SARSCoV encontrados em hu manos morcegos e no pangolin mamífero asiático Fonte Rossetti 2020 online Confira uma reportagem sobre a aplicabilidade da bioinformática para a identificação do coronavírus Ela foi feita pelo pesquisador Vasco Azevedo do Departamento de Genética Ecologia e Evolução do Instituto de Ciências Biológicas ICB da Universidade Federal de Minas Gerais UFMG Para acessar use seu leitor de QR Code 179 UNIDADE 8 Muitas são as aplicações e as expectativas da bioinformática em diferentes áreas e setores da sociedade No entanto é importante destacar que para compreender a grandeza dessa nova área do conheci mento é preciso ter habilidades relevantes e indispensáveis ao uso dela Uma profissional dessa área deve ter certo aprofundamento voltado à informática domínio da língua inglesa êxito nas pesquisas básicas na área de biologia molecular e compreensão da crescente otimização de técnicas moleculares mais sensíveis que surgem a cada dia Portanto osas profissionais que lidarão com essa tecnologia precisam ser multidisciplinares Sem dúvidas você percebeu que a bioinformática veio para facilitar e agilizar os resultados de vários trabalhos relacionados à biologia molecular Atualmente é uma ciência de intenso interesse caracte rizandose como uma das mais importantes ferramentas para os profissionais da área da saúde graças às grandes descobertas e aos avanços gerados especialmente no âmbito biomédico Em relação ao problema de Mário que é portador da talassemia anemia causada pela ineficiência da hemoglobina a bioinformática ajudaria acessar a estrutura da proteína hemoglobina nos bancos de dados secundários a fim de detectar as mutações ocorridas e comparálas com a hemoglobina extraída de Mário Talvez será encontrado um medicamento que poderá ajudar no tratamento da doença ou aparecerão informações precisas e que poderão auxiliar na produção de um fármaco específico Futuramente a identificação dessa alteração pela bioinformática poderá auxiliar na manipulação das sequências mutadas transformandoas em sequências sadias Dessa forma o valor da bioinformática se torna indispensável no que se refere à manutenção das ciências que caminham concomitantes à tecnologia principalmente à pesquisa biológica Você já ouviu alguém falar do Big Data e da Inteligência Artificial IA Essas são as tecnologias mais mencionadas na atualidade e são usadas em várias áreas do conhecimento Na área da saúde têm apresentado resultados de sucesso contribuindo para o entendimento dos dados gerados da biologia molecular No podcast desta unidade você enten derá como essas tecnologias se correlacionam com as características da bioinformática Aperte e play e mergulhe nesta temática 180 Agora é o momento de sintetizar os conceitos aprendidos nesta unidade O mapa mental ilustrado a seguir mostra os principais aspectos estudados sobre a bioinformática Observe que as caixas vazias devem ser completadas de acordo com as características que interligam cada palavra Bioinformática Atribuição dos bancos de dados Aplicabilidade Terapia Gênica Melhoramento de plantas Conceito A bioinformática é uma ciência multidisciplinar que surgiu da necessidade de se compreender as funções biológicas utilizandose de ferramentas computacionais Áreas que compreendem a bioinformática Biologia Função capazes de analisar grandes quantidades de dados biológicos e predizer funções dos genes e a demonstrar relações entre genes e proteínas Genômica funcional Transcriptoma Proteômica Ferramentas utilizadas Bancos de dados Exemplos GenBank Tipos Primário Secundário EMBLBank 181 1 A bioinformática é um campo interdisciplinar que combina a biologia molecular e a ciência da computação O termo bioinformática foi citado pela primeira vez pelos bió logos Paulien Hogeweg e Ben Hesper que o descreveram como o método de detecção de informações de sistemas biológicos Em relação à bioinformática assinale a alternativa que descreve corretamente os sistemas biológicos que são avaliados por essa técnica a Analisa os comparativos das sequências de nucleotídeos de ácido nucleicos e aminoá cidos de proteínas provindos de um sequenciamento genético b Procura a similaridade de genes com sequências incomuns c Encontra genes de RNAm com o uso de hibridização in situ d Analisa os comparativos das sequências de nucleotídeos de ácido nucleicos e aminoá cidos de proteínas de fenótipos mutantes e Seleciona as sequências de aminoácidos diferentes provindas da eletroforese 2 A bioinformática é uma ciência em expansão devido ao desenvolvimento crescente de ferramentas mais úteis e métodos de gerenciamento visualização integração análi ses e modelagem das informações biológicas Para alcançar os objetivos propostos a bioinformática conta com algumas ferramentas Assinale a alternativa que descreve corretamente as ferramentas utilizadas pela bioin formática a Para organizar os dados provindos do sequenciamento em um conjunto de registros estruturados a bioinformática utiliza diferentes softwares os quais variam de ferramen tas simples a programas gráficos mais complexos e serviços da web independentes b Os bancos de dados são as ferramentas de armazenamento da bioinformática Eles ficam em uma central de registro disponibilizada apenas para pesquisadores c A bioinformática usa uma rede de computadores específicos para armazenar e dispo nibilizar os dados biológicos para pesquisadores d Para comparar as sequências de uma molécula de DNA a bioinformática disponibiliza o armazenamento na nuvem para que todos os interessados possam acessar e A bioinformática utiliza diferentes softwares os quais variam de ferramentas simples a programas gráficos mais complexos e serviços da web independentes Os dados provindos do sequenciamento são liberados apenas com as declarações de pesquisa 182 3 O reconhecimento da bioinformática como uma disciplina essencial para a área da biologia molecular se deu após a multiplicação em tamanho e em número dos bancos de dados de sequências resultantes dos projetos genomas As sequências recémdesco bertas são disponibilizadas pela internet para cientistas e estudantes de todo o mundo Sobre os bancos de dados analise as assertivas a seguir I Os bancos de dados primários contêm informações sobre a sequência em conjunto com informações que descrevem a fonte da sequência e a determinação dela II O uso dos bancos de dados para fazer as comparações e as análises não necessita do DNA sequenciado III Os bancos de dados apresentam um enfoque comparativo Eles procuram similari dade entre uma nova sequência e todos os genes conhecidos IV O programa mais utilizado para o alinhamento de sequências é conhecido como BLAST Basic Local Alignment Search Tool É correto o que se afirma em a II e III b IV c I II III e IV d I II e IV e I III e IV 4 A literatura relata que os programas de bioinformática para identificar genes são menos precisos que quando utilizados para comparar sequências de aminoácidos de proteínas já conhecidas Assim podemos concluir que os programas que foram desenvolvidos para identificar genes na sequência de DNA não são perfeitos dando dados apenas de estimativas Diante dos conhecimentos obtidos a partir desta unidade explique de forma geral o motivo pelo qual os dados podem ser apenas estimados e não obtidos com certeza 5 As citações da aplicabilidade da bioinformática são várias Os destaques são inseri dos tanto nos avanços da pesquisa básica quanto na ciência aplicada promovendo a elucidação das bases moleculares envolvidas em importantes eventos celulares Em relação à aplicabilidade da bioinformática faça uma lista com os principais aspectos da utilização desse método na investigação do novo coronavírus Tome como ponto motivador as explicações descritas nesta unidade e o item Eu Indico sobre o assunto apresentando as suas conclusões 183 6 Considerada uma profissão do futuro vários cursos são lançados na área de bioinfor mática para que os profissionais se especializem Sobre os aspectos gerais da bioinfor mática e os profissionais que desejam trabalhar na área analise as afirmativas a seguir I Um profissional que pretende trabalhar com a bioinformática precisa apenas de um conhecimento simples de informática II A bioinformática entra na área da biologia após a finalização do sequenciamento de um genoma empregando algoritmos computacionais para a montagem e a anotação III Na biologia molecular a bioinformática é capaz de utilizar apenas os dados provindos do sequenciamento de DNA uma vez que não detecta todas as bases nitrogenadas IV O bioinformata é o profissional que conta com os conhecimentos das biociências da informática e das ciências exatas para a aquisição o gerenciamento a análise e o prognóstico de dados coletados de fontes biológicas como DNA RNA proteínas e enzimas É correto o que se afirma em a II e III b IV c I II III e IV d II e IV e I III e IV MEU ESPAÇO 9 Nesta unidade você compreenderá a importância da biologia foren se na identificação de crimes ou atos civis Assim apresentaremos as diferentes áreas de estudo que envolvem as ciências forenses nas investigações Também exporemos algumas técnicas importantes da biologia molecular que são usadas nas ciências forenses Ao final serão evidenciadas diferentes representações da ciência forense na vida real comparandoas com a ficção Por fim explicaremos alguns conceitos relacionados à ética e que os profissionais da área devem seguir Biologia Forense e as aplicabilidades na área da saúde Dra Ana Luisa Monezi Lucena 186 UNICESUMAR Você já deve ter assistido a um filme ou a uma série que utilizou técnicas muito interessantes e que confirmaram os resultados de investigações criminais Não só na ficção mas na vida real os noticiários também apresentam casos em que os acusados são presos após a confirmação de digitais na cena do crime ou de exame de DNA São muitas as técnicas da biologia forense para identificar ações criminosas Elas não se restringem apenas às práticas contra o patrimônio ou contra a vida mas também são incluídas na área ambiental Você já pensou na importância da participação de profissionais especializados em diversas áreas para realizar investigações eficazes Reflita quais profissionais poderiam contribuir em uma investigação criminal Atualmente os métodos das ciências forenses têm sido validados e testados continuamente na área científica Portanto nesta unidade você conhecerá algumas áreas de abrangência da biologia forense e a aplicabilidade delas Por exemplo a série americana Crime Scene Investigation CSI Las Vegas que apresenta episódios de casos de investigações criminais popularizou o trabalho dos cientistas forenses materializado pelos peritos que desvendam os mais variados crimes e conduzem à identificação do culpado A biologia forense conta com uma interdisciplinaridade de metodologias para a execução dos exames periciais Assim como os advogados lançam mão de vários elementos para mostrar a interpretação da lei os peritos utilizam os conhecimentos das diversas áreas da ciência para analisar os vestígios encontrados na cena de um crime Com o avanço da criminalidade e a sofisticação com que os crimes são cometidos os métodos de investigação utilizados tiveram que avançar a fim de resolver situações mais complexas Muitas técnicas desenvolvidas para detectar os vestígios deixados na cena de um crime são lançadas continuamente tais como os materiais que detectam substâncias orgânicas ou inorgânicas e os exames de DNA feitos em corpos em estado de decomposição devido à presença de insetos específicos De acordo com a lei processual penal brasileira nos crimes que deixam vestígios é indispensável a realização do exame de corpo de delito Esse exame por conseguinte envolve tanto a materialidade dos fatos que deixam vestígios da prática de um crime quanto os indícios de autoria BRASIL 1941 Os vestígios encontrados nas cenas de crimes se tornam portanto uma prova material indispensável Por meio de análises dos materiais biológicos eles podem ser de grande importância na solução de crimes Considere que você está prestes a decidir por um campo de atuação na investigação forense e para isso decide realizar uma pesquisa sobre as áreas de atuação de acordo com os principais vestígios que são analisados por esses profissionais Utilize o diário de bordo para registrar os resultados de sua busca Um crime pode envolver uma ou mais cenas ou locais específicos Durante a ação muitos são os vestígios que podem ser deixados os quais podem ser investigados e fazer parte do levantamento das evidências do crime A partir do estudo das evidências colhidas no âmbito da investigação as ciências forenses ajudam a identificar os suspeitos e a elucidar determinado crime criando hipóte ses sobre o ocorrido O foco principal do profissional forense é confirmar a autoria ou descartar o envolvimento dos suspeitos 187 UNIDADE 9 Nas ciências forenses existem muitas áreas profissionais que atuam separadamente porém conver gem a fim de fornecer resultados precisos e confirmar a autoria do crime ou descartála A credibilidade do trabalho do perito é alcançada com a experiência dele e o estudo amplo e aprofundado mostrando competência para formular o relatório final Dessa forma é extremamente importante a ação eficiente dos profissionais envolvidos Para começarmos a trabalhar a biologia forense é importante entender o significado das palavras e fazer uma associação Primeiramente você sabe de onde provém o significado da palavra forense Ela tem uma significação jurídica e se refere ao sentido de foro judicial Já biologia tem o significado voltado ao estudo da vida e aos fatores envolvidos Associar a biologia à área forense é relacionar os testes científicos incluindo o uso dos elementos biológicos para ajudar a polícia na solução de um crime Ao relacionarmos as duas palavras ou seja biologia forense incluímos o estudo de materiais biológicos para investigação Isso repercute na palavra forense que apoia a Justiça nas decisões a serem tomadas DICIO 2021 online¹ DIÁRIO DE BORDO 188 UNICESUMAR A ciência forense foco de estudo desta unidade também pode ser chamada de criminalística Para essa ciência alcançar o objetivo de trabalho conta com a junção de várias áreas do saber as quais usam conhecimento métodos e técnicas científicas para investigações criminais Por ser uma ciência de caráter judicial a função básica dela é descobrir a partir de investigações os motivos as circunstâncias e as datas em que foi efetuado determinado crime JNDS GABRIEL 2021 Em virtude das diferentes espécies de crime pessoa patrimônio família e am biente por exemplo e dos locais que eles venham a ser efetuados considerase que muitas são as provas ou os vestígios que podem ser encontrados na trajetória e no local do crime Diante dessa abrangência os profissionais envolvidos são de várias áreas contribuindo com conhecimentos específicos A especialidade dos profissionais de cada área é extremamente importante para a validação dos resultados A ciência forense é uma área interdisciplinar que envolve física biologia química matemática e outras ciências de fronteira Figura 1 O objetivo é dar suporte às investigações relativas à Justiça civil e criminal SEBASTIANY et al 2013 A biologia enquanto ciência é um campo muito amplo haja vista que o es tudo da vida não se restringe apenas à vida humana Dessa forma a ciência forense é multidisciplinar e é composta por diversas áreas da biologia com aplicações úteis para desvendar crimes como antropologia forense botânica forense entomologia forense ornitologia forense toxicologia forense pato logia forense e várias técnicas baseadas em DNA ou proteína Para obter informações importantes sobre os prazos de um crime e saber se o corpo foi movido entre duas ou mais localizações diferentes é possível analisar folhas sementes e pólen encontrados tanto em um corpo quanto na cena de um crime Isso pode produzir resultados específicos do local da morte decomposição e época do ano por exemplo Fonte adaptado de Marcel 2021 189 UNIDADE 9 Na ciência forense os conhecimentos científicos e as técnicas de diferentes áreas são utilizados para apurar crimes e assuntos legais diversos cíveis penais ou administrativos Muitos são os campos de atuação dos peritos tais como contábeis informática ambiental química forense balística medicina legal e grafotecnia O perito criminal está vinculado à materialidade das provas analisando outros vestígios Logo pode apresentar áreas distintas de formação incluindo química farmácia biomedicina engenharias contabilidade física e biologia o que facilita o entendimento da especialidade de cada vestígio a ser investigado Quadro 1 BRANT 2019 CIÊNCIAS FORENSES Criminologia Entomologia Antropologia Toxicologia Psicologia e Psiquiatria Genética Biologia Medicina Legal Odontologia Balística Descrição da Imagem a figura apresenta um esquema circular Assim há um círculo maior central de cor rosa Nele está escrito Ciências forenses Ao redor dele estão dispostos vários círculos menores de cores diferentes e em cada um está escrito as áreas que podem auxiliar a ciências forenses A partir do topo no sentido horário estão criminologia verde entomologia roxo antropologia azul toxicologia laranja psicologia psiquiatria vermelho genética biologia verde medicina legal roxo odontologia verde e balística verde Figura 1 Algumas áreas que auxiliam a ciência forense nas investigações Fonte a autora 190 UNICESUMAR Áreas de atuação forense Características Perito digital ou de informática Analisa sites mídias de armazenamento computadores celu lares ataques de hackers e localização de criminosos online Perito contábil e financeiro Elucida crimes tributários contra as finanças públicas lava gem de dinheiro e outros Perito em documentação e grafotécnica Investiga registros documentais que podem ser questionados em juízo A documentoscopia investiga fraudes nesse campo Perito em química Analisa e identifica substâncias químicas que estejam rela cionadas às práticas criminosas tais como drogas fármacos bebidas fluidos biológicos e combustíveis Perito em meio ambiente Busca elucidar crimes que envolvem a fauna a flora e os recursos naturais e arqueológicos como um todo Perito em engenharia Investiga diferentes aspectos em obras públicas ou não como superfaturamento descumprimento de contrato de constru ção e falhas em normas de segurança que causam acidentes Perito em balística Estuda as armas de fogo a munição e os efeitos dos tiros visando ao esclarecimento e à prova da ocorrência Perito em medicina legal Objetiva determinar e documentar os danos físicos em pes soas vivas ou mortas Perito em genética Faz a realização de perícias referentes aos casos de filiação criminalística biológica e identificação individual genética Quadro 1 Diferentes áreas de abrangência da investigação forense Fonte adaptado de Cirilo Leite e Vale 2019 É notável que a biologia é uma das áreas de grande abrangência das ciências forenses que dispõe de conhecimentos específicos Isso abre um leque de fatores que podem ser investigados como a anato mia forense a botânica forense a entomologia forense a ornitologia forense a toxicologia forense a patologia forense e a tão utilizada e mencionada genética forense A anatomia forense também descrita como antropologia forense é muito utilizada na inves tigação de pessoas desaparecidas por acidentes aéreos ou mortas em crimes por atentados contra a pessoa com o uso de fogo por exemplo A análise óssea de traumatismos também pode ser utilizada para identificar a quantidade e a qualidade de informações das lesões traumáticas o que tem im plicações marcantes na resolução de casos criminais e na Justiça fornecendo uma resposta rápida e eficiente CUNHA 2019 Segundo Cunha 2019 os ossos e os dentes são os tecidos corporais mais resistentes pois na maioria das vezes mesmo quando já se passou muito tempo do óbito são as únicas testemunhas daquilo que aconteceu no momento da morte Figura 2 Dessa forma a análise dos ossos e dos dentes possibilita a identificação do sexo da idade e da estatura do indivíduo Um exemplo típico é a distinção de ossos femininos em relação aos masculinos já que os ossos da pelve feminina são adaptados para o parto Assim são mais largos e baixos quanto à estrutura da bacia Além disso é possível identificar a estima tiva da idade por meio da arcada dentária a partir da observação das erupções dentárias e por meio da estatura mediante o tamanho dos ossos longos como o fêmur 191 UNIDADE 9 O estudo da cena de um crime pode ser analisa do até mesmo pela botânica forense uma vez que as folhas as sementes e o pólen encontrados em um corpo ou na cena de um crime podem oferecer informações valiosas sobre a época de um crime e esclarecer se o corpo foi movido entre duas ou mais localizações diferentes por meio de pistas vegetais deixadas no corpo BE ZERRA CAVALCANTE LIMA 2020 A entomologia forense é outra área da biologia que utiliza informações importantes e relacionadas ao comportamento à alimentação à reprodução e às características morfológicas de insetos necrófagos Essas informações possibilitam caracterizar o tempo de morte de um indivíduo a partir das análises dos insetos que são encontrados no interior e na superfície de um corpo além da causa da morte e a localidade do indivíduo Segundo Ventura et al 2016 após a morte o corpo libera gases que são atraídos por insetos e passa a ser um ambiente ideal para a proliferação dos insetos Os grupos de insetos são identificados e pode ser estimado o estágio cadavérico do corpo Por exemplo a colonização das moscas varejeiras indica o primeiro estágio da morte Já quando o corpo se encontra inchado há a produção de gases por ação bacteriana e a presença de larvas de diferentes espécies de insetos tais como os gêneros Calliphoridae Sarcophagidae e Muscidae Quando o cadáver se encontra reduzido a cabelos pelos pele e ossos as moscas são reduzidas e há o predomínio de coleópteros Descrição da Imagem a figura representa um crânio huma no na forma óssea Nele é mostrada a região ventral da face óssea e pode ser visualizada a calota craniana com os orifícios do olho nariz região da maxila e mandíbula com os dentes Figura 2 Crânio uma das peçaschave para o exame an tropológico A literatura indica muitas conquistas provindas dos conhecimentos da botânica forense No artigo intitulado A ciência para a resolução de crimes o papel da botânica forense no âmbito criminal você tem a possibilidade de conhecer essas informações Para acessar use seu leitor de QR Code 192 UNICESUMAR Até mesmo os estudiosos de aves podem auxiliar na interpretação de um crime Por exemplo o encontro de penas de aves em turbinas de avião pode ser uma estratégia de análise feita pelos ornitólogos os quais podem confirmar ou indicar um desastre aéreo Essa área pericial é chamada de ornitologia forense Merecem destaque ainda a patologia e a toxicologia A patologia forense estuda as doenças que podem ser responsáveis pela confirmação de uma morte Desse modo abrange as investigações microscópica e macroscópica com o intuito de encontrar algum tipo de alteração anatômica ou fisiológica de tecidos e órgãos Um exemplo é uma vítima que morre por causas violentas se durante o exame de perícia o médico perito legista não conseguir detectar a causa da morte por meio do exame feito a olho nu ou se há a suspeita de outro fator patológico que tenha contribuído para a morte da vítima o profissional solici tará uma perícia microscópica que será feita por um patologista forense Por intermédio das análises feitas pelos patologistas é possível detectar doenças cardiovasculares traumas em órgãos neoplasias doenças trombogênicas coagulopatias e alterações anatomopatológicas que tenham contribuído para a morte SOUZA 2020 Já a toxicologia forense tem por finalidade identificar a presença de substâncias químicas em investigações de violência homicídios suicídios acidentes uso de drogas de abuso e envenenamentos para aplicação legal Os objetos de investigação da toxicologia são os fluidos biológicos sangue urina conteúdo gástrico fluido oral humor vítreo suor e bílis os órgãos os tecidos fígado rim pulmão cérebro baço ossos e medula óssea músculo cardíaco músculo esquelético e tecido adiposo ou outros elementos cabelo unhas ar expirado líquido cefalorraquidiano efusão pleural fluido pericár dico e amostras entomológicas Os maiores casos de intoxicação detectados pela toxicologia forense são os medicamentos os agrotóxicos e as drogas de abuso RODRIGUES et al 2019 No Brasil os profissionais oficiais para a realização de perícias incluem os concursados e os pertencentes à Polícia Civil e à Polícia Federal que enfati zam a análise principalmente na identificação humana por meio das papilas dérmicas os papiloscopistas A papiloscopia é uma ciência que tem como base o estudo da identificação humana a partir da observação das saliências da pele dos pés mãos e dedos também chamadas de impressões digitais Figura 3 MULLER 2012 Os pequenos desenhos presentes nos dedos são a forma mais precisa de identificação dado que até mesmo os gêmeos idênticos apresentam contornos diferentes FOLTRAN SHIBATTA 2011 193 UNIDADE 9 Cristas Sulcos Poros Acidentes A B Descrição da Imagem a Figura mostra as representações das digitais e das saliências das peles dos dedos das mãos e dos pés Desse modo na Figura 3 a a esquerda é mostrada a digital de um dedo Na figura 3 b a direita estão indicadas por meio de setas vermelhas as regiões das cristas papilares Também há espaços em branco que representam a formação dos sulcos interpapilares Os poros são simbolizados por pontos brancos distribuídos nas cristas e os acidentes são representados por linhas das cristas sem continuidade Já na Figura 3 b à esquerda são expostas as digitais da palma de uma mão e ao lado direito encontrase a representação das digitais de dois pés um ao lado do outro Figura 3 Apresentação das regiões de estudo da papiloscopia a Digital de um dedo b Digitais da palma de uma mão e dos pés 194 UNICESUMAR A genética e a biologia forense são as principais áreas da ciência forense que dispõem de múltiplas atividades e que possibilitam realizar técnicas laboratoriais de perícias de casos de filiação crimina lística biologia e identificação individual BARBOSA ROMANO 2018 As perícias se baseiam na identificação de vestígios Na área da genética são enfatizadas as carac terísticas da distribuição dos nucleotídeos presentes na molécula de DNA as quais são estudadas e comparadas em casos de vítimas e de suspeitos Dentre os elementos de maior interesse de estudo para a identificação das características destacamse as secreções de diferentes origens sangue sê men urina saliva e fezes além de utilizar outras amostras biológicas de podem identificar o DNA do indivíduo como os fios de cabelo com raiz tecidos órgãos e ossos deixados entre o criminoso e a vítima Elas são fundamentais para a identificação do autor do crime e até mesmo de uma vítima por exemplo BARBOSA ROMANO 2018 A coleta dos objetos investigativos realizada por um perito forense exige normas rígidas pois para terem um valor científico em investigações criminais os vestígios devem ser documentados e preser vados de forma correta Dessa maneira a coleta do material exige passos importantes e destacados na segunda unidade deste livro Compreendese assim o momento da coleta do material o transporte No Brasil a investigação das impressões digitais presentes na palma das mãos e na sola dos pés começou por volta de 1901 A análise pode ser dividida de acordo com a região das papilas a serem estudadas Nesse sentido existem a datiloscopia impressões dos dedos a quiros copia das mãos a podoscopia impressões plantares dos pés a poroscopia dos poros e a cristascopia leitura das cristas papilares Quando é realizada a análise em cadáveres a área de estudo é chamada de necropapilosco pia Ela tem o objetivo de identificar as pessoas falecidas cuja identidade é desconhecida A identificação será feita a partir do confronto das impressões papilares Fonte adaptado de Brant 2019 As impressões digitais são únicas Cada um tem a sua mesmo os gêmeos univitelinos Dessa forma não é o DNA que influencia as características do desenvolvimento das digitais Acesse o QR Code e entenda as propriedades da formação das digitais Para acessar use seu leitor de QR Code 195 UNIDADE 9 até o laboratório em que são feitos os registros os exames e os testes realizados o armazenamento o descarte ou a devolução OGA CAMARGO BATISTUZZO 2014 BARBOSA ROMANO 2018 Por exemplo em uma coleta de sangue e de sêmen o material biológico em forma líquida geralmente é coletado por absorção Já o sangue líquido deve ser coletado e preservado com anticoagulantes Já os tecidos fios de cabelo órgãos e ossos quando encontrados devem ser documentados e fotografados para registrar o estado deles Eles devem ser coletados com o auxílio de instrumentos como pinça e bisturi sempre livres de contaminações Saliva urina e fluidos corporais devem ser transferidos em garrafas de plástico ou de vidro esterilizadas Caso sejam encontradas apenas manchas desses fluidos é preciso cortar a área com o material e levála até o laboratório para ser analisada BARBOSA ROMANO 2018 Assim como já foi sustentado a efetividade de um resultado nas investigações com o uso de métodos da ciência forense pode ser dirigida por diferentes profissionais O que muda na maioria das vezes é o tipo de profissional especializado em relação à espécie de crime a ser investigado Contudo você pode estar se perguntando e na área da saúde quais são os profissionais mais frequentes Nessa área muitos são os pro fissionais que atuam na ciência forense tais como médicos biomédicos enfermeiros dentistas e psicólogos Na área da saúde cada profissional pode apresentar uma variedade de direções Por exemplo na área médica temos os chamados médicos legistas que atuam na investigação das causas de morte e de pessoas vítimas de lesões Um dentista consegue estimar a idade de pacientes e identificar individualmente em casos de desastres usando a comparação da arcada dentária que não sofre grandes modificações durante a vida do indivíduo Biomédicos forenses atuam na análise de amostras biológicas sangue sêmen saliva e outros em cenas de crimes Portanto utilizam conhecimentos e técnicas em genética e biologia molecular para apoiar a Justiça e desvendar crimes CIRILO LEITE VALE 2019 FOLTRAN SHIBATTA 2011 Os resquícios deixados no local nas vítimas ou nos objetos presentes na cena de um crime são os principais fatores utilizados para a identificação individual de suspeitos Na presença de fluidos corporais eles são primordialmente analisados por intermédio do uso das técnicas de biologia molecular Figura 4 De acordo com o Direito Processual Penal os vestígios podem ser classificados em três formas uma em relação ao fato e as outras duas formas em relação ao autor Em relação ao fato temos vestígios forjados colocados propositalmente visando atrasar a investigação vestígios verda deiros vestígios que o perito concluiu ter relação direta com o fato delituoso em investigação e vestígios ilusórios não foram produzidos de forma proposital Em relação ao autor temos os vestígios absolutos que são aqueles que pertencem inegavel mente ao autor ou à vítima como sangue digitais esperma e saliva e os vestígios relativos que não esclarecem a quem estão ligados No caso do sangue um exemplo é não conseguir obter o DNA mas especificar a tipagem sanguínea Fonte adaptado de Araújo 2019 e Costa Filho 2012 196 UNICESUMAR Já sabemos que a biologia molecular tem como foco o estudo da estrutura e da função do material genético e dos produtos de expressão que são as proteínas Assim os materiais biológicos deixados na cena de um crime podem ser analisados por diferentes técnicas a fim de identificar as peculiaridades dos estudos da biologia molecular como o DNA Ao longo das descrições feitas neste livro você pode recordar que a partir de meados dos anos 80 os avanços nas técnicas de análise de DNA propiciaram um significativo impacto na área da investigação de doenças e no campo da ciência forense incluindo CENA DE CRIME NÃO ULTRA PASSE CENA DO CRIME NÃ O ULTRAPASSE A N Descrição da Imagem na figura há um contorno em branco de uma pessoa no chão Ao redor desse contorno estão distribuídas três placas amarelas com numerações Uma indica uma mancha vermelha representando sangue e está situada na região da cabeça do contorno A segunda placa indica uma faca de cabo preto envolta por uma mancha vermelha sangue situada na região da cintura Já a terceira indica uma mancha vermelha maior sangue espalhado pela região da cintura O contorno branco está sendo analisado por três peritos Um está em pé fotografa e usa todos os equipamentos de segurança macacão branco máscara branca e luvas verdes Os outros dois estão agachados Um deles situado no lado esquerdo está usando todos os equipamentos de segurança e coloca uma placa amarela com o número 3 de identificação do vestígio Já o outro presente no lado direito está usando roupa e sapatos pretos um colete e luvas na cor verde Ele está apenas observando O cenário atrás dos peritos mostra uma fita amarela que está delimitando o local do crime e tem escrito Cena do crime não ultrapasse Figura 4 Fluidos corporais identificados na cena de um crime 197 UNIDADE 9 a identificação de pessoas mortas em acidentes aéreos pessoas perdidas paternidade restos mortais encontrados após anos Não só mas a análise de DNA também é ferramenta poderosa de identificação humana em investigações criminais BARBOSA ROMANO 2018 A partir dos conhecimentos apresentados nas unidades anteriores você pode constatar que várias téc nicas elementos de manipulação do DNA tipos de PCR marcadores moleculares e a bioinformática desenvolvidas permitiram uma melhor análise da molécula do DNA demonstrando a importância delas nos diferentes campos científicos incluindo a ciência forense Enquanto as técnicas laboratoriais ajudaram na identificação de maneira ágil das informações contidas na molécula de ácidos nucleicos a bioinformática proporcionou o armazenamento de dados feitos dessas análises Figura 5 Nessa seara a associação das técnicas de detecção do material genético e a comparação com o de outros indivíduos presente nos bancos de dados da bioinformática auxiliaram na identificação de criminosos BARBOSA ROMANO 2018 O envolvimento da biologia molecular com a ciência forense é um tanto crescente Acesse o QR Code e relembre os métodos da biologia molecular correlacionandoos com a investigação forense Para acessar use seu leitor de QR Code DADOS BIOLÓGICOS Descrição da Imagem a figura representa um símbolo da bioinformática que é o computador com os dados gerados das análises da molécula de DNA no monitor O monitor que é de cor cinza apresenta na tela preta vários riscos coloridos na vertical e distribuídos em quatro linhas Eles representam códigos genéticos Da primeira linha superior sai para o lado direito uma molécula de DNA dupla fita fitas na cor preta unidas por linhas coloridas iguais as representadas na tela na forma de uma hélice na horizontal Na frente da molécula de DNA está escrito Dados biológicos Figura 5 Representação da bioinformática como uma ferramenta da ciência forense 198 UNICESUMAR Atualmente muitos seriados e filmes têm tornado a ciência forense um assunto popular em meio à sociedade que antes pouco a conhecia No entanto é válido recordar como as técnicas de biologia molecular são desenvolvidas pois os procedimentos técnicos e científicos utilizados apesar de se assemelharem com os utilizados nas séries carregam uma diferença importante o tempo O inves tigador na vida real para averiguar um crime depende da passagem dos procedimentos de análise O tempo de conclusão não é tão rápido portanto o tempo real de resposta não é bem mostrado na ficção SCHWEITZER SAKS 2007 A percepção do público diante das investigações criminais é a de que pode ser usado o chamado efeito CSI como possível método para se chegar ao autor do crime rapidamente Na vida real nem sempre é assim há processos que demoram mais tempo a ser analisados que outros Além disso outra diferença diz respeito a quem faz a investigação na série o inspetor que faz a investigação criminal também analisa as provas no laboratório Essa situação raramente acontece pois o DNA as impressões digitais ou o fio de cabelo nem sempre são encontrados em uma cena de crime Nos laboratórios fora da ficção cada pessoa tem uma função a desempenhar SCHWEITZER SAKS 2007 Nas ciências forenses existem muitas áreas envolvidas e que atuam separadamente mas que buscam o mesmo propósito fornecer resultados precisos e confirmar a autoria do crime ou descartar o envol vimento dos suspeitos Para que o trabalho dos profissionais seja válido a experiência conta muito Além disso é necessário um conhecimento técnico específico e atualizado para que no encerramento do processo o profissional seja competente para formular o relatório final BARROS et al 2021 A imparcialidade do profissional ao transmitir as informações à Justiça é uma característica essen cial pois a sociedade as vítimas e os suspeitos têm direitos No caso da sociedade o principal dever do perito se baseia na confiança nele depositada enquanto para a acusação a vítima e o suspeito o profissional é o responsável pelo resultado correto da investigação que deve ser conduzida de maneira eficiente e eficaz BARROS et al 2021 Assim como toda profissão agir de maneira ética e profissional é uma exigência para cumprir a função Várias entidades do campo forense estabelecem códigos de conduta que são regularmente avaliados e atualizados Esses códigos estruturam princípios para auxiliar os especialistas a discernir o A ficção científica está cada vez mais especializada na representação de histórias na área criminal investigativa Acesse o QR Code para conhecer as principais séries que abordam a ciência forense nos métodos de identificação Conheça Para acessar use seu leitor de QR Code 199 UNIDADE 9 que é aceitável e orientar as decisões e resolução de problemas tendo como base os valores profissionais da categoria As normas e diretrizes objetivam prevenir comportamentos considerados antiéticos e assegurar o profissionalismo BARROS et al 2021 As ciências forenses são um campo de atuação em que os profissionais visam apresentar resultados satisfatórios para a Justiça a fim de elucidar problemas nas áreas criminais administrativas e civil Em detrimento de nenhum crime se mostrar perfeito a área forense vem para ajudar a identificar de forma minuciosa cada vestígio que possa ter sido deixado na cena do crime Para a identificação desses vestígios contase com diferentes profissionais Todavia no contexto da saúde sobressaemse aqueles que tiverem o contato com as disciplinas voltadas à genética à biologia molecular e às biotecnologias as quais preparam profissionais como você futuroa biomédicoa para atuar em uma das principais atividades a de perito biomédico Oa biomédicoa pode trabalhar nos locais em que os delitos foram cometidos na cena do crime ou em laboratórios Em ambas você já teve as bases apresentadas neste livro Agora falta apenas escolher a sua área de atuação O Código de Ética do Perito Criminal enfatiza os interesses da sociedade por meio de alguns princípios como profissionalismo eficácia integridade objetividade confidencialidade e ho nestidade Descrevemse ainda outros deveres profissionais que contrapostos tornamse direitos da sociedade a abstenção de abusos a vigilância o cuidado e a atenção No entanto a ética vai muito além uma vez que não é permitida ao perito uma ação irres ponsável ilícita ou eticamente condenável Devese considerar que o perito criminal trabalha o tempo todo com pessoas vulneráveis pelo fato de lidar tão somente com indivíduos em estado de privação ou no mínimo de sofrimento já que se trata de uma área criminal Assim o profissional deve ter boas noções sobre ética e condutas profissionais Fonte adaptado de Cruz e Rodrigues 2018 No podcast desta unidade você conhecerá ou até mesmo relem brará casos em que a ciência forense foi essencial para desvendar crimes identificar pessoas após tragédias e casos de identificação de paternidade na vida dos famosos Acesse o QR Code 200 Chegou o momento de resumir os conteúdos abordados na unidade Assim preencha o mapa conceitual a seguir Nele está escrito no centro Ciências forenses Desse local partem vários traços que a caracterizam tais como o objetivo da área o que ela analisa os profissionais que atuam os benefícios da biologia molecular na área e a ética profissional Você deverá verificar as caixas de texto que não estão preenchidas e ajudar na caracterização delas CIÊNCIAS FORENSES Objetivo utilização de técnicas específcas que ajudam na investigação de crimes Local do Crime O que analisa Fluídos corporais ex sangue e sêmen Documentos Digitais Componentes químicos ex drogas Profssionais da área da saúde Enfermeiros Médicos Psicólogos Dentista Benefícios da Biologia Molecular para analises forenses Identifcação de pessoas em acidentes aéreos Identifcação de pessoas perdidas Ética profssional 201 1 A palavra forense significa respeitante ao fórum judicial Portanto toda ciência cujos conhecimentos podem ser utilizados para a elucidação de questões de interesse judicial recebe essa terminologia Sobre a temática assinale a alternativa correta a A medicina legal é uma área atuante nas ciências forenses pois os conhecimentos relacionados à análise de sites e de mídias podem localizar criminosos online b A química é uma área importante na área forense pois os profissionais da área podem utilizar os conhecimentos para analisar e identificar substâncias químicas que estejam relacionadas às práticas criminosas c Um profissional da área contábil ou financeira pode atuar na área forense investigando documentos e registros que provem falhas em normas de segurança relacionadas às causas de acidentes em construções por exemplo d Um profissional da informática pode ajudar na área forense fazendo a análise de ma teriais biológicos deixados na cena de um crime e Um biomédico pode atuar na área forense fazendo o uso dos conhecimentos voltados às armas de fogo esclarecendo a prova da ocorrência 2 As ciências forenses iluminam os caminhos daqueles que buscam a verdade e a justiça por meio da ciência O uso das técnicas da biologia molecular é extremamente impor tante visto que ajuda os profissionais a solucionarem os casos analisados pela Justiça Assinale a alternativa que melhor explica as características da biologia molecular usada para as ciências forenses a As realizações das técnicas de biologia molecular na maioria requerem como amos tra materiais biológicos para extrair o DNA permitindo a identificação humana em um ato criminal b As técnicas de biologia molecular que ajudam a solucionar os atos envolvendo a Justiça Penal e Civil na maioria requerem a análise de amostras de digitais dos suspeitos permitindo a identificação humana c São muitos vestígios biológicos encontrados na cena do crime Para detectar o perfil genético e fazer a comparação dos dados desses perfis a biologia molecular conta com aplicativos de armazenamento d As técnicas da biologia molecular são excelentes para a investigação criminal e con tribuíram na solução de casos pois cada indivíduo tem o próprio material genético inclusive os gêmeos monozigóticos e O estudo da genética forense é uma das áreas que auxilia a ciência forense mas não está relacionada com a biologia molecular para auxiliar na solução de casos da justiça 202 3 Avalie as asserções a seguir e a relação proposta entre elas I As impressões digitais das mãos humanas podem ser utilizadas como um meio con fiável de identificação pessoal Essa técnica tem sido utilizada há mais de um século PORQUE II Não é possível encontrar dois padrões de impressão digital idênticos a As asserções I e II são verdadeiras e a II é uma justificativa correta da I b As asserções I e II são verdadeiras mas a II não é uma justificativa correta da I c A asserção I é uma proposição verdadeira e a II é uma proposição falsa d A asserção I é uma proposição falsa e a II é uma proposição verdadeira e As asserções I e II são falsas 4 Os resquícios deixados no local nas vítimas ou nos objetos presentes na cena de um crime são os principais fatores utilizados para a identificação individual de suspeitos Na presença de fluidos corporais eles são primordialmente analisados por intermédio do uso das técnicas de biologia molecular Nos anos 80 os avanços voltados às técnicas da biologia molecular propiciaram um significativo impacto na área da investigação da ciência forense Sobre a temática leia as afirmativas a seguir I A PCR foi uma das técnicas desenvolvidas e possibilitou o aprimoramento da inves tigação da genética forense Essa metodologia permitiu a análise de materiais e de amostras que continham pouca quantidade de DNA II Os vestígios coletados em locais de crime quando questionáveis só podem ser pro cessados para a obtenção do perfil de DNA quando tiverem uma amostra para com paração Se isso não for possível as amostras coletadas deverão ficar armazenadas III A análise de DNA é considerada uma importante prova para a validação de um crime Como os procedimentos da técnica utilizam protocolos e kits comerciais validados para a identificação humana e baseados em cálculos estatísticos essa análise pode ser considerada perfeita e ser utilizada como prova única É correto o que se afirma em a I apenas b II e III apenas c III apenas d I II apenas e I II e III 203 5 Atualmente muitos seriados e filmes têm popularizado as ciências forenses em meio à sociedade Em relação às ações profissionais de peritos da vida real e de peritos fic cionais na área das ciências forenses analise as sentenças a seguir I Os procedimentos técnicos e científicos utilizados pelos peritos se assemelham com aqueles usados nas séries principalmente no que se diz respeito ao tempo real de resposta do problema II O método de chegada ao autor do crime não é bem retratado na ficção pois muitas vezes na ficção as respostas são adquiridas rapidamente No entanto na vida real há processos que demoram mais tempo para serem analisados III Na ficção quem faz a investigação também analisa as provas no laboratório Essa situação raramente acontece nos laboratórios verdadeiros em que cada pessoa tem a própria função É correto o que se afirma em a I apenas b II e III apenas c III apenas d I II apenas e I II e III 6 Assim como toda profissão agir de maneira ética e profissional é uma das exigências para cumprir a função com maestria O Código de Ética do Perito Criminal enfatiza os interesses da sociedade por meio dos princípios que esses profissionais devem cumprir Assinale a alternativa que consta a maneira ética que deve ser adotada pelos peritos criminais a Exercer a profissão com zelo delinquência honestidade dignidade e independência profissional b Sob nenhuma hipótese guardar sigilo sobre o que souber em razão do exercício das funções c Comunicar desde logo à Justiça eventual circunstância adversa que possa influir na conclusão do trabalho pericial para o qual foi nomeado d Sempre assinar documentos ou peças elaboradas por outrem alheio à orientação supervisão e fiscalização e Facilitar por qualquer meio o exercício da profissão aos não habilitados proibidos impedidos 204 UNIDADE 1 ALBERTS B et al Fundamentos da biologia celular uma introdução à biologia molecular da célula 4 ed Porto Alegre Artmed 2017 LODISH H et al Biologia celular e molecular 7 ed Porto Alegre Artmed 2014 NAOUM P C O DNA seus incríveis números Revista Laes e Haes 2010 Disponível em https wwwciencianewscombrarquivosACETIMAGENSdnaincriveldnaincrivelpdf Acesso em 16 nov 2021 NELSON D L COX M M Princípios de bioquímica de Lehninger 6 ed Porto Alegre Artmed 2014 PIERCE B A Genética um enfoque conceitual Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2013 UNIDADE 2 ALLEN L C Role of a quality management system in improving patient safetyLaboratory aspects Clinical Biochemistry v 46 n 1314 p 11871193 2013 ANS Resolução Normativa RN nº 405 de 9 de maio de 2016 Dispõe sobre o Programa de Qualificação dos Prestadores de Serviços na Saúde Suplementar QUALISS revoga a Resolução Normativa RN nº 267 de 24 de agosto de 2011 com exceção do art44B incorporado à RN nº 124 de 30 de março de 2006 e revoga também a RN nº 275 de 1º de novembro de 2011 a RN nº 321 de 21 de março de 2013 a RN nº 350 de 19 de maio de 2014 e a Instrução Normativa IN nº 52 de 22 de março de 2013 da Diretoria de Desenvolvimento Setorial e dá outras providências 2016 Disponível em httpwwwansgovbrcomponentlegislacaoviewlegislacaotaskTex toLeiformatrawidMzI0OA Acesso em 17 nov 2021 BEZERRA C C Exame de DNA coleta de amostras biológicas em local de crime Perícia Federal DNA forense técnicas de coleta em locais de crimes n 18 p 614 2004 CASTELARI G M et al Toxicologia forense ciência multidisciplinar que abrange o estudo das causas de mortes por intoxicação e os materiais biológicos utilizados para esse fim que direcionam a investigação médicolegal e a emissão do laudo toxicológico Ambiente Acadêmico v 4 n 1 2018 DALE W M BECKER W S The crime scene how forensic science works New York Kaplan Publishing 2007 DELCAMPO E R A Exame e levantamento técnico pericial de locais de interesse à justiça criminal abordagem descritiva e crítica 2008 Dissertação Mestrado em Medicina Legal Facul dade de Direito da Universidade de São Paulo Universidade de São Paulo São Paulo 2008 DUARTE G L O papel da ciência forense na investigação dos crimes de homicídio 2009 Dissertação Mestrado 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FASB 17 2019 Barreiras Anais Barreiras s n 2019 213 COSTA FILHO P E G da Medicina Legal e criminalística Brasília DF Vestcon 2012 CRUZ C F da RODRIGUES J C A perspectiva da ética na atitude cotidiana do perito criminal Revista Criminalística e Medicina Legal v 3 2018 CUNHA E Devolvendo a identidade a antropologia forense no Brasil Ciência e Cultura São Paulo v 71 n 2 p 3034 2019 FOLTRAN R K SHIBATTA L A ciência forense e as principais áreas auxiliares In CONGRESSO MULTIPROFISSIONAL EM SAÚDE 5 2011 S l Anais S l s n 2011 JNDS L GABRIEL R Ciências Forenses Biomedicina Informativa 2021 Disponível em http biomedicinainformativacomunidadesnetcienciasforenses Acesso em 20 dez 2021 MARCEL G Biologia forense áreas de atuação salários e empregos Eu Quero Biologia 2021 Disponível em httpsbitylicomLALGZer Acesso em 20 dez 2021 MULLER J E F A cadeia de custódia de vestígios papilares na polícia federal uma proposta de normatização Cadernos ANP Brasília n 9 2012 OGA S CAMARGO M M de A BATISTUZZO J A de O Fundamentos de toxicologia 4 ed São Paulo Atheneu 2014 RODRIGUES K S et al A toxicologia na análise forense uma revisão de literatura In SEMINÁRIO INTERINSTITUCIONAL DE ENSINO PESQUISA E EXTENSÃO 24 2019 Cruz Alta Anais Cruz Alta s n 2019 SCHWEITZER N J SAKS M J The CSI effect popular fiction about forensic science affects the publics expectations about real forensic science Jurimetrics p 357364 2007 SEBASTIANY A P et al A utilização da Ciência Forense e da investigação criminal como estratégia didática na compreensão de conceitos científicos Educación Química Ciudad de México v 24 n 1 2013 SOUZA S Patologia forense é forte aliada na investigação de casos complexos Ceará 17 jun 2020 Disponível em httpsbitylicompNJBaUL Acesso em 20 dez 2021 VENTURA R M et al Entomologia forense coleta e estudos taxonômicos de insetos necrófagos do município de Santa Isabel SP Atas de Ciências da Saúde 2016 REFERÊNCIAS ONLINE ¹Em httpswwwdiciocombrforense Acesso em 20 dez 2021 214 UNIDADE 1 1 A A alternativa A está correta pois a molécula de DNA deveria ser representada por uma dupla fita constituída por nucleotídeos ligados entre si por ligações fosfodiéster Além disso as bases nitrogenadas localizadas no centro estariam associando as duas fitas de maneira complementar AT e CG por ligações de hidrogênio Já a alternativa B é falsa pois a molécula de DNA é dupla fita e não fita única A alternativa C também está incorreta já que os nucleotídeos do DNA são interligados entre si por meio de ligações fosfodiéster e não ligações de hidrogênio As bases nitrogenadas fariam a ligação de uma fita a outra por intermédio de ligações de hidrogênio A alternativa D é falsa uma vez que a molécula de DNA é dupla fita e não simples Não só mas a complementariedade de base correta seria AT CG Por fim a alternativa D está incorreta dado que a associação das fitas de DNA deve ser feita de forma que as bases se associem de forma específica ou seja complementar sendo a ligação AT e CG 2 Toda vez que um produto gênico é necessário ele é transcrito na forma de RNA para que depois seja traduzido Isso acontece porque o DNA contém sequências não gênicas reguladoras Ao serem transcritas são chamadas de introns e estão intercaladas entre as regiões codificantes os exons Dessa forma o DNA produz os RNAs que podem ser submetidos aos processamen tos de retirada dos introns traduzindo apenas as regiões codificantes A vantagem de passar a informação para o RNA é que o DNA preserva os dados de modo mais seguro evitando a ocorrência de erros permanentes uma vez que o RNA é mais suscetível a erros Ele é degradado continuamente depois de algumas traduções mas a informação correta fica preservada no DNA 3 E A alternativa E está correta pois o RNAm passa por processamentos durante a transcrição como a retirada de introns a junção de exons e a modificação das extremidades 5 com a cap e da 3 com a poliadenilação Já a alternativa A é falsa já que os ribossomos podem produzir qualquer proteína que seja especificada por meio de um RNAm que esteja sendo traduzido A alternativa B também está incorreta uma vez que as subunidades dos ribossomos ficam separadas antes de iniciar a tradução unindose posteriormente A alternativa C é falsa tendo em vista que o RNAm não tem timina T mas uracila U Por fim a alternativa D está incorreta porque a posição do promotor determina o sentido no qual ocorre a transcrição e delimita a fita de DNA será utilizada como molde Em geral a fita mais utilizada como molde é a 3 5 4 C I verdadeira O DNA polimerase é a enzima responsável pela construção da nova fita Ela adiciona os nucleotídeos complementares a cada uma das fitas II falsa A sequência das etapas de replicação é a seguinte quebra por meio da helicase das pontes de hidrogênio que unem as bases Antes da adição dos nucleotídeos complementares pelo DNA polimerase são inseridos os primers para que sejam reconhecidos pelo DNA polimerase III falsa Ao final da replicação as fitas que serviram de molde se voltam a unir e as novas fitas formadas se associam Ao final da replicação a nova fita formada permanecerá com a fita que lhe serviu de molde o que justifica ser um processo semiconservativo 215 IV falsa A replicação é o processo de formação de uma nova molécula de DNA No caso das células eucariontes ela ocorre no interior do núcleo celular 5 Primeiramente é preciso recordar das etapas que estão incluídas no dogma central da biologia molecular ou seja a replicação a transcrição e a tradução Dentre elas a melhor para se fazer o sistema de reparo seria o processo de replicação uma vez que a replicação forma moléculas de DNA que é a responsável por armazenar as informações genéticas e passar os dados para as próximas etapas 6 A A melhor forma de destruir um vírus que tenha o material genético do tipo DNA seria impedir que a replicação do DNA viral acontecesse no interior do corpo do hospedeiro Dessa forma muitos fármacos agem impedindo a comunicação do vírus com a célula hospedeira de forma que ele não possa se replicar e formar novos vírus Destruir as proteínas virais não seria uma boa estratégia já que elas são produzidas por comandos direcionados do vírus para a célula hospedeira Por sua vez a utilização de um fármaco para impedir a transcrição dos genes de hospedeiro iria prejudicar ainda mais as células pulmonares e não o vírus Além disso ativar uma replicação viral por um fármaco aumentaria o vírus e não o diminuiria Por fim ativar a transcrição da célula hospedeira não impede o desenvolvimento do vírus UNIDADE 2 1 A Um dos objetivos da atenção em um sistema de gestão de qualidade em procedimentos efe tuados por laboratórios forenses é apresentar um resultado de qualidade no procedimento identificatório forense Assim é preciso ter equipamentos e insumos para efetuar a análise e profissionais formados e capacitados para a função Além disso é necessário considerar a quali dade de vida daqueles que convivem no ambiente e a proteção do meio ambiente A alternativa B é equivocada uma vez que é necessário dar atenção ao meio ambiente e ter adequação em relação à liberação e ao tratamento de resíduos Já a alternativa C é incorreta dado que é preciso ter equipamentos bons para efetuar a análise dos materiais A alternativa D não é verdadeira já que não é correto pedir para que os profissionais tragam os equipamentos para fazer a análise de um material Por fim a alternativa E é incorreta já que os elementos são necessários não apenas para a aquisição de um resultado de qualidade mas também caracterizam o objetivo do sistema de gestão de qualidade para um laboratório 2 Oa alunoa pode responder a pergunta tratando dos aspectos judiciais enfrentados pelos responsáveis pelo laboratório Também pode explorar a não elucidação dos crimes diante da ausência da identificação de suspeitos para confronto e adentrar em questões sociais éticas e psicológicas dos envolvidos 3 D Sociedade Brasileira de Patologia ClínicaMedicina Laboratorial SBPCML PALC O PALC é o Pro grama de Acreditação de Laboratórios Clínicos criado em 1998 e é reconhecido por instituições e entidades nacionais e estrangeiras Os requisitos do PALC são fundamentados em normas específicas de qualidade que contemplam as atividades laboratoriais 216 4 E A cadeia de custódia carrega duas etapas A primeira abrange o momento de coleta do material e o transporte até o laboratório Ela é chamada de cadeia de custódia externa A segunda etapa é chamada de cadeia de custódia interna Nela a amostra chega ao laboratório e são feitos os registros dela Além disso acontecem os exames e os testes o armazenamento o descarte ou a devolução O uso de EPIs é necessário em qualquer uma das etapas Além disso na primeira etapa ou seja na cadeia de custódia externa é preciso expor as informações do manuseador da amostra do local onde ela foi obtida e do momento em que foi feito o manuseio UNIDADE 3 1 D Existem duas classes de enzimas de restrição e elas se diferenciam quanto ao modo de corte das sequências específicas dos nucleotídeos de DNA Quando é efetuado o corte simétrico entre a dupla fita de DNA não deixando pares de bases não pareados nas extremidades são formadas pontas robustas ou extremidades cegas No entanto quando o corte é feito de forma assimétrica deixando as extremidades da fita cortadas de 2 a 4 nucleotídeos não pareados são apresentadas as extremidades chamadas de coesivas 2 A sequência correta seria ABDC As enzimas de restrição têm a propriedade de cortar o DNA em pontos específicos Elas foram identificadas pela primeira vez em células bacterianas com o papel biológico natural de protegêlas contra os vírus Em B os plasmídeos são moléculas circulares duplas de DNA capazes de se reproduzir independentemente do DNA cromossômico Ocorrem geralmente em bactérias D se refere à técnica de eletroforese que é utilizada para separar os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho As amostras de DNA são submetidas a uma corrente elétrica separando os fragmentos DNA que se movem na direção do eletrodo positivo Por outro lado em C o vetor representa as moléculas dos organismos que têm as condições necessárias para a clonagem molecular de fragmentos de DNA Eles são capazes de formar centenas de cópias da informação genética que neles for inserida Diferemse quanto ao tamanho de fragmentos que podem replicar 3 Considerando que o gene A e a são de igual tamanho e que a enzima de restrição foi capaz de clivar cortar gene A em duas partes de diferentes tamanhos mas não foi capaz de clivar o seg mento de DNA do gene a concluise a partir da análise da eletroforese dos três indivíduos que a afirmativa I está correta pois provavelmente o indivíduo 01 tem apenas o gene a uma vez que não foi fragmentado e tem o mesmo tamanho do gene A que é mais pesado e se localiza no gel na extremidade próxima do polo negativo A afirmativa II é falsa dado que o indivíduo 02 não tem duas cópias do gene a dado que apresenta peso igual e não se localizaria no gel em posições diferentes como mostrado A afirmativa III está correta porque o indivíduo 03 tem um gene a e um gene A o qual mostra os dois fragmentos resultantes da ação da endonuclease A afirmativa IV é falsa pois o indivíduo 03 não tem um gene a clivado pois é dito no enunciado da questão que a enzima de restrição não foi capaz de realizar cortes nesse gene A afirmativa V também é falsa tendo em vista que o gene A quando clivado origina dois fragmentos mas não com cerca de 700pb A afirmativa VI por sua vez está correta visto que o gene A depois de clivado tem um tamanho de aproximadamente 400pb e 300pb Por fim a afirmativa VII é falsa dado que os fragmentos maiores do gene A ficaram mais próximos do polo negativo pois são mais pesados enquanto os menores estariam mais próximos do polo positivo 217 4 A Um marcador de rastreabilidade utilizado na técnica Southern blot são as sondas Elas são constituídas por duas estruturas uma biologicamente ativa responsável por se ligar à molécula de interesse e outra que carrega um grupo funcional fluorescente responsável pela emissão luminosa 5 A As duas asserções são proposições verdadeiras e a segunda é uma justificativa correta da primeira UNIDADE 4 1 D Quando sabemos pelo menos as sequências das regiões terminais do segmento de DNA que estamos interessados é possível construir primers que venham a complementar o fragmento e assim amplificálo por meio da técnica de PCR 2 A A PCR é uma técnica bastante sensível Ela pode detectar e amplificar um fragmento de DNA mes mo que ele esteja em pequenas quantidades Contudo a contaminação deve ser investigada uma vez que é possível detectar segmentos de DNA do pesquisador ou de bactérias contaminantes 3 C A PCR é uma técnica que permite identificar as sequências de DNA presentes em vírus e em outros patógenos uma vez que os primers são desenhados para detectar e amplificar apenas os fragmentos deste Após a amplificação os fragmentos podem ser analisados 4 E Nas afirmativas I e III as descrições voltadas à RTPCR e à PCR em tempo real estão corretas uma vez que a primeira utiliza a transcriptase reversa antes de iniciar a amplificação e a segunda utiliza uma sonda que quando degradada emite uma fluorescência que detecta em tempo real a quantidade de produtos amplificados Já a assertiva II está incorreta uma vez que a descrição feita corresponde à técnica de nested PCR e não PCR multiplex Por sua vez a afirmativa IV também está incorreta pois a descrição de nested PCR corresponde à PCR multiplex 218 5 D O momento em que ocorre o anelamento dos primers e em seguida o resfriamento da reação corresponde à segunda etapa Já a alternativa A está errada pois a polimerização feita pela Taq polimerase se refere à terceira etapa da reação A alternativa B também não é verdadeira pois a descrição diz respeito à primeira etapa do processo de PCR A alternativa C é falsa visto que a descrição realizada não corresponde ao método da PCR mas à espectrofotometria Por fim a alternativa E não é verdadeira tendo em vista que a descrição faz referência a segunda etapa da PCR em tempo real Contudo para que haja o anelamento submetese ao resfriamento da temperatura e não ao aumento UNIDADE 5 1 B O sequenciamento é um método capaz de identificar de forma ordenada os nucleotídeos presentes no genoma de um organismo 2 A Os materiais necessários para efetuar o sequenciamento de Sanger são os mesmos usados na técnica de PCR com exceção dos didesoxinucleotídeos Dessa forma o DNA polimerase uma fita molde de DNA um iniciador desoxinucleotídeos e didesoxinucleotídeos são os elementos utilizados para o sequenciamento de Sanger O evento é processado a partir do término da replicação de um mesmo DNA em pontos diferentes que são visualizados e analisados por eletroforese 3 B Aqueles que interrompem a síntese de DNA são os didesoxinucleotídeos ddNTPs por não terem o grupamento 3 hidroxila necessário para permitir a associação do próximo nucleotídeo dNTP 4 O aluno deve descrever as vantagens e as desvantagens da técnica de sequenciamento se comparada ao método de Sanger Embora distintas as técnicas de Sanger e NGS apresentam vantagens e desvantagens assim como limitações de custo e benefícios para obter e gerar dados As principais vantagens do método de Sanger foram por certo tempo a possibilidade de leitura de maiores fragmentos e a precisão da base gerada No entanto atualmente os métodos de NGS se aprimoraram e permitem sequenciar fragmentos maiores como os feitos por Sanger A desvantagens do método tradicional de Sanger de sequenciamento é que ele demanda uma grande quantidade de material genético o que pode inviabilizar as análises em ampla escala 5 A O pirosequenciamento diferentemente do método tradicional de Sanger não utiliza didesoxinu cleotídeos ddNTPs Ao contrário adiciona um grupamento de pirofosfato no desoxinucleotídeo combinação que ajuda no progresso das reações enzimáticas que perpetuam a emissão de luz 219 6 São várias as aplicabilidades da técnica Algumas delas incluem Identificação dos microrganismos presentes nas cadeias produtivas em casos de contaminação em uma indústria alimentícia Detecção de fraudes quando há a presença de componentes de origens diferentes em alimentos Monitoramento ambiental em um hospital ou em outros locais pela análise dos microrganismos presentes Análise de fezes a fim de verificar os hábitos e a saúde das pessoas Quantificar a eficiência do uso de antibióticos UNIDADE 6 1 E Os marcadores moleculares são metodologias de estudo para a identificação das variações genéticas entre indivíduos Eles se baseiam na identificação de variações nas sequências de nucleotídeos de DNA após a extração As análises são feitas de diferentes modos dependendo do tipo de marcador 2 D Em relação à triagem necessária para a escolha do marcador ideal as características que deve riam ser levadas em consideração são atribuídas às afirmativas I II e IV 3 B Quanto ao método de detecção feito pelos diferentes marcadores podemos verificar que den tre os marcadores citados considerase correto apenas aquilo que é descrito na alternativa B O RFLP é um tipo de marcador que tem como princípio detectar as sequências polimórficas Utiliza para isso a técnica de hibridização também chamada de Southern blot 4 A Em relação ao modo de ação gênica os marcadores moleculares podem ser dominantes ou co dominantes Os marcadores moleculares dominantes possibilitam a identificação da presença ou da ausência de um determinado alelo 220 5 A Em relação aos SNP a frase descreve que a principal vantagem que eles carregam é o elevado potencial deles para uma análise automatizada Portanto permitem identificar milhares de loci simultaneamente de forma a revelar a codominância de cada alelo Nesse caso as duas asserções são proposições verdadeiras e a segunda é uma justificativa correta da primeira UNIDADE 7 1 A biotecnologia é uma área da ciência que combina a tecnologia com os conhecimentos vol tados aos processos biológicos a fim de criar produtos ou serviços para resolver problemas Na área da saúde com a chegada das ferramentas biotecnológicas houve uma revolução nos métodos e nos procedimentos utilizados A tecnologia do DNA recombinante possibilitou dois aprimoramentos importantes O primeiro foi o aprimoramento das vacinas tornandoas mais seguras e eficazes O segundo foi a combinação de um medicamento comum com princípio ativo e um agente biológico para a criação de biofármacos Tanto as vacinas quanto os biofármacos auxiliam no controle de doenças e contribuem para a saúde pública 2 E A tecnologia permitiu o aprimoramento de técnicas e de procedimentos e consequentemente tornou as vacinas já existentes mais eficazes e seguras 3 D A afirmativa I é falsa pois a produção de biofármacos envolve outras etapas além das descritas As etapas são expansão celular upstream purificação downstream recuperação purificação e formulação final A afirmativa II não é verdadeira já que existem duas etapas de purificação mas elas não ocorrem uma seguida da outra Elas são intercaladas pela etapa de recuperação Já a afirmativa III está correta uma vez que para produzir um biofármaco é preciso cultivar or ganismos produtores A partir disso é possível submeter esses organismos a diferentes etapas a fim de fazer a extração e a purificação da proteína de interesse Por fim a afirmativa IV está correta dado que na purificação o objetivo é tornar a matériaprima mais pura somente com a proteína de interesse Assim a eficácia do medicamento estará garantida 4 D A afirmativa II está correta dado que a terapia gênica utiliza a introdução de genes sadios para substituir um gene mutado causador de alguma doença A afirmativa IV também está correta visto que o CRISPR é uma ótima ferramenta para a edição genômica e promete garantir uma maior segurança e efetividade ao tratamento 221 UNIDADE 8 1 A De acordo com a indagação feita na questão podemos dizer que a bioinformática tem como objetivo no âmbito da biologia analisar e comparar as sequências de nucleotídeos de ácido nucleicos e aminoácidos de proteínas oriundas do sequenciamento genético 2 A Segundo estudos sobre a bioinformática é possível constatar que as principais ferramentas utilizadas na área da biologia molecular são úteis para organizar os dados provindos do se quenciamento em um conjunto de registros estruturados Para isso a bioinformática utiliza diferentes softwares que variam de ferramentas simples a programas gráficos mais complexos e serviços da web independentes 3 E Em relação aos bancos de dados os bancos de dados primários contêm informações sobre a sequência em conjunto com informações que descrevem a fonte da sequência e a determinação No entanto para fazer comparações e análises de sequências de DNA ele deve ser sequenciado Dessa forma não poderíamos considerar a assertiva I correta Além disso os bancos de dados apresentam um enfoque comparativo o qual procura similaridade entre uma nova sequência e todos os genes conhecidos Alguns programas fazem o alinhamento de sequências sendo o mais utilizado o BLAST 4 Os dados de comparação de sequências podem apenas ser estimados pois devido à degene ração do código genético proteínas relacionadas exibem invariavelmente mais similaridade de sequências que genes que codificam Esse fato ocorre porque as sequências de DNA não contêm apenas regiões gênicas como mencionado mas carregam a presença de vários íntrons que possibilitam após os splices a recombinação alternativa variando as sequências que determinam cada tipo de RNAm que será transcrito Isso resulta em várias cópias de alguns genes Além disso a presença de muitos DNA não codificantes entre os genes pode dificultar a identificação precisa e a contagem dos genes por programas comparativos da bioinformática 5 É possível fazer o alinhamento das sequências da proteína spike do vírus utilizado a fim de comparar essa região em diferentes espécies A elucidação de algumas evidências científicas sobre as possíveis origens do novo coronavírus foi auxiliada com a prevenção de futuros eventos zoonóticos uma vez que a sequência guarda as marcas de como o processo evolucionário deu forma à história e expõe o tempo que passou durante o processo evolutivo Auxilia a instituir o desenvolvimento de fármacos e vacinas de maneira mais ágil 222 6 D Em relação às particularidades que devem ser atribuídas aos profissionais que escolhem seguir a carreira da bioinformática é imprescindível um conhecimento aprofundado da bioinformática e da biologia molecular Portanto a afirmativa I está incorreta Além disso é válido frisar que para seguir a carreira não é essencial somente o conhecimento da área da biologia mas tam bém da informática pois após a finalização do sequenciamento de um genoma empregase o uso de algoritmos computacionais para montagem e anotação Desse modo a afirmativa II está correta As análises que a bioinformática faz incluem os dados do sequenciamento de DNA do RNA e das proteínas além de detectar os nucleotídeos Nesse sentido a afirmativa III está incorreta Por fim é importante destacar que um bioinformata é um profissional que conta com os conhecimentos das biociências da informática e das ciências exatas para aquisição gerenciamento análise e prognóstico de dados coletados de fontes biológicas como DNA RNA proteínas e enzimas Dessa forma a afirmativa IV está correta UNIDADE 9 1 B A química é uma área importante na esfera forense uma vez que os profissionais utilizam os conhecimentos e as técnicas dela para analisar e identificar substâncias químicas tais como drogas medicamentos substâncias tóxicas que estejam relacionadas às práticas criminosas 2 A A realização das técnicas de biologia molecular em sua maioria requer como amostra materiais biológicos para extrair o DNA permitindo a identificação humana em um ato criminal 3 A As impressões digitais das mãos humanas têm sido usadas como meio confiável de identificação pessoal há mais de um século Durante esse tempo não foram encontrados dois padrões de impressão digital idênticos Portanto as duas asserções são verdadeiras e a segunda é uma justificativa correta da primeira 4 A A PCR foi uma das técnicas que permitiu a melhor identificação de materiais de interesse inves tigativo na genética forense Isso possibilitou a análise de materiais e de amostras armazenados que continham pouca quantidade de DNA A afirmativa II está incorreta pois os vestígios cole tados em locais de crime não devem ser necessariamente processados para obtenção do perfil de DNA quando houver amostras referências para comparação A afirmativa III também está incorreta visto que a análise de DNA por ser uma prova técnica que utiliza protocolos e kits comerciais validados para identificação humana e baseada em cálculos estatísticos não pode ser considerada infalível nem ser usada como prova única 223 5 B A afirmativa I é falsa pois os procedimentos técnicos e científicos utilizados pelos peritos não se assemelham com os usados nas séries principalmente no que se diz respeito ao tempo real de resposta do problema Já a afirmativa II está correta visto que o método de chegar ao autor do crime realmente não é bem retratado na ficção Muitas vezes as séries apresentam as respostas rápidas sendo que na vida real há processos que demoram mais tempo a ser analisados que outros Por fim a afirmativa III é verdadeira já que na ficção quem faz a investigação também analisa as provas no laboratório Esse é o caso dos inspetores do CSI Essa situação raramente acontece nos laboratórios verdadeiros dado que cada pessoa tem uma função 6 C É necessário comunicar desde logo à Justiça uma eventual circunstância adversa que possa influir na conclusão do trabalho pericial para o qual o perito foi nomeado MEU ESPAÇO