Micropropagacao de Stachytarpheta reticulata: Protocolo in vitro para conservacao

Micropropagação de Stachytarpheta reticulata espécie endémica dos Campos Rupestres Jhoão Studart Kotsubo Segundo autor RESUMO Este estudo abordou a propagação in vitro da Stachytarpheta reticulata uma Verbenaceae endêmica do Brasil encontrada nos Campos Rupestres O avanço da agricultura e pecuária ameaça seus microhabitats sinalizando a necessidade de conservação O protocolo in vitro envolveu a desinfestação eficaz dos exemplares Durante a multiplicação in vitro a presença de BAP influenciou significativamente a proliferação celular destacandose na concentração de 30 μM onde observouse um maior número de brotos A interação sinérgica entre BAP e ANA especialmente em 30 μM e 54 nM resultou na melhor taxa de multiplicação A presença de ANA durante a multiplicação exerceu influência positiva na maioria das concentrações Na análise da rizogênese a auxina AIB mostrouse a mais eficaz apresentando resultados superiores e ausência de formação de calos Contudo as concentrações testadas de AIA não apresentaram significância estatística em relação ao número de raízes A Stachytarpheta reticulata demonstrou ser propensa à hiperidricidade fenômeno visível mesmo em concentrações mais baixas de citocinina Os resultados indicam a viabilidade da propagação in vitro como uma técnica crucial para a conservação da espécie reduzindo o risco de extinção Essa abordagem oferece perspectivas promissoras para a preservação e multiplicação controlada dessa planta contribuindo assim para a manutenção da diversidade biológica Bibliotecária Universidade Federal de Juiz de Fora Mestre em Ciência da Informação Universidade Federal de Santa Catarina Email xxxxxufjfedubr 1 INTRODUÇÃO Este estudo centrase na Stachytarpheta reticulata uma Verbenaceae endêmica do Brasil que se configura como um arbusto atingindo uma altura de até 15 metros nos Campos Rupestres Esta espécie se destaca por suas folhas coriáceas com nervuras proeminentes e reticuladas na face abaxial cálice 5dentado inflorescência adornada por corolas azuis e um fruto composto por dois mericarpos RIBEIRO et al 2022 As espécies de Stachytarpheta costumam ser restritas de habitats específicos em sua maioria é encontrada nos Campos Rupestres porém o avanço da agricultura e pecuária vem causando danos a esses micro habitats isso pode ser um sinal de alerta para sua conservação considerando a especificidade que essas espécies têm a este ambiente A micropropagação de plantas uma ferramenta de destaque na botânica desempenha um papel essencial na reprodução eficiente e assexuada de diversas espécies vegetais em larga escala Sua base reside na notável propriedade de totipotência das células permitindo a geração de novos indivíduos geneticamente idênticos a partir de fragmentos de tecido ou órgãos Esta técnica é instrumental por exemplo na superação de desafios como dormência de sementes e dificuldades de propagação como observado em Aspidosperma polyneuron Ribas et al 2005 Além disso viabiliza a conservação em ambientes controlados e assépticos promovendo a preservação do germoplasma in vitro por meio de métodos de crescimento lento Peixoto et al 2006 A micropropagação permite a produção contínua ao longo do ano independentemente das condições sazonais facilitando a obtenção de quantidades substanciais de indivíduos uniformes para fins comerciais Thiyagarajan Venkatachalam 2012 Adicionalmente destacase como uma ferramenta valiosa em projetos de melhoramento genético Angra et al 1999 e oferece um modelo para a análise do comportamento fisiológico das plantas sob diversas condições ambientais conferindo potencial preditivo em relação às mudanças climáticas Kevers et al 2004 A eficácia da propagação in vitro é intrinsecamente vinculada à especificidade dos protocolos em relação às espécies de plantas Diferentes procedimentos são evidenciados para o estabelecimento de espécies pertencentes ao mesmo gênero como exemplificado por L filifolia Peixoto et al 2006 L alba Gupta et al 2001 e L rotundifolia Resende et al 2015 Contudo todos os benefícios derivados da propagação in vitro demandam uma otimização criteriosa dos protocolos envolvendo a composição adequada do meio de cultura e condições de cultivo específicas para cada propósito Qualquer desvio nesses fatores pode resultar em alterações morfofisiológicas prejudiciais ao crescimento das plantas culminando em perda de material valioso Um desequilíbrio desencadeado por variáveis em ambientes in vitro é a hiperidricidade uma condição que leva a alterações morfológicas evidenciadas pela aparência de excesso de água na planta manifestandose em folhas e caules turgidos espessos torcidos e translúcidos Gaspar et al 1987 Kevers et al 2004 Além das implicações morfológicas essa condição exerce influência em diversos aspectos fisiológicos interferindo em vias metabólicas cruciais como fotossíntese respiração e transpiração impactando consequentemente a formação de brotos durante o processo de micropropagação Ziv 1991 Existem estratégias para mitigar a incidência de hiperidricidade destacandose a prática de não vedar completamente o recipiente que contém o explante Essa abordagem permite a redução da umidade e facilita a troca de gases acumulados no tubo de cultivo Em decorrência dessa prática observase um aumento na concentração de clorofila nas folhas como evidenciado em A polyphylla e Lippia grata Ivanova 2009 Palhares et al 2018 A baixa concentração de clorofila é uma característica distintiva de folhas afetadas pela hiperidricidade No entanto este método apresenta desafios incluindo a perda de água para o meio embora estudos indiquem que o uso adequado da intensidade de luz pode compensar eficientemente a perda de água pela planta Saez 2012 Adicionalmente plantas submetidas a ambientes não completamente vedados apresentam maior taxa de sobrevivência ao serem transplantadas para aclimatização posterior Este fenômeno é atribuído à maior formação de cera epicuticular resultado do ambiente com menor umidade que por sua vez promove taxas elevadas de evapotranspiração e redução na quantidade de água no meio de cultivo Tsay et al 2006 Majada et al 1997 Tanaka et al 1992 Essas considerações são cruciais na busca por estratégias eficazes de manejo para minimizar os efeitos adversos da hiperidricidade em culturas in vitro Nenhuma evidência relativa à propagação in vitro de Stachytarpheta reticulata foi identificada Diante dessa lacuna de conhecimento este estudo se propõe a investigar a adaptabilidade da espécie ao processo de micropropagação in vitro O objetivo primordial é estabelecer um protocolo que assegure sua reprodução e conservação eficientes ao mesmo tempo em que busca compreender as alterações suscitadas pelas condições singulares de um ambiente de reprodução in vitro Especificamente a pesquisa direciona sua atenção para a hiperidricidade reconhecida como uma das principais causas de perda de material nessa técnica A abordagem sistemática adotada visa aprimorar as práticas de propagação e conservação de Stachytarpheta reticulata em contextos de cultivo in vitro 2 DESENVOLVIMENTO As amostras de Stachytarpheta reticulata foram coletadas na região da Cadeia do Espinhaço Minas Gerais Brasil Para estabelecer a cultura in vitro as superfícies das plantas passaram por um processo de esterilização Inicialmente utilizouse 172 mM de Benomyl aplicado por aspersão uma vez por semana ao longo de 30 dias Em seguida os segmentos nodais foram colhidos e submetidos a uma imersão em álcool 70 vv por 30 minutos seguido por uma solução de 172 mM de Benomyl por 10 minutos Posteriormente os segmentos foram imersos em uma solução comercial de água sanitária 2 de cloro ativo diluída em 30 vv acrescida de duas gotas de Tween20 durante 15 minutos Os segmentos foram então lavados meticulosamente em água destilada e autoclavada sendo repetido esse processo por cinco vezes Este protocolo rigoroso de esterilização foi crucial para assegurar condições assépticas ideais e a saúde das culturas in vitro ao longo do experimento Com o objetivo de esclarecer a estratégia mais eficaz para a propagação in vitro da espécie Stachytarpheta reticulata realizamos uma série de ensaios preliminares visando compreender seu processo de multiplicação in vitro Empregamos o meio MS enriquecido com agar a 7gL sacarose a 30gL e pH ajustado para 57 A este meio incorporamos diversas concentrações de BAP 0 15 30 e 45 μM e ANA 0 54 54 e 540 nM considerando a potencial influência dessa combinação na formação de raízes e brotos A avaliação dos tratamentos baseouse primordialmente no número de brotações NBRT oferecendo uma métrica para analisar e comparar o desenvolvimento das culturas frente as diferentes condições hormonais testadas A análise da rizogênese por sua vez empregou o meio MS contendo agar a 7gL sacarose a 30gL e pH mantido em 57 Diferentes concentrações de auxinas ANA AIA e AIB foram testadas 011 022 033 e 044 μM além de um grupo controle sem a adição dessas substâncias A quantificação dos resultados foi realizada mediante a contagem do número de raízes e seu tamanho proporcionando uma avaliação dos efeitos dessas variáveis nas raízes da Stachytarpheta reticulata 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Na fase de multiplicação in vitro a influência do BAP na proliferação celular foi notória manifestandose em todas as concentrações testadas através da formação de calos e do encurtamento perceptível dos explantes Por outro lado a ausência desse regulador de crescimento promoveu um alongamento acentuado das plantas Conforme ilustrado na Figura 1 concentrações mais elevadas de BAP resultaram em uma marcante aparência de hiperidricidade caracterizada por folhas turgidas e translúcidas Adicionalmente observamos uma significativa interação entre BAP e ANA Os resultados mais expressivos em termos de brotações foram alcançados na presença conjunta desses dois hormônios especialmente na concentração específica de 30 μM para BAP e 54 nM para ANA culminando em um Número de Brotamento Total NBT de 7 superando significativamente o valor de 313 encontrado em outra espécie do mesmo gênero S jamaicensis RAJENDER 2011 A adição de ANA em todos os tratamentos com citocininas revelou uma interação positiva evidenciando mudanças significativas conforme detalhado na Tabela 1 em consonância com achados de outros estudos de propagação in vitro THIYAGARAJAN VENKATACHALAM 2012 Essas descobertas reforçam a importância da precisão na seleção de concentrações de reguladores de crescimento para alcançar respostas desejáveis durante o processo de cultivo in vitro além de ressaltar a singularidade dos resultados em comparação com outras espécies do mesmo gênero Tabela 1 Número brotações em explantes de S reticulata cultivados in vitro em resposta a diferentes concentrações de BAP e ANA 40 dias após o início do experimento Nota médias seguidas pelas mesmas letras na linha não diferem entre si pelo teste de ScottKnott a 5 de probabilidade Figura 1 Explantes de Stachytarpheta reticulata em tratamento com diferentes concentrações de citocinina A BAP 0 μM B BAP 15 μM C BAP 30 μM D BAP 45 μM ANA nM BAP µM 0 54 54 540 Média 0 10 a 10 a 12 a 10 a 13 C 15 30 b 35 b 46 a 40 a 38 B 3 52 c 70 a 63 b 60 b 61 A 45 65 a 67 a 60 b 50 c 60 A Na análise da rizogênese as concentrações testadas de AIA não apresentaram significância em relação ao número de raízes não diferindo estatisticamente do meio sem auxina conforme detalhado na Tabela 2 Esse resultado pode ser atribuído à possibilidade de a concentração ser baixa para uma auxina de degradação mais rápida No entanto o tratamento com ANA revelou resultados significativos apenas na maior concentração 044 μM o que está em consonância com descobertas semelhantes em outras Verbenaceaes como observado em L rotundifolia RESENDE et al 2015 Dentre as auxinas testadas a AIB obteve os melhores resultados em termos de média sendo mais eficaz em todas as concentrações quando comparada ao controle Além disso não houve formação de calos indicando que a AIB se mostra um método eficiente para o enraizamento da espécie in vitro Esses resultados destacam a sensibilidade da Stachytarpheta reticulata a diferentes auxinas sendo a AIB uma escolha particularmente eficaz para promover a rizogênese no contexto da propagação in vitro dessa espécie Tabela 2 Número de raízes nos explantes de S reticulata cultivados in vitro em resposta a diferentes concentrações de ANA AIA AIB 40 dias após o início do experimento Nota médias seguidas pelas mesmas letras na linha não diferem entre si pelo teste de ScottKnott a 5 de probabilidade Concentração μM 0 011 022 033 044 Média ANA 20 b 21 b 18 b 21 b 28 a 216 B AIA 20 a 18 a 13 b 21 a 21 a 186 B AIB 20 b 30 a 32 a 28 a 27 a 274 A Figura 2 Explantes de Stachytarpheta reticulata 40 dias após inoculação em tratamento com diferentes concentrações de AIB em ordem 011 022 033 044μM 4 CONCLUSÃO Os procedimentos de desinfestação realizados no laboratório demonstraram ser eficazes no controle da contaminação dos exemplares durante o estabelecimento in vitro A otimização da taxa de multiplicação ocorreu na sinergia entre citocinina e auxina especialmente nas concentrações de BAP 30 μM e ANA 54 nM A inclusão de auxina durante a fase de multiplicação exerceu uma influência positiva em grande parte das concentrações testadas A Stachytarpheta reticulata mostrouse propensa à ocorrência de hiperidricidade fenômeno visível mesmo em concentrações mais baixas de citocinina Para o enraizamento da espécie destacouse a auxina AIB evidenciando resultados superiores mesmo em concentrações reduzidas nas quais diferenças estatísticas no número de raízes foram notáveis Os resultados obtidos indicam que a técnica de propagação in vitro é viável para a espécie Stachytarpheta reticulata apresentandose como uma ferramenta crucial para a conservação da espécie e mitigação do risco de extinção Essa abordagem oferece perspectivas promissoras para a preservação e multiplicação controlada dessa planta contribuindo assim para a manutenção da diversidade biológica e a preservação de espécies vulneráveis no contexto da biodiversidade 5 REFERENCIAS ANGRA Dilma Cristina et al Cultivo de embriões em retrocruzamentos entre Triticum aestivum Thell e Agropyron elongatum host beauv Pesquisa Agropecuária Brasileira Brasília v 34 p 209215 fev 1999 httpsscihubse101590S0100204X1999000200009 RIBAS Luciana Lopes Fortes et al Micropropagação de Aspidosperma polyneuron peroba rosa a partir de segmentos nodais de mudas juvenis Revista Árvore ViçosaMG v 29 n 4 p 517524 ago 2005 KEVERS C et al Hyperhydricity of micropropagated shoots a typically stressinduced change of physiological state Plant Cell Tissue and Organ Culture sl v 77 n 2 p 181 191 set 2004 httpsdoiorg101023BTICU000001682518930e4 GUPTA Shiv K KHANUJA S P In vitro micropropagation of Lippia Current science sl v 81 n 2 jul 2001 httpswwwcurrentscienceacinVolumes81020206pdf RESENDE Cristiano Ferrara de et al In vitro propagation and acclimatization of Lippia rotundifolia an endemic species of Brazilian Campos Rupestres Revista Ciência Agronômica sl v 46 p 582589 julset 2015 httpwwwccarevistaufcbrseerindexphpccarevistaarticleview3356 ZIV M Quality of micropropagated plants vitification In vitro Cellular Developmental Biology Plant sl v27 p6469 abr1991 httpsscihubsehttpsdoiorg101007BF02632130 GASPAR Th et al Vitrification morphological physiological and ecological aspects Cell and tissue culture in forestry general principles and biotechnology p 152166 1987 httpsdoiorg101007978940170994110 Ribeiro ARCP Cardoso PH Menini Neto L Nobre PH Salimena FRG Verbenaceae no Parque Estadual do Biribiri Estado de Minas Gerais Brasil Hoehnea sl v 49 2022 PALHARES NETO Luiz et al Controlling hyperhydricity in micropropagated plants of Lippia grata Schauer Verbenaceae a native species of a dry seasonal tropical forest with pharmacological potential Brazilian Journal of Botany sl v 41 n 3 p 529538 jun 2018 httpsscihubsehttpsdoiorg101007s4041501804766 SÁEZ Patricia L et al Increased light intensity during in vitro culture improves water loss control and photosynthetic performance of Castanea sativa grown in ventilated vessels Scientia Horticulturae sl v 138 p 716 2012 httpsscihubsehttpsdoiorg101016jscienta201202005 TSAY HsinSheng et al Influence of ventilation closure gelling agent and explant type on shoot bud proliferation and hyperhydricity in Scrophularia yoshimuraea medicinal plant In Vitro Cellular Developmental BiologyPlant sl v 42 p 445449 setout 2006 httpsscihubsehttpsdoiorg101079IVP2006791 MAJADA Juan Pedro FAL Maria Angeles SÁNCHEZTAMÉS Ricardo The effect of ventilation rate on proliferation and hyperhydricity of Dianthus caryophyllus L In Vitro Cellular Developmental BiologyPlant sl v 33 p 6269 jan 1997 httpsscihubsehttpsdoiorg101007s1162799700426 TANAKA M et al Effect of different films used for film culture vessels on plantlet development of Phalaenopsis and Cymbidium Acta Horticulturae sl v 319 p 225230 1992 httpsscihubse1017660ActaHortic199231933 PEIXOTO Paulo Henrique Pereira et al In vitro propagation of endangered Lippia filifolia Mart and Schauer ex Schauer In Vitro Cellular and Developmental BiologyPlant sl v 42 n 6 p 558561 nov 2006 THIYAGARAJAN M VENKATACHALAM P Large scale in vitro propagation of Stevia rebaudiana bert for commercial application Pharmaceutically important and antidiabetic medicinal herb Industrial Crops and Products sl v 37 n 1 p 111117 jan 2012 httpdxdoiorg101016jindcrop201110037 IVANOVA Mariyana Vasileva Regulation of hyperhydricity in Aloe polyphylla propagated in vitro 2009 Tese Doutorado em Fisiologia Vegetal e Biotecnologia Centro de Pesquisa para Crescimento e Desenvolvimento de Plantas University of KwaZuluNatal Pietermaritzburg 2009 httpsresearchspaceukznaczabitstreamhandle10413800IvanovaMV2009pdf sequence1isAllowedy RAJENDER K et al Micropropagation of Stachytarpheta jamaicensis L VahlA medicinally important plant Indian Journal Of Biotecnhology Warangal p 105107 11 fev 2011 httpsnoprniscprresinbitstream123456789135191IJBT20112812920105 107pdf