Métodos Moleculares na Identificação de Microrganismos

Métodos moleculares aplicados na identificação de microrganismos Laboratório de Microbiologia Clínica Profa Dra Fernanda C de A Maranhão Professora Associada II ICBSUFAL Setor de Microbiologia fcamicbsufalbr Detectar presença do patógeno Testes de amplificação do ácido nucleico Análise da sequência do ácido nucleico Sondas de ácido nucleico Os testes baseados em ácidos nucleicos são altamente específicos bastante sensíveis e mais rápidos que o cultivo do organismo Amplificação de DNA a reação em cadeia de polimerase Princípios da PCR Método de amplificação do DNA alvo por meio do processo enzimático utilizando oligonucleotídeos específicos primers Permite a amplificação de uma sequência de interesse em uma amostra complexa Alta sensibilidade 1 célula Polimerases em altas temperaturas Termus aquaticus Taq polimerase Diferentes ALVOS na PCR RESUMÃO ITS Internal Transcribed Spacer Gene específico Elementos da PCR RESUMÃO Iniciadores primers senso forward e antissenso reverse Enzima Taq DNA polimerase Amostra contendo o DNA Nucleotídeos dNTPs Solução tampão H2O e MgCl2 Eletroforese É uma técnica de separação de moléculas com carga em uma matriz devido a uma diferença de potencial elétrico Os fragmentos DNA estão carregados negativamente Todos os fragmentos de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa os fragmentos menores atravessam o gel mais rapidamente do que os maiores httpsptkhanacademyorgsciencebiologybiotechdnatechnologydnasequencingpcrelectrophoresisagelelectrophoresis Marcador de peso molecular Ladder 1 kb 500 µl Fragmento de DNA ou cDNA RsaIHaeIII BstOIHinfI ScrFIBstUI RsaIHaeIII 1 3 2 1 2 3 Genotipagem e Subtipagem Definição Identificação da ordem exata dos pares de bases A T G e C em um segmento de DNA Importância O conhecimento da sequência de bases fornece importantes informações sobre sua estrutura função e relação evolutiva Sequenciamento de ácidos nucléicos Sequenciamento de nova 2 geração NGS Sequenciamento direto e paralelo de milhõesbilhões de moléculas de DNA shortreads Redução da quantidade de amostra necessária Redução do tempo para obtenção de dados Aumenta a resolução das análises Desenvolvimento de sofisticadas ferramentas de bioinformática para analisar grandes quantidades de dados gerados classificação taxonômica