·
Cursos Gerais ·
Botânica
Send your question to AI and receive an answer instantly
Recommended for you
Preview text
Universidade Federal de Viçosa\nDepartamento de Biologia Vegetal\n\nMÉTODOS HISTOQUÍMICOS EM VEGETAIS\n\nProf. Dra. Lia Ascensão\nFaculdade de Ciências da Universidade de Lisboa\n\nJulho 2004 Universidade Federal de Viçosa\nDepartamento de Biologia Vegetal\n\nMÉTODOS HISTOQUÍMICOS EM VEGETAIS\n\nProf. Dra. Lia Ascensão\nCentro de Biotecnologia Vegetal\nDepartamento de Biologia Vegetal\nFaculdade de Ciências da Universidade de Lisboa\n\nNo âmbito da disciplina BVE 792 “Tópicos Especiais em Botânica III”\ndo Programa de Pós-graduação em Botânica da UFV\n\nJulho 2004 ÍNDICE\n\n1. DETECÇÃO DE LIPÍDOS ...................................................................... 1\n 1.1. Lipídios Totais ....................................................................................... 1\n 1.1.1. Em Luz Visível ....................................................................... 1\n 1.1.2. Em Luz Ultravioleta .............................................................. 2\n 1.2. Lipídios Ácidos e Neutros .............................................................. 2\n 1.3. Lipídios Insaturados .................................................................... 3\n 1.4. Ácidos Gordos ................................................................................ 3\n\n2. DETECÇÃO DE TERPENÓIDES .................................................... 4\n 2.1. Óleos Essenciais e Oleoresinas ................................................ 4\n 2.2. Esteróides ...................................................................................... 5\n 2.2.1. Em luz visível e em luz ultravioleta ............................ 5\n 2.3. Lactonas sesquiterpênicas ...................................................... 5\n 2.4. Terpenoides com Grupos Carbonilo ...................................... 6\n 2.5. Borracha ....................................................................................... 7\n 2.5.1. Em luz visível e em luz ultra violeta ............................. 7\n 2.5.2. Em luz ultra violeta .............................................................. 7\n\n3. DETECÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS ............................... 8\n 3.1. Compostos Fenólicos Gerais ...................................................... 8\n 3.1.1. Em Luz Visível ...................................................................... 8\n 3.1.2. Em Luz Ultravioleta ............................................................. 10\n 3.2. Taninos ............................................................................................ 10\n 3.3. Lentinhas ....................................................................................... 11\n\n4. DETECÇÃO DE ALCALÓIDES ......................................................... 12\n\n5. DETECÇÃO DE GLUCÍDOS ............................................................... 13\n 5.1. Polissacarídeos Gerais ................................................................. 13\n 5.1.1. Em luz visível ..................................................................... 13\n 5.1.2. Em luz ultravioleta .............................................................. 14\n 5.2. Aminó ............................................................................................ 15\n 5.3. β-1,3 e β-1,4 Glucanos ............................................................... 15\n 5.3.1. Em luz ultravioleta .............................................................. 15 5.4. Calose .................................................................................... 15\n5.4.1. Em luz azul ................................................................... 16\n5.5. Pectinas .............................................................................. 15\n5.6. Mucopolissacarídeos Ácidos .................................. 16\n5.7. Mucilagens ....................................................................... 16\n6. DETECÇÃO DE PROTEÍNAS ......................................... 17\n6.1. Proteínas totais ................................................................ 17\n6.1.1. Em luz visível ............................................................... 17\nANEXO ....................................................................................... 19\nREFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................... 21 1. DETECÇÃO DE LIPÍDOS .................................................... 1\n1.1. Lipídios Totais ................................................................. 1\n1.1.1. Em Luz Visível ............................................................ 1\nOs Sudões são corantes, lisocromos, usados na detecção geral de lipídios por um\nprocesso físico em que ocorre partilha entre os lipídios e o solvente do lisocromo. As\nmoléculas do lisocromo têm maior afinidade para os lipídios do que o solvente onde\nestão dissolvidos (Etnol a 70% ou Polietilenoglicol 400). Só os lipídios em fase líquida à\ntemperatura ambiente são capazes de dissolver o lisocromo, pelo que é impossível por este\nmétodo detectar lipídios na fase cristalina.\nVermelho Sudão IV, Negro Sudão B (Pearse, 1980)\n• Procedimento:\n• Solução saturada de Vermelho Sudão IV ou de Negro Sudão B (±0.3%) em Etanol a\n70% durante 15 min. à temperatura ambiente ou a 60ºC.\n• Lavagem rápida em Etanol a 70%.\n• Lavagem rápida em água.\nControle:\n• Os cortes são previamente tratados com uma mistura de Metanol / Cloroformio / água/\nÁcido Clorídrico (66:33:4:1) durante 3 horas à temperatura ambiente.\nResultado:\n• Os lipídios coram de vermelho com o Vermelho Sudão IV e de azul a negro com o\nNegro Sudão B.\nVermelho Sudão 7B (Brundrett et al., 1991)\n• Procedimento:\n• Vermelho Sudão 7B a 0.1% em Polietilenoglicol 400 e Glicerol a 90% (v/v) durante\n60 min. à temperatura ambiente.\n• Lavagem rápida em água.\nControle:\n• Idêntico ao anterior.\nResultado:\n• Os lipídios coram de carmim com o Vermelho Sudão 7B. 1.1.2. Em Luz Ultrarvioleta ......................................................... 1\nVermelho Neutro (Kirk, 1970)\nO Vermelho Neutro, como fluorocromo para lipídios, induz uma fluorescência\namarela ou azul esverdeada, que depende da composição dos diferentes tipos de lipídios.\nProcedimento:\n• Vermelho Neutro a 0.1% em Tampão Fosfato de Sódio a 0.1 M pH 6.5 durante\n20 min.\n• Lavagem rápida em água.\nControle:\n• Idêntico ao do teste anterior.\nResultado:\n• Os lipídios apresentam fluorescência amarela ou azul esverdeada, de acordo com a sua\ncomposição.\n1.2. Lipídios Ácidos e Neutros\nSulfato Azul do Nilo (Cain, 1947)\nO Sulfato Azul do Nilo é um corante alocromático que permite distinguir\ndiferencialmente lipídios neutros de lipídios ácidos, devido à presença de uma oxazina de\ncor vermelha (lisocromo) e de uma oxazina de 'cor azul. A oxazina dissolve-se nos lipídios\nneutros (gorduras), enquanto que a oxazina, uma base livre, reage com os grupos carboxilo\ndos ácidos gordos livres e com os resíduos de ácido ortofosfórico dos fosfolipídios.\nProcedimento:\n• Sulfato Azul do Nilo durante 5 min. a 60ºC.\n• Ácido Acético a 1% durante 30 seg. a 1 min. a 60ºC.\n• Lavagem rápida em água.\nSulfato Azul do Nilo\n- Sulfato Azul do Nilo a 1% ................................... 200 ml\n- Ácido Sulfúrico a 1% ............................................... 10 ml\n- Deixar ferver quatro horas, arrefecer, filtrar e guardar. A solução deve estar o pH 2 para evitar a\ncoloração de compostos não lipídicos.\nControle:\n• Idêntico ao utilizado para os lipídios gerais. Resultado:\n\n• Os lipídios neutros coram de rosa enquanto que os lipídios ácidos coram de azul.\n\n1.3. Lipídios Insaturados\n\nTetróxido de Ósmio (Ganter & Jollets, 1969, 1970)\n\nNa presença de lipídios com duplas ligações (C=C), como por exemplo os ácidos gordos, o Tetróxido de Ósmio é reduzido formando um composto negro. Ao detectar a presença de duplas ligações o OsO4 pode reagir com outros compostos como por exemplo os orço-dihidroxiifenóis.\n\nProcedimento:\n\n• Tetróxido de Ósmio a 1% durante 1 hora (na hot).\n• Lavagem em água.\n\nControle:\n\n• Idêntico ao utilizado para os lipídios gerais.\n\nResultado:\n\n• Os lipídios insaturados coram de negro.\n\n1.4. Ácidos Gordos\n\nAcetato de Cobre / Ácido Rubeânico (Ganter & Jollets, 1969, 1970)\n\nEste método de caracterização diferencial de lipídios baseia-se na formação de sabões cúpricos por reação dos ácidos gordos livres com o acetato de cobre. Os íons de cobre que não formam ligações com os ácidos gordos livres são eliminados pelo Etileno-diamina-tetraacético (EDTA), sendo os fixados evidenciados revelados pelo Ácido Rubeânico (ditioxamida), sob a forma de um precipitado verde-escuro.\n\nProcedimento:\n\n• Acetato de Cobre a 0.05% durante 3 horas.\n• Solução de Na2EDTA a 0.1% em Tampão Fosfato de Sódio 0.1 M, pH 7.1 durante 5 min.\n• Lavagem em Água durante 10 min.\n• Ácido Rubeânico a 0.1% em Etanol a 70% (recém preparado) durante 30 min.\n• Lavagem em Etanol a 70% durante 5 min.\n• Lavagem rápida em água.\n Controle:\n\n• Idêntico ao utilizado para os lipídios gerais.\n\nResultado:\n\n• Os ácidos gordos livres coram de verde-escuro.\n\n2. DETECÇÃO DE TERPENÓIDES\n\n2.1. Óleos Essenciais e Oleoresinas\n\nReagente de NADI (David & Carde, 1964)\n\nO reagente de NADI (uma mistura de dois componentes incolores, o α-naftol e o Cloridrato de Dimetilparafenileno Diamina) origina por oxidação Azul de Indofenol, composto fortemente lipossolúvel que altera a cor por variação do pH, permitindo uma coloração diferencial de essências e ácidos resinosos.\n\nProcedimento:\n\n• Reagente de NADI (recém preparado) durante 1 hora à temperatura ambiente ou escuro.\n• Lavagem em Tampão Fosfato de Sódio 0.1 M, pH 7.2 durante 2 min.\n• Reagente de NADI\n\n• α-naftol a 0.1% em Etanol a 40%......................0.5 ml\n• Cloridrato de Dimetilparafenileno diamina a 1%........0.5 ml\n• Tampão Fosfato de Sódio 0.05 M, pH 7.2..................49.0 ml\n\nControle:\n\n• Idêntico ao utilizado para os lipídios gerais.\n\nResultados:\n\n• As essências coram de azul e os ácidos resinosos coram de vermelho escuro. A ocorrência de uma mistura de essências e de ácidos resinosos é evidenciada por uma coloração que vai do violeta ao púrpura, de acordo com a predominância destes componentes.\n 2.2. Esteróides\n\n2.2.1. Em luz visível e em luz ultravioleta\n\nTricloreto de Antimônio (Hardman & Sofowora, 1972; Mace et al., 1974)\n\nEste método de caracterização diferencial de terpenóides é indicado para a deteção de esteróides. De acordo com alguns autores, a presença destes compostos é evidenciada por uma coloração vermelha que ocorre provavelmente devido à quelacão do íon Antimônio (Sb3+) pelo aldeído e pelo grupo hidroxilo ligado ao C7 de alguns terpenóides (por ex. gossipol). Contudo para outros, a reação parece depender da presença de uma dupla ligação em C5 (Δ5) e não do grupo hidroxilo. Com moléculas sem insaturação em C5 não se observa a formação de produto corado.\n\nProcedimento:\n\n• Solução saturada de Tricloreto de Antimônio em Ácido Perclórico a 60%, a quente (60ºC) ou à temperatura ambiente.\n• Montar diretamente os cortes no reagente.\n• Observar ao fim de 3 a 10 min., em luz visível ou ultravioleta.\n\nControle:\n\n• Adicionar também extremos prenotados tratados com Tetróxido Boretode de Sódio a 1% (recém preparado) durante 10 min. e lavados ulteriormente em água (3 x 15 min.).\n\nResultado:\n\n• Os esteróides coram de vermelho-alaranjado em luz visível e de amarelo a púrpura em luz ultravioleta.\n\n2.3. Lactonas sesquiterpênicas\n\nÁcido Sulfúrico (Geissman & Griffin, 1971)\n\nAs lactonas sesquiterpênicas reagem com os ácidos fortes dando origem a compostos intensamente corados.\n\nProcedimento:\n\n• Montar os cortes diretamente em Ácido Sulfúrico e observar imediatamente.\n\nResultado:\n\n• As lactonas sesquiterpênicas coram de vermelho-acastanhado. Reação Modificada de Abraham (Caniato et al., 1989)\nEste método de detecção de peróxidos pode ser utilizado para revelar lactonas sesquiterpênicas, que são frequentemente peróxidos de natureza terpênica.\nProcedimento:\n• Solução metanólica de Tiocianato de Ferroso (recém-preparada) durante 15 a 20 minutos, em recipiente fechado.\n• Lavagem rápida em água.\n\nSolução metanólica de Tiocianato de Ferroso\n• Solução metanólica saturada de Sulfato Ferroso ............ I V\n• Solução metanólica saturada de Tiocianato de Amônio .... I V\n\nControle:\n• Aplicar o método a secções previamente tratadas com Clorofórmio durante 30 min.\n\nResultado:\n• As lactonas sesquiterpênicas coram de vermelho-acastanhado.\n\n2.4. Terpenoides com Grupos Carbonilo\n2,4-Dinitrofenilhidrazina (Ganter & Jollès, 1969; 1970)\nEste reagente é usado na detecção de compostos com grupo carbonilo. A dinitrofenilhidrazina reage com aldeídos e cetonas formando dinitrofenilhidrazonas coradas.\n\nProcedimento:\n• Solução saturada de 2,4-Dinitrofenilhidrazina em HCl 2N à temperatura ambiente durante 10 min.\n• Lavagem em água.\n\nControle:\n• Aplicar o método a cortes previamente tratados com Tetrahidreto Boro de Sódio a 1% (recém preparado) durante 10 min. e ulteriormente lavados em água (3 x 15 min.). Realizar também um controle utilizando apenas o Ácido Clorídico 2N, durante 1 min.\n\nResultado:\n• Alguns terpenoides, ecosteroides, coram de vermelho alaranjado. 2.5. Borracha\n2.5.1. Em luz visível e em luz ultra violeta\nOil Red O ou Oil Blue N (Pearse, 1968 modificado por Jayabalan & Shah, 1986)\nO ácido fórmico coagula as partículas de borracha que são reveladas por estes lisocromos.\n\nProcedimento:\n• Solução saturada de Oil Red O ou Oil Blue N em Ácido Fórmico a 90% durante 3 a 5 min.\n• Lavagem em água.\n• Montagem em glicerina para luz visível ou em glicerina a 50% para fluorescência.\n\nResultado:\n• As partículas de borracha coram de vermelho em luz visível e fluorescem de vermelho pálido em UV.\n\n2.5.2. Em luz ultra violeta\nDansyl chloride (Jayabalan & Siah, 1986)\nO cloreto de dansil (dimetilaminonafthalene sulfonic acid) reage com os amino ácidos e proteínas dando origem a um complexo secundário fluorescente de cor esbranquiçada. A ocorrência desta fluorescência em secções, em que previamente se extraíram as resinas e os lipídios e em que se removeram as proteínas, permite assumir que se deve à presença de glóbulos de borracha.\n\nProcedimento:\n• Mistura de Acetona/Água 88:12 (v/v) durante 3x15 min. a 55C (para extração de resinas)\n• Mistura de Clorofórmio/Metanol 1/1 (v/v) durante 30 min. (para extração de lipídios)\n• Lavagem em Hidróxido de sódio a 5% em Etanol a 95% durante 30 segundos com agitação.\n• Lavagem em Ácido Clorídico 2N durante 2x3min.\n• Lavagem em água.\n• Pepsina (pH 6) durante 6 horas (para extração de proteínas).\n• Lavagem rápida, com agitação, em ácido tricloroacético a 10% (para remover as proteínas precipitadas). • Etanol a 70% durante 5min.\n• Lavagem em água.\n• Lavagem em Bicarbonato de sódio a 1% (pH 8 - 9)\n• Cloreto de Dansil (1mg/4ml de acetona) durante 2 a 3 min.\n• Lavagem em água.\n• Montagem em Bicarbonato de sódio a 1% (para evitar o background durante a fotografia).\n\nResultados:\n• As partículas de borracha fluorescem de branco.\n\nOil-Red O/Cloreto de Dansil (Jayabalan & Siah, 1986)\nA reação realiza-se em seções em que os lípidos e as proteínas foram extraídos de modo idêntico ao teste anterior.\n\nProcedimento:\n• Solução saturada de Oil Red O em Ácido Fórmico a 90% durante 3 a 5min.\n• Cloreto de Dansil (1 mg/4 ml de Isopropanol a 60%)\n• Lavagem em água.\n• Montagem em Bicarbonato de sódio a 1%.\n\nResultado:\n• As partículas de borracha fluorescem de branco.\n\n3. DETECÇÃO de COMPOSTOS FENÓLICOS\n3.1. Compostos Fenólicos Gerais\n3.1.1. Em Luz Visível\nCloreto de Ferro III (Johansen, 1940)\nNeste teste, vulgarmente utilizado para a deteção de fenóis simples, os orto-dihidroxi fenóis complexam o ião ferro, originando precipitados intensamente corados.\n\nProcedimento:\n• Cloreto de Ferro III a 10% durante 15 a 30 min.\n• Lavagem rápida em água. Controle:\n\nNão existe dado que o grupo fenóil está presente num número elevado e biomoléculas.\nContudo pode aplicar-se numa rodela de papel de filtro padrões dissolvidos em metanol e secretado da planta, tratando essas rodelas como tecido vegetal.\n\nResultado:\n\nOs fenóis coram de verde intenso, púrpura, azul ou negro.\n\nDicromato de Potássio (Gabe, 1968)\nO método baseia-se na formação de um produto corado por condensação dos grupos -OH livres dos fenóis com o crómio do reagente.\n\nProcedimento:\n- Dicromato de Potássio a 10% durante 15 a 30 min.\n- Lavagem rápida em água.\n\nControle:\n- Idêntico ao utilizado para o cloreto de ferro.\n\nResultado:\n\nOs fenóis coram de castanho avermelhado.\n\nDiazoreacção (Ganter & Jollés, 1969; 1970)\nO método baseia-se na formação de um complexo ácido corado, por condensação do fenol com um sal de diazônio, em meio alcalino. Tanto o fenol como o sal de diazônio são incolores, contudo o produto da reação é corado. A diazoreacção é característica dos compostos fenólicos com um grupo -OH livre e sem substituintes em posição orto ou para, relativamente ao -OH.\n\nProcedimento:\n- Fast-Blue B a 0,1% em Tampão Veronal 0,1M, pH 7,5-8,5 (recém-preparado) durante 1 a 2 min a 4ºC.\n- Lavagem em HCl a 1% em Etanol a 70% durante 3 x 2 min.\n- Lavagem rápida em água.\n\nControle:\n- Idêntico ao utilizado para o cloreto de ferro. Resultado:\n\nOs fenóis coram de vermelho.\n\n3.1.2. Em Luz Ultravioleta\nAção de fluorocromos (Charrière-Ladreix, 1976)\nAlguns fluorocromos, tais como o Cloreto de Alumínio, o Acetato de Magnésio, o Acetato Neutro de Chumbo e o Reagente de Wilson (Mistura Citraborética de Wilson), ao reagirem com os flavonoides induzem uma fluorescência secundária, mais ou menos estável em meio ácido.\n\nProcedimento:\n- Fluorocromo durante 15 a 30 min.\n- Lavagem rápida no solvente.\n\nUtilizam-se os seguintes fluorocromos:\n- Cloreto de Alumínio a 5-15% (solução aquosa ou metanólica).\n- Acetato de Magnésio a 5% (solução metanólica).\n- Acetato Neutro de Chumbo 1-3% (solução aquosa).\n- Reagente de Wilson (Ácido Cítrico a 10% em Acetona e solução saturada de Ácido Bórico em Acetona V.V).\n\nControle:\n- Verificar se o fluorocromo tem, por si só fluorescência. Observar também em paralelo secções que não foram submetidas à ação dos fluorocromos.\n\nResultado:\n\nOs flavonóides emitem uma fluorescência secundária, mais ou menos intensa, de cor amarela-esverdeada em presença do Cloreto de Alumínio, Acetato de Magnésio e Acetato Neutro de Chumbo. As agliconas flavonócidas emitem uma fluorescência amarela muito intensa com o Reagente de Wilson.\n\n3.2. Taninos\n\nVanilina Clorídrica (Mace & Howell, 1976)\nO método fundamenta-se na formação de um produto de condensação resultante da reação dos grupos aldeídicos da vanilina com fenóis.\n\nProcedimento:\n- Vanilina a 0,5% em Ácido Clorídrico a 9% durante 10 min. Montagem em Ácido Clorídrico a 9%.\n\nControle: \n\nSecções montadas apenas em Ácido Clorídrico a 9%.\n\nResultado:\n\nOs taninos coram de vermelho.\n\n3.3. Lenhinas\nFloroglucinol (Johansen, 1940)\nO Floroglucinol, ao reagir com o álcool coniférico, forma um complexo vermelho em meio cloridrico.\n\nProcedimento:\n- Floroglucinol em HCl a 20% durante 1 a 2 min.\n\nResultado:\n\nAs lenhinas coram de vermelho.\n\n4. Detecção de Alcalóides\nOs alcalóides precipitam por ação de bases, de ácidos oxigenados, de sais de metais pesados e de halogéneos, tal como outros compostos que possuem grupos básicos azotados.\n\nReagente de Dragendorff (Swendset & Verpoorte, 1983)\nEste reagente permite detectar o azoto terciário ou quaternário, não revelando as aminas primárias e secundárias a não ser que se encontrem em concentração muito elevada.\n\nProcedimento:\n- Reagente de Dragendorff durante 5 a 10 min.\n- Lavagem rápida em Nitrito de Sódio a 5%.\n- Lavagem em água.\n\nSolução stock do Reagente de Dragendorff:\n- Nitrato de Bismuto a 12,3% em água contendo 25% de Ácido Acético... 25 ml\n- Iodeto de Potássio a 40%... 10 ml\n- A solução stock pode ser guardada durante 6 meses. Na altura de usar retirar 5 ml desta solução, juntar 10 ml de Ácido Acético e passar com água destilada até 100 ml. Controle:\n• Aplicar o método a seções previamente tratadas com Ácido Tartárico a 5% em Etanol a 95% durante 48 – 72 horas.\n\nResultado:\n• Os alcaloides coram de castanho-avermelhado.\n\nReagente de Wagner (Furr & Mahlberg, 1981)\nProcedimento:\n• Reagente de Wagner durante 5 a 10 min.\n• Lavagem rápida em água.\n\nReagente de Wagner\n• Iodeto de Potássio,.................................2 g\n• Iodo,....................................................1,27 g\n• Água,...................................................100 ml\n\nControle:\n• Idêntico ao do teste anterior.\n\nResultado:\n• Os alcaloides coram de vermelho.\n\nReagente de Dittmar (Furr & Mahlberg, 1981)\nProcedimento:\n• Reagente de Dittmar durante 5 a10 min.\n• Lavagem em água.\n\nReagente de Dittmar\n• Iodeto de Potássio,.................................1 g\n• Iodo,...................................................1 g\n• Água,...................................................10 ml\n\nControle:\n• Idêntico ao do teste anterior.\n\nResultado:\n• Os alcaloides coram de castanho-avermelhado. Reagente de Ellram (Furr & Mahlberg, 1981)\nProcedimento:\n• Reagente de Ellram (vanilina a 1% em Ácido Sulfúrico a 40%) durante 5 a10 min.\n• Lavagem em água.\n\nControle:\n• Idêntico ao do teste anterior.\n\nResultado:\n• Os alcaloides coram de castanho-avermelhado.\n\n5. DETECÇÃO DE GLÚCIDOS\n5.1. Polissacarídeos Gerais\n5.1.1. Em luz visível\nÁcido Periódico / Reagente de Schiff (PAS) (McManus, 1948)\nEste teste baseia-se na oxidação, pela ação do Ácido Periódico, dos grupos 1,2-glícidos dos resíduos de glucose constituintes dos macromoléculas glucídicas. Por cada resíduo de glucose formam-se duas funções \"aldeído\", como consequência da quebra da ligação entre os carbonos portadores de radicais -OH. Os grupos carbonilo, assim formados, dão origem em presença do Reagente de Schiff a um produto de condensação cor-de-rosa. Os grupos carbonilo endógenos podem ser bloqueados pela Dimedona (5,5 Dimetilcicloxano 1,3 diona) ou reduzidos pelo Tetraidreto Boro de Sódio, de modo que só os grupos carbonilo formados durante a reação sejam corados.\n\nProcedimento:\n• Tetraidreto Boreto de Sódio a 1% (recém preparado) durante 30 min ou solução saturada de Dimedona toda a noite.\n• Ácido Periódico a 1% durante 10 min.\n• Lavagem rápida em água.\n• Reagente de Schiff durante 15 min.\n• Água Lavagem em Metabissulfito de Sódio(1g de Metabissulfito de Sódio + 10 ml HCl 1N + 190 ml de água) durante 3 x 2 min.\n• Lavagem em água. Reagente de Schiff\n• 2 g Fucsina Diamante (Paroranilina) em 60 ml Ácido Clorídrico 1N.\n• 2 g de Metabissulfito de Sódio em 100 ml Água Destilada.\n• Misturar bem as duas soluções e deixar repousar 24 horas, em frasco bem rolhado.\n• Adicionar 1,2 g de Carvão Ativado e agitar durante 2 minutos.\n\nControle:\n• Aplicar o método omitindo o tratamento com Ácido Periódico.\n\nResultado:\n• O amido e os polissacarídeos da parede celular coram intensamente de rosa assim como alguns fenóis. A celulose e a calose não coram.\n\n5.1.2. Em luz ultravioleta\nÁcido Periódico / Acriflavina-Pseudo Schiff (F-PAS) (Clark, 1981)\nVários reagentes do tipo Schiff são obtidos por adição de anidrido sulfuroso (SO) a soluções aquosas de corantes básicos da série aminoacídica. A acriflavina e a acridina orange têm origem em presença do Reagente de Schiff. Resultado:\n• Os polissacarídeos fluorescem de amarelo a laranja.\n\n5.2. Amido\nLugol (Jensen, 1940)\nO iodo de Potássio (KI) é um sal iônico, que provoca a ruptura das pontes de hidrogênio e a consequente separação das várias unidades de glucose que constituem a macromolécula de amido. O KI permite, desta forma, que o iodo se acumule na molécula de amido.\n\nProcedimento:\n• Lugol (solução de iodo a 0,5% adicionada de iodeto de potássio a 1%) durante 5 a 10 min.\n• Lavagem em água.\n\nResultado:\n• O amido cora de roxo.\n\n5.3. β-1,3 e β-1,4 Glucanos\n5.3.1. Em luz ultravioleta\nCalcefluor White (Hughes & McCully, 1975)\nEste fluorocromo, amplamente usado no fabrico de detergentes como agente branquedor, ao ligar-se fortemente às fibras vegetais permite a deteção de β-glucanos.\n\nProcedimento:\n• Calcefluor White MR2 a 0,01% durante 5 a 10 min.\n• Lavagem rápida em água.\n\nResultado:\n• A celulose, os polissacarídeos carboxilados, os β-1,3 e os β-1,4 glucanos, as pectinas e alguns polissacarídeos das mucilagens fluorescem de azul pálido.\n\n5.4. Pectinas\nVermelho de Rutênio (Johansen,1940)\nO Vermelho Rutênio é um composto catiônico hexavalente que, in vitro, na ausência de Tetróxido do Ósmio reage com substâncias ácidas de natureza muita diversa. Procedimento:\n• Vermelho de Rutênio a 1000 p.p.m. durante 10 min.\n• Lavagem rápida em Água.\n\nResultado:\n• As pectinas coram intensamente de rosa.\n\n5.5. Calose\n5.5.1. Em luz azul\nAzul de Anilina (Smith & McCully, 1978)\nProcedimento:\n• Azul de Anilina a 0,05% em Tampo Fosfato de Potássio 0,06 pH 8 (recém-preparada) ou armazenada no frigorífico) durante 5min.\n\nResultado:\n• A calose fluoresce de amarelo pálido.\n\n5.6. Mucopolissacarídeos Ácidos\nAzul de Alciano (Pearse, 1980)\n• A pH controlado (2,4 - 2,6), os grupos dos mucopolissacarídeos ácidos (carboxílico e sulfato) reagem provavelmente com os grupos isotiorônicos do Azul de Alciano, uma flaloceaniaina cúprica, retendo o corante.\n\nProcedimento:\n• Azul Alciano 8 GX a 1% em Ácido Acético a 3% a pH 2,5 durante 30 min.\n• Lavagem em Água durante 5 min.\n\nResultado:\n• Os mucopolissacarídeos ácidos das paredes celulares ou das secreções coram de azul-turquesa. Ácido Tânico/Cloreto de Ferro III (Pizzolato & Lillie, 1973)\nO método fundamental-se na reação do ácido tânico com os grupos amina presentes nas proteínas das mucilagens. O complexo formado é depois revelado pelo cloreto de ferro,\n\nProcedimento:\n• Ácido Tânico a 5% durante 10 min.\n• Lavagem em água.\n• Cloreto de Ferro III a 3% durante 1 min.\n• Lavagem rápida em água.\n\nControle:\n• Secções apenas tratadas com Ácido Tânico ou só com Cloreto de ferro III.\n\nResultado:\n• As mucilagens coram de negro.\n\n6. Deteção de proteínas\n6.1. Proteínas totais\n6.1.1. Em luz visível\nAzul Mercúrio de Bromofenol (Mazia et al., 1953)\nO mercúrio ao reagir com os grupos carboxilo e hidroxilo das proteínas forma um complexo, em que os grupos hidroxilo, envolvidos nas ligações de hidrogênio intramoleculares, ficam disponíveis para o estabelecimento de pontes de hidrogênio com o corante.\n\nProcedimento:\n• Azul de Bromofenol a 0,1% em Etanol a 95% adicionado de Cloreto de Mercúrio (10% final) durante 10 min.\n• Ácido Acético a 0,5% durante 3 x 5 min.\n• Lavagem rápida em água.\n• Lavagem em Tampo Fosfato de Sódio 0,1 M pH 7,0 durante 3 min.\n\nControle:\n• Aplicar o método a secções previamente tratadas com uma solução de Anidrido Acético a 10% em Piridina durante 2 a 4 horas. Resultado:\n\n• As proteínas coram de azul claro.\n\nAzul Brilhante de Comassie (Fischer, 1968)\n\nO Azul Brilhante de Comassie é um corante muito sensível que existe sob duas formas, uma vermelha e uma azul. Por ligação do corante à proteína, a forma vermelha é convertida na forma azul, provocando um desvio na banda de absorção máxima de 465 para 595 nm. Tal facto permite determinar por espectrofotometria a quantidade da proteína de uma amostra.\n\nProcedimento:\n\n• Azul de Comassie R250 a 0,25% em ácido acético a 7% temperatura ambiente ou a quente.\n• Lavagem em Ácido Acético a 7%\n• Lavagem rápida em água\n\nControle:\n\n• Idêntico ao teste anterior.\n\nResultado:\n\n• As proteínas coram de azul claro. ANEXO\n\nTampão Fosfato de Sódio 0,1 M\nSoluções stock\n\nA - Fosfato de sódio monobásico 0,2 M\n(27,8 g de NaH2PO4.7H2O em 100 ml de água)\n\nB - Fosfato de sódio dibásico 0,2 M\n(53,6 g de Na2HPO4.7H2O em 1000 ml de água) ou\n(71,7 g de Na2HPO4.12H2O em 1000 ml de água)\n\nDe acordo com o pH pretendido misturar:\n\nx ml de A com ml de B e perfazer com água destilada para 200 ml.\n\nA | B | pH\n51,0 | 49,0 | 6,8\n39,0 | 61,0 | 7,0\n72,0 | 72,0 | 7,2\n81,0 | 81,0 | 7,4\n87,0 | 87,0 | 7,6\n91,5 | 91,5 | 7,8\n5,3 | 94,7 | 8,0\n\nTampão cacodilato de sódio 0,1 M\nSoluções Stock\n\n• A - cacodilato de sódio 0,2 M\n(42,8 g de Na(CH3)AsO2.3H2O em 1000 ml de água\n• B - HCl 0,2 M\n\nDe acordo com o pH pretendido, misturar:\n\n50 ml de A + x ml de B e perfazer com água para 200 ml\n\nx | pH\n2,7 | 7,4\n4,2 | 7,2\n6,3 | 7,0\n9,3 | 6,8 Tampão veronal de sódio 0,1 M\nSoluções stock\n\nA - Solução veronal (barbitral) de sódio a 0,2 M\n(41,2 g em 1000 ml)\n\nB - HCl 0,2 M\n\nDe acordo com o pH pretendido, misturar:\n\n50 ml de A + x ml de B e perfazer com água para 200 ml\n\nx | pH\n17,5 | 8,0\n22,5 | 7,8\n25,5 | 7,6\n32,5 | 7,4\n43,0 | 7,2\n45,0 | 6,8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS\n\nBrundrett MC, Kendrick B & Peterson CA (1991). Efficient lipid staining in plant material with Sudan Red 7B or Floral Yellow 088 in polyethylene glycol-glycerol. Biotech. & Histochem. 66: 111-116.\n\nCain AJ (1947). The use of Nile Blue in the examination of lipids. Quart. J. Microsc. Sci. 88: 383-392.\n\nCaniato R, Filippini R, Cappelletti EM & Appendino G (1989). Detection of peroxides in intact plant material. Fitoterapia LX: 549-551.\n\nCharrière-Ladraze Y (1976). Répartition intracellulaire du sécrét éventuellement de Populus nigra L. Planta 129: 167-174.\n\nClark G (1981). Staining procedures. Williams & Wilkins, Baltimore.\n\nDavid R & Carde JP (1964). Coloration différentielle des inclusions lipidique et terpéniques des pseudophylles du Pin maritime au moyen du reactif Nacl. C. R. Acad. Sci. Paris, Ser. D 258: 1338-1340.\n\n*Fisher DB (1968). Protein staining of ribbond Epon sections for light microscopy. Histochemie 16: 92-96.\n\nFurr M & Mahlberg PG (1981). Histochemical analyses of lactifiers and glandular trichomes in Cannabis sativa. J. Nat. Prod. 44: 153-159.\n\nGabe M (1968). Techniques histologiques. Masson & Cie, Paris.\n\nGanter P & Jollés G (1969, 1970). Histologie normale et pathologique. Vols I e II. Gauthier - Villars, Paris.\n\nGeissman TA & Griffin TS (1971). Sesquiterpene lactones: acid-catalyzed color reactions in and in situ isolation. Phytochemistry 10: 2475-2485.\n\nHardman R & Sowora EA (1972). Antimony chloride as test reagents for steroids, especially diosgenin and yamogenin, in plant tissues. Stain Technol. 47: 205-208.\n\nHigh OB (1984). Lipid histochemistry. Royal Microscopical Society Handbook 006. Oxford University Press, Oxford.\n\nHughes J & McCully ME (1975). The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain Technol. 50: 319-329.\n\nJayabalan M & Shah JJ (1986). Histochemical techniques to localize rubber in guayule (Parthenium argentatum Gray). Stain Technol. 61: 303-308.\n\nJensen WA (1962). Botanical histochemistry. WH Freeman and Co, San Francisco.\n\nJohansen DA (1940). Plant Microtechnique. McGraw-Hill, New York.\n\nKirk Jr PW (1970). Neutral red as a lipid fluorochrome. Stain Technol. 45: 1-4.\n\nMace ME, Bell A & Stipanović RD (1974). Histochemistry and isolation of gossypol and related terpenoids in roots of cotton seedlings. Phytopathol. 64: 1297-1302.\n\nMace ME & Howell CR (1974). Histochemistry and identification of condensed tannin precursor in roots of cotton seedlings. Can. J. Bot. 52: 2423-2426.\n\nMcManus JFA (1948). Histological and histochemical uses of periodic acid. Stain Technol. 23: 99-108. Mazia D, Brewer PA & Alfert M (1953). The cytochemistry staining and measurement of protein with mercuric bromophenol blue. Biol. Bull. 104: 57-67.\n\nPearse AGE (1980). Histochemistry theoretical and applied. Vol. II, 4th ed. Longman Group Limited.\n\nPizzolato TD & Lillie RD (1973). Mayer's tannic acid-ferric chloride stain for mucins. J. Histochem. Cytochem. 21: 56-64.\n\nReeve RM (1951). Histochemical tests for polyphenols in plant tissues. Stain Technol. 26: 91-96.\n\nSmith MM & McCully (1978). A critical evaluation of the specificity of aniline blue induced fluorescence. Protoplasma, 95: 229-254.\n\nSvendsen AB & Verpoorte R (1983). Chromatography of alkaloids. Elsevier Scientific Publishing Company, New York.
Send your question to AI and receive an answer instantly
Recommended for you
Preview text
Universidade Federal de Viçosa\nDepartamento de Biologia Vegetal\n\nMÉTODOS HISTOQUÍMICOS EM VEGETAIS\n\nProf. Dra. Lia Ascensão\nFaculdade de Ciências da Universidade de Lisboa\n\nJulho 2004 Universidade Federal de Viçosa\nDepartamento de Biologia Vegetal\n\nMÉTODOS HISTOQUÍMICOS EM VEGETAIS\n\nProf. Dra. Lia Ascensão\nCentro de Biotecnologia Vegetal\nDepartamento de Biologia Vegetal\nFaculdade de Ciências da Universidade de Lisboa\n\nNo âmbito da disciplina BVE 792 “Tópicos Especiais em Botânica III”\ndo Programa de Pós-graduação em Botânica da UFV\n\nJulho 2004 ÍNDICE\n\n1. DETECÇÃO DE LIPÍDOS ...................................................................... 1\n 1.1. Lipídios Totais ....................................................................................... 1\n 1.1.1. Em Luz Visível ....................................................................... 1\n 1.1.2. Em Luz Ultravioleta .............................................................. 2\n 1.2. Lipídios Ácidos e Neutros .............................................................. 2\n 1.3. Lipídios Insaturados .................................................................... 3\n 1.4. Ácidos Gordos ................................................................................ 3\n\n2. DETECÇÃO DE TERPENÓIDES .................................................... 4\n 2.1. Óleos Essenciais e Oleoresinas ................................................ 4\n 2.2. Esteróides ...................................................................................... 5\n 2.2.1. Em luz visível e em luz ultravioleta ............................ 5\n 2.3. Lactonas sesquiterpênicas ...................................................... 5\n 2.4. Terpenoides com Grupos Carbonilo ...................................... 6\n 2.5. Borracha ....................................................................................... 7\n 2.5.1. Em luz visível e em luz ultra violeta ............................. 7\n 2.5.2. Em luz ultra violeta .............................................................. 7\n\n3. DETECÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS ............................... 8\n 3.1. Compostos Fenólicos Gerais ...................................................... 8\n 3.1.1. Em Luz Visível ...................................................................... 8\n 3.1.2. Em Luz Ultravioleta ............................................................. 10\n 3.2. Taninos ............................................................................................ 10\n 3.3. Lentinhas ....................................................................................... 11\n\n4. DETECÇÃO DE ALCALÓIDES ......................................................... 12\n\n5. DETECÇÃO DE GLUCÍDOS ............................................................... 13\n 5.1. Polissacarídeos Gerais ................................................................. 13\n 5.1.1. Em luz visível ..................................................................... 13\n 5.1.2. Em luz ultravioleta .............................................................. 14\n 5.2. Aminó ............................................................................................ 15\n 5.3. β-1,3 e β-1,4 Glucanos ............................................................... 15\n 5.3.1. Em luz ultravioleta .............................................................. 15 5.4. Calose .................................................................................... 15\n5.4.1. Em luz azul ................................................................... 16\n5.5. Pectinas .............................................................................. 15\n5.6. Mucopolissacarídeos Ácidos .................................. 16\n5.7. Mucilagens ....................................................................... 16\n6. DETECÇÃO DE PROTEÍNAS ......................................... 17\n6.1. Proteínas totais ................................................................ 17\n6.1.1. Em luz visível ............................................................... 17\nANEXO ....................................................................................... 19\nREFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................... 21 1. DETECÇÃO DE LIPÍDOS .................................................... 1\n1.1. Lipídios Totais ................................................................. 1\n1.1.1. Em Luz Visível ............................................................ 1\nOs Sudões são corantes, lisocromos, usados na detecção geral de lipídios por um\nprocesso físico em que ocorre partilha entre os lipídios e o solvente do lisocromo. As\nmoléculas do lisocromo têm maior afinidade para os lipídios do que o solvente onde\nestão dissolvidos (Etnol a 70% ou Polietilenoglicol 400). Só os lipídios em fase líquida à\ntemperatura ambiente são capazes de dissolver o lisocromo, pelo que é impossível por este\nmétodo detectar lipídios na fase cristalina.\nVermelho Sudão IV, Negro Sudão B (Pearse, 1980)\n• Procedimento:\n• Solução saturada de Vermelho Sudão IV ou de Negro Sudão B (±0.3%) em Etanol a\n70% durante 15 min. à temperatura ambiente ou a 60ºC.\n• Lavagem rápida em Etanol a 70%.\n• Lavagem rápida em água.\nControle:\n• Os cortes são previamente tratados com uma mistura de Metanol / Cloroformio / água/\nÁcido Clorídrico (66:33:4:1) durante 3 horas à temperatura ambiente.\nResultado:\n• Os lipídios coram de vermelho com o Vermelho Sudão IV e de azul a negro com o\nNegro Sudão B.\nVermelho Sudão 7B (Brundrett et al., 1991)\n• Procedimento:\n• Vermelho Sudão 7B a 0.1% em Polietilenoglicol 400 e Glicerol a 90% (v/v) durante\n60 min. à temperatura ambiente.\n• Lavagem rápida em água.\nControle:\n• Idêntico ao anterior.\nResultado:\n• Os lipídios coram de carmim com o Vermelho Sudão 7B. 1.1.2. Em Luz Ultrarvioleta ......................................................... 1\nVermelho Neutro (Kirk, 1970)\nO Vermelho Neutro, como fluorocromo para lipídios, induz uma fluorescência\namarela ou azul esverdeada, que depende da composição dos diferentes tipos de lipídios.\nProcedimento:\n• Vermelho Neutro a 0.1% em Tampão Fosfato de Sódio a 0.1 M pH 6.5 durante\n20 min.\n• Lavagem rápida em água.\nControle:\n• Idêntico ao do teste anterior.\nResultado:\n• Os lipídios apresentam fluorescência amarela ou azul esverdeada, de acordo com a sua\ncomposição.\n1.2. Lipídios Ácidos e Neutros\nSulfato Azul do Nilo (Cain, 1947)\nO Sulfato Azul do Nilo é um corante alocromático que permite distinguir\ndiferencialmente lipídios neutros de lipídios ácidos, devido à presença de uma oxazina de\ncor vermelha (lisocromo) e de uma oxazina de 'cor azul. A oxazina dissolve-se nos lipídios\nneutros (gorduras), enquanto que a oxazina, uma base livre, reage com os grupos carboxilo\ndos ácidos gordos livres e com os resíduos de ácido ortofosfórico dos fosfolipídios.\nProcedimento:\n• Sulfato Azul do Nilo durante 5 min. a 60ºC.\n• Ácido Acético a 1% durante 30 seg. a 1 min. a 60ºC.\n• Lavagem rápida em água.\nSulfato Azul do Nilo\n- Sulfato Azul do Nilo a 1% ................................... 200 ml\n- Ácido Sulfúrico a 1% ............................................... 10 ml\n- Deixar ferver quatro horas, arrefecer, filtrar e guardar. A solução deve estar o pH 2 para evitar a\ncoloração de compostos não lipídicos.\nControle:\n• Idêntico ao utilizado para os lipídios gerais. Resultado:\n\n• Os lipídios neutros coram de rosa enquanto que os lipídios ácidos coram de azul.\n\n1.3. Lipídios Insaturados\n\nTetróxido de Ósmio (Ganter & Jollets, 1969, 1970)\n\nNa presença de lipídios com duplas ligações (C=C), como por exemplo os ácidos gordos, o Tetróxido de Ósmio é reduzido formando um composto negro. Ao detectar a presença de duplas ligações o OsO4 pode reagir com outros compostos como por exemplo os orço-dihidroxiifenóis.\n\nProcedimento:\n\n• Tetróxido de Ósmio a 1% durante 1 hora (na hot).\n• Lavagem em água.\n\nControle:\n\n• Idêntico ao utilizado para os lipídios gerais.\n\nResultado:\n\n• Os lipídios insaturados coram de negro.\n\n1.4. Ácidos Gordos\n\nAcetato de Cobre / Ácido Rubeânico (Ganter & Jollets, 1969, 1970)\n\nEste método de caracterização diferencial de lipídios baseia-se na formação de sabões cúpricos por reação dos ácidos gordos livres com o acetato de cobre. Os íons de cobre que não formam ligações com os ácidos gordos livres são eliminados pelo Etileno-diamina-tetraacético (EDTA), sendo os fixados evidenciados revelados pelo Ácido Rubeânico (ditioxamida), sob a forma de um precipitado verde-escuro.\n\nProcedimento:\n\n• Acetato de Cobre a 0.05% durante 3 horas.\n• Solução de Na2EDTA a 0.1% em Tampão Fosfato de Sódio 0.1 M, pH 7.1 durante 5 min.\n• Lavagem em Água durante 10 min.\n• Ácido Rubeânico a 0.1% em Etanol a 70% (recém preparado) durante 30 min.\n• Lavagem em Etanol a 70% durante 5 min.\n• Lavagem rápida em água.\n Controle:\n\n• Idêntico ao utilizado para os lipídios gerais.\n\nResultado:\n\n• Os ácidos gordos livres coram de verde-escuro.\n\n2. DETECÇÃO DE TERPENÓIDES\n\n2.1. Óleos Essenciais e Oleoresinas\n\nReagente de NADI (David & Carde, 1964)\n\nO reagente de NADI (uma mistura de dois componentes incolores, o α-naftol e o Cloridrato de Dimetilparafenileno Diamina) origina por oxidação Azul de Indofenol, composto fortemente lipossolúvel que altera a cor por variação do pH, permitindo uma coloração diferencial de essências e ácidos resinosos.\n\nProcedimento:\n\n• Reagente de NADI (recém preparado) durante 1 hora à temperatura ambiente ou escuro.\n• Lavagem em Tampão Fosfato de Sódio 0.1 M, pH 7.2 durante 2 min.\n• Reagente de NADI\n\n• α-naftol a 0.1% em Etanol a 40%......................0.5 ml\n• Cloridrato de Dimetilparafenileno diamina a 1%........0.5 ml\n• Tampão Fosfato de Sódio 0.05 M, pH 7.2..................49.0 ml\n\nControle:\n\n• Idêntico ao utilizado para os lipídios gerais.\n\nResultados:\n\n• As essências coram de azul e os ácidos resinosos coram de vermelho escuro. A ocorrência de uma mistura de essências e de ácidos resinosos é evidenciada por uma coloração que vai do violeta ao púrpura, de acordo com a predominância destes componentes.\n 2.2. Esteróides\n\n2.2.1. Em luz visível e em luz ultravioleta\n\nTricloreto de Antimônio (Hardman & Sofowora, 1972; Mace et al., 1974)\n\nEste método de caracterização diferencial de terpenóides é indicado para a deteção de esteróides. De acordo com alguns autores, a presença destes compostos é evidenciada por uma coloração vermelha que ocorre provavelmente devido à quelacão do íon Antimônio (Sb3+) pelo aldeído e pelo grupo hidroxilo ligado ao C7 de alguns terpenóides (por ex. gossipol). Contudo para outros, a reação parece depender da presença de uma dupla ligação em C5 (Δ5) e não do grupo hidroxilo. Com moléculas sem insaturação em C5 não se observa a formação de produto corado.\n\nProcedimento:\n\n• Solução saturada de Tricloreto de Antimônio em Ácido Perclórico a 60%, a quente (60ºC) ou à temperatura ambiente.\n• Montar diretamente os cortes no reagente.\n• Observar ao fim de 3 a 10 min., em luz visível ou ultravioleta.\n\nControle:\n\n• Adicionar também extremos prenotados tratados com Tetróxido Boretode de Sódio a 1% (recém preparado) durante 10 min. e lavados ulteriormente em água (3 x 15 min.).\n\nResultado:\n\n• Os esteróides coram de vermelho-alaranjado em luz visível e de amarelo a púrpura em luz ultravioleta.\n\n2.3. Lactonas sesquiterpênicas\n\nÁcido Sulfúrico (Geissman & Griffin, 1971)\n\nAs lactonas sesquiterpênicas reagem com os ácidos fortes dando origem a compostos intensamente corados.\n\nProcedimento:\n\n• Montar os cortes diretamente em Ácido Sulfúrico e observar imediatamente.\n\nResultado:\n\n• As lactonas sesquiterpênicas coram de vermelho-acastanhado. Reação Modificada de Abraham (Caniato et al., 1989)\nEste método de detecção de peróxidos pode ser utilizado para revelar lactonas sesquiterpênicas, que são frequentemente peróxidos de natureza terpênica.\nProcedimento:\n• Solução metanólica de Tiocianato de Ferroso (recém-preparada) durante 15 a 20 minutos, em recipiente fechado.\n• Lavagem rápida em água.\n\nSolução metanólica de Tiocianato de Ferroso\n• Solução metanólica saturada de Sulfato Ferroso ............ I V\n• Solução metanólica saturada de Tiocianato de Amônio .... I V\n\nControle:\n• Aplicar o método a secções previamente tratadas com Clorofórmio durante 30 min.\n\nResultado:\n• As lactonas sesquiterpênicas coram de vermelho-acastanhado.\n\n2.4. Terpenoides com Grupos Carbonilo\n2,4-Dinitrofenilhidrazina (Ganter & Jollès, 1969; 1970)\nEste reagente é usado na detecção de compostos com grupo carbonilo. A dinitrofenilhidrazina reage com aldeídos e cetonas formando dinitrofenilhidrazonas coradas.\n\nProcedimento:\n• Solução saturada de 2,4-Dinitrofenilhidrazina em HCl 2N à temperatura ambiente durante 10 min.\n• Lavagem em água.\n\nControle:\n• Aplicar o método a cortes previamente tratados com Tetrahidreto Boro de Sódio a 1% (recém preparado) durante 10 min. e ulteriormente lavados em água (3 x 15 min.). Realizar também um controle utilizando apenas o Ácido Clorídico 2N, durante 1 min.\n\nResultado:\n• Alguns terpenoides, ecosteroides, coram de vermelho alaranjado. 2.5. Borracha\n2.5.1. Em luz visível e em luz ultra violeta\nOil Red O ou Oil Blue N (Pearse, 1968 modificado por Jayabalan & Shah, 1986)\nO ácido fórmico coagula as partículas de borracha que são reveladas por estes lisocromos.\n\nProcedimento:\n• Solução saturada de Oil Red O ou Oil Blue N em Ácido Fórmico a 90% durante 3 a 5 min.\n• Lavagem em água.\n• Montagem em glicerina para luz visível ou em glicerina a 50% para fluorescência.\n\nResultado:\n• As partículas de borracha coram de vermelho em luz visível e fluorescem de vermelho pálido em UV.\n\n2.5.2. Em luz ultra violeta\nDansyl chloride (Jayabalan & Siah, 1986)\nO cloreto de dansil (dimetilaminonafthalene sulfonic acid) reage com os amino ácidos e proteínas dando origem a um complexo secundário fluorescente de cor esbranquiçada. A ocorrência desta fluorescência em secções, em que previamente se extraíram as resinas e os lipídios e em que se removeram as proteínas, permite assumir que se deve à presença de glóbulos de borracha.\n\nProcedimento:\n• Mistura de Acetona/Água 88:12 (v/v) durante 3x15 min. a 55C (para extração de resinas)\n• Mistura de Clorofórmio/Metanol 1/1 (v/v) durante 30 min. (para extração de lipídios)\n• Lavagem em Hidróxido de sódio a 5% em Etanol a 95% durante 30 segundos com agitação.\n• Lavagem em Ácido Clorídico 2N durante 2x3min.\n• Lavagem em água.\n• Pepsina (pH 6) durante 6 horas (para extração de proteínas).\n• Lavagem rápida, com agitação, em ácido tricloroacético a 10% (para remover as proteínas precipitadas). • Etanol a 70% durante 5min.\n• Lavagem em água.\n• Lavagem em Bicarbonato de sódio a 1% (pH 8 - 9)\n• Cloreto de Dansil (1mg/4ml de acetona) durante 2 a 3 min.\n• Lavagem em água.\n• Montagem em Bicarbonato de sódio a 1% (para evitar o background durante a fotografia).\n\nResultados:\n• As partículas de borracha fluorescem de branco.\n\nOil-Red O/Cloreto de Dansil (Jayabalan & Siah, 1986)\nA reação realiza-se em seções em que os lípidos e as proteínas foram extraídos de modo idêntico ao teste anterior.\n\nProcedimento:\n• Solução saturada de Oil Red O em Ácido Fórmico a 90% durante 3 a 5min.\n• Cloreto de Dansil (1 mg/4 ml de Isopropanol a 60%)\n• Lavagem em água.\n• Montagem em Bicarbonato de sódio a 1%.\n\nResultado:\n• As partículas de borracha fluorescem de branco.\n\n3. DETECÇÃO de COMPOSTOS FENÓLICOS\n3.1. Compostos Fenólicos Gerais\n3.1.1. Em Luz Visível\nCloreto de Ferro III (Johansen, 1940)\nNeste teste, vulgarmente utilizado para a deteção de fenóis simples, os orto-dihidroxi fenóis complexam o ião ferro, originando precipitados intensamente corados.\n\nProcedimento:\n• Cloreto de Ferro III a 10% durante 15 a 30 min.\n• Lavagem rápida em água. Controle:\n\nNão existe dado que o grupo fenóil está presente num número elevado e biomoléculas.\nContudo pode aplicar-se numa rodela de papel de filtro padrões dissolvidos em metanol e secretado da planta, tratando essas rodelas como tecido vegetal.\n\nResultado:\n\nOs fenóis coram de verde intenso, púrpura, azul ou negro.\n\nDicromato de Potássio (Gabe, 1968)\nO método baseia-se na formação de um produto corado por condensação dos grupos -OH livres dos fenóis com o crómio do reagente.\n\nProcedimento:\n- Dicromato de Potássio a 10% durante 15 a 30 min.\n- Lavagem rápida em água.\n\nControle:\n- Idêntico ao utilizado para o cloreto de ferro.\n\nResultado:\n\nOs fenóis coram de castanho avermelhado.\n\nDiazoreacção (Ganter & Jollés, 1969; 1970)\nO método baseia-se na formação de um complexo ácido corado, por condensação do fenol com um sal de diazônio, em meio alcalino. Tanto o fenol como o sal de diazônio são incolores, contudo o produto da reação é corado. A diazoreacção é característica dos compostos fenólicos com um grupo -OH livre e sem substituintes em posição orto ou para, relativamente ao -OH.\n\nProcedimento:\n- Fast-Blue B a 0,1% em Tampão Veronal 0,1M, pH 7,5-8,5 (recém-preparado) durante 1 a 2 min a 4ºC.\n- Lavagem em HCl a 1% em Etanol a 70% durante 3 x 2 min.\n- Lavagem rápida em água.\n\nControle:\n- Idêntico ao utilizado para o cloreto de ferro. Resultado:\n\nOs fenóis coram de vermelho.\n\n3.1.2. Em Luz Ultravioleta\nAção de fluorocromos (Charrière-Ladreix, 1976)\nAlguns fluorocromos, tais como o Cloreto de Alumínio, o Acetato de Magnésio, o Acetato Neutro de Chumbo e o Reagente de Wilson (Mistura Citraborética de Wilson), ao reagirem com os flavonoides induzem uma fluorescência secundária, mais ou menos estável em meio ácido.\n\nProcedimento:\n- Fluorocromo durante 15 a 30 min.\n- Lavagem rápida no solvente.\n\nUtilizam-se os seguintes fluorocromos:\n- Cloreto de Alumínio a 5-15% (solução aquosa ou metanólica).\n- Acetato de Magnésio a 5% (solução metanólica).\n- Acetato Neutro de Chumbo 1-3% (solução aquosa).\n- Reagente de Wilson (Ácido Cítrico a 10% em Acetona e solução saturada de Ácido Bórico em Acetona V.V).\n\nControle:\n- Verificar se o fluorocromo tem, por si só fluorescência. Observar também em paralelo secções que não foram submetidas à ação dos fluorocromos.\n\nResultado:\n\nOs flavonóides emitem uma fluorescência secundária, mais ou menos intensa, de cor amarela-esverdeada em presença do Cloreto de Alumínio, Acetato de Magnésio e Acetato Neutro de Chumbo. As agliconas flavonócidas emitem uma fluorescência amarela muito intensa com o Reagente de Wilson.\n\n3.2. Taninos\n\nVanilina Clorídrica (Mace & Howell, 1976)\nO método fundamenta-se na formação de um produto de condensação resultante da reação dos grupos aldeídicos da vanilina com fenóis.\n\nProcedimento:\n- Vanilina a 0,5% em Ácido Clorídrico a 9% durante 10 min. Montagem em Ácido Clorídrico a 9%.\n\nControle: \n\nSecções montadas apenas em Ácido Clorídrico a 9%.\n\nResultado:\n\nOs taninos coram de vermelho.\n\n3.3. Lenhinas\nFloroglucinol (Johansen, 1940)\nO Floroglucinol, ao reagir com o álcool coniférico, forma um complexo vermelho em meio cloridrico.\n\nProcedimento:\n- Floroglucinol em HCl a 20% durante 1 a 2 min.\n\nResultado:\n\nAs lenhinas coram de vermelho.\n\n4. Detecção de Alcalóides\nOs alcalóides precipitam por ação de bases, de ácidos oxigenados, de sais de metais pesados e de halogéneos, tal como outros compostos que possuem grupos básicos azotados.\n\nReagente de Dragendorff (Swendset & Verpoorte, 1983)\nEste reagente permite detectar o azoto terciário ou quaternário, não revelando as aminas primárias e secundárias a não ser que se encontrem em concentração muito elevada.\n\nProcedimento:\n- Reagente de Dragendorff durante 5 a 10 min.\n- Lavagem rápida em Nitrito de Sódio a 5%.\n- Lavagem em água.\n\nSolução stock do Reagente de Dragendorff:\n- Nitrato de Bismuto a 12,3% em água contendo 25% de Ácido Acético... 25 ml\n- Iodeto de Potássio a 40%... 10 ml\n- A solução stock pode ser guardada durante 6 meses. Na altura de usar retirar 5 ml desta solução, juntar 10 ml de Ácido Acético e passar com água destilada até 100 ml. Controle:\n• Aplicar o método a seções previamente tratadas com Ácido Tartárico a 5% em Etanol a 95% durante 48 – 72 horas.\n\nResultado:\n• Os alcaloides coram de castanho-avermelhado.\n\nReagente de Wagner (Furr & Mahlberg, 1981)\nProcedimento:\n• Reagente de Wagner durante 5 a 10 min.\n• Lavagem rápida em água.\n\nReagente de Wagner\n• Iodeto de Potássio,.................................2 g\n• Iodo,....................................................1,27 g\n• Água,...................................................100 ml\n\nControle:\n• Idêntico ao do teste anterior.\n\nResultado:\n• Os alcaloides coram de vermelho.\n\nReagente de Dittmar (Furr & Mahlberg, 1981)\nProcedimento:\n• Reagente de Dittmar durante 5 a10 min.\n• Lavagem em água.\n\nReagente de Dittmar\n• Iodeto de Potássio,.................................1 g\n• Iodo,...................................................1 g\n• Água,...................................................10 ml\n\nControle:\n• Idêntico ao do teste anterior.\n\nResultado:\n• Os alcaloides coram de castanho-avermelhado. Reagente de Ellram (Furr & Mahlberg, 1981)\nProcedimento:\n• Reagente de Ellram (vanilina a 1% em Ácido Sulfúrico a 40%) durante 5 a10 min.\n• Lavagem em água.\n\nControle:\n• Idêntico ao do teste anterior.\n\nResultado:\n• Os alcaloides coram de castanho-avermelhado.\n\n5. DETECÇÃO DE GLÚCIDOS\n5.1. Polissacarídeos Gerais\n5.1.1. Em luz visível\nÁcido Periódico / Reagente de Schiff (PAS) (McManus, 1948)\nEste teste baseia-se na oxidação, pela ação do Ácido Periódico, dos grupos 1,2-glícidos dos resíduos de glucose constituintes dos macromoléculas glucídicas. Por cada resíduo de glucose formam-se duas funções \"aldeído\", como consequência da quebra da ligação entre os carbonos portadores de radicais -OH. Os grupos carbonilo, assim formados, dão origem em presença do Reagente de Schiff a um produto de condensação cor-de-rosa. Os grupos carbonilo endógenos podem ser bloqueados pela Dimedona (5,5 Dimetilcicloxano 1,3 diona) ou reduzidos pelo Tetraidreto Boro de Sódio, de modo que só os grupos carbonilo formados durante a reação sejam corados.\n\nProcedimento:\n• Tetraidreto Boreto de Sódio a 1% (recém preparado) durante 30 min ou solução saturada de Dimedona toda a noite.\n• Ácido Periódico a 1% durante 10 min.\n• Lavagem rápida em água.\n• Reagente de Schiff durante 15 min.\n• Água Lavagem em Metabissulfito de Sódio(1g de Metabissulfito de Sódio + 10 ml HCl 1N + 190 ml de água) durante 3 x 2 min.\n• Lavagem em água. Reagente de Schiff\n• 2 g Fucsina Diamante (Paroranilina) em 60 ml Ácido Clorídrico 1N.\n• 2 g de Metabissulfito de Sódio em 100 ml Água Destilada.\n• Misturar bem as duas soluções e deixar repousar 24 horas, em frasco bem rolhado.\n• Adicionar 1,2 g de Carvão Ativado e agitar durante 2 minutos.\n\nControle:\n• Aplicar o método omitindo o tratamento com Ácido Periódico.\n\nResultado:\n• O amido e os polissacarídeos da parede celular coram intensamente de rosa assim como alguns fenóis. A celulose e a calose não coram.\n\n5.1.2. Em luz ultravioleta\nÁcido Periódico / Acriflavina-Pseudo Schiff (F-PAS) (Clark, 1981)\nVários reagentes do tipo Schiff são obtidos por adição de anidrido sulfuroso (SO) a soluções aquosas de corantes básicos da série aminoacídica. A acriflavina e a acridina orange têm origem em presença do Reagente de Schiff. Resultado:\n• Os polissacarídeos fluorescem de amarelo a laranja.\n\n5.2. Amido\nLugol (Jensen, 1940)\nO iodo de Potássio (KI) é um sal iônico, que provoca a ruptura das pontes de hidrogênio e a consequente separação das várias unidades de glucose que constituem a macromolécula de amido. O KI permite, desta forma, que o iodo se acumule na molécula de amido.\n\nProcedimento:\n• Lugol (solução de iodo a 0,5% adicionada de iodeto de potássio a 1%) durante 5 a 10 min.\n• Lavagem em água.\n\nResultado:\n• O amido cora de roxo.\n\n5.3. β-1,3 e β-1,4 Glucanos\n5.3.1. Em luz ultravioleta\nCalcefluor White (Hughes & McCully, 1975)\nEste fluorocromo, amplamente usado no fabrico de detergentes como agente branquedor, ao ligar-se fortemente às fibras vegetais permite a deteção de β-glucanos.\n\nProcedimento:\n• Calcefluor White MR2 a 0,01% durante 5 a 10 min.\n• Lavagem rápida em água.\n\nResultado:\n• A celulose, os polissacarídeos carboxilados, os β-1,3 e os β-1,4 glucanos, as pectinas e alguns polissacarídeos das mucilagens fluorescem de azul pálido.\n\n5.4. Pectinas\nVermelho de Rutênio (Johansen,1940)\nO Vermelho Rutênio é um composto catiônico hexavalente que, in vitro, na ausência de Tetróxido do Ósmio reage com substâncias ácidas de natureza muita diversa. Procedimento:\n• Vermelho de Rutênio a 1000 p.p.m. durante 10 min.\n• Lavagem rápida em Água.\n\nResultado:\n• As pectinas coram intensamente de rosa.\n\n5.5. Calose\n5.5.1. Em luz azul\nAzul de Anilina (Smith & McCully, 1978)\nProcedimento:\n• Azul de Anilina a 0,05% em Tampo Fosfato de Potássio 0,06 pH 8 (recém-preparada) ou armazenada no frigorífico) durante 5min.\n\nResultado:\n• A calose fluoresce de amarelo pálido.\n\n5.6. Mucopolissacarídeos Ácidos\nAzul de Alciano (Pearse, 1980)\n• A pH controlado (2,4 - 2,6), os grupos dos mucopolissacarídeos ácidos (carboxílico e sulfato) reagem provavelmente com os grupos isotiorônicos do Azul de Alciano, uma flaloceaniaina cúprica, retendo o corante.\n\nProcedimento:\n• Azul Alciano 8 GX a 1% em Ácido Acético a 3% a pH 2,5 durante 30 min.\n• Lavagem em Água durante 5 min.\n\nResultado:\n• Os mucopolissacarídeos ácidos das paredes celulares ou das secreções coram de azul-turquesa. Ácido Tânico/Cloreto de Ferro III (Pizzolato & Lillie, 1973)\nO método fundamental-se na reação do ácido tânico com os grupos amina presentes nas proteínas das mucilagens. O complexo formado é depois revelado pelo cloreto de ferro,\n\nProcedimento:\n• Ácido Tânico a 5% durante 10 min.\n• Lavagem em água.\n• Cloreto de Ferro III a 3% durante 1 min.\n• Lavagem rápida em água.\n\nControle:\n• Secções apenas tratadas com Ácido Tânico ou só com Cloreto de ferro III.\n\nResultado:\n• As mucilagens coram de negro.\n\n6. Deteção de proteínas\n6.1. Proteínas totais\n6.1.1. Em luz visível\nAzul Mercúrio de Bromofenol (Mazia et al., 1953)\nO mercúrio ao reagir com os grupos carboxilo e hidroxilo das proteínas forma um complexo, em que os grupos hidroxilo, envolvidos nas ligações de hidrogênio intramoleculares, ficam disponíveis para o estabelecimento de pontes de hidrogênio com o corante.\n\nProcedimento:\n• Azul de Bromofenol a 0,1% em Etanol a 95% adicionado de Cloreto de Mercúrio (10% final) durante 10 min.\n• Ácido Acético a 0,5% durante 3 x 5 min.\n• Lavagem rápida em água.\n• Lavagem em Tampo Fosfato de Sódio 0,1 M pH 7,0 durante 3 min.\n\nControle:\n• Aplicar o método a secções previamente tratadas com uma solução de Anidrido Acético a 10% em Piridina durante 2 a 4 horas. Resultado:\n\n• As proteínas coram de azul claro.\n\nAzul Brilhante de Comassie (Fischer, 1968)\n\nO Azul Brilhante de Comassie é um corante muito sensível que existe sob duas formas, uma vermelha e uma azul. Por ligação do corante à proteína, a forma vermelha é convertida na forma azul, provocando um desvio na banda de absorção máxima de 465 para 595 nm. Tal facto permite determinar por espectrofotometria a quantidade da proteína de uma amostra.\n\nProcedimento:\n\n• Azul de Comassie R250 a 0,25% em ácido acético a 7% temperatura ambiente ou a quente.\n• Lavagem em Ácido Acético a 7%\n• Lavagem rápida em água\n\nControle:\n\n• Idêntico ao teste anterior.\n\nResultado:\n\n• As proteínas coram de azul claro. ANEXO\n\nTampão Fosfato de Sódio 0,1 M\nSoluções stock\n\nA - Fosfato de sódio monobásico 0,2 M\n(27,8 g de NaH2PO4.7H2O em 100 ml de água)\n\nB - Fosfato de sódio dibásico 0,2 M\n(53,6 g de Na2HPO4.7H2O em 1000 ml de água) ou\n(71,7 g de Na2HPO4.12H2O em 1000 ml de água)\n\nDe acordo com o pH pretendido misturar:\n\nx ml de A com ml de B e perfazer com água destilada para 200 ml.\n\nA | B | pH\n51,0 | 49,0 | 6,8\n39,0 | 61,0 | 7,0\n72,0 | 72,0 | 7,2\n81,0 | 81,0 | 7,4\n87,0 | 87,0 | 7,6\n91,5 | 91,5 | 7,8\n5,3 | 94,7 | 8,0\n\nTampão cacodilato de sódio 0,1 M\nSoluções Stock\n\n• A - cacodilato de sódio 0,2 M\n(42,8 g de Na(CH3)AsO2.3H2O em 1000 ml de água\n• B - HCl 0,2 M\n\nDe acordo com o pH pretendido, misturar:\n\n50 ml de A + x ml de B e perfazer com água para 200 ml\n\nx | pH\n2,7 | 7,4\n4,2 | 7,2\n6,3 | 7,0\n9,3 | 6,8 Tampão veronal de sódio 0,1 M\nSoluções stock\n\nA - Solução veronal (barbitral) de sódio a 0,2 M\n(41,2 g em 1000 ml)\n\nB - HCl 0,2 M\n\nDe acordo com o pH pretendido, misturar:\n\n50 ml de A + x ml de B e perfazer com água para 200 ml\n\nx | pH\n17,5 | 8,0\n22,5 | 7,8\n25,5 | 7,6\n32,5 | 7,4\n43,0 | 7,2\n45,0 | 6,8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS\n\nBrundrett MC, Kendrick B & Peterson CA (1991). Efficient lipid staining in plant material with Sudan Red 7B or Floral Yellow 088 in polyethylene glycol-glycerol. Biotech. & Histochem. 66: 111-116.\n\nCain AJ (1947). The use of Nile Blue in the examination of lipids. Quart. J. Microsc. Sci. 88: 383-392.\n\nCaniato R, Filippini R, Cappelletti EM & Appendino G (1989). Detection of peroxides in intact plant material. Fitoterapia LX: 549-551.\n\nCharrière-Ladraze Y (1976). Répartition intracellulaire du sécrét éventuellement de Populus nigra L. Planta 129: 167-174.\n\nClark G (1981). Staining procedures. Williams & Wilkins, Baltimore.\n\nDavid R & Carde JP (1964). Coloration différentielle des inclusions lipidique et terpéniques des pseudophylles du Pin maritime au moyen du reactif Nacl. C. R. Acad. Sci. Paris, Ser. D 258: 1338-1340.\n\n*Fisher DB (1968). Protein staining of ribbond Epon sections for light microscopy. Histochemie 16: 92-96.\n\nFurr M & Mahlberg PG (1981). Histochemical analyses of lactifiers and glandular trichomes in Cannabis sativa. J. Nat. Prod. 44: 153-159.\n\nGabe M (1968). Techniques histologiques. Masson & Cie, Paris.\n\nGanter P & Jollés G (1969, 1970). Histologie normale et pathologique. Vols I e II. Gauthier - Villars, Paris.\n\nGeissman TA & Griffin TS (1971). Sesquiterpene lactones: acid-catalyzed color reactions in and in situ isolation. Phytochemistry 10: 2475-2485.\n\nHardman R & Sowora EA (1972). Antimony chloride as test reagents for steroids, especially diosgenin and yamogenin, in plant tissues. Stain Technol. 47: 205-208.\n\nHigh OB (1984). Lipid histochemistry. Royal Microscopical Society Handbook 006. Oxford University Press, Oxford.\n\nHughes J & McCully ME (1975). The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain Technol. 50: 319-329.\n\nJayabalan M & Shah JJ (1986). Histochemical techniques to localize rubber in guayule (Parthenium argentatum Gray). Stain Technol. 61: 303-308.\n\nJensen WA (1962). Botanical histochemistry. WH Freeman and Co, San Francisco.\n\nJohansen DA (1940). Plant Microtechnique. McGraw-Hill, New York.\n\nKirk Jr PW (1970). Neutral red as a lipid fluorochrome. Stain Technol. 45: 1-4.\n\nMace ME, Bell A & Stipanović RD (1974). Histochemistry and isolation of gossypol and related terpenoids in roots of cotton seedlings. Phytopathol. 64: 1297-1302.\n\nMace ME & Howell CR (1974). Histochemistry and identification of condensed tannin precursor in roots of cotton seedlings. Can. J. Bot. 52: 2423-2426.\n\nMcManus JFA (1948). Histological and histochemical uses of periodic acid. Stain Technol. 23: 99-108. Mazia D, Brewer PA & Alfert M (1953). The cytochemistry staining and measurement of protein with mercuric bromophenol blue. Biol. Bull. 104: 57-67.\n\nPearse AGE (1980). Histochemistry theoretical and applied. Vol. II, 4th ed. Longman Group Limited.\n\nPizzolato TD & Lillie RD (1973). Mayer's tannic acid-ferric chloride stain for mucins. J. Histochem. Cytochem. 21: 56-64.\n\nReeve RM (1951). Histochemical tests for polyphenols in plant tissues. Stain Technol. 26: 91-96.\n\nSmith MM & McCully (1978). A critical evaluation of the specificity of aniline blue induced fluorescence. Protoplasma, 95: 229-254.\n\nSvendsen AB & Verpoorte R (1983). Chromatography of alkaloids. Elsevier Scientific Publishing Company, New York.