Introdução à Genética - 11ª Edição

INTRODUÇÃO À GENÉTICA O GEN Grupo Editorial Nacional a maior plataforma editorial no segmento CTP científico técnico e profissional publica nas áreas de saúde ciências exatas jurídicas sociais aplicadas humanas e de concursos além de prover serviços direcionados a educação capacitação médica continuada e preparação para concursos Conheça nosso catálogo composto por mais de cinco mil obras e três mil ebooks em wwwgrupogencombr As editoras que integram o GEN respeitadas no mercado editorial construíram catálogos inigualáveis com obras decisivas na formação acadêmica e no aperfeiçoamento de várias gerações de profissionais e de estudantes de Administração Direito Engenharia Enfermagem Fisioterapia Medicina Odontologia Educação Física e muitas outras ciências tendo se tornado sinônimo de seriedade e respeito Nossa missão é prover o melhor conteúdo científico e distribuílo de maneira flexível e conveniente a preços justos gerando benefícios e servindo a autores docentes livreiros funcionários colaboradores e acionistas Nosso comportamento ético incondicional e nossa responsabilidade social e ambiental são reforçados pela natureza educacional de nossa atividade sem comprometer o crescimento contínuo e a rentabilidade do grupo INTRODUÇÃO À GENÉTICA Anthony J F Griffiths Susan R Wessler Sean B Carroll John Doebley 11ª EDIÇÃO INTRODUÇÃO À GENÉTICA Anthony J F Griffiths University of British Columbia Susan R Wessler University of California Riverside Sean B Carroll Howard Hughes Medical Institute University of WisconsinMadison John Doebley University of WisconsinMadison Revisão Técnica Márcia Mattos Gonçalves Pimentel Bacharel em Ciências Biológicas Mestre em Ciências Biológicas Genética Humana pela Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ Doutora em Ciências Genética Humana pela UFRJ Professora Associada do Departamento de Genética do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes da Universidade do Estado do Rio de Janeiro UERJ Coordenadora do Serviço de Genética Humana da UFRJ Tradução Sylvia Etig Roberto Décima primeira edição Os autores deste livro e a EDITORA GUANABARA KOOGAN LTDA empenharam seus melhores esforços para assegurar que as informações e os procedimentos apresentados no texto estejam em acordo com os padrões aceitos à época da publicação e todos os dados foram atualizados pelos autores até a data da entrega dos originais à editora Entretanto tendo em conta a evolução das ciências da saúde as mudanças regulamentares governamentais e o constante fluxo de novas informações sobre terapêutica medicamentosa e reações adversas a fármacos recomendamos enfaticamente que os leitores consultem sempre outras fontes fidedignas de modo a se certificarem de que as informações contidas neste livro estão corretas e de que não houve alterações nas dosagens recomendadas ou na legislação regulamentadora Adicionalmente os leitores podem buscar por possíveis atualizações da obra em httpgeniogrupogencombr Os autores e a editora se empenharam para citar adequadamente e dar o devido crédito a todos os detentores de direitos autorais de qualquer material utilizado neste livro dispondose a possíveis acertos posteriores caso inadvertida e involuntariamente a identificação de algum deles tenha sido omitida INTRODUCTION TO GENETIC ANALYSIS ELEVENTH EDITION First published in the United States by WH FREEMAN AND COMPANY New York Copyright 2015 WH FREEMAN AND COMPANY All Rights Reserved Publicado originalmente nos Estados Unidos por WH FREEMAN AND COMPANY New York Copyright 2015 WH FREEMAN AND COMPANY Todos os Direitos Reservados ISBN 9781464109485 Direitos exclusivos para a língua portuguesa Copyright 2016 by EDITORA GUANABARA KOOGAN LTDA Uma editora integrante do GEN Grupo Editorial Nacional Travessa do Ouvidor 11 Rio de Janeiro RJ CEP 20040040 Tels 21 3543077011 50800770 Fax 21 35430896 wwwgrupogencombr editorialsaudegrupogencombr Reservados todos os direitos É proibida a duplicação ou reprodução deste volume no todo ou em parte em quaisquer formas ou por quaisquer meios eletrônico mecânico gravação fotocópia distribuição pela Internet ou outros sem permissão por escrito da EDITORA GUANABARA KOOGAN LTDA Capa Vicki Tomaselli Produção digital Geethik Ficha catalográfica I48 11 ed Introdução à genéticaAnthony J F Griffiths et al tradução Sylvia Werdmüller von Elgg Roberto 11 ed Rio de Janeiro Guanabarra Koogan 2016 il Tradução de Introduction to genetic analysis ISBN 9788527729956 1 Genética 2 Biologia I Griffiths Anthony J F II Roberto Sylvia Werdmüller von Elgg 1633012 CDD 5765 CDU 575 Barbara Moon Anthony J F Griffiths é Professor Emérito de Botânica na University of British Columbia Sua pesquisa é voltada para a genética do desenvolvimento utilizando como modelo o fungo Neurospora crassa Foi Presidente da Genetics Society of Canada e SecretárioGeral da International Genetics Federation Foi recentemente laureado com a Fellow Medal da International Mycological Association Iqbal Pittawala Susan R Wessler é Professora especializada em Genética no Department of Botany and Plant Sciences da University of California Riverside Sua pesquisa é voltada para os elementos de transposição de plantas e sua contribuição para a evolução dos genomas e dos genes Dra Wessler foi eleita para a National Academy of Sciences em 1998 Como Professora do Howard Hughes Medical Institute desenvolveu e ministra aulas em uma série de cursos sobre genoma dinâmico nas quais graduandos vivenciam a interessante experiência da descoberta científica Sean Carroll Sean B Carroll é Vicepresidente de Educação Científica no Howard Hughes Medical Institute e Professor de Biologia Molecular e Genética na University of WisconsinMadison Dr Carroll é um líder no campo da biologia do desenvolvimento evolutivo e foi eleito para a National Academy of Sciences em 2007 Ele também é o autor de Brave Genius Endless Forms Most Beautiful The Making of the Fittest e Remarkable Creatures finalista do National Book Award na categoria não ficção em 2009 John Doebley John Doebley é Professor de Genética na University of Wisconsin Madison Ele estuda a genética da domesticação de plantas cultivadas usando os métodos de genética de populações e quantitativa Em 2003 foi eleito para a National Academy of Sciences e em 2005 foi Presidente da American Genetics Association Ensina Genética Geral e Evolutiva na University of Wisconsin D esde a primeira edição publicada em 1974 Introdução à Genética enfatiza a força e a eficácia da abordagem genética na pesquisa biológica e suas aplicações Em suas muitas edições ampliouse continuamente a abrangência do texto à medida que a força da análise genética tradicional se estendeu com a introdução da tecnologia do DNA recombinante e em seguida da genômica Na 11ª edição damos continuidade a essa tradição e mostramos de que maneira o surgimento desse tipo de análise foi inspirador nas pesquisas em biologia agricultura e saúde humana Ferramentas pedagógicas Uma das novidades mais importantes desta nova edição é a inclusão de uma lista de resultados de aprendizagem no início de cada capítulo Os resultados de aprendizagem são elementos cruciais de entendimento Um dos princípios da teoria construtivista do aprendizado versa sobre o fato de que embora o entendimento possa ser uma série de novos circuitos mentais o estudante nunca é capaz de saber o que se encontra em seu cérebro até que busque realizar com tal conhecimento algum tipo de atividade De fato o entendimento já foi até mesmo definido por alguns como capacidade flexível de realização A lista de objetivos mostra aos estudantes quais realizações específicas são esperadas As notas a seguir mostram como os benefícios dos resultados de aprendizagem presentes neste livro podem ser ampliados por professores que queiram utilizálos RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Realizar uma análise quantitativa da progênie de um cruzamentoteste di híbrido para avaliar se os dois genes estão ligados no mesmo cromossomo ou não Estender o mesmo tipo de análise a diversos loci para produzir um mapa das posições relativas dos loci em um cromossomo Em fungos ascomicetos mapear os centrômeros a outros loci ligados Em ascos prever as proporções de alelos oriundos de etapas específicas no modelo heterodúplex de crossing over Aulas ministradas para turmas grandes ou pequenas por exemplo palestras e tutoriais devem ser estruturadas o máximo possível sobre resultados de aprendizagem semelhantes aos apresentados nos capítulos Em vários momentos os alunos presentes devem ser solicitados a demonstrar o quanto compreenderam o material trabalhado por meio da tentativa de realização de um ou mais dos resultados Em provas discursivas ou testes o professor deve tentar aterse ao máximo aos resultados de aprendizagem Ao corrigir os testes mostrar de que maneira os resultados foram ou não atingidos pelo aprendiz Os estudantes devem ler a lista de resultados de aprendizagem antes de iniciarem um capítulo Embora não seja possível compreender a maior parte deles antes da leitura seu texto passa uma ideia do que se encontra à frente mostrando quais são as expectativas do professor É ideal que após a leitura da seção de um capítulo os alunos voltem à lista e encontrem a que resultado se aplica o material recémestudado processo que deve ser repetido também ao fim do capítulo para os alunos fazerem uma varredura nas seções e ligarem cada assunto a seu respectivo resultado esperado tanto quanto possível Durante a resolução dos problemas finais de cada capítulo os alunos devem focar seus esforços nas habilidades descritas nos resultados de aprendizagem além de utilizálos como revisão rápida ao estudar para provas tentando imaginar de que maneiras será esperado que demonstrem entendimento por meio da aplicação de tais resultados O objetivo geral de um curso de genética é aprender a pensar e trabalhar como um geneticista Os resultados de aprendizagem dividem tal objetivo geral nas diversas habilidades diferentes exigidas por esse assunto analítico Nesta edição substituímos as Mensagens por Conceitoschave As mensagens fizeram parte desta obra desde sua primeira edição em 1974 Nos anos 1960 e 70 talvez em virtude da popularidade do princípio de Marshall McLuhan O meio é a mensagem a palavra mensagem tinha um uso comum e professores eram com frequência indagados Qual é a sua mensagem Embora com a ascensão da mídia eletrônica talvez seja o momento de trazer de volta o princípio de McLuhan sentimos que a palavra mensagem já não tem o mesmo significado que carregava em 1974 Nova cobertura da análise genética moderna Um dos objetivos esperados com a leitura desta obra é mostrar como a identificação de genes e suas interações é um recurso poderoso para se entender as propriedades biológicas Nesta 11ª edição o Capítulo 1 introdutório foi completamente reescrito focando nas aplicações modernas da genética A partir desse capítulo o estudante acompanha o processo de dissecção da genética tradicional começando por uma cobertura em etapas da identificação de um gene no Capítulo 2 o mapeamento gênico no Capítulo 4 e a identificação de vias e redes pelas interações gênicas no Capítulo 6 Novas abordagens genômicas para identificar e localizar são exploradas nos Capítulos 10 14 e 19 FIGURA 120 Comparação do rendimento da variedade Swarna que não é tolerante ao alagamento círculos roxos e da variedade Swarnasub1 que é tolerante círculos verdes Rendimento em toneladas por hectare eixo y versus duração do alagamento em dias eixo x Dados de Ismail et al The contribution of submergencetolerant Sub 1 rice varieties to food security in floodprone rainfed lowland areas in Asia Field Crops Research 152 2013 8393 Elsevier O Capítulo 1 com novo conceito visa despertar o interesse do estudante para a genética por meio da apresentação de uma seleção de aplicações modernas na biologia na evolução na medicina e na agricultura Após uma breve história do estudo de genética e uma revisão sobre seus fundamentos o capítulo descreve quatro utilizações da genética nos dias de hoje Os Capítulos 2 e 4 apresentam uma dissecção da genética clássica com uma introdução mais gradual O Capítulo 2 inicia com uma nova introdução à genética e ao papel da análise genética na identificação de traços de herança monogênica Os cruzamentos são mostrados visual e matematicamente e os conceitos de dominância e recessividade são explicados em termos de haplossuficiência e haploinsuficiência Os usos do teste do quiquadrado no Capítulo 4 foram reescritos com mais clareza A aplicação moderna da genética introduzida no Capítulo 1 tem prosseguimento no Capítulo 14 por meio da aplicação de novas técnicas genômicas como os sequenciamentos de RNA e exomas os quais são utilizados na resolução de problemas em medicina A busca por significado nos segmentos não codificadores do genoma é uma fronteira importante na genômica e o projeto ENCODE foi adicionado ao capítulo em questão como exemplo dessa pesquisa Foco nos avanços mais importantes da genética Aprimoramos a abordagem a diversos tópicos importantes nesta 11ª edição Remodelagem da cromatina e epigenética Antes desmembrado em vários capítulos o nascente campo da epigenética consta por completo no Capítulo 12 Na seção 123 Cromatina dinâmica tratamos dos três maiores mecanismos de alteração da estrutura da cromatina remodelagem de cromatina modificação das histonas e variantes de histonas Foram feitas modificações ao longo de toda a seção a fim de detalhar e esclarecer melhor o assunto com base em avanços recentes no campo em questão Vigilância do genoma Pesquisas de ponta sobre os elementos de transposição revelaram sistemas de vigilância do genoma em plantas animais e bactérias semelhantes ao anteriormente identificado em C elegans O Capítulo 15 traz uma visão geral sobre piRNA em animais e crRNA em bactérias além de permitir que os alunos comparem e contrastem essas abordagens com elementos Tc1 em nematódeos e MITE em plantas Figura 1213 A As caudas das histonas se projetam a partir do cerne do nucleossomo vermelho B Estão demonstrados exemplos de modificações nas caudas das histonas Os círculos com A representam acetilação enquanto os círculos com M representam metilação Ver o texto para os detalhes Figura 1527 A inserção dos transpósons verde e corderosa em um agrupamento pi no genoma resulta na degradação de transcritos destes dois transpósons por meio das etapas demonstradas e descritas no texto Contrariamente o transpóson amarelo permanecerá ativo até que cópias sejam inseridas ao acaso em um agrupamento pi Aspectos mantidos Cobertura de organismosmodelo Esta 11a edição mantém a cobertura a respeito dos sistemas que servem de modelo em formato prático e flexível tanto para estudantes como para professores No Capítulo 1 há uma introdução a alguns dos principais organismosmodelo e esclarecimentos sobre o sucesso obtido pelo seu uso Os Boxes Organismomodelo são apresentados no contexto apropriado fornecendo informação adicional sobre o organismo na natureza e seu uso experimental Um Guia Resumido de Organismosmodelo antes dos Apêndices garante acesso rápido a informações essenciais e práticas sobre os usos de organismos modelo específicos em pesquisas Um Índice de Organismosmodelo no final do livro cita as páginas do texto em que se encontram referências a organismos específicos possibilitando aos professores e estudantes encontrar com facilidade e obter informação comparativa sobre os organismos Grupos de problemas Não importa quão clara tenha sido a exposição o entendimento profundo requer que o estudante se engaje pessoalmente com o material Daí nosso esforço para estimulálo a resolver os problemas Com o foco na análise genética esta 11ª edição fornece aos estudantes oportunidades de praticar habilidades para resolver os problemas de acordo com o seguinte Conjuntos versáteis de problemas os problemas abrangem todos os graus de dificuldade sendo categorizados de acordo com os níveis básicos ou desafiadores Questões sobre as figuras um novo grupo de problemas incluído no fim de cada capítulo abrange perguntas sobre as figuras estudadas Essas questões estimulam o estudante a raciocinar sobre as figuras e o ajudam a avaliar seu entendimento dos principais conceitos Problemas resolvidos no fim de cada capítulo esses exemplos ilustram como os geneticistas aplicam os princípios aos dados experimentais Como solucionar o problema um problema de genética é um esboço de uma matriz complexa de conceitos e informação Esta parte ajuda os estudantes a aprenderem a usar uma abordagem estratégica para resolver o problema uma etapa de cada vez conceito por conceito Como a genética é praticada hoje Uma seção intitulada O que os geneticistas fazem atualmente sugere como as técnicas genéticas estão sendo utilizadas atualmente para responder a questões biológicas específicas como Qual a ligação entre encurtamento do telômero e envelhecimento ou Como podemos encontrar componentes perdidos em uma via biológica específica Estendemos nossos agradecimentos e nossa gratidão aos colegas que fizeram a revisão desta edição e cujos conselhos e percepções foram muito úteis Anna Allen Howard University Melissa Antonio California Baptist University Dave Bachoon Georgia College State University Brianne Barker Drew University Lina Begdache Binghamton University Edward Berger Dartmouth College Aimee Bernard University of Colorado Denver Jaime Blair Franklin Marshall College Jay Brewster Pepperdine University Doug Broadfield Florida Atlantic University Mirjana Brockett Georgia Institute of Technology Judy Brusslan California State University Long Beach Gerald Buldak Loyola University Chicago Aaron Cassill University of Texas at San Antonio Helen Chamberlin Ohio State University Henry Chang Purdue University Randolph Christensen Coe College Mary Clancy University of New Orleans Craig Coleman Brigham Young University Matthew Collier Wittenberg University Shannon Compton University of MassachusettsAmherst Diane Cook Louisburg College Victoria Corbin University of Kansas Claudette Davis George Mason University Ann Marie Davison Kwantlen Polytechnic University Elizabeth De Stasio Lawrence University Matt Dean University of Southern California Michael Dohm Chaminade University Robert Dotson Tulane University Chunguang Du Montclair State University Erastus Dudley Huntingdon College Edward Eivers California State University Los Angeles Robert Farrell Penn State University David Foltz Louisiana State University Wayne Forrester Indiana University Rachael French San Jose State University Shirlean Goodwin University of Memphis Topher Gee UNC Charlotte John Graham Berry College Theresa Grana University of Mary Washington Janet Guedon Duquesne University Patrick Gulick Concordia University Richard Heineman Kutztown University Anna Hicks Memorial University Susan Hoffman Miami University Stanton Hoegerman College of William and Mary Margaret Hollingsworth University at Buffalo Nancy Huang Colorado College Jeffrey Hughes Millikin University Varuni Jamburuthugoda Fordham University Pablo Jenik Franklin Marshall College Aaron Johnson University of Colorado School of Medicine Anil Kapoor University of La Verne Jim Karagiannis University of Western Ontario Kathleen Karrer Marquette University Jessica Kaufman Endicott College Darrell Killian Colorado College Dennis Kraichely Cabrini College Anuj Kumar University of Michigan Janice Lai Austin Community College Evan Lau West Liberty University MinKen Liao Furman University Sarah Lijegren University of Mississippi Renyi Liu University of California Riverside Diego Loayza Hunter College James Lodolce Loyola University Chicago Joshua Loomis Nova Southeastern University Amy Lyndaker Ithaca College Jessica Malisch Claremont McKenna College Patrick Martin North Carolina AT State University Presley Martin Hamline University Dmitri Maslov University of California Riverside Maria Julia Massimelli Claremont McKenna College Endre Mathe Vasile Goldis Western University of Arad Herman Mays University of Cincinnati Thomas McGuire Penn State Abington Mark Meade Jacksonville State University Ulrich Melcher Oklahoma State University Philip Meneely Haverford College Ron Michaelis Rutgers University Chris Mignone Berry College Sarah MordanMcCombs Franklin College of Indiana Ann Murkowski North Seattle Community College Saraswathy Nair University of Texas at Brownsville SangChul Nam Texas AM International University Scot Nelson University of Hawaii at Manoa Brian Nichols University of Illinois at Chicago Todd Nickle Mount Royal University Juliet Noor Duke University Mohamed Noor Duke University Daniel Odom California State University Northridge Kirk Olsen East Los Angeles College Kavita Oommen Georgia State University Maria Orive University of Kansas Laurie Pacarynuk University of Lethbridge Patricia Phelps Austin Community College Martin Poenie University of Texas at Austin Jennifer Powell Gettysburg College Robyn Puffenbarger Bridgewater College Jason Rauceo John Jay College CUNY Eugenia RibieroHurley Fordham University Ronda Rolfes Georgetown University Edmund Rucker University of Kentucky Jeffrey Sands Lehigh University Monica Sauer University of Toronto at Scarborough UTSC Ken Saville Albion College Pratibha Saxena University of Texas at Austin Jon Schnorr Pacific University Malcolm Schug University of North Carolina at Greensboro Deborah Schulman Lake Erie College Allan Showalter Ohio University Elaine Sia University of Rochester Robert Smith Nova Southeastern University Joyce Stamm University of Evansville Tara Stoulig Southeastern Louisiana University Julie Torruellas Garcia Nova Southeastern University Virginia Vandergon California State University Northridge Charles Vigue University of New Haven Susan Walsh Rollins College Michael Watters Valparaiso University Roger Wartell Georgia Institute of Technology Matthew White Ohio University Dwayne Wise Mississippi State University Andrew Wood Southern Illinois University Mary Alice Yund UC Berkeley Extension Malcom Zellars Georgia State University Deborah Zies University of Mary Washington Tony Griffiths gostaria de agradecer às sugestões pedagógicas de David Suzuki coautor das primeiras edições desta obra o qual inspirou o público do mundo todo com seus ensinamentos na mídia Agradece também a Jolie Mayer Smith e Barbara Moon que apresentaram a Tony o poder da abordagem construtivista aplicada ao ensino de genética Sean Carroll agradece a Leanne Olds pela ajuda no trabalho de arte dos Capítulos 11 12 13 14 e 20 John Doebley agradece aos seus colegas da University of Wisconsin Bill Engels Carter Denniston e Jim Crow que adaptaram a abordagem ao ensino da genética Os autores agradecem ainda à equipe da W H Freeman pelo árduo trabalho e pela paciência Em particular agradecemos à nossa editora de desenvolvimento e suplementos Erica Champion à editora de aquisição sênior Lauren Schultz à editora de projetos sênior Jane ONeill e à copidesque Teresa Wilson Agradecemos também a Susan Wein supervisora de produção Diana Blume diretora de arte Vicki Tomaselli designer de texto e capa Sheridan Sellers paginador Janice Donnola coordenadora de ilustração Jennifer MacMillan direitos autorais Amanda Dunning editora executiva de mídia e Alexandra Garrett assistente editorial Por fim apreciamos especialmente os esforços de marketing e vendas de John Britch diretor executivo de marketing e de toda a equipe de vendas 11 12 13 21 22 23 24 1 2 A Revolução Genética O surgimento da genética Gregor Mendel Um monge no jardim Redescoberta de Mendel Dogma central da biologia molecular Após decifrar o código Organismosmodelo Ferramentas para a análise genética Genética atual Da genética clássica à genômica médica Investigação da mutação e do risco de doença Quando os pés de arroz ficam um pouco molhados Evolução recente em humanos Herança Monogênica Padrões de herança monogênica Experimentos pioneiros de Mendel Lei de Mendel da segregação igual Base cromossômica dos padrões de herança monogênica Herança monogênica em diploides Herança monogênica em haploides Base molecular dos padrões de herança mendeliana Diferenças estruturais entre os alelos no nível molecular Aspectos moleculares da transmissão dos genes Alelos no nível molecular Alguns genes descobertos por meio da observação das proporções de 25 26 31 32 33 3 segregação Um gene ativo no desenvolvimento da cor da flor Um gene para o desenvolvimento das asas Um gene para a ramificação das hifas Previsão das proporções na progênie ou dos genótipos parentais por meio da aplicação dos princípios da herança monogênica Padrões de herança monogênica ligada ao sexo Cromossomos sexuais Padrões de herança ligada ao sexo Herança ligada ao X Análise de heredogramas humanos Distúrbios autossômicos recessivos Distúrbios autossômicos dominantes Polimorfismos autossômicos Distúrbios recessivos ligados ao X Distúrbios dominantes ligados ao X Herança ligada ao Y Cálculo de riscos na análise de heredogramas Segregação Independente de Genes Lei de Mendel de segregação independente A segregação independente Previsão das proporções da progênie Utilização do teste do quiquadrado em proporções monohíbridas e dihíbridas Síntese de linhagens puras Vigor híbrido Base cromossômica da segregação independente Distribuição independente em organismos diploides Segregação independente em organismos haploides Segregação independente de combinações de genes autossômicos e ligados ao X Recombinação 34 35 41 42 43 44 45 46 4 Herança poligênica Genes de organelas Herança independente do núcleo Padrões de herança em organelas Segregação citoplasmática Mutações citoplasmáticas em humanos mtDNA em estudos evolutivos Mapeamento de Cromossomos Eucarióticos por Recombinação Diagnóstico de ligação Utilização da frequência de recombinantes para reconhecer ligação Como os crossovers produzem recombinantes de genes ligados Simbolismo e terminologia de ligação Evidências de que o crossing over é um processo de quebra e reunião Evidências de que o crossing over ocorre no estágio de quatro cromátides Crossovers múltiplos podem incluir mais de duas cromátides Mapeamento por frequência de recombinantes Unidades de mapa Cruzamentoteste de três pontos Dedução da ordem dos genes por inspeção Interferência Utilização de proporções como diagnóstico Mapeamento com marcadores moleculares Polimorfismos de nucleotídio único Polimorfismos de comprimento de sequência simples Análise de recombinação com a utilização de marcadores moleculares Mapeamento de centrômeros com tétrades lineares Utilização do teste do quiquadrado para inferir ligação Cômputo de crossovers múltiplos não visualizados Função de mapeamento Fórmula de Perkins 47 48 51 52 53 54 55 56 61 5 6 Utilização de mapas com base em recombinação em conjunto com mapas físicos Mecanismo molecular de crossover A Genética das Bactérias e Seus Vírus Trabalho com microrganismos Conjugação bacteriana Descoberta da conjugação Descoberta do fator de fertilidade F Linhagens Hfr Mapeamento de cromossomos bacterianos Plasmídios F carreadores de fragmentos genômicos Plasmídios R Transformação bacteriana Natureza da transformação Mapeamento cromossômico com a utilização de transformação Genética de bacteriófagos Infecção de bactérias por fagos Mapeamento de cromossomos de fagos por meio da utilização de cruzamentos de fagos Transdução Descoberta da transdução Transdução generalizada Transdução especializada Mecanismo de transdução especializada Comparação de mapas físicos e mapas de ligação Interação Gênica Interações de alelos de um único gene Variações de dominância Dominância completa e recessividade 62 63 64 71 72 73 74 75 76 7 Dominância incompleta Codominância Alelos letais recessivos Interação dos genes nas vias Vias bioquímicas de síntese em Neurospora Interação gênica em outros tipos de vias bioquímicas Inferência das interações gênicas Segregação de mutantes com a utilização do teste de complementação Análise de mutantes duplos de mutações aleatórias Penetrância e expressividade DNA Estrutura e Replicação DNA O material genético Descoberta da transformação Experimento de HersheyChase Estrutura do DNA Estrutura do DNA antes de Watson e Crick Duplahélice Replicação semiconservativa Experimento de MeselsonStahl Forquilha de replicação DNA polimerases Visão geral da replicação do DNA Replissomo Uma máquina de replicação notável Deselicoidização da duplahélice Montagem do replissomo Início da replicação Replicação em organismos eucariotos Origens da replicação eucariótica Replicação do DNA e ciclo celular de levedura 77 81 82 83 84 85 91 92 8 9 Origens de replicação em eucariotos superiores Telômeros e telomerase Término da replicação RNA Transcrição e Processamento RNA Experimentos iniciais sugerem um RNA intermediário Propriedades do RNA Classes de RNA Transcrição Visão geral O DNA como modelo da transcrição Estágios da transcrição Transcrição em eucariotos Iniciação da transcrição em eucariotos Alongamento término e processamento de prémRNA em eucariotos Remoção de íntrons e recomposição de éxons Pequenos RNA nucleares snRNA O mecanismo de recomposição de éxons Autorrecomposição de íntrons e o mundo do RNA Pequenos RNA funcionais que regulam e protegem o genoma eucariótico Os miRNA são importantes reguladores da expressão gênica Os siRNA asseguram a estabilidade do genoma Mecanismos semelhantes geram siRNA e miRNA Proteínas e sua Síntese Estrutura proteica Código genético Códigos sobrepostos versus não sobrepostos Número de letras no códon Utilização de supressores para demonstrar um código triplo Degeneração do código genético Como decifrar o código 93 94 95 101 102 103 104 105 10 Códons de parada tRNA O adaptador Tradução do códon pelo tRNA Novamente a degeneração Ribossomos Características do ribossomo Iniciação alongamento e término da tradução Mutações supressoras sem sentido Proteoma A recomposição alternativa gera isoformas de proteínas Eventos póstradução Isolamento e Manipulação de Genes Visão geral Isolamento e amplificação de fragmentos específicos de DNA Produção de moléculas de DNA recombinante O DNA genômico pode ser cortado antes da clonagem A reação da cadeia de polimerase amplifica regiões selecionadas do DNA in vitro Cópias do DNA podem ser sintetizadas a partir de mRNA Ligação do DNA doador e do vetor Amplificação do DNA doador em uma célula bacteriana Construção de bibliotecas genômicas e de cDNA Utilização de sondas moleculares para encontrar e analisar um clone de interesse específico Detecção de clones específicos com a utilização de sondas Detecção de clones específicos por complementação funcional Análise de DNA por Southern e Northern blot Determinação da sequência de bases de um segmento de DNA Alinhamento genético e mapas físicos para isolar genes específicos Utilização de clonagem posicional para identificar o gene de uma doença humana Utilização do mapeamento fino para identificar genes 106 111 112 113 114 115 116 117 121 122 11 12 Engenharia genética Engenharia genética em Saccharomyces cerevisiae Engenharia genética em plantas Engenharia genética em animais Regulação da Expressão Gênica em Bactérias e seus Vírus Regulação gênica Base da regulação da transcrição procariótica Interruptores genéticos Primeira observação do circuito regulador lac Descoberta do sistema lac Controle negativo Genes controlados juntos Evidências genéticas do operador e do repressor Evidências genéticas em relação à alosteria Análise genética do promotor lac Caracterização molecular do repressor Lac e do operador lac Repressão catabólica do óperon lac Controle positivo Base da repressão catabólica de lac Escolha do melhor açúcar a ser metabolizado Estrutura dos sítiosalvo no DNA Resumo do óperon lac Duplo controle positivo e negativo Óperon da arabinose Vias metabólicas e níveis adicionais de regulação Atenuação Ciclos de vida de bacteriófagos Mais reguladores óperons complexos Anatomia molecular do interruptor genético Ligação sequênciaespecífica de proteínas reguladoras ao DNA Fatores sigma alternativos regulam grandes conjuntos de genes Regulação da Expressão Gênica em Eucariotos Regulação da transcrição em eucariotos Visão geral Lições das leveduras Sistema GAL 123 124 125 126 127 131 13 Gal4 regula múltiplos genes por meio de sequências de ativação upstream Proteína Gal4 apresenta domínios de ligação ao DNA e ativação separados Atividade da Gal4 é regulada fisiologicamente Funções da Gal4 na maior parte dos eucariotos Ativadores recrutam o maquinário de transcrição Controle do tipo reprodutivo de leveduras Interações combinatórias Cromatina dinâmica Proteínas remodeladoras da cromatina e ativação gênica Modificação das histonas Metilação das histonas pode ativar ou reprimir a expressão gênica Herança das modificações de histonas e estrutura da cromatina Variantes de histonas Metilação do DNA Outra marca hereditária que influencia a estrutura da cromatina Ativação de genes em um ambiente de cromatina Acentuassomo de βinterferona Isoladores de bloqueio de acentuador Inativação a longo prazo de genes em um ambiente de cromatina Alteração do tipo reprodutivo e silenciamento gênico Comparação da heterocromatina e da eucromatina Variegação por efeito de posição em Drosophila revela vizinhanças genômicas Análise genética de PEV revela proteínas necessárias para a formação de heterocromatina Silenciamento gêneroespecífico de genes e cromossomos inteiros Imprinting genômico explica alguns padrões de herança incomuns Mas o que dizer sobre Dolly e outros mamíferos clonados Silenciamento de um cromossomo inteiro Inativação do cromossomo X Repressão gênica póstranscricional pelos miRNA Controle Genético do Desenvolvimento Abordagem genética do desenvolvimento Análise mutacional do desenvolvimento inicial de Drosophila Utilização do conhecimento de um organismomodelo para acelerar a descoberta de genes de desenvolvimento em outros organismos 132 133 134 135 136 137 141 142 14 Toolkit genética para o desenvolvimento de Drosophila Classificação dos genes pela função no desenvolvimento Genes homeóticos e identidade segmentar Organização e expressão dos genes Hox Homeoboxe Grupos de genes Hox controlam o desenvolvimento na maior parte dos animais Definição da toolkit inteira Eixos anteroposterior e dorsoventral Expressão dos genes toolkit Regulação espacial da expressão gênica no desenvolvimento Gradientes maternos e ativação gênica Desenho das listras Integração dos estímulos das proteínas gap Diferenciação dos segmentos Integração dos estímulos de Hox Regulação póstranscricional da expressão gênica no desenvolvimento Recomposição do RNA e determinação do sexo em Drosophila Regulação da tradução do mRNA e linhagem celular em C elegans Controle da tradução no embrião inicial O nematódeo Caenorhabditis elegans como um modelo para decisões do destino de linhagens celulares Controle da cronologia do desenvolvimento por miRNA em C elegans e outras espécies De moscas a dedos penas e placas do assoalho Os muitos papéis dos genes toolkit Desenvolvimento e doença Polidactilia Holoprosencefalia Câncer como uma doença do desenvolvimento Genomas e Genômica Revolução genômica Obtenção da sequência de um genoma Transformação das leituras de sequências em uma sequência montada 143 144 145 146 147 151 152 153 15 Sequenciamento do genoma inteiro WGS tradicional Sequenciamento shotgun de última geração do genoma inteiro Montagem da sequência do genoma inteiro Bioinformática Significado da sequência genômica Natureza do conteúdo da informação do DNA Dedução dos genes codificadores de proteínas a partir da sequência genômica Estrutura do genoma humano Elementos funcionais não codificadores no genoma Genômica comparativa de seres humanos com outras espécies Inferência filogenética Camundongos e humanos Genômica comparativa de chimpanzés e seres humanos Genômica comparativa e medicina de seres humanos Exoma e genômica personalizada Genômica comparativa de E coli não patogênica e patogênica Genômica funcional e genética reversa Omas Genética reversa Genoma Dinâmico Elementos de Transposição Descoberta dos elementos de transposição no milho Experimentos de McClintock O elemento Ds Elementos autônomos e não autônomos Elementos de transposição Apenas no milho Elementos de transposição em procariotos Sequências de inserção bacteriana Transpósons procarióticos Mecanismo de transposição Elementos de transposição em eucariotos 154 155 161 162 163 164 16 Classe 1 Retrotranspósons Classe 2 Transpósons de DNA Utilidade dos transpósons de DNA para a descoberta de genes O genoma dinâmico Mais elementos de transposição do que jamais se imaginou Grandes genomas são predominantemente elementos de transposição Elementos de transposição no genoma humano As gramíneas Retrotranspósons LTR desenvolvemse em grandes genomas Abrigos seguros Regulação epigenética de elementos de transposição pelo hospedeiro Vigilância do genoma em animais e bactérias Mutação Reparo e Recombinação Consequências fenotípicas das mutações no DNA Tipos de mutação de ponto Consequências moleculares das mutações de ponto em uma região codificadora Consequências moleculares das mutações de ponto em uma região não codificadora Base molecular das mutações espontâneas Teste de flutuação de Luria e Delbrück Mecanismos de mutações espontâneas Mutações espontâneas em seres humanos Doenças por repetições de trinucleotídios Base molecular das mutações induzidas Mecanismos de mutagênese Teste de Ames Avaliação de mutágenos em nosso ambiente Mecanismos biológicos de reparo Reversão direta de DNA danificado Reparo por excisão de base Reparo por excisão de nucleotídio Reparo pósreplicação Reparo de malpareamento Reparo propenso a erro Síntese de DNA translesão Reparo de quebras bifilamentares 165 171 172 173 181 182 183 17 18 Envolvimento do reparo DSB na recombinação meiótica Câncer Uma importante consequência fenotípica da mutação Como as células cancerosas diferem das células normais Mutações em células cancerosas Alterações Cromossômicas em Grande Escala Alterações no número de cromossomos Euploidia aberrante Aneuploidia Conceito de balanço gênico Alterações na estrutura dos cromossomos Deleções Duplicações Inversões Translocações recíprocas Translocações robertsonianas Aplicações de inversões e translocações Rearranjos e câncer Identificação de mutações cromossômicas pela genômica Incidência geral de mutações cromossômicas humanas Genética de Populações Detecção da variação genética Polimorfismos de nucleotídio único Microssatélites Haplótipos Outras fontes e outros tipos de variação Projeto HapMap Conceito de pool gênico e lei de HardyWeinberg Sistemas de acasalamento 184 185 186 191 192 193 19 Cruzamento preferencial Isolamento pela distância Endocruzamento Coeficiente de endocruzamento Tamanho da população e endocruzamento Variação genética e sua medida Modulação da variação genética Novos alelos na população Mutação e migração Recombinação e desequilíbrio de ligação Deriva genética e tamanho da população Seleção Tipos de seleção Equilíbrio entre mutação e deriva Equilíbrio entre mutação e seleção Aplicações biológicas e sociais Genética da conservação Cálculo dos riscos de doenças DNA forense Procura no Google por seus parceiros de DNA Herança de Traços Complexos Medida da variação quantitativa Tipos de traço e herança Média Variância Distribuição normal Modelo genético simples para os traços quantitativos Desvios genéticos e ambientais Variâncias genética e ambiental Correlação entre variáveis Herdabilidade no sentido amplo Natureza versus criação Medida da herdabilidade em seres humanos a partir de estudos com gêmeos 194 195 196 201 202 203 204 205 20 Herdabilidade no sentido restrito Previsão dos fenótipos Ação gênica e transmissão de variação genética Efeitos aditivos e da dominância Modelo com aditividade e dominância Herdabilidade no sentido restrito Previsão dos fenótipos da descendência Seleção de traços complexos Mapeamento de QTL em populações com heredogramas conhecidos Método básico Do QTL ao gene Mapeamento de associação em populações de cruzamento aleatório Método básico GWA genes doença e herdabilidade Evolução de Genes e Traços Evolução por seleção natural Seleção natural em ação Caso exemplar Vantagem seletiva de HbS Origens moleculares de HbS Evolução molecular Teoria neutra Desenvolvimento da teoria neutra Taxa de substituições neutras Assinatura da seleção purificadora no DNA Seleção cumulativa e vias de múltiplas etapas até a alteração funcional Vias de múltiplas etapas na evolução Assinatura de seleção positiva nas sequências de DNA Evolução morfológica Alterações adaptativas em uma proteína reguladora de pigmento Inativação gênica Evolução de sequência reguladora 206 Perda de características por meio da evolução de sequências reguladoras Evolução reguladora em seres humanos Origem de novos genes e funções proteicas Expansão do número de genes Destino de genes duplicados Guia Resumido de Organismosmodelo Apêndice A Nomenclatura genética Apêndice B Recursos de bioinformática para genética e genômica Glossário Respostas dos Problemas Selecionados INTRODUÇÃO À GENÉTICA 11 12 13 O DNA ácido desoxirribonucleico é a molécula que codifica a informação genética Os filamentos com 4 diferentes bases químicas no DNA armazenam a informação genética de modo muito semelhante ao modo como as séries de 0 e 1 armazenam as informações no código de computador Sergey NivensShutterstock TÓPICOS Surgimento da genética Após decifrar o código Genética atual A RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Descrever o modo como a genética moderna se desenvolveu Listar os principais constituintes celulares envolvidos na expressão e na ação dos genes Fornecer alguns exemplos de como a genética influenciou a medicina moderna a agricultura e a evolução genética é um tipo de ciência da informação Os geneticistas tentam compreender as regras que controlam a transmissão da informação genética em 3 níveis do genitor à descendência dentro das famílias do DNA à ação dos genes dentro das células e entre elas e ao longo de muitas gerações dentro de populações de organismos Esses três focos da genética são conhecidos como genética da transmissão genética molecular do desenvolvimento e genética evolutiva de populações As três partes deste texto examinam esses três focos da genética A ciência da genética surgiu há pouco mais de 100 anos Desde aquela época a genética alterou profundamente nossa compreensão sobre a vida desde o nível da célula individual até aquele de uma população de organismos que se desenvolve ao longo de milhões de anos Em 1900 William Bateson um proeminente biólogo britânico escreveu de modo profético que a determinação exata das leis da hereditariedade provavelmente causará mais alterações na percepção do ser humano sobre o mundo e em seu poder sobre a natureza do que qualquer outro avanço no conhecimento natural que possa ser previsto Em todo este texto você observará a realização da previsão de Bateson A genética desencadeou uma revolução nas ciências biológicas e na sociedade em geral Neste primeiro capítulo revisaremos brevemente a história da genética e ao fazêlo revisaremos alguns dos conceitos básicos dessa disciplina os quais foram descobertos ao longo dos últimos 100 anos Depois disso observaremos alguns exemplos de como a análise genética está sendo aplicada atualmente em 11 problemas críticos na biologia na agricultura e na saúde humana Você verá como as pesquisas contemporâneas em genética integram conceitos descobertos há décadas com recentes avanços tecnológicos Verá também que atualmente a genética é um campo de investigação dinâmico no qual novas descobertas estão desenvolvendo continuamente a nossa compreensão sobre o mundo biológico O surgimento da genética Ao longo de toda a história registrada as pessoas ao redor do mundo compreendiam que semelhantes geram semelhantes Os filhos se assemelham aos seus genitores a semente de uma árvore que contém frutos saborosos por sua vez crescerá como uma árvore carregada com frutos saborosos e mesmo membros de grupos de lobos demonstram semelhanças familiares Figura 11 Embora as pessoas confiassem nessas observações elas pensavam a respeito do mecanismo subjacente A tribo ameríndia Hopi do sudoeste dos EUA compreendia que se eles plantassem um grão de milho vermelho em seus campos ele cresceria com uma planta que também forneceria grãos vermelhos O mesmo era verdadeiro em relação aos grãos azuis brancos ou amarelos Assim eles consideravam o grão como uma mensagem aos deuses na Terra a respeito do tipo de milho que os fazendeiros Hopi esperavam colher Ao receber essa mensagem os deuses fielmente devolveriam a eles uma planta que produziria grãos da cor desejada FIGURA 11 Os grupos familiares nos loboscinzentos demonstram semelhanças familiares em relação às cores e ao padrão do pelo Parte superior altrendo natureGetty Images parte inferior Bev McConnellGetty Images Nos anos 1800 na Europa horticultores criadores de animais e biólogos também tentavam explicar as semelhanças entre os genitores e a descendência Naquela época uma visão comum era a teoria da mistura da herança ou a crença de que a herança atuava como uma mistura de líquidos semelhante ao que ocorre com as tintas tintas vermelha e branca quando misturadas originam corderosa Assim seria esperado que o filho de um genitor alto com um genitor baixo crescesse até uma altura intermediária Embora a teoria da mistura aparentasse atuar algumas vezes também estava claro que havia exceções como crianças altas nascidas de genitores de estatura mediana A teoria da mistura também não fornecia nenhuma explicação por meio da qual os líquidos da hereditariedade após a mistura pudessem ser separados as tintas vermelha e branca não podem ser reconstituídas a partir do corderosa Portanto a expectativa a longo prazo da teoria da mistura ao longo de muitas gerações de intercruzamento entre indivíduos era que todos os membros da população irão expressar o mesmo valor médio de um traço Claramente não é assim que a natureza atua As populações humanas apresentam pessoas com uma diversidade de estaturas de baixas a altas e não apresentamos uma estatura média única apesar das muitas gerações das populações humanas que residiram sobre a Terra Gregor Mendel Um monge no jardim Enquanto os méritos e as falhas da teoria da mistura estavam sendo debatidos Gregor Mendel um monge austríaco estava trabalhando para compreender as regras que controlam a transmissão dos traços dos genitores para a descendência após a hibridização entre diferentes variedades de ervilha Figura 12 O ambiente do seu trabalho era o jardim do monastério na cidade de Brünn Áustria atualmente Brno na República Tcheca De 1856 a 1863 Mendel realizou a polinização cruzada ou o intercruzamento de diferentes variedades de ervilha Um de seus experimentos envolveu o cruzamento entre uma variedade com flores roxas e outra com flores brancas Figura 13 Mendel registrou que toda a primeira geração híbrida da descendência desse cruzamento apresentava flores roxas bem como um dos genitores Não havia mistura Em seguida Mendel autopolinizou as plantas híbridas de primeira geração e cultivou uma segunda geração da descendência Entre a progênie ele observou plantas com flores roxas bem como plantas com flores brancas Das 929 plantas ele registrou 705 com flores roxas e 224 com flores brancas Figura 14 Ele observou que havia aproximadamente três plantas com flores roxas para cada planta com flores brancas Como Mendel explicou os seus resultados Claramente a teoria da mistura não funcionaria tendo em vista que aquela teoria prevê um grupo uniforme de plantas híbridas da primeira geração com flores roxoclaras Portanto Mendel propôs que os fatores que controlam os traços atuam como partículas em vez de líquidos e que tais partículas não se misturam em conjunto mas são transmitidas intactas de uma geração para a próxima Atualmente as partículas de Mendel são conhecidas como genes FIGURA 12 Gregor Mendel era um monge austríaco que descobriu as leis da herança James King HolmesScience Source Um dos experimentos de Mendel Genitores Duas cópias do gene Híbrido da primeira geração Autopolinizacão Híbridos da segunda geração Óvócitos Espermatozoides 3 roxas 1 branca FIGURA 13 O esquema de cruzamento do experimento de Mendel envolvendo o cruzamento de variedades de ervilhas com flores roxas e brancas Os círculos roxos e brancos significam as variantes gênicas para a cor da flor roxa versus branca Os gametas carreiam uma cópia do gene Cada uma das plantas carreia duas cópias do gene O significa uma polinização cruzada entre as plantas com flores roxas e brancas Mendel propôs que cada planta da ervilha apresenta duas cópias do gene que codifica a cor da flor em cada uma das células do corpo da planta células somáticas Entretanto quando a planta forma as células sexuais ou gametas ovócitos e espermatozoides apenas uma cópia do gene entra nessas células reprodutivas ver Figura 13 Em seguida quando o ovócito e o espermatozoide se unem para dar início a um novo ser mais uma vez haverá duas cópias do gene da cor da flor em cada célula do corpo da planta FIGURA 14 Trechos da publicação de Mendel de 1866 Versuche über PflanzenHybriden Experimentos com hibridização de plantas Abadia Agostiniana em Old Brno Cortesia de Masaryk University Mendel Museum Mendel apresentou algumas percepções adicionais Ele propôs que o gene para a cor da flor ocorre em duas variantes genéticas ou alelos um que condiciona as flores roxas e outro que condiciona as brancas Propôs também que o alelo roxo do gene da cor da flor é dominante em relação ao alelo branco de modo que uma planta com um alelo roxo e um alelo branco apresentaria flores roxas Apenas as plantas com dois alelos brancos apresentariam flores brancas ver Figura 13 As duas conclusões de Mendel 1 de que os genes se comportavam como partículas que não se misturam em conjunto e 2 de que um alelo é dominante em relação ao outro possibilitaram que ele explicasse a ausência de mistura nos híbridos da primeira geração e o reaparecimento das plantas com flores brancas nos híbridos da segunda geração com uma proporção de 31 de plantas com flores roxas e brancas Esse avanço revolucionário na nossa compreensão sobre a herança será totalmente discutido no Capítulo 2 Como Mendel acertou quando tantos outros antes dele estavam errados Mendel escolheu um bom organismo e bons traços para estudar Todos os traços que ele estudou eram controlados por genes únicos Os traços que são controlados por diversos genes como ocorre com muitos traços não teriam possibilitado que ele descobrisse as leis da herança tão facilmente Mendel também era um observador cuidadoso e manteve registros detalhados de cada um dos seus experimentos Por fim Mendel era um pensador criativo capaz de raciocinar bem além das ideias de sua época A teoria da herança particulada de Mendel foi publicada em 1866 nos Proceedings of the Natural History Society de Brünn ver Figura 14 Naquela época seu trabalho chamou a atenção e foi lido por alguns biólogos mas as suas implicações e a sua importância foram subestimadas durante mais de 30 anos Ao contrário de Charles Darwin cuja teoria da evolução por meio da seleção natural o tornou mundialmente reconhecido da noite para o dia quando Mendel morreu em 1884 era relativamente desconhecido no mundo da ciência Conforme o bioquímico Erwin Chargaff mencionou Existem pessoas que parecem ter nascido com um manto de invisibilidade Mendel era uma delas CONCEITOCHAVE Gregor Mendel demonstrou que os genes se comportavam como partículas não como líquidos Redescoberta de Mendel Conforme diz a lenda quando o biólogo britânico William Bateson Figura 15 embarcou em um trem dirigindose a uma conferência em Londres em 1900 ele não tinha ideia do quão profundamente o seu mundo iria mudar durante a breve jornada Bateson carregava consigo uma cópia do artigo de Mendel de 1866 sobre a hibridização das variedades de plantas O estudioso soubera recentemente que biólogos na Alemanha na Holanda e na Áustria haviam reproduzido cada um de modo independente a proporção de 31 de Mendel e que cada um citava o trabalho original de Mendel Esse trio havia redescoberto as leis de Mendel acerca da herança Bateson precisava ler o artigo de Mendel Quando desceu do trem o biólogo tinha uma nova missão na vida Havia compreendido que o mistério da herança fora solucionado Logo tornouse um apóstolo persistente das leis de Mendel sobre a herança Alguns anos depois em 1905 Bateson cunhou o termo genética o estudo da herança A revolução genética havia começado FIGURA 15 William Bateson o zoólogo e evolucionista britânico que introduziu o termo genética para o estudo da herança e que promoveu o trabalho de Mendel SPLScience Source Quando as leis de Mendel sobre a herança foram redescobertas em 1900 foi liberado um grande fluxo de novos pensamentos e novas ideias O mendelismo tornouse o princípio de organização para uma grande parte da biologia Havia muitas novas questões a ser formuladas a respeito da herança A Tabela 11 resume a cronologia das descobertas influentes realizadas ao longo das décadas subsequentes e os capítulos deste livro que abrangem cada um desses tópicos Vejamos brevemente algumas questões que transformaram as ciências biológicas e suas respostas Tabela 11 Eventoschave na história da genética Ano Evento Capítulos 1865 Gregor Mendel demonstrou que os traços são controlados por fatores distintos atualmente conhecidos como genes 2 3 1869 Friedrich Miescher isolou o DNA dos núcleos de leucócitos 7 1903 Walter Sutton e Theodor Boveri formularam a hipótese de que os cromossomos são os elementos hereditários 4 1905 William Bateson introduziu o termo genética para descrever o estudo da herança 2 1908 G H Hardy e Wilhelm Weinberg propuseram a lei de HardyWeinberg o fundamento da genética de populações 18 1910 Thomas H Morgan demonstrou que os genes estão localizados nos cromossomos 4 1913 Alfred Sturtevant criou um mapa da ligação genética do cromossomo X da Drosophila o primeiro mapa genético 4 1918 Ronald Fisher propôs que fatores mendelianos múltiplos podem explicar a variação contínua em relação aos traços fundando o campo da genética quantitativa 19 1931 Harriet Creighton e Barbara McClintock demonstraram que o crossing over é a causa da recombinação 4 16 1941 Edward Tatum e George Beadle propuseram a hipótese de um geneum polipeptídio 6 1944 Oswald Avery Colin MacLeod e Maclyn McCarty forneceram evidências persuasivas de que o DNA é o material genético nas células bacterianas 7 1946 Joshua Lederberg e Edward Tatum descobriram a conjugação bacteriana 5 1948 Barbara McClintock descobriu elementos móveis transpósons que se movimentam de um local para outro no genoma 15 1950 Erwin Chargaff demonstrou que a composição do DNA segue algumas regras simples em relação às quantidades relativas de A C G e T 7 1952 Alfred Hershey e Martha Chase comprovaram que o DNA é a molécula que codifica as informações genéticas 7 1953 James Watson e Francis Crick determinaram que o DNA forma uma duplahélice 7 1958 Matthew Meselson e Franklin Stahl demonstraram a natureza semiconservativa da replicação do DNA 7 1958 Jérôme Lejeune descobriu que a síndrome de Down resultava de uma cópia extra do cromossomo 21 17 1961 François Jacob e Jacques Monod propuseram que os níveis enzimáticos nas células são controlados por mecanismos de retroalimentação 11 1961 a 1967 Marshall Nirenberg Har Gobind Khorana Sydney Brenner e Francis Crick desvendaram o código genético 9 1968 Motoo Kimura propôs a teoria neutra da evolução molecular 18 20 1977 Fred Sanger Walter Gilbert e Allan Maxam inventaram métodos para a determinação das sequências de nucleotídios das moléculas de DNA 10 1980 Christiane NüssleinVolhard e Eric F Wieschaus definiram o complexo de genes que regulam o desenvolvimento do plano corporal na Drosophila 13 1989 Francis Collins e LapChee Tsui descobriram o gene que causa a fibrose cística 4 10 1993 Victor Ambrose e colegas descobriram o primeiro microRNA 13 1995 Publicada a primeira sequência de genoma de um organismo vivo Haemophilus influenzae 14 1996 Publicada a primeira sequência de genoma de um eucarioto Saccharomyces cerevisiae 14 1998 Publicada a primeira sequência de genoma de um animal Caenorhabditis elegans 14 2000 Publicada a primeira sequência de genoma de uma planta Arabidopsis thaliana 14 2001 Publicada pela primeira vez a sequência do genoma humano 14 2006 Andrew Fire e Craig Mello vencem o prêmio Nobel por sua descoberta do gene que é silenciado pelo RNA de filamento duplo 8 2012 John Gurdon e Shinya Yamanaka vencem o prêmio Nobel por sua descoberta de que apenas 4 genes reguladores conseguem converter células adultas em 8 12 célulastronco Onde na célula estão os genes de Mendel A resposta veio em 1910 quando Thomas H Morgan da Columbia University em Nova York demonstrou que os genes de Mendel estão localizados nos cromossomos ele comprovou a teoria cromossômica da herança A ideia não era novidade Walter Sutton que cresceu em uma fazenda no Kansas e posteriormente atuou como cirurgião para o exército norteamericano durante a Primeira Guerra Mundial havia proposto a teoria cromossômica da herança em 1903 Theodor Boveri um biólogo alemão propôs tal teoria independentemente na mesma época Era uma hipótese persuasiva mas não havia dados experimentais para amparála Isso mudou em 1910 quando Morgan comprovou a teoria cromossômica da herança com a utilização da genética mendeliana e a moscadasfrutas como seu organismo experimental No Capítulo 4 você retraçará os experimentos de Morgan que comprovaram que os genes estão nos cromossomos Os genes mendelianos conseguem explicar a herança de traços continuamente variáveis como a estatura humana Enquanto as proporções de segregação de 31 podem ser diretamente observadas em relação a traços simples como a cor da flor muitos traços demonstram uma variação contínua de valores em híbridos da segunda geração sem proporções simples como 31 Em 1918 Ronald Fisher o estatístico e geneticista britânico resolveu como os genes mendelianos explicavam a herança de traços continuamente variáveis como a estatura nas pessoas Figura 16 A ideia central de Fisher era de que os traços contínuos são cada um controlados por genes mendelianos múltiplos A percepção de Fisher é conhecida como hipótese multifatorial No Capítulo 19 dissecaremos o modelo matemático e a evidência experimental em relação à hipótese de Fisher Como os genes atuam dentro das células de modo que lhes é possibilitado o controle de diferentes estados em relação a um traço como a cor das flores Em 1941 Edward Tatum e George Beadle propuseram que os genes codificam enzimas Com a utilização do fungo do pão Neurospora crassa como seu organismo experimental eles demonstraram que os genes codificam as enzimas que realizam funções metabólicas dentro das células Figura 17 No caso da ervilha existe um gene que codifica uma enzima necessária para produzir o pigmento roxo nas células de uma flor A descoberta de Tatum e Beadle se tornou conhecida como a hipótese de um geneuma enzima Você verá como eles desenvolveram tal hipótese no Capítulo 6 FIGURA 16 Estudantes no Connecticut Agricultural College em 1914 demonstram uma diversidade de estaturas Ronald Fisher propôs que traços continuamente variáveis como a estatura humana são controlados por genes mendelianos múltiplos A F Blakeslee Corn and Men Journal of Heredity 5 11 1914 511 518 Qual é a natureza física do gene Os genes são compostos por proteínas ácido nucleico ou outra substância Em 1944 Oswald Avery Colin MacLeod e Maclyn McCarty ofereceram a primeira evidência experimental persuasiva de que os genes são feitos de ácido desoxirribonucleico DNA Eles demonstraram que o DNA extraído de uma cepa virulenta de bactérias carreava as informações genéticas necessárias para transformar uma cepa não virulenta em uma cepa virulenta Você aprenderá no Capítulo 7 como exatamente eles demonstraram isso Como as moléculas de DNA conseguem armazenar informação Na década de 1950 havia um certo tipo de corrida entre diversos grupos de geneticistas e químicos para responder a essa questão Em 1953 James Watson e Francis Crick que trabalhavam na Cambridge University na Inglaterra venceram a corrida Eles determinaram que a estrutura molecular do DNA se encontrava na forma de uma duplahélice dois filamentos de DNA enrolados lado a lado em uma espiral Sua estrutura da duplahélice é semelhante a uma escada torcida Figura 18 As laterais da escada são compostas por grupos de açúcar e fosfato Os degraus por 4 bases adenina A timina T guanina G e citosina C As bases estão voltadas para o centro e cada base está ligada por uma ponte de hidrogênio com a base voltada para ela no filamento oposto A adenina em um filamento sempre está pareada com a timina no outro por meio de uma dupla ligação de hidrogênio enquanto a guanina sempre está pareada com a citosina por meio de uma tripla ligação de hidrogênio A especificidade da ligação tem por base os formatos e as cargas elétricas complementares das bases A sequência de A T G e C representa a informação codificada pela molécula de DNA Você aprenderá no Capítulo 7 como tudo isso ocorreu Como os genes são regulados As células necessitam de mecanismos para ligar ou desligar os genes em tipos de células e tecidos específicos e em ocasiões específicas durante o desenvolvimento Em 1961 François Jacob e Jacques Monod realizaram uma descoberta conceitual sobre essa questão Trabalhando com os genes necessários para metabolizar o açúcar lactose na bactéria Escherichia coli eles demonstraram que os genes apresentam elementos regulatórios que comandam a expressão gênica ou seja se um gene está ligado ou desligado Figura 19 Os elementos regulatórios são sequências de DNA específicas às quais uma proteína regulatória se liga e atua como um ativador ou um repressor da expressão do gene No Capítulo 11 você explorará a lógica por trás dos experimentos de Jacob e Monod com E coli e no 12 você explorará os detalhes da regulação gênica em eucariotos Como as informações armazenadas no DNA são decodificadas para sintetizar proteínas Embora a descoberta da estrutura helicoidal dupla do DNA tenha sido um divisor de águas para a biologia muitos detalhes ainda eram desconhecidos Precisamente como as informações eram codificadas no DNA e como elas eram decodificadas para formar as enzimas que Tatum e Beadle haviam demonstrado ser desencadeadoras da ação gênica permanecia desconhecido Entre os anos de 1961 e 1967 equipes de geneticistas moleculares e químicos que trabalhavam em diversos países responderam a essas questões quando desvendaram o código genético Isso significa que eles deduziram como uma sequência de nucleotídios no DNA cada qual com uma de quatro bases diferentes A T C ou G codifica o conjunto de 20 aminoácidos diferentes que formam as proteínas Eles também descobriram que existe uma molécula mensageira feita de ácido ribonucleico RNA que carreia as informações do DNA no núcleo para o citoplasma no qual as proteínas são sintetizadas Em 1967 o fluxograma básico em relação à transmissão da informação nas células foi conhecido Esse fluxograma é considerado o dogma central da biologia molecular FIGURA 17 O modelo de um geneuma enzima propôs que os genes codificam enzimas que realizam funções bioquímicas dentro das células Tatum e Beadle propuseram esse modelo com base no estudo da síntese da arginina um aminoácido no fungo do pão Neurospora crassa FIGURA 18 A A estrutura da duplahélice do DNA demonstrando os arcabouços de açúcarfosfato em azul e as bases pareadas em marrom B Uma representação plana do DNA demonstrando como A sempre pareia com T e G com C Cada fileira de traços entre as bases representa uma ponte de hidrogênio FIGURA 19 Estrutura de um gene codificador de proteína demonstrando um elemento regulatório no DNA GGGCCC ao qual uma proteína reguladora se liga a região promotora na qual o complexo da RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição e uma região codificadora de proteína CONCEITOCHAVE A redescoberta das leis de Mendel lançou uma nova era na qual os geneticistas resolveram muitas questões fundamentais a respeito da natureza do gene e do fluxo da informação genética dentro das células Durante essa era os geneticistas aprenderam que os genes estão localizados em cromossomos e são feitos de DNA Os genes codificam proteínas que conduzem o trabalho enzimático básico dentro das células Dogma central da biologia molecular Em 1958 Francis Crick introduziu a expressão dogma central para representar o fluxo da informação genética dentro das células a partir do DNA e daí para o RNA e para a proteína e desenhou um diagrama simples para resumir essas relações Figura 110 A Curiosamente Crick escolheu a palavra dogma pensando que ela significava hipótese o que era a sua intenção sem o conhecimento de que o seu real significado é uma crença que deve ser aceita sem dúvidas Apesar desse pensamento inadequado a expressão apresentava um poder inegável e sobreviveu A Figura 110 B mostra uma grande parte do que foi aprendido a respeito da bioquímica da herança de 1905 até 1967 Revisemos a riqueza do conhecimento que essa figura simples captura À esquerda você visualiza o DNA e uma seta circular que representa a replicação do DNA o processo por meio do qual uma cópia do DNA é produzida Esse processo possibilita que cada uma das duas célulasfilhas que resultam da divisão celular apresente uma cópia completa de todo o DNA da célula genitora No Capítulo 7 você explorará os detalhes da estrutura do DNA e sua replicação Outra seta conecta o DNA ao RNA simbolizando como a sequência dos pares de bases em um gene DNA é copiada para uma molécula de RNA O processo de síntese do RNA a partir de um molde de DNA é denominado transcrição Uma classe de moléculas de RNA sintetizada por meio da transcrição é o RNA mensageiro ou mRNA abreviadamente O mRNA é o molde para a síntese proteica No Capítulo 8 você descobrirá como a transcrição é realizada A seta final na Figura 110 B conecta o mRNA e a proteína Tal seta simboliza a síntese proteica ou a tradução da informação contida na sequência de bases específica no mRNA em uma sequência de aminoácidos que compõem uma proteína As proteínas são as oficinas de produção das células e compreendem as enzimas os componentes estruturais das células e as moléculas para a sinalização celular O processo de tradução ocorre nos ribossomos no citoplasma de cada célula No Capítulo 9 você aprenderá como o código genético é escrito em trincas de letras denominadas códons Um códon é um conjunto de três nucleotídios consecutivos no mRNA conjunto esse que especifica um aminoácido em uma proteína CGC especifica o aminoácido arginina AGC a serina e assim por diante Desde que Crick propôs o dogma central vias adicionais do fluxo da informação genética foram descobertas Atualmente sabemos que existem classes de RNA que não codificam proteínas além de casos nos quais o mRNA é editado após a transcrição e outros em que a informação no RNA é copiada de volta para o DNA ver Capítulos 8 9 e 15 12 Após decifrar o código Com as leis básicas da herança amplamente descobertas até o fim da década de 1960 floresceu uma nova era de aplicação da análise genética para um amplo espectro de questões biológicas Para esse fim muitos esforços foram e continuam a ser investidos no desenvolvimento dos recursos e das ferramentas para abordar essas questões Os geneticistas enfocaram suas pesquisas em uma pequena quantidade de espécies conhecidas como organismosmodelo que são bemadequadas para a análise genética Eles também desenvolveram uma variedade impressionante de ferramentas para a manipulação e a análise do DNA Organismosmodelo Geneticistas fazem uso em especial de um pequeno conjunto de organismos modelo para a análise genética Um organismomodelo é uma espécie utilizada em biologia experimental com a presunção de que o que é aprendido a partir da análise daquela espécie permanecerá verdadeiro em relação às demais em especial outras que sejam relacionadas de modo próximo A filosofia subjacente à utilização dos organismosmodelo em biologia foi ironicamente expressada por Jacques Monod Qualquer coisa que se observe ser verdadeira para E coli também tem de ser verdadeira para os elefantes1 FIGURA 110 A Versão do esboço feito por Francis Crick do dogma central demonstrando o fluxo de informações entre as moléculas biológicas A seta circular representa a replicação do DNA a seta reta central representa a transcrição do DNA em RNA e a seta à direita a tradução do RNA em proteína B Esboço mais detalhado demonstrando como os dois filamentos da duplahélice de DNA são replicados de modo independente como são desassociados para a transcrição e como o RNA mensageiro mRNA é traduzido em uma proteína no ribossomo Na medida em que a genética amadureceu e enfocou nos organismosmodelo as ervilhas de Mendel caíram no esquecimento mas as moscasdasfrutas de Morgan aumentaram em proeminência até se tornarem um dos organismosmodelo mais importantes para a pesquisa genética Novas espécies foram adicionadas à lista Uma pequena planta que cresce como uma erva daninha denominada Arabidopsis thaliana tornouse a espécie de plantamodelo e um nematódeo mínimo denominado Caenorhabditis elegans que vive em pilhas de compostagem tornouse uma estrela da análise genética na biologia do desenvolvimento Figura 111 Quais características tornam uma espécie adequada como um organismo modelo 1 Pequenos organismos que sejam de manutenção fácil e não dispendiosa são muito convenientes para pesquisas Assim moscasdasfrutas são boas mas baleiasazuis nem tanto 2 Um curto tempo de geração é imperativo tendo em vista que os geneticistas tais como Mendel precisam cruzar diferentes linhagens e em seguida estudar seus híbridos de primeira e segunda gerações Quanto mais curto o tempo de geração mais cedo os experimentos podem ser concluídos 3 Um pequeno genoma é útil Conforme você aprenderá no Capítulo 15 algumas espécies apresentam genomas grandes outras genomas pequenos em termos do número total de pares de bases do DNA Boa parte do tamanho extra das espécies de genoma grande é composta por elementos repetitivos de DNA entre os genes Se um geneticista estiver procurando genes eles podem ser mais facilmente encontrados em organismos com genomas menores e menos elementos repetitivos 4 Organismos que sejam de fácil cruzamento ou acasalamento e que produzam grandes quantidades de descendentes são os melhores FIGURA 111 A árvore demonstra as relações evolutivas entre os principais grupos de organismos bactérias Archaea e eucariotos plantas fungos e animais Em sentido horário a partir da parte superior ao centro Sinclair StammersScience Source SciMATScience Source Darwin DaleScience Source Biophoto AssociatesScience Photo Library ImagebrokernetSuperStock blickwinkelAlamy Na medida em que ler este compêndio você encontrará determinados organismos muitas e muitas vezes Organismos tais como Escherichia coli uma bactéria Saccharomyces cerevisiae fermento biológico Caenorhabditis elegans nematódeo Drosophila melanogaster moscadasfrutas e Mus musculus camundongo têm sido utilizados repetidamente em experimentos e revelaram muito do que sabemos a respeito de como a herança atua Os organismosmodelo podem ser encontrados em diversos ramos da árvore da vida ver Figura 111 representando bactérias fungos algas plantas e animais invertebrados e vertebrados Essa diversidade possibilita que cada geneticista utilize um modelo mais bemadequado para uma questão em particular Cada organismomodelo apresenta uma comunidade de cientistas que trabalham com ele que compartilham informações e recursos facilitando assim as pesquisas Os experimentos de Mendel foram possíveis porque ele tinha diferentes variedades de ervilha cada qual carregando uma variante genética diferente em relação a traços tais como flores roxas versus brancas sementes verdes versus amarelas ou caules altos versus anões Para cada uma das espéciesmodelo os geneticistas reuniram muitas variedades também denominadas cepas ou estoques com características genéticas especiais que as tornam úteis em pesquisas Existem cepas de moscasdasfrutas que apresentam variantes de traços tais como olhos vermelhos versus brancos Existem cepas de camundongos que são propensas ao desenvolvimento de tipos específicos de câncer ou outras condições clínicas tais como diabetes Em relação ao fermento biológico existe uma coleção de quase 5000 estoques com deleção cada um deles apresentando apenas um gene deletado do genoma Esses estoques possibilitam que os geneticistas estudem a função de cada gene ao examinar como a levedura é afetada quando o gene é removido Tendo em vista que S cerevisiae apresenta aproximadamente 6000 genes no total essa coleção de 5000 estoques com deleção abrange a maior parte dos genes no genoma As diferentes linhagens de cada organismomodelo estão disponíveis para os pesquisadores por meio de centros de estoque que mantêm e distribuem as linhagens As listas dos estoques disponíveis encontramse na Internet ver Apêndice B Para visualizar um exemplo em relação aos estoques de camundongos dirijase ao link httpjaxmicejaxorg Em seguida clique em Find JAX mice na parte superior da página insira a palavra black no campo de pesquisa e clique em Search Agora clique no link C57BL6J Você verá uma imagem e informações sobre uma linhagem de camundongos G57Black comumente utilizada Outros termos de pesquisa tais como albino ou obese ligarão você a linhagens com outras características CONCEITOCHAVE A maior parte dos estudos genéticos é realizada em um dentre um número limitado de organismosmodelo com características que os tornam especialmente adequados para a análise genética Ferramentas para a análise genética Geneticistas e bioquímicos também criaram uma variedade incrível de ferramentas para a caracterização e a manipulação do DNA do RNA e de proteínas Muitas dessas ferramentas estão descritas no Capítulo 10 ou em outros capítulos relevantes para uma ferramenta específica Existem alguns poucos temas a ser mencionados aqui Primeiramente os geneticistas se aproveitaram do maquinário da própria célula para copiar colar cortar e transcrever o DNA possibilitando que os pesquisadores realizem tais reações dentro de tubos de ensaio As enzimas que realizam cada uma dessas funções nas células vivas foram purificadas e estão disponíveis para os pesquisadores as DNA polimerases conseguem fazer uma cópia de um único filamento de DNA ao sintetizar um filamento correspondente com a sequência complementar de A C G e T As nucleases podem cortar as moléculas de DNA em locais específicos ou degradar toda uma molécula de DNA em nucleotídios únicos As ligases podem unir duas moléculas de DNA a partir de suas extremidades Com a utilização da DNA polimerase ou de outras enzimas o DNA também pode ser rotulado ou marcado com um corante fluorescente ou um elemento radioativo de modo que o DNA possa ser detectado com a utilização de um detector de fluorescência ou radiação Em segundo lugar os geneticistas desenvolveram métodos para clonar o DNA e os genes que ele codifica Aqui a clonagem se refere à obtenção de muitas cópias clones de uma molécula de DNA O modo comum de fazer isso envolve o isolamento de uma molécula de DNA relativamente pequena até o comprimento de alguns milhares de pares de bases a partir de um organismo de interesse A molécula de DNA pode ser todo um gene ou uma parte dele A molécula é inserida em um organismo hospedeiro com frequência E coli no qual ela é replicada muitas vezes pela DNA polimerase do hospedeiro Possuir muitas cópias de um gene é importante para uma vasta variedade de experimentos utilizados para a sua caracterização e manipulação Em terceiro lugar os geneticistas desenvolveram métodos para inserir moléculas de DNA estranhas nos genomas de muitas espécies incluindo aquelas de todos os organismosmodelo Esse processo é denominado transformação e é possível por exemplo transformar os genes de uma espécie no genoma de outra A espécie receptora se torna então um organismo geneticamente modificado OGM A Figura 112 demonstra uma planta do tabaco na qual foi inserido um gene do vagalume possibilitando que a planta do tabaco emita luz ou brilhe no escuro Em quarto lugar os geneticistas desenvolveram um grande conjunto de métodos com base na hibridização de moléculas de DNA entre si ou entre moléculas de RNA Os dois filamentos complementares de DNA na duplahélice são unidos por ligações de hidrogênio sejam G C ou A T Essas ligações podem ser rompidas por meio de calor desnaturadas em uma solução aquosa para fornecer duas moléculas de DNA de filamento único Figura 113 Quando a solução é resfriada sob condições controladas moléculas de DNA com filamentos complementares hibridizarão preferencialmente entre si Os métodos de hibridização do DNA possibilitaram muitas descobertas Por exemplo o DNA clonado de um gene pode ser marcado com um corante fluorescente e em seguida hibridizado com cromossomos fixados em uma lâmina de microscópio revelando o cromossomo no qual o gene está localizado FIGURA 112 Esta planta do tabaco geneticamente modificada apresenta um gene do vagalume inserido em seu genoma proporcionando a ela a capacidade de emitir luz D W Ow et al Transient and Stable Expression of the Firefly Luciferase Gene in Plant Cells and Transgenic Plants Science 234 4778 1986 856 859 FIGURA 113 Os dois filamentos da duplahélice do DNA podem ser dissociados por meio de calor em soluções aquosas Após o resfriamento sob condições controladas os filamentos se reassociam ou hibridizam com o seu complemento Em quinto lugar geneticistas e bioquímicos desenvolveram diversos métodos para determinar a sequência exata de todas as A C G e T nos genomas nos cromossomos ou nos genes de um organismo O processo utilizado para decifrar a sequência exata de A C G e T em uma molécula de DNA é denominado sequenciamento do DNA e possibilitou que os geneticistas lessem a linguagem da vida Finalmente ao longo dos últimos 20 anos pesquisadores criaram ferramentas moleculares e matemáticas para a análise de todo o genoma de um organismo em um único experimento Esses esforços deram origem ao campo da genômica o estudo da estrutura e da função de genomas inteiros ver Capítulo 14 As ferramentas da genômica possibilitaram que os geneticistas reunissem quantidades extraordinárias de informações sobre os organismosmodelo incluindo a sequência de DNA completa de seus genomas listas de todos os seus genes catálogos de variantes nesses genes dados sobre os tipos de células e tecidos nos quais cada gene é expresso e muito mais Para se ter uma ideia do que se encontra disponível tente navegar no Fly Base httpflybaseorg o site dos 13 dados genômicos da moscadasfrutas ver Apêndice B CONCEITOCHAVE O progresso na genética foi produzido e catalisado pelo desenvolvimento de ferramentas moleculares e matemáticas para a análise de genes únicos e genomas inteiros Genética atual Em uma entrevista em 2008 o geneticista Leonid Kruglyak da Princeton University comentou Você tem esse fenômeno claro e tangível no qual os filhos se assemelham aos seus genitores Apesar do que se diga aos estudantes de ciências na escola elementar nós simplesmente não sabemos como ele atua Embora a observação de Kruglyak aparente ser depreciativa do progresso obtido na compreensão da herança ao longo dos últimos 100 anos certamente não era essa sua intenção Em vez disso seu comentário destaca que apesar das descobertas de alteração do paradigma dos séculos 19 e 20 enigmas são abundantes na genética e a necessidade de novos pensamentos e novas tecnologias nunca foi maior Mendel Morgan Fisher Watson Crick e muitos outros ver Tabela 11 delimitaram o fundamento das leis da herança mas os detalhes que existem sobre aquele fundamento permanecem obscuros O 180 m de DNA na célula única de um zigoto humano codifica as informações necessárias para transformar aquela célula em um adulto mas como exatamente isso ocorre é compreendido apenas nos detalhes mais escassos Nesta seção revisaremos quatro avanços recentes na genética descobertas de bastante importância e interesse geral que receberam destaque na imprensa A leitura dessas descobertas irá revelar o poder da genética de responder questões críticas a respeito da vida e destacar como esse conhecimento pode ser aplicado para a abordagem de problemas na sociedade Esse compêndio e o progresso do estudo no qual você está envolvido devem transmitir uma mensagem dupla a ciência da genética alterou profundamente a nossa compreensão sobre a vida mas também é um campo jovem no meio de uma fase dinâmica do seu desenvolvimento Da genética clássica à genômica médica Conheça a paciente VI1 Figura 114 A Seu nome é Louise Benge e quando jovem ela desenvolveu uma doença incapacitante No início de seus 20 anos ela começou a sentir dores insuportáveis nas pernas após caminhar por tão pouco quanto um quarteirão Primeiramente ela ignorou a dor em seguida conversou com seu médico de assistência primária Por fim visitou uma longa lista de especialistas Ela realizou uma bateria de exames e radiografias que lhe revelaram o problema suas artérias desde a aorta até os membros inferiores estavam calcificadas obstruídas com depósitos de fosfato de cálcio Figura 114 B Era uma doença para a qual seus médicos não tinham nome nem tratamento Ela apresentava uma doença mas não um diagnóstico Havia apenas uma coisa a fazer seu médico encaminhou Benge ao Programa de Doenças Não Diagnosticadas em inglês Undiagnosed Diseases Program UDP nos National Institutes of Health em Bethesda Maryland O UDP é um grupo de médicos e cientistas que possuem conexões com especialistas pelos National Institutes of Health em todos os campos imagináveis da medicina Essa equipe é solicitada a abordar os casos mais desafiadores Trabalhando com Benge a equipe do UDP a submeteu a quase todos os exames em seu arsenal e logo descobriu o defeito subjacente da doença Benge apresentava um nível muito baixo de uma enzima denominada CD73 a qual está envolvida na sinalização celular e é a responsável por enviar um sinal que bloqueia a calcificação Com isso os médicos do UDP poderiam fornecer a Benge um diagnóstico Denominaram a doença calcificação arterial em virtude de deficiência de CD73 ou ACDC do inglês arterial calcification due to deficiency of CD73 O que intrigava a equipe do UDP a respeito do caso de Benge era que ela não era a única a apresentar tal doença Benge tinha dois irmãos e duas irmãs e todos eles apresentavam calcificação arterial Entretanto o que era digno de nota era que os pais de Benge não eram afetados Além disso Benge e todos os seus irmãos tinham filhos mas nenhum apresentava calcificação arterial Esse padrão de herança sugeria que a causa subjacente fosse genética Especificamente ele sugeria que Benge e todos os seus irmãos herdaram duas cópias defeituosas do CD73 ou de um gene que influencia a expressão de CD73 uma de sua mãe e uma de seu pai Uma pessoa com uma cópia funcional e uma cópia defeituosa pode ser normal mas se ambas as cópias de uma pessoa forem defeituosas ocorre a ausência da função que o gene proporciona A situação é justamente igual à das ervilhas com flores brancas de Mendel Tendo em vista que o alelo funcional é dominante sobre o alelo não funcional a ACDC assim como as flores brancas aparece apenas se um indivíduo carrear dois alelos defeituosos A equipe do UDP esmiuçou ainda mais o histórico familiar de Benge e descobriu que seus genitores eram primos em terceiro grau Figura 115 Tal revelação se adequava bem à ideia de que a causa era um gene defeituoso Quando um marido e uma esposa são parentes próximos tais como primos em terceiro grau existe um aumento da chance de que ambos tenham herdado a mesma versão de um gene defeituoso de seu ancestral em comum e de que ambos venham a transmitir esse gene defeituoso aos filhos Crianças com uma cópia de um gene defeituoso com frequência são normais mas uma criança que herda uma cópia defeituosa de ambos os genitores provavelmente apresentará um distúrbio genético FIGURA 114 A Louise Benge desenvolveu uma doença não diagnosticada quando jovem B Uma radiografia revelou que a condição da doença de Louise Benge causou a calcificação das artérias em suas pernas A Jeannine Mjoseth NHGRIwwwgenomegov B National Human Genome Research Institute NHGRI FIGURA 115 Árvore genealógica ou heredograma demonstrando a herança do gene mutante que causa calcificação arterial em virtude de deficiência de CD73 ACDC Os quadrados são homens e os círculos são mulheres As linhas horizontais que conectam um indivíduo do sexo masculino com um do feminino são os cruzamentos As linhas verticais conectam um casal à sua descendência Os numerais romanos designam as gerações os numerais arábicos designam os indivíduos dentro das gerações Os quadrados ou círculos semipreenchidos indicam um indivíduo que carreia uma cópia do gene mutante Os quadrados ou círculos preenchidos indicam um indivíduo com duas cópias do gene mutante e que apresenta a doença ACDC O indivíduo I1 ou I2 era necessariamente portador do gene mutante mas qual deles é incerto conforme indicado por A seta azul indica Louise Benge As setas vermelhas demonstram a transmissão do gene mutante através das gerações Dados de C St Hilaire et al New England Journal of Medicine 364 2011 432442 Na Figura 115 podemos observar como isso ocorre A mãe e o pai de Benge indivíduos V1 e V2 na figura apresentam os mesmos tataravôs I1 e I2 Se um dos tataravôs era portador de um gene mutante para CD73 ele pode ter sido transmitido ao longo das gerações para ambos os genitores de Benge siga as setas vermelhas Assim se Benge recebeu a cópia mutante tanto de sua mãe quanto de seu pai então ambas as suas cópias serão defeituosas Cada um de seus irmãos também deve ter herdado duas cópias mutantes de seus genitores o que explicaria o fato de eles apresentarem ACDC A chance de algo assim ocorrer é muito pequena Se ambos os pais de Benge apresentavam uma cópia mutante a chance de Benge e todos os seus quatro irmãos receberem uma cópia mutante de ambos os genitores é de apenas 1 em 1024 No Capítulo 2 você aprenderá como calcular essas probabilidades Com essa dica do histórico familiar a equipe do UDP conseguiu descobrir onde procurar o gene mutante no genoma Eles precisavam procurar um segmento em um dos cromossomos no qual a cópia que Benge herdou de sua mãe fosse idêntica à cópia que ela herdou de seu pai Além disso cada um dos irmãos de Benge também deveria apresentar duas cópias desse segmento idênticas às de Benge Tais regiões são muito raras nas pessoas exceto se seus genitores forem aparentados como no caso de Benge em que seus pais eram primos em terceiro grau Em geral um segmento de um cromossomo com algumas centenas de pares de bases de comprimento apresentará diversas diferenças na sequência de A C G e T entre a cópia que herdamos de nossa mãe e a que herdamos de nosso pai Essas diferenças são conhecidas como polimorfismos de nucleotídio único ou abreviadamente SNP do inglês single nucleotide polymorphisms ver Quadro 11 Quadro 11 Polimorfismos de nucleotídio único Variação genética é qualquer diferença entre duas cópias do mesmo gene ou molécula de DNA O tipo mais simples de variação genética que se pode observar em um sítio de nucleotídio único é uma diferença na base do nucleotídio presente seja adenina citosina guanina ou timina Essas variantes são denominadas polimorfismos de nucleotídio único SNP e são o tipo mais comum de variação na maior parte dos organismos senão em todos A figura demonstra duas cópias de uma molécula de DNA da mesma região de um cromossomo Observe que as bases são as mesmas nas duas moléculas exceto onde uma molécula apresenta um par CG e a outra um par TA Se lermos o filamento 1 das duas moléculas a molécula superior apresenta uma G e a molécula inferior uma A no sítio do SNP A equipe do UDP utilizou uma nova tecnologia genômica denominada microarranjo de DNA ver Capítulo 18 que lhe possibilitou o estudo de um milhão de posições de pares de bases em todo o genoma Em cada uma dessas posições ao longo dos cromossomos a equipe pôde verificar onde os dois segmentos cromossômicos de Benge eram idênticos e se todos os irmãos de Benge também carreavam duas cópias idênticas daquele segmento Em relação a Benge esperase que uma parte de apenas 1512 do seu genoma apresente duas cópias idênticas e a chance de que todos os seus quatro irmãos também apresentem as mesmas duas cópias idênticas é ainda menor Ao observar os dados de SNP de todo o genoma a equipe do UDP encontrou exatamente o tipo de segmento cromossômico que estava procurando Havia um pequeno segmento em um dos cromossomos de Benge em relação ao qual ela e todos os seus irmãos apresentavam as mesmas duas cópias idênticas Além disso eles descobriram que o gene que codifica a enzima CD73 está localizado neste segmento Esse resultado sugeria que Benge e todos os seus irmãos apresentavam duas cópias idênticas do mesmo gene codificador de CD73 defeituoso A equipe parecia ter encontrado a agulha que estavam procurando no palheiro entretanto havia um último experimento a ser realizado A equipe precisava identificar o defeito específico no gene CD73 defeituoso que Benge e seus irmãos haviam herdado Após a determinação da sequência do DNA em relação ao gene CD73 de Benge e seus irmãos a equipe encontrou o defeito no gene a prova concreta O gene defeituoso codificava apenas uma proteína curta ou truncada ele não codificava a sequência de aminoácidos completa Um dos códons do DNA com as letras TCG que codifica o aminoácido serina havia mutado para TAG que sinaliza o truncamento da proteína A proteína sintetizada a partir da versão de Benge do gene CD73 estava truncada de modo que ela não conseguia sinalizar para manter a via da calcificação desligada nas células das artérias A jornada de Louise Benge desde a primeira dor nas pernas até o conhecimento de que apresentava uma nova doença denominada ACDC foi longa O diagnóstico da doença foi um triunfo possibilitado pela integração da genética de transmissão clássica e da genômica Conhecer o defeito subjacente à ACDC possibilitou que os médicos tentassem um medicamento que jamais teriam considerado sem que soubessem que a causa era uma enzima CD73 defeituosa medicamento esse denominado etidronato o qual pode substituir a CD73 na sinalização celular para manter a via da calcificação desligada Estudos clínicos com etidronato atualmente estão em andamento para pacientes com ACDC e sua conclusão está programada para 2017 CONCEITOCHAVE A genética de transmissão clássica fornece o fundamento para a genética médica moderna A integração da genética clássica e das tecnologias genômicas possibilita que as causas de doenças herdadas sejam prontamente identificadas Investigação da mutação e do risco de doença Logo após a redescoberta do trabalho de Mendel o médico alemão Wilhelm Weinberg relatou que parece haver uma incidência mais alta de nanismo com membros curtos acondroplasia entre crianças nascidas por último em famílias alemãs do que entre aquelas nascidas primeiro Algumas décadas mais tarde o geneticista britânico J B S Haldane observou outro padrão incomum de herança As genealogias de algumas famílias britânicas sugeriam que novas mutações em relação ao distúrbio da coagulação sanguínea hemofilia tendiam a surgir em homens com mais frequência do que em mulheres Consideradas em conjunto essas duas observações sugeriram que o risco de uma criança herdar um distúrbio é maior na medida em que os genitores envelhecem e também que os pais apresentam maior probabilidade do que as mães de contribuir com novas mutações para seus filhos Ao longo das décadas seguintes as observações de Weinberg e Haldane foram amparadas por outros estudos mas os dados não eram conclusivos Imputar uma nova mutação em uma criança ao pai ou à mãe era uma tarefa difícil e havia uma escassez de famílias bemadequadas para o estudo da ligação entre a idade parental e novas mutações associadas a doenças Esses fatores evitaram conclusões definitivas sobre a relação entre a idade parental e a ocorrência de novas mutações Em 2012 avanços na genômica e na tecnologia de sequenciamento do DNA ver Capítulo 14 possibilitaram novas análises que comprovaram que as suspeitas de Weinberg e Haldane estavam corretas e que forneceram um quadro muito detalhado da origem de novas mutações dentro das famílias Aqui se encontra como isso foi possível Uma equipe de geneticistas da Islândia estudou 78 trios grupos familiares compostos por mãe pai e um filho Figura 116 Os pesquisadores possuíam dados de até três gerações de algumas das famílias dados esses que correspondiam ao filho seus genitores e no mínimo um conjunto de avós Os estudiosos determinaram a sequência completa do genoma de cada indivíduo com o DNA isolado a partir de suas células sanguíneas compilando as sequências do genoma de um total de 219 indivíduos Tendo em vista que cada indivíduo possui duas cópias de cada cromossomo i e duas cópias do genoma humano seus dados de fato incluem as sequências de 438 genomas Com essas sequências do genoma em mãos os pesquisadores conseguiram vasculhar os dados à procura de mutações novas ou mutações de novo variantes de DNA únicas que existem em uma criança mas em nenhum de seus genitores Seu enfoque foi nas mutações de ponto mutações pontuais ou uma alteração de uma letra no código do DNA para outra que pode ocorrer durante a replicação do DNA ver Capítulo 16 Por exemplo uma alteração de uma adenina A para uma guanina G Figura 117 A lógica do processo de descoberta utilizada pelos geneticistas islandeses está resumida na Figura 117 que demonstra um segmento de DNA para cada membro de um trio Cada indivíduo apresenta duas cópias do segmento Observe que a cópia M1 na mãe possui um SNP letra verde que a distingue da cópia M2 De modo semelhante existem dois SNP letras roxas que distinguem as duas cópias do mesmo segmento no pai Comparando o filho aos genitores observamos que o filho herdou a cópia M1 de sua mãe e a cópia F2 de seu pai Observe com mais cuidado as duas cópias do segmento do filho e você verá mais uma coisa Existe uma variante única letra vermelha que ocorre no filho mas em nenhum de seus genitores Essa é uma mutação pontual de novo Nesse caso tratase de uma mutação de uma guanina G para uma timina T Podemos observar que a mutação surgiu no pai tendo em vista que se encontra na cópia F2 do segmento FIGURA 116 Os quadrados são homens e os círculos mulheres As linhas horizontais indicam um cruzamento As linhas verticais conectam um par cruzado à sua descendência Onde e exatamente quando a nova mutação ilustrada na Figura 117 surgiu A maior parte de nossos corpos é composta por células somáticas que constituem tudo desde o nosso cérebro até o nosso sangue Entretanto também apresentamos uma linhagem de células especiais denominada linhagem germinativa que se divide para produzir ovócitos nas mulheres e espermatozoides nos homens As novas mutações que têm origem nas células somáticas na medida em que elas se dividem durante o crescimento e o desenvolvimento de nossos corpos não são transmitidas para nossa descendência Entretanto uma nova mutação que ocorre na linhagem germinativa pode ser transmitida para a descendência A mutação ilustrada na Figura 117 surgiu na linhagem germinativa do pai Com os dados da sequência genômica em relação aos trios os geneticistas islandeses fizeram algumas descobertas bastante surpreendentes Primeiramente entre os 78 filhos no estudo eles observaram um total de 4933 novas mutações de ponto Cada filho carreava aproximadamente 63 mutações únicas que não existiam em seus genitores A maior parte delas ocorreu em partes do genoma que apresentam apenas uma pequena chance de impor um risco à saúde mas 62 das 4933 mutações causaram alterações potencialmente nocivas aos genes pois alteraram a sequência de aminoácidos da proteína codificada Em segundo lugar entre as mutações que poderiam ser atribuídas a um genitor de origem havia em média 55 do pai para cada 14 da mãe Os filhos estavam herdando quase quatro vezes mais novas mutações de seus pais do que de suas mães A equipe islandesa havia confirmado a previsão de Haldane realizada 90 anos antes As sequências do genoma também possibilitaram que a equipe testasse a previsão de Weinberg de que a frequência das mutações aumenta com a idade dos genitores Os pesquisadores tomaram conhecimento das idades da mãe e do pai no momento da concepção para cada trio estudado Quando investigaram se a frequência das mutações aumentava com a idade da mãe ao controlar a idade do pai a equipe não encontrou qualquer evidência dessa hipótese Mães mais velhas não transmitiram mais novas mutações de ponto à sua descendência do que as mães mais novas É sabido que mães mais velhas produzem mais aberrações cromossômicas do que mães mais jovens tais como uma cópia extra do cromossomo 21 que causa síndrome de Down ver Capítulo 17 Em seguida os estudiosos examinaram a relação entre a mutação e a idade do pai ao controlar a idade da mãe Nesse ponto eles encontraram uma relação poderosa Quanto mais velho o pai mais alta a frequência de novas mutações de ponto Figura 118 De fato para cada ano de aumento em sua idade um pai transmitirá duas novas mutações adicionais aos seus filhos Um pai de 20 anos de idade transmitirá aproximadamente 25 novas mutações a cada um de seus filhos mas um pai de 40 anos de idade transmitirá aproximadamente 65 novas mutações A observação de Weinberg realizada 100 anos antes foi confirmada FIGURA 117 É demonstrado um segmento curto do DNA de um dos cromossomos Cada indivíduo apresenta 2 cópias do segmento Na mãe elas estão rotuladas M1 e M2 no pai F1 e F2 O filho herdou a cópia M1 de sua mãe e a F2 de seu pai A versão de F2 no filho carreia uma nova mutação de ponto vermelho Os polimorfismos de nucleotídio único SNP que distinguem as diferentes cópias estão demonstrados em verde mãe e em roxo pai FIGURA 118 Gráfico do número de novas mutações de ponto em cada filho eixo y de acordo com a idade do pai da criança eixo x Cada ponto representa um dos 78 filhos estudados A linha diagonal indica a taxa de aumento em novas mutações com a idade do pai Dados de A Kong et al Nature 488 2012 471475 Por que a idade do pai é importante enquanto a da mãe aparenta não apresentar efeito sobre a frequência de novas mutações de ponto A resposta está nos diferentes modos por meio dos quais homens e mulheres formam gametas Nas mulheres assim como nas fêmeas de outros mamíferos o processo de produção dos ovócitos ocorre principalmente antes do nascimento da mulher Portanto quando uma mulher nasce possui em seus ovários um conjunto de células precursoras dos ovócitos que amadurecerão até ovócitos sem ciclos adicionais de replicação do DNA Na mulher a partir do ponto em que ela foi concebida até a formação dos ovócitos em seus ovários existem aproximadamente 24 ciclos de divisão celular 23 dos quais apresentam um ciclo de replicação cromossômica DNA e uma oportunidade para que ocorra um erro de cópia ou uma mutação Todos os 23 desses ciclos de replicação cromossômica ocorrem antes do nascimento da mulher de modo que não existem ciclos adicionais após o seu nascimento e nenhuma chance de mutações adicionais na medida em que ela envelhece Portanto mães mais velhas não contribuem com mais novas mutações de ponto para seus filhos do que mães mais jovens A produção de espermatozoides é completamente diferente As divisões celulares que produzem os espermatozoides continuam durante toda a vida de um homem e existem muito mais ciclos de divisão celular na formação dos espermatozoides do que na formação dos ovócitos Os espermatozoides produzidos por homens de 20 anos de idade terão sido submetidos a aproximadamente 150 ciclos de replicação do DNA desde o momento da concepção do homem quase sete vezes mais do que em relação aos ovócitos produzidos por mulheres de 20 anos de idade Na ocasião em que um homem chega aos 40 anos de idade seus espermatozoides apresentarão um histórico que envolve mais de 25 vezes mais ciclos de replicação do DNA do que em relação aos ovócitos em uma mulher da mesma idade Portanto existe muito mais risco de ocorrência de novas mutações de ponto durante estes ciclos extras de divisão celular e replicação do DNA com o aumento da idade do pai Existe uma reviravolta final no projeto extraordinário realizado pelos geneticistas islandeses Os 78 trios que eles estudaram foram escolhidos em virtude de os filhos na maior parte dos trios terem distúrbios hereditários Foram incluídos 44 filhos com distúrbios do espectro autista e 21 com esquizofrenia Não havia casos desses distúrbios entre os parentes de nenhum deles sugerindo que sua condição ocorria em virtude de uma mutação nova Conforme esperado os pesquisadores observaram uma correlação entre a idade do pai e o risco de doença pais mais velhos apresentavam maior probabilidade de ter filhos com autismo e esquizofrenia Em diversos casos os dados do DNA da criança e dos genitores também possibilitaram que os pesquisadores identificassem novas mutações específicas em genes que provavelmente causavam o distúrbio Por exemplo uma criança com autismo herdou uma nova mutação no gene do receptor de EPH B2 EPHB2 que atua no sistema nervoso e no qual uma mutação havia sido encontrada anteriormente em uma criança autista Estudos como esse podem apresentar importantes implicações para os indivíduos e a sociedade Alguns homens que pretendem postergar a decisão de ter filhos poderiam optar por congelar amostras de seus espermatozoides enquanto ainda são jovens O estudo também nos informa que mudanças na sociedade podem impactar o número de novas mutações que entram no pool gênico humano Se os homens optarem por adiar a paternidade para cursar a faculdade ou o estabelecimento de suas carreiras haverá um aumento correlato no número de novas mutações entre seus filhos É de conhecimento comum que a infertilidade aumenta com a idade nas mulheres Como dito com frequência o relógio biológico de uma mulher começa a funcionar a partir da puberdade O trabalho dos geneticistas islandeses nos informa que o tempo também corre para os homens CONCEITOCHAVE As sequências do genoma dos genitores e de seus filhos esclarecem os fatores que contribuem para novas mutações de ponto Os pais contribuem com quatro vezes mais novas mutações para a sua descendência do que as mães O número de novas mutações transmitidas de um pai para seus filhos aumenta com a idade do pai Quando os pés de arroz ficam um pouco molhados Entre as plantações de cereais o arroz é único Enquanto trigo cevada milho e as outras plantações de grãos crescem somente em campos secos o arroz comumente é cultivado em campos alagados denominados arrozais Figura 119 A capacidade do arroz de crescer em campos alagados oferece a ele uma vantagem consegue sobreviver a pequenos alagamentos até 25 cm de água parada nos arrozais mas a maioria das ervas daninhas não consegue Assim os agricultores de arroz conseguem utilizar os alagamentos para controlar as ervas daninhas em seus campos enquanto seu arroz se desenvolve A estratégia funciona bem nos locais em que os agricultores possuem sistemas de irrigação para controlar os níveis de água nas plantações e as chuvas fortes não excedem sua capacidade de controlar esses níveis Se a água nos arrozais se tornar muito profunda superior a 50 cm durante um período prolongado as plantas do arroz assim como as ervas daninhas podem sofrer e até morrer FIGURA 119 O arroz é cultivado em campos com água parada denominados arrozais O arroz está adaptado para tolerar níveis modestos de água parada mas a água impede o crescimento de ervas daninhas que poderiam competir com o arroz DinodiaAGE Fotostock A agricultura de arrozais conforme praticada nas planícies da Índia do Sudeste Asiático e da África Ocidental depende da precipitação atmosférica natural em vez da irrigação para alagar os campos Essa circunstância impõe um risco Quando as chuvas são fortes a profundidade da água nos arrozais pode exceder os 50 cm e submergir completamente as plantas fazendo com que as plantas do arroz sofram uma perda no rendimento ou simplesmente morram Dos 60 milhões de hectares de arrozais em planícies alimentadas pela chuva um terço sofre com alagamentos prejudiciais regularmente Estimase que as chuvas fortes e as monções que alagam os campos causem uma perda superior a US 1 bilhão a cada ano Apenas na Índia na Indonésia e em Bangladesh 4 milhões de toneladas de arroz são perdidas em virtude dos alagamentos a cada ano o suficiente para alimentar 30 milhões de pessoas Tendo em vista que essa perda em sua maior parte é sofrida pelos fazendeiros mais pobres ela pode levar à desnutrição e até à inanição No início da década de 1990 David Mackill um geneticista de plantas e um cultivador no International Rice Research Institute teve uma ideia sobre como melhorar o arroz de modo que ele pudesse tolerar a submersão Ele identificou uma extraordinária variedade de arroz denominada FR13A que conseguia sobreviver submersa e mesmo se desenvolver após as plantas terem permanecido totalmente submersas em água profunda por até 2 semanas Infelizmente a FR13A apresentava baixo rendimento e a qualidade de seus grãos era mínima Então Mackill estabeleceu a transferência de fatores genéticos da FR13A em relação à tolerância à submersão para uma variedade de arroz com mais alto rendimento e mais alta qualidade de grãos Primeiramente cruzou FR13A com uma variedade superior de arroz e em seguida cruzou durante diversas gerações as plantas híbridas novamente com a variedade superior até que criou um tipo de arroz melhor que combinava a tolerância à submersão e o alto rendimento Mackill havia conquistado seu objetivo inicial de transferir a tolerância à submersão para uma variedade superior mas a base genética de a FR13A ser tolerante à submersão permanecia obscura A tolerância à submersão da FR13A era controlada por muitos genes em cromossomos múltiplos ou poderia ser controlada principalmente por apenas um gene Para esmiuçar a base genética da tolerância à submersão Mackill e sua equipe conduziram um tipo de análise genética denominada mapeamento de locus de traço quantitativo QTL ver Capítulo 19 Um QTL é um locus genético que contribui de modo incremental ou quantitativo para a variação em relação a um traço O gene de Mendel em relação à cor das flores apresentava dois alelos categóricos um para as flores roxas e o outro para as flores brancas O QTL apresenta alelos que normalmente geram apenas alterações parciais tais como a diferença entre um roxo claro e um roxo médio Com a utilização do mapeamento do QTL Mackill compreendeu que o segredo da excepcionalidade da FR13A ocorria em sua maior parte por causa de um locus genético único ou QTL em um dos cromossomos do arroz Ele denominou tal locus SUB1 em referência a tolerância à submersão Com a localização cromossômica do SUB1 revelada era o momento de esmiuçar ainda mais profundamente e identificar a natureza molecular do SUB1 Qual tipo de proteína ele codificava Como o alelo de SUB1 observado na FR13A possibilitava que a planta lidasse com a submersão Qual é a resposta fisiológica que possibilita que a planta sobreviva à submersão Para abordar essas questões as geneticistas moleculares Pamela Ronald da California University Davis e Julia BaileySerres da California University Riverside uniramse à equipe Trabalhando com Mackill a equipe expandida enfocou no segmento do cromossomo que contém o QTL SUB1 e determinou que ele engloba um membro de uma classe de genes denominados fatores de resposta ao etileno ERF Os genes ERF codificam proteínas regulatórias que se ligam a elementos regulatórios em outros genes e assim regulam a sua expressão Portanto o SUB1 é um gene que regula a expressão de outros genes Além disso eles determinaram que o alelo do SUB1 na FR13A é ativado em resposta à submersão enquanto o alelo do SUB1 encontrado em variedades sensíveis à submersão não é ativado pela submersão A próxima pergunta era como a ativação do SUB1 possibilita que a FR13A sobreviva à submersão completa Para responder a essa questão revisemos como as plantas do arroz comuns respondem à submersão Quando uma planta está completamente submersa os níveis de oxigênio em suas células diminuem até um nível baixo e a concentração de etileno um hormônio das plantas aumenta nas células O etileno sinaliza para a planta que escape à submersão por meio do alongamento de folhas e caules para manter a cabeça acima da água Essa estratégia de escape funciona bem desde que a água não seja profunda a ponto de a planta falhar em crescer o suficiente para posicionar caules e folhas acima do nível de alagamento Se o alagamento for excessivo a planta não consegue crescer o suficiente para escapar Na tentativa de crescer e escapar a um alagamento profundo a planta utiliza todas as suas reservas energéticas carboidratos tornase longa e fraca e finalmente morre Como a variedade FR13A consegue sobreviver à submersão enquanto muitos outros tipos de arroz não conseguem A FR13A apresenta uma estratégia diferente que pode ser denominada esperar pacientemente Em resposta à submersão completa em vez de tentar um crescimento rápido para escapar ao alagamento uma planta FR13A que utiliza a estratégia de esperar sentada se torna quiescente Ela interrompe a resposta de crescimento por alongamento evitando assim o esgotamento de sua reserva de carboidratos e consequente enfraquecimento Com a estratégia da espera uma planta consegue permanecer em um estado submerso e quiescente por até 2 semanas permanecendo saudável para retomar o crescimento normal quando o alagamento retroceder A estratégia da espera paciente utilizada pela FR13A é controlada pelo SUB1 que atua como o interruptor principal ou gene regulatório para a ativação desse mecanismo Quando o alagamento aumenta a concentração do hormônio etileno também aumenta nas células da planta Tendo em vista que o SUB1 é um ERF ele é ligado em resposta à elevação dos níveis de etileno Em seguida a proteína que o SUB1 codifica orquestra a resposta da planta ao ligar ou desligar uma bateria de genes envolvidos no crescimento e no metabolismo da planta Nas plantas FR13A que se tornam submersas os genes envolvidos no alongamento do caule e das folhas como parte da estratégia de escape são desligados assim como os genes envolvidos na mobilização das reservas de energia carboidratos necessárias para alimentar a estratégia de escape Com a utilização de ferramentas de genética molecular e genômica tais como microarranjos de DNA ver Capítulos 10 e 14 a equipe do arroz foi capaz de decifrar o extensivo catálogo de genes que controlam o alongamento do órgão o metabolismo do carbono a florescência e a fotossíntese que são regulados pelo SUB1 para a conquista da resposta de esperar sentada Com a genética básica do SUB1 elucidada era o momento de colocar em funcionamento esse conhecimento A equipe repetiu o trabalho de cultivo inicial de Mackill para transferir a tolerância ao alagamento para uma variedade superior Agora entretanto tendo em vista que conheciam a localização precisa do SUB1 em um dos cromossomos eles puderam transferilo para uma variedade superior com precisão cirúrgica Essa precisão é importante pois possibilitou que a equipe evitasse a transferência de outros genes indesejáveis ao mesmo tempo Para esse projeto os pesquisadores trabalharam com uma variedade indiana intolerante à submersão porém superior denominada Swarna que é amplamente cultivada e favorecida pelos fazendeiros A nova linhagem que criaram é denominada Swarnasub1 e ela correspondeu às expectativas Estudos a campo demonstraram uma diferença surpreendente na sobrevivência e no rendimento das plantas entre a Swarna e a Swarnasub1 quando existe uma submersão completa Conforme demonstrado na Figura 120 a Swarnasub1 proporciona rendimento superior à Swarna original sob todos os diferentes níveis de alagamento Em diversos estudos o SUB1 melhorou o rendimento entre uma a três toneladas de grãos por hectare Com o amparo e o patrocínio de organizações de pesquisa internacionais agências governamentais e filantropias a Swarnasub1 e outras variedades superiores que carreiam o alelo SUB1 da FR13A agora foram distribuídas para os fazendeiros Em 2008 apenas 700 fazendeiros estavam cultivando o arroz melhorado com SUB1 mas em 2012 esse número havia aumentado para 38 milhões de fazendeiros Em 2014 a quantidade de fazendeiros que cultivam arroz com SUB1 deveria aumentar para 5 milhões com adição considerável à segurança alimentar entre alguns dos fazendeiros mais pobres do mundo Ao longo prazo o impacto da pesquisa sobre o SUB1 pode não estar limitado ao arroz Muitos cultivos estão sujeitos a alagamentos prejudiciais que reduzem as produções ou destroem todo o cultivo A pesquisa genética sobre o SUB1 proporcionou uma profunda compreensão da genética molecular de como as plantas respondem aos alagamentos Com esse conhecimento será possível manipular os genomas de outras plantas cultivadas de modo que elas também possam suportar que seus pés fiquem um pouco mais molhados FIGURA 120 Comparação do rendimento da variedade Swarna que não é tolerante ao alagamento círculos roxos e da variedade Swarnasub1 que é tolerante círculos verdes Rendimento em toneladas por hectare eixo y versus duração do alagamento em dias eixo x Dados de Ismail et al The contribution of submergencetolerant Sub 1 rice varieties to food security in floodprone rainfed lowland areas in Asia Field Crops Research 152 2013 8393 Elsevier CONCEITOCHAVE A genética e a genômica estão desempenhando um papel de liderança no melhoramento do cultivo de plantas Os princípios básicos da genética que você aprenderá durante o seu curso sobre genética são o fundamento para esses avanços Evolução recente em humanos Um objetivo da genética é compreender as regras que controlam como os genes e as informações que eles codificam são alterados entre as gerações dentro das populações Os genes nas populações são alterados ao longo do tempo em virtude de diversos motivos diferentes Por exemplo conforme vimos a mutação na linhagem germinativa pode originar uma nova variante gênica ou um novo alelo na próxima geração que não estava presente na geração atual Outro fator é a seleção natural que foi descrita pela primeira vez por Charles Darwin Em resumo se os indivíduos com uma determinada variante genética contribuem com mais descendentes para a próxima geração do que indivíduos que não apresentam aquela variante a frequência daquela variante aumentará ao longo do tempo na população Os últimos três capítulos do livro enfocam as regras que controlam a transmissão dos genes de uma geração para a próxima dentro das populações Ao longo da última década geneticistas evolutivos descreveram em detalhes extraordinários como as alterações genéticas possibilitaram que as populações humanas se adaptassem às condições de vida em diferentes partes do globo Esse trabalho revelou que três fatores foram particularmente poderosos na moldagem dos tipos de variantes gênicas que ocorrem em diferentes populações humanas São eles 1 patógenos tais como os de malária ou varíola 2 condições climáticas locais incluindo radiação solar temperatura e altitude e 3 dieta como as quantidades relativas de carne cereais ou laticínios ingeridos No Capítulo 20 você aprenderá como uma variante genética no gene da hemoglobina possibilitou que pessoas na África se adaptassem às devastações da malária Observemos brevemente exemplos de adaptações genéticas ao clima e à dieta Daremos início com um caso de adaptação humana à vida em altas altitudes Adaptação às altas altitudes Em seu esforço de colonizar a Cordilheira dos Andes na América Sul colonizadores espanhóis estabeleceram cidades no alto das montanhas próximas aos assentamentos dos povos nativos Logo perceberam que algo estava errado Os espanhóis não estavam gerando filhos Em Potosi na Bolívia que está situada 4000 m acima do nível do mar 53 anos se passaram após a fundação da cidade antes que nascesse o primeiro filho de espanhóis Conforme observado pelo padre espanhol Cobo Os índios são mais saudáveis e se multiplicam de modo mais prolífero nestas mesmas temperaturas frias o que é completamente contrário ao que ocorre com os filhos dos espanhóis cuja maior parte quando nascida nestas regiões não sobrevive2 Contrariamente aos nativos andinos os espanhóis estavam apresentando doença crônica da montanha DCM uma condição causada pela sua incapacidade em obter oxigênio suficiente do ar rarefeito das montanhas Desde observações iniciais como essas geneticistas investiram muitos esforços no estudo da adaptação humana às altas altitudes na América do Sul no Tibete e na Etiópia O que possibilita que os nativos dessas regiões prosperem enquanto nativos de planícies que se mudam para as altas elevações sofrem as graves consequências de saúde da DCM Vejamos o caso no Tibete onde os montanheses tibetanos vivem em altitudes de até 4000 metros acima do nível do mar Figura 121 O alto Platô Tibetano foi colonizado há aproximadamente 3000 anos e os colonizadores eram relacionados de modo próximo aos chineses modernos Han Entretanto em altas altitudes tibetanos nativos apresentam muito menos probabilidade do que os chineses Han de apresentar DCM e condições como hipertensão pulmonar e a correlata formação de coágulos sanguíneos que a fundamenta Para compreender a genética de como os tibetanos se adaptaram à vida em altas elevações uma equipe de pesquisadores liderada por Cynthia Beall da Case Western Reserve University comparou os tibetanos aos chineses Han em mais de 500000 SNP ao longo do genoma Tendo em vista que os tibetanos e os chineses são relacionados de modo próximo esperase que cada variante de SNP ocorra aproximadamente na mesma frequência em ambos os grupos Se a variante T de um SNP ocorrer a uma frequência de 10 em chineses Han ela também deve ser de aproximadamente 10 em tibetanos Entretanto se a variante estiver associada à melhora da saúde em altas elevações a sua frequência teria aumentado entre os tibetanos ao longo das muitas gerações desde que eles colonizaram o Platô Tibetano tendo em vista que tibetanos com esta variante teriam sido mais saudáveis e teriam tido mais filhos sobreviventes do que aqueles sem a variante A seleção natural de Charles Darwin estaria atuando FIGURA 121 Uma jovem mulher tibetana A inserção demonstra a localização do Tibete na Ásia Stefan AuthimagebrokerAGE Fotostock inserção Planet ObserverUIGGetty Images Quando a equipe de pesquisadores analisou os seus dados de SNP os SNP em um gene destacaramse O gene é denominado EPAS1 e alguns SNP nele ocorrem em frequências muito diferentes em tibetanos 87 e em chineses Han 9 Seus resultados estão demonstrados na Figura 122 Nessa figura os cromossomos humanos numerados 1 a 22 estão ao longo do eixo x e uma medida da diferença na frequência da variante do SNP entre tibetanos e chineses está no eixo y Cada ponto representa um SNP Os SNP que se encontram acima da linha vermelha horizontal são aqueles em relação aos quais a diferença de frequência entre tibetanos e chineses Han é tão grande que o gene próximo desses SNP deve ter proporcionado alguma vantagem às pessoas que colonizaram o Platô Tibetano Os SNP em EPAS1 encontramse acima da linha FIGURA 122 Os 22 cromossomos humanos são arranjados da esquerda para a direita O eixo y demonstra os resultados de um teste estatístico sobre a possibilidade de existir uma diferença significativa na frequência de SNP entre tibetanos e chineses Han Cada pequeno ponto representa um dos SNP que foram testados Os SNP acima da linha vermelha horizontal são significativamente diferentes Apenas os SNP no gene EPAS1 demonstram uma diferença significativa C Beall et al Proceedings of the National Academy of Sciences USA 107 25 2010 1145911464 Fig 1 Tais resultados sugerem que os tibetanos apresentam uma variante especial do EPAS1 que os auxilia na adaptação à vida em altitudes elevadas Para compreender melhor esse fato revisemos primeiramente o que se sabe a respeito do EPAS1 Esse gene regula a quantidade de eritrócitos que nossos corpos produzem Regula também a quantidade de eritrócitos em resposta ao nível de oxigênio em nossos tecidos Quando os níveis de oxigênio em nossos tecidos estão baixos o EPAS1 sinaliza o corpo para produzir mais eritrócitos Por que o EPAS1 direciona nossos corpos a produzirem mais eritrócitos quando os níveis de oxigênio em nossos tecidos estão baixos A resposta do EPAS1 à baixa concentração de oxigênio pode ser como nossos corpos normalmente respondem à anemia muito poucos eritrócitos Pessoas com baixas contagens de eritrócitos obtêm muito pouco oxigênio em seus tecidos e assim o EPAS1 pode sinalizar o corpo para que fabrique mais eritrócitos para corrigir a anemia Esse mecanismo pode explicar o motivo pelo qual as pessoas que vivem em baixas altitudes necessitam do gene EPAS1 Agora pensemos sobre como pessoas de uma baixa altitude responderiam caso se mudassem para uma altitude elevada Em virtude do ar rarefeito em altas altitudes seus tecidos obteriam menos oxigênio Se os seus corpos interpretassem a baixa concentração de oxigênio em virtude do ar rarefeito como um sinal de anemia o EPAS1 tentaria corrigir o problema ao sinalizar seus corpos para fabricarem mais eritrócitos Entretanto tendo em vista que elas não estão anêmicas e já possuem eritrócitos suficientes seu sangue se tornaria sobrecarregado com eritrócitos Uma contagem elevada deles pode causar hipertensão pulmonar e formação de coágulos sanguíneos condições subjacentes à DCM Finalmente como uma nova variante do EPAS1 poderia ter ajudado os tibetanos a evitarem a DCM e a se adaptarem às altas altitudes A resposta para essa questão não é conhecida e atualmente está sendo ativamente investigada mas existe uma hipótese Contrariamente aos nativos de planícies os tibetanos mantêm níveis relativamente normais de eritrócitos em altas elevações e apresentam um risco mais baixo de formação de coágulos sanguíneos e hipertensão pulmonar do que nativos de planícies que se mudam para altas altitudes Portanto a versão do EPAS1 dos tibetanos pode ter deixado de causar a produção excessiva de eritrócitos em altas altitudes ao mesmo tempo que proporciona outro mecanismo para lidar com o ar rarefeito A variante tibetana do EPAS1 ajudaos a viver em altitudes elevadas sem sofrer de DCM Tolerância à lactose Antes da invenção da agricultura há aproximadamente 10000 a 12000 anos as populações humanas sobreviviam de alimentos colhidos da natureza ao caçar animais selvagens e colher frutas e vegetais selvagens Naquela época nenhuma população humana consumia laticínios O gado ainda precisava ser domesticado e os métodos para ordenha das vacas ainda não haviam sido inventados Crianças eram alimentadas com o leite materno mas quando cresciam o gene que codifica a enzima lactase a qual possibilita que as crianças realizem a digestão do açúcar do leite lactose era desligado Após o desmame uma criança nas sociedades préagrícolas deixava de necessitar da enzima lactase de modo que o gene da lactase apresentava um interruptor ou elemento regulatório que o desligava na segunda infância Com a origem da agricultura o gado foi domesticado a partir de auroques selvagens Os primeiros fazendeiros podem ter mantido o gado primeiramente como uma fonte de carne Após a invenção da ordenha o leite oferecia outra fonte de alimento Mas havia um problema Embora as crianças nessas sociedades antigas conseguissem digerir o açúcar do leite os adultos não conseguiam Os adultos poderiam consumir o leite mas tendo em vista que não conseguiam digerir a lactose apresentavam distenção abdominal cólicas e diarreia Os adultos que apresentam esses sintomas em virtude da ingestão de leite são intolerantes à lactose Dessa maneira tendo em vista que não conseguiam digerir o açúcar do leite não o estavam utilizando como fonte de nutrição Nas sociedades antigas nas quais os alimentos por vezes poderiam ser escassos a diferença entre a vida e a morte poderia depender de fazer o melhor uso de todas as fontes de alimentos disponíveis Ainda assim tendo em vista que o gene da lactase é desligado em adultos esses não conseguiam digerir a lactose Suponha porém que uma nova mutação tenha sido inserida na população mutação essa que tenha possibilitado ao gene da lactase ser expresso em adultos Adultos com essa nova mutação ou variante então poderiam se beneficiar da ingestão do leite de um modo que adultos com ausência desta variante não poderiam Tal benefício poderia aumentar as suas chances de sobreviver e ter filhos e ao longo do tempo a variante que proporciona a persistência da lactase na vida adulta se tornaria mais comum na população O cenário há pouco descrito é o que aparenta ter ocorrido durante a história humana em diversas áreas do mundo nas quais as pessoas mantinham gado ou camelos e consumiam o leite desses animais Isso ocorreu na Europa no Oriente Médio e na África Na Europa algumas pessoas têm uma variante do gene da lactase que apresenta uma T em um SNP em particular enquanto pessoas de outras regiões do mundo apresentam uma C nesse SNP Recentemente geneticistas descobriram que a T aparenta estar localizada em um elemento regulatório que controla quando o gene da lactase é ligado Figura 123 Pessoas com a variante T apresentam expressão persistente do gene da lactase na vida adulta enquanto pessoas com a variante C apresentam seu gene da lactase desligado após a infância A T aparenta possibilitar a ligação de uma proteína regulatória denominada OCT1 próxima ao gene da lactase e assim causar a sua expressão em adultos Outras variantes que apresentam o mesmo efeito aparentam ter surgido de modo independente no Oriente Médio e na Ásia Conforme demonstrado na Figura 124 no norte da Europa onde a pecuária e o consumo de laticínios são proeminentes a persistência da lactase e a variante da lactase T que a produz são comuns enquanto tais características são muito menos comuns no sul da Europa Geneticistas inferem que os criadores de gado iniciais do norte da Europa que apresentavam a variante T se beneficiaram do consumo do leite o que possibilitou que eles sobrevivessem e produzissem mais descendentes de modo que essa variante se tornou mais comum na população ao longo do tempo Atualmente a variante T encontrase em uma frequência de 90 no norte da Europa Tendo em vista que o leite não era uma parte tão importante da dieta no sul da Europa a variante T não oferecia benefício em especial e assim permaneceu em uma frequência mais baixa aproximadamente 10 FIGURA 123 Diagrama simplificado do gene da lactase demonstrando um elemento regulatório e a região codificadora da proteína Acreditase que a OCT1 seja uma proteína reguladora da expressão do gene da lactase Variantes de SNP no elemento regulatório são encontradas em algumas partes do mundo Esses SNP estão associados à ligação da OCT1 ao elemento e à expressão do gene da lactase em adultos Esses dois exemplos destacam como as populações humanas evoluíram nos tempos recentes em resposta às condições da vida tais como os alimentos disponíveis e o clima Nos últimos três capítulos deste livro você aprenderá a teoria e os métodos utilizados pelos geneticistas para compreender como as populações evoluem em resposta ao seu ambiente Você aprenderá como os dados de SNP são reunidos como as frequências das variantes são calculadas e como são realizadas comparações para compreender as forças que influenciaram os tipos de variantes gênicas que ocorrem em diferentes populações Por meio desse tipo de análise geneticistas evolutivos aprenderam muito a respeito de como diferentes espécies de plantas animais fungos e microrganismos evoluíram e continuam a evoluir em resposta às condições em que vivem CONCEITOCHAVE Geneticistas evolutivos fornecem as ferramentas para documentar como as variantes gênicas que proporcionam um efeito benéfico podem aumentar em frequência em uma população e tornar os indivíduos na população mais bemadaptados ao ambiente em que vivem FIGURA 124 A Frequência na Europa da persistência da lactase expressão da enzima lactase em adultos B Frequência na Europa da variante T no gene da lactase que aparenta controlar a persistência da lactase A Adaptada com autorização de Y Itan et al BMC Evolutionary Biology 10 2010 36 B Adaptada com autorização de A BejaPereira et al Nature Genetics 35 2003 311313 RESUMO Ao iniciar seus estudos sobre genética imaginese no meio de uma surpreendente jornada de descobertas Os últimos 100 anos testemunharam uma revolução extraordinária no conhecimento humano a respeito de como os sistemas biológicos são reunidos e atuam A genética esteve no epicentro dessa revolução A análise genética respondeu a muitas questões fundamentais a respeito da transmissão das informações genéticas dentro das famílias e das células bem como ao longo das eras do período evolutivo Ainda assim conforme você aprenderá o processo de descoberta na genética nunca foi mais dinâmico e o ritmo do crescimento no conhecimento nunca foi maior As questões não respondidas são abundantes Como todos os genes no genoma atuam em conjunto para transformar um ovócito fertilizado em um organismo adulto Como as células conseguem orquestrar continuamente o arranjo incrivelmente complexo das interações gênicas e das reações bioquímicas que ocorrem dentro delas Como as variantes genéticas em centenas ou até mesmo milhares de genes controlam a produção das plantas cultivadas Como a genética pode orientar a prevenção e o tratamento do câncer do autismo e de outras doenças Como os genes proporcionam aos humanos a capacidade da linguagem e da consciência A análise genética ao longo dos próximos 100 anos promete ajudar a responder muitas questões como essas TERMOSCHAVE adenina A alelos células somáticas citosina C códon complementar DNA polimerase dominante elemento regulatório expressão gênica gametas gene genética genômica guanina G hipótese multifatorial hipótese um geneuma enzima ligase locus de traço quantitativo QTL mutação de ponto nuclease 1 2 3 organismo geneticamente modificado OGM organismomodelo polimorfismo de nucleotídio único SNP replicação do DNA RNA mensageiro mRNA sequenciamento do DNA teoria cromossômica teoria da mistura timina T tradução transcrição transformação PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Se a variedade parental com flores brancas na Figura 13 fosse cruzada com a planta híbrida de primeira geração naquela figura quais tipos de progênie você esperaria observar e em quais proporções Na publicação de Mendel de 1866 conforme demonstrado na Figura 14 ele relata 705 descendentes com flores roxas violeta e 224 descendentes com flores brancas A proporção que ele obteve é de 3151 para roxasbrancas Como você acha que ele explicou o fato de que a proporção não é de exatamente de 31 Na Figura 16 os estudantes apresentam uma de 15 estaturas diferentes e existem duas classes de estatura 150 m e 152 m em relação às quais não são observados estudantes Esse é um total de 17 classes de altura Se um gene mendeliano único pode explicar apenas duas classes de um traço como flores roxas ou brancas quantos genes mendelianos seriam minimamente necessários para explicar a observação de 17 classes de estatura 4 5 6 7 8 9 A Figura 17 demonstra uma via simplificada para a síntese da arginina em Neurospora Suponha que você dispõe de uma cepa especial de Neurospora que produz citrulina mas não arginina Qualis genes provavelmente ésão mutantes ou estáão ausentes na sua cepa especial Você dispõe de uma segunda cepa de Neurospora que não produz citrulina nem arginina mas produz ornitina Qualis genes ésão mutantes ou estáão ausentes nessa cepa Considere a Figura 18 A a O que as esferas azuis pequenas representam b O que as pranchas marrons representam c Você concorda com a analogia de que o DNA está estruturado como uma escada Na Figura 18 B você consegue dizer se a quantidade de ligações de hidrogênio entre adenina e timina é a mesma daquelas entre citosina e guanina Você acha que uma molécula de DNA com um alto conteúdo de A T seria mais estável do que uma molécula com um alto conteúdo de G C Qual dos três maiores grupos domínios da vida na Figura 111 não está representado por um organismomodelo A Figura 115 demonstra o heredograma ou árvore genealógica de Louise Benge indivíduo VI1 que sofre da doença ACDC por apresentar duas cópias mutantes do gene CD73 Ela tem quatro irmãos VI2 VI3 VI4 e VI5 que apresentam a doença pelo mesmo motivo Todos os 10 filhos de Louise e seus irmãos apresentam o mesmo número de cópias mutantes do gene CD73 ou esse número pode ser diferente para alguns dos 10 filhos PROBLEMAS BÁSICOS Abaixo está a sequência de um filamento único de uma molécula curta de DNA Em um pedaço de papel reescreva esta sequência e em seguida escreva a sequência do filamento complementar abaixo dela 10 11 12 13 GTTCGCGGCCGCGAAC Comparando os filamentos superior e inferior o que você observa a respeito da relação entre eles Mendel estudou uma variedade alta de ervilha com caules que apresentam 20 cm de comprimento e uma variedade anã com caules que apresentam apenas 12 cm de comprimento a Sob a teoria da mistura quão longos você espera que os caules dos híbridos de primeira e segunda geração sejam b Sob as regras mendelianas e presumindo que o comprimento do caule seja controlado por um gene único o que você espera observar nos híbridos de segunda geração se todos os híbridos de primeira geração forem altos Se uma duplahélice de DNA que tem 100 pares de bases de comprimento apresentar 32 adeninas quantas citosinas guaninas e timinas ela deve apresentar Os filamentos complementares do DNA na duplahélice são mantidos unidos por meio de pontes de hidrogênio G C ou A T Essas ligações podem ser quebradas desnaturadas em soluções aquosas por meio de aquecimento para produzir dois filamentos únicos de DNA ver Figura 113 A Como você espera que as quantidades relativas de pares de bases GC versus AT em uma duplahélice de DNA afetem o calor necessário para a sua desnaturação Como você espera que o comprimento de uma dupla hélice de DNA em pares de bases afete o calor necessário para a sua desnaturação A figura na parte inferior da página demonstra a sequência de DNA de uma parte de um dos cromossomos de um trio mãe pai e filho Você consegue localizar quaisquer novas mutações de ponto no filho que não se encontram em nenhum dos genitores Em qual genitor surgiu a mutação PROBLEMAS DESAFIADORES 14 15 16 a Existem três nucleotídios em cada códon e cada um deles pode apresentar uma de quatro bases diferentes Quantos códons únicos possíveis existem ali b Se o DNA apresentasse apenas dois tipos de bases em vez de quatro quão longos os códons precisariam ser para especificar todos os 20 aminoácidos Os pais contribuem com mais mutações de ponto novas para seus filhos do que as mães Você deve saber da biologia geral que as pessoas apresentam cromossomos sexuais dois cromossomos X em mulheres e um cromossomo X e um Y em homens Ambos os sexos apresentam os autossomos A a Em qual tipo de cromossomo A X ou Y você esperara que os genes apresentem a maior quantidade de novas mutações por par de bases ao longo de muitas gerações em uma população Por quê b Em qual tipo de cromossomo você espera o menor número de novas mutações de par de bases Por quê c Você consegue calcular o número esperado de novas mutações por par de bases em relação a um gene nos cromossomos X e Y para cada nova mutação em um gene autossômico se a taxa de mutação em homens for o dobro daquela em mulheres Em relação a homens jovens de 20 anos de idade ocorreram 150 rodadas de replicação do DNA durante a produção de espermatozoides em comparação a apenas 23 rodadas para uma mulher de 20 anos de idade Essa é uma quantidade 65 vezes maior de divisões celulares e uma oportunidade proporcionalmente maior para novas mutações de ponto Ainda assim em média homens de 20 anos de idade contribuem com apenas aproximadamente o dobro de novas mutações de ponto para a sua descendência em relação às mulheres Como você consegue explicar essa discrepância 17 18 Na ciência da computação um bit armazena um de dois estados 0 ou 1 Um byte é um grupo de 8 bits que apresenta 28 256 estados possíveis Os arquivos de computador moderno com frequência são do tamanho de megabites 106 bytes ou mesmo gigabytes 109 bytes O genoma humano tem o tamanho de aproximadamente 3 bilhões de pares de bases Quantos nucleotídios são necessários para codificar um único byte Quão grande um arquivo de computador deveria ser para armazenar a mesma quantidade de informações de um genoma humano O genoma humano tem o tamanho de aproximadamente 3 bilhões de pares de bases a Com a utilização de um papelpadrão de 216 cm 279 cm com margens de 25 cm um tamanho de fonte 12 e linhas com espaçamento simples quantas folhas de papel impressas em um lado seriam necessárias para imprimir o genoma humano b Uma resma 500 folhas de papel apresenta aproximadamente 5 cm de espessura Quão alta seria a pilha de papel com o genoma humano total c Você desejaria uma mochila um carrinho de supermercado ou um caminhão para transportar essa pilha 1F Jacob e J Monod Cold Spring Harbor Quant Symp Biol 26 1963 393 2V J Vitzthum The home team advantage Reproduction in women indigenous to high altitude Journal of Experimental Biology 204 2001 31413150 O monastério do pai da genética Gregor Mendel Uma estátua de Mendel encontrase visível ao fundo Atualmente essa parte do monastério é um museu e os curadores plantaram begônias vermelhas e brancas em uma disposição que representa graficamente o tipo de padrões de herança obtido por Mendel com ervilhas Anthony Griffiths TÓPICOS 21 22 23 24 25 26 Q Padrões de herança monogênica Base cromossômica dos padrões de herança monogênica Base molecular dos padrões de herança mendeliana Alguns genes descobertos por meio da observação das proporções de segregação Padrões de herança monogênica ligada ao sexo Análise de heredogramas humanos RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Descobrir um conjunto de genes que afetam uma propriedade biológica específica de interesse por meio da observação das proporções de herança monogênica de mutantes que afetam aquela propriedade Na progênie dos cruzamentos controlados reconhecer as proporções fenotípicas diagnósticas da herança monogênica 11 em haploides e 31 121 e 11 em diploides Explicar as proporções de herança monogênica em termos do comportamento cromossômico na meiose Prever as proporções fenotípicas entre descendentes de cruzamentos de genitores que diferem em um único gene Propor hipóteses razoáveis para explicar a dominância e a recessividade de alelos específicos no nível molecular Aplicar as regras da herança monogênica para a análise de heredogramas em seres humanos e reconhecer os padrões diagnósticos de condições autossômicas dominantes autossômicas recessivas ligadas ao X dominantes e ligadas ao X recessivas Calcular o risco de os descendentes herdarem uma condição causada por um alelo mutante em um ou mais ancestrais específicos ue tipos de pesquisas os biólogos realizam Uma área central de pesquisas na biologia de todos os organismos é a tentativa de compreender como um organismo se desenvolve a partir de um ovo fertilizado até um adulto em outras palavras o que faz um organismo ser como ele é Normalmente esse objetivo geral é fragmentado no estudo das propriedades biológicas individuais tais como o desenvolvimento da cor das flores da planta ou a locomoção animal ou a absorção de nutrientes embora os biólogos também estudem algumas áreas gerais tais como o modo como uma célula funciona Como os geneticistas analisam as propriedades biológicas A abordagem genética para a compreensão de qualquer propriedade biológica é encontrar o subconjunto de genes no genoma que influenciam aquela propriedade um processo por vezes denominado descoberta dos genes Após esses genes terem sido identificados as suas funções celulares podem ser elucidadas por meio de pesquisas adicionais Existem diversos tipos diferentes de abordagens analíticas para a descoberta dos genes mas um método amplamente utilizado depende da detecção de padrões de herança monogênica tópico deste capítulo Tudo na genética em um ou outro aspecto tem por base as variantes que podem ser herdadas A abordagem básica da genética é comparar e contrastar as propriedades de variantes e a partir dessas comparações fazer deduções a respeito da função genética Isso é semelhante ao modo como você faria inferências a respeito de como funciona uma máquina não familiar ao alterar a composição ou as posições das partes atuantes ou até mesmo por meio da remoção das partes cada uma de uma vez Cada variante representa um ajuste da máquina biológica a partir do qual a sua função pode ser deduzida Em genética o tipo mais comum de qualquer propriedade de um organismo é denominado tipo selvagem o qual é encontrado no ambiente ou na natureza As variantes hereditáveis observadas em um organismo que difere do tipo selvagem são mutantes organismos que apresentam algum tipo anormal de uma propriedade Como exemplos o tipo selvagem e alguns mutantes em dois organismosmodelo estão mostrados na Figura 21 Os tipos alternativos da propriedade são denominados fenótipos Nessa análise distinguimos um fenótipo do tipo selvagem e um fenótipo mutante Em comparação ao tipo selvagem os mutantes são raros Sabemos que eles surgem a partir dos tipos selvagens por meio de um processo denominado mutação que resulta em uma alteração que pode ser herdada no DNA de um 1 2 gene O tipo alterado do gene também é denominado mutação As mutações nem sempre são prejudiciais para um organismo por vezes elas podem ser vantajosas mas com mais frequência não apresentam efeito observável Sabese bastante a respeito dos mecanismos que causam as mutações ver Capítulo 16 mas em geral podese dizer que elas surgem a partir de erros no processamento celular do DNA A maior parte das populações naturais também apresenta polimorfismos definidos como a coexistência de dois ou mais fenótipos de uma propriedade biológica razoavelmente comuns tais como a ocorrência de ambas as plantas com frutas vermelhas e laranja em uma população de framboesas selvagens A análise genética pode utilizar e utiliza os polimorfismos mas os polimorfismos apresentam a desvantagem de em geral não envolver a propriedade específica de interesse para o pesquisador Os mutantes são muito mais úteis tendo em vista que possibilitam que o pesquisador enfoque qualquer propriedade Declarando simplesmente as etapas gerais da análise funcional por meio da descoberta dos genes são como segue Reunião de mutantes que afetam a propriedade biológica de interesse Cruzamento acasalamento de mutantes com o tipo selvagem para verificar se os seus descendentes mostram proporções de selvagens e mutantes características da herança monogênica FIGURA 21 Estas fotografias mostram a variedade dos fenótipos mutantes típicos daqueles obtidos na dissecção genética das propriedades biológicas Esses casos são da dissecção do desenvolvimento das flores 3 4 na Arabidopsis thaliana A e do crescimento de hifas em Neurospora crassa um fungo B WT Tipo selvagem A George Haughn B Anthony GriffithsOlivera Gavric Dedução das funções do gene no nível molecular Dedução de como o gene interage com outros genes para produzir a propriedade em questão Dessas etapas apenas 1 e 2 serão abrangidas no presente capítulo A descoberta dos genes tem início com uma caçada para reunir mutantes nos quais a função biológica em investigação está alterada ou destruída Embora os mutantes sejam individualmente raros existem modos de intensificar a sua recuperação Um método amplamente utilizado é tratar o organismo com radiação ou substâncias químicas que aumentam a taxa de mutação Após o tratamento o modo mais direto de identificar os mutantes é rastrear visualmente uma quantidade muito grande de indivíduos procurando por uma ocorrência aleatória de mutantes naquela população Além disso diversos métodos de seleção podem ser planejados para o enriquecimento em relação aos tipos procurados Armados com um conjunto de mutantes que afetam a propriedade de interesse esperase que cada mutante represente uma lesão em um de um conjunto de genes que controlam a propriedade Portanto a esperança é que uma via genética ou uma rede razoavelmente completa esteja representada Entretanto nem todos os mutantes são causados por lesões monogênicas alguns têm etiologia muito mais complexa de modo que primeiramente cada mutante deve ser testado para verificar se de fato ele é causado por uma mutação monogênica O teste em relação à herança monogênica ocorre por meio do cruzamento dos indivíduos que apresentam a propriedade mutante com o tipo selvagem e em seguida com a análise da primeira e da segunda gerações dos descendentes Como um exemplo uma planta mutante com flores brancas é cruzada com o tipo selvagem que apresenta flores vermelhas A progênie desse cruzamento é analisada e em seguida intercruzada para produzir uma segunda geração de descendentes Em cada geração as proporções diagnósticas de plantas com flores vermelhas em relação àquelas com flores brancas revelam se um gene único controla a cor da flor Em caso afirmativo por inferência o tipo selvagem seria codificado pela forma selvagem do gene e o mutante seria codificado por um tipo do mesmo gene no qual um evento de mutação tenha de algum modo alterado a sequência do DNA Outras mutações que afetam a cor da flor talvez malva manchada listrada e assim por diante são analisadas do mesmo modo em geral resultando em um conjunto definido de genes de cor da flor A utilização de mutantes desse modo por vezes é denominada dissecção genética tendo em vista que a propriedade biológica em questão nesse caso a cor da flor é selecionada e separada para revelar o seu programa genético subjacente não com um bisturi mas com mutantes Cada mutante possivelmente identifica um gene em separado que afeta aquela propriedade Após um conjunto de geneschave ter sido definido desse modo diversos métodos moleculares diferentes podem ser utilizados para estabelecer as funções de cada um dos genes Esses métodos serão abordados nos capítulos posteriores Portanto a genética tem sido utilizada para definir o conjunto de funções gênicas que interagem para produzir a propriedade que denominamos cor da flor neste exemplo Esse tipo de abordagem para a descoberta dos genes por vezes é denominado genética direta uma estratégia para a compreensão da função biológica que tem início com mutantes de gene único aleatórios e que termina com a sua sequência de DNA e a sua função bioquímica Veremos a genética reversa em atuação nos capítulos posteriores Em resumo ela tem início com a análise genômica no nível do DNA para identificar um conjunto de genes candidatos que codificam a propriedade biológica de interesse em seguida induz mutantes direcionados especificamente para aqueles genes e em seguida examina os fenótipos mutantes para verificar se de fato eles afetam a propriedade em estudo CONCEITOCHAVE A abordagem genética para a compreensão de uma propriedade biológica é descobrir os genes que a controlam Uma abordagem para a descoberta dos genes é isolar os mutantes e verificar cada um em relação aos padrões de herança monogênica proporções específicas da expressão normal e mutante da propriedade nos descendentes 21 A descoberta dos genes é importante não apenas em organismos experimentais como também em estudos aplicados Uma área crucial é a agricultura na qual a descoberta dos genes pode ser utilizada para compreender uma propriedade comercial desejável de um organismo tal como o seu conteúdo proteico A genética humana é outra área importante saber quais funções gênicas estão envolvidas em uma doença ou uma condição específica são informações úteis para desenvolver terapias As regras da herança monogênica foram elucidadas originalmente na década de 1860 pelo monge Gregor Mendel que vivia em um monastério na cidade de Brno atualmente parte da República Tcheca A análise de Mendel é o protótipo da abordagem experimental para a descoberta de gene único ainda utilizada atualmente De fato Mendel foi o primeiro a descobrir um gene Mendel não sabia o que os genes eram como influenciavam as propriedades biológicas ou como eram herdados no nível celular Atualmente sabemos que os genes atuam por meio de proteínas um tópico ao qual retornaremos nos capítulos posteriores Também sabemos que os padrões de herança monogênica são produzidos em virtude de os genes serem parte dos cromossomos e de esses serem repartidos de modo muito preciso entre as gerações conforme veremos posteriormente no capítulo Padrões de herança monogênica Relembre que a primeira etapa na dissecção genética é obter as variantes que diferem na propriedade em investigação Supondo que obtivemos uma coleção de mutantes relevantes a próxima questão é se cada uma das mutações é herdada como um gene único Experimentos pioneiros de Mendel A primeira análise da herança monogênica como uma via para a descoberta dos genes foi realizada por Gregor Mendel É dele a análise que seguiremos como um exemplo Mendel escolheu a ervilha de jardim Pisum sativum como seu organismo de pesquisa A escolha do organismo para qualquer pesquisa biológica é crucial e a escolha de Mendel comprovou ser uma boa escolha tendo em vista que ervilhas são de fácil plantio e cultivo Entretanto observe que Mendel não investigou mutantes de ervilhas em vez disso fez uso de mutantes que haviam sido encontrados por outras pessoas e que haviam sido utilizados na horticultura Além disso o trabalho de Mendel difere da maior parte das pesquisas genéticas realizadas atualmente no sentido em que não foi uma dissecção genética ele não estava interessado nas propriedades das próprias ervilhas mas sim no modo como as unidades hereditárias que influenciavam aquelas propriedades eram herdadas de geração para geração Contudo as leis da herança deduzidas por Mendel são exatamente aquelas que utilizamos atualmente na genética moderna na identificação dos padrões monogênicos de herança Mendel optou por investigar a herança de sete propriedades da espécie de ervilha escolhida cor da ervilha formato da ervilha cor da vagem formato da vagem cor da flor altura da planta e posição do broto florescente Em genética os termos característica e traço são utilizados de modo mais ou menos sinônimo eles significam aproximadamente propriedade Para cada uma dessas sete características Mendel obteve de seu fornecedor de horticultura duas linhagens que apresentavam fenótipos distintos e contrastantes Esses fenótipos contrastantes estão ilustrados na Figura 22 Seus resultados foram substancialmente os mesmos em relação a cada traço e assim podemos utilizar um traço a cor da semente da ervilha como uma ilustração Todas as linhagens utilizadas por Mendel eram linhagens puras o que significa que em relação ao fenótipo em questão toda a prole produzida por meio de cruzamentos entre os membros daquela linhagem era idêntica Por exemplo dentro da linhagem com sementes amarelas toda a progênie de qualquer cruzamento era de sementes amarelas A análise de Mendel da hereditariedade em ervilhas fez uso extensivo de cruzamentos Para realizar um cruzamento em plantas como a ervilha o pólen simplesmente é transferido das anteras de uma planta para o estigma de outra Um tipo especial de cruzamento é a autopolinização que é realizada ao permitir que o pólen de uma flor seja depositado sobre o seu próprio estigma O cruzamento e a autopolinização estão ilustrados na Figura 23 O primeiro cruzamento realizado por Mendel foi de plantas das linhagens com sementes amarelas com plantas das linhagens com sementes verdes Em seu programa de cruzamento geral essas linhagens constituíram a geração parental abreviada P Na Pisum sativum a cor da semente a ervilha é determinada pela constituição genética da própria semente portanto as ervilhas que resultam de um cruzamento são efetivamente progênie e podem ser convenientemente classificadas em relação ao fenótipo sem a necessidade de seu cultivo até plantas Observouse que a progênie de ervilhas do cruzamento entre as diferentes linhagens puras eram todas amarelas não importava qual genitor amarelo ou verde fosse utilizado como masculino ou feminino Essa geração de progênie é denominada primeira geração filial ou F1 A palavra filial advém das palavras em latim filia filha e filius filho Portanto os resultados desses dois cruzamentos recíprocos foram como segue em que representa um cruzamento FIGURA 22 Para cada característica Mendel estudou dois fenótipos contrastantes Fêmea da linhagem amarela Macho da linhagem verde Todas as ervilhas da F1 amarelas Fêmea da linhagem verde Macho da linhagem amarela Todas as ervilhas da F1 amarelas Os resultados observados nos descendentes de ambos os cruzamentos recíprocos foram os mesmos e assim iremos tratálos como um cruzamento Mendel cultivou as ervilhas da F1 até se tornarem plantas e autopolinizou essas plantas para obter a segunda geração filial ou F2 A F2 foi composta por 6022 ervilhas amarelas e 2011 ervilhas verdes Em resumo FIGURA 23 Em um cruzamento de uma ervilha esquerda o pólen das anteras de uma planta é transferido para o estigma de outra Na autopolinização direita o pólen é transferido das anteras para o estigma da mesma planta F1 amarela F1 amarela F2 composta por 6022 amarelas 2001 verdes Total 8023 Mendel observou que esse resultado estava muito próximo de uma proporção matemática de três quartos 75 de amarelas e um quarto 25 de verdes Um cálculo simples nos demonstra que 60228023 0751 ou 751 e que 20018023 0249 ou 249 Portanto havia uma proporção de 31 de amarelas e verdes Curiosamente o fenótipo verde que havia desaparecido na F1 havia reaparecido em um quarto dos indivíduos da F2 demonstrando que os determinantes genéticos em relação ao verde realmente existiam na F1 amarela embora não expressos Para investigar adicionalmente a natureza das plantas da F2 Mendel autopolinizou as plantas cultivadas a partir das sementes da F2 Ele observou três tipos de resultados diferentes As plantas cultivadas a partir das sementes verdes da F2 quando autopolinizadas originavam apenas ervilhas verdes Entretanto a autopolinização das plantas cultivadas a partir das sementes amarelas da F2 resultou em dois tipos um terço delas era de sementes amarelas puras mas dois terços delas deram progênie mista sendo três quartos de sementes amarelas e um quarto de sementes verdes assim como as plantas da F1 Em resumo da F2 era verde que quando autopolinizada forneceu todas verdes da F2 eram amarelas dessas quando autopolinizado originou todas amarelas quando autopolinizados originaram amarelas e verde Portanto observada de outro modo a F2 foi composta por verde puras amarelo puras de amarelas semelhantes às da F1 progênie mista Assim a proporção de 31 em um nível mais fundamental é uma proporção de 121 Mendel realizou outro cruzamento informativo entre as plantas com sementes amarelas da F1 e qualquer planta com sementes verdes Nesse cruzamento a progênie demonstrou as proporções de metade amarelas e metade verdes Em resumo Amarela da F1 Verde amarelo verde Esses dois tipos de cruzamentos a autopolinização de F1 e o cruzamento da F1 com qualquer planta com sementes verdes forneceram progênies amarelas e verdes mas em diferentes proporções Essas duas proporções estão representadas na Figura 24 Observe que as proporções são observadas apenas quando são combinadas as ervilhas de diversas vagens FIGURA 24 Mendel obteve uma proporção fenotípica de 31 em sua autopolinização da F1 esquerda e uma proporção fenotípica de 11 em seu cruzamento da F1 amarela com verde direita Os tamanhos de amostra são arbitrários As proporções de 31 e 11 observadas em relação à cor da ervilha também foram observadas para cruzamentos comparáveis em relação às outras seis características que Mendel estudou Os valores reais para as proporções de 31 1 2 3 em relação àqueles traços são mostrados na Tabela 21 Lei de Mendel da segregação igual Inicialmente o significado dessas proporções matemáticas precisas e repetíveis não foi evidente para Mendel mas ele foi capaz de planejar um modelo brilhante que não apenas explicou todos os resultados como também representou o nascimento histórico da ciência da genética O modelo de Mendel para o exemplo da cor da ervilha traduzido em termos modernos foi como segue Um fator hereditário denominado gene é necessário para a produção da cor da ervilha Cada planta apresenta um par desse tipo de gene O gene se apresenta em duas formas denominadas alelos Se o gene for foneticamente denominado um gene ípsilon então os dois alelos podem ser representados por Y que faz referência ao fenótipo amarelo e y que faz referência ao fenótipo verde Tabela 21 Resultados de todos os cruzamentos de Mendel nos quais os genitores diferiam em uma característica Fenótipos parentais F1 F2 Proporção da F2 1 Sementes lisas Rugosas Todas lisas 5474 lisas 1850 rugosas 2961 2 Sementes amarelas Verdes Todas amarelas 6022 amarelas 2011 verdes 3011 3 Pétalas roxas Brancas Todas roxas 705 roxas 224 brancas 3151 4 5 6 7 4 Vagens infladas Murchas Todas infladas 882 infladas 299 murchas 2951 5 Vagens verdes Amarelas Todas verdes 428 verdes 152 amarelas 2821 6 Flores axiais Terminais Todas axiais 651 axiais 207 terminais 3141 7 Caules longos Curtos Todos longos 787 longos 277 curtos 2841 Uma planta pode ser YY yy ou Yy A barra demonstra que os alelos são um par Na planta Yy o alelo Y domina e assim o fenótipo será amarelo Portanto o fenótipo da planta Yy define o alelo Y como dominante e o alelo y como recessivo Na meiose os membros de um par de genes separamse igualmente dentro das células que se tornam ovócitos e espermatozoides os gametas Essa separação igual se tornou conhecida como primeira lei de Mendel ou lei de segregação igual Portanto um único gameta contém apenas um membro do par de genes Na fertilização os gametas se fundem aleatoriamente independentemente de qual alelos eles contêm Aqui introduzimos uma parte da terminologia Um ovócito fertilizado a primeira célula que se desenvolve em um indivíduo da progênie é denominado zigoto Uma planta com um par de alelos idênticos é denominada homozigota substantivo homozigose e uma planta na qual os alelos do par são diferentes é denominada heterozigota substantivo heterozigose Por vezes um heterozigoto em relação a um gene é denominado monohíbrido Um indivíduo pode ser classificado como homozigoto dominante tal como YY heterozigoto Yy ou homozigoto recessivo yy Em geral em genética as combinações alélicas subjacentes aos fenótipos são denominadas genótipos Portanto YY Yy e yy são todos genótipos A Figura 25 demonstra como os postulados de Mendel explicam as proporções das progênies ilustradas na Figura 24 As linhagens puras são homozigotas sejam YY ou yy Portanto cada linhagem produz apenas gametas Y ou apenas gametas y originando só homozigotos Quando cruzadas entre si as linhagens YY e yy produzem uma geração F1 composta por todos indivíduos heterozigotos Yy Tendo em vista que Y é dominante todos os indivíduos da F1 são de fenótipo amarelo Podese pensar na autopolinização dos indivíduos da F1 como um cruzamento do tipo Yy Yy que por vezes é denominado um cruzamento mono híbrido A segregação igual dos alelos Y e y na F1 heterozigota resulta em gametas do sexo masculino e feminino metade dos quais são Y e metade dos quais são y Os gametas masculinos e femininos se fundem aleatoriamente na fertilização com os resultados demonstrados na grade na Figura 25 A composição da F2 é de três quartos de sementes amarelas e um quarto de verdes uma proporção de 31 A proporção de um quarto das sementes F2 é verde puro conforme esperado do genótipo yy Entretanto as sementes amarelas da F2 que totalizam três quartos são de dois genótipos dois terços delas são claramente heterozigotos Yy e um terço é homozigoto dominante YY Portanto observamos que na base da proporção fenotípica de 31 na F2 encontrase uma proporção genotípica de 121 A ilustração geral de um indivíduo que expressa o alelo dominante é Y o travessão representa uma abertura que pode ser preenchida por outro Y ou por um y Observe que a segregação igual é detectável apenas na meiose de um heterozigoto Portanto Yy produz metade dos gametas Y e metade dos gametas y Embora a segregação igual esteja ocorrendo também em homozigotos nem a segregação Y Y nem a segregação y y é significativa ou detectável no nível genético FIGURA 25 Os resultados de Mendel esquerda são explicados por um modelo monogênico direita que postula a segregação igual dos membros de um par de genes nos gametas Agora também podemos explicar os resultados do cruzamento entre as plantas cultivadas a partir de sementes amarelas da F1 Yy e as plantas cultivadas a partir de sementes verdes yy Nesse caso a segregação igual nas heterozigotas amarelas da F1 fornece gametas com uma proporção de Y y Entretanto o genitor yy somente pode produzir gametas y Assim o fenótipo da progênie depende apenas de qual alelo elas herdam do genitor Yy Portanto a proporção gamética de Y y do heterozigoto é convertida em uma proporção genotípica de Yy yy que corresponde a uma proporção fenotípica de 11 de plantas com sementes amarelas e plantas com sementes verdes Isso está ilustrado no painel à direita da Figura 25 Observe que ao definir os pares de alelos subjacentes aos seus fenótipos 22 Mendel havia identificado um gene que afeta radicalmente a cor da ervilha Essa identificação não era o seu interesse primário mas podemos observar como o achado dos padrões de herança monogênica é um processo de descoberta de genes que identifica os genes individuais que influenciam uma propriedade biológica CONCEITOCHAVE Todas as proporções genéticas de 11 31 e 121 são diagnósticas da herança monogênica e têm por base a segregação igual em um heterozigoto A pesquisa de Mendel em meados do século 19 não foi notada pela comunidade científica internacional até que observações semelhantes foram publicadas de modo independente por diversos outros pesquisadores no século 20 Logo depois pesquisas em muitas espécies de plantas animais fungos e algas demonstraram que a lei da segregação igual de Mendel era aplicável a todos os eucariotos sexuados e em todos os casos tinha por base as segregações cromossômicas que ocorrem na meiose um tópico ao qual nos voltaremos na próxima seção Base cromossômica dos padrões de herança monogênica A consideração de Mendel sobre a segregação igual era que os membros de um par de genes segregavam igualmente na formação dos gametas Ele não tinha conhecimento a respeito dos eventos subcelulares que ocorrem quando as células se dividem na formação dos gametas Atualmente compreendemos que os pares de genes estão localizados em pares de cromossomos e que são os membros de um par de cromossomos que de fato se segregam carreando os genes com eles Os membros de um par de genes são segregados como uma consequência inevitável Herança monogênica em diploides Quando as células se dividem assim também precisam se dividir o núcleo e seus principais componentes os cromossomos Para compreender a segregação gênica primeiramente é preciso compreender e contrastar os dois tipos de divisões nucleares que ocorrem em células eucarióticas Quando as células somáticas corporais se dividem para aumentar sua quantidade a divisão nuclear que as acompanha é denominada mitose um estádio programado de todos os ciclos de divisão celular eucariótica Figura 26 A mitose pode ocorrer em células diploides ou haploides Como resultado uma célula genitora se torna duas células geneticamente idênticas Portanto Qualquer 2n 2n 2n ou n n n Esse truque de constância é conquistado quando cada cromossomo se replica para produzir duas cópias idênticas dele próprio com a concomitante replicação do DNA As duas cópias idênticas que com frequência são discerníveis visualmente são denominadas cromátidesirmãs Em seguida cada cópia é puxada em direção às extremidades opostas da célula Quando a célula se divide cada célulafilha apresenta o mesmo conjunto cromossômico que a sua genitora Além disso a maior parte dos eucariotos apresenta um ciclo sexuado e nesses organismos células diploides especializadas denominadas meiócitos são separadas e se dividem para produzir células sexuais tais como espermatozoides e ovócitos em plantas e animais ou esporos sexuais em fungos ou algas Ocorrem duas divisões celulares sequenciais e as duas divisões nucleares que as acompanham são denominadas meiose Tendo em vista que ocorrem duas divisões quatro células são produzidas a partir de cada célula genitora A meiose ocorre apenas em células diploides e os gametas resultantes espermatozoides e ovócitos em animais e plantas são haploides Portanto o resultado líquido da meiose é FIGURA 26 2n n n n n Essa divisão geral pela metade da quantidade de cromossomos durante a meiose é conquistada por meio de uma replicação e duas divisões Assim como com a mitose cada cromossomo é replicado uma vez mas na meiose os cromossomos replicados cromátidesirmãs permanecem unidos Um de cada um dos pares de cromossomos replicados é puxado em direção às extremidades opostas da célula e ocorre a divisão Na segunda divisão as cromátidesirmãs se separam e são puxadas em direção às extremidades opostas da célula A localização dos meiócitos nos ciclos de vida de animais plantas e fungos está demonstrada na Figura 27 As características genéticas básicas da mitose e da meiose estão resumidas na Figura 28 Para facilitar a comparação ambos os processos estão demonstrados em uma célula diploide Observe novamente que a mitose ocorre em uma divisão celular e as duas célulasfilhas resultantes apresentam o mesmo conteúdo genômico que a célulamãe genitora O primeiro processochave a ser observado é uma replicação cromossômica prémitótica No nível do DNA esse estágio é a fase de síntese ou S ver Figura 26 na qual o DNA é replicado A replicação produz pares de cromátidesirmãs idênticas que se tornam visíveis no início da mitose Quando uma célula se divide cada membro de um par de cromátidesirmãs é puxado para dentro de uma célulafilha onde assume o papel de um cromossomo pleno Portanto cada célulafilha apresenta o mesmo conteúdo cromossômico da célula original Antes da meiose assim como na mitose ocorre a replicação cromossômica para formar cromátidesirmãs que se tornam visíveis na meiose O centrômero aparentemente não se divide nesse estádio mas se divide na mitose Também contrariamente à mitose os pares homólogos de cromátidesirmãs agora se unem para formar um feixe de quatro cromátides homólogas Essa reunião dos pares homólogos é denominada sinapse e se forma em virtude das propriedades de uma estrutura macromolecular denominada complexo sinaptonêmico SC a qual corre pelo centro do par Os cromossomosirmãos replicados em conjunto são denominados díade da palavra grega dois A unidade que compreende o par de díades em sinapse é denominada bivalente As quatro cromátides que compõem um bivalente são denominadas tétrade da palavra grega quatro para indicar que existem quatro unidades homólogas no feixe FIGURA 27 Os ciclos de vida de humanos plantas e fungos demonstrando os pontos nos quais ocorrem a mitose e a meiose Observe que em humanos do sexo feminino e em muitas plantas três células da tétrade meiótica são abortadas A abreviação n indica uma célula haploide 2n uma célula diploide gp faz referência a gametófito o nome da pequena estrutura composta por células haploides que produzirá gametas Em muitas plantas tais como o milho um núcleo do gametófito masculino se funde com dois núcleos do gametófito feminino dando origem a uma célula triploide 3n que em seguida replica para formar o endosperma um tecido nutritivo que circunda o embrião que é derivado do zigoto 2n Uma observação entre parênteses O processo de crossing over ocorre nesse estágio de tétrade O crossing over altera as combinações de alelos de diversos genes diferentes mas não afeta diretamente os padrões de herança monogênica portanto adiaremos a sua abrangência detalhada até o Capítulo 4 Para o momento vale observar que à parte da sua função de combinação de alelos o crossing over sabidamente também é um evento crucial que é essencial para a adequada segregação dos cromossomos na primeira divisão meiótica FIGURA 28 Representação simplificada da mitose e da meiose em células diploides 2n Diploide n Haploide Versões detalhadas estão demonstradas no Apêndice 21 adiante Os bivalentes de todos os cromossomos se movimentam até o equador da célula e quando a célula se divide uma díade vai para cada nova célula puxada por fibras do fuso ligadas próximo aos centrômeros Na segunda divisão celular da meiose os centrômeros se dividem e cada membro de uma díade cada membro de um par de cromátides se movimenta para uma célulafilha Portanto embora o processo tenha início com o mesmo conteúdo genômico da mitose as duas segregações sucessivas resultam em quatro células haploides Cada uma das quatro células haploides que constituem os quatro produtos da meiose contém um membro de uma tétrade portanto o grupo de quatro células por vezes também é denominado uma tétrade A meiose pode ser resumida como segue Início dois homólogos Replicação duas díades Pareamento tétrade Primeira divisão uma díade para cada célulafilha Segunda divisão uma cromátide para cada célulafilha Pesquisas em biologia celular demonstraram que as fibras do fuso que separam os cromossomos são polímeros da molécula tubulina A separação é causada principalmente por uma despolimerização e consequente encurtamento das fibras no ponto em que elas estão unidas aos cromossomos O comportamento dos cromossomos durante a meiose explica claramente a lei de Mendel sobre a segregação igual Considere um heterozigoto de tipo geral Aa Podemos simplesmente seguir o resumo precedente enquanto consideramos o que ocorre com os alelos desse gene Início um homólogo carrega A e um carrega a Replicação uma díade é AA e uma é aa Pareamento a tétrade é AAaa Produtos da primeira divisão uma célula AA a outra célula aa o crossing over pode misturar esses tipos de produtos mas a proporção geral não é alterada Produtos da segunda divisão quatro células duas do tipo A e duas do tipo a Portanto os produtos da meiose de um meiócito heterozigoto Aa são A e a precisamente a proporção igual que é necessária para explicar a primeira lei de Mendel Meiose Observe que enfocamos os amplos aspectos genéticos da meiose necessários para explicar a herança monogênica Descrições mais completas dos estágios detalhados da mitose e da meiose são apresentadas nos Apêndices 21 e 22 ao fim deste capítulo Herança monogênica em haploides Vimos que a base celular da lei da segregação igual é a segregação dos cromossomos na primeira divisão da meiose Até então na discussão a evidência em relação à segregação igual de alelos nos meiócitos de plantas e de animais é indireta com base na observação que cruzamentos demonstram proporções adequadas de progênie esperadas pela segregação igual Reconheça que os gametas nesses estudos tais como o de Mendel precisam advir de muitos meiócitos diferentes Entretanto em alguns organismos seu ciclo de vida especial possibilita o exame dos produtos de um único meiócito Esses organismos são denominados haploides bons exemplos dos quais são a maior parte dos fungos e das algas Eles passam a maior parte de suas vidas no estado haploide mas conseguem se cruzar no processo que forma uma célula diploide temporária que se torna o meiócito Em algumas espécies os quatro produtos de uma única meiose são temporariamente mantidos juntos em um tipo de saco Saccharomyces cerevisiae um fungo fornece um bom exemplo ver Organismomodelo Levedura no Capítulo 12 Em fungos existem formas simples de sexos denominadas tipos reprodutivos Em S cerevisiae existem dois tipos reprodutivos e um cruzamento de sucesso somente pode ocorrer entre linhagens de tipos reprodutivos opostos Vejamos um cruzamento que inclui um mutante de levedura Colônias de levedura do tipo selvagem normais são brancas mas ocasionalmente surgem mutantes vermelhos em virtude de uma mutação em um gene na via bioquímica que sintetiza a adenina Utilizemos o mutante vermelho para investigar a segregação igual em um único meiócito Podemos denominar o alelo mutante r para vermelho Qual símbolo podemos utilizar para o alelo normal ou do tipo selvagem Em genética experimental o alelo do tipo selvagem em relação a qualquer gene em geral é designado por um sinal de mais Esse sinal é unido como um sobrescrito ao símbolo inventado para o alelo mutante Portanto o alelo do tipo selvagem nesse exemplo será designado r mas com frequência é utilizado apenas o sinal como uma abreviação Para verificar a segregação monogênica o mutante vermelho é cruzado com o tipo selvagem O cruzamento será r r Quando duas células do tipo reprodutivo oposto se fundem é formada uma célula diploide e é essa célula que se torna o meiócito No presente exemplo o meiócito diploide será heterozigoto rr A replicação e a segregação de r e r originam uma tétrade de dois produtos meióticos esporos de genótipo r e dois de genótipo r todos contidos dentro de um saco membranoso denominado asco Portanto Os detalhes do processo estão demonstrados na Figura 29 Se os quatro esporos de um asco forem isolados representando uma tétrade de cromátides e utilizados para gerar quatro culturas de leveduras a segregação igual dentro de um meiócito é revelada diretamente como duas culturas brancas e duas vermelhas Se analisarmos os esporos aleatórios de muitos meiócitos encontraremos aproximadamente 50 de vermelhos e 50 de brancos Observe a simplicidade da genética haploide um cruzamento requer a análise de apenas uma meiose contrariamente um cruzamento diploide requer uma consideração da meiose em ambos os genitores dos sexos masculino e feminino Essa simplicidade é um motivo importante para a utilização de haploides como organismosmodelo Outro motivo é que em haploides todos os alelos estão expressos no fenótipo tendo em vista que não existe mascaramento de recessivos por alelos dominantes no outro homólogo Demonstração da segregação igual dentro de um meiocito na levedura S cerevisiae 23 FIGURA 29 Um asco isolado do cruzamento r leva a duas culturas de e duas culturas de r Base molecular dos padrões de herança mendeliana É claro que Mendel não fazia ideia da natureza molecular dos conceitos com os quais estava trabalhando Nesta seção podemos iniciar a introdução de alguns dos conceitos de Mendel em um contexto molecular Iniciemos com os alelos Utilizamos o conceito de alelos sem definilos no nível molecular Quais são as diferenças estruturais entre os alelos do tipo selvagem e mutantes no nível do DNA de um gene Quais são as diferenças funcionais no nível proteico Os alelos mutantes podem ser utilizados para estudar a herança monogênica sem a necessidade de compreender a sua natureza estrutural ou funcional Entretanto tendo em vista que um motivo primário para o embarque na herança monogênica é finalmente investigar a função de um gene devemos compreender a natureza molecular dos alelos do tipo selvagem e mutante em ambos os níveis estrutural e funcional Diferenças estruturais entre os alelos no nível molecular Mendel propôs que os genes se apresentam em diferentes formas que atualmente denominamos alelos O que são alelos no nível molecular Quando alelos tais como A e a são examinados no nível do DNA por meio da utilização da tecnologia moderna em geral observase que são idênticos na maior parte de suas sequências e que diferem apenas em um ou diversos nucleotídios das centenas ou dos milhares de nucleotídios que compõem o gene Portanto observamos que os alelos são versões verdadeiramente diferentes do mesmo gene O diagrama a seguir representa o DNA de dois alelos de um gene a letra x representa uma diferença na sequência de nucleotídios Se a sequência de nucleotídios de um alelo é alterada como resultado de um acidente químico raro é criado um novo alelo mutante As referidas alterações podem ocorrer em qualquer local ao longo da sequência de nucleotídios de um gene Por exemplo uma mutação pode ser uma alteração na identidade de um nucleotídio único ou a deleção de um ou mais nucleotídios ou até mesmo a adição de um ou mais nucleotídios Existem muitos modos por meio dos quais um gene pode ser alterado pela mutação Por um lado a lesão mutacional pode ocorrer em qualquer um de muitos locais diferentes Podemos representar a situação como segue em que o azul escuro indica a sequência de DNA do tipo selvagem normal e o vermelho com a letra x representa a sequência alterada Aspectos moleculares da transmissão dos genes Replicação dos alelos durante a fase S O que ocorre com os alelos no nível molecular durante a divisão celular Sabemos que o componente genômico primário de cada cromossomo é uma molécula de DNA Essa molécula de DNA é replicada durante a fase S que precede a mitose e a meiose Conforme veremos no Capítulo 7 a replicação é um processo preciso e assim todas as informações genéticas são duplicadas sejam do tipo selvagem ou mutante Por exemplo se uma mutação for o resultado de uma alteração em um único par de nucleotídios digamos de GC tipo selvagem para AT mutante então em um heterozigoto a replicação será como segue A replicação do DNA antes da mitose em um haploide e um diploide está demonstrada na Figura 210 Esse tipo de ilustração serve para nos lembrar que em nossas considerações sobre os mecanismos da herança essencialmente são as moléculas de DNA que estão sendo movimentadas nas células em divisão Meiose e mitose no nível molecular A replicação do DNA durante a fase S produz duas cópias de cada alelo A e a que agora podem ser segregadas em células separadas A divisão nuclear visualizada no nível do DNA está demonstrada na Figura 211 Demonstração da segregação cromossômica no nível molecular Interpretamos os padrões de herança fenotípica monogênica em relação à segregação do DNA cromossômico na meiose Existe algum modo para demonstrar a segregação do DNA diretamente contrariamente à segregação fenotípica A abordagem mais direta seria sequenciar os alelos digamos A e a nos genitores e nos produtos meióticos o resultado seria que metade dos produtos apresentaria a sequência do DNA A e metade apresentaria a sequência do DNA a O mesmo seria verdadeiro em relação a qualquer sequência de DNA que diferisse nos cromossomos herdados incluindo aquelas não necessariamente dentro dos alelos correlacionados com fenótipos conhecidos tais como flores vermelhas e brancas Portanto observamos que as regras da segregação anunciadas por Mendel se aplicam não somente aos genes mas também a qualquer trecho de DNA ao longo de um cromossomo As moléculas de DNA se replicam para formar cromátides idênticas FIGURA 210 Cada cromossomo se divide longitudinalmente em duas cromátides esquerda no nível molecular direita a molécula de DNA única de cada cromossomo se replica produzindo duas moléculas de DNA uma para cada cromátide Também estão demonstradas diversas combinações de um gene com o alelo do tipo selvagem b e o tipo mutante b causado pela alteração em um único par de bases de GC para AT Observe que no nível do DNA as duas cromátides produzidas quando um cromossomo se replica são sempre idênticas entre si e ao cromossomo original CONCEITOCHAVE A herança mendeliana é demonstrada por qualquer segmento de DNA em um cromossomo por meio dos genes e de seus alelos e por meio de marcadores moleculares não necessariamente associados a qualquer função biológica Alelos no nível molecular No nível molecular o fenótipo primário de um gene é a proteína que ele produz Quais são as diferenças funcionais entre as proteínas que explicam os distintos efeitos dos alelos do tipo selvagem e mutantes sobre as propriedades de um organismo Exploremos o tópico ao utilizar a doença humana fenilcetonúria PKU Veremos em uma seção posterior na análise de heredogramas que o fenótipo da PKU é herdado como um traço mendeliano recessivo A doença é causada por um alelo defeituoso do gene que codifica a enzima hepática fenilalanina hidroxilase PAH Essa enzima normalmente converte a fenilalanina nos alimentos no aminoácido tirosina Entretanto uma mutação no gene que codifica essa enzima pode alterar a sequência de aminoácidos próxima ao sítio ativo da enzima Nesse caso a enzima não consegue se ligar à fenilalanina seu substrato ou convertêla em tirosina Portanto a fenilalanina se acumula no corpo e é convertida em vez disso em ácido fenilpirúvico Esse composto interfere no desenvolvimento do sistema nervoso levando ao retardo mental Os bebês atualmente são testados de modo rotineiro ao nascimento em relação a essa deficiência de processamento Se a deficiência for detectada o acúmulo de fenilalanina poderá ser evitado com a utilização de uma dieta especial e o desenvolvimento da doença será interrompido A enzima PAH é composta por um único tipo de proteína Quais alterações ocorreram no DNA mutado do gene da PKU e como a referida alteração no nível do DNA afeta a função da proteína e produz o fenótipo da doença O sequenciamento dos alelos mutantes de muitos pacientes com PKU revelou uma pletora de mutações em diferentes sítios ao longo do gene principalmente nas regiões de codificação da proteína ou éxons os resultados estão resumidos na Figura 212 Elas representam uma variação de alterações do DNA mas a maior parte é de pequenas alterações que afetam apenas um par de nucleotídios entre os milhares que constituem o gene O que esses alelos têm em comum é que eles codificam uma proteína defeituosa que deixa de apresentar a atividade normal da PAH Ao alterar um ou mais aminoácidos todas as mutações inativam alguma parte essencial da proteína codificada pelo gene O efeito da mutação sobre a função gênica depende da região dentro do gene no qual ocorre a mutação Uma região funcional importante do gene é aquela que codifica um sítio ativo da enzima assim essa região é muito sensível à mutação Além disso se observa que uma minoria das mutações ocorre em íntrons e essas mutações com frequência impedem o processamento normal do transcrito primário do RNA Algumas das consequências gerais da mutação no nível da proteína estão demonstradas na Figura 213 Muitos dos alelos mutantes são de um tipo em geral denominado alelos nulos as proteínas codificadas por eles apresentam ausência completa da função da PAH Outros alelos mutantes reduzem o nível da função enzimática por vezes eles são denominados mutações hipomórficas leaky tendo em vista que alguma função do tipo selvagem parece vazar no fenótipo mutante O sequenciamento do DNA com frequência detecta alterações que não causam impacto funcional de modo que elas são funcionalmente do tipo selvagem Portanto observamos que os termos tipo selvagem e mutante por vezes devem ser utilizados com cautela FIGURA 211 Transmissão gênica e de DNA na mitose e na meiose em eucariotos Estão demonstrados a fase S e os principais estágios da mitose e da meiose As divisões mitóticas à esquerda e na parte central conservam o genótipo da célula original À direita as duas divisões meióticas sucessivas que ocorrem durante o estágio sexuado do ciclo de vida apresentam o efeito líquido de dividir pela metade o número de cromossomos Os alelos A e a de um gene são utilizados para demonstrar como os genótipos são transmitidos na divisão celular FIGURA 212 Muitas mutações no gene da fenilalanina hidroxilase humana que causam mau funcionamento enzimático são conhecidas O número de mutações nos éxons ou regiões codificadoras da proteína pretas está listado acima do gene O número de mutações nas regiões intrônicas verdes numeradas 1 a 13 que alteram a recomposição do mRNA está listado abaixo do gene Dados de C R Scriver Ann Rev Genet 28 1994 141165 FIGURA 213 Mutações nas regiões de um gene que codificam sítios enzimáticos ativos levam à formação de enzimas que não funcionam mutações nulas Mutações em outras regiões gênicas podem não apresentar efeitos sobre a função enzimática mutações silenciosas Os promotores são sítios importantes na iniciação da transcrição CONCEITOCHAVE A maior parte das mutações que alteram o fenótipo altera a sequência de aminoácidos do produto proteico do gene resultando em redução ou ausência de função Temos seguido a ideia de que descobrir um conjunto de genes que interferem com a propriedade biológica em investigação é um objetivo importante da genética tendo em vista que ele define os componentes do sistema Entretanto descobrir o modo preciso por meio do qual os alelos mutantes levam aos fenótipos mutantes com frequência é desafiador requerendo não apenas a identificação dos produtos proteicos desses genes mas também estudos celulares e fisiológicos detalhados para medir os efeitos das mutações Além disso descobrir como o conjunto de genes interage é um segundo nível de desafio e um tópico que seguiremos posteriormente com início no Capítulo 6 Dominância e recessividade Com uma compreensão a respeito de como os genes atuam por meio de seus produtos proteicos podemos compreender melhor a dominância e a recessividade A dominância foi definida anteriormente neste capítulo como o fenótipo mostrado por um heterozigoto Portanto formalmente é o fenótipo que é dominante ou recessivo mas na prática os geneticistas com frequência aplicam o termo aos alelos Essa definição formal não apresenta conteúdo molecular mas ambas a dominância e a recessividade podem apresentar explicações simples no nível molecular Introduzimos aqui o tópico para ser revisitado no Capítulo 6 Como os alelos podem ser dominantes Como eles podem ser recessivos A recessividade é observada em mutações nulas nos genes que são funcionalmente haplossuficientes imprecisamente significando que uma cópia do gene apresenta função suficiente para produzir um fenótipo do tipo selvagem Embora uma célula diploide do tipo selvagem normalmente apresente duas cópias totalmente funcionais de um gene uma cópia de um gene haplossuficiente proporciona produtos genéticos suficientes em geral uma proteína para realizar as transações normais da célula Em um heterozigoto digamos m em que m é um nulo a única cópia funcional codificada pelo alelo proporciona produto proteico suficiente para a função celular normal Em um exemplo simples presuma que uma célula necessite de no mínimo 10 unidades proteicas para funcionar normalmente Cada alelo do tipo selvagem consegue produzir 12 unidades Portanto um homozigoto do tipo selvagem produzirá 24 unidades O heterozigoto m produzirá 12 unidades excedendo o mínimo de 10 unidades e portanto o alelo mutante é recessivo tendo em vista que não apresenta impacto sobre o heterozigoto Outros genes são haploinsuficientes Nos referidos casos um alelo mutante nulo será dominante tendo em vista que em um heterozigoto P o único alelo do tipo selvagem não consegue proporcionar produto suficiente para a função normal Como outro exemplo vamos presumir que a célula necessite de no mínimo 20 unidades dessa proteína e que o alelo do tipo selvagem produza apenas 12 unidades Um homozigoto do tipo selvagem produz 24 unidades que é superior ao mínimo Entretanto um heterozigoto que envolve uma mutação nula P produz apenas 12 portanto a presença do alelo mutante no heterozigoto resulta em um suprimento inadequado de produtos e se segue um fenótipo mutante Em alguns casos a mutação resulta em uma nova função para o gene As referidas mutações podem ser dominantes tendo em vista que em um heterozigoto o alelo do tipo selvagem não consegue mascarar essa nova função A partir das breves considerações anteriores observamos que o fenótipo a descrição ou a medida que seguimos durante a herança mendeliana é uma propriedade emergente com base na natureza dos alelos e no modo como o gene funciona normal ou anormalmente O mesmo pode ser dito em relação às descrições de dominante e recessivo que aplicamos para um fenótipo 24 1 2 3 Alguns genes descobertos por meio da observação das proporções de segregação Relembre que um objetivo geral da análise genética atual é dissecar uma propriedade biológica por meio da descoberta do conjunto de genes únicos que a afetam Aprendemos que um modo importante de identificar esses genes é por meio das proporções de segregação fenotípica geradas por suas mutações com mais frequência proporções de 11 e 31 ambas as quais têm por base a segregação igual conforme definida por Gregor Mendel Vejamos alguns exemplos que estendem a abordagem mendeliana para um ambiente experimental moderno Tipicamente o pesquisador é confrontado com uma variedade de fenótipos mutantes interessantes que afetam a propriedade de interesse tal como aquelas ilustradas na Figura 21 e agora precisa saber se eles são herdados como alelos de mutantes únicos Os alelos mutantes podem ser dominantes ou recessivos dependendo da sua ação assim a questão da dominância também precisa ser considerada na análise O procedimento padrão é cruzar o mutante com o tipo selvagem Se o mutante for estéril então é necessária outra abordagem Primeiramente consideraremos três casos simples que abrangem a maior parte dos desfechos possíveis Uma flor fértil mutante sem pigmento nas pétalas p ex com pétalas brancas contrariamente às vermelhas normais Uma moscadasfrutas fértil mutante com asas curtas Um fungo fértil mutante que produz excesso de ramos hifais hiper ramificação Um gene ativo no desenvolvimento da cor da flor Para iniciar o processo a planta com flores brancas é cruzada com o tipo selvagem normal vermelho Todas as plantas da F1 são com flores vermelhas e das 500 plantas da F2 amostradas 378 são com flores vermelhas e 122 são com flores brancas Se reconhecermos a existência do erro de amostragem essas quantidades da F2 estão muito próximas de uma proporção de ou 31 Tendo em vista que essa proporção indica a herança monogênica podemos concluir que o mutante é causado por uma alteração recessiva em um gene único De acordo com as regras gerais da nomenclatura dos genes o alelo mutante para as pétalas brancas pode ser denominado alb que se refere a albino e o alelo do tipo selvagem seria alb ou apenas As convenções em relação à nomenclatura dos alelos variam um pouco entre os organismos algumas das variações estão demonstradas no Apêndice A sobre a nomenclatura Conjeturamos que o alelo do tipo selvagem desempenha um papel essencial na produção das pétalas coloridas da planta uma propriedade que é quase certamente necessária para atrair polinizadores para a flor O gene poderia estar implicado na síntese bioquímica do pigmento ou na parte do sistema de sinalização que informa às células da flor que iniciem a fabricação do pigmento ou em uma diversidade de outras possibilidades que necessitam de investigação adicional No nível puramente genético os cruzamentos realizados seriam representados simbolicamente como P albalb F1 Todos alb F2 alb albalb ou graficamente conforme nas grades a seguir ver também Figura 25 Esse tipo de grade que demonstra os gametas e as fusões gaméticas é denominado quadrado de Punnett em homenagem a um dos primeiros geneticistas Reginald C Punnett Eles são dispositivos úteis para explicar as proporções genéticas Encontraremos mais nas discussões posteriores Um gene para o desenvolvimento das asas No exemplo da moscadasfrutas o cruzamento da mosca com asas curtas mutante com o estoque com asas longas do tipo selvagem produziu uma progênie de 788 moscas classificadas como segue 196 machos com asas curtas 194 fêmeas com asas curtas 197 machos com asas longas 201 fêmeas com asas longas No total existem 390 moscas com asas curtas e 398 com asas longas muito próximas de uma proporção de 11 A proporção é a mesma nos machos e nas fêmeas novamente dentro dos limites do erro de amostragem Portanto a partir desses resultados o mutante asas curtas muito provavelmente foi produzido por uma mutação dominante Observe que para que uma mutação dominante seja expressa é necessária apenas uma dose única do alelo mutante Assim na maior parte dos casos quando o mutante aparecer pela primeira vez na população ele ocorrerá no estado heterozigoto Isso não é verdadeiro em relação a uma mutação recessiva tal como aquela no exemplo da planta antecedente que precisa ser homozigota para ser expressa e deve ser originária da autopolinização de uma planta heterozigota não identificada na geração anterior Quando a progênie de asas longas foi intercruzada todos os descendentes tinham asas longas conforme esperado de um alelo do tipo selvagem recessivo Quando a progênie de asas curtas foi intercruzada seus descendentes demonstraram uma proporção de três quartos curtos para um quarto de asas longas As mutações dominantes são representadas por letras ou palavras maiúsculas no presente exemplo o alelo mutante pode ser denominado SH que se refere a curta em inglês short Então os cruzamentos seriam representados simbolicamente como P SH F1 SH F1 Todas F1 SH SH SHSH SH ou graficamente conforme demonstrado nas grades adiante Essa análise do mutante da mosca identifica um gene que faz parte de um subconjunto de genes que na forma selvagem são cruciais para o desenvolvimento normal de uma asa Tal resultado é o ponto de partida para estudos adicionais cujo foco é identificar o exato desenvolvimento e as vias celulares nas quais o crescimento da asa é interrompido que após a identificação revelariam o momento de ação do alelo selvagem durante o desenvolvimento Um gene para a ramificação das hifas Um fungo mutante hiperramificado tal como a colônia semelhante a um botão na Figura 21 foi cruzado com um fungo do tipo selvagem com ramificação esparsa normal Em uma progênie de 300 152 eram do tipo selvagem e 148 eram hiper ramificados muito próximas de uma proporção de 11 Inferimos a partir dessa proporção de herança monogênica que a mutação hiperramificada é de um gene único Em haploides atribuir a dominância normalmente não é possível mas para conveniência podemos denominar o alelo hiperramificado hb e o tipo selvagem hb ou Os cruzamentos obrigatoriamente foram P hb Meiócito diploide hb F1 hb A análise da mutação e da herança revelou um gene cujo alelo do tipo selvagem é essencial para o controle normal da ramificação uma funçãochave na dispersão do fungo e na aquisição de nutrientes Agora o mutante precisa ser investigado para saber em que ponto na sequência normal do desenvolvimento ele produz um bloqueio Essa informação revelará o momento e o local nas células em que o alelo normal atua Por vezes a gravidade de um fenótipo mutante torna o organismo estéril incapaz de passar pelo ciclo sexual Como a herança monogênica dos mutantes estéreis pode ser demonstrada Em um organismo diploide um mutante recessivo estéril pode ser propagado como um heterozigoto e em seguida o heterozigoto pode ser autofecundado para produzir os esperados 25 de mutantes homozigotos recessivos para o estudo Um mutante dominante estéril é um beco sem saída genético e não pode ser propagado sexuadamente mas em plantas e fungos tal mutante pode ser facilmente propagado assexuadamente E se um cruzamento entre um mutante e um tipo selvagem não produzir uma proporção de 31 ou 11 conforme discutido aqui mas alguma outra proporção Tal resultado pode ocorrer em virtude das interações de diversos genes ou de um efeito ambiental Algumas dessas possibilidades são discutidas no Capítulo 6 Previsão das proporções na progênie ou dos genótipos parentais por meio da aplicação dos princípios da herança monogênica Podemos resumir a análise da descoberta dos genes como segue Observe as proporções fenotípicas na progênie Deduza os genótipos dos genitores AA Aa ou aa Entretanto o mesmo princípio da herança essencialmente a lei de Mendel sobre a segregação igual também pode ser utilizado para prever as proporções fenotípicas na progênie de genitores de genótipos conhecidos Esses genitores seriam originários de estoques mantidos pelo pesquisador Os tipos e as proporções da progênie de cruzamentos tais como AA Aa AA aa Aa Aa e Aa aa podem ser facilmente previstos Em resumo Cruze genitores de genótipos conhecidos Preveja as proporções fenotípicas na progênie Esse tipo de análise é utilizado em cruzamentos gerais para sintetizar genótipos para pesquisas ou para a agricultura Também é útil para prever probabilidades de diversos desfechos em reproduções humanas em famílias com histórias de doenças monogênicas Após a herança monogênica ter sido estabelecida um indivíduo que apresente o fenótipo dominante mas de genótipo desconhecido pode ser testado para verificar se o genótipo é homozigoto ou heterozigoto Um referido teste pode ser realizado por meio do cruzamento do indivíduo de fenótipo A com uma linhagemtestadora recessiva aa Se o indivíduo for heterozigoto resultará uma proporção de 11 Aa e aa se o indivíduo for homozigoto toda a progênie apresentará o fenótipo dominante todas Aa Em geral o cruzamento de um indivíduo de heterozigosidade desconhecida em relação a um gene ou mais com 25 um genitor totalmente recessivo é denominado um cruzamentoteste e o indivíduo recessivo é denominado testador Encontraremos cruzamentosteste muitas vezes em todos os capítulos subsequentes eles são muito úteis para deduzir os eventos meióticos que ocorrem em genótipos mais complexos tais como dihíbridos e trihíbridos A utilização de um testador totalmente recessivo significa que a meiose no genitor testador pode ser ignorada tendo em vista que todos os seus gametas são recessivos e não contribuem para os fenótipos da progênie Um teste alternativo em relação à heterozigosidade útil se o testador recessivo não estiver disponível e o organismo puder ser autofecundado é simplesmente autofecundar o desconhecido se o organismo que está sendo testado for heterozigoto será observada uma proporção de 31 na progênie Os referidos testes são úteis na análise genética de rotina CONCEITOCHAVE Os princípios da herança tais como a lei de segregação igual podem ser aplicados em duas direções 1 inferindo os genótipos a partir das proporções fenotípicas e 2 prevendo as proporções fenotípicas a partir de genitores de genótipos conhecidos Padrões de herança monogênica ligada ao sexo Os cromossomos que estivemos analisando até o momento são autossomos os cromossomos regulares que formam a maior parte do conjunto genômico Entretanto muitos animais e plantas apresentam um par especial de cromossomos associados ao sexo Os cromossomos sexuais também se segregam igualmente mas as proporções fenotípicas observadas na progênie com frequência são diferentes das proporções autossômicas Cromossomos sexuais A maior parte dos animais e muitas plantas demonstram dimorfismo sexual em outras palavras os indivíduos são do sexo masculino ou feminino Na maioria desses casos o sexo é determinado por um par especial de cromossomos sexuais Observemos os seres humanos como um exemplo As células do corpo humano apresentam 46 cromossomos 22 pares homólogos de autossomos mais 2 cromossomos sexuais As mulheres apresentam um par de cromossomos sexuais idênticos denominados cromossomos X Os homens apresentam um par não idêntico composto por um X e um Y O cromossomo Y é consideravelmente mais curto que o X Portanto se deixarmos A representar os cromossomos autossômicos podemos escrever Mulheres 44A XX Homens 44A XY Na meiose em indivíduos do sexo feminino os dois cromossomos X pareiam e segregam como os autossomos e assim cada ovócito recebe um cromossomo X Portanto em relação aos cromossomos sexuais os gametas são de apenas um tipo e dizse que o indivíduo do sexo feminino é o sexo homogamético Na meiose em indivíduos do sexo masculino os cromossomos X e Y pareiam ao longo de uma região curta que assegura que X e Y se separem de modo que existem dois tipos de espermatozoides metade com um X e a outra metade com um Y Portanto o indivíduo do sexo masculino é denominado sexo heterogamético Os padrões de herança de genes nos cromossomos sexuais são diferentes daqueles dos genes autossômicos Os padrões de herança dos cromossomos sexuais foram investigados pela primeira vez no início da década de 1900 no laboratório do grande geneticista Thomas Hunt Morgan com a utilização da moscadasfrutas Drosophila melanogaster ver Organismomodelo adiante Esse inseto tem sido um dos organismos de pesquisa mais importantes em genética seu ciclo de vida curto e simples contribui para a sua utilidade nesse sentido As moscasdasfrutas apresentam três pares de autossomos mais um par de cromossomos sexuais novamente denominados X e Y Assim como em mamíferos as fêmeas da Drosophila apresentam a constituição XX e os machos são XY Entretanto o mecanismo de determinação sexual na Drosophila difere daquele em mamíferos Na Drosophila o número de cromossomos X em relação aos autossomos determina o sexo dois X resultam em uma fêmea e um X resulta em um macho Em mamíferos a presença do cromossomo Y determina a masculinidade e a ausência de um Y determina a feminilidade Entretanto é importante observar que apesar dessa base um pouco diferente para a determinação sexual os padrões de herança monogênica dos genes nos cromossomos sexuais são extraordinariamente semelhantes na Drosophila e em mamíferos As plantas vasculares demonstram uma diversidade de arranjos sexuais As espécies dioicas são aquelas que demonstram dimorfismo sexual semelhante ao dos animais com as plantas do sexo feminino apresentando flores que contêm apenas ovários e as plantas do sexo masculino apresentando flores que contêm apenas anteras Figura 214 Algumas das plantas dioicas mas não todas apresentam um par não idêntico de cromossomos associado ao e quase certamente determinando o sexo da planta Das espécies com cromossomos sexuais não idênticos uma grande proporção apresenta um sistema XY Por exemplo a planta dioica Melandrium album apresenta 22 cromossomos por célula 20 autossomos mais 2 cromossomos sexuais com fêmeas XX e machos XY Outras plantas dioicas não apresentam pares de cromossomos visivelmente diferentes elas ainda podem apresentar cromossomos sexuais mas não de tipos visivelmente distinguíveis Padrões de herança ligada ao sexo A citogenética divide os cromossomos X e Y em regiões homólogas e diferenciais Novamente utilizemos os seres humanos como um exemplo Figura 215 As regiões diferenciais que contêm a maioria dos genes não apresentam correspondentes no outro cromossomo sexual Portanto em homens os genes nas regiões diferenciais são denominados hemizigotos meiozigotos A região diferencial do cromossomo X contém muitas centenas de genes a maior parte desses genes não participa na função sexual e eles influenciam uma grande variedade de propriedades humanas O cromossomo Y contém apenas algumas dúzias de genes Alguns desses genes apresentam correspondentes no cromossomo X mas a maior parte não Esse último tipo participa da função sexual masculina Um desses genes SRY determina a própria masculinidade Diversos outros genes são específicos para a produção de espermatozoides em homens FIGURA 214 Exemplos de duas espécies de plantas dioicas são A Osmaronia dioica B Aruncus dioicus A Leslie Bohm B Anthony Griffiths Em geral dizse que os genes nas regiões diferenciais demonstram padrões de herança denominados ligados ao sexo Os alelos mutantes na região diferencial do cromossomo X demonstram um padrão de herança monogênica denominado ligado ao X Os alelos mutantes dos poucos genes na região diferencial do cromossomo Y demonstram ligação ao Y Um gene que é ligado ao sexo pode apresentar proporções fenotípicas que são diferentes em cada sexo Nesse sentido os padrões de herança ligada ao sexo contrastam com os padrões de herança dos genes nos autossomos que são os mesmos em cada sexo Se a localização genômica de um gene for desconhecida um padrão de herança ligado ao sexo indica que o gene se encontra em um cromossomo sexual Os cromossomos X e Y humanos apresentam duas regiões homólogas curtas uma em cada extremidade ver Figura 215 Como essas regiões são homólogas elas são semelhantes a regiões autossômicas e assim são denominadas regiões pseudoautossômicas 1 e 2 Uma dessas regiões ou ambas pareiam na meiose e sofrem crossing over ver Capítulo 4 para detalhes sobre o crossing over Por esse motivo os cromossomos X e Y podem atuar como um par e segregar em números iguais de espermatozoides Herança ligada ao X Para o nosso primeiro exemplo de ligação ao X nos voltamos para a cor dos olhos na Drosophila A cor dos olhos do tipo selvagem da Drosophila é vermelhoescura mas existem linhagens puras com olhos brancos Figura 216 Essa diferença fenotípica é determinada por dois alelos de um gene localizado na região diferencial do cromossomo X O alelo mutante no presente caso é w para olhos brancos a letra minúscula indica que o alelo é recessivo e o alelo do tipo selvagem correspondente é w Quando machos de olhos brancos são cruzados com fêmeas de olhos vermelhos toda a progênie da F1 apresenta olhos vermelhos sugerindo que o alelo que determina olhos brancos seja recessivo O cruzamento desses machos e fêmeas da F1 de olhos vermelhos produz uma proporção da F2 de 31 de moscas de olhos vermelhos para moscas de olhos brancos mas todas as moscas de olhos brancos são machos Esse padrão de herança que demonstra uma clara diferença entre os sexos está explicado na Figura 217 A base do padrão de herança é que todas as moscas da F1 recebem um alelo do tipo selvagem de suas mães mas as fêmeas da F1 também recebem um alelo de olhos brancos de seus pais Portanto todas as fêmeas da F1 são heterozigotas do tipo selvagem ww e os machos da F1 são hemizigotos do tipo selvagem w As fêmeas da F1 transmitem o alelo de olhos brancos para metade de seus filhos que o expressam e para metade de suas filhas que não o expressam certamente porque precisam herdar o alelo do tipo selvagem de seus pais FIGURA 215 Os cromossomos sexuais humanos contêm uma região diferencial e duas regiões de pareamento As regiões foram localizadas ao observar onde os cromossomos pareavam na meiose e onde não pareavam ORGANISMOMODELO Drosophila A Drosophila melanogaster foi um dos primeiros organismosmodelo a serem utilizados em genética Encontrase prontamente disponível a partir de frutas maduras apresenta um ciclo de vida curto e é de simples cultivo e cruzamento O sexo é determinado pelos cromossomos sexuais X e Y XX Fêmea XY Macho e machos e fêmeas são facilmente distinguidos Os fenótipos mutantes surgem regularmente em populações de laboratório e sua frequência pode ser aumentada por meio do tratamento com radiação mutagênica ou substâncias químicas É um organismo diploide com quatro pares de cromossomos homólogos 2n 8 Nas glândulas salivares e determinados outros tecidos ciclos múltiplos de replicação do DNA sem divisão cromossômica resultam em cromossomos gigantes cada um com um padrão de bandas único que proporciona aos geneticistas pontos de referência para o estudo de mapeamento e de rearranjos cromossômicos Existem muitas espécies e raças de Drosophila que tem sido uma matériaprima importante para o estudo da evolução Drosophila melanogaster a moscadasfrutas blickwinkelAlamy O tempo voa como uma flecha moscasdasfrutas gostam de banana1 Groucho Marx 1Time flies like an arrow fruit flies like a banana O cruzamento recíproco fornece um resultado diferente ou seja o cruzamento entre fêmeas com olhos brancos e machos com olhos vermelhos fornece uma F1 na qual todas as fêmeas têm olhos vermelhos mas todos os machos têm olhos brancos Nesse caso cada fêmea herdou o alelo w dominante do cromossomo X do pai enquanto cada macho herdou o alelo w recessivo de sua mãe A F2 é composta por metade de moscas com olhos vermelhos e metade de moscas com olhos brancos de ambos os sexos Portanto na ligação ao sexo observamos exemplos não apenas de diferentes proporções em diferentes sexos mas também de diferenças entre cruzamentos recíprocos FIGURA 216 A mosca com olhos vermelhos é do tipo selvagem e a mosca com olhos brancos é um mutante Science SourceGetty Images Observe que a cor dos olhos da Drosophila não apresenta correspondência com a determinação do sexo e assim temos uma ilustração do princípio de que os genes nos cromossomos sexuais não estão necessariamente relacionados com a função sexual O mesmo é verdadeiro em seres humanos na discussão da análise de heredogramas posteriormente neste capítulo devemos observar muitos genes ligados ao X ainda que poucos possam ser interpretados como relacionados à função sexual O alelo anormal associado à cor dos olhos brancos na Drosophila é recessivo mas também surgem alelos anormais de genes no cromossomo X que são dominantes tal como o mutante de asas peludas Hw da Drosophila Nos referidos casos o alelo do tipo selvagem Hw é recessivo Os alelos anormais dominantes demonstram o padrão de herança correspondente àquele do alelo do tipo selvagem para olhos vermelhos no exemplo precedente As proporções obtidas são as mesmas FIGURA 217 Cruzamentos recíprocos entre Drosophila com olhos vermelhos vermelho e com olhos brancos branco fornecem diferentes resultados Os alelos são ligados ao X e a herança do cromossomo X 26 explica as proporções fenotípicas observadas que são diferentes daquelas dos genes autossômicos Na Drosophila e em muitos outros sistemas experimentais é utilizado um sinal de mais sobrescrito para designar o alelo normal ou do tipo selvagem Aqui w codifica os olhos vermelhos e w codifica os olhos brancos CONCEITOCHAVE A herança ligada ao sexo demonstra regularmente diferentes proporções fenotípicas nos dois sexos da progênie bem como diferentes proporções em cruzamentos recíprocos Historicamente nas décadas iniciais do século 20 a demonstração por Morgan da herança ligada ao X dos olhos brancos na Drosophila foi uma peçachave da evidência que sugeriu que os genes estão de fato localizados em cromossomos tendo em vista que um padrão de herança foi correlacionado com um par específico de cromossomos A ideia se tornou conhecida como a teoria cromossômica da herança Naquele período na história havia sido recentemente demonstrado que em muitos organismos o sexo é determinado por um cromossomo X e um Y e que em machos esses cromossomos segregam igualmente na meiose para regenerar quantidades iguais de machos e fêmeas na próxima geração Morgan reconheceu que a herança dos alelos do gene da cor dos olhos é exatamente paralela à herança dos cromossomos X na meiose portanto provavelmente o gene estava no cromossomo X A herança dos olhos brancos foi estendida às linhagens de Drosophila que apresentavam números anormais de cromossomos sexuais Com a utilização dessa nova situação ainda foi possível prever os padrões de herança de genes a partir da segregação dos cromossomos anormais Essas previsões terem comprovado estar corretas foi um teste convincente da teoria cromossômica Outras análises genéticas revelaram que em galinhas e mariposas a herança ligada ao sexo poderia ser explicada apenas se a fêmea fosse o sexo heterogamético Nesses organismos os cromossomos sexuais femininos foram designados ZW e os masculinos foram designados ZZ Análise de heredogramas humanos Os cruzamentos humanos assim como aqueles dos organismos experimentais fornecem muitos exemplos de herança monogênica Entretanto cruzamentos experimentais controlados não podem ser realizados em seres humanos e assim os geneticistas precisam recorrer ao exame de registros médicos na esperança de que tenham ocorrido cruzamentos informativos tais como cruzamentos de mono híbridos que possam ser utilizados para inferir a herança monogênica Um referido exame dos registros de cruzamentos é denominado análise de heredogramas Um membro de uma família que primeiramente chama a atenção de um geneticista é denominado probando ou propósito Normalmente o fenótipo do probando é de algum modo excepcional Por exemplo o probando pode apresentar algum tipo de distúrbio clínico O investigador em seguida traça o histórico do fenótipo por meio do histórico da família e desenha uma árvore genealógica ou heredograma com a utilização dos símbolospadrão fornecidos na Figura 218 Para verificar a herança monogênica os padrões no heredograma têm de ser interpretados de acordo com a lei de Mendel sobre a segregação igual mas os seres humanos normalmente têm poucos filhos e assim em virtude desse pequeno tamanho da progênie as proporções esperadas de 31 e 11 normalmente não são observadas exceto se muitos heredogramas semelhantes forem combinados A abordagem para a análise de heredogramas também depende de um dos fenótipos contrastantes ser um distúrbio raro ou ambos os fenótipos de um par serem comuns caso em que se diz que são morfos de um polimorfismo A maior parte dos heredogramas é desenhada por motivos clínicos e portanto dizem respeito a doenças que são quase por definição raras Nesse caso temos dois fenótipos a presença e a ausência do distúrbio Quatro padrões de herança monogênica são revelados nos heredogramas Primeiramente observemos os distúrbios recessivos causados por alelos recessivos de genes autossômicos únicos FIGURA 218 Uma diversidade de símbolos é utilizada na análise de heredogramas humanos Distúrbios autossômicos recessivos O fenótipo afetado de um distúrbio autossômico recessivo é herdado como um alelo recessivo Portanto o fenótipo não afetado correspondente foi necessariamente herdado como o alelo dominante correspondente Por exemplo a doença humana fenilcetonúria PKU discutida anteriormente é herdada de modo mendeliano simples como um fenótipo recessivo com a PKU determinada pelo alelo p e a condição normal determinada por P Portanto pessoas com essa doença têm genótipo pp e pessoas que não apresentam a doença são PP ou Pp Relembre que o termo tipo selvagem e seus símbolos alélicos não são utilizados na genética humana tendo em vista que é impossível definir o tipo selvagem Quais padrões em um heredograma revelariam a herança autossômica recessiva Os dois pontoschave são que 1 em geral o distúrbio aparece na progênie de genitores não afetados e 2 a progênie afetada inclui indivíduos dos sexos masculino e feminino Quando sabemos que tantos homens quanto mulheres são afetados podemos inferir que muito provavelmente estamos lidando com a herança mendeliana simples de um gene em um autossomo em vez de um gene em um cromossomo sexual O heredograma típico a seguir ilustra o pontochave de que crianças afetadas nascem de pais não afetados A partir desse padrão podemos deduzir um cruzamento monohíbrido simples com o alelo recessivo responsável pelo fenótipo excepcional indicado em preto Ambos os genitores têm de ser heterozigotos digamos Aa ambos precisam apresentar um alelo a tendo em vista que cada um contribuiu com um alelo a para cada criança afetada e ambos têm de apresentar um alelo A tendo em vista que são fenotipicamente normais Podemos identificar os genótipos das crianças demonstrados da esquerda para a direita como A aa aa e A Portanto o heredograma pode ser reescrito como segue Esse heredograma não ampara a hipótese de herança recessiva ligada ao X tendo em vista que sob essa hipótese uma filha afetada necessariamente tem a mãe heterozigota possível e o pai hemizigoto o que é claramente impossível tendo em vista que o pai teria expressado o fenótipo do distúrbio Observe que embora as regras mendelianas estejam atuando as proporções mendelianas não são necessariamente observadas em famílias isoladas em virtude do pequeno tamanho de amostra conforme previsto anteriormente No exemplo precedente observamos uma proporção fenotípica de 11 na progênie de um cruzamento monohíbrido Se o casal tivesse digamos 20 filhos a proporção seria algo como 15 filhos não afetados e cinco com PKU uma proporção de 31 mas em uma amostra pequena de quatro filhos qualquer proporção é possível e todas as proporções são comumente encontradas FIGURA 219 Heredograma de um fenótipo recessivo raro determinado por um alelo recessivo a Os símbolos gênicos normalmente não são incluídos no heredograma mas os genótipos são inseridos aqui para referência As pessoas II1 e II5 se casam dentro da família presumese que sejam normais tendo em vista que a condição hereditária em exame é rara Observe também que não é possível ter certeza sobre o genótipo de algumas pessoas com fenótipo normal as referidas pessoas são indicadas por A Os indivíduos III5 e III 6 que geram os recessivos na geração IV são primos em primeiro grau Ambos herdaram seu alelo recessivo de um dos avós seja I1 ou I2 Os heredogramas familiares de distúrbios autossômicos recessivos tendem a aparentar ser um tanto quanto simples com poucos símbolos pretos Uma condição recessiva aparece em grupos de irmãos afetados e as pessoas em gerações anteriores e posteriores tendem a não ser afetadas Para compreender por que isso é assim é importante ter alguma compreensão sobre a estrutura genética das populações subjacentes às referidas condições raras Por definição se a condição for rara a maior parte das pessoas não carreia o alelo anormal Além disso a maior parte daquelas pessoas que carreia o alelo anormal é heterozigota para ele em vez de homozigota O motivo básico de os heterozigotos serem muito mais comuns do que os homozigotos recessivos é que para ser um homozigoto recessivo ambos os genitores precisam apresentar o alelo a mas para ser um heterozigoto apenas um genitor precisa apresentálo O nascimento de uma pessoa afetada normalmente depende da chance rara de união de genitores heterozigotos não aparentados Entretanto a endogamia cruzamento entre parentes por vezes denominado consanguinidade em seres humanos aumenta a chance de que dois heterozigotos cruzem Um exemplo de um casamento entre primos é demonstrado na Figura 219 Os indivíduos III5 e III6 são primos em primeiro grau e produzem dois homozigotos em relação ao alelo raro Você pode observar a partir da Figura 219 que um ancestral que é um heterozigoto pode produzir muitos descendentes que também são heterozigotos Portanto dois primos podem carrear o mesmo alelo recessivo raro herdado de um ancestral em comum Para que duas pessoas não aparentadas sejam heterozigotas elas teriam herdado o alelo raro de ambas as suas famílias Portanto cruzamentos entre parentes em geral implicam um risco mais alto de produzir distúrbios recessivos do que cruzamentos entre não parentes Por esse motivo casamentos de primos em primeiro grau contribuem para uma grande proporção das pessoas com doenças recessivas na população Alguns outros exemplos de distúrbios recessivos humanos estão demonstrados na Figura 220 A fibrose cística é uma doença herdada no cromossomo 7 de acordo com as regras mendelianas como um fenótipo autossômico recessivo Seu sintoma mais importante é a secreção de grandes quantidades de muco para os pulmões que resulta em morte em virtude de uma combinação de efeitos mas normalmente precipitada pela infecção do sistema respiratório O muco pode ser deslocado por tapotagem e a infecção pulmonar pode ser prevenida com antibióticos portanto com tratamento pacientes com fibrose cística podem viver até a fase adulta O gene da fibrose cística e seu alelo mutante foi um dos primeiros genes de doença humana a serem isolados no nível do DNA em 1989 Essa linha de pesquisa finalmente revelou que o distúrbio é causado por uma proteína defeituosa que normalmente transporta íons cloreto pela membrana celular A alteração resultante do equilíbrio eletrolítico altera a constituição do muco pulmonar Essa nova compreensão sobre a função do gene em pessoas afetadas e não afetadas deu esperanças para um tratamento mais efetivo FIGURA 220 As posições dos genes mutados em algumas doenças monogênicas mostradas nos 23 pares de cromossomos em um ser humano Cada cromossomo apresenta um padrão de bandas característico X e Y são os cromossomos sexuais XX em mulheres e XY em homens Os genes associados a cada doença estão demonstrados em parênteses O albinismo humano também é herdado de modo autossômico recessivo padrão O alelo mutante é de um gene que normalmente sintetiza o pigmento melanina marrom ou preto normalmente encontrado na pele nos cabelos e na retina do olho Figura 221 CONCEITOCHAVE Em heredogramas humanos um distúrbio autossômico recessivo em geral é revelado pelo aparecimento do distúrbio na progênie masculina e feminina de pais não afetados Distúrbios autossômicos dominantes Quais padrões de heredograma são esperados de distúrbios autossômicos dominantes Aqui o alelo normal é recessivo e o alelo defeituoso é dominante Pode parecer um paradoxo que um distúrbio raro possa ser dominante mas lembre que a dominância e a recessividade são simplesmente propriedades de como os alelos atuam em heterozigotos e não são definidas em referência a quão comuns eles são na população Um bom exemplo de um fenótipo dominante raro que demonstra herança monogênica é a pseudoacondroplasia um tipo de nanismo Figura 222 Em relação a esse gene pessoas com estatura normal são genotipicamente dd e o fenótipo anão em princípio poderia ser Dd ou DD Entretanto acreditase que as duas doses do alelo D no genótipo DD produzam um efeito tão grave que esse genótipo é letal Se essa crença em geral for verdadeira todos os anões são heterozigotos Na análise de heredogramas os principais indícios para a identificação de um distúrbio autossômico dominante com herança mendeliana são o fato de o fenótipo tender a aparecer em todas as gerações do heredograma e de os pais ou mães afetados transmitirem o fenótipo para ambos os filhos e filhas Novamente a representação igual de ambos os sexos entre a progênie afetada descarta a herança por meio dos cromossomos sexuais O fenótipo aparece em todas as gerações porque em geral o alelo anormal carreado por uma pessoa necessariamente provém de um genitor na geração precedente Alelos anormais também podem surgir de novo por mutações Essa possibilidade tem de ser mantida em mente em relação a distúrbios que interferem com a reprodução pois aqui a condição provavelmente não foi herdada de um genitor afetado Um heredograma típico de um distúrbio dominante está demonstrado na Figura 223 Mais uma vez observe que as proporções mendelianas não são necessariamente observadas em famílias Assim como nos distúrbios recessivos pessoas que contêm uma cópia do alelo A raro Aa são muito mais comuns do que aquelas que contêm duas cópias AA assim a maior parte das pessoas afetadas é heterozigota e virtualmente todos os cruzamentos que produzem progênie com distúrbios dominantes são Aa aa Portanto se a progênie dos referidos cruzamentos for totalizada é esperada uma proporção de 11 de pessoas não afetadas aa e afetadas Aa FIGURA 221 Uma versão não funcional de um gene que produz o pigmento da pele resulta em ausência de pigmento Nesse caso ambas as cópias do par de genes são mutadas Yves GELLIEGammaRaphoGetty Images A doença de Huntington é um exemplo de uma doença herdada como um fenótipo dominante determinado por um alelo de um gene único O fenótipo é de degeneração neural que leva a convulsões e à morte prematura O cantor de folk Woody Guthrie sofria de doença de Huntington A doença é um tanto quanto incomum porque apresenta início tardio os sintomas em geral não aparecem até que a pessoa tenha procriado Figura 224 Quando a doença é diagnosticada em um dos pais sabese que toda criança já nascida apresenta uma chance de 50 de herdar o alelo e a doença correlata Esse padrão trágico inspirou um grande esforço para encontrar modos de identificar pessoas que carreiam o alelo anormal antes de manifestarem a doença Atualmente existem exames moleculares para a identificação de pessoas portadoras do alelo da doença de Huntington FIGURA 222 O fenótipo da pseudoacondroplasia humana está ilustrado aqui por uma família de cinco irmãs e dois irmãos O fenótipo é determinado por um alelo dominante que podemos denominar D que interfere no crescimento dos ossos longos durante o desenvolvimento Esta fotografia foi feita quando a família chegou a Israel após o término da Segunda Guerra Mundial BettmannCORBIS Algumas outras condições dominantes raras são a polidactilia dedos extras demonstrada na Figura 225 e o piebaldismo demonstrado na Figura 226 FIGURA 223 Heredograma de um fenótipo dominante determinado por um alelo A dominante Neste heredograma todos os genótipos foram deduzidos CONCEITOCHAVE Heredogramas de distúrbios mendelianos autossômicos dominantes demonstram indivíduos dos sexos masculino e feminino afetados em todas as gerações eles também demonstram homens e mulheres afetados que transmitem a condição para proporções iguais de seus filhos e suas filhas FIGURA 224 O gráfico demonstra que pessoas que carreiam o alelo em geral manifestam a doença após a idade fértil FIGURA 225 A polidactilia é um fenótipo dominante raro das mãos e dos pés humanos A A polidactilia caracterizada por dedos extras das mãos ou dos pés ou de ambos é determinada por um alelo P Os números no heredograma B fornecem a quantidade de dedos das mãos nas linhas superiores e a quantidade de dedos dos pés nas linhas inferiores Observe a variação na expressão do alelo P A Biophoto AssociatesScience Source Polimorfismos autossômicos Os fenótipos alternativos de um polimorfismo os morfos com frequência são herdados como alelos de um gene autossômico único pelo modo mendeliano padrão Entre os muitos exemplos humanos estão os dimorfismos com dois morfos os polimorfismos mais simples a seguir olhos castanhos versus azuis cabelo pigmentado versus louro capacidade de sentir o odor de frésias um tipo de flor fragrante versus incapacidade pico de viúva versus nenhum cerume viscoso versus seco e lóbulos da orelha presos versus livres Em cada exemplo o morfo determinado pelo alelo dominante é escrito primeiramente A interpretação dos heredogramas em relação aos polimorfismos é um pouco diferente daquela dos distúrbios raros tendo em vista que por definição os morfos são comuns Vejamos um heredograma em relação a um caso humano interessante A maior parte das populações humanas é dimórfica em relação à capacidade de degustar a substância química feniltiocarbamida PTC ou seja as pessoas conseguem detectála como um gosto ruim e amargo ou para a grande surpresa e a descrença dos degustadores podem não a sentir em absoluto A partir do heredograma na Figura 227 podemos observar que dois degustadores por vezes produzem filhos não degustadores o que torna claro que o alelo que confere a capacidade de sentir o gosto é dominante e que o alelo para a não degustação é recessivo Observe na Figura 227 que quase todas as pessoas que entraram para a família carreiam o alelo recessivo seja em uma condição heterozigota ou homozigota Portanto tal heredograma difere daqueles de distúrbios recessivos raros em relação aos quais a presunção convencional é de que todos os que entram para a família são homozigotos normais Tendo em vista que ambos os alelos da PTC são comuns não é surpresa que todos com exceção de um dos familiares nesse heredograma tenham se casado com pessoas com no mínimo uma cópia do alelo recessivo FIGURA 227 Heredograma em relação à capacidade de sentir o gosto da substância química feniltiocarbamida FIGURA 226 O piebaldismo é um fenótipo humano dominante raro Embora o fenótipo seja encontrado esporadicamente em todas as raças os padrões aparecem mais nos indivíduos com pele escura As fotografias demonstram as vistas frontais e posteriores das pessoas afetadas IV1 IV3 III5 III8 e III9 A do heredograma familiar B Observe a variação na expressão do gene do piebaldismo entre os familiares Acreditase que os padrões sejam causados pelo alelo dominante que interfere na migração de melanócitos células produtoras de melanina da superfície dorsal para a ventral durante o desenvolvimento A mancha branca na testa é particularmente característica e com frequência é acompanhada por uma mecha branca nos cabelos O piebaldismo não é um tipo de albinismo as células nas áreas claras apresentam o potencial genético de produzir melanina mas tendo em vista que não são melanócitos não são programadas no seu desenvolvimento para fabricála No albinismo verdadeiro as células não apresentam o potencial de produzir melanina O piebaldismo é causado por mutações no ckit um tipo de gene denominado protooncogene ver Capítulo 16 Fotos A e dados B de I Winship K Young R Martell R Ramesar D Curtis e P Beighton Piebaldism An Autonomous Autosomal Dominant Entity Clin Genet 39 1991 330 Reproduzida com autorização de John Wiley Sons Inc O polimorfismo é um fenômeno genético interessante Geneticistas de 1 2 populações surpreenderamse ao descobrir quantos polimorfismos existem em populações naturais de plantas e animais em geral Além disso embora a genética de polimorfismos seja direta existem muito poucos polimorfismos em relação aos quais existem explicações satisfatórias para a coexistência dos morfos Mas os polimorfismos são abundantes em todos os níveis da análise genética até mesmo no nível do DNA De fato os polimorfismos observados no nível do DNA têm sido inestimáveis como pontos de referência para ajudar os geneticistas a encontrar seu caminho nos cromossomos de organismos complexos conforme será descrito no Capítulo 4 A genética de populações e evolutiva de polimorfismos é considerada nos Capítulos 17 e 19 CONCEITOCHAVE As populações de plantas e animais incluindo seres humanos são altamente polimórficas Morfos contrastantes com frequência são herdados como alelos de um gene único Distúrbios recessivos ligados ao X Vejamos os heredogramas de distúrbios causados por alelos recessivos raros de genes localizados no cromossomo X Os referidos heredogramas demonstram tipicamente as características a seguir Muito mais indivíduos do sexo masculino do que feminino apresentam o fenótipo raro em estudo O motivo é que um indivíduo do sexo feminino só consegue herdar o genótipo se a sua mãe e o seu pai possuírem o alelo p ex XA Xa Xa Y enquanto um indivíduo do sexo masculino pode herdar o fenótipo quando apenas a mãe carrear o alelo XA Xa XA Y Se o alelo recessivo for muito raro quase todas as pessoas que apresentam o fenótipo são do sexo masculino Ninguém na progênie de um indivíduo do sexo masculino afetado apresenta o fenótipo mas todas as suas filhas são portadoras carreando o alelo recessivo mascarado na condição heterozigota Na próxima geração metade dos filhos dessas filhas portadoras apresenta o fenótipo Figura 228 3 Nenhum dos filhos homens de um indivíduo do sexo masculino afetado apresenta o fenótipo em estudo nem transmitirá a condição para seus descendentes O motivo por trás dessa ausência de transmissão entre indivíduos do sexo masculino é que um filho recebe seu cromossomo Y do pai assim normalmente ele não pode herdar o cromossomo X do pai também Por outro lado a transmissão entre indivíduos do sexo masculino de um distúrbio é um diagnóstico útil em relação a uma condição herdada de modo autossômico Na análise de heredogramas de recessivos ligados ao X raros presumese que um indivíduo do sexo feminino normal de genótipo desconhecido seja homozigoto exceto se houver evidências em contrário FIGURA 228 Conforme normalmente é o caso a expressão dos alelos recessivos ligados ao X ocorre apenas em indivíduos do sexo masculino Estes alelos são carreados porém não expressos pelas filhas na próxima geração para serem novamente expressos nos filhos Observe que III3 e III4 não podem ser distinguidos fenotipicamente Talvez o exemplo mais familiar da herança recessiva ligada ao X seja o daltonismo Pessoas com essa condição são incapazes de distinguir o vermelho do verde Os genes para visão de cores foram caracterizados no nível molecular A visão de cores tem por base três diferentes tipos de cones na retina cada um sensível aos comprimentos de onda vermelho verde ou azul Os determinantes genéticos em relação aos cones vermelhos e verdes encontramse no cromossomo X Pessoas daltônicas para vermelho e verde apresentam uma mutação em um desses dois genes Assim como em qualquer distúrbio recessivo ligado ao X existem muito mais homens com o fenótipo do que mulheres Outro exemplo familiar é a hemofilia a falha do sangue em coagular Muitas proteínas atuam em sequência para realizar a coagulação sanguínea O tipo mais comum de hemofilia é causado pela ausência ou pela disfunção de uma dessas proteínas da coagulação denominada fator VIII Um heredograma de hemofilia bem conhecido é aquele das famílias reais interrelacionadas da Europa Figura 229 O alelo original da hemofilia no heredograma possivelmente surgiu espontaneamente como uma mutação nas células reprodutivas dos pais da Rainha Victoria ou na própria Rainha Victoria Entretanto alguns propuseram que a origem do alelo era um amante secreto da mãe de Victoria Alexis o filho do último czar da Rússia herdou o alelo da hemofilia da Rainha Victoria que era avó de sua mãe Alexandra Atualmente a hemofilia pode ser tratada clinicamente mas anteriormente era uma condição potencialmente fatal É interessante observar que o texto judaico do Talmude contém regras a respeito de isenções da circuncisão masculina demonstrando claramente que o modo de transmissão da doença por meio de mulheres portadoras não afetadas era bem conhecido nos tempos antigos Por exemplo uma isenção era para filhos de mulheres cujos filhos das irmãs haviam sangrado profusamente quando foram circuncidados Portanto o sangramento anormal sabidamente era transmitido pelas mulheres da família mas expresso apenas em filhos do sexo masculino A distrofia muscular de Duchenne é uma doença recessiva fatal ligada ao X O fenótipo consiste em degeneração e atrofia dos músculos Em geral o início ocorre antes dos 6 anos de idade com o confinamento a uma cadeira de rodas até os 12 anos e a morte até os 20 O gene para a distrofia muscular de Duchenne codifica a proteína muscular distrofina Esse conhecimento implica esperanças para melhor compreensão sobre a fisiologia dessa condição e finalmente uma terapia Um fenótipo recessivo ligado ao X raro que é interessante do ponto de vista da diferenciação sexual é uma condição denominada síndrome de feminização testicular que apresenta uma frequência de aproximadamente 1 em 65000 nascimentos do sexo masculino Pessoas com essa síndrome são cromossomicamente homens apresentam 44 autossomos mais um cromossomo X e um Y mas se desenvolvem como indivíduos do sexo feminino Figura 230 Eles apresentam genitália externa feminina uma vagina com fundo cego e ausência de útero Os testículos podem estar presentes nos lábios do pudendo ou no abdome Embora muitas das referidas pessoas se casem são estéreis A condição não é revertida por meio do tratamento com o hormônio masculino androgênio e assim por vezes é denominada síndrome da insensibilidade a andrógenos O motivo da insensibilidade é que uma mutação no gene do receptor de androgênio causa disfunção dos receptores e assim o hormônio masculino não tem efeito sobre os órgãosalvo que contribuem para a masculinidade Em humanos a feminilidade resulta quando o sistema determinante da masculinidade não é funcional FIGURA 229 Heredograma da hemofilia condição recessiva ligada ao X nas famílias reais da Europa Um alelo recessivo que causa a hemofilia comprometimento da coagulação sanguínea surgiu por meio de uma mutação nas células reprodutivas da Rainha Victoria ou de um de seus pais Esse alelo da hemofilia se propagou para outras famílias reais por meio do casamento entre elas A Esse heredograma parcial demonstra os homens afetados e as mulheres portadoras heterozigotas A maior parte das pessoas que se casaram com os familiares da Rainha Victoria foi omitida para simplificar o heredograma Você consegue deduzir a probabilidade de a atual família real britânica possuir o alelo recessivo B Um quadro que demonstra a Rainha Victoria cercada por seus numerosos descendentes B Lebrecht Music and Arts Photo LibraryAlamy FIGURA 230 Um indivíduo XY com síndrome de feminização testicular causada pelo alelo recessivo ligado ao X para a insensibilidade aos androgênios Wellcome Photo LibraryCustom Medical Stock Distúrbios dominantes ligados ao X Os padrões de herança dos distúrbios dominantes ligados ao X apresentam as características a seguir nos heredogramas Figura 231 1 2 Indivíduos do sexo masculino afetados transmitem a condição para todas as suas filhas mas para nenhum de seus filhos FIGURA 231 Todas as filhas de um indivíduo do sexo masculino que expressa um fenótipo dominante ligado ao X demonstrarão o fenótipo Indivíduos do sexo feminino heterozigotos para um alelo dominante ligado ao X transmitirão a condição para metade de seus filhos e suas filhas Mulheres heterozigotas afetadas casadas com homens não afetados transmitem a condição para metade de seus filhos e de suas filhas Esse tipo de herança não é comum Um exemplo é a hipofosfatemia um tipo de raquitismo resistente à vitamina D Alguns tipos de hipertricose excesso de pelos corporais e faciais demonstram herança dominante ligada ao X Herança ligada ao Y Apenas os homens herdam genes localizados na região diferencial do cromossomo Y humano com os pais transmitindo os genes aos seus filhos homens O gene que desempenha um papel primário na masculinidade é o gene SRY por vezes denominado fator determinante testicular A análise genômica confirmou que de fato o gene SRY encontrase na região diferencial do cromossomo Y Portanto a própria masculinidade é ligada ao Y e demonstra o padrão esperado de transmissão exclusivamente de homem para homem Demonstrouse que alguns casos de esterilidade masculina são causados por deleções de regiões do cromossomo Y que contêm genes promotores da espermatogênese A esterilidade masculina não é hereditária mas é interessante observar que os pais desses homens apresentam cromossomos Y normais demonstrando que as deleções são novas Não houve casos convincentes de variantes fenotípicas não sexuais associadas ao cromossomo Y Pelos nas bordas das orelhas Figura 232 foram propostos como uma possibilidade embora controversa O fenótipo é extremamente raro entre as populações da maior parte dos países mas é mais comum entre as populações da Índia Em algumas famílias os pelos nas bordas das orelhas são transmitidos exclusivamente do pai para os filhos CONCEITOCHAVE Os padrões de herança com uma representação desigual dos fenótipos em indivíduos dos sexos masculino e feminino permitem localizar os genes envolvidos em um dos cromossomos sexuais FIGURA 232 Propôsse que os pelos nas bordas das orelhas são causados por um alelo de um gene ligado ao Y Mark CollinsonAlamy Cálculo de riscos na análise de heredogramas Quando um distúrbio com uma herança monogênica bemdocumentada sabidamente encontrase presente em uma família o conhecimento sobre os padrões de transmissão pode ser utilizado para calcular a probabilidade de os possíveis genitores terem um filho com o distúrbio Por exemplo considere um caso no qual marido e esposa recémcasados descobrem que cada um deles tinha um tio com doença de TaySachs uma doença autossômica recessiva grave causada por disfunção da enzima hexosaminidase A O defeito leva ao acúmulo 1 2 3 de depósitos adiposos nas células nervosas causando paralisia seguida por morte precoce O heredograma é como segue A probabilidade de o primeiro filho do casal apresentar doença de TaySachs pode ser calculada da seguinte maneira Tendo em vista que nenhum dos pais apresenta a doença cada um somente pode ser um homozigoto normal ou um heterozigoto Se ambos forem heterozigotos então eles têm uma chance de transmitir o alelo recessivo para a criança que então pode apresentar a doença de TaySachs Portanto precisamos calcular a probabilidade de ambos serem heterozigotos e assim sendo a probabilidade de transmissão do alelo deletério para a criança Ambos os avós do marido eram necessariamente heterozigotos Tt tendo em vista que tiveram um filho tt o tio Portanto eles efetivamente constituíram um cruzamento monohíbrido O pai do marido poderia ser TT ou Tt mas dentro dos 34 da progênie não afetada sabemos que as probabilidades relativas desses genótipos devem ser de 14 e 12 respectivamente a proporção da progênie esperada em um cruzamento monohíbrido é TT Tt tt Portanto existe uma probabilidade de 23 de o pai ser um heterozigoto dois terços é a proporção da progênie não afetada de heterozigotos 24 divididos por 34 Presumese que a mãe do marido seja TT tendo em vista que ela entrou para a família e os alelos da doença em geral são raros Portanto se o pai for Tt então o cruzamento com a mãe foi um cruzamento Tt TT e as proporções esperadas na progênie que inclui o marido são TT e Tt A probabilidade geral de o marido ser um heterozigoto precisa ser calculada com a utilização de uma regra estatística denominada regra do produto a 4 5 6 qual estabelece que A probabilidade de dois eventos independentes ocorrerem é o produto de suas probabilidades individuais Tendo em vista que as transmissões de genes em diferentes gerações são eventos independentes podemos calcular que a probabilidade de o marido ser um heterozigoto é a probabilidade de seu pai ser um heterozigoto 23 multiplicada pela probabilidade de seu pai ter um filho heterozigoto 12 que é 23 12 13 De modo semelhante a probabilidade de a esposa ser heterozigota também é de 13 Se eles forem ambos heterozigotos Tt seu cruzamento será um cruzamento monohíbrido padrão e assim a probabilidade de terem um filho tt é de 14 Em geral a probabilidade do casal de ter um filho afetado é a probabilidade de ambos serem heterozigotos e em seguida de ambos transmitirem o alelo recessivo para um filho Novamente esses eventos são independentes e assim podemos calcular a probabilidade geral como 13 13 14 136 Em outras palavras existe 1 chance em 36 de eles terem uma criança com doença de TaySachs Em algumas comunidades judias o alelo de TaySachs não é tão raro como é na população geral Nos referidos casos não se pode presumir que pessoas não afetadas que se casam dentro de famílias com um histórico de TaySachs sejam TT Se a frequência de heterozigotos Tt na comunidade for conhecida essa frequência pode ser levada em conta no cálculo da regra do produto Atualmente estão disponíveis testes de diagnóstico molecular em relação aos alelos de Tay Sachs e a utilização prudente desses testes reduziu drasticamente a frequência da doença em algumas comunidades RESUMO Na divisão das células somáticas o genoma é transmitido por meio da mitose uma divisão nuclear Nesse processo cada cromossomo se replica em um par de cromátides e as cromátides são separadas para produzir duas célulasfilhas idênticas A mitose pode ocorrer em células diploides ou haploides Na meiose que ocorre no ciclo sexual em meiócitos cada homólogo se replica para formar uma díade de cromátides em seguida as díades pareiam para formar uma tétrade que sofre segregação em cada uma das duas divisões celulares O resultado é quatro células haploides ou gametas A meiose pode ocorrer apenas em uma célula diploide portanto organismos haploides se unem para formar um meiócito diploide Um modo fácil de relembrar os principais eventos da meiose por meio da utilização de seus dedos para representar os cromossomos está demonstrado na Figura 233 A dissecção genética de uma propriedade biológica tem início com uma coleção de mutantes Cada mutante tem de ser testado para verificar se é herdado como uma alteração monogênica O procedimento seguido mantémse essencialmente inalterado desde a época de Mendel que realizou a análise prototípica desse tipo A análise tem por base a observação de proporções fenotípicas específicas na progênie de cruzamentos controlados Em um caso típico um cruzamento de AA aa produz uma F1 que é toda Aa Quando a F1 é autofecundada ou entrecruzada uma proporção genotípica de AA Aa aa é produzida na F2 No nível fenotípico essa proporção é de A aa Os três genótipos monogênicos são homozigoto dominante heterozigoto mono híbrido e homozigoto recessivo Se um indivíduo Aa for cruzado com um aa um cruzamentoteste é produzida uma proporção de 11 na progênie As proporções de 11 31 e 121 têm origem no princípio da segregação igual isso é os produtos haploides da meiose de Aa serão A e a A base celular da segregação igual dos alelos é a segregação de cromossomos homólogos na meiose Fungos haploides podem ser utilizados para demonstrar a segregação igual no nível de uma meiose única uma proporção de 11 em um asco A base molecular para a produção das cromátides na meiose é a replicação do DNA A segregação na meiose pode ser observada diretamente no nível molecular DNA A força molecular da segregação é a despolimerização e o subsequente encurtamento dos microtúbulos que estão unidos aos centrômeros As mutações recessivas em geral ocorrem em genes haplossuficientes enquanto as mutações dominantes com frequência ocorrem em virtude da haploinsuficiência gênica Em muitos organismos o sexo é determinado cromossomicamente e tipicamente XX é o sexo feminino e XY é o sexo masculino Os genes no cromossomo X genes ligados ao X não apresentam correspondentes no cromossomo Y e demonstram um padrão de herança monogênica que difere nos dois sexos com frequência resultando em proporções diferentes nas progênies masculina e feminina A segregação monogênica mendeliana é útil na identificação dos alelos mutantes subjacentes a muitos distúrbios humanos A análise de heredogramas pode revelar distúrbios autossômicos ou ligados ao X de ambos os tipos dominante e recessivo A lógica da genética mendeliana precisa ser utilizada com cautela levando em consideração que o tamanho da progênie humana é pequeno e as proporções fenotípicas não são necessariamente típicas daquelas esperadas em tamanhos de amostra maiores Se um distúrbio monogênico conhecido estiver presente em um heredograma a lógica mendeliana pode ser utilizada para prever a probabilidade de os filhos herdarem a doença Os principais eventos da mitose e da meiose FIGURA 233 Utilização dos dedos das mãos para relembrar os principais eventos da mitose e meiose TERMOSCHAVE alelo alelo nulo análise de heredogramas asco autopolinização bivalente característica cromátide cromossomo sexual cromossomo X cromossomo Y cruzamento cruzamento monohíbrido cruzamentoteste descoberta dos genes díade dimorfismo dissecção genética dominante espécie dioica fenótipo gene gene SRY genética direta genética reversa genótipo geração parental P haploinsuficiente haplossuficiente hemizigoto heterozigoto heterozigose homozigoto homozigoto dominante homozigoto recessivo lei da segregação igual primeira lei de Mendel ligação ao sexo ligação ao X ligação ao Y linhagem pura meiócito meiose mitose monohíbrido morfo mutação mutação hipomórfica leaky mutante polimorfismo primeira geração filial F1 probando produto da meiose propriedade recessivo regiões pseudoautossômicas 1 e 2 regra do produto segunda geração filial F2 sexo heterogamético sexo homogamético testador tétrade tipo selvagem traço zigoto PROBLEMAS RESOLVIDOS Esta seção em cada capítulo contém alguns poucos problemas resolvidos que demonstram como abordar os conjuntos de problemas que se seguem A finalidade dos conjuntos de problemas é desafiar a sua compreensão sobre os princípios genéticos aprendidos no capítulo O melhor modo de demonstrar a compreensão sobre um assunto é ser capaz de utilizar aquele conhecimento em uma situação real ou simulada Esteja alerta que não existe um modo semelhante ao de uma máquina de solucionar esses problemas As três fontes principais à sua disposição são os princípios genéticos aprendidos há pouco a lógica e a tentativa e o erro Existem alguns conselhos gerais antes de iniciar Primeiramente é absolutamente essencial ler e compreender todo o problema A maior parte dos problemas utiliza dados obtidos a partir de uma pesquisa que alguém realmente realizou perguntese por que a pesquisa pode ter sido iniciada e qual era o objetivo provável Descubra exatamente quais fatos são fornecidos quais presunções precisam ser feitas quais indicações são fornecidas no problema e quais inferências podem ser feitas a partir das informações disponíveis Em segundo lugar seja metódico Contemplar o problema raramente é útil Reformule as informações no problema da sua própria maneira preferencialmente com a utilização de uma representação diagramática ou um fluxograma para lhe ajudar a pensar sobre o problema Boa sorte Problema resolvido 1 Foram realizados cruzamentos entre duas linhagens puras de coelhos que podemos denominar A e B Um macho da linhagem A foi cruzado com uma fêmea da linhagem B e os coelhos da F1 foram subsequentemente intercruzados para produzir uma F2 Descobriuse que três quartos dos animais da F2 apresentavam gordura subcutânea branca e um quarto apresentava gordura subcutânea amarela Posteriormente a F1 foi examinada e observouse que apresentava gordura branca Diversos anos depois foi realizada uma tentativa de repetir o experimento com a utilização do mesmo macho da linhagem A e a mesma fêmea da linhagem B Nessa ocasião a F1 e a F2 22 animais apresentavam gordura branca A única diferença entre o experimento original e a repetição que aparentou ser relevante foi que no original todos os animais foram alimentados com vegetais frescos enquanto na repetição foram alimentados com ração comercial para coelhos Forneça uma explicação para a diferença e um teste da sua ideia Solução Na primeira vez que o experimento foi realizado os criadores teriam justificado perfeitamente a proposta de que um par de alelos determina a gordura corporal branca versus amarela tendo em vista que os dados se assemelham claramente aos resultados de Mendel nas ervilhas O branco tem de ser dominante de modo que podemos representar o alelo branco como W e o alelo amarelo como w Os resultados então podem ser expressos como segue P WW ww F1 Ww F2 Ww Ww ww Sem dúvidas se os coelhos parentais houvessem sido sacrificados se poderia prever que um genitor não podemos dizer qual apresentava gordura branca e o outro amarela Felizmente os coelhos não foram sacrificados e os mesmos animais foram cruzados novamente levando a um resultado muito interessante e diferente Com frequência na ciência uma observação inesperada pode levar a um novo princípio e em vez de prosseguir para algo diferente é útil tentar explicar a inconsistência Assim por que a proporção de 31 desapareceu Aqui estão algumas possíveis explicações Primeiramente talvez os genótipos dos animais parentais houvessem alterado Esse tipo de alteração espontânea que afeta todo o animal ou no mínimo as suas gônadas é muito improvável tendo em vista que até mesmo a experiência comum nos informa que os organismos tendem a ser estáveis em seu tipo Em segundo lugar na repetição a amostra de 22 animais da F2 não continha qualquer gordura amarela simplesmente ao acaso chance Novamente essa explicação aparenta ser improvável tendo em vista que a amostra era consideravelmente grande mas essa é uma possibilidade Uma terceira explicação advém do princípio de que os genes não atuam em um vácuo eles dependem do ambiente para os seus efeitos Portanto a fórmula Genótipo Ambiente Fenótipo é um mnemônico útil Um corolário dessa fórmula é que os genes podem atuar de modo diferente em diferentes ambientes assim Genótipo 1 Ambiente 1 Fenótipo 1 e Genótipo 1 Ambiente 2 Fenótipo 2 No presente problema as dietas diferentes constituíram os ambientes diferentes e assim uma explicação possível dos resultados é que o homozigoto recessivo ww produz gordura amarela apenas quando a dieta contém vegetais frescos Essa explicação pode ser testada Um modo de testála é repetir o experimento novamente e utilizar vegetais frescos como alimento mas os genitores podem estar mortos nessa ocasião Um modo mais convincente é cruzar diversos coelhos da F2 com gordura branca do segundo experimento De acordo com a interpretação original alguns deles devem ser heterozigotos e se a sua progênie for criada com vegetais a gordura amarela deve aparecer em proporções mendelianas Por exemplo se um cruzamento for Ww e ww a progênie será ½ com gordura branca e ½ com gordura amarela Se esse resultado não ocorrer e nenhum descendente com gordura amarela aparecer em quaisquer dos cruzamentos seremos forçados de volta à primeira ou à segunda explicação A segunda explicação pode ser testada por meio da utilização de quantidades maiores e se essa explicação não funcionar nos resta a primeira explicação que é difícil de ser testada diretamente Como você poderia ter percebido na realidade a dieta era a culpada Os detalhes específicos ilustram muito bem os efeitos ambientais Os vegetais frescos contêm substâncias amarelas denominadas xantofilas e o alelo dominante W proporciona aos coelhos a capacidade de fragmentar essas substâncias até um tipo incolor branco Entretanto os animais ww não têm essa capacidade e as xantofilas são depositadas na gordura tornandoa amarela Quando nenhuma xantofila tiver sido ingerida ambos os animais W e ww apresentarão gordura branca Problema resolvido 2 A fenilcetonúria PKU é uma doença hereditária humana que resulta da incapacidade do corpo de processar a substância química fenilalanina que está contida nas proteínas que ingerimos A PKU é manifestada no início da infância e se permanecer sem tratamento em geral leva ao retardo mental A PKU é causada por um alelo recessivo com herança mendeliana simples Um casal pretende ter filhos mas aconselhase com um consultor genético uma vez que o homem tem uma irmã com PKU e a mulher tem um irmão com PKU Não existem outros casos conhecidos em suas famílias Eles solicitam ao consultor genético que determine a probabilidade de que seu primeiro filho apresente PKU Qual é a probabilidade Solução O que podemos deduzir Se denominarmos o alelo que causa o fenótipo da PKU de p e o respectivo alelo normal de P então a irmã e o irmão do homem e da mulher respectivamente necessariamente são pp Para produzir essas pessoas afetadas todos os quatro avós tinham de ser heterozigotos normais O pedigree pode ser resumido como segue Quando essas inferências tiverem sido feitas o problema é reduzido a uma aplicação da regra do produto O único modo por meio do qual o homem e a mulher podem ter um filho com PKU é se ambos forem heterozigotos é óbvio que eles próprios não apresentam a doença Ambos os cruzamentos dos avós são cruzamentos monohíbridos mendelianos simples que se espera produzirem progênie nas proporções a seguir Sabemos que o homem e a mulher são normais e assim a probabilidade de cada um ser um heterozigoto é de 23 tendo em vista que dentro da classe P 23 são Pp e 13 é PP A probabilidade de ambos o homem e a mulher serem heterozigotos é 23 23 49 Se ambos forem heterozigotos então um quarto de seus filhos apresentará PKU e assim a probabilidade de seu primeiro filho apresentar PKU é de 14 e a probabilidade de serem heterozigotos e de seu primeiro filho apresentar PKU é 49 14 436 19 que é a resposta Problema resolvido 3 Uma doença humana rara é observada em uma família conforme demonstrado no heredograma a seguir a Deduza o modo de herança mais provável b Quais seriam os desfechos dos casamentos dos primos 1 9 1 4 2 3 e 2 8 Solução a O modo mais provável de herança é o dominante ligado ao X Presumimos que o fenótipo da doença seja dominante tendo em vista que após ter sido introduzido no heredograma pelo homem na geração II ele aparece em todas as gerações Presumimos que o fenótipo seja ligado ao X porque não há transmissão paterna para os filhos homens Se ele fosse autossômico dominante a transmissão de pai para filho seria comum Em teoria a herança autossômica recessiva poderia ocorrer mas é improvável Em particular observe os casamentos entre os membros afetados da família e os estranhos não afetados Se a condição fosse autossômica recessiva o único modo por meio do qual esses casamentos poderiam ter descendência afetada seria se cada pessoa que entrou para a família fosse heterozigota então os cruzamentos seriam aa afetado Aa não afetado Entretanto nos é dito que a doença é rara nesse caso é altamente improvável que os heterozigotos sejam tão comuns A herança recessiva ligada ao X é impossível tendo em vista que um cruzamento de uma mulher afetada com um homem normal não produziria filhas afetadas Assim podemos deixar A representar o alelo que causa a doença e a representar o alelo normal b 1 9 O número 1 tem de ser heterozigoto Aa tendo em vista que ela 1 2 necessariamente obteve a de sua mãe normal O número 9 deve ser AY Portanto o cruzamento é Aa AY 1 4 Tem de ser Aa aY 2 3 Tem de ser aY Aa o mesmo que 1 4 2 8 Tem de ser aY aa toda a progênie normal PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS As primeiras 13 questões requerem a inspeção das figuras do capítulo Na parte à esquerda da Figura 24 as setas vermelhas demonstram autofecundação de flores únicas de uma planta da F1 Os mesmos resultados da F2 seriam produzidos por meio da polinização cruzada de duas plantas da F1 diferentes Na parte à direta da Figura 24 na planta que demonstra uma proporção de 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1111 você acredita que seria possível encontrar uma vagem com todas as ervilhas amarelas Todas verdes Explique Na Tabela 21 declare o fenótipo recessivo em cada um dos sete casos Considerando a Figura 28 a sequência pareamento replicação segregação segregação é uma boa descrição abreviada da meiose Aponte todos os casos de bivalentes díades e tétrades na Figura 211 Na Figura 211 presuma como nas plantas do milho que A codifica um alelo que produz amido no pólen e que o alelo a não produz A solução de iodo cora o amido em preto Como você demonstraria a primeira lei de Mendel diretamente com tal sistema Considerando a Figura 213 se você tivesse um mutante duplo homozigoto m3m3 m5m5 esperaria um fenótipo mutante Nota essa linhagem apresentaria dois sítios mutantes na mesma sequência codificadora Em quais dos estágios do ciclo de vida da Drosophila representado no quadro Organismomodelo anteriormente você encontraria os produtos da meiose Se você presumir que a Figura 215 também se aplica a camundongos e você irradiar os espermatozoides do macho com raios X que sabidamente inativam os genes qual fenótipo você procuraria na progênie com a finalidade de encontrar casos de camundongos com um gene SRY inativado Na Figura 217 como a proporção de 31 na grade na parte inferior à esquerda difere das proporções de 31 obtidas por Mendel Na Figura 219 presuma que o heredograma seja em relação a camundongos nos quais qualquer cruzamento escolhido pode ser realizado Se você cruzar IV1 com IV3 qual é a probabilidade de que o primeiro filhote apresente o fenótipo recessivo Na sua opinião qual parte do heredograma na Figura 223 demonstra melhor a primeira lei de Mendel O heredograma na Figura 231 poderia ser explicado como um distúrbio 14 15 16 17 18 19 20 21 autossômico dominante Explique PROBLEMAS BÁSICOS Crie uma sentença que inclua as palavras cromossomo genes e genoma Ervilhas Pisum sativum são diploides e 2n 14 Em Neurospora o fungo haploide n 7 Se você precisasse isolar o DNA genômico de ambas as espécies e utilizasse eletroforese para separar as moléculas do DNA de acordo com o tamanho quantas bandas de DNA distintas seriam visíveis em cada espécie A fava Vicia faba é diploide e 2n 18 Cada conjunto haploide de cromossomos contém aproximadamente 4 m de DNA O tamanho médio de cada cromossomo durante a metáfase da mitose é de 13 μm Qual é a proporção de empacotamento média do DNA na metáfase Proporção de compressão Comprimento do cromossomocomprimento da molécula de DNA Como essa compressão é realizada Se denominarmos a quantidade de DNA por genoma x cite uma situação ou situações em organismos diploides nas qualis a quantidade de DNA por célula seja a x b 2x c 4x Cite a funçãochave da mitose Cite as duas funçõeschave da meiose Desenhe um sistema de divisão nuclear diferente que alcance o mesmo desfecho da meiose Em uma possível situação futura a fertilidade masculina cai para zero mas felizmente os cientistas desenvolvem um modo para que as mulheres engravidem Os meiócitos são convertidos diretamente sem ser submetidos à meiose em zigotos que se implantam do modo habitual Quais seriam os efeitos a curto e longo prazos em uma referida sociedade 22 23 24 25 26 27 28 29 30 De quais modos a segunda divisão da meiose difere da mitose Crie mnemônicos para relembrar os cinco estágios da prófase I da meiose e os quatro estágios da mitose Em uma tentativa de simplificar a meiose para o benefício dos estudantes cientistas malucos desenvolvem um modo de evitar a fase S prémeiótica e realizála com apenas uma divisão incluindo pareamento crossing over e segregação Esse sistema funcionaria e os produtos de um referido sistema difeririam daqueles do sistema atual Theodor Boveri disse O núcleo não se divide ele é dividido O que ele estava mencionando Francis Galton um geneticista da era prémendeliana elaborou o princípio de que metade de nossa constituição genética é derivada de cada um dos pais um quarto de cada um dos avós um oitavo de cada um dos bisavós e assim por diante Ele estava certo Explique Se os filhos obtêm metade de seus genes de um dos genitores e metade do outro porque eles não são irmãos idênticos Declare onde as células se dividem mitoticamente e onde elas se dividem meioticamente em uma samambaia um musgo uma planta florescente um pinheiro um cogumelo uma rã uma borboleta e um caracol As células humanas normalmente têm 46 cromossomos Em relação a cada um dos estágios a seguir declare o número de moléculas de DNA nuclear presentes em uma célula humana a Metáfase da mitose b Metáfase I da meiose c Telófase da mitose d Telófase I da meiose e Telófase II da meiose Quatro dos eventos a seguir fazem parte tanto da meiose quanto da mitose mas apenas um é meiótico Qual a Formação das cromátides 31 32 33 34 35 36 b Formação do fuso c Condensação cromossômica d Movimentação dos cromossomos para os polos e Sinapse No milho o alelo f causa um endosperma farinhento e o alelo f causa um endosperma rígido No cruzamento ff ff todos os endospermas da progênie são farinhentos mas no cruzamento recíproco todos os endospermas da progênie são rígidos Qual é uma possível explicação Verifique a legenda da Figura 27 Qual é a primeira lei de Mendel Se você tivesse uma moscadasfrutas Drosophila melanogaster que fosse do fenótipo A qual cruzamento você realizaria para determinar se o genótipo da mosca era AA ou Aa Ao examinar uma grande amostra de colônias de leveduras em uma placa de Petri um geneticista observa uma colônia de aspecto anormal que é muito pequena Essa pequena colônia foi cruzada com o tipo selvagem e os produtos da meiose ascósporos foram espalhados sobre uma placa para produzir colônias No total houve 188 colônias do tipo selvagem tamanho normal e 180 colônias pequenas a O que pode ser deduzido a partir desses resultados a respeito da herança do fenótipo da colônia pequena Invente símbolos genéticos b Qual seria o aspecto de um asco desse cruzamento Duas cobaias pretas foram cruzadas e ao longo de diversos anos produziram 29 descendentes pretos e 9 brancos Explique esses resultados fornecendo os genótipos dos genitores e da progênie Em um fungo com quatro ascósporos um alelo mutante lys5 faz com que os ascósporos que contêm o alelo sejam brancos enquanto o alelo do tipo selvagem lys5 resulta em ascósporos pretos Ascósporos são os esporos que constituem os quatro produtos da meiose Desenhe um asco de cada um dos cruzamentos a seguir 37 38 39 40 a lys5 lys5 b lys5 lys5 c lys5 lys5 Em relação a um determinado gene em um organismo diploide 8 unidades de produto proteico são necessárias para a função normal Cada alelo do tipo selvagem produz cinco unidades a Se uma mutação criar um alelo nulo você acredita que esse alelo será recessivo ou dominante b Quais presunções precisam ser feitas para responder a parte a Uma colônia de Neurospora sobre uma placa aparentava ser esparsa densidade baixa em comparação às outras colônias na placa Acreditou se que essa colônia fosse uma possível mutante e então ela foi removida e cruzada com um tipo selvagem do tipo reprodutivo oposto A partir desse cruzamento foi obtida uma progênie de 100 ascósporos Nenhuma das colônias desses ascósporos era esparsa todas aparentando serem normais Qual é a explicação mais simples desse resultado Como você testaria a sua explicação Nota Neurospora é haploide A partir de uma triagem em grande escala de muitas Collinsia grandiflora foi descoberta uma planta com três cotilédones normalmente existem dois cotilédones Essa planta foi cruzada com uma planta do tipo selvagem pura normal e foram plantadas 600 sementes desse cruzamento Houve 298 plantas com 2 cotilédones e 302 com 3 cotilédones O que pode ser deduzido a respeito da herança dos três cotilédones Invente símbolos gênicos como parte da sua explicação Na planta Arabidopsis thaliana um geneticista está interessado no desenvolvimento de tricomas pequenas projeções Uma grande triagem resulta em duas plantas mutantes A e B que não apresentam tricomas e esses mutantes aparentam ser possivelmente úteis no estudo do desenvolvimento de tricomas Se eles fossem determinados por mutações monogênicas o achado das funções normal e anormal desses genes seria instrutivo Cada planta é cruzada com o tipo selvagem em ambos os casos 41 42 43 a próxima geração F1 apresentou tricomas normais Quando as plantas da F1 foram autofecundadas a F2 resultante foi como segue F2 do mutante A 602 normais 198 sem tricomas F2 do mutante B 267 normais 93 sem tricomas a O que esses resultados demonstram Inclua os genótipos propostos de todas as plantas em sua resposta b De acordo com sua explicação para a parte a é possível prever com confiança a F1 do cruzamento do mutante A original com o mutante B original Você tem três dados um vermelho R um verde G e um azul B Quando todos os três dados são jogados ao mesmo tempo calcule a probabilidade dos desfechos a seguir a 6 R 6 G 6 B b 6 R 5 G 6 B c 6 R 5 G 4 B d Absolutamente nenhum seis e Um número diferente em cada dado No heredograma a seguir os símbolos pretos representam indivíduos com uma doença sanguínea muito rara Se você não tivesse nenhuma outra informação para prosseguir você acharia mais provável que a doença fosse dominante ou recessiva Dê os seus motivos a A capacidade de degustar a substância química feniltiocarbamida é um fenótipo autossômico dominante e a incapacidade de degustála é 1 2 3 4 5 6 7 8 9 recessiva Se uma mulher degustadora com um pai não degustador se casar com um homem degustador que em um casamento anterior teve uma filha não degustadora qual é a probabilidade de que o seu primeiro filho seja 1 Uma menina não degustadora 2 Uma menina degustadora 3 Um menino degustador b Qual é a probabilidade de que os seus dois primeiros filhos de qualquer sexo sejam degustadores Como solucionar o problema 44 John e Martha estão pensando em ter filhos mas o irmão de John apresenta galactosemia uma doença recessiva autossômica e a bisavó de Martha também apresentava galactosemia Martha tem uma irmã que tem três filhos nenhum dos quais apresenta galactosemia Qual é a probabilidade de que o primeiro filho de John e Martha apresente galactosemia O problema pode ser reformulado como um heredograma Caso afirmativo escreva um Partes do problema podem ser reformuladas por meio da utilização de quadrados de Punnett Partes do problema podem ser reformuladas por meio da utilização de diagramas ramificados No heredograma identifique um cruzamento que ilustre a primeira lei de Mendel Defina todos os termos científicos no problema e procure quaisquer outros termos a respeito dos quais você não tenha certeza Quais presunções precisam ser feitas ao responder esse problema Quais familiares não mencionados precisam ser considerados Por quê Quais regras estatísticas poderiam ser relevantes e em quais situações elas podem ser aplicadas As referidas situações existem neste problema Quais são duas generalidades a respeito das doenças autossômicas 10 11 12 13 14 15 45 46 47 recessivas em populações humanas Qual é a relevância da raridade do fenótipo em estudo na análise de heredogramas em geral e o que pode ser inferido neste problema Nessa família os genótipos de quais pessoas são certos e de quais pessoas são incertos De que modo o lado de John do heredograma é diferente daquele do lado de Martha Como essa diferença afeta os seus cálculos Existem quaisquer informações irrelevantes no problema conforme formulado De que modo a solução desse tipo de problema é similar à de problemas que você já resolveu com sucesso De que modo ela é diferente Você pode criar uma breve história com base no dilema humano neste problema Agora tente solucionar o problema Se você não conseguir tente identificar o obstáculo e escreva uma sentença ou duas que descrevam a sua dificuldade Em seguida retorne às questões de expansão e verifique se qualquer uma delas se relaciona à sua dificuldade O gado Holstein normalmente é preto e branco Um touro branco e preto esplêndido Charlie foi adquirido por um fazendeiro por US 10000000 Toda a progênie gerada por Charlie foi de aspecto normal Entretanto determinados pares de sua progênie quando entrecruzados produziram progênie vermelha e branca numa frequência de aproximadamente 25 Charlie logo foi removido das listas de reprodutores dos criadores de Holstein Utilize símbolos para explicar precisamente o motivo Suponha que o marido e a esposa sejam ambos heterozigotos em relação a um alelo recessivo para o albinismo Se eles tiverem gêmeos dizigóticos dois ovócitos qual é a probabilidade de que ambos os gêmeos tenham o mesmo fenótipo em relação à pigmentação A planta Omphalodes verna cresce em locais do Canadá como a ilha de Vancouver e a parte continental mais baixa da Colúmbia Britânica As 48 49 populações são dimórficas para manchas roxas nas folhas algumas plantas apresentam manchas e outras não Próximo de Nanaimo uma planta na natureza apresentava folhas manchadas Essa planta que ainda não havia florescido foi colhida e levada para um laboratório onde se possibilitou sua autopolinização As sementes foram coletadas e cultivadas dando origem à progênie Uma folha aleatoriamente selecionada mas típica de cada uma da progênie está demonstrada na ilustração a seguir a Formule uma hipótese genética concisa para explicar esses resultados Explique todos os símbolos e demonstre todas as classes genotípicas e o genótipo da planta original b Como você testaria a sua hipótese Seja específico Pode chegar a ser comprovado que um animal não é um portador de um alelo recessivo ou seja não é um heterozigoto em relação a um determinado gene Explique Na natureza a planta Plectritis congesta é dimórfica para o formato do fruto ou seja plantas individuais contêm frutos não alados ou alados conforme demonstrado na ilustração Foram coletadas plantas da natureza antes da floração as quais foram cruzadas ou autofecundadas com os resultados a seguir Número de progênie Polinização Alados Não alados Alados autofecundadas 91 1 Alados autofecundadas 90 30 Não alados autofecundadas 4 80 Alados Não alados 161 0 Alados Não alados 29 31 Alados Não alados 46 0 Alados Alados 44 0 50 51 O fenótipo provavelmente tem uma explicação não genética Interprete esses resultados e derive o modo de herança desses fenótipos do formato do fruto Utilize símbolos Qual você acredita que seja a explicação não genética para os fenótipos marcados pelos asteriscos na tabela O heredograma a seguir é em relação a um distúrbio de pele hereditário raro porém relativamente brando a Como o distúrbio é herdado Declare os motivos da sua resposta b Forneça os genótipos para tantos indivíduos no heredograma quanto possível Invente os seus próprios símbolos alélicos definidos c Considere os quatro filhos não afetados dos genitores III4 e III5 Em todas as progênies com quatro filhos de genitores desses genótipos qual proporção se espera que contenha todos os filhos não afetados Quatro heredogramas humanos são demonstrados na ilustração a seguir Os símbolos pretos representam um fenótipo anormal herdado de modo mendeliano simples 52 a Em relação a cada heredograma declare se a condição anormal é dominante ou recessiva Tente declarar a lógica por trás da sua resposta b Em relação a cada heredograma descreva os genótipos de tantas pessoas quanto possível A doença de TaySachs é uma doença humana rara na qual substâncias tóxicas acumulamse nas células nervosas O alelo recessivo responsável pela doença é herdado de modo mendeliano simples Por motivos desconhecidos o alelo é mais comum em populações de judeus asquenaze do Leste Europeu Uma mulher está planejando se casar com seu primo em primeiro grau mas o casal descobre que a irmã de seu avô em comum 53 54 morreu no primeiro ano de vida de doença de TaySachs a Desenhe as partes relevantes do heredograma e demonstre todos os genótipos tão completamente quanto possível b Qual é a probabilidade de que o primeiro filho dos primos apresente doença de TaySachs presumindo que todas as pessoas que se casam dentro da família sejam homozigotas normais O heredograma a seguir foi obtido em relação a uma doença renal rara a Deduza a herança dessa condição declarando os seus motivos b Se as pessoas 1 e 2 se casarem qual é a probabilidade de que o seu primeiro filho apresente a doença renal O heredograma a seguir é em relação à doença de Huntington um distúrbio do sistema nervoso de início tardio As barras indicam familiares falecidos 55 a Esse heredograma é compatível com o modo de herança em relação à doença de Huntington mencionado no capítulo b Considere duas crianças recémnascidas nos dois braços do heredograma Susan no braço esquerdo e Alan no braço direito Estude o gráfico na Figura 224 e forme uma opinião sobre a probabilidade de que eles desenvolvam doença de Huntington Presuma para fins de discussão que os genitores tiveram filhos aos 25 anos de idade Considere o heredograma que acompanha de uma doença autossômica recessiva rara a PKU 56 57 a Liste os genótipos de tantos dos familiares quanto possível b Se as pessoas A e B se casarem qual é a probabilidade de que seu primeiro filho apresente PKU c Se o seu primeiro filho for normal qual é a probabilidade de que o seu segundo filho apresente PKU d Se o seu primeiro filho apresentar a doença qual é a probabilidade de que o seu segundo filho não seja afetado Presuma que todas as pessoas que se casam no heredograma não possuam o alelo anormal Um homem apresenta lóbulos da orelha presos enquanto sua esposa apresenta lóbulos da orelha livres Seu primeiro filho um menino apresenta lóbulos da orelha presos a Se for presumido que a diferença fenotípica ocorre em virtude de dois alelos de um gene único é possível que o gene esteja ligado ao X b É possível decidir se os lóbulos da orelha presos são uma característica dominante ou recessiva Um alelo recessivo raro herdado de modo mendeliano causa a doença fibrose cística Um homem fenotipicamente normal cujo pai apresentava fibrose cística se casa com uma mulher fenotipicamente normal de fora da família e o casal considera ter um filho a Desenhe o heredograma como descrito b Se a frequência na população de heterozigotos em relação à fibrose cística é de 1 em 50 qual é a chance de que o primeiro filho do casal 58 59 60 61 62 63 apresente fibrose cística c Se o primeiro filho apresentar fibrose cística qual é a probabilidade de que o segundo filho seja normal O alelo c causa albinismo em camundongos C faz com que os camundongos sejam pretos O cruzamento CC cc produz uma progênie de 10 Qual é a probabilidade de que toda ela seja preta O alelo recessivo s faz com que a Drosophila apresentem asas pequenas e o alelo s causa asas normais Esse gene sabidamente é ligado ao X Se um macho com asas pequenas for cruzado com uma fêmea homozigota do tipo selvagem qual proporção de moscas normais e com asas pequenas pode ser esperada em cada sexo na F1 Se as moscas da F1 forem entrecruzadas quais proporções da progênie F2 são esperadas Quais proporções de progênie são previstas se as fêmeas da F1 forem retrocruzadas com seu pai Um alelo dominante ligado ao X causa hipofosfatemia em humanos Um homem com hipofosfatemia se casa com uma mulher normal Qual proporção de seus filhos apresentará hipofosfatemia A distrofia muscular de Duchenne é ligada ao sexo e normalmente afeta apenas homens As vítimas da doença se tornam progressivamente mais fracas e a doença se manifesta precocemente a Qual é a probabilidade de que uma mulher cujo irmão apresenta a distrofia de Duchenne tenha um filho afetado b Se o irmão da sua mãe seu tio teve distrofia de Duchenne qual é a probabilidade de que você tenha recebido o alelo c Se o irmão do seu pai teve a doença qual é a probabilidade de que você tenha recebido o alelo Um homem e uma mulher casados recentemente descobrem que cada um teve um tio com alcaptonúria uma doença rara causada por um alelo autossômico recessivo de um gene único Eles estão para ter o seu primeiro bebê Qual é a probabilidade de que seu filho apresente alcaptonúria O heredograma a seguir se refere a uma anormalidade dentária hereditária 64 65 66 rara a amelogênese imperfeita a Qual modo de herança explica melhor a transmissão desse traço b Escreva os genótipos de todos os familiares de acordo com a sua hipótese Um casal que está para se casar descobre ao estudar seus históricos familiares que em ambas as suas famílias seus avós não afetados tinham irmãos com fibrose cística uma doença autossômica recessiva rara a Se o casal se casar e tiver um filho qual é a probabilidade de que o filho apresente fibrose cística b Se eles tiverem quatro filhos qual é a chance de que os filhos apresentem a proporção mendeliana precisa de 31 de normaisfibrose cística c Se o primeiro filho deles apresentar fibrose cística qual é a probabilidade de que os próximos três filhos sejam normais Um alelo c recessivo ligado ao sexo produz daltonismo verdevermelho em humanos Uma mulher normal cujo pai era daltônico se casa com um homem daltônico a Quais genótipos são possíveis em relação à mãe do homem daltônico b Quais são as chances de que o primeiro filho desse casamento seja um menino daltônico c Das meninas geradas por esses genitores podese esperar que qual proporção seja daltônica d De todos os filhos sexo não especificado desses genitores podese esperar que qual proporção apresente visão normal para cores Gatos domésticos machos são pretos ou laranja as fêmeas são pretas laranja ou cálicas tricolores a Se esses fenótipos de cor de pelagem forem controlados por um gene 67 68 ligado ao sexo como essas observações podem ser explicadas b Com a utilização de símbolos apropriados determine os fenótipos esperados na progênie de um cruzamento entre uma fêmea laranja e um macho preto c Metade das fêmeas produzidas por um determinado tipo de cruzamento é cálica e metade é preta metade dos machos é laranja e metade é preta De que cores são os machos e as fêmeas parentais nesse tipo de cruzamento d Outro tipo de cruzamento produz progênie nas proporções a seguir um quarto de machos laranja um quarto de fêmeas laranja um quarto de machos pretos e um quarto de fêmeas cálicas De que cores são os machos e as fêmeas parentais nesse tipo de cruzamento O heredograma a seguir referese a uma determinada doença rara que é incapacitante porém não fatal a Determine o modo de herança mais provável dessa doença b Escreva o genótipo de cada familiar de acordo com o seu modo de herança proposto c Se você fosse o médico dessa família como informaria os três casais na terceira geração a respeito da probabilidade de terem um filho afetado No milho o alelo s causa endosperma açucarado enquanto S causa endosperma amiláceo Quais genótipos de endosperma resultam de cada um dos cruzamentos a seguir a Sexo feminino ss sexo masculino SS b Sexo feminino SS sexo masculino ss c Sexo feminino Ss sexo masculino Ss 69 70 71 72 Uma geneticista de plantas possui duas linhagens puras uma com pétalas roxas e uma com pétalas azuis Ela formula a hipótese de que a diferença fenotípica ocorre em virtude de dois alelos de um gene Para testar essa ideia ela pretende observar uma proporção de 31 na F2 Ela cruza as linhagens e obtém toda a progênie F1 roxa As plantas da F1 são autopolinizadas e são obtidas 400 plantas da F2 Dessas plantas da F2 320 são roxas e 80 são azuis Esses resultados correspondem bem à sua hipótese Caso negativo sugira o motivo O avô de um homem apresenta galactosemia uma doença autossômica recessiva rara causada pela incapacidade de processar a galactose que leva à disfunção muscular nervosa e renal O homem se casou com uma mulher cuja irmã apresentava galactosemia A mulher agora está grávida de seu primeiro filho a Desenhe o heredograma conforme descrito b Qual é a probabilidade de que esse filho apresente galactosemia c Se o primeiro filho apresentar galactosemia qual é a probabilidade de que um segundo filho a apresente PROBLEMAS DESAFIADORES Um geneticista que trabalha com ervilhas tem uma única planta mono híbrida Yy amarela e a partir da autofecundação dessa planta deseja produzir uma planta de genótipo yy para ser utilizada como testador Quantas plantas da progênie precisam ser cultivadas para se ter 95 de certeza de que se obterá no mínimo uma na amostra Um polimorfismo curioso em populações humanas está relacionado com a capacidade de dobrar as laterais da língua para formar uma depressão rolamento da língua Algumas pessoas conseguem realizar esse truque enquanto outras simplesmente não conseguem Portanto esse é um exemplo de um dimorfismo A sua significância é um completo mistério Em uma família um menino era incapaz de dobrar a sua língua mas para sua grande decepção sua irmã conseguia Além disso ambos os genitores 73 74 conseguiam realizar o rolamento e assim também ambos os avós um tio paterno e uma tia paterna Uma tia paterna um tio paterno e um tio materno não conseguiam dobrar suas línguas a Desenhe o heredograma em relação a essa família definindo os seus símbolos claramente e deduza os genótipos de tantos membros quanto possível b O heredograma que você desenhou é típico da herança de dobrar a língua e levou os geneticistas a avaliarem o mecanismo de herança que sem dúvida você deduziu Entretanto em um estudo de 33 pares de gêmeos idênticos ambos os membros de 18 pares conseguiam fazêlo nenhum dos membros de 8 pares conseguia e um dos gêmeos em 7 pares conseguia realizar o rolamento mas o outro não Tendo em vista que gêmeos idênticos são derivados da divisão de um ovócito fertilizado em dois embriões os membros de um par têm de ser geneticamente idênticos Como a existência dos sete pares discordantes pode ser conciliada com a sua explicação genética do heredograma Os cabelos ruivos ocorrem em famílias conforme o heredograma a seguir demonstra Dados de heredograma de W R Singleton e B Ellis Journal of Heredity 55 1964 261 a O padrão de herança nesse heredograma sugere que os cabelos ruivos poderiam ser causados por um alelo dominante ou recessivo de um gene que é herdado de modo mendeliano simples b Você acredita que o alelo de cabelos ruivos seja comum ou raro na população como um todo Quando muitas famílias foram testadas em relação à capacidade de degustar a substância química feniltiocarbamida os cruzamentos foram agrupados em três tipos e a progênie foi totalizada com os resultados demonstrados a seguir Filhos 75 Genitores Número de famílias Degustadores Não degustadores Degustador Degustador 425 929 130 Degustador Não degustador 289 483 278 Não degustador Não degustador 86 5 218 Com a presunção de que a degustação da PTC seja dominante P e a não degustação seja recessiva p como as proporções da progênie em cada um dos três tipos de cruzamentos podem ser explicadas Uma condição conhecida como ictiose hystrix gravior apareceu em um menino no início do século 18 Sua pele se tornou muito espessa e formou espinhos que se desprendiam em intervalos Quando cresceu esse homem 76 77 porcoespinho se casou e teve seis filhos todos os quais apresentavam essa condição e diversas filhas todas normais Durante quatro gerações essa condição foi transmitida de pai para filho A partir dessa evidência o que você pode postular a respeito da localização do gene A mariposa Abraxas do tipo selvagem W apresenta grandes manchas em suas asas mas a forma lacticolor L dessa espécie apresenta manchas muito pequenas Foram realizados cruzamentos entre linhagens que diferem nessa característica com os resultados a seguir Genitores Progênie Cruzamento F1 F2 1 L W W L W W W 2 W L L W L W W L Forneça uma explicação genética clara dos resultados nesses dois cruzamentos demonstrando os genótipos de todas as mariposas O heredograma na parte inferior da página demonstra a herança de uma doença humana rara O padrão é mais bemexplicado como causado por um alelo recessivo ligado ao X ou por um alelo autossômico dominante com expressão limitada aos homens Dados de heredograma de J F Crow Genetics Notes 6th ed Copyright 1967 por Burgess Publishing Co Minneapolis 78 79 Um determinado tipo de surdez em humanos é herdado como um traço recessivo ligado ao X Um homem com esse tipo de surdez se casou com uma mulher normal e eles estão esperando um filho Eles descobrem que são parentes afastados Parte do heredograma está demonstrada aqui Como você alertaria os pais a respeito da probabilidade de seu filho ser um menino surdo uma menina surda um menino normal ou uma menina normal Assegurese de declarar todas as presunções que você faz O heredograma a seguir demonstra um padrão de herança muito incomum que de fato existiu Toda a progênie é mostrada mas os pais em cada cruzamento foram omitidos para chamar a atenção para o padrão extraordinário a Declare de modo conciso o que é incomum a respeito desse heredograma b O padrão pode ser explicado por meio da herança mendeliana APÊNDICE 21 Estágios da mitose A mitose normalmente ocupa apenas uma pequena proporção do ciclo celular aproximadamente 5 a 10 O tempo remanescente é a intérfase composta pelos estágios G1 S e G2 O DNA é replicado durante a fase S embora o DNA duplicado não se torne visível até posteriormente na mitose Os cromossomos não podem ser observados durante a intérfase ver seguir principalmente em virtude de estarem em um estado estendido e entrelaçados entre si como um emaranhado de fios As fotografias demonstram a mitose nos núcleos de células da extremidade da raiz do Lilium regale J McLeish and B Snoad Looking at Chromosomes Copyright 1958 St Martins Macmillan As fotografias a seguir demonstram os estágios da mitose nos núcleos de células da extremidade da raiz do lírio real Lilium regale Em cada um dos estágios é demonstrada uma fotografia à esquerda e um desenho interpretativo à direita As fotografias demonstram a mitose nos núcleos de células da extremidade da raiz do Lilium regale J McLeish and B Snoad Looking at Chromosomes Copyright 1958 St Martins Macmillan APÊNDICE 22 Estágios da meiose A meiose é composta por duas divisões nucleares diferenciadas como meiose I e meiose II que ocorrem em divisões celulares consecutivas Cada divisão meiótica é formalmente dividida em prófase metáfase anáfase e telófase Desses estágios o mais complexo e duradouro é a prófase I que é dividida em cinco estágios As fotografias a seguir demonstram os estágios da meiose nos núcleos de células da extremidade da raiz do lírio real Lilium regale Em cada um dos estágios é demonstrada uma fotografia à esquerda e um desenho interpretativo à direita As fotografias demonstram a meiose e a formação do pólen em Lilium regale Nota para simplificar são desenhados quiasmas múltiplos entre duas cromátides apenas na realidade todas as quatro cromátides podem participar J McLeish and B Snoad Looking at Chromosomes Copyright 1958 St Martins Macmillan 31 32 33 34 A Revolução Verde na agricultura é promovida pelo plantio disseminado de linhagens superiores de cultivos tal como o arroz demonstrado aqui produzidas por meio da combinação de traços genéticos benéficos Jorgen Schytte TÓPICOS Lei de Mendel de segregação independente A segregação independente Base cromossômica da segregação independente Herança poligênica 35 Genes de organelas Herança independente do núcleo RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Em diploides elaborar experimentos para produzir um dihíbrido e em seguida realizar o seu autocruzamento ou cruzamentoteste Em diploides analisar os fenótipos da progênie de autocruzamentos e cruzamentosteste de dihíbridos e a partir desses resultados avaliar se os dois genes estão se distribuindo de modo independente o que sugeriria localizações em diferentes cromossomos Em haploides desenhar experimentos para produzir um dihíbrido diploide temporário AaBb e analisar a sua progênie haploide para avaliar se o dois genes estão segregando de modo independente Em cruzamentos que envolvem dihíbridos com segregação independente prever as proporções genotípicas nos produtos meióticos as proporções genotípicas na progênie e as proporções fenotípicas na progênie Utilizar a análise do quiquadrado para testar se as proporções fenotípicas observadas estão em uma correspondência aceitável com aquelas previstas por segregação independente Em diploides elaborar experimentos para sintetizar linhagens que sejam puras homozigotas em relação a dois ou mais genes Interpretar as proporções da segregação independente de dois genes em termos do comportamento cromossômico na meiose Analisar as proporções da progênie de dihíbridos em termos da frequência de recombinantes FR e aplicar a FR diagnóstica para a segregação independente Estender os princípios da segregação independente de dois genes para heterozigotos em relação a três ou mais genes Estender o princípio da segregação independente para genes múltiplos que contribuem cada um para um fenótipo que demonstra distribuição contínua Aplicar os critérios diagnósticos para avaliar se as mutações estão em E genes de organelas citoplasmáticas ste capítulo é a respeito dos princípios que atuam quando dois ou mais casos de herança monogênica são analisados simultaneamente Em nenhuma outra área esses princípios foram mais importantes do que cultivo de plantas e na criação de animais na agricultura Por exemplo entre os anos de 1960 e 2000 a produção mundial de plantas alimentícias duplicou marcando uma assim denominada Revolução Verde O que tornou essa Revolução Verde possível Em parte ela ocorreu em virtude da melhora da prática da agricultura mas mais importante foi o desenvolvimento de genótipos de cultivos superiores por geneticistas de plantas Esses cultivadores estão em uma busca constante por mutações aleatórias em genes únicos que aumentem significativamente a produção ou o valor nutritivo Entretanto as referidas mutações surgem em linhagens diferentes em distintas partes do mundo Por exemplo no arroz um dos principais cultivos alimentícios mundiais as mutações a seguir foram cruciais na Revolução Verde sd1 Esse alelo recessivo resulta em estatura baixa tornando a planta mais resistente à queda no vento e na chuva ele também aumenta a quantidade relativa da energia da planta que é dirigida para a semente a parte que ingerimos se1 Esse alelo recessivo altera a necessidade da planta por uma duração específica de período diurno possibilitando que ela seja cultivada em diferentes latitudes Xa4 Esse alelo dominante confere resistência à doença ferrugem bacteriana bph2 Esse alelo confere resistência à cigarrinhacastanha um tipo de inseto Snb1 Esse alelo confere tolerância à submersão da planta após chuvas fortes Para produzir um genótipo verdadeiramente superior a combinação dos referidos alelos em uma linhagem é claramente desejável Para conquistar uma referida combinação linhagens mutantes têm de ser intercruzadas duas de cada vez Por exemplo um geneticista de plantas poderia iniciar por meio do cruzamento de uma linhagem homozigota para sd1 com outra homozigota para Xa4 A progênie da F1 desse cruzamento carregaria ambas as mutações porém em um estado heterozigoto Entretanto a maior parte da agricultura utiliza linhagens puras tendo em vista que elas podem ser propagadas de modo eficiente e distribuídas para os fazendeiros Para obter uma linhagem duplamente mutante pura sd1sd1 Xa4Xa4 a F1 precisaria ser adicionalmente cultivada para possibilitar que os alelos se distribuíssem na combinação desejável Alguns produtos do referido cruzamento estão demonstrados na Figura 31 Quais princípios são relevantes aqui Depende muito se os dois genes estão no mesmo par de cromossomos ou em pares de cromossomos diferentes No último caso os pares de cromossomos atuam de modo independente na meiose e dizse que os alelos dos dois pares de genes heterozigotos demonstram segregação distribuição independente Este capítulo explica como podemos reconhecer a segregação independente e como tal princípio pode ser utilizado na construção de linhagens tanto na agricultura quanto na pesquisa genética básica O Capítulo 4 abrange os princípios análogos aplicáveis aos pares de genes heterozigotos no mesmo par de cromossomos Também devemos observar que a distribuição independente de uma variedade de genes também é útil para fornecer um mecanismo hereditário básico em relação aos fenótipos contínuos Essas são propriedades tais como a estatura ou o peso que não se encontram em categorias distintas mas que apesar disso com frequência são influenciadas fortemente por genes múltiplos coletivamente denominados poligenes Examinaremos o papel da distribuição independente na herança de fenótipos contínuos influenciados pelos referidos poligenes Observaremos que a distribuição independente dos poligenes pode produzir uma distribuição fenotípica contínua entre a progênie Por último apresentaremos um tipo diferente de herança independente aquele dos genes nas organelas mitocôndrias e cloroplastos Contrariamente aos cromossomos nucleares esses genes são herdados citoplasmaticamente e resultam em padrões de herança diferentes daqueles observados em relação aos genes e cromossomos nucleares Esse padrão é independente dos genes que demonstram 31 herança nuclear FIGURA 31 Genótipos superiores de cultivos tal como o arroz revolucionaram a agricultura Esta fotografia demonstra alguns dos genótiposchave utilizados em programas de cultivo de arroz BloombergGetty Images Primeiramente examinamos os procedimentos analíticos que se referem à distribuição independente dos genes nucleares Esses foram desenvolvidos pela primeira vez pelo pai da genética Gregor Mendel Assim novamente voltamos para o seu trabalho como um exemplo prototípico Lei de Mendel de segregação independente Em uma grande parte do seu trabalho original com ervilhas Mendel analisou os descendentes de linhagens puras que diferiam em duas características O simbolismo geral a seguir é utilizado para representar genótipos que incluem dois genes Se dois genes estão em cromossomos diferentes os pares de genes são separados por um ponto e vírgula por exemplo Aa Bb Se eles estão no mesmo cromossomo os alelos em um homólogo são escritos de modo adjacente sem pontuação e são separados daqueles no outro homólogo por uma barra por exemplo ABab ou AbaB Não existe um simbolismo aceito para situações nas quais não se sabe se os genes estão no mesmo cromossomo ou em cromossomos diferentes Para essa situação de posição desconhecida utilizaremos neste livro um ponto para separar os genes por exemplo Aa Bb Relembre do Capítulo 2 que um heterozigoto para um gene único tal como Aa por vezes é denominado um monohíbrido um heterozigoto duplo tal como Aa Bb por vezes é denominado um dihíbrido A partir do estudo de cruzamentos dihíbridos Aa Bb Aa Bb Mendel inventou seu segundo princípio de hereditariedade importante a lei da segregação independente por vezes denominada segunda lei de Mendel O par de características com o qual ele começou a trabalhar foi o formato e a cor da semente Nós já acompanhamos o cruzamento monohíbrido em relação à cor da semente Yy Yy que forneceu uma proporção da progênie de 3 amarelas1 verde Os fenótipos do formato da semente Figura 32 eram lisa determinado pelo alelo R e rugosa determinada pelo alelo r O cruzamento monohíbrido Rr Rr forneceu uma proporção de progênie de 3 lisas1 rugosa conforme esperado ver Tabela 21 no Capítulo 2 Para realizar um cruzamento dihíbrido Mendel iniciou com duas linhagens parentais puras Uma linhagem apresentava sementes rugosas e amarelas Tendo em vista que Mendel não tinha o conceito da localização cromossômica dos genes precisamos utilizar a representação com ponto para escrever o genótipo combinado inicialmente como rr YY A outra linhagem apresentava sementes lisas e verdes com o genótipo RR yy Quando essas duas linhagens foram cruzadas elas necessariamente produziram gametas que eram r Y e R y respectivamente Portanto as sementes da F1 tinham de ser dihíbridas do genótipo Rr Yy Mendel descobriu que as sementes da F1 eram lisas e amarelas Esse resultado demonstrou que a dominância de R sobre r e de Y sobre y não foi afetada pela condição do outro par de genes no dihíbrido Rr Yy Em outras palavras R permaneceu dominante sobre r independentemente da cor da semente e Y permaneceu dominante sobre y independentemente do formato da semente FIGURA 32 Ervilhas lisas RR ou Rr e rugosas rr estão presentes em uma vagem de uma planta heterozigota Rr autocruzada A proporção fenotípica nesta vagem é precisamente a proporção de 31 esperada em média na progênie deste autocruzamento Estudos moleculares demonstraram que o alelo rugoso utilizado por Mendel é produzido pela inserção de um segmento de DNA móvel dentro do gene ver Capítulo 15 Madan K Bhattacharyya Em seguida Mendel autocruzou a F1 dihíbrida para obter a geração F2 As sementes da F2 eram de 4 diferentes tipos nas proporções a seguir de sementes lisas e amarelas de sementes lisas e verdes de sementes rugosas e amarelas de sementes rugosas e verdes um resultado que está ilustrado na Figura 33 com os números reais obtidos por Mendel Essa proporção 9331 inicialmente inesperada em relação a essas duas características aparenta ser muito mais complexa do que as proporções de 31 simples dos cruzamentos monohíbridos Não obstante a proporção de 9331 comprovou ser um padrão de herança consistente em ervilhas Como evidência Mendel também realizou cruzamentos dihíbridos que incluíram diversas outras combinações de características e observou que todos os indivíduos da F1 dihíbridos produziram proporções de 9331 na F2 A proporção era outro padrão de herança que exigiu o desenvolvimento de uma nova ideia para a sua explicação Primeiramente verificaremos os números reais obtidos por Mendel na Figura 33 para determinar se as proporções de 31 de monohíbridos ainda podem ser observadas na F2 Em relação ao formato da semente existem 423 sementes lisas 315 108 e 133 sementes rugosas 101 32 Esse resultado está próximo de uma proporção de 31 na realidade 321 Em seguida em relação à cor da semente existem 416 sementes amarelas 315 101 e 140 verdes 108 32 também muito próximo de uma proporção de 31 quase exatamente 31 A presença dessas duas proporções de 31 escondidas na proporção de 9331 era indubitavelmente uma fonte da percepção que Mendel necessitava para explicar a proporção de 9331 tendo em vista que ele percebeu que se tratava simplesmente de duas proporções de 31 diferentes combinadas aleatoriamente Um modo de visualizar a combinação aleatória dessas duas proporções é com um diagrama ramificado como segue FIGURA 33 Mendel sintetizou um dihíbrido que quando autocruzado produziu uma progênie da F2 na proporção de 9331 As probabilidades dos quatro resultados possíveis são calculadas por meio da utilização da regra do produto a probabilidade de dois eventos independentes ocorrerem em conjunto é o produto de suas probabilidades individuais Portanto multiplicamos ao longo das ramificações no diagrama Por exemplo 34 de todas as sementes serão lisas e 34 das sementes lisas serão amarelas de modo que a probabilidade de uma semente ser lisa e amarela é calculada como 34 34 que é igual a 916 Essas multiplicações fornecem as quatro proporções a seguir Essas proporções constituem a proporção de 9331 que estamos tentando explicar Entretanto esse exercício não é meramente um malabarismo com números O que a combinação das duas proporções de 31 significa biologicamente O modo pelo qual Mendel escreveu sua explicação de fato equivale a um mecanismo biológico No que atualmente é conhecido como a lei de segregação independente segunda lei de Mendel ele concluiu que diferentes pares de genes se distribuem independentemente durante a formação dos gametas A consequência é que em relação a dois pares de genes heterozigotos Aa e Bb o alelo b apresenta justamente a mesma probabilidade de figurar em um gameta com um alelo a como com um alelo A e da mesma maneira em relação ao alelo B Retrospectivamente sabemos que na maioria dos casos essa lei se aplica aos genes em cromossomos diferentes Os genes no mesmo cromossomo em geral não se distribuem independentemente tendo em vista que são mantidos em conjunto pelo próprio cromossomo CONCEITOCHAVE A segunda lei de Mendel o princípio de segregação independente declara que pares de genes em pares de cromossomos diferentes se distribuem independentemente na meiose A declaração original de Mendel dessa lei foi que genes diferentes se distribuem independentemente tendo em vista que aparentemente ele não encontrou ou ignorou quaisquer exceções que pudessem ter levado ao conceito de ligação Explicamos a proporção fenotípica de 9331 como duas proporções fenotípicas de 31 combinadas aleatoriamente Mas também podemos chegar à proporção de 9331 a partir de uma consideração da frequência dos gametas os reais produtos meióticos Consideremos os gametas produzidos pelo dihíbrido da F1 Rr Yy o ponto e vírgula demonstra que agora estamos abraçando a ideia de que os genes estão em cromossomos diferentes Novamente utilizaremos o diagrama ramificado para iniciarmos tendo em vista que ele ilustra visualmente a independência Combinando as leis de Mendel sobre a segregação igual e sobre a segregação independente podemos prever que A multiplicação ao longo das ramificações de acordo com a regra do produto nos fornece as proporções de gametas R Y R y r Y r y Essas proporções são um resultado direto da aplicação das duas leis mendelianas da segregação e da independência Entretanto ainda não chegamos à proporção de 9331 A próxima etapa é reconhecer que tendo em vista que os gametas masculinos e femininos obedecem às mesmas leis durante a formação ambos os gametas masculinos e femininos demonstrarão as mesmas proporções há pouco fornecidas Os quatro tipos gaméticos femininos serão fertilizados aleatoriamente pelos quatro tipos gaméticos masculinos para obter a F2 O melhor modo gráfico de demonstrar os desfechos do cruzamento é por meio da utilização de uma grade de 4 4 denominada quadrado de Punnett que está ilustrado na Figura 34 Já observamos que as grades são úteis em genética por permitirem uma representação visual dos dados Sua utilidade está no fato de que as suas proporções podem ser desenhadas de acordo com as proporções genéticas ou as proporções em consideração No quadrado de Punnett na Figura 34 por exemplo foram desenhadas quatro linhas e quatro colunas para corresponder aos quatro genótipos dos gametas femininos e aos quatro dos gametas masculinos Observamos que existem 16 quadros que representam as diversas fusões gaméticas e que cada quadro é 116 da área total da grade De acordo com a regra do produto cada 116 é um resultado da fertilização de um tipo de ovócito a uma frequência de 14 por um tipo de espermatozoide também a uma frequência de 14 fornecendo a probabilidade daquela fusão como 14² Conforme o quadrado de Punnett demonstra a F2 contém uma diversidade de genótipos mas existem apenas quatro fenótipos e suas proporções estão na proporção de 9331 Assim observamos que quando calculamos as frequências da progênie diretamente por meio das frequências dos gametas ainda chegamos à proporção de 9331 Portanto a lei de Mendel explica não apenas os fenótipos da F2 mas também os genótipos dos gametas e da progênie que são a base da proporção fenotípica da F2 Mendel prosseguiu para testar o seu princípio de segregação independente de diversos modos O modo mais direto enfocou na proporção gamética de 1111 supostamente produzida pelo dihíbrido da F1 Rr Yy tendo em vista que essa proporção surgiu diretamente de seu princípio da distribuição independente e foi a base biológica da proporção de 9331 na F2 conforme demonstrado pelo quadrado de Punnett Para verificar a proporção gamética de 1111 Mendel utilizou um cruzamentoteste Ele realizou o cruzamentoteste do dihíbrido da F1 com um testador de genótipo rr yy que produz apenas gametas com alelos recessivos genótipo r y Ele ponderou que se de fato havia uma proporção de 1111 de gametas R Y R y r Y e r y as proporções da progênie desse cruzamento deveriam corresponder diretamente às proporções gaméticas produzidas pelo dihíbrido Em outras palavras Quadrado de Punnett ilustrando os genótipos subjacentes a uma proporção de 9331 FIGURA 34 Podemos utilizar o quadrado de Punnett para prever o resultado de um cruzamento dihíbrido Este quadrado demonstra a constituição genotípica e fenotípica prevista na geração F2 a partir de um cruzamento dihíbrido Rr Yy lisas e amarelas Rr yy lisas e verdes rr Yy rugosas e amarelas rr yy rugosas e verdes Essas proporções foram o resultado que ele obteve perfeitamente consistente com as suas expectativas Ele obteve resultados semelhantes em relação a todos os outros cruzamentos dihíbridos que realizou e tais testes e outros tipos de testes demonstraram todos que de fato ele havia planejado um modelo robusto para explicar os padrões de herança observados em seus diversos cruzamentos de ervilhas No início do século 20 ambas as leis de Mendel foram testadas em um amplo espectro de organismos eucarióticos Os resultados desses testes demonstraram que os princípios mendelianos em geral eram aplicáveis As proporções mendelianas tais como 31 11 9331 e 1111 foram extensivamente relatadas sugerindo que a segregação igual e a distribuição independente são processos hereditários fundamentais observados em toda a natureza As leis de Mendel não são meramente leis a respeito das ervilhas São leis a respeito da genética dos organismos eucarióticos em geral Como um exemplo da aplicabilidade universal do princípio da segregação independente podemos examinar a sua ação em haploides Se o princípio da segregação igual é válido de modo geral então devemos ser capazes de observar a sua ação em haploides tendo em vista que os haploides são submetidos à meiose De fato a distribuição independente pode ser observada em um cruzamento do tipo A B a b A fusão das células parentais resulta em um meiócito diploide temporário que é um dihíbrido Aa Bb e os produtos da meiose aleatoriamente amostrados esporos sexuados tais como ascósporos em 32 fungos serão A B A b a B a b Portanto observamos a mesma proporção do cruzamentoteste dihíbrido em um organismo diploide novamente a proporção é uma combinação aleatória das duas proporções de 11 monohíbridas em virtude da distribuição independente CONCEITOCHAVE As proporções de 1111 e 9331 são diagnósticas da distribuição independente em um e dois meiócitos dihíbridos respectivamente A segregação independente Nesta seção examinaremos diversos procedimentos analíticos que são parte da pesquisa genética diária e todos têm por base o conceito da distribuição independente Todos esses procedimentos são utilizados para analisar as proporções fenotípicas Previsão das proporções da progênie A genética pode atuar em qualquer uma de duas direções 1 prevendo os genótipos desconhecidos dos progenitores por meio da utilização das proporções fenotípicas da progênie ou 2 prevendo as proporções fenotípicas da progênie a partir dos progenitores de genótipo conhecido A última é uma parte importante da genética pertinente à previsão dos tipos de progênie que surgirão a partir de um cruzamento e ao cálculo de suas frequências esperadas em outras palavras as suas probabilidades Isso é útil não apenas na pesquisa em organismosmodelo mas também para prever os desfechos de cruzamentos na genética humana por exemplo no aconselhamento genético pessoas apreciam estimativas de risco específicas Já examinamos dois métodos para a previsão os quadrados de Punnett e os diagramas ramificados Os quadrados de Punnett podem ser utilizados para demonstrar padrões hereditários com base em um par de genes dois pares de genes ou mais As referidas grades são bons dispositivos gráficos para a representação da progênie mas desenhálos demanda tempo Até mesmo o quadrado de Punnett de 16 compartimentos que utilizamos para analisar um cruzamento dihíbrido demora um longo tempo para ser escrito mas em relação a um cruzamento trihíbrido existem 2³ ou 8 tipos de gametas diferentes e o quadrado de Punnett apresenta 64 compartimentos O diagrama ramificado demonstrado a seguir é de mais fácil criação e é adaptável às proporções fenotípicas genotípicas ou gaméticas conforme ilustrado em relação ao di híbrido Aa Bb Observe entretanto que a árvore de ramificações em relação aos genótipos é um tanto complicada até mesmo nesse caso simples que utiliza dois pares de genes tendo em vista que existem 3² 9 genótipos Em relação a três pares de genes existem 3³ ou 27 possíveis genótipos Para simplificar esse problema podemos utilizar uma abordagem estatística que constitui um terceiro método para o cálculo das probabilidades frequências esperadas de fenótipos ou genótipos específicos resultantes de um cruzamento As duas regras estatísticas necessárias são a regra do produto introduzida no Capítulo 2 e a regra da soma que agora consideramos em conjunto CONCEITOCHAVE A regra do produto estabelece que a probabilidade de eventos independentes ocorrerem em conjunto é o produto de suas probabilidades individuais Os desfechos possíveis ao jogar dois dados seguem a regra do produto tendo em vista que o resultado em um dado é independente do outro Como um exemplo calculemos a probabilidade p de obtermos um par de 4 A probabilidade de um 4 em um dado é de 16 tendo em vista que o dado apresenta seis lados e apenas um lado contém o número 4 A probabilidade é escrita como segue Portanto com a utilização da regra do produto a probabilidade de um 4 aparecer em ambos os dados é de 16 16 136 que é escrita Agora em relação à regra da soma CONCEITOCHAVE A regra da soma estabelece que a probabilidade de um ou de outro de dois eventos mutuamente exclusivos ocorrer é a soma das suas probabilidades individuais Observe que na regra do produto o enfoque está nos desfechos A e B Na regra da soma o enfoque está no desfecho A ou A Dados também podem ser utilizados para ilustrar a regra da soma Já calculamos que a probabilidade de dois 4 é de 136 claramente com a utilização do mesmo tipo de cálculo a probabilidade de dois 5 será a mesma ou 136 Agora podemos calcular a probabilidade de dois 4 ou de dois 5 Tendo em vista que esses desfechos são mutuamente exclusivos a regra da soma pode ser utilizada para nos informar que a resposta é 136 136 que é 118 A probabilidade pode ser escrita como segue Qual proporção da progênie será de um genótipo específico Agora podemos nos voltar para um exemplo genético Presuma que temos duas plantas de genótipos Aa bb Cc Dd Ee e Aa Bb Cc dd Ee A partir de um cruzamento entre essas plantas desejamos recuperar uma planta da progênie de genótipo aa bb cc dd ee talvez com a finalidade de atuar como a linhagem testadora em um cruzamentoteste Qual proporção da progênie devemos esperar que seja daquele genótipo Se presumirmos que todos os pares de genes se distribuem independentemente então podemos realizar esse cálculo facilmente por meio da utilização da regra do produto Os cinco pares de genes diferentes são considerados individualmente como se fossem cinco cruzamentos separados e em seguida as probabilidades individuais de obtenção de cada genótipo são multiplicadas em conjunto para chegar à resposta De Aa Aa um quarto da progênie será aa De bb Bb metade da progênie será bb De Cc Cc um quarto da progênie será cc De Dd dd metade da progênie será dd De Ee Ee um quarto da progênie será ee Portanto a probabilidade geral ou a frequência esperada de obtenção de uma progênie de genótipo aa bb cc dd ee será 14 12 14 12 14 1256 Esse cálculo da probabilidade pode ser estendido para prever as frequências fenotípicas ou as frequências gaméticas De fato existem muitas outras utilizações para esse método na análise genética e encontraremos algumas nos capítulos posteriores Quantos descendentes precisamos cultivar Para adotar o exemplo antecedente em uma etapa adiante suponha que precisemos estimar quantas plantas da progênie precisam ser cultivadas para haver uma chance razoável de obtenção do genótipo desejado aa bb cc dd ee Primeiramente calculamos a proporção da progênie que se espera ser daquele genótipo Conforme demonstrado há pouco aprendemos que precisamos examinar no mínimo 256 progênies para haver uma chance média de obtenção de uma planta individual do genótipo desejado A probabilidade de obtenção de um sucesso uma planta totalmente recessiva entre 256 precisa ser considerada mais cuidadosamente Essa é a probabilidade média de sucesso Infelizmente se isolarmos e testarmos 256 progênies muito provavelmente não obteremos sucesso em absoluto simplesmente em virtude de azar De um ponto de vista prático uma questão mais significativa a ser indagada seria Qual tamanho de amostra necessitamos para ter uma confiança de 95 de que obteremos no mínimo um sucesso Nota esse valor de confiança de 95 é o padrão em ciência O modo mais simples de realizar esse cálculo é abordálo ao considerar a probabilidade de completo insucesso ou seja a probabilidade de não obtermos nenhum indivíduo do genótipo desejado Em nosso exemplo para cada indivíduo isolado a probabilidade de que ele não seja do tipo desejado é 1 1256 255256 Estendendo essa ideia para uma amostra de tamanho n observamos que a probabilidade de nenhum sucesso em uma amostra de n é 255256n Essa probabilidade é uma aplicação simples da regra do produto 255256 multiplicada por si própria n vezes Portanto a probabilidade de obtenção de no mínimo um sucesso é a probabilidade de todos os desfechos possíveis essa probabilidade é 1 menos a probabilidade de insucesso total ou 255256n Portanto a probabilidade de no mínimo um sucesso é 1 255256n Para atender o nível de confiança de 95 precisamos tornar essa expressão igual a 095 o equivalente a 95 Portanto 1 255256n 095 A solução dessa equação em relação ao n nos fornece um valor de 765 o número necessário de progênie para virtualmente garantir o sucesso Observe quão diferente esse número é da expectativa ingênua de sucesso na progênie de 256 Esse tipo de cálculo é útil em muitas aplicações em genética e em outras situações nas quais é necessário um desfecho de sucesso de muitos estudos Quantos genótipos distintos um cruzamento produzirá As regras da probabilidade podem ser facilmente utilizadas para prever a quantidade de genótipos ou fenótipos na progênie de linhagens parentais complexas Os referidos cálculos são utilizados de modo rotineiro em pesquisas na análise de progênie e na criação de linhagens Por exemplo em um endocruzamento do tetrahíbrido Aa Bb Cc Dd haverá três genótipos para cada par de genes por exemplo em relação ao primeiro par de genes os três genótipos serão Aa AA e aa Tendo em vista que existem quatro pares de genes no total haverá 34 81 genótipos diferentes Em um cruzamentoteste de um referido tetrahíbrido haverá dois genótipos para cada par de genes p ex Aa e aa e um total de 24 16 genótipos na progênie Tendo em vista que estamos presumindo que todos os genes se encontram em cromossomos diferentes todos esses genótipos do cruzamentoteste ocorrerão a uma frequência igual de 116 Utilização do teste do quiquadrado em proporções monohíbridas e dihíbridas Na genética em geral um pesquisador com frequência é confrontado com resultados que estão próximos de uma proporção esperada mas que não são idênticos a ela As referidas proporções podem ser de monohíbridos di híbridos ou genótipos mais complexos e com independência ou não Mas quão próximo de um resultado esperado é suficiente É necessário um teste estatístico para verificar os referidos números em face das expectativas e o teste do qui quadrado ou teste do χ² preenche esse papel Em quais situações experimentais o teste de χ² em geral é aplicável A situação geral é uma situação na qual os resultados observados são comparados àqueles previstos por uma hipótese Em um exemplo genético simples suponha que você cultivou uma planta em relação à qual você formula a hipótese de que com base em uma análise precedente seja uma heterozigota Aa Para testar essa hipótese você cruza essa heterozigota com um testador de genótipo aa e conta os números de fenótipos com genótipos A e aa na progênie Em seguida você deve avaliar se os números que você obtém constituem a proporção esperada de 11 Se houver uma correspondência próxima então a hipótese é considerada consistente com o resultado enquanto se houver uma correspondência inadequada a hipótese é rejeitada Como parte desse processo deve ser feita uma avaliação se os números observados estão suficientemente próximos daqueles esperados Correspondências muito próximas e incompatibilidades óbvias em geral não apresentam problemas mas inevitavelmente existem áreas sombrias nas quais a correspondência não é óbvia O teste do χ² é simplesmente um modo de quantificar os diversos desvios aleatórios esperados se uma hipótese for verdadeira Adote a hipótese simples precedente que prevê uma proporção de 11 por exemplo Ainda que a hipótese seja verdadeira apenas raramente podemos esperar uma proporção exata de 11 Podemos modelar essa ideia com um barril cheio de bolas de gude vermelhas e brancas em quantidades iguais Se removermos amostras de 100 bolas de gude às cegas com base no acaso esperaríamos que as amostras demonstrassem pequenos desvios tais como 52 vermelhas48 brancas de modo consideravelmente comum e que demonstrassem desvios maiores tais como 60 vermelhas40 brancas menos comumente Até mesmo 100 bolas de gude vermelhas é um desfecho possível a uma probabilidade muito baixa de 12100 Entretanto se qualquer resultado for possível em algum nível de probabilidade até mesmo se a hipótese for verdadeira como podemos chegar a rejeitar uma hipótese Uma convenção científica geral é que uma hipótese será rejeitada como falsa se houver uma probabilidade inferior a 5 de observação de um desvio das expectativas no mínimo tão grande quanto aquele realmente observado A hipótese pode ainda ser verdadeira mas precisamos tomar uma decisão em algum ponto e 5 é a linha de decisão convencional A implicação é que embora os resultados assim tão distantes das expectativas sejam esperados em 5 das ocasiões até mesmo quando a hipótese é verdadeira rejeitaremos erroneamente a hipótese em apenas 5 dos casos e estamos desejando aceitar essa chance de erro Esses 5 são o contrário do nível de confiança de 95 utilizado anteriormente Vejamos alguns dados reais Testaremos a nossa hipótese anterior de que uma planta seja uma heterozigota Consideraremos A para pétalas vermelhas e consideraremos a para brancas Os cientistas testam uma hipótese ao realizar previsões com base na hipótese Na presente situação uma possibilidade é prever os resultados de um cruzamentoteste Presuma que nós realizamos o cruzamento teste do heterozigoto presumido Com base na hipótese a lei de Mendel da segregação igual prevê que deveremos ter 50 Aa e 50 aa Presuma que na realidade obtemos uma progênie de 120 e observamos que 55 são vermelhas e 65 são brancas Esses números diferem das expectativas precisas que seriam 60 vermelhas e 60 brancas O resultado aparenta estar um pouco longe da proporção esperada o que gera incerteza assim precisamos utilizar o teste do χ² Calculamos o χ² por meio da utilização da fórmula a seguir χ² Σ O E²E para todas as classes na qual E é o número esperado em uma classe O é o número observado em uma classe e Σ significa soma de O valor resultante χ² fornecerá um valor numérico que estima o grau de concordância entre os resultados esperados hipotetizados e observados reais com o número crescendo ainda mais na medida em que a concordância aumenta O cálculo é mais simplesmente realizado por meio da utilização de uma tabela 1 2 Classe O E O E² O E²E Vermelha 55 60 25 2560 042 Branca 65 60 25 2560 042 Total χ² 084 Agora precisamos procurar esse valor de χ² na Tabela 31 que nos fornecerá o valor da probabilidade que desejamos As linhas na Tabela 31 listam diferentes valores de graus de liberdade gl O número de graus de liberdade é o número de variáveis independentes nos dados No presente contexto o número de variáveis independentes é simplesmente o número de classes fenotípicas menos 1 Nesse caso gl 2 1 1 Assim observamos apenas a linha de 1 gl Observamos que nosso valor de χ² de 084 encontrase em algum ponto entre as colunas marcadas 05 e 01 em outras palavras entre 50 e 10 Esse valor de probabilidade é muito superior ao valor limite de 5 e assim aceitamos os resultados observados como sendo compatíveis com a hipótese Seguemse algumas observações importantes sobre a aplicação desse teste O que realmente significa o valor da probabilidade É a probabilidade de observação de um desvio dos resultados esperados no mínimo tão grande não exatamente esse desvio com base no acaso se a hipótese estiver correta O fato de que os nossos resultados passaram no teste do quiquadrado em virtude de p 005 não significa que a hipótese seja verdadeira Isso significa meramente que os resultados são compatíveis com aquela hipótese 3 4 Entretanto se houvéssemos obtido um valor de p 005 teríamos sido forçados a rejeitar a hipótese A ciência se refere totalmente a hipóteses que podem ser falsas não trata da verdade Devemos ser cuidadosos ao formular a hipótese tendo em vista que presunções tácitas com frequência encontramse encerradas dentro dela A presente hipótese é um caso assim se fôssemos declarála cuidadosamente deveríamos dizer que o indivíduo em teste é um heterozigoto Aa esses alelos demonstram segregação igual na meiose e as progênies Aa e aa são de viabilidade igual Investigaremos os efeitos do alelo sobre a viabilidade no Capítulo 6 mas por enquanto devemos têlos em mente como uma possível complicação tendo em vista que as diferenças na sobrevivência afetariam os tamanhos das diversas classes O problema é que se rejeitarmos uma hipótese que apresenta componentes escondidos não sabemos quais dos componentes estamos rejeitando Por exemplo no presente caso se fôssemos forçados a rejeitar a hipótese como resultado do teste do χ² não saberíamos se estamos rejeitando a segregação igual ou a viabilidade igual ou ambas O desfecho do teste do χ² depende fortemente dos tamanhos das amostras números nas classes Portanto o teste deve utilizar números reais não proporções ou porcentagens Além disso quanto maiores as amostras mas poderoso é o teste Quaisquer proporções mendelianas familiares consideradas neste capítulo ou no Capítulo 2 podem ser testadas por meio da utilização do teste do χ² por exemplo 31 1 gl 121 2 gl 9331 3 gl e 1111 3 gl Retornaremos a mais aplicações do teste do χ² no Capítulo 4 Tabela 31 Valores críticos da distribuição do χ² P gl 0995 0975 09 05 01 005 0025 1 0000 0000 0016 0455 2706 3841 5024 2 0010 0051 0211 1386 4605 5991 7378 3 0072 0216 0584 2366 6251 7815 9348 4 0207 0484 1064 3357 7779 9488 11143 5 0412 0831 1610 4351 9236 11070 12832 6 0676 1237 2204 5348 10645 12592 14449 7 0989 1690 2833 6346 12017 14067 16013 8 1344 2180 3490 7344 13362 15507 17535 9 1735 2700 4168 8343 14684 16919 19023 10 2156 3247 4865 9342 15987 18307 20483 11 2603 3816 5578 10341 17275 19675 21920 12 3074 4404 6304 11340 18549 21026 23337 13 3565 5009 7042 12340 19812 22362 24736 14 4075 5629 7790 13339 21064 23685 26119 15 4601 6262 8547 14339 22307 24996 27488 Síntese de linhagens puras As linhagens puras estão entre as ferramentas essenciais da genética Por um lado apenas essas linhagens totalmente homozigotas expressarão alelos recessivos mas a principal necessidade de linhagens puras está na manutenção de estoques para pesquisas Os membros de uma linhagem pura podem ser entrecruzados ao longo do tempo e assim atuar como uma fonte constante do genótipo para utilização em experimentos Portanto em relação à maior parte dos organismos modelo existem centros de estoque internacionais que são repositórios das linhagens puras para utilização em pesquisas Centros de estoque semelhantes fornecem linhagens de plantas e animais para utilização na agricultura As linhagens puras de plantas ou animais são produzidas por meio de gerações repetidas de autocruzamento Em animais isso é feito por meio do cruzamento de animais de genótipo idêntico O autocruzamento de uma planta monohíbrida demonstra o princípio em ação Suponha que iniciemos com uma população de indivíduos que são todos Aa e que deixemos que ocorra autocruzamento Podemos aplicar a primeira lei de Mendel para prever que na próxima geração haverá AA Aa e aa Observe que a heterozigosidade a proporção de heterozigotos foi dividida pela metade de 1 para ½ Se repetirmos esse processo por outra geração todos os descendentes dos homozigotos serão homozigotos mas novamente os heterozigotos dividirão pela metade a sua proporção para um quarto O processo está demonstrado na representação a seguir Após digamos 8 gerações de autocruzamento a proporção de heterozigotos é reduzida para 128 que é 1256 ou aproximadamente 04 Vejamos esse processo de um modo discretamente diferente presumiremos que iniciamos um referido programa com um genótipo que é heterozigoto em 256 pares de genes Se também presumirmos a distribuição independente então após o autocruzamento por oito gerações terminaríamos com uma variedade de genótipos cada um apresentando em média apenas um gene heterozigoto ou seja 1256 Em outras palavras estamos bem no caminho de criar um número de linhagens puras Apliquemos esse princípio para a seleção de linhagens agrícolas o tópico com o qual iniciamos o capítulo Podemos utilizar como nosso exemplo a seleção do trigo Marquis por Charles Saunders na parte inicial do século 20 O objetivo de Saunders era desenvolver uma linhagem de trigo produtiva que apresentaria uma estação de crescimento mais curta e que portanto abriria grandes áreas de terreno em países do norte tais como Canadá e Rússia para o cultivo do trigo outro dos alimentos básicos mundiais Ele cruzou uma linhagem que apresentava excelente qualidade de grãos denominada Red Fife com uma linhagem denominada Hard Red Calcutta a qual embora de inadequada produção e qualidade maturava 20 dias antes do que a Red Fife A F1 produzida pelo cruzamento presumivelmente era heterozigota para genes múltiplos que controlam as qualidades do trigo A partir dessa F1 Saunders realizou autocruzamentos e seleções que finalmente levaram a uma linhagem pura que apresentava a combinação das propriedades favoráveis necessárias grãos de boa qualidade e maturação precoce Essa linhagem foi denominada Marquis Ela foi rapidamente adotada em muitas partes do mundo Uma abordagem semelhante pode ser aplicada às linhagens de arroz com as quais iniciamos o capítulo Todas as mutações monogênicas são cruzadas em pares e em seguida as plantas das suas F1 são auto ou intercruzadas com outras plantas da F1 Como uma demonstração consideremos apenas quatro mutações 1 a 4 Um programa de cruzamento pode ser como segue no qual os alelos mutantes e seus correspondentes do tipo selvagem sempre estão listados na mesma ordem relembre que o sinal de designa o tipo selvagem Esse tipo de cruzamento foi aplicado a muitas outras espécies de cultivo As linhagens puras coloridas e diversas de tomates utilizadas no comércio estão demonstradas na Figura 35 Observe que em geral quando um heterozigoto múltiplo é autocruzado é produzida uma diversidade de diferentes homozigotos Por exemplo de Aa Bb Cc existem dois homozigotos para cada par de genes ou seja em relação ao primeiro gene os homozigotos são AA e aa e assim existem 2³ 8 homozigotos diferentes possíveis AA bb Cc e aa BB cc e assim por diante Cada homozigoto distinto pode ser o início de uma nova linhagem pura FIGURA 35 O cruzamento de tomates resultou em uma ampla diversidade de linhagens de diferentes genótipos e fenótipos MascarucciCorbis CONCEITOCHAVE O autocruzamento repetido leva a um aumento na proporção de homozigotos um processo que pode ser utilizado para criar linhagens puras para pesquisas ou outras aplicações Vigor híbrido Temos considerado a síntese das linhagens puras superiores para pesquisas e para a agricultura As linhagens puras são convenientes no sentido em que a propagação do genótipo de um ano para o outro é razoavelmente fácil Entretanto uma grande proporção de sementes comerciais que fazendeiros e jardineiros utilizam é denominada semente híbrida Curiosamente em muitos casos em que duas linhagens de plantas e animais discrepantes são unidas em um híbrido da F1 presumidamente heterozigoto o híbrido demonstra tamanho e vigor superiores aos das duas linhagens contribuintes Figura 36 Essa superioridade geral dos heterozigotos múltiplos é denominada vigor híbrido Os motivos moleculares para o vigor híbrido são em sua maior parte desconhecidos e ainda debatidos acaloradamente mas o fenômeno é inegável e realizou grandes contribuições para a agricultura Um aspecto negativo da utilização de híbridos é que a cada estação as duas linhagens parentais devem ser cultivadas em separado e em seguida devem ser entrecruzadas para a produção das sementes híbridas para a venda Esse processo é muito mais inconveniente do que a manutenção de linhagens puras que requer apenas o autocruzamento das plantas consequentemente a semente híbrida é mais cara do que a semente de linhagens puras FIGURA 36 Híbridos heterozigotos múltiplos ladeados por duas linhagens puras cultivadas para a sua produção A As plantas B Espigas das mesmas plantas A Foto cortesia de Jun Cao Schnable Laboratory Iowa State University B Deana NamuthCovert PhD Univ of Nebraska 33 A partir da perspectiva do usuário existe outro aspecto negativo da utilização de híbridos Após uma planta híbrida ter sido cultivada e produzida a sua safra para venda não é realista manter algumas das sementes que ela produz e esperar que as suas sementes sejam igualmente vigorosas no próximo ano O motivo é que quando o híbrido é submetido à meiose a distribuição independente dos diversos pares de genes misturados formará muitas combinações alélicas diferentes e muito poucas dessas combinações serão aquelas do híbrido original Por exemplo o tetrahíbrido descrito anteriormente quando autofecundado produz 81 genótipos diferentes dos quais apenas uma minoria será tetrahíbrida Se presumirmos a distribuição independente então em relação a cada par de genes a autofecundação produzirá metade de heterozigotos Aa AA Aa e aa Tendo em vista que existem quatro pares de genes nesse tetrahíbrido a proporção da progênie que provavelmente será como o híbrido original Aa Bb Cc Dd será de 124 116 CONCEITOCHAVE Alguns híbridos entre linhagens geneticamente diferentes demonstram vigor híbrido Entretanto a distribuição dos genes quando o híbrido é submetido à meiose rompe a combinação alélica favorável e assim poucos membros da próxima geração a apresentarão Base cromossômica da segregação independente Assim como a segregação igual a segregação independente de pares de genes em diferentes cromossomos é explicada pelo comportamento dos cromossomos durante a meiose Considere um cromossomo que podemos denominar número 1 seus dois homólogos podem ser denominados 1 e 1 Se os cromossomos se alinham no equador então 1 pode se dirigir para o norte e 1 para o sul ou viceversa De modo semelhante em relação a um cromossomo 2 com homólogos 2 e 2 2 pode se dirigir para o norte e 2 para o sul ou viceversa Portanto o cromossomo 1 pode acabar sendo empacotado com o cromossomo 2 ou 2 dependendo de quais cromossomos foram puxados na mesma direção A distribuição independente não é fácil de demonstrar por meio da observação da segregação cromossômica ao microscópio tendo em vista que homólogos tais como 1 e 1 normalmente não aparentam ser diferentes embora possam carregar uma pequena variação de sequência Entretanto a distribuição independente pode ser observada em determinados casos especializados Um caso foi crucial no desenvolvimento histórico da teoria cromossômica Em 1913 Elinor Carothers encontrou uma situação cromossômica incomum em uma determinada espécie de gafanhoto uma situação que possibilitou testar diretamente se os diferentes pares de cromossomos de fato segregam independentemente Estudando as meioses nos testículos de gafanhotos ela encontrou um gafanhoto no qual um par de cromossomos apresentava membros não idênticos Tal par é denominado heteromórfico Presumivelmente os cromossomos demonstram homologia apenas parcial Além disso o mesmo gafanhoto apresentava outro cromossomo não relacionado com o par heteromórfico que absolutamente não apresentava um parceiro de pareamento Carothers conseguiu utilizar esses cromossomos incomuns como marcadores citológicos visíveis do comportamento dos cromossomos durante a meiose Ela triou visualmente muitas meioses e observou que havia dois padrões distintos que estão demonstrados na Figura 37 Além disso ela observou que os dois padrões eram igualmente frequentes Em resumo se mantivermos a segregação do par heteromórfico constante em marrom na figura então o cromossomo não pareado roxo pode se dirigir para qualquer polo com frequência igual metade do tempo com a forma longa e metade do tempo com a forma curta Em outras palavras os conjuntos roxo e marrom segregaramse de maneira independente Embora esses obviamente não sejam cromossomos típicos os resultados sugerem fortemente que diferentes cromossomos distribuemse independentemente na primeira divisão da meiose Distribuição independente em organismos diploides A base cromossômica da lei de segregação independente está formalmente diagramada na Figura 38 que ilustra como o comportamento separado de dois pares de cromossomos diferentes dá origem às proporções mendelianas de 1111 dos tipos gaméticos esperados a partir da distribuição independente A célula hipotética apresenta quatro cromossomos um par de cromossomos homólogos longos amarelo e um par de cromossomos homólogos curtos azul O genótipo dos meiócitos é Aa Bb e os dois pares alélicos Aa e Bb estão demonstrados em dois pares de cromossomos diferentes As partes 4 e 4 da Figura 38 demonstram a etapachave na distribuição independente existem dois padrões de segregação alélica igualmente frequentes um demonstrado em 4 e o outro em 4 Em um caso os alelos AA e BB são puxados em conjunto para dentro de uma célula e os aa e bb são puxados para dentro da outra célula No outro caso os alelos AA e bb estão unidos na mesma célula e os alelos aa e BB também estão unidos na mesma célula Os dois padrões resultam de duas ligações ao fuso igualmente frequentes dos centrômeros na anáfase I Em seguida a meiose produz quatro células dos genótipos indicados de cada um desses padrões de segregação Tendo em vista que os padrões de segregação 4 e 4 são igualmente comuns as células do produto meiótico dos genótipos A B a b A b e a B são produzidos em frequências iguais Em outras palavras a frequência de cada um dos quatro genótipos é de 14 Essa distribuição gamética é aquela postulada por Mendel em relação a um dihíbrido e é aquela que inserimos ao longo de uma borda do quadrado de Punnett na Figura 34 A fusão aleatória desses gametas resulta na proporção fenotípica da F2 de 9331 FIGURA 37 Carothers observou estes dois padrões igualmente frequentes por meio dos quais um par heteromórfico marrom e um cromossomo não pareado roxo se movimentam para os gametas na meiose A distribuição independente dos cromossomos na meiose explica a proporção de Mendel FIGURA 38 Meiose em uma célula diploide do genótipo Aa Bb O diagrama demonstra como a segregação e a distribuição dos diferentes pares de cromossomos dão origem à proporção gamética mendeliana de 1111 Segregação independente em organismos haploides Nos fungos ascomicetos de fato podemos inspecionar os produtos de um único meiócito para demonstrar diretamente a distribuição independente Utilizemos o fungo filamentoso Neurospora crassa para ilustrar esse ponto ver Organismo modelo adiante Conforme observamos a partir dos exemplos anteriores de fungos um cruzamento em Neurospora é realizado por meio da mistura de duas linhagens haploides parentais de tipo reprodutivo oposto De modo similar àquele da levedura o tipo reprodutivo é determinado por dois alelos de um gene nessa espécie denominados MATA e MATa O modo por meio do qual um cruzamento é realizado está demonstrado na Figura 39 Os produtos da meiose nos fungos são esporos sexuados Relembre que os ascomicetos que incluem Neurospora e Saccharomyces são únicos no sentido em que em relação a qualquer determinado meiócito os esporos são mantidos juntos em um saco membranoso denominado asco Portanto em relação a esses organismos os produtos de uma única meiose podem ser recuperados e testados No bolor laranja do pão Neurospora os fusos nucleares das meioses I e II não se sobrepõem dentro do asco com formato de charuto e assim os quatro produtos de um único meiócito se encontram em uma linha reta Figura 310 A Além disso em virtude de algum motivo não compreendido existe uma mitose pósmeiose que também não demonstra sobreposição do fuso Portanto a meiose e a mitose extra resultam em um asco linear que contém 8 ascósporos ou uma óctade Em um meiócito heterozigoto Aa se não houver crossings entre os genes e seu centrômero ver Capítulo 4 haverá então dois blocos adjacentes de ascósporos quatro de A e quatro de a Figura 310 B Agora podemos examinar um dihíbrido Façamos um cruzamento entre dois mutantes distintos que apresentam mutações em diferentes genes em diferentes cromossomos Ao presumir que os loci dos genes mutados estão muito próximos de seus respectivos centrômeros evitamos complicações em virtude do crossing over entre os loci e os centrômeros O primeiro mutante é albino a que contrasta com o tipo selvagem normal rosa a O segundo mutante é biscoito b que apresenta uma colônia muito compacta com formato semelhante a um biscoito que contrasta com a colônia plana e espalhada do tipo selvagem b Presumiremos que os dois mutantes são de tipo reprodutivo oposto Portanto o cruzamento é FIGURA 39 O ciclo de vida de Neurospora crassa o bolor laranja do pão A autofertilização não é possível nesta espécie existem dois tipos reprodutivos determinados pelos alelos A e a de um gene e qualquer um deles pode atuar como fêmea Um esporo assexuado de tipo reprodutivo oposto se funde com um filamento receptivo e um núcleo do esporo assexuado se difunde através do filamento até parearse com um núcleo feminino nas células O par A e a em seguida é submetido a mitoses sincronizadas finalmente se fundindo para formar meiócitos diploides a b a b A meiose linear de Neurospora FIGURA 310 Neurospora é um sistemamodelo ideal para o estudo da segregação alélica na meiose A Os quatro produtos da meiose tétrade são submetidos à mitose para produzir uma óctade Os produtos estão contidos dentro de um asco B Um meiócito Aa é submetido à meiose seguida pela mitose resultando em números iguais de produtos A e a e demonstrando o princípio da segregação igual Em virtude da ligação aleatória ao fuso os 8 tipos de óctades a seguir serão igualmente frequentes a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b 50 50 A frequência igual desses dois tipos é uma demonstração convincente da distribuição independente que ocorre em meiócitos individuais Segregação independente de combinações de genes autossômicos e ligados ao X O princípio da segregação independente é algo útil na análise dos genótipos que são heterozigotos em relação a ambos os genes autossômicos e ligados ao X Os autossomos e os cromossomos sexuais são movimentados independentemente por fibras do fuso ligadas aleatoriamente aos seus centrômeros justamente como com dois pares de autossomos diferentes São produzidas algumas proporções de di híbridos interessantes Vejamos um exemplo da Drosophila O cruzamento é entre uma fêmea com asas vestigiais autossômico recessivo vg e um macho com olhos brancos recessivo ligado ao X w Simbolicamente o cruzamento é vgvg wY A F1 será Fêmeas de genótipo vg w Machos de genótipo vg Y Essas moscas da F1 têm de ser intercruzadas para a obtenção de uma F2 Tendo em vista que o cruzamento é um cruzamento monohíbrido em relação ao gene autossômico vestigial ambos os sexos da F2 demonstrarão Em relação ao gene dos olhos brancos ligado ao X as proporções serão como segue Se os genes autossômicos e ligados ao X forem combinados as proporções fenotípicas da F2 serão Portanto observamos uma proporção da progênie que revela elementos claros de ambas as heranças autossômica e ligada ao X Recombinação A distribuição independente dos genes na meiose é um dos principais modos por meio dos quais um organismo produz novas combinações de alelos A produção de novas combinações de alelos é formalmente denominada recombinação Existe uma concordância geral de que a vantagem evolutiva da produção de novas combinações de alelos é que ela produz variação como a matériaprima para a seleção natural A recombinação é um princípio crucial em genética em parte em virtude da sua relevância para a evolução mas também em virtude de sua utilização na análise genética Ela é particularmente útil para a análise dos padrões de herança de genótipos multigênicos Nesta seção definiremos a recombinação de tal modo que possamos reconhecêla em resultados experimentais e mostramos o modo como a recombinação é analisada e interpretada ORGANISMOMODELO Neurospora Neurospora crassa foi um dos primeiros microrganismos eucarióticos a ser adotado pelos geneticistas como um organismomodelo É um fungo haploide n 7 que pode ser observado crescendo na vegetação morta em muitas partes do mundo Quando um esporo assexuado haploide germina ele produz uma estrutura tubular que se estende rapidamente por meio do crescimento das extremidades e que origina diversos ramos laterais O resultado é uma massa de filamentos ramificados denominados hifas que constituem uma colônia As hifas não apresentam paredes cruzadas de modo que uma colônia é essencialmente uma célula que contém muitos núcleos haploides De uma colônia brotam milhões de esporos assexuados que conseguem se dispersar e repetir o ciclo assexuado As colônias assexuadas são mantidas facilmente e de modo não dispendioso em laboratório ou em meio definido de sais inorgânicos mais uma fonte de energia como açúcar Um gel inerte tal como ágar é adicionado para proporcionar uma superfície firme O fato de que Neurospora consegue sintetizar quimicamente todas as suas moléculas essenciais a partir de um referido meio simples levou os geneticistas bioquímicos com início com George Beadle e Edward Tatum ver Capítulo 6 a escolhêlo para os estudos das vias sintéticas Os geneticistas elaboraram as etapas nessas vias por meio da introdução de mutações e da observação de seus efeitos O estado haploide de Neurospora é ideal para a referida análise mutacional tendo em vista que os alelos mutantes são sempre expressos diretamente no fenótipo Neurospora apresenta dois tipos reprodutivos MATA e MATa que podem ser considerados como sexos simples Quando colônias de tipos reprodutivos diferentes entram em contato suas paredes celulares e seus núcleos se fundem resultando em muitos núcleos diploides temporários cada um dos quais sofre meiose Os quatro produtos haploides de uma meiose permanecem juntos em um saco denominado asco Cada um desses produtos da meiose é submetido a uma divisão mitótica adicional resultando em oito ascósporos dentro de cada asco Os ascósporos germinam e produzem colônias exatamente iguais àquelas produzidas pelos esporos assexuados Portanto os referidos fungos ascomicetos são ideais para o estudo da segregação e da recombinação dos genes em meioses individuais O fungo Neurospora crassa A Colônias laranja de Neurospora crescendo na canadeaçúcar Na natureza as colônias de Neurospora são observadas com mais frequência após incêndios que ativam os ascósporos dormentes Campos de canadeaçúcar são queimados para remover a folhagem antes da colheita dos caules da cana B Óctades de Neurospora em desenvolvimento a partir de um cruzamento do tipo selvagem com uma linhagem que carreia um alelo modificado da proteína fluorescente verde de águaviva fundido à histona As óctades demonstram a segregação mendeliana esperada de 44 da fluorescência Em alguns esporos o núcleo foi dividido mitoticamente para formar dois finalmente cada esporo conterá diversos núcleos A David J Jacobson PhD B Namboori B Raju Stanford University A recombinação é observada em uma diversidade de situações biológicas mas por enquanto a definimos em relação à meiose Recombinação meiótica é qualquer processo meiótico que gera um produto haploide com novas combinações dos alelos carreados pelos genótipos haploides que se uniram para formar o meiócito A definição aparentemente prolixa é realmente bastante simples ela demonstra o importante ponto de que detectamos a recombinação por meio da comparação das entradas na meiose com as saídas Figura 311 As entradas são os dois genótipos haploides que se combinam para formar o meiócito a célula diploide que sofre meiose Em relação aos seres humanos as entradas são o ovócito e o espermatozoide parentais Eles se unem para formar um zigoto diploide que se divide para produzir todas as células corporais incluindo os meiócitos que são armazenados dentro das gônadas Os genótipos de saída são os produtos haploides da meiose Em seres humanos esses produtos haploides são os ovócitos ou os espermatozoides da própria pessoa Qualquer produto meiótico que apresente uma nova combinação dos alelos fornecidos por meio dos dois genótipos da entrada por definição é um recombinante FIGURA 311 Os recombinantes azuis são aqueles produtos da meiose com combinações alélicas diferentes daquelas das células haploides que formaram o diploide meiótico amarelas Observe que os genes Aa e Bb estão demonstrados em separado por um ponto tendo em vista que podem estar no mesmo cromossomo ou em cromossomos diferentes CONCEITOCHAVE A meiose gera recombinantes que são produtos meióticos haploides com novas combinações dos alelos carreados pelos genótipos haploides que se uniram para formar o meiócito Primeiramente vejamos como os recombinantes são detectados experimentalmente A detecção dos recombinantes em organismos com ciclos de vida haploides tais como fungos ou algas é direta Os tipos de entrada e saída em ciclos de vida haploides são os genótipos dos indivíduos em vez dos gametas e portanto podem ser inferidos diretamente a partir dos fenótipos A Figura 311 pode ser considerada como um resumo da simples detecção de recombinantes em organismos com ciclos de vida haploides A detecção de recombinantes em organismos com ciclos de vida diploides é mais complicada Os tipos de entrada e saída em ciclos diploides são os gametas Portanto precisamos conhecer os genótipos de ambos os gametas de entrada e saída para detectar os recombinantes com um ciclo diploide Embora não possamos detectar os genótipos dos gametas de entrada ou saída diretamente podemos inferir esses genótipos por meio da utilização das técnicas adequadas Para conhecer os gametas de entrada utilizamos genitores diploides puros tendo em vista que eles podem produzir apenas um tipo gamético Para detectar os gametas de saída recombinantes realizamos o cruzamento teste do indivíduo diploide e observamos a sua progênie Figura 312 Uma descendência de um cruzamentoteste que surge de um produto recombinante da meiose também é denominada recombinante Observe novamente que o cruzamentoteste possibilita que nos concentremos em uma meiose e evita a ambiguidade A partir da autofecundação da F1 na Figura 312 por exemplo uma descendência recombinante AA Bb não poderia ser diferenciada de AA BB sem cruzamentos adicionais Uma parte central da análise da recombinação é a frequência de recombinantes Um motivo para enfocar na frequência de recombinantes é que seu valor numérico é um teste conveniente para saber se dois genes estão em cromossomos diferentes Os recombinantes são produzidos por meio de dois processos celulares diferentes a distribuição independente dos genes em cromossomos diferentes neste capítulo e o crossing over entre genes no mesmo cromossomo ver Capítulo 4 A proporção de recombinantes é uma ideiachave aqui tendo em vista que o valor diagnóstico pode nos informar se os genes estão em cromossomos diferentes Aqui lidaremos com a distribuição independente FIGURA 312 Os produtos recombinantes de uma meiose diploide são na maior parte prontamente detectados em um cruzamento de um heterozigoto e um testador recessivo Observe que a Figura 311 é repetida como parte deste diagrama Em relação aos genes em cromossomos separados os recombinantes são produzidos por meio da distribuição independente conforme demonstrado na Figura 313 Novamente observamos a proporção de 1111 que observamos anteriormente mas agora a progênie do cruzamentoteste é classificada como recombinante ou semelhante aos tipos de entrada P parental Estabelecida desse modo a proporção de recombinantes é claramente ou 50 da progênie total Portanto observamos que a distribuição independente na meiose produz uma frequência de recombinantes de 50 Se observarmos uma frequência de recombinantes de 50 em um cruzamentoteste podemos inferir que os dois genes em estudo se distribuem independentemente A interpretação mais simples e mais provável da distribuição independente é que os dois genes estão em pares de cromossomos separados Entretanto devemos observar que genes que estão muito distantes no mesmo par de cromossomos podem virtualmente ser distribuídos independentemente e produzir o mesmo resultado ver Capítulo 4 34 CONCEITOCHAVE Uma frequência de recombinantes de 50 indica que os genes são distribuídos independentemente e que mais provavelmente estão em cromossomos diferentes Herança poligênica Até agora a nossa análise neste livro enfocou diferenças monogênicas com a utilização de fenótipos nitidamente contrastantes tais como pétalas vermelhas versus brancas sementes lisas versus rugosas e Drosophila com asas longas versus vestigiais Entretanto uma grande parte da variação observada na natureza é contínua na qual um fenótipo pode assumir qualquer valor mensurável entre dois extremos Estatura peso e intensidade da cor são exemplos dos referidos fenótipos métricos ou quantitativos Em geral quando o valor métrico é plotado contra a frequência em uma população natural a curva de distribuição apresenta um formato semelhante a um sino Figura 314 O formato de sino ocorre em virtude de os valores médios na parte intermediária serem os mais comuns enquanto os valores extremos são raros Primeiramente é difícil observar como as distribuições contínuas podem ser influenciadas por genes herdados de modo mendeliano Afinal toda análise mendeliana é facilitada por meio da utilização de categorias claramente distinguíveis Entretanto veremos nesta seção que a distribuição independente de diversos a muitos genes heterozigotos que afetam um traço contínuo pode produzir uma curva em sino FIGURA 313 Este diagrama demonstra dois pares de cromossomos de um organismo diploide com A e a em um par e B e b no outro A segregação independente produz uma frequência de recombinantes de 50 Observe que poderíamos representar a situação haploide por meio da remoção das gerações parentais P e do testador É claro que muitos casos de variação contínua apresentam uma base puramente ambiental pouco afetada pela genética Por exemplo uma população de plantas geneticamente homozigotas cultivadas em uma área de terreno com frequência demonstra uma curva sinusoidal em relação à altura com as plantas menores ao redor das extremidades do gráfico e as plantas maiores na parte intermediária Essa variação pode ser explicada apenas por fatores ambientais tais como umidade e quantidade de fertilizante aplicada Entretanto muitos casos de variação contínua apresentam uma base genética A cor da pele humana é um exemplo todos os graus de cor escura da pele podem ser observados em populações de diferentes partes do mundo e essa variação claramente apresenta um componente genético Nos referidos casos diversos a muitos alelos interagem com um efeito mais ou menos aditivo Os genes que interagem subjacentes à variação contínua hereditária são denominados poligenes ou loci de traço quantitativo QTL O termo locus de traço quantitativo requer uma definição quantitativo é mais ou menos sinônimo de contínuo traço é mais ou menos sinônimo de característica ou propriedade locus que literalmente significa local em um cromossomo é mais ou menos sinônimo de gene Os poligenes ou QTL em relação ao mesmo traço estão distribuídos por todo o genoma em muitos casos estão em cromossomos diferentes e demonstram distribuição independente FIGURA 314 Em uma população um caractere métrico tal como a intensidade da cor pode assumir muitos valores Portanto a distribuição ocorre na forma de uma curva uniforme com os valores mais comuns representando o ponto alto da curva Se a curva for simétrica ela tem o formato de um sino conforme demonstrado Vejamos como a herança de diferentes poligenes heterozigotos até mesmo dois pode gerar uma curva de distribuição sinusoidal Podemos considerar um modelo simples que foi utilizado originalmente para explicar a variação contínua no grau de vermelhidão em sementes de trigo O trabalho foi realizado por Hermann NilssonEhle no início do século 20 Presumiremos dois pares de genes que se distribuem independentemente R1r1 e R2r2 Ambos R1 e R2 contribuem para a vermelhidão da semente do trigo Cada dose de um alelo R em cada gene é aditiva o que significa que ela aumenta o grau de vermelhidão de modo proporcional Um cruzamento ilustrativo é a autofecundação de um dihíbrido R1r1 R2r2 Ambos os gametas masculino e feminino demonstrarão proporções genotípicas como segue R1 R2 2 doses de vermelho R1 r2 1 dose de vermelho r1 R2 1 dose de vermelho r1 r2 0 dose de vermelho Em geral nessa população de gametas um quarto apresenta duas doses metade apresenta uma dose e um quarto apresenta zero dose A união de ambos os gametas masculino e feminino que demonstra esse arranjo de doses de R está ilustrada na Figura 315 A quantidade de doses na progênie varia de quatro R1R1 R2R2 a zero r1r1 r2r2 com todos os valores entre elas As proporções na grade da Figura 315 podem ser desenhadas como um histograma conforme demonstrado na Figura 316 O formato do histograma pode ser considerado como um arcabouço que pode ser o fundamento de base para a curva de distribuição sinusoidal Quando essa análise da vermelhidão nas sementes de trigo foi originalmente realizada foi observada uma variação dentro das classes que alegadamente representavam um nível de dose de poligene Presumivelmente essa variação dentro de uma classe é o resultado de diferenças ambientais Portanto podese considerar que o ambiente contribui de um modo que arredonda as extremidades afiladas do histograma de barras resultando em uma curva suave com formato de sino a linha vermelha no histograma Se o número de poligenes for aumentado o histograma aproximase mais de uma suave distribuição contínua Por exemplo em relação a uma característica determinada por três poligenes o histograma é conforme demonstrado na Figura 317 Em nossa ilustração utilizamos um autocruzamento dihíbrido para demonstrar como o histograma é produzido Mas como o nosso exemplo é relevante para o que está ocorrendo em populações naturais Afinal nem todos os cruzamentos podem ser desse tipo Não obstante se os alelos em cada par de genes forem aproximadamente iguais em frequência na população p ex R1 é quase tão comum quanto r1 então pode ser dito que o cruzamento dihíbrido representa um cruzamento médio em relação a uma população na qual dois poligenes estão segregando FIGURA 315 A progênie de um autocruzamento dihíbrido em relação a dois poligenes pode ser expressa como quantidades de doses alélicas aditivas FIGURA 316 A progênie demonstrada na Figura 315 pode ser representada como um histograma de frequência de alelos poligênicos contribuintes doses FIGURA 317 A progênie de um trihíbrido poligênico pode ser representada por um gráfico de histograma de frequência de alelos poligênicos contribuintes doses A identificação de poligenes e a compreensão sobre como eles atuam e interagem são desafios importantes para os geneticistas no século 21 A identificação de poligenes será especialmente importante na medicina Acredita se que muitas doenças humanas comuns tais como a aterosclerose e a hipertensão apresentem um componente poligênico Nesse caso uma total compreensão sobre essas condições que afetam grandes proporções de populações humanas requer uma compreensão sobre esses poligenes sua herança e função Atualmente diversas abordagens moleculares podem ser aplicadas à tarefa de encontrar poligenes Consideraremos algumas nos capítulos subsequentes Observe que os poligenes não são considerados uma classe funcional especial de genes Eles são identificados como um grupo apenas no sentido em que apresentam alelos que contribuem para a variação contínua 35 CONCEITOCHAVE A variação e a distribuição dos poligenes pode contribuir para a variação contínua em uma população Genes de organelas Herança independente do núcleo Até agora consideramos como os genes nucleares se distribuem independentemente em virtude de seus loci em diferentes cromossomos Entretanto embora o núcleo contenha a maior parte dos genes de um organismo eucariótico um subconjunto distinto e especializado do genoma é encontrado nas mitocôndrias e em plantas também nos cloroplastos Esses subconjuntos são herdados independentemente do genoma nuclear e assim constituem um caso especial de herança independente por vezes denominada herança extranuclear As mitocôndrias e os cloroplastos são organelas especializadas localizadas no citoplasma Elas contêm pequenos cromossomos circulares que carreiam um subconjunto definido do genoma celular total Os genes mitocondriais estão relacionados com a tarefa de produção de energia da mitocôndria enquanto os genes dos cloroplastos são necessários para que o cloroplasto realize a sua função de fotossíntese Entretanto nenhuma organela é funcionalmente autônoma tendo em vista que cada uma delas depende em grande parte dos genes nucleares para a sua função O motivo pelo qual alguns dos genes necessários estão nas próprias organelas e outros estão no núcleo ainda é algo misterioso que não será abordado aqui Outra peculiaridade dos genes das organelas é a grande quantidade de cópias presentes em uma célula Cada organela tem muitas cópias por célula e além disso cada organela contém muitas cópias do seu cromossomo Portanto cada célula pode conter centenas ou milhares de cromossomos de organelas Considere os cloroplastos por exemplo qualquer célula verde de uma planta apresenta muitos cloroplastos e cada cloroplasto contém muitas moléculas idênticas de DNA circular os assim denominados cromossomos de cloroplasto Portanto o número de cromossomos de cloroplasto por célula pode ser da ordem de milhares e o número pode até mesmo variar um pouco de célula para célula O DNA por vezes é observado acondicionado em estruturas suborganelares denominadas nucleoides que se tornam visíveis se usado um corante de ligação ao DNA Figura 318 O DNA encontrase dobrado dentro do nucleoide mas não apresenta o tipo de helicoidização associada às histonas demonstrado pelos cromossomos nucleares O mesmo arranjo é verdadeiro em relação ao DNA nas mitocôndrias Por enquanto presumiremos que todas as cópias de um cromossomo de organela dentro de uma célula são idênticas mas posteriormente precisaremos relaxar essa presunção FIGURA 318 Coloração fluorescente de uma célula de Euglena gracilis Com os corantes utilizados o núcleo aparece em vermelho em virtude da fluorescência de grandes quantidades de DNA nuclear As mitocôndrias fluorescem em verde e dentro das mitocôndrias as concentrações de DNA mitocondrial nucleoides fluorescem em amarelo De Y Hayashi e K Ueda The shape of mitochondria and the number of mitochondrial nucleoids during the cell cycle of Euglena gracilis J Cell Sci 93 1989 565 Foto por The Company of Biologists Ltd Muitos cromossomos de organelas atualmente foram sequenciados Exemplos de tamanho e espaçamento relativo dos genes no DNA mitocondrial mtDNA e no DNA de cloroplasto cpDNA estão demonstrados na Figura 319 Os genes de organelas estão espaçados de modo muito próximo e em alguns organismos os genes de organelas podem conter segmentos não traduzidos denominados íntrons Observe como a maior parte dos genes está relacionada com as reações químicas que ocorrem dentro da própria organela a fotossíntese em cloroplastos e a fosforilação oxidativa em mitocôndrias Padrões de herança em organelas Os genes de organelas demonstram seu próprio modo de herança especial denominado herança uniparental a progênie herda os genes de organelas exclusivamente de um dos genitores mas não do outro Na maior parte dos casos o genitor é a mãe um padrão denominado herança materna Por que apenas a mãe A resposta encontrase no fato de que os cromossomos de organelas estão localizados no citoplasma e os gametas masculino e feminino não contribuem com o citoplasma igualmente para o zigoto No que diz respeito aos genes nucleares ambos os genitores contribuem igualmente para o zigoto Entretanto o ovócito contribui com a maior parte do citoplasma enquanto o espermatozoide quase não contribui Portanto tendo em vista que as organelas estão localizadas no citoplasma a genitora contribui com as organelas juntamente com o citoplasma e essencialmente nenhum DNA de organela no zigoto é do genitor Algumas variantes fenotípicas são causadas por um alelo mutante de um gene de organela e podemos utilizar esses mutantes para seguir os padrões da herança de organelas Presumiremos temporariamente que o alelo mutante está presente em todas as cópias do cromossomo da organela uma situação que de fato é observada com frequência Em um cruzamento o fenótipo variante será transmitido para a progênie se a variante utilizada for a genitora mas não se for o genitor Portanto em geral a herança citoplasmática demonstra o padrão a seguir Fêmea mutante Macho do tipo selvagem Toda a progênie mutante Fêmea do tipo selvagem Macho mutante Toda a progênie do tipo selvagem De fato esse padrão de herança é diagnóstico da herança de organelas nos casos em que a localização genômica de um alelo mutante não é conhecida FIGURA 319 Mapas de DNA em relação a mitocôndrias e cloroplastos Muitos dos genes de organelas codificam proteínas que realizam as funções de produção de energia destas organelas verdes enquanto outros vermelhos e laranja atuam na síntese proteica A Mapas de mtDNA de levedura e humano Observe que o mapa humano não está desenhado na mesma escala que o mapa de levedura B O genoma de cloroplasto de 121 kb da planta Marchantia polymorpha Os genes demonstrados no mapa estão transcritos em sentido horário e os do lado de fora estão transcritos em sentido antihorário IRA e IRB indicam repetições invertidas O desenho superior no centro do mapa ilustra uma planta Marchantia do sexo masculino o desenho inferior ilustra uma planta do sexo feminino Dados de K Umesono e H Ozeki Trends Genet 3 1987 A herança materna pode ser claramente demonstrada em determinados mutantes de fungos Por exemplo no fungo Neurospora um mutante denominado poky apresenta um fenótipo de crescimento lento Podese cruzar Neurospora de tal modo que um genitor atue como a genitora materna contribuindo com o citoplasma ver Figura 39 Os resultados dos cruzamentos recíprocos a seguir sugerem que o gene mutante está localizado nas mitocôndrias os fungos não apresentam cloroplastos Fêmea poky Macho do tipo selvagem Toda a progênie poky Fêmea do tipo selvagem Macho poky Toda a progênie do tipo selvagem O sequenciamento demonstrou que o fenótipo poky é causado por uma mutação de um gene de RNA ribossômico no mtDNA A sua herança está demonstrada diagramaticamente na Figura 320 O cruzamento inclui uma diferença alélica ad e ad em um gene nuclear adicional ao poky observe como a herança mendeliana do gene nuclear é independente da herança materna do fenótipo poky CONCEITOCHAVE Os fenótipos variantes causados por mutações no DNA de organelas citoplasmáticas em geral são herdados de modo materno e independente dos padrões mendelianos demonstrados pelos genes nucleares Segregação citoplasmática Em alguns casos as células contêm misturas de organelas mutantes e normais Essas células são denominadas cytohets ou heteroplasmons Nessas misturas pode ser detectado um tipo de segregação citoplasmática no qual os próprios dois tipos se distribuem em diferentes célulasfilhas O processo muito provavelmente tem origem na divisão aleatória das organelas múltiplas durante a divisão celular As plantas fornecem um bom exemplo Muitos casos de folhas brancas são causados por mutações nos genes dos cloroplastos que controlam a produção e a deposição do pigmento verde clorofila Tendo em vista que a clorofila é necessária para que uma planta viva esse tipo de mutação é letal e as plantas com folhas brancas não podem ser obtidas para cruzamentos experimentais Entretanto algumas plantas são variegadas contendo manchas verdes e brancas e essas plantas são viáveis Portanto as plantas variegadas proporcionam um modo para demonstrar a segregação citoplasmática FIGURA 320 Cruzamentos recíprocos de Neurospora poky e do tipo selvagem produzem resultados diferentes tendo em vista que um genitor diferente contribui com o citoplasma A genitora contribui com a maior parte do citoplasma das células da progênie O sombreamento em marrom representa o citoplasma com mitocôndrias que contêm a mutação poky e o sombreamento em verde representa o citoplasma com mitocôndrias do tipo selvagem Observe que toda a progênie na parte A é poky enquanto toda a progênie na parte B é normal Portanto ambos os cruzamentos demonstram herança materna O gene nuclear com os alelos ad preto e ad vermelho é utilizado para ilustrar a segregação dos genes nucleares na proporção mendeliana de 11 esperada para este organismo haploide A planta maravilha na Figura 321 exibe um fenótipo comumente observado de folhas e ramos variegados que demonstra a herança de um alelo mutante de um gene de cloroplasto O alelo mutante faz com que os cloroplastos sejam brancos por sua vez a cor dos cloroplastos determina a cor das células e portanto a cor dos ramos compostos por aquelas células Os ramos variegados são mosaicos de células todas verdes e todas brancas As flores podem se desenvolver em ramos verdes brancos ou variegados e os genes de cloroplasto nas células de uma flor são aqueles do ramo no qual ela cresce Portanto em um cruzamento Figura 322 o gameta materno dentro da flor o ovócito determina a cor das folhas e dos ramos das plantas da progênie Por exemplo se um ovócito for de uma flor em um ramo verde toda a progênie será verde independentemente da origem do pólen Um ramo branco apresentará cloroplastos brancos e as plantas da progênie resultantes serão brancas Em virtude da letalidade os descendentes brancos não viveriam além do estágio de muda Os zigotos variegados parte inferior da Figura 322 demonstram segregação citoplasmática Essa progênie variegada tem origem em ovócitos que são cytohets Curiosamente quando um referido zigoto se divide os cloroplastos brancos e verdes com frequência segregam ou seja eles próprios se dividem em células separadas produzindo os setores verdes e brancos distintos que causam a variegação nos ramos Portanto aqui está uma demonstração direta da segregação citoplasmática Tendo em vista que uma célula é uma população de moléculas de organelas como é possível a obtenção de uma célula mutante pura que contém apenas cromossomos mutantes Muito provavelmente mutantes puros são criados em células assexuadas como segue As variantes surgem por mutação de um único gene em um único cromossomo Em seguida em alguns casos o cromossomo que contém a mutação apresenta aumento aleatório da frequência na população dentro da célula Esse processo é denominado deriva genética aleatória Uma célula que é um cytohet pode apresentar digamos 60 de cromossomos A e 40 de cromossomos a Quando essa célula se divide por vezes todos os cromossomos A dirigemse para uma célulafilha e todos os cromossomos a para a outra novamente ao acaso Com mais frequência essa separação requer diversas gerações subsequentes de divisão celular para ser completada Figura 323 Portanto como resultado desses eventos ao acaso ambos os alelos são expressos em diferentes célulasfilhas e essa separação continuará nos descendentes dessas células Observe que a segregação citoplasmática não é um processo mitótico ela ocorre na divisão das células assexuadas mas não está relacionada com a mitose Em cloroplastos a segregação citoplasmática é um mecanismo comum para a produção de plantas variegadas verdes e brancas conforme já mencionado Em mutantes de fungos tal como o mutante poky de Neurospora a mutação original em uma molécula de mtDNA necessariamente acumulou e sofreu segregação citoplasmática para produzir a linhagem que expressa os sintomas poky FIGURA 321 Variegação das folhas na Mirabilis jalapa a planta maravilha As flores podem se formar em qualquer ramo variegado verde ou branco e ser utilizadas em cruzamentos FIGURA 322 Os resultados dos cruzamentos da Mirabilis jalapa podem ser explicados pela herança autônoma dos cloroplastos As esferas grandes e escuras representam os núcleos Os corpos menores representam os cloroplastos sejam verdes ou brancos Presumese que cada ovócito contenha muitos cloroplastos e presumese que cada célula de pólen não contenha cloroplastos Os primeiros dois cruzamentos exibem herança materna estrita Entretanto se o ramo materno for variegado podem resultar três tipos de zigotos dependendo de o ovócito conter apenas cloroplastos brancos apenas verdes ou ambos verdes e brancos No último caso o zigoto resultante pode produzir ambos os tecidos verde e branco e assim resulta uma planta variegada 1 2 3 CONCEITOCHAVE As populações de organelas que contêm misturas de dois cromossomos geneticamente distintos com frequência demonstram segregação dos dois tipos nas célulasfilhas na divisão celular Esse processo é denominado segregação citoplasmática Em determinados sistemas especiais tal como em fungos e em algas foram obtidos cytohets que são dihíbridos digamos AB em um cromossomo de organela e ab em outro Nos referidos casos podem ocorrer processos raros semelhantes ao crossing mas tal ocorrência tem de ser considerada um fenômeno genético menor CONCEITOCHAVE Alelos em cromossomos de organelas Em cruzamentos sexuados são herdados de apenas um genitor em geral do sexo feminino e portanto não demonstram proporções de segregação do tipo nuclear que os genes nucleares demonstram Em células assexuadas podem demonstrar segregação citoplasmática Em células assexuadas ocasionalmente há processos análogos ao crossing over Mutações citoplasmáticas em humanos Existem mutações citoplasmáticas em humanos Alguns heredogramas humanos demonstram a transmissão de distúrbios raros apenas por meio das mulheres e nunca por meio dos homens Esse padrão sugere fortemente a herança citoplasmática e aponta para uma mutação no mtDNA como o motivo para o fenótipo A doença MERFF epilepsia mioclônica com fibras vermelhas rotas é um referido fenótipo que resulta de uma alteração de uma base no mtDNA É uma doença que afeta os músculos mas os sintomas também incluem distúrbios oculares e auditivos Outro exemplo é a síndrome de KearnsSayre uma constelação de sintomas que afeta olhos coração músculos e cérebro que é causada pela perda de parte do mtDNA Em alguns desses casos as células de uma pessoa afetada contêm misturas de cromossomos normais e mutantes e as proporções de cada um que são transmitidas para a progênie podem variar conforme resultado da segregação citoplasmática As proporções em uma pessoa também podem variar em diferentes tecidos ou ao longo do tempo O acúmulo de determinados tipos de mutações mitocondriais ao longo do tempo tem sido proposto como uma possível causa de envelhecimento FIGURA 323 Ao acaso organelas geneticamente distintas podem segregar para células separadas em diversas divisões celulares sucessivas Os pontos vermelhos e azuis representam organelas geneticamente distinguíveis tais como mitocôndrias com e sem uma mutação A Figura 324 demonstra algumas das mutações em genes mitocondriais humanos que podem levar à doença quando por meio de deriva aleatória e segregação citoplasmática aumentam em frequência até uma tal medida que a função celular é comprometida A herança de uma doença mitocondrial humana está demonstrada na Figura 325 Observe que a condição sempre é transmitida para a descendência pelas mães e nunca pelos pais Ocasionalmente a mãe terá um filho não afetado não demonstrado provavelmente em virtude da segregação citoplasmática no tecido que forma o gameta FIGURA 324 Este mapa do mtDNA humano demonstra loci de mutações que levam a citopatias Os genes de RNA transportador estão representados por abreviações de aminoácidos de letra única ND NADH desidrogenase COX Citocromo C oxidase e 12S e 16S fazem referência aos RNA ribossômicos Dados de S DiMauro et al Mitochondria in Neuromuscular Disorders Biochim Biophys Acta 1366 1998 199 210 FIGURA 325 Este heredograma demonstra que uma doença mitocondrial humana é herdada apenas da mãe mtDNA em estudos evolutivos As diferenças e as semelhanças das sequências de mtDNA homólogas entre as espécies foram utilizadas extensivamente para construir árvores evolutivas Além disso foi possível introduzir alguns organismos extintos em árvores evolutivas com a utilização de sequências de mtDNA obtidas dos remanescentes de organismos extintos tais como peles e ossos em museus O mtDNA evolui relativamente rápido e assim essa abordagem tem sido mais útil no traçado da evolução recente tal como a evolução de humanos e outros primatas Um achado chave é que a raiz da árvore do mtDNA humano está na África sugerindo que o Homo sapiens teve origem na África e a partir de lá se dispersou por todo o mundo ver Capítulo 18 RESUMO A pesquisa genética e o cultivo de plantas e a criação de animais com frequência necessitam da síntese de genótipos que são combinações complexas de alelos de diferentes genes Os referidos genes podem estar no mesmo cromossomo ou em cromossomos diferentes o último é o assunto principal deste capítulo No caso mais simples um dihíbrido em relação ao qual os dois pares de genes estão em pares de cromossomos diferentes cada par de genes demonstra segregação igual na meiose conforme previsto pela primeira lei de Mendel Tendo em vista que no núcleo as fibras do fuso se ligam aleatoriamente aos centrômeros na meiose os dois pares de genes são separados independentemente dentro dos produtos meióticos Esse princípio de segregação independente é denominado segunda lei de Mendel tendo em vista que Mendel foi o primeiro a observálo A partir de um dihíbrido Aa Bb são produzidos quatro genótipos de produtos meióticos A B A b a B e a b todos a uma frequência igual de 25 cada Portanto em um cruzamentoteste de um dihíbrido com um recessivo duplo as proporções fenotípicas da progênie também são de 25 uma proporção de 1111 Se um referido dihíbrido é autofecundado as classes fenotípicas na progênie são A B A bb aa B e aa bb As proporções de 1111 e 9331 são ambas diagnósticas da segregação independente Genótipos mais complexos compostos por genes de distribuição independente podem ser tratados como extensões do caso de segregação monogênica As proporções genotípicas fenotípicas ou gaméticas em geral são calculadas por meio da aplicação da regra do produto ou seja por meio da multiplicação das proporções relevantes de genes individuais A probabilidade de ocorrência de qualquer uma das diversas categorias da progênie é calculada por meio da aplicação da regra da soma ou seja por meio da adição de suas probabilidades individuais No tipo mnemônico a regra do produto lida com A E B enquanto a regra da soma lida com A OU A O teste do χ² pode ser utilizado para testar se as proporções observadas das classes na análise genética estão conforme as expectativas de uma hipótese genética tal como uma hipótese de herança monogênica ou digênica Se um valor de probabilidade inferior a 5 for calculado a hipótese tem de ser rejeitada Gerações sequenciais de autocruzamento aumentam as proporções de homozigotos de acordo com os princípios da segregação igual e da segregação independente se os genes estiverem em cromossomos diferentes Portanto o autocruzamento é utilizado para criar linhagens puras complexas com combinações de mutações desejáveis A distribuição independente dos cromossomos na meiose pode ser observada citologicamente por meio da utilização de pares de cromossomos heteromórficos aqueles que demonstram uma diferença estrutural Os cromossomos X e Y são um referido caso mas outros casos mais raros podem ser observados e utilizados para essa demonstração A distribuição independente dos genes no nível de meiócitos únicos pode ser observada nos fungos ascomicetos tendo em vista que os ascos demonstram os dois tipos alternativos de segregações em frequências iguais Uma das principais funções da meiose é produzir recombinantes novas combinações de alelos dos genótipos haploides que se uniram para formar o meiócito A distribuição independente é a principal fonte de recombinantes Em um cruzamentoteste de dihíbridos que demonstra distribuição independente a frequência de recombinantes será de 50 Características métricas tais como a intensidade da cor demonstram uma distribuição contínua em uma população Distribuições contínuas podem ter por base uma variação ambiental alelos variantes de genes múltiplos ou uma combinação de ambos Um modelo genético simples propõe que alelos ativos de diversos genes denominados poligenes contribuem de modo mais ou menos aditivo para o caractere métrico Em uma análise da progênie a partir do autocruzamento de um indivíduo multiplamente heterozigoto o histograma que demonstra a proporção de cada fenótipo se aproxima de uma curva sinusoidal típica da variação contínua Os pequenos subconjuntos do genoma observados em mitocôndrias e cloroplastos são herdados independentemente do genoma nuclear Mutantes nesses genes de organelas com frequência demonstram herança materna juntamente com o citoplasma que é a localização dessas organelas Em citoplasmas geneticamente mistos cytohets os dois genótipos digamos do tipo selvagem e mutante com frequência se separam em diferentes célulasfilhas por meio de um processo pouco compreendido denominado segregação citoplasmática A mutação mitocondrial em seres humanos resulta em doenças que demonstram segregação citoplasmática nos tecidos corporais e herança materna em um cruzamento TERMOSCHAVE cruzamento dihíbrido dihíbrido DNA de cloroplasto cpDNA DNA mitocondrial mtDNA herança materna herança uniparental lei da segregação independente segunda lei de Mendel locus de traço quantitativo QTL poligene locus de traço quantitativo recombinação recombinação meiótica recombinante regra da soma regra do produto segregação citoplasmática segregação distribuição independente teste do quiquadrado vigor híbrido PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 Duas moscas Drosophila que apresentavam asas normais transparentes e longas foram cruzadas Na progênie apareceram dois fenótipos novos asas pardas que apresentam um aspecto semiopaco e asas aparadas com extremidades quadradas A progênie foi como segue Fêmeas Machos 179 transparentes e longas 92 transparentes e longas 58 transparentes e aparadas 89 pardas e longas 28 transparentes e aparadas 31 pardas e aparadas a Forneça uma explicação cromossômica para esses resultados demonstrando os genótipos cromossômicos dos genitores e de todas as classes de progênie sob o seu modelo b Desenhe um teste para o seu modelo Solução a O primeiro passo é declarar quaisquer características interessantes dos dados A primeira característica surpreendente é o aparecimento de dois fenótipos novos Encontramos o fenômeno no Capítulo 2 onde ele foi explicado como alelos recessivos mascarados por seus correspondentes dominantes Assim primeiramente poderíamos supor que uma ou ambas as moscas genitoras apresentam alelos recessivos de dois genes diferentes Essa inferência é fortalecida pela observação de que parte da progênie expressa apenas um dos fenótipos novos Se os novos fenótipos sempre apareceram em conjunto podemos supor que o mesmo alelo recessivo determina ambos Entretanto a outra característica surpreendente dos dados que não conseguimos explicar por meio da utilização dos princípios mendelianos do Capítulo 2 é a diferença óbvia entre os sexos embora existam quantidades aproximadamente iguais de machos e fêmeas os machos se situam dentro de quatro classes fenotípicas mas as fêmeas constituem apenas duas Esse fato deve sugerir imediatamente algum tipo de herança ligada ao sexo Quando estudamos os dados observamos que os fenótipos longos e aparados estão se segregando em ambos machos e fêmeas mas apenas os machos apresentam o fenótipo pardo Essa observação sugere que a herança da transparência das asas difere da herança do formato das asas Primeiramente longas e aparadas são observadas a uma proporção de 31 em ambos machos e fêmeas Essa proporção pode ser explicada se ambos os genitores forem heterozigotos em relação a um gene autossômico podemos representálos como Ll em que L faz referência a longas e l faz referência a aparadas Tendo realizado essa análise parcial observamos que apenas a herança da transparência das asas está associada ao sexo A possibilidade mais óbvia é de que os alelos em relação a transparente D e parda d estejam no cromossomo X pois vimos no Capítulo 2 que a localização dos genes nesse cromossomo proporciona padrões de herança correlacionados com o sexo Se essa sugestão for verdadeira a fêmea genitora tem de ser aquela que porta o alelo d tendo em vista que se o macho apresentasse o d ele teria sido pardo sendo que nos é informado que ele apresentava asas transparentes Portanto a genitora do sexo feminino seria Dd e o macho D Vejamos se essa sugestão funciona se ela for verdadeira toda a progênie do sexo feminino herdaria o alelo D de seu pai e assim todas seriam aladas e transparentes conforme foi observado Metade dos filhos seria D transparentes e metade d pardas o que também foi observado Assim em geral podemos representar a genitora como Dd Ll e o genitor como D Ll Então a progênie seria b Em geral um bom modo de testar um referido modelo é realizar um cruzamento e prever o desfecho Mas qual cruzamento Devemos prever algum tipo de proporção na progênie e assim é importante realizar um cruzamento a partir do qual uma proporção fenotípica única possa ser esperada Observe que a utilização de uma descendente como genitora não atenderia as nossas necessidades não podemos dizer a partir da observação do fenótipo de quaisquer dessas fêmeas qual é o seu genótipo Uma fêmea com asas transparentes pode ser DD ou Dd e uma com asas longas pode ser LL ou Ll Seria bom cruzar a fêmea parental do cruzamento original com um filho pardo e aparado tendo em vista que os genótipos totais de ambos estão especificados sob o modelo que criamos De acordo com o nosso modelo esse cruzamento é Dd Ll d ll A partir desse cruzamento prevemos Problema resolvido 2 Considere três ervilhas amarelas e lisas rotuladas A B e C Cada uma foi cultivada até uma planta e cruzada com uma planta cultivada a partir de uma ervilha verde rugosa Exatamente 100 ervilhas originárias de cada cruzamento foram separadas em classes fenotípicas como segue A 51 amarelas e lisas 49 verdes e lisas B 100 amarelas e lisas C 24 amarelas e lisas 26 amarelas e rugosas 25 verdes e lisas 25 verdes e rugosas Quais eram os genótipos de A B e C Utilize símbolos gênicos de sua própria escolha assegurese de definir cada um deles Solução Observe que cada um dos cruzamentos é Amarela e lisa Verde e rugosa Progênie Tendo em vista que A B e C foram todas cruzadas com a mesma planta todas as diferenças entre as três populações de progênie têm de ser atribuíveis às diferenças nos genótipos subjacentes a A B e C Você pode relembrar muito a respeito dessas análises a partir do capítulo o que é bom mas vejamos quanto podemos deduzir a partir dos dados O que dizer a respeito da dominância O cruzamentochave para a dedução da dominância é B Aqui o padrão de herança é Amarela e lisa Verde e rugosa Todas amarelas e lisas Assim amarela e lisa têm de ser fenótipos dominantes tendo em vista que a dominância é literalmente definida pelo fenótipo de um híbrido Agora sabemos que o genitor verde e rugoso utilizado em cada cruzamento tem de ser totalmente recessivo temos uma situação muito conveniente tendo em vista que ela significa que cada cruzamento é um cruzamentoteste que em geral é o tipo de cruzamento mais informativo Voltando para a progênie de A observamos uma proporção de 11 em relação a amarelas e verdes Essa proporção é uma demonstração da primeira lei de Mendel segregação igual e demonstra que em relação à característica da cor o cruzamento foi obrigatoriamente heterozigoto homozigoto recessivo Deixando Y representar amarela e y representar verde temos Yy yy Yy amarelas yy verdes 1 Em relação ao formato tendo em vista que toda a progênie é lisa o cruzamento foi necessariamente homozigoto dominante homozigoto recessivo Deixando R representar lisas e r representar rugosas temos RR rr Rr lisas Combinando as duas características temos Yy RR yy rr Yy Rr yy Rr Agora o cruzamento B está claro e tem de ser YY RR yy rr Yy rr tendo em vista que qualquer heterozigosidade na ervilha B teria dado origem a diversos fenótipos na progênie não apenas um O que dizer sobre C Aqui observamos uma proporção de 50 amarelas50 verdes 11 e uma proporção de 49 lisas51 rugosas também 11 Assim ambos os genes na ervilha C são obrigatoriamente heterozigotos e o cruzamento C foi Yy Rr yy rr que é uma boa demonstração da segunda lei de Mendel distribuição independente de genes diferentes Como um geneticista teria analisado esses cruzamentos Basicamente do mesmo modo que acabamos de fazer porém com menos etapas de permeio Possivelmente algo como isto amarela e lisa dominante segregação monogênica em A B homozigoto dominante segregação independente de dois genes em C PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Com a utilização da Tabela 31 responda as questões a seguir a respeito 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 dos valores de probabilidade anteriormente a Se χ² for calculado como sendo 17 com 9 gl qual é o valor aproximado da probabilidade b Se χ² for 17 com 6 gl qual é o valor da probabilidade c Qual tendência regra você observa nos dois cálculos anteriores Inspecione a Figura 38 qual estágio meiótico é responsável por gerar a segunda lei de Mendel Na Figura 39 a identifique os núcleos diploides b identifique qual parte da figura ilustra a primeira lei de Mendel Inspecione a Figura 310 qual seria o desfecho na óctade se em raras ocasiões um núcleo da divisão mitótica pósmeiótica do núcleo 2 passasse para um núcleo da divisão mitótica pósmeiótica do núcleo 3 Como você poderia medir a frequência de um referido evento raro Na Figura 311 se os genótipos de entrada fossem a B e A b quais seriam os genótipos de cor azul Na progênie observada na Figura 313 quais são as origens dos cromossomos de cor azulescura azulclara e azul muito clara Na Figura 317 em qual barra do histograma o genótipo R1r1 R2R2 r3r3 seria encontrado Ao examinar a Figura 319 qual você acredita que seja o principal motivo para a diferença no tamanho do mtDNA de uma levedura e humano Na Figura 320 qual cor é utilizada para indicar o citoplasma que contém mitocôndrias do tipo selvagem Na Figura 321 quais seriam os tipos de folhas da progênie da flor apical parte superior A partir do heredograma na Figura 325 qual princípio você pode deduzir a respeito da herança da doença mitocondrial a partir dos pais afetados 12 13 14 15 PROBLEMAS BÁSICOS Presuma que ocorre segregação independente e inicie com uma planta que é dihíbrida Aa Bb a Que proporção fenotípica é produzida a partir do autocruzamento b Que proporção genotípica é produzida a partir do autocruzamento c Que proporção fenotípica é produzida a partir do seu cruzamentoteste d Que proporção genotípica é produzida a partir do seu cruzamentoteste A mitose normal ocorre em uma célula diploide de genótipo AA Bb Quais dos genótipos a seguir poderiam representar as possíveis células filhas a A B b a b c A b d a B e AA BB f Aa Bb g aa bb Em um organismo diploide de 2n 10 presuma que você consiga rotular todos os centrômeros derivados da genitora e todos os centrômeros derivados do genitor Quando esse organismo produz gametas quantas combinações de centrômeros rotulados dos sexos masculino e feminino são possíveis nos gametas Demonstrouse que quando um fino feixe de luz é direcionado para um núcleo a quantidade de luz absorvida é proporcional ao conteúdo de DNA da célula Com a utilização desse método o DNA nos núcleos de diversos tipos de células diferentes em uma planta do milho foi comparado Os números a seguir representam as quantidades relativas de DNA nesses diferentes tipos de células 07 14 21 28 e 42 16 17 18 19 20 21 Que células poderiam ter sido utilizadas para essas medições Nota em plantas a parte do endosperma da semente com frequência é triploide 3n Desenhe uma mitose haploide do genótipo a b No musgo os genes A e B são expressos apenas no gametófito Possibilita se que um esporófito de genótipo Aa Bb produza gametófitos a Qual proporção dos gametófitos será A B b Se a fertilização for aleatória qual proporção de esporófitos na próxima geração será Aa Bb Quando uma célula de genótipo Aa Bb Cc que apresenta todos os genes em pares de cromossomos separados se divide mitoticamente quais são os genótipos das célulasfilhas Na levedura haploide Saccharomyces cerevisiae os dois tipos reprodutivos são conhecidos como MATa e MATα Você cruza uma linhagem roxa ad do tipo de cruzamento a e uma linhagem branca ad do tipo de cruzamento α Se ad e ad são alelos de um gene e a e α são alelos de um gene herdado independentemente em um par de cromossomos separados qual progênie você espera obter Em quais proporções Em camundongos o nanismo é causado por um alelo recessivo ligado ao X e a pelagem rosa é causada por um alelo dominante autossômico a pelagem normalmente é amarronzada Se uma fêmea anã de uma linhagem pura for cruzada com um macho rosa de uma linhagem pura quais serão as proporções fenotípicas na F1 e na F2 em cada sexo Invente e defina os seus próprios símbolos gênicos Suponha que você descobre duas interessantes anormalidades citológicas raras no cariótipo de um homem Um cariótipo é o complemento de cromossomo visível total Existe uma parte extra satélite em um dos cromossomos do par 4 e existe um padrão anormal de coloração em um dos cromossomos do par 7 Com a presunção de que todos os gametas desse homem são igualmente viáveis qual proporção de seus filhos apresentará o mesmo cariótipo que ele apresenta 22 23 24 25 Suponha que a meiose ocorre no estágio diploide temporário do ciclo de um organismo haploide de número de cromossomos n Qual é a probabilidade de que uma célula haploide que resulta da divisão meiótica apresente um conjunto parental completo de centrômeros ou seja um conjunto todo de um genitor ou todo do outro genitor Finja que é o ano de 1868 Você é um fabricante de lentes jovem e habilidoso que trabalha em Viena Com as suas novas lentes superiores você acabou de construir um microscópio que apresenta melhor resolução do que quaisquer outros disponíveis Em seu teste desse microscópio você tem observado as células nos testículos de gafanhotos e está fascinado pelo comportamento das estranhas estruturas alongadas que observou dentro das células em divisão Um dia na biblioteca você lê um artigo de periódico recente de G Mendel sobre os fatores hipotéticos que ele alega explicarem os resultados de determinados cruzamentos em ervilhas Em uma revelação súbita você percebe os paralelos entre os seus estudos do gafanhoto e os estudos da ervilha de Mendel e você resolve escrever uma carta para ele O que você escreve O problema 23 tem por base uma ideia de Ernest Kroeker A partir de um presumido cruzamentoteste Aa aa no qual A representa vermelho e a representa branco utilize o teste do χ² para descobrir qual dos possíveis resultados a seguir corresponderia às expectativas a 120 vermelhos 100 brancos b 5000 vermelhos 5400 brancos c 500 vermelhos 540 brancos d 50 vermelhos 54 brancos Observe o quadrado de Punnett na Figura 34 a Quantos genótipos diferentes estão demonstrados nos 16 quadrados da grade b Qual é a proporção genotípica subjacente à proporção fenotípica de 9331 c Você consegue planejar uma fórmula simples para o cálculo da 26 27 quantidade de genótipos na progênie em cruzamentos dihíbridos tri híbridos e assim por diante Repita em relação aos fenótipos d Mendel previu que dentro de todas as classes fenotípicas no quadrado de Punnett com exceção de uma deve haver diversos genótipos diferentes Em particular ele realizou muitos cruzamentos para identificar os genótipos subjacentes ao fenótipo amarelo e liso Demonstre dois modos diferentes que poderiam ser utilizados para identificar os diversos genótipos subjacentes ao fenótipo amarelo e liso Relembre que todas as ervilhas amarelas e lisas aparentam ser idênticas Presumindo a distribuição independente de todos os genes desenvolva fórmulas que demonstrem o número de classes fenotípicas e o número de classes genotípicas a partir do autocruzamento de uma planta heterozigota para n pares de genes Nota a primeira parte deste problema foi introduzida no Capítulo 2 A base lógica é estendida aqui Na planta Arabidopsis thaliana um geneticista está interessado no desenvolvimento de tricomas pequenas projeções nas folhas Uma grande triagem demonstra duas plantas mutantes A e B que não apresentam tricomas e essas mutantes aparentam ser possivelmente úteis no estudo do desenvolvimento dos tricomas Se eles forem determinados por mutações monogênicas então o achado da função normal e anormal desses genes será instrutiva Cada planta foi cruzada com o tipo selvagem em ambos os casos a próxima geração F1 apresentou tricomas normais Ao serem autofecundadas as plantas da F1 resultaram na seguinte F2 F2 do mutante A 602 normais 198 sem tricomas F2 do mutante B 267 normais 93 sem tricomas a O que esses resultados demonstram Inclua os genótipos propostos de todas as plantas em sua resposta b Presuma que os genes estão localizados em cromossomos separados Uma F1 é produzida por meio do cruzamento da mutante A original com a mutante B original Realizase o cruzamentoteste dessa F1 que proporção 28 da progênie do cruzamentoteste não apresentará tricomas Em cães a pelagem escura é dominante sobre a albina e os pelos curtos são dominantes sobre os pelos longos Presuma que esses efeitos sejam causados por dois genes de segregação independente Foram realizados sete cruzamentos conforme demonstrado a seguir nos quais D e A fazem referência aos fenótipos escuro e albino respectivamente e S e L fazem referência aos fenótipos de pelos curtos e pelos longos Fenótipos parentais Número de progênie D S D L A S A L a D S D S 88 31 29 12 b D S D L 19 18 0 0 c D S A S 21 0 20 0 d A S A S 0 0 29 9 e D L D L 0 31 0 11 f D S D S 45 16 0 0 g D S D L 31 30 10 10 29 Escreva os genótipos dos progenitores em cada cruzamento Utilize os símbolos C e c para os alelos da cor da pelagem escura e albina e os símbolos H e h para os alelos dos pelos curtos e pelos longos respectivamente Presuma que os genitores são homozigotos exceto se houver evidências em contrário Em tomates um gene determina se a planta apresenta caules roxos G ou verdes g e um gene separado e independente determina se as folhas são cut P ou potato p Cinco cruzamentos de fenótipos da planta do tomate originam os resultados a seguir Cruzamento Fenótipos parentais Número de progênie G P G p g P g p 1 G P g P 323 102 309 106 2 G P G p 220 206 65 72 3 G P g P 723 229 0 0 4 G P g p 405 0 389 0 5 G p g P 71 90 85 78 a Quais alelos são dominantes b Quais são os genótipos mais prováveis em relação aos genitores em cada 30 31 cruzamento Um alelo mutante em camundongos causa uma cauda dobrada Seis pares de camundongos foram cruzados Seus fenótipos e aqueles de sua progênie são fornecidos na tabela a seguir N é o fenótipo normal D é o fenótipo dobrado Deduza modo de herança da cauda dobrada Cruzamento Genitores Progênie 1 N D Todos D Todos N 2 D N D N D N 3 D N Todos D Todos D 4 N N Todos N Todos N 5 D D Todos D Todos D 6 D D Todos D D N a Ela é recessiva ou dominante b Ela é autossômica ou ligada ao sexo c Quais são os genótipos de todos os genitores e de todos os descendentes A cor normal dos olhos da Drosophila é vermelha mas estão disponíveis linhagens nas quais todas as moscas apresentam olhos marrons De modo semelhante as asas normalmente são longas mas existem cepas com asas curtas Uma fêmea de uma linhagem pura com olhos marrons e asas curtas é cruzada com um macho de uma linhagem pura normal A F1 é composta por fêmeas normais e machos com asas curtas Em seguida uma F2 é produzida por meio do intercruzamento da F1 Ambos os sexos das moscas da F2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 demonstram fenótipos como segue olhos vermelhos e asas longas olhos vermelhos e asas curtas olhos marrons e asas longas olhos marrons e asas curtas Deduza a herança desses fenótipos utilize símbolos genéticos claramente definidos de sua própria invenção Declare os genótipos de todas as três gerações e as proporções genotípicas da F1 e da F2 Como solucionar o Problema 31 Antes de tentar uma solução para este problema tente responder às questões a seguir O que a palavra normal significa neste problema As palavras linhagem e cepa são utilizadas neste problema O que elas significam e elas são intercambiáveis Desenhe um esboço simples das duas moscas parentais demonstrando seus olhos suas asas e as diferenças sexuais Quantas características diferentes existem neste problema Quantos fenótipos existem neste problema e quais fenótipos estão associados a que características Qual é o fenótipo integral das fêmeas da F1 denominadas normais Qual é o fenótipo integral dos machos da F1 denominados com asas curtas Liste as proporções fenotípicas da F2 em relação a cada caractere que você inventou na resposta à questão 4 O que as proporções fenotípicas da F2 informam a você Qual padrão importante de herança distingue a herança ligada ao sexo da herança autossômica Os dados da F2 demonstram tal critério de distinção Os dados da F1 demonstram um referido critério de distinção 13 14 15 32 33 34 O que você pode aprender a respeito da dominância na F1 Na F2 Quais regras a respeito do simbolismo do tipo selvagem você pode utilizar para decidir quais símbolos alélicos devem ser inventados em relação a esses cruzamentos O que significa deduza a herança desses fenótipos Agora tente solucionar o problema Se você não conseguir fazer isso crie uma lista de questões a respeito das coisas que você não compreende Inspecione os objetivos do aprendizado no início do capítulo e se pergunte quais são relevantes para as suas questões Se essa abordagem não funcionar inspecione os Conceitoschave deste capítulo e se pergunte quais poderiam ser relevantes para as suas questões Em uma população natural de plantas anuais é encontrada uma única planta que aparenta estar enferma e que apresenta folhas amarelas A planta é colhida e trazida para o laboratório Observase que as taxas de fotossíntese são muito baixas O pólen de uma planta normal com folhas verdeescuras é utilizado para fertilizar as folhas emasculadas da planta amarelada Uma centena de sementes resulta das quais apenas 60 germinam Todas as plantas resultantes são de aspecto amarelo e enfermo a Proponha uma explicação genética para o padrão de herança b Sugira um teste simples para o seu modelo c Explique a redução da fotossíntese a enfermidade e o aspecto amarelado Qual é a base da variegação verde e branca nas folhas da Mirabilis Se o cruzamento a seguir for realizado variegada verde quais tipos de progênie podem ser previstos O que dizer sobre o cruzamento recíproco Em Neurospora o mutante stp exibe crescimento errático e intermitente 35 36 37 38 Sabidamente o sítio mutante está no mtDNA Se uma linhagem stp for utilizada como genitora em um cruzamento com uma linhagem normal que atua como masculina qual tipo de progênie pode se esperado O que dizer a respeito da progênie do cruzamento recíproco Duas plantas do milho são estudadas Uma é resistente R e a outra é suscetível S a um determinado fungo patogênico São realizados os cruzamentos a seguir com os resultados demonstrados S R Toda a progênie S R S Toda a progênie R O que você pode concluir a respeito da localização dos determinantes genéticos de R e S Um dihíbrido presumido na Drosophila Bb Ff é submetido ao cruzamentoteste com bb ff B Corpo preto b Corpo marrom F Cerdas bifurcadas f Cerdas não bifurcadas Os resultados são Preto e bifurcado 230 Marrom e bifurcado 240 Preto e não bifurcado 210 Marrom e não bifurcado 250 Utilize o teste do χ² para determinar se esses resultados correspondem aos resultados esperados do cruzamentoteste do suposto dihíbrido Os números de progênie a seguir são consistentes com os resultados esperados do autocruzamento de uma planta que presumidamente é uma di híbrida de dois genes de distribuição independente Hh Rr H Folhas pilosas h Folhas lisas R Ovário redondo r Ovário alongado Explique a sua resposta Pilosa e redondo 178 Lisa e redondo 56 Pilosa e alongado 62 Lisa e alongado 24 Uma mariposa fêmea escura é cruzada com um macho escuro Toda a 39 40 41 42 progênie masculina é escura mas metade da progênie feminina é clara e o restante é escura Proponha uma explicação para esse padrão de herança Em Neurospora uma linhagem mutante denominada stopper stp surgiu espontaneamente Stopper demonstrou crescimento errático que para e começa em comparação ao crescimento ininterrupto das linhagens do tipo selvagem Nos cruzamentos foram observados os resultados a seguir stopper do tipo selvagem Toda a progênie stopper do tipo selvagem stopper Toda a progênie do tipo selvagem a O que esses resultados sugerem a respeito da localização da mutação stopper no genoma b De acordo com o seu modelo em relação à parte a que progênie e proporções são previstas em óctades do cruzamento a seguir incluindo uma mutação nic3 localizada no cromossomo VI stp nic3 do tipo selvagem Em sistemas poligênicos quantas classes fenotípicas correspondentes ao número de doses de poligenes são esperadas em autocruzamentos a De linhagens com quatro poligenes heterozigotos b De linhagens com seis poligenes heterozigotos Na autofecundação de um poligênico trihíbrido R1r1 R2r2 R3r3 utilize as regras do produto e da soma para calcular a proporção da progênie com apenas uma dose de poligenes Foram realizados cruzamentos recíprocos e autocruzamentos entre as duas espécies de musgos Funaria mediterranea e F hygrometrica Os esporófitos e as folhas dos gametófitos estão demonstrados no diagrama que acompanha Os cruzamentos estão escritos primeiramente com a genitora a Descreva os resultados apresentados resumindo os principais achados b Proponha uma explicação dos resultados c Demonstre como você testaria a sua explicação assegurese de 43 44 45 1 2 3 4 5 6 demonstrar como ela poderia ser distinguida de outras explicações Presuma que a planta diploide A apresenta um citoplasma geneticamente diferente daquele da planta B Para estudar as relações nucleares e citoplasmáticas você deseja obter uma planta com o citoplasma da planta A e o genoma nuclear predominantemente da planta B Como você faria para produzir uma referida planta Você está estudando uma planta com um tecido composto por setores verdes e brancos Você deseja decidir se esse fenômeno ocorre em virtude de 1 uma mutação de cloroplasto do tipo considerado neste capítulo ou 2 uma mutação nuclear dominante que inibe a produção de clorofila e que está presente apenas em determinadas camadas de tecido da planta como um mosaico Resuma a abordagem experimental que você utilizaria para resolver este problema PROBLEMAS DESAFIADORES Você tem três potes contendo bolas de gude como segue pote 1 600 vermelhas e 400 brancas pote 2 900 azuis e 100 brancas pote 3 10 verdes e 990 brancas a Se você selecionar às cegas uma bola de gude de cada pote calcule a probabilidade de obter uma vermelha uma azul e uma verde três brancas uma vermelha uma verde e uma branca uma vermelha e duas brancas uma colorida e duas brancas no mínimo uma branca b Em uma determinada planta R Vermelho e r Branco Você realiza a autofecundação de uma heterozigota Rr vermelha com a finalidade expressa de obter uma planta branca para um experimento Qual número 46 47 48 mínimo e sementes você deve cultivar para ter no mínimo 95 de certeza de obter no mínimo um indivíduo branco c Quando uma mulher recebe a injeção de um ovócito fertilizado in vitro a probabilidade de sucesso na sua implantação é de 20 Se uma mulher receber a injeção de cinco ovócitos fertilizados simultaneamente qual é a probabilidade de que ela engravidará A parte c é de Margaret Holm Em tomates o fruto vermelho é dominante sobre o amarelo o fruto biloculado é dominante sobre o fruto multiloculado e o pé alto é dominante sobre o anão Um cultivador possui duas linhagens puras 1 vermelha biloculada e anã e 2 amarela multiloculada e alta A partir dessas duas linhagens ele deseja produzir uma nova linhagem pura para comercialização que seja amarela biloculada e alta Como exatamente ele deve fazer isso Demonstre não apenas quais cruzamentos devem ser realizados mas também quantos descendentes devem ser amostrados em cada caso Lidamos principalmente com apenas dois genes mas os mesmos princípios se mantêm em relação a mais de dois genes Considere o cruzamento a seguir Aa Bb Cc Dd Ee aa Bb cc Dd ee a Qual proporção da progênie fenotipicamente se assemelhará 1 ao primeiro genitor 2 ao segundo genitor 3 a qualquer genitor e 4 a nenhum dos genitores b Qual proporção da progênie será genotipicamente a mesma 1 do primeiro genitor 2 do segundo genitor 3 de qualquer genitor e 4 de nenhum genitor Presuma a segregação independente O heredograma a seguir demonstra o padrão da transmissão de dois fenótipos humanos raros catarata e nanismo pituitário Os familiares com catarata estão demonstrados com uma metade esquerda sólida do símbolo aqueles com nanismo pituitário estão indicados com uma metade direita 49 sólida a Qual é o modo mais provável de herança de cada um desses fenótipos Explique b Liste os genótipos de todos os membros na geração III tanto quanto possível c Se um cruzamento hipotético ocorreu entre IV1 e IV5 qual é a probabilidade de que o primeiro filho seja um anão com catarata Uma criança fenotipicamente normal O Problema 48 é adaptado de J Kuspira e R Bhambhani Compendium of Problems in Genetics Direitos autorais 1994 por Wm C Brown Um geneticista de milho possui três linhagens puras de genótipos aa BB CC AA bb CC e AA BB cc Todos os fenótipos determinados por a b e c aumentarão o valor de mercado do milho Assim naturalmente ele deseja combinar todos em uma linhagem pura do genótipo aa bb cc a Resuma um programa de cruzamento efetivo que possa ser utilizado para obter a linhagem pura aa bb cc b A cada estágio declare exatamente quais fenótipos serão selecionados e forneça as suas frequências esperadas c Existe mais de um modo de obter o genótipo desejado Qual é o melhor modo Presuma a distribuição independente dos três pares de genes Nota o 50 51 52 milho será submetido facilmente à autopolinização ou à polinização cruzada Em humanos a visão colorida depende de genes que codificam três pigmentos Os genes R pigmento vermelho e G pigmento verde estão próximos no cromossomo X enquanto o gene B pigmento azul é autossômico Uma mutação recessiva em qualquer um desses genes pode causar daltonismo Suponha que um homem daltônico se casou com uma mulher com visão para cores normal Os quatro filhos desse casamento eram daltônicos e as cinco filhas eram normais Especifique os genótipos mais prováveis de ambos os genitores e de seus filhos explicando a sua justificativa Um desenho do heredograma provavelmente será útil O Problema 50 é de Rosemary Redfield Considere o heredograma a seguir em relação a uma doença muscular humana rara a Qual característica incomum distingue esse heredograma daqueles estudados anteriormente neste capítulo b Onde você acredita que o DNA mutante responsável por esse fenótipo está localizado na célula A planta Haplopappus gracilis apresenta 2n de 4 Foi estabelecida uma cultura de célula diploide e na fase S prémitótica um nucleotídio radioativo foi adicionado e incorporado ao DNA recentemente sintetizado As células então foram removidas da radioatividade lavadas e possibilitouse que prosseguissem pela mitose Os cromossomos ou cromátides radioativos podem ser detectados por meio da colocação de emulsão fotográfica sobre as células os cromossomos radioativos apareceram cobertos por manchas de prata da emulsão Os cromossomos 53 54 tiram a sua própria fotografia Desenhe os cromossomos na prófase e na telófase da primeira e da segunda divisões da mitose após o tratamento radioativo Se eles forem radioativos desenhe no seu diagrama Se houver diversas possibilidades demonstreas também Na espécie do Problema 52 você pode introduzir a radioatividade por meio da injeção nas anteras na fase S antes da meiose Desenhe os quatro produtos da meiose com seus cromossomos e demonstre quais são radioativos A planta Haplopappus gracilis é diploide e 2n 4 Existe um par longo e um par curto de cromossomos Os diagramas a seguir numerados de 1 a 12 representam as anáfases estágios de separação de células individuais na meiose ou na mitose em uma planta que é geneticamente di híbrida Aa Bb em relação a genes em cromossomos diferentes As linhagens representam cromossomos ou cromátides e as pontas dos V representam os centrômeros Em cada caso indique se o diagrama representa uma célula em meiose I meiose II ou mitose Se um diagrama demonstrar uma situação impossível afirme isso 55 56 O heredograma a seguir demonstra a recorrência de uma doença neurológica rara símbolos pretos grandes e abortos fetais espontâneos símbolos pretos pequenos em uma família Uma barra diagonal significa que o indivíduo é falecido Forneça uma explicação para este heredograma em relação à segregação citoplasmática de mitocôndrias defeituosas Um homem é braquidáctilo dedos das mãos muito curtos autossômico dominante raro e sua esposa não é Ambos conseguem degustar a 57 substância química feniltiocarbamida autossômico dominante alelo comum mas suas mães não conseguiam a Forneça os genótipos do casal Se os genes se distribuem independentemente e o casal tem quatro filhos qual é a probabilidade de b Todos eles serem braquidáctilos c Nenhum ser braquidáctilo d Todos eles serem degustadores e Todos eles serem não degustadores f Todos eles serem degustadores braquidáctilos g Nenhum ser degustador braquidáctilo h No mínimo um ser um degustador braquidáctilo Uma forma de esterilidade masculina no milho é transmitida maternalmente Plantas de uma linhagem masculina estéril cruzadas com pólen normal originam plantas masculinas estéreis Além disso algumas linhagens de milho sabidamente carreiam um alelo restaurador nuclear dominante Rf que restaura a fertilidade do pólen em linhagens masculinas estéreis a Pesquisas demonstram que a introdução de alelos restauradores em linhagens masculinas estéreis não altera nem afeta a manutenção dos fatores citoplasmáticos em relação à esterilidade masculina Qual tipo de resultados de pesquisas levaria a uma referida conclusão b Uma planta masculina estéril é cruzada com o pólen de uma planta homozigota em relação a Rf Qual é o genótipo da F1 O fenótipo c As plantas da F1 da parte b são utilizadas como fêmeas em um cruzamentoteste com o pólen de uma planta normal rfrf Quais são os resultados desse cruzamentoteste Forneça os genótipos e os fenótipos e designe o tipo de citoplasma d O alelo restaurador já descrito pode ser denominado Rf1 Outro restaurador dominante Rf2 foi observado Rf1 e Rf2 estão localizados em cromossomos diferentes Cada um ou ambos os alelos restauradores proporcionarão a fertilidade ao pólen Com a utilização de uma planta masculina estéril como uma testadora qual será o resultado de um cruzamento no qual o progenitor do sexo masculino é 1 heterozigoto em ambos os loci restauradores 2 homozigoto dominante em um locus restaurador e homozigoto recessivo no outro 3 heterozigoto em um locus restaurador e homozigoto recessivo no outro 4 heterozigoto em um locus restaurador e homozigoto dominante no outro Mapeamento de Cromossomos Eucarióticos por Recombinação 41 42 43 44 45 46 47 48 Mapa com base na recombinação de um dos cromossomos de Drosophila organismo na imagem demonstrando os loci dos genes cujas mutações produzem fenótipos conhecidos David ScharfCorbis TÓPICOS Diagnóstico de ligação Mapeamento por frequência de recombinantes Mapeamento com marcadores moleculares Mapeamento de centrômeros com tétrades lineares Utilização do teste do quiquadrado para inferir ligação Cômputo de crossovers múltiplos não visualizados Utilização de mapas com base em recombinação em conjunto com mapas físicos Mecanismo molecular de crossover RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Realizar uma análise quantitativa da progênie de um cruzamentoteste di híbrido para avaliar se os dois genes estão ligados no mesmo cromossomo ou não Estender o mesmo tipo de análise a diversos loci para produzir um mapa A das posições relativas dos loci em um cromossomo Em fungos ascomicetos mapear os centrômeros a outros loci ligados Em ascos prever as proporções de alelos oriundos de etapas específicas no modelo heterodúplex de crossing over lgumas das questões a que os geneticistas desejam responder a respeito do genoma são Que genes estão presentes no genoma Que funções apresentam Que posições ocupam nos cromossomos Convencionouse chamar mapeamento a busca pela resposta à terceira questão O mapeamento é o principal enfoque deste capítulo mas todas as três questões estão interrelacionadas conforme veremos Sentimos diariamente quão importantes são os mapas em geral e é fato que em algum momento de nossas vidas já os utilizamos para encontrar o caminho Relevante para o enfoque deste capítulo é que em algumas situações diversos mapas precisam ser utilizados simultaneamente Um bom exemplo na vida diária está em percorrer o denso arranjo de ruas e edifícios de uma cidade tal como Londres na Inglaterra Um mapa das ruas que demonstra o plano geral é uma necessidade Entretanto o mapa das ruas é utilizado por turistas e também por londrinos juntamente com outro mapa aquele do sistema ferroviário subterrâneo O sistema subterrâneo é tão complexo e intrincado que em 1933 um engenheiro de circuitos elétricos chamado Harry Beck desenhou o mapa simplificado embora distorcido que permanece até hoje um ícone de Londres Os mapas das ruas e dos subterrâneos de Londres estão comparados na Figura 41 Observe que as posições das estações subterrâneas e as distâncias exatas entre elas não são de interesse por si próprias exceto como um modo para se chegar até um destino de interesse tal como a Abadia de Westminster Veremos três paralelos com os mapas de Londres quando os mapas cromossômicos são utilizados para indicar destinos individuais ou genes específicos Primeiramente diversos tipos de mapas cromossômicos com frequência são necessários e precisam ser utilizados em conjunto em segundo lugar mesmo mapas que contêm distorções são úteis e em terceiro lugar diversos sítios em um mapa cromossômico são traçados apenas 1 2 3 por serem úteis para tentar situar outros pontos que são os de real interesse A obtenção de um mapa das posições dos genes nos cromossomos é um esforço que ocupou milhares de geneticistas durante os últimos 80 anos Por que isso é tão importante Existem diversos motivos A posição do gene é uma informação crucial para construir genótipos complexos necessários para fins experimentais ou para aplicações comerciais Por exemplo no Capítulo 6 veremos casos nos quais combinações alélicas especiais precisam ser reunidas para explorar a interação gênica O conhecimento sobre a posição ocupada por um gene proporciona um modo para a descoberta da sua estrutura e função A posição de um gene pode ser utilizada para definilo no nível do DNA Por sua vez a sequência de DNA de um gene do tipo selvagem ou de seu alelo mutante é uma parte necessária para a dedução da sua função subjacente Os genes presentes e seu arranjo nos cromossomos com frequência são discretamente diferentes em espécies correlatas Por exemplo o longo cromossomo humano número 2 é dividido em dois cromossomos mais curtos nos grandes primatas Ao comparar essas diferenças geneticistas podem deduzir os mecanismos genéticos evolutivos por meio dos quais esses genomas divergiram Portanto mapas cromossômicos são úteis na interpretação dos mecanismos da evolução FIGURA 41 Estes mapas de Londres ilustram o princípio de que com frequência diversos mapas são necessários para se chegar ao destino desejado O mapa da ferrovia subterrânea o Tubo é utilizado para se chegar até um destino de interesse tal como o endereço de uma rua demonstrado no mapa das ruas Em genética dois tipos diferentes de mapas genômicos com frequência são úteis para a localizar um gene levando a uma compreensão sobre a sua estrutura e função A MAPScomCorbis B Transport for London O arranjo dos genes nos cromossomos é representado diagramaticamente como um mapa cromossômico unidimensional que demonstra as posições dos genes conhecidas como loci no singular locus e as distâncias entre os loci com base em algum tipo de escala Dois tipos básicos de mapas cromossômicos são utilizados atualmente em genética eles são montados por meio de procedimentos consideravelmente diferentes ainda que sejam utilizados de modo complementar Os mapas baseados na recombinação que são o tópico deste capítulo mapeiam os loci dos genes que foram identificados por meio de fenótipos mutantes que demonstram herança monogênica Os mapas físicos ver Capítulo 14 demonstram os genes como segmentos arranjados ao longo da molécula de DNA que constitui um cromossomo Esses mapas demonstram visões diferentes do genoma mas assim como os mapas de Londres podem ser utilizados em conjunto para se descobrir a função de um gene no nível molecular e como essa função influencia o fenótipo 41 CONCEITOCHAVE Os mapas genéticos são úteis para a construção de linhagens para a interpretação de mecanismos evolutivos e para a descoberta da função desconhecida de um gene essa última facilitada pela integração das informações baseadas em recombinação com aquelas obtidas de mapas físicos Diagnóstico de ligação Os mapas de recombinação dos cromossomos normalmente são montados com dois ou três genes por vez com a utilização de um método denominado análise de ligação Quando os geneticistas dizem que dois genes estão ligados eles querem dizer que os loci daqueles genes estão no mesmo cromossomo e portanto os alelos em qualquer um dos homólogos estão fisicamente unidos ligados pelo DNA entre eles O modo como os primeiros geneticistas deduziram a ligação é um meio útil para apresentar a maior parte das ideiaschave e dos procedimentos chave na análise Utilização da frequência de recombinantes para reconhecer ligação No início do século 20 William Bateson e R C Punnett em homenagem ao qual o quadrado de Punnett foi denominado estavam estudando a herança de dois genes em ervilhasdecheiro Em uma autofecundaçãopadrão de uma F1 di híbrida a F2 não demonstrou a proporção de 9331 prevista pelo princípio da distribuição independente De fato Bateson e Punnett observaram que determinadas combinações de alelos apareceram com mais frequência do que o esperado quase como se estivessem fisicamente unidas de algum modo Entretanto eles não tinham uma explicação para essa descoberta Mais tarde Thomas Hunt Morgan observou um desvio semelhante da segunda lei de Mendel enquanto estudava dois genes autossômicos em Drosophila Morgan propôs a ligação como uma hipótese para explicar o fenômeno da aparente associação de alelos Vejamos alguns dos dados de Morgan Um dos genes afetava a cor dos olhos pr roxo e pr vermelho e o outro gene afetava o comprimento das asas vg vestigial e vg normal As asas vestigiais são muito pequenas em comparação ao tipo selvagem Os alelos do tipo selvagem de ambos os genes são dominantes Morgan realizou um cruzamento para obter dihíbridos e em seguida prosseguiu com um cruzamentoteste Cruzamentoteste Fêmea dihíbrida da F1 Macho testador A utilização do cruzamentoteste por Morgan é importante Tendo em vista que o genitor testador contribui com gametas que carreiam apenas alelos recessivos os fenótipos da descendência revelam diretamente os alelos trazidos pelos gametas do genitor dihíbrido conforme descrito nos Capítulos 2 e 3 Portanto o analista pode se concentrar na meiose em um genitor o dihíbrido e essencialmente esquecer a meiose no outro o testador Contrariamente a partir de uma F1 autofecundada existem dois conjuntos de meioses a serem considerados na análise da progênie um no genitor e o outro na genitora Os resultados do cruzamentoteste de Morgan foram como segue listados como classes gaméticas do dihíbrido pr vg 1339 pr vg 1195 pr vg 151 pr vg 154 2839 Obviamente esses números desviamse drasticamente da previsão mendeliana de uma proporção de 1111 esperada a partir da distribuição independente aproximadamente 710 em cada uma das quatro classes Nos resultados de Morgan observamos que as primeiras duas combinações de alelos estão em sua maioria indicando claramente que eles estão associados ou ligados Outro modo útil de avaliar os resultados do cruzamentoteste é por meio da consideração da porcentagem de recombinantes na progênie Por definição os recombinantes no presente cruzamento são de dois tipos pr vg e pr vg tendo em vista que eles claramente não são os dois genótipos fornecidos para o di híbrido da F1 pelas moscas parentais homozigotas originais mais precisamente por seus gametas Observamos que os dois tipos recombinantes são aproximadamente iguais em frequência 151 154 Seu total é 305 que é uma frequência de 3052839 100 ou 107 Podemos compreender esses dados como Morgan compreendeu ao postular que os genes estavam ligados no mesmo cromossomo e assim as combinações alélicas parentais são mantidas juntas na maior parte da progênie No dihíbrido a conformação alélica é necessariamente como segue A tendência de alelos ligados serem herdados juntos está ilustrada na Figura 42 Agora observemos outro cruzamento que Morgan realizou com a utilização dos mesmos alelos mas em uma combinação diferente Nesse cruzamento cada genitor é homozigoto em relação ao alelo do tipo selvagem de um gene e ao alelo mutante do outro Novamente as fêmeas da F1 foram submetidas ao cruzamento teste Cruzamentoteste FIGURA 42 Herança simples de dois genes localizados no mesmo par de cromossomos Os mesmos genes estão presentes juntos em um cromossomo em ambos os genitores e na progênie A progênie a seguir foi obtida a partir do cruzamentoteste pr vg 157 pr vg 146 pr vg 965 pr vg 1067 2335 Novamente esses resultados não estão nem sequer próximos de uma proporção mendeliana de 1111 Entretanto agora as classes recombinantes são o contrário daquelas na primeira análise pr vg e pr vg Entretanto observe que a sua frequência é aproximadamente a mesma 157 1462335 100 129 Novamente é sugerida a ligação mas nesse caso o dihíbrido da F1 é necessariamente como segue Resultados de cruzamentosteste de dihíbridos como aqueles há pouco apresentados são comumente encontrados em genética Eles seguem o padrão geral Duas classes de não recombinantes igualmente frequentes que totalizam mais de 50 Duas classes de recombinantes igualmente frequentes que totalizam menos de 50 CONCEITOCHAVE Quando dois genes estão próximos no mesmo par cromossômico ou seja estão ligados eles não se distribuem independentemente mas produzem uma frequência de recombinantes inferior a 50 Portanto uma frequência de recombinantes inferior a 50 é diagnóstica de ligação FIGURA 43 A troca de partes por meio do crossing over produz cromossomos gaméticos cujas combinações alélicas diferem das combinações parentais Como os crossovers produzem recombinantes de genes ligados A hipótese de ligação explica por que as combinações alélicas das gerações parentais permanecem juntas os genes estão fisicamente unidos pelo segmento do cromossomo entre eles Mas exatamente como quaisquer recombinantes são produzidos quando os genes estão ligados Morgan sugeriu que quando cromossomos homólogos pareiam na meiose os cromossomos ocasionalmente se rompem e trocam partes em um processo denominado crossing over A Figura 43 ilustra essa troca física de segmentos cromossômicos As duas novas combinações são denominadas produtos de crossover Existe algum processo microscopicamente observável que possa explicar o crossing over Na meiose quando os cromossomos homólogos duplicados pareiam entre si em termos genéticos quando as duas díades se unem como um bivalente com frequência ocorre a formação de uma estrutura com formato de cruz denominada quiasma entre duas cromátides não irmãs Para Morgan o 1 2 3 4 5 aparecimento dos quiasmas comprovou visualmente o conceito de crossing over Observe que os quiasmas parecem indicar que as cromátides não os cromossomos duplicados participam de um crossover Retornaremos a esse ponto posteriormente CONCEITOCHAVE Em relação aos genes ligados os recombinantes são produzidos por meio de crossovers Os quiasmas são as manifestações visíveis dos crossovers Simbolismo e terminologia de ligação O trabalho de Morgan demonstrou que os genes ligados em um dihíbrido podem estar presentes em uma de duas conformações básicas Em uma os dois alelos dominantes ou do tipo selvagem estão presentes no mesmo homólogo como na Figura 43 esse arranjo é denominado conformação cis cis significa adjacente Na outra eles estão em homólogos diferentes o que é denominado conformação trans trans significa oposto As duas conformações são escritas como segue Cis ABab ou ab Trans AbaB ou ba Observe as convenções a seguir que se referem ao simbolismo da ligação Alelos no mesmo homólogo não apresentam pontuação entre si Uma barra separa simbolicamente os dois homólogos Os alelos sempre são escritos na mesma ordem em cada homólogo Como nos capítulos anteriores os genes sabidamente localizados em cromossomos diferentes genes não ligados são demonstrados em separado por um ponto e vírgula por exemplo Aa Cc Neste livro genes de ligação desconhecida são demonstrados em separado por um ponto Aa Dd Evidências de que o crossing over é um processo de quebra e reunião A ideia de que os recombinantes são produzidos por meio de algum tipo de troca de material entre cromossomos homólogos era uma ideia atraente Mas era necessário experimentação para testar essa hipótese Uma primeira etapa era encontrar um caso no qual a troca de partes entre os cromossomos fosse visível ao microscópio Diversos investigadores abordaram esse problema do mesmo modo e uma de suas análises se segue Em 1931 Harriet Creighton e Barbara McClintock estavam estudando dois genes do milho que elas sabiam estarem ambos localizados no cromossomo 9 Um afetava a cor da semente C colorida c incolor e o outro afetava a composição do endosperma Wx ceroso wx amiláceo A planta era uma dihíbrida em conformação cis Entretanto em uma planta o cromossomo 9 que carreava os alelos C e Wx era incomum no sentido em que ele também carreava um elemento grande e densamente corado denominado knob na extremidade C e um segmento mais longo do cromossomo na extremidade Wx portanto o heterozigoto era Na progênie de um cruzamentoteste dessa planta elas compararam os genótipos recombinantes e parentais Elas observaram que todos os recombinantes herdaram um ou outro dos dois cromossomos a seguir dependendo de sua constituição recombinante Portanto havia uma correlação precisa entre o evento genético do aparecimento de recombinantes e o evento cromossômico do crossing over Consequentemente os quiasmas aparentavam ser os sítios de troca embora o que foi considerado como teste definitivo só tenha sido realizado em 1978 O que podemos dizer a respeito do mecanismo molecular da troca cromossômica em um evento de crossover A resposta curta é que o crossover resulta da quebra e da reunião do DNA Dois cromossomos parentais são quebrados na mesma posição e em seguida cada parte é unida à parte vizinha do outro cromossomo Na Seção 48 veremos um modelo dos processos moleculares que possibilitam que o DNA seja quebrado e reunido de uma maneira precisa de modo que não haja perda ou ganho de material genético CONCEITOCHAVE Um crossover é a quebra de duas moléculas de DNA na mesma posição e a sua reunião em duas combinações recombinantes recíprocas Evidências de que o crossing over ocorre no estágio de quatro cromátides Conforme já observado a representação diagramática do crossing over na Figura 43 demonstra a ocorrência de um crossover no estágio de quatro cromátides da meiose em outras palavras os crossovers ocorrem entre cromátides não irmãs Entretanto teoricamente era possível que o crossing over ocorresse antes da replicação no estágio de dois cromossomos Essa incerteza foi resolvida por meio da análise genética de organismos cujos quatro produtos da meiose permanecem juntos em grupos de quatro denominados tétrades Esses organismos que encontramos nos Capítulos 2 e 3 são os fungos e as algas unicelulares Os produtos da meiose de uma única tétrade podem ser isolados o que é equivalente ao isolamento de todas as quatro cromátides de um único meiócito As análises de tétrades de cruzamentos nos quais os genes estão ligados demonstram muitas tétrades que contêm quatro diferentes combinações alélicas Por exemplo a partir do cruzamento AB ab algumas mas não todas tétrades contêm quatro genótipos AB Ab aB ab Esse resultado pode ser explicado apenas se crossovers ocorrerem no estágio de quatro cromátides tendo em vista que se crossovers ocorressem no estágio de dois cromossomos somente poderia haver um máximo de dois genótipos diferentes em uma tétrade individual Esse argumento está ilustrado na Figura 44 Crossovers múltiplos podem incluir mais de duas cromátides A análise de tétrades também pode demonstrar duas outras características importantes do crossing over Primeiramente em alguns meiócitos podem ocorrer diversos crossovers ao longo de um par de cromossomos Em segundo lugar em qualquer meiócito esses crossovers múltiplos podem trocar o material entre mais de duas cromátides Para pensar a respeito desse assunto precisamos observar o caso mais simples crossovers duplos Para estudar os crossovers duplos precisamos de três genes ligados Por exemplo se todos os três loci estiverem ligados em um cruzamento tal como ABC abc são possíveis muitos tipos de tétrades diferentes mas alguns tipos são informativos na presente conexão tendo em vista que eles podem ser explicados apenas por crossovers duplos nos quais participam mais de duas cromátides Considere a tétrade a seguir como um exemplo FIGURA 44 O crossing over ocorre no estágio de quatro cromátides Tendo em vista que mais de dois produtos diferentes de uma única meiose podem ser observados em algumas tétrades o crossing over não pode ocorrer no estágio de dois filamentos antes da replicação do DNA O círculo branco designa a posição do centrômero Quando as cromátidesirmãs são visíveis o centrômero parece não replicado ABc AbC aBC abc Essa tétrade é necessariamente explicada por dois crossovers nos quais participam três cromátides conforme demonstrado na Figura 45 A Além disso o tipo de tétrade a seguir demonstra que todas as quatro cromátides podem participar no crossing over na mesma meiose Figura 45 B ABc Abc 42 aBC abC Portanto em relação a qualquer par de cromossomos homólogos duas três ou quatro cromátides podem participar em eventos de crossing over em um único meiócito Entretanto observe que qualquer crossover único ocorre entre duas cromátides Você pode estar se perguntando sobre os crossovers entre cromátidesirmãs Eles ocorrem embora sejam raros e não produzem novas combinações alélicas motivo pelo qual normalmente não são considerados FIGURA 45 Crossovers duplos podem incluir A três cromátides ou B quatro cromátides Mapeamento por frequência de recombinantes A frequência de recombinantes produzidos por meio de crossing over é a chave para o mapeamento cromossômico A análise de tétrades em fungos demonstrou que em relação a quaisquer dois genes ligados específicos os crossovers ocorrem entre eles em alguns dos meiócitos mas não em todos Figura 46 Quanto mais distantes estiverem os genes maior será a probabilidade de ocorrência de um crossover e mais alta será a proporção de produtos recombinantes Portanto a proporção de recombinantes é uma indicação da distância que separa dois loci gênicos em um mapa cromossômico Conforme declarado anteriormente em relação aos dados de Morgan a frequência de recombinantes era significativamente inferior a 50 especificamente 107 A Figura 47 demonstra a situação geral em relação à ligação na qual os recombinantes são menos que 50 As frequências de recombinantes em relação a diferentes genes ligados variam de 0 a 50 dependendo da sua proximidade Quanto mais distantes estiverem os genes mais suas frequências de recombinantes se aproximam de 50 e nos referidos casos não se pode decidir se os genes estão ligados ou se estão em cromossomos diferentes O que dizer sobre as frequências de recombinantes superiores a 50 A resposta é que as referidas frequências nunca são observadas conforme será comprovado posteriormente Observe na Figura 46 que um único crossover gera dois produtos recombinantes recíprocos o que explica o motivo pelo qual as classes de recombinantes recíprocos em geral são aproximadamente iguais em frequência O corolário desse ponto é que os dois tipos não recombinantes parentais também têm de ser iguais em frequência conforme também observado por Morgan Unidades de mapa O método básico do mapeamento de genes com a utilização das frequências de recombinantes foi planejado por um aluno de Morgan Na medida em que Morgan estudava mais e mais genes ligados ele observou que a proporção da progênie recombinante variava consideravelmente dependendo de quais genes ligados estavam sendo estudados e ele acreditava que a referida variação na frequência de recombinantes poderia de algum modo indicar as distâncias reais que separam os genes nos cromossomos Morgan atribuiu a quantificação desse processo a um aluno de graduação Alfred Sturtevant que também se tornou um dos grandes geneticistas Morgan pediu a Sturtevant que tentasse compreender os dados sobre o crossing over entre diferentes genes ligados Uma noite Sturtevant desenvolveu um método para mapear genes que ainda é utilizado atualmente Nas palavras do próprio Sturtevant Na parte final de 1911 em uma conversa com Morgan subitamente percebi que as variações na força de ligação já atribuídas por Morgan às diferenças na separação espacial dos genes ofereciam a possibilidade de determinação das sequências na dimensão linear de um cromossomo Fui para casa e passei a maior parte da noite tendo negligenciado minha tarefa de casa da graduação produzindo o primeiro mapa cromossômico FIGURA 46 Os recombinantes surgem a partir de meioses nas quais ocorre um crossover entre cromátides não irmãs FIGURA 47 Um cruzamentoteste revela que as frequências de recombinantes que têm origem dos crossovers entre genes ligados são inferiores a 50 Como um exemplo da lógica de Sturtevant considere os resultados do cruzamentoteste de Morgan com os genes pr e vg a partir dos quais ele calculou uma frequência de recombinantes de 107 Sturtevant sugeriu que podemos utilizar essa porcentagem de recombinantes como um índice quantitativo da distância linear entre dois genes em um mapa genético ou mapa de ligação conforme por vezes ele é denominado A ideia básica aqui é consideravelmente simples Imagine dois genes específicos posicionados a uma determinada distância fixa Agora imagine o crossing over aleatório ao longo dos homólogos pareados Em algumas meioses cromátides não irmãs realizam o crossover aleatoriamente na região cromossômica entre esses genes a partir dessas meioses são produzidos recombinantes Em outras divisões meióticas não existem crossovers entre esses genes nenhum recombinante resulta dessas meioses Ver Figura 46 para uma ilustração diagramática Sturtevant postulou uma proporcionalidade bruta quanto maior a distância entre os genes ligados maior a chance de crossovers na região entre os genes e portanto maior a proporção de recombinantes que será produzida Assim ao determinar a frequência de recombinantes podemos obter uma medida da distância entre os genes no mapa De fato Sturtevant definiu uma unidade de mapa genético um como a distância entre genes em relação aos quais 1 produto da meiose em 100 é recombinante Por exemplo a frequência de recombinantes FR de 107 obtida por Morgan é definida como 107 um Uma unidade de mapa por vezes é denominada um centimorgan cM em homenagem a Thomas Hunt Morgan Esse método produz um mapa linear correspondente à linearidade cromossômica Sturtevant previu que em um mapa linear se 5 unidades de mapa 5 um separam os genes A e B e 3 um separam os genes A e C então a distância que separa B e C deve ser ou 8 ou 2 um Figura 48 Sturtevant observou que era o caso da sua previsão Em outras palavras sua análise sugeriu fortemente que os genes estão arranjados em alguma ordem linear tornando as distâncias de mapa aditivas Existem algumas exceções porém não insignificantes conforme veremos posteriormente Tendo em vista que sabemos a partir da análise molecular que um cromossomo é uma molécula de DNA única com os genes arranjados ao longo dela atualmente para nós não é surpresa saber que os mapas com base na recombinação são lineares tendo em vista que refletem um arranjo linear de genes Como um mapa é representado Como um exemplo em Drosophila o locus do gene da cor dos olhos e o locus do gene do comprimento das asas estão a uma distância de aproximadamente 11 um conforme mencionado anteriormente A relação normalmente é diagramada do seguinte modo Em geral fazemos referência ao locus desse gene da cor dos olhos de modo abreviado como o locus pr por ter sido o primeiro alelo mutante descoberto mas queremos dizer o local no cromossomo onde qualquer alelo desse gene será observado mutante ou do tipo selvagem Conforme declarado nos Capítulos 2 e 3 a análise genética pode ser aplicada em sentidos opostos Esse princípio é aplicável às frequências de recombinantes Em um sentido as frequências de recombinantes podem ser utilizadas para criar mapas No outro quando nos é fornecido um mapa estabelecido com a distância genética em unidades de mapa podemos prever as frequências da progênie nas diferentes classes Por exemplo a distância genética entre os loci pr e vg na Drosophila é de aproximadamente 11 um Assim conhecendo esse valor sabemos que haverá 11 de recombinantes na progênie de um cruzamentoteste de uma fêmea dihíbrida heterozigota em conformação cis pr vgpr vg Esses recombinantes consistirão em dois recombinantes recíprocos de igual frequência portanto 55 serão pr vg e 55 serão pr vg Também sabemos que 100 11 89 serão não recombinantes em duas classes iguais 445 pr vg e 445 pr vg Observe que a contribuição do testador pr vg foi ignorada quando escrevemos esses genótipos FIGURA 48 Uma região cromossômica que contém três genes ligados Tendo em vista que as distâncias de mapa são aditivas o cálculo das distâncias AB e AC nos deixa com as duas possibilidades demonstradas em relação à distância BC Existe uma forte implicação de que a distância em um mapa de ligação seja uma distância física ao longo de um cromossomo e Morgan e Sturtevant certamente queriam dizer exatamente isso Mas devemos perceber que o mapa de ligação é uma entidade hipotética construída a partir de uma análise puramente genética O mapa de ligação poderia ter sido derivado até mesmo sem se saber que existiam cromossomos Além disso nesse ponto na nossa discussão não podemos dizer se as distâncias genéticas calculadas por meio das frequências de recombinantes representam as distâncias físicas reais nos cromossomos Entretanto os mapas físicos demonstraram que as distâncias genéticas são de fato aproximadamente proporcionais às distâncias baseadas em recombinação Existem exceções causadas por hotspots pontos quentes de recombinação locais no genoma em que o crossing over ocorre de modo mais frequente do que o habitual A presença de hotspots causa a expansão proporcional de algumas regiões do mapa Também são conhecidos bloqueios de recombinação que apresentam o efeito oposto Um resumo do modo como os recombinantes do crossing over são utilizados no mapeamento está demonstrado na Figura 49 Os crossovers ocorrem mais ou menos aleatoriamente ao longo do par cromossômico Em geral nas regiões mais longas o número médio de crossovers é mais alto e de acordo com isso recombinantes são obtidos com mais frequência o que se traduz em uma distância de mapa mais longa CONCEITOCHAVE A recombinação entre genes ligados pode ser utilizada para mapear a sua distância em um cromossomo A unidade de mapeamento 1 um é definida como uma frequência de recombinantes de 1 Cruzamentoteste de três pontos Até agora observamos a ligação em cruzamentos de dihíbridos heterozigotos duplos com testadores recessivos duplos O próximo nível de complexidade é um cruzamento de um trihíbrido heterozigoto triplo com um testador recessivo triplo Esse tipo de cruzamento denominado cruzamentoteste de três pontos ou cruzamento de três fatores é comumente utilizado na análise de ligação O objetivo é deduzir se três genes estão ligados e caso afirmativo deduzir a sua ordem e as distâncias de mapa entre eles Observemos um exemplo também da Drosophila No nosso exemplo os alelos mutantes são v olhos vermelhos cv ausência de nervuras nas asas e ct bordas das asas aparadas ou cortadas A análise é feita por meio da realização dos cruzamentos a seguir FIGURA 49 Crossovers produzem cromátides recombinantes cuja frequência pode ser utilizada para mapear os genes em um cromossomo Regiões mais longas produzem mais crossovers O marrom demonstra os recombinantes em relação àquele intervalo Fêmeas trihíbridas são submetidas ao cruzamentoteste com machos recessivos triplos A partir de qualquer trihíbrido são possíveis apenas 2 2 2 8 genótipos de gameta Eles são os genótipos observados na progênie do cruzamentoteste O quadro a seguir demonstra o número de cada um dos oitos genótipos gaméticos em uma amostra de 1448 moscas da progênie As colunas laterais demonstram quais genótipos são recombinantes R em relação aos loci considerandose dois de cada vez É preciso que sejamos cuidadosos em nossa classificação dos tipos parentais e recombinantes Observe que os genótipos parentais que entram para os heterozigotos triplos são v cv ct e v cv ct qualquer outra combinação além dessas duas constitui um recombinante Recombinantes em relação aos loci Gametas v e cv v e ct cv e ct v cv ct 580 v cv ct 592 v cv ct 45 R R v cv ct 40 R R v cv ct 89 R R v cv ct 94 R R v cv ct 3 R R v cv ct 5 R R 1448 268 191 93 Analisemos os loci dois por vez iniciando com os loci v e cv Em outras palavras observamos apenas as primeiras duas colunas sob Gametas e cobrimos a terceira coluna Tendo em vista que os parentais em relação a esse par de loci são v cv e v cv sabemos que os recombinantes são por definição v cv e v cv Existem 45 40 89 94 268 desses recombinantes De um total de 1448 moscas esse número fornece uma FR de 185 Em relação aos loci v e ct os recombinantes são v ct e v ct Existem 89 94 3 5 191 desses recombinantes entre 1448 moscas e assim a FR 132 Em relação a ct e cv os recombinantes são cv ct e cv ct Existem 45 40 3 5 93 desses recombinantes entre as 1448 e assim a FR 64 Claramente todos os loci estão ligados tendo em vista que os valores das FR são todos consideravelmente inferiores a 50 Tendo em vista que os loci v e cv apresentam o maior valor da FR eles têm de ser os mais distantes Assim o locus ct encontrase obrigatoriamente entre eles Pode ser desenhado um mapa como segue O cruzamentoteste pode ser reescrito como segue agora que sabemos o arranjo de ligação v ct cvv ct cv v ct cvv ct cv Aqui observe diversos pontos importantes Primeiramente deduzimos uma ordem dos genes que é diferente daquela utilizada em nossa lista dos genótipos da progênie Tendo em vista que o ponto do exercício era determinar a relação de ligação desses genes a lista original era de necessidade arbitrária a ordem simplesmente não era conhecida antes de os dados serem analisados Daqui por diante os genes têm de ser escritos na ordem correta Em segundo lugar estabelecemos definitivamente que ct está entre v e cv No diagrama posicionamos v arbitrariamente à esquerda e cv à direita mas o mapa poderia ser igualmente bemdesenhado com o posicionamento invertido desses loci Em terceiro lugar observe que os mapas de ligação meramente mapeiam os loci em relação uns aos outros com a utilização das unidades de mapa padrão Não sabemos onde os loci estão em um cromossomo ou até mesmo em qual cromossomo específico eles estão Nas análises subsequentes na medida em que mais loci forem mapeados em relação a esses três o mapa cromossômico completo seria concluído CONCEITOCHAVE Cruzamentosteste de três pontos e superiores possibilitam que os geneticistas avaliem a ligação entre três ou mais genes e determinem a ordem dos genes tudo em um cruzamento Por fim é preciso que as duas distâncias de mapa menores 132 um e 64 um somam 196 um que é superior a 185 um a distância calculada em relação a v e cv Por quê A resposta dessa questão está no modo como tratamos as duas classes de progênie mais raras que totalizam 8 em relação à recombinação de v e cv Agora que temos o mapa podemos observar que essas duas classes raras são de fato recombinantes duplos que surgem a partir de dois crossovers Figura 410 Entretanto quando calculamos o valor da FR em relação a v e cv não contamos os genótipos v ct cv e v ct cv afinal em relação a v e cv eles são combinações parentais v cv e v cv À luz do nosso mapa entretanto observamos que esse descuido nos levou a subestimar a distância entre os loci v e cv Não apenas deveríamos ter contato as duas classes mais raras como deveríamos ter contato cada uma delas duas vezes tendo em vista que cada uma representa recombinantes duplos Portanto podemos corrigir o valor ao adicionar os números 45 40 89 94 3 3 5 5 284 Do total de 1448 essa quantidade é exatamente 196 que é idêntica à soma dos dois valores componentes Na prática não necessitamos desse cálculo tendo em vista que a soma das duas distâncias mais curtas nos fornece a melhor estimativa da distância geral FIGURA 410 Exemplo de um crossover duplo entre duas cromátides Observe que um crossover duplo produz cromátides recombinantes duplas que apresentam as combinações de alelos parentais em outros loci A posição do centrômero não pode ser determinada a partir dos dados Ele foi adicionado para fins de integridade Dedução da ordem dos genes por inspeção Agora que obtivemos alguma experiência com o cruzamentoteste de três pontos podemos observar novamente a listagem da progênie e verificar que em relação a trihíbridos de genes ligados a ordem dos genes normalmente pode ser deduzida por inspeção sem uma análise da frequência de recombinantes Tipicamente em relação aos genes ligados temos os oito genótipos nas frequências a seguir dois com frequência alta dois com frequência intermediária dois com frequência intermediária diferente dois raros Apenas três ordens de genes são possíveis cada uma com um gene diferente na posição intermediária Em geral é verdadeiro que as classes de recombinantes duplos são as menores conforme listado aqui por último Apenas uma ordem é compatível com a formação das classes menores por meio de crossovers duplos conforme demonstrado na Figura 411 ou seja apenas uma ordem fornece recombinantes duplos dos genótipos v ct cv e v ct cv Uma regra geral simples para deduzir o gene do meio é que ele é o par de alelos que mudou de posição nas classes de recombinantes duplos FIGURA 411 As três ordens de genes possíveis demonstradas à esquerda produzem os seis produtos de um crossover duplo demonstrado à direita Apenas a primeira possibilidade é compatível com os dados no texto Observe que apenas as cromátides não irmãs que participam no crossover duplo estão demonstradas Interferência Conhecer a existência dos crossovers duplos nos permite indagar questões a respeito da sua possível interdependência Podemos indagar os crossovers em regiões cromossômicas adjacentes são eventos independentes ou um crossover em uma região afeta a probabilidade de haver um crossover em uma região adjacente A resposta é que em geral os crossovers inibem uns aos outros de um modo semelhante a uma interação denominado interferência As classes de recombinantes duplos podem ser utilizadas para deduzir a extensão dessa interferência A interferência pode ser medida do modo a seguir Se os crossovers nas duas regiões forem independentes podemos utilizar a regra do produto ver Capítulo 3 para prever a frequência de recombinantes duplos aquela frequência será igual ao produto das frequências de recombinantes nas regiões adjacentes Nos dados da recombinação de vctcv o valor da FR de vct é 0132 e o valor de ctcv é 0064 Assim se não houver interferência os recombinantes duplos podem ser esperados na frequência de 0132 0064 00084 084 Na amostra de 1448 moscas 00084 1448 12 recombinantes duplos são esperados Mas os dados demonstram que apenas 8 foram realmente observados Se essa deficiência de recombinantes duplos fosse consistentemente observada ela nos mostraria que as duas regiões não são independentes e sugeriria que a distribuição dos crossovers favorece a ocorrência de recombinantes únicos à custa dos duplos Em outras palavras existe algum tipo de interferência um crossover reduz a probabilidade de um crossover em uma região adjacente A interferência é quantificada primeiro por meio do cálculo de um termo denominado coeficiente de coincidência cdc que é a proporção de recombinantes duplos observados com relação à esperada A interferência I é definida como 1 cdc Portanto Em nosso exemplo Em algumas regiões nunca foram observados quaisquer recombinantes duplos Nesses casos cdc 0 e assim I 1 e a interferência é completa Valores de interferência em qualquer localização entre 0 e 1 são observados em diferentes regiões e em diferentes organismos Você pode ter se perguntado o motivo de sempre utilizarmos fêmeas heterozigotas para cruzamentosteste em Drosophila A explicação está em uma característica incomum dos machos de Drosophila Quando por exemplo machos pr vgpr vg são cruzados com fêmeas pr vgpr vg apenas decendentes pr vgpr vg e pr vgpr vg são recuperadas Esse resultado demonstra que não existe crossing over em machos de Drosophila Entretanto essa ausência de crossing over em um sexo é limitada a determinadas espécies não é o caso dos machos de todas as espécies ou em relação ao sexo heterogamético Em outros organismos ocorre crossing over em machos XY e em fêmeas WZ O motivo da ausência de crossing over em machos de Drosophila é que eles apresentam uma prófase I incomum sem complexos sinaptonêmicos Incidentalmente existe uma diferença de recombinação também entre os sexos humanos Mulheres demonstram frequências de recombinantes mais altas em relação aos mesmos loci autossômicos do que os homens Com a utilização de uma reiteração das técnicas precedentes baseadas na recombinação foram produzidos mapas de milhares de genes em relação aos quais foram identificados fenótipos variantes mutantes Um exemplo ilustrativo simples do tomate está demonstrado na Figura 412 Os cromossomos do tomate estão demonstrados na Figura 412 A a sua numeração na Figura 412 B e os mapas genéticos com base na recombinação na Figura 412 C Os cromossomos estão demonstrados como aparecem sob o microscópio juntamente com os mapas cromossômicos baseados na análise de ligação de diversos pares alélicos mostrados com seus fenótipos Mapa dos 12 cromossomos de tomate 43 FIGURA 412 A Fotomicrografia de uma prófase I meiótica paquíteno das anteras demonstrando os 12 pares de cromossomos B Ilustração dos 12 cromossomos demonstrados na parte A Os cromossomos estão identificados por meio do sistema de numeração cromossômica atualmente utilizado Os centrômeros estão demonstrados em laranja e as regiões flanqueadoras densamente coradas heterocromatina em verde C Mapa de ligação de 1952 Cada locus é ladeado por desenhos dos fenótipos normais e variantes As distâncias de mapa interlocus estão demonstradas em unidades de mapa A e B de C M Rick The Tomato Scientific American 1978 C Dados de L A Butler Utilização de proporções como diagnóstico A análise das proporções é um dos pilares da genética Até agora no texto encontramos muitas proporções diferentes cujas derivações estão difundidas ao longo de diversos capítulos Tendo em vista que o reconhecimento das proporções e a sua utilização no diagnóstico do sistema genético em estudo fazem parte da genética diária revisaremos as principais proporções que abrangemos até agora Elas estão demonstradas na Figura 413 Você pode ler as proporções pelas larguras relativas dos boxes coloridos em uma fileira A Figura 413 se refere às autofecundações e aos cruzamentosteste de monohíbridos dihíbridos com distribuição independente e ligação e trihíbridos também com distribuição independente e ligação de todos os genes Uma situação não representada é um trihíbrido no qual apenas dois dos três genes estão ligados como um exercício você pode querer deduzir o padrão geral que deveria ser incluído em um referido diagrama a partir dessa situação Observe que em relação à ligação os tamanhos das classes dependem das distâncias de mapa Um geneticista deduz os estados genéticos desconhecidos em um modo semelhante ao seguinte uma proporção de 9331 me informa que essa proporção muito provavelmente foi produzida por um dihíbrido autofecundado no qual os genes estão em cromossomos diferentes Mapeamento com marcadores moleculares Até agora neste capítulo mapeamos os loci de genes com a utilização dos valores da FR ao contar os fenótipos visíveis produzidos pelos diversos alelos envolvidos Entretanto também existem diferenças no DNA entre dois cromossomos que não produzem fenótipos visivelmente diferentes seja em virtude dessas diferenças no DNA não estarem localizadas em genes ou por estarem localizadas em genes mas não alterarem o produto proteico As referidas diferenças na sequência podem ser consideradas alelos moleculares ou marcadores moleculares Seus loci podem ser mapeados por meio dos valores de FR do mesmo modo que os alelos que produzem fenótipos visíveis Os marcadores moleculares são extremamente numerosos e portanto são muito úteis como marcos genômicos que podem ser utilizados para localizar os genes de interesse Os dois tipos principais de marcadores moleculares utilizados no mapeamento são os polimorfismos de nucleotídio único e os polimorfismos de comprimento de sequência simples Polimorfismos de nucleotídio único O sequenciamento demonstrou que conforme esperado as sequências genômicas dos indivíduos em uma espécie são em sua maior parte idênticas Por exemplo comparações das sequências de diferentes indivíduos revelaram que somos idênticos em aproximadamente 999 Quase toda a diferença de 01 ocorre com base em diferenças de um único nucleotídio Como um exemplo em um indivíduo uma sequência localizada pode ser AAGGCTCAT TTCCGAGTA e em outro pode ser AAAGCTCAT TTTCGAGTA FIGURA 413 P Parental R Recombinante SCO Crossover único DCO Crossover duplo Além disso observase que uma grande proporção dessas sequências localizadas é polimórfica o que significa que ambos os alelos moleculares são consideravelmente comuns na população Em geral as referidas diferenças entre os indivíduos são denominadas polimorfismos de nucleotídio único abreviadas como SNP do inglês single nucleotide polymorphisms Em seres humanos acreditase que existam aproximadamente 3 milhões de SNP distribuídos mais ou menos aleatoriamente a uma frequência de 1 em cada 300 a 1000 bases Alguns desses SNP estão localizados nos genes muitos deles não No Capítulo 2 vimos casos nos quais a alteração em um único par de nucleotídios pode produzir um novo alelo causando um fenótipo mutante Os dois pares de nucleotídios do tipo selvagem e mutante são exemplos de um SNP Entretanto a maior parte dos SNP não produz fenótipos diferentes seja em virtude de não estarem localizados em um gene ou em virtude de estarem localizados em um gene mas ambas as versões do gene produzem o mesmo produto proteico Existem dois modos de detectar um SNP O primeiro é sequenciar um segmento de DNA em cromossomos homólogos e comparar os segmentos homólogos para localizar as diferenças Um segundo modo é possível no caso de SNP localizados em um sítioalvo de uma enzima de restrição esses SNP são polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição RFLP do inglês restriction fragment length polymorphisms Nos referidos casos haverá dois alelos de RFLP ou morfos um dos quais apresenta o alvo da enzima de restrição enquanto o outro não apresenta A enzima de restrição cortará o DNA no SNP que contém o alvo e ignorará o outro SNP Os SNP são assim detectados como bandas diferentes em um gel de eletroforese Os sítios de RFLP podem estar entre ou dentro dos genes Polimorfismos de comprimento de sequência simples Uma das surpresas da análise genômica molecular é que a maior parte dos genomas contém uma grande quantidade de DNA repetitivo Além disso existem muitos tipos de DNA repetitivo Em uma extremidade do espectro estão as múltiplas repetições adjacentes de sequências de DNA curtas e simples A origem dessas repetições não está clara mas a característica que as torna úteis é que em indivíduos diferentes com frequência existem números diferentes de cópias Portanto essas repetições são denominadas polimorfismos de comprimento de sequência simples SSLP do inglês simple sequence length polymorphisms Por vezes elas também são denominadas repetições em tandem de número variável ou VNTR do inglês variable number tandem repeats Os SSLP comumente apresentam alelos múltiplos até 15 alelos foram encontrados em relação a um locus de SSLP Por consequência por vezes quatro alelos dois de cada genitor podem ser seguidos em um heredograma Dois tipos de SSLP são úteis no mapeamento e em outras análises do genoma os marcadores minissatélites e microssatélites A palavra satélite nessa conexão se refere à observação de que quando o DNA genômico é isolado e fracionado com a utilização de técnicas físicas as sequências repetitivas com frequência formam uma fração que está fisicamente separada do restante ou seja é uma fração satélite no sentido em que está separada da maior parte Marcadores minissatélites Um marcador minissatélite tem por base a variação no número de repetições em tandem de uma unidade de repetição com comprimento de 15 a 100 nucleotídios Em seres humanos o comprimento total da unidade é de 1 a 5 kb Os loci de minissatélites que apresentam a mesma unidade de repetição mas números diferentes de repetições estão dispersos por todo o genoma Marcadores microssatélite Um marcador microssatélite tem por base números variáveis de repetições em tandem de uma sequência ainda mais simples em geral um pequeno número de nucleotídios tal como um dinucleotídio O tipo mais comum é uma repetição de CA e do seu complemento GT como no exemplo a seguir 5 CACACACACACACACA 3 3 GTGTGTGTGTGTGTGT 5 Detecção de polimorfismos de comprimento de sequência simples Os polimorfismos de comprimento de sequência simples são detectados aproveitandose da vantagem de que regiões homólogas que contêm números diferentes de repetições em tandem serão de diferentes comprimentos Um procedimento comumente utilizado para revelar essas diferenças é utilizar as regiões flanqueadoras como primers em uma análise de PCR ver Capítulo 10 A PCR replica as sequências de DNA até que elas estejam disponíveis em quantidade suficiente para análises adicionais Os diferentes comprimentos dos produtos amplificados pela PCR podem ser detectados por meio das diferentes mobilidades das sequências em um gel de eletroforese No caso dos minissatélites os padrões produzidos no gel por vezes são denominados impressões digitais do DNA Tais impressões digitais são altamente individualizadas e portanto apresentam grande valor para a ciência forense conforme detalhado no Capítulo 18 Análise de recombinação com a utilização de marcadores moleculares Quando mapeamos a posição de um gene cujos fenótipos são determinados pela diferença de um único nucleotídio estamos efetivamente mapeando um SNP A mesma técnica utilizada para mapear os loci gênicos também pode ser utilizada para mapear os SNP que não determinam um fenótipo Suponha que um indivíduo apresente um par de bases GC digamos na posição 5658 no DNA de um cromossomo e um AT na posição 5658 no outro cromossomo Um referido indivíduo é um heterozigoto molecular ATGC em relação àquela posição do DNA Esse fato é útil para o mapeamento tendo em vista que um heterozigoto molecular ATGC pode ser mapeado justamente do mesmo modo que um heterozigoto fenotípico Aa O locus de um heterozigoto molecular pode ser inserido em um mapa cromossômico por meio da análise da frequência de recombinação exatamente do mesmo modo como é inserido o locus de alelos heterozigotos fenotípicos Esse princípio é mantido ainda que a variação normalmente seja uma diferença silenciosa talvez não em um gene Atuando como importantes marcos no mapa os marcadores moleculares são úteis para orientar o pesquisador em uma investigação para encontrar um gene de interesse Para compreender esse ponto considere os marcos reais eles são de pouco interesse por si próprios mas são muito úteis para lhe informar quão próximo você se encontra do seu destino Em um exemplo genético específico presumiremos que desejamos conhecer a posição no mapa de um gene de doença em camundongos talvez como um modo de detectálo em sua sequência de DNA Realizamos uma diversidade de cruzamentos Em cada um dos casos cruzamos um indivíduo portador do gene da doença com um indivíduo que carreia um de uma gama de diferentes marcadores moleculares cujas posições no mapa já são conhecidas Com a utilização da PCR os genitores e a progênie são classificados em relação aos marcadores moleculares de posição no mapa conhecida e em seguida é realizada a análise de recombinação para verificar se o gene de interesse está ligado a qualquer um deles O resultado desses cruzamentos pode revelar que o gene da doença está à distância de 2 um de um desses marcadores que denominaremos M Portanto o procedimento nos forneceu uma localização aproximada do gene da doença no cromossomo A localização do gene da doença humana fibrose cística foi originalmente descoberta por meio da sua ligação com marcadores moleculares que se sabia estarem localizados no cromossomo 7 Essa descoberta levou ao isolamento e ao sequenciamento do gene resultando na descoberta adicional de que ele codifica a proteína atualmente denominada reguladora de condutância transmembrana da fibrose cística CFTR do inglês cystic fibrosis transmembrane condutance regulator O gene da doença de Huntington também foi localizado desse modo levando à descoberta de que ele codifica uma proteína muscular denominada huntingtina O procedimento experimental em relação a um exemplo hipotético pode ser como segue Considere que A e a sejam os alelos do gene da doença e M1 e M2 sejam os alelos de um locus de marcador molecular específico Presuma que o cruzamento é Aa M1M2 aa M1M1 um tipo de cruzamentoteste A progênie seria classificada primeiramente em relação aos fenótipos A e a e em seguida o DNA seria extraído de cada indivíduo e sequenciado ou de outro modo avaliado a fim de determinar os alelos moleculares Presuma que obtemos os resultados a seguir Aa M1M1 49 Aa M2M1 1 aa M2M1 49 aa M1M1 1 Esses resultados nos informam que o cruzamentoteste tem obrigatoriamente a conformação a seguir A M1a M2 a M1a M1 e os dois genótipos da progênie à direita na lista têm de ser recombinantes fornecendo uma distância de mapa de 2 um entre o locus Aa e o locus molecular M1M2 Portanto agora sabemos a localização geral do gene no genoma e podemos estreitar ainda mais a sua localização com abordagens mais meticulosas Além disso diferentes marcadores moleculares podem ser mapeados entre si criandose um mapa que pode atuar como uma série de trampolins no caminho até algum gene com um fenótipo de interesse Embora o mapeamento de marcadores moleculares com a utilização do que efetivamente são cruzamentosteste seja o tipo mais simples de análise informativa em muitas análises tais como aquelas em seres humanos os marcadores moleculares não podem ser mapeados com a utilização de um cruzamentoteste Entretanto tendo em vista que cada alelo molecular apresenta a sua própria assinatura os produtos recombinantes e não recombinantes podem ser identificados a partir de qualquer meiose até mesmo em cruzamentos que não são cruzamentosteste Uma referida análise está diagramada na Figura 414 FIGURA 414 Um padrão de bandeamento de PCR é demonstrado em relação a uma família com seis filhos Tal padrão está interpretado na parte superior da ilustração com a utilização de quatro alelos microssatélites de tamanhos diferentes M a M Um desses marcadores M provavelmente está ligado em configuração cis ao alelo P da doença Nota este não é um cruzamentoteste ainda que seja informativo a respeito da ligação A Figura 415 contém alguns dados reais que demonstram como os marcadores moleculares podem contribuir para o mapa de um cromossomo humano Você pode observar que o número de marcadores moleculares mapeados excede em muito o número de genes mapeados com fenótipos mutantes Observe que os SNP em virtude de sua densidade ainda mais alta não podem ser representados em um mapa de cromossomo inteiro tal como aquele na Figura 415 uma vez que haveria milhares deles Um centimorgan 1 um do DNA humano é um segmento enorme estimado como 1 megabase 1 Mb 1 milhão de pares de bases ou 1000 kb Portanto você pode verificar a necessidade de marcadores moleculares próximos para uma análise meticulosa de distâncias menores Observe que o DNA equivalente a 1 um varia muito entre as espécies por 44 exemplo no parasita da malária Plasmodium falciparum 1 um 17 kb CONCEITOCHAVE Os loci de qualquer heterozigosidade do DNA podem ser mapeados e utilizados como marcadores cromossômicos moleculares ou marcos Mapeamento de centrômeros com tétrades lineares Centrômeros não são genes mas regiões do DNA das quais a reprodução ordenada dos organismos vivos depende totalmente e portanto são de grande interesse em genética Na maior parte dos eucariotos a análise de recombinação não pode ser utilizada para mapear os loci dos centrômeros tendo em vista que eles não demonstram heterozigosidade que lhes possibilite serem utilizados como marcadores Entretanto nos fungos que produzem tétrades lineares ver Capítulo 3 os centrômeros podem ser mapeados Utilizaremos o fungo Neurospora como um exemplo Relembre que em fungos haploides tais como Neurospora os núcleos haploides de cada genitor se fundem para formar um diploide temporário que é submetido a divisões meióticas ao longo do eixo longitudinal do asco e assim cada meiócito produz um arranjo linear de oito ascósporos denominado óctade Esses oito ascósporos constituem os quatro produtos da meiose uma tétrade mais uma mitose pósmeiótica Marcadores fenotípicos e moleculares mapeados no cromossomo humano 1 FIGURA 415 O diagrama demonstra a distribuição de todas as diferenças genéticas que haviam sido mapeadas no cromossomo 1 na ocasião em que este diagrama foi desenhado Alguns marcadores são genes de fenótipos conhecidos seus números estão sombreados em verde mas a maior parte é de marcadores de DNA polimórficos os números sombreados em malva e azul representam duas classes diferentes de marcadores moleculares Um mapa de ligação que ilustra um conjunto bemespaçado destes marcadores com base nas análises da frequência de recombinantes do tipo descrito neste capítulo está no centro da ilustração As distâncias de mapa estão demonstradas em centimorgans cM Com um comprimento total de 356 cM o cromossomo 1 é o mais longo dos cromossomos humanos Também foram localizados alguns marcadores no mapa citogenético do cromossomo 1 mapa à direita denominado um idiograma por meio da utilização das técnicas descritas posteriormente neste capítulo A existência de marcadores em comum nos diferentes mapas genéticos possibilita que as localizações de outros genes e marcadores moleculares sejam estimadas em cada mapa Dados de B R Jasny et al Science 30 de setembro de 1994 Em sua forma mais simples o mapeamento do centrômero considera um locus gênico e indaga quão distante esse locus está do centrômero O método tem por base o fato de que um padrão diferente de alelos aparecerá em uma tétrade linear ou uma óctade que tenha se originado de uma meiose com um crossover entre um gene e seu centrômero Considere um cruzamento entre dois indivíduos cada um deles apresentando um alelo diferente em um locus digamos A a A lei da segregação igual de Mendel dita que em uma óctade sempre haverá quatro ascósporos do genótipo A e quatro do genótipo a mas como eles estarão dispostos Se não houve crossover na região entre Aa e o centrômero haverá dois blocos adjacentes de quatro ascósporos na óctade linear ver Figura 310 no Capítulo 3 Entretanto se houve um crossover naquela região haverá um de quatro padrões diferentes na óctade cada um dos padrões demonstrando blocos de dois alelos idênticos adjacentes Alguns dados de um cruzamento real de A a estão demonstrados na tabela a seguir Óctades A a A a A a A a A a A a A a a A a A A a a A a A a A A a a A a A A a a A a A a A A a a A a A A a 126 132 9 11 10 12 Total 300 As primeiras duas colunas à esquerda são de meioses sem crossover na região entre o locus A e o centrômero A letra M é utilizada para fazer referência a um tipo de segregação na meiose Os padrões em relação às primeiras duas colunas são denominados padrões de MI ou padrões de segregação de primeira divisão tendo em vista que os dois alelos diferentes segregam para dois núcleos filhos na primeira divisão da meiose As outras quatro colunas são todas de meiócitos com um crossover Esses padrões são denominados padrões de segregação de segunda divisão MII tendo em vista que como um resultado do crossover na região entre o centrômero e o locus os alelos A e a ainda estão juntos nos núcleos ao término da primeira divisão da meiose Figura 416 Não houve segregação na primeira divisão Entretanto a segunda divisão meiótica segrega os alelos A e a em núcleos separados Os outros padrões são produzidos de modo semelhante a diferença é que as cromátides se movimentam em direções diferentes na segunda divisão Figura 417 Você pode observar que a frequência de óctades com um padrão de MII deve ser proporcional ao tamanho da região do centrômero até Aa e pode ser utilizada como uma medida do tamanho daquela região Em nosso exemplo a frequência de MII é 42300 14 Essa porcentagem significa que o locus Aa está a 14 um do centrômero A resposta é não mas esse valor poderia ser utilizado para calcular o número de unidades de mapa O valor de 14 é uma porcentagem da meiose que não é o modo como as unidades de mapa são definidas As unidades de mapa são definidas como a porcentagem de cromátides recombinantes oriundas da meiose Tendo em vista que um crossover em qualquer meiose resulta em apenas 50 de cromátides recombinantes quatro entre oito ver Figura 417 é preciso dividir os 14 por 2 para converter a frequência de MII uma frequência de meiose em unidades de mapa uma frequência de cromátides recombinantes Portanto essa região tem obrigatoriamente um comprimento de 7 um e essa medida pode ser introduzida no mapa daquele cromossomo FIGURA 416 A e a segregamse em núcleos separados na segunda divisão meiótica quando existe um crossover entre o centrômero e o locus A 45 FIGURA 417 Na segunda divisão meiótica os centrômeros se ligam ao fuso aleatoriamente produzindo os quatro arranjos demonstrados Os quatro arranjos são igualmente frequentes Utilização do teste do quiquadrado para inferir ligação O teste genético padrão em relação à ligação é um cruzamentoteste dihíbrido Considere um cruzamento geral daquele tipo no qual não se sabe se os genes estão ligados ou não Aa Bb aa bb Se não existe ligação ou seja se os genes se distribuem de modo independente observamos a partir das discussões neste capítulo e no Capítulo 3 que as proporções fenotípicas a seguir são esperadas na progênie A B 025 A b 025 a B 025 a b 025 Foi realizado um cruzamento desse tipo e os fenótipos a seguir foram obtidos em uma amostra da progênie de 200 A B 60 A b 37 a B 41 a b 62 Claramente existe um desvio da previsão de nenhuma ligação que teria proporcionado os números de progênie de 50505050 Os resultados sugerem que o dihíbrido apresentava uma configuração cis de genes ligados A Ba b tendo em vista que as progênies A B e a b são a maioria A frequência de recombinantes seria 37 41200 78200 39 ou 39 um Entretanto sabemos que desvios ao acaso em virtude de erro de amostragem podem fornecer resultados que se assemelham àqueles produzidos pelos processos genéticos portanto precisamos do teste do χ² pronunciado qui quadrado para nos ajudar a calcular a probabilidade de um desvio ao acaso dessa magnitude de uma proporção de 1111 Primeiramente examinemos as proporções de alelos em relação a ambos os loci Essas são de 97103 para Aa e 10199 para Bb Os referidos números estão próximos das proporções de alelos de 11 esperadas a partir da primeira lei de Mendel de modo que proporções de alelos distorcidas não podem ser responsáveis pelos desvios consideravelmente grandes dos números esperados de 50505050 É preciso aplicar a análise do χ² para testar uma hipótese de nenhuma ligação Se a hipótese for rejeitada podemos inferir a ligação Não podemos testar uma hipótese de ligação diretamente tendo em vista que não temos como prever qual frequência de recombinantes deve ser testada O cálculo para o teste da ausência de ligação é como segue Observado O Esperado E O E O E² O E² E 60 50 10 100 200 46 37 50 13 169 338 41 50 9 81 162 62 50 12 144 288 χ² Σ O E²E para todas as classes 988 Tendo em vista que existem quatro classes genotípicas é preciso utilizar 4 1 3 graus de liberdade Consultando a tabela do quiquadrado no Capítulo 3 observamos que nossos valores de 988 e 3 gl fornecem um valor p de aproximadamente 0025 ou 25 Esse é inferior ao valor de corte padrão de 5 e assim podemos rejeitar a hipótese de nenhuma ligação Portanto chegamos à conclusão de que os genes muito provavelmente estão ligados com distância de aproximadamente 39 um Observe retrospectivamente que foi muito importante assegurar que os alelos estavam segregando a 11 para evitar uma hipótese composta de proporções de alelos de 11 e nenhuma ligação Se rejeitássemos uma referida hipótese composta não saberíamos qual parte dela seria responsável pela rejeição Cômputo de crossovers múltiplos não visualizados Na discussão sobre o cruzamentoteste de três pontos algumas cromátides parentais não recombinantes resultaram de crossovers duplos Esses crossovers inicialmente não podem ser contados na frequência de recombinantes distorcendo os resultados Essa situação leva à noção preocupante de que todas as distâncias de mapa com base na frequência de recombinantes podem ser subestimativas das distâncias físicas tendo em vista que podem ter ocorrido crossovers múltiplos não detectados alguns produtos dos quais não seriam recombinantes Foram desenhadas diversas abordagens matemáticas criativas para contornar o problema do crossover múltiplo Observaremos dois métodos Primeiramente examinamos um método originalmente trabalhado por J B S Haldane nos primórdios da genética Função de mapeamento A abordagem trabalhada por Haldane foi o planejamento de uma função de mapeamento uma fórmula que relaciona um valor de frequência de recombinantes observado com uma distância de mapa corrigida em relação a crossovers múltiplos A abordagem relaciona FR com o número médio de crossovers m que devem ter ocorrido naquele segmento cromossômico pela meiose e em seguida deduz qual distância de mapa esse valor m deve ter produzido Para encontrar a relação de FR com m primeiramente devemos pensar a respeito dos desfechos das diversas possibilidades de crossover Em qualquer região cromossômica devemos esperar meioses com 0 1 2 3 4 ou mais crossovers Surpreendentemente a única classe que é realmente crucial é a classe zero Para saber o motivo considere o que segue Um fato curioso porém não intuitivo é que qualquer quantidade de crossovers produz uma frequência de 50 de recombinantes naquelas meioses A Figura 418 comprova essa declaração em relação a crossovers únicos e duplos como exemplos mas isso é verdadeiro em relação a qualquer número de crossovers Portanto o verdadeiro determinante da FR é o tamanho relativo das classes sem crossovers a classe zero em comparação às classes com qualquer número não zero de crossovers Agora a tarefa é calcular o tamanho da classe zero A ocorrência de crossovers em uma região cromossômica específica é bem descrita por meio de uma distribuição estatística denominada distribuição de Poisson A fórmula de Poisson em geral descreve a distribuição dos sucessos em amostras quando a probabilidade média de sucessos é baixa Um exemplo ilustrativo é mergulhar uma pequena rede em um lago de peixes a maior parte das imersões não pegará peixes uma proporção menor pegará um peixe uma proporção ainda menor pegará dois e assim por diante Essa analogia pode ser aplicada diretamente a uma região cromossômica que apresentará 0 1 2 crossovers de sucesso em diferentes meioses e assim por diante A fórmula de Poisson fornecida aqui nos informará a proporção das classes com diferentes números de crossovers fi emmii Qualquer número de crossovers fornece 50 de recombinantes FIGURA 418 Demonstração de que a FR média é de 50 em relação a meioses nas quais o número de crossovers não é zero As cromátides recombinantes são marrons Crossovers duplos de dois filamentos produzem todos os tipos parentais Assim todas as cromátides são laranja Observe que todos os crossovers são entre cromátides não irmãs Tente você mesmo a classe de crossover triplo Os termos na fórmula apresentam os significados a seguir e A base dos logaritmos naturais aproximadamente 27 m O número médio de sucessos em um tamanho definido de amostra i O número real de sucessos em uma amostra desse tamanho fi A frequência das amostras que contém i sucessos O símbolo de fatorial p ex 5 5 4 3 2 1 A distribuição de Poisson nos informa que a frequência da classe i 0 a classe chave é Tendo em vista que m0 e 0 são iguais a 1 a fórmula é reduzida a em Agora podemos escrever uma função que relaciona FR com m A frequência da classe com qualquer número não zero de crossovers será 1 em e nessas meioses 50 12 dos produtos serão recombinantes Assim FR 1 em e essa fórmula é a função do mapeamento que estávamos buscando Observemos um exemplo no qual FR é convertida em uma distância de mapa corrigida em relação a crossovers múltiplos Presuma que em um cruzamento teste obtemos um valor de FR de 275 0275 Substituindo esse valor na função podemos calcular m 0275 1 em Assim em 1 2 0275 045 Ao utilizar uma calculadora para encontrar o logaritmo natural ln de 045 podemos deduzir que m 08 Ou seja em média existe 08 crossover por meiose naquela região cromossômica A etapa final é converter essa medida da frequência de crossover para fornecer uma distância de mapa corrigida Tudo o que precisamos fazer para a conversão em unidades de mapa corrigidas é multiplicar a frequência média de crossover calculada por 50 tendo em vista que em média um crossover produz uma frequência de recombinantes de 50 Portanto no exemplo numérico antecedente o valor m de 08 pode ser convertido em uma fração recombinante corrigida de 08 50 40 um corrigidas Observamos que de fato esse valor é substancialmente maior do que as 275 um que teríamos deduzido a partir da FR observada Observe que a função de mapeamento explica de modo organizado porque o valor máximo da FR para genes ligados é de 50 Na medida em que m se torna muito grande em tende a zero e a FR tende a 12 ou 50 Fórmula de Perkins Para os fungos e outros organismos que produzem tétrades existe outro modo de compensar os crossovers múltiplos especificamente crossovers duplos o tipo mais comum esperado Na análise de tétrades de dihíbridos em geral apenas três tipos de tétrades são possíveis quando classificadas com base na presença de genótipos parentais e recombinantes nos produtos A classificação das tétrades tem por base a existência de dois ditipo ou quatro tetratipo genótipos Nos ditipos existem duas classes parental que demonstra dois genótipos parentais e não parental que demonstra dois genótipos não parentais A partir de um cruzamento AB ab elas são Ditipo parental DP Tetratipo T Ditipo não parental DNP A B A B A b A B A b A b a b a B a B a b a b a B Os genótipos recombinantes estão demonstrados em vermelho Se os genes estiverem ligados uma abordagem simples para mapear sua distância pode ser a utilização da fórmula a seguir Distância de mapa FR 100 DNP T tendo em vista que essa fórmula fornece a porcentagem de todos os recombinantes Entretanto na década de 1960 David Perkins desenvolveu uma fórmula que compensa os efeitos de crossovers duplos A fórmula de Perkins portanto proporciona uma estimativa mais exata da distância de mapa Distância de mapa corrigida 50 T 6 DNP Não desmembraremos mais essa fórmula a não ser para dizer que ela tem por base os totais das classes de DP T e DNP esperadas a partir de meioses com 0 1 e 2 crossovers ela presume que números mais altos são cada vez mais raros Observemos um exemplo da sua utilização Em nosso cruzamento hipotético de A B a b as frequências observadas das classes de tétrades são DP 056 T 041 e DNP 003 Ao utilizar a fórmula de Perkins observamos que a distância de mapa corrigida entre os loci a e b é 50 041 6 003 50 059 295 um Comparemos esse valor com o valor não corrigido obtido diretamente da FR Ao utilizar os mesmos dados encontramos 47 Distância de mapa não corrigida 100 T DNP 100 0205 003 235 um Essa distância é 6 um inferior à estimativa que obtivemos por meio da utilização da fórmula de Perkins tendo em vista que não a corrigimos em relação a crossovers duplos Como um comentário à parte quais valores de DP DNP e T são esperados quando lidamos com genes não ligados Os tamanhos das classes de DP e DNP serão iguais como um resultado da distribuição independente A classe T pode ser produzida apenas a partir de um crossover entre qualquer um dos dois loci e seus respectivos centrômeros e portanto o tamanho da classe T dependerá do tamanho total das duas regiões que estão localizadas entre o locus e o centrômero Entretanto a fórmula T DNP sempre deve produzir 050 refletindo a distribuição independente CONCEITOCHAVE A tendência inerente de crossovers múltiplos de levar a uma subestimativa da distância de mapa pode ser contornada por meio da utilização das funções de mapa em qualquer organismo e pela fórmula de Perkins em organismos que produzem tétrades tais como fungos Utilização de mapas com base em recombinação em conjunto com mapas físicos Os mapas de recombinação têm sido o principal tópico deste capítulo Eles demonstram os loci de genes em relação aos quais foram observados alelos mutantes e seus fenótipos mutantes As posições desses loci em um mapa são determinadas com base na frequência de recombinantes na meiose Presumese que a frequência de recombinantes seja proporcional à distância que separa dois loci no cromossomo portanto a frequência de recombinantes se torna a unidade de mapeamento O referido mapeamento com base na recombinação de genes com fenótipos mutantes conhecidos vem sendo realizado por quase um século Observamos como os sítios de heterozigosidade molecular não associados a fenótipos mutantes também podem ser incorporados a esses mapas de recombinação Assim como qualquer sítio heterozigoto esses marcadores moleculares são mapeados por meio de recombinação e em seguida são utilizados para navegar em direção a um gene de interesse biológico Realizamos a presunção perfeitamente razoável de que um mapa de recombinação representa o arranjo de genes nos cromossomos mas conforme declarado anteriormente esses mapas na realidade são constructos hipotéticos Contrariamente os mapas físicos são o mais próximo do mapa genômico real que a ciência consegue obter O tópico dos mapas físicos será examinado mais de perto no Capítulo 14 mas podemos indicálo aqui Um mapa físico é simplesmente um mapa do DNA genômico real uma sequência de nucleotídios muito longa que demonstra onde os genes estão a sua sequência quão grandes eles são o que se encontra entre eles e outros marcos de interesse As unidades de distância em um mapa físico são os números de bases do DNA por conveniência o quilobase é a unidade preferida A sequência completa de uma molécula de DNA é obtida por meio do sequenciamento de grandes números de pequenos fragmentos genômicos e em seguida da sua montagem em uma sequência integral A sequência em seguida é examinada por um computador programado para procurar por segmentos semelhantes a genes reconhecidos por meio de sequências de bases características incluindo sequências de sinal conhecidas em relação ao início e ao término da transcrição Quando o programa de computador encontra um gene ele compara sua sequência com a base de dados pública de outros genes sequenciados em relação aos quais foram descobertas as funções em outros organismos Em muitos casos ocorre um achado em outras palavras a sequência se assemelha de modo próximo àquela de um gene de função conhecida em outra espécie Nos referidos casos as funções dos dois genes também podem ser semelhantes A similaridade de sequência com frequência próxima dos 100 é explicada pela herança do gene a partir de algum ancestral comum e pela conservação geral de sequências funcionais durante o período evolutivo Outros genes descobertos pelo computador não demonstram similaridade de sequência com qualquer gene de função conhecida Portanto eles podem ser considerados genes em busca de uma função É claro que na realidade é o pesquisador não o gene que realiza a procura e que deve encontrar a função O sequenciamento de diferentes indivíduos membros de uma população também pode produzir sítios de heterozigosidade molecular os quais assim como o fazem nos mapas de recombinação atuam como marcadores de orientação no mapa físico Tendo em vista que atualmente estão disponíveis mapas físicos em relação à maior parte dos principais organismosmodelo genéticos realmente existe necessidade de mapas de recombinação Eles poderiam ser considerados obsoletos A resposta é que ambos os mapas são utilizados em conjunto para triangular a determinação da função gênica um princípio ilustrado anteriormente pelos mapas de Londres A abordagem geral está ilustrada na Figura 419 que demonstra um mapa físico e um mapa de recombinação da mesma região de um genoma Ambos os mapas contêm genes e marcadores moleculares Na parte inferior da Figura 419 observamos uma seção de um mapa com base na recombinação com as posições dos genes em relação aos quais foram encontrados e mapeados fenótipos mutantes Nem todos os genes naquele segmento estão incluídos Em relação a alguns desses genes pode ter sido descoberta uma função com base em estudos bioquímicos ou outros estudos de linhagens mutantes os genes em relação às proteínas A e B são exemplos O gene na parte intermediária é um gene de interesse que um pesquisador observou afetar o aspecto do desenvolvimento que está sendo estudado Para determinar a sua função o mapa físico pode ser útil Os genes no mapa físico que estão na região geral do gene de interesse no mapa de recombinação se tornam genes candidatos qualquer um dos quais pode ser o gene de interesse São necessários estudos adicionais para estreitar a escolha até um Se aquele caso único for um gene cuja função é conhecida em outros organismos então é sugerida uma função para o gene de interesse Desse modo o fenótipo mapeado no mapa de recombinação pode ser associado a uma função deduzida a partir do mapa físico Marcadores moleculares em ambos os mapas não demonstrados na Figura 419 podem ser alinhados para auxiliar no processo de seleção Portanto observamos 48 que ambos os mapas contêm elementos da função o mapa físico demonstra a possível ação de um gene no nível celular enquanto o mapa de recombinação contém informação relacionada ao efeito do gene no nível fenotípico Em algum estágio os dois precisam ser combinados para a compreensão da contribuição do gene para o desenvolvimento do organismo Existem diversas outras técnicas de mapeamento genético algumas das quais encontraremos nos Capítulos 5 18 e 19 FIGURA 419 Comparação das posições relativas em mapas físicos e de recombinação pode conectar o fenótipo a uma função gênica desconhecida CONCEITOCHAVE A união dos mapas físico e de recombinação permite atribuir uma função bioquímica a um gene identificado por meio de seu fenótipo mutante Mecanismo molecular de crossover Neste capítulo analisamos as consequências genéticas do processo citologicamente visível de crossover sem nos preocuparmos a respeito do mecanismo do crossing over Entretanto o crossing over por si próprio é um processo molecular extraordinário como duas grandes moléculas de DNA espiraladas podem trocar segmentos com tamanha precisão que nenhum nucleotídio é perdido ou ganho Estudos em óctades de fungos forneceram um indício Embora a maior parte das óctades demonstre a esperada segregação de alelos de 44 tais como 4A4a algumas óctades raras demonstram proporções aberrantes Existem diversos tipos mas como um exemplo utilizaremos óctades de 53 sejam 5A3a ou 5a3A Dois aspectos são peculiares dessa proporção Primeiramente existem muitos esporos de um alelo e muito poucos do outro Em segundo lugar existe um par de esporosirmãos não idêntico Normalmente a replicação pósmeiótica origina pares de esporosirmãos idênticos como segue a tétrade A A a a se torna AAAA aaaa os hifens demonstram esporosirmãos Contrariamente uma óctade aberrante de 5A3a deve ser AA AA Aa aa Em outras palavras existe um par de esporosirmãos não idêntico em negrito A observação de um par de esporosirmãos não idêntico sugere que o DNA de um dos quatro homólogos meióticos finais contém DNA heterodúplex O DNA heterodúplex é o DNA no qual existe um par de nucleotídios incorretamente pareados no gene em estudo A lógica é como segue Se em um cruzamento de A a um alelo A for GC e o outro alelo a for AT os dois alelos normalmente se replicam fielmente Entretanto um heterodúplex que se forma apenas raramente seria um par de nucleotídios incorretamente pareados tal como GT ou AC efetivamente uma molécula de DNA que contém ambas as informações de A e a Observe que um heterodúplex envolve apenas a posição de um nucleotídio o segmento de DNA adjacente pode ser como segue onde o sítio do heterodúplex está demonstrado em negrito GCTAATGTTATTAG CGATTATAATAATC Na replicação para formar uma óctade um heterodúplex GT seria separado e replicado fielmente com a ligação de G com C e a ligação de A com T O resultado seria um par de esporos não idênticos de GC alelo A e AT alelo a Observouse que esporosirmãos não idênticos e em geral óctades aberrantes estão estatisticamente correlacionados com o crossing over na região do gene em questão fornecendo uma indicação importante de que o crossing over poderia basearse na formação de DNA heterodúplex No modelo atualmente aceito acompanheo na Figura 420 ambos o DNA heterodúplex e um crossover são produzidos por uma quebra do filamento duplo no DNA de uma das cromátides que participam no crossover Vejamos como isto ocorre Estudos moleculares demonstram que as extremidades do DNA quebradas promoverão a recombinação entre diferentes cromátides Na etapa 1 ambos os filamentos de uma cromátide quebram no mesmo local A partir da quebra o DNA é erodido na extremidade 5 de cada filamento quebrado deixando ambas as extremidades 3 em filamento simples etapa 2 Um dos filamentos simples invade o DNA da outra cromátide participante ou seja ele entra no centro da hélice e dos pares de bases com a sua sequência homóloga etapa 3 deslocando o outro filamento Em seguida a ponta do filamento invasor utiliza a sequência adjacente como um molde para a nova polimerização que prossegue forçando os dois filamentos residentes da hélice a se separarem etapa 4 Ligações de hidrogênio formamse entre a alça de filamento simples deslocada e o outro filamento simples o filamento azul na figura Se a invasão e o deslocamento do filamento abrangerem um sítio de heterozigosidade tal como Aa então é formada uma região de DNA heterodúplex A replicação também ocorre a partir da outra extremidade do filamento simples para preencher o espaço deixado pelo filamento invasor também demonstrado no filamento azul superior na etapa 4 da Figura 420 As extremidades replicadas são seladas e o resultado líquido é uma estrutura estranha com duas junções de filamento simples denominadas junções de Holliday em homenagem ao seu proponente original Robin Holliday Essas junções são sítios potenciais de quebra e reunião de filamentos simples os dois referidos eventos demonstrados pelos dardos na figura levam então a um crossover completo de filamento duplo etapa 5 O crossing over cria DNA heteroduplex FIGURA 420 Um modelo molecular de crossing over Apenas as duas cromátides azul e vermelha que participam no crossover estão demonstradas O sentido do filamento 3 para 5 consta de ambos para maior clareza As cromátides diferem em um sítio GC em um alelo talvez o alelo A e AT no outro talvez a Apenas o desfecho com DNA heterodúplex incorretamente pareado e um crossover estão demonstrados Os produtos finais do crossover estão sombreados em amarelo e azul Observe que quando o filamento invasor utiliza o DNA invadido como molde para a replicação isso resulta automaticamente em uma cópia extra da sequência invadida à custa da sequência invasora explicando assim o afastamento da proporção esperada de 44 Esse mesmo tipo de recombinação ocorre em muitos locais cromossômicos diferentes nos quais a invasão e o deslocamento do filamento não abrangem um sítio heterozigoto mutante Aqui seria formado um DNA que é heterodúplex no sentido em que é composto por filamentos de cada cromátide participante mas não haveria um par de nucleotídios incorretamente pareados e a óctade resultante conteria apenas pares de esporos idênticos Aquelas ocasiões raras nas quais a invasão e a polimerização abrangem um sítio heterozigoto são simplesmente casos de sorte que forneceram a indicação em relação ao mecanismo de crossing over CONCEITOCHAVE Um crossover é iniciado por meio de uma quebra do filamento duplo no DNA de uma cromátide na meiose Seguese uma série de eventos moleculares que finalmente produzem o crossover de moléculas de DNA Além disso se o sítio do crossover estiver próximo de um sítio de heterozigosidade do DNA na meiose podem ser produzidas proporções não mendelianas aberrantes de alelos em relação ao sítio heterozigoto RESUMO Em um cruzamentoteste dihíbrido em Drosophila Thomas Hunt Morgan encontrou um desvio da lei de Mendel sobre a distribuição independente Ele postulou que os dois genes estavam localizados no mesmo par de cromossomos homólogos Essa relação é denominada ligação A ligação explica por que as combinações gênicas parentais permanecem juntas mas não como surgem as combinações recombinantes não parentais Morgan postulou que na meiose pode haver uma troca física de partes dos cromossomos por meio de um processo atualmente denominado crossover Um resultado da quebra física e da reunião de partes dos cromossomos o crossover ocorre no estágio de quatro cromátides da meiose Portanto existem dois tipos de recombinação meiótica A recombinação por meio da distribuição independente mendeliana resulta em uma frequência de recombinantes de 50 O crossover resulta em uma frequência de recombinantes em geral inferior a 50 Na medida em que Morgan estudava mais genes ligados ele descobriu muitos valores diferentes em relação à frequência de recombinantes e ponderou se esses valores correspondiam às distâncias reais entre genes em um cromossomo Alfred Sturtevant um aluno de Morgan desenvolveu um método para determinar a distância entre genes em um mapa de ligação com base na FR O modo mais fácil de medir a FR é com um cruzamentoteste de um dihíbrido ou trihíbrido Os valores de FR calculados como porcentagens podem ser utilizados como unidades de mapa para construir um mapa cromossômico que demonstre os loci dos genes analisados Em fungos ascomicetos os centrômeros também podem ser localizados no mapa por meio da medição das frequências de segregação da segunda divisão Os polimorfismos de nucleotídio único SNP são diferenças de um único nucleotídio nas sequências do DNA Os polimorfismos de comprimento de sequência simples SSLP são diferenças no número de unidades repetidas Os SNP e SSLP podem ser utilizados como marcadores moleculares para o mapeamento de genes Embora o teste básico em relação à ligação seja o desvio da distribuição independente um referido desvio pode não ser óbvio em um cruzamentoteste e é necessário um teste estatístico O teste do χ² que nos informa com que frequência as observações se desviam das expectativas puramente ao acaso é particularmente útil para determinar se os loci estão ligados Alguns crossovers múltiplos podem resultar em cromátides não recombinantes levando a uma subestimativa da distância de mapa com base na FR A função de mapeamento aplicável em qualquer organismo corrige em relação a essa tendência A fórmula de Perkins apresenta a mesma utilização na análise de tétrades de fungos Em geral na genética o mapa de loci com base na recombinação que confere os fenótipos mutantes é utilizado em conjunto com um mapa físico como a sequência completa do DNA que demonstra todas as sequências semelhantes a genes O conhecimento da posição do gene em ambos os mapas possibilita associar a função celular ao efeito do gene no fenótipo Acreditase que o mecanismo de crossover tenha início com uma quebra do filamento duplo em uma cromátide participante A erosão deixa as extremidades em filamento simples Um filamento simples invade a duplahélice da outra cromátide participante levando à formação do DNA heterodúplex Os espaços são preenchidos por polimerização A resolução molecular dessa estrutura se torna um crossover de filamento duplo total no nível do DNA TERMOSCHAVE centimorgan cM coeficiente de coincidência cdc conformação cis conformação trans crossing over cruzamento de três fatores cruzamentoteste de três pontos distribuição de Poisson DNA heterodúplex frequência de recombinantes FR função de mapeamento genes ligados impressões digitais do DNA interferência locus mapa cromossômico mapa de ligação mapa de recombinação mapa físico marcador microssatélite marcador minissatélite marcador molecular óctade padrão de segregação de primeira divisão padrão de MI padrão de segregação de segunda divisão padrão de MII polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição RFLP polimorfismo de comprimento de sequência simples SSLP polimorfismo de nucleotídio único SNP produto de crossover quebra do filamento duplo repetições em tandem de número variável VNTR unidade de mapa genético um PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 Um heredograma humano demonstra pessoas afetadas pela rara síndrome unhapatela unhas e rótulas deformadas e fornece o genótipo do grupo sanguíneo AB0 de cada pessoa Ambos os loci em questão são autossômicos Estude o heredograma a seguir a A síndrome unhapatela é um fenótipo dominante ou recessivo Forneça os motivos para amparar sua resposta b Existe evidência de ligação entre o gene relacionado à unhapatela e o gene do tipo sanguíneo AB0 conforme analisado a partir desse heredograma Por que sim ou por que não c Se houver evidência de ligação em seguida desenhe os alelos nos homólogos relevantes dos avós Se não houver evidência de ligação desenhe os alelos em dois pares homólogos d De acordo com o seu modelo quais descendentes da geração II são recombinantes e Qual é a melhor estimativa de FR f Se o homem III1 se casar com uma mulher normal de tipo sanguíneo O qual é a probabilidade de que seu primeiro filho seja do tipo sanguíneo B com síndrome unhapatela Solução a A síndrome unhapatela é mais provavelmente dominante Énos informado que ela é uma anormalidade rara e assim as pessoas não afetadas que se casam com pessoas da família provavelmente não carreiam um alelo presumidamente recessivo para a síndrome unhapatela Deixe que N seja o alelo causador Então todas as pessoas com a síndrome são heterozigotas Nn tendo em vista que todas provavelmente incluindo a avó resultam de cruzamentos com pessoas normais nn Observe que a síndrome aparece em todas as três gerações outra indicação de herança dominante b Existe evidência de ligação Observe que a maior parte das pessoas afetadas aquelas que carregam o alelo N também carregam o alelo IB mais provavelmente esses alelos estão ligados no mesmo cromossomo A avó deve carregar ambos os alelos recessivos para produzir descendência de genótipo ii e nn d Observe que o cruzamento dos avós é equivalente a um cruzamentoteste assim os recombinantes na geração II são II5 n IBn i e II8 N in i enquanto todos os outros são não recombinantes sendo N IBn i ou n in i e Observe que o cruzamento dos avós e os primeiros dois cruzamentos na geração II são idênticos e são cruzamentosteste Três da progênie total de 16 são recombinantes II5 II8 e III3 O cruzamento de II6 com II7 não é um cruzamentoteste mas podese deduzir que os cromossomos doados de II6 são não recombinantes Portanto FR 318 que é 17 As duas classes parentais são sempre iguais e assim também são as duas classes recombinantes Portanto a probabilidade de que o primeiro filho apresente síndrome unhapatela e grupo sanguíneo tipo B é de 415 Problema resolvido 2 O alelo b proporciona às moscas Drosophila um corpo preto e b proporciona uma cor marrom o fenótipo do tipo selvagem O alelo wx de um gene separado proporciona asas cerosas e wx proporciona não cerosas o fenótipo do tipo selvagem O alelo cn de um terceiro gene proporciona olhos cor de cinábrio e cn proporciona olhos vermelhos o fenótipo do tipo selvagem Uma fêmea heterozigota em relação a esses três genes é submetida a um cruzamento teste e uma progênie de 1000 é classificada como segue 5 do tipo selvagem 6 pretas cerosas cinábrio 69 cerosas cinábrio 67 pretas 382 cinábrio 379 pretas cerosas 48 cerosas e 44 pretas cinábrio Observe que um grupo da progênie pode ser especificado por meio da listagem apenas dos fenótipos mutantes a Explique esses números b Desenhe os alelos em suas posições adequadas nos cromossomos do heterozigoto triplo c Se apropriado de acordo com a sua explicação calcule a interferência Solução a Um conselho geral é ser metódico Aqui é uma boa ideia escrever os genótipos que podem ser inferidos a partir dos fenótipos O cruzamento é um cruzamento teste do tipo bb wxwx cncn bb wxwx cncn Observe que existem pares distintos de classes de progênie em relação à frequência Já podemos adivinhar que as duas classes maiores representam cromossomos parentais que as duas classes de aproximadamente 68 representam crossovers únicos em uma região que as duas classes de aproximadamente 45 representam crossovers únicos na outra região e que as duas classes de aproximadamente 5 representam crossovers duplos Podemos escrever a progênie como classes derivadas dos gametas femininos agrupados como segue b wx cn 382 b wx cn 379 b wx cn 69 b wx cn 67 b wx cn 48 b wx cn 44 b wx cn 6 b wx cn 5 1000 Listar as classes desse modo confirma que os pares de classes são de fato genótipos recíprocos que surgem de zero um ou dois crossovers Primeiramente tendo em vista que não conhecemos os genitores da fêmea heterozigota tripla aparentemente não podemos aplicar a definição de recombinação na qual os genótipos gaméticos são comparados aos dois genótipos parentais que formam uma mosca individual Mas com a reflexão os únicos tipos parentais que fazem sentido em relação aos dados apresentados são bb wxwx cncn e bb wxwx cncn tendo em vista que esses tipos representam as classes gaméticas mais comuns Agora podemos calcular as frequências de recombinantes Em relação a bwx em relação a bcn e em relação a wxcn Portanto o mapa é b Os cromossomos parentais no heterozigoto triplo são c O número esperado de recombinantes duplos é 0103 0147 1000 15141 O número observado é 6 5 11 e assim a interferência pode ser calculada como I 1 1115141 1 0726 0274 274 Problema resolvido 3 É realizado um cruzamento entre uma linhagem haploide de Neurospora de genótipo nic ad e outra linhagem haploide de genótipo nic ad A partir desse cruzamento um total de 1000 ascos lineares é isolado e categorizado como na tabela a seguir Mapeie os loci ad e nic em relação aos centrômeros e uns aos outros 1 2 3 4 5 6 7 nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic nic ad nic ad nic ad ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad nic ad 808 1 90 5 90 1 5 Solução Em quais princípios podemos nos inspirar para solucionar este problema É uma boa ideia iniciar realizando algo direto que é calcular as duas distâncias do locus até o centrômero Não sabemos se os loci ad e nic estão ligados mas não precisamos saber As frequências dos padrões de MII em relação a cada locus fornecem a distância do locus até o centrômero Podemos nos preocupar se é o mesmo centrômero posteriormente Relembre que um padrão de MII é qualquer padrão que não é dois blocos de quatro Iniciemos com a distância entre o locus nic e o centrômero Tudo o que precisamos fazer é somar os ascos dos tipos 4 5 6 e 7 tendo em vista que todos eles são padrões de MII em relação ao locus nic O total é 5 90 1 5 101 de 1000 ou 101 Neste capítulo vimos que para converter essa porcentagem em unidades de mapa devemos dividir por 2 o que fornece 505 um Realizamos o mesmo em relação ao locus ad Aqui o total dos padrões de MII é fornecido pelos tipos 3 5 6 e 7 e é 90 90 1 5 186 de 1000 ou 186 que é 93 um Agora precisamos posicionar os dois em conjunto e decidir entre as alternativas a seguir todas as quais são compatíveis com as distâncias do locus até o centrômero precedentes Aqui uma combinação do senso comum e da análise simples nos informa qual alternativa está correta Primeiramente uma inspeção dos ascos revela que o tipo único mais comum é aquele rotulado 1 que contém mais de 80 de todos os ascos Esse tipo contém apenas os genótipos nic ad e nic ad e eles são genótipos parentais Assim sabemos que a recombinação é consideravelmente baixa e os loci certamente estão ligados Isso descarta a alternativa a Agora considere a alternativa c Se essa alternativa estivesse correta um crossover entre o centrômero e o locus nic geraria não apenas um padrão de MII em relação àquele locus mas também um padrão de MII em relação ao locus ad tendo em vista que ele está mais distante do centrômero do que o nic O padrão de asco produzido por um crossover entre nic e o centrômero na alternativa c deve ser Relembre que o locus nic demonstra padrão de MII nos ascos dos tipos 4 5 6 e 7 um total de 101 ascos deles o tipo 5 é justamente aquele a respeito do qual estamos falando e contém 90 ascos Portanto a alternativa c aparenta ser a correta tendo em vista que o asco do tipo 5 compreende aproximadamente 90 dos ascos de MII em relação ao locus nic Essa relação não seria mantida se a alternativa b estivesse correta tendo em vista que crossovers em qualquer lado do centrômero gerariam padrões de MII em relação os loci nic e ad de modo independente A distância de mapa de nic até ad é simplesmente 930 505 425 um Próximo disto mas não tanto O melhor modo de calcular as distâncias de mapa entre os loci sempre é por meio da medição da frequência de recombinantes Podemos passar pelos ascos e contar todos os ascósporos recombinantes mas com a utilização da fórmula FR ½ T DNP é mais simples Os ascos T são das classes 3 4 e 7 e os ascos DNP são das classes 2 e 6 Portanto FR 12 100 21000 52 ou 52 um e um mapa melhor é O motivo da subestimativa da distância de ad até o centrômero calculada a partir 1 2 3 4 5 6 7 da frequência de MII é a ocorrência de crossovers duplos que podem produzir um padrão de MI para ad como no asco do tipo 4 PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Na Figura 43 existem quaisquer produtos meióticos que não passaram por um crossover na meiose ilustrada Caso afirmativo de quais cores eles seriam na convenção de cores utilizada Na Figura 45 por que o diagrama não demonstra meioses nas quais ocorrem dois crossovers entre as mesmas duas cromátides tais como as duas internas Na Figura 47 alguns produtos meióticos são rotulados parentais A qual genitor está sendo feita referência nessa terminologia Na Figura 48 por que apenas o locus A está demonstrado em uma posição constante Na Figura 49 qual é a frequência média de crossovers por meiose na região AB Na região BC Na Figura 410 é verdadeiro dizer que a partir de um dado cruzamento o produto v cv pode apresentar duas origens diferentes Na Figura 413 na fileira inferior quatro cores estão rotuladas SCO Por 8 9 10 11 12 que elas não são todas do mesmo tamanho frequência Com a utilização das convenções da Figura 414 desenhe as classes dos genitores e das progênies a partir de um cruzamento P Mp M p Mp M Na Figura 416 desenhe os arranjos de alelos em uma óctade a partir de uma meiose semelhante na qual o produto superior da primeira divisão segregou de modo invertido na segunda divisão Na Figura 418 qual seria a FR entre Aa e Bb em um cruzamento no qual puramente ao acaso todas as meioses apresentassem crossovers duplos de quatro filamentos naquela região a Na Figura 420 GC A e AT a Desenhe a óctade fúngica que resultaria da estrutura final 5 b Desafiador Insira alguns marcadores flanqueadores proximamente ligados no diagrama digamos Pp à esquerda e Qq à direita presuma arranjos cis ou trans Presuma que nenhum desses loci apresente segregação não mendeliana Em seguida desenhe a óctade final com base na estrutura na parte 5 PROBLEMAS BÁSICOS Uma planta de genótipo é submetida ao cruzamentoteste com Se os dois loci estiverem a uma distância de 10 um qual proporção da progênie será ABab 13 14 15 16 17 18 O locus A e o locus D estão ligados de modo tão próximo que nenhuma recombinação chega a ser observada entre eles Se AdAd for cruzado com aDaD e a F1 for entrecruzada quais fenótipos serão observados na F2 e em quais proporções Os loci R e S estão a uma distância de 35 um Se uma planta de genótipo for autofecundada quais fenótipos da progênie serão observados e em quais proporções É realizado o cruzamento EE FF ee ff e em seguida a F1 é retrocruzada com o genitor recessivo Os genótipos da progênie são inferidos a partir dos fenótipos Os genótipos da progênie escritos como as contribuições gaméticas do genitor heterozigoto estão nas proporções a seguir E F E f e F e f Explique esses resultados Uma linhagem de Neurospora com o genótipo H I é cruzada com uma linhagem com o genótipo h i Metade da progênie é H I e a outra metade é h i Explique como esse desfecho é possível Uma fêmea com genótipo Aa Bb é cruzada com um macho duplo recessivo aa bb Sua progênie inclui 442 Aa Bb 458 aa bb 46 Aa bb e 54 aa Bb Explique esses resultados Se AA BB for cruzado com aa bb e a F1 for submetida ao cruzamento teste qual porcentagem da progênie do cruzamentoteste será aa bb se os dois genes forem a não ligados b completamente ligados 19 20 21 1 2 absolutamente nenhum crossing over c distantes 10 um d distantes 24 um Em um organismo haploide os loci C e D estão a uma distância de 8 um A partir de um cruzamento C d c D forneça a proporção de cada uma das classes de progênie a seguir a C D b c d c C d d todos os recombinantes combinados Uma moscadasfrutas de genótipo B Rb r é submetida ao cruzamentoteste com b rb r Em 84 das meioses não existem quiasmas entre os genes ligados em 16 das meioses existe um quiasma entre os genes Qual proporção da progênie será B rb r Foi realizado um cruzamentoteste de três pontos no milho Os resultados e uma análise de recombinação estão demonstrados na ilustração a seguir que é típica de cruzamentosteste de três pontos p Folhas roxas Verdes v Mudas resistentes a vírus Sensíveis b Diafragma marrom na semente Plano Estude a ilustração e responda às partes a a c P pp vv bb Gametas p v b a Determine quais genes estão ligados b Desenhe um mapa que demonstre as distâncias em unidades de mapa c Calcule a interferência se apropriado Como solucionar o problema 21 Esboce desenhos das plantas do milho P da F1 e testadoras e utilize setas para demonstrar exatamente como você realizaria esse experimento Demonstre onde as sementes são obtidas Por que todos os apresentam aparência semelhante até mesmo em relação a genes diferentes Por que isso não causa confusão 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Como um fenótipo pode ser roxo e marrom por exemplo ao mesmo tempo É significativo que os genes sejam escritos na ordem pvb no problema Qual é um testador e por que ele é utilizado nessa análise O que a coluna marcada Fenótipos da progênie representa Na classe 1 por exemplo declare exatamente o que verdes sensíveis plano significa O que a linha marcada Gametas representa e como ela é diferente da coluna marcada Gametas da F1 De que modo a comparação desses dois tipos de gametas é relevante para a recombinação Qual meiose é o principal foco do estudo Rotulea no seu desenho Por que os gametas do testador não estão demonstrados Por que existem apenas oito classes fenotípicas Alguma classe está faltando Quais classes e em quais proporções seriam esperadas se todos os genes estivessem em cromossomos separados A que correspondem os quatro pares de tamanhos de classe muito grande duas intermediárias muito pequenas O que você pode dizer a respeito da ordem dos genes simplesmente ao inspecionar as classes fenotípicas e suas frequências Classe Fenótipos da progênie Gametas da F1 Números Recombinante em relação a pb pv 1 verdes sensíveis plano 3210 2 roxas resistentes p v b 3222 14 15 marrom 3 verdes resistentes plano v 1024 R 4 roxas sensíveis marrom p b 1044 R 5 roxas resistentes plano p v 690 R 6 verdes sensíveis marrom b 678 R 7 verdes resistentes marrom v b 72 R R 8 roxas sensíveis plano p 60 R R Total 10000 1500 2200 Qual será a distribuição esperada das classes fenotípicas se apenas dois genes estiverem ligados A que a palavra ponto faz referência em um cruzamentoteste de três 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 22 pontos A utilização dessa palavra implica ligação Como seria um cruzamentoteste de quatro pontos Qual é a definição de recombinante e como ela é aplicada aqui O que as colunas Recombinante em relação a significam Por que existem apenas três colunas Recombinante em relação a O que os R significam e como eles são determinados O que os totais das colunas significam Como eles são utilizados Qual é o teste diagnóstico para ligação O que é uma unidade de mapa É o mesmo que um centimorgan Em um cruzamentoteste de três pontos como esse por que a F1 e o testador não são considerados como sendo parentais no cálculo da recombinação Eles são genitores em um sentido Qual é a fórmula em relação à interferência Como as frequências esperadas são calculadas na fórmula do coeficiente de coincidência Por que a parte c do problema diz se apropriado É muito trabalhoso obter um referido tamanho grande de progênie no milho Qual dos três genes seria o mais trabalhoso para ser classificado Aproximadamente quantas progênies são representadas por uma espiga Você possui uma linhagem de Drosophila que é homozigota em relação aos alelos recessivos a b e c ligados naquela ordem Você cruza fêmeas dessa linhagem com machos homozigotos em relação aos alelos do tipo selvagem correspondentes Em seguida você cruza os machos heterozigotos da F1 com suas irmãs heterozigotas Você obtém os fenótipos da F2 a seguir nos quais as letras indicam fenótipos recessivos e sinais de mais indicam fenótipos do tipo selvagem 1364 365 a b c 87 a b 84 c 47 a 44 b c 5 a c e 4 b a Qual é a frequência de recombinantes entre a e b Entre b e c Lembre se não existe crossover em machos de Drosophila b Qual é o coeficiente de coincidência 23 24 25 R A Emerson cruzou duas linhagens puras diferentes de milho e obteve uma F1 fenotipicamente do tipo selvagem que era heterozigota em relação aos três alelos que determinam fenótipos recessivos an determina antera br braquítico e f fino Ele realizou o cruzamentoteste da F1 com um testador que era homozigoto recessivo em relação aos três genes e obteve esses fenótipos de progênie 355 anteras 339 braquíticos e finos 88 completamente do tipo selvagem 55 anteras braquíticos e finos 21 finos 17 anteras e braquíticos 2 braquíticos 2 anteras e finos a Quais eram os genótipos das linhagens parentais b Desenhe um mapa de ligação em relação aos três genes inclua as distâncias de mapa c Calcule o valor da interferência O cromossomo 3 do milho carrega três loci b para intensificador da cor da planta v para virescente e lg para sem língula Um cruzamentoteste de recessivos triplos com plantas da F1 heterozigotas em relação aos três genes produz uma progênie que apresenta os genótipos a seguir 305 v lg 275 b 128 b lg 112 v 74 lg 66 b v 22 e 18 b v lg Forneça a sequência dos genes no cromossomo as distâncias de mapa entre os genes e o coeficiente de coincidência Groodies são organismos haploides úteis porém fictícios que são puras ferramentas genéticas Um groody do tipo selvagem apresenta um corpo gordo uma cauda longa e flagelos Sabidamente as linhagens mutantes apresentam corpos magros não têm cauda e não apresentam flagelos Os groodies podem ser cruzados entre si embora sejam tão tímidos que não sabemos como e produzem recombinantes Um groody do tipo selvagem cruza com um groody magro e com ausência de cauda e de flagelos Os 1000 bebês groodies produzidos são classificados conforme demonstrado na ilustração aqui Atribua os genótipos e mapeie os três genes O Problema 25 é de Burton S Guttman 26 Em Drosophila o alelo dp determina asas longas e dp determina asas curtas atarracadas Em um locus separado e determina corpo cinza e e determina corpo cor de ébano Ambos os loci são autossômicos Foram realizados os cruzamentos a seguir iniciando com genitores puros 27 28 Utilize o teste do χ² para determinar se esses loci estão ligados Ao realizar isso indique a a hipótese b o cálculo do χ² c o valor p d o que o valor p significa e a sua conclusão f a constituição cromossômica inferida dos genitores da F1 do testador e da progênie A mãe de uma família com 10 filhos apresenta tipo sanguíneo Rh Ela também apresenta uma condição muito rara eliptocitose fenótipo E que faz com que os eritrócitos tenham um formato oval em vez de redondo mas que não produz efeitos clínicos adversos O pai é Rh não possui o antígeno Rh e apresenta eritrócitos normais fenótipo e Os filhos são 1 Rh e 4 Rh E e 5 Rh e Estão disponíveis informações sobre os genitores da mãe que são Rh E e Rh e Um dos 10 filhos que é Rh E se casa com uma pessoa que é Rh e e eles têm um filho Rh E a Desenhe o heredograma dessa família b O heredograma está de acordo com a hipótese de que o alelo Rh é dominante e o Rh é recessivo c Qual é o mecanismo de transmissão da eliptocitose d Os genes que controlam os fenótipos E e Rh podem estar no mesmo cromossomo Caso afirmativo estime a distância de mapa entre eles e comente o seu resultado A partir de diversos cruzamentos do tipo geral AA BB aa bb os indivíduos da F1 do tipo Aa Bb foram submetidos ao cruzamentoteste com aa bb Os resultados são como segue Cruzamentoteste da F1 do cruzamento Progênie do cruzamentoteste Aa Bb aa bb Aa bb aa Bb 1 310 315 287 288 2 36 38 23 23 29 30 3 360 380 230 230 4 74 72 50 44 Em relação a cada grupo de progênie utilize o teste do χ² para decidir se existe evidência de ligação Nos dois heredogramas diagramados aqui uma barra vertical em um símbolo faz referência à deficiência de esteroide sulfatase e uma barra horizontal faz referência à deficiência de ornitina transcarbamilase a Existe evidência nesses heredogramas de que os genes que determinam as deficiências estão ligados b Se os genes estão ligados existem evidências no heredograma de crossover entre eles c Atribua os genótipos desses indivíduos tanto quanto possível No heredograma a seguir as linhas verticais fazem referência ao daltonismo protano e as horizontais ao daltonismo deutano Essas são condições separadas que causam percepções errôneas diferentes das 31 32 cores cada uma é determinada por um gene separado a O heredograma demonstra evidências de que os genes estão ligados b Se houver ligação como o heredograma demonstra evidências de crossing over Explique as suas respostas em relação às partes a e b com o auxílio do diagrama c Você consegue calcular um valor para a recombinação entre esses genes Essa recombinação ocorre por meio de distribuição independente ou por meio de crossover No milho foi obtido um heterozigoto triplo que carrega os alelos mutantes s encolhido w aleurona branca e y endosperma ceroso todos pareados com seus alelos do tipo selvagem normais Esse heterozigoto triplo foi submetido ao cruzamentoteste e a progênie continha 116 encolhidos e brancos 4 totalmente do tipo selvagem 2538 encolhidos 601 encolhidos e cerosos 626 brancos 2708 brancos e cerosos 2 encolhidos brancos e cerosos e 113 cerosos a Determine se quaisquer desses três loci estão ligados e caso positivo demonstre as distâncias de mapa b Demonstre o arranjo de alelos nos cromossomos do heterozigoto triplo utilizado no cruzamentoteste c Calcule a interferência se apropriado 33 34 a É realizado um cruzamento de camundongos Aa Bb aa bb e na progênie existe 25 Aa Bb 25 aa bb 25 Aa bb 25 aa Bb Explique essas proporções com o auxílio de diagramas de meiose simplificados b É realizado um cruzamento de camundongos Cc Dd cc dd e na progênie existe 45 Cc dd 45 cc Dd 5 cc dd 5 Cc Dd Explique essas proporções com o auxílio de diagramas de meiose simplificados Na pequena plantamodelo Arabidopsis o alelo recessivo hyg confere resistência às sementes ao fármaco higromicina e her um alelo recessivo de um gene diferente confere resistência a herbicidas Uma planta que era homozigota hyghyg herher foi cruzada com o tipo selvagem e a F1 foi autofecundada As sementes resultantes da F1 autofecundada foram colocadas em placas de Petri contendo higromicina e herbicida a Se os dois genes não forem ligados esperase o crescimento de qual porcentagem de sementes b De fato 13 das sementes cresceram Essa porcentagem ampara a hipótese de não ligação Explique Caso negativo calcule o número de unidades de mapa entre os loci c Sob a sua hipótese se a F1 for submetida ao cruzamentoteste qual proporção das sementes crescerá no meio que contém higromicina e herbicida Em um organismo diploide de genótipo Aa Bb Dd os pares de alelos estão todos em diferentes pares de cromossomos O diagrama ao lado demonstra anáfases estágios de separação em células individuais 35 Declare se cada desenho representa mitose meiose I ou meiose II ou se isso é impossível em relação a esse genótipo em particular É realizado o cruzamento de Neurospora al2 al2 Uma análise de tétrade linear revela que a frequência de segregação da segunda divisão é de 8 a Desenhe dois exemplos de padrões de segregação de segunda divisão nesse cruzamento b O que pode ser calculado por meio da utilização do valor de 8 a b c d e f g h i j 36 37 38 A partir do cruzamento de fungos arg6 al2 arg6 al2 quais serão os genótipos de esporos em tétrades não ordenadas que são a ditipos parentais b tetratipos c ditipos não parentais Em relação a uma determinada região cromossômica o número médio de crossovers na meiose é calculado como sendo de dois por meiose Naquela região qual proporção de meioses se espera que apresente a nenhum crossover b um crossover c dois crossovers Foi realizado um cruzamento de Neurospora entre uma linhagem que carregava o alelo de tipo reprodutivo A e o alelo mutante arg1 e outra linhagem que carregava o alelo de tipo reprodutivo a e o alelo do tipo selvagem em relação a arg1 Foram isoladas quatrocentas óctades lineares e elas se situaram em sete classes fornecidas na tabela a seguir Para simplicidade elas são demonstradas como tétrades a Deduza o arranjo de ligação do locus do tipo reprodutivo e do locus arg1 Inclua o centrômero ou os centrômeros em qualquer mapa que você desenhe Rotule todos os intervalos em unidades de mapa b Diagrame as divisões meióticas que levaram à classe 6 Rotule claramente 1 2 3 4 5 6 7 A arg A A arg A arg A arg A A A arg A A a arg a a arg a arg A a arg a arg A A arg A A arg a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 A a arg a a a arg a 127 125 100 36 2 4 6 Como solucionar o problema 38 Os fungos em geral são haploides ou diploides Quantos ascósporos estão no asco de Neurospora A sua resposta corresponde ao número apresentado neste problema Explique qualquer discrepância Qual é o tipo reprodutivo em fungos Como você acha que ele é determinado experimentalmente Os símbolos A e a têm alguma relação com dominância e recessividade O que o símbolo arg1 significa Como você testaria em relação a esse genótipo Como o símbolo arg1 está relacionado ao símbolo O que a expressão do tipo selvagem significa O que a palavra mutante significa A função biológica dos alelos demonstrada tem alguma relação com a solução deste problema O que a expressão análise de óctade linear significa Em geral o que mais pode ser aprendido a partir da análise de tétrade linear que não pode ser aprendido a partir da análise de tétrade não ordenada Como é realizado um cruzamento em um fungo como Neurospora Explique como isolar ascos e ascósporos individuais Como o termo tétrade se relaciona com os termos asco e óctade Onde ocorre a meiose no ciclo de vida de Neurospora Demonstrea no 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 diagrama do ciclo de vida Qual a relação do Problema 38 com a meiose Você consegue escrever os genótipos das duas linhagens parentais Por que somente quatro genótipos estão demonstrados em cada classe Por que existem apenas sete classes Quantos outros modos você aprendeu para a classificação das tétrades em geral Qual dessas classificações pode ser aplicada a ambas as tétrades lineares e não ordenadas Você consegue aplicar essas classificações às tétrades neste problema Classifique cada classe de tantos modos quanto possível Você consegue pensar sobre mais possibilidades neste cruzamento Caso afirmativo por que elas não estão demonstradas Você acredita que existam diversas diferentes ordens de esporos dentro de cada classe Por que essas diferentes ordens de esporos não alteram a classe Por que a classe a seguir não está listada a A arg a A arg O que a expressão arranjo de ligação significa O que é um intervalo genético Por que o problema declara centrômero ou centrômeros não apenas centrômero Qual é o método geral para o mapeamento de centrômeros na análise de tétrades Qual é a frequência total de ascósporos A Você calculou essa frequência por meio da utilização de uma fórmula ou por meio da inspeção Esse é um genótipo recombinante Caso afirmativo ele é o único genótipo recombinante As primeiras duas classes são as mais comuns e são aproximadamente iguais em frequência O que essa informação lhe diz Qual é o seu conteúdo 39 de genótipos parentais e recombinantes Um geneticista estuda 11 diferentes pares de loci de Neurospora ao realizar cruzamentos do tipo a b a b e em seguida ao analisar 100 ascos lineares de cada cruzamento Para a conveniência da confecção de uma tabela o geneticista organiza os dados como se todos os 11 pares de genes apresentassem a mesma designação a e b conforme demonstrado a seguir Em relação a cada cruzamento mapeie os loci em relação uns aos outros e aos centrômeros Número de ascos do tipo a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b Cruzamento a b a b a b a b a b a b a b 1 34 34 32 0 0 0 0 2 84 1 15 0 0 0 0 3 55 3 40 0 2 0 0 4 71 1 18 1 8 0 1 40 5 9 6 24 22 8 10 20 6 31 0 1 3 61 0 4 7 95 0 3 2 0 0 0 8 6 7 20 22 12 11 22 9 69 0 10 18 0 1 2 10 16 14 2 60 1 2 5 11 51 49 0 0 0 0 0 Três cruzamentos diferentes em Neurospora são analisados com base em tétrades não ordenadas Cada cruzamento combina um par diferente de genes ligados Os resultados estão demonstrados na tabela a seguir Cruzamento Genitores Ditipos parentais Tetratipos Ditipos não parentais 1 a b a b 51 45 4 2 c d c d 64 34 2 3 e f e f 45 50 5 Em relação a cada cruzamento calcule a A frequência de recombinantes FR 41 42 b A distância de mapa não corrigida com base na FR c A distância de mapa corrigida com base nas frequências de tétrades d A distância de mapa corrigida com base na função de mapeamento No cromossomo 4 de Neurospora o gene leu3 está logo à esquerda do centrômero e sempre segrega na primeira divisão enquanto o gene cys2 está à direita do centrômero e demonstra uma frequência de segregação na segunda divisão de 16 Em um cruzamento entre uma linhagem leu3 e uma cepa cys2 calcule as frequências previstas das sete classes a seguir de tétrades lineares nas quais l leu 3 e c cys2 Ignore os crossovers duplos e outros crossovers múltiplos i l c ii l iii l c iv l c v l c vi l vii l l c l l c c c c c c c l l c l l c Um cultivador de arroz obteve um heterozigoto triplo que carrega os três alelos recessivos em relação a flores albinas al arestas marrons b e folhas felpudas fu todos pareados com seus alelos do tipo selvagem normais Esse heterozigoto triplo foi submetido ao cruzamentoteste Os fenótipos da progênie foram 170 do tipo selvagem 710 albinos 150 albinos marrons e felpudos 698 marrons e felpudos 5 marrons 42 felpudos 3 albinos e felpudos 38 albinos e marrons a Alguns dos genes estão ligados Caso afirmativo desenhe um mapa rotulado com as distâncias de mapa Não se preocupe com uma correção em relação a crossovers múltiplos b O heterozigoto triplo foi originalmente produzido por meio do cruzamento de duas linhagens puras Quais são os seus genótipos 43 44 Em um fungo um mutante prolina pro foi cruzado com um mutante histidina his Uma análise de uma tétrade não linear produziu os resultados a seguir his his his pro his pro pro pro his pro his pro 6 82 112 a Os genes estão ligados ou não b Desenhe um mapa se ligados ou dois mapas se não ligados demonstrando as distâncias de mapa com base na frequência de recombinantes direta onde apropriado c Se houver ligação corrija as distâncias de mapa em relação a crossovers múltiplos escolha apenas uma abordagem No fungo Neurospora uma linhagem que é auxotrófica em relação à tiamina alelo mutante t foi cruzada com uma linhagema que é auxotrófica em relação à metionina alelo mutante m Os ascos lineares foram isolados e classificados nos grupos a seguir Par de esporos Tipos de ascos 1 e 2 t t t t t m t m 3 e 4 t t m m t m 5 e 6 m t t m t 7 e 8 m m m m 45 46 m Número 260 76 4 54 1 5 a Determine as relações de ligação desses dois genes com os seus centrômeros e entre si Especifique as distâncias em unidades de mapa b Desenhe um diagrama para demonstrar a origem do tipo de asco com apenas um representante único segundo a partir da direita Uma geneticista deseja obter uma planta de milho que apresente os três fenótipos dominantes antocianina A cabelos longos L e planta anã D Em sua coleção de linhagens puras as únicas linhagens que contêm esses alelos são AA LL dd e aa ll DD Ela também possui a linhagem totalmente recessiva aa ll dd Ela decide entrecruzar as duas primeiras e realizar o cruzamentoteste do híbrido resultante para obter na progênie uma planta do fenótipo desejado que nesse caso deve ser Aa Ll Dd Ela sabe que os três genes estão ligados na ordem escrita que a distância entre os loci Aa e Ll é de 16 um e que a distância entre os loci Ll e Dd é de 24 um a Desenhe um diagrama dos cromossomos dos genitores do híbrido e do testador b Desenhe um diagrama dos crossovers necessários para produzir o genótipo desejado c Qual porcentagem da progênie do cruzamentoteste será do fenótipo que ela necessita d Quais presunções você fez se existentes Na plantamodelo Arabidopsis thaliana os alelos a seguir foram utilizados em um cruzamento T Presença de tricomas t Ausência de tricomas D Plantas altas d Plantas anãs W Cutícula cerosa w Não cerosa A Presença do pigmento roxo a Ausência branca 47 48 antocianina Os loci Tt e Dd estão ligados a uma distância de 26 um no cromossomo 1 enquanto os loci Ww e Aa estão ligados a uma distância de 8 um no cromossomo 2 Uma planta não cerosa sem tricomas homozigota recessiva dupla pura é cruzada com outra planta branca anã homozigota recessiva dupla pura a Qual será o aspecto da F1 b Esboce os cromossomos 1 e 2 dos genitores e da F1 demonstrando o arranjo dos alelos c Se a F1 for submetida ao cruzamentoteste qual proporção da progênie apresentará todos os quatro fenótipos recessivos No milho é realizado o cruzamento WW ee FF ww EE ff Os três loci estão ligados como segue Presuma a ausência de interferência a Se a F1 for submetida ao cruzamentoteste qual proporção da progênie será ww ee ff b Se a F1 for autofecundada qual proporção da progênie será ww ee ff Foi realizado o cruzamento de fungos c m e foram coletadas tétrades não lineares não ordenadas Os resultados foram m m m c m c c c m c m c 49 Total 112 82 6 a A partir desses resultados calcule uma frequência de recombinantes simples b Compare a função de mapeamento de Haldane e a fórmula de Perkins em suas conversões do valor da FR em uma distância de mapa corrigida c Na derivação da fórmula de Perkins apenas a possibilidade de meioses com zero um e dois crossovers foi considerada Esse limite poderia explicar qualquer discrepância nos seus valores calculados Explique brevemente nenhum cálculo é necessário Em camundongos os alelos a seguir foram utilizados em um cruzamento W Valsador deambulação w Não valsador em valsa G Cor cinza normal g Albino B Cauda dobrada b Cauda reta Um camundongo cinza de cauda dobrada e valsador é cruzado com um camundongo albino de cauda reta e não valsador e ao longo de diversos anos são obtidos os totais de progênie a seguir valsador cinza dobrada 18 valsador albino dobrada 21 não valsador cinza reta 19 não valsador albino reta 22 valsador cinza reta 4 valsador albino reta 5 não valsador cinza dobrada 5 não valsador albino dobrada 6 Total 100 a Quais eram os genótipos dos dois camundongos parentais no cruzamento 50 51 52 b Desenhe os cromossomos dos genitores c Se você deduziu ligação declare o valor ou os valores de unidade de mapa e demonstre como eles foram obtidos Considere o cruzamento de Neurospora f p Sabidamente o locus f está muito próximo do centrômero no cromossomo 7 na verdade tão próximo que nunca ocorrem quaisquer segregações na segunda divisão Também se sabe que o locus p está no cromossomo 5 a uma tal distância que normalmente ocorre uma média de 12 de segregações na segunda divisão Com essas informações qual será a proporção de óctades que são a Ditipos parentais que demonstram padrões de MI em relação a ambos os loci b Ditipos não parentais que demonstram padrões de MI em relação a ambos os loci c Tetratipos que demonstram um padrão de MI em relação a f e um padrão de MII em relação a p d Tetratipos que demonstram um padrão de MII em relação a f e um padrão de MI em relação a p Em um fungo haploide os genes al2 e arg6 estão a uma distância de 30 um no cromossomo 1 e os genes lys5 e met1 estão a uma distância de 20 um no cromossomo 6 Em um cruzamento al2 met1 arg6 lys5 qual proporção da progênie será prototrófica Os alelos recessivos k olhos com formato de rim em vez de redondos do tipo selvagem c cor dos olhos cardeal em vez do tipo selvagem vermelho e e corpo cor de ébano em vez do tipo selvagem cinza identificam três genes no cromossomo 3 de Drosophila Fêmeas com olhos em formato de rim e cor cardeal foram cruzadas com machos cor de ébano A F1 foi do tipo selvagem Quando as fêmeas da F1 foram submetidas ao cruzamentoteste com machos kk cc ee foram obtidos os fenótipos da 53 54 progênie a seguir k c e 3 k c 876 k e 67 k 49 c e 44 c 58 e 899 4 Total 2000 a Determine a ordem dos genes e as distâncias de mapa entre eles b Desenhe os cromossomos dos genitores e da F1 c Calcule a interferência e diga o que você pensa a respeito da sua significância A partir de genitores com genótipos AA BB e aa bb foi produzido um dihíbrido Em um cruzamentoteste do dihíbrido foi obtida a progênie de sete indivíduos a seguir Aa Bb aa bb Aa Bb Aa bb aa bb Aa Bb e aa Bb Esses resultados fornecem evidências convincentes de ligação PROBLEMAS DESAFIADORES Utilize a função de mapeamento de Haldane para calcular a distância de mapa corrigida em casos nos quais a FR medida 5 10 20 30 e 40 Esboce um gráfico de FR em face da distância de mapa corrigida e utilizeo para responder a questão Quando se deve utilizar a função de mapeamento 55 56 Como solucionar o Problema 55 Um indivíduo heterozigoto em relação a quatro genes Aa Bb Cc Dd é submetido ao cruzamentoteste com aa bb cc dd e uma progênie de 1000 foi classificada pela contribuição gamética do genitor heterozigoto como segue a B C D 42 A b c d 43 A B C d 140 a b c D 145 a B c D 6 A b C d 9 A B c d 305 a b C D 310 a Quais genes estão ligados b Se duas linhagens puras fossem cruzadas para produzir o indivíduo heterozigoto quais teriam sido os seus genótipos c Desenhe um mapa de ligação dos genes ligados demonstrando a ordem e as distâncias em unidades de mapa d Calcule um valor de interferência se apropriado Um alelo autossômico N em seres humanos causa anormalidades nas unhas e patelas rótulas denominadas síndrome unhapatela Considere casamentos nos quais um parceiro apresenta a síndrome unhapatela e o tipo sanguíneo A e o outro parceiro apresenta unhas e patelas normais e tipo sanguíneo 0 Esses casamentos produzem alguns filhos que apresentam ambas a síndrome unhapatela e o tipo sanguíneo A Presuma que filhos não relacionados desse grupo fenotípico crescem se casam entre si e têm filhos São observados quatro fenótipos nas porcentagens a seguir nessa segunda geração 57 58 Síndrome unhapatela e tipo sanguíneo A 66 Unhas e patelas normais e tipo sanguíneo 0 16 Unhas e patelas normais e tipo sanguíneo A 9 Síndrome unhapatela e tipo sanguíneo 0 9 Analise totalmente esses dados explicando as frequências relativas dos quatro fenótipos Ver Capítulo 6 para a base genética desses tipos sanguíneos Presuma que três pares de alelos sejam observados na Drosophila x e x y e y e z e z Conforme demonstrado pelos símbolos cada alelo não do tipo selvagem é recessivo do seu alelo do tipo selvagem Um cruzamento entre fêmeas heterozigotas nesses três loci e machos do tipo selvagem produz progênie que apresenta os genótipos a seguir 1010 fêmeas x y z 430 machos x y z 441 machos x y z 39 machos x y z 32 machos x y z 30 machos x y z 27 machos x y z 1 macho x y z e 0 macho x y z a Em qual cromossomo de Drosophila estão esses genes b Desenhe os cromossomos relevantes na genitora heterozigota demonstrando o arranjo dos alelos c Calcule as distâncias de mapa entre os genes e o coeficiente de coincidência Os cinco conjuntos de dados fornecidos na tabela a seguir representam os resultados de cruzamentosteste com a utilização de genitores com os mesmos alelos mas em diferentes combinações Determine a ordem dos genes por meio da inspeção ou seja sem calcular os valores de recombinação Os fenótipos recessivos estão simbolizados pelas letras minúsculas e os dominantes por sinais 59 Fenótipos observados em cruzamentoteste de 3 pontos Conjuntos de dados 1 2 3 4 5 317 1 30 40 305 c 58 4 6 232 0 b 10 31 339 84 28 b c 2 77 137 201 107 a 0 77 142 194 124 a c 21 31 291 77 30 a b 72 4 3 235 1 a b c 203 1 34 46 265 A partir dos dados de fenótipos fornecidos na tabela a seguir para cruzamentosteste de 3 pontos em relação a 1 a b e c e 2 b c e d determine a sequência dos quatro genes a b c e d e as três distâncias de mapa entre eles Os fenótipos recessivos estão simbolizados por letras minúsculas e os fenótipos dominantes por 1 2 669 b c d 8 a b 139 b 441 60 61 a 3 b d 90 c 121 c d 376 b c 2 14 a c 2280 d 153 a b c 653 c 65 b 2215 b c 141 Vulcanos apresentam orelhas pontudas determinadas pelo alelo P ausência de adrenais determinada por A e coração do lado direito determinado por R Todos esses alelos são dominantes em relação aos alelos terráqueos normais orelhas redondas p existência de adrenais a e coração do lado esquerdo r Os três loci são autossômicos e estão ligados conforme demonstrado nesse mapa de ligação O Sr Spock o primeiro oficial da espaçonave Enterprise possui pai vulcano e mãe terráquea Se o Sr Spock se casar com uma terráquea e não houver interferência genética qual proporção de seus filhos apresentará a Fenótipos vulcanos em relação às três características b Fenótipos terráqueos em relação às três características c Orelhas e coração vulcanos mas adrenais terráqueas d Orelhas vulcanas mas coração e adrenais terráqueos Em uma determinada planta diploide os três loci A B e C estão ligados como segue 62 Uma planta está disponível para você denominea planta genitora Ela apresenta a constituição A b ca B C a Com a presunção de ausência de interferência se a planta for autofecundada qual proporção da progênie será do genótipo a b ca b c b Novamente com a presunção de ausência de interferência se a planta genitora for cruzada com a planta a b ca b c quais classes genotípicas serão observadas na progênie Quais serão as suas frequências se houver uma progênie de 1000 c Repita a parte b dessa vez presumindo 20 de interferência entre as regiões O heredograma a seguir demonstra uma família com dois fenótipos anormais raros esclerótica azul associada à osteogênese imperfeita representado por um símbolo com bordas pretas e hemofilia representada por um centro preto no símbolo Os membros representados por símbolos completamente pretos apresentam ambos os distúrbios Os números em alguns símbolos são os números de indivíduos com aqueles tipos 63 a Qual padrão de herança é demonstrado por cada condição nesse heredograma b Forneça os genótipos de tantos familiares quanto possível c Existe evidência de ligação d Existe evidência de distribuição independente e Algum dos familiares pode ser considerado como recombinante ou seja formado a partir de no mínimo um gameta recombinante Ambos os genes humanos em relação ao daltonismo e à hemofilia estão no cromossomo X e demonstram uma frequência de recombinantes de aproximadamente 10 A ligação de um gene patológico com um gene relativamente inofensivo pode ser utilizada para prognóstico genético Aqui está demonstrada uma parte de um heredograma maior Os símbolos escuros indicam que os indivíduos apresentam hemofilia e as cruzes indicam daltonismo Quais informações podem ser fornecidas para as mulheres III4 e III5 a respeito da probabilidade de terem filhos com hemofilia 64 O Problema 63 é adaptado de J F Crow Genetics Notes An Introduction to Genetics Burgess 1983 Um geneticista que está mapeando os genes A B C D e E realiza dois cruzamentosteste de 3 pontos O primeiro cruzamento de linhagens puras é AA BB CC DD EE aa bb CC dd EE O geneticista cruza a F1 com um testador recessivo e classifica a progênie pela contribuição gamética da F1 A B C D E 316 a b C d E 314 A B C d E 31 a b C D E 39 A b C d E 130 a B C D E 140 A b C D E 17 a B C d E 13 1000 O segundo cruzamento de linhagens puras é AA BB CC DD EE aa BB cc DD ee O geneticista cruza a F1 desse cruzamento com um testador recessivo e obtém A B C D E 243 a B c D e 237 65 66 A B c D e 62 a B C D E 58 A B C D e 155 a B c D E 165 a B C D e 46 A B c D E 34 1000 O geneticista também sabe que os genes D e E se distribuem de modo independente a Desenhe um mapa desses genes demonstrando as distâncias em unidades de mapa sempre que possível b Existe qualquer evidência de interferência Na planta Arabidopsis os loci em relação ao comprimento da vagem L Longa l Curta e aos pelos do fruto H Piloso h Liso estão ligados a uma distância de 16 um no mesmo cromossomo Foram realizados os cruzamentos a seguir I L HL H l hl h F1 II L hL h l Hl H F1 Se as F1 dos cruzamentos I e II forem cruzadas a Qual proporção da progênie esperase que seja l h l h b Qual proporção da progênie esperase que seja L h l h No milho Zea mays o mapa genético de parte do cromossomo 4 é como segue onde w s e e representam alelos mutantes recessivos que afetam a cor e o formato do pólen Se o cruzamento a seguir for realizado 67 68 w s ew s e e a F1 for submetida ao cruzamentoteste com w s e w s e e se for presumido que não há interferência nessa região do cromossomo qual proporção da progênie será dos genótipos a seguir a e e b w s e f w s c s e g w e d w h s Toda sextafeira à noite a estudante de genética Jean Allele exausta em virtude de seus estudos vai ao boliche da reunião de estudantes para relaxar Entretanto até lá ela é assombrada por seus estudos genéticos A pista de boliche um tanto quanto modesta apresenta apenas quatro bolas de boliche duas vermelhas e duas azuis Elas são jogadas contra os pinos e em seguida são coletadas e devolvidas pela canaleta em ordem aleatória repousando na parada final Na medida em que a noite passa Jean observa padrões familiares das quatro bolas na medida em que elas chegam até o repouso na parada Compulsivamente ela conta os diferentes padrões Quais padrões ela visualizou quais foram as suas frequências e qual é a relevância desse assunto para a genética Em uma análise de tétrade o arranjo de ligação dos loci p e q é como segue Presuma que Na região I não há crossover em 88 das meioses e há um crossover único em 12 das meioses Na região II não há crossover em 80 das meioses e há um crossover único em 20 das meioses Não há interferência em outras palavras a situação em uma região não 69 afeta o que está ocorrendo na outra região Quais proporções de tétrades serão dos tipos a seguir a MIMI DP b MIMI DNP c MIMII T d MIIMI T e MIIMII DP f MIIMII DNP g MIIMII T Nota aqui o padrão M escrito primeiramente é aquele que se refere ao locus p Dica o modo mais fácil de resolver esse problema é iniciar com o cálculo das frequências de ascos com crossovers em ambas as regiões na região I na região II e em nenhuma região Em seguida determine quais padrões de MI e MII resultam Para um experimento com uma levedura haploide você tem duas culturas diferentes Cada uma será cultivada em meio mínimo ao qual foi adicionada arginina mas nenhuma será cultivada apenas em meio mínimo O meio mínimo é composto por sais inorgânicos mais açúcar Com a utilização dos métodos apropriados você induz as duas culturas ao cruzamento As células diploides em seguida se dividem por meiose e formam tétrades não ordenadas Alguns dos ascósporos serão cultivados em meio mínimo Você classifica um grande número dessas tétrades em relação aos fenótipos ARG necessidade de arginina e ARG independente de arginina e registra os dados a seguir Segregação de ARGARG Frequência 40 40 31 20 22 40 a Com a utilização de símbolos de sua própria escolha atribua os genótipos para as duas culturas parentais Em relação a cada um dos três tipos de segregação atribua genótipos aos segregantes b Se houver mais de um locus controlando a necessidade de arginina esses 70 loci estão ligados Uma análise de RFLP de duas linhagens puras AA BB e aa bb demonstrou que a primeira era homozigota em relação a um alelo de RFLP longo l e que a última em relação a um alelo curto s As duas foram cruzadas para formar uma F1 que em seguida foi retrocruzada com a segunda linhagem pura Uma progênie de mil foi classificada como segue Aa BB ss 9 Aa bb ss 43 Aa Bb ls 362 Aa bb ls 93 aa bb ls 11 aa Bb ls 37 aa bb ss 358 aa Bb ss 87 a O que esses resultados nos informam a respeito de ligação b Desenhe um mapa se apropriado c Incorpore os fragmentos de RFLP no seu mapa 51 52 53 Bactérias em divisão Custom Medical Stock Photo RMGetty Images TÓPICOS Trabalho com microrganismos Conjugação bacteriana Transformação bacteriana 54 55 56 A Genética de bacteriófagos Transdução Comparação de mapas físicos e mapas de ligação RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Distinguir entre os procedimentos experimentais e as análises nos três principais modos por meio dos quais bactérias trocam genes Mapear os genomas bacterianos com a utilização da conjugação interrompida Mapear os genomas bacterianos com a utilização da frequência de recombinantes Avaliar o desfecho de experimentos de transformação dupla em termos de ligação Prever os desfechos de experimentos de transdução com a utilização de fagos capazes de transdução generalizada ou restrita Mapear os genomas dos fagos por meio da recombinação em infecções duplas de bactérias Desenhar experimentos para mapear uma mutação causada por mutagênese por transpóson Prever a herança dos genes e das funções contidas em plasmídios em cruzamentos bacterianos tecnologia de DNA é responsável pelos rápidos avanços que estão sendo realizados na genética de todos os organismosmodelo Ela também é um tópico de interesse considerável no domínio público Exemplos são os anúncios intensamente publicados das sequências completas dos genomas de seres humanos e chimpanzés nos últimos anos e a popularidade da análise forense com base no DNA em séries de televisão e filmes Figura 51 De fato melhoras na tecnologia levaram ao sequenciamento dos genomas de muitas centenas de espécies Os referidos resultados dramáticos sejam em seres humanos peixes insetos plantas ou fungos são todos baseados na utilização de métodos que possibilitam que pequenas partes do DNA sejam isoladas carreadas de uma célula para outra e amplificadas em grandes amostras puras Quase todos os sistemas sofisticados que possibilitam essas manipulações do DNA de qualquer organismo são derivados de bactérias e seus vírus Assim sendo o avanço da genética moderna até o seu presente estado de compreensão foi totalmente dependente do desenvolvimento da genética bacteriana o tópico deste capítulo Entretanto o objetivo da genética bacteriana nunca foi facilitar a genética molecular eucariótica As bactérias são biologicamente importantes por si próprias Elas são os organismos mais numerosos em nosso planeta Elas contribuem para a reciclagem de nutrientes tais como nitrogênio enxofre e carbono nos ecossistemas Algumas são agentes de doenças em seres humanos animais e plantas Outras vivem em simbiose dentro de nossas bocas e de nossos intestinos Além disso muitos tipos de bactérias são úteis para a síntese industrial de uma ampla diversidade de produtos orgânicos Portanto o ímpeto para a dissecção genética das bactérias tem sido o mesmo que aquele em relação aos organismos multicelulares compreender a sua função biológica FIGURA 51 Os resultados dramáticos da tecnologia do DNA moderna tal como o sequenciamento do genoma humano foram possíveis apenas porque a genética bacteriana levou à invenção de eficientes vetores para manipulação do DNA Science 291 2001 pp 11451434 Imagem por Ann E Cutting Reproduzida com autorização da AAAS As bactérias pertencem a uma classe de organismos conhecidos como procariotos que também incluem algas azuis e verdes classificadas como cianobactérias Uma característicachave da definição dos procariotos é que o seu DNA não está contido em um núcleo limitado por uma membrana Assim como os organismos superiores as bactérias possuem genes compostos por DNA dispostos em uma longa série em um cromossomo Entretanto a organização do seu material genético é única em diversos aspectos O genoma da maior parte das bactérias é uma molécula única de DNA com filamento duplo no formato de um círculo fechado Além disso as bactérias na natureza com frequência contêm elementos extras de DNA denominados plasmídios A maior parte dos plasmídios também são círculos de DNA mas muito menores do que o genoma bacteriano principal As bactérias podem ser parasitadas por vírus específicos denominados bacteriófagos ou simplesmente fagos Os fagos e outros vírus são muito diferentes dos organismos que temos estudado até agora Os vírus apresentam algumas propriedades em comum com os organismos Por exemplo seu material genético pode ser DNA ou RNA constituindo um cromossomo curto Entretanto a maior parte dos biólogos considera os vírus como não vivos tendo em vista que eles não são células e não apresentam um metabolismo próprio Portanto para estudar sua genética os vírus precisam ser propagados nas células de seus organismos hospedeiros Quando os cientistas começaram a estudar as bactérias e os fagos eles estavam naturalmente curiosos a respeito dos seus sistemas hereditários Claramente as bactérias e os fagos têm sistemas hereditários uma vez que demonstram aspecto e função constantes de uma geração para a próxima realmente são constantes Mas como esses sistemas hereditários atuam As bactérias assim como os organismos eucarióticos unicelulares reproduzemse assexuadamente por meio do crescimento e da divisão celular uma célula se tornando duas Essa reprodução assexuada é consideravelmente fácil de ser demonstrada experimentalmente Entretanto chega a ocorrer alguma união de tipos diferentes para fins da reprodução sexuada Além disso como os fagos muito menores se reproduzem Eles chegam a se unir para um ciclo semelhante ao sexuado Essas questões são buscadas neste capítulo Veremos que existe uma diversidade de processos hereditários em bactérias e fagos Esses processos são interessantes em virtude da biologia básica dessas formas mas também atuam como modelos como fontes de percepção dos processos genéticos em atuação em todos os organismos Para um geneticista o atrativo dessas formas é que elas podem ser cultivadas em números muito grandes em virtude de serem tão pequenas Consequentemente é possível detectar e estudar eventos genéticos muito raros que são difíceis ou impossíveis de estudar em eucariotos Quais processos hereditários são observados em procariotos Eles podem apresentar tanto a reprodução assexuada quanto a sexuada A mutação ocorre em células assexuadas em grande parte do mesmo modo como ela ocorre em eucariotos e os alelos mutantes podem ser seguidos por meio de ambos esses processos em uma abordagem análoga àquela utilizada em eucariotos Seguiremos os alelos desse modo no capítulo adiante Quando as células bacterianas se reproduzem assexuadamente seu DNA genômico se replica e é repartido para as célulasfilhas mas o método de partição é consideravelmente diferente da mitose Na reprodução sexuada duas moléculas de DNA de diferentes fontes são reunidas Entretanto uma diferença importante dos eucariotos é que nas bactérias raramente dois cromossomos completos são reunidos normalmente a união é de um cromossomo completo com um fragmento de outro As possibilidades estão resumidas na Figura 52 O primeiro processo de troca de genes a ser examinado será a conjugação que é o contato e a fusão de duas células bacterianas diferentes Após a fusão uma célula denominada doadora por vezes transfere o DNA genômico para a outra célula Esse DNA transferido pode ser parte do ou raramente todo o genoma bacteriano Em alguns casos um ou mais elementos de DNA extragenômico autônomos denominados plasmídios se estiverem presentes são transferidos Os referidos plasmídios conseguem carrear o DNA genômico para dentro da célula receptora Qualquer fragmento genômico transferido por meio de qualquer via pode se recombinar com o cromossomo da receptora após a entrada Uma célula bacteriana também pode captar um fragmento de DNA do ambiente externo e incorporar esse DNA ao seu próprio cromossomo um processo denominado transformação Além disso determinados fagos podem captar um fragmento de DNA de uma célula bacteriana e injetálo em outra onde ele pode ser incorporado ao cromossomo em um processo conhecido como transdução A transferência do DNA em um plasmídio por meio da transformação ou por meio da transdução constitui um processo conhecido como transmissão horizontal um tipo de transmissão gênica sem a necessidade de divisão celular Esse termo distingue esse tipo de transferência de DNA daquele durante a transmissão vertical a passagem do DNA entre as gerações bacterianas A transmissão horizontal pode difundir o DNA rapidamente em uma população bacteriana por meio do contato em grande parte do mesmo modo como uma doença se difunde Para as bactérias a transmissão horizontal proporciona um método poderoso por meio do qual elas conseguem se adaptar rapidamente às alterações nas condições ambientais Os próprios fagos podem sofrer recombinação quando dois genótipos diferentes infectam a mesma célula bacteriana recombinação de fagos não demonstrada na Figura 52 Antes de analisarmos esses modos de troca genética consideremos os modos práticos de manuseio de bactérias que são muito diferentes daqueles utilizados no manuseio de organismos multicelulares FIGURA 52 O DNA bacteriano pode ser transferido de uma célula para outra de quatro modos conjugação com transferência de plasmídio conjugação com transferência parcial de genoma transformação e transdução 51 FIGURA 53 Fenótipos bacterianos podem ser avaliados em suas colônias Um estoque de células bacterianas pode ser cultivado em um meio líquido que contenha nutrientes e em seguida um pequeno número de bactérias da suspensão líquida pode ser espalhado sobre um meio de ágar sólido Cada uma das células dará origem a uma colônia Todas as células em uma colônia apresentam os mesmos genótipo e fenótipo Trabalho com microrganismos As bactérias têm divisão rápida e ocupam pouco espaço assim elas são muito convenientes como organismosmodelo genéticos Elas podem ser cultivadas em um meio líquido ou em uma superfície sólida como um gel de ágar desde que os nutrientes básicos sejam fornecidos Cada célula bacteriana se divide assexuadamente de 1 2 4 8 16 células e assim por diante até que os nutrientes se esgotem ou as escórias metabólicas tóxicas se acumulem em níveis que interrompam o crescimento da população Uma pequena quantidade de uma cultura líquida pode ser pipetada sobre uma placa de Petri contendo meio de ágar sólido e espalhada de modo uniforme sobre a superfície com um difusor estéril em um processo denominado plaqueamento Figura 53 As células se dividem mas tendo em vista que não conseguem se dispersar na superfície do gel todas as células permanecem agrupadas Quando essa massa alcança mais de 107 células ela se torna visível a olho nu como uma colônia Cada colônia distinta na placa foi derivada de uma célula original única Os membros de uma colônia que apresentam um ancestral genético único são conhecidos como clones celulares Os mutantes bacterianos são de obtenção consideravelmente fácil Mutantes nutricionais são um bom exemplo Bactérias do tipo selvagem são prototróficas o que significa que podem crescer e se dividir em meio mínimo um substrato que contém apenas sais inorgânicos uma fonte de carbono para energia e água A partir de uma cultura prototrópica podem ser obtidos mutantes auxotróficos esses mutantes são células que não crescerão exceto se o meio contiver um ou mais blocos de construção celular específicos tais como adenina treonina ou biotina Outro tipo de mutante útil difere do tipo selvagem na capacidade de utilizar uma fonte de energia específica por exemplo o tipo selvagem lac consegue utilizar a lactose e crescer enquanto um mutante lac não consegue A Figura 54 demonstra outro modo para distinguir as colônias lac e lac por meio da utilização de um corante Em outra categoria mutante enquanto os tipos selvagens são suscetíveis a um inibidor tal como o antibiótico estreptomicina os mutantes resistentes conseguem se dividir e formar colônias na presença do inibidor Todos esses tipos de mutantes possibilitam que o geneticista distinga as diferentes linhagens individuais proporcionando assim marcadores genéticos alelos marcadores para seguir os genomas e as células em experimentos A Tabela 51 resume alguns fenótipos bacterianos mutantes e seus símbolos genéticos As seções a seguir documentam a descoberta dos diversos processos por meio dos quais os genomas bacterianos se recombinam Os métodos históricos são interessantes por si próprios mas também servem para introduzir os diversos processos de recombinação bem como as técnicas analíticas que ainda são aplicáveis atualmente FIGURA 54 Bactérias do tipo selvagem capazes de utilizar a lactose como uma fonte de energia lac são coradas em vermelho na presença deste corante indicador As células não coradas são mutantes incapazes de utilizar a lactose lac Jeffrey H Miller Tabela 51 Alguns símbolos genotípicos utilizados em genética bacteriana Símbolo Característica ou fenótipo associado ao símbolo bio Requer a adição de biotina como um suplemento ao meio mínimo 52 arg Requer a adição de arginina como um suplemento ao meio mínimo met Requer a adição de metionina como um suplemento ao meio mínimo lac Não consegue utilizar a lactose como uma fonte de carbono gal Não consegue utilizar a galactose como uma fonte de carbono strr Resistente ao antibiótico estreptomicina strs Sensível ao antibiótico estreptomicina Nota o meio mínimo é o meio sintético básico para o crescimento bacteriano sem suplementos de nutrientes Conjugação bacteriana Os estudos mais iniciais em genética bacteriana revelaram o processo inesperado da conjugação celular Descoberta da conjugação As bactérias apresentam um processo semelhante à reprodução sexuada e à recombinação A questão foi respondida pelo trabalho experimental elegantemente simples de Joshua Lederberg e Edward Tatum que em 1946 descobriram um processo semelhante ao sexuado no que se tornou o principal modelo para a genética bacteriana a Escherichia coli ver Organismomodelo adiante Eles estavam estudando duas linhagens de E coli com diferentes conjuntos de mutações auxotróficas A linhagem A cresceria apenas se o meio fosse suplementado com metionina e biotina a linhagem B cresceria apenas se ele fosse suplementado com treonina leucina e tiamina Portanto podemos designar as linhagens como Linhagem A met bio thr leu thi Linhagem B met bio thr leu thi A Figura 55 A ilustra de modo simplificado o desenho de seu experimento As linhagens A e B foram misturadas em conjunto incubadas durante um período e em seguida plaqueadas em meio mínimo no qual nenhum auxotrófico poderia crescer Observouse que uma minoria das células 1 em 107 crescia como prototróficos e portanto necessariamente era do tipo selvagem tendo recuperado a capacidade de crescer sem a adição de nutrientes Algumas das placas foram plaqueadas apenas com bactérias da linhagem A e algumas com apenas bactérias da linhagem B para atuar como controles mas nenhum prototrófico surgiu a partir desses plaqueamentos A Figura 55 B ilustra o experimento em mais detalhes Esses resultados sugeriram que algum tipo de recombinação de genes havia ocorrido entre os genomas das duas linhagens para produzir os prototróficos FIGURA 55 Com a utilização deste método Lederberg e Tatum demonstraram que a recombinação genética entre genótipos bacterianos é possível A O conceito básico duas culturas auxotróficas A e B são misturadas produzindo tipos selvagens WT prototróficos B Células do tipo A ou do tipo B não podem ser cultivadas em um meio não suplementado mínimo MM tendo em vista que cada uma de A e B carreia mutações que causam a incapacidade de sintetizar os constituintes necessários para o crescimento celular Entretanto quando A e B são misturadas durante algumas horas e em seguida são plaqueadas algumas poucas colônias aparecem na placa de ágar Essas colônias derivam de células únicas nas quais o material genético foi trocado Assim são capazes de sintetizar todos os constituintes necessários do metabolismo Poderia ser argumentado que as células das duas linhagens na realidade não trocam genes mas em vez disso extravasam substâncias que as outras células conseguem absorver e utilizar para crescimento Essa possibilidade de alimentação cruzada foi descartada por Bernard Davis como segue Ele construiu um tubo com formato de U no qual os dois braços eram separados por um filtro fino Os poros do filtro eram muito pequenos para possibilitar a passagem das bactérias mas grandes o suficiente para possibilitar a fácil passagem de quaisquer substâncias dissolvidas Figura 56 A linhagem A foi colocada em um braço a linhagem B no outro Após as linhagens terem sido incubadas durante um período Davis testou o conteúdo de cada braço para verificar se havia quaisquer células prototróficas mas nenhuma foi observada Em outras palavras era necessário o contato físico entre as duas linhagens para a formação das células do tipo selvagem Aparentemente havia ocorrido algum tipo de união de genoma e recombinantes genuínos haviam sido produzidos A união física das células bacterianas pode ser confirmada sob um microscópio eletrônico e atualmente é denominada conjugação Figura 57 FIGURA 56 Linhagens bacterianas auxotróficas A e B são cultivadas em qualquer um dos lados de um tubo com formato de U O líquido pode passar entre os braços por meio da aplicação de pressão ou sucção mas as células bacterianas não conseguem passar pelo filtro Após a incubação e o plaqueamento nenhuma colônia recombinante cresce em meio mínimo FIGURA 57 Uma célula doadora estende uma ou mais projeções ou pili que se unem a uma célula receptora e aproximam as duas bactérias Dr L CaroScience Source Descoberta do fator de fertilidade F Em 1953 William Hayes descobriu que nos tipos de cruzamentos há pouco descritos aqui os genitores conjugantes atuavam de modo desigual veremos modos para demonstrar essa participação desigual posteriormente Um genitor e apenas esse genitor aparentava transferir uma parte do ou todo o seu genoma para a outra célula Portanto uma célula atua como doadora e a outra célula atua como uma receptora Esse cruzamento é consideravelmente diferente dos cruzamentos eucarióticos nos quais os genitores contribuem igualmente com genomas nucleares para um indivíduo da progênie CONCEITOCHAVE A transferência do material genético na conjugação de E coli não é recíproca Uma célula a doadora transfere parte de seu genoma para outra célula que atua como receptora Acidentalmente Hayes descobriu uma variante de sua linhagem doadora original que não produzia recombinantes no cruzamento com a linhagem receptora Aparentemente a linhagem do tipo doadora havia perdido a capacidade de transferir o material genético e havia sido alterada para uma linhagem do tipo receptora Ao trabalhar com sua variante doadora estéril Hayes observou que ela podia recuperar a capacidade de atuar como doadora por meio da associação com outras linhagens doadoras De fato a capacidade de doadora foi transmitida de modo rápido e efetivo entre as linhagens durante a conjugação Um tipo de transferência infecciosa de algum fator aparentava estar ocorrendo Ele sugeriu que a capacidade doadora por si própria é um estado hereditário imposto por um fator de fertilidade F As linhagens que carreiam o F conseguem doar e são denominadas F As linhagens com ausência do F não conseguem doar e são receptoras denominadas F Agora sabemos muito mais a respeito do F Ele é um exemplo de uma molécula de DNA circular pequena e não essencial denominada plasmídio que consegue se replicar no citoplasma independentemente do cromossomo do hospedeiro A Figura 58 demonstra como as bactérias conseguem transferir plasmídios tal como o F O plasmídio F orienta a síntese dos pili singular pilus projeções que iniciam o contato com uma receptora ver Figuras 57 e 58 e que a puxam para mais perto O DNA de F na célula doadora faz uma versão de si próprio de filamento único por um mecanismo peculiar denominado replicação por círculo rolante O plasmídio circular rola e na medida em que gira desenrola o filamento único como uma linha de pesca Esse filamento único passa por um poro para dentro da célula receptora onde o outro filamento é sintetizado formando uma duplahélice Portanto uma cópia de F permanece na doadora e outra aparece na receptora conforme demonstrado na Figura 58 Observe que o genoma da E coli é ilustrado como um cromossomo circular único na Figura 58 Examinaremos a evidência em relação a isso posteriormente A maior parte dos genomas bacterianos é circular uma característica consideravelmente diferente dos cromossomos nucleares eucarióticos Veremos que essa característica leva às muitas idiossincrasias da genética bacteriana FIGURA 58 A Durante a conjugação o pilus aproxima duas bactérias B Em seguida formase uma ponte entre as duas células Uma cópia de filamento único do DNA do plasmídio é produzida na célula doadora e em seguida passa para a bactéria receptora na qual o filamento único atuando como um molde é convertido na duplahélice Linhagens Hfr 1 2 Uma importante descoberta surgiu quando Luca CavalliSforza descobriu um derivado de uma linhagem F com duas propriedades incomuns No cruzamento com linhagens F essa nova linhagem produziu 1000 vezes mais recombinantes do que uma linhagem F normal CavalliSforza designou essa derivada uma linhagem Hfr para simbolizar a sua capacidade de promover uma alta frequência de recombinação Em cruzamentos Hfr F virtualmente nenhum dos genitores F foi convertido em F ou em Hfr Esse resultado contrasta com os cruzamentos F F nos quais conforme vimos a transferência infecciosa do F resulta em uma grande proporção de genitores F que são convertidos em F Ficou aparente que uma linhagem Hfr resulta da integração do fator F no cromossomo conforme ilustrado na Figura 59 Agora podemos explicar a primeira propriedade incomum das linhagens Hfr Durante a conjugação o fator F inserido no cromossomo direciona com eficiência parte desse ou todo esse cromossomo para dentro da célula F O fragmento cromossômico em seguida pode participar da recombinação com o cromossomo receptor Os raros recombinantes observados por Lederberg e Tatum em cruzamentos F F ocorreram em virtude da formação espontânea porém rara de células Hfr na cultura F CavalliSforza isolou exemplos dessas células raras de culturas F e observou que de fato agora elas atuavam como verdadeiras Hfr Uma célula Hfr morre após doar seu material cromossômico para uma célula F A resposta é não Assim como o plasmídio F o cromossomo Hfr se replica e transfere um único filamento para a célula F durante a conjugação O fato que o DNA transferido é um filamento único pode ser demonstrado visualmente com a utilização de linhagens e anticorpos especiais conforme demonstrado na Figura 510 A replicação do cromossomo assegura um cromossomo completo para a célula doadora após o cruzamento O filamento transferido é convertido em uma duplahélice na célula receptora e os genes doadores podem se tornar incorporados no cromossomo da receptora por meio de crossovers criando uma célula recombinante Figura 511 Se não houver recombinação os fragmentos de DNA transferidos são simplesmente perdidos na progressão da divisão celular FIGURA 59 Em uma linhagem F o plasmídio F livre ocasionalmente se integra ao cromossomo de E coli criando uma linhagem Hfr ORGANISMOMODELO Escherichia coli O microscopista do século 17 Antony van Leeuwenhoek provavelmente foi o primeiro a visualizar células bacterianas e a reconhecer o seu pequeno tamanho Existe mais vida na espuma sobre os dentes na boca de um homem do que existem homens em todo o reino Entretanto a bacteriologia só iniciou de fato no século 19 Na década de 1940 Joshua Lederberg e Edward Tatum fizeram a descoberta que lançou a bacteriologia no campo da genética em desenvolvimento descobriram que em uma determinada bactéria havia um tipo de ciclo sexual incluindo um processo semelhante ao crossing over O organismo que eles escolheram para esse experimento se tornou o modelo não apenas para a genética dos procariotos mas em um sentido para toda a genética O organismo era a Escherichia coli uma bactéria denominada em homenagem ao seu descobridor o bacteriologista alemão do século 19 Theodore Escherich A escolha da E coli foi uma sorte tendo em vista que ela comprovadamente apresenta muitas características adequadas para as pesquisas genéticas isso além de ser facilmente obtida tendo em vista que vive no intestino de seres humanos e de outros animais No intestino é uma simbionte benigna mas ocasionalmente causa infecções urinárias e diarreia E coli tem um cromossomo circular único com comprimento de 46 Mb De seus 4000 genes sem íntrons aproximadamente 35 são de função desconhecida O ciclo sexual é possibilitado por meio da ação de um plasmídio extragenômico denominado F que confere um tipo de masculinidade Outros plasmídios carreiam genes cujas funções equipam a célula para a vida em ambientes específicos tais como genes de resistência a fármacos Esses plasmídios foram adaptados como vetores gênicos que são transportadores de genes que formam a base das transferências gênicas no centro da engenharia genética moderna A E coli é unicelular e cresce por simples divisão celular Em virtude de seu tamanho pequeno comprimento de cerca de 1 μm a E coli pode ser cultivada em grandes números e submetida à seleção intensiva e à triagem em relação a eventos genéticos raros Pesquisas com E coli representam o início do esclarecimento da caixa preta em genética por meio da seleção e da análise de mutantes as funções do maquinário genético puderam ser deduzidas ainda que fossem muito pequenas para serem visualizadas Fenótipos tais como tamanho da colônia resistência a fármacos utilização de fonte de carbono e produção de corante colorido tomaram o lugar dos fenótipos visíveis da genética de eucariotos Uma micrografia eletrônica de uma célula de E coli demonstrando flagelos longos utilizados para a locomoção e fímbrias pelos proteicos que são importantes para a ancoragem das células nos tecidos animais Os pili sexuais não estão demonstrados nesta micrografia Biophoto AssociatesScience Photo Library Transmissão linear dos genes Hfr a partir de um ponto fixo Uma visão mais clara do comportamento das linhagens Hfr foi obtida em 1957 quando Elie Wollman e François Jacob investigaram o padrão de transmissão de genes Hfr para células F durante um cruzamento Eles cruzaram Hfr azir tonr lac gal strs F azis tons lac gal strr Os sobrescritos r e s fazem referência a resistente e sensível respectivamente Em ocasiões específicas após a mistura eles removeram amostras cada uma das quais foi colocada em um liquidificador de cozinha durante alguns segundos para separar os pares de células em cruzamento Esse procedimento é denominado cruzamento interrompido Em seguida a amostra foi plaqueada em um meio contendo estreptomicina para matar as células doadoras Hfr que continham o alelo de sensibilidade strs As células strr sobreviventes em seguida foram testadas em relação à presença de alelos do genoma Hfr doador Qualquer célula strr que continha um alelo doador deve ter participado na conjugação as referidas células são denominadas exconjugantes Os resultados estão inseridos em um gráfico na Figura 512 A que demonstra o momento de entrada de cada alelo doador azir tonr lac e gal A Figura 512 B ilustra a transferência dos alelos Hfr FIGURA 510 As fotografias demonstram uma visualização da transferência do DNA de filamento único na conjugação em células de E coli com a utilização de anticorpos fluorescentes especiais As linhagens Hfr parentais A são pretas com DNA vermelho O vermelho é da ligação de um anticorpo com uma proteína normalmente ligada ao DNA As células receptoras F B são verdes em virtude da presença do gene para uma proteína de uma águaviva que fluoresce em verde e em virtude de serem mutantes em relação a um determinado gene a proteína de seu DNA não se liga com os anticorpos Quando o DNA de filamento único da doadora Hfr entra na receptora ele promove a ligação atípica desta proteína que fluoresce em amarelo neste fundo A parte C demonstra Hfr inalteradas e exconjugantes células que foram submetidas à 1 2 3 conjugação com DNA transferido em amarelo Algumas poucas células F não cruzadas estão visíveis De M Kohiyama S Hiraga I Matic and M Radman Bacterial Sex Playing Voyeurs 50 Years Later Science 301 2003 p 803 Fig 1 Reproduzida com autorização da AAAS Os elementoschave nesses resultados são Cada alelo doador aparece pela primeira vez nas receptoras F em uma ocasião específica após o início do cruzamento Os alelos doadores aparecem em uma sequência específica Os alelos doadores posteriores estão presentes em menos células receptoras Reunindo essas observações Wollman e Jacob deduziram que na conjugante Hfr a transferência do DNA de filamento único tem início a partir de um ponto fixo no cromossomo doador denominado origem O e continua de modo linear Atualmente sabese que o ponto O é o sítio no qual o plasmídio F é inserido Quanto mais longe um gene estiver de O mais tardiamente ele é transferido para F O processo de transferência em geral será interrompido antes que os genes mais distantes sejam transferidos e como resultado esses genes são incluídos em menos exconjugantes Observe que um tipo de mapa cromossômico pode ser produzido em unidades de minutos com base na ocasião da entrada dos genes marcados No exemplo na Figura 512 o mapa seria Como podemos explicar a segunda propriedade incomum dos cruzamentos Hfr que os exconjugantes F raramente são convertidos em Hfr ou F Quando Wollman e Jacob possibilitaram que os cruzamentos Hfr F continuassem por até 2 horas antes da separação eles observaram que de fato alguns poucos exconjugantes eram convertidos em Hfr Em outras palavras a parte de F que confere a capacidade doadora foi por fim transmitida mas a uma frequência muito baixa A raridade das exconjugantes Hfr sugeriu que o F inserido foi transmitido como o último elemento do cromossomo linear Podemos resumir a ordem de transmissão com o tipo de mapa geral a seguir no qual a seta indica o sentido da transferência que tem início com O FIGURA 511 Após a conjugação são necessários crossovers para integrar os genes do fragmento doador ao cromossomo receptor e portanto tornaremse uma parte estável de seu genoma Acompanhamento do tempo de entrada do marcador gera um mapa cromossômico FIGURA 512 Neste experimento de conjugação com cruzamento interrompido células F resistentes à estreptomicina com mutações em azi ton lac e gal são incubadas durante períodos variáveis com células Hfr que são sensíveis à estreptomicina e carreiam alelos do tipo selvagem em relação a esses genes A Um gráfico da frequência dos alelos doadores em exconjugantes em relação ao tempo após o cruzamento B Uma ilustração esquemática da transferência de marcadores demonstrados em cores diferentes com o passar do tempo A Dados de E L Wollman F Jacob and W Hayes Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 21 1956 141 Portanto quase nenhuma das receptoras F é convertida tendo em vista que o fator de fertilidade é o último elemento transferido e normalmente o processo de transmissão terá sido interrompido antes de chegar a esse ponto CONCEITOCHAVE O cromossomo Hfr originalmente circular desenrola uma cópia de si próprio que é transferida para a célula F de modo linear com o fator F entrando por último Inferência dos sítios de integração de F e a circularidade cromossômica Wollman e Jacob prosseguiram para esclarecer melhor como e onde o plasmídio F se integra para formar uma célula Hfr e ao fazer isso deduziram que o cromossomo é circular Eles realizaram experimentos de cruzamento interrompido com linhagens Hfr diferentes e derivadas em separado Significativamente a ordem de transmissão dos alelos diferiu de linhagem para linhagem como nos exemplos a seguir Linhagem Hfr H O thr pro lac pur gal his gly thi F 1 O thr thi gly his gal pur lac pro F 2 O pro thr thi gly his gal pur lac F 3 O pur lac pro thr thi gly his gal F AB 312 O thi thr pro lac pur gal his gly F Cada linhagem pode ser considerada um mapa que demonstra a ordem dos alelos no cromossomo À primeira vista aparentemente há uma mistura aleatória de genes Entretanto quando alguns dos mapas de Hfr são invertidos a relação das sequências se torna clara H escrita em ordem invertida F thi gly his gal pur lac pro thr O 1 O thr thi gly his gal pur lac pro F 2 O pro thr thi gly his gal pur lac F 3 O pur lac pro thr thi gly his gal F AB 312 escrita em ordem invertida F gly his gal pur lac pro thr thi O A relação das sequências entre si é explicada se cada mapa for o segmento de um círculo Essa foi a primeira indicação de que os cromossomos bacterianos são circulares Além disso Allan Campbell propôs uma hipótese surpreendente que explicou os diferentes mapas de Hfr Ele propôs que se F é um anel então a inserção poderia ocorrer por meio de um crossover simples entre F e o cromossomo bacteriano Figura 513 Sendo esse o caso quaisquer dos cromossomos lineares Hfr podem ser gerados simplesmente por meio da inserção de F no anel no local e na orientação apropriados Figura 514 1 2 1 2 Diversas hipóteses amparadas posteriormente se seguiram a partir da proposta de Campbell Uma extremidade do fator F integrado seria a origem na qual tem início a transferência do cromossomo Hfr O término estaria na outra extremidade de F A orientação na qual F é inserido determinaria a ordem de entrada dos alelos doadores Se o círculo contém os genes A B C e D então a inserção entre A e D proporcionaria a ordem ABCD ou DCBA dependendo da orientação Verifique as diferentes orientações das inserções na Figura 514 Como é possível que F se integre em diferentes sítios Se o DNA de F apresentar uma região homóloga a quaisquer das diversas regiões no cromossomo bacteriano qualquer uma delas poderia atuar como uma região de pareamento na qual o pareamento poderia ser seguido por um crossover Atualmente essas regiões de homologia sabidamente são segmentos principalmente de elementos de transposição denominados sequências de inserção Para uma explicação completa sobre as sequências de inserção ver Capítulo 15 Portanto o fator de fertilidade existe em dois estados O estado de plasmídio como um elemento citoplasmático livre F é facilmente transferido para receptoras F O estado integrado como uma parte contígua de um cromossomo circular F é transmitido apenas muito tardiamente na conjugação O ciclo de conjugação de E coli está resumido na Figura 515 Mapeamento de cromossomos bacterianos Mapeamento cromossômico geral por meio da utilização do tempo de entrada Wollman e Jacob perceberam que seria fácil a construção de mapas de ligação a partir dos resultados de cruzamento interrompido por meio da utilização como uma medida de distância dos tempos nos quais os alelos doadores aparecem pela primeira vez após o cruzamento As unidades de distância de mapa nesse caso são minutos Portanto se b começa a entrar na célula F 10 minutos após a começar a entrar a e b estão a uma distância de 10 unidades ver mapa anteriormente Assim como os mapas eucarióticos com base em crossovers esses mapas de ligação eram originalmente construções puramente genéticas Na ocasião em que foram originalmente planejados não havia um modo para testar a sua base física Mapeamento cromossômico detalhado por meio da utilização da frequência de recombinantes Para que um exconjugante adquira genes doadores como uma característica permanente do seu genoma o fragmento doador precisa se recombinar com o cromossomo receptor Entretanto observe que o mapeamento do tempo de entrada não tem por base a frequência de recombinantes De fato as unidades são minutos não FR Não obstante a frequência de recombinantes pode ser utilizada para um tipo de mapeamento mais meticuloso em bactérias um método para o qual nos voltamos agora FIGURA 513 A inserção de F cria uma célula Hfr Os marcadores hipotéticos 1 e 2 estão demonstrados em F para ilustrar a direção da inserção A origem O é o ponto de mobilização no qual ocorre a inserção dentro do cromossomo de E coli a região de pareamento é homóloga a uma região do cromossomo de E coli a a d são genes representativos no cromossomo de E coli As regiões de pareamento hachuradas são idênticas no plasmídio e no cromossomo Elas são derivadas de elementos móveis denominados sequências de inserção ver Capítulo 15 Neste exemplo a célula Hfr criada pela inserção de F transferiria os seus genes na ordem a d c b FIGURA 514 Cada uma das cinco linhagens Hfr de E coli demonstradas apresentam diferentes pontos de inserção do plasmídio F e orientações Todas as linhagens apresentam a mesma ordem de genes no cromossomo de E coli A orientação do fator F determina qual gene entra na célula receptora primeiro O gene mais próximo do término entra por último FIGURA 515 A conjugação pode ocorrer por meio da transferência parcial de um cromossomo que contém o fator F ou por meio da transferência de um plasmídio F que permanece uma entidade em separado FIGURA 516 Um crossover único entre o exogenoto e o endogenoto em um merozigoto levaria a um cromossomo linear e parcialmente diploide que não sobreviveria Primeiramente precisamos compreender algumas características especiais do evento de recombinação em bactérias Relembre que a recombinação não ocorre entre dois genomas integrais como ocorre em eucariotos Contrariamente ele ocorre entre um genoma completo da célula receptora F denominado endogenoto e um genoma incompleto derivado da célula doadora Hfr e denominado exogenoto A célula nesse estágio apresenta duas cópias de um segmento de DNA uma cópia é parte do endogenoto e a outra cópia é parte do exogenoto Portanto nesse estágio a célula é uma diploide parcial denominada merozigoto A genética bacteriana é a genética do merozigoto Um crossover único em um merozigoto quebraria o anel e portanto não produziria recombinantes viáveis conforme demonstrado na Figura 516 Para manter o círculo intacto deve haver um número par de crossovers Um número par de crossovers produz um cromossomo circular intacto e um fragmento Embora os referidos eventos de recombinação sejam representados de modo resumido como crossovers duplos o real mecanismo molecular é um pouco diferente mais como uma invasão do endogenoto por uma seção interna do exogenoto O outro produto do crossover duplo o fragmento em geral é perdido no crescimento celular subsequente Portanto apenas um dos produtos recíprocos da recombinação sobrevive Portanto outra característica única da recombinação bacteriana é que devemos nos esquecer dos produtos de troca recíproca na maior parte dos casos CONCEITOCHAVE A recombinação durante a conjugação resulta de um evento semelhante a um crossover duplo que dá origem a recombinantes recíprocos dos quais apenas um sobrevive Com essa compreensão podemos examinar o mapeamento de recombinação Suponha que desejamos calcular as distâncias de mapa que separam três loci próximos met arg e leu Para examinar a recombinação desses genes precisamos de trihíbridos exconjugantes que receberam todos os três marcadores doadores Presuma que um experimento de cruzamento interrompido tenha demonstrado que a ordem é met arg leu com met transferido primeiro e leu por último Para obter um trihíbrido precisamos do merozigoto diagramado aqui Para obter esse merozigoto primeiramente devemos selecionar exconjugantes estáveis que contenham o último alelo doador o qual nesse caso é leu Por quê Em exconjugantes leu sabemos que todos os três marcadores foram transferidos para o receptor tendo em vista que leu é o último alelo doador Também sabemos que no mínimo o marcador leu foi integrado ao endogenoto Desejamos saber com que frequência os outros dois marcadores também foram integrados de modo que possamos determinar o número de eventos de recombinação nos quais arg ou met tenha sido omitido em virtude de crossover duplo Agora o objetivo é contar as frequências de crossovers em locais diferentes Observe que agora temos uma situação diferente da análise de conjugação interrompida No mapeamento por meio de conjugação interrompida medimos o tempo de entrada de loci individuais para ser herdado de modo estável cada marcador tem de se recombinar com o cromossomo do receptor por meio de um crossover duplo que o abranja Entretanto na análise da frequência de recombinantes selecionamos especificamente trihíbridos como um ponto de partida e agora precisamos considerar as diversas combinações possíveis dos três alelos doadores que podem ser inseridos por meio de crossover duplo nos diversos intervalos Sabemos que leu necessariamente penetrou e se inseriu pois o selecionamos mas os recombinantes leu que selecionamos podem ou não ter incorporado os outros marcadores doadores dependendo de onde ocorreu o crossover duplo Portanto o procedimento é primeiramente selecionar exconjugantes leu e em seguida isolar e testar uma amostra grande deles para verificar quais dos outros marcadores foram integrados Vejamos um exemplo No cruzamento Hfr leu arg met strs F met arg leu strr selecionaríamos os recombinantes leu e em seguida os examinaríamos em relação aos alelos arg e met denominados marcadores não selecionados A Figura 517 ilustra os tipos de eventos de crossover duplo esperados Um crossover necessariamente ocorreu no lado esquerdo do marcador leu e o outro obrigatoriamente ocorreu no lado direito Presumiremos que os exconjugantes leu sejam dos tipos e das frequências a seguir leu arg met 4 leu arg met 9 leu arg met 87 Os crossovers duplos necessários para produzir esses genótipos estão demonstrados na Figura 517 Os primeiros dois tipos são a chave tendo em vista que necessitam de um crossover entre leu e arg no primeiro caso e entre arg e met no segundo Portanto as frequências relativas desses tipos correspondem aos tamanhos dessas duas regiões entre os genes Concluiríamos que a região de leu a arg tem 4 um e que a região de arg a met tem 9 um FIGURA 517 O diagrama demonstra como genes podem ser mapeados por meio de recombinação em E coli Em exconjugantes a seleção é realizada em relação a merozigotos que contenham o marcador leu que é doado tardiamente Os marcadores iniciais arg e met podem ou não ser inseridos dependendo do sítio onde ocorre a recombinação entre o fragmento Hfr e o cromossomo F As frequências dos eventos diagramados nas partes a e b são utilizadas para obter os tamanhos relativos das regiões de leu a arg e arg a met Observe que em cada caso apenas o DNA inserido no cromossomo F sobrevive o outro fragmento é perdido Em um cruzamento tal como o descrito há pouco um tipo de possíveis recombinantes de genótipo leu arg met requer quatro crossovers em vez de dois ver parte inferior da Figura 517 Esses recombinantes raramente são recuperados tendo em vista que a sua frequência é muito baixa em comparação àquela dos outros tipos de recombinantes Plasmídios F carreadores de fragmentos genômicos O fator F em linhagens Hfr em geral é consideravelmente estável em sua posição de inserção Entretanto ocasionalmente um fator F claramente sai do cromossomo graças à reversão do processo de recombinação que o inseriu primeiramente As duas regiões homólogas de pareamento em ambos os lados realizam um novo pareamento e ocorre um crossover para liberar o plasmídio F Entretanto algumas vezes a saída não é limpa e o plasmídio carreia com ele uma parte do cromossomo bacteriano Um plasmídio F que carreia um DNA genômico bacteriano é denominado plasmídio F prime F A primeira evidência desse processo teve origem nos experimentos em 1959 por Edward Adelberg e François Jacob Uma de suas observaçõeschave foi de uma Hfr na qual o fator F estava integrado próximo do locus lac Iniciando com essa linhagem Hfr lac Jacob e Adelberg observaram um derivado F que em cruzamentos transferia lac para receptores F lac a uma frequência muito alta Essas transferentes puderam ser detectados por plaqueamento em meio contendo lactose no qual apenas lac pode crescer O lac transferido não é incorporado ao cromossomo principal do receptor o qual sabemos que retém o alelo lac tendo em vista que esses exconjugantes F lac ocasionalmente dão origem a célulasfilhas F lac a uma frequência de 1 103 Portanto o genótipo desses receptores aparentava ser F lacF lac Em outras palavras os exconjugantes lac aparentavam carrear um plasmídio F com uma parte do cromossomo doador incorporado A origem desse plasmídio F está demonstrada na Figura 518 Observe que a excisão defeituosa ocorre em virtude da existência de outra região homóloga próxima que pareia com a original O F em nosso exemplo é denominado F lac tendo em vista que a parte do cromossomo hospedeiro que é captada possui o gene lac Observouse que os fatores F carreiam muitos genes cromossômicos diferentes e foram denominados de acordo Por exemplo os fatores F que carreiam gal ou trp são denominados F gal e F trp respectivamente Tendo em vista que as células F lacF lac são de fenótipo lac sabemos que lac é dominante em relação a lac Diploides parciais produzidos com a utilização de linhagens F são úteis para alguns aspectos da genética bacteriana de rotina tais como o estudo da dominância ou da interação de alelos Algumas linhagens F conseguem carrear partes muito grandes até 25 do cromossomo bacteriano CONCEITOCHAVE O DNA de um plasmídio F contém parte do fator F e parte do genoma bacteriano Assim como os plasmídios F os plasmídios F são transferidos rapidamente Eles podem ser utilizados para estabelecer diploides parciais para estudos de dominância bacteriana e interação de alelos FIGURA 518 Um fator F consegue captar o DNA cromossômico quando ele sai de um cromossomo A O F é inserido em uma linhagem Hfr em um elemento repetitivo identificado como IS1 sequência de inserção 1 entre os alelos ton e lac B O fator F inserido C Alça anormal por crossing over com um elemento diferente IS2 para incluir o locus lac D A partícula F lac resultante E Diploide parcial F lacF lac produzido por meio da transferência da partícula F lac para uma receptora F lac Dados de G S Stent and R Calendar Molecular Genetics 2nd ed Plasmídios R Uma propriedade alarmante das bactérias patogênicas foi verificada pela primeira vez por meio de estudos em hospitais japoneses na década de 1950 A disenteria bacteriana é causada por bactérias do gênero Shigella Essa bactéria inicialmente era sensível a uma ampla variedade de antibióticos que eram utilizados para controlar a doença Entretanto nos hospitais japoneses Shigella isoladas de pacientes com disenteria eram simultaneamente resistentes a muitos desses fármacos incluindo penicilina tetraciclina sulfanilamida estreptomicina e cloranfenicol Essa resistência a múltiplos fármacos foi herdada como um pacote genético único e pode ser transmitida de modo infeccioso não apenas para outras linhagens de Shigella sensíveis mas também para outras espécies de bactérias correlatas Esse talento que se assemelha à mobilidade do plasmídio F de E coli é um talento extraordinariamente útil para a bactéria patogênica tendo em vista que a resistência pode ser difundida rapidamente em uma população Entretanto suas implicações para a ciência médica são terríveis tendo em vista que a doença bacteriana subitamente se torna resistente ao tratamento com uma grande variedade de fármacos Do ponto de vista do geneticista entretanto o mecanismo comprovou ser interessante e útil na engenharia genética Os vetores que carreiam essas resistências múltiplas comprovaram ser outro grupo de plasmídios denominados plasmídios R Eles são transferidos rapidamente na conjugação celular de modo muito semelhante ao plasmídio F em E coli De fato os plasmídios R em Shigella comprovaram ser justamente os primeiros de muitos elementos genéticos semelhantes a serem descobertos Todos existem no estado de plasmídio no citoplasma Observouse que esses elementos carreiam muitos tipos diferentes de genes em bactérias A Tabela 52 demonstra algumas das características que podem ser transmitidas pelos plasmídios A Figura 519 demonstra um exemplo de um plasmídio bemconhecido isolado da indústria de laticínios Tabela 52 Determinantes genéticos transmitidos por plasmídios Característica Exemplos de plasmídios Fertilidade F R1 Col Produção de bacteriocina Col E1 Resistência a metais pesados R6 Produção de enterotoxina Ent Metabolismo da cânfora Cam Tumorigenicidade em plantas T1 em Agrobacterium tumefaciens FIGURA 519 O diagrama demonstra as origens dos genes do plasmídio pk214 de Lactococcus lactis Os genes são provenientes de muitas bactérias diferentes Dados da Tabela 1 em V Perreten F Schwartz L Cresta M Boeglin G Dasen and M Teuber Nature 389 1997 801802 Derivados modificados de plasmídios R tais como pBR 322 e pUC ver Capítulo 10 tornamse os vetores preferidos para a clonagem molecular do DNA de todos os organismos Os genes em um plasmídio R que conferem resistência podem ser utilizados como marcadores para o seguimento da movimentação dos vetores entre as células Nos plasmídios R os alelos para resistência a antibióticos com frequência estão contidos em uma unidade denominada transpóson Figura 520 Transpósons são segmentos únicos de DNA que conseguem moverse para sítios diferentes no genoma um processo denominado transposição Os mecanismos de transposição a qual ocorre na maior parte das espécies estudadas serão detalhados no Capítulo 15 Quando um transpóson no genoma se movimenta até um local novo ocasionalmente ele consegue englobar entre as suas extremidades diversos tipos de genes incluindo alelos para resistência a fármacos e os transporta até seus novos locais como passageiros Por vezes um transpóson carreia um alelo de resistência a fármacos até um plasmídio criando um plasmídio R Assim como os F muitos plasmídios R são conjugativos em outras palavras são efetivamente transmitidos para uma célula receptora durante a conjugação Até mesmo os plasmídios R que não são conjugativos e que nunca deixam suas próprias células podem doar seus alelos R para um plasmídio conjugativo por transposição Portanto por meio dos plasmídios os alelos de resistência a antibióticos podem ser difundidos rapidamente em uma população de bactérias Embora a difusão de plasmídios R seja uma estratégia eficaz para a sobrevivência das bactérias ela apresenta um problema importante para a prática médica conforme mencionado anteriormente tendo em vista que as populações bacterianas rapidamente se tornam resistentes a qualquer novo fármaco antibiótico que seja inventado e aplicado em humanos FIGURA 520 Um transpóson tal como Tn5 pode adquirir diversos genes de resistência a fármacos neste caso aqueles em relação à resistência aos fármacos canamicina e neomicina e os transmitir rapidamente para um plasmídio levando à transferência infecciosa de genes de resistência como um pacote A sequência de inserção 50 IS50 forma os lados de TN5 53 Transformação bacteriana Algumas bactérias conseguem captar fragmentos de DNA do meio externo e a referida captação constitui outro modo por meio do qual as bactérias conseguem trocar seus genes A fonte de DNA pode ser outras células da mesma espécie ou células de outras espécies Em alguns casos o DNA foi liberado a partir de células mortas em outros casos o DNA foi secretado de células bacterianas vivas O DNA captado integrase ao cromossomo da receptora Se esse DNA for de um genótipo diferente daquele da receptora o genótipo da receptora pode ser permanentemente alterado um processo adequadamente denominado transformação Natureza da transformação A transformação foi descoberta na bactéria Streptococcus pneumoniae em 1928 por Frederick Griffith Posteriormente em 1944 Oswald T Avery Colin M MacLeod e Maclyn McCarty demonstraram que o princípio transformante era o DNA Ambos os resultados são marcos na elucidação da natureza molecular dos genes Consideramos esse trabalho em mais detalhes no Capítulo 7 O DNA transformante é incorporado ao cromossomo bacteriano por meio de um processo análogo aos eventos de recombinação dupla observados em cruzamentos Hfr F Entretanto observe que na conjugação o DNA é transferido de uma célula viva para outra por meio do contato próximo enquanto na transformação fragmentos isolados de DNA externo são captados por uma célula por meio da parede celular e da membrana plasmática A Figura 521 demonstra um modo por meio do qual esse processo pode ocorrer A transformação tem sido útil em diversas áreas da pesquisa bacteriana tendo em vista que o genótipo de uma linhagem pode ser deliberadamente alterado em um modo muito específico por meio da transformação com um fragmento de DNA apropriado Por exemplo a transformação é amplamente utilizada na engenharia genética Observouse que até mesmo células eucarióticas podem ser transformadas por meio da utilização de procedimentos consideravelmente semelhantes e essa técnica tem sido inestimável para a modificação de células eucarióticas ver Capítulo 10 Mapeamento cromossômico com a utilização de transformação A transformação pode ser utilizada para medir quão próximos dois genes estão ligados em um cromossomo bacteriano Quando o DNA o cromossomo bacteriano é extraído para experimentos de transformação alguma quebra em fragmentos menores é inevitável Se dois genes do doador estiverem localizados muito próximos no cromossomo existe uma boa chance de que por vezes eles venham a ser carreados no mesmo fragmento de DNA transformante Portanto ambos serão captados causando uma transformação dupla Contrariamente se os genes estiverem amplamente separados no cromossomo mais provavelmente eles serão carreados em segmentos transformantes separados Um genoma poderia captar ambos os segmentos de modo independente criando um transformante duplo mas aquele desfecho não é provável Portanto em genes amplamente separados a frequência de transformantes duplos será igual ao produto das frequências dos transformantes únicos Portanto deve ser possível testar a ligação próxima testando o desvio pela regra do produto Em outras palavras se os genes estiverem ligados a proporção de transformantes duplos será superior ao produto das frequências de transformantes únicos FIGURA 521 Uma bactéria sofrendo transformação A capta DNA livre liberado de uma célula bacteriana morta Na medida em que os complexos de ligação ao DNA na superfície bacteriana captam o DNA inserção enzimas degradam um filamento em nucleotídios um derivado do outro filamento pode integrarse ao cromossomo bacteriano B Infelizmente a situação se torna mais complexa por diversos fatores o mais importante sendo que nem todas as células em uma população de bactérias são competentes para serem transformadas Não obstante no final deste capítulo você poderá aguçar as suas habilidades na análise de transformação em um dos problemas o qual presume que 100 das células receptoras sejam competentes CONCEITOCHAVE As bactérias conseguem captar fragmentos de DNA a partir do meio adjacente Dentro da célula esses fragmentos conseguem integrarse ao cromossomo 54 Genética de bacteriófagos A palavra bacteriófago que é uma denominação dos vírus bacterianos significa comedor de bactérias Esses vírus parasitam e matam as bactérias Trabalhos pioneiros sobre a genética dos bacteriófagos em meados do século 20 formaram o fundamento de pesquisas mais recentes sobre vírus que causam tumores e outros tipos de vírus de animais e plantas Desse modo os vírus bacterianos proporcionaram um importante sistemamodelo Esses vírus podem ser utilizados em dois tipos diferentes de análises genéticas Primeiramente dois genótipos de fagos distintos podem ser cruzados para medir a recombinação e portanto mapear o genoma viral O mapeamento do genoma viral por meio desse método é o tópico desta seção Em segundo lugar os bacteriófagos podem ser utilizados como um modo de unir genes bacterianos para estudos de ligação e outros estudos genéticos Estudaremos a utilização dos fagos em estudos bacterianos na Seção 55 Além disso conforme veremos no Capítulo 10 os fagos são utilizados em tecnologia de DNA como portadores ou vetores de DNA estranho Antes que possamos compreender a genética dos fagos devemos primeiramente examinar o ciclo de infecção dos fagos Infecção de bactérias por fagos A maior parte das bactérias é suscetível ao ataque por bacteriófagos Um fago é composto por um cromossomo de ácido nucleico DNA ou RNA circundado por um revestimento de moléculas proteicas Os tipos de fagos são identificados não pelos nomes das espécies mas por símbolos por exemplo fago T4 fago λ e assim por diante As Figuras 522 e 523 demonstram a estrutura do fago T4 Durante a infecção um fago adere a uma bactéria e injeta o seu material genético no citoplasma bacteriano conforme diagramado na Figura 522 Uma micrografia eletrônica do processo está demonstrada na Figura 524 As informações genéticas do fago em seguida assumem o controle do maquinário da célula bacteriana ao desligar a síntese dos componentes bacterianos e ao redirecionar o maquinário de síntese bacteriano para produzir os componentes do fago As cabeças de fagos recémformadas são dotadas individualmente com réplicas do cromossomo do fago Finalmente muitos descendentes do fago são produzidos e liberados quando a parede celular bacteriana se rompe Esse processo de ruptura é denominado lise A população de progênie de fagos é denominada lisado de fagos FIGURA 522 Um fago infectante injeta DNA por meio de sua estrutura central na célula esquerda O bacteriófago T4 é demonstrado como um fago livre e em seguida no processo de infecção de uma célula de E coli direita Os principais componentes estruturais de T4 FIGURA 523 A ampliação do fago T4 de E coli revela detalhes da cabeça da cauda e das fibras da cauda Science Source FIGURA 524 Bacteriófagos são demonstrados em diversos estágios do processo de infecção que inclui a ligação e a injeção do DNA Eye of ScienceScience Source Como podemos estudar a herança nos fagos quando eles são tão pequenos que são visíveis apenas ao microscópio eletrônico Nesse caso não conseguimos produzir uma colônia visível por meio de plaqueamento mas podemos produzir uma manifestação visível de um fago ao tirar vantagem de diversas características do fago Vejamos as consequências da infecção de uma célula bacteriana única por um fago A Figura 525 demonstra a sequência de eventos no ciclo infeccioso que leva à liberação da progênie de fagos pela célula lisada Após a lise os fagos da progênie infectam as bactérias vizinhas Esse ciclo é repetido durante rodadas progressivas de infecção e na medida em que esses ciclos se repetem a quantidade de células lisadas aumenta exponencialmente Dentro de 15 horas após a infecção de uma única célula bacteriana por uma única partícula de fago os efeitos são visíveis a olho nu como uma área clara ou placa na camada opaca de bactérias que recobre a superfície de uma placa de meio sólido Figura 526 As referidas placas podem ser grandes ou pequenas difusas ou bemdefinidas e assim por diante dependendo do genótipo do fago Portanto a morfologia da placa é uma característica do fago que pode ser analisada no nível genético Outro fenótipo do fago que podemos analisar geneticamente é a variedade de hospedeiros tendo em vista que os fagos diferem nos espectros de linhagens bacterianas que conseguem infectar e lisar Por exemplo uma linhagem específica de bactérias pode ser imune ao fago 1 mas suscetível ao fago 2 Ciclo do fago que lisa as células hospedeiras FIGURA 525 A infecção por um fago único redireciona o maquinário da célula para a produção da progênie de fagos que são liberados na lise Mapeamento de cromossomos de fagos por meio da utilização de cruzamentos de fagos Dois genótipos de fagos podem ser cruzados em grande parte do mesmo modo que cruzamos organismos Um cruzamento de fagos pode ser ilustrado por meio de um cruzamento de fagos T2 originalmente estudados por Alfred Hershey Os genótipos das duas linhagens parentais no cruzamento de Hershey foram h r h r Os alelos correspondem aos fenótipos a seguir h consegue infectar duas linhagens diferentes de E coli as quais podemos denominar linhagens 1 e 2 FIGURA 526 Por meio de infecção repetida e produção de progênie de fagos um único fago produz uma área clara ou placa na camada opaca de células bacterianas D Sue Katz Rogers State University Claremore OK h consegue infectar apenas a linhagem 1 r lisa as células rapidamente produzindo assim placas grandes r lisa as células lentamente produzindo placas pequenas Para realizar o cruzamento a linhagem 1 de E coli é infectada com ambos os genótipos parentais do fago T2 Esse tipo de infecção é denominado infecção mista ou infecção dupla Figura 527 Após um período de incubação apropriado o lisado de fagos que contém os fagos da progênie é analisado por meio da sua difusão sobre uma camada de bactérias composta por uma mistura das linhagens 1 e 2 de E coli Quatro tipos de placas são distinguíveis em seguida Figura 528 As placas grandes indicam lise rápida r e as placas pequenas indicam lise lenta r As placas de fagos com o alelo h infectarão ambas os hospedeiros formando uma placa clara enquanto as placas de fagos com o alelo h infectarão apenas um hospedeiro formando uma placa turva Portanto os quatro genótipos podem ser facilmente classificados como parentais h r e h r e recombinantes h r e h r e uma frequência de recombinantes pode ser calculada como segue Se presumirmos que os cromossomos recombinantes de fagos são lineares então crossovers únicos produzem produtos recíprocos viáveis Entretanto os cruzamentos de fagos estão sujeitos a algumas complicações analíticas Primeiramente diversas rodadas de troca podem ocorrer no hospedeiro um recombinante produzido logo após a infecção pode sofrer recombinação adicional na mesma célula ou em ciclos de infecção posteriores Em segundo lugar a recombinação pode ocorrer entre fagos geneticamente semelhantes bem como entre tipos diferentes Portanto se considerarmos P1 e P2 uma referência aos genótipos parentais gerais podem ocorrer cruzamentos de P1 P1 e P2 P2 além de P1 P2 Em virtude de ambos esses motivos os recombinantes de cruzamentos de fagos são uma consequência de uma população de eventos em vez de eventos definidos de troca de etapa única Não obstante se restante for constante o cálculo da FR representa um índice válido da distância de mapa nos fagos FIGURA 527 FIGURA 528 Estes fenótipos de placas foram produzidos pela progênie do cruzamento h r h r Quatro fenótipos de placas podem ser diferenciados representando dois tipos parentais e dois recombinantes De G S Stent Molecular Biology of Bacterial Viruses Direitos autorais 1963 por W H Freeman and Company Tendo em vista que números astronomicamente grandes de fagos podem ser utilizados em análises de recombinação de fagos podem ser detectados eventos de crossover muito raros Na década de 1950 Seymour Benzer utilizou os referidos eventos de crossover raros para mapear os sítios mutantes no gene rII do fago T4 um gene que controla a lise Em relação a diferentes alelos mutantes rII que surgem espontaneamente o sítio mutante normalmente está em diferentes posições no gene Portanto quando dois mutantes rII diferentes são cruzados podem ocorrer alguns crossovers raros entre os sítios mutantes produzindo recombinantes do tipo selvagem conforme demonstrado aqui Na medida em que a distância entre dois sítios mutantes aumenta um referido evento de crossover é mais provável Portanto a frequência de recombinantes rII é uma medida dessa distância no gene O produto recíproco é um mutante duplo e indistinguível dos parentais Benzer utilizou uma abordagem inteligente para detectar os muito raros recombinantes rII Ele fez uso do fato de que os mutantes rII não infectarão uma linhagem de E coli denominada K Portanto ele realizou o cruzamento rII rII em outra linhagem e em seguida plaqueou o lisado de fagos em uma camada da linhagem K Apenas os recombinantes rII formarão placas nessa camada Esse modo de observar um evento genético raro nesse caso um recombinante é um sistema seletivo apenas o evento raro desejado consegue produzir um determinado desfecho visível Contrariamente uma triagem é um sistema no qual grandes números de indivíduos são analisados visualmente para buscar a agulha em um palheiro rara Essa mesma abordagem pode ser utilizada para mapear sítios mutantes em genes de qualquer organismo a partir do qual grandes números de células possam ser obtidos e em relação ao qual os fenótipos do tipo selvagem e mutante possam ser distinguidos Entretanto esse tipo de mapeamento intragênico foi amplamente substituído pelo advento de métodos químicos não dispendiosos para sequenciamento do DNA que identificam as posições dos sítios mutantes diretamente 55 CONCEITOCHAVE A recombinação entre cromossomos de fagos pode ser estudada por meio da junção dos cromossomos parentais em uma célula hospedeira pela infecção mista Os fagos da progênie podem ser examinados em relação aos genótipos parentais e recombinantes Transdução Alguns fagos são capazes de captar genes bacterianos e carreálos de uma célula bacteriana até outra um processo conhecido como transdução Portanto a transdução juntase à bateria de modos de transferência do material genômico entre bactérias juntamente com a transferência do cromossomo Hfr transferência do plasmídio F e transformação Descoberta da transdução Em 1951 Joshua Lederberg e Norton Zinder estavam testando a recombinação na bactéria Salmonella typhimurium por meio da utilização de técnicas que haviam apresentado sucesso com E coli Os pesquisadores utilizaram duas linhagens diferentes uma era phe trp tyr e a outra era met his Não nos preocuparemos com a natureza desses alelos exceto para observar que todos são auxotróficos Quando cada uma das linhagens foi plaqueada em um meio mínimo não foram observadas células do tipo selvagem Entretanto após as duas linhagens serem misturadas prototróficos do tipo selvagem apareceram em uma frequência de aproximadamente 1 em 105 Até então a situação aparenta ser semelhante àquela em relação à recombinação em E coli Entretanto nesse caso os pesquisadores também recuperaram recombinantes de um experimento com um tubo em formato de U no qual a conjugação foi evitada por meio de um filtro que separava os dois braços relembre a Figura 56 Eles formularam a hipótese de que algum agente carreava os genes de uma bactéria para outra Ao variar o tamanho dos poros no filtro eles observaram que o agente responsável pela transferência gênica era do mesmo tamanho de um fago de Salmonella conhecido denominado fago P22 Além disso o agente filtrável e o P22 eram idênticos na sensibilidade ao antissoro e na imunidade às enzimas hidrolíticas Portanto Lederberg e Zinder haviam descoberto um novo tipo de transferência gênica mediada por um vírus Eles foram os primeiros a denominar esse processo transdução Como uma raridade no ciclo lítico as partículas de vírus por vezes captam genes bacterianos e os transferem quando infectam outro hospedeiro A transdução foi demonstrada subsequentemente em muitas bactérias Para compreender o processo de transdução precisamos distinguir dois tipos de ciclo de fagos Os fagos virulentos são aqueles que lisam e matam o hospedeiro imediatamente Os fagos temperados conseguem permanecer dentro da célula hospedeira durante um período sem matála O seu DNA se integra ao cromossomo do hospedeiro para ser replicado com ele ou é replicado separadamente no citoplasma assim como um plasmídio Um fago integrado ao genoma bacteriano é denominado profago Uma bactéria que abriga um fago quiescente é descrita como lisogênica e ela própria é denominada lisógena Ocasionalmente o fago quiescente em uma bactéria lisogênica se torna ativo se replica e causa a lise espontânea da sua célula hospedeira Um fago temperado residente confere resistência à infecção por outros fagos do mesmo tipo Existem dois tipos de transdução generalizada e especializada Os fagos de transdução generalizada conseguem carrear qualquer parte do cromossomo bacteriano enquanto os fagos de transdução especializada carreiam apenas determinadas partes específicas CONCEITOCHAVE Os fagos virulentos não conseguem se tornar profagos eles se replicam e lisam uma célula imediatamente Os fagos temperados conseguem existir dentro da célula bacteriana como profagos possibilitando que seus hospedeiros sobrevivam como bactérias lisogênicas eles também são capazes de ocasionalmente lisar a bactéria Transdução generalizada Por meio de quais mecanismos um fago consegue realizar a transdução generalizada Em 1965 H Ikeda e J Tomizawa lançaram luz sobre essa questão em alguns experimentos sobre o fago P1 de E coli Eles descobriram que quando uma célula doadora é lisada por P1 o cromossomo bacteriano é rompido em pequenos fragmentos Ocasionalmente as partículas de fagos recentemente formadas incorporam de modo errôneo um fragmento do DNA bacteriano dentro de uma cabeça de fago não no DNA do fago Esse evento é a origem do fago transdutor Um fago que carreia o DNA bacteriano consegue infectar outra célula Em seguida aquele DNA bacteriano pode ser incorporado dentro do cromossomo da célula receptora por meio de recombinação Figura 529 Tendo em vista que os genes em quaisquer das partes cortadas do genoma hospedeiro podem ser transduzidos esse tipo de transdução é necessariamente do tipo generalizado Ambos os fagos P1 e P22 pertencem a um grupo de fagos que demonstra transdução generalizada O DNA de P22 é inserido no cromossomo hospedeiro enquanto o DNA de P1 permanece livre como um grande plasmídio Entretanto ambos transduzem por meio do enchimento defeituoso da cabeça A transdução generalizada pode ser utilizada para a obtenção de informações sobre ligação bacteriana quando os genes estão suficientemente próximos para que o fago possa captálos e transduzilos em um único fragmento de DNA Por exemplo suponha que desejamos encontrar a distância de ligação entre met e arg em E coli Cultivamos o fago P1 em uma linhagem doadora met arg e em seguida possibilitamos que os fagos P1 da lise dessa linhagem infectem uma linhagem met arg Primeiramente é selecionado um alelo doador digamos met Em seguida é medida a porcentagem de colônias met que também são arg As linhagens transduzidas para ambos met e arg são denominadas cotransdutantes Quanto maior a frequência de cotransdução mais próximos dois marcadores genéticos precisam estar o oposto da maior parte das medidas de mapeamento Os valores de ligação normalmente são expressos como frequências de cotransdução Figura 530 Ao utilizar uma extensão dessa abordagem podemos estimar o tamanho do fragmento do cromossomo hospedeiro que um fago consegue captar assim como no tipo de experimento a seguir que utiliza o fago P1 doador leu thr azir receptor leu thr azis Nesse experimento o fago P1 cultivado na linhagem doadora leu thr azir infecta a linhagem receptora leu thr azis A estratégia é selecionar um ou mais alelos doadores na receptora e em seguida testar esses transdutantes em relação à presença dos alelos não selecionados Os resultados estão resumidos na Tabela 53 O experimento 1 na Tabela 53 nos informa que leu está relativamente próximo de azi e distante de thr restandonos duas possibilidades O experimento 2 nos informa que leu está mais próximo de thr do que azi está e assim o mapa tem de ser Ao selecionar thr e leu juntos nos fagos transdutores no experimento 3 observamos que o fragmento transduzido de material genético nunca inclui o locus azi tendo em vista que a cabeça do fago não consegue carrear um fragmento de DNA tão grande quanto aquele P1 somente consegue cotransduzir genes com distância inferior a aproximadamente 15 minuto no mapa cromossômico de E coli FIGURA 529 Um fago recentemente formado capta DNA do cromossomo de sua célula hospedeira parte superior e em seguida injetao em uma célula nova parte inferior à direita O DNA injetado inserese no cromossomo do novo hospedeiro por meio de recombinação parte inferior à esquerda Na realidade apenas uma minoria muito pequena da progênie de fagos 1 em 10000 carreia genes doadores FIGURA 530 O diagrama demonstra um mapa genético da região de purB a cysB de E coli determinada pela cotransdução de P1 Os números fornecidos são as médias em porcentagem em relação às frequências de transdução obtidas em diversos experimentos Os valores entre parênteses são considerados não confiáveis Dados de J R Guest Mol Gen Genet 105 1969 p 285 Transdução especializada Um transdutor generalizado tal como o fago P22 capta fragmentos de DNA quebrado do hospedeiro aleatoriamente Como os outros fagos que atuam como transdutores especializados conseguem carrear apenas determinados genes do hospedeiro até as células receptoras A resposta curta é que um transdutor especializado inserese no cromossomo bacteriano em apenas uma posição Quando ele sai ocorre uma alça defeituosa semelhante ao tipo que produz plasmídios F Portanto ele consegue captar e transduzir apenas genes que estão próximos Tabela 53 Marcadores de acompanhamento em transduções de P1 específicas Experimento Marcador selecionado Marcadores não selecionados 1 leu 50 são azir 2 são thr 2 thr 3 são leu 0 são arir 3 leu e thr 0 são azir O protótipo da transdução especializada foi fornecido por estudos realizados por Joshua e Esther Lederberg em um fago temperado de E coli denominado lambda λ O fago λ se tornou o fago mais intensivamente estudado e mais bem caracterizado Comportamento do profago O fago λ apresenta efeitos incomuns quando células lisogênicas em relação a ele são utilizadas em cruzamentos No cruzamento de uma Hfr não infectada com uma receptora lisogênica F Hfr F λ as exconjugantes F lisogênicas com genes Hfr são prontamente recuperadas Entretanto no cruzamento recíproco Hfr λ F os genes iniciais do cromossomo Hfr são recuperados entre as exconjugantes mas os recombinantes em relação aos genes tardios não são recuperados Além disso exconjugantes lisogênicas quase nunca são recuperadas a partir desse cruzamento recíproco Qual é a explicação As observações fazem sentido se o profago λ estiver se comportando como um locus gênico bacteriano se comporta ou seja como parte do cromossomo bacteriano Portanto no cruzamento Hfr λ F o profago entraria na célula F em um momento específico correspondente à sua posição no cromossomo Os genes iniciais são recuperados porque eles entram antes do profago Os genes tardios não são recuperados porque a lise destrói a célula receptora Em experimentos de cruzamento interrompido o profago λ de fato sempre entra na célula F em um momento específico ligado de modo próximo ao locus gal Em um cruzamento Hfr λ F a entrada do profago λ na célula aciona imediatamente o profago para um ciclo lítico esse processo é denominado indução zigótica Figura 531 Entretanto no cruzamento de duas células lisogênicas Hfr λ F λ não existe indução zigótica A presença de qualquer profago evita que outro vírus infectante cause lise Isso porque o profago produz um fator citoplasmático que reprime a multiplicação do vírus O repressor citoplasmático fagodirecionado explica muito bem a imunidade das bactérias lisogênicas tendo em vista que um fago encontraria imediatamente um repressor e seria inativado Inserção do λ Os experimentos de cruzamento interrompido até aqui descritos demonstraram que o profago λ faz parte do cromossomo da bactéria lisogênica Como o profago λ é inserido no genoma bacteriano Em 1962 Allan Campbell propôs que ele é inserido por meio de um crossover único entre um cromossomo de fago λ circular e o cromossomo de E coli circular conforme demonstrado na Figura 532 O ponto do crossover estaria entre um sítio específico em λ o sítio de ligação do λ e um sítio de ligação no cromossomo bacteriano localizado entre os genes gal e bio tendo em vista que λ integrase naquela posição no cromossomo de E coli Uma atração da proposta de Campbell é que a partir dela se seguem previsões que os geneticistas conseguem testar Por exemplo a integração do profago ao cromossomo de E coli deve aumentar a distância genética entre os genes bacterianos flanqueadores conforme pode ser observado na Figura 532 em relação a gal e bio De fato estudos demonstram que a lisogenia aumenta o tempo de entrada ou as distâncias de recombinação entre os genes bacterianos Essa localização única de λ contribui para sua transdução especializada FIGURA 531 Um profago λ pode ser transferido para uma receptora durante a conjugação mas o profago aciona a lise um processo denominado indução zigótica apenas se a receptora já não apresentar profago ou seja no caso demonstrado na parte A mas não na parte B FIGURA 532 A recombinação recíproca ocorre entre um sítio de ligação específico no DNA circular e uma região específica denominada sítio de ligação no cromossomo de E coli entre os genes gal e bio Mecanismo de transdução especializada Como é um profago λ sempre se insere entre a região gal e a região bio do cromossomo hospedeiro Figura 533 e em experimentos de transdução conforme esperado λ consegue transduzir apenas os genes gal e bio Como λ transporta os genes vizinhos Novamente a explicação está em uma reversão imperfeita do mecanismo de inserção de Campbell como aquele em relação à formação de F O evento de recombinação entre regiões específicas de λ e o cromossomo bacteriano é catalisado por um sistema enzimático especializado codificado pelo fago que utiliza o sítio de ligação de λ como um substrato O sistema enzimático determina que λ integrese apenas em um ponto específico entre gal e bio no cromossomo ver Figura 533 A Além disso durante a lise o profago λ normalmente é excisado precisamente no ponto correto para produzir um cromossomo λ circular normal conforme observado na Figura 533 B I Muito raramente a excisão é anormal em virtude da alça defeituosa Nesse caso a alça de DNA do fago pode captar um gene próximo e deixar para trás alguns genes do fago conforme observado na Figura 533 B II O genoma do fago resultante é defeituoso em virtude dos genes deixados para trás mas também obteve um gene bacteriano gal ou bio O DNA anormal que carreia os genes próximos pode ser condensado nas cabeças dos fagos para produzir partículas de fagos que conseguem infectar outras bactérias Esses fagos são denominados λdgal gal λdefeituoso ou λdbio Na presença de uma segunda partícula de fago normal em uma infecção dupla λdgal consegue integrarse ao cromossomo no sítio de ligação de λ Figura 533 C Desse modo os genes gal nesse caso são transduzidos para o segundo hospedeiro Alça defeituosa produz fago λ que contém DNA bacteriano 56 FIGURA 533 O diagrama demonstra como a transdução especializada é operada no fago λ A Um crossover no sítio de ligação especializado produz uma bactéria lisogênica B A bactéria lisogênica pode produzir um λ normal I ou raramente λdgal II uma partícula transdutora que contém o gene gal C Transdutantes gal podem ser produzidos por meio I da coincorporação de λdgal e λ que atua como um auxiliar ou II de crossovers flanqueadores do gene gal um evento raro Os quadrados duplos azuis são sítios de ligação bacteriana os quadrados duplos roxos são o sítio de ligação de λ e os pares dos quadrados azuis e roxos são os sítios híbridos de integração derivados parcialmente de E coli e parcialmente de λ CONCEITOCHAVE A transdução ocorre quando fagos recentemente formados adquirem genes do hospedeiro e os transferem para outras células bacterianas A transdução generalizada consegue transferir qualquer gene do hospedeiro Ela ocorre quando o processo de condensação do fago acidentalmente incorpora DNA bacteriano em vez de DNA do fago A transdução especializada ocorre em virtude da alça defeituosa do profago do cromossomo bacteriano e assim o novo fago contém os genes do fago e bacterianos O fago transdutor só consegue transferir genes específicos do hospedeiro Comparação de mapas físicos e mapas de ligação Alguns mapas cromossômicos muito detalhados de bactérias foram obtidos por meio da combinação das técnicas de mapeamento de cruzamento interrompido mapeamento de recombinação transformação e transdução Atualmente novos marcadores genéticos são tipicamente mapeados primeiramente em um segmento de aproximadamente 10 a 15 minutos de mapa por meio da utilização do cruzamento interrompido Em seguida marcadores adicionais ligados de modo próximo podem ser mapeados em uma análise mais meticulosa com a utilização de cotransdução de P1 ou recombinação Em 1963 o mapa de E coli Figura 534 já detalhava as posições de aproximadamente 100 genes Após 27 anos de refinamento adicional o mapa de 1990 ilustrava as posições de mais de 1400 genes A Figura 535 demonstra uma seção de 5 minutos do mapa de 1990 que está ajustado para uma escala de 100 minutos A complexidade desses mapas ilustra o poder e a sofisticação da análise genética Quão bem esses mapas correspondem à realidade física Em 1997 a sequência do DNA de todo o genoma de E coli de 4632221 pares de bases foi concluída o que nos possibilita comparar a posição exata dos genes no mapa genético com a posição da sequência codificadora correspondente na sequência do DNA linear o mapa físico O mapa integral está representado na Figura 536 A Figura 537 realiza uma comparação em relação a um segmento de ambos os mapas Claramente o mapa genético é uma correspondência próxima do mapa físico FIGURA 534 O mapa genético de 1963 dos genes de E coli com fenótipos mutantes As unidades são minutos com base em experimentos de cruzamento interrompido e recombinação Os asteriscos fazem referência às posições do mapa que não são tão precisas quanto as outras posições Dados de G S Stent Molecular Biology of Bacterial Viruses FIGURA 535 Um desenho em escala linear de uma seção de 5 min sequenciada do mapa de ligação de E coli de 1990 de 100 min Os parênteses e os asteriscos indicam marcadores em relação aos quais a localização exata era desconhecida na ocasião da publicação As setas acima dos genes e dos grupos de genes indicam o sentido da transcrição Dados de B J Bachmann Linkage Map of Escherichia coli K12 Edition 8 Microbiol Rev 54 1990 130197 O Capítulo 4 considerou alguns modos pelos quais o mapa físico normalmente a sequência completa do genoma pode ser útil no mapeamento de novas mutações Em bactérias a técnica da mutagênese insercional é outro modo de detectar rapidamente a posição de uma mutação em um mapa físico conhecido A técnica causa mutações por meio da inserção aleatória de fragmentos de DNA estranhos Os insertos inativam qualquer gene no qual penetrem por meio da interrupção da unidade transcricional Os transpósons são inserções particularmente úteis para essa finalidade em diversos organismosmodelo incluindo bactérias Para mapear uma nova mutação o procedimento é como segue O DNA de um transpóson que carreia um alelo de resistência ou outro marcador selecionável é introduzido por meio de transformação nas receptoras bacterianas que não apresentam transpósons ativos Os transpósons inseremse mais ou menos aleatoriamente e qualquer um que entre no meio de um gene causa uma mutação Um subconjunto de todos os mutantes obtidos apresentará fenótipos relevantes para o processo bacteriano em estudo e esses fenótipos se tornam o foco da análise A beleza da inserção dos transpósons é que tendo em vista que sua sequência é conhecida o gene mutante pode ser localizado e sequenciado São criados primers para a replicação do DNA que correspondem à sequência conhecida do transpóson ver Capítulo 10 Esses primers são utilizados para iniciar uma análise de sequenciamento que ocorre de modo centrífugo a partir do transpóson em direção ao gene adjacente Em seguida a curta sequência obtida pode ser colocada em um computador e comparada à sequência completa do genoma A partir dessa análise a posição do gene e sua sequência completa são obtidas A função de um homólogo desse gene pode já ter sido deduzida em outros organismos Portanto você pode verificar que essa abordagem assim como aquela introduzida no Capítulo 4 é outro modo de unir o fenótipo mutante com a posição do mapa e a possível função A Figura 538 resume a abordagem FIGURA 536 Este mapa foi obtido a partir do sequenciamento do DNA e da plotagem das posições dos genes Legenda dos componentes do exterior para o interior A origem e o término da replicação do DNA estão marcados As duas escalas estão em pares de base de DNA e em minutos Os histogramas em laranja e amarelo demonstram a distribuição dos genes nos dois filamentos de DNA diferentes As setas representam os genes para rRNA vermelhas e tRNA verdes A explosão estelar central é um histograma de cada gene com linhas de comprimento que refletem o nível de transcrição previsto F R Blattner et al The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K12 Science 277 1997 1453 1462 DOI 101126science27753311453 Reproduzida com autorização da AAAS Cortesia do Dr Guy Plunkett III FIGURA 537 Um alinhamento dos mapas genético e físico A Marcadores no mapa genético de 1990 na região próxima de 60 e 61 min B As posições exatas de cada gene com base na sequência completa do genoma de E coli Nem todo gene está denominado neste mapa para simplicidade Os quadros alongados são genes e genes putativos Cada cor representa um tipo de função diferente Por exemplo vermelho indica funções regulatórias e azulescuro indica funções na replicação na recombinação e no reparo do DNA As linhas entre os mapas nas partes A e B conectam o mesmo gene em cada mapa Dados de F R Blattner et al The Complete Science 277 1997 14531462 É interessante mencionar que muitos dos experimentos históricos que revelam a circularidade dos genomas bacterianos e de plasmídios coincidiram com a publicação e a popularização de O Senhor dos Anéis de J R R Tolkien Consequentemente uma revisão da genética bacteriana naquela ocasião começou com a seguinte citação da trilogia Um Anel para a todos governar um Anel para encontrálos Um Anel para a todos trazer e na escuridão aprisionálos FIGURA 538 A inserção de um transpóson insere uma mutação em um gene de posição e função desconhecidas O segmento próximo do transpóson é replicado sequenciado e corresponde a um segmento na sequência completa do genoma RESUMO Avanços na genética bacteriana e de fagos nos últimos 50 anos proporcionaram o fundamento para a biologia molecular e a clonagem discutida nos capítulos posteriores Inicialmente nesse período observouse que a transferência e a recombinação de genes ocorrem entre diferentes linhagens de bactérias Entretanto nas bactérias o material genético é transmitido em apenas um sentido por exemplo na Escherichia coli de uma célula doadora F ou Hfr para uma célula receptora F A capacidade do doador é determinada pela presença na célula de um fator de fertilidade F um tipo de plasmídio Às vezes o fator F presente no estado livre nas células F consegue integrarse ao cromossomo de E coli e formar uma célula Hfr Quando isso ocorre um fragmento do cromossomo doador pode ser transferido para uma célula receptora e subsequentemente recombinarse com o cromossomo receptor Tendo em vista que o fator F pode ser inserido em diferentes locais no cromossomo hospedeiro os investigadores iniciais conseguiram reunir os fragmentos transferidos para demonstrar que o cromossomo de E coli é um círculo único ou anel A interrupção da transferência em tempos diferentes proporcionou aos geneticistas um método não convencional cruzamento interrompido para a construção de um mapa de ligação do único cromossomo de E coli e de outras bactérias semelhantes no qual a unidade de mapa é uma unidade de tempo minutos Em uma extensão dessa técnica a frequência de recombinantes entre marcadores que sabidamente entraram na receptora pode determinar melhor uma distância de mapa Podem ser observados diversos tipos de plasmídios além de F Os plasmídios R carreiam alelos de resistência a antibióticos com frequência em um elemento móvel denominado transpóson A rápida difusão dos plasmídios causa uma resistência ampla na população a fármacos de importância médica Os derivados dos referidos plasmídios naturais se tornaram importantes vetores de clonagem úteis para o isolamento dos genes e estudo em todos os organismos Os traços genéticos também podem ser transferidos de uma célula bacteriana para outra na forma de fragmentos de DNA transferidos para dentro da célula a partir do ambiente extracelular Esse processo de transformação nas células bacterianas foi a primeira demonstração de que o DNA é o material genético Para que ocorra a transformação o DNA tem de ser transferido para uma célula receptora e em seguida é necessário ocorrer recombinação entre o cromossomo receptor e o DNA incorporado As bactérias podem ser infectadas por vírus denominados bacteriófagos Em um método de infecção o cromossomo do fago penetra na célula bacteriana e utiliza o maquinário metabólico bacteriano para produzir fagos que rompem a bactéria hospedeira Em seguida os novos fagos infectam outras células Se dois fagos de genótipos diferentes infectarem a mesma hospedeira pode ocorrer recombinação entre os seus cromossomos Em outro modo de infecção a lisogenia o fago injetado permanece quiescente na célula bacteriana Em muitos casos esse fago quiescente o profago incorporase ao cromossomo da hospedeira e é replicado com ele Seja espontaneamente ou sob a estimulação apropriada o profago pode deixar seu estado quiescente e lisar a célula hospedeira bacteriana Um fago pode carrear genes bacterianos de um doador para um receptor Na transdução generalizada o DNA aleatório do hospedeiro é incorporado isoladamente dentro da cabeça do fago durante a lise Na transdução especializada a excisão defeituosa do profago de um locus cromossômico único resulta na inclusão de genes específicos do hospedeiro bem como de DNA do fago na cabeça do fago Atualmente um mapa físico na forma da sequência completa do genoma está disponível em relação a muitas espécies bacterianas Com a utilização desse mapa físico do genoma a posição no mapa de uma mutação de interesse pode ser localizada com precisão Primeiramente são produzidas mutações apropriadas por meio da inserção de transpósons mutagênese insercional Em seguida a sequência de DNA adjacente ao transpóson inserido é obtida e correlacionada com uma sequência no mapa físico Essa técnica fornece o locus a sequência e possivelmente a função do gene de interesse TERMOSCHAVE auxotrófico bacteriófago fago clone celular colônia conjugação cotransdutante cruzamento interrompido doadora endogenoto exconjugante exogenoto F doadora F receptora fago bacteriófago fago temperado fago virulento fator de fertilidade F Hfr alta frequência de recombinação indução zigótica infecção dupla mista infecção mista dupla lisado lise lisógena bactéria lisogênica marcador genético marcador não selecionado meio mínimo merozigoto mutagênese insercional mutante resistente origem O placa plaqueamento plasmídio plasmídio F plasmídio R procarioto profago prototrófica receptora recombinação de fago replicação por círculo rolante sistema seletivo sítio de ligação de λ término transdução transdução especializada transdução generalizada transformação transformação dupla transmissão horizontal transmissão vertical triagem vírus PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 Suponha que uma célula seja incapaz de realizar a recombinação generalizada rec Como essa célula se comportaria como uma receptora na transdução generalizada e na transdução especializada Primeiramente compare cada tipo de transdução e em seguida determine o efeito da mutação rec sobre a herança dos genes por meio de cada processo Solução A transdução generalizada envolve a incorporação de fragmentos cromossômicos às cabeças dos fagos que em seguida infectam as linhagens receptoras Os fragmentos do cromossomo são incorporados aleatoriamente às cabeças dos fagos e assim qualquer marcador no cromossomo hospedeiro bacteriano pode ser transduzido para outra linhagem por meio da transdução generalizada Contrariamente a transdução especializada envolve a integração do fago em um ponto específico no cromossomo e a rara incorporação dos marcadores cromossômicos próximo ao sítio de integração no genoma do fago Portanto apenas aqueles marcadores que estão próximos do sítio de integração específico do fago no cromossomo hospedeiro podem ser transduzidos Os marcadores são herdados por vias diferentes na transdução generalizada e na transdução especializada Um fago de transdução generalizada injeta um fragmento do cromossomo doador no receptor Esse fragmento tem de ser incorporado ao cromossomo do receptor por recombinação com a utilização do sistema de recombinação do receptor Portanto um receptor rec não será capaz de incorporar os fragmentos de DNA e não consegue herdar marcadores por meio da transdução generalizada Por outro lado a principal via de herança de marcadores por transdução especializada é por meio da integração da partícula de transdução especializada no cromossomo hospedeiro no sítio específico de integração do fago Essa integração que por vezes requer um fago do tipo selvagem adicional auxiliar é mediada por um sistema enzimático específico do fago que é independente das enzimas de recombinação normais Portanto um receptor rec ainda pode herdar marcadores genéticos por meio da transdução especializada Problema resolvido 2 Em E coli quatro linhagens Hfr doam os marcadores genéticos a seguir demonstrados na ordem doada Linhagem 1 Q W D M T Linhagem 2 A X P T M Linhagem 3 B N C A X Linhagem 4 B Q W D M Todas essas linhagens Hfr são derivadas da mesma linhagem F Qual é a ordem desses marcadores no cromossomo circular da F original Solução Uma abordagem de duas etapas funciona bem 1 determine o princípio subjacente e 2 desenhe um diagrama Aqui o princípio claramente é que cada linhagem Hfr doa marcadores genéticos a partir de um ponto fixo no cromossomo circular e que os marcadores mais iniciais são doados com mais alta frequência Tendo em vista que nem todos os marcadores são doados por cada Hfr apenas os marcadores iniciais tem de ser doados para cada Hfr Cada linhagem nos possibilita desenhar os círculos a seguir A partir dessas informações podemos consolidar cada círculo em um mapa de ligação circular na ordem Q W D M T P X A C N B Q Problema resolvido 3 Em um cruzamento Hfr F leu entra como o primeiro marcador mas a ordem dos outros marcadores é desconhecida Se Hfr for do tipo selvagem e F for auxotrófica em relação a cada marcador em questão qual é a ordem dos marcadores em um cruzamento no qual recombinantes leu são selecionados se 27 forem ile 13 forem mal 82 forem thr e 1 for trp Solução Relembre que a quebra espontânea cria um gradiente de transferência natural o qual torna a cada vez menos provável que uma receptora receba marcadores cada vez mais tardios Tendo em vista que selecionamos o marcador mais inicial nesse cruzamento a frequência de recombinantes depende da ordem de entrada em relação a cada marcador Portanto podemos determinar imediatamente a ordem dos marcadores genéticos simplesmente ao observar a porcentagem de recombinantes em relação a qualquer marcador entre os recombinantes leu Tendo em vista que a herança de thr é a mais alta thr tem de ser o primeiro marcador a entrar após leu A ordem completa é leu thr ile mal trp Problema resolvido 4 É realizado um cruzamento entre uma Hfr que é met thi pur e uma F que é met thi pur Estudos de cruzamento interrompido demonstram que met entra no receptor por último e assim recombinantes met são selecionados em um meio que contém suplementos que atendem apenas as exigências de pur e thi Esses recombinantes são testados à procura dos alelos thi e pur Os números de indivíduos a seguir são observados em relação a cada genótipo met thi pur 280 met thi pur 0 met thi pur 6 met thi pur 52 a Por que a metionina met foi deixada fora do meio de seleção b Qual é a ordem dos genes c Quais são as distâncias de mapa em unidades de recombinação Solução a A metionina foi deixada fora do meio para possibilitar a seleção em relação aos recombinantes met tendo em vista que met é o último marcador a entrar na receptora A seleção em relação a met assegura que todos os loci que estamos considerando no cruzamento já terão entrado em cada recombinante que analisamos b Aqui um diagrama das possíveis ordens de genes é útil Tendo em vista que sabemos que met entra na receptora por último existem apenas duas ordens de genes possíveis se o primeiro marcador entrar à direita met thi pur ou met pur thi Como podemos distinguir entre essas duas ordens Felizmente uma das quatro possíveis classes de recombinantes requer dois crossovers adicionais Cada ordem possível prevê uma classe diferente que surge por meio de quatro crossovers em vez de dois Por exemplo se a ordem fosse met thi pur os recombinantes met thi pur seriam muito raros Por outro lado se a ordem fosse met pur thi a classe de quatro crossovers seria met pur thi A partir das informações fornecidas na tabela a classe met pur thi é claramente a classe de quatro crossovers e portanto a ordem de genes met pur thi está correta c Consulte o diagrama a seguir Para computar a distância entre met e pur calculamos a porcentagem de met pur thi que é 52338 154 um De modo semelhante a distância entre pur e thi é 6338 18 um Problema resolvido 5 Compare o mecanismo de transferência e herança dos genes lac em cruzamentos com linhagens Hfr F e F lac Como uma célula F que não pode sofrer recombinação homóloga normal rec se comporta em cruzamentos com cada uma dessas três linhagens Como a célula seria capaz de herdar o gene lac Solução Cada uma dessas três linhagens doa genes por meio de conjugação Nas linhagens Hfr e F os genes lac no cromossomo hospedeiro são doados Na linhagem Hfr o fator F é integrado ao cromossomo em todas as células e assim os marcadores cromossômicos podem ser doados com eficiência em particular se um marcador estiver próximo do sítio de integração de F e for doado inicialmente A população de células F contém uma pequena porcentagem de células Hfr nas quais F é integrado ao cromossomo Essas células são responsáveis pela transferência de genes ilustrada por culturas de células F Na transferência de genes mediada por Hfr e F a herança requer a incorporação de um fragmento transferido por recombinação relembre que são necessários dois crossovers no cromossomo da F Portanto uma linhagem F que não consegue sofrer recombinação não pode 1 2 3 4 5 6 herdar marcadores cromossômicos da doadora embora eles sejam transferidos por linhagens Hfr ou por células Hfr em linhagens F O fragmento não pode ser incorporado ao cromossomo por recombinação Tendo em vista que esses fragmentos não possuem a capacidade de se replicar na célula F eles são diluídos rapidamente durante a divisão celular Contrariamente às células Hfr as células F transferem os genes carreados pelo fator F um processo que não requer a transferência do cromossomo Nesse caso os genes lac estão ligados ao fator F e são transferidos com ele a uma alta eficiência Na célula F nenhuma recombinação é necessária tendo em vista que a linhagem F lac consegue replicarse e ser mantida na população de células F em divisão Portanto os genes lac são herdados até mesmo em uma linhagem rec PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Na Figura 52 em qual dos quatro processos demonstrados um genoma bacteriano completo pode ser transferido de uma célula para outra Na Figura 53 se a concentração de células bacterianas na suspensão original for 200mℓ e se 02 mℓ for plaqueado em cada uma de 100 placas de Petri qual é a quantidade média esperada de colônias por placa Na Figura 55 a Por que as células A e B por si próprias não formam colônias no meio da cultura na placa b Qual evento genético as colônias roxas na placa do meio representam Na Figura 510 C o que os pontos amarelos representam Na Figura 511 quais alelos doadores se tornam parte do genoma recombinante produzido Na Figura 512 a Qual gene Hfr entra na receptora por último Qual diagrama o demonstra realmente entrando 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 b Qual é a porcentagem máxima de casos de transferência desse gene c Quais genes entraram em 25 minutos Eles podem todos ter se tornado parte de um genoma exconjugante estável Na Figura 514 qual é o último gene a ser transferido para a F a partir de cada uma das cinco linhagens Hfr Na Figura 515 como cada um dos genótipos a seguir é produzido a F a b F a c F a d F a Na Figura 517 quantos crossovers são necessários para produzir um exconjugante completamente prototrópico Na Figura 518 C por que o crossover é demonstrado como ocorrendo nos segmentos em laranja do DNA Na Figura 519 quantas espécies bacterianas diferentes são demonstradas como tendo contribuído com DNA para o plasmídio pk214 Na Figura 525 você consegue apontar algum fago da progênie que poderia transduzir Na Figura 528 quais são as características físicas das placas de fagos recombinantes Na Figura 529 você acredita que b poderia ser transduzido em vez de a Tão bem quanto a Na Figura 530 que genes demonstram as mais altas frequências de cotransdução Na Figura 532 o que os segmentos metade vermelhos metade azuis representam Na Figura 533 qual é o mais raro genótipo de λ produzido no lisado inicial Na Figura 538 precisamente qual gene é finalmente identificado a partir 19 20 21 22 23 24 25 da sequência do genoma PROBLEMAS BÁSICOS Descreva o estado do fator F em uma linhagem Hfr F e F Como uma cultura de células F transfere marcadores do cromossomo hospedeiro para uma receptora Em relação à transferência gênica e à integração do gene transferido para o genoma receptor compare a Cruzamentos de Hfr por meio de conjugação e transdução generalizada b Derivados de F tais como F lac e transdução especializada Por que a transdução generalizada é capaz de transferir qualquer gene mas a transdução especializada é restrita a apenas um pequeno conjunto Uma geneticista microbiana isola uma nova mutação em E coli e deseja mapear a sua localização cromossômica Ela utiliza experimentos de cruzamento interrompido com linhagens Hfr e experimentos de transdução generalizada com o fago P1 Explique por que cada técnica por si própria é insuficiente para o mapeamento preciso Em E coli quatro linhagens Hfr doam os marcadores a seguir demonstrados na ordem doada Linhagem 1 M Z X W C Linhagem 2 L A N C W Linhagem 3 A L B R U Linhagem 4 Z M U R B Todas essas linhagens Hfr são derivadas da mesma linhagem F Qual é a ordem desses marcadores no cromossomo circular da F original Você recebe duas linhagens de E coli A linhagem Hfr é arg ala glu pro leu Ts a linhagem F é arg ala glu pro leu Tr Todos os marcadores são nutricionais com exceção de T que determina a sensibilidade ou a resistência ao fago T1 A ordem de entrada é conforme 26 27 28 fornecida com arg entrando na receptora primeiramente e Ts por último Você observa que a linhagem F morre quando exposta à penicilina pens mas a linhagem Hfr não morre penr Como você localizaria o locus de pen no cromossomo bacteriano em relação a arg ala glu pro e leu Formule a sua resposta em etapas lógicas e bem explicadas e desenhe diagramas explícitos quando possível É realizado um cruzamento entre duas linhagens de E coli Hfr arg bio leu F arg bio leu Estudos de cruzamento interrompido demonstram que arg entra na receptora por último e assim recombinantes arg são selecionados em um meio que contém apenas bio e leu Esses recombinantes são testados em relação à presença de bio e leu São observados os números de indivíduos a seguir em relação a cada genótipo arg bio leu 320 arg bio leu 0 arg bio leu 8 arg bio leu 48 a Qual é a ordem dos genes b Quais são as distâncias de mapa em porcentagens de recombinação Os mapas de ligação em uma linhagem bacteriana Hfr são calculados em unidades de minutos o número de minutos entre os genes indica o período de tempo necessário para que o segundo gene siga o primeiro na conjugação Ao produzir os referidos mapas geneticistas microbianos presumem que o cromossomo bacteriano seja transferido de Hfr para F a uma velocidade constante Portanto presumese que dois genes separados por 10 minutos perto da extremidade da origem estejam à mesma distância física que dois genes separados por 10 minutos perto da extremidade de ligação de F Sugira um experimento crítico para testar a validade dessa hipótese Uma linhagem Hfr em particular normalmente transmite o marcador pro como o último na conjugação Em um cruzamento dessa linhagem com uma linhagem F alguns recombinantes pro são recuperados inicialmente no processo de cruzamento Quando essas células pro são misturadas com 29 30 31 células F a maioria das células F é convertida em células pro que também carreiam o fator F Explique esses resultados Linhagens F em E coli são derivadas de linhagens Hfr Em alguns casos essas linhagens F demonstram uma alta taxa de integração ao cromossomo bacteriano de uma segunda linhagem Além disso o sítio de integração com frequência é o local ocupado pelo fator sexual na linhagem Hfr original antes da produção de linhagens F Explique esses resultados Você possui duas linhagens de E coli F strs ala e Hfr strs ala nas quais o fator F é inserido próximo de ala Planeje um teste de triagem para detectar linhagens que carreiam F ala Cinco linhagens de Hfr A a E são derivadas de uma única linhagem F de E coli O quadro a seguir demonstra os tempos de entrada dos primeiros cinco marcadores em uma linhagem F quando cada um é utilizado em um experimento de conjugação interrompida A B C D E mal 1 ade 13 pro 3 pro 10 his 7 strs 11 his 28 met 29 gal 16 gal 17 ser 16 gal 38 xyl 32 his 26 pro 23 ade 36 pro 44 mal 37 ade 41 met 49 his 51 met 70 strs 47 ser 61 xyl 52 a Desenhe um mapa da linhagem F indicando as posições de todos os 32 33 34 genes e suas distâncias em minutos b Demonstre o ponto de inserção e a orientação do plasmídio F em cada linhagem Hfr c Na utilização de cada uma dessas linhagens Hfr declare qual alelo você selecionaria para obter a mais alta proporção de exconjugantes Hfr Células de Streptococcus pneumoniae de genótipo strs mtl são transformadas pelo DNA doador de genótipo strr mtl e em um experimento em separado por uma mistura de dois DNA com genótipos strr mtl e strs mtl A tabela que acompanha demonstra os resultados DNA transformante Porcentagem de células transformadas em strr mtl strs mtl strr mtl strr mtl 43 040 017 strr mtl stra mtl 28 085 00066 a O que a primeira fileira da tabela informa a você Por quê b O que a segunda fileira da tabela informa a você Por quê Relembre que no Capítulo 4 consideramos a possibilidade de que um evento de crossover afete a probabilidade de outro crossover No bacteriófago T4 o gene a está a 10 um do gene b que está a 02 um do gene c A ordem dos genes é a b c Em um experimento de recombinação você recupera cinco crossovers duplos entre a e c de uma progênie de 100000 É correto concluir que a interferência é negativa Explique a sua resposta Células de E coli foram infectadas por duas linhagens de vírus T4 Uma linhagem é mínima m lise rápida r e turva t a outra é do tipo selvagem em relação a todos os três marcadores Os produtos líticos dessa 35 infecção foram plaqueados e classificados As 10342 placas resultantes foram distribuídas entre oito genótipos como segue m r t 3469 m 521 3727 r t 475 m r 854 r 171 m t 163 t 963 a Quais são as distâncias de ligação entre m e r entre r e t e entre m e t b Determine a ordem de ligação dos três genes c Qual é o coeficiente de coincidência ver Capítulo 4 nesse cruzamento O que ele significa Com a utilização de P22 como um fago de transdução generalizada cultivado em uma doadora bacteriana pur pro his uma linhagem receptora de genótipo pur pro his foi infectada e incubada Posteriormente transdutantes para pur pro e his foram selecionados individualmente nos experimentos I II e III respectivamente a Qual meio é utilizado em cada um desses experimentos de seleção b Os transdutantes foram examinados em relação à presença de marcadores doadores não selecionados com os resultados a seguir I II III pro his 86 pur his 44 pur pro 20 pro his 0 pur his 0 pur pro 14 pro his 10 pur his 54 pur pro 61 pro his 4 pur his 2 pur pro 5 36 37 Qual é a ordem dos genes bacterianos c Quais dois genes estão mais próximos d Com base na sua resposta para a parte c explique as proporções relativas dos genótipos observados no experimento II Embora a maior parte dos transdutantes gal mediados por λ seja de lisógenos induzíveis uma pequena porcentagem desses transdutantes de fato não é lisogênica ou seja eles não contêm λ integrado Experimentos de controle demonstram que esses transdutantes não são produzidos por meio de mutação Qual é a provável origem desses tipos Uma linhagem bacteriana ade arg cys his leu pro sabidamente é lisogênica em relação a um fago recentemente descoberto mas o sítio do profago não é conhecido O mapa bacteriano é A linhagem lisogênica é utilizada como uma fonte do fago e os fagos são adicionados a uma linhagem bacteriana de genótipo ade arg cys his leu pro Após uma breve incubação amostras dessas bactérias são plaqueadas em seis meios diferentes com as suplementações indicadas na tabela a seguir A tabela também demonstra se foram observadas colônias nos diversos meios Meio Suplementação de nutrientes no meio Presença de colônias Ade Arg Cys His Leu Pro 1 N 38 2 N 3 C 4 N 5 C 6 N Nessa tabela um sinal de mais indica a presença de um suplemento de nutriente um sinal de menos indica que um suplemento não está presente N indica ausência de colônias e C indica presença de colônias a Qual processo genético está atuando aqui b Qual é o locus aproximado do profago Em um sistema de transdução generalizada com a utilização do fago P1 a doadora é pur nad pdx e a receptora é pur nad pdx O alelo doador pur é selecionado inicialmente após a transdução e 50 transdutantes pur são pontuados em seguida em relação aos outros alelos presentes Aqui estão os resultados Genótipo Número de colônias nad pdx 3 nad pdx 10 nad pdx 24 nad pdx 13 39 40 50 a Qual é a frequência de cotransdução em relação a pur e nad b Qual é a frequência de cotransdução em relação a pur e pdx c Quais dos loci não selecionados estão mais próximos de pur d nad e pdx estão do mesmo lado ou em lados opostos de pur Explique Desenhe as trocas necessárias para produzir as diversas classes transformantes sob cada ordem para verificar qual requer o número mínimo para produzir os resultados obtidos Em um experimento de transdução generalizada fagos são coletados de uma linhagem doadora de E coli de genótipo cys leu thr e utilizados para transduzir uma receptora de genótipo cys leu thr Inicialmente a população receptora tratada é plaqueada em um meio mínimo suplementado com leucina e treonina Muitas colônias são obtidas a Quais são os possíveis genótipos dessas colônias b Essas colônias em seguida são plaqueadas em réplica em três meios diferentes 1 mínimo mais treonina apenas 2 mínimo mais leucina apenas e 3 mínimo Quais genótipos poderiam teoricamente crescer nesses três meios c Das colônias originais observase que 56 crescem no meio 1 5 no meio 2 e nenhuma colônia no meio 3 Quais são os genótipos reais das colônias nos meios 1 2 e 3 d Desenhe um mapa demonstrando a ordem dos três genes e qual dos dois genes externos está mais próximo do gene intermediário Deduza os genótipos das linhagens 1 a 4 de E coli a seguir 41 1 2 3 4 Em um experimento de conjugação interrompida em E coli o gene pro entra após o gene thi Uma linhagem Hfr pro thi é cruzada com uma linhagem F pro thi e exconjugantes são plaqueados em meio que contém tiamina mas não prolina É observado um total de 360 colônias e elas são isoladas e cultivadas em meio totalmente suplementado Em seguida essas culturas são testadas em relação à sua capacidade de crescer em meio que não contém prolina ou tiamina meio mínimo e observase que 320 colônias conseguem crescer mas o restante não a Deduza os genótipos dos dois tipos de culturas b Desenhe os eventos de crossover necessários para produzir esses genótipos c Calcule a distância entre os genes pro e thi em unidades de recombinação Como solucionar o problema 41 Que tipo de organismo é a E coli Qual é a aparência de uma cultura de E coli Em quais tipos de substratos a E coli em geral cresce em seu habitat natural Quais são as exigências mínimas para que as células de E coli se dividam 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 42 Defina os termos prototrófico e auxotrófico Quais culturas nesse experimento são prototróficas e quais são auxotróficas Tendo recebido algumas linhagens de genótipo desconhecido quanto a tiamina e prolina como você testaria os seus genótipos Forneça os detalhes experimentais precisos incluindo o equipamento Quais tipos de substâncias químicas são a prolina e a tiamina Isso é importante nesse experimento Desenhe um diagrama demonstrando o conjunto integral de manipulações realizadas no experimento Por que você acredita que o experimento tenha sido realizado Como foi estabelecido que pro entra depois de thi Forneça as etapas experimentais precisas De que modo um experimento de cruzamento interrompido difere do experimento descrito nesse problema O que é um exconjugante Como você acredita que os exconjugantes foram obtidos Isso pode incluir genes não descritos nesse problema Quando se diz que o gene pro entra depois de thi isso significa o alelo pro o alelo pro qualquer um deles ou ambos O que é meio totalmente suplementado no contexto dessa questão Alguns exconjugantes não crescem em meio mínimo Em qual meio eles crescem Declare os tipos de crossovers que participam na recombinação Hfr F Como esses crossovers diferem dos crossovers em eucariotos O que é uma unidade de recombinação no contexto da presente análise Como ela difere das unidades de mapa utilizadas na genética de eucariotos Um experimento de transdução generalizada utiliza uma linhagem metE pyrD como doadora e metE pyrD como receptora Os transdutantes metE são selecionados e em seguida testados em relação ao alelo pyrD 43 44 Foram obtidos os números a seguir metE pyrD 857 metE pyrD 1 Esses resultados sugerem que esses loci estão ligados de modo próximo Quais outras explicações existem em relação ao único duplo Uma linhagem argC foi infectada com um fago transdutor e o lisado foi utilizado para transduzir receptoras metF em um meio que contém arginina mas não metionina As transdutantes metF em seguida foram testadas em relação à necessidade de arginina a maior parte era argC mas observouse que uma pequena porcentagem era argC Desenhe diagramas para demonstrar a provável origem das linhagens argC e argC PROBLEMAS DESAFIADORES Quatro linhagens de E coli de genótipo a b são rotuladas 1 2 3 e 4 Quatro linhagenss de genótipo a b são rotuladas 5 6 7 e 8 Os dois genótipos são misturados em todas as combinações possíveis e após a incubação são plaqueadas para determinar a frequência de recombinantes a b São obtidos os resultados a seguir em que M Muitos recombinantes L Poucos recombinantes e 0 Nenhum recombinante 1 2 3 4 5 0 M M 0 6 0 M M 0 7 L 0 0 M 45 8 0 L L 0 Com base nesses resultados atribua um tipo de sexo seja Hfr F ou F a cada linhagem Uma linhagem Hfr de genótipo a b c d strs é cruzada com uma linhagem fêmea de genótipo a b c d strr Em diversos momentos os pares do cruzamento são separados por meio da agitação vigorosa da cultura Em seguida as células são plaqueadas em três tipos de ágar conforme demonstrado a seguir onde o nutriente A possibilita o crescimento de células a o nutriente B de células b o nutriente C de células c e o nutriente D de células d Um sinal de mais indica a presença de estreptomicina ou de um nutriente e um sinal de menos indica a sua ausência Tipo de ágar Str A B C D 1 2 3 a Quais genes doadores estão sendo selecionados em cada tipo de ágar b A tabela a seguir demonstra o número de colônias em cada tipo de ágar em relação a amostras coletadas em diversos tempos após a mistura das linhagens Utilize essas informações para determinar a ordem dos genes a b e c Tempo da amostragem min Número de colônias em ágar do tipo 1 2 3 46 0 0 0 0 5 0 0 0 75 102 0 0 10 202 0 0 125 301 0 74 15 400 0 151 175 404 49 225 20 401 101 253 25 398 103 252 c De cada uma das placas aos 25 minutos 100 colônias são coletadas e transferidas para uma placa de Petri contendo ágar com todos os nutrientes exceto D Os números de colônias que crescem nesse meio são 90 em relação à amostra do ágar tipo 1 52 em relação à amostra do ágar tipo 2 e 9 em relação à amostra do ágar tipo 3 Com a utilização desses dados encaixe o gene d na sequência de a b e c d Em que tempo da amostragem você espera que as colônias apareçam pela primeira vez no ágar que contém C e estreptomicina mas não A ou B No cruzamento Hfr aro arg eryr strs F aro arg erys strr os marcadores são transferidos na ordem fornecida com aro entrando primeiramente mas os primeiros três genes estão muito próximos Exconjugantes são plaqueados em um meio contendo Str estreptomicina para matar as células Hfr Ery eritromicina Arg arginina e Aro aminoácidos aromáticos São obtidos os resultados a seguir em relação a 47 300 colônias isoladas a partir dessas placas e testadas em relação ao crescimento em diversos meios em Ery apenas 263 linhagens cresceram em Ery Arg 264 linhagens cresceram em Ery Aro 290 linhagens cresceram em Ery Arg Aro 300 linhagens cresceram a Desenhe uma lista de genótipos e indique o número de indivíduos em cada genótipo b Calcule as frequências de recombinação c Calcule a proporção do tamanho da região de arg a aro e do tamanho da região de ery a arg É realizada uma transformação bacteriana com uma linhagem doadora que é resistente a quatro fármacos A B C e D e uma linhagem receptora que é sensível a todos os quatro fármacos A população resultante de células receptoras é dividida e plaqueada em meios que contêm diversas combinações dos fármacos A tabela a seguir demonstra os resultados Fármacos adicionados Número de colônias Fármacos adicionados Número de colônias Nenhum 10000 BC 50 A 1155 BD 48 B 1147 CD 785 C 1162 ABC 31 D 1140 ABD 43 AB 47 ACD 631 AC 641 BCD 35 48 49 AD 941 ABCD 29 a Um dos genes está distante dos outros três que aparentam estar ligados de modo próximo Qual é o gene distante b Qual é a ordem provável dos três genes ligados de modo próximo Você possui duas linhagens de λ que conseguem lisogenizar E coli seus mapas de ligação são como segue O segmento demonstrado na parte inferior do cromossomo designado 12 3 é a região responsável pelo pareamento e pelo crossover com o cromossomo de E coli Mantenha os marcadores em todos os seus desenhos a Diagrame o modo pelo qual λ da linhagem X é inserido no cromossomo de E coli de modo que E coli seja lisogenizada b As bactérias que são lisogênicas em relação à linhagem X podem ser superinfectadas por meio da utilização da linhagem Y Uma determinada porcentagem dessas bactérias superinfectadas se torna duplamente lisogênica ou seja lisogênica em relação a ambas as linhagens Diagrame como isso ocorrerá Não se preocupe a respeito de como as duplamente lisogênicas são detectadas c Diagrame como os dois profagos λ conseguem parear d Podem ser recuperados os produtos de crossover entre os dois profagos Diagrame um evento de crossover e as consequências Você possui três linhagens de E coli a linhagem A é F cys trp1cys trp1 ou seja tanto F quanto o cromossomo carreiam cys e trp1 um alelo em 50 relação à necessidade de triptofano A linhagem B é F cys trp2 Z essa linhagem necessita de cisteína para crescer e carreia trp2 outro alelo que causa necessidade de triptofano a linhagem B é lisogênica em relação ao fago Z de transdução generalizada A linhagem C é F cys trp1 ela é uma Fderivada da linhagem A que perdeu o F Como você determinaria se trp1 e trp2 são alelos do mesmo locus Descreva os cruzamentos e os resultados esperados Um fago de transdução generalizada é utilizado para transduzir uma linhagem receptora a b c d e de E coli com uma doadora a b c d e A cultura receptora é plaqueada em diversos meios com os resultados demonstrados na tabela a seguir Observe que a indica uma necessidade de A como um nutriente e assim por diante O que você pode concluir a respeito da ligação e da ordem dos genes Compostos adicionados ao meio mínimo Presença ou ausência de colônias CDE BDE BCE BCD ADE ACE ACD ABE 51 52 ABD ABC Em 1965 Jon Beckwith e Ethan Signer elaboraram um método para a obtenção de fagos transdutores especializados que carreiam a região lac Eles sabiam que o sítio de integração designado att80 em relação ao fago temperado ϕ80 um parente do fago λ estava localizado perto de tonB um gene que confere resistência ao fago virulento T1 Eles utilizaram um plasmídio F lac que não podia ser replicado em altas temperaturas em uma linhagem que carreava uma deleção dos genes lac Ao forçar a célula a permanecer lac a altas temperaturas os pesquisadores puderam selecionar linhagens nas quais o plasmídio integrouse ao cromossomo possibilitando assim que F lac fosse conservado em altas temperaturas Ao combinar essa seleção com uma seleção simultânea em relação à resistência à infecção pelo fago T1 eles observaram que as únicas sobreviventes eram células nas quais o F lac integouse ao locus tonB conforme demonstrado aqui Esse resultado posicionou a região lac perto do sítio de integração para o fago ϕ80 Descreva as etapas subsequentes que os pesquisadores necessariamente seguiram para isolar as partículas de transdução especializadas do fago ϕ80 que carreavam a região lac E coli do tipo selvagem capta e concentra um determinado corante alimentício vermelho tornando as colônias vermelhosangue Foi utilizada a mutagênese por transpóson e as células foram plaqueadas em corante alimentício A maior parte das colônias era vermelha mas algumas colônias não captaram o corante e apareceram brancas Em uma colônia branca o DNA adjacente ao transpóson inserido foi sequenciado com a utilização de um primer de replicação de DNA idêntico à parte terminal da sequência do transpóson e observouse que a sequência adjacente ao transpóson corresponde a um gene de função desconhecida denominado atoE abrangendo as posições 2322 a 2324 Mb no mapa numerada a partir de uma posição arbitrária zero Proponha uma função para atoE Qual processo biológico poderia ser investigado desse modo e quais outros tipos de colônias brancas poderiam ser esperados As cores dos pimentões são determinadas pela interação de diversos genes Um alelo Y promove a eliminação precoce da clorofila um pigmento verde enquanto y não promove O alelo R determina o pigmento carotenoide vermelho e r determina o amarelo Os alelos c1 e c2 de dois genes diferentes infrarregulam as quantidades de carotenoides causando as tonalidades mais claras Laranja é vermelho infrarregulado Marrom é verde mais vermelho Amarelopálido é produto da infrarregulação de amarelo Anthony Griffiths 61 62 63 64 A TÓPICOS Interações de alelos de um único gene Variações de dominância Interação dos genes nas vias Inferência das interações gênicas Penetrância e expressividade RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Desenhar experimentos para testar duas ou mais mutações em relação ao alelismo com a utilização das proporções da progênie ou com a utilização de testes de complementação Inferir vários tipos de dominância com base nos fenótipos dos heterozigotos Reconhecer o diagnóstico em relação à presença de um alelo letal Inferir a interação de diferentes genes com base nas proporções mendelianas modificadas Formular hipóteses moleculares razoáveis para explicar vários tipos de interação gênica Reconhecer os diagnósticos em relação a variações na penetrância e na expressividade dos genótipos Prever a progênie de cruzamentos nos quais os genes demonstram um ou mais dos tipos anteriores de interação motivação da nossa apresentação no livro até agora tem sido demonstrar como os geneticistas identificam um gene que afeta alguma propriedade biológica de interesse Observamos como as abordagens da genética direta podem ser utilizadas para identificar genes individuais O pesquisador inicia com um conjunto de mutantes e em seguida cruza cada um dos mutantes com o tipo selvagem para verificar se o mutante demonstra herança monogênica Os dados cumulativos de um referido programa de pesquisa revelariam um conjunto 61 de genes no qual todos apresentam papéis no desenvolvimento da propriedade em investigação Em alguns casos o pesquisador pode ser capaz de identificar funções bioquímicas específicas em relação a muitos dos genes por meio da comparação das sequências gênicas com aquelas de outros organismos A próxima etapa que é um desafio maior é deduzir como os genes em conjunto interagem para influenciar o fenótipo Como as interações gênicas subjacentes a uma propriedade são deduzidas Uma abordagem molecular é analisar as interações proteicas diretamente in vitro por meio da utilização de uma proteína como isca e observar quais outras proteínas celulares se unem a ela As proteínas que se observa se ligarem à isca são candidatas à interação na célula viva Outra abordagem molecular é analisar transcritos de mRNA Os genes que colaboram em algum processo específico do desenvolvimento podem ser definidos por meio do conjunto de RNA transcritos presentes quando aquele processo está ocorrendo um tipo de análise atualmente realizada com a utilização de chips genômicos ver Capítulo 14 Finalmente as interações gênicas e sua significância na modelagem do fenótipo podem ser deduzidas por meio da análise genética que é o foco deste capítulo As interações gênicas podem ser amplamente classificadas em duas categorias A primeira categoria consiste em interações dos alelos de um locus falando amplamente variações de dominância Nos capítulos anteriores lidamos com a dominância total e a recessividade total mas conforme veremos neste capítulo existem outros tipos de dominância cada uma com a sua própria biologia celular subjacente Embora essa informação não aborde a variedade de genes que afetam uma função podese aprender muito sobre o papel de um gene ao considerar as interações alélicas A segunda categoria consiste em interações de dois ou mais loci Essas interações revelam o número e os tipos de genes no programa geral subjacente a uma função biológica em particular Interações de alelos de um único gene Variações de dominância Existem milhares de diferentes modos de alterar a sequência de um gene cada um produzindo um alelo mutante embora apenas alguns desses alelos mutantes apareçam em uma população real Os alelos mutantes conhecidos de um gene e seu alelo do tipo selvagem são denominados alelos múltiplos ou série alélica Um dos testes realizados de modo rotineiro sobre um novo alelo mutante é verificar se ele é dominante ou recessivo Informações básicas sobre a dominância e a recessividade são úteis para trabalhar com a nova mutação e podem ser uma fonte de percepção sobre o modo como o gene funciona conforme veremos nos exemplos A dominância é uma manifestação de como os alelos de um gene único interagem em um heterozigoto Em qualquer experimento os alelos que interagem podem ser alelos do tipo selvagem e mutantes m ou dois alelos mutantes diferentes m1m2 Foram descobertos diversos tipos de dominância cada um deles representando um tipo diferente de interação dos alelos Dominância completa e recessividade O tipo mais simples de dominância é a dominância total ou completa que examinamos no Capítulo 2 Um alelo totalmente dominante será expresso no fenótipo quando apenas uma cópia estiver presente como em um heterozigoto enquanto o alelo alternativo será totalmente recessivo Na dominância completa o homozigoto dominante não pode ser distinguido do heterozigoto ou seja no nível fenotípico AA Aa Conforme mencionado anteriormente a fenilcetonúria PKU e muitas outras doenças humanas monogênicas são totalmente recessivas enquanto seus alelos do tipo selvagem são dominantes Outras doenças monogênicas tais como a acondroplasia são totalmente dominantes enquanto nesses casos o alelo do tipo selvagem é recessivo Como essas relações de dominância podem ser interpretadas no nível celular A doença PKU é um bom modelo geral em relação às mutações recessivas Relembre que a PKU é causada por um alelo defeituoso do gene que codifica a enzima fenilalanina hidroxilase PAH Na ausência da PAH normal a fenilalanina que entra no corpo pelo alimento não é fragmentada e portanto acumulase Nessas condições a fenilalanina é convertida em ácido fenilpirúvico que é transportado até o cérebro por meio da corrente sanguínea e ali impede o desenvolvimento normal levando ao retardo mental O motivo de o alelo defeituoso ser recessivo é que uma dose do alelo P do tipo selvagem produz PAH suficiente para fragmentar a fenilalanina que entra no corpo Portanto dizse que o alelo do tipo selvagem PAH é haplossuficiente Haplo significa uma dose haploide e suficiente faz referência à capacidade de aquela dose única produzir o fenótipo do tipo selvagem Portanto ambos PP duas doses e Pp uma dose apresentam atividade de PAH suficiente para resultar na bioquímica celular normal Pessoas com pp apresentam zero dose de atividade de PAH A Figura 61 ilustra a noção geral Como podemos explicar as mutações totalmente dominantes Existem diversos mecanismos moleculares para dominância Um mecanismo encontrado regularmente é que o alelo do tipo selvagem de um gene é haploinsuficiente Na haploinsuficiência uma dose do tipo selvagem não é suficiente para alcançar níveis de função normais Presuma que 16 unidades do produto de um gene sejam necessárias para a bioquímica normal e que cada alelo do tipo selvagem possa produzir 10 unidades Dois alelos do tipo selvagem produzirão 20 unidades do produto bem superiores ao mínimo Mas considere o que ocorre se uma das mutações é uma mutação nula que produz uma proteína não funcional Uma mutação nula em combinação com um único alelo do tipo selvagem produziria 10 0 10 unidades bem inferiores ao mínimo Portanto o heterozigoto tipo selvagemnulo é mutante e a mutação é por definição dominante Em camundongos o gene Tbx1 é haploinsuficiente Esse gene codifica uma proteína reguladora de transcrição um fator de transcrição que atua nos genes responsáveis pelo desenvolvimento da faringe Um nocaute de um dos alelos do tipo selvagem resulta em uma concentração inadequada da proteína reguladora que resulta em defeitos no desenvolvimento das artérias faríngeas Acreditase que a mesma haploinsuficiência seja responsável pela síndrome de DiGeorge em seres humanos uma condição com anormalidades cardiovasculares e craniofaciais FIGURA 61 No heterozigoto embora a cópia mutada do gene produza uma proteína não funcional a cópia do tipo selvagem gera proteína funcional suficiente para produzir o fenótipo do tipo selvagem Outro tipo importante de mutação dominante é denominado dominante negativo Polipeptídios com esse tipo de mutação atuam como espoliadores ou trapaceiros Em alguns casos o produto do gene é uma unidade de uma proteína homodimérica uma proteína composta por duas unidades do mesmo tipo No heterozigoto M o polipeptídio mutante se liga ao polipeptídio do tipo selvagem e atua como um espoliador ao distorcêlo ou ao interferir de outro modo em sua função O mesmo tipo de estrago também pode impedir o funcionamento de um heterodímero composto por polipeptídios de diferentes genes Em outros casos o produto gênico é um monômero e nessas situações o mutante se liga ao substrato e atua como um espoliador ao dificultar a ligação da proteína do tipo selvagem ao substrato Um exemplo de mutações que podem atuar como dominantes negativas é observado no gene da proteína colágeno Algumas mutações nesse gene dão origem ao fenótipo humano osteogênese imperfeita O colágeno é uma proteína do tecido conjuntivo formada por três monômeros entrelaçados um trímero No heterozigoto mutante a proteína anormal é enrolase ao redor de uma ou duas normais e distorce o trímero levando ao mau funcionamento Desse modo o colágeno defeituoso atua como um espoliador A diferença entre a haploinsuficiência e a ação de um dominante negativo como causas da dominância de uma mutação está ilustrada na Figura 62 CONCEITOCHAVE Em relação à maior parte dos genes uma única cópia do tipo selvagem é adequada para a expressão total os referidos genes são haplossuficientes e suas mutações nulas são totalmente recessivas As mutações prejudiciais de genes haploinsuficientes com frequência são dominantes Mutações nos genes que codificam unidades em homodímeros ou heterodímeros podem se comportar como dominantes negativas que atuam por meio de proteínas espoliadoras FIGURA 62 Uma mutação pode ser dominante em virtude esquerda de um único gene do tipo selvagem não produzir produto proteico suficiente para a função adequada ou direita de o alelo mutante atuar como um dominante negativo que produz um produto proteico espoliador spoiler Dominância incompleta Maravilhas são plantas nativas da América tropical cujas flores se abrem ao fim da tarde Quando uma linhagem de maravilha do tipo selvagem pura que apresenta pétalas vermelhas é cruzada com uma linhagem pura que apresenta pétalas brancas a F1 apresenta pétalas rosa Se uma F2 for produzida por meio de autofecundação da F1 o resultado é das plantas apresenta pétalas vermelhas das plantas apresenta pétalas rosa das plantas apresenta pétalas brancas A Figura 63 demonstra esses fenótipos A partir dessa proporção de 121 na F2 podemos deduzir que o padrão de herança tem por base dois alelos de um gene único Entretanto os heterozigotos a F1 e metade da F2 são de fenótipo intermediário Ao inventar símbolos alélicos podemos listar os genótipos das maravilhas nesse experimento como cc vermelho cc branco e cc rosa A ocorrência do fenótipo intermediário sugere uma dominância incompleta o termo utilizado para descrever o caso geral no qual o fenótipo de um heterozigoto é intermediário entre aqueles dos dois homozigotos em alguma escala de medição quantitativa Como explicamos a dominância incompleta no nível molecular Na dominância incompleta cada alelo do tipo selvagem em geral produz uma dose estabelecida de seu produto proteico O número de doses de um alelo do tipo selvagem determina a concentração de uma substância química produzida pela proteína tal como um pigmento Na planta maravilha duas doses produzem a maior parte das cópias do transcrito produzindo assim a maior quantidade de proteína e portanto maior quantidade de pigmento suficiente para tornar as pétalas das flores vermelhas Uma dose produz menos pigmento e assim as pétalas são cor derosa Uma dose zero não produz pigmento FIGURA 63 Em bocasdeleão um heterozigoto é rosa o intermediário entre os dois homozigotos o vermelho e o branco O heterozigoto rosa demonstra dominância incompleta John KaprielianScience Source Codominância Outra variação sobre o tema da dominância é a codominância a expressão de ambos os alelos de um heterozigoto Um exemplo claro é observado nos grupos sanguíneos AB0 humanos em que existe codominância de alelos de antígenos Os grupos sanguíneos AB0 são determinados por três alelos de um gene Esses três alelos interagem de diversos modos para produzir os quatro tipos sanguíneos do sistema AB0 Os três alelos principais são i IA e IB mas uma pessoa pode apresentar apenas dois dos três alelos ou duas cópias de um deles As combinações resultam em seis genótipos diferentes três homozigotos e três tipos diferentes de heterozigotos como segue Genótipo Tipo sanguíneo IAIA IAi A IBIB IBi B IAIB AB ii 0 Nessa série alélica os alelos determinam a presença e o tipo de uma molécula de açúcar complexa presente sobre a superfície dos eritrócitos Essa molécula de açúcar é um antígeno uma molécula de superfície celular que pode ser reconhecida pelo sistema imune Os alelos IA e IB determinam dois tipos diferentes dessa molécula de superfície celular Entretanto o alelo i resulta na ausência de uma molécula de superfície celular desse tipo é um alelo nulo Nos genótipos IAi e IBi os alelos IA e IB são totalmente dominantes em relação a i Entretanto no genótipo IAIB cada um dos alelos produz seu próprio tipo de molécula de superfície celular e assim os alelos A e B são codominantes A doença humana anemia falciforme ilustra os modos um pouco arbitrários pelos quais classificamos a dominância O gene em questão codifica a molécula hemoglobina que é responsável pelo transporte de oxigênio nos vasos sanguíneos e é o principal constituinte dos eritrócitos Existem dois alelos principais HbA e HbS e os três genótipos possíveis apresentam fenótipos diferentes como segue HbAHbA normal os eritrócitos nunca se tornam falciformes HbSHbS anemia grave com frequência fatal a hemoglobina anormal faz com que os eritrócitos apresentem um formato falciforme HbAHbS nenhuma anemia os eritrócitos se tornam falciformes apenas sob baixas concentrações de oxigênio A Figura 64 demonstra uma micrografia eletrônica de hemácias incluído algumas hemácias falciformes Em relação à presença ou à ausência de anemia o alelo HbA é dominante No heterozigoto um único alelo HbA produz hemoglobina funcional suficiente para prevenir a anemia Em relação ao formato da hemácia entretanto existe dominância incompleta conforme demonstrado pelo fato que no heterozigoto muitas das células apresentam um formato discretamente falciforme Finalmente em relação à própria hemoglobina existe codominância Os alelos HbA e HbS codificam dois diferentes tipos de hemoglobina que diferem em um único aminoácido e ambos os tipos são sintetizados no heterozigoto Os tipos A e S da hemoglobina podem ser separados por meio de eletroforese uma vez que apresentam cargas elétricas diferentes Figura 65 Observamos que pessoas homozigotas HbAHbA apresentam um tipo de hemoglobina A e pessoas anêmicas apresentam outro tipo S que se movimenta mais lentamente no campo elétrico Os heterozigotos apresentam ambos os tipos A e S Em outras palavras existe codominância no nível molecular A fascinante genética de populações dos alelos HbA e HbS será considerada no Capítulo 20 FIGURA 64 A hemácia falciforme é causada por uma mutação no gene da hemoglobina Eye of ScienceScience Source FIGURA 65 A eletroforese de hemoglobinas normal e mutante Estão demonstrados os resultados produzidos pela hemoglobina de uma pessoa com traço falciforme um heterozigoto uma pessoa com anemia falciforme e uma pessoa normal As manchas demonstram as posições até as quais as hemoglobinas migram no gel de amido A anemia falciforme ilustra a arbitrariedade dos termos dominância dominância incompleta e codominância O tipo de dominância inferido depende do nível fenotípico no qual o ensaio é realizado do organismo da célula ou da molécula De fato devese ter cautela com muitas das categorias que os cientistas utilizam para classificar as estruturas e os processos essas categorias são planejadas por seres humanos para a conveniência da análise CONCEITOCHAVE Em geral três tipos principais de dominância podem ser distinguidos dominância total dominância incompleta e codominância O tipo de dominância é determinado pelas funções moleculares dos alelos de um gene e pelo nível investigativo da análise As folhas dos trevos demonstram diversas variações sobre o tema da dominância O trevo é o nome comum de plantas do gênero Trifolium Existem muitas espécies Algumas são nativas da América do Norte enquanto outras crescem ali como sementes introduzidas Foram realizadas muitas pesquisas genéticas com o trevobranco que demonstra variação considerável entre plantas individuais no curioso padrão em V ou divisas das folhas Os diferentes tipos de divisas e a ausência de divisas são determinados por uma série de sete alelos conforme observado na Figura 66 que demonstra os muitos tipos diferentes de possíveis interações em relação a até mesmo um alelo Na maior parte dos casos práticos muitos alelos de um gene podem ser observados juntos em uma população constituindo uma série alélica Os fenótipos demonstrados pelas combinações alélicas são muitos e variados refletindo a natureza relativa da dominância um alelo pode demonstrar dominância com um parceiro mas não com outro Portanto a complexidade ilustrada pelo sistema do tipo sanguíneo AB0 é pequena em comparação àquela em um caso tal como as divisas do trevo FIGURA 66 Alelos múltiplos determinam o padrão de divisas nas folhas do trevobranco O genótipo de cada planta está demonstrado abaixo dela Existe uma variedade de interações de dominância Pesquisa por W Ellis Davies Alelos letais recessivos Um alelo que é capaz de causar a morte de um organismo é denominado alelo letal Na caracterização de um conjunto de alelos mutantes recentemente descobertos por vezes observase que uma mutação recessiva é letal Essa informação é potencialmente útil no sentido em que demonstra que o gene recentemente descoberto de função ainda desconhecida é essencial para a operação do organismo Genes essenciais são aqueles sem os quais um organismo morre Um exemplo de um gene essencial poderia ser um gene ribossômico sem o qual nenhuma proteína seria produzida De fato com a utilização da tecnologia do DNA moderna um alelo mutante nulo de um gene de interesse pode agora ser produzido intencionalmente e tornado homozigoto para verificar se ele é letal e sob quais condições ambientais Os alelos letais também são úteis na determinação do estágio de desenvolvimento no qual o gene normalmente atua Nesse caso os geneticistas observam se a morte em virtude de um alelo mutante letal ocorre inicial ou tardiamente no desenvolvimento de um zigoto O fenótipo associado à morte também pode ser informativo em relação à função do gene por exemplo se um determinado órgão aparenta ser anormal o gene provavelmente será expresso naquele órgão Qual é o teste diagnóstico em relação à letalidade O teste é bemilustrado por um dos exemplos prototípicos de um alelo letal um alelo de cor de pelagem em camundongos ver Organismomodelo adiante Camundongos do tipo selvagem normais apresentam pelagem com pigmentação geral um tanto escura Uma mutação denominada amarela uma cor de pelagem mais clara demonstra um padrão de herança curioso Se qualquer camundongo amarelo for cruzado com um camundongo do tipo selvagem homozigoto sempre é observada uma proporção de 11 de camundongos amarelos e do tipo selvagem na progênie Esse resultado sugere que um camundongo amarelo é sempre heterozigoto em relação ao alelo amarelo e que o alelo amarelo é dominante sobre o tipo selvagem Entretanto se dois camundongos amarelos forem cruzados entre si o resultado é sempre como segue Amarelo Amarelo amarelos do tipo selvagem A Figura 67 demonstra uma ninhada típica a partir de um cruzamento entre camundongos amarelos Como a proporção de 21 pode ser explicada Os resultados fazem sentido se for presumido que o alelo amarelo é letal quando homozigoto Sabidamente o alelo amarelo é de um gene de cor de pelagem denominado A Iremos denominá lo AY Portanto os resultados do cruzamento de dois camundongos amarelos são FIGURA 67 Ninhada de um cruzamento entre dois camundongos heterozigotos em relação ao alelo dominante de cor de pelagem amarela O alelo é letal em dose dupla Nem toda a progênie é visível Anthony Griffiths AYA AYA Progênies AYAY letal AYA amarelo AA tipo selvagem A proporção monohíbrida esperada de 121 seria observada entre os zigotos mas é alterada para uma proporção de 21 na progênie realmente observada ao nascimento tendo em vista que os zigotos com um genótipo AYAY letal não sobrevivem para ser contados Essa hipótese é amparada pela remoção dos úteros de fêmeas prenhes do cruzamento amarelo amarelo observase que um quarto dos embriões está morto O alelo AY produz efeitos sobre duas características cor da pelagem e sobrevivência Entretanto é totalmente possível que ambos os efeitos do alelo AY resultem da mesma causa básica que promove pelagem amarela em dose única e morte em dose dupla Em geral o termo pleiotrópico é utilizado em relação a qualquer alelo que afete diversas propriedades de um organismo O fenótipo sem cauda em gatos Manx Figura 68 também é produzido por um alelo que é letal no estado homozigoto Uma dose única do alelo Manx ML interfere substancialmente com o desenvolvimento da coluna vertebral resultando na ausência de cauda no heterozigoto MLM Mas no homozigoto MLML a dose dupla do gene produz uma anormalidade tão extrema no desenvolvimento da coluna que o embrião não sobrevive Os alelos amarelo e ML apresentam seus próprios fenótipos em um heterozigoto mas a maioria dos letais recessivos é silenciosa no heterozigoto Em uma referida situação a letalidade recessiva é diagnosticada por meio da observação da morte de 25 da progênie em algum estágio do desenvolvimento ORGANISMOMODELO Camundongo O camundongo de laboratório é descendente do camundongo doméstico Mus musculus As linhagens puras atualmente utilizadas como padrões são derivadas dos camundongos criados nos séculos anteriores por apreciadores de camundongos Entre os organismosmodelo é aquele cujo genoma se assemelha de modo mais próximo ao genoma humano Seu número diploide de cromossomos é 40 em comparação a 46 em seres humanos e o genoma é discretamente menor do que aquele dos seres humanos o genoma humano sendo de 3000 Mb e contém aproximadamente o mesmo número de genes estimativa atual de 25000 Além disso todos os genes de camundongos aparentam ter correspondentes nos seres humanos Uma grande proporção de genes está disposta em blocos exatamente nas mesmas posições daquelas dos seres humanos Pesquisas sobre a genética mendeliana de camundongos tiveram início no começo do século 20 Uma das contribuições iniciais mais importantes foi a elucidação dos genes que controlam a cor e o padrão da pelagem O controle genético da pelagem dos camundongos proporcionou um modelo para todos os mamíferos incluindo gatos cães cavalos e gado Também foi realizada uma grande quantidade de trabalhos sobre mutações induzidas por radiação e substâncias químicas A genética de camundongos tem sido de grande significância na medicina Uma grande proporção de doenças genéticas humanas apresenta em camundongos correspondentes úteis para estudos experimentais denominados modelos em camundongo O camundongo foi muito importante no desenvolvimento da nossa atual compreensão sobre o papel dos genes no câncer O genoma do camundongo pode ser modificado por meio da inserção de fragmentos específicos de DNA em um ovócito fertilizado ou em células somáticas Os camundongos na fotografia receberam um gene de águaviva para a proteína fluorescente verde GFP do inglês green fluorescent protein que faz com que eles brilhem em verde sob luzes especiais Também são possíveis nocautes e substituições de genes Uma limitação importante da genética de camundongos é o seu custo Enquanto o trabalho com um milhão de E coli ou S cerevisiae é uma questão trivial o trabalho com um milhão de camundongos requer uma edificação do tamanho de uma fábrica Além disso embora os camundongos reproduzamse rapidamente em comparação com os seres humanos eles não conseguem competir com os microrganismos em função da velocidade do ciclo de vida dos microrganismos Portanto as seleções e as triagens em grande escala necessárias para detectar eventos genéticos raros não são possíveis Camundongos geneticamente modificados fluorescendo em verde O gene de águaviva para a proteína fluorescente verde foi inserido nos cromossomos dos camundongos que fluorescem Os outros camundongos são normais Eye of ScienceScience Source FIGURA 68 Um gato Manx Um alelo dominante que causa a ausência da cauda é letal no estado homozigoto O fenótipo de duas cores dos olhos não está relacionado com a ausência da cauda Gerard LaczNHPAPhotoshot Se um alelo é letal ou não com frequência depende do ambiente no qual o organismo se desenvolve Enquanto determinados alelos são letais em virtualmente qualquer ambiente outros são viáveis em um ambiente mas letais em outros Doenças hereditárias humanas proporcionam alguns exemplos A fibrose cística e a anemia falciforme são doenças que seriam letais sem tratamento Além disso muitos dos alelos favorecidos e selecionados por criadores de animais e cultivadores de plantas quase certamente seriam eliminados na natureza como um resultado da competição com os membros da população natural As variedades mutantes de grão anão que têm alta produção fornecem bons exemplos apenas o cultivo cuidadoso por parte dos fazendeiros manteve os referidos alelos para o nosso benefício Os geneticistas comumente encontram situações nas quais as proporções fenotípicas esperadas são consistentemente desviadas em uma direção em virtude de um alelo mutante reduzir a viabilidade Por exemplo no cruzamento Aa aa prevemos uma proporção de progênie de 50 Aa e 50 aa mas podemos observar consistentemente uma proporção tal como 5545 ou 6040 Em um referido caso dizse que o alelo recessivo é subletal tendo em vista que a letalidade é expressa em apenas alguns mas não em todos os indivíduos homozigotos Portanto a letalidade pode variar de 0 a 100 dependendo do próprio gene do restante do genoma e do ambiente Observamos que os alelos letais são úteis para diagnosticar o momento em que um gene atua e a natureza do defeito fenotípico que mata Entretanto a manutenção de estoques que contêm alelos letais para uso laboratorial é um desafio Em diploides os alelos letais recessivos podem ser mantidos como heterozigotos Em haploides alelos letais sensíveis ao calor são úteis Eles são membros de uma classe geral de mutações sensíveis à temperatura st Seu fenótipo é do tipo selvagem na temperatura permissiva com frequência a temperatura ambiente mas mutante em alguma temperatura restritiva mais alta Acreditase que os alelos sensíveis à temperatura sejam causados por mutações que tornam a proteína propensa à torção ou ao dobramento do seu formato até uma conformação inativa na temperatura restritiva Estoques para pesquisas podem ser facilmente mantidos sob condições permissivas e o fenótipo mutante pode ser analisado em um subconjunto de indivíduos por meio de uma alteração para as condições restritivas As mutações letais dominantes sensíveis à temperatura também são úteis Esse tipo de mutação é expressa até mesmo quando presente em uma dose única mas apenas quando o experimentador altera o organismo para a temperatura restritiva Alelos nulos para genes identificados por sequenciamento genômico podem ser obtidos por meio da utilização de uma diversidade de procedimentos de genética reversa que nocauteiam especificamente a função daquele gene Esses serão descritos no Capítulo 14 CONCEITOCHAVE Para verificar se um gene é essencial o alelo nulo é testado em relação à letalidade 62 Agora nos voltamos para as abordagens que podem ser utilizadas para detectar a interação de dois ou mais loci Interação dos genes nas vias Os genes atuam por meio do controle da química celular No início do século 20 Archibald Garrod um médico inglês Figura 69 fez a primeira observação que ampara essa percepção Garrod observou que diversas doenças humanas recessivas demonstram defeitos no que é denominado metabolismo o conjunto geral de reações químicas que ocorrem em um organismo Essa observação levou à noção de que as referidas doenças genéticas são erros inatos do metabolismo Garrod trabalhou com uma doença denominada alcaptonúria AKU ou doença da urina negra Ele descobriu que a substância responsável pela urina negra era o ácido homogentísico que é encontrado em altas concentrações e que é secretado na urina em pacientes com AKU Ele sabia que em pessoas não afetadas o ácido homogentísico é convertido em ácido maleilacetoacético assim ele propôs que na AKU existe um defeito nessa conversão Consequentemente o ácido homogentísico se acumula e é excretado As observações de Garrod levantaram a possibilidade de que as vias químicas das células estivessem sob o controle de um grande conjunto de genes em interação Entretanto a demonstração direta desse controle foi fornecida pelo trabalho posterior de Beadle e Tatum com o fungo Neurospora FIGURA 69 O médico britânico Archibald Garrod 18571936 Science Photo LibraryScience Source Vias bioquímicas de síntese em Neurospora O estudo de George Beadle e Edward Tatum foi um marco na década de 1940 pois não apenas esclareceu o papel dos genes mas também demonstrou a interação dos genes nas vias bioquímicas Eles posteriormente receberam um Prêmio Nobel por seu estudo que marca o início de toda a biologia molecular Beadle e Tatum realizaram seu trabalho com o fungo haploide Neurospora que conhecemos nos capítulos anteriores Seu plano era investigar o controle genético da química celular No que se tornou a abordagem genética direta padrão eles irradiaram pela primeira vez células de Neurospora para produzir mutações e em seguida testaram culturas crescidas a partir de ascosporos em relação aos fenótipos mutantes de interesse relevantes para a função bioquímica Eles observaram diversos mutantes que apresentavam nutrição defeituosa Especificamente esses mutantes eram mutantes auxotróficos do tipo descrito em relação às bactérias no Capítulo 5 Enquanto o fungo Neurospora do tipo selvagem consegue utilizar a sua bioquímica celular para sintetizar virtualmente todos os seus componentes celulares a partir dos nutrientes inorgânicos e uma fonte de carbono no meio os mutantes auxotróficos não conseguem Para crescerem os referidos mutantes necessitam que seja fornecido um nutriente um nutriente que um fungo do tipo selvagem é capaz de sintetizar para si próprio sugerindo que o mutante é defeituoso em relação a alguma etapa de síntese normal Como sua primeira etapa Beadle e Tatum confirmaram que cada mutação que gerava uma exigência de nutriente era herdada como uma mutação monogênica tendo em vista que cada uma delas fornecida uma proporção de 11 quando cruzada com um tipo selvagem Deixando que aux represente uma mutação auxotrófica Sua segunda etapa foi classificar a exigência nutricional específica de cada auxotrófico Alguns cresceriam apenas se fosse fornecida prolina outros metionina outros piridoxina outros arginina e assim por diante Beadle e Tatum decidiram focar nos auxotróficos para arginina Eles observaram que os genes que tinham sofrido mutação e originaram auxotróficos para arginina mapeavam em três loci diferentes em três cromossomos em separado Iremos denominar os genes nos três loci de arg1 arg2 e arg3 Uma conquistachave foi a descoberta de Beadle e Tatum de que os auxotróficos em relação a cada um dos três loci diferiam em sua resposta aos compostos estruturalmente correlatos ornitina e citrulina Figura 610 Os mutantes arg1 cresceram quando receberam suprimento de qualquer uma das substâncias químicas ornitina citrulina ou arginina Os mutantes arg2 cresceram quando receberam arginina ou citrulina mas não ornitina Os mutantes arg3 cresceram apenas quando a arginina foi fornecida Esses resultados estão resumidos na Tabela 61 Já se sabia que as enzimas celulares interconvertem os referidos compostos correlatos Com base nas propriedades dos mutantes arg Beadle e Tatum e seus colegas propuseram uma via bioquímica em relação às referidas conversões em Neurospora Essa via explica bem as três classes de mutantes demonstradas na Tabela 61 Sob o modelo os mutantes arg1 não apresentam a enzima X e assim são incapazes de converter o precursor em ornitina como a primeira etapa na produção de arginina Entretanto eles apresentam as enzimas normais Y e Z e assim os mutantes arg1 são capazes de produzir arginina se receberem suprimento de ornitina ou citrulina De modo semelhante os mutantes arg2 não apresentam a enzima Y e os mutantes arg3 não apresentam a enzima Z Portanto presumese que uma mutação em um gene em particular interfira na produção de uma única enzima A falta da enzima cria um bloqueio em alguma via bioquímica de síntese O bloqueio pode ser evitado por meio do fornecimento para as células de qualquer composto que normalmente vem após o bloqueio na via FIGURA 610 As estruturas químicas da arginina e dos compostos estruturalmente correlatos citrulina e ornitina Tabela 61 Crescimento de mutantes arg em resposta aos suplementos Mutante Suplemento Ornitina Citrulina Arginina arg1 arg2 arg3 Nota um sinal de mais significa crescimento um sinal de menos significa ausência de crescimento Agora podemos diagramar um modelo bioquímico mais completo Esse modelo brilhante que inicialmente era conhecido como a hipótese um gene uma enzima foi a fonte da primeira percepção excitante sobre as funções dos genes os genes de algum modo eram responsáveis pela função das enzimas e cada gene aparentemente controlava uma enzima específica em uma série de etapas interconectadas em uma via bioquímica Outros pesquisadores obtiveram resultados semelhantes em relação a outras vias de síntese e a hipótese logo conquistou a aceitação geral Também se observou que todas as proteínas sejam enzimas ou não são codificadas por genes e assim a frase foi refinada para se tornar a hipótese um geneum polipeptídio Relembre que um polipeptídio é o tipo mais simples de proteína uma cadeia única de aminoácidos Logo se tornou claro que um gene codifica a estrutura física de uma proteína que por sua vez dita a sua função A hipótese de Beadle e Tatum se tornou um dos grandes conceitos de unificação em biologia tendo em vista que proporcionou uma ponte que uniu as duas principais áreas de pesquisa genética e bioquímica Devemos adicionar entre parênteses que embora a grande maioria dos genes codifique proteínas atualmente sabese que algumas codificam RNA que apresentam funções especiais Todos os genes são transcritos para produzir RNA Os genes que codificam proteínas são transcritos em RNA mensageiro mRNA que em seguida é traduzido em proteína Entretanto o RNA codificado por uma minoria de genes nunca é traduzido em proteína tendo em vista que o próprio RNA apresenta uma função única Esses são denominados RNA funcionais Alguns exemplos são os RNA transportador RNA ribossômicos e pequenos RNA citoplasmáticos saberemos mais a respeito deles nos capítulos posteriores CONCEITOCHAVE A síntese química nas células ocorre por meio de vias de etapas sequenciais catalisadas por enzimas Os genes que codificam as enzimas de uma via específica constituem um subconjunto do genoma funcionalmente interativo Interação gênica em outros tipos de vias bioquímicas A noção de que os genes interagem por meio de vias bioquímicas é uma noção poderosa que apresenta aplicação em todos os organismos A via da arginina de Neurospora é um exemplo de uma via de síntese uma cadeia de conversões enzimáticas que sintetiza moléculas essenciais Podemos estender novamente a ideia para um caso humano já introduzido a doença fenilcetonúria PKU que é causada por um alelo autossômico recessivo Essa doença resulta da incapacidade de converter a fenilalanina em tirosina Como um resultado do bloqueio a fenilalanina se acumula e é espontaneamente convertida em um composto tóxico o ácido fenilpirúvico O gene da PKU é parte de uma via metabólica como a via da arginina de Neurospora e parte dela está demonstrada na Figura 611 A ilustração inclui diversas outras doenças causadas por bloqueios em etapas dessa via incluindo alcaptonúria a doença investigada por Garrod Outro tipo de via bioquímica é a via de transdução de sinal Esse tipo de via é uma cadeia de sinais complexos do ambiente para o genoma e de um gene para outro Essas vias são cruciais para a função adequada de um organismo Uma das vias de transdução de sinal mais bemcompreendidas surgiu a partir de uma análise genética da resposta reprodutiva de levedura Dois tipos reprodutivos determinados pelos alelos MATa e MATα são necessários para que ocorra o cruzamento em levedura Quando uma célula se encontra na presença de outra célula de tipo reprodutivo oposto ela é submetida a uma série de alterações no formato e no comportamento como preparo para se reproduzir A resposta reprodutiva é acionada por uma via de transdução de sinal que requer a ação sequencial de um conjunto de genes Esse conjunto de genes foi descoberto por meio de uma análise de interação padrão de mutantes com resposta reprodutiva aberrante a maior parte era estéril As etapas foram unidas por meio da utilização das abordagens na próxima seção O sinal que move esse conjunto de coisas é um feromônio hormônio reprodutivo liberado pelo tipo reprodutivo oposto o feromônio se liga a um receptor de membrana que é acoplado a uma proteína G dentro da membrana e que ativa a proteína A proteína G por sua vez promove uma série de fosforilações sequenciais de proteínas denominada cascata de quinases Finalmente a cascata ativa a transcrição de um conjunto de genes específicos de reprodução que possibilitam que a célula se reproduza Uma mutação em qualquer uma dessas etapas pode comprometer o processo reprodutivo As vias do desenvolvimento compreendem as etapas por meio das quais um zigoto se torna um organismo adulto Esse processo envolve muitas etapas geneticamente controladas incluindo o estabelecimento dos eixos anteroposterior e dorsoventral estabelecendo o plano corporal básico dos órgãos e a diferenciação e a movimentação teciduais Essas etapas podem requerer regulação gênica e transdução de sinal As vias do desenvolvimento serão abordadas em detalhes no Capítulo 13 mas a interação de genes nessas vias é analisada do mesmo modo conforme veremos em seguida Uma via bioquímica de sintese e doenças correlacionadas 63 FIGURA 611 Uma seção da via metabólica da fenilalanina em seres humanos incluindo doenças associadas a bloqueios enzimáticos A fenilcetonúria é produzida quando a enzima fenilalanina hidroxilase apresenta mau funcionamento O acúmulo de fenilalanina resulta em aumento de ácido fenilpirúvico que interfere no desenvolvimento do sistema nervoso Inferência das interações gênicas A abordagem genética que revela os genes interagindo em relação a uma propriedade biológica específica é resumidamente como segue Etapa 1 Obtenha muitos mutantes monogênicos e teste em relação à dominância Etapa 2 Teste os mutantes em relação ao alelismo eles estão em um locus ou em diversos loci Etapa 3 Combine os mutantes em pares para formar mutantes duplos para verificar se os genes interagem A interação gênica é inferida a partir do fenótipo do mutante duplo se os genes interagem então o fenótipo difere da simples combinação de ambos os fenótipos monogênicos mutantes Se os alelos mutantes de diferentes genes interagem então inferimos que os genes do tipo selvagem também normalmente interagem Em casos nos quais os dois mutantes interagem com frequência resultará uma proporção mendeliana modificada de 9331 Um procedimento que deve ser realizado antes de testar as interações é determinar se cada mutação é de um locus diferente etapa 2 anterior A triagem do mutante pode não intencionalmente ter favorecido determinados genes Portanto o conjunto de loci gênicos precisa ser definido conforme demonstrado na próxima seção Segregação de mutantes com a utilização do teste de complementação Como é possível decidir se duas mutações pertencem ao mesmo gene Existem diversos modos Primeiramente cada alelo mutante pode ser mapeado Em seguida se duas mutações forem mapeadas em dois loci cromossômicos diferentes provavelmente elas são de genes diferentes Entretanto essa abordagem é demorada em um grande conjunto de mutações Uma abordagem mais rápida utilizada com frequência é o teste de complementação Em um diploide o teste de complementação é realizado por meio do intercruzamento de dois indivíduos que são homozigotos em relação a diferentes mutações recessivas A próxima etapa é observar se a progênie apresenta o fenótipo do tipo selvagem Se a progênie for do tipo selvagem as duas mutações recessivas estão obrigatoriamente em genes diferentes tendo em vista que os respectivos alelos do tipo selvagem proporcionam função do tipo selvagem Nesse caso dizse que as duas mutações se complementaram Aqui denominaremos os genes a1 e a2 de acordo com seus alelos mutantes Podemos representar os heterozigotos como segue dependendo de os genes estarem no mesmo cromossomo ou estarem em cromossomos diferentes Cromossomos diferentes Mesmo cromossomo demonstrado na configuração trans Entretanto se a progênie não for do tipo selvagem as mutações recessivas têm de ser alelos do mesmo gene Tendo em vista que ambos os alelos do gene são mutantes não existe um alelo do tipo selvagem para auxiliar na distinção entre dois alelos mutantes diferentes de um gene cujo alelo do tipo selvagem é a Esses alelos podem apresentar sítios mutantes diferentes no mesmo gene mas ambos seriam não funcionais O heterozigoto aa seria No nível operacional a complementação é definida como a produção de um fenótipo do tipo selvagem quando dois genomas haploides que contêm mutações recessivas diferentes estão unidos na mesma célula Ilustraremos o teste de complementação com um exemplo de plantas campânula gênero Campanula A cor da flor do tipo selvagem dessa planta é azul Presumiremos que a partir de uma caça a uma mutante tenhamos obtido três mutantes com pétalas brancas e que elas estejam disponíveis como linhagens homozigotas puras Todas apresentam o mesmo aspecto e assim a priori não sabemos se elas são geneticamente idênticas Denominaremos as linhagens mutantes e para evitar qualquer simbolismo com a utilização de letras que pode implicar dominância Quando cruzada com o tipo selvagem cada mutante fornece os mesmos resultados na F1 e na F2 como segue branca Azul F1 toda azul F2 azul branca branca Azul F1 toda azul F2 azul branca branca Azul F1 toda azul F2 azul branca Flores da planta campânula espécie de Campanula Gregory G DimijianScience Source Em cada caso os resultados demonstram que a condição mutante é determinada pelo alelo recessivo de um único gene Entretanto existem três alelos de um gene de dois genes ou de três genes Tendo em vista que os mutantes são recessivos a questão pode ser respondida por meio do teste de complementação que indaga se os mutantes complementam uns aos outros Iremos entrecruzar os mutantes para testar a complementação Presuma que os resultados do entrecruzamento dos mutantes e são como segue branca branca F1 toda branca branca branca F1 toda azul branca branca F1 toda azul A partir desse conjunto de resultados podemos concluir que os mutantes e devem ser causados por alelos de um gene digamos w1 tendo em vista que eles não se complementam mas deve ser causado por um alelo mutante de outro gene w2 tendo em vista que complementa tanto quanto CONCEITOCHAVE Quando dois alelos mutantes recessivos independentemente derivados que produzem fenótipos recessivos semelhantes não se complementam eles têm de ser alelos do mesmo gene Como a complementação atua no nível molecular A cor azul normal da flor da campânula é causada por um pigmento azul denominado antocianina Os pigmentos são substâncias químicas que absorvem determinadas cores da luz em relação à campânula a antocianina absorve todos os comprimentos de onda com exceção do azul que é refletido no olho do observador Entretanto essa antocianina é produzida a partir de precursores químicos que não são pigmentos ou seja eles não absorvem a luz de um comprimento de onda específico e simplesmente refletem de volta a luz branca do sol para o observador proporcionando um aspecto branco O pigmento azul é o produto final de uma série de conversões bioquímicas de não pigmentos Cada etapa é catalisada por uma enzima específica codificada por um gene específico Podemos explicar os resultados com uma via como segue Uma mutação homozigota em qualquer dos genes levará ao acúmulo de um precursor que simplesmente tornará a planta branca Agora as designações dos mutantes podem ser escritas como segue w1w1 w2w2 w1w1 w2w2 w1w1 w2w2 Entretanto na prática os símbolos subscritos seriam abandonados e os genótipos seriam escritos como segue w1w1 w2w2 w1w1 w2w2 w1w1 w2w2 Portanto uma F1 de será w1w1 w2w2 Essas plantas da F1 apresentarão dois alelos defeituosos para w1 e portanto serão bloqueadas na etapa 1 Embora a enzima 2 seja totalmente funcional ela não apresenta um substrato sobre o qual atuar assim nenhum pigmento azul será produzido e o fenótipo será branco As plantas da F1 de outros cruzamentos entretanto apresentarão os alelos do tipo selvagem para ambas as enzimas necessárias para levar os intermediários até o produto final azul Seus genótipos serão w1w1 w2w2 Portanto observamos que a complementação é realmente um resultado da interação cooperativa de alelos do tipo selvagem dos dois genes A Figura 612 resume a interação da complementação e da não complementação de mutantes brancos nos níveis genético e celular Em um organismo haploide o teste de complementação não pode ser realizado por meio de entrecruzamento Em fungos um método alternativo une alelos mutantes para testar a complementação a fusão que resulta em um heterocário Figura 613 As células de fungo se fundem prontamente Quando duas linhagens diferentes se fundem os núcleos haploides das diferentes linhagens ocupam uma célula que é o heterocário grego núcleos diferentes Os núcleos em um heterocário em geral não se fundem Em um sentido essa condição é uma mímica de um diploide A base molecular da complementação genética FIGURA 612 Três mutantes de campânula branca fenotipicamente idênticos e são entrecruzados As mutações no mesmo gene tais como e não se complementam tendo em vista que a F1 apresenta um gene com dois alelos mutantes A via é bloqueada e as flores são brancas Quando as mutações estão em genes diferentes tais como e existe complementação pelos alelos do tipo selvagem de cada gene no heterozigoto da F1 O pigmento é sintetizado e as flores são azuis Qual você prevê que seja o resultado do cruzamento de e Presuma que em linhagens diferentes existam mutações em dois genes diferentes que conferem o mesmo fenótipo mutante por exemplo uma exigência de arginina Denominaremos esses genes arg1 e arg2 Os genótipos das duas linhagens podem ser representados como arg1 arg2 e arg1 arg2 Essas duas linhagens podem ser fundidas para formar um heterocário com os dois núcleos em um citoplasma compartilhado O núcleo 1 é arg1 arg2 O núcleo 2 é arg1 arg2 Tendo em vista que os produtos dos genes são criados em um citoplasma comum os dois alelos do tipo selvagem podem exercer seu efeito dominante e colaborar para a produção de um heterocário de fenótipo do tipo selvagem Em outras palavras as duas mutações se complementam justamente conforme ocorreria em um diploide Se as mutações fossem de alelos do mesmo gene não haveria complementação Análise de mutantes duplos de mutações aleatórias Relembre que para saber se dois genes interagem precisamos avaliar o fenótipo do mutante duplo para verificar se ele é diferente da combinação de ambas as mutações únicas O mutante duplo é obtido por meio de entrecruzamento A F1 é obtida como parte do teste de complementação assim com a presunção de que a complementação foi observada sugerindo genes diferentes a F1 é autofecundada ou entrecruzada para se obter uma F2 homozigota para ambas as mutações Esse mutante duplo pode ser identificado em seguida ao se observarem as proporções mendelianas Por exemplo se uma proporção mendeliana 9331 padrão for obtida o fenótipo presente no único 116 da progênie representa o mutante duplo o 1 em 9331 Nos casos de interação gênica entretanto o fenótipo do mutante duplo pode não ser distinto mas corresponderá àquele dos mutantes únicos Nesse caso resultará uma proporção mendeliana modificada tal como 934 ou 97 A proporção mendeliana de 9331 padrão é o caso mais simples esperado se não houver interação gênica e se as duas mutações em teste estiverem em cromossomos diferentes Essa proporção de 9331 é a hipótese nula qualquer proporção mendeliana modificada que represente um desvio dessa hipótese nula será informativa como os exemplos a seguir irão demonstrar A proporção de 9331 Nenhuma interação gênica Como um valor basal iniciaremos com o caso no qual dois genes mutantes não interagem uma situação na qual esperamos a proporção de 9331 Vejamos a herança da cor da pele em cobras do milho A cor natural da cobra é um padrão de repetição de camuflagem preta e laranja conforme demonstrado na Figura 614 A O fenótipo é produzido por dois pigmentos separados ambos os quais estão sob controle genético Um gene determina o pigmento laranja e os alelos que consideraremos são o presença de pigmento laranja e o ausência de pigmento laranja Outro gene determina o pigmento preto e seus alelos são b presença de pigmento preto e b ausência de pigmento preto Esses dois genes não estão ligados O padrão natural é produzido pelo genótipo o b O travessão representa a presença de qualquer alelo Uma cobra que é oo b é preta tendo em vista que não apresenta o pigmento laranja Figura 614 B e uma cobra que é o bb é laranja tendo em vista que não apresenta o pigmento preto Figura 614 C O duplo homozigoto recessivo oo bb é albino Figura 614 D Entretanto observe que a cor rosa pálida do albino advém de um outro pigmento a hemoglobina do sangue que é visível através da pele dessa cobra quando os outros pigmentos estão ausentes A cobra albina também demonstra claramente que existe outro elemento para o padrão de pigmentação da pele além do pigmento o motivo em repetição no qual e ao redor do qual o pigmento é depositado FIGURA 613 Um heterocário de Neurospora e fungos semelhantes mimetiza um estado diploide Quando as células vegetativas se fundem os núcleos haploides compartilham o mesmo citoplasma em um heterocário Neste exemplo os núcleos haploides com mutações em diferentes genes na via de síntese da arginina se complementam para produzir um Neurospora que deixa de necessitar de arginina FIGURA 614 Em cobras Pantherophis guttatus combinações dos pigmentos laranja e preto determinam os quatro fenótipos demonstrados A Uma cobra camuflada preta e laranja do tipo selvagem sintetiza ambos os pigmentos preto e laranja B Uma cobra preta não sintetiza o pigmento laranja C Uma cobra laranja não sintetiza o pigmento preto D Uma cobra albina não sintetiza pigmento preto nem laranja Anthony Griffiths Se uma cobra laranja homozigota e uma cobra preta homozigota forem cruzadas a F1 é do tipo selvagem camuflada demonstrando a complementação Aqui entretanto uma F2 demonstra uma proporção de 9331 padrão A proporção de 9331 é produzida em virtude de os dois genes para pigmento atuarem de modo independente no nível celular Se a presença de um mutante torna uma via bioquímica falha a outra via ainda está ativa produzindo a cor do outro pigmento Ambas as vias falham apenas quando ambos os mutantes estão presentes e não é produzido pigmento de nenhuma cor A proporção de 97 Genes na mesma via bioquímica A proporção da F2 do cruzamento dihíbrido da campânula demonstra ambas as plantas azuis e brancas em uma proporção de 97 Como os referidos resultados podem ser explicados A proporção de 97 é claramente uma modificação da proporção dihíbrida de 9331 com 331 combinadas para perfazer 7 portanto é inferido algum tipo de interação O cruzamento das duas linhagens brancas e as gerações subsequentes podem ser representados como segue Claramente nesse caso o único modo por meio do qual é possível uma proporção de 97 é se o mutante duplo apresentar os mesmos fenótipos que os dois mutantes únicos Portanto a proporção modificada constitui um modo de identificar o fenótipo do mutante duplo Além disso os fenótipos idênticos dos mutantes únicos e duplos sugerem que cada alelo mutante controla uma etapa diferente na mesma via bioquímica Os resultados demonstram que uma planta apresentará pétalas brancas se for homozigota em relação ao alelo mutante recessivo de qualquer um dos genes ou de ambos os genes Para apresentar o fenótipo azul uma planta deve apresentar no mínimo uma cópia do alelo dominante de ambos os genes tendo em vista que ambos são necessários para completar as etapas sequenciais na via Não importa qual esteja ausente a mesma via bioquímica falha produzindo o mesmo fenótipo Portanto três das classes genotípicas produzirão o mesmo fenótipo e assim em geral resultam apenas dois fenótipos O exemplo nas campânulas envolveu etapas diferentes em uma via de síntese Resultados semelhantes podem surgir a partir da regulação gênica Um gene regulador com frequência atua por meio da produção de uma proteína que se liga a um sítio regulador upstream de um genealvo facilitando a transcrição do gene Figura 615 Na ausência da proteína reguladora o genealvo será transcrito em níveis muito baixos inadequados para as necessidades celulares Cruzaremos uma linhagem pura rr defeituosa para a proteína reguladora com uma linhagem pura aa defeituosa para a proteínaalvo O cruzamento é rr aa rr aa O dihíbrido rr aa demonstrará complementação entre os genótipos mutantes tendo em vista que ambos r e a estão presentes possibilitando a transcrição normal do alelo do tipo selvagem Quando autofecundados os dihíbridos da F1 também resultarão em uma proporção fenotípica de 97 na F2 FIGURA 615 O gene r codifica uma proteína reguladora e o gene a codifica uma proteína estrutural Ambos têm de ser normais para que uma proteína estrutural funcional ativa seja sintetizada CONCEITOCHAVE Uma proporção de 97 na F2 sugere interação de genes na mesma via a ausência de qualquer função gênica leva à ausência do produto final da via A proporção de 934 Epistasia recessiva Uma proporção de 934 na F2 sugere um tipo de interação gênica denominado epistasia Essa palavra significa predominância sobre e se refere à situação na qual o mutante duplo demonstra o fenótipo de uma mutação mas não de outra A mutação que predomina sobre é epistática enquanto a que fica sob é hipostática A epistasia também resulta de os genes estarem na mesma via bioquímica Em uma via de síntese simples a mutação epistática é carreada por um gene que está mais upstream mais inicialmente na via do que o gene da mutação hipostática Figura 616 O fenótipo mutante do gene upstream predomina não importa o que esteja ocorrendo posteriormente na via Vejamos um exemplo a respeito da síntese do pigmento das pétalas na planta mariaolhosazuis Collinsia parviflora A partir do tipo selvagem azul iniciaremos com duas linhagens mutantes puras uma com pétalas brancas ww e a outra com pétalas magenta mm Os genes w e m não estão ligados A F1 e a F2 são como segue ww mm branca ww mm magenta FIGURA 616 Alelos do tipo selvagem de dois genes w e m codificam enzimas que catalisam etapas sucessivas na síntese de um pigmento azul das pétalas As plantas homozigotas mm produzem flores magenta e as plantas homozigotas ww produzem flores brancas O mutante duplo ww mm também produz flores brancas indicando que o branco é epistático em relação ao magenta Na F2 a proporção fenotípica de 934 é diagnóstica de epistasia recessiva Assim como no caso precedente novamente observamos que a proporção nos informa qual é obrigatoriamente o fenótipo do duplo mutante tendo em vista que o componente da proporção deve ser um agrupamento de uma classe mutante única mais a classe mutante dupla Portanto o mutante duplo expressa apenas um dos dois fenótipos mutantes assim por definição branco tem de ser epistático em relação a magenta Para encontrar o mutante duplo dentro do grupo as plantas brancas da F2 deveriam ser individualmente submetidas ao cruzamento teste Essa interação é denominada epistasia recessiva tendo em vista que um fenótipo recessivo branco supera o outro fenótipo A epistasia dominante será considerada na próxima seção No nível celular podemos justificar a epistasia recessiva em Collinsia por meio do tipo de via a seguir ver também Figura 616 Observe que a mutação epistática ocorre em uma etapa na via que leva ao pigmento azul essa etapa é anterior à etapa que é bloqueada pela mutação mascarada Outro caso informativo de epistasia recessiva é a cor amarela da pelagem de alguns cães labrador retriever Dois alelos B e b fazem referência às pelagens preta e marrom respectivamente Os dois alelos produzem melanina preta e marrom O alelo e de outro gene é epistático em relação a esses alelos proporcionando uma pelagem amarela Figura 617 Portanto ambos os genótipos B ee e bb ee produzem um fenótipo amarelo enquanto B E e bb E são preto e marrom respectivamente Esse caso de epistasia não é causado por um bloqueio upstream na via que leva ao pigmento escuro Cães amarelos podem produzir pigmento preto ou marrom conforme pode ser observado em seus narizes e seus lábios A ação do alelo e é evitar a deposição do pigmento nos pelos Nesse caso o gene epistático está dowstream no desenvolvimento ele representa um tipo de alvo do desenvolvimento que tem de ser de genótipo E antes que o pigmento possa ser depositado FIGURA 617 Três cores de pelagem diferentes em labrador retriever Dois alelos B e b de um gene de pigmento determinam A preto e B marrom respectivamente Em um gene em separado E possibilita a deposição da cor na pelagem e ee impede a deposição resultando C no fenótipo dourado A parte C ilustra a epistasia recessiva Anthony Griffiths CONCEITOCHAVE A epistasia é inferida quando um alelo mutante de um gene mascara a expressão de um alelo mutante de outro gene e em vez disso expressa o seu próprio fenótipo Em fungos a análise de tétrades é útil na identificação de um mutante duplo Por exemplo um asco que contém metade dos seus produtos como do tipo selvagem deve conter mutantes duplos Considere o cruzamento a b a b Em alguma proporção da progênie os alelos a e b segregarão juntos um asco ditipo não parental Uma referida tétrade demonstrará os fenótipos a seguir tipo selvagem a b mutante duplo a b tipo selvagem a b mutante duplo a b Portanto o mutante duplo obrigatoriamente tem o genótipo não do tipo selvagem e pode ser avaliado de acordo Se o fenótipo for o fenótipo a então b está sendo sobrepujado se o fenótipo for o fenótipo b então a está sendo sobrepujado Se ambos os fenótipos estiverem presentes então não há epistasia A proporção de 1231 Epistasia dominante Em dedaleiras Digitalis purpurea dois genes interagem na via que determina a coloração das pétalas Os dois genes não estão ligados Um gene afeta a intensidade do pigmento vermelho na pétala o alelo d resulta na cor vermelhoclara observada em populações naturais de dedaleiras enquanto D é um alelo mutante que produz a cor vermelho escura Figura 618 O outro gene determina em quais células o pigmento é sintetizado o alelo w possibilita a síntese do pigmento por todas as pétalas assim como no tipo selvagem mas o alelo mutante W confina a síntese do pigmento às pequenas manchas na garganta Se autofecundarmos um dihíbrido Dd Ww a proporção da F2 é como segue A proporção nos informa que o alelo dominante W é epistático produzindo a proporção 1231 O componente da proporção inclui obrigatoriamente a classe mutante dupla que é claramente de fenótipo branco estabelecendo a epistasia do alelo dominante W Os dois genes atuam em uma via comum do desenvolvimento W evita a síntese do pigmento vermelho mas apenas em uma classe especial de células que constituem a área principal da pétala a síntese é limitada às manchas da garganta Quando a síntese é permitida o pigmento pode ser produzido em concentrações altas ou baixas FIGURA 618 Em dedaleiras D e d causam pigmentos escuros e claros respectivamente enquanto o W epistático restringe o pigmento às manchas na garganta Anthony Griffiths Supressores Não é fácil selecionar ou triar especificamente interações epistáticas e casos de epistasia devem ser construídos por meio da laboriosa combinação de duas mutações candidatas por vez Entretanto em relação ao nosso próximo tipo de interação gênica o experimentador pode selecionar prontamente alelos mutantes de interesse Um supressor é um alelo mutante de um gene que reverte o efeito de uma mutação de outro gene resultando em um fenótipo do tipo selvagem ou próximo do tipo selvagem A supressão implica que o genealvo e o gene supressor normalmente interagem em algum nível funcional em seus estados do tipo selvagem Por exemplo presuma que um alelo a produza o fenótipo normal enquanto um alelo mutante recessivo a resulte em uma anormalidade Um alelo mutante recessivo s em outro gene suprime o efeito de a e assim o genótipo aa ss apresentará o fenótipo do tipo selvagem semelhante a a Alelos supressores por vezes não apresentam efeito na ausência da outra mutação em um referido caso o fenótipo de aa ss seria do tipo selvagem Em outros casos o alelo supressor produz o seu próprio fenótipo anormal A triagem de supressores é bem direta Inicie com um mutante em algum processo de interesse exponha esse mutante a agentes que causem mutação tal como radiação de alta energia e trie os descendentes em relação aos tipos selvagens Em haploides tais como fungos a triagem é realizada simplesmente por meio do plaqueamento de células mutagenizadas e da observação das colônias com fenótipos do tipo selvagem Na maior parte os tipos selvagens que são originados desse modo são meramente reversões do evento mutacional original e são denominados revertentes Entretanto alguns serão pseudorrevertentes mutantes duplos nos quais uma das mutações é um supressor Os estados revertente e suprimido podem ser distinguidos por meio de cruzamento apropriado Por exemplo em leveduras os dois resultados seriam distinguidos como segue O surgimento do fenótipo mutante original identifica o genitor como um mutante suprimido Em diploides os supressores produzem diversas proporções de F2 modificadas que são úteis na confirmação da supressão Vejamos um exemplo da vida real de Drosophila O alelo recessivo pd resulta na cor dos olhos roxa quando não suprimido Um alelo su recessivo não apresenta por si próprio um fenótipo detectável mas suprime o alelo recessivo não ligado pd Portanto pdpd susu tem o aspecto do tipo selvagem e apresenta olhos vermelhos A análise a seguir ilustra o padrão de herança Uma mosca com olhos roxos homozigota é cruzada com uma com olhos vermelhos homozigota que carreia o supressor A proporção geral na F2 é de 13 vermelhos3 roxos O componente de obrigatoriamente inclui o mutante duplo que é claramente de fenótipo do tipo selvagem Essa proporção é esperada a partir de um supressor recessivo que por si próprio não apresenta fenótipo detectável Por vezes a supressão é confundida com epistasia Entretanto a diferença chave é que um supressor cancela a expressão de um alelo mutante e restaura o fenótipo do tipo selvagem correspondente Além disso com frequência apenas dois fenótipos segregam assim como nos exemplos precedentes em vez de três como na epistasia Como os supressores atuam no nível molecular Existem muitos mecanismos possíveis Um tipo de supressão particularmente útil tem por base a ligação física de produtos gênicos na célula por exemplo ligação entre proteínas Presuma que duas proteínas normalmente se combinem para proporcionar algum tipo de função celular Quando uma mutação causa uma alteração no formato de uma proteína ela deixa de se combinar à outra portanto a função é perdida Figura 619 Entretanto uma mutação supressora que causa uma alteração no formato compensatória na segunda proteína pode restaurar a combinação portanto a função normal Nessa figura se os genótipos fossem diploides que representam uma F2 de um dihíbrido então resultaria uma proporção de 142 tendo em vista que os únicos genótipos mutantes seriam mm ss 116 e mm ss 116 totalizando 216 Se esse fosse um cruzamento dihíbrido haploide tal como m s m s resultaria uma proporção de 11 A partir das proporções de supressores em geral com frequência as proteínas que interagem podem ser deduzidas Alternativamente quando uma mutação causa um bloqueio em uma via metabólica o supressor encontra algum modo de superar o bloqueio por exemplo por meio do redirecionamento de intermediários similares para além do bloqueio da via No exemplo a seguir o supressor fornece um intermediário B para contornar o bloqueio FIGURA 619 Uma primeira mutação altera o sítio de ligação de uma proteína de modo que ela não consegue mais se ligar a um parceiro Uma mutação supressora no parceiro altera o sítio de ligação de modo que ambas as proteínas são capazes de se ligar novamente Em diversos organismos foram encontrados supressores sem sentido mutações nos genes de tRNA que resultam em um anticódon que se ligará a um códon de parada prematuro em uma sequência codificadora mutante Portanto o supressor possibilita que a tradução prossiga além do bloqueio anterior e produza uma proteína completa em vez de uma proteína truncada Essas mutações supressoras com frequência apresentam poucos efeitos sobre o fenótipo além da supressão CONCEITOCHAVE Alelos mutantes denominados supressores cancelam o efeito de um alelo mutante de outro gene resultando em fenótipo do tipo selvagem Modificadores Como a denominação sugere uma mutação modificadora em um segundo locus altera o grau de expressão de um gene mutado no primeiro locus Os genes reguladores fornecem uma ilustração simples Assim como em um exemplo anterior as proteínas reguladoras se ligam à sequência do DNA upstream do sítio de início da transcrição Essas proteínas regulam o nível de transcrição Na discussão sobre a complementação consideramos uma mutação nula de um gene regulador que evitou quase completamente a transcrição Entretanto algumas mutações reguladoras alteram o nível de transcrição do gene alvo de modo que mais ou menos proteína é produzida Em outras palavras uma mutação em uma proteína reguladora pode diminuir ou aumentar o gene transcrito Vejamos um exemplo que utiliza uma mutação b em um regulador que regula para menos que afeta o gene A em um fungo tal como levedura Observamos o efeito de b sobre uma mutação leaky no gene A Uma mutação leaky é uma mutação com algum nível baixo de função gênica Cruzamos uma mutação gotejante a com a mutação reguladora b Mutante leaky a b Regulador ineficiente a b Progênie Fenótipo a b tipo selvagem a b defeituoso baixa transcrição a b defeituoso proteína A defeituosa extremamente defeituoso baixa transcrição da proteína a b defeituosa Portanto a ação do modificador é observada no aparecimento de duas gradações de fenótipos mutantes dentro da progênie a Letais sintéticos Em alguns casos quando dois mutantes únicos viáveis são intercruzados os mutantes duplos resultantes são letais Em uma F2 diploide esse resultado seria manifestado como uma proporção de 933 tendo em vista que o mutante duplo que seria o componente 1 da proporção estaria ausente Esses letais sintéticos podem ser considerados uma categoria especial de interação gênica Eles podem apontar para tipos específicos de interações de produtos gênicos Por exemplo a análise do genoma revelou que a evolução produziu muitos sistemas duplicados dentro da célula Uma vantagem desses sistemas duplicados pode ser o fornecimento de cópias de segurança Se houver mutações nulas nos genes em ambos os sistemas duplicados então um sistema defeituoso não apresentará uma cópia de segurança e o indivíduo não apresentará a função essencial e morrerá Em outro caso uma mutação leaky em uma etapa de uma via bioquímica pode causar a diminuição da velocidade da via mas deixar função suficiente para a vida Entretanto se mutantes duplos são combinados cada um com uma mutação leaky em uma etapa diferente a via inteira é interrompida Uma versão da última interação é de duas mutações em proteínas que interagem conforme demonstrado na Figura 620 Nas discussões anteriores sobre proporções mendelianas modificadas todos os cruzamentos eram autofecundações de dihíbridos Como um exercício você pode querer calcular as proporções que seriam produzidas nos mesmos sistemas se fossem realizados cruzamentosteste em vez de autofecundações CONCEITOCHAVE Uma diversidade de proporções da F1 de 9331 modificadas pode revelar tipos específicos de interação gênica Um resumo de algumas das proporções que revelam a interação gênica está demonstrado na Tabela 62 FIGURA 620 Duas proteínas em interação realizam alguma função essencial em algum substrato tal como DNA mas primeiramente precisam se ligar a ele A ligação reduzida de qualquer proteína possibilita a permanência de algumas funções mas a ligação reduzida de ambas é letal Tabela 62 Algumas proporções de F2 modificadas 64 1 2 Penetrância e expressividade Na análise da herança monogênica existe uma tendência natural de escolher mutantes que produzem proporções mendelianas claras Nos referidos casos podemos utilizar o fenótipo para distinguir os genótipos mutantes e do tipo selvagem com quase 100 de certeza Nesses casos dizemos que a mutação é 100 penetrante no fenótipo Entretanto muitas mutações demonstram penetrância incompleta ou seja nem todos os indivíduos com o genótipo expressam o fenótipo correspondente Portanto a penetrância é definida como a porcentagem de indivíduos com um determinado alelo que exibem o fenótipo associado àquele alelo Por que um organismo apresentaria um determinado genótipo e ainda assim não expressaria o fenótipo correspondente Existem diversos motivos possíveis A influência do ambiente Indivíduos com o mesmo genótipo podem demonstrar uma diversidade de fenótipos dependendo do ambiente A variação dos fenótipos em relação aos indivíduos mutantes e do tipo selvagem pode se sobrepor o fenótipo de um indivíduo mutante que cresceu em um conjunto de circunstâncias pode corresponder ao fenótipo de um indivíduo do tipo selvagem que cresceu em um conjunto de circunstâncias diferente Se essa correspondência ocorrer o mutante não pode ser distinguido do tipo selvagem A influência de interação com outros genes Modificadores não caracterizados genes epistáticos ou supressores no restante do genoma 3 atuam para prevenir a expressão do fenótipo típico A sutileza do fenótipo mutante Os efeitos sutis ocasionados pela ausência de uma função gênica podem ser de difícil mensuração em uma situação de laboratório Um exemplo típico com penetrância incompleta está demonstrado na Figura 621 Nesse heredograma humano observamos um fenótipo herdado normalmente de modo dominante desaparecendo na segunda geração apenas para reaparecer na próxima Outra medida para descrever a variação da expressão fenotípica é denominada expressividade A expressividade mede o grau no qual um determinado alelo é expresso no nível fenotípico ou seja a expressividade mede a intensidade do fenótipo Por exemplo animais marrons genótipo bb de diferentes estoques podem demonstrar intensidades muito diferentes do pigmento marrom do claro até o escuro Em relação à penetrância a expressividade variável pode ocorrer em virtude da variação na constituição alélica do restante do genoma ou de fatores ambientais A Figura 622 ilustra a distinção entre penetrância e expressividade Um exemplo de expressividade variável em cães é observado na Figura 623 FIGURA 621 Neste heredograma humano de um alelo dominante que não é totalmente penetrante a pessoa Q não demonstra o fenótipo mas transmitiu o alelo dominante para no mínimo dois descendentes Tendo em vista que alelo não é totalmente penetrante o restante da progênie p ex R pode ter herdado o alelo dominante ou não FIGURA 622 Presuma que todos os indivíduos demonstrados apresentam o mesmo alelo de um pigmento P e possuem o mesmo potencial de produzir o pigmento Os efeitos do restante do genoma e do ambiente podem suprimir ou modificar a produção do pigmento em qualquer indivíduo A cor indica o nível de expressão FIGURA 623 Dez gradações de padrões de manchas não pigmentadas em beagles Cada um desses cães apresenta o alelo SP responsável pelas manchas não pigmentadas nos cães A variação é causada pela variação em outros loci Os fenômenos de penetrância incompleta e expressividade variável podem tornar qualquer tipo de análise genética substancialmente mais difícil incluindo a análise de heredogramas humanos e as previsões no aconselhamento genético Por exemplo esse com frequência é o caso em que um alelo que causa uma doença não é totalmente penetrante Portanto uma pessoa poderia apresentar o alelo mas não demonstrar sinais da doença Se esse for o caso é difícil fornecer um claro laudo genético de saúde para uma pessoa em um heredograma de doença p ex a pessoa R na Figura 621 Por outro lado a análise de heredogramas por vezes consegue identificar pessoas que não expressam mas que quase certamente apresentam um genótipo de doença p ex o indivíduo Q na Figura 621 De modo semelhante a expressividade variável pode complicar o aconselhamento tendo em vista que pessoas com baixa expressividade poderiam ser erroneamente diagnosticadas Embora a penetrância e a expressividade possam ser quantificadas não obstante elas representam situações nebulosas tendo em vista que raramente é possível identificar fatores específicos que causam a variação sem pesquisas substanciais adicionais CONCEITOCHAVE Os termos penetrância e expressividade quantificam a modificação do efeito de um gene por meio da variação do ambiente e do background genético eles medem respectivamente a porcentagem de casos nos quais o fenótipo é observado e a sua gravidade RESUMO Um gene não atua isoladamente em vez disso ele atua em conjunto com muitos outros genes no genoma Na análise genética direta a dedução dessas interações complexas é um estádio importante da pesquisa As mutações individuais são testadas primeiramente a respeito de suas relações de dominância um tipo de interação alélica As mutações recessivas com frequência resultam da haplossuficiência do alelo do tipo selvagem enquanto as mutações dominantes com frequência são o resultado da haploinsuficiência do tipo selvagem ou da ação do mutante como um dominante negativo um polipeptídio trapaceiro Algumas mutações causam efeitos graves ou até mesmo morte mutações letais A letalidade de uma mutação homozigota recessiva é um modo de avaliar se um gene é essencial no genoma A interação de diferentes genes resulta de sua participação na mesma via bioquímica ou em vias de conexão de diversos tipos síntese transdução de sinal ou desenvolvimento A dissecção genética das interações gênicas tem início por meio da reunião por parte do experimentador de mutantes que afetam um caractere de interesse O teste de complementação determina se duas mutações recessivas distintas são de um gene ou de dois genes diferentes Os genótipos mutantes são reunidos em um indivíduo da F1 e se o fenótipo for mutante então não ocorreu nenhuma complementação e os dois alelos são obrigatoriamente do mesmo gene Se o fenótipo for do tipo selvagem então ocorreu complementação e os alelos têm de ser de genes diferentes A interação dos diferentes genes pode ser detectada por meio do teste de mutantes duplos tendo em vista que a interação alélica implica a interação de produtos gênicos no nível funcional Alguns tiposchave de interação são a epistasia a supressão e a letalidade sintética A epistasia é a substituição de um fenótipo mutante produzido por uma mutação por um fenótipo mutante produzido por mutação em outro gene A observação de epistasia sugere uma via em comum seja química ou do desenvolvimento Um supressor é uma mutação de um gene que consegue restaurar o fenótipo do tipo selvagem em uma mutação em outro gene Os supressores com frequência revelam proteínas ou ácidos nucleicos que interagem fisicamente Algumas combinações de mutantes viáveis são letais um resultado conhecido como letalidade sintética Os letais sintéticos podem revelar uma diversidade de interações dependendo da natureza das mutações Os diferentes tipos de interações gênicas produzem proporções dihíbridas de F2 que são modificações do padrão de 9331 Por exemplo a epistasia recessiva resulta em uma proporção de 934 Em termos mais gerais a interação gênica e a interação do gene com o ambiente são reveladas por meio da penetrância variável a capacidade de um genótipo de expressar a si próprio no fenótipo e da expressividade o grau quantitativo da manifestação fenotípica de um genótipo TERMOSCHAVE alelo letal alelos múltiplos alelo pleiotrópico codominância complementação dominância incompleta dominância total completa epistasia expressividade gene essencial heterocário hipótese um geneum polipeptídio letal sintético modificador mutação dominante negativa mutação nula mutantes duplos mutações sensíveis à temperatura st penetrância revertente RNA funcional série alélica alelos múltiplos supressor temperatura permissiva temperatura restritiva teste de complementação PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 A maior parte dos heredogramas demonstra a polidactilia ver Figura 225 herdada como autossômica dominante rara mas os heredogramas de algumas famílias não se ajustam totalmente aos padrões esperados em relação à referida herança Um referido heredograma está demonstrado aqui Os losangos não sombreados fazem referência aos números especificados de pessoas não afetadas de sexo desconhecido a Qual irregularidade esse heredograma demonstra b Qual fenômeno genético esse heredograma ilustra c Sugira um mecanismo de interação gênica específico que possa produzir um referido heredograma demonstrando os genótipos dos familiares pertinentes Solução a A expectativa normal em relação a um autossômico dominante é que cada indivíduo afetado apresente um progenitor afetado mas essa expectativa não é observada nesse heredograma o que constitui a irregularidade Quais são algumas possíveis explicações Alguns casos de polidactilia poderiam ser causados por um gene diferente um que seja um gene dominante ligado ao X Essa sugestão não é útil tendo em vista que ainda precisamos explicar a ausência da condição nas pessoas II6 e II10 Além disso postular a herança recessiva seja autossômica ou ligada ao sexo exige que muitas pessoas no heredograma sejam heterozigotas o que é inadequado tendo em vista que a polidactilia é uma condição rara b Portanto restanos a conclusão de que a polidactilia por vezes é incompletamente penetrante Conforme descrito neste capítulo alguns indivíduos que apresentam o genótipo em relação a um fenótipo em particular não o expressam Nesse heredograma II6 e II10 aparentam pertencer a essa categoria eles obrigatoriamente carreiam o gene da polidactilia herdado de I1 tendo em vista que o transmitem à sua progênie c Conforme discutido neste capítulo a supressão ambiental da expressão gênica pode causar penetrância incompleta assim como a supressão por outro gene Para fornecer a explicação genética solicitada é preciso elaborar uma hipótese genética O que precisamos explicar A chave é que I1 transmite a mutação para dois tipos de progênie representadas por II1 que expressa o fenótipo mutante e por II6 e II10 que não expressam A partir do heredograma não podemos dizer se os outros filhos de I1 apresentam o alelo mutante A supressão genética está atuando I1 não apresenta um alelo supressor tendo em vista que expressa polidactilia Assim a única pessoa da qual o supressor poderia advir é I2 Além disso I2 deve ser heterozigoto em relação ao alelo supressor tendo em vista que no mínimo um de seus filhos expressa polidactilia Portanto o alelo supressor tem de ser dominante Sendo assim formulamos a hipótese de que o cruzamento na geração I deve ter sido I1 Pp ss I2 pp Ss em que S é o supressor e P é o alelo responsável pela polidactilia A partir dessa hipótese prevemos que a progênie será composta pelos quatro tipos a seguir se os genes se distribuírem Genótipo Fenótipo Exemplo Pp Ss normal suprimido II6 II10 Pp ss polidáctilo II1 pp Ss normal pp ss normal Se S for raro as progênies de II6 e II10 serão Genótipo da progênie Exemplo Pp Ss III13 Pp ss III8 pp Ss pp ss Não podemos descartar as possibilidades de que II2 e II4 apresentem o genótipo Pp Ss e que ao acaso nenhum de seus descendentes seja afetado Problema resolvido 2 Besouros de uma determinada espécie podem apresentar coberturas das asas verde azul ou turquesa Besouros virgens foram selecionados a partir de uma população de laboratório polimórfica e foram cruzados para determinar a herança da cor das coberturas das asas Os cruzamentos e os resultados foram conforme fornecidos na tabela a seguir a Deduza a base genética da cor das coberturas das asas nessa espécie b Escreva os genótipos de todos os genitores e da progênie tão completamente quanto possível Solução a Esses dados primeiramente aparentam ser complexos mas o padrão de herança se torna claro se consideramos cada um dos cruzamentos por vez Um princípio geral para a solução dos referidos problemas conforme vimos é iniciar observando todos os cruzamentos e agrupando os dados para revelar os padrões Um indício que surge de uma visão geral dos dados é que todas as proporções são proporções monogênicas absolutamente não existe evidência da participação de dois genes em separado Como essa variação pode ser explicada com um gene único A resposta é que existe variação em relação ao próprio gene único ou seja alelismo múltiplo Talvez existam três alelos de um gene denominaremos o gene w em relação à cor das coberturas das asas e representaremos os alelos como wg wb e wt Agora temos um problema adicional que é determinar a dominância desses alelos O cruzamento 1 nos informa algo a respeito da dominância tendo em vista que toda a progênie de um cruzamento azul verde é azul portanto o azul aparenta ser dominante sobre o verde Essa conclusão é amparada pelo cruzamento 5 tendo em vista que o determinante verde obrigatoriamente existia no estoque parental para aparecer na progênie O cruzamento 3 nos informa a respeito dos determinantes de turquesa que obrigatoriamente existiam no estoque parental embora não fossem expressos tendo em vista que existem coberturas das asas turquesa na progênie Assim verde tem de ser dominante sobre turquesa Portanto formamos um modelo no qual a dominância é wb wg wt De fato a posição inferida do alelo wt na parte inferior da série de dominância é amparada pelos resultados do cruzamento 7 no qual turquesa aparece na progênie de um cruzamento azul verde b Agora se trata apenas de uma questão de deduzir os genótipos específicos Observe que a questão declara que os genitores foram obtidos de uma população polimórfica o que significa que eles podem ser homozigotos ou heterozigotos Um genitor com coberturas das asas azuis por exemplo pode ser homozigoto wbwb ou heterozigoto wbwg ou wbwt Aqui são necessários um pouco de tentativa e erro e bom senso mas nesse estágio a questão foi essencialmente respondida e tudo o que resta é cortar os t e pôr os pontos nos i Os genótipos a seguir explicam os resultados Um travessão indica que o genótipo pode ser homozigoto ou heterozigoto na apresentação de um segundo alelo na série alélica Problema resolvido 3 As folhas de abacaxi podem ser classificadas em três tipos espinhosas S com pontas espinhosas ST e tubulares não espinhosas P Em cruzamentos entre linhagens puras seguidos por intercruzamentos da F1 apareceram os resultados a seguir Fenótipos Cruzamento Parental F1 F2 1 ST S ST 99 ST34 S 2 P ST P 120 P39 ST 3 P S P 95 P25 ST8 S a Atribua símbolos gênicos Explique esses resultados em relação aos genótipos produzidos e suas proporções b Com a utilização do modelo da parte a forneça as proporções fenotípicas que você esperaria se cruzasse 1 a progênie F1 de tubulares espinhosas com o estoque parental espinhoso e 2 a progênie F1 de tubulares espinhosas com a progênie F1 de espinhosas pontas espinhosas Solução a Primeiramente vejamos as proporções da F2 Temos claras proporções de 31 nos cruzamentos 1 e 2 indicando segregações monogênicas Entretanto o cruzamento 3 demonstra uma proporção que é quase certamente uma proporção de 1231 Como conhecemos essa proporção Bem simplesmente não existem tantas proporções complexas em genética e a tentativa e erro nos traz à proporção de 1231 de modo consideravelmente rápido No total de 128 da progênie são esperados os números 96248 mas os números reais correspondem notavelmente bem a essas expectativas Um dos princípios deste capítulo é que as proporções mendelianas modificadas revelam interações gênicas O cruzamento 3 proporciona números de F2 apropriados para uma proporção mendeliana dihíbrida modificada e assim aparentemente estamos lidando com uma interação de dois genes Esse aparenta ser o lugar mais promissor para o início podemos retornar aos cruzamentos 1 e 2 e tentar ajustálos posteriormente Qualquer proporção dihíbrida tem por base as proporções fenotípicas de 9331 Nossa modificação observada as agrupa como segue Assim sem nos preocuparmos a respeito da denominação do tipo de interação gênica de qualquer maneira não nos é solicitado o seu fornecimento já podemos definir nossos três fenótipos das folhas do abacaxi em relação aos pares alélicos propostos Aa e Bb Tubular A Bb irrelevante Ponta espinhosa aa B Espinhosa aa bb O que dizer sobre os genitores do cruzamento 3 O genitor espinhoso tem de ser aa bb e tendo em vista que o gene B é necessário para produzir folhas com pontas espinhosas na F2 o genitor tubular tem de ser AA BB Observe que nos é informado que todos os genitores são puros ou homozigotos Portanto a F1 deve ser Aa Bb Sem pensamentos adicionais podemos escrever nosso cruzamento 1 como segue O cruzamento 2 pode ser escrito parcialmente sem pensamentos adicionais utilizando nossos símbolos gênicos arbitrários Sabemos que a F2 do cruzamento 2 demonstra segregação monogênica e agora aparenta estar certo que há participação do par alélico Aa Mas o alelo B é necessário para produzir o fenótipo ponta espinhosa e assim todas as plantas devem ser homozigotas BB Observe que as duas segregações monogênicas nos cruzamentos 1 e 2 não demonstram que os genes não estão interagindo O que está demonstrado é que a interação de dois genes não é revelada por esses cruzamentos apenas pelo cruzamento 3 no qual a F1 é heterozigota em relação a ambos os genes b Agora é simplesmente uma questão de utilizar as leis de Mendel para prever os desfechos dos cruzamentos PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Na Figura 61 a o que as estrelas amarelas representam b explique em suas próprias palavras por que o heterozigoto é funcionalmente do tipo selvagem Na Figura 62 explique como o polipeptídio mutante atua como um espoliador e qual é o seu efeito líquido sobre o fenótipo Na Figura 66 avalie o alelo Vf em relação ao alelo Vby ele é dominante recessivo codominante incompletamente dominante Na Figura 611 a em virtude da posição da HPA oxidase anteriormente na via bioquímica em comparação àquela da HA oxidase você espera que pessoas com tirosinemia demonstrem sintomas de alcaptonúria b se um mutante duplo puder ser encontrado você espera que a tirosinemia seja epistática em relação à alcaptonúria Na Figura 612 a o que os símbolos de dólar libra e iene representam b por que o heterozigoto da F1 à esquerda não consegue sintetizar o pigmento azul Na Figura 613 explique no nível proteico por que esse heterocário consegue crescer em meio mínimo Na Figura 614 escreva os possíveis genótipos em relação a cada uma das quatro cobras ilustradas Na Figura 615 a qual painel representa o mutante duplo b declare a função do gene regulador c na situação no painel B a proteína do gene da proteína ativa seria produzida Na Figura 616 se você realizasse a autofecundação de 10 plantas corde rosa da F2 diferentes você esperaria observar quaisquer plantas com flores brancas na progênie Quaisquer plantas com flores azuis 10 11 12 13 14 Na Figura 619 a o que as cavilhas quadradastriangulares e os orifícios representam b a mutação supressora isoladamente é de fenótipo do tipo selvagem Na Figura 621 proponha uma explicação genética específica em relação ao indivíduo Q forneça um genótipo possível definindo os alelos PROBLEMAS BÁSICOS Em seres humanos a doença galactosemia causa retardo mental em uma idade precoce A lactose o açúcar do leite é fragmentada em galactose e glicose Normalmente a galactose é adicionalmente degradada pela enzima galactose1fosfato uridiltransferase GALT Entretanto em pacientes com galactosemia a GALT é inativa levando ao acúmulo de níveis altos de galactose os quais no cérebro causam retardo mental Como você proporcionaria uma cura secundária para a galactosemia Você espera que o fenótipo dessa doença seja dominante ou recessivo Em seres humanos a PKU fenilcetonúria é uma doença recessiva causada por uma insuficiência enzimática na etapa A na sequência de ações simplificada a seguir e a AKU alcaptonúria é outra doença recessiva em virtude de uma ineficiência enzimática em uma das etapas resumida aqui como a etapa B Uma pessoa com PKU se casa com uma pessoa com AKU Quais fenótipos você espera em relação aos seus filhos Todos normais todos apresentando apenas PKU todos apresentando apenas AKU todos apresentando ambas PKU e AKU ou alguns apresentando AKU e alguns apresentando PKU Na Drosophila o autossômico recessivo bw causa olhos marromescuros e o autossômico recessivo não ligado st causa em olhos escarlatevivo Um homozigoto em relação a ambos os genes apresenta olhos brancos Portanto temos as correspondências a seguir entre os genótipos e os 15 fenótipos stst bwbw Olho vermelho tipo selvagem stst bwbw Olho marrom stst bwbw Olho escarlate stst bwbw Olho branco Construa uma via de biossíntese hipotética demonstrando como os produtos gênicos interagem e por que as diferentes combinações de mutantes apresentam fenótipos diferentes Diversos mutantes são isolados todos os quais necessitam do composto G para o crescimento Os compostos A a E na via de biossíntese para G são conhecidos mas a sua ordem na via não é conhecida Cada composto é testado em relação à sua capacidade de estimular o crescimento de cada mutante 1 a 5 Na tabela a seguir um sinal de mais indica crescimento e um sinal de menos indica ausência de crescimento Composto testado A B C D E G Mutante 1 2 3 4 5 a Qual é a ordem dos compostos A a E na via b Em que ponto na via cada mutante é bloqueado 16 17 c Um heterocário composto por mutantes duplos 13 e 24 cresceria em um meio mínimo 13 e 34 cresceriam 12 e 24 e 14 cresceriam Em uma determinada planta as pétalas das flores normalmente são roxas Duas mutações recessivas surgem em plantas separadas e observase que estão em cromossomos diferentes A mutação 1 m1 proporciona pétalas azuis quando em homozigose m1m1 A mutação 2 m2 proporciona pétalas vermelhas quando em homozigose m2m2 Bioquímicos que trabalham com a síntese dos pigmentos das flores nessa espécie já descreveram a via a seguir a Qual mutante você espera que seja deficiente na atividade da enzima A b Uma planta apresenta o genótipo M1m1 M2m2 Qual você espera que seja o seu fenótipo c Se a planta na parte b for autofecundada quais cores da progênie você espera e em quais proporções d Por que esses mutantes são recessivos Em ervilhasdecheiro a síntese do pigmento antocianina roxo nas pétalas é controlada por dois genes B e D A via é a Quais cores de pétalas você espera em uma planta pura incapaz de catalisar a primeira reação b Quais cores de pétalas você espera em uma planta pura incapaz de catalisar a segunda reação c Se as plantas nas partes a e b forem cruzadas quais cores de pétalas as plantas da F1 apresentarão 18 19 20 21 22 d Qual proporção de plantas roxasazuisbrancas você esperaria na F2 Se um homem do grupo sanguíneo AB se casar com uma mulher do grupo sanguíneo A cujo pai era do grupo sanguíneo O a quais diferentes grupos sanguíneos esse homem e essa mulher podem esperar que seus filhos pertençam A maior parte das penas da ave erminette é de cor clara com uma preta ocasional proporcionando um aspecto pintado Um cruzamento de duas erminette produziu uma progênie total de 48 composta por 22 erminettes 14 pretas e 12 brancas puras Qual base genética do padrão erminette é sugerida Como você testaria a sua hipótese Os rabanetes podem ser longos redondos ou ovais e podem ser vermelhos brancos ou roxos Você cruza uma variedade longa e branca com uma variedade redonda e vermelha e obtém uma F1 oval e roxa A F2 demonstra nove classes fenotípicas como segue 9 longos e vermelhos 15 longos e roxos 19 ovais e vermelhos 32 ovais e roxos 8 longos e brancos 16 redondos e roxos 8 redondos e brancos 16 ovais e brancos e 9 redondos e vermelhos a Forneça uma explicação genética desses resultados Assegurese de definir os genótipos e demonstrar a constituição dos genitores da F1 e da F2 b Preveja as proporções genotípicas e fenotípicas na progênie de um cruzamento entre um rabanete longo e roxo e um rabanete oval e roxo Na série de alelos múltiplos que determina a cor da pelagem em coelhos c codifica aguti cch codifica chinchila uma cor de pelagem bege e ch codifica himalaio A dominância é na ordem c cch ch Em um cruzamento de ccch cchch qual proporção da progênie será chinchila Preto sépia creme e albino são cores da pelagem de cobaias Animais individuais não necessariamente de linhagens puras que demonstram essas cores foram entrecruzados os resultados estão tabulados como segue em que as abreviações A albino B preto C creme e S sépia representam os fenótipos 23 Cruzamento Fenótipos parentais Fenótipos da progênie B S C A 1 B B 22 0 0 7 2 B A 10 9 0 0 3 C C 0 0 34 11 4 S C 0 24 11 12 5 B A 13 0 12 0 6 B C 19 20 0 0 7 B S 18 20 0 0 8 B S 14 8 6 0 9 S S 0 26 9 0 10 C A 0 0 15 17 a Deduza a herança dessas cores de pelagem e utilize símbolos gênicos de sua própria escolha Demonstre todos os genótipos dos genitores e da progênie b Se os animais pretos nos cruzamentos 7 e 8 forem cruzados quais proporções de progênie você pode prever ao utilizar o seu modelo Em uma ala de maternidade quatro recémnascidos são misturados acidentalmente Os tipos AB0 dos quatro bebês sabidamente são 0 A B e AB Os tipos AB0 dos quatro conjuntos de pais são determinados Indique 24 25 qual recémnascido pertence a cada conjunto de pais a AB 0 b A 0 c A AB d 0 0 Considere dois polimorfismos sanguíneos que os seres humanos apresentam adicionalmente ao sistema AB0 Dois alelos LM e LN determinam os grupos sanguíneos M N e MN O alelo dominante R de um gene diferente faz com que uma pessoa apresente o fenótipo Rh rhesus positivo enquanto o homozigoto em relação a r é Rh rhesus negativo Dois homens levaram uma disputa de paternidade aos tribunais cada um reclamando que três crianças são suas Os grupos sanguíneos dos homens das crianças e de sua mãe eram como segue Pessoa Grupo sanguíneo marido 0 M Rh amante da esposa AB MN Rh esposa A N Rh criança 1 0 MN Rh criança 2 A N Rh criança 3 A MN Rh A partir dessas evidências a paternidade das crianças pode ser estabelecida Em uma fazenda de raposas em Wisconsin surgiu uma mutação que proporcionou uma cor de pelagem platina A cor platina comprovou ser muito popular entre compradores de casacos de raposa mas os criadores não conseguiram desenvolver uma linhagem platina pura Cada vez que 26 duas platinas eram cruzadas apareciam algumas raposas normais na progênie Por exemplo os cruzamentos repetidos do mesmo par de platinas produziram progênie de 82 platinas e 38 normais Todos os outros referidos cruzamentos forneceram proporções de progênie semelhantes Declare uma hipótese genética concisa que explique esses resultados Durante diversos anos Hans Nachtsheim investigou uma anomalia hereditária de leucócitos de coelhos Essa anomalia denominada anomalia de Pelger é a parada da segmentação dos núcleos de determinados leucócitos Essa anomalia não aparenta afetar seriamente os coelhos a Quando coelhos que demonstram a anomalia de Pelger foram cruzados com coelhos de um estoque puro normal Nachtsheim contou 217 descendentes demonstrando a anomalia de Pelger e 237 descendentes normais Qual é a base genética da anomalia de Pelger b Quando coelhos com a anomalia de Pelger foram cruzados entre si Nachtsheim observou na progênie 223 normais 439 com a anomalia de Pelger e 39 extremamente anormais Essa progênie muito anormal não apenas apresentava leucócitos defeituosos mas também demonstrava deformidades graves do sistema esquelético quase toda ela morreu logo após o nascimento Em termos genéticos o que você supõe que esses coelhos extremamente defeituosos tenham representado Por que existem apenas 39 deles c Qual evidência experimental adicional você poderia coletar para testar a sua hipótese na parte b d Em Berlim aproximadamente 1 ser humano em 1000 demonstra uma anomalia de Pelger de leucócitos muito semelhante àquela descrita em relação aos coelhos A anomalia é herdada como um dominante simples mas o tipo homozigoto não foi observado em humanos Com base na condição em coelhos por que você supõe que o homozigoto humano não foi observado e Novamente por meio da analogia com os coelhos quais fenótipos e genótipos você esperaria entre os filhos de um homem e uma mulher que 27 28 29 demonstram ambos a anomalia de Pelger Dados de A M Srb R D Owen and R S Edgar General Genetics 2nd ed W H Freeman and Company 1965 Duas moscasdasfrutas de aspecto normal foram cruzadas e na progênie havia 202 fêmeas e 98 machos a O que é incomum a respeito desse resultado b Forneça uma explicação genética para essa anomalia c Forneça um teste para sua hipótese Você recebeu uma fêmea de Drosophila virgem Você observa que as cerdas em seu tórax são muito mais curtas do que o normal Você a cruza com um macho normal com cerdas longas e obtém a progênie de F1 a seguir de fêmeas com cerdas curtas de fêmeas com cerdas longas e de machos com cerdas longas Um cruzamento das fêmeas com cerdas longas da F1 com seus irmãos fornece apenas uma F2 com cerdas longas Um cruzamento de fêmeas com cerdas curtas com seus irmãos fornece de fêmeas com cerdas curtas de fêmeas com cerdas longas e de machos com cerdas longas Forneça uma hipótese genética para explicar todos esses resultados demonstrando os genótipos em cada cruzamento Um alelo dominante H reduz a quantidade de cerdas corporais que as moscas Drosophila apresentam dando origem a um fenótipo calvo Na condição homozigota H é letal Um alelo dominante de distribuição independente S não apresenta efeitos sobre a quantidade de cerdas exceto na presença de H caso em que uma dose única de S suprime o fenótipo calvo restaurando assim o fenótipo com cerdas Entretanto S também é letal na condição homozigota SS a Qual proporção de moscas com e sem cerdas você encontraria na progênie viva de um cruzamento entre duas moscas com cerdas carreadoras de H na condição suprimida b Quando a progênie sem cerdas é retrocruzada com uma mosca parental com cerdas qual proporção fenotípica você esperaria observar na sua progênie viva 30 31 1 2 32 Após irradiar células do tipo selvagem de Neurospora um fungo haploide um geneticista observa dois mutantes auxotróficos que necessitam de leucina Ele combina os dois mutantes em um heterocário e descobre que o heterocário é prototrófico a As mutações nos dois auxotróficos estão no mesmo gene na via para a síntese de leucina ou em dois genes diferentes naquela via Explique b Escreva o genótipo das duas linhagens de acordo com o seu modelo c Qual progênie e em quais proporções você preveria a partir do cruzamento dos dois mutantes auxotróficos Presuma a distribuição independente Um geneticista de leveduras irradia células haploides de uma linhagem que é um mutante auxotrófico que necessita de adenina causada pela mutação do gene ade1 Milhões de células irradiadas são plaqueadas em meio mínimo e um pequeno número de células se divide e produz colônias prototróficas Essas colônias são cruzadas individualmente com uma linhagem do tipo selvagem Dois tipos de resultados são obtidos Prototrófica Tipo selvagem todas a progênie prototrófica Prototrófica Tipo selvagem progênie 75 prototrófica 25 auxotrófica que necessita de adenina a Explique a diferença entre esses dois tipos de resultados b Escreva os genótipos dos prototróficos em cada caso c Quais fenótipos e proporções da progênie você prevê a partir do cruzamento de um prototrófico do tipo 2 com o auxotrófico ade1 original Em rosas a síntese do pigmento vermelho ocorre por meio de duas etapas em uma via como segue a Qual seria o fenótipo de uma planta homozigota em relação a uma mutação nula do gene P 33 34 b Qual seria o fenótipo de uma planta homozigota em relação a uma mutação nula do gene Q c Qual seria o fenótipo de uma planta homozigota em relação a mutações nulas dos genes P e Q d Escreva os genótipos das três linhagens nas partes a b e c e Qual proporção da F2 é esperada a partir do cruzamento de plantas das partes a e b Presuma a distribuição independente Tendo em vista que bocasdeleão Antirrhinum possuem o pigmento antocianina elas apresentam pétalas roxas avermelhadas Foram desenvolvidas duas linhagens sem antocianina puras de Antirrhinum uma na Califórnia e uma na Holanda Elas aparentavam ser idênticas sem apresentar pigmento vermelho em absoluto manifestadas como flores brancas albinas Entretanto quando pétalas das duas linhagens foram trituradas juntas em tampão no mesmo tubo de ensaio a solução que primeiramente aparentava ser incolor gradualmente se tornou vermelha a Quais experimentos de controle um investigador deve conduzir antes de proceder com a análise adicional b O que poderia explicar a produção da cor vermelha no tubo de ensaio c De acordo com a sua explicação em relação à parte b quais seriam os genótipos das duas linhagens d Se as duas linhagens brancas fossem cruzadas quais você esperaria que fossem os fenótipos da F1 e da F2 A ave frizzle é muito admirada por apreciadores de galinhas Ela obtém sua denominação em virtude do modo incomum como as suas penas se encurvam dando a impressão de que foram nas palavras memoráveis do geneticista animal F B Hutt puxadas para trás através de um nó da madeira Infelizmente frizzle não é pura quando duas frizzle são entrecruzadas elas sempre produzem 50 de aves frizzle 25 de normais e 25 com penas lanosas peculiares que logo em seguida caem deixando as aves sem plumagem a Forneça uma explicação genética para esses resultados demonstrando os 35 1 2 genótipos de todos os fenótipos e forneça uma declaração de como a sua explicação funciona b Se você quisesse produzir aves frizzle em massa para a venda quais tipos seriam os melhores para serem utilizados como um par de cruzamento As pétalas da planta Collinsia parviflora normalmente são azuis Duas linhagens puras foram obtidas a partir de variantes coloridas encontradas na natureza a primeira linhagem apresentava pétalas rosa e a segunda linhagem apresentava pétalas brancas Foram realizados os cruzamentos a seguir entre as linhagens puras com os resultados demonstrados Genitores F1 F2 Azul Branca azul 101 azuis 33 brancas Azul Rosa azul 192 azuis 63 rosa Rosa Branca azul 272 azuis 121 brancas 89 rosa a Explique esses resultados geneticamente Defina os símbolos alélicos que você utilizar e demonstre a constituição genética dos genitores da F1 e da F2 em cada cruzamento b Um cruzamento entre uma determinada planta da F2 azul e uma determinada planta da F2 branca forneceu progênie da qual eram azuis eram rosa e eram brancas Quais devem ter sido os genótipos dessas duas plantas da F2 Como solucionar problema 35 Qual é a característica que está sendo estudada Qual é o fenótipo do tipo selvagem 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 O que é uma variante Quais são as variantes neste problema O que significa na natureza De qual modo as variantes teriam sido encontradas na natureza Descreva a cena Em quais estágios nos experimentos seriam utilizadas sementes O modo de escrever um cruzamento azul branca por exemplo significaria o mesmo que branca azul Você esperaria resultados semelhantes Por que sim ou por que não De que modo as duas primeiras fileiras na tabela diferem da terceira fileira Quais fenótipos são dominantes O que é complementação De onde advém a característica azul na progênie do cruzamento rosa branca Qual fenômeno genético a produção de uma F1 azul de genitores rosa e branco representa Liste quaisquer proporções que você consiga visualizar Existem quaisquer proporções monohíbridas Existem quaisquer proporções dihíbridas O que a observação das proporções monohíbridas e dihíbridas informa a você Liste quatro proporções mendelianas modificadas a respeito das quais você consiga pensar Existem quaisquer proporções mendelianas modificadas no problema O que as proporções mendelianas modificadas em geral indicam O que é indicado pela proporção ou pelas proporções modificadas específicas neste problema 22 23 36 37 Desenhe os cromossomos representando as meioses nos genitores no cruzamento azul branca e representando a meiose na F1 Repita a etapa 22 em relação ao cruzamento azul rosa Uma mulher que possuía um poodle albino puro um fenótipo autossômico recessivo desejava filhotes brancos assim ela levou o cão até um criador que lhe disse que cruzaria a fêmea com um macho reprodutor albino também de um estoque puro Quando nasceram seis filhotes todos eles eram pretos assim a mulher processou o criador reclamando que ele substituiu o macho reprodutor por um cão preto dando a ela seis filhotes indesejados Você é chamado como uma testemunha especialista e a defesa indaga a você se é possível produzir descendência preta a partir de dois genitores albinos recessivos puros Que testemunho você fornece Uma planta bocadeleão pura para pétalas brancas foi cruzada com uma planta que produziu o mesmo fenótipo em relação a pétalas roxas e toda a F1 apresentou pétalas brancas A F1 foi autofecundada Entre a F2 foram observados três fenótipos nas quantidades a seguir branca 240 roxa sólida 61 roxa manchada 19 Total 320 a Proponha uma explicação para esses resultados demonstrando os genótipos de todas as gerações crie e explique os seus símbolos b Uma planta da F2 branca foi cruzada com uma planta da F2 roxa sólida e a progênie foi Branca 50 Roxa sólida 25 Roxa manchada 25 Quais eram os genótipos das plantas da F2 cruzadas 38 39 40 A maior parte dos besouros Tribolium castaneum é preta mas são conhecidas diversas variantes coloridas Cruzamentos de genitores puros produziram os resultados a seguir ver tabela na geração F1 e o intercruzamento da F1 a partir de cada cruzamento forneceu as proporções demonstradas em relação à geração F2 Os fenótipos são abreviados Bl Preto Br Marrom Y Amarelo e W Branco Cruzamento Genitores F1 F2 1 Br Y Br 3 Br1 Y 2 Bl Br Bl 3 Bl1 Br 3 Bl Y Bl 3 Bl1 Y 4 W Y Bl 9 Bl3 Y4 W 5 W Br Bl 9 Bl3 Br4 W 6 Bl W Bl 9 Bl3 Y4 W a A partir desses resultados deduza e explique a herança dessas cores b Escreva os genótipos de cada um dos genitores da F1 e da F2 em todos os cruzamentos Dois albinos se casam e têm quatro filhos normais Como isso é possível Considere a produção da cor das flores na glóriadamanhã japonesa Pharbitis nil Os alelos dominantes de qualquer um de dois genes separados A bb ou aa B produzem pétalas roxas A B produz pétalas azuis e aa bb produz pétalas escarlate Deduza os genótipos dos genitores e da progênie nos cruzamentos a seguir 41 Cultivadores de milho obtiveram linhagens puras cujas espigas se tornam vermelhosol rosa escarlate ou laranja quando expostas à luz solar as espigas normais permanecem amarelas na luz solar Alguns cruzamentos entre essas linhagens produziram os resultados a seguir Os fenótipos são abreviados O Laranja P Rosa Sc Escarlate e SR Vermelhosol Cruzamento Fenótipos Genitores F1 F2 1 SR P todos SR 66 SR20 P 2 O SR todos SR 998 SR314 O 3 O P todos O 1300 O429 P 4 O Sc todos Y 182 Y80 O 58 Sc Analise os resultados de cada cruzamento e forneça uma hipótese unificadora para explicar todos os resultados Explique todos os símbolos que você utilizar 42 Muitos tipos de animais selvagens apresentam o padrão de cor aguti no qual cada pelo apresenta uma faixa amarela ao seu redor a Camundongos pretos e outros animais pretos não apresentam a faixa amarela cada um de seus pelos é todo preto Essa ausência do padrão aguti selvagem é denominada não aguti Quando camundongos de uma linhagem aguti pura são cruzados com não agutis a F1 é toda aguti e a F2 apresenta uma proporção de 31 de agutis e não agutis Diagrame esse cruzamento fazendo A representar o alelo responsável pelo fenótipo aguti e a não aguti Demonstre os fenótipos e os genótipos dos genitores de seus gametas da F1 de seus gametas e da F2 b Outro desvio da cor herdado em camundongos substitui a cor marrom pela preta no pelo do tipo selvagem Os referidos camundongos aguti marrons são denominados canela Quando camundongos do tipo selvagem são cruzados com canelas toda a F1 é do tipo selvagem e a F2 apresenta uma proporção de 31 do tipo selvagem e canela Diagrame esse cruzamento como na parte a tendo B como referência ao alelo preto do tipo selvagem e b como referência ao alelo marrom canela c Quando camundongos de uma linhagem canela pura são cruzados com camundongos de uma linhagem pura não aguti preta toda a F1 é do tipo selvagem Utilize um diagrama genético para explicar esse resultado d Na F2 do cruzamento na parte c uma quarta cor denominada chocolate aparece além da canela e não aguti parental e do tipo selvagem da F1 Camundongos chocolate apresentam uma cor marrom sólida e rica Qual é a constituição genética deles e Presumindo que os pares alélicos Aa e Bb distribuamse independentemente entre si quais você espera serem as frequências relativas dos quatro tipos de cores na F2 descrita na parte d Diagrame o cruzamento das partes c e d demonstrando os fenótipos e os genótipos incluindo os gametas f Quais fenótipos seriam observados e em quais proporções na progênie de um retrocruzamento de camundongos da F1 da parte c com o estoque parental canela Com o estoque parental não aguti preto Diagrame esses 43 retrocruzamentos g Diagrame um cruzamentoteste em relação à F1 da parte c Quais cores resultariam e em quais proporções h Camundongos albinos brancos com olhos rosa são homozigotos em relação ao membro recessivo de um par alélico Cc que se distribui independentemente dos pares Aa e Bb Suponha que você possui quatro diferentes linhagens albinas altamente endocruzadas e portanto presumivelmente homozigotas Você cruza cada uma dessas linhagens com uma linhagem do tipo selvagem pura e obtém uma grande progênie F2 a partir de cada cruzamento Quais genótipos em relação às linhagens albinas você consegue deduzir a partir dos fenótipos da F2 a seguir F2 da linhagem Fenótipos da progênie Tipo selvagem Preto Canela Chocolate Albino 1 87 0 32 0 39 2 62 0 0 0 18 3 96 30 0 0 41 4 287 86 92 29 164 Adaptada de A M Srb R D Owen and R S Edgar General Genetics 2nd ed W H Freeman and Company 1965 Um alelo A que não é letal quando homozigoto faz com que os ratos apresentem pelagem amarela O alelo R de um gene em separado que se distribui independentemente produz pelagem preta Em conjunto A e R produzem pelagem acinzentada enquanto a e r produzem pelagem branca Um macho cinza é cruzado com uma fêmea amarela e a F1 é amarela 44 45 cinza preta e branca Determine os genótipos dos genitores O genótipo rr pp proporciona às aves uma crista única R P proporciona uma crista em noz rr P proporciona uma crista em ervilha e R pp proporciona uma crista rosa ver ilustrações Presuma a distribuição independente a Quais tipos de crista aparecerão na F1 e na F2 e em quais proporções se aves com crista única forem cruzados com aves de uma linhagem pura em noz b Quais são os genótipos dos genitores em um cruzamento noz rosa a partir do qual a progênie é rosa noz ervilha e única c Quais são os genótipos dos genitores em um cruzamento noz rosa a partir do qual toda a progênie é noz d Quantos genótipos produzem um fenótipo noz Escrevaos A produção do pigmento da cor dos olhos em Drosophila requer o alelo dominante A O alelo dominante P de um segundo gene independente torna o pigmento roxo mas seu alelo recessivo tornao vermelho Uma mosca que não produz pigmento apresenta olhos brancos Duas linhagens puras foram cruzadas com os resultados a seguir 46 47 48 Explique esse modo de herança e demonstre os genótipos dos genitores da F1 e da F2 Quando cães marrons puros são cruzados com determinados cães brancos puros todos os filhotes da F1 são brancos A progênie F2 de alguns cruzamentos F1 F1 é de 118 filhotes brancos 32 pretos e 10 marrons Qual é a base genética desses resultados Linhagens do tipo selvagem do fungo haploide Neurospora produzem seu próprio triptofano Um alelo anormal td torna o fungo incapaz de produzir seu próprio triptofano Um indivíduo de genótipo td cresce apenas quando seu meio fornece triptofano O alelo su se distribui independentemente de td seu único efeito conhecido é suprimir o fenótipo td Portanto linhagens que carreiam ambos td e su não necessitam de triptofano para o crescimento a Se uma linhagem td su for cruzada com uma linhagem genotipicamente do tipo selvagem quais genótipos serão esperados na progênie e em quais proporções b Qual será a proporção da progênie dependente do triptofano e independente do triptofano no cruzamento da parte a Camundongos dos genótipos AA BB CC DD SS e aa bb cc dd ss são cruzados A progênie é entrecruzada Quais fenótipos serão produzidos na F2 e em quais proporções Os símbolos de alelos fazem 49 50 referência ao que segue A Aguti a Sólido não aguti B Pigmento preto b Marrom C Pigmentado c Albino D Nenhuma diluição d Diluição cor leitosa S Não manchado s Manchas pigmentadas em fundo branco Considere os genótipos de duas linhagens de galinhas a linhagem pura manchada hondurenha é ii DD MM WW e a linhagem pura leghorne é II dd mm ww onde I Penas brancas i Penas coloridas D Crista dupla d Crista simples M Com barbela m Sem barbela W Pele branca w Pele amarela Esses quatro genes se distribuem independentemente Iniciando com essas duas linhagens puras qual é o modo mais rápido e mais conveniente de gerar uma linhagem pura que apresente penas coloridas apresente uma crista simples seja sem barbela e apresente pele amarela Assegurese de demonstrar a O heredograma do cruzamento b O genótipo de cada animal representado c Quantos ovos colocar para chocar em cada cruzamento e o motivo dessa quantidade d Por que o seu esquema é o mais rápido e o mais conveniente O heredograma a seguir é em relação a um fenótipo dominante regulado por um alelo autossômico O que esse heredograma sugere a respeito do fenótipo e o que você pode deduzir a respeito do genótipo do indivíduo A 51 52 A cor das pétalas em dedaleiras é determinada por três genes M codifica uma enzima que sintetiza a antocianina o pigmento roxo observado nessas pétalas mm não produz pigmento resultando no fenótipo albino com manchas amareladas D é um intensificador da antocianina resultando em um pigmento mais escuro ddia não intensifica No terceiro locus ww possibilita a deposição do pigmento nas pétalas mas W evita a deposição do pigmento exceto nas manchas e assim resulta no fenótipo branco e manchado Considere os dois cruzamentos a seguir Cruzamento Genitores Progênie 1 Roxoescuro Branco com manchas amareladas roxoescuro roxo claro 2 Branco com manchas amareladas Roxo claro branco com manchas roxas roxoescuro roxoclaro Em cada caso forneça os genótipos dos genitores e da progênie em relação aos três genes Em uma espécie de Drosophila as asas normalmente são de formato redondo mas você obteve duas linhagens puras uma das quais apresenta asas ovais e a outra asas falciformes Cruzamentos entre linhagens puras revelam os resultados a seguir Genitores F1 Fêmea Macho Fêmea Macho falciforme redonda falciforme falciforme 53 54 redonda falciforme falciforme redonda falciforme oval oval falciforme a Forneça uma explicação genética desses resultados definindo todos os símbolos alélicos b Se as fêmeas F1 ovais do cruzamento 3 forem cruzadas com os machos redondos da F1 do cruzamento 2 quais proporções fenotípicas são esperadas em relação a cada sexo na progênie Camundongos normalmente apresentam uma faixa amarela em cada pelo mas são conhecidas variantes com duas ou três faixas Uma fêmea de camundongo que apresenta uma faixa foi cruzada com um macho que apresenta três faixas Nenhum animal era de uma linhagem pura A progênie foi Fêmeas uma faixa Machos uma faixa três faixas duas faixas a Forneça uma explicação clara da herança desses fenótipos b De acordo com o seu modelo qual seria o desfecho de um cruzamento entre uma filha com três faixas e um filho com uma faixa Em visons os tipos selvagens apresentam uma pelagem quase preta Criadores desenvolveram muitas linhagens puras de variantes da cor para a indústria de casacos de visom Duas das referidas linhagens puras são platina cinzaazulada e aleutiana cinzaaço Essas linhagens foram utilizadas em cruzamentos com os resultados a seguir Cruzamento Genitores F1 F2 1 Selvagem selvagem 18 selvagens 5 55 56 Platina platinas 2 Selvagem Aleutiana selvagem 27 selvagens 10 aleutianas 3 Platina Aleutiana selvagem 133 selvagens 41 platinas 46 aleutianas 17 safiras novas a Planeje uma explicação genética desses três cruzamentos Demonstre os genótipos em relação aos genitores à F1 e à F2 nos três cruzamentos e assegurese de demonstrar os alelos de cada gene da hipótese que você formula em relação a cada visom b Preveja as proporções fenotípicas da F1 e da F2 a partir do cruzamento de safira com as linhagens puras platina e aleutiana Na Drosophila um gene autossômico determina o formato das cerdas com B proporcionado cerdas retas e b proporcionando cerdas inclinadas Em outro autossomo existe um gene do qual um alelo dominante I inibe a formação das cerdas de modo que a mosca é sem cerdas i não apresenta efeito fenotípico conhecido a Se uma mosca com cerdas retas de uma linhagem pura for cruzada com uma mosca de uma linhagem sem cerdas pura que sabidamente é um genótipo inclinado inibido quais serão os genótipos e os fenótipos da F1 e da F2 b Qual cruzamento forneceria a proporção de 4 sem cerdas3 retas1 inclinada O heredograma a seguir diz respeito aos fenótipos dos olhos em besouros 57 58 59 60 Tribolium Os símbolos sólidos representam olhos pretos os símbolos abertos representam olhos marrons e os símbolos cruzados X representam o fenótipo sem olhos no qual os olhos estão totalmente ausentes a A partir desses dados deduza o modo de herança desses três fenótipos b Com a utilização de símbolos gênicos definidos demonstre o genótipo do besouro II3 Uma planta que se acredita ser heterozigota em relação a um par de alelos Bb no qual B codifica amarelo e b codifica bronze foi autofecundada e na progênie havia 280 plantas amarelas e 120 bronze Esses resultados amparam a hipótese de que a planta é Bb Uma planta que se acredita ser heterozigota em relação a dois genes de distribuição independente Pp Qq foi autofecundada e a progênie foi 88 P Q 25 pp Q 32 P qq 14 pp qq Esses resultados amparam a hipótese de que a planta original era Pp Qq Uma planta de fenótipo 1 foi autofecundada e na progênie havia 100 plantas de fenótipo 1 e 60 plantas de um fenótipo alternativo 2 Esses números são compatíveis com as proporções esperadas de 97 133 e 31 Forme uma hipótese genética com base nos seus cálculos Quatro linhagens mutantes homozigotas recessivas de Drosophila melanogaster rotuladas 1 a 4 demonstram coordenação anormal das 61 patas o que faz com que elas andem de modo altamente errático Essas linhagens foram entrecruzadas os fenótipos das moscas da F1 estão demonstrados na tabela a seguir na qual representa a deambulação do tipo selvagem e representa a deambulação anormal 1 2 3 4 1 2 3 4 a Qual tipo de teste essa análise representa b Quantos genes diferentes sofreram mutação na criação dessas quatro linhagens c Invente símbolos para os tipos selvagem e mutante e escreva os genótipos completos em relação a todas as quatro linhagens e em relação às moscas da F1 d Esses dados nos informam quais genes estão ligados Caso negativo como a ligação pode ser testada e Esses dados nos informam o número total de genes que participam na coordenação das patas nesse animal Três mutantes de uma levedura haploide que necessitam de triptofano isolados de modo independente são denominadas trpB trpD e trpE Suspensões celulares de cada um são espalhadas em uma placa de meio nutricional suplementado com triptofano suficiente apenas para possibilitar o crescimento fraco de uma linhagem trp As faixas estão dispostas em um padrão triangular de modo que elas não se toquem É observado crescimento exuberante em ambas as extremidades da faixa trpE e em uma 62 extremidade da faixa trpD ver figura adiante a Você acredita que tenha havido complementação b Explique brevemente o padrão do crescimento exuberante c Desenhe as etapas enzimáticas que são defeituosas nos mutantes trpB trpD e trpE na ordem na via de síntese do triptofano d Por que foi necessário adicionar uma pequena quantidade de triptofano ao meio para demonstrar esse padrão de crescimento PROBLEMAS DESAFIADORES Uma linhagem pura de abóbora que produz frutos com formato de disco ver a ilustração a seguir foi cruzada com uma linhagem pura que apresenta frutos longos A F1 apresentou frutos em disco mas a F2 demonstrou um novo fenótipo esférico e foi composta pelas proporções a seguir 63 Proponha uma explicação para esses resultados e demonstre os genótipos das gerações P F1 e F2 A síndrome de Marfan é um distúrbio do tecido conjuntivo fibroso caracterizada por muitos sintomas incluindo dedos longos e finos defeitos oculares cardiopatia e membros longos Flo Hyman a estrela do voleibol americano sofria de síndrome de Marfan Ela morreu em virtude de uma ruptura da aorta a Utilize o heredograma anterior para propor um modo de herança em relação à síndrome de Marfan b Qual fenômeno genético é demonstrado por esse heredograma c Especule um motivo para esse fenômeno Dados de J V Neel e W J Schull Human Heredity University of 64 65 66 Chicago Press 1954 No milho três alelos dominantes denominados A C e R são necessários para produzir sementes coloridas O genótipo A C R é colorido todos os outros são incolores Uma planta colorida é cruzada com três plantas testadoras de genótipo conhecido Com a testadora aa cc RR a planta colorida produz 50 de sementes coloridas com aa CC rr ela produz 25 de coloridas e com AA cc rr ela produz 50 de coloridas Qual é o genótipo da planta colorida A produção do pigmento na camada exterior das sementes do milho requer que cada um dos três genes de distribuição independente A C e R seja representado por no mínimo um alelo dominante conforme especificado no Problema 64 O alelo dominante Pr de um quarto gene de distribuição independente é necessário para converter o precursor bioquímico em um pigmento roxo e seu alelo recessivo pr torna o pigmento vermelho As plantas que não produzem pigmento apresentam sementes amarelas Considere um cruzamento de uma linhagem de genótipo AA CC RR prpr com uma linhagem de genótipo aa cc rr PrPr a Quais são os fenótipos dos genitores b Qual será o fenótipo da F1 c Quais fenótipos e em quais proporções aparecerão na progênie de uma F1 autofecundada d Quais proporções da progênie você prevê a partir do cruzamentoteste de uma F1 O alelo B proporciona aos camundongos uma pelagem preta e b proporciona uma pelagem marrom O genótipo ee de outro gene de distribuição independente evita a expressão de B e b tornando a cor da pelagem bege enquanto E possibilita a expressão de B e b Ambos os genes são autossômicos No heredograma a seguir os símbolos pretos indicam pelagem preta os símbolos rosa indicam marrom e os símbolos brancos indicam bege 67 68 a Qual é a denominação dada ao tipo de interação gênica nesse exemplo b Quais são os genótipos dos camundongos no heredograma Se existem possibilidades alternativas declareas Um pesquisador cruza duas linhagens com flores brancas de plantas Antirrhinum e obtém os resultados a seguir a Deduza a herança desses fenótipos utilize símbolos gênicos claramente definidos Forneça os genótipos dos genitores da F1 e da F2 b Preveja o resultado dos cruzamentos da F1 com cada linhagem parental Presuma que dois pigmentos vermelho e azul são misturados para fornecer a cor roxa normal das pétalas de petúnia Vias bioquímicas separadas sintetizam os dois pigmentos conforme demonstrado nas duas fileiras superiores do diagrama a seguir Branco se refere aos compostos que não são pigmentos A ausência total de pigmento resulta em uma pétala branca O pigmento vermelho é formado a partir de um intermediário 69 amarelo que normalmente está a uma concentração muito baixa para colorir as pétalas Uma terceira via cujos compostos não contribuem com pigmento para as pétalas normalmente não afeta as vias azul e vermelha mas se um de seus intermediários branco3 aumentar em concentração pode ser convertido no intermediário amarelo da via vermelha No diagrama as letras A a E representam enzimas seus genes correspondentes todos os quais não estão ligados podem ser simbolizados pelas mesmas letras Presuma que os alelos do tipo selvagem sejam dominantes e codifiquem a função enzimática e que os alelos recessivos resultem em uma ausência de função enzimática Deduza quais combinações de genótipos parentais verdadeiros podem ser cruzadas para produzir a progênie F2 nas proporções a seguir a 9 roxas3 verdes4 azuis b 9 roxas3 vermelhas3 azuis1 branca c 13 roxas3 azuis d 9 roxas3 vermelhas3 verdes1 amarela Nota azul misturado com amarelo produz verde presuma que nenhuma mutação seja letal As flores de capuchinha Tropaeolum majus podem ser únicas S duplas D ou superduplas Sd As superduplas são estéreis do sexo feminino elas tiveram origem a partir de uma variedade com flores duplas Cruzamentos entre variedades forneceram a progênie listada na tabela a 70 seguir na qual pura significa homozigoto Cruzamento Genitores Progênie 1 S pura D pura Todas S 2 F1 do cruzamento 1 F1 do cruzamento 1 78 S 27 D 3 D pura Sd 112 Sd 108 D 4 S pura Sd 8 Sd 7 S 5 D pura progênie Sd do cruzamento 4 18 Sd 19 S 6 D pura progênie S do cruzamento 4 14 D 16 S Com a utilização dos seus próprios símbolos genéticos proponha uma explicação para esses resultados demonstrando a Todos os genótipos em cada uma das seis fileiras b A origem proposta da superdupla Em uma determinada espécie de moscas a cor dos olhos normal é vermelha R Quatro fenótipos anormais em relação à cor dos olhos foram observados dois eram amarelos Y1 e Y2 um era marrom B e um laranja O Foi estabelecida uma linhagem pura em relação a cada fenótipo e todas as combinações possíveis das linhagens puras foram cruzadas Moscas de cada F1 foram entrecruzadas para produzir uma F2 As moscas da F1 e da F2 estão demonstradas no quadrado a seguir as linhagens puras são fornecidas na parte superior e do lado esquerdo Y1 Y2 B O F1 todas Y todas R todas R todas R Y1 F2 todas Y 9 R 9 R 9 R 7 Y 4 Y 4 O 3 B 3 Y F1 todas Y todas R todas R Y2 F2 todas Y 9 R 9 R 4 Y 4 Y 3 B 3 O F1 todas B todas R B F2 todas B 9 R 4 O 3 B F1 todas O O F2 todas O a Defina seus próprios símbolos e liste os genótipos de todas as quatro linhagens puras b Demonstre como os fenótipos da F1 e as proporções da F2 são 71 72 produzidos c Demonstre uma via bioquímica que explique os resultados genéticos indicando qual gene controla qual enzima No trigo comum Triticum aestivum a cor da espiga é determinada por genes multiplamente duplicados cada um com um alelo R e um r Qualquer número de alelos R proporcionará vermelho e uma ausência completa de alelos R proporcionará o fenótipo branco Em um cruzamento entre uma linhagem pura vermelha e uma linhagem pura branca a F2 foi de vermelhos e branco a Quantos genes R estão segregando nesse sistema b Demonstre os genótipos dos genitores da F1 e da F2 c Plantas F2 diferentes são retrocruzadas com o progenitor branco Forneça exemplos de genótipos que forneceriam as proporções de progênie a seguir nos referidos retrocruzamentos 1 1 vermelha1 branca 2 3 vermelhas1 branca 3 7 vermelhas1 branca d Qual é a fórmula que em geral relaciona o número de genes em segregação com a proporção de indivíduos vermelhos na F2 nos referidos sistemas O heredograma a seguir demonstra a herança do surdomutismo a Forneça uma explicação para a herança dessa condição rara nas duas famílias nas gerações I e II demonstrando os genótipos de tantas pessoas quanto possível utilize símbolos de sua própria escolha b Forneça uma explicação para a produção de apenas pessoas normais na 73 74 geração III assegurandose de que a sua explicação seja compatível com a resposta da parte a O heredograma a seguir é em relação à esclera azul e osteogênese imperfeita a Essas duas anormalidades são causadas pelo mesmo gene ou por genes separados Declare claramente os seus motivos b O gene ou os genes é são autossômicos ou ligados ao sexo c O heredograma demonstra alguma evidência de penetrância incompleta ou expressividade Caso afirmativo realize os melhores cálculos que você conseguir dessas medidas As operárias da linhagem de abelhas melíferas conhecida como Marrom absolutamente não relacionada com a cor demonstram o que é denominado comportamento higiênico ou seja elas abrem as tampas de compartimentos da colmeia que contêm pupas mortas e em seguida removem as pupas mortas Esse comportamento evita a difusão de bactérias infecciosas pela colônia As operárias da linhagem Van Scoy entretanto não realizam essas tarefas e portanto dizse que essa linhagem é não higiênica Quando uma rainha da linhagem Marrom foi cruzada com zangões Van Scoy toda a F1 foi não higiênica Quando zangões dessa F1 inseminaram uma rainha da linhagem Marrom os comportamentos da progênie foram como segue 75 higiênico de abertura das tampas mas sem a remoção das pupas não higiênico Entretanto quando a tampa do compartimento de pupas mortas foi aberta pelo apicultor e as abelhas melíferas não higiênicas foram adicionalmente examinadas observouse que aproximadamente metade das abelhas removia as pupas mortas mas a outra metade não removia a Proponha uma hipótese genética para explicar esses padrões comportamentais b Discuta os dados em relação a epistasia dominância e interação ambiental Nota as operárias são estéreis e todas as abelhas de uma linhagem carreiam os mesmos alelos A cor normal das bocasdeleão é vermelha Foram encontradas algumas linhagens puras que demonstram variações da cor das flores Quando essas linhagens puras foram cruzadas elas forneceram os resultados a seguir ver tabela Cruzamento Genitores F1 F2 1 Laranja Amarela laranja 3 laranja 1 amarela 2 Vermelha Laranja vermelha 3 vermelhas 1 laranja 3 Vermelha Amarela vermelha 3 vermelhas 1 amarela 4 Vermelha Branca vermelha 3 vermelhas 1 branca 76 77 5 Amarela Branca vermelha 9 vermelhas 3 amarelas 4 brancas 6 Laranja Branca vermelha 9 vermelhas 3 laranja 4 brancas 7 Vermelha Branca vermelha 9 vermelhas 3 laranja 4 brancas a Explique a herança dessas cores b Escreva os genótipos dos genitores da F1 e da F2 Considere os indivíduos da F1 a seguir em diferentes espécies e as proporções da F2 produzida por autofecundação Se cada F1 fosse submetida ao cruzamentoteste quais proporções fenotípicas resultariam na progênie do cruzamentoteste Para compreender a base genética da locomoção no nematódeo diploide Caenorhabditis elegans foram obtidas mutações recessivas todas fazendo com que o parasita oscile de modo ineficaz em vez de se movimentar com seu movimento habitual de deslizamento suave Essas mutações presumivelmente afetam o sistema nervoso ou muscular Doze mutantes homozigotos foram entrecruzados e os híbridos da F1 foram examinados para verificar se eles oscilavam Os resultados foram como segue em que um sinal de mais significa que o híbrido da F1 era do tipo selvagem deslizante e w significa que o híbrido oscilava 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 w w 2 w w w w 3 w w 4 w 5 w 6 w w w 7 w w w 8 w w 9 w 10 w 11 w w 12 w a Explique o que esse experimento foi desenhado para testar b Utilize essa justificativa para atribuir os genótipos para todos os 12 78 79 mutantes c Explique por que o fenótipo dos híbridos da F1 entre os mutantes 1 e 2 diferiu daquele dos híbridos entre os mutantes 1 e 5 Um geneticista que trabalha com um fungo haploide realiza um cruzamento entre dois mutantes de crescimento lento denominados musgoso e aranha fazendo referência ao aspecto anormal das colônias As tétrades do cruzamento são de três tipos A B C mas duas delas contêm esporos que não germinam Esporo A B C 1 tipo selvagem tipo selvagem aranha 2 tipo selvagem aranha aranha 3 nenhuma germinação musgoso musgoso 4 nenhuma germinação nenhuma germinação musgoso Planeje um modelo para explicar esses resultados genéticos e proponha uma base molecular para o seu modelo No nematódeo C elegans alguns parasitas apresentam cutículas bolhosas em virtude de uma mutação recessiva em um dos genes bli Pessoas que estudavam uma mutação supressora que suprimia as mutações bli3 desejavam saber se ela também suprime as mutações em bli4 Elas possuíam uma linhagem homozigota em relação a essa mutação supressora recessiva e seu fenótipo era do tipo selvagem a Como elas determinariam se essa mutação supressora recessiva suprime as mutações em bli4 Em outras palavras qual é o genótipo dos parasitas 1 2 necessário para responder à pergunta b Qualis cruzamentos elas realizariam para produzir esses parasitas c Quais resultados elas esperariam na F2 se ela atuasse como uma supressora de bli4 ela não atuasse como uma supressora de bli4 DNA Estrutura e Replicação 71 72 73 74 75 76 77 J Modelo em computador do DNA Kenneth EwardScience SourceGetty Images TÓPICOS DNA O material genético Estrutura do DNA Replicação semiconservativa Visão geral da replicação do DNA Replissomo Uma máquina de replicação notável Replicação em organismos eucariotos Telômeros e telomerase Término da replicação RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Avaliar os tipos de evidências históricas e modernas que podem ser utilizadas para demonstrar que o DNA é o material genético Avaliar os dados utilizados para construir o modelo de duplahélice do DNA Explicar por que a estrutura helicoidal dupla sugere um mecanismo específico de replicação do DNA Ilustrar as características da replicação do DNA que contribuem para a sua velocidade e a sua precisão Explicar por que as extremidades dos cromossomos necessitam de replicação especial Prever as possíveis consequências para a saúde humana se a replicação da extremidade for defeituosa ames Watson um geneticista microbiano americano e Francis Crick um físico inglês solucionaram a estrutura do DNA em 1953 Seu modelo da estrutura do DNA foi revolucionário Eles propuseram uma definição para o gene em termos químicos e ao fazer isso propiciaram a compreensão da ação gênica e da hereditariedade no nível molecular Uma medida da importância da sua descoberta é que a estrutura em duplahélice se tornou um ícone cultural que é observado com cada vez mais frequência em pinturas em esculturas e até mesmo em playgrounds Figura 71 A história tem início na primeira metade do século 20 quando os resultados de diversos experimentos levaram os cientistas a concluírem que o DNA é o material genético não outra molécula biológica tal como um carboidrato uma proteína ou um lipídio O DNA é uma molécula simples composta por apenas quatro diferentes elementos estruturais as quatro bases de nucleotídios Portanto era necessário compreender como essa molécula tão simples podia ser responsável pela incrível diversidade de organismos sobre a Terra O modelo da duplahélice proposto por Watson e Crick foi construído com base nos resultados de cientistas antes deles Eles se basearam nas descobertas anteriores da composição química do DNA e das proporções de suas bases Além disso imagens de difração de raios X do DNA revelaram ao olho treinado que o DNA é uma hélice de dimensões precisas Watson e Crick concluíram que o DNA é uma duplahélice composta por dois filamentos de bases de nucleotídios ligados que se enrolam um ao redor do outro A estrutura do material hereditário proposta imediatamente sugeriu como ela poderia atuar como um molde e como poderia ser transmitida entre as gerações Primeiramente a informação para a formação de um organismo está codificada na sequência de bases nucleotídicas que compõem os dois filamentos da hélice de DNA Em segundo lugar em virtude das regras da complementaridade de bases descobertas por Watson e Crick a sequência de um filamento dita a sequência do outro filamento Assim as informações genéticas na sequência do DNA podem ser transmitidas de uma geração para a próxima quando cada um dos filamentos de DNA em separado atua como molde para a produção de novas cópias da molécula 71 FIGURA 71 Neil GrantAlamy Neste capítulo enfocamos o DNA sua estrutura e a produção de cópias do DNA em um processo denominado replicação Precisamente como o DNA é replicado ainda é uma área ativa de pesquisas mais de 50 anos após a descoberta da duplahélice Nossa atual compreensão sobre o mecanismo da replicação confere um papel central para uma estrutura proteica denominada replissomo Esse complexo de proteínas coordena as diversas reações que são necessárias para a replicação rápida e precisa do DNA DNA O material genético Antes de verificarmos como Watson e Crick solucionaram a estrutura do DNA revisaremos o que era conhecido a respeito dos genes e do DNA na ocasião em 1 2 3 4 5 que eles iniciaram a sua colaboração histórica Os genes os fatores hereditários descritos por Mendel sabidamente estavam associados a traços específicos mas a sua natureza física não era compreendida De modo semelhante as mutações sabidamente alteravam a função dos genes mas a natureza química precisa de uma mutação não era compreendida A hipótese um geneum polipeptídio descrita no Capítulo 6 postulava que os genes determinam a estrutura das proteínas e de outros polipeptídios Sabidamente os genes eram carreados nos cromossomos Observouse que os cromossomos são compostos por DNA e proteínas Os resultados de uma série de experimentos com início na década de 1920 revelaram que o DNA é o material genético Esses experimentos descritos em seguida demonstraram que as células bacterianas que expressam um fenótipo podem ser transformadas em células que expressam um fenótipo diferente e que o agente transformante é o DNA Descoberta da transformação Frederick Griffith fez uma observação enigmática durante os experimentos realizados em 1928 com a bactéria Streptococcus pneumoniae Essa bactéria que causa pneumonia em seres humanos normalmente é letal em camundongos Entretanto algumas linhagens dessa espécie bacteriana evoluíram para serem menos virulentas menos capazes de causar doença ou morte Os experimentos de Griffith estão resumidos na Figura 72 Nesses experimentos Griffith utilizou duas linhagens que são distinguíveis pelo aspecto de suas colônias quando cultivadas em culturas de laboratório Uma linhagem era um tipo virulento normal mortal para a maior parte dos animais de laboratório As células dessa linhagem estão envoltas por uma cápsula de polissacarídios o que proporciona às colônias um aspecto liso portanto essa linhagem é identificada como S A outra linhagem de Griffith era um tipo não virulento mutante que cresce em camundongos mas que não é letal Nessa linhagem revestimento de polissacarídios não existe proporcionando às colônias um aspecto rugoso essa linhagem é denominada R FIGURA 72 A presença de células S mortas pelo calor transforma as células R vivas em células S vivas A O camundongo morre após a injeção da linhagem S virulenta B O camundongo sobrevive após a injeção da linhagem R C O camundongo sobrevive após a injeção da linhagem S morta pelo calor D O camundongo morre após a injeção de uma mistura da linhagem S morta pelo calor e da linhagem R viva Células S vivas foram isoladas do camundongo morto indicando que a linhagem S morta pelo calor de algum modo transforma a linhagem R na linhagem S virulenta Griffith matou algumas células virulentas por meio de fervura Em seguida ele injetou as células mortas pelo calor em camundongos Os camundongos sobreviveram demonstrando que os restos das células não causam a morte Entretanto camundongos injetados com uma mistura de células virulentas mortas pelo calor e células não virulentas vivas morreram Além disso células vivas puderam ser recuperadas dos camundongos mortos essas células formaram colônias lisas e eram virulentas na injeção subsequente De algum modo os restos celulares das células S fervidas haviam convertido as células R vivas em células S vivas O processo já discutido no Capítulo 5 é denominado transformação A etapa seguinte foi determinar qual componente químico das células doadoras mortas havia causado essa transformação Essa substância modificou o genótipo da linhagem receptora e portanto podia ser uma candidata para o material hereditário Esse problema foi solucionado por experimentos conduzidos em 1944 por Oswald Avery e dois colegas Colin MacLeod e Maclyn McCarty Figura 73 Sua abordagem para o problema foi destruir quimicamente todas as principais categorias de substâncias químicas em um extrato de células mortas uma por vez e descobrir se o extrato havia perdido a capacidade de transformação As células virulentas apresentavam um revestimento liso de polissacarídios enquanto as células não virulentas não apresentavam portanto os polissacarídios eram candidatos óbvios a serem o agente transformante Entretanto quando os polissacarídios foram destruídos a mistura ainda podia ser transformada Proteínas lipídios e ácidos ribonucleicos RNA demonstraram todos de modo semelhante não serem o agente transformante A mistura perdeu a sua capacidade de transformação apenas quando a mistura doadora foi tratada com a enzima desoxirribonuclease DNase que fragmenta o DNA Esses resultados implicam fortemente o DNA como o material genético Agora se sabe que os fragmentos do DNA transformante que conferem virulência entram no cromossomo bacteriano e substituem seus correspondentes que conferem não virulência CONCEITOCHAVE A demonstração de que o DNA é o princípio transformante foi a primeira demonstração de que os genes o material hereditário são compostos por DNA FIGURA 73 O DNA é o agente que transforma a linhagem R em virulenta Se o DNA em um extrato de células da linhagem S mortas pelo calor for destruído os camundongos sobrevivem quando injetados com uma mistura das células mortas pelo calor e as células da linhagem R não virulenta vivas Experimento de HersheyChase Os experimentos conduzidos por Avery e seus colegas foram definitivos mas muitos cientistas estavam relutantes em aceitar o DNA em vez das proteínas como o material genético Afinal como uma molécula de tal baixa complexidade como o DNA poderia codificar a diversidade da vida sobre este planeta Alfred Hershey e Martha Chase forneceram evidências adicionais em 1952 em um experimento que fez uso do fago T2 um vírus que infecta bactérias Eles ponderaram que o fago infectante obrigatoriamente injetavam na bactéria as informações específicas que ditam a reprodução de novas partículas virais Se eles pudessem descobrir qual material o fago estava injetando na hospedeira bacteriana eles teriam determinado o material genético dos fagos O fago é relativamente simples em constituição molecular A estrutura do T2 é similar à do T4 demonstrada nas Figuras 522 a 524 A maior parte de sua estrutura é de proteínas com o DNA contido dentro da bainha proteica de sua cabeça Hershey e Chase decidiram marcar diferencialmente o DNA e a proteína por meio da utilização de radioisótopos de modo que eles pudessem seguir os dois materiais durante a infecção O fósforo não é observado nos aminoácidos que formam os blocos de proteínas mas é uma parte integrante do DNA contrariamente o enxofre está presente nas proteínas mas nunca no DNA Hershey e Chase incorporaram o radioisótopo do fósforo 32P no DNA do fago e aquele do enxofre 35S nas proteínas de uma cultura de fagos em separado Conforme demonstrado na Figura 74 em seguida eles infectaram duas culturas de E coli com muitas partículas virais por célula uma cultura de E coli recebeu o fago marcado com 32P e a outra recebeu o fago marcado com 35S Após possibilitar tempo suficiente para a ocorrência da infecção eles fragmentaram as carcaças vazias dos fagos denominadas fantasmas das células bacterianas por meio de agitação em um liquidificador de cozinha Eles separaram as células bacterianas dos fantasmas dos fagos em uma centrífuga e em seguida mediram a radioatividade nas duas frações Quando os fagos marcados com 32P foram utilizados para infectar E coli a maior parte da radioatividade estava dentro das células bacterianas indicando que o DNA do fago entrava nas células Quando os fagos marcados com 35S foram utilizados a maior parte do material radioativo estava nos fantasmas dos fagos indicando que a proteína do fago nunca entrava na célula bacteriana A conclusão é inevitável o DNA é o material hereditário As proteínas dos fagos são meros envoltórios estruturais que são descartados após a penetração do DNA viral na célula bacteriana 72 1 FIGURA 74 O experimento de HersheyChase demonstrou que o material genético dos fagos é o DNA não a proteína O experimento utiliza dois conjuntos de bacteriófagos T2 Em um conjunto o revestimento proteico é marcado com enxofre radioativo 35S não observado no DNA No outro conjunto o DNA é marcado com fósforo radioativo 32P não observado em aminoácidos Apenas 32P é recuperado da E coli indicando que o DNA é o agente necessário para a produção de novos fagos Estrutura do DNA Até mesmo antes de a estrutura do DNA ter sido elucidada estudos genéticos indicavam que o material hereditário tinha necessariamente três propriedades chave Tendo em vista que essencialmente todas as células no corpo de um organismo apresentam a mesma constituição genética a replicação fiel do material genético a cada divisão celular é crucial Portanto as características estruturais do DNA precisam assegurar a replicação fiel Essas características estruturais serão consideradas posteriormente neste 2 3 capítulo Tendo em vista que ele precisa codificar a constelação de proteínas expressas por um organismo o material genético precisa ter um conteúdo informativo Como as informações codificadas no DNA são decifradas para produzir proteínas será o assunto dos Capítulos 8 e 9 Tendo em vista que alterações hereditárias denominadas mutações fornecem a matériaprima para a seleção evolutiva o material genético tem de ser capaz de mudar em ocasiões raras Não obstante a estrutura do DNA deve ser estável de modo que os organismos possam confiar em sua informação codificada Consideraremos os mecanismos de mutação no Capítulo 16 Estrutura do DNA antes de Watson e Crick Considere a descoberta da estrutura da duplahélice do DNA por Watson e Crick como a solução para um quebracabeça tridimensional complicado Para solucionar esse quebracabeça Watson e Crick utilizaram um processo denominado construção de modelo no qual eles reuniram os resultados de experimentos anteriores e em andamento as peças do quebracabeça para formar o quebracabeça tridimensional o modelo da duplahélice Para compreender como eles fizeram isso primeiramente precisamos saber quais peças do quebra cabeça estavam disponíveis para Watson e Crick em 1953 Elementos estruturais do DNA A primeira peça do quebracabeça era o conhecimento sobre as estruturas básicas do DNA Como uma substância química o DNA é consideravelmente simples Ele contém três tipos de componentes químicos 1 fosfato 2 um açúcar denominado desoxirribose e 3 quatro bases nitrogenadas adenina guanina citosina e timina O açúcar no DNA é denominado desoxirribose tendo em vista que ele apresenta apenas um átomo de hidrogênio H no átomo de carbono 2 contrariamente à ribose um componente do RNA que apresenta um grupo hidroxila OH naquela posição Duas das bases adenina e guanina apresentam uma estrutura de anel duplo característica de um tipo de substância química denominado purina As outras 1 2 duas bases citosina e timina apresentam uma estrutura de anel único de um tipo denominado pirimidina São atribuídos números aos átomos de carbono nas bases para facilidade de referência Também são atribuídos números aos átomos de carbono no grupo açúcar nesse caso o número é seguido por apóstrofo reto 1 2 e assim por diante Os componentes químicos do DNA estão dispostos em grupos denominados nucleotídios cada um composto por um grupo fosfato uma molécula de açúcar desoxirribose e qualquer uma das quatro bases Figura 75 É uma convenção fazer referência a cada nucleotídio pela primeira letra da denominação de sua base A G C ou T O nucleotídio com a base adenina é denominado desoxiadenosina 5monofosfato em que 5 faz referência à posição do átomo de carbono no anel de açúcar ao qual o único grupo fosfato mono está ligado Regras de Chargaff da composição de bases A segunda peça do quebracabeça utilizada por Watson e Crick teve origem em um trabalho realizado muitos anos antes por Erwin Chargaff Estudando uma grande seleção de DNA de diferentes organismos Tabela 71 Chargaff estabeleceu determinadas regras empíricas a respeito das quantidades de cada tipo de nucleotídio observado no DNA A quantidade total de nucleotídios pirimidínicos T C sempre é igual à quantidade total de nucleotídios purínicos A G A quantidade de T sempre é igual à quantidade de A e a quantidade de C sempre é igual à quantidade de G Mas a quantidade de A T não é necessariamente igual à quantidade de G C conforme pode ser observado na coluna à direita da Tabela 71 Essa proporção varia entre os diferentes organismos mas é virtualmente a mesma em diferentes tecidos do mesmo organismo Análise do DNA por difração de raios X A terceira e mais controversa peça do quebracabeça teve origem nos dados de difração de raios X sobre a estrutura do DNA que foram coletados por Rosalind Franklin quando ela estava no laboratório de Maurice Wilkins Figura 76 Nos referidos experimentos foram disparados raios X nas fibras de DNA e a dispersão dos raios a partir das fibras é observada por meio da captação dos raios em filme fotográfico sobre o qual os raios X produzem pontos O ângulo da dispersão representado por cada ponto no filme fornece informações a respeito da posição de um átomo ou de determinados grupos de átomos na molécula de DNA Esse procedimento não é de fácil realização ou explicação e a interpretação dos padrões de pontos exige tratamento matemático complexo que está além do escopo deste texto Os dados disponíveis sugeriam que o DNA é longo e fino e que apresenta duas partes semelhantes que são paralelas entre si e que estão localizadas ao longo do comprimento da molécula Os dados dos raios X demonstraram que a molécula é helicoidal semelhante a uma espiral Sem o conhecimento de Rosalind Franklin sua melhor radiografia foi mostrada a Watson e Crick por Maurice Wilkins e foi essa peça crucial do quebracabeça que possibilitou que eles deduzissem a estrutura tridimensional que poderia explicar os padrões de pontos dos raios X FIGURA 75 Estes nucleotídios dois com bases purina e dois com bases pirimidina são os elementos estruturais fundamentais do DNA O açúcar é denominado desoxirribose tendo em vista que é uma variação de um açúcar comum a ribose que contém mais um átomo de oxigênio posição indicada pela seta vermelha Tabela 71 Propriedades molares das bases em DNA de diversas fontes Organismo Tecido Adenina Timina Guanina Citosina Escherichia coli K12 260 239 249 252 Diplococcus pneumoniae 298 316 205 180 Mycobacterium tuberculosis 151 146 349 354 Levedura 313 329 187 171 Paracentrotus lividus ouriçodo mar Espermatozoide 328 321 177 184 Arenque Espermatozoide 278 275 222 226 Rato Medula óssea 286 284 214 215 Ser humano Timo 309 294 199 198 Ser humano Fígado 303 303 195 199 Ser humano Espermatozoide 307 312 193 188 Definidas em moles de constituintes nitrogenados por 100 g átomos de fosfato em hidrolisado Fonte Dados de E Chargaff e J Davidson eds The Nucleic Acids Academic Press 1955 Duplahélice Um artigo de 1953 de Watson e Crick no periódico Nature foi iniciado com duas sentenças que conduziram a uma nova era da biologia Desejamos sugerir uma estrutura para o sal do ácido nucleico desoxirribose DNA Essa estrutura apresenta características novas que são de interesse biológico considerável1 A estrutura do DNA havia sido tema de grande debate desde os experimentos de Avery e colaboradores em 1944 Conforme observamos a composição geral do DNA era conhecida mas não se sabia como as partes se encaixavam A estrutura precisava atender as principais exigências em relação a uma molécula hereditária a capacidade de armazenar informações a capacidade de ser replicada e a capacidade de sofrer mutação A estrutura tridimensional derivada por Watson e Crick é composta por duas cadeias de nucleotídios filamentos uma ao lado da outra torcidas no formato de uma duplahélice Figura 77 Os dois filamentos de nucleotídios são mantidos unidos por ligações de hidrogênio entre as bases de cada filamento formando uma estrutura semelhante a uma escada em espiral Figura 78 A O arcabouço de cada filamento é formado por unidades de fosfato e açúcar desoxirribose alternadas que estão conectadas por ligações fosfodiéster Figura 78 B Podemos utilizar essas ligações para descrever como uma cadeia de nucleotídios é organizada Conforme mencionado anteriormente os átomos de carbono dos grupos de açúcar são numerados 1 a 5 Uma ligação fosfodiéster conecta o átomo de carbono 5 de uma desoxirribose ao átomo de carbono 3 da desoxirribose adjacente Portanto dizse que cada filamento de açúcar e fosfato apresenta uma polaridade ou sentido de 5 para 3 e a compreensão dessa polaridade é essencial para compreender como o DNA atua Na molécula de DNA bifilamentar os dois filamentos têm orientação oposta ou antiparalela ver Figura 78 B FIGURA 76 Rosalind Franklin esquerda e seu padrão de difração de raios X do DNA direita Esquerda Science Source direita Rosalind FranklinScience Source FIGURA 77 James Watson e Francis Crick com seu modelo do DNA A Barrington BrownScience Source Cada base está ligada ao átomo de carbono 1 de um açúcar desoxirribose no arcabouço de cada filamento e está voltada para dentro e em direção a uma base no outro filamento Ligações de hidrogênio entre os pares de bases mantêm os dois filamentos da molécula de DNA unidos As ligações de hidrogênio estão indicadas pelas linhas tracejadas na Figura 78 B FIGURA 78 A Modelo simplificado demonstrando a estrutura helicoidal do DNA Os bastões representam os pares de bases e as fitas representam o arcabouço de açúcar e fosfato das duas cadeias antiparalelas B Diagrama químico preciso da duplahélice do DNA desenrolada para demonstrar as espinhas dorsais açúcar fosfato azul e os degraus de pares de bases roxo laranja As espinhas dorsais correm em direções opostas as extremidades 5 e 3 são denominadas em virtude da orientação dos átomos de carbono 5 e 3 dos anéis de açúcar Cada par de bases apresenta uma base purina adenina A ou guanina G e uma base pirimidina timina T ou citosina C conectadas por ligações de hidrogênio linhas tracejadas vermelhas Dois filamentos de nucleotídios complementares pareados de modo antiparalelo assumem automaticamente uma conformação de duplahélice Figura 79 principalmente por meio da interação dos pares de bases Os pares de bases que são estruturas planares achatadas ficam empilhados uns sobre os outros no centro da duplahélice ver Figura 79 A O empilhamento aumenta a estabilidade da molécula de DNA ao excluir as moléculas de água dos espaços entre os pares de bases A forma mais estável que resulta do empilhamento de bases é uma duplahélice com dois tamanhos distintos de sulcos que ocorrem em uma espiral o sulco maior e o sulco menor que podem ser observados em ambos os modelos da fita e do preenchimento dos espaços da Figura 79 A e 79 B A maior parte das associações DNAproteína ocorre nos sulcos maiores Um filamento de nucleotídios único não apresenta estrutura helicoidal o formato helicoidal do DNA depende totalmente do pareamento e do empilhamento das bases nos filamentos antiparalelos O DNA é uma hélice com giro para a direita em outras palavras ele apresenta a mesma estrutura de um parafuso que seria parafusado em um local por meio de um movimento em sentido horário A duplahélice corresponde bem aos dados de difração dos raios X e às regras de Chargaff Ao estudar os modelos da estrutura que eles produziram Watson e Crick perceberam que o raio observado da duplahélice conhecido a partir dos dados de raios X seria explicado se uma base purina sempre pareasse por meio de ligações de hidrogênio com uma base pirimidina Figura 710 O referido pareamento explicaria a regularidade de A G T C observada por Chargaff mas preveria quatro pareamentos possíveis TA TG CA e CG Os dados de Chargaff entretanto indicam que T pareia apenas com A e que C pareia apenas com G Watson e Crick concluíram que cada par de bases é composto por uma base purina e uma base pirimidina pareadas de acordo com a regra a seguir G pareia com C e A pareia com T Observe que o par GC apresenta três ligações de hidrogênio enquanto o par AT apresenta apenas duas ver Figura 78 B Preveríamos que o DNA que contém muitos pares GC seria mais estável do que o DNA que contém muitos pares AT De fato essa previsão é confirmada O calor causa a separação dos dois filamentos da duplahélice do DNA um processo denominado dissociação do DNA ou desnaturação do DNA DNA com mais alto conteúdo de G C necessita de temperaturas mais altas para se dissociar em virtude da maior atração do pareamento GC CONCEITOCHAVE O DNA é uma duplahélice composta por duas cadeias de nucleotídios unidas por meio do pareamento complementar de A com T e de G com C FIGURA 79 O diagrama do filamento A destaca o empilhamento dos pares de bases enquanto o modelo de preenchimento de espaços B demonstra os sulcos maior e menor 1 2 3 FIGURA 710 O pareamento das purinas com as pirimidinas explica exatamente o diâmetro da duplahélice de DNA determinado a partir dos dados de raios X Aquele diâmetro é indicado pelas linhas verticais tracejadas A descoberta da estrutura do DNA por Watson e Crick é considerada por algumas pessoas a descoberta biológica mais importante do século 20 e isso fez com que eles recebessem o Prêmio Nobel com Maurice Wilkins em 1962 Rosalind Franklin morreu de câncer em 1958 e o prêmio não é concedido postumamente O motivo para essa descoberta ser considerada tão importante é que o modelo da duplahélice além de ser consistente com os dados anteriores a respeito da estrutura do DNA preencheu os três requisitos em relação a uma substância hereditária A estrutura da duplahélice sugeriu como o material genético poderia determinar a estrutura das proteínas Talvez a sequência de pares de nucleotídios no DNA dite a sequência de aminoácidos na proteína especificada por aquele gene Em outras palavras algum tipo de código genético pode escrever as informações no DNA como uma sequência de nucleotídios e em seguida traduzilas em uma linguagem diferente de sequências de aminoácidos na proteína Como isso é realizado é o assunto do Capítulo 9 Se a sequência de bases do DNA especifica a sequência de aminoácidos então é possível a mutação por meio da substituição de um tipo de base por outro em uma ou mais posições As mutações serão discutidas no Capítulo 16 Na medida em que Watson e Crick declararam nas palavras da conclusão de seu artigo de 1953 na Nature que relatava a estrutura da duplahélice do DNA Não escapou da nossa atenção que o pareamento específico que postulamos sugere imediatamente um possível mecanismo de cópia em relação ao material genético2 Para os geneticistas da época o significado dessa declaração estava claro conforme veremos na próxima seção 73 Replicação semiconservativa O mecanismo de cópia ao qual Watson e Crick fizeram referência é denominado replicação semiconservativa e está diagramado na Figura 711 Os arcabouços de açúcar e fosfato são representados por fitas espessas e a sequência de pares de bases é aleatória Imaginemos que a duplahélice é análoga a um zíper que se abre com início em uma extremidade Podemos observar que se essa analogia com o zíper é válida a deselicoidização dos dois filamentos exporá bases únicas em cada filamento Cada base exposta apresenta o potencial de parear com nucleotídios livres em uma solução Tendo em vista que a estrutura do DNA impõe estritas exigências de pareamento cada base exposta irá parear apenas com a sua base complementar A com T e G com C Portanto cada um dos dois filamentos únicos atuará como um modelo ou molde para direcionar a montagem das bases complementares para formar novamente uma duplahélice idêntica à original Presumese que os nucleotídios recentemente adicionados advenham de um conjunto de nucleotídios livres que deve estar presente na célula Se esse modelo estiver correto então cada moléculafilha deve conter uma cadeia de nucleotídios parental e uma cadeia de nucleotídios recentemente sintetizada Entretanto um pouco de ponderação demonstra que existem no mínimo três modos diferentes nos quais uma molécula de DNA parental pode estar relacionada com as moléculasfilhas Esses modos hipotéticos de replicação são denominados semiconservativo o modelo de WatsonCrick conservativo e dispersivo Figura 712 Na replicação semiconservativa a duplahélice de cada moléculafilha de DNA contém um filamento da molécula de DNA original e um filamento recémsintetizado Na replicação conservativa a molécula de DNA do genitor é conservada e uma única dupla hélicefilha é produzida composta por dois filamentos recémsintetizados Na replicação dispersiva cada uma das moléculasfilhas é composta por filamentos que contêm segmentos de ambos os DNA parentais e do DNA recémsintetizado Experimento de MeselsonStahl O primeiro problema na compreensão da replicação do DNA foi descobrir se o mecanismo da replicação era semiconservativo conservativo ou dispersivo Em 1958 dois jovens cientistas Matthew Meselson e Franklin Stahl decidiram descobrir quais dessas possibilidades descrevia corretamente a replicação do DNA A ideia deles era possibilitar que moléculas de DNA parental contendo nucleotídios de uma densidade replicassem em um meio contendo nucleotídios de densidade diferente Se o DNA fosse replicado de modo semiconservativo as moléculasfilhas seriam metade antigas e metade novas e portanto de densidade intermediária Para realizar o seu experimento Meselson e Stahl cultivaram E coli em um meio contendo o isótopo pesado de nitrogênio 15N em vez do tipo leve 14N normal Esse isótopo foi inserido nas bases nitrogenadas que em seguida foram incorporadas em filamentos de DNA recémsintetizados Após muitas divisões celulares em 15N o DNA das células estava bemmarcado com o isótopo pesado Em seguida as células foram removidas do meio com 15N e colocadas em um meio com 14N após uma e duas divisões celulares foram coletadas amostras e o DNA foi isolado de cada amostra Replicação semiconservativa do DNA FIGURA 711 O modelo semiconservativo da replicação do DNA proposto por Watson e Crick tem por base a especificidade dos pares de bases ligados por pontes de hidrogênio Os filamentos parentais demonstrados em azul atuam como moldes para a polimerização Os filamentos recémpolimerizados demonstrados em amarelo apresentam as sequências de bases que são complementares aos seus respectivos moldes FIGURA 712 Dos três modelos alternativos para a replicação do DNA o modelo da estrutura do DNA de WatsonCrick produziria o primeiro modelo semiconservativo As linhas amarelas representam os filamentos recémsintetizados Meselson e Stahl foram capazes de distinguir o DNA de diferentes densidades porque as moléculas podem ser separadas umas das outras por meio de um procedimento denominado centrifugação em gradiente de cloreto de césio Se o cloreto de césio CsCl for centrifugado em velocidades tremendamente altas 50000 rpm durante muitas horas os íons césio e cloreto tendem a ser empurrados pela força centrífuga para o fundo do tubo Finalmente é estabelecido um gradiente de íons no tubo com a mais alta concentração de íons ou densidade no fundo O DNA centrifugado com o cloreto de césio forma uma banda em uma posição idêntica à sua densidade no gradiente Figura 713 O DNA de diferentes densidades formará bandas em locais diferentes As células inicialmente cultivadas no isótopo pesado 15N demonstraram DNA de alta densidade Esse DNA está demonstrado em azul à esquerda da Figura 713 A Após o cultivo dessas células no isótopo leve 14N por uma geração os pesquisadores observaram que o DNA era de densidade intermediária demonstrando uma metade azul 15N e uma metade dourada 14N na parte intermediária da Figura 713 A Observe que Meselson e Stahl continuaram o experimento durante duas gerações de E coli de modo que puderam distinguir a replicação semiconservativa da dispersiva Após duas gerações foram observados tanto DNA de densidade intermediária quanto de densidade baixa à direita da Figura 713 A precisamente como previsto pelo modelo de replicação semiconservativa de Watson e Crick CONCEITOCHAVE O DNA é replicado por meio da deselicoidização dos dois filamentos da duplahélice e da construção de um novo filamento complementar em cada um dos filamentos separados da duplahélice original Forquilha de replicação Outra previsão do modelo de replicação do DNA de WatsonCrick é que um zíper de replicação ou forquilha será observado na molécula de DNA durante a replicação Essa forquilha é o local no qual a duplahélice é desenrolada para produzir os dois filamentos únicos que atuam como moldes para a cópia Em 1963 John Cairns testou essa previsão ao possibilitar a replicação do DNA em células bacterianas para incorporar a timidina tritiada 3Htimidina o nucleotídio da timidina marcado com um isótopo de hidrogênio radioativo denominado trítio Teoricamente cada moléculafilha recentemente sintetizada deve conter um filamento radioativo quente com 3H e outro filamento não radioativo frio Após intervalos variados e quantidades variadas de ciclos de replicação em um meio quente Cairns lisou cuidadosamente as bactérias e possibilitou que os conteúdos celulares assentassem em lâminas de microscopia eletrônica Finalmente Cairns cobriu as lâminas com emulsão fotográfica e a expôs ao escuro durante 2 meses Esse procedimento denominado autorradiografia possibilitou que Cairns desenvolvesse uma imagem da localização de 3H no material celular Na medida em que o 3H decai ele emite uma partícula beta um elétron energético A emulsão fotográfica detecta uma reação química que ocorre sempre que uma partícula beta atinge a emulsão Em seguida a emulsão pode ser revelada como uma impressão fotográfica de modo que o rastro de emissão de partículas beta aparece como pontos ou grãos pretos Após um ciclo de replicação em 3Htimidina apareceu um anel de pontos na autorradiografia Cairns interpretou esse anel como um filamento radioativo recentemente formado em uma moléculafilha de DNA circular conforme demonstrado na Figura 714 A Portanto estava aparente que o cromossomo bacteriano é circular um fato que também surgiu a partir da análise genética descrita anteriormente Capítulo 5 No segundo ciclo de replicação as forquilhas previstas pelo modelo de fato foram observadas Além disso a densidade dos grãos nos três segmentos foi tal que a interpretação demonstrada na Figura 714 B pode ser realizada a curva espessa de pontos que corta o interior do círculo de DNA seria o filamentofilho recémsintetizado dessa vez composto por dois filamentos radioativos Cairns observou todos os tamanhos desses padrões autorradiográficos em formato de lua correspondendo à movimentação progressiva das forquilhas de replicação ao redor do anel O DNA é copiado por meio da replicação semiconservativa FIGURA 713 O experimento de MeselsonStahl demonstra que o DNA é copiado por meio da replicação semiconservativa O DNA centrifugado em um gradiente de cloreto de césio CsCl formará bandas de acordo com a sua densidade A Quando as células cultivadas em 15N são transferidas para um meio com 14N a primeira geração produz uma única banda de DNA intermediária e a segunda geração produz duas bandas uma intermediária e uma leve Este resultado corresponde às previsões do modelo semiconservativo de replicação do DNA B e C Os resultados previstos em relação à replicação conservativa e replicação dispersiva demonstrados aqui não foram observados FIGURA 714 Um cromossomo bacteriano replicando apresenta duas forquilhas de replicação A Esquerda autorradiografia de um cromossomo bacteriano após uma replicação em timidina tritiada De acordo com o modelo de replicação semiconservativa um dos dois filamentos deve ser radioativo Direita interpretação da autorradiografia A hélice amarela representa o filamento tritiado B Esquerda autorradiografia de um cromossomo bacteriano na segunda rodada da replicação em timidina tritiada 3H Nesta molécula a dupla hélice recentemente replicada que cruza o círculo pode ser composta por dois filamentos radioativos se o filamento parental for o filamento radioativo Direita a espessura dupla do traçado radioativo no autorradiograma aparenta confirmar a interpretação demonstrada aqui DNA polimerases Um problema confrontado pelos cientistas era compreender justamente como as bases são trazidas até o molde da duplahélice Embora os cientistas suspeitassem que enzimas desempenhassem um papel essa possibilidade não foi comprovada até 1959 quando Arthur Kornberg isolou a DNA polimerase de E coli e demonstrou sua atividade enzimática in vitro Essa enzima adiciona desoxirribonucleotídios na extremidade 3 de uma cadeia de nucleotídios em 1 2 3 crescimento utilizando como molde um filamento único de DNA que foi exposto pela deselicoidização localizada da duplahélice Figura 715 Os substratos para a DNA polimerase são as formas trifosfato dos desoxirribonucleotídios dATP dGTP dCTP e dTTP A adição de cada base ao polímero em crescimento é acompanhada pela remoção de dois dos três fosfatos na forma de pirofosfato PPi A energia produzida pela clivagem dessa ligação de alta energia e a subsequente hidrólise do pirofosfato em duas moléculas de fosfato inorgânico auxiliam no direcionamento do processo endergônico de construção de um polímero de DNA Atualmente sabese que existem cinco DNA polimerases na E coli A primeira enzima que Kornberg purificou atualmente é denominada DNA polimerase I ou pol I Essa enzima apresenta três atividades que aparentam estar localizadas em diferentes partes da molécula Uma atividade de polimerase que catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5 para 3 Uma atividade de exonuclease 3 para 5 que remove bases incorretamente pareadas Uma atividade de exonuclease 5 para 3 que degrada filamentos únicos de DNA ou RNA Retornaremos à significância das duas atividades de exonuclease posteriormente neste capítulo Embora a pol I atue na replicação do DNA ver próxima seção alguns cientistas suspeitavam de que ela não fosse responsável pela maior parte da síntese do DNA tendo em vista que ela era muito lenta aproximadamente 20 nucleotídioss e muito abundante aproximadamente 400 moléculascélula além de se dissociar do DNA após a incorporação de apenas 20 a 50 nucleotídios Em 1969 John Cairns e Paula DeLucia resolveram essa questão quando demonstraram que uma linhagem de E coli com uma mutação no gene que codifica a DNA pol I ainda era capaz de crescer normalmente e replicar o seu DNA Eles concluíram que outra DNA polimerase atualmente denominada pol III 74 catalisa a síntese de DNA na forquilha de replicação FIGURA 715 A DNA polimerase catalisa a reação de alongamento da cadeia A energia para a reação advém da quebra da ligação fosfato de alta energia do substrato trifosfato Visão geral da replicação do DNA Na medida em que a DNA pol III avança a duplahélice é continuamente desenrolada à frente da enzima para expor comprimentos adicionais de filamentos de DNA simples que atuarão como moldes Figura 716 A DNA pol III atua como a forquilha de replicação a zona na qual a duplahélice está desenrolando Entretanto tendo em vista que a DNA polimerase sempre adiciona nucleotídios na extremidade 3 em crescimento apenas um dos dois filamentos antiparalelos pode atuar como molde para a replicação na direção da forquilha de replicação Em relação a esse filamento a síntese pode ocorrer de modo contínuo e suave na direção da forquilha o novo filamento no sentido líder é denominado filamento contínuo no sentido líder leading A síntese do outro filamento também ocorre na extremidade em crescimento 3 mas essa síntese ocorre no sentido errado tendo em vista que em relação a esse filamento o sentido 5 para 3 da síntese está longe da forquilha de replicação ver Figura 716 Conforme veremos a natureza do maquinário de replicação requer que a síntese de ambos os filamentos ocorra na região da forquilha de replicação Portanto a síntese que se afasta da forquilha de crescimento não pode prosseguir por muito tempo Ela tem de ocorrer em segmentos curtos a polimerase sintetiza um segmento em seguida se movimenta de volta para a extremidade 5 do segmento onde a forquilha em crescimento expôs o novo molde e inicia o processo novamente Esses trechos curtos 1000 a 2000 nucleotídios de DNA recémsintetizado são denominados fragmentos de Okazaki FIGURA 716 A forquilha de replicação se movimenta na síntese de DNA na medida em que a duplahélice é continuamente desenrolada A síntese do filamento contínuo leading pode prosseguir suavemente sem interrupções na direção do movimento da forquilha de replicação mas a síntese do filamento descontínuo lagging deve prosseguir na direção oposta para longe da forquilha de replicação Outro problema na replicação do DNA surge em virtude de a DNA polimerase conseguir estender uma cadeia mas não iniciar uma cadeia Portanto a síntese do filamento contínuo e de cada fragmento de Okazaki tem de ser iniciada por um primer ou uma cadeia curta de nucleotídios que se liga ao filamentomolde para formar um segmento de ácido nucleico dúplex O primer na replicação do DNA pode ser observado na Figura 717 Os primers são sintetizados por um conjunto de proteínas denominado primossomo do qual um componente central é uma enzima denominada primase um tipo de RNA polimerase A primase sintetiza um trecho curto aproximadamente 8 a 12 nucleotídios de RNA complementar a uma região específica do cromossomo No filamento contínuo é necessário apenas um primer inicial tendo em vista que após a ação do primer inicial o filamento de DNA em crescimento atua como primer para a adição contínua Entretanto no filamento descontínuo cada fragmento de Okazaki necessita de seu próprio primer A cadeia de RNA que compõe o primer em seguida é estendida como uma cadeia de DNA pela DNA pol III Uma DNA polimerase diferente pol I remove os primers de RNA com sua atividade de exonuclease 5 para 3 e preenche as lacunas com sua atividade de polimerase 3 para 5 Conforme mencionado anteriormente a pol I é a enzima originalmente purificada por Kornberg Outra enzima a DNA ligase une a extremidade 3 do DNA que preencheu a lacuna à extremidade 5 do fragmento de Okazaki dowstream O novo filamento assim formado é denominado filamento descontínuo lagging A DNA ligase une os fragmentos do DNA ao catalisar a formação de uma ligação fosfodiéster entre a extremidade 5fosfato de um fragmento e o grupo 3OH adjacente de outro fragmento Um marco da replicação do DNA é a sua precisão também denominada fidelidade em geral é inserido menos de um erro por 1010 nucleotídios Parte do motivo da precisão da replicação do DNA é que ambas a DNA pol I e a DNA pol III possuem atividade de exonuclease 3 para 5 que atua como uma função de revisão por meio da excisão de bases incorretamente inseridas Em virtude da importância da revisão veremos mais de perto como ela atua Um par de bases incorretamente pareado ocorre quando a atividade da polimerase 5 para 3 insere por exemplo uma A em vez de uma G para parear com uma C A adição de uma base incorreta com frequência ocorre em virtude de um processo denominado tautomerização Cada uma das bases no DNA pode se apresentar em uma de diversas formas denominadas tautômeros que são isômeros que diferem nas posições de seus átomos e nas ligações entre os átomos As formas estão em equilíbrio A forma ceto de cada base normalmente está presente no DNA mas em casos raros uma base pode ser alterada para a forma imino ou enol As formas imino e enol podem parear com a base errada formando um par errôneo Figura 718 Quando uma C é alterada para a sua forma rara imino a polimerase adiciona uma A em vez de uma G Figura 719 Felizmente tal erro normalmente é detectado e removido pela atividade de exonuclease 3 para 5 Após a remoção da base incorreta a polimerase tem outra chance de adicionar a base G complementar correta Conforme seria esperado linhagens mutantes sem uma exonuclease 3 para 5 funcional apresentam uma taxa mais alta de mutação Além disso tendo em vista que a primase não apresenta uma função de revisão o primer de RNA apresenta maior probabilidade de conter erros do que o DNA A necessidade de manter a alta fidelidade da replicação é um motivo pelo qual os primers de RNA nas extremidades dos fragmentos de Okazaki precisam ser removidos e substituídos por DNA Apenas após a remoção do primer de RNA a DNA pol I catalisa a síntese do DNA para substituir o primer O assunto do reparo do DNA será comentado em detalhes no Capítulo 16 FIGURA 717 Etapas na síntese do filamento descontínuo lagging A síntese de DNA prossegue por meio da síntese contínua no filamento leading e da síntese descontínua no filamento lagging FIGURA 718 Pareamento de bases normal em comparação com o de bases incorretamente pareadas A Pareamento entre as formas normais ceto das bases B Formas tautoméricas raras de bases resultam em pareamentos incorretos CONCEITOCHAVE A replicação do DNA ocorre na forquilha de replicação onde a duplahélice está desenrolando e os dois filamentos estão se separando A replicação do DNA prossegue continuamente na direção da forquilha de replicação em deselicoidização no filamento contínuo O DNA é sintetizado em segmentos curtos na direção para longe da forquilha de replicação no filamento descontínuo A DNA polimerase necessita que um primer ou uma cadeia curta de nucleotídios já esteja posicionado para iniciar a síntese 75 FIGURA 719 A DNA polimerase remove o pareamento incorreto AC com a utilização da sua atividade de exonuclease 3 para 5 Replissomo Uma máquina de replicação notável Outro marco da replicação do DNA é a velocidade O tempo necessário para que a E coli replique o seu cromossomo é tão breve quanto 40 min Portanto seu genoma de aproximadamente 5 milhões de pares de bases deve ser copiado a uma velocidade de aproximadamente 2000 nucleotídios por segundo A partir do experimento de Cairns sabemos que a E coli utiliza apenas duas forquilhas de replicação para copiar o seu genoma inteiro Portanto cada forquilha tem de ser capaz de se movimentar a uma velocidade de até 1000 nucleotídios por segundo O que é notável a respeito de todo o processo de replicação do DNA é que ele não sacrifica a velocidade pela precisão Como ele consegue manter ambas a velocidade e a precisão tendo em vista a complexidade das reações na forquilha de replicação A resposta é que a DNA polimerase é parte de um grande complexo nucleoproteico que coordena as atividades na forquilha de replicação Esse complexo denominado replissomo é um exemplo de uma máquina molecular Você encontrará outros exemplos nos capítulos posteriores A descoberta de que as principais funções da célula replicação transcrição e tradução por exemplo são realizadas por grandes complexos de multissubunidades alterou o modo como pensamos a respeito das células Para começar a compreender o motivo vejamos o replissomo mais de perto Alguns dos componentes do replissomo na E coli em interação estão demonstrados na Figura 720 Na forquilha de replicação o centro catalítico da DNA pol III for parte de um complexo muito maior denominado holoenzima pol III que é composto por dois centros catalíticos e muitas proteínas acessórias Um dos centros catalíticos lida com a síntese do filamento contínuo enquanto o outro lida com a síntese do filamento descontínuo Algumas das proteínas acessórias não visíveis na Figura 720 formam uma conexão entre os dois centros catalíticos coordenando assim a síntese dos filamentos contínuo e descontínuo O filamento descontínuo está demonstrado fazendo uma alça de modo que o replissomo consegue coordenar a síntese de ambos os filamentos e se movimentar para a forquilha de replicação Uma proteína acessória importante denominada grampo β circunda o DNA como uma rosquinha e mantém a pol III ligada à molécula de DNA Portanto a pol III é transformada de uma enzima que pode adicionar apenas 10 nucleotídios antes de sair do molde denominada enzima distributiva em uma enzima que permanece na forquilha em movimento e que adiciona dezenas de milhares de nucleotídios uma enzima processiva Resumidamente por meio da ação de proteínas acessórias a síntese de ambos os filamentos contínuo e descontínuo é rápida e altamente coordenada FIGURA 720 O replissomo e as proteínas acessórias realizam uma diversidade de etapas na forquilha de replicação A topoisomerase e a helicase desenrolam e abrem a duplahélice na preparação para a replicação do DNA Quando a duplahélice foi desenrolada proteínas de ligação a filamento simples evitam que a dupla hélice se forme novamente A ilustração é uma representação do assim denominado modelo em trombone denominado em virtude da sua semelhança com um trombone em virtude da alça do filamento descontínuo demonstrando como se imagina que os dois centros catalíticos do replissomo interajam para coordenar os diversos eventos de replicação dos filamentos contínuo e descontínuo Observe que a primase a enzima que sintetiza o primer de RNA não está tocando na proteína grampo Portanto a primase atua como uma enzima distributiva ela adiciona apenas alguns ribonucleotídios antes de se dissociar do molde Esse modo de ação faz sentido tendo em vista que o primer precisa ser apenas longo o suficiente para formar um ponto inicial dúplex adequado para a DNA pol III Deselicoidização da duplahélice Quando a duplahélice foi proposta em 1953 uma objeção importante era que a replicação de uma referida estrutura exigiria a deselicoidização da duplahélice na forquilha de replicação e a quebra das ligações de hidrogênio que mantêm os filamentos unidos Como o DNA poderia ser desenrolado tão rapidamente e ainda que pudesse como não helicoidizar excessivamente o DNA atrás da forquilha e o tornar extremamente emaranhado Atualmente sabemos que o replissomo contém duas classes de proteínas que abrem a hélice e evitam a helicoidização excessiva elas são as helicases e as topoisomerases respectivamente As helicases são enzimas que rompem as ligações de hidrogênio que mantêm os dois filamentos da duplahélice juntos Assim como a proteína grampo a helicase se adéqua como uma rosquinha ao redor do DNA a partir dessa posição ela rapidamente desenrola a duplahélice à frente da síntese do DNA O DNA desenrolado é estabilizado por meio de proteínas de ligação a filamento simples SSB do inglês singlestrandbinding que se ligam ao DNA unifilamentar e evitam a reestruturação do dúplex O DNA circular pode ser torcido e espiralado de modo muito semelhante às espirais extras que podem ser introduzidas em um elástico torcido O desenrolar da forquilha de replicação pelas helicases causa torção extra em outras regiões e são formadas superespirais para liberar a tensão da torção extra Tanto as torções quanto as superespirais têm de ser removidas para possibilitar que a replicação continue Essa superhelicoidização pode ser criada ou relaxada por enzimas denominadas topoisomerases das quais um exemplo é a DNA girase Figura 721 As topoisomerases relaxam o DNA superhelicoidizado por meio da quebra de um único filamento de DNA ou de ambos os filamentos o que possibilita que o DNA gire tornandose uma molécula relaxada As topoisomerases encerram reunindo os filamentos da molécula de DNA agora relaxada CONCEITOCHAVE Uma máquina molecular denominada replissomo realiza a síntese do DNA Ela inclui duas unidades de DNA polimerase para lidar com a síntese em cada filamento e coordena a atividade das proteínas acessórias necessárias para o priming a deselicoidização da duplahélice e a estabilização dos filamentos separados FIGURA 721 A DNA girase uma topoisomerase remove torções extras durante a replicação A Regiões extratorcidas positivamente superhelicoidizadas se acumulam à frente da forquilha na medida em que os filamentos parentais se separam para a replicação B Uma topoisomerase tal como a DNA girase remove estas regiões por meio de corte nos filamentos de DNA possibilitando que eles girem e em seguida reúne os filamentos Montagem do replissomo Início da replicação A montagem do replissomo é um processo ordenado que tem início em locais precisos no cromossomo denominados origens e que ocorre apenas em determinadas ocasiões na vida da célula A replicação da E coli tem início a partir de uma origem fixa um locus denominado oriC e em seguida prossegue em ambas as direções com forquilhas movendose em ambas as extremidades conforme demonstrado na Figura 714 até que as forquilhas se fundam A Figura 722 demonstra o processo de montagem do replissomo A primeira etapa é a ligação de uma proteína denominada DnaA a uma sequência de 13 pares de bases pb específica denominada DnaA box que é repetida cinco vezes em oriC Em resposta à ligação da DnaA a origem é deselicoidizada em um grupo de nucleotídios A e T Relembre que os pares de bases AT são mantidos juntos por apenas duas ligações de hidrogênio enquanto os pares de bases GC são mantidos juntos por três Portanto é mais fácil separar dissociar a duplahélice em trechos de DNA que são enriquecidos com bases A e T Iniciação da replicação procariótica Rico em AT Boxes de DnaA Múltiplas proteínas DnaA Reconhecimento da origem oriC e desenrolização Carregamento da helicase Deslizamento da helicase Recrutamento do replissomo 76 FIGURA 722 A síntese de DNA é iniciada nas origens de replicação em procariotos As proteínas se ligam à origem oriC onde separam os dois filamentos da duplahélice e recrutam componentes do replissomo para as duas forquilhas de replicação Após o início da deselicoidização proteínas DnaA adicionais se ligam às regiões de filamentos simples recémdeselicoidizadas Com a DnaA revestindo a origem duas helicases proteína DnaB agora se ligam e deslizam de 5 para 3 a fim de iniciar a abertura da hélice na forquilha de replicação A primase e a holoenzima DNA pol III são recrutadas para a forquilha de replicação por meio de interações proteínaproteína e a síntese do DNA tem início Você pode estar pensando o motivo de a DnaA não estar presente na Figura 720 que demonstra o replissomo A resposta é que embora ela seja necessária para a montagem do replissomo ela não é parte da máquina de replicação Em vez disso sua função é posicionar o replissomo no local correto no cromossomo circular para a iniciação da replicação Replicação em organismos eucariotos A replicação do DNA em procariotos e eucariotos utiliza um mecanismo semiconservativo e emprega a síntese de filamentos contínuo e descontínuo Por esse motivo não deve ser uma surpresa que os componentes do replissomo procariótico e aqueles do replissomo eucariótico sejam bastante semelhantes Entretanto na medida em que os organismos aumentam em complexidade o número de componentes do replissomo também aumenta Origens da replicação eucariótica Bactérias tais como E coli normalmente completam um ciclo de replicação e divisão em 20 a 40 minutos mas em eucariotos o ciclo pode variar de 14 hora em leveduras a 24 horas em células animais cultivadas e pode durar de 100 a 200 horas em algumas células Os eucariotos têm de resolver o problema da coordenação da replicação de mais de um cromossomo Para compreender as origens da replicação eucariótica primeiramente voltaremos a nossa atenção para a levedura um eucarioto simples Muitas proteínas eucarióticas que atuam nas origens de replicação foram identificadas pela primeira vez em leveduras em virtude da facilidade da análise genética em pesquisas com leveduras ver Organismomodelo Levedura no Capítulo 12 As origens de replicação em leveduras são muito semelhantes à oriC em E coli As origens de 100 a 200 pb apresentam uma sequência de DNA conservada que inclui uma região rica em AT que se dissocia quando uma proteína iniciadora se liga aos sítios de ligação adjacentes Contrariamente aos cromossomos procarióticos cada cromossomo eucariótico apresenta muitas origens de replicação para replicar rapidamente os genomas eucarióticos muito maiores Aproximadamente 400 origens de replicação estão dispersas pelos 16 cromossomos de levedura e estimase que existam milhares de forquilhas de replicação nos 23 cromossomos dos seres humanos Portanto em eucariotos a replicação prossegue em ambos os sentidos a partir de múltiplos pontos de origem Figura 723 As duplashélices que estão sendo produzidas em cada origem da replicação alongam e finalmente se unem umas às outras Quando a replicação dos dois filamentos está completa resultam duas moléculasfilhas de DNA idênticas CONCEITOCHAVE Onde e quando ocorre a replicação são cuidadosamente controlados pela montagem ordenada do replissomo em um local preciso denominado origem A replicação prossegue em ambos os sentidos a partir de uma única origem no cromossomo procariótico circular A replicação prossegue em ambos os sentidos a partir de centenas de milhares de origens em cada um dos cromossomos eucarióticos lineares FIGURA 723 A replicação do DNA prossegue em ambos os sentidos a partir de uma origem de replicação As setas pretas indicam o sentido do crescimento das moléculasfilhas de DNA A Começando na origem as DNA polimerases se movimentam para o exterior em ambos os sentidos As setas amarelas longas representam os filamentos contínuos e as setas amarelas curtas unidas representam os filamentos descontínuos B Como a replicação prossegue no nível cromossômico Três origens de replicação estão demonstradas neste exemplo Replicação do DNA e ciclo celular de levedura A síntese do DNA ocorre na fase S síntese do ciclo celular eucariótico Figura 724 Como o início da síntese do DNA está limitado a esse estágio único Em leveduras o método de controle é ligar a montagem do replissomo ao ciclo celular A Figura 725 demonstra o processo Em leveduras são necessárias três proteínas para iniciar a montagem do replissomo O complexo de reconhecimento da origem ORC se liga primeiramente às sequências nas origens de leveduras de modo muito semelhante como a proteína DnaA o faz em E coli A presença de ORC na origem atua para recrutar duas outras proteínas Cdc6 e Cdt1 Ambas as proteínas mais o ORC em seguida recrutam a helicase denominada complexo MCM e os outros componentes do replissomo A replicação está ligada ao ciclo celular por meio da disponibilidade de Cdc6 e Cdt1 Em leveduras essas proteínas são sintetizadas durante o final da mitose e o intervalo 1 G1 e são destruídas por proteólise após o início da síntese Desse modo o replissomo pode ser montado apenas antes da fase S Quando a replicação tem início não pode haver formação de novos replissomos nas origens tendo em vista que Cdc6 e Cdt1 são degradadas durante a fase S e deixam de estar disponíveis FIGURA 724 O DNA é replicado durante a fase S do ciclo celular Início da replicação eucariótica Sequência consenso de 11 pb Rica em AT Reconhecimento da origem Carga de helicase Cdt1 e Cdc6 Desenrolização da hélice e deslizamento da helicase Recrutamento da DNA polimerase FIGURA 725 Este exemplo de levedura demonstra a iniciação da síntese de DNA em uma origem de replicação em um eucarioto Assim como na iniciação da replicação procariótica ver Figura 720 as proteínas do complexo de reconhecimento da origem ORC se ligam à origem onde separam os dois filamentos da duplahélice e recrutam os componentes do replissomo nas duas forquilhas de replicação A replicação está ligada ao ciclo celular por meio da disponibilidade de duas proteínas Cdc6 e Cdt1 Origens de replicação em eucariotos superiores Conforme já declarado a maior parte das aproximadamente 400 origens de replicação em leveduras é composta por sequências de DNA motifs semelhantes 100 a 200 pb de comprimento que são reconhecidas pelas subunidades de ORC Curiosamente embora todos os eucariotos caracterizados apresentem proteínas ORC semelhantes as origens de replicação em eucariotos superiores são muito mais longas possivelmente de até dezenas de milhares ou centenas de milhares de nucleotídios Significativamente os eucariotos apresentam semelhança limitada de sequências Portanto embora o ORC de levedura reconheça sequências de DNA específicas em cromossomos de levedura o que os ORC correlatos de eucariotos superiores reconhecem não está claro nesse momento mas a característica reconhecida provavelmente não é uma sequência de DNA específica O que essa incerteza significa em termos práticos é que é muito mais difícil isolar origens de replicação de seres humanos e outros eucariotos superiores tendo em vista que os cientistas não conseguem utilizar uma sequência de DNA isolada de uma origem humana por exemplo para realizar uma pesquisa computadorizada de toda a sequência do genoma humano para encontrar outras origens Se os ORC de eucariotos superiores são interagem com uma sequência específica dispersa pelos cromossomos então como eles encontram as origens de replicação Acreditase que esses ORC interajam indiretamente com as origens por meio da associação com outros complexos proteicos que estão ligados aos cromossomos Um referido mecanismo de reconhecimento pode ter evoluído de modo que os eucariotos superiores possam regular o momento da replicação do DNA durante a fase S ver Capítulo 12 para mais a respeito da eucromatina e da heterocromatina Há algum tempo sabese que as regiões cromossômicas ricas 77 em genes a eucromatina são replicadas inicialmente na fase S enquanto as regiões pobres em genes incluindo a heterocromatina condensada são replicadas tardiamente na fase S A replicação do DNA não poderia ser programada por região se os ORC estivessem ligados às sequências relacionadas dispersas pelos cromossomos Em vez disso os ORC por exemplo apresentam uma afinidade maior por origens na cromatina aberta e se ligar a essas origens primeiro e posteriormente se ligar à cromatina condensada apenas após as regiões ricas em genes terem sido replicadas CONCEITOCHAVE A origem da replicação de levedura assim como a origem em procariotos contém uma sequência de DNA conservada que é reconhecida pelo ORC e outras proteínas necessárias para montar o replissomo Em contrapartida as origens de eucariotos superiores têm sido difíceis de isolar e estudar tendo em vista que são longas e complexas e não contêm uma sequência de DNA conservada Telômeros e telomerase Término da replicação A replicação da molécula de DNA linear em um cromossomo eucariótico prossegue em ambos os sentidos a partir de diversas origens de replicação conforme demonstrado na Figura 723 Esse processo replica a maior parte do DNA cromossômico mas existe um problema inerente na replicação das duas extremidades das moléculas de DNA lineares as regiões denominadas telômeros A síntese contínua no filamento leading pode prosseguir até a ponta do molde Entretanto a síntese do filamento descontínuo necessita de primers à frente do processo assim quando o último primer é removido faltam sequências no final daquele filamento Consequentemente uma ponta unifilamentar permanece em uma das moléculasfilhas de DNA Figura 726 Se o cromossomofilho com essa molécula de DNA fosse replicado novamente o filamento com sequências ausentes na extremidade se tornaria uma molécula bifilamentar encurtada após a replicação A cada ciclo de replicação subsequente o telômero continuaria a encurtar até que finalmente seriam perdidas informações codificantes essenciais FIGURA 726 Parte superior A replicação de cada fragmento de Okazaki no filamento descontínuo tem início com a inserção de um primer Parte inferior O destino do filamento inferior na bolha de transcrição Quando o primer do último fragmento de Okazaki do filamento descontínuo é removido não há como preencher a lacuna por meio da replicação convencional Resultaria um cromossomo encurtado quando o cromossomo que contém a lacuna fosse replicado As células desenvolveram um sistema especializado para evitar essa perda A solução envolve a adição de múltiplas cópias de uma sequência não codificadora simples ao DNA nas pontas do cromossomo Portanto cada vez que um cromossomo é duplicado ele fica mais curto e apenas essas sequências repetidas que não contêm informações são perdidas As repetições perdidas são em seguida adicionadas novamente às extremidades do cromossomo A descoberta de que as extremidades dos cromossomos são compostas por sequências repetidas em tandem foi feita em 1978 por Elizabeth Blackburn e Joe Gall que estavam estudando o DNA no macronúcleo incomum do ciliado unicelular Tetrahymena Assim como outros ciliados o Tetrahymena apresenta um micronúcleo convencional e um macronúcleo incomum no qual os cromossomos são fragmentados em milhares de pedaços do tamanho de um gene com novas extremidades adicionadas a cada pedaço Com tantas extremidades cromossômicas Tetrahymena apresenta aproximadamente 40000 telômeros e como tal era a escolha perfeita para determinar a composição do telômero Blackburn e Gall foram capazes de isolar os fragmentos que continham os genes para RNA ribossômico fragmentos denominados rDNA ver Capítulo 9 para mais sobre os ribossomos por meio da utilização da centrifugação em gradiente de CsCl a técnica desenvolvida por Meselson e Stahl para isolar DNA de E coli recémreplicado ver anteriormente As extremidades dos fragmentos de rDNA continham arranjos em tandem da sequência TTGGGG Atualmente sabemos que virtualmente todos os eucariotos apresentam repetições curtas em tandem nas extremidades de seus cromossomos entretanto a sequência não é exatamente a mesma Os cromossomos humanos por exemplo terminam em aproximadamente 10 a 15 kb de repetições em tandem da sequência TTAGGG A questão sobre como essas repetições de fato são adicionadas às extremidades dos cromossomos após cada rodada de replicação foi abordada por Elizabeth Blackburn e Carol Grieder Elas formularam a hipótese de que uma enzima catalisava o processo Novamente trabalhando com extratos do macronúcleo de Tetrahymena elas identificaram uma enzima que denominaram telomerase que adiciona repetições curtas às extremidades 3 das moléculas de DNA Curiosamente a proteína telomerase carrega uma pequena molécula de RNA parte da qual atua como um molde para a síntese da unidade de repetição telomérica Em todos os vertebrados incluindo seres humanos a sequência de RNA 3AAUCCC5 atua como o molde para a unidade de repetição 5 TTAGGG3 por meio de um mecanismo demonstrado na Figura 727 Brevemente a RNA telomerase primeiro se liga ao prolongamento 3 do DNA que em seguida é estendido com a utilização dos dois componentes da telomerase o pequeno RNA como molde e a proteína como atividade de polimerase Após a adição de alguns nucleotídios ao prolongamento 3 a RNA telomerase se movimenta ao longo do DNA de modo que a extremidade 3 possa ser adicionalmente estendida por meio da sua atividade de polimerase A extremidade 3 continua a ser estendida pela movimentação repetida da RNA telomerase A primase e a DNA polimerase em seguida utilizam o prolongamento 3 muito longo como molde para preencher a extremidade do outro filamento de DNA Trabalhando com Elizabeth Blackburn um terceiro pesquisador Jack Szostak prosseguiu até demonstrar que também existem telômeros na levedura Pela contribuição para a descoberta de como os telômeros protegem os cromossomos do encurtamento Blackburn Grieder e Szostak receberam o Prêmio Nobel em Medicina ou Fisiologia de 2009 A Alongamento do prolongamento 3 A telomerase ligase ao prolongamento 3 3 AACC CCAAC 5 3 AACC CCAAC 5 3 AACC CCAAC 5 3 AACC CCAAC 5 3 Translocação 3 AACC CCAAC 5 5 TGGGTTG GGGTTGG GGT 5 5 TTGGGTTGGGGTTGGT 5 B Replicação do filamentocomplementar Um primer é sintetizado 5 TGGGTTG GGGTTGGGGT 3 3 AACC CCAAC 5 3 AACC CCAAC 5 3 AACC CCAAC 5 5 O primer é removido e a ligase sela a lacuna 5 TGGGTTG GGGTTGGGGT 3 FIGURA 727 A telomerase carreia uma molécula de RNA curta letras vermelhas que atua como um molde para a adição de uma sequência de DNA complementar que é adicionada ao prolongamento 3 letras azuis Para adicionar outra repetição a telomerase translocase para a extremidade da repetição que acabou de adicionar O prolongamento 3 estendido em seguida pode atuar como um molde para a replicação do DNA convencional Uma característica notável dessa reação é que o RNA serve como o molde para a síntese de DNA Conforme você verificou no Capítulo 1 e revisará no Capítulo 8 o DNA normalmente atua como molde para a síntese de RNA no processo denominado transcrição É por esse motivo que se diz que a polimerase da telomerase apresenta atividade de transcriptase reversa Revisaremos a transcriptase reversa nos Capítulos 10 e 15 Além de prevenir a erosão do material genético após cada rodada de replicação os telômeros preservam a integridade cromossômica por meio da associação com proteínas para formar capuzes protetores Esses capuzes isolam o prolongamento unifilamentar 3 que pode ter até 100 nucleotídios de comprimento Figura 728 Sem esse capuz as extremidades bifilamentares dos cromossomos seriam confundidas pela célula com quebras bifilamentares e seriam tratadas de acordo Conforme você verá posteriormente no Capítulo 16 quebras bifilamentares são possivelmente muito perigosas tendo em vista que podem resultar em instabilidade cromossômica que pode levar ao câncer e a uma diversidade de fenótipos associados ao envelhecimento Por esse motivo quando uma quebra bifilamentar é detectada a célula responde de vários modos dependendo em parte do tipo celular e da extensão da lesão Por exemplo a quebra bifilamentar pode fundirse com outra quebra ou a célula pode limitar o dano para o organismo interrompendo a divisão celular denominada senescência ou iniciando uma via de morte celular denominada apoptose CONCEITOCHAVE Os telômeros são estruturas especializadas nas extremidades dos cromossomos que contêm repetições em tandem de uma sequência curta de DNA que é adicionada à extremidade 3 pela enzima telomerase Os telômeros estabilizam os cromossomos ao prevenir a perda de informação genômica após cada rodada de replicação do DNA e por meio da associação com proteínas para formar um capuz que esconde as extremidades dos cromossomos do maquinário de reparo do DNA da célula Surpreendentemente embora a maior parte das células germinativas apresente telomerase em abundância as células somáticas produzem muito pouca ou nenhuma telomerase Por esse motivo os cromossomos de células somáticas proliferativas se tornam progressivamente mais curtos a cada divisão celular até que a célula interrompe todas as divisões e entra em uma fase de senescência Essa observação levou muitos investigadores a suspeitarem que havia uma ligação entre o encurtamento dos telômeros e o envelhecimento Geneticistas que estudam doenças humanas que levam ao fenótipo de envelhecimento precoce recentemente revelaram evidências que amparam essa conexão Pessoas com síndrome de Werner apresentam manifestação precoce de muitos eventos relacionados com a idade incluindo enrugamento da pele catarata osteoporose branqueamento dos cabelos e doença cardiovascular Figura 729 Estudos genéticos e bioquímicos observaram que pessoas afetadas apresentam telômeros mais curtos do que aqueles de pessoas normais em virtude de uma mutação em um gene denominado WRN que codifica uma proteína uma helicase que está associada a proteínas que formam a estrutura de revestimento do telômero TRF2 ver Figura 728 Formulase a hipótese de que essa mutação rompe o telômero normal resultando em instabilidade cromossômica e no fenótipo de envelhecimento precoce Pacientes com outra síndrome de envelhecimento precoce denominada disqueratose congênita também apresentam telômeros mais curtos do que aqueles de pessoas saudáveis da mesma idade e também apresentam mutações em genes necessários para a atividade da telomerase FIGURA 728 Um capuz protege o telômero na extremidade de um cromossomo O prolongamento 3 é escondido quando desloca um filamento de DNA em uma região na qual as repetições teloméricas são bifilamentares As proteínas TRF1 e TRF2 se ligam às repetições teloméricas e outras proteínas incluindo WRN ligamse a TRF1 e TRF2 formando assim o capuz protetor do telômero Os geneticistas também estão muito interessados em conexões entre telômeros e câncer Contrariamente às células somáticas normais a maior parte das células cancerosas apresenta atividade de telomerase A capacidade de manter telômeros funcionais pode ser um motivo pelo qual as células cancerosas mas não as células normais conseguem crescer em culturas celulares durante décadas e são consideradas imortais Como tal muitas empresas farmacêuticas estão buscando capitalizar essa diferença entre as células cancerosas e normais com o desenvolvimento de fármacos que têm por alvo seletivo as células cancerosas por meio da inibição da atividade da telomerase FIGURA 729 Uma mulher com síndrome de Werner aos 15 e aos 48 anos de idade International Registry of Werner Syndrome wwwwernersyndromeorg RESUMO Trabalhos experimentais sobre a natureza molecular do material hereditário demonstraram conclusivamente que o DNA e não proteínas lipídios ou carboidratos é de fato o material genético Com a utilização de dados obtidos por outros pesquisadores Watson e Crick deduziram um modelo de duplahélice com dois filamentos de DNA enrolados um ao redor do outro de modo antiparalelo A ligação dos dois filamentos tem por base o pareamento da adenina A com a timina T e da guanina G com a citosina C O primeiro par é unido por duas ligações de hidrogênio o segundo por três O modelo de WatsonCrick demonstra como o DNA pode ser replicado de modo ordenado requisito indispensável para o material genético A replicação é realizada de modo semiconservativo tanto em procariotos quanto em eucariotos Uma duplahélice é replicada para formar duas hélices idênticas cada uma com seus nucleotídios na ordem linear idêntica cada uma das duas novas duplas hélices é composta por um filamento antigo e um filamento recémpolimerizado de DNA A duplahélice de DNA é desenrolada em uma forquilha de replicação e os dois filamentos únicos assim produzidos atuam como moldes para a polimerização de nucleotídios livres Os nucleotídios são polimerizados pela enzima DNA polimerase que adiciona novos nucleotídios apenas à extremidade 3 de uma cadeia de DNA em crescimento Tendo em vista que a adição é apenas nas extremidades 3 a polimerização em um molde é contínua produzindo o filamento contínuo leading e no outro é descontínua em trechos curtos fragmentos de Okazaki produzindo o filamento descontínuo lagging A síntese do filamento contínuo e de cada fragmento de Okazaki é iniciada por um primer de RNA curto sintetizado pela primase que fornece uma extremidade 3 para a adição de desoxirribonucleotídios Os eventos múltiplos que têm de ocorrer com precisão e rapidez na forquilha de replicação são realizados por uma máquina biológica denominada replissomo Esse complexo proteico inclui duas unidades de DNA polimerase uma para atuar no filamento contínuo e uma para atuar no filamento descontínuo Desse modo a síntese é mais demorada e a união dos fragmentos de Okazaki em um filamento contínuo pode ser temporalmente coordenada com a síntese menos complicada do filamento contínuo Onde e quando a replicação ocorre é cuidadosamente controlado pela montagem ordenada do replissomo em determinados locais nos cromossomos denominados origens Os genomas eucarióticos podem apresentar dezenas de milhares de origens A montagem dos replissomos nessas origens ocorre apenas em uma fase específica no ciclo celular As extremidades dos cromossomos lineares telômeros apresentam um problema para o sistema de replicação tendo em vista que sempre há um trecho curto em um filamento que não pode ser iniciado A enzima telomerase adiciona várias sequências curtas e repetitivas para manter o comprimento A telomerase carrega um RNA curto que atua como o molde para a síntese das repetições teloméricas Essas repetições teloméricas não codificadoras associamse a proteínas para formar um revestimento telomérico Os telômeros encurtam com a idade nas células somáticas tendo em vista que a telomerase não é produzida naquelas células Indivíduos que apresentam telômeros defeituosos sofrem envelhecimento precoce TERMOSCHAVE antiparalela base base complementar ceto código genético desoxirribose DNA ligase duplahélice enol enzima distributiva enzima processiva filamento contínuo líder leading filamento descontínuo lento lagging forquilha de replicação fosfato fragmento de Okazaki helicase holoenzima polimerase III pol III imino modelo ou molde moléculafilha nucleotídio origem pirimidina primase primer primossomo proteína de ligação a filamento simples SSB purina replicação conservativa replicação semiconservativa replissomo sulco maior sulco menor tautomerização telomerase telômero topoisomerase PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 A mitose e a meiose foram apresentadas no Capítulo 2 Considerando o que foi abrangido neste capítulo a respeito da replicação do DNA desenhe um gráfico demonstrando o conteúdo de DNA contra o tempo em uma célula que sofre mitose e em seguida meiose Presuma uma célula diploide Solução Problema resolvido 2 Se o conteúdo de GC de uma molécula de DNA é de 56 quais são as porcentagens das quatro bases A T G e C nessa molécula Solução Se o conteúdo de GC for de 56 então tendo em vista que G C o conteúdo de G é de 28 e o conteúdo de C é de 28 O conteúdo de AT 100 56 44 1 Tendo em vista que A T o conteúdo de A é de 22 e o conteúdo de T é de 22 Problema resolvido 3 Descreva o padrão esperado de bandas em um gradiente de CsCl para a replicação conservativa no experimento de MeselsonStahl Desenhe um diagrama Solução Consulte a Figura 713 para uma explicação adicional Na replicação conservativa se bactérias são cultivadas na presença de 15N e em seguida transferidas para 14N uma molécula de DNA será toda 15N após a primeira geração e a outra molécula será toda 14N resultando em uma banda pesada e uma banda leve no gradiente Após a segunda geração o DNA 15N produzirá uma molécula toda com 15N e uma molécula toda com 14N enquanto o DNA 14N produzirá apenas DNA14N Portanto apenas DNA todo 14N ou todo 15N é gerado novamente produzindo uma banda leve e uma banda pesada PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Na Tabela 71 por que não há dados em relação às primeiras quatro fontes teciduais Em relação às três últimas entradas qual é a explicação mais 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 provável para as discretas diferenças na composição do DNA humano das três fontes teciduais Na Figura 77 você reconhece alguns dos componentes utilizados para a construção do modelo do DNA de Watson e Crick Onde você os viu anteriormente Fazendo referência à Figura 720 responda às questões a seguir a O que a enzima DNA polimerase I está fazendo b Quais outras proteínas são necessárias para que a DNA polimerase III à esquerda continue sintetizando DNA c Quais outras proteínas são necessárias para que a DNA polimerase III à direita continue sintetizando DNA O que há de diferente a respeito da reação catalisada pela helicase verde na Figura 720 e a girase amarela na Figura 721 Na Figura 723 A rotule todos os filamentos líder leading e lentos lagging PROBLEMAS BÁSICOS Descreva os tipos de ligações químicas na duplahélice do DNA Explique qual é o significado dos termos replicação conservativa e semiconservativa Qual é o significado de primer e por que os primers são necessários para a replicação do DNA O que são helicases e topoisomerases Por que a síntese do DNA é contínua em um filamento e descontínua no filamento oposto Se os quatro desoxinucleotídios demonstrassem pareamento inespecífico de bases A com C A com G T com G e assim por diante as informações únicas contidas em um gene seriam mantidas a cada ciclo de replicação Explique 12 13 14 15 16 17 Se não houvesse helicases durante a replicação o que ocorreria com o processo de replicação O que aconteceria se durante a replicação as topoisomerases fossem incapazes de reconectar os fragmentos de DNA de cada filamento após a a deselicoidização relaxamento da molécula de DNA Qual das que seguem não é uma propriedadechave do material hereditário a Ele tem de ser capaz de ser copiado com precisão b Ele obrigatoriamente codifica as informações necessárias para formar proteínas e estruturas complexas c Ele sofre mutação ocasionalmente d Ele precisa ser capaz de se adaptar a cada um dos tecidos do corpo É essencial que os primers de RNA nas extremidades dos fragmentos de Okazaki sejam removidos e substituídos por DNA porque de outro modo qual dos eventos a seguir resultaria a O RNA interferiria com a função da topoisomerase b O RNA apresentaria maior probabilidade de conter erros tendo em vista que a primase não apresenta uma função de revisão c O grampo β do dímero da DNA pol II liberaria o DNA e a replicação seria interrompida d Os primers de RNA provavelmente formariam ligações de hidrogênio entre si originando estruturas complexas que podem interferir com a formação adequada da hélice de DNA As polimerases normalmente adicionam apenas aproximadamente 10 nucleotídios a um filamento de DNA antes de se dissociarem Entretanto durante a replicação a DNA pol III consegue adicionar dezenas de milhares de nucleotídios a uma forquilha em movimento Como essa adição é realizada Em cada origem de replicação a síntese do DNA prossegue bidirecionalmente a partir de duas forquilhas de replicação Qual dos que seguem ocorreria se um mutante eucariótico surgisse e apresentasse apenas 18 19 20 21 22 23 uma forquilha funcional por bolha de replicação Ver diagrama a Nenhuma alteração na replicação b A replicação ocorreria apenas em metade do cromossomo c A replicação seria completa apenas no filamento contínuo d A replicação demoraria o dobro do tempo Em uma célula diploide na qual 2n 14 quantos telômeros existem em cada uma das fases a seguir do ciclo celular a G1 b G2 c prófase da mitose d telófase da mitose Se a timina compõe 15 das bases em uma molécula de DNA específica qual porcentagem das bases é de citosina Se o conteúdo de GC de uma molécula de DNA é de 48 quais são as porcentagens das quatro bases A T G e C nessa molécula Bactérias denominadas extremófilas são capazes de crescer em fontes termais tais como o gêiser Old Faithful no Parque Nacional Yellowstone em Wyoming Você acredita que o DNA das extremófilas apresenta conteúdo mais alto de pares de bases GC ou AT Justifique a sua resposta Presuma que um determinado cromossomo bacteriano apresenta uma origem de replicação Sob algumas condições de divisão celular rápida a replicação poderia ter início a partir da origem antes de o ciclo de replicação precedente ser concluído Quantas forquilhas de replicação estariam presentes sob essas condições Uma molécula de composição 24 25 26 5AAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTTT5 é replicada em uma solução que contém GTP CTP e TTP não marcados não radioativo mais nucleosídios adenosina trifosfato com todos seus átomos de fósforo na forma do isótopo radioativo 32P Ambas as moléculas filhas serão radioativas Explique Em seguida repita a questão em relação à molécula 5ATATATATATATAT3 3TATATATATATATA5 O experimento de Meselson e Stahl teria funcionado se houvessem sido utilizadas células eucarióticas diploides Considere o segmento de DNA a seguir que é parte de uma molécula muito mais longa que constitui um cromossomo 5ATTCGTACGATCGACTGACTGACAGTC3 3TAAGCATGCTAGCTGACTGACTGTCAG5 Se a DNA polimerase iniciar a replicação desse segmento a partir da direita a Qual será o molde para o filamento contínuo b Desenhe a molécula quando a DNA polimerase está na metade desse segmento c Desenhe as duas moléculasfilhas completas d O seu diagrama na parte b é compatível com replicação bidirecional a partir de uma origem única o modo de replicação habitual As DNA polimerases são posicionadas ao longo do segmento de DNA a seguir que é parte de uma molécula muito maior e se movimentam da direita para a esquerda Se presumirmos que um fragmento de Okazaki é produzido a partir desse segmento qual será a sequência do fragmento Rotule suas extremidades 5 e 3 27 28 29 5CCTTAAGACTAACATCTTACTGGGATC3 3GGAATTCTGATTGATGAATGACCCTAG5 Permitese que cromossomos de E coli nos quais cada um dos átomos de nitrogênio está marcado ou seja cada átomo de nitrogênio é o isótopo pesado 15N em vez do isótopo normal 14N repliquem em um ambiente no qual todo nitrogênio é 14N Com a utilização de uma linha sólida para representar uma cadeia pesada de polinucleotídios e uma linha tracejada para uma cadeia leve esboce cada uma das descrições a seguir a O cromossomo parental pesado e os produtos da primeira replicação após a transferência para um meio 14N presumindo que o cromossomo é uma duplahélice de DNA e que a replicação é semiconservativa b Repita a parte a mas agora presuma que a replicação é conservativa c Se os cromossomosfilhos da primeira divisão em 14N forem centrifugados em um gradiente de densidade de cloreto de sódio e uma banda única for obtida qual das possibilidades nas partes a e b pode ser descartada Reconsidere o experimento de Meselson e Stahl O que ele comprova PROBLEMAS DESAFIADORES Se uma mutação que inativou a telomerase ocorreu em uma célula atividade da telomerase na célula zero qual você espera que seja o desfecho No planeta Rama o DNA é de seis tipos de nucleotídios A B C D E e F Os tipos A e B são denominados marzines C e D são orsines E e F são pirines As regras a seguir são válidas em todos os DNA de Rama Total de marzines Total de orsines Total de pirines A C E B D F a Prepare um modelo em relação à estrutura do DNA de Rama 30 31 32 33 34 b Em Rama a mitose produz três célulasfilhas Tendo esse fato em mente proponha um padrão de replicação para o seu modelo de DNA c Considere o processo da meiose em Rama Quais comentários ou conclusões você pode sugerir Se você extrair o DNA do colifago ϕ X174 você observará que a sua composição é de 25 A 33 T 24 G e 18 C Essa composição é compatível com as regras de Chargaff Como você interpretaria esse resultado Como esse fago poderia replicar o seu DNA No Capítulo 5 você viu que as bactérias transferem DNA de um membro de sua espécie para outro em um processo denominado conjugação Recentemente foi demonstrado que a transferência do DNA de uma célula bacteriana para outra não está limitada aos membros da mesma espécie Um microbiologista que estuda a bactéria Diplococcus pneumoniae formula a hipótese de que uma região do seu cromossomo foi de fato transferida do Mycobacterium tuberculosis Com base nos dados apresentados na Tabela 71 que característica distintiva do DNA transferido forneceria amparo para essa hipótese Tendo em vista o que você sabe a respeito da estrutura e da função da telomerase forneça um modelo plausível para explicar como uma espécie poderia existir com uma combinação de duas repetições diferentes p ex TTAGGG e TTGTGG em cada um de seus telômeros As bactérias necessitam de telomerase Explique por que sim ou por que não Watson e Crick utilizaram uma abordagem denominada construção de modelo para deduzir a estrutura da duplahélice do DNA Como ela difere da abordagem experimental mais convencional que é realizada em um laboratório de pesquisas Nesse sentido por que o experimento de Meselson e Stahl foi considerado de tal importância crítica 1J Watson e F Crick Nature 171 737 1953 2J Watson e F Crick Nature 171737 1953 A RNA polimerase em ação Uma RNA polimerase azul muito pequena produzida pelo bacteriófago T7 transcreve o DNA em um filamento de RNA vermelho A enzima separa a duplahélice do DNA amarelo laranja expondo o filamentomolde para ser copiado em RNA David S Goodsell Scripps Research Institute 81 82 83 84 85 C TÓPICOS RNA Transcrição Transcrição em eucariotos Remoção de íntrons e recomposição de éxons Pequenos RNA funcionais que regulam e protegem o genoma eucariótico RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Descrever como a estrutura do RNA difere daquela do DNA Distinguir as diferentes classes de RNA em uma célula Explicar a função dos promotores e as características necessárias para iniciar a transcrição Diagramar as etapas no processamento do RNA a partir de sua transcrição até o seu transporte para fora do núcleo Avaliar o motivo de a descoberta dos íntrons autorremovíveis ser considerada tão importante Descrever os diferentes tipos de RNA não codificadores ncRNA om a utilização do conhecimento recentemente adquirido sobre as sequências de DNA de genomas inteiros cientistas têm sido capazes de determinar o número aproximado de genes em diversos organismos tanto simples quanto complexos Primeiramente não havia surpresas a bactéria Escherichia coli apresenta aproximadamente 4400 genes a levedura Saccharomyces cerevisiae um eucarioto unicelular apresenta aproximadamente 6300 genes e a moscadasfrutas multicelular Drosophila melanogaster apresenta aproximadamente 13600 genes Cientistas presumiram que organismos mais complexos necessitariam de mais genes e assim as estimativas iniciais eram de que o nosso genoma apresentaria 100000 genes Em uma conferência que focou em pesquisas genômicas no ano 2000 cientistas iniciaram um grupo de apostas informais denominado GeneSweep que seria vencido por quem houvesse previsto de modo mais próximo o número real de genes no genoma humano As apostas variaram de aproximadamente 26000 a aproximadamente 150000 genes Com a liberação do primeiro rascunho de sequência foi anunciado um vencedor Surpreendentemente o vencedor era o apostador com a mais baixa estimativa 25947 genes Como o Homo sapiens com seu cérebro complexo e seu sistema imune sofisticado apresenta apenas o dobro de genes dos nematódeos e aproximadamente o mesmo número de genes da primeira planta a ter seu genoma sequenciado a erva daninha mostarda Arabidopsis thaliana Parte da resposta a essa questão está relacionada com uma descoberta extraordinária feita no fim da década de 1970 Naquela ocasião observouse que as proteínas de muitos eucariotos são codificadas no DNA não como trechos contínuos como ocorre em bactérias e leveduras mas em segmentos Portanto os genes de eucariotos superiores normalmente são compostos por segmentos denominados éxons que se referem às regiões expressas que codificam partes das proteínas e segmentos denominados íntrons que se referem às regiões intercalares que separam os éxons Como você aprenderá neste capítulo uma cópia de RNA que contém tanto éxons quanto íntrons é sintetizada a partir de um gene Uma máquina biológica denominada spliceossomo remove os íntrons e une os éxons em um processo denominado recomposição ou splicing do RNA para produzir um RNA maduro que contém a informação contínua necessária para sintetizar uma proteína Como os éxons e os íntrons estão relacionados com uma baixa contagem de genes humanos Por enquanto é suficiente dizer que o RNA transcrito a partir de um gene pode ser recomposto de modos alternativos Embora apresentemos apenas aproximadamente 21000 genes esses genes codificam mais de 100000 proteínas graças ao processo de splicing alternativo do RNA Ainda mais surpreendente é o achado de que apenas uma pequena fração do genoma de fato codifica proteínas pouco mais de 2 na maior parte dos organismos multicelulares complexos O conteúdo dos genomas será o assunto de capítulos futuros Por enquanto é importante observar que apesar de apresentar uma pequena proporção de DNA codificador a maior parte do genoma ainda codifica RNA A história desse adequadamente denominado RNA não 1 codificador de proteína ncRNA é um trabalho em andamento Aquela história será introduzida neste capítulo e será desenvolvida nos capítulos posteriores Neste capítulo observamos as primeiras etapas na transferência de informações dos genes para os produtos gênicos Na sequência do DNA do genoma de qualquer organismo está codificada a informação que especifica cada um dos produtos gênicos que o organismo pode produzir Essas sequências de DNA também contêm informações que especificam quando onde e quanto produto é produzido Para utilizar a informação uma cópia de RNA do gene deve ser sintetizada em um processo denominado transcrição A transferência da informação do gene para o produto gênico ocorre em diversas etapas A primeira etapa que é o foco deste capítulo é copiar transcrever a informação em um filamento de RNA com a utilização do DNA como um molde Em procariotos a informação no RNA codificador de proteína é quase imediatamente convertida em uma cadeia de aminoácidos proteína por meio de um processo denominado tradução Essa segunda etapa é o foco do Capítulo 9 Em eucariotos a transcrição e a tradução são separadas espacialmente a transcrição ocorre no núcleo e a tradução no citoplasma Entretanto antes que os RNA estejam prontos para ser transportados para o citoplasma para tradução ou outros usos eles são submetidos a um processamento extensivo incluindo a remoção de íntrons e a adição de um revestimento cap especial em 5 e uma cauda de nucleotídios adenina em 3 Um tipo de RNA totalmente processado denominado RNA mensageiro mRNA é o intermediário na síntese das proteínas Além disso em procariotos e eucariotos existem outros tipos de RNA que nunca são traduzidos Esses ncRNA realizam muitos papéis essenciais A função do DNA e do RNA durante a transcrição tem por base dois princípios A complementaridade de bases é responsável pela determinação da sequência do transcrito de RNA na transcrição Por meio do pareamento das bases complementares a informação codificada no DNA passa para o RNA e os complexos proteicos associados aos ncRNA são guiados até regiões 2 81 específicas no RNA para regular a sua expressão Determinadas proteínas reconhecem sequências de bases específicas no DNA e no RNA Essas proteínas de ligação a ácidos nucleicos se ligam a essas sequências e atuam nelas Veremos esses princípios em atuação durante as discussões detalhadas sobre a transcrição e a tradução que se seguem neste capítulo e nos capítulos posteriores CONCEITOCHAVE As interações do DNA e do RNA ocorrem por meio do pareamento de bases complementares e da ligação de diversas proteínas a sítios específicos no DNA ou no RNA RNA Investigadores iniciais tinham bons motivos para acreditar que a informação não é transferida diretamente do DNA para a proteína Em uma célula eucariótica o DNA é observado no núcleo enquanto a proteína é sintetizada no citoplasma É necessário um intermediário Experimentos iniciais sugerem um RNA intermediário Em 1957 Elliot Volkin e Lawrence Astrachan fizeram uma observação significativa Eles observaram que uma das alterações moleculares mais surpreendentes que ocorre quando a E coli é infectada pelo fago T2 é uma salva de síntese de RNA Além disso esse RNA induzido por fago se renova rapidamente ou seja seu tempo de vida é breve da ordem de minutos Seus rápidos aparecimento e desaparecimento sugeriram que o RNA pode desempenhar algum papel na expressão do genoma de T2 necessário para produzir mais partículas virais Volkin e Astrachan demonstraram a rápida rotatividade do RNA por meio da utilização de um protocolo denominado experimento de pulsocaça Para conduzir um experimento de pulsocaça as bactérias infectadas primeiramente 1 são alimentadas pulso com uracila radioativa uma molécula necessária para a síntese de RNA mas não de DNA Qualquer RNA sintetizado nas bactérias a partir de então é marcado com uracila radioativa prontamente detectável Após um curto período de incubação a uracila radioativa é lavada e substituída caça pela uracila não radioativa Esse procedimento caça a marcação para fora do RNA tendo em vista que na medida em que o RNA marcado com o pulso é degradado apenas os precursores não marcados estão disponíveis para sintetizar novas moléculas de RNA os nucleotídios marcados são diluídos pelo enorme excesso de uracila não marcada adicionado na caça O RNA recuperado brevemente após o pulso é marcado mas o RNA recuperado algum tempo depois não é marcado indicando que o RNA apresenta um período de vida muito curto Um experimento semelhante pode ser realizado com células eucarióticas As células primeiramente são pulsadas com uracila radioativa e após um curto período são transferidas para um meio com uracila não marcada Em amostras coletadas após o pulso a maior parte da marcação está no núcleo Em amostras coletadas após a caça o RNA marcado também é encontrado no citoplasma Figura 81 Aparentemente em eucariotos o RNA é sintetizado no núcleo e em seguida se movimenta para o citoplasma onde as proteínas são sintetizadas Portanto o RNA é um bom candidato para ser um intermediário na transferência de informação entre o DNA e a proteína Propriedades do RNA Consideraremos as características gerais do RNA Embora ambos o RNA e o DNA sejam ácidos nucleicos o RNA difere do DNA em diversos aspectos importantes O RNA apresenta o açúcar ribose em seus nucleotídios em vez da desoxirribose observada no DNA Conforme o nome sugere os dois açúcares diferem na presença ou na ausência de apenas um átomo de oxigênio O açúcar do RNA contém um grupo hidroxila OH ligado ao átomo de carbono 2 enquanto o açúcar do DNA apresenta apenas um átomo de hidrogênio ligado ao átomo de carbono 2 FIGURA 81 O experimento de pulsocaça demonstrou que o mRNA se movimenta para o citoplasma As células são cultivadas brevemente em uracila radioativa para marcar o RNA recémsintetizado pulso As células são lavadas para remover a uracila radioativa e em seguida são cultivadas em excesso de uracila não radioativa caça Os pontos vermelhos indicam a localização do RNA que contém uracila radioativa ao longo do tempo 2 3 O RNA normalmente é uma cadeia unifilamentar de nucleotídios não uma duplahélice como o DNA Uma consequência é que o RNA é mais flexível e consegue formar uma variedade muito maior de formas moleculares tridimensionais complexas do que o DNA bifilamentar consegue Um filamento de RNA pode dobrarse de tal modo que algumas de suas próprias bases pareiam entre si O referido pareamento de bases intramolecular é um determinante importante da forma do RNA Conforme você verá posteriormente neste capítulo a presença do grupo hidroxila no átomo de carbono 2 facilita a ação do RNA em muitos processos celulares importantes Assim como um filamento de DNA individual um filamento de RNA é formado por um arcabouço de açúcarfosfato com uma base ligada de modo covalente à posição 1 em cada ribose As ligações de açúcarfosfato são produzidas nas posições 5 e 3 do açúcar justamente como no DNA assim uma cadeia de RNA apresentará uma extremidade 5 e uma extremidade 3 Os nucleotídios do RNA denominados ribonucleotídios contêm as bases adenina guanina e citosina mas a base pirimidínica uracila abreviada U está presente em lugar da timina A uracila forma duas ligações de hidrogênio com a adenina assim como a timina A Figura 82 demonstra os quatro ribonucleotídios observados no RNA Além disso a uracila é capaz de parear com G As bases U e G formam pares de bases apenas durante o dobramento do RNA não durante a 4 transcrição As duas ligações de hidrogênio que podem se formar entre U e G são mais fracas do que as duas que se formam entre U e A A capacidade de U parearse tanto com A quanto com G é o principal motivo pelo qual o RNA consegue formar estruturas extensas e complicadas muitas das quais são importantes em processos biológicos O RNA assim como as proteínas mas contrariamente ao DNA pode catalisar reações biológicas A denominação ribozima foi cunhada para as moléculas de RNA que atuam como enzimas proteicas Classes de RNA Os RNA podem ser agrupados em duas classes gerais Uma classe de RNA codifica a informação necessária para produzir cadeias polipeptídicas proteínas Fazemos referência a essa classe como RNA mensageiro mRNA tendo em vista que esses RNA assim como um mensageiro atuam como o intermediário que transmite a informação do DNA para a proteína Fazemos referência à outra classe como RNA funcional tendo em vista que o RNA não codifica informação para produzir proteínas Em vez disso o próprio RNA é o produto funcional final FIGURA 82 RNA mensageiro As etapas por meio das quais um gene influencia o fenótipo são denominadas expressão gênica Em relação à vasta maioria dos genes o transcrito de RNA é apenas um intermediário necessário para a síntese de uma proteína que é o produto funcional final que influencia o fenótipo RNA funcional Na medida em que mais é aprendido a respeito dos detalhes íntimos da expressão e da regulação gênica tornase aparente que os RNA funcionais pertencem a uma diversidade de classes e que desempenham papéis diversos Novamente é importante enfatizar que os RNA funcionais são ativos como RNA eles nunca são traduzidos em polipeptídios As principais classes de RNA funcionais contribuem para as diversas etapas na transferência da informação do DNA para a proteína no processamento de outros RNA e na regulação do RNA e dos níveis de proteínas na célula Duas dessas referidas classes de RNA funcionais são observadas em procariotos e em eucariotos RNA transportadores e RNA ribossômicos As moléculas de RNA transportador ou de transferência tRNA são responsáveis por transportar o aminoácido correto até o mRNA no processo de tradução As moléculas de RNA ribossômico rRNA são os principais componentes dos ribossomos que são grandes máquinas macromoleculares que guiam a montagem da cadeia de aminoácidos pelos mRNA e tRNA A coleção inteira de tRNA e rRNA é codificada por um pequeno número de genes de algumas dezenas a no máximo algumas centenas Entretanto embora os genes que os codifiquem sejam em pequeno número os rRNA são responsáveis por uma porcentagem muito grande do RNA na célula tendo em vista que são estáveis e transcritos em muitas cópias Outra classe de RNA funcionais participa no processamento do RNA e é específica de eucariotos Os pequenos RNA nucleares snRNA são parte de um sistema que processa adicionalmente os transcritos de RNA nas células eucariotas Alguns snRNA se unem a diversas subunidades proteicas para formar o complexo ribonucleoproteico de processamento o spliceossomo que remove os íntrons dos mRNA eucarióticos Finalmente um grande grupo de RNA funcionais suprime a expressão gênica em muitos níveis e também mantém a estabilidade do genoma Três classes desses RNA funcionais podem ser codificadas por grandes partes dos genomas eucarióticos microRNA pequenos RNA de interferência e RNA de interação piwi Recentemente foi reconhecido que os microRNA miRNA apresentam um papel amplo na regulação da quantidade de proteínas produzidas por muitos genes eucarióticos Os pequenos RNA de interferência siRNA e os RNA de interação piwi piRNA auxiliam na proteção da integridade dos genomas de plantas e de 82 animais Os siRNA inibem a produção de vírus enquanto ambos siRNA e piRNA previnem a difusão de elementos de transposição para outros loci cromossômicos Os siRNA restringem os elementos de transposição em plantas e os piRNA realizam a mesma função em animais Recentemente observouse que os RNA não codificadores longos lncRNA ou por vezes abreviados apenas ncRNA são transcritos a partir da maior parte das regiões dos genomas de seres humanos e de outros animais e plantas Enquanto alguns poucos lncRNA desempenham um papel em fenômenos genéticos clássicos tais como a compensação da dose ver Capítulo 12 a função da maior parte dos lncRNA se existente atualmente é desconhecida Tendo em vista que a síntese proteica e o processamento de mRNA ocorrem durante todo o período de vida da maior parte das células tRNA rRNA e snRNA são sempre necessários Como tal esses RNA são sintetizados continuamente dizse que a sua transcrição é constitutiva Contrariamente miRNA siRNA piRNA e lncRNA são transcritos eou processados a partir de transcritos maiores de modo intermitente apenas quando são necessários para exercer seus papéis na proteção do genoma e na regulação da expressão gênica CONCEITOCHAVE Existem duas classes gerais de RNA aqueles que codificam proteínas mRNA e aqueles que são funcionais ncRNA Os RNA funcionais participam em uma diversidade de processos celulares incluindo a síntese proteica tRNA rRNA o processamento do RNA snRNA a regulação da expressão gênica miRNA e a defesa do genoma siRNA piRNA Transcrição A primeira etapa na transferência da informação do gene para a proteína é produzir um filamento de RNA cuja sequência de bases seja complementar à sequência de bases de um segmento de DNA por vezes seguida por uma modificação daquele RNA para preparálo para os seus papéis celulares específicos Portanto o RNA é produzido por meio de um processo que copia a sequência de nucleotídios do DNA Tendo em vista que esse processo é reminiscente da transcrição cópia de palavras escritas a síntese do RNA é denominada transcrição Dizse que o DNA é transcrito em RNA e o RNA é denominado transcrito Visão geral O DNA como modelo da transcrição Como a informação codificada na molécula de DNA é transferida para o transcrito de RNA A transcrição depende do pareamento complementar de bases Considere a transcrição de um segmento cromossômico que constitui um gene Primeiramente os dois filamentos da duplahélice de DNA são separados localmente e um dos filamentos separados atua como molde para a síntese de RNA No cromossomo em geral ambos os filamentos de DNA são utilizados como moldes mas em qualquer gene apenas um filamento é utilizado e naquele gene é sempre o mesmo filamento com início na extremidade 3 do gene molde Figura 83 Em seguida os ribonucleotídios que foram sintetizados quimicamente em outro local na célula formam pares estáveis com suas bases complementares no molde O ribonucleotídio A pareia com T no DNA G com C C com G e U com A Cada ribonucleotídio é posicionado oposto à sua base complementar pela enzima RNA polimerase Essa enzima se liga ao DNA e se movimenta ao longo dele ligando os ribonucleotídios alinhados para produzir uma molécula crescente de RNA conforme demonstrado na Figura 84 A Portanto já vemos em ação os dois princípios da complementaridade das bases e da ligação ácido nucleicoproteína nesse caso a ligação da RNA polimerase Observamos que o RNA apresenta uma extremidade 5 e uma extremidade 3 Durante a síntese o crescimento do RNA é sempre no sentido 5 para 3 em outras palavras os nucleotídios são sempre adicionados a uma ponta em crescimento 3 conforme demonstrado na Figura 84 B Tendo em vista que os filamentos complementares de ácido nucleico estão orientados de modo oposto o fato de o RNA ser sintetizado de 5 para 3 significa que o filamentomolde deve estar orientado de 3 para 5 FIGURA 83 Apenas um filamento de DNA é o molde para a transcrição gênica mas qual filamento varia com o gene O sentido da transcrição é sempre o mesmo em relação a qualquer gene e tem início a partir da extremidade 3 do molde de DNA e da extremidade 5 do transcrito de RNA Portanto os genes transcritos em diferentes sentidos utilizam filamentos opostos do DNA como moldes FIGURA 84 A Transcrição de dois genes em sentidos opostos Os genes 1 e 2 da Figura 83 estão demonstrados O gene 1 é transcrito a partir do filamento inferior A RNA polimerase migra para a esquerda lendo o filamentomolde no sentido 3 para 5 e sintetizando RNA no sentido 5 para 3 O gene 2 é transcrito no sentido oposto para a direita tendo em vista que o filamento superior é o molde Na medida em que a transcrição prossegue a extremidade 5 do RNA é deslocada do molde conforme a bolha de transcrição se fecha atrás da polimerase B Na medida em que o gene 1 é transcrito o grupo fosfato na extremidade 5 do ribonucleotídio U que entra ligase à extremidade 3 da cadeia de RNA em crescimento S Açúcar À medida que a molécula de RNA polimerase se movimenta ao longo do gene ela desenrola a duplahélice de DNA à sua frente e enrola novamente o DNA que já foi transcrito Conforme a molécula de RNA é progressivamente alongada a extremidade 5 do RNA é deslocada do molde e a bolha de transcrição se fecha atrás da polimerase Sucessões ou moléculas sucessivas de RNA polimerases cada uma sintetizando uma molécula de RNA movimentamse ao longo do gene Figura 85 FIGURA 85 Esta eletromicrografia demonstra a transcrição dos genes de RNA ribossômico repetidos em tandem no núcleo do anfíbio Triturus viridiscens Ao longo de cada gene muitas RNA polimerases estão transcrevendo em um sentido Os transcritos de RNA em crescimento aparecem como fios que se estendem para fora do arcabouço do DNA Os transcritos mais curtos estão próximos do início da transcrição os mais longos estão perto do fim do gene O aspecto de árvore de Natal é o resultado Fotografia de O L Miller Jr e Barbara A Hamkalo Também observamos que as bases no transcrito e no molde são complementares Consequentemente a sequência de nucleotídios no RNA deve ser a mesma daquela no filamento não molde do DNA exceto pelo fato de que as T são substituídas por U conforme demonstrado na Figura 86 Quando as sequências de bases do DNA são citadas na literatura científica a sequência do filamento não molde é fornecida de modo convencional tendo em vista que essa sequência é a mesma daquela observada no RNA Por esse motivo o filamento não molde do DNA é denominado filamento codificador É extremamente importante ter em mente essa distinção quando a transcrição é discutida CONCEITOCHAVE A transcrição é assimétrica apenas um filamento do DNA de um gene é utilizado como um molde para a transcrição Esse filamento está na orientação de 3 para 5 e o RNA é sintetizado no sentido 5 para 3 Estágios da transcrição A sequência codificadora de proteína em um gene é um segmento relativamente pequeno do DNA inserido em uma molécula de DNA muito mais longa o cromossomo Como o segmento apropriado é transcrito em uma molécula de RNA unifilamentar de comprimento e sequência de nucleotídios corretos Tendo em vista que o DNA de um cromossomo é uma unidade contínua a maquinaria de transcrição deve estar direcionada para o início de um gene para iniciar a transcrição no local certo continuar transcrevendo o comprimento do gene e finalmente interromper a transcrição na outra extremidade Esses três estágios distintos da transcrição são denominados iniciação alongamento e término Embora o processo geral de transcrição seja notavelmente semelhante em procariotos e em eucariotos existem diferenças importantes Por esse motivo acompanharemos os três estágios primeiramente em procariotos com a utilização da bactéria intestinal E coli como exemplo e em seguida em eucariotos Iniciação em procariotos Como a RNA polimerase encontra o ponto de início correto para a transcrição Em procariotos a RNA polimerase normalmente se liga a uma sequência de DNA específica denominada promotor localizada próximo do início da região transcrita Um promotor é uma parte importante da região reguladora de um gene Relembre que tendo em vista que a síntese de um transcrito de RNA tem início na sua extremidade 5 e continua no sentido 5 para 3 a convenção é desenhar e fazer referência à orientação do gene também no sentido 5 para 3 Por esse motivo o filamento de DNA não molde normalmente é demonstrado Em geral a extremidade 5 é desenhada à esquerda e a 3 à direita Com essa visão tendo em vista que o promotor deve estar próximo da extremidade do gene na qual a transcrição tem início dizse que ele está na extremidade 5 do gene portanto a região promotora também é denominada região reguladora 5 Figura 87 A FIGURA 86 A sequência de mRNA é complementar ao filamentomolde de DNA a partir do qual ela é transcrita e portanto corresponde à sequência do filamento não molde exceto que o RNA apresenta U onde o DNA apresenta T Esta sequência é do gene para a enzima βgalactosidase A primeira base transcrita está sempre na mesma localização designada sítio de iniciação É feita referência ao promotor como upstream do sítio de iniciação tendo em vista que está localizado à frente do sítio de iniciação 5 do gene no sentido oposto ao da transcrição Um sítio downstream estaria localizado posteriormente no sentido da transcrição Por convenção a primeira base do DNA a ser transcrita é numerada 1 As posições dos nucleotídios upstream do sítio de iniciação são indicadas por um sinal negativo e aquelas dowstream por um sinal positivo A Figura 87 B demonstra as sequências promotoras de sete genes diferentes no genoma de E coli Tendo em vista que a mesma RNA polimerase se liga às sequências promotoras desses genes diferentes as semelhanças entre os promotores não são uma surpresa Em particular duas regiões de grande semelhança aparecem em virtualmente todos os casos Essas regiões foram denominadas as regiões 35 menos 35 e 10 tendo em vista que estão localizadas 35 pares de bases e 10 pares de bases respectivamente upstream da primeira base transcrita Elas estão demonstradas em amarelo na Figura 87 B Conforme você pode observar as regiões 35 e 10 de diferentes genes não precisam ser idênticas para realizar uma função semelhante Não obstante é possível chegar a uma sequência de nucleotídios denominada sequência consenso que está de acordo com a maior parte das sequências A sequência consenso do promotor de E coli está demonstrada na parte inferior da Figura 87 B Uma holoenzima RNA polimerase ver próximo parágrafo se liga ao DNA nesse ponto em seguida desenrola a duplahélice do DNA e inicia a síntese de uma molécula de RNA Observe na Figura 87 A que a parte do gene codificadora de proteína normalmente tem início em uma sequência ATG mas o sítio de iniciação onde a transcrição tem início normalmente está bem upstream dessa sequência A parte intercalar é denominada região 5 não traduzida 5 UTR A RNA polimerase bacteriana que procura no DNA uma sequência promotora é denominada holoenzima RNA polimerase Figura 88 Esse complexo multissubunidades é composto pelas cinco subunidades do cerne da enzima duas subunidades α uma β uma β e uma ω mais uma subunidade denominada fator sigma σ As duas subunidades α auxiliam na montagem da enzima e promovem interações com proteínas reguladoras a subunidade β é ativa na catálise a subunidade β se liga ao DNA e a subunidade ω apresenta papéis na montagem da enzima e na regulação da expressão gênica A subunidade σ se liga às regiões 10 e 35 posicionando assim a holoenzima para iniciar a transcrição corretamente no sítio de início ver Figura 88 A A subunidade σ também apresenta um papel na separação dissociação dos filamentos de DNA ao redor da região 10 de modo que o cerne da enzima consegue se ligar fortemente ao DNA no preparo para a síntese do RNA Após a ligação do cerne da enzima a transcrição tem início e a subunidade σ se dissocia do restante do complexo ver Figura 88 B FIGURA 87 A O promotor está localizado upstream em direção à extremidade 5 do ponto de início e das sequências codificadoras B Os promotores apresentam regiões de sequências semelhantes conforme indicado pelo sombreado em amarelo em sete diferentes sequências promotoras em E coli Os espaços pontos estão inseridos nas sequências para otimizar o alinhamento das sequências comuns Os números fazem referência ao número de bases antes ou após o ponto de iniciação da síntese de RNA A sequência consenso em relação à maior parte dos promotores de E coli está na parte inferior Dados de H Lodish D Baltimore A Berk S L Zipursky P Matsudaira e J Darnell Molecular Cell Biology 3rd ed A E coli assim como a maior parte das outras bactérias apresenta diversos fatores σ diferentes Um denominado σ70 em virtude de sua massa em quilodáltons ser 70 é a subunidade σ primária utilizada para iniciar a transcrição da vasta maioria dos genes de E coli Outros fatores σ reconhecem diferentes sequências promotoras Portanto por meio da associação com diferentes fatores σ o mesmo cerne enzimático consegue reconhecer diferentes sequências de promotor e transcrever diferentes conjuntos de genes Alongamento Na medida em que a RNA polimerase se movimenta ao longo do DNA ela desenrola o DNA à sua frente e enrola novamente o DNA que já foi transcrito Desse modo ela mantém uma região do DNA unifilamentar denominada bolha de transcrição dentro da qual o filamentomolde é exposto Na bolha a polimerase monitora a ligação de um ribonucleosídio trifosfato livre à próxima base exposta no molde de DNA e se houver complementariedade adicionaa à cadeia A energia para a adição de um nucleotídio é derivada da divisão do trifosfato de alta energia e da liberação de difosfato inorgânico de acordo com a fórmula geral a seguir FIGURA 88 A subunidade σ posiciona a RNA polimerase procariótica para o início da transcrição A A ligação da subunidade σ às regiões 10 e 35 posiciona as outras subunidades para a iniciação correta B Logo após o início da síntese de RNA a subunidade σ se dissocia das outras subunidades que continuam a transcrição A Figura 89 A fornece uma ilustração física do alongamento Dentro da bolha os últimos oito ou nove nucleotídios adicionados à cadeia de RNA formam um híbrido de RNADNA por meio do pareamento de bases complementares com o filamentomolde Na medida em que a cadeia de RNA é alongada em sua extremidade 3 a extremidade 5 é adicionalmente liberada da polimerase Os pares de bases complementares são quebrados no ponto de saída liberando o um filamento único Término A transcrição de um gene individual continua além do segmento do gene codificador de proteína criando uma região 3 não traduzida 3 UTR na extremidade do transcrito O alongamento prossegue até que a RNA polimerase reconhece sequências de nucleotídios especiais que atuam como um sinal em relação ao término da cadeia O encontro com os nucleotídios de sinal inicia a liberação do RNA nascente e da enzima do molde Figura 89 B Os dois mecanismos principais de término em E coli e em outras bactérias são denominados intrínseco e rhodependente No mecanismo intrínseco o término é direto As sequências de terminação contêm aproximadamente 40 pares de bases terminando em um trecho rico em GC que é seguido por um trecho de seis ou mais A Tendo em vista que G e C no molde fornecerão C e G respectivamente no transcrito o RNA nessa região também é rico em GC Essas bases C e G são capazes de formar ligações de hidrogênio complementares entre si resultando em uma alça em grampo Figura 810 Relembre que o par de bases GC é mais estável do que o par AT em virtude de estar ligado pelo hidrogênio em três sítos enquanto o par AT ou A U é mantido junto por apenas duas ligações de hidrogênio As alças em grampo do RNA que são largamente pares GC são mais estáveis do que as alças que são largamente constituídas por pares AU A estrutura em grampo é seguida por um trecho de aproximadamente oito U que são complementares aos resíduos de A no molde de DNA FIGURA 89 As cinco subunidades da RNA polimerase estão demonstradas como uma forma única semelhante a uma elipse circundando a bolha de transcrição A Alongamento a síntese de um filamento de RNA complementar à região unifilamentar do filamentomolde de DNA ocorre no sentido 5 para 3 O DNA que é desenrolado à frente da RNA polimerase é novamente enrolado após ter sido transcrito B Término o mecanismo intrínseco demonstrado aqui é um de dois modos utilizados para interromper a síntese de RNA e liberar o transcrito de RNA concluído e a RNA polimerase do DNA Neste caso a formação de uma alça em grampo estabelece a sua liberação Em relação a ambos os mecanismos intrínseco e mediado por rho o término primeiramente requer a síntese de determinadas sequências de RNA Normalmente na progressão do alongamento da transcrição a RNA polimerase irá pausar se o curto híbrido de DNARNA na bolha de transcrição for fraco e irá retroceder para estabilizar o híbrido Assim como nos grampos a força do híbrido é determinada pelo número relativo de pares de bases GC em comparação aos pares de bases AU ou pares de bases AT em híbridos de RNADNA No mecanismo intrínseco acreditase que a polimerase pause após a síntese das U AU forma um híbrido de DNARNA fraco Entretanto a polimerase ao retroceder encontra a alça em grampo Esse bloqueio no trajeto desencadeia a liberação do RNA da polimerase e a liberação da polimerase do molde de DNA O segundo tipo de mecanismo de término requer o auxílio de uma proteína denominada fator rho Essa proteína reconhece as sequências de nucleotídios que atuam como sinais de término para a RNA polimerase RNA com sinais de término rhodependentes não apresentam o trecho de resíduos U em sua extremidade 3 e normalmente não apresentam alças em grampo Em vez disso eles apresentam uma sequência de aproximadamente 40 a 60 nucleotídios que é rica em resíduos C e pobre em resíduos G e inclui um segmento upstream denominado sítio rut utilização de rho Rho é um hexâmero composto por seis subunidades idênticas que se ligam à cadeia de RNA nascente no sítio rut Esses sítios estão localizados logo upstream das sequências relembre que upstream significa a 5 de nas quais a RNA polimerase tende a pausar Após a ligação rho facilita a liberação do RNA da RNA polimerase Portanto o término rho dependente envolve a ligação de rho a rut a pausa da polimerase e a dissociação mediada por rho do RNA da RNA polimerase 83 1 FIGURA 810 A estrutura de um sítio de término para a RNA polimerase em bactérias A estrutura em grampo é formada por meio do pareamento de bases complementares em um filamento de RNA rico em GC A maior parte dos pareamentos de bases no RNA ocorre entre G e C mas existe um par AU CONCEITOCHAVE Os transcritos procarióticos são iniciados em 5 da região codificadora dos genes quando a RNA polimerase se liga a uma sequência promotora consenso ou quando ela se associa a um fator σ que a guia até uma sequência promotora não consenso O término da transcrição ocorre em sequências especiais 3 da região codificadora que são intrínsecas ou rhodependentes Transcrição em eucariotos Conforme descrito no Capítulo 7 a replicação do DNA em eucariotos embora mais complicada é muito semelhante à replicação do DNA em procariotos De algum modo o mesmo pode ser dito em relação à transcrição tendo em vista que eucariotos retêm muitos dos eventos associados à iniciação ao alongamento e ao término em procariotos A transcrição é mais complicada em eucariotos por causa de três motivos primários Os genomas eucarióticos maiores apresentam muito mais genes a ser a b c 2 reconhecidos e transcritos Enquanto as bactérias normalmente apresentam alguns milhares de genes os eucariotos apresentam dezenas de milhares de genes Além disso existe muito mais DNA não codificador em eucariotos O DNA não codificador originase por uma diversidade de mecanismos que serão discutidos no Capítulo 15 Assim embora os eucariotos apresentem mais genes do que os procariotos seus genes estão em média mais distantes Por exemplo enquanto a densidade de genes número médio de genes por comprimento de DNA na E coli é de 1 gene por 1400 pb esse número cai para 1 gene por 9000 pb na moscadasfrutas Drosophila e é de apenas 1 gene por 100000 pb nos seres humanos Essa baixa densidade de genes torna a etapa de iniciação da transcrição um processo muito mais complicado Nos genomas de eucariotos multicelulares encontrar o início de um gene pode ser como encontrar uma agulha em um palheiro Como você verá os eucariotos lidam com essa situação de diversos modos Primeiramente eles dividiram o trabalho da transcrição entre três polimerases diferentes A RNA polimerase I transcreve os genes de rRNA excluindo o rRNA 5S A RNA polimerase II transcreve todos os genes codificadores de proteínas em relação aos quais o transcrito final é o mRNA e transcreve alguns snRNA A RNA polimerase III transcreve os pequenos genes de RNA funcional tais como os genes para tRNA alguns snRNA e o rRNA 5S Nesta seção focaremos nossa atenção na RNA polimerase II Em segundo lugar os eucariotos necessitam da montagem de muitas proteínas em um promotor antes que a RNA polimerase II possa começar a sintetizar o RNA Algumas dessas proteínas denominadas fatores gerais de transcrição GTF do inglês general transcription factors ligamse antes da ligação da RNA polimerase II enquanto outras se ligam posteriormente O papel dos GTF e sua interação com a RNA polimerase II serão descritos na próxima seção sobre o início da transcrição em eucariotos Uma diferença significativa entre eucariotos e procariotos é a presença de 3 um núcleo em eucariotos Em procariotos que apresentam ausência de uma membrana nuclear a informação no RNA é quase imediatamente traduzida em uma cadeia de aminoácidos polipeptídios conforme veremos no Capítulo 9 Em eucariotos a transcrição e a tradução são espacialmente separadas a transcrição ocorre no núcleo e a tradução no citoplasma Figura 811 Em eucariotos o RNA é sintetizado no núcleo onde o DNA está localizado e é exportado do núcleo para o citoplasma para tradução Antes que o RNA deixe o núcleo ele deve ser modificado de diversos modos Essas modificações são coletivamente denominadas processamento do RNA Para distinguir o RNA antes e após o processamento o RNA recém sintetizado é denominado transcrito primário ou prémRNA e o termo mRNA é reservado para o transcrito totalmente processado que pode ser exportado para fora do núcleo Conforme veremos a extremidade 5 do RNA é submetida ao processamento enquanto a extremidade 3 ainda está sendo sintetizada Portanto a RNA polimerase II deve sintetizar o RNA enquanto coordena simultaneamente um arranjo diverso de eventos de processamento Por esse motivo entre outros a RNA polimerase II é uma enzima formada por multissubunidades mais complexa que a RNA polimerase procariótica Na verdade ela é considerada outra máquina molecular A coordenação do processamento e da síntese do RNA pela RNA polimerase II será discutida na seção sobre o alongamento da transcrição em eucariotos Finalmente o molde para a transcrição o DNA genômico está organizado em cromatina nos eucariotos ver Capítulo 1 enquanto está virtualmente despido em procariotos Como você aprenderá no Capítulo 12 determinadas estruturas da cromatina podem bloquear o acesso da RNA polimerase ao molde de DNA Essa característica da cromatina se desenvolveu em um mecanismo muito sofisticado para a regulação da expressão gênica em eucariotos Entretanto uma discussão sobre a influência da cromatina na capacidade da RNA polimerase II de iniciar a transcrição será colocada à margem até o Capítulo 12 tendo em vista que focamos nos eventos que ocorrem após a RNA polimerase II ter o acesso ao molde de DNA Iniciação da transcrição em eucariotos Como declarado anteriormente a transcrição tem início em procariotos quando a subunidade σ da holoenzima RNA polimerase reconhece as regiões 10 e 35 no promotor de um gene Após o início da transcrição a subunidade σ se dissocia e o cerne da polimerase continua a sintetizar o RNA dentro de uma bolha de transcrição que se movimenta ao longo do DNA De modo semelhante em eucariotos o cerne da RNA polimerase II também não consegue reconhecer sequências promotoras por si próprio Entretanto contrariamente às bactérias nas quais o fator σ é uma parte integrante da holoenzima polimerase os eucariotos necessitam de GTF para se ligar às regiões no promotor antes da ligação do cerne da enzima FIGURA 811 A transcrição e a tradução ocorrem no mesmo compartimento celular em procariotos mas em compartimentos diferentes nos eucariotos Além disso contrariamente aos transcritos de RNA procarióticos os transcritos eucarióticos são submetidos a um extensivo processamento antes que possam ser traduzidos em proteínas O início da transcrição em eucariotos apresenta algumas características que são reminiscentes do início da replicação do DNA nas origens de replicação Relembre do Capítulo 7 que proteínas que não são parte do replissomo iniciam a montagem da máquina de replicação A proteína DnaA em E coli e o complexo de reconhecimento da origem ORC em leveduras por exemplo primeiramente reconhecem e se ligam à origem nas sequências de DNA Essas proteínas atuam para atrair proteínas de replicação incluindo a DNA polimerase III por meio de interações proteínaproteína De modo semelhante GTF que não participam da síntese de RNA reconhecem e se ligam às sequências no promotor ou a outros GTF e atuam para atrair o cerne da RNA polimerase II e posicionálo no sítio correto a fim de iniciar a transcrição Os GTF são designados TFIIA TFIIB e assim por diante em referência a transcription factor of RNA polymerase II fator de transcrição da RNA polimerase II em inglês Os GTF e o cerne da RNA polimerase II constituem o complexo de pré iniciação PIC do inglês preinitiation complex Esse complexo é consideravelmente grande ele contém seis GTF cada um dos quais é um complexo multiproteico mais o cerne da RNA polimerase II que é composto por uma dúzia ou mais de subunidades proteicas A sequência de aminoácidos de algumas das subunidades do cerne da RNA polimerase II é conservada desde leveduras até seres humanos Essa conservação pode ser dramaticamente demonstrada por meio da substituição de algumas subunidades de RNA polimerase II de levedura por suas correspondentes humanas para formar um complexo de RNA polimerase II quimérico denominado em referência a uma criatura da mitologia grega que lançava fogo e que apresentava uma cabeça de leão um corpo de cabra e uma cauda de serpente Esse complexo de RNA polimerase II quimérico é totalmente funcional em leveduras Assim como os promotores procarióticos os promotores eucarióticos estão localizados no lado 5 upstream do sítio de início da transcrição Quando regiões promotoras eucarióticas de diferentes espécies são alinhadas com frequência podese observar que a sequência TATA está localizada a aproximadamente 30 pares de bases 30 pb do local de início da transcrição Figura 812 Essa sequência denominada TATA boxe é o sítio do primeiro evento na transcrição a ligação da proteína de ligação a TATA TBP do inglês TATAbinding protein A TBP é parte do complexo TFIID um dos seis GTF Quando ligada ao TATA boxe a TBP atrai outros GRF e o cerne da RNA polimerase II para o promotor formando assim o PIC Após o início da transcrição a RNA polimerase II se dissocia da maior parte dos GTF para alongar o transcrito primário de RNA Alguns dos GTF permanecem no promotor para atrair o próximo cerne de RNA polimerase Assim diversas enzimas RNA polimerase II podem sintetizar simultaneamente transcritos de um único gene Como o cerne da RNA polimerase II é capaz de se separar dos GTF e iniciar a transcrição Embora os detalhes desse processo ainda estejam sendo analisados sabese que a subunidade β da RNA polimerase II contém uma cauda proteica denominada domínio carboxiterminal CTD do inglês carboxy terminal domain que desempenha um papelchave O CTD está estrategicamente localizado próximo ao sítio no qual o RNA nascente surgirá a partir da polimerase A fase de iniciação termina e a fase de alongamento tem início após o CTD ter sido fosforilado por um dos GTF Acreditase que essa fosforilação de algum modo enfraqueça a ligação da RNA polimerase II com outras proteínas do PIC e possibilite o alongamento O CTD também participa em diversas outras fases críticas da síntese e do processamento do RNA Iniciação da transcrição em eucariotos FIGURA 812 A formação do complexo de préiniciação normalmente tem início com a ligação da proteína de ligação a TATA TBP que em seguida recruta os outros fatores gerais de transcrição GTF e a RNA polimerase II para o sítio de início da transcrição A transcrição tem início após a fosforilação do domínio carboxiterminal CTD da RNA polimerase II CONCEITOCHAVE Os promotores eucarióticos são reconhecidos primeiramente pelos fatores gerais de transcrição GTF A função dos GTF é atrair o cerne da RNA polimerase II de modo que ela seja posicionada para iniciar a síntese de RNA no sítio de início da transcrição Alongamento término e processamento de prémRNA em eucariotos O alongamento ocorre dentro da bolha de transcrição essencialmente conforme descrito em relação à síntese do RNA procariótico Entretanto o RNA nascente apresenta destinos muito diferentes em procariotos e em eucariotos Em procariotos a tradução tem início na extremidade 5 do RNA nascente enquanto a metade 3 ainda está sendo sintetizada Contrariamente o RNA dos eucariotos deve ser submetido a um processamento adicional antes que ele possa ser traduzido Esse processamento inclui 1 a adição de um revestimento cap na extremidade 5 2 a recomposição splicing para eliminar os íntrons e 3 a adição de uma cauda de nucleotídios adenina poliadenilação em 3 Assim como a replicação do DNA a síntese e o processamento do prémRNA em mRNA requerem que muitas etapas sejam realizadas rapidamente e com precisão Primeiramente acreditavase que a maior parte do processamento do prémRNA eucariótico ocorresse após a conclusão da síntese do RNA O processamento após a conclusão da síntese do RNA é denominado pós transcricional Entretanto atualmente evidências experimentais indicam que o processamento realmente ocorre durante a síntese de RNA ele é cotranscricional Portanto o RNA parcialmente sintetizado nascente está sendo submetido a reações de processamento na medida em que emerge do complexo da RNA polimerase II O CTD da RNA polimerase II eucariótica desempenha um papel central na coordenação de todos os eventos de processamento O CTD é composto por muitas repetições de uma sequência de sete aminoácidos Essas repetições atuam como sítios de ligação para algumas das enzimas e outras proteínas que são necessárias para o revestimento do RNA a recomposição e a clivagem seguida pela poliadenilação O CTD está localizado próximo do sítio onde o RNA nascente emerge da polimerase e assim está em um local ideal para orquestrar a ligação e a liberação das proteínas necessárias para processar o transcrito de RNA nascente enquanto a síntese do RNA continua Nas diversas fases do processamento os aminoácidos do CTD são modificados de modo reversível normalmente por meio da adição e da remoção de grupos fosfato denominadas fosforilação e desfosforilação respectivamente O estado de fosforilação do CTD determina que proteínas de processamento podem se ligar Desse modo o CTD determina a tarefa a ser realizada no RNA na medida em que ele emerge da polimerase Os eventos de processamento e o papel do CTD na sua execução estão demonstrados na Figura 813 e são considerados em seguida Processamento cotranscricional do RNA FIGURA 813 O processamento cotranscricional do RNA é coordenado pelo domínio carboxiterminal CTD da subunidade β da RNA polimerase II A fosforilação reversível dos aminoácidos de CTD indicada por P cria sítios de ligação para as diferentes enzimas de processamento e os fatores necessários para A revestimento B recomposição C clivagem e polidenilação Processamento das extremidades 5 e 3 A Figura 813 A ilustra o processamento da extremidade 5 do transcrito de um gene codificador de proteína Quando o RNA nascente emerge pela primeira vez a partir da RNA polimerase II uma estrutura especial denominada cap revestimento é adicionada à extremidade 5 por diversas proteínas que interagem com o CTD O cap consiste em um resíduo 7metilguanosina ligado ao transcrito por três grupos fosfato O cap apresenta duas funções Primeiramente ele protege o RNA da degradação em sua longa jornada até o local da tradução Em segundo lugar conforme você verá no Capítulo 9 o cap é necessário para a tradução do mRNA O alongamento do RNA continua até que a sequência conservada AAUAAA ou AUUAAA seja alcançada marcando a extremidade 3 do transcrito Uma enzima reconhece aquela sequência e corta a extremidade do RNA a aproximadamente 20 bases adiante A essa extremidade cortada é adicionado um trecho de 150 a 200 nucleotídios adenina denominado cauda poliA ver Figura 813 C Portanto a sequência AAUAAA do mRNA de genes codificadores de proteínas é denominada sinal de poliadenilação Recomposição do RNA a remoção de íntrons Em 1977 surgiu um estudo científico intitulado An amazing sequence arrangement at the 5 end of adenovirus 2 messenger RNA Um arranjo incrível de sequência na extremidade 5 do RNA mensageiro do adenovírus 21 Os cientistas normalmente suavizam suas palavras pelo menos em suas publicações e a utilização da palavra amazing incrível indicou que algo verdadeiramente inesperado havia sido observado Os laboratórios de Richard Roberts e Phillip Sharp haviam descoberto de modo independente que a informação codificada pelos genes eucarióticos no caso o gene de um vírus que infecta células eucarióticas pode ser fragmentada em segmentos de dois tipos éxons e íntrons Conforme declarado anteriormente os segmentos que codificam partes das proteínas são os éxons e os segmentos que separam os éxons são os íntrons Os íntrons estão presentes não apenas em genes codificadores de proteínas mas também em alguns rRNA e até mesmo em genes de tRNA Os íntrons são removidos do transcrito primário enquanto o RNA ainda está sendo transcrito e após o cap ter sido adicionado mas antes de o transcrito ser transportado para o citoplasma A remoção dos íntrons e a união dos éxons é denominada recomposição splicing tendo em vista que é reminiscente do modo pelo qual uma fita de vídeo ou um filme podem ser cortados e reunidos para deletar um segmento específico A recomposição une as regiões codificadoras ou éxons de modo que o mRNA agora contém uma sequência codificadora que é completamente colinear à proteína que ela codifica O número e o tamanho dos íntrons varia de gene para gene e de espécie para espécie Por exemplo apenas 200 dos 6300 genes em leveduras apresentam íntrons enquanto genes típicos em mamíferos incluindo seres humanos apresentam diversos O tamanho médio de um íntron de mamífero é de aproximadamente 2000 nucleotídios e um éxon médio apresenta aproximadamente 200 nucleotídios portanto uma porcentagem maior de DNA em mamíferos codifica íntrons em vez de éxons Um exemplo extremo é o gene humano da distrofia muscular de Duchenne Esse gene apresenta 79 éxons e 78 íntrons em seus 25 milhões de pares de bases Quando submetidos à recomposição seus 79 éxons produzem um mRNA de 14000 nucleotídios o que significa que os íntrons são responsáveis pela vasta maioria dos 25 milhões de pares de bases Recomposição alternativa Nesse ponto você pode estar ponderando a respeito da utilidade de ter genes organizados em éxons e íntrons Relembre que este capítulo teve início com uma discussão sobre o número de genes no genoma humano Esse número agora estimado em aproximadamente 21000 genes é inferior ao dobro da quantidade de genes em nematódeos ainda que o espectro de proteínas humanas denominado proteoma ver Capítulo 9 seja superior a 70000 O fato de as proteínas superarem tanto o número de genes indica que um gene pode codificar informação para mais de uma proteína Um modo como um gene pode codificar múltiplas proteínas é por meio de um processo denominado recomposição alternativa ou splicing alternativo Nesse processo diferentes mRNAs e subsequentemente diferentes proteínas são produzidos a partir do mesmo transcrito primário por meio da recomposição de diferentes combinações de éxons Por motivos que atualmente são desconhecidos a proporção de genes submetidos à recomposição alternativa varia de espécie para espécie Embora a recomposição alternativa seja rara em plantas mais de 70 dos genes humanos são recompostos de maneira alternativa Muitas mutações com consequências sérias para o organismo ocorrem em virtude de defeitos na recomposição As consequências da recomposição alternativa sobre a estrutura e a função proteica serão apresentadas posteriormente no livro Por enquanto é suficiente dizer que as proteínas produzidas por meio da recomposição alternativa normalmente estão relacionadas tendo em vista que elas normalmente contêm subconjuntos dos mesmos éxons do transcrito primário e que com frequência elas são utilizadas em diferentes tipos celulares ou em diferentes estágios do desenvolvimento A Figura 814 demonstra a miríade de combinações produzidas por meio da recomposição alternativa do transcrito primário de RNA do gene da αtropomiosina O mecanismo de recomposição é considerado na próxima seção CONCEITOCHAVE O prémRNA eucariótico é extensivamente processado antes de ser transportado como mRNA até o citoplasma para a tradução em proteína São adicionados um cap em 5 e uma cauda poliA em 3 os íntrons são removidos e os éxons são unidos Um gene pode codificar mais de um polipeptídio quando o seu prémRA é submetido à recomposição alternativa 84 FIGURA 814 O prémRNA transcrito do gene da αtropomiosina de rato é submetido à recomposição alternativa em diferentes tipos celulares Os campos verdeclaros representam íntrons as outras cores representam éxons Os sinais de poliadenilação estão indicados por um A As linhas tracejadas nos mRNA maduros indicam regiões que foram removidas pela recomposição TM Tropomiosina Dados de J P Lees et al Mol Cell Biol 10 1990 17291742 Remoção de íntrons e recomposição de éxons Em virtude de o RNA ser uma molécula tão versátil ele participa em uma diversidade de processos celulares No Capítulo 9 você aprenderá mais a respeito do papel dos RNA funcionais como importantes componentes do ribossomo a máquina biológica que é o local da síntese proteica Nesta seção e na próxima você verá que os RNA funcionais também apresentam papéis proeminentes no processamento do mRNA e na regulação de seu nível na célula Pequenos RNA nucleares snRNA O mecanismo de recomposição de éxons Após a descoberta dos éxons e dos íntrons cientistas voltaram a sua atenção para o mecanismo de recomposição do RNA Tendo em vista que os íntrons precisam ser removidos com precisão e que os éxons precisam ser unidos com precisão a primeira abordagem foi comparar as sequências de prémRNA para indicações sobre como os íntrons e os éxons são reconhecidos A Figura 815 demonstra as junções éxoníntron dos prémRNA Essas junções são os sítios nos quais ocorrem as reações de recomposição Nessas junções observouse que determinados nucleotídios específicos são quase idênticos entre os genes e entre as espécies eles foram altamente conservados em virtude de participarem nas reações de recomposição Cada íntron é cortado em cada extremidade e essas extremidades do íntron quase sempre apresentam GU na extremidade 5 e AG na extremidade 3 a regra GUAG Outro sítio invariante é um resíduo A o ponto de ramificação A entre 15 e 45 nucleotídios upstream do sítio de corte 3 Os nucleotídios que flanqueiam os nucleotídios altamente conservados também são conservados mas em menor grau A existência de sequências de nucleotídios conservadas nas junções de corte sugeriu que deve haver uma maquinaria celular que reconhece essas sequências e realiza a recomposição Assim como em geral ocorre na pesquisa científica a maquinaria de recomposição foi encontrada acidentalmente e o mecanismo da recomposição era totalmente inesperado FIGURA 815 Sequências de nucleotídios conservados estão presentes nas junções de íntrons e éxons Os números abaixo dos nucleotídios indicam a porcentagem de semelhança entre os organismos De particular importância são os resíduos G e U na extremidade 5 e os resíduos A e G na extremidade 3 e o resíduo A rotulado ponto de ramificação ver Figura 817 para uma visão da estrutura da ramificação N representa qualquer base Um achado afortunado no laboratório de Joan Steitz levou à descoberta dos componentes da maquinaria de recomposição Pacientes com uma diversidade de doenças autoimunes incluindo lúpus eritematoso sistêmico produzem anticorpos contra suas próprias proteínas Durante a análise de amostras sanguíneas de pacientes com lúpus Steitz e colegas identificaram anticorpos que conseguiam se ligar a um grande complexo molecular de pequenos RNA e proteínas Em virtude de esse complexo riboproteico estar localizado no núcleo os componentes do RNA foram denominados pequenos RNA nucleares Observouse que os snRNA são complementares às sequências consenso nas junções de recomposição levando os cientistas a formularem a hipótese de um papel para os snRNA no processo de recomposição Os nucleotídios conservados no transcrito sabidamente são reconhecidos por cinco pequenas ribonucleoproteínas nucleares snRNP que são complexos de proteínas e um de cinco snRNA U1 U2 U4 U5 e U6 Essas snRNP e mais de 100 proteínas adicionais são parte do spliceossomo a grande máquina biológica que remove os íntrons e une os éxons Os componentes do spliceossomo interagem com o CTD conforme sugerido na Figura 813 B Esses componentes do spliceossomo se unem às sequências de íntrons e éxons conforme demonstrado na Figura 816 As snRNP U1 e U2 ajudam a alinhar os sítios de corte em qualquer extremidade de um íntron por meio da formação de ligações de hidrogênio com o íntron conservado e as sequências de éxons Em seguida os snRNP recrutam U4 U5 e U6 e formam o spliceossomo que catalisa a remoção do íntron por meio de duas etapas consecutivas de recomposição ver Figura 816 A primeira etapa une uma extremidade do íntron à adenina interna conservada formando uma estrutura em alça no formato de um laço de caubói A segunda etapa libera o laço e une os dois éxons adjacentes A Figura 817 retrata a química por trás da remoção do íntron e da recomposição dos éxons Quimicamente as duas etapas são reações de transesterificação entre os nucleotídios conservados Os grupos hidroxila nas posições 2 e 3 dos ribonucleotídios são participanteschave da reação Montagem e função do spliceossomo FIGURA 816 O spliceossomo é composto por diversos snRNP que se ligam sequencialmente ao RNA geralmente nas posições conforme demonstradas O alinhamento dos snRNP resulta das ligações de hidrogênio de suas moléculas de snRNA com as sequências complementares do íntron Desse modo os reagentes são adequadamente alinhados e as duas reações de recomposição podem ocorrer A química destas reações pode ser observada em mais detalhes na Figura 817 Reações na recomposição de éxons FIGURA 817 Duas reações de transesterificação ocorrem na recomposição do RNA primeiramente para unir a extremidade 5 doadora do íntron ao ponto de ramificação interno primeira reação na Figura 816 e em segundo lugar para unir os dois éxons segunda reação na Figura 816 Autorrecomposição de íntrons e o mundo do RNA Dois casos excepcionais de processamento de RNA levaram a uma descoberta considerada por alguns tão importante quanto a da estrutura da duplahélice do DNA Em 1981 Tom Cech e colaboradores relataram que em um tubo de ensaio o transcrito primário de um rRNA do protozoário ciliado Tetrahymena conseguiu remover um íntron de 413 nucleotídios próprio seu sem a adição de qualquer proteína Figura 818 Subsequentemente foi demonstrado que outros íntrons apresentam essa propriedade e eles passaram a ser conhecidos como íntrons de autorremoção Alguns anos antes enquanto estudava o processamento do tRNA em bactérias Sidney Altman identificou uma ribonucleoproteína denominada RNase P responsável pelo corte da molécula de prétRNA em um sítio específico A grande surpresa surgiu quando eles determinaram que a atividade catalítica da RNase P estava localizada no componente RNA da enzima não no componente proteico Os achados de Cech e Altman são considerados marcantes tendo em vista que assinalavam a primeira vez em que foi demonstrado que outras moléculas biológicas além de proteínas catalisam reações Como tal era justo que recebessem o Prêmio Nobel em Química em 1989 FIGURA 818 O íntron autorremovível do Tetrahymena executa duas reações de transesterificação para se autorremover do RNA A descoberta dos íntrons de autorremoção levou a um reexame do papel dos snRNA no spliceossomo Os estudos mais recentes indicam que a remoção dos íntrons é catalisada pelos snRNA e não pelo componente proteico do 85 spliceossomo Conforme veremos no Capítulo 9 os RNA no ribossomo os rRNA não as proteínas ribossômicas apresentam o papel central na maior parte dos eventos importantes da síntese proteica Os diversos exemplos de ribozimas forneceram evidências sólidas em relação a uma teoria denominada mundo do RNA que sustenta que o RNA deve ter sido o material genético nas primeiras células tendo em vista que apenas o RNA sabidamente codifica informação genética e catalisa reações biológicas CONCEITOCHAVE A remoção dos íntrons e a união dos éxons são catalisadas por moléculas de RNA Em eucariotos os snRNA do spliceossomo catalisam a remoção de íntrons do prémRNA Alguns íntrons são autorremovíveis nesses casos o próprio íntron catalisa a sua própria remoção RNA capazes de catálise são denominados ribozimas Pequenos RNA funcionais que regulam e protegem o genoma eucariótico Em 2002 um dos principais periódicos científicos a revista Science nomeou o Pequeno RNA sua descoberta do ano Os RNA aos quais eles estavam se referindo não eram os pequenos RNA descritos anteriormente tais como os snRNA ou tRNA que são considerados mantenedores e como tal são sintetizados constitutivamente Em vez disso esses outros pequenos RNA são sintetizados em resposta a alterações no estado do desenvolvimento de uma célula ou no ambiente celular Atualmente sabemos que eles são criticamente importantes para a manutenção de um genoma estável e para a regulação da expressão gênica Os miRNA são importantes reguladores da expressão gênica O primeiro desse tipo de pequenos RNA foi descoberto em 1993 por Victor Ambros e colegas enquanto estudavam o gene lin4 do nematódeo C elegans Tendo em vista que mutações no lin4 resultavam em larvas anormais foi formulada a hipótese de que esse gene codificava uma proteína que era necessária para o desenvolvimento normal da larva Portanto foi uma surpresa quando o grupo isolou o gene lin4 e relatou que em vez de codificar uma proteína ele produzia dois pequenos RNA de 22 nucleotídios e 61 nucleotídios Em seguida eles observaram que o RNA de 22 nucleotídios era produzido por meio do processamento do RNA maior de 61 nucleotídios Finalmente eles observaram que o RNA de 22 nucleotídios reprimia a expressão de determinados outros genes por meio do pareamento de bases com seus mRNA O produto do RNA de 22 nucleotídios do gene lin4 foi o primeiro membro a ser descoberto de uma classe muito grande de RNA denominados microRNA miRNA agora sabidamente presentes nos genomas de plantas e de animais A maior parte dos miRNA atua para reprimir a expressão de genes De fato estima se que cada um dos genomas de plantas e de animais apresente até 1000 miRNA que por sua vez regulam a expressão de milhares de genes Assim como o produto de lin4 muitos miRNA são inicialmente transcritos pela RNA polimerase II como um RNA mais longo de um gene que produz apenas um produto de RNA O RNA mais longo assume uma estrutura em alça com haste de filamento duplo com uma base errada na haste Figura 819 O RNA é processado no núcleo até uma forma menor porém ainda não final e em seguida é exportado para o citoplasma Ali duas máquinas biológicas ambas com a capacidade de clivar o RNA participam em um processo de duas etapas Uma máquina denominada Dicer reconhece as moléculas de RNA de filamento duplo dsRNA e as cliva em produtos de aproximadamente 22 nucleotídios Uma segunda máquina denominada RISC complexo de silenciamento induzido por RNA do inglês RNAinduced silencing complex ligase ao dsRNA curto e o desenrola formando o miRNA de filamento único biologicamente ativo O miRNA ainda ligado ao RISC ligase a mRNA complementares O RISC em seguida reprime a tradução desses mRNA em proteínas ou remove a cauda poliA o que acelera a degradação do mRNA No exemplo demonstrado na Figura 819 o miRNA do lin4 se liga aos mRNA de lin14 e lin28 e reprime a sua tradução FIGURA 819 Os miRNA são sintetizados pela RNA pol II como RNA mais longos que são processados em diversas etapas até a sua forma madura Uma vez totalmente processados os miRNA se ligam ao RISC e direcionam as suas atividades para reduzir a expressão de mRNA complementares por meio da repressão de sua tradução ou da promoção de sua degradação Você aprenderá mais a respeito da função dos miRNA nos Capítulos 12 e 13 O pontochave a ser relembrado é que parte de um miRNA é complementar ao RNA do gene que ele regula Quando o gene regulado precisa ser desligado ou a sua expressão precisa ser reduzida o gene do miRNA é transcrito em RNA e aquele RNA se liga ao RNA do gene regulado interferindo na tradução em proteína ou promovendo a sua degradação CONCEITOCHAVE Os miRNA são processados a partir de transcritos mais longos da RNA pol II pela Dicer que se liga aos RNA de filamento duplo O miRNA de filamento único biologicamente ativo se liga ao RISC e o direciona até sequências complementares em mRNA codificadores de proteínas onde o RISC reprime a tradução ou promove a degradação do mRNA Os siRNA asseguram a estabilidade do genoma Os cientistas logo encontraram um caso diferente de dsRNA que poderia reprimir a expressão gênica antes da tradução Esse achado levou à descoberta de um segundo tipo de RNA curto os siRNA Esse segundo tipo de RNA curto apresenta origem e função muito diferentes dos miRNA Contrariamente aos miRNA um siRNA silencia o gene que o produz Portanto ele não é utilizado para regular outros genes mas em vez disso para desativar elementos genéticos indesejáveis que se inserem no genoma Os referidos elementos indesejáveis podem ser genes em um vírus infectante ou podem ser elementos genéticos internos denominados transpósons a respeito dos quais você aprenderá no Capítulo 15 Em 1998 5 anos após a descoberta dos miRNA Andrew Fire e Craig Mello relataram que haviam encontrado um modo potente de desligar seletivamente genes também no nematódeo C elegans Fire e Mello descobriram que ao injetar cópias do dsRNA de um gene de C elegans em embriões de C elegans eles conseguiram bloquear a síntese do produto proteico daquele gene Figura 820 A O desligamento seletivo do gene por meio desse procedimento é denominado silenciamento gênico O dsRNA havia sido sintetizado no laboratório e era composto por um filamento de RNA senso codificador e um filamento de RNA antissenso complementar Em seu experimento inicial Fire e Mello injetaram cópias de dsRNA do gene unc22 em embriões de C elegans e observaram na medida em que os embriões cresciam até adultos que se contraíam e que apresentavam defeitos musculares Esse resultado era animador tendo em vista que sabidamente o unc22 codificava uma proteína muscular e mutantes nulos de unc22 demonstravam as mesmas contrações e os mesmos defeitos musculares Consideradas em conjunto essas observações indicaram que o dsRNA injetado evitou a produção da proteína Unc22 Em virtude de sua descoberta sobre um novo modo de silenciar genes Fire e Mello receberam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 2004 FIGURA 820 Três experimentos revelam características fundamentais do silenciamento gênico A Fire e Mello demonstraram que cópias de dsRNA podem silenciar seletivamente genes em C elegans B Jorgensen descobriu que um transgene pode silenciar um gene endógeno de petúnia necessário para a cor das flores C Baulcombe demonstrou que plantas com uma cópia de um transgene viral eram resistentes à infecção viral e produziam siRNA complementares ao genoma viral Em vez de uma cópia de dsRNA de um gene o que aconteceria se uma cópia de DNA de um gene normalmente observado em um organismo fosse inserida no seu genoma Em um referido experimento o gene introduzido seria um exemplo de um transgene que é uma abreviação de gene transformado Um transgene é um gene que foi introduzido nos cromossomos de um organismo em laboratório Um organismo que contém um transgene em seu genoma é denominado organismo transgênico ou organismo geneticamente modificado ou o termo abreviado popular OGM Esse experimento foi realmente realizado em 1990 por Rich Jorgensen um cientista de plantas que estudava a cor das flores em petúnias Um dos maiores prazeres de realizar pesquisas científicas é a observação de um resultado completamente inesperado Isso é precisamente o que ocorreu com Jorgensen após ter inserido um gene de petúnia que codifica uma enzima necessária para a síntese do pigmento floral roxoazulado em uma planta de petúnia normal que apresenta flores roxoazuladas Figura 820 B Ele esperava que a cor das flores dessa planta transgênica não fosse alterada Afinal a planta transgênica apresentava dois genes necessários para a produção do pigmento um em seu locus habitual no genoma da petúnia denominado gene endógeno na Figura 820 B ele é denominado gene de pigmento mais o transgene introduzido que foi inserido em outro local no genoma Entretanto em vez de flores roxas as plantas transgênicas demonstraram os padrões florais incomuns demonstrados na Figura 821 Em um desfecho totalmente inesperado o transgene acionou a supressão de ambos o transgene e o gene de pigmento endógeno resultando em flores brancas ou mais comumente setores florais brancos Esse fenômeno é denominado cossupressão tendo em vista que a expressão de ambos o transgene introduzido e a cópia endógena é suprimida Para uma revisão a introdução de uma cópia de dsRNA de um gene ou do próprio gene dentro de um organismo pode silenciar aquele gene Para compreender o motivo pelo qual esses diferentes experimentos levaram ao mesmo resultado cientistas formularam a hipótese de que a inserção do transgene levou à síntese de RNA antissenso que poderia se complementar com um RNA senso para produzir dsRNA Tendo em vista que os cientistas não podem controlar onde os transgenes são inseridos alguns transgenes acabarão próximos a genes em uma orientação oposta Figura 822 A transcrição iniciada no promotor gênico pode prosseguir a leitura através do transgene e produzir um RNA quimérico muito longo que contém tanto o filamento com sentido senso do gene quanto o filamento antissenso do transgene RNA bifilamentar em seguida será formado quando a parte antissenso do RNA longo hibridizar com o RNA senso produzido pelo transgene ou pelo gene endógeno Portanto o dsRNA é uma característica comum desse tipo se silenciamento gênico Entretanto a função desse processo claramente não é desligar genes introduzidos pelos cientistas Qual é o papel normal desse tipo de silenciamento gênico na célula Uma indicação importante surgiu a partir dos experimentos conduzidos por outro cientista de plantas David Baulcombe que estava investigando o motivo pelo qual as plantas de tabaco que eram modificadas para expressar um gene viral eram resistentes à infecção subsequente pelo vírus Nesse experimento o gene viral é outro exemplo de um transgene o qual nesse caso foi introduzido no genoma do tabaco ver Figura 820 C Uma diferençachave entre este e o experimento com petúnias foi que as plantas do tabaco normalmente não apresentam um gene viral no seu genoma Assim esse experimento sugeriu que esse tipo de silenciamento gênico atue para silenciar vírus invasores FIGURA 821 A O fenótipo do tipo selvagem nenhum transgene B e C Os assim denominados fenótipos de cossupressão que resultam da transformação da petúnia do tipo selvagem demonstrada na parte A com um gene de petúnia necessário para a pigmentação Nas regiões incolores ambos o transgene e a cópia cromossômica do mesmo gene foram inativados Richard Jorgensen Department of Plant Biology Carnegie Institution for Science FIGURA 822 A inserção de um transgene pode levar à produção de RNA bifilamentar dsRNA se o transgene for inserido na extremidade de um gene em orientação oposta O RNA antissenso produzido quando o gene vizinho é transcrito pode se ligar ao mRNA do próprio transgene ou do gene endógeno para produzir dsRNA Baulcombe e seus colaboradores observaram que as plantas resistentes e apenas as plantas resistentes produziam grandes quantidades de pequenos RNA de 25 nucleotídios de comprimento que eram complementares ao genoma viral Significativamente também foi observado que os pequenos RNA relacionados com os genes endógenos estão presentes durante o silenciamento gênico no nematódeo e na petúnia Os RNA curtos gerados durante a resistência viral e o silenciamento gênico associados aos dsRNA ou transgenes injetados atualmente são denominados coletivamente pequenos RNA de interferência siRNA do inglês small interfering RNAs O fenômeno que resulta no silenciamento gênico e na resistência viral por meio da produção de siRNA é denominado RNA de interferência RNAi do inglês RNA interference Os RNA curtos 21 a 31 nucleotídios de comprimento atualmente são classificados como um de três tipos dependendo da sua biogênese miRNA ou siRNA ambos com 21 a 25 nucleotídios ou os recentemente descobertos RNA de interação piwi piRNA do inglês piwiinteracting RNAs 24 a 31 nucleotídios Tendo em vista que o mecanismo da síntese de piRNA ainda está em investigação enfocaremos os mais bemcaracterizados miRNA e siRNA Mecanismos semelhantes geram siRNA e miRNA Conforme vimos os siRNA podem ter origem a partir de uma cópia antissenso de qualquer fonte de mRNA no genoma desde os genes endógenos até os transgenes e até os vírus invasores Entretanto a fonte mais provável de RNA antissenso não são os genes do próprio organismo mas em vez disso um DNA estranho que se insere no genoma Nesse sentido seria correto pensar nos siRNA como o produto de um sistema imune do genoma que detecta a inserção de DNA estranho em alguns casos promove a síntese de mRNA antissenso A complementaridade entre os RNA senso e antissenso produz dsRNA os quais assim como na via de miRNA são reconhecidos pela Dicer e clivados em produtos bifilamentares curtos que são ligados pelo RISC Figura 823 Assim como com os miRNA RISC desenrola o produto em um siRNA unifilamentar biologicamente ativo que direciona RISC para mRNA complementares de modo que eles possam ser degradados Contrariamente aos miRNA a complementaridade entre os siRNA e os mRNA é perfeita não existem incompatibilidades Isso ocorre em virtude de suas origens diferentes siRNA são derivados do mesmo gene enquanto miRNA advêm de um gene diferente Essa diferença provavelmente é responsável pelos desfechos diferentes miRNA direcionam RISC para reprimir a tradução de um mRNA ou degradar mRNA quando eles estão sendo traduzidos enquanto siRNA direcionam RISC para degradar o mRNA diretamente FIGURA 823 Na via de RNA de interferência o RNA bifilamentar dsRNA interage especificamente com o complexo Dicer que corta o dsRNA O complexo de silenciamento induzido por RNA RISC utiliza os pequenos dsRNA para encontrar e destruir mRNA homólogo transcrito a partir do DNAalvo reprimindo assim a expressão gênica Conforme discutido anteriormente a produção de siRNA provavelmente desempenha um papel importante na defesa viral Entretanto seu papel mais importante pode ser proteger o material hereditário de um organismo contra elementos genéticos no seu próprio genoma No Capítulo 15 você aprenderá a respeito dos elementos de transposição que constituem uma enorme fração dos genomas de eucariotos multicelulares incluindo seres humanos Esses elementos podem amplificar a si próprios e se mover para locais novos criando uma óbvia ameaça à integridade do genoma Assim como a introdução dos transgenes pelos cientistas a movimentação dos elementos de transposição para novos locais cromossômicos pode acionar a produção de siRNA por meio da geração de dsRNA Os siRNA finalmente inativam os elementos de transposição em parte ao prevenir a síntese dos produtos proteicos necessários para a sua movimentação e amplificação CONCEITOCHAVE O RNA antissenso com frequência é formado em resposta à inserção de DNA estranho no genoma Dicer detecta o RNA bifilamentar que se forma entre o RNA antissenso e senso e o processa em RNA curtos RISC se liga ao RNA curto e o desenrola para formar siRNA biologicamente ativo O siRNA direciona RISC para um mRNA perfeitamente complementar que é degradado silenciando assim a expressão do DNA estranho RESUMO Sabemos que a informação não é transferida diretamente do DNA para a proteína tendo em vista que em uma célula eucariótica o DNA está no núcleo enquanto a proteína é sintetizada no citoplasma A transferência da informação do DNA para a proteína necessita de um intermediário O intermediário é o RNA Embora o DNA e o RNA sejam ácidos nucleicos o RNA difere do DNA no sentido em que 1 normalmente é um filamento único em vez de uma dupla hélice 2 seus nucleotídios contêm o açúcar ribose em vez de desoxirribose 3 ele apresenta a base pirimidínica uracila em vez de timina e 4 pode atuar como um catalisador biológico A semelhança do RNA com o DNA sugere que o fluxo de informação do DNA para o RNA depende da complementaridade das bases o que também é a chave para a replicação do DNA Um filamentomolde de DNA é copiado ou transcrito em um RNA funcional tal como RNA transportador ou RNA ribossômico que nunca é traduzido em polipeptídios ou em um RNA mensageiro a partir do qual as proteínas são sintetizadas Em procariotos todas as classes de RNA são transcritas por uma única RNA polimerase Essa enzima multissubunitária inicia a transcrição por meio da ligação ao DNA em promotores que contêm sequências específicas em 35 e 10 bases antes do sítio de início da transcrição em 1 Após a sua ligação a RNA polimerase desenrola localmente o DNA e inicia a incorporação de ribonucleotídios que são complementares ao filamentomolde de DNA A cadeia cresce no sentido 5 para 3 até que um de dois mecanismos intrínseco ou rho dependente leve à dissociação da polimerase e do RNA do molde de DNA Conforme veremos no Capítulo 9 na ausência de um núcleo os RNA procarióticos que codificam proteínas são traduzidos enquanto estão sendo transcritos Em eucariotos existem três RNA polimerases diferentes apenas a RNA polimerase II transcreve mRNA Em geral as fases de iniciação alongamento e término da síntese de RNA em eucariotos se assemelham às dos procariotos Entretanto existem diferenças importantes A RNA polimerase II não se liga diretamente ao promotor no DNA mas em vez disso aos GTF um dos quais reconhece a sequência TATA na maior parte dos promotores eucarióticos A RNA polimerase II é uma molécula muito maior que a sua correspondente procariótica Ela contém diversas subunidades que atuam não apenas para alongar o transcrito primário de RNA mas também para coordenar os eventos de processamento extensivos que são necessários para produzir o mRNA maduro Esses eventos de processamento são a adição do cap em 5 a remoção de íntrons e a união de éxons pelos spliceossomos e a clivagem em 3 seguida por poliadenilação Parte do centro da RNA polimerase II o domínio carboxiterminal CTD é posicionado idealmente para interagir com o RNA nascente na medida em que ele surge a partir da polimerase Por meio do CTD a RNA polimerase II coordena os diversos eventos de síntese e de processamento do RNA As descobertas dos últimos 20 anos revelaram a importância de novas classes de RNA funcionais O RNA o qual se chegou a acreditar que fosse um mensageiro modesto atualmente é reconhecido como um participante versátil e dinâmico em muitos processos celulares A descoberta de íntrons autorremovíveis demonstrou que o RNA pode atuar como um catalisador de modo muito semelhante às proteínas Desde a descoberta dessas ribozimas a comunidade científica começou a prestar mais atenção ao RNA Pequenos RNA nucleares os RNA não codificadores no spliceossomo atualmente são reconhecidos como promotores da atividade catalítica para remover íntrons e unir os éxons O século 20 terminou com a descoberta de que duas outras classes de RNA funcional miRNA e siRNA associamse aos complexos de silenciamento induzidos por RNA RISC e têm por alvo o mRNA celular complementar para a repressão no caso do miRNA ou para a destruição no caso do siRNA TERMOSCHAVE alongamento bolha de transcrição cap revestimento cauda poliA complexo de préiniciação PIC constitutiva cossupressão Dicer domínio carboxiterminal downstream éxon experimento de pulsocaça expressão gênica fator geral de transcrição GTF fator sigma σ filamento codificador filamento de RNA antissenso gene endógeno holoenzima RNA polimerase iniciação íntron íntron de autorremoção microRNA miRNA molde mundo do RNA organismo geneticamente modificado transgênico OGM pequenos RNA de interferência siRNA pequenos RNA nucleares snRNA processamento cotranscricional processamento póstranscricional processamento do RNA promotor proteína de ligação a TATA TBP proteoma recomposição alternativa recomposição ou splicing recomposição ou splicing do RNA região 3 não traduzida 3 UTR região 5 não traduzida 5 UTR regra GUAG ribose ribozima RISC complexo de silenciamento induzido por RNA RNA de filamento duplo bifilamentar dsRNA RNA de interação piwi piRNA 1 2 3 4 5 RNA de interferência RNAi RNA funcional RNA mensageiro mRNA RNA não codificador de proteínas ncRNA RNA não codificadores longos lncRNA RNA polimerase RNA ribossômico rRNA RNA transportador tRNA sequência consenso silenciamento gênico spliceossomo TATA boxe término transcrição transcrito transcrito primário prémRNA transgene upstram uracila U PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Na Figura 83 por que as setas em relação aos genes 1 e 2 estão apontando em sentidos opostos Na Figura 85 desenhe o gene um em resolução muito superior com os componentes a seguir DNA RNA polimerases RNAs Na Figura 86 descreva onde o promotor gênico está localizado Na Figura 89 B escreva uma sequência que possa formar a estrutura de alça em grampo Como você sabe que os eventos na Figura 813 estão ocorrendo no núcleo 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Na Figura 815 qual você acredita que seja o efeito de uma mutação de G para A no primeiro resíduo G do íntron Ao comparar as Figuras 816 e 817 avalie qual équais são as funçãoões das proteínas U1 a U6 Ao comparar as Figuras 816 e 817 com a Figura 818 especule quais características do RNA possibilitam a autorrecomposição ou seja na ausência de proteínas Na Figura 820 estão demonstradas três situações muito diferentes todas resultando em silenciamento gênico O que essas situações apresentam em comum para tornar isso possível Na Figura 822 demonstre como o RNA bifilamentar é capaz de silenciar o transgene O que deve ocorrer para que o transgene também silencie o gene celular flanqueador em amarelo PROBLEMAS BÁSICOS Em procariotos e eucariotos descreva o que mais está ocorrendo com o RNA enquanto a RNA polimerase está sintetizando um transcrito a partir do molde de DNA Liste três exemplos de proteínas que atuam nos ácidos nucleicos durante a transcrição Qual é a função primária do fator sigma Existe em eucariotos uma proteína análoga ao fator sigma Você identificou uma mutação em uma levedura um eucarioto unicelular que previne o revestimento da extremidade 5 do transcrito de RNA Entretanto para a sua grande surpresa todas as enzimas necessárias para o revestimento são normais Você determina que a mutação é em vez disso em uma das subunidades da RNA polimerase II Qual subunidade é mutante e como essa mutação resulta na falha em adicionar um cap ao RNA de levedura Por que o RNA é produzido apenas a partir do filamentomolde de DNA e 16 17 18 19 não a partir de ambos os filamentos Um plasmídio linear contém apenas dois genes os quais são transcritos em sentidos opostos cada um partir da extremidade e em direção ao centro do plasmídio Desenhe diagramas a Do DNA do plasmídio demonstrando as extremidades 5 e 3 dos filamentos de nucleotídios b Do filamentomolde em relação a cada gene c Das posições dos sítios de início da transcrição d Dos transcritos demonstrando as extremidades 5 e 3 Existem semelhanças entre as bolhas de replicação do DNA e as bolhas de transcrição observadas em eucariotos Explique Quais das declarações a seguir são verdadeiras a respeito do mRNA eucariótico a O fator sigma é essencial para a correta iniciação da transcrição b O processamento do mRNA nascente pode ter início antes de sua transcrição ser concluída c O processamento ocorre no citoplasma d O término é realizado por meio da pela utilização de uma alça em grampo ou por meio da utilização do fator rhô e Muitos RNA podem ser transcritos simultaneamente a partir de um molde de DNA Uma pesquisadora estava induzindo mutações em células procarióticas por meio da inserção de segmentos de DNA Desse modo ela realizou a mutação a seguir Original TTGACAT 15 para 17 pb TATAAT Mutante TATAAT 15 para 17 pb TTGACAT a O que essa sequência representa b Qual você prevê que seja o efeito de uma tal mutação Explique 20 21 22 23 24 25 Você aprenderá mais a respeito da engenharia genética no Capítulo 10 mas por enquanto coloque seu capacete de engenheiro genético e tente resolver este problema E coli é amplamente utilizada em laboratórios para produzir proteínas de outros organismos a Você isolou um gene de levedura que codifica uma enzima metabólica e deseja produzir essa enzima em E coli Você suspeita que o promotor de levedura não funcionará em E coli Por quê b Após substituir o promotor de levedura por um promotor de E coli você com prazer detecta o RNA do gene de levedura mas está confuso porque o RNA apresenta quase o dobro do comprimento do mRNA desse gene isolado de levedura Explique por que esse resultado pode ter ocorrido Desenhe um gene procariótico e seu produto RNA Assegurese de incluir o promotor o sítio de início da transcrição o sítio de término da transcrição as regiões não traduzidas e as extremidades 5 e 3 marcadas Desenhe um gene eucariótico com dois íntrons e seus produtos de pré mRNA e mRNA Assegurese de incluir todas as características do gene procariótico incluídas em sua resposta ao Problema 19 mais os eventos de processamento necessários para produzir o mRNA Um determinado gene codificador de proteína de Drosophila apresenta um íntron Se uma amostra grande de alelos nulos desse gene for examinada alguns sítios mutantes serão esperados a Nos éxons b No íntron c No promotor d No limite íntronéxon O que são íntrons de autorremoção e por que sua existência ampara a teoria de que o RNA surgiu antes da proteína Antibióticos são fármacos que matam seletivamente bactérias sem prejudicar os animais Muitos antibióticos atuam ao se ligar seletivamente a determinadas proteínas que são críticas para a função bacteriana Explique por que alguns dos antibióticos de mais sucesso têm por alvo a RNA 26 27 28 polimerase bacteriana Descreva quatro tipos de RNA que realizam funções distintas PROBLEMAS DESAFIADORES Os dados a seguir representam as composições de bases do DNA bifilamentar de duas espécies bacterianas diferentes e seus produtos de RNA obtidos em experimentos conduzidos in vitro Espécie A T G C A U G C A G U C Bacillus subtilis 136 130 102 E coli 100 098 080 a A partir desses dados determine se o RNA dessas espécies é copiado a partir de um filamento único ou de ambos os filamentos do DNA Desenhe um diagrama para demonstrar como você resolve este problema b Como você poderia dizer se o próprio RNA é unifilamentar ou bifilamentar Um gene humano foi inicialmente identificado como apresentando três éxons e dois íntrons Os éxons são de 456 224 e 524 pb enquanto os íntrons são de 23 kb e 46 kb a Desenhe esse gene demonstrando o promotor os íntrons os éxons e os sítios de início e término da transcrição b Surpreendentemente observase que esse gene codifica não um mas dois mRNA que apresentam apenas 224 nucleotídios em comum O mRNA original é de 1204 nucleotídios e o novo mRNA tem 2524 nucleotídios Utilize o seu desenho para demonstrar como essa região única do DNA 29 30 31 pode codificar esses dois transcritos Enquanto trabalha em seu laboratório você isola um mRNA de C elegans que você suspeita ser essencial para que os embriões se desenvolvam com sucesso Com a presunção de que você é capaz de tornar o mRNA um RNA bifilamentar desenhe um experimento para testar a sua hipótese O glifosato é um herbicida utilizado para matar ervas daninhas Ele é o principal componente de um produto fabricado pela Monsanto Company denominado Roundup O glifosato mata as plantas por meio da inibição de uma enzima da via shikimate denominada EPSPS Esse herbicida é considerado seguro tendo em vista que os animais não apresentam a via shikimate Para vender ainda mais do seu herbicida a Monsanto encarregou seus geneticistas de plantas de modificarem diversas plantas de cultivo incluindo milho para se tornarem resistentes ao glifosato Para tanto os cientistas precisaram introduzir uma enzima EPSPS que era resistente à inibição pelo glifosato em plantas de cultivo e em seguida testaram as plantas transformadas em relação à resistência ao herbicida Imagine que você é um desses cientistas e que você conseguiu introduzir com sucesso o gene EPSPS resistente nos cromossomos do milho Você observa que algumas das plantas transgênicas são resistentes ao herbicida enquanto outras não são Seu supervisor está muito aborrecido e exige uma explicação sobre o motivo de algumas das plantas não serem resistentes embora apresentem o transgene em seus cromossomos Desenhe uma ilustração para ajudálo a entender Muitos cânceres humanos resultam de quando um gene normal sofre mutação e leva ao crescimento descontrolado um tumor Os genes que causam câncer quando mutados são denominados oncogenes A quimioterapia é eficaz contra muitos tumores tendo em vista que tem por alvo células em rápida divisão e mataas Infelizmente a quimioterapia apresenta muitos efeitos colaterais tais como perda de cabelos ou náuseas tendo em vista que ela também mata muitas de nossas células normais que estão em rápida divisão tais como aquelas dos folículos pilosos ou do 32 33 revestimento estomacal Muitos cientistas e grandes empresas farmacêuticas estão animados a respeito das perspectivas de explorar a via do RNAi para inibir seletivamente os oncogenes em tumores de risco à vida Explique em termos muito gerais como a terapia com silenciamento gênico pode atuar para tratar o câncer e por que esse tipo de terapia apresentaria menos efeitos colaterais do que a quimioterapia Você espera que íntrons de autorremoção sejam em média mais longos ou mais curtos que os íntrons recompostos por spliceossomos Justifique sua resposta Um cientista que inseriu um gene de planta nos cromossomos humanos não foi capaz de detectar qualquer transcrição do gene da planta Proponha uma explicação com base no que você aprendeu a respeito da transcrição Agora planeje um experimento para testar sua hipótese 1L T Chow R E Gelinas T R Broker e R J Roberts Cell 1218 1977 Esta imagem demonstra em resolução atômica uma superfície do ribossomo da bactéria Haloarcula marismortui deduzida a partir de cristalografia de raios X A parte do ribossomo composta por RNA está demonstrada em azul aquela que é composta por proteínas está demonstrada em roxo As estruturas branca vermelha e amarela no centro são tRNA nos sítios de ligação E P e A com suas hastes aceptoras 91 92 93 94 95 E desaparecendo em uma fissura no ribossomo P Nissen J Hansen N Ban P B Moore e T A Steitz The Structural Basis of Ribosome Activity in Peptide Bond Synthesis Science 289 2000 920930 Fig 10A Reimpressa com permissão de AAAS TÓPICOS Estrutura proteica Código genético tRNA O adaptador Ribossomos Proteoma RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Comparar as sequências de um gene e sua proteína para avaliar a sua relação Examinar e explicar os achados experimentais de que o código genético é não sobreposto e degenerado Compreender que embora a tradução seja conservada em todos os seres vivos existem algumas diferenças importantes entre procariotos e eucariotos Comparar e diferenciar os papéis críticos desempenhados por dois RNA funcionais o RNA ribossômico e o tRNA na síntese proteica Fornecer evidências de que o RNA ribossômico e não as proteínas ribossômicas realiza as etapaschave na tradução Comparar diferentes tipos de processamento póstradução e sua importância para o funcionamento das proteínas m um pronunciamento no Congresso em 1969 William Stewart Ministro da Saúde dos EUA disse É tempo de fechar o livro sobre as doenças infecciosas A guerra contra a pestilência acabou Na ocasião sua proclamação de vitória não era uma ostentação insensata Nas duas décadas anteriores três doenças infecciosas que haviam atormentado a humanidade durante séculos poliomielite varíola e tuberculose haviam sido notadamente eliminadas em todo o mundo Um fator importante que contribuiu para a erradicação da tuberculose e de algumas outras doenças infecciosas foi a descoberta e o uso disseminado dos antibióticos um grupo diverso de compostos químicos que matam patógenos bacterianos específicos sem prejudicar o hospedeiro animal Antibióticos tais como penicilina tetraciclina ampicilina e cloranfenicol para citar alguns salvaram centenas de milhões de vidas Infelizmente a proclamação da vitória de William Stewart na batalha contra as doenças infecciosas era prematura A utilização excessiva de antibióticos mundialmente estimulou a evolução de linhagens bacterianas resistentes Por exemplo a cada ano mais de 2 milhões de pacientes hospitalares nos EUA adquirem uma infecção que é resistente a antibióticos e 90000 morrem como resultado Como a resistência se desenvolveu tão rapidamente As doenças infecciosas serão novamente uma causa significativa de mortalidade humana Ou os cientistas serão capazes de utilizar a sua compreensão sobre os mecanismos de resistência para desenvolver antibióticos mais duradouros Para responder a essas questões cientistas enfocaram no maquinário celular que é o alvo dos antibióticos Mais da metade de todos os antibióticos atualmente em uso têm por alvo o ribossomo bacteriano o sítio da síntese proteica em procariotos Neste capítulo você aprenderá que os cientistas obtiveram um sucesso incrível com a utilização de uma técnica denominada cristalografia de raios X para visualizar os RNA ribossômicos rRNA e as aproximadamente 50 proteínas que compõem as subunidades maior e menor dos ribossomos bacterianos Embora os ribossomos dos procariotos e eucariotos sejam muito semelhantes ainda existem diferenças sutis Em virtude dessas diferenças os antibióticos são capazes de atacar os ribossomos bacterianos mas deixam os ribossomos eucarióticos intocados Com a utilização da cristalografia de raios X os cientistas também obtiveram sucesso na visualização de antibióticos ligados ao ribossomo Figura 91 A partir desses estudos eles determinaram que mutações no rRNA bacteriano eou em proteínas ribossômicas são responsáveis pela resistência aos antibióticos Com esse conhecimento sobre os pontos de contato entre determinados antibióticos e o ribossomo projetistas de fármacos estão tentando eleborar uma nova geração de antibióticos que por exemplo seja capaz de se ligar a múltiplos sítios próximos Haveria menos probabilidade de desenvolvimento de resistência a um referido fármaco tendo em vista que seria necessária a ocorrência de duas mutações o que é um evento muito improvável mesmo para as bactérias Os Capítulos 7 e 8 descreveram como o DNA é copiado de geração para geração e como o RNA é sintetizado a partir de regiões específicas do DNA Podemos pensar a respeito desses processos como dois estágios da transferência de informação a replicação a síntese do DNA e a transcrição a síntese de uma cópia do RNA de uma parte do DNA Neste capítulo você aprenderá a respeito do estágio final da transferência de informação a tradução a síntese de um polipeptídio direcionada pela sequência de RNA FIGURA 91 O fármaco eritromicina vermelho bloqueia o túnel a partir do qual uma proteína recém sintetizada surge do ribossomo A imagem é uma visão superior da subunidade ribossômica 50S na bactéria Deinococcus radiodurans Os RNA ribossômicos estão demonstrados em azul e as proteínas ribossômicas em amarelo Dr Joerg Harms MPI for Molecular Genetics Berlim Alemanha Como você aprendeu no Capítulo 8 o RNA transcrito a partir dos genes é classificado como RNA mensageiro mRNA ou RNA funcional Neste capítulo veremos o destino de ambas as classes de RNA A vasta maioria dos genes codifica mRNA cuja função é atuar como um intermediário na síntese do produto gênico final a proteína Contrariamente relembre que os RNA funcionais são ativos como RNA eles nunca são traduzidos em proteínas As principais classes de RNA funcionais são atores importantes na síntese proteica Elas incluem os RNA transportadores ou de transferência e os RNA ribossômicos As moléculas de RNA transportador ou de transferência tRNA são os adaptadores que traduzem o códon de três nucleotídios no mRNA em um aminoácido correspondente que é trazido pelo tRNA até o ribossomo no processo de tradução Os tRNA são componentes gerais do maquinário de tradução uma molécula de tRNA pode trazer um aminoácido até o ribossomo para fins de traduzir qualquer RNA Os RNA ribossômicos rRNA são os principais componentes dos ribossomos que são grandes complexos macromoleculares que juntam aminoácidos para formar a proteína cuja sequência é codificada em um mRNA específico Os ribossomos são compostos por diversos tipos de rRNA e dezenas de diferentes proteínas Assim como o tRNA os ribossomos têm uma função geral no sentido em que podem ser utilizados para traduzir os mRNA de qualquer gene codificador de proteína Embora a maioria dos genes codifique mRNA os RNA funcionais constituem sem dúvida a maior fração do RNA celular total Em uma célula eucariótica típica ativamente em divisão o rRNA e o tRNA são responsáveis por quase 95 do RNA total enquanto o mRNA é responsável por apenas aproximadamente 5 Dois fatores explicam a abundância de rRNA e tRNA Primeiramente eles são muito mais estáveis do que os mRNA e assim essas moléculas permanecem 91 intactas por muito mais tempo Em segundo lugar tendo em vista que uma célula eucariótica ativamente em divisão apresenta dezenas de milhares de ribossomos a transcrição dos genes de rRNA e tRNA constitui mais da metade da transcrição nuclear total nas células eucarióticas ativas e quase 80 da transcrição em células de leveduras Os componentes do maquinário de tradução e o processo de tradução são muito semelhantes em procariotos e eucariotos A principal característica que distingue a tradução em procariotos daquela em eucariotos é o local no qual a transcrição e a tradução ocorrem na célula os dois processos ocorrem no mesmo compartimento em procariotos enquanto estão fisicamente separados em eucariotos pela membrana nuclear Após substancial processamento os mRNA eucarióticos são exportados a partir do núcleo para a tradução nos ribossomos que estão localizados no citoplasma Contrariamente a transcrição e a tradução são acopladas em procariotos a tradução de um RNA tem início na sua extremidade 5 enquanto o restante do mRNA ainda está sendo transcrito Estrutura proteica Quando um transcrito primário é totalmente processado em uma molécula de mRNA madura ocorre sua tradução em proteína Antes de considerar como as proteínas são produzidas precisamos compreender a estrutura proteica As proteínas são os principais determinantes da forma e da função biológica Essas moléculas influenciam fortemente a forma a cor o tamanho o comportamento e a fisiologia dos organismos Tendo em vista que os genes codificam proteínas compreender a natureza das proteínas é essencial para entender a ação gênica Uma proteína é um polímero composto por monômeros denominados aminoácidos Em outras palavras uma proteína é uma cadeia de aminoácidos Tendo em vista que os aminoácidos chegaram a ser denominados peptídios a cadeia por vezes é denominada polipeptídio Todos os aminoácidos apresentam a fórmula geral Todos os aminoácidos apresentam dois grupos funcionais carboxila e amino demonstrados anteriormente ligados ao mesmo átomo de carbono denominado carbono α Também ligados ao carbono α estão um átomo de H e uma cadeia lateral ou grupo R reativo Sabidamente existem 20 aminoácidos nas proteínas cada um apresentando um grupo R diferente que proporciona ao aminoácido suas propriedades únicas A cadeia lateral pode ser desde um átomo de hidrogênio como no aminoácido glicina até um anel complexo como no aminoácido triptofano Nas proteínas os aminoácidos são unidos por ligações covalentes denominadas ligações peptídicas Uma ligação peptídica é formada pela ligação da extremidade amino NH2 de um aminoácido com a extremidade carboxila COOH de outro aminoácido Figura 92 Uma molécula de água é removida durante a reação Em virtude do modo pelo qual a ligação peptídica é formada uma cadeia de polipeptídios sempre apresenta uma extremidade amino NH2 e uma extremidade carboxila COOH conforme demonstrado na Figura 92 A FIGURA 92 A Um polipeptídio é formado pela remoção de água entre os aminoácidos para formar ligações peptídicas Cada aa indica um aminoácido R1 R2 e R3 representam os grupos R cadeias laterais que diferenciam os aminoácidos B A ligação peptídica é uma unidade planar rígida com os grupos R se projetando para fora da espinha dorsal CN Estão demonstradas as distâncias das ligaçõespadrão em angstroms As proteínas apresentam uma estrutura complexa com quatro níveis de organização ilustrados na Figura 93 A sequência linear dos aminoácidos em uma cadeia de polipeptídios constitui a estrutura primária da proteína Regiões locais da cadeia de polipeptídios se dobram em formas específicas denominadas estrutura secundária da proteína Cada forma tem origem a partir de forças de ligação entre os aminoácidos que estão próximos na sequência linear Essas forças incluem diversos tipos de ligações fracas notavelmente ligações de hidrogênio forças eletrostáticas e forças de Van Der Waals As estruturas secundárias mais comuns são a αhélice e a folha βpregueada Diferentes proteínas demonstram uma ou outra ou por vezes ambas em suas estruturas A estrutura terciária é produzida pelo dobramento da estrutura secundária Algumas proteínas apresentam estrutura quaternária uma referida proteína é composta por dois ou mais polipeptídios dobrados em separado também denominados subunidades unidos por ligações fracas A associação quaternária pode ser entre diferentes tipos de polipeptídios resultando em um heterodímero se houver duas subunidades ou entre polipeptídios idênticos produzindo um homodímero A hemoglobina é um exemplo de um heterotetrâmero uma proteína com quatro subunidades ela é composta por duas cópias de cada um de dois polipeptídios diferentes demonstrados em verde e em roxo na Figura 93 D FIGURA 93 Uma proteína pode apresentar quatro níveis de estrutura A Estrutura primária A sequência de aminoácidos definida por seus grupos R B Estrutura secundária O polipeptídio pode formar uma estrutura helicoidal uma αhélice ou uma estrutura em ziguezague uma folha βpregueada A folha βpregueada apresenta dois segmentos de polipeptídios dispostos em polaridade oposta conforme indicado pelas setas C Estrutura terciária O grupo heme é uma estrutura em anel não proteica com um átomo de ferro em seu centro D Estrutura quaternária ilustrada pela hemoglobina que é composta por quatro subunidades de polipeptídios duas subunidades α e duas subunidades β 92 Muitas proteínas são estruturas compactas elas são denominadas proteínas globulares As enzimas e os anticorpos estão entre as proteínas globulares mais bemconhecidas As proteínas com forma linear denominadas proteínas fibrosas são componentes importantes de estruturas tais como a pele os cabelos e os tendões A forma é totalmente importante para uma proteína tendo em vista que a forma específica de uma proteína possibilita que ela realize uma função específica na célula A forma de uma proteína é determinada pela sua sequência primária de aminoácidos e por condições na célula que promovem o dobramento e a ligação necessários para formar estruturas de nível superior O dobramento das proteínas em sua conformação correta será discutido no final deste capítulo A sequência de aminoácidos também determina quais grupos R estão presentes em posições específicas e portanto disponíveis para a ligação com outros componentes celulares Os locais ativos das enzimas são boas ilustrações das interações precisas dos grupos R Cada enzima apresenta um bolsão denominado sítio ativo ao qual seu substrato ou substratos conseguem se adaptar No sítio ativo os grupos R de determinados aminoácidos estão estrategicamente posicionados para interagir com um substrato e catalisar uma reação química específica Atualmente as regras por meio das quais a estrutura primária é convertida em uma estrutura de nível superior não são perfeitamente compreendidas Entretanto a partir do conhecimento da sequência primária de aminoácidos de uma proteína as funções de regiões específicas podem ser previstas Por exemplo algumas sequências proteicas características são os pontos de contato com fosfolipídios de membrana que posicionam uma proteína em uma membrana Outras sequências características atuam para ligar a proteína ao DNA Sequências de aminoácidos ou dobras nas proteínas que estão associadas a funções em particular são denominadas domínios Uma proteína pode conter um ou mais domínios separados Código genético A hipótese de um geneum peptídio de Beadle e Tatum ver Capítulo 6 foi a fonte da primeira percepção excitante sobre as funções dos genes os genes de algum modo eram responsáveis pela função das enzimas e cada gene aparentemente controlava uma enzima Essa hipótese se tornou um dos grandes conceitos unificadores em biologia tendo em vista que proporcionou um elemento de ligação dos conceitos e das técnicas de pesquisa de genética e bioquímica Quando a estrutura do DNA foi deduzida em 1953 aparentava ser provável que houvesse uma correspondência linear entre a sequência de nucleotídios no DNA e a sequência de aminoácidos na proteína Logo foi deduzido que a sequência de ácido nucleico no mRNA de 5 para 3 corresponde à sequência de aminoácidos que vai do Nterminal ao Cterminal Se os genes são segmentos de DNA e se um filamento de DNA é apenas uma série de nucleotídios então a sequência de nucleotídios de algum modo deve ditar a sequência de aminoácidos nas proteínas Como a sequência de DNA dita a sequência da proteína A analogia com um código logo vem à mente A lógica simples nos diz que se os nucleotídios são as letras em um código então uma combinação de letras pode formar palavras que representam diferentes aminoácidos Primeiramente é crucial indagar como o código é lido Ele é sobreposto ou não sobreposto Em seguida devemos indagar quantas letras no mRNA formam uma palavra ou códon e qual ou quais códons representam cada aminoácido Como decifrar o código genético é a história contada nesta seção Códigos sobrepostos versus não sobrepostos A Figura 94 demonstra a diferença entre um código sobreposto e um não sobreposto O exemplo demonstra um código com três letras ou trinca Em relação a um código não sobreposto os aminoácidos consecutivos são especificados por palavrascódigo consecutivas códons conforme demonstrado na parte inferior da Figura 94 Em relação a um código sobreposto os aminoácidos consecutivos são especificados por códons que apresentam algumas bases consecutivas em comum por exemplo as duas últimas bases de um códon podem ser também as duas primeiras bases do próximo códon Códons sobrepostos estão demonstrados na parte superior da Figura 94 Portanto em relação à sequência AUUGCUCAG em um código não sobreposto as três trincas AUU GCU e CAG codificam os três primeiros aminoácidos respectivamente Entretanto em um código sobreposto as trincas AUU UUG e UGC codificam os três primeiros aminoácidos se a sobreposição for de duas bases conforme demonstrado na Figura 94 FIGURA 94 Um código genético sobreposto e um não sobreposto seriam traduzidos de modo diferente em uma sequência de aminoácidos O exemplo utiliza um códon com três nucleotídios no RNA um código triplo Em um código sobreposto nucleotídios únicos ocupam posições em múltiplos códons Nesta ilustração o terceiro nucleotídio no RNA U é encontrado em três códons Em um código não sobreposto uma proteína é traduzida por meio da leitura de nucleotídios sequencialmente em conjuntos de três Um nucleotídio é observado em apenas um códon Neste exemplo o terceiro U no RNA está apenas no primeiro códon Em 1961 já estava claro que o código genético era não sobreposto Análises de proteínas alteradas por mutações demonstravam que apenas um único aminoácido é alterado por vez em uma região da proteína Esse resultado é previsto por um código não sobreposto Conforme podemos observar na Figura 94 um código sobreposto prevê que a alteração de uma única base alterará até três aminoácidos em posições adjacentes na proteína Número de letras no códon Se uma molécula de mRNA for lida de uma extremidade para a outra apenas uma das quatro bases diferentes A U G ou C pode ser observada em cada posição Portanto se as palavras que codificam os aminoácidos tivessem uma letra seriam possíveis apenas quatro palavras Esse vocabulário não pode ser o código genético tendo em vista que precisamos ter uma palavra para cada um dos 20 aminoácidos comumente observados nas proteínas celulares Se as palavras tivessem duas letras então seriam possíveis 4 4 16 palavras por exemplo AU CU ou CC Esse vocabulário ainda não é grande o suficiente Se as palavras tiverem três letras então são possíveis 4 4 4 64 palavras por exemplo AUU GCG ou UGC Esse vocabulário proporciona palavras mais do que suficientes para descrever os aminoácidos Podemos concluir que as palavras do código devem ser compostas por no mínimo três nucleotídios Entretanto se todas as palavras são trincas então as palavras possíveis excedem consideravelmente as 20 necessárias para denominar os aminoácidos comuns Retornaremos a esse excesso de códons posteriormente no capítulo Utilização de supressores para demonstrar um código triplo A comprovação convincente de que um códon tem de fato três letras e não mais do que três surgiu a partir dos belos experimentos genéticos relatados pela primeira vez em 1961 por Francis Crick Sidney Brenner e seus colaboradores Esses experimentos utilizaram mutantes no locus rII do fago T4 A utilização de mutações rII na análise de recombinação foi discutida no Capítulo 5 O fago T4 normalmente consegue crescer em duas linhagens de E coli diferentes denominadas B e K Entretanto mutações no gene rII alteram a gama de hospedeiros do fago os fagos mutantes ainda podem crescer em um hospedeiro E coli B mas não conseguem crescer em um hospedeiro E coli K Mutações que causam esse fenótipo rII foram induzidas por meio da utilização de uma substância química denominada proflavina que se acreditava atuar por meio da adição ou deleção de pares de nucleotídios únicos no DNA Essa presunção tem por base evidências experimentais não apresentadas aqui Os exemplos a seguir ilustram a ação da proflavina no DNA bifilamentar Iniciando com uma mutação específica induzida por proflavina denominada FCO Crick e seus colegas observaram reversões reversões da mutação que eram capazes de crescer na linhagem K da E coli A análise genética dessas placas revelou que os revertentes não eram idênticos às de tipos selvagens verdadeiros Na verdade observouse que a reversão ocorre em virtude da existência de uma segunda mutação em um sítio diferente daquele de FCO embora no mesmo gene Essa segunda mutação suprimiu a expressão mutante de FCO original Relembre do Capítulo 6 que uma mutação supressora se contrapõe ou suprime os efeitos de outra mutação de modo que a bactéria é mais semelhante ao tipo selvagem Como podemos explicar esses resultados Se presumirmos que o gene é lido apenas a partir de uma extremidade então a adição ou deleção original induzida pela proflavina pode resultar em uma mutação tendo em vista que ela interrompe um mecanismo de leitura normal que estabelece o grupo de bases a ser lido como palavras Por exemplo se cada grupo de três bases no mRNA resultante formar uma palavra então o quadro de leitura pode ser estabelecido ao considerar as três primeiras bases a partir da extremidade como a primeira palavra e as 1 próximas três como a segunda palavra e assim por diante Naquele caso uma adição ou uma deleção induzida por proflavina de um único par no DNA alteraria o quadro de leitura no mRNA a partir daquele ponto correspondente em diante causando a leitura errônea de todas as palavras a seguir Uma referida mutação por deslocamento do quadro de leitura poderia reduzir a maioria da mensagem genética a algo confuso Entretanto o quadro de leitura adequado poderia ser restaurado por meio de uma inserção ou uma deleção compensatória em algum outro local deixando apenas um trecho curto de confusão entre as duas Considere o exemplo a seguir no qual palavras de três letras em inglês são utilizadas para representar os códons A inserção suprime o efeito da deleção ao restaurar a maior parte do sentido da sentença Entretanto por si própria a inserção também rompe a sentença THE FAT CAT AAT ETH EBI GRA T Se presumirmos que o mutante FCO é causado por uma adição então a segunda mutação supressora precisaria ser uma deleção pois conforme vimos apenas uma deleção restauraria o quadro de leitura da mensagem resultante uma segunda inserção não corrigiria o quadro Nos diagramas a seguir utilizamos uma cadeia de nucleotídios hipotética para representar o RNA de maneira simplificada Também presumimos que as palavras do código apresentam três letras e que são lidas em um sentido da esquerda para a direita nos nossos diagramas Mensagem do tipo selvagem CAU CAU CAU CAU CAU 2 3 Mensagem de rIIa as palavras após a adição são alteradas por deslocamento do quadro de leitura as palavras marcadas com não são afetadas Mensagem de rIIa rIIb poucas palavras estão erradas mas o quadro de leitura é restaurado em relação às palavras posteriores As poucas palavras erradas no genótipo suprimido podem explicar o fato de que os revertentes fenótipos suprimidos que Crick e seus colaboradores recuperaram não aparentavam ser de fenótipo exatamente semelhante aos verdadeiros tipos selvagens Aqui presumimos que a mudança do quadro de leitura original era uma adição mas a explicação também funciona bem se presumirmos que a mutação FCO original é uma deleção e o supressor é uma adição Você pode desejar verificar isso por conta própria Muito curiosamente combinações de três adições ou três deleções demonstraram atuar em conjunto para restaurar um fenótipo do tipo selvagem Essa observação proporcionou a primeira confirmação experimental de que uma palavra no código genético é composta por três nucleotídios sucessivos ou uma trinca O motivo é que três adições ou três deleções em um gene automaticamente restauram o quadro de leitura no mRNA se as palavras forem trincas Degeneração do código genético Conforme já declarado com quatro letras a partir das quais se pode optar em cada posição um códon de três letras poderia produzir 4 4 4 64 palavras 1 2 3 4 5 Com apenas 20 palavras necessárias para os 20 aminoácidos comuns para que são utilizadas as outras palavras se utilizadas para algo O trabalho de Crick sugeriu que o código genético é degenerado o que significa que cada uma das 64 trincas deve apresentar algum significado no código Para que o código seja degenerado alguns dos aminoácidos devem ser especificados por no mínimo dois ou mais trincas diferentes O motivo é o seguinte Se apenas 20 trincas fossem utilizadas então as outras 44 não teriam significado no sentido de que não codificariam qualquer aminoácido Naquele caso poderia ser esperado que a maioria das mutações por deslocamento do quadro de leitura produzisse palavras sem sentido que presumivelmente interromperiam o processo de formação das proteínas e a supressão das mutações por deslocamento do quadro de leitura raramente ou nunca funcionariam Entretanto se todas as trincas especificassem algum aminoácido então as palavras alteradas simplesmente resultariam na inserção dos aminoácidos incorretos na proteína Portanto Crick raciocinou que muitos dos ou todos os aminoácidos precisam apresentar diversos nomes diferentes no código de pares de bases essa hipótese foi posteriormente confirmada bioquimicamente CONCEITOCHAVE Até agora a discussão demonstra que A sequência linear de nucleotídios em um gene determina a sequência linear de aminoácidos em uma proteína O código genético é não sobreposto Três bases codificam um aminoácido Essas trincas são denominadas códons O código é lido a partir de um ponto de início fixo e continua até o término da sequência codificadora Sabemos que o código é lido sequencialmente tendo em vista que uma única mutação por deslocamento do quadro de leitura em qualquer parte da sequência codificadora altera o alinhamento do códon em relação ao restante da sequência O código é degenerado porque alguns aminoácidos são especificados por mais de um códon Como decifrar o código Decifrar o código genético determinar o aminoácido especificado por cada trinca foi uma das descobertas genéticas mais animadoras dos últimos 50 anos Após a disponibilização das técnicas experimentais necessárias o código genético foi rapidamente decifrado Um grande avanço foi a descoberta de como produzir mRNA sintético Se os nucleotídios do RNA são misturados com uma enzima especial polinucleotídio fosforilase é formado um RNA unifilamentar na reação Contrariamente à transcrição nenhum molde de DNA é necessário para essa síntese e assim os nucleotídios são incorporados aleatoriamente A capacidade de sintetizar RNA ofereceu a excitante perspectiva de criar sequências de mRNA específicas e em seguida observar quais aminoácidos elas especificariam O primeiro mensageiro sintético obtido foi produzido por meio da mistura apenas de nucleotídios uracila com a enzima de síntese de RNA produzindo UUUU poliU Em 1961 Marshall Nirenberg e Heinrich Matthaei misturaram poliU com o maquinário de síntese de proteínas de E coli in vitro e observaram a formação de uma proteína A principal empolgação foi centrada na questão da sequência de aminoácidos dessa proteína Ela comprovou ser a polifenilalanina uma série de moléculas de fenilalanina ligadas para formar um polipeptídio Portanto a trinca UUU deve codificar a fenilalanina Por essa descoberta Nirenberg recebeu o Prêmio Nobel Em seguida foram sintetizados mRNAs que contêm dois tipos de nucleotídios em grupos repetidos Por exemplo o mRNA sintético que apresenta a sequência AGAn que é uma longa sequência de AGAAGAAGAAGAAGA foi utilizado para estimular a síntese de polipeptídios in vitro em um tubo de ensaio que também continha um extrato celular com todos os componentes necessários para a tradução A sequência de polipeptídios resultante foi observada a partir de uma diversidade dos referidos testes com a utilização de diferentes trincas localizadas em outros RNA sintéticos A partir dos referidos testes muitas palavras do código puderam ser verificadas Esse tipo de experimento está detalhado no Problema 44 ao fim deste capítulo Ao resolvêlo você pode se colocar no lugar de H Gobind Khorana que recebeu um Prêmio Nobel por orientar os experimentos Abordagens experimentais adicionais levaram à atribuição de cada aminoácido a um ou mais códons Relembre que se propôs que o código é degenerado o que significa que alguns aminoácidos apresentavam mais de um códon determinante Essa degeneração pode ser observada claramente na Figura 95 que fornece os códons e os aminoácidos que eles especificam Virtualmente todos os organismos sobre a Terra utilizam esse mesmo código genético Existem apenas algumas exceções nas quais um pequeno número de códons apresenta significados diferentes por exemplo nos genomas mitocondriais Códons de parada Você pode ter observado na Figura 95 que alguns códons absolutamente não especificam um aminoácido Esses códons são códons de parada ou término Eles podem ser considerados como sendo semelhantes aos pontos finais ou às vírgulas que pontuam a mensagem codificada no DNA FIGURA 95 O código genético designa os aminoácidos especificados por cada códon Uma das primeiras indicações da existência de códons de parada surgiu em 1965 a partir do trabalho de Brenner com o fago T4 Brenner analisou determinadas mutações m1 a m6 em um gene único que controla a proteína da cabeça do fago Ele observou que a proteína da cabeça de cada mutante era uma cadeia polipeptídica mais curta do que aquela do tipo selvagem Brenner examinou as extremidades das proteínas encurtadas e as comparou à proteína do tipo selvagem Em relação a cada mutante ele registrou o próximo aminoácido que teria sido inserido para continuar a cadeia do tipo selvagem Os aminoácidos em relação às seis mutações eram glutamina lisina ácido glutâmico tirosina triptofano e serina Esses resultados não apresentam um padrão imediatamente óbvio mas Brenner deduziu que determinados códons para cada um desses aminoácidos são semelhantes Especificamente cada um desses códons pode mutar para o códon UAG por meio de uma única alteração em um par de 93 nucleotídios do DNA Portanto ele postulou que UAG é um códon de parada término um sinal para o mecanismo de tradução de que a proteína agora está completa O UAG foi o primeiro códon de parada decifrado ele é denominado o códon âmbar âmbar é a tradução do último nome do descobridor do códon Bernstein Os mutantes que são defeituosos em virtude da presença de um códon âmbar anormal são denominados mutantes âmbar Dois outros códons de parada são UGA e UAA De modo análogo ao códon âmbar e continuando o tema da denominação em relação às cores e às pedras preciosas UGA é denominado códon opala e UAA é denominado códon ocre Mutantes que são defeituosos em virtude de conterem códons opala ou ocre anormais são denominados mutantes opala e ocre respectivamente Os códons de parada com frequência são denominados códons sem sentido tendo em vista que não designam aminoácidos Além de uma proteína de cabeça mais curta os fagos mutantes de Brenner apresentavam outra característica interessante em comum uma mutação supressora su no cromossomo do hospedeiro causaria o desenvolvimento pelo fago de uma proteína de cabeça de comprimento de cadeia normal tipo selvagem apesar da presença da mutação m Consideraremos os códons de parada e seus supressores adicionalmente após termos lidado com o processo da síntese proteica tRNA O adaptador Após o código genético ter sido decifrado cientistas começaram a ponderar como a sequência de aminoácidos de uma proteína era determinada pelos códons triplos do mRNA Um modelo inicial rapidamente dispensado como ingênuo e improvável propôs que os códons do mRNA poderiam se dobrar e formar 20 cavidades distintas que ligam diretamente os aminoácidos específicos na ordem correta Em vez disto em 1958 Crick reconheceu o que segue É portanto uma hipótese natural que o aminoácido seja levado até o molde por uma molécula adaptadora e que o adaptador seja a parte que de fato se encaixa no RNA Em sua forma mais simples essa hipótese necessitaria de vinte adaptadores um para cada aminoácido1 Ele especulou que o adaptador poderia conter nucleotídios Isso possibilitaria a sua junção ao molde de RNA por meio do mesmo pareamento de bases conforme observado no DNA Além disso uma enzima em separado seria necessária para unir cada adaptador ao seu próprio aminoácido Atualmente sabemos que a hipótese do adaptador de Crick está amplamente correta De fato os aminoácidos estão ligados a um adaptador relembre que os adaptadores constituem uma classe especial de RNA estáveis denominados RNA transportador Cada aminoácido se torna unido a um tRNA específico que em seguida transporta aquele aminoácido até o ribossomo o complexo molecular que ligará o aminoácido a um polipeptídio em crescimento Tradução do códon pelo tRNA A estrutura do RNA mantém o segredo da especificidade entre um códon de mRNA e o aminoácido que ele designa A molécula de tRNA unifilamentar apresenta uma forma de folha de trevo composto por quatro hastes de dupla hélice e três alças unifilamentares Figura 96 A A alça intermediária de cada tRNA é denominada alça do anticódon tendo em vista que ela transporta uma trinca de nucleotídios denominada anticódon Essa sequência é complementar ao códon para o aminoácido transportado pelo tRNA O anticódon no tRNA e o códon no mRNA se ligam por pareamento específico de bases entre os RNA Novamente observamos o princípio da complementaridade de ácidos nucleicos em ação nesse momento na ligação de dois RNA diferentes Tendo em vista que os códons no mRNA são lidos na direção 5 3 os anticódons estão orientados e escritos na direção 3 5 conforme a Figura 96 A demonstra Os aminoácidos são unidos aos tRNA por meio de enzimas denominadas aminoaciltRNA sintetases Existem 20 dessas enzimas na célula uma para cada um dos 20 aminoácidos Cada aminoácido apresenta uma sintetase específica que o liga apenas àqueles tRNA que reconhecem os códons em relação àquele aminoácido em particular Para catalisar essa reação as sintetases apresentam dois sítios de ligação um para o aminoácido e o outro para o seu tRNA cognato Figura 97 Um aminoácido é ligado à extremidade 3 livre de seu tRNA o aminoácido alanina no caso demonstrado nas Figuras 96 A e 97 Dizse que o tRNA com um aminoácido ligado está carregado Um tRNA normalmente existe como uma folha de trevo dobrada em forma de L conforme demonstrado na Figura 96 B em vez da folha de trevo achatada demonstrada na Figura 96 A A estrutura tridimensional do tRNA foi determinada com a utilização de cristalografia de raios X Nos anos desde que essa técnica foi utilizada para deduzir a estrutura da duplahélice do DNA ela tem sido refinada de modo que atualmente pode ser utilizada para determinar a estrutura de macromoléculas muito complexas tais como o ribossomo Embora os tRNA difiram em sua sequência primária de nucleotídios todos os tRNA se dobram virtualmente na mesma conformação em forma de L com exceção de diferenças na alça do anticódon e na extremidade aminoacil Essa semelhança de estrutura pode ser facilmente observada na Figura 98 que demonstra dois tRNA diferentes sobrepostos A conservação da estrutura nos mostra que a forma é importante para a função do tRNA O que aconteceria se o aminoácido errado fosse covalentemente unido a um tRNA Um experimento convincente respondeu a essa questão O experimento utilizou cisteiniltRNA tRNACys o tRNA específico para cisteína Esse tRNA foi carregado com cisteína o que significa que a cisteína foi ligada ao tRNA O tRNA carregado foi tratado com hidreto de níquel que converteu a cisteína enquanto ainda estava ligada ao tRNACys em outro aminoácido alanina sem afetar o tRNA A proteína sintetizada com essa espécie híbrida apresentava alanina sempre que era esperada a cisteína O experimento demonstrou que os aminoácidos são analfabetos eles são inseridos na posição adequada em virtude de os tRNA adaptadores reconhecerem os códons do mRNA e inserirem adequadamente seus aminoácidos ligados Portanto a ligação do aminoácido correto ao seu tRNA cognato é uma etapa crítica para assegurar que uma proteína seja sintetizada corretamente Se o aminoácido errado for ligado não há como prevenir a sua incorporação em uma cadeia proteica em crescimento FIGURA 96 A A estrutura do tRNA da alanina de levedura demonstrando o anticódon do tRNA ligandose ao seu códon complementar no mRNA B Diagrama da estrutura tridimensional real do tRNA da fenilalanina de levedura FIGURA 97 Cada aminoaciltRNA sintetase apresenta bolsões de ligação para um aminoácido específico e seu tRNA cognato Por este meio um aminoácido é covalentemente ligado ao tRNA com o anticódon correspondente 1 2 FIGURA 98 Quando dobrado em suas estruturas tridimensionais corretas o tRNA de levedura para glutamina azul sobrepõe quase completamente o tRNA de levedura para fenilalanina vermelho exceto em relação à alça do anticódon e à extremidade aminoacil Dados de M A Rould J J Perona D Soll e T A Steitz Structure of E coli GlutaminyltRNA Synthetase Complexed with tRNAGln and ATP at 28 Å Resolution Science 246 1989 11351142 Novamente a degeneração Conforme pode ser observado na Figura 95 o número de códons para um único aminoácido varia desde um códon UGG em relação ao triptofano até tantos quantos seis UCC UCU UCA UCG AGC ou AGU em relação à serina O motivo de o código genético conter essa variação não está exatamente claro mas dois fatores explicam isso A maioria dos aminoácidos pode ser trazida até o ribossomo por diversos tipos de tRNA alternativos Cada tipo apresenta um anticódon diferente que pareia bases com um códon diferente no mRNA Determinadas espécies de tRNA carregados podem trazer seus aminoácidos específicos para qualquer um de diversos códons Esses tRNA reconhecem e se ligam a diversos códons alternativos não apenas àquele com uma sequência complementar por meio de um tipo frouxo de pareamento de bases na extremidade 3 do códon e na extremidade 5 do anticódon Esse pareamento frouxo é denominado oscilante O pareamento oscilante é uma situação na qual o terceiro nucleotídio de um anticódon na extremidade 5 pode formar qualquer um de dois alinhamentos Figura 99 Esse terceiro nucleotídio pode formar ligações de hidrogênio com seu nucleotídio complementar normal na terceira posição do códon ou com um nucleotídio diferente naquela posição As regras do pareamento oscilante ditam quais nucleotídios podem e não podem formar ligações de hidrogênio com nucleotídios alternativos por meio de oscilação Tabela 91 Na Tabela 91 a letra I faz referência à inosina uma das raras bases observadas no tRNA com frequência no anticódon Tabela 91 Pareamentos de códonanticódon possibilitados pelas regras de oscilação Extremidade 5 do anticódon Extremidade 3 do códon G C ou U C Apenas G A Apenas U U A ou G I U C ou A 94 CONCEITOCHAVE Dizse que o código genético é degenerado porque em muitos casos mais de um códon é atribuído a um único aminoácido além disso diversos códons conseguem parear com mais de um anticódon pareamento oscilante FIGURA 99 No terceiro sítio extremidade 5 do anticódon G pode adotar qualquer uma de duas posições oscilantes sendo capaz portanto de parearse com U ou C Essa capacidade significa que uma única espécie de tRNA que carreia um aminoácido nesse caso serina consegue reconhecer dois códons UCU e UCC no mRNA Ribossomos A síntese proteica ocorre quando moléculas de tRNA e mRNA se associam aos ribossomos A tarefa dos tRNA e do ribossomo é traduzir a sequência de códons de nucleotídios no mRNA na sequência de aminoácidos na proteína O termo máquina biológica foi utilizado nos capítulos antecedentes para caracterizar complexos multissubunitários que realizam funções celulares O replissomo por exemplo é uma máquina biológica que pode replicar o DNA com precisão e velocidade O sítio de síntese proteica o ribossomo é muito maior e mais complexo do que as máquinas descritas até agora Sua complexidade ocorre porque ele realiza diversas tarefas com precisão e velocidade Por isso é melhor pensar a respeito do ribossomo como uma fábrica que contém muitas máquinas que atuam em conjunto Vejamos como essa fábrica é organizada para realizar suas diversas funções Em todos os organismos o ribossomo é composto por uma subunidade pequena e uma grande cada uma composta por RNA denominado RNA ribossômico ou rRNA e proteínas Cada subunidade é composta por um a três tipos de rRNA e até 50 proteínas As subunidades ribossômicas foram originalmente caracterizadas pela sua velocidade de sedimentação quando centrifugadas em uma ultracentrífuga e assim suas denominações são derivadas de seus coeficientes de sedimentação em unidades Svedberg S que é uma indicação do tamanho molecular Em procariotos as subunidades pequena e grande são denominadas 30S e 50S respectivamente e elas se associam para formar uma partícula 70S Figura 910 A As correspondentes eucarióticas são denominadas 40S e 60S e o ribossomo completo é denominado 80S Figura 910 B Embora os ribossomos eucarióticos sejam maiores em virtude de seus componentes maiores e mais numerosos os componentes e as etapas na síntese proteica são em geral semelhantes As semelhanças indicam claramente que a tradução é um processo antigo que teve origem em um ancestral comum dos eucariotos e procariotos Quando os ribossomos foram estudados pela primeira vez o fato de que quase dois terços de sua massa são de RNA e apenas um terço é de proteínas foi surpreendente Durante décadas haviase presumido que os rRNA atuavam como andaime estrutura necessária para a montagem correta das proteínas ribossômicas Aquele papel aparentava ser lógico tendo em vista que os rRNA se dobram por meio do pareamento de bases intramolecular em estruturas secundárias estáveis Figura 911 De acordo com esse modelo as proteínas ribossômicas eram responsáveis apenas pela realização das etapas mais importantes na síntese proteica A visão foi alterada com a descoberta na década de 1980 dos RNA catalíticos ver Capítulo 8 Conforme você verá atualmente os cientistas acreditam que os rRNA assistidos pelas proteínas ribossômicas realizam a maioria das etapas importantes na síntese proteica FIGURA 910 Um ribossomo contém uma subunidade grande e uma pequena Cada subunidade contém rRNA de comprimentos variáveis e um conjunto de proteínas Existem duas moléculas de rRNA principais em todos os ribossomos Os ribossomos procarióticos também contêm um rRNA de 120 bases que sedimenta em 5S enquanto os ribossomos eucarióticos apresentam dois rRNA pequenos uma molécula de RNA 5S semelhante à 5S procariótica e uma molécula 58S com 160 bases de comprimento FIGURA 911 A estrutura dobrada do RNA ribossômico 16S procariótico da subunidade ribossômica pequena Características do ribossomo O ribossomo reúne os outros importantes participantes na síntese proteica as moléculas de tRNA e mRNA para traduzir a sequência de nucleotídios de um mRNA na sequência de aminoácidos de uma proteína As moléculas de tRNA e mRNA estão posicionadas no ribossomo de modo que o códon do mRNA consegue interagir com o anticódon do tRNA Os sítioschave de interação estão ilustrados na Figura 912 O sítio de ligação ao mRNA está completamente dentro da subunidade menor Existem três sítios de ligação em relação às moléculas de tRNA Cada tRNA ligado une as subunidades 30S e 50S posicionado com sua extremidade do anticódon na primeira e sua extremidade aminoacil que carreia o aminoácido na última O sítio A de aminoacil liga um aminoaciltRNA que chega cujo anticódon corresponde ao códon no sítio A da subunidade 30S Na medida em que prosseguimos na direção de 5 no mRNA o próximo códon interage com o anticódon do tRNA no sítio P de peptidil da subunidade 30S O tRNA no sítio P ligase à cadeia de peptídios em crescimento parte da qual se encaixa em uma estrutura semelhante a um túnel na subunidade 50S O sítio E de saída contém um tRNA desacilado que deixa de carrear um aminoácido que está pronto para ser liberado do ribossomo Não está claro se as interações códonanticódon também ocorrem entre o mRNA e o tRNA no sítio E Duas regiões adicionais no ribossomo são críticas para a síntese proteica O centro decodificador na subunidade 30S assegura que apenas os tRNA que carreiam anticódons que correspondem ao códon denominados tRNA cognatos serão aceitos no sítio A O centro peptidiltransferase na subunidade 50S é o sítio no qual a formação da ligação peptídica é catalisada Recentemente muitos laboratórios especialmente aqueles de Thomas Steitz Venkatraman Ramakrishnan e Ada Yonath utilizaram a cristalografia de raios X para resolver a estrutura do ribossomo no nível atômico Por essa conquista esses três cientistas receberam o Prêmio Nobel de Química em 2009 Os resultados de seus elegantes estudos demonstram claramente que ambos os centros decodificador e peptidiltransferase são compostos totalmente por regiões de rRNA ou seja os contatos importantes nesses centros são contatos tRNArRNA Acreditase até que a formação de ligações peptídicas seja catalisada por um sítio ativo no RNA ribossômico e auxiliada apenas por proteínas ribossômicas Em outras palavras a subunidade ribossômica maior atua como uma ribozima para catalisar a formação da ligação peptídica Sitioschave de interação no ribossomo FIGURA 912 Sítioschave de interação em um ribossomo na fase de alongamento da tradução A Um modelo em computador da estrutura tridimensional do ribossomo incluindo mRNA tRNA e cadeia polipeptídica nascente na medida em que ela emerge da subunidade ribossômica maior B Um modelo esquemático do ribossomo durante o alongamento da tradução Ver o texto para detalhes A J Frank Cryo electron microscopy as an investigative tool the ribosome as an example BioEssays 23 2001 725732 Figure 2 Reproduzida com autorização de John Wiley Sons Inc O QUE OS GENETICISTAS FAZEM ATUALMENTE Estudos estruturais semelhantes examinaram a subunidade ribossômica grande que forma complexos com diversos antibióticos diferentes Esses estudos identificaram os pontos de contato entre o antibiótico e o ribossomo e ao fazer isso forneceram uma explicação para o motivo de determinados antibióticos inativarem apenas ribossomos bacterianos Por exemplo os macrolídeos são uma família de compostos estruturalmente semelhantes que inclui os antibióticos populares eritromicina e Zithromax Esses antibióticos inibem a síntese proteica parando o ribossomo no mRNA Eles fazem isso por meio da ligação a uma região específica do rRNA 23S na subunidade ribossômica grande e do bloqueio do assim denominado túnel de saída onde o polipeptídio nascente emerge dessa subunidade ver Figura 91 Em virtude de pequenas diferenças de sequência entre os rRNA de procariotos e eucariotos os macrolídios inibem apenas a tradução bacteriana Curiosamente as bactérias patogênicas que desenvolveram resistência a alguns desses antibióticos aparentam apresentar mutações ribossômicas que tornam o túnel de saída maior Portanto o conhecimento a respeito de como os antibióticos se ligam aos ribossomos auxilia os cientistas a compreenderem como o ribossomo atua e como desenhar novos antibióticos que possam ser ativos contra mutantes resistentes A utilização de informações básicas a respeito do maquinário celular para o desenvolvimento de novos antibióticos e outros fármacos foi apelidada desenho de fármaco com base na estrutura Iniciação alongamento e término da tradução O processo de tradução pode ser dividido em três fases iniciação alongamento e término Além do ribossomo do mRNA e dos tRNA proteínas adicionais são necessárias para a conclusão bemsucedida de cada fase Tendo em vista que determinadas etapas na iniciação diferem significativamente em procariotos e em eucariotos a iniciação é descrita separadamente em relação aos dois grupos As fases de alongamento e término são descritas como ocorrem em bactérias que têm sido o foco de muitos estudos recentes da tradução Iniciação da tradução A principal tarefa da iniciação é posicionar o primeiro aminoaciltRNA no sítio P do ribossomo e desse modo estabelecer o quadro de leitura correto do mRNA Na maioria dos procariotos e em todos os eucariotos o primeiro aminoácido em qualquer polipeptídio recémsintetizado é a metionina especificada pelo códon AUG Ela é inserida não pelo tRNAMet mas por um tRNA especial denominado iniciador simbolizado por tRNAMet i Em bactérias um grupo formil é adicionado à metionina enquanto o aminoácido se liga ao iniciador formando a Nformilmetionina O grupo formil na Nformilmetionina é removido posteriormente Como o maquinário de tradução sabe onde iniciar Em outras palavras como o códon de iniciação AUG é selecionado entre os muitos códons AUG em uma molécula de mRNA Relembre que em ambos os procariotos e os eucariotos o mRNA apresenta uma região 5 não traduzida que consiste na sequência entre o sítio de início da transcrição e o sítio de início da tradução ver Figura 87 Conforme você verá posteriormente a sequência de nucleotídios da 5 UTR adjacente ao iniciador AUG é crítica para a ligação do ribossomo em procariotos mas não em eucariotos Iniciação em procariotos Os códons de iniciação são precedidos por sequências especiais denominadas sequências de ShineDalgarno que pareiam com a extremidade 3 de um rRNA denominado rRNA 16S na subunidade ribossômica 30S Figura 913 Esse pareamento posiciona corretamente o códon iniciador no sítio P ao qual o tRNA iniciador se ligará O mRNA pode parear apenas com a subunidade 30S que está dissociada do restante do ribossomo Observe novamente que o rRNA realiza a funçãochave ao assegurar que o ribossomo esteja no local correto para iniciar a tradução Três proteínas IF1 IF2 e IF3 de fator de iniciação são necessárias para a iniciação correta Figura 914 A IF3 é necessária para manter a subunidade 30S dissociada da subunidade 50S e IF1 e IF2 atuam para assegurar que apenas o tRNA iniciador entre no sítio P A subunidade 30S o mRNA e o tRNA iniciador constituem o complexo de iniciação O ribossomo 70S completo é formado por meio da associação da subunidade maior 50S com o complexo de iniciação e da liberação dos fatores de iniciação Tendo em vista que um procarioto não apresenta um compartimento nuclear que separe a transcrição e a tradução o complexo de iniciação procariótico é capaz de se formar em uma sequência de ShineDalgarno próxima da extremidade 5 de um RNA que ainda está sendo transcrito Portanto a tradução pode ter início em RNA procarióticos até mesmo antes que eles sejam completamente transcritos FIGURA 913 Em bactérias a complementaridade de bases entre a extremidade 3 do rRNA 16S da subunidade ribossômica pequena 30S e a sequência de ShineDalgarno do mRNA posiciona o ribossomo para iniciar corretamente a tradução no códon AUG downstream Iniciação da tradução em procariotos FIGURA 914 Os fatores de iniciação auxiliam na montagem do ribossomo no sítio de início da tradução e em seguida se dissociam antes da tradução Iniciação em eucariotos A transcrição e a tradução ocorrem em compartimentos separados na célula eucariótica Como discutido no Capítulo 8 os mRNA eucarióticos são transcritos e processados no núcleo antes de serem exportados para o citoplasma para a tradução Na chegada ao citoplasma o mRNA normalmente é recoberto por proteínas e algumas regiões podem ter duplahélice em virtude do pareamento intramolecular de bases Essas regiões de estrutura secundária devem ser removidas para expor o códon iniciador AUG Essa remoção é realizada por fatores de iniciação eucarióticos denominados eIF4A B e G Esses fatores de iniciação se associam à estrutura do cap que se encontra na extremidade 5 de virtualmente todos os mRNA eucarióticos e à subunidade 40S e ao tRNA iniciador para formar um complexo de iniciação Uma vez no local o complexo se movimenta ao longo do mRNA no sentido 5 para 3 e desenrola as regiões com bases pareadas Figura 915 Ao mesmo tempo a sequência exposta é varrida à procura de um códon AUG no qual a tradução possa ter início Após o códon AUG ser alinhado adequadamente com o tRNA iniciador ao complexo de iniciação se une à subunidade 60S para formar o ribossomo 80S Assim como em procariotos os fatores de iniciação eucarióticos se dissociam do ribossomo antes que a fase de alongamento da tradução tenha início Iniciação da tradução em eucariotos FIGURA 915 O complexo de iniciação se forma na extremidade 5 do mRNA e em seguida realiza a varredura no sentido da extremidade 3 à procura de um códon de início O reconhecimento do códon de início aciona a montagem do ribossomo completo e a dissociação dos fatores de iniciação não demonstrados A hidrólise de ATP fornece energia para direcionar o processo de varredura Alongamento É durante o processo de alongamento que o ribossomo mais se assemelha a uma fábrica O mRNA atua como um mapa que especifica a entrega de tRNA cognatos cada um carregando um aminoácido como carga Cada aminoácido é adicionado à cadeia de polipeptídios em crescimento enquanto o tRNA desacilado é reciclado por meio da adição de outro aminoácido A Figura 916 detalha as etapas no alongamento Dois fatores proteicos denominados fator de alongamento Tu EFTu e fator de alongamento G EFG auxiliam no processo de alongamento Conforme descrito anteriormente neste capítulo um aminoaciltRNA é formado por meio da ligação covalente de um aminoácido à extremidade 3 de um tRNA que contém o anticódon correto Antes que os aminoaciltRNA possam ser utilizados na síntese proteica eles se associam ao fator proteico EFTu para formar um complexo ternário composto por tRNA aminoácido e EFTu O ciclo de alongamento começa com um tRNA iniciador e sua metionina unida no sítio P e com o sítio A pronto para aceitar um complexo ternário ver Figura 916 Qual dos 20 complexos ternários diferentes deverá ser aceito é determinado pelo reconhecimento códonanticódon no centro decodificador da subunidade menor ver Figura 912 B Quando há correspondência correta o ribossomo altera sua forma EFTu deixa o complexo ternário e as duas extremidades aminoacil são justapostas no centro peptidiltransferase da subunidade maior ver Figura 912 B Ali uma ligação peptídica é formada com a transferência da metionina no sítio P para o aminoácido no sítio A Nesse ponto o segundo fator proteico EF G desempenha a sua parte O fator EFG aparenta se encaixar no sítio A A sua entrada nesse sítio altera os tRNA nos sítios A e P para os sítios P e E respectivamente e o mRNA se movimenta pelo ribossomo de modo que o próximo códon é posicionado no sítio A ver Figura 916 Quando o EFG deixa o ribossomo o sítio A é aberto para aceitar o próximo complexo ternário Nos ciclos subsequentes o sítio A é preenchido com um novo complexo ternário na medida em que o tRNA desacilado deixa o sítio E Na medida em que o alongamento progride o número de aminoácidos no peptidiltRNA no sítio P aumenta Finalmente a extremidade aminoterminal do polipeptídio em crescimento emerge do túnel na subunidade 50S e sai do ribossomo Término O ciclo continua até que o códon no sítio A seja um dos três códons de parada UGA UAA ou UAG Relembre que nenhum tRNA reconhece esses códons Em vez disso proteínas denominadas fatores de liberação RF1 RF2 e RF3 em bactérias reconhecem os códons de parada Figura 917 Em bactérias RF1 reconhece UAA ou UAG enquanto RF2 reconhece UAA ou UGA ambos são auxiliados por RF3 A interação dos fatores de liberação 1 e 2 e o sítio A difere daquela do complexo ternário de dois modos importantes Primeiramente os códons de parada são reconhecidos por tripeptídios nas proteínas RF não por um anticódon Em segundo lugar os fatores de liberação se encaixam no sítio A da subunidade 30S mas não participam na formação da ligação peptídica Em vez disto uma molécula de água entra no centro peptidiltransferase e sua presença leva à liberação do polipeptídio do tRNA no sítio P As subunidades ribossômicas se separam e a subunidade 30S agora está pronta para formar um novo complexo de iniciação FIGURA 916 Um complexo ternário composto por um aminoaciltRNA ligado a um fator EFTu se liga ao sítio A Quando o seu aminoácido se une à cadeia de polipeptídios em crescimento um fator EFG se liga a sítio A enquanto empurra os tRNA e seus códons do mRNA para os sítios E e P Ver o texto para detalhes FIGURA 917 A tradução é encerrada quando fatores de liberação reconhecem os códons de parada no sítio A do ribossomo CONCEITOCHAVE A tradução é realizada pelos ribossomos que se movimentam ao longo do mRNA no sentido 5 para 3 Um conjunto de moléculas de tRNA traz os aminoácidos até o ribossomo e seus anticódons se ligam aos códons do mRNA expostos no ribossomo Um aminoácido que chega se torna ligado à extremidade amino da cadeia de polipeptídios em crescimento no ribossomo Mutações supressoras sem sentido É interessante considerar os supressores das mutações sem sentido definidas por Brenner e colaboradores Relembre que as mutações em fagos denominadas mutantes âmbar substituíram os códons do tipo selvagem por códons de parada mas as mutações supressoras no cromossomo hospedeiro se contrapuseram aos efeitos das mutações âmbar Agora podemos dizer mais especificamente onde as mutações supressoras estavam localizadas e como elas atuaram Muitos desses supressores são mutações em genes que codificam tRNA e são conhecidas como supressoras do tRNA Essas mutações alteram as alças do anticódon de tRNA específicos de tal modo que um tRNA se torna capaz de reconhecer um códon de parada no mRNA Na Figura 918 a mutação âmbar substitui um códon do tipo selvagem pelo códon de término de cadeia UGA Por si próprio o UAG causaria o corte prematuro da proteína na posição correspondente A mutação supressora nesse caso produz um tRNATyr com um anticódon que reconhece o códon de parada UAG mutante Portanto no mutante suprimido o tRNATyr compete com o fator de liberação pelo acesso ao códon de parada UAG Como resultado se a tirosina for inserida a tradução continua além daquela trinca 95 FIGURA 918 Um supressor possibilita que a tradução continue enquanto uma mutação a teria interrompido A No tipo selvagem um tRNA lê o códon UAC e a tradução continua B Término da tradução Aqui o aparato de tradução não consegue passar por um códon de parada neste caso UAG tendo em vista que nenhum tRNA consegue reconhecer a trinca UAG Em vez disso um fator de liberação se liga ao códon e a síntese proteica termina com a subsequente liberação do fragmento polipeptídico C Uma mutação altera o anticódon de um tRNA de tirosina de modo que esse tRNA agora consegue ler o códon UAG A supressão do códon UAG pelo tRNA alterado agora possibilita o alongamento da cadeia Supressoras de tRNA como tRNATyr também poderiam se ligar a sinais de término normais e resultar na síntese de proteínas anormalmente longas Agora que muitos genomas foram sequenciados sabese que um dos três códons de parada UAA ocre é utilizado com muito mais frequência para terminar a síntese proteica Como tal não é surpresa que células com supressores ocre normalmente sejam mais doentes do que células com mutações supressoras âmbar ou opala Proteoma O Capítulo 8 foi iniciado com uma discussão sobre o número de genes no genoma humano e como aquela número aproximadamente 21000 era muito inferior ao número real de proteínas em uma célula humana mais de 100000 Agora que você está familiarizado sobre como a informação codificada no DNA é transcrita em RNA e como o RNA é traduzido em proteína esse é um bom momento para revisar esse assunto e observar de modo mais próximo as fontes de diversificação das proteínas Primeiramente revisaremos alguns poucos termos antigos e adicionaremos um novo que será útil nessa discussão Você já sabe que o genoma é todo o conjunto de material genético em um organismo Você aprenderá no Capítulo 14 que o transcriptoma é o conjunto completo de transcritos codificadores e não codificadores em um organismo órgão tecido ou célula Outro termo é o proteoma que foi brevemente introduzido no Capítulo 8 mas que é definido aqui como o conjunto completo de proteínas em um organismo órgão tecido ou célula No restante deste capítulo você verá como o proteoma é enriquecido por dois processos celulares a recomposição alternativa do pré mRNA e a modificação póstradução das proteínas A recomposição alternativa gera isoformas de proteínas Conforme você relembra do Capítulo 8 a recomposição alternativa do pré mRNA possibilita que um gene codifique mais de uma proteína As proteínas são compostas por domínios funcionais que com frequência são codificados por diferentes éxons Portanto a recomposição alternativa de um prémRNA pode levar à síntese de diversas proteínas denominadas isoformas com diferentes combinações de domínios funcionais Esse conceito é ilustrado pelo FGFR2 um gene humano que codifica o receptor que liga os fatores de crescimento de fibroblastos e em seguida transduz um sinal dentro da célula Figura 919 A proteína FGFR2 é composta por diversos domínios incluindo um domínio de ligação a ligante extracelular A recomposição alternativa resulta em duas isoformas que diferem em seus domínios extracelulares Em virtude dessa diferença cada isoforma ligase a diferentes fatores de crescimento Para muitos genes que são recompostos alternativamente diferentes isoformas são produzidas em diferentes tecidos Eventos póstradução Quando liberadas do ribossomo a maioria das proteínas recémsintetizadas é incapaz de atuar Conforme você verá nesta seção e nos capítulos subsequentes deste livro a sequência de DNA é apenas uma parte da história de como os organismos funcionam Nesse caso todas as proteínas recémsintetizadas precisam se dobrar corretamente e os aminoácidos de algumas proteínas precisam ser quimicamente modificados Tendo em vista que uma parte do dobramento e da modificação das proteínas ocorre após a síntese proteica eles são denominados eventos póstradução Dobramento da proteína dentro da célula O evento póstradução mais importante é o dobramento da proteína nascente recémsintetizada em sua forma tridimensional correta Dizse que uma proteína que é dobrada corretamente está em sua conformação nativa contrariamente a uma proteína não dobrada ou dobrada erroneamente que é não nativa Como observamos no início deste capítulo as proteínas existem em uma extraordinária diversidade de estruturas As estruturas distintas das proteínas são essenciais para a sua atividade enzimática para a sua capacidade de se ligar ao DNA ou para seus papéis estruturais na célula Embora se saiba desde a década de 1950 que a sequência de aminoácidos de uma proteína determina a sua estrutura tridimensional também se sabe que o ambiente aquoso dentro da célula não favorece o dobramento correto da maioria das proteínas Tendo em vista que as proteínas de fato se dobram corretamente na célula uma questão antiga tem sido como o dobramento correto é realizado A resposta aparentemente é que as proteínas nascentes são dobradas corretamente com o auxílio de chaperonas uma classe de proteínas encontrada em todos os organismos desde bactérias até plantas e seres humanos Uma família de chaperonas denominada chaperoninas GroE forma grandes complexos multissubunitários denominados máquinas de dobramento de chaperoninas Embora o mecanismo preciso ainda não seja compreendido acreditase que proteínas recémsintetizadas e não dobradas entrem em uma câmara na máquina de dobramento que proporciona um microambiente eletricamente neutro dentro do qual a proteína nascente consegue se dobrar com sucesso em sua conformação nativa Modificação póstradução das cadeias laterais de aminoácidos Conforme já declarado as proteínas são polímeros de aminoácidos produzidos a partir de qualquer um dos 20 diferentes tipos Entretanto a análise bioquímica de muitas proteínas revela que uma diversidade de moléculas pode ligarse covalentemente às cadeias laterais de aminoácidos Mais de 300 modificações de cadeias laterais de aminoácidos são possíveis após a tradução Duas das modificações pós tradução mais comumente encontradas a fosforilação e a ubiquitinação são consideradas em seguida FIGURA 919 RNA mensageiros produzidos por recomposição alternativa do prémRNA do gene FGFR2 humano codificam duas isoformas de proteína que se ligam a diferentes ligantes os fatores de crescimento Fosforilação Enzimas denominadas quinases unem os grupos fosfato aos grupos hidroxila dos aminoácidos serina treonina e tirosina enquanto enzimas denominadas fosfatases removem esses grupos fosfato Tendo em vista que os grupos fosfato são negativamente carregados a sua adição a uma proteína normalmente altera a conformação proteica A adição e a remoção de grupos fosfato atuam como uma alteração reversível para controlar uma diversidade de eventos celulares incluindo a atividade enzimática as interações proteína proteína e as interações proteínaDNA Figura 920 Uma medida da importância da fosforilação de proteínas é o número de genes que codificam a atividade quinase no genoma Até mesmo um organismo simples como uma levedura apresenta centenas de genes de quinases enquanto a planta da mostarda Arabidopsis thaliana apresenta mais de 1000 Outra medida da significância da fosforilação de proteínas é que a maior parte das diversas interações de proteínas que ocorrem em uma célula típica é regulada por fosforilação Análises recentes das interações de proteínas do proteoma indicam que a maioria das proteínas atua por meio da interação com outras proteínas Interatoma é a denominação dada ao conjunto completo de interações de proteínas em um organismo órgão tecido ou célula Um modo de ilustrar a rede de interações de proteínas que constitui um interatoma está demonstrado na Figura 921 Para gerar esta figura pesquisadores determinaram as 3186 interações proteicas entre 1705 proteínas humanas Entretanto essas interações constituem apenas uma pequena fração das interações de proteínas que estão ocorrendo em todas as células humanas sob todas as condições de crescimento FIGURA 920 As proteínas podem ser ativadas por meio da ligação enzimática de grupos fosfato aos grupos laterais de seus aminoácidos e inativadas por meio da remoção desses grupos fosfato FIGURA 921 As proteínas representadas pelos círculos interagem com outras proteínas conectadas por linhas para formar complexos proteicos simples ou grandes Este interatoma demonstra 3186 interações de 1705 proteínas humanas Dados de Ulrich Steizl et al Max Delbrück Center for Molecular Medicine MDC BerlinBuch Direitos autorais MDC Qual é a significância biológica dessas interações Neste capítulo e nos antecedentes você observou que as interações de proteínas são centrais para a função de grandes máquinas biológicas tais como o replissomo o spliceossomo e o ribossomo Outro conjunto de interações significativas é a das associações entre as proteínas humanas e as proteínas dos patógenos humanos Por exemplo o interatoma de 40 proteínas do vírus EpsteinBarr EBV e de 112 proteínas humanas é composto por 173 interações Figura 922 A compreensão sobre essa rede de interações pode levar a novas terapias para a mononucleose uma doença causada por infecção pelo EBV Ubiquitinação Surpreendentemente uma das modificações póstradução mais comuns não é sutil como a adição de um grupo fosfato Em vez disso essa modificação tem por alvo a degradação da proteína por meio de uma máquina biológica e da protease denominada proteossomo 26S Figura 923 A modificação que marca uma proteínaalvo para ser degradada é a adição de cadeias de múltiplas cópias de uma proteína denominada ubiquitina aos resíduos de εamina da lisina denominada ubiquitinação A ubiquitina contém 76 aminoácidos e é observada apenas em eucariotos nos quais é altamente conservada em plantas e em animais Duas classes amplas de proteínas são alvo de destruição por meio da ubiquitinação proteínas de vida curta tais como reguladoras do ciclo celular ou proteínas danificadas ou mutadas FIGURA 922 A rede de 173 interações de 40 proteínas do vírus EpsteinBarr EBV com 112 proteínas humanas As proteínas virais estão demonstradas como círculos amarelos e as proteínas humanas como quadrados azuis As interações estão demonstradas como linhas vermelhas Dados de Calderwood et al Proceedings of the National Academy of Sciences 104 2007 76067611 Direitos autorais 2007 por National Academy of Sciences FIGURA 923 Estão demonstradas as principais etapas na degradação proteica mediada pela ubiquitina A ubiquitina é primeiramente conjugada a outra proteína e em seguida degradada pelo proteossomo Em seguida a ubiquitina e os oligopeptídios são reciclados Direcionamento de proteínas Em eucariotos todas as proteínas são sintetizadas nos ribossomos no citoplasma Entretanto algumas dessas proteínas acabam no núcleo outras nas mitocôndrias e ainda outras ancoradas na membrana ou secretadas da célula Como essas proteínas sabem onde elas devem ir A resposta para esse problema aparentemente complexo de fato é consideravelmente simples uma proteína recémsintetizada contém uma sequência curta que a direciona para o local ou compartimento celular correto Por exemplo uma proteína de membrana recémsintetizada ou uma proteína destinada para uma organela apresenta um curto peptídio líder denominado sequência de sinal na sua extremidade aminoterminal Para as proteínas de membrana esse trecho de 15 a 25 aminoácidos direciona a proteína para canais na membrana do retículo endoplasmático onde a sequência de sinal é clivada por uma peptidase Figura 924 A partir do retículo endoplasmático a proteína é direcionada para o seu destino final Existe um fenômeno semelhante para determinadas proteínas bacterianas que são secretadas FIGURA 924 As proteínas destinadas a serem secretadas da célula apresentam uma sequência amino terminal que é rica em resíduos hidrofóbicos Essa sequência de sinal se liga às proteínas na membrana do retículo endoplasmático RE que retiram o restante da proteína por meio da bicamada lipídica A sequência de sinal é clivada da proteína neste processo por uma enzima denominada peptidase de sinal não demonstrada Uma vez dentro do retículo endoplasmático a proteína é direcionada para a membrana celular a partir da qual será secretada As proteínas destinadas ao núcleo incluem as RNA e DNA polimerases e os fatores de transcrição discutidos nos Capítulos 7 e 8 As sequências de aminoácidos inseridas no interior das referidas proteínas ligadas ao núcleo são necessárias para o transporte do citoplasma para o núcleo Essas sequências de localização nuclear NLS são reconhecidas por proteínas receptoras citoplasmáticas que transportam proteínas recémsintetizadas através dos poros nucleares sítios na membrana por meio dos quais moléculas grandes são capazes de passar para dentro e para fora do núcleo Uma proteína normalmente não observada no núcleo será direcionada para o núcleo se uma NLS estiver ligada a ela Por que as sequências de sinal são clivadas durante o direcionamento enquanto uma NLS localizada no interior de uma proteína permanece após a proteína se movimentar para dentro do núcleo Uma explicação pode ser que na desintegração nuclear que acompanha a mitose ver Capítulo 2 as proteínas localizadas no núcleo podem ser encontradas no citoplasma Tendo em vista que essa proteína contém uma NLS ela pode ser realocada para o núcleo de um célulafilha que resulta da mitose CONCEITOCHAVE A maioria das proteínas eucarióticas é inativa exceto se modificada após a tradução Alguns eventos póstradução tais como a fosforilação ou a ubiquitinação modificam os grupos laterais de aminoácidos promovendo assim a ativação ou a degradação proteica respectivamente Outros mecanismos póstradução reconhecem a identidade dos aminoácidos em uma sequência proteica e direcionam aquelas proteínas para locais nos quais sua atividade é necessária dentro ou fora da célula RESUMO Este capítulo descreveu a tradução da informação codificada na sequência de nucleotídios de um mRNA em uma sequência de aminoácidos de uma proteína Nossas proteínas mais do que qualquer outra macromolécula determinam quem e o que somos Elas são as enzimas responsáveis pelo metabolismo celular incluindo a síntese de DNA e RNA e são os fatores reguladores necessários para a expressão do programa genético A versatilidade das proteínas como moléculas biológicas é manifestada na diversidade de formas que elas podem assumir Além disso até mesmo após a sua síntese elas podem ser modificadas em uma diversidade de modos por meio da adição de moléculas que conseguem alterar a sua função Tendo em vista o papel central das proteínas na vida não é surpresa que ambos o código genético e o maquinário para a tradução desse código em proteínas tenham sido altamente conservados desde as bactérias até os seres humanos Os principais componentes da tradução são três classes de RNA tRNA mRNA e rRNA A precisão da tradução depende da ligação enzimática de um aminoácido com seu tRNA cognato gerando uma molécula de tRNA carregada Como adaptadores os tRNA são as moléculaschave na tradução Contrariamente o ribossomo é a fábrica na qual mRNA tRNA carregados e outros fatores proteicos se unem para a síntese proteica A decisãochave na tradução é onde iniciar a tradução Em procariotos o complexo de iniciação é montado no mRNA na sequência de ShineDalgarno logo upstream do códon de início AUG O complexo de iniciação em eucariotos é montado na estrutura cap 5 do mRNA e se movimenta na direção 3 até que o códon de início seja reconhecido A fase mais longa da tradução é o ciclo de alongamento nessa fase o ribossomo se movimenta ao longo do mRNA revelando o próximo códon que irá interagir com seu tRNA carregado cognato de modo que os tRNA carregados com aminoácidos possam ser adicionados à cadeia de polipeptídios em crescimento Esse ciclo continua até que um códon de parada seja encontrado Os fatores de liberação facilitam o término da tradução Nos últimos anos novas técnicas de imagem revelaram interações ribossômicas no nível atômico Com esses novos olhos atualmente podemos ver que o ribossomo é uma máquina incrivelmente dinâmica que altera sua forma em resposta aos contatos realizados com tRNA e com proteínas Além disso as imagens em resolução atômica revelaram que os RNA ribossômicos não as proteínas ribossômicas estão intimamente associados aos centros funcionais do ribossomo O proteoma é o conjunto completo de proteínas que pode ser expresso pelo material genético de um organismo Enquanto um eucarioto multicelular típico apresenta aproximadamente 20000 genes o proteoma típico provavelmente é 10 a 50 vezes maior Essa diferença em parte é o resultado de modificações pós tradução tais como fosforilação e ubiquitinação que influenciam a atividade e a estabilidade proteica TERMOSCHAVE aminoácido aminoaciltRNA sintetase anticódon centro decodificador centro peptidiltransferase código degenerado códon desenho de fármaco com base na estrutura direcionamento de proteínas domínio estrutura primária estrutura quaternária estrutura secundária estrutura terciária extremidade amino extremidade carboxila fator de iniciação fator de liberação RF iniciador interatoma isoforma oscilante polipeptídio proteína fibrosa proteína globular proteoma ribossomo RNA ribossômico rRNA RNA transportador ou de transferência tRNA sequência de localização nuclear NLS sequência de ShineDalgarno sequência de sinal sítio A sítio ativo sítio E sítio P subunidade trinca tRNA carregado ubiquitina ubiquitinação PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 Com a utilização da Figura 95 demonstre as consequências sobre a tradução subsequente da adição de uma base adenina no início da sequência codificadora a seguir Solução Com a adição da A no início da sequência codificadora o quadro de leitura é alterado e um conjunto diferente de aminoácidos é especificado pela sequência conforme demonstrado aqui observe que é encontrado um conjunto de códons sem sentido que resulta no término da cadeia ACGAUCGGAACCACGUGAUAAGCA Thr Ile Gly Thr parada parada Problema resolvido 2 A adição de um único nucleotídio seguida por uma deleção de um nucleotídio único à distância de aproximadamente 20 pb no DNA causa uma alteração na sequência proteica de HisThrGluAspTrpLeuHisGlnAsp para HisAspArgGlyLeuAlaThrSerAsp Qual nucleotídio foi adicionado e qual foi deletado Qual é a sequência de mRNA original e a nova Dica ver Figura 95 Solução Podemos desenhar a sequência de mRNA em relação à sequência proteica original com as ambiguidades inerentes nesse estágio Tendo em vista que a alteração na sequência proteica fornecida a nós no início do problema tem início após o primeiro aminoácido His em virtude da adição de um nucleotídio único podemos deduzir que um códon Thr tem de ser alterado para um códon Asp Essa alteração necessariamente resulta da adição de uma G diretamente antes do códon Thr indicado por um quadro que altera o quadro de leitura conforme demonstrado aqui 1 2 3 Além disso tendo em vista que uma deleção de um nucleotídio deve restaurar o códon Asp final para o quadro de leitura correto uma A ou G deve ter sido deletada do final do códon próximo ao último original conforme demonstrado pela seta A sequência proteica original nos possibilita desenhar o mRNA com uma diversidade de ambiguidades Entretanto a sequência proteica que resulta do deslocamento do quadro de leitura nos possibilita determinar qual nucleotídio estava no mRNA original na maior parte desses pontos de ambiguidade Os nucleotídios que podem ter aparecido na sequência original estão circulados Em apenas alguns casos a ambiguidade permanece PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS A estrutura proteica primária está demonstrada na Figura 93 A Onde no mRNA próximo da extremidade 5 ou 3 uma mutação em R2 seria codificada Neste capítulo você conheceu mutações supressoras sem sentido nos genes do tRNA Entretanto as mutações supressoras também ocorrem em genes codificadores de proteínas Com a utilização da estrutura terciária da subunidade β da hemoglobina demonstrada na Figura 93 C explique em termos estruturais como uma mutação poderia causar a perda da função proteica da globina Agora explique como uma mutação em um segundo local na mesma proteína poderia suprimir esta mutação e levar a uma proteína normal ou quase normal Com a utilização da estrutura quaternária da hemoglobina demonstrada na 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Figura 93 D explique em termos estruturais como uma mutação na proteína da subunidade β poderia ser suprimida por uma mutação no gene da subunidade α RNA transportadores tRNA são exemplos de moléculas de RNA que não codificam proteínas Com base nas Figuras 96 e 98 qual é a significância da sequência de moléculas de tRNA Qual você prevê que seria o impacto sobre a tradução de uma mutação em uma das bases de uma das hastes na estrutura do tRNA No organismo mutante Os componentes de ribossomos procarióticos e eucarióticos estão demonstrados na Figura 910 Com base nesta figura você acredita que o grande RNA ribossômico procariótico rRNA 23S seria capaz de substituir o rRNA 28S eucariótico Justifique a sua resposta Os RNA ribossômicos rRNA são outro exemplo de uma molécula de RNA funcional Com base na Figura 911 qual você acredita que seja a significância da estrutura secundária do rRNA Na Figura 912 o aminoácido terminal que está emergindo do ribossomo é codificado pela extremidade 5 ou 3 do mRNA Na Figura 912 B o que você acredita que ocorra com o tRNA que é liberado do sítio E Na Figura 917 o que você acredita que ocorra próximo das subunidades ribossômicas após elas terminarem a tradução daquele mRNA Com base na Figura 919 você consegue prever a posição de uma mutação que afetaria a síntese de uma isoforma mas não da outra Com base na Figura 924 você consegue prever a posição de uma mutação que produziria uma proteína ativa que não foi direcionada para o local correto PROBLEMAS BÁSICOS a Utilize o dicionário de códons na Figura 95 para completar a tabela a 13 seguir Presuma que a leitura seja da esquerda para a direita e que as colunas representem os alinhamentos da transcrição e da tradução C Duplahélice de DNA T G A C A U mRNA transcrito G C A Anticódon de tRNA adequado Trp Aminoácidos incorporados à proteína b Rotule as extremidades 5 e 3 do DNA e do RNA bem como as extremidades amino e carboxila da proteína Considere o segmento de DNA a seguir 5 GCTTCCCAA 3 3 CGAAGGGTT 5 Presuma que o filamento superior seja o filamentomolde utilizado pela RNA polimerase a Desenhe o RNA transcrito b Rotule as suas extremidades 5 e 3 14 15 16 17 18 19 20 c Desenhe a cadeia de aminoácidos correspondente d Rotule as suas extremidades amino e carboxila Repita as partes a a d presumindo que o filamento inferior seja o filamentomolde Um evento mutacional insere um par de nucleotídios extra no DNA Qual dos desfechos a seguir você espera 1 Absolutamente nenhuma proteína 2 uma proteína na qual um aminoácido está alterado 3 uma proteína na qual três aminoácidos estão alterados 4 uma proteína na qual dois aminoácidos estão alterados 5 uma proteína na qual a maior parte dos aminoácidos após o sítio da inserção está alterada Antes de a verdadeira natureza do processo do código genético ter sido totalmente compreendida foi proposto que a mensagem poderia ser lida em trincas sobrepostas Por exemplo a sequência GCAUC poderia ser lida como GCA CAU AUC Planeje um teste experimental dessa ideia Se o tRNA é o adaptador para a tradução o que é o ribossomo Qual anticódon você preveria para uma espécie de tRNA que carreia a isoleucina Existe mais de uma resposta possível Caso afirmativo declare quaisquer respostas alternativas a Em quantos casos no código genético você falharia em conhecer o aminoácido especificado por um códon se você soubesse apenas os primeiros dois nucleotídios do códon b Em quantos casos você falharia em conhecer os primeiros dois nucleotídios do códon se soubesse qual aminoácido é especificado por ele Deduza quais seis códons do tipo selvagem podem ter estado nos mutantes que levaram Brenner a inferir a natureza do códon UAG Se um polirribonucleotídio contém quantidades iguais de bases adenina e 21 22 23 24 25 26 uracila posicionadas aleatoriamente qual proporção de suas trincas irá codificar a fenilalanina b isoleucina c leucina d tirosina Você sintetizou três RNA mensageiros diferentes com bases incorporadas em uma sequência aleatória nas razões a seguir a 1 U 5 C b 1 A 1 C 4 U c 1 A 1 C 1 G 1 U Em um sistema de síntese proteica in vitro indique as identidades e as proporções de aminoácidos que serão incorporados nas proteínas quando cada um desses mRNA for testado Consulte a Figura 95 No fungo Neurospora foram obtidos alguns mutantes que apresentavam ausência de atividade em relação a uma determinada enzima Observouse por meio de mapeamento que as mutações estão em um de dois genes não ligados Forneça uma explicação possível em referência à estrutura proteica quaternária Qual é o significado da declaração O código genético é universal Qual é a significância desse achado A enzima triptofano sintetase é produzida em dois tamanhos grande e pequena Alguns mutantes sem atividade enzimática produziram enzimas exatamente do mesmo tamanho que o tipo selvagem Outros mutantes sem atividade produziram apenas a enzima grande outros ainda apenas a enzima pequena a Explique os diferentes tipos de mutantes no nível da estrutura proteica b Por que você acredita que não havia mutantes que não produziam nenhuma enzima Nos experimentos de CrickBrenner descritos neste capítulo três inserções ou três deleções restauraram o quadro de leitura normal e a dedução foi que o código era lido em grupos de três Essa dedução realmente é comprovada pelos experimentos Um códon pode ter sido composto por seis bases por exemplo Um mutante não apresenta atividade em relação à enzima isocitrato liase Como esse resultado comprova que a mutação está no gene que codifica a 27 28 29 30 31 32 isocitrato liase Um determinado supressor sem sentido corrige um mutante sem crescimento até um estado que é próximo mas não exatamente do tipo selvagem ele apresenta crescimento anormal Sugira um possível motivo pelo qual a reversão não é uma correção total Em genes bacterianos assim que algum transcrito de mRNA parcial é produzido pelo sistema de RNA polimerase o ribossomo se associa a ele e inicia a tradução Desenhe um diagrama desse processo identificando as extremidades 5 e 3 do mRNA as extremidades COOH e NH da proteína a RNA polimerase e no mínimo um ribossomo Por que esse sistema não poderia atuar em eucariotos Em um haploide um supressor sem sentido su1 atua na mutação 1 mas não na mutação 2 ou 3 do gene P Um supressor sem sentido não ligado su2 atua na mutação 2 de P mas não sobre 1 ou 3 Explique esse padrão em relação à natureza das mutações e dos supressores Foram desenvolvidos sistemas de tradução in vitro nos quais moléculas de RNA específicas podem ser adicionadas a um tubo de ensaio que contém um extrato celular bacteriano que inclui todos os componentes necessários para a tradução ribossomos tRNA aminoácidos Se um aminoácido marcado radioativamente for incluído qualquer proteína traduzida a partir daquele RNA pode ser detectada e demonstrada em um gel Se um mRNA eucariótico for adicionado ao tubo de ensaio serão produzidas proteínas radioativas Explique Um sistema de tradução in vitro contém um extrato de célula eucariótica que inclui todos os componentes necessários para a tradução ribossomos tRNA aminoácidos Se um RNA bacteriano for adicionado ao tubo de ensaio uma proteína será produzida Caso negativo por que não Um sistema de tradução quimérico que contém a subunidade ribossômica grande de E coli e a subunidade ribossômica pequena de levedura um eucarioto unicelular seria capaz de atuar na síntese proteica Explique por 33 34 35 36 37 38 39 que sim ou por que não Mutações que alteram um único aminoácido no sítio ativo de uma enzima podem resultar na síntese de quantidades do tipo selvagem de uma enzima inativa Você consegue pensar em outras regiões em uma proteína nas quais uma alteração de aminoácido único pode apresentar o mesmo resultado Qual evidência ampara a visão de que os RNA ribossômicos são um componente mais importante do ribossomo do que as proteínas ribossômicas Explique por que os antibióticos tais como eritromicina e azitromicina que se ligam à subunidade ribossômica grande não nos prejudicam Por que os eucariotos multicelulares precisam ter centenas de genes que codificam quinases Nosso sistema imune produz muitas proteínas diferentes que nos protegem contra infecções virais e bacterianas Empresas de biotecnologia precisam produzir grandes quantidades dessas proteínas imunes para testes em humanos e a venda final para o público Para essa finalidade seus cientistas modificam culturas celulares bacterianas ou humanas para expressar essas proteínas imunes Explique por que as proteínas isoladas de culturas bacterianas com frequência são inativas enquanto as mesmas proteínas isoladas a partir das culturas celulares humanas são ativas funcionais Você esperaria encontrar sequências de localização nuclear NLS nas proteínas que produzem DNA e RNA polimerases procarióticas e eucarióticas Explique por que sim ou por que não PROBLEMAS DESAFIADORES A adição de um nucleotídio único e a deleção de um nucleotídio único à distância de aproximadamente 15 bases no DNA causam uma alteração na sequência proteica de 40 PheSerProArgLeuAsnAlaValLys para PheValHisAlaLeuMetAlaValLys a Quais são as sequências de nucleotídios do mRNA antigo e do novo Utilize o dicionário de códons na Figura 95 b Qual nucleotídio foi adicionado Qual foi deletado Você está estudando um gene de E coli que especifica uma proteína Uma parte da sua sequência é AlaProTrpSerGluLysCysHis Você recupera uma série de mutantes em relação a esse gene que não demonstram atividade enzimática Ao isolar os produtos enzimáticos mutantes você observa as sequências a seguir Mutante 1 AlaProTrpArgGluLysCysHis Mutante 2 AlaPro Mutante 3 AlaProGlyValLysAsnCysHis Mutante 4 AlaProTrpPhePheThrCysHis Qual é a base molecular em relação a cada mutação Qual é a sequência de DNA que especifica essa parte da proteína 41 42 43 44 Atualmente são conhecidos supressores de mutações por deslocamento do quadro de leitura Proponha um mecanismo para a sua ação Considere os genes que especificam a estrutura da hemoglobina Disponha os eventos a seguir na sequência mais provável na qual eles ocorreriam a É observada anemia b A forma do sítio de ligação do oxigênio é alterada c Um códon incorreto é transcrito no mRNA da hemoglobina d O ovócito gameta feminino recebe uma dose alta de radiação e Um códon incorreto é gerado no DNA de um gene de hemoglobina f Uma mãe uma técnica de radiologia acidentalmente tropeça na frente de um gerador de raios X em operação g Uma criança morre h A capacidade de transporte de oxigênio do corpo está gravemente comprometida i O anticódon do tRNA que se alinha é de um tipo que traz um aminoácido inadequado j Ocorre a substituição de pares de nucleotídios no DNA de um gene de hemoglobina Quais características estruturais são compartilhadas pelos spliceossomos Figuras 816 e 817 e os ribossomos Por que ambas as estruturas são utilizadas para amparar a teoria do Mundo do RNA Uma molécula de DNA bifilamentar com a sequência demonstrada aqui produz in vivo um polipeptídio que apresenta o comprimento de cinco aminoácidos TACATGATCATTTCACGGAATTTCTAGCATGTA ATGTACTAGTAAAGTGCCTTAAAGATCGTACAT a Qual filamento de DNA é o filamentomolde e em qual direção ele é transcrito b Rotule as extremidades 5 e 3 de cada filamento c Se ocorre uma inversão entre a segunda e a terceira trincas das 45 extremidades esquerda e direita respectivamente e o mesmo filamento de DNA é transcrito quão longo será o polipeptídio resultante d Presuma que a molécula original esteja intacta e que o filamento inferior seja transcrito da esquerda para a direita Forneça a sequência de bases do RNA e rotule as extremidades 5 e 3 do anticódon que insere o quarto aminoácido no polipeptídio nascente Qual é o aminoácido Uma das técnicas que Khorana utilizou para decifrar o código genético foi sintetizar polipeptídios in vitro utilizando mRNA sintético com diversas sequências de bases repetidas Por exemplo AGAn que pode ser escrita como AGAAGAAGAAGAAGA Por vezes o polipeptídio resultante continha apenas um aminoácido um homopolímero e por vezes continha mais de um aminoácido um heteropolímero dependendo da sequência de repetição utilizada Khorana observou que por vezes polipeptídios diferentes eram produzidos a partir do mesmo mRNA sintético sugerindo que a iniciação da síntese proteica no sistema in vitro nem sempre tem início no primeiro nucleotídio do mensageiro Por exemplo a partir de CAAn três polipeptídios podem ter sido produzidos homopolímero aa1 abreviado aa1aa1 homopolímero aa2 aa2aa2 e homopolímero aa3 aa3 aa3 Esses polipeptídios provavelmente correspondem às leituras a seguir derivadas do início em diferentes locais na sequência CAA CAA CAA CAA ACA ACA ACA ACA AAC AAC AAC AAC A tabela a seguir demonstra os resultados do experimento de Khorana mRNA sintético Polipeptídios sintetizados UGn SerLeu UGn ValCys ACn ThrHis AGn ArgGlu UUCn SerSer e LeuLeu e PhePhe UUGn LeuLeu e ValVal e CysCys AAGn ArgArg e LysLys e GluGlu CAAn ThrThr e AsnAsn e GlnGln UACn ThrThr e LeuLeu e TyrTyr AUCn IleIle e SerSer e HisHis GUAn SerSer e ValVal GAUn AspAsp e MetMet UAUCn TyrLeuSerIle UUACn LeuLeuThrTyr GAUAn Nenhum GUAAn Nenhum Nota a ordem na qual os polipeptídios ou aminoácidos estão listados na tabela não é significativa exceto em relação a UAUCn e UUACn 46 a Por que GUAn e GAUn codificam cada um apenas dois homopolipeptídios b Por que GAUAn e GUAAn falham em estimular a síntese c Com a utilização dos resultados de Khorana atribua um aminoácido para cada trinca na lista a seguir Relembre que com frequência existem diversos códons para um único aminoácido e que as duas primeiras letras em um códon normalmente são importantes mas que a terceira letra ocasionalmente é significativa Também tenha em mente que alguns códons muito diferentes por vezes codificam o mesmo aminoácido Tente solucionar este problema sem consultar a Figura 95 GUA GAU UUG AAC GUG UUC UUA GAA GUU AGU UAU AGA AUG CUU AUC GAG UGU CUA UAC CAA ACA UCU AAG UAG CAC CUC ACU UGA A solução deste problema requer tanto lógica quanto tentativa e erro Não se sinta desencorajado Khorana recebeu um Prêmio Nobel por solucioná lo Boa sorte Dados de J Kuspira e G W Walker Genetics Questions and Problems McGrawHill 1973 Para construir um interatoma como aquele demonstrado na Figura 921 cientistas identificam todas as interações proteicas em um tipo de tecido ou célula em particular A comparação dos interatomas do tecido muscular humano versus o tecido cerebral humano revela padrões muito diferentes Se você fosse o cientista envolvido nesse estudo como explicaria esses 47 48 49 50 resultados Os genomas da maioria dos eucariotos multicelulares codificam aproximadamente 25000 genes ainda que seus proteomas contenham mais de 200000 proteínas Proponha dois processos que considerados em conjunto expliquem essa discrepância Os éxons e os íntrons de um gene estão demonstrados a seguir A recomposição alternativa desse gene produz três diferentes quadros de leitura abertos Preveja quais éxons formarão esses três mRNA e forneça a justificativa para a sua resposta nt Nucleotídios Se fosse encontrada vida em outro planeta você acredita que ela apresentaria o mesmo código genético Justifique sua resposta A imagem na primeira página do Capítulo 9 é de um ribossomo em resolução atômica no qual o rRNA é azul e as proteínas ribossômicas são corderosa Observe essa figura cuidadosamente prestando atenção nos pontos de interação dos rRNA com as proteínas ribossômicas e das proteínas ribossômicas com os tRNA mRNA e fatores ribossômicos EF Tu RF1 Agora planeje um modelo que explique a natureza de algumas das interações em termos muito gerais que estão ocorrendo dentro dessa máquina molecular Como o conhecimento sobre essas interações pode auxiliar no desenho de uma nova geração de antibióticos 1F Crick On Protein Synthesis The Symposia of the Society for Experimental Biology 12138163 1958 101 102 Injeção de DNA exógeno em uma célula animal A microagulha utilizada para a injeção está demonstrada à direita e uma pipeta de manuseio celular está demonstrada à esquerda Rapho AgenceScience Source TÓPICOS Visão geral Isolamento e amplificação de fragmentos específicos de DNA Produção de moléculas de DNA recombinante 103 104 105 106 O Utilização de sondas moleculares para encontrar e analisar um clone de interesse específico Determinação da sequência de bases de um segmento de DNA Alinhamento genético e mapas físicos para isolar genes específicos Engenharia genética RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Diagramar as etapas por meio das quais um gene é isolado e amplificado por meio de clonagem Descrever quantos tipos diferentes de bibliotecas são utilizados para identificar moléculas de DNA específicas Comparar as técnicas utilizadas para amplificar o DNA com e sem clonagem Aplicar os diversos procedimentos utilizados para analisar o DNA isolado o RNA isolado e as proteínas isoladas Contrastar as diferentes abordagens experimentais utilizadas para modificar os genomas de plantas e animais em laboratório Descrever as implicações das técnicas moleculares para a compreensão da função gênica s genes são o foco central da genética e assim claramente seria desejável isolar um gene de interesse ou alguma região do DNA do genoma em uma quantidade adequada para estudo O isolamento de genes individuais e a produção de uma quantidade suficiente deles para a análise pode ser uma tarefa desencorajadora tendo em vista que um gene único é uma pequena fração de um genoma inteiro Por exemplo o genoma humano haploide contém mais de 3 bilhões de pares de bases enquanto a região codificadora de um gene médio contém apenas alguns milhares de pares de bases Como os cientistas encontram a agulha no palheiro o gene e em seguida produzem quantidades dele para análise Muitas investigações em genética têm início com o desejo de estudar um traço ou uma doença Com a utilização da genética direta conforme descrito no Capítulo 2 procuramos mutantes que exibam um fenótipo alterado e em seguida realizamos cruzamentos ou analisamos heredogramas para determinar se aquele fenótipo é determinado por um gene único No Capítulo 4 discutimos como o mapeamento por meio de recombinação auxilia na localização gênica no nível do DNA Neste capítulo continuamos com a apresentação dos métodos moleculares para a identificação de um gene de interesse e o estudo da sua função molecular A primeira etapa no estudo da função gênica é isolar o seu DNA e reproduzilo em quantidades adequadas para o estudo Assim como um operário da construção um engenheiro genético necessita de ferramentas A maior parte das caixas de ferramentas com as quais estamos familiarizados é preenchida com instrumentos como martelos chaves de fenda e chaves inglesas que são desenhadas por pessoas e manufaturadas em fábricas Contrariamente as ferramentas da engenharia genética são moléculas isoladas a partir de células A maior parte dessas ferramentas foi produto de descobertas científicas nas quais o objetivo era responder a uma questão biológica Apenas posteriormente alguns cientistas reconheceram o possível valor prático de algumas dessas moléculas e inventaram modos para integrálas em protocolos com o objetivo de isolar e amplificar fragmentos de DNA Já fomos apresentados a algumas dessas moléculas nos capítulos anteriores e neste capítulo você verá como elas se tornaram o fundamento da revolução biotecnológica Um modo de separar o nosso gene de interesse do restante do genoma é cortar o genoma com uma tesoura molecular e isolar o pequeno fragmento que contém o gene Werner Arber descobriu essas tesouras moleculares e por sua descoberta recebeu o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1978 Entretanto Arber não estava procurando uma ferramenta para cortar o DNA precisamente Em vez disso ele estava tentando compreender o motivo de algumas bactérias serem resistentes à infecção por vírus bacterianos Ao responder a essa questão biológica ele descobriu que bactérias resistentes possuem uma enzima anteriormente desconhecida uma endonuclease de restrição que corta o DNA em sequências específicas A enzima que ele descobriu EcoRI tornouse a primeira tesoura molecular comercialmente disponível 101 Como outro exemplo é improvável que alguém houvesse previsto que a DNA polimerase enzima descoberta por Arthur Kornberg uma descoberta pela qual ele recebeu o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1959 pudesse transformarse em outra ferramenta poderosa para o isolamento e a análise do DNA ver Capítulo 7 Até hoje muitas das técnicas utilizadas para determinar a sequência de nucleotídios do DNA depende da síntese de DNA com a DNA polimerase De modo semelhante a maior parte dos protocolos utilizados para isolar e amplificar regiões específicas do DNA de fontes tão díspares quanto uma cena de crime até um fóssil inserido em âmbar depende da atividade da DNA polimerase Tecnologia do DNA é um termo que descreve as técnicas coletivas para a obtenção a amplificação e a manipulação de fragmentos de DNA específicos Desde meados da década de 1970 o desenvolvimento da tecnologia do DNA revolucionou o estudo da biologia abrindo muitas áreas de pesquisa para a investigação molecular A engenharia genética a aplicação da tecnologia do DNA para problemas biológicos médicos ou agrícolas específicos agora é um ramo bemestabelecido da tecnologia Genômica é a extensão final da tecnologia para a análise global dos ácidos nucleicos presentes em um núcleo uma célula um organismo ou um grupo de espécies correlatas ver Capítulo 14 Posteriormente neste capítulo veremos como a tecnologia do DNA e a genômica juntamente com os métodos apresentados nos Capítulos 2 e 4 podem ser utilizados em conjunto para isolar e identificar um gene Visão geral Isolamento e amplificação de fragmentos específicos de DNA Como um segmento de DNA específico pode ser isolado de um genoma inteiro Além disso como ele pode ser isolado em quantidades suficientes para analisar as características do DNA tais como a sua sequência de nucleotídios e o seu produto proteico Uma percepção crucial para a solução desse problema foi que os pesquisadores poderiam utilizar o maquinário de replicação do DNA ver Capítulo 7 para replicar o segmento de DNA em questão A referida replicação é denominada amplificação Ela pode ser realizada em células bacterianas vivas in vivo ou em um tubo de ensaio in vitro Na abordagem in vivo Figura 101 A um investigador inicia com uma amostra de moléculas de DNA que contêm o gene de interesse Essa amostra é denominada DNA doador e na maioria das vezes é um genoma inteiro Fragmentos do DNA doador são inseridos em um plasmídio ou vírus bacteriano especialmente projetado que transportará e amplificará o gene de interesse e que portanto são denominados vetores Primeiramente as moléculas do DNA doador são cortadas por meio da utilização de enzimas denominadas endonucleases de restrição como tesouras moleculares Elas cortam longas moléculas de DNA do tamanho de cromossomos em centenas ou milhares de fragmentos de tamanho mais manuseável Em seguida cada fragmento é inserido em um cromossomo vetor que foi cortado para formar moléculas de DNA recombinante As moléculas de DNA recombinante são transferidas para células bacterianas e em geral apenas uma molécula recombinante é captada por célula Dentro da célula bacteriana a molécula recombinante é amplificada juntamente com o vetor durante a divisão celular A partir de uma única célula esse processo resulta em um clone de células idênticas cada um contendo a molécula de DNA recombinante e assim essa técnica de amplificação é denominada clonagem de DNA Tendo em vista que muitos fragmentos de DNA são inseridos no vetor a mistura de células resultante contém coletivamente tanto quanto o genoma inteiro do organismo doador O próximo estágio é encontrar o clone raro que contém o DNA de interesse entre as muitas células FIGURA 101 Dois métodos de isolamento e amplificação de um gene são A in vivo enganandose o maquinário de replicação de uma bactéria para que amplifique o DNA recombinante que contém o gene e B in vitro em tubo de ensaio com a utilização da técnica de reação da cadeia de polimerase Ambos os métodos empregam os princípios básicos da biologia molecular a capacidade de proteínas específicas vermelhas e verdes de se ligarem ao DNA e a capacidade de segmentos de ácidos nucleicos unifilamentares complementares hibridizarem o primer utilizado no método do tubo de ensaio Na abordagem in vitro denominada reação da cadeia de polimerase PCR Figura 101 B um gene específico ou uma região do DNA de interesse são isolados e amplificados pela DNA polimerase A PCR encontra a região do DNA de interesse denominada DNAalvo por meio da ligação complementar de moléculas de DNA sintéticas curtas específicas denominadas primers às extremidades daquela sequência Esses primers em seguida guiam o processo de replicação direcionado pela DNA polimerase que ocorre em ciclos exponenciais resultando na produção de grandes quantidades do DNAalvo como um fragmento de DNA isolado Quantidades ainda maiores de DNAalvo podem ser obtidas por meio da inserção do produto da PCR em um plasmídio ou seja o método in vivo gerando portanto uma molécula de DNA recombinante como aquela descrita anteriormente Veremos repetidamente que a tecnologia do DNA depende de dois fundamentos básicos da pesquisa em biologia molecular A capacidade de proteínas específicas reconhecerem e se ligarem a sequências de bases específicas dentro da duplahélice do DNA os exemplos estão demonstrados em verde e em vermelho na Figura 101 A capacidade de sequências unifilamentares de DNA ou de RNA complementares parearem para formar moléculas bifilamentares um exemplo é a ligação dos primers demonstrada em amarelo na Figura 101 O restante do capítulo explorará algumas aplicações do DNA amplificado Essas aplicações variam desde o isolamento gênico de rotina para pesquisas biológicas básicas passando pela terapia gênica para tratar doenças humanas e chegando até a produção de herbicidas e pesticidas para plantações Para ilustrar como o DNA recombinante é produzido consideraremos a clonagem do gene da insulina humana um hormônio proteico utilizado no tratamento do diabetes O diabetes melito é uma doença na qual os níveis de açúcar no sangue estão anormalmente altos seja em virtude de o corpo não produzir insulina suficiente diabetes tipo I ou de as células serem incapazes de responder à insulina diabetes tipo II Formas brandas de diabetes tipo I podem ser tratadas por meio de restrições alimentares mas para muitos pacientes são necessários tratamentos diários com insulina Até aproximadamente 30 anos atrás as vacas eram a principal fonte da proteína insulina que era obtida a partir do pâncreas de animais abatidos em frigoríficos e purificada em grande escala para eliminar a maioria das proteínas e outros contaminantes dos extratos de pâncreas Em seguida em 1982 a primeira insulina humana recombinante chegou ao mercado A insulina humana pode ser produzida em uma forma mais pura a um custo mais baixo e em escala industrial 102 por ser produzida em maiores quantidades em bactérias por meio de técnicas do DNA recombinante que utilizam a sequência real do gene da insulina humana Além disso não há o risco de introdução de vírus bovinos ou de uma resposta imune contra a insulina bovina Utilizaremos o isolamento e a produção da insulina recombinante como um exemplo das etapas gerais necessárias para a produção de qualquer DNA recombinante Produção de moléculas de DNA recombinante As moléculas de DNA recombinante normalmente contêm um fragmento de DNA inserido em um vetor bacteriano Nesta seção você verá que existem muitos tipos de moléculas de DNA recombinante que podem ser construídas a partir de uma diversidade de DNA doadores e de vetores Iniciamos discutindo as fontes de DNA doador Se o pesquisador deseja obter uma coleção de insertos que represente o genoma inteiro de um organismo o DNA genômico pode ser cortado antes da clonagem Alternativamente se o objetivo é isolar um gene único a reação da cadeia de polimerase pode ser utilizada para amplificar regiões selecionadas do DNA in vitro Finalmente se o pesquisador deseja apenas as sequências codificadoras de genes sem íntrons cópias de DNA dos produtos de mRNA denominadas cDNA podem ser sintetizadas e inseridas em um vetor O DNA genômico pode ser cortado antes da clonagem O DNA genômico é obtido diretamente a partir de cromossomos do organismo em estudo normalmente por meio da trituração do tecido fresco e da purificação do DNA O DNA cromossômico pode ser utilizado como o ponto de início para ambos os métodos in vivo e de PCR a fim de isolar genes Em relação ao método in vivo o DNA genômico precisa ser cortado para que a clonagem seja possível Conforme descrito posteriormente nesta seção o DNA genômico não precisa ser cortado para a realização da PCR tendo em vista que os primers curtos específicos se ligam a ele e identificam o sítio de início para a DNA polimerase que direciona a replicação do DNA interveniente As longas moléculas de DNA do tamanho de um cromossomo do DNA genômico devem ser cortadas em fragmentos de tamanho muito menor antes que possam ser inseridas em um vetor A maior parte dos cortes é realizada com a utilização de enzimas de restrição bacterianas Essas enzimas realizam cortes em sequências de DNA específicas denominadas sítios de restrição e essa propriedade é uma das característicaschave que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA Essas enzimas são exemplos de endonucleases que clivam uma ligação fosfodiéster entre nucleotídios no DNA Puramente ao acaso qualquer molécula de DNA de qualquer organismo pode conter sítios de reconhecimento de enzima de restrição Portanto uma enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelos locais dos sítios de restrição e produzirá o mesmo padrão de fragmentos a cada vez que ele for cortado Outra propriedadechave de algumas enzimas de restrição é que muitas criam extremidades coesivas nos fragmentos Vejamos um exemplo A enzima de restrição EcoRI da E coli reconhece a sequência a seguir de seis pares de nucleotídios no DNA de qualquer organismo 5GAATTC3 3CTTAAG5 Esse tipo de segmento é denominado palíndromo de DNA o que significa que ambos os filamentos apresentam a mesma sequência de nucleotídios porém em orientação antiparalela a leitura de 5 para 3 produz a mesma sequência em qualquer filamento Diferentes enzimas de restrição realizam cortes em diferentes sequências palindrômicas Por vezes os cortes são na mesma posição em cada um dos dois filamentos antiparalelos deixando extremidades cegas Entretanto a maior parte das enzimas de restrição úteis realiza cortes que são alternados ou em ziguezague A enzima EcoRI realiza cortes apenas entre os nucleotídios G e A em cada filamento do palíndromo Esses cortes alternados deixam um par de extremidades e cada um deles apresenta uma extremidade unifilamentar de quatro bases AATT As extremidades são denominadas coesivas em virtude de sendo unifilamentares poderem realizar pareamento de bases ou seja aderir com uma sequência complementar O pareamento de filamentos únicos complementares desse tipo é denominado hibridização A Figura 102 ilustra a enzima de restrição EcoRI realizando cortes alternados em ziguezague nos dois filamentos em uma molécula de DNA circular tal como um plasmídio o corte abre o círculo e a molécula linear resultante apresenta duas extremidades coesivas Ela agora pode hibridizar com um fragmento de uma molécula de DNA diferente que apresenta as mesmas extremidades coesivas complementares FIGURA 102 Para formar uma molécula de DNA recombinante a enzima de restrição EcoRI corta uma molécula de DNA circular que contém uma sequênciaalvo resultando em uma molécula linear com extremidades unifilamentares coesivas Em virtude da complementaridade outras moléculas lineares com extremidades coesivas cortadas pela EcoRI podem hibridizar com o DNA circular linearizado formando uma molécula de DNA recombinante A digestão do DNA genômico humano com EcoRI gera aproximadamente 500000 fragmentos Você verá posteriormente nesta seção como os cientistas analisaram esses fragmentos para encontrar a agulha no palheiro um ou dois fragmentos dentre os 500000 que contêm a sequência de DNA de interesse em nosso exemplo o gene da insulina humana CONCEITOCHAVE O DNA genômico pode ser utilizado diretamente para a clonagem de genes Como primeira etapa as enzimas de restrição cortam o DNA em fragmentos de tamanho manuseável e muitas delas geram extremidades coesivas unifilamentares adequadas para a produção do DNA recombinante A reação da cadeia de polimerase amplifica regiões selecionadas do DNA in vitro Se nos esforçássemos para clonar o gene da insulina humana hoje armados com a sequência genômica humana o conhecimento do gene e das sequências flanqueadoras nos possibilitaria utilizar um método mais direto Atualmente podemos simplesmente amplificar o gene in vitro por meio da utilização da reação da cadeia de polimerase PCR A estratégia básica da PCR está resumida na Figura 103 O processo utiliza múltiplas cópias de um par de primers de DNA curtos quimicamente sintetizados com comprimento de aproximadamente 20 bases desenhados de modo que cada primer se ligue a uma extremidade do gene ou da região a ser amplificada Os dois primers se ligam a filamentos de DNA opostos que circundam a sequênciaalvo com suas extremidades 3 apontando uma em direção à outra As DNA polimerases adicionam bases às extremidades 3 desses primers e copiam a sequênciaalvo A repetição do processo de polimerização produz um número exponencialmente crescente de moléculas de DNA bifilamentares Os detalhes são como segue Iniciamos com uma solução que contém a fonte de DNA os primers os quatro desoxirribonucleotídios trifosfato necessários para a síntese de DNA ver Figura 715 e uma DNA polimerase tolerante ao calor O DNAalvo é desnaturado pelo calor 95C resultando em moléculas de DNA unifilamentares Quando a solução é resfriada entre 50 e 65C os primers hibridizam ou pareiam com suas sequências complementares nas moléculas de DNA unifilamentares Após a temperatura ser elevada até 72C a DNA polimerase termoestável replica os segmentos unifilamentares de DNA que se estendem a partir de um primer A DNA polimerase Taq da bactéria Thermus aquaticus é uma enzima comumente utilizada Para sobreviver no calor extremo das fontes hidrotermais essa bactéria desenvolveu proteínas que são extremamente resistentes ao calor Portanto sua DNA polimerase sobrevive a altas temperaturas necessárias para desnaturar a duplahélice de DNA que desnaturariam e inativariam a DNA polimerase da maior parte das outras espécies Novos filamentos complementares são sintetizados assim como na replicação normal do DNA nas células formando duas moléculas bifilamentares de DNA idênticas à molécula bifilamentar parental Um ciclo é composto por essas três etapas levando a uma replicação única do segmento entre os dois primers Reação da cadeia de polimerase FIGURA 103 A reação da cadeia de polimerase copia rapidamente uma sequência de DNAalvo A DNA bifilamentar que contém a sequênciaalvo B Dois primers escolhidos ou sintetizados apresentam sequências complementares aos sítios de ligação do primer nas extremidades 3 do genealvo nos dois filamentos Os filamentos são separados por meio de aquecimento em seguida são resfriados para possibilitar que os dois primers pareiem com os sítios de ligação de primers Em conjunto os primers assim flanqueiam a sequência alvo C Após a elevação da temperatura a polimerase Taq em seguida sintetiza o primeiro conjunto de filamentos complementares por meio da adição dos quatro nucleotídios trifosfato que também estão na mistura da reação Estes dois primeiros filamentos são de comprimento variável tendo em vista que não apresentam um sinal de parada comum Eles se estendem além das extremidades da sequênciaalvo conforme delineado pelos sítios de ligação de primers D Os dois duplexes são novamente aquecidos expondo quatro sítios de ligação Após o resfriamento os dois primers pareiam novamente com seus respectivos filamentos nas extremidades 3 da regiãoalvo E Após a elevação da temperatura a polimerase Taq sintetiza quatro filamentos complementares Embora os filamentosmolde neste estágio sejam de comprimento variável dois dos quatro filamentos recémsintetizados a partir deles apresentam precisamente o comprimento da sequência alvo desejada Esse comprimento preciso é conquistado em virtude de cada um desses filamentos ter início no sítio de ligação do primer em uma extremidade da sequênciaalvo e prosseguir até sair do molde na outra extremidade da sequência F O processo é repetido por muitos ciclos a cada vez criando mais moléculas bifilamentares de DNA idênticas à sequênciaalvo Após a replicação do segmento entre os dois primers ser concluída os dois novos duplexes são desnaturados pelo calor mais uma vez para gerar moldes unifilamentares e um segundo ciclo de replicação é realizado por meio da redução da temperatura na presença de todos os componentes necessários para que a polimerização produza quatro duplexes idênticos Ciclos repetidos de desnaturação pareamento e síntese resultam em um aumento exponencial no número de segmentos replicados Tendo em vista que um ciclo típico dura 5 minutos a amplificação até um bilhão de vezes pode ser prontamente realizada em 25 h Conforme você verá posteriormente nesta seção os produtos da PCR podem ser adicionalmente amplificados por meio de sua clonagem em células bacterianas A PCR é uma técnica poderosa que é utilizada rotineiramente para isolar genes específicos ou fragmentos de DNA quando existe um conhecimento anterior a respeito da sequência a ser amplificada De fato se todas as sequências correspondentes aos primers estiverem presentes apenas uma vez no genoma e estiverem suficientemente próximas o único segmento de DNA que pode ser amplificado é aquele entre os dois primers A PCR é uma técnica muito sensível com diversas aplicações em biologia Ela pode amplificar sequênciasalvo que estão presentes em números de cópias extremamente baixos em uma amostra desde que sejam utilizados primers específicos para essa sequência rara Por exemplo investigadores criminais podem amplificar segmentos de DNA humano a partir das poucas células foliculares que circundam um único fio de cabelo retirado Se os investigadores optarem por realizar isso eles podem amplificar o gene da insulina a partir dessa amostra de DNA utilizando a sua localização precisa no cromossomo 11 para desenhar primers flanqueadores para a PCR direta Não seria exagerado dizer que a PCR revolucionou o estudo de muitos campos da biologia nos quais é necessária a análise do DNA Em reconhecimento de sua importância para a ciência Kary Mullis recebeu o Prêmio Nobel de Química em 1993 pelo desenvolvimento do primeiro protocolo de PCR viável CONCEITOCHAVE A reação da cadeia de polimerase utiliza primers especialmente desenhados para o isolamento direto e a amplificação de regiões específicas do DNA em um tubo de ensaio Cópias do DNA podem ser sintetizadas a partir de mRNA Conforme vimos no Capítulo 8 os genes eucarióticos com frequência contêm um ou mais íntrons que rompem as regiões codificadoras Além disso conforme veremos nos Capítulos 14 e 15 os genes codificadores de proteínas com frequência correspondem a menos de 5 do DNA genômico de eucariotos multicelulares Conforme mencionado na seção anterior o gene da insulina humana contém dois íntrons um problema se o objetivo for criar bactérias que sintetizem a insulina humana tendo em vista que as bactérias não apresentam a capacidade de remover os íntrons presentes no DNA genômico natural Em vez disso tendo em vista que estamos interessados apenas na sequência codificadora podemos utilizar o mRNA da insulina como material de início para a PCR Em relação à insulina e outros genes codificadores de proteínas em eucariotos superiores coleções de mRNA nos quais as sequências intrônicas foram removidas por spliceossomos são um ponto de início mais útil do que o DNA genômico A sequência do mRNA pode ser virtualmente traduzida na sequência de aminoácidos da proteína simplesmente por meio da leitura dos códons triplos O DNA complementar cDNA é uma versão do DNA de uma molécula de mRNA Os pesquisadores utilizam o cDNA em vez do próprio mRNA tendo em vista que os RNA são inerentemente menos estáveis que o DNA Além disso o RNA não pode ser manipulado pelas enzimas disponíveis para a clonagem do DNA e não existem técnicas para a amplificação e a purificação de rotina de moléculas de RNA individuais O cDNA é produzido a partir do mRNA com a utilização de uma enzima especial denominada transcriptase reversa originalmente isolada de retrovírus ver Capítulo 15 Os retrovírus apresentam genomas de RNA que são copiados no DNA que se insere no cromossomo do hospedeiro Você consegue pensar o motivo de ela ser denominada transcriptase reversa Para produzir o cDNA um pesquisador purifica o mRNA de um tecido que produz uma grande quantidade da proteína desejada A insulina é produzida nas células β das ilhotas do pâncreas de modo que utilizaríamos aquele órgão como a nossa fonte para o mRNA da insulina Em seguida o mRNA purificado é adicionado a um tubo de ensaio contendo transcriptase reversa os quatro dNTP e um primer curto de resíduos de dTTP polimerizados denominado primer oligo dT O primer oligodT unese à cauda poliA da molécula de mRNA que está sendo copiada Com a utilização dessa molécula de mRNA como um molde a transcriptase reversa catalisa a síntese de uma molécula de DNA unifilamentar com início a partir do primer oligodT Quando alcança a extremidade do molde do RNA a transcriptase reversa sintetiza uma alça em grampo Quando o mRNA é removido por meio de tratamento com uma solução básica a alça em grampo pode atuar como um primer natural para que a DNA polimerase copie o cDNA em uma molécula de DNA bifilamentar Figura 104 Assim como os fragmentos do DNA genômico ou produtos da PCR esse cDNA bifilamentar pode ser inserido em moléculas de DNA recombinante para amplificação adicional ou pode ser utilizado em qualquer outro procedimento com base no DNA conforme descrito neste capítulo FIGURA 104 A formação do cDNA para o gene da insulina O gene da insulina com seus dois íntrons é transcrito no pâncreas em prémRNA O íntrons são removidos por splicing e resíduos A são adicionados à extremidade 3 para formar o mRNA poliadenilado Em laboratório os mRNA são isolados de células pancreáticas e um primer oligodT curto é hibridizado com a cauda polia de todos os mRNA para iniciar a síntese de DNA complementar a partir do molde de RNA pela transcriptase reversa A transcriptase reversa sintetiza uma estrutura de alça em grampo que atua como um primer para a síntese do segundo filamento de cDNA após o filamento do mRNA ter sido degradado por meio do tratamento com NaOH ou com RNAseH CONCEITOCHAVE O mRNA com frequência é um ponto de início preferível no isolamento de um gene A conversão enzimática do mRNA em cDNA possibilita o isolamento de uma cópia de um gene sem íntrons Ligação do DNA doador e do vetor Conforme descrito anteriormente temos diversas opções para a obtenção do gene da insulina humana a partir do genoma ou do mRNA purificado Esses métodos produzem fragmentos de DNA genômico produtos da PCR ou cDNA bifilamentar A próxima etapa é construir moléculas de DNA recombinante por meio da inserção do DNA doador no DNA vetor Clonagem de fragmentos de DNA com extremidades coesivas Relembre que os cientistas originais que isolaram o gene da insulina humana não conheciam a sequência do gene e assim precisavam criar uma biblioteca de fragmentos de DNA do genoma humano a partir da qual isolariam o gene específico Para produzir moléculas de DNA recombinante contendo fragmentos de DNA genômico doador ambos os DNA doador e vetor são digeridos por uma enzima de restrição que produz as mesmas extremidades coesivas complementares ver Figura 102 Os fragmentos resultantes em seguida são misturados para possibilitar que as extremidades coesivas do DNA doador e do vetor hibridizem entre si e formem moléculas recombinantes A Figura 105 A demonstra um DNA de plasmídio bacteriano que carrega um sítio de restrição de EcoRI único de modo que a digestão com a enzima de restrição EcoRI converte o DNA circular em uma molécula linear única com extremidades coesivas O DNA doador de qualquer outra fonte tal como o DNA humano também é tratado com a enzima EcoRI para produzir uma população de fragmentos que carregam as mesmas extremidades coesivas Quando as duas populações são misturadas sob condições fisiológicas adequadas os fragmentos de DNA das duas fontes podem hibridizar tendo em vista que se formam duplashélices entre as suas extremidades coesivas Figura 105 B Em qualquer reação de clonagem existem muitas moléculas de plasmídios linearizadas na solução bem como muitos fragmentos diferentes de EcoRI do DNA doador uma pequena fração dos quais apresentará o DNAalvo Portanto será produzido um arranjo diverso de plasmídios recombinados com diferentes fragmentos doadores Nesse estágio as moléculas hibridizadas não apresentam arcabouços açúcarfosfato unidos de modo covalente e provavelmente serão destruídas tendo em vista que oito ligações de hidrogênio proporcionam apenas ligações fracas entre as sequências Entretanto os arcabouços podem ser covalentemente selados por meio da adição da enzima DNA ligase que cria ligações fosfodiéster nas junções Figura 105 C FIGURA 105 Método para a produção de uma coleção de plasmídios de DNA recombinante contendo genes derivados da digestão de DNA doador com enzima de restrição Clonagem de fragmentos de DNA com extremidades cegas O conhecimento sobre a sequência do gene da insulina humana nos ajuda a focar no gene mas adiciona uma pequena complicação na reação de clonagem Algumas enzimas de restrição produzem extremidades cegas em vez de cortes alternados Além disso o cDNA e os fragmentos de DNA que têm origem a partir da PCR apresentam extremidades cegas ou quase cegas Enquanto os fragmentos com extremidades cegas de todas essas fontes podem ser unidos ao vetor apenas com a utilização da ligase essa é uma reação muito ineficiente tendo em vista que as extremidades cegas não podem ficar juntas Um método alternativo é criar produtos de PCR com extremidades coesivas por meio da utilização de primers de PCR especialmente desenhados que contêm sequências de reconhecimento de endonuclease de restrição nas suas extremidades 5 Figura 106 A digestão do produto final da PCR com a enzima de restrição EcoRI nesse caso produz um fragmento que está pronto para ser inserido em um vetor ver Figura 105 B Outro método adiciona extremidades coesivas a qualquer fragmento de DNA bifilamentar incluindo os cDNA Figura 107 Oligonucleotídios bifilamentares curtos denominados ligadores ou adaptadores que contêm um sítio de restrição são adicionados a um tubo de ensaio que contém cDNA e ligase A ligase une os ligadores às extremidades dos filamentos de cDNA Após a ligação estar completa o DNA é incubado com a enzima de restrição correspondente para gerar as extremidades coesivas necessárias para a clonagem em um vetor plasmidial ver Figura 105 B Observe que nos exemplos demonstrados ambos o DNA amplificado e o cDNA não devem conter um sítio de EcoRI interno ou ele também será digerido Se ele contiver a sequência para um sítio de restrição que não está no DNA amplificado pode ser adicionada aos primers ou aos ligadores CONCEITOCHAVE DNA doadores e de vetores com as mesmas extremidades coesivas podem ser unidos e ligados com eficiência Alternativamente o DNA doador que é o produto da PCR ou da síntese de cDNA requer a adição de extremidades coesivas antes da inserção em um vetor Amplificação do DNA doador em uma célula bacteriana A amplificação das moléculas de DNA recombinantes tira vantagem de processos genéticos procarióticos tais como a transformação bacteriana a replicação de plasmídios e o crescimento de bacteriófagos todos discutidos no Capítulo 5 A Figura 108 ilustra a clonagem de um segmento de DNA doador Um vetor recombinante único entra em uma célula bacteriana e é amplificado pelo mesmo maquinário que replica o cromossomo bacteriano Uma exigência básica é a presença de uma origem de replicação do DNA reconhecida pelas proteínas de replicação do hospedeiro conforme descrito no Capítulo 7 Logo existem muitas cópias de cada vetor em cada célula bacteriana Portanto após a amplificação uma colônia de bactérias conterá tipicamente bilhões de cópias do inserto de DNA doador único fundido ao seu vetor Esse conjunto de cópias amplificadas do fragmento de DNA doador único dentro do vetor de clonagem é o clone de DNA recombinante FIGURA 106 Adição de sítios de EcoRI nas extremidades de produtos da PCR A Um par de primers de PCR é desenhado de modo que as suas extremidades 3 unamse à sequênciaalvo enquanto suas extremidades 5 contenham sequências que codificam o sítio da enzima de restrição EcoRI neste caso Dois nucleotídios adicionais aleatórios são adicionados à extremidade 5 tendo em vista que as enzimas de restrição necessitam de sequências em ambos os lados da sequência de reconhecimento para o corte eficiente O DNAalvo é desnaturado e as extremidades 5 com os sítios de restrição permanecem unifilamentares enquanto o restante dos primers pareia e é estendido pela DNA polimerase B Na segunda rodada da PCR apenas os filamentos recémsintetizados estão demonstrados os primers de DNA pareiam novamente e dessa vez a síntese do DNA produz moléculas de DNA bifilamentares como a PCR convencional mas essas moléculas apresentam sítios de restrição em uma extremidade C Os produtos da segunda rodada e de todas as rodadas subsequentes apresentam sítios de EcoRI em ambas as extremidades D Quando estas são cortadas com a EcoRI são produzidas extremidades coesivas A amplificação do DNA doador dentro de uma célula bacteriana envolve as etapas a seguir Escolha de um vetor de clonagem e introdução do inserto ver seção antecedente para uma discussão sobre a última Introdução da molécula de DNA recombinante em uma célula bacteriana Recuperação das moléculas recombinantes amplificadas FIGURA 107 Adição de sítios de EcoRI às extremidades de moléculas de cDNA As moléculas de cDNA têm origem na última etapa na Figura 104 Adaptadores regiões nos quadros são adicionadas a ambas as extremidades das moléculas de cDNA Esses adaptadores são oligonucleotídios bifilamentares que contêm um sítio de restrição o sítio EcoRI está demonstrado em vermelho e uma sequência de DNA aleatória em ambas as extremidades representada por N FIGURA 108 A estratégia geral utilizada para clonar um gene O tratamento com enzima de restrição do DNA doador e do vetor possibilita a inserção de fragmentos únicos nos vetores Um vetor único entra em um hospedeiro bacteriano no qual a replicação e a divisão celulares resultam em um grande número de cópias do fragmento doador Escolha dos vetores de clonagem Os vetores devem ser moléculas pequenas para manipulação conveniente mas podem variar de diversas formas para a adequação ao objetivo do experimento Alguns vetores devem ser capazes de replicação prolífica em uma célula viva com a finalidade de amplificar o fragmento doador inserido Contrariamente outros são projetados para estarem presentes em apenas uma única cópia para manter a integridade do DNA inserido ver adiante Todos os vetores devem apresentar sítios de restrição convenientes nos quais o DNA a ser clonado possa ser inserido denominado um sítio poliligador ou de clonagem múltipla Idealmente o sítio de restrição deve estar presente apenas uma vez no vetor tendo em vista que os fragmentos de restrição do DNA doador serão inseridos apenas naquela localização única no vetor Também é importante ter um modo de identificar e recuperar rapidamente a molécula recombinante desejada Diversos vetores de clonagem que atendem uma ampla diversidade de necessidades experimentais estão em uso atualmente Em seguida estão algumas classes gerais de vetores de clonagem Vetores plasmidiais Conforme descrito anteriormente os plasmídios bacterianos são pequenas moléculas circulares de DNA que comumente replicam seu DNA independentemente do cromossomo bacteriano Os plasmídios rotineiramente utilizados como vetores carregam um gene de resistência a fármacos e um gene para distinguir plasmídios com e sem insertos de DNA Esses genes de resistência a fármacos proporcionam um modo conveniente de selecionar células bacterianas transformadas por plasmídios aquelas células ainda vivas após a exposição ao fármaco devem carrear os vetores plasmidiais Entretanto nem todos os plasmídios nessas células transformadas conterão insertos de DNA Alguns vetores plasmidiais também apresentam um sistema que possibilita que os pesquisadores identifiquem colônias bacterianas com plasmídios que contenham insertos de DNA Por esse motivo é desejável ser capaz de identificar colônias bacterianas com plasmídios que contenham insertos de DNA Uma referida característica é parte do vetor plasmidial pUC18 demonstrado na Figura 109 os insertos de DNA rompem um gene lacZ no plasmídio que codifica uma enzima βgalactosidase necessária para clivar um composto adicionado ao ágar da placa de Petri Xgal de modo que ele produza um pigmento azul Portanto as colônias que contêm os plasmídios com o inserto de DNA serão brancas em vez de azuis elas não conseguem clivar o Xgal tendo em vista que não produzem β galactosidase Vetores bacteriófagos Um vetor bacteriófago abriga DNA como um inserto compactado dentro da partícula do fago Diferentes classes de vetores bacteriófagos podem carregar insertos de DNA doador de diferentes tamanhos O bacteriófago λ lambda discutido nos Capítulo 5 e 11 é um vetor de clonagem eficaz para insertos de DNA bifilamentares tão longos quanto 15 kb A parte central do genoma do fago não é necessária para a replicação ou o acondicionamento de moléculas de DNA λ em E coli e assim pode ser cortada por enzimas de restrição e descartada A parte central deletada em seguida é substituída por insertos de DNA doador Utilização de um vetor plasmidial pUC18 FIGURA 109 O vetor plasmidial pUC18 foi designado para a utilização como um vetor para a clonagem de DNA A inserção de DNA em pUC18 é detectada por meio da inativação da função da βgalactosidase de lacZ resultando em uma capacidade de converter o substrato artificial Xgal em um corante azul O poliligador apresenta diversos sítios de restrição alternativos dentro dos quais o DNA doador pode ser inserido Foto Dr James M Burnette III e Dra Leslie Bañuelos Vetores para insertos de DNA maiores Os vetores plasmidiais padrão e o fago λ já descritos podem aceitar DNA doador de tamanhos tão grandes quanto 10 a 15 kb Entretanto muitos experimentos necessitam de insertos que excedem em muito esse limite superior Para atender a essas necessidades foram construídos por engenharia genética vetores especiais que necessitam de métodos mais sofisticados para a transferência de DNA para a célula hospedeira Em todos os casos os DNA replicam como plasmídios grandes após terem sido introduzidos na bactéria Fosmídios são vetores que conseguem carrear insertos de 35 a 45 kb Figura 1010 Eles são híbridos modificados de DNA de fago λ e DNA de plasmídio F bacteriano ver Capítulo 5 Os fosmídios são acondicionados nas partículas de fago λ que atuam como as seringas que introduzem esses grandes pedaços de DNA recombinante dentro de células de E coli receptoras Após estarem na célula esses híbridos assim como o fago λ formam moléculas circulares que replicam extracromossomicamente de modo semelhante aos plasmídios Entretanto em virtude da presença de origens de replicação do plasmídio F que acoplam a replicação do plasmídio à duplicação do cromossomo da célula hospedeira muito poucas cópias de fosmídios se acumulam em uma célula O vetor mais popular para a clonagem de insertos de DNA muito grandes em bactérias é o cromossomo artificial bacteriano BAC Derivado do plasmídio F ele pode carregar insertos que variam de 100 a 200 kb embora o próprio vetor seja de apenas aproximadamente 7 kb ver Figura 1010 O DNA a ser clonado é inserido no plasmídio e esse grande DNA recombinante circular é introduzido na bactéria Os BAC foram os vetores burros de carga para a extensiva clonagem requerida por projetos de sequenciamento genômico em grande escala incluindo o projeto público para sequenciar o genoma humano discutido no Capítulo 14 CONCEITOCHAVE O conjunto de ferramentas do engenheiro genético contém uma diversidade de vetores de clonagem que aceitam insertos de tamanhos pequenos em plasmídios de tamanhos médios em bacteriófagos e de tamanhos grandes em fosmídios e BAC Entrada das moléculas recombinantes na célula bacteriana São utilizados três métodos para introduzir moléculas de DNA recombinante nas células bacterianas transformação transdução e infecção Figura 1011 ver seções 53 e 54 Na transformação as bactérias são banhadas em uma solução que contém a molécula de DNA recombinante Tendo em vista que as células bacterianas utilizadas em pesquisas não conseguem captar moléculas de DNA tão grandes quanto os plasmídios recombinantes elas devem se tornar competentes ou seja capazes de captar o DNA do meio circundante por meio da incubação em uma solução de cálcio ou da exposição a um pulso elétrico de alta voltagem eletroporação Após a entrada em uma célula competente através dos poros da membrana a molécula recombinante se torna um cromossomo de plasmídio Figura 1011 A A eletroporação é o método de escolha para a introdução de DNA especialmente grandes tais como BAC nas células bacterianas FIGURA 1010 Características de alguns vetores de clonagem de inserto grande O número de clones necessário para abranger o genoma humano uma vez 1 tem por base um tamanho de genoma de 3000 Mb 3 bilhões de pares de bases FIGURA 1011 O DNA recombinante pode ser inserido nas células bacterianas por meio de transformação transdução ou infecção com um fago A Vetores plasmidiais e BAC são inseridos por transformação mediada por DNA B Determinados vetores tais como os fosmídios são inseridos nas cabeças dos bacteriófagos transdução entretanto após terem sido injetados na bactéria eles formam círculos e são replicados como grandes plasmídios C Vetores bacteriófagos tais como o fago λ infectam e lisam a bactéria liberando um clone de fagos como progênie todos carregando a molécula de DNA recombinante idêntica no genoma do fago Na transdução a molécula recombinante é combinada com a cabeça do fago e as proteínas da cauda para produzir um vírus que contém um DNA amplamente não viral Esses fagos modificados em seguida são misturados com bactérias e injetam sua carga de DNA nas células bacterianas mas novos fagos não conseguem se formar tendo em vista que eles não carregam os genes virais necessários para a replicação dos fagos Os fosmídios são introduzidos dentro das células por meio de transdução Figura 1011 B Contrariamente à transdução que produz plasmídios e colônias bacterianas mas não novos vírus a infecção produz partículas de fagos recombinantes Figura 1011 C Por meio de rodadas repetidas de reinfecção uma placa repleta de partículas de fagos é formada a partir de cada bactéria inicial que foi infectada Cada partícula de fago em uma placa contém não apenas o DNA recombinante mas também os genes virais necessários para criar novas partículas de fagos infecciosas Recuperação das moléculas recombinantes amplificadas O DNA recombinante empacotado dentro das partículas de fagos é facilmente obtido por meio da coleta do lisado de fago e do isolamento do DNA que ele contém Para obter o DNA recombinante acondicionado em plasmídios fosmídios ou BAC as bactérias são quebradas química ou mecanicamente O plasmídio de DNA recombinante é separado do cromossomo bacteriano principal muito maior por meio de centrifugação eletroforese ou outras técnicas seletivas que distinguem o cromossomo do plasmídio pelo tamanho ou pela forma CONCEITOCHAVE A clonagem de genes é realizada por meio da introdução de vetores recombinantes únicos em células bacterianas receptoras seguida pela amplificação dessas moléculas como cromossomos de plasmídios ou fagos Construção de bibliotecas genômicas e de cDNA Vimos como obter e amplificar moléculas de DNA recombinante individuais tais como o nosso cDNA de insulina humana Considere a tarefa em 1982 quando o gene da insulina humana deveria ser identificado a partir de uma biblioteca de fragmentos do genoma humano Para assegurar que clonamos o segmento de DNA de interesse precisamos produzir grandes coleções de segmentos de DNA que sejam totalmente inclusivas Por exemplo tomamos todo o DNA de um genoma quebramos em segmentos do tamanho correto para o nosso vetor de clonagem e inserimos cada segmento em uma cópia diferente do vetor criando assim uma coleção de moléculas de DNA recombinante que consideradas em conjunto representam o genoma inteiro Em seguida transformamos ou infectamos essas moléculas em células receptoras bacterianas em separado onde elas são amplificadas A coleção resultante de bactérias ou bacteriófagos que contêm o DNA recombinante é denominada biblioteca genômica Se estivermos utilizando um vetor de clonagem que aceita um inserto de tamanho médio de 10 kb e se o genoma inteiro for do tamanho de 100000 kb o tamanho aproximado do genoma do nematódeo Caenorhabditis elegans então no mínimo 10000 clones recombinantes independentes serão necessários para representar o equivalente a um genoma de DNA Para assegurar que todas as sequências genômicas que podem ser clonadas estejam contidas em uma coleção as bibliotecas genômicas tipicamente representam um segmento médio do genoma no mínimo cinco vezes e assim em nosso exemplo haverá 50000 clones independentes na biblioteca genômica Essa representação múltipla torna altamente improvável que ao acaso uma sequência não esteja representada no mínimo uma vez na biblioteca De modo semelhante coleções representativas de insertos de cDNA requerem dezenas ou centenas de milhares de clones de cDNA independentes essas coleções são bibliotecas de cDNA e representam apenas as regiões codificadoras de proteínas do genoma Uma biblioteca de cDNA abrangente inclui amostras de mRNA de diferentes tecidos diferentes estágios do desenvolvimento ou de organismos cultivados em diferentes condições ambientais Se optamos por construir uma biblioteca de DNA genômico ou uma biblioteca 103 de cDNA depende da situação Se estivermos procurando um gene específico que seja ativo em um tipo específico de tecido em uma planta ou um animal então faz sentido construir uma biblioteca de cDNA a partir de uma amostra daquele tecido Por exemplo suponha que desejamos identificar cDNA que correspondam aos mRNA da insulina As células β das ilhotas do pâncreas são a fonte de insulina mais abundante e assim os mRNA das células pancreáticas são a fonte apropriada para uma biblioteca de cDNA tendo em vista que esses mRNA devem ser enriquecidos para o gene em questão Uma biblioteca de cDNA representa um subconjunto das regiões transcritas do genoma assim ela inevitavelmente será menor do que uma biblioteca genômica completa Embora as bibliotecas genômicas sejam maiores elas apresentam o benefício de conter genes em sua forma nativa incluindo íntrons e sequências reguladoras não transcritas Uma biblioteca genômica é necessária em algum estágio como um prelúdio para a clonagem de um gene inteiro ou de um genoma inteiro CONCEITOCHAVE A tarefa de isolamento de um clone de um gene específico tem início com a produção de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA se possível enriquecida em relação às sequências que contêm o gene em questão Utilização de sondas moleculares para encontrar e analisar um clone de interesse específico A produção de uma biblioteca conforme acabamos de descrever por vezes é denominada clonagem shotgun tendo em vista que o experimentador clona uma grande amostra de fragmentos e espera que um dos clones contenha um acerto o gene desejado A tarefa em seguida é encontrar aquele clone em particular considerada em seguida Detecção de clones específicos com a utilização de sondas Uma biblioteca pode conter até centenas de milhares de fragmentos de DNA clonados Essa enorme coleção de fragmentos deve ser triada para encontrar a molécula de DNA recombinante que contém o gene de interesse para um pesquisador A referida triagem é realizada por meio da utilização de uma sonda específica que encontrará e marcará apenas o clone desejado Existem dois tipos de sondas 1 aquelas que reconhecem uma sequência de ácido nucleico específica e 2 aquelas que reconhecem uma proteína específica Sondas para detectar DNA As sondas para DNA fazem uso do poder da complementaridade de bases Dois ácidos nucleicos unifilamentares com sequência de bases complementares total ou parcial encontrarão um ao outro em uma solução por colisão aleatória Após a sua união o híbrido bifilamentar assim formado é estável Essa abordagem proporciona um meio poderoso para a detecção de sequências de interesse específicas O uso de sondas de DNA requer que todas as moléculas se tornem unifilamentares por meio de aquecimento Uma sonda unifilamentar marcada radioativa ou quimicamente é enviada para detectar sua sequênciaalvo complementar em uma população de DNA tal como uma biblioteca Sondas tão pequenas quanto de 15 a 20 pares de bases hibridizarão com as sequências complementares específicas dentro de DNA clonados muito maiores A identificação de um clone específico em uma biblioteca é um procedimento de múltiplas etapas Na Figura 1012 essas etapas estão demonstradas em relação a uma biblioteca clonada em um vetor fosmídio As etapas são semelhantes para bibliotecas de plasmídios ou BAC Em relação às bibliotecas de fagos placas são triadas em vez de colônias Primeiramente colônias da biblioteca em uma placa de Petri são transferidas para uma membrana absorvente simplesmente posicionandose a membrana sobre a superfície do meio A membrana é retirada as colônias aderidas à superfície da membrana são lisadas no local e o DNA é simultaneamente desnaturado de modo a se tornar unifilamentar Em segundo lugar a membrana é banhada com uma solução de uma sonda unifilamentar que é específica para a sequência de DNA que está sendo procurada Em geral a própria sonda é um fragmento de DNA clonado que apresenta uma sequência que é complementar àquela do gene desejado A sonda deve ser marcada com um isótopo radioativo ou um corante fluorescente Portanto a posição de uma marcação radioativa ou fluorescente concentrada indicará a posição do clone positivo Em relação às sondas radioativas a membrana é posicionada sobre um pedaço de filme de raios X e o decaimento do radioisótopo produz partículas subatômicas que expõem o filme produzindo nele um ponto escuro adjacente à localização da concentração do radioisótopo Um referido filme exposto é denominado autorradiograma Se um corante fluorescente for utilizado como um marcador a membrana é exposta ao comprimento de onda de luz correto para ativar a fluorescência do corante e é realizada uma fotografia da membrana para registrar a localização do corante fluorescente Detecção do clone de interesse por meio da utilização de sondas de DNA ou RNA FIGURA 1012 O clone que carrega um gene de interesse é identificado por meio da triagem de uma biblioteca genômica neste caso produzida por meio da clonagem de genes em um vetor fosmídio com DNA ou RNA sabidamente relacionado com o gene desejado Uma sonda radioativa hibridiza com qualquer DNA recombinante que incorpore uma sequência de DNA complementar e a posição do clone que apresenta o DNA é revelada por meio de autorradiografia Agora o clone desejado pode ser selecionado a partir do ponto correspondente na placa de Petri e transferido para um novo hospedeiro bacteriano de modo que um gene puro possa ser produzido Qual a origem do DNA para produzir uma sonda O DNA pode ter origem em uma de diversas fontes Podese utilizar um gene homólogo ou um cDNA de um organismo correlato Esse método depende do fato de que organismos descendentes de um ancestral comum recente apresentarão sequências de DNA semelhantes Embora o DNA da sonda e o DNA do clone desejado possam não ser idênticos com frequência eles são semelhantes o suficiente para promover a hibridização Podese utilizar o produto proteico do gene de interesse Se toda a sequência da proteína ou parte dela for conhecida podese retrotraduzila por meio da utilização da tabela do código genético ao contrário de aminoácido para códon para deduzir as sequências de DNA que podem têla codificado Em seguida é projetada uma sonda de DNA sintética que corresponde àquela sequência Relembre entretanto que o código genético é degenerado ou seja a maior parte dos aminoácidos é codificada por múltiplos códons Portanto teoricamente diversas possíveis sequências de DNA podem codificar a proteína em questão mas apenas uma dessas sequências de DNA está presente no gene que de fato codifica a proteína Para contornar esse problema é selecionado um trecho curto de aminoácidos com redundância mínima Um conjunto misto de sondas é projetado em seguida contendo todas as possíveis sequências de DNA que podem codificar essa sequência de aminoácidos Esse coquetel de oligonucleotídios é utilizado como uma sonda e um filamento correto ou muito semelhante nesse coquetel hibridizará com o gene de interesse Oligonucleotídios de aproximadamente 20 nucleotídios de comprimento têm especificidade suficiente para hibridizar com uma única sequência de DNA complementar na biblioteca Sondas para a detecção de proteínas Se o produto proteico de um gene for conhecido e isolado na forma pura essa proteína então poderá ser utilizada para detectar o clone do gene correspondente em uma biblioteca O processo descrito na Figura 1013 requer dois componentes Primeiramente ele requer uma biblioteca de expressão produzida por meio da utilização de vetores de expressão que direcionarão a célula hospedeira para produzir a proteína Para construir a biblioteca o cDNA é inserido no vetor na trinca correta do quadro de leitura com um promotor bacteriano e as células que contêm o vetor e seu inserto produzem uma tradução do inserto de cDNA Em segundo lugar o processo necessita de um anticorpo que se ligue ao produto proteico específico do gene de interesse Um anticorpo é uma proteína produzida pelo sistema imune de um animal que se liga com alta afinidade a uma determinada molécula O anticorpo é utilizado para triar a biblioteca de expressão daquela proteína Uma membrana é sobreposta na superfície do meio e removida de modo que algumas das células de cada colônia agora estejam aderidas à membrana em locais que correspondem às suas posições sobre a placa de Petri original ver Figura 1013 A membrana impressa em seguida é seca e banhada em uma solução do anticorpo que se ligará à impressão de qualquer colônia que contenha a proteína de fusão de interesse Clones positivos são revelados por meio de um anticorpo secundário marcado que se liga ao primeiro anticorpo Ao detectar a proteína correta o anticorpo identifica o clone que contém o gene que deve ter sintetizado aquela proteína e que portanto contém o cDNA desejado FIGURA 1013 Para encontrar o clone de interesse uma biblioteca de expressão construída com o vetor de fago λ especial denominado λgt11 é triada com um anticorpo específico de proteína Após os anticorpos não ligados à membrana terem sido removidos os anticorpos ligados são visualizados por meio da ligação de um anticorpo secundário radioativo Podemos observar como esse tipo de sonda atua na prática ao retornar ao exemplo da insulina humana Para clonar um cDNA correspondente à insulina humana primeiramente sintetizamos cDNA com a utilização de mRNA isolado de células pancreáticas como o molde Em seguida as moléculas de cDNA são inseridas em um vetor bacteriano de expressão e o vetor é transformado dentro de bactérias As colônias bacterianas que contiverem o cDNA de insulina expressarão a proteína insulina A proteína insulina é identificada por meio de sua ligação com um anticorpo de insulina conforme descrito anteriormente Detecção de clones específicos por complementação funcional Em muitos casos não temos uma sonda para o gene com a qual iniciar mas temos uma mutação recessiva no gene de interesse Esse gene pode ser mutante em uma bactéria ou levedura ou até uma planta ou um camundongo O objetivo dessa abordagem é identificar o clone que contém o gene de interesse em virtude do fato de que ele restaurará a função eliminada pela mutação recessiva Na prática primeiramente é produzida uma biblioteca genômica ou de cDNA a partir de um organismo que apresenta o alelo do tipo selvagem do gene de interesse O gene de interesse é um de milhares representados na biblioteca Entretanto apenas o gene de interesse apresenta a capacidade de complementar o organismo mutante e restaurar o fenótipo do tipo selvagem Portanto se formos capazes de introduzir a biblioteca na espécie que contém a mutação recessiva ver seção 106 podemos detectar clones específicos na biblioteca por meio da sua capacidade de restaurar a função eliminada pela mutação recessiva Esse procedimento é denominado complementação funcional ou resgate de mutante O resumo geral do procedimento é como segue Produza uma biblioteca contendo insertos de DNA doador recombinante do tipo selvagem a Transforme as células da linhagem celular mutante recessiva a com essa biblioteca de insertos de DNA Identifique os clones da biblioteca que produzem células transformadas com o fenótipo dominante a Recupere o gene a do clone bacteriano ou de fago bemsucedido Até agora descrevemos as técnicas para transformar apenas células bacterianas Você verá posteriormente nesse capítulo que o DNA pode ser introduzido em muitos organismosmodelo genéticos incluindo Saccharomyces cerevisiae levedura Caenorhabditis elegans verme nematódeo Arabidopsis thaliana planta e Mus musculus camundongo CONCEITOCHAVE Um gene clonado pode ser selecionado a partir de uma biblioteca por meio da utilização de sondas para descobrir a sequência de DNA do gene ou seu produto proteico ou por complementação de um fenótipo mutante Análise de DNA por Southern e Northern blot Após ter amplificado seu produto de PCR ou selecionado um clone de interesse a partir de uma biblioteca genômica ou de cDNA a próxima etapa é saber mais a respeito do DNA Digamos que você tenha recuperado o cDNA da insulina a partir de um vetor de expressão e que deseja determinar os sítios de restrição na cópia genômica do gene da insulina Talvez você deseje verificar se esses sítios diferem entre as diversas populações humanas Você também pode desejar saber se o tamanho do mRNA da insulina varia entre as populações humanas Alternativamente você pode desejar determinar se um gene semelhante está presente no genoma de um organismo relacionado Na seção a seguir você verá que essas questões importantes podem ser respondidas por meio da utilização de técnicas relativamente simples Nessas técnicas misturas complexas de DNA ou RNA são ordenadas pelo tamanho e em seguida submetidas à hibridização com sondas para detectar moléculas de DNA relacionadas com alguma outra molécula de DNA O método mais extensivamente utilizado para a detecção de uma molécula dentro de uma mistura é o blotting que tem início com a eletroforese em gel para separar as moléculas na mistura Uma mistura de moléculas lineares de DNA é colocada em um poço formado em um gel de agarose O gel é posicionado em uma caixa com eletrodos nas extremidades de modo que os poços estejam na extremidade catódica negativamente carregada e o DNA em virtude da sua carga negativa migre até a extremidade anódica positivamente carregada A velocidade de migração das moléculas de DNA no gel é inversamente dependente do seu tamanho tendo em vista que a agarose atua como uma peneira por meio da qual pequenas moléculas se movimentam mais fácil e rapidamente do que fragmentos maiores Figura 1014 Portanto os fragmentos em classes de tamanhos distintos formarão bandas distintas no gel As bandas podem ser visualizadas por meio da coloração do DNA com brometo de etídio que causa a fluorescência do DNA na luz ultravioleta O tamanho absoluto de cada fragmento na mistura pode ser determinado por meio da comparação de sua distância de migração com um conjuntopadrão de fragmentos de tamanhos conhecidos Se as bandas estiverem bem separadas uma banda individual pode ser cortada do gel e a amostra de DNA pode ser purificada a partir da matriz de gel Portanto a eletroforese de DNA pode ser diagnóstica demonstrando os tamanhos e as quantidades relativas dos fragmentos de DNA presentes ou preparativa útil no isolamento de fragmentos de DNA específicos O DNA genômico digerido por enzimas de restrição em geral produz tantos fragmentos que a eletroforese produz um esfregaço contínuo de DNA e nenhuma banda discreta Uma sonda pode identificar um fragmento nessa mistura com a utilização de uma técnica desenvolvida por E M Southern denominada Southern blotting Figura 1015 A Assim como a identificação de clones ver Figura 1012 essa técnica envolve a obtenção de uma impressão de moléculas de DNA em uma membrana utilizandose a membrana para transferir o gel após a conclusão da eletroforese O DNA deve ser primeiramente desnaturado o que possibilita sua aderência à membrana Em seguida a membrana é hibridizada com uma sonda marcada Um autorradiograma ou uma fotografia das bandas fluorescentes revelará a presença de quaisquer bandas no gel que sejam complementares à sonda Para detectar o gene da insulina podemos aplicar esse protocolo ao DNA genômico humano digerido com enzimas de restrição na membrana utilizando o cDNA da insulina como a sonda marcada FIGURA 1014 Misturas de fragmentos de DNA de tamanhos diferentes foram separadas eletroforeticamente em um gel de agarose As amostras são oito vetores recombinantes tratados com EcoRI As misturas são aplicadas em poços próximos da parte superior do gel e os fragmentos se movimentam a partir da extremidade negativa para a positiva sob a influência de um campo elétrico até diferentes posições dependendo do tamanho As bandas de DNA foram visualizadas por meio de coloração com brometo de etídio e fotografadas sob luz ultravioleta A letra M representa colunas que contêm fragmentospadrão que atuam como marcadores para estimar o comprimento do DNA Ingram PublishingThinkstock A técnica de Southern blotting pode ser modificada para detectar uma molécula de RNA específica a partir de uma mistura de RNA fracionados em um gel Essa técnica é denominada RNA blotting ou mais comumente Northern blotting graças ao senso de humor de algum cientista para contrastála com a técnica de Southern blotting utilizada para a análise de DNA O RNA separado por meio de eletroforese pode ser uma amostra do RNA total isolado a partir de um tecido ou a partir de um organismo inteiro No exemplo demonstrado na Figura 1015 B fezse a eletroforese em gel de RNA isolado das sementes de diversas plantas Contrariamente ao DNA colocado em um gel não há necessidade de digerir a amostra de RNA tendo em vista que ela se encontra em moléculas de tamanho de transcritos discreto Os géis de RNA são colocados sobre uma membrana e hibridizados do mesmo modo como o DNA é hibridizado no Southern blotting Uma aplicação da análise Northern é determinar se um gene específico é transcrito em um determinado tecido ou sob determinadas condições ambientais Outra é determinar o tamanho do mRNA e se um RNA de tamanho semelhante pode ser detectado em plantas relacionadas de modo próximo como na Figura 1015 B FIGURA 1015 Neste exemplo é utilizada uma sonda radioativa para identificar ácidos nucleicos específicos separados por meio de eletroforese em gel A Fragmentos de restrição de RNA ou DNA são aplicados em um gel de agarose e são submetidos à eletroforese Os diversos fragmentos migram em diferentes velocidades de acordo com seus respectivos tamanhos O gel é colocado em tampão e recoberto por uma membrana e uma pilha de toalhas de papel Os fragmentos são desnaturados até filamentos únicos de modo que possam aderir à membrana Eles são carregados para a membrana pelo tampão que é absorvido pelas toalhas Em seguida a membrana é removida e incubada com uma sonda unifilamentar marcada radioativamente que é complementar à sequênciaalvo A sonda não ligada é lavada e removida e um filme de raios X é exposto à membrana Tendo em vista que a sonda radioativa hibridizou apenas com seus fragmentos de restrição complementares o filme será exposto apenas nas bandas que correspondem àqueles fragmentos A comparação dessas bandas com marcadores revela o número e o tamanho dos fragmentos nos quais as sequênciasalvo são encontradas Esse procedimento é denominado Southern blotting quando o DNA é transferido para a membrana e Northern blotting quando o RNA é transferido B Northern blot real com RNA isolado a partir das sementes de diversas plantas Uma única sonda de RNA é utilizada para identificar a presença de um locus único Os resultados demonstram que o milho está relacionado de modo mais próximo ao arroz ao sorgo e ao painço do que à soja ou ao algodão B Susan Wessler Iniciamos esta seção sobre a análise de blot indagando questões a respeito do gene da insulina e seu mRNA em populações humanas e em espécies correlatas Com base nas técnicas anteriores você consegue projetar experimentos de Southern blot e Northern blot para responder a essas questões Você pode presumir que tem acesso às amostras de DNA e RNA genômicos necessários Portanto vemos que o DNA clonado apresenta aplicação ampla como uma sonda utilizada para a detecção de um clone específico um fragmento de DNA ou uma molécula de RNA Em todos esses casos observe que a técnica novamente explora a capacidade dos ácidos nucleicos com sequências de nucleotídios complementares de se encontrar e ligar uns aos outros CONCEITOCHAVE As técnicas de DNA recombinante que dependem da complementaridade com uma sonda de DNA clonado incluem sistemas de blotting e de hibridização para a identificação de clones específicos fragmentos de restrição ou mRNA para estimativa do tamanho de DNA ou RNA específicos Hibridização com sonda para uma proteína específica Em relação às proteínas a hibridização em geral é realizada por meio da utilização de anticorpos como sondas Um anticorpo é uma proteína produzida pelo sistema imune de um animal que se liga com alta afinidade a uma molécula tal como uma proteína específica que atua como um antígeno tendo em vista que o anticorpo apresenta um encaixe chavefechadura específico com ela Para a detecção da proteína uma mistura proteica extraída de células é separada em bandas de proteínas distintas 104 por meio de eletroforese e em seguida é colocada sobre uma membrana esse é um Western blot A posição de uma proteína de interesse específica na membrana é revelada lavandose membrana em uma solução de anticorpos obtidos de um coelho ou outro hospedeiro no qual o antígeno tenha sido injetado anteriormente A posição da proteína é revelada pela posição da marcação que o anticorpo carrega Determinação da sequência de bases de um segmento de DNA Após termos clonado e identificado nosso gene desejado ou termos amplificado esse gene por meio da PCR tem início a tarefa de tentar compreender a sua função A linguagem final do genoma é composta por filamentos dos nucleotídios A T C e G A obtenção da sequência de nucleotídios completa de um segmento de DNA com frequência é uma parte importante da compreensão da organização de um gene e da sua regulação sua relação com outros genes ou da função do RNA ou da proteína que ele codifica De fato a sequência de DNA pode ser utilizada para determinar a estrutura primária proteica tendo em vista que na maior parte a tradução da sequência de ácidos nucleicos de uma molécula de cDNA para descobrir a sequência de aminoácidos de sua cadeia polipeptídica codificada é mais simples do que sequenciar diretamente o próprio polipeptídio Nessa seção consideramos as técnicas utilizadas para ler a sequência de nucleotídios do DNA Assim como as tecnologias do DNA recombinante e da PCR o sequenciamento do DNA explora a complementaridade de pares de bases juntamente com uma compreensão da bioquímica básica da replicação do DNA Foram desenvolvidas diversas técnicas mas uma delas tem sido o método predominante utilizado até agora para sequenciar a maior parte das moléculas de DNA Embora ainda seja a técnica mais comumente utilizada para sequenciar DNA mais curtos novas tecnologias de sequenciamento suplantaram amplamente essa técnica quando o objetivo é determinar a sequências de genomas inteiros conforme descrito em detalhes no Capítulo 14 Essa técnica de sequenciamento é denominada sequenciamento didesóxi ou por vezes sequenciamento de Sanger em homenagem ao seu inventor O termo didesóxi tem origem em um nucleotídio especial modificado denominado didesoxinucleotídio trifosfato genericamente ddNTP Esse nucleotídio modificado é a chave para a técnica de Sanger em virtude da sua capacidade de bloquear a síntese contínua do DNA Um didesoxinucleotídio não apresenta o grupo 3hidroxila bem como o grupo 2hidroxila que também está ausente em um desoxinucleotídio Figura 1016 compare com a Figura 75 Para que a síntese do DNA ocorra a DNA polimerase deve catalisar uma reação entre o grupo 3hidroxila do último nucleotídio e o grupo 5fosfato do próximo nucleotídio a ser adicionado Tendo em vista que um didesoxinucleotídio não apresenta o grupo 3hidroxila essa reação não pode ocorrer e portanto a síntese do DNA é bloqueada no ponto da adição A lógica do sequenciamento didesóxi é direta Suponha que desejamos ler a sequência de um segmento de DNA clonado de até 800 pares de bases Esse segmento de DNA pode ser um inserto de plasmídio ou até mesmo um produto da PCR Primeiramente desnaturamos os dois filamentos desse segmento Em seguida criamos um primer para a síntese de DNA que hibridizará exatamente em um local no segmento de DNA clonado e em seguida adicionamos um coquetel especial de DNA polimerase desoxinucleotídios trifosfato normais dATP dCTP dGTP e dTTP e uma pequena quantidade de um didesoxinucleotídio a uma das quatro bases p ex ddATP A polimerase começará a sintetizar o filamento de DNA complementar iniciando a partir do primer mas será interrompida em qualquer ponto no qual o didesoxinucleotídio trifosfato for incorporado na cadeia de DNA em crescimento em lugar do desoxinucleotídio trifosfato normal Suponha que o segmento de DNA que estamos tentando sequenciar seja 5 ACGGGATAGCTAATTGTTTACCGCCGGAGCCA 3 FIGURA 1016 23didesoxinucleotídios que são empregados no método de sequenciamento de DNA de Sanger estão ausentes no grupo hidroxila da ribose presente no DNA Em seguida iniciaremos a síntese de DNA a partir de um primer complementar Utilizando o coquetel especial para a síntese de DNA enriquecido com uma pequena quantidade de ddATP por exemplo criaremos um conjunto estabelecido de fragmentos de DNA que apresentam o mesmo ponto de início mas diferentes pontos de término tendo em vista que os fragmentos são interrompidos no ponto de inserção de ddATP em vez de dATP interrompendo a replicação do DNA A série de diferentes cadeias de DNA interrompidas por ddATP se assemelha à lista de sequências a seguir A indica o didesoxinucleotídio Podemos produzir um arranjo dos referidos fragmentos para cada um dos quatro didesoxinucleotídios trifosfato possíveis em quatro coquetéis em separado um enriquecido com ddATP um com ddCTP um com ddGTP e um com ddTTP Cada um produzirá um arranjo diferente de fragmentos com nenhum de dois coquetéis enriquecidos produzindo fragmentos do mesmo tamanho Em seguida os fragmentos de DNA gerados nos quatro coquetéis são separados e colocados em ordem com a utilização de eletroforese em gel Ao aplicar os fragmentos em quatro colunas adjacentes de um gel de poliacrilamida que pode separar fragmentos de DNA que variam em apenas um nucleotídio no comprimento observamos que os fragmentos podem ser ordenados pelo comprimento com os comprimentos aumentando em uma base por vez Os filamentos recémsintetizados devem ser marcados de algum modo para tornar as bandas visíveis no gel Os filamentos são marcados na medida em que são produzidos por meio da utilização de um primer marcado radioativamente ou quando houver um dos dNTP regulares com marcação radioativa Também podem ser utilizadas marcações fluorescentes e nesse caso a fluorescência ocorre em cada ddNTP ver a seguir Os produtos das referidas reações de sequenciamento didesóxi estão demonstrados na Figura 1017 Tal resultado é uma escada de cadeias de DNA marcadas que aumentam em comprimento uma a uma e assim tudo o que precisamos fazer é ler o gel para ler a sequência de DNA do filamento sintetizado no sentido de 5 para 3 Se a marcação for um corante fluorescente um emissor de cor fluorescente diferente é utilizado para cada uma das quatro reações de ddNTP e um detector na extremidade do gel consegue distinguir cada uma das cores As quatro reações ocorrem no mesmo tubo de ensaio e os quatro conjuntos de cadeias de DNA formadas podem ser submetidos à eletroforese juntos Portanto quatro vezes mais sequências podem ser produzidas no mesmo período de tempo do que as que seriam produzidas por meio de reações em separado Essa lógica é utilizada na detecção da fluorescência por máquinas de sequenciamento automático de DNA Graças a essas máquinas o sequenciamento de DNA pode prosseguir em um nível maciço e sequências de genomas inteiros foram obtidas por meio da ampliação dos procedimentos descritos nesta seção A Figura 1018 ilustra uma leitura de sequenciamento automático Cada pico colorido representa um fragmento de DNA de tamanho diferente que termina com uma base fluorescente detectada pelo scanner fluorescente do sequenciador automático de DNA as quatro cores diferentes representam as quatro bases do DNA As aplicações da tecnologia de sequenciamento automático em escala genômica são um foco importante do Capítulo 14 5 ATGGGATAGCTAATTGTTTACCACGCGAGCCA 3 3 CGCCCTCGG 5 Clone de DNAmolde Primer para síntese Sentido da síntese de DNA FIGURA 1017 O DNA é sequenciado com eficiência por meio da inclusão de didesoxinucleotídios entre os nucleotídios utilizados para copiar um segmento de DNA A Um primer marcado desenhado a partir da 105 sequência flanqueadora do vetor é utilizado para iniciar a síntese de DNA A adição de quatro didesoxinucleotídios diferentes o ddATP está demonstrado aqui interrompe a síntese aleatoriamente B Os fragmentos resultantes são separados eletroforeticamente e submetidos à autorradiografia A sequência inferida está demonstrada à direita C Gel de sequenciamento de Sanger C Loida EscoteCarlson PhD FIGURA 1018 Cópia impressa de um sequenciador automático que utiliza corantes fluorescentes Cada uma das quatro cores representa uma base diferente A letra N representa uma base que não pode ser atribuída em virtude de os picos serem muito baixos Observe que se este fosse um gel como na Figura 1017 C cada um destes picos corresponderia a uma das bandas escuras no gel em outras palavras estes picos coloridos representam uma leitura diferente do mesmo tipo de dados produzidos em um gel de sequenciamento CONCEITOCHAVE Um segmento de DNA clonado pode ser sequenciado por meio da caracterização das bases de término de um conjunto de fragmentos de DNA sintéticos truncados cada um terminando em posições diferentes correspondentes à incorporação de um didesoxinucleotídio Alinhamento genético e mapas físicos para isolar genes específicos Antes que sequências genômicas completas estivessem disponíveis a clonagem molecular de genes em relação a distúrbios genéticos tais como a fibrose cística FC e determinados cânceres era uma tarefa árdua A identificação de genes clonados em bibliotecas genômicas com frequência necessitava de um projeto de pesquisa maior envolvendo os esforços cooperativos de diversos laboratórios O processo é conhecido como clonagem posicional e sua estratégia é utilizar a posição genética para isolar o gene subjacente ao traço Até mesmo com a disponibilidade de sequências de genomas inteiros com frequência ainda é necessário primeiramente mapear traços que não foram associados a um produto gênico antes de identificar o gene responsável pela atividade Para iniciar a clonagem posicional pesquisadores primeiramente precisam mapear o gene responsável por um traço em particular Para mapear o gene os pesquisadores podem testar a ligação com marcadores de localização conhecida conforme descrito no Capítulo 4 Os marcadores podem ser RFLP polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição SNP polimorfismos de nucleotídio único ou outros polimorfismos moleculares ver Capítulos 4 e 14 ou podem ser pontos de quebra cromossômica bemmapeados ver Capítulo 17 Marcadores em cada lado do gene de interesse são os melhores tendo em vista que delimitam a possível localização daquele gene É importante ter em mente que o mapeamento de um gene por meio de qualquer um desses procedimentos serve apenas para localizar a vizinhança cromossômica do gene nenhum desses procedimentos identifica diretamente o gene Portanto as regiões delimitadas pelos marcadores moleculares tais como SNP e RFLP normalmente contêm muitos genes espalhados por centenas de milhares ou mesmo milhões de pares de bases Para identificar o gene correto responsável por um traço em particular os pesquisadores devem ser capazes de analisar toda a vizinhança em relação ao gene de interesse Em organismos modelo para os quais a sequência de todo o genoma está disponível a vizinhança local com seus diversos genes pode ser obtida simplesmente a partir de uma base de dados em computador ver Capítulo 14 A partir da análise da sequência desses genes da vizinhança são escolhidos os candidatos mais prováveis que possam representar o gene que está sendo buscado A seguir discutiremos brevemente como a clonagem posicional foi utilizada antes da disponibilidade da sequência genômica humana para isolar o gene responsável pela devastadora doença humana fibrose cística o gene da FC Embora essa técnica não seja mais necessária para a identificação de genes humanos ela ainda é utilizada para identificar genes específicos em organismos nos quais uma sequência genômica ainda deva ser determinada Utilização de clonagem posicional para identificar o gene de uma doença humana Seguiremos os métodos utilizados para identificar a sequência genômica do gene da fibrose cística Nenhum defeito bioquímico primário era conhecido na ocasião em que o gene foi isolado e assim tratavase muito mais um gene em busca de uma função Triagens genéticas dependentes do mapeamento gênico podem ser utilizadas para dissecar qualquer processo biológico Entretanto triagens genéticas não podem ser utilizadas em seres humanos tendo em vista que não podemos criar intencionalmente mutantes humanos Em vez disso são realizadas análises de heredogramas de grandes famílias com o traço da doença ver Capítulo 2 quando as referidas informações estão disponíveis para determinar a posição do defeito genético que causa uma doença tal como a fibrose cística Observase que membros de uma família que têm a doença apresentam um ou mais marcadores moleculares anormalidades cromossômicas traços ligados de localização conhecida SNP e assim por diante em comum que não são observados em outras famílias ver uma discussão sobre os marcadores moleculares no Capítulo 4 A ligação a marcadores moleculares em famílias com FC localizou o gene da FC no braço longo do cromossomo 7 entre as bandas 7q22 e 7q311 Acreditavase que o gene da FC estivesse nessa região mas entre esses marcadores há 15 centimorgan unidades de mapa de cromossomo um vasto terreno inexplorado de mais de 1 milhão de bases Para chegar mais perto era necessário gerar mais marcadores moleculares nessa região O método geral para isolamento de marcadores moleculares descrito no Capítulo 4 é identificar uma região do DNA que seja polimórfica em indivíduos ou populações que diferem em relação ao traço de interesse Ao encontrar marcadores moleculares adicionais ligados ao gene da FC os geneticistas estreitaram a região que contém o gene da FC para aproximadamente 500 kbp ainda uma distância considerável Foi criado um mapa físico dessa região inteira ou seja um conjunto aleatório de clones dessa região foi posicionado na ordem correta Isso foi parcialmente realizado por meio da utilização de uma técnica denominada caminhada cromossômica chromosome walk Figura 1019 A ideia básica é utilizar a sequência do marcador próximo como uma sonda para identificar um segundo conjunto de clones que se sobrepõe ao clone do marcador que contém o marco mas que se estende para fora a partir dele em uma de duas direções em direção ao alvo ou para longe do alvo Fragmentos terminais dos novos conjuntos de clones podem ser utilizados como sondas para a identificação de um terceiro conjunto de clones sobrepostos a partir da biblioteca genômica Desse modo tedioso geneticistas identificaram o clone que contém os marcadores moleculares que estão mais firmemente ligados ao traço da FC e sequenciaram aquele clone Com a sequência em mãos a caçada por quaisquer genes ao longo desse trecho de DNA que contivessem os genes e as sequências não codificadoras pôde ser iniciada No exemplo da FC os genes candidatos foram identificados por meio da observação de características tais como sinais de início e parada comuns aos genes As sequências dos genes candidatos e dos cDNA em seguida foram comparadas entre indivíduos normais e pacientes com FC Foi observada uma mutação em um gene candidato que aparecia em todos os pacientes com FC analisados mas em nenhum dos indivíduos normais Essa mutação era uma deleção de três pares de bases que eliminava uma fenilalanina da proteína Por sua vez a partir da sequência inferida foi prevista a estrutura tridimensional da proteína Essa proteína é estruturalmente semelhante às proteínas de transporte de íons em outros sistemas sugerindo que um defeito de transporte é a causa primária da FC Quando utilizado para transformar linhagens celulares mutantes de pacientes com FC o gene do tipo selvagem restaurou a função normal esse resgate fenotípico foi a confirmação final de que a sequência isolada era de fato o gene da FC Outros genes humanos isolados por meio de clonagem posicional incluem aqueles envolvidos em diversas doenças hereditárias incluindo doença de Huntington câncer de mama síndrome de Werner ver Capítulo 7 e suscetibilidade à asma Em virtude da facilidade relativa de cruzamento de plantas a clonagem posicional tem sido uma técnica muito poderosa para isolar genes envolvidos em muitos processos incluindo a identificação de genes que contribuíram para a domesticação de cultivos Utilização do mapeamento fino para identificar genes Atualmente o processo extremamente tedioso de caminhada até o gene deixou de ser necessário para qualquer organismo em relação ao qual uma sequência genômica esteja disponível Pesquisadores ainda iniciam a caçada ao gene por meio da identificação de dois marcadores moleculares que flanqueiem de modo próximo o gene de interesse ver Figura 1019 Na Figura 1020 A os dois marcadores flanqueadores iniciais estão indicados como marcador de início 1 e marcador de início 2 No intervalo entre os dois marcadores de início há sete genes cuja existência é conhecida genes A a G Qual desses genes é responsável pelo traço de interesse Os pesquisadores tentam estreitar o intervalo que encerra o gene de interesse Para isso selecionam marcadores adicionais localizados entre os marcadores de início a partir de bancos de dados online de sequências genômicas e de marcadores Eles devem selecionar marcadores que apresentem um alelo em indivíduos com o traço fenotípico e um alelo diferente em indivíduos sem o fenótipo Esses marcadores adicionais são denominados marcadores de finalização na Figura 1020 A eles são os marcadores de finalização 1 a 7 O objetivo é encontrar os marcadores mais estreitamente ligados ao gene de interesse FIGURA 1019 Esta caminhada cromossômica tem início com um fago recombinante ou clone BAC obtido a partir de uma biblioteca que contém grandes insertos que representam um genoma eucariótico inteiro No exemplo demonstrado o marcador molecular 7q22 é utilizado como sonda em uma biblioteca genômica humana Apenas os insertos de DNA estão demonstrados O inserto de DNA selecionado pela sonda é utilizado em seguida para isolar outro fago recombinante ou BAC que contenha um segmento adjacente de DNA eucariótico Esta caminhada ilustra como iniciar no marcador molecular 7q22 e chegar ao marcador 7q311 que está do outro lado do gene da FC A próxima etapa é procurar indivíduos nos quais um evento de crossover raro tenha ocorrido dentro da região limitada pelos dois marcadores de início Normalmente os marcadores de início estão a uma distância de 1 ou mais centimorgans Como tal haverá em média um único crossover em um intervalo desse tamanho em uma progênie de 100 Em virtude do grande número de progênie necessária esse tipo de mapeamento tem sido aplicado com sucesso em muitos organismosmodelo genéticos tais como a moscadasfrutas e C elegans mas é especialmente de sucesso em plantas tendo em vista que os cruzamentos de plantas podem produzir centenas ou milhares de progênies que podem ser obtidas e analisadas A Figura 1021 demonstra a série de cruzamentos utilizados para produzir progênie contendo recombinantes entre os marcadores de início M1 e M2 ver Figura 1020 Os alelos marcadores revelam se os marcadores e os genes na mesma região foram herdados da mãe ou do pai Nos recombinantes parte do segmento entre os marcadores de início em um cromossomo terá sido herdada da mãe e uma parte do pai Genitor 2 na Figura 1021 Na Figura 1020 o traço é uma doença herdada do pai Em indivíduos com a doença o crossover criou uma região colorida em azul na Figura 1020 B que é homozigota em relação ao gene da doença Portanto o gene deve estar localizado na região azul em todos os indivíduos com a doença Comparando todos os indivíduos com a doença você pode verificar que apenas a região azul compartilhada por todos é a região na qual está localizado o gene D Em outras palavras D é o gene presente em regiões do genoma que são homozigotas em relação ao alelo paterno em indivíduos com a doença Se o número de indivíduos nos heredogramas ou nas populações de estudo for suficientemente grande então pode ser possível identificar não apenas o gene em questão mas também a lesão da doença que é o sítio polimórfico no gene que controla a diferença no traço Observe que esse processo não envolve a clonagem de segmentos de DNA nas bibliotecas de BAC ou a triagem das referidas bibliotecas Como tal ele é mais adequadamente denominado mapeamento fino em vez de clonagem posicional FIGURA 1020 Uma caçada moderna de um gene utiliza marcadores e sequências obtidos a partir de bancos de dados online para determinar os genótipos em uma região de DNA em relação a grandes números de indivíduos com e sem o traço da doença Os indivíduos demonstrados aqui foram derivados da progênie F2 na Figura 1021 O genealvo é o alelo gênico compartilhado por todos com a doença o gene D Vermelho é homozigoto para o alelo D dominante do Genitor 1 normal azul é homozigoto para o alelo d recessivo do Genitor 2 doente mutante cinza é heterozigoto Os investigadores ainda devem trabalhar muito e superar muitos obstáculos para isolar os genes que controlam doenças ou outros traços Primeiramente eles precisam ter grandes amostras de indivíduos para assegurar que possam identificar eventos de crossover raros entre todos os genes Tipicamente isso significa dispor de milhares de indivíduos Sem grandes populações os investigadores podem recuperar crossovers apenas a cada conjunto de diversos genes e consequentemente não teriam certeza sobre qual desses seria o gene causador Por exemplo com apenas os indivíduos a e b na Figura 1020 B um investigador somente poderia estreitar a busca a quatro genes D E F G Em segundo lugar embora os bancos de dados online contenham listas de marcadores com base no DNA tais como SNP nem todos apresentam alelos que estejam presentes somente em indivíduos com o traço de interesse em um heredograma ou cruzamento em particular de modo que os pesquisadores devem primeiramente triar um grande número de marcadores para encontrar aqueles que o apresentam Finalmente os investigadores precisam determinar a sequência completa do DNA do alelo do gene da doença para identificar a lesão causadora Na maior parte dos casos a sequência genômica online conterá o alelo do tipo selvagem O alelo da doença é mais facilmente sequenciado com a utilização da PCR para amplificar aquele alelo do DNA de indivíduos afetados e sem de fato clonar o DNA A mutação precisa pode então ser deduzida a partir da sequência de DNA do produto da PCR CONCEITOCHAVE Até mesmo com o acesso às sequências de genomas inteiros o isolamento dos genes defeituosos que causam doenças tem início com o mapeamento genético do traço da doença Dispondo de marcadores estreitamente ligados flanqueando o traço os investigadores podem utilizar o mapeamento fino para estreitar a busca do gene de interesse As seções precedentes introduziram as técnicas fundamentais que revolucionaram a genética A seção final desse capítulo enfocará a aplicação dessas técnicas na engenharia genética 106 FIGURA 1021 Uma caçada moderna de um gene com frequência tem início com um cruzamento entre genitores com traços contrastantes No exemplo demonstrado o Genitor 1 carrega o alelo do tipo selvagem D e é normal enquanto o Genitor 2 carrega o alelo mutante d e como resultado apresenta a doença Toda a progênie F1 é heterozigota em todos os loci e é normal A progênie F2 está segregando em relação à doença A maior parte da progênie com a doença apresenta o genótipo do Genitor 2 mutante parental Indivíduos mutantes raros sofreram um evento de recombinação em um dos genitores no intervalo cromossômico entre os marcadores M1 e M2 mutante heterozigoto parte inferior à direita Engenharia genética Graças à tecnologia do DNA recombinante os genes podem ser isolados e caracterizados como sequências de nucleotídios específicas Mas até mesmo essa conquista não é o fim da história Veremos em seguida que o conhecimento de uma sequência com frequência é o início de uma nova rodada de manipulação genética Quando caracterizada uma sequência pode ser manipulada para alterar o genótipo de um organismo A introdução de um gene alterado em um organismo tornouse central para a pesquisa genética básica mas também encontra ampla aplicação comercial Dois exemplos da última são 1 cabras que secretam em seu leite antibióticos derivados de um fungo e 2 plantas protegidas do congelamento por meio da incorporação de genes anticongelamento de um peixe ártico em seus genomas A utilização de técnicas de DNA recombinante para alterar o genótipo e o fenótipo de um organismo é denominada engenharia genética e a sua aplicação prática é denominada biotecnologia As técnicas de engenharia genética descritas na primeira parte deste capítulo foram originalmente desenvolvidas em bactérias Portanto essas técnicas precisaram ser estendidas para eucariotosmodelo que constituem uma grande proporção dos organismosmodelo de pesquisas Os genes eucarióticos ainda são tipicamente clonados e sequenciados em hospedeiros bacterianos mas eventualmente são introduzidos em um eucarioto seja a espécie doadora original ou uma completamente diferente O gene transferido é denominado transgene e o produto modificado é denominado organismo transgênico O transgene pode ser introduzido em uma célula eucariótica por meio de uma diversidade de técnicas incluindo transformação injeção infecção bacteriana ou viral e bombardeamento com partículas de tungstênio ou ouro revestidas por DNA com a utilização de um disparador de genes Figura 1022 Quando o transgene entra em uma célula ele se movimenta até o núcleo onde deve se tornar uma parte estável do genoma por meio da inserção em um cromossomo ou apenas em algumas poucas espécies da replicação como parte de um plasmídio Se a inserção ocorre o transgene pode substituir o gene residente por meio de recombinação homóloga ou inserirse ectopicamente ou seja em outros locais no genoma Transgenes de outras espécies tipicamente se inserem ectopicamente CONCEITOCHAVE A transgênese pode introduzir material genético novo ou modificado em células eucarióticas Agora nos voltamos para alguns exemplos em fungos plantas e animais Engenharia genética em Saccharomyces cerevisiae É justo dizer que o S cerevisiae é o modelo genético eucariótico facilmente manipulado mais sofisticado A maior parte das técnicas tipicamente utilizada para a engenharia genética eucariótica foi desenvolvida em leveduras assim consideraremos as vias gerais em relação à transgênese em leveduras Os vetores de leveduras mais simples são os plasmídios integrativos YIp derivados de plasmídios bacterianos nos quais o DNA de levedura de interesse foi inserido Quando transformados em células de levedura esses plasmídios se inserem nos cromossomos da levedura em geral por meio de recombinação homóloga com o gene residente seja por meio de um crossover único ou duplo Figura 1023 Como resultado o plasmídio inteiro é inserido ou o aleloalvo é substituído pelo alelo no plasmídio O último é um exemplo de substituição gênica nesse caso a substituição do gene original na célula de levedura por um gene modificado por engenharia genética A substituição gênica pode ser utilizada para deletar um gene ou substituir um alelo mutante pelo seu correspondente do tipo selvagem ou contrariamente substituir um alelo do tipo selvagem por um mutante As referidas substituições podem ser detectadas por meio do plaqueamento de células em um meio seletivo para um alelo marcador no plasmídio A origem bacteriana da replicação é diferente das origens eucarióticas e assim os plasmídios bacterianos não replicam em leveduras Portanto o único modo pelo qual os referidos vetores podem gerar um genótipo modificado estável é se eles estiverem integrados ao cromossomo da levedura Engenharia genética em plantas A tecnologia do DNA recombinante introduziu uma nova dimensão ao esforço de desenvolver variedades de cultivos melhores A diversidade genética deixou de ser conquistada somente por meio da seleção de variantes de uma determinada espécie Atualmente podese introduzir o DNA de outras espécies de plantas animais ou até mesmo bactérias produzindo organismos geneticamente modificados OGM As modificações do genoma que se tornaram possíveis por meio dessa tecnologia são quase ilimitadas Em resposta às novas possibilidades uma parcela do público expressou a preocupação de que a introdução de OGM nos suprimentos alimentares possa produzir problemas de saúde inesperados A preocupação a respeito dos OGM é uma faceta de um debate público em andamento a respeito de complexas questões de saúde pública segurança ética e questões educacionais originadas pelas novas tecnologias genéticas FIGURA 1022 A Quatro modos diferentes de introduzir um DNA exógeno em uma célula B Um disparador de genes B Matt MeadowsGetty Images FIGURA 1023 Um plasmídio que contém um alelo ativo gene X se insere em uma linhagem de levedura receptora que contém um gene defeituoso X por meio de recombinação homóloga O resultado pode ser a substituição do gene defeituoso X pelo X parte superior ou a sua retenção juntamente com o novo alelo parte inferior O sítio mutante do gene X é representado como uma barra preta vertical Crossovers únicos na posição 2 também são possíveis mas não estão demonstrados Um vetor rotineiramente utilizado para produzir plantas transgênicas é derivado do plasmídio Ti um plasmídio natural de uma bactéria do solo denominada Agrobacterium tumefaciens Essa bactéria causa o que é conhecido como doença galha da coroa na qual a planta produz crescimentos descontrolados denominados tumores ou galhas A base para a produção de tumor é um grande 200 kb plasmídio de DNA circular o plasmídio Ti indutor de tumor Quando a bactéria infecta uma célula da planta uma parte do plasmídio Ti é transferida e inserida aparentemente mais ou menos de modo aleatório no genoma da planta hospedeira Figura 1024 A região do plasmídio Ti que se insere na planta hospedeira é denominada TDNA em referência ao DNA de transferência Os genes cujos produtos catalisam essa transferência do T DNA estão localizados em uma região do plasmídio Ti separada da própria região do TDNA O comportamento natural do plasmídio Ti tornao bemadequado para o papel de um vetor para a engenharia genética em plantas Em particular qualquer DNA que seja inserido entre as sequências de bordas de TDNA extremidades de 24 pb pode ser mobilizado por outras funções proporcionadas pelo plasmídio Ti e inserido em cromossomos de plantas Portanto os cientistas foram capazes de eliminar toda a sequência de TDNA entre as bordas incluindo os genes que causam tumores e substituíla pelos genes de interesse e por um marcador selecionável p ex resistência à canamicina Um método para introduzir o T DNA no genoma da planta está demonstrado na Figura 1025 Bactérias que contêm esse TDNA e outras que contêm TDNA similares modificados por engenharia genética são utilizadas para infectar segmentos cortados de tecido vegetal tais como discos de folhas perfuradas Se os discos de folhas forem colocados em um meio contendo canamicina apenas as células da planta que adquiriram o gene kanR modificado por engenharia genética no TDNA sofrerão divisão celular As células transformadas crescem em um aglomerado ou calo que pode ser induzido a formar brotos e raízes Esses calos são transferidos para o solo onde podem se desenvolver em plantas transgênicas Tipicamente apenas uma cópia única da região do TDNA se insere no genoma de uma determinada planta onde ele se segrega na meiose como um alelo mendeliano regular Figura 1026 A presença do inserto pode ser verificada por meio da triagem do tecido transgênico em relação a marcadores genéticos transgênicos ou por meio da triagem do DNA purificado com uma sonda de TDNA em uma hibridização por Southern Plantas transgênicas que carregam qualquer um de uma diversidade de genes exógenos estão em uso atualmente incluindo plantas de cultivo que carregam genes que conferem resistência a determinadas pragas bacterianas ou fúngicas e muitas mais estão em desenvolvimento Não apenas as qualidades das próprias plantas estão sendo manipuladas mas assim como os microrganismos as plantas também estão sendo utilizadas como fábricas convenientes para produzir proteínas codificadas por genes exógenos FIGURA 1024 Representação simplificada das principais regiões do plasmídio Ti de A tumefaciens contendo um TDNA modificado por engenharia genética FIGURA 1025 A inserção de TDNA nos cromossomos de uma planta A incubação de discos de folhas com a bactéria A tumefaciens contendo um TDNA modificado por engenharia genética leva às células das folhas com o TDNA em seu genoma que são capazes de crescer em placas de ágar e que podem ser induzidas a se diferenciarem em plantas do tabaco transgênicas FIGURA 1026 A região do TDNA e qualquer DNA inserido no cromossomo de uma planta em uma planta transgênica são transmitidos em um padrão de herança mendeliana Engenharia genética em animais Tecnologias transgênicas estão sendo empregadas atualmente com muitos sistemas de animaismodelo Enfocaremos os dois modelos de animais bastante utilizados para a pesquisa genética básica o nematódeo Caenorhabditis elegans e o camundongo Mus musculus Um método comumente utilizado para transformar um terceiro organismomodelo a moscadasfrutas Drosophila melanogaster está descrito no Capítulo 15 Versões de muitas das técnicas consideradas até agora também podem ser aplicadas nesses sistemas animais Transgênese em C elegans O método utilizado para introduzir transgenes em C elegans é simples DNA transgênicos são injetados diretamente no organismo tipicamente como plasmídios fosmídios ou outros DNA clonados em bactérias A estratégia de injeção é determinada pela biologia reprodutiva do verme As gônadas do verme são sinciciais o que significa que existem muitos núcleos dentro da mesma célula gonadal Uma célula sincicial é uma grande proporção de um braço da gônada e a outra célula sincicial é a maior parte do outro braço Figura 1027 A Esses núcleos não formam células individuais até a meiose quando iniciam sua transformação em ovócitos ou espermatozoides individuais Uma solução de DNA é injetada na região sincicial de um dos braços expondo assim mais de 100 núcleos ao DNA transformador Ao acaso alguns desses núcleos incorporarão o DNA lembre que a membrana nuclear é fragmentada durante a divisão e assim o citoplasma dentro do qual o DNA é injetado se torna contínuo com o nucleoplasma Tipicamente o DNA transgênico forma arranjos extracromossômicos de múltiplas cópias Figura 1027 B que existem como unidades independentes fora dos cromossomos Mais raramente os transgenes se tornarão integrados em uma posição ectópica em um cromossomo ainda como um arranjo de múltiplas cópias Infelizmente as sequências podem se misturar aos arranjos complicando o trabalho do pesquisador Transgênese em M musculus Camundongos são os modelos mais importantes para a genética de mamíferos O que é mais excitante é que uma grande parte da tecnologia desenvolvida em camundongos é potencialmente aplicável para os seres humanos Existem duas estratégias para a transgênese em camundongos cada uma apresentando suas vantagens e desvantagens Inserções ectópicas Os transgenes são inseridos aleatoriamente no genoma normalmente como arranjos de múltiplas cópias Direcionamento gênico A sequência do transgene é inserida em um local ocupado por uma sequência homóloga no genoma Ou seja o transgene substitui seu correspondente homólogo normal Inserções ectópicas Para inserir transgenes em locais aleatórios o procedimento é simplesmente injetar uma solução de DNA clonado em bactéria no núcleo de um zigoto Figura 1028 A Diversos zigotos injetados são inseridos no oviduto de uma fêmea onde alguns se desenvolverão em filhotes de camundongo Em algum estágio posterior o transgene se integrará aos cromossomos de núcleos aleatórios Ocasionalmente as células transgênicas formam parte da linhagem germinativa e nesses casos um embrião injetado se desenvolverá em um camundongo adulto cujas células germinativas contêm o transgene inserido em alguma posição aleatória em um dos cromossomos Figura 1028 B Parte da progênie desses adultos herdará o transgene em todas as células Haverá um arranjo de múltiplas cópias do gene em cada ponto de inserção mas a localização o tamanho e a estrutura dos arranjos serão diferentes em cada evento de integração A técnica dá origem a alguns problemas 1 o padrão de expressão dos genes aleatoriamente inseridos pode ser anormal denominado efeito de posição tendo em vista que o ambiente cromossômico local não apresenta as sequências reguladoras normais do gene ver Capítulo 12 para mais sobre o efeito de posição e 2 podem ocorrer rearranjos de DNA nos arranjos de múltiplas cópias em essência mutando as sequências Não obstante essa técnica é muito mais eficiente e menos trabalhosa do que o direcionamento gênico FIGURA 1027 Transgenes de C elegans são criados por meio da injeção do DNA transgênico diretamente em uma gônada A Método de injeção B Os dois tipos principais de resultados transgênicos arranjos extracromossômicos e arranjos integrados em locais cromossômicos ectópicos FIGURA 1028 Transgenes de M musculus são criados por meio da injeção de DNA clonado em ovos fertilizados e da inserção subsequente em locais cromossômicos ectópicos A Método de injeção B Um integrante ectópico típico com múltiplas cópias do transgene recombinante inseridas em um arranjo Direcionamento gênico O direcionamento gênico possibilita que os pesquisadores eliminem um gene ou modifiquem a função que ele codifica Em uma aplicação denominada substituição gênica um alelo mutante pode ser reparado por meio de sua substituição por um alelo do tipo selvagem em sua localização cromossômica normal A substituição gênica evita tanto o efeito de posição quanto os rearranjos de DNA associados à inserção ectópica tendo em vista que uma única cópia do gene é inserida em seu ambiente cromossômico normal Contrariamente um gene pode ser inativado por meio da substituição de um gene normal pelo gene inativo Uma referida inativação direcionada é denominada nocaute knockout gênico O direcionamento gênico em camundongo é realizado em célulastronco embrionárias células ES cultivadas Em geral uma célulatronco é uma célula indiferenciada em um determinado tecido ou órgão que se divide assimetricamente para produzir uma progênie de célulastronco e uma célula que irá se diferenciar em um tipo de célula terminal As células ES são célulastronco especiais que podem se diferenciar para formar qualquer tipo de célula do corpo incluindo de maior importância a linhagem germinativa 1 2 3 Para ilustrar o processo de direcionamento gênico observamos como ele alcança um de seus desfechos típicos a saber a substituição de um gene normal pelo gene inativo ou nocaute gênico O processo requer três estágios Um gene inativo é direcionado para substituir o gene funcional em uma cultura de células ES produzindo células ES que contêm um nocaute gênico Figura 1029 As células ES que contêm o gene inativo são transferidas para embriões de camundongos Figura 1030 Os camundongos transgênicos são identificados e criados para produzir camundongos de genótipo conhecido Estágio 1 a versão inativa do gene é preparada por meio da inserção de um segmento do DNA que interrompe cópias do gene clonado Em seguida construtos de DNA que contêm o gene defeituoso são injetados nos núcleos de células ES cultivadas O gene defeituoso se insere com muito mais frequência em sítios não homólogos ectópicos do que em sítios homólogos Figura 1029 B e assim a próxima etapa é selecionar as células raras nas quais o gene defeituoso substituiu o gene funcional conforme desejado Como é possível selecionar células ES que contêm um gene raro substituído O engenheiro genético pode incluir alelos de resistência a fármacos no construto de DNA arranjados de tal modo que as substituições possam ser distinguidas das inserções ectópicas Um exemplo está demonstrado na Figura 1029 C Estágio 2 as células ES que contêm uma cópia do gene de interesse interrompido ou seja o gene nocaute são injetadas em um embrião em estágio de blastocisto que em seguida é implantado em uma mãe substituta Figura 1030 A Algumas das células ES podem se tornar incorporadas no embrião hospedeiro e se isso acontecer o camundongo que se desenvolve será quimérico ou seja conterá células de duas linhagens diferentes de camundongos Quando o camundongo quimérico alcança a idade adulta é cruzado com um camundongo normal Se o camundongo quimérico houver captado as células ES com o nocaute gênico nas células da linhagem germinativa alguns indivíduos da progênie então resultante herdarão o gene nocaute em todas as suas células Camundongos da mesma ninhada identificados como heterozigotos em relação à versão do gene nocaute de interesse são cruzados em seguida para produzir camundongos que são homozigotos em relação ao alelo nocaute Se o gene for essencial os homozigotos serão letais e nenhum será obtido a partir desse cruzamento Figura 1030 B CONCEITOCHAVE Foram desenvolvidas técnicas transgênicas em linhagens germinativas para todas as espécies eucarióticas bemestudadas Essas técnicas dependem de uma compreensão sobre a biologia reprodutiva da espécie receptora FIGURA 1029 Produção de células que contêm uma mutação em um gene específico conhecida como uma mutação direcionada ou nocaute gênico A Cópias de um gene clonado são alteradas in vitro para produzir o vetor que atingirá o alvo O gene demonstrado aqui foi inativado por meio da inserção do gene de resistência à neomicina neoR em uma região codificadora da proteína éxon 2 do gene e foi inserido em um vetor O gene neoR posteriormente atuará como um marcador para indicar que o DNA vetor se fixou em um cromossomo O vetor também foi modificado por engenharia genética para carregar um segundo marcador em uma extremidade o gene tk do herpes Estes marcadores são padrão mas outros podem ser utilizados Quando um vetor com seus dois marcadores está completo é introduzido em células isoladas de um embrião de camundongo B Quando ocorre recombinação homóloga esquerda as regiões homólogas no vetor juntamente com qualquer DNA entre elas mas excluindo o marcador na extremidade assumem o lugar do gene original Este evento é importante em virtude de as sequências do vetor atuarem como um marcador útil para detectar a presença deste gene mutante Entretanto em muitas células o vetor total completo com o marcador extra na extremidade se insere ectopicamente parte intermediária ou não se integra direita C Para isolar células que carregam uma mutação direcionada todas as células são colocadas em um meio que contém fármacos selecionados aqui um análogo da neomicina G418 e ganciclovir G418 é letal para as células exceto se elas carrearem um gene neoR funcional e assim elimina as células nas quais não ocorreu a integração do DNA do vetor amarelo Enquanto isso o ganciclovir mata quaisquer células que abriguem o gene tk eliminando assim as células que contêm um vetor aleatoriamente integrado vermelho Por consequência virtualmente as únicas células que sobrevivem e proliferam são aquelas que têm a inserção direcionada verde FIGURA 1030 Um camundongo nocaute é produzido por meio da inserção de células ES que carreiam a mutação direcionada A As célulastronco embrionárias ES são isoladas a partir de uma linhagem de camundongos aguti marrom AA e alteradas para carregar uma mutação direcionada m em um cromossomo Em seguida as células ES são inseridas em embriões jovens um dos quais está demonstrado A cor da pelagem dos futuros neonatos é um guia para saber se as células ES sobreviveram no embrião Portanto as células ES são tipicamente colocadas em embriões que na ausência das células ES adquiririam uma pelagem totalmente preta Os referidos embriões são obtidos a partir de uma linhagem preta que não tem o alelo aguti dominante aa Os embriões que contêm as células ES crescem a termo em mães substitutas O matiz aguti entremeado com preto indica aqueles neonatos nos quais as células ES sobreviveram e proliferaram Os referidos camundongos são denominados quimeras tendo em vista que contêm células derivadas de duas linhagens diferentes de camundongos A pelagem preta sólida contrariamente indica que as células ES pereceram e estes camundongos são excluídos A representa aguti a preto m é a mutação direcionada e M é o seu alelo do tipo selvagem B Machos quiméricos são cruzados com fêmeas pretas não aguti A progênie é triada à procura de evidências da mutação direcionada verde na inserção no gene de interesse O exame direto dos genes em camundongos aguti revela quais daqueles animais no quadro herdaram a mutação direcionada Machos e fêmeas que carregam a mutação são cruzados entre si para produzir camundongos cujas células carregam a mutação escolhida em ambas as cópias do genealvo inserção e portanto apresentam ausência de um gene funcional Os referidos animais no quadro são definitivamente identificados por meio de análises diretas de seu DNA O nocaute neste caso resulta em um fenótipo com cauda enrolada RESUMO O DNA recombinante é construído em laboratório para possibilitar que pesquisadores amplifiquem e analisem segmentos de DNA DNA doador de qualquer genoma ou de cópias de DNA dos mRNA Três fontes de DNA doador são 1 o genoma inteiro digerido com uma enzima de restrição 2 os produtos da PCR de regiões específicas do DNA definidas pelas sequências de primer flanqueadores e 3 as cópias de cDNA de mRNA A reação da cadeia de polimerase é um método poderoso para a amplificação direta de uma sequência relativamente pequena de DNA a partir de uma mistura complexa de DNA sem a necessidade de uma célula hospedeira ou de muito material inicial A chave é possuir primers que são complementares às regiões flanqueadoras em cada um dos dois filamentos de DNA Essas regiões atuam como sítios para a polimerização Múltiplas rodadas de desnaturação pareamento de primers e polimerização amplificam exponencialmente a sequência de interesse Para inserir o DNA doador nos vetores o DNA doador e o DNA vetor são cortados pela mesma endonuclease de restrição em sequências específicas O DNA vetor e o doador são unidos por meio do pareamento das extremidades coesivas que resultam da digestão seguida por ligação para unir covalentemente as moléculas As moléculas de PCR e cDNA são inseridas em vetores primeiramente por meio da adição de sequências de reconhecimento de endonucleases de restrição à extremidade 5 dos primers da PCR ou por meio da ligação de adaptadores curtos que contêm sítios de restrição em suas extremidades antes da inserção no vetor Existe uma ampla variedade de vetores bacterianos A escolha do vetor depende amplamente do tamanho do fragmento de DNA a ser clonado Plasmídios são utilizados para clonar pequenos fragmentos de restrição moléculas de PCR ou moléculas de cDNA Fragmentos de tamanho intermediário tais como aqueles que resultam da digestão de DNA genômico podem ser clonados em versões modificadas do bacteriófago λ para insertos de 10 a 15 kb ou em híbridos de fago e plasmídio denominados fosmídios para insertos de 35 a 45 kb Finalmente cromossomos artificiais bacterianos BAC são utilizados de modo rotineiro para clonar fragmentos genômicos muito grandes aproximadamente 100 a 120 kb O construto de DNA vetordoador é amplificado dentro de células hospedeiras bacterianas como moléculas extracromossômicas que são replicadas quando o hospedeiro está replicando o seu genoma O resultado da amplificação de plasmídios fagos e BAC é de clones que contêm múltiplas cópias de cada constructo de DNA recombinante Contrariamente apenas um único fosmídio está presente em cada célula bacteriana Com frequência encontrar um clone específico com um gene de interesse requer a triagem de toda uma biblioteca genômica Uma biblioteca genômica é um conjunto de clones ligados no mesmo vetor que em conjunto representam todas as regiões do genoma do organismo em questão O número de clones que constitui uma biblioteca genômica depende 1 do tamanho do genoma em questão e 2 do tamanho do inserto tolerado pelo sistema de vetor de clonagem em particular De modo semelhante uma biblioteca de cDNA é uma representação do conjunto total de mRNA produzido por um determinado tecido ou estágio de desenvolvimento em um determinado organismo Sondas de DNA unifilamentar ou RNA marcadas são importantes para identificar sequências semelhantes ou idênticas em misturas complexas de moléculas seja em bibliotecas genômicas ou de cDNA ou no Southern blotting DNA e no Northern blotting RNA O princípio geral da técnica para a identificação de clones ou fragmentos em gel é criar uma imagem das colônias ou das placas em uma cultura em placa de Petri com ágar ou dos ácidos nucleicos que foram separados em um campo elétrico passado por uma matriz de gel Em seguida o DNA ou RNA é desnaturado e misturado com uma sonda desnaturada que foi marcada com um corante fluorescente ou um marcador radioativo Após a sonda não ligada ter sido eliminada a localização da sonda é detectada por meio da observação de sua fluorescência ou se radioativa por meio da exposição da amostra a um filme radiográfico As localizações da sonda correspondem às localizações do DNA ou RNA relevante na placa de Petri original ou na eletroforese em gel Os anticorpos marcados são sondas importantes para identificar proteínas específicas em misturas complexas produzidas por bibliotecas de expressão com insertos de cDNA ou no Western blotting Os vastos recursos genômicos estão tornando cada vez mais possível o isolamento de genes unicamente a partir do conhecimento sobre a sua posição em um mapa genético Dois procedimentos gerais são as estratégias genéticas diretas denominadas clonagem posicional e mapeamento de estrutura fina Com o sequenciamento do genoma humano e a disponibilidade de famílias com distúrbios hereditários estratégias de mapeamento de estrutura fina levaram ao isolamento de genes que quando mutados produzem a doença humana Os transgenes são moléculas de DNA modificadas por engenharia genética que são introduzidas e expressas em células eucarióticas Eles podem ser utilizados para modificar uma mutação nova ou para estudar as sequências reguladoras que constituem parte de um gene Os transgenes podem ser introduzidos como moléculas extracromossômicas ou podem ser integrados em um cromossomo seja em locais aleatórios ectópicos ou no lugar do gene homólogo dependendo do sistema Tipicamente os mecanismos utilizados para introduzir um transgene dependem da compreensão e da exploração da biologia reprodutiva do organismo TERMOSCHAVE amplificação anticorpo autorradiograma biblioteca de cDNA biblioteca genômica caminhada cromossômica chromosome walk clonagem de DNA clonagem posicional complementação funcional resgate de mutante cromossomo artificial bacteriano BAC DNA complementar cDNA DNA doador DNA ligase DNA recombinante ectopicamente efeito de posição eletroforese em gel engenharia genética enzima de restrição fosmídio fragmento de restrição genômica hibridização mapeamento fino nocaute knockout gênico Northern blotting organismo geneticamente modificado OGM organismo transgênico palíndromo de DNA plasmídio Ti reação da cadeia de polimerase PCR resgate de mutante complementação funcional RNA blotting sequenciamento de Sanger didesóxi sequenciamento didesóxi de Sanger sonda Southern blotting substituição gênica tecnologia do DNA transgene vetores PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 No Capítulo 9 estudamos a estrutura das moléculas de tRNA Suponha que você deseja clonar gene de fungo que codifica um determinado tRNA Você possui uma amostra de tRNA purificado e um plasmídio de E coli que contém um único sítio de corte de EcoRI em um gene tetR resistência à tetraciclina bem como um gene de resistência à ampicilina ampR Como você pode clonar o gene de interesse Solução Você pode utilizar o próprio tRNA ou uma cópia do cDNA clonado dele para investigar o DNA que contém o gene Um método é digerir o DNA genômico com EcoRI e em seguida misturálo com o plasmídio que você também deve cortar com a EcoRI Após a transformação de um receptor ampS tetS selecione colônias de AmpR que indicam a transformação de sucesso Dessas colônias de AmpR selecione as colônias que são TetS Essas colônias TetS conterão vetores com insertos no gene tetR e é necessário um grande número deles para produzir a biblioteca Teste a biblioteca por meio da utilização do tRNA como sonda Aqueles clones que hibridizam com a sonda conterão o gene de interesse Alternativamente você pode submeter o DNA genômico digerido por EcoRI à eletroforese em gel e em seguida identificar a banda correta hibridizando a sonda com o tRNA Essa região do gel pode ser cortada e utilizada como uma fonte de DNA enriquecido para clonar no plasmídio cortado com EcoRI Em seguida você hibridiza esses clones com o tRNA para confirmar que esses clones contêm o gene de interesse Problema resolvido 2 Você isolou um gene de levedura que atua na síntese do aminoácido leucina e você formula a hipótese de que ele apresenta a mesma função de um gene correlato de E coli Como você utilizaria a complementação funcionalresgate de mutante para testar a sua teoria Solução Primeiramente assumiremos que o gene de interesse da levedura está em um fragmento digerido por EcoRI Você utilizará técnicas de DNA recombinante para inserir esse fragmento no sítio poliligador de um plasmídio bacteriano que foi cortado com EcoRI e tratado com ligase para formar novamente o plasmídio circular Esse plasmídio também deve conter um marcador selecionável para resistência a antibióticos tal como ampR ver Figura 109 Em seguida você precisa transformar esse plasmídio recombinante em mutantes de E coli leu Entretanto tendo em vista que existem quatro genes necessários para a biossíntese da leucina e você não sabe qual pode ser o seu gene de levedura você precisa testar para complementação em quatro linhagens de E coli mutantes cada uma com uma mutação em um gene diferente dos quatro genes denominados leuA leuB leuC e leuD Cultive as quatro linhagens de E coli em separado e realize um experimento de transformação no qual o mesmo plasmídio recombinante é introduzido em cada uma das quatro linhagens Em seguida plaqueie os transformantes em placas com ágar que contenham o antibiótico ampicilina assim apenas as células que captaram o plasmídio conseguem crescer mas que não contenham leucina Se você observar colônias crescendo em uma das quatro placas que contêm células de E coli transformadas não apenas você pode concluir que isolou um gene de levedura envolvido na biossíntese da leucina como também pode determinar qual é o gene leu leuA leuB leuC ou leuD Ou 1 2 3 4 5 6 7 seja se o gene da levedura for leuA ele somente complementará o mutante de E coli leuA PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS A Figura 101 demonstra que fragmentos de DNA específicos podem ser sintetizados in vitro antes da clonagem Quais são dois modos de sintetizar insertos de DNA para DNA recombinante in vitro Na Figura 104 por que o cDNA é produzido apenas a partir do mRNA e não também a partir dos tRNA e RNA ribossômicos Redesenhe a Figura 106 com o objetivo de adicionar uma extremidade EcoRI e uma extremidade XhoI A seguir apresentamos a sequência de reconhecimento de XhoI Sequência de reconhecimento Após o corte CTCGAG GAGCTC C TCGAG GAGCT C Redesenhe a Figura 107 de modo que o cDNA possa ser inserido em um sítio XhoI de um vetor em vez de em um sítio EcoRI conforme demonstrado Na Figura 1010 determine aproximadamente quantos clones BAC são necessários para proporcionar 1 a cobertura a do genoma de levedura 12 Mpb b do genoma de E coli 41 Mpb c do genoma da moscadasfrutas 130 Mpb Na Figura 1014 por que o DNA migra para o anodo polo Na Figura 1017 A por que os fragmentos de DNA são de diferentes comprimentos e todos terminam em um resíduo A sintetizado 8 9 10 11 12 13 14 15 Conforme você verá no Capítulo 15 a maior parte dos genomas de eucariotos superiores plantas e animais é preenchida por sequências de DNA que estão presentes em centenas até mesmo milhares de cópias por todos os cromossomos No procedimento de caminhada cromossômica demonstrado na Figura 1019 como o experimentador saberia se o fragmento que está utilizando para caminhar até o próximo BAC ou fago é repetitivo O DNA repetitivo pode ser utilizado em uma caminhada cromossômica Redesenhe a Figura 1023 para incluir as posições dos crossovers únicos e duplos Na Figura 1025 por que apenas as células de plantas que apresentam insertos de TDNA em seus cromossomos crescem em placas com ágar Todas as células de uma planta transgênica cultivada a partir de um aglomerado de células contêm o TDNA Justifique a sua resposta Na Figura 1027 qual é a diferença entre DNA extracromossômico e os arranjos integrados de DNA Os últimos são ectópicos Qual é a distinção da região sincicial que a torna um bom local para injetar DNA PROBLEMAS BÁSICOS A partir deste capítulo faça uma lista de todos os exemplos a de hibridização de DNA unifilamentares e b de proteínas que se ligam ao DNA e em seguida atuam sobre ele Compare e contraste a utilização da palavra recombinante conforme utilizada nas frases a DNA recombinante e b frequência de recombinantes Por que a ligase é necessária para produzir DNA recombinante Qual seria a consequência imediata no processo de clonagem se uma pessoa se esquecesse de adicionála No processo de PCR se presumirmos que cada ciclo demora 5 minutos quantas vezes a amplificação seria realizada em 1 hora 16 17 18 19 20 21 A posição do gene para a proteína actina no fungo haploide Neurospora é conhecida a partir da sequência genômica completa Se você tivesse um mutante de crescimento lento que você suspeitasse ser um mutante da actina e desejasse verificar se era um mutante da actina você a clonaria o mutante por meio da utilização de sítios de restrição convenientes que flanqueiam o gene da actina e em seguida realizaria o seu sequenciamento ou b amplificaria o gene mutante por meio da utilização de PCR e em seguida realizaria o seu sequenciamento Você obtém a sequência de DNA de um mutante de um gene de 2 kb no qual você está interessado e ela demonstra diferenças de bases em três posições todas em diferentes códons Uma é uma alteração silenciosa mas as outras duas são alterações de sentido trocado elas codificam novos aminoácidos Como você demonstraria que essas alterações são mutações reais e não erros de sequenciamento Presuma que o sequenciamento é aproximadamente 999 preciso Em uma transformação de TDNA de uma planta com um transgene de um fungo não observado em plantas a planta presumidamente transgênica não expressa o fenótipo do transgene esperado Como você demonstraria que o transgene de fato está presente Como você demonstraria que o transgene foi expresso Como você produziria um camundongo homozigoto para um transgene de hormônio de crescimento de ratos Por que o cDNA e não o DNA genômico foi utilizado na clonagem comercial do gene da insulina humana Após o DNA de Drosophila ter sido tratado com uma enzima de restrição os fragmentos são inseridos em plasmídios e selecionados como clones em E coli Com a utilização dessa técnica de shotgun cada sequência do DNA de Drosophila em uma biblioteca pode ser recuperada a Como você identificaria um clone que contém DNA que codifica a proteína actina cuja sequência de aminoácidos é conhecida b Como você identificaria um clone que codifica um tRNA específico 22 23 24 25 26 27 28 Em qualquer célula eucariótica transformada digamos de Saccharomyces cerevisiae como você poderia dizer se o DNA transformador carregado em um vetor bacteriano circular a substituiu o gene residente do receptor por meio de crossing over duplo ou de crossing over único b foi inserido ectopicamente Em um gel de eletroforese ao longo do qual é aplicado um campo elétrico pulsado alternado poderoso o DNA do fungo haploide Neurospora crassa n 7 se movimenta lentamente mas ao final forma sete bandas que representam frações de DNA que são de diferentes tamanhos e que portanto movimentaramse em diferentes velocidades Essas bandas presumidamente são os sete cromossomos Como você demonstraria qual banda corresponde a qual cromossomo A proteína codificada pelo gene da fibrose cística apresenta 1480 aminoácidos de comprimento ainda que o gene abranja 250 kb Como essa diferença é possível Em uma levedura você sequenciou um segmento de DNA do tipo selvagem e ele claramente contém um gene mas você não sabe que gene é Portanto para investigar adicionalmente você gostaria de encontrar seu fenótipo mutante Como você utilizaria o gene do tipo selvagem clonado para tanto Demonstre claramente as suas etapas experimentais Por que é necessário utilizar uma DNA polimerase especial Taq polimerase na PCR Em relação a cada um dos objetivos experimentais a seguir é preferível a PCR ou a clonagem do gene e por quê a Isolar o mesmo gene de 20 indivíduos b Isolar 100 genes do mesmo indivíduo c Isolar um gene de camundongo quando você possui um fragmento de gene de rato No Northern blotting a eletroforese é utilizada para analisar quais 29 30 31 32 moléculas biológicas Qual tipo de sonda é utilizado para identificar as moléculasalvo Uma característica que virtualmente todos os vetores plasmidiais apresentam em comum é o poliligador também denominado sítio de clonagem múltipla Explique o que é um poliligador e por que essa é uma característica tão importante Uma segunda característica que virtualmente todos os vetores plasmidiais apresentam em comum é o marcador selecionável Explique o que é isso e por que ele é uma característica tão importante PROBLEMAS DESAFIADORES A prototrofia com frequência é o fenótipo selecionado para detectar transformantes Células prototróficas são utilizadas para a extração de DNA doador em seguida esse DNA é clonado e os clones são adicionados a uma cultura receptora auxotrófica Transformantes bemsucedidos são identificados por meio do plaqueamento da cultura receptora em meio mínimo e da observação das colônias Qual desenho experimental você utilizaria para assegurar que uma colônia que você espera ser um transformante não seja de fato a uma célula prototrófica que entrou na cultura receptora como um contaminante b um revertente mutação de retorno à prototrofia por meio de uma segunda mutação no gene originalmente mutado da mutação auxotrófica Um fragmento de DNA clonado foi sequenciado por meio da utilização do método de término de cadeia didesóxi Uma parte do autorradiograma do gel de sequenciamento está representada aqui 33 34 a Deduza a sequência de nucleotídios da cadeia de nucleotídios do DNA sintetizada a partir do primer Rotule as extremidades 5 e 3 b Deduza a sequência de nucleotídios da cadeia de nucleotídios do DNA utilizada como o filamentomolde Rotule as extremidades 5 e 3 c Escreva a sequência de nucleotídios da duplahélice de DNA rotule as extremidades 5 e 3 O clone de cDNA em relação ao gene humano que codifica a tirosinase foi marcado radioativamente e utilizado em uma análise de Southern de DNA genômico digerido por EcoRI de camundongos do tipo selvagem Observouse que três fragmentos de camundongo eram radioativos estavam ligados à sonda Quando camundongos albinos foram utilizados nessa análise de Southern nenhum fragmento genômico ligouse à sonda Explique esses resultados em relação à natureza dos alelos de camundongo do tipo selvagem e mutante Foram obtidas plantas de tabaco transgênicas nas quais o vetor plasmídio Ti foi desenhado para inserir o gene de interesse mais um gene adjacente de resistência à canamicina A herança da inserção cromossômica foi seguida 35 36 37 pelo teste da progênie em relação à resistência à canamicina Duas plantas tipificaram os resultados obtidos em geral Quando a planta 1 foi submetida ao retrocruzamento com tabaco do tipo selvagem 50 da progênie foi resistente à canamicina e 50 foi sensível Quando a planta 2 foi submetida ao retrocruzamento com o tipo selvagem 75 da progênie foi resistente à canamicina e 25 foi sensível Qual deve ter sido a diferença entre as duas plantas transgênicas O que você preveria sobre a situação a respeito do gene de interesse Uma mutação para fibrose cística em um determinado heredograma ocorre em virtude de uma alteração em um único par de nucleotídios Essa alteração destrói um sítio de restrição de EcoRI normalmente observado nessa posição Como você utilizaria essas informações no aconselhamento de membros dessa família a respeito da sua probabilidade de serem portadores Declare os experimentos precisos necessários Presuma que você encontra uma mulher nessa família que é portadora e ocorre que ela é casada com um homem não relacionado que também é um heterozigoto em relação à fibrose cística mas no caso dele é uma mutação diferente no mesmo gene Como você aconselharia esse casal a respeito dos riscos de um filho apresentar a fibrose cística A glicuronidase bacteriana converte uma substância incolor denominada X Gluc em um pigmento azul índigo brilhante O gene para a glicuronidase também atua em plantas se for fornecida uma região promotora à planta Como você utilizaria esse gene como um gene repórter para encontrar os tecidos nos quais um gene de planta que você acabou de clonar normalmente é ativo Presuma que o XGluc é facilmente captado pelos tecidos da planta A planta Arabidopsis thaliana foi transformada por meio da utilização do plasmídio Ti dentro do qual havia sido inserido um gene de resistência à canamicina na região TDNA Duas colônias resistentes à canamicina A e B foram selecionadas e as plantas foram regeneradas a partir delas Foi possibilitada a autopolinização das plantas e os resultados foram como segue Planta A autopolinizada da progênie resistente à canamicina da progênie sensível à canamicina Planta B autopolinizada da progênie resistente à canamicina da progênie resistente à canamicina a Desenhe os cromossomos da planta relevantes em ambas as plantas b Explique as duas proporções diferentes 111 112 O controle da expressão gênica é regulado primariamente por proteínas de ligação ao DNA que reconhecem sequências de controle específicas dos genes Aqui está modelada a ligação da proteína repressora Lac ao DNA do operador lac Kenneth EwardScience Source TÓPICOS Regulação gênica Descoberta do sistema lac Controle negativo 113 114 115 116 117 E Repressão catabólica do óperon lac Controle positivo Duplo controle positivo e negativo Óperon da arabinose Vias metabólicas e níveis adicionais de regulação Atenuação Ciclos de vida de bacteriófagos Mais reguladores óperons complexos Fatores sigma alternativos regulam grandes conjuntos de genes RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Contrastar regulações positiva e negativa da expressão gênica e explicar como ambos os mecanismos controlam a atividade do operon lac Identificar os componentes de ação trans e de ação cis dos óperons e prever o efeito de mutações nesses componentes sobre a expressão gênica Comparar como moléculas simples acionam alterações na expressão gênica de diferentes óperons em bactérias Explicar os papéis das proteínas de ligação ao DNA sequênciaespecífica e as sequências reguladoras do DNA na coordenação da expressão de conjuntos de genes em bactérias e bacteriófagos m dezembro de 1965 o rei da Suécia concedeu o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina a François Jacob Jacques Monod e André Lwoff do Instituto Pasteur por suas descobertas sobre como a expressão gênica é regulada Figura 111 O prêmio foi o fruto de uma excepcional colaboração entre três cientistas esplêndidos Foi também um triunfo sobre grandes obstáculos Eram poucas as chances de que cada um desses três homens vivesse para ver aquele dia ainda mais para receber as referidas honrarias Vinte e cinco anos antes Monod era um doutorando na Sorbonne em Paris e trabalhava com um fenômeno em bactérias denominado adaptação enzimática algo tão obscuro para alguns que o diretor do laboratório de zoologia onde ele trabalhava declarou O que Jacques Monod está realizando é de absolutamente nenhum interesse para a Sorbonne Jacob era um estudante de medicina de 19 anos de idade que pretendia tornarse cirurgião Lwoff naquela época era um membro bemestabelecido do Instituto Pasteur em Paris chefe do departamento de fisiologia microbiana Então veio a Segunda Guerra Mundial Na medida em que a França foi invadida e rapidamente derrotada Jacob correu até a costa para se juntar às forças francesas livres que se reuniam na Inglaterra Ele serviu como médico no norte da África e na Normandia até que foi gravemente ferido Monod se juntou à Resistência Francesa enquanto continuava seu trabalho Após uma incursão da Gestapo em seu laboratório na Sorbonne Monod decidiu que trabalhar ali era muito perigoso seu predecessor na Resistência foi preso e executado e André Lwoff ofereceu a ele um espaço no Pasteur Monod por sua vez conectou Lwoff com a Resistência FIGURA 111 François Jacob Jacques Monod e André Lwoff receberam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 1965 por seu trabalho pioneiro sobre como a expressão gênica é regulada Instituto Pasteur Após a libertação de Paris Monod serviu no Exército francês e teve acesso a um artigo de Oswald Avery e colegas que demonstrava que o DNA é o material hereditário em bactérias ver Capítulo 7 Seu interesse por genética foi reacendido e ele reencontrou Lwoff depois da guerra Enquanto isso as lesões de Jacob eram muito graves para que ele seguisse uma carreira em cirurgia Inspirado pelo enorme impacto dos antibióticos introduzidos tardiamente durante a guerra Jacob finalmente decidiu seguir a pesquisa científica Jacob se aproximou de Lwoff diversas vezes pretendendo uma posição em seu laboratório mas foi recusado Ele fez uma última tentativa e encontrou Lwoff em um humor jovial O cientista sênior disse a Jacob Você sabe acabamos de descobrir a indução do prófago Você estaria interessado em trabalhar com o fago Jacob não tinha ideia sobre o que Lwoff estava falando Ele gaguejou Isso é exatamente o que eu gostaria de fazer O elenco estava estabelecido O desdobramento na década subsequente foi uma das colaborações mais criativas e produtivas na história da genética cujas descobertas ainda reverberam por toda a biologia atualmente Uma das percepções mais importantes ocorreu não no laboratório mas em um cinema Lutando para preparar uma palestra Jacob optou por levar sua esposa Lise a uma matinê de domingo Aborrecido e sonhando acordado Jacob elaborou uma conexão entre o trabalho que ele estava realizando sobre a indução do prófago e aquele de Monod sobre a indução da síntese enzimática Jacob foi envolvido por uma súbita animação misturada a um vago prazer Ambos os experimentos sobre o fago e aquele realizado com Pardee e Monod no sistema da lactose são os mesmos Mesma situação Mesmo resultado Em ambos os casos o gene regula a formação de um repressor que bloqueia a expressão de outros genes e assim evita a síntese de galactosidase ou a multiplicação do vírus Onde o repressor pode atuar para interromper tudo de uma vez A única resposta simples é no próprio DNA1 E assim nascia o conceito de um repressor que atua no DNA para reprimir a indução de genes Seriam necessários muitos anos antes que os repressores hipotéticos fossem isolados e caracterizados bioquimicamente Os conceitos trabalhados por Jacob e Monod e explicados neste capítulo RNA mensageiro 111 promotores operadores genes reguladores óperons e proteínas alostéricas foram deduzidos inteiramente a partir de evidências genéticas e esses conceitos modelaram o futuro campo da genética molecular Walter Gilbert que isolou o primeiro repressor e que posteriormente recebeu um Prêmio Nobel em Química por coinventar um método de sequenciamento do DNA explicou o efeito do trabalho de Jacob e Monod naquela época A maior parte das descobertas cruciais na ciência são de uma tal natureza tão simples que é muito difícil até mesmo de conceber sem de fato realizar a experiência envolvida na descoberta A sugestão de Jacob e Monod tornou as coisas que eram completamente obscuras muito simples2 Os conceitos que Jacob e Monod iluminaram muito além das enzimas e dos vírus bacterianos Eles compreenderam e foram capazes de articular com eloquência excepcional como as suas descobertas a respeito da regulação gênica estavam relacionadas aos mistérios gerais da diferenciação celular e do desenvolvimento embrionário em animais Os dois homens uma vez gracejaram qualquer coisa que se observe ser verdadeira para a E coli também deve ser verdadeira para os elefantes3 Nos próximos três capítulos veremos até que grau essa afirmação é verdadeira Iniciaremos neste capítulo com exemplos bacterianos que ilustram temaschave e mecanismoschave na regulação da expressão gênica Enfocaremos amplamente proteínas reguladoras únicas e os interruptores genéticos sobre as quais elas atuam Em seguida no Capítulo 12 abordaremos a regulação gênica em células eucarióticas que envolve um maquinário bioquímico e genético mais complexo E finalmente no Capítulo 13 examinaremos o papel da regulação gênica no desenvolvimento de animais multicelulares Ali veremos como conjuntos de proteínas reguladoras atuam sobre arranjos de interruptores genéticos para controlar a expressão gênica no tempo e no espaço e coreografar a construção de corpos e partes corporais Regulação gênica Apesar da sua simplicidade de forma as bactérias apresentam em comum com os organismos maiores e mais complexos a necessidade de regular a expressão de seus genes Um dos principais motivos é que elas são oportunistas nutricionais Considere como as bactérias obtêm muitos compostos importantes tais como açúcares aminoácidos e nucleotídios necessários para o metabolismo As bactérias nadam em um mar de possíveis nutrientes Elas podem adquirir os compostos de que necessitam a partir do ambiente ou sintetizálos por meio de vias enzimáticas Mas a síntese desses compostos também requer gasto energético e recursos celulares para produzir as enzimas necessárias para essas vias Portanto quando lhes for proporcionada uma opção as bactérias captarão compostos do ambiente A seleção natural favorece a eficiência contra o gasto de recursos e de energia Para serem econômicas as bactérias sintetizarão as enzimas necessárias para produzir compostos apenas quando não houver outra opção em outras palavras quando os compostos estiverem indisponíveis em seu ambiente local As bactérias desenvolveram sistemas reguladores que acoplam a expressão dos produtos gênicos a sistemas sensores que detectam o composto relevante no ambiente local de uma bactéria A regulação das enzimas que participam no metabolismo do açúcar fornece um exemplo As moléculas de açúcar podem ser fragmentadas para fornecer energia ou podem ser utilizadas como elementos estruturais para uma grande variedade de compostos orgânicos Entretanto existem muitos tipos diferentes de açúcares que as bactérias podem utilizar incluindo lactose glicose galactose e xilose É necessária uma proteína de importação diferente para que seja possibilitada a entrada de cada um desses açúcares na célula Além disso é necessário um conjunto diferente de enzimas para processar cada um dos açúcares Se uma célula precisasse sintetizar simultaneamente todas as enzimas de que ela pudesse vir a necessitar a célula gastaria muito mais energia e materiais para produzir as enzimas do que obteria a partir da fragmentação das esperadas fontes de carbono A célula planejou mecanismos para desligar reprimir a transcrição de todos os genes que codificam enzimas não necessárias em uma determinada ocasião e para ligar ativar aqueles genes que codificam enzimas necessárias Por exemplo se apenas a lactose estiver no ambiente a célula desligará a transcrição dos genes 1 2 que codificam as enzimas necessárias para a importação e o metabolismo da glicose galactose xilose e de outros açúcares Contrariamente a E coli iniciará a transcrição dos genes que codificam as enzimas necessárias para a importação e o metabolismo da lactose Resumidamente as células necessitam de mecanismos que atendam dois critérios Eles devem ser capazes de reconhecer as condições ambientais nas quais devem ativar ou reprimir a transcrição dos genes relevantes Eles devem ser capazes de alternar entre ligar e desligar como um interruptor a transcrição de cada gene específico ou de um grupo de genes Preveremos o atual modelo em relação à regulação da transcrição procariótica e em seguida utilizaremos um exemplo bemcompreendido a regulação de genes no metabolismo do açúcar lactose para o seu exame detalhado Em particular enfocaremos como esse sistema regulador foi dissecado com a utilização das ferramentas da genética clássica e da biologia molecular Base da regulação da transcrição procariótica Interruptores genéticos A regulação da transcrição depende principalmente de dois tipos de interações DNAproteína Ambas ocorrem próximo do sítio no qual a transcrição gênica tem início Uma dessas interações DNAproteína determina onde a transcrição tem início O DNA que participa dessa interação é um segmento de DNA denominado promotor Capítulo 8 Seção 82 e a proteína que se liga a esse sítio é a RNA polimerase Quando a RNA polimerase se liga ao DNA promotor a transcrição pode ter início à distância de algumas poucas bases do sítio promotor Cada gene deve ter um promotor ou ele não poderá ser transcrito O outro tipo de interação DNAproteína determina se ocorre a transcrição direcionada pelo promotor Segmentos de DNA próximos ao promotor atuam como sítios de ligação para as proteínas reguladoras sequênciaespecíficas denominadas ativadores e repressores Em bactérias a maior parte dos sítios de ligação para os repressores é denominada operador Em relação a alguns genes uma proteína ativadora deve se ligar ao seu sítioalvo no DNA como um pré requisito necessário para que a transcrição seja iniciada Os referidos casos por vezes são denominados regulação positiva tendo em vista que é necessária a presença da proteína ligada para a transcrição Figura 112 Em relação a outros genes deve ser evitada a ligação de uma proteína repressora ao seu sítioalvo como um prérequisito necessário para que a transcrição seja iniciada Os referidos casos por vezes são denominados regulação negativa tendo em vista que a ausência do repressor ligado possibilita que a transcrição seja iniciada Como os ativadores e os repressores regulam a transcrição Com frequência uma proteína ativadora ligada ao DNA auxilia fisicamente a ancorar a RNA polimerase ao seu promotor próximo de modo que a polimerase possa iniciar a transcrição Uma proteína repressora ligada ao DNA atua tipicamente ao interferir fisicamente com a ligação da RNA polimerase ao seu promotor bloqueando o início da transcrição ou ao impedir a movimentação da RNA polimerase ao longo da cadeia de DNA bloqueando a transcrição Em conjunto essas proteínas reguladoras e seus sítios de ligação constituem interruptores genéticos que controlam as alterações eficientes na expressão gênica que ocorrem em resposta às condições ambientais CONCEITOCHAVE Os interruptores genéticos controlam a transcrição gênica A função ligadesliga dos interruptores depende das interações de diversas proteínas com seus sítios de ligação no DNA A RNA polimerase interage com o promotor para iniciar a transcrição As proteínas ativadoras ou repressoras se ligam a sítios na vizinhança do promotor para controlar sua acessibilidade à RNA polimerase Ambas as proteínas ativadoras e repressoras devem ser capazes de reconhecer quando as condições ambientais são apropriadas para as suas ações e agir de acordo Portanto para que as proteínas ativadoras ou repressoras realizem o seu trabalho cada uma deve ser capaz de existir em dois estados um que possa se ligar a seu DNAalvo e outro que não possa O estado de ligação deve ser apropriado para o conjunto de condições fisiológicas presentes na célula e em seu ambiente Em relação a muitas proteínas reguladoras a ligação do DNA é efetuada por meio da interação de dois sítios diferentes na estrutura tridimensional da proteína Um sítio é o domínio de ligação ao DNA O outro sítio o sítio alostérico atua como um sensor que configura o domínio de ligação ao DNA em um de dois modos funcional ou não funcional O sítio alostérico interage com pequenas moléculas denominadas efetores alostéricos No metabolismo da lactose na realidade é um isômero do açúcar lactose denominado alolactose que é um efetor alostérico o açúcar se liga a uma proteína reguladora que inibe a expressão dos genes necessários para o metabolismo da lactose Em geral um efetor alostérico se liga ao sítio alostérico da proteína reguladora de tal modo a alterar a sua atividade Nesse caso a alolactose altera a forma e a estrutura do domínio de ligação ao DNA de uma proteína reguladora Algumas proteínas ativadoras ou repressoras devem se ligar aos seus efetores alostéricos antes que possam se ligar ao DNA Outras conseguem se ligar ao DNA somente na ausência de seus efetores alostéricos Duas dessas situações estão demonstradas na Figura 113 CONCEITOCHAVE Os efetores alostéricos controlam a capacidade das proteínas ativadoras ou repressoras de se ligarem aos seus sítios do DNA alvo Primeira observação do circuito regulador lac O trabalho pioneiro de François Jacob e Jacques Monod na década de 1950 demonstrou como o metabolismo da lactose é regulado geneticamente Examinaremos o sistema sob duas condições a presença e a ausência de lactose A Figura 114 é uma visão simplificada dos componentes desse sistema O elenco de personagens para a regulação do óperon lac inclui genes codificadores de proteínas e sítios no DNA que são alvos para proteínas de ligação ao DNA FIGURA 112 A ligação de proteínas reguladoras pode ativar ou bloquear a transcrição FIGURA 113 Efetores alostéricos controlam a capacidade de ligação das proteínas ativadoras ou repressoras a seus sítiosalvo no DNA Genes estruturais lac O metabolismo da lactose necessita de duas enzimas 1 uma permease para transportar a lactose para dentro da célula e 2 β galactosidase para modificar a lactose em alolactose e clivar a molécula de lactose para produzir glicose e galactose Figura 115 As estruturas das proteínas βgalactosidase e permease são codificadas por duas sequências adjacentes Z e Y respectivamente Uma terceira sequência contígua codifica uma enzima adicional denominada transacetilase que não é necessária para o metabolismo da lactose Denominaremos Z Y e A genes estruturais em outras palavras segmentos que codificam proteínas enquanto reservaremos o julgamento sobre essa categorização até posteriormente Enfocaremos principalmente os genes Z e Y Todos os três genes são transcritos em uma única molécula de RNA mensageiro A regulação da produção desse mRNA coordena a síntese de todas as três enzimas Ou seja todas as três enzimas são sintetizadas ou nenhuma o é Dizse que os genes cuja transcrição é controlada por um meio comum são genes controlados coordenadamente FIGURA 114 Um modelo simplificado do óperon lac A expressão coordenada dos genes Z Y e A está sob o controle negativo do produto do gene I o repressor Quando o indutor se liga ao repressor o óperon é totalmente expresso FIGURA 115 O metabolismo da lactose A A enzima βgalactosidase catalisa uma reação na qual é adicionada água à ligação de βgalactosidase para fragmentar a lactose em moléculas separadas de glicose e galactose B A enzima também modifica uma proporção menor da lactose em alolactose que atua como um indutor do óperon lac CONCEITOCHAVE Se os genes codificadores de proteínas constituem uma unidade de transcrição única a expressão de todos esses genes será regulada coordenadamente Componentes reguladores do sistema lac Os componentes reguladoreschave do sistema metabólico da lactose incluem um gene que codifica uma proteína reguladora de transcrição e dois sítios de ligação no DNA um sítio para a proteína reguladora e outro sítio para a RNA polimerase 1 2 3 O gene para o repressor Lac Um quarto gene além dos genes estruturais Z Y e A o gene I codifica a proteína repressora Lac Ele é assim denominado em virtude de conseguir bloquear a expressão dos genes Z Y e A Ocorre que o gene I está mapeado próximo dos genes Z Y e A mas essa proximidade não é importante para a sua função tendo em vista que ele codifica uma proteína difundível O sítio promotor lac O promotor P é o sítio no DNA ao qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição dos genes estruturais lac Z Y e A O sítio operador lac O operador O é o sítio no DNA ao qual o repressor Lac se liga Ele está localizado entre o promotor e o gene Z próximo do ponto no qual a transcrição do mRNA multigênico tem início Indução do sistema lac Os segmentos P O Z Y e A demonstrados na Figura 116 em conjunto constituem um óperon definido como um segmento de DNA que codifica um mRNA multigênico bem como um promotor comum adjacente e uma região reguladora O gene lacI que codifica o repressor Lac não é considerado parte do próprio óperon lac mas a interação do repressor Lac com o sítio operador lac é crucial para a adequada regulação do óperon lac O repressor Lac apresenta um sítio de ligação ao DNA que consegue reconhecer a sequência do DNA operador e um sítio alostérico que liga a alolactose ou análogos da lactose que são úteis experimentalmente O repressor se ligará firmemente apenas ao sítio O no DNA próximo dos genes que está controlando e não a outras sequências distribuídas por todo o cromossomo Por meio da ligação ao operador o repressor evita a transcrição pela RNA polimerase que se ligou ao sítio promotor adjacente o óperon lac é desligado FIGURA 116 Regulação do óperon lac O gene I produz continuamente o repressor A Na ausência de lactose o repressor se liga à região O operador e bloqueia a transcrição B A ligação da lactose altera a forma do repressor de modo que o repressor deixa de se ligar ao O e sai do DNA A RNA polimerase é então capaz de transcrever os genes estruturais Z Y e A e assim as três enzimas são produzidas Quando a alolactose ou seus análogos se ligam à proteína repressora a proteína é submetida a uma transição alostérica uma alteração na forma Essa alteração discreta na forma por sua vez altera o sítio de ligação ao DNA de modo que o repressor deixa de apresentar alta afinidade pelo operador Portanto em resposta à ligação da alolactose o repressor sai do DNA possibilitando que 112 a RNA polimerase prossiga transcreva o gene o óperon lac está ligado A resposta do repressor à alolactose atende uma exigência em relação ao referido sistema de controle que a presença da lactose estimula a síntese dos genes necessários para o seu processamento O alívio da repressão em sistemas tal como o lac é denominado indução A alolactose e seus análogos que inativam alostericamente o repressor levando à expressão dos genes lac são denominados indutores Resumiremos como o interruptor lac atua Na ausência de um indutor alolactose ou um análogo o repressor Lac se liga ao sítio operador lac e evita a transcrição do óperon lac por meio do bloqueio da movimentação da RNA polimerase Nesse sentido o repressor Lac atua como um bloqueio no DNA Consequentemente todos os genes estruturais do óperon lac os genes Z Y e A são reprimidos e existem muito poucas moléculas de βgalactosidase permease ou transacetilase na célula Contrariamente quando um indutor está presente ele se liga ao sítio alostérico de cada subunidade do repressor Lac inativando assim o sítio que se liga ao operador O repressor Lac sai do DNA possibilitando que tenha início a transcrição dos genes estruturais do óperon lac As enzimas βgalactosidase permease e transcetilase agora aparecem na célula de modo coordenado Assim quando a lactose está presente no ambiente de uma célula bacteriana a célula produz as enzimas necessárias para a sua metabolização Mas quando nenhuma lactose está presente os recursos não são gastos Descoberta do sistema lac Controle negativo Para estudar a regulação gênica idealmente necessitamos de três ingredientes um ensaio bioquímico que nos possibilite medir a quantidade de mRNA ou de proteína expressa ou de ambos condições confiáveis nas quais os níveis de expressão sejam diferentes em um genótipo do tipo selvagem e mutações genéticas que perturbem os níveis de expressão Em outras palavras precisamos de um modo para descrever a regulação do gene do tipo selvagem e necessitamos de mutações que possam romper o processo regulador do tipo selvagem Com esses elementos em mãos podemos analisar a expressão em genótipos mutantes tratando as mutações de modo único e combinado para desvendar qualquer tipo de evento de regulação gênica A aplicação clássica dessa abordagem foi utilizada por Jacob e Monod que realizaram os estudos definitivos da regulação gênica bacteriana Jacob e Monod utilizaram o sistema do metabolismo da lactose de E coli ver Figura 114 para dissecar geneticamente o processo de indução enzimática ou seja o aparecimento de uma enzima específica apenas na presença de seus substratos Esse fenômeno havia sido observado em bactérias por muitos anos mas como uma célula possivelmente poderia saber precisamente quais enzimas devem ser sintetizadas Como um substrato em particular poderia induzir o aparecimento de uma enzima específica No sistema lac a presença de lactose faz com que as células produzam mais de 1000 vezes a quantidade da enzima βgalactosidase que produzem quando cultivadas sem lactose Que papel a lactose desempenha no fenômeno da indução Uma ideia era que a lactose estava simplesmente ativando um precursor de β galactosidase que havia se acumulado na célula Entretanto quando Monod e colaboradores acompanharam o destino de aminoácidos marcados radioativamente adicionados ao cultivo das células antes ou após a adição de um indutor eles observaram que a indução resultava na síntese de novas moléculas de enzimas conforme indicado pela presença de aminoácidos radioativos nas enzimas Essas novas moléculas poderiam ser detectadas tão precocemente quanto três minutos após a adição de um indutor Além disso a retirada da lactose ocasionou uma interrupção abrupta na síntese da nova enzima Portanto tornouse claro que a célula apresenta um mecanismo rápido e eficaz para ligar e desligar a expressão gênica em resposta a sinais ambientais Genes controlados juntos Quando Jacob e Monod induziram a βgalactosidase eles observaram que também induziram a enzima permease que é necessária para transportar a lactose para dentro da célula A análise de mutantes indicou que cada enzima era codificada por um gene diferente A enzima transacetilase com uma função dispensável e ainda desconhecida também foi induzida juntamente com a β galactosidase e a permease e posteriormente foi demonstrado que ela é codificada por um gene em separado Portanto Jacob e Monod puderam identificar três genes controlados de modo coordenado O mapeamento de recombinação demonstrou que os genes Z Y e A estavam ligados de modo muito próximo no cromossomo Evidências genéticas do operador e do repressor Agora chegamos ao centro do trabalho de Jacob e Monod como eles deduziram os mecanismos de regulação gênica no sistema lac Sua estratégia foi uma abordagem genética clássica examinar as consequências fisiológicas das mutações Portanto eles induziram mutações nos genes estruturais e nos elementos reguladores do óperon lac Conforme veremos as propriedades das mutações nesses diferentes componentes do óperon lac são consideravelmente diferentes e forneceram indicações importantes para Jacob e Monod Os indutores naturais tais como a alolactose não são ideais para esses experimentos tendo em vista que são degradados pela βgalactosidase A concentração do indutor diminui durante o experimento e assim as medições da indução enzimática se tornam consideravelmente complicadas Em vez disso para os referidos experimentos Jacob e Monod utilizaram indutores sintéticos tais como o isopropilβDtiogalactosídeo IPTG Figura 117 O IPTG não é hidrolisado pela βgalactosidase mas ainda induz a expressão da enzima β galactosidase Jacob e Monod observaram que diversas classes diferentes de mutações podem alterar a expressão dos genes estruturais do óperon lac Eles estavam interessados na avaliação das interações dos novos alelos tais como quais alelos exibiam dominância Mas para realizar os referidos testes são necessários diploides e bactérias são haploides Entretanto Jacob e Monod foram capazes de produzir bactérias que são parcialmente diploides por meio da inserção de fatores F ver Capítulo 5 que carregam a região lac do genoma Eles então conseguiram criar linhagens que eram heterozigotas em relação a mutações lac selecionadas Esses diploides parciais possibilitaram que Jacob e Monod distinguissem mutações no sítio do DNA regulador o operador lac a partir de mutações na proteína reguladora o repressor Lac codificado pelo gene I FIGURA 117 O IPTG é um indutor do óperon lac Iniciamos por meio do exame de mutações que inativam os genes estruturais para βgalactosidase e permease respectivamente designados Z e Y A primeira coisa que aprendemos é que Z e Y são recessivos em relação aos seus respectivos alelos do tipo selvagem Z e Y Por exemplo a linhagem 2 na Tabela 111 pode ser induzida a sintetizar βgalactosidase assim como a linhagem 1 haploide do tipo selvagem na tabela ainda que seja heterozigota em relação aos alelos Z mutante e selvagem Isso demonstra que o alelo Z é dominante em relação ao seu correspondente Z Jacob e Monod primeiramente identificaram duas classes de mutações reguladoras denominadas OC e I Essas foram denominadas mutações constitutivas tendo em vista que causaram a expressão dos genes estruturais do óperon lac independentemente da presença do indutor Jacob e Monod identificaram a existência do operador com base em sua análise das mutações OC Essas mutações tornam o operador incapaz de se ligar ao repressor elas danificam o interruptor de tal modo que o operador está sempre ligado Tabela 111 linhagem 3 De importância os efeitos constitutivos das mutações OC foram restritos somente àqueles genes estruturais lac no mesmo cromossomo da mutação OC Por isso o operador mutante foi denominado de ação cis conforme demonstrado pelo fenótipo da linhagem 4 na Tabela 111 Aqui tendo em vista que o gene da permease do tipo selvagem Y é cis em relação ao operador do tipo selvagem a permease é expressa apenas quando a lactose ou um análogo estão presentes Contrariamente o gene da βgalactosidase do tipo selvagem Z é cis em relação ao operador mutante OC portanto a βgalactosidase é expressa constitutivamente Essa propriedade incomum da ação cis sugeriu que o operador é um segmento de DNA que influencia apenas a expressão dos genes estruturais ligados a ele Figura 118 Portanto o operador atua simplesmente como um sítio de ligação à proteína e não faz produto gênico Jacob e Monod realizaram testes genéticos comparáveis com as mutações I Tabela 112 Uma comparação da linhagem I do tipo selvagem indutível linhagem 1 com linhagens I demonstra que as mutações I são constitutivas linhagem 2 Ou seja elas causam a expressão dos genes estruturais o tempo todo A linhagem 3 demonstra que o fenótipo indutível de I é dominante em relação ao fenótipo constitutivo de I Esse achado demonstrou a Jacob e Monod que a quantidade de proteína do tipo selvagem codificada por uma cópia do gene é suficiente para regular ambas as cópias do operador em uma célula diploide Mais significativamente a linhagem 4 demonstrou a eles que o produto do gene I é transatuante o que significa que o produto do gene consegue regular todos os genes estruturais do óperon lac estejam eles localizados na mesma molécula de DNA ou em moléculas diferentes em cis ou em trans respectivamente Contrariamente ao operador o gene I se comporta como um genepadrão codificador de proteína O produto proteico do gene I é capaz de se difundir por uma célula e atuar sobre ambos os operadores no diploide parcial Figura 119 Tabela 111 Síntese de βgalactosidase e permease em mutantes operadores haploides e diploides heterozigotos βgalactosidase Z Permease Y Não Não Linhagem Genótipo induzida Induzida induzida Induzida 1 O Z Y 2 O Z YF O Z Y 3 OC Z Y 4 O Z YF OC Z Y Nota as bactérias foram cultivadas em glicerol nenhuma glicose presente com e sem o indutor IPTG Presença e ausência da enzima são indicadas por ou respectivamente Todas as linhagens são l FIGURA 118 Os heterozigotos OOC demonstram que os operadores são de ação cis Tendo em vista que um repressor não consegue se ligar aos operadores OC os genes estruturais lac ligados a um operador OC são expressos mesmo na ausência de um indutor Entretanto os genes lac adjacentes a um operador O ainda estão sujeitos à repressão CONCEITOCHAVE As mutações no operador revelam que um referido sítio é de ação cis ou seja ele regula a expressão de uma unidade de transcrição adjacente na mesma molécula de DNA Contrariamente mutações no gene codificador de uma proteína repressora revelam que essa proteína é transatuante ou seja ela pode atuar sobre qualquer cópia do DNAalvo Evidências genéticas em relação à alosteria Finalmente Jacob e Monod foram capazes de demonstrar alosteria por meio da análise de outra classe de mutações repressoras Relembre que o repressor Lac inibe a transcrição do óperon lac na ausência de um indutor mas possibilita a transcrição quando o indutor está presente Essa regulação é realizada por meio de um segundo sítio na proteína repressora o sítio alostérico que se liga ao indutor Quando ligado ao indutor o repressor é submetido a uma alteração na estrutura geral de tal modo que seu sítio de ligação ao DNA deixa de funcionar Jacob e Monod isolaram outra classe de mutações repressoras denominadas mutações superrepressoras IS As mutações IS causam a persistência da repressão até mesmo na presença de um indutor compare a linhagem 2 na Tabela 113 com a linhagem 1 do tipo selvagem indutível Contrariamente às mutações I as mutações IS são dominantes em relação a I ver Tabela 113 linhagem 3 Essa observaçãochave levou Jacob e Monod a especularem que as mutações IS alteram o sítio alostérico de tal modo que ele não consegue mais se ligar a um indutor Por consequência a proteína repressora codificada por IS se liga continuamente ao operador evitando a transcrição do óperon lac mesmo quando o indutor está presente na célula Com base nisso podemos ver o motivo de IS ser dominante em relação a I A proteína IS mutante se ligará a ambos os operadores na célula mesmo na presença de um indutor e independentemente do fato de que a proteína codificada por I pode estar presente na mesma célula Figura 1110 Tabela 112 Síntese de βgalactosidase e permease em linhagens haploides e diploides heterozigotas que carregam I e I βgalactosidase Z Permease Y Linhagem Genótipo Não induzida Induzida Não induzida Induzida 1 I Z Y 2 I Z Y 3 I Z YF I Z Y 4 I Z YF I Z Y Nota as bactérias foram cultivadas em glicerol nenhuma glicose presente e induzidas com IPTG A presença do nível máximo da enzima é indicada por um sinal de mais a ausência ou o nível muito baixo de uma enzima é indicado por um sinal de menos Todas as linhagens são O FIGURA 119 A natureza recessiva das mutações I demonstra que o repressor é transatuante Embora nenhum repressor ativo seja sintetizado a partir do gene I o gene do tipo selvagem I proporciona um repressor funcional que se liga a ambos os operadores em uma célula diploide e bloqueia a expressão do óperon lac na ausência de um indutor Tabela 113 Síntese de βgalactosidase e permease pelo tipo selvagem e por linhagens que carregam alelos diferentes do gene I βgalactosidase Z Permease Y Linhagem Genótipo Não induzida Induzida Não induzida Induzida 1 I Z Y 2 IS Z Y 3 IS ZYF I Z Y Nota as bactérias foram cultivadas em glicerol sem glicose com e sem o indutor IPTG A presença da enzima indicada é representada por a ausência ou níveis baixos por FIGURA 1110 A dominância da mutação IS ocorre em virtude da inativação do sítio alostérico no repressor Lac Em uma célula diploide ISI nenhum dos genes estruturais do lac é transcrito O repressor IS não apresenta um sítio de ligação à alolactose sítio alostérico funcional e portanto não é inativado por um indutor Portanto até na presença de um indutor o repressor IS se liga irreversivelmente a todos os operadores em uma célula bloqueando a transcrição do óperon lac Análise genética do promotor lac A análise mutacional também demonstrou que um elemento essencial para a transcrição de lac está localizado entre o gene para o repressor I e o sítio operador O Esse elemento denominado promotor P atua como o sítio de iniciação para a transcrição pela RNA polimerase conforme descrito no Capítulo 8 Existem duas regiões de ligação para a RNA polimerase em um promotor procariótico típico demonstradas na Figura 1111 como as duas regiões altamente conservadas em 35 e 10 As mutações do promotor são de ação cis pois afetam a transcrição de todos os genes estruturais adjacentes no óperon Assim como os operadores e outros elementos de ação cis os promotores são sítios na molécula de DNA que são ligados a proteínas e eles próprios não dão origem a produto proteico Caracterização molecular do repressor Lac e do operador lac Walter Gilbert e Benno MüllerHill forneceram uma demonstração decisiva do sistema lac em 1966 por meio do monitoramento da ligação do indutor IPTG marcado radioativamente à proteína repressora purificada Primeiramente eles demonstraram que o repressor é composto por quatro subunidades idênticas e portanto contém quatro sítios de ligação de IPTG e portanto de ligação de alolactose Em segundo lugar eles demonstraram que no tubo de ensaio a proteína repressora se liga a um DNA que contém o operador e que sai do DNA na presença de IPTG Uma descrição mais detalhada sobre como o repressor e outras proteínas de ligação ao DNA atuam é fornecida posteriormente no fim da Seção 116 Gilbert e seus colaboradores demonstraram que o repressor pode proteger bases específicas no operador contra reagentes químicos Essa informação possibilitou que eles isolassem o segmento de DNA que constitui o operador e determinassem a sua sequência Eles usaram o DNA do óperon ao qual o repressor estava ligado e o trataram com a enzima DNase que fragmenta o DNA Foram capazes de recuperar trechos curtos de DNA que haviam sido protegidos da atividade enzimática pela molécula repressora Esses trechos curtos presumivelmente constituíam a sequência do operador A sequência de bases de cada filamento foi determinada e foi demonstrado que cada mutação no operador é uma alteração na sequência Figura 1112 Esses resultados demonstraram que o locus operador é uma sequência específica de 17 a 25 nucleotídios situados logo antes em 5 do gene estrutural Z Eles também demonstraram a incrível especificidade do reconhecimento do repressoroperador que pode ser rompida pela substituição de uma única base Quando a sequência de bases no mRNA lac transcrito a partir do óperon lac foi determinada as primeiras 21 bases na extremidade de iniciação 5 comprovaram ser complementares à sequência do operador que Gilbert havia determinado demonstrando que a sequência operadora é transcrita Os resultados desses experimentos forneceram confirmações cruciais sobre o mecanismo da ação repressora formulado por Jacob e Monod FIGURA 1111 Sequências de DNA específicas são importantes para a transcrição eficiente dos genes de E coli pela RNA polimerase Apenas o filamento não molde está demonstrado aqui ver Figura 84 A transcrição prosseguiria da esquerda para a direita 5 para 3 e o transcrito de mRNA seria homólogo à sequência demonstrada As sequências em quadro são altamente conservadas em todos os promotores de E coli uma indicação do seu papel como sítios de contato no DNA para a ligação da RNA polimerase e os contatos são realizados com ambos os filamentos não demonstrados Mutações nessas regiões apresentam efeitos leves dourados e graves marrons sobre a transcrição As mutações podem ser alterações de nucleotídios únicos ou pares de nucleotídios ou pode ocorrer uma deleção Δ Dados de J D Watson M Gilman J Witkowski e M Zoller Recombinant DNA 2nd ed 113 FIGURA 1112 A sequência de bases do DNA do operador da lactose e as alterações de bases associadas a oito mutações OC As regiões de simetria rotacional dupla estão indicadas pela cor e por um ponto em seu eixo de simetria Dados de W Gilbert A Maxam e A Mirzabekov in N O Kjeldgaard e O Malløe eds Control of Ribosome Synthesis Academic Press 1976 Repressão catabólica do óperon lac Controle positivo Durante um longo processo evolutivo o sistema lac existente foi selecionado para operar para a eficiência energética ideal da célula bacteriana Presumivelmente para maximizar a eficiência energética duas condições ambientais devem ser atendidas para que as enzimas metabólicas da lactose sejam expressas Uma condição é que a lactose deve estar presente no ambiente Essa condição faz sentido tendo em vista que seria ineficiente para a célula produzir enzimas metabólicas de lactose se não houver lactose a ser metabolizada Já vimos que a célula é capaz de responder à presença da lactose por meio da ação de uma proteína repressora A outra condição é que a glicose não pode estar presente no ambiente da célula Tendo em vista que a célula consegue capturar mais energia a partir da fragmentação da glicose do que consegue a partir da fragmentação de outros açúcares é mais eficiente para a célula metabolizar glicose do que lactose Portanto foram desenvolvidos mecanismos que evitam que a célula sintetize as enzimas para o metabolismo da lactose quando tanto lactose quanto glicose estão presentes A repressão da transcrição dos genes que metabolizam lactose na presença da glicose é um exemplo de repressão catabólica a glicose é um produto da fragmentação ou um catabólito da lactose A transcrição dos genes que codificam as proteínas necessárias para o metabolismo de muitos açúcares diferentes é reprimida de modo semelhante na presença de glicose Veremos que a repressão catabólica atua por meio de uma proteína ativadora Base da repressão catabólica de lac Escolha do melhor açúcar a ser metabolizado Se tanto a lactose quanto glicose estiverem presentes a síntese de βgalactosidase não é induzida até que toda a glicose tenha sido metabolizada Portanto a célula conserva a sua energia metabolizando qualquer glicose existente antes de realizar o processo de gasto energético de criação de um novo maquinário para metabolizar a lactose Existem múltiplos mecanismos que as bactérias desenvolveram para assegurar a utilização preferencial de uma fonte de carbono e o crescimento ideal Um mecanismo é excluir a lactose da célula Um segundo mecanismo é regular a expressão do óperon por meio de catabólitos Os resultados de estudos indicam que o produto da fragmentação da glicose evita a ativação do óperon lac pela lactose a repressão catabólica mencionada há pouco A identidade desse produto da fragmentação ainda é desconhecida Entretanto o produto da fragmentação da glicose sabidamente modula o nível de um constituinte celular importante a adenosina monofosfato cíclico cAMP Quando a glicose está presente em altas concentrações a concentração de cAMP na célula é baixa Na medida em que a concentração da glicose diminui a concentração de cAMP da célula aumenta de modo correspondente Figura 1113 A É necessária uma alta concentração de cAMP para a ativação do óperon lac Mutantes que não conseguem converter ATP em cAMP não podem ser induzidos a produzir βgalactosidase tendo em vista que a concentração de cAMP não é grande o suficiente para ativar o óperon lac Qual é o papel da cAMP na ativação de lac O estudo de um conjunto diferente de mutantes forneceu uma resposta Esses mutantes produzem cAMP mas não conseguem ativar as enzimas Lac tendo em vista que elas não tem outra proteína denominada proteína ativadora de catabólito CAP codificada pelo gene crp A CAP se liga a uma sequência de DNA específica do óperon lac o sítio de ligação à CAP ver Figura 1114 B A CAP ligada ao DNA em seguida é capaz de interagir fisicamente com a RNA polimerase e aumentar a afinidade da enzima pelo promotor lac Por si própria a CAP não consegue se ligar ao sítio de ligação à CAP do óperon lac Entretanto por meio da ligação à cAMP seu efetor alostérico a CAP é capaz de se ligar ao sítio de ligação à CAP e ativar a transcrição pela RNA polimerase Figura 1113 B Por meio da inibição da CAP quando a glicose está disponível o sistema de repressão catabólica assegura que o óperon lac será ativado apenas quando a glicose for escassa FIGURA 1113 O controle catabólico do óperon lac A Apenas sob condições de glicose baixa a cAMP adenosina monofosfato cíclico é formada B Quando cAMP está presente ele forma um complexo com a CAP proteína ativadora de catabólito que ativa a transcrição por meio da ligação a uma região no promotor do lac CONCEITOCHAVE O óperon lac apresenta um nível de controle adicional de modo que o óperon é inativo na presença de glicose até mesmo se a lactose também estiver presente Um efetor alostérico cAMP ligase ao ativador CAP para possibilitar a indução do óperon lac Entretanto concentrações altas de catabólitos da glicose inibem a produção de cAMP falhando assim em produzir cAMPCAP e portanto deixando de ativar o óperon lac Estrutura dos sítiosalvo no DNA As sequências de DNA às quais o complexo CAPcAMP se liga ver Figura 1114 são diferentes das sequências às quais o repressor Lac se liga Essas diferenças são a base da especificidade da ligação ao DNA por parte dessas proteínas reguladoras muito diferentes Uma propriedade que essas sequências apresentam em comum e que é comum a muitos outros sítios de ligação ao DNA é a simetria rotacional dupla Em outras palavras se girarmos a sequência de DNA demonstrada na Figura 1114 em 180 dentro do plano da página a sequência das bases destacadas dos sítios de ligação será idêntica Acreditase que as bases destacadas constituam os importantes sítios de contato para as interações proteínaDNA Essa simetria rotacional corresponde às simetrias nas proteínas de ligação ao DNA muitas das quais são compostas por duas ou quatro subunidades idênticas Consideraremos as estruturas de algumas proteínas de ligação ao DNA posteriormente no capítulo FIGURA 1114 As sequências de bases do DNA A do operador lac ao qual o repressor Lac se liga e B do sítio de ligação da CAP ao qual o complexo CAPcAMP se liga As sequências que exibem simetria rotacional dupla estão indicadas pelos quadros coloridos e por um ponto na parte central da simetria A Dados de W Gilbert A Maxam e A Mirzabekov in N O Kjeldgaard e O Malløe eds Control of Ribosome Synthesis Academic Press 1976 Como a ligação do complexo cAMPCAP ao óperon promove a ligação da RNA polimerase ao promotor lac Na Figura 1115 o DNA está dobrado quando a CAP está ligada Esse dobramento do DNA pode auxiliar a ligação da RNA polimerase ao promotor Também existem evidências de que a CAP realiza um contato direto com a RNA polimerase que é importante para o efeito de ativação da CAP A sequência de bases demonstra que a CAP e a RNA polimerase se ligam de modo diretamente adjacente entre si no promotor lac Figura 1116 CONCEITOCHAVE Generalizando a partir do modelo do óperon lac podemos imaginar o DNA ocupado por proteínas reguladoras ligadas aos sítios operadores que elas controlam O padrão exato da ligação dependerá de quais genes estão ligados ou desligados e do fato de ativadores ou repressores regularem óperons em particular Resumo do óperon lac Agora podemos ajustar os sítios de ligação da CAPcAMP e da RNA polimerase ao modelo detalhado do óperon lac conforme demonstrado na Figura 1117 A presença de glicose evita o metabolismo da lactose tendo em vista que um produto da fragmentação da glicose inibe a manutenção dos altos níveis de cAMP necessários para a formação do complexo CAPcAMP que por sua vez é necessário para que a RNA polimerase se ligue ao sítio do promotor lac ver Figura 1117 A e B Até quando há uma escassez de catabólitos de glicose e formação de CAPcAMP o mecanismo para o metabolismo da lactose será implementado apenas se a lactose estiver presente ver Figura 1117 C Apenas duas ou três moléculas de βgalactosidase estão presentes por célula na ausência de lactose ou na presença de lactose e glicose Essas aumentam para aproximadamente 3000 moléculas da enzima quando a lactose está presente e a glicose está ausente Portanto a célula conserva a sua energia e seus recursos por meio da produção de enzimas que metabolizam a lactose apenas quando elas são tanto necessárias quanto úteis FIGURA 1115 A Quando a CAP se liga ao promotor ela cria uma dobra superior a 90 no DNA B Imagem derivada da análise estrutural do complexo CAPDNA B De S Schultz e T A Steitz FIGURA 1116 A região de controle do óperon lac A sequência de bases e os limites genéticos da região de controle do óperon lac com sequências parciais para os genes estruturais Dados de R C Dickson J Abelson W M Barnes e W S Reznikoff Genetic Regulation The Lac Control Region Science 187 1975 27 FIGURA 1117 O óperon lac é controlado em conjunto pelo repressor Lac controle negativo e pela proteína ativadora de catabólito CAP controle positivo Grandes quantidades de mRNA são produzidas apenas quando a lactose está presente para inativar o repressor e baixos níveis de glicose promovem a formação do complexo CAPcAMP que regula positivamente a transcrição O controle do indutorrepressor do óperon lac é um exemplo de repressão ou controle negativo no qual a expressão normalmente está bloqueada Contrariamente o sistema de CAPcAMP é um exemplo de ativação ou controle positivo tendo em vista que ele atua como um sinal que ativa a expressão nesse caso o sinal de ativação é a interação do complexo CAPcAMP com o sítio de ligação da CAP ao DNA A Figura 1118 resume esses dois tipos básicos de sistemas de controle CONCEITOCHAVE O óperon lac é um agrupamento de genes estruturais que especificam enzimas que participam no metabolismo da lactose Esses genes são controlados pelas ações coordenadas das regiões do promotor e operador de ação cis A atividade dessas regiões por sua vez é determinada por moléculas repressoras e ativadoras especificadas por genes reguladores em separado 114 FIGURA 1118 A Na repressão um repressor ativo codificado pelo gene R neste exemplo bloqueia a expressão do óperon A B C por meio da ligação a um sítio operador O B Na ativação é necessário um ativador funcional para a expressão gênica Um ativador não funcional resulta em ausência de expressão dos genes X Y Z Pequenas moléculas conseguem converter um ativador não funcional em um ativador funcional que em seguida se liga à região de controle do óperon neste caso denominada I As posições tanto de O quanto de I em relação ao promotor P nos dois exemplos são desenhadas arbitrariamente visto que as suas posições diferem em diferentes óperons Duplo controle positivo e negativo Óperon da arabinose Assim como com o sistema lac o controle da transcrição em bactérias não é nem puramente positivo nem puramente negativo em vez disso tanto a regulação positiva quanto a negativa podem regular óperons individuais A regulação do óperon da arabinose fornece um exemplo no qual uma única proteína de ligação ao DNA pode atuar tanto como um repressor quanto como um ativador um desvio no tema geral da regulação da transcrição por proteínas de ligação ao DNA Os genes estruturais araB araA e araD codificam as enzimas metabólicas que fragmentam o açúcar arabinose Os três genes são transcritos em uma unidade como um único mRNA A Figura 1119 demonstra um mapa do óperon ara A transcrição é ativada em araI a região iniciadora que contém um sítio de ligação para uma proteína ativadora O gene araC que está mapeado próximo codifica uma proteína ativadora Quando ligada à arabinose essa proteína se liga ao sítio araI e ativa a transcrição do óperon ara talvez por auxiliar a RNA polimerase a se ligar ao promotor Além disso o mesmo sistema de repressão catabólica CAP cAMP que evita a expressão do óperon lac na presença de glicose também evita a expressão do óperon ara FIGURA 1119 Os genes B A e D juntamente com os sítios I e O constituem o óperon ara O é araO e I é araI Na presença de arabinose ambos os complexos CAPcAMP e AraCarabinose devem se ligar a araI para que a RNA polimerase se ligue ao promotor e transcreva o óperon ara Figura 1120 A Na ausência de arabinose a proteína AraC assume uma conformação diferente e reprime o óperon ara por meio da ligação a araI e a um segundo sítio distante araO formando assim uma alça Figura 1120 B que evita a transcrição Portanto a proteína AraC apresenta duas conformações uma que atua como um ativador e outra que atua como um repressor A alternância ligadesliga do óperon é disparada pela arabinose As duas conformações dependendo de a arabinose efetora alostérica estar ligada à proteína diferem em suas capacidades de se ligar a um sítioalvo específico na região araO do óperon CONCEITOCHAVE A transcrição do óperon pode ser regulada por ambas a ativação e a repressão Os óperons que regulam o metabolismo de compostos semelhantes tais como açúcares podem ser regulados de modos consideravelmente diferentes FIGURA 1120 Duplo controle do óperon ara A Na presença de arabinose a proteína AraC se liga à região araI O complexo CAPcAMP se liga a um sítio adjacente a araI Esta ligação estimula a transcrição dos genes araB araA e araD B Na ausência de arabinose a proteína AraC se liga a ambas as regiões araI e araO formando uma alça de DNA Esta ligação evita a transcrição do óperon ara 115 Vias metabólicas e níveis adicionais de regulação Atenuação O controle coordenado dos genes em bactérias é difuso Na seção precedente observamos exemplos que ilustram a regulação de vias para a fragmentação de açúcares específicos De fato a maior parte dos genes coordenados em bactérias é regulada por meio de mecanismos de óperon Em muitas vias que sintetizam moléculas essenciais de blocos de construção inorgânicos simples os genes que codificam as enzimas estão organizados em óperons completados com mRNA multigênicos Além disso nos casos em relação aos quais a sequência da atividade catalítica é conhecida existe uma extraordinária congruência entre a ordem dos genes no óperon no cromossomo e a ordem na qual os seus produtos atuam na via metabólica Essa congruência está surpreendentemente ilustrada pela organização do óperon do triptofano em E coli Figura 1121 O óperon do triptofano contém cinco genes trpE trpD trpC trpB trpA que codificam enzimas que contribuem para a síntese do aminoácido triptofano CONCEITOCHAVE Em bactérias os genes que codificam enzimas que estão nas mesmas vias metabólicas em geral estão organizados em óperons Existem dois mecanismos para regular a transcrição no óperon do triptofano e em alguns outros óperons que atuam na biossíntese de aminoácidos Um proporciona o controle global da expressão do mRNA do óperon e o outro proporciona um controle fino O nível de expressão gênica do óperon trp é regulado pelo nível de triptofano Quando o triptofano está ausente no meio de crescimento a expressão do gene trp é alta quando os níveis de triptofano são altos o óperon trp é reprimido Um mecanismo para o controle da transcrição do óperon trp é semelhante ao mecanismo que já vimos e que controla o óperon lac uma proteína repressora se liga a um operador evitando o início da transcrição Esse repressor é o repressor Trp o produto do gene trpR O repressor Trp se liga ao triptofano quando estão presentes níveis adequados do aminoácido e apenas após a ligação do triptofano o repressor Trp se ligará ao operador e desligará a transcrição do óperon Esse mecanismo simples assegura que a célula não desperdice energia produzindo triptofano quando o aminoácido é suficientemente abundante Linhagens de E coli com mutações em trpR continuam a expressar o mRNA de trp e portanto continuam a produzir triptofano quando o aminoácido é abundante Ao estudar essas linhagens mutantes de trpR Charles Yanofsky descobriu que quando o triptofano era removido do meio a produção de mRNA de trp aumentava várias vezes Esse achado foi a evidência de que além do repressor Trp existia um segundo mecanismo de controle para regular negativamente a transcrição Esse mecanismo é denominado atenuação tendo em vista que a produção de mRNA normalmente é atenuada o que significa diminuída quando o triptofano é abundante Contrariamente aos outros mecanismos de controle bacterianos descritos até agora a atenuação atua como uma etapa após o início da transcrição Os mecanismos que regulam a atenuação foram descobertos por meio da identificação de mutações que reduziam ou aboliam a atenuação Linhagens com essas mutações produzem mRNA de trp em níveis máximos mesmo na presença de triptofano Yanofsky mapeou as mutações em uma região entre o operador trp e o gene trpE essa região denominada sequência líder está na extremidade 5 do mRNA do óperon trp antes do primeiro códon do gene trpE Figura 1122 A sequência líder de trp é incomumente longa para um mRNA procariótico de 160 bases e análises detalhadas revelaram como uma parte dessa sequência atua como um atenuador que regula a transcrição adicional do mRNA de trp FIGURA 1121 A ordem cromossômica dos genes no óperon trp de E coli e a sequência de reações catalisadas pelos produtos enzimáticos dos genes estruturais trp Os produtos dos genes trpD e trpE formam um complexo que catalisa etapas específicas assim como os produtos dos genes trpB e trpA A triptofano sintetase é uma enzima tetramérica formada pelos produtos de trpB e trpA Ela catalisa um processo de duas etapas que leva à formação do triptofano Abreviações PRPP fosforribosilpirofosfato CDRP 1o carboxifenilamino1desoxirribulose 5fosfato Dados de S Tanemura e R H Bauerle Genetics 95 1980 545 As observaçõeschave são que na ausência da proteína repressora TrpR a presença do triptofano interrompe a transcrição após aproximadamente as primeiras 140 bases enquanto na ausência de triptofano a transcrição do óperon continua O mecanismo de término ou de continuação da transcrição é composto por dois elementoschave Primeiramente a sequência líder do mRNA de trp codifica um peptídio curto de 14 aminoácidos que inclui dois códons de triptofano adjacentes O triptofano é um dos aminoácidos menos abundantes nas proteínas e é codificado por um único códon Esse par de códons de triptofano portanto é uma característica incomum Em segundo lugar partes do mRNA líder trp formam estruturas de haste e alça que são capazes de alternar entre duas conformações Uma dessas conformações favorece o término da transcrição Figura 1123 A A lógica reguladora do óperon depende da abundância de triptofano Quando o triptofano é abundante existe um suprimento suficiente de aminoaciltRNATrp para possibilitar a tradução do peptídio de 14 aminoácidos Relembre que a transcrição e a tradução em bactérias estão acopladas assim os ribossomos podem ligarse aos transcritos de mRNA e iniciar a tradução antes que a transcrição esteja completa A ligação do ribossomo altera a conformação do mRNA de trp de tal forma que favorece o término da transcrição onde os segmentos 3 e 4 formam pares de bases Figura 1123 B Entretanto quando o triptofano é escasso o ribossomo fica parado nos códons do triptofano os segmentos 2 e 3 pareiam bases e a transcrição pode continuar Figura 1123 C Outros óperons para enzimas nas vias de biossíntese apresentam controles de atenuação semelhantes Uma característica dos óperons de biossíntese de aminoácidos é a presença de múltiplos códons para o aminoácido que está sendo sintetizado em um peptídio separado codificado pela sequência líder 5 Por exemplo o óperon phe apresenta sete códons de fenilalanina em um peptídio líder e o óperon his apresenta sete códons de histidina em tandem em seu peptídio líder Figura 1124 CONCEITOCHAVE Um segundo nível de regulação em óperons de biossíntese de aminoácidos é a atenuação da transcrição mediada pela abundância do aminoácido e pela tradução de um peptídio líder FIGURA 1122 Na sequência líder do mRNA de trp a região atenuadora precede a sequência codificadora trpE Upstream nas bases 54 a 59 estão os dois códons de triptofano demonstrados em vermelho do peptídio líder FIGURA 1123 Modelo em relação à atenuação no óperon trp A Estruturas secundárias propostas na conformação do mRNA líder do trp que favorecem o término da transcrição Quatro regiões podem parear bases para formar três estruturas de haste e alça mas apenas duas regiões pareiam bases entre si em um determinado momento Portanto a região 2 pode parear bases com a região 1 ou a região 3 B Quando o triptofano é abundante o segmento 1 do mRNA do trp é traduzido O segmento 2 entra no ribossomo embora não seja traduzido o que possibilita que os segmentos 3 e 4 pareiem bases Esta região com bases pareadas faz com que a RNA polimerase termine a transcrição C Contrariamente quando o triptofano é escasso o ribossomo fica parado nos códons do segmento 1 O segmento 2 interage com o segmento 3 em vez de ser puxado para o ribossomo e assim os segmentos 3 e 4 não podem parear Consequentemente a transcrição continua Dados de D L Oxender G Zurawsk e C Yanofsky Proc Natl Acad Sci USA 76 1979 5524 116 FIGURA 1124 A A parte traduzida da região líder trp contém dois códons de triptofano consecutivos B A sequência líder phe contém sete códons de fenilalanina C A sequência líder his contém sete códons de histidina consecutivos Ciclos de vida de bacteriófagos Mais reguladores óperons complexos Naquele cinema em Paris François Jacob teve um lampejo de que o fenômeno da indução do prófago pudesse ser análogo de modo próximo à indução da síntese de βgalactosidase Ele estava certo Aqui veremos como o ciclo de vida do bacteriófago λ é regulado Embora a sua regulação seja mais complexa do que aquela dos óperons individuais ela é controlada por modos de regulação gênica agora familiares O bacteriófago λ é um assim denominado fago temperado que apresenta dois ciclos de vida alternativos Figura 1125 Quando uma bactéria normal é infectada por um fago λ do tipo selvagem podem se seguir dois possíveis desfechos 1 o fago pode se replicar e finalmente lisar a célula o ciclo lítico ou 2 o genoma do fago pode integrarse ao cromossomo bacteriano como um prófago inerte o ciclo lisogênico No estado lítico a maior parte dos 71 genes do fago é expressa em algum ponto enquanto no estado lisogênico a maior parte dos genes está inativa O que decide qual dessas duas vias é adotada O controle fisiológico da decisão entre a via lítica ou lisogênica depende dos recursos disponíveis na bactéria hospedeira Se os recursos forem abundantes o ciclo lítico é preferido tendo em vista que então existem nutrientes suficientes para produzir muitas cópias do vírus Se os recursos forem limitados a via lisogênica é adotada O vírus então permanece presente como um prófago até que as condições melhorem O prófago inerte pode ser induzido por luz ultravioleta a entrar no ciclo lítico o fenômeno estudado por Jacob Os estados lítico e lisogênico são caracterizados por programas muito distintos de expressão gênica que devem ser regulados Qual estado alternativo é selecionado é determinado por um interruptor genético complexo que compreende diversas proteínas reguladoras de ligação ao DNA e um conjunto de sítios operadores FIGURA 1125 Se o bacteriófago λ entra imediatamente no ciclo lítico ou se entra no ciclo lisogênico depende da disponibilidade de recursos O vírus lisogênico insere seu genoma no cromossomo bacteriano onde ele permanece quiescente até que as condições sejam favoráveis Assim como o foram para os sistemas reguladores lac e outros as análises genéticas de mutantes foram fonte de percepções cruciais sobre os componentes e a lógica do interruptor genético de λ Jacob utilizou triagens fenotípicas simples para isolar mutantes que eram defeituosos na via lítica ou na lisogênica Os mutantes de cada tipo puderam ser reconhecidos pelo aspecto das placas infectadas em uma camada de bactérias Quando partículas de fago do tipo selvagem são colocadas em uma camada de bactérias sensíveis aparecem áreas claras denominadas placas onde as bactérias são infectadas e lisadas mas essas placas são turvas tendo em vista que bactérias lisogenizadas crescem nelas Figura 1126 Os fagos mutantes que formam placas claras são incapazes de lisogenizar as células Os referidos mutantes claros denominados por c são análogos aos mutantes I e O do sistema lac Esses mutantes com frequência foram isolados como mutantes sensíveis à temperatura que apresentavam fenótipos claros em temperaturas mais altas mas fenótipos do tipo selvagem em temperaturas mais baixas Três classes de mutantes levaram à identificação das características reguladoraschave do fago λ Na primeira classe os mutantes para os genes cI cII e cIII formam placas claras ou seja eles são incapazes de estabelecer a lisogenia Foi isolada uma segunda classe de mutantes que não lisogeniza as células mas que pode se replicar e entrar no ciclo lítico em uma célula lisogenizada Esses mutantes são análogos aos mutantes constitutivos do operador do sistema lac Um terceiro mutantechave consegue lisogenizar mas é incapaz de lisar as células O gene mutado nesse caso é o gene cro em referência ao controle do repressor e de outras coisas A decisão entre as vias lítica e lisogênica depende da atividade das proteínas codificadas pelos quatro genes cI cII cIII e cro três dos quais são proteínas de ligação ao DNA FIGURA 1126 As placas são claras onde ocorreu a lise da célula hospedeira elas são turvas onde as células sobreviveram à infecção e continuaram a crescer como um lisógeno De Microbiology An Evolving Science 1st ed Figure 1022 John Foster Primeiramente enfocaremos os dois genes cI e cro nas proteínas que eles codificam Tabela 114 O gene cI codifica um repressor com frequência denominado repressor λ que reprime o crescimento lítico e promove a lisogenia O gene cro codifica um repressor que reprime a lisogenia possibilitando assim o crescimento lítico O interruptor genético que controla os dois ciclos de vida do fago λ apresenta dois estados no estado lisogênico cI está ligado mas cro está desligado e no ciclo lítico cro está ligado mas cI está desligado Portanto o repressor λ e Cro estão competindo e o repressor que prevalece determina o estado do interruptor e da expressão do genoma λ A corrida entre o repressor λ e o Cro é iniciada quando o fago λ infecta uma bactéria normal A sequência de eventos na corrida é criticamente determinada pela organização dos genes no genoma λ e dos promotores e operadores entre os genes cI e cro O genoma λ de aproximadamente 50 kb codifica proteínas que apresentam papéis na replicação do DNA na recombinação na montagem da partícula do fago e na lise celular Figura 1127 Essas proteínas são expressas em uma sequência lógica tal que primeiramente são produzidas cópias do genoma essas cópias em seguida são empacotadas em partículas virais e finalmente a célula hospedeira é lisada para liberar o vírus e iniciar a infecção de outras células hospedeiras ver Figura 1125 A ordem da expressão gênica viral flui a partir do início da transcrição em dois promotores PL e PR em referência a promotor à esquerda e à direita em relação ao mapa genético Com a infecção a RNA polimerase inicia a transcrição em ambos os promotores Observando o mapa genético ver Figura 1127 vemos que a partir de PR cro é o primeiro gene transcrito e a partir de PL N é o primeiro gene transcrito O gene N codifica um regulador positivo mas o mecanismo dessa proteína difere daquele de outros reguladores que consideramos até agora A proteína N possibilita que a RNA polimerase continue a transcrever regiões do DNA que de outro modo causariam o término da transcrição Uma proteína reguladora tal como N que atua impedindo o término da transcrição é denominada antiterminalizador Portanto N possibilita a transcrição de cIII e outros genes à esquerda de N bem como de cII e outros genes à direita de cro O gene cII codifica uma proteína ativadora que se liga a um sítio que promove a transcrição à esquerda de um promotor diferente PRE em referência a promotor de estabelecimento do repressor que ativa a transcrição do gene cI Relembre que o gene cI codifica o repressor λ que evitará o crescimento lítico Tabela 114 Principais reguladores do ciclo de vida do bacteriófago λ Gene Proteína Promove cI repressor λ via lisogênica cro repressor Cro via lítica N regulador positivo expressão de cII cIII cII ativador expressão de cI cIII inibidor de protease atividade de cII FIGURA 1127 Mapa do fago λ na forma circular Os genes para recombinação integração e excisão replicação montagem da cabeça e da cauda e lise celular estão agrupados juntos e são regulados de modo coordenado A transcrição do lado direito do genoma tem início em PR e aquela dos genes à esquerda tem início em PL Interações reguladoraschave que regulam a decisão lisogênica versus lítica ocorrem nos operadores entre os genes cro e cI Antes de ocorrer a expressão do restante dos genes virais deve ser tomada uma decisão continuar com a expressão do gene viral e lisar a célula ou reprimir aquela via e lisogenizar a célula A decisão de lisar ou lisogenizar uma célula depende da atividade da proteína cII A proteína cII é instável tendo em vista que é sensível a proteases bacterianas enzimas que degradam proteínas Essas proteases respondem às condições ambientais elas são mais ativas quando os recursos são abundantes mas menos ativas quando as células estão em inanição Vejamos o que ocorre com cII quando os recursos são abundantes e não abundantes Quando os recursos são abundantes cII é degradado e pouco repressor λ é produzido Os genes transcritos a partir de PL e PR continuam a ser expressos e o ciclo lítico prevalece Entretanto se os recursos são limitados cII é mais ativo e mais repressor λ é produzido Nesse caso os genes transcritos a partir de PL e PR são reprimidos pelo repressor λ e ocorre a entrada no ciclo lisogênico A proteína cII também é responsável pela ativação da transcrição de int um gene que codifica uma proteína adicional necessária para a lisogenia uma integrase necessária para a integração do genoma λ ao cromossomo hospedeiro A proteína cIII protege cII da degradação assim ela também contribui para a decisão lisogênica Recapitulemos brevemente a sequência de eventos e os pontos de decisão no ciclo de vida do bacteriófago λ Com a infecção A RNA polimerase do hospedeiro inicia a transcrição em PL e PR expressando os genes cro e N Em seguida A proteína antiterminalizadora N possibilita a transcrição do gene cIII e dos genes de recombinação ver Figura 1127 esquerda bem como do gene cII e outros genes ver Figura 1127 direita Em seguida A proteína cII protegida pela proteína cIII liga cI e int por meio da ativação da transcrição em PRE Em seguida Se os recursos e as proteases forem abundantes cII é degradada Cro reprime cI e o ciclo lítico continua Se os recursos e as proteases não forem abundantes cII está ativa a transcrição de cI prossegue em um nível alto a proteína Int integrase ao cromossomo do fago e cI repressor λ desliga todos os genes exceto a si próprio Anatomia molecular do interruptor genético Para ver como a decisão é executada no nível molecular nos voltaremos para as atividades do repressor λ e de Cro O operador OR está localizado entre os dois genes que codificam essas proteínas e contém três sítios OR1 OR2 e OR3 que sobrepõem dois promotores opostos PR que promove a transcrição de genes líticos e PRM em referência a manutenção de repressor que direciona a transcrição do gene cI ver Figura 1127 Relembre que o gene cI codifica o repressor λ Os três sítios operadores são semelhantes mas não idênticos em sequência e embora Cro e o repressor λ possam se ligar a qualquer um dos operadores eles realizam isso com diferentes afinidades o repressor λ se liga a OR1 com a mais alta afinidade enquanto Cro se liga a OR3 com a mais alta afinidade A ocupação de OR1 pelo repressor λ bloqueia a transcrição a partir de PR e portanto bloqueia a transcrição dos genes para o sítio lítico A ocupação de OR3 por Cro bloqueia a transcrição a partir de PRM e portanto bloqueia a manutenção da transcrição de cI Portanto nenhum repressor λ é produzido e a transcrição dos genes em relação ao ciclo lítico pode continuar A ocupação dos sítios operadores portanto determina os padrões lítico versus lisogênico da expressão do gene λ Figura 1128 Após um lisógeno ter sido estabelecido em geral ele é estável Mas o lisógeno pode ser induzido a entrar no ciclo lítico por meio de diversas alterações ambientais A luz ultravioleta induz a expressão dos genes do hospedeiro Um dos genes do hospedeiro codifica uma proteína RecA que estimula a clivagem do repressor λ afetando assim a manutenção da lisogenia e resultando em crescimento lítico A indução do prófago assim como Jacob e Monod conjeturaram requer a liberação de um repressor do DNA O papel fisiológico da luz ultravioleta na indução lisogênica faz sentido pois esse tipo de radiação lesiona o DNA hospedeiro e estressa as bactérias o fago replica e deixa a célula lesionada e estressada para outro hospedeiro FIGURA 1128 A ligação do repressor λ e de Cro aos sítios operadores A lisogenia é promovida pela ligação do repressor λ a OR1 e OR2 o que evita a transcrição a partir de PR Na indução ou no ciclo lítico a ligação de Cro a OR3 evita a transcrição do gene cI Dados de M Ptashne e A Gann Genes and Signals p 30 Fig 113 CONCEITOCHAVE O interruptor genético do fago λ ilustra como algumas poucas proteínas reguladoras de ligação ao DNA que atuam por meio de alguns poucos sítios controlam a expressão de um número muito maior de genes no vírus em um mecanismo de cascata Assim como nos sistemas lac ara trp e outros os estados alternativos da expressão gênica são determinados por sinais fisiológicos Ligação sequênciaespecífica de proteínas reguladoras ao DNA Como o repressor λ e Cro reconhecem diferentes operadores com diferentes afinidades Essa questão direciona a nossa atenção para um princípio fundamental no controle da transcrição gênica as proteínas reguladoras se ligam a sequências de DNA específicas Para que proteínas individuais se liguem a determinadas sequências e não a outras há necessidade de especificidade nas interações das cadeias laterais dos aminoácidos da proteína e os grupos químicos das bases do DNA Estudos estruturais detalhados do repressor λ Cro e de outros reguladores bacterianos revelaram como as estruturas tridimensionais dos reguladores e do DNA interagem e como o arranjo de aminoácidos em particular lhes possibilita reconhecer sequências de bases específicas A análise cristalográfica identificou uma característica estrutural comum dos domínios de ligação ao DNA de λ e Cro Ambas as proteínas fazem contato com o DNA por meio de um domínio de hélicegirohélice que é composto por duas hélices α unidas por uma região ligante flexível curta Figura 1129 Uma hélice a hélice de reconhecimento se encaixa no sulco maior do DNA Naquela posição os aminoácidos na face externa da hélice são capazes de interagir com grupos químicos nas bases do DNA Os aminoácidos específicos na hélice de reconhecimento determinam a afinidade de uma proteína por uma sequência de DNA específica FIGURA 1129 A ligação de um motif hélicegirohélice ao DNA Os cilindros roxos são as hélices alfa Muitas proteínas reguladoras se ligam como dímeros ao DNA Em cada monômero a hélice de reconhecimento R faz contato com bases no sulco maior do DNA As hélices de reconhecimento do repressor λ e do Cro apresentam estruturas semelhantes e alguns resíduos de aminoácidos idênticos As diferenças entre as hélices nos resíduos de aminoácidoschave determinam as suas propriedades de ligação ao DNA Por exemplo no repressor λ e proteínas Cro as cadeias laterais 117 de glutamina e serina fazem contato com as mesmas bases mas um resíduo de alanina no repressor λ e resíduos de lisina e asparagina na proteína Cro impõem afinidades de ligação diferentes para sequências em OR1 e OR3 Figura 1130 Os repressores Lac e TrpR bem como o ativador AraC e muitas outras proteínas também se ligam ao DNA por meio de motifs hélicegirohélice de diferentes especificidades dependendo das sequências de aminoácidos primários de suas hélices de reconhecimento Em geral outros domínios dessas proteínas tais como aqueles que se ligam a seus respectivos efetores alostéricos são diferentes CONCEITOCHAVE A especificidade biológica da regulação gênica ocorre em virtude da especificidade química das interações aminoácidobase de proteínas reguladoras individuais com as sequências de DNA discretas FIGURA 1130 As interações de aminoácidos e bases determinam a especificidade e a afinidade das proteínas de ligação ao DNA Estão demonstradas as sequências de aminoácidos das hélices de reconhecimento do repressor λ e das proteínas Cro As interações dos resíduos de glutamina Gln serina Ser e alanina Ala do repressor λ e as bases no operador OR determinam a força da ligação De modo semelhante as interações dos resíduos de glutamina serina asparagina Asn e lisina Lys da proteína Cro medeiam a ligação ao operador OR3 Cada sequência de DNA demonstrada é aquela ligada por um monômero individual do respectivo repressor ela tem metade do sítio operador ocupado pelo dímero do repressor Dados de M Ptashne A Genetic Switch Phage I and Higher Organisms 2nd ed Fatores sigma alternativos regulam grandes conjuntos de genes Até agora vimos como interruptores únicos podem controlar a expressão de óperons únicos ou de dois óperons que contêm tantos quanto um par de dúzias de genes Algumas respostas fisiológicas às alterações no ambiente requerem a expressão coordenada de grandes conjuntos de genes não ligados localizados por todo o genoma para ocasionar alterações fisiológicas dramáticas e até mesmo morfológicas As análises desses processos revelaram outro desvio na regulação gênica bacteriana o controle de grandes números de genes por fatores sigma σ alternativos da RNA polimerase Um referido exemplo o processo da esporulação no Bacillus subtilis foi analisado em grande detalhe nas últimas poucas décadas Sob estresse a bactéria forma esporos que são notavelmente resistentes ao calor e à dessecação Inicialmente no processo de esporulação a bactéria se divide assimetricamente gerando dois componentes de tamanho desigual que apresentam destinos muito diferentes O compartimento menor o próesporo desenvolvese dentro do esporo O compartimento maior a célulamãe nutre o esporo em desenvolvimento e é lisado quando a morfogênese do esporo está completa para liberar o esporo Figura 1131 A A dissecção genética desse processo envolveu o isolamento de muitos mutantes que não conseguem esporular Investigações detalhadas levaram à caracterização de diversas proteínas reguladoraschave que regulam diretamente programas de expressão gênica que são específicos do pré esporo ou da célulamãe Quatro dessas proteínas são fatores σ alternativos Lembre que o início da transcrição em bactérias inclui a ligação da subunidade σ da RNA polimerase às regiões 35 e 10 dos promotores dos genes O fator σ se desassocia do complexo quando a transcrição tem início e é reciclado No B subtilis dois fatores σ σA e σH são ativos em células vegetativas Durante a esporulação um diferente fator σ σF tornase ativo no próesporo e ativa um grupo de mais de 40 genes Um gene ativado por σF é uma proteína secretada que por sua vez aciona o processamento proteolítico do precursor inativo próσE um fator σ distinto na célulamãe O fator σE é necessário para ativar conjuntos de genes na célulamãe Dois fatores σ adicionais σK e σG são subsequentemente ativados na célulamãe e no próesporo respectivamente Figura 1131 A A expressão de fatores σ distintos possibilita a transcrição coordenada de diferentes conjuntos de genes ou regulons por uma única RNA polimerase FIGURA 1131 A esporulação no Bacillus subtilis é regulada por cascatas de fatores σ A Em células vegetativas σA e σH são ativos No início da esporulação σF é ativo no próesporo e σE é ativo na célulamãe Esses fatores σ em seguida são substituídos por σG e σK respectivamente A célulamãe finalmente é lisada e libera o esporo maduro B Os fatores σE e σF controlam os regulons de muitos genes ybaN e assim por diante nesta ilustração Estão demonstrados três exemplos do grande número de promotores regulados por cada fator σ Cada fator σ apresenta uma sequência de ligação distinta e específica nas sequências 35 e 10 dos promotoresalvo Dados de P Eichenberger et al J Mol Biol 327 2003 945972 e S Wang et al J Mol Biol 358 2006 1637 Como esses fatores σ alternativos controlam diferentes aspectos do processo de esporulação As respostas se tornaram cristalinas com o advento de novas abordagens para a caracterização da expressão de todos os genes em um genoma ver Seção 146 Atualmente é possível monitorar a transcrição de cada gene de B subtilis durante o crescimento vegetativo e a formação de esporos e em diferentes compartimentos do esporo Diversas centenas de genes foram identificadas desse modo os quais são transcricionalmente ativados ou reprimidos durante a formação dos esporos Como os diferentes conjuntos de genes são controlados por cada fator σ Cada fator σ apresenta diferentes propriedades de ligação sequência específica ao DNA Os óperons ou genes individuais regulados por fatores σ específicos apresentam sequências caracterizadas nas regiões 35 e 10 de seus promotores que são ligadas por um fator σ e não por outros Figura 1131 B Por exemplo σE se liga a no mínimo 121 promotores dentro de 34 óperons e 87 genes individuais para regular mais de 250 genes e σF se liga a no mínimo 36 promotores para regular 48 genes CONCEITOCHAVE A expressão sequencial de fatores σ alternativos que reconhecem sequências promotoras alternativas proporciona a expressão coordenada de grandes números de óperons independentes e genes não ligados durante o programa de desenvolvimento da esporulação Fatores σ alternativos também desempenham papéis importantes na virulência de patógenos humanos Por exemplo bactérias do gênero Clostridium produzem toxinas potentes que são responsáveis por diversas doenças tais como botulismo tétano e gangrena Recentemente descobriuse que os genes de toxinaschave de C botulinum C tetani e C perfringens são controlados por fatores σ alternativos correlatos que reconhecem sequências semelhantes nas regiões 35 e 10 dos genes de toxina A compreensão sobre os mecanismos de regulação dos genes de toxina pode levar a novos meios de prevenção de doenças e terapia RESUMO A regulação gênica com frequência é mediada por proteínas que reagem a sinais ambientais por meio da elevação ou da redução das taxas de transcrição de genes específicos A lógica dessa regulação é direta Para que a regulação opere de modo adequado as proteínas reguladoras apresentam sensores integrados que monitoram continuamente as condições celulares As atividades dessas proteínas dependem então de condições ambientais apropriadas Em bactérias e seus vírus o controle de diversos genes estruturais pode ser coordenado pelo agrupamento dos genes em óperons no cromossomo de modo que eles são transcritos em mRNA multigênicos O controle coordenado simplifica a tarefa para as bactérias tendo em vista que um grupo de sítios reguladores por óperon é suficiente para regular a expressão de todos os genes do óperon Alternativamente o controle coordenado também pode ser conquistado por meio de fatores σ discretos que regulam dúzias de promotores independentes simultaneamente No controle regulador negativo uma proteína repressora bloqueia a transcrição por meio da ligação ao DNA no sítio operador O controle regulador negativo é exemplificado pelo sistema lac A regulação negativa é um modo muito direto de o sistema lac desligar genes na ausência de açúcares apropriados no ambiente No controle regulador positivo são necessários fatores proteicos para ativar a transcrição Alguns controles gênicos procarióticos tais como aquele em relação à repressão catabólica operam por meio do controle gênico positivo Muitas proteínas reguladoras são membros de famílias de proteínas que apresentam motifs de ligação ao DNA muito semelhantes tais como o domínio hélicegirohélice Outras partes das proteínas tais como seus domínios de interação proteínaproteína tendem a ser menos semelhantes A especificidade da regulação gênica depende de interações químicas das cadeias laterais dos aminoácidos com grupos químicos nas bases do DNA TERMOSCHAVE ação cis adenosina monofosfato cíclico cAMP antiterminalizador atenuação atenuador ativador ciclo lisogênico ciclo lítico controle negativo controle positivo diploide parcial domínio de ligação ao DNA efetor alostérico genes controlados coordenadamente indução indutor iniciador interruptor genético mutação constitutiva operador óperon promotor proteína ativadora de catabólito CAP regulon repressão catabólica repressor sequência líder sítio alostérico transatuante transição alostérica PROBLEMAS RESOLVIDOS Este conjunto de quatro problemas resolvidos que são semelhantes ao Problema 10 nos Problemas básicos ao fim deste capítulo é desenhado para testar a compreensão sobre o modelo do óperon Aqui recebemos diversos diploides e nos é solicitado que determinemos se os produtos dos genes Z e Y são produzidos na presença ou na ausência de um indutor Utilize uma tabela semelhante àquela no Problema 11 como base para as suas respostas com a exceção de que os títulos das colunas serão como segue Gene Z Gene Y Genótipo Nenhum indutor Indutor Nenhum indutor Indutor PROBLEMA RESOLVIDO 1 I P OC Z Y I P O Z Y Solução Um modo de abordar estes problemas é primeiramente considerar cada cromossomo em separado e em seguida construir um diagrama A ilustração a seguir digrama este diploide O primeiro cromossomo é P e assim a transcrição é bloqueada e nenhuma enzima Lac pode ser sintetizada a partir dele O segundo cromossomo P pode ser transcrito e portanto a transcrição é reprimível O Entretanto os genes estruturais ligados ao bom promotor são defeituosos portanto nenhum produto de Z ou produto de Y ativo pode ser produzido Os símbolos a serem adicionados à sua tabela são PROBLEMA RESOLVIDO 2 I P O Z Y I P O Z Y Solução O primeiro cromossomo é P e assim nenhuma enzima pode ser sintetizada a partir dele O segundo cromossomo é O e assim a transcrição é reprimida pelo repressor fornecido a partir do primeiro cromossomo que pode atuar em trans através do citoplasma Entretanto apenas o gene Z desse cromossomo está intacto Portanto na ausência de um indutor nenhuma enzima é produzida na presença de um indutor apenas o produto do gene Z a βgalactosidase é produzida Os símbolos a serem adicionados à tabela são PROBLEMA RESOLVIDO 3 I P OC Z Y I P O Z Y Solução Tendo em vista que o segundo cromossomo é P precisamos considerar apenas o primeiro cromossomo Esse cromossomo é OC e assim a enzima é produzida na ausência de um indutor muito embora em virtude da mutação Z apenas a permease ativa Y seja produzida As entradas na tabela devem ser PROBLEMA RESOLVIDO 4 IS P O Z Y I P OC Z Y Solução Na ausência de um repressor IS todos os operadores do tipo selvagem são desligados tanto com um indutor quanto sem um indutor Portanto o primeiro cromossomo é incapaz de produzir qualquer enzima Entretanto o segundo cromossomo apresenta um operador alterado OC e pode produzir enzima tanto na ausência quanto na presença de um indutor Apenas o gene Y é do tipo selvagem no cromossomo OC e assim apenas a permease é produzida constitutivamente As entradas na tabela devem ser 1 2 3 4 5 PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Compare a estrutura de IPTG demonstrada na Figura 117 com a estrutura da galactose demonstrada na Figura 115 Por que o IPTG se liga ao repressor Lac mas não é fragmentado pela βgalactosidase Observando a Figura 119 por que os diploides parciais eram essenciais para estabelecer a natureza de ação trans do repressor Lac Seria possível distinguir os genes de ação cis dos genes de ação trans transatuantes em haploides Por que as mutações no promotor se agrupam nas posições 10 e 35 conforme demonstrado na Figura 1111 Qual interação de proteínaDNA é rompida por essas mutações Observando a Figura 1116 verifique a grande sobreposição entre o operador e a região do óperon lac que é transcrita Qual proteína se liga especificamente a essa sequência sobreposta e qual efeito ela apresenta sobre a transcrição Examinando a Figura 1121 qual efeito você prevê que as mutações do 6 7 8 9 10 trpA terão sobre os níveis de triptofano Examinando a Figura 1121 qual efeito você prevê que as mutações do trpA terão sobre a expressão do mRNA do trp PROBLEMAS BÁSICOS Qual das moléculas a seguir é um indutor do óperon lac a Galactose b Glicose c Alolactose d Isotiocianato e cAMP f Lactose Explique por que os alelos I no sistema lac normalmente são recessivos aos alelos I e por que os alelos I são recessivos aos alelos IS O que queremos dizer quando falamos que as mutações OC no sistema lac são de ação cis Os símbolos a b e c na tabela a seguir representam os genes do sistema lac de E coli em relação ao repressor I à região operadora O e à β galactosidase Z embora não necessariamente nessa ordem Além disso a ordem na qual os símbolos estão escritos nos genótipos não é necessariamente a sequência real no óperon lac Atividade ou inatividade do gene Z Genótipo Indutor ausente Indutor presente a b c a b c 11 12 a b c a b ca b c a b ca b c a b ca b c a b ca b c a Qual símbolo a b ou c representa cada um dos genes lac I O e Z b Na tabela um sinal de menos sobrescrito em um símbolo de gene indica meramente um mutante mas alguns comportamentos mutantes nesse sistema recebem designações de mutantes especiais Com a utilização dos símbolos gênicos convencionais em relação ao óperon lac designe cada genótipo na tabela O mapa do óperon lac é POZY A região promotora P é o local de início da transcrição por meio da ligação da molécula de RNA polimerase antes da real produção de mRNA Promotores alterados por mutação P aparentemente não conseguem ligar a molécula de RNA polimerase Podem ser feitas determinadas previsões a respeito do efeito das mutações P Utilize as suas previsões e o seu conhecimento sobre o sistema lactose para completar a tabela a seguir Insira um onde uma enzima é produzida e um onde nenhuma enzima é produzida A primeira foi realizada como um exemplo Explique as diferenças fundamentais entre o controle negativo e o controle positivo da transcrição em procariotos Cite dois exemplos de cada 13 14 15 16 mecanismo de controle Mutantes que são lacY retêm a capacidade de sintetizar βgalactosidase Entretanto embora o gene lacI ainda esteja intacto a βgalactosidade deixou de ser induzida pela adição de lactose ao meio Explique Quais são as analogias entre os mecanismos que controlam o óperon lac e aqueles que controlam os interruptores genéticos do fago λ Compare o arranjo dos sítios de ação cis nas regiões de controle do óperon lac e do fago λ Qual proteína reguladora induz os genes da fase lítica do ciclo de vida do fago λ a cI b Cro 17 18 19 20 c Repressor Lac d Lactose Preveja o efeito de uma mutação que elimine a atividade de ligação ao DNA da proteína σE na formação de esporos no Bacillus subtilis PROBLEMAS DESAFIADORES Uma mutação interessante em lacI resulta em repressores com aumento de 110 vezes de ligação a ambos o DNA operador e não operador Esses repressores demonstram uma curva de indução reversa que possibilita a síntese de βgalactosidase na ausência de um indutor IPTG mas que reprime parcialmente a expressão de βgalactosidase na presença de IPTG Como você pode explicar isso Observe que quando o IPTG se liga a um repressor ele não destrói completamente a afinidade pelo operador mas em vez disso reduz a afinidade em 110 vezes Adicionalmente na medida em que as células se dividem e novos operadores são produzidos pela síntese de filamentosfilhos o repressor deve encontrar os novos operadores por meio da busca ao longo do DNA ligandose rapidamente a sequências não operadoras e se dissociando delas Determinadas mutações lacI eliminam a ligação do operador ao repressor Lac mas não afetam a agregação de subunidades para a produção de um tetrâmero a forma ativa do repressor Essas mutações são parcialmente dominantes em relação ao tipo selvagem Você pode explicar o fenótipo I parcialmente dominante dos heterodiploides II Você está examinando a regulação do óperon da lactose na bactéria Escherichia coli Você isola sete novas linhagens mutantes independentes que não apresentam os produtos de todos os três genes estruturais Você suspeita que algumas dessas mutações são lacIS e que outras mutações são alterações que evitam a ligação da RNA polimerase à região promotora Com a utilização de quaisquer genótipos haploides e diploides parciais que você considere necessários descreva um conjunto de genótipos que permitirá que você diferencie entre as classes lacI e lacP de mutações não 21 22 indutíveis Você está estudando as propriedades de um novo tipo de mutação reguladora do óperon da lactose Essa mutação denominada S leva à repressão completa dos genes lacZ lacY e lacA independentemente da presença da lactose Os resultados dos estudos dessa mutação em diploides parciais demonstram que essa mutação é completamente dominante sobre o tipo selvagem Quando você trata bactérias da linhagem mutante S com um mutágeno e seleciona bactérias mutantes que conseguem expressar as enzimas codificadas pelos genes lacZ lacY e lacA na presença da lactose algumas mutações mapeiam na região do operador lac e outras para o gene repressor do lac Com base no seu conhecimento sobre o óperon da lactose forneça uma explicação genética molecular para todas essas propriedades da mutação S Inclua uma explicação sobre a natureza constitutiva das mutações reversas O óperon trp na E coli codifica enzimas essenciais para a biossíntese do triptofano O mecanismo geral para o controle do óperon trp é semelhante àquele observado com o óperon lac quando o repressor se liga ao operador a transcrição é evitada quando o repressor não se liga ao operador a transcrição prossegue A regulação do óperon trp difere da regulação do óperon lac da seguinte maneira as enzimas codificadas pelo óperon trp não são sintetizadas quando o triptofano está presente mas sim ausente No óperon trp o repressor apresenta dois sítios de ligação um para o DNA e o outro para a molécula efetora o triptofano O repressor trp deve primeiramente se ligar a uma molécula de triptofano antes que possa efetivamente se ligar ao operador trp a Desenhe um mapa do óperon do triptofano indicando o promotor P o operador O e o primeiro gene estrutural do óperon do triptofano trpA No seu desenho indique onde no DNA a proteína repressora se liga quando está ligada ao triptofano b O gene trpR codifica o repressor trpO é o operador trpA codifica a enzima triptofano sintetase Um repressor trpR não consegue se ligar ao 23 24 25 26 triptofano um operador trpO não consegue se ligar ao repressor e a enzima codificada por um gene mutante trpA é completamente inativa Você espera encontrar uma triptofano sintetase ativa em cada uma das linhagens mutantes a seguir quando as células são cultivadas na presença de triptofano Na sua ausência 1 R O A tipo selvagem 2 R O AR O A 3 R O AR O A É medida a atividade da enzima βgalactosidase produzida por células do tipo selvagem cultivadas em meio suplementado com diferentes fontes de carbono Em unidades relativas são observados os níveis de atividade a seguir Glicose Lactose Lactose glicose 0 100 1 Preveja os níveis relativos de atividade da βgalactosidase em células cultivadas sob condições semelhantes quando as células são lacI lacIS lacO e crp Observase que um bacteriófago λ é capaz de lisogenizar sua E coli hospedeira a 30C mas não a 42C Quais genes podem ser mutantes nesse fago O que aconteceria com a capacidade do bacteriófago λ de lisar uma célula hospedeira se ela adquirisse uma mutação no sítio de ligação OR em relação à proteína Cro Por quê Contraste os efeitos das mutações nos genes que codificam os fatores σ de esporulação específica com as mutações nas regiões 35 e 10 dos promotores de genes em seus regulons a As mutações funcionais nos genes do fator σ ou nos promotores individuais apresentariam o maior efeito sobre a esporulação b Com base nas sequências demonstradas na Figura 1130 B você esperaria que todas as mutações de ponto nas regiões 35 ou 10 afetassem a expressão gênica 1F Jacob The Statue Within An Autobiography 1988 2H F Judson The Eight Day of Creation Makers of the Revolution in Biology 1979 3F Jacob e J Monod Cold Spring Harbor Quant Symp Biol 26 1963 393 121 O RNA Xist marcado por um corante rodamina vermelho abrange uma das duas cópias do cromossomo X A expressão de Xist levará à inativação do cromossomo A imagem é de um experimento de hibridização fluorescente in situ FISH de RNA realizado em um cromossomo em metáfase obtido a partir de uma linhagem celular de fibroblasto feminino J T Lee et al Lessons from Xchromosome inactivation long ncRNA as guides and tethers to the epigenome Genes Dev 23 16 2009 18311842 Fig 2 Cold Spring Harbor Laboratory Press Fotografia de Jeannie Lee TÓPICOS Regulação da transcrição em eucariotos Visão geral 122 123 124 125 126 127 A Lições das leveduras Sistema GAL Cromatina dinâmica Ativação de genes em um ambiente de cromatina Inativação a longo prazo de genes em um ambiente de cromatina Silenciamento gêneroespecífico de genes e cromossomos inteiros Repressão gênica póstranscricional pelos miRNA RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Comparar e contrastar os mecanismos moleculares da regulação gênica em eucariotos e em bactérias Explicar como os eucariotos geram muitos padrões diferentes de expressão gênica com um número limitado de proteínas reguladoras Discutir o envolvimento da cromatina na regulação gênica eucariótica Descrever o conceito de marcas epigenéticas e discutir como podem atuar no DNA e nas proteínas Comparar e contrastar os papéis desempenhados por moléculas de RNA na repressão da expressão gênica eucariótica clonagem de Dolly uma ovelha foi relatada mundialmente em 1996 Figura 121 Dolly se desenvolveu a partir de núcleos somáticos adultos que haviam sido implantados dentro de ovócitos enucleados ovócitos com os núcleos removidos Mais recentemente vacas porcos camundongos e outros mamíferos também foram clonados com a utilização de tecnologias semelhantes A clonagem bemsucedida de Dolly foi uma grande surpresa para a comunidade científica tendo em vista que sabidamente a formação de gametas espermatozoides e ovócitos inclui modificações específicas do sexo nos respectivos genomas que resultam em padrões de expressão gênica específicos do sexo Dolly é um símbolo do quanto progredimos na compreensão dos aspectos da regulação gênica eucariótica tais como o controle global da expressão gênica exemplificado pelo desenvolvimento dos gametas Entretanto para cada clone de sucesso incluindo Dolly existem muitos mais talvez centenas de embriões que falham em se desenvolver em progênie viável A taxa de insucesso extremamente alta enfatiza o quanto ainda falta para a ser decifrado a respeito da regulação gênica eucariótica Neste capítulo examinaremos a regulação gênica em eucariotos De muitos modos a nossa observação da regulação gênica será um estudo de contrastes No Capítulo 11 você aprendeu como as atividades dos interruptores genéticos em bactérias com frequência eram reguladas por proteínas ativadoras ou repressoras únicas e como o controle de grupos de genes foi conquistado por meio de sua organização em óperons ou por meio da atividade de fatores específicos As expectativas iniciais eram de que a expressão gênica eucariótica seria regulada por meios semelhantes Em eucariotos entretanto a maior parte dos genes não é encontrada em óperons Além disso veremos que as proteínas e as sequências de DNA que participam na regulação gênica eucariótica são mais numerosas Com frequência muitas proteínas de ligação ao DNA atuam sobre um interruptor único com muitos interruptores separados por gene e as sequências reguladoras desses interruptores com frequência estão localizadas longe dos promotores Mais uma diferençachave entre as bactérias e os eucariotos é que o acesso aos promotores gênicos eucarióticos é restringido pela cromatina A regulação gênica em eucariotos requer a atividade de grandes complexos proteicos que promovem ou restringem o acesso a promotores gênicos pela RNA polimerase Este capítulo proporcionará um fundamento essencial para a compreensão da regulação espaço temporal da expressão gênica que realiza a coreografia do processo de desenvolvimento descrito no Capítulo 13 121 FIGURA 121 O primeiro mamífero clonado foi uma ovelha chamada Dolly Roslin InstitutePhototake Regulação da transcrição em eucariotos Visão geral As propriedades biológicas de cada tipo de célula eucariótica são amplamente determinadas pelas proteínas expressas dentro dela Essa constelação de proteínas expressas determina uma grande parte da arquitetura da célula suas atividades enzimáticas suas interações com o seu ambiente e muitas outras propriedades fisiológicas Entretanto em qualquer momento determinado na história de vida de uma célula apenas uma fração dos RNA e das proteínas codificadas em seu genoma é expressa Em momentos diferentes o perfil dos produtos de genes expressos pode diferir dramaticamente tanto em relação a quais proteínas são expressas quanto em quais níveis Como esses perfis específicos são gerados Assim como poderia ser esperado se o produto final é uma proteína a regulação pode ser alcançada por meio do controle da transcrição do DNA em RNA ou da tradução do RNA em proteína De fato a regulação gênica ocorre em muitos níveis incluindo o nível do mRNA por meio de alterações na recomposição ou na estabilidade do mRNA e após a tradução por meio de modificações das proteínas Os diversos modos como os genes eucarióticos podem ser regulados foram divididos em duas categorias gerais que refletem quando eles atuam regulação gênica transcricional e regulação gênica pós transcricional Enquanto a primeira será o enfoque primário deste capítulo a última está recebendo cada vez mais atenção Em particular o papel do RNA de atuar na repressão póstranscricional da expressão gênica denominado silenciamento gênico ver Capítulo 8 é uma das áreas de maior interesse das pesquisas atuais Três dos tipos de RNA que participam no silenciamento gênico o miRNA o ncRNA e o siRNA foram introduzidos no Capítulo 8 Posteriormente neste capítulo exploraremos os mecanismos de regulação gênica mediada pelo miRNA e pelo ncRNA A maior parte da regulação caracterizada até o momento ocorre no nível da transcrição gênica portanto neste capítulo o foco primário é na regulação da transcrição gênica O mecanismo básico em atuação é que sinais moleculares externos ou internos à célula levam à ligação de proteínas reguladoras a sítios específicos do DNA fora das regiões codificadoras de proteínas e a ligação dessas proteínas modula a velocidade da transcrição Essas proteínas podem auxiliar direta ou indiretamente a RNA polimerase na ligação ao seu sítio de início da transcrição o promotor ou podem reprimir a transcrição ao evitar a ligação da RNA polimerase Embora bactérias e eucariotos compartilhem uma grande parte da lógica da regulação gênica existem algumas diferenças fundamentais nos mecanismos subjacentes e no maquinário Ambos utilizam proteínas de ligação ao DNA com sequências específicas para modular o nível de transcrição Entretanto os genomas eucarióticos são maiores e sua diversidade de propriedades é maior do que aquela das bactérias Inevitavelmente a regulação dos genomas eucarióticos é mais complexa refletindo a sua complexidade estrutural e funcional Isso requer mais tipos de proteínas reguladoras e mais tipos de interações com as regiões reguladoras adjacentes no DNA Uma diferença notável é que o DNA eucariótico é compactado em nucleossomos formando a cromatina enquanto o DNA bacteriano não apresenta nucleossomos Em eucariotos a estrutura da cromatina é dinâmica e é um ingrediente essencial na regulação gênica Em geral o estado básico de um gene bacteriano é ligado Portanto normalmente a RNA polimerase consegue se ligar diretamente a um promotor quando nenhuma outra proteína reguladora está próxima para se ligar ao DNA Em bactérias o início da transcrição é evitado ou reduzido se a ligação da RNA polimerase estiver bloqueada normalmente por meio da ligação de uma proteína reguladora repressora As proteínas reguladoras ativadoras aumentam a ligação da RNA polimerase aos promotores onde pouco auxílio é necessário Contrariamente o estado básico em eucariotos é desligado Portanto o maquinário de transcrição incluindo a RNA polimerase II e os fatores gerais de transcrição associados não consegue se ligar ao promotor na ausência de outras proteínas reguladoras Figura 122 Em muitos casos não é possível a ligação do aparato transcricional tendo em vista que nucleossomos estão posicionados para bloquear o promotor Portanto a estrutura da cromatina normalmente precisa ser alterada para ativar a transcrição eucariótica Aquelas alterações em geral dependem da ligação de proteínas reguladoras a uma sequência específica do DNA A estrutura da cromatina ao redor dos genes ativados ou reprimidos dentro das células pode ser consideravelmente estável e herdada pelas célulasfilhas A herança dos estados da cromatina é um tipo de herança que não envolve diretamente a sequência de DNA ela proporciona um meio de regulação epigenética 1 2 FIGURA 122 Em bactérias a RNA polimerase normalmente consegue iniciar a transcrição exceto se uma proteína repressora a bloquear Em eucariotos entretanto a compactação do DNA com os nucleossomos evita a transcrição exceto se outras proteínas reguladoras estiverem presentes Essas proteínas reguladoras expõem as sequências promotoras ao alterar a densidade ou a posição do nucleossomo Elas também podem recrutar a RNA polimerase II mais diretamente por meio de ligação As características únicas da regulação transcricional eucariótica são o foco deste capítulo Algumas diferenças das bactérias no processo da transcrição e que afetam a regulação já foram observadas no Capítulo 8 Em bactérias todos os genes são transcritos em RNA pela mesma RNA polimerase enquanto três RNA polimerases atuam em eucariotos A RNA polimerase II que transcreve DNA em mRNA foi o foco do Capítulo 8 e será a única polimerase discutida neste capítulo Os transcritos de RNA são extensivamente processados durante a transcrição em eucariotos as extremidades 5 e 3 são modificadas e os íntrons são removidos 3 1 2 A RNA polimerase II é muito maior e mais complexa do que a sua correspondente bacteriana Um motivo de ser mais complexa é que a RNA polimerase II deve sintetizar RNA e coordenar os eventos únicos de processamento especiais de eucariotos Os eucariotos multicelulares podem apresentar até 25000 genes diversas vezes mais do que a bactéria média Além disso os padrões de expressão gênica eucariótica podem ser extraordinariamente complexos Ou seja o momento da expressão gênica e a quantidade de transcritos produzida variam amplamente entre os genes eucarióticos Por exemplo um gene pode ser transcrito apenas durante um estágio do desenvolvimento e outro apenas na presença de uma infecção viral Finalmente a maioria dos genes em uma célula eucariótica está desligada em qualquer momento Com base nessas considerações isoladamente a regulação gênica eucariótica deve ser capaz de Assegurar que a expressão da maior parte dos genes no genoma esteja desligada em qualquer momento enquanto ocorre a ativação de um subgrupo de genes Gerar milhares de padrões de expressão gênica Conforme você verá posteriormente no capítulo foram desenvolvidos mecanismos para assegurar que a maior parte dos genes em uma célula eucariótica não seja transcrita Antes de considerar como os genes são mantidos transcricionalmente inativos enfocaremos o segundo ponto como os genes eucarióticos são capazes de exibir enorme número e diversidade de padrões de expressão O maquinário necessário para a geração de tantos padrões de transcrição gênica in vivo apresenta muitos componentes incluindo as proteínas reguladoras de ação trans e as sequências de DNA reguladoras de ação cis Podemos dividir as proteínas reguladoras em dois conjuntos com base nas sequências reguladoras do DNA a que elas se ligam O primeiro conjunto de proteínas é o grande complexo de RNA polimerase II e os fatores gerais de transcrição a respeito dos quais você aprendeu no Capítulo 8 Para iniciar a transcrição essas proteínas interagem com sequências reguladoras de ação cis no DNA denominadas elementos proximais do promotor próximas do promotor de um gene O segundo conjunto de proteínas reguladoras é composto por fatores de transcrição que se ligam às sequências reguladoras de ação cis no DNA denominadas acentuadores Essas sequências reguladoras podem estar localizadas a uma distância considerável dos promotores gênicos Falando em termos gerais os promotores e seus elementos proximais são ligados por fatores de transcrição que afetam a expressão de muitos genes Os acentuadores são ligados por fatores de transcrição que controlam a regulação de subconjuntos menores de genes Com frequência um acentuador atuará em apenas um ou em alguns poucos tipos celulares em um eucarioto multicelular Uma grande parte da estratégia do controle transcricional eucariótico depende de como fatores de transcrição específicos controlam o acesso dos fatores gerais de transcrição e da RNA polimerase II Para que a RNA polimerase II transcreva o DNA em RNA a uma velocidade máxima múltiplos elementos reguladores de ação cis devem participar Os promotores seus elementos proximais e os acentuadores são todos alvos para a ligação ao DNA de diferentes proteínas de ação trans A Figura 123 é uma representação esquemática do promotor e dos elementos da sequência proximal do promotor A ligação da RNA polimerase II ao promotor não produz transcrição eficiente por si própria A transcrição requer a ligação de fatores gerais de transcrição a elementos proximais do promotor que são comumente encontrados dentro de 100 pb do sítio de início da transcrição de muitos genes mas não de todos Um desses elementos é o CCAAT boxe pronunciado cat e outro geralmente é um segmento rico em GC mais distante upstream Os fatores gerais de transcrição que se ligam aos elementos proximais do promotor são expressos na maior parte das células e assim estão disponíveis para iniciar a transcrição a qualquer momento Mutações nesses sítios podem apresentar um efeito dramático na transcrição demonstrando quão importantes eles são Se esses elementos de sequência estiverem mutados o nível de transcrição em geral é reduzido conforme demonstrado na Figura 124 Para modular a transcrição as proteínas reguladoras apresentam um ou mais dos domínios funcionais a seguir 1 2 Um domínio que reconhece uma sequência reguladora no DNA o sítio de ligação da proteína ao DNA Um domínio que interage com uma ou mais proteínas do aparato de transcrição RNA polimerase ou uma proteína associada à RNA polimerase FIGURA 123 A região upstream do sítio de início da transcrição em eucariotos superiores contém elementos proximais do promotor e o promotor FIGURA 124 Mutações de ponto no promotor e nos elementos proximais do promotor impedem a transcrição do gene da βglobina Mutações de ponto por toda a região do promotor foram analisadas em relação aos seus efeitos sobre as taxas de transcrição A altura de cada linha representa o nível de transcrição em relação a um promotor do tipo selvagem ou elemento proximal do promotor 10 Apenas as substituições de bases que estão localizadas dentro dos três elementos demonstrados alteram o nível de transcrição As 3 4 5 122 posições com pontos pretos não foram testadas Dados de T Maniatis S Goodbourn e J A Fischer Regulation of Inducible and TissueSpecific Gene Expression Science 236 1987 1237 Um domínio que interage com proteínas ligadas a sequências reguladoras próximas no DNA de tal modo que elas possam atuar de modo cooperativo para regular a transcrição Um domínio que influencia a condensação da cromatina seja direta ou indiretamente Um domínio que atua como um sensor das condições fisiológicas dentro da célula Os mecanismos reguladores de genes eucarióticos foram descobertos por meio de abordagens bioquímicas e genéticas As últimas sofreram avanços em particular por meio de estudos da levedura unicelular Saccharomyces cerevisiae ver Organismomodelo adiante Esse organismo que desempenhou um papel chave em vinificação produção de cervejas e panificação por muitos séculos tem sido um passaporte para a compreensão de uma grande parte da biologia celular eucariótica Diversas décadas de pesquisas produziram muitas percepções fundamentais sobre os princípios de como as proteínas reguladoras da transcrição eucariótica atuam e como os diferentes tipos celulares são gerados Examinaremos dois sistemas reguladores de genes de levedura em detalhes o primeiro se refere à via de utilização da galactose o segundo é o controle do tipo reprodutivo Lições das leveduras Sistema GAL Para fazer uso da galactose extracelular a levedura importa o açúcar e o converte em um tipo de glicose que pode ser metabolizada Diversos genes GAL1 GAL2 GAL7 e GAL10 no genoma de levedura codificam enzimas que catalisam as etapas na via bioquímica que converte a galactose em glicose Figura 125 Três genes adicionais GAL3 GAL4 e GAL80 codificam proteínas que regulam a expressão dos genes enzimáticos Assim como no sistema lac de E coli a abundância do açúcar determina o nível de expressão gênica na via bioquímica Em células de levedura cultivadas em meios com ausência de galactose os genes GAL são amplamente silenciados Mas na presença de galactose e na ausência de glicose os genes GAL são induzidos Assim como em relação ao óperon lac as análises genéticas e moleculares de mutantes têm sido uma chave para compreender como a expressão dos genes na via da galactose é controlada FIGURA 125 A galactose é convertida em glicose1fosfato em uma série de etapas Essas etapas são catalisadas por enzimas Gal1 e assim por diante codificadas pelos genes estruturais GAL1 GAL2 GAL7 e GAL10 O reguladorchave da expressão gênica de GAL é a proteína Gal4 uma proteína de ligação ao DNA sequênciaespecífica A Gal4 talvez seja a proteína reguladora da transcrição mais bemestudada em eucariotos A dissecção detalhada da sua regulação e atividade tem sido uma fonte de diversas percepçõeschave sobre o controle da transcrição em eucariotos ORGANISMOMODELO Levedura O Saccharomyces cerevisiae surgiu nos últimos anos como um importante sistema genético eucariótico Os seres humanos têm cultivado leveduras há séculos tendo em vista que são um componente essencial da cerveja do pão e do vinho A levedura apresenta muitas características que a tornam um organismomodelo ideal Como um eucarioto unicelular ela pode ser cultivada em placas com ágar e com o ciclo de vida da levedura de apenas 90 minutos grandes quantidades podem ser cultivadas em meio líquido Ela apresenta um genoma muito compacto com aproximadamente apenas 12 megapares de bases de DNA em comparação a quase 3000 megapares de bases nos seres humanos que contêm aproximadamente 6000 genes distribuídos em 16 cromossomos Foi o primeiro eucarioto a ter o seu genoma sequenciado O ciclo de vida da levedura a torna muito versátil para estudos laboratoriais As células podem ser cultivadas como diploides ou haploides Em ambos os casos a célulamãe produz um brotamento que contém uma célulafilha idêntica As células diploides continuam a crescer por brotamento ou são induzidas à meiose que produz quatro esporos haploides mantidos unidos em um asco também chamado tétrade Os esporos haploides de tipo reprodutivo oposto a ou α se fundirão e formarão um diploide Esporos do mesmo tipo reprodutivo continuarão a crescer por brotamento A levedura tem sido denominada a E coli dos eucariotos em virtude da facilidade da análise de mutantes direta e reversa Para isolar mutantes por meio de uma abordagem genética direta são induzidas mutações nas células haploides com raios X por exemplo e triadas em placas em relação aos fenótipos mutantes Esse procedimento normalmente é realizado primeiramente por meio do plaqueamento de células em um meio rico no qual todas as células crescem e por meio da realização de cópias ou plaqueamento em réplica das colônias dessa placa máster em placas de réplica que contêm meio seletivo ou condições de crescimento especiais Ver também o Capítulo 16 Por exemplo mutantes sensíveis à temperatura crescerão na placa máster na temperatura permissiva mas não na réplica em uma temperatura restritiva A comparação das colônias nas placas máster e réplica revelará os mutantes sensíveis à temperatura Com a utilização da genética reversa os cientistas também conseguem substituir qualquer gene de levedura de função conhecida ou desconhecida por uma versão mutante sintetizada em um tubo de ensaio para compreender a natureza do produto gênico Micrografia eletrônica de células de levedura de brotamento SciMAT Science Souce O ciclo de vida de S cerevisiae Os alelos nucleares MATa e MATα determinam o tipo reprodutivo Gal4 regula múltiplos genes por meio de sequências de ativação upstream Na presença de galactose os níveis de expressão dos genes GAL1 GAL2 GAL7 e GAL10 são 1000 vezes superiores ou mais do que na sua ausência Em mutantes GAL4 entretanto eles permanecem silenciosos Cada um desses quatro genes apresenta dois ou mais sítios de ligação Gal4 localizados a alguma distância de 5 upstream do seu promotor Considere os genes GAL10 e GAL1 que estão adjacentes entre si e que são transcritos em sentidos opostos Entre o sítio de início da transcrição de GAL1 e o sítio de início da transcrição de GAL10 está uma única região de 118 pb que contém quatro sítios de ligação Gal4 Figura 126 Cada sítio de ligação Gal4 apresenta de 17 pares de bases de comprimento e está ligado por um dímero da proteína Gal4 Também existem dois sítios de ligação Gal4 upstream do gene GAL2 e outros dois upstream do gene GAL7 Esses sítios de ligação são necessários para a ativação gênica in vivo Se eles são deletados os genes são silenciados até mesmo na presença de galactose Essas sequências reguladoras são acentuadores A presença de acentuadores localizados a uma distância linear considerável do promotor de um gene eucariótico é típica Tendo em vista que os acentuadores ativados por Gal4 estão localizados upstream 5 dos genes que eles regulam eles também são denominados sequências de ativação upstream UAS CONCEITOCHAVE A ligação de proteínas de ligação ao DNA sequência específicas a regiões fora dos promotores dos genesalvo é uma característica comum da regulação da transcrição eucariótica Proteína Gal4 apresenta domínios de ligação ao DNA e ativação separados Após a ligação de Gal4 ao elemento UAS como a expressão gênica é induzida É necessário um domínio distinto da proteína Gal4 o domínio de ativação para a atividade reguladora Portanto a proteína Gal4 apresenta no mínimo dois domínios um para a ligação ao DNA e outro para a ativação da transcrição Observouse que uma organização modular semelhante é uma característica comum também de outros fatores de transcrição de ligação ao DNA A organização modular da proteína Gal4 foi demonstrada em uma série de experimentos A estratégia era testar a ligação ao DNA e a ativação gênica de formas mutantes da proteína nas quais partes haviam sido deletadas ou fundidas a outras proteínas Dessa maneira os investigadores puderam determinar se uma parte da proteína era necessária para uma função em particular Para realizar esses estudos os experimentadores necessitavam de um meio simples para analisar a expressão das enzimas codificadas pelos genes GAL A expressão dos genes GAL e outros alvos de fatores de transcrição é tipicamente monitorada por meio da utilização de um gene repórter cujo nível de expressão é facilmente medido Nos construtos de gene repórter ele é ligado a sequências reguladoras que determinam a expressão do gene que está sendo investigado A expressão do gene repórter reflete a atividade do elemento regulador que está sendo investigado Com frequência o gene repórter é o gene lacZ de E coli O lacZ é um gene repórter eficaz pois os produtos de sua atividade são facilmente medidos Outro gene repórter comum é o que codifica a proteína fluorescente verde GFP da águaviva Conforme a sua denominação sugere a concentração da proteína repórter é facilmente medida pela quantidade de luz que ela emite Para investigar o controle da expressão do gene GAL a região codificadora de um desses genes repórter e um promotor são posicionados downstream de um elemento UAS do gene GAL A expressão do repórter é então uma leitura da atividade de Gal4 nas células Figura 127 A Vejamos o que ocorre quando uma forma da proteína Gal4 com ausência do domínio de ativação é expressa em leveduras Nesse caso os sítios de ligação do elemento UAS estão ocupados mas nenhuma transcrição é estimulada Figura 127 B O mesmo é verdadeiro quando outras proteínas reguladoras com ausência de domínios de ativação tais como o repressor bacteriano LexA são expressas nas células que contêm genes repórter com seus respectivos sítios de ligação O resultado mais interessante é obtido quando o domínio de ativação da proteína Gal4 é inserido no domínio de ligação ao DNA da proteína LexA a proteína híbrida agora ativa a transcrição dos sítios de ligação de LexA Figura 127 D Experimentos adicionais de permuta de domínio revelaram que a função de ativação da transcrição da proteína Gal4 reside em duas pequenas regiões com comprimento de aproximadamente 50 a 100 aminoácidos Essas duas regiões formam um domínio de ativação em separado que auxilia no recrutamento do maquinário da transcrição para o promotor conforme veremos posteriormente nesta seção Esse arranjo altamente modular dos domínios de regulação de atividade é observado em muitos fatores de transcrição FIGURA 126 A proteína Gal4 ativa os genesalvo por meio de elementos de sequência de ativação upstream UAS A proteína Gal4 apresenta dois domínios funcionais um domínio de ligação ao DNA quadrado rosa e um domínio de ativação oval laranja A proteína se liga como um dímero a sequências específicas upstream dos promotores gênicos da via Gal Alguns dos genes GAL são adjacentes GAL1 GAL10 enquanto outros estão em cromossomos diferentes O elemento UAS GAL1 contém quatro sítios de ligação Gal4 FIGURA 127 Proteínas ativadoras da transcrição apresentam múltiplos domínios separáveis A A proteína Gal4 apresenta dois domínios e forma um dímero B A remoção experimental do domínio de ativação demonstra que a ligação ao DNA não é suficiente para a ativação gênica C De modo semelhante a proteína LexA bacteriana não consegue ativar a transcrição por si própria mas quando fundida ao domínio de ativação Gal4 D consegue ativar a transcrição por meio dos sítios de ligação de LexA CONCEITOCHAVE Muitas proteínas eucarióticas reguladoras de transcrição são proteínas modulares que apresentam domínios separados para a ligação ao DNA ativação ou repressão e interação com outras proteínas Atividade da Gal4 é regulada fisiologicamente Como a Gal4 se torna ativa na presença de galactose As indicaçõeschave advêm da análise de mutações nos genes GAL80 e GAL3 Em mutantes GAL80 os genes estruturais GAL estão ativos até mesmo na ausência de galactose Esse resultado sugere que a função normal da proteína Gal80 é inibir de algum modo a expressão do gene GAL Contrariamente em mutantes GAL3 os genes estruturais GAL não estão ativos na presença de galactose sugerindo que Gal3 normalmente promove a expressão dos genes GAL Análises bioquímicas extensivas revelaram que a proteína Gal80 se liga à proteína Gal4 com alta afinidade e inibe diretamente a atividade de Gal4 Especificamente Gal80 se liga a uma região em um dos domínios de ativação de Gal4 bloqueando a sua capacidade de promover a transcrição dos genesalvo A proteína Gal80 é expressa continuamente de modo que ela está sempre atuando para reprimir a transcrição dos genes estruturais GAL exceto se for interrompida O papel da proteína Gal3 é liberar os genes estruturais GAL da repressão pela Gal80 quando a galactose está presente Portanto Gal3 é tanto um sensor quanto um indutor Quando Gal3 se liga à galactose e ao ATP ela é submetida a uma alteração alostérica que promove a ligação à Gal80 que por sua vez permite que Gal80 liberte Gal4 que então é capaz de interagir com outros fatores de transcrição e a RNA pol II para ativar a transcrição de seus genesalvo Portanto Gal3 Gal80 e Gal4 são todas partes de uma mudança cujo estado é determinado pela presença ou pela ausência de galactose Figura 128 Nessa mudança a ligação do regulador transcricional ao DNA não é a etapa regulada fisiologicamente como no caso no óperon lac e no bacteriófago λ em vez disso a atividade do domínio de ativação é regulada CONCEITOCHAVE A atividade das proteínas reguladoras da transcrição eucariótica com frequência é controlada por interações com outras proteínas Funções da Gal4 na maior parte dos eucariotos Além de sua ação em células de levedura demonstrouse que a Gal4 é capaz de ativar a transcrição em células de insetos células humanas e de muitas outras espécies eucarióticas Essa versatilidade sugere que o maquinário bioquímico e os mecanismos de ativação gênica são comuns a uma ampla variedade de eucariotos que as características reveladas em leveduras em geral estão presentes em outros eucariotos e viceversa Além disso em virtude da sua versatilidade a Gal4 e seus elementos UAS se tornaram ferramentas favorecidas na análise genética para a manipulação da expressão e da função gênica em uma ampla variedade de sistemasmodelo FIGURA 128 A atividade de Gal4 é regulada pela proteína Gal80 Na ausência de galactose a proteína Gal4 é inativa muito embora ela possa se ligar a sítios upstream do genealvo GAL1 A atividade de Gal4 é suprimida pela ligação da proteína Gal80 parte superior Na presença de galactose e da proteína Gal3 Gal80 sofre uma alteração na conformação e é liberada possibilitando que o domínio de ativação Gal4 ative a transcrição do genealvo parte inferior CONCEITOCHAVE A capacidade de Gal4 bem como de outros reguladores eucarióticos de atuar em uma diversidade de eucariotos indica que os eucariotos em geral apresentam o maquinário regulador da transcrição e mecanismos em comum Agora observaremos como os ativadores e outras proteínas reguladoras interagem com o maquinário de transcrição para controlar a expressão gênica Ativadores recrutam o maquinário de transcrição Em bactérias ativadores comumente estimulam a transcrição por meio da interação diretamente com o DNA e com a RNA polimerase Em eucariotos os ativadores em geral atuam indiretamente Os ativadores eucarióticos recrutam a RNA polimerase II para promotores gênicos por meio de dois mecanismos importantes Primeiramente os ativadores podem interagir com subunidades dos complexos proteicos que atuam no início da transcrição e em seguida os recrutam para o promotor Em segundo lugar os ativadores podem recrutar proteínas que modificam a estrutura da cromatina possibilitando à RNA polimerase II e a outras proteínas o acesso ao DNA Muitos ativadores incluindo Gal4 apresentam ambas as atividades Primeiramente examinaremos o recrutamento de partes do complexo de iniciação transcricional Lembre do Capítulo 8 que o maquinário da transcrição eucariótica contém muitas proteínas que são parte de diversos subcomplexos no aparato de transcrição o que é montado nos promotores gênicos Um subcomplexo o fator de transcrição IID TFIID ligase ao TATA boxe de promotores eucarióticos por meio da proteína de ligação a TATA TBP ver Figura 812 Um modo pelo qual a Gal4 atua para ativar a expressão gênica é pela ligação à TBP em um sítio no seu domínio de ativação Por meio dessa interação de ligação recruta o complexo TFIID e por sua vez a RNA polimerase II para o promotor Figura 129 A força dessa interação entre Gal4 e TBP está bem correlacionada com a potência de Gal4 como um ativador Um segundo modo pelo qual a Gal4 atua para ativar a expressão gênica é pela interação com o complexo mediador um grande complexo multiproteico que por sua vez interage diretamente com a RNA polimerase II para recrutála para os promotores gênicos O complexo mediador é um exemplo de coativador termo aplicado a uma proteína ou um complexo proteico que facilita a ativação gênica por meio de um fator de transcrição mas que por si próprio não é parte do maquinário de transcrição nem é uma proteína de ligação ao DNA A capacidade dos fatores de transcrição de se ligarem às sequências do DNA upstream e interagirem com proteínas que se ligam direta ou indiretamente aos promotores ajuda a explicar como a transcrição pode ser estimulada por sequências reguladoras mais distantes ver Figura 129 FIGURA 129 Gal4 recruta o maquinário de transcrição A proteína Gal4 e muitos outros ativadores de transcrição se ligam a múltiplos complexos proteicos incluindo o TFIID e os complexos mediadores demonstrados aqui setas tracejadas que recrutam a RNA polimerase II para os promotores gênicos As interações facilitam a ativação gênica pelos sítios de ligação que estão distantes dos promotores gênicos CONCEITOCHAVE Os ativadores da transcrição eucariótica com frequência atuam por meio do recrutamento de partes do maquinário de transcrição para os promotores gênicos Controle do tipo reprodutivo de leveduras Interações combinatórias Até agora enfocamos neste capítulo a regulação de genes únicos ou de alguns genes em uma via Em organismos multicelulares tipos celulares distintos diferem na expressão de centenas de genes A expressão ou a repressão de grupos de genes portanto deve ser coordenada na formação de tipos celulares em particular Um dos exemplos mais bemcompreendidos de regulação do tipo celular em eucariotos é a regulação do tipo reprodutivo em leveduras Esse sistema regulador foi dissecado por uma combinação de genética biologia molecular e bioquímica O tipo reprodutivo atua como um excelente modelo para a compreensão da lógica da regulação gênica em animais multicelulares Saccharomyces cerevisiae pode existir em qualquer um de três tipos celulares diferentes conhecidos como a α e aα Os dois tipos celulares a e α são haploides e contêm apenas uma cópia de cada cromossomo A célula aα é diploide e contém duas cópias de cada cromossomo Embora os dois tipos de células haploides não possam ser distinguidos por seu aspecto ao microscópio eles podem ser diferenciados por meio de uma diversidade de características celulares específicas principalmente do seu tipo reprodutivo ver Organismo modelo anteriormente Uma célula α cruza apenas com uma célula a e uma célula a cruza apenas com uma célula α Uma célula α secreta um oligopeptídio feromônio ou hormônio sexual denominado fator α que paralisa as células a no ciclo celular De modo semelhante uma célula a secreta um feromônio denominado fator a que paralisa as células α A parada celular de ambos os participantes é necessária para o sucesso reprodutivo A célula diploide aα não realiza cruzamento é maior do que as células α e a e não responde aos hormônios reprodutivos A análise genética de mutantes defeituosos no cruzamento demonstrou que o tipo celular é controlado por um único locus genético o locus do tipo reprodutivo MAT Existem dois alelos do locus MAT as células haploides a apresentam o alelo MATa e as células haploides α apresentam o alelo MATα A célula diploide aα apresenta ambos os alelos Embora o tipo reprodutivo esteja sob o controle genético determinadas linhagens alteram o seu tipo reprodutivo por vezes tão frequentemente quanto a cada divisão celular Examinaremos a base da alteração posteriormente neste capítulo mas primeiramente vejamos como cada tipo celular expressa o grupo de genes correto Veremos que diferentes combinações de proteínas de ligação ao DNA regulam a expressão de conjuntos de genes específicos para tipos celulares diferentes Como o locus MAT controla o tipo celular Análises genéticas de mutantes que não podem cruzar identificaram uma quantidade de genes estruturais que estão separados do locus MAT mas cujos produtos proteicos são necessários para o cruzamento Um grupo de genes estruturais é expresso apenas no tipo celular α genes específicos de α e outro grupo é expresso apenas no tipo celular a genes aespecíficos O locus MAT controla quais desses grupos de genes estruturais são expressos em cada tipo celular O alelo MATa causa a expressão dos genes estruturais da célula do tipo a enquanto o alelo MATα causa a expressão dos genes estruturais da célula do tipo α Esses dois alelos ativam diferentes grupos de genes tendo em vista que codificam diferentes proteínas reguladoras Além disso uma proteína reguladora não codificada pelo locus MAT denominada MCM1 desempenha um papelchave na regulação do tipo celular O caso mais simples é o tipo celular a Figura 1210 A O locus MATa codifica uma única proteína reguladora a1 Entretanto a1 não apresenta efeito em células haploides apenas em células diploides Em uma célula haploide a a proteína reguladora Mcm1 ativa a expressão dos genes estruturais necessários para uma célula a ligandose às sequências reguladoras em promotores gênicos aespecíficos Em uma célula α os genes estruturais αespecíficos devem ser transcritos mas além disso devese evitar que a proteína MCM1 ative genes aespecíficos A sequência do DNA do alelo MATα codifica duas proteínas α1 e α2 que são produzidas por unidades de transcrição em separado Essas duas proteínas apresentam papéis reguladores diferentes na célula conforme pode ser demonstrado por meio da análise das suas propriedades de ligação do DNA in vitro Figura 1210 B A proteína α1 é um ativador de expressão gênica α específico Ela se liga em combinação com a proteína MCM1 a uma sequência discreta de DNA que controla diversos genes αespecíficos A proteína α2 reprime a transcrição de genes aespecíficos Ela se liga como um dímero com MCM1 a sítios nas sequências de DNA localizadas upstream de um grupo de genes aespecíficos e atua como um repressor Em uma célula diploide de levedura as proteínas reguladoras codificadas por cada locus MAT são expressas Figura 1210 C Qual é o resultado Todos os genes estruturais envolvidos no cruzamento celular são desligados pois são um conjunto de genes em separado denominados haploides específicos que é expresso em células haploides mas não em células diploides Como isso ocorre A proteína a1 codificada por MATa tem finalmente uma função a desempenhar A proteína a1 consegue se ligar a algumas das proteínas α2 presentes e alterar sua especificidade de ligação de modo que o complexo de a1α2 não se liga a genes aespecíficos Em vez disso o complexo de a1α2 se liga a uma sequência diferente localizada upstream dos genes haploideespecíficos Então em células diploides a proteína α2 se apresenta em duas formas 1 como um complexo α2 MCM1 que reprime genes aespecíficos e 2 em um complexo com a proteína a1 que reprime genes específicos de haploides Além disso o complexo de a1α2 também reprime a expressão do gene α1 que assim deixa de estar presente para ligar os genes αespecíficos Os diferentes parceiros de ligação determinam quais sequências de DNA específicas são ligadas e quais genes são regulados por cada um dos complexos que contêm α2 A regulação de diferentes conjuntos de genes alvo por meio da associação do mesmo fator de transcrição com diferentes parceiros de ligação desempenha um papel importante na geração de diferentes padrões de expressão gênica em diferentes tipos celulares dentro de eucariotos multicelulares 123 FIGURA 1210 Controle da expressão gênica específica do tipo celular em leveduras Os três tipos celulares de S cerevisiae são determinados pelas proteínas reguladoras a1 α1 e α2 que regulam diferentes subconjuntos de genesalvo A proteína MCM1 atua em todos os três tipos celulares e interage com α1 e α2 CONCEITOCHAVE Em leveduras e em eucariotos multicelulares os padrões de expressão gênica específicos do tipo celular são regulados por combinações de fatores de transcrição que interagem Cromatina dinâmica Um segundo mecanismo que influencia a transcrição gênica em eucariotos modifica a estrutura da cromatina local ao redor das sequências gênicas reguladoras Para compreender totalmente como esse mecanismo atua primeiramente precisamos compreender a estrutura da cromatina e em seguida considerar como ela pode ser alterada e como essas alterações afetam a expressão gênica O recrutamento do maquinário de transcrição por ativadores pode aparentar ser um pouco semelhante em eucariotos e bactérias com a principal diferença sendo o número de proteínas que interagem no maquinário de transcrição De fato há duas décadas muitos biólogos imaginavam a regulação eucariótica simplesmente como uma versão bioquimicamente mais complicada daquela que havia sido descoberta em bactérias Entretanto essa visão foi alterada dramaticamente na medida em que os biólogos consideraram o efeito da organização do DNA genômico em eucariotos Em comparação ao DNA eucariótico o DNA bacteriano é relativamente nu o que o torna prontamente acessível para a RNA polimerase Contrariamente os cromossomos eucarióticos estão compactados na cromatina que é composta por DNA e proteínas principalmente histonas A unidade básica da cromatina é o nucleossomo que contém aproximadamente 150 pb de DNA envolto 17 vez ao redor de um cerne de proteínas histonas Figura 1211 O cerne do nucleossomo contém oito histonas duas subunidades de cada uma das quatro histonas histonas 2A 2B 3 e 4 denominadas H2A H2B H3 e H4 organizadas como dois dímeros de H2A e H2B e um tetrâmero de H3 e H4 Circundando o cerne do nucleossomo encontrase uma histona ligante H1 que consegue compactar os nucleossomos em estruturas de ordem superior que condensam ainda mais o DNA FIGURA 1211 A O nucleossomo na cromatina descondensada e condensada B Vista final da cadeia enrolada de nucleossomos C A estrutura da cromatina varia ao longo do comprimento de um cromossomo A cromatina menos condensada eucromatina está demonstrada em amarelo as regiões de condensação intermediária estão em laranja e azul e a heterocromatina revestida por proteínas especiais roxo está em vermelho C De P J Horn e C L Peterson Chromatin Higher Order Folding Wrapping Up Transcription Science 297 2002 1827 Fig 3 Copyright 2002 AAAS A compactação do DNA eucariótico em cromatina significa que uma grande parte do DNA não está prontamente acessível às proteínas reguladoras e ao aparato de transcrição Portanto enquanto os genes procarióticos em geral estão acessíveis e ligados exceto se reprimidos os genes eucarióticos estão inacessíveis e desligados exceto se ativados Portanto a modificação da estrutura da cromatina é uma característica distintiva de muitos processos 1 2 3 eucarióticos incluindo a regulação gênica discutida neste capítulo a replicação do DNA Capítulo 7 e o reparo do DNA Capítulo 16 Existem três mecanismos importantes para alterar a estrutura da cromatina que serão discutidos de modo aprofundado nesta seção Movimentação dos nucleossomos ao longo do DNA também denominada remodelagem da cromatina Modificação das histonas no cerne do nucleossomo Substituição das histonas comuns em um nucleossomo por variantes de histonas Proteínas remodeladoras da cromatina e ativação gênica Um modo de alterar a estrutura da cromatina pode ser simplesmente mover o octâmero de histonas ao longo do DNA Na década de 1980 foram desenvolvidas técnicas bioquímicas que possibilitaram que os pesquisadores determinassem a posição dos nucleossomos em e ao redor de genes específicos Nesses estudos a cromatina foi isolada de tecidos ou células nos quais um gene estava ligado e comparada à cromatina do tecido no qual o mesmo gene estava desligado O resultado em relação à maior parte dos genes analisados foi que as posições dos nucleossomos estavam alteradas especialmente nas regiões reguladoras dos genes Portanto as regiões do DNA que estão enroladas nos nucleossomos podem ser alteradas as posições do nucleossomo podem ser alteradas no DNA de célula para célula e ao longo do ciclo de vida de um organismo A transcrição é reprimida quando o promotor e as sequências flanqueadoras estão enrolados em um nucleossomo o que evita o início da transcrição pela RNA pol II Portanto a ativação da transcrição requer que os nucleossomos sejam deslocados para longe do promotor Contrariamente quando a repressão gênica é necessária os nucleossomos são alterados para uma posição que evita a transcrição A alteração da posição do nucleossomo é denominada remodelagem da cromatina Sabidamente a remodelagem da cromatina é uma parte integral da expressão gênica eucariótica e estão sendo feitos grandes avanços na determinação dos mecanismos subjacentes e das proteínas reguladoras participantes Aqui novamente os estudos genéticos em leveduras foram essenciais Duas triagens genéticas em leveduras na busca por mutantes em processos aparentemente não relacionados levaram à descoberta do mesmo gene cujo produto desempenha um papelchave na remodelagem da cromatina Em ambos os casos as células de leveduras foram tratadas com agentes que causariam mutações Em uma triagem essas células de leveduras mutagenizadas foram triadas na busca por células que não cresciam adequadamente em sacarose mutantes não fermentadores de açúcar sugar em inglês snf Em outra triagem células de leveduras mutagenizadas foram triadas na busca por mutantes que fossem defeituosos em alterar seu tipo reprodutivo mutantes de alteração swi ver Seção 125 Muitos mutantes em relação a diferentes loci foram recuperados em cada triagem mas observouse que um gene mutante causa ambos os fenótipos Os mutantes no assim denominado locus swi2snf2 switchsniff não conseguem utilizar a sacarose efetivamente nem alterar o tipo reprodutivo Qual era a conexão entre a capacidade de utilizar o açúcar e a capacidade de alterar os tipos reprodutivos A proteína Swi2Snf2 foi purificada e descobriuse que é parte de um grande complexo multissubunitário denominado complexo de SWISNF que consegue reposicionar os nucleossomos em uma análise em tubo de ensaio se o ATP for fornecido como uma fonte de energia Figura 1212 Em algumas situações o complexo multissubunitário SWISNF ativa a transcrição por meio da movimentação dos nucleossomos que estão recobrindo as sequências TATA Desse modo o complexo facilita a ligação da RNA polimerase II O complexo de SWISNF portanto é um coativador A Gal4 também se liga ao complexo de remodelagem da cromatina SWISNF e o recruta para promotores ativados Linhagens de leveduras que contêm um complexo SWISNF defeituoso demonstram um nível reduzido de atividade de Gal4 Por que um ativador pode utilizar múltiplos mecanismos de ativação Existem no mínimo dois motivos compreendidos no momento O primeiro é que os promotoresalvo podem se tornar menos acessíveis em determinados estágios do ciclo celular ou em determinados tipos celulares em eucariotos multicelulares Por exemplo os genes estão menos acessíveis durante a mitose quando a cromatina está mais condensada Naquele estágio a Gal4 deve recrutar o complexo de remodelagem da cromatina enquanto em outras ocasiões pode não ser necessário utilizar o complexo FIGURA 1212 O octâmero de histonas desliza em resposta à atividade de remodelagem da cromatina tal como aquela do complexo SWISNF neste caso expondo o DNA marcado em vermelho Ver Figura 1219 para os detalhes sobre como o SWISNF é recrutado para uma região do DNA em particular Um segundo motivo é que muitos fatores de transcrição atuam em combinações para controlar a expressão gênica de modo sinérgico Veremos brevemente que essa sinergia combinatória é resultante do fato de que os complexos de remodelagem da cromatina e o maquinário de transcrição são recrutados de modo mais eficiente quando diversos fatores de transcrição atuam em conjunto CONCEITOCHAVE A cromatina pode ser dinâmica os nucleossomos não necessariamente estão em posições fixas no cromossomo A remodelagem da cromatina altera a densidade ou a posição do nucleossomo e é uma parte integrante da regulação gênica eucariótica Modificação das histonas Vejamos o nucleossomo mais de perto para verificar se alguma parte dessa estrutura poderia carregar a informação necessária para influenciar a posição do nucleossomo a densidade do nucleossomo ou ambas Conforme já declarado a maior parte dos nucleossomos é composta por um octâmero de histonas composto por dois dímeros de H2A e H2B e um tetrâmero de H3 e H4 Sabidamente as histonas são as proteínas mais conservadas na natureza ou seja as histonas são quase idênticas em todos os organismos eucarióticos desde leveduras até plantas e até animais No passado essa conservação contribuiu para a visão de que as histonas não poderiam participar em nada mais complicado do que a compactação do DNA para o encaixe no núcleo Entretanto relembre que o DNA apenas com suas quatro bases chegou a ser considerado uma molécula muito simples para conter o mapa de todos os organismos sobre a Terra A Figura 1213 A demonstra um modelo de estrutura de nucleossomo que representa contribuições de muitos estudos Digno de nota é que as proteínas histonas estão organizadas no cerne do octâmero com algumas de suas extremidades aminoterminais realizando contatos eletrostáticos com o esqueleto de fosfato do DNA circundante Essas extremidades em protrusão são denominadas caudas de histonas Desde o início da década de 1960 sabese que resíduos de aminoácidos básicos específicos lisina e arginina nas caudas de histonas podem ser modificados de modo covalente por meio da ligação de grupos acetil e metil Figura 1213 B Essas reações que ocorrem após a proteína histona ter sido traduzida e até mesmo após a histona ter sido incorporada ao nucleossomo são denominadas modificações póstradução PTM Sabese que existem no mínimo 150 modificações diferentes de histonas que utilizam uma ampla variedade de moléculas além dos grupos acetil e metil já mencionados incluindo fosforilação ubiquitinação e ribosilação de ADP Dizse que a modificação covalente das caudas de histonas contribui para um código de histonas Cientistas cunharam a expressão código de histonas em virtude de a modificação covalente das caudas de histonas ser reminiscente do código genético Em relação ao código de histonas a informação é armazenada nos padrões de modificação de histonas em vez de na sequência de nucleotídios Com mais de 150 modificações de histonas conhecidas existe um número enorme de possíveis padrões e os cientistas estão apenas começando a decifrar os seus efeitos sobre a estrutura da cromatina e a regulação da transcrição Para aumentar essa complexidade o código provavelmente não é interpretado precisamente do mesmo modo em todos os organismos O papel da acetilação e da metilação das histonas na expressão gênica está descrito a seguir Acetilação e desacetilação de histonas e expressão gênica A reação de acetilação é uma das modificações das histonas mais bemcaracterizadas Observe que a reação é reversível o que significa que grupos acetil podem ser adicionados pela enzima histona acetiltransferase HAT e removidos pela enzima histona desacetilase HDAC do mesmo resíduo de histona Por enquanto veremos como a acetilação e a desacetilação de aminoácidos de histonas influenciam a estrutura da cromatina e a expressão gênica FIGURA 1213 A As caudas das histonas se projetam a partir do cerne do nucleossomo vermelho B Estão demonstrados exemplos de modificações nas caudas das histonas Os círculos com A representam acetilação enquanto os círculos com M representam metilação Ver o texto para os detalhes Há anos tem ocorrido o acúmulo de evidências de que as histonas associadas aos nucleossomos de genes ativos são ricas em grupos acetil dizse que são hiperacetiladas enquanto aquelas associadas aos genes inativos são subacetiladas hipoacetiladas A enzima HAT comprovou ser muito difícil de isolar Quando ela finalmente foi isolada e sua sequência proteica foi deduzida observouse que é ortóloga de um ativador de transcrição de levedura denominado GCN5 o que significa que foi codificada pelo mesmo gene em um organismo diferente Portanto a conclusão foi que GCN5 é uma histona acetiltransferase Ele se liga ao DNA nas regiões reguladoras de alguns genes e ativa a transcrição por meio da acetilação de histonas próximas Atualmente compreendese que diversos complexos proteicos que são recrutados por ativadores de transcrição possuem atividade de HAT Como a acetilação das histonas altera a estrutura da cromatina e no processo facilita as alterações na expressão gênica A adição de grupos acetil aos resíduos de histonas neutraliza a carga positiva dos resíduos de lisina e reduz a interação das caudas de histonas com a espinha dorsal do DNA carregada negativamente Isso resulta em uma cromatina mais aberta na medida em que as interações eletrostáticas dos nucleossomos adjacentes e dos nucleossomos com o DNA adjacente são reduzidas Figura 1214 Além disso a acetilação de histonas em conjunto com outras modificações de histonas influencia a ligação das proteínas reguladoras ao DNA Uma proteína reguladora ligada pode participar em uma de diversas funções que direta ou indiretamente aumentam a frequência de início da transcrição Assim como outras modificações de histonas a acetilação é reversível e HDAC desempenham papéischave na repressão gênica Por exemplo na presença de galactose e glicose a ativação de genes GAL é evitada pela proteína Mig1 A Mig1 é um repressor de ligação a sequências específicas de DNA que se liga a um sítio entre o elemento UAS e o promotor do gene GAL1 Figura 1215 Mig1 recruta um complexo proteico denominado Tup1 que contém uma histona desacetilase e que reprime a transcrição gênica O complexo Tup1 é um exemplo de correpressor que facilita a repressão gênica mas que por si próprio não é um repressor de ligação ao DNA O complexo Tup1 também é recrutado por outros repressores de leveduras tais como MATα2 ver anteriormente e correspondentes desse complexo são observados em todos os eucariotos FIGURA 1214 A acetilação dos aminoácidos lisina nas caudas de histonas abre a cromatina expondo o DNA à atividade das proteínas que regulam a transcrição FIGURA 1215 O recrutamento de um complexo repressor leva à repressão da transcrição Na presença de glicose a transcrição de GAL1 é reprimida pela proteína Mig1 independentemente da presença de Gal4 em UAS Mig1 se liga a um sítio entre UAS e o promotor do gene GAL1 e recruta o complexo repressor Tup1 que recruta uma histona desacetilase desligando a transcrição do gene Metilação das histonas pode ativar ou reprimir a expressão gênica A metilação é outra modificação póstradução de resíduos de arginina e lisina nas caudas de histonas que pode resultar em alteração da cromatina e da expressão gênica A enzima histona metiltransferase HMTase adiciona um dois ou três grupos metil a um aminoácido específico na cauda da histona H3 Uma das reações catalisadas pela HMTase está demonstrada aqui O aminoácido lisina está abreviado com um K Como tal essas modificações póstradução da lisina 9 da histona H3 são denominadas H3K9me1 H3K9me2 e H3K9me3 respectivamente Contrariamente à acetilação a adição de grupos metil pode ativar ou reprimir a expressão gênica Relembre que a acetilação da lisina atua para neutralizar a carga positiva da histona e desse modo direto ativa a expressão gênica por meio da redução das interações dos nucleossomos com o DNA abrindo a cromatina Contrariamente a metilação de resíduos de lisina específicos que não afeta a carga cria sítios de ligação para outras proteínas que ativam ou reprimem a expressão gênica dependendo dos resíduos modificados Por exemplo a metilação do resíduo 4 da lisina da H3 H3K4me está associada à ativação da expressão gênica e está enriquecida nos nucleossomos próximos do início da transcrição Existe um desfecho muito diferente quando H3K9 ou H3K27 são metilados Essas modificações que estão associadas à repressão gênica e à cromatina firmemente compactada serão discutidas em mais detalhes posteriormente neste capítulo CONCEITOCHAVE A modificação póstradução das histonas está associada à ativação e à repressão da expressão gênica Enquanto a acetilação das histonas atua diretamente para reduzir a densidade da cromatina e ativar a expressão gênica a metilação de aminoácidos específicos das histonas cria sítios de ligação para proteínas que ativam ou reprimem a expressão gênica Herança das modificações de histonas e estrutura da cromatina Uma característica importante da estrutura da cromatina é que ela pode ser herdada Essa forma de herança recebe uma denominação herança epigenética e é definida operacionalmente como a herança dos estados da cromatina de uma geração celular para a próxima O que essa herança significa é que na replicação do DNA tanto a sequência do DNA quanto a estrutura da cromatina são fielmente transmitidas para a próxima geração celular Entretanto contrariamente à sequência de DNA a estrutura da cromatina pode ser alterada no curso do ciclo celular e durante gerações sucessivas de divisão celular Relembre que a replicação procariótica é orquestrada na forquilha de replicação pelo replissomo uma máquina molecular que inclui duas holoenzimas DNA pol III e proteínas acessórias ver Figura 720 Em eucariotos a replicação da cromatina significa que o replissomo não apenas deve copiar a sequência de nucleotídios dos filamentos parentais como também deve desmontar os nucleossomos nos filamentos parentais e remontálos nas moléculasfilhas Durante esse processo as histonas antigas dos nucleossomos existentes são distribuídas aleatoriamente para as moléculasfilhas e novas histonas são liberadas para o replissomo As histonas antigas distribuídas aleatoriamente atuam como moldes para orientar a modificação das novas histonas Desse modo as histonas antigas com suas caudas modificadas e as histonas novas com caudas não modificadas são montadas nos nucleossomos que se tornam associados a ambos os filamentosfilhos Figura 1216 As modificações carregadas pelas histonas antigas são responsáveis em parte pela herança epigenética Como tal essas antigas modificações são denominadas marcas epigenéticas tendo em vista que orientam a modificação das novas histonas FIGURA 1216 Na replicação as histonas antigas roxo com seus códigos de histonas são distribuídas aleatoriamente para os filamentosfilhos onde direcionam a codificação das histonas adjacentes recém montadas laranja para formar nucleossomos completos CONCEITOCHAVE O replissomo eucariótico realiza todas as funções do replissomo procariótico além disso ele deve desmontar e remontar os complexos de proteínaDNA denominados nucleossomos Variantes de histonas Contrariamente às histonas comuns também denominadas de consenso que são adicionadas durante a replicação do DNA os eucariotos também apresentam outras histonas denominadas variantes de histonas que podem substituir as histonas de consenso que já foram montadas nos nucleossomos Por exemplo duas variantes em relação à histona H2 são denominadas H2AZ e H2AX e uma variante da H3 é denominada CENPA Tendo em vista que as histonas podem ser modificadas de tantos modos por que pode ser necessário substituir uma histona por uma variante Embora os cientistas estejam apenas começando a compreender os diferentes papéis das variantes de histonas um tema comum é que elas proporcionam um modo rápido para alterar a cromatina por meio da substituição de um código de histonas por outro A CENPA por exemplo substitui a H3 no DNA centromérico e acreditase que a sua presença defina a função do centrômero O papel da variante de histona H2AZ na identificação do DNA danificado para o reparo rápido é discutido em detalhes no Capítulo 16 Metilação do DNA Outra marca hereditária que influencia a estrutura da cromatina Existe outra marca epigenética importante na maior parte dos mas não em todos os eucariotos Essa marca não é uma modificação de histonas em vez disso é a adição de grupos metil aos resíduos de DNA após a replicação Uma enzima normalmente liga esses grupos metil ao carbono 5 de um resíduo de citosina específico Em mamíferos o grupo metil normalmente é adicionado à citosina em um dinucleotídio CG O padrão da metilação é denominado metilação simétrica tendo em vista que os grupos metil estão presentes em ambos os filamentos no mesmo contexto CG G C Um número extraordinário de resíduos C é metilado em mamíferos 70 a 80 de todos os dinucleotídios CG são metilados em todo o genoma Curiosamente a maior parte dos dinucleotídios CG não metilados é observada em aglomerados próximos aos promotores gênicos Essas regiões são denominadas ilhotas de CpG em que o p representa a ligação fosfodiéster Portanto a metilação de C está associada a regiões inativas do genoma Assim como as modificações das histonas as marcas da metilação do DNA podem ser herdadas de modo estável de uma geração celular para a próxima A herança da metilação do DNA é mais bemcompreendida do que a herança das modificações de histonas A replicação semiconservativa gera hélicesfilhas que são metiladas apenas no filamento parental As moléculas de DNA metiladas em apenas um filamento são denominadas hemimetiladas Os grupos metil são adicionados aos filamentos não metilados por meio de DNA metiltransferases que apresentam uma alta afinidade por esses substratos hemimetilados Essas enzimas são orientadas pelo padrão de metilação no filamento parental Figura 1217 Conforme você verá posteriormente no capítulo em virtude de a metilação do DNA ser mais estável do que as modificações de histonas com frequência ela está associada a regiões do genoma que são mantidas em um estado inativo durante todo o período de vida de um organismo As referidas regiões serão discutidas posteriormente neste capítulo 124 FIGURA 1217 Após a replicação os resíduos de dinucleotídios CG hemimetilados são totalmente metilados Os filamentos parentais são azuis e o filamentofilho é amarelo A letra M representa o grupo metil no nucleotídio C CONCEITOCHAVE A estrutura da cromatina é herdada de uma geração celular para outra geração celular tendo em vista que existem mecanismos para replicar as marcas epigenéticas associadas juntamente com o DNA Desse modo a informação inerente nas modificações de histonas e os padrões de metilação do DNA existentes atuam para reconstituir a estrutura da cromatina local que existia antes da síntese do DNA e da mitose Contrariamente as variantes das histonas podem ser utilizadas para alterar rapidamente a cromatina em uma via independente da replicação Ativação de genes em um ambiente de cromatina Conforme você viu neste capítulo a transcrição de genes eucarióticos deve ser ligada e desligada durante o período de vida de um organismo Para compreender como os eucariotos regulam os genes durante o seu período de vida é necessário verificar como a cromatina é alterada durante a ativação da transcrição Além disso o desenvolvimento de um organismo complexo requer que os níveis de transcrição sejam regulados ao longo de uma ampla variação de atividades Pense a respeito de um mecanismo de regulação mais como um reostato que controla o som de um iPod do que como um interruptor em vez de um gene que produz muitas proteínas ou nenhuma proteína ele pode produzir uma quantidade intermediária dependendo do nível de transcrição Em eucariotos os níveis de transcrição se tornam finamente ajustáveis em um ambiente de cromatina por meio do agrupamento dos sítios de ligação em acentuadores Diversos fatores de transcrição diferentes ou diversas moléculas do mesmo fator de transcrição podem se ligar a sítios adjacentes A ligação desses fatores a sítios que estão separados na distância correta leva a um efeito amplificado ou superaditivo sobre a ativação da transcrição Quando um efeito é superior ao aditivo dizse que é sinérgico A ligação de múltiplas proteínas reguladoras aos múltiplos sítios de ligação em um acentuador pode catalisar a formação de um acentuassomo enhanceosome um grande complexo proteico que atua sinergicamente para ativar a transcrição Na Figura 1218 você pode observar como as proteínas arquitetônicas dobram o DNA para promover interações cooperativas das outras proteínas de ligação ao DNA Nesse modo de ação do acentuassomo a transcrição é ativada até níveis muito altos apenas quando todas as proteínas estão presentes e mantendo contato do modo correto Para compreender melhor o que um acentuassomo é e como ele atua sinergicamente vejamos um exemplo específico Acentuassomo de βinterferona O gene humano de βinterferona que codifica a proteína antiviral interferona é um dos genes mais bemcaracterizados em eucariotos Ele normalmente está desligado mas é ativado até níveis de transcrição muito altos na infecção viral A chave para a ativação desse gene é a montagem de fatores de transcrição em um acentuassomo a aproximadamente 100 pb upstream do TATA boxe e do sítio de início da transcrição Todas as proteínas reguladoras do acentuassomo de β interferona se ligam à mesma face da duplahélice de DNA Ligadas ao outro lado da hélice estão diversas proteínas estruturais que dobram o DNA e possibilitam que as diferentes proteínas reguladoras se toquem e formem um complexo ativado Quando todas as proteínas reguladoras estão ligadas e interagindo corretamente elas formam uma plataforma um sítio de ligação de alta afinidade para a proteína CBP uma proteína coativadora que também recruta o maquinário de transcrição A grande proteína CBP também contém uma atividade de histona acetilase intrínseca que modifica os nucleossomos e facilita os níveis altos de transcrição FIGURA 1218 O acentuassomo de βinterferona Neste caso os fatores de transcrição recrutam um coativador CBP que se liga aos fatores de transcrição e à RNA polimerase II iniciando a transcrição Embora o promotor de βinterferona esteja demonstrado sem nucleossomos na Figura 1218 o acentuassomo de fato é circundado por dois nucleossomos denominados nuc 1 e nuc 2 na Figura 1219 Um deles nuc 2 está estrategicamente posicionado no TATA boxe e no sítio de início da transcrição GCN5 outro coativador se liga e acetila os dois nucleossomos Após a acetilação os fatores ativadores de transcrição recrutam o coativador CBP a holoenzima RNA pol II e o complexo de remodelagem da cromatina SWISNF SWISNF em seguida é posicionado para afastar o nucleossomo 37 pb do TATA boxe tornando o TATA boxe acessível à proteína de ligação TATA e possibilitando que a transcrição seja iniciada As interações cooperativas ajudam a explicar diversas observações que causam perplexidade a respeito dos acentuadores Por exemplo elas explicam por que a mutação de qualquer fator de transcrição ou sítio de ligação reduzir dramaticamente a atividade do acentuador Elas também explicam por que a distância entre os sítios de ligação dentro do acentuador é uma característica crítica Além disso os acentuadores não precisam estar próximos do sítio de início da transcrição como é o exemplo demonstrado na Figura 1219 Uma característica dos acentuadores é que eles podem ativar a transcrição quando estão localizados a grandes distâncias do promotor 50 kb seja upstream ou downstream de um gene ou até em um íntron Isoladores de bloqueio de acentuador Um elemento regulador tal como um acentuador que consegue atuar sobre dezenas de milhares de pares de bases pode interferir com a regulação de genes próximos Para evitar a referida ativação promíscua foram desenvolvidos elementos reguladores denominados isoladores de bloqueio de acentuador Quando posicionados entre um acentuador e um promotor os isoladores de bloqueio de acentuador evitam que o acentuador ative a transcrição naquele promotor Os referidos isoladores não apresentam efeito na ativação de outros promotores que não estão separados de seus acentuadores pelo isolador Figura 1220 Foram propostos diversos modelos para explicar como um isolador poderia bloquear a atividade do acentuador apenas quando posicionado entre um acentuador e um promotor Muitos dos modelos como aquele demonstrado na Figura 1221 propõem que o DNA está organizado em alças que contêm genes ativos De acordo com esse modelo os isoladores movem um promotor para uma nova alça onde ele está protegido do acentuador Conforme você verá posteriormente no capítulo os isoladores de bloqueio de acentuador são um componente fundamental de um fenômeno denominado imprinting genômico Os acentuassomos recrutam remodeladores da cromatina FIGURA 1219 O acentuassomo de βinterferona atua para mover os nucleossomos por meio do recrutamento do complexo SWISNF FIGURA 1220 Os isoladores de bloqueio de acentuador evitam a ativação gênica quando posicionados entre um acentuador e um promotor FIGURA 1221 Uma proposta é que os isoladores de bloqueio de acentuador criam novas alças que separam fisicamente um promotor do seu acentuador CONCEITOCHAVE Os acentuadores eucarióticos podem atuar a grandes distâncias para modular a atividade do aparato de transcrição Os acentuadores contêm sítios de ligação para muitos fatores de transcrição que se ligam e interagem cooperativamente Essas interações resultam em uma 125 diversidade de respostas incluindo o recrutamento de coativadores adicionais e a remodelagem da cromatina Inativação a longo prazo de genes em um ambiente de cromatina Até agora vimos como os genes são ativados em um ambiente de cromatina Entretanto conforme declarado no início deste capítulo a maior parte dos genes em genomas eucarióticos está desligada em qualquer momento Um dos achados mais surpreendentes da era da genômica é que muitos genes eucarióticos são inativos durante a vida do organismo Isso leva a duas questões que serão abordadas nesta seção Primeiramente por que os organismos apresentam genes que estão sempre inativos Em segundo lugar como os organismos mantêm os genes em um estado inativo durante todo o seu período de vida Um dos modelos mais úteis para a compreensão dos mecanismos que mantêm a inatividade dos genes a longo prazo diz respeito ao controle da alteração do tipo reprodutivo em leveduras Os componentes do locus do tipo reprodutivo de leveduras foram introduzidos ao fim da Seção 122 Aqui continuamos com a história ao enfocar no mecanismo de alteração do tipo reprodutivo que requer que cada célula de levedura mantenha cópias inativas dos genes a e α em outros locais de seu genoma Alteração do tipo reprodutivo e silenciamento gênico As células haploides de leveduras são capazes de alterar seu tipo reprodutivo por vezes tão frequentemente quanto a cada ciclo celular Desse modo uma célula haploide de levedura de um tipo reprodutivo digamos a formará uma colônia de ambas as células a e α que podem cruzar para formar células diploides aα Durante épocas de crise tais como os períodos de escassez de nutrientes cada célula diploide pode sofrer meiose e produzir quatro esporos haploides Esse processo é vantajoso para a sobrevivência da espécie tendo em vista que os esporos podem sobreviver em condições ambientais adversas melhor do que as células haploides As análises genéticas de determinados mutantes que não conseguiam alterar seu tipo reprodutivo ou que não conseguiam reproduzirse eram estéreis foram fontes de percepçõeschave sobre a alteração do tipo reprodutivo Entre os mutantes de alteração estavam diversos loci mutantes incluindo o gene HO e os genes HMRa e HMLα Estudos adicionais revelaram que o gene HO codifica uma endonuclease enzima que cliva o DNA ver Capítulo 10 necessária para o início da alteração Também se observou que os loci HMRa e HMLα que estão no mesmo cromossomo do locus MAT contêm cassetes dos alelos MATa e MATα respectivamente que não são expressos Os loci HMR e HML portanto são cassetes silenciosos Lembre do Capítulo 8 que um tipo de silenciamento gênico ocorre quando o dsRNA tem por alvo o complexo RISC para destruir o RNA complementar Esse é um exemplo de silenciamento gênico pós transcricional Contrariamente HMRa e HMLα não podem ser transcritos e como tal são exemplos de silenciamento gênico transcricional Duas características da alteração do tipo reprodutivo eram de interesse para os geneticistas como as células alteram o seu tipo reprodutivo e por que HMRa e HMLα são silenciosos em relação à transcrição A chave para a alteração é a endonuclease HO que inicia a alteração do tipo reprodutivo ao gerar uma quebra no filamento duplo no locus MAT A interconversão do tipo reprodutivo ocorre então por meio de um tipo de recombinação entre o segmento de DNA um cassete de um dos dois loci não expressos e o locus MAT O resultado é a substituição do cassete antigo no locus MAT por um novo cassete de HMRa ou HMLα O tipo reprodutivo resultante é o tipo MATa ou MATα dependendo de qual gene se encontra no locus MAT Figura 1222 O cassete inserido de fato é copiado a partir do locus HMRa ou HMLα Desse modo a alteração é reversível tendo em vista que a informação em relação aos cassetes a e α está sempre presente nos loci HMRa e HMLα e nunca é perdida Portanto a alteração do tipo reprodutivo fornece um exemplo de genes que precisam ser silenciados durante todo o período de vida de um organismo Conforme você verá posteriormente neste capítulo o silenciamento gênico durante todo o período de vida também ocorre em humanos e em todos os outros mamíferos FIGURA 1222 O cromossomo III de S cerevisiae codifica três loci de tipos reprodutivos mas apenas os genes no locus MAT são expressos HML codifica um cassete silencioso de genes α e HMR codifica um cassete silencioso de genes a A cópia de um cassete silencioso e a inserção por meio de recombinação no locus MAT alteram o tipo reprodutivo A segunda característica de alteração do tipo reprodutivo de interesse para os geneticistas é o mecanismo subjacente de silenciamento gênico Por que os genes nos cassetes HMRa e HMLα não são expressos Normalmente esses cassetes são silenciosos Entretanto em mutantes SIR reguladores de informação silenciosos o silenciamento está comprometido de modo que ambas as informações a e α são expressas Os mutantes resultantes são estéreis Isso significa que em leveduras normais não mutantes os genes nos cassetes HMRa e HMLα são capazes de serem expressos mas não o são em virtude da ação das proteínas Sir As proteínas Sir2 Sir3 e Sir4 formam um complexo que desempenha um papelchave no silenciamento gênico Sir2 é uma histona desacetilase que facilita a condensação da cromatina e ajuda a manter HMRa e HMLα em domínios da cromatina nos quais a transcrição não pode ser iniciada O silenciamento gênico é um processo muito diferente da repressão gênica o silenciamento é um efeito de posição que depende da vizinhança na qual a informação genética está localizada Por exemplo um gene normalmente ativo inserido nos loci HMR ou HML será silenciado Você aprenderá mais a respeito dos efeitos de posição posteriormente na seção sobre a variegação por efeito de posição na moscadasfrutas Drosophila melanogaster Comparação da heterocromatina e da eucromatina Examinaremos por que o silenciamento gênico a longo prazo do tipo que silencia HMLα e HMRa é um processo diferente da repressão gênica Para tanto é importante observar que a cromatina não é uniforme em todos os cromossomos determinadas regiões cromossômicas estão agrupadas em uma cromatina altamente condensada denominada heterocromatina Outros domínios estão acondicionados em uma cromatina menos condensada denominada eucromatina ver Figura 1211 B A condensação da cromatina é alterada durante o período do ciclo celular A cromatina das células que entram em mitose se torna altamente condensada na medida em que os cromossomos se alinham no preparo para a divisão celular Após a divisão celular as regiões que formam a heterocromatina permanecem condensadas especialmente ao redor dos centrômeros e dos telômeros denominada heterocromatina constitutiva enquanto as regiões que formam a eucromatina se tornam menos condensadas Conforme observado em relação ao exemplo de βinterferona ver Figura 1219 a cromatina dos genes ativos pode ser alterada em resposta ao estágio do desenvolvimento ou às condições ambientais A principal distinção entre a heterocromatina e a eucromatina é que a primeira contém poucos genes enquanto a última é rica em genes Mas o que é a heterocromatina se não genes A maior parte do genoma eucariótico é composta por sequências repetitivas que não codificam proteína ou RNA estrutural ver Capítulo 14 Portanto dizse que os nucleossomos densamente compactados da heterocromatina organizados em fibras de cromatina de 30 nm ver Figura 1211 A formam uma estrutura fechada que é amplamente inacessível às proteínas reguladoras e inóspita para a atividade gênica Contrariamente a eucromatina com seus nucleossomos mais amplamente espaçados organizados em fibras de 10 nm ver Figura 1211 A adota uma estrutura aberta que possibilita a transcrição CONCEITOCHAVE A cromatina dos eucariotos não é uniforme As regiões heterocromáticas altamente condensadas apresentam menos genes e frequências de recombinação mais baixas do que as regiões eucromáticas menos condensadas Variegação por efeito de posição em Drosophila revela vizinhanças genômicas Muito antes de os loci de reprodução silenciosos de leveduras terem sido descritos o geneticista Hermann Muller descobriu um fenômeno genético interessante enquanto estudava a Drosophila existem vizinhanças cromossômicas que podem silenciar genes que são experimentalmente realocados para regiões adjacentes do cromossomo Nesses experimentos as moscas foram irradiadas com raios X para induzir mutações em suas células germinativas A progênie das moscas irradiadas foi triada em relação a fenótipos incomuns Uma mutação no gene white próximo à extremidade do cromossomo X resultará em uma progênie com olhos brancos em vez da cor vermelha do tipo selvagem Parte da progênie apresentou olhos muito incomuns com manchas brancas e vermelhas O exame citológico revelou um rearranjo cromossômico nas moscas mutantes no cromossomo X encontravase presente uma inversão de um pedaço do cromossomo que carrega o gene white Figura 1223 As inversões e outros rearranjos cromossômicos serão discutidos no Capítulo 17 Nesse rearranjo o gene white que normalmente está localizado em uma região eucromática do cromossomo X agora se encontra próximo do centrômero heterocromático Em algumas células a heterocromatina pode se difundir para a eucromatina vizinha e silenciar o gene white As manchas de tecido branco nos olhos são derivadas dos descendentes de uma única célula na qual o gene white foi silenciado e permanece silenciado durante as futuras divisões celulares Contrariamente as manchas vermelhas têm origem em células nas quais a heterocromatina não se difundiu para o gene white e assim esse gene permanece ativo em todos os seus descendentes A existência de manchas vermelhas e brancas em células do olho de um único organismo ilustra dramaticamente duas características do silenciamento epigenético Primeiramente que a expressão de um gene pode ser reprimida em virtude de sua posição no cromossomo em vez de por uma mutação na sequência de seu DNA Em segundo lugar que o silenciamento epigenético pode ser herdado de uma geração celular para a próxima Os achados de estudos subsequentes em Drosophila e leveduras demonstraram que muitos genes ativos são silenciados nesse modo mosaico quando eles são realocados para regiões vizinhas próximo de centrômeros ou telômeros heterocromáticas Portanto a capacidade da heterocromatina de se difundir para a eucromatina e silenciar genes é uma característica comum a muitos organismos Esse fenômeno foi denominado variegação por efeito de posição PEV Ele fornece evidências poderosas de que a estrutura da cromatina é capaz de regular a expressão de genes nesse caso determinar se genes com sequências de DNA idênticas serão ativos ou silenciados FIGURA 1223 O rearranjo cromossômico produz variegação por efeito de posição A inversão cromossômica posiciona o alelo white do tipo selvagem próximo da heterocromatina A difusão da heterocromatina silencia o alelo As facetas oculares são brancas em vez do vermelho do tipo selvagem onde o alelo foi silenciado CONCEITOCHAVE Os genes ativos que são realocados para adjacências genômicas que são heterocromáticas podem ser silenciados se a heterocromatina se difundir para os genes Análise genética de PEV revela proteínas necessárias para a formação de heterocromatina O QUE OS GENETICISTAS FAZEM ATUALMENTE Os geneticistas deduziram que a PEV poderia ser explorada para identificar as proteínas necessárias para a formação da heterocromatina Para essa finalidade eles isolaram mutações em um segundo locus cromossômico que suprimia ou acentuava o padrão variegado Figura 1224 Os supressores da variegação denominados Suvar são genes que quando mutados reduzem a difusão da heterocromatina o que significa que os produtos do tipo selvagem desses genes são necessários para a difusão De fato os alelos Suvar comprovaram ser um grande tesouro para os cientistas interessados nas proteínas que são necessárias para estabelecer e manter o estado heterocromático inativo Entre os mais de 50 produtos dos genes de Drosophila identificados por essas triagens estava a proteína heterocromatina 1 HP1 a qual anteriormente observouse estar associada aos telômeros e centrômeros heterocromáticos Portanto faz sentido que uma mutação no gene que codifica HP1 mostrese como um alelo Suvar tendo em vista que de algum modo a proteína é necessária para gerar a estrutura da cromatina de ordem superior associada à heterocromatina Mas por que a HP1 se liga a algumas regiões do DNA e não a outras A resposta a isso surgiu com a descoberta de que outro gene Suvar codificava uma metiltransferase que adiciona grupos metil à lisina 9 na cauda da histona H3 denominada histona H3 metiltransferase ou HMTase Relembre que o H3K9me está associado à repressão da expressão gênica ver Figura 1213 B Isso em virtude de a cromatina modificada desse modo se ligar às proteínas HP1 que em seguida se associam para formar heterocromatina Proteínas semelhantes à HP1 e à HMTase foram isoladas em diversos grupos taxonômicos sugerindo a conservação de uma importante função eucariótica FIGURA 1224 Foram utilizadas mutações para identificar genes que suprimem Suvar ou acentuam Evar a variegação por efeito de posição Observamos que regiões transcritas ativamente estão associadas a nucleossomos cujas caudas de histonas são hiperacetiladas e que ativadores de transcrição tais como GCN5 codificam uma atividade de histona acetiltransferase Conforme já discutido as marcas de acetil também podem ser removidas das histonas por histona desacetilases De modo semelhante a cromatina composta por nucleossomos que são metilados em H3K9 e ligados à proteína HP1 contém marcas epigenéticas que estão associadas à heterocromatina Atualmente os cientistas são capazes de separar a heterocromatina e a eucromatina e analisar as diferenças nas modificações das histonas e nas proteínas ligadas O procedimento utilizado imunoprecipitação da cromatina ChIP está descrito no Capítulo 14 A Figura 1225 ilustra que na ausência de quaisquer barreiras a heterocromatina pode se espalhar para regiões adjacentes e inativar genes em algumas células mas não em outras Isso pode ser o que está ocorrendo com o gene white de Drosophila quando ele é translocado para próximo do domínio de heterocromatina associado às extremidades do cromossomo Mas a difusão da heterocromatina pode ser interrompida Podese imaginar que a difusão da heterocromatina para regiões gênicas ativas pode ser desastrosa para um organismo tendo em vista que os genes ativos seriam silenciados na medida em que fossem convertidos em heterocromatina Para evitar esse possível desastre o genoma contém elementos de DNA denominados isoladores de barreira que previnem a difusão da heterocromatina por meio da criação de um ambiente local que não é favorável à formação de heterocromatina Por exemplo um isolador de barreira pode se ligar a HAT e ao fazer isso assegurar que as histonas adjacentes sejam hiperacetiladas Um modelo sobre como um isolador de barreira pode atuar para proteger uma região da eucromatina da conversão em heterocromatina está demonstrado na Figura 1226 FIGURA 1225 A difusão da heterocromatina na eucromatina adjacente é variável Em quatro células diploides geneticamente idênticas a heterocromatina se difunde o suficiente para o nocaute gênico em alguns cromossomos mas não em outros A heterocromatina e a eucromatina estão representadas pelas esferas laranja e verdes respectivamente CONCEITOCHAVE O isolamento das proteínas críticas necessárias para a formação de heterocromatina incluindo HP1 e HMTase foi possibilitado pelo isolamento de linhagens mutantes de Drosophila que suprimiam ou acentuavam PEV 126 FIGURA 1226 Neste modelo isoladores de barreira recrutam atividades enzimáticas como da histona acetiltransferase HAT que promovem a formação de eucromatina A letra M faz referência à metilação e a letra A à acetilação Silenciamento gêneroespecífico de genes e cromossomos inteiros Até agora discutimos os domínios cromossômicos que estão abertos ou condensados em todos os membros de uma espécie Nesta seção consideramos dois fenômenos genéticos disseminados em mamíferos que dependem do sexo do indivíduo Nesses casos genes específicos ou até um cromossomo inteiro são silenciados durante toda a vida de um organismo Entretanto contrariamente aos exemplos anteriores esses genes ou cromossomos são silenciados no sexo masculino ou feminino mas não em ambos Imprinting genômico explica alguns padrões de herança incomuns O fenômeno de imprinting genômico foi descoberto há aproximadamente 20 anos em mamíferos No imprinting genômico determinados genes autossômicos apresentam padrões de herança incomuns Por exemplo um alelo Igf2 é expresso em um camundongo apenas se ele for herdado do pai do camundongo um exemplo de imprinting materno tendo em vista que a cópia do gene derivada da mãe é inativa Contrariamente um alelo H19 de camundongo é expresso apenas se for herdado da mãe o H19 é um exemplo de imprinting paterno tendo em vista que a cópia paterna é inativa A consequência do imprinting parental é que os genes imprintados são expressos como se fossem a única cópia do gene presente na célula embora existam duas De importância nenhuma alteração é observada nas sequências de DNA dos genes imprintados ou seja o gene idêntico pode ser ativo ou inativo na progênie dependendo de ter sido herdado da mãe ou do pai Isso então representa um fenômeno epigenético Se a sequência do DNA do gene não está correlacionada com a atividade o que está correlacionado A resposta é que durante o desenvolvimento dos gametas grupos metil são adicionados ao DNA nas regiões reguladoras de genes imprintados apenas em um sexo Vimos anteriormente que o DNA de genes que estão desligados durante toda a vida normalmente é altamente metilado Entretanto é importante observar que a metilação do DNA é uma de diversas marcas epigenéticas associadas à inativação gênica a longo prazo Outras marcas incluem a metilação de aminoácidos de histonas específicos incluindo H3K27me1 Voltemos novamente aos genes Igf2 e H19 de camundongos para verificar como o imprinting atua no nível molecular Esses dois genes estão localizados em um grupo de genes imprintados no cromossomo 7 de camundongo Estimase que existam 100 genes imprintados em camundongo e a maior parte é observada em grupos que compreendem de 3 a 11 genes imprintados Os seres humanos apresentam a maior parte dos mesmos genes imprintados de camundongos Em todos os casos examinados existe um padrão específico de metilação do DNA para cada cópia de um gene imprintado Em relação ao grupo Igf2H19 uma região específica do DNA localizada entre os dois genes Figura 1227 é metilada em células germinativas masculinas e não metilada em células germinativas femininas Essa região é denominada região de controle de imprinting ICR Portanto a metilação da ICR leva ao estado ativo de Igf2 e ao estado inativo de H19 enquanto a ausência de metilação leva ao contrário FIGURA 1227 Imprinting genômico no camundongo A região de controle do imprinting ICR não é metilada nos gametas femininos e pode se ligar a um dímero CTCF formando um isolador que bloqueia a ativação do acentuador de Igf2 A metilação M de ICR nas células germinativas masculinas impede a ligação da CTCF mas também impede a ligação de outras proteínas ao promotor H19 Como a metilação controla qual dos dois genes está ativo A metilação atua como um bloqueio à ligação das proteínas necessárias para a transcrição Apenas a ICR não metilada feminina pode ligarse a uma proteína reguladora denominada CTCF Quando ligada CTCF atua como um isolador de bloqueio de acentuador que impede a ativação do acentuador da transcrição de Igf2 Entretanto o acentuador nas fêmeas ainda consegue ativar a transcrição de H19 Nos machos CTCF não consegue se ligar à ICR e o acentuador consegue ativar a transcrição de Igf2 lembre que os acentuadores podem atuar a grandes distâncias Entretanto o acentuador não consegue ativar H19 tendo em vista que a região metilada se estende para o promotor H19 O promotor metilado não consegue se ligar às proteínas necessárias para a transcrição de H19 Portanto vemos como um isolador de bloqueio de acentuador nesse caso CTCF ligada a parte de ICR impede que o acentuador ative um gene distante nesse caso Igf2 Além disso vemos que o sítio de ligação de CTCF é metilado apenas em cromossomos derivados genitor do sexo masculino A metilação do sítio de ligação de CTCF impede a ligação de CTCF nos machos e possibilita que o acentuador ative Igf2 Observe que o imprinting parental pode afetar amplamente a análise de heredogramas Tendo em vista que o alelo herdado de um genitor é inativo uma mutação no alelo herdado do outro genitor aparentará ser dominante embora de fato o alelo seja expresso apenas em virtude de um dos dois homólogos ser ativo em relação a esse gene A Figura 1228 demonstra como uma mutação em um gene imprintado pode apresentar desfechos diferentes sobre o fenótipo do organismo se herdado do genitor do sexo masculino ou do sexo feminino São necessárias muitas etapas para o imprinting Figura 1229 Logo após a fertilização os mamíferos reservam células que se tornarão suas células germinativas Os imprints são apagados antes que as células germinativas sejam formadas Sem a sua marca distinta de metilação do DNA dizse agora que esses genes são epigeneticamente equivalentes Tendo em vista que essas células germinativas primordiais se tornam gametas totalmente formados os genes imprintados recebem a marca específica do sexo que determinará se o gene será ativo ou silencioso após a fertilização Mas o que dizer sobre Dolly e outros mamíferos clonados Muitos acreditavam que o imprinting genômico levaria a uma exigência da participação tanto da célula germinativa masculina quanto da feminina no desenvolvimento embrionário de mamíferos Ou seja os gametas masculinos e femininos contêm diferentes subconjuntos de genes imprintados assim as células germinativas de ambos os sexos devem participar para que o embrião apresente um complemento total de genes imprintados ativos Por que então mamíferos tais como Dolly e mais recentemente porcos gatos cães e vacas clonados que foram derivados de núcleos somáticos são capazes de sobreviver e desenvolver se Afinal conforme já observado mesmo a mutação de um único gene imprintado pode ser letal ou levar a uma doença grave FIGURA 1228 Uma mutação representada por uma estrela laranja no gene A não apresentará efeitos se for herdada do sexo masculino Abreviações M Metilação ICR Região de controle do imprinting Nesse ponto os cientistas não compreendem o motivo da clonagem de muitas espécies de mamíferos ter obtido sucesso Entretanto apesar desses sucessos a clonagem é extremamente ineficiente em todas as espécies testadas Em relação à maior parte dos experimentos um clone de sucesso é um evento extremamente raro que requer centenas até mesmo milhares de tentativas Poderia ser argumentado que a falha da maior parte dos embriões clonados em se desenvolver em organismos viáveis é um atestado da importância dos mecanismos epigenéticos de regulação gênica em eucariotos Como tal isso ilustra como o conhecimento sobre a sequência completa do DNA de todos os genes em um organismo é apenas uma primeira etapa na compreensão sobre como os genes eucarióticos são regulados FIGURA 1229 Como Igf2 e H19 são imprintados de modo diferencial nos sexos masculino e feminino Silenciamento de um cromossomo inteiro Inativação do cromossomo X O fenômeno epigenético denominado inativação do cromossomo X tem intrigado cientistas há décadas No Capítulo 17 você aprenderá a respeito dos efeitos do número de cópias gênicas sobre o fenótipo de um organismo Por enquanto você precisa saber apenas que o número de transcritos produzidos por um gene normalmente é proporcional ao número de cópias daquele gene em uma célula Os mamíferos por exemplo são diploides e apresentam duas cópias de cada gene localizadas em seus autossomos Para a vasta maioria dos genes ambos os alelos são expressos Portanto todos os indivíduos estão produzindo aproximadamente o mesmo número de transcritos em relação a esses genes proporcional a duas cópias dos genes Entretanto existe uma exceção a essa generalização Todos os indivíduos não produziriam o mesmo número de transcritos de genes localizados nos cromossomos sexuais se ambos os cromossomos X fossem expressos no sexo feminino Conforme discutido no Capítulo 2 o número de cromossomos sexuais X e Y difere entre os sexos com as fêmeas de mamíferos apresentando dois cromossomos X e os machos apenas um Acreditase que o cromossomo X de mamíferos contenha aproximadamente 1000 genes As fêmeas apresentam o dobro de cópias dos genes ligados ao X em relação aos machos e expressariam o dobro de transcritos desses genes do que os machos se não houvesse um mecanismo para corrigir esse desequilíbrio A ausência de um cromossomo Y não é um problema para os indivíduos do sexo feminino tendo em vista que os pouquíssimos genes nesse cromossomo são necessários apenas para o desenvolvimento da masculinidade Dizemos que as fêmeas produzem duas doses de transcritos para cada dose produzida pelos machos Esse desequilíbrio de dosagem é corrigido por meio de um processo denominado compensação de dose que torna a quantidade da maior parte dos produtos gênicos das duas cópias do cromossomo X no sexo feminino equivalente à dose única do cromossomo X no sexo masculino Em mamíferos a equivalência de doses é alcançada por meio da inativação aleatória de um dos dois cromossomos X em cada célula em um estágio inicial no desenvolvimento Esse estado inativo em seguida é propagado para todas as células da progênie Na linhagem germinativa o segundo cromossomo X se torna reativado na ovogênese O cromossomo inativado denominado corpúsculo de Barr pode ser observado no núcleo como uma estrutura heterocromática altamente condensada e fortemente corada A inativação do cromossomo X é um exemplo de herança epigenética Primeiramente a maior parte dos genes no cromossomo X inativado denominado Xi é silenciada e o cromossomo apresenta marcas epigenéticas associadas à heterocromatina incluindo H3K9me hipoacetilação de histonas e hipermetilação de seu DNA Em segundo lugar a maior parte dos genes no cromossomo inativado mas não todos permanece inativa em todos os descendentes dessas células ainda que a própria sequência do DNA esteja inalterada O mecanismo que converte um cromossomo X totalmente funcional em heterocromatina é o objeto de investigações atuais O processo está bem caracterizado em camundongos e a inativação do cromossomo X naquele organismo compartilha muitas características com a inativação do cromossomo X em células somáticas femininas humanas Ambos apresentam um locus no cromossomo X denominado centro de inativação do X abreviado Xic que produz um RNA não codificador de proteína ncRNA ver Capítulo 8 de 17 kb denominado Xist Acreditase que o Xist seja transcrito a partir de apenas um cromossomo no início do desenvolvimento dos embriões de fêmeas de camundongos O cromossomo que produz Xist se torna inativo na medida em que o Xist reveste especificamente a região central desse cromossomo levando à formação de heterocromatina Não se sabe como o Xist está localizado em um cromossomo nem o modo como ele aciona a conversão para heterocromatina Um modelo interessante em relação ao modo como a transcrição de um ncRNA pode influenciar a estrutura da cromatina no Xi está demonstrado na Figura 1230 De acordo com esse modelo na medida em que um ncRNA é transcrito pela RNA pol II proteínas se ligam especificamente às suas sequências e catalisam as modificações de histona que iniciam a formação de heterocromatina Desse modo os ncRNA atuam como amarras para recrutar proteínas modificadoras da cromatina para o cromossomo X a partir do qual ele é transcrito CONCEITOCHAVE Em relação à maior parte dos organismos diploides ambos os alelos de um gene são expressos de modo independente O 127 imprinting genômico e a inativação do X são exemplos de expressão monoalélica Nesses casos mecanismos epigenéticos silenciam um único locus cromossômico ou uma cópia de um cromossomo inteiro respectivamente Repressão gênica póstranscricional pelos miRNA O Xist é um exemplo da classe em rápido crescimento de RNA funcionais ver Capítulo 8 Os RNA funcionais não codificam proteínas em vez disso realizam uma diversidade de tarefas que exploram a complementaridade do RNARNA e do RNADNA Os RNA funcionais discutidos aqui contêm sequências específicas que direcionam as proteínas ou os complexos proteicos para locais na célula onde seus serviços são necessários Por exemplo o Xist atua para direcionar proteínas envolvidas na formação da heterocromatina para um dos dois cromossomos X FIGURA 1230 Um modelo que demonstra como o RNA Xist pode atuar em cis para ligar proteínas que inativam um cromossomo X por meio da formação de heterocromatina Dois tipos de pequenos RNA funcionais foram introduzidos no Capítulo 8 os siRNA e os miRNA Nesta seção exploramos como os miRNA auxiliam na regulação da expressão gênica eucariótica A função dos siRNA será considerada adicionalmente no Capítulo 15 Lembre do Capítulo 8 que os miRNA são sintetizados pela RNA pol II como RNA mais longos que são processados nos miRNA biologicamente ativos menores aproximadamente 22 nt ver Figura 820 Os organismos contêm centenas de miRNA que regulam milhares de genes Desses aproximadamente 13 está organizado em grupos que são transcritos em um único transcrito que posteriormente é processado para formar diversos miRNA Contrariamente aproximadamente 14 de todos os miRNA é processado a partir de transcritos derivados de íntrons recompostos As etapas finais no processamento dos miRNA ocorrem no citoplasma No Capítulo 8 vimos como os miRNA de filamento único ativos se ligam ao complexo de silenciamento induzido por RNA RISC e hibridizam com mRNA complementares aos miRNA Especificamente a região de ligação do miRNA é composta pelos nucleotídios 2 a 8 do miRNA de aproximadamente 22 nt denominada região semente Os nucleotídios da região semente se ligam à 3UTR de um mRNA que está sendo traduzido pelos ribossomos Figura 1231 Embora se saiba que o complexo miRNARISC inibe a tradução o mecanismo preciso ainda está sob investigação Modelos em relação a como a tradução pode ser reprimida incluem a interferência no início da tradução ou alongamento ou a remoção da cauda poliA que aceleraria a degradação do mRNA Figura 1231 Embora os miRNA tenham sido descobertos há cerca de 20 anos os cientistas estão apenas começando a decifrar a extensão e a complexidade do controle da expressão gênica eucariótica pelos miRNA Considere que em mamíferos sequências complementares às regiões semente dos miRNA são encontradas na 3UTR de diversas centenas de genes Além disso as 3UTR de alguns genes contêm sequências complementares a diversos miRNA enquanto muitos miRNA contêm sequências complementares às 3UTR de diversos genes Portanto um gene possivelmente pode ser reprimido por diversos miRNA seja individualmente ou em combinação e um miRNA possivelmente pode reprimir a tradução de diversos genes No Capítulo 11 você viu que a organização de genes bacterianos em óperons possibilitou a regulação coordenada de genes que contribuíram para um traço único tal como a capacidade de utilizar o açúcar lactose Tendo em vista que a maior parte dos genes eucarióticos não está organizada em óperons foi sugerido que a regulação póstranscricional de diversos genes por um miRNA possibilita aos organismos superiores a capacidade de coordenar a expressão dos seus genes FIGURA 1231 Ver o texto para detalhes RESUMO Muitos aspectos da regulação gênica eucariótica se assemelham à regulação dos óperons bacterianos Ambas operam amplamente no nível da transcrição e ambas dependem de proteínas transatuantes que se ligam às sequênciasalvo reguladoras de ação cis na molécula de DNA Essas proteínas reguladoras determinam o nível de transcrição de um gene ao controlar a ligação da RNA polimerase ao promotor gênico Existem três características de distinção importantes do controle da transcrição em eucariotos Primeiramente os genes eucarióticos apresentam acentuadores que são elementos reguladores de ação cis localizados por vezes a grandes distâncias lineares do promotor Muitos genes apresentam múltiplos acentuadores Em segundo lugar esses acentuadores com frequência são ligados por mais fatores de transcrição do que os óperons bacterianos Eucariotos multicelulares devem gerar milhares de padrões de expressão gênica com um número limitado de proteínas reguladoras fatores de transcrição Eles realizam isso por meio de interações combinatórias de fatores de transcrição Os acentuassomos são complexos de proteínas reguladoras que interagem de modo cooperativo e sinérgico para promover altos níveis de transcrição por meio do recrutamento da RNA polimerase II para o sítio de início da transcrição Em terceiro lugar os genes eucarióticos estão compactados na cromatina A ativação e a repressão dos genes necessitam de modificações específicas na cromatina A vasta maioria dos milhares de genes em um genoma eucariótico típico está desligada em qualquer ocasião Os genes são mantidos em um estado transcricionalmente inativo por meio da participação dos nucleossomos que atuam para compactar a cromatina e prevenir a ligação da RNA polimerase II A posição dos nucleossomos e a extensão da condensação da cromatina são determinadas pelo padrão de modificações póstradução das caudas de histonas As modificações das histonas são marcas epigenéticas que juntamente com a metilação das bases citosina podem ser alteradas por fatores de transcrição Esses fatores se ligam às regiões reguladoras e recrutam complexos proteicos que modificam enzimaticamente os nucleossomos adjacentes Esses grandes complexos proteicos multissubunitários utilizam a energia da hidrólise de ATP para movimentar os nucleossomos e remodelar a cromatina A replicação do DNA copia fielmente ambas a sequência do DNA e a estrutura da cromatina da célula genitora para as célulasfilhas Células recémformadas herdam tanto a informação genética inerente à sequência de nucleotídios do DNA quanto a informação epigenética que está no código de histonas e no padrão de metilação do DNA A existência de fenômenos epigenéticos tais como o imprinting genético e a inativação do cromossomo X demonstra que a expressão gênica eucariótica pode ser silenciada sem a alteração da sequência de DNA do gene Outro fenômeno epigenético a variegação por efeito de posição revelou a existência de domínios heterocromáticos repressivos que estão associados a nucleossomos altamente condensados e que contêm poucos genes Isoladores de barreira mantêm a integridade do genoma ao evitar a conversão da eucromatina em heterocromatina Existe uma crescente apreciação em relação ao papel dos RNA funcionais tais como os ncRNA e os miRNA na regulação da expressão gênica eucariótica Esses RNA direcionam complexos proteicos para o DNA complementar ou o RNA na célula Em relação a alguns RNA como o Xist o ato de transcrição pode fixar o RNA a uma região cromossômica na qual proteínas se ligarão e alterarão a cromatina Contrariamente a tradução de centenas de mRNA é reprimida quando RISC ligado a miRNA complementares é direcionado às regiões 3UTR dos mRNA TERMOSCHAVE acentuador acentuassomo cauda de histonas coativador código de histonas compensação de dose complexo mediador corpúsculo de Barr correpressor domínio de ativação efeito sinérgico elemento proximal do promotor eucromatina gene repórter hemimetilação 1 2 herança epigenética heterocromatina heterocromatina constitutiva hiperacetilação hipoacetilação histona desacetilase HDAC ilhota de CpG imprinting genômico imprinting materno imprinting paterno isolador de barreira isolador de bloqueio de acentuador marca epigenética modificação das histonas modificação póstradução PTM remodelagem da cromatina sequência de ativação upstream UAS silenciamento gênico póstranscricional silenciamento gênico transcricional variante de histonas variegação por efeito de posição PEV PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Na Figura 124 determinadas mutações diminuem a taxa de transcrição relativa do gene da βglobina Onde essas mutações estão localizadas e como elas exercem seus efeitos sobre a transcrição Com base nas informações na Figura 126 como Gal4 regula quatro genes GAL diferentes ao mesmo tempo Contraste esse mecanismo com o modo como o repressor Lac controla a expressão de três genes 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Em qualquer experimento controles são essenciais para determinar o efeito específico da alteração de algum parâmetro Na Figura 127 quais construtos são os controles que atuam para estabelecer o princípio de que os domínios de ativação são modulares e intercambiáveis Contraste o papel da proteína MCM1 nos diferentes tipos celulares de levedura demonstrados na Figura 1210 Como os genes aespecíficos são diferentemente controlados em tipos celulares diferentes Na Figura 1211 B em qual região cromossômica você provavelmente encontra a maior parte da proteína histona H1 Qual é a conexão conceitual entre as Figuras 1212 e 1219 Na Figura 1219 onde o TATA boxe está localizado antes da formação do acentuassomo na parte superior da figura Digamos que você apresenta habilidades incríveis e consegue isolar as manchas brancas e vermelhas de tecido dos olhos de Drosophila demonstradas na Figura 1224 com a finalidade de isolar o mRNA de cada preparação tecidual Utilizando o seu conhecimento sobre as técnicas de DNA do Capítulo 10 desenhe um experimento que possibilitaria a você determinar se o RNA é transcrito a partir do gene branco no tecido vermelho ou no tecido branco ou ambos Se for necessário você tem acesso ao DNA radioativo do gene branco Na Figura 1226 forneça um mecanismo bioquímico pelo qual a HP1 consegue se ligar ao DNA apenas do lado esquerdo do isolador de barreira De modo semelhante por que a HMTase consegue se ligar apenas ao DNA à esquerda do isolador de barreira Em referência à Figura 1228 desenhe o desfecho se houver uma mutação no gene B PROBLEMAS BÁSICOS Quais analogias você consegue traçar entre os fatores de transcrição transatuantes que ativam a expressão gênica em eucariotos e os fatores 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 correspondentes em bactérias Forneça um exemplo Contraste como os estados fundamentais dos genes no DNA de bactérias e eucariotos diferem em relação à ativação gênica ver Figura 122 Preveja e explique o efeito sobre a transcrição de GAL1 na presença somente de galactose das mutações a seguir a Deleção de um sítio de ligação de Gal4 no elemento UAS GAL1 b Deleção de todos os quatro sítios de ligação de Gal4 no elemento UAS GAL1 c Deleção do sítio de ligação Mig1 upstream de GAL1 d Deleção do domínio de ativação Gal4 e Deleção do gene GAL80 f Deleção do promotor GAL1 g Deleção do gene GAL3 Como a ativação do gene GAL1 é evitada na presença de galactose e glicose Quais são os papéis da desacetilação e da acetilação de histonas na regulação gênica respectivamente Uma linhagem α de levedura que não consegue realizar a alteração do tipo reprodutivo é isolada Quais mutações ela pode carregar que expliquem esse fenótipo Quais genes são regulados pelas proteínas α1 e α2 em uma célula α O que são as proteínas Sir Como as mutações nos genes SIR afetam a expressão dos cassetes de tipo reprodutivo Qual é o significado do termo herança epigenética Cite dois exemplos de tal herança O que é um acentuassomo Por que uma mutação em qualquer uma das proteínas do acentuassomo poderia reduzir drasticamente a taxa de transcrição Normalmente a deleção de um gene resulta em uma mutação recessiva Explique como a deleção de um gene imprintado pode ser uma mutação 22 23 24 25 26 27 28 29 dominante O que é necessário ocorrer para que a expressão de dois genes diferentes em dois cromossomos diferentes seja regulada pelo mesmo miRNA Quais mecanismos se acredita serem responsáveis pela herança da informação epigenética Qual a diferença fundamental no modo como os genes bacterianos e eucarióticos são regulados Por que se diz que a regulação da transcrição em eucariotos é caracterizada por interações combinatórias Qual das declarações a seguir a respeito das histonas é verdadeira a Elas são proteínas cuja sequência é altamente conservada em todos os eucariotos b Elas são os blocos de construção dos nucleossomos c a e b estão corretas d Nenhuma das anteriores está correta Os nucleossomos são a compostos por DNA e proteína b necessários para condensar o DNAos cromossomos c essenciais para a correta regulação da expressão gênica eucariótica d Todas as anteriores são verdadeiras As regiões cromossômicas que formam a heterocromatina a contêm genes altamente expressos b contêm poucos genes c estão associadas à membrana nuclear d são abundantes em procariotos A compensação de dose é necessária porque a algumas regiões do genoma contêm mais genes do que outras b os genes próximos da heterocromatina tendem a ser silenciados c os acentuadores podem ativar a transcrição estejam eles upstream ou downstream de um gene 30 31 32 33 34 d os genes no cromossomo X apresentam o dobro de cópias nas fêmeas do que nos machos Qual das seguintes é verdadeira a respeito da cromatina em procariotos a Os cromossomos bacterianos não estão organizados em cromatina b Está localizada no núcleo c Está localizada no citoplasma d É muito semelhante à cromatina em eucariotos Qualis das declarações a seguir ésão verdadeiras sobre o fenótipo da cor de olhos variegada na Figura 1223 a O gene branco está ativo nos setores brancos e inativo nos setores vermelhos b O gene branco está inativo nos setores brancos e ativo nos setores vermelhos c O gene branco está inativo nos setores brancos em virtude da difusão da heterocromatina d b e c são ambas verdadeiras Quais dos seguintes são marcas epigenéticas a Aminoácidos básicos metilados nas caudas de histonas b Resíduos de citosina metilados no DNA c Aminoácidos acetilados nas caudas de histonas d Todas as anteriores são marcas epigenéticas PROBLEMAS DESAFIADORES A transcrição de um gene denominado YFG your favorite gene é ativada quando três fatores de transcrição TFA TFB TFC interagem para recrutar o coativador CRX TFA TFB TFC e CRX e seus respectivos sítios de ligação constituem um acentuassomo localizado a 10 kb do local de início da transcrição Desenhe um diagrama demonstrando como você acredita que o acentuassomo atue para recrutar a RNA polimerase para o promotor de YFG Uma única mutação em um dos fatores de transcrição no Problema 33 35 36 37 38 39 resulta em uma redução drástica na transcrição de YFG Diagrame a representação dessa interação mutante Diagrame o efeito de uma mutação no sítio de ligação para um dos fatores de transcrição no Problema 33 Alelos nulos genes mutantes não produzem produto proteico Essa é uma alteração genética Entretanto genes epigeneticamente silenciados também não produzem produto proteico Como se determina experimentalmente se um gene foi silenciado por mutação ou se foi silenciado epigeneticamente O que são marcas epigenéticas Quais estão associadas à heterocromatina Como se acredita que as marcas epigenéticas sejam responsáveis pela determinação da estrutura da cromatina Você recebe quatro linhagens de leveduras pelo correio e as instruções de acompanhamento declaram que cada linhagem contém uma única cópia do transgene A Você cultiva as quatro linhagens e determina que apenas três linhagens expressam o produto proteico do transgene A Análise adicional revela que o transgene A está localizado em uma posição diferente no genoma de levedura em cada uma das quatro linhagens Forneça uma hipótese para explicar esse resultado Você deseja encontrar os elementos reguladores de ação cis do DNA responsáveis pelas respostas de transcrição de dois genes cfos e globina A transcrição do gene cfos é ativada em resposta ao fator de crescimento de fibroblasto FGF mas é inibida pelo cortisol Cort Por outro lado a transcrição do gene globina não é afetada pelo FGF ou pelo cortisol mas é estimulada pelo hormônio eritropoetina EP Para encontrar os elementos reguladores do DNA de ação cis responsáveis por essas respostas transcricionais você utiliza os clones a seguir dos genes cfos e globina bem como duas combinações híbridas genes de fusão conforme demonstrado no diagrama a seguir A letra A representa o gene cfos intacto D representa o gene globina intacto e B e C representam fusões dos genes cfos e globina Os éxons E e os íntrons I de cfos e globina estão numerados Por exemplo E3f é o terceiro éxon do gene cfos e I2g é o segundo íntron do gene globina Esses rótulos são fornecidos para ajudar a tornar a sua resposta clara Os sítios de início da transcrição setas pretas e os sítios de poliadenilação setas vermelhas estão indicados Você introduz todos os quatro clones simultaneamente em células de cultura de tecido e em seguida estimula alíquotas individuais dessas células com um dos três fatores A análise em gel do RNA isolado a partir das células fornece os resultados a seguir Os níveis de transcritos produzidos pelos genes introduzidos em resposta a diversos tratamentos estão demonstrados a intensidade dessas bandas é proporcional à quantidade de transcritos produzidos a partir de um clone em particular A falha na visualização de uma banda indica que o nível de transcrito é indetectável a Onde está o elemento de DNA que possibilita a ativação por FGF b Onde está o elemento de DNA que possibilita a repressão por Cort 40 41 c Onde está o elemento de DNA que possibilita a indução por EP Explique a sua resposta Com a utilização do sistema experimental demonstrado na Figura 1226 um geneticista é capaz de inserir um isolador de barreira entre o gene white e a heterocromatina O fenótipo do olho de Drosophila transgênica mais provavelmente seria a todo branco tendo em vista que o elemento de barreira evitará a difusão da heterocromatina b todo vermelho tendo em vista que o elemento de barreira evitará a difusão da heterocromatina c ainda variegado tendo em vista que os elementos de barreira não interrompem a difusão da heterocromatina d ainda variegado tendo em vista que os elementos de barreira não atuam em Drosophila Qual dos seguintes é um exemplo de repressão gênica póstranscricional a A quantidade de RNA transcrito a partir de um gene é reduzida em virtude da metilação do DNA b A quantidade de RNA é reduzida em virtude de sua rápida degradação c A quantidade de proteína produzida é reduzida por meio da ação de um miRNA d As alternativas b e c estão ambas corretas 131 132 133 134 135 136 137 Expressão gênica em um embrião de moscadasfrutas em desenvolvimento As sete listras magenta marcam as células que expressam o mRNA de um gene que codifica uma proteína reguladora que controla o número de segmentos no embrião de Drosophila A regulação espacial da expressão gênica é central para o controle do desenvolvimento animal Dave Kosman Ethan Bier e Bill McGinnis TÓPICOS Abordagem genética do desenvolvimento Toolkit genética para o desenvolvimento de Drosophila Definição da toolkit inteira Regulação espacial da expressão gênica no desenvolvimento Regulação póstranscricional da expressão gênica no desenvolvimento De moscas a dedos penas e placas do assoalho Os muitos papéis dos genes toolkit Desenvolvimento e doença RESULTADOS DE APRENDIZAGEM D Após ler este capítulo você será capaz de Distinguir os membros da toolkit genética para o desenvolvimento de outros genes e explicar como eles são identificados Correlacionar onde e quando os genes reguladores de padrões são expressos durante o desenvolvimento com os fenótipos que resultam de mutações neles Explicar exemplos de como padrões de expressão gênica espacialmente restritos são gerados durante o desenvolvimento Relacionar as funções bioquímicas das proteínas toolkit aos seus efeitos sobre o desenvolvimento dos corpos ou das partes corporais Identificar componentes homólogos da toolkit genética em diferentes filos de animais e todos os fenômenos na biologia poucos inspiram mais admiração do que a formação de um animal complexo a partir de uma célula única o zigoto Nessa transformação espetacular forças invisíveis organizam a massa de células em divisão em uma forma com uma cabeça e uma cauda distintas vários apêndices e muitos órgãos O grande geneticista Thomas Hunt Morgan não ficou imune a esse apelo estético Um zigoto transparente na medida em que se desenvolve é um dos objetos mais fascinantes no mundo dos seres vivos A contínua alteração na forma que ocorre hora a hora nos intriga em virtude de sua grande simplicidade Os padrões geométricos que se apresentam a cada mudança convidam à análise matemática Esse espetáculo faz um apelo irresistível aos lados emocional e artístico de nossa natureza1 Entretanto por toda a sua beleza e fascinação biólogos foram confundidos durante décadas a respeito de como a forma biológica é gerada durante o desenvolvimento Morgan também disse que se o mistério que circunda a embriologia sequer chegar a ser da nossa compreensão devemos recorrer a outros meios além da descrição do espetáculo que se apresenta A longa estagnação na embriologia durou muito mais do que a época de Morgan nas décadas de 1910 e 1920 mas finalmente foi rompida por geneticistas que trabalhavam muito na tradição da genética ao estilo de Morgan e com seu modelo genético favorito e mais produtivo a moscadasfrutas Drosophila melanogaster Os catalisadoreschave para a compreensão da formação dos animais foram as descobertas de monstros genéticos moscasdasfrutas mutantes com alterações dramáticas das estruturas corporais Figura 131 Nos primórdios da genética de Drosophila mutantes raros com transformações espetaculares de partes do corpo surgiram espontaneamente ou como subprodutos de outros experimentos Em 1915 Calvin Bridges então aluno de Morgan isolou uma mosca com uma mutação que fazia com que as pequenas asas traseiras halteres da moscadas frutas se assemelhassem às grandes asas dianteiras Ele apelidou o mutante de bithorax A transformação em mutantes bithorax é denominada homeótica do grego homeos que significa o mesmo ou semelhante tendo em vista que uma parte do corpo a asa traseira é transformada e se assemelha a outra a asa dianteira conforme demonstrado na Figura 131 B Subsequentemente diversos outros mutantes homeóticos foram identificados em Drosophila tais como o dramático mutante Antennapedia no qual pernas se desenvolvem no lugar das antenas Figura 131 C Os efeitos espetaculares dos mutantes homeóticos inspiraram o que se tornaria uma revolução na embriologia após terem sido disponibilizados recursos de biologia molecular para compreender o que os genes homeóticos codificavam e como exerciam tamanha influência no desenvolvimento de partes corporais inteiras Surpreendentemente esses estranhos genes da moscadasfrutas se tornaram um passaporte para o estudo de todo o reino animal na medida em que foram descobertos correspondentes desses genes que desempenhavam papéis semelhantes em quase todos os animais FIGURA 131 Em mutantes homeóticos a identidade de uma estrutura corporal foi alterada para outra A Mosca normal com um par de asas dianteiras no segundo segmento torácico e um par de pequenas asas traseiras no terceiro segmento torácico B Mutante triplo para três mutações no gene Ultrabithorax A função de Ubx é perdida na parte posterior do tórax o que causa o desenvolvimento de asas dianteiras no lugar das asas traseiras C Mutante Antennapedia no qual as antenas são transformadas em pernas Sean Carroll O estudo do desenvolvimento de animais e plantas é uma disciplina muito ampla e ainda em crescimento Como tal não tentamos uma visão geral abrangente da embriologia Em vez disso neste capítulo enfocaremos alguns poucos conceitos gerais que ilustram a lógica do controle genético do 131 desenvolvimento de animais Exploraremos como a informação para a construção de estruturas complexas é codificada no genoma Contrariamente ao controle da regulação gênica em células únicas bacterianas ou eucarióticas o controle genético da formação e da padronização corporal é fundamentalmente uma questão de regulação gênica no espaço tridimensional e no tempo Veremos ainda que os princípios que regem o controle genético do desenvolvimento estão conectados àqueles já apresentados nos Capítulos 11 e 12 determinantes do controle fisiológico da expressão gênica em bactérias e eucariotos unicelulares Abordagem genética do desenvolvimento Durante muitas décadas o estudo do desenvolvimento embrionário envolveu sobretudo a manipulação física de embriões células e tecidos Foram estabelecidos diversos conceitoschave a respeito das propriedades de embriões em desenvolvimento por meio de experimentos nos quais parte de um embrião foi transplantada em outra Por exemplo o transplante de uma parte de um embrião de anfíbio em desenvolvimento para outro local em um embrião receptor induz o tecido adjacente a formar um segundo eixo corporal completo Figura 132 A De modo semelhante o transplante da parte posterior de um membro de pintinho em desenvolvimento para a anterior pôde induzir dedos extras mas com polaridade reversa em relação aos dedos normais Figura 132 B Essas regiões transplantadas do embrião de anfíbio e do membro de galinha em desenvolvimento foram denominadas organizadores em virtude de sua extraordinária capacidade de organizar o desenvolvimento de tecidos adjacentes Foi postulado que as células nos organizadores produzem morfógenos moléculas que induziam diversas respostas no tecido adjacente de modo dependente da concentração Embora esses resultados experimentais fossem espetaculares e fascinantes não houve progresso adicional na compreensão da natureza dos organizadores e dos morfógenos após a sua descoberta na primeira metade da década de 1900 Era praticamente impossível isolar as moléculas responsáveis por essas atividades 1 2 3 4 com a utilização de técnicas de separação bioquímica As células embrionárias produzem milhares de substâncias proteínas glicolipídios hormônios e assim por diante Um morfógeno pode ser qualquer uma dessas moléculas mas estaria presente em quantidades minúsculas uma agulha no palheiro dos produtos celulares O longo impasse na definição da embriologia em termos moleculares foi rompido por abordagens genéticas principalmente o isolamento sistemático de mutantes com defeitos discretos no desenvolvimento e a subsequente caracterização e estudo dos produtos gênicos que eles codificavam A abordagem genética para o estudo do desenvolvimento apresentou muitas vantagens sobre as estratégias bioquímicas alternativas Primeiramente o geneticista não precisa realizar quaisquer presunções a respeito do número ou da natureza das moléculas necessárias para um processo Em segundo lugar a quantidade limitada de um produto gênico não é um impedimento todos os genes podem sofrer mutação independentemente da quantidade de produto produzido por um gene Em terceiro lugar a abordagem genética pode revelar fenômenos para os quais não existe ensaio bioquímico ou outro bioensaio Do ponto de vista genético existem quatro questõeschave a respeito do número da identidade e da função dos genes que participam no desenvolvimento Quais genes são importantes no desenvolvimento Onde no animal em desenvolvimento e em quais ocasiões esses genes estão ativos Como a expressão dos genes do desenvolvimento é regulada Por meio de quais mecanismos moleculares os produtos gênicos afetam o desenvolvimento Para abordar essas questões precisaram ser planejadas estratégias para identificar catalogar e analisar os genes que controlam o desenvolvimento Uma das primeiras considerações na análise genética do desenvolvimento animal foi qual animal deveria ser estudado Dentre os milhões de espécies vivas quais eram as mais promissoras A moscadasfrutas Drosophila melanogaster surgiu como o modelo genético líder do desenvolvimento animal em virtude de sua facilidade de criação do rápido ciclo de vida da citogenética e das décadas de análise genética clássica incluindo o isolamento de muitos mutantes notáveis que proporcionavam vantagens experimentais importantes ver Organismo modelo Drosophila O nematódeo Caenorhabditis elegans também apresentava diversas características atraentes mais particularmente sua estrutura simples e linhagens celulares bemestudadas Entre os vertebrados o desenvolvimento das técnicas de alteração de genesalvo disponibilizou o camundongo de laboratório para estudos genéticos mais sistemáticos e o peixezebra Danio rerio recentemente se tornou um modelo favorito em virtude da transparência do embrião e dos avanços no seu estudo genético Entre as plantas a Arabidopsis thaliana tem desempenhado um papel semelhante ao da Drosophila no esclarecimento dos mecanismos fundamentais no desenvolvimento das plantas FIGURA 132 Experimentos com transplantes desempenharam um papel central no início da embriologia e demonstraram a atividade de organização de longo alcance dos tecidos embrionários A O organizador Spemann O lábio do blastóporo dorsal de um embrião de anfíbio inicial pode induzir um segundo eixo embrionário e um novo embrião quando transplantado para a região ventral de um embrião receptor B No broto do membro vertebral de galinha em desenvolvimento a zona de atividade polarizada ZPA organiza o padrão ao longo do eixo anteroposterior O transplante de ZPA de uma posição posterior para uma anterior induz dedos extras com polaridade reversa ORGANISMOMODELO Drosophila Análise mutacional do desenvolvimento inicial de Drosophila As percepções iniciais sobre o controle genético da formação de padrões tiveram origem a partir de estudos da moscadasfrutas Drosophila melanogaster O desenvolvimento da Drosophila comprovou ser uma mina de ouro para os pesquisadores tendo em vista que os problemas do desenvolvimento podem ser abordados por meio da utilização de técnicas genéticas e moleculares simultaneamente O embrião de Drosophila tem sido especialmente importante na compreensão da formação do plano corporal animal básico Um motivo para isso é que uma anormalidade no plano corporal de um mutante é facilmente identificada no exoesqueleto larval do embrião da Drosophila O exoesqueleto larval é uma estrutura não celular composta por um polímero de polissacarídio denominado quitina que é produzido como uma secreção das células epidérmicas do embrião Cada estrutura do exoesqueleto é formada a partir de células epidérmicas ou imediatamente adjacentes àquela estrutura Com seu padrão intricado de cerdas endentações e outras estruturas o exoesqueleto proporciona diversos pontos de referência que atuam como indicadores dos destinos atribuídos às muitas células epidérmicas Em particular existem muitas estruturas anatômicas distintas ao longo dos eixos anteroposterior AP e dorsoventral DV ver adiante Além disso tendo em vista que todos os nutrientes necessários para o desenvolvimento do estágio larval estão préacondicionados no zigoto embriões mutantes nos quais os destinos das células AP ou DV são drasticamente alterados podem não obstante desenvolverse até o final da embriogênese e produzir uma larva mutante em aproximadamente 1 dia ver ilustração O exoesqueleto de uma referida larva mutante espelha os destinos mutantes atribuídos aos subconjuntos das células epidérmicas e assim pode identificar genes valiosos para uma análise detalhada O desenvolvimento do padrão corporal adulto da Drosophila demora pouco mais de 1 semana ver ilustrações Pequenas populações de células reservadas durante a embriogênese proliferam durante três estágios larvais instars e se diferenciam no estágio de pupa em estruturas adultas Essas células reservadas incluem os discos imaginais regiões com formato de disco que dão origem a apêndices e tecidos específicos em cada segmento como pernas asas olhos e discos de antenas Os discos imaginais são de fácil remoção para a análise da expressão gênica ver Figura 137 Os genes que contribuem para o plano corporal de Drosophila podem ser clonados e caracterizados no nível molecular com facilidade A análise dos genes clonados com frequência fornece informações valiosas sobre a função do produto proteico normalmente pela identificação de correlatos próximos na sequência de aminoácidos do polipeptídio codificado por meio de comparações com todas as sequências proteicas armazenadas em bases de dados públicas Além disso podese investigar os padrões espacial e temporal da expressão 1 de um mRNA por meio da utilização de sequências de DNA unifilamentar marcadas histoquimicamente complementares ao mRNA para a realização da hibridização in situ do RNA ou 2 de uma proteína por meio da utilização de anticorpos marcados histoquimicamente que se ligam especificamente à proteína Utilização do conhecimento de um organismomodelo para acelerar a descoberta de genes de desenvolvimento em outros organismos Com a descoberta de que existem diversos genes homeoboxe no genoma de Drosophila as semelhanças entre as sequências de DNA desses genes podem ser exploradas em caças ao tesouro em relação a outros membros da família do gene homeótico Essas caçadas dependem da complementaridade dos pares de bases do DNA Para essa finalidade foram realizadas hibridizações de DNA sob condições de estringência moderada nas quais pode haver algum pareamento incorreto de bases entre os filamentos hibridizados sem prejudicar o pareamento adequado por ligações de hidrogênio dos pares de bases próximos Algumas dessas caças ao tesouro foram realizadas no próprio genoma de Drosophila na busca por mais membros da família Outras procuraram genes homeoboxe em outros animais por meio de zoo blots Southern blots de DNA digerido por enzima de restrição de diferentes animais por meio da utilização do DNA homeoboxe radioativo de Drosophila como sonda Essa abordagem levou à descoberta de sequências homeoboxe homólogas em muitos animais diferentes incluindo seres humanos e camundongos De fato essa é uma abordagem muito poderosa para pescar correlatos de quase todos os genes em seu organismo favorito Agora os genes homólogos são tipicamente identificados por meio de pesquisas computadorizadas de sequências genômicas Capítulo 14 Visão geral do desenvolvimento de Drosophila A larva se forma em 1 dia e em seguida é submetida a diversos estágios de crescimento durante os quais os discos imaginais e outros precursores de estruturas adultas proliferam Estas estruturas se diferenciam durante a pupação e a mosca adulta eclode eclosão e inicia o ciclo novamente 132 Por meio de análise genética sistemática e direcionada bem como de estudos genômicos comparativos foi definida uma grande parte da caixa de ferramentas genéticas toolkit para o desenvolvimento dos corpos das partes corporais e dos tipos celulares de diferentes espécies animais Primeiramente enfocaremos a toolkit genética de Drosophila melanogaster tendo em vista que a sua identificação foi uma fonte de percepções importantes sobre o controle genético do desenvolvimento a sua descoberta catalisou a identificação da toolkit genética de outros animais incluindo seres humanos Toolkit genética para o desenvolvimento de Drosophila Os genomas animais tipicamente contêm aproximadamente 13000 a 22000 genes Muitos desses genes codificam proteínas que atuam em processos essenciais em todas as células do corpo p ex no metabolismo celular ou na biossíntese de macromoléculas Os referidos genes com frequência são denominados genes de manutenção Outros genes codificam proteínas que realizam as tarefas especializadas de diversos sistemas orgânicos tecidos e células do corpo tais como as proteínas globinas no transporte de oxigênio ou proteínas de anticorpos que medeiam a imunidade Aqui estamos interessados em um conjunto diferente de genes aqueles que dizem respeito à formação de órgãos e tecidos e à especificação dos tipos celulares a toolkit genética para o desenvolvimento que determina o plano corporal geral e o número a identidade e o padrão das partes corporais Os genes toolkit da moscadasfrutas em geral foram identificados por meio das monstruosidades ou catástrofes que surgem quando eles estão mutados Mutações nos genes toolkit de duas fontes produziram a maior parte do nosso conhecimento A primeira fonte é composta por mutações espontâneas que surgem em populações de laboratório A segunda por mutações induzidas aleatoriamente por meio do tratamento com mutágenos tais como substâncias químicas ou radiação que aumentam muito a frequência de genes danificados em todo o genoma Os elegantes refinamentos da última abordagem tornaram possíveis pesquisas sistemáticas por mutantes que identificaram muitos membros da toolkit genética da mosca Os membros dessa toolkit constituem apenas uma pequena fração talvez diversas centenas de genes dos aproximadamente 14000 genes no genoma da mosca CONCEITOCHAVE A toolkit genética para o desenvolvimento animal é composta por uma pequena fração de todos os genes Apenas um pequeno subconjunto de todo o complemento de genes no genoma afeta o desenvolvimento de modos bemdefinidos Classificação dos genes pela função no desenvolvimento Uma das primeiras tarefas após a execução de uma triagem genética em relação a mutações é classificar aquelas de interesse Muitas mutações são letais quando hemizigotas ou homozigotas tendo em vista que as células não conseguem sobreviver sem os produtos afetados por essas mutações As mutações mais interessantes são aquelas que causam algum defeito bemdefinido sobre o padrão corporal embrionário ou adulto ou ambos Comprovouse útil agrupar os genes afetados por mutações em diversas categorias com base na natureza de seus fenótipos mutantes Muitos genes toolkit podem ser classificados de acordo com a sua função no controle da identidade das partes corporais p ex de diferentes segmentos ou apêndices na formação de partes corporais p ex de órgãos e anexos no número de partes corporais na formação de tipos celulares e na organização dos eixos corporais primários os eixos anteroposterior ou AP e dorsoventral ou DV Iniciaremos o nosso inventário da toolkit de Drosophila por meio do exame dos genes que controlam a identidade dos segmentos e dos apêndices Fazemos isso para fins históricos e conceituais Os genes que controlam a identidade dos segmentos e dos apêndices estão entre os primeiros genes toolkit identificados As descobertas subsequentes a respeito da sua natureza foram fontes de percepções profundas não apenas sobre como os seus produtos atuam mas também sobre o conteúdo e o funcionamento da toolkit da maior parte dos animais Além disso seus espetaculares fenótipos mutantes indicam que eles estão entre os genes de ação mais global que afetam a forma animal O aprendizado a respeito desses genes deve estimular os nossos apetites para aprender mais a respeito de toda a toolkit que controla o desenvolvimento da forma animal Genes homeóticos e identidade segmentar Entre as anormalidades mais fascinantes a serem descritas em animais estão aquelas nas quais uma parte corporal normal é substituída por outra As referidas transformações homeóticas foram observadas em muitas espécies na natureza incluindo dípteros nos quais uma perna formase no lugar de uma antena e rãs nas quais uma vértebra torácica formase no lugar de uma vértebra cervical Figura 133 Embora comumente apenas um membro de um par de estruturas bilaterais esteja alterado em muitas variantes de ocorrência natural ambos os membros de um par de estruturas bilaterais estão alterados em mutantes homeóticos das moscasdasfrutas No caso anterior a alteração não é hereditária mas mutantes homeóticos reproduzemse de geração para geração FIGURA 133 Um desenho do fim do século 19 de um dos primeiros estudos de transformações homeóticas na natureza A Homeose em um díptero com a antena esquerda transformada em uma perna B Homeose em uma rã A amostra intermediária é normal A amostra à esquerda apresenta estruturas extras que crescem para fora da parte superior da coluna vertebral A amostra à direita apresenta um par de vértebras extra De W Bateson Material for the Study of Variation Macmillan 1894 A fascinação científica pelos mutantes homeóticos tem origem em três propriedades Primeiramente é impressionante que uma única mutação gênica possa alterar uma via do desenvolvimento tão dramaticamente Em segundo lugar é surpreendente que a estrutura formada no mutante seja um similar bem desenvolvido de outra parte corporal Por fim é importante observar que mutações homeóticas transformam a identidade de estruturas serialmente reiteradas Os corpos de insetos e de muitos animais são compostos por partes repetidas de estruturas semelhantes como blocos estruturais arranjados em uma série As asas dianteiras e traseiras os segmentos e as antenas as pernas e as partes bucais dos insetos são conjuntos de partes corporais serialmente reiteradas As mutações homeóticas transformam identidades dentro desses grupos Uma mutação pode causar uma perda de função do gene homeótico onde o gene normalmente atua ou pode causar um ganho de função homeótica onde o gene homeótico normalmente não atua Por exemplo o gene Ultrabithorax Ubx atua no desenvolvimento da asa traseira promovendo o desenvolvimento da asa traseira e reprimindo o da asa dianteira Mutações de perda de função em Ubx transformam a asa traseira em dianteira Mutações de ganho de função dominantes em Ubx transformam a asa dianteira em traseira De modo semelhante as transformações de antena em perna dos mutantes Antennapedia Antp são causadas pelo ganho dominante de função de Antp na antena Além dessas transformações na identidade dos apêndices as mutações homeóticas podem transformar a identidade de segmentos fazendo com que um segmento corporal do adulto ou da larva se assemelhe a outro Embora os genes homeóticos tenham sido identificados pela primeira vez por meio de mutações espontâneas que afetam moscas adultas eles são necessários durante a maior parte do desenvolvimento de uma mosca Pesquisas sistemáticas em relação a genes homeóticos levaram à identificação de oito loci atualmente denominados genes Hox que afetam a identidade dos segmentos e de seus apêndices correlatos em Drosophila Em geral a perda completa de qualquer função dos genes Hox é letal no início do desenvolvimento As mutações dominantes que transformam adultos são viáveis nos heterozigotos tendo em vista que o alelo do tipo selvagem proporciona a função gênica normal no animal em desenvolvimento Organização e expressão dos genes Hox Uma característica muito intrigante dos genes Hox é que eles estão agrupados em dois complexos gênicos que estão localizados no terceiro cromossomo de Drosophila O complexo Bithorax contém três genes Hox e o complexo Antennapedia cinco Além disso a ordem dos genes nos complexos e no cromossomo corresponde à ordem das regiões corporais da cabeça à cauda que são influenciadas por cada gene Hox A relação entre a estrutura dos complexos de genes Hox e os fenótipos dos mutantes de genes Hox foi esclarecida pela caracterização molecular dos genes A clonagem molecular das sequências que compreendem cada locus Hox forneceu os meios para analisar onde no animal em desenvolvimento cada gene é expresso Esses aspectos espaciais da expressão e da regulação gênica são cruciais para compreender a lógica do controle genético do desenvolvimento Em relação aos genes Hox e a outros genes toolkit o desenvolvimento de tecnologias que tornaram possível a visualização da expressão gênica e proteica foi crucial para a compreensão da relação entre a organização gênica a função gênica e os fenótipos mutantes Duas tecnologias principais para a visualização da expressão gênica em embriões ou outros tecidos são 1 a expressão de transcritos de RNA visualizada por meio de hibridização in situ e 2 a expressão de proteínas visualizadas por meio de métodos imunológicos Cada tecnologia depende do isolamento de clones de cDNA que representam o transcrito de mRNA maduro e a proteína Figura 134 No embrião em desenvolvimento os genes Hox são expressos em domínios espacialmente restritos por vezes sobrepostos dentro do embrião Figura 135 Os genes também são expressos nos tecidos da larva e da pupa que darão origem às partes corporais do adulto Os padrões de expressão dos genes Hox e outros genes toolkit em geral estão correlacionados com as regiões do animal afetadas pelas mutações gênicas Por exemplo o sombreamento azulescuro na Figura 135 indica onde o gene Ubx é expresso Esse gene Hox é expresso no segmento torácico posterior e na maior parte dos segmentos abdominais do embrião O desenvolvimento desses segmentos está alterado em mutantes Ubx O gene Ubx também é expresso nas asas traseiras em desenvolvimento mas não nas asas dianteiras em desenvolvimento Figura 136 conforme seria esperado sabendose que o Ubx promove o desenvolvimento das asas traseiras e reprime o desenvolvimento das asas dianteiras nesse apêndice CONCEITOCHAVE A expressão espacial dos genes toolkit normalmente está correlacionada de modo próximo com as regiões do animal afetadas por mutações gênicas É crucial distinguir o papel dos genes Hox na determinação da identidade de uma estrutura daquele papel que regula a sua formação Na ausência de função de todos os genes Hox os segmentos são formados mas todos apresentam a mesma identidade os membros também podem se formar mas apresentam a identidade de antenas e de modo semelhante as asas podem se formar mas apresentam a identidade de asas dianteiras Outros genes controlam a formação de segmentos membros e asas e serão descritos posteriormente Primeiramente precisamos compreender como os genes Hox exercem seus efeitos dramáticos sobre o desenvolvimento da mosca FIGURA 134 As duas tecnologias principais para visualizar onde um gene é transcrito ou onde a proteína que ele codifica é expressa são esquerda a hibridização in situ de sonda de RNA complementar ao mRNA e direita a imunolocalização da expressão proteica Estão resumidos os procedimentos em relação a cada método Os padrões de expressão podem ser visualizados como o produto de uma reação enzimática ou de um substrato cromogênico ou com compostos marcados com fluorescência FIGURA 135 Expressão dos genes Hox no embrião de Drosophila A Representação esquemática do embrião de Drosophila demonstrando as regiões nas quais oito genes Hox individuais são expressos B Imagem real da expressão de sete genes Hox visualizados por meio de hibridização in situ As cores indicam a expressão de labial turquesa Deformed lavanda Sex combs reduced verde Antennapedia laranja Ultrabithorax azulescuro AbdominalA vermelho e AbdominalB amarelo O embrião está dobrado de modo que a extremidade posterior amarela aparece próximo ao centro da parte superior B Dave Kosman Ethan Bier e Bill McGinnis FIGURA 136 Um exemplo de expressão de gene Hox A A asa adulta de D melanogaster B A proteína Ubx não é expressa em células do disco imaginal em desenvolvimento que formará as asas dianteiras As células enriquecidas com proteínas Hox estão coradas em verde nesta imagem as células coradas em verde são células que não formam a asa C A asa traseira adulta haltere D A proteína Ubx é expressa em níveis altos em todas as células do disco imaginal das asas traseiras em desenvolvimento Scott Weatherbee Homeoboxe Tendo em vista que os genes Hox apresentam grandes efeitos nas identidades de segmentos inteiros e outras estruturas corporais a natureza e a função das proteínas que eles codificam são de interesse em especial Edward Lewis um pioneiro no estudo de genes homeóticos observou inicialmente que o agrupamento de genes do complexo Bithorax sugeria que os múltiplos loci haviam surgido por duplicação em tandem de um gene ancestral Essa ideia levou os pesquisadores a procurar por semelhanças nas sequências de DNA dos genes Hox Eles observaram que todos os oito genes Hox dos dois complexos eram semelhantes o suficiente para hibridizar entre si Observouse que essa hibridização ocorre em virtude de uma curta região da sequência em cada gene de 180 pb de comprimento Esse trecho de similaridade na sequência de DNA em virtude da sua presença em genes homeóticos foi apelidado homeoboxe O homeoboxe codifica um domínio proteico o homeodomínio que contém 60 aminoácidos A sequência de aminoácidos do homeodomínio é muito semelhante entre as proteínas Hox Embora a descoberta de um motivo proteico em comum em cada uma das proteínas Hox tenha sido muito empolgante análise adicional da estrutura do homeodomínio revelou que ela forma um motif hélicegirohélice a estrutura comum ao repressor Lac ao repressor λ Cro e às proteínas reguladoras α2 e a1 dos loci de tipos reprodutivos de leveduras Essa semelhança sugeriu imediatamente e foi subsequentemente corroborada que as proteínas Hox são proteínas sequênciaespecíficas de ligação ao DNA e que elas exercem seus efeitos por meio do controle da expressão de genes nos segmentos e apêndices em desenvolvimento Portanto os produtos desses genes extraordinários atuam por meio de princípios que já são familiares dos Capítulos 11 e 12 por meio da ligação aos elementos reguladores de outros genes para ativar ou reprimir a sua expressão Veremos que isso também é verdadeiro para muitos outros genes toolkit uma fração significativa desses genes codifica fatores de transcrição que controlam a expressão de outros genes CONCEITOCHAVE Muitos genes toolkit codificam fatores de transcrição que regulam a expressão de outros genes Examinaremos como as proteínas Hox e outras proteínas toolkit orquestram a expressão gênica no desenvolvimento um pouco mais posteriormente Primeiramente existe mais uma grande descoberta a ser descrita que revelou que o que aprendemos a partir dos genes Hox da mosca apresenta implicações muito gerais para o reino animal Grupos de genes Hox controlam o desenvolvimento na maior parte dos animais Quando o homeoboxe foi descoberto nos genes Hox de moscas levantouse a dúvida sobre se essa característica era alguma peculiaridade desses genes bizarros de moscas ou se estava mais amplamente distribuída em outros insetos ou animais segmentados por exemplo Para abordar essa possibilidade pesquisadores procuraram por homeoboxes nos genomas de outros insetos bem como de minhocas rãs vacas e até mesmo seres humanos Eles encontraram muitos homeoboxes nos genomas de cada um desses animais As similaridades nas sequências homeoboxe de diferentes espécies eram impressionantes Ao longo dos 60 aminoácidos do homeodomínio algumas proteínas Hox de camundongos e rãs eram idênticas às sequências das moscas em até 59 das 60 posições À luz das vastas distâncias evolutivas entre esses animais com mais de 500 milhões de anos desde o seu último ancestral comum a extensão da similaridade das sequências indica uma pressão muito forte para manter a sequência do homeodomínio A existência de genes Hox com homeoboxes em todo o reino animal era totalmente inesperada Por que diferentes tipos de animais possuiriam os mesmos genes reguladores não era óbvio motivo pelo qual os biólogos foram ainda mais surpreendidos pelos resultados quando a organização e a expressão de genes Hox foram examinadas em outros animais Em vertebrados como o camundongo de laboratório os genes Hox também estão agrupados em quatro grandes complexos gênicos em quatro cromossomos diferentes Cada grupo contém de 9 a 11 genes Hox um total de 39 genes Hox Além disso a ordem dos genes nos complexos Hox de camundongos é paralela à ordem de seus correspondentes mais correlatos nos complexos Hox de moscas bem como em cada um dos outros grupos Hox de camundongos Essa correspondência indica que os complexos Hox de insetos e vertebrados estão relacionados e que existia algum tipo de complexo Hox em seu ancestral comum distante Os quatro complexos Hox em camundongos surgiram por meio de duplicações de complexos Hox inteiros talvez de cromossomos inteiros em ancestrais dos vertebrados A relação entre os eixos corporais adulto e embrionário Por que tais animais diferentes apresentariam esses conjuntos de genes em comum Seus ancestrais comuns indicam que os genes Hox desempenham algum papel fundamental no desenvolvimento da maior parte dos animais Esse papel está aparente a partir de análises sobre como os genes Hox são expressos em diferentes animais Em embriões de vertebrados os genes Hox adjacentes também são expressos em domínios adjacentes ou parcialmente sobrepostos ao longo do eixo corporal anteroposterior Além disso a ordem dos genes Hox nos complexos corresponde à ordem da cabeça à cauda das regiões corporais nas quais os genes são expressos Os padrões de expressão dos genes Hox de vertebrados sugeriam que eles também especificam a identidade das regiões corporais e análises subsequentes de mutantes dos genes Hox corroboraram essa sugestão Por exemplo mutações nos genes Hoxa11 e Hoxd11 causam a transformação homeótica das vértebras sacrais em vértebras lombares Figura 137 Portanto assim como na mosca perda ou ganho de função dos genes Hox em vertebrados causa a transformação da identidade de estruturas serialmente repetidas Os referidos resultados foram obtidos em diversas classes incluindo mamíferos aves anfíbios e peixes Além disso foi demonstrado que grupos de genes Hox regulam a padronização de outros insetos e estão dispostos em regiões ao longo do eixo anteroposterior em anelídeos moluscos nematódeos diversos artrópodes cordatos primitivos platelmintos e outros animais Portanto apesar das enormes diferenças na anatomia a apresentação de um ou mais grupos de genes Hox que estão dispostos em regiões ao longo do eixo corporal principal é uma característica comum e fundamental de no mínimo todos os animais bilaterais De fato as lições surpreendentes dos genes Hox pressagiaram o que se descobriu ser uma tendência geral entre os genes toolkit ou seja a maior parte dos genes toolkit é comum a diferentes animais FIGURA 137 As morfologias das diferentes regiões da coluna vertebral são reguladas pelos genes Hox A Em camundongos seis vértebras lombares são formadas logo anteriormente às vértebras sacrais números em 133 vermelho B Em camundongos com ausência da função de ação posterior do gene Hoxd11 e que apresentam uma cópia funcional do gene Hoxa11 sete vértebras lombares se formam e uma vértebra sacral é perdida C Em camundongos com ausência da função de ambos Hoxa11 e Hoxd11 oito vértebras lombares se formam e duas vértebras sacrais são perdidas As fotografias são cortesia da Dra Anne Boulet HHMI University of Utah de S B Carroll J K Grenier e S D Weatherbee From DNA to Diversity Molecular Genetics and the Evolution of Animal Design 2nd ed Blackwell 2005 CONCEITOCHAVE Apesar de grandes diferenças na anatomia muitos genes toolkit são comuns a uma ampla variedade de diferentes filos de animais Agora façamos um inventário do restante toolkit para verificar quais outros princípios gerais surgem Definição da toolkit inteira Os genes Hox talvez sejam os membros mais bemconhecidos da toolkit mas são apenas uma pequena família em um grupo muito maior de genes necessários para o desenvolvimento dos números formas tamanhos e tipos adequados de partes do corpo Pouco se sabia a respeito do restante da toolkit até o final da década de 1970 e o início da década de 1980 quando Christine NüssleinVolhard e Eric Wieschaus que trabalhavam no Max Planck Institute em Tübingen Alemanha encontraram os genes necessários para a formação da organização segmentar do embrião e da larva de Drosophila Até os seus esforços a maior parte dos trabalhos sobre o desenvolvimento da mosca enfocava fenótipos de adultos viáveis não o embrião NüssleinVolhard e Wieschaus perceberam que os tipos de genes que eles estavam procurando provavelmente eram letais para os embriões ou as larvas em mutantes homozigotos Assim eles inventaram um esquema para procurar os genes que eram necessários no zigoto o produto da fertilização Figura 138 parte inferior Eles também desenvolveram triagens para identificar os genes com produtos que atuam no zigoto antes que o genoma zigótico esteja ativo e que são necessários para a adequada padronização do embrião Os genes com produtos fornecidos pela fêmea ao zigoto são denominados genes de efeito materno Os fenótipos mutantes de genes de efeito materno estrito dependem apenas do genótipo da fêmea Figura 138 parte superior Nessas triagens foram identificados genes que eram necessários para produzir o número e o padrão adequados dos segmentos larvais para produzir as suas três camadas teciduais ectoderma mesoderma e endoderma e para padronizar os detalhes finos da anatomia animal O poder das triagens genéticas era a sua natureza sistemática Ao saturar cada um dos cromossomos da mosca com exceção do pequeno quarto cromossomo com mutações induzidas quimicamente os pesquisadores conseguiram identificar a maior parte dos genes que eram necessários para a construção da mosca Por seus esforços pioneiros Nüsslein Volhard Wieschaus e Lewis compartilharam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 1995 FIGURA 138 Triagens genéticas identificam se um produto gênico atua no ovócito ou no zigoto Os fenótipos da progênie dependem parte superior do genótipo materno em relação aos genes de efeito materno ou parte inferior do genótipo da progênie zigótico em relação aos genes zigoticamente necessários m Mutante Tipo selvagem As características mais surpreendentes e informativas dos mutantes recentemente identificados eram que eles demonstravam defeitos dramáticos porém bemdefinidos na organização ou na padronização do embrião Ou seja a larva morta não era uma carcaça amorfa mas exibia defeitos de padronização específicos com frequência surpreendentes O corpo da larva de Drosophila apresenta diversas características cujo número posição ou padrão podem atuar como pontos de referência para diagnosticar ou classificar as anormalidades em animais mutantes Cada locus portanto pode ser classificado de acordo com o eixo corporal afetado e o padrão de defeitos causados pela mutação Cruzamentos genéticos revelam se o locus está ativo no ovócito materno ou no zigoto Cada classe de genes parece representar diferentes etapas no refinamento progressivo do plano corporal embrionário desde aqueles que afetam grandes regiões do embrião até aqueles com áreas de influência mais limitadas Em relação a qualquer gene toolkit três informações são chaves para a compreensão da função gênica 1 o fenótipo mutante 2 o padrão de expressão gênica e 3 a natureza do produto gênico Estudos extensivos de dúzias de genes levaram a um quadro razoavelmente detalhado de como cada eixo corporal é estabelecido e subdividido em segmentos ou camadas germinativas Eixos anteroposterior e dorsoventral São necessárias algumas dúzias de genes para a adequada organização do eixo corporal anteroposterior do embrião da mosca Os genes estão agrupados em cinco classes com base na sua região de influência no padrão embrionário A primeira classe estabelece o eixo anteroposterior e é composta pelos genes de efeito materno Um membrochave dessa classe é o gene Bicoid Embriões de mães mutantes Bicoid apresentam ausência da região anterior do embrião Figura 139 o que nos informa que o gene é necessário para o desenvolvimento daquela região As próximas três classes são genes zigoticamente ativos necessários para o desenvolvimento dos segmentos do embrião A segunda classe contém os genes gap Cada um desses genes afeta a formação de um bloco contíguo de segmentos mutações nos genes gap levam a grandes intervalos na segmentação Figura 1310 esquerda A terceira classe abrange os genes de regra dos pares que atuam na periodicidade de segmentos duplos Os mutantes de regra dos pares apresentam ausência de uma parte de cada par de segmentos mas diferentes genes de regra dos pares afetam diferentes partes de cada segmento duplo Por exemplo o gene evenskipped afeta um conjunto de limites segmentares e o gene oddskipped afeta o conjunto complementar de limites Figura 1310 parte intermediária FIGURA 139 O gene de efeito materno Bicoid bcd afeta a parte anterior da larva em desenvolvimento Estas fotomicrografias são de larvas de Drosophila que foram preparadas para demonstrar seus exoesqueletos rígidos Estruturas densas tais como as bandas denticuladas segmentares aparecem em branco Esquerda Uma larva normal Direita Larva de uma fêmea mutante bcd homozigota A cabeça e as estruturas torácicas anteriores estão ausentes De C H NüssleinVolhard G Frohnhöfer e R Lehmann Determination of Anteroposterior Polarity in Drosophila Science 238 1987 1678 Reproduzida com autorização da AAAS A quarta classe é composta por genes de polaridade do segmento que afetam a padronização dentro de cada segmento Mutantes dessa classe demonstram defeitos na polaridade e no número de segmentos Figura 1310 direita A quinta classe de genes determina o destino de cada segmento A quinta classe inclui os genes Hox já discutidos os mutantes Hox não afetam o número de segmentos mas alteram o aspecto de um ou mais segmentos Expressão dos genes toolkit Para compreender a relação entre genes e o fenótipo mutante precisamos saber a ocasião e a localização dos padrões de expressão dos genes e a natureza molecular dos produtos gênicos Os padrões de expressão dos genes toolkit correspondem de modo nítido aos seus fenótipos uma vez que com frequência estão precisamente correlacionados com as partes do corpo em desenvolvimento alteradas nos mutantes Cada gene é expresso em uma região que pode ser mapeada para coordenadas específicas ao longo de cada eixo do embrião Por exemplo a proteína Bicoid de efeito materno é expressa em um padrão graduado que emana do polo anterior do embrião inicial a seção do embrião ausente nos mutantes Figura 1311 A De modo semelhante as proteínas gap são expressas em blocos de células que correspondem às futuras posições dos segmentos que estão ausentes nos respectivos mutantes de genes gap Figura 1311 B As proteínas de regra dos pares são expressas em padrões listrados surpreendentes uma listra transversal é expressa a cada dois segmentos em um total de sete listras que abrangem os 14 segmentos corporais futuros a posição e a periodicidade das listras correspondem à periodicidade dos defeitos em larvas mutantes conforme demonstrado na Figura 1311 C Muitos genes de polaridade do segmento são expressos em listras de células dentro de cada segmento 14 listras que no total correspondem aos 14 segmentos corporais Figura 1311 D Observe que os domínios da expressão gênica se tornam progressivamente mais refinados na medida em que o desenvolvimento prossegue os genes são expressos primeiramente em grandes regiões proteínas gap em seguida em listras com três a quatro células de largura proteínas de regra dos pares e em seguida em listras com uma a duas células de largura proteínas de polaridade do segmento Além do que aprendemos a partir dos padrões espaciais da expressão de genes toolkit a ordem de expressão desses genes ao longo do tempo é lógica A proteína Bicoid de efeito materno aparece antes das proteínas gap zigóticas que são expressas antes do aparecimento dos padrões de sete listras das proteínas de regra dos pares que por sua vez precedem os padrões de 14 listras das proteínas de polaridade do segmento A ordem da expressão gênica e o progressivo refinamento dos domínios no embrião revelam que a produção do plano corporal é um processo passo a passo com subdivisões importantes do corpo primeiramente delineadas e em seguida refinadas até que um padrão fino seja estabelecido A ordem de ação gênica sugere adicionalmente que a expressão de um conjunto de genes pode regular a expressão do conjunto de genes seguintes FIGURA 1310 Classes de mutantes de genes de segmentação de Drosophila Esses diagramas ilustram mutantes gap regra dos pares e polaridade do segmento representativos Os trapézios vermelhos são as faixas densas do exoesqueleto observado na Figura 139 O limite de cada segmento está indicado por uma linha pontilhada O diagrama à esquerda de cada par ilustra uma larva do tipo selvagem e o diagrama à direita ilustra o padrão formado em um determinado mutante As regiões laranjaclaras sombreadas nos diagramas do tipo selvagem ilustram os domínios da larva que estão ausentes ou afetados no mutante FIGURA 1311 Os padrões de expressão de genes toolkit correspondem a fenótipos mutantes Embriões de Drosophila foram corados com anticorpos contra A a proteína Bicoid de origem materna B a proteína gap Krüppel C a proteína de regra dos pares Hairy D a proteína de polaridade do segmento Engrailed Os embriões foram visualizados por meio de métodos imunoenzimáticos a coloração é marrom A ou com imunofluorescência a coloração é verde B a D Cada proteína está localizada nos núcleos em regiões do embrião que são afetadas por mutações nos respectivos genes As fotomicrografias são cortesia de A Ruth Lehmann B a D James Langeland Uma indicação de que essa progressão de fato é o que ocorre advém da análise dos efeitos das mutações em genes toolkit na expressão de outros genes toolkit Por exemplo em embriões de mães mutantes Bicoid a expressão de diversos genes gap está alterada bem como aquela dos genes de regra dos pares e de polaridade do segmento Esse achado sugere que a proteína Bicoid de algum modo direta ou indiretamente influencia a regulação dos genes gap Outra indicação de que a expressão de um conjunto de genes pode regular a expressão do conjunto de genes que se sucede advém do exame dos produtos proteicos A inspeção da sequência da proteína Bicoid revela que ela contém um homeodomínio relacionado com o das proteínas Hox porém distinto dele Portanto a Bicoid apresenta as propriedades de um fator de transcrição de ligação ao DNA Cada gene gap também codifica um fator de transcrição assim como cada gene de regra dos pares diversos genes de polaridade do segmento e conforme descrito anteriormente todos os genes Hox Esses fatores de transcrição incluem representantes das famílias mais conhecidas de proteínas sequência específicas de ligação ao DNA assim embora não exista restrição a respeito de a qual família elas possam pertencer muitas proteínas toolkit de ação precoce são fatores de transcrição Aquelas que não são fatores de transcrição tendem a ser componentes de vias de sinalização Tabela 131 Essas vias medeiam processos de sinalização induzidos por ligantes entre as células e seu produto em geral leva à ativação ou à repressão gênica Portanto a maior parte das proteínas toolkit afeta a regulação gênica seja direta como fatores de transcrição ou indiretamente como componentes de vias de sinalização A maior parte das vias de sinalização opera por meio de lógicas semelhantes mas apresenta diferentes componentes proteicos e mecanismos de transdução de sinal CONCEITOCHAVE A maior parte das proteínas toolkit são fatores de transcrição ou componentes de vias de transdução de sinal mediadas por ligantes Os mesmos princípios se aplicam à produção do eixo corporal dorsoventral assim como se aplicam ao eixo anteroposterior O eixo dorsoventral também é subdividido em regiões Diversos genes de efeito materno tais como dorsal são necessários para estabelecer essas regiões em posições distintas do lado dorsal superior em relação ao ventral inferior do embrião Os mutantes dorsais são dorsalizados e não apresentam estruturas ventrais tais como o mesoderma e o sistema nervoso Um punhado de genes que são ativados no zigoto também são necessários para a subdivisão do eixo dorsovenral O produto do gene de efeito materno dorsal é um fator de transcrição a proteína Dorsal Essa proteína é expressa em um gradiente ao longo do eixo dorsoventral com seu mais alto nível de acúmulo em células ventrais Figura 1312 A O gradiente estabelece subregiões de diferentes concentrações da proteína Dorsal Em cada subregião é expresso um conjunto diferente de genes zigóticos que contribuem para a padronização dorsoventral Os conjuntos de genes zigóticos expressos definem regiões que dão origem a camadas teciduais em particular tais como o mesoderma e o neuroectoderma a parte do ectoderma que dá origem ao sistema nervoso ventral conforme demonstrado na Figura 1312 B Tabela 131 Exemplos de genes do eixo AP de Drosophila que contribuem para a formação de padrões Símbolo do gene Nome do gene Função proteica Papeléis no desenvolvimento inicial hbz hunchback zygotic Fator de transcrição proteína zincfinger Gene gap Kr Krüppel Fator de transcrição proteína zincfinger Gene gap kni knirps Fator de transcrição proteína do tipo receptor de esteroide Gene gap eve evenskipped Fator de transcrição proteína de homeodomínio Gene de regra dos pares ftz fushi tarazu Fator de transcrição proteína de Gene de regra dos homeodomínio pares opa oddpaired Fator de transcrição proteína zincfinger Gene de regra dos pares prd paired Fator de transcrição proteína PHOX Gene de regra dos pares en engrailed Fator de transcrição proteína de homeodomínio Gene de polaridade do segmento wg wingless Proteína de sinalização WG Gene de polaridade do segmento hh hedgehog Proteína de sinalização HH Gene de polaridade do segmento ptc patched Proteína transmembrana Gene de polaridade do segmento lab labial Fator de transcrição proteína de homeodomínio Gene de identidade do segmento Dfd Deformed Fator de transcrição proteína de homeodomínio Gene de identidade do segmento Antp Antennapedia Fator de transcrição proteína de homeodomínio Gene de identidade do segmento Ubx Ultrabithorax Fator de transcrição proteína de homeodomínio Gene de identidade do segmento FIGURA 1312 Os domínios de expressão dos genes de padrão do eixo dorsoventral específicos correspondem a camadas específicas de futuros tecidos A A proteína Dorsal de origem materna é expressa em um gradiente com a mais alta concentração de Dorsal nos núcleos de células ventrais parte inferior da fotografia B A expressão de quatro genes zigóticos de padrão do eixo dorsoventral revelada por meio de hibridização in situ com RNA Nesta vista lateral estão revelados os domínios dos genes decapentaplegic amarelo muscle segment homeobox vermelho intermediate neuroblasts defective verde e ventral neuroblasts defective azul Cortesia de A Michael Levine B David Kosnan Bill McGinnis e Ethan Bier O controle genético do desenvolvimento é então fundamentalmente uma 134 questão de regulação gênica no espaço e no tempo Como a ligação e o desligamento de genes toolkit constroem a forma animal E como isso é coreografado durante o desenvolvimento Para responder a essas questões examinaremos as interações das proteínas com os genes toolkit da mosca em mais detalhes Os mecanismos que veremos em relação ao controle da expressão dos genes toolkit no embrião de Drosophila surgiram como modelos para a regulação espacial da expressão gênica no desenvolvimento animal em geral Regulação espacial da expressão gênica no desenvolvimento Vimos que os genes toolkit são expressos em referência a coordenadas no embrião Mas como as coordenadas espaciais do embrião em desenvolvimento são repassadas como instruções para os genes para ligálos ou desligálos em padrões precisos Conforme descrito nos Capítulos 11 e 12 o controle fisiológico da expressão gênica em bactérias e eucariotos simples é em última instância regulado por proteínas sequênciaespecíficas de ligação ao DNA que atuam em elementos reguladores de ação cis p ex operadores e elementos de sequência de ativação upstream ou UAS De modo semelhante o controle espacial da expressão gênica durante o desenvolvimento é amplamente regulado pela interação de fatores de transcrição com os elementos reguladores de ação cis Entretanto o controle espacial e temporal da regulação gênica no desenvolvimento de um embrião multicelular tridimensional requer a ação de mais fatores de transcrição em elementos reguladores de ação cis mais numerosos e mais complexos Para definir uma posição em um embrião deve existir informação reguladora que diferencie aquela posição das regiões adjacentes Se ilustrarmos um embrião tridimensional como um globo deve então ser especificada a informação posicional que indique a longitude localização ao longo do eixo anteroposterior a latitude localização ao longo do eixo dorsoventral e a altitude ou profundidade posição nas camadas germinativas Ilustraremos os princípios gerais a respeito de como as posições da expressão gênica são especificadas com três exemplos Esses exemplos devem ser considerados apenas como algumas ilustrações do vasto número de interações regulatórias que coordenam o desenvolvimento das moscas e dos animais O desenvolvimento é um contínuo no qual cada padrão de atividade gênica apresenta uma base causal precedente O processo inteiro inclui dezenas de milhares de interações regulatórias e produtos Enfocaremos algumas conexões entre os genes em diferentes níveis de hierarquia que determinam o plano corporal segmentar básico e os pontos nodais nos quais geneschave integram múltiplos estímulos reguladores e respondem produzindo expressão gênica mais simples Gradientes maternos e ativação gênica A proteína Bicoid é um fator de transcrição do tipo homeodomínio que é traduzida a partir do mRNA de origem materna depositado no zigoto e localizado no polo anterior Tendo em vista que o embrião inicial de Drosophila é um sincício com todos os núcleos em um citoplasma e ausência de quaisquer membranas celulares que possam impedir a difusão de moléculas proteicas a proteína Bicoid consegue se difundir pelo citoplasma Essa difusão estabelece um gradiente de concentração proteica Figura 1313 A a proteína Bicoid está altamente concentrada na extremidade anterior e essa concentração diminui gradativamente na medida em que a distância daquela extremidade aumenta até que haja muito pouca proteína Bicoid além da parte intermediária do embrião Esse gradiente de concentração fornece informação posicional a respeito da localização ao longo do eixo anteroposterior Uma concentração alta significa a extremidade anterior uma concentração mais baixa significa a parte intermediária e assim por diante Portanto um modo de assegurar que um gene esteja ativado em apenas uma localização ao longo do eixo é relacionar a expressão gênica ao nível de concentração Um caso em questão é o dos genes gap que devem ser ativados em regiões específicas ao longo do eixo FIGURA 1313 A proteína Bicoid ativa a expressão zigótica do gene hunchback A A expressão da proteína Bicoid é graduada ao longo do eixo anteroposterior O gene gap hunchback é expresso na metade anterior do zigoto B A proteína Bicoid azul se liga a três sítios 5 do gene hunchback Quando esse DNA 5 está posicionado upstream de um gene repórter a expressão do gene repórter recapitula o padrão de expressão de hunchback parte superior à direita Entretanto a deleção progressiva de um dois ou todos os três sítios de ligação à Bicoid leva à expressão mais restrita do gene repórter ou a suprime totalmente Estas observações demonstram que o nível e o padrão de expressão de hunchback são controlados por Bicoid por meio de sua ligação às sequências reguladoras do DNA hunchback Diversos genes zigóticos incluindo os genes gap são regulados por diferentes níveis da proteína Bicoid Por exemplo o gene hunchback é um gene gap ativado no zigoto na metade anterior do embrião Essa ativação ocorre por meio da ligação direta da proteína Bicoid a três sítios 5 do promotor do gene hunchback Bicoid se liga a esses sítios de modo cooperativo ou seja a ligação de uma molécula de proteína Bicoid a um sítio facilita a ligação de outras moléculas Bicoid a sítios próximos Experimentos in vivo podem demonstrar que a ativação de hunchback depende do gradiente de concentração Esses testes requerem a ligação de sequências reguladoras do gene a um gene repórter um gene codificador de enzima tal como o gene LacZ ou a proteína fluorescente verde de águaviva introduzindo o construto de DNA na linhagem germinativa da mosca e monitorando a expressão do repórter na progênie de embriões das moscas transgênicas uma visão geral do método está demonstrada na Figura 1314 As sequências 5 do tipo selvagem do gene hunchback são suficientes para direcionar a expressão do repórter na metade anterior do embrião De importância deleções de sítios de ligação da Bicoid nesse elemento regulador de ação cis reduzem ou eliminam a expressão do repórter ver Figura 1313 B Mais de um sítio da Bicoid deve estar ocupado para gerar uma delimitação nítida da expressão do repórter que indica que uma concentração limiar da proteína Bicoid é necessária para ocupar múltiplos sítios antes da ativação da expressão gênica Um gene gap com menos sítios de ligação não será ativado em locais com concentrações mais baixas da proteína Bicoid Cada gene gap contém elementos reguladores de ação cis com diferentes arranjos de sítios de ligação e esses sítios de ligação podem apresentar afinidades diferentes pela proteína Bicoid Consequentemente cada gene gap é expresso em um domínio distinto único no embrião em resposta a níveis diferentes de Bicoid e outros gradientes de fatores de transcrição Um tema semelhante é encontrado na padronização do eixo dorsoventral os elementos reguladores de ação cis contêm diferentes números e arranjos de sítios de ligação para Dorsal e outros fatores de transcrição dorsoventral Consequentemente os genes são ativados em domínios discretos ao longo do eixo dorsoventral CONCEITOCHAVE A resposta dependente de concentração dos genes a estímulos graduados é uma característica crucial da regulação gênica no embrião inicial de Drosophila Os elementos reguladores de ação cis que controlam respostas distintas contêm diferentes números e arranjos de sítios de ligação de fatores de transcrição Desenho das listras Integração dos estímulos das proteínas gap A expressão de cada gene de regra dos pares em sete listras é o primeiro sinal da organização periódica do embrião e do futuro animal Como os referidos padrões periódicos são gerados a partir de uma informação aperiódica anterior Antes da análise molecular da regulação dos genes de regra dos pares foram apresentados diversos modelos para explicar a formação das listras Cada uma dessas ideias visualizava todas as sete listras como produtos idênticos em resposta a estímulos idênticos Entretanto o modo real pelo qual os padrões de alguns genes de regra dos pares importantes são codificados e gerados é uma listra por vez A solução para o mistério da geração das listras destaca um dos conceitos mais importantes a respeito do controle espacial da regulação gênica nos animais em desenvolvimento a saber os elementos reguladores de ação cis distintos de genes individuais são controlados independentemente FIGURA 1314 Os loci toolkit tais como hunchback conforme descrito no texto com frequência contêm múltiplos elementos reguladores de ação cis independentes que controlam a expressão gênica em diferentes locais em diferentes ocasiões durante o desenvolvimento ou em ambos p ex A B C aqui Esses elementos são identificados por sua capacidade quando posicionados em cis em um gene repórter e inseridos de volta em um genoma hospedeiro de controlar o padrão a ocasião ou o nível ou todos os três da expressão do gene repórter Nesse exemplo cada elemento direciona um padrão diferente de expressão gênica em um embrião de mosca A maior parte dos genes repórter codifica enzimas ou proteínas fluorescentes que podem ser facilmente visualizadas A descobertachave foi de que cada uma das sete listras que compõem os padrões de expressão dos genes de regra dos pares evenskipped e hairy é controlada independentemente Considere a segunda listra expressa pelo gene evenskipped Figura 1315 A Essa listra está localizada dentro da região ampla de expressão de hunchback e nas bordas das regiões de expressão de duas outras proteínas gap Giant e Krüppel Figura 1315 B Portanto dentro da área da futura listra haverá grandes quantidades de proteínas Hunchback e pequenas quantidades de proteínas Giant e Krüppel Também haverá uma determinada concentração da proteína Bicoid de efeito materno Nenhuma outra listra no embrião conterá essas proteínas nessas proporções A formação da listra 2 é controlada por meio de um elemento regulador de ação cis específico um acentuador que contém um número de sítios de ligação para essas quatro proteínas Figura 1315 C A análise detalhada do elemento regulador de ação cis eve da listra 2 revelou que essa listra simples é controlada pela ligação desses quatro fatores de transcrição aperiodicamente distribuídos incluindo uma proteína materna e três proteínas gap FIGURA 1315 Regulação de uma listra de regra dos pares controle combinatório de um elemento regulador de ação cis independente A A regulação do elemento regulador de ação cis eve da listra 2 controla a formação da segunda listra da expressão de eve no embrião inicial apenas uma das sete listras de expressão de eve B A listra se forma nos domínios das proteínas Bicoid e Hunchback e na borda das proteínas gap Giant e Krüppel Bcd e Hb são ativadores Gt e Kr são repressores da listra C O elemento eve da listra 2 é apenas um de diversos elementos reguladores de ação cis do gene eve cada um dos quais controlando diferentes partes da expressão de eve O elemento eve da listra 2 engloba cerca de 1 a 17 kb upstream da unidade de transcrição de eve D No elemento eve da listra 2 existem diversos sítios de ligação para cada fator de transcrição os repressores estão demonstrados acima do elemento e os ativadores abaixo A produção líquida dessa combinação de ativadores e repressores é a expressão da estreita faixa eve Especificamente o elemento eve da listra 2 contém múltiplos sítios para a proteína Bicoid materna e as proteínas gap Hunchback Giant e Krüppel Figura 1315 D Análises mutacionais de diferentes combinações de sítios de ligação revelaram que Bicoid e Hunchback ativam a expressão do elemento eve da faixa 2 ao longo de uma região ampla As proteínas Giant e Krüppel são repressores que modulam os limites da listra a apenas algumas células de largura O elemento eve da listra 2 atua então como um interruptor genético integrando múltiplas atividades de proteínas reguladoras para produzir uma listra de três a quatro células de largura no embrião O padrão periódico inteiro de sete listras da expressão de evenskipped é a soma de diferentes conjuntos de estímulos nos elementos reguladores de ação cis em separado Os acentuadores em relação a outras listras contêm diferentes combinações de sítios de ligação proteica CONCEITOCHAVE A regulação dos elementos reguladores de ação cis por meio de combinações de ativadores e repressores é um tema comum na regulação espacial da expressão gênica Padrões complexos de estímulos com frequência estão integrados para produzir padrões de respostas mais simples Diferenciação dos segmentos Integração dos estímulos de Hox A atividade combinada e sequencial das proteínas de efeito materno gap regra dos pares e proteínas de polaridade do segmento estabelece o plano corporal segmentado básico do embrião e da larva Como as diferentes identidades dos segmentos são estabelecidas pelas proteínas Hox Esse processo apresenta dois aspectos Primeiramente os genes Hox são expressos em diferentes domínios ao longo do eixo anteroposterior A expressão do gene Hox é amplamente controlada por proteínas de segmentação especialmente proteínas gap por meio de mecanismos que são semelhantes àqueles já descritos aqui em relação a hunchback e eve da faixa 2 bem como a alguma regulação cruzada por parte das proteínas Hox de outros genes Hox A regulação dos genes Hox não será considerada de modo aprofundado aqui O segundo aspecto do controle da identidade dos segmentos por Hox é a regulação dos genesalvo por proteínas Hox Examinaremos um exemplo que ilustra bem como uma característica importante do plano corporal da moscadasfrutas é controlada por meio da integração de muitos estímulos por um único elemento regulador de ação cis Os membros pareados partes da boca e antenas de Drosophila se desenvolvem a partir de populações inicialmente pequenas de aproximadamente 20 células em diferentes segmentos Diferentes estruturas se desenvolvem a partir dos diferentes segmentos da cabeça e do tórax enquanto o abdome não apresenta membros O primeiro sinal de desenvolvimento dessas estruturas é a ativação de genes reguladores dentro de pequenos grupos de células que são denominados primórdios de apêndices A expressão do gene Distalless Dll marca o início do desenvolvimento dos apêndices Esse gene é um dos alvoschave dos genes Hox e a sua função é necessária para o subsequente desenvolvimento das partes distais de cada um desses apêndices Os pequenos grupos de células que expressam Distalless surgem em diversos segmentos da cabeça e em cada um dos três segmentos torácicos mas não no abdome Figura 1316 A FIGURA 1316 A ausência de membros no abdome é controlada pelos genes Hox A A expressão do gene Distalless Dll vermelho marca a posição dos futuros apêndices a expressão do gene Hox Ultrabithorax roxo marca a posição dos segmentos abdominais A1 a A7 e a expressão do gene engrailed azul marca a parte posterior de cada segmento B Representação esquemática de embrião Ubx demonstrando que a expressão de Dll círculos vermelhos deixa de ser reprimida no segmento A1 C Representação esquemática do embrião Ubx abdA demonstrando que a expressão de Dll círculos vermelhos deixa de ser reprimida nos primeiros sete segmentos abdominais A Fotomicrografia por Dave Kosman Ethan Bier e Bill McGinnis B e C Dados de B Gebelein D J McKay e R S Mann Direct integration of Hox and Segmentation Gene Inputs During Drosophila Development Nature 431 2004 653659 Como a expressão de Distalless é restrita aos segmentos mais anteriores Por meio da repressão de sua expressão no abdome Diversas linhas de evidências revelaram que o gene Distalless é reprimido por duas proteínas Hox as proteínas Ultrabithorax e AbdominalA que atuam em colaboração com duas proteínas de segmentação Observe na Figura 135 que Ultrabithorax é expressa nos segmentos abdominais um a sete e AbdominalA é expressa nos segmentos abdominais dois a sete com sobreposição de todos os segmentos com exceção do primeiro segmento coberto por Ultrabithorax Em embriões mutantes Ultrabithorax a expressão de Distalless se expande até o primeiro segmento abdominal Figura 1316 B e em embriões duplos mutantes UltrabithoraxAbdominalA a expressão de Distalless se estende pelos primeiros sete segmentos abdominais Figura 1316 C indicando que ambas as proteínas são necessárias para a repressão da expressão de Distalless no abdome O elemento regulador de ação cis responsável pela expressão de Distalless no embrião foi identificado e caracterizado em detalhes Figura 1317 A Ele contém dois sítios de ligação para as proteínas Hox Se esses dois sítios de ligação estiverem mutados de tal modo que as proteínas Hox não consigam se ligar a expressão de Distalless deixa de ser reprimida no abdome Figura 1317 B Diversas proteínas adicionais colaboram com as proteínas Hox na repressão de Distalless Duas são proteínas codificadas por genes de polaridade do segmento Sloppypaired Slp e engrailed en As proteínas Sloppypaired e Engrailed são expressas nas listras que marcam os compartimentos anterior e posterior de cada segmento respectivamente Cada proteína também se liga ao elemento regulador de ação cis de Distalless Quando o sítio de ligação Sloppy paired está mutado no elemento regulador de ação cis a expressão do gene repórter deixa de ser reprimida nos compartimentos anteriores dos segmentos abdominais Figura 1317 C Quando o sítio de ligação de Engrailed está mutado a expressão do repórter deixa de ser reprimida nos compartimentos posteriores de cada segmento abdominal Figura 1317 D E quando os sítios de ligação em relação a ambas as proteínas estão mutados a expressão do gene repórter deixa de ser reprimida em ambos os compartimentos de cada segmento abdominal assim como quando os sítios de ligação Hox estão mutados Figura 1317 C Duas outras proteínas denominadas Extradenticle e Homothorax que são amplamente expressas em cada segmento também se ligam ao elemento regulador de ação cis de Distalless e são necessárias para a repressão da transcrição no abdome Figura 1317 F FIGURA 1317 Integração dos estímulos das proteínas Hox e de segmentação por meio de um elemento regulador de ação cis A Um elemento regulador de ação cis do gene Dll regula a repressão da expressão de Dll no abdome por meio de um conjunto de fatores de transcrição esquerda A expressão de Dll vermelho se estende até o tórax mas não para dentro do abdome em um embrião do tipo selvagem direita B a F Mutações nos respectivos sítios de ligação demonstram desrepressão da expressão de Dll em diversos padrões no abdome Os sítios de ligação são Slp Sloppypaired Hox1 e Hox2 Ultrabithorax e AbdominalA Exd Extradenticle En Engrailed Hth Homothorax Dados de B Gebelein D J McKay e R S Mann Direct Integration of Hox and Segmentation Gene Inputs During Drosophila Development Nature 431 2004 653659 135 Portanto em conjunto duas proteínas Hox e quatro outros fatores de transcrição se ligam a um trecho de 57 pares de bases e atuam em conjunto para reprimir a expressão Distalless e portanto a formação de apêndices no abdome A repressão da expressão Distalless é uma clara demonstração de como as proteínas Hox regulam a identidade dos segmentos e o número de estruturas corporais reiteradas Também é uma boa ilustração de como diversos estímulos reguladores atuam de modo combinatório em elementos reguladores de ação cis Nesse caso a presença de sítios de ligação Hox não é suficiente para a repressão da transcrição são necessárias interações colaborativas e cooperativas entre diversas proteínas para reprimir totalmente a expressão gênica no abdome CONCEITOCHAVE A regulação combinatória e cooperativa da transcrição gênica impõe maior especificidade sobre os padrões espaciais de expressão gênica e possibilita a sua maior diversidade Embora a diversidade evolutiva não tenha sido explicitamente abordada neste capítulo a presença de múltiplos elementos reguladores de ação cis independentes para cada gene toolkit apresenta profundas implicações para a evolução da forma Especificamente a modularidade desses elementos possibilita alterações em um aspecto da expressão gênica independente de outras funções dos genes A evolução da regulação gênica desempenha um papel importante na evolução do desenvolvimento e da morfologia Retornaremos a esse tópico no Capítulo 20 Regulação póstranscricional da expressão gênica no desenvolvimento Embora a regulação da transcrição seja um meio importante para restringir a expressão dos produtos gênicos a áreas definidas durante o desenvolvimento ela absolutamente não é o meio exclusivo para tanto A recomposição alternativa do RNA também contribui para a regulação gênica assim como a regulação da tradução do mRNA por proteínas e microRNA miRNA Em cada caso sequências reguladoras no RNA são reconhecidas por meio de fatores de recomposição proteínas de ligação ao mRNA ou miRNA e regulam a estrutura do produto proteico sua quantidade ou a localização na qual a proteína é produzida Veremos um exemplo de cada tipo de interação reguladora no nível do RNA Recomposição do RNA e determinação do sexo em Drosophila Uma decisão fundamental no desenvolvimento de organismos com reprodução sexuada é a especificação do sexo Em animais o desenvolvimento de muitos tecidos segue vias diferentes dependendo do sexo do animal em questão Em Drosophila foram identificados muitos genes que regulam a determinação do sexo por meio da análise de fenótipos mutantes nos quais a identidade sexual está alterada ou é ambígua O gene doublesex dsx desempenha um papel central na regulação da identidade sexual do tecido somático linhagem não germinativa Mutações nulas em dsx causam o desenvolvimento de machos e fêmeas como intersexos intermediários que perderam as diferenças distintas entre os tecidos masculinos e femininos Embora a função de dsx seja necessária em ambos os sexos diferentes produtos gênicos são gerados pelo locus em diferentes sexos Nos machos o produto é uma isoforma específica e mais longa DsxM que contém uma região C terminal única de 150 aminoácidos não observada na isoforma específica feminina DsxF que em vez disso contém uma sequência única de 30 aminoácidos na carboxiterminal Cada forma da proteína Dsx é um fator de transcrição de ligação ao DNA que aparentemente ligase às mesmas sequências de DNA Entretanto as atividades das duas isoformas diferem DsxF ativa determinados genesalvo nas fêmeas que DsxM reprime nos machos As formas alternativas da proteína Dsx são geradas por meio da recomposição alternativa do transcrito de RNA primário de dsx Portanto nesse caso a escolha dos sítios de recomposição deve ser regulada para produzir mRNA finais que codificam proteínas diferentes Os diversos fatores genéticos que influenciam a expressão de Dsx e a determinação do sexo foram identificados por meio de mutações que afetam o fenótipo sexual Um reguladorchave é o produto do gene transformer tra Enquanto mutações nulas em tra não apresentam efeitos nos machos moscasfêmeas XX que apresentam mutações em tra são transformadas no fenótipo masculino A proteína Tra é um fator de recomposição alternativa que afeta as opções de recomposição no transcrito de RNA de dsx Na presença de Tra e uma proteína correlata Tra2 ocorre uma recomposição que incorpora o éxon 4 do gene dsx ao transcrito dsxF maduro Figura 1318 mas não os éxons 5 e 6 Os machos apresentam ausência da proteína Tra assim essa recomposição não ocorre e os éxons 5 e 6 são incorporados ao transcrito dsxM mas não o éxon 4 A proteína Tra explica como formas alternativas de Dsx são expressas mas como a expressão da própria Tra é regulada para diferir em fêmeas e machos O próprio RNA de tra é recomposto alternativamente Nas fêmeas está presente um fator de recomposição codificado pelo gene Sexlethal Sxl Esse fator de recomposição se liga ao RNA de tra e evita o evento de recomposição que de outro modo incorporaria um éxon que contém um códon de fim Nos machos nenhuma proteína Tra é produzida tendo em vista que esse códon de fim está presente A produção da proteína Sexlethal por sua vez é regulada pela recomposição do RNA e por fatores que alteram o nível de transcrição O nível de transcrição de Sxl é regulado por ativadores no cromossomo X e repressores nos autossomos Nas fêmeas a ativação de Sxl prevalece e é produzida a proteína Sxl a qual regula a recomposição do RNA de tra e realiza um feedback para regular a recomposição do próprio RNA de Sxl Nas fêmeas um códon de fim é recomposto de modo que a produção da proteína Sxl possa continuar Entretanto nos machos nos quais não há proteína Sxl o códon de fim ainda está presente no transcrito de RNA de Sxl não recomposto e nenhuma proteína Sxl pode ser produzida Essa cascata de recomposição de RNA sexoespecífico em D melanogaster ilustra um modo pelo qual o genótipo do cromossomo sexual leva à expressão de diferentes formas de proteínas reguladoras em um sexo e não no outro Curiosamente a regulação genética da determinação do sexo difere muito entre as espécies de animais pois o genótipo sexual pode levar à expressão diferencial de genes reguladores por meio de vias claramente diferentes Entretanto as proteínas relacionadas com a Dsx desempenham papéis na diferenciação sexual em uma ampla variedade de animais incluindo seres humanos Portanto embora existam muitos modos para gerar a expressão diferencial de fatores de transcrição uma família de proteínas semelhantes aparenta ser a base de uma grande parte da diferenciação sexual Regulação da tradução do mRNA e linhagem celular em C elegans Em muitas espécies de animais o desenvolvimento inicial do embrião envolve a repartição de células ou grupos de células em linhagens discretas que darão origem a tecidos distintos no adulto Esse processo é mais bemcompreendido no verme nematódeo C elegans no qual o animal adulto é composto por apenas aproximadamente 1000 células somáticas um terço das quais é composto de células nervosas e um número semelhante de células germinativas na gônada A estrutura simples o ciclo de vida rápido e a transparência do C elegans o tornaram um modelo poderoso para a análise do desenvolvimento ver Organismomodelo C elegans adiante Todas as linhagens celulares desse animal foram mapeadas em uma série de estudos liderados por John Sulston no laboratório Medical Research Council MRC em Cambridge na Inglaterra Triagens genéticas sistemáticas em relação a mutações que modificam ou estendem linhagens celulares proporcionaram uma recompensa de informações a respeito do controle genético de decisões das linhagens A genética de C elegans tem sido especialmente importante para a compreensão do papel da regulação póstranscricional no nível do RNA e aqui examinaremos dois mecanismos 1 o controle da tradução por meio de proteínas de ligação ao mRNA e 2 o controle da expressão gênica por miRNA FIGURA 1318 Três prémRNA de importantes genes de determinação do sexo em Drosophila são recompostos alternativamente A via específica das fêmeas está demonstrada à esquerda e a via específica dos machos está demonstrada à direita Os prémRNA são idênticos em ambos os sexos e estão demonstrados na parte intermediária No macho existem códons de fim nos mRNA Sexlethal e transformer que encerram a tradução Essas sequências são removidas por recomposição para produzir proteínas funcionais na fêmea As proteínas Transformer e Tra2 em seguida recompõem o prémRNA de doublesex da fêmea para produzir a isoforma específica da fêmea da proteína Dsx que difere da isoforma específica do macho pela recomposição alternativa de diversos éxons Controle da tradução no embrião inicial Primeiramente veremos como uma linhagem celular tem início Após duas divisões celulares o embrião de C elegans contém quatro células denominadas blastômeros Cada célula dará início a uma linhagem distinta e os descendentes das linhagens separadas apresentarão destinos diferentes Já nesse estágio são observadas diferenças nas proteínas presentes nos quatro blastômeros Pelo que já aprendemos muitas dessas proteínas são proteínas toolkit que determinam quais genes serão expressos nas células descendentes Entretanto o que é surpreendente é que os mRNA que codificam algumas proteínas toolkit do verme estejam presentes em todas as células do embrião inicial Entretanto em uma célula específica apenas alguns desses mRNA serão traduzidos em proteínas Portanto no embrião de C elegans a regulação póstranscricional é crítica para a adequada especificação dos destinos celulares iniciais Durante a primeira divisão celular a polaridade dentro do zigoto leva à repartição de moléculas reguladoras para células embrionárias específicas Por exemplo o gene glp1 codifica uma proteína de receptor transmembrana relacionada com o receptor Notch de moscas e outros animais Embora o mRNA de glp1 esteja presente em todas as células no estágio de quatro células a proteína GLP1 é traduzida apenas nas duas células anteriores Aba e ABp Figura 1319 A Essa expressão localizada de GLP1 é crítica para o estabelecimento de destinos distintos As mutações que eliminam a função de glp1 no estágio de quatro células alteram os destinos dos descendentes de ABp e ABa ORGANISMOMODELO Caenorhabditis elegans O nematódeo Caenorhabditis elegans como um modelo para decisões do destino de linhagens celulares Nos últimos 20 anos estudos do verme nematódeo Caenorhabditis elegans ver Diagrama 1 avançaram muito a nossa compreensão sobre o controle genético das decisões de linhagens celulares A transparência e a estrutura simples desse animal levaram Sydney Brenner a avançar a sua utilização como um organismomodelo O verme adulto contém aproximadamente 1000 células somáticas e pesquisadores liderados por John Sulston mapearam cuidadosamente a série inteira de decisões de células somáticas que produzem o animal adulto Diagrama 1 Caenorhabditis elegans hermafrodita adulto demonstrando diversos órgãos Algumas das decisões de linhagens tais como a formação da vulva têm sido modeloschave das assim denominadas interações indutivas no desenvolvimento nas quais a sinalização entre as células induz as alterações no destino celular e a formação dos órgãos ver Diagrama 2 Triagens genéticas exaustivas identificaram muitos componentes que participam na sinalização e na transdução de sinal na formação da vulva Diagrama 2 Produção das linhagens celulares da vulva A As partes da anatomia vulvar que estão ocupadas pelas assim denominadas células primárias 1a secundárias 2a e terciárias 3a B As linhagens ou os pedigrees das células primárias secundárias e terciárias são distinguidas por meio de seus padrões de divisão celular Em relação a algumas das divisões celulares embrionárias e larvais em particular aquelas que contribuirão para o sistema nervoso do verme uma célula genitora dá origem a uma progênie de duas células uma das quais em seguida é submetida à morte celular programada A análise de mutantes nos quais a morte celular programada é aberrante liderada por Robert Horvitz revelou muitos componentes das vias da morte celular programada comuns à maior parte dos animais Sydney Brenner John Sulston e Robert Horvitz compartilharam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2002 por seu trabalho pioneiro com base em C elegans A GLP1 está localizada nas células anteriores em virtude da repressão de sua tradução nas células posteriores A repressão da tradução de GLP1 necessita de sequências na 3 UTR do mRNA de glp1 especificamente uma região de 61 nucleotídios denominada região de controle espacial SCR A importância da SCR foi demonstrada por meio da ligação do mRNA transcrito de genes repórteres a diferentes variantes de SCR A deleção dessa região ou a mutação de sítioschave dentro dela leva à expressão do gene repórter em todos os quatro blastômeros do embrião inicial Figura 1319 B Com base no modo como vimos o controle da transcrição podemos imaginar que uma ou mais proteínas se ligam à SCR para reprimir a tradução do mRNA de glp1 Para identificar essas proteínas repressoras pesquisadores isolaram proteínas que se ligam à SCR Uma proteína GLD1 ligase especificamente a uma região da SCR Além disso a proteína GLD1 está enriquecida em blastômeros posteriores justamente onde a expressão de glp1 é reprimida Finalmente quando a expressão de GLD1 é inibida pelo uso de RNA de interferência a proteína GLP1 é expressa nos blastômeros posteriores Figura 1319 C Essa evidência sugere que a GLD1 é uma proteína repressora da tradução que controla a expressão de glp1 FIGURA 1319 Regulação da tradução e decisões de linhagem celular no embrião inicial de C elegans A No estágio de quatro células do embrião de C elegans a proteína GLP1 é expressa em duas células anteriores verde brilhante mas não em outras células A tradução do mRNA de glp1 é regulada pela proteína GLD1 nas células posteriores B A fusão de 3 UTR glp1 ao gene repórter lacZ leva à expressão do repórter nas células ABa e ABp do estágio de quatro células do embrião de C elegans sombreado direita Mutações em sítios de ligação de GLD1 na região de controle espacial SCR causam desrepressão da tradução nas linhagens EMS e P2 assim como a perda da função de gld C A Cortesia de Thomas C Evans University of Colorado Anschutz Medical Campus A regulação espacial da tradução de GLP1 nada mais é do que um exemplo do controle da tradução no desenvolvimento ou pela GLD1 Muitos outros mRNA são regulados em relação à tradução e a GLD1 se liga a outros mRNAalvo nas células embrionárias e da linhagem germinativa CONCEITOCHAVE As proteínas de ligação ao RNA sequênciaespecíficas atuam por meio de sequências de RNA de ação cis para regular o padrão espacial da tradução da proteína Controle da cronologia do desenvolvimento por miRNA em C elegans e outras espécies O desenvolvimento é um processo ordenado tanto temporal quanto espacialmente Quando os eventos ocorrem é tão importante quanto onde As mutações nos genes heterocrônicos de C elegans têm sido fontes de percepção sobre o controle da cronologia do desenvolvimento Mutações nesses genes alteram a ocasião dos eventos na especificação do destino celular fazendo com que os referidos eventos sejam reiterados ou omitidos A investigação detalhada dos produtos de genes heterocrônicos levou à descoberta de um mecanismo totalmente inesperado em relação à regulação da expressão gênica por meio de microRNA Entre os primeiros membros dessa classe de moléculas reguladoras descobertas em C elegans está o RNA produzido pelo gene let7 Tal gene regula a transição dos destinos celulares dos últimos estágios larvais para o adulto Em mutantes let7 por exemplo os destinos das células larvais são reiterados no estágio adulto Figura 1320 A Contrariamente o aumento de dosagem do gene let7 causa especificação precoce dos destinos adultos nos estágios larvais O gene let7 não codifica uma proteína Em vez disso ele codifica um RNA final de 22 nucleotídios regulado temporalmente o qual é processado a partir de um precursor de aproximadamente 70 nucleotídios O RNA final é complementar às sequências nas regiões 3 não traduzidas de uma diversidade de genes regulados durante o desenvolvimento e a ligação de miRNA a essas sequências impede a tradução desses transcritos gênicos Um desses genesalvo lin41 também afeta a transição de larva para adulto Os mutantes de lin41 causam a especificação precoce dos destinos celulares adultos sugerindo que o efeito da hiperexpressão de let7 ocorre pelo menos em parte em virtude de um efeito na expressão de lin41 O mRNA de let7 se liga ao RNA de lin41 in vitro em diversos sítios complementares imperfeitos Figura 1320 B FIGURA 1320 Normalmente C elegans se desenvolve em um adulto após quatro estágios larvais e as linhagens celulares hipodérmicas concluem o seu desenvolvimento em L4 linhagens eclodidas nas extremidades das linhagens V1 a V4 A Em mutantes let7 a transição do estágio larvar L4 para adulto é adiada e as linhagens celulares de células hipodérmicas laterais V são reiteradas B let7 codifica um miRNA que é complementar a sequências em 3 UTR do mRNA de lin41 O papel dos miRNA no desenvolvimento de C elegans se estende muito além de let7 Foram identificadas diversas centenas de miRNA e foi demonstrado que muitos genesalvo são regulados pelo miRNA Além disso a descoberta dessa classe de RNA regulador provocou a busca pelos referidos genes em outros 136 genomas e em geral centenas de genes de miRNA candidatos foram detectados em genomas animais incluindo aquele de seres humanos De modo razoavelmente surpreendente o gene de miRNA let7 é amplamente conservado e encontrado nos genomas de Drosophila ascídias moluscos anelídeos e vertebrados incluindo seres humanos O gene lin41 também é conservado e evidências sugerem que a interação reguladora de let7 e lin41 também controla a cronologia dos eventos no desenvolvimento de outras espécies As descobertas da regulação por miRNA dos genes de desenvolvimento e do escopo do repertório de miRNA são razoavelmente recentes Geneticistas e outros biólogos estão consideravelmente entusiasmados a respeito dos papéis dessa classe de moléculas reguladoras no desenvolvimento e na fisiologia levando a uma área muito vigorosa e acelerada de novas pesquisas De moscas a dedos penas e placas do assoalho Os muitos papéis dos genes toolkit Vimos que as proteínas toolkit e os RNA reguladores apresentam múltiplos papéis no desenvolvimento Por exemplo relembre que na mosca a proteína Ultrabithorax reprime a formação dos membros no abdome e promove o desenvolvimento das asas traseiras no tórax De modo semelhante a Sloppy paired e a Engrailed participam na geração da organização segmentar básica do embrião e colaboram com as proteínas Hox para suprimir a formação dos membros Esses papéis são apenas alguns dos muitos papéis desempenhados por esses genes toolkit em todo o período do desenvolvimento da mosca A maior parte dos genes toolkit atua em mais de uma ocasião e em mais de um local e a maior parte pode influenciar a formação ou a padronização de muitas estruturas distintas que são formadas em diferentes partes do corpo da larva ou do adulto Aqueles que regulam a expressão gênica podem regular diretamente dezenas até centenas de genes diferentes A função de uma proteína toolkit ou RNA individual quase sempre é dependente do contexto motivo pelo qual a analogia com uma caixa de ferramentas talvez seja bastante adequada Assim como a caixa de ferramentas de um carpinteiro um conjunto comum de ferramentas pode ser utilizado para produzir muitas estruturas Para ilustrar esse princípio mais claramente observaremos o papel de uma proteína toolkit no desenvolvimento de muitas características de vertebrados incluindo características presentes em seres humanos Essa proteína toolkit é homóloga nos vertebrados àquela do gene hedgehog de Drosophila O gene hedgehog foi identificado pela primeira vez por NüssleinVolhard e Wieschaus como um gene de polaridade de segmento Ele foi caracterizado como codificador de uma proteína de sinalização secretada por células em Drosophila Na medida em que cresciam as evidências de que os genes toolkit são comuns a diferentes filos de animais a descoberta e a caracterização de genes toolkit da mosca tais como o hedgehog tornaramse um trampolim comum para a caracterização de genes em outros grupos particularmente em vertebrados A clonagem de genes homólogos com base na similaridade de sequências ver Capítulo 14 foi uma via rápida para a identificação dos genes toolkit nos vertebrados A aplicação dessa estratégia para o gene hedgehog ilustra o poder e as recompensas da utilização da homologia para descobrir genes importantes Diversos homólogos distintos de hedgehog foram isolados de peixezebra camundongos galinhas e seres humanos No espírito extravagante da nomenclatura do gene de Drosophila os três homólogos de vertebrados foram denominados Sonic hedgehog em referência ao personagem de videogame Indian hedgehog e Desert hedgehog Um dos primeiros meios para caracterizar os possíveis papéis desses genes no desenvolvimento foi examinar onde eles são expressos Observouse que o Sonic hedgehog Shh é expresso em diversas partes do desenvolvimento de galinhas e outros vertebrados Mais intrigante foi a sua expressão na parte posterior dos brotos dos membros em desenvolvimento Figura 1321 A Sabese há décadas que essa parte dos brotos dos membros é a zona de polarização de atividade ZPA tendo em vista que é um organizador responsável pelo estabelecimento da polaridade anteroposterior do membro e de seus dedos Figura 1321 B Para testar se o Shh pode desempenhar um papel na função da ZPA Cliff Tabin e seus colegas na Harvard Medical School fizeram com que a proteína Shh fosse expressa na região anterior dos brotos dos membros de galinhas em desenvolvimento Eles observaram o mesmo efeito do transplante de ZPA a indução de dedos extras com polaridade reversa Seus resultados foram uma evidência chocante de que Shh era o morfógeno produzido pela ZPA que há muito tempo se procurava FIGURA 1321 O gene Shh é expresso em muitas partes diferentes do embrião de galinha em desenvolvimento indicado pela coloração escura incluindo A a zona de atividade de polarização em cada um dos dois brotos dos membros em desenvolvimento e no longo tubo neural e B os brotos das penas em desenvolvimento O mRNA de Shh é visualizado por meio de hibridização in situ As fotomicrografias são cortesia de A Cliff Tabin B Dr John Fallon University of Wisconsin e Matthew Harris Harvard Medical 137 School Department of Genetics A Shh também é expressa em outros padrões intrigantes em galinhas e outros vertebrados Por exemplo Shh é expressa em brotos de penas em desenvolvimento onde desempenha um papel no desenvolvimento do padrão e da polaridade da formação das penas ver Figura 1321 B A Shh também é expressa no tubo neural em desenvolvimento de embriões de vertebrados em uma região denominada placa do assoalho ver Figura 1321 A Experimentos subsequentes demonstraram que a sinalização de Shh a partir dessas células da placa do assoalho é crítica para a subdivisão dos hemisférios cerebrais e para a subdivisão do olho em desenvolvimento nos lados esquerdo e direito Quando a função do gene Shh é eliminada por uma mutação no camundongo esses hemisférios e essas regiões do olho não se separam e o embrião resultante é ciclópico com um olho central e um único prosencéfalo ele também não tem membros Os papéis dramáticos e diversos de Shh são um exemplo surpreendente dos diferentes papéis desempenhados por genes toolkit em diferentes locais e ocasiões no desenvolvimento Os resultados da sinalização de Shh são diferentes em cada caso a via de sinalização de Shh induzirá a expressão de um conjunto de genes no membro em desenvolvimento um conjunto diferente no broto das penas e ainda outro conjunto na placa do assoalho Como diferentes tipos celulares e tecidos são capazes de responder de modo diferente à mesma molécula sinalizadora O desfecho da sinalização de Shh depende do contexto proporcionado pelos outros genes toolkit que estão atuando ao mesmo tempo CONCEITOCHAVE A maior parte dos genes toolkit apresenta múltiplos papéis em diferentes tecidos e tipos celulares A especificidade de sua ação é determinada pelo contexto proporcionado por outros genes toolkit que atuam em uma combinação com eles Desenvolvimento e doença A descoberta da toolkit para o desenvolvimento de moscas vertebrados e seres humanos também apresentou um profundo efeito sobre o estudo da base genética das doenças humanas em particular defeitos congênitos e câncer Foi identificado um grande número de mutações nos genes toolkit que afetam o desenvolvimento e a saúde humana Aqui enfocaremos apenas alguns exemplos que ilustram como a compreensão sobre a função e a regulação dos genes em modelos animais foi traduzida em melhor compreensão da biologia humana Polidactilia Uma síndrome relativamente comum em seres humanos é o desenvolvimento de dedos extras parciais ou completos nas mãos e nos pés Essa condição denominada polidactilia surge em aproximadamente 5 a 17 de cada 10000 nascimentos vivos Nos casos mais dramáticos a condição está presente nas mãos e nos pés Figura 1322 A polidactilia ocorre amplamente em todos os vertebrados em gatos galinhas camundongos e outras espécies A descoberta do papel da Shh na padronização dos dedos levou os geneticistas a investigarem se o gene Shh estava alterado em seres humanos com polidactilia e outras espécies De fato determinadas mutações de polidactilia são mutações no gene Shh As mutações não estão na região codificadora do gene Shh em vez disso se encontram em um elemento regulador de ação cis longe da região codificadora que controla a expressão de Shh no broto do membro em desenvolvimento Os dedos extras são induzidos pela expressão de Shh em uma parte do membro na qual o gene normalmente não é expresso Mutações em elementos reguladores de ação cis apresentam duas propriedades importantes que são distintas das mutações nas regiões codificadoras Primeiramente tendo em vista que elas afetam a regulação em cis os fenótipos com frequência são dominantes Em segundo lugar tendo em vista que apenas um dos diversos elementos reguladores de ação cis pode estar afetado as outras funções do gene podem ser completamente normais A polidactilia pode ocorrer sem quaisquer problemas colaterais de desenvolvimento Entretanto as mutações codificadoras em Shh contam uma história diferente conforme veremos na próxima seção FIGURA 1322 Esta pessoa apresenta seis dedos em cada mão e sete dedos em cada pé em virtude de uma mutação reguladora no gene Sonic hedgehog Cortesia de Dr Robert Hill MRC Human Genetics Unit Edinburgo Escócia de L A Lettice et al Disruption of a LongRange CisActing Regulator for Shh Causes Preaxial Polydactyly Proc Natl Acad Sci USA 99 2002 7548 2002 National Academy of Sciences USA Holoprosencefalia Também foram identificadas mutações na região codificadora do Shh humano As consequentes alterações na proteína Shh estão associadas a uma síndrome denominada holoprosencefalia na qual ocorrem anormalidades no tamanho do cérebro na formação do nariz e em outras estruturas da linha média Essas anormalidades aparentam ser correspondentes menos graves dos defeitos do desenvolvimento observados em camundongos mutantes Shh homozigotos De fato as crianças afetadas consultadas nas clínicas são heterozigotas Uma cópia de um gene Shh normal parece ser insuficiente para o desenvolvimento da linha média normal o gene é haploinsuficiente Fetos humanos homozigotos para mutações de perda da função em Shh muito provavelmente morrem na gestação com defeitos mais graves A holoprosencefalia não é causada exclusivamente por mutações em Shh A Shh é um ligante em uma via de transdução de sinal Conforme se pode esperar mutações nos genes que codificam outros componentes da via afetam a eficiência da sinalização de Shh e também estão associadas à holoprosencefalia Diversos componentes da via Shh humana foram identificados pela primeira vez como homólogos de membros da via na mosca demonstrando novamente a conservação da toolkit genética e o poder dos sistemasmodelo para as descobertas biomédicas Câncer como uma doença do desenvolvimento Em animais de vida longa tais como nós mesmos e outros mamíferos o desenvolvimento não cessa ao nascimento ou ao final da adolescência Tecidos e diversos tipos celulares estão sendo constantemente renovados A manutenção da função de muitos órgãos depende do crescimento controlado e da diferenciação de células que substituem aquelas que são descamadas ou de outro modo morrem A manutenção de tecidos e órgãos em geral é controlada por vias de sinalização Mutações hereditárias ou espontâneas nos genes que codificam os componentes dessas vias podem romper a organização tecidual e contribuir para a perda do controle da proliferação celular Tendo em vista que a proliferação celular descontrolada é uma característica do câncer a formação de cânceres pode ser uma consequência O câncer então é uma doença do desenvolvimento um produto dos processos normais de desenvolvimento que deram errado Alguns dos genes associados aos tipos de cânceres humanos são membros compartilhados da toolkit dos animais Por exemplo o gene patched codifica um receptor para as proteínas de sinalização Hedgehog Além de causar distúrbios hereditários do desenvolvimento tais como polidactilia e holoprosencefalia mutações no gene patched humano estão associadas à formação de uma diversidade de cânceres Aproximadamente 30 a 40 dos pacientes com um distúrbio genético dominante denominado síndrome do nevo basocelular BCNS apresentam mutações patched Essas pessoas são fortemente predispostas ao desenvolvimento de um tipo de câncer de pele denominado carcinoma basocelular Elas também apresentam um grande aumento da incidência de meduloblastoma um tipo mortal de tumor cerebral Uma crescente lista de cânceres atualmente está associada a rupturas de vias de transdução de sinal vias que foram elucidadas pela primeira vez por triagens genéticas sistemáticas iniciais de padrões mutantes nas moscasdasfrutas Tabela 132 As descobertas de ligações entre mutações dos genes de vias de transdução de sinal e o câncer humano facilitaram muito o estudo da biologia do câncer e o desenvolvimento de novas terapias Por exemplo aproximadamente 30 dos camundongos heterozigotos para uma mutação específica no gene patched desenvolvem meduloblastoma Portanto esses camundongos atuam como um excelente modelo em relação à biologia da doença humana e uma plataforma de testes para terapias Muitos dos agentes anticâncer mais recentes empregados atualmente são de fato direcionados aos componentes das vias de transdução de sinal que estão comprometidos em determinados tipos de tumores Tabela 132 Alguns genes toolkit que apresentam papéis no câncer Gene de mosca Gene de mamífero Tipo de câncer Componentes de vias de sinalização Wingless armadillo βcatenin Cólon e pele DTCF TLF Cólon Hedgehog cubitus interruptus Gli1 Carcinoma basocelular patched patched Carcinoma basocelular meduloblastoma smoothened smoothened Carcinoma basocelular Notch Notch hNotch1 Leucemia linfoma Receptor EGF torpedo CerbB2 Mama e cólon DecapentaplégicoTFG β Medea DPC4 Pâncreas e cólon Toll dorsal NFκB Linfoma Outro extradenticle Pbx1 Leucemia aguda de célula préB É justo dizer que até mesmo os pesquisadores mais otimistas e previdentes não esperavam que a descoberta da toolkit genética para formar uma mosca viesse a apresentar efeitos de longo alcance sobre a compreensão do desenvolvimento e das doenças em seres humanos Mas os grandes dividendos inesperados são familiares na história recente da pesquisa genética básica O advento de medicamentos geneticamente modificados anticorpos monoclonais para diagnóstico e terapia e testes de DNA forense tiveram todos origens semelhantes em investigações aparentemente não relacionadas RESUMO No Capítulo 11 mencionamos o gracejo de Jacques Monod e François Jacob de que qualquer coisa que se observe ser verdadeira para a E coli também deve ser verdadeira para os elefantes2 Agora que vimos os processos reguladores que produzem vermes moscas camundongos e elefantes nós diríamos que eles 1 estavam certos Se Monod e Jacob estavam se referindo ao princípio de que a transcrição gênica é controlada por proteínas reguladoras sequênciaespecíficas vimos que o repressor Lac bacteriano e as proteínas Hox das moscas de fato atuam de modo semelhante Além disso suas proteínas de ligação ao DNA apresentam o mesmo tipo de motivo As percepções fundamentais que Jacob e Monod apresentaram a respeito do papel central do controle da transcrição gênica na fisiologia bacteriana e que esperavam se aplicar à diferenciação celular e ao desenvolvimento em organismos multicelulares complexos foram corroboradas em muitos aspectos no controle genético do desenvolvimento animal Muitas características em eucariotos unicelulares e multicelulares entretanto não são observadas em bactérias e seus vírus Geneticistas e biólogos moleculares descobriram as funções dos íntrons a recomposição do RNA elementos reguladores de ação cis múltiplos e distantes a cromatina a recomposição alternativa e mais recentemente os miRNA Ainda assim central para o controle genético do desenvolvimento é o controle da expressão gênica diferencial Este capítulo apresentou uma visão geral sobre a lógica e os mecanismos para o controle da expressão gênica e do desenvolvimento em moscasdasfrutas e algumas outras espéciesmodelo Nós nos concentramos nos genes toolkit para os processos de desenvolvimento animal e nos mecanismos que controlam a organização de características importantes do plano corporal o estabelecimento dos eixos corporais a segmentação e a identidade dos segmentos Embora tenhamos explorado apenas um número modesto de mecanismos reguladores de modo aprofundado e apenas algumas poucas espécies semelhanças na lógica e nos mecanismos reguladores nos possibilitam identificar alguns temas gerais a respeito do controle genético do desenvolvimento Apesar das vastas diferenças no aspecto e na anatomia os animais apresentam em comum uma toolkit de genes que regulam o desenvolvimento Essa caixa de ferramentas é uma pequena fração de todos os genes no genoma e a maior parte dos genes dessa toolkit controla fatores 2 3 4 de transcrição e componentes das vias de transdução de sinal Genes toolkit individuais apresentam múltiplas funções e afetam o desenvolvimento de diferentes estruturas em diferentes estágios O desenvolvimento do embrião em crescimento e de suas partes corporais ocorre em uma progressão ordenada espacial e temporalmente São estabelecidos domínios dentro do embrião por meio da expressão dos genes toolkit que marcam subdivisões progressivamente mais finas ao longo de ambos os eixos embrionários Os padrões de expressão gênica espacialmente restritos são produtos da regulação combinatória Cada padrão de expressão gênica apresenta uma base causal precedente Novos padrões são gerados por meio de estímulos combinados de padrões precedentes Nos exemplos apresentados neste capítulo o posicionamento das listras de regra dos pares e a restrição da expressão de genes reguladores de apêndices a segmentos individuais requerem a integração de diversos estímulos reguladores positivos e negativos por parte de elementos reguladores de ação cis A regulação póstranscricional no nível do RNA adiciona outra camada de especificidade ao controle da expressão gênica A recomposição alternativa do RNA e o controle da tradução por proteínas e miRNA também contribuem para o controle espacial e temporal da expressão de genes toolkit O controle combinatório é a chave para a especificidade e para a diversidade da expressão gênica bem como para a função de genes toolkit Em relação à especificidade mecanismos combinatórios proporcionam os meios para localizar a expressão gênica em populações celulares discretas por meio da utilização de estímulos que não são específicas do tipo celular ou tecido As ações de proteínas toolkit portanto podem ser razoavelmente específicas em diferentes contextos Em relação à diversidade mecanismos combinatórios proporcionam os meios para gerar uma diversidade virtualmente ilimitada de padrões de expressão gênica A modularidade dos elementos reguladores de ação cis possibilita o controle espacial e temporal independente da expressão e da função de genes toolkit Assim como os operadores e os elementos UAS dos procariotos e eucariotos simples atuam como interruptores no controle fisiológico da expressão gênica os elementos reguladores de ação cis de genes toolkit atuam como interruptores no controle da expressão gênica no desenvolvimento A característica de distinção de genes toolkit é a presença típica de diversos elementos reguladores de ação cis independentes que regulam a expressão gênica em diferentes domínios espaciais e em diferentes estágios do desenvolvimento A regulação espacial e temporal independente da expressão gênica possibilita que os genes toolkit individual apresentem funções diferentes porém específicas em contextos distintos Assim não é adequado ou preciso descrever a função de um determinado gene toolkit somente em relação à proteína ou miRNA que ele codifica tendo em vista que a função do produto gênico quase sempre depende do contexto no qual ele é expresso TERMOSCHAVE complexo gênico estrutura serialmente reiterada gene de efeito materno gene de manutenção gene de polaridade segmentar gene de regra dos pares gene gap gene Hox homeoboxe homeodomínio informação posicional toolkit genética zigoto PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 O gene Bicoid bcd é um gene de efeito materno 1 necessário para o desenvolvimento da região anterior de Drosophila A mãe heterozigota em relação a uma deleção bcd apresenta apenas uma cópia do gene bcd Com a utilização de elementos P para inserir cópias do gene bcd clonado no genoma por meio de transformação é possível produzir mães com cópias extras do gene O embrião inicial de Drosophila desenvolve uma endentação denominada sulco cefálico que é mais ou menos perpendicular ao eixo corporal longitudinal anteroposterior AP Na progênie de mães com apenas uma única cópia de bcd esse sulco está muito próximo da ponta anterior localizado a uma posição a um sexto da distância desde a ponta anterior até a posterior Na progênie de diploides do tipo selvagem padrão que apresentam duas cópias de bcd o sulco cefálico surge mais posteriormente em uma posição a um quinto da distância desde a ponta anterior até a posterior do embrião Na progênie de mães com três cópias de bcd ele é ainda mais posterior Na medida em que doses adicionais do gene são adicionadas o sulco cefálico se move mais e mais posteriormente até que na progênie de mães com seis cópias de bcd ele está no ponto médio ao longo do eixo AP do embrião Explique o efeito da dosagem gênica de bcd sobre a formação do sulco cefálico à luz da contribuição que bcd proporciona para a formação do padrão AP Solução A determinação das partes anteroposteriores do embrião é regulada por um gradiente de concentração da proteína Bicoid O sulco se desenvolve a uma concentração crítica de bcd Na medida em que a dosagem gênica de bcd e portanto a concentração da proteína Bicoid diminui o sulco é deslocado anteriormente na medida em que a dosagem gênica aumenta o sulco é deslocado posteriormente PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Na Figura 132 o transplante de determinadas regiões do tecido embrionário induz o desenvolvimento de estruturas em novos locais Como 2 3 4 5 6 7 8 9 10 são denominadas essas regiões especiais e quais são as substâncias que se propõe que elas produzam Na Figura 134 estão ilustrados dois métodos diferentes para a visualização da expressão gênica em animais em desenvolvimento Qual método possibilitaria detectar onde dentro de uma célula uma proteína está localizada A Figura 136 ilustra a expressão da proteína Hox Ultrabithorax Ubx nos apêndices das asas em desenvolvimento Qual é a relação entre o local onde a proteína é expressa e o fenótipo que resulta da perda de sua expressão demonstrada na Figura 131 Na Figura 137 qual é a evidência de que os genes Hox de vertebrados regulam a identidade de estruturas serialmente repetidas Conforme demonstrado na Figura 1310 qual é a distinção fundamental entre um gene de regra dos pares e um gene de polaridade do segmento Na Tabela 131 qual é a função mais comum das proteínas que contribuem para a formação do padrão Por que esse é o caso Na Figura 1315 qual proteína gap regula o limite posterior de eve da faixa 2 Descreva como ela realiza isso em termos moleculares Conforme demonstrado na Figura 1317 quantos fatores de transcrição diferentes regulam onde o gene Distalless Dll será expresso Conforme demonstrado na Figura 1321 o gene Sonic hedgehog é expresso em muitos locais em uma galinha em desenvolvimento A proteína Sonic hedgehog expressa em cada tecido é idêntica Em caso afirmativo como os tecidos se desenvolvem em diferentes estruturas Em caso negativo como as diferentes proteínas Sonic hedgehog são produzidas PROBLEMAS BÁSICOS Engrailed evenskipped hunchback e Antennapedia Para um geneticista de Drosophila o que são eles Como eles diferem 11 12 13 14 15 16 Descreva o padrão de expressão do gene eve de Drosophila no embrião inicial Contraste a função dos genes homeóticos com aquela dos genes de regra dos pares Quando um embrião é homozigoto mutante em relação ao gene gap Kr a quarta e a quinta listras do gene de regra dos pares ftz contadas a partir da extremidade anterior não se formam normalmente Quando o gene gap kni é mutante a quinta e a sexta listras de ftz não se formam normalmente Explique esses resultados em relação ao modo como o número de segmentos é estabelecido no embrião Alguns dos genes Hox de mamíferos demonstraram ser mais semelhantes a um dos genes Hox de insetos do que a outros Descreva uma abordagem experimental que possibilitaria a você demonstrar esse achado em um teste funcional em moscas vivas As três proteínas de homeodomínio AbdB AbdA e Ubx são codificadas por genes do completo Bithorax de Drosophila Em embriões do tipo selvagem o gene AbdB é expresso nos segmentos abdominais posteriores AbdA nos segmentos abdominais intermediários e Ubx nos segmentos abdominal anterior e torácico posterior Quando o gene AbdB é deletado AbdA é expresso em ambos os segmentos abdominal intermediário e posterior Quando AbdA é deletado Ubx é expresso no tórax posterior e nos segmentos abdominal anterior e intermediário Quando Ubx é deletado os padrões de expressão do tipo selvagem de AbdA e AbdB são inalterados Quando ambos AbdA e AbdB são deletados Ubx é expresso em todos os segmentos desde o tórax posterior até a extremidade posterior do embrião Explique essas observações levando em consideração o fato de que os genes gap controlam os padrões de expressão iniciais dos genes homeóticos Quais testes genéticos possibilitam que você diga se um gene é zigoticamente necessário ou se ele apresenta um efeito materno 17 18 19 20 Ao considerar a formação dos eixos AP e DV em Drosophila observamos que em relação a mutações tais como bcd mães mutantes homozigotas produzem uniformemente descendentes mutantes com defeitos de segmentação Esse desfecho sempre é verdadeiro independentemente de a progênie ser bcdbcd ou bcdbcd Algumas outras mutações letais de efeito materno são diferentes porque o fenótipo mutante pode ser resgatado por meio da introdução de um alelo do tipo selvagem do gene do pai Em outras palavras em relação aos referidos letais de efeito materno resgatáveis animais mutmut são normais enquanto animais mutmut apresentam o defeito mutante Explique a diferença entre as mutações letais de efeito materno resgatáveis e não resgatáveis Suponha que você isola uma mutação que afeta a padronização AP do embrião de Drosophila na qual estão ausentes segmentos alternados das larvas mutantes em desenvolvimento a Você consideraria que essa mutação se encontra em um gene gap um gene de regra dos pares um gene de polaridade do segmento ou um gene de identidade do segmento b Você clonou um fragmento de DNA que contém quatro genes Como você utilizaria o padrão de expressão espacial de seu mRNA em um embrião do tipo selvagem para identificar qual representa um gene candidato em relação à mutação descrita c Presuma que você identificou o gene candidato Se agora você examinar o padrão de expressão espacial do seu mRNA em um embrião que é homozigoto mutante em relação ao gene gap Krüppel você espera observar um padrão de expressão normal Explique Como o gradiente da proteína Bicoid é formado Em um embrião de uma fêmea mutante homozigota Bicoid qualis classes de expressão gênica ésão normalis a Genes gap b Genes de regra dos pares c Genes de polaridade do segmento 21 22 23 24 25 d Genes Hox PROBLEMAS DESAFIADORES a O gene eyeless é necessário para a formação dos olhos em Drosophila Ele codifica um homeodomínio O que você preveria a respeito da função bioquímica da proteína Eyeless b Onde você preveria que o gene eyeless seja expresso no desenvolvimento Como você testaria a sua previsão c Os genes Small eye e Aniridia de camundongos e seres humanos respectivamente codificam proteínas com sequências muito similares às proteínas Eyeless da mosca e elas são denominadas de acordo com seus efeitos sobre o desenvolvimento ocular Planeje um teste para examinar se os genes de camundongos e seres humanos são funcionalmente equivalentes ao gene eyeless de mosca O gene X é expresso no cérebro no coração e nos pulmões em desenvolvimento de camundongos Mutações que afetam seletivamente a função do gene X nesses três tecidos são mapeadas em três regiões diferentes A B e C respectivamente a 5 da região codificadora de X a Explique a natureza dessas mutações b Desenhe um mapa do locus X consistente com a informação precedente c Como você testaria a função das regiões A B e C Por que as mutações reguladoras no gene Sonic hedgehog de camundongos são dominantes e viáveis Por que as mutações codificadoras causam defeitos mais difusos Ocorre uma mutação no gene doublesex de Drosophila que evita a ligação de Tra ao transcrito de RNA de dsx Quais seriam as consequências dessa mutação para a expressão da proteína Dsx em machos E em fêmeas Você isola uma mutação em glp1 de C elegans e descobre que a região do DNA que codifica o controle espacial SCR foi deletada Qual será o padrão de expressão da proteína GLP1 em um embrião de quatro células 26 nos heterozigotos mutantes E em homozigotos mutantes Avalie a validade da observação de Monod e Jacob de que qualquer coisa que se observe ser verdadeira para a E coli também deve ser verdadeira para os elefantes a Compare as estruturas e os mecanismos de ação das proteínas Hox de animais e do repressor Lac De que modos eles são semelhantes 1T H Morgan Experimental Embryology Columbia University Press 1927 2F Jacob e J Monod Cold Spring Harbor Quant Symp Biol 26 1963 393 141 142 143 144 O genoma nuclear humano visualizado como um conjunto de DNA marcado O DNA de cada cromossomo foi marcado com um corante que emite fluorescência em um comprimento de onda específico produzindo uma cor específica Nallasivam Palanisamy MSc MPhil PhD Professor Associado de Patologia Michigan Center for Translational Pathology University of Michigan TÓPICOS Revolução genômica Obtenção da sequência de um genoma Bioinformática Significado da sequência genômica Estrutura do genoma humano 145 146 147 N Genômica comparativa de seres humanos com outras espécies Genômica comparativa e medicina de seres humanos Genômica funcional e genética reversa RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Descrever as combinações de estratégias tipicamente necessárias para a obtenção e a montagem das sequências de DNA completas de organismos Listar os elementos funcionais nos genomas e explicar como eles são identificados por computador e experimentalmente Comparar as abordagens de genoma inteiro e subgenômicas para a medicina personalizada Descrever como a genômica comparativa é empregada para revelar as diferenças genéticas entre as espécies Explicar como a disponibilidade da sequência genômica possibilita a análise genética reversa da função dos genes o verão de 2009 o Dr Alan Mayer um pediatra do Childrens Hospital of Wisconsin em Milwaukee escreveu para um colega a respeito do caso desconcertante e de partir o coração de um paciente seu com 4 anos de idade Figura 141 Durante 2 anos o pequeno Nicholas Volker havia realizado mais de 100 jornadas até o centro cirúrgico enquanto os médicos tentavam tratar uma doença misteriosa que estava destruindo os seus intestinos deixandoo vulnerável a infecções perigosas gravemente abaixo do peso e com frequência incapaz de comer Nem Mayer nem quaisquer outros médicos haviam visto uma doença como a de Nicholas eles não conseguiam diagnosticála ou evitar seus danos por meio de qualquer tratamento clínico cirúrgico ou nutricional Era difícil tratar uma doença que ninguém conseguia identificar Assim o Dr Mayer indagou ao seu colega o Dr Howard Jacob do Medical College of Wisconsin se existe algum modo de conseguirmos realizar o sequenciamento de seu genoma Existe uma boa chance de que o Nicholas apresente um defeito genético e é provável que seja uma nova doença Além disso um diagnóstico breve poderia salvar a sua vida e mostrar verdadeiramente a medicina genômica personalizada1 O Dr Jacob sabia que seria um tiro no escuro Encontrar uma única mutação responsável por uma doença requereria peneirar milhares de variações no DNA de Nicholas Uma decisãochave era estreitar a busca para apenas as sequências de éxons no DNA de Nicholas A justificativa era de que se a mutação causal fosse uma alteração na codificação proteica ela poderia ser identificada por meio do sequenciamento de todos os éxons ou do exoma de Nicholas o que compreende pouco mais de 1 do genoma humano inteiro Ainda assim seria uma busca dispendiosa o sequenciamento custaria aproximadamente US 75000 com a tecnologia disponível na ocasião Não obstante o dinheiro foi obtido a partir de doadores e Jacob e uma equipe de colaboradores assumiram a tarefa FIGURA 141 O sequenciamento de todos os éxons do DNA do genoma de Nicholas Volker revelou uma mutação única responsável por sua doença debilitante porém anteriormente não identificada Gary PorterMCTNewscom Conforme Jacob esperava eles encontraram mais de 16000 possíveis variações candidatas no DNA de Nicholas Estreitaram essa longa lista ao enfocar as mutações que não haviam sido identificadas anteriormente em seres humanos e que causavam substituições de aminoácidos que não eram observadas em outras espécies Finalmente eles identificaram uma única substituição de bases em um gene denominado inibidor da apoptose ligado ao X XIAP que alterava um aminoácido na posição 203 da proteína um aminoácido que era invariante nos correspondentes do gene XIAP entre mamíferos peixes e mesmo nas moscadasfrutas Felizmente a identificação da mutação no gene XIAP de Nicholas sugeriu uma abordagem terapêutica Sabiase anteriormente que o gene XIAP apresenta um papel na resposta inflamatória e mutações no gene estavam associadas a um distúrbio imune muito raro porém possivelmente fatal embora não aos sintomas intestinais de Nicholas Com base nesse conhecimento os médicos de Nicholas atacaram o seu sistema imune com uma infusão de sangue de cordão umbilical de um doador compatível Durante os diversos meses que se seguiram a saúde de Nicholas melhorou até o ponto em que ele conseguia comer carne e outros alimentos E ao longo dos 2 anos seguintes Nicholas não precisou de quaisquer cirurgias intestinais adicionais O diagnóstico e o tratamento de Nicholas Volker ilustram os avanços dramáticos na tecnologia e o impacto da genômica o estudo dos genomas em sua totalidade A promessa há muito esperada de que a genômica modelaria a medicina clínica agora é muito mais uma realidade O progresso tecnológico e biológico que teve início com alguns dados na década de 1990 foi impressionante Em 1995 o genoma de 18 Mb 18 megabase da bactéria Haemophilus influenzae foi o primeiro genoma de um organismo vivo a ser sequenciado Em 1996 surgiu o genoma de 12 Mb de Saccharomyces cerevisiae em 1998 o genoma de 100 Mb de C elegans em 2000 o genoma de 180 Mb de Drosophila melanogaster em 2001 o primeiro rascunho do genoma humano de 3000 Mb e em 2005 o primeiro rascunho de nosso parente vivo mais próximo o chimpanzé Essas espécies são apenas uma pequena amostra No final de 2013 as sequências de quase 27000 genomas bacterianos e mais de 6600 espécies eucarióticas incluindo fungos plantas e animais haviam sido decifradas Não é uma hipérbole dizer que a genômica revolucionou o modo como a análise genética é realizada e abriu vias de indagações que não eram concebíveis há alguns anos A maior parte das análises genéticas que consideramos até então emprega uma abordagem direta para a análise de processos genéticos e biológicos Ou seja a análise tem início primeiramente com a triagem de mutantes que afetam algum fenótipo observável e a caracterização desses mutantes finalmente leva à identificação do gene e da função do DNA do RNA e das sequências proteicas Contrariamente conhecer as sequências inteiras de DNA do genoma de um organismo possibilita que os geneticistas trabalhem em ambos os sentidos diretamente do fenótipo até o gene e de modo reverso do gene até o fenótipo Sem exceções as sequências genômicas revelam muitos genes que não foram detectados a partir da análise mutacional clássica Com a utilização da assim denominada genética reversa atualmente os geneticistas conseguem estudar sistematicamente os papéis dos referidos genes não identificados anteriormente Além disso a ausência de estudo genético clássico prévio deixou de ser um impedimento para a investigação genética dos organismos As fronteiras da análise experimental estão crescendo muito além dos limites do número muito modesto de organismosmodelo há muito explorados As análises de genomas inteiros atualmente contribuem para todos os aspectos das pesquisas biológicas Na genética humana a genômica está proporcionando novos modos para localizar genes que contribuem para muitas doenças genéticas como a de Nicholas que anteriormente haviam escapado dos investigadores Logo chegará o dia em que a sequência do genoma de uma pessoa será uma parte padrão de seu registro médico A disponibilidade das sequências genômicas de organismosmodelo estudados há muito tempo e seus parentes acelerou dramaticamente a identificação dos genes a análise da função gênica e a caracterização de elementos não codificadores do genoma Novas tecnologias para a análise global do papel fisiológico de todos os produtos gênicos do 141 genoma estão direcionando o desenvolvimento do novo campo denominado biologia de sistemas A partir de uma perspectiva evolutiva a genômica proporciona uma visão detalhada sobre como os genomas e os organismos divergiram e se adaptaram ao longo do tempo geológico A sequência de DNA do genoma é o ponto de início para todo um novo conjunto de análises direcionadas à compreensão da estrutura da função e da evolução do genoma e de seus componentes Neste capítulo enfocaremos três aspectos importantes da análise genômica Bioinformática a análise do conteúdo das informações de genomas inteiros Essas informações incluem os números e os tipos de genes e produtos gênicos bem como a localização o número e os tipos de sítios de ligação no DNA e no RNA que possibilitam aos produtos funcionais serem sintetizados na ocasião e no local corretos Genômica comparativa que considera os genomas de espécies relacionadas de modo próximo e distante a partir de uma percepção evolutiva Genômica funcional a utilização de uma diversidade de métodos em expansão incluindo genética reversa para compreender a função dos genes e das proteínas nos processos biológicos Revolução genômica Após o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante na década de 1970 laboratórios de pesquisa passaram a fazer a clonagem e o sequenciamento de um gene por vez prosseguindo apenas após terem primeiramente encontrado algo interessante a respeito daquele gene a partir de uma análise mutacional clássica As etapas desde a elaboração do mapa genético clássico de um locus para isolar o DNA codificador de um gene clonagem até a determinação de sua sequência com frequência eram numerosas e tomavam tempo Na década de 1980 alguns cientistas perceberam que uma grande equipe de pesquisadores em um esforço conjunto poderia clonar e sequenciar o genoma inteiro de um organismo selecionado Tais projetos genoma tornariam então os clones e a sequência recursos publicamente disponíveis Um atrativo da disponibilização desses recursos é que quando os pesquisadores se interessam por um gene de uma espécie cujo genoma foi sequenciado eles apenas precisam descobrir onde esse gene está localizado no mapa do genoma para conseguir enfocar sua sequência e possivelmente sua função Assim um gene pode ser caracterizado muito mais rapidamente do que por meio da sua clonagem e do seu sequenciamento a partir do zero algo que na época poderia demorar muitos anos para ser realizado Essa abordagem mais rápida atualmente é uma realidade em relação a todos os organismosmodelo De modo similar o Projeto Genoma Humano teve por objetivo revolucionar o campo da genética humana A disponibilidade de sequências do genoma humano e a capacidade de sequenciar os genomas de pacientes e seus parentes auxiliaram muito na identificação dos genes causadores de doenças De modo semelhante a capacidade de determinar as sequências gênicas em tecidos normais e enfermos p ex cânceres tem sido um grande catalisador para a compreensão dos processos de doença e apontou o caminho para novas terapias De uma perspectiva mais ampla os projetos genoma tinham o atrativo de proporcionar um vislumbre dos princípios pelos quais os genomas são construídos O genoma humano contém 3 bilhões de pares de bases de DNA A sequência inteira decifrada deu origem a questões como quantos genes ele contém Como eles estão distribuídos e por quê Que fração do genoma é a sequência codificadora Que fração é a sequência reguladora Quanto do nosso genoma é similar ou diferente do de outros animais Embora estejamos convictos de que podemos compreender um único gene de interesse o principal desafio da genômica atualmente é a literatura genômica como lemos o depósito de informações codificadas na sequência de genomas completos As técnicas básicas necessárias para o sequenciamento de genomas inteiros já estavam disponíveis na década de 1980 ver Capítulo 10 Mas a escala necessária para sequenciar um genoma complexo estava assim como um projeto de engenharia muito além da capacidade de pesquisa da comunidade científica daquela época A genômica no final da década de 1980 e na década de 1990 evoluiu a partir de grandes centros de pesquisas que conseguiram integrar essas tecnologias elementares em uma linha de produção de nível industrial Esses centros desenvolveram robótica e automação para realizar as milhares de etapas de clonagem e milhões de reações de sequenciamento necessárias para montar a sequência de um organismo complexo Tão importante quanto isso avanços na tecnologia da informação auxiliaram na análise dos dados resultantes Os primeiros sucessos no sequenciamento do genoma compensaram as ondas de inovação que levaram às tecnologias de sequenciamento mais rápidas e muito menos dispendiosas Atualmente máquinas individuais podem produzir tantas sequências em 1 dia quanto os centros costumavam realizar em meses Atualmente novas tecnologias podem obter mais de 100 bilhões de sequências de bases em 1 dia de trabalho de um único instrumento Esse número representa um aumento de aproximadamente 100000 vezes na produtividade em relação aos instrumentos mais iniciais utilizados para obter a primeira sequência do genoma humano A genômica auxiliada pelo crescimento explosivo na tecnologia da informação encorajou os pesquisadores a desenvolverem modos de experimentação no genoma como um todo em vez de simplesmente um gene por vez A genômica também demonstrou o valor da coleta antecipada de conjuntos de dados em grande escala de modo que eles possam ser utilizados posteriormente para abordar problemas de pesquisa específicos Nas últimas seções deste capítulo exploraremos alguns modos pelos quais atualmente a genômica direciona pesquisas genéticas básicas e aplicadas Nos capítulos subsequentes veremos como a genômica está catalisando os avanços na compreensão da dinâmica da mutação da recombinação e da evolução CONCEITOCHAVE A caracterização de genomas inteiros é fundamental para a compreensão de todo o conjunto de informação genética subjacente à fisiologia e ao desenvolvimento dos organismos vivos e para a descoberta de novos genes tais como aqueles que apresentam papéis em doenças genéticas humanas 142 Obtenção da sequência de um genoma Quando as pessoas encontram novos territórios uma de suas primeiras atividades é criar um mapa Essa prática tem sido frequente para exploradores geógrafos oceanógrafos e astrônomos sendo também utilizada pelos geneticistas Os geneticistas utilizam muitos tipos de mapas para explorar o terreno de um genoma Exemplos são os mapas de ligação com base nos padrões de herança de alelos gênicos e os mapas citogenéticos com base na localização de características microscopicamente visíveis tais como pontos de quebra de rearranjos O mapa de mais alta resolução é a sequência completa do DNA do genoma ou seja a sequência completa de nucleotídios A T C e G de cada duplahélice no genoma Tendo em vista que a obtenção da sequência completa de um genoma é uma realização tão maciça de um tipo não observado anteriormente na biologia novas estratégias devem ser utilizadas todas com base na automação Transformação das leituras de sequências em uma sequência montada Você provavelmente viu um ato de mágica no qual o mágico corta uma página de jornal em muitas partes misturaas em seu chapéu diz algumas palavras mágicas e voilà reaparece uma página de jornal intacta Basicamente é assim que as sequências genômicas são obtidas A abordagem é 1 quebrar as moléculas de DNA de um genoma em milhares a milhões de pequenos segmentos sobrepostos mais ou menos aleatórios 2 ler a sequência de cada pequeno segmento 3 encontrar de modo computadorizado a sobreposição entre os pequenos segmentos na qual suas sequências são idênticas e 4 continuar a realizar a sobreposição de peças cada vez maiores até que todos os pequenos segmentos estejam ligados Figura 142 Nesse ponto a sequência de um genoma está montada Por que esse processo requer automação Para compreender o motivo consideraremos o genoma humano que contém aproximadamente 3 109 pb de DNA ou 3 bilhões de pares de bases 3 gigapares de bases 3 Gpb Suponha que possamos purificar o DNA intacto de cada um dos 24 cromossomos humanos X Y e os 22 autossomos posicionar em separado cada uma dessas 24 amostras de DNA em uma máquina de sequenciamento e ler as suas sequências diretamente a partir de um telômero até o outro A obtenção de uma sequência completa seria totalmente direta como a leitura de um livro com 24 capítulos apesar de ser um livro muito muito longo com 3 bilhões de caracteres aproximadamente o comprimento de 3000 romances Infelizmente não existe tal máquina de sequenciamento Em vez disso o sequenciamento automatizado é a atual tecnologia de ponta no sequenciamento do DNA Inicialmente baseado no pioneiro método de Sanger de terminação de cadeia didesóxi ver Capítulo 10 o sequenciamento automatizado atualmente emprega uma diversidade de métodos químicos e de detecção óptica Os métodos atualmente disponíveis variam no comprimento da sequência de DNA obtida nas bases determinadas por segundo e na precisão bruta Para os projetos de sequenciamento em grande escala que buscam analisar grandes genomas individuais ou os genomas de muitos indivíduos ou espécies diferentes a escolha de um método requer o equilíbrio entre a velocidade o custo e a precisão Reações de sequenciamento individuais denominadas leituras de sequenciamento fornecem sequências de letras que dependendo da técnica de sequenciamento empregada variam em média desde aproximadamente 100 a 5000 bases de comprimento Tais comprimentos são pequenos em comparação ao DNA de um único cromossomo Por exemplo uma leitura individual de 300 bases é apenas 00001 do mais longo cromossomo humano aproximadamente 3 108 pb de DNA e apenas aproximadamente 000001 do genoma humano inteiro Portanto um grande desafio enfrentado pelo projeto genoma é a montagem da sequência ou seja a junção de todas as leituras individuais em uma sequência consenso uma sequência em relação à qual existe consenso ou concordância de que essa é uma representação autêntica da sequência para cada uma das moléculas de DNA naquele genoma FIGURA 142 Para obter uma sequência genômica múltiplas cópias do genoma são cortadas em pequenos pedaços que são sequenciados As leituras das sequências resultantes são sobrepostas por meio da correspondência de sequências idênticas em fragmentos diferentes até que seja produzida uma sequência consenso de cada duplahélice do DNA no genoma Vejamos esses números de um modo razoavelmente diferente para compreender a escala do problema Assim como qualquer observação experimental as máquinas de sequenciamento automatizado nem sempre fornecem leituras de sequência perfeitamente precisas De fato tecnologias de sequenciamento mais novas e de mais alta produtividade geram uma frequência maior de erros do que os métodos mais antigos a taxa de erro pode variar de menos de 1 até tanto quanto 10 dependendo da tecnologia Portanto para assegurar a precisão os projetos genoma convencionalmente obtêm muitas leituras de sequência independentes de cada par de bases em um genoma A cobertura de muitas vezes assegura que os erros ao acaso nas leituras não forneçam uma reconstrução falsa da sequência consenso Considerando uma leitura de sequência média de aproximadamente 100 bases de DNA e um genoma humano de 3 bilhões de pares de bases são necessários 300 milhões de leituras independentes para proporcionar uma cobertura média de 10 vezes de cada par de bases Entretanto nem todas as sequências são representadas igualmente e assim o número de leituras necessárias é maior A quantidade de informação a ser rastreada é enorme Portanto o sequenciamento do genoma necessitou de muitos avanços na automação e na tecnologia da informação Quais são os objetivos do sequenciamento de um genoma Primeiramente nos esforçamos para produzir uma sequência consenso que seja uma representação verdadeira e precisa do genoma iniciando com um organismo individual ou uma linhagempadrão a partir dos quais o DNA tenha sido obtido Essa sequência atuará então como uma sequência de referência em relação à espécie Atualmente sabemos que existem muitas diferenças na sequência de DNA entre diferentes indivíduos de uma espécie e até mesmo entre os genomas de origem materna e paterna em um único indivíduo diploide Portanto nenhuma sequência do genoma representa verdadeiramente o genoma de toda a espécie Não obstante a sequência do genoma atua como um padrão ou uma referência à qual outras sequências podem ser comparadas e pode ser analisada para determinar a informação codificada no DNA tal como o inventário dos RNA e polipeptídios codificados Assim como os manuscritos as sequências genômicas podem variar desde a qualidade rascunho o esboço geral está presente mas existem erros tipográficos erros gramaticais lacunas seções que necessitam de rearranjo e assim por diante até a qualidade final uma taxa muito baixa de erros tipográficos algumas seções ausentes mas tudo o que atualmente é possível foi feito para preencher essas seções até a verdadeiramente completa nenhum erro tipográfico cada par de bases absolutamente correto de telômero a telômero Nas seções a seguir examinaremos a estratégia e alguns métodos para a produção de montagens de sequências genômicas rascunho e finalizadas Também encontraremos algumas das características dos genomas que desafiam os projetos de sequenciamento genômico Sequenciamento do genoma inteiro A atual estratégia geral para a obtenção e a montagem da sequência de um genoma é denominada sequenciamento shotgun de genoma inteiro WGS do inglês wholegenome shotgun Essa abordagem tem por base a determinação da sequência de muitos segmentos de DNA genômico que foram gerados por meio da quebra de DNA de longos cromossomos em muitos segmentos curtos Duas abordagens do sequenciamento shotgun de genoma inteiro são responsáveis pela maior parte das sequências genômicas obtidas até agora As diferenças fundamentais entre elas estão no modo como os segmentos curtos de DNA são obtidos e preparados para o sequenciamento e na química empregada no sequenciamento O primeiro método utilizado para sequenciar o primeiro genoma humano baseouse na clonagem do DNA em células microbianas e empregou a técnica de sequenciamento didesóxi de Sanger Faremos referência a essa abordagem como WGS tradicional No segundo grupo os métodos em geral são livres de células empregam novas técnicas para o sequenciamento e são desenhados para processamento muito alto que se refere ao número de leituras por máquina por unidade de tempo Faremos referência a esse grupo de métodos como WGS de última geração WGS tradicional A abordagem WGS tradicional tem início com a construção de bibliotecas genômicas que são coleções desses segmentos de DNA curtos representando o genoma inteiro Os segmentos de DNA curtos em tal biblioteca foram inseridos em um de uma diversidade de tipos de cromossomos acessórios elementos não essenciais tais como plasmídios vírus bacterianos modificados ou cromossomos artificiais e propagados em microrganismos normalmente bactérias ou leveduras Esses cromossomos acessórios que carregam insertos de DNA são denominados vetores Para gerar uma biblioteca genômica um pesquisador primeiramente utiliza enzimas de restrição que clivam o DNA em sequências específicas para cortar o DNA genômico purificado Algumas enzimas cortam o DNA em muitos locais enquanto outras o cortam em menos locais Assim o pesquisador consegue controlar se o DNA é cortado em média em pedaços mais longos ou mais curtos Os fragmentos resultantes apresentam filamentos únicos curtos de DNA em ambas as extremidades Cada fragmento em seguida é unido à molécula de DNA do cromossomo acessório que também foi cortado com uma enzima de restrição e que apresenta extremidades que são complementares àquelas dos fragmentos genômicos Para que o genoma inteiro seja representado múltiplas cópias do DNA genômico são cortadas em fragmentos Assim são gerados milhares a milhões de diferentes moléculas recombinantes fragmentovetor O resultante conjunto de moléculas de DNA recombinante é propagado em seguida tipicamente por meio da introdução das moléculas em células bacterianas Cada célula capta uma molécula recombinante Em seguida cada molécula recombinante é replicada durante o crescimento e a divisão normais de seu hospedeiro de modo que são produzidas muitas cópias idênticas do fragmento inserido para a utilização na análise da sequência do fragmento de DNA Tendo em vista que cada molécula recombinante é amplificada a partir de uma célula individual cada célula é um clone distinto Mais detalhes a respeito da clonagem de DNA são fornecidos no Capítulo 10 A biblioteca de clones resultante é denominada biblioteca shotgun tendo em vista que as sequências lidas são obtidas a partir de clones selecionados aleatoriamente da biblioteca do genoma inteiro sem qualquer informação sobre onde esses clones estão mapeados no genoma Em seguida os fragmentos genômicos nos clones da biblioteca shotgun são parcialmente sequenciados A reação de sequenciamento deve ter início a partir de um primer de sequência conhecida Tendo em vista que a sequência de um inserto clonado não é conhecida e é o objetivo do exercício os primers baseiamse na sequência de DNA do vetor adjacente Esses primers são utilizados para direcionar a reação de sequenciamento do inserto Portanto regiões curtas em uma das ou ambas as extremidades dos insertos genômicos podem ser sequenciadas Figura 143 Após o sequenciamento obtémse uma grande coleção de sequências curtas aleatórias algumas delas sobrepostas Essas sequências são montadas em uma sequência consenso que abrange o genoma inteiro por meio da correspondência de sequências homólogas compartilhadas por leituras de clones sobrepostos As sequências de leituras sobrepostas são montadas em unidades denominadas sequências contigs sequências que são contíguas ou que se tocam Sequenciamento shotgun de última geração do genoma inteiro O objetivo do WGS de nova geração é o mesmo daquele do WGS tradicional obter um grande número de leituras de sequências sobrepostas que possam ser montadas em contigs Entretanto as metodologias utilizadas diferem em diversos modos substanciais do WGS tradicional Foram desenvolvidos diversos sistemas diferentes que embora sejam diferentes na sua química de sequenciamento e no desenho de sua máquina empregam cada um três estratégias que aumentaram dramaticamente a produtividade 1 2 3 FIGURA 143 As leituras de sequenciamento são obtidas apenas das extremidades dos insertos clonados O uso de sequências de dois sítios de iniciação diferentes um em cada extremidade do vetor torna possível o sequenciamento de até 600 pares de bases em cada extremidade do inserto genômico Se ambas as extremidades do mesmo clone forem sequenciadas as duas leituras de sequência resultantes são denominadas leituras de pontas pareadas As moléculas de DNA são preparadas para o sequenciamento em reações livres de células sem clonagem em hospedeiros microbianos Milhões de fragmentos de DNA individuais são isolados e sequenciados em paralelo durante cada operação da máquina Tecnologias de manipulação de líquido câmeras e software avançados tornam possível detectar os produtos de reações de sequenciamento em volumes de reação extremamente pequenos Tendo em vista que o campo da tecnologia genômica está evoluindo rapidamente não descreveremos todos os sistemas de nova geração Entretanto examinaremos uma abordagem amplamente utilizada que emprega todas essas características Um dos primeiros sistemas de nova geração foi o 454 desenvolvido pela Life Sciences Corporation Essa abordagem ilustra os ganhos que foram obtidos na produtividade e o que os referidos ganhos possibilitam que os geneticistas realizem Podese considerar que a abordagem tenha três estágios Estágio 1 É construída uma biblioteca de DNA molde de moléculas de DNA unifilamentares Estágio 2 As moléculas de DNA na biblioteca molde são amplificadas em muitas cópias não por meio do crescimento de colônias como nas bibliotecas genômicas tradicionais mas por meio da utilização da reação da cadeia de polimerase PCR ver Capítulo 10 Primeiramente moléculas únicas são imobilizadas em esferas individuais beads Em seguida as moléculas são amplificadas por meio de PCR de modo que as moléculas de DNA unifilamentares permaneçam unidas aos beads Assim cada bead contém muitos fragmentos de DNA idênticos Em seguida cada bead é depositado individualmente dentro de poços de volume muito pequeno em um dispositivo no qual ocorrem as reações de sequenciamento Figura 144 Estágio 3 O sequenciamento de cada bead é realizado com a utilização de uma nova química de sequenciamento por síntese denominada pirossequenciamento Figura 145 A DNA polimerase e um primer são adicionados aos poços para iniciar a síntese de um filamento de DNA complementar Cada um dos quatro desoxirribonucleotídios dATP dGTP dTTP e dCTP flui por todos os poços um por vez em uma ordem específica Quando é adicionado um nucleotídio que é complementar à próxima base no filamentomolde em um determinado poço ele é incorporado e a reação libera uma molécula de pirofosfato Duas enzimas sulfurilase e luciferase que também estão presentes em seguida atuam para converter o sinal de pirofosfato em um sinal de luz visível ver Figura 145 A luz é detectada por meio de uma câmera especial Portanto os filamentos de DNA em crescimento que apresentam A como a primeira base após o primer produzirão um sinal apenas quando o dATP fluir através do poço não quando os outros desoxinucleotídios fluírem A reação é repetida por no mínimo 100 ciclos e os sinais de cada poço ao longo de todos os ciclos são integrados para gerar as leituras de sequência de cada poço Outras plataformas amplamente utilizadas tais como os sistemas de sequenciamento Illumina e da Pacific Bioscience também detectam a síntese de DNA mas por diferentes meios O sistema Illumina detecta a incorporação de dNTP individuais marcados por fluorescência enquanto o processo da Pacific Bioscience detecta bases que estão sendo incorporadas em uma única molécula de DNA imobilizada O método escolhido pelos investigadores depende muito da aplicação O sistema Illumina produz uma quantidade maior de leituras mais curtas em relação ao sistema 454 enquanto o sistema da Pacific Bioscience proporciona a vantagem de leituras individuais muito mais longas do que qualquer outro sistema mas com uma taxa de erros mais alta A alta produtividade de cada sistema é produto do sequenciamento maciçamente em paralelo diversas centenas de milhares a mais de 1 milhão de reações podem ocorrer simultaneamente As máquinas de sequenciamento precedentes eram capazes de realizar apenas 384 reações de sequenciamento por operação FIGURA 144 A No sistema de sequenciamento 454 DNA unifilamentares são replicados em pequenos beads no preparo para o sequenciamento B As reações de sequenciamento de pirossequenciamento ocorrem em pequenos poços dispostos em placas Os muitos poços em uma placa e os volumes de reação muito pequenos possibilitam o sequenciamento paralelo maciço do DNA a um custo modesto B 2010 The Regents of the University of California Lawrence Berkeley National Laboratory FIGURA 145 No processo de pirossequenciamento nucleotídios são adicionados sequencialmente para formar o filamento complementar ao molde unifilamentar ao qual um primer de sequenciamento foi pareado As reações são realizadas na presença das enzimas DNA polimerase sulfurilase e luciferase Uma molécula de pirofosfato PPi é liberada para cada nucleotídio incorporado ao filamento em crescimento pela DNA polimerase e é convertida em ATP pela sulfurilase A luz visível é produzida a partir da luciferina em uma reação catalisada pela luciferase que utiliza o ATP produzido pela sulfurilase Montagem da sequência do genoma inteiro Seja qual for o método de obtenção de sequência bruta utilizado permanece o desafio de montar os contigs na sequência do genoma inteiro A dificuldade de tal processo depende fortemente do tamanho e da complexidade do genoma Por exemplo os genomas de espécies bacterianas são relativamente fáceis de montar O DNA bacteriano é essencialmente um DNA de cópia única sem sequências repetidas Portanto qualquer sequência de DNA lida de um genoma bacteriano terá vindo de um único lugar naquele genoma Em virtude dessas propriedades contigs nos genomas bacterianos com frequência podem ser montados em contigs maiores que representam a maior parte ou toda a sequência genômica de modo relativamente direto Além disso um genoma bacteriano típico é do tamanho de apenas alguns pares de megabases de DNA Em relação aos eucariotos a montagem do genoma normalmente apresenta algumas dificuldades Um grande obstáculo é a existência de diversas classes de sequências repetidas algumas dispostas em tandem e outras dispersas Por que elas são um problema para o sequenciamento do genoma Resumidamente porque uma leitura de sequenciamento de DNA repetitivo se encaixa dentro de muitos locais no rascunho do genoma Não raramente uma sequência repetitiva em tandem no total é mais longa do que o comprimento de uma leitura de sequência máxima Nesse caso não existe como preencher a lacuna entre sequências únicas adjacentes Elementos repetitivos dispersos podem causar o alinhamento errôneo conjunto de leituras de diferentes cromossomos ou diferentes partes do mesmo cromossomo CONCEITOCHAVE O cenário dos cromossomos eucarióticos inclui uma diversidade de segmentos de DNA repetitivos Esses segmentos são de difícil alinhamento como leituras de sequência O sequenciamento shotgun de genoma inteiro é particularmente bom para a produção de sequências de qualidade rascunho de genomas complexos com muitas sequências repetitivas Como um exemplo consideraremos o genoma da moscadasfrutas D melanogaster que foi inicialmente sequenciado pelo método de WGS tradicional O projeto teve início com o sequenciamento de bibliotecas de clones genômicos de diferentes tamanhos 2 kb 10 kb 150 kb As leituras de sequência foram obtidas a partir de ambas as extremidades dos insertos de clones genômicos e alinhadas por meio de uma lógica idêntica àquela utilizada para o sequenciamento WGS bacteriano Por meio dessa lógica foram identificadas as sobreposições de sequências e os clones foram posicionados em ordem produzindo sequências contigs sequências consenso em relação a esses trechos de cópia única do genoma Entretanto contrariamente à situação em bactérias os contigs finalmente atingiram um segmento do DNA repetitivo impedindo a montagem não ambígua dos contigs em um genoma inteiro As sequências contigs apresentavam um tamanho médio de aproximadamente 150 kb O desafio então era como unir as milhares de tais sequências contigs em sua ordem e orientação corretas A solução para esse problema foi utilizar os pares de leituras de sequência de extremidades opostas dos insertos genômicos no mesmo clone essas leituras são denominadas leituras de pontas pareadas A ideia era encontrar leituras de pontas pareadas que abrangessem os intervalos entre duas sequências contigs Figura 146 Em outras palavras se uma ponta de um inserto fosse parte de um contig e a outra extremidade fosse parte de um segundo contig então esse inserto deveria abranger o intervalo entre dois contigs e os dois contigs estariam claramente próximos um do outro De fato tendo em vista que o tamanho de cada clone era conhecido ou seja ele tinha origem em uma biblioteca que continha insertos genômicos de tamanho uniforme fosse a biblioteca de 2 kb 100 kb ou 150 kb a distância entre as leituras de extremidades era conhecida Além disso o alinhamento das sequências dos dois contigs por meio da utilização de leituras de pontas pareadas automaticamente determina a orientação relativa dos dois contigs Desse modo contigs de cópia única puderam ser unidos embora com intervalos onde os elementos repetitivos estão localizados Essas coleções espaçadas de sequências contigs unidas são denominadas arcabouços por vezes também denominados supercontigs Tendo em vista que a maior parte das repetições de Drosophila são grandes 3 a 8 kb e amplamente espaçadas uma repetição aproximadamente a cada 150 kb essa técnica foi extremamente eficaz na produção de uma sequência rascunho corretamente montada do DNA de cópia única Um resumo da lógica dessa abordagem está demonstrado na Figura 147 FIGURA 146 Leituras de pontas pareadas podem ser utilizadas para unir duas sequências contigs em um único arcabouço ordenado e orientado O WGS de nova geração não conseguiu contornar o problema das sequências repetitivas e dos intervalos Tendo em vista que essa abordagem se destina a evitar a construção de bibliotecas que por sua vez facilitaria a ligação dos intervalos entre os contigs por meio de leituras de pontas pareadas pesquisadores do WGS de nova geração precisavam planejar um modo de ligar esses intervalos sem construir bibliotecas genômicas em vetores Uma solução era construir uma biblioteca de fragmentos circulares de DNA genômico de tamanhos desejados A circularização possibilita que segmentos curtos de sequências anteriormente distantes localizadas nas extremidades de cada fragmento sejam justapostas em cada lado de uma sequência ligadora A obtenção dessas moléculas circulares a amplificação e o sequenciamento dos fragmentos que contêm ligadores produzem leituras de pontas pareadas equivalentes àquelas obtidas a partir do sequenciamento de insertos de bibliotecas genômicas tradicionais Figura 148 Tanto no sequenciamento tradicional quanto no shotgun de genoma inteiro de última geração normalmente permanecem alguns intervalos Devem ser utilizados procedimentos específicos direcionados aos intervalos individuais para preencher os dados ausentes nas montagens de sequências Se os intervalos forem curtos os fragmentos que faltam podem ser gerados por meio da utilização das sequências conhecidas nas extremidades das montagens como primers para amplificar e analisar a sequência genômica entre elas Se os intervalos forem mais longos podem ser realizadas tentativas para isolar as sequências ausentes como partes de insertos maiores que foram clonadas em um vetor e em seguida sequenciar os insertos Se um genoma é sequenciado nos padrões rascunho ou finalizado é uma questão de custobenefício É relativamente fácil criar um rascunho mas muito difícil finalizar uma sequência FIGURA 147 No sequenciamento shotgun de genoma inteiro primeiramente as sobreposições de sequência única entre as leituras de sequência são utilizadas para construir contigs Em seguida as leituras de pontas pareadas são utilizadas para abranger os intervalos e para ordenar e orientar os contigs em unidades maiores denominadas arcabouços Leituras de pontas pareadas podem ser produzidas por meio de circularização 143 FIGURA 148 Leituras de pontas pareadas para o sequenciamento de alta produtividade podem ser produzidas sem a construção de bibliotecas genômicas A figura tem por base o protocolo de ponta pareada da Roche GS FLX Titanium Series Roche Applied Science Mannheim Alemanha Bioinformática Significado da sequência genômica A sequência genômica é um código altamente criptografado que contém a informação bruta para a construção e o funcionamento dos organismos O estudo do conteúdo de informação dos genomas é denominado bioinformática Estamos longe de ser capazes de ler essa informação do início ao fim do modo como lemos um livro Muito embora saibamos quais trincas codificam quais aminoácidos nos segmentos codificadores de proteínas uma grande parte das informações contidas em um genoma não é decifrável a partir da mera inspeção Natureza do conteúdo da informação do DNA O DNA contém informação mas como ela é codificada Convencionalmente pensamos na informação como a soma de todos os produtos gênicos proteínas e RNA Entretanto o conteúdo de informação do genoma é mais complexo do que isso O genoma também contém sítios de ligação para diferentes proteínas e RNA Muitas proteínas se ligam a sítios localizados no próprio DNA enquanto outras proteínas e RNA se ligam a sítios localizados no mRNA Figura 149 A sequência e as posições relativas dos sítios possibilitam que os genes sejam transcritos recompostos e traduzidos adequadamente na ocasião apropriada e no tecido apropriado Por exemplo sítios de ligação de proteínas reguladoras determinam quando onde e em que nível um gene será expresso No nível do RNA em eucariotos as localizações dos sítios de ligação para os RNA e as proteínas dos spliceossomos determinarão os sítios de splicing em 5 e 3 nos quais os íntrons são removidos Independentemente de um sítio de ligação de fato atuar como tal no DNA ou RNA o sítio deve estar codificado no DNA A informação no genoma pode ser considerada como a soma de todas as sequências que codificam proteínas e RNA mais os sítios de ligação que regulam a ocasião e o local de suas ações Na medida em que o rascunho do genoma continua a ser melhorado o objetivo principal é a identificação de todos os elementos funcionais do genoma Esse processo é denominado anotação Dedução dos genes codificadores de proteínas a partir da sequência genômica Tendo em vista que as proteínas presentes em uma célula determinam amplamente sua morfologia e propriedades fisiológicas uma das primeiras prioridades na análise e na anotação do genoma é tentar determinar um inventário de todos os polipeptídios codificados pelo genoma de um organismo Esse inventário é denominado proteoma do organismo Ele pode ser considerado uma lista parcial para a célula Para determinar a lista de polipeptídios a sequência de cada mRNA codificado pelo genoma deve ser deduzida Em virtude da remoção dos íntrons essa tarefa é particularmente desafiadora em eucariotos multicelulares nos quais os íntrons são a regra Em seres humanos por exemplo um gene médio apresenta aproximadamente 10 éxons Além disso muitos genes codificam éxons alternativos ou seja alguns éxons são incluídos em algumas versões de um mRNA processado mas não são incluídos em outras ver Capítulo 8 Os mRNA alternativamente processados podem codificar polipeptídios que apresentam uma grande parte das suas sequências de aminoácidos em comum porém não todas Muito embora tenhamos muitos exemplos de genes e mRNA completamente sequenciados ainda não conseguimos identificar os sítios de splicing 5 e 3 meramente a partir da sequência de DNA com um alto grau de precisão Portanto não podemos ter certeza sobre quais sequências são íntrons As previsões de éxons utilizados alternativamente são ainda mais propensas a erros Em virtude de tais motivos a dedução da lista total de partes de polipeptídios em eucariotos superiores é um grande problema Seguem algumas abordagens FIGURA 149 Um gene no DNA pode ser visualizado como uma série de sítios de ligação para as proteínas e RNA Detecção de ORF A principal abordagem para a produção de uma lista de polipeptídios é utilizar a análise computadorizada da sequência do genoma para prever as sequências de mRNA e polipeptídios uma parte importante da bioinformática O procedimento é procurar por sequências que apresentem as características de genes Essas sequências seriam do tamanho de um gene e compostas por códons com sentido após a remoção de possíveis íntrons As sequências apropriadas das extremidade 5 e 3 estariam presentes tais como os códons de início e de parada As sequências com essas características típicas de genes são denominadas matrizes de leitura abertas ORF open reading frames Para encontrar candidatos a ORF programas de computador realizam a varredura da sequência do DNA em ambos os filamentos em cada matriz de leitura Tendo em vista que existem três possíveis matrizes de leitura em cada filamento existem seis matrizes de leitura possíveis no total Evidências diretas a partir de sequências de cDNA Outro meio de identificar ORF e éxons é por meio da análise da expressão de mRNA Essa análise pode ser realizada de dois modos Ambos os métodos envolvem a síntese de bibliotecas de moléculas de DNA complementares a sequências de mRNA denominadas cDNA ver Capítulo 10 O método estabelecido mais longo envolve a clonagem e a amplificação dessas moléculas de cDNA em um vetor Entretanto tecnologias de NGS possibilitam o sequenciamento direto de moléculas de cDNA curtas sem a etapa da clonagem denominado sequenciamento de RNA ou RNAseq abreviadamente Seja qual for o método utilizado as sequências de DNA complementar são extremamente valiosas de dois modos Primeiramente elas são a evidência direta de que um determinado segmento do genoma é expresso e portanto pode codificar um gene Em segundo lugar em virtude de o cDNA ser complementar ao mRNA final os íntrons do transcrito primário foram removidos o que facilita muito a identificação dos éxons e íntrons de um gene Figura 1410 O alinhamento dos cDNA com a sua sequência genômica correspondente delineia claramente os éxons e portanto os íntrons são revelados como as regiões que se situam entre os éxons Na sequência de cDNA montada o ORF deve ser contínuo desde o códon de início até o códon de fim Portanto as sequências de cDNA podem auxiliar muito na identificação da matriz de leitura correta incluindo os códons de início e fim Evidência de cDNA completo é tida como a comprovação padrãoouro de que foi identificada a sequência de uma unidade de transcrição incluindo seus éxons e a sua localização no genoma Além das sequências do cDNA completas existem grandes conjuntos de dados de cDNA em relação aos quais apenas as extremidades 5 ou 3 ou ambas foram sequenciadas Essas leituras de sequências de cDNA curtas são denominadas etiquetas de sequências expressas EST As etiquetas de sequências expressas podem ser alinhadas com o DNA genômico e assim ser utilizadas para determinar as extremidades 5 e 3 dos transcritos em outras palavras para determinar os limites do transcrito conforme demonstrado na Figura 1410 FIGURA 1410 Alinhamento de DNA complementares cDNA totalmente sequenciados e de etiquetas de sequências expressas EST com DNA genômico As linhas tracejadas indicam as regiões de alinhamento em relação ao cDNA estas regiões são os éxons do gene Os pontos entre os segmentos de cDNA ou EST indicam regiões no DNA genômico que não estão alinhadas com as sequências de cDNA ou EST essas regiões são locais de íntrons Os números acima da linha do cDNA indicam as coordenadas das bases da sequência de cDNA em que a base 1 é a base mais próxima de 5 e a base 816 é a mais próxima de 3 do cDNA Em relação às EST apenas uma leitura de sequência curta é obtida a partir de cada extremidade 5 e 3 do cDNA correspondente Essas leituras de sequências estabelecem os limites da unidade de transcrição mas não são informativas a respeito da estrutura interna do transcrito exceto se as sequências EST cruzarem um íntron como é verdadeiro para a 3 EST ilustrada aqui Previsões dos sítios de ligação Conforme já discutido um gene consiste em um segmento de DNA que codifica um transcrito bem como em sinais reguladores que determinam quando onde e em que quantidade aquele transcrito é produzido Por sua vez esse transcrito apresenta os sinais necessários para determinar a sua recomposição em mRNA e a tradução desse mRNA em um polipeptídio Figura 1411 Atualmente existem programas de computador estatísticos de busca de genes os quais procuram por sequências previstas dos diversos sítios de ligação utilizados como promotores por sítios de início de transcrição sítios de splicing 3 e 5 e por códons de início de tradução no DNA genômico Essas previsões baseiamse em motifs consenso para as referidas sequências conhecidas mas não são perfeitas Uso de polipeptídios e similaridade de DNA Tendo em vista que os organismos apresentam ancestrais em comum eles também apresentam muitos genes com sequências similares em comum Portanto um gene provavelmente apresentará correlatos entre os genes isolados e sequenciados em outros organismos especialmente nos muito correlatos Os genes candidatos previstos pelas técnicas precedentes com frequência podem ser verificados por meio de sua comparação com todas as outras sequências de genes que já foram encontradas Uma sequência candidata é apresentada como uma sequência indagada às bases de dados públicas que contêm um registro de todas as sequências gênicas conhecidas Esse procedimento é denominado pesquisa BLAST Basic Local Alignment Search Tool A sequência pode ser apresentada como uma sequência de nucleotídios uma pesquisa BLASTn ou como uma sequência traduzida de aminoácidos BLASTp O computador realiza a varredura da base de dados e fornece uma lista parcial ou total de alvos iniciando com as correspondências mais próximas Se a sequência candidata se assemelhar de modo muito próximo àquela de um gene anteriormente identificado de outro organismo então essa semelhança proporciona uma forte indicação de que o gene candidato é o gene de fato Correspondências menos próximas também são úteis Por exemplo uma identidade de aminoácidos de apenas 35 mas em posições idênticas é um forte indicador de que duas proteínas apresentam uma estrutura tridimensional comum As pesquisas BLAST são utilizadas de muitos outros modos mas o objetivo sempre é saber mais a respeito de alguma sequência de interesse identificada Previsões com base na tendenciosidade de códons Lembre do Capítulo 9 que o código triplo para aminoácidos é degenerado ou seja a maior parte dos aminoácidos é codificada por dois ou mais códons ver Figura 95 Os códons múltiplos para um único aminoácido são denominados códons sinônimos Em uma determinada espécie nem todos os códons sinônimos para um aminoácido são utilizados com frequência igual Em vez disso determinados códons estão presentes muito mais frequentemente nos mRNA e portanto no DNA que os codifica Por exemplo em D melanogaster dos dois códons para cisteína UGC é utilizado em 73 das ocasiões enquanto UGU é utilizado em 27 das ocasiões Essa utilização é um diagnóstico de Drosophila uma vez que em outros organismos esse padrão de tendenciosidade de códons é razoavelmente diferente Acreditase que as tendenciosidades de códons ocorram em virtude da abundância relativa dos tRNA complementares a esses diversos códons em uma determinada espécie Se a utilização do códon de um ORF previsto corresponde ao padrão conhecido de utilização de códons daquela espécie então essa correspondência é uma evidência que ampara que o ORF proposto é genuíno FIGURA 1411 Transferência de informação eucariótica de um gene para uma cadeia polipeptídica Observe os sítios de ligação do DNA e RNA que estão conectados por complexos proteicos para iniciar os eventos de transcrição splicing e tradução Resumo Um resumo de como diferentes fontes de informação são combinadas para criar as melhores previsões possíveis do mRNA e dos genes está ilustrado na Figura 1412 Esses diferentes tipos de evidências são complementares e podem ter validação cruzada entre si Por exemplo a estrutura de um gene pode ser inferida a partir da evidência da similaridade da proteína dentro de uma região do DNA genômico ligado pelas EST 5 e 3 São possíveis previsões úteis até mesmo sem uma sequência de cDNA ou evidência de similaridade proteica Um programa de previsão de sítio de ligação pode propor um ORF hipotético e a tendenciosidade de códon adequado seria a evidência de suporte CONCEITOCHAVE As previsões da estrutura polipeptídica e do mRNA a partir da sequência do DNA genômico dependem da integração da informação da sequência de cDNA das previsões do sítio de ligação das similaridades de polipeptídios e da tendenciosidade de códons Consideraremos algumas das percepções de nossa primeira visão das estruturas genômicas em geral e de listas de partes globais de algumas espécies cujos genomas foram sequenciados Iniciaremos conosco mesmos O que podemos aprender ao observar o genoma humano por si próprio Em seguida veremos o que podemos aprender ao comparar nosso genoma com outros 144 FIGURA 1412 Os diferentes modos de evidenciar produtos gênicos cDNA EST correspondências similares de BLAST tendenciosidade de códons e concordância de motifs são integrados para realizar previsões sobre os genes Onde se observa que múltiplas classes de evidências estão associadas a uma sequência de DNA genômico em particular há maior confiança na probabilidade de que uma previsão gênica seja precisa Estrutura do genoma humano Ao descrever a estrutura geral do genoma humano primeiramente devemos confrontar sua estrutura repetida Uma fração considerável do genoma humano aproximadamente 45 é repetitiva Uma grande parte desse DNA repetitivo é composta por cópias de elementos de transposição De fato até mesmo no DNA de cópia única restante uma fração apresenta sequências que sugerem que elas podem ser descendentes de elementos de transposição antigos que agora são imóveis e acumularam mutações aleatórias causando a sua divergência na sequência em relação aos elementos de transposição ancestrais Portanto uma grande parte do genoma humano parece ser composta por caronas genéticos Apenas uma pequena parte do genoma humano codifica polipeptídios ou seja um pouco menos de 3 dele codifica éxons dos mRNA Os éxons são tipicamente pequenos aproximadamente 150 bases enquanto os íntrons são grandes muitos se estendendo a mais de 1000 bases e alguns se estendendo a mais de 100000 bases Os transcritos são compostos por uma média de 10 éxons embora muitos apresentem substancialmente mais Finalmente os íntrons podem ser submetidos a splicing do mesmo gene em locais variáveis Essa variação na localização dos sítios de splicing gera diversidade adicional considerável ao mRNA e à sequência polipeptídica Com base nos atuais dados de cDNA e EST no mínimo 60 dos genes humanos codificadores de proteínas provavelmente apresentam duas ou mais variantes de corte Em média existem diversas variantes de corte por gene Portanto o número de proteínas distintas codificadas pelo genoma humano é muito superior ao número de genes reconhecidos Não foi fácil definir o número de genes no genoma humano No rascunho inicial do genoma humano havia uma estimativa de 30000 a 40000 genes codificadores de proteínas Entretanto a complexa arquitetura desses genes e do genoma pode tornar a anotação difícil Algumas sequências registradas como genes realmente podem ser éxons de genes maiores Além disso existem mais de 19000 pseudogenes que são ORF ou ORF parciais que primeiramente podem parecer genes mas não são funcionais ou são inativos em virtude do modo de sua origem ou de mutações Os assim denominados pseudogenes processados são sequências de DNA que foram transcritas de modo reverso a partir do RNA e inseridas aleatoriamente no genoma Aproximadamente 90 dos pseudogenes humanos aparentam ser desse tipo Aproximadamente 900 pseudogenes parecem genes convencionais que adquiriram uma ou mais mutações que romperam ORF no decorrer da evolução Na medida em que os desafios na anotação foram superados o número estimado de genes no genoma humano diminuiu drasticamente Uma estimativa recente é que existam aproximadamente 21000 genes codificadores de proteínas A anotação do genoma humano progrediu na medida em que as sequências de cada cromossomo foram finalizadas uma a uma Essas sequências em seguida se tornaram a área de pesquisas na busca por genes candidatos Em exemplo de previsões de genes para um cromossomo do genoma humano está demonstrado na Figura 1413 As referidas previsões estão sendo continuamente revisadas na medida em que novos dados se tornam disponíveis O atual estado das previsões pode ser visualizado em diversos sites mais notavelmente nas bases de dados de DNA públicas nos EUA e na Europa ver Apêndice B Essas previsões são as melhores inferências atuais sobre os genes codificadores de proteínas presentes nas espécies sequenciadas e como tal são trabalhos em andamento Elementos funcionais não codificadores no genoma A discussão até agora focou exclusivamente nas regiões do genoma que codificam proteínas Essa ênfase ocorre mais em virtude da facilidade analítica do que da importância biológica Em virtude da simplicidade e da universalidade do código genético e da capacidade de sintetizar cDNA a partir de mRNA a detecção de ORF e éxons é muito mais fácil do que a detecção de sequências não codificadoras funcionais Conforme declarado anteriormente apenas 3 do genoma humano codificam éxons de mRNA e menos da metade dessas sequências de éxons pouco mais de 1 do DNA total do genoma codifica sequências proteicas Assim mais de 98 do nosso genoma não codifica proteínas Como identificamos outras partes funcionais do genoma Os íntrons e as sequências 5 e 3 não traduzidas são prontamente anotados por meio da análise de transcritos gênicos enquanto os promotores dos genes normalmente são identificados por meio de sua proximidade das unidades de transcrição e de sequências sinalizadoras no DNA Entretanto outras sequências reguladoras tais como acentuadores não são identificáveis por meio da mera inspeção de sequências de DNA e outras sequências que codificam diversos tipos de transcritos de RNA microRNA pequenos RNA de interferência longos RNA não codificadores requerem a detecção e a anotação de seus transcritos Embora muitos dos referidos elementos não codificadores tenham sido identificados no curso do estudo da genética molecular humana o potencialmente vasto número dos elementos recomenda uma abordagem mais sistemática O projeto Encyclopedia of DNA Elements ENCODE portanto foi lançado com o ambicioso objetivo de identificar todos os elementos funcionais do genoma humano Esse esforço cooperativo em grande escala empregou um arranjo diverso de técnicas para detectar sequências possivelmente envolvidas no controle da transcrição gênica bem como de todas as regiões transcritas Tendo em vista que se espera que tais sequências sejam ativas apenas em tipos celulares individuais ou subconjuntos de tipos celulares pesquisadores estudaram 147 tipos celulares humanos Ao procurar regiões que estivessem associadas à ligação de fatores de transcrição o projeto ENCODE estimou que existam aproximadamente 500000 possíveis acentuadores associados aos genes conhecidos O projeto também detectou transcritos que emanam de 80 do genoma humano FIGURA 1413 Foram identificados diversos genes no cromossomo humano 20 As coordenadas do mapa de recombinação e citogenético estão demonstradas nas linhas superiores da figura Diversos gráficos que ilustram a densidade gênica e as diferentes propriedades do DNA estão demonstrados nas seções intermediárias Os identificadores dos genes previstos estão demonstrados na parte inferior do painel Cortesia de Jim Kent Ewan Birney Darryl Leja e Francis Collins De acordo com o International Human Genome Sequencing Consortium Initial Sequencing and Analysis of the Human Genome Nature 409 2001 860921 Essa é uma fração muito maior do genoma do que era esperado Afinal conforme declarado anteriormente apenas um pouco mais de 1 do genoma é de sequências codificadoras Entretanto a produção de um transcrito não necessariamente significa que o transcrito contribui para a biologia humana É possível que alguma proporção desses transcritos represente ruídos na célula transcritos que não apresentam função biológica mas que também não prejudicam Não é sensato atribuir uma função a uma sequência sem algum tipo de dados adicionais Assim quais tipos de dados adicionais podem ser utilizados para resolver questões de função A conservação evolutiva de sequências comprovou ser um bom indicador da função biológica Sequências não serão conservadas ao longo do período evolutivo exceto se mutações que as alteram forem eliminadas por seleção natural Um modo de localizar elementos não codificadores potencialmente funcionais então é procurar por sequências conservadas que não foram alteradas ao longo de milhões de anos de evolução Por exemplo podese procurar sequências altamente conservadas de comprimento modesto entre algumas espécies ou sequências menos perfeitamente conservadas de maior comprimento entre um número maior de espécies Comparações dos genomas de seres humanos ratos e camundongos levaram à identificação dos assim denominados elementos ultraconservados sequências perfeitamente conservadas entre as três espécies Pesquisas nesses genomas identificaram mais de 5000 sequências de mais de 100 pb e 481 sequências de mais de 200 pb que são absolutamente conservadas Embora muitos desses elementos sejam observados em regiões pobres em genes eles são mais ricamente concentrados próximos a genes reguladores importantes para o desenvolvimento A maioria dos elementos não codificadores altamente conservados pode participar amplamente na regulação da expressão da toolkit genética para o desenvolvimento de mamíferos e outros vertebrados ver Capítulo 13 Como podemos verificar que os referidos elementos conservados desempenham um papel na regulação gênica Esses elementos podem ser testados do mesmo modo que os elementos reguladores de transcrição de ação cis examinados nos capítulos anteriores com a utilização de genes repórter ver Seção 122 Um pesquisador posiciona as regiões reguladoras candidatas adjacentes a um promotor e ao gene repórter e introduz o gene repórter em uma espécie hospedeira Um referido exemplo está demonstrado na Figura 1414 Um elemento que é altamente conservado entre mamíferos galinhas e uma espécie de rã está localizado a 488 kb da extremidade 3 do gene ISL1 humano que codifica uma proteína necessária para a diferenciação de neurônio motor Esse elemento foi posicionado upstream de um promotor e do gene repórter de βgalactosidade lacZ e o construto foi injetado em pronúcleos de ovócitos fertilizados de camundongos Em seguida observase se proteína repórter é expressa ao longo da medula espinal e na cabeça como seria esperado em relação à localização de futuros neurônios motores ver Figura 1414 Mais significativamente o padrão de expressão corresponde a parte do padrão de expressão do gene ISL1 nativo de camundongo presumidamente outros elementos não codificadores controlam as outras características da expressão de ISL1 O padrão de expressão sugere fortemente que o elemento conservado seja uma região reguladora do gene ISL1 em cada espécie Muitos milhares de elementos reguladores não codificadores humanos provavelmente serão identificados com base na conservação de sequência e na atividade desses elementos em ensaios de repórter FIGURA 1414 Um elemento regulador transcricional de ação cis é identificado em um elemento ultraconservado do genoma humano Um elemento ultraconservado que está localizado próximo do gene ISL1 humano foi acoplado a um gene repórter e injetado em ovócitos fertilizados de camundongo As regiões nas quais o gene é expresso estão coradas em azulescuro ou preto A O gene repórter é expresso na cabeça e na medula espinal de um camundongo transgênico conforme observado aqui no dia 115 de gestação Este padrão de expressão corresponde B ao padrão nativo de expressão do gene ISL1 de camundongos no dia 115 de gestação Este experimento demonstra como elementos não codificadores funcionais podem ser identificados por meio de genômica comparativa e testados em um organismomodelo De G Bejerono et al A Distal Enhancer and an Ultraconserved Exon Are Derived from a Novel Retroposon Nature 441 2006 8790 Fig 3 CONCEITOCHAVE Os elementos funcionais não codificadores do genoma são muito mais difíceis de identificar do que as sequências codificadoras e requerem uma combinação de evidências comparativas e experimentais para a validação 145 Genômica comparativa de seres humanos com outras espécies Fundamentalmente uma grande parte da ciência genômica envolve uma abordagem comparativa Por exemplo a maior parte do que sabemos a respeito da função das proteínas humanas é baseada na função de tais proteínas conforme analisadas em espéciesmodelo E muitas das questões que podem ser abordadas por meio da genômica são comparativas Por exemplo com frequência desejamos saber assim como no caso de Nicholas Volker como um indivíduo com um traço ou uma doença difere geneticamente daqueles sem eles A genômica comparativa também apresenta o potencial de revelar como as espécies divergem As espécies evoluem e os traços são modificados por meio de alterações na sequência de DNA O genoma portanto contém um registro da história evolutiva de uma espécie Comparações entre os genomas das espécies podem revelar eventos únicos de linhagens em particular que podem contribuir para as diferenças na fisiologia no comportamento ou na anatomia Os referidos eventos podem incluir por exemplo o ganho e a perda de genes individuais ou de grupos de genes Aqui exploraremos os princípioschave subjacentes à genômica comparativa e veremos alguns exemplos de como as comparações revelam o que é semelhante e diferente entre os seres humanos e outras espécies Na próxima seção examinaremos como as diferenças são identificadas entre seres humanos individuais Inferência filogenética A primeira etapa na comparação de genomas das espécies é decidir quais espécies devem ser comparadas Para que as comparações sejam informativas é crucial compreender as relações evolutivas entre as espécies a serem comparadas A história evolutiva de um grupo é denominada filogenia As filogenias são úteis por nos possibilitarem inferir como os genomas das espécies foram alterados ao longo do tempo A segunda etapa na comparação de genomas é a identificação dos genes relacionados de modo mais próximo denominados homólogos Os genes homólogos podem ser reconhecidos por meio de semelhanças em suas sequências de DNA e de aminoácidos das proteínas que codificam É importante distinguir aqui duas classes de genes homólogos Alguns homólogos são genes no mesmo locus genético em diferentes espécies Esses genes teriam sido herdados de um ancestral comum e são denominados ortólogos Entretanto muitos genes homólogos pertencem a famílias que foram expandidas e contraídas em número no período da evolução Esses genes homólogos estão em diferentes loci genéticos no mesmo organismo Eles tiveram origem quando genes em um genoma foram duplicados Os genes relacionados por meio de eventos de duplicação gênica em um genoma são denominados parálogos A história das famílias de genes pode ser razoavelmente reveladora a respeito da história evolutiva de um grupo Por exemplo suponha que desejamos saber como o genoma de mamíferos evoluiu ao longo da história do grupo Desejamos saber se os mamíferos como um grupo podem ter adquirido alguns genes únicos se mamíferos com diferentes estilos de vida podem possuir conjuntos diferentes de genes e qual foi o destino dos genes que existiam em ancestrais mamíferos Felizmente possuímos atualmente um conjunto grande e em expansão de sequências de genomas de mamíferos para comparar que incluem representantes dos três principais ramos dos mamíferos monotremados p ex ornitorrinco marsupiais p ex canguru gambá e eutérios p ex ser humano cão gato camundongo As relações entre esses grupos alguns membros dentro desses grupos e outros vertebrados amniotas amniotas são principalmente vertebrados terrestres que apresentam um ovo adaptado à vida terrestre estão demonstradas na Figura 1415 Para ilustrar a importância da compreensão das filogenias e como as utilizar consideramos o genoma do ornitorrinco Os monotremados diferem de outros mamíferos pois põem ovos A inspeção do genoma do ornitorrinco revelou que ele contém um gene para gema de ovo denominado vitelogenina Análises dos genomas de marsupiais e eutérios não revelaram tal gene funcional A presença de vitelogenina no ornitorrinco e sua ausência em outros mamíferos pode ser explicada de dois modos 1 a vitelogenina é uma invenção nova do ornitorrinco ou 2 a vitelogenina existia em um ancestral comum de monotremados marsupiais e eutérios mas foi subsequentemente perdida em marsupiais e eutérios O sentido da alteração evolutiva é oposto nessas duas alternativas Uma comparação pareada simples entre o ornitorrinco e outro mamífero não distingue entre essas alternativas Para tanto primeiramente devemos inferir se a vitelogenina provavelmente estava presente no último ancestral comum do ornitorrinco dos marsupiais e eutérios Realizamos essa inferência filogenética ao examinar se a vitelogenina é observada fora desse grupo inteiro de mamíferos que é denominado um grupo evolutivo externo De fato existem três genes de vitelogenina homólogos em galinha Em seguida consideramos a relação da galinha com os mamíferos As galinhas pertencem a outro ramo importante dos amniotas Observando a árvore evolutiva na Figura 1415 podemos explicar a presença de vitelogeninas em galinhas e no ornitorrinco como o resultado de duas aquisições independentes na linhagem do ornitorrinco e na linhagem da galinha respectivamente ou de apenas uma aquisição em um ancestral comum do ornitorrinco e da galinha que com base na árvore seria um ancestral comum de todos os amniotas seguida pela perda dos genes de vitelogenina em marsupiais e eutérios FIGURA 1415 Filogenia de mamíferos e outros amniotas vivos A árvore filogenética ilustra as relações evolutivas entre os três principais grupos de mamíferos monotremados marsupiais e eutérios e outros amniotas incluindo aves e diversos répteis Por meio do mapeamento da presença ou da ausência de genes em grupos particulares de filogenia conhecida podese inferir o sentido da alteração evolutiva ganho ou perda em linhagens particulares Como decidimos entre essas alternativas Ao estudar eventos infrequentes tais como a invenção de um gene biólogos evolutivos preferem confiar no princípio da parcimônia ou seja favorecer a explicação mais simples que envolve o menor número de alterações evolutivas Portanto a explicação preferida para o padrão da evolução da vitelogenina em mamíferos é que essa proteína da gema do ovo e o gene correspondente estavam presentes em algum ancestral amniota ovíparo e foram retidos no ornitorrinco ovíparo e perdidos em animais não ovíparos Como é o caso existe uma evidência adicional e muito persuasiva que ampara essa inferência Embora a inspeção dos genomas de eutérios não revele quaisquer genes da vitelogenina funcionais intactos existem traços de sequências do gene da vitelogenina nos genomas de seres humanos e cães na mesma posição sintênicos dos genes da vitelogenina do ornitorrinco e da galinha Figura 1416 Essas sequências são relíquias moleculares de nossos ancestrais ovíparos Na medida em que nossos ancestrais mamíferos se afastaram dos ovos com gemas a seleção natural foi relaxada nas sequências do gene da vitelogenina de tal modo que elas foram quase eliminadas por mutações ao longo de dezenas de milhões de anos Nosso genoma contém diversas relíquias de genes que chegaram a ser funcionais em nossos ancestrais e conforme veremos novamente nesta seção as identidades desses pseudogenes refletem como a biologia humana divergiu da de nossos ancestrais É claro que a evolução também diz respeito à aquisição de novos traços Por exemplo a produção de leite é um traço compartilhado entre todos os mamíferos Uma família de genes que codificam as proteínas caseína do leite é única dos mamíferos e está agrupada firmemente nos seus genomas incluindo o do ornitorrinco Apenas esse breve vislumbre de alguns poucos genomas de mamíferos nos informa que sim de fato alguns mamíferos apresentam genes que outros não apresentam alguns genes são compartilhados por todos os mamíferos e a presença ou a ausência de determinados genes está correlacionada com o estilo de vida dos mamíferos O último é um achado persuasivo na genômica comparativa FIGURA 1416 Sequências de genes ao longo do cromossomo 8 de galinha e do cromossomo 1 do ser humano e do ornitorrinco estão na mesma ordem relativa quadros Embora o genoma da galinha apresente três genes que codificam as proteínas da gema do ovo o ornitorrinco ovíparo apresenta um gene funcional e dois pseudogenes e os seres humanos apresentam remanescentes muito curtos e fragmentados dos genes da gema CONCEITOCHAVE A determinação de quais elementos genômicos foram adquiridos ou perdidos durante a evolução requer o conhecimento sobre a filogenia das espécies que estão sendo comparadas A presença ou a ausência de genes com frequência está correlacionada com os estilos de vida do organismo Vejamos mais alguns exemplos que iluminam a história evolutiva de nosso genoma e como somos diferentes de e semelhantes a outros mamíferos Camundongos e humanos A sequência do genoma de camundongo tem sido particularmente informativa para a compreensão do genoma humano em virtude do papel de longa data do camundongo como uma espéciemodelo genética do vasto conhecimento sobre a sua genética clássica e da relação evolutiva do camundongo com os seres humanos As linhagens humanas e de camundongos divergiram há aproximadamente 75 milhões de anos tempo suficiente para mutações causarem a diferenciação de seus genomas em média em aproximadamente um a cada dois nucleotídios Portanto as sequências comuns aos genomas de camundongos e humanos provavelmente indicam funções comuns Os homólogos são identificados em virtude de apresentarem sequências de DNA similares A análise do genoma de camundongo indica que o número de genes codificadores de proteínas que ele contém é semelhante ao do genoma humano A inspeção adicional dos genes de camundongo revela que no mínimo 99 de todos os genes de camundongo apresentam algum homólogo no genoma humano e que no mínimo 99 de todos os genes humanos apresentam algum homólogo no genoma de camundongo Portanto os tipos de proteínas codificadas em cada genoma são essencialmente os mesmos Além disso aproximadamente 80 de todos os genes de camundongo e humanos são ortólogos claramente identificáveis As semelhanças entre os genomas se estendem bem além do inventário dos genes codificadores de proteínas para a organização geral do genoma Mais de 90 dos genomas humano e de camundongo podem ser separados em regiões correspondentes de sintenia conservada nas quais a ordem dos genes dentro de blocos de tamanhos variados é a mesma da ordem no ancestral comum mais recente das duas espécies Essa sintenia é muito útil para relacionar os mapas dos dois genomas Por exemplo o cromossomo humano 17 é ortólogo de um único cromossomo de camundongo cromossomo 11 Embora tenha havido extensivos rearranjos intracromossômicos no cromossomo humano existem 23 segmentos de sequências colineares com tamanho superior a 100 kb Figura 1417 CONCEITOCHAVE Os genomas humano e de camundongo contêm conjuntos de genes semelhantes com frequência dispostos em ordem semelhante Existem algumas diferenças detectáveis entre os inventários dos genes de camundongo e humanos Em uma família de genes envolvidos na visão de cores as opsinas os seres humanos possuem um parálogo adicional A presença dessa opsina equipou os seres humanos com a assim denominada visão tricromática de modo que conseguimos perceber as cores ao longo de todo o espectro de luz visível violeta azul verde vermelho enquanto o camundongo não consegue Mas novamente a presença desse parálogo adicional em seres humanos e sua ausência em camundongos não nos informam isoladamente se ele foi adquirido na linhagem humana ou perdido na linhagem do camundongo A análise dos genomas de outros primatas e mamíferos revelou que os primatas do Velho Mundo tais como chimpanzés gorilas e o macaco colobo possuem esse gene mas em todos os mamíferos não primatas ele está ausente Podemos inferir com segurança a partir dessa distribuição filogenética do gene da opsina adicional que ele evoluiu em um ancestral dos primatas do Velho Mundo o que inclui os seres humanos FIGURA 1417 Sintenia entre o cromossomo 17 humano e o cromossomo 11 de camundongo Grandes blocos sintênicos conservados com o tamanho de 100 kb ou mais estão demonstrados no cromossomo 17 humano no cromossomo 11 de camundongo e no cromossomo inferido de seu último ancestral comum reconstruído por meio da análise de genomas de outros mamíferos Blocos diretos de sintenia estão demonstrados em roxo claro os blocos invertidos estão demonstrados em verde Os tamanhos dos cromossomos estão indicados em megabases Mb Dados de M C Zody et al DNA Sequence of Human Chromosome 17 and Analysis of Rearrangement in the Human Lineage Nature 440 2006 10451049 Fig 2 Por outro lado o genoma do camundongo contém mais cópias funcionais de alguns genes que refletem o seu estilo de vida Camundongos apresentam aproximadamente 1400 genes envolvidos no olfato essa é a maior categoria funcional única de genes em seu genoma Cães também apresentam uma grande quantidade de genes olfatórios Isso certamente faz sentido para os estilos de vida das espécies Camundongos e cães dependem fortemente do seu sentido de olfato e encontram odores diferentes daqueles notados por seres humanos E o conjunto de genes olfatórios humanos em comparação àquele de camundongos e cães é surpreendentemente inferior Apresentamos muitos genes olfatórios mas uma grande fração deles é de pseudogenes com mutações inativadoras Por exemplo em apenas uma classe de genes olfatórios denominados genes V1r camundongos apresentam aproximadamente 160 genes funcionais mas apenas cinco dos aproximadamente 200 genes V1r no genoma humano são funcionais Ainda assim essas diferenças no conteúdo gênico são relativamente modestas à luz das vastas diferenças na anatomia e no comportamento A semelhança geral nos genomas de camundongos e seres humanos corresponde ao quadro que obtemos a partir do exame da toolkit genética que controla o desenvolvimento em diferentes espécies ver Capítulo 13 que grandes diferenças podem evoluir de genomas que contêm conjuntos de genes semelhantes Esse mesmo tema é ilustrado pela comparação de nosso genoma com aquele de nosso parente vivo mais próximo o chimpanzé Genômica comparativa de chimpanzés e seres humanos Os chimpanzés e os seres humanos apresentaram um último ancestral comum há aproximadamente 5 a 6 milhões de anos Desde aquela época as diferenças genéticas foram acumuladas por mutações que ocorreram em cada linhagem O sequenciamento do genoma revelou que existem aproximadamente 35 milhões de diferenças de nucleotídios únicos entre chimpanzés e seres humanos correspondendo a um grau de divergência de aproximadamente 106 Além disso aproximadamente 5 milhões de inserções e deleções que variam em comprimento de apenas um único nucleotídio até mais de 15 kb contribuem para um total de aproximadamente 90 Mb de sequência de DNA divergente aproximadamente 3 do genoma total A maior parte dessas inserções ou deleções está localizada fora das regiões codificadoras Em geral as proteínas codificadas pelos genomas humano e de chimpanzé são extremamente semelhantes Vinte e nove por cento de todas as proteínas ortólogas são idênticas em sequência A maior parte das proteínas que diferem fazem isso por meio de apenas aproximadamente duas substituições de aminoácidos Existem algumas diferenças detectáveis entre os chimpanzés e os seres humanos nos conjuntos de genes funcionais Aproximadamente 80 genes que eram funcionais em seu ancestral comum deixaram de ser funcionais em seres humanos em virtude de sua deleção ou do acúmulo de mutações Algumas dessas alterações podem contribuir para diferenças na fisiologia Além das alterações em determinados genes duplicações de segmentos cromossômicos em uma única linhagem contribuíram para a divergência genômica Mais de 170 genes no genoma humano e mais de 90 genes no genoma de chimpanzé estão presentes em grandes segmentos duplicados Essas duplicações são responsáveis por uma fração maior da divergência genômica total do que todas as mutações de nucleotídio único combinadas Entretanto ainda não está claro se elas contribuem para diferenças fenotípicas importantes 146 É claro que todas as diferenças genéticas entre as espécies têm origem como variações dentro das espécies O sequenciamento do genoma humano e o advento de métodos de sequenciamento de alta produtividade mais rápidos e menos dispendiosos abriram as portas para a análise detalhada da variação genética humana Genômica comparativa e medicina de seres humanos A espécie humana Homo sapiens teve origem na África há aproximadamente 200000 anos Há cerca de 60000 anos populações deixaram a África e migraram por todo o mundo povoando os cinco continentes Essas populações migratórias encontraram diferentes climas adotaram dietas diferentes e combateram diferentes patógenos em diferentes partes do mundo Uma grande parte da história evolutiva recente da nossa espécie está registrada em nossos genomas assim como as diferenças genéticas que tornam os indivíduos ou as populações mais ou menos suscetíveis a doenças Em geral quaisquer dois genomas humanos não relacionados são 999 idênticos A diferença de apenas 01 corresponde a aproximadamente 3 milhões de bases Atualmente o desafio é decifrar quais daquelas diferenças de bases são significativas em relação à fisiologia ao desenvolvimento e à doença Após o avanço da sequência do primeiro genoma humano tal conquista abriu as portas para uma análise muito mais rápida e menos dispendiosa de outros indivíduos O motivo é que com uma montagem de genoma conhecida como uma referência é muito mais fácil alinhar as leituras de sequências brutas de indivíduos adicionais e desenhar abordagens para estudo e comparação de partes do genoma Uma das primeiras e maiores surpresas surgidas a partir da comparação de genomas humanos individuais é que os seres humanos diferem não meramente em uma base dentre um milhão mas também no número de cópias de partes de genes individuais genomas inteiros ou conjuntos de genes Essas variações no número de cópias CNV incluem repetições e duplicações que aumentam o número de cópias e deleções que reduzem o número de cópias Entre quaisquer dois indivíduos não relacionados pode haver 1000 ou mais segmentos de DNA de comprimento superior a 500 pb que diferem no número de cópias Algumas CNV podem ser razoavelmente grandes e abranger mais de 1 milhão de pares de bases Como tais números de cópias podem desempenhar um papel na evolução e nas doenças de seres humanos é de intenso interesse Um caso no qual um aumento do número de cópias aparenta ter sido adaptativo diz respeito à dieta Pessoas com dietas com alto teor de amido contêm em média mais cópias de um gene da amilase salivar uma enzima que fragmenta o amido do que pessoas com dietas tradicionalmente com baixo teor de amido Em outros casos variações no número de cópias foram associadas a síndromes como o autismo Exoma e genômica personalizada O QUE OS GENETICISTAS FAZEM ATUALMENTE Avanços nas tecnologias de sequenciamento reduziram o custo do sequenciamento de genomas individuais de aproximadamente US 300 milhões em 2000 para US 1 milhão em 2008 para aproximadamente US 5000 em 2013 Mas para muitos estudos em grande escala esse ainda é um valor proibitivo Para algumas aplicações é mais prático e de custo eficaz podendo ser tão informativo quanto sequenciar apenas uma parte do genoma Por exemplo tendo em vista que muitas mutações que causam doenças ocorrem em sequências codificadoras foram desenhadas estratégias para sequenciar todos os éxons ou o exoma de indivíduos assim como foi realizado no caso de Nicholas Volker A estratégia para o sequenciamento do exoma envolve a geração de uma biblioteca de DNA genômico que é enriquecida com sequências de éxons Figura 1418 O DNA é preparado por meio de 1 fragmentação do DNA genômico em segmentos unifilamentares curtos 2 hibridização dos segmentos unifilamentares com sondas marcadas com biotina complementares às regiões dos éxons e purificação dos duplexes marcados com biotina 3 amplificação dos duplexes ricos em éxons e 4 sequenciamento dos duplexes ricos em éxons Desse modo 30 a 60 megabases do genoma humano são alvo para o sequenciamento contrariamente às 3200 megabases da sequência total Até o final de 2013 os exomas de mais de 100000 indivíduos haviam sido sequenciados no custo atual de apenas aproximadamente US 500 por exoma Um poder do sequenciamento do exoma particularmente importante é a identificação das mutações de novo mutações que não estão presentes em seus genitores nos indivíduos As referidas mutações são responsáveis por muitas doenças genéticas de aparecimento espontâneo cujas origens não seriam reveladas por meio de estudos tradicionais com base no heredograma Como tal o sequenciamento do exoma inteiro atualmente é uma ferramenta diagnóstica clínica em rápida difusão E assim como o sequenciamento do exoma pode ser utilizado para identificar diferenças genéticas entre os indivíduos ele também pode ser utilizado para identificar diferenças entre células normais e anormais tais como células cancerosas O câncer é um grupo de doenças genéticas nas quais combinações de mutações de genes contribuem tipicamente para a perda do controle do crescimento e metástase Compreender quais alterações genéticas são comuns a cânceres em particular ou a subconjuntos de cânceres não apenas aumentará a nossa compreensão sobre o câncer mas também promete impactar o diagnóstico e o tratamento de modo poderoso Pesquisadores em todo o mundo estão colaborando para criar um atlas de genomas de cânceres que compile nosso conhecimento em expansão sobre as mutações genéticas associadas a muitos cânceres ver httpcancergenomenihgov para mais informações A capacidade de analisar rapidamente os genomas dos organismos também está impactando outras dimensões da medicina Veremos um caso em seguida Genômica comparativa de E coli não patogênica e patogênica A Escherichia coli é encontrada em nossas bocas e em nossos tratos intestinais em grande número e essa espécie em geral é um simbionte benigno Em virtude de seu papel central nas pesquisas genéticas ela foi um dos primeiros genomas bacterianos sequenciados O genoma de E coli apresenta o tamanho de aproximadamente 46 Mb e contém 4405 genes Entretanto realmente não é acurado denominálo o genoma de E coli O primeiro genoma sequenciado foi derivado da linhagem de E coli comum de laboratório K12 Existem muitas outras linhagens de E coli incluindo diversas importantes para a saúde humana FIGURA 1418 Com a finalidade de sequenciar apenas a fração exônica do genoma o DNA genômico é fragmentado e desnaturado e os fragmentos que contêm éxons são hibridizados com sondas marcadas com biotina Os duplexes que contêm as sondas pareadas em seguida são purificados e preparados para o sequenciamento Em 1982 um surto de uma doença humana em diversos estados dos EUA foi relacionado ao consumo de carne moída malcozida A linhagem de E coli O157H7 foi identificada como a responsável e desde então tem sido associada a uma diversidade de surtos de infecção em grande escala De fato existe uma estimativa de 75000 casos de infecção por E coli anualmente nos EUA Embora quase todas as pessoas se recuperem da infecção uma fração desenvolve síndrome hemolíticourêmica uma doença renal de risco potencial à vida Para compreender as bases genéticas da patogenicidade o genoma de uma linhagem O157H7 de E coli foi sequenciado As linhagens O157 e K12 apresentam um arcabouço de 3574 genes codificadores de proteínas em comum e a identidade média dos nucleotídios entre os genes ortólogos é de 984 comparável àquela dos ortólogos de seres humanos e chimpanzés Aproximadamente 25 dos ortólogos de E coli codificam proteínas idênticas semelhantes aos 29 de ortólogos de seres humanos e chimpanzés Apesar das semelhanças em muitas proteínas os genomas e os proteomas diferem enormemente no conteúdo O genoma de E coli O157 codifica 5416 genes enquanto o genoma de E coli K12 codifica 4405 genes O genoma de E coli O157 contém 1387 genes que não são observados no genoma de K12 e o genoma de K12 contém 528 genes não observados no genoma de O157 A comparação dos mapas genômicos revela que os arcabouços comuns às duas linhagens estão entremeados com ilhas de genes específicos de K12 ou O157 Figura 1419 Entre os 1387 genes específicos de E coli O157 estão muitos genes que se suspeita codificarem fatores de virulência incluindo toxinas proteínas de invasão celular proteínas de adesão e sistemas de secreção de toxinas bem como possíveis genes metabólicos que podem ser necessários para o transporte de nutrientes a resistência a antibióticos e outras atividades que podem conferir a capacidade de sobreviver em diferentes hospedeiros A maior parte desses genes não era conhecida antes do sequenciamento e não seria conhecida atualmente se os pesquisadores tivessem confiado apenas na E coli K12 como um guia para todas as E coli O surpreendente nível de diversidade entre dois membros da mesma espécie demonstra quão dinâmica a evolução do genoma pode ser Acreditase que a maior parte dos novos genes em linhagens de E coli tenha sido introduzida por meio da transferência horizontal de genomas de vírus e outras bactérias ver Capítulo 5 As diferenças também podem surgir por deleção gênica Outras E coli patogênicas e espécies bacterianas também exibem muitas diferenças no 147 conteúdo gênico de suas primas não patogênicas A identificação dos genes que podem contribuir diretamente para a patogenicidade abre novos caminhos para compreensão prevenção e tratamento de doenças infecciosas Genômica funcional e genética reversa Geneticistas têm estudado a expressão e as interações de produtos gênicos individuais durante as últimas décadas Com o advento da genômica temos uma oportunidade de expandir esses estudos até um nível global por meio da utilização de abordagens de genoma total para estudar a maior parte dos ou todos os produtos gênicos de modo sistemático e simultâneo e em espécies que não são modelos experimentais previamente estabelecidos Essa abordagem global para o estudo da função da expressão e da interação dos produtos gênicos é denominada genômica funcional FIGURA 1419 Os mapas genômicos circulares das linhagens de E coli K12 e O157H7 O círculo ilustra a distribuição de sequências específicas de cada linhagem O arcabouço colinear comum a ambas as linhagens está demonstrado em azul As posições de sequências específicas de O157H7 estão demonstradas em vermelho As posições das sequências específicas de K12 estão demonstradas em verde As posições das sequências específicas de O157H7 e K12 no mesmo local estão demonstradas em marrom As sequências hipervariáveis estão demonstradas em roxo Dados de N T Perna et al Genome Sequence of Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157H7 Nature 409 2001 529533 Cortesia de Guy Plunkett III e Frederick Blattner Omas Além do genoma outros conjuntos de dados globais são de interesse Seguindo o exemplo do termo genoma em relação ao qual gene mais oma se torna uma palavra para todos os genes pesquisadores da genômica cunharam uma diversidade de termos para descrever outros conjuntos de dados globais com os quais estão trabalhando Essa lista de omas inclui O transcriptoma Sequências e padrões de expressão de todos os transcritos de RNA quais tipos onde nos tecidos quando quanto O proteoma Sequências e padrões de expressão de todas as proteínas onde quando quanto O interatoma Conjunto completo de interações físicas de proteínas e segmentos de DNA de proteínas e segmentos de RNA e entre proteínas Não consideraremos todos esses omas nesta seção mas enfocaremos algumas das técnicas globais que estão começando a ser exploradas para obter esses conjuntos de dados Utilização de microarranjos de DNA para estudar o transcriptoma Suponha que desejamos responder à questão que genes são ativos em uma célula em particular sob determinadas condições Essas condições podem ser um ou mais estágios no desenvolvimento ou podem ser a presença ou a ausência de um patógeno ou de um hormônio Os genes ativos são transcritos em RNA e assim o conjunto de transcritos de RNA presentes na célula pode nos informar quais genes estão ativos Aqui é onde a nova tecnologia de chips de DNA utilizada para analisar transcritos de DNA é tão poderosa Os chips de DNA são amostras de DNA dispostas como uma série de manchas microscópicas ligadas a um chip de vidro do tamanho de uma lamínula de microscópio O conjunto de DNA assim demonstrado é denominado microarranjo Um tipo de microarranjo típico contém oligonucleotídios sintéticos curtos que representam a maior parte dos genes ou todos em um genoma Figura 1420 Os microarranjos de DNA têm enriquecido a genética molecular ao possibilitar a análise de transcritos de RNA para todos os genes simultaneamente em um único experimento Vejamos como atua esse processo em mais detalhes Microarranjos podem detectar diferenças na expressão gênica FIGURA 1420 As principais etapas em uma análise com microarranjo são 1 extração do mRNA de células ou tecidos 2 síntese de sondas de cDNA marcadas com corante fluorescente 3 hibridização com o microarranjo 4 detecção do sinal fluorescente de sondas hibridizadas e 5 análise da imagem para identificar os níveis relativos da sonda hibridizada Os níveis relativos revelam os genes cuja expressão está aumentada ou diminuída sob as condições analisadas Os microarranjos são expostos a sondas de cDNA por exemplo um conjunto de sondas utilizadas como controle e um conjunto de sondas representando uma condição específica O conjunto utilizado como um controle pode ser produzido a partir do conjunto total de moléculas de RNA extraídas de um tipo celular em particular cultivado sob condições típicas O segundo conjunto de sondas pode ser produzido a partir do RNA extraído de células cultivadas em alguma condição experimental Marcações fluorescentes são ligadas às sondas e as sondas são hibridizadas com o microarranjo A ligação relativa das moléculas da sonda com o microarranjo é automaticamente monitorada com a utilização de um microscópio iluminado com feixe de laser Desse modo são identificados os genes cujos níveis de expressão estão aumentados ou diminuídos sob a determinada condição experimental De modo semelhante os genes que estão ativos em um determinado tipo celular ou em um determinado estágio do desenvolvimento podem ser identificados Com a compreensão sobre quais genes estão ativos ou inativos em um determinado estágio do desenvolvimento em um tipo celular em particular ou em diversas condições ambientais os conjuntos de genes que podem responder a sinais reguladores semelhantes podem ser identificados Além disso os perfis de expressão gênica podem pintar um quadro das diferenças entre as células normais e doentes Ao identificar os genes cuja expressão é alterada por mutações em células cancerosas ou por um patógeno os pesquisadores podem planejar novas estratégias terapêuticas Utilização do teste dihíbrido para estudar o interatoma proteínaproteína Uma das atividades mais importantes das proteínas é sua interação com outras proteínas Em virtude do grande número de proteínas em qualquer célula biólogos buscam modos para estudar sistematicamente todas as interações de proteínas individuais em uma célula Um dos modos mais comuns de estudar o interatoma utiliza um sistema criado em células de levedura denominado teste di híbrido que detecta interações físicas entre duas proteínas A base do teste é o ativador transcricional codificado pelo gene GAL4 de levedura ver Capítulo 12 Lembre que essa proteína apresenta dois domínios 1 um domínio de ligação ao DNA que se liga ao sítio de início de transcrição e 2 um domínio de ativação que ativará a transcrição mas que por si próprio não consegue se ligar ao DNA Portanto os dois domínios devem estar próximos para que ocorra a ativação da transcrição Suponha que você está investigando se duas proteínas interagem A estratégia do sistema dihíbrido é separar os dois domínios do ativador codificado por GAL4 tornando a ativação de um gene repórter impossível Cada domínio é conectado a uma proteína diferente Se as duas proteínas interagem elas unirão os dois domínios O ativador se tornará ativo e iniciará a transcrição do gene repórter Como esse esquema é implementado na prática O gene GAL4 é dividido entre dois plasmídios de modo que um plasmídio contém a parte que codifica o domínio de ligação ao DNA e o outro plasmídio contém a parte que codifica o domínio de ativação Em um plasmídio um gene para uma proteína em investigação é recomposto próximo ao domínio de ligação ao DNA e essa proteína de fusão atua como uma isca No outro plasmídio um gene para outra proteína em investigação é recomposto próximo ao domínio de ativação e dizse que essa proteína de fusão é o alvo Figura 1421 Os dois plasmídios híbridos em seguida são introduzidos na mesma célula de levedura talvez por meio do cruzamento de células haploides que contêm a isca e os plasmídiosalvo A etapa final é procurar pela ativação da transcrição por um construto de gene repórter regulado por GAL4 que seria a comprovação de que aquela isca e o alvo ligaramse O sistema dihíbrido pode ser automatizado para possibilitar a busca por interações proteicas em todo o proteoma Estudo do interatoma proteínaDNA com a utilização de análise de imunoprecipitação de cromatina ChIP A ligação sequênciaespecífica de proteínas ao DNA é crítica para a expressão gênica correta Por exemplo proteínas reguladoras se ligam a promotores e ativam ou reprimem a transcrição tanto em bactérias quanto em eucariotos ver Capítulos 11 12 e 13 No caso dos eucariotos os cromossomos estão organizados em cromatina na qual a unidade fundamental o nucleossomo contém DNA enrolado ao redor de histonas A modificação póstradução das histonas com frequência dita quais proteínas se ligam e onde ver Capítulo 12 Foi desenvolvida uma diversidade de tecnologias que possibilitam que os pesquisadores isolem regiões específicas da cromatina de modo que o DNA e suas proteínas correlatas possam ser analisados em conjunto O método mais amplamente utilizado é denominado ChIP em referência a imunoprecipitação da cromatina e a sua aplicação está descrita a seguir Figura 1422 FIGURA 1421 O sistema utiliza a ligação de duas proteínas uma proteína isca e uma proteína alvo para restaurar a função da proteína Gal4 que ativa um gene repórter Cam Trp e Leu são componentes dos sistemas de seleção para a movimentação dos plasmídios entre as células O gene repórter é lacZ que está localizado em um cromossomo de levedura em azul Digamos que você isolou um gene de levedura e suspeita que ele codifique uma proteína que se liga ao DNA quando a levedura é cultivada em alta temperatura Você deseja saber se essa proteína se liga ao DNA e caso afirmativo a qual sequência na levedura Um modo de abordar essa questão é primeiramente tratar as células de levedura que foram cultivadas em alta temperatura com uma substância química que realizará a ligação cruzada das proteínas com o DNA Desse modo as proteínas ligadas ao DNA na ocasião do isolamento da cromatina permanecerão ligadas durante os tratamentos subsequentes A próxima etapa é quebrar a cromatina em pequenos pedaços Para separar o fragmento que contém seu complexo proteínaDNA de outros você utiliza um anticorpo que reage especificamente com a proteína codificada Você adiciona seu anticorpo à mistura de modo a formar um complexo imune que pode ser purificado O DNA ligado ao complexo imune pode ser analisado após a reversão da ligação cruzada O DNA ligado à proteína pode ser sequenciado diretamente ou amplificado em muitas cópias por meio de PCR para preparar para o sequenciamento do DNA Conforme você viu no Capítulo 12 as proteínas reguladoras com frequência ativam a transcrição de muitos genes simultaneamente por meio da ligação a diversas regiões promotoras Uma variação do procedimento de ChIP denominada ChIPchip foi planejada para identificar múltiplos sítios de ligação em um genoma sequenciado As proteínas que se ligam a muitas regiões genômicas são imunoprecipitadas conforme descrito anteriormente Em seguida após a reversão da ligação cruzada os fragmentos de DNA são marcados e utilizados como sondas em chips de microarranjo que contêm a sequência genômica inteira da espécie em estudo Genética reversa Os tipos de dados obtidos a partir de experimentos de microarranjos e triagens de interação proteica são sugestivos de interações no genoma e no proteoma mas não possibilitam que sejam obtidas conclusões firmes a respeito das funções dos genes e das interações in vivo Por exemplo a descoberta de que a expressão de determinados genes é perdida em alguns cânceres não é uma comprovação de causa e efeito O padrãoouro para o estabelecimento da função de um gene ou de um elemento genético é romper a sua função e compreender os fenótipos em condições nativas Com início a partir das sequências gênicas disponíveis pesquisadores atualmente podem utilizar uma diversidade de métodos para romper a função de um gene específico Esses métodos são denominados genética reversa A análise por genética reversa tem início com uma molécula conhecida uma sequência de DNA um mRNA ou uma proteína e em seguida realizamse tentativas para romper essa molécula para avaliar a função do produto gênico normal na biologia do organismo FIGURA 1422 ChIP é uma técnica para o isolamento do DNA e suas proteínas correlatas em uma região específica da cromatina de modo que ambos possam ser analisados em conjunto Existem diversas abordagens para a genética reversa e novas tecnologias estão sendo constantemente desenvolvidas e refinadas Uma abordagem é introduzir mutações aleatórias no genoma mas em seguida enfocar o gene de interesse por meio da identificação molecular de mutações no gene Uma segunda abordagem é conduzir uma mutagênese direcionada que produza mutações diretamente no gene de interesse Uma terceira abordagem é criar fenocópias efeitos comparáveis a fenótipos mutantes normalmente por meio de tratamento com agentes que interfiram com o transcrito de mRNA do gene Cada abordagem tem suas vantagens A mutagênese aleatória está bem estabelecida mas requer que todas as mutações sejam peneiradas para encontrar aquelas que incluem o gene de interesse A mutagênese direcionada também pode ser de trabalho intenso mas após a obtenção da mutaçãoalvo sua caracterização é mais direta A criação de fenocópias pode ser muito eficiente especialmente como bibliotecas de ferramentas que foram desenvolvidas para espéciesmodelo em particular Consideraremos exemplos de cada uma dessas abordagens Genética reversa por meio de mutagênese aleatória A mutagênese aleatória para genética reversa emprega os mesmos tipos de mutágenos gerais que são utilizados para a genética direta agentes químicos radiação ou elementos genéticos de transposição ver Capítulo 5 Entretanto em vez de triar o genoma como um todo à procura de mutações que exerçam um efeito fenotípico em particular a genética reversa enfoca o gene em questão o que pode ser realizado por um de dois modos gerais Uma abordagem é enfocar a localização do gene no mapa Apenas mutações que se encontram na região do genoma na qual o gene está localizado são retidas para a análise molecular detalhada adicional Portanto nessa abordagem as mutações recuperadas devem ser mapeadas Um modo direto é cruzar um novo mutante com um mutante que contenha uma deleção ou mutação conhecida do gene de interesse Simbolicamente o pareamento é mutante novomutante conhecido Apenas os pareamentos que resultam em progênie com um fenótipo mutante que demonstram ausência de complementação são salvos para estudo Em outra abordagem o gene de interesse é identificado no genoma mutagenizado e verificado em relação à presença de mutações Por exemplo se o mutágeno causa pequenas deleções então após a amplificação por PCR dos fragmentos gênicos os genes dos genomas parental e mutagenizado podem ser comparados na busca por um genoma mutagenizado no qual o gene de interesse seja de tamanho reduzido De modo semelhante inserções de elementos de transposição no gene de interesse podem ser prontamente detectadas em virtude do aumento de seu tamanho Com a capacidade de sequenciar genomas inteiros de espéciesmodelo rapidamente e com custo relativamente baixo podese também buscar por substituições de um só par de bases Desses modos um conjunto de genomas que contém mutações aleatórias pode ser efetivamente triado para identificar a pequena fração de mutações que são de interesse para o pesquisador Genética reversa por mutagênese direcionada Durante a maior parte do século 20 pesquisadores consideraram a possibilidade de direcionar mutações para um gene específico como o santo graal inatingível da genética Entretanto atualmente diversas das técnicas estão disponíveis Após a inativação de um gene em um indivíduo os geneticistas podem avaliar o fenótipo exibido em busca de pistas da função do gene Embora as ferramentas para as mutações gênicas direcionadas tenham sido desenvolvidas pela primeira vez com a utilização de técnicas para organismosmodelo novas tecnologias estão possibilitando a ruptura e a manipulação de genes em espécies não modelo A mutagênese de gene específico normalmente requer a substituição de uma cópia do tipo selvagem residente de todo um gene por uma versão mutada desse gene O gene mutado é inserido no cromossomo por meio de um mecanismo que se assemelha à recombinação homóloga substituindo a sequência normal pela mutante Figura 1423 Essa abordagem pode ser utilizada para o nocaute de um genealvo no qual um alelo nulo substitui a cópia do tipo selvagem Algumas técnicas são tão eficientes que em E coli e S cerevisiae por exemplo foi possível produzir mutações em todos os genes do genoma para tentar determinar sua função biológica CONCEITOCHAVE A mutagênese direcionada é o meio mais preciso para obter mutações em um gene específico e atualmente pode ser praticada em uma diversidade de sistemasmodelo incluindo camundongos e moscas Genética reversa por meio da criação de fenocópias A vantagem da inativação de um gene é que as mutações serão transmitidas de uma geração para a próxima e assim após sua obtenção uma linhagem de mutantes estará sempre disponível para futuros estudos Por outro lado a criação de fenocópias pode ser aplicada a muitos organismos independentemente de quão desenvolvida é a tecnologia genética para uma determinada espécie Uma das descobertas mais animadoras da última década foi a de um mecanismo difundido cuja função natural aparenta ser proteger a célula de um DNA exógeno Esse mecanismo é denominado RNA de interferência RNAi descrito no Capítulo 8 Pesquisadores tiraram vantagem desse mecanismo celular a fim de desenvolver um método poderoso para inativar genes específicos A inativação é conquistada como segue Um RNA bifilamentar é produzido com sequências homólogas à parte do gene em estudo e é introduzido em uma célula Figura 1424 Em seguida o complexo de silenciamento induzido pelo RNA ou RISC degrada o mRNA nativo que é complementar ao RNA bifilamentar O resultado é uma redução completa ou considerável dos níveis de mRNA que dura horas ou dias anulando assim a expressão daquele gene A técnica tem sido amplamente aplicada em sistemasmodelo tais como C elegans Drosophila peixezebra e diversas espécies de plantas FIGURA 1423 Evento molecular básico na substituição gênica direcionada Um transgene que contém sequências de duas extremidades de um gene mas com um segmento de DNA selecionável no meio é introduzido em uma célula A dupla recombinação entre o transgene e um gene cromossômico normal produz um gene cromossômico recombinante que incorporou o segmento anormal Mas o que torna o RNAi especialmente poderoso é que ele pode ser aplicado a organismos não modelo Primeiramente os genesalvo de interesse podem ser identificados por meio de genômica comparativa Em seguida são produzidas sequências de RNAi para promover a inibição de genesalvo específicos Essa técnica tem sido aplicada por exemplo para um mosquito de transmite malária Anopheles gambiae Com a utilização dessas técnicas os cientistas conseguem compreender melhor os mecanismos biológicos relacionados com o efeito clínico ou econômico da referida espécie Os genes que controlam o complicado ciclo de vida do parasita da malária parcialmente no mosquito hospedeiro e parcialmente no corpo humano podem ser mais bemcompreendidos revelando novos modos de controlar a doença infecciosa mais comum no mundo CONCEITOCHAVE Os métodos baseados em RNAi proporcionam modos gerais de interferir experimentalmente com a função de um gene específico sem alterar a sua sequência de DNA em geral denominado fenocópia Genômica funcional com organismos não modelo Uma grande parte de nossa consideração da dissecção mutacional e da criação de fenocópias enfocou em organismosmodelo genéticos Um atual foco de muitos geneticistas é a aplicação mais ampla dessas técnicas incluindo para espécies que apresentam efeitos negativos sobre a sociedade humana tais como parasitas transmissores de doenças ou pragas agrícolas As técnicas genéticas clássicas não são prontamente aplicáveis para maior parte dessas espécies mas os papéis de genes específicos podem ser avaliados por meio da inserção de transgenes e da criação de fenocópias A inserção de transgenes em um besouro está demonstrada na Figura 1425 Besouros transgênicos podem ser produzidos por meio da utilização de metodologia semelhante àquela utilizada para produzir Drosophila transgênica ver Capítulo 10 Entretanto é necessário algum modo para identificar a transgênese de sucesso Portanto a técnica depende da utilização de um gene repórter que possa ser expresso em um receptor do tipo selvagem A proteína fluorescente verde GFP originalmente isolada a partir de águaviva é um repórter útil para essa aplicação Assim como em Drosophila os transgenes são inseridos como partes de transpósons e um plasmídio auxiliar que codifica uma transposase facilita a inserção do transpóson que contém o transgene A Figura 1425 demonstra a utilização de transgenes GFP direcionados por um elemento acentuador que orienta a expressão no olho do inseto Esse método também foi utilizado efetivamente para criar transgenes que expressam GFP em espécies de mosquito que transmitem a febre amarela e a dengue Aedes aegypti em um besouro da farinha Tribolium castaneum e no bichodaseda Bombyx mori Figura 1426 Com frequência o transgene GFP é utilizado simplesmente como um marcador genético para experimentos nos quais o construto de RNAi ou outro transgene é coinserido com a finalidade de manipular a função gênica FIGURA 1424 Três modos para criar e introduzir um RNA bifilamentar dsRNA em uma célula O dsRNA em seguida estimulará a RNAi degradando sequências que correspondem àquelas no dsRNA FIGURA 1425 Criação de besouros transgênicos que expressam uma proteína fluorescente verde TIR Repetição invertida terminal FIGURA 1426 Exemplos de uma proteína repórter fluorescente verde transgênica expressa nos olhos de alguns insetos não modelo A expressão é ativada a partir de um único promotor ativo nos olhos Os insetos são o mosquito Aedes aegypti parte superior e o bichodaseda Bombyx mori parte inferior Parte superior AP PhotoJacquelyn Martin parte inferior Marek Jindra RESUMO A análise genômica adota as abordagens da análise genética e as aplica à coleção de conjuntos de dados globais para conquistar objetivos tais como o mapeamento e o sequenciamento de genomas inteiros e a caracterização de todos os transcritos e de todas as proteínas As técnicas genômicas requerem o rápido processamento de grandes conjuntos de material experimental todas dependentes de extensiva automação O problemachave na compilação de uma sequência precisa de um genoma é obter leituras de sequências curtas e relacionálas entre si por meio da identidade de sequência para construir uma sequência de consenso de um genoma inteiro Isso pode ser realizado diretamente em relação aos genomas bacterianos ou de ancestrais por meio do alinhamento de sequências sobrepostas de diferentes leituras de sequência para compilar o genoma inteiro tendo em vista que existem poucos segmentos de DNA ou nenhum presentes em mais de uma cópia nos referidos organismos O problema é que os genomas complexos de plantas e animais estão repletos de tais sequências repetitivas Essas sequências repetitivas interferem com a produção de sequências contigs precisas O problema é resolvido pelo sequenciamento shotgun de genoma inteiro WGS com a utilização de leituras de pontas pareadas A apresentação de um mapa de sequência genômica fornece o texto criptografado e bruto do genoma O papel da bioinformática é interpretar essa informação criptografada Para a análise dos produtos gênicos são utilizadas técnicas de informática para identificar ORF e RNA não codificadores em seguida integrar esses resultados com as evidências experimentais disponíveis para estruturas transcritas sequências de cDNA semelhanças proteicas e conhecimento de motifs de sequências características Um dos meios mais poderosos para o avanço da análise e da anotação dos genomas é por meio da comparação dos genomas de espécies relacionadas A conservação de sequências entre espécies é um guia confiável para a identificação de sequências funcionais nos genomas complexos de muitos animais e plantas A genômica comparativa também pode revelar como os genomas foram alterados no curso da evolução e como essas alterações podem estar relacionadas com diferenças na fisiologia na anatomia ou no comportamento das espécies As comparações dos genomas humanos estão acelerando a descoberta de mutações de doenças raras Na genômica bacteriana comparações de linhagens patogênicas e não patogênicas revelaram muitas diferenças no conteúdo gênico que podem contribuir para a patogenicidade A genômica funcional tenta compreender o funcionamento do genoma como um todo Dois elementoschave são o transcriptoma o conjunto de todos os transcriptos produzidos e o interatoma o conjunto de produtos gênicos que interagem e outras moléculas que em conjunto possibilitam que uma célula seja produzida e funcione A função dos genes individuais e dos produtos gênicos em relação aos quais mutações clássicas não se encontram disponíveis pode ser testada por meio de genética reversa por mutação direcionada ou criação de fenocópias TERMOSCHAVE anotação arcabouço biblioteca de DNA molde biblioteca genômica bioinformática ChIP análise de imunoprecipitação da cromatina etiqueta de sequência expressa EST exoma filogenia genética reversa genômica genômica comparativa genômica funcional grupo evolutivo externo homólogo inferência filogenética leitura de pontas pareadas matriz de leitura aberta ORF microarranjo montagem de sequência ortólogo parálogo parcimônia pirossequenciamento projeto genoma proteoma pseudogene pseudogene processado RNA de interferência RNAi sequência consenso sequência contig sequenciamento de RNA sintenia supercontig teste dihíbrido variação no número de cópias CNV vetor PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 Você deseja estudar o desenvolvimento do sistema olfatório de recepção de cheiro em camundongo Você sabe que as células que detectam odores químicos específicos odorantes estão localizadas no revestimento das passagens nasais de camundongo Descreva algumas abordagens para a utilização da genética reversa para estudar a olfação Solução Existem muitas abordagens que podem ser imaginadas Em relação à genética reversa você deseja identificar genes candidatos que são expressos no 1 2 3 4 5 revestimento das passagens nasais Em virtude das técnicas da genômica funcional essa identificação pode ser conquistada por meio da purificação do RNA a partir de células de revestimento da passagem nasal isoladas e da utilização desse RNA como uma sonda de chips de DNA que contém sequências que correspondem a todos os mRNA conhecidos em camundongo Por exemplo você pode optar por primeiramente examinar os mRNA que estão expressos no revestimento da passagem nasal mas em nenhum outro local em camundongo como candidatos importantes para um papel específico na olfação Muitas das moléculas importantes também podem apresentar outros papéis em outros locais no corpo mas você precisa começar em algum ponto Alternativamente você pode optar por iniciar com aqueles genes cujos produtos proteicos são proteínas candidatas à ligação dos próprios odorantes Independentemente da sua escolha a próxima etapa seria construir um nocaute direcionado do gene que codifica cada mRNA ou proteína de interesse ou utilizar RNA de interferência para tentar obter fenocópia do fenótipo de perda de função de cada um dos genes candidatos PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Com base na Figura 142 por que os fragmentos de DNA sequenciados devem estar sobrepostos para obter uma sequência genômica O preenchimento dos intervalos no rascunho de sequências genômicas é um desafio importante Com base na Figura 146 as leituras de pontas pareadas de uma biblioteca de fragmentos de 2 kb podem preencher um intervalo de 10 kb Na Figura 149 como as posições dos códons são determinadas Na Figura 1410 etiquetas de sequências expressas EST estão alinhadas com a sequência genômica Como as EST são úteis na anotação do genoma Na Figura 1410 sequências de cDNA estão alinhadas com a sequência genômica Como as sequências de cDNA são úteis na anotação do genoma Os cDNA são mais importantes para as anotações do genoma bacteriano ou 6 7 8 9 10 11 12 13 14 eucariótico Com base na Figura 1414 e nas características de elementos ultraconservados o que você prevê que observaria se injetasse o construto de um gene repórter de rato ortólogo do elemento ultraconservado ISL1 em ovócitos fertilizados de camundongo e examinasse a expressão do gene repórter no embrião em desenvolvimento A Figura 1417 demonstra regiões sintênicas do cromossomo 11 de camundongo e do cromossomo 17 humano O que essas regiões sintênicas revelam a respeito do genoma do último ancestral comum de camundongos e humanos Na Figura 1418 qual etapachave possibilita o sequenciamento do exoma e o distingue do sequenciamento do genoma inteiro Os genomas de duas linhagens de E coli são comparados na Figura 1419 Você esperaria que uma terceira linhagem contivesse mais das regiões em azul em marrom ou vermelho demonstradas na Figura 1419 Explique A Figura 1421 ilustra o sistema dihíbrido baseado em Gal4 Por que as proteínas isca fundidas à proteína de ligação ao DNA Gal4 ativam a expressão do gene repórter PROBLEMAS BÁSICOS Explique a abordagem que você aplicaria para sequenciar o genoma de uma espécie bacteriana recentemente descoberta Leituras de sequenciamento terminal de insertos de clones são uma parte rotineira do sequenciamento do genoma Como a parte central do inserto do clone é obtida Qual é a diferença entre um contig e um arcabouço Suspeitase que dois contigs em particular sejam adjacentes possivelmente separados por DNA repetitivo Em uma tentativa de ligálos são utilizadas sequências das extremidades como primers para tentar preencher o intervalo Essa abordagem é razoável Em qual situação ela não atuará 15 16 17 18 19 20 21 22 Um segmento de DNA clonado que contém um gene codificador de proteína é marcado radioativamente e utilizado em uma hibridização in situ com cromossomos Foi observada radioatividade ao longo de cinco regiões em diferentes cromossomos Como esse resultado é possível Em um experimento de hibridização in situ um determinado clone se ligou apenas ao cromossomo X em um menino sem sintomas de doença Entretanto em um menino com distrofia muscular de Duchenne doença recessiva ligada ao X ele se ligou ao cromossomo X e a um autossomo Explique Esse clone pode ser útil no isolamento do gene da distrofia muscular de Duchenne Em uma análise genômica na busca por um gene de uma doença específica observouse que um gene candidato apresenta uma única substituição de par de bases que resulta em uma alteração de aminoácido não sinônimo O que você precisa verificar antes de concluir que identificou o gene causador da doença Um operador em bactérias é um sítio de ligação Um determinado cDNA de 2 kb de tamanho hibridizou com oito fragmentos genômicos de 30 kb de tamanho total e que continham duas EST curtas As EST também foram observadas em dois dos fragmentos genômicos cada um de 2 kb de tamanho Esboce uma possível explicação para esses resultados Um fragmento sequenciado de DNA de Drosophila foi utilizado em uma pesquisa BLAST A melhor mais próxima correspondência foi com um gene de quinase de Neurospora Essa correspondência significa que a sequência da Drosophila contém um gene de quinase Em um teste dihíbrido um determinado gene A proporcionou resultados positivos com dois clones M e N Quando M foi utilizado ele deu positivo com três clones A S e Q O clone N proporcionou apenas um positivo com A Desenvolva uma interpretação experimental desses resultados Você possui as seguintes leituras de sequências de um clone do genoma de 23 24 25 Drosophila melanogaster Leitura 1 TGGCCGTGATGGGCAGTTCCGGTG Leitura 2 TTCCGGTGCCGGAAAGA Leitura 3 CTATCCGGGCGAACTTTTGGCCG Leitura 4 CGTGATGGGCAGTTCCGGTG Leitura 5 TTGGCCGTGATGGGCAGTT Leitura 6 CGAACTTTTGGCCGTGATGGGCAGTTCC Utilize essas seis leituras de sequências para criar uma sequência contig dessa parte do genoma de D melanogaster Algumas vezes os cDNA tornamse monstros ou seja fusões de cópias de DNA de dois mRNA diferentes acidentalmente inseridos de modo adjacente entre si no mesmo clone Você suspeita de que um clone de cDNA do nematódeo Caenorhabditis elegans é um monstro tendo em vista que a sequência do inserto de cDNA prevê uma proteína com dois domínios estruturais normalmente não observados na mesma proteína Como você utilizaria a disponibilidade da sequência genômica inteira para avaliar se esse clone de cDNA é um monstro ou não Ao verificar a sequência do genoma humano você identifica um gene que apresenta uma região codificadora aparentemente longa mas existe uma deleção de dois pares de bases que rompe a matriz de leitura a Como você determinaria se a deleção estava correta ou foi um erro no sequenciamento b Você observa que existe exatamente a mesma deleção no homólogo do gene de chimpanzé mas que a matriz de leitura do gene de gorila está intacta Tendo em vista a filogenia dos grandes primatas o que você pode concluir a respeito de quando na evolução dos primatas a mutação ocorreu Ao verificar o genoma do chimpanzé você observa que ele apresenta três homólogos de um gene em particular enquanto os seres humanos apresentam apenas dois a Quais são as duas explicações possíveis para essa observação b Como você poderia distinguir entre essas duas possibilidades 26 27 28 29 30 31 O ornitorrinco é um dos poucos mamíferos venenosos O ornitorrinco macho apresenta um esporão na pata traseira por meio da qual consegue liberar uma mistura de proteínas venenosas Observando a filogenia na Figura 1415 como você determinaria se essas proteínas venenosas são encontradas apenas no ornitorrinco Você sequenciou o genoma da bactéria Salmonella typhimurium e está utilizando uma análise BLAST para identificar semelhanças no genoma de S typhimurium com proteínas conhecidas Você encontra uma proteína que é 100 idêntica na bactéria Escherichia coli Quando você compara as sequências de nucleotídios dos genes da S typhimurium e de E coli você observa que suas sequências de nucleotídios são apenas 87 idênticas a Explique essa observação b O que essas observações lhe informam a respeito do mérito das pesquisas de similaridade de nucleotídios versus proteínas na identificação de genes correlatos Para inativar um gene por meio de RNAi de que informação você necessita Você precisa da posição do genealvo no mapa Qual é a finalidade de criar uma fenocópia Qual é a diferença entre genética direta e reversa Por que o sequenciamento do exoma falharia em identificar uma mutação causadora de uma doença em uma pessoa afetada 32 33 34 PROBLEMAS DESAFIADORES Você possui as leituras de sequências a seguir de um clone genômico do genoma de Homo sapiens Leitura 1 ATGCGATCTGTGAGCCGAGTCTTTA Leitura 2 AACAAAAATGTTGTTATTTTTATTTCAGATG Leitura 3 TTCAGATGCGATCTGTGAGCCGAG Leitura 4 TGTCTGCCATTCTTAAAAACAAAAATGT Leitura 5 TGTTATTTTTATTTCAGATGCGA Leitura 6 AACAAAAATGTTGTTATT a Utilize essas seis leituras de sequências para criar uma sequência contig dessa parte do genoma de H sapiens b Traduza a sequência contig em todas as matrizes de leitura possíveis c Dirijase à página BLAST do National Center for Biotechnology Information ou NCBI httpwwwncbinlmnihgovBLAST Apêndice B e verifique se você consegue identificar o gene do qual essa sequência é parte por meio da utilização de cada um dos quadros de leitura como um questionamento para a comparação entre cada proteína BLASTp Algumas regiões mensuráveis de diferentes cromossomos do genoma humano apresentam nucleotídios mais de 99 idênticos entre si Essas regiões foram ignoradas na produção do rascunho da sequência do genoma humano em virtude do seu alto nível de similaridade Das técnicas discutidas neste capítulo qual possibilitaria que pesquisadores do genoma identificassem a existência das referidas regiões duplicadas Alguns éxons no genoma humano são razoavelmente pequenos menos de 75 pb de comprimento A identificação desses microéxons é difícil tendo em vista que essas distâncias são muito curtas para utilizar a identificação de ORF ou tendenciosidade de códons de modo confiável para determinar se as pequenas sequências genômicas são verdadeiramente uma parte de um mRNA e um polipeptídio Quais técnicas de busca de genes podem ser utilizadas para tentar avaliar se uma determinada região de 75 pb constitui um éxon 35 36 37 Você está estudando proteínas que apresentam papéis na tradução em camundongo Por meio da análise BLAST das proteínas previstas do genoma de camundongo você identifica um conjunto de genes de camundongo que codifica proteínas com sequências semelhantes àquelas de fatores de iniciação de tradução eucariótica conhecidos Você está interessado em determinar os fenótipos associados às mutações de perda de função desses genes a Você utilizaria abordagens de genética direta ou reversa para identificar essas mutações b Resuma brevemente duas abordagens diferentes que você pode utilizar para procurar fenótipos de perda de função em um desses genes Todo o genoma da levedura Saccharomyces cerevisiae foi sequenciado Esse sequenciamento levou à identificação de todas as matrizes de leitura abertas ORF sequências do tamanho do gene com sinais de início e término da tradução apropriados no genoma Alguns desses ORF são genes previamente conhecidos com funções estabelecidas entretanto o restante é de matrizes de leitura incógnitas URF Para deduzir as possíveis funções dos URF eles estão sendo convertidos sistematicamente um por vez em alelos nulos por meio de técnicas de nocaute in vitro Os resultados são como segue 15 são letais quando nocauteados 25 demonstram algum fenótipo mutante morfologia alterada nutrição alterada e assim por diante 60 absolutamente não demonstram fenótipo mutante detectável e se assemelham ao tipo selvagem Explique a possível base genética molecular dessas três categorias de mutantes inventando exemplos quando possível Diferentes linhagens de E coli são responsáveis por infecções êntero hemorrágicas e urinárias Com base nas diferenças entre a linhagem K12 benigna e a linhagem O157H7 ênterohemorrágica você preveria que existem diferenças genômicas óbvias a Entre K12 e as linhagens uropatogênicas b Entre O157H7 e as linhagens uropatogênicas c O que poderia explicar as diferenças par a par observadas no conteúdo do genoma d Como a função de genes específicos de linhagens pode ser testada 1M Johnson e K Gallagher A Baffling Illness Milwaukee Journal Sentinel Publicado em 10 de dezembro de 2010 Acesso em 5 de março de 2014 151 152 153 154 Grãos em uma espiga de milho Os grãos manchados nesta espiga resultam da interação de um elemento genético móvel um elemento de transposição com um gene de milho cujo produto é necessário para a pigmentação Cliff Weil e Susan Wessler TÓPICOS Descoberta dos elementos de transposição no milho Elementos de transposição em procariotos Elementos de transposição em eucariotos O genoma dinâmico Mais elementos de transposição do que jamais se imaginou 155 U Regulação epigenética de elementos de transposição pelo hospedeiro RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Descrever como os elementos de transposição foram primeiro descobertos geneticamente no milho e em seguida foram primeiro isolados molecularmente de E coli Descrever como os elementos de transposição participam na dispersão de bactérias resistentes a antibióticos Comparar e contrastar os dois mecanismos principais utilizados pelos elementos para a transposição Fornecer motivos para explicar como a espécie humana sobrevive sendo mais de 50 de nosso genoma derivados de elementos de transposição Descrever os mecanismos utilizados por genomas hospedeiros para reprimir a difusão de alguns elementos de transposição Descrever as estratégias utilizadas pelos elementos de transposição para evitar os mecanismos de repressão dos hospedeiros m menino nasce com uma doença que torna o seu sistema imune ineficiente Os testes diagnósticos determinam que ele apresenta um distúrbio genético recessivo denominado SCID doença por imunodeficiência combinada grave mais comumente conhecida como doença do menino da bolha Essa doença é causada por uma mutação no gene que codifica a enzima sanguínea adenosina desaminase ADA Como resultado da perda dessa enzima as células precursoras que originam um dos tipos celulares do sistema imune estão ausentes Tendo em vista que esse menino não apresenta a capacidade de combater infecções ele precisa viver em um ambiente completamente isolado e estéril ou seja uma bolha na qual o ar é filtrado para tornarse estéril Figura 151 Nenhuma terapia medicamentosa ou outra terapia convencional está disponível para tratar essa doença A realização no menino de um transplante de tecido contendo as células precursoras de outra pessoa não funcionaria na maioria dos casos tendo em vista que uma compatibilidade tecidual precisa entre o doador e o paciente é extremamente rara Consequentemente as células doadoras acabariam por criar uma resposta imune contra os tecidos do próprio menino doença enxerto versus hospedeiro Nas duas últimas décadas foram desenvolvidas técnicas que oferecem a possibilidade de um diferente tipo de terapia com transplante a terapia gênica que poderia ajudar pessoas com SCID e outras doenças genéticas incuráveis Em relação à SCID um gene ADA normal é transplantado para células do sistema imunológico de um paciente possibilitando assim que essas células sobrevivam e funcionem normalmente Nos estudos iniciais de terapia gênica humana os cientistas modificaram um tipo de vírus denominado retrovírus em laboratório de modo que ele pudesse inserir a si próprio em um gene ADA normal nos cromossomos das células imunes coletadas de pacientes com SCID Neste capítulo você verá que os retrovírus apresentam muitas propriedades biológicas em comum com um tipo de elemento móvel denominado retrotranspóson que está presente em nosso genoma e nos genomas da maior parte dos eucariotos As lições aprendidas a respeito do comportamento dos retrotranspósons e de outros elementos móveis a partir de organismosmodelo como as leveduras são fontes de valiosas descobertas de uma nova geração de vetores biológicos para a terapia gênica humana FIGURA 151 Um paciente com SCID deve viver em uma bolha protetora BettmannCorbis Com início na década de 1930 estudos genéticos no milho produziram resultados que superaram muito o quadro da genética clássica dos genes localizados apenas em loci fixos nos cromossomos A literatura científica começou a transmitir relatos que sugeriam que determinados elementos genéticos presentes nos cromossomos de algum modo poderiam se mover de um local para outro Esses achados foram considerados com ceticismo durante muitos anos mas atualmente está claro que tais elementos móveis são muito disseminados na natureza Vários termos curiosos alguns dos quais ajudam a descrever suas respectivas propriedades foram aplicados a esses elementos genéticos elementos controladores genes saltadores genes móveis elementos móveis e transpósons Aqui utilizamos os termos elementos transponíveis ou de transposição e elementos móveis que abrangem toda a família de tipos Os elementos de transposição conseguem moverse até novas posições dentro do mesmo cromossomo ou até mesmo para um cromossomo diferente Eles foram detectados geneticamente em organismosmodelo tais como E coli milho levedura C 151 elegans e Drosophila por meio de mutações que eles produzem quando se inserem em genes e os inativam O sequenciamento do DNA de genomas de uma diversidade de microrganismos plantas e animais indica que os elementos de transposição existem em praticamente todos os organismos Surpreendentemente eles são de longe o maior componente do genoma humano responsáveis por quase 50 de nossos cromossomos Apesar da sua abundância o papel genético normal desses elementos não é conhecido com certeza Em seus estudos os cientistas são capazes de explorar a capacidade dos elementos de transposição de se inserirem em novos sítios no genoma Os elementos de transposição modificados em tubo de ensaio são ferramentas valiosas tanto em procariotos quanto em eucariotos para o mapeamento genético criação de mutantes clonagem de genes e mesmo para a produção de organismos transgênicos Reconstruiremos algumas das etapas na evolução de nossa atual compreensão sobre os elementos de transposição Ao fazer isso revelaremos os princípios que orientam essas fascinantes unidades genéticas Descoberta dos elementos de transposição no milho Experimentos de McClintock O elemento Ds Na década de 1940 Barbara McClintock fez uma descoberta incrível enquanto estudava os grãos coloridos do chamado milho indiano ver Organismomodelo Milho adiante O milho tem 10 cromossomos numerados do maior 1 até o menor 10 Enquanto analisava a quebra dos cromossomos desse milho McClintock observou alguns fenômenos incomuns Ela observou que em uma linhagem de milho o cromossomo 9 quebrava muito frequentemente em um local particular ou locus Figura 152 Ela determinou que a quebra do cromossomo nesse locus ocorria em virtude da presença de dois fatores genéticos um fator que ela denominou Ds em referência à Dissociação e estava localizado no lugar da quebra e outro fator não ligado necessário para ativar a quebra do cromossomo 9 no locus Ds McClintock denominou esse segundo fator Ac em referência a Ativador McClintock começou a suspeitar de que Ac e Ds fossem de fato elementos genéticos móveis quando ela descobriu ser impossível mapear Ac Em algumas plantas ele mapeava em uma posição em outras plantas da mesma linhagem ele mapeava em posições diferentes Como se esse mapeamento variável não fosse uma curiosidade suficiente grãos raros com fenótipos marcadamente diferentes podiam ser derivados da linhagem original que sofreu quebras frequentes no cromossomo 9 Um desses fenótipos era um grão incolor raro que continha manchas pigmentadas A Figura 153 compara o fenótipo da linhagem com a quebra cromossômica com o fenótipo de uma dessas linhagens derivadas Em relação à linhagem com quebra cromossômica um cromossomo que se quebra em Ds ou perto dele perde a sua extremidade que contém alelos do tipo selvagem dos genes C Sh e Wx No exemplo demonstrado na Figura 153 A ocorreu uma quebra em uma única célula que se dividiu mitoticamente até produzir o grande setor de tecido mutante c sh wx A quebra pode ocorrer muitas vezes em um único grão mas cada setor de tecido demonstrará a perda de expressão de todos os três genes Contrariamente cada novo derivado afetava a expressão de apenas um único gene Um derivado que afetava a expressão apenas do gene C de pigmento está demonstrado na Figura 153 B Nesse exemplo manchas pigmentadas apareceram em um fundo de grão incolor Embora a expressão de C tenha sido alterada desse modo estranho a expressão de Sh e Wx era normal e o cromossomo 9 deixou de apresentar quebras frequentes Para explicar os novos derivados McClintock formulou a hipótese de que Ds havia se movido de um sítio perto do centrômero para o gene C localizado próximo da extremidade telomérica Nessa nova localização Ds evita a expressão de C A inativação do gene C explica as partes incolores do grão mas o que explica o aparecimento das manchas pigmentadas O grão manchado é um exemplo de um fenótipo instável McClintock concluiu que tais fenótipos instáveis resultavam da movimentação ou transposição de Ds para longe do gene C Ou seja o grão inicia o desenvolvimento com um gene C que sofreu mutação pela inserção de Ds Entretanto em algumas células do grão Ds deixa o gene C possibilitando que o fenótipo mutante seja revertido para o tipo selvagem e produza o pigmento na célula original e em todos os seus descendentes mitóticos Existem grandes manchas coloridas quando Ds deixa o gene C inicialmente no desenvolvimento do grão tendo em vista que existem mais descendentes mitóticos enquanto existem manchas pequenas quando Ds deixa o gene C posteriormente no desenvolvimento do grão Fenótipos mutantes instáveis que revertem ao tipo selvagem são uma indicação da participação de elementos móveis FIGURA 152 O cromossomo 9 de milho quebra no locus DS em que o elemento de transposição Ds foi inserido Elementos autônomos e não autônomos Qual é a relação entre Ac e Ds Como eles interagem com os genes e os cromossomos para produzir esses fenótipos interessantes e incomuns Essas questões foram respondidas por meio de análise genética adicional As interações de Ds Ac e o gene C de pigmento são utilizadas como um exemplo na Figura 154 Aqui Ds é demonstrado como um segmento de DNA que tem o gene C inativado pela inserção em sua região codificadora O alelo que carreia o inserto é denominado cmutávelDs ou cmDs abreviadamente Uma linhagem com c mDs e nenhum Ac apresenta grãos incolores tendo em vista que Ds não consegue se mover ele está preso no gene C Uma linhagem com cmDs e Ac apresenta grãos manchados tendo em vista que Ac ativa Ds em algumas células para deixar o gene C restaurando assim a função do gene Dizse que o elemento que sai é excisado do cromossomo ou transposto Foram isoladas outras linhagens nas quais o próprio elemento Ac havia se inserido no gene C denominado cmAc Contrariamente ao alelo cmDs que é instável apenas quando Ac está no genoma cmAc é sempre instável Além disso McClintock observou que em raras ocasiões um alelo do tipo Ac poderia ser transformado em um alelo do tipo Ds Essa transformação ocorria em virtude da geração espontânea de um elemento Ds a partir do elemento Ac inserido Em outras palavras Ds é com todas as probabilidades uma versão mutada e incompleta do próprio Ac Diversos sistemas como AcDs foram encontrados por McClintock e outros geneticistas que trabalhavam com milho Dois outros sistemas são o Dotted Dt descoberto por Marcus Rhoades e o Supressormutator Spm descoberto independentemente por McClintock e Peter Peterson que o denominaram EnhancerInhibitor EnIn Além disso conforme você verá nas seções a seguir foram isolados elementos com comportamento genético semelhante em bactérias plantas e animais FIGURA 153 Novos fenótipos no milho são produzidos por meio da movimentação do elemento de transposição Ds no cromossomo 9 A Um fragmento cromossômico é perdido por meio da quebra no locus de Ds Os alelos recessivos no cromossomo homólogo são expressos produzindo o setor incolor no grão B A inserção de Ds no gene C parte superior cria células de grão de milho incolores A excisão de Ds do gene C por meio da ação de Ac nas células e nos seus descendentes mitóticos possibilita que a cor seja novamente expressa produzindo o fenótipo manchado FIGURA 154 As manchas do grão são controladas pela inserção e pela excisão de elementos Ds ou Ac no gene C que controla o pigmento ORGANISMOMODELO Milho O milho Zea mays é membro da família das gramíneas As gramíneas que incluem também o arroz o trigo e a cevada são a fonte mais importante de calorias para a humanidade O milho foi domesticado a partir da grama selvagem teosinto pelos indígenas americanos no México e na América Central e foi introduzido na Europa por Colombo em seu retorno do Novo Mundo Na década de 1920 Rollins A Emerson estabeleceu um laboratório na Cornell University para estudar a genética de traços do milho incluindo a cor dos grãos ideais para a análise genética Além disso a separação física das flores masculinas e femininas na borla e na espiga respectivamente tornava os cruzamentos genéticos controlados fáceis de ser realizados Entre os excepcionais geneticistas atraídos para o laboratório de Emerson estavam Marcus Rhoades Barbara McClintock e George Beadle ver Capítulo 6 Antes do advento da biologia molecular e do surgimento de microrganismos como organismosmodelo os geneticistas realizavam as análises microscópicas dos cromossomos e relacionavam o seu comportamento à segregação dos traços Os grandes cromossomos da ponta da raiz do milho e da glândula salivar de Drosophila os tornaram os organismos de escolha para as análises citogenéticas Os resultados desses estudos iniciais levaram a uma compreensão sobre o comportamento dos cromossomos durante a meiose e a mitose incluindo eventos tais como a recombinação e as consequências de quebras cromossômicas tais como inversões translocações e duplicação O laboratório de milho de Rollins A Emerson na Cornell University 1929 Em pé da esquerda para a direita Charles Burnham Marcus Rhoades Rollins Emerson e Barbara McClintock Agachado está George Beadle Tanto McClintock quanto Beadle receberam um Prêmio Nobel Department of Plant Breeding Cornell University Análise dos cromossomos de milho naquela época e atualmente Os cromossomos de milho são grandes e facilmente visualizados por microscopia óptica Uma imagem de Marcus Rhoades 1952 James A Birchler R Kelly Dawe e John F Doebley Perspectives Anecdotal Historical and Critical Commentaries on Genetics Marcus Rhoades Preferential Segregation and Meiotic Drive 2003 Genetics Society of America p 836 O milho ainda atua como um organismomodelo genético Biólogos moleculares continuam a explorar seus belos cromossomos do paquíteno com novas sondas de anticorpos e utilizaram a sua riqueza de elementos de transposição geneticamente bemcaracterizados como ferramentas para identificar e isolar genes importantes O comportamento genético comum desses elementos levou os geneticistas a propor novas categorias para todos os elementos Ac e elementos com propriedades genéticas semelhantes atualmente são denominados elementos autônomos tendo em vista que não necessitam de outros elementos para a sua mobilidade De modo semelhante Ds e elementos com propriedades genéticas semelhantes são denominados elementos não autônomos Uma família de elementos é composta por um ou mais elementos autônomos e pelos membros não autônomos que podem ser mobilizados Os elementos autônomos codificam a informação necessária para a sua própria movimentação e para a movimentação de elementos não autônomos não ligados no genoma Tendo em vista que os elementos não autônomos não codificam as funções necessárias para sua própria movimentação eles não conseguem se movimentar exceto se um elemento autônomo de sua família estiver presente em alguma outra parte do genoma A Figura 155 demonstra um exemplo dos efeitos dos transpósons em uma rosa CONCEITOCHAVE Os elementos de transposição em milho podem inativar um gene no qual eles estão localizados causar quebras cromossômicas e se transpor para novos locais dentro do genoma Os elementos autônomos podem realizar essas funções sem auxílio os elementos não autônomos só podem se transpor apenas com o auxílio de um elemento autônomo em alguma outra parte do genoma FIGURA 155 O mosaicismo é causado pela excisão de elementos de transposição em rosas A inserção de um elemento de transposição rompe a produção de pigmento resultando em flores brancas A excisão do elemento de transposição restaura a produção de pigmento resultando em setores de tecido floral vermelho Susan Wessler Elementos de transposição Apenas no milho Embora os geneticistas tenham aceitado a descoberta de McClintock dos elementos de transposição em milho muitos relutaram em considerar a possibilidade de que elementos semelhantes estivessem presentes nos genomas de outros organismos Sua existência em todos os organismos implicaria o fato de os genomas serem inerentemente instáveis e dinâmicos Essa visão era inconsistente com o fato de que os mapas genéticos de membros da mesma espécie eram iguais Afinal se genes podem ser geneticamente mapeados em uma localização 152 cromossômica precisa esse mapeamento não indica que eles não estão se movimentando Tendo em vista que McClintock era uma geneticista altamente respeitada seus resultados não foram questionados Em vez disso sua relevância em relação a outros organismos foi questionada por outras pessoas que argumentavam que o milho não é um organismo natural ele é uma planta de cultivo que é produto da seleção humana e da domesticação Essa visão foi mantida até a década de 1960 quando os primeiros elementos de transposição foram isolados do genoma de E coli e estudados no nível da sequência de DNA Os elementos de transposição foram subsequentemente isolados dos genomas de muitos organismos incluindo Drosophila e levedura Quando se tornou aparente que os elementos de transposição são um componente significativo dos genomas da maior parte e talvez de todos os organismos Barbara McClintock foi reconhecida por sua importante descoberta e recebeu o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1983 Elementos de transposição em procariotos A descoberta genética dos elementos de transposição levou a muitas questões a respeito da semelhança na sequência de DNA de tais elementos e como eles são capazes de se movimentar de um local para outro no genoma Todos os organismos os apresentam Todos os elementos se assemelham ou existem classes diferentes de elementos de transposição Se existem muitas classes de elementos eles podem coexistir em um genoma O número de elementos de transposição no genoma varia de espécie para espécie A natureza molecular dos elementos genéticos de transposição foi compreendida pela primeira vez em bactérias Portanto continuaremos essa história ao examinar os estudos originais realizados com procariotos Existem dois tipos amplos de elementos de transposição em bactérias Sequências curtas denominadas elementos IS que conseguem se mover até novas posições mas que não carreiam outros genes além daqueles necessários para seu movimento Sequências mais longas denominadas transpósons que não apenas carreiam os genes de que necessitam para seu movimento mas que também carreiam outros genes Sequências de inserção bacteriana As sequências de inserção ou elementos de sequência de inserção IS são segmentos de DNA bacteriano que conseguem se mover de uma posição em um cromossomo para uma posição diferente no mesmo cromossomo ou em um cromossomo diferente Quando os elementos IS aparecem na parte intermediária dos genes eles interrompem a sequência codificadora e inativam a expressão daquele gene Em virtude do seu tamanho e em alguns casos da presença de sinais de término de transcrição e tradução no elemento IS os elementos IS também conseguem bloquear a expressão de outros genes no mesmo óperon se aqueles genes estiverem downstream do sítio de inserção Os elementos IS foram observados pela primeira vez em E coli no óperon gal um grupo de três genes que participam do metabolismo do açúcar galactose Identificação de elementos IS bemdefinidos Observouse que diversos mutantes gal de E coli contêm grandes inserções de DNA no óperon gal Esse achado naturalmente levou à próxima questão os segmentos de DNA que se inserem nos genes são meramente fragmentos aleatórios de DNA ou são entidades genéticas distintas A resposta para essa questão teve origem nos resultados de experimentos de hibridização que demonstram que muitas mutações de inserção diferentes são causadas por um pequeno conjunto de sequências de inserção Esses experimentos são realizados com a utilização de fagos λdgal que contêm o óperon gal de diversas linhagens mutantes de gal independentemente isoladas Partículas de fagos individuais são isoladas a partir das linhagens e seu DNA é utilizado para sintetizar RNA radioativo in vitro Observase que determinados fragmentos desse RNA hibridizam com o DNA de outras mutações gal que contêm grandes inserções de DNA mas não com DNA do tipo selvagem Esses resultados foram interpretados como evidência de que mutantes gal independentemente isolados contêm o mesmo pedaço extra do DNA Esses fragmentos particulares de RNA também hibridizam com o DNA de outros mutantes que contêm inserções IS em outros genes demonstrando que o mesmo trecho de DNA pode inserirse em diferentes locais no cromossomo bacteriano Estrutura dos elementos IS Com base em seus padrões de hibridização cruzada foi identificado um número de elementos IS distintos Uma sequência denominada IS1 é o segmento de 800 pb identificado em gal Outra sequência denominada IS2 apresenta o comprimento de 1350 pb Embora os elementos IS sejam diferentes na sequência de DNA eles apresentam diversas características em comum Por exemplo todos os elementos IS codificam uma proteína denominada transposase que é uma enzima necessária para a movimentação dos elementos IS de um local no cromossomo para outro Além disso todos os elementos IS começam e terminam com sequências curtas de repetições invertidas que são necessárias para a sua mobilidade A transposição dos elementos IS e outros elementos genéticos móveis será considerada posteriormente no capítulo O genoma do tipo selvagem padrão de E coli é rico em elementos IS ele contém oito cópias de IS1 cinco cópias de IS2 e cópias de outros tipos de IS não tão bemestudados Tendo em vista que os mesmos elementos IS apresentam sequências idênticas eles são sítios nos quais podem ocorrer crossovers Por exemplo a recombinação entre o plasmídio fator F e o cromossomo de E coli para formar linhagens Hfr é o resultado de um único crossover entre o elemento IS1 localizado no plasmídio e um elemento IS1 localizado no cromossomo ver Figura 518 Tendo em vista que existem múltiplos elementos IS1 o fator F pode se inserir em múltiplos sítios CONCEITOCHAVE O genoma bacteriano contém segmentos de DNA denominados elementos IS que conseguem se mover de uma posição no cromossomo até uma posição diferente no mesmo cromossomo ou em um cromossomo diferente Transpósons procarióticos No Capítulo 5 você aprendeu a respeitos dos fatores R plasmídios que carreiam genes que codificam a resistência a diversos antibióticos Esses fatores R em referência à resistência também conhecidos como plasmídios R são transferidos rapidamente com a conjugação celular de um modo muito semelhante ao fator F em E coli Os fatores R são justamente os primeiros de muitos fatores semelhantes do tipo F a serem descobertos Observouse que os fatores R carreiam muitos tipos diferentes de genes em bactérias Em particular os fatores R coletam genes que conferem resistência a diferentes antibióticos Como eles adquirem suas novas capacidades genéticas Ocorre que os genes de resistência a fármacos estão localizados em um elemento genético móvel denominado transpóson Tn Existem dois tipos de transpósons bacterianos Os transpósons compostos contêm uma diversidade de genes que estão localizados entre dois elementos IS quase idênticos orientados em sentido oposto Figura 156 A e como tal formam o que é denominada uma sequência de repetição invertida A transposase codificada por um dos dois elementos IS é necessária para catalisar o movimento do transpóson inteiro Um exemplo de um transpóson composto é o Tn10 demonstrado na Figura 156 A O Tn10 carreia um gene que confere a resistência ao antibiótico tetraciclina e é flanqueado por dois elementos IS10 em orientação oposta Os elementos IS que compõem os transpósons compostos não são capazes de ser transpostos por conta própria em virtude de mutações em suas repetições invertidas Os transpósons simples também são compostos por genes bacterianos flanqueados por sequências de repetições invertidas mas essas sequências são curtas 50 pb e não codificam a enzima transposase que é necessária para a transposição Portanto a sua mobilidade não ocorre em virtude de uma associação com elementos IS Em vez disso os transpósons simples codificam a sua própria transposase na região entre as sequências de repetições invertidas além de carrear os genes bacterianos Um exemplo de transpóson simples é o Tn3 demonstrado na Figura 156 B Para uma revisão os elementos IS são sequências móveis curtas que codificam apenas aquelas proteínas necessárias para a sua mobilidade Os transpósons compostos e os transpósons simples contêm genes adicionais que conferem funções novas para as células bacterianas Sejam compostos ou simples os transpósons normalmente são denominados apenas transpósons e transpósons diferentes são designados Tn1 Tn2 Tn505 e assim por diante FIGURA 156 A Tn10 um exemplo de um transpóson composto Os elementos IS estão inseridos em orientação oposta e formam repetições invertidas IR Cada elemento IS carreia uma transposase mas apenas uma normalmente é funcional B Tn3 um exemplo de um transpóson simples Repetições invertidas curtas não contêm transposase Em vez disso os transpósons simples codificam sua própria transposase A resolvase é uma proteína que promove recombinação e que resolve os cointegrados ver Figura 159 Um transpóson pode pular de um plasmídio para um cromossomo bacteriano ou de um plasmídio para outro plasmídio Desse modo são gerados plasmídios resistentes a múltiplos fármacos A Figura 157 é um diagrama composto de um fator R que indica os diversos locais nos quais os transpósons podem estar localizados Em seguida consideramos a questão de como ocorrem tais eventos de transposição ou mobilização CONCEITOCHAVE Os transpósons foram originalmente detectados como elementos genéticos móveis que conferem a resistência a fármacos Muitos desses elementos são compostos por elementos IS que flanqueiam um gene que codifica a resistência a fármacos Essa organização promove a disseminação de bactérias resistentes a fármacos por meio da facilitação do movimento do gene de resistência do cromossomo de uma bactéria resistente para um plasmídio que pode ser conjugado a outra linhagem bacteriana suscetível Mecanismo de transposição Conforme já declarado a movimentação de um elemento de transposição depende da ação de uma transposase Essa enzima desempenha papéischave nos dois estágios da transposição excisão saída do local original e inserção em um novo local Excisão do local original A maior parte dos elementos de transposição em procariotos e em eucariotos emprega um de dois mecanismos de transposição denominados replicativo e conservativo não replicativo conforme ilustrado na Figura 158 Na via replicativa conforme demonstrada em relação ao Tn3 uma nova cópia do elemento de transposição é gerada no evento de transposição Os resultados da transposição são que uma cópia aparece no novo sítio e uma cópia permanece no sítio antigo Na via conservativa conforme demonstrada em relação ao Tn10 não existe replicação Em vez disso o elemento é excisado do cromossomo ou do plasmídio e é integrado ao novo sítio A via conservativa também é denominada corte e colagem Transposição replicativa Tendo em vista que esse mecanismo é um pouco complicado ele será descrito aqui em mais detalhes Assim como a Figura 158 ilustra uma cópia de Tn3 é produzida a partir de uma cópia única inicial produzindo duas cópias de Tn3 A Figura 159 demonstra os detalhes dos intermediários na transposição do Tn3 de um plasmídio o doador para outro plasmídio o alvo Durante a transposição os plasmídios doador e receptor são temporariamente fundidos formando um plasmídio duplo A formação desse intermediário é catalisada pela transposase codificada por Tn3 que realiza cortes no filamento único nas duas extremidades de Tn3 e cortes desencontrados na sequênciaalvo e une as extremidades livres formando um círculo fundido denominado cointegrado O elemento de transposição é duplicado no evento de fusão O cointegrado em seguida é resolvido por meio de um evento semelhante à recombinação que transforma um cointegrado em dois círculos menores deixando uma cópia do elemento de transposição em cada plasmídio O resultado é que uma cópia permanece no local original do elemento enquanto a outra é integrada em uma nova posição genômica Transposição conservativa Alguns transpósons tais como o Tn10 são excisados do cromossomo e integrados no DNAalvo Nesses casos o DNA do elemento não é replicado e o elemento é perdido a partir do sítio do cromossomo original ver Figura 158 Assim como a transposição replicativa essa reação é iniciada pela transposase codificada pelo elemento que realiza cortes nas extremidades do transpóson Entretanto contrariamente à transposição replicativa a transposase corta o elemento fora do sítio do doador Em seguida ela realiza um corte desencontrado em um sítioalvo e insere nele o elemento Revisaremos esse mecanismo em mais detalhes em uma discussão sobre a transposição de elementos de transposição eucarióticos incluindo a família de AcDs de milho FIGURA 157 Mapa esquemático de um plasmídio com diversas inserções de transpósons simples e compostos que carreiam genes de resistência As sequências dos plasmídios estão em azul Estão demonstrados os genes que codificam resistência aos antibióticos tetraciclina tetR canamicina kanR estreptomicina smR sulfonamida suR e ampicilina ampR bem como ao mercúrio hgR O segmento determinante de resistência consegue se mover como um grupo de genes de resistência Tn3 está dentro de Tn4 Cada transpóson pode ser transferido de modo independente Dados de S N Cohen e J A Shapiro Transposable Genetic Elements Direitos autorais 1980 por Scientific American Inc Todos os direitos reservados FIGURA 158 A transposição de elemento móvel pode ser replicativa ou conservativa Ver texto para detalhes Transposição replicativa de Tn3 FIGURA 159 A transposição replicativa de Tn3 ocorre por meio de um intermediário cointegrado Inserção em um novo local Vimos que a transposase continua a desempenhar um papel importante na inserção Em uma das primeiras etapas da inserção a transposase realiza um corte desencontrado no sítioalvo do DNA não diferente das quebras desencontradas catalisadas pelas endonucleases de restrição no arcabouço açúcarfosfato do DNA A Figura 1510 demonstra as etapas na inserção de um elemento de transposição genérico Nesse caso a transposase realiza um corte desencontrado de cinco pares de bases O elemento de transposição se insere entre as extremidades cortadas e o maquinário de reparo do DNA hospedeiro ver Capítulo 16 preenche o intervalo oposto a cada filamento único utilizando as bases das projeções como molde Agora existem duas sequências duplicadas cada uma com cinco pares de bases de comprimento nos sítios das projeções anteriores Essas sequências são denominadas duplicação de sítioalvo Praticamente todos os elementos de transposição tanto em procariotos quanto eucariotos são flanqueados por uma duplicação de sítio alvo indicando que todos utilizam um mecanismo de inserção semelhante àquele demonstrado na Figura 1510 O que difere é o comprimento da duplicação um tipo particular de elemento de transposição apresenta um comprimento característico para sua duplicação de sítioalvo tão pequeno quanto dois pares de bases para alguns elementos É importante ter em mente que os elementos de transposição apresentam repetições invertidas em suas extremidades e que as repetições invertidas são flanqueadas pela duplicação de sítioalvo que é uma repetição direta FIGURA 1510 Uma sequência curta de DNA é duplicada no sítio de inserção do transpóson O DNA receptor é clivado em sítios desencontrados está demonstrado um corte desencontrado de 5 pb levando à produção de duas cópias da sequência de cinco pares de bases que flanqueiam o elemento inserido CONCEITOCHAVE Em procariotos a transposição ocorre por meio de no 153 mínimo duas vias diferentes Alguns elementos de transposição podem replicar uma cópia do elemento em um sítioalvo deixando uma cópia para trás no sítio original Em outros casos a transposição consiste na excisão direta do elemento e pela sua reinserção dentro em um novo sítio Elementos de transposição em eucariotos Embora os elementos de transposição tenham sido primeiro descobertos em milho os primeiros elementos eucarióticos a ser caracterizados no nível molecular foram isolados a partir de genes mutantes de levedura e Drosophila Os elementos de transposição eucarióticos estão situados em duas classes classe 1 de retrotranspósons e classe 2 de transpósons de DNA A primeira classe a ser isolada os retrotranspósons absolutamente não se assemelha aos elementos IS procarióticos e aos elementos de transposição Classe 1 Retrotranspósons O laboratório de Gerry Fink estava entre os primeiros a utilizar levedura como um organismomodelo para estudar a regulação gênica eucariótica Durante anos ele e seus colegas isolaram milhares de mutações no gene HIS4 que codifica uma das enzimas na via que leva à síntese do aminoácido histidina Eles isolaram mais de 1500 mutantes espontâneos HIS4 e observaram que dois deles apresentavam um fenótipo mutante instável Os mutantes instáveis denominados pseudorrevertentes apresentavam 1000 vezes mais probabilidade de reverterem para um fenótipo semelhante ao tipo selvagem do que os outros mutantes HIS4 Simbolicamente dizemos que esses mutantes instáveis reverteram de His para His os tipos selvagens apresentam um sinal de mais sobrescrito enquanto os mutantes apresentam um sinal de menos sobrescrito Assim como os mutantes gal de E coli observouse que esses mutantes de levedura abrigam uma grande inserção de DNA no gene HIS4 Observouse que a inserção é muito semelhante àquela de um grupo de elementos de transposição já caracterizados em leveduras denominados elementos Ty Existem de fato aproximadamente 35 cópias do elemento inserido denominado Ty1 no genoma de levedura A clonagem dos elementos desses alelos mutantes levou à descoberta surpreendente de que as inserções absolutamente não se assemelhavam aos elementos IS bacterianos ou transpósons Em vez disso elas se assemelhavam a uma classe bemcaracterizada de vírus de animais denominados retrovírus Um retrovírus é um vírus de RNA unifilamentar que emprega um DNA bifilamentar intermediário para replicação O RNA é copiado em DNA pela enzima transcriptase reversa O DNA bifilamentar é integrado aos cromossomos hospedeiros a partir dos quais ele é transcrito para produzir o genoma de RNA viral e as proteínas que formam novas partículas virais Quando integrada aos cromossomos hospedeiros como DNA bifilamentar a cópia de DNA bifilamentar do genoma retroviral é denominada provírus O ciclo de vida de um retrovírus típico está demonstrado na Figura 1511 Alguns retrovírus tais como o vírus do tumor mamário de camundongos MMTV e o vírus do sarcoma de Rous RSV são responsáveis pela indução de tumores cancerosos Em relação ao MMTV isso ocorre quando ele se insere aleatoriamente no genoma próximo de um gene cuja expressão alterada leva ao câncer A Figura 1512 demonstra a semelhança na estrutura e no conteúdo gênico de um retrovírus e o elemento Ty1 isolado a partir dos mutantes HIS4 Ambos são flanqueados por sequências de longa repetição terminal LTR que apresentam diversas centenas de pares de bases de comprimento Os retrovírus codificam no mínimo três proteínas que participam na replicação viral os produtos dos genes gag pol e env A proteína codificada por gag apresenta um papel na maturação do genoma de RNA pol codifica a importante transcriptase reversa e env codifica a proteína estrutural que circunda o vírus Essa proteína é necessária para que o vírus saia da célula para infectar outras células Curiosamente os elementos Ty1 apresentam genes relacionados com gal e pol mas não com env Essas características levaram à hipótese de que assim como os retrovírus os elementos Ty1 são transcritos em RNA que são copiados em DNA bifilamentar pela transcriptase reversa Entretanto contrariamente aos retrovírus os elementos Ty1 não conseguem deixar a célula tendo em vista que não codificam env Em vez disso as cópias de DNA bifilamentar são inseridas de volta no genoma da mesma célula Essas etapas estão diagramadas na Figura 1513 FIGURA 1511 O genoma de RNA do retrovírus sofre transcrição reversa em DNA bifilamentar dentro da célula hospedeira FIGURA 1512 Comparação estrutural de um retrovírus com retrotranspósons observados em genomas eucarióticos A Um retrovírus vírus da leucemia murina Moloney MoMLV de camundongos B Um retrotranspóson Ty1 em levedura C Um retrotranspóson copia em Drosophila D Um elemento longo intercalado LINE em seres humanos Abreviações LTR Longa repetição terminal ORF Matriz de leitura aberta Em 1985 David Garfinkel Jef Boeke e Gerald Fink demonstraram que assim como os retrovírus os elementos Ty de fato são transpostos por meio de um RNA intermediário A Figura 1514 diagrama o desenho experimental desenvolvido por eles Eles iniciaram com a alteração de um elemento Ty1 de levedura clonado em um plasmídio Primeiramente perto de uma extremidade de um elemento eles inseriram um promotor que pode ser ativado pela adição de galactose ao meio Em segundo lugar eles introduziram um íntron de outro gene de levedura na região codificadora do transpóson Ty A adição de galactose aumenta muito a frequência de transposição do elemento Ty alterado Esse aumento na frequência sugere a participação de RNA tendo em vista que a galactose estimula a transcrição do DNA Ty em RNA com início no promotor sensível à galactose O resultado experimentalchave entretanto é o destino do DNA Ty transposto Os pesquisadores observaram que o íntron havia sido removido do DNA Ty transposto Tendo em vista que os íntrons são recompostos apenas no período do processamento de RNA ver Capítulo 8 o DNA Ty transposto deve ter sido copiado a partir de um RNA intermediário A conclusão foi que o RNA é transcrito a partir do elemento Ty original e recomposto O mRNA recomposto sofre transcrição reversa de volta ao DNA bifilamentar que em seguida é integrado ao cromossomo de levedura Os elementos de transposição que empregam a transcriptase reversa para transpor por meio de um RNA intermediário são denominados retrotranspósons Eles também são conhecidos como elementos de transposição da classe 1 Retrotranspósons tais como Ty1 que apresentam longas repetições terminais em suas extremidades são denominados retrotranspósons LTR e o mecanismo que eles utilizam para a transposição é denominado cópia e colagem o que os diferencia do mecanismo de corte e colagem que caracteriza a maior parte dos elementos de transposição de DNA FIGURA 1513 Um transcrito de RNA do retrotranspóson sofre transcrição reversa em DNA por meio de uma transcriptase reversa codificada pelo retrotranspóson A cópia de DNA é inserida em um novo local no genoma Também foi demonstrado que diversas mutações espontâneas isoladas ao longo dos anos em Drosophila também contêm inserções de retrotranspósons Os elementos tipo copia de Drosophila são estruturalmente semelhantes aos elementos Ty1 e aparecem em 10 a 100 posições no genoma de Drosophila ver Figura 1512 C Determinadas mutações clássicas de Drosophila resultam da inserção de tipo copia de outros elementos Por exemplo a mutação white apricot wa para cor de olho é causada pela inserção de um elemento da família copia no locus white A inserção de retrotranspósons LTR em genes de plantas incluindo o milho também demonstrou contribuir para mutações espontâneas nesse reino FIGURA 1514 Um elemento Ty é alterado por meio da adição de um íntron e um promotor que pode ser ativado pela adição de galactose A sequência do íntron é removida antes da transcrição reversa Antes de deixarmos os retrotranspósons retornaremos a eles posteriormente neste capítulo existe uma questão que precisa ser respondida Relembre que o primeiro retrotranspóson LTR foi descoberto em uma linhagem His instável de levedura que com frequência revertia para His Entretanto acabamos de ver que os retrotranspósons LTR contrariamente à maior parte dos elementos de transposição de DNA não são excisados quando transpostos O que então é responsável pelo aumento de aproximadamente 1000 vezes na frequência de reversão desse alelo quando comparado a outros alelos His A resposta está demonstrada na Figura 1515 a qual demonstra que o elemento Ty1 no alelo His está localizado na região promotora do gene His onde ele impede a transcrição gênica Contrariamente os revertentes contêm uma única cópia do LTR denominada LTR solo Essa inserção muito menor não interfere na transcrição do gene His O LTR solo é produto da recombinação entre LTR idênticos que resulta na deleção do restante do elemento ver Capítulos 4 e 16 para mais sobre recombinação Os LTR solo são uma característica muito comum nos genomas de virtualmente todos os eucariotos indicando a importância desse processo O genoma de levedura sequenciado contém mais de cinco vezes mais LTR solo do que elementos Ty1 completos FIGURA 1515 Revertentes His contêm um LTR solo que resulta da recombinação entre as sequências de DNA idênticas nos dois LTR do retrotranspóson LTR no promotor HIS CONCEITOCHAVE Os elementos de transposição que são transpostos por RNA intermediários predominam em eucariotos Os retrotranspósons também conhecidos como elementos da classe 1 codificam uma transcriptase reversa que produz uma cópia de DNA bifilamentar de um RNA intermediário que é capaz de se integrar em uma nova posição no genoma Classe 2 Transpósons de DNA Alguns elementos móveis observados em eucariotos aparentam ser transpostos por meio de mecanismos semelhantes àqueles em bactérias Conforme ilustrado na Figura 158 em relação aos elementos IS e aos transpósons o que se insere em uma nova posição no genoma é o próprio elemento ou uma cópia do elemento Os elementos transpostos dessa maneira são denominados elementos da classe 2 ou transpósons de DNA Atualmente sabese que os primeiros elementos de transposição descobertos por McClintock em milho são transpósons de DNA Entretanto os primeiros transpósons de DNA a serem caracterizados molecularmente foram os elementos P em Drosophila Elementos P De todos os elementos de transposição em Drosophila os mais intrigantes e úteis para os geneticistas são os elementos P O elemento P de tamanho total se assemelha aos transpósons simples de bactérias uma vez que suas extremidades são repetições invertidas curtas 31 pb e que codifica uma proteína única a transposase que é responsável pela sua mobilização Figura 1516 Os elementos P variam em tamanho oscilando de 05 a 29 kb de comprimento Essa diferença no tamanho ocorre em virtude da presença de muitos elementos P defeituosos a partir dos quais partes do meio do elemento que codifica o gene da transposase foram deletadas FIGURA 1516 A análise da sequência de DNA do elemento P de 29 kb revela um gene que codifica a transposase Uma repetição invertida perfeita de 31 pb está localizada em cada ponta do elemento Os elementos P foram descobertos por Margaret Kidwell que estava estudando a disgenesia híbrida um fenômeno que ocorre quando fêmeas de linhagens de laboratório de D melanogaster são cruzadas com machos derivados de populações naturais Nesses cruzamentos dizse que os estoques de laboratório apresentam um citotipo M tipo celular e que os estoques naturais apresentam um citotipo P Em um cruzamento de M fêmea P macho a progênie demonstra uma diversidade de fenótipos surpreendentes que são manifestados na linhagem germinativa incluindo esterilidade uma alta taxa de mutação e uma alta frequência de aberrações cromossômicas e não disjunção Figura 1517 Essa progênie híbrida é disgênica ou biologicamente deficiente daí a expressão disgenesia híbrida Curiosamente o cruzamento recíproco P fêmea M macho não produz descendência disgênica Uma observação importante é que uma grande porcentagem das mutações disgenicamente induzidas é instável ou seja elas revertem para o tipo selvagem ou para outros alelos mutantes em frequências muito altas Essa instabilidade em geral é restrita à linhagem germinativa de uma mosca que apresente um citotipo M por meio de um mecanismo explicado posteriormente Os mutantes instáveis de Drosophila apresentavam semelhanças com os mutantes instáveis de milho caracterizados por McClintock Os investigadores formularam a hipótese de que as mutações disgênicas são causadas pela inserção de elementos de transposição em genes específicos tornandoos assim inativos De acordo com essa consideração a reversão normalmente resultaria da excisão dessas sequências inseridas Essa hipótese foi testada criticamente por meio do isolamento de mutações disgênicas instáveis no locus white da cor de olho Observouse que a maior parte das mutações foi causada pela inserção de um elemento de transposição no gene white Observouse que o elemento denominado elemento P está presente em 30 a 50 cópias por genoma nas linhagens P mas está completamente ausente nas linhagens M Por que os elementos P não causam problemas em linhagens P A resposta mais simples é que a transposição do elemento P é reprimida em linhagens P Primeiramente acreditavase que a repressão ocorresse em virtude de um repressor proteico que estava nas linhagens P mas não nas linhagens M Esse modelo deixou de ser favorecido Em vez disso os geneticistas atualmente acreditam que todos os genes da transposase nos elementos P são silenciados nas linhagens P Os genes são ativados na geração F1 conforme demonstrado na Figura 1518 O silenciamento gênico foi discutido anteriormente ver Capítulos 8 e 12 e será revisado no fim deste capítulo Por algum motivo a maior parte das linhagens de laboratório não apresenta elementos P e consequentemente o mecanismo de silenciamento não é ativado Em híbridos do cruzamento M fêmea sem elementos P P machos com elementos P os elementos P no zigoto recémformado estão em um ambiente livre de silenciamento Os elementos P derivados do genoma masculino agora podem transporse pelo genoma diploide causando uma diversidade de danos na medida em que eles se inserem nos genes e causam mutações Esses eventos moleculares são expressos como as diversas manifestações de disgenesia híbrida Por outro lado os cruzamentos P fêmea M macho não resultam em disgenesia presumivelmente em virtude de o citoplasma do zigoto conter os componentes necessários para o silenciamento da transposase do elemento P FIGURA 1517 Na disgenesia híbrida um cruzamento entre uma fêmea de um estoque de laboratório e um macho selvagem produz progênie defeituosa Ver texto para os detalhes Uma questão intrigante permanece não respondida por que as linhagens de laboratório não apresentam elementos P enquanto as linhagens no ambiente selvagem apresentam Uma hipótese é que a maior parte das atuais linhagens de laboratório seja descendente dos isolados originais coletados da natureza por Morgan e seus alunos há quase um século Em algum ponto entre a captura daquelas linhagens originais e as atuais os elementos P se difundiram pelas populações naturais mas não pelas linhagens de laboratório Essa diferença não foi notada até que linhagens selvagens fossem novamente capturadas e cruzadas com linhagens de laboratório Embora não saibamos exatamente como os elementos P foram disseminados está claro que os elementos de transposição podem se disseminar rapidamente a partir de alguns membros de uma população Nesse sentido a disseminação dos elementos P se assemelha à disseminação dos transpósons que carreiam genes de resistência para populações bacterianas anteriormente suscetíveis Revisão dos elementos de transposição em milho Embora o agente causal responsável pelos mutantes instáveis tenha sido primeiramente demonstrado geneticamente como os elementos de transposição em milho isso ocorreu quase 50 anos antes que os elementos Ac e Ds de milho fossem isolados e que se demonstrasse que eles estão relacionados com os transpósons de DNA em bactérias e em outros eucariotos Assim como o elemento P de Drosophila Ac apresenta repetições terminais invertidas e codifica uma proteína única a transposase O elemento Ds não autônomo não codifica a transposase e portanto não consegue realizar a transposição por conta própria Quando Ac está presente no genoma sua transposase consegue se ligar a ambas as extremidades dos elementos Ac ou Ds e promover a sua transposição Figura 1519 FIGURA 1518 Eventos moleculares subjacentes à disgenesia híbrida Cruzamentos de macho de Drosophila que contém a transposase P com fêmea de Drosophila que não apresenta elementos P funcionais produzem mutações na linhagem germinativa da progênie F1 causadas por inserções do elemento P Os elementos P são capazes de se mover causando mutações tendo em vista que o zigoto não silencia o gene da transposase Conforme observado anteriormente no capítulo Ac e Ds são membros de uma única família de transpósons e existem outras famílias de elementos de transposição em milho Cada família contém um elemento autônomo que codifica uma transposase capaz de movimentar elementos na mesma família mas não de movimentar elementos em outras famílias tendo em vista que a transposase consegue se ligar apenas às extremidades de membros da família Embora alguns organismos tais como leveduras não apresentem transpósons de DNA elementos estruturalmente semelhantes aos elementos P e Ac foram isolados de muitas espécies de plantas e animais FIGURA 1519 O elemento Ac em milho codifica uma transposase que liga as suas próprias extremidades ou aquelas de um elemento Ds excisando o elemento clivando o sítioalvo e possibilitando que o elemento se insira em algum outro local no genoma CONCEITOCHAVE Os primeiros elementos de transposição conhecidos em milho são transpósons de DNA que se assemelham estruturalmente aos transpósons de DNA em bactérias e outros eucariotos Os transpósons de DNA codificam uma transposase que corta o transpóson do cromossomo e catalisa a sua reinserção em outros locais cromossômicos Utilidade dos transpósons de DNA para a descoberta de genes Além de seu interesse como um fenômeno genético os transpósons de DNA se tornaram ferramentas importantes utilizadas pelos geneticistas que trabalham com uma diversidade de organismos Sua mobilidade foi explorada para marcar genes para clonagem e para inserir transgenes O elemento P em Drosophila fornece um dos melhores exemplos de como os geneticistas exploram as propriedades dos elementos de transposição em eucariotos Utilização de elementos P para marcar genes para clonagem Os elementos P podem ser utilizados para criar mutações por meio de inserção marcar a posição dos genes e facilitar a clonagem dos genes Os elementos P inseridos nos genes in vivo rompem os genes aleatoriamente criando mutantes com fenótipos diferentes Moscasdasfrutas com fenótipos mutantes interessantes podem ser selecionadas para clonagem do gene mutante que é marcado pela presença do elemento P um método denominado marcação de transpóson Após a clonagem do gene interrompido os fragmentos do alelo mutante podem ser utilizados como uma sonda para isolar o gene do tipo selvagem Utilização de elementos P para inserir genes Gerald Rubin e Allan Spradling demonstraram que o DNA do elemento P pode ser um veículo eficaz para a transferência dos genes doadores para a linhagem germinativa de uma mosca receptora Eles planejaram o procedimento experimental a seguir Figura 1520 Suponha que o objetivo é transferir o alelo ry que confere uma cor de olho característica para o genoma da mosca O genótipo receptor é homozigoto para a mutação rosy ry A partir dessa linhagem os embriões são coletados ao término de aproximadamente nove divisões nucleares Nesse estágio o embrião é uma célula multinucleada e os núcleos que se destinam à formação das células germinativas estão agrupados em uma extremidade Os elementos P mobilizam apenas nas células da linhagem germinativa Dois tipos de DNA são injetados em embriões desse tipo O primeiro é um plasmídio bacteriano que carreia um elemento P defeituoso no qual o gene ry foi inserido O elemento P defeituoso se assemelha ao elemento Ds de milho pois não codifica a transposase mas ainda apresenta as extremidades que ligam a transposase e possibilitam a transposição Esse elemento deletado não é capaz de se transpor e assim conforme mencionado anteriormente também é injetado um plasmídio auxiliar que codifica a transposase porém sem as repetições terminais de modo que ele não consegue se transpor As moscas que se desenvolvem a partir desses embriões ainda são fenotipicamente mutantes rosy mas sua descendência inclui uma grande proporção de moscas ry A hibridização in situ confirmou que o gene ry juntamente com o elemento P deletado foi inserido em um de diversos locais cromossômicos distintos Nenhum apareceu exatamente no locus normal do gene rosy Observouse que esses novos genes ry são herdados de modo mendeliano estável FIGURA 1520 Transferência gênica mediada por elemento P em Drosophila O gene de cor de olho rosy ry é inserido em um elemento P deletado carreado em um vetor bacteriano Ao mesmo tempo é utilizado um plasmídio auxiliar que contém um elemento P intacto Ambos são injetados em um embrião ry no qual o ry é transposto com o elemento P para os cromossomos das células da linhagem germinativa Tendo em vista que o elemento P pode ser transposto apenas em Drosophila tais aplicações são restritas a essas moscas Contrariamente o elemento Ac de 154 milho é capaz de se transpor após sua introdução nos genomas de muitas espécies de plantas incluindo Arabidopsis alface cenoura arroz e cevada Assim como os elementos P Ac foi modificado por geneticistas para a utilização no isolamento de genes por meio da marcação de transpóson Desse modo o Ac o primeiro elemento de transposição descoberto por Barbara McClintock atua como uma importante ferramenta utilizada por geneticistas de plantas há mais de 50 anos CONCEITOCHAVE Os transpósons de DNA têm sido modificados e utilizados por cientistas de dois modos importantes 1 para produzir mutantes que possam ser molecularmente identificados pela presença de uma marcação de transpóson e 2 como vetores que podem introduzir genes exógenos em um cromossomo O genoma dinâmico Mais elementos de transposição do que jamais se imaginou Os elementos de transposição foram primeiro descobertos com a utilização de abordagens genéticas Nesses estudos os elementos tornaram sua presença conhecida quando foram transpostos para um gene ou em sítios de quebra ou rearranjo cromossômico Após o DNA de elementos de transposição ter sido isolado de mutações instáveis os cientistas puderam utilizálo como sondas moleculares para determinar se havia mais cópias relacionadas no genoma Em todos os casos diversas cópias e em alguns casos várias centenas de cópias do elemento sempre estavam presentes no genoma Os cientistas ponderaram a respeito da prevalência dos elementos de transposição nos genomas Haveria outros elementos de transposição no genoma que permaneciam desconhecidos em virtude de não terem causado uma mutação que pudesse ser estudada em laboratório Haveria elementos de transposição na vasta maioria dos organismos que não eram passíveis de análise genética Perguntando de outro modo os organismos sem mutações induzidas por elementos de transposição ainda assim apresentam elementos de transposição em seus genomas Essas questões são reminiscentes da experimentação do pensamento filosófico Se uma árvore cai na floresta e ninguém está perto para ouvir ela produz som Grandes genomas são predominantemente elementos de transposição Muito antes do advento dos projetos de sequenciamento de DNA cientistas que utilizavam uma diversidade de técnicas bioquímicas descobriram que o conteúdo de DNA denominado valor C variava dramaticamente em eucariotos e não estava correlacionado com a complexidade biológica Por exemplo os genomas de salamandras são 20 vezes maiores que o genoma humano enquanto o genoma da cevada é mais de 10 vezes maior que o genoma do arroz uma gramínea correlata A ausência de correlação entre o tamanho do genoma e a complexidade biológica de um organismo é conhecida como paradoxo do valor C A cevada e o arroz são ambos gramíneas de cereais e como tal o conteúdo do seu genoma deveria ser semelhante Entretanto se os genes são um componente relativamente constante dos genomas de organismos multicelulares o que é responsável pelo DNA adicional nos genomas maiores Com base nos resultados de experimentos adicionais os cientistas foram capazes de determinar que as sequências de DNA que são repetidas milhares até mesmo centenas de milhares de vezes compõem uma grande fração dos genomas eucarióticos e que alguns genomas contêm muito mais DNA repetitivo do que outros Graças a muitos projetos recentes para sequenciar os genomas de uma ampla variedade de organismos incluindo Drosophila seres humanos camundongos Arabidopsis e arroz atualmente sabemos que existem muitas classes de sequências repetitivas nos genomas de organismos superiores e que algumas são semelhantes aos transpósons de DNA e aos retrotranspósons mostrados como responsáveis por mutações em plantas leveduras e insetos Mais notavelmente essas sequências compõem a maior parte do DNA nos genomas de eucariotos multicelulares Em vez de se correlacionar com o conteúdo gênico o tamanho do genoma com frequência se correlaciona com a quantidade de DNA no genoma que é derivada de elementos de transposição Organismos com genomas grandes apresentam muitas sequências que se assemelham aos elementos de transposição enquanto organismos com genomas pequenos apresentam muito menos Dois exemplos um do genoma humano e o outro de uma comparação dos genomas de gramíneas ilustram esse ponto As características estruturais dos elementos de transposição que são observados nos genomas humanos estão resumidas na Figura 1521 e será feita referência a elas na próxima seção CONCEITOCHAVE O paradoxo do valor C é a ausência de correlação entre o tamanho do genoma e a complexidade biológica Os genes compõem apenas uma pequena proporção dos genomas de organismos multicelulares O tamanho do genoma normalmente corresponde à quantidade de sequências de elementos de transposição em vez de ao conteúdo gênico FIGURA 1521 Diversas classes gerais de elementos de transposição são observadas no genoma humano Dados de Nature 409 880 15 de fevereiro de 2001 Initial Sequencing and Analysis of the Human Genome The International Human Genome Sequencing Consortium Elementos de transposição no genoma humano Quase metade do genoma humano é derivada de elementos de transposição A maioria desses elementos de transposição é de dois tipos de retrotranspósons denominados elementos longos intercalados ou LINE e elementos curtos intercalados ou SINE ver Figura 1521 Os LINE se movem como um retrotranspóson com o auxílio de uma transcriptase reversa codificada por um elemento mas não apresentam algumas características estruturais de elementos do tipo retrovírus incluindo LTR ver Figura 1512 D Os SINE podem ser mais bemdescritos como LINE não autônomos tendo em vista que eles apresentam as características estruturais de LINE mas não codificam a sua própria transcriptase reversa Presumivelmente eles são mobilizados por enzimas transcriptases reversas que são codificadas por LINE presentes no genoma O SINE mais abundante em seres humanos é denominado Alu em virtude de conter um sítioalvo para a enzima de restrição Alu O genoma humano contém mais de 1 milhão de sequências Alu inteiras e parciais dispersas entre os genes e dentro de íntrons Essas sequências Alu compõem mais de 10 do genoma humano A sequência Alu total apresenta aproximadamente 200 nucleotídios de comprimento e apresenta uma semelhança extraordinária com o RNA 7SL um RNA que é parte de um complexo por meio do qual polipeptídios recém sintetizados são secretados pelo retículo endoplasmático Presumivelmente as sequências Alu foram originadas como transcritos reversos dessas moléculas de RNA Existe aproximadamente 20 vezes mais DNA no genoma humano derivado de elementos de transposição do que DNA codificador de todas as proteínas humanas A Figura 1522 ilustra o número e a diversidade de elementos de transposição presentes no genoma humano utilizando como exemplo as posições de Alu individuais outros SINE e LINE na vizinhança de um gene humano típico O genoma humano parece ser típico de um organismo multicelular na abundância e na distribuição de elementos de transposição Portanto uma questão óbvia é Como as plantas e os animais sobrevivem com tantas inserções nos genes e tanto DNA móvel no genoma Primeiramente em relação à função dos genes todos os elementos demonstrados na Figura 1522 estão inseridos em íntrons Portanto o mRNA produzido por esse gene não incluirá quaisquer sequências de elementos de transposição tendo em vista que eles terão sido removidos do pré mRNA com o íntron adjacente Presumivelmente os elementos de transposição se inserem tanto em éxons quanto em íntrons mas apenas as inserções em íntrons permanecerão na população tendo em vista que apresentam menos probabilidade de causar uma mutação deletéria Dizse que as inserções em éxons estão sujeitas à seleção negativa Em segundo lugar os seres humanos assim como todos os outros organismos multicelulares conseguem sobreviver com tanto DNA móvel no genoma em virtude de a vasta maioria ser inativa e não conseguir se mover ou aumentar o número de cópias A maior parte das sequências de elementos de transposição em um genoma é de remanescentes que acumularam mutações inativadoras durante o período evolutivo Outros ainda são capazes de movimentação mas se tornam inativos pelos mecanismos reguladores do hospedeiro ver Seção 155 Entretanto existem alguns LINE e Alu ativos que conseguiram escapar do controle do hospedeiro e inseriramse em genes importantes causando diversas doenças humanas Três inserções de LINE em separado romperam o gene do fator VIII causando a hemofilia A No mínimo 11 inserções Alu em genes humanos demonstraram causar diversas doenças incluindo a hemofilia B no gene do fator IX a neurofibromatose no gene NF1 e o câncer de mama no gene BRCA2 FIGURA 1522 Diversos elementos repetitivos são observados no gene humano HGO que codifica a homogentisato 12dioxigenase a enzima cuja deficiência causa alcaptonúria A fileira superior diagrama as posições dos éxons de HGO As localizações de Alu azul outros SINE roxo e LINE amarelo na sequência de HGO estão indicadas na fileira inferior Dados de B Granadino D BeltránValero de Bernabé J M FernándezCañón M A Peñalva e S Rodríguez de Córdoba The Human Homogentisate 12 dioxygenase HGO gene Genomics 43 1997 115 A frequência geral de mutação espontânea em virtude da inserção de elementos da classe 2 em seres humanos é razoavelmente baixa responsável por menos de 02 1 em 500 de todas as mutações espontâneas caracterizadas Surpreendentemente as inserções de retrotranspósons são responsáveis por aproximadamente 10 das mutações espontâneas em outro mamífero o camundongo O aumento de aproximadamente 50 vezes nesse tipo de mutação no camundongo muito provavelmente corresponde à atividade muito mais alta desses elementos no genoma de camundongo do que no genoma humano CONCEITOCHAVE Os elementos de transposição compõem a maior fração do genoma humano com LINE e SINE sendo os mais abundantes A maioria dos elementos de transposição é resquício ancestral que não consegue mais se mover ou aumentar seu número de cópias Alguns poucos elementos permanecem ativos e sua movimentação para os genes pode causar doenças As gramíneas Retrotranspósons LTR desenvolvemse em grandes genomas Conforme já mencionado o paradoxo do valor C é a ausência de correlação entre o tamanho do genoma e a complexidade biológica Como os organismos podem apresentar conteúdo gênico muito semelhante mas diferir dramaticamente no tamanho de seus genomas Essa situação foi investigada nas gramíneas de cereais As diferenças nos tamanhos dos genomas dessas gramíneas demonstraram estar correlacionadas primariamente com o número de uma classe de elementos os retrotranspósons LTR Os cereais são parentes evolutivos que tiveram origem a partir de um ancestral comum nos últimos 70 milhões de anos Como tal seus genomas ainda são muito semelhantes em relação ao conteúdo gênico e à organização denominada sintenia ver Capítulo 14 e regiões podem ser comparadas diretamente Essas comparações revelam que genes ligados no pequeno genoma de arroz estão fisicamente mais próximos do que os mesmos genes nos genomas maiores de milho e cevada Nos genomas de milho e cevada os genes são separados por grandes grupos de retrotranspósons Figura 1523 FIGURA 1523 As gramíneas incluindo cevada arroz sorgo e milho divergiram a partir de um ancestral comum há aproximadamente 70 milhões de anos Desde aquela época os elementos de transposição acumularamse em níveis diferentes em cada espécie Os cromossomos são maiores em milho e cevada cujos genomas contêm grandes quantidades de retrotranspósons LTR A cor verde no genoma parcial na parte inferior representa um aglomerado de transpósons enquanto laranja representa os genes Abrigos seguros A abundância de elementos de transposição nos genomas de organismos multicelulares levou alguns investigadores a postular que elementos de transposição bemsucedidos aqueles que são capazes de alcançar números muito altos de cópias desenvolveram mecanismos para prevenir danos aos seus hospedeiros por meio da não inserção em genes hospedeiros Em vez disso os elementos de transposição bemsucedidos se inserem dentro dos assim denominados abrigos seguros no genoma Em relação às gramíneas um abrigo seguro para novas inserções aparenta ser em outros retrotranspósons Outro abrigo seguro é a heterocromatina dos centrômeros na qual existem muito poucos genes mas muito DNA repetitivo ver Capítulo 12 para mais sobre a heterocromatina Muitas classes de elementos de transposição em espécies de plantas e de animais tendem a inserirse na heterocromatina centromérica Abrigos seguros em genomas pequenos Inserções dirigidas Contrariamente aos genomas de eucariotos multicelulares o genoma de leveduras unicelulares é muito compacto com genes próximos e muito poucos íntrons Com quase 70 de seu genoma como éxons existe uma alta probabilidade de que novas inserções de elementos de transposição interrompam uma sequência codificadora Ainda assim conforme vimos anteriormente neste capítulo o genoma de leveduras ampara uma coleção de retrotranspósons LTR denominados elementos Ty Como os elementos de transposição são capazes de se difundir para novos sítios nos genomas com poucos abrigos seguros Investigadores identificaram centenas de elementos Ty no genoma de leveduras sequenciado e determinaram que eles não estão distribuídos aleatoriamente Em vez disso cada família de elementos Ty inserese em uma região genômica em particular Por exemplo a família Ty3 inserese quase exclusivamente próximo dos genes de tRNA embora não nesses genes em sítios onde eles não interferem com a produção de tRNA e presumivelmente não prejudicam seus hospedeiros Os elementos Ty desenvolveram um mecanismo que possibilita a sua inserção em regiões do genoma em particular as proteínas Ty necessárias para integração interagem com proteínas específicas de levedura ligadas ao DNA genômico As proteínas Ty3 por exemplo reconhecem e se ligam às subunidades do complexo da RNA polimerase que foram reunidas em promotores de tRNA Figura 1524 A A capacidade de alguns transpósons de se inserirem preferencialmente em determinadas sequências ou regiões genômicas é denominada direcionamento Um exemplo surpreendente de direcionamento é ilustrado pelos elementos R1 e R2 de artrópodes incluindo a Drosophila R1 e R2 são LINE ver Figura 1521 que se inserem apenas em genes que produzem RNA ribossômico Em artrópodes diversas centenas de genes de rRNA estão organizadas em arranjos em tandem Figura 1524 B Com tantos genes codificando o mesmo produto o hospedeiro tolera a inserção em um subconjunto Entretanto demonstrouse que muitas inserções de R1 e R2 diminuem a viabilidade do inseto presumivelmente por meio de interferência na montagem do ribossomo Revisão da terapia gênica Este capítulo foi iniciado com uma descrição de um distúrbio genético recessivo denominado SCID doença por imunodeficiência combinada grave Os sistemas imunológicos de pessoas afetadas pela SCID estão gravemente comprometidos em virtude de uma mutação em um gene que codifica a enzima adenosina desaminase Para corrigir esse defeito genético células da medula óssea de pacientes com SCID foram coletadas e tratadas com um vetor retrovírus contendo um gene ADA normal Em seguida as células transformadas foram infundidas de volta nos pacientes Os sistemas imunólogos da maior parte dos pacientes demonstraram melhora significativa Entretanto a terapia apresentou um efeito colateral muito sério dois dos pacientes desenvolveram leucemia Em ambos os pacientes o vetor retroviral inseriuse integrouse próximo de um gene celular cuja expressão aberrante está associada à leucemia Um provável cenário é que aquela inserção do vetor retroviral próximo ao gene celular alterou a sua expressão e indiretamente causou a leucemia FIGURA 1524 Alguns elementos de transposição são direcionados a abrigos seguros específicos A O retrotranspóson Ty3 de levedura inserese na região promotora de genes de RNA transportador B Os retrotranspósons não LTR LINE R1 e R2 de Drosophila inseremse em genes que codificam RNA ribossômico que são observados em longos arranjos em tandem no cromossomo Apenas os genes de transcriptase reversa RT de R1 e R2 são destacados Claramente o sério risco associado a esse tipo de terapia gênica poderia ser bem menor se os médicos pudessem controlar onde o vetor retroviral se integra no genoma humano Já vimos que existem muitas semelhanças entre os retrotranspósons LTR e os retrovírus Existe a esperança de que ao compreendermos o direcionamento de Ty em leveduras possamos aprender como 155 construir vetores retrovirais que se inseriram com sua carga transgênica em abrigos seguros no genoma humano CONCEITOCHAVE Um elemento de transposição bemsucedido aumenta o número de cópias sem prejudicar seu hospedeiro Um modo por meio do qual um elemento aumenta com segurança o número de cópias é com o direcionamento de novas inserções para abrigos seguros regiões do genoma nas quais existem poucos genes Regulação epigenética de elementos de transposição pelo hospedeiro A análise genética é uma ferramenta muito poderosa utilizada para dissecar processos biológicos complexos por meio do isolamento de mutantes e finalmente de genes mutantes p ex ver Capítulo 13 sobre o desenvolvimento Muitos laboratórios em todo o mundo estão utilizando análises genéticas para identificar os genes hospedeiros responsáveis pela repressão de movimento dos elementos de transposição e desse modo manter a estabilidade do genoma A repressão de elementos de transposição foi investigada pela primeira vez no laboratório de Ron Plasterk no final da década de 1990 com a utilização do organismomodelo C elegans um nematódeo ver Organismomodelo no Capítulo 13 Essa história tem início com a observação de uma diferença surpreendente entre a mobilidade de um elemento de transposição denominado Tc1 em dois tipos celulares diferentes do organismomodelo O Tc1 é um transpóson de DNA que assim como o elemento Ac do milho pode levar a um fenótipo mutante instável quando é excisado de um gene com um fenótipo visível ver Figura 154 Existem 32 elementos Tc1 no genoma sequenciado da linhagem de laboratório comum denominada Bristol Significativamente Tc1 é transposto em células somáticas mas não nas células da linhagem germinativa Tal observação sugeriu a Plasterk que a transposição é reprimida na linhagem germinativa pelo hospedeiro Evidentemente a repressão na linhagem germinativa resulta do silenciamento dos genes de transposase de todas as 32 cópias do Tc1 nas células da linhagem germinativa Você consegue propor uma explicação sobre qual o sentido biológico de um hospedeiro reprimir a transposição na linhagem germinativa e não na somática Plasterk e seus colaboradores decidiram identificar os genes de C elegans responsáveis pelo silenciamento do gene da transposase Eles iniciaram com uma linhagem de C elegans que apresentava Tc1 inserido no gene unc22 designado unc22Tc1 Figura 1525 Esse era o mesmo gene que estava silenciado no experimento de Fire e Mello que os levou a compartilharem o Prêmio Nobel ver Capítulo 8 Enquanto C elegans do tipo selvagem desliza suavemente sobre a superfície do ágar em uma placa de Petri conforme ilustrado pelas setas horizontais na Figura 1525 vermes com o gene unc22Tc1 mutante apresentam um movimento de contração conforme ilustrado pelas setas verticais na Figura 1525 que pode ser facilmente observado com um microscópio Tendo em vista que Tc1 normalmente não consegue realizar transposição na linhagem germinativa ele permanece inserido no gene unc22 e continua a interromper a sua função Portanto a linhagem com o gene mutante unc22Tc1 deve expressar um fenótipo de contração de geração à geração Entretanto Plasterk e colaboradores raciocinaram que as mutações que inativavam os genes de C elegans necessários para a repressão possibilitariam a Tc1 excisarse do alelo unc22Tc1 na linhagem germinativa e reverter o fenótipo de contração para o tipo selvagem unc22 Com essa finalidade eles expuseram a linhagem unc22Tc1 mutante a uma substância química que aumentava muito a frequência de mutação denominada mutágeno ver Capítulo 16 e examinaram a sua progênie ao microscópio procurando por vermes raros que haviam deixado de apresentar a contração FIGURA 1525 Desenho experimental utilizado para identificar os genes necessários para reprimir a transposição Investigadores procuram por mutantes que tenham obtido novamente o movimento normal tendo em vista que mutações nestes indivíduos teriam incapacitado o mecanismo de repressão que evita a transposição do elemento Tc1 do gene unc22 Essa triagem genética e outras subsequentes identificaram mais de 25 genes de C elegans que quando mutados possibilitavam que o hospedeiro excisasse o Tc1 na linhagem germinativa Significativamente muitos dos produtos desses genes são componentes integrantes da via de silenciamento do RNAi incluindo proteínas observadas em Dicer e RISC ver Capítulos 8 e 12 Lembre do Capítulo 8 que Dicer se liga a dsRNA longos e os cliva em pequenos fragmentos de dsRNA Esses fragmentos em seguida se desenrolam de modo que um filamento o siRNA possa direcionar RISC para cortar mRNA complementares ver Figura 824 Iniciando com essa elegante triagem genética muitos anos de experimentação levaram ao modelo a seguir de repressão de elementos de transposição na linhagem germinativa de C elegans Com 32 elementos Tc1 dispersos por todo o genoma de C elegans alguns elementos próximos de genes são transcritos com o gene próximo por meio de transcrição contínua de leitura ver Capítulo 8 Tendo em vista que as extremidades de Tc1 são repetições terminais invertidas de 54 pb o RNA de Tc1 forma espontaneamente dsRNA Figura 1526 Assim como todos os dsRNA produzidos na maior parte dos eucariotos esse RNA é reconhecido por Dicer e finalmente o siRNA é produzido que direciona RISC para cortar os transcritos complementares de Tc1 Tendo em vista que todo RNA de Tc1 é cortado de modo eficiente na linhagem germinativa o gene da transposase codificado pelo elemento é silenciado Sem a transposase o elemento não consegue excisar Foi formulada a hipótese de que Tc1 consegue realizar transposição em células somáticas em virtude de o RNAi não ser tão eficiente e alguma transposase poder ser produzida Ao longo da última década diversos laboratórios que trabalham com plantas e animais descobriram que as mutações que rompem a via do RNAi com frequência levam à ativação de elementos de transposição em seus respectivos genomas Em virtude da abundância de elementos de transposição nos genomas eucarióticos e sua associação ancestral sugeriuse que a função natural da via do RNAi é manter a estabilidade do genoma ao reprimir o movimento dos elementos de transposição CONCEITOCHAVE Hospedeiros eucarióticos utilizam RNAi para reprimir a expressão de elementos de transposição ativos em seus genomas Desse modo um único elemento que se insere próximo de um gene pode ser transcrito para produzir dsRNA que acionará o silenciamento de todas as cópias do elemento no genoma Vigilância do genoma em animais e bactérias A via de silenciamento do RNAi é semelhante a um radar no sentido de que o hospedeiro é capaz de detectar novas inserções de transpósons no genoma se elas gerarem RNA antissenso Em seguida o hospedeiro responde por meio da produção de siRNA que tem por alvo o mRNA da transposase silenciando o gene e prevenindo o movimento de todos os membros da família de elementos de transposição TE Recentemente foram descritos dois outros tipos de radar do genoma também denominado vigilância do genoma que utilizam diferentes classes de pequenos RNA não codificadores com alvo em ácidos nucleicos invasores incluindo transpósons e vírus ver Capítulo 5 Embora ainda não completamente compreendidos esses mecanismos são apresentados aqui em virtude de ilustrarem como diferentes soluções são desenvolvidas para solucionar problemas biológicos semelhantes FIGURA 1526 A produção de dsRNA de apenas um único elemento Tc1 é suficiente para silenciar todos os genes da transposase de Tc1 e assim reprimir a transposição na linhagem germinativa O siRNA derivado do dsRNA do Tc1 é ligado ao RISC que direciona todo o RNA complementar para degradação piRNA em animais Nas linhagens germinativas de diversas espécies de animais incluindo Drosophila e mamíferos os transpósons ativos são reprimidos por meio da ação de piRNA abreviação para RNA de interação piwi Assim como os siRNA os piRNA são RNA unifilamentares curtos 26 a 30 nt em mamíferos que interagem com um complexo proteico nesse caso um que contém a proteína PiwiArgonauta da qual a sua denominação deriva Uma vez associados os piRNA orientam PiwiArgonauta a degradar os mRNA complementares Figura 1527 Contrariamente aos siRNA os piRNA não têm origem na via do RNA bifilamentar demonstrada na Figura 1526 em relação a Tc1 Em vez disso e de modo razoavelmente ingênuo os genomas de animais contêm diversos loci longos com frequência 100 kb denominados agrupamentos pi que atuam como armadilhas para apanhar transpósons ativos Um agrupamento pi é composto por remanescentes de muitos transpósons diferentes que representam um registro histórico das inserções anteriores de transpósons ativos naquele locus FIGURA 1527 A inserção dos transpósons verde e corderosa em um agrupamento pi no genoma resulta na degradação de transcritos destes dois transpósons por meio das etapas demonstradas e descritas no texto Contrariamente o transpóson amarelo permanecerá ativo até que cópias sejam inseridas ao acaso em um agrupamento pi A primeira etapa na vigilância do genoma hospedeiro é a inserção de um transpóson em um de diversos loci de agrupamentos pi dispersos pelo genoma A transcrição de agrupamentos pi produz RNA longos que podem incluir o RNA antissenso do elemento recentemente inserido Em seguida esses RNA longos são processados em piRNA finais que se associam com o PiwiArgonauta e prosseguem para degradar mRNA derivados de transpósons transcritos a partir de qualquer local no genoma Portanto um TE ativo que se insere aleatoriamente no genoma é reconhecido pela vigilância do genoma apenas quando sua inserção ocorre em um agrupamento pi e ele se torna uma parte permanente do locus crRNA em bactérias As moléculas de ácido nucleico normalmente invadem espécies bacterianas durante a infecção por bacteriófago ver Capítulo 5 quando genomas de DNA viral são injetados em bactérias ver Figura 522 Em uma via antiviral que ainda está sendo elucidada fragmentos do genoma do vírus invasor são capturados por loci bacterianos denominados CRISPR repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente agrupadas Figura 1528 nos quais são transcritos em RNA longos que são processados em crRNA curtos De modo muito semelhante aos siRNA e aos piRNA os crRNA interagem com e orientam os complexos proteicos bacterianos a degradar os RNA complementares do genoma viral invasor Uma característica compartilhada dos agrupamentos pi e dos loci CRISPR é que novas inserções de transpósons ou fragmentos de DNA viral respectivamente resultam em uma alteração genética permanente nesses loci que é herdada por suas progênies CONCEITOCHAVE Assim como siRNA piRNA em animais e crRNA em bactérias interagem com complexos proteicos e os orientam a degradar sequências complementares em transpósons e vírus respectivamente Esses pequenos RNA não codificadores têm a sua origem em RNA longos transcritos a partir de loci que capturam fragmentos de DNA invasor FIGURA 1528 Aquisição de DNA pelo locus CRISPR em algumas espécies bacterianas Parte do DNA do genoma de um fago invasor demonstrado em amarelo é incorporada ao locus CRISPR por meio de um mecanismo desconhecido O QUE OS GENETICISTAS FAZEM ATUALMENTE De modo muito semelhante a aviões que escapam de radares ao voar próximo do solo alguns transpósons desenvolveram mecanismos que os possibilitam escapar da via de silenciamento do RNAi Esses transpósons conseguem alcançar números de cópias muito altos As evidências em relação a esses mecanismos podem ser observadas nos genomas de todas as plantas e de todos os animais caracterizados que contêm famílias de transpósons tais como Alu em seres humanos que apresentam milhares de membros Como alguns transpósons evitam a detecção pela via de silenciamento do RNAi A resposta curta é que na maior parte dos casos não sabemos Para compreender como um transpóson evita ser detectado é necessário estudar ativamente os elementos em transposição Até o momento os cientistas detectaram muito poucas famílias de transpósons com altos números de cópias que ainda estão ativamente em transposição Um dos elementos mais bem caracterizados desse pequeno grupo é um tipo especial de transpóson de DNA não autônomo denominado elemento transponível miniatura com repetições invertidas MITE miniature inverted repeat transposable element Assim como outros elementos não autônomos os MITE podem formarse por deleção do gene da transposase a partir de um elemento autônomo Entretanto contrariamente à maior parte dos elementos não autônomos os MITE podem alcançar números de cópias muito altos particularmente nos genomas de alguns gramíneas ver Figura 1523 Alguns MITE em gramíneas foram amplificados até milhares de cópias O único MITE ativamente em transposição isolado até o momento é o elemento mPing do arroz que é formado a partir do elemento Ping autônomo por deleção de todo o gene da transposase Figura 1529 Esse elemento foi descoberto no laboratório de Susan Wessler por Ning Jiang Outro membro do laboratório de Wessler Ken Naito documentou que em algumas linhagens de arroz existem apenas 3 a 7 cópias de Ping e mais de 1000 cópias de mPing Notavelmente o número de cópias de mPing nessas linhagens está aumentando em quase 40 novas inserções a cada planta por geração FIGURA 1529 MITE são transpósons de DNA não autônomos que podem alcançar números de cópias muito altos tendo em vista que não codificam a transposase necessária para a sua transcrição O MITE mPing ativo é o único derivado por deleção do elemento Ping autônomo que alcançou um alto número de cópias em determinadas linhagens de arroz Duas questões a respeito do rápido aumento no número de cópias de mPing surgem imediatamente no pensamento Primeiramente como uma linhagem de arroz sobrevive a uma explosão de elementos de transposição dessa magnitude Para abordar essa questão o laboratório de Wessler utilizou a tecnologia de sequenciamento de nova geração ver Capítulo 14 para determinar os sítios de inserção de mais de 1700 elementos mPing no genoma do arroz Surpreendentemente eles observaram que o elemento evitava inserirse em éxons minimizando assim o impacto da inserção sobre a expressão gênica do arroz O mecanismo de base dessa preferência está sendo investigado atualmente A segunda questão é por que o arroz hospedeiro aparentemente falha em reprimir a transposição do mPing Embora essa questão também seja uma área ativa de pesquisas atuais uma hipótese razoável é que o mPing consiga voar abaixo do radar do RNAi dos hospedeiros tendo em vista que ele não contém qualquer parte do gene da transposase que está localizado no elemento mPing Figura 1529 Portanto a transcrição de leitura nos elementos mPing inseridos por todo o genoma do arroz produzirá muitos lotes de dsRNA e siRNA Entretanto tendo em vista que os siRNA derivados de mPing não compartilham sequência com a fonte de transposase os siRNA produzidos a partir de mPing não induzem os mecanismos de silenciamento direcionados à transposase Em vez disso o gene da transposase permanecerá ativo e continuará a catalisar a movimentação de mPing De acordo com essa hipótese a transposição de mPing será reprimida apenas quando uma inserção de Ping muito mais rara gerar dsRNA que acione o silenciamento de seu gene da transposase CONCEITOCHAVE MITE são transpósons de DNA não autônomos que conseguem alcançar altos números de cópias Embora os MITE possam utilizar a transposase de elementos autônomos eles provavelmente escapam à repressão do hospedeiro em virtude de sua amplificação não levar ao silenciamento do gene da transposase RESUMO Os elementos de transposição foram descobertos em milho por Barbara McClintock como responsáveis por diversas mutações instáveis Um exemplo de um elemento não autônomo é Ds cuja transposição requer a presença do elemento autônomo Ac no genoma As sequências de inserção de elementos bacterianos foram os primeiros elementos de transposição molecularmente isolados Existem muitos tipos diferentes de elementos IS em linhagens de E coli e eles normalmente estão presentes em diversas cópias Os transpósons compostos contêm elementos IS flanqueando um ou mais genes tais como os genes que conferem a resistência a antibióticos Os transpósons com genes de resistência conseguem se inserir em plasmídios e em seguida são transferidos por meio de conjugação para bactérias não resistentes Existem dois grupos principais de elementos de transposição em eucariotos elementos da classe 1 retrotranspósons e elementos da classe 2 transpósons de DNA O elemento P foi o primeiro transpóson de DNA eucariótico da classe 2 a ser molecularmente isolado Ele foi isolado a partir de mutações instáveis em Drosophila que foram induzidas por disgenesia híbrida Os elementos P foram desenvolvidos em vetores para a introdução de DNA exógeno nas células germinativas de Drosophila Ac Ds e P são exemplos de transpósons de DNA assim denominados em virtude de o intermediário da transposição ser o próprio elemento de DNA Elementos autônomos tais como Ac codificam uma transposase que se liga às extremidades de elementos autônomos e não autônomos e catalisa a excisão do elemento do sítio doador e a reinserção em um novo sítioalvo em algum outro local no genoma Os retrotranspósons foram molecularmente isolados pela primeira vez a partir de mutantes de leveduras e a sua semelhança com os retrovírus ficou logo evidente Os retrotranspósons são elementos da classe 1 assim como o são todos os elementos de transposição que utilizam RNA como seu intermediário de transposição Os elementos de transposição ativos isolados a partir de organismosmodelo tais como levedura Drosophila E coli e milho constituem uma fração muito pequena de todos os elementos de transposição no genoma O sequenciamento do DNA de genomas inteiros incluindo o genoma humano levou ao achado surpreendente de que quase metade do genoma humano é derivado de elementos de transposição Apesar da apresentação de tantos elementos de transposição os genomas eucarióticos são extremamente estáveis assim como a transposição é relativamente rara em virtude de dois fatores Primeiramente a maior parte dos elementos de transposição em genomas eucarióticos não consegue moverse tendo em vista que mutações inativadoras evitam a produção da transposase e da transcriptase reversa normais Em segundo lugar a expressão da maioria dos elementos remanescentes é silenciada pela via do RNAi em plantas e C elegans e da via do piRNA em animais O silenciamento de elementos de transposição depende da capacidade do hospedeiro de detectar novas inserções no genoma e de gerar pequenos RNA não codificadores que orientam os complexos proteicos a degradarem RNA complementares codificados por transpósons Alguns elementos com altos números de cópias tais como os MITE podem escapar do silenciamento em virtude de não acionarem o silenciamento da transposase que catalisa a sua transposição TERMOSCHAVE abrigo seguro agrupamento pi Alu Ativador Ac citotipo M citotipo P cointegrado cópia e colagem corte e colagem crRNA direcionamento disgenesia híbrida Dissociação Ds duplicação de sítioalvo elemento autônomo elemento curto intercalado SINE elemento de sequência de inserção IS elemento de transposição da classe 1 retrotransposon elemento de transposição da classe 2 transpóson de DNA elemento longo intercalado LINE elemento não autônomo elemento P elemento tipo copia elemento transponível miniatura com repetições invertidas MITE elemento Ty excisado factor R fenótipo instável loci CRISPR longa repetição terminal LTR LTR solo marcação de transpóson paradoxo do valor C piRNA provírus repetição invertida retrotranspóson retrotranspóson LTR retrovírus seleção negativa sintenia terapia gênica transcriptase reversa transposase transposição transposição conservativa transposição replicativa transpóson Tn transpóson composto transpóson de DNA transpóson simples transposto valor C vigilância do genoma PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 Os elementos de transposição foram denominados genes saltadores em virtude de aparentemente pularem de uma posição para outra deixando o locus antigo e aparecendo em um novo locus À luz do que agora sabemos a respeito do mecanismo de transposição quão apropriado é o termo genes saltadores em relação aos elementos de transposição bacterianos Solução Em bactérias a transposição ocorre por meio de dois modos diferentes O modo conservativo resulta em genes saltadores verdadeiros tendo em vista que nesse caso o elemento de transposição é excisado de sua posição original e é inserido em uma nova posição O outro modo é o modo replicativo Nessa via um elemento de transposição movese até uma nova localização por meio da replicação no DNAalvo deixando para trás uma cópia do elemento de transposição no sítio original Ao operar por meio do modo replicativo os elementos de transposição não são realmente genes saltadores uma vez que uma cópia permanece no sítio original Problema resolvido 2 Após a questão anterior à luz do que agora sabemos a respeito do mecanismo de transposição quão apropriado é o termo genes saltadores em relação à maioria dos elementos de transposição no genoma 1 2 3 humano e nos genomas da maior parte dos outros mamíferos Solução A maioria dos elementos de transposição nos genomas caracterizados de mamíferos é de retrotranspósons Em seres humanos dois retrotranspósons o LINE denominado L1 e o SINE denominado Alu são responsáveis por até um terço do nosso genoma inteiro Assim como os elementos bacterianos os retrotranspósons não são excisados do sítio original de modo que eles não são realmente genes saltadores Em vez disso o elemento atua como um molde para a transcrição de RNA que podem ser transcritos de modo reverso pela enzima transcriptase reversa em um cDNA bifilamentar Cada cDNA possivelmente pode inserirse em sítiosalvo por todo o genoma Observe que embora ambos os elementos bacterianos e os retrotranspósons não deixem o sítio original seus respectivos mecanismos de transposição são dramaticamente diferentes Finalmente embora os retrotranspósons LTR não sejam excisados eles podem se tornar inserções muito mais curtas em virtude da produção de LTR solo por meio de recombinação PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Na fotografia de abertura do capítulo dos grãos em uma espiga de milho qual é a base genética do que segue Dica consulte a Figura 154 para algumas indicações a Do grão totalmente pigmentado b Dos grãos não pigmentados Observe que eles podem ser originados por dois modos diferentes Na Figura 153 A qual seria o fenótipo do grão se a linhagem fosse homozigota em relação a todos os marcadores dominantes no cromossomo 9 Em relação à Figura 157 desenhe uma série de etapas que possam explicar 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a origem desse grande plasmídio que contém muitos elementos de transposição Desenhe uma figura em relação ao modo de transposição não demonstrado na Figura 158 a retrotransposição Na Figura 1510 demonstre onde a transposase precisaria realizar o corte para gerar uma duplicação no sítioalvo de 6 pb Demonstre também a localização do corte para gerar uma duplicação no sítioalvo de 4 pb Se o elemento de transposição na Figura 1514 fosse um transpóson de DNA que apresentasse um íntron no seu gene da transposase o íntron seria removido durante a transposição Justifique sua resposta Em relação à Figura 1522 desenhe o prémRNA que é transcrito a partir desse gene e em seguida desenhe o seu mRNA PROBLEMAS BÁSICOS Descreva a geração de plasmídios resistentes a múltiplos fármacos Descreva brevemente o experimento que demonstra que a transposição do elemento Ty1 em leveduras ocorre por meio de um RNA intermediário Explique como as propriedades dos elementos P em Drosophila tornam os experimentos de transferência gênica possíveis nesse organismo Embora os transpósons de DNA sejam abundantes nos genomas de eucariotos multicelulares elementos da classe 1 normalmente compõem a maior fração de genomas muito grandes tais como aqueles de seres humanos aproximadamente 2500 Mb do milho aproximadamente 2500 Mb e da cevada aproximadamente 5000 Mb Tendo em vista o que você sabe a respeito dos elementos das classes 1 e 2 o que dizer sobre os seus mecanismos de transposição distintos que seriam responsáveis por essa diferença consistente na abundância Conforme você observou na Figura 1522 os genes de eucariotos multicelulares com frequência contêm muitos elementos de transposição Por que a maior parte desses elementos não afeta a expressão do gene 13 14 15 16 17 18 O que são abrigos seguros Existem locais nos genomas bacterianos muito mais compactos que podem ser um abrigo seguro para os elementos de inserção Os Prêmios Nobel normalmente são concedidos muitos anos após a descoberta real Por exemplo James Watson Francis Crick e Maurice Wilkens receberam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1962 quase uma década após a sua descoberta da estrutura em duplahélice do DNA Entretanto Barbara McClintock recebeu o prêmio em 1983 quase quatro décadas após a sua descoberta dos elementos de transposição em milho Por que você acredita que tenha demorado tanto para que a significância da sua descoberta fosse reconhecida dessa maneira A proteína transposase consegue a Ligarse ao DNA b Catalisar a excisão de um elemento de transposição de um sítio doador c Catalisar a inserção de um elemento de transposição em um sítioalvo d Todas as alternativas anteriores Quais dos seguintes são abrigos seguros para as inserções de elementos de transposição a Íntrons b Éxons c Outros elementos de transposição d As alternativas a e c estão corretas Por que os retrotranspósons não conseguem se mover de uma célula para outra assim como os retrovírus a Porque eles não codificam a proteína Env b Porque eles são elementos não autônomos c Porque eles necessitam da transcriptase reversa d As alternativas a e b são verdadeiras Contrariamente aos retrotranspósons os transpósons de DNA a Apresentam repetições terminais invertidas b Geram uma duplicação do sítioalvo após a inserção 19 20 21 22 23 c São transpostos por meio de um RNA intermediário d Não são observados em procariotos A principal diferença entre os retrotranspósons e os retrovírus é a Os retrotranspósons codificam transcriptase reversa b Os retrovírus se movem de um sítio no genoma até outro c Os retrovírus codificam o gene env que possibilita que eles se movimentem de uma célula para outra d Nenhuma das alternativas anteriores está correta Qual das seguintes é verdadeira em relação à transcriptase reversa a Ela é necessária para a movimentação dos transpósons de DNA b Ela catalisa a síntese do DNA a partir do RNA c Ela é necessária para a transposição de retrotranspósons d As alternativas b e c estão corretas Qual elemento de transposição é utilizado para introduzir DNA exógeno na moscadasfrutas Drosophila melanogaster a Elemento Ac b Elemento P c Elemento Alu d Transpósons compostos Qual é o principal motivo pelo qual o genoma de milho é muito maior que o genoma de arroz a O milho apresenta mais genes do que o arroz b O arroz apresenta mais genes do que o milho c O milho apresenta mais transpósons de DNA do que o arroz d O milho apresenta mais retrotranspósons do que o arroz Por que os elementos de transposição são observados com muito mais frequência em íntrons do que em éxons a Porque os elementos de transposição preferem se inserir em íntrons b Porque os elementos de transposição preferem se inserir em éxons c Porque os elementos de transposição se inserem tanto em éxons como em íntrons mas a seleção remove as inserções em éxons 24 25 26 d Nenhuma das alternativas anteriores é verdadeira Aproximadamente que porcentagem do genoma humano é derivada de elementos de transposição a 10 b 25 c 50 d 75 Por que as plantas e os animais prosperam com tantos elementos de transposição em seus genomas a A maior parte dos elementos de transposição é inativa em virtude de mutação b Os elementos de transposição ativos são silenciados pelo hospedeiro c A maior parte dos elementos de transposição está inserida em abrigos seguros d Todas as alternativas anteriores são verdadeiras PROBLEMAS DESAFIADORES A inserção de elementos de transposição em genes pode alterar o padrão de expressão normal Nas situações a seguir descreva as possíveis consequências sobre a expressão gênica a Um LINE inserido em um acentuador de um gene humano b Um elemento de transposição contém um sítio de ligação para um repressor de transcrição e inserese na posição adjacente a um promotor c Um elemento Alu inserido no sítio de corte 3 AG de um íntron em um gene humano d Um elemento Ds que foi inserido no éxon de um gene de milho é excisado de modo imperfeito e deixa três pares de bases para trás no éxon e Outra excisão por aquele mesmo elemento Ds deixa dois pares de bases para trás no éxon f Um elemento Ds que foi inserido na parte intermediária de um íntron é excisado de modo imperfeito e deixa para trás cinco pares de bases no 27 28 29 30 íntron Antes da integração de um transpóson sua transposase realiza um corte desencontrado no DNAalvo do hospedeiro Se o corte desencontrado está nos sítios das setas a seguir desenhe qual será a sequência do DNA hospedeiro após o transpóson ter sido inserido Represente o transpóson como um retângulo AATTTGGCCTAGTACTAATTGGTTGG TTAAACCGGATCATGATTAACCAACC Em Drosophila M Green encontrou um alelo singed sn com algumas características incomuns As fêmeas homozigotas em relação a esse alelo ligado ao X apresentam cerdas singed mas apresentam diversas áreas de cerdas sn tipo selvagem na cabeça no tórax e no abdome Quando essas moscas são cruzadas com machos sn algumas fêmeas produzem apenas progênie singed mas outras produzem tanto progênies singed quanto do tipo selvagem em proporções variáveis Explique esses resultados Considere duas plantas do milho a Genótipo Ccm AcAc no qual cm é um alelo instável causado por uma inserção de Ds b Genótipo Ccm no qual cm é um alelo instável causado por uma inserção de Ac Quais fenótipos seriam produzidos e em quais proporções quando 1 cada planta fosse cruzada com um mutante com substituição de par de bases cc e 2 a planta na parte a fosse cruzada com a planta na parte b Presuma que Ac e c não estejam ligados que a frequência de quebra cromossômica seja insignificante e que aquele mutante cC seja Ac Você encontra sua amiga uma cientista na academia e ela começa a lhe contar sobre um gene de camundongo que ela está estudando no laboratório O produto desse gene é uma enzima necessária para produzir a pelagem 31 32 33 34 35 marrom O gene é denominado FB e a enzima é denominada enzima FB Quando FB é mutante e não consegue produzir a enzima FB a pelagem é branca A cientista diz a você que ela isolou o gene de dois camundongos com pelagem marrom e que surpreendentemente observou que os dois genes diferem pela presença de um SINE de 250 pb assim como o elemento Alu humano no gene FB de um camundongo mas não no gene do outro Ela não compreende como essa diferença é possível especialmente tendo em vista que ela determinou que ambos os camundongos produzem a enzima FB Você pode lhe ajudar a formular uma hipótese que explique por que o camundongo ainda produz a enzima FB com um elemento de transposição em seu gene FB O genoma de levedura apresenta elementos de transposição da classe 1 Ty1 Ty2 e assim por diante porém nenhum elemento da classe 2 Qual é um possível motivo pelo qual os elementos de DNA não obtiveram sucesso no genoma de levedura Além de Tc1 o genoma de C elegans contém outras famílias de transpósons de DNA tais como Tc2 Tc3 Tc4 e Tc5 Assim como Tc1 sua transposição é reprimida na linhagem germinativa mas não em células somáticas Preveja o comportamento desses elementos nas linhagens mutantes nas quais Tc1 deixou de ser reprimido em virtude de mutações na via do RNAi Justifique a sua resposta Com base no mecanismo de silenciamento gênico quais características dos elementos de transposição a via do RNAi explora para assegurar que os genes do próprio hospedeiro também não sejam silenciados Quais são as semelhanças e as diferenças entre os retrovírus e os retrotranspósons Foi formulada a hipótese de que os retrovírus se desenvolveram a partir de retrotranspósons Você concorda com esse modelo Justifique a sua resposta Você isolou um elemento de transposição do genoma humano e determinou a sequência de seu DNA Como você utilizaria essa sequência para determinar o número de cópias do elemento no genoma humano se você 36 37 38 39 acabou de receber um computador com uma conexão à Internet Dica ver Capítulo 14 No ensejo da questão anterior como você determinaria se outros primatas apresentavam um elemento semelhante nos seus genomas De todos os genes no genoma humano aqueles com as inserções de Alu mais caracterizadas são aqueles que causam a hemofilia incluindo diversas inserções nos genes do fator VIII e do fator IX Com base nesse fato seu colega formula a hipótese de que o elemento Alu prefere se inserir nesses genes Você concorda Qual outro motivo você fornece que também explica esses dados Se todos os membros de uma família de elementos de transposição podem ser silenciados pelo dsRNA sintetizado a partir de um único membro da família como é possível que uma família de elementos como Tc1 apresente 32 cópias no genoma do C elegans enquanto outra família Tc2 apresenta menos de cinco cópias Como os loci CRISPR e de agrupamento pi são alterados ao longo do tempo Mutação Reparo e Recombinação 161 162 163 164 165 U Um modelo computadorizado de dois cromossomos sofrendo um crossover Laguna DesignScience Photo LibraryScience Source TÓPICOS Consequências fenotípicas das mutações no DNA Base molecular das mutações espontâneas Base molecular das mutações induzidas Mecanismos biológicos de reparo Câncer Uma importante consequência fenotípica da mutação RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Explicar a base molecular das mutações Comparar e contrastar as origens e os efeitos das mutações espontâneas versus induzidas Descrever os diferentes mecanismos de reparo biológico Descrever as doenças genéticas humanas que são causadas por mutações nos mecanismos de reparo Discutir as diferenças entre as células cancerosas e normais Explicar por que os agentes mutagênicos podem causar alguns cânceres ma paciente jovem desenvolve uma grande quantidade de pequenas lesões cutâneas précancerosas semelhantes a sardas e é extremamente sensível à luz solar Figura 161 É obtido um histórico familiar e a paciente é diagnosticada com uma doença autossômica recessiva denominada xeroderma pigmentoso Durante toda a sua vida ela estará propensa ao desenvolvimento de cânceres pigmentados de pele Diversos genes diferentes podem ser mutados para gerar esse fenótipo de doença Em uma pessoa sem a doença cada um desses genes contribui para processos bioquímicos na célula que respondem a dano químico no DNA e o reparam antes que ele leve à formação de novas mutações Posteriormente neste capítulo veremos como as mutações nos sistemas de reparo levam a doenças genéticas tais como o xeroderma pigmentoso Pessoas com essa doença são exemplos de variantes genéticas indivíduos que demonstram diferenças fenotípicas em uma ou mais características em particular Tendo em vista que a genética é o estudo das diferenças hereditárias a análise genética não seria possível sem variantes Nos capítulos precedentes você viu muitas análises da herança de tais variantes agora consideraremos a sua origem Como surgem as variantes genéticas Dois processos principais são responsáveis pela variação genética mutação e recombinação Vimos que a mutação é uma alteração na sequência de DNA de um gene A mutação é especialmente significativa tendo em vista que é a fonte primária de alteração evolutiva novos alelos surgem em todos os organismos alguns espontaneamente e outros resultantes de exposição à radiação ou às substâncias químicas no ambiente Os novos alelos produzidos por mutação se tornam a matériaprima para um segundo nível de variação efetuado por recombinação Conforme a sua denominação sugere a recombinação é o desfecho de processos celulares que causam o agrupamento de alelos de diferentes genes em novas combinações ver Capítulo 4 Para utilizar uma analogia a mutação ocasionalmente produz uma nova carta nos jogos mas é a recombinação que embaralha as cartas e as distribui de modos diferentes FIGURA 161 A doença hereditária recessiva xeroderma pigmentoso é causada por deficiência em uma de diversas proteínas que auxiliam a corrigir o DNA danificado Essa deficiência enzimática leva à formação de cânceres de pele com a exposição da pele aos raios ultravioleta da luz solar KOKELBSIPSuperStock No ambiente celular as moléculas de DNA não são absolutamente estáveis cada par de bases em uma duplahélice de DNA apresenta uma determinada probabilidade de mutação Conforme veremos o termo mutação abrange uma ampla gama de tipos de alterações Essas alterações variam desde a simples permuta de um par de bases por outro até o desaparecimento de um cromossomo inteiro No Capítulo 17 consideraremos as alterações mutacionais que afetam cromossomos inteiros ou grandes pedaços dos cromossomos No presente capítulo enfocamos os eventos mutacionais que ocorrem em genes individuais Denominamos tais eventos mutações gênicas As células desenvolveram sistemas sofisticados para identificar e reparar DNA danificado prevenindo assim a ocorrência da maior parte das mutações mas não de todas Podemos considerar que o DNA está sujeito a um cabo de guerra dinâmico entre os processos químicos que o danificam e o levam a novas mutações e os processos de reparo celular que o monitoram constantemente em relação a tais danos para corrigilos Entretanto esse cabo de guerra não é direto 161 Conforme já mencionado as mutações fornecem a matériaprima para a evolução e portanto a introdução de um baixo nível de mutações deve ser tolerada Veremos que os sistemas de replicação do DNA e de reparo do DNA de fato podem introduzir mutações Outros transformam mutações possivelmente devastadoras tais como quebras bifilamentares em mutações que podem afetar apenas um único produto gênico Veremos que a classe possivelmente mais séria de dano ao DNA uma quebra bifilamentar também é uma etapa intermediária no processo celular normal de recombinação por meio do crossing over meiótico Portanto podemos traçar paralelos entre a mutação e a recombinação em dois níveis Primeiramente conforme mencionado anteriormente a mutação e a recombinação são as principais fontes de variação Em segundo lugar os mecanismos de reparo e recombinação do DNA apresentam algumas características em comum incluindo a utilização de algumas das mesmas proteínas Por esse motivo exploraremos primeiramente os mecanismos de reparo do DNA e em seguida os compararemos ao mecanismo de recombinação do DNA Consequências fenotípicas das mutações no DNA O termo mutação de ponto referese tipicamente à alteração de um único par de bases do DNA ou de um pequeno número de pares de bases adjacentes Nesta seção consideraremos os efeitos das referidas alterações no nível fenotípico As mutações de ponto estão classificadas em termos moleculares na Figura 162 que demonstra os principais tipos de alterações do DNA e seus efeitos sobre a função proteica quando elas ocorrem na região codificadora de proteína de um gene FIGURA 162 Mutações de ponto na região codificadora de um gene variam em seus efeitos sobre a função proteica As proteínas com mutações sinônimas e de sentido trocado normalmente ainda são funcionais Tipos de mutação de ponto Os dois tipos principais de mutação de ponto no DNA são as substituições de bases e as inserções ou deleções de bases As substituições de bases são mutações nas quais um par de bases é substituído por outro e podem ser divididas em dois subtipos transições e transversões Para descrever esses subtipos consideremos como uma mutação altera a sequência de um filamento de DNA a alteração complementar ocorrerá no outro filamento Uma transição é a substituição de uma base por outra base da mesma categoria química Uma purina é substituída por uma purina A por G ou G por A ou uma pirimidina é substituída por uma pirimidina C por T ou T por C Uma transversão é o oposto a substituição de uma base de uma categoria química por uma base da outra Uma pirimidina é substituída por uma purina C por A C por G T por A ou T por G ou uma purina é substituída por uma pirimidina A por C A por T G por C ou G por T Ao descrever as mesmas alterações no nível do filamento duplo de DNA devemos representar ambos os membros de um par de bases na mesma localização relativa Portanto um exemplo de uma transição é G C A T aquele de uma transversão é G C T A As mutações de inserção ou deleção são de fato inserções ou deleções de pares de nucleotídios não obstante a convenção é denominálas inserções ou deleções de pares de bases Coletivamente elas são denominadas mutações indel em referência a inserção deleção A mais simples dessas mutações é a adição ou a deleção de um único par de bases As mutações por vezes surgem por meio da adição ou deleção simultânea de múltiplos pares de bases de uma só vez Conforme veremos posteriormente neste capítulo os mecanismos que produzem seletivamente determinados tipos de adições ou deleções de múltiplos pares de bases são a causa de determinadas doenças genéticas humanas Consequências moleculares das mutações de ponto em uma região codificadora Quais são as consequências funcionais desses diferentes tipos de mutações de ponto Primeiramente consideramos o que ocorre quando surge uma mutação em uma parte de um gene codificadora de polipeptídio Em relação às substituições de uma única base existem diversos desfechos possíveis mas todos são consequências diretas de dois aspectos do código genético degeneração do código e existência de códons de término de tradução ver Figura 162 Mutações sinônimas A mutação altera um códon de um aminoácido por outro códon desse mesmo aminoácido As mutações sinônimas em éxons também são denominadas mutações silenciosas Mutações de sentido trocado O códon de um aminoácido é alterado por um códon de outro aminoácido As mutações de sentido trocado por vezes são denominadas mutações não sinônimas Mutações sem sentido O códon de um aminoácido é alterado para um códon de término de tradução fim As substituições sinônimas nunca alteram a sequência de aminoácidos da cadeia polipeptídica A gravidade do efeito das mutações de sentido trocado e sem sentido no polipeptídio difere caso a caso Por exemplo uma mutação de sentido trocado pode substituir um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante sendo denominada substituição conservativa Nesse caso a alteração apresenta menor probabilidade de afetar gravemente a estrutura e a função da proteína Alternativamente um aminoácido pode ser substituído por outro quimicamente diferente em uma substituição não conservativa Esse tipo de alteração apresenta maior probabilidade de causar uma alteração grave na estrutura e na função da proteína As mutações sem sentido levarão ao término antecipado da tradução Portanto elas apresentam um efeito considerável sobre a função proteica Quanto mais próxima uma mutação sem sentido estiver da extremidade 3 da matriz de leitura aberta ORF mais plausível será que a proteína resultante possa apresentar alguma atividade biológica Entretanto muitas mutações sem sentido produzem produtos proteicos completamente inativos Alterações de um único par de bases que inativam proteínas com frequência ocorrem em virtude de mutações no sítio de corte Conforme observado na Figura 163 as referidas alterações podem modificar dramaticamente o transcrito de mRNA levando a grandes inserções ou deleções que podem ocorrer na matriz de leitura ou não Assim como as mutações sem sentido as mutações indel podem apresentar consequências sobre a sequência de polipeptídios que se estendem até muito além do sítio da própria mutação ver Figura 162 Relembre que a sequência de mRNA é lida pelo aparato de tradução na matriz de leitura três bases um códon por vez A adição ou a deleção de um único par de bases do DNA altera a matriz de leitura do restante do processo de tradução a partir do sítio da mutação do par de bases até o próximo códon de fim na nova matriz de leitura Portanto essas lesões são denominadas mudança de matriz de leitura frameshift mutations Essas mutações fazem com que toda a sequência de aminoácidos downstream ao sítio mutante não apresente relação com a sequência de aminoácidos original Portanto as mudanças de matriz de leitura tipicamente resultam em perda completa da estrutura e da função proteica normal Figura 164 Consequências moleculares das mutações de ponto em uma região não codificadora Agora nos voltaremos para as mutações que ocorrem nas sequências reguladoras e em outras não codificadoras As partes de um gene que não codificam diretamente uma proteína contêm muitos sítios de ligação ao DNA cruciais para proteínas intercaladas entre as sequências que não são essenciais para a expressão ou atividade gênica No nível do DNA os sítios de ligação incluem aqueles aos quais a RNA polimerase e seus fatores associados se ligam bem como os sítios aos quais proteínas específicas reguladoras da transcrição se ligam No nível do RNA sítios de ligação importantes adicionais incluem os sítios de ligação dos ribossomos de mRNA bacterianos os sítios de corte 5 e 3 para a união de éxons em mRNA eucarióticos e sítios que regulam a tradução e localizam o mRNA em áreas e compartimentos particulares dentro da célula FIGURA 163 Dois exemplos demonstram as consequências das mutações de ponto em sítios de corte A Uma mutação por transição de C para T leva a um dinucleotídio GT no éxon formando um novo sítio de corte em 5 Como resultado 64 nucleotídios na extremidade de um éxon são removidos B Uma mutação por transversão de G para T eliminaria o sítio de corte em 5 de modo que o íntron seria retido no mRNA FIGURA 164 Mutações de ponto em regiões codificadoras podem alterar a estrutura da proteína com ou sem alteração no tamanho do mRNA As mutações de ponto em regiões reguladoras podem evitar a síntese de mRNA e proteína As ramificações de mutações em partes de um gene além dos segmentos 162 codificadores de polipeptídios são mais difíceis de prever do que as mutações nos segmentos codificadores Em geral as consequências funcionais de qualquer mutação de ponto em tal região dependem do fato de a mutação abolir ou criar um sítio de ligação As mutações que comprometem esses sítios apresentam o potencial de alterar o padrão de expressão de um gene ao alterar a quantidade do produto expresso em uma determinada ocasião ou em um determinado tecido ou ao alterar a resposta a determinados estímulos ambientais As referidas mutações reguladoras irão alterar a quantidade de produto proteico produzida mas não a estrutura da proteína Alternativamente algumas mutações em sítios de ligação podem bloquear completamente uma etapa necessária na expressão gênica normal tal como a ligação da RNA polimerase ou dos fatores de recomposição e portanto inativar totalmente o produto gênico ou bloquear a sua formação A Figura 164 demonstra alguns exemplos de como diferentes tipos de mutações dentro e fora da região codificadora podem afetar o mRNA e a proteína É importante ter em mente a distinção entre a ocorrência de uma mutação gênica ou seja uma alteração na sequência de DNA de um determinado gene e a detecção de tal evento no nível fenotípico Muitas mutações de ponto dentro das sequências não codificadoras evocam pouca ou nenhuma alteração fenotípica essas mutações estão localizadas entre os sítios de ligação ao DNA para proteínas reguladoras Tais sítios podem ser funcionalmente irrelevantes ou outros sítios dentro do gene podem duplicar a sua função Base molecular das mutações espontâneas As mutações gênicas podem surgir espontaneamente ou ser induzidas As mutações espontâneas são mutações de ocorrência natural e surgem em todas as células As mutações induzidas surgem por meio da ação de determinados agentes denominados mutágenos que aumentam a taxa na qual as mutações ocorrem Nesta seção consideraremos a natureza das mutações espontâneas Teste de flutuação de Luria e Delbrück A origem da alteração hereditária espontânea sempre foi um tópico de interesse considerável Entre as primeiras questões indagadas pelos geneticistas estava As mutações espontâneas ocorrem em resposta ao agente selecionado ou são variantes presentes a uma baixa frequência na maior parte das populações Um sistema experimental ideal para abordar essa questão importante foi a análise de mutações em bactérias que conferem resistência a agentes ambientais específicos normalmente não tolerados por células do tipo selvagem Um experimento de Salvador Luria e Max Delbrück em 1943 foi particularmente influente na moldagem da nossa compreensão sobre a natureza da mutação não apenas em bactérias mas nos organismos em geral Naquela ocasião sabiase que se bactérias E coli são espalhadas sobre uma placa de meio nutriente na presença do fago T1 os fagos logo infectam e matam as bactérias Raramente porém de modo regular eram observadas colônias resistentes ao ataque de fagos essas colônias eram estáveis e assim aparentavam ser mutantes genuínos Entretanto não se sabia se esses mutantes eram produzidos espontaneamente porém de modo aleatório no tempo ou se a presença do fago induzia uma alteração fisiológica que causava resistência Luria raciocinou que se as mutações ocorriam espontaneamente então poderiam ocorrer em ocasiões diferentes em culturas diferentes Nesse caso o número de colônias resistentes por cultura deveria demonstrar alta variação ou flutuação em suas palavras Posteriormente ele alegou que a ideia passou por sua mente quando observou os retornos flutuantes obtidos por colegas que apostavam em um caçaníquel do baile de faculdade de um country club local daí a origem do termo mutação jackpot Luria e Delbrück projetaram seu teste de flutuação como se segue Eles inocularam 20 pequenas culturas cada uma com algumas células e as incubaram até que houvesse 108 células por mililitro Ao mesmo tempo também foi inoculada uma cultura muito maior e ela foi incubada até que houvesse 108 células por mililitro As 20 culturas individuais e 20 amostras de mesmo tamanho da cultura grande foram plaqueadas na presença do fago As 20 culturas individuais demonstraram alta variação no número de colônias resistentes 11 placas apresentaram 0 colônia resistente e as remanescentes apresentaram 1 1 3 5 5 6 35 64 e 107 por placa Figura 165 A As 20 amostras da cultura grande demonstraram muito menos variação placa a placa todas na faixa de 14 a 26 Se o fago estivesse induzindo mutações não haveria motivo para a flutuação ser mais alta nas culturas individuais tendo em vista que todas foram expostas ao fago de modo semelhante A melhor explicação era que a mutação estava ocorrendo aleatoriamente no tempo as mutações iniciais proporcionaram números mais altos de células resistentes pois as células mutantes tiveram tempo para produzir muitos descendentes resistentes As últimas mutações produziram menos células resistentes Figura 165 B Esse resultado levou ao paradigma da mutação isso é seja em vírus bactérias ou eucariotos podem ocorrer mutações em qualquer célula em qualquer ocasião e a sua ocorrência é aleatória Por esse e por outro trabalho Luria e Delbrück receberam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1969 Curiosamente isso ocorreu após o primeiro aluno de pós graduação de Luria James Watson ter recebido o seu Prêmio Nobel com Francis Crick em 1964 pela descoberta da estrutura de duplahélice do DNA FIGURA 165 Estes heredogramas celulares ilustram as expectativas de duas hipóteses contrastantes a respeito da origem de células resistentes Essa análise elegante sugere que as células resistentes são selecionadas pelo agente ambiental aqui o fago em vez de produzidas por ele A existência de mutantes em uma população pode ser demonstrada diretamente antes da seleção Essa demonstração foi possibilitada por meio da utilização de uma técnica denominada plaqueamento em réplica desenvolvida em grande parte por Esther Lederberg em 1952 Uma população de bactérias foi plaqueada em meio não seletivo ou seja um meio não contendo fagos e cresceu uma colônia a partir de cada célula Essa placa foi denominada placa máster Um pedaço de veludo estéril foi pressionado levemente sobre a superfície da placa máster e o veludo coletou células em todos os locais onde havia uma colônia Figura 166 Desse modo o veludo coletou uma impressão das colônias da placa inteira Em seguida placasréplica contendo meio seletivo ou seja contendo o fago T1 foram tocadas com o veludo Ao toque das placas com o veludo as células contidas nele foram inoculadas nas placasréplica nas mesmas posições relativas daquelas das colônias na placa máster original Conforme esperado foram observadas colônias mutantes resistentes raras nas placasréplica mas as múltiplas placasréplica demonstraram padrões idênticos de colônias resistentes Figura 167 Se as mutações houvessem ocorrido após a exposição aos agentes seletivos os padrões em relação a cada placa teriam sido tão aleatórios quanto as próprias mutações Os eventos de mutação devem ter ocorrido antes da exposição ao agente seletivo Novamente esses resultados confirmam que a mutação está ocorrendo aleatoriamente o tempo todo em vez de em resposta a um agente seletivo CONCEITOCHAVE A mutação é um processo aleatório Qualquer alelo em qualquer célula pode sofrer mutação em qualquer ocasião Mecanismos de mutações espontâneas As mutações espontâneas têm origem a partir de uma diversidade de fontes Uma fonte é o processo de replicação do DNA Embora a replicação do DNA seja um processo notavelmente preciso são produzidos erros na cópia de milhões e até mesmo bilhões de pares de bases em um genoma As mutações espontâneas também surgem em parte porque o DNA é uma molécula muito frágil e o próprio ambiente celular pode danificálo Conforme descrito no Capítulo 15 as mutações podem ser causadas até mesmo pela inserção de um elemento de transposição de outro local do genoma Neste capítulo enfocamos as mutações que não são causadas por elementos de transposição Erros na replicação do DNA Pode resultar um erro na replicação do DNA quando um par incorreto de nucleotídios digamos AC é formado na síntese de DNA levando a uma substituição de bases que pode ser uma transição ou uma transversão Outros erros podem adicionar ou subtrair pares de bases de modo que é criada uma mudança de matriz de leitura FIGURA 166 O plaqueamento em réplica revela colônias mutantes em uma placa máster por meio do seu comportamento em placasréplica seletivas FIGURA 167 Os padrões idênticos nas réplicas demonstram que as colônias resistentes são da placa máster Transições Você viu no Capítulo 7 que cada uma das bases no DNA pode estar presente em uma de diversas formas tautoméricas que podem parear com a base errada Malpareamentos também podem resultar quando uma das bases se torna ionizada Esse tipo de pareamento incorreto pode ocorrer mais frequentemente do que os malpareamentos decorrentes de tautomerização Esses erros com frequência são corrigidos pela função de revisão edição da DNA pol III bacteriana ver Figura 718 Se a revisão não ocorrer todos os malpareamentos descritos até então levam a mutações de transição nas quais uma purina substitui uma purina ou uma pirimidina substitui uma pirimidina ver Figura 162 Outros sistemas de reparo descritos posteriormente neste capítulo corrigem muitas das bases malpareadas que escapam à correção pela função de edição da polimerase Transversões Em mutações por transversão uma pirimidina substitui uma purina ou viceversa ver Figura 162 A criação de uma transversão por um erro de replicação necessitaria em algum ponto no curso da replicação o pareamento errôneo de uma purina com uma purina ou de uma pirimidina com uma pirimidina Embora as dimensões da duplahélice de DNA tornem tais malpareamentos energeticamente desfavoráveis agora sabemos a partir de estudos de difração de raios X que podem ser formados pares GA bem como outros pares de purinas com purinas Mudanças de matriz de leitura Os erros de replicação também podem levar a mudanças de matriz de leitura Relembre do Capítulo 9 que as referidas mutações resultam em proteínas muito alteradas Determinados tipos de erros de replicação podem levar a mutações indel ou seja inserções ou deleções de um ou mais pares de bases que produzem mudanças de matriz de leitura quando adicionam ou subtraem uma quantidade de bases não divisível por três o tamanho de um códon nas regiões codificadoras de proteína O modelo predominante Figura 168 propõe que as mutações indel surgem quando alças nas regiões unifilamentares são estabilizadas por pareamento deslocado slipped de sequências repetidas no curso da replicação Esse mecanismo por vezes é denominado replicação deslocada Lesões espontâneas Além dos erros de replicação lesões espontâneas danos no DNA de ocorrência natural podem gerar mutações Duas das lesões espontâneas mais frequentes resultam da depurinação e desaminação A depurinação a mais comum das duas é a perda de uma base purina A depurinação consiste na interrupção da ligação glicosídica entre a base e a desoxirribose e a subsequente perda de uma guanina ou adenina do DNA O arcabouço do DNA permanece intacto Uma célula de mamífero perde de modo espontâneo aproximadamente 10000 purinas de seu DNA em um período de ciclo celular de 20 horas a 37C Se essas lesões persistissem elas resultariam em um dano genético significativo tendo em vista que na replicação os sítios apurínicos resultantes não conseguem especificar uma base complementar à purina original Entretanto conforme veremos posteriormente no capítulo sistemas de reparo eficientes removem os sítios apurínicos Sob determinadas condições descritas posteriormente uma base pode ser inserida através de um sítio apurínico essa inserção com frequência resultará em uma mutação A desaminação da citosina produz uracila Os resíduos de uracila não reparados irão parearse com adenina na replicação resultando na conversão de um par G C em um par A T uma transição G C A T Bases danificadas de modo oxidativo representam um terceiro tipo de lesão espontânea que gera mutações Espécies ativas de oxigênio tais como radicais superóxido O2 peróxido de hidrogênio H2O2 e radicais hidroxila OH são subprodutos do metabolismo aeróbico normal Elas podem causar danos oxidativos ao DNA bem como nos precursores do DNA como GTP resultando em mutação As mutações por danos oxidativos foram implicadas em uma diversidade de doenças humanas A Figura 169 demonstra dois produtos de dano oxidativo O produto da 8oxo7hidrodesoxiguanosina 8oxo dG ou GO com frequência induz pareamento errôneo com A resultando em um alto nível de transversões G T O produto timidina glicol bloqueia a replicação do DNA se não reparado CONCEITOCHAVE Mutações espontâneas podem ser geradas por meio de diferentes processos Erros de replicação e lesões espontâneas geram a maior parte das substituições de bases espontâneas Os erros de replicação também podem causar deleções que levam a mudanças de matriz de leitura FIGURA 168 Inserções e deleções de bases mutações indel causam mudanças de matriz de leitura por meio do pareamento errôneo de sequências repetidas no curso da replicação Mutações espontâneas em seres humanos Doenças por repetições de trinucleotídios A análise da sequência de DNA revelou as mutações gênicas que contribuem para diversas doenças hereditárias humanas Muitas são como esperado substituições de bases ou tipo indel de um único par de bases Entretanto algumas mutações são mais complexas Uma diversidade desses distúrbios humanos ocorre em virtude da duplicação de sequências curtas repetidas Um mecanismo comum responsável por uma diversidade de doenças genéticas é a expansão de uma repetição de três pares de bases Por esse motivo elas são denominadas doenças por repetição de trinucleotídios Um exemplo é a doença humana denominada síndrome do X frágil Essa doença é a forma mais comum de comprometimento mental hereditário que ocorre em aproximadamente 1 de 1500 homens e 1 de 2500 mulheres Ela se manifesta citologicamente por um sítio frágil no cromossomo X que resulta em quebras in vitro mas isso não leva ao fenótipo da doença A síndrome do X frágil resulta de mudanças no número de uma repetição de CGGn em uma região do gene FMR1 que é transcrita mas não traduzida Figura 1610 A FIGURA 169 Produtos formados após o DNA ter sido atacado por radicais de oxigênio Abreviação dR Desoxirribose Como o número de repetições se correlaciona ao fenótipo da doença Os seres humanos normalmente demonstram variação considerável no número de repetições CGG no gene FMR1 que variam de 6 a 54 com o alelo mais frequente contendo 29 repetições Por vezes genitores e avós não afetados dão origem a diversos descendentes com a síndrome do X frágil Os descendentes com os sintomas da doença apresentam enorme número de repetições que variam de 200 a 1300 Figura 1610 B Também se observou que os genitores e os avós não afetados contêm um aumento no número de cópias da repetição mas que variam de apenas 50 a 200 Por esse motivo tem sido dito que esses ancestrais carreiam prémutações As repetições nesses alelos prémutados não são suficientes para causar o fenótipo da doença mas são muito mais instáveis ou seja facilmente expandidas do que os alelos normais e assim levam a uma expansão ainda maior na sua descendência Em geral quanto mais expandida a repetição maior a instabilidade parece ser FIGURA 1610 O gene FMR1 na síndrome do X frágil A Estrutura do éxon e repetição CGG upstream B Transcrição e metilação em alelos normais prémutação e mutação total Os círculos vermelhos representam os grupos metil Dados de W T ODonnell e S T Warren Annu Rev Neurosci 25 2002 315 338 Fig 1 O mecanismo proposto em relação à geração dessas repetições é o deslize na replicação que ocorre no período da síntese de DNA Figura 1611 Entretanto a frequência extraordinariamente alta de mutação nas repetições de trinucleotídios na síndrome do X frágil sugere que em células humanas após um limiar de aproximadamente 50 repetições o maquinário de replicação não consegue replicar fielmente a sequência correta e ocorrem grandes variações no número de repetições Outras doenças tais como a doença de Huntington ver Capítulo 2 também foram associadas à expansão das repetições de trinucleotídios em um gene ou em suas regiões reguladoras Diversos temas gerais se aplicam a essas doenças Na doença de Huntington por exemplo o gene do tipo selvagem HD inclui uma sequência repetida com frequência na região codificadora da proteína e a mutação está correlacionada com uma expansão considerável dessa região repetida A gravidade da doença está correlacionada com o número de cópias repetidas A doença de Huntington e a doença de Kennedy também denominada atrofia muscular bulbar e espinal ligada ao X resultam da amplificação de uma repetição de três pares de bases CAG Pessoas não afetadas apresentam uma média de 19 a 21 repetições CAG enquanto os pacientes afetados apresentam uma média de aproximadamente 46 Na doença de Kennedy que é caracterizada por fraqueza e atrofia muscular progressiva a expansão da repetição de trinucleotídios está no gene que codifica o receptor de andrógeno FIGURA 1611 As regiões de repetições de trinucleotídios são propensas a malpareamento durante a replicação alça vermelha Consequentemente a mesma região de repetições de trinucleotídios pode ser duplicada duas vezes no curso da replicação As propriedades comuns a algumas doenças por repetição de trinucleotídios sugerem um mecanismo comum por meio do qual os fenótipos anormais são produzidos Primeiramente muitas dessas doenças aparentam incluir neurodegeneração ou seja morte celular dentro do sistema nervoso central Em segundo lugar nas referidas doenças as repetições de trinucleotídios ocorrem nas matrizes de leitura abertas dos transcritos do gene mutado levando a expansões ou contrações do número de repetições de um único aminoácido no polipeptídio p ex repetições de CAG codificam uma repetição de poliglutamina Desse modo é fácil compreender o motivo de essas doenças resultarem de expansões de unidades do tamanho de códons com o comprimento de três pares de bases Entretanto essa explicação não é válida para todas as doenças por repetição de trinucleotídios Afinal na síndrome do X frágil a expansão de trinucleotídios está 163 próxima da extremidade de 5 do mRNA do FMR1 antes do sítio de início da tradução Portanto não podemos atribuir as anormalidades fenotípicas das mutações no FMR1 a um efeito sobre a estrutura proteica Uma pista para o problema com os genes FMR1 mutantes é que contrariamente ao gene normal eles são hipermetilados uma característica associada aos genes transcricionalmente silenciados ver Figura 1610 B Com base nesses achados supõese que a repetição expandida leva a alterações na estrutura da cromatina que silenciam a transcrição gênica mutante ver Capítulo 12 Em amparo a esse modelo está o achado de que o gene FMR1 está deletado em alguns pacientes com síndrome do X frágil Essas observações amparam uma mutação de perda de função CONCEITOCHAVE Doenças por repetição de trinucleotídios surgem por meio da expansão do número de cópias de uma sequência de três pares de bases normalmente presente em diversas cópias com frequência na região codificadora de um gene Base molecular das mutações induzidas Enquanto algumas mutações são produzidas espontaneamente dentro da célula outras fontes de mutação estão presentes no ambiente aplicadas intencionalmente em laboratório ou encontradas naturalmente na vida diária A produção de mutações em laboratório por meio da exposição a mutágenos é denominada mutagênese e dizse que o organismo é mutagenizado Mecanismos de mutagênese Os mutágenos induzem mutações por meio de no mínimo três mecanismos diferentes Eles podem substituir uma base no DNA alterar uma base de modo que ela realize especificamente o pareamento errôneo com outra base ou danificar uma base de modo que ela não consiga mais parear com qualquer base sob condições normais Induzir mutações em genes e observar as consequências fenotípicas é uma das estratégias experimentais primárias utilizadas pelos geneticistas Incorporação de análogos de bases Alguns compostos químicos são suficientemente semelhantes às bases nitrogenadas normais do DNA de modo que ocasionalmente eles são incorporados ao DNA em lugar das bases normais os referidos compostos são denominados análogos de bases Após o seu posicionamento esses análogos apresentam propriedades de pareamento diferentes àquelas das bases normais portanto eles podem produzir mutações ao causar a inserção de nucleotídios incorretos em oposição a eles na replicação O análogo de base original existe apenas em um único filamento mas pode causar uma substituição de par de nucleotídios que é replicada em todas as cópias do DNA descendentes do filamento original Um análogo de base amplamente utilizado em pesquisas é a 2aminopurina 2 AP Esse análogo da adenina consegue se parear com a timina mas também consegue realizar o pareamento errôneo com a citosina quando protonado conforme demonstrado na Figura 1612 Portanto quando a 2AP é incorporada no DNA por meio do pareamento com timina ela consegue gerar transições A T G C por meio do pareamento errôneo com citosina nas replicações subsequentes Ou se 2AP for incorporada por meio do pareamento errôneo com citosina então resultarão transições G C A T quando ela parear com timina Estudos genéticos demonstraram que 2AP causa quase exclusivamente transições Malpareamento específico Alguns mutágenos não são incorporados ao DNA mas em vez disso alteram uma base de modo que ela formará um malpareamento específico Determinados agentes alquilantes tais como o etilmetanossulfonato EMS e a amplamente utilizada nitrosoguanidina NG operam por meio dessa via FIGURA 1612 A Um análogo da adenina a 2aminopurina 2AP consegue parear com timina B Em seu estado protonado 2AP consegue parear com citosina Tais agentes adicionam grupos alquila um grupo etil em EMS e um grupo metil em NG a muitas posições em todas as quatro bases Entretanto a formação de uma mutação está mais bemcorrelacionada com uma adição ao oxigênio na posição 6 da guanina para criar uma O6alquilguanina Essa adição leva ao malpareamento direto com timina conforme demonstrado na Figura 1613 que resultará em transições G C A T na próxima rodada de replicação Os agentes alquilantes também podem modificar as bases em dNTPs em que N é qualquer base os quais são precursores na síntese de DNA Agentes intercalares Os agentes intercalares formam outra classe importante de modificadores de DNA Esse grupo de compostos inclui a proflavina a acridina laranja e uma classe de substâncias químicas denominadas compostos ICR Figura 1614 A Esses agentes são moléculas planares que mimetizam pares de bases e que conseguem inserirse intercalarse entre as bases nitrogenadas empilhadas no cerne da duplahélice de DNA Figura 1614 B Nessa posição intercalada tal agente pode causar uma inserção ou uma deleção de um único par de nucleotídios FIGURA 1613 O tratamento com EMS altera a estrutura da guanina e da timina e leva a malpareamentos Danos a bases Um grande número de mutágenos danifica uma ou mais bases e assim nenhum pareamento de bases específico é possível O resultado é um bloqueio de replicação tendo em vista que a síntese de DNA não prosseguirá além de uma base que não consegue especificar seu parceiro complementar por meio de pontes de hidrogênio Os bloqueios de replicação podem causar mutações adicionais conforme será explicado posteriormente no capítulo ver seção sobre o reparo por excisão de bases A luz ultravioleta normalmente causa danos às bases nucleotídicas na maior parte dos organismos pois gera uma diversidade de tipos distintos de alterações no DNA denominados fotoprodutos da palavra foto em referência à luz Desses produtos os que mais provavelmente levam a mutações são duas lesões diferentes que unem resíduos de pirimidina adjacentes no mesmo filamento Esses fotoprodutos são o fotodímero pirimidina ciclobutano e o fotoproduto 64 Figura 1615 A radiação ionizante resulta na formação de moléculas ionizadas e excitadas que podem danificar o DNA Em virtude da natureza aquosa dos sistemas biológicos as moléculas geradas pelos efeitos da radiação ionizante sobre a água produzem a maior parte dos danos São produzidos muitos tipos diferentes de espécies reativas de oxigênio mas as que causam mais danos às bases do DNA são OH O2 e H2O2 Essas espécies levam à formação de diferentes adutos e produtos de degradação Entre os mais prevalentes ilustrados na Figura 169 estão a timidina glicol e 8oxo dG ambas podendo resultar em mutações A radiação ionizante também pode danificar o DNA diretamente em vez de por meio de espécies reativas de oxigênio Tal radiação pode causar a quebra da ligação Nglicosídica levando à formação de sítios apurínicos ou apirimidínicos e pode causar quebras de filamentos De fato as quebras de filamentos são responsáveis pela maior parte dos efeitos letais da radiação ionizante FIGURA 1614 Estruturas de agentes intercalares comuns A e sua interação com o DNA B Dados de L S Lerman The Structure of the DNAAcridine Complex Proc Natl Acad Sci USA 49 1963 94 FIGURA 1615 Os fotoprodutos que unem pirimidinas adjacentes no DNA estão fortemente correlacionados com mutagênese A aflatoxina B1 é um poderoso carcinógeno que se une à guanina na posição N 7 Figura 1616 A formação desse produto de adição leva à quebra da ligação entre a base e o açúcar liberando assim a base e gerando um sítio apurínico A aflatoxina B1 é um membro de uma classe de carcinógenos químicos conhecidos como produtos de adição volumosos quando eles se ligam de modo covalente ao DNA Outros exemplos incluem os epóxidos diol de benzoapireno um composto produzido por mecanismos de combustão interna Todos os compostos dessa classe induzem mutações embora por mecanismos nem sempre claros CONCEITOCHAVE Os mutágenos induzem mutações por meio de uma diversidade de mecanismos Alguns mutágenos mimetizam bases normais e são incorporados ao DNA onde podem parear de modo incorreto Outros danificam as bases e causam malpareamento específico ou destroem o pareamento causando o não reconhecimento de bases Teste de Ames Avaliação de mutágenos em nosso ambiente Foi sintetizado um número enorme de compostos químicos e muitos apresentam possíveis aplicações comerciais Aprendemos pelo modo mais difícil que os possíveis benefícios dessas aplicações devem ser ponderados com relação aos riscos para a saúde e ambientais Portanto é essencial a apresentação de técnicas de triagem eficientes para avaliar alguns dos riscos de um grande número de compostos FIGURA 1616 A aflatoxina B1 metabolicamente ativada se liga ao DNA Muitos compostos são possíveis agentes causadores de câncer carcinógenos e assim a apresentação de sistemasmodelo válidos nos quais a carcinogênese dos compostos possa ser avaliada de modo eficiente e efetivo é muito importante Entretanto a utilização de um sistemamodelo de mamífero tal como o camundongo é muito lenta consome muito tempo e é dispendiosa Na década de 1970 Bruce Ames reconheceu que existe uma forte correlação entre a capacidade dos compostos de causarem câncer e mutações Ele conjeturou que a medição das taxas de mutação em sistemas bacterianos seria um modelo eficaz para a avaliação da mutagenicidade dos compostos como um primeiro nível de detecção de possíveis carcinógenos Entretanto tornouse claro que nem todos os carcinógenos eram por si próprios mutagênicos em vez disso alguns metabólitos de carcinógenos produzidos no corpo são de fato os agentes mutagênicos Tipicamente esses metabólitos são produzidos no fígado e as reações enzimáticas que convertem os carcinógenos em metabólitos bioativos não ocorrem em bactérias Ames percebeu que ele poderia superar esse problema por meio do tratamento de linhagens especiais da bactéria Salmonella typhimurium com extratos de fígado de rato contendo enzimas metabólicas Figura 1617 As linhagens especiais de S typhimurium apresentavam um dos vários alelos mutantes de um gene responsável pela síntese de histidina que sabidamente são conhecidos por reverter ou seja retornar ao fenótipo do tipo selvagem apenas por meio de determinados tipos de eventos mutacionais adicionais Por exemplo um alelo denominado TA100 poderia ser revertido para o tipo selvagem apenas por mutação de substituição de base enquanto TA1538 e 1535 poderiam ser revertidos apenas por mutações indel que resultam em uma mudança de matriz de leitura da proteína Figura 1618 As bactérias tratadas de cada uma dessas linhagens foram expostas ao composto do teste e em seguida foram cultivadas em placas de Petri contendo meio sem histidina A ausência desse nutriente assegurou que apenas os indivíduos revertentes contendo a substituição de base apropriada ou mudança de matriz de leitura cresceriam O número de colônias em cada placa e o número total de bactérias testadas foram determinados possibilitando que Ames medisse a frequência da reversão Os compostos que produziam metabólitos que induziam elevados níveis de reversão em relação aos extratos de fígado de controle não tratados seriam então claramente mutagênicos e seriam possíveis carcinógenos Portanto o teste de Ames proporcionou um modo importante para triar milhares de compostos e avaliar um aspecto de seu risco para a saúde e o ambiente Ele ainda está em uso atualmente como uma importante ferramenta para a avaliação da segurança de compostos químicos FIGURA 1617 Resumo do procedimento utilizado no teste de Ames Enzimas hepáticas solubilizadas S9 são adicionadas a uma suspensão de bactérias auxotróficas em uma solução do possível carcinógeno X A mistura é plaqueada em um meio que não contém histidina A presença de revertentes indica que a substância química é um mutágeno e possivelmente também um carcinógeno 164 FIGURA 1618 TA100 TA1538 e TA1535 são linhagens de Salmonella que contêm diferentes mutações auxotróficas de histidina A linhagem TA100 é altamente sensível à reversão por meio da substituição de par de bases As linhagens TA1535 e TA1538 são sensíveis à reversão por meio da mudança de matriz de leitura Os resultados do teste demonstram que a aflatoxina B1 é um mutágeno potente que causa substituições de pares de bases mas não mudanças de matriz de leitura Dados de J McCann e B N Ames in W G Flamm e M A Mehlman eds Advances in Modern Technology vol 5 Direitos autorais por Hemisphere Publishing Corporation Washington DC Mecanismos biológicos de reparo Após pesquisar os diversos modos por meio dos quais o DNA pode ser danificado sejam fontes intracelulares replicação oxigênio reativo e assim por diante ou extracelulares ambientais luz UV radiação ionizante mutágenos você pode estar ponderando como a vida conseguiu superar esses obstáculos e evoluir durante bilhões de anos O fato é que os organismos que variam desde bactérias até seres humanos e plantas conseguem reparar de modo eficiente seus DNA Esses organismos utilizam uma diversidade de mecanismos de reparo que em conjunto empregam cerca de 100 proteínas conhecidas De fato nossa atual compreensão de é que o DNA é a única molécula que os organismos reparam em vez de substituir Conforme você verá a falha desses sistemas de reparo é uma causa significativa das muitas doenças humanas hereditárias O mais importante mecanismo de reparo foi mencionado brevemente no Capítulo 7 a função de revisão das DNA polimerases que replicam o DNA como parte do replissomo Conforme lá observado tanto a DNA polimerase I quanto a DNA polimerase III são capazes de realizar a excisão das bases malpareadas inseridas erroneamente Agora examinaremos algumas das outras vias de reparo iniciando com o reparo sem erros Reversão direta de DNA danificado O modo mais direto de reparar uma lesão é revertêla diretamente regenerando assim a base normal Figura 1619 Embora a maior parte dos tipos de danos seja essencialmente irreversível as lesões podem ser reparadas por meio de reversão direta em alguns casos Um caso é um fotodímero mutagênico causado pela luz UV O dímero de pirimidina ciclobutano CPD pode ser reparado por uma enzima denominada CPD fotoliase A enzima se liga ao fotodímero e o divide para regenerar as bases originais Esse mecanismo de reparo é denominado fotorreativação tendo em vista que a enzima necessita de luz para atuar São necessárias outras vias de reparo para remover danos de UV na ausência de luz do comprimento de onda apropriado 300 nm Alquiltransferases são enzimas que também revertem as lesões diretamente Elas removem determinados grupos alquila que foram adicionados à posição O6 da guanina ver Figura 1613 por mutágenos tais como nitrosoguanidina e etilmetanossulfonato A metiltransferase de E coli tem sido bem estudada Essa enzima transfere o grupo metil da O6metilguanina para um resíduo de cisteína no sítio ativo da enzima Entretanto a transferência inativa a enzima e assim esse sistema de reparo pode ser saturado se o nível de alquilação for suficientemente alto FIGURA 1619 A enzima CPD fotoliase divide um fotodímero de pirimidina ciclobutano para reparar esta mutação Reparo por excisão de base Um princípio abrangente que orienta os sistemas genéticos celulares é o poder da complementaridade da sequência de nucleotídios Lembre que a análise genética também depende fortemente desse princípio Sistemas de reparo importantes exploram as propriedades da complementaridade antiparalela para restaurar os segmentos de DNA danificados até o seu estado não danificado inicial Nesses sistemas uma base ou um segmento mais longo de uma cadeia de DNA é removido e substituído por um segmento de nucleotídios recémsintetizado complementar ao filamentomolde oposto Contrariamente aos exemplos de reversão de danos descritos na seção precedente essas vias incluem a remoção e a substituição de uma ou mais bases O primeiro sistema de reparo desse tipo que examinaremos é o reparo por excisão de base Após a revisão do DNA pela DNA polimerase o reparo por excisão de base é o mecanismo mais importante utilizado para remover bases incorretas ou danificadas O principal alvo do reparo por excisão de base é o dano não volumoso a bases Esse tipo de dano pode resultar da diversidade de causas mencionadas nas seções precedentes incluindo metilação desaminação oxidação ou perda espontânea de uma base do DNA O reparo por excisão de base Figura 1620 é realizado por DNA glicosilases que clivam as ligações baseaçúcar liberando assim as bases alteradas e gerando sítios apurínicos ou apirimidínicos AP Uma enzima denominada endonuclease AP em seguida corta o filamento danificado upstream do sítio AP Uma terceira enzima desoxirribofosfodiesterase limpa o arcabouço ao remover um trecho de resíduos açúcarfosfato vizinhos de modo que uma DNA polimerase possa preencher o intervalo com nucleotídios complementares ao outro filamento A DNA ligase em seguida sela o novo nucleotídio no arcabouço ver Figura 1620 Existem diversas DNA glicosilases Uma a uracilaDNA glicosilase remove a uracila do DNA As unidades de uracila que resultam da desaminação espontânea da citosina ver anteriormente podem levar a uma transição de C para T se não forem reparadas Uma vantagem de ter timina 5metiluracila em vez da uracila como parceira natural de pareamento da adenina no DNA é que os eventos de desaminação espontânea da citosina podem ser reconhecidos como anormais e em seguida podem ser excisados e reparados Se a uracila fosse um constituinte normal do DNA tal reparo não seria possível Entretanto a desaminação impõe outros problemas para as bactérias e os eucariotos Ao analisar um grande número de mutações no gene lacI Jeffrey Miller identificou locais no gene nos quais uma ou mais bases estavam propensas a mutações frequentes Miller observou que esses assim denominados pontos quentes hotspots mutacionais correspondiam a desaminações em determinados resíduos de citosina A análise da sequência de DNA de hotspots de transição G C T A no gene lacI demonstrou que resíduos de 5metilcitosina estão presentes em cada hotspot Relembre do Capítulo 12 que o DNA eucariótico pode ser metilado para inativar genes De modo semelhante E coli e outras bactérias também metilam o seu DNA embora para diferentes finalidades Alguns dos dados desse estudo de lacI estão demonstrados na Figura 1621 A altura de cada barra no gráfico representa a frequência de mutações em cada sítio Podese observar que as posições dos resíduos de 5metilcitosina estão bem correlacionadas com os sítios mais mutáveis FIGURA 1620 No reparo por excisão de base as bases danificadas são removidas e reparadas por meio da ação sequencial de uma DNA glicosilase uma endonuclease AP uma desoxirribofosfodiesterase dRpase uma DNA polimerase e uma ligase Por que as 5metilcitosinas são hotspots para mutações A desaminação da 5 metilcitosina gera timina 5metiluracila FIGURA 1621 Hotspots de metilcitosina em E coli Mutações sem sentido em 15 sítios diferentes em lacI foram registradas Todas resultaram em transições G C A T O asterisco marca as posições das 5 metilcitosinas e as barras brancas marcam os sítios nos quais transições sabidamente ocorridas não foram isoladas nesse grupo Dados de C Coulondre J H Miller P J Farabaugh e W Gilbert Molecular Basis of Base Substitution Hotspots in Escherichia coli Nature 274 1978 775 A timina não é reconhecida pela enzima uracilaDNA glicosilase e assim não é reparada Portanto as transições C T geradas pela desaminação são observadas mais frequentemente nos sítios de 5metilcitosina em virtude de escaparem a esse sistema de reparo Uma consequência da frequente mutação da 5metilcitosina em timina é que as regiões metiladas do genoma que normalmente são transcricionalmente inativas ver Capítulo 12 são convertidas ao longo do tempo evolutivo em regiões ricas em AT Contrariamente as regiões codificadoras e reguladoras que são menos metiladas permanecem ricas em GC CONCEITOCHAVE No reparo por excisão de base dano não volumoso ao DNA é reconhecido por uma de diversas enzimas denominadas DNA glicosilases que clivam as ligações baseaçúcar liberando a base incorreta O reparo consiste na remoção do sítio que agora não tem uma base e na inserção da base correta conforme orientada pela base complementar no filamento não danificado Reparo por excisão de nucleotídio Embora a maioria dos danos sofridos por um organismo seja um pequeno dano de base que pode ser reparado por meio do reparo por excisão de base esse mecanismo não consegue corrigir adições volumosas que distorcem a hélice do DNA adições tais como os dímeros de pirimidina ciclobutano causados pela luz UV ver Figura 1615 nem corrigir dano a mais de uma base Uma DNA polimerase não consegue continuar a síntese de DNA após tais lesões e assim o resultado é um bloqueio na replicação Uma forquilha de replicação bloqueada pode causar a morte celular De modo semelhante uma base anormal ou danificada pode parar o complexo de transcrição Para lidar com ambas essas situações procariotos e eucariotos utilizam uma via extremamente versátil denominada reparo por excisão de nucleotídio NER que é capaz de desfazer os bloqueios da replicação e da transcrição e reparar o dano Curiosamente duas doenças autossômicas recessivas em seres humanos o xeroderma pigmentoso XP e a síndrome de Cockayne são causadas por defeitos no reparo por excisão de nucleotídio Embora os pacientes com XP ou síndrome de Cockayne sejam excepcionalmente sensíveis à luz UV outros sintomas são dramaticamente diferentes O xeroderma pigmentoso foi introduzido no início deste capítulo e é caracterizado pelo desenvolvimento precoce de 1 2 3 4 cânceres especialmente câncer de pele e em alguns casos defeitos neurológicos Contrariamente os pacientes afetados pela síndrome de Cockayne apresentam uma diversidade de distúrbios do desenvolvimento incluindo nanismo surdez e retardo Em termos amplos pacientes com XP adquirem câncer precoce enquanto pacientes com síndrome de Cockayne envelhecem prematuramente Como defeitos na mesma via de reparo podem levar a sintomas de doença tão diferentes Embora não exista uma resposta simples para essa questão os trabalhos sobre a base genética dessas doenças levou à identificação de importantes proteínas na via NER O reparo por excisão de nucleotídio é um processo complexo que requer dúzias de proteínas Apesar dessa complexidade o processo de reparo pode ser dividido em quatro fases Reconhecimento das bases danificadas Montagem de um complexo multiproteico no sítio Corte do filamento danificado diversos nucleotídios upstream e downstream do sítio danificado e remoção dos nucleotídios aproximadamente 30 entre os cortes Utilização do filamento não danificado como molde para a DNA polimerase seguida pela ligação do filamento O fato conforme já mencionado de a parada tanto da forquilha de replicação como do complexo de transcrição ativar essa via de reparo implica a existência de dois tipos de reparo por excisão de nucleotídio que diferem no reconhecimento do dano etapa 1 Atualmente sabemos que um tipo denominado reparo por excisão de nucleotídio genômico global GGNER corrige lesões em qualquer local do genoma e é ativado por forquilhas de replicação paradas O outro tipo repara as regiões transcritas do DNA e é denominado não surpreendentemente reparo por excisão de nucleotídio acoplado à transcrição TCNER Conforme pode ser observado na Figura 1622 embora a etapa de reconhecimento seja diferente tanto GGNER quanto TCNER compartilham as últimas quatro etapas Nesse ponto você pode estar se perguntando E se as diferenças nos sintomas das doenças XP e síndrome de Cockayne ocorressem em virtude de mutações em diferentes classes de proteínas de reconhecimento Você estaria no caminho certo ao indagar essa questão Pacientes com XP estão contidos em oito grupos de complementação que carreiam mutações em um dos oito genes que codificam as proteínas XPA a XPG Figura 1622 Pacientes com síndrome de Cockayne apresentam uma mutação em uma de duas proteínas denominadas CSA e CSB que se acredita reconhecerem complexos de transcrição parados GGNER é iniciado quando um complexo proteico de XPC e RAD23B reconhece uma duplahélice distorcida causada por uma base danificada e se liga ao filamento oposto Contrariamente TCNER é iniciado quando um complexo de RNA polimerase é parado por uma lesão do DNA no filamento transcrito e CSA e CSB se ligam nesse sítio para formar um complexo de reconhecimento Após o reconhecimento da lesão as vias GGNER e TCNER utilizam amplamente as mesmas proteínas para remover e reparar o DNA danificado tendo em vista que o papel de XPCRAD23B e CSACSB é atrair o complexo multiproteico TFIIH Duas de suas 10 subunidades XPB e XPD são helicases 3 para 5 e 5 para 3 respectivamente que desenrolam e abrem a hélice de DNA ao redor da lesão As etapas subsequentes comuns a GGNER e TCNER medeiam a clivagem e a excisão da base danificada e até 30 nucleotídios adjacentes seguidas pela síntese de DNA para preencher o intervalo ver detalhes na Figura 1622 Além de XPC RAD23D XPB e XPD pacientes com XP apresentam mutações em outras proteínas que participam nas etapas comuns de NER Conforme demonstrado na Figura 1622 XPA promove a liberação da subunidade CAK e a ligação de RPA enquanto as endonucleases XPF com ERCCI e XPG cortam respectivamente a 5 e 3 do dano ao DNA Após a remoção da base danificada e do DNA adjacente o intervalo é preenchido por uma DNA polimerase auxiliada pelas proteínas RFC e PCNA A última etapa no NER envolve a ligação do novo filamento ao DNA adjacente por meio de um de dois complexos de ligação XRCC1LIG3 ou FEN1LIG1 As diferenças moleculares entre GGNER e TCNER podem proporcionar uma explicação para os diferentes sintomas demonstrados por pacientes com XP e síndrome de Cockayne Relembre que pacientes com XP desenvolvem cânceres precoces enquanto pacientes com síndrome de Cockayne apresentam uma diversidade de sintomas associados ao envelhecimento prematuro Vimos que o sistema de reparo dos pacientes com síndrome de Cockayne não consegue reconhecer complexos de transcrição parados Uma consequência desse defeito é que a célula apresenta maior probabilidade de ativar a via suicida da apoptose Em uma pessoa saudável a morte celular com frequência é preferível à propagação de uma célula que tenha sofrido dano persistente no DNA Entretanto de acordo com essa teoria a via de morte celular seria ativada mais frequentemente em um paciente com síndrome de Cockayne levando assim a uma diversidade de sintomas de envelhecimento prematuro Contrariamente pacientes com XP podem reconhecer os complexos de transcrição parados eles apresentam proteínas CSA e CSB normais e evitar a morte celular quando a transcrição é reiniciada Entretanto eles não conseguem reparar o dano original em virtude de mutações em uma de suas proteínas XP Portanto as mutações serão acumuladas nas células de pacientes com XP e conforme declarado anteriormente neste capítulo a presença de mutações causadas por mutágenos ou por falha das vias de reparo aumenta o risco de desenvolvimento de muitos tipos de câncer CONCEITOCHAVE O reparo por excisão de nucleotídio é uma via versátil que reconhece e corrige as lesões do DNA amplamente em virtude dos danos causados por UV e ao fazer isso alivia as forquilhas de replicação e os complexos de transcrição parados Pacientes com xeroderma pigmentoso e síndrome de Cockayne são sensíveis à luz UV em virtude de mutações importantes em proteínas de reparo por excisão de nucleotídio que reconhecem ou reparam as bases danificadas Reparo pósreplicação Reparo de malpareamento Você aprendeu na primeira metade deste capítulo que ocorrem muitos erros na replicação do DNA De fato a taxa de erro é de aproximadamente 105 A correção por meio da função de revisão 3 para 5 da polimerase replicativa reduz 1 2 3 a taxa de erro para menos de 107 A principal via que corrige os erros replicativos remanescentes é denominada reparo de malpareamento Essa via de reparo reduz a taxa de erro para menos de 109 ao reconhecer e reparar as bases malpareadas e as pequenas alças causadas pela inserção e pela deleção de nucleotídios indels no período da replicação A partir desses valores você pode verificar que as mutações que levam à perda da via de reparo de malpareamento poderiam aumentar a frequência de mutações em 100 vezes De fato a perda do reparo de malpareamento também está associada a formas hereditárias de câncer de cólon Os sistemas de reparo de malpareamento devem realizar no mínimo três coisas Reconhecer pares de bases malpareados Determinar qual base é a incorreta no malpareamento Excisar a base incorreta e realizar a síntese de reparo Duas vias de reparo por excisão de nucleotídeos Etapa 1 a via de reparo por excisão de nucleotídeo NER é ativada quando adutos volumosos ou múltiplas bases danificadas são reconhecidos em regiões não transcritas GGNER ou transcritas TCNER do genoma Na via GGNER XPARAD23 se liga a uma lesão Na via TCNER CSA e CSB se ligam a complexos de RNA polimerase II que estão parados em uma lesão Reparo por excisão de nucleotídeo genômico global GGNER Reconhecimento da base danificada XPCRAD23B Etapa 2 na primeira etapa compartilhada ambos os complexos de reconhecimento de danos ao DNA recrutam o complexo TFIIH para a lesão Etapa 3 as helicases XPB e XPD desenrolam a hélice de DNA ao redor da lesão Etapa 4 XPF e XPG excisam o segmento de DNA danificado Grampo deslizante PCNA Etapa 5 a DNA polimerase preenche o intervalo utilizando o filamento de DNA complementar como molde Etapa 6 o novo filamento de DNA é ligado no local FIGURA 1622 A via de reparo por excisão de nucleotídio é ativada quando adutos volumosos ou múltiplas bases danificadas são reconhecidos em regiões não transcritas GGNER ou transcritas TCNER do genoma Essas duas vias são iniciadas por diferentes eventos e complexos distintos conforme demonstrado na primeira etapa Ambos os complexos atuam para atrair o mesmo complexo TFIIH Etapa 2 Os complexos de reconhecimento são removidos na Etapa 3 não demonstrada Nas etapas 4 a 6 um complexo multiproteico excisa diversas bases e as ressintetiza utilizando o filamento oposto como molde Ver texto para detalhes A maior parte do que se sabe a respeito do reparo de malpareamento tem origem em décadas de análises genéticas e bioquímicas com a utilização da bactéria modelo E coli ver Organismomodelo E coli no Capítulo 5 Especialmente digna de nota foi a reconstituição do sistema de reparo de malpareamento em tubo de ensaio no laboratório de Paul Modrich A conservação de muitas das proteínas de reparo de malpareamento de bactérias e leveduras até seres humanos indica que essa via é antiga e importante em todos os organismos vivos Recentemente o sistema de reparo de malpareamento humano também foi reconstituído em tubo de ensaio no laboratório de Modrich A capacidade de estudar os detalhes da reação estimulará futuros estudos sobre a via humana Entretanto por enquanto enfocaremos o sistema muito bemcaracterizado de E coli Figura 1623 A primeira etapa no reparo de malpareamento é o reconhecimento do dano no DNA recémreplicado pela proteína MutS A ligação dessa proteína às distorções na duplahélice de DNA causadas por bases incompatíveis inicia a via de reparo de malpareamento ao atrair três outras proteínas para o sítio da lesão MutL MutH e UvrD não demonstrada A proteínachave é MutH que realiza a função crucial de cortar o filamento que contém a base incorreta Sem essa capacidade de discriminação entre as bases corretas e incorretas o sistema de reparo de malpareamento não poderia determinar qual base deve ser excisada para evitar o surgimento de uma mutação Se por exemplo ocorre malpareamento entre GT como um erro de replicação como o sistema consegue determinar se G ou T está incorreta Ambas são bases normais no DNA Mas os erros de replicação produzem pareamentos errados no filamento recémsintetizado e assim o sistema de reparo de malpareamento substitui a base naquele filamento Como o reparo de malpareamento distingue o filamento recémsintetizado do antigo Relembre do Capítulo 12 que as bases citosina com frequência são metiladas em eucariotos e que essa marca epigenética é propagada do filamento parental para o filho logo após a replicação O DNA de E coli também é metilado mas os grupos metil relevantes para o reparo de malpareamento são adicionados às bases adenina Para distinguir o filamentomolde antigo do filamento recémsintetizado o sistema de reparo bacteriano se aproveita de um atraso na metilação da sequência a seguir 5GATC3 3CTAG5 A enzima responsável pela metilação é a adenina metilase que cria a 6 metiladenina em cada filamento Entretanto a adenina metilase necessita de diversos minutos para reconhecer e modificar os trechos de GATC recém sintetizados Nesse intervalo a proteína MutH corta o sítio de metilação no filamento que contém A ainda não metilada Esse sítio pode estar a diversas centenas de pares de bases de distância da base erroneamente pareada Após o corte no sítio a proteína UrvD se liga ao corte e utiliza a sua atividade de helicase para desenrolar o DNA Uma proteína de ligação a filamento único protetora reveste o filamento parental desenrolado enquanto a parte do novo filamento entre o pareamento errado e o corte é excisada O reparo de malpareamento corrige os erros replicativos 5 3 5 3 GT GATC CTAG 5 3 5 3 GC CTAG GATC 5 3 5 3 MutS reconhece par malpareado MutS 3 5 GATC CTAG 5 3 5 3 GC CTAG GATC 5 3 5 3 MutH reconhece filamentoparental metilado e corta filamentofilho MutL MutH 5 3 5 3 GATC CTAG 5 3 5 3 GC CTAG GATC 5 3 5 3 Novo filamento é excisado e substituído entre o corte e o par malpareado FIGURA 1623 Modelo em relação ao reparo de malpareamento em E coli O DNA é metilado Me no resíduo A na sequência GATC A replicação do DNA produz um dúplex hemimetilado que existe até que a metilase consiga modificar o filamento recémsintetizado O sistema de reparo de malpareamento realiza quaisquer correções necessárias com base na sequência observada no filamento metilado modelo original MutS MutH e MutL são proteínas Muitas das proteínas no reparo de malpareamento de E coli são conservadas no reparo de malpareamento humano No entanto como os eucariotos reconhecem e reparam apenas o filamento recémsintetizado ainda é desconhecido O problema causa perplexidade nos organismos sem a maior parte da metilação do DNA ou completamente desprovidos dela tais como leveduras Drosophila e C elegans Um modelo popular propõe que a discriminação tenha por base o reconhecimento de extremidades livres 3 que caracterizam os filamentos de replicação contínua e descontínua recémsintetizados Um alvo importante do sistema de malpareamento humano são as curtas sequências repetidas que podem ser expandidas ou deletadas na replicação pelo mecanismo de malpareamento descrito anteriormente ver Figura 168 Mutações em alguns dos componentes dessa via demonstraram ser responsáveis por diversas doenças humanas especialmente cânceres Existem milhares de repetições curtas microssatélites localizadas por todo o genoma humano ver Capítulo 4 Embora a maior parte delas esteja localizada em regiões não codificadoras tendo em vista que a maior parte do genoma é não codificador algumas estão localizadas em genes críticos para o crescimento e o desenvolvimento normais Portanto podese prever que defeitos na via de reparo de malpareamento humana tenham como consequência doenças muito graves Essa previsão comprovou ser verdadeira e um caso pontual é a síndrome denominada câncer colorretal não polipose hereditário HNPCC a qual apesar de sua denominação não é propriamente um câncer mas aumenta o risco de câncer Uma das predisposições hereditárias ao câncer mais comuns a doença afeta uma em 200 pessoas no mundo ocidental Estudos demonstraram que o HNPCC resulta da perda do sistema de reparo de malpareamento em grande parte em virtude de mutações herdadas em genes que codificam as contrapartes e homólogas humanas das proteínas MutS e MutL bacterianas ver Figura 1623 A herança do HNPCC é autossômica dominante As células com uma cópia funcional dos genes de reparo de malpareamento apresentam atividade de reparo de malpareamento normal mas as linhagens celulares tumorais têm origem em células que perderam uma cópia funcional e que portanto são deficientes do malpareamento Essas células demonstram altas taxas de mutação em parte em virtude de uma incapacidade de corrigir a formação de indel na replicação CONCEITOCHAVE O sistema de reparo de malpareamento corrige erros na replicação que não são corrigidos pela função de revisão da DNA polimerase replicativa O reparo é restrito ao filamento recémsintetizado que é reconhecido pelo maquinário de reparo em procariotos porque não tem um marcador de metilação Reparo propenso a erro Síntese de DNA translesão Até agora todos os mecanismos de reparo que encontramos são livres de erro uma vez que eles revertem o dano diretamente ou utilizam a complementaridade de bases para inserir a base correta Além disso existem vias de reparo que são elas próprias uma fonte significativa de mutação Esses mecanismos aparentam ter evoluído para evitar a ocorrência de desfechos possivelmente mais sérios tais como morte celular ou câncer Conforme já mencionado uma forquilha de replicação parada pode iniciar uma via de morte celular Tanto em procariotos quanto em eucariotos tais blocos de replicação podem ser contornados pela inserção de bases inespecíficas Em E coli esse processo requer a ativação do sistema SOS A denominação SOS tem origem na ideia de que esse sistema é induzido como uma resposta de emergência para prevenir a morte celular na presença de dano significativo ao DNA Como tal a indução de SOS é um mecanismo de último recurso um tipo de tolerância ao dano que possibilita que uma célula troque a morte por um determinado nível de mutagênese Levou mais de 30 anos para descobrir como o sistema SOS dá origem a mutações enquanto possibilita que a DNA polimerase contorne lesões nas forquilhas de replicação paradas Já estamos familiarizados com o dano do DNA induzido pela luz UV ver Figura 1615 Uma classe incomum de mutantes de E coli que sobreviveram à exposição à luz UV sem a sofrer mutações adicionais foi isolada na década de 1970 O fato de que tais mutantes existiram sugeriu que alguns genes de E coli atuem para gerar mutações quando expostos à luz UV A mutação induzida pela luz UV não ocorrerá se os genes DinB UmuC ou UmuD estiverem mutados A Figura 1624 demonstra as etapas no mecanismo SOS Na primeira etapa a luz UV induz a síntese de uma proteína denominada RecA Veremos mais sobre a proteína RecA posteriormente no capítulo tendo em vista que ela é um componente importante nos mecanismoschave de reparo do DNA e recombinação Quando a polimerase replicativa DNA polimerase III está parada em um sítio de dano ao DNA o DNA à frente da polimerase continua a ser desenrolado expondo regiões de DNA unifilamentares que se ligam a proteínas de ligação a filamento único Em seguida as proteínas RecA unemse às proteínas de ligação a filamento único e formam um filamento de proteínaDNA O filamento RecA é a forma biologicamente ativa dessa proteína Nessa situação RecA atua como um sinal que leva à indução de diversos genes sabidamente reconhecidos por codificar membros de uma família recémdescoberta de DNA polimerases que conseguem contornar o bloqueio da replicação e que são distintas das polimerases replicativas As DNA polimerases que conseguem contornar as paradas da replicação também foram observadas em diversos grupos de eucariotos que variam de leveduras a seres humanos Essas polimerases eucarióticas contribuem para um mecanismo de tolerância a danos denominado síntese de DNA translesão que se assemelha ao sistema de bypass SOS em E coli Essas polimerases translesão ou de bypass como passaram a ser conhecidas diferem das principais polimerases replicativas de diversos modos Primeiramente elas conseguem tolerar adutos incomumente grandes nas bases Enquanto a polimerase replicativa para se uma base não se ajusta no sítio ativo as polimerases de bypass apresentam bolsões muito maiores que conseguem acomodar bases danificadas Em segundo lugar em algumas situações as polimerases de bypass apresentam uma taxa de erro muito mais alta em parte em virtude da ausência da atividade de revisão 3 para 5 das principais polimerases replicativas Por fim elas conseguem adicionar apenas alguns nucleotídios antes de sair Essa característica é atraente tendo em vista que a principal função de uma polimerase propensa a erro é desbloquear a forquilha de replicação não sintetizar longos trechos de DNA que poderiam conter muitos pareamentos errados FIGURA 1624 Um modelo de síntese translesão em E coli Durante o período da replicação a DNA polimerase III é temporariamente substituída por uma polimerase de bypass pol V que consegue continuar a replicação passando pela lesão As polimerases de bypass são propensas a erros O grampo β bacteriano proteína vermelha é equivalente à PCNA eucariótica Dados de E C Friedberg A R Lehmann e R P Fuchs Trading Places How Do DNA Polymerases Switch During Translesion DNA Synthesis Molec Cell 18 2005 499505 Atualmente são conhecidas diversas polimerases de bypass que aparentam estar sempre presentes em células eucarióticas Em virtude de estarem sempre presentes seu acesso ao DNA deve ser regulado de modo que elas sejam utilizadas apenas quando necessário A célula desenvolveu uma solução organizada para esse problema Relembre que uma parte integrante do replissomo é a proteína PCNA antígeno nuclear de proliferação celular que atua como um grampo deslizante para orquestrar os incontáveis eventos na forquilha de replicação ver Figura 720 Uma proteína crítica presente em uma forquilha de replicação parada é a Rad6 a qual curiosamente é uma enzima que adiciona ubiquitina às proteínas Figura 1625 Conforme descrito no Capítulo 9 a adição de cadeias de muitos monômeros de ubiquitina marca a proteína para degradação ver Figura 923 Contrariamente a ligação de um monômero de ubiquitina único à PCNA altera sua conformação de modo que agora ela consegue se ligar à polimerase de bypass e orquestrar a síntese translesão A remoção enzimática da marcação de ubiquitina na PCNA leva à dissociação da polimerase de bypass e à restauração final da replicação normal Qualquer malpareamento de base em virtude da síntese translesão ainda apresenta uma chance de detecção e correção pela via de reparo de malpareamento A regulação da função de PCNA por meio da adição e da remoção de monômeros de ubiquitina ilustra a importância das modificações póstraducionais em eucariotos Se o dano da base no filamentomolde não for rapidamente corrigido a forquilha de replicação parada sinalizará a ativação da via de morte celular Uma célula eucariótica não pode esperar pela síntese de novo de polimerases de bypass após a transcrição e a tradução como ocorre no sistema SOS de E coli Em vez disso as polimerases de bypass eucarióticas são transcritas constitutivamente e estão sempre presentes o seu acesso à forquilha de replicação é controlado por modificações póstraducionais rápidas e reversíveis CONCEITOCHAVE Na síntese translesão polimerases de bypass são recrutadas para as forquilhas de replicação que pararam em virtude do dano no filamentomolde As polimerases de bypass introduzem erros no período da síntese que podem persistir e levar à mutação ou que podem ser corrigidos por meio de outros mecanismos tais como o reparo de malpareamento FIGURA 1625 A adição de um único monômero de ubiquitina Ub ao grampo deslizante PCNA possibilita que a polimerase de bypass se ligue ao PCNA e inicie a replicação Reparo de quebras bifilamentares Conforme vimos muitos sistemas de correção exploram a complementaridade do DNA para realizar reparos livres de erros Tal reparo livre de erros é caracterizado por dois estágios 1 remoção das bases danificadas talvez em conjunto com o DNA próximo de um filamento da duplahélice e 2 utilização do outro filamento como um molde para a síntese de DNA necessária para preencher o espaço unifilamentar Entretanto o que ocorreria se ambos os filamentos da duplahélice estivessem danificados de tal modo que a complementaridade não pudesse ser explorada Por exemplo a exposição aos raios X com frequência causa a quebra de ambos os filamentos da duplahélice em sítios bem próximos Esse tipo de mutação é denominado quebra bifilamentar Se não reparadas as quebras bifilamentares podem causar uma diversidade de aberrações cromossômicas resultando em morte celular ou um estado précanceroso Curiosamente a produção de quebras bifilamentares é uma característica integrante de alguns processos celulares normais que necessitam de rearranjos de DNA Um exemplo é a recombinação meiótica Conforme veremos no restante deste capítulo a célula utiliza muitas das mesmas proteínas e vias para reparar as quebras bifilamentares e para realizar a recombinação meiótica Por esse motivo iniciamos enfocando os mecanismos moleculares que reparam as quebras bifilamentares antes de voltarmos a nossa atenção para o mecanismo de recombinação meiótica As quebras bifilamentares podem surgir espontaneamente p ex em resposta a espécies reativas de oxigênio produzidas como subproduto do metabolismo celular ou podem ser induzidas por radiação ionizante São conhecidos diversos mecanismos para o reparo de quebras bifilamentares e novos mecanismos ainda estão sendo descobertos Dois mecanismos distintos estão descritos na seção a seguir junção de extremidades não homólogas e recombinação homóloga Junção de extremidades não homólogas Muitos dos mecanismos de reparo anteriormente descritos são ativados na fase S do ciclo celular quando o DNA está se replicando em preparo para a mitose ou a meiose Entretanto contrariamente às células da maior parte dos procariotos e dos eucariotos inferiores as células dos eucariotos superiores normalmente não estão replicando seu DNA tendo em vista que estão em uma fase de repouso do ciclo celular ou cessaram totalmente de se dividir O que acontece quando ocorrem quebras bifilamentares em células nas quais os filamentos ou as cromátidesirmãs não danificados não estão presentes A resposta é que essas extremidades devem ser reparadas perfeita ou imperfeitamente tendo em vista que as extremidades quebradas podem iniciar rearranjos cromossômicos possivelmente perigosos que podem levar a um estado canceroso ver Capítulo 17 Um modo pelo qual os eucariotos superiores juntam as extremidades bifilamentares quebradas é um mecanismo um tanto deselegante porém importante denominado junção de extremidades não homólogas NHEJ que está demonstrado na Figura 1626 Assim como em outros mecanismos de reparo a primeira etapa na via NHEJ é o reconhecimento do dano A via NHEJ é iniciada quando duas proteínas muito abundantes KU70 e KU80 ligamse às extremidades quebradas formando um heterodímero que atua em duas funções Primeiramente ele previne lesão adicional às extremidades e em segundo lugar recruta outras proteínas em verde na Figura 1626 que cortam as extremidades do filamento para gerar as extremidades 5P e 3OH que são necessárias para a ligação A DNA ligase IV em seguida une as duas extremidades Como os cientistas sabem quando todos os componentes de uma via biológica foram identificados Como se vê esse problema é difícil A recente identificação de um novo componente da via NHEJ fornece um exemplo Por diversos motivos acreditavase que todos os componentes da via NHEJ tivessem sido identificados Entretanto geneticistas que analisavam uma linhagem celular denominada 2BN derivada de uma criança com um distúrbio hereditário raro foram surpreendidos Embora eles pudessem demonstrar que aquela linhagem celular 2B era defeituosa em relação ao reparo de quebras bifilamentares eles não conseguiram restaurar o sistema de reparo e produzir o fenótipo do tipo selvagem por meio de complementação genética com quaisquer dos genes que codificam as proteínas de NHEJ Ou seja quando eles introduziram genes do tipo selvagem que codificam proteínas NHEJ conhecidas p ex KU70 KU80 ligase IV na linhagem 2BN a linhagem celular ainda era defeituosa no reparo das quebras bifilamentares Esse resultado negativo indicou que a linhagem celular 2BN carreava uma mutação em uma proteína NHEJ desconhecida Na era da genômica a identificação de proteínas ligadas a doenças está se tornando mais comum em virtude da ampla disponibilidade de linhagens celulares de pessoas com fenótipos de doenças Quando nós seres humanos apresentamos um problema de saúde vamos a um médico e lhe contamos a respeito dos nossos sintomas incluindo as informações a respeito de parentes com problemas semelhantes Tais informações são de crescente importância na era da genômica com sua toolkit genética sempre em expansão que com frequência pode ser utilizada para identificar genes mutantes associados a distúrbios hereditários ver Capítulos 10 e 14 O QUE OS GENETICISTAS FAZEM ATUALMENTE O que os geneticistas podem fazer em laboratório para encontrar uma proteína tal como a proteína NHEJ desconhecida que ainda não tenha sido identificada Dois laboratórios que utilizam abordagens muito diferentes obtiveram sucesso na identificação do novo componente NHEJ uma abordagem será descrita aqui tendo em vista que ela tem sido empregada com sucesso para descobrir diversas outras proteínas Conforme observado nos capítulos precedentes muitas proteínas celulares realizam suas ações por meio da interação com outras proteínas O Capítulo 14 por exemplo descreveu o teste dihíbrido de levedura utilizado para identificar proteínas que interagem com a proteína de interesse No caso atualmente sob consideração a proteína de interesse era o componente XRCC4 da NHEJ ver Figura 1626 e o teste dihíbrido identificou uma proteína de interação 33kD que era codificada por uma matriz de leitura aberta humana não caracterizada O fato de duas proteínas interagirem no teste dihíbrido de levedura não significa necessariamente que essas proteínas interagem nas células humanas Para estabelecer uma conexão entre a proteína 33kD e a via NHEJ os geneticistas utilizaram outra técnica valiosa da sua caixa de ferramentas a do RNAi ver Capítulo 8 Nesse caso eles demonstraram que as células normais que expressam RNA antissenso da ORF que codifica a proteína 33kD que evitaria a tradução desse gene em proteína agora eram defeituosas na execução da via NHEJ FIGURA 1626 Mecanismo de junção de extremidades não homólogas NHEJ Esse mecanismo é propenso a erro Ver texto para detalhes Nessa história o círculo foi fechado quando foi demonstrado que as células 2BN defeituosas no reparo bifilamentar apresentam ausência da proteína 33kD A expressão dessa proteína corrigiu os defeitos celulares CONCEITOCHAVE NHEJ é uma via propensa a erro que repara quebras bifilamentares em eucariotos superiores ligando as pontas livres de volta A identificação dos genes responsáveis por distúrbios hereditários é uma via importante utilizada pelos geneticistas para isolar componentes anteriormente desconhecidos das vias de reparo e de outras vias biológicas Recombinação homóloga Se uma quebra bifilamentar ocorre após a replicação de uma região cromossômica em uma célula em divisão o dano pode ser corrigido por meio de um mecanismo livre de erros denominado pareamento de filamento dependente de síntese SDSA Esse mecanismo está ilustrado na Figura 1627 Ele utiliza as cromátidesirmãs disponíveis na mitose como moldes para assegurar o reparo correto As primeiras etapas no SDSA são a ligação das extremidades quebradas por meio de proteínas especializadas e enzimas o aparo das extremidades 5 por uma endonuclease para expor as regiões unifilamentares e o revestimento dessas regiões com proteínas que incluem o homólogo de RecA Rad51 Relembre que na resposta SOS os monômeros RecA se associam a regiões de DNA unifilamentar para formar filamentos de nucleoproteína De modo semelhante Rad51 forma longos filamentos na medida em que se associa à região unifilamentar exposta Em seguida o filamento de DNARad51 participa em uma extraordinária busca pela cromátideirmã não danificada para a sequência complementar que será utilizada como molde para a síntese de DNA Esse processo é denominado invasão de filamento A extremidade 3 do filamento invasor desloca uma das cromátidesirmãs não danificada que forma uma alça D em referência ao deslocamento e inicia a síntese de DNA a partir de sua extremidade 3 livre A síntese do novo DNA continua a partir de ambas as extremidades 3 até que ambos os filamentos se desenrolem de seus moldes e se pareiem A ligação sela os cortes deixando um trecho reparado de DNA que apresenta uma característica muito distinta ele foi replicado por meio de um processo conservativo Ou seja ambos os filamentos foram recémsintetizados o que está em acentuado contraste com a replicação semiconservativa da maior parte do DNA ver Capítulo 7 FIGURA 1627 O mecanismo sem erros de pareamento de filamento dependente de síntese SDSA repara quebras bifilamentares em células em divisão CONCEITOCHAVE O pareamento de filamento dependente de síntese é um mecanismo livre de erros que repara quebras bifilamentares em células em divisão nas quais uma cromátideirmã está disponível para atuar como molde para a síntese de reparo Envolvimento do reparo DSB na recombinação meiótica Nossa consideração sobre o reparo de quebras bifilamentares em células em divisão leva naturalmente ao tópico do crossing over na meiose tendo em vista que uma quebra bifilamentar inicia o crossing over Embora as quebras sejam uma parte normal e essencial da meiose elas são se não processadas correta e eficientemente tão perigosas quanto as quebras acidentais discutidas até agora O crossing over é um processo notavelmente preciso que ocorre entre dois cromossomos homólogos Figura 1628 Tal processo foi descrito na Seção 48 Relembre que a recombinação ocorre após a forquilha de replicação ter passado por uma região cromossômica formando duas cromátides de cada cromossomo homólogo Uma cromátide de um cromossomo homólogo irá recombinar com uma cromátide não irmã do outro cromossomo homólogo Para que a segregação meiótica atue corretamente cada par de homólogos deve apresentar no mínimo um crossing over A recombinação é iniciada quando uma enzima denominada Spo11 realiza cortes no DNA bifilamentar em uma das cromátides que irá recombinar Figura 1629 Embora tenha sido descoberta pela primeira vez em leveduras a proteína Spo11 é amplamente conservada em eucariotos indicando que esse mecanismo para iniciar a recombinação é amplamente empregado FIGURA 1628 A troca de braços cromossômicos entre cromátides não irmãs durante a meiose produz um quiasma o local dos crossing overs Os círculos representam os centrômeros que estão unidos às fibras do fuso Após a realização de seus cortes a enzima Spo11 permanece unida à extremidade 5 agora livre onde aparentemente atua para duas finalidades Primeiramente ela protege as extremidades contra danos adicionais incluindo a recombinação espúria com outras extremidades livres Em segundo lugar ela pode atrair outras proteínas que são necessárias para a próxima etapa na recombinação Essa etapa de fato é muito semelhante ao que ocorre no reparo de quebras bifilamentares nas células em divisão As extremidades 5 são aparadas novamente resseccionadas e um complexo proteico se liga às extremidades 3 unifilamentares ver Figura 1629 Esse complexo inclui a proteína Rad51 a qual conforme já mencionado é homóloga à proteína RecA que participa nessa extraordinária busca pela complementaridade na cromátideirmã Nesse momento a recombinação meiótica assume uma via dramaticamente diferente do reparo de quebra bifilamentar Na meiose Rad51 se associa a outra proteína Dmc1 que está presente apenas durante a meiose ver Figura 1629 Devese observar que os organismosmodelo Drosophila e C elegans não apresentam homólogos da Dmc1 De alguma maneira por meio de um mecanismo não completamente compreendido o filamento que contém Rad51 e Dmc1 conduz uma busca por uma sequência complementar Entretanto contrariamente ao reparo de quebra bifilamentar o filamento busca uma cromátide não irmã do cromossomo homólogo e não a cromátideirmã A busca culmina com a invasão do filamento e a formação da alça D assim como no reparo de quebra bifilamentar Esses eventos são necessários para a formação de quiasmas na meiose I Ou seja os homólogos se tornam conectados como um resultado da recombinação FIGURA 1629 A recombinação meiótica é iniciada quando a enzima Spo11 realiza cortes desencontrados em um par de filamentos de DNA em uma cromátide CONCEITOCHAVE A recombinação meiótica é iniciada pela enzima Spo11 que introduz cortes bifilamentares nos cromossomos após terem se 165 replicado mas antes da separação dos homólogos Câncer Uma importante consequência fenotípica da mutação Por que tantos agentes mutagênicos causam câncer Qual é a conexão entre o câncer e a mutação Nesta seção exploraremos a conexão mutaçãocâncer Tornouse claro que praticamente todos os cânceres de células somáticas surgem em virtude de uma série de mutações especiais que se acumulam em uma célula Algumas dessas mutações alteram a atividade de um gene outras simplesmente eliminam a atividade gênica As mutações que promovem o câncer estão classificadas em uma de algumas categorias importantes aquelas que aumentam a capacidade de uma célula de proliferar aquelas que diminuem a suscetibilidade de uma célula a uma via suicida denominada apoptose ou aquelas que aumentam a taxa de mutações geral da célula ou a sua longevidade de modo que todas as mutações incluindo aquelas que encorajam a proliferação ou a apoptose apresentam maior probabilidade de ocorrência Como as células cancerosas diferem das células normais Um tumor maligno ou câncer é um agregado de células todas descendentes de uma célula aberrante inicial Em outras palavras todas as células malignas são membros de um único clone até mesmo em cânceres avançados que apresentam múltiplos tumores em muitos locais no corpo As células cancerosas diferem tipicamente de suas vizinhas normais em uma diversidade de características fenotípicas tais como rápida taxa de divisão capacidade de invadir novos territórios celulares alta taxa metabólica e forma anormal Por exemplo quando as células de folhetos celulares epiteliais normais são semeadas em uma cultura celular elas conseguem crescer apenas quando ancoradas à própria placa de cultura Além disso as células epiteliais normais em cultura se dividem apenas até formarem uma única camada contínua Figura 1630 A Nesse ponto de alguma maneira elas reconhecem que formaram uma única camada epitelial e param de se dividir Contrariamente as células malignas derivadas de tecido epitelial continuam a proliferar empilhandose umas sobre as outras Figura 1630 B Claramente os fatores que regulam a fisiologia celular normal foram alterados Qual então é a causa subjacente do câncer Muitos tipos celulares diferentes podem ser convertidos em um estado maligno Existe um tema em comum Ou cada um surge de modo diferente Podemos pensar a respeito do câncer de modo geral como consequente ao acúmulo de múltiplas mutações em uma única célula que causam a sua proliferação descontrolada Algumas dessas mutações podem ser transmitidas a partir dos genitores por meio da linhagem germinativa A maior parte surge de novo na linhagem somáticas de uma célula em particular FIGURA 1630 Micrografias de varredura eletrônica de A células normais e B células transformadas pelo vírus do sarcoma de Rous que infecta as células com o oncogene src A Uma linhagem celular normal denominada 3T3 Observe a estrutura de monocamada organizada das células B Uma derivativa transformada de 3T3 Observe como as células são mais arredondadas e estão empilhadas umas sobre as outras De Victor R Ambros Lan Bo Chen e John M Buchanan Surface Ruffles as Markers for Studies of Cell Transformation by Rous Sarcoma Virus Proc Nat Acad Sci USA 72 No 8 31443148 August 1975 Cell Biology p 3144 Figure 1A e 1B Mutações em células cancerosas Diversas linhas de evidências apontam para uma origem genética em relação à transformação de células do estado benigno até o canceroso Primeiramente conforme já discutido neste capítulo muitos agentes mutagênicos tais como substâncias químicas e radiação causam câncer sugerindo que eles introduzam mutações nos genes Em segundo lugar e mais importante foram identificadas mutações que frequentemente estão associadas a tipos de cânceres em particular Dois tipos gerais estão associados aos tumores mutações em oncogenes e mutações em genes supressores de tumor As mutações em oncogenes atuam na célula cancerosa como mutações dominantes de ganho de função ver Capítulo 6 para uma discussão sobre as mutações dominantes Essa declaração sugere duas característicaschave das mutações em oncogenes Primeiramente as proteínas codificadas pelos oncogenes em geral são ativadas em células tumorais e em segundo lugar a mutação deve estar presente em apenas um alelo para contribuir para formação do tumor O gene em sua forma normal e não mutado é denominado protooncogene As mutações nos genes supressores de tumor que promovem a formação de tumor são mutações recessivas de perda de função Ou seja esse tipo de mutação faz com que os produtos dos genes codificados percam uma grande parte de sua atividade ou toda ela ou seja a mutação é nula Além disso para que o câncer se desenvolva a mutação deve estar presente em ambos os alelos do gene CONCEITOCHAVE Os oncogenes codificam formas mutadas de proteínas celulares normais que resultam em mutações dominantes normalmente em virtude de sua ativação inadequada Contrariamente os genes supressores de tumor codificam proteínas cuja perda de atividade pode contribuir para um estado canceroso Como tal são mutações recessivas Classes de oncogenes Foi identificada aproximadamente uma centena de oncogenes diferentes Como os seus correspondentes normais os proto oncogenes atuam Os protooncogenes em geral codificam uma classe de proteínas que estão ativas apenas quando os sinais regulatórios adequados possibilitam que eles sejam ativados Muitos produtos de protooncogenes são elementos em vias que induzem controlam positivamente o ciclo celular Esses produtos incluem receptores de fatores de crescimento proteínas de transdução de sinal e reguladores de transcrição Outros produtos de protooncogenes atuam para inibir controlar negativamente a via apoptótica que destrói as células danificadas Em ambos os tipos de mutação de oncogenes a atividade da proteína mutante foi desacoplada de sua via reguladora normal levando à sua expressão desregulada contínua O produto proteico continuamente expresso de um oncogene é denominado oncoproteína Diversas categorias de oncogenes foram identificadas de acordo com as diferentes vias nas quais as funções reguladoras foram desacopladas O oncogene ras pode ser utilizado para ilustrar o que ocorre quando um gene normal mantém uma mutação promotora de tumor Conforme frequentemente é o caso a alteração de uma proteína normal em uma oncoproteína envolve modificações estruturais da própria proteína nesse caso causada por uma simples mutação de ponto Uma substituição de um único par de bases que converte glicina em valina no aminoácido 12 da proteína Ras por exemplo cria a oncoproteína observada no câncer de bexiga humano Figura 1631 A A proteína Ras normal é uma subunidade da proteína G que participa na transdução de sinal Ela normalmente atua por meio da oscilação entre o estado ativo ligado ao GTP e o inativo ligado ao GDP A mutação de sentido trocado no oncogene ras produz uma oncoproteína que sempre se liga ao GTP Figura 1631 B até mesmo na ausência de sinais normais Consequentemente a oncoproteína Ras propaga continuamente um sinal que promove a proliferação celular Genes supressores de tumor As funções normais dos genes supressores de tumor estão classificadas em categorias complementares àquelas dos protooncogenes Tabela 161 Alguns genes supressores de tumor codificam reguladores negativos cuja função normal é inibir o ciclo celular Outros codificam reguladores positivos que normalmente ativam a apoptose ou a morte celular de uma célula danificada Outros ainda são participantes indiretos no câncer com um papel normal no reparo de DNA danificado ou no controle da longevidade celular Consideraremos um exemplo aqui Mutações no gene p53 estão associadas a muitos tipos de tumores De fato estimase que 50 dos tumores humanos apresentem ausência de um gene p53 funcional A proteína p53 ativa é um regulador transcricional que é ativado em resposta a dano no DNA A p53 do tipo selvagem ativada atua em uma função dupla previne a progressão do ciclo celular até que o dano ao DNA seja reparado e sob algumas circunstâncias induz apoptose Se nenhum gene p53 funcional está presente o ciclo celular progride até mesmo se o DNA danificado não houver sido reparado A progressão do ciclo celular para a mitose eleva a frequência geral de mutações rearranjos cromossômicos e aneuploidia e portanto aumenta as chances de que surjam outras mutações que promovam a proliferação celular ou bloqueiem a apoptose Agora está claro que as mutações capazes de elevar a taxa de mutação são importantes contribuintes para a progressão de tumores em seres humanos Essas mutações são recessivas nos genes supressores de tumor que normalmente atuam nas vias de reparo do DNA Mutações nesses genes portanto interferem no reparo do DNA Elas promovem o crescimento tumoral indiretamente ao elevar a taxa de mutação o que torna muito mais provável o surgimento de uma série de mutações em oncogenes e supressores de tumor corrompendo a regulação normal do ciclo celular e a morte celular programada Foram identificadas inúmeras das referidas mutações em genes supressores de tumor incluindo algumas associadas a formas hereditárias de câncer em tecidos específicos Exemplos são as mutações em BRCA1 e BRCA2 e o câncer de mama FIGURA 1631 Formação e efeito da oncoproteína Ras A O oncogene ras difere do tipo selvagem em um único par de bases produzindo uma oncoproteína Ras que difere do tipo selvagem em um aminoácido na posição 12 na matriz de leitura aberta de ras B A oncoproteína Ras não consegue hidrolisar GTP em GDP Em virtude deste defeito a oncoproteína Ras permanece no complexo ativo RasGTP e ativa continuamente o sinal para a proliferação Tabela 161 Funções de proteínas do tipo selvagem e propriedades das mutações promotoras de tumor nos genes correspondentes Função da proteína do tipo selvagem Propriedades das mutações promotoras de tumor Promove a progressão do ciclo celular Oncogene ganho de função Inibe a progressão do ciclo celular Mutação de supressor de tumor perda de função Promove apoptose Mutação de supressor de tumor perda de função Inibe apoptose Oncogene ganho de função Promove o reparo de DNA Mutação de supressor de tumor perda de função CONCEITOCHAVE Agentes mutagênicos podem causar alguns cânceres tendo em vista que o câncer é em parte causado por versões mutantes de genes normais que levam ao crescimento descontrolado RESUMO A alteração do DNA em um gene mutação de ponto em geral envolve um ou alguns poucos pares de bases As substituições de pares de bases únicos podem criar códons de sentido trocado ou códons sem sentido término de tradução Uma purina substituída pela outra purina ou uma pirimidina substituída pela outra pirimidina é uma transição Uma purina substituída por uma pirimidina ou vice versa é uma transversão Adições ou deleções indels de pares de bases únicos produzem mudança de matriz de leitura Determinados genes humanos que contêm repetições de trinucleotídios especialmente aqueles que são expressos no tecido neural se tornam mutados por meio da expansão dessas repetições e assim podem causar doenças A formação de repetições de monoaminoácidos nos polipeptídios codificados por esses genes com frequência é responsável pelos fenótipos mutantes As mutações podem ocorrer espontaneamente como um subproduto de processos celulares normais tais como replicação do DNA ou metabolismo ou podem ser induzidas por radiação mutagênica ou substâncias químicas Os mutágenos com frequência resultam em um tipo específico de alteração em virtude de sua especificidade química Por exemplo alguns produzem exclusivamente transições G C A T outros exclusivamente mudanças de matriz de leitura Embora as mutações sejam necessárias para gerar diversidade muitas mutações estão associadas a doenças genéticas hereditárias tais como o xeroderma pigmentoso Além disso as mutações que ocorrem em células somáticas são a fonte de muitos cânceres humanos Foram desenvolvidas muitas vias biológicas para corrigir o amplo espectro de mutações espontâneas e induzidas Algumas vias tais como o reparo por excisão de base e nucleotídio e o reparo de malpareamento utilizam as informações inerentes à complementaridade de bases para executar reparo livre de erro Outras vias que utilizam polimerases de bypass para corrigir bases danificadas podem introduzir erros na sequência de DNA A correção de quebras bifilamentares é particularmente importante tendo em vista que essas lesões podem levar a rearranjos cromossômicos desestabilizantes A junção de extremidades não homólogas é uma via que une as extremidades quebradas de modo que uma forquilha de replicação parada não resulte em morte celular Nas células em replicação as quebras bifilamentares podem ser reparadas de um modo livre de erro por meio da via de pareamento de filamento dependente de síntese que utiliza a cromátideirmã para reparar a quebra Centenas de quebras bifilamentares programadas iniciam o crossing over meiótico entre as cromátides não irmãs Assim como outras quebras bifilamentares as quebras meióticas devem ser processadas rapidamente e com eficiência para prevenir consequências sérias tais como a morte celular e o câncer O modo exato como esse reparo é realizado ainda está sendo explorado TERMOSCHAVE agente intercalar análogo de base apoptose câncer gene supressor de tumor junção de extremidades não homólogas NHEJ lesão espontânea mudança de matriz de leitura mutação de ponto mutação de sentido trocado mutação espontânea mutação indel mutação induzida mutação sem sentido mutação sinônima mutagênese mutágeno oncogene oncoproteína pareamento de filamento dependente de síntese SDSA plaqueamento em réplica polimerase de bypass translesão polimerase translesão de bypass protooncogene quebra bifilamentar reparo de malpareamento reparo por excisão de base reparo por excisão de nucleotídio NER reparo por excisão de nucleotídio genômico global GGNER reparo por excisão de nucleotídio acoplado à transcrição TCNER repetição de trinucleotídios síndrome de Cockayne síntese de DNA translesão sistema SOS sítio apurínico substituição não conservativa teste de Ames teste de flutuação transição transversão xeroderma pigmentoso XP PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 No Capítulo 9 aprendemos que os códons UAG e UAA são duas trincas sem sentido de término de cadeia Com base na especificidade da aflatoxina B1 e do etilmetanossulfonato EMS descreva se cada mutágeno seria capaz de reverter esses códons para o tipo selvagem Solução O EMS induz primariamente transições G C A T Os códons UAG não podem ser revertidos para o tipo selvagem tendo em vista que apenas a alteração de UAG UAA seria estimulada pelo EMS e geraria um códon sem sentido ocre Os códons UAA não atuariam por meio do EMS A aflatoxina B1 induz primariamente transversões de G C T A Apenas a terceira posição dos códons UAG atuaria resultando em uma alteração de UAG UAU no nível do mRNA que produz tirosina Portanto se a tirosina for um aminoácido aceitável no sítio correspondente na proteína a aflatoxina B1 pode reverter os códons UAG A aflatoxina B1 não reverteria os códons UAA tendo em vista que nenhum par de bases G C aparece na posição correspondente no DNA Problema resolvido 2 Explique por que as mutações induzidas por acridinas no fago T4 ou por ICR191 em bactérias não podem ser revertidas pela 5 bromouracila Solução Acridinas e ICR191 induzem mutações por meio da deleção ou da adição de um ou mais pares de bases o que resulta em uma mudança da matriz de leitura Entretanto a 5bromouracila induz mutações ao causar a substituição de uma base por outra Essa substituição não consegue compensar a mudaça de matriz de leitura que resulta de ICR191 e acridinas PROBLEMAS 1 2 3 4 5 6 7 8 QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Na Figura 163 A qual é a consequência do novo sítio de corte 5 na matriz de leitura aberta Na 163 B quão grande poderia ser o íntron para manter a matriz de leitura digamos entre 75 e 100 pb Com a utilização da Figura 164 como um exemplo compare a migração do RNA e da proteína em relação ao gene do tipo selvagem e a mutação demonstrada na Figura 163 B Presuma que o íntron retido mantém a matriz de leitura No teste de Ames demonstrado na Figura 1617 qual é o motivo para a adição do extrato hepático a cada amostra Com base no modo de ação da aflatoxina Figura 1616 proponha uma situação que explique a sua resposta no teste de Ames Figura 1618 Na Figura 1622 aponte as proteínas mutantes em pacientes com síndrome de Cockayne Qualis proteínas ésão mutantes em pacientes com XP Como se acredita que essas diferentes mutações sejam responsáveis pelos diferentes sintomas da doença A proteína MutH corta o filamento recémsintetizado Figura 1623 Como ela sabe qual é esse filamento Quais características da polimerase de bypass a tornam ideal para o seu papel na síntese translesão demonstrada na Figura 1624 PROBLEMAS BÁSICOS Considere as sequências do tipo selvagem e mutante a seguir Tipo selvagem CTTGCAAGCGAATC Mutante CTTGCTAGCGAATC A substituição demonstrada parece ter criado um códon de fim Quais informações adicionais você necessita para estar confiante de que isso 9 10 11 12 13 14 15 16 tenha ocorrido Qual tipo de mutação está ilustrado pelas sequências a seguir demonstradas como mRNA Tipo selvagem 5 AAUCCUUACGGA 3 Mutante 5 AAUCCUACGGA 3 Uma mutação de sentido trocado de prolina para histidina pode ser realizada com mutágeno que causa uma transição G C A T O que dizer a respeito de uma mutação de sentido trocado de prolina para serina Por meio da substituição de par de bases quais são todas as alterações sinônimas que podem ser produzidas com início no códon CGG a Quais são todas as transversões que podem ser realizadas com início no códon CGG b Quais dessas transversões serão de sentido trocado Você pode ter certeza a A acridina laranja é um mutágeno eficaz para a produção de alelos nulos por meio de mutação Por que ela produz alelos nulos b Um determinado composto semelhante à acridina dá origem apenas a inserções únicas Uma mutação induzida com esse composto é tratada com o mesmo composto e são produzidos alguns revertentes Como esse desfecho é possível Defenda a declaração O câncer é uma doença genética Forneça um exemplo de um defeito de reparo do DNA que leve ao câncer No reparo de malpareamento em E coli apenas um erro no filamento recémsintetizado é corrigido Como a E coli é capaz de reconhecer o 17 18 19 20 21 22 23 24 25 filamento recémsintetizado Por que essa capacidade faz sentido biológico Uma lesão mutacional resulta em uma sequência que contém um par de bases malpareado 5 AGCTGCCTT 3 3 ACGATGGAA 5 Códon Se o reparo de malpareamento ocorre em qualquer direção quais aminoácidos poderiam ser observados nesse sítio Sob quais circunstâncias poderia ser dito que a junção de extremidades não homólogas é propensa a erro Por que tantas substâncias químicas que apresentam resultado positivo no teste de Ames também são classificadas como carcinogênicas A proteína Spo11 está conservada em eucariotos Você acredita que ela também esteja conservada em espécies bacterianas Justifique a sua resposta Diferencie os elementos dos pares a seguir a Transições e transversões b Mutações sinônimas e neutras c Mutações de sentido trocado e sem sentido d Mudanças de matriz de leitura e mutações sem sentido Descreva duas lesões espontâneas que podem levar a mutações O que são polimerases de bypass Como elas diferem das polimerases replicativas Como as suas características especiais facilitam seu papel no reparo do DNA Em células adultas que pararam de se dividir quais tipos de sistemas de reparo são possíveis Um determinado composto que é um análogo da base citosina pode se 26 27 28 29 30 31 tornar incorporado ao DNA Ele normalmente forma pontes de hidrogênio com a citosina mas com uma razoável frequência isomerizase em uma forma que faz pontes de hidrogênio com a timina Você espera que esse composto seja mutagênico e em caso afirmativo quais tipos de alterações ele pode induzir no DNA Duas vias a recombinação homóloga e a junção de extremidades não homólogas NHEJ podem reparar quebras bifilamentares no DNA Se a recombinação homóloga é uma via livre de erros enquanto NHEJ nem sempre é livre de erros por que NHEJ é utilizada na maior parte das vezes em eucariotos Qual via de reparo reconhece o dano ao DNA durante a transcrição O que ocorre se o dano não for reparado Onde em um gene uma inserção de 4 pb apresentaria o menor efeito sobre a expressão gênica a Íntrons b Éxons c Regiões reguladoras d Íntrons e éxons Qual das mutações gênicas a seguir apresenta maior probabilidade de provocar o impacto mais grave sobre a expressão gênica a Uma mutação sem sentido no último éxon b Uma mutação de ponto em um éxon c Uma mutação de ponto no sítio doador de corte de um íntron d Uma mutação de ponto na parte intermediária de um íntron Qual das seguintes não é possível a Uma mutação não sinônima em um íntron b Uma mutação não sinônima em um éxon c Uma mutação indel em um íntron d Uma mutação indel em um éxon Qualis das seguintes estáestão associadas à mutação espontânea 32 33 34 a Uma ocorrência de câncer de pulmão em virtude de tabagismo b Uma mutação sem sentido em um éxon causada por um erro na replicação do DNA c Uma mutação indel em um íntron causada pelo deslize da replicação d Uma mutação sem sentido em um éxon causada por um erro na replicação do DNA e uma mutação indel em um íntron causada pelo deslize da replicação Qual das declarações a seguir descreve melhor a via de reparo de malpareamento a É parte da função de revisão 3 para 5 da DNA polimerase b Atua após a replicação do DNA ao reconhecer pares de bases malpareadas c É ativada por forquilhas de replicação paradas d Está acoplada à transcrição PROBLEMAS DESAFIADORES a Por que é impossível induzir mutações sem sentido representadas no nível do mRNA pelas trincas UAG UAA e UGA por meio do tratamento de linhagens do tipo selvagem com mutágenos que causam apenas transições A G T C no DNA b A hidroxilamina HA causa apenas transições G C A T no DNA A HA produzirá mutações sem sentido em linhagens do tipo selvagem c O tratamento com HA reverterá as mutações sem sentido Várias mutações de ponto auxotróficas em Neurospora são tratadas com diversos agentes para verificar se ocorrerá a reversão Foram obtidos os resultados a seguir um sinal de mais indica reversão HA causa apenas transições G C A T Mutante 5BU HA Proflavina Reversão espontânea 35 1 2 3 4 5 a Em relação a cada um dos cinco mutantes descreva a natureza do evento de mutação original não a reversão no nível molecular Seja tão específico quanto possível b Em relação a cada um dos cinco mutantes denomine um possível mutágeno que possa ter causado o evento de mutação original Mutação espontânea não é uma resposta aceitável c No experimento de reversão em relação ao mutante 5 é obtido um derivativo prototrófico particularmente interessante Quando esse tipo é cruzado com uma linhagem do tipo selvagem padrão a progênie é composta por 90 de prototróficos e 10 auxotróficos Forneça uma explicação completa para esses resultados incluindo um motivo preciso para as frequências observadas Você está utilizando a nitrosoguanidina para reverter alelos mutantes nic 2 que necessitam de nicotinamida em Neurospora Você trata as células plaqueiaas em um meio sem nicotinamida e procura por colônias prototróficas Você obtém os resultados a seguir em relação a dois alelos mutantes Explique esses resultados no nível molecular e indique como você testaria as suas hipóteses a Com o alelo 1 de nic2 você não obtém prototróficos b Com o alelo 2 de nic2 você obtém três colônias prototróficas A B e C e cruza cada uma separadamente com uma linhagem do tipo selvagem A partir do cruzamento prototrófico A tipo selvagem você obtém uma progênie de 100 todos prototróficos A partir do cruzamento prototrófico B tipo selvagem você obtém uma progênie de 100 da qual 78 são 36 37 38 prototróficos e 22 necessitam de nicotinamida A partir do cruzamento prototrófico C tipo selvagem você obtém uma progênie de 1000 da qual 996 são prototróficos e 4 necessitam de nicotinamida Você está trabalhando com um mutágeno recentemente descoberto e deseja determinar a alteração de base que ele introduz no DNA Até agora você determinou que o mutágeno altera quimicamente uma única base de tal modo que as suas propriedades de pareamento de base são alteradas permanentemente Para determinar a especificidade da alteração você examina as alterações dos aminoácidos que ocorrem após a mutagênese Um exemplo do que você encontra está demonstrado aqui Original GlnHisIleGluLis Mutante GlnHisMetGluLis Original AlaValAsnArg Mutante AlaValSerArg Original ArgSerLeu Mutante ArgSerLeuTrpLisTreFen Qual é a especificidade da alteração de base do mutágeno Agora você encontra um mutante adicional a partir do experimento no Problema 31 Original IleLeuHisGln Mutante IleProHisGln A especificidade da alteração de base na sua resposta ao Problema 31 poderia ser responsável por essa mutação Por que sim ou por que não Você é um perito em mecanismos de reparo do DNA Você recebe uma amostra de uma linhagem celular humana derivada de uma mulher que apresenta sintomas de xeroderma pigmentoso Você determina que ela 39 apresenta uma mutação em um gene que não foi associada anteriormente ao XP Como isso é possível O ozônio O3 é um componente de ocorrência natural importante na nossa atmosfera na qual ele forma uma camada que absorve a radiação UV Foi descoberto um buraco na camada de ozônio na década de 1970 sobre a Antártica e a Austrália O buraco aparece sazonalmente e observouse que ocorre em virtude da atividade humana Especificamente o ozônio é destruído por uma classe de substâncias químicas denominadas CFC em referência a clorofluorocarbonos que são observadas em refrigerantes sistemas de arcondicionado e aerossóis Como um cientista que trabalha com mecanismos de reparo do DNA você descobre que tem ocorrido um aumento significativo no câncer de pele nas comunidades praianas na Austrália Um amigo repórter jornalístico oferece deixar que você publique um breve comentário um parágrafo no qual você deve descrever a possível conexão entre o buraco de ozônio e o aumento dos cânceres de pele Com base no que você aprendeu a respeito do reparo do DNA neste capítulo escreva um parágrafo que explique essa conexão Uma translocação recíproca demonstrada por coloração de cromossomos Uma suspensão de cromossomos de muitas células passa por um dispositivo eletrônico que classifica os cromossomos por tamanho O DNA é extraído de cromossomos individuais desnaturado ligado a um de diversos corantes fluorescentes e em seguida adicionado a cromossomos parcialmente desnaturados em uma lâmina O DNA fluorescente 171 172 173 encontra o seu próprio cromossomo e se liga ao longo de seu comprimento por meio da complementaridade de bases pintandoo Neste exemplo foram utilizados um corante vermelho e um verde para pintar cromossomos diferentes A figura demonstra preparações não coloridas acima e coloridas abaixo A preparação colorida demonstra um cromossomo verde normal um vermelho normal e dois que apresentam segmentos trocados Addenbrookes HospitalScience Source TÓPICOS Alterações no número de cromossomos Alterações na estrutura dos cromossomos Incidência geral de mutações cromossômicas humanas RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Distinguir entre os principais tipos de mutações cromossômicas no nível citológico Deduzir as configurações de pareamento meiótico em relação a todas as principais mutações cromossômicas Prever as razões da progênie de heterozigotos autopoliploides específicos em relação ao um ou mais genes Desenhar cruzamentos para sintetizar um alotetraploide Prever o desfecho da não disjunção meiótica na primeira e na segunda divisões Identificar um aneuploide com a utilização de critérios genéticos Prever as razões na progênie de aneuploides específicos Distinguir entre os principais tipos aneuploides humanos Na análise da progênie diagnosticar a presença de um dos principais tipos de rearranjos cromossômicos translocações inversões deleções duplicações Em um cruzamento envolvendo um rearranjo específico conhecido prever a herança de genes ligados e não ligados ao rearranjo Prever os padrões de expressão de genes possivelmente afetados pela U variegação por efeito de posição No caso de mutações cromossômicas a análise da progênies envolve a análise de padrões de um ou mais dos seguintes esterilidade letalidade e proporções fenotípicas dos genes heterozigotos nos cruzamentos m casal jovem está planejando ter filhos O marido sabe que sua avó teve um filho com síndrome de Down em um segundo casamento A síndrome de Down é um conjunto de distúrbios físicos e mentais causado pela presença de um cromossomo 21 extra Figura 171 Não se dispõe do nascimento que ocorreu no início do século 20 mas o casal não conhece outros casos de síndrome de Down em suas famílias O casal ouviu dizer que a síndrome de Down resulta de um raro erro ao acaso na produção do zigoto e portanto acredita que apresenta apenas uma chance baixa de ter uma criança com a doença Eles decidem ter filhos Seu primeiro filho não é afetado mas a próxima concepção resulta em aborto espontâneo e seu segundo filho nasce com síndrome de Down O fato de terem um filho com síndrome de Down é uma coincidência ou uma conexão entre a constituição genética do pai da criança e a de sua avó levou ambos a terem filhos com síndrome de Down O aborto espontâneo tem alguma relação Quais testes podem ser necessários para investigar essa situação A análise de tais questões é o tópico deste capítulo Verificamos em todo este livro que as mutações gênicas são uma fonte importante de alterações na sequência genômica Entretanto o genoma também pode ser remodelado em maior escala por meio de alterações na estrutura cromossômica ou por meio de alterações no número de cópias dos cromossomos em uma célula Essas variações em grande escala são denominadas mutações cromossômicas para que sejam distinguidas das mutações gênicas Em termos mais amplos as mutações gênicas são definidas como alterações que ocorrem dentro de um gene enquanto as mutações cromossômicas são alterações em uma região do cromossomo que engloba múltiplos genes As mutações gênicas nunca são detectáveis microscopicamente um cromossomo que contém uma mutação gênica ao microscópio aparenta ser igual a um que carreia o alelo do tipo selvagem Contrariamente muitas mutações cromossômicas podem ser detectadas por microscopia por análise genética ou molecular ou por uma combinação de todas as técnicas As mutações cromossômicas foram mais bemcaracterizadas em eucariotos e todos os exemplos neste capítulo são desse grupo FIGURA 171 A síndrome de Down resulta de uma cópia extra do cromossomo 21 Terry HarrisRex FeaturesAssociated Press As mutações cromossômicas são importantes a partir de diversas perspectivas biológicas Primeiramente elas podem ser fontes de percepção sobre o modo como os genes atuam em conjunto em uma escala genômica Em segundo lugar elas revelam diversas características importantes da meiose e da arquitetura 171 cromossômica Em terceiro lugar elas constituem ferramentas úteis para a manipulação genômica experimental Em quarto lugar elas são fontes de percepção a respeito dos processos evolutivos Em quinto lugar as mutações cromossômicas são observadas regularmente em seres humanos e algumas dessas mutações causam doenças genéticas Muitas mutações cromossômicas causam anormalidades na célula e na função do organismo A maior parte dessas anormalidades tem origem em alterações no número ou na posição dos genes Em alguns casos uma mutação cromossômica resulta da quebra do cromossomo Se a quebra ocorre dentro de um gene o resultado é a ruptura funcional daquele gene Para os nossos objetivos dividiremos as mutações cromossômicas em dois grupos alterações no número de cromossomos e alterações na estrutura cromossômica Esses dois grupos representam dois tipos de eventos fundamentalmente diferentes As alterações no número de cromossomos não estão associadas a alterações estruturais de quaisquer das moléculas de DNA da célula Em vez disso é o número dessas moléculas de DNA que está alterado e essa alteração no número é a base dos seus efeitos genéticos As alterações na estrutura cromossômica por outro lado resultam em novos arranjos de sequência em uma ou mais duplashélices de DNA Esses dois tipos de mutações cromossômicas estão ilustrados na Figura 172 que é um resumo dos tópicos deste capítulo Iniciamos explorando a natureza e as consequências das alterações no número de cromossomos Alterações no número de cromossomos Na genética como um todo poucos tópicos afetam as questões humanas tão diretamente quanto as alterações no número de cromossomos presentes em nossas células Em primeiro lugar está o fato de que um grupo de distúrbios genéticos comuns resulta da presença de um número anormal de cromossomos Embora esse grupo de distúrbios seja pequeno ele é responsável por uma grande proporção dos problemas de saúde geneticamente determinados que afetam os seres humanos Também de relevância para os seres humanos é o papel das mutações cromossômicas na agricultura cultivadores de plantas manipularam rotineiramente o número de cromossomos para melhorar os cultivos agrícolas comercialmente importantes FIGURA 172 A ilustração está dividida em três regiões coloridas para ilustrar os principais tipos de mutações cromossômicas que podem ocorrer a perda o ganho ou a realocação de cromossomos inteiros ou de segmentos cromossômicos O cromossomo do tipo selvagem está demonstrado ao centro As alterações no número de cromossomos são de dois tipos básicos alterações em conjuntos completos de cromossomos que resultam em uma condição denominada euploidia aberrante e alterações em partes dos conjuntos de cromossomos que resultam em uma condição denominada aneuploidia Euploidia aberrante Os organismos com múltiplos do conjunto cromossômico básico genoma são denominados euploides Você aprendeu nos capítulos anteriores que eucariotos conhecidos tais como plantas animais e fungos carreiam em suas células um conjunto de cromossomos haploidia ou dois conjuntos de cromossomos diploidia Nessas espécies tanto o estado haploide quanto o diploide são casos de euploidia normal Os organismos que apresentam mais ou menos do que o número normal do conjunto cromossômico são euploides aberrantes Os poliploides são organismos que apresentam mais de dois conjuntos de cromossomos Eles podem ser representados por 3n triploide 4n tetraploide 5n pentaploide 6n hexaploide e assim por diante O número de conjuntos de cromossomos é denominado ploidia ou nível de ploidia Um membro de uma espécie normalmente diploide que apresenta apenas um conjunto de cromossomos n é denominado monoploide para que seja distinguido de um membro de uma espécie normalmente haploide também n Exemplos dessas condições estão demonstrados nas quatro primeiras linhas da Tabela 171 Monoploides Machos de abelhas vespas e formigas são monoploides Nos ciclos de vida normais desses insetos os machos se desenvolvem por meio de partenogênese o desenvolvimento de um tipo especializado de ovo não fertilizado em um embrião sem a necessidade de fertilização Entretanto na maior parte das outras espécies zigotos monoploides falham em se desenvolver O motivo é que praticamente todos os membros de uma espécie diploide carreiam um número de mutações recessivas deletérias denominadas em conjunto carga genética Os alelos recessivos deletérios são mascarados por alelos do tipo selvagem na condição diploide mas são automaticamente expressos em um monoploide derivado de um diploide Os monoploides que chegam a se desenvolver até os estágios avançados são anormais Se eles sobrevivem até a fase adulta suas células germinativas não conseguem entrar em meiose normalmente tendo em vista que os cromossomos não apresentam parceiros de pareamento Portanto os monoploides são caracteristicamente estéreis Nos machos de abelhas vespas e formigas não há meiose nesses grupos os gametas são produzidos por mitose Tabela 171 Constituições cromossômicas em um organismo normalmente diploide com três cromossomos identificados como A B e C no conjunto básico Nome Designação Constituição Número de cromossomos Euploides Monoploide n A B C 3 Diploide 2n AA BB CC 6 Triploide 3n AAA BBB CCC 9 Tetraploide 4n AAAA BBBB CCCC 12 Aneuploides Monossômico 2n 1 A BB CC 5 AA B CC 5 AA BB C 5 Trissômico 2n 1 AAA BB CC 7 AA BBB CC 7 AA BB CCC 7 Poliploides A poliploidia é muito comum em plantas porém é mais rara em animais por motivos que consideraremos posteriormente De fato um aumento no número de conjuntos cromossômicos tem sido um fator importante na origem de novas espécies de plantas A evidência desse benefício é que acima de um número haploide de aproximadamente 12 números pares de cromossomos são muito mais comuns do que números ímpares Esse padrão é uma consequência da origem poliploide de muitas espécies de plantas tendo em vista que a duplicação e a reduplicação de um número podem dar origem apenas a números pares Espécies de animais não demonstram tal distribuição em virtude da relativa raridade de animais poliploides Em euploides aberrantes com frequência existe uma correlação entre o número de cópias do conjunto cromossômico e o tamanho do organismo Um organismo tetraploide por exemplo tipicamente aparenta ser muito semelhante ao seu correspondente diploide em suas proporções a não ser pelo fato de que o tetraploide é maior no todo e em suas partes componentes Quanto mais alto o nível de ploidia maior o tamanho do organismo Figura 173 CONCEITOCHAVE Poliploides com frequência são maiores e apresentam partes componentes maiores do que os seus correlatos diploides No âmbito dos poliploides devemos distinguir entre os autopoliploides que apresentam múltiplos conjuntos cromossômicos que se originam dentro de uma espécie e os alopoliploides que apresentam conjuntos de duas ou mais espécies diferentes Os alopoliploides são formados apenas entre espécies relacionadas de modo próximo entretanto os diferentes conjuntos cromossômicos são apenas homeólogos parcialmente homólogos não totalmente homólogos como são em autopoliploides Autopoliploides Os triploides 3n normalmente são autopoliploides Eles surgem espontaneamente na natureza mas podem ser obtidos por geneticistas a partir do cruzamento de um 4n tetraploide com um 2n diploide Os gametas 2n e n produzidos pelo tetraploide e pelo diploide respectivamente unemse para formar um triploide 3n Os triploides são caracteristicamente estéreis O problema que também é verdadeiro em relação aos monoploides está na presença de cromossomos não pareados na meiose Os mecanismos moleculares para a sinapse ou pareamento verdadeiro ditam que em um triploide o pareamento pode ocorrer apenas entre dois dos três cromossomos de cada tipo Figura 174 Os homólogos pareados bivalentes segregamse para polos opostos mas os homólogos não pareados univalentes passam para qualquer polo aleatoriamente Em um trivalente um grupo pareado de três os centrômeros pareados segregamse como um bivalente e o não pareado como um univalente Essas segregações ocorrem em relação a cada trio cromossômico assim em relação a qualquer tipo cromossômico o gameta pode receber um ou dois cromossomos É improvável que um gameta receba dois de cada tipo cromossômico ou que receba um de cada tipo cromossômico Portanto a probabilidade é de que os gametas apresentem números de cromossomos intermediários entre o número haploide e o diploide tais genomas são de um tipo denominado aneuploide não euploide FIGURA 173 Células epidérmicas de folhas de plantas do tabaco com ploidia crescente O tamanho da célula aumenta com o aumento da ploidia o que é particularmente evidente no tamanho do estoma A Diploide B Tetraploide C Octoploide Os gametas aneuploides em geral não dão origem a descendência viável Em plantas os grãos de pólen aneuploides em geral são inviáveis e portanto incapazes de fertilizar o gameta feminino Em qualquer organismo os zigotos que podem ter origem a partir da fusão de um gameta haploide e um aneuploide serão eles próprios aneuploides e tipicamente esses zigotos também são inviáveis Examinaremos o motivo subjacente à inviabilidade dos aneuploides quando considerarmos o balanço gênico posteriormente no capítulo FIGURA 174 Os três cromossomos homólogos de um triploide podem parear de dois modos na meiose como um trivalente ou como um bivalente mais um univalente CONCEITOCHAVE Os poliploides com números ímpares de conjuntos cromossômicos tais como os triploides são estéreis ou altamente inférteis porque seus gametas e sua descendência são aneuploides Os autotetraploides têm origem a partir da duplicação de um complemento 2n para 4n Essa duplicação pode ocorrer espontaneamente mas também pode ser induzida artificialmente por meio da aplicação de agentes químicos que interrompem a polimerização dos microtúbulos Conforme declarado no Capítulo 2 a segregação cromossômica é movida pelas fibras do fuso que são polímeros da proteína tubulina Portanto a interrupção da polimerização dos microtúbulos bloqueia a segregação dos cromossomos O tratamento químico normalmente é aplicado ao tecido somático durante a formação das fibras do fuso em células que estão sofrendo divisão O tecido poliploide resultante tal como um ramo poliploide de uma planta pode ser detectado por meio do exame dos cromossomos corados do tecido ao microscópio Tal ramo pode ser removido e utilizado como uma muda para gerar uma planta poliploide ou deixar que produza flores as quais quando autofecundadas produzirão descendência poliploide Um agente antitubulina comumente utilizado é a colchicina um alcaloide extraído do açafrãodoprado Em células tratadas com colchicina a fase S do ciclo celular ocorre mas não há segregação dos cromossomos ou divisão celular Na medida em que a célula tratada entra na telófase ocorre a formação de uma membrana nuclear ao redor do conjunto inteiro de cromossomos duplicados Portanto o tratamento de células diploides 2n com a colchicina durante um ciclo celular leva à formação de tetraploides 4n com exatamente quatro cópias de cada tipo de cromossomo Figura 175 O tratamento durante um ciclo celular adicional produz octoploides 8n e assim por diante Esse método funciona com células de plantas e de animais mas em geral as plantas aparentam ser muito mais tolerantes à poliploidia Observe que todos os alelos no genótipo são duplicados Portanto se uma célula diploide de genótipo Aa Bb for duplicada o autotetraploide resultante será de genótipo AAaa BBbb FIGURA 175 A colchicina pode ser aplicada para gerar um tetraploide a partir de um diploide A colchicina adicionada às células mitóticas durante a metáfase e a anáfase interrompe a formação das fibras do fuso impedindo a migração das cromátides após a divisão do centrômero É criada uma única célula que contém pares de cromossomos idênticos que são homozigotos em todos os loci Em virtude de quatro ser um número par os autotetraploides podem apresentar uma meiose regular embora esse resultado nem sempre ocorra O fator crucial é o modo como os quatro cromossomos de cada par segregamse Existem diversas possibilidades conforme demonstrado na Figura 176 Se os cromossomos parearem como bivalentes ou quadrivalentes segregamse normalmente produzindo gametas diploides A fusão dos gametas na fertilização regenera o estado tetraploide Se trivalentes são formados a segregação leva a gametas aneuploides não funcionais e portanto à esterilidade Quais razões genéticas são produzidas por um autotetraploide Presuma para simplificar que o tetraploide forma apenas bivalentes Se iniciarmos com uma planta tetraploide AAaa e a autofecundarmos qual proporção da progênie será aaaa Primeiramente precisamos deduzir a frequência de gametas aa em virtude de esse tipo ser o único que pode produzir um homozigoto recessivo Os gametas aa apenas podem surgir se ambos os pareamentos forem de A com a e então ambos os alelos a devem segregar para o mesmo polo Utilizaremos o experimento hipotético a seguir para calcular as frequências dos possíveis desfechos Considere as opções a partir do ponto de vista de um dos cromossomos a diante das opções de pareamento com o outro cromossomo a ou com um dos dois cromossomos A se o pareamento for aleatório existe uma chance de dois terços de que ele irá parear com um cromossomo A Se ele parear então o pareamento dos dois cromossomos remanescentes necessariamente será de A com a tendo em vista que aqueles são os únicos cromossomos remanescentes Com esses dois pareamentos de A com a existem duas segregações igualmente prováveis e em geral um quarto dos produtos conterá ambos os alelos a em um polo Portanto a probabilidade de um gameta aa será 23 14 16 Portanto se os gametas parearem aleatoriamente a probabilidade de um zigoto aaaa será de 16 16 136 e por subtração a probabilidade de A será de 3536 Portanto é esperada uma razão fenotípica de 351 CONCEITOCHAVE Se poliploides sofrerem ordenadamente pareamento meiótico de dois centrômeros podem resultar razões fenotípicas não mendelianas padrão Alopoliploides Um alopoliploide é uma planta híbrida de duas ou mais espécies contendo duas ou mais cópias de cada genoma incluído O alopoliploide modelo foi um alotetraploide sintetizado por Georgi Karpechenko em 1928 Ele desejava produzir um híbrido fértil que apresentasse as folhas do repolho Brassica e as raízes do rabanete Raphanus tendo em vista que elas eram as partes importantes de cada planta em termos agrícolas Cada uma dessas duas espécies apresenta 18 cromossomos e assim 2n1 2n2 18 e n1 n2 9 As espécies são relacionadas de modo próximo o suficiente para possibilitar o cruzamento A fusão de um gameta n1 e um n2 produziu um indivíduo de progênie híbrida viável de constituição n1 n2 18 Entretanto esse híbrido era funcionalmente estéril tendo em vista que os 9 cromossomos do genitor repolho eram suficientemente diferentes dos cromossomos do rabanete de modo que os pares não realizavam sinapse nem se segregavam normalmente na meiose e portanto o híbrido não poderia produzir gametas funcionais FIGURA 176 Existem três possibilidades de pareamento diferentes na meiose em tetraploides Os quatro cromossomos homólogos podem parearse como dois bivalentes ou como um quadrivalente e cada um pode produzir gametas funcionais Uma terceira possibilidade um trivalente mais um univalente produz gametas não funcionais Finalmente uma parte da planta híbrida produziu algumas sementes Após o plantio essas sementes produziram indivíduos férteis com 36 cromossomos Todos esses indivíduos eram alopoliploides Aparentemente eles derivaram da duplicação cromossômica acidental espontânea para 2n1 2n2 em uma região do híbrido estéril presumivelmente no tecido que finalmente se tornou uma flor e sofreu meiose para produzir gametas No tecido 2n1 2n2 existe um parceiro de pareamento para cada cromossomo e são produzidos gametas funcionais do tipo n1 n2 Esses gametas se fundem para produzir progênie alopoliploide 2n1 2n2 que também é fértil Esse tipo de alopoliploide por vezes é denominado anfidiploide ou diploide duplo Figura 177 O tratamento de um híbrido estéril com colchicina aumenta muito as chances de que os conjuntos cromossômicos sejam duplicados Os anfidiploides atualmente são sintetizados de modo rotineiro dessa maneira Infelizmente para Karpechenko seu anfidiploide apresentava as raízes de um repolho e as folhas de um rabanete Quando o alopoliploide de Karpechenko foi cruzado com cada espécie parental o repolho ou o rabanete resultaram descendentes estéreis A descendência do cruzamento com o repolho foi 2n1 n2 constituída a partir de um gameta n1 n2 do alopoliploide e um gameta n1 do repolho Os cromossomos n2 não apresentavam parceiros de pareamento portanto não poderia ocorrer uma meiose normal e a descendência era estéril Assim Karpechenko havia efetivamente criado uma nova espécie sem possibilidade de troca gênica com o repolho ou com o rabanete Ele denominou essa nova planta Raphanobrassica Na natureza a alopoliploidia aparenta ter sido uma importante força na evolução de novas espécies de plantas Um exemplo convincente é demonstrado pelo gênero Brassica conforme ilustrado na Figura 178 Aqui três espécies genitoras diferentes hibridizaram em todas as combinações de pares possíveis para formar novas espécies anfidiploides A poliploidia natural já chegou a ser considerada algo raro mas trabalhos recentes demonstraram que ela é um evento recorrente em muitas espécies de plantas A utilização de marcadores de DNA tornou possível demonstrar que poliploides em qualquer população ou área que aparentam ser os mesmos são resultantes de muitas fusões anteriores independentes entre indivíduos geneticamente distintos das mesmas duas espécies parentais Estimase que 50 de todas as plantas angiospermas sejam poliploides resultando da autopoliploidia ou da alopoliploidia Como resultado de múltiplas poliploidizações a quantidade de variação alélica em uma espécie poliploide é muito mais alta do que se acreditava anteriormente talvez contribuindo para o seu potencial de adaptação FIGURA 177 Na progênie de um cruzamento de repolho Brassica e rabanete Raphanus o anfidiploide fértil surgiu a partir da duplicação espontânea no híbrido estéril 2n 18 Um alopoliploide natural particularmente interessante é o trigo do pão Triticum aestivum 6n 42 Ao estudar os seus parentes selvagens geneticistas reconstruíram um provável histórico evolutivo dessa planta A Figura 179 demonstra que o trigo é composto por dois conjuntos de três genomas ancestrais Na meiose o pareamento é sempre entre homólogos do mesmo genoma ancestral Portanto na meiose do trigo sempre existem 21 bivalentes As células da planta alopoliploide também podem ser produzidas artificialmente por meio da fusão de células diploides de espécies diferentes Primeiramente as paredes de duas células diploides são removidas por meio do tratamento com uma enzima e as membranas das duas células se fundem e se tornam uma Com frequência os núcleos também se fundem resultando no poliploide Se a célula for nutrida com os hormônios e os nutrientes apropriados ela se divide para se tornar uma pequena muda de planta alopoliploide que em seguida pode ser transferida para o solo CONCEITOCHAVE Plantas alopoliploides podem ser sintetizadas por meio do cruzamento de espécies correlatas e da duplicação dos cromossomos do híbrido ou por meio da fusão de células diploides Aplicações agrícolas Variações no número de cromossomos têm sido exploradas para criar novas linhagens de plantas com características desejáveis Seguem alguns exemplos Monoploides A diploidia é um incômodo inerente para os agricultores Quando eles desejam induzir e selecionar novas mutações recessivas que sejam favoráveis para fins agrícolas as novas mutações não podem ser detectadas a menos que sejam homozigotas Os agricultores também podem desejar encontrar novas combinações favoráveis de alelos em diferentes loci mas tais combinações favoráveis de alelos em heterozigotos serão desfeitas pela recombinação na meiose Os monoploides proporcionam um modo de contornar alguns desses problemas Os monoploides podem ser artificialmente derivados dos produtos da meiose nas anteras de uma planta Uma célula haploide destinada a tornarse um grão de pólen pode em vez disso ser induzida por meio de tratamento a frio sujeito a baixas temperaturas para tornarse um embrioide uma pequena massa de células monoploides em divisão O embrioide pode ser cultivado em ágar até a formação de uma muda monoploide que em seguida pode ser plantada no solo e amadurecer Figura 1710 FIGURA 178 A alopoliploidia é importante na produção de novas espécies No exemplo demonstrado três espécies diploides de Brassica quadros verdeclaros foram cruzadas em diferentes combinações para produzir seus alopoliploides quadros bege Alguns dos derivados agrícolas de algumas das espécies estão demonstrados dentro dos quadros As plantas monoploides podem ser exploradas de diversos modos Em uma abordagem elas são primeiramente examinadas em relação a combinações alélicas favoráveis que tenham surgido a partir da recombinação de alelos já presentes em um genitor diploide heterozigoto Portanto a partir de um genitor que é Aa Bb pode surgir uma combinação monoploide favorável a b Em seguida o monoploide pode ser submetido à duplicação cromossômica até produzir células diploides homozigotas aa bb que conseguem realizar reprodução normal Outra abordagem é tratar as células monoploides basicamente como uma população de organismos haploides em um procedimento de mutagênese e seleção Uma população de células monoploides é isolada suas paredes são removidas por meio de tratamento enzimático e elas são expostas a um mutágeno Em seguida elas são plaqueadas em um meio seletivo para algum fenótipo desejável Essa abordagem tem sido utilizada para a seleção em relação à resistência a compostos tóxicos produzidos por um parasita de plantas bem como para a seleção em relação à resistência a herbicidas que estão sendo utilizados por fazendeiros para matar pragas nas plantações As mudas resistentes finalmente crescem em plantas monoploides cujo número cromossômico em seguida pode ser duplicado com a utilização de colchicina levando a um diploide homozigoto resistente Essas técnicas poderosas podem contornar o processo normalmente lento do cultivo de plantas com base na meiose Elas têm sido aplicadas com sucesso em importantes plantações tais como soja e tabaco CONCEITOCHAVE Geneticistas podem criar novas linhagens de plantas por meio da produção de monoploides com genótipos favoráveis e em seguida duplicar seus cromossomos até formar diploides homozigotos férteis FIGURA 179 O trigo moderno teve origem a partir de dois casos ancestrais de anfidiploidia primeiramente por meio de gametas não reduzidos depois por meio de um intermediário estéril Autotriploides As bananas que se encontram disponíveis comercialmente de modo amplo são triploides estéreis com 11 cromossomos em cada conjunto 3n 33 A expressão mais óbvia da esterilidade das bananas é a ausência de sementes na fruta que ingerimos As manchas pretas nas bananas não são sementes as sementes de banana são muito duras podem quebrar os dentes Melancias sem sementes são outro exemplo da exploração comercial da triploidia em plantas Autotetraploides Muitas plantas autotetraploides foram desenvolvidas como cultivos comerciais para se obter uma vantagem de seu tamanho aumentado Figura 1711 Frutos e flores grandes são particularmente favorecidos Alopoliploides A alopoliploidia formação de poliploides entre espécies diferentes foi importante na produção de plantações modernas O algodão do Novo Mundo é um alopoliploide natural que surgiu espontaneamente assim como o trigo Os alopoliploides também são sintetizados artificialmente para combinar as características úteis das espécies parentais em um tipo Apenas um anfidiploide sintético chegou a ser utilizado comercialmente de modo amplo um cultivo conhecido como Triticale Ele é um anfidiploide entre o trigo Triticum 6n 42 e o centeio Secale 2n 14 Portanto em relação ao Triticale 2n 2 21 7 56 Essa nova planta combina a alta produtividade do trigo com a resistência do centeio FIGURA 1710 Plantas monoploides podem ser derivadas artificialmente de células destinadas a tornarse grãos de pólen por meio da exposição das células ao tratamento a frio em cultura de tecido FIGURA 1711 Folhas e flores de melancia diploide esquerda e tetraploide direita Michael E Compton University of Wisconsin Platteville Animais poliploides Conforme observado anteriormente a poliploidia é mais comum em plantas do que em animais mas existem casos de animais poliploides de ocorrência natural Espécies poliploides de platelmintos sanguessugas e camarões de água salgada se reproduzem por meio de partenogênese Drosophilae triploides e tetraploides foram sintetizadas experimentalmente Entretanto os exemplos não estão limitados a essas chamadas formas inferiores Anfíbios e répteis poliploides de ocorrência natural são surpreendentemente comuns Eles apresentam diversos modos de reprodução espécies poliploides de rãs e sapos têm na reprodução sexuada enquanto salamandras e lagartos poliploides são partenogenéticos Salmonidae a família de peixes que inclui o salmão e a truta é um exemplo conhecido das diversas espécies de animais que aparentam ter sido originadas por poliploidia ancestral A esterilidade dos triploides tem sido explorada comercialmente em animais bem como em plantas Ostras triploides têm sido desenvolvidas em virtude de apresentarem uma vantagem comercial sobre as diploides Os diploides passam por uma temporada de produção de ovos quando não são palatáveis mas os triploides estéreis não põem ovos e são palatáveis durante o ano todo Aneuploidia A aneuploidia é a segunda maior categoria de aberrações cromossômicas na qual o número de cromossomos é anormal Um aneuploide é um organismo cujo número de cromossomos difere daquele do tipo selvagem em parte de um conjunto cromossômico Em geral o conjunto cromossômico aneuploide difere do tipo selvagem em apenas um cromossomo ou em um pequeno número de cromossomos Um aneuploide pode apresentar um número de cromossomos superior ou inferior àquele do tipo selvagem A nomenclatura aneuploide ver Tabela 171 tem por base o número de cópias do cromossomo específico no estado aneuploide Em relação aos autossomos em organismos diploides o aneuploide 2n 1 é trissômico 2n 1 é monossômico e 2n 2 o 2 representa a perda de ambos os homólogos de um cromossomo é nulissômico Em haploides n 1 é dissômico É utilizada uma anotação especial para descrever os cromossomos sexuais aneuploides tendo em vista que ela deve lidar com dois cromossomos diferentes A notação meramente lista as cópias de cada cromossomo sexual tal como XXY XYY XXX ou XO o O referese à ausência de um cromossomo e é incluído para demonstrar que o símbolo X único não é um erro tipográfico Não disjunção A causa da maior parte das aneuploidias é a não disjunção no curso da meiose ou da mitose Disjunção é outra palavra para a segregação normal de cromossomos ou cromátides homólogas para polos opostos nas divisões meióticas ou mitóticas A não disjunção é uma falha desse processo na qual dois cromossomos ou duas cromátides se dirigem incorretamente para um polo e não para o outro A não disjunção mitótica pode ocorrer à medida que as células se dividem durante o desenvolvimento Como resultado partes do corpo serão aneuploides setores aneuploides A não disjunção meiótica é observada mais comumente Nesse caso os produtos da meiose são aneuploides levando a descendentes totalmente aneuploides Na não disjunção meiótica os cromossomos podem falhar em se separar na primeira ou na segunda divisão meiótica Figura 1712 De qualquer modo são produzidos gametas n 1 e n 1 Se um gameta n 1 é fertilizado por um gameta n é produzido um zigoto monossômico 2n 1 A fusão de um gameta n 1 e um gameta n produz um trissômico 2n 1 CONCEITOCHAVE Os organismos aneuploides resultam principalmente de não disjunção na meiose parental FIGURA 1712 Produtos aneuploides da meiose ou seja os gametas são produzidos por meio da não disjunção na primeira ou na segunda divisão meiótica Observe que todos os outros cromossomos estão presentes em números normais incluindo nas células nas quais nenhum cromossomo está demonstrado A não disjunção ocorre espontaneamente Assim como a maior parte das mutações gênicas ela é um exemplo de uma falha ao acaso de um processo celular básico Os processos moleculares precisos que falham não são conhecidos mas em sistemas experimentais a frequência de não disjunção pode ser aumentada por meio da interferência com a polimerização dos microtúbulos inibindo assim a movimentação cromossômica normal Aparentemente a disjunção apresenta maior probabilidade de erro na meiose I Essa falha não é uma surpresa tendo em vista que a disjunção normal na anáfase I requer que as cromátides homólogas da tétrade permaneçam pareadas durante a prófase I e a metáfase I além de crossovers Contrariamente a disjunção adequada na anáfase II ou na mitose requer que o centrômero se divida adequadamente mas não requer o pareamento cromossômico ou o crossing over Os crossovers são um componente necessário do processo de disjunção normal De algum modo a formação de um quiasma ajuda a manter um bivalente unido e assegura que as duas díades irão se dirigir para os polos opostos Na maior parte dos organismos crossing over é suficiente para assegurar que todos os bivalentes apresentarão no mínimo um quiasma por meiose Em Drosophila muitos dos cromossomos que sofreram não disjunção observados em gametas dissômicos n 1 são não recombinantes demonstrando que eles surgem a partir de meioses nas quais não ocorre um crossing over naquele cromossomo Foram realizadas observações semelhantes em trissomias humanas Além disso em inúmeros organismos experimentais diferentes as mutações que interferem com a recombinação apresentam o efeito de aumentar maciçamente a frequência de não disjunção na meiose I Todas essas observações fornecem evidências em relação ao papel do crossing over na manutenção do pareamento cromossômico na ausência dessas associações os cromossomos são vulneráveis à não disjunção na anáfase I CONCEITOCHAVE Os crossovers são necessários para manter os bivalentes pareados até a anáfase I Se o crossing over por algum motivo falha ocorre a não disjunção de primeira divisão Monossômicos 2n 1 Os monossômicos apresentam a ausência de uma cópia de um cromossomo Na maior parte dos organismos diploides a ausência de uma cópia de um cromossomo de um par é deletéria Em seres humanos os monossômicos em relação a qualquer dos autossomos morrem in utero Muitos monossômicos do cromossomo X também morrem in utero mas alguns são viáveis Um complemento cromossômico humano de 44 autossomos mais um único X produz uma condição conhecida como síndrome de Turner representada como XO As pessoas afetadas apresentam um fenótipo característico elas são mulheres estéreis de estatura baixa e com frequência apresentam uma frouxidão da pele que se estende entre o pescoço e os ombros Figura 1713 Embora a sua inteligência esteja próxima do normal algumas de suas funções cognitivas específicas são defeituosas Aproximadamente 1 em 5000 nascimentos do sexo feminino demonstra a síndrome de Turner Geneticistas utilizaram plantas monossômicas viáveis para mapear alelos mutantes recessivos recémdescobertos em um cromossomo específico Por exemplo podese produzir um conjunto de linhagens monossômicas cada uma sabidamente sem um cromossomo diferente Os homozigotos em relação ao novo alelo mutante são cruzados com cada linhagem monossômica e a progênie de cada cruzamento é inspecionada em relação ao fenótipo recessivo O aparecimento do fenótipo recessivo identifica o cromossomo que não apresenta uma cópia como aquele no qual o gene normalmente está localizado O teste funciona porque metade dos gametas de um monossômico 2n 1 fértil será n 1 e quando um gameta n 1 é fertilizado por um gameta que contém uma nova mutação no cromossomo homólogo o alelo mutante será o único alelo daquele gene presente e portanto será expresso Para ilustrar presumiremos que um gene Aa se encontra no cromossomo 2 Prevêse que cruzamentos de aa com monossômicos para o cromossomo 1 e o cromossomo 2 produzam resultados diferentes o cromossomo 1 é abreviado cr1 Trissômicos 2n 1 Os trissômicos contêm uma cópia extra de um cromossomo Em organismos diploides em geral o desequilíbrio cromossômico da condição trissômica pode resultar em anormalidade ou morte Entretanto existem muitos exemplos de trissômicos viáveis Além disso os trissômicos podem ser férteis Quando as células de alguns organismos trissômicos são observadas ao microscópio no momento do pareamento cromossômico meiótico observase que os cromossomos trissômicos formam um grupo associado de três um trivalente enquanto os outros cromossomos formam bivalentes regulares FIGURA 1713 A síndrome de Turner resulta da presença de um único cromossomo X XO Quais razões genéticas podem ser esperadas para genes no cromossomo trissômico Consideraremos um gene A que está próximo do centrômero naquele cromossomo e assumiremos que o genótipo é Aaa Além disso postularemos que na anáfase I os dois centrômeros pareados no trivalente passam para polos opostos e que o outro centrômero passa aleatoriamente para qualquer polo Em seguida podemos prever as três segregações igualmente frequentes demonstradas na Figura 1714 Essas segregações resultam em uma razão gamética geral conforme demonstrado nos seis compartimentos da Figura 1714 ou seja A a Aa aa Se estiver disponível um conjunto de linhagens cada uma carreando um cromossomo trissômico diferente então uma mutação gênica pode ser localizada em um cromossomo por meio da determinação de qual das linhagens proporciona uma razão trissômica do tipo precedente Existem diversos exemplos de trissomias humanas viáveis Diversos tipos de trissômicos de cromossomos sexuais podem viver até a fase adulta Cada um desses tipos é observado a uma frequência de aproximadamente 1 em 1000 nascimentos vivos do sexo relevante Ao considerar as trissomias dos cromossomos sexuais humanos relembre que o sexo dos mamíferos é determinado pela presença ou pela ausência do cromossomo Y A combinação XXY resulta na síndrome de Klinefelter Pessoas com essa síndrome são homens que apresentam constituições magras um QI levemente comprometido e são estéreis Figura 1715 Outra combinação anormal XYY apresenta um histórico controverso Foram realizadas tentativas de ligar a condição XYY a uma predisposição à violência Entretanto atualmente está claro que uma condição XYY de modo algum garante tal comportamento A maior parte dos homens XYY é fértil As meioses demonstram pareamento normal do X com um dos Y o outro Y não pareia e não é transmitido para os gametas Portanto os gametas contêm X ou Y nunca YY ou XY Trissômicos triplo X XXX são mulheres fenotipicamente normais e férteis A meiose demonstra o pareamento de apenas dois cromossomos X o terceiro não pareia Portanto os ovócitos apresentam apenas um X e assim como aquela de homens XYY a condição não é transmitida para a progênie FIGURA 1714 Três segregações igualmente prováveis podem ocorrer na meiose de um trissômico Aaa produzindo os genótipos demonstrados FIGURA 1715 A síndrome de Klinefelter resulta da presença de dois cromossomos X e um cromossomo Y Das trissomias humanas o tipo mais familiar é a síndrome de Down Figura 1716 discutida brevemente no início do capítulo A frequência da síndrome de Down é de aproximadamente 015 de todos os nascimentos vivos A maioria das pessoas afetadas apresenta uma cópia extra do cromossomo 21 causada pela não disjunção do cromossomo 21 em um genitor cromossomicamente normal Nesse tipo esporádico de síndrome de Down não existe um histórico familiar de aneuploidia Alguns tipos mais raros de síndrome de Down surgem a partir de translocações um tipo de rearranjo cromossômico discutido posteriormente no capítulo nesses casos conforme veremos a síndrome de Down recorre no heredograma tendo em vista que a translocação pode ser transmitida do genitor para o filho Os fenótipos combinados que compõem a síndrome de Down incluem retardo mental com QI na faixa de 20 a 50 face achatada e larga olhos com dobra epicântica estatura baixa mãos curtas com uma prega na parte intermediária e uma língua grande e sulcada As mulheres podem ser férteis e produzir progênie normal ou trissômica mas os homens são estéreis com raríssimas exceções A expectativa de vida média é de aproximadamente 17 anos e apenas 8 das pessoas com síndrome de Down sobrevivem até depois dos 40 anos de idade FIGURA 1716 A síndrome de Down resulta da presença de uma cópia extra do cromossomo 21 A incidência da síndrome de Down está relacionada com a idade materna mães mais velhas apresentam um risco muito elevado de ter um filho com síndrome de Down Figura 1717 Por esse motivo a análise cromossômica do feto por meio de amniocentese ou de amostra de vilosidades coriônicas atualmente é recomendada para mães gestantes mais velhas Também foi demonstrado um efeito menos pronunciado da idade paterna Embora o efeito da idade materna tenha sido conhecido há muitos anos ainda não se sabe a sua causa Não obstante existem algumas correlações biológicas interessantes Com a idade possivelmente o cromossomo bivalente apresenta menos probabilidade de permanecer unido durante a prófase I da meiose A parada meiótica dos ovócitos meiócitos femininos no final da prófase I é um fenômeno comum em muitos animais Em mulheres todos os ovócitos param no diplóteno antes do nascimento A meiose é retomada a cada período menstrual o que significa que os cromossomos bivalentes devem permanecer adequadamente associados por até cinco ou mais décadas Se especularmos que essas associações apresentam uma probabilidade crescente de ruptura por acidente na medida em que o tempo passa podemos imaginar um mecanismo que contribui para o aumento da não disjunção materna com a idade Consistente com essa especulação a maior parte das não disjunções relacionadas com o efeito da idade materna ocorre em virtude da não disjunção na anáfase I não na anáfase II FIGURA 1717 Mães mais velhas apresentam uma proporção mais alta de bebês com síndrome de Down do que mães mais jovens Dados de L S Penrose e G F Smith Downs Anomaly Little Brown and Company 1966 Os únicos outros trissômicos autossômicos humanos que sobrevivem até o nascimento são aqueles com a trissomia do cromossomo 13 síndrome de Patau e a trissomia do cromossomo 18 síndrome de Edwards Ambos apresentam anormalidades físicas e mentais graves A síndrome fenotípica da trissomia do cromossomo 13 inclui fenda labial cabeça pequena e malformada pés arqueados e expectativa de vida média de 130 dias A trissomia do cromossomo 18 inclui orelhas tipo fauno implantação baixa mandíbula estreita pelve estreita e pés arqueados quase todos os bebês com trissomia do 18 morrem nas primeiras semanas após o nascimento Todos os outros trissômicos morrem in utero Conceito de balanço gênico Ao considerar a euploidia aberrante observamos que um aumento no número de conjuntos de cromossomos completos está correlacionado com o maior tamanho do organismo mas que a forma e as proporções gerais do organismo permanecem em grande parte as mesmas Contrariamente a aneuploidia autossômica tipicamente altera a forma e as proporções do organismo de modos característicos As plantas tendem a ser um pouco mais tolerantes à aneuploidia do que os animais Estudos no estramônio Datura stramonium fornecem um exemplo clássico dos efeitos da aneuploidia e da poliploidia Nessa planta o número de cromossomos haploides é 12 Conforme esperado o estramônio poliploide é proporcional assim como o diploide normal apenas maior Contrariamente cada um dos 12 trissômicos possíveis é desproporcional mas de diferentes modos entre si conforme exemplificado pelas alterações na forma da cápsula da semente Figura 1718 As 12 trissomias diferentes levam a 12 alterações diferentes e características na forma da cápsula De fato essas características e outras dos trissômicos individuais são tão confiáveis que a síndrome fenotípica pode ser utilizada para identificar plantas que carreiam uma trissomia em particular De modo semelhante os 12 monossômicos são eles próprios diferentes entre si e de cada um dos trissômicos Em geral um monossômico em relação a um cromossomo em particular é mais gravemente anormal do que o trissômico correspondente Observamos tendências semelhantes em animais aneuploides Na moscadas frutas Drosophila os únicos aneuploides autossômicos que sobrevivem até a fase adulta são os trissômicos e os monossômicos em relação ao cromossomo 4 que é o menor cromossomo de Drosophila representando apenas aproximadamente 1 a 2 do genoma Os trissômicos em relação ao cromossomo 4 são apenas levemente afetados e são muito menos anormais do que os monossômicos em relação ao cromossomo 4 Em seres humanos nenhum monossômico autossômico sobrevive até o nascimento mas conforme já declarado três tipos de trissômicos autossômicos podem sobreviver Assim como é verdadeiro para o estramônio aneuploide cada um desses três trissômicos demonstra síndromes fenotípicas únicas em virtude dos efeitos especiais de doses alteradas de cada um desses cromossomos FIGURA 1718 Cada um dos 12 trissômicos possíveis de Datura é desproporcional de um modo diferente A Fruto de Datura B Cada desenho é do fruto de um trissômico diferente com sua respectiva denominação A iStockphotoThinkstock Por que os aneuploides são muito mais anormais do que os poliploides Por que a aneuploidia em relação a cada cromossomo apresenta seus próprios efeitos fenotípicos característicos E por que os monossômicos são em geral mais gravemente afetados do que os trissômicos correspondentes As respostas aparentam ser certamente uma questão de balanço gênico Em um euploide a razão de genes em qualquer cromossomo com relação aos genes em outros cromossomos é sempre 11 independentemente de estarmos considerando um monoploide diploide triploide ou tetraploide Por exemplo em um tetraploide em razão ao gene A no cromossomo 1 e ao gene B no cromossomo 2 a razão é de 4 A4 B ou 11 Contrariamente em um aneuploide a razão de genes no cromossomo aneuploide em relação aos genes em outros cromossomos difere do tipo selvagem em 5050 em relação aos monossômicos 150 para os trissômicos Com a utilização do mesmo exemplo anterior em um trissômico em razão ao cromossomo 2 observamos que a razão dos genes A e B é de 2 A3 B Portanto podemos verificar que os genes aneuploides estão desbalanceados Como o fato de estarem desbalanceados nos ajuda a responder as questões levantadas Em geral a quantidade de transcritos produzida por um gene é diretamente proporcional ao número de cópias daquele gene em uma célula Ou seja em relação a um determinado gene a taxa de transcrição está diretamente relacionada com o número de moldes de DNA disponíveis Portanto quanto mais cópias do gene mais transcritos são produzidos e mais do produto proteico correspondente é produzido Essa relação entre o número de cópias de um gene e a quantidade do produto gênico produzida é denominada efeito de dosagem gênica Podemos inferir que a fisiologia normal em uma célula depende da razão adequada de produtos gênicos na célula euploide Essa razão é o balanço gênico normal Se a dosagem relativa de determinados genes for alterada por exemplo em virtude da remoção de uma das duas cópias de um cromossomo ou até mesmo de um segmento dele podem surgir desequilíbrios fisiológicos nas vias celulares Em alguns casos os desbalanceamentos de aneuploidia resultam dos efeitos de alguns poucos genes importantes cuja dosagem foi alterada em vez de alterações na dosagem de todos os genes em um cromossomo Tais genes podem ser considerados haploanormais resultando em um fenótipo anormal se presente apenas uma vez ou triploanormais resultando em um fenótipo anormal se presente em três cópias ou ambos Eles contribuem significativamente para as síndromes fenotípicas aneuploides Por exemplo o estudo de pessoas trissômicas em relação a apenas uma parte do cromossomo 21 tornou possível localizar os genes que contribuem para a síndrome de Down em diversas regiões do cromossomo 21 os resultados indicam que alguns aspectos do fenótipo podem ocorrer em virtude da tripla anormalidade em relação a genes importantes únicos nessas regiões cromossômicas Além dos efeitos desses genes importantes outros aspectos das síndromes aneuploides provavelmente resultam dos efeitos cumulativos da aneuploidia de diversos genes cujos produtos estão todos desbalanceados Indubitavelmente o fenótipo aneuploide inteiro resulta de uma combinação dos efeitos do desbalanço de alguns genes importantes juntamente com um desbalanço cumulativo de muitos genes menos importantes Entretanto o conceito de balanço gênico não nos informa o motivo pelo qual a apresentação de poucos produtos gênicos monossomia é muito pior para um organismo do que a apresentação de muitos produtos gênicos trissomia Paralelamente podemos indagar por que existem muito mais genes haploanormais do que triploanormais Uma chave para explicar a anormalidade extrema dos monossômicos é que quaisquer alelos recessivos deletérios presentes em um autossomo monossômico serão automaticamente expressos Como aplicamos a ideia de balanço gênico para casos de aneuploidia de cromossomos sexuais O balanço gênico é mantido também em relação aos cromossomos sexuais mas também devemos levar em consideração as propriedades especiais dos cromossomos sexuais Em organismos com determinação sexual XY o cromossomo Y aparenta ser um cromossomo X degenerado no qual existem muito poucos genes funcionais além de alguns relacionados com a própria determinação sexual à produção de espermatozoides ou ambas O cromossomo X por outro lado contém muitos genes relacionados com processos celulares básicos genes de manutenção presentes no cromossomo que por fim evoluiu para o cromossomo X Os mecanismos de determinação sexual XY provavelmente evoluíram independentemente de 10 a 20 vezes em diferentes grupos taxonômicos Por exemplo aparentemente existe um mecanismo de determinação sexual para todos os mamíferos mas ele é completamente diferente do mecanismo que regula a determinação sexual XY nas moscasdasfrutas Em um sentido os cromossomos X são naturalmente aneuploides Em espécies com um sistema de determinação sexual XY as fêmeas apresentam dois cromossomos X enquanto os machos apresentam apenas um Não obstante os genes de manutenção do cromossomo X são expressos de modo aproximadamente igual por célula em fêmeas e em machos Em outras palavras existe compensação de dose Como essa compensação é conquistada A resposta depende do organismo Nas moscasdasfrutas o cromossomo X do macho aparenta estar hiperativado possibilitando que ele seja transcrito no dobro da taxa de cada cromossomo X na fêmea Como resultado o macho XY de Drosophila apresenta uma dosagem do gene X equivalente àquela de uma fêmea XX Em mamíferos contrariamente a regra é que não importa quantos cromossomos X estejam presentes existe apenas um cromossomo X ativo em relação à transcrição em cada célula somática Essa regra proporciona à fêmea XX de mamíferos uma dosagem gênica do X equivalente àquela de um macho XY A compensação de dose em mamíferos é conquistada por meio da inativação do cromossomo X Uma fêmea com dois cromossomos X por exemplo é um mosaico de dois tipos celulares no qual um ou outro cromossomo X está ativo Examinamos esse fenômeno no Capítulo 12 Portanto indivíduos XY e XX produzem as mesmas quantidades de produtos dos genes de manutenção do cromossomo X A inativação do cromossomo X também explica o motivo pelo qual os seres humanos triplo X são fenotipicamente normais apenas um dos três cromossomos X está ativo em relação à transcrição em uma determinada célula De modo semelhante um homem XXY é apenas moderadamente afetado tendo em vista que apenas um de seus dois cromossomos X está ativo em cada célula Por que os indivíduos XXY são anormais tendo em vista que indivíduos triplo X são fenotipicamente normais Ocorre que alguns poucos genes dispersos em um X inativo ainda estão ativos em relação à transcrição Em homens XXY esses genes são transcritos no dobro do nível em que são transcritos em homens XY Em mulheres XXX por outro lado os poucos genes transcritos estão ativos em apenas 15 vez o nível em que são transcritos em mulheres XX Esse nível mais baixo de aneuploidia funcional em XXX do que em XXY somado ao fato de que os genes do X ativo aparentam levar à feminilização podem explicar o fenótipo feminilizado dos machos XXY A gravidade da síndrome de Turner XO pode ocorrer em virtude dos efeitos deletérios da monossomia e a mais baixa atividade dos genes transcritos das fêmeas X em comparação às XX Conforme normalmente é observado em relação aos aneuploides a monossomia do cromossomo X produz um fenótipo mais anormal do que a presença de uma cópia extra do mesmo cromossomo mulheres triplo X ou homens XXY A dosagem gênica também é importante nos fenótipos de poliploides Zigotos poliploides humanos surgem por meio de diversos tipos de erros na divisão celular A maior parte morre in utero Ocasionalmente nascem bebês triploides mas nenhum sobrevive Esse fato aparenta violar o princípio de que os poliploides são mais normais do que os aneuploides A explicação para essa 172 1 contradição parece estar relacionada com a compensação de dose do cromossomo X Parte da regra em relação ao balanço gênico em organismos que apresentam um único X ativo parece ser que deve haver um X ativo para cada duas cópias do complemento cromossômico autossômico Portanto observase que algumas células em mamíferos triploides apresentam um X ativo enquanto outras surpreendentemente apresentam dois Nenhuma situação está em balanço com os genes autossômicos CONCEITOCHAVE A aneuploidia é quase sempre deletéria em virtude do desbalanceamento gênico a razão de genes é diferente daquela em euploides e essa diferença interfere na função normal do genoma Alterações na estrutura dos cromossomos As alterações na estrutura dos cromossomos denominadas rearranjos envolvem diversas classes de eventos importantes Um segmento cromossômico pode ser perdido constituindo uma deleção ou duplicado para formar uma duplicação A orientação de um segmento dentro do cromossomo pode ser revertida constituindo uma inversão Ou um segmento pode ser movido para um cromossomo diferente constituindo uma translocação A quebra do DNA é uma causa importante de cada um desses eventos Ambos os filamentos de DNA devem ser quebrados em dois locais diferentes seguidos pela reunião das extremidades quebradas para produzir um novo rearranjo cromossômico Figura 1719 à esquerda Os rearranjos cromossômicos por quebra podem ser induzidos artificialmente por meio da utilização de radiação ionizante Esse tipo de radiação notavelmente raios X e gama é altamente energético e causa diversas quebras bifilamentares no DNA Para compreender como os rearranjos cromossômicos são produzidos por meio de quebra devese ter em mente diversos pontos Cada cromossomo é uma única molécula de DNA bifilamentar 2 3 4 5 6 O primeiro evento na produção de um rearranjo cromossômico é a geração de duas ou mais quebras bifilamentares nos cromossomos de uma célula ver Figura 1719 linha superior à esquerda As quebras bifilamentares são possivelmente letais exceto se forem reparadas Os sistemas de reparo na célula corrigem as quebras bifilamentares por meio da reunião das extremidades quebradas ver Capítulo 16 para uma discussão detalhada sobre o reparo do DNA Se as duas extremidades da mesma quebra forem reunidas a ordem do DNA original é restaurada Se as extremidades de duas quebras diferentes forem unidas entretanto o resultado é um ou outro tipo de rearranjo cromossômico Os únicos rearranjos cromossômicos que sobrevivem à meiose são aqueles que produzem moléculas de DNA que apresentam um centrômero e dois telômeros Se um rearranjo produzir um cromossomo com ausência de um centrômero tal cromossomo acêntrico não será atraído para nenhum polo na anáfase da mitose ou meiose e não será incorporado ao núcleo de qualquer progênie Portanto os cromossomos acêntricos não são herdados Se um rearranjo produzir um cromossomo com dois centrômeros dicêntrico com frequência ele será atraído simultaneamente para os polos opostos na anáfase formando uma ponte anafásica Os cromossomos com ponte anafásica tipicamente não serão incorporados na célula de qualquer progênie Se uma quebra cromossômica produzir um cromossomo com ausência de telômero tal cromossomo não poderá replicarse adequadamente Relembre do Capítulo 7 que os telômeros são necessários para iniciar a replicação adequada do DNA nas extremidades ver Figura 726 7 FIGURA 1719 Cada um dos quatro tipos de rearranjos cromossômicos pode ser produzido por meio de dois mecanismos básicos quebra cromossômica e reunião ou crossing over entre o DNA repetitivo As regiões cromossômicas são numeradas de 1 a 10 Os cromossomos homólogos são da mesma cor Se um rearranjo duplicar ou deletar um segmento de um cromossomo o balanço gênico poderá ser afetado Quanto maior o segmento que é perdido ou duplicado maior a probabilidade de que o desbalanceamento gênico cause anormalidades fenotípicas Outra causa importante de rearranjos é o crossing over entre segmentos de DNA repetitivo duplicado Esse tipo de crossing over é denominado recombinação homóloga não alélica NAHR Em organismos com sequências repetidas de DNA em um cromossomo ou em cromossomos diferentes existe uma ambiguidade a respeito de qual das repetições pareará com outra na meiose Se as sequências pareadas não estiverem nas mesmas posições relativas nos homólogos o crossing over pode produzir cromossomos aberrantes Deleções duplicações inversões e translocações podem todas ser produzidas por crossing over ver Figura 1719 à direita Existem dois tipos gerais de rearranjos desbalanceado e balanceado Os rearranjos desbalanceados alteram a dosagem gênica de um segmento cromossômico Assim como na aneuploidia em relação a cromossomos inteiros a perda de uma cópia de um segmento ou a adição de uma cópia extra pode romper o balanço gênico normal As duas classes simples de rearranjos desbalanceados são as deleções e as duplicações Uma deleção é a perda de um segmento de um braço cromossômico e a justaposição dos dois segmentos em cada lado do segmento deletado como nesse exemplo que demonstra a perda do segmento CD Uma duplicação é a repetição de um segmento de um braço cromossômico No tipo mais simples de duplicação os dois segmentos estão adjacentes uns aos outros uma duplicação em tandem assim como nessa duplicação do segmento C Entretanto o segmento duplicado pode terminar em uma posição diferente no mesmo cromossomo ou até mesmo em um cromossomo diferente Os rearranjos balanceados alteram a ordem dos genes no cromossomo mas não removem ou duplicam qualquer DNA As duas classes simples de rearranjos balanceados são as inversões e as translocações recíprocas Uma inversão é um rearranjo no qual um segmento interno de um cromossomo foi quebrado duas vezes girou 180 e foi reunido Uma translocação recíproca é um rearranjo no qual dois cromossomos não homólogos são cada um quebrados uma vez criando fragmentos acêntricos que em seguida podem trocar de lugar Por vezes as quebras do DNA que precedem a formação de um rearranjo ocorrem dentro dos genes Quando ocorrem elas modificam a função do gene porque parte dele movese para um novo local e porque nenhum transcrito completo pode ser produzido Além disso as sequências de DNA de cada lado das extremidades reunidas de um cromossomo rearranjado são sequências que normalmente não estão justapostas Por vezes a junção ocorre de tal modo que a fusão produz um gene híbrido não funcional composto por partes de dois outros genes As seções a seguir consideram as propriedades desses rearranjos balanceados e desbalanceados Deleções Uma deleção é simplesmente a perda de parte de um braço cromossômico O processo de deleção requer duas quebras cromossômicas para cortar o segmento interveniente O fragmento deletado não apresenta um centrômero consequentemente ele não pode ser puxado para um polo do fuso na divisão celular e é perdido Os efeitos das deleções dependem de seu tamanho Uma deleção pequena dentro de um gene denominada deleção intragênica inativa o gene e apresenta o mesmo efeito de outras mutações nulas daquele gene Se o fenótipo nulo homozigoto for viável como por exemplo no albinismo humano a deleção homozigota também será viável As deleções intragênicas podem ser distinguidas das mutações causadas por alterações em um único nucleotídio tendo em vista que os genes com as referidas deleções nunca revertem para o tipo selvagem Na maior parte desta seção estaremos lidando com deleções multigênicas nas quais diversos a muitos genes são perdidos As consequências dessas deleções são mais graves do que aquelas das deleções intragênicas Se tal deleção ocorrer em homozigose por endogamia ou seja se ambos os homólogos apresentarem a mesma deleção a combinação será sempre letal Esse fato sugere que todas as regiões dos cromossomos são essenciais para a viabilidade normal e que a eliminação completa de qualquer segmento do genoma é deletéria Até mesmo um organismo heterozigoto para uma deleção multigênica ou seja que apresenta um homólogo normal e um com a deleção não sobrevive Principalmente esse desfecho letal ocorre em virtude do rompimento do balanço gênico normal Alternativamente a deleção pode revelar alelos recessivos deletérios possibilitando que as cópias únicas sejam expressas CONCEITOCHAVE A letalidade das grandes deleções heterozigotas pode ser explicada pelo desbalanceamento gênico e pela expressão de recessivos deletérios Deleções pequenas por vezes são viáveis em combinação com um homólogo normal Tais deleções podem ser identificadas por meio do exame dos cromossomos meióticos ao microscópio A falha do segmento correspondente no homólogo normal em parear cria uma alça de deleção visível Figura 1720 A Em Drosophila as alças de deleção também estão visíveis nos cromossomos politênicos Esses cromossomos são observados nas células de glândulas salivares e em outros tecidos específicos de determinados insetos Nessas células os homólogos pareiam e replicam muitas vezes e assim cada cromossomo é representado por um espesso feixe de réplicas Esses cromossomos politênicos são facilmente visíveis e cada um apresenta um conjunto de bandas escuras de posição e número fixos Essas bandas atuam como marcos cromossômicos úteis Um exemplo de um cromossomo politênico no qual um homólogo original carreava uma deleção está demonstrado na Figura 1720 B Uma deleção pode ser atribuída a um local específico no cromossomo por meio do exame microscópico dos cromossomos politênicos e da determinação da posição da alça de deleção FIGURA 1720 Na meiose os cromossomos de uma deleção heterozigota formam uma configuração em alça A No pareamento meiótico o homólogo normal forma uma alça Os genes nesta alça não apresentam alelos com os quais realizar sinapse B Tendo em vista que os cromossomos politênicos de Drosophila observados em glândulas salivares e em outros locais específicos apresentam padrões de bandeamento específicos podemos inferir quais bandas estão ausentes no homólogo com a deleção ao observar quais bandas aparecem na alça do homólogo normal B William M Gelbart Harvard University Outra indicação da presença de uma deleção é que a deleção de um segmento em um homólogo por vezes revela os alelos recessivos presentes no outro homólogo levando à sua expressão inesperada Considere por exemplo a deleção demonstrada no diagrama a seguir Se não houver deleção esperase que nenhum dos sete alelos recessivos seja expresso entretanto se b e c forem expressos então provavelmente ocorreu uma deleção que abrange os genes b e c no outro homólogo Tendo em vista que os alelos recessivos aparentam estar demonstrando dominância nos referidos casos o efeito é denominado pseudodominância No caso reverso se já conhecemos o local da deleção podemos aplicar o efeito da pseudodominância no sentido oposto para mapear as posições dos alelos mutantes Esse procedimento denominado mapeamento de deleção pareia as mutações em face de um conjunto de deleções sobrepostas definidas Um exemplo em Drosophila está demonstrado na Figura 1721 Nesse diagrama o mapa de recombinação está demonstrado na parte superior marcado com as distâncias em unidades de mapa a partir da extremidade esquerda As barras vermelhas horizontais abaixo do cromossomo demonstram a extensão das deleções listadas à esquerda Cada deleção está pareada com cada mutação em teste e o fenótipo é observado para verificar se a mutação é pseudodominante A mutação pn prune por exemplo demonstra pseudodominância apenas com a deleção 26438 e esse resultado determina sua localização na região 2D4 a 3A 2 Entretanto fa facet demonstra pseudominância com todas as deleções com exceção de duas 25811 e 25814 assim a sua posição pode ser apontada para a banda 3C7 que é a região que todas as deleções apresentam em comum com exceção de duas CONCEITOCHAVE As deleções podem ser reconhecidas por meio das alças de deleção e da pseudodominância Os médicos encontram regularmente deleções nos cromossomos humanos As deleções normalmente são pequenas mas apresentam efeitos adversos mesmo quando heterozigotas As deleções de regiões cromossômicas humanas específicas causam síndromes únicas de anormalidades fenotípicas Um exemplo é a síndrome cri du chat causada por uma deleção heterozigota da extremidade do braço curto do cromossomo 5 Figura 1722 As bandas específicas deletadas na síndrome cri du chat são 5p152 e 5p153 as duas bandas mais distais identificáveis em 5p Os braços curto e longo dos cromossomos humanos são tradicionalmente denominados p e q respectivamente O fenótipo mais característico na síndrome é aquele que dá origem à sua denominação o choro semelhante ao miado de um gato produzido pelas crianças afetadas Outras manifestações da síndrome são microencefalia cabeça anormalmente pequena e face redonda fácies de lua cheia Assim como as síndromes causadas por outras deleções a síndrome cri du chat inclui o retardo mental As taxas de fatalidade são baixas e muitas pessoas com essa deleção alcançam a fase adulta FIGURA 1721 Uma linhagem heterozigota de Drosophila para cromossomos com deleção e normais pode ser utilizada para mapear alelos mutantes As barras vermelhas demonstram a extensão dos segmentos deletados em 13 deleções Todos os alelos recessivos na mesma região deletada em um cromossomo homólogo serão expressos Outro exemplo instrutivo é a síndrome de Williams Essa síndrome é autossômica dominante e é caracterizada pelo desenvolvimento incomum do sistema nervoso e de determinadas características externas A síndrome de Williams é observada a uma frequência de aproximadamente 1 em 10000 pessoas Os pacientes com frequência apresentam habilidades musicais ou de canto pronunciadas A síndrome quase sempre é causada por uma deleção de 15 Mb em um homólogo do cromossomo 7 A análise da sequência demonstrou que esse segmento contém 17 genes de função conhecida e desconhecida O fenótipo anormal portanto é causado por haploinsuficiência de um ou mais desses 17 genes A análise da sequência também revela a origem dessa deleção tendo em vista que a sequência normal é delimitada por cópias repetidas de um gene denominado PMS que codifica uma proteína de reparo do DNA Conforme vimos as sequências repetidas podem atuar como substratos para crossing over desigual Um crossover entre cópias flanqueadoras de PMS nas extremidades opostas do segmento dos 17 genes leva a uma duplicação não observada e uma deleção na síndrome de Williams conforme demonstrado na Figura 1723 A maior parte das deleções humanas tais como aquelas que acabamos de considerar surge espontaneamente nas gônadas de um genitor normal de uma pessoa afetada portanto normalmente não são observados sinais de deleções nos cromossomos dos genitores Menos comumente os indivíduos que contêm deleções aparecem na descendência de um indivíduo que apresenta um rearranjo balanceado de cromossomos não detectado Por exemplo a síndrome cri du chat pode resultar de um genitor heterozigoto para uma translocação recíproca tendo em vista que conforme veremos a segregação produz deleções As deleções também podem resultar de recombinação em um heterozigoto que apresenta uma inversão pericêntrica uma inversão que abrange o centrômero em um cromossomo Ambos os mecanismos serão detalhados posteriormente no capítulo Animais e plantas demonstram diferenças na sobrevivência de gametas ou de descendência que contêm deleções Um animal macho com uma deleção em um cromossomo produz espermatozoides que carreiam um ou outro dos dois cromossomos em números aproximadamente iguais Esses espermatozoides aparentemente funcionam até uma determinada medida independentemente de seu conteúdo genético Em plantas diploides por outro lado o pólen produzido por uma deleção heterozigota é de dois tipos pólen funcional que carreia o cromossomo normal e pólen não funcional abortado que carreia o homólogo deficiente Portanto as células do pólen aparentam ser sensíveis às alterações na quantidade de material cromossômico e essa sensibilidade pode atuar para extirpar as deleções Esse efeito é análogo à sensibilidade do pólen à aneuploidia de um cromossomo inteiro descrita anteriormente neste capítulo Contrariamente às células de espermatozoides de animais cuja atividade metabólica depende de enzimas que já foram depositadas nelas durante a sua formação as células de pólen devem germinar e em seguida produzir um longo tubo de pólen que cresce para fertilizar o óvulo Esse crescimento requer que a célula de pólen produza grandes quantidades de proteínas tornandoa assim sensível às anormalidades genéticas em seu próprio núcleo Os óvulos das plantas ao contrário são razoavelmente tolerantes às deleções presumivelmente em virtude de receberem sua nutrição dos tecidos maternos circundantes FIGURA 1722 A síndrome cri du chat é causada pela perda da extremidade do braço curto de um dos homólogos do cromossomo 5 FIGURA 1723 Um crossover entre os genes flanqueadores repetitivos esquerdo e direito resulta em dois rearranjos recíprocos um dos quais corresponde à deleção na síndrome de Williams Duplicações Os processos de mutação cromossômica por vezes produzem uma cópia extra de alguma região cromossômica As regiões duplicadas podem estar localizadas adjacentes entre si denominadas duplicação em tandem ou a cópia extra pode estar localizada em algum outro local no genoma denominada duplicação insercional Uma célula diploide que contém uma duplicação apresentará três cópias da região cromossômica em questão duas em um conjunto cromossômico e uma no outro um exemplo de uma duplicação heterozigota Na prófase meiótica os heterozigotos com duplicação em tandem demonstram uma alça formada pela região extra não pareada As duplicações sintéticas de cobertura conhecida podem ser utilizadas para o mapeamento gênico Em haploides por exemplo uma linhagem cromossomicamente normal que carreia uma nova mutação recessiva m pode ser cruzada com linhagens que contêm numerosos rearranjos geradores de duplicações p ex translocações e inversões pericêntricas Em qualquer cruzamento se alguma progênie com duplicação apresentar o fenótipo recessivo a duplicação não abrangerá o gene m tendo em vista que se ela abrangesse o seu segmento extra mascararia o alelo recessivo m Análises das sequências de DNA genômico revelaram um alto nível de duplicações em seres humanos e na maior parte dos organismosmodelo Repetições de sequências simples que se estendem por todo o genoma e são úteis como marcadores moleculares no mapeamento foram discutidas nos capítulos anteriores Entretanto outra classe de duplicações tem por base unidades duplicadas que são muito maiores do que as repetições de sequências simples As duplicações nessa classe são denominadas duplicações segmentares As unidades duplicadas nas duplicações segmentares variam de 10 a 50 quilobases de comprimento e abrangem genes inteiros e as regiões entre eles A extensão das duplicações segmentares está demonstrada na Figura 1724 na qual a maior parte das duplicações está dispersa mas existem alguns casos em tandem Outra propriedade demonstrada na Figura 1724 é que a dispersão das unidades duplicadas está principalmente no mesmo cromossomo não entre cromossomos A origem das duplicações segmentares ainda não é conhecida FIGURA 1724 O mapa dos cromossomos humanos 1 2 e 3 demonstra as posições das duplicações com tamanho superior a 10 quilobases As linhas de conexão azuis demonstram duplicações intracromossômicas a maioria As duplicações intracromossômicas estão demonstradas com barras vermelhas As letras A e B indicam hotspots nos quais a recombinação de duplicações deu origem a distúrbios genéticos Dados de J A Bailey et al Recent Segmental Duplications in the Human Genome Science 297 2002 10031007 Acreditase que as duplicações segmentares apresentem um papel importante como substratos para a recombinação homóloga não alélica conforme demonstrado na Figura 1719 O crossing over entre duplicações segmentares pode levar a diversos rearranjos cromossômicos Esses rearranjos aparentam ter sido importantes na evolução uma vez que algumas inversões importantes que são diferençaschave entre as sequências humanas e de primatas quase certamente têm origem na NAHR recombinação homóloga não alélica Também aparenta ser provável que a NAHR seja responsável pelos rearranjos que causam algumas doenças humanas Os loci das referidas doenças estão em hotspots de duplicação segmentar exemplos dos referidos loci estão demonstrados na Figura 1724 Observamos que em alguns organismos como os poliploides o genoma atual evoluiu como resultado de uma duplicação de todo o genoma ancestral Após a ocorrência de uma duplicação do genoma inteiro todos os genes são duplicados Esses genes duplicados são uma fonte de algumas das duplicações segmentares observadas nos genomas Um caso bemestudado é Saccharomyces cerevisiae A evolução desse genoma foi analisada por meio da comparação da sequência de todo o genoma de S cerevisiae com o de outra levedura Kluyveromyces cujo genoma é semelhante ao do ancestral de levedura Aparentemente no período da evolução de Saccharomyces o genoma ancestral semelhante ao de Kluyveromyces foi duplicado e assim existiam dois conjuntos cada um contendo o genoma inteiro Após a ocorrência da duplicação muitas cópias gênicas foram perdidas de um conjunto ou do outro e os conjuntos remanescentes foram rearranjados resultando no genoma atual de Saccharomyces Esse processo está reconstruído na Figura 1725 Inversões Observamos que para criar uma inversão um segmento de um cromossomo é cortado girado e reinserido As inversões são de dois tipos básicos Se o centrômero estiver fora da inversão dizse que a inversão é paracêntrica As inversões que abrangem o centrômero são pericêntricas Tendo em vista que as inversões são rearranjos balanceados elas não alteram a quantidade geral de material genético e assim não resultam em desbalanceamento gênico Os indivíduos com inversões em geral são normais se não houver quebras dentro dos genes Uma quebra que rompe um gene produz uma mutação que pode ser detectável como um fenótipo anormal Se o gene apresenta uma função essencial o ponto de quebra então atua como uma mutação letal ligada à inversão Nesse caso a inversão não pode dar origem à homozigose Entretanto muitas inversões podem se tornar homozigotas e além disso as inversões podem ser detectadas em organismos haploides Nesses casos os pontos de quebra da inversão claramente não estão em regiões essenciais Algumas das possíveis consequências da inversão no nível do DNA estão demonstradas na Figura 1726 A maior parte das análises de inversões é realizada em células diploides que contêm um conjunto cromossômico normal mais um conjunto que carreia a inversão Esse tipo de célula é denominado heterozigota para inversão mas observe que essa designação não implica que qualquer locus gênico seja heterozigoto em vez disso significa que um conjunto cromossômico normal e um anormal estão presentes A localização do segmento invertido com frequência pode ser detectada microscopicamente Na meiose um cromossomo se torce nas extremidades da inversão formando uma alça para parear com seu homólogo não torcido desse modo os homólogos pareados formam uma alça de inversão visível Figura 1727 Em uma inversão paracêntrica o crossing over na alça de inversão durante a meiose conecta os centrômeros homólogos em uma ponte dicêntrica enquanto também produz um fragmento acêntrico Figura 1728 Em seguida na medida em que os cromossomos se separam na anáfase I os centrômeros permanecem ligados pela ponte O fragmento acêntrico não consegue se alinhar ou se movimentar consequentemente ele é perdido A tensão finalmente quebra a ponte dicêntrica formando dois cromossomos com deleções terminais Os gametas que contêm tais cromossomos ou os zigotos que eles finalmente venham a formar provavelmente serão inviáveis Portanto um evento de crossover que normalmente dá origem à classe recombinante de produtos meióticos é em vez disso letal para aqueles produtos O resultado geral é uma frequência drasticamente mais baixa de recombinantes viáveis De fato em relação aos genes dentro da inversão a frequência de recombinantes está próxima de zero Ela não é exatamente zero em virtude de os raros crossovers duplos entre apenas duas cromátides serem viáveis Em relação aos genes que flanqueiam a inversão a frequência de recombinantes é reduzida em proporção ao tamanho da inversão tendo em vista que em uma inversão mais longa existe maior probabilidade de ocorrência de um crossover dentro dela e da produção de um produto meiótico inviável FIGURA 1725 Um ancestral comum semelhante à levedura Kluyveromyces moderna duplicou seu genoma 1 Alguns genes foram perdidos 2 Os genes duplicados tais como 3 e 13 estão na mesma ordem relativa O painel inferior compara os dois genomas modernos Dados da Figura 1 Manolis Kellis Bruce W Birren e Eric S Lander Proof and Evolutionary Analysis of Ancient Genome Duplication in the Yeast Saccharomyces cerevisiae Nature 428 8 de abril de 2004 direitos autorais Nature Publishing Group Em uma inversão pericêntrica heterozigota o efeito genético líquido é o mesmo daquele de uma inversão paracêntrica os produtos do crossover não são recuperados mas os motivos são diferentes Em uma inversão pericêntrica os centrômeros estão contidos dentro da região invertida Consequentemente os cromossomos envolvidos no crossover se separam do modo normal sem a criação de uma ponte Figura 1729 Entretanto o crossover produz cromátides que contêm uma duplicação e uma deleção em diferentes partes do cromossomo Nesse caso se um gameta que carrega um cromossomo com crossover é fertilizado o zigoto morre em virtude do desbalanceamento gênico Novamente o resultado é que apenas as cromátides que não sofreram crossover estão presentes na progênie viável Portanto o valor da frequência de recombinação de genes em uma inversão pericêntrica também é zero As inversões também afetam a recombinação de outro modo Os heterozigotos com inversão frequentemente apresentam problemas mecânicos de pareamento na região da inversão A alça de inversão causa uma grande distorção que pode se estender além da própria alça Essa distorção reduz a oportunidade de realização de crossing over nas regiões vizinhas FIGURA 1726 Uma inversão pode não apresentar nenhum efeito sobre os genes pode romper um gene ou pode fundir partes de dois genes dependendo do local do ponto de quebra Os genes estão representados por A B C e D O filamentomolde é verdeescuro o filamento não molde é verdeclaro as linhas vermelhas denteadas indicam onde as quebras no DNA produziram fusões gênicas A com D após a inversão e a reunião A letra P faz referência ao promotor as setas indicam as posições dos pontos de quebra FIGURA 1727 Os cromossomos de heterozigotos para inversão pareiam em uma alça na meiose FIGURA 1728 Um crossover na alça de um heterozigoto com inversão paracêntrica dá origem a cromossomos que contêm deleções Consideraremos um exemplo dos efeitos de uma inversão sobre a frequência de recombinantes Um espécime de Drosophila do tipo selvagem de uma população natural é cruzado com um estoque de laboratório homozigoto recessivo dp cndp cn O alelo dp codifica asas dumpy e cn codifica olhos cinnabar Os dois genes sabidamente estão distantes 45 unidades de mapa no cromossomo 2 A geração F1 é do tipo selvagem Quando uma fêmea da F1 é cruzada com o genitor recessivo a progênie é 250 tipo selvagem dp cn 246 asas dumpy e olhos cinnabar dp cndp cn 5 asas dumpy dp dp cn 7 olhos cinnabar cndp cn FIGURA 1729 Um crossover na alça de um heterozigoto para inversão pericêntrica dá origem a cromossomos que contêm duplicações e deleções Nesse cruzamento que é efetivamente um cruzamentoteste dihíbrido esperase que 45 da progênie seja dumpy ou cinnabar elas constituem as classes de crossover mas apenas 12 de 508 aproximadamente 2 são obtidas Algo está reduzindo o crossing over nessa região e uma provável explicação é uma inversão que abrange a maior parte da região dpcn Tendo em vista que a FR esperada teve por base as medições realizadas em linhagens de laboratório a mosca do tipo selvagem da natureza era a fonte mais provável do cromossomo invertido Portanto o cromossomo 2 na F1 pode ser representado como segue As inversões pericêntricas também podem ser detectadas microscopicamente por meio das razões do novo braço Considere a inversão pericêntrica a seguir Observe que a razão do comprimento do braço longo e do braço curto foi alterada de aproximadamente 41 para aproximadamente 11 pela inversão As inversões paracêntricas não alteram a razão do braço mas podem ser detectadas microscopicamente por meio da observação das alterações no bandeamento ou de outros marcos cromossômicos se disponíveis CONCEITOCHAVE As principais características diagnósticas das inversões heterozigotas são as alças de inversão a frequência de recombinantes reduzida e a fertilidade reduzida em virtude dos produtos meióticos desbalanceados ou deletados Em alguns sistemasmodelo experimentais notavelmente em Drosophila e no nematódeo Caenorhabditis elegans as inversões são utilizadas como balanceadoras Um cromossomo balanceador contém múltiplas inversões assim quando ele é combinado com o cromossomo do tipo selvagem correspondente pode não haver produtos de crossover viáveis Em algumas análises é importante manter um estoque com todos os alelos em um cromossomo juntos O geneticista cria indivíduos portadores de genomas que combinam um referido cromossomo com um balanceador Essa combinação elimina crossovers e assim apenas as combinações parentais aparecem na progênie Por conveniência os cromossomos balanceadores são marcados com uma mutação morfológica dominante O marcador possibilita que o geneticista rastreie a segregação de todo balanceador ou de seu homólogo normal ao observar a presença ou a ausência do marcador Translocações recíprocas Existem diversos tipos de translocações mas aqui consideramos apenas as translocações recíprocas o tipo mais simples Relembre que para formar uma translocação recíproca dois cromossomos realizam permuta de fragmentos acêntricos criados por duas quebras cromossômicas simultâneas Assim como com outros rearranjos a meiose em heterozigotos que apresentam dois cromossomos translocados e seus correspondentes normais produz configurações características A Figura 1730 ilustra a meiose em um indivíduo que é heterozigoto para uma translocação recíproca Observe a configuração do pareamento em forma de cruz Tendo em vista que a lei da distribuição independente está atuando existem dois padrões comuns de segregação Utilizaremos N1 e N2 para representar os cromossomos normais e T1 e T2 os cromossomos translocados A segregação de cada um dos cromossomos estruturalmente normais com um dos translocados T1 N2 e T2 N1 é denominada segregação adjacente 1 Cada um dos dois produtos meióticos é deficiente para um braço diferente da cruz e apresenta uma duplicata do outro Esses produtos são inviáveis Por outro lado os dois cromossomos normais podem segregar juntos assim como farão as partes recíprocas dos translocados para gerar os produtos N1 N2 e T1 T2 Esse padrão de segregação é denominado segregação alternada Esses produtos são ambos balanceados e viáveis FIGURA 1730 Os cromossomos em segregação de um heterozigoto para translocação recíproca formam uma configuração de pareamento em cruz Os dois padrões de segregação mais comumente encontrados que resultam são o adjacente 1 com frequência inviável e o alternado viável N1 e N2 cromossomos não homólogos normais T1 e T2 cromossomos translocados Acima e Abaixo designam os polos opostos para os quais os homólogos migram na anáfase I As segregações adjacente 1 e alternada são iguais em número e assim metade da população geral de gametas será não funcional uma condição conhecida como semiesterilidade A semiesterilidade é uma ferramenta diagnóstica importante para a identificação de heterozigotos com translocação Entretanto a semiesterilidade é definida de modo diferente para plantas e animais Em plantas os 50 dos produtos meióticos provenientes da segregação adjacente 1 em geral abortam no estágio gamético Figura 1731 Em animais esses produtos são viáveis como gametas mas letais para os zigotos que eles produzem na fertilização Relembre que os heterozigotos para inversões também podem demonstrar alguma redução na fertilidade mas em uma quantidade dependente do tamanho da região afetada A redução exata de 50 nos gametas ou zigotos viáveis normalmente é uma indicação diagnóstica confiável de translocação Geneticamente os genes em cromossomos translocados atuam como se estivessem ligados se seus loci estiverem próximos do ponto de quebra da translocação A Figura 1732 demonstra uma translocação heterozigota que foi estabelecida por meio do cruzamento de um indivíduo aa bb com um homozigoto para translocação que contém os alelos do tipo selvagem Quando o heterozigoto é submetido ao cruzamentoteste são criados recombinantes mas eles não sobrevivem tendo em vista que carreiam genomas desbalanceados duplicações e deleções A única progênie viável é aquela que contém os genótipos parentais assim é observada a ligação entre loci que originalmente estavam em cromossomos diferentes A aparente ligação dos genes normalmente conhecidos por estarem em cromossomos não homólogos separados por vezes denominada pseudoligação é uma indicação diagnóstica genética da presença de uma translocação FIGURA 1731 Pólen de uma planta do milho semiestéril Os grãos de pólen claros contêm produtos meióticos cromossomicamente desbalanceados de um heterozigoto para translocação recíproca Os grãos de pólen opacos que contêm cromossomos com genótipo da translocação completa ou normais são funcionais na fertilização e no desenvolvimento William Sheridan FIGURA 1732 Quando um fragmento translocado carrega um gene marcador esse marcador pode demonstrar ligação com genes no outro cromossomo CONCEITOCHAVE As translocações recíprocas heterozigotas são diagnosticadas geneticamente por meio da semiesterilidade e pela aparente ligação de genes cujos loci normais estão em cromossomos separados Translocações robertsonianas Retornaremos para a família da criança com síndrome de Down introduzida no início do capítulo O nascimento pode na verdade ter sido uma coincidência afinal coincidências acontecem Entretanto o aborto fornece uma indicação de que pode estar acontecendo algo mais Uma grande proporção de abortos espontâneos carreia anormalidades cromossômicas de tal modo que talvez seja esse o caso nesse exemplo Nesse caso o casal pode ter tido duas concepções com mutações cromossômicas o que seria muito improvável exceto se houvesse uma causa comum Entretanto uma pequena proporção de casos de síndrome de Down sabidamente resulta de uma translocação em um dos genitores Vimos que as translocações podem produzir progênie que apresente material extra de uma parte do genoma e assim uma translocação que envolva o cromossomo 21 pode produzir progênie que apresente material extra daquele cromossomo Na síndrome de Down a translocação responsável é de um tipo denominado translocação robertsoniana Ela produz progênie que carrega uma cópia extra quase completa do cromossomo 21 A translocação e sua segregação estão ilustradas na Figura 1733 Observe que além dos complementos que causam a síndrome de Down são produzidos outros complementos cromossômicos aberrantes cuja maior parte é abortada Em nosso exemplo o homem pode apresentar essa translocação que ele pode ter herdado de sua avó Para confirmar essa possibilidade seus cromossomos são verificados Seu filho não afetado pode apresentar cromossomos normais ou pode ter herdado essa translocação FIGURA 1733 Na menor parte dos casos a origem da síndrome de Down é um genitor heterozigoto para uma translocação robertsoniana envolvendo o cromossomo 21 A segregação meiótica resulta em alguns gametas que carregam um cromossomo com um grande segmento adicional do cromossomo 21 Em combinação com um cromossomo 21 normal fornecido pelo gameta do sexo oposto são produzidos os sintomas da síndrome de Down muito embora não exista uma trissomia completa do cromossomo 21 Aplicações de inversões e translocações As inversões e as translocações comprovaram ser ferramentas genéticas úteis seguem alguns exemplos de suas utilizações Mapeamento gênico As inversões e as translocações são úteis para o mapeamento e o subsequente isolamento de genes específicos O gene da neurofibromatose humana foi isolado desse modo A informação crítica surgiu a partir de pessoas que não apenas apresentavam a doença como também carregavam translocações cromossômicas Todas as translocações apresentavam um ponto de quebra em comum em uma banda próxima do centrômero do cromossomo 17 Portanto essa banda aparentava ser o locus do gene da neurofibromatose que havia sido rompido pelo ponto de quebra da translocação A análise subsequente demonstrou que os pontos de quebra do cromossomo 17 não estavam em posições idênticas entretanto tendo em vista que eles devem estar no gene a variação de suas posições revelou o segmento do cromossomo que constituía o gene da neurofibromatose O isolamento de fragmentos de DNA dessa região finalmente levou à recuperação do próprio gene Síntese de duplicações ou deleções específicas As translocações e as inversões são utilizadas de modo rotineiro para deletar ou duplicar segmentos cromossômicos específicos Relembre por exemplo que as inversões pericêntricas bem como as translocações dão origem a produtos de meiose que contêm uma duplicação e uma deleção ver Figuras 1729 e 1730 Se o segmento duplicado ou deletado for muito pequeno então os produtos meióticos de duplicação e deleção são equivalentes às duplicações ou deleções respectivamente As duplicações e deleções são úteis para uma diversidade de aplicações experimentais incluindo o mapeamento de genes e a variação da dosagem gênica para o estudo da regulação conforme observado nas seções precedentes Outra abordagem para a criação de duplicações utiliza translocações insercionais unidirecionais nas quais um segmento de um cromossomo é removido e inserido em outro Em um heterozigoto para translocação insercional resulta uma duplicação se o cromossomo com a inserção segregar juntamente com a cópia normal Variegação por efeito de posição Conforme vimos no Capítulo 12 a ação gênica pode ser bloqueada pela proximidade com as regiões cromossômicas densamente coradas denominadas heterocromatina As translocações e as inversões podem ser utilizadas para estudar esse efeito Por exemplo o locus para a cor de olho branco em Drosophila está próximo da extremidade do cromossomo X Considere uma translocação na qual a extremidade de um cromossomo X que carrega w é realocada para perto da região heterocromática digamos do cromossomo 4 Figura 1734 A seção superior A variegação por efeito de posição é observada em moscas que são heterozigotas para tal translocação O cromossomo X normal em um referido heterozigoto carrega o alelo recessivo w Esperase que o fenótipo do olho seja vermelho em virtude de o alelo do tipo selvagem ser dominante sobre w Entretanto nos referidos casos o fenótipo observado é uma mistura variegada de facetas oculares vermelhas e brancas Figura 1734 B Como podemos explicar as áreas brancas O alelo w nem sempre é expresso tendo em vista que o limite da heterocromatina é um pouco variável em algumas células ele envolve e inativa o gene w evitando assim a sua expressão e possibilitando assim a expressão de w Se as posições dos alelos w e w forem permutadas por um crossover então a variegação por efeito de posição não será detectada ver Figura 1734 A seção inferior FIGURA 1734 A A translocação de w para uma posição próxima da heterocromatina causa a falha da função de w em algumas células produzindo a variegação por efeito de posição B Um olho de Drosophila que demonstra variegação por efeito de posição B Gordon Watts Rearranjos e câncer O câncer é uma doença de proliferação celular anormal Como resultado de alguma lesão uma célula do corpo se divide descontroladamente até formar uma população de células denominada câncer Um aglomerado localizado de células proliferadas é denominado tumor enquanto os cânceres de células móveis tais como as células sanguíneas dispersamse por todo o corpo O câncer é causado com mais frequência por uma mutação na sequência codificadora ou reguladora de um gene cuja função normal é regular a divisão celular Tais genes são denominados protooncogenes Entretanto os rearranjos cromossômicos especialmente as translocações também podem interferir na função normal de tais protooncogenes Existem dois modos básicos por meio dos quais as translocações podem alterar a função dos protooncogenes No primeiro mecanismo a translocação realoca um protooncogene para perto de um novo elemento regulador Um bom exemplo é fornecido pelo linfoma de Burkitt O protooncogene nesse câncer codifica a proteína MYC um fator de transcrição que ativa genes necessários para a proliferação celular Normalmente o gene myc é transcrito apenas quando uma célula precisa ser submetida à proliferação mas em células cancerosas o proto oncogene MYC é realocado para perto da região reguladora dos genes de imunoglobulina Ig Figura 1735 A Esses genes de imunoglobulina são transcritos constitutivamente ou seja eles estão ligados o tempo todo Consequentemente o gene myc é transcrito em todas as ocasiões e os genes de proliferação celular estão continuamente ativados O outro mecanismo por meio do qual as translocações podem causar câncer é a formação de um gene híbrido Um exemplo é fornecido pela leucemia mieloide crônica CML um câncer dos leucócitos Esse câncer pode resultar da formação de um gene híbrido entre os dois protooncogenes BRC1 e ABL Figura 1735 B O protooncogene abl codifica uma proteinoquinase em uma via de sinalização A proteinoquinase transmite um sinal iniciado por um fator de crescimento que leva à proliferação celular A proteína de fusão de Brc1Abl apresenta uma atividade de proteinoquinase permanente A proteína alterada propaga continuamente o seu sinal de crescimento adiante independentemente da presença do sinal iniciador Identificação de mutações cromossômicas pela genômica Os microarranjos de DNA ver Figura 1419 tornaram possível detectar e quantificar duplicações ou deleções de um determinado segmento de DNA A técnica é denominada hibridização genômica comparativa O DNA total do tipo selvagem e aquele de um mutante são marcados com dois corantes fluorescentes diferentes que emitem comprimentos de onda de luz distintos Esses DNA marcados são adicionados a um microarranjo de cDNA e ambos hibridizam com o arranjo Em seguida o arranjo é submetido a uma varredura por um detector ajustado para um comprimento de onda fluorescente e depois é novamente submetido a outra varredura em outro comprimento de onda É calculada a razão dos valores para cada cDNA As razões de mutantes em relação ao tipo selvagem substancialmente superiores a 1 representam regiões que foram amplificadas Uma razão de 2 pontos representa uma duplicação e uma razão inferior a 1 ponto uma deleção Alguns exemplos estão demonstrados na Figura 1736 FIGURA 1735 Os dois modos principais por meio dos quais as translocações podem causar câncer em uma 173 célula somática do corpo são ilustrados pelos cânceres linfoma de Burkitt A e leucemia mieloide crônica B Os genes MYC BRC1 e ABL são protooncogenes FIGURA 1736 Para detectar rearranjos cromossômicos o DNA genômico mutante e do tipo selvagem são marcados com corantes que fluorescem em diferentes comprimentos de onda Estes DNA marcados são adicionados a clones de cDNA dispostos em microarranjos cromossomicamente ordenados e a razão de fluorescência ligada em cada comprimento de onda é calculada em relação a cada clone Estão ilustrados os resultados esperados para um genoma normal e três tipos de mutantes Incidência geral de mutações cromossômicas humanas As mutações cromossômicas surpreendentemente surgem com frequência na reprodução sexuada humana demonstrando que os processos celulares relevantes são propensos a um alto nível de erros A Figura 1737 demonstra a distribuição estimada de mutações cromossômicas entre as concepções humanas que se desenvolvem o suficiente para a implantação no útero Dos estimados 15 de concepções que abortam espontaneamente gestações que são encerradas naturalmente metade demonstra anormalidades cromossômicas Alguns geneticistas clínicos acreditam que até mesmo esse alto nível seja uma subestimativa tendo em vista que muitos casos nunca são detectados Entre os nascimentos vivos 06 apresentam anormalidades cromossômicas que resultam de aneuploidia e de rearranjos cromossômicos FIGURA 1737 A proporção de mutações cromossômicas é muito mais alta em abortos espontâneos Dados de K Sankaranarayanan Mutat Res 61 1979 249257 RESUMO A poliploidia é uma condição anormal na qual existe um número de conjuntos cromossômicos superior ao normal Os poliploides tais como triploides 3n e os tetraploides 4n são comuns entre as plantas e estão representados também em animais Os organismos com um número ímpar de conjuntos cromossômicos são estéreis tendo em vista que nem todo cromossomo apresenta um parceiro na meiose Os cromossomos não pareados se juntam aleatoriamente aos polos da célula na meiose levando a conjuntos desbalanceados de cromossomos nos gametas resultantes Tais gametas desbalanceados não produzem progênie viável Em poliploides com um número par de conjuntos cada cromossomo apresenta um parceiro de pareamento em potencial e portanto pode produzir gametas balanceados e progênie A poliploidia pode resultar em um organismo de dimensões maiores essa descoberta possibilitou avanços importantes na horticultura e nas plantações comerciais Em plantas os alopoliploides poliploides formados pela combinação de conjuntos cromossômicos de diferentes espécies podem ser produzidos por meio do cruzamento de duas espécies relacionadas e em seguida da duplicação dos cromossomos da progênie por meio da utilização da colchicina ou por meio da fusão de células somáticas Essas técnicas apresentam aplicações potenciais na agricultura tendo em vista que os alopoliploides combinam as características das duas espécies parentais Quando acidentes celulares alteram partes dos conjuntos cromossômicos resultam os aneuploides A própria aneuploidia normalmente resulta em um genótipo desbalanceado com um fenótipo anormal Exemplos de aneuploides incluem monossômicos 2n 1 e trissômicos 2n 1 A síndrome de Down trissomia do cromossomo 21 a síndrome de Klinefelter XXY e a síndrome de Turner XO são exemplos bemdocumentados de condições aneuploides em seres humanos O nível espontâneo de aneuploidia em seres humanos é consideravelmente alto e é responsável por uma grande proporção de enfermidades com base genética em populações humanas O fenótipo de um organismo aneuploide depende muito do cromossomo afetado em particular Em alguns casos como na trissomia do cromossomo 21 humano existe uma constelação altamente característica de fenótipos associados A maior parte dos casos de aneuploidia resulta da segregação cromossômica errônea acidental na meiose não disjunção O erro é espontâneo e pode ocorrer em qualquer meiócito particular na primeira ou na segunda divisão Em seres humanos um efeito da idade materna está associado à não disjunção do cromossomo 21 resultando em uma mais alta incidência de síndrome de Down nos filhos de mães mais velhas A outra categoria geral de mutações cromossômicas abrange os rearranjos estruturais que incluem deleções duplicações inversões e translocações Essas alterações resultam da quebra e da reunião incorreta ou de crossing over entre elementos repetitivos recombinação homóloga não alélica Os rearranjos cromossômicos são uma causa importante de enfermidades em populações humanas e são úteis na construção de linhagens especiais de organismos para a genética experimental e aplicada Em organismos com um conjunto cromossômico normal mais um conjunto rearranjado rearranjos heterozigotos existem estruturas de pareamento incomuns na meiose que resultam da forte afinidade de pareamento das regiões cromossômicas homólogas Por exemplo as inversões heterozigotas demonstram alças e as translocações recíprocas demonstram estruturas em forma de cruz A segregação dessas estruturas resulta em produtos meióticos anormais únicos do rearranjo Uma deleção é a perda de uma parte do cromossomo seja em virtude de quebras cromossômicas seguidas pela perda do segmento interveniente seja em virtude da segregação em translocações ou inversões heterozigotas Se a região removida em uma deleção for essencial à vida uma deleção homozigota é letal As deleções heterozigotas podem ser letais em virtude do desequilíbrio cromossômico ou em virtude de revelarem alelos deletérios recessivos ou podem ser não letais Quando uma deleção em um homólogo possibilita a expressão fenotípica de alelos recessivos no outro o desmascaramento dos alelos recessivos é denominado pseudodominância As duplicações em geral são produzidas a partir de outros rearranjos ou por meio de crossing over aberrante Elas também desequilibram o material genético produzindo um efeito fenotípico deletério ou a morte do organismo Entretanto as duplicações podem ser uma fonte de novo material para a evolução tendo em vista que a função pode ser mantida em uma cópia deixando a outra cópia livre para desenvolver novas funções Uma inversão é um giro de 180 de parte de um cromossomo No estado homozigoto as inversões podem causar poucos problemas para um organismo exceto se a heterocromatina ocasionar um efeito de posição ou se uma das quebras romper um gene Por outro lado os heterozigotos para inversão demonstram alças de inversão na meiose e o crossing over dentro da alça resulta em produtos inviáveis Os produtos do crossover de inversões pericêntricas que abrangem o centrômero diferem daqueles das inversões paracêntricas que não abrangem mas ambos demonstram redução da frequência de recombinantes na região afetada e com frequência resultam em redução da fertilidade Uma translocação movimenta um segmento cromossômico para outra posição no genoma Um exemplo simples é uma translocação recíproca na qual partes de cromossomos não homólogos trocam de posições No estado heterozigoto as translocações geram produtos meióticos com duplicação e deleção que podem levar a zigotos desbalanceados Novas ligações gênicas podem ser produzidas por meio de translocações A segregação aleatória dos centrômeros em um heterozigoto com translocação resulta em 50 de produtos meióticos desbalanceados e portanto 50 de esterilidade semiesterilidade TERMOSCHAVE alça de deleção alça de inversão alopoliploide aneuploide anfidiploide autopoliploide balanceador balanço gênico bivalente carga genética compensação de dose cromossomo acêntrico cromossomo dicêntrico cromossomo homeólogo cromossomo politênico deleção deleção intragênica deleção multigênica dissômico duplicação duplicação em tandem duplicação insercional duplicação segmentar efeito de dosagem gênica embrioide euploide fragmento acêntrico heterozigoto para inversão hexaploide inversão inversão paracêntrica inversão pericêntrica mapeamento de deleção monoploide monossômico mutação cromossômica não disjunção nulissômico partenogênese pentaploide poliploide ponte anafásica ponte dicêntrica pseudodominância pseudoligação rearranjo rearranjo balanceado rearranjo desbalanceado recombinação homóloga não alélica NAHR segregação adjacente 1 segregação alternada semiesterilidade síndrome de Down síndrome de Klinefelter síndrome de Turner tetraploide translocação triploide trissômico trivalente univalente variegação por efeito de posição PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 Uma planta de milho é heterozigota em relação a uma translocação recíproca e portanto é semiestéril Essa planta é cruzada com uma linhagem cromossomicamente normal que é homozigota em relação ao alelo recessivo braquítico b localizado no cromossomo 2 Uma planta da F1 semiestéril em seguida é retrocruzada com a linhagem braquítica homozigota A progênie obtida demonstra os fenótipos a seguir Não braquítica Braquítica Semiestéril Fértil Semiestéril Fértil 334 27 42 279 a Qual razão você espera que resulte se o cromossomo que carrega o alelo braquítico não participar da translocação b Você acredita que o cromossomo 2 participa da translocação Explique a sua resposta demonstrando a conformação dos cromossomos relevantes da F1 semiestéril e o motivo dos números específicos obtidos Solução a Devemos iniciar com a abordagem metódica e simplesmente reformular os dados como um diagrama no qual Para simplificar o diagrama não demonstramos os cromossomos divididos em cromátides embora eles estejam nesse estágio da meiose Em seguida diagramamos o primeiro cruzamento Toda a progênie desse cruzamento será heterozigota em relação ao cromossomo que carrega o alelo braquítico mas o que dizer sobre os cromossomos que participam da translocação Neste capítulo vimos que apenas os produtos da segregação alternada sobrevivem e que metade desses sobreviventes será cromossomicamente normal além de metade carregar os dois cromossomos rearranjados A combinação rearranjada regenerará um heterozigoto com translocação quando se combinar com o complemento cromossomicamente normal do genitor normal Esses últimos tipos os semiestéreis da F1 são diagramados como parte do retrocruzamento com a linhagem braquítica parental No cálculo da razão esperada de fenótipos a partir desse cruzamento podemos tratar o comportamento dos cromossomos translocados independentemente do comportamento do cromossomo 2 Portanto podemos prever que a progênie será Essa razão de 1111 prevista é bem diferente daquela obtida no cruzamento real b Em virtude de observarmos um desvio da razão esperada com base na independência do fenótipo braquítico e da semiesterilidade o cromossomo 2 provavelmente participa da translocação Presumiremos que o locus braquítico b está no cromossomo laranja Mas onde Para a finalidade do diagrama não importa onde o posicionamos mas isso importa geneticamente tendo em vista que a posição do locus b afeta as razões na progênie Se presumirmos que o locus b está próximo da extremidade do pedaço que é translocado podemos redesenhar o heredograma Se os cromossomos da F1 semiestéril segregarem como diagramado aqui podemos então prever fértil braquítico semiestéril não braquítico A maior parte da progênie certamente é desse tipo e assim devemos estar no rumo certo Como os dois tipos menos frequentes são produzidos De algum modo precisamos posicionar o alelo b no cromossomo amarelo normal e o alelo b no cromossomo translocado Esse posicionamento deve ser conquistado por meio de crossing over entre o ponto de quebra da translocação o centro da estrutura em forma de cruz e o locus braquítico Os cromossomos recombinantes produzem alguma progênie que é fértil e não braquítica e alguma que é semiestéril e braquítica essas duas classes em conjunto constituem 69 de uma progênie total de 682 ou uma frequência de aproximadamente 10 Podemos observar que essa frequência é realmente uma medida da distância de mapa 10 um do locus braquítico ao ponto de quebra O mesmo princípio básico teria sido obtido se houvéssemos desenhado o locus braquítico na parte do cromossomo no outro lado do ponto de quebra Problema resolvido 2 Possuímos linhagens de camundongos puras para dois fenótipos comportamentais alternativos que sabemos serem determinados por dois alelos em um único locus v faz um camundongo se movimentar em marcha de valsador enquanto V determina marcha normal Após o cruzamento dos valsadores puros com os normais observamos que a maior parte da F1 é normal mas inesperadamente existe uma fêmea valsadora Cruzamos a valsadora da F1 com dois machos valsadores diferentes e observamos que ela produz apenas progênie valsadora Quando a cruzamos com machos normais ela produz progênie normal e nenhum valsador Cruzamos três fêmeas de sua progênie normal com dois de seus irmãos e esses camundongos produzem uma progênie de 60 camundongos todos normais Entretanto quando cruzamos uma dessas mesmas três fêmeas com um terceiro irmão obtemos seis normais e dois valsadores em uma ninhada de oito Ao pensar a respeito dos genitores da valsadora da F1 podemos considerar algumas possíveis explicações desses resultados a Um alelo dominante pode ter sofrido mutação para um alelo recessivo em seu genitor normal b Em um genitor pode ter havido uma mutação dominante em um segundo gene para criar um alelo epistático que atua para prevenir a expressão de V levando à característica valsadora c A não disjunção meiótica do cromossomo que carrega V no seu genitor normal pode ter dado origem a um aneuploide viável d Pode ter havido uma deleção viável abrangendo V no meiócito de seu genitor normal Quais dessas explicações são possíveis e quais são eliminadas pela análise genética Explique detalhadamente Solução O melhor modo de responder à questão é considerar as explicações uma por vez e verificar se cada uma delas se encaixa nos resultados fornecidos a Mutação de V para v Essa hipótese requer que a fêmea valsadora excepcional seja homozigota vv Essa presunção é compatível tanto com os resultados do seu cruzamento com machos valsadores com os quais se ela for vv produziria toda a progênie valsadora vv quanto com os machos normais com que produziria toda a progênie normal Vv Entretanto os cruzamentos de irmão e irmã dentro dessa progênie normal então produziriam uma razão de 31 de normais para valsadores Tendo em vista que de fato alguns dos cruzamentos de irmão e irmã não produziram valsadores essa hipótese não explica os dados b Mutação epistática de s para S Aqui os genitores seriam VV ss e vv ss e uma mutação germinativa em um deles forneceria à valsadora da F1 o genótipo Vv Ss Quando realizássemos o seu cruzamento com um macho valsador que seria do genótipo vv ss esperaríamos alguma progênie Vv Ss que seria fenotipicamente normal Entretanto não observamos progênie normal a partir desse cruzamento e assim a hipótese já é derrubada A ligação poderia salvar a hipótese temporariamente se presumíssemos que a mutação ocorreu no genitor normal fornecendo um gameta VS Então a valsadora da F1 seria VSvs e se a ligação fosse suficientemente forte poucos gametas Vs seriam produzidos ou mesmo nenhum tipo que é necessário para combinar com o gameta vs do macho para originar os normais Vsvs Entretanto se a hipótese de ligação fosse verdadeira o cruzamento com os machos normais seria VSvs VsVs e isso proporcionaria uma alta porcentagem de progênie VSVs que seria valsadora nenhum valsador foi observado c Não disjunção no genitor normal Essa explicação forneceria um gameta nulissômico que se combinaria com v para originar a valsadora da F1 com o genótipo hemizigoto v Os cruzamentos subsequentes seriam v vv que fornece progênie vv e v todos valsadores Essa se encaixa v Vv que fornece progênie Vv e V todos normais Essa também se encaixa Primeiro intercruzamento de progênie normal V V Esse intercruzamento fornece V e VV que são normais Essa se encaixa Segundo intercruzamento de progênie normal V Vv Esse intercruzamento fornece 25 cada de VV Vv V todas normais e v valsadores Essa também se encaixa Portanto essa hipótese é consistente com os dados d Deleção de V no genitor normal Denominaremos a deleção D A valsadora da F1 seria Dv e os cruzamentos subsequentes seriam Dv vv que fornece vv e Dv valsadores Essa se encaixa Dv VV que fornece Vv e DV normais Essa se encaixa Primeiro intercruzamento de progênie normal DV DV que fornece DV e VV todos normais Essa se encaixa Segundo intercruzamento de progênie normal DV Vv que fornece 25 cada de VV Vv DV todos normais e Dv valsadores Essa também se encaixa Mais uma vez a hipótese se encaixa nos dados fornecidos assim restamnos duas hipóteses que são compatíveis com os resultados e são necessários experimentos adicionais para distinguilas Um modo de fazer isso seria examinar os cromossomos da fêmea excepcional ao microscópio a aneuploidia seria fácil de distinguir da deleção PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Com base na Tabela 171 como você categorizaria os genomas a seguir As letras H a J fazem referência a quatro cromossomos diferentes HH II J KK HH II JJ KKK HHHH IIII JJJJ KKKK Com base na Figura 174 quantas cromátides estão em um trivalente Com base na Figura 175 se a colchicina for utilizada em uma planta na qual 2n 18 quantos cromossomos estariam no produto anormal Baseando o seu trabalho na Figura 177 utilize canetas coloridas para representar os cromossomos do anfidiploide fértil Se o trigo de Emmer Figura 179 fosse cruzado com outro trigo selvagem CC não demonstrado qual seria a constituição de um produto estéril desse cruzamento Qual anfidiploide poderia surgir a partir do produto estéril O anfidiploide seria fértil Na Figura 1712 qual seria a constituição de um indivíduo formado a partir da união de um monossômico resultante de uma não disjunção na primeira divisão em uma fêmea e um dissômico resultante de uma não disjunção de segunda divisão em um macho presumindo que os gametas sejam funcionais Na Figura 1714 qual seria a porcentagem esperada de cada tipo de segregação Na Figura 1719 existe qualquer diferença entre os produtos de inversão formados a partir da quebra e aqueles formados a partir de crossing over Fazendo referência à Figura 1719 desenhe um diagrama demonstrando o processo por meio do qual uma inversão formada a partir de crossing over poderia gerar uma sequência normal Na Figura 1721 um alelo fa recessivo seria expresso quando pareado com a deleção 26432 E com 26511 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Observe a Figura 1722 e declare quais bandas são perdidas na deleção de cri du chat Na Figura 1725 qual espécie está relacionada de modo mais próximo com a linhagem de levedura ancestral Por que os genes 3 e 13 são considerados duplicados Fazendo referência à Figura 1726 desenhe o produto se ocorreram quebras nos genes A e B Na Figura 1726 o painel inferior demonstra que os genes B e C estão orientados em uma direção diferente observe os promotores Você acredita que essa diferença na orientação afetaria a sua funcionalidade Na Figura 1728 qual seria a consequência de um crossover entre o centrômero e o locus A Com base na Figura 1730 genomas normais chegam a ser formados a partir dos dois tipos de segregação Genomas normais chegam a ser formados a partir de uma segregação adjacente 1 Fazendo referência à Figura 1732 desenhe um produto inviável a partir da mesma meiose Com base na Figura 1735 escreva uma sentença declarando como a translocação pode levar ao câncer Você consegue pensar a respeito de outra causa genética de câncer Observando a Figura 1736 por que você acha que a razão do sinal é tão mais alta no painel inferior Utilizando a Figura 1737 calcule qual porcentagem das concepções é de triploides A mesma figura demonstra XO na categoria de aborto espontâneo entretanto sabemos que muitos indivíduos XO são viáveis Em qual das categorias de viáveis os XO seriam agrupados PROBLEMAS BÁSICOS Ao manter o estilo da Tabela 171 como você denominaria os organismos 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 que são MM N OO MM NN OO MMM NN PP Uma grande planta surgiu em uma população natural Qualitativamente ela aparentava ser justamente como as outras exceto por ser muito maior É mais provável que ela seja um alopoliploide ou um autopoliploide Como você testaria se ela é um poliploide não apenas uma planta crescida em um solo rico Um trissômico é um aneuploide ou um poliploide Em um tetraploide BBbb existem quantos pareamentos quadrivalentes possíveis Desenheos ver Figura 175 Alguém lhe diz que a couveflor é um anfidiploide Você concorda Explique Por que Raphanobrassica é fértil enquanto a seu genitor não era Na designação dos genomas de trigo quantos cromossomos são representados pela letra B Como você recriaria o trigo hexaploide a partir de Triticum tauschii e Emmer Como você produziria uma muda monoploide ao iniciar com uma planta diploide É obtido um produto dissômico da meiose Qual é a sua provável origem Quais outros genótipos você esperaria entre os produtos daquela meiose sob a sua hipótese Um trissômico AAa pode chegar a produzir um gameta de genótipo a Quais se houver algum dos aneuploides de cromossomos sexuais em seres humanos a seguir são férteis XXX XXY XYY XO Por que as mães gestantes mais velhas realizam amniocentese ou obtenção e análise de amostra de vilosidade coriônica como procedimento de rotina Em uma inversão uma extremidade de 5 do DNA chega a ser unida a outra extremidade de 5 Explique 35 36 37 38 39 40 41 42 43 Se você observou uma ponte dicêntrica na meiose qual rearranjo você prevê que tenha ocorrido Por que os fragmentos acêntricos são perdidos Diagrame uma translocação que surge a partir de DNA repetitivo Repita em relação a uma deleção A partir de um grande estoque de rearranjos de Neurospora disponíveis do centro de estoques genéticos de fungos qual tipo você escolheria para sintetizar uma linhagem apresentando uma duplicação do braço direito do cromossomo 3 e uma deleção da extremidade do cromossomo 4 Você observa uma alça de pareamento muito grande na meiose É mais provável que ela seja de uma inversão heterozigota ou de uma deleção heterozigota Explique Um novo alelo mutante recessivo não demonstra pseudodominância com quaisquer das deleções que abrangem o cromossomo 2 de Drosophila Qual pode ser a explicação Compare e contraste as origens da síndrome de Turner da síndrome de Williams da síndrome cri du chat e da síndrome de Down Por que elas são denominadas síndromes Liste as características diagnósticas genéticas ou citológicas que são utilizadas para identificar essas alterações cromossômicas a Deleções b Duplicações c Inversões d Translocações recíprocas A sequência normal de nove genes em um determinado cromossomo de Drosophila é 123 456789 na qual o ponto representa o centrômero Observouse que algumas moscasdasfrutas apresentam cromossomos aberrantes com as estruturas a seguir a 123 476589 b 123 46789 44 45 46 c 1654 32789 d 123 4566789 Denomine cada tipo de rearranjo cromossômico e desenhe diagramas para demonstrar como cada um realizaria sinapse com o cromossomo normal Os dois loci P e Bz normalmente estão à distância de 36 um no mesmo braço de um determinado cromossomo de planta Uma inversão paracêntrica abrange aproximadamente um quarto dessa região mas não inclui qualquer um dos loci Qual frequência de recombinantes aproximada entre P e Bz você preveria em plantas que são a Heterozigotas em relação à inversão paracêntrica b Homozigotas em relação à inversão paracêntrica Conforme declarado no Problema resolvido 2 a mutação recessiva em determinados camundongos denominados valsadores faz com que eles executem passos bizarros W H Gates cruzou valsadores com camundongos normais de raça pura e observou entre diversas centenas de progênie normal uma única fêmea valsadora Ela foi cruzada com um macho valsador e toda sua progênie foi valsadora Quando cruzada com um macho normal homozigoto toda a progênie foi normal Alguns desses machos e fêmeas normais foram intercruzados e inesperadamente não houve descendentes valsadores T S Painter examinou os cromossomos de alguns dos camundongos valsadores de Gates que demonstravam um comportamento reprodutivo semelhante àquele da fêmea valsadora incomum original Ele observou que esses camundongos apresentavam o número normal de 40 cromossomos Entretanto nos valsadores incomuns um membro de um par de cromossomos era anormalmente curto Interprete essas observações tão completamente quanto possível tanto genética quanto citologicamente Um cromossomo da glândula salivar de Drosophila apresenta seis bandas conforme demonstrado na ilustração a seguir Abaixo do cromossomo estão demonstradas as extensões de cinco deleções Del 1 a Del 5 47 Os alelos recessivos a b c d e e f sabidamente estão na região mas a sua ordem é desconhecida Quando as deleções são combinadas com cada alelo são obtidos os resultados a seguir a b c d e f Del 1 Del 2 Del 3 Del 4 Del 5 Nesta tabela um sinal de menos significa que a deleção revela o alelo recessivo é observado o fenótipo recessivo e um sinal de mais significa que o alelo do tipo selvagem correspondente ainda está presente Corresponda cada banda salivar com um gene Observouse que uma moscadasfrutas é heterozigota em relação a uma 48 inversão paracêntrica Entretanto a obtenção de moscas que eram homozigotas em relação à inversão foi impossível até mesmo após muitas tentativas Qual é a explicação mais provável para essa incapacidade de produzir uma inversão homozigota Orangotangos são uma espécie ameaçada em seu ambiente natural as ilhas de Bornéu e Sumatra e assim foi estabelecido um programa de criação em cativeiro com a utilização de orangotangos atualmente mantidos em zoológicos por todo o mundo Um componente desse programa é pesquisar a citogenética dos orangotangos Essa pesquisa demonstrou que todos os orangotangos de Bornéu carregam um tipo de cromossomo 2 conforme demonstrado no diagrama que acompanha e todos os orangotangos de Sumatra carregam o outro tipo Antes de essa diferença citogenética se tornar conhecida foram realizados alguns cruzamentos entre animais de diferentes ilhas e 14 progênies híbridas atualmente estão sendo criadas em cativeiro a Qual termo ou quais termos descrevem as diferenças entre estes cromossomos b Desenhe o cromossomo 2 pareado na primeira prófase meiótica de tal orangotango híbrido Assegurese de demonstrar todos os pontos de referência indicados no diagrama que acompanha e rotule todas as partes de seu desenho c Em 30 das meioses haverá um crossover em algum local na região entre as bandas p11 e q12 Desenhe os cromossomos 2 do gameta que resultaria de uma meiose na qual ocorreu um único crossover dentro da banda q11 49 1 d Qual fração dos gametas produzidos por um orangotango híbrido dará origem a progênie viável se esses cromossomos forem os únicos que diferem entre os genitores O Problema 48 é de Rosemary Redfield No milho os genes para o comprimento da borla alelos T e t e para resistência à ferrugem alelos R e r sabidamente estão em cromossomos separados No período da realização de cruzamentos de rotina um cultivador observou que uma planta Tt Rr proporcionava resultados incomuns em um cruzamentoteste com o pólen de um genitor duplo recessivo tt rr Os resultados foram Progênies Tt Rr 98 tt rr 104 Tt rr 3 tt Rr 5 Espigas de milho apenas aproximadamente metade com muitos grãos como de costume a Quais característicaschave dos dados são diferentes dos resultados esperados b Elabore uma hipótese concisa que explique os resultados c Demonstre os genótipos dos genitores e da progênie d Desenhe um diagrama demonstrando o arranjo de alelos nos cromossomos e Explique a origem das duas classes de progênie que demonstram três e cinco membros Como solucionar o Problema 49 O que um gene em relação ao comprimento da borda e um gene em relação à resistência à ferrugem significam 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 É de importância que o significado preciso dos símbolos alélicos T t R e r não seja fornecido Por que sim ou por que não Como os termos gene e alelo conforme utilizados aqui estão relacionados com os conceitos de locus e par de genes Qual evidência experimental anterior forneceria ao geneticista de milho a ideia de que dois genes estão em cromossomos separados O que você imagina que cruzamentos de rotina sejam para um cultivador de milho Qual termo é utilizado para descrever os genótipos do tipo Tt Rr O que é um pólen genitor O que são cruzamentosteste e por que os geneticistas acham que eles são tão úteis Quais tipos de progênie e frequências o cultivador poderia estar esperando a partir do cruzamentoteste Descreva como a progênie observada difere das expectativas O que a igualdade aproximada das duas primeiras classes de progênie informa a você O que a igualdade aproximada das duas segundas classes de progênie informa a você Quais eram os gametas da planta incomum e quais eram as suas proporções Quais gametas estavam na maioria Quais gametas estavam na minoria Quais dos tipos de progênie aparentam ser recombinantes Quais combinações alélicas aparentam estar ligadas de algum modo Como pode haver ligação de genes supostamente em cromossomos separados O que essas classes majoritárias e minoritárias nos informam a respeito dos genótipos dos genitores da planta incomum O que é uma espiga de milho Qual é o aspecto de uma espiga de milho normal Esboce uma e a rotule Qual é o aspecto das espigas de milho desse cruzamento Esboce uma O que exatamente é um grão de milho 24 25 50 Qual efeito poderia levar à ausência de metade dos grãos de milho Metade dos grãos de milho morreu Em caso afirmativo o motivo das mortes foi o genitor do sexo feminino ou do masculino Agora tente solucionar o problema Corpo amarelo em Drosophila é causado por um alelo mutante y de um gene localizado na extremidade do cromossomo X o alelo do tipo selvagem causa um corpo cinza Em um experimento com radiação um macho do tipo selvagem foi irradiado com raios X e em seguida cruzado com uma fêmea de corpo amarelo A maior parte da progênie do sexo masculino era amarela conforme esperado mas a varredura de milhares de moscas revelou dois machos de corpos cinza fenotipicamente do tipo selvagem Esses machos de corpos cinza foram cruzados com fêmeas de corpos amarelos com os resultados a seguir Progênie Macho cinza 1 Fêmea amarela Todas as fêmeas amarelas Todos os machos cinza Macho cinza 2 Fêmea amarela fêmeas amarelas fêmeas cinza machos amarelos machos cinza a Explique a origem e o comportamento de cruzamento do macho cinza 1 b Explique a origem e o comportamento de cruzamento do macho cinza 2 51 52 53 54 55 56 No milho o alelo Pr define talos verdes e pr roxos Uma planta do milho de genótipo prpr que apresenta cromossomospadrão é cruzada com uma planta PrPr que é homozigota em relação a uma translocação recíproca entre os cromossomos 2 e 5 A F1 é semiestéril e fenotipicamente Pr Um retrocruzamento com o genitor com cromossomospadrão dá origem a 764 Pr semiestéreis 145 pr semiestéreis 186 Pr normais e 727 pr normais Qual é a distância de mapa entre o locus Pr e o ponto de translocação Diferencie entre as síndromes de Klinefelter Down e Turner Quais síndromes são observadas em ambos os sexos Demonstre como você poderia produzir um alotetraploide entre duas espécies de plantas diploides relacionadas ambas 2n 28 Em Drosophila trissômicos e monossômicos em relação ao pequeno cromossomo 4 são viáveis mas nulissômicos e tetrassômicos não são O locus b está nesse cromossomo Deduza as proporções fenotípicas na progênie dos cruzamentos de trissômicos a seguir a bbb bb b bbb bb c bbb bb Observase que uma mulher com síndrome de Turner é daltônica um fenótipo recessivo ligado ao X Tanto sua mãe quanto seu pai apresentam visão normal a Explique a origem simultânea da síndrome de Turner e do daltonismo por meio do comportamento anormal dos cromossomos na meiose b A sua explicação pode distinguir se o comportamento cromossômico anormal ocorreu no pai ou na mãe c A sua explicação pode distinguir se o comportamento cromossômico anormal ocorreu na primeira ou na segunda divisão da meiose d Agora presuma que um homem com Klinefelter daltônico possui genitores com visão normal e resposta as partes a b e c a Como você sintetizaria um pentaploide b Como você sintetizaria um triploide de genótipo Aaa 57 58 c Você acabou de obter uma mutação recessiva rara a em uma planta diploide que a análise mendeliana informa a você ser Aa A partir dessa planta como você sintetizaria um tetraploide 4n de genótipo AAaa d Como você sintetizaria um tetraploide de genótipo Aaaa Suponha que você possui uma linhagem de camundongos que apresenta tipos citologicamente distintos do cromossomo 4 A extremidade do cromossomo pode apresentar uma protuberância denominado 4K ou um satélite 4S ou nenhum deles 4 Aqui estão os esboços dos três tipos Você cruza uma fêmea 4 K4S com um macho 44 e observa que a maior parte da progênie é 4 K4 ou 4S4 conforme o esperado Entretanto ocasionalmente você observa alguns tipos raros como segue todos os outros cromossomos são normais a 4K4K4 b 4K4S4 c 4K Explique os tipos raros que você observou Forneça tão precisamente quanto possível os estágios nos quais eles se originam e declare se eles são originados no genitor na genitora ou no zigoto Forneça brevemente os motivos É realizado um cruzamento em tomates entre uma planta do sexo feminino que é trissômica em relação ao cromossomo 6 e uma planta do sexo masculino diploide normal que é homozigota em relação ao alelo recessivo relativo à folha de potato pp Uma planta F1 trissômica é submetida ao retrocruzamento com o macho de folhas de potato a Qual é a razão de plantas com folhas normais e plantas com folhas de 59 60 potato quando você presume que p está localizado no cromossomo 6 b Qual é a razão de plantas com folhas normais e plantas com folhas de potato quando você presume que p não está localizado no cromossomo 6 Uma geneticista de tomate tenta atribuir cinco mutações recessivas a cromossomos específicos por meio da utilização de trissômicos Ela cruza cada mutante homozigoto 2n com cada um de três trissômicos nos quais os cromossomos 1 7 e 10 participam A partir desses cruzamentos a geneticista seleciona progênie trissômica que é menos vigorosa e realiza o seu retrocruzamento com o homozigoto recessivo apropriado É examinada a progênie diploide a partir desses cruzamentos Os seus resultados nos quais as razões são tipo selvagemmutante são como segue Cromossomo trissômico Mutação d y c h cot 1 4855 7229 5650 5354 3228 7 5256 5248 5251 5856 8140 10 4542 3633 2832 9650 2017 Quais das mutações a geneticista pode atribuir a quais cromossomos Explique totalmente a sua resposta Uma petúnia é heterozigota em relação aos homólogos autossômicos a seguir 61 a Desenhe a configuração de pareamento que você observaria na metáfase I e identifique todas as partes do seu diagrama Numere as cromátides sequencialmente a partir da parte superior até a parte inferior da página b Ocorre um crossover duplo de três filamentos com um crossover entre os loci C e D nas cromátides 1 e 3 e o segundo crossover entre os loci G e H nas cromátides 2 e 3 Diagrame os resultados desses eventos de recombinação conforme você os observaria na anáfase I e identifique todas as partes do seu diagrama c Desenhe o padrão cromossômico que você observaria na anáfase II após os crossovers descritos na parte b d Forneça os genótipos dos gametas dessa meiose que levariam à formação de progênie viável Presuma que todos os gametas são fertilizados pelo pólen que apresenta a ordem de genes A B C D E F G H I Dois grupos de geneticistas na Califórnia e no Chile começam a trabalhar para desenvolver um mapa de ligação de medfly moscadasfrutas do Mediterrâneo Independentemente ambos descobrem que os loci em relação à cor do corpo B Preto b Cinza e ao formato dos olhos R Redondos r Estrelados estão ligados com uma distância de 28 um Eles enviam linhagens uns aos outros e realizam cruzamentos um resumo de todos os seus achados está demonstrado aqui Cruzamento F1 Progênie de F1 qualquer brbr BRbr brbr 36 36 62 BRBR Calif brbr Calif BRbr Brbr bRbr 14 14 BRBR Chile brbr Chile BRbr BRbr brbr Brbr bRbr 36 36 14 14 BRBR Calif brbr Chile ou brbr Calif BRBR Chile BRbr BRbr brbr Brbr bRbr 48 48 2 2 a Forneça uma hipótese genética que explique os três conjuntos de resultados dos cruzamentosteste b Desenhe as características cromossômicaschave da meiose na F1 a partir de um cruzamento das linhagens da Califórnia e do Chile Uma planta do milho aberrante proporciona os valores de FR a seguir quando submetida a um cruzamentoteste Intervalo 63 df fb bx xy yp Controle 5 18 23 12 6 Planta aberrante 5 2 2 0 6 A ordem do locus é centrômerodfbxyp A planta aberrante é uma planta saudável mas produz muito menos óvulos normais e pólen do que a plantacontrole produz a Proponha uma hipótese para explicar os valores de recombinação anormais e a redução da fertilidade na planta aberrante b Utilize diagramas para explicar a origem dos recombinantes de acordo com a sua hipótese Os loci do milho a seguir estão em um braço do cromossomo 9 na ordem indicada as distâncias entre eles estão demonstradas em unidades de mapa cbzwxshdcentrômero 12 8 10 20 10 C proporciona aleurona colorida c aleurona branca Bz proporciona folhas verdes bz folhas bronze Wx proporciona sementes amiláceas wx sementes cerosas Sh proporciona sementes lisas sh sementes enrugadas D proporciona plantas altas d anãs 64 Uma planta de um estoque padrão que é homozigota em relação a todos os cinco alelos recessivos é cruzada com uma planta do tipo selvagem do México que é homozigota em relação a todos os cinco alelos dominantes As plantas da F1 expressam todos os alelos dominantes e quando retrocruzadas com o genitor recessivo proporciona os fenótipos de progênie a seguir colorida verde amilácea lisa alta 360 branca bronze cerosa enrugada anã 355 colorida bronze cerosa enrugada anã 40 branca verde amilácea lisa alta 46 colorida verde amilácea lisa anã 85 branca bronze cerosa enrugada alta 84 colorida bronze cerosa enrugada alta 8 branca verde amilácea lisa anã 9 colorida verde cerosa lisa alta 7 branca bronze amilácea enrugada anã 6 Proponha uma hipótese para explicar esses resultados Inclua a Uma declaração geral da sua hipótese com diagramas se necessário b O motivo da existência de 10 classes c Uma explicação da origem de cada classe incluindo sua frequência e d No mínimo um teste de sua hipótese Plantas de milho cromossomicamente normais apresentam um locus p no cromossomo 1 e um locus s no cromossomo 5 P proporciona folhas verdeescuras p folhas verdepálidas 65 S proporciona espigas grandes s espigas murchas Uma planta original de genótipo Pp Ss apresenta o fenótipo esperado verdeescura espigas grandes mas proporciona resultados inesperados em cruzamentos como segue Na autofecundação a fertilidade é normal mas a frequência de tipos pp ss é de 14 não de 116 conforme o esperado Quando cruzadas com um testador normal de genótipo pp ss a progênie da F1 é 12 Pp Ss e 12 pp ss a fertilidade é normal Quando uma planta da F1 Pp Ss é cruzada com um testador normal pp ss ela comprova ser semiestéril mas novamente a progênie é 12 Pp Ss e 12 pp ss Explique esses resultados demonstrando os genótipos completos da planta original do testador e das plantas da F1 Como você testaria a sua hipótese Embriões número médio Cruzamento Implantados na parede uterina Degeneração após a implantação Normais Degeneração excepcional normal 87 50 37 375 normal normal 95 06 89 65 Um rato macho que é fenotipicamente normal demonstra anomalias 66 reprodutivas quando comparado com ratos machos normais conforme demonstrado na tabela anterior Proponha uma explicação genética para esses resultados incomuns e indique como a sua ideia poderia ser testada Uma geneticista de tomate que trabalha com Fr um alelo mutante dominante que causa o rápido amadurecimento do fruto decide descobrir qual cromossomo contém esse gene por meio da utilização de um conjunto de linhagens das quais cada uma é trissômica em relação a um cromossomo Para tanto ela cruza um mutante diploide homozigoto com cada uma das linhagens trissômicas do tipo selvagem a Uma planta trissômica da F1 é cruzada com uma planta do tipo selvagem diploide Qual é a razão das plantas de amadurecimento rápido e lento na progênie diploide desse segundo cruzamento se o Fr está no cromossomo trissômico Utilize diagramas para explicar b Qual é a razão de plantas de amadurecimento rápido e lento na progênie diploide desse segundo cruzamento se Fr não está localizado no cromossomo trissômico Utilize diagramas para explicar c Aqui estão os resultados dos cruzamentos Em qual cromossomo está Fr e por quê Cromossomo trissômico Amadurecimento rápidoamadurecimento lento na progênie diploide 1 4547 2 3334 3 5552 4 2630 67 5 3132 6 3741 7 4479 8 4953 9 3434 10 3739 O Problema 66 é de Tamara Western PROBLEMAS DESAFIADORES O locus un3 de Neurospora está próximo do centrômero no cromossomo 1 e crossovers entre un3 e o centrômero são muito raros O locus ad3 está do outro lado do centrômero do mesmo cromossomo e ocorrem crossovers entre ad3 e o centrômero em aproximadamente 20 das meioses não ocorrem crossovers múltiplos a Quais tipos de ascos lineares ver Capítulo 4 você prevê com que frequência em um cruzamento normal de un3 ad3 tipo selvagem Especifique os genótipos dos esporos nos ascos b Na maior parte do tempo tais cruzamentos se comportam de modo previsível mas em um caso uma linhagem un3 ad3 padrão foi cruzada com um tipo selvagem isolado em um campo de canadeaçúcar no Havaí Seguem os resultados 68 Explique esses resultados e declare como você poderia testar a sua ideia Nota em Neurospora os ascósporos com material cromossômico extra sobrevivem e são da cor preta normal enquanto os ascósporos com ausência de qualquer região cromossômica são brancos e inviáveis Duas mutações em Neurospora ad3 e pan2 estão localizadas nos cromossomos 1 e 6 respectivamente Uma linhagem ad3 incomum surge em laboratório fornecendo os resultados demonstrados na tabela a seguir Explique todos os três resultados com o auxílio de diagramas claramente marcados Nota em Neurospora os ascósporos com material cromossômico extra sobrevivem e são da cor preta normal enquanto os ascósporos com ausência de qualquer região cromossômica são brancos e inviáveis Aspecto dos ascósporos FR entre ad 3 e pan2 1 ad3 normal pan2 normal Todos pretos 50 69 70 2 ad3 anormal pan2 normal Aproximadamente pretos e brancos inviáveis 1 3 Dos esporos pretos do cruzamento 2 aproximadamente metade era completamente normal e metade repetiu o mesmo comportamento da linhagem ad3 anormal original Deduza as proporções fenotípicas na progênie dos cruzamentos a seguir de autotetraploides nos quais os locus aa está muito próximo do centrômero Presuma que os quatro cromossomos homólogos de qualquer tipo pareiam aleatoriamente dois a dois e que apenas uma cópia do alelo a é necessária para o fenótipo do tipo selvagem a aaaa aaaa b aaaa aaaa c aaaa aaaa d aaaa aaaa A espécie de algodão do Novo Mundo Gossypium hirsutum apresenta um número 2n de 52 cromossomos As espécies do Velho Mundo G thurberi e G herbaceum apresentam cada uma um número 2n de 26 Quando essas espécies são cruzadas os híbridos resultantes demonstram os arranjos de pareamento cromossômico na meiose a seguir Híbrido Arranjo de pareamento G hirsutum G thurberi 13 bivalentes pequenos 13 univalentes grandes G hirsutum G herbaceum 13 bivalentes grandes 13 univalentes pequenos 71 G thurberi G herbaceum 13 univalentes grandes 13 univalentes pequenos Interprete essas observações filogeneticamente utilizando diagramas Indique claramente as relações entre as espécies Como você comprovaria que a sua interpretação está correta Existem seis espécies principais do gênero Brassica B carinata B campestris B nigra B oleracea B juncea e B napus Você consegue deduzir as interrelações dessas seis espécies a partir da tabela a seguir a Deduza o número de cromossomos de B campestris B nigra e B oleracea b Demonstre claramente quaisquer relações evolutivas entre as seis espécies que você consiga deduzir no nível cromossômico Espécie ou híbrido de F1 Número de cromossomos Número de bivalentes Número de univalentes B juncea 36 18 0 B carinata 34 17 0 B napus 38 19 0 B juncea B nigra 26 8 10 B napus B campestris 29 10 9 72 73 B carinata B oleracea 26 9 8 B juncea B oleracea 27 0 27 B carinata B campestris 27 0 27 B napus B nigra 27 0 27 Diversos tipos de mosaicismo sexual estão bemdocumentados em seres humanos Sugira como cada um dos exemplos a seguir pode ter surgido por meio da não disjunção na mitose a XXXO ou seja existem dois tipos celulares no corpo XX e XO b XXXXYY c XOXXX d XXXY e XOXXXXX Em Drosophila foi realizado um cruzamento cruzamento 1 entre duas moscas mutantes uma homozigota em relação à mutação recessiva asas dobradas b e a outra homozigota em relação à mutação recessiva sem olhos e As mutações e e b são alelos de dois genes diferentes que sabidamente estão ligados de modo muito próximo no pequeno cromossomo 4 autossômico Toda a progênie apresenta um fenótipo do tipo selvagem Uma fêmea da progênie foi cruzada com um macho de genótipo bebe denominaremos esse cruzamento 2 A maior parte da progênie do cruzamento 2 foi dos tipos esperados mas houve também uma fêmea rara de fenótipo do tipo selvagem 1 2 3 4 5 6 7 8 a Explique que progênie comum esperase do cruzamento 2 b A fêmea do tipo selvagem rara pode ter surgido por meio de 1 crossing over ou 2 não disjunção Explique c A fêmea do tipo selvagem rara foi submetida ao cruzamentoteste com um macho de genótipo bebe cruzamento 3 A progênie foi tipo selvagem asas dobradas asas dobradas sem olhos sem olhos Qual das explicações na parte b é compatível com esse resultado Explique os genótipos e os fenótipos da progênie do cruzamento 3 e as suas proporções Como solucionar o Problema 73 Defina homozigoto mutação alelo estreitamente ligado recessivo tipo selvagem crossing over não disjunção cruzamentoteste fenótipo e genótipo Esse problema diz respeito à ligação ao sexo Explique Quantos cromossomos a Drosophila apresenta Desenhe um heredograma claro resumindo os resultados dos cruzamentos 1 2 e 3 Desenhe os gametas produzidos por ambos os genitores no cruzamento 1 Desenhe a constituição do cromossomo 4 da progênie do cruzamento 1 É surpreendente que a progênie do cruzamento 1 seja de fenótipo do tipo selvagem O que esse desfecho informa a você Desenhe a constituição do cromossomo 4 do testador macho utilizado no cruzamento 2 e os gametas que ele pode produzir 9 10 11 12 13 14 15 16 74 Em relação ao cromossomo 4 quais gametas o genitor feminino no cruzamento 2 pode produzir na ausência de não disjunção Quais seriam comuns e quais seriam raros Desenhe a não disjunção meiótica de primeira e de segunda divisão no genitor feminino do cruzamento 2 bem como nos gametas resultantes Algum dos gametas da parte 10 é aneuploide Você esperaria que os gametas aneuploides dessem origem a progênie viável Essa progênie seria nulissômica monossômica dissômica ou trissômica Quais fenótipos de progênie seriam produzidos pelos diversos gametas considerados nas partes 9 e 10 Considere a razão fenotípica na progênie do cruzamento 3 Muitas razões genéticas têm por base as metades e os quartos mas essa razão tem por base os terços e os sextos Essa razão pode apontar para o quê Pode haver qualquer significância no fato de que os cruzamentos dizem respeito a genes em um cromossomo muito pequeno Quando o tamanho do cromossomo é relevante em genética Desenhe a progênie esperada a partir do cruzamento 3 sob as duas hipóteses e forneça alguma ideia das proporções relativas No fungo Ascobolus semelhante a Neurospora os ascósporos normalmente são pretos A mutação f que produz ascósporos de cor castanhoclara está em um gene logo à direita do centrômero no cromossomo 6 enquanto a mutação b que produz ascósporos bege está em um gene logo à esquerda do mesmo centrômero Em um cruzamento de genitores castanhoclaros e bege f b a maior parte das óctades demonstrou quatro ascósporos castanhoclaros e quatro bege mas foram observadas três óctades excepcionais raras conforme demonstrado na ilustração a seguir No esboço o preto é o fenótipo do tipo selvagem uma linha vertical é castanhoclara uma linha horizontal é bege e um círculo vazio representa um ascósporo abortado morto 75 a Forneça explicações razoáveis para essas três óctades excepcionais b Diagrame a meiose que deu origem à óctade 2 O ciclo de vida do fungo haploide Ascobolus é semelhante àquele de Neurospora Um tratamento mutacional produziu duas linhagens mutantes 1 e 2 ambas cruzadas com o tipo selvagem dando origem a tétrades desordenadas todas do tipo a seguir castanhoclaro é uma cor marrom clara normalmente os cruzamentos produzem ascósporos todos pretos par 1 de esporos pretos par 3 de esporos castanhoclaros par 2 de esporos pretos par 4 de esporos castanhoclaros a O que esse resultado demonstra Explique As duas linhagens mutantes foram cruzadas A maior parte das tétrades desordenadas era do tipo a seguir par 1 de esporos castanhoclaros par 3 de esporos claros castanhoclaros par 2 de esporos castanhoclaros par 4 de esporos claros castanhoclaros b O que esse resultado sugere Explique Quando grandes números de tétrades desordenadas foram triados ao microscópio foram observadas algumas tétrades raras que continham esporos pretos Quatro casos estão demonstrados aqui Caso A Caso B Caso C Caso D Par 1 de esporos Preto Preto Preto Preto Par 2 de esporos Preto Castanho claro Preto Abortado Par 3 de esporos Castanho claro Castanho claro Abortado Castanho claro Par 4 de esporos Castanho claro Castanho claro Abortado Castanho claro Nota os ascósporos com material genético extra sobrevivem mas aqueles com menos de um genoma haploide abortam c Proponha explicações genéticas razoáveis para cada um desses quatro casos raros d Você acredita que as mutações nas duas linhagens mutantes originais estavam em um único gene Explique Concepção da artista Lynn Fellman do Adão Eurasiano um homem africano com um cromossomo Y pertencente a um grupo de haplótipos que foi o ancestral de todos os cromossomos Y de homens fora da África e que surgiu na África há aproximadamente 70000 anos Lynn Fellman wwwFellmanstudiocom 181 182 183 184 185 186 E TÓPICOS Detecção da variação genética Conceito de pool gênico e lei de HardyWeinberg Sistemas de acasalamento Variação genética e sua medida Modulação da variação genética Aplicações biológicas e sociais RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Analisar dados para determinar quanta variação genética existe nas populações Desenhar um experimento para testar se uma população de organismos está de acordo com as expectativas de HardyWeinberg Explicar como novos alelos entram em uma população Compreender os impactos negativos do endocruzamento em uma população Descrever os tipos de seleção em relação à genética de populações Prever de que maneira forças como a seleção a mutação e a deriva genética alteram a quantidade de variação nas populações m 2009 Sean Hodgson foi libertado de uma prisão britânica após cumprir 27 anos pelo assassinato de Teresa De Simone balconista e garçonete de um bar Hodgson que sofre de doença mental inicialmente confessou o crime mas retirou a sua confissão durante o processo Durante seus anos na prisão ele afirmou a sua inocência Mais de duas décadas após o crime a justiça analisou o DNA do assaltante encontrado na cena do crime e determinou que ele não era de Hodgson A sua condenação foi anulada e a polícia reabriu a investigação do assassinato da Sra De Simone Conforme você aprenderá neste capítulo a análise com base no DNA utilizada para absolver o Sr Hodgson e centenas de outros prisioneiros erroneamente condenados depende da análise genética de populações Os princípios da genética de populações são o cerne de muitas questões que a sociedade enfrenta atualmente Quais são os riscos de que um casal tenha um filho com uma doença genética As práticas de cultivo de plantas e criação de animais causaram uma perda da diversidade genética na agroindústria que imponha riscos para o nosso suprimento alimentar Na medida em que a população humana continua a se expandir e a vida selvagem recua para partes cada vez menores da Terra as espécies selvagens serão capazes de evitar o endocruzamento e sobreviver Os princípios da genética de populações também são fundamentais para a compreensão de muitas questões históricas e evolutivas Como as populações humanas de diferentes regiões do mundo estão relacionadas umas às outras Como o genoma humano reagiu à medida que os seres humanos se espalharam por todo o globo e se tornaram adaptados a diferentes ambientes e estilos de vida Como as populações e as espécies evoluem ao longo do tempo Uma população é um grupo de indivíduos da mesma espécie A genética de populações analisa a quantidade e a distribuição da variação genética nas populações e as forças que controlam essa variação Ela tem suas origens no início do século 20 quando geneticistas começaram a estudar como as leis de Mendel poderiam ser estendidas para compreender a variação genética dentro de populações inteiras de organismos Embora as leis de Mendel expliquem como os genes são transmitidos dos genitores para a descendência nos casos de cruzamentos controlados e heredogramas conhecidos essas leis são insuficientes para a compreensão da transmissão de genes de uma geração para a próxima em populações naturais nas quais nem todos os indivíduos produzem descendência e nem toda a descendência sobrevive Geneticistas iniciaram o desenvolvimento dos princípios da genética de populações no início do século 20 mas naquela época eles tinham ferramentas um tanto quanto limitadas para realmente medir a variação genética Com o desenvolvimento das tecnologias com base no DNA ao longo das últimas três décadas os geneticistas atualmente têm a capacidade de observar diretamente as diferenças entre as sequências de DNA dos indivíduos em todo o seu genoma e podem medir essas diferenças em grandes amostras de indivíduos em muitas espécies O resultado tem sido uma revolução na nossa 181 compreensão sobre a variação genética nas populações Neste capítulo consideraremos o conceito de pool gênico e como os geneticistas estimam as frequências de alelos e de genótipos nas populações Em seguida examinaremos o impacto que os sistemas de cruzamento apresentam sobre as frequências de genótipos em uma população Também discutiremos como os geneticistas medem a variação com a utilização de tecnologias baseadas no DNA Em seguida discutiremos as forças que modulam os níveis de variação genética nas populações Finalmente observaremos alguns estudos de caso que envolvem a aplicação da genética de populações para questões de interesse para a sociedade Detecção da variação genética Os métodos da genética de populações podem ser utilizados para analisar qualquer variável ou locus polimórfico nas sequências de DNA de uma população de organismos Historicamente os geneticistas não tinham as ferramentas moleculares necessárias para observar diretamente as diferenças nas sequências de DNA entre os indivíduos e assim a maior parte das análises da genética de populações observava as diferenças nas proteínas ou nos fenótipos Por exemplo as diferenças na proteína glicosiltransferase codificada pelo gene AB0 que controla o grupo sanguíneo AB0 em seres humanos podem ser detectadas com a utilização de sondas de anticorpos A partir dessas diferenças na proteína os investigadores podem inferir diferenças na sequência de DNA desse gene entre os indivíduos Ao longo das últimas três décadas foram desenvolvidas novas tecnologias tais como sequenciamento do DNA microarranjos de DNA e PCR ver Capítulos 10 e 14 possibilitando que os geneticistas observem as diferenças nas sequências de DNA diretamente Como resultado as análises da genética de populações deixaram de estar confinadas a um pequeno conjunto de genes tais como AB0 tendo sido expandidas para incluir todos os nucleotídios no genoma Na genética de populações um locus é simplesmente um local no genoma ele pode ser um sítio de nucleotídio único ou um segmento de muitos nucleotídios O tipo mais simples de variação que se pode observar entre os indivíduos em um locus é uma diferença no nucleotídio presente em um sítio de nucleotídio único seja adenina citosina guanina ou timina Esses tipos de variantes são denominados polimorfismos de nucleotídio único SNP e são as variantes mais amplamente estudadas na genética de populações humanas Figura 181 ver também Capítulo 4 A genética de populações também faz uso extensivo dos loci de microssatélites ver Capítulo 4 Esses loci apresentam um motif de sequência curta com comprimento de dois a seis pares de bases que é repetido múltiplas vezes com diferentes alelos e números diferentes de repetições Por exemplo o motif de sequência AG de 2 pb em um locus pode ser repetido em tandem cinco vezes em um alelo AGAGAGAGAG mas três vezes em outro AGAGAG ver Figura 181 FIGURA 181 Variação nas sequências de DNA alinhadas de sete cromossomos de diferentes pessoas Os asteriscos demonstram a localização dos SNP A localização de uma indel inserçãodeleção de uma série de pares de nucleotídios e de um microssatélite também está indicada Polimorfismos de nucleotídio único Os polimorfismos de nucleotídio único SNP são os tipos de polimorfismo mais prevalentes na maior parte dos genomas A maioria dos SNP apresenta apenas dois alelos por exemplo A e C Os SNP normalmente são considerados SNP comuns em uma população se o alelo menos comum ocorre a uma frequência de aproximadamente 5 ou superior Os SNP em relação aos quais o alelo menos comum ocorre a uma frequência inferior a 5 são considerados SNP raros Em relação aos seres humanos existe um SNP comum aproximadamente a cada 300 a 1000 pb no genoma É claro que existe um número muito maior de SNP raros Os SNP ocorrem dentro de genes incluindo éxons íntrons e regiões reguladoras Os SNP em regiões codificadoras de proteínas podem ser classificados em um de três grupos sinônimos se os diferentes alelos codificam o mesmo aminoácido não sinônimos se os dois alelos codificam aminoácido diferentes e sem sentido se um alelo codifica um códon de fim e o outro um aminoácido Portanto por vezes é possível associar um SNP a uma variação funcional nas proteínas e a uma alteração associada no fenótipo Os SNP localizados fora de sequências codificadoras são denominados SNP não codificadores ncSNP Se os ncSNP não apresentam efeitos sobre a função gênica e o fenótipo eles são denominados silenciosos Os ncSNP silenciosos podem ser muito úteis na genética de populações tendo em vista que podem ser utilizados como marcadores para abordar questões a respeito de processos da genética de populações tais como o fluxo gênico entre populações Para estudar a variação de SNP em uma população primeiramente precisamos determinar quais sítios de nucleotídios no genoma são variáveis ou seja constituem um SNP Essa primeira etapa é denominada descoberta de SNP Os SNP com frequência são descobertos por meio do sequenciamento de genomas de uma pequena amostra de indivíduos de uma espécie e em seguida com a comparação dessas sequências Por exemplo a descoberta de SNP em seres humanos teve início por meio do sequenciamento parcial de genomas de um painel de descoberta de 48 indivíduos de todo o mundo Os sítios de nucleotídios variáveis foram descobertos por meio da comparação das sequências genômicas parciais desses 48 indivíduos entre si Esse esforço inicial levou à descoberta de mais de 1 milhão de SNP Após a descoberta dos SNP pode ser determinado o genótipo a composição alélica de diferentes indivíduos na população para cada SNP Os microarranjos de DNA são uma tecnologia amplamente utilizada para essa finalidade Figura 182 Os microarranjos utilizados para análises de SNP podem conter milhares de sondas correspondentes aos SNP conhecidos Biotecnólogos desenvolveram diversos métodos diferentes para detectar variantes de SNP com a utilização de microarranjos Em um método o DNA de um indivíduo é marcado com corantes fluorescentes e hibridizado com o microarranjo Cada ponto SNP no microarranjo fluorescerá em vermelho para uma classe homozigota em verde para a outra homozigota e em amarelo para o heterozigoto ver Figura 182 O procedimento inteiro tem sido intensificado com a robótica para possibilitar a rápida genotipagem ou atribuição de genótipos p ex AA versus AC em grande escala FIGURA 182 Detecção da variação no DNA os SNP Visualização de uma pequena parte de um microarranjo utilizado para realizar a varredura do genoma de um único indivíduo Cada ponto representa um SNP com vermelho e verde para as classes homozigotas e amarelo para os heterozigotos Microssatélites Os microssatélites são loci poderosos para a análise da genética de populações por diversos motivos Primeiramente ao contrário dos SNP que tipicamente apresentam apenas dois alelos por locus e que nunca podem apresentar mais de quatro alelos o número de alelos em um microssatélite com frequência é muito grande 20 ou mais Em segundo lugar eles apresentam uma alta taxa de mutação tipicamente na faixa de 103 a 104 mutações por locus por geração em comparação a 108 a 109 mutações por sítio por geração em relação aos SNP A alta taxa de mutação significa que os níveis de variação são mais altos mais alelos por locus e maior chance de que quaisquer dois indivíduos apresentem genótipos diferentes Em terceiro lugar os microssatélites são muito abundantes na maior parte dos genomas Os seres humanos apresentam mais de um milhão de microssatélites Os microssatélites são observados por todo o genoma da maior parte dos organismos e podem estar presentes em éxons íntrons regiões reguladoras e sequências não funcionais de DNA Os microssatélites com repetições de trinucleotídios são observados nas sequências codificadoras de alguns genes esses codificam séries de um único aminoácido O gene da doença de Huntington HD ver Capítulo 16 contém uma repetição de CAG que codifica uma série de glutaminas Os indivíduos que carregam alelos com mais de 30 glutaminas são predispostos ao desenvolvimento da doença Entretanto em geral a maior parte dos microssatélites está localizada fora das sequências codificadoras e a variação no número de repetições não está associada a diferenças no fenótipo São utilizados dois métodos principais para descobrir os loci de microssatélites no genoma Se uma sequência genômica completa estiver disponível em relação a um organismo podese simplesmente conduzir uma pesquisa para encontrálos com a utilização de um computador Em relação às espécies sem sequências genômicas a maior parte dos organismos não modelo é necessário um trabalho laboratorial considerável para descobrir microssatélites Tipicamente criase uma biblioteca genômica realizase a varredura da biblioteca com uma sonda para o motif de interesse p ex repetições AG e determinase a sequência de DNA dos clones selecionados para identificar os microssatélites e as sequências que os flanqueiam Os métodos moleculares para a realização desse tipo de trabalho foram discutidos no Capítulo 10 Após a identificação de um microssatélite e suas sequências flanqueadoras amostras de DNA de um conjunto de indivíduos na população podem ser analisadas para determinar o número de repetições que estão presentes em cada indivíduo Para realizar a análise são projetados primers de oligonucleotídios que correspondam às sequências flanqueadoras para a utilização na PCR Se os primers forem marcados com um corante fluorescente então os tamanhos dos produtos da PCR podem ser determinados no mesmo aparato utilizado para determinar a sequência de moléculas de DNA Figura 183 Esses tamanhos revelam o número de repetições em um alelo de microssatélite Por exemplo o produto da PCR de um alelo de microssatélite que contém sete repetições AG será 8 pb mais longo do que um alelo que contém três repetições AG Os indivíduos heterozigotos possuirão produtos de dois tamanhos diferentes Tendo em vista que a PCR a determinação do tamanho dos produtos da PCR e a classificação dos alelos podem ser todas automatizadas é possível determinar os genótipos de grandes amostras de indivíduos em relação a grandes números de microssatélites de modo relativamente rápido Haplótipos Para algumas questões na genética de populações é importante considerar os genótipos de loci ligados como um grupo em vez de individualmente Os geneticistas utilizam o termo haplótipo para fazer referência à combinação de alelos em múltiplos loci no mesmo cromossomo homólogo Dois cromossomos homólogos que compartilham o mesmo alelo em cada um dos loci em consideração têm o mesmo haplótipo Se dois cromossomos apresentam genótipos diferentes até mesmo em um dos loci em questão eles então apresentam haplótipos diferentes Se o locus A com alelos A e a estiver ligado ao locus B com alelos B e b então existem quatro haplótipos possíveis em relação ao segmento cromossômico no qual esses loci estão localizados FIGURA 183 Detecção da variação no DNA microssatélites Desenho esquemático de uma imagem de gel dos loci em relação a cinco microssatélites avaliados simultaneamente As três fileiras verticais correspondem a três indivíduos Observe que existem três alelos presentes em relação ao locus 1 e que os indivíduos 2 e 3 são ambos heterozigotos em relação a este locus A B A b a B a b Um exemplo mais complexo porém mais realista está demonstrado na Figura 184 Na Figura 184 A existem sete segmentos cromossômicos mas apenas seis haplótipos tendo em vista que os segmentos cromossômicos 5 e 6 apresentam o mesmo haplótipo E Os haplótipos são utilizados com mais frequência na genética de populações em relação aos loci que estão fisicamente próximos Por exemplo os sítios de nucleotídios variáveis em um único gene podem ser utilizados para definir haplótipos em relação àquele gene Entretanto o conceito de haplótipo funciona em relação a regiões maiores quando há pouca ou nenhuma recombinação ao longo da região Ele pode até mesmo ser aplicado para um cromossomo inteiro tal como o cromossomo Y humano Finalmente por vezes ele é útil para agrupar haplótipos em classes Conforme demonstrado na Figura 184 A existem duas classes principais de haplótipos I e II que diferem em cinco sítios de nucleotídios mais um microssatélite Entretanto cada classe contém diversos subtipos Ia Ib A rede de haplótipos demonstra as relações entre os haplótipos posicionando cada mutação em um dos ramos Figura 184 B Quais percepções podemos obter a partir da análise de haplótipos Os geneticistas de populações estudando o cromossomo Y humano entre homens asiáticos descobriram um haplótipo altamente prevalente denominado haplótipo aglomerado estelar Figura 185 A Tipicamente a maior parte dos homens apresenta um haplótipo de cromossomo Y raro mas o haplótipo aglomerado estelar está presente em 8 dos homens asiáticos Com a utilização da taxa de mutação conhecida os pesquisadores estimaram que esse haplótipo comum surgiu entre 700 e 1300 anos atrás Posteriormente neste capítulo discutiremos as taxas de mutação e sua utilização na genética de populações Esse haplótipo é mais comum na Mongólia sugerindo que ele surgiu ali Os pesquisadores inferiram que o haplótipo aglomerado estelar remonta a um homem na Mongólia há aproximadamente 1000 anos Notavelmente a distribuição atual desse haplótipo segue os limites geográficos do Império Mongol estabelecido por Genghis Khan há aproximadamente 1200 anos Figura 185 B Aparentemente todos os homens contemporâneos com esse haplótipo são descendentes de Genghis Khan ou de seus parentes da linhagem masculina FIGURA 184 A Existe um total de seis haplótipos A a F nas sequências de DNA alinhadas de sete cromossomos individuais de diferentes pessoas B Estes seis haplótipos estão unidos em uma rede de haplótipos que demonstra as relações entre os haplótipos Cada círculo representa um dos seis haplótipos Quaisquer dois haplótipos diferem nos loci observados em todos os ramos que os conectam Os asteriscos demonstram a localização dos SNP FIGURA 185 A Rede de haplótipos em relação aos cromossomos Y de homens asiáticos demonstrando a predominância do haplótipo aglomerado estelar que se acredita remontar a Genghis Khan A área do círculo é proporcional ao número de indivíduos com o haplótipo específico que o círculo representa B Distribuição geográfica do haplótipo aglomerado estelar As populações estão demonstradas como círculos com uma área proporcional ao tamanho da amostra a proporção de indivíduos na amostra que carregam cromossomos com aglomerado estelar está indicada pelos setores verdes Não foram observados cromossomos com aglomerado estelar nas populações que não apresentam setor verde no círculo A área sombreada representa a extensão do império de Genghis Khan Dados de T Zerjal et al Am J Hum Genet 72 2003 717721 Outras fontes e outros tipos de variação Além dos SNP e dos microssatélites qualquer variação na sequência de DNA dos cromossomos em uma população é passível de análise genética de populações As variações que podem ser analisadas incluem inversões translocações deleções ou duplicações e a presença ou a ausência de um elemento de transposição em um locus em particular no genoma Outro tipo comum de variação é o polimorfismo por inserção e deleção ou indel abreviadamente ver Capítulo 16 Esse tipo de polimorfismo envolve a presença ou a ausência de um ou mais nucleotídios em um locus em um alelo em relação a outro Na Figura 181 os segmentos cromossômicos 5 e 6 diferem dos outros cinco segmentos por uma indel de 3 pb Contrariamente aos microssatélites as indels não contêm motifs repetidos tais como AGAGAGAG Até agora a nossa discussão sobre os SNP e os microssatélites enfocou o genoma nuclear Entretanto também pode ser observada uma interessante variação genética nos genomas mitocondrial mtDNA e de cloroplasto cpDNA de eucariotos Tanto os SNP quanto os microssatélites são observados nesses genomas de organelas Tendo em vista que o mtDNA e o cpDNA normalmente são herdados por via materna sua análise pode ser utilizada para seguir a história das linhagens femininas Em 1987 um proeminente estudo da linhagem mitocondrial humana traçou a história dos haplótipos do mtDNA humano e determinou que os genomas mitocondriais de todos os seres humanos modernos remontam a uma única mulher que viveu na África há aproximadamente 150000 anos Figura 186 Ela foi apelidada de Eva Mitocondrial pela imprensa popular Esse estudo do mtDNA foi a primeira análise genética completa a sugerir que todos os seres humanos modernos vieram da África Projeto HapMap Um importante avanço na genética de populações humanas ao longo da última década foi a criação de um mapa de haplótipos de todo o genoma ou HapMap Um consórcio de cientistas ao redor do mundo genotipou milhares de pessoas que representam a diversidade de nossa espécie em relação a centenas de milhares de SNP e microssatélites O resultado é um quadro altamente detalhado da variação em nossa espécie Os dados estão disponíveis para o público em diversos web sites incluindo aquele do International HapMap Project wwwhapmaporg e do Human Genome Diversity Project hgdpuchicagoedu Neste capítulo utilizaremos esses dados para apresentar os princípios da genética de populações Embora primeiramente desenvolvidos para seres humanos os HapMaps têm sido desde então desenvolvidos para diversas outras espécies incluindo Drosophila camundongo Arabidopsis arroz e milho CONCEITOCHAVE Os genomas estão repletos de diversos tipos de variação passíveis de análise por genética de populações Os SNP e os microssatélites são os dois tipos de polimorfismos mais comumente estudados na genética de populações Tecnologias de alta produção possibilitam que centenas de milhares de polimorfismos sejam classificados em dezenas de milhares de indivíduos FIGURA 186 A rede de haplótipos para grupos de haplótipos do mtDNA desenhada em um mapa mundial O grupo de haplótipo L ancestral aparece na África e os grupos derivados A B e assim por diante estão dispersos por todo o mundo Dados de wwwmitomaporg 182 Conceito de pool gênico e lei de HardyWeinberg Talvez você tenha visto alguém realizando um truque mortal e pensado que a pessoa sofria o risco de eliminar a si própria do pool gênico Em caso afirmativo você estava utilizando um conceito o pool gênico que tem sua origem diretamente na genética de populações e que trilhou o seu caminho até a cultura popular O conceito de pool gênico é uma ferramenta básica para se pensar a respeito da variação genética nas populações Podemos definir o pool gênico como a soma total de todos os alelos nos membros reprodutivos de uma população em um determinado momento Por exemplo a Figura 187 demonstra uma população de 16 rãs cada uma das quais carregando dois alelos no locus autossômico A Por meio da simples contagem podemos determinar que existem cinco homozigotos AA oito heterozigotos Aa e três homozigotos aa O tamanho da população normalmente simbolizado pela letra N é 16 e existe um total de 32 alelos ou 2N nessa população diploide Com esse simples conjunto de números descrevemos o pool gênico em relação ao locus A Tipicamente os geneticistas de populações não se importam com contagens absolutas dos diferentes genótipos em uma população mas sim com as frequências genotípicas Podemos calcular a frequência do genótipo AA simplesmente dividindo o número de indivíduos AA pelo número total de indivíduos na população N para obter 031 A frequência de heterozigotos Aa é de 050 e a frequência de homozigotos aa é de 019 Por serem frequências elas somam 10 As frequências são uma medida mais prática do que as contagens absolutas tendo em vista que raramente os geneticistas de populações são capazes de estudar todos os indivíduos em uma população Em vez disso os geneticistas de populações coletarão uma amostra aleatória ou não tendenciosa de indivíduos em uma população e utilizarão a amostra para inferir as frequências genotípicas na população inteira FIGURA 187 Um pool gênico de rãs Podemos fazer uma descrição mais simples desse pool gênico de rãs se calcularmos as frequências alélicas em vez das frequências genotípicas Quadro 181 Na Figura 187 18 dos 32 alelos são A e assim a frequência de A é 1832 056 A frequência do alelo A é tipicamente simbolizada pela letra p e nesse caso p 056 A frequência do alelo a é simbolizada pela letra q e nesse caso q 1432 044 Novamente tendo em vista que essas são frequências a sua soma é 10 p q 056 044 10 Agora temos uma descrição do nosso pool gênico de rãs com a utilização de apenas dois números p e q CONCEITOCHAVE O pool gênico é um conceito fundamental para o estudo da variação genética nas populações ele é a soma de todos os alelos nos membros reprodutivos de uma população em uma determinada ocasião Podemos descrever a variação em uma população em termos das frequências genotípicas e alélicas Conforme mencionado anteriormente um objetivo importante da genética de populações é compreender a transmissão de alelos de uma geração até a próxima nas populações naturais Nesta seção começaremos a ver como isso funciona Veremos como podemos utilizar as frequências alélicas no pool gênico para fazer previsões a respeito das frequências genotípicas na próxima geração Quadro 181 Cálculo das frequências alélicas Em um locus com dois alelos A e a definiremos as frequências dos três genótipos AA Aa e aa como fAA fAa e faa respectivamente Podemos utilizar essas frequências genotípicas para calcular as frequências alélicas p é a frequência do alelo A e q é a frequência do alelo a Tendo em vista que cada homozigoto AA é composto apenas por alelos A e tendo em vista que metade dos alelos de cada heterozigoto Aa é de alelos A a frequência total p de alelos A na população é calculada como p fAA fAa Frequência de A De modo semelhante a frequência q do alelo a é fornecida por q faa fAa Frequência de a Portanto p q fAa fAa faa 10 e q 1 p Se houver mais de duas formas alélicas diferentes a frequência em relação a cada alelo é simplesmente a frequência de seu homozigoto mais metade da soma das frequências de todos os heterozigotos nos quais ele aparece A frequência de um alelo no pool gênico é igual à probabilidade de que o alelo seja escolhido na coleta aleatória de um alelo do pool gênico para formar um ovócito ou um espermatozoide Sabendo disso podemos calcular a probabilidade de que uma rã na próxima geração seja um homozigoto AA Se nos dirigirmos ao pool gênico das rãs ver Figura 187 e coletarmos o primeiro alelo a probabilidade de que ele seja um A é p 056 e de modo semelhante a probabilidade de que o segundo alelo que coletarmos também seja um A é p 056 O produto dessas duas probabilidades ou p² 03136 é a probabilidade de que uma rã na próxima geração seja AA A probabilidade de que uma rã na próxima geração seja aa é q² 044 044 01936 Existem dois modos para produzir um heterozigoto Podemos primeiramente coletar um A com probabilidade p e em seguida coletar um a com probabilidade q ou podemos coletar o a primeiramente e o A em segundo lugar Portanto a probabilidade de que uma rã na próxima geração seja heterozigota Aa é pq qp 2pq 04928 Em geral as frequências f genotípicas são fAA p² faa q² fAa 2pq Finalmente conforme esperado a soma da probabilidade de ser AA mais a probabilidade de ser Aa mais a probabilidade de ser aa é 10 p² 2pq q² 10 Essa equação simples é a lei de HardyWeinberg um dos fundamentos da teoria da genética de populações O processo de acesso ao pool gênico para coletar um alelo é denominado amostragem do pool gênico Tendo em vista que qualquer indivíduo que contribui para o pool gênico pode produzir muitos ovócitos ou espermatozoides que carreiem exatamente a mesma cópia de um alelo é possível coletar uma cópia em particular e em seguida voltar ao pool gênico e coletar exatamente a mesma cópia mais uma vez Existe também um elemento de acaso envolvido na amostragem do pool gênico Algumas cópias podem por acaso ser coletadas mais de uma vez e outras podem absolutamente não ser coletadas Posteriormente no capítulo veremos como essas propriedades da amostragem do pool gênico podem levar a alterações no pool gênico ao longo do tempo Utilizamos a lei de HardyWeinberg para calcular as frequências genotípicas na próxima geração a partir das frequências alélicas na geração atual Também podemos utilizar a lei de HardyWeinberg para calcular as frequências alélicas a partir das frequências genotípicas em uma única geração Por exemplo alguns tipos de albinismo em seres humanos ocorrem em virtude de alelos recessivos no locus OCA2 Na África um tipo de albinismo denominado albinismo oculocutâneo marrom resulta de um alelo recessivo de OCA2 Figura 188 Os indivíduos com essa condição estão presentes a frequências tão altas quanto 1 em 1100 em alguns grupos étnicos na África Podemos utilizar a lei de Hardy Weinberg para calcular as frequências alélicas faa q² 11100 00009 assim e p 1 q 097 Com a utilização das frequências alélicas também podemos calcular a frequência de heterozigotos na população como 2pq 2 097 003 006 O último número prevê que aproximadamente 6 dessa população são heterozigotos ou portadores do alelo recessivo no OCA2 Quando utilizamos a lei de HardyWeinberg para calcular as frequências alélicas ou genotípicas realizamos algumas presunções críticas Primeiramente presumimos que o cruzamento é aleatório na população quanto ao gene em questão O desvio do cruzamento aleatório viola essa presunção tornando inadequada a aplicação da lei de HardyWeinberg Por exemplo uma tendência de indivíduos fenotipicamente semelhantes de cruzarem entre si viola a lei de HardyWeinberg Se albinos cruzassem mais frequentemente com outros albinos do que com não albinos então a lei de HardyWeinberg superestimaria a frequência do alelo recessivo FIGURA 188 Indivíduo de ancestralidade africana com albinismo oculocutâneo marrom BOCA uma condição definida pela pele bronzeclara e pelos cabelos bege a marromclaros Dra Michele Ramsay Department of Human Genetics School of Pathology the National Health Laboratory Service University of Witwatersrand Em segundo lugar se um dos genótipos reduzir a viabilidade de tal modo que alguns indivíduos com aquele genótipo morrem antes que as frequências dos genótipos sejam contadas então a estimativa das frequências gênicas será imprecisa Em terceiro lugar para que a lei de HardyWeinberg seja aplicada a população não pode ser dividida em subpopulações que sejam parcial ou totalmente isoladas geneticamente Se existirem subpopulações separadas os alelos podem estar presentes em frequências distintas nas diferentes subpopulações Nesse caso a utilização das contagens genotípicas da população em geral pode não fornecer uma estimativa precisa das frequências alélicas globais Finalmente a lei de HardyWeinberg se aplica estritamente apenas às populações infinitamente grandes Em relação às populações finitas haverá desvios das frequências previstas pela lei de HardyWeinberg em virtude do acaso quando a amostragem do pool gênico produzir a próxima geração Observamos como podemos utilizar a lei de HardyWeinberg e as frequências gênicas na geração atual t0 para calcular as frequências genotípicas na próxima geração t1 por meio da amostragem aleatória do pool gênico para a produção de ovócitos e espermatozoides De modo semelhante as frequências genotípicas previstas em relação à geração t1 podem ser utilizadas por sua vez para calcular as frequências gênicas em relação à próxima geração t2 As frequências gênicas na geração t2 permanecerão as mesmas da geração t1 Sob a lei de Hardy Weinberg nem as frequências gênicas nem as genotípicas mudam de uma geração para a próxima quando uma população infinitamente grande é amostrada aleatoriamente para a formação de ovócitos e espermatozoides Portanto uma lição importante da lei de HardyWeinberg é que em populações grandes a variação genética não é criada nem destruída pelo processo de transmissão de genes de uma geração para a próxima Dizse que as populações que aderem a esse princípio estão em equilíbrio de HardyWeinberg Frequências genotípicas Frequências gênicas Geração AA Aa aa A a t0 064 032 004 08 02 1 2 3 t1 064 032 004 08 02 tn 064 032 004 08 02 Aqui estão mais alguns poucos pontos a respeito da lei de HardyWeinberg Em relação a qualquer alelo que exista em uma frequência muito baixa os indivíduos homozigotos serão observados apenas muito raramente Se o alelo a apresenta uma frequência de 1 em mil q 0001 então apenas 1 em 1 milhão q² de indivíduos será homozigoto em relação àquele alelo Consequentemente os alelos recessivos para distúrbios genéticos podem ocorrer no estado heterozigoto em muito mais indivíduos do que aqueles que de fato expressam o distúrbio genético em questão A lei de HardyWeinberg ainda é aplicável quando existem mais de dois alelos por locus Se existem n alelos A1 A2 An com as frequências p1 p2 pn então a soma de todas as frequências individuais é igual a 10 As frequências de cada um dos genótipos homozigotos são simplesmente o quadrado das frequências dos alelos e as frequências das diferentes classes de heterozigotos são duas vezes o produto das frequências do primeiro e do segundo alelo A Tabela 181 fornece um exemplo com p1 05 p2 03 e p3 02 A lógica de HardyWeinberg também é aplicável aos loci ligados ao X Os homens são hemizigotos em relação aos genes ligados ao X o que significa que um homem apresenta uma única cópia desses genes Portanto em relação 4 aos genes ligados ao X em homens as frequências genotípicas são iguais às frequências alélicas Para as mulheres as frequências genotípicas em relação aos genes ligados ao X seguem as expectativas normais de Hardy Weinberg A calvície masculina padrão é um traço ligado ao X Figura 189 O gene AR em referência a receptor de andrógeno é um gene ligado ao X envolvido no desenvolvimento masculino Existe um haplótipo AR denominado EurH1 que está fortemente associado à calvíciepadrão A calvície masculina padrão é comum na Europa onde o haplótipo EurH1 ocorre a uma frequência de 071 o que significa que 71 dos homens europeus o carregam Com a utilização da lei de HardyWeinberg podemos calcular que 50 das mulheres europeias são homozigotas para o EurH1 e que 41 são heterozigotas A herança da calvície é complexa e é afetada por múltiplos genes Assim nem todos os homens que apresentam o EurH1 se tornam calvos Podese testar se as frequências genotípicas observadas em um locus correspondem às previsões de HardyWeinberg com a utilização do teste de χ² ver Capítulo 3 Um exemplo é fornecido pelo gene do antígeno leucocitário humano HLADQA1 do complexo principal de histocompatibilidade MHC O MHC é um agrupamento de genes no cromossomo 6 que desempenham papéis no sistema imune A Tabela 182 apresenta as frequências genotípicas em relação a um SNP rs9272426 no HLADQA1 para 84 habitantes da Toscana na Itália Esse SNP apresenta os alelos A e G A partir das frequências genotípicas na Tabela 182 podemos calcular as frequências alélicas fA p 053 e fG q 047 Em seguida podemos calcular as frequências genotípicas esperadas sob a lei de HardyWeinberg p² 0281 2pq 0498 e q² 0221 A multiplicação das frequências genotípicas esperadas pelo tamanho da amostra N 84 nos fornece o número esperado de indivíduos para cada genótipo Agora podemos calcular a estatística do χ² como 829 Com a utilização da Tabela 31 observamos que a probabilidade sob a hipótese nula de que os dados observados correspondam às previsões de HardyWeinberg é P 0005 com gl 1 Temos apenas um grau de liberdade tendo em vista que temos três categorias genotípicas e utilizamos dois números a partir dos dados N e p para calcular os valores esperados 3 2 resulta em 1 grau de liberdade Não precisamos utilizar q tendo em vista que q p 1 Essa análise nos conduz à forte suspeita de que os toscanos não estão em conformidade com as expectativas de HardyWeinberg em relação ao HLA DQA1 Observaremos adicionalmente a genética de populações do MHC na Seção 183 sobre os sistemas de acasalamento e na Seção 185 sobre a seleção natural Tabela 181 Frequências genotípicas de HardyWeinberg em relação a um locus com três alelos A1 A2 e A3 com frequências 05 03 e 02 respectivamente Genótipo Expectativa Frequência A1A1 025 A2A2 009 A3A3 004 A1A2 2 p1 p2 030 A1A3 2 p1 p3 020 A2A3 2 p2 p3 012 Soma 100 FIGURA 189 Indivíduo demonstrando calvície masculina padrão uma condição ligada ao cromossomo X B2M ProductionsGetty Images Tabela 182 Frequências de genótipos do SNP rs9272426 no locus HLADQA1 do MHC para pessoas da Toscana na Itália Genótipos AA AG GG Soma Número observado 17 55 12 84 Frequência observada 0202 0655 0143 1 Frequência esperada 0281 0498 0221 1 Número observado 23574 41851 18574 84 183 Observado esperado²esperado 1833 4131 2327 829 Fonte International HapMap Project wwwhapmaporg A lei de HardyWeinberg é parte do fundamento da genética de populações Ela se aplica a uma população idealizada de tamanho infinito e na qual o cruzamento é aleatório Ela também presume que todos os genótipos são igualmente adaptados ou seja que todos eles são igualmente viáveis e que apresentam o mesmo sucesso na reprodução As populações reais se desviam dessa idealizada No restante do capítulo examinaremos como fatores tais como o cruzamento não aleatório o tamanho de população finito e a aptidão desigual de diferentes genótipos causam desvios das expectativas de HardyWeinberg Também veremos como a lei de HardyWeinberg pode ser modificada para compensar esses fatores CONCEITOCHAVE A lei de HardyWeinberg descreve a relação entre as frequências alélicas e genotípicas Essa lei nos informa que a variação genética não é criada nem destruída pelo processo de transmissão de genes de uma geração para a próxima A lei de HardyWeinberg se aplica estritamente a populações infinitamente grandes e de cruzamento aleatório Sistemas de acasalamento O cruzamento aleatório é uma suposição crítica da lei de HardyWeinberg A suposição de cruzamento aleatório é atendida se todos os indivíduos na população apresentam igual probabilidade de representar uma escolha quando um parceiro é escolhido Entretanto se um parente vizinho ou indivíduo fenotipicamente semelhante é um parceiro mais provável do que um indivíduo aleatório então a suposição de cruzamento aleatório foi violada As populações que não têm cruzamento aleatório não exibirão as proporções de HardyWeinberg exatas em relação aos genótipos em alguns dos genes ou todos Três tipos de desvios na escolha do parceiro que violam a suposição de cruzamento aleatório são o cruzamento preferencial o isolamento pela distância e o endocruzamento Cruzamento preferencial Ocorre o cruzamento preferencial se os indivíduos escolhem parceiros com base na semelhança consigo mesmos O cruzamento preferencial positivo ocorre quando tipos semelhantes acasalam por exemplo se indivíduos altos acasalam preferencialmente com outros indivíduos altos e indivíduos baixos acasalam com outros indivíduos baixos Nesses casos os genes que controlam a diferença na altura não seguirão a lei de HardyWeinberg Em vez disso esperaríamos observar um excesso de homozigotos em relação aos alelos altos entre a progênie de pares de cruzamento altos e um excesso de homozigotos em relação aos alelos baixos entre a progênie de pares de cruzamento baixos Em seres humanos ocorre um cruzamento preferencial positivo em relação à altura O cruzamento preferencial negativo ou não preferencial ocorre quando indivíduos diferentes acasalam ou seja quando os opostos se atraem Um exemplo de cruzamento preferencial negativo é fornecido pelo locus da autoincompatibilidade ou S em plantas como Brassica brócolis e seus parentes Existem diversos alelos no locus S S1 S2 S3 e assim por diante O estigma de uma planta não será receptivo ao pólen que carrega qualquer um de seus dois próprios alelos Figura 1810 Por exemplo o estigma de um heterozigoto S1S2 não possibilitará que os grãos de pólen que carregam um alelo S1 ou S2 germinem e fertilizem os seus óvulos embora os grãos de pólen que carregam os alelos S3 ou S4 possam fazer isso Esse mecanismo bloqueia a autofertilização forçando assim a polinização cruzada O locus S viola a lei de HardyWeinberg uma vez que não são formados genótipos homozigotos para S Um segundo exemplo de cruzamento preferencial negativo é fornecido pelo complexo principal de histocompatibilidade MHC que sabidamente influencia a escolha do parceiro em vertebrados O MHC afeta o odor corporal em camundongos e ratos proporcionando uma base para a escolha do parceiro Nos que são conhecidos como os experimentos da camiseta suada pesquisadores solicitaram a um grupo de homens que vestissem camisetas durante 2 dias Em seguida eles solicitaram a um grupo de mulheres que sentissem o odor das camisetas e as classificassem em relação à preferência As mulheres preferiram o odor de homens cujos haplótipos do MHC eram diferentes dos seus próprios Os dados do projeto HapMap humano confirmaram que os casais americanos são significativamente mais heterozigotos quanto ao MHC do que o esperado ao acaso O MHC desempenha um papel central na nossa resposta imune aos patógenos e os heterozigotos podem ser mais resistentes aos patógenos Portanto a nossa descendência se beneficia se acasalamos de modo não preferencial em relação ao nosso genótipo MHC Esse mecanismo pode explicar o motivo de o SNP no gene HLADQA1 de MHC a respeito do qual discutimos anteriormente não seguir a lei de HardyWeinberg entre os residentes da Toscana Observe novamente a Tabela 182 e você notará que existem mais heterozigotos do que o esperado 55 versus 42 Os toscanos aparentam estar praticando o cruzamento não preferencial em relação a esse SNP FIGURA 1810 Cruzamento preferencial negativo causado pelo locus de autoincompatibilidade S do gênero de plantas florescentes Brassica A Um estigma autopolinizado S1S2 demonstra ausência de crescimento do tubo de pólen B Ocorre o crescimento do tubo de pólen para um estigma S1S2 submetido à polinização cruzada com o pólen de um heterozigoto S3S4 June Bowman Nasrallah Isolamento pela distância Outro tipo de desvio na escolha do parceiro tem origem a partir da distância geográfica entre os indivíduos Os indivíduos são mais aptos a acasalarem com um vizinho do que com outro membro da sua espécie do lado oposto do continente ou seja os indivíduos podem demonstrar isolamento pela distância Consequentemente as frequências alélicas e genotípicas com frequência são diferentes entre peixes em lagos separados ou entre pinheiros em diferentes regiões de um continente Dizse que as espécies ou as populações que exibem tal padrão de variação genética demonstram estrutura populacional Uma espécie pode ser dividida em uma série de subpopulações tais como as rãs em diferentes lagoas ou as pessoas em diferentes cidades Se uma espécie apresenta estrutura populacional a proporção de homozigotos será maior na espécie como um todo do que o esperado sob a lei de Hardy Weinberg Considere um exemplo hipotético de uma espécie de girassóis selvagens distribuída por todo o estado do Kansas com um gradiente na frequência do alelo A de 09 perto de Kansas City a 01 perto de Elkhart Figura 1811 A Obtivemos amostras de 100 plantas de girassol de cada uma dessas duas cidades mais 100 de Hutchinson no centro do estado e calculamos as frequências alélicas Cada cidade representa uma subpopulação Em relação a qualquer uma das três cidades a lei de HardyWeinberg funciona bem Por exemplo em Elkhart esperamos que Nq² 100 09² 81 homozigotos aa e isso é o que observamos Entretanto para todo o estado preveríamos que Nq² 300 05² 75 homozigotos aa mas observamos 107 Em virtude da estrutura populacional existem mais plantas de girassol homozigotas do que o esperado Número de indivíduos N AA Aa aa p q Kansas City 100 81 18 1 090 010 Hutchinson 100 25 50 25 050 050 Elkhart 100 1 18 81 010 090 Todo o estado observado 300 107 86 107 050 050 Todo o estado esperado 300 75 150 75 Eis um exemplo real de estrutura populacional de nossa própria espécie Na África o alelo FYnulo do grupo sanguíneo Duffy demonstra um gradiente com uma baixa frequência no leste e no norte da África uma frequência moderada no sul da África e uma alta frequência ao longo da África central Figura 1811 B Esse alelo é raro fora da África Em virtude desse gradiente não podemos utilizar as frequências alélicas globais na África para calcular as frequências genotípicas com a utilização da lei de HardyWeinberg Posteriormente neste capítulo e no Capítulo 20 discutiremos a relação entre o FYnulo e a malária FIGURA 1811 A Variação da frequência alélica em todo o Kansas em relação a uma espécie hipotética de girassol selvagem B Variação da frequência em relação ao alelo FYnulo do locus do grupo sanguíneo Duffy na África Dados de P C Sabeti et al Science 312 2006 16141620 CONCEITOCHAVE O cruzamento preferencial e o isolamento pela distância violam a lei de HardyWeinberg e podem fazer com que as frequências genotípicas desviemse das expectativas de HardyWeinberg Endocruzamento O terceiro tipo de desvio no acasalamento é o endocruzamento ou cruzamento entre parentes Muito antes que qualquer pessoa soubesse a respeito dos alelos recessivos deletérios algumas sociedades reconheciam que distúrbios como mudez surdez e cegueira eram mais comuns entre os filhos de casamentos consanguíneos Por isso os casamentos de irmãos e irmãs e primos em primeiro grau são ilegais ou desencorajados Apesar disso muitos indivíduos famosos se casaram com primos incluindo Charles Darwin Albert Einstein J S Bach Edgar Allan Poe Jesse James e a Rainha Victoria Conforme veremos a descendência dos casamentos consanguíneos tem risco mais alto de apresentar um distúrbio hereditário A progênie de endocruzamento apresenta maior probabilidade de ser homozigota em qualquer locus do que a progênie de cruzamentos não consanguíneos Portanto ela apresenta maior probabilidade de ser homozigota em relação a alelos recessivos deletérios Por esse motivo o endocruzamento pode levar a uma redução no vigor e no sucesso reprodutivo denominada depressão por endocruzamento Entretanto o endocruzamento também apresenta vantagens Em muitas espécies de plantas observase alta incidência de autopolinização e endogamia Essas incluem a plantamodelo Arabidopsis uma erva daninha de sucesso e os cultivos de cereais produtivos de arroz e de trigo Tendo em vista que a maior parte das espécies de plantas contém órgãos masculinos e femininos no mesmo indivíduo a autopolinização pode ser conquistada mais facilmente do que o cruzamento externo Outra vantagem da autopolinização é que quando uma única semente é dispersa em um novo local a planta que cresce a partir da semente apresenta um parceiro pronto ela própria o que possibilita que uma nova população seja estabelecida a partir de uma única semente Finalmente se uma planta individual apresenta uma combinação benéfica de alelos em diferentes loci o endocruzamento então preserva aquela combinação Nas espécies de plantas endogâmicas benefícios como esses oferecem vantagens que superam o custo associado à depressão por endocruzamento Coeficiente de endocruzamento O endocruzamento aumenta o risco de que um indivíduo seja homozigoto em relação a um alelo recessivo deletério e exiba uma doença genética O aumento desse risco depende de dois fatores 1 frequência do alelo deletério na população e 2 grau de endocruzamento Para medir o grau de endocruzamento os geneticistas utilizam o coeficiente de endocruzamento F que é a probabilidade de que dois alelos em um indivíduo remontem à mesma cópia em um ancestral comum Consideraremos primeiramente como calcular F com a utilização de heredogramas e em seguida examinaremos como F pode ser utilizado para determinar o aumento no risco de herdar uma doença recessiva Considere um heredograma simples em relação a um cruzamento entre meios irmãos indivíduos que apresentam um genitor em comum Figura 1812 A Na figura B e C são meiosirmãos que apresentam a mesma mãe A mas pais diferentes B e C têm uma filha I Observe que existe uma alça fechada de I para B e A e de volta para I por C A presença de uma alça fechada no heredograma nos informa que I é resultante de uma união consanguínea As duas cópias do gene em A estão coloridas em azul e corderosa o azul do pai de A e o corderosa de sua mãe Conforme desenhado I herdou a cópia corderosa tanto através de seu pai B quanto de sua mãe C Tendo em vista que as duas cópias do gene de I remontam à mesma cópia em sua avó as suas duas cópias são idênticas por descendência IBD Em termos mais gerais se duas cópias de um gene em um indivíduo remontam à mesma cópia em um ancestral então as cópias são IBD Gostaríamos de ter um modo para calcular a probabilidade de que os dois alelos de I sejam IBD Essa probabilidade é o coeficiente de endocruzamento para I que é na forma de símbolo FI Primeiramente tendo em vista que estamos interessados apenas em traçar o trajeto dos alelos IBD podemos simplificar o heredograma para que ele contenha apenas os indivíduos na alça fechada e ainda seguir a transmissão de quaisquer alelos IBD Figura 1812 B Além disso tendo em vista que o sexo do indivíduo não importa utilizamos círculos para ambos os sexos Os alelos transmitidos a cada cruzamento são rotulados w x y e z Utilizamos para simbolizar IBD Gostaríamos de calcular a probabilidade de que w e x sejam IBD mas faremos esse cálculo passo a passo Primeiramente qual é a probabilidade de que x e y sejam IBD ou simbolicamente qual é Px y Essa é a probabilidade de C transmitir a cópia herdada de A para I que é 12 ou Px y 12 De modo semelhante a probabilidade de B transmitir a cópia herdada de A para I é 12 ou Pw z 12 Agora precisamos calcular a probabilidade de que z e y sejam IBD Existem dois modos por meio dos quais z e y podem ser IBD O primeiro modo é quando z e y são ambos a mesma cópia ambas corderosa ou ambas azuis Isso ocorre em 12 das ocasiões tendo em vista que em 14 das ocasiões elas são ambas azuis e em 14 ambas corderosa O segundo modo é quando z e y são cópias diferentes uma corderosa e a outra azul mas o indivíduo A foi endocruzado Se o indivíduo A é endocruzado existe então uma probabilidade de que as suas duas cópias do gene sejam IBD A probabilidade de que as duas cópias de A sejam IBD é o coeficiente de endocruzamento de A FA A probabilidade de que z e y sejam cópias diferentes uma corderosa a outra azul é de 12 Assim a probabilidade de que z e y sejam cópias diferentes que são IBD é 12 multiplicada pelo coeficiente de endocruzamento FA para fornecer FA Em conjunto a probabilidade de que z e y sejam IBD é a probabilidade de que eles sejam a mesma cópia 12 mais a probabilidade de que eles sejam cópias diferentes que são IBD FA Simbolicamente escrevemos FIGURA 1812 A Heredograma em relação a um cruzamento entre meiosirmãos desenhado no formato padrão As pequenas bolas coloridas representam uma única cópia de um gene No indivíduo A as cópias corderosa e azul representam as cópias do gene que ela herdou de sua mãe e de seu pai respectivamente B Heredograma em relação a um cruzamento entre meiosirmãos desenhado no formato simplificado utilizado para a análise de endocruzamento Apenas as linhas que conectam o genitor à descendência estão desenhadas e apenas os indivíduos na alça de endocruzamento fechada estão incluídos w x y e z são símbolos para o alelo transmitido do genitor para a descendência Pz y FA Px y Pw z e Pz y são probabilidades independentes portanto podemos utilizar a regra do produto e reunir tudo para obter FI Px y Pw z Pz y FA 3 1 FA Na análise de heredogramas consanguíneos podemos substituir o valor de FA na equação anterior se ele for conhecido De outro modo podemos presumir que FA é zero se não houver informação para sugerir que o indivíduo A seja endocruzado No exemplo atual se presumirmos que FA 0 então FI 3 Esse cálculo nos informa que a descendência de cruzamentos entre meiosirmãos será homozigota em relação aos alelos que são IBD em relação a no mínimo 18 de seus genes Ela pode ser superior a 18 se FA for superior a zero Heredogramas de endocruzamentos adicionais e uma fórmula geral para o cálculo de F podem ser encontrados no Quadro 182 Quando existe um endocruzamento em uma população a presunção de cruzamento aleatório de HardyWeinberg será violada Entretanto a lei de Hardy Weinberg pode ser modificada para corrigir as proporções genotípicas previstas em relação a diferentes graus de endocruzamento por meio da utilização de F o coeficiente de endocruzamento médio para a população As frequências de HardyWeinberg modificadas são fAA p2 pqF fAa 2pq 2pqF faa q2 pqF Essas proporções de HardyWeinberg modificadas fazem sentido intuitivamente demonstrando como o endocruzamento reduz a frequência de heterozigotos em 2pqF e adiciona metade dessa quantidade a cada uma das classes homozigotas Com essas equações de HardyWeinberg modificadas você também observará que quando não há endocruzamento F 0 você obtém novamente as frequências genotípicas de HardyWeinberg padrão e quando existe um endocruzamento completo F 1 você obtém fAA p e faa q Em quanto o endocruzamento aumenta o risco de que aquela descendência exiba uma condição de doença recessiva A Tabela 183 demonstra os coeficientes de endocruzamento em relação à descendência e alguns diferentes cruzamentos consanguíneos e o número previsto de homozigotos recessivos em relação a diferentes frequências q do alelo recessivo Quando q 001 existe um aumento de 7 vezes 71910 na descendência homozigota recessiva para cruzamentos entre primos de primeiro grau em comparação aos cruzamentos entre indivíduos não relacionados O aumento no risco aumenta para 13 vezes 336025 quando q 0005 e para 63 vezes 063001 quando q 0001 Em outras palavras o risco aumenta dramaticamente em relação aos alelos raros Cruzamentos entre irmão e irmã e entre genitores e filhos são os mais arriscados quando q 0001 eles demonstram um risco 250 vezes 251001 maior em comparação aos cruzamentos entre indivíduos não relacionados Quadro 182 Cálculo dos coeficientes de endocruzamento a partir de heredogramas No texto vimos que o coeficiente de endocruzamento FI em relação à descendência de um cruzamento entre meiosirmãos é FI 3 1 FA em que FA é o coeficiente de endocruzamento do ancestral Essa expressão inclui o termo 12 elevado à terceira potência ½³ Na Figura 1812 você verá que existem três indivíduos na alça de endocruzamento sem contar I A fórmula geral para computar os coeficientes de endocruzamento a partir de heredogramas é FI n 1 FA em que n é o número de indivíduos na alça de endocruzamento sem contar I Vejamos outro heredograma no qual os avós de I são meiosirmãos Existem cinco indivíduos na alça de endocruzamento além de I assim se presumirmos que o ancestral não foi endocruzado FA 0 então FI 51 FA 003125 Em alguns heredogramas existe mais de uma alça de endocruzamento Aqui está um heredograma no qual I é a descendência de um cruzamento entre irmãos legítimos Em relação aos heredogramas com diversas alças de endocruzamento somase a contribuição em todas as alças em que FA é o coeficiente de endocruzamento do ancestral A da alça em questão Portanto em relação ao heredograma no qual I é a descendência de um cruzamento entre irmãos legítimos obtemos FI 31 FA1 3 1 FA2 presumindo que os coeficientes de endocruzamento em relação a ambos os ancestrais sejam 0 Tabela 183 Número de homozigotos recessivos por 10000 indivíduos em relação a diferentes frequências alélicas q Cruzamento F q 001 q 0005 q 0001 Genitores não relacionados 00 100 025 001 Genitor e filho ou irmão e irmã 14 2575 1269 251 Meios irmãos 18 1338 647 126 Primos de primeiro grau 116 719 336 063 Primos de segundo grau 164 255 103 017 O impacto do endocruzamento sobre a frequência de distúrbios genéticos em populações humanas pode ser observado na Figura 1813 Os filhos de casamentos de primos em primeiro grau demonstram uma frequência duas vezes mais alta de distúrbios em comparação aos filhos de genitores não relacionados Registros históricos sugerem que os riscos do endocruzamento eram compreendidos muito antes da existência da genética Tamanho da população e endocruzamento O tamanho da população é um fator de contribuição importante para o nível de endocruzamento nas populações Em populações pequenas os indivíduos apresentam maior probabilidade de cruzar com um parente do que em populações maiores O fenômeno é observado em pequenas populações humanas tais como a das Ilhas Tristão da Cunha no Atlântico Sul que tem menos de 300 pessoas Vejamos o efeito do tamanho da população sobre o nível geral de endocruzamento em uma população conforme medido por F Considere uma população com Ft sendo o nível de endocruzamento na geração t Para formar um indivíduo na próxima geração t 1 selecionamos o primeiro alelo do pool gênico Suponha que o tamanho da população é N Após a seleção do primeiro alelo a probabilidade de que o segundo alelo que coletamos seja exatamente a mesma cópia é 12N e o coeficiente de endocruzamento em relação a esse indivíduo é 10 A probabilidade de que o segundo alelo que coletamos seja uma cópia diferente do primeiro alelo é 1 12N e o nível de endocruzamento em relação ao indivíduo resultante seria Ft o coeficiente de endocruzamento médio em relação à população inicial na geração t O nível de endocruzamento na próxima geração é a soma desses dois desfechos possíveis ou FIGURA 1813 A frequência de distúrbios genéticos entre filhos de genitores não relacionados colunas azuis em comparação àquela de filhos de genitores que são primos de primeiro grau colunas vermelhas Dados de C Stern Principles of Human Genetics W H Freeman 1973 Essa equação nos informa que a F aumentará ao longo do tempo como uma função do tamanho da população Quando N é grande F aumenta lentamente ao longo do tempo Quando N é pequeno F aumenta rapidamente ao longo do tempo Por exemplo suponha que Ft na população inicial seja 01 e N 10000 Em seguida Ft1 seria 010005 um valor apenas ligeiramente mais alto Entretanto se N 10 então Ft1 seria 0145 um valor muito mais alto Também podemos utilizar essa equação recursivamente para calcular Ft2 por meio da utilização de Ft1 em vez de Ft do lado direito O resultado com N 10 e Ft 01 será Ft2 0188 Os efeitos do tamanho da população sobre o endocruzamento em populações são adicionalmente explorados no Quadro 183 Uma consequência do aumento de endocruzamento é que os indivíduos em populações pequenas apresentam maior probabilidade de ser homozigotos em relação a alelos deletérios assim como a descendência de casamentos entre primos em primeiro grau apresenta maior probabilidade de ser homozigota em relação a tais alelos Esse efeito é observado em grupos étnicos que vivem em pequenas comunidades isoladas em termos reprodutivos Por exemplo um tipo de nanismo no qual os indivíduos afetados apresentam seis dedos ocorre com uma frequência superior a 1 em 200 em uma população de aproximadamente 13000 Amish no Condado de Lancaster na Pensilvânia embora sua frequência na população norteamericana em geral seja de apenas 1 em 60000 Quadro 183 Endocruzamento em populações finitas No texto principal derivamos a fórmula em relação ao aumento no endocruzamento entre gerações em populações finitas como que pode ser reescrita como Também apresentamos a fórmula em relação à frequência de heterozigotos H com endocruzamento como H fAa 2pq 2pqF que pode ser reescrita como 1 F H2pq Combinando essas duas equações obtemos e em seguida Portanto em relação a cada geração o nível de heterozigosidade é reduzido pela fração 1 12N A redução em H ao longo de t gerações é e a alteração em F ao longo das gerações t é fornecida por Conforme demonstrado na figura a seguir o endocruzamento aumentará com o tempo em uma população finita até mesmo quando não houver endocruzamento na população inicial Aumento no endocruzamento F ao longo do tempo em relação a diversos tamanhos de populações diferentes 184 CONCEITOCHAVE O endocruzamento aumenta a frequência de homozigotos em uma população e pode resultar em uma frequência mais alta de distúrbios genéticos recessivos O coeficiente de endocruzamento F é a probabilidade de que dois alelos em um indivíduo remontem à mesma cópia em um ancestral comum Variação genética e sua medida Para estudar a quantidade e a distribuição da variação genética em populações precisamos de alguns modos para quantificar a variação Para descrever como podemos quantificar a variação utilizaremos dados em relação ao gene da glicose6fosfato desidrogenase G6PD de seres humanos O G6PD é um gene ligado ao X que codifica uma enzima que catalisa uma etapa na glicólise O alelo do tipo selvagem B de G6PD apresenta atividade enzimática total Um segundo alelo denominado A leva à atividade enzimática fortemente reduzida e os indivíduos que carregam esse alelo desenvolvem anemia hemolítica Entretanto esse alelo também confere uma redução de 50 no risco de malária grave nos portadores Em regiões da África nas quais a malária é endêmica o alelo A alcança frequências próximas de 20 embora esse alelo esteja ausente ou seja raro em outros locais Outro alelo A leva a uma atividade enzimática apenas modestamente reduzida Contrariamente aos indivíduos que carregam o alelo A os indivíduos que carregam apenas os alelos A ou B não desenvolvem anemia hemolítica A Figura 1814 demonstra os SNP em 18 sítios polimórficos que foram identificados por meio do sequenciamento de um segmento de 5102 pb do G6PD a partir de uma amostra mundial de 47 homens Os 5084 sítios remanescentes eram fixado ou invariantes existe apenas um único alelo nucleotídio na amostra inteira em relação a cada um desses sítios Ao fazer amostragem apenas com homens observamos apenas um alelo e um haplótipo para cada indivíduo tendo em vista que o gene é ligado ao X O alelo A difere de B pela substituição de um único aminoácido ácido aspártico em lugar de asparagina no SNP3 na Figura 1814 O alelo A difere do alelo B em dois aminoácidos ele contém ambas a substituição do ácido aspártico em lugar da asparagina observada no alelo A e uma diferença em um segundo aminoácido metionina em lugar de valina no SNP2 Como podemos quantificar a variação no locus G6PD Uma medida simples é o número de sítios segregantes S ou polimórficos Em relação aos dados de G6PD S é 18 na amostra total 14 na amostra africana e 7 na amostra não africana Os africanos contêm o dobro do número de sítios segregantes apesar do fato de nossa amostra apresentar menos africanos Outra medida simples é o número de haplótipos NH O valor da NH é 12 na amostra total 9 na amostra africana e 6 na amostra não africana Novamente a amostra africana apresenta maior variação Uma falha de medidas tais como S e NH é que os valores que observamos dependem fortemente do tamanho da amostra Se temos amostras com mais indivíduos então os valores de S e NH tendem a aumentar Por exemplo nossa amostra apresenta 16 africanos em comparação a 31 não africanos Embora S tenha o dobro do tamanho em africanos do que em não africanos a diferença provavelmente seria ainda maior se apresentássemos um número igual 31 de africanos e não africanos Em lugar de S e NH podemos calcular as frequências alélicas que não são influenciadas por diferenças no tamanho da amostra Em relação aos dados de G6PD B A e A apresentam frequências mundiais de 083 013 e 004 respectivamente Entretanto você observará que A apresenta uma frequência de 00 fora da África e de 038 em nossa amostra africana que é uma diferença substancial Podemos utilizar os dados da frequência alélica para calcular uma estatística denominada diversidade gênica GD que é a probabilidade de que dois alelos coletados aleatoriamente do pool gênico sejam diferentes A probabilidade de coleta de dois alelos diferentes é igual a 1 menos a probabilidade de coleta de duas cópias do mesmo alelo somada a todos os alelos do locus Portanto em que pi é a frequência do iésimo alelo e Σ é o sinal de somatório indicando que adicionamos os quadrados de todos os n valores observados de p para i 1 2 até o nésimo alelo O valor de GD pode variar de 0 a 1 Ele se aproximará de 1 quando houver um grande número de alelos de frequências aproximadamente iguais Será 0 quando houver um único alelo e estará próximo de 0 sempre que houver um único alelo muito comum com uma frequência de 099 ou superior A Tabela 184 demonstra que a diversidade gênica é razoavelmente alta em africanos 047 Tendo em vista que os não africanos apresentam apenas o alelo B a diversidade gênica é 00 O valor de GD é igual à proporção esperada de heterozigotos sob o equilíbrio de HardyWeinberg heterozigosidade H Entretanto H como um conceito é aplicável apenas aos diploides e não se aplicaria aos loci ligados ao X em indivíduos do sexo masculino Portanto conceitualmente a diversidade gênica GD é mais apropriada até mesmo se for matematicamente a mesma quantidade de H para populações de diploides sob o equilíbrio de HardyWeinberg A diversidade gênica pode ser calculada em relação a um sítio de nucleotídio único Ela pode ser calculada para todos os sítios de nucleotídios em um gene caso em que é denominada diversidade nucleotídica Tendo em vista que a maioria dos nucleotídios em quaisquer duas cópias de um gene de uma espécie é tipicamente a mesma os valores para a diversidade nucleotídica em relação aos genes são tipicamente muito pequenos Em relação à G6PD existem apenas 18 sítios de nucleotídios polimórficos mas 5084 sítios invariantes A diversidade nucleotídica média para toda a sequência do gene G6PD é de 00008 em africanos 00002 em não africanos e 00006 na amostra total Esses valores nos informam que os africanos apresentam quatro vezes mais diversidade nucleotídica em G6PD do que os não africanos Tabela 184 Dados de diversidade em relação à glicose6fosfato desidrogenase G6PD em seres humanos Amostra total Africanos Não africanos Tamanho da amostra 47 16 31 Número de sítios segregantes 18 14 7 Número de haplótipos 12 9 6 Diversidade gênica GD no SNP2 022 047 000 Diversidade de nucleotídios 00006 00008 00002 FIGURA 1814 Variação de nucleotídios de 5102 pb do gene G6PD em relação a uma amostra mundial de 47 homens Apenas os 18 sítios variáveis estão demonstrados A classe alélica funcional A A ou B está demonstrada em relação a cada sequência O SNP2 é um SNP não sinônimo que causa uma substituição de valina para metionina que é causa das diferenças na atividade enzimática associada ao alelo A O SNP3 é um SNP não sinônimo que causa substituição do aminoácido ácido aspártico por asparagina Dados de M A Saunders et al Genetics 162 2002 18491861 A Figura 1815 demonstra o nível de diversidade nucleotídica em diversos organismos Os eucariotos unicelulares são os mais diversos seguidos pelas plantas e em seguida pelos invertebrados Os vertebrados são o grupo menos diverso entretanto a maior parte dos vertebrados ainda apresenta muita diversidade nucleotídica Em relação aos seres humanos a diversidade nucleotídica é de aproximadamente 0001 o que significa que dois cromossomos humanos escolhidos aleatoriamente diferirão em aproximadamente 1 pb por mil Com 3 bilhões de pb em nosso genoma isso soma um total de aproximadamente 3 milhões de diferenças entre o conjunto de cromossomos herdado da mãe de uma pessoa e o conjunto herdado do pai de uma pessoa para os indivíduos não consanguíneos CONCEITOCHAVE As populações biológicas com frequência são ricas em variação genética Essa diversidade pode ser quantificada por meio de diferentes estatísticas para comparar os níveis de variação entre as populações e as espécies 185 FIGURA 1815 Níveis de diversidade nucleotídica em sítios sinônimos e silenciosos em alguns organismos diferentes 1 Mus musculus 2 Homo sapiens 3 Oryza sativa 4 Plasmodium falciparum 5 Fugu rubripes 6 Strongylocentrotus purpuratus 7 Anopheles gambiae 8 Ciona intestinalis 9 Arabidopsis thaliana 10 Caenorhabditis elegans 11 Zea mays 12 Encephalitozoon cuniculi 13 Drosophila melanogaster 14 Leishmania major 15 espécies de Trypanosoma 16 Toxoplasma gondii 17 Giardia lamblia 18 Neurospora crassa 19 Dictyostelium discoideum 20 Saccharomyces cerevisiae 21 Cryptosporidium parvum 22 Cryptococcus neoformans Dados de M Lynch e J S Conery Science 302 2003 14011404 Modulação da variação genética Quais são as forças que modulam a quantidade de variação genética em uma população Como os novos alelos entram no pool gênico Quais forças removem alelos do pool gênico Como as variantes genéticas podem ser recombinadas para criar novas combinações de alelos As respostas a essas questões são o cerne da compreensão do processo da evolução Nesta seção examinaremos os papéis da mutação da migração da recombinação da deriva genética acaso e da seleção na formação da composição genética das populações Novos alelos na população Mutação e migração A mutação é a fonte definitiva de toda a variação genética No Capítulo 16 discutimos os mecanismos moleculares que são a base das mutações em pequena escala tais como mutações de ponto indels e alterações no número de unidades de repetição em microssatélites Os geneticistas de populações estão particularmente interessados na taxa de mutação que é a probabilidade de que uma cópia de um alelo seja alterada para alguma outra forma alélica em uma geração A taxa de mutação é tipicamente simbolizada pela letra grega μ Conforme veremos a seguir se soubermos a taxa de mutação e o número de diferenças nucleotídicas entre duas sequências então poderemos estimar há quanto tempo as duas sequências divergiram Como os geneticistas conseguem estimar a taxa de mutação Os geneticistas podem estimar as taxas de mutação iniciando com um único indivíduo homozigoto e seguindo o heredograma de seus descendentes durante diversas gerações Então eles podem comparar a sequência de DNA do indivíduo fundador com as sequências de DNA dos descendentes diversas gerações depois e registrar quaisquer novas mutações que tenham ocorrido O número de mutações observadas por genoma por geração fornece uma estimativa da taxa Tendo em vista que estamos procurando eventos um tanto quanto raros é necessário sequenciar bilhões de nucleotídios para encontrar apenas algumas mutações de SNP Em 2009 a taxa de mutação de SNP em relação a uma parte do cromossomo Y humano foi estimada por meio dessa abordagem como sendo de 30 108 mutaçõesnucleotídiogeração ou aproximadamente uma mutação a cada 30 milhões de pb Se extrapolarmos para o genoma humano inteiro 3 bilhões de pb cada um de nós herdou então 100 novas mutações de cada um de nossos genitores Felizmente a maioria das mutações não é prejudicial tendo em vista que elas ocorrem em regiões do genoma que não são críticas A Tabela 185 lista as taxas de mutação em relação a SNP e microssatélites em diversos organismosmodelo A taxa de mutação de SNP é diversas ordens de magnitude mais baixa do que a taxa de microssatélites A sua mais alta taxa de mutação e a maior variação tornam os microssatélites particularmente úteis na genética de populações e na ciência forense do DNA A taxa de mutação de SNP por geração aparenta ser mais baixa em relação a organismos unicelulares do que em relação a organismos multicelulares Essa diferença pode ser explicada no mínimo parcialmente pelo número de divisões celulares por geração Existem aproximadamente 200 divisões celulares desde o zigoto até o gameta em seres humanos mas apenas uma em E coli Se a taxa humana for dividida por 200 então a taxa por divisão celular em seres humanos está notavelmente próxima da taxa em E coli Tabela 185 Taxas de mutação aproximadas por geração por genoma haploide Organismo Mutações de SNP por pb Microssatélite Arabidopsis 7 109 9 104 Milho 3 108 8 104 E coli 5 1010 Levedura 5 1010 4 105 C elegans 3 109 4 103 Drosophila 4 109 9 106 Camundongo 4 109 3 104 Ser humano 3 108 6 104 Nota a taxa de microssatélites é em relação a repetições de dinucleotídios ou trinucleotídios Fonte dados de diversos estudos publicados Além da mutação o único outro meio para a entrada de nova variação em uma população é por meio de migração ou fluxo gênico a movimentação de indivíduos ou gametas entre as populações A maior parte das espécies é dividida em um conjunto de pequenas populações ou subpopulações locais As barreiras físicas tais como oceanos rios ou montanhas podem reduzir o fluxo gênico entre as subpopulações mas com frequência ocorre algum grau de fluxo gênico apesar de tais barreiras Dentro das subpopulações um indivíduo pode ter uma chance de acasalar com qualquer outro membro do sexo oposto entretanto os indivíduos de diferentes subpopulações não podem acasalar exceto se houver migração As subpopulações isoladas tendem a divergir na medida em que cada uma acumula as suas próprias mutações únicas O fluxo gênico limita a divergência genética entre as subpopulações Uma das consequências genéticas da migração é a mistura genética a mistura de genes que resulta quando os indivíduos apresentam antepassados de mais de uma subpopulação Esse fenômeno é comum em populações humanas Ele é prontamente observado na África do Sul para onde migrantes de todo o mundo foram levados Conforme demonstrado na Figura 1816 os genomas dos sulafricanos de ancestralidade mista são complexos e incluem partes da população indígena da África Austral mais contribuições de migrantes da África Ocidental da Europa da Índia da Ásia Oriental e de outras regiões CONCEITOCHAVE A mutação é a fonte definitiva de toda a variação genética A migração pode adicionar variação genética a uma população por meio do fluxo gênico de outra população da mesma espécie FIGURA 1816 Representação gráfica da mistura genética em 39 pessoas de ancestralidade mista da África do Sul Cada coluna representa o genoma de uma pessoa e as cores representam as partes de seu genoma com contribuição por parte de seus ancestrais que vieram de muitas regiões do mundo A figura tem por base a análise genética de populações de mais de 800 microssatélites e 500 indels que foram classificados em quase 4000 pessoas de todo o mundo incluindo as 39 de ancestralidade mista da África do Sul Dados de S A Tishkoff et al Science 324 2009 10351044 Recombinação e desequilíbrio de ligação A recombinação é uma força crítica que molda os padrões da variação genética nas populações Nesse caso não existe ganho ou perda de alelos em vez disso a recombinação cria novos haplótipos Vejamos como isso funciona Considere os loci A e B ligados Pode haver uma população na qual apenas dois haplótipos são observados na geração t0 AB e ab Suponha que um indivíduo nessa população é heterozigoto em relação a esses dois haplótipos Se ocorrer um crossing over nesse indivíduo então gametas com dois novos haplótipos Ab e aB podem ser formados e entrar na população na geração t1 Portanto a recombinação pode criar a variação que adota a forma de novos haplótipos Os novos haplótipos podem apresentar propriedades únicas que alterem a função proteica Por exemplo suponha que um aminoácido variante em uma proteína em um haplótipo aumente a atividade enzimática da proteína em duas vezes e que um segundo aminoácido variante em outro haplótipo também aumente a atividade em duas vezes Um evento de recombinação que combine essas duas variantes produziria uma proteína com uma atividade quatro vezes mais alta Agora consideraremos as frequências observadas e esperadas dos quatro possíveis haplótipos em relação a dois loci cada um com dois alelos Os loci ligados A e B apresentam os alelos A e a e B e b com as frequências pA pa pB e pb respectivamente Os quatro haplótipos possíveis são AB Ab aB e ab com as frequências observadas PAB PAb PaB e Pab A qual frequência esperamos observar cada um desses quatro haplótipos Se houver uma relação aleatória entre os alelos nos dois loci então a frequência de qualquer haplótipo será o produto das frequências dos dois alelos que compõem aquele haplótipo PAB pA pB PAb pA pb PaB pa pB Pab pa pb Por exemplo suponha que a frequência de cada um dos alelos é de 05 ou seja pA pa pB pb 05 Quando obtemos uma amostra do pool gênico a probabilidade de coleta de um cromossomo com um alelo A é de 05 Se a relação entre os alelos no locus A e os alelos no locus B for aleatória então a probabilidade de que o cromossomo selecionado apresente o alelo B também é de 05 Portanto a probabilidade de coletarmos um cromossomo com o haplótipo AB é PAB pA pB 05 05 025 Se a associação entre os alelos em dois loci for aleatória conforme descrito há pouco dizse então que os dois loci estão em equilíbrio de ligação Nesse caso as frequências observadas e esperadas serão as mesmas A Figura 1817 A diagrama um caso de dois loci em equilíbrio de ligação Se a associação entre os alelos em dois loci for não aleatória dizse então que os loci estão em desequilíbrio de ligação LD Nesse caso um alelo específico no primeiro locus está associado a um alelo específico no segundo locus mais frequentemente do que o esperado ao acaso A Figura 1817 B diagrama um caso de LD completo entre dois loci O alelo A sempre está associado ao alelo B enquanto o alelo a sempre está associado ao alelo b Não existem cromossomos com haplótipos Ab ou aB Nesse caso as frequências observadas e esperadas não serão as mesmas Podemos quantificar o nível de LD entre dois loci como a diferença D entre a frequência observada de um haplótipo e a frequência esperada em relação a uma associação aleatória entre alelos nos dois loci Se ambos os loci envolvidos apresentarem apenas dois alelos então D PAB pApB FIGURA 1817 A Equilíbrio de ligação B Desequilíbrio de ligação em relação a dois loci A e B Na Figura 1817 A D 0 tendo em vista que não há LD e na Figura 1817 B D 025 que é superior a 0 indicando a presença de LD Como o LD surge Sempre que ocorre uma nova mutação em um locus a mutação aparece em um único cromossomo específico e assim ela é instantaneamente ligada ou associada a alelos específicos em qualquer loci vizinho naquele cromossomo Considere uma população na qual existem apenas dois haplótipos AB e Ab Se uma nova mutação a surgir no locus A em um cromossomo que já possui o alelo b no locus B então um novo haplótipo ab será formado Ao longo do tempo esse novo haplótipo ab pode aumentar em frequência na população Outros cromossomos na população possuiriam os haplótipos AB ou Ab nesses dois loci mas nenhum cromossomo possuiria aB Portanto os loci estariam em LD A migração também pode causar LD quando uma subpopulação apresenta apenas o haplótipo AB e outra apenas o haplótipo ab Quaisquer migrantes entre as subpopulações dariam origem a LD na subpopulação que recebe os migrantes O LD entre dois loci declinará ao longo do tempo na medida em que os crossovers entre eles tornarem aleatória a relação entre os seus alelos A taxa de declínio no LD depende da taxa na qual o crossing over ocorre A frequência de recombinantes FR entre os dois loci nos gametas que formam a próxima geração ver Capítulo 4 fornece uma estimativa da taxa de recombinação a qual na genética de populações é simbolizada pela letra minúscula r Se D0 é o valor do desequilíbrio de ligação entre dois loci na geração atual então o valor na próxima geração D1 é fornecido por esta equação D1 D01 r Em outras palavras o desequilíbrio de ligação conforme medido por D declina a uma taxa de 1 r por geração Quando r é pequena D declina lentamente ao longo do tempo Quando r está no seu máximo 05 então D declina em 12 a cada geração Tendo em vista que o LD decai como uma função do tempo e da fração de recombinação geneticistas de populações podem utilizar o nível de LD entre uma mutação e os loci que a circundam para estimar o tempo em gerações desde que a mutação surgiu pela primeira vez na população Mutações mais antigas apresentam pouco LD com os loci vizinhos enquanto mutações recentes demonstram um alto nível de LD com os loci vizinhos Se você observar novamente a Figura 1814 você verá que existe um LD considerável entre SNP2 no G6PD e os SNP vizinhos SNP2 codifica a substituição do aminoácido valina por metionina no alelo A que confere resistência à malária Geneticistas de populações utilizaram o LD na G6PD para estimar que o alelo A surgiu há aproximadamente 10000 anos Não se acreditava que a malária fosse prevalente na África até então Portanto o A surgiu por meio de uma mutação aleatória mas foi mantido na população em virtude de proporcionar a proteção contra a malária CONCEITOCHAVE O desequilíbrio de ligação decorre do fato de que novas mutações surgem em um único haplótipo O desequilíbrio de ligação decairá ao longo do tempo em virtude da recombinação Deriva genética e tamanho da população A lei de HardyWeinberg nos informa que as frequências alélicas permanecem as mesmas de uma geração até a próxima em uma população infinitamente grande Entretanto as reais populações de organismos na natureza são finitas não infinitas Em populações finitas as frequências alélicas podem ser alteradas de uma geração para a próxima como resultado do acaso erro de amostragem quando os gametas são retirados do pool gênico para formar a próxima geração A alteração nas frequências alélicas entre as gerações em virtude de erro de amostragem é denominada deriva genética aleatória ou apenas deriva abreviadamente Consideraremos um caso simples porém extremo uma população composta por um único indivíduo N 1 heterozigoto Aa na geração t0 Possibilitaremos a autofertilização Nesse caso o pool gênico pode ser descrito como apresentando dois alelos A e a cada um presente a uma frequência de p q 05 O tamanho da população permanece o mesmo N 1 na geração subsequente t1 Qual é a probabilidade de que as frequências alélicas sejam alteradas derivem para p 1 e q 0 na geração t1 Em outras palavras qual é a probabilidade de que a população se torne fixada em relação ao alelo A de modo que ela seja composta por um único indivíduo homozigoto AA Tendo em vista que N 1 precisamos coletar apenas dois gametas do pool gênico para formar um único indivíduo A probabilidade de coleta de dois A é p² 05² 025 Portanto em 25 das ocasiões essa população derivará para longe das frequências alélicas originais e se tornará fixada em relação ao alelo A após apenas uma geração O que ocorre se aumentarmos o tamanho da população para N 2 e o pool gênico inicial ainda apresentar p q 05 As frequências alélicas serão alteradas para p 1 e q 0 na próxima geração apenas se a população for composta por dois indivíduos AA Para que isso ocorra precisamos coletar quatro alelos A cada um com uma probabilidade de p 05 assim a probabilidade de que próxima geração apresente p 1 e q 00 é p4 054 00625 ou apenas pouco mais de 6 Portanto uma população com N 2 apresenta menos propensão à deriva para a fixação do alelo A do que uma população com N 1 Em termos mais gerais a probabilidade de que uma população sofra deriva para a fixação do alelo A em uma única geração é p2N e portanto essa probabilidade se torna progressivamente menor na medida em que o tamanho da população N se torna maior A deriva é uma força mais fraca em populações grandes Deriva significa qualquer alteração nas frequências alélicas em virtude de erro de amostragem não apenas a perda ou a fixação de um alelo Em uma população de N 500 com dois alelos a uma frequência de p q 05 existem 500 cópias de A e 500 cópias de a Se a próxima geração apresentar 501 cópias de A p 0501 e 499 cópias de a q 0499 terá ocorrido deriva genética embora seja um nível de deriva muito modesto Uma fórmula geral para o cálculo da probabilidade de observação de um número específico de cópias de um alelo na próxima geração tendo em vista as frequências na geração atual é apresentada no Quadro 184 Quando a deriva está operando em uma população finita podemos calcular a probabilidade de diferentes desfechos mas não podemos prever com precisão o desfecho específico que ocorrerá O processo é como o de jogar dados Em qualquer locus a deriva pode continuar de uma geração até a próxima até que um alelo tenha sido fixado Além disso em uma população em particular a frequência do alelo A pode aumentar da geração t0 para a t1 mas em seguida diminuir da geração t1 até a t2 A deriva não prossegue em um sentido específico em direção à perda ou à fixação de um alelo As Figuras 1818 A e 1818 B demonstram estudos aleatórios simulados por computador jogadas de dados em relação a seis populações de tamanho N 10 e N 500 Cada população inicia com a apresentação de dois alelos a uma frequência de p q 05 e em seguida os estudos aleatórios prosseguem durante 30 gerações Primeiramente observe a aleatoriedade do processo de uma geração até a próxima Por exemplo a frequência de A na população ilustrada pela linha amarela na Figura 1818 A oscila para cima e para baixo de uma geração até a próxima alcançando uma baixa de p 016 na t16 mas que em seguida retorna para p 075 na t30 Em segundo lugar seja N 10 ou N 500 observe que duas populações não apresentam exatamente a mesma trajetória A deriva é um processo aleatório e provavelmente não observaremos exatamente o mesmo desfecho com populações diferentes ao longo de muitas gerações exceto quando N é muito pequeno Em terceiro lugar observe que quando N 10 as populações se tornaram fixadas seja p 1 ou p 0 antes da geração 20 em cinco dos seis estudos Entretanto quando N 500 as populações retiveram ambos os alelos em todos os seis estudos até mesmo depois de 30 gerações Quadro 184 A frequência alélica é alterada sob a deriva Considere uma população de N indivíduos diploides segregando para dois alelos A e a no locus A com frequências p e q respectivamente A população é de cruzamento aleatório e o tamanho da população permanece o mesmo N em cada geração Quando se obtém uma amostra do pool gênico para criar a próxima geração o número exato de cópias do alelo A que são retiradas não pode ser previsto estritamente em virtude de erro de amostragem Entretanto a probabilidade de que um número específico de cópias de A seja retirado pode ser calculada com a utilização da fórmula binomial Deixe que k seja o número específico de cópias do alelo A A probabilidade de coleta de k cópias é Se estabelecermos N 10 e p q 05 então a probabilidade de coleta de 10 cópias do alelo A é Portanto em apenas 176 das ocasiões a próxima geração apresentará a mesma frequência de A e a da geração original Podemos utilizar essa fórmula para calcular os desfechos em relação a todos os valores possíveis de k e obter uma distribuição de probabilidade demonstrada na figura a seguir Distribuição de probabilidade demonstrando a probabilidade de que números diferentes de A estarão presentes após uma geração O desfecho único mais provável é a ausência de deriva com k 10 e uma probabilidade de 0176 Entretanto todos os outros desfechos envolvem alguma deriva e assim a probabilidade de que a população apresente alguma deriva é de 0824 Além do tamanho da população o destino de um alelo é determinado por sua frequência na população Especificamente a probabilidade de que um alelo sofra deriva para fixação em uma geração futura é igual à sua frequência na geração atual Um alelo que está a uma frequência de 05 apresenta uma chance de 5050 de fixação ou perda da população em uma geração futura Você pode observar o efeito da frequência alélica sobre o destino de um alelo na Figura 1818 C Em relação a dez populações com uma frequência inicial de p 01 oito populações apresentaram a perda do alelo A uma a sua fixação e uma população reteve ambos os alelos após 30 gerações Isso está muito próximo da expectativa de que A chegue à fixação em 10 das ocasiões quando p 01 O fato de a frequência de um alelo ser igual à sua probabilidade de fixação significa que a maior parte das mutações surgidas recentemente será finalmente perdida em uma população em virtude da deriva A frequência inicial de uma nova mutação no pool gênico é Se N for até mesmo modestamente grande tal como 10000 a probabilidade de que uma nova mutação finalmente alcance a fixação é então extremamente pequena 12N 120000 5 105 A probabilidade de que uma nova mutação finalmente seja perdida da população é que está próxima de 10 em grandes populações Ela é de 099995 em uma população de 10000 A Figura 1819 A demonstra uma representação gráfica do destino de novas mutações em uma população O eixo x representa o tempo e o eixo y o número de cópias de um alelo As linhas pretas demonstram o destino da maior parte das novas mutações Elas aparecem e logo em seguida são perdidas da população As linhas coloridas demonstram as poucas novas mutações de sorte que se fixaram A partir da teoria da genética de populações podese demonstrar que o tempo médio necessário para que uma mutação tenha a sorte de ser fixada é de 4N gerações A Figura 1819 B demonstra uma população que tem 12 do tamanho da população na Figura 1819 A Portanto 4N gerações correspondem a 12 do tempo e as novas mutações de sorte são fixadas mais rapidamente Uma consequência importante da deriva é que alelos levemente deletérios podem ser fixados ou alelos vantajosos podem ser perdidos por meio desse processo aleatório Considere um novo alelo que surge em uma população e que proporciona ao indivíduo que o carrega ter um sistema imune mais forte Esse indivíduo pode transmitir o alelo vantajoso para a sua descendência mas a descendência pode morrer antes da reprodução em virtude de um evento aleatório tal como o fato de ser atingida por raios Ou se o indivíduo que carrega o alelo favorável for heterozigoto ele pode transmitir apenas o alelo menos favorável para a sua descendência ao acaso FIGURA 1818 Simulações em computador de deriva genética aleatória Cada linha colorida representa uma população simulada ao longo de 30 gerações A N 10 p q 05 B N 500 p q 05 C N 10 p q 09 Ao calcular as probabilidades de diferentes desfechos sob deriva genética estamos presumindo que os alelos A e a não conferem diferenças na viabilidade ou no sucesso reprodutivo aos indivíduos que os carregam Presumimos que indivíduos AA Aa e aa apresentam probabilidade igual de sobreviver e se reproduzir Nesse caso A e a seriam denominados alelos neutros ou variantes um em relação ao outro A alteração nas frequências de alelos neutros ao longo do tempo em virtude da deriva é denominada evolução neutra O processo de evolução neutra é o fundamento do relógio molecular a taxa constante de substituição de variantes alélicas de surgimento recente em relação às preexistentes durante longos períodos Quadro 185 A evolução neutra é distinta da evolução darwiniana na qual os alelos favoráveis aumentam em frequência em virtude de os indivíduos que os carregam deixarem mais descendentes Discutiremos sobre a evolução darwiniana na próxima seção deste capítulo e no Capítulo 20 FIGURA 1819 A Representação gráfica do aparecimento da perda e da incorporação final de novas mutações em uma população ao longo do tempo sob a ação da deriva genética As linhas de cor cinza demonstram o destino da maior parte das novas mutações as quais aparecem e em seguida são perdidas da população em algumas poucas gerações As linhas coloridas demonstram o destino das poucas mutações de sorte que continuam a aumentar em frequência até alcançarem a fixação B Uma população que tem 12 do tamanho da população na parte A Nessa população 4N gerações correspondem a 12 do tempo e as novas mutações de sorte são fixadas mais rapidamente Até agora temos considerado a deriva no contexto de populações que permanecem do mesmo tamanho de uma geração para a próxima Na realidade as populações com frequência contraem ou expandem em tamanho ao longo do tempo Por exemplo uma nova população de tamanho muito menor pode ser formada subitamente quando um número relativamente pequeno de membros de uma população migra para um novo local e estabelece uma nova população Os migrantes ou fundadores da nova população podem não carregar todos os alelos presentes na população original ou podem carregar os mesmos alelos porém em frequências diferentes A deriva genética causada pela amostragem aleatória da população original para criar a nova população é conhecida como efeito fundador Um dos muitos eventos fundadores na história humana ocorreu quando pessoas cruzaram a ponte terrestre de Bering da Ásia até as Américas durante a era do gelo há aproximadamente 15000 a 30000 anos Como resultado a diversidade genética entre nativos americanos é mais baixa do que entre pessoas em outras regiões do mundo Figura 1820 O tamanho da população também pode ser alterado em um único local Um período de uma ou diversas gerações consecutivas de contração no tamanho da população é conhecido como um gargalo populacional Os gargalos ocorrem em populações naturais em virtude de flutuações ambientais tais como uma redução no suprimento alimentar ou um aumento na predação O lobocinzento o bisão americano a águiadecabeçabranca o condordacalifórnia o grouamericano e muitas espécies de baleias são alguns exemplos familiares de espécies que sofreram gargalos recentes em virtude da caça pelos seres humanos ou da invasão do seu habitat por parte dos seres humanos A redução no tamanho da população durante um gargalo aumenta o nível de deriva em uma população Conforme explicado anteriormente no capítulo o nível de endocruzamento em populações também depende do tamanho da população Portanto os gargalos também causam um aumento no nível de endocruzamento O condordacalifórnia representa um exemplo extraordinário de um gargalo Essa espécie chegou a habitar uma ampla área mas na década de 1980 ela declinou até uma população reprodutiva de apenas 14 aves em cativeiro A população atualmente é superior a 400 indivíduos mas a heterozigosidade média no genoma diminuiu em 8 durante o gargalo inicial Além disso um alelo recessivo deletério em relação a um tipo letal de nanismo ocorre a uma frequência de aproximadamente 9 entre os animais sobreviventes presumivelmente como um resultado da deriva a partir de uma frequência mais baixa na população prégargalo Para tratar desses problemas biólogos de conservação estabelecem cruzamentos de animais em cativeiro para minimizar o endocruzamento adicional e remover os alelos deletérios da população Quadro 185 Relógio molecular Visto que as espécies divergem ao longo do tempo suas sequências de DNA se tornam cada vez mais diferentes na medida em que mutações surgem e são fixadas na população A qual taxa as sequências divergem Para responder a essa questão considere uma população na geração t0 O número de mutações que aparecerá na geração t1 é o produto do número de cópias da sequência no pool gênico 2N vezes a taxa na qual elas sofrem mutação μ ou seja 2Nμ Se uma mutação for neutra então a probabilidade de que ela derive até a fixação é de 12N Assim a cada geração 2Nμ novas mutações entram no pool gênico e 12N delas será fixada O produto desses dois números é a taxa k na qual as sequências evoluem O valor k é denominado taxa de substituição e é igual à taxa de mutação em relação às mutações neutras Se a taxa de mutação permanecer constante ao longo do tempo a taxa de substituição então baterá regularmente como um relógio o relógio molecular Considere duas espécies A e B e seu ancestral comum Definiremos d divergência como o número de substituições neutras em sítios de nucleotídios na sequência de DNA de um gene que ocorreram desde a divergência de A e B de seu ancestral O valor esperado em relação a d será o produto da taxa k na qual as substituições ocorrem e duas vezes o tempo em gerações 2t durante as quais a substituição foi acumulada O 2 é necessário em virtude de existirem duas linhagens que causam o distanciamento do ancestral comum Portanto temos d 2tk Essa equação pode se reescrita como demonstrando como podemos calcular o tempo em gerações desde a divergência de duas espécies quando conhecemos d e k A taxa de mutação de SNP por geração μ é conhecida em relação a muitos grupos de organismos ver Tabela 185 e é a mesma que a taxa de substituição k em relação às mutações neutras Podese sequenciar um ou mais genes de duas espécies e determinar a proporção de sítios de nucleotídios silenciosos neutros nos quais eles diferem e utilizar essa proporção como uma estimativa em relação a d Portanto podese calcular o tempo desde que duas sequências duas espécies divergiram com a utilização do relógio molecular Entre seres humanos e chimpanzés existe aproximadamente 0018 diferença de bases em sítios sinônimos nas sequências codificadoras A taxa de mutação de SNP em relação aos seres humanos é de 3 108 e o tempo de geração é de aproximadamente 20 anos Com a utilização desses valores e da equação anterior o tempo de divergência estimado em relação aos seres humanos e aos chimpanzés é de aproximadamente 60 milhões de anos Esses cálculos presumem que as substituições são neutras e que a taxa de substituição tem sido constante ao longo do tempo O Quadro 186 discute sobre o gargalo bemcaracterizado que ocorreu durante a domesticação de espécies de cultivo Esse gargalo explica o motivo de nossas plantas de cultivo apresentarem muito menos diversidade genética do que seus ancestrais selvagens CONCEITOCHAVE O tamanho da população é um fatorchave que afeta a variação genética nas populações A deriva genética exerce maior força sobre populações pequenas do que grandes A probabilidade de que um alelo se torne fixado ou seja perdido em uma população por meio de deriva é uma função de sua frequência na população e do tamanho da população A maior parte das novas mutações neutras é perdida das populações em decorrência de deriva Seleção Até agora consideramos como os novos alelos entram em uma população por meio de mutação e migração e como esses alelos podem se fixar ou se perder em uma população por meio da deriva aleatória Mas a mutação a migração e a deriva não conseguem explicar o motivo de os organismos aparentarem estar tão bemadaptados aos seus ambientes Elas não conseguem explicar as adaptações as características da forma ou da fisiologia de um organismo que possibilitam que ele lide melhor com as condições ambientais sob as quais ele vive Para explicar a origem das adaptações em 1859 Charles Darwin em seu histórico livro A Origem das Espécies propôs que as adaptações surgem por meio da ação de outro processo que ele denominou seleção natural Nesta seção exploraremos o papel da seleção natural na modulação da variação genética nas populações Posteriormente no Capítulo 20 consideraremos os efeitos da seleção natural sobre a evolução de genes e de traços ao longo de períodos prolongados FIGURA 1820 O gráfico da heterozigosidade de haplótipos versus heterozigosidade de microssatélites demonstra a diversidade genética em relação a diferentes grupos geográficos de seres humanos A diversidade genética é mais baixa para os nativos americanos em virtude do efeito fundador Dados de D F Conrad et al Nat Genet 38 2006 12511260 Quadro 186 Gargalo da domesticação Antes de 10000 anos atrás nossos ancestrais em todo o mundo proviam a si mesmos com a caça de animais selvagens e a coleta de plantas alimentícias selvagens Aproximadamente naquela época as sociedades humanas começaram a desenvolver a agricultura Pessoas coletavam plantas e animais selvagens locais cultivavam plantações e domesticavam os animais Alguns dos principais cultivos que foram domesticados nessa ocasião incluem o trigo no Oriente Médio o arroz na Ásia o sorgo na África e o milho no México Quando os primeiros fazendeiros coletaram sementes selvagens para iniciar a domesticação eles coletaram uma amostra do pool gênico selvagem Essa amostra apresentava apenas um subconjunto da variação genética observada na vida selvagem As populações domesticadas passaram por um gargalo Consequentemente as plantas de cultivo e os animais domesticados tipicamente apresentam menos variação genética do que os seus genitores selvagens O cultivo científico moderno de plantas que objetivava a melhora das plantações criou um segundo gargalo Ao amostrar o pool gênico das variedades de cultivo tradicionais agricultores modernos criaram variedades de elite com traços de valor comercial tais como alta produção e adequabilidade à coleta e ao processamento mecânicos Consequentemente as variedades de elite ou modernas apresentam ainda menos variação genética do que as variedades tradicionais A perda da variação genética resultante dos gargalos da domesticação e do melhoramento pode impor uma ameaça Tendo em vista que existem menos alelos por locus os cultivos apresentam um repertório menor de alelos nos genes de resistência a doenças e possivelmente maior suscetibilidade a patógenos emergentes Para reduzir essa vulnerabilidade cultivadores realizam cruzamentos entre as variedades modernas e os parentes selvagens ou as variedades tradicionais para reintroduzir alelos criticamente importantes nos cultivos modernos Gargalos da domesticação e do melhoramento de cultivos Os pontos coloridos representam alelos diferentes M Yamasaki et al Plant Cell 17 2005 28592872 Definiremos a seleção natural como o processo por meio do qual os indivíduos com determinadas características hereditárias apresentam maior probabilidade de sobreviver e se reproduzir do que outros indivíduos com ausência dessas características Conforme resumido por Darwin o processo funciona assim A cada geração são produzidos mais descendentes do que os que conseguem sobreviver e se reproduzir no ambiente A natureza apresenta um mecanismo mutação para produzir novas formas ou variantes hereditárias Indivíduos com variantes particulares de algumas características apresentam maior probabilidade de sobreviver e se reproduzir Indivíduos com características que intensificam a sua capacidade de sobreviver e se reproduzir transmitirão essas características à sua descendência Ao longo do tempo essas características aumentarão em frequência na população Portanto as populações serão alteradas ao longo do tempo evoluirão na medida em que o ambiente a natureza favorecer selecionar as características que intensificam a capacidade de sobreviver e se reproduzir Essa é a teoria da evolução de Darwin por meio da seleção natural A evolução darwiniana com frequência é descrita com a utilização da frase sobrevivência do mais apto Essa frase pode ser enganosa Um indivíduo que é fisicamente forte resistente a doenças e vive uma vida longa mas que não apresenta descendência não é adaptado no sentido darwiniano A adaptabilidade darwiniana referese à capacidade de sobreviver e de se reproduzir Ela considera tanto a viabilidade quanto a fecundidade Uma medida da adaptabilidade darwiniana é simplesmente o tamanho da descendência que um indivíduo apresenta Essa medida é denominada adaptabilidade absoluta e a simbolizaremos com um W maiúsculo Em relação a um indivíduo sem descendência W é igual a 0 em relação a um indivíduo com um descendente W é igual a 1 em relação a um indivíduo com dois descendentes W é igual a 2 e assim por diante W também é o número de alelos em um locus com que um indivíduo contribui para o pool gênico A adaptabilidade absoluta mistura o tamanho da população e diferenças no sucesso reprodutivo entre os indivíduos Geneticistas de populações estão primariamente interessados no último e assim utilizam uma medida denominada adaptabilidade relativa simbolizada por um w minúsculo que é a adaptabilidade de um indivíduo em relação àquela de algum outro indivíduo normalmente o indivíduo mais adaptado na população Se o indivíduo X apresenta dois descendentes e o indivíduo mais adaptado Y apresenta 10 descendentes a adaptabilidade relativa de X é w 210 02 A adaptabilidade relativa de Y é w 1010 1 Para cada 10 alelos com os quais Y contribui para a próxima geração X contribuirá com 2 O conceito de adaptabilidade se aplica aos genótipos bem como aos indivíduos A adaptabilidade absoluta em relação ao genótipo AA WAA é o número médio de descendentes deixados pelos indivíduos com aquele genótipo Se conhecermos a adaptabilidade absoluta em relação a todos os genótipos em um locus podemos então calcular a adaptabilidade relativa de cada um dos genótipos Agora veremos como as frequências alélicas podem ser alteradas ao longo do tempo quando genótipos diferentes apresentam adaptabilidade diferente ou seja quando a seleção natural está atuando A seguir estão a adaptabilidade e as frequências genotípicas em relação a três genótipos no locus A em uma população Nesse caso A é um alelo dominante favorecido tendo em vista que a adaptabilidade dos indivíduos AA e Aa é a mesma e superior à dos indivíduos aa Estamos presumindo que essa população segue a lei de HardyWeinberg com p 01 e q 09 AA Aa aa Número médio de descendentes W 10 10 5 Adaptabilidade relativa w 10 10 05 Frequência genotípica 001 018 081 A contribuição relativa de cada genótipo para o pool gênico é determinada pelo produto de sua adaptabilidade com sua frequência Quanto mais adaptado e mais alta a frequência de um genótipo mais ele contribui Genótipo AA Aa aa Soma Contribuição 1 001 1 018 05 081 0595 relativa 001 018 0405 As contribuições relativas não somam 1 então precisamos redimensionálas ao dividir cada uma pela soma das três 0595 para obter as frequências genotípicas esperadas que contribuem para o pool gênico Genótipo AA Aa aa Soma Frequências genotípicas 002 030 068 10 Com a utilização dessas frequências genotípicas esperadas e da lei de Hardy Weinberg podemos calcular as frequências alélicas na próxima geração p 002 03 017 e q 068 03 083 A diferença entre p e q Δp p p é 017 01 007 então concluímos que o alelo A aumentou 7 em uma geração em virtude da seleção natural O Quadro 187 apresenta as equaçõespadrão para o cálculo das alterações nas frequências alélicas ao longo do tempo em virtude da seleção natural Passaremos por esse processo recursivamente utilizando as frequências alélicas da primeira geração para calcular aquelas na segunda geração utilizando em seguida aquelas da segunda para calcular as da terceira e assim por diante Se em seguida inserirmos em um gráfico p pelo tempo medido em número de gerações t teremos um quadro do tempo no qual as frequências alélicas são alteradas sob a força da seleção natural A Figura 1821 demonstra um referido gráfico em relação a ambos um alelo dominante favorecido e um recessivo favorecido O alelo dominante no início aumenta rapidamente mas em seguida alcança um platô e se aproxima apenas lentamente da fixação Após o alelo dominante favorecido alcançar uma alta frequência o alelo recessivo não favorecido ocorre principalmente em heterozigotos e raramente em homozigotos com adaptabilidade reduzida e assim a seleção é ineficaz para removêlo da população O recessivo favorecido se comporta da maneira oposta primeiramente ele aumenta lentamente em frequência tendo em vista que os homozigotos aa com adaptabilidade intensificada são raros mas posteriormente prossegue mais rapidamente até a fixação Tendo em vista que a classe heterozigota apresenta adaptabilidade reduzida o alelo dominante não favorecido finalmente pode ser removido da população FIGURA 1821 Alteração na frequência alélica de um alelo dominante favorecido vermelho e um alelo recessivo favorecido azul direcionada pela seleção natural ao longo de 600 gerações Quadro 187 Efeito da seleção sobre as frequências alélicas A seleção causa alterações nas frequências alélicas entre gerações tendo em vista que alguns genótipos contribuem com mais alelos para o pool gênico do que outros Descreveremos um conjunto de equações para prever as frequências gênicas na próxima geração quando a seleção está operando As frequências genotípicas e a adaptabilidade absoluta são simbolizadas como segue genótipo AA Aa aa frequência p² 2pq q² adaptabilidade absoluta WAA WAa Waa O número médio de alelos com que indivíduos de um determinado genótipo contribuem é a frequência do genótipo vezes a adaptabilidade absoluta Se N é o tamanho da população o número total de alelos com que todos os indivíduos de determinado genótipo contribuem é N multiplicado pelo número médio de alelos com que indivíduos de determinado genótipo contribuem número médio p²WAA 2pqWAa q²Waa número total Np²WAA N2pqWAa Nq²Waa Portanto o pool gênico apresentará número de alelos A Np2WAA N2pqWAa número de alelos a Np2Waa N2pqWAa A adaptabilidade média da população é p2WAA 2pqWAa q2Waa que é o número médio de alelos com que um indivíduo contribui para o pool gênico N é o número total de alelos no pool gênico Agora podemos calcular a proporção de alelos A no pool gênico na próxima geração como Essa equação é reduzida para Observe a expressão pWAA qWAa Essa é denominada adaptabilidade alélica ou adaptabilidade média de alelos A WA WA pWAA qWAa A partir da lei de HardyWeinberg sabemos que uma proporção p de todos os alelos A está presente em homozigotos com outro A caso em que eles apresentam uma adaptabilidade de WAA enquanto uma proporção q de todos os alelos A está presente em heterozigotos com a e eles apresentam uma adaptabilidade de WAa Substituindo WA na equação anterior obtemos Essa equação pode ser utilizada para calcular a frequência de A na próxima geração e pode ser utilizada recursivamente para seguir a alteração em p ao longo do tempo Embora tenhamos derivado essas fórmulas com a utilização da adaptabilidade absoluta em geral não estamos interessados no tamanho da população assim utilizamos formas dessas equações com a adaptabilidade relativa p2wAA2pqwAaq2waa wA pwAAqwAa Finalmente podemos expressar a alteração na frequência alélica entre as gerações como Mas a adaptabilidade relativa média da população é a média de wA e wa que são as adaptabilidades alélicas de A e a respectivamente pwA qwa Substituindo essa expressão por w na fórmula em relação a Δp e relembrando que q 1 p obtemos Tipos de seleção A seleção natural pode operar de diversos modos A seleção direcional que temos discutido movimenta a frequência de um alelo em uma direção até que ele alcance a fixação ou seja perdido A seleção direcional pode ser positiva ou purificadora A seleção positiva atua para trazer uma nova mutação ou um novo alelo favorável até uma frequência mais alta Esse tipo de seleção está em atuação quando novas adaptações evoluem Uma varredura seletiva ocorre quando um alelo favorável alcança a fixação A seleção direcional também pode atuar para remover mutações deletérias da população Esse tipo de seleção é denominado seleção purificadora e evita que as características adaptativas existentes sejam degradadas ou perdidas A seleção nem sempre prossegue de modo direcional até a perda ou a fixação de um alelo Se a classe heterozigota apresenta adaptabilidade mais alta do que qualquer uma das classes homozigotas a seleção natural então favorecerá a manutenção de ambos os alelos na população Nesse caso o locus está sob seleção balanceadora e a seleção natural irá movimentar a população até um ponto de equilíbrio no qual ambos os alelos são mantidos na população ver Capítulo 20 Cada um dos diferentes tipos de seleção deixa uma assinatura distinta na sequência de DNA próxima do locusalvo em uma população Por exemplo a seleção positiva pode ser detectada em sequências de DNA por meio de seus efeitos sobre a diversidade genética e o equilíbrio de ligação A Figura 1822 demonstra haplótipos esquemáticos antes e depois de um episódio de seleção positiva No painel que demonstra os haplótipos antes da seleção a região entre chaves apresenta muitos polimorfismos e múltiplos haplótipos Entretanto após a seleção existe apenas um único haplótipo nessa região e portanto nenhum polimorfismo Quando a seleção é aplicada ao sítioalvo demonstrado em vermelho todos os sítiosalvo e vizinhos podem ser varridos até a fixação antes que a recombinação fragmente o haplótipo no qual a mutação favorável ocorreu pela primeira vez O resultado é uma diversidade mais baixa e um LD mais alto próximo do alvo Na medida em que a distância do alvo aumenta existem mais oportunidades para a recombinação e assim a diversidade retrocede gradualmente A Figura 1823 demonstra o padrão de diversidade na região que circunda o gene SLC24A5 em seres humanos Esse gene influencia a deposição da melanina na pele Quando pessoas migraram da África para a Europa uma varredura seletiva no SLC24A5 causou a perda de toda a diversidade nesse locus Consequentemente existe um alelo único e um haplótipo único nesse locus na Europa O alelo único que foi selecionado na Europa produz a cor da pele mais clara Com o distanciamento do gene em qualquer direção o número de haplótipos aumenta nas populações europeias tendo em vista que a recombinação perturbou o desequilíbrio de ligação entre o SLC24A5 e os sítios mais distantes A pele clara pode ser adaptativa em latitudes ao norte As pessoas são capazes de sintetizar vitamina D mas para tanto elas precisam absorver a radiação UV pela pele Nas latitudes equatoriais as pessoas são expostas a altos níveis de luz UV e conseguem sintetizar a vitamina D até mesmo com a pele fortemente pigmentada Mais distante do equador as pessoas são expostas a menos luz UV e a cor da pele mais clara pode facilitar a síntese de vitamina D nessas latitudes FIGURA 1822 Esquema de haplótipos observados em uma população antes e depois de um alelo favorecido vermelho ser varrido até a fixação Existem 11 loci no total Existem dois alelos vermelho e cinza no locus que era o alvo da seleção Existem dois alelos preto e cinza em cada locus ligado ao locusalvo Após a seleção o sítioalvo e alguns vizinhos foram varridos até a fixação FIGURA 1823 Diversidade genética em grupos continentais humanos ao longo de um segmento de 2 milhões de pb do cromossomo 15 humano que circunda o gene SLC24A5 Dados de Human Diversity Genome Project wwwhgdpuchicagoedu A Tabela 186 lista alguns dos genes que demonstram evidência de seleção natural em seres humanos modernos Esses genes estão situados em algumas poucas categorias básicas Um grupo fortalece a resistência a patógenos Os genes G6PD FYnulo e Hb hemoglobina B o gene da anemia falciforme todos ajudam a adaptar os seres humanos à ameaça da malária A Figura 1811 B demonstra que a frequência de FYnulo é mais alta na África central A África central também apresenta a mais alta prevalência de malária sugerindo que a seleção levou o FYnulo até a sua mais alta frequência na região na qual a pressão da seleção é maior Recentemente geneticistas descobriram o gene CCR5 receptor de quimiocina 5 que apresenta um alelo CCR5Δ32 que proporciona resistência à AIDS Esse alelo atualmente é um alvo da seleção natural Enquanto existirem patógenos a seleção natural continuará a operar nas populações humanas Outro grupo de genes selecionados na Tabela 186 adapta as pessoas às dietas regionais Antes de 10000 atrás todos os seres humanos eram caçadores coletores Mais recentemente a maior parte dos seres humanos realizou a transferência para os alimentos agrícolas mas existem diferenças regionais nas dietas No norte da Europa e em partes da África os laticínios são uma parte substancial da dieta Na maior parte das populações a enzima lactase para a digestão do açúcar do leite lactose é expressa durante a infância mas deixa de ser sintetizada em adultos Entretanto em partes da Europa e da África nas quais os adultos bebem leite alelos especiais do gene da lactase que continuam a expressar a enzima lactase durante a fase adulta aumentaram em frequência em virtude da seleção natural Finalmente a Tabela 186 inclui alguns genes para adaptação fisiológica ao clima Entre esses estão os genes da pigmentação da pele tais como o SLC24A5 discutido anteriormente Tabela 186 Alguns genes que demonstram evidência de seleção natural em populações humanas específicas Gene Traço presumido População EDA2R receptor A2 da ectodisplasina Calvíciepadrão masculina Europeus EDAR receptor A da ectodisplasina Morfologia dos cabelos Asiáticos orientais FYnulo antígeno Duffy Resistência à malária Africanos G6PD glicose6fosfato desidrogenase Resistência à malária Africanos Hb hemoglobina B Resistência à malária Africanos KITLG ligante KIT Pigmentação da pele Asiáticos orientais e europeus LARGE glicosiltransferase Resistência à febre de Lassa Africanos LCT lactase Persistência da lactase capacidade de digerir o açúcar do leite quando adulto Africanos europeus LPR receptor de leptina Processamento de gorduras alimentares Asiáticos orientais MC1R receptor de melanocortina Pigmentação dos cabelospelos e da pele Asiáticos orientais MHC complexo principal de histocompatibilidade Resistência a doenças infecciosas Múltiplas populações OCA2 albinismo oculocutâneo Pigmentação da pele e cor dos olhos Europeus PPARD receptor delta ativado por proliferador de peroxissomo Processamento de gorduras alimentares Europeus SI sacaraseisomaltase Metabolismo da sacarose Asiáticos orientais SLC24A5 família transportadora de soluto 24 Pigmentação da pele Europeus e asiáticos ocidentais TYRP1 proteína 1 relacionada à tirosinase Pigmentação da pele Europeus Fonte P C Sabeti et al Science 312 2006 16141620 P C Saberi et al Nature 449 2007 913919 B F Voight et al PLoS Biology 4 2006 446458 J K Pickrell et al Genome Research 19 2009 826837 Enquanto a seleção direcional causa uma perda de variação genética na região que circunda o locusalvo a seleção balanceadora consegue prevenir a perda de diversidade por meio de deriva genética aleatória levando a regiões de diversidade genética incomumente alta no genoma Uma região de alta diversidade genética circunda o complexo principal de histocompatibilidade MHC no cromossomo 6 A Figura 1824 demonstra um pico distinto no número de SNP no MHC Esse complexo inclui os genes do antígeno leucocitário humano HLA que estão envolvidos no reconhecimento de e na resposta a patógenos por parte do sistema imune A seleção balanceadora é uma hipótese proposta para explicar a alta diversidade observada no MHC Tendo em vista que heterozigotos apresentam dois alelos eles podem ser resistentes a um repertório maior de tipos de patógenos proporcionando aos heterozigotos uma vantagem adaptativa Finalmente a seleção pode ser imposta por outro agente além da natureza Os seres humanos impuseram a seleção no processo de domesticação e melhoria de cultivos de plantas e criação de animais Esse tipo de seleção é denominado seleção artificial Nesse caso os indivíduos com traços que os seres humanos preferem contribuem com mais alelos para o pool gênico do que os indivíduos com os traços não favorecidos Ao longo do tempo os alelos que conferem os traços favorecidos aumentam em frequência na população As muitas raças de cães e vacas leiteiras e de variedades de vegetais de jardinagem e cultivos de cereais são todas produtos de seleção artificial FIGURA 1824 Número de sítios segregantes S ou SNP em janelas de 20 quilopares de bases ao longo do braço curto do cromossomo 6 humano Existe um pico de alta diversidade no locus do MHC Dados de International HapMap Project wwwhapmaporg CONCEITOCHAVE A seleção natural é uma força que pode direcionar alelos favoráveis em um locus até a fixação ou manter múltiplos alelos em um locus em uma população A seleção deixa uma assinatura no genoma no tipo de padrão de diversidade genética que circunda o alvo da seleção Geneticistas de populações identificaram um número de genes que têm sido alvo de seleção em seres humanos Equilíbrio entre mutação e deriva Consideramos as forças que regulam a variação nas populações individualmente Agora consideraremos os efeitos opostos da mutação e da deriva a primeira adicionando variação e a última removendoa das populações Quando essas duas forças estão em equilíbrio uma população pode alcançar um equilíbrio no qual a perda e o ganho de variação são iguais Utilizaremos a heterozigosidade H como uma medida de variação Relembre que H estará próximo de 0 quando uma população estiver próxima da fixação em relação a um único alelo variação baixa e que H se aproximará de 1 quando houver muitos alelos de frequência igual variação alta Utilizaremos H com acento circunflexo como símbolo do valor de equilíbrio de H Para encontrar iniciamos com duas equações matemáticas uma equação que relaciona a alteração em H ao tamanho da população deriva e outra equação que relaciona a alteração em H à taxa de mutação Em seguida podemos estabelecer essas equações como iguais entre si e calcular Primeiramente precisamos de uma equação para o declínio na variação H entre as gerações como uma função do tamanho da população deriva Desenvolvemos uma referida equação no Quadro 183 quando discutimos sobre o endocruzamento Essa equação se aplica aos efeitos da deriva bem como àqueles do endocruzamento A partir dessa equação seguese que a alteração em H entre as gerações em virtude da deriva é Em segundo lugar precisamos de uma equação para o aumento na variação conforme medido por H entre gerações em virtude da mutação Qualquer mutação nova aumentará a heterozigosidade a uma taxa proporcional à frequência de homozigotos na população 1 H vezes a taxa na qual a mutação os converte em heterozigotos 2μ O 2 é necessário em virtude da existência de dois alelos que podem sofrer mutação em um diploide Portanto a alteração em H entre as gerações em virtude de mutação é ΔH 2μ1 Quando a população alcançar um equilíbrio a perda da heterozigosidade por meio de deriva será igual ao ganho por mutação Portanto temos que pode ser reescrita como Essa equação fornece o valor de equilíbrio de quando a perda pela deriva e o ganho por mutação estão equilibrados Essa equação é aplicável apenas à variação neutra ou seja estamos presumindo que a seleção não está atuando Também estamos presumindo que cada nova mutação produz um alelo único Expressões tais como essa são úteis quando temos estimativas em relação a duas das variáveis e gostaríamos de conhecer a terceira Por exemplo a diversidade de nucleotídios H no nível de nucleotídio em relação às sequências não codificadoras que são amplamente neutras é de aproximadamente 00013 em seres humanos e μ em seres humanos é 3 108 ver Tabela 185 A utilização desses valores e a solução da equação anterior em relação a N produzem uma estimativa do tamanho da população humana de 10498 indivíduos Essa estimativa está muito abaixo dos 72 bilhões que somos atualmente O que acontece Essa é uma estimativa do valor de equilíbrio Os seres humanos modernos são um grupo jovem de apenas aproximadamente 150000 anos de idade Ao longo dos últimos 150000 anos nossa população cresceu dramaticamente na medida em que preenchemos o globo mas a mutação é um processo lento e assim a diversidade genética não foi mantida e a população humana não está em equilíbrio O tamanho da população de 10498 representa uma estimativa de nosso tamanho histórico ou quantos membros em idade reprodutiva havia há aproximadamente 150000 anos Equilíbrio entre mutação e seleção As frequências alélicas também podem alcançar um equilíbrio estável quando a introdução de novos alelos por mutação repetida é balanceada por sua remoção por seleção natural Esse equilíbrio provavelmente explica a persistência de doenças genéticas como polimorfismos de nível baixo em populações humanas Novas mutações deletérias estão constantemente surgindo de modo espontâneo Essas mutações podem ser completamente recessivas ou parcialmente dominantes A seleção removeas da população mas existe um equilíbrio entre o seu aparecimento e a sua remoção Iniciaremos com o caso mais simples a frequência de um recessivo deletério quando é alcançado um equilíbrio entre mutação e seleção Para essa finalidade é conveniente expressar o valor adaptativo relativo em termos do coeficiente de seleção s que é a desvantagem seletiva de ou a perda de adaptabilidade em um genótipo WAA WAa waa 1 1 1 s Em seguida conforme demonstrado no Quadro 188 a equação em relação à frequência de equilíbrio de um alelo recessivo deletério é Quadro 188 Equilíbrio entre seleção e mutação Se deixamos q ser a frequência do alelo deletério a e p 1 q ser a frequência do alelo normal A a alteração na frequência alélica em virtude da taxa de mutação μ então é Δqmut μp Um modo simples de expressar os valores adaptativos dos genótipos no caso de um alelo recessivo deletério a é wAA wAa 10 e waa 1 s em que s o coeficiente de seleção é a perda de adaptabilidade nos homozigotos recessivos Agora podemos substituir esses valores adaptativos em nossa expressão geral pela alteração da frequência alélica ver Quadro 187 e obter O equilíbrio significa que o aumento na frequência alélica em virtude de mutação equilibra exatamente a diminuição na frequência alélica em virtude da seleção assim A frequência de um alelo recessivo deletério q no equilíbrio será consideravelmente pequena então 1 sq² 1 e temos no equilíbrio Essa equação demonstra que a frequência no equilíbrio depende da razão μs Quando a taxa de mutação de A a se tornar maior e a desvantagem seletiva se tornar menor a frequência no equilíbrio de um alelo recessivo deletério aumentará Como um exemplo um alelo letal recessivo s 1 que surge por meio de mutação do alelo selvagem na taxa de μ 106 apresentará uma frequência de equilíbrio de 103 Consideraremos o equilíbrio entre a seleção e a mutação em relação ao caso discretamente mais complicado de um alelo deletério parcialmente dominante ou seja um alelo com algum efeito deletério em heterozigotos bem como seu efeito em homozigotos Definiremos h como o grau de dominância do alelo deletério Quando h é 1 o alelo deletério é totalmente dominante e quando h é 0 o alelo deletério é totalmente recessivo Em seguida os valores adaptativos são WAA WAa waa 1 1 hs 1 s em que a é um alelo deletério parcialmente dominante Uma derivação semelhante àquela no Quadro 188 nos fornece Aqui está um exemplo Se μ 106 e o alelo letal não for totalmente recessivo mas causar uma redução de 5 na adaptabilidade dos heterozigotos s 10 h 005 então Esse resultado é menor em duas ordens de magnitude do que a frequência de equilíbrio em relação ao caso puramente recessivo descrito anteriormente Em 186 geral então podemos esperar que alelos deletérios completamente recessivos apresentem frequências muito mais altas do que aquelas de alelos parcialmente dominantes tendo em vista que os alelos recessivos estão protegidos nos heterozigotos CONCEITOSCHAVE A quantidade de variação genética nas populações representa um equilíbrio entre forças opostas mutação e migração que adicionam nova variação versus deriva e seleção que removem a variação A seleção balanceadora também atua para manter a variação nas populações Como resultado desses processos as frequências alélicas podem alcançar valores de equilíbrio explicando o motivo pelo qual as populações com frequência mantêm altos níveis de variação genética Aplicações biológicas e sociais Assim como os princípios da física orientam os engenheiros que projetam pontes e jatos também assim os princípios da genética de populações tocam todas as nossas vidas de muitas maneiras despercebidas No Capítulo 19 você verá como a genética de populações figura de modo proeminente na busca por genes que contribuem para o risco de doenças em pessoas com a utilização de conceitos tais como o desequilíbrio de ligação descrito neste capítulo Nesta seção final do capítulo examinaremos quatro outras áreas nas quais os princípios da genética de populações estão sendo aplicados em questões que afetam as sociedades modernas Genética da conservação Biólogos conservacionistas que estão tentando salvar espécies selvagens ameaçadas e profissionais de zoológicos que estão tentando manter pequenas populações de animais em cativeiro com frequência realizam análises de genética de populações Anteriormente discutimos como um gargalo genético causou perda de variação genética no condordacalifórnia e um aumento na frequência de uma forma letal de nanismo Os gargalos também podem aumentar o nível de endocruzamento em uma população levando talvez a um declínio na adaptabilidade por meio da depressão por endocruzamento Entretanto a questão é complexa tendo em vista que o endocruzamento nem sempre está associado a um declínio na adaptabilidade O endocruzamento por vezes pode ajudar a remover alelos recessivos deletérios de uma população A seleção purificadora é mais eficaz na eliminação de alelos recessivos deletérios tendo em vista que a classe homozigota recessiva se torna mais frequente nas populações endocruzadas Portanto biólogos conservacionistas têm debatido se devem tentar maximizar a diversidade genética e minimizar o endocruzamento ou submeter deliberadamente as populações de zoológicos ao endocruzamento com o objetivo de remover os alelos deletérios Para ajudar a abordar essa questão pesquisadores procuraram por evidências de sucesso na remoção entre populações de zoológicos Definiremos a depressão por endocruzamento como delta δ em que wf é a adaptabilidade de indivíduos endocruzados e w0 é o valor adaptativo de indivíduos não endocruzados O valor de δ será positivo quando houver um declínio na adaptabilidade com o endocruzamento mas negativo quando a adaptabilidade melhorar com o endocruzamento Pesquisadores calcularam δ para 119 populações de zoológico incluindo 88 espécies e observaram evidências de que a remoção havia melhorado a adaptabilidade valores negativos para δ em 14 populações Ainda assim não está claro se o endocruzamento deliberado de animais de zoológico é recomendável Por um lado embora 14 das 119 populações tenham melhorado a maioria das populações declinou na adaptabilidade quando foi endocruzada Portanto se iniciarmos com uma pequena população de zoológico e realizarmos propositalmente o endocruzamento dos animais um declínio na adaptabilidade será o desfecho mais provável Cálculo dos riscos de doenças No Capítulo 2 vimos como os alelos de distúrbios genéticos podiam ser traçados em heredogramas e discutimos como calcular o risco de que um casal tenha um filho que herde tal distúrbio Os princípios da genética de populações nos possibilitam estender esse tipo de análise Consideraremos dois exemplos O alelo em relação à fibrose cística FC ocorre a uma frequência de aproximadamente 0025 em caucasianos No heredograma de uma família caucasiana a seguir o indivíduo II2 apresenta um primo em primeiro grau II1 com fibrose cística II2 é casado com uma caucasiana não relacionada II3 e eles estão planejando ter um filho Qual é a chance de que o filho III1 apresente fibrose cística Um dos avós maternos de II2 deve ter sido um portador Começamos calculando a probabilidade de que III1 herde esse alelo da fibrose cística desse avô ou dessa avó através de seu pai II2 utilizando métodos já familiares do Capítulo 2 A probabilidade de que esse avô ou essa avó tenha transmitido o alelo da doença para I3 é 12 A probabilidade de que I3 o tenha transmitido para II2 e de que II2 o transmita para III1 também são ambas 12 Assim a probabilidade de III 1 herdar o alelo da FC de II2 é ³ ou 18 Agora estendemos o cálculo para determinar a probabilidade de que III1 possa herdar o alelo da fibrose cística de sua mãe II3 O indivíduo II3 não apresenta FC mas não temos certeza se ela é ou não uma portadora Se a frequência q do alelo da doença na população é de 0025 então a probabilidade de que um indivíduo não afetado tal como II3 seja um portador é de 2pq1 q² 0049 Se II3 for portadora existe então uma chance de de que ela transmita o alelo da doença para III1 Essas são todas probabilidades independentes assim podemos utilizar a regra do produto A probabilidade de que III1 apresente fibrose cística é A frequência de fibrose cística entre caucasianos é p² 0025² 0000625 Esses cálculos nos informam que os indivíduos que têm um primo em primeiro grau com fibrose cística apresentam um risco 0003 0000625 49 vezes mais alto de ter um filho com a doença do que membros da população em geral Aqui está outra aplicação da genética de populações para avaliar o risco de doenças A anemia falciforme uma doença recessiva apresenta uma frequência de aproximadamente 025 ou 1 em 400 entre afroamericanos ver Capítulo 6 Aplicando a lei de HardyWeinberg estimamos a frequência do alelo da doença HbS como 005 Qual seria a frequência esperada dessa doença entre a descendência de afroamericanos que são primos de primeiro grau Utilizando o método descrito no Quadro 182 calculamos que o coeficiente de endocruzamento F em relação à descendência de casamentos entre primos de primeiro grau é de 116 Na seção anterior sobre o endocruzamento vimos que a frequência de homozigotos aumenta quando existe endocruzamento conforme demonstrado por essa equação faa q2 pqF Com a utilização dessa equação obtemos Isso representa um aumento de 22 vezes no risco de ter um filho com a doença para casamentos de primos de primeiro grau em comparação àquele em um casamento entre indivíduos não relacionados DNA forense Criminosos podem deixar evidências de DNA na cena de um crime na forma de sangue sêmen cabelospelos ou até mesmo células bucais da saliva em uma ponta de cigarro A reação da cadeia de polimerase PCR possibilita que cientistas forenses amplifiquem quantidades muito pequenas de DNA e determinem o genótipo do indivíduo que deixou a amostra Se o DNA encontrado em uma cena de crime corresponder àquele do suspeito então eles podem ser o mesmo indivíduo A frasechave aqui é podem ser e é aqui que a genética de populações realiza o seu papel Vejamos como isso funciona Considere dois loci de microssatélites cada um com múltiplos alelos A1 A2 An e B1 B2 Bn Cientistas forenses determinam que uma amostra de DNA de uma cena de crime e uma do suspeito são ambas A3A8 B1B7 Eles determinaram que existe uma correspondência entre a evidência e o suspeito A correspondência comprova que a evidência do DNA é originária do suspeito Ela prova que o suspeito estava na cena do crime O que os geneticistas de populações fazem com esse tipo de evidência é testar uma hipótese específica a evidência é originária de outra pessoa além do suspeito Isso é o que os estatísticos denominam hipótese nula ou a hipótese que é considerada verdadeira exceto se evidências demonstrarem que ela é muito improvável ver Capítulo 4 Para realizar o teste calculamos a probabilidade de observar uma correspondência entre a evidência e o suspeito dado que o suspeito e a pessoa que deixou a evidência são indivíduos diferentes Simbolicamente escrevemos Prob correspondência indivíduos diferentes em que significa dado que Se essa probabilidade for muito pequena podemos então rejeitar a hipótese nula e argumentar em favor de uma hipótese alternativa a evidência foi deixada pelo suspeito Nunca comprovamos formalmente que o suspeito deixou a evidência tendo em vista que pode haver hipóteses alternativas tais como a evidência foi deixada pelo gêmeo idêntico do suspeito Para calcular a probabilidade de observar uma correspondência entre a evidência e o suspeito se a evidência for originária de um indivíduo diferente precisamos conhecer as frequências dos alelos de microssatélites na população A4 003 A6 005 B1 001 B7 012 A prob correspondência indivíduos diferentes é a mesma probabilidade de que a evidência seja originária de um indivíduo escolhido aleatoriamente Podemos calcular essa probabilidade utilizando as frequências alélicas anteriores Primeiramente presumiremos que a lei de HardyWeinberg seja aplicável e calcularemos a probabilidade de ser A4A6 no primeiro locus e B1B7 no segundo Prob A4A6 2pq 2 003 005 0003 Prob B1B7 2 001 012 00024 Para combinar essas duas probabilidades precisamos realizar mais uma presunção Precisamos presumir que os dois loci são independentes ou seja que os loci estão em equilíbrio de ligação Ao realizar essa presunção podemos aplicar a regra do produto a eventos independentes ver Capítulo 2 e determinar que Prob correspondência indivíduos diferentes Prob A4A6 Prob B1B7 72 106 Portanto a probabilidade sob a hipótese nula de que a evidência seja originária de alguma outra pessoa além do suspeito é de 72 106 ou aproximadamente 7 em um milhão Essa é uma probabilidade pequena e assim a hipótese nula aparenta ser improvável nesse caso Entretanto se a Prob correspondência indivíduos diferentes fosse 01 10 da população seria correspondente e poderia ter deixado a evidência Naquele caso não rejeitaríamos a hipótese nula Dois microssatélites não proporcionam muito poder de discriminação e então o FBI nos EUA utiliza um conjunto de 13 microssatélites Os loci de microssatélites apresentam tipicamente grandes números de alelos 10 a 20 ou mais portanto o número de possíveis genótipos com base em 13 microssatélites é astronomicamente grande Com 10 alelos por locus existem 55 possíveis genótipos em cada locus e 5513 ou 42 1022 possíveis genótipos multilocus para 13 loci O FBI também reuniu uma base de dados denominada CODIS Combined DNA Index System que contém as frequências de diferentes alelos nesses loci na população incluindo dados específicos de diferentes grupos étnicos e regiões do país Procura no Google por seus parceiros de DNA Neste capítulo revisamos os princípios básicos da genética de populações e discutimos muitas aplicações para a genética humana A teoria básica da genética de populações tem estado presente há quase 100 anos mas apenas na última década o desenvolvimento de tecnologias com base no alto processamento do DNA para a genotipagem de indivíduos trouxe à tona os complexos padrões de variação entre e dentro das populações humanas Não apenas tem sido possível desembaraçar muitos dos detalhes a respeito de como e quando os seres humanos povoaram o globo a partir da sua origem na África como também os geneticistas obtiveram uma profunda compreensão sobre como forças tais como a seleção natural e a deriva genética modelaram quem somos O que o futuro reserva para nós Logo o sequenciamento de um genoma humano poderá custar um pouco mais do que uma nova bicicleta Uma estudante universitária poderá esfregar o interior de sua bochecha com um Qtip e depositar a amostra em um quiosque enquanto ouve música Semanas depois ela poderá visualizar a sequência de seu genoma em um site comparála àquela de seus amigos e parentes e aprender a respeito de seus ancestrais Conforme veremos no próximo capítulo a nossa capacidade de prever os riscos de doenças os talentos e outros traços de uma pessoa a partir do seu genótipo está melhorando Até a medida na qual o gosto de uma pessoa pela música ou a admiração por esportes radicais apresenta fundamentos genéticos teoricamente uma pessoa poderia buscar no Google parceiros de DNA que provavelmente compartilham os mesmos interesses A tecnologia do DNA e a teoria da genética de populações já estão funcionando entretanto existem questões sociais e éticas a serem abordadas As informações poderão ser mantidas em sigilo e como Existem muitos limites sobre o que uma pessoa deve saber a respeito de sua própria sequência O governo deve sequenciar o genoma de qualquer pessoa quando ela nasce Planos de saúde podem exigir que seus clientes submetam as sequências do seu genoma Uma compreensão sobre a ciência pode auxiliar na determinação de como essas questões são respondidas RESUMO A genética de populações procura compreender as leis que regulam e as forças que influenciam a quantidade de variação genética nas populações e as alterações na variação genética ao longo do tempo O conceito do pool gênico fornece um modelo para pensarmos a respeito da transmissão da variação genética de uma geração para a próxima em relação a uma população inteira A teoria básica da genética de populações tem início com uma população idealizada de tamanho infinito e na qual o cruzamento é aleatório Em uma referida população a lei de HardyWeinberg define a relação entre as frequências alélicas no pool gênico e as frequências genotípicas na população As populações reais normalmente se desviam em pequeno ou grande grau do modelo de HardyWeinberg Uma fonte de desvio advém do tipo de cruzamento não aleatório ou preferencial Se os indivíduos cruzam preferencialmente com outros que compartilham um fenótipo semelhante então haverá um excesso de homozigotos para genes que controlam aquele fenótipo em comparação às expectativas de HardyWeinberg Quando os indivíduos cruzam mais frequentemente com parentes do que o esperado ao acaso haverá então um excesso de genótipos homozigotos em todo o genoma e a população se torna endocruzada Até mesmo quando as populações locais de uma espécie estão de acordo com as expectativas de HardyWeinberg aquelas estão aptas a ser isoladas de outras populações em locais distantes Portanto uma espécie com frequência é composta por uma série de subpopulações geneticamente distintas ou seja as espécies demonstram estrutura genética de população Diversas forças podem adicionar novas variações a uma população ou remover dela a variação existente A mutação é a fonte definitiva de toda a variação genética Geneticistas de populações determinaram estimativas razoavelmente precisas da taxa na qual surgem novas mutações nas populações A migração também pode trazer nova variação para uma população A migração resulta em alguns indivíduos que são geneticamente misturados que apresentam ancestrais de múltiplas populações A recombinação genética também pode adicionar variação às populações por meio da recombinação de alelos em novos haplótipos Duas forças controlam o destino da variação genética nas populações Primeiramente a deriva genética é uma força aleatória que pode levar à perda ou à fixação de um alelo como resultado do erro de amostragem em populações finitas A deriva age com mais força sobre populações pequenas e menor sobre populações grandes Em segundo lugar a seleção natural direciona alterações nas frequências alélicas nas populações ao longo do tempo Os alelos que intensificam a adaptabilidade dos indivíduos que os carregam aumentarão em frequência e poderão se tornar fixos enquanto alelos deletérios que reduzem a adaptabilidade serão removidos da população O objetivo fundamental da genética de populações é compreender as contribuições relativas dos sistemas de cruzamento mutação migração recombinação deriva e seleção natural para a quantidade e a distribuição da variação genética nas populações Neste capítulo vimos como pesquisas em genética de populações desenvolveram a teoria básica e coletaram uma vasta quantidade de dados para a conquista desse objetivo Nossa compreensão sobre a genética de populações de nossa própria espécie é notavelmente detalhada Finalmente os métodos e os resultados da genética de populações nos informam a respeito do processo evolutivo e apresentam aplicações práticas para questões que as sociedades modernas enfrentam A teoria e as análises da genética de populações desempenham papéis importantes no manejo de espécies ameaçadas na identificação de criminosos no cultivo de plantas e na criação animal e na avaliação dos riscos de um casal ter um filho com uma doença TERMOSCHAVE adaptabilidade absoluta adaptabilidade darwiniana adaptabilidade relativa adaptação alelo neutro coeficiente de endocruzamento coeficiente de seleção s cruzamento preferencial negativo cruzamento preferencial positivo depressão por endocruzamento deriva genética aleatória desequilíbrio de ligação LD diversidade gênica GD diversidade nucleotídica efeito fundador endocruzamento equilíbrio de HardyWeinberg equilíbrio de ligação estrutura populacional evolução neutra fixado fluxo gênico frequência alélica frequência genotípica gargalo genética de populações haplótipo HapMap heterozigosidade H idêntico por descendência IBD isolamento pela distância lei de HardyWeinberg locus microssatélite migração mistura genética número de haplótipos NH painel de descoberta polimorfismo de nucleotídio único SNP pool gênico população rede de haplótipos relógio molecular seleção artificial seleção balanceadora seleção direcional seleção natural seleção positiva seleção purificadora sítios segregantes S SNP comum SNP raro taxa de mutação μ PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 Aproximadamente 70 de todos os caucasianos conseguem degustar a substância química feniltiocarbamida e o restante não consegue A capacidade de degustar essa substância química é determinada pelo alelo dominante T e a incapacidade de degustar é determinada pelo alelo recessivo t Se presumirmos que a população está em equilíbrio de Hardy Weinberg quais são as frequências genotípicas e alélicas nessa população Solução Tendo em vista que 70 são degustadores TT e Tt 30 devem ser não degustadores tt Essa frequência de homozigotos recessivos é igual a q² assim para obter q simplesmente calculamos a raiz quadrada de 030 Tendo em vista que p q 1 podemos escrever p 1 q 1 055 045 Agora podemos calcular p² 045² 020 a frequência de TT 2pq 2 045 055 050 a frequência de Tt q² 03 a frequência de tt Problema resolvido 2 Em uma grande população experimental de Drosophila o valor adaptativo relativo de um fenótipo recessivo é calculado como 090 e a taxa de mutação em relação ao alelo recessivo é 5 105 Se a população estiver em equilíbrio quais frequências alélicas podem ser previstas Solução Aqui a mutação e a seleção estão atuando em direções opostas e assim é previsto um equilíbrio Tal equilíbrio é descrito pela fórmula Na presente questão μ 5 105 e s 1 w 1 09 01 Portanto Problema resolvido 3 Uma colônia de 50 papagaiosdomar Fratercula corniculata é estabelecida em um zoológico e ali é mantida durante 30 gerações a Se o coeficiente de endocruzamento dos membros fundadores for zero F 00 qual é o coeficiente de endocruzamento esperado para essa população atualmente b Em relação a um alelo deletério para doença com uma frequência de 0001 na natureza qual é a frequência prevista de aves homozigotas afetadas na natureza e na população do zoológico atualmente Solução a No Quadro 183 vimos que o endocruzamento aumentará como uma função do tamanho da população N ao longo do tempo t conforme medido nas gerações de acordo com a equação a seguir Substituindo por N 50 t 30 e F0 0 obtemos b Se a frequência de um alelo de doença recessiva q na natureza é 0001 então por meio da aplicação da lei de HardyWeinberg prevemos que a frequência de indivíduos homozigotos afetados na natureza será q² 106 Em relação à população do zoológico a frequência de homozigotos será mais alta em virtude do endocruzamento de acordo com a equação a seguir faa q2 pqF Substituindo por q 0001 p 0999 e F 026 obtemos faa 106 0001 0999 026 261 104 A razão de 261 104 a 106 nos demonstra que existe um aumento de 261 vezes na frequência esperada de indivíduos afetados na população do zoológico atual em comparação à população selvagem ancestral Problema resolvido 4 Em um julgamento penal o promotor apresenta os genótipos em relação a três loci de microssatélites do conjunto CODIS do FBI Ele relata que uma amostra de DNA da cena do crime e uma do suspeito apresentam ambas o genótipo FGA1FGA4 TPOX1TPOX3 VWA2VWA7 nesses três microssatélites Ele também apresenta as frequências alélicas em relação à população em geral à qual o suspeito pertence ver tabela a seguir Qual é a probabilidade de que o genótipo da evidência de DNA corresponda àquele do suspeito dado que a pessoa que cometeu o crime e o suspeito sejam indivíduos diferentes Quais presunções você realiza quando calcula essa probabilidade Alelo Frequência FGA1 030 FGA4 026 TPOX1 032 TPOX3 065 VWA2 023 VWA7 059 Solução 1 2 3 4 A probabilidade de que o genótipo da evidência de DNA corresponda àquele do suspeito dado que a pessoa que cometeu o crime e o suspeito sejam indivíduos diferentes é a mesma probabilidade de que um membro da população escolhido aleatoriamente apresente o mesmo genótipo da evidência de DNA A probabilidade de uma pessoa escolhida aleatoriamente ser FGA1FGA4 2pq 2 030 026 0156 e de modo semelhante a probabilidade de uma pessoa aleatória ser TPOX1TPOX3 0416 e VWA2VWA7 02714 Aplicando a regra da multiplicação a probabilidade de um membro aleatório da população ser FGA1FGA4 TPOX1TPOX3 VWA2VWA7 0156 0416 02714 00176 Ao calcular essa probabilidade presumimos que a população está em equilíbrio de HardyWeinberg e que os três loci em questão estão em equilíbrio de ligação entre si PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Qual indivíduo na Figura 183 apresenta o maior número de loci heterozigotos e qual indivíduo apresenta o menor número Suponha que os setes cromossomos na Figura 184 A representem uma amostra aleatória de cromossomos de uma população a Calcule a diversidade genética GD em separado em relação ao indel o locus de microssatélite e o SNP na posição 3 b Se a sequência foi encurtada de modo que você tivesse os dados apenas em relação às posições 1 a 24 quantos haplótipos haveria ali c Calcule o parâmetro do desequilíbrio de ligação D entre os SNP nas posições 29 e 33 Observando a Figura 186 você consegue contar quantos haplótipos mitocondriais foram transportados da Ásia para as Américas Na Figura 1813 a coluna não relacionados azul em relação ao Japão é mais alta do que a coluna não relacionados em relação à França O que isso lhe informa 5 6 7 8 9 10 11 12 Na Figura 1814 alguns indivíduos apresentam alelos de SNP únicos por exemplo o alelo T no SNP4 ocorre apenas no indivíduo 12 Você consegue identificar dois indivíduos que apresentem cada um alelos únicos em dois SNP Observando a Figura 1820 as pessoas do Oriente Médio tendem a apresentar níveis mais altos ou mais baixos de heterozigosidade em comparação às pessoas da Ásia Oriental Por que esse pode ser o caso PROBLEMAS BÁSICOS Quais são as forças que podem alterar a frequência de um alelo em uma população Quais presunções são feitas quando se utiliza a fórmula de HardyWeinberg para estimar as frequências genotípicas a partir das frequências alélicas Em uma população de camundongos existem dois alelos no locus A A1 e A2 Testes demonstraram que nessa população existem 384 camundongos de genótipo A1A1 210 A1A2 e 260 de A2A2 Quais são as frequências dos dois alelos na população Em uma população natural de Drosophila melanogaster o gene da desidrogenase alcoólica apresenta dois alelos denominados F rápido e S lento com as frequências de AdhF em 075 e AdhS em 025 Em uma amostra de 480 moscas dessa população quantos indivíduos de cada classe genotípica você esperaria observar sob o equilíbrio de HardyWeinberg Em uma população de laboratório de Drosophila de cruzamento aleatório 4 das moscas apresentam corpo preto codificado pelo autossômico recessivo b e 96 apresentam corpo marrom o tipo selvagem codificado por B Se presumirmos que essa população está em equilíbrio de Hardy Weinberg quais são as frequências alélicas de B e b e as frequências genotípicas de BB e Bb Em uma população de uma espécie de besouro você observa que existe uma razão de 31 de coberturas brilhantes e foscas das asas Essa razão 13 14 15 16 17 comprova que o alelo brilhante é dominante Presuma que os dois estados são causados por dois alelos de um gene Caso negativo o que ela comprova Como você elucidaria a situação A fibrose cística FC é um distúrbio autossômico recessivo que ocorre relativamente com frequência entre pessoas de descendência europeia Em uma comunidade Amish em Ohio pesquisadores médicos relataram a ocorrência de fibrose cística FC como sendo de 1569 nascimentos vivos Com a utilização da regra de HardyWeinberg estime a frequência de portadores do alelo da doença nessa população Amish Os valores adaptativos relativos de três genótipos são wAA 10 wAa 10 e waa 07 a Se a população tem início com a frequência alélica p 05 qual é o valor de p na próxima geração b Qual é a frequência alélica no equilíbrio prevista se a taxa de mutação de A para a é 2 105 Indivíduos AA e Aa são igualmente férteis Se 01 da população é aa qual pressão de seleção existe contra aa se a taxa de mutação de A a é 105 Presuma que as frequências alélicas estão em seus valores de equilíbrio Quando os alelos em um locus atuam de modo semidominante sobre a adaptabilidade o valor adaptativo relativo do heterozigoto está no meio da distância entre as duas classes homozigotas Por exemplo genótipos com semidominância no locus A podem apresentar esses valores adaptativos relativos wAA 10 wAa 09 e waa 08 a Altere um desses valores adaptativos de modo que aa se torne um alelo recessivo deletério b Altere um desses valores adaptativos de modo que AA se torne um alelo dominante favorecido Se o alelo recessivo em relação a uma doença recessiva ligada ao X em seres humanos apresenta uma frequência de 002 na população qual proporção de indivíduos na população apresentará a doença Presuma que 18 19 20 21 22 23 24 a população é 5050 masculinafeminina O daltonismo é um distúrbio recessivo ligado ao X em seres humanos causado por mutações em um dos genes que codificam a proteína opsina sensível à luz Se o alelo mutante apresenta uma frequência de 008 na população qual proporção de mulheres será portadora Presuma que a população é 5050 masculinafeminina Uma nova mutação neutra apresenta maior probabilidade de alcançar a fixação em uma população grande ou pequena Aparentemente está claro que o endocruzamento causa uma redução na adaptabilidade Você pode explicar o motivo Em uma população de 50000 indivíduos diploides qual é a probabilidade de que uma nova mutação neutra finalmente alcance a fixação Qual é a probabilidade de que ela finalmente seja perdida da população O endocruzamento em uma população causa um desvio das expectativas de HardyWeinberg de tal modo que existem mais homozigotos do que o esperado Em relação a um locus com um alelo deletério raro a uma frequência de 004 qual seria a frequência de homozigotos em relação ao alelo deletério em populações com coeficientes de endocruzamento de F 00 e F 0125 A anemia falciforme é um distúrbio autossômico recessivo causado pela substituição de um aminoácido na proteína βhemoglobina A mutação no DNA subjacente a essa substituição é um SNP que altera um códon GAG para o aminoácido glutamato para um GTG que codifica uma valina A frequência de anemia falciforme entre afroamericanos é de aproximadamente 1400 Qual é a frequência desse códon GTG no gene da βhemoglobina entre afroamericanos Você tem uma amostra de 10 sequências de DNA de 100 pb de comprimento de uma seção de um gene altamente conservado de 10 indivíduos de uma espécie As 10 sequências são quase totalmente 25 26 27 idênticas entretanto cada sequência carrega um SNP único não observado em qualquer uma das outras Qual é a diversidade nucleotídica em relação a essa amostra de sequências PROBLEMAS DESAFIADORES A Figura 1814 apresenta os dados de haplótipos em relação ao gene G6PD em uma amostra mundial de pessoas a Desenhe uma rede de haplótipos em relação a esses haplótipos Rotule os ramos nos quais cada SNP ocorre b Qual dos haplótipos apresenta a maioria das conexões com outros haplótipos c Em quais continentes esse haplótipo é encontrado d Contando o número de SNP ao longo dos ramos da sua rede quantas diferenças existem entre os haplótipos 1 e 12 A Figura 1812 demonstra um heredograma de um cruzamento entre meios irmãos a Se o coeficiente de endocruzamento em relação ao ancestral comum A na Figura 1812 é 12 qual é o coeficiente de endocruzamento de I b Se o coeficiente de endocruzamento do indivíduo I na Figura 1812 é 18 qual é o coeficiente de endocruzamento do ancestral comum A Considere 10 populações que apresentam as frequências genotípicas demonstradas na tabela a seguir População AA Aa aa 1 10 00 00 2 00 10 00 28 3 00 00 10 4 050 025 025 5 025 025 050 6 025 050 025 7 033 033 033 8 004 032 064 9 064 032 004 10 0986049 0013902 0000049 a Quais das populações estão em equilíbrio de HardyWeinberg b Quais são p e q em cada população c Na população 10 descobrese que a taxa de mutação de A a é de 5 106 Qual deve ser a adaptabilidade do fenótipo aa se a população está em equilíbrio d Na população 6 o alelo a é deletério além disso o alelo A é incompletamente dominante assim AA é perfeitamente adaptado Aa apresenta adaptabilidade de 08 e aa apresenta adaptabilidade de 06 Se não existir mutação quais serão p e q na próxima geração O gene da hemoglobina B Hb apresenta um alelo comum A de um SNP rs334 que codifica a forma HbA da hemoglobina adulta e um alelo raro 29 30 31 32 33 T que codifica a forma falciforme da hemoglobina HbS Entre 571 residentes de uma vila na Nigéria observouse que 440 indivíduos eram AA e 129 eram AT e 2 eram TT Utilize o teste do χ² para determinar se essas frequências genotípicas observadas correspondem às expectativas de HardyWeinberg Uma população apresenta as frequências gaméticas a seguir em dois loci AB 04 Ab 01 aB 01 e ab 04 Se possibilitarmos que a população cruze aleatoriamente até que o equilíbrio de ligação seja alcançado qual será a frequência esperada de indivíduos que são heterozigotos em ambos os loci Duas espécies de palmeiras diferem em 50 pb em um trecho de 5000 pb de DNA que se acredita ser neutro A taxa de mutação em relação a essas espécies é de 2 108 substituições por sítio por geração O tempo de geração em relação a essas espécies é de 5 anos Estime o tempo desde que essas espécies apresentavam um ancestral comum O daltonismo em seres humanos é causado por um alelo recessivo ligado ao X Dez por cento dos homens de uma população grande e de cruzamento aleatório são daltônicos Um grupo representativo de 1000 pessoas dessa população migra para uma ilha do Pacífico Sul onde já existem 1000 habitantes e na qual 30 dos homens são daltônicos Presumindo que o equilíbrio de HardyWeinberg é totalmente aplicável nas duas populações originais antes da migração e na população mista imediatamente após a migração qual fração de homens e mulheres esperase que seja daltônica na geração imediatamente após a chegada dos migrantes Com a utilização de diagramas de heredogramas calcule o coeficiente de endocruzamento F em relação à descendência de a cruzamentos entre pais e filhos b cruzamentos entre primos em primeiro grau c cruzamentos entre tia e sobrinho ou tio e sobrinha d autofertilização de um hermafrodita Um grupo de 50 homens e 50 mulheres estabelece uma colônia em uma ilha remota Após 50 gerações de cruzamentos aleatórios quão frequente seria 34 35 36 um traço recessivo se ele apresentasse uma frequência de 1500 no continente A população permanece do mesmo tamanho durante as 50 gerações e o traço não apresenta efeito sobre a adaptabilidade A Figura 1822 demonstra 10 haplótipos de uma população antes de uma varredura seletiva e outros 10 haplótipos muitas gerações depois após a ocorrência de uma varredura seletiva em relação a essa região cromossômica Existem 11 loci que definem cada haplótipo incluindo um com um alelo vermelho que era o alvo da seleção Na figura dois loci estão designados A e B Cada um desses loci apresenta dois alelos um preto e o outro cinza Calcule o parâmetro do desequilíbrio de ligação D entre A e B tanto antes quanto após a varredura seletiva Qual efeito a varredura seletiva apresentou sobre o nível do desequilíbrio de ligação A taxa de recombinação r entre os loci ligados A e B é de 010 Em uma população observamos as frequências haplotípicas a seguir AB 040 aB 010 Ab 010 ab 040 a Qual é o nível do desequilíbrio de ligação conforme medido por D na geração atual b Qual será D na próxima geração c Qual é a frequência esperada do haplótipo Ab na próxima geração d Com a utilização de um software de planilhas construa um gráfico do declínio em D ao longo de 10 gerações O alelo B é um autossômico dominante deletério A frequência de indivíduos afetados é 40 106 A capacidade reprodutiva desses indivíduos é de aproximadamente 30 daquela dos indivíduos normais 37 38 39 40 41 Estime μ a taxa na qual b sofre mutação para o seu alelo deletério B Presuma que as frequências alélicas estão em seus valores de equilíbrio Qual é o equilíbrio de heterozigosidade para um SNP em uma população de 50000 quando a taxa de mutação é 3 108 De 31 crianças nascidas de cruzamentos entre pai e filha 6 morreram no primeiro ano de vida 12 eram muito anormais e morreram na infância e 13 eram normais A partir dessa informação calcule aproximadamente quantos genes letais recessivos nós apresentamos em média em nossos genomas humanos Dica se a resposta for 1 uma filha então apresenta uma chance de 50 de carregar o alelo letal e a probabilidade de a união produzir uma combinação letal será 12 14 18 Assim 1 não é a resposta Considere também a possibilidade de fatalidades in utero não detectadas nos referidos cruzamentos Como elas afetariam o seu resultado O locus B apresenta dois alelos B e b com frequências de 095 e 005 respectivamente em uma população na geração atual As adaptabilidades genotípicas nesse locus são wBB 10 wBb 10 e wbb 00 a Qual será a frequência do alelo b em duas gerações b Qual será a frequência do alelo b em duas gerações se as adaptabilidades forem wBB 10 wBb 00 e wbb 00 c Explique por que existe uma diferença na taxa de alteração em relação à frequência do alelo b sob as partes a e b deste problema O gene sd causa uma doença letal da infância em seres humanos quando em homozigose Um em 100000 recémnascidos morre a cada ano em virtude dessa doença A taxa de mutação de Sd para sd é de 2 104 Qual deve ser a adaptabilidade do heterozigoto para explicar a frequência do gene observada em vista da taxa de mutação Atribua um valor adaptativo relativo de 10 para os homozigotos SdSd Presuma que a população está em equilíbrio em relação à frequência de sd Se definirmos o custo da seleção total para uma população de genes recessivos deletérios como a perda de adaptabilidade por indivíduo afetado s multiplicada pela frequência de indivíduos afetados q² então 42 o custo da seleção sq² a Suponha que uma população esteja em equilíbrio entre mutação e deleção em relação a um alelo recessivo deletério em que s 05 e μ 10 5 Qual é a frequência de equilíbrio do alelo Qual é o custo da seleção b Suponha que iniciamos irradiando membros individuais da população de modo que a taxa de mutação seja duplicada Qual é a nova frequência de equilíbrio do alelo Qual é o novo custo de seleção c Se não alterarmos a taxa de mutação mas em vez disso reduzirmos o coeficiente de seleção para 03 o que acontece com a frequência de equilíbrio e o custo da seleção A seleção balanceadora atua para manter a diversidade genética em um locus tendo em vista que a classe heterozigota apresenta adaptabilidade maior do que as classes homozigotas Sob esse tipo de seleção as frequências alélicas na população se aproximam de um ponto de equilíbrio em algum ponto entre 0 e 1 Considere um locus com dois alelos A e a com frequências p e q respectivamente As adaptabilidades genotípicas relativas estão demonstradas a seguir em que s e g são as desvantagens seletivas das duas classes homozigotas Genótipo AA Aa aa Adaptabilidade relativa 1 s 1 1 g a Em equilíbrio a adaptabilidade média dos alelos A wA será igual à adaptabilidade média dos alelos a wa ver Quadro 187 Estabeleça a adaptabilidade média dos alelos A wA igual à adaptabilidade média dos alelos a wa Solucione a equação resultante em relação à frequência do alelo A Essa é a expressão em relação à frequência de equilíbrio de A b Utilizando a expressão que você acabou de derivar encontre p quando s 02 e g 08 191 O exastro de basquete Kareem AbdulJabbar 218 m de altura e o famoso exjóquei Willie Shoemaker 150 m demonstram alguns dos extremos na altura humana um traço quantitativo Associated Press TÓPICOS Medida da variação quantitativa 192 193 194 195 196 O Modelo genético simples para os traços quantitativos Herdabilidade no sentido amplo Natureza versus criação Herdabilidade no sentido restrito Previsão dos fenótipos Mapeamento de QTL em populações com heredogramas conhecidos Mapeamento de associação em populações de cruzamento aleatório RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Em relação a qualquer característica em particular analisar dados para determinar o quanto da variação em uma população ocorre em virtude de fatores genéticos e o quanto em virtude de fatores ambientais Utilizar o conhecimento sobre os fenótipos parentais para prever o fenótipo da descendência Determinar quantos genes contribuem para a variação genética de um traço Identificar os genes específicos que contribuem para a variação em traços quantitativos nas populações bserve quase qualquer grande grupo de homens e mulheres e você notará uma variação considerável nas suas alturas alguns são baixos alguns altos e alguns têm estatura mediana Kareem AbdulJabbar um astro pivô de basquete das décadas de 1970 e 1980 era altíssimo com 218 m de altura enquanto Willie Shoemaker um famoso jóquei que venceu o Kentucky Derby quatro vezes tinha meros 150 m Você também pode ter observado que em algumas famílias os genitores e seus filhos adultos são todos do grupo dos altos enquanto em outras famílias os genitores e os filhos adultos são todos razoavelmente baixos Tais observações sugerem que os genes desempenham um papel na determinação das nossas alturas Ainda assim as pessoas não são segregadas claramente nas categorias alta e baixa conforme vimos em relação às ervilhas de Mendel Na primeira inspeção os traços contínuos tais como a altura não aparentam seguir as leis de Mendel apesar do fato de serem hereditários Traços tais como a altura que demonstram uma amplitude de variação contínua e que não se comportam do modo mendeliano simples são conhecidos como traços quantitativos ou complexos O termo traço complexo com frequência é preferido em virtude da variação em relação a tais traços ser regulada por um complexo de fatores genéticos e ambientais Quão alto você é pode ser parcialmente explicado pelos genes que herdou de seus pais e parcialmente por fatores ambientais tais como quão bemnutrido você foi quando criança Discriminar as contribuições genéticas e ambientais em relação a um fenótipo individual é um desafio substancial mas os geneticistas apresentam um poderoso conjunto de recursos para a sua conquista No início do século 20 quando as leis de Mendel foram redescobertas surgiu uma controvérsia sobre o fato de elas serem ou não aplicáveis aos traços contínuos Um grupo conhecido como os biometristas descobriu que existem correlações entre os parentes em relação aos traços contínuos de modo que genitores altos tendem a ter filhos altos Entretanto os biometristas não observaram evidências de que os referidos traços seguissem as leis de Mendel Alguns biometristas concluíram que os loci de Mendel não controlam os traços contínuos Por outro lado alguns adeptos do mendelismo pensavam que a variação contínua não era importante e que ela poderia ser ignorada no estudo da herança Em 1920 essa controvérsia foi resolvida com a formulação da hipótese multifatorial Essa hipótese propôs que os traços contínuos são regulados por uma combinação de múltiplos loci mendelianos cada um com um pequeno efeito sobre o traço e por fatores ambientais A hipótese multifatorial trouxe os traços quantitativos para o reino da genética mendeliana Embora a hipótese multifatorial tenha fornecido uma explicação sensível em relação à variação contínua a análise mendeliana clássica é inadequada para o estudo dos traços complexos Se a progênie não puder ser classificada em categorias com proporções esperadas a abordagem mendeliana então apresenta pouca utilidade para a análise de traços complexos Em resposta a esse problema os geneticistas desenvolveram um conjunto de modelos matemáticos e métodos estatísticos para a análise de traços complexos Por meio da aplicação desses métodos analíticos os geneticistas realizaram grandes avanços na compreensão sobre os traços complexos A subárea da genética que desenvolve e aplica esses métodos para a compreensão da herança de traços complexos é denominada genética quantitativa No cerne da área da genética quantitativa está o objetivo de definir a arquitetura genética de traços complexos A arquitetura genética é uma descrição de todos os fatores genéticos que influenciam um traço Ela inclui o número de genes que afetam o traço e a contribuição relativa de cada gene Alguns genes podem apresentar um grande efeito sobre o traço enquanto outros apresentam apenas um pequeno efeito Conforme veremos neste capítulo a arquitetura genética é a propriedade de uma população específica e pode variar entre as populações de uma espécie Por exemplo a arquitetura genética de um traço tal como a pressão arterial sistólica em seres humanos varia entre as diferentes populações Isso ocorre porque diferentes alelos segregam em diferentes populações e diferentes populações vivenciam ambientes diferentes portanto diferentes populações estão aptas a apresentar diferentes arquiteturas em relação a muitos traços A compreensão da herança de traços complexos é um dos desafios mais importantes que os geneticistas enfrentam no século 21 Os traços complexos são de suprema importância na genética médica e agrícola Para os seres humanos a pressão arterial o peso corporal a suscetibilidade à depressão os níveis séricos de colesterol e o risco de desenvolvimento de câncer ou outros distúrbios são todos traços complexos Para as plantas de cultivo o nível de produção a resistência a patógenos a capacidade de tolerar o estresse pela seca a eficiência da captação de fertilizantes e até mesmo o sabor são todos traços complexos Para o gado a produção de leite em vacas leiteiras a massa muscular no gado de corte o tamanho da ninhada em porcos e a produção de ovos em galinhas são todos traços complexos Apesar da importância dos referidos traços sabemos muito menos a respeito de sua herança do que sabemos a respeito da herança de traços herdados de modo simples tais como a fibrose cística ou a anemia falciforme Neste capítulo exploraremos a herança dos traços complexos Iniciaremos com uma revisão de alguns conceitos estatísticos básicos Em seguida desenvolveremos o modelo matemático utilizado para conectar a ação de genes na 191 célula com os fenótipos que observamos no nível do organismo inteiro Com a utilização desse modelo em seguida demonstraremos como os geneticistas quantitativos separam a variação fenotípica em uma população nas partes que ocorrem em virtude de fatores genéticos e ambientais Revisaremos os métodos utilizados por cultivadores de plantas e criadores de animais para prever o fenótipo da descendência a partir do fenótipo de seus genitores Finalmente veremos como uma combinação da análise estatística e de marcadores moleculares pode ser utilizada para identificar os genes específicos que controlam os traços quantitativos Medida da variação quantitativa Para estudar a herança de traços quantitativos necessitamos de algumas ferramentas estatísticas básicas Nesta seção introduziremos a média que pode ser utilizada para descrever as diferenças entre os grupos e a variância que pode ser utilizada para mensurar a quantidade de variação que existe em um grupo Também discutiremos sobre a distribuição normal que é central para a compreensão da variação quantitativa nas populações Mas antes de discutir as ferramentas estatísticas definiremos os diferentes tipos de variação em traços complexos que podem ocorrer em uma população Tipos de traço e herança Um traço contínuo é um traço que pode assumir um número possivelmente infinito de estados ao longo de uma variação contínua A altura em seres humanos é um bom exemplo As pessoas podem variar de aproximadamente 140 a 230 cm de altura Se medíssemos a altura com precisão o número possível de alturas seria infinito Por exemplo uma pessoa pode ter 170 cm de altura ou 1702 ou 1700002 cm Os traços contínuos tipicamente apresentam uma herança complexa que envolve múltiplos genes além de fatores ambientais Em relação a alguns traços os indivíduos em uma população podem ser classificados em grupos ou categorias distintas Os referidos traços são conhecidos como traços categóricos Exemplos incluem flores roxas versus brancas ou caules altos versus baixos em relação às ervilhas de Mendel conforme vimos no Capítulo 2 Os traços categóricos com frequência exibem uma herança simples de tal modo que a progênie de cruzamentos segrega em razões mendelianas padrão tais como 31 em relação a um gene único ou 151 em relação a dois genes A herança é simples em virtude de apenas um ou dois genes estarem envolvidos e o ambiente apresentar pouco ou nenhum efeito sobre o fenótipo Alguns traços categóricos não demonstram herança simples Esses incluem muitas condições de doenças em seres humanos Em genética médica os indivíduos podem ser classificados nas categorias acometidos ou não acometidos por uma doença Por exemplo um indivíduo pode ou não ter diabetes tipo 2 Entretanto o diabetes tipo 2 não segue as regras mendelianas simples nem produz razões mendelianas nos heredogramas Em vez disso existem múltiplos fatores genéticos e ambientais que impõem a uma pessoa o risco de desenvolvimento dessa doença Os indivíduos que apresentam um determinado número de fatores de risco ultrapassarão um limiar e desenvolverão a doença O diabetes tipo 2 é um traço categórico denominado traço de limiar e apresenta herança complexa Outro tipo de traço é o traço merístico ou traço de contagem que assume uma diversidade de valores distintos Um exemplo seria o tamanho da ninhada em aves Uma ave pode pôr 1 2 3 ou mais ovos mas não pode pôr 249 ovos Os traços merísticos são quantitativos mas estão restritos a valores definidos Eles não assumem uma variação contínua de valores Os traços merísticos normalmente apresentam herança complexa Geneticistas quantitativos buscam compreender a herança de traços que demonstram herança complexa que resulta de uma combinação de fatores genéticos e ambientais Eles podem investigar traços que são categóricos merísticos ou contínuos A ênfase está no tipo de herança complexa Por esse motivo o termo traço complexo com frequência é preferido ao traço contínuo ou quantitativo tendo em vista que inclui todos os tipos de traços com os quais a genética quantitativa se preocupa Qualquer fenômeno biológico em relação ao qual existe uma variação pode demonstrar herança complexa e pode ser estudado como um traço complexo Portanto o tamanho e a forma das estruturas a cinética enzimática os níveis de mRNA os ritmos circadianos e os cantos das aves podem ser todos tratados como traços complexos Média Quando os geneticistas quantitativos estudam a herança de um traço eles trabalham com um grupo de indivíduos em particular ou população Por exemplo podemos estar interessados na herança da altura em relação à população de homens adultos em Xangai na China Aqui estamos utilizando população para indicar um grupo que compartilha determinadas características em comum tais como idade sexo etnia ou origem geográfica Tendo em vista que existem mais de 5 milhões de homens adultos em Xangai a determinação de cada uma das suas alturas seria uma tarefa hercúlea Portanto geneticistas quantitativos estudam tipicamente apenas um subconjunto ou amostra da população total A amostra deve ser escolhida aleatoriamente de tal modo que cada um dos 5 milhões de homens apresente uma chance igual de ser incluído na amostra Se a amostra satisfizer a esse critério então podemos utilizar medidas realizadas na amostra para fazer inferências a respeito da população inteira Utilizando o exemplo da altura para os homens de Xangai podemos descrever a população com a utilização da média ou do valor médio em relação ao traço Selecionamos uma amostra aleatória de 100 homens da população e medimos as suas alturas Alguns dos homens podem ter 166 cm de altura outros 172 cm de altura e assim por diante Para calcular a média simplesmente somamos todas as medidas individuais e dividimos a soma pelo tamanho da amostra n que nesse caso é 100 Em relação aos dados na Tabela 191 o resultado seria 170 cm ou 5 pés e 7 polegadas Tendo em vista que temos uma amostra aleatória podemos inferir que a altura média da população inteira é de 170 cm A altura é uma variável aleatória o que significa que pode assumir diferentes valores e quando selecionamos alguém da população aleatoriamente o valor que observamos é regulado por um elemento ao acaso As variáveis aleatórias normalmente são representadas pela letra X em estatística Temos as medidas de X1 X2 X3 X100 em relação aos n 100 homens na amostra Simbolicamente podemos expressar a média como em que representa a média da amostra A letra grega maiúscula sigma Σ é o sinal de somatório que indica que adicionamos todos os n valores de X observados em relação a i 1 2 até n Com frequência o n sobre Σ e o i 1 abaixo de Σ são omitidos para simplificar o aspecto das equações Existe uma distinção que é feita entre a média de uma amostra e a média verdadeira da população Para conhecer a média verdadeira em relação à altura dos homens em Xangai precisaríamos determinar a altura de todo e cada homem A média verdadeira é simbolizada pela letra grega μ e assim temos diferentes símbolos para as médias da amostra e da população Aqui está outro modo para calcular a média que com frequência é consideravelmente útil Podemos adicionar os produtos de cada classe de valores de X no conjunto de dados vezes a frequência daquela classe no conjunto de dados Essa operação é simbolizada como em que fi é a frequência da iésima classe de observações Xi é o valor da iésima classe e existe um total de k classes Em relação aos dados na Tabela 191 um homem dos 100 f 001 tem 156 cm de altura dois homens f 002 têm 157 cm de altura e assim por diante e portanto podemos calcular a média da amostra como 001 156 002 157 002 184 170 A média é útil para descrever populações e para comparar as diferenças entre as populações Por exemplo homens em áreas urbanas da China têm em média 170 cm de altura enquanto homens em áreas rurais da China têm 166 cm de altura Esses valores foram calculados com a utilização de amostras coletadas de cada região Uma questão que um geneticista quantitativo pode indagar a respeito da diferença observada na altura entre homens chineses rurais e urbanos é a seguinte A diferença ocorre em virtude de fatores genéticos ou ocorre em virtude de diferenças na nutrição nos cuidados de saúde ou outros fatores ambientais Posteriormente no capítulo veremos como os geneticistas quantitativos desmembram as contribuições genéticas versus ambientais para um traço Por último existe outra anotação útil da estatística que pode ser utilizada para definir a média A média de uma variável aleatória X é a expectativa ou o valor esperado daquela variável aleatória O valor esperado é a média de todos os valores que observaríamos se medíssemos X muitas vezes A expectativa é simbolizada por E e escrevemos EX para significar o valor esperado de X Simbolicamente escrevemos EX Tabela 191 Dados simulados em relação à altura de 100 homens de Xangai na China Altura cm Contagem Frequência Altura 156 1 156 157 2 314 158 1 158 159 2 318 160 1 160 161 1 161 162 2 324 164 7 1148 165 7 1155 166 1 166 167 6 1002 168 9 1512 169 7 1183 170 9 1530 171 5 855 172 5 860 173 6 1038 174 5 870 175 6 1050 176 3 528 177 4 708 178 2 356 179 2 358 180 2 360 181 2 362 184 2 368 Soma 100 1700 Utilizaremos a anotação de expectativa em diversos locais neste capítulo Variância Além da média também precisamos de uma medida para quantificar a variação existente nas populações Podemos criar uma representação visual da variação ao inserir em um gráfico a contagem ou a frequência de cada classe de altura A Figura 191 demonstra um referido gráfico em relação aos nossos dados de altura simulados para 100 homens de Xangai O eixo x demonstra diferentes classes de altura e o eixo y demonstra a contagem ou a frequência de cada classe Nessa figura os homens foram acondicionados em grupos de 4 cm por exemplo entre 155 e 158 cm Esse tipo de gráfico é denominado histograma de frequência Se os valores estiverem agrupados firmemente ao redor da média existe então menos variação e se os valores estiverem dispersos ao longo do eixo x existe maior variação FIGURA 191 Histograma de frequências de dados simulados em relação à altura de homens adultos de Xangai na China Podemos quantificar a variação em uma população ao utilizar uma medida estatística denominada variância A variância mede a extensão até a qual os indivíduos na população se desviam da média da população Se todos os 100 homens em nossa amostra apresentassem alturas muito próximas da média a variância seria então pequena Se as suas alturas se desviassem amplamente da média a variância seria grande Tendo em vista que a variância é uma medida de desvio da média definiremos o desvio matematicamente Conhecendo o valor médio em relação à variável aleatória X podemos calcular o desvio do referido indivíduo da média ao subtrair das observações individuais Representaremos os desvios por um x minúsculo x X Alguns indivíduos apresentarão valores de X acima da média e eles apresentarão um desvio positivo Outros apresentarão valores de X abaixo da média e eles apresentarão um desvio negativo Em relação à população em geral o valor esperado de x é 0 ou Ex 0 Para medir a quantidade de variação em relação a X na população utilizamos a variância que é a média dos desvios ao quadrado Primeiramente calculamos a soma dos desvios ao quadrado ou soma dos quadrados abreviadamente como Tendo em vista que os desvios com valores negativos formam quadrados positivos ambos os desvios negativos e positivos contribuirão positivamente para a soma dos quadrados A variância é a média dos desvios ao quadrado ou a soma dos quadrados dividida por n Simbolicamente expressamos a variância da população como em que VX indica a variância de X A variância da população por vezes é simbolizada com a utilização da letra grega sigma minúscula ao quadrado σ² Em estatística também é feita uma distinção entre a variância da população σ² e a variância da amostra s² A última é calculada ao dividir as somas dos quadrados por n 1 em vez de n para corrigir um desvio causado por um tamanho de amostra pequeno Para simplicidade utilizaremos a variância da população e a fórmula anterior em todo este capítulo Existem diversos pontos a serem compreendidos a respeito da variância Primeiramente a variância fornece uma medida da dispersão ao redor da média Quando a variância é alta os valores indivíduos estão dispersos até mais distante da média quando ela é baixa então os valores individuais são agrupados mais próximo da média Em segundo lugar a variância é medida em unidades ao quadrado de tal modo que se medirmos a altura humana em centímetros a variância então será em centímetros² Em terceiro lugar a variância pode variar de 00 até o infinito Em quarto lugar a variância é igual ao valor esperado do desvio elevado ao quadrado x² ou E x² A variância dos traços quantitativos é medida em unidades ao quadrado Essas unidades ao quadrado apresentam propriedades matemáticas desejáveis conforme veremos a seguir entretanto elas não fazem sentido intuitivamente Se medirmos o peso em quilogramas a variância então será em quilogramas² que não apresenta um sentido claro Portanto outra estatística utilizada para quantificar a extensão do desvio da média em uma população é o desvio padrão σ que é a raiz quadrada da variância O desvio padrão é expresso nas mesmas unidades que o próprio traço e assim o seu significado é mais intuitivo Utilizaremos o desvio padrão na descrição dos traços a seguir Distribuição normal Até mesmo se você nunca fez um curso de estatística provavelmente você ouviu falar da distribuição normal também conhecida como a curva sinosoidal A distribuição normal é notavelmente útil na biologia em geral e na genética quantitativa em particular tendo em vista que a distribuição de frequência em relação a muitos traços biológicos se aproxima de uma curva normal Por esse motivo geneticistas podem tirar vantagem de diversas características da distribuição normal para descrever os traços quantitativos e dissecar a genética subjacente A distribuição normal é uma distribuição de frequência contínua semelhante ao histograma de frequência demonstrado na Figura 191 A distribuição normal se aplica aos traços contínuos Conforme mencionado anteriormente os traços contínuos podem assumir um número infinito de valores Uma pessoa pode ter 170 cm de altura ou 1702 ou 170002 e assim por diante Em relação a tais traços a frequência esperada de diferentes valores de traço é mais bemrepresentada por uma curva do que por um histograma de frequência Em relação à distribuição normal o formato da curva é determinado por dois fatores a média e o desvio padrão Aqui está um exemplo com a utilização de dados da altura em relação a 660 mulheres dos EUA coletados pelos Centers for Disease Control and Prevention O histograma de frequência demonstra o formato clássico da curva sinusoidal com o pico próximo do valor médio de 1644 cm e os valores fora da média distribuídos simetricamente ao redor da média Figura 192 A Podemos adaptar uma curva normal a essa distribuição utilizando apenas duas informações a média e o desvio padrão A forma da curva é definida por uma equação denominada função de densidade da probabilidade normal na qual a média e o desvio padrão estão conectados A distribuição normal possibilita que prevejamos a porcentagem das observações que estará situada dentro de uma determinada distância da média Figura 192 B Se medirmos a distância ao longo do eixo x em desvios padrões então é esperado que 68 das observações estejam situadas dentro de 1 desvio padrão σ da média e 955 dentro de 2 desvios padrões Em relação aos dados da altura das mulheres norteamericanas 71 449 mulheres estão situadas dentro de 1 desvio padrão da média e 96 633 mulheres dentro de 2 desvios padrões Esses valores estão muito próximos das previsões de 682 e 955 com base na curva normal Se conhecermos apenas a média e o desvio padrão em relação a um traço podemos prever a forma da distribuição do traço na população e podemos prever como provavelmente observaremos determinados valores na realização de amostragem da população Por exemplo se a altura média em relação às mulheres norteamericanas é de 1644 cm 5 pés e 5 polegadas e o desvio padrão é de 618 cm podemos prever que apenas 2 das mulheres terão mais de 177 cm de altura ou 5 pés e 10 polegadas Conforme demonstrado na Figura 192 C se o desvio padrão for maior p ex 8 então a curva será mais achatada e maior porcentagem estará situada acima de 177 cm Entretanto ainda seria verdadeiro que apenas 2 estariam a mais de 2σ acima da média ou 1804 cm 1644 2 8 CONCEITOCHAVE Um traço complexo é qualquer traço que não demonstre herança mendeliana simples Um traço complexo pode ser um traço descontínuo tal como a presença ou a ausência de uma condição de doença ou um traço continuamente variável tal como a altura em seres humanos O campo da genética quantitativa estuda a herança de traços complexos com a utilização de algumas ferramentas estatísticas básicas incluindo a média a variância e a distribuição normal FIGURA 192 A Histograma de frequência de dados reais em relação à altura de mulheres adultas dos EUA A linha vermelha representa a adaptação da curva normal a estes dados com uma média de 1644 cm e desvio padrão de 618 cm B Curva normal em relação à altura de mulheres norteamericanas 192 demonstrando as porcentagens previstas de mulheres que estarão classificadas dentro de diferentes números de desvios padrões da média C Curvas normais com a mesma média 1644 cm mas diferentes desvios padrões demonstrando o efeito do desvio padrão sobre a forma da curva Modelo genético simples para os traços quantitativos Um modelo matemático é uma representação simplificada de um fenômeno complexo Como um exemplo podemos colocar um balde sob uma torneira aberta e medir o volume de água no balde como uma função da quantidade de tempo que o balde é deixado sob a torneira volume função tempo Podemos construir um modelo mais detalhado que inclua a velocidade na qual a água sai da torneira volume função velocidade tempo Os modelos nos possibilitam descrever um fenômeno em termos das variáveis que o influenciam e em seguida utilizar o modelo para fazer previsões a respeito do estado do fenômeno sob valores diferentes em relação a essas variáveis Nesta seção definiremos o modelo matemático utilizado por geneticistas quantitativos para estudar traços complexos Desvios genéticos e ambientais Agora examinaremos como os fenótipos podem ser decompostos em suas contribuições genéticas e ambientais utilizando como um exemplo a altura de Yao Ming o expivô do time de basquete Houston Rockets Yao Ming tem a altura de 229 cm ou 7 pés e 6 polegadas Figura 193 Isso mesmo Yao Ming é quase 60 cm mais alto do que o homem médio de Xangai que é justamente a cidade natal de Yao Ming Assim como em relação a todos nós a altura de Yao Ming é o resultado combinado do seu genótipo e do ambiente no qual ele cresceu Faremos um experimento imaginário e veremos como podemos desmembrar as contribuições genéticas e ambientais em relação à altura excepcional de Yao Ming Primeiramente definiremos um modelo matemático simples que possa ser aplicado para qualquer traço quantitativo O valor para um indivíduo em relação a um traço X pode ser expresso em termos da média da população e dos desvios da média em virtude de fatores genéticos g e ambientais e X g e Estamos utilizando as letras minúsculas g e e para os desvios genéticos e ambientais assim como utilizamos uma letra minúscula x para o desvio de X da média Portanto no caso de Yao Ming a sua altura pode ser expressa como o valor médio dos homens de Xangai 170 cm mais os seus desvios genético e ambiental específicos g e 59 cm Podemos simplificar a equação anterior ao subtrair de ambos os lados para obter x g e FIGURA 193 O astro pivô de basquete Yao Ming que tem 229 cm ou 7 pés e 6 polegadas de altura passando por um grupo de praticantes de marcha atlética STRAFPGetty ImagesNewscom em que x representa o desvio fenotípico do indivíduo Para Yao Ming x g e 59 Como podemos determinar os valores de g e e em relação a Yao Ming Um modo seria se tivéssemos clones de Yao Ming os clones são indivíduos geneticamente idênticos Imaginemos que clonamos Yao Ming e que distribuímos esses clones quando recémnascidos para um grupo de famílias escolhidas aleatoriamente em Xangai Vinte e um anos depois localizamos esse exército de clones de Yao Ming medimos as suas alturas e determinamos que a sua altura média é de 212 cm A expectativa de e nos muitos ambientes nos quais os clones de Yao Ming foram criados é 0 Em algumas famílias os clones obtêm um ambiente positivo e e em outras um ambiente negativo e Em geral Ee 0 Portanto a média para os clones menos a média da população é igual ao desvio genotípico de Yao Ming ou g 212 170 42 cm Os 17 cm remanescentes de seu extraordinário desvio fenotípico de 59 cm é e para o ambiente específico no qual o Yao Ming real cresceu Acoplando esses valores na equação anterior obtemos 229 170 42 17 Concluímos que a altura excepcional de Yao Ming ocorre principalmente em virtude da genética excepcional mas ele também vivenciou um ambiente que reforçou a sua altura Embora o nosso experimento imaginário de clonagem de Yao Ming seja exagerado muitas espécies de plantas e algumas espécies de animais podem ser propagadas pela clonagem com facilidade Por exemplo podese utilizar cortes de uma planta individual para produzir múltiplos indivíduos geneticamente idênticos Outro modo de criar indivíduos geneticamente idênticos é por meio da produção de linhagens ou cepas endocruzadas Quadro 191 Todos os indivíduos nas referidas linhagens são geneticamente idênticos tendo em vista que são totalmente endocruzados a partir de um genitor ou genitores em comum Ao utilizar clones ou linhagens endocruzadas os geneticistas podem estimar as contribuições genéticas e ambientais em relação a um traço ao criar os clones em ambientes atribuídos aleatoriamente Aqui está um exemplo A Tabela 192 experimento I demonstra dados simulados em relação a 10 linhagens endocruzadas de milho que foram cultivadas em três ambientes diferentes e pontuadas em relação ao número de dias entre o plantio e a ocasião em que as plantas liberaram pólen pela primeira vez A média geral é de 70 dias Consideraremos a linhagem A quando cultivada no ambiente 1 A média para todas as linhagens no ambiente 1 é de 68 ou 2 a menos do que a média geral e assim e para o ambiente 1 é 2 A média da linhagem A em todos os três ambientes é de 64 ou 6 a menos do que a média geral e assim g para a linhagem A é 6 Reunindo esses dois valores decompomos o fenótipo da linhagem A quando cultivada no ambiente 1 como Quadro 191 Linhagens endocruzadas Uma linhagem endocruzada é uma linhagem específica de uma espécie de planta ou animal que foi autofertilizada ou submetida ao cruzamento entre irmãos durante múltiplas gerações de tal modo que ela se torna homozigota ou endocruzada na maior parte de seu genoma A autofertilização pode ser utilizada em espécies hermafroditas tais como a maior parte das plantas Nesse processo apenas uma semente é utilizada para formar cada geração subsequente No milho por exemplo uma única planta individual é escolhida e autopolinizada Em seguida na próxima geração uma única planta de sua descendência é escolhida e autopolinizada Na terceira geração uma única planta de sua descendência é escolhida e autopolinizada e assim por diante Suponha que a planta original seja uma heterozigota Aa a autopolinização produzirá então descendência que é heterozigota e homozigota AA mais aa Do conjunto de todos os loci heterozigotos no genoma então após uma geração de autopolinização apenas ainda será heterozigota após duas gerações após três gerações e assim por diante Na nésima geração em que Hetn é a proporção de loci heterozigotos na nésima geração e Het0 é a proporção na geração 0 Quando a autofecundação não é possível o cruzamento entre irmão e irmã alcançará a mesma finalidade embora mais lentamente A tabela demonstra a quantidade de heterozigosidade remanescente após n gerações de autofecundação e cruzamento entre irmão e irmã Heterozigosidade remanescente Geração Autofecundação Cruzamento irmãoirmã 0 1000 1000 1 0500 0750 2 0250 0625 3 0125 0500 4 00625 0406 5 003125 0338 10 0000977 0114 20 095 106 0014 n Hetn Hetn1 Hetn Hetn1 Hetn2 As linhagens endocruzadas são imensamente importantes não apenas na genética quantitativa mas na genética em geral Geneticistas desenvolveram muitas linhagens endocruzadas para diferentes organismosmodelo incluindo Drosophila camundongo C elegans levedura Arabidopsis e milho Se uma linhagem endocruzada for utilizada em um experimento sabese então que os indivíduos que recebem diferentes tratamentos são geneticamente idênticos Portanto quaisquer diferenças observadas entre os tratamentos não podem ser atribuídas às diferenças genéticas entre os indivíduos utilizados no experimento Tabela 192 Dados simulados em relação aos dias até a polinização para 10 linhagens endocruzadas de milho cultivadas em dois experimentos Experimento I Linhagens endocruzadas A B C D E F G H I J Ambiente 1 62 64 66 66 68 68 70 70 72 74 Ambiente 2 64 66 68 68 70 70 72 72 74 76 Ambiente 3 66 68 70 70 72 72 74 74 76 78 Média 64 66 68 68 70 70 72 72 74 76 Experimento II Linhagens endocruzadas A B C D E F G H I J Ambiente 4 58 60 62 62 64 64 66 66 68 70 Ambiente 5 64 66 68 68 70 70 72 72 74 76 Ambiente 6 70 72 74 74 76 76 78 78 80 83 Média 64 66 68 68 70 70 72 72 74 76 62 70 6 2 Podemos fazer os mesmos cálculos em relação às outras nove linhagens endocruzadas e em seguida teríamos uma descrição completa de todos os fenótipos em cada ambiente em termos da extensão na qual o seu desvio da média geral ocorre em virtude de fatores genéticos e ambientais Variâncias genética e ambiental Podemos utilizar o modelo simples x g e para pensar adicionalmente a respeito da variância de traços quantitativos Relembre que a variância é um modo de medir o quanto os indivíduos se desviam da média da população Sob esse modelo a variância do traço pode ser separada nas variâncias genética e ambiental VX Vg Ve Esta equação simples nos informa que o traço ou a variação fenotípica VX é a soma de dois componentes a variância genética Vg e a variância ambiental Ve Conforme observado no Quadro 192 existe uma presunção importante por trás dessa equação a saber que o genótipo e o ambiente não estão correlacionados ou seja eles são independentes Se os melhores genótipos estão inseridos nos melhores ambientes e os piores genótipos nos piores ambientes essa equação então fornece resultados imprecisos Discutiremos essa presunção importante posteriormente no capítulo Podemos utilizar os dados da Tabela 192 experimento I para explorar a equação em relação às variâncias Primeiramente utilizaremos todos os 30 valores fenotípicos em relação às 10 linhagens nos três ambientes para calcular a variância O resultado é VX 1467 dias² Agora para estimar Vg calculamos a variância das médias entre as 10 linhagens endocruzadas O resultado é Vg 120 dias² Finalmente para estimar Ve calculamos a variância das médias entre os três ambientes O resultado é Ve 267 dias² Portanto a variância fenotípica 1467 é igual à variância genética 120 mais a variância ambiental 267 A equação funciona em relação a esses dados porque o genótipo e o ambiente não estão correlacionados Todos os genótipos experimentam a mesma variação de ambientes Se calcularmos os desvios padrões em relação aos dados na Tabela 192 experimento I observaremos que o desvio padrão fenotípico 383 não é a soma dos desvios padrões genético 346 e ambiental 163 As variâncias podem ser decompostas em diferentes fontes Os desvios padrões não podem ser decompostos dessa maneira A seguir veremos como essa propriedade da variância é útil para quantificar a extensão na qual a variação do traço é hereditária versus ambiental Quadro 192 Variâncias genética e ambiental Para compreender melhor a equação básica VX Vg Ve precisamos introduzir um novo conceito de estatística a covariância A covariância proporciona uma medida da associação entre os traços Em relação a duas variáveis aleatórias X e Y a sua covariância é em que x e y são os desvios de X e Y de suas respectivas médias conforme descrito no texto principal O termo Xi Yi ou xiyi é denominado produto cruzado A covariância é obtida somando todos os produtos cruzados em conjunto e dividindo por n A covariância é a média ou o valor esperado Exy dos produtos cruzados A covariância pode variar de infinito negativo até infinito positivo Se valores grandes de X estiverem associados a valores grandes de Y a covariância então será positiva Se valores grandes de X estiverem associados a valores pequenos de Y então a covariância será negativa Se não houver associação entre X e Y a covariância então será zero Em relação aos traços independentes a covariância será zero No texto principal vimos que a variância é o valor esperado dos desvios ao quadrado VX Ex² Tendo em vista que o desvio fenotípico x é a soma dos desvios genotípicos g e ambientais e podemos substituir g e por x e obter Vx Eg e2 Eg2 e2 2ge Eg2 Ee2 E2ge O primeiro termo Eg² é a variância genética o termo intermediário Ee² é a variância ambiental e o último termo é o dobro da covariância entre o genótipo e o ambiente Em experimentos controlados os diferentes genótipos são inseridos em diferentes ambientes aleatoriamente Em outras palavras o genótipo e o ambiente são independentes Se o genótipo e o ambiente forem independentes então a covariância entre o genótipo e o ambiente Ege 0 e a equação é reduzida para Vx Eg2 Ee2 Vg Ve Portanto a variância fenotípica é a soma da variância em virtude dos diferentes genótipos na população e da variância em virtude dos diferentes ambientes nos quais os organismos são criados Finalmente veremos o que ocorre com as variâncias se o genótipo e o ambiente estiverem correlacionados Para tanto imagine que conhecemos os desvios genéticos g de nove cavalos purossanguesingleses em relação ao tempo necessário para que eles corram no Kentucky Derby Também conhecemos os desvios ambientais e com os quais seus treinadores contribuem para que cada cavalo dispute essa corrida Suporemos que além do treinamento não existem outras fontes de variação ambiental A média da população em relação a esse conjunto de purossanguesingleses é de 123 segundos para correr no Derby Atribuímos os melhores cavalos aos melhores treinadores e os piores cavalos aos piores treinadores Ao fazer isso criamos uma relação não aleatória ou uma correlação entre os cavalos genótipos e os treinadores ambientes A Tabela 193 demonstra os dados em relação a esse experimento imaginário Você observará que VX 667 não é igual à soma de Vg 222 e Ve 133 Tendo em vista que o genótipo e o ambiente estão correlacionados violamos a presunção da equação que declara que VX Vg Ve A equação funciona apenas quando o genótipo e o ambiente não são correlacionados Correlação entre variáveis Se o genótipo e o ambiente estiverem correlacionados então a equação VX Vg Ve não será aplicável Em vez disso para que essa equação seja apropriada o genótipo e o ambiente devem ser não correlacionados ou independentes Vejamos um pouco mais de perto o conceito de correlação a existência de uma relação entre duas variáveis Esse é um conceito crítico para a genética quantitativa conforme veremos neste capítulo Para visualizar o grau de correlação entre duas variáveis podemos construir gráficos ou diagramas de dispersão A Figura 194 demonstra os gráficos de dispersão que observaríamos sob diversas forças de correlação diferentes entre duas variáveis Esses gráficos utilizam dados simulados em relação às alturas de conjuntos imaginários de gêmeos adultos idênticos O painel superior da figura demonstra uma correlação perfeita que é o que observaríamos se a altura de um gêmeo fosse exatamente a mesma do outro gêmeo para todos os conjuntos de gêmeos O painel intermediário demonstra uma correlação forte porém não perfeita Aqui quando um gêmeo é baixo o outro também tende a ser baixo e quando um é alto o outro tende a ser alto O painel inferior demonstra a relação que observaríamos se a altura de um gêmeo não estivesse correlacionada com a do outro gêmeo do conjunto Aqui a altura de um gêmeo de cada conjunto é aleatória a respeito do outro gêmeo do conjunto Na próxima seção veremos que os dados em relação a gêmeos reais se assemelhariam a algo como o painel intermediário Em estatística existe uma medida específica de correlação denominada coeficiente de correlação que é simbolizada por uma letra minúscula r É uma medida da associação entre duas variáveis O coeficiente de correlação está relacionado com a covariância que foi introduzida no Quadro 192 entretanto ele é dimensionado para variar entre 1 e 1 Se simbolizarmos uma variável aleatória por X e a outra por Y então o coeficiente de correlação entre X e Y é O termo é utilizado para dimensionar a covariância para variar entre 1 e 1 A equação expandida em relação ao coeficiente de correlação é A equação é trabalhosa e na prática o cálculo do coeficiente de correlação é realizado com o auxílio de computadores Em relação a duas variáveis que estão perfeitamente correlacionadas r 10 se na medida em que uma variável aumentar a outra aumentar ou r 10 se na medida em que uma aumentar a outra diminuir Em relação a variáveis completamente independentes r 00 Tabela 193 Dados simulados em relação ao tempo em segundos X de corrida dos cavalos no Kentucky Derby decomposto em desvios genético g e ambiental e da média da população Cavalo Média da população g Treinador e x X Secretariat 123 2 Lucien 2 4 119 Decidedly 123 2 Horatio 1 3 120 Barbaro 123 1 Mike 1 2 121 Unbridled 123 1 Carl 0 1 122 Ferdinand 123 0 Charlie 0 0 123 Cavalcade 123 1 Bob 0 1 124 Meridian 123 1 Albert 1 2 125 Whiskery 123 2 Fred 1 3 126 Gallant Fox 123 2 Jim 2 4 127 Média s 123 0 0 0 123 Variância s² 222 133 667 667 FIGURA 194 Gráficos de dispersão para o caso de uma correlação perfeita A uma correlação forte B e nenhuma correlação C As linhas vermelhas apresentam uma inclinação igual ao coeficiente de correlação 193 Na Figura 194 o coeficiente de correlação é demonstrado em cada painel Ele é 10 no painel superior para a uma correlação positiva perfeita 074 no painel intermediário para uma correlação forte e 00 no painel inferior para nenhuma correlação independência de X e Y A inclinação da linha vermelha em cada painel é igual ao coeficiente de correlação e fornece um indicador visual da força da correlação Como um exercício utilize os dados na Tabela 193 para construir um diagrama de dispersão e calcular o coeficiente de correlação Isso seria mais bemrealizado com um computador e um software de planilhas Utilize os desvios genéticos g no eixo x e os desvios ambientais e no eixo y Em seguida calcule o coeficiente de correlação entre g e e O diagrama de dispersão será semelhante àquele na Figura 194 painel intermediário e o coeficiente de correlação será 090 Portanto quando os melhores cavalos são colocados com os melhores treinadores a genética e o ambiente estão correlacionados e o modelo VX Vg Ve não pode ser utilizado CONCEITOCHAVE O fenótipo de um indivíduo em relação a um traço pode ser expresso em termos do seu desvio da média da população O desvio fenotípico x de um indivíduo é composto por duas partes seu desvio genético g e seu desvio ambiental e Experimentos com clones ou linhagens endocruzadas podem ser utilizados para decompor o fenótipo de um indivíduo em seus componentes genético e ambiental A variação fenotípica em uma população em relação a um traço VX pode ser decomposta nas variâncias genética Vg e ambiental Ve Essa decomposição presume que os genótipos e os ambientes não são correlacionados Herdabilidade no sentido amplo Natureza versus criação Uma questãochave em genética é Quanto da variação em uma população ocorre em virtude de fatores genéticos e quanto em virtude de fatores ambientais Na imprensa popular essa questão com frequência é expressa em termos de natureza versus criação ou seja qual é a influência dos fatores inatos genéticos em comparação com os fatores externos ambientais As respostas a algumas questões de natureza versus criação são de importância prática Se a pressão arterial alta ocorre primariamente em virtude de escolhas no estilo de vida ambiente então as alterações nos hábitos alimentares ou de exercícios são as mais apropriadas Entretanto se a pressão arterial alta for amplamente predeterminada por nossos genes então a terapia medicamentosa pode ser recomendada Geneticistas quantitativos desenvolveram ferramentas estatísticas necessárias para estimar com precisão razoável a extensão na qual a variação em traços complexos ocorre em virtude dos genes versus do ambiente A seguir descreveremos essas ferramentas No fim desta seção discutiremos sobre as presunções subjacentes a essas estimativas e os limites da sua utilidade Iniciaremos definindo a herdabilidade no sentido amplo H² como a parte da variância fenotípica que ocorre em virtude de diferenças genéticas entre os indivíduos em uma população Matematicamente escrevemos isso como a razão entre variância genética e a variância total na população H está ao quadrado porque é a razão de duas variâncias que são medidas em unidades ao quadrado H² pode variar de 0 a 10 Quando toda a variação em uma população ocorre em virtude de fontes ambientais e não há variação genética então H² é 0 Quando toda a variação em uma população ocorre em virtude de fontes genéticas então Vg é igual a VX e H² é 10 H² é denominada no sentido amplo porque envolve diversos diferentes modos por meio dos quais os genes contribuem para a variação Por exemplo uma parte da variação ocorrerá em virtude das contribuições de genes individuais A contribuição da variação genética adicional pode ocorrer em virtude do modo como os genes atuam em conjunto das interações dos genes ou da epistasia Na Seção 192 demonstramos como podemos calcular as variâncias genética e ambiental quando temos linhagens endocruzadas ou clones Em relação ao exemplo imaginário de dias até a polinização das linhagens endocruzadas de milho na Tabela 192 experimento I vimos que Vg é 120 e VX é 1467 Com a utilização desses valores a herdabilidade do traço é 1201467 082 ou 82 Essa estimativa de H² nos informa que os genes contribuem com a maior parte da variação e que os fatores ambientais contribuem com uma parte mais modesta da variação Portanto podemos concluir que os dias até a polinização são um traço altamente hereditário no milho Vejamos os dados em relação ao experimento II na Tabela 192 Os genótipos são exatamente os mesmos do experimento I esses são os genótipos das linhagens endocruzadas A a J Nesse caso entretanto as linhagens são criadas em ambientes mais extremos Se calcularmos a variância em relação às médias da linhagem endocruzada no experimento II Vg será 120 dias² como no experimento I Tendo em vista que os genótipos são os mesmos em ambos os experimentos a variância genética é a mesma Se calcularmos a variância em relação às médias dos diferentes ambientes Ve no experimento II obteremos 240 dias² que é muito maior do que o valor de Ve no experimento I 267 Tendo em vista que os ambientes são mais extremos a variância ambiental é maior Finalmente se calcularmos H² em relação ao experimento II obtemos A estimativa de H² em relação ao experimento II é menor mais próxima de 0 do que de 1 Portanto podemos concluir que os dias até a polinização não são um traço altamente hereditário no milho O contraste entre as estimativas da herdabilidade em relação ao mesmo conjunto de linhagens endocruzadas de milho criadas em diferentes ambientes destaca o ponto de que a herdabilidade é a proporção da variância fenotípica VX devida à genética Tendo em vista que VX Vg Ve na medida em que Ve aumenta Vg representará então uma parte menor de VX e H² diminuirá De modo semelhante se a variância ambiental for mantida no mínimo então Vg representará uma parte maior de VX e H² aumentará H² é um alvo em movimento e os resultados de um estudo podem não se aplicar a outro Medida da herdabilidade em seres humanos a partir de estudos com gêmeos Como podemos medir a herdabilidade em seres humanos Embora não tenhamos linhagens endocruzadas em seres humanos temos indivíduos geneticamente idênticos os gêmeos monozigóticos ou idênticos Figura 195 Na maioria dos casos os gêmeos idênticos são criados na mesma família e assim vivenciam um ambiente semelhante Quando indivíduos com os mesmos genótipos são criados nos mesmos ambientes violamos a presunção de nosso modelo genético de que os genes e o ambiente são independentes Assim para estimar a herdabilidade em seres humanos precisamos utilizar conjuntos de gêmeos idênticos que tenham sido separados logo após o nascimento e criados em separado por pais adotivos não relacionados A equação para a estimativa da H² em estudos de gêmeos idênticos que são criados em separado é relativamente simples Ela utiliza a medida estatística denominada covariância que foi introduzida no Quadro 192 Conforme explicado no Quadro 193 a covariância entre gêmeos idênticos que são criados em separado é igual à variância genética Vg Portanto podemos estimar H² em seres humanos ao utilizar essa covariância como o numerador e a variância do traço VX como o denominador Aqui está como isso é feito Para cada conjunto de gêmeos designaremos o valor do traço em relação a um gêmeo como X e ao outro como X Se tivermos n conjuntos de gêmeos então os valores dos traços em relação aos n conjuntos deverão ser designados X1 X1 X2 X2 Xn Xn FIGURA 195 Um par de gêmeos idênticos Barbara PenoyarPhotodiscGetty Images Suponha que tivéssemos as medições do QI em relação a cinco conjuntos de gêmeos como segue Gêmeo X X 1 100 110 2 125 118 3 97 90 4 92 104 5 86 89 Utilizando esses dados e a fórmula em relação à covariância do Quadro 192 calculamos que a COVXX é 1192 pontos² Utilizando a fórmula em relação à variância do traço calcularíamos que o valor de VX é 1543 pontos² Portanto obtemos Os pontos² no numerador e no denominador são cancelados e ficamos com uma medida sem unidade que é a proporção da variância total que ocorre em virtude da genética O Quadro 193 fornece alguns detalhes adicionais a respeito da estimativa de H² a partir dos dados de gêmeos incluindo a derivação da fórmula que acabamos de utilizar Ele também discute a relação entre a razão de COVXXVX e o coeficiente de correlação Geneticistas quantitativos desenvolveram diversos meios para estimar a herdabilidade com a utilização da correlação entre parentes Gêmeos idênticos compartilham 100 de seus genes enquanto irmãos irmãs e gêmeos dizigóticos compartilham 50 de seus genes A força da correlação entre os diferentes tipos de parentes pode ser dimensionada em relação à proporção dos genes que eles compartilham e os resultados utilizados para estimar as contribuições genética e ambiental para a variação do traço Quadro 193 Estimativa da herdabilidade a partir de estudos com gêmeos humanos Se tivéssemos muitos conjuntos de gêmeos idênticos que fossem criados em separado como poderíamos utilizálos para medir H² Representaremos arbitrariamente o valor do traço em relação a um membro de cada par de gêmeos como X e o valor do traço em relação ao outro como X Temos muitos n conjuntos de gêmeos X1X1 X2X2 XnXn Podemos expressar os desvios fenotípicos em relação a um grupo de gêmeos como a soma de seus desvios genético e ambiental x g e e x g e utilizando x como o desvio em relação a um gêmeo e x em relação ao outro gêmeo Observe que g é o mesmo tendo em vista que os gêmeos são geneticamente idênticos mas e e e são diferentes em virtude de os gêmeos terem sido criados em famílias separadas Em seguida desenvolvemos uma expressão para a covariância entre os gêmeos No Quadro 192 vimos que a covariância é a média ou o valor esperado dos produtos cruzados Exy Utilizando nossa notação em relação aos gêmeos x e x em vez de x e y obtemos COVXX Exx Podemos substituir g e por x e g e por x que nos fornece COVXX Eg eg e Eg2 ge ge ee Eg2 Ege Ege Eee Consideraremos os últimos três termos dessa expressão Sob nosso modelo os gêmeos são atribuídos aleatoriamente a famílias e portanto não deve haver correlação entre os ambientes aos quais os gêmeos X e X de cada par são atribuídos De acordo com isso a covariância entre os ambientes Eee será 00 De modo semelhante tendo em vista que a atribuição dos gêmeos às famílias é aleatória esperamos uma ausência de correlação entre o desvio genético dos gêmeos g e a família à qual eles são atribuídos de modo que Ege e Ege serão 00 Portanto a equação em relação à covariância entre os gêmeos é reduzida para COVXX Eg2 Vg Em outras palavras a covariância entre gêmeos idênticos criados em separado é igual à variância genética Se tivermos um grande conjunto de gêmeos idênticos que foram criados em separado podemos utilizar a covariância entre os gêmeos para estimar a quantidade de variação genética em relação a um traço na população geral Se dividirmos essa covariância pela variância fenotípica teremos então uma estimativa de H² Essa equação é essencialmente o coeficiente de correlação entre os gêmeos Esperase que a variância em relação ao gêmeo de cada conjunto designado X e aquela em relação ao gêmeo designado X sejam as mesmas em uma amostra grande Portanto podemos reescrever o denominador da equação como segue e veremos que H² é equivalente à correlação entre gêmeos Ao longo dos últimos 100 anos houve extensivos estudos genéticos com gêmeos e outros conjuntos de parentes Foi aprendido muito a respeito da variação hereditária em seres humanos a partir desses estudos A Tabela 194 lista alguns resultados de estudos com gêmeos Pode ou não ser uma surpresa para você mas existe uma contribuição genética para a variância em relação a muitos traços diferentes incluindo a psique a fisiologia os atributos da personalidade os transtornos psiquiátricos e até mesmo as nossas atitudes sociais e crenças políticas Observamos prontamente que traços tais como a cor dos cabelos e dos olhos ocorrem nas famílias e sabemos que esses traços são a manifestação de processos bioquímicos e do desenvolvimento controlados geneticamente Nesse contexto não é tão surpreendente que outros aspectos de quem somos como pessoa também apresentem uma influência genética Tabela 194 Herdabilidade no sentido amplo em relação a alguns traços em seres humanos conforme determinado por estudos com gêmeos Traço H² Atributos físicos Altura 088 Circunferência torácica 061 Circunferência da cintura 025 Contagem de cristas digitais 097 Pressão arterial sistólica 064 Frequência cardíaca 049 Atributos mentais QI 069 Velocidade do processamento espacial 036 Velocidade da aquisição de informações 020 Velocidade do processamento de informações 056 Atributos da personalidade Extroversão 054 Conscientização 049 Neuroticismo 048 Emocionalidade positiva 050 Comportamento antissocial em adultos 041 Transtornos psiquiátricos Autismo 090 Esquizofrenia 080 Depressão maior 037 Transtornos de ansiedade 030 Alcoolismo 050 a 060 Crenças e atitudes políticas Religiosidade entre adultos 030 a 045 Conservadorismo entre adultos 045 a 065 Visões de orador escolar 041 Visões sobre pacifismo 038 Fontes J R Alford et al American Political Science Review 99 2005 115 T Bouchard et al Science 250 1990 223228 T Bouchard Curr Dir Phys Sci 13 2004 148151 P J Clark Am J Hum Genet 7 1956 4954 C M Freitag Mol Psychiatry 12 2007 222 Estudos com gêmeos e as estimativas da herdabilidade que eles proporcionam podem ser facilmente interpretados excessiva ou erroneamente Aqui estão alguns pontos importantes para se ter em mente Primeiramente H² é uma propriedade de uma população e de um ambiente em particular Por esse motivo as estimativas de H² podem diferir amplamente entre populações e ambientes diferentes Observamos esse fenômeno anteriormente no caso dos dias até a polinização em relação às linhagens endocruzadas de milho Em segundo lugar os conjuntos de gêmeos utilizados em muitos estudos foram separados ao nascimento e inseridos em lares adotivos As agências de adoção não atribuem os bebês aleatoriamente para uma ampla gama de famílias em uma sociedade em vez disso eles inserem os bebês em famílias econômica social e emocionalmente estáveis Como resultado Ve é menor do que na população em geral e a estimativa de H² será inflada De acordo com isso as estimativas publicadas provavelmente nos levam a subestimar a importância do ambiente e a superestimar a importância da genética Em terceiro lugar em relação a gêmeos os efeitos prénatais podem causar uma correlação positiva entre o genótipo e o ambiente Conforme vimos anteriormente no caso dos purossanguesingleses e dos jóqueis tal correlação viola o nosso modelo e desviará H² para cima Finalmente a herdabilidade não é útil na interpretação das diferenças entre grupos A Tabela 194 demonstra que a herdabilidade em relação à altura em seres humanos pode ser muito alta 088 Entretanto esse valor alto em relação à herdabilidade absolutamente não nos informa se grupos com alturas distintas diferem em virtude da genética ou do ambiente Por exemplo homens na Holanda atualmente têm em média 184 cm de altura enquanto aproximadamente em 1800 os homens na Holanda tinham aproximadamente 168 cm de altura em média uma diferença de 16 cm O pool gênico dos holandeses provavelmente não foi alterado sensivelmente ao longo daquele período e assim a genética não pode explicar a enorme diferença na altura entre a população atual e aquela de 200 anos atrás Em vez disso melhoras na saúde e na nutrição provavelmente são a causa Portanto embora a altura seja altamente hereditária e as populações holandesas anteriores e atuais sejam muito diferentes na altura a diferença apresenta uma base ambiental 194 CONCEITOCHAVE A herdabilidade no sentido amplo H² é a razão entre a variação genética Vg e a fenotípica Vx H² fornece uma medida do quanto as diferenças entre os indivíduos de uma população ocorrem em virtude de fatores genéticos versus ambientais As estimativas de H² se aplicam apenas à população e ao ambiente no qual elas foram feitas H² não é útil para interpretar diferenças nas médias dos traços entre populações Herdabilidade no sentido restrito Previsão dos fenótipos A herdabilidade no sentido amplo nos informa a proporção da variância em uma população que ocorre em virtude de fatores genéticos A herdabilidade no sentido amplo expressa o grau até o qual as diferenças nos fenótipos entre os indivíduos em uma população são determinados por diferenças nos seus genótipos Entretanto até mesmo quando existe variação genética em uma população conforme medida pela herdabilidade no sentido amplo ela pode não ser transmissível para a próxima geração de modo previsível Nesta seção exploraremos como a variação genética se apresenta de dois modos a variação aditiva e de dominância não aditiva Enquanto a variação aditiva é transmitida de modo previsível dos genitores para a descendência a variação de dominância não é Também definiremos outro tipo de herdabilidade denominada herdabilidade no sentido restrito que é a razão entre a variância aditiva e a variância fenotípica A herdabilidade no sentido restrito fornece uma medida do grau em que a constituição genética dos indivíduos determina os fenótipos de sua descendência Os diferentes tipos de ação gênica interação dos alelos em um locus estão no cerne da compreensão da herdabilidade no sentido restrito e assim vamos revisálos brevemente Considere um locus B que controla o número de flores em uma planta O locus apresenta dois alelos B1 e B2 e três genótipos B1B1 B1B2 e B2B2 Conforme diagramado na Figura 196 A plantas com o genótipo B1B1 apresentam 1 flor plantas B1B2 apresentam 2 flores e plantas B2B2 apresentam 3 flores Em um caso como esse quando o valor do traço do heterozigoto é intermediário entre aqueles das duas classes homozigotas a ação gênica é definida como aditiva Na Figura 196 B o heterozigoto apresenta 3 flores o mesmo que o homozigoto B2B2 Aqui o alelo B2 é dominante em relação ao alelo B1 Nesse caso a ação gênica é definida como dominante Também poderíamos definir essa ação gênica como recessiva com o alelo B1 sendo recessivo em relação ao alelo B2 A ação gênica não precisa ser puramente aditiva ou dominante mas pode demonstrar dominância parcial Por exemplo se heterozigotos B1B2 apresentassem 25 flores em média diríamos então que o alelo B2 demonstra dominância parcial Ação gênica e transmissão de variação genética Trabalharemos com um exemplo simples para demonstrar como o modo de ação gênica influencia a herdabilidade Suponha que um floricultor deseje criar uma população de plantas melhoradas com mais flores por planta O número de flores é controlado pelo locus B que apresenta dois alelos B1 e B2 conforme diagramado na Figura 196 A As frequências dos alelos B1 e B2 são ambas 05 e as frequências dos genótipos B1B1 B1B2 e B2B2 são de 025 050 e 025 respectivamente Plantas com o genótipo B1B1 apresentam 1 flor plantas B1B2 apresentam 2 flores e plantas B2B2 apresentam 3 flores O número médio de flores por planta na população é 20 Lembre que podemos calcular a média como a soma dos produtos da frequência de cada classe vezes o valor em relação àquela classe FIGURA 196 Gráfico do genótipo eixo x pelo fenótipo eixo y em relação a um locus hipotético B que regula o número de flores por planta A Ação gênica aditiva B Ação gênica dominante Genótipo Frequência Valor do traço no de flores Contribuição para a média frequência valor B1B1 025 1 025 B1B2 050 2 10 B2B2 025 3 075 Média 20 Tendo em vista que o heterozigoto apresenta um fenótipo intermediário entre as duas classes homozigotas a ação gênica é aditiva Não existem efeitos ambientais e o genótipo isoladamente determina o número de flores de modo que H² é 10 Se o cultivador de plantas selecionar plantas com 3 flores B2B2 realizar o seu intercruzamento e em seguida cultivar a descendência então todas a descendência será B2B2 e o número médio de flores por planta na descendência será 30 Quando a ação gênica é completamente aditiva e não existem efeitos ambientais o fenótipo é totalmente hereditário A seleção conforme praticada pelo cultivador de plantas atua perfeitamente Agora consideraremos o caso diagramado na Figura 196 B na qual o alelo B2 é dominante em relação ao B1 Nesse caso o heterozigoto B1B2 tem 3 flores A frequência de ambos os alelos B1 e B2 é de 05 e as frequências dos genótipos B1B1 B1B2 e B2B2 são de 025 050 e 025 respectivamente Novamente não existe contribuição ambiental para as diferenças entre os indivíduos de modo que H² é 10 O número médio de flores por planta na população inicial é 25 Genótipo Frequência Fenótipo Contribuição para a média frequência valor B1B1 025 1 025 B1B2 050 3 15 B2B2 025 3 075 Média 25 Se o floricultor selecionar um grupo de plantas com 3 flores 23 serão B1B2 e 13 B2B2 Quando o floricultor realizar o intercruzamento das plantas selecionadas 044 23 23 dos cruzamentos serão entre heterozigotos e 14 da descendência desses cruzamentos será B1B1 e portanto com 1 flor O remanescente da descendência será B1B2 ou B2B2 e portanto com 3 flores A média geral em relação à descendência será de 278 embora a média de seus genitores tenha sido de 30 Portanto quando existe dominância o fenótipo não é totalmente hereditário A seleção conforme praticada pelo floricultor atuou porém não perfeitamente tendo em vista que algumas das diferenças entre os indivíduos ocorrem em virtude da dominância Concluindo quando existe dominância não podemos prever estritamente os fenótipos da descendência a partir dos fenótipos dos genitores Algumas das diferenças variação entre os indivíduos na geração parental ocorrem em virtude de interações de dominância entre os alelos Tendo em vista que os genitores transmitem os seus genes mas não os seus genótipos para a sua descendência essas interações de dominância não são transmitidas para a descendência Efeitos aditivos e da dominância Conforme descrito anteriormente os traços controlados por genes com ação gênica aditiva responderão de modo muito diferente daqueles com dominância Portanto os geneticistas precisam quantificar o grau de dominância e aditividade Nesta seção veremos como isso é feito Consideraremos novamente o locus B que controla o número de flores em uma planta ver Figura 196 O efeito aditivo A proporciona uma medida do grau de alteração no fenótipo que ocorre com a substituição de um alelo B2 por um alelo B1 O efeito aditivo é calculado como a diferença entre as duas classes homozigotas dividida por 2 Por exemplo conforme demonstrado na Figura 196 A se o valor do traço do genótipo B1B1 for 1 e o valor do traço do genótipo B2B2 for 3 então O efeito da dominância D é o desvio do heterozigoto B1B2 do ponto médio das duas classes homozigotas Conforme demonstrado na Figura 196 B se o valor do traço do genótipo B1B1 for 1 do genótipo B2B2 3 e do genótipo B2B2 3 então Se você calcular D em relação à situação ilustrada na Figura 196 A você encontrará D 0 ou seja nenhuma dominância A razão de DA fornece uma medida do grau de dominância Para a Figura 196 A DA 00 indicando aditividade pura ou nenhuma dominância Para a Figura 196 B DA 10 indicando dominância completa Uma razão de DA de 1 indicaria um recessivo completo A distinção entre dominância e recessividade depende do modo como os fenótipos são codificados e nesse sentido é arbitrária Os valores que são superiores a 0 e inferiores a 1 representam dominância parcial e os valores que são inferiores a 0 e superiores a 1 representam recessividade parcial Aqui está um exemplo de cálculo dos efeitos aditivos e da dominância em um único locus O peixe esganagato Gasterosteus aculeatus apresenta populações marinhas com longas espinhas pélvicas e populações que vivem próximas do fundo de lagos de água doce com espinhas pélvicas altamente reduzidas Figura 197 A Acreditase que as espinhas desempenhem um papel na defesa contra a predação As populações que vivem no fundo de água doce são derivadas de populações marinhas ancestrais Uma alteração na predação entre os ambientes marinho e de água doce pode explicar a perda das espinhas nos ambientes de água doce ver Capítulo 20 FIGURA 197 A O esganagato Gasterosteus aculeatus com três espinhas dorsais B O peixecego Astyanax mexicanus de cavernas parte superior e seu parente da superfície com visão parte inferior B Masato Yoshizawa e William Jeffery University of Maryland O Pitx1 é um de diversos genes que contribuem para o comprimento das espinhas pélvicas nos esganagatos Esse gene codifica um fator de transcrição que regula o desenvolvimento da pelve em vertebrados incluindo o crescimento de espinhas pélvicas em esganagatos Michael Shapiro e seus colegas na Stanford University mediram o comprimento da espinha pélvica em uma população F2 que segregava o alelo marinho ou longo l e o alelo de água doce ou curto s do Pitx1 Eles registraram os valores médios a seguir em unidades proporcionais ao comprimento corporal em relação ao comprimento da espinha pélvica para as três classes genotípicas ss sl ll 0068 0132 0148 Utilizando esses valores e as fórmulas anteriores podemos calcular os efeitos aditivos e da dominância O efeito aditivo A é 0148 00682 004 ou 4 do comprimento corporal O efeito da dominância D é 0132 0148 00682 0024 A razão de dominânciaaditividade é 0024004 06 O valor de 06 em relação à razão indica que o alelo longo l de Pitx1 é parcialmente dominante em relação ao alelo curto s Podese também calcular a média dos efeitos aditivos e da dominância sobre todos os genes no genoma que afetam o traço Aqui está um exemplo com a utilização do peixecego Astyanax mexicanus de cavernas e seus parentes da superfície Figura 197 B As populações de cavernas apresentam olhos altamente reduzidos de pequeno diâmetro em comparação às populações da superfície As populações que colonizam cavernas sem luz não se beneficiam do fato de ter olhos Tendo em vista que existem custos fisiológicos e neurológicos para a formação e a manutenção dos olhos a evolução pode ter forçado uma redução no tamanho dos olhos nas populações de caverna Horst Wilkins na University of Hamburg mediu o diâmetro médio dos olhos em mm em populações de caverna e da superfície e de seu híbrido F1 Caverna F1 Superfície 210 509 705 Com a utilização das fórmulas anteriores calculamos que A 248 D 052 e DA 021 Nesse caso a ação gênica está mais próxima de um estado puramente aditivo embora o genoma dos peixes de superfície seja ligeiramente dominante CONCEITOCHAVE Quando o valor do traço em relação à classe heterozigota é intermediário entre as duas classes homozigotas a ação gênica é denominada aditiva Qualquer desvio do heterozigoto do ponto médio entre as duas classes homozigotas indica um grau de dominância de um alelo Os efeitos aditivos A da dominância D e a sua razão DA proporcionam medidas para quantificar o modo de ação gênica Modelo com aditividade e dominância O exemplo anterior com o locus B e o número de flores demonstra que não podemos prever com precisão os fenótipos da descendência a partir dos fenótipos parentais quando existe dominância embora possamos fazer isso em casos de aditividade pura Ao prever os fenótipos da descendência precisamos separar as contribuições aditiva e da dominância Para tanto precisamos modificar o modelo simples introduzido na Seção 192 x g e Iniciaremos ao observar mais de perto a situação ilustrada na Figura 196 B Indivíduos com os genótipos B1B2 e B2B2 apresentam o mesmo fenótipo 3 flores Se subtrairmos a média da população 25 de seu valor de traço 3 observaremos que eles apresentam o mesmo desvio genotípico g gB1B2 gB2B2 05 Agora calcularemos os fenótipos médios de sua descendência Se autopolinizarmos um indivíduo B1B2 a descendência será B1B1 B1B2 e B2B2 e o valor médio do traço dessa descendência será 275 Entretanto se autopolinizarmos um indivíduo B2B2 toda a descendência será B2B2 e o valor médio do traço dessa descendência será 30 Embora os indivíduos B1B2 e B2B2 apresentem o mesmo valor de traço e o mesmo valor em relação ao seu desvio genotípico g eles não produzem descendência equivalente tendo em vista que o fundamento de base de seus fenótipos é diferente O fenótipo do indivíduo B1B2 depende do efeito da dominância D enquanto aquele do indivíduo B2B2 não envolve dominância Podemos expandir o modelo simples x g e para incorporar as contribuições aditiva e da dominância O desvio genotípico g é a soma de dois componentes a o desvio aditivo que é transmitido para a descendência e d o desvio de dominância que não é transmitido para a descendência Podemos reescrever o modelo simples e separar esses dois componentes como segue O desvio aditivo é transmitido dos genitores para a descendência de modo previsível O desvio da dominância não é transmitido dos genitores para a descendência tendo em vista que são criados novos genótipos e portanto novas interações dos alelos a cada geração Vejamos como o desvio genético é decomposto nos desvios aditivo e da dominância em relação ao caso demonstrado na Figura 196 B B1B1 B2B2 B2B2 Valor de traço 1 3 3 Desvio genético g 15 05 05 Desvio aditivo a 1 0 1 Desvio da dominância d 05 05 05 Os desvios genotípicos g são calculados simplesmente subtraindose a média da população 25 do valor de traço em relação a cada genótipo Cada desvio genotípico em seguida é decomposto nos desvios aditivo a e da dominância d com a utilização de fórmulas que estão além do escopo deste livro Essas fórmulas incluem os efeitos aditivos A e de dominância D bem como as frequências do alelo B1 e B2 na população Você observará que a d somam g Os desvios aditivo a e da dominância d são dependentes das frequências dos alelos tendo em vista que o fenótipo de uma descendência que recebe um alelo B1 de um genitor dependerá da combinação desse alelo com um alelo B1 ou B2 do outro genitor e esse desfecho depende das frequências dos alelos na população O desvio aditivo a tem um significado importante no cultivo de plantas e na criação de animais Ele é o valor produtivo ou a parte do desvio de um indivíduo da média da população que ocorre em virtude de efeitos aditivos Essa é a parte transmitida para sua progênie Portanto se desejarmos aumentar o número de flores por planta na população os indivíduos B2B2 apresentam o mais alto valor produtivo Os valores produtivos também podem ser calculados em relação ao genoma em geral para um indivíduo Criadores de animais estimam os valores produtivos genômicos de cada animal e essas estimativas podem determinar o valor econômico do animal Separamos o desvio genético g em desvios aditivo a e da dominância d Utilizando a álgebra semelhante àquela descrita no Quadro 192 também podemos separar a variância genética em variâncias aditiva e da dominância como segue Vg Va Vd em que Va é a variância aditiva e Vd é a variância da dominância Va é a variância dos desvios aditivos ou a variância dos valores genéticos É a parte da variação genética que é transmitida dos genitores para a sua descendência Vd é a variância dos desvios da dominância Finalmente podemos substituir esses termos na equação em relação à variância fenotípica apresentada anteriormente no capítulo em que Ve é a variância ambiental Essa equação presume que os componentes aditivo e da dominância não estão correlacionados com os efeitos ambientais Essa presunção será verdadeira em experimentos nos quais os indivíduos são atribuídos aleatoriamente aos ambientes Até agora descrevemos modelos com variâncias e desvios genéticos ambientais aditivos e da dominância Na genética quantitativa os modelos podem chegar a ser até mesmo mais complexos Em particular os modelos podem ser expandidos para incluir a interação dos fatores Se um fator altera o efeito de outro fator existe então uma interação O Quadro 194 revisa brevemente como as interações são levadas em conta nos modelos genéticos quantitativos CONCEITOCHAVE O desvio genético g de um indivíduo da média da população é composto por duas partes seu desvio aditivo a e seu desvio da dominância d O desvio aditivo é conhecido como valor genético e representa o componente do fenótipo de um indivíduo que é transmitido para a sua descendência A variação genética em relação a um traço em uma população Vg pode ser decomposta nas variâncias aditiva Va e da dominância Vd A variância aditiva é a fração da variação genética que é transmitida dos genitores para a descendência Herdabilidade no sentido restrito Agora podemos definir a herdabilidade no sentido restrito que é simbolizada por uma letra minúscula h ao quadrado h² como a razão entre a variância aditiva a variância fenotípica total Esse tipo de herdabilidade mede o quanto da variação entre os indivíduos em uma população é transmitido de modo previsível para a sua descendência A herdabilidade no sentido restrito é o tipo de herdabilidade de interesse para cultivadores de plantas e criadores de animais tendo em vista que proporciona uma medida de quão bem um traço responderá ao cultivo e à criação seletiva Para estimar h² precisamos medir Va mas como isso pode ser realizado Com a utilização da álgebra e da lógica semelhantes àquelas que utilizamos para demonstrar que Vg pode ser estimada com a utilização da covariância entre gêmeos monozigóticos criados em separado ver Quadro 193 também pode ser demonstrado que a covariância entre um genitor e a sua descendência é igual à metade da variância aditiva A covariância dos genitores para a descendência é metade de Va em virtude de a descendência herdar apenas metade de seus genes de cada genitor Combinando essa fórmula com aquela em relação a h² obtemos Quadro 194 Efeitos da interação O modelo simples para a decomposição de traços em desvios genéticos e ambientais x g e presume que não existe interação do genótipo com o ambiente Por meio dessa declaração queremos dizer que as diferenças entre os genótipos não são alteradas nos ambientes Em outras palavras uma interação do genótipo com o ambiente ocorre quando o desempenho de diferentes genótipos é afetado de modo desigual por uma alteração no ambiente Aqui está um exemplo Considere duas linhagens endocruzadas IL1 e IL2 que apresentam genótipos diferentes Criamos ambas as linhagens endocruzadas em dois ambientes E1 ou E2 Podemos visualizar o desempenho dessas duas linhagens nos dois ambientes utilizando um gráfico a seguir Esse tipo de gráfico que demonstra o padrão dos valores de traço de diferentes genótipos entre dois ou mais ambientes é denominado norma de reação Se não houver interação a diferença no valor de traço entre as linhagens endocruzadas será então a mesma em ambos os ambientes conforme demonstrado pelo gráfico à esquerda Sem interação a diferença entre as duas linhagens endocruzadas é 10 em ambos os ambientes e assim a diferença entre a média das linhagens nos dois ambientes é 10 Ambiente 1 IL1 IL2 2 1 10 Ambiente 2 IL1 IL2 3 2 10 A diferença na média geral demonstra que as linhagens são geneticamente diferentes A média em ambos os ambientes é de 25 para IL1 e 15 para IL2 O gráfico à direita demonstra um caso de uma interação do genótipo com o ambiente IL1 apresenta bom desempenho no Ambiente 1 mas desempenho inadequado no Ambiente 2 O oposto é verdadeiro em relação a IL2 A diferença no valor de traço entre as duas linhagens é de 10 no Ambiente 1 mas 10 no Ambiente 2 Ambiente 1 IL1 IL2 2 1 10 Ambiente 2 IL1 IL2 1 2 10 A diferença entre a média das linhagens nos dois ambientes é de 00 e assim podemos concluir erroneamente que essas linhagens endocruzadas são geneticamente equivalentes se observamos apenas a média geral O modelo simples pode ser expandido para incluir um termo da interação do genótipo com o ambiente ge x g e ge e VX Vg Ve Vge em que Vge é a variância da interação do genótipo com o ambiente Se o termo interação não estiver incluído no modelo existe então uma presunção implícita de que não existem interações do genótipo com o ambiente As interações também podem ocorrer entre os alelos em genes separados Esse tipo de interação é denominado epistasia Vejamos como as interações epistáticas afetam a variação nos traços quantitativos Considere dois genes A com os alelos A1 e A2 e B com os alelos B1 e B2 O lado esquerdo da tabela a seguir demonstra o caso de nenhuma interação desses genes Iniciando com o genótipo A1A1 B1B1 sempre que você substituir um alelo A2 por um alelo A1 o valor do traço subirá em 1 independentemente do genótipo no locus B O mesmo é verdadeiro quando substituímos os alelos no locus B Os efeitos dos alelos no locus A são independentes daqueles no locus B e viceversa Não existe interação ou epistasia Nenhuma interação Interação B1B1 B1B2 B2B2 B1B1 B1B2 B2B2 A1A1 0 1 2 A1A1 0 1 2 A1A2 1 2 3 A1A2 0 1 3 A2A2 2 3 4 A2A2 0 1 4 Observe agora o lado direito da tabela Iniciando com o genótipo A1A1 B1B1 a substituição de um alelo A2 por um alelo A1 apresenta um efeito apenas sobre o valor de traço quando o genótipo no locus B é B2B2 Os efeitos dos alelos no locus A são dependentes daqueles no locus B Existe uma interação ou epistasia entre os genes O modelo genético pode ser expandido para incluir um termo epistático ou de interação i x a d i e e VX Va Vd Vi Ve em que Vi é a variância da interação ou variância epistática Se o termo interação não estiver incluído no modelo existe então uma presunção implícita de que os genes atuam independentemente ou seja não existe epistasia A variância da interação Vi assim como a variância da dominância não é transmitida dos genitores para a sua descendência tendo em vista que novos genótipos e portanto novas relações epistáticas são formados a cada geração Para estimar a Va com a utilização da covariância entre os genitores e a descendência é necessário controlar os fatores ambientais nos experimentos Isso pode ser um desafio tendo em vista que os genitores e a descendência necessariamente são criados em ocasiões diferentes Va também pode ser estimada com a utilização da covariância entre meiosirmãos caso em que todos os indivíduos no experimento podem ser criados ao mesmo tempo no mesmo ambiente Meiosirmãos compartilham um quarto de seus genes e assim Va é igual a 4 a covariância entre meiosirmãos Se você comparar a equação de h² à equação de H² ver Quadro 193 você observará que ambas envolvem a razão de uma covariância e uma variância O coeficiente de correlação introduzido anteriormente no capítulo também é a razão de uma covariância e uma variância Estamos utilizando o grau de correlação entre parentes para inferir a extensão até a qual os traços são hereditários Aqui está um exercício que a sua classe pode tentar fazer Faça com que cada estudante apresente a sua altura e a altura do seu genitor do mesmo sexo Com a utilização desses dados e de um software de planilhas calcule a covariância entre os genitores e a sua descendência os estudantes Em seguida estime h² como duas vezes a covariância dividida pela variância fenotípica Para a variância fenotípica total VX no denominador da equação você pode utilizar a variância entre os genitores Os dados em relação aos estudantes do sexo masculino e feminino devem ser analisados em separado Tipicamente os valores em relação à herdabilidade no sentido restrito da altura em seres humanos são de aproximadamente 08 o que significa que aproximadamente 80 da variância é aditiva ou transmissível do genitor para a descendência Os resultados da sua classe podem se desviar desse valor por diversos motivos Primeiramente se a sua classe for pequena o erro de amostragem pode afetar a precisão da sua estimativa de h² Em segundo lugar você não estará conduzindo um experimento randomizado Se os genitores recriarem em suas famílias os ambientes de promoção do crescimento ou de limitação do crescimento que vivenciaram quando crianças haverá então uma correlação entre os ambientes dos genitores e os de sua descendência Essa correlação de ambientes viola uma presunção da análise Em terceiro lugar a população de estudantes em sua classe pode não ser representativa da população na qual o valor de 08 é obtido A Figura 198 é um gráfico de dispersão com os dados da altura de estudantes dos sexos masculino e feminino e seus genitores Existe uma clara correlação entre as alturas dos estudantes e de seu genitor do mesmo sexo Esses dados fornecem estimativas da herdabilidade no sentido restrito de 086 para mãe e filha e de 082 para pai e filho Os resultados estão próximos do valor de h² igual a 08 obtido a partir de estudos nos quais as crianças foram separadas de seus pais ao nascimento e criadas em famílias adotivas Aqui estão alguns pontos a mais a respeito da herdabilidade no sentido restrito Primeiramente quando h² 10 Va VX o valor esperado em relação ao fenótipo de uma descendência será igual ao valor de um dos genitores Toda a variação na população é aditiva e herdada no sentido restrito Em segundo lugar quando h² 00 Va 0 o valor esperado do fenótipo de qualquer descendência será a média da população Toda a variação na população ocorre em virtude de dominância ou de fatores ambientais e portanto não é transmissível para a descendência Finalmente assim como a herdabilidade no sentido amplo H² a herdabilidade no sentido restrito é a propriedade do ambiente específico e da população em que foi medida Uma estimativa de uma população e um ambiente pode não ser significativa para outra população ou outro ambiente FIGURA 198 Diagramas de dispersão em relação à altura em polegadas de estudantes do sexo feminino parte superior e do sexo masculino parte inferior e seus genitores do mesmo sexo Os gráficos demonstram correlações positivas entre as alturas dos estudantes e de seus genitores A inclinação da linha diagonal é igual ao coeficiente de correlação A herdabilidade no sentido restrito é um conceito importante no cultivo de plantas e na criação de animais e na evolução Para um cultivador ou criador h² indica quais traços podem ser melhorados por meio de seleção artificial Para um biólogo evolutivo h² é crítica para compreender como as populações serão alteradas em resposta à seleção natural imposta por um ambiente em alteração A Tabela 195 lista as estimativas da herdabilidade no sentido restrito em relação a alguns traços e organismos Previsão dos fenótipos da descendência Com a finalidade de melhorar os cultivos e as criações animais em relação aos traços de importância agronômica o cultivador ou criador deve ser capaz de prever o fenótipo da descendência a partir dos fenótipos de seus genitores Tais previsões são feitas com a utilização do conhecimento do cultivador ou criador sobre a herdabilidade no sentido restrito O desvio fenotípico de um indivíduo x da média da população é a soma dos desvios aditivo de dominância e ambiental x a d e A parte aditiva é a parte herdada que é transmitida para a descendência Veremos um conjunto de genitores com desvios fenotípicos x em relação à mãe e x em relação ao pai Os desvios de dominância dos genitores d e d não são transmitidos para a sua descendência tendo em vista que são criados novos genótipos e novas interações de dominância a cada geração De modo semelhante os genitores não transmitem seus desvios ambientais e e e para a sua descendência Portanto os únicos fatores que os genitores transmitem para a sua descendência são os seus desvios aditivos a e a De acordo com isso podemos estimar o desvio fenotípico da descendência x0 como a média dos desvios aditivos de seus genitores ap Assim para prever o fenótipo da descendência precisamos conhecer os desvios aditivos dos genitores Não podemos observar diretamente os desvios aditivos dos genitores mas podemos estimálos O desvio aditivo de um indivíduo é a parte herdada de seu desvio fenotípico ou seja â h²x em que â significa uma estimativa do desvio aditivo ou do valor genético Portanto podemos estimar a média dos desvios aditivos dos genitores como o produto de h² vezes a média de seu desvio fenotípico e esse produto será uma estimativa do desvio fenotípico da descendência ˆx0 Tabela 195 Herdabilidade no sentido restrito em relação a alguns traços em diversas espécies diferentes Traço h² Espécies agronômicas Peso corporal em bovinos 65 Produção leiteira em bovinos 35 Espessura da capa de gordura em suínos 70 Tamanho da ninhada em suínos 5 Peso corporal em galinhas 55 Peso do ovo em galinhas 50 Espécies naturais Comprimento do bico em tentilhõesdedarwin 65 Duração do voo no Oncopeltus fasciatus 20 Altura das plantas Impatiens biflora e I pallida 8 Fecundidade do Cervus elaphus 46 Período de vida do pássaro Ficedula albicollis 15 Fonte D F Falconer e T F C Mackay Introduction to Quantitative Genetics Longman 1996 J C Conner e D L Hartl A Primer in Ecological Genetics Sinauer 2004 ou A descendência apresentará seus próprios desvios de dominância e ambiental Entretanto esses não podem ser previstos Tendo em vista que são desvios em média eles serão zero sobre um grande número de descendentes Aqui está um exemplo Ovelhas islandesas são premiadas pela qualidade de seu velo A ovelha adulta média em uma população particular produz 27 kg de velo por ano Um carneiro que produz 29 kg por ano é cruzado com uma ovelha que produz 32 kg por ano A herdabilidade no sentido restrito da produção de velo nessa população é 04 Qual é a produção de velo prevista para a descendência desse cruzamento Primeiramente calcule os desvios fenotípicos em relação aos genitores subtraindo a média da população de seus valores fenotípicos Carneiro 65 60 05 Ovelha 70 60 10 Média dos genitores xp 05 102 075 Agora multiplique h² vezes xp para determinar ˆx0 o desvio fenotípico estimado da descendência 04 075 03 Finalmente adicione a média da população 60 ao desvio fenotípico previsto da descendência 03 e obtenha o resultado de que o fenótipo previsto da descendência é 28 kg de velo por ano Pode parecer surpreendente a previsão de que a descendência produzirá menos velo do que os seus genitores Entretanto esse desfecho é esperado em relação a um traço com uma herdabilidade modesta de 04 A maior parte 60 do desempenho superior dos genitores ocorre em virtude de fatores dominante e ambiental que não são transmitidos para a descendência Se a herdabilidade fosse 10 o valor previsto para a descendência então estaria entre os dos genitores Se a herdabilidade fosse 00 o valor previsto para a descendência então estaria na média da população tendo em vista que toda a variação ocorreria em virtude de fatores não hereditários Seleção de traços complexos Nosso tópico final a respeito da herdabilidade no sentido restrito é a aplicação da seleção a longo prazo para melhorar o desempenho de uma população em relação a um traço complexo Ao aplicar a seleção agricultores ao longo dos últimos 10000 anos transformaram um grande número de espécies de plantas selvagens no notável arranjo de cultivos de frutas vegetais cereais e especiarias de que desfrutamos atualmente De modo semelhante criadores de animais aplicaram a seleção para domesticar muitas espécies selvagens transformando lobos em cães aves selvagens em galinhas e javalis em porcos A seleção é um processo por meio do qual apenas os indivíduos com determinadas características contribuem para o pool gênico que forma a próxima geração ver Capítulos 18 e 20 A seleção aplicada pelos seres humanos para melhorar um cultivo ou rebanho é denominada seleção artificial para distinguila da seleção natural Vejamos um exemplo de como a seleção artificial atua A provitamina A é um precursor na biossíntese da vitamina A um nutriente importante para olhos saudáveis e um sistema imune com bom funcionamento Produtos vegetais são uma fonte importante de provitamina A para os seres humanos entretanto pessoas em muitas áreas do globo têm muito pouca provitamina A em suas dietas Para solucionar esse problema um agricultor busca aumentar o conteúdo de provitamina A de uma população de milho utilizada em partes da América Latina nas quais a deficiência de vitamina A é comum Atualmente essa população produz 125 μg de provitamina A por grama de grãos de milho A variância em relação à população é de 006 μg² Figura 199 Para melhorar a população o agricultor seleciona um grupo de plantas que produz 15 μg ou mais de provitamina A por grama de grãos de milho A média em relação ao grupo selecionado é de 163 μg O agricultor cruza aleatoriamente as plantas selecionadas e cultiva a descendência para produzir a próxima geração que apresenta média de 144 μg por grama de grãos de milho Se a herdabilidade no sentido restrito de um traço não é conhecida antes da realização de um experimento de seleção artificial os resultados de tais experimentos podem ser utilizados para estimála Aqui está um exemplo com a utilização do caso da provitamina A no milho Iniciaremos com a equação anterior FIGURA 199 Distribuição dos valores de traço em relação à provitamina A em grãos de milho em uma população inicial A e na população de descendentes B após uma geração de seleção A população inicial apresentava uma média de 125 μgg os indivíduos selecionados uma média de 163 μgg e a população de descendentes uma média de 144 μgg e a reescreveremos como xp é o desvio médio dos genitores as plantas selecionadas da média da população Esse é conhecido como o diferencial de seleção S a diferença entre a média do grupo selecionado e aquela da população de base Em relação ao nosso exemplo xp 163 125 038 x0 é o desvio médio da descendência da média da população Essa é conhecida como a resposta à seleção R a diferença entre a média da descendência e aquela da população original Em relação ao nosso exemplo x0 144 125 019 Agora podemos calcular a herdabilidade no sentido restrito em relação a esse traço nessa população como A lógica de base desse cálculo é que a resposta representa a parte herdada ou aditiva do diferencial de seleção Ao longo do último século geneticistas quantitativos conduziram um grande número de experimentos de seleção como esse Tipicamente esses experimentos são realizados ao longo de muitas gerações e são denominados estudos de seleção a longo prazo A cada geração os melhores indivíduos são selecionados para produzir a geração subsequente Tais estudos foram realizados em espécies economicamente importantes tais como plantas de cultivo e criações animais e em muitos organismosmodelo como Drosophila camundongos e nematódeos Esse trabalho demonstrou que praticamente qualquer espécie responderá à seleção em relação a praticamente qualquer traço As populações contêm conjuntos profundos de variação genética aditiva Aqui estão dois exemplos de experimentos de seleção a longo prazo No primeiro experimento moscasdasfrutas foram selecionadas em relação ao aumento da velocidade de voo ao longo de um período de 100 gerações Figura 1910 A A cada geração as moscas mais velozes foram selecionadas e cruzadas 195 para formar a próxima geração Ao longo das 100 gerações a velocidade de voo média das moscas na população aumentou de 2 para 170 cms e nem as moscas nem os ganhos produzidos pela seleção demonstraram quaisquer sinais de diminuição após 100 gerações No segundo experimento os camundongos foram selecionados ao longo de 10 gerações em relação à quantidade de corrida na roda que realizavam por dia Figura 1910 B Houve um aumento de 75 ao longo de apenas 10 gerações Esses estudos e outros similares demonstram o tremendo poder da seleção artificial e de profundos conjuntos de variação genética aditiva nas espécies CONCEITOCHAVE A herdabilidade no sentido restrito h² é a proporção da variância fenotípica que é atribuível aos efeitos aditivos Esse tipo de herdabilidade mede até que ponto a variação entre os indivíduos em uma população é transmitida de modo previsível para a sua descendência O valor de h² pode ser estimado de dois modos 1 com a utilização da correlação entre os genitores e a descendência e 2 com a utilização da razão da resposta à seleção e do diferencial de seleção O valor de h² é importante no cultivo de plantas e na criação de animais tendo em vista que fornece uma medida do quão bem um traço responderá ao cruzamento seletivo Mapeamento de QTL em populações com heredogramas conhecidos Os genes que controlam a variação em traços quantitativos ou complexos são conhecidos como loci de traço quantitativo ou QTL abreviadamente Conforme veremos a seguir os QTL são genes assim como quaisquer outros a respeito dos quais você aprendeu neste livro Eles podem codificar enzimas metabólicas proteínas de superfície celular enzimas de reparo do DNA fatores de transcrição ou qualquer uma de muitas outras classes de genes O que é de interesse aqui é que os QTL apresentam variantes alélicas que tipicamente realizam contribuições quantitativas relativamente pequenas para o fenótipo FIGURA 1910 Resultados de experimentos de seleção a longo prazo A Seleção para aumento na velocidade de voo de moscasdasfrutas A velocidade foi testada em um túnel de vento no qual as moscas voaram contra o vento para alcançar uma fonte de luz B Seleção de camundongos para aumento na quantidade de caminhada voluntária na roda A Dados de K E Weber Genetics 144 1996 205213 B Dados de J G Swallow et al Behav Genet 28 1998 227237 Podemos visualizar as contribuições dos alelos em um QTL para o valor do traço ao observar as distribuições de frequências associadas a cada genótipo em um QTL conforme demonstrado na Figura 1911 O locus QTL é B e as classes genotípicas são BB Bb e bb Os indivíduos BB tendem a apresentar valores de traço mais altos Bb valores intermediários e bb valores pequenos Entretanto suas distribuições se sobrepõem e não podemos determinar o genótipo simplesmente observando o fenótipo de um indivíduo conforme conseguimos fazer em relação aos genes que segregam em razões mendelianas Na Figura 1911 um indivíduo com um valor de traço intermediário pode ser BB Bb ou bb FIGURA 1911 Distribuições de frequências demonstrando como as distribuições das diferentes classes genotípicas no locus B de QTL estão relacionadas com a distribuição geral na população linha preta Em virtude dessa propriedade dos QTL precisamos de ferramentas especiais para determinar sua localização no genoma e caracterizar seus efeitos sobre a variação do traço Nesta seção revisaremos um tipo poderoso de análise para a conquista do primeiro desses objetivos Esse tipo de análise é denominado mapeamento de QTL Ao longo das últimas duas décadas o mapeamento de QTL revolucionou a nossa compreensão sobre a herança de traços quantitativos Foi realizado um trabalho pioneiro no mapeamento de QTL com plantas de cultivo tais como tomate e milho Entretanto ele tem sido amplamente aplicado em organismosmodelo tais como camundongo Drosophila e Arabidopsis Mais recentemente biólogos evolutivos empregaram o mapeamento de QTL para investigar a herança de traços quantitativos em populações naturais FIGURA 1912 Esquema de cruzamento em relação a uma população retrocruzada entre tomates Beefmaster e Sungold Na geração BC1 existe uma variação contínua no tamanho dos frutos A ideia fundamental por trás do mapeamento de QTL é que é possível identificar a localização de QTL no genoma com a utilização de loci marcadores ligados a um QTL Aqui está como o método funciona Suponha que você realiza um cruzamento entre duas linhagens endocruzadas genitor um P1 com alto valor de traço e genitor dois P2 com um baixo valor de traço A F1 pode ser retrocruzada com P1 para criar uma população BC1 na qual os alelos em todos os genes nos dois genomas parentais irão segregar Loci marcadores tais como os SNP ou microssatélites podem ser pontuados de modo não ambíguo como P1 homozigoto ou heterozigoto em relação a cada indivíduo de BC1 Se houver um QTL ligado ao locus marcador o valor de traço médio dos indivíduos homozigotos P1 no locus marcador será então diferente do valor de traço médio de indivíduos heterozigotos Com base em tais evidências podemos inferir que um QTL está localizado próximo do locus marcador Vejamos mais detalhadamente como isso funciona Método básico Existe uma diversidade de desenhos experimentais que podem ser utilizados em experimentos de mapeamento de QTL Iniciaremos descrevendo um desenho simples Digamos que temos duas linhagens endocruzadas de tomates que diferem no peso do fruto Beefmaster com frutos de 230 g de peso e Sungold com frutos de 10 g de peso Figura 1912 Cruzamos as duas linhagens para produzir um híbrido de F1 e em seguida retrocruzamos a F1 com a linhagem Beefmaster para produzir uma geração BC1 Cultivamos diversas centenas de plantas de BC1 até a maturidade e medimos o peso dos frutos em cada uma delas Também extraímos o DNA de cada uma das plantas de BC1 Utilizamos essas amostras de DNA para determinar o genótipo de cada planta em um conjunto de loci marcadores SNP ou SSR que estão distribuídos entre todos os cromossomos de modo que temos um locus marcador a cada 5 a 10 centimorgans A partir desse processo montaríamos um conjunto de dados em relação a diversas centenas de plantas e 100 ou mais loci marcadores distribuídos pelo genoma A Tabela 196 demonstra parte de um conjunto de dados em relação a apenas 20 plantas e 5 loci marcadores que estão ligados em um único cromossomo Em relação a cada planta de BC1 temos o peso de seus frutos e os genótipos nos loci marcadores Você observará que os valores de traço em relação às plantas de BC1 são intermediários entre os dois genitores conforme esperado mas estão mais próximos do valor de Beefmaster tendo em vista que essa é uma população de BC1 e Beefmaster foi o genitor do retrocruzamento Além disso tendo em vista que essa é uma população originada por retrocruzamento os genótipos em cada locus marcador são homozigotos em relação ao alelo Beefmaster BB ou heterozigotos BS Na Tabela 196 você pode observar as posições dos crossing overs entre os loci marcadores que ocorreram durante a meiose no genitor F1 da geração BC1 Por exemplo a planta BC1001 apresenta um cromossomo recombinante com um crossing over entre os loci marcadores M3 e M4 O peso do fruto médio geral em relação à população de BC1 é 1757 Também podemos calcular a média em relação às duas classes genotípicas em cada locus marcador conforme demonstrado na Tabela 196 Em relação ao marcador M1 as médias para as classes genotípicas BB 1763 e BS 1753 estão muito próximas da média geral 1757 Essa é a expectativa se não houver um QTL que afete o peso do fruto próximo de M1 Em relação ao marcador M3 as médias para as classes genotípicas BB 1807 e BS 1696 são consideravelmente diferentes da média geral 1757 e entre si Essa é a expectativa se houver um QTL que afete o peso do fruto próximo de M3 Portanto temos evidências em relação a um QTL que afeta o peso do fruto próximo do marcador M3 Observe também que a classe BB apresenta um fruto mais pesado do que a classe BS de M3 As plantas que herdaram o alelo S da linhagem Sungold com frutos pequenos apresentam frutos menores do que aquelas que herdaram o alelo B da linhagem Beefmaster Tabela 196 Dados simulados de peso do fruto e do locus marcador em relação a uma população de retrocruzamento entre duas linhagens endocruzadas de tomates Beefmaster e Sungold Marcadores Planta Peso do fruto g M1 M2 M3 M4 M5 Beefmaster 230 BB BB BB BB BB Sungold 10 SS SS SS SS SS BC1001 183 BB BB BB BS BS BC1002 176 BS BS BB BB BB BC1003 170 BB BS BS BS BS BC1004 185 BB BB BB BS BS BC1005 182 BB BB BB BB BB BC1006 170 BS BS BS BS BB BC1007 170 BB BS BS BS BS BC1008 174 BS BS BS BS BS BC1009 171 BS BS BS BB BB BC1010 180 BS BS BB BB BB BC1011 185 BS BB BB BS BS BC1012 169 BS BS BS BS BS BC1013 165 BB BB BS BS BS BC1014 181 BS BS BB BB BS BC1015 169 BS BS BS BB BB BC1016 182 BB BB BB BS BS BC1017 179 BS BS BB BB BB BC1018 182 BS BB BB BB BB BC1019 168 BS BS BS BB BB BC1020 173 BB BB BB BB BB Média de BB 1763 1796 1807 1761 1750 Média de BS 1753 1731 1696 1753 1764 Média geral 1757 A Figura 1913 é uma representação gráfica dos dados de mapeamento de QTL de muitas plantas ao longo de um cromossomo Os dados fenotípicos em relação às classes genotípicas BB e BS estão representados como distribuições de frequência de modo que podemos observar as distribuições dos valores de traço No marcador M1 as distribuições estão totalmente sobrepostas e as médias em relação às distribuições de BB e BS estão muito próximas Aparentemente as classes BB e BS apresentam a mesma distribuição subjacente No marcador M3 as distribuições estão apenas parcialmente sobrepostas e as médias em relação às distribuições de BB e BS são consideravelmente diferentes As classes BB e BS apresentam diferentes distribuições subjacentes semelhantes à situação na Figura 1911 Temos evidência de um QTL próximo de M3 Conforme demonstrado na Figura 1913 as médias de traço em relação aos grupos BB e BS em alguns marcadores são quase as mesmas Em outros marcadores essas médias são um tanto quanto diferentes Quão diferentes elas precisam ser antes que declaremos que um QTL está localizado próximo de um marcador Os detalhes estatísticos para responder a essa questão estão além do escopo deste texto Entretanto revisaremos a lógica básica por trás da estatística A análise estatística envolve o cálculo da probabilidade de observação dos dados os pesos dos frutos específicos e os genótipos do locus marcador em relação a todas as plantas considerando que exista um QTL próximo do locus marcador e a probabilidade de observação dos dados considerando que não exista um QTL próximo do locus marcador A razão dessas duas probabilidades é denominada odds chances A linha vertical significa considerando que e o termo Prob dadosQTL é lido como a probabilidade de observar os dados considerando que exista um QTL Se a probabilidade dos dados quando houver um QTL for 10 e a probabilidade dos dados quando não houver um QTL for 0001 então as odds são de 010001 100 Ou seja as chances são de 100 em 1 em favor da existência de um QTL Pesquisadores reportam o log10 das odds ou Lod score Assim se a razão das chances odds ratio for 100 então o log10 de 100 ou o Lod score é 20 Se houver um QTL próximo do marcador os dados então foram coletados de duas distribuições subjacentes uma distribuição em relação à classe BB e uma em relação à classe BS Cada uma dessas distribuições apresenta a sua própria média e variância Se não houver um QTL então os dados foram coletados a partir de uma única distribuição em relação à qual a média e a variância são aquelas da população de BC1 inteira Em um locus marcador M1 na Figura 1913 as distribuições das classes BB e BS são quase idênticas Portanto existe uma alta probabilidade de que os dados tenham sido coletados a partir de uma única distribuição subjacente No marcador M3 as distribuições das classes BB e BS são consideravelmente diferentes Portanto existe mais alta probabilidade de observação dos nossos dados se inferirmos que as plantas BB tenham sido coletadas de uma distribuição e as plantas BS de outra FIGURA 1913 Um segmento cromossômico de tomate com loci marcadores M1 a M5 Em cada locus marcador estão demonstradas as distribuições de frequências em relação ao peso dos frutos de uma população de BC1 de um cruzamento de Beefmaster Sungold Além de pesquisar QTL nos loci marcadores onde os genótipos são conhecidos Lod scores podem ser calculados em relação a pontos entre os marcadores Isso pode ser feito com a utilização dos genótipos dos marcadores flanqueadores para inferir os genótipos em pontos entre os marcadores Por exemplo na Tabela 196 a planta BC1001 é BB nos marcadores M1 e M2 e assim ela apresenta uma alta probabilidade de ser BB em todos os pontos entre eles A planta BC1003 é BB no marcador M1 mas BS em M2 e assim a planta pode ser BB ou BS nos pontos entre eles A equação da odds incorpora essa incerteza quando o Lod score é calculado em pontos entre os marcadores Os Lod scores podem ser plotados em gráficos ao longo do cromossomo conforme demonstrado pela linha azul na Figura 1914 Tais gráficos tipicamente demonstram alguns picos de altura variável bem como trechos que são relativamente planos Os picos representam QTL putativos mas quão alto um pico precisa ser antes que declaremos que ele representa um QTL Conforme discutido nos Capítulos 4 e 18 podemos estabelecer um limiar estatístico para rejeitar a hipótese nula Nesse caso a hipótese nula é que não existe um QTL em uma posição específica ao longo do cromossomo Quanto maior o Lod score mais baixa então a probabilidade sob a hipótese nula Existem diferentes procedimentos estatísticos para o estabelecimento de um valor limiar para o Lod score Onde o Lod score excede o valor limiar rejeitamos então a hipótese nula em favor da hipótese alternativa de que um QTL está localizado naquela posição Na Figura 1914 o Lod score excede o valor limiar linha vermelha próximo do locus marcador M3 Concluímos que um QTL está localizado próximo de M3 Além de populações oriundas de retrocruzamento o mapeamento de QTL pode ser realizado com populações F2 e outros desenhos de cruzamento Uma vantagem da utilização de uma população F2 é que são obtidas estimativas dos valores de traço médios em relação a todos os três genótipos de QTL genitor homozigoto1 genitor homozigoto2 e heterozigoto Com esses dados podemos obter estimativas dos efeitos aditivos A e da dominância D do QTL conforme discutido anteriormente neste capítulo Portanto o mapeamento de QTL possibilita que aprendamos sobre a ação gênica seja dominante ou aditiva em relação a cada QTL Aqui está um exemplo Suponha que tenhamos estudado uma população F2 de um cruzamento de tomates Beefmaster e Sungold e que tenhamos identificado dois QTL para o peso do fruto Os pesos médios dos frutos das diferentes classes genotípicas no QTL pode ser semelhante a algo como Peso dos frutos Efeitos BB BS SS A D QTL 1 180 170 160 10 0 QTL 2 200 185 110 45 30 Podemos utilizar esses valores do peso dos frutos para o QTL para calcular os efeitos aditivo e de dominância O QTL 1 é puramente aditivo D 0 mas o QTL 2 apresenta um grande efeito de dominância Além disso observe que o efeito aditivo do QTL 2 é mais do que 4 vezes aquele do QTL 1 45 versus 10 Alguns QTL apresentam grandes efeitos e outros apresentam efeitos pequenos O que pode ser aprendido a partir do mapeamento de QTL Com os desenhos de mapeamento de QTL mais poderosos os geneticistas podem estimar 1 o número de QTL genes que afetam um traço 2 as localizações genômicas desses genes 3 o tamanho dos efeitos de cada QTL 4 o modo de ação gênica do QTL dominante versus aditiva e 5 se um QTL afeta a ação de outro QTL interação epistática Em outras palavras podemos obter uma descrição um tanto quanto completa da arquitetura genética do traço Muito foi aprendido a respeito da arquitetura genética a partir dos estudos de mapeamento de QTL em diversos organismos Aqui estão dois exemplos Primeiramente o tempo de floração no milho é um traço quantitativo ou contínuo clássico e de importância crítica no cultivo do milho tendo em vista que as plantas precisam florescer e amadurecer antes do final da temporada de crescimento O milho do Canadá está adaptado para florescer dentro de 45 dias após o plantio enquanto o milho do México pode necessitar de 120 dias ou mais O mapeamento de QTL demonstrou que a arquitetura genética em relação ao tempo de florescimento no milho envolve mais de 50 genes Os resultados de um experimento estão demonstrados na Figura 1915 A esses resultados mostram evidências em relação a 15 QTL Os QTL de tempo de floração do milho em geral apresentam um efeito pequeno de tal modo que a substituição de um alelo por outro em um QTL altera o tempo de floração em apenas 1 dia ou menos Portanto a diferença no tempo de floração entre o milho tropical e o de regiões temperadas envolve muitos QTL Em segundo lugar camundongos têm sido utilizados para mapear QTL de muitos traços de suscetibilidade a doenças O que é aprendido a respeito dos genes de suscetibilidade a doenças em camundongos com frequência é verdadeiro também em seres humanos A Figura 1915 B demonstra os resultados de uma varredura genômica em camundongos para QTL de densidade mineral óssea DMO o traço subjacente à osteoporose Essa varredura identificou dois QTL um no cromossomo 9 e um no cromossomo 12 A partir de estudos como esse pesquisadores identificaram mais de 80 QTL em camundongos que podem contribuir para a suscetibilidade à osteoporose Foram realizados estudos semelhantes em dúzias de outras doenças FIGURA 1914 Gráfico dos Lod score de um experimento de mapeamento de QTL ao longo de um cromossomo com 10 loci marcadores A linha azul demonstra o valor do Lod score em cada posição Onde o Lod score excede o valor limiar existe uma evidência estatística de um QTL FIGURA 1915 Gráfico de Lod scores de varreduras genômicas para QTL A Resultados de uma varredura para QTL do tempo de floração no milho B Resultados de uma varredura para QTL da densidade mineral óssea em camundongos A Dados de E S Buckler et al Science 325 2009 714718 B Dados de N Ishimori et al J Bone Min Res 23 2008 15291537 Do QTL ao gene O mapeamento de QTL tipicamente não revela a identidade dos genes no QTL No melhor caso a resolução do mapeamento de QTL está na ordem de 1 a 10 cM o tamanho de uma região que pode conter 100 ou mais genes O direcionamento do QTL para um gene único requer experimentos adicionais para o mapeamento fino de um QTL Para tanto o pesquisador cria um conjunto de estoques genéticos homozigotos também denominados linhagens cada um com um crossing over próximo do QTL Esses estoques ou linhagens diferem entre si próximo do QTL mas são idênticos uns aos outros isogênicos em todo o restante de seus genomas As linhagens que são idênticas em seus genomas inteiros com exceção de uma pequena região de interesse são denominadas linhagens congênicas ou quase isogênicas O isolamento de QTL em um contexto isogênico é crítico tem em vista que apenas a única região do QTL difere entre as linhagens congênicas Portanto a utilização de linhagens congênicas elimina as complicações causadas pela presença de múltiplos QTL que segregam ao mesmo tempo Com a utilização do exemplo anterior do peso do fruto do tomate a região cromossômica de um conjunto das referidas linhagens congênicas está demonstrada na Figura 1916 Os genes flc arf4 estão demonstrados na parte superior e a localização de cada crossing over está indicada pela alteração da cor do vermelho genótipo Beefmaster para o amarelo genótipo Sungold O peso médio do fruto em relação às linhagens congênicas que carregam esses cromossomos recombinantes está indicado à direita Ao inspecionar a Figura 1916 você observará que todas as linhagens com alelo Beefmaster de kin1 um gene de quinase apresentam frutos de aproximadamente 180 g enquanto aquelas com o alelo Sungold de kin1 apresentam frutos de aproximadamente 170 g Nenhum dos outros genes está associado ao peso dos frutos dessa maneira Se confirmado por meio de testes estatísticos apropriados esse resultado possibilita que identifiquemos o kin1 como o gene subjacente a esse QTL A Tabela 197 lista uma pequena amostra de centenas de genes ou QTL que afetam a variação quantitativa de diferentes espécies que foram identificados A lista inclui o gene em relação ao tempo de floração do milho Vgt que é a base de um dos picos de Lod na Figura 1915 A Um aspecto notável dessa lista é a diversidade de funções gênicas Aparentemente não existe uma regra no sentido de que apenas tipos de genes em particular possam ser um QTL A maior parte dos genes nos genomas dos organismos se não todos provavelmente contribui para uma variação quantitativa nas populações CONCEITOCHAVE O mapeamento de locus de traço quantitativo QTL é um procedimento para a identificação das localizações genômicas dos genes QTL que controlam a variação em relação aos traços quantitativos ou complexos O mapeamento de QTL avalia a progênie de cruzamentos controlados em relação aos seus genótipos em marcadores moleculares e em relação aos seus valores de traço Se os diferentes genótipos em um locus marcador apresentarem diferentes valores médios para o traço existe então evidência de um QTL próximo do marcador Após uma região do genoma que contém um QTL ter sido identificada o QTL pode ser mapeado até genes únicos com a utilização de linhagens congênicas FIGURA 1916 Um segmento cromossômico de tomate para um conjunto de 10 linhagens congênicas que apresentam crossing overs próximos de um QTL para peso do fruto Os segmentos cromossômicos vermelhos são derivados da linhagem Beefmaster e os segmentos amarelos da linhagem Sungold Diferenças no peso do fruto entre as linhagens tornam possível a identificação do gene kin1 como o gene subjacente a esse QTL Tabela 197 Alguns genes que contribuem para a variação quantitativa e que foram identificados pela primeira vez com a utilização do mapeamento de QTL Organismo Traço Gene Função gênica Levedura Crescimento em alta temperatura RHO2 GTPase Arabidopsis Tempo para floração CRY2 Criptocromo Milho Ramificação Tb1 Fator de transcrição Milho Tempo para floração Vgt Fator de transcrição Arroz Sensibilidade ao fotoperíodo Hd1 Fator de transcrição Arroz Sensibilidade ao fotoperíodo CK2α Subunidade α da caseinoquinase Tomate Conteúdo de açúcar do fruto Brix925 Invertase Tomate Peso do fruto Fw22 Sinalização entre células Drosophila Número de cerdas Scabrous Glicoproteína secretada Vaca Produção leiteira DGAT1 Diacilglicerol acetiltransferase Camundongos Câncer de cólon Mom1 Modificador de um gene supressor de tumor Camundongos Diabetes melito do tipo 1 IAβ Antígeno de histocompatibilidade Proteína contendo 196 Seres humanos Asma ADAM33 domínio de metaloproteinase Seres humanos Doença de Alzheimer ApoE Apolipoproteína Seres humanos Diabetes melito do tipo 1 HLADQA Glicoproteína de superfície de MHC de classe II Fonte A M Glazier et al Science 298 2002 23452349 Mapeamento de associação em populações de cruzamento aleatório Se você leu recentemente alguma notícia anunciando que pesquisadores identificaram um gene de suscetibilidade para autismo diabetes melito hipertensão arterial ou algum outro distúrbio existe uma excelente chance de que o gene tenha sido descoberto com a utilização da técnica que iremos revisar denominada mapeamento de associação O mapeamento de associação é um método para encontrar QTL no genoma com base no desequilíbrio de ligação de ocorrência natural ver Capítulo 18 entre um locus marcador e o QTL em uma população de cruzamento aleatório Tendo em vista que ele utiliza o desequilíbrio de ligação o método também é denominado mapeamento de desequilíbrio de ligação Conforme veremos esse método com frequência possibilita que os pesquisadores identifiquem diretamente os genes específicos que controlam as diferenças no fenótipo entre os membros de uma população A ideia básica por trás do mapeamento de associação tem sido apresentada e utilizada durante décadas Aqui está um exemplo da década de 1990 em relação ao gene ApoE em seres humanos um gene envolvido no metabolismo de lipoproteínas complexos de lipídios e proteínas Em virtude do seu papel no metabolismo das lipoproteínas o ApoE foi considerado um gene candidato para um papel causal nas doenças cardiovasculares o acúmulo de depósitos de gordura lipídio nas artérias Pesquisadores procuraram por associações estatísticas entre os alelos do ApoE que as pessoas carreiam e se elas apresentavam doença cardiovascular Eles encontraram uma associação entre o alelo e4 desse gene e a doença pessoas que carreavam o alelo e4 apresentavam 42 mais probabilidade de ter a doença do que aquelas que carreavam outros alelos Embora esse tipo de estudo tenha obtido sucesso ele exigia que um gene candidato que se suspeitava afetar o traço fosse conhecido previamente Ao longo da última década os avanços nas tecnologias genômicas catalisaram a aplicação em ampla escala do mapeamento de associação Em particular o mapeamento de associação foi revolucionado por meio do desenvolvimento de mapas de SNP do genoma inteiro e das tecnologias de genotipagem de alta produção que possibilitam a identificação de centenas de milhares de SNP em dezenas de milhares de indivíduos ver Capítulo 18 O mapeamento de associação atualmente é utilizado de modo rotineiro para realizar a varredura do genoma inteiro em relação aos genes que contribuem para a variação quantitativa Esse tipo de estudo é conhecido como estudo de associação ampla do genoma estudo de GWA ou GWAS Uma vantagem importante dos estudos de GWA é que os genes candidatos não são necessários uma vez que é realizada a varredura de todos os genes no genoma O mapeamento de associação oferece diversas vantagens sobre o mapeamento de QTL Primeiramente tendo em vista que ele é realizado com populações de cruzamento aleatório não há necessidade de realizar cruzamentos controlados ou de trabalhar com famílias humanas com relações de genitores e descendência conhecidas Em segundo lugar ele testa muitos alelos em um locus de uma vez Nos estudos de mapeamento de QTL existem dois genitores tomates Beefmaster e Sungold no exemplo anterior e assim apenas dois alelos estão sendo comparados Com o mapeamento de associação todos os alelos na população estão sendo analisados ao mesmo tempo Finalmente o mapeamento de associação pode levar à identificação direta dos genes no QTL sem a necessidade de estudos de mapeamento fino subsequentes Isso é possível porque os SNP em qualquer gene que influencia o traço demonstrarão associações mais fortes com o traço do que os SNP em outros genes Vejamos como isso funciona Método básico Iniciaremos observando como a variação genética é padronizada no genoma em uma população No Capítulo 18 discutimos o desequilíbrio de ligação LD ou a associação não aleatória de alelos em dois loci A Figura 1917 demonstra como o LD poderia aparecer entre uma amostra de cromossomos de 18 indivíduos diferentes Os SNP ou outros polimorfismos que estão próximos entre si tendem a estar em forte desequilíbrio enquanto aqueles que estão mais distantes estão em desequilíbrio fraco ou nenhum desequilíbrio Os genomas também tendem a apresentar hotspots de recombinação pontos nos quais o crossing over ocorre a uma alta frequência Os hotspots rompem o desequilíbrio de ligação de tal modo que os SNP em qualquer lado do hotspot estão em equilíbrio entre si Os SNP que não estão separados por um hotspot formam um bloco de haplótipo de SNPs fortemente correlacionados Suponha que o SNP8 na Figura 1917 seja um SNP em um gene que causa uma diferença no fenótipo de tal modo que os indivíduos com o genótipo AA apresentam um fenótipo diferente daqueles com AG ou GG O SNP8 poderia afetar o fenótipo ao causar uma troca de aminoácido ou afetar a expressão gênica O SNP8 ou quaisquer SNP que afetem diretamente um fenótipo são denominados SNP funcionais Tendo em vista que o SNP8 está em um forte desequilíbrio com outros SNP no bloco SNP 6 7 9 e 10 qualquer um desses outros SNP pode atuar como um substituto do SNP8 funcional Os indivíduos que são TT no SNP7 apresentarão o mesmo fenótipo daqueles que são AA no SNP8 tendo em vista que o SNP7 e o SNP8 estão em LD Quando os genótipos de SNP estão correlacionados em desequilíbrio o valor de traço estará então correlacionado Por esse motivo os estudos de GWA não precisam analisar os SNP funcionais reais mas precisam apresentar os SNP em cada bloco de haplótipo Para conduzir um estudo de GWA em relação a uma condição de doença em seres humanos podemos analisar 2000 indivíduos com um distúrbio tal como o diabetes melito com início em adultos ou tipo 2 Também poderíamos selecionar outros 2000 indivíduos de controle que não apresentam esse distúrbio Cada um dos 4000 participantes doaria sangue a partir do qual o seu DNA seria extraído As amostras de DNA seriam genotipadas em relação a um conjunto de 300000 SNP que estão distribuídos por todo o genoma Desejamos um número de SNP suficiente de tal modo que cada um dos blocos de haplótipo no genoma seja marcado por um ou mais SNP ver Figura 1917 O conjunto de dados resultante seria enorme composto por 300000 genótipos em 4000 indivíduos um total de 12 bilhão de pontos de dados Uma pequena parte de tal conjunto de dados está demonstrada na Tabela 198 Após a montagem dos dados o pesquisador realiza um teste estatístico em cada SNP para determinar se um de seus alelos está mais frequentemente associado ao diabetes do que o esperado ao acaso No caso de um traço categórico tal como ser afetado ou não afetado pelo diabetes podem ser utilizados testes estatísticos semelhantes ao teste do χ² ver Capítulo 3 Um teste estatístico é realizado em separado em cada SNP e os valores P são inseridos em um gráfico ao longo do cromossomo A hipótese nula é que o SNP não está associado ao traço Se o valor P em relação a um SNP for inferior a 005 então a evidência em relação à hipótese nula é fraca e favoreceremos a hipótese alternativa de que os diferentes genótipos no SNP estão associados a diferentes fenótipos do traço O mapeamento de associação realmente não comprova que um gene ou um SNP em um gene afete um traço Ele apenas fornece evidências estatísticas em relação a uma associação entre o SNP e o traço A comprovação requer a caracterização molecular do gene e de seus diferentes alelos FIGURA 1917 Parte superior Diagrama da distribuição de SNP e haplótipos em relação a um segmento cromossômico de 18 indivíduos Os haplótipos com frequência ocorrem em blocos regiões de recombinação mais baixa separados uns dos outros por hotspots de recombinação diferentes cores indicam os blocos de haplótipos A coluna de S e D à direta são para o Problema 194 O SNP8 negrito controla uma diferença nos valores de traço Parte inferior Você consegue dizer se dois SNP demonstram desequilíbrio ao observar a cor do quadrado onde as linhas dos marcadores apresentam intersecção Em um bloco de haplótipo os SNP demonstram forte desequilíbrio Os SNP em diferentes blocos de haplótipos demonstram desequilíbrio fraco ou nenhum desequilíbrio Dados de David Altshuler et al Science 322 2008 881888 A Figura 1918 A demonstra os resultados de um estudo de mapeamento de associação em relação ao tamanho corporal em cães Cada ponto inserido em gráfico ao longo dos cromossomos eixo x representa o valor P eixo y em relação a um teste de associação entre o tamanho corporal e um SNP Os valores P são inseridos em gráfico com a utilização de uma escala inversa de tal modo que quanto mais alto no eixo x menor o valor No cromossomo 15 existe um aglomerado de SNP acima da linha do limiar indicando que a hipótese nula de nenhuma associação pode ser rejeitada em relação a esses SNP em favor da hipótese alternativa de que um gene que afeta o tamanho corporal em cães está localizado nessa posição O pico forte no cromossomo 15 envolve SNP no gene do fator de crescimento 1 semelhante à insulina IGF1 um gene que codifica um hormônio envolvido no crescimento juvenil em mamíferos Esse gene é o principal contribuinte para a diferença no tamanho entre raças pequenas e grandes de cães Figura 1918 B Tabela 198 Parte de um conjunto de dados simulados para um experimento de mapeamento de associação Indivíduo SNP1 SNP2 SNP3 Diabetes tipo 2 Altura cm 1 CC AG TT sim 173 2 CC AA CC sim 170 3 CG GG TT não 183 4 CG GG CT não 180 5 CC GG CT não 173 6 GG AG CT sim 178 7 GG AG CT não 163 8 CG GG CT não 168 9 CG AG CT sim 165 10 GG AA CC sim 157 FIGURA 1918 A Resultados de um experimento de mapeamento de associação em relação ao tamanho corporal em cães Cada ponto no gráfico representa o valor P em um teste de associação entre um SNP e o tamanho corporal Os pontos acima da linha limiar demonstram evidência de uma associação estatisticamente significativa B Exemplos de uma raça pequena e uma grande de cães B Tetra ImagesCorbis GWA genes doença e herdabilidade Ao longo dos últimos 10 anos foi realizado um grande número de estudos de GWA e muito foi aprendido a partir deles a respeito da variação herdada em seres humanos e em outras espécies Vejamos um dos maiores estudos que foi uma pesquisa em relação aos genes de risco de doenças em um grupo de 17000 pessoas com a utilização de 500000 SNP A Figura 1919 demonstra gráficos dos valores P em relação às associações entre os SNP e diversas doenças comuns Os pontos verdes são as associações estatisticamente significativas Note a espícula de pontos verdes no cromossomo 6 para artrite reumatoide e diabetes tipo 1 juvenil Essas são duas doenças autoimunes e a espícula está posicionada em um gene do antígeno leucocitário humano HLA do complexo principal de histocompatibilidade MHC de genes que regulam a resposta imune em seres humanos e em outros vertebrados Portanto os genes ativos na resposta imune normal estão implicados como uma causa de doenças autoimunes O gene PTPN22 também está associado ao risco de diabetes tipo 1 O PTPN22 codifica a proteína tirosina fosfatase que é expressa em células linfoides do sistema imune Em relação à doença coronariana existe uma associação significativa com o gene ApoE confirmando um estudo inicial mencionado anteriormente Estudos de GWA identificaram mais de 300 genes de risco em relação a aproximadamente 70 doenças e os números estão aumentando Esses dados estão conduzindo a uma nova era da genômica pessoal na qual um indivíduo pode ter seu genoma varrido para determinar o seu genótipo em genes que sabidamente aumentam o risco de doenças Embora essa ciência seja relativamente jovem é possível identificar indivíduos que apresentam um risco 10 vezes mais alto em relação a determinadas doenças do que outros membros da população Tais informações podem ser utilizadas para iniciar medidas de prevenção e alterações no estilo de vida ambiente que contribuem para o risco de doenças Algumas empresas estão propondo oferecer para a compra em sua farmácia local kits de teste genético em relação a doenças específicas tal como a doença de Alzheimer Bioeticistas expressaram a sua preocupação de que os consumidores não estejam preparados para avaliar adequadamente os resultados sem o aconselhamento de profissionais médicos FIGURA 1919 Resultados de um estudo de associação de genoma inteiro de doenças comuns em seres humanos Os 23 cromossomos humanos estão dispostos da esquerda para a direita O eixo y demonstra o valor P em relação ao teste estatístico de uma associação entre a doença e cada SNP Os resultados de testes significativos estão demonstrados como pontos verdes As denominações de alguns genes identificados por meio desta análise estão demonstradas em vermelho Dados de The Wellcome Trust Case Control Consortium Nature 447 2007 661678 Tendo em vista que a altura em seres humanos é um traço quantitativo clássico geneticistas quantitativos apresentam grande interesse na realização de estudos de GWA em relação a esse traço Estudos de GWA identificaram mais de 180 genes que afetam a altura Cada um desses genes apresenta um pequeno efeito aditivo aproximadamente 1 a 4 mm conforme esperado em relação a um traço regulado por muitos genes Entretanto um resultado desconcertante foi que os 180 genes foram responsáveis por apenas 10 da variância genética na altura Isso está muito longe do valor de quase 80 em relação à herdabilidade no sentido amplo para a altura A diferença entre os 10 e os 80 foi atribuída à perda de herdabilidade Em relação ao risco de doenças também existe muita perda de herdabilidade Por exemplo estudos de GWA obtiveram sucesso ao explicar apenas 10 da variação genética em relação à doença de Crohn e apenas 5 da variação genética em relação ao diabetes melito do tipo 2 Foi uma surpresa para muitos geneticistas que estudos de GWA com centenas de milhares de SNP englobando o genoma e amostras de mais de 10000 indivíduos conseguissem explicar apenas uma pequena fração da variação hereditária Até o momento não se sabe a razão disso Pesquisadores esperavam que doenças comuns tal como o diabetes melito do tipo 2 fossem causadas por alelos comuns ou seja alelos com frequências entre 5 e 95 Estudos de GWA são projetados para detectar os efeitos de alelos comuns mas não para detectar os efeitos de alelos raros Portanto uma hipótese é que a suscetibilidade em relação a muitas doenças comuns ou a variação na altura seja causada por uma grande quantidade de alelos raros Em outras palavras os alelos de suscetibilidade a doenças que estão segregados em uma família são diferentes daqueles de outra família não relacionada Apesar da incapacidade dos estudos de GWA de explicar toda a variação hereditária em relação aos traços essa abordagem proporcionou um importante avanço na compreensão da variação genética quantitativa Centenas de novos genes que contribuem para a variação quantitativa em relação ao risco de doenças foram identificadas Esses genes atualmente são o alvo para o desenvolvimento de novas terapias Além dos seres humanos os estudos de GWA avançaram a nossa compreensão sobre a herança de traços quantitativos em Arabidopsis Drosophila levedura e milho CONCEITOCHAVE O mapeamento de associação é um método para identificação de associações estatísticas entre marcadores moleculares e variação fenotípica em relação a traços complexos O desequilíbrio de ligação em uma população entre o locus marcador e uma variante funcional em um gene pode causar a associação Se marcadores moleculares em todo o genoma estiverem disponíveis um estudo de associação ampla do genoma GWA pode então ser realizado Estudos de GWA em seres humanos possibilitaram que os geneticistas identificassem centenas de genes que contribuem para os riscos de desenvolvimento de muitas doenças comuns RESUMO A genética quantitativa procura compreender a herança de traços complexos os traços que são influenciados por uma mistura de fatores genéticos e ambientais e que não segregam em razões mendelianas simples Os traços complexos podem ser traços categóricos limiares de contagem merísticos ou continuamente variáveis Qualquer traço em relação ao qual não podemos inferir diretamente o genótipo a partir do fenótipo é um alvo para a análise genética quantitativa A arquitetura genética de um traço é a descrição total do número de genes que afetam o traço das suas contribuições relativas para o fenótipo da contribuição de fatores ambientais para o fenótipo e de uma compreensão sobre como os genes interagem uns com os outros e com os fatores ambientais Para decifrar a arquitetura genética dos traços complexos geneticistas quantitativos desenvolveram um modelo matemático simples que decompõe os fenótipos dos indivíduos em diferenças que ocorrem em virtude de fatores genéticos g e aquelas que ocorrem em virtude de fatores ambientais e As diferenças nos valores de traço entre os membros de uma população podem ser resumidas por uma medida estatística denominada variância A variância mede até que ponto os indivíduos se desviam da média da população A variância de um traço pode ser separada em uma parte que ocorre em virtude de fatores genéticos a variância genética e uma parte que ocorre em virtude de fatores ambientais a variância ambiental Uma presunçãochave por trás da separação da variância do traço em componentes genéticos e ambientais é que os fatores genéticos e ambientais não estão correlacionados ou são independentes Até que ponto a variação em relação a um traço em uma população é explicada por fatores genéticos é medida pela herdabilidade no sentido amplo H² do traço H² é a razão entre a variância genética e a variância fenotípica A herdabilidade no sentido amplo expressa o grau até o qual as diferenças nos fenótipos entre os indivíduos em uma população são determinadas por diferenças nos seus genótipos A medida de H² em seres humanos revelou que muitos traços apresentam influências genéticas incluindo atributos físicos funções mentais características de personalidade distúrbios psiquiátricos e até mesmo atitudes políticas Os genitores transmitem os genes mas não os genótipos aos seus descendentes A cada geração são criadas novas interações de dominância entre os alelos em um locus Para incorporar esse fenômeno no modelo matemático em relação à variação quantitativa o desvio genético g é decomposto nos desvios aditivo a e de dominância d Apenas o desvio aditivo é transmitido dos genitores para a descendência O desvio aditivo representa a parte herdada do fenótipo no sentido restrito A parte aditiva da variância em uma população é a parte herdada da variância A herdabilidade no sentido restrito h² é a razão da variância aditiva em relação à variância fenotípica A herdabilidade no sentido restrito fornece uma medida da magnitude em que os fenótipos dos indivíduos são determinados pelos genes que eles herdam de seus genitores O conhecimento sobre a herdabilidade no sentido restrito de um traço é fundamental para compreender como um traço responderá ao cruzamento seletivo ou à força da seleção natural Criadores de animais e cultivadores de plantas utilizam seu conhecimento sobre a herdabilidade no sentido restrito em relação aos traços de interesse para direcionar programas de melhoramento de plantas e animais A herdabilidade no sentido restrito é utilizada para prever os fenótipos da descendência e para estimar o valor genético dos membros individuais da população reprodutora Os loci genéticos subjacentes à variação em traços complexos são conhecidos como loci de traços quantitativos ou QTL abreviadamente Existem dois métodos experimentais para a caracterização de QTL e a determinação de suas localizações no genoma Primeiramente o mapeamento de QTL procura por correlações estatísticas entre os genótipos em loci marcadores e os valores de traço em populações com heredogramas conhecidos tais como uma população de BC1 O mapeamento de QTL proporciona estimativas sobre o número de genes que controlam um traço se os alelos no QTL exibem aditividade ou dominância e se cada QTL apresenta um pequeno ou grande efeito sobre o traço Em segundo lugar o mapeamento de associação procura por correlações estatísticas entre os genótipos em loci marcadores e os valores de traço em populações de cruzamento aleatório O mapeamento de associação pode possibilitar que pesquisadores identifiquem os genes que são a base do QTL Estudos de associação ampla do genoma GWA utilizam marcadores que englobam o genoma inteiro A maior parte dos traços de importância na medicina na agricultura e na biologia evolutiva demonstra herança complexa Exemplos incluem o risco de doenças em seres humanos a produção de soja a produção de leite em vacas leiteiras e o espectro total de fenótipos que diferenciam todas as espécies de plantas animais e microrganismos na terra A análise genética quantitativa está à frente da compreensão da base genética desses traços críticos TERMOSCHAVE ação gênica ação gênica aditiva ação gênica dominante ação gênica recessiva amostra arquitetura genética associação ampla do genoma GWA ou GWAS coeficiente de correlação correlação covariância desvio desvio padrão diferencial de seleção S distribuição normal dominância parcial efeito aditivo A efeito da dominância D gene candidato genética quantitativa genômica pessoal herança complexa herança simples herdabilidade no sentido amplo H² herdabilidade no sentido restrito h² hipótese multifatorial histograma de frequência isogênico linhagem congênica linhagem ou cepa endocruzada linhagem quase isogênica loci de traço quantitativo QTL mapeamento de associação mapeamento de QTL mapeamento fino média população resposta à seleção R traço categórico traço complexo traço contínuo traço de limiar traço merístico traço quantitativo valor produtivo variância variância aditiva variância ambiental variância da dominância variância genética PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 Em uma ninhada de frangos de corte o peso médio é de 700 g e o desvio padrão é de 100 g Presuma que os valores de traço sigam a distribuição normal a Quantos dos frangos se espera que pesem mais de 700 g b Quantos dos frangos se espera que pesem mais de 900 g c Se H² é 10 qual é a variância genética em relação a essa população Solução a Tendo em vista que a distribuição normal é simétrica ao redor da média 50 da população apresentará um valor de traço acima da média e os outros 50 apresentarão um valor de traço abaixo da média Nesse caso esperase que 50 dos 100 frangos pesem mais de 700 g b O valor de 900 g é 2 desvios padrões maior do que a média Sob a distribuição normal 955 da população encontramse dentro de 2 desvios padrões da média e os 45 remanescentes estarão situados a mais de 2 desvios padrões da média Desses 45 metade 225 será mais de 2 desvios padrões inferior à média e a outra metade 225 será mais de 2 desvios padrões superior à média Portanto esperamos que aproximadamente 225 dos 100 frangos ou aproximadamente 2 frangos pesem mais de 900 g c Quando H² é 10 toda a variação então é genética Sabemos que o desvio padrão é 100 e a variância é o quadrado do desvio padrão Variância σ² Portanto a variação genética será 100² 10000 g² Problema resolvido 2 Duas linhagens endocruzadas de feijões são intercruzadas Na F1 a variância no peso dos feijões é medida em 15 g² A F1 é autofecundada na F2 a variância no peso dos feijões é 61 g² Estime a herdabilidade ampla do peso dos feijões na população F2 desse experimento Solução Aqui a chave é reconhecer que toda a variância na população F1 deve ser ambiental tendo em vista que todos os indivíduos apresentam o mesmo genótipo Além disso a variância na F2 deve ser uma combinação de componentes ambientais e genéticos tendo em vista que todos os genes que são heterozigotos na F1 irão segregar na F2 para proporcionar uma variedade de genótipos diferentes que estão relacionados com o peso dos feijões Portanto podemos estimar Ve 15 g² Vg Ve 61 g² Portanto Vg 61 15 46 g² e a herdabilidade ampla é Problema resolvido 3 Em uma população experimental de Tribolium besouros de farinha o comprimento corporal demonstra uma distribuição contínua com média de 6 mm Um grupo de machos e fêmeas com comprimento corporal médio de 9 mm é removido e intercruzado O comprimento corporal de sua descendência apresenta média de 72 mm A partir desses dados calcule a herdabilidade no sentido restrito em relação ao comprimento corporal nessa população Solução O diferencial da seleção S é 9 6 3 mm e a resposta à seleção R é 72 6 12 mm Portanto a herdabilidade no sentido restrito é Problema resolvido 4 Uma equipe de pesquisas relata que a herdabilidade no sentido amplo em relação à altura em seres humanos é 05 com base em um estudo de gêmeos idênticos criados em separado na Islândia Outra equipe relata que a herdabilidade no sentido restrito em relação à altura humana é 08 com base em um estudo de correlação entre genitores e descendência nos EUA O que parece ser inesperado a respeito desses resultados Como os resultados inesperados podem ser explicados Solução A herdabilidade no sentido amplo é a razão entre a variância genética total Vg e a variância fenotípica VX A variância genética total inclui tanto a variância aditiva Va quanto a de dominância Vd A herdabilidade no sentido restrito é a razão entre a variância aditiva Va e a variância fenotípica VX Portanto todas as outras variáveis sendo iguais H² deve ser maior ou igual a h² Ela será igual a h² quando Vd for 00 É inesperado que h² seja maior que H² Entretanto as duas equipes de pesquisa estudaram diferentes populações na Islândia e nos EUA As estimativas de herdabilidade são aplicáveis apenas à população e ao ambiente no qual elas foram medidas As estimativas realizadas em uma população podem ser diferentes daquelas realizadas em outra população tendo em vista que duas populações podem segregar diferentes alelos em diversos genes e viver em ambientes diferentes PROBLEMAS 1 2 3 QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS A Figura 199 demonstra as distribuições de traço antes e depois de um ciclo de seleção artificial A variância do traço aparenta ter mudado como resultado da seleção A Figura 1911 demonstra as distribuições esperadas em relação às três classes genotípicas se o locus B é um QTL que afeta o valor de traço a Conforme desenhado qual é a razão de dominânciaaditiva DA b Como você redesenharia essa figura se o locus B não apresentasse efeito sobre o valor de traço c Como as posições ao longo do eixo x das curvas em relação às diferentes classes genotípicas do locus B seriam alteradas se DA 10 A Figura 1916 demonstra os resultados de um experimento de mapeamento fino de QTL Qual gene estaria implicado no controle do peso dos frutos se o peso médio dos frutos em relação a cada linhagem fosse como segue Linhagem Peso do fruto g 1 1814 2 1693 3 1707 4 1712 5 1714 6 1822 4 5 6 7 1806 8 1807 9 1818 10 1693 A Figura 1917 demonstra um conjunto de haplótipos Suponha que esses sejam haplótipos em relação a um segmento cromossômico de 18 linhagens haploides de leveduras Na extremidade direita da figura S e D indicam se a linhagem sobrevive S ou morre D em alta temperatura 40C Com a utilização do teste do χ² ver Capítulo 3 e da Tabela 31 o SNP1 ou o SNP6 demonstram evidências em relação a uma associação com o fenótipo de crescimento Explique A Figura 1918 A demonstra um gráfico de valores P representados pelos pontos ao longo dos cromossomos do genoma canino Cada valor P é o resultado de um teste estatístico de associação entre um SNP e o tamanho corporal Além do aglomerado de pequenos valores P próximos de IGF1 você observa algumas regiões cromossômicas com evidências de uma associação significativa entre um SNP e o tamanho corporal Explique A Figura 1919 demonstra gráficos de valores P representados pelos pontos ao longo dos cromossomos do genoma humano Cada valor P é o resultado de um teste estatístico de associação entre um SNP e uma doença Existe um aglomerado ou espícula de valores P estatisticamente significativos pontos verdes no gene HLADRB1 em relação a duas doenças Por que esse gene em particular pode contribuir para a suscetibilidade às doenças autoimunes artrite reumatoide e diabetes melito do tipo 1 7 8 9 10 PROBLEMAS BÁSICOS Diferencie entre a variação contínua e descontínua em uma população e forneça alguns exemplos de cada uma Quais são as premissas centrais da hipótese multifatorial A tabela abaixo demonstra uma distribuição do número de cerdas em uma população de Drosophila Calcule a média a variância e o desvio padrão em relação a esses dados Número de cerdas Número de indivíduos 1 1 2 4 3 7 4 31 5 56 6 17 7 4 Suponha que o QI médio nos EUA seja de aproximadamente 100 e que o desvio padrão seja de 15 pontos Pessoas com QI de 145 ou mais alto são consideradas gênios em algumas escalas de medição Esperase que qual porcentagem da população apresente um QI de 145 ou mais alto Em um 11 12 13 país com 300 milhões de pessoas quantos gênios se espera que existam Em uma amostra de mulheres adultas dos EUA a altura média foi de 1644 cm e o desvio padrão foi de 62 cm As mulheres que estão a mais de 2 desvios padrões acima da média são consideradas muito altas e as mulheres que estão a mais de 2 desvios padrões abaixo da média são consideradas muito baixas A altura em mulheres está distribuída normalmente a Quais são as alturas das mulheres muito altas e muito baixas b Em uma população de 10000 mulheres quantas se espera que sejam muito altas e quantas muito baixas Um cultivador de feijões está trabalhando com uma população na qual a quantidade média de vagens por planta é 50 e a variância é de 10 vagens² Sabese que a herdabilidade no sentido amplo é de 08 Tendo em vista essas informações o cultivador pode ter certeza de que a população responderá à seleção em relação a um aumento no número de vagens por planta na próxima geração A tabela a seguir demonstra o número de leitões por ninhada em relação a um grupo de 60 porcas Qual é a quantidade média de leitões por ninhada Qual é a frequência relativa de ninhadas com no mínimo 12 leitões Número de ninhadas Leitõesninhada 1 6 3 7 7 8 12 9 14 15 18 10 20 11 17 12 14 13 6 14 2 15 Um granjeiro está trabalhando com uma população na qual o número médio de ovos postos por galinha em 1 mês é 28 e a variância é de 5 ovos² Sabe se que a herdabilidade no sentido restrito é 08 Tendo em vista essas informações o granjeiro pode esperar que a população responda à seleção em relação a um aumento no número de ovos por galinha na próxima geração a Não a aplicação da seleção é sempre arriscada e um granjeiro nunca sabe o que esperar b Não um granjeiro precisa conhecer a herdabilidade no sentido restrito para saber o que esperar c Sim tendo em vista que a herdabilidade no sentido restrito está próxima de 1 08 podese então esperar que o cruzamento seletivo possa levar ao aumento da produção de ovos na próxima geração d Sim tendo em vista que a variância é superior a 0 e c e d estão corretas A herdabilidade no sentido restrito do número de ervilhas por vagem em uma população de ervilhas sugar snap é 05 A média da população é de 16 62 ervilhas por vagem Um agricultor seleciona uma planta com 68 ervilhas por vagem e realiza o cruzamento com uma segunda planta que apresenta 80 ervilhas por vagem Quais são os números esperados de ervilhas por vagem entre a descendência desse cruzamento O mapeamento de QTL e o mapeamento de GWA de associação são dois métodos diferentes utilizados para identificar genes que afetam traços complexos Em relação a cada uma das declarações a seguir escolha se ela é aplicável ao mapeamento de QTL ao mapeamento de associação ou a ambos Declaração QTL GWA Ambos Esse método requer que o experimentador realize cruzamentos entre diferentes linhagens para produzir uma população de mapeamento Esse método pode varrer o genoma inteiro para encontrar QTL para um traço Esse método com frequência pode identificar os genes específicos que representam o QTL Esse método pode amostrar um grande número de indivíduos de uma população de cruzamento aleatório que apresentam variação em relação ao traço que está sendo estudado 17 Esse método tipicamente testa dois alelos que diferem entre os dois genitores da população de mapeamento PROBLEMAS DESAFIADORES Em um grande rebanho de bovinos três diferentes características que demonstram distribuição contínua são medidas e são calculadas as variâncias na tabela a seguir Características Variância Comprimento da canela Comprimento do pescoço Conteúdo de gordura Fenotípica 3102 7304 1060 Ambiental 2481 2922 530 Genética aditiva 465 730 424 Genética de dominância 156 3652 106 a Calcule as herdabilidades no sentido amplo e restrito em relação a cada característica b Na população de animais estudada qual característica responderia 18 19 20 melhor à seleção Por quê c É realizado um projeto para diminuir o conteúdo médio de gordura no rebanho O conteúdo médio de gordura atualmente é de 105 Animais com média de conteúdo de gordura de 65 são intercruzados como genitores da próxima geração Qual conteúdo médio de gordura pode ser esperado nos descendentes desses animais Em uma espécie de tentilhões Geospiza fortis a herdabilidade no sentido restrito da profundidade do bico foi estimada como sendo 079 A profundidade do bico está correlacionada com a capacidade dos tentilhões de ingerir sementes grandes A profundidade média do bico para a população é de 96 mm Um macho com uma profundidade de bico de 108 mm é cruzado com uma fêmea com uma profundidade de bico de 98 mm Qual é o valor esperado em relação à profundidade do bico para a descendência desse cruzamento Duas linhagens endocruzadas de camundongos de laboratório são intercruzadas Na F1 que apresenta genótipos idênticos em todos os loci a variância no peso adulto é medida em 3 g² Os animais da F1 são intercruzados para criar uma F2 na qual a variância no peso adulto é de 16 g² Estime a herdabilidade ampla do peso adulto na população da F2 desse experimento Os ambientes nos quais os animais da F1 e da F2 foram criados eram equivalentes A tabela a seguir demonstra os pesos de 100 camundongos individuais da mesma linhagem endocruzada criados com dietas diferentes Em relação a um camundongo que pesa 27 g quanto de seu peso ocorre em virtude da sua genética e quanto da dieta específica que foi fornecida ambiente Com exceção da dieta os camundongos foram criados em ambientes equivalentes Número de camundongos Peso g 21 5 21 13 22 18 23 21 24 22 25 16 26 5 27 A tabela a seguir contém as medidas do colesterol sérico total mgdℓ em relação a 10 conjuntos de gêmeos monozigóticos que foram criados em separado Calcule o seguinte média geral variância geral covariância entre os gêmeos e herdabilidade no sentido amplo H² X X 228 222 186 152 204 220 22 142 185 226 210 217 190 207 226 185 213 179 159 170 129 A tabela a seguir contém a altura em centímetros em relação a 10 conjuntos de mulheres gêmeas adultas Calcule o coeficiente de correlação r entre as alturas das irmãs em relação aos pares de gêmeas Gêmea 1 Gêmea 2 158 163 156 150 172 173 156 154 23 24 25 160 163 159 153 170 174 177 174 165 168 172 165 A população A é composta por 100 galinhas que são totalmente isogênicas e que são criadas em um ambiente uniforme O peso médio dos ovos que elas põem é de 52 g e a variância é de 35 g² A população B é composta por 100 galinhas geneticamente variáveis que produzem ovos com um peso médio de 52 g e variância de 210 g² A população B é criada em um ambiente que é equivalente àquele da população A Qual é a variância ambiental Ve em relação ao peso dos ovos Qual é a variância genética na população B Qual é a herdabilidade no sentido amplo na população B Plantas de milho em uma população apresentam em média 180 cm de altura A herdabilidade no sentido restrito em relação à altura da planta nessa população é de 05 Um cultivador seleciona plantas que em média são 10 cm mais altas do que a média da população para produzir a próxima geração e o cultivador continua a aplicar esse nível de seleção durante oito gerações Qual será a altura média das plantas após oito gerações de seleção Presuma que h² permanece 05 e que Ve não é alterada ao longo do período do experimento Em uma população de Drosophila melanogaster criada em laboratório o 26 comprimento médio das asas é de 055 mm e a variação é de 035 a 065 Um geneticista seleciona uma fêmea com asas que têm 042 mm de comprimento e a cruza com um macho que tem asas com 056 mm de comprimento a Qual é o comprimento esperado das asas de sua descendência se o comprimento das asas apresenta uma herdabilidade no sentido restrito de 10 b Qual é o comprimento esperado das asas de sua descendência se o comprimento das asas apresenta uma herdabilidade no sentido restrito de 00 Diferentes espécies de grilos apresentam cantos distintos e eles utilizam esses cantos para o reconhecimento dos parceiros Pesquisadores cruzaram duas espécies de grilos havaianos Laupala paranigra e L kohalensis cujos cantos são distinguidos pela frequência de pulso o número de pulsoss Shaw et al Molecular Ecology 16 2007 28792892 Em seguida eles mapearam QTL na população F2 derivada desse cruzamento Foram detectados seis QTL autossômicos Os valores de traço médio pulsoss nas três classes genotípicas da F2 em relação a cada QTL estão demonstrados na tabela a seguir em que P indica o alelo de L paranigra e K indica o alelo de L kohalensis QTL PP PK KK 1 154 189 210 2 175 187 194 3 172 188 192 27 28 29 4 170 182 202 5 167 180 213 6 157 188 219 a Calcule os efeitos aditivos A e de dominância D e a razão de DA em relação a cada um dos seis QTL b Qual desses QTL demonstra a maior quantidade de dominância c Qual desses apresenta o maior efeito aditivo d A frequência de pulso média em relação ao L kohalensis é de 372 e é de 071 em relação ao L paranigra Todos os seis QTL atuam no sentido esperado com o alelo de L kohalensis conferindo uma frequência de pulso mais alta do que o alelo de L paranigra A questão 26 faz referência ao QTL nos autossomos de grilos Em relação aos cromossomos sexuais grilosfêmeas são XX e grilosmachos são XO com a apresentação de apenas um cromossomo X mas nenhum cromossomo Y O QTL em relação à frequência de pulso pode ser mapeado em cromossomos X de grilos Se o canto é realizado apenas por grilos machos os efeitos de dominância do QTL sobre o X podem ser estimados Estudos de GWA revelam correlações estatísticas entre os genótipos em loci marcadores em genes e traços complexos Os estudos de GWA comprovam que a variação alélica em um gene realmente causa a variação no traço Caso negativo quais experimentos poderiam comprovar que as variantes alélicas em um gene em uma população são responsáveis pela variação em um traço O gene do albinismo ocular2 OCA2 e o gene do receptor 1 de melanocortina MC1R estão ambos envolvidos no metabolismo da melanina em células cutâneas em seres humanos Para testar se uma variação nesses genes contribui para a sensibilidade ao sol e o risco correlato de ser afetado pelo câncer de pele você realiza análises de associação Solicitamos a uma amostra de 1000 pessoas da Islândia que classificassem a si próprias como bronzeadas ou com queimaduras nenhum bronzeamento quando expostas ao sol Os indivíduos também foram genotipados em relação a um SNP em cada gene rs7495174 e rs1805007 A tabela demonstra o número de indivíduos em cada classe OCA2 rs7495174 MC1R rs1805007 AA AG GG CC CT TT Queimadura 245 56 1 192 89 21 Bronzeamento 555 134 9 448 231 19 a Quais são as frequências dos fenótipos de bronzeamento e queimadura na Islândia b Quais são as frequências alélicas em cada locus SNP c Com a utilização do teste do χ² ver Capítulo 3 e da Tabela 31 teste a hipótese nula de que não existe associação entre esses SNP e a pele sensível ao sol Algum SNP demonstra evidência em relação a uma associação d Se você observar evidências de uma associação entre o gene e o traço qual é o modo de ação gênica e Se o valor P for superior a 005 isso comprova que o gene não contribui para a variação em relação à sensibilidade ao sol Por quê 201 202 A teoria da evolução pela seleção natural foi desenvolvida independentemente por dois intrépidos naturalistas britânicos Charles Darwin 18091882 e Alfred Russel Wallace 18231913 no período de suas respectivas longas viagens Esquerda Graphic ArtsCorbis direita Hulton ArchiveGetty Images TÓPICOS Evolução por seleção natural Seleção natural em ação Caso exemplar 203 204 205 206 C Evolução molecular Teoria neutra Seleção cumulativa e vias de múltiplas etapas até a alteração funcional Evolução morfológica Origem de novos genes e funções proteicas RESULTADOS DE APRENDIZAGEM Após ler este capítulo você será capaz de Identificar e explicar os ingredientes essenciais da evolução por seleção natural Descrever exemplos de traços e genes que foram desenvolvidos por meio da seleção natural Contrastar a evolução molecular neutra com os processos adaptativos Diferenciar as assinaturas da seleção positiva e da seleção purificadora nas sequências de DNA e proteínas Contrastar análises experimentais e estatísticas da seleção cumulativa em proteínas Formular uma justificativa para o papel crítico das sequências reguladoras na evolução de traços morfológicos Avaliar o papel da duplicação de genes na origem de novas funções proteicas harles Darwin 18091882 chegou às ilhas Galápagos em 1835 no quarto ano do que deveria ter sido uma viagem de dois anos Podese pensar que essas ilhas agora intrinsecamente ligadas ao nome de Darwin fossem o paraíso para o jovem naturalista Longe disso Darwin achou as ilhas terrivelmente quentes com suas rochas magmáticas negras queimando sob o sol quente Em seu diário ele observou que as árvores raquíticas demonstram poucos sinais de vida as plantas também têm um odor desagradável As rochas magmáticas negras na praia são frequentadas por grandes 60 a 90 cm lagartos os mais desajeitados e repugnantes Eles certamente dominam o terreno que habitam1 Além dos lagartos e das tartarugas a vida animal nas ilhas era escassa e inexpressiva Ele mal podia esperar para ir embora O explorador de 26 anos de idade não sabia que suas 5 semanas em Galápagos inspirariam uma série de ideias radicais que aproximadamente 24 anos depois com a publicação de seu A Origem das Espécies 1859 alterariam a nossa percepção sobre o mundo e o nosso lugar nele Diversos meses após deixar as ilhas na última parte da viagem de volta à Inglaterra Darwin teve seu primeiro lampejo de percepção Ele havia começado a organizar suas abundantes anotações de campo de seus quase 5 anos de exploração e coleta Seu plano era que de volta à Inglaterra especialistas liderassem o estudo de suas coleções de fósseis plantas animais e rochas Voltandose para as suas observações sobre as aves de Galápagos ele relembrou que havia observado tipos ligeiramente diferentes de tordos em três ilhas diferentes Agora havia um quebracabeça A visão prevalecente sobre a origem das espécies em 1835 sustentada pela maior parte dos professores de Darwin e por uma grande parte da comunidade científica era de que as espécies haviam sido especialmente criadas por Deus na sua forma atual inalterável e inseridas no habitat ao qual elas se adaptavam melhor Por que então haveria aves ligeiramente diferentes em ilhas tão semelhantes Darwin anotou em seu caderno de ornitologia Quando vejo essas ilhas uma à vista das outras e possuídas por nada além de um escasso estoque de animais habitadas por essas aves que diferem ligeiramente na estrutura que preenche o mesmo espaço na Natureza devo suspeitar de que sejam apenas variedades Se houver um mínimo fundamento nessas anotações bem valerá a pena examinar a zoologia dos Arquipélagos tendo em vista que tais fatos abalariam a estabilidade das espécies grifo nosso2 A percepção de Darwin foi de que as espécies podem ser alteradas Isso não era o que ele havia aprendido em Cambridge University Era uma heresia Embora Darwin tivesse decidido manter para si próprio tais perigosos pensamentos ele foi absorvido pela ideia Após chegar em casa na Inglaterra ele preencheu uma série de cadernos com pensamentos a respeito da alteração das espécies Dentro de um ano ele havia se convencido de que as espécies surgem naturalmente a partir de espécies preexistentes tão naturalmente quanto as crianças nascem dos pais e os pais dos avós Ele então ponderou como as espécies são alteradas e se adaptam às circunstâncias em particular Em 1838 apenas dois anos após a conclusão de sua viagem e antes que ele completasse 30 anos ele concebeu a sua resposta seleção natural Nesse processo competitivo indivíduos que apresentam alguma vantagem relativa sobre outros vivem por mais tempo e produzem mais descendência a qual por sua vez herda a vantagem Darwin sabia que para convencer outras pessoas de suas ideias a descendência das espécies a partir de ancestrais e a seleção natural ele precisaria de mais evidências Passou as duas próximas décadas organizando todos os fatos que ele conseguia a partir de registros de botânica zoologia embriologia e fósseis Ele recebeu informações cruciais de especialistas que ajudaram a separar e caracterizar as suas coleções O ornitólogo John Gould apontou para Darwin que o que o jovem naturalista acreditava serem melros pardais e tentilhões de Galápagos eram de fato 12 atualmente reconhecidas como 13 novas e distintas espécies de tentilhões terrestres Figura 201 As espécies de Galápagos embora claramente consideradas tentilhões exibem uma imensa variação no comportamento alimentar e no formato do bico que corresponde às suas fontes de alimentos Por exemplo o tentilhãoarborícolavegetariano utiliza seu bico forte para comer frutos e folhas o tentilhão insetívoro apresenta um bico com uma ponta cortante para comer grandes insetos e o mais extraordinário de tudo o tentilhãopicapau agarra um ramo no seu bico e o utiliza para obter insetos ao examinar os buracos nas árvores Essa diversidade de espécies Darwin deduziu deve ter surgido a partir de uma população original de tentilhões que chegou a Galápagos a partir do continente da América do Sul e povoou as ilhas Os descendentes dos colonizadores originais se difundiram até as diferentes ilhas e formaram populações locais que divergiram entre si e que finalmente formaram diferentes espécies Os tentilhões ilustram o processo de adaptação no qual as características de uma espécie se modificam para a adaptação ao ambiente em que vivem Darwin forneceu um nível de explicação para o processo a seleção natural mas não conseguiu explicar como os traços variavam ou como eles foram alterados com o tempo tendo em vista que ele não compreendia os mecanismos de herança A compreensão da base genética da adaptação é um dos objetivos a longo prazo da biologia evolutiva Um primeiro passo em direção a esse objetivo foi realizado quando o trabalho de Mendel que apontava para a existência dos genes foi redescoberto duas décadas após a morte de Darwin Outra chave surgiu herança meio século mais tarde quando a base molecular da hereditabilidade e o código genético foram decifrados Há muitas décadas biólogos têm conhecimento de que as espécies e os traços se desenvolvem por meio de alterações na sequência de DNA Entretanto a elucidação das alterações específicas na sequência de DNA que levam à evolução fisiológica ou morfológica impôs desafios técnicos consideráveis Avanços em genética molecular genética do desenvolvimento e genômica comparativa estão agora revelando os diversos mecanismos subjacentes à evolução gênica dos traços e da diversidade dos organismos Uma diversidade de espécies pode resultar da adaptação os Comedores de sementes apresentam bicos que são adaptados para coletar e triturar sementes Comedores de brotos O comedor de brotos apresenta um bico forte adaptado para puxar os brotos dos ramos Comedores de insetos Os comedores de insetos apresentam uma diversidade de bicos adaptados para a ingestão de diferentes tamanhos e tipos de insetos os quais eles capturam de diversos modos 201 FIGURA 201 As 13 espécies de tentilhões encontradas nas ilhas Galápagos O estudo da evolução é uma disciplina muito ampla e em expansão Como tal não tentaremos uma visão geral abrangente de todas as facetas da análise evolutiva Em vez disso neste capítulo examinaremos os mecanismos genéticos moleculares que levam à variação e à evolução dos traços bem como à adaptação dos organismos aos seus ambientes Primeiramente examinaremos o processo evolutivo em geral e em seguida focaremos em exemplos específicos em relação aos quais foram apontadas as bases genéticas e moleculares das diferenças fenotípicas entre as populações ou as espécies Todos os exemplos enfocarão a evolução de traços relativamente simples controlados por um único gene Esses exemplos relativamente simples são suficientes para ilustrar o processo fundamental de evolução no nível do DNA e a diversidade de maneiras pelas quais a evolução gênica afeta o ganho a perda e a modificação dos traços Evolução por seleção natural A teoria da evolução moderna está tão completamente identificada com o nome de Darwin que muitas pessoas pensam que o próprio Darwin tenha proposto pela primeira vez o conceito de que os organismos evoluíam mas esse não é o caso A ideia de que a vida foi alterada ao longo do tempo estava circulando nas comunidades científicas havia muitas décadas antes da histórica viagem de Darwin A grande questão era Como a vida era alterada Para alguns a explicação era uma série de criações especiais de Deus Para outros tais como JeanBaptiste Lamarck 17441829 a alteração era causada pelo ambiente que atuava diretamente sobre o organismo e aquelas alterações adquiridas no período de vida de um organismo eram transmitidas para a sua descendência O que Darwin proporcionou foi uma explicação detalhada sobre o mecanismo do processo evolutivo que incorporava corretamente o papel da herança A teoria da evolução por seleção natural de Darwin tem início com a variação que existe entre os organismos de uma espécie Indivíduos de uma geração são qualitativamente diferentes entre si A evolução da espécie como um todo resulta do fato de que os diversos tipos diferem em suas taxas de sobrevivência e reprodução Tipos mais bemadaptados deixam mais descendência e assim as frequências relativas dos tipos são alteradas ao longo do tempo Portanto os três ingredientes críticos da alteração evolutiva que Darwin apresentou foram a variação a seleção e o tempo Pode então ser considerado improvável que variações de algum modo úteis para cada ser na grande e complexa batalha da vida por vezes possam ocorrer no período de milhares de gerações Podemos duvidar relembrando que nascem muito mais indivíduos do que possivelmente conseguem sobreviver de que indivíduos que apresentam qualquer vantagem sobre outros ainda que pequena apresentam maior chance de sobreviver e procriar a sua espécie Por outro lado podemos ter a certeza de que qualquer variação no mínimo prejudicial será rigidamente destruída A essa preservação de variações favoráveis e rejeição de variações prejudiciais eu dou o nome de Seleção Natural A Origem das Espécies Capítulo IV3 Os textos e as ideias de Darwin são bemconhecidos e é justificável que sejam mas é muito importante observar que ele não estava sozinho ao chegar até esse conceito de seleção natural Alfred Russel Wallace 18231913 um colega inglês que explorou a floresta amazônica e o arquipélago Malaio durante 12 anos chegou a uma conclusão muito semelhante em um artigo que publicou em conjunto com um trecho de Darwin em 1858 A vida dos animais selvagens é uma luta pela existência Talvez todas as variações da forma típica de uma espécie devam apresentar algum efeito definitivo mas leve sobre os hábitos ou as capacidades dos indivíduos Também está evidente que a maior parte das alterações afeta seja de modo favorável ou adverso a possibilidade de uma existência prolongada Se por outro lado qualquer espécie precisar produzir uma variedade que apresente capacidade ligeiramente aumentada para a preservação da existência aquela variedade inevitavelmente deve no tempo adquirir uma superioridade numérica4 Embora a denominação de Darwin atualmente tenda a ser exclusivamente ligada à evolução por seleção natural na sua época a teoria foi reconhecida como teoria de DarwinWallace Talvez a atual percepção ocorra pelo menos em parte em virtude do próprio Wallace que sempre fazia deferências a Darwin e se referia à teoria da evolução emergente como darwinismo CONCEITOCHAVE Darwin e Wallace propuseram uma nova explicação 1 2 3 para justificar o fenômeno da evolução Eles compreenderam que a população de uma determinada espécie em uma determinada ocasião inclui indivíduos com características variáveis Perceberam que a população de gerações sucessivas conterá uma frequência mais alta daqueles tipos que sobrevivem e se reproduzem com mais sucesso sob as condições ambientais existentes Portanto as frequências dos diversos tipos dentro das espécies serão alteradas ao longo do tempo Existe uma óbvia semelhança entre o processo evolutivo conforme Darwin e Wallace o descreveram e o processo por meio do qual o agricultor ou pecuarista melhora um estoque doméstico O agricultor seleciona as plantas de mais alta produção da população atual e as utiliza como genitoras da próxima geração Se as características que causam a mais alta produção são hereditárias a próxima geração então deverá ter produção mais alta Não foi ao acaso que Darwin escolheu o termo seleção natural para descrever o seu modelo de evolução por meio de diferenças nas taxas de reprodução demonstradas por diferentes variantes na população Como um modelo para esse processo evolutivo na natureza ele tinha em mente a seleção que os cultivadores e criadores exercem sobre sucessivas gerações de plantas e animais domésticos Podemos resumir a teoria da evolução pela seleção natural em três princípios Princípio da variação Entre os indivíduos de qualquer população existe variação na morfologia na fisiologia e no comportamento Princípio da hereditariedade A descendência se assemelha aos seus genitores mais do que se assemelha aos indivíduos não relacionados Princípio da seleção Alguns tipos obtêm mais sucesso na sobrevivência e na reprodução do que outros tipos em um determinado ambiente Um processo seletivo pode produzir alterações na composição da população apenas se houver algumas variações que possam ser selecionadas Se todos os indivíduos forem idênticos nenhuma diferença nas taxas reprodutivas dos indivíduos não importa quanto extrema seja alterará a composição da população Além disso a variação deve ser em parte hereditária para que essas diferenças nas taxas reprodutivas alterem a composição genética da população Se animais grandes de uma população apresentarem mais descendência do que os animais pequenos mas a sua descendência em média não for maior do que aquela dos animais pequenos não haverá então alteração na composição da população de uma geração até outra Finalmente se todos os tipos variantes deixarem em média o mesmo número de descendentes podemos então esperar que a população permaneça inalterada CONCEITOCHAVE Os princípios da variação da hereditariedade e da seleção devem ser todos aplicáveis para que ocorra evolução por meio de um mecanismo de variação A variação hereditária proporciona a matériaprima para alterações sucessivas em uma espécie e para a multiplicação de novas espécies Os mecanismos básicos dessas alterações conforme discutido no Capítulo 18 são a origem de novas variações genéticas por mutação da alteração na frequência de alelos em populações por meio de processos seletivos e aleatórios da divergência de diferentes populações em virtude da diferença das forças seletivas ou em virtude da deriva aleatória e da redução da variação entre populações por migração Figura 202 A partir desses mecanismos básicos pode ser derivado um conjunto de princípios que regulam as alterações na composição genética das populações A aplicação desses princípios da genética de populações proporciona uma teoria genética da evolução 202 FIGURA 202 Os efeitos de diversas forças evolutivas sobre a frequência alélica As setas azuis demonstram uma tendência em direção ao aumento da variação na população as setas vermelhas diminuição da variação CONCEITOCHAVE A evolução a alteração em populações ou espécies ao longo do tempo é a conversão da variação hereditária entre indivíduos nas populações em diferenças hereditárias entre populações no tempo e no espaço por meio de mecanismos da genética de populações Seleção natural em ação Caso exemplar Durante quase um século após a publicação de A Origem das Espécies não houve um exemplo de seleção natural que não tenha sido totalmente elucidado ou seja onde o agente da seleção natural era conhecido o efeito sobre os diferentes genótipos pôde ser medido a base genética e molecular da variação foi identificada e o papel fisiológico do gene ou da proteína envolvida foi bem compreendido O primeiro exemplo integrado de seleção natural sobre uma variante molecular foi elucidado na década de 1950 antes mesmo da elucidação do código genético Notavelmente esse trabalho pioneiro revelou que a seleção natural opera em seres humanos Ele ainda permanece como um dos exemplos mais detalhados e importantes de evolução por seleção natural em qualquer espécie A história teve início quando Tony Allison um estudante de medicina de Oxford nascido no Quênia fez um estudo de campo dos tipos sanguíneos entre tribos quenianas Um dos exames de sangue que ele realizou foi em relação às células falciformes eritrócitos que adquirem um formato de foice com a exposição ao agente redutor metabissulfito de sódio ou após ficarem em repouso por alguns dias Figura 203 As células deformadas são um marco da anemia falciforme uma doença descrita pela primeira vez em 1910 Essas células causam complicações patológicas por meio da oclusão dos vasos sanguíneos e levam à mortalidade precoce Em 1949 o mesmo ano em que Allison realizava seu trabalho de campo o grupo de pesquisa de Linus Pauling demonstrou que pacientes com anemia falciforme apresentavam proteína hemoglobina com uma carga anormal hemoglobina S ou HbS em seu sangue em comparação à hemoglobina de indivíduos não afetados hemoglobina A ou HbA Essa foi a primeira demonstração de uma anormalidade molecular ligada a uma doença complexa Naquela época em geral compreendiase que portadores de células falciformes eram heterozigotos e portanto apresentavam uma mistura de HbA e HbS indicados como AS enquanto os indivíduos afetados eram homozigotos em relação ao alelo HbS indicados como SS Allison coletou amostras de sangue de membros das tribos Kikuyo Masai Luo e outras tribos em diversas regiões do Quênia Embora ele não tenha observado associação particularmente surpreendente entre os tipos sanguíneos AB0 ou MN entre as tribos ele mediu frequências notavelmente diferentes de HbS Nas tribos que viviam no Quênia central árido ou nas montanhas a frequência de HbS era inferior a 1 entretanto nas tribos que viviam na costa ou próximo do lago Victoria a frequência de HbS normalmente excedia os 10 e se aproximava de 40 em alguns locais Tabela 201 As frequências alélicas eram surpreendentes por dois motivos Primeiramente tendo em vista que a anemia falciforme normalmente era letal por que as frequências do alelo HbS eram tão altas E em segundo lugar tendo em vista as distâncias relativamente curtas entre as regiões por que a frequência de HbS era tão alta em alguns locais e em outros não A familiaridade de Allison com o terreno as tribos e as doenças tropicais do Quênia o levou à explicação crucial Allison percebeu que o alelo HbS estava a uma frequência alta em regiões úmidas e baixas com níveis muito altos de malária e quase ausente em altitudes elevadas tais como ao redor de Nairóbi Carregado por mosquitos o parasita intracelular Plasmodium falciparum que causa a malária multiplicase dentro dos eritrócitos Figura 204 Os mosquitos e a doença são prevalentes por toda a África Subsaariana em regiões baixas e úmidas próximas a coleções de água nas quais os mosquitos se reproduzem Allison conjeturou que o alelo HbS poderia por meio da alteração dos eritrócitos conferir algum grau de resistência à infecção por malária Tabela 201 Frequência de HbS em algumas tribos quenianas Tribo Afinidade ética Distritoregião HbS Luo Nilótica Kisumu lago Victoria 257 Suba Bantu Ilha Rusingo 277 Kikuy Bantu Nairóbi 04 FIGURA 203 Uma micrografia eletrônica colorida demonstrando células falciformes entre eritrócitos normais Eye of ScienceScience Source FIGURA 204 Esfregaço sanguíneo de um indivíduo infectado por parasitas da malária Uma amostra eritrocitária foi tratada com corante Giemsa para revelar os parasitas dentro das células pontos vermelhos CDCDra Mae Melvin Vantagem seletiva de HbS Com a finalidade de testar esta ideia Allison realizou uma pesquisa muito maior da frequência de HbS por toda a África Oriental incluindo Uganda Tanzânia e Quênia Ele examinou aproximadamente 5000 indivíduos que representavam mais de 30 tribos diferentes Novamente ele observou frequências de HbS de até 40 em áreas com malária e frequências de até 0 onde a malária estava ausente A ligação sugeria que o alelo HbS poderia afetar os níveis do parasita e assim Allison realizou um estudo sobre o nível de parasitas no sangue de crianças heterozigotas AS versus crianças do tipo selvagem AA Em um estudo de quase 300 crianças ele observou que a incidência de parasitas da malária de fato era inferior em crianças AS 279 do que em crianças AA 457 e que a densidade de parasitas também era mais baixa em crianças AS Os resultados indicaram que crianças AS apresentavam mais baixas incidência e gravidade de infecções por malária e que portanto apresentavam uma vantagem seletiva nas áreas em que a malária era prevalente A vantagem dos heterozigotos AS era especialmente surpreendente à luz da doença sofrida pelos homozigotos SS Allison observou A proporção de indivíduos com células falciformes em qualquer população então será o resultado de um equilíbrio entre dois fatores a gravidade da malária que tenderá a aumentar a frequência do gene e a taxa de eliminação dos genes falciformes em indivíduos que morrem por anemia falciforme Geneticamente falando esse é um polimorfismo balanceado grifo nosso no qual o heterozigoto apresenta uma vantagem sobre qualquer homozigoto5 Em outras palavras a mutação falciforme estava sob seleção balanceada ver Capítulo 18 nas áreas em que a malária estava presente A seleção positiva que opera sobre indivíduos AS é equilibrada pela seleção natural que opera contra os indivíduos AA suscetíveis à malária e os indivíduos SS que podem sucumbir à anemia falciforme Quanta vantagem os indivíduos AS vivenciam Isso pode ser calculado ao medir a frequência do alelo HbS nas populações e examinar como essas frequências diferem das frequências esperadas sob as presunções da equação de HardyWeinberg ver Capítulo 18 Uma análise em grande escala de 12387 africanos orientais revelou uma frequência do alelo HbS q de 0123 As frequências calculadas a partir da equação de HardyWeinberg são mais baixas em relação aos fenótipos homozigotos e mais altas em relação ao fenótipo heterozigoto Tabela 202 Se presumirmos que o heterozigoto AS apresenta adaptabilidade de 10 o valor adaptativo relativo dos outros genótipos então pode ser estimado a partir dessas diferenças O valor adaptativo relativo do genótipo heterozigoto AS é 10088 1136 que corresponde a uma vantagem seletiva de aproximadamente 14 Essa vantagem seletiva foi bemdocumentada por estudos da sobrevida a longo prazo de crianças AA AS e SS no Quênia Esses estudos observaram que os indivíduos AS apresentam uma vantagem de sobrevida pronunciada sobre indivíduos AA e SS nos primeiros anos de vida Figura 205 CONCEITOCHAVE O alelo da hemoglobina falciforme HbS está sob seleção balanceada em zonas com malária e transmite uma grande vantagem de sobrevida em heterozigotos ao longo dos primeiros anos de vida Origens moleculares de HbS Após a descoberta de Allison houve um entusiasmado interesse em determinar a base molecular das diferenças entre HbS e HbA O sequenciamento da proteína determinou que HbS difere de HbA em apenas um aminoácido uma valina no lugar de um resíduo de ácido glutâmico Essa alteração de um único aminoácido altera a carga das hemoglobinas e causa a sua agregação em estruturas longas em formato de bastão dentro dos eritrócitos Após o código genético ter sido decifrado e métodos para o sequenciamento do DNA terem sido desenvolvidos determinouse que HbS é causada por uma única mutação de ponto CTC CAC no códon do ácido glutâmico que codifica o sexto aminoácido da subunidade β globina dentro da proteína hemoglobina Tabela 202 Vantagem em termos de adaptabilidade de heterozigotos falciformes Genótipo Frequência fenotípica observada Frequência fenotípica esperada Razão de observadaesperada Wadaptabilidade relativa SS 29 1874 0155 0155112 014 AS 2993 26724 112 112112 100 AA 9365 95272 0983 0983112 088 Total 12387 12387 FIGURA 205 A sobrevida relativa de aproximadamente 1000 crianças de Kisumu está inserida em gráfico desde o nascimento até os primeiros anos de vida Heterozigotos falciformes apresentaram uma vantagem significativa na sobrevida geral dos 2 aos 16 meses de idade Dados de M Aidoo et al The Lancet 359 2002 13111312 Curiosamente Allison também observou uma alta incidência de HbS fora da África incluindo Itália Grécia e Índia Outros marcadores de tipo sanguíneo não indicaram fortes relações genéticas entre essas populações Em vez disso Allison observou que essas também eram áreas com alta incidência de malária A correlação entre a frequência de HbS e a incidência de malária era mantida não apenas na África Oriental mas no continente africano no sul da Europa e no subcontinente indiano Allison compôs mapas demonstrando essas surpreendentes correlações Figura 206 e inferiu que os alelos HbS em diferentes regiões surgiram independentemente não por meio da difusão por migração Na verdade com o advento de ferramentas para a genotipagem do DNA está claro que a mutação HbS surgiu independentemente em cinco haplótipos diferentes e sua frequência aumentou em certas regiões Com base na diversidade genética limitada das populações com malária acreditase que a mutação HbS tenha surgido nos últimos séculos após as populações começarem a viver ao redor de cursos de água com o advento da agricultura FIGURA 206 Estes mapas demonstram a correspondência próxima entre a distribuição da malária esquerda e a frequência do traço falciforme direita na África Dados de A C Allison Genetics 66 2004 1591 redesenhada por Leanne Olds 1 2 3 203 CONCEITOCHAVE O papel da mutação da hemoglobina S falciforme de conferir resistência à malária foi o primeiro exemplo de seleção natural a ser elucidado no qual o agente de seleção foi demonstrado o valor adaptativo relativo dos diferentes genótipos pôde ser medido e a base genética e molecular da variação funcional foi revelada O papel da HbS de conferir resistência à malária ilustrou três facetas importantes do processo evolutivo A evolução pode se repetir e se repete As múltiplas origens e expansões independentes da mutação HbS demonstram que quando são proporcionados um tamanho de população e um tempo suficiente as mesmas mutações podem surgir e se difundir repetidamente Atualmente são conhecidos muitos outros exemplos de repetição independente e precisa da evolução de mutações adaptativas e encontraremos diversos outros neste capítulo A adaptabilidade é um estado condicional muito relativo Se uma mutação é vantajosa desvantajosa ou nenhuma das duas depende muito das condições ambientais Na ausência de malária HbS é muito rara e desfavorecida Onde a malária está presente ela pode alcançar altas frequências apesar das desvantagens impostas aos homozigotos SS Em afroamericanos a frequência de HbS está em declínio em virtude da seleção contra o alelo na ausência de malária na América do Norte A seleção natural atua sobre qualquer variação que esteja disponível não necessariamente pelos melhores meios imagináveis A mutação HbS embora seja uma proteção contra a malária também causa uma condição de risco à vida Nas áreas em que a malária é prevalente onde vivem mais de 40 da população mundial o imperativo de combater a malária contrabalanceia o efeito deletério da mutação falciforme Evolução molecular Teoria neutra Darwin e Wallace conceberam a evolução amplamente como alterações nos organismos ocasionadas por seleção natural Na verdade é assim que a maior parte das pessoas pensa a respeito do significado de evolução Entretanto um século após a teoria de Darwin na medida em que biólogos moleculares começaram a confrontar a evolução no nível das proteínas e das moléculas de DNA eles encontraram e identificaram outra dimensão do processo evolutivo a evolução molecular neutra que não envolve a seleção natural Uma compreensão sobre a evolução molecular neutra é crucial para entender como os genes se alteram ao longo do tempo Desenvolvimento da teoria neutra Na década de 1950 e no início da década de 1960 foram desenvolvidos métodos que possibilitaram que os biólogos determinassem as sequências de aminoácidos das proteínas Essa nova capacidade deu origem à perspectiva de que a base fundamental da alteração evolutiva finalmente estivesse ao alcance das mãos Entretanto na medida em que as sequências de proteínas de uma diversidade de espécies foram decifradas surgiu um paradoxo As sequências das globinas e do citocromo c por exemplo diferem tipicamente entre duas espécies quaisquer no número de aminoácidos e esse número aumenta com o tempo decorrido desde a sua divergência a partir de um ancestral comum Figura 207 Ainda assim a função dessas proteínas é a mesma em diferentes espécies transportar e disponibilizar oxigênio para os tecidos no caso da hemoglobina e alternar elétrons durante a respiração celular no caso do citocromo c O quebracabeça era então se as substituições de aminoácidos entre as espécies refletiam alterações na função das proteínas e adaptações às condições seletivas Os bioquímicos Linus Pauling e Emile Zuckerkandl não achavam isso Eles observaram que muitas substituições eram de um aminoácido por outro com propriedades semelhantes Eles concluíram que a maior parte das substituições de aminoácidos era neutra ou quase neutra e que elas não alteravam em nada a função de uma proteína Essa linha de raciocínio foi rejeitada à primeira vista por muitos biólogos evolutivos que na ocasião consideravam todas as alterações evolutivas resultado da seleção natural e da adaptação O paleontólogo George Gaylord Simpson argumentou que existe um forte consenso de que genes ou alelos completamente neutros devem ser raros se chegarem a existir Para um biólogo evolutivo portanto parece ser altamente improvável que as proteínas possam ser alteradas de maneira regular porém não adaptativa6 Zuckerkandl e Pauling afirmaram que a semelhança ou as diferenças entre os organismos não precisam ser refletidas no nível da proteína que a alteração molecular e a alteração visível não eram necessariamente ligadas ou proporcionais FIGURA 207 Número de substituições de aminoácidos na evolução dos vertebrados como uma função do tempo desde a divergência As três proteínas fibrinopeptídios hemoglobina e citocromo c diferem na taxa de substituições em virtude de as diferentes proporções de suas substituições de aminoácidos serem seletivamente neutras O debate foi resolvido por um ataque de dados empíricos e pela elucidação do código genético Tendo em vista que múltiplos códons codificam o mesmo aminoácido uma mutação que altera digamos CAG para CAC não altera o aminoácido codificado Portanto pode existir uma variação no nível do DNA que não apresenta efeitos sobre as sequências proteicas e portanto existem alelos neutros No entanto mais importante para a genética de populações foi o desenvolvimento da teoria neutra da evolução molecular por Motoo Kimura Jack L King e Thomas Jukes Esses autores propuseram que a maior parte das mutações que são fixadas é neutra ou quase neutra mas não todas e que quaisquer diferenças entre as espécies em tais sítios no DNA evoluem por deriva genética aleatória A teoria neutra marcou uma profunda alteração conceitual que se distancia da consideração sobre a evolução sempre orientada por seleção natural Além disso ela proporcionou uma base sobre como o DNA deve mudar ao longo do tempo se nenhum outro agente tal como a seleção natural intervier CONCEITOCHAVE A teoria neutra da evolução molecular propôs que a maior parte das mutações no DNA ou das substituições de aminoácidos entre as espécies é funcionalmente neutra ou quase neutra e fixada por deriva genética aleatória A suposição de neutralidade oferece uma expectativa basal sobre como o DNA deve mudar ao longo do tempo quando a seleção natural está ausente Taxa de substituições neutras Conforme vimos no Capítulo 18 ver Quadro 185 podemos calcular a taxa esperada de alterações neutras nas sequências de DNA ao longo do tempo Se μ é a taxa de novas mutações em um locus por cópia de gene por geração o número absoluto de novas mutações que aparecerão em uma população de N indivíduos diploides é então 2Nμ As novas mutações estão sujeitas à deriva genética aleatória a maior parte será perdida da população enquanto algumas se tornarão fixas e substituirão o alelo anterior Se uma mutação que se originou recentemente for neutra existe então uma probabilidade de 12N de que ela substitua o alelo anterior em virtude da deriva genética aleatória Cada uma das 2Nμ novas mutações que aparecerão em uma população apresenta uma probabilidade de 12N de finalmente fazer parte dessa população Portanto a taxa de substituição absoluta k é a taxa de mutação multiplicada pela probabilidade de que qualquer mutação acaba sofrendo deriva K Taxa de substituição neutra 2Nμ 12N μ Ou seja esperamos que a cada geração ocorram μ substituições na população puramente a partir de deriva genética das mutações neutras CONCEITOCHAVE A taxa de substituições no DNA na evolução que resulta de deriva genética aleatória das mutações neutras é igual à taxa de mutação para tais alelos μ Assinatura da seleção purificadora no DNA Quando as medidas da alteração molecular se desviam do que é esperado em relação às alterações neutras isso é um sinal importante um sinal de que a seleção interveio Tal sinal pode revelar que a seleção favoreceu alguma alteração específica ou que rejeitou outras Vimos no caso da mutação HbS como a seleção natural favorece a mutação na presença do parasita da malária mas a rejeita onde a malária está ausente A influência mais pervasiva da seleção natural sobre o DNA na verdade é conservar a função e a sequência do gene Todas as classes de sequências de DNA incluindo éxons íntrons sequências reguladoras e sequências entre genes demonstram diversidade de nucleotídios entre os indivíduos nas populações e entre as espécies A taxa constante de substituições neutras prevê que se o número de diferenças nucleotídicas entre duas espécies for inserido em um gráfico em face do tempo desde a sua divergência de um ancestral comum o resultado deverá ser uma linha reta com uma inclinação igual a μ Ou seja a evolução deve avançar de acordo com um relógio molecular que está operando a uma taxa μ A Figura 208 demonstra um gráfico em relação ao gene da βglobina Os resultados são consideravelmente consistentes com a alegação de que as substituições de nucleotídios têm sido neutras nos últimos 500 milhões de anos Dois tipos de substituições de nucleotídios neutras estão inseridos no gráfico substituições sinônimas que são de um códon alternativo para outro sem alterar o aminoácido e substituições não sinônimas que resultam em alteração no aminoácido A Figura 208 demonstra uma inclinação muito mais baixa em relação às substituições não sinônimas do que em relação às substituições sinônimas o que significa que a taxa de substituição das substituições não sinônimas neutras é muito mais baixa do que aquela das substituições neutras sinônimas FIGURA 208 A divergência nucleotídica em sítios sinônimos é maior do que em sítios não sinônimos do gene da βglobina Esse desfecho é precisamente o que esperamos sob seleção natural As mutações que causam a substituição de um aminoácido devem apresentar um efeito deletério com mais frequência do que as substituições sinônimas que não alteram a proteína As variantes deletérias serão removidas das populações pela seleção purificadora ver Capítulo 18 Uma razão inferior à esperada entre alterações não sinônimas e sinônimas é uma assinatura da seleção purificadora É importante notar que essas observações não demonstram que as substituições sinônimas não sofrem restrições seletivas sobre elas Em vez disso elas demonstram que essas restrições em média não são tão fortes quanto aquelas das mutações que alteram aminoácidos Assim uma alteração sinônima ainda que não apresente efeito sobre a sequência de aminoácidos altera o mRNA naquela sequência e portanto pode afetar a estabilidade do mRNA ou a eficiência em que o mRNA é traduzido A seleção purificadora é a faceta mais disseminada mas frequentemente negligenciada da seleção natural A rejeição de variações danosas tal como Darwin denominou é universal A seleção purificadora explica o motivo de encontrarmos tantas sequências de proteínas que são inalteradas ou quase inalteradas ao longo de vastos períodos de tempo evolutivo Por exemplo há várias dezenas de genes que existem em todos os domínios da vida Archaea bactérias fungos plantas e animais que codificam proteínas cujas sequências têm sido amplamente conservadas ao longo de 3 bilhões de anos de evolução Para preservar as referidas sequências variantes que surgiram aleatoriamente em bilhões de indivíduos em dezenas de milhões de espécies foram rejeitadas por seleção repetidamente CONCEITOCHAVE A seleção purificadora é um aspecto penetrante da seleção natural que reduz a variação genética e preserva as sequências de DNA e proteínas por muito tempo Outra previsão da teoria da evolução neutra é que diferentes proteínas apresentarão diferentes taxas temporais tendo em vista que as funções metabólicas de algumas proteínas serão muito mais sensíveis às alterações em suas sequências de aminoácidos As proteínas nas quais cada aminoácido faz uma diferença apresentarão uma taxa mais baixa de mutação neutra tendo em vista que uma menor proporção de suas mutações será neutra em comparação às proteínas que são mais tolerantes à substituição A Figura 207 demonstra uma comparação 204 dos relógios para os fibrinopeptídios a hemoglobina e o citocromo c É razoável que os fibrinopeptídios apresentem uma proporção muito mais alta de mutações neutras tendo em vista que esses peptídios são meramente uma trava de segurança não metabólica retirada do fibrinogênio para ativar a reação de coagulação sanguínea Não está claro o motivo pelo qual as hemoglobinas são menos sensíveis às alterações de aminoácidos do que o citocromo c CONCEITOCHAVE A taxa de evolução neutra em relação à sequência de aminoácidos de uma proteína depende da sensibilidade da função da proteína às alterações de aminoácidos A conservação das sequências gênicas por meio da seleção purificadora e a evolução neutra de sequências gênicas são duas dimensões cruciais do processo evolutivo mas nenhuma delas explica a origem das adaptações Nas duas próximas seções ilustraremos diversos exemplos dos modos por meio dos quais as alterações genéticas estão ligadas às alterações nos traços e à diversidade dos organismos Seleção cumulativa e vias de múltiplas etapas até a alteração funcional Tendo em vista que uma grande parte da evolução é neutra não existe uma relação simples entre a quantidade de alterações no DNA de um gene e a quantidade de alterações se existente na função da proteína codificada Em um extremo quase toda a sequência de aminoácidos de uma proteína pode ser substituída ao mesmo tempo que se mantém a função original se aqueles aminoácidos que são substituídos mantiverem a estrutura tridimensional da enzima Contrariamente a função de uma enzima pode ser alterada pela substituição de um único aminoácido A mosca dos ovinos Lucilia cuprina desenvolveu resistência a inseticidas organofosforados amplamente utilizados para o seu controle Richard Newcombe Peter Campbell e seus colegas demonstraram que essa resistência é a consequência de uma única substituição do ácido aspártico por um resíduo de glicina no sítio ativo de uma enzima que é ordinariamente uma carboxilesterase desmembra um éster carboxílico RCOOR em um álcool e um carboxilato A mutação causa a perda completa da atividade de carboxilesterase e a sua substituição pela atividade de esterase desmembra qualquer éster RO R em um ácido e um álcool A modelagem tridimensional da molécula indica que a proteína substituída ganha a capacidade de se ligar a uma molécula de água próxima do sítio de ligação do organoforado Em seguida a molécula de água reage com o organoforado dividindoo em dois CONCEITOCHAVE Não existe uma relação proporcional entre quanta alteração ocorre no DNA na evolução e quanta alteração funcional resulta A seleção claramente desempenha um papel na evolução da carboxilesterase do inseto e na resistência ao inseticida Entretanto em muitos casos as substituições de aminoácidos que alteram a função da proteína são mais numerosas e se acumulam durante repetidas rodadas de mutação e seleção ao que se denomina seleção cumulativa O poder da seleção cumulativa de direcionar alterações maiores na função de uma molécula é uma das facetas menos apreciadas da evolução por seleção natural Um motivo é que o papel da seleção em cada uma das múltiplas substituições é mais difícil de certificar CONCEITOCHAVE A seleção cumulativa pode impulsionar a fixação de muitas alterações em moléculas em evolução Com a finalidade de compreender o papel da seleção em casos de substituições múltiplas são adotadas duas abordagens principais análise experimental empírica e métodos estatísticos Ilustraremos de início a primeira delas Vias de múltiplas etapas na evolução Quando as mutações surgem em múltiplos sítios na evolução de um estado fenotípico para outro existem múltiplas ordens possíveis nas quais essas mutações podem aparecer cada uma representando uma via diferente no espaço genético que a evolução pode assumir Tais vias de múltiplas etapas da alteração evolutiva são denominadas vias adaptativas Suponha que a diferença entre o fenótipo original e a forma que evoluiu seja uma consequência de mutações em cinco sítios A B C D e E Existem muitas ordens diferentes nas quais essas mutações podem ter ocorrido ao longo da evolução Primeiramente o sítio A pode ter sido fixado na população em seguida D em seguida C em seguida E e finalmente B Por outro lado a ordem de fixação pode ter sido E D A B C Em relação a cinco sítios existem 5 4 3 2 1 120 ordens possíveis Duas questões importantes na compreensão da evolução são Quantas dessas vias evolutivas alternativas são possíveis e Quais são as probabilidades de diferentes vias possíveis em relação umas às outras Daniel Weinreich e seus colegas caracterizaram em detalhes tal conjunto de vias adaptativas no espaço genético em seu estudo sobre a evolução da resistência a antibiótico na bactéria E coli A resistência ao antibiótico cefotaxima é adquirida por meio do acúmulo de cinco mutações em diferentes sítios no gene da βlactamase bacteriana Quatro das mutações levam a alterações de aminoácidos e a quinta é uma mutação não codificadora Quando todas as cinco mutações estão presentes a concentração mínima de antibiótico necessária para inibir o crescimento bacteriano aumenta em um fator de 100000 Os experimentadores primeiramente mediram a resistência conferida por uma mutação em um determinado sítio na presença de todas as 24 16 combinações possíveis de mutantes e não mutantes nos outros quatro sítios Na maior parte das combinações mas não em todas um mutante em um sítio era mais resistente independentemente do estado dos outros quatro sítios Por exemplo um mutante no sítio G238S demonstrou resistência significativa independentemente do estado mutante ou não mutante dos outros quatro sítios Tabela 203 Por outro lado a mutação no sítio não codificador g4205a conferiu resistência significativa em oito combinações alteração insignificante na resistência em seis casos e uma diminuição na resistência em duas combinações Essa dependência da vantagem ou da desvantagem adaptativa de uma nova mutação sobre as mutações que haviam sido fixadas anteriormente é o que os experimentadores denominam epistasia de sinal Weinrich e colegas mediram a resistência a cada etapa na sequência temporal da adição de mutações um sítio após o outro Se uma mutação em uma das 120 ordens possíveis não conferisse uma resistência mais alta presumivelmente aquela via evolutiva seria então encerrada tendo em vista que não haveria seleção em favor da mutação ou mesmo contra ela Eles observaram que das 120 vias possíveis pelo histórico da mutação apenas 18 conferiam aumento de resistência a cada etapa da mutação Portanto 102120 85 das possíveis vias de mutação até a resistência máxima não eram acessíveis para a evolução por seleção natural Finalmente presumimos que em uma população que desenvolve resistência a probabilidade de que uma via acessível em particular de fato seja seguida é proporcional à magnitude do aumento da resistência a cada etapa Sob essa premissa apenas 10 das 18 vias acessíveis explicarão 90 dos casos de evolução de resistência bacteriana ao antibiótico Figura 209 CONCEITOCHAVE A ordem na qual as mutações ocorrem é de importância crítica para determinar a via de evolução e se a evolução por seleção natural irá ou não de fato alcançar o estado mais vantajoso Tendo em vista que a ordem de ocorrência das mutações é aleatória muitos fenótipos vantajosos podem nunca ser alcançados muito embora ocorram mutações individuais Tabela 203 A dependência dos efeitos da adaptabilidade de mutações sobre mutações anteriores em E coli Número de alelos nos quais o efeito mutacional médio é Mutação Positivo Negativo Insignificante Aumento proporcional médio g4205a 8 2 6 14 A42G 12 0 4 59 E104K 15 1 0 97 M182T 8 3 5 28 G238S 16 0 0 10 10³ As mutações que levam à resistência ao antibiótico são designadas pela posição de seus nucleotídios ou aminoácidos Das 16 possíveis combinações alélicas dos quatro outros sítios os efeitos positivos negativos ou neutros da mutação estão indicados juntamente com o aumento proporcional médio na adaptabilidade em relação às mutações no sítio indicado FIGURA 209 As etapas mutacionais em relação às 10 trajetórias mais prováveis desde a suscetibilidade do tipo selvagem ao antibiótico cefotaxima até a resistência máxima Cada círculo representa um alelo cuja identidade é indicada por um trecho de cinco símbolos de ou correspondentes esquerda para a direita à presença ou à ausência das mutações g4205a A42G E104K M182T e G238S respectivamente Os números indicam o grau de resistência à cefotaxima em microgramas por mililitro A probabilidade relativa de cada mutação benéfica é representada pela cor e pela largura das setas verde larga mais alta azul média moderada roxa estreita baixa e laranja muito estreita a mais baixa Dados de D Weinreich et al Science 312 2006 111114 Então um fatorchave na determinação da via evolutiva que uma população pode seguir é a aleatoriedade do processo de mutação Após a variação genética inicial ser exaurida pela fixação seletiva e aleatória de alelos a nova variação que tem origem a partir da mutação pode ser a fonte da alteração evolutiva adicional A direção em particular dessa evolução adicional depende das mutações em particular que ocorrem e da ordem temporal na qual elas surgem Uma ilustração muito clara dessa contingência histórica de vias adaptativas é um experimento de seleção realizado por Holly Wichman e seus colegas Eles forçaram o bacteriófago ΦX174 a se reproduzir em altas temperaturas e no hospedeiro Salmonella typhimurium em vez de no seu hospedeiro normal Escherichia coli Duas linhagens independentes de vírus foram estabelecidas rotuladas TX e ID e mantidas em separado embora ambas tenham sido expostas às mesmas condições Ambas desenvolveram a capacidade de se reproduzir em altas temperaturas no novo hospedeiro Em uma das duas linhagens a capacidade de se reproduzir na E coli ainda existia mas na outra linhagem a capacidade foi perdida O bacteriófago apresenta apenas 11 genes e assim os experimentadores puderam registrar as sucessivas alterações no DNA em relação a todos esses genes e nas proteínas codificadas por eles durante o processo de seleção Houve 15 alterações do DNA na linhagem TX localizadas em seis genes diferentes na linhagem ID houve 14 alterações localizadas em quatro genes diferentes Em sete casos as alterações nas duas linhagens foram idênticas incluindo uma grande deleção mas até mesmo essas alterações idênticas apareceram em cada linhagem em uma ordem diferente Tabela 204 Assim por exemplo a alteração no sítio 1533 do DNA que causou uma substituição de isoleucina por treonina foi a terceira alteração na linhagem ID mas a 14a alteração na linhagem TX Portanto o curso da evolução seguido pelos vírus inicialmente idênticos dependeu das mutações disponíveis em um dado momento no processo de seleção cumulativa Contraste essa situação com a origem repetida do alelo falciforme HbS nesse caso a mesma mutação surgiu e se difundiu cinco vezes Claramente em alguns casos existem muitas soluções moleculares para as condições seletivas e em outros apenas uma ou poucas CONCEITOCHAVE Sob condições idênticas de seleção natural duas populações podem chegar a composições genéticas idênticas ou diferentes como resultado direto da seleção natural Tabela 204 Substituições moleculares em dois bacteriófagos ΦX174 TX e ID durante adaptação Ordem Sítio TX Troca de aminoácido Sítio ID Troca de aminoácido 1 782 E72 T 1 2167 F388 H Q 2 1727 F242 L F 1613 F204 T S 3 2085 F361 A V 15336 F177 T I 4 319 C63 V F 1460 F153 Q E 5 2973 H15 G S 1300 F99 silenciosa 6 323 C64 D G 1305³ F101 G D 7 4110³ A44 H Y 1308 F102 Y C 8 1025 F8 E K 4110¹ A44 H Y 9 31667 H79 A V 4637 A219 silenciosa 10 5185 A402 T M 965914 deleção 11 1305² F101 G D 53655 A462 M T 12 965914 deleção 41687 A63 Q R 13 53655 A462 M T 3166² H79 A V 14 1533¹ F177 T I 1809 F269 K R 15 41686 A63 Q R As alterações estão listadas na ordem em que apareceram em cada uma das duas linhagens de bacteriófagos durante a seleção A posição do nucleotídio está listada seguida pela proteína afetada AH com o número do resíduo de aminoácido e a natureza da substituição do aminoácido As alterações em paralelo estão demonstradas em negrito e um sobrescrito indica a ordem daquelas alterações na outra linhagem viral de seleção Fonte H A Wichman et al Science 285 1999 422424 A dissecção experimental das vias evolutivas consome muito tempo e é dispendiosa Além disso com frequência não é prático para os experimentadores modificar todo genótipo possível em uma via adaptativa nas populações ou tentar medir a adaptabilidade relativa de muitos organismos na natureza Os exemplos de resistência a antibióticos e hospedeiros virais são casos em que tanto a modificação genética quanto medições de adaptabilidade são prontamente 1 2 executadas em bactérias e seus vírus em laboratório Em outras situações foram planejados métodos estatísticos para revelar uma assinatura que indicasse que a seleção atuou nas sequências de DNA e proteínas Assinatura de seleção positiva nas sequências de DNA A demonstração do relógio molecular argumenta que a maior parte das substituições de nucleotídios que ocorreram na evolução foi neutra mas não nos informa o quanto da evolução molecular consistiu em uma alteração adaptativa direcionada por seleção positiva Um modo de detectar a evolução adaptativa de uma proteína é por meio da comparação dos polimorfismos sinônimos e não sinônimos de nucleotídios dentro das espécies com as alterações sinônimas e não sinônimas nos nucleotídios entre espécies Se todas as mutações forem neutras a razão de polimorfismos não sinônimos de nucleotídios em relação aos sinônimos dentro de uma espécie deverá ser a mesma que a razão de substituições de nucleotídios não sinônimos em relação aos sinônimos entre espécies Por outro lado se as alterações de aminoácidos entre as espécies houverem sido direcionadas por seleção positiva deve haver um excesso de alterações não sinônimas entre as espécies Um teste para detectar a seleção positiva nas sequências de DNA foi desenvolvido por John McDonald e Martin Kreitman Esse teste envolve diversas etapas lógicas porém simples A sequência de DNA de um gene é obtida a partir de um número de indivíduos ou linhagens em separado de cada uma das duas espécies Dez ou mais sequências de cada espécie seriam desejáveis Em seguida as diferenças de nucleotídios fixados entre as espécies são classificadas em diferenças não sinônimas a e sinônimas b As diferenças de nucleotídios entre os indivíduos dentro de cada espécie polimorfismos são tabuladas em seguida e classificadas como aquelas que resultam em mudanças de aminoácidos polimorfismos não sinônimos c na tabela a seguir ou aquelas que não alteram o aminoácido polimorfismos sinônimos d na tabela a seguir 3 Se a divergência entre as espécies for puramente o resultado de deriva genética aleatória esperamos então que ab seja igual a cd Se por outro lado houver ocorrido uma divergência seletiva deverá haver um excesso de diferenças não sinônimas fixadas e assim ab deve ser maior que cd Diferenças fixadas nas espécies Polimorfismos Não sinônimos a c Sinônimos b d Razão ab cd A Tabela 205 demonstra uma aplicação desse princípio para o gene da desidrogenase alcoólica em três espécies de Drosophila relacionadas de modo próximo Claramente existe um excesso de substituições de aminoácidos entre as espécies acima do que é esperado Portanto concluímos que algumas das substituições de aminoácidos na enzima foram alterações adaptativas direcionadas por seleção natural Tabela 205 Polimorfismos sinônimos e não sinônimos e diferenças em relação à desidrogenase alcoólica em três espécies de Drosophila Organismo Diferenças nas espécies Polimorfismos Não sinônimo 7 2 Sinônimo 17 42 205 Razão 029071 005095 Fonte J McDonald e M Kreitman Adaptive Protein Evolution at the Adh locus in Drosophila Nature 351 1991 652654 Evolução morfológica Uma das categorias mais óbvias e interessantes da evolução dos traços é aquela da morfologia dos organismos Entre animais por exemplo existe uma grande diversidade no número tipo tamanho formato e cor das partes corporais Tendo em vista que a forma adulta é o produto do desenvolvimento embrionário as alterações na forma devem ser o resultado de alterações que ocorrem durante o desenvolvimento Avanços recentes na compreensão do controle genético do desenvolvimento ver Capítulo 13 possibilitaram que os pesquisadores investigassem as bases genéticas e moleculares da evolução da forma dos animais Veremos que algumas das alterações dramáticas na forma dos animais apresentam uma base genética e molecular relativamente simples enquanto a evolução dos traços regulados por muitos genes toolkit envolve mecanismos moleculares que são distintos daqueles que examinamos até agora Examinaremos casos nos quais as substituições codificadoras a inativação de genes e a evolução da sequência reguladora respectivamente são a base da divergência morfológica Alterações adaptativas em uma proteína reguladora de pigmento Alguns dos exemplos mais surpreendentes e mais bemcompreendidos da divergência morfológica são encontrados nos padrões da coloração corporal em animais A pelagem dos mamíferos a plumagem das aves as escamas dos peixes e os esquemas de cores das asas dos insetos são maravilhosamente diversos Investigadores realizaram muitos progressos na compreensão sobre o controle genético da formação das cores e de seu papel na evolução das diferenças de colorações dentro das espécies e entre elas Na região de Pinacate no sudoeste do Arizona afloramentos rochosos escuros são circundados por granito arenoso de cor mais clara Figura 2010 O pequeno roedor Chaetodipus intermedius habita Pinacate bem como outras áreas rochosas dessa região Os camundongos encontrados nas rochas magmáticas são tipicamente de coloração escura enquanto aqueles encontrados nas áreas adjacentes de granito de cor arenosa ou no solo desértico em geral são normalmente de coloração clara Figura 2011 Estudos de campo sugerem que a correspondência entre a cor da coloração da pelagem e do ambiente protege os camundongos contra a sua visualização por parte de predadores O roedor Chaetodipus intermedius fornece um exemplo do melanismo a ocorrência de uma forma escura em uma população ou espécie O melanismo é um dos tipos mais comuns de variação fenotípica em animais A coloração escura da pelagem ocorre em virtude da pesada deposição do pigmento melanina o pigmento mais difundido no reino animal Em mamíferos dois tipos de melanina são produzidos nos melanócitos as células de pigmento da epiderme e dos folículos pilosos eumelanina que forma os pigmentos pretos ou marrons e feomelanina que forma os pigmentos amarelos ou vermelhos As quantidades relativas de eumelanina e feomelanina são controladas pelos produtos de diversos genes Duas proteínaschave são o receptor de melanocortina 1 MC1R e a proteína aguti Durante o ciclo de crescimento dos pelos o hormônio estimulante dos melanócitos α αMSH se liga à proteína MC1R que aciona a indução das enzimas produtoras dos pigmentos A proteína aguti bloqueia a ativação de MC1R e inibe a produção de eumelanina FIGURA 2010 Fluxos de lava no deserto de Pinacate produziram rochas pretas adjacentes aos substratos de cor arenosa Michael Nachman University of Arizona FIGURA 2011 Chaetodipus intermedius de coloração clara e escura da região de Pinacate no Arizona estão demonstrados em solo com cor arenosa e na rocha magmática preta Michael Nachman de M W Nachman et al The Genetic Basis of Adaptive Melanism in Pocket Mice Proc Natl Acad Sci USA 100 2003 52685273 Michael Nachman e seus colegas examinaram as sequências de DNA dos genes mcr1 dos roedores Chaetodipus intermedius de coloração clara e escura Eles observaram a presença de quatro mutações no gene mc1r em roedores escuros que fazem com que a proteína MC1R seja diferente em quatro resíduos de aminoácidos da proteína correspondente em roedores claros Achados de estudos bioquímicos sugerem que tais mutações fazem com que a proteína MC1R seja constitutivamente ativa ativa em todas as ocasiões evitando bypassing a regulação da atividade receptora pela proteína aguti Na verdade mutações em mc1r estão associadas ao melanismo em todos os tipos de vertebrados selvagens e domesticados Muitas dessas mutações alteram resíduos na mesma parte da proteína MC1R e as mesmas mutações ocorreram independentemente em algumas espécies Figura 2012 De muitas maneiras podemos pensar a respeito desses roedores escuros como análogos aos tentilhões das Galápagos e das rochas magmáticas como novos habitats insulares produzidos pela mesma atividade vulcânica que produziu as ilhas Galápagos O tipo de coloração arenosa do roedor aparenta ser o tipo ancestral semelhante ao tentilhão continental ancestral que colonizou Galápagos A vantagem de ser menos visível para os predadores resultou em seleção natural em relação à coloração da pelagem e a invasão das ilhas de rochas magmáticas pelos roedores levou à difusão de um alelo que foi favorecido no solo rochoso negro e selecionado contra o solo de coloração arenosa Novas mutações no gene mc1r foram essenciais para essa adaptação ao cenário em alteração A evolução do melanismo em roedores Chaetodipus intermedius ilustra como a adaptabilidade depende das condições nas quais um organismo vive A nova mutação preta foi favorecida no ambiente com rochas magmáticas mas desfavorecida na população ancestral que vive em terreno de cor arenosa CONCEITOCHAVE A adaptabilidade relativa de uma nova variante depende das condições seletivas imediatas Uma mutação que pode ser benéfica em uma população pode ser deletéria em outra FIGURA 2012 Substituições de aminoácidos círculos laranja associadas ao melanismo variam discretamente na localização em diferentes espécies mas estão localizadas na mesma parte da proteína MC1R A parte superior da figura demonstra a topologia geral da proteína MC1R A região na qual as substituições estão localizadas está aumentada na parte inferior da figura Dados de E Eizirik et al Molecular Genetics and Evolution in the Cat Family Curr Biol 13 2003 448453 reimpressa com permissão de Elsevier Inativação gênica Há muito tempo observouse que animais que residem em cavernas com frequência são cegos e incolores Darwin observou em A Origem das Espécies que diversos animais que pertencem às mais diferentes classes que habitam as cavernas de Carniola na Eslovênia e Kentucky EUA são cegos Tendo em vista que é difícil imaginar que os olhos ainda que inúteis de algum modo possam ser prejudiciais para os animais que vivem no escuro a sua perda pode ser atribuída à não utilização7 Muitas espécies de peixes que vivem em cavernas perderam seus olhos e a coloração corporal Tendo em vista que essas espécies pertencem a muitas diferentes famílias que incluem espécies que contêm olhos e que habitam a superfície claramente a perda dos olhos e da pigmentação ocorreu repetidamente Por exemplo o peixecego mexicano de caverna Astyonax mexicanus pertence à mesma ordem que a piranha e o tetra cor de neon Aproximadamente 30 populações de peixes de caverna no México perderam a coloração do corpo dos seus parentes que habitam a superfície Figura 2013 FIGURA 2013 Tipos de superfície do peixe Astyanu mexicanus aparentam ser normais mas as populações de caverna tais como aquelas das cavernas de Molino e Pachón no México desenvolveram repetidamente a cegueira e o albinismo Cortesia de Richard Borowsky Estudos genéticos indicaram que o albinismo na população de peixes da caverna Pachón ocorre em virtude de mutação recessiva única Além disso um cruzamento entre um indivíduo da caverna Molino e um indivíduo da caverna Pachón produziu apenas descendência albina sugerindo que o albinismo nas duas populações ocorra em virtude do mesmo locus genético Para identificar o gene responsável pelo albinismo nos peixes pesquisadores investigaram os genótipos de peixes em diversos loci de pigmentação que sabidamente causam albinismo em camundongos ou seres humanos Eles observaram um desses genes Oca2 mapeado no locus albino Eles também observaram que havia uma associação perfeita entre o genótipo do locus Oca2 e o fenótipo de albinismo na descendência de F2 que era um retrocruzamento entre a progênie F1 Molino e Molinosuperfície ou a progênie F1 Pachón e Pachónsuperfície A inspeção adicional do gene Oca2 revelou que a população de Pachón era homozigota em relação a uma deleção que se estendia de um íntron até a maior parte de um éxon e que a população Molino era homozigota em relação à deleção de um éxon diferente Análises funcionais comprovaram que cada deleção no gene Oca2 causava a perda da função de Oca2 A identificação de diferentes lesões no gene Oca2 das duas populações de caverna indica que o albinismo evoluiu em separado nas duas populações de caverna Também existem evidências de que uma terceira população de caverna carrega ainda uma terceira mutação distinta em Oca2 Sabese de outros vertebrados que o albinismo pode ser desenvolvido por meio de mutações em outros genes O que pode explicar a repetida inativação do gene Oca2 Existem duas explicações possíveis Primeiramente as mutações em Oca2 aparentam não causar nenhum defeito colateral sério além da perda da pigmentação e da visão Alguns outros genes de pigmentação quando mutados em peixes causam reduções dramáticas na viabilidade Os efeitos das mutações em Oca2 então aparentam ser menos pleiotrópicos e causar efeitos sobre a adaptabilidade geral que são menos prejudiciais do que aqueles das mutações em outros genes de pigmentação em peixes Em segundo lugar o locus Oca2 é muito grande abrangendo aproximadamente 345 kb em seres humanos e contendo 24 éxons Ele representa um alvo muito grande para mutações aleatórias que perturbariam a função do gene portanto é mais provável que surjam mutações em Oca2 do que mutações em loci menores A perda da função gênica não é o que normalmente pensamos quando refletimos a respeito da evolução Mas a inativação gênica certamente é o que devemos prever que ocorra quando as condições seletivas se alteram ou quando populações ou espécies alteram seus habitats ou estilos de vida e determinadas funções gênicas deixam de ser necessárias CONCEITOCHAVE As mutações de inativação gênica podem ocorrer e aumentar até uma alta frequência quando alterações no habitat ou no estilo de vida relaxam a seleção natural sobre traços e funções gênicas subjacentes Evolução de sequência reguladora Conforme discutido anteriormente uma importante restrição na evolução gênica é o potencial de efeitos colaterais prejudiciais causados por mutações em regiões codificadoras que alteram a função da proteína Esses efeitos podem ser contornados por mutações nas sequências reguladoras que são cruciais para a evolução da regulação gênica e para a forma corporal Os exemplos de evolução da coloração corporal que vimos até agora apresentam alterações no padrão da pelagem ou das escamas por todo o corpo A evolução de coloração corporal totalmente preta ou totalmente não pigmentada pode surgir por meio de mutações nos genes de pigmentação Entretanto com frequência muitos esquemas de cores são compostos por duas ou mais cores em algum padrão espacial Nesses casos a expressão dos genes de pigmentação deve diferir nas áreas do corpo que serão de cores diferentes Em diferentes populações ou espécies a regulação dos genes de pigmentação deve evoluir por meio de algum mecanismo que não altere a função das proteínas de pigmentação As espécies das moscasdasfrutas do gênero Drosophila demonstram extensiva diversidade de marcas corporais e nas asas Um padrão comum é a presença de uma mancha preta próxima à ponta das asas em machos Figura 2014 A produção de manchas pretas requer enzimas que sintetizam a melanina o mesmo pigmento produzido em roedores Chaetodipus intermedius Muitos genes que controlam a via de síntese da melanina foram bemestudados no organismomodelo Drosophila melanogaster Um gene é denominado yellow amarelo tendo em vista que as mutações no gene fazem com que áreas do corpo com pigmentação escura aparentem ser amareladas ou bronze O gene yellow desempenha um papel central no desenvolvimento de padrões de melanina divergentes Em espécies com manchas a proteína Yellow é expressa em níveis altos nas células das asas que produzirão a mancha preta enquanto em espécies sem manchas a proteína Yellow é expressa em um nível baixo por toda a lâmina das asas Figura 2015 A FIGURA 2014 Machos de Drosophila melanogaster não apresentam manchas nas asas parte superior enquanto machos de Drosophila biarmipes parte inferior apresentam manchas escuras nas asas que são exibidas em um ritual de acasalamento Esta diferença morfológica simples ocorre em virtude de diferenças na regulação dos genes de pigmentação Nicolas Gompel A diferença na expressão de Yellow entre as espécies manchadas e não manchadas pode ocorrer em virtude de diferenças no modo como o gene yellow é regulado nas duas espécies Qualquer um dos dois mecanismos possíveis pode atuar ou ambos as espécies podem diferir na disposição espacial de fatores de transcrição que regulam o gene yellow ou seja alterações nas sequências de ação trans para o gene yellow ou podem diferir nas sequências reguladoras de ação cis que controlam como o gene yellow é regulado Para examinar quais mecanismos estão envolvidos investigadores examinaram a atividade das sequências reguladoras de ação cis de yellow de diferentes espécies ao posicionálas upstream de um gene repórter e introduzilas em D melanogaster O gene yellow é regulado por um arranjo de sequências reguladoras de ação cis separadas que regulam a transcrição do gene em diferentes tecidos e tipos celulares e em diferentes ocasiões no desenvolvimento Figura 2015 B Essas sequências reguladoras incluem aquelas que controlam a transcrição nas partes bucais das larvas no tórax e no abdome das pupas e na lâmina das asas em desenvolvimento Descobriuse que enquanto o elemento regulador de ação cis da lâmina das asas de espécies não manchadas direciona a expressão em nível baixo de um gene repórter na lâmina das asas o elemento correspondente de uma espécie manchada tal como D biarmipes ou D elegans direciona um alto nível de expressão do repórter em uma mancha próxima da ponta das asas Figura 2015 C Essas observações demonstram que alterações na sequência e na função de um elemento regulador de ação cis são responsáveis pela alteração na regulação do gene yellow e contribuem para a origem das manchas das asas Demonstrouse que o elemento regulador de ação cis das espécies manchadas adquiriu sítios de ligação para fatores de transcrição que atualmente direcionam altos níveis de transcrição gênica em um padrão de manchas nas asas em desenvolvimento FIGURA 2015 A evolução da regulação gênica e da morfologia no caso demonstrado ocorre em virtude da evolução em sequências reguladoras de ação cis A Em moscasdasfrutas manchadas a proteína de pigmentação Yellow é expressa em altos níveis nas células que produzirão grandes quantidades de melanina B O locus yellow das espécies de Drosophila contém diversos elementos reguladores de ação cis discretos vermelho que regulam a transcrição de yellow em diferentes partes corporais Os éxons estão demonstrados em dourado As setas indicam o ponto de início e o sentido da transcrição do gene C O elemento regulador das asas da D biarmipes direciona a expressão do gene repórter em um padrão manchado na asa em desenvolvimento enquanto o elemento homólogo de D melanogaster não ativa um padrão de machas de expressão do repórter Esta diferença nas atividades do elemento regulador de ação cis demonstra que as alterações na função do elemento regulador de ação cis são a base das diferenças na expressão da Yellow e na pigmentação entre as duas espécies Portanto alterações evolutivas nas sequências reguladoras de ação cis desempenham um papel crítico na evolução da forma corporal A localização da alteração na sequência reguladora em vez do próprio gene pode ser mais bem explicada à luz dos muitos diferentes efeitos que podem aparecer como resultado de uma mutação codificadora em um gene toolkit Nesse caso o gene yellow é altamente pleiotrópico ele é necessário para a pigmentação de muitas estruturas e também para funções no sistema nervoso Uma mutação codificadora que altera a atividade da proteína Yellow alteraria a atividade de Yellow em todos os tecidos o que poderia apresentar uma consequência negativa em termos de aptidão Entretanto tendo em vista que as sequências reguladoras de ação cis individuais normalmente afetam apenas um aspecto da expressão gênica mutações nessas sequências proporcionam um mecanismo para alterar um aspecto da expressão gênica enquanto preservam o papel dos produtos proteicos em outros processos do desenvolvimento CONCEITOCHAVE As alterações evolutivas nas sequências reguladoras de ação cis desempenham um papel crítico na evolução da expressão gênica Elas contornam os efeitos pleiotrópicos de mutações nas sequências codificadoras dos genes que apresentam múltiplos papéis no desenvolvimento Perda de características por meio da evolução de sequências reguladoras Características morfológicas podem ser perdidas bem como ganhas como resultado de alterações adaptativas nas sequências reguladoras de ação cis Se não houver pressão seletiva para manter uma característica ela pode ser perdida ao longo do tempo Mas algumas perdas são benéficas tendo em vista que facilitam alguma alteração no estilo de vida Os membros traseiros por exemplo foram perdidos muitas vezes em vertebrados em cobras lagartos baleias e peixesboi na medida em que esses organismos se adaptaram a diferentes habitats e meios de locomoção As alterações evolutivas em sequências reguladoras de ação cis também estão ligadas a essas importantes alterações Os precursores evolutivos dos membros traseiros dos vertebrados quadrúpedes são as barbatanas pélvicas dos peixes Diferenças acentuadas na anatomia das barbatanas pélvicas evoluíram em populações de peixes relacionadas de modo próximo O peixe esganagato ocorre em dois tipos em muitos lagos da América do Norte um tipo de águas abertas com espinha pélvica bemdesenvolvida e um tipo que habita o fundo de águas superficiais com uma pelve e espinhas dramaticamente reduzidas Em águas abertas as espinhas longas ajudam na proteção dos peixes para que não sejam engolidos por predadores maiores Mas no fundo dos lagos tais espinhas são uma desvantagem tendo em vista que podem ser agarradas por larvas de libélulas que se alimentam dos peixes jovens Figura 2016 A e 2016 B As diferenças na morfologia pélvica evoluíram repetidamente nos últimos 10000 anos desde a recessão das geleiras da última era do gelo Muitos lagos separados foram colonizados por esganagatos oceânicos com espinhas longas e tipos com espinhas pélvicas reduzidas evoluíram independentemente muitas vezes Tendo em vista que os peixes estão relacionados de modo tão próximo e são intercruzados em laboratório geneticistas conseguem mapear os genes envolvidos na redução da pelve O grupo de David Kingsley na Stanford University juntamente com o grupo de Dolph Schluter na University of British Columbia mapeou um fator importante envolvido nas diferenças pélvicas no gene Pitx1 que codifica um fator de transcrição Assim como a maior parte dos outros genes toolkit do desenvolvimento o gene Pitx1 apresenta diversas funções distintas no desenvolvimento dos peixes Entretanto no tipo do peixe esganagato com pelve reduzida a sua expressão é perdida da área do embrião do peixe em desenvolvimento que dará origem ao broto da barbatana pélvica e das espinhas ver Figura 2016 O fato de que a diferença na morfologia pélvica entre os dois tipos foi mapeada no locus Pitx1 e foi associada à perda da expressão gênica sugeriu que alterações nas sequências reguladoras de Pitx1 eram responsáveis pela diferença nos fenótipos Assim como a maior parte dos genes toolkit pleiotrópicos a expressão do gene Pitx1 em diferentes partes do peixe em desenvolvimento é controlada por elementos reguladores de ação cis em separado Frank Chan et al demonstraram que o elemento regulador que controla a expressão de Pitx1 na pelve em desenvolvimento foi inativado por grandes mutações de deleção em múltiplas populações independentes de peixes com a pelve reduzida Figura 2016 C e D Além disso observouse que a heterozigosidade era reduzida ao redor das sequências de ação cis que controlam a expressão pélvica em relação a outras sequências próximas Essa observação é consistente com a deleção do alelo que está sendo favorecido por seleção natural que atua sobre o tipo com pelve reduzida que habita o fundo Portanto esses achados ilustram ainda mais como mutações em sequências reguladoras contornam os efeitos pleiotrópicos de mutações codificadoras nos genes toolkit e que as alterações adaptativas na morfologia podem ocorrer em virtude da perda bem como do ganho de expressão gênica durante o desenvolvimento CONCEITOCHAVE As alterações adaptativas na morfologia podem resultar da inativação de sequências reguladoras e da perda da expressão gênica bem como da modificação das sequências reguladoras e do ganho de expressão gênica Contornar os efeitos colaterais possivelmente prejudiciais de mutações codificadoras é um fator muito importante para explicar por que a evolução atua dando origem a novos papéis para os fatores de transcrição que podem regular dúzias a centenas de genesalvo Alterações nas sequências codificadoras de um fator de transcrição por exemplo no domínio de ligação ao DNA podem afetar todos os genesalvo com consequências catastróficas para o animal A restrição nas sequências codificadoras de proteínas altamente pleiotrópicas com muitas funções explica a extraordinária conservação dos domínios de ligação ao DNA das proteínas Hox e muitos outros fatores de transcrição ao longo de vastos períodos de tempo evolutivo Embora as funções bioquímicas das proteínas sejam restringidas a sua regulação diverge A evolução dos padrões de expressão dos genes Hox e outros toolkit desempenha um papel importante na evolução da forma corporal FIGURA 2016 Deleções em um elemento regulador cis de Pitx1 são a base da evolução adaptativa do esqueleto pélvico do peixe esganagato A Um tipo de peixe esganagato habita águas rasas e um tipo diferente habita águas abertas B O tipo de águas superficiais apresenta um esqueleto pélvico reduzido esquerda em relação ao tipo de águas abertas direita C Esta redução ocorre em virtude da perda seletiva da expressão do gene Pitx1 laranja do broto da barbatana pélvica durante o desenvolvimento das larvas do esganagato compare as larvas de esganagato à esquerda e à direita D A perda da expressão de Pitx1 por sua vez ocorre em virtude da mutação de um acentuador do gene Pitx1 específico para a barbatana pélvica X marca o acentuador mutado Outros acentuadores do gene Pitx1 que controlam a expressão do gene em algum outro local no corpo em desenvolvimento não são afetados e atuam de modo semelhante em ambos os tipos de peixe Evolução reguladora em seres humanos A evolução reguladora não está limitada aos genes que afetam o desenvolvimento O nível o momento ou o padrão espacial da expressão de qualquer gene podem variar nas populações ou divergir entre as espécies Por exemplo conforme observado anteriormente ver Capítulo 18 as frequências de alelos no locus do grupo sanguíneo Duffy variam amplamente em populações humanas O locus Duffy indicado como Fy codifica uma glicoproteína que atua como um receptor para múltiplas proteínas de sinalização intercelular Na África Subsaariana a maior parte dos membros de populações indígenas carrega o alelo Fynulo Indivíduos com esse alelo não expressam quaisquer das glicoproteínas Duffy nos eritrócitos embora a proteína ainda esteja sendo produzida em outros tipos celulares Como e por que a glicoproteína Duffy está ausente nos eritrócitos desses indivíduos A explicação molecular para a ausência de expressão da glicoproteína Duffy nos eritrócitos é a presença de uma mutação de ponto na região promotora do gene Duffy na posição 46 Essa mutação está localizada em um sítio de ligação para um fator de transcrição específico de eritrócitos denominado GATA1 Figura 2017 A mutação desse sítio elimina a atividade de um acentuador do gene Duffy em ensaios de gene repórter Uma explicação evolutiva sugere que a ausência da expressão da glicoproteína Duffy nos eritrócitos entre africanos é resultado da seleção natural que favorece a resistência à infecção por malária O parasita da malária Plasmodium vivax é o segundo tipo mais prevalente de parasita da malária na maior parte das regiões tropicais e subtropicais do mundo mas atualmente está ausente na África Subsaariana O parasita obtém o acesso aos eritrócitos e aos precursores dos eritrócitos por meio da ligação à glicoproteína Duffy ver Figura 2017 A frequência muito alta de homozigotos Fynulo na África evita que o P vivax se torne comum ali Além disso se supusermos que P vivax tenha sido comum na África no passado o alelo Fynulo teria então sido selecionado A ausência complexa da proteína Duffy nos eritrócitos de uma grande subpopulação dá origem ao questionamento se a proteína Duffy apresenta qualquer função necessária tendo em vista que aparentemente ela é dispensável Mas não é o caso de esses indivíduos não apresentarem expressão da proteína Duffy A proteína é expressa nas células endoteliais do sistema vascular e nas 206 células de Purkinje do cerebelo Assim como a evolução da expressão da proteína Yellow em moscasdasfrutas com asas manchadas e da expressão de Pitx1 em esganagatos a mutação reguladora no locus Fy possibilita que um aspecto da expressão gênica em eritrócitos seja alterado sem modificar os outros ver Figura 2017 Modificações em sequências codificadoras e reguladoras são meios comuns para a alteração evolutiva Elas ilustram como a diversidade por surgir sem a alteração no número de genes em uma espécie Entretanto as alterações mutacionais em maior escala podem ocorrer no DNA e ocorrem o que resulta na expansão do número de genes e essa expansão fornece a matériaprima para a inovação evolutiva Origem de novos genes e funções proteicas A evolução é composta por mais do que a substituição de um alelo por outro em loci de funções definidas Uma grande fração de genes codificadores de proteínas e de RNA pertence a famílias gênicas grupos de genes que estão relacionados em termos de sequência e tipicamente também na função bioquímica Por exemplo existem mais de 1000 genes que codificam receptores olfatórios estruturalmente relacionados em um camundongo e três genes de opsina estruturalmente relacionados que codificam proteínas necessárias para a visão em cores nos seres humanos Dentro de famílias como essas foram desenvolvidas novas funções que possibilitaram novas capacidades Essas novas funções podem ser expansões de capacidades existentes Nos exemplos anteriores novos receptores apareceram em camundongos com a capacidade de detectar novas substâncias químicas no ambiente ou no caso dos seres humanos e de seus parentes primatas do Velho Mundo apareceram novas opsinas que conseguem detectar comprimentos de onda de luz que outros mamíferos não conseguem Em outros casos a evolução de novas famílias gênicas pode levar a funções totalmente novas que podem proporcionar novos modos de vida tais como a aquisição de proteínas anticongelamento em peixes polares Aqui indagaremos de onde vem o DNA para os novos genes Quais são os destinos dos novos genes E como as novas funções proteicas se desenvolvem FIGURA 2017 Uma mutação reguladora em um acentuador do gene humano Duffy está associada à resistência à malária A A proteína Duffy azulescuro é tipicamente expressa em células sanguíneas bem como em células de Purkinje no cérebro e em células endoteliais B Uma alta proporção de africanos ocidentais não apresenta expressão de Duffy em seus eritrócitos em virtude de uma mutação em um acentuador de células sanguíneas a sequência GATA é mutada para GACA Tendo em vista que a proteína Duffy é parte do receptor para o parasita da malária P vivax laranja indivíduos com a mutação reguladora são resistentes à infecção mas apresentam expressão normal de Duffy em algum outro local no corpo Expansão do número de genes Existem diversos mecanismos genéticos que podem expandir o número de genes ou de partes de genes Um processo em grande escala para a expansão do número de genes é a formação de poliploides indivíduos com mais de dois conjuntos cromossômicos Os poliploides resultam da duplicação do genoma inteiro Muito mais comum em plantas do que em animais ver Capítulo 17 a formação de poliploides desempenhou um papel importante na evolução das espécies de plantas Considere a distribuição de frequências de números de cromossomos haploides entre as espécies de plantas dicotiledôneas demonstradas na Figura 2018 Acima de um número cromossômico de aproximadamente 12 números pares são muito mais comuns do que números ímpares uma consequência da poliploidia frequente Um segundo mecanismo que pode aumentar o número de genes é a duplicação gênica A replicação errônea do DNA durante a meiose pode causar a duplicação de segmentos de DNA Os comprimentos dos segmentos duplicados podem variar de apenas um ou dois nucleotídios até segmentos substanciais de cromossomos contendo muitos ou até mesmo centenas de genes Análises detalhadas da variação do genoma humano revelaram que seres humanos comumente carregam pequenas duplicações que resultam em uma variação no número de cópias de genes Um terceiro mecanismo que pode dar origem às duplicações gênicas é a transposição Por vezes quando um elemento de transposição é transposto para outra parte do genoma ele pode carregar também material genético adicional do hospedeiro e inserir uma cópia de alguma parte do genoma em outro local ver Capítulo 15 Um quarto mecanismo que pode expandir o número de genes é a retrotransposição Muitos genomas animais abrigam elementos genéticos semelhantes a retrovírus ver Capítulo 15 que codificam atividade de transcriptase reversa Os próprios retrotranspósons compõem aproximadamente 40 do genoma humano Ocasionalmente transcritos de mRNA do genoma hospedeiro são transcritos de modo reverso em cDNA e inseridos de volta no genoma produzindo uma duplicata do gene sem íntrons Destino de genes duplicados Chegouse a acreditar que em virtude de a função ancestral ser proporcionada pelo gene original os genes duplicados seriam essencialmente elementos genéticos sobressalentes que estão livres para desenvolver novas funções denominada neofuncionalização e que esse seria um destino comum Entretanto a análise detalhada de genomas e as considerações da genética de populações levaram a melhor compreensão sobre os destinos alternativos das novas duplicatas de genes com a evolução da nova função sendo apenas uma via FIGURA 2018 Distribuição de frequência de números haploides de cromossomos em plantas dicotiledôneas Dados de Verne Grant The Origin of Adaptations Columbia University Press 1963 Para simplificar consideraremos um evento de duplicação que resulta na duplicação de toda a região codificadora e reguladora de um gene Figura 2019 A Muitos desfechos diferentes podem surgir a partir de uma duplicação O resultado mais simples é que o alelo que contém a duplicação é perdido da população antes de aumentar até alcançar qualquer frequência significativa assim como é o destino de muitas novas mutações ver Capítulo 18 Mas consideraremos em seguida cenários mais interessantes suponha que a 1 2 3 duplicação sobreviva e que novas mutações comecem a ocorrer no par de genes duplicado Tendo em mente que os genes originais e duplicados são inicialmente cópias exatas e portanto redundantes após o surgimento de novas mutações existem diversos destinos possíveis Pode ocorrer uma mutação de inativação na região codificadora de qualquer duplicata O parálogo inativado é denominado pseudogene e em geral será invisível para a seleção natural Portanto ele acumulará mais mutações e evoluirá por deriva genética enquanto a seleção natural manterá o parálogo funcional Figura 2019 B Podem ocorrer mutações que alteram a regulação de uma duplicata ou a atividade de uma proteína codificada Esses alelos podem então se tornar sujeitos à seleção positiva e adquirir uma nova função neofuncionalização Figura 2019 C Em casos nos quais o gene ancestral apresenta mais de uma função e mais de um gene regulador assim como em relação à maior parte dos genes toolkit um terceiro desfecho possível é que as mutações iniciais inativem ou alterem um elemento regulador em cada duplicata A função do gene inicial agora é dividida entre as duplicatas que se complementam Com a finalidade de preservar a função ancestral a seleção natural manterá a integridade de ambas as regiões codificadoras dos genes Dizse que os loci que seguem essa via de duplicação e mutação que produzem parálogos complementares são subfuncionalizados Figura 2019 D Alguns desses destinos alternativos de duplicatas de genes estão ilustrados na história da evolução gênica da globina humana A evolução da nossa linhagem desde os ancestrais peixes até o amniotos terrestres que botam ovos e até os mamíferos placentários necessitou de uma série de inovações na oxigenação tecidual que incluem a evolução de genes de globina adicionais com novos padrões de regulação e a evolução de proteínas de hemoglobina com propriedades de ligação ao oxigênio distintas A hemoglobina adulta é um tetrâmero composto por duas cadeias de polipeptídios α e duas cadeias β cada uma com a sua molécula de heme ligada O gene que codifica a cadeia α adulta está no cromossomo 16 e o gene que codifica a cadeia β está no cromossomo 11 As duas cadeias são aproximadamente 49 idênticas em suas sequências de aminoácidos essa similaridade reflete a sua origem comum a partir de um gene de globina ancestral há muito no tempo evolutivo O gene da cadeia α está localizado em um aglomerado de cinco genes relacionados α e ζ no cromossomo 16 enquanto o da cadeia β está localizado em um aglomerado de seis genes relacionados no cromossomo 11 ε β δ e γ Figura 2020 Cada aglomerado contém um pseudogene ψα e ψβ respectivamente que acumulou mutações inativadoras aleatórias FIGURA 2019 Os destinos alternativos de genes duplicados A A duplicação de um gene Os quadros laranja amarelos e corderosa indicam elementos reguladores cis o quadro bege indica a região codificadora Após a duplicação diversos destinos alternativos das duplicatas são possíveis B qualquer mutação inativadora em uma região codificadora tornará aquela duplicata um pseudogene e em seguida a seleção purificadora operará no parálogo remanescente C podem surgir mutações que alteram a função de uma proteína e elas podem ser favorecidas por seleção positiva neofuncionalização D as mutações podem afetar uma subfunção de qualquer duplicata e desde que os dois parálogos em conjunto proporcionem as funções ancestrais diferentes subfunções podem ser mantidas resultando na evolução de dois loci complementares subfuncionalização Cada aglomerado contém genes que desenvolveram perfis de expressão distintos uma função distinta ou ambos De maior interesse são os dois genes γ Esses genes são expressos durante os últimos 7 meses de desenvolvimento fetal para produzir a hemoglobina fetal também conhecida como hemoglobina F que é composta por duas cadeias α e duas cadeias γ A hemoglobina fetal apresenta maior afinidade pelo oxigênio do que a hemoglobina adulta o que possibilita que o feto extraia o oxigênio a partir da circulação materna por meio da placenta Ao nascimento até 95 da hemoglobina é do tipo fetal em seguida a expressão da forma β adulta substitui a γ e uma pequena quantidade de globina δ também é produzida A ordem de aparecimento das cadeias de globina durante o desenvolvimento é orquestrada por um conjunto complexo de sequências reguladoras de ação cis e notavelmente segue a ordem dos genes em cada cromossomo Os genes γ são restritos aos mamíferos placentários Sua regulação do desenvolvimento distinta e seus produtos proteicos significam que essas duplicatas desenvolveram diferenças na função que contribuíram para a evolução do estilo de vida placentário Curiosamente são conhecidas variantes reguladoras desses genes que causam a persistência da expressão da hemoglobina fetal na infância e na fase adulta Essas variantes de ocorrência natural aparentam moderar a gravidade da anemia falciforme ao suprimir os níveis de HbS produzidos Uma estratégia difundida para o tratamento da anemia falciforme é administrar fármacos que estimulam a reativação da expressão da hemoglobina fetal FIGURA 2020 Distribuição cromossômica dos genes em relação à família α de globinas no cromossomo 16 e à família β de globinas no cromossomo 11 em seres humanos A estrutura do gene está demonstrada pelas barras pretas éxons e pelas barras coloridas íntrons RESUMO A teoria da evolução por seleção natural explica as alterações que ocorrem em populações de organismos como resultantes de alterações nas frequências relativas de diferentes variantes na população Se não houver variação dentro de uma espécie em relação a algum traço não pode haver evolução Além disso tal variação deve ser influenciada por diferenças genéticas Se as diferenças não forem hereditárias elas não podem evoluir tendo em vista que a vantagem reprodutiva de uma variante não será transmitida para as gerações seguintes É crucial compreender que os processos mutacionais que dão origem à variação no genoma atuam aleatoriamente mas que o processo seletivo que separa as variantes vantajosas e desvantajosas não é aleatório A capacidade de estudar a evolução no nível do DNA e das proteínas transformou a nossa compreensão sobre o processo evolutivo Antes que tivéssemos a capacidade de estudar a evolução no nível molecular não havia suspeita de que grande parte da evolução fosse de verdades resultado de deriva genética não da seleção natural Uma grande parte da evolução molecular aparenta ser a substituição de uma sequência proteica por outra de função equivalente Entre as evidências em relação à prevalência da evolução neutra está o fato de que o número de diferenças nos aminoácidos entre duas espécies diferentes em uma molécula por exemplo hemoglobina é diretamente proporcional ao número de gerações desde a sua divergência a partir de um ancestral comum no passado evolutivo Não esperaríamos que existisse um relógio molecular com uma taxa de alterações constante se a seleção das diferenças fosse dependente de alterações em particular no ambiente Assim uma grande parte da evolução de sequências é neutra de modo que não há uma relação simples entre a quantidade de alterações na sequência de DNA de um gene e a quantidade de alterações se existente na função da proteína codificada Algumas funções proteicas podem ser alteradas por meio da substituição de um único aminoácido enquanto outras requerem uma série de substituições ocasionadas por meio da seleção cumulativa Tais vias adaptativas de múltiplas etapas podem seguir vias diferentes inclusive quando as condições de seleção natural são as mesmas Isso ocorre porque as vias disponíveis para qualquer população em determinado momento dependem da ocorrência de mutações ao acaso que podem não surgir na mesma ordem em diferentes populações Além disso as etapas anteriores adotadas podem afetar o fato de uma nova mutação ser favorecida desfavorecida ou neutra Antes do advento da genética molecular não era possível saber se eventos evolutivos independentes poderiam ter dado origem à mesma adaptação múltiplas vezes Ao detalhar os genes e as mutações exatas envolvidas nas alterações de função agora reconhecemos que a evolução pode se repetir e se repete por meio da ação sobre os mesmos genes para produzir resultados semelhantes em casos independentes Por exemplo alterações nos mesmos genes são responsáveis por casos de surgimento independente de melanismo e albinismo em alguns vertebrados ou pela perda de espinhas pélvicas em diferentes populações de peixes esganagato A evolução pode se repetir por meio da alteração do mesmo nucleotídio no caso do surgimento independentemente das mutações falciformes que levam à resistência adaptativa à malária Uma importante restrição na evolução das sequências codificadoras é a dos efeitos colaterais possivelmente prejudiciais das mutações Se uma proteína desempenha múltiplas funções em diferentes tecidos como é o caso em relação a muitos genes envolvidos na regulação dos processos de desenvolvimento mutações nas sequências codificadoras podem afetar todas as funções e diminuir a adaptabilidade Os possíveis efeitos pleiotrópicos das mutações codificadoras podem ser contornados por mutações em sequências reguladoras não codificadoras As mutações nessas sequências podem alterar seletivamente a expressão gênica em apenas um tecido ou uma parte corporal não em outras A evolução das sequências reguladoras de ação cis é central para a evolução dos traços morfológicos e para a expressão de genes toolkit que controlam o desenvolvimento Com frequência surgem novas funções proteicas por meio da duplicação de genes e subsequente mutação Um novo DNA pode surgir por meio da duplicação do genoma inteiro poliploidia uma ocorrência frequente em plantas ou por meio de diversos mecanismos que produzem duplicatas de genes individuais ou conjuntos de genes O destino de genes duplicados depende muito da natureza das mutações adquiridas após a duplicação Os possíveis destinos são a inativação de uma duplicata a divisão de função entre duas duplicatas ou o ganho de novas funções Em geral a evolução genética está sujeita à contingência histórica e ao acaso mas é restringida pela necessidade de os organismos sobreviverem e se reproduzirem em um mundo constantemente em alteração O mais adaptado é um estado condicional sujeito a alteração na medida em que o planeta e os habitats são alterados TERMOSCHAVE adaptação duplicação gênica epistasia de sinal família gênica neofuncionalização pseudogene relógio molecular retrotransposição seleção cumulativa seleção natural subfuncionalização substituição não sinônima substituição sinônima via adaptativa PROBLEMAS RESOLVIDOS Problema resolvido 1 Observase que duas espécies de bactérias relacionadas de modo próximo fixaram dois alelos diferentes detectados eletroforeticamente em um locus que codifica uma enzima envolvida na fragmentação de um nutriente Como você testaria experimentalmente se a divergência nas sequências 1 2 3 enzimáticas pode ter causado diferenças na função e na adaptabilidade Solução Com a finalidade de testar se as enzimas apresentam diferentes propriedades funcionais devemos planejar experimentos in vitro e in vivo Se os substratos e as propriedades das enzimas forem conhecidos podemos purificar a enzima de cada espécie e medir diretamente se existem diferenças funcionais Alternativamente um teste indireto seria verificar se cada espécie cresce bem no nutriente em particular que a enzima fragmenta Idealmente com a finalidade de medir as diferenças na adaptabilidade substituímos a região codificadora da enzima de uma espécie pela região codificadora da enzima da segunda espécie e viceversa Em seguida o crescimento de cada linhagem do tipo selvagem e transgênica poderia ser comparado no meio contendo o mesmo nutriente com o crescimento sendo um indicador de adaptabiliadade Se houver diferenças na adaptabilidade relativa das linhagens transgênica e do tipo selvagem então é possível que as enzimas tenham divergido sob a seleção natural Caso negativo é então provável que as enzimas tenham evoluído de modo neutro ou que o efeito da seleção seja muito pequeno para ser medido experimentalmente PROBLEMAS QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS Na Figura 205 observe que a diferença nas taxas de sobrevida entre os genótipos AS e AA declina na medida em que as crianças ficam mais velhas Ofereça uma possível explicação para essa observação Examinando a Figura 208 explique por que a taxa de evolução em sítios não sinônimos é mais baixa Você espera que isso seja verdadeiro apenas para os genes de globina ou para a maior parte dos genes A partir da Tabela 203 você espera que a mutação não codificadora g4205a seja fixada antes ou depois da mutação codificadora G238S em 4 5 6 7 8 9 10 11 12 uma população de bactérias que está desenvolvendo resistência ao antibiótico cefotaxima Forneça no mínimo dois motivos para a sua resposta Examinando a Tabela 204 qual você acredita que seja a ordem das mutações fixadas durante a seleção em uma terceira linhagem de vírus em evolução As mutações se tornariam fixadas na mesma ordem que o vírus TX ou ID Examinando a Tabela 205 como a interpretação dos resultados do teste de McDonaldKreitman diferiria se o número de diferenças de espécies observadas não sinônimas fosse 1 em vez de 7 Utilizando a Figura 2017 explique como a mutação na sequência GATA do gene Duffy confere resistência à infecção pelo P vivax Na Figura 2018 qual é a evidência de que a formação de poliploides foi importante na evolução das plantas PROBLEMAS BÁSICOS Compare a descrição de Darwin sobre a seleção natural conforme citado anteriormente neste capítulo com a descrição de Wallace sobre a tendência das variedades de se distanciarem do tipo original descrita logo após Que ideias elas apresentam em comum Quais são os três princípios da teoria da evolução por seleção natural Por que a teoria neutra da evolução molecular foi uma ideia revolucionária Qual você preveria que fosse a taxa relativa de substituições sinônimas e não sinônimas em um pseudogene de globina Os heterozigotos AS são completamente resistentes à infecção por malária Explique a evidência para a sua resposta PROBLEMAS DESAFIADORES 13 14 15 16 17 Se a taxa de mutação de um novo alelo é 105 presumindo que não existe migração quão grandes as populações isoladas devem ser para prevenir a diferenciação ao acaso entre elas na frequência desse alelo A glicose6fosfato desidrogenase G6PD é uma enzima crítica envolvida no metabolismo da glicose especialmente em eritrócitos Deficiências na enzima são o defeito enzimático humano mais comum e ocorrem a uma alta frequência em determinadas populações de crianças da África Oriental a Ofereça uma hipótese para a alta incidência de mutações na G6PD em crianças da África Oriental b Como você testaria adicionalmente a sua hipótese c Pontos de diferentes mutações na G6PD que afetam a função enzimática foram encontrados em populações humanas Ofereça uma explicação para a abundância de diferentes mutações na G6PD Grandes diferenças nas frequências de HbS entre tribos quenianas e ugandenses têm sido observadas em análises conduzidas por outros pesquisadores além de Tony Allison Esses pesquisadores ofereceram explicações alternativas diferentes da ligação com a malária proposta por Allison Ofereça um contraargumento ou um teste experimental em relação às seguintes hipóteses alternativas a A taxa de mutação é mais alta em determinadas tribos b Existe um baixo grau de mistura genética entre as tribos e assim o alelo aumentou sua frequência por meio do endocruzamento em determinadas tribos Quantas possíveis vias evolutivas existem para que um alelo desenvolva seis mutações diferentes Sete mutações diferentes Dez mutações diferentes O gene MC1R afeta a cor da pele e dos cabelos em seres humanos Existem no mínimo 13 polimorfismos do gene nas populações europeias e asiáticas 10 dos quais são não sinônimos Em africanos existem no mínimo 5 polimorfismos do gene nenhum dos quais é não sinônimo Qual pode ser uma explicação para as diferenças na variação do MC1R entre africanos e 18 19 20 21 22 23 24 25 não africanos As proteínas opsinas detectam a luz em células fotorreceptoras do olho e são necessárias para a visão em cores O macacodanoite o lêmure noturno e roedores da família Spalacidae semelhantes à toupeira apresentam diferentes mutações em um gene da opsina que a torna não funcional Explique por que todas as três espécies conseguem tolerar mutações nesse gene que opera na maior parte dos outros mamíferos A ausência total ou parcial de membros evoluiu muitas vezes em vertebrados cobras lagartos peixesboi baleias Você espera que as mutações que ocorreram na evolução da ausência de membros estejam nas sequências codificadoras ou não codificadoras de genes toolkit Por quê Diversas espécies de Drosophila com asas não manchadas são descendentes de um ancestral manchado Você preveria que a perda da formação de manchas envolvesse alterações codificadoras ou não codificadoras nos genes de pigmentação Como você testaria qual é o caso Foi declarado que a evolução se repete Qual é a evidência para essa declaração a partir a Da análise dos alelos HbS b Da análise da resistência a antibióticos em bactérias c Da análise do bacteriófago ΦX174 experimentalmente selecionado d Da análise de mutações no Oca2 em peixes de caverna e Da análise dos loci Pitx1 do esganagato Qual é a evidência molecular de que a seleção natural inclui a rejeição de alterações prejudiciais Quais são os três destinos alternativos de uma nova duplicata de gene Qual é a evidência de que a duplicação gênica tem sido a fonte das famílias de genes α e β em relação à hemoglobina humana Estudos de sequenciamento do DNA em relação a um gene em duas 26 27 espécies relacionadas de modo próximo produzem os seguintes números de sítios que variam Polimorfismos sinônimos 50 Polimorfismos não sinônimos 20 Diferenças entre espécies sinônimas 18 Diferenças entre espécies não sinônimas 2 Esse resultado ampara a evolução neutra do gene Ele ampara uma substituição adaptativa de aminoácidos Qual explicação você ofereceria para as observações Em seres humanos observase que dois genes que codificam os pigmentos visuais da opsina que são sensíveis aos comprimentos de onda de luz verde e vermelha estão adjacentes entre si no cromossomo X Eles codificam proteínas que são 96 idênticas Mamíferos não primatas possuem apenas um gene que codifica uma opsina sensível ao comprimento de onda vermelhoverde a Ofereça uma explicação para a presença dos dois genes de opsina no cromossomo X humano b Como você testaria sua explicação e detalharia quando na história evolutiva o segundo gene surgiu Aproximadamente 9 dos homens caucasianos são daltônicos e não conseguem distinguir os objetos de cor vermelha dos objetos de cor verde a Ofereça um modelo genético em relação ao daltonismo b Explique por que e como o daltonismo alcançou uma frequência de 9 nessa população 1C Darwin Charles Darwins Beagle Diary Ed R D Keynes Cambridge University Press 2001 2C Darwin Charles Darwins Beagle Diary Ed R D Keynes Cambridge University Press 2001 3C Darwin On the Origin of Species by Means of Natural Selection or the Preservation of Favored Races in the Struggle for Life D Appleton 1864 4C Darwin e A Wallace On the Tendency of Species to Form Varieties and on the Perpetuation of Varieties and Species by Natural Means of Selection Journal of the Proceedings of the Linnean Society of London Zoology 3 1858 4550 5A C Allison Protection Afforded by Sicklecell Trait against Subtertian Malarial Infection British Medical Journal 1 1954 290294 6G G Simpson Organisms and Molecules in Evolution Science 146 1964 15351538 7C Darwin On the Origin of Species by Means of Natural Selection p 137 John Murray Londres 1859 E Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Neurospora crassa Arabidopsis thaliana Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Mus musculus ste guia resumido reúne em um local as principais características dos organismosmodelo relacionados à genética Cada um dos sete organismosmodelo recebe sua própria extensão de duas páginas o formato é consistente possibilitando que os leitores comparem e contrastem as características dos organismosmodelo Cada tratamento enfoca características especiais do organismo que o tornaram útil como um modelo as técnicas especiais que foram desenvolvidas para o estudo do organismo e as principais contribuições que os estudos do organismo realizaram para a nossa compreensão sobre a genética Embora muitas diferenças estejam aparentes as abordagens das análises de genética em geral são semelhantes mas precisam ser adaptadas para levar em consideração o ciclo de vida individual o nível de ploidia tamanho e formato e as propriedades genômicas tais como a presença de plasmídios e transpósons naturais Os organismosmodelo sempre estiveram na vanguarda da genética Inicialmente no desenvolvimento histórico de um organismomodelo um pesquisador seleciona o organismo em virtude de alguma característica que o torna particularmente apropriado para o estudo de um processo genético no qual o pesquisador está interessado O conselho dos últimos cem anos foi escolha bem o seu organismo Por exemplo os fungos ascomicetos tais como Saccharomyces cerevisiae e Neurospora crassa são muito apropriados para o estudo dos processos meióticos tais como o crossing over em virtude de sua característica única o asco manter unidos os produtos de uma única meiose Diferentes espécies tendem a demonstrar processos notavelmente semelhantes até mesmo entre os membros de grandes grupos tais como os eucariotos Portanto podemos esperar razoavelmente que o que se aprende em uma espécie pode ser no mínimo parcialmente aplicado para outras Em particular os geneticistas mantêm os olhos abertos para novos achados de pesquisas que possam ser aplicáveis para a nossa própria espécie Em comparação a outras espécies os seres humanos são relativamente difíceis de estudar no nível genético e assim os avanços na genética humana devem muito a mais de um século de trabalhos com os organismosmodelo Todos os organismosmodelo apresentam muito mais do que uma característica útil para os estudos genéticos e outros estudos biológicos Portanto após um organismomodelo ter sido desenvolvido por algumas poucas pessoas com interesses específicos ele em seguida atua como um núcleo para o desenvolvimento de uma comunidade de pesquisas um grupo de pesquisadores com um interesse em diversas características de um organismomodelo em particular Existem comunidades de pesquisas organizadas para todos os organismosmodelo mencionados neste resumo Seus integrantes estão regularmente em contato compartilham suas linhagens mutantes e encontramse no mínimo uma vez ao ano em conferências que podem atrair milhares de pessoas Tais comunidades tornam possível a prestação de serviços importantes como bases de dados de informações de pesquisas técnicas estoques genéticos clones bibliotecas de DNA e sequências genômicas Outra vantagem que pertencer a uma comunidade proporciona a um pesquisador é poder desenvolver uma percepção do organismo expressão da geneticista de milho vencedora de um Prêmio Nobel Barbara McClintock Essa ideia é difícil de transmitir mas implica uma compreensão dos modos gerais de um organismo Nenhum processo vivo ocorre isolado e assim conhecer os modos gerais de um organismo com frequência é benéfico para tentar compreender um processo e interpretálo em seu contexto adequado À medida que a base de dados em relação a cada organismomodelo se expande o que atualmente está ocorrendo a passos largos em virtude da genômica os geneticistas são cada vez mais capazes de adotar uma visão holística englobando o funcionamento integrado de todas as partes da constituição do organismo Desse modo os organismosmodelo se tornam não apenas modelos para processos isolados mas também modelos de processos biológicos integrados Usase a expressão biologia de sistemas para descrever essa abordagem holística Escherichia coli Organismochave para estudar Transcrição tradução replicação recombinação Mutação Regulação gênica Tecnologia do DNA recombinante Estatística vital genética Tamanho do genoma 46 Mb Cromossomos 1 circular Número de genes 4000 Porcentagem com homólogos humanos 8 Tamanho médio dos genes 1 kb nenhum íntron Transpósons Linhagemespecíficos aproximadamente 60 cópias por genoma Genoma sequenciado em 1997 A bactéria unicelular Escherichia coli é amplamente conhecida como patógeno causador de doenças fonte de intoxicação alimentar e de doenças intestinais Entretanto sua reputação negativa não é merecida Embora algumas linhagens de E coli sejam prejudiciais outras são residentes naturais e essenciais do intestino humano Como organismosmodelo as linhagens de E coli desempenham um papel indispensável nas análises genéticas Na década de 1940 diversos grupos começaram a investigar a genética de E coli Havia necessidade de um organismo simples que pudesse ser cultivado de modo não dispendioso para produzir grandes quantidades de bactérias individuais para que fosse possível encontrar e analisar eventos genéticos raros Tendo em vista que E coli pode ser obtida a partir do intestino humano e é pequena e fácil de cultivar ela foi uma escolha natural O trabalho com E coli definiu o início da revelação da caixa preta na genética por meio da seleção e da análise de mutantes o funcionamento dos processos celulares pôde ser deduzido ainda que uma célula individual fosse muito pequena para ser visualizada Genoma de Ecoli Micrografia eletrônica do genoma da bactéria E coli liberado da célula por meio de choque osmótico G MurtiScience Source Características especiais Uma grande parte do sucesso da E coli como organismomodelo pode ser atribuída a duas estatísticas seu tamanho celular de 1 μm e um tempo de geração de 20 minutos A replicação do cromossomo demora 40 minutos mas múltiplas forquilhas de replicação possibilitam que a célula se divida em 20 minutos Consequentemente esse procarioto pode crescer em números surpreendentes uma característica que possibilita que os geneticistas identifiquem mutações e outros eventos genéticos raros tais como recombinantes intragênicos A E coli também é notavelmente fácil de cultivar Quando as células são semeadas em placas de meio com nutriente cada célula se divide in situ e forma uma colônia visível Alternativamente grupos de células podem ser cultivados em cultura líquida sob agitação Fenótipos tais como o tamanho da colônia a resistência a fármacos a capacidade de obter energia a partir de fontes de carbono em particular e a produção de corante colorido assumem o lugar dos fenótipos morfológicos da genética de eucariotos Colônias bacterianas Biophoto AssociatesScience Source Ciclo de vida A Escherichia coli se reproduz assexuadamente por meio da fissão celular simples seu genoma haploide se replica e se divide com a célula em divisão Na década de 1940 Joshua Lederberg e Edward Tatum descobriram que E coli também apresenta um tipo de ciclo sexuado no qual células de sexos geneticamente diferenciados se fundem e trocam seus genomas de forma parcial ou total por vezes levando à recombinação ver Capítulo 5 Machos conseguem converter fêmeas em machos por meio da transmissão de um plasmídio em particular Esse plasmídio de DNA de 100 kb extragenômico circular denominado F determina um tipo de masculinidade As células F que atuam como doadores machos transmitem uma cópia do plasmídio F para uma célula receptora O plasmídio F consegue se integrar no cromossomo para formar um tipo de célula Hfr que transmite o cromossomo linearmente para receptores F Outros plasmídios são observados em E coli na natureza Alguns carreiam genes cujas funções equipam a célula para a vida em ambientes específicos os plasmídios R que carreiam genes de resistência a fármacos são exemplos Duração do ciclo de vida 20 minutos Geneticistas também têm se beneficiado de alguns elementos genéticos únicos associados à E coli Plasmídios e fagos bacterianos são utilizados como vetores para clonar os genes de outros organismos em E coli Os elementos de transposição de E coli são usados para romper genes em DNA eucariótico clonado Esses elementos bacterianos são fundamentais na tecnologia do DNA recombinante Análise genética Mutantes espontâneos de E coli demonstram uma diversidade de alterações no DNA que variam desde simples substituições de bases até a inserção de elementos de transposição O estudo de mutações espontâneas raras na E coli é possível uma vez que grandes populações podem ser triadas Entretanto mutágenos também são utilizados para aumentar as frequências de mutação Para a obtenção de fenótipos mutantes específicos que possam representar defeitos em um processo sob estudo devem ser planejadas triagens ou seleções Por exemplo mutações nutricionais e mutações que conferem resistência a fármacos ou fagos podem ser obtidas em placas suplementadas com substâncias químicas fármacos ou fagos específicos Mutações nulas de qualquer gene essencial resultarão em ausência de crescimento essas mutações podem ser selecionadas por meio da adição de penicilina um fármaco antibacteriano isolado a partir de um fungo que mata as células em divisão mas não os mutantes que não crescem Em relação às mutações letais condicionais pode ser utilizado o plaqueamento réplica colônias que sofreram mutação em uma placa máster são transferidas por meio de uma almofada de feltro para outras placas e em seguida são submetidas a algum ambiente tóxico As mutações que afetam a expressão de um gene de interesse específico podem ser triadas por meio de sua fusão com um gene repórter tal como o lacZ cujo produto proteico pode produzir um corante azul ou o gene GFP cujo produto fluoresce quando exposto à luz de um comprimento de onda em particular Após um conjunto de mutantes que afetam o processo de interesse ter sido obtido as mutações são distribuídas em seus genes por meio de recombinação e complementação Esses genes são clonados e sequenciados para a obtenção de indicações da função A mutagênese direcionada pode ser utilizada para adequar alterações induzidas por mutação a posições proteicas específicas ver Capítulo 14 Em E coli são utilizados cruzamentos para mapear mutações e produzir genótipos celulares específicos ver Capítulo 5 Os recombinantes são produzidos por meio da mistura de células Hfr que apresentam um plasmídio F integrado e de células F Em geral um doador Hfr transmite parte do genoma bacteriano formando um merozigoto temporário no qual ocorre recombinação Cruzamentos de Hfr podem ser utilizados para realizar o mapeamento de acordo com o tempo de entrada de marcador ou por meio da frequência de recombinantes Por meio da transferência de derivados F que carreiam genes doadores para F é possível produzir diploides parciais estáveis para estudar a interação gênica ou dominância Técnicas de modificação genética Mutagênesepadrão Substâncias químicas e radiação Mutações somáticas aleatórias Transpósons Inserções somáticas aleatórias Transgênese No plasmídio vetor Livre ou integrado No fago vetor Livre ou integrado Transformação Integrada Nocautes gênicos direcionados Alelo nulo no vetor Substituição gênica por recombinação Alelo modificado no vetor Mutagênese sítiodirigida por substituição gênica Engenharia genética Transgênese A E coli desempenha um papelchave na introdução de transgenes em outros organismos ver Capítulo 10 Ela é o organismopadrão utilizado para a clonagem de genes de qualquer organismo Os plasmídios ou bacteriófagos de E coli são utilizados como vetores que carreiam a sequência de DNA a ser clonada Esses vetores são introduzidos em uma célula bacteriana por meio de transformação se for um plasmídio ou por meio de transdução se for um fago dentro de cujo citoplasma eles se replicam Os vetores são especialmente modificados para incluir sítios de clonagem únicos que podem ser cortados por meio de uma diversidade de enzimas de restrição Outros vetores de transporte são projetados para mover fragmentos de DNA de levedura a E coli eucariótica para E coli em virtude da sua facilidade de manipulação genética e em seguida de volta à levedura para avaliação fenotípica Um plasmídio projetado como um vetor para a clonagem de DNA A inserção bemsucedida de um gene exógeno no plasmídio é detectada por meio da inativação de qualquer gene de resistência a fármacos tetR ou ampR Os sítios de restrição estão identificados Nocautes gênicos direcionados Um conjunto completo de nocautes gênicos está sendo acumulado Em um procedimento um transpóson de resistência à canamicina é introduzido em um gene clonado in vitro por meio da utilização de uma transposase O construto é transformado nele sendo as colônias resistentes nocautes produzidos por meio de recombinação homóloga Contribuições principais Estudos pioneiros em relação à genética como um todo foram realizados em E coli Talvez o maior triunfo tenha sido a elucidação do código genético universal de 64 códons mas essa conquista está muito longe de ser a única na lista de realizações atribuíveis a esse organismo Outros fundamentos da genética que foram demonstrados pela primeira vez em E coli incluem a natureza espontânea da mutação o teste de flutuação Capítulo 16 os diversos tipos de alterações de bases que causam mutações e a replicação semiconservativa do DNA o experimento de Meselson e Stahl Capítulo 7 Essa bactéria ajudou a abrir novas áreas da genética tais como a regulação gênica o óperon lac Capítulo 11 e a transposição do DNA elementos IS Capítulo 15 Por último mas não menos importante a tecnologia do DNA recombinante foi inventada em E coli e atualmente o organismo ainda desempenha um papel central nessa tecnologia Outras áreas de contribuição Metabolismo celular Supressores sem sentido Colinearidade de gene e polipeptídio Óperon Resistência a fármacos baseada em plasmídios Transporte ativo Saccharomyces cerevisiae Organismochave para estudar Genômica Biologia de sistemas Controle genético do ciclo celular Transdução de sinal Recombinação Tipo reprodutivo Herança mitocondrial Interação gênica dihíbrido Estatística vital genética Tamanho do genoma 12 Mb Cromossomos n 16 Número de genes 6000 Porcentagem com homólogos humanos 25 Tamanho médio dos genes 15 kb 003 íntrongene Transpósons Pequena proporção do DNA Genoma sequenciado em 1996 O ascomiceto S cerevisiae conhecido como levedura do pão broto de levedura ou simplesmente levedura tem sido a base das indústrias panificadora e cervejeira desde a Antiguidade Na natureza provavelmente cresce sobre as superfícies das plantas utilizando exsudatos como nutrientes embora o seu nicho preciso ainda seja um mistério Embora as linhagens de laboratório sejam principalmente haploides as células na natureza podem ser diploides ou poliploides Em aproximadamente 70 anos de pesquisas genéticas a levedura se tornou E coli dos eucariotos Tendo em vista que ela é haploide e unicelular e que forma colônias compactas em placas ela pode ser tratada em grande parte do mesmo modo que uma bactéria Entretanto ela apresenta meiose ciclo celular e mitocôndrias eucarióticas características centrais da história de sucesso da levedura Células de levedura Saccharomyces cerevisiae SciMATScience Source Características especiais Como um organismomodelo a levedura combina o melhor de dois mundos ela apresenta uma grande parte da conveniência de uma bactéria mas com as característicaschave de um eucarioto As células de levedura são pequenas 10 μm e completam seu ciclo celular em apenas 90 minutos o que possibilita que enormes quantidades sejam produzidas em um curto período Assim como as bactérias a levedura pode ser cultivada em grandes grupos em um meio líquido agitado continuamente E assim como as bactérias a levedura produz colônias visíveis quando semeada em meio com ágar pode ser triada em relação a mutações e plaqueada em réplica De maneira eucariótica típica a levedura apresenta um ciclo de divisão celular mitótica sofre meiose e contém mitocôndrias que hospedam um pequeno genoma único As células de levedura podem realizar respiração anaeróbica ao utilizar o ciclo de fermentação e portanto sem as mitocôndrias o que possibilita que os mutantes mitocondriais sejam viáveis Análise genética A realização de cruzamentos em levedura é consideravelmente direta Linhagens de tipo reprodutivo oposto são simplesmente misturadas em um meio apropriado Os diploides aα resultantes são induzidos a sofrer meiose mediante a utilização de um meio de esporulação especial Os investigadores podem isolar os ascósporos de uma tétrade única ao utilizar uma máquina denominada micromanipulador Eles também têm a opção de sintetizar diploides aa ou αα para finalidades especiais ou criar diploides parciais por meio da utilização de plasmídios especialmente modificados Tendo em vista que está disponível uma enorme variedade de mutantes de leveduras e construtos de DNA na comunidade científica linhagens para finalidades especiais de triagens e seleções podem ser produzidas por meio do cruzamento de diversos tipos de leveduras Além disso novos alelos mutantes podem ser mapeados por meio do cruzamento com linhagens que contêm uma diversidade de marcadores fenotípicos ou de DNA de posição conhecida no mapa A disponibilidade de células haploides e diploides proporciona flexibilidade para os estudos mutacionais As células haploides são convenientes para as seleções ou triagens em grande escala tendo em vista que os fenótipos mutantes são expressos diretamente As células diploides são convenientes para obter mutações dominantes abrigar mutações letais realizar testes de complementação e explorar interações gênicas Ciclo de vida A levedura é uma espécie unicelular com um ciclo de vida muito simples composto pelas fases sexuada e assexuada A fase assexuada pode ser haploide ou diploide Uma célula se divide assexuadamente por meio de brotamento uma célulamãe emite um broto para o qual é transmitido um dos núcleos que resulta da mitose Para a reprodução sexuada existem dois tipos reprodutivos determinados pelos alelos MATα e MATa Quando células haploides de diferentes tipos reprodutivos se unem elas formam uma célula diploide que pode se dividir mitoticamente ou sofrer divisão meiótica O produto da meiose é uma tétrade não linear de quatro ascósporos Duração total do ciclo de vida 90 minutos para completar o ciclo celular Técnicas de manipulação genética Mutagênesepadrão Substâncias químicas e radiação Mutações somáticas aleatórias Transpósons Inserções somáticas aleatórias Transgênese Plasmídio integrativo Inserções por recombinação homóloga Plasmídio replicativo Pode se replicar de modo autônomo origem de replicação 2μ ou ARS Cromossomo artificial de levedura Replica e segrega como um cromossomo Vetor de transporte Pode replicar em levedura ou E coli Nocautes gênicos direcionados Substituição de gene A recombinação homóloga substitui o alelo do tipo selvagem por uma cópia nula Engenharia genética Transgênese A levedura em brotamento proporciona mais oportunidades para a manipulação genética do que qualquer outro eucarioto ver Capítulo 10 O DNA exógeno é facilmente captado pelas células cujas paredes celulares foram parcialmente removidas por meio de digestão enzimática ou abrasão Estão disponíveis diversos tipos de vetores Para que um plasmídio se replique livre dos cromossomos ele deve conter uma origem normal de replicação em levedura ARS ou uma origem de replicação de um plasmídio de 2 μm encontrado em determinados isolados de levedura O vetor mais elaborado o cromossomo artificial de levedura YAC é composto por um ARS um centrômero de levedura e dois telômeros Um YAC pode carrear grandes insertos transgênicos que em seguida são herdados do mesmo modo que os cromossomos mendelianos Os YAC têm sido vetores importantes na clonagem e no sequenciamento de genomas grandes tais como o genoma humano Um vetor de levedura simples Este tipo de vetor é denominado plasmídio integrativo de levedura YIp Nocautes direcionados A mutagênese de transpóson marcação de transpóson pode ser alcançada por meio da introdução do DNA de levedura em E coli em um vetor de transporte os transpósons bacterianos são integrados ao DNA da levedura provocando nocaute inativação da função gênica O vetor de transporte em seguida é transferido de volta para a levedura e os mutantes marcados substituem as cópias do tipo selvagem por meio de recombinação homóloga Os nocautes gênicos também podem ser conquistados por meio da substituição dos alelos do tipo selvagem por uma cópia nula modificada por meio de recombinação homóloga Ao utilizar essas técnicas pesquisadores construíram sistematicamente um conjunto completo de linhagens nocauteadas de levedura cada uma carreando um nocaute diferente para avaliar a função nula de cada gene no nível fenotípico Mutantes de ciclo celular A Mutantes que se alongam sem se dividir B Mutantes que param sem brotamento Cortesia de Susan L Forsburg the Salk Institute The Art and Design of Genetic Screens Yeast Nature Reviews Genetics 2 2001 659668 Contribuições principais Graças a uma combinação de genética adequada e bioquímica adequada estudos em leveduras realizaram contribuições substanciais para a nossa compreensão sobre o controle genético dos processos celulares Ciclo celular A identificação de genes de divisão celular por meio de seus mutantes sensíveis à temperatura mutantes cdc levou a um modelo poderoso para o controle genético da divisão celular Os diferentes fenótipos Cdc revelam os componentes do maquinário necessário para a execução de etapas específicas na progressão do ciclo celular Esse trabalho tem sido útil para a compreensão sobre os controles da divisão celular anormal que podem levar ao câncer humano Recombinação Muitas das ideiaschave em relação aos atuais modelos moleculares de crossing over tais como o modelo de quebra bifilamentar têm por base a análise de tétrades da conversão gênica em leveduras ver Capítulo 4 A conversão gênica proporções alélicas aberrantes tais como 31 é consideravelmente comum nos genes de levedura proporcionando um conjunto de dados adequadamente grande para a quantificação das característicaschave desse processo Interações gênicas A levedura liderou o caminho no estudo das interações gênicas As técnicas da genética tradicional têm sido utilizadas para revelar padrões de epistasia e supressão que sugerem interações gênicas ver Capítulo 6 O sistema de plasmídio dihíbrido para a observação das interações proteicas foi desenvolvido em levedura e gerou mapas de interação complexos que representam o início da biologia de sistemas ver Capítulo 14 Letais sintéticos mutantes duplos letais criados por meio do intercruzamento de dois mutantes únicos viáveis também são utilizados para criar redes de interação ver Capítulo 6 Genética mitocondrial Mutantes com mitocôndrias defeituosas são reconhecíveis como colônias muito pequenas denominadas petites A disponibilidade dessas petites e de outros mutantes mitocondriais possibilitou a primeira análise detalhada da estrutura e da função do genoma mitocondrial em qualquer organismo Genética do tipo reprodutivo Os alelos MAT de leveduras foram os primeiros genes de tipos reprodutivos a ser caracterizados no nível molecular Curiosamente a levedura é submetida à alteração espontânea de um tipo reprodutivo para outro Uma cópia sobressalente silenciosa do alelo MAT oposto localizada em algum outro local no genoma entra no locus do tipo reprodutivo substituindo o alelo residente por meio de recombinação homóloga A levedura proporcionou um dos modelos centrais para a transdução de sinais durante a detecção e a resposta aos hormônios reprodutivos do tipo reprodutivo oposto Outras áreas de contribuição Genética da alteração entre o crescimento semelhante à levedura e o filamentoso Genética da senescência Neurospora crassa Organismochave para estudar Genética do metabolismo e da captação Genética do crossing over e da meiose Citogenética de fungos Crescimento polar Ritmos circadianos Interações do núcleo com as mitocôndrias Estatística vital genética Tamanho do genoma 43 Mb Cromossomos 7 autossomos n 7 Número de genes 10000 Porcentagem com homólogos humanos 6 Tamanho médio dos genes 17 kb 17 íntrongene Transpósons Raros Genoma sequenciado em 2003 O Neurospora crassa fungo alaranjado do pão foi um dos primeiros microrganismos eucarióticos a ser adotado pelos geneticistas como um organismomodelo Assim como a levedura originalmente ele foi escolhido em virtude de sua haploidia de seu ciclo de vida simples e rápido e da facilidade com a qual ele pode ser cultivado Particularmente significativo foi o fato de que ele cresce em um meio com um conjunto definido de nutrientes tornando possível estudar o controle genético da química celular Na natureza ele é observado em muitas partes do mundo crescendo sobre a vegetação morta Em virtude da ativação dos seus ascósporos quiescentes pelo fogo ele é mais facilmente coletado após queimadas por exemplo sob a casca de árvores queimadas e em campos de cultivos tais como os de canadeaçúcar que são queimados de modo rotineiro antes da coleta Neurospora crassa crescendo em canadeaçúcar Cortesia de David Jacobson Características especiais Neurospora detém o recorde de velocidade dos fungos tendo em vista que cada hifa cresce mais de 10 cm ao dia Esse rápido crescimento combinado com o seu ciclo de vida haploide e a capacidade de crescer em meio definido tornouo um organismo de escolha para o estudo da genética bioquímica da nutrição e da captação de nutrientes Outra característica única de Neurospora e de fungos relacionados possibilita que geneticistas tracem as etapas de meioses únicas Os quatro produtos haploides de uma meiose permanecem unidos em um saco denominado asco Cada um dos quatro produtos da meiose sofre a uma divisão mitótica adicional resultando em uma óctade linear de oito ascósporos ver Capítulo 3 Essa característica torna o Neurospora um sistema ideal para o estudo de crossing over conversão gênica rearranjos cromossômicos ausência de disjunção meiótica e controle genético da própria meiose Os cromossomos embora pequenos são facilmente visíveis e assim os processos meióticos podem ser estudados nos níveis genético e cromossômico Portanto em Neurospora foram realizados estudos fundamentais sobre os mecanismos subjacentes a esses processos ver Capítulo 4 Análise genética A análise genética é direta ver Capítulo 3 Centros que mantêm estoques fornecem uma ampla diversidade de mutantes que afetam todos os aspectos da biologia do fungo Os genes de Neurospora podem ser facilmente mapeados por meio de seu cruzamento com um banco de linhagens com loci mutantes ou alelos de RFLP conhecidos Linhagens de tipo reprodutivo oposto são cruzadas simplesmente por meio do seu cultivo em conjunto Um geneticista com uma agulha pode coletar um único ascósporo para estudo Portanto as análises nas quais são utilizados ascos completos ou ascósporos aleatórios são rápidas e diretas Ciclo de vida N crassa apresenta um ciclo de vida eucariótico haploide Um esporo assexuado haploide denominado conídio germina para produzir um tubo germinativo que se estende na sua ponta O crescimento progressivo da ponta e a ramificação produzem uma massa de filamentos ramificados denominados hifas que forma uma colônia compacta no meio de crescimento Tendo em vista que as hifas não apresentam paredes transversais uma colônia é essencialmente uma célula que contém muitos núcleos haploides A colônia brota e libera milhões de esporos assexuados que podem se dispersar no ar e repetir o ciclo assexuado No ciclo sexuado de N crassa existem dois tipos reprodutivos de aspecto idêntico MATA e MATa que podem ser considerados sexos simples Assim como em leveduras os dois tipos reprodutivos são determinados pelos dois alelos de um gene Quando colônias de tipos reprodutivos diferentes entram em contato as suas paredes celulares e os seus núcleos se fundem Surgem muitos núcleos diploides temporários cada um sofrendo meiose produzindo uma óctade de ascósporos Os ascósporos germinam e produzem colônias exatamente como aquelas produzidas pelos esporos assexuados Duração do ciclo de vida 4 semanas para o ciclo sexuado Neurospora do tipo selvagem esquerda e mutante direita cultivados em uma placa de Petri Cortesia de Anthony GriffithsOlivera Gavric Tendo em vista que Neurospora é haploide fenótipos mutantes recémobtidos são facilmente detectados com a utilização de diversos tipos de triagem e seleção Um sistema favorito para o estudo do mecanismo de mutação é o gene ad3 tendo em vista que mutantes do ad3 são roxos e facilmente detectados Embora diploides vegetativos de Neurospora não sejam prontamente obtidos geneticistas são capazes de criar um diploide mimético útil para testes de complementação e outras análises que requerem a presença de duas cópias de um gene ver Capítulo 6 A saber a fusão de duas linhagens diferentes produz um heterocário indivíduo que contém dois tipos nucleares diferentes em um citoplasma comum Os heterocários também possibilitam a utilização de uma versão do teste de locus específico um modo de recuperar mutações em um alelo recessivo específico As células de um heterocário m são plaqueadas e busca se pelas colônias mm Técnicas de manipulação genética Mutagênesepadrão Substâncias químicas e radiação Mutações somáticas aleatórias Mutagênese de transpósons Não disponível Transgênese Transformação mediada por plasmídio Inserção aleatória Nocautes de gênicos direcionados RIP Mutações de GC AT em segmentos transgênicos duplicados antes de um cruzamento Repressão Inativação póstranscricional somática de transgenes Engenharia genética Transgênese A primeira transformação eucariótica foi conquistada em Neurospora Atualmente Neurospora é facilmente transformado com a utilização de plasmídios bacterianos que carreiam o transgene desejado mais um marcador selecionável tal como a resistência à higromicina para demonstrar que o plasmídio entrou Nenhum plasmídio replica em Neurospora e assim um transgene é herdado apenas se estiver integrado a um cromossomo Nocautes direcionados Em linhagens especiais de Neurospora os transgenes com frequência integramse por meio de recombinação homóloga Portanto uma linhagem transgênica normalmente apresenta o gene residente mais o transgene homólogo inserido em uma localização ectópica aleatória Em virtude dessa duplicação de material se a linhagem for cruzada ela está sujeita a RIP um processo genético que é único de Neurospora RIP é um mecanismo prémeiótico que introduz muitas transições de GC para AT em ambas as cópias duplicadas rompendo efetivamente o gene Portanto RIP pode ser aproveitado como um modo conveniente para nocautear deliberadamente um gene específico Contribuições principais George Beadle e Edward Tatum utilizaram Neurospora como organismomodelo em seus estudos pioneiros sobre as relações entre genes e enzimas nos quais foram capazes de determinar as etapas enzimáticas na síntese da arginina ver Capítulo 6 Seu trabalho com Neurospora estabeleceu o início da genética molecular Seguiramse muitos estudos comparáveis sobre a genética do metabolismo celular com a utilização de Neurospora Via de síntese do pigmento carotenoide laranja em Neurospora Cortesia de Anthony Griffiths Têm sido realizados trabalhos pioneiros sobre a genética dos processos meióticos tais como crossing over e disjunção e sobre os ritmos de formação de conídios Culturas em crescimento contínuo demonstram um ritmo diário de formação de conidiósporos Os resultados de estudos pioneiros com a utilização de mutações que alteram esse ritmo contribuíram para um modelo geral em relação à genética dos ritmos circadianos O Neurospora atua como um modelo em relação à grande quantidade de fungos filamentosos patogênicos que afetam cultivos e seres humanos tendo em vista que esses fungos com frequência são difíceis de cultivar e manipular geneticamente Ele é até mesmo utilizado como um sistema de teste eucariótico simples para substâncias mutagênicas e carcinogênicas no ambiente humano Tendo em vista que podem ser realizados cruzamentos com a utilização de apenas uma genitora o ciclo é conveniente para o estudo da genética mitocondrial e da interação de núcleo e mitocôndrias Foi descoberta uma ampla variedade de plasmídios mitocondriais lineares e circulares em isolados naturais Alguns deles são retroelementos que se acredita serem intermediários na evolução dos vírus Outras áreas de contribuição Diversidade e adaptação dos fungos Citogenética base cromossômica da genética Genes do tipo reprodutivo Genes de compatibilidade de heterocário um modelo para o reconhecimento genético próprio e não próprio Arabidopsis thaliana Organismochave para estudar Desenvolvimento Expressão e regulação gênica Genômica de plantas Estatística vital genética Tamanho do genoma 125 Mb Cromossomos Diploide 5 autossomos 2n 10 Número de genes 25000 Porcentagem com homólogos humanos 18 Tamanho médio dos genes 2 kb 4 íntronsgene Transpósons 10 do genoma Genoma sequenciado em 2000 A Arabidopsis thaliana um membro da família Brassicaceae repolho couve de plantas chegou de modo relativamente tardio como um organismomodelo genético A maior parte dos trabalhos foi realizada nos últimos 20 anos Ela não apresenta significância econômica ela cresce de modo prolífico como uma erva daninha em muitas partes temperadas do mundo Entretanto em virtude do seu pequeno tamanho do ciclo de vida curto e do genoma pequeno ela ultrapassou os modelos genéticos de plantas mais tradicionais tais como o milho e o trigo e se tornou o modelo dominante para a genética molecular vegetal Arabidopsis thaliana crescendo na natureza As versões cultivadas em laboratório são menores Floral ImagesAlamy Características especiais Em comparação a outras plantas a Arabidopsis é pequena em relação ao seu tamanho físico e ao tamanho de seu genoma características que são vantajosas para um organismomodelo A Arabidopsis cresce até uma altura inferior a 10 cm sob condições apropriadas portanto pode ser cultivada em grandes quantidades possibilitando triagens de mutantes e análises de progênie em grande escala O tamanho total de seu genoma de 125 Mb tornou o genoma relativamente fácil de sequenciar em comparação a outros genomas de organismosmodelo de plantas tais como o genoma do milho 2500 Mb e o genoma do trigo 16000 Mb Análise genética A análise de mutações em Arabidopsis por meio de cruzamentos depende de tentativas e métodos verdadeiros essencialmente aqueles utilizados por Mendel Os estoques de plantas que carreiam mutações úteis e relevantes para o experimento são obtidos a partir de centros públicos As linhagens podem ser cruzadas manualmente umas com as outras ou podem ser autofertilizadas Embora as flores sejam pequenas a polinização cruzada é facilmente realizada por meio da remoção das anteras que não se abriram que por vezes são ingeridas pelo experimentador como um meio conveniente de descarte Cada flor polinizada em seguida produz uma vagem longa que contém um grande número de sementes Essa abundante produção de descendência milhares de sementes por planta é uma vantagem para os geneticistas que procuram por mutantes raros ou outros eventos raros Se uma planta carreia uma nova mutação recessiva na linhagem germinativa a autofecundação possibilita que a progênie homozigota para a mutação recessiva seja recuperada nos descendentes imediatos da planta Ciclo de vida A Arabidopsis apresenta o ciclo de vida familiar das plantas com um estágio diploide dominante Uma planta contém diversas flores cada qual produzindo muitas sementes Assim como muitas ervas daninhas anuais o seu ciclo de vida é rápido demora apenas aproximadamente 6 semanas para que uma semente plantada produza uma nova colheita de sementes Duração total do ciclo de vida 6 semanas Mutantes de Arabidopsis Esquerda Flor de Arabidopsis do tipo selvagem Centro Mutação agamous ag que resulta em flores apenas com pétalas e sépalas nenhuma estrutura reprodutiva Direita Um mutante duplo ap1 cal que produz uma flor que se assemelha a uma couveflor Mutações semelhantes no repolho provavelmente são a causa das couvesflores reais George Haughn Técnicas de modificação genética Mutagênesepadrão Substâncias químicas e radiação Mutações nas linhagens germinativas ou somáticas aleatórias O próprio TDNA ou transpósons Inserções aleatórias marcadas Transgênese O TDNA carreia o transgene Inserção aleatória Nocautes gênicos direcionados Mutagênese mediada por TDNA ou transpóson Inserção aleatória nocautes de mutagênese selecionados com PCR RNAi Simula o nocaute direcionado Engenharia genética Transgênese A TDNA de Agrobacterium é um vetor conveniente para a introdução de transgenes ver Capítulo 10 O construto vetortransgene se insere aleatoriamente no genoma A transgênese oferece um modo efetivo para estudar a regulação gênica O transgene é unido a um gene repórter tal como GUS que produz um corante azul em quaisquer posições na planta na qual o gene estiver ativo Nocautes direcionados Tendo em vista que a recombinação homóloga é rara em Arabidopsis genes específicos não podem ser facilmente nocauteados por meio da substituição homóloga com um transgene Portanto em Arabidopsis os genes são nocauteados por meio da inserção aleatória de um TDNA vetor ou transpóson são utilizados transpósons de milho tais como AcDs e em seguida nocautes gênicos específicos são selecionados por meio da aplicação da análise por PCR ao DNA de grandes conjuntos de plantas A PCR utiliza uma sequência no TDNA ou no transpóson como um primer e uma sequência no gene de interesse como o outro primer Portanto a PCR amplifica apenas as cópias do gene de interesse que carreiam uma inserção A subdivisão do conjunto e a repetição do processo levam à planta específica que carreia o nocaute Alternativamente RNAi pode ser utilizado para inativar um gene específico Estão disponíveis grandes coleções de mutantes de inserção de TDNA elas apresentam as sequências flanqueadoras das plantas listadas em bases de dados públicas assim se você estiver interessado em um gene específico poderá verificar se a coleção contém uma planta que apresenta uma inserção naquele gene Uma característica conveniente de populações nocaute em plantas é que elas podem ser mantidas facilmente e de modo não dispendioso como coleções de sementes durante muitos anos talvez mesmo décadas Essa característica não é possível em relação à maior parte das populações de modelos animais O verme Caenorhabditis elegans pode ser preservado congelado mas a moscadasfrutas Drosophila melanogaster não pode ser congelada e reavivada Portanto linhagens de mutantes de moscadasfrutas devem ser mantidas vivas Contribuições principais Como o primeiro genoma de planta a ser sequenciado Arabidopsis proporcionou um importante modelo em relação à arquitetura e à evolução do genoma de plantas Além disso estudos conduzidos em Arabidopsis deram contribuições chave para a nossa compreensão sobre o controle genético do desenvolvimento das plantas Geneticistas isolaram mutações homeóticas que afetam o desenvolvimento das flores por exemplo Nesses mutantes um tipo de parte floral é substituído por outro A integração da ação desses mutantes levou a um modelo sofisticado de determinação do verticilo das flores com base nos padrões sobrepostos de expressão de genes reguladores no meristema da flor Arabidopsis também contribuiu amplamente para a base genética da fisiologia vegetal da regulação gênica e da interação das plantas com o ambiente incluindo a genética da resistência a doenças Tendo em vista que Arabidopsis é uma planta natural de distribuição mundial ela apresenta um grande potencial para o estudo da diversificação e da adaptação evolutiva O estabelecimento do destino do verticilo A Padrões de expressão gênica correspondentes aos diferentes destinos do verticilo Do mais externo para o mais interno os destinos são sépala se pétala pe estame st e carpelo ca B As regiões sombreadas dos diagramas transversais da flor em desenvolvimento indicam os padrões de expressão gênica em relação aos genes das classes A B e C Outras áreas de contribuição Resposta ao estresse ambiental Sistemas de controle hormonal Caenorhabditis elegans Organismochave para estudar Desenvolvimento Comportamento Nervos e músculos Envelhecimento Estatística vital genética Tamanho do genoma 97 Mb Cromossomos 5 autossomos 2n 10 cromossomo X Número de genes 19000 Porcentagem com homólogos humanos 25 Tamanho médio dos genes 5 kb 5 éxonsgene Transpósons Diversos tipos ativos em algumas linhagens Genoma sequenciado em 1998 O Caenorhabditis elegans pode não parecer grande coisa sob um microscópio e de fato esse nematódeo geohelminto de 1 mm de comprimento e que habita o solo é um animal relativamente simples Mas tal simplicidade é parte do que torna o C elegans um bom organismomodelo Seu tamanho pequeno o crescimento rápido a capacidade de autofecundação a transparência e a baixa quantidade de células no corpo tornaramno uma escolha ideal para o estudo da genética do desenvolvimento eucariótico Fotomicrografia e desenho de um Caenorhabditis elegans adulto De J E Sulston e H R Horvitz Developmental Biology 56 1977 111 Características especiais Os geneticistas conseguem enxergar através do C elegans Contrariamente a outros organismosmodelo multicelulares tais como a moscadasfrutas e Arabidopsis esse pequeno nematódeo é transparente o que o torna eficiente para triar grandes populações em relação a mutações interessantes que afetam praticamente qualquer aspecto da anatomia ou do comportamento A transparência também o torna apropriado para estudos do desenvolvimento os pesquisadores conseguem observar diretamente todos os estágios do desenvolvimento ao simplesmente olhar os nematódeos sob um microscópio óptico Os resultados de tais estudos demonstraram que o desenvolvimento do C elegans é firmemente programado e que cada nematódeo apresenta um número de células surpreendentemente pequeno e consistente 959 nos hermafroditas e 1031 nos machos De fato biólogos rastrearam os destinos de células específicas na medida em que o nematódeo se desenvolve e determinaram o padrão exato de divisão celular que leva a cada órgão adulto Esse esforço produziu um heredograma de linhagem em relação a todas as células adultas ver Capítulo 13 Uma representação simbólica das linhagens de 11 células Uma célula que é submetida à morte celular programada é indicada por um X azul no final da ramificação de uma linhagem Ciclo de vida C elegans é único entre os principais animaismodelo pois um dos dois sexos é hermafrodita XX O outro é masculino XO Os dois sexos podem ser distinguidos pelo tamanho maior dos hermafroditas e por diferenças nos seus órgãos sexuais Os hermafroditas produzem ovócitos e espermatozoides e assim podem se autofecundar A progênie de um hermafrodita autofecundado também é hermafrodita exceto quando uma rara não disjunção origina um macho XO Se hermafroditas e machos forem misturados os sexos copulam e muitos dos zigotos resultantes terão sido fertilizados pelo espermatozoide ameboide dos machos A fertilização e a produção do embrião ocorrem dentro do hermafrodita que em seguida deposita os ovos Os ovos finalizam o seu desenvolvimento externamente Duração total do ciclo de vida 3 dias e Análise genética Tendo em vista que esses nematódeos são pequenos e se reproduzem rapidamente e de modo prolífico a autofecundação produz aproximadamente uma progênie de 300 organismos e o cruzamento produz aproximadamente 1000 originam progênie grande que pode ser triada em relação a eventos genéticos raros Além disso tendo em vista que o hermafroditismo no C elegans torna a autofecundação possível os nematódeos com mutações homozigotas recessivas podem ser rapidamente isolados por meio de autofecundação da progênie tratada Contrariamente outros modelos animais tais como moscasdasfrutas ou camundongos requerem o cruzamento entre irmãos e demoram mais gerações para isolar mutações recessivas Técnicas de modificação genética Mutagênesepadrão Substâncias químicas EMS e radiação Mutações aleatórias na linhagem germinativa Transpósons Inserções aleatórias na linhagem germinativa Transgênese Injeção de transgene na gônada Transgene não integrado integração ocasional Nocautes gênicos direcionados Mutagênese mediada por transpóson Nocautes selecionados com PCR RNAi Simula o nocaute direcionado Ablação a laser Nocaute de uma célula Engenharia genética Transgênese A introdução de transgenes na linhagem germinativa é possibilitada por meio de uma propriedade especial das gônadas do C elegans que são sinciciais o que significa que existem muitos núcleos em um citoplasma comum Os núcleos não se tornam incorporados nas células até a meiose quando a formação de ovócitos individuais ou espermatozoides tem início Portanto uma solução de DNA que contém o transgene injetado na gônada de um hermafrodita expõe mais de 100 núcleos precursores de células germinativas ao transgene Ao acaso alguns desses núcleos incorporarão o DNA ver Capítulo 10 Os transgenes se recombinam para formar arranjos em tandem de multicópias Em um ovócito os arranjos não se integram em um cromossomo mas os transgenes dos arranjos ainda são expressos Portanto o gene carreado em um clone de DNA do tipo selvagem pode ser identificado por meio da sua introdução em uma linhagem receptora recessiva específica complementação funcional Em alguns casos porém não em todos os arranjos transgênicos são transmitidos para a progênie Para aumentar a chance de herança os vermes são expostos à radiação ionizante que pode induzir a integração de um arranjo em uma posição cromossômica ectópica e nesse sítio o arranjo é transmitido de modo confiável para a progênie Nocautes direcionados Em linhagens com transpósons ativos os próprios transpósons se tornam agentes de mutação por meio da inserção em locais aleatórios no genoma nocauteando os genes interrompidos Se pudermos identificar organismos com inserções em um gene de interesse específico podemos isolar um nocaute gênico direcionado Insertos em genes específicos podem ser detectados por meio da utilização da PCR se um primer de PCR tiver por base a sequência do transpóson e outro tiver por base a sequência do gene de interesse Alternativamente RNAi pode ser utilizado para anular a função de genes específicos Como uma alternativa para a mutação células individuais podem ser mortas por um feixe de laser para a observação do efeito sobre a função ou o desenvolvimento do verme ablação a laser Criação de transgenes de C elegans A Método de injeção B Arranjos extracromossômicos e integrados Contribuições principais O C elegans se tornou um organismomodelo favorito para o estudo de diversos aspectos do desenvolvimento em virtude de seu tamanho pequeno e número invariável de células Um exemplo é a morte celular programada um aspecto crucial do desenvolvimento normal Algumas células são geneticamente programadas para morrer no período do desenvolvimento um processo denominado apoptose Os resultados dos estudos de C elegans contribuíram para um modelo geral útil em relação à apoptose que sabidamente também é uma característica do desenvolvimento humano Outro sistemamodelo é o desenvolvimento da vulva a abertura do trato reprodutivo para o exterior Hermafroditas com vulvas defeituosas ainda produzem progênie que em triagens são facilmente visíveis agrupadas dentro do corpo Os resultados de estudos de hermafroditas sem vulvas ou com muitas revelaram como as células que apresentam um início completamente equivalente podem se tornar diferenciadas em diferentes tipos celulares ver Capítulo 13 Produção da vulva de C elegans A O tecido definitivo diferenciado B Método de diferenciação As células têm um início completamente equivalente Uma célulaâncora por trás das células equivalentes envia um sinal para as células mais próximas que formam a vulva A célula vulvar primária em seguida envia um sinal lateral para suas vizinhas evitando que elas se tornem células primárias mesmo que também tenham recebido o sinal da célulaâncora O comportamento também tem sido assunto de dissecção genética C elegans oferece uma vantagem pois nematódeos com comportamento defeituoso ainda conseguem sobreviver e se reproduzir Os sistemas nervoso e muscular do verme foram geneticamente dissecados possibilitando que os comportamentos fossem ligados a genes específicos Outra área de contribuição Sinalização célulacélula Drosophila melanogaster Organismochave para estudar Genética da transmissão Citogenética Desenvolvimento Genética de populações Evolução Estatística vital genética Tamanho do genoma 180 Mb Cromossomos Diploide 3 autossomos X e Y 2n 8 Número de genes 13000 Porcentagem com homólogos humanos Aproximadamente 50 Tamanho médio dos genes 3 kb 4 éxonsgene Transpósons Elementos P entre outros Genoma sequenciado em 2000 A moscadasfrutas Drosophila melanogaster livremente traduzida como apreciadora parda de néctar foi um dos primeiros organismosmodelo a ser utilizado em genética Ela foi escolhida em parte por ser facilmente obtida em frutas maduras apresentar um ciclo de vida curto do tipo diploide e ser simples de criar e cruzar em potes ou frascos contendo uma camada de alimento A análise genética inicial demonstrou que os seus mecanismos de herança apresentam fortes semelhanças com aqueles de outros eucariotos destacando o seu papel como um organismomodelo A sua popularidade como organismomodelo entrou em declínio durante os anos em que E coli leveduras e outros microrganismos estavam sendo desenvolvidos como ferramentas moleculares Entretanto a Drosophila vivenciou um renascimento em virtude de ser muito adequada para o estudo da base genética do desenvolvimento uma das questões centrais da biologia A importância da Drosophila como um modelo para a genética humana é demonstrada pela descoberta de que aproximadamente 60 dos genes considerados causadores de doenças em humanos bem como 70 dos genes de câncer apresentam correspondentes na Drosophila Cromossomos politênicos William M Gelbart Harvard University Características especiais Drosophila entrou em voga como um organismo experimental no início do século 20 em virtude de características comuns à maior parte dos organismosmodelo Ela é pequena 3 mm de comprimento simples de criar originalmente em garrafas de leite de reprodução rápida apenas 12 dias do ovo ao adulto e de fácil obtenção apenas deixe alguma fruta apodrecendo Ela comprovou reunir facilmente uma grande variedade de alelos mutantes interessantes que foram utilizados para determinar as regras básicas da genética da transmissão Os primeiros pesquisadores também se aproveitaram de uma característica única da moscadasfrutas os cromossomos politênicos ver Capítulo 17 Nas glândulas salivares e em outros determinados tecidos esses cromossomos gigantes são produzidos por múltiplas rodadas de replicação do DNA sem segregação cromossômica Cada cromossomo politênico demonstra um padrão de bandeamento único que proporciona aos geneticistas pontos de referência que podem ser utilizados para correlacionar mapas com base na recombinação com cromossomos reais O impulso proporcionado por esses avanços iniciais juntamente com a grande quantidade de conhecimento acumulado a respeito do organismo tornou a Drosophila um modelo genético atraente Análise genética Cruzamentos em Drosophila podem ser realizados de modo consideravelmente fácil Os genitores podem ser selvagens estoques mutantes obtidos de centros de estoques ou novas linhagens mutantes Dois mutantes morfológicos de Drosophila com o tipo selvagem para a comparação Ciclo de vida A Drosophila apresenta um ciclo de vida diploide curto que a torna adequada para a análise genética Após a eclosão do ovo a mosca se desenvolve durante diversos estágios de larva e um estágio de pupa antes de surgir como adulta que logo se torna sexualmente madura O sexo é determinado pelos cromossomos sexuais X e Y XX é fêmea XY é macho muito embora contrariamente aos seres humanos o número de cromossomos X em relação ao número de autossomos determine o sexo ver Capítulo 2 Duração total do ciclo de vida 12 dias do ovo ao adulto Para realizar um cruzamento machos e fêmeas são colocados em conjunto em um frasco e as fêmeas botam ovos no alimento semissólido que recobre o fundo do frasco Após surgir das pupas a progênie pode ser anestesiada para possibilitar a contagem dos membros de classes fenotípicas e para distinguir os machos e as fêmeas por meio de seus padrões de listras abdominais diferentes Entretanto tendo em vista que a progênie feminina permanece virgem durante poucas horas após seu surgimento das pupas ela deve ser isolada imediatamente se for ser utilizada em cruzamentos controlados Os cruzamentos destinados à construção de combinações genéticas específicas devem ser cuidadosamente planejados tendo em vista que o crossing over não ocorre em machos de Drosophila Portanto em machos os alelos ligados não se recombinarão para ajudar na criação de novas combinações Para a obtenção de novas mutações recessivas programas de cruzamento especiais dos quais o protótipo é o teste CIB de Muller proporcionam sistemas de triagem convenientes Nesses testes moscas mutagenizadas são cruzadas com um estoque que apresenta um cromossomo balanceador ver Capítulo 17 As mutações recessivas são finalmente trazidas à homozigose por autocruzamento durante uma ou duas gerações iniciando com moscas individuais da F1 Técnicas de modificação genética Mutagênesepadrão Substâncias químicas EMS e radiação Mutações aleatórias nas linhagens germinativa e somática Transgênese Mediada por elemento P Inserção aleatória Nocautes gênicos direcionados Substituição induzida O alelo ectópico nulo sai e se recombina com o alelo do tipo selvagem RNAi Mimetiza o nocaute direcionado Engenharia genética Transgênese A construção de moscas transgênicas requer o auxílio de um transpóson de Drosophila denominado elemento P Geneticistas constroem um vetor que carreia um transgene flanqueado por repetições do elemento P O transgene vetor em seguida é injetado em um zigoto juntamente com um plasmídio auxiliar que contém uma transposase A transposase possibilita que o transgene salte aleatoriamente para o genoma nas células germinativas do embrião ver Capítulo 15 Nocautes direcionados Os nocautes de genesalvo podem ser conquistados primeiramente com a introdução de um alelo nulo de modo transgênico em uma posição ectópica e em segundo lugar com a indução de enzimas especiais que causam a excisão do alelo nulo O fragmento excisado que é linear em seguida encontra e substitui a cópia endógena por meio do crossing over homólogo Entretanto nocautes funcionais podem ser produzidos de modo mais eficiente por RNAi Contribuições principais Uma grande parte do desenvolvimento inicial da teoria cromossômica da hereditariedade teve por base os resultados de estudos com Drosophila Geneticistas que trabalham com a Drosophila fizeram avançoschave no desenvolvimento de técnicas para o mapeamento gênico na compreensão da origem e da natureza da mutação gênica e na documentação da natureza e do comportamento dos rearranjos cromossômicos ver Capítulo 4 Os segmentos torácico e abdominal normais de Drosophila Suas descobertas abriram as portas para outros estudos pioneiros Estudos iniciais sobre a cinética da indução de mutação e a estimativa das taxas de mutação foram realizados com a utilização da Drosophila O teste de CIB de Muller e testes semelhantes proporcionaram métodos de triagem convenientes em relação às mutações recessivas Rearranjos cromossômicos que movem os genes adjacentes à heterocromatina foram utilizados para descobrir e estudar a variegação por efeito de posição Na última parte do século 20 após a identificação de determinadas classes de mutaçõeschave tais como as mutações homeóticas e de efeito materno a Drosophila assumiu um papel central na genética do desenvolvimento um papel que continua atualmente ver Capítulo 13 As mutações de efeito materno que afetam o desenvolvimento de embriões por exemplo têm sido cruciais na elucidação da determinação genética do plano corporal de Drosophila essas mutações são identificadas pela triagem de fenótipos do desenvolvimento anormais nos embriões de uma fêmea específica Técnicas tais como rastreamento de captura de acentuador possibilitaram a descoberta de novas regiões reguladoras no genoma que afetam o desenvolvimento Por meio desses métodos e de outros biólogos que trabalham com Drosophila fizeram avanços importantes na compreensão sobre a determinação da segmentação e dos eixos corporais Alguns dos geneschave descobertos tais como os genes homeóticos apresentam ampla relevância nos animais em geral Fotomicrografias demonstrando gradientes de determinantes do plano corporal A O mRNA do gene bcd está demonstrado localizado na ponta anterior à esquerda do embrião B O mRNA do gene nos está localizado posteriormente ponta à direita do embrião A distribuição das proteínas codificadas por estes e outros genes determina o eixo corporal A Cortesia de Ruth Lehman B Cortesia de James Langeland Outras áreas de contribuição Genética de populações Genética evolutiva Genética comportamental Mus musculus Organismochave para estudar Doenças humanas Mutações Desenvolvimento Cor da pelagem Imunologia Estatística vital genética Tamanho do genoma 2600 Mb Cromossomos 19 autossomos X e Y 2n 40 Número de genes 30000 Porcentagem com homólogos humanos 99 Tamanho médio dos genes 40 kb 83 éxonsgene Transpósons Fonte de 38 do genoma Genoma sequenciado em 2002 Tendo em vista que os seres humanos e a maior parte dos animais domesticados são mamíferos a genética dos mamíferos é de grande interesse Entretanto os mamíferos não são ideais para a genética eles são de tamanho relativamente grande em comparação aos outros organismosmodelo ocupam por isso instalações grandes e dispendiosas seus ciclos de vida são longos e seus genomas são grandes e complexos Entretanto em comparação aos outros mamíferos os camundongos Mus musculus são relativamente pequenos apresentam ciclos de vida curtos e são facilmente obtidos o que os torna uma excelente escolha para um modelo em mamíferos Além disso os camundongos tiveram uma vantagem na genética tendo em vista que apreciadores de camundongos já haviam desenvolvido muitas linhagens interessantes e diferentes desses animais que proporcionaram uma fonte de variantes para a análise genética Pesquisas sobre a genética mendeliana de camundongos começaram no início do século 20 Camundongo adulto e sua ninhada Anthony Griffiths Características especiais Os camundongos não são exatamente humanos pequenos e peludos mas a sua constituição genética é notavelmente semelhante à nossa Entre os organismos modelo o camundongo é aquele cujo genoma se assemelha de modo mais próximo ao genoma humano O genoma do camundongo é aproximadamente 14 menor do que o dos seres humanos o genoma humano tem 3000 Mb mas apresenta aproximadamente o mesmo número de genes as estimativas atuais são de um pouco menos de 30000 Surpreendentemente 99 dos genes do camundongo aparentam apresentar homólogos em seres humanos Além disso uma grande proporção do genoma é sintênica com o dos seres humanos ou seja existem grandes blocos que contêm os mesmos genes nas mesmas posições relativas ver Capítulo 14 Tais semelhanças genéticas são a chave para o sucesso do camundongo como um organismomodelo elas possibilitam que os camundongos sejam tratados como substitutos para seus correspondentes humanos de muitas maneiras Os possíveis mutágenos e carcinógenos suspeitos de causar danos para os seres humanos por exemplo são testados em camundongos e modelos em camundongos são essenciais no estudo de uma ampla variedade de doenças genéticas humanas Um mapa de sintenia entre camundongoser humano de 12 cromossomos do genoma humano A codificação colorida é utilizada para ilustrar as correspondências regionais de cada bloco do genoma humano com as seções correspondentes do genoma do camundongo Cada cor representa um cromossomo diferente de camundongo Análise genética Camundongos mutantes e do tipo selvagem mesmo que não verdadeiramente retirados do ambiente selvagem são fáceis de ser obtidos eles podem ser solicitados de grandes centros de estoques que fornecem camundongos adequados para cruzamentos e diversos outros tipos de experimentos Muitas dessas linhagens são derivadas de camundongos criados nos séculos passados Os cruzamentos controlados podem ser realizados simplesmente por meio do pareamento de um macho com uma fêmea não prenhe Na maior parte dos casos os genótipos parentais podem ser fornecidos pelo macho ou pela fêmea Ciclo de vida Camundongos apresentam um ciclo de vida diploide familiar com um sistema de determinação sexual XY semelhante àquele dos seres humanos As ninhadas têm de 5 a 10 filhotes entretanto a fecundidade das fêmeas declina após aproximadamente 9 meses e assim elas raramente têm mais de cinco ninhadas Duração total do ciclo de vida 10 semanas desde o nascimento até parir os filhotes na maior parte das linhagens de laboratório A maior parte das estimativaspadrão das taxas de mutação em mamíferos incluindo seres humanos tem por base medições em camundongos Na verdade os camundongos proporcionam o teste final dos agentes suspeitos de causar mutações em seres humanos As taxas de mutação na linhagem germinativa são medidas com a utilização do teste locus específico indução de mutagênese nas gônadas cruzamento com mm m é uma mutação recessiva conhecida no locus em estudo e procura por progênie mm m é uma nova mutação O procedimento é repetido em sete loci de amostra A medida das taxas de mutação somática utiliza uma configuração semelhante mas o mutágeno é injetado no feto Camundongos têm sido utilizados extensivamente para estudar o tipo de mutação somática que dá origem ao câncer Técnicas de modificação genética Mutagênesepadrão Substâncias químicas e radiação Mutações nas linhagens germinativa e somática Transgênese Injeção de transgene no zigoto Inserção aleatória e homóloga Captação de transgene por células tronco Inserção aleatória e homóloga Nocautes gênicos direcionados Captação de transgene nulo por células tronco Seleção das célulastronco de nocaute direcionado Engenharia genética Transgênese A criação de camundongos transgênicos é direta mas requer a cuidadosa manipulação de um zigoto ver Capítulo 10 Primeiramente o DNA genômico do camundongo é clonado em E coli com a utilização de vetores bacterianos ou fagos Em seguida o DNA é injetado em um zigoto onde ele se integra em locais ectópicos aleatórios no genoma ou menos comumente no locus normal A atividade da proteína transgênica pode ser monitorada por meio da fusão do transgene com um gene repórter tal como GFP antes que o gene seja injetado Com a utilização de um método semelhante as células somáticas de camundongos também podem ser modificadas por meio da inserção de um transgene fragmentos específicos de DNA são inseridos em células somáticas individuais e essas células por sua vez são inseridas nos embriões de camundongos Produção de um camundongo transgênico O transgene um gene do hormônio de crescimento de rato unido a um promotor de camundongo é injetado em um zigoto de camundongo homozigoto para nanismo litlit Foto R L Brinster School of Veterinary Medicine University of Pennsylvania Nocautes direcionados Nocautes de genes específicos para a dissecção genética podem ser obtidos por meio da introdução de um transgene que contenha um alelo defeituoso e dois marcadores de resistência a fármacos em uma célulatronco embrionária do tipo selvagem ver Capítulo 10 Os marcadores são utilizados para selecionar células transformantes específicas nas quais o alelo defeituoso tenha substituído o alelo do tipo selvagem homólogo As células transgênicas em seguida são introduzidas em embriões de camundongo Um método semelhante pode ser utilizado para substituir os alelos do tipo selvagem por um transgene funcional terapia gênica Produção de um nocaute gênico Um gene de resistência a fármacos neoR é inserido no transgene tanto para atuar como um marcador quanto para romper o gene produzindo um nocaute O gene tk é um segundo marcador O construto transgênico em seguida é injetado em células embrionárias de camundongo Contribuições principais Inicialmente na carreira do camundongo como um organismomodelo geneticistas utilizavam os camundongos para elucidar os genes que controlam a cor e o padrão da pelagem fornecendo um modelo em relação a todos os mamíferos que contêm pelos incluindo gatos cães cavalos e gado ver Capítulo 6 Mais recentemente estudos da genética de camundongo realizaram uma diversidade de contribuições com impacto direto na saúde humana Uma grande proporção de doenças genéticas humanas apresenta um correspondente em camundongos denominado um camundongomodelo útil para estudos experimentais Os camundongos atuam como modelos em relação aos mecanismos de mutações em mamíferos Estudos sobre os mecanismos genéticos do câncer são realizados em camundongos Muitos possíveis carcinógenos são testados em camundongos Camundongos têm sido modelos importantes para o estudo da genética do desenvolvimento em mamíferos ver Capítulo 13 Por exemplo eles proporcionam um sistemamodelo para o estudo de genes que afetam as fendas labial e palatina um distúrbio comum do desenvolvimento humano Linhagens celulares híbridas resultantes da fusão dos genomas de camundongos e seres humanos desempenharam um papel importante na atribuição de genes humanos a cromossomos humanos específicos Existe uma tendência dos cromossomos humanos de serem perdidos dos referidos híbridos e assim a perda de cromossomos específicos pode ser correlacionada à perda de alelos humanos específicos Outras áreas de contribuição Genética do comportamento Genética quantitativa Os genes do sistema imune Apêndice A Nomenclatura genética Não existe um conjunto de normas universalmente aceitas para a denominação de genes alelos produtos proteicos e fenótipos correlatos Primeiramente cada geneticista desenvolveu seus próprios símbolos para o registro do seu trabalho Posteriormente grupos de pessoas que trabalhavam com determinado organismo se reuniam e decidiam sobre um conjunto de convenções que todos utilizariam Tendo em vista que a Drosophila foi um dos primeiros organismos a serem extensivamente utilizados pelos geneticistas a maior parte dos sistemas atuais é uma variante do sistema de Drosophila Entretanto existem divergências consideráveis Alguns cientistas atualmente defendem uma padronização desse simbolismo a qual entretanto não foi realizada De fato a situação se tornou mais complexa com o advento da tecnologia do DNA Embora a maior parte dos genes tenha sido denominada anteriormente em relação aos fenótipos produzidos por mutações neles a nova tecnologia demonstrou a natureza precisa dos produtos de muitos desses genes Portanto aparenta ser mais adequado fazer referência a eles de acordo com a sua função celular Entretanto as antigas denominações ainda estão na literatura de modo que muitos genes apresentam dois conjuntos de nomenclaturas em paralelo Os exemplos a seguir de modo algum abrangem todos os organismos utilizados em genética mas a maior parte dos sistemas de nomenclatura segue um desses tipos Drosophila melanogaster inseto ry Gene que quando mutado causa olhos rosados ry502 Alelo mutante recessivo específico que produz olhos rosados em homozigotos ry Alelo do tipo selvagem de rosy ry Fenótipo mutante rosy rosado ry Fenótipo do tipo selvagem olhos vermelhos RY Produto proteico do gene rosy XDH Xantina desidrogenase uma descrição alternativa do produto proteico do gene rosy denominada de acordo com a enzima que codifica D Dichaete um gene que quando mutado causa a perda de determinadas cerdas e a manutenção de asas lateralmente nos heterozigotos e causa letalidade nos homozigotos D³ Alelo mutante específico do gene Dichaete D Alelo do tipo selvagem de Dichaete D Fenótipo mutante Dichaete D Fenótipo do tipo selvagem D Depende do contexto Produto proteico do gene Dichaete uma proteína de ligação ao DNA Neurospora crassa fungo arg Gene que quando mutado causa necessidade de arginina arg1 Gene arg específico arg1 Alelo mutante não especificado do gene arg arg1 1 Alelo mutante específico do gene arg1 arg1 Alelo do tipo selvagem arg1 Produto proteico do gene arg1 Arg Uma linhagem que não necessita de arginina Arg Linhagem que necessita de arginina Saccharomyces cerevisiae fungo ARG Gene que quando mutado causa necessidade de arginina ARG1 Gene ARG específico arg1 Alelo mutante não especificado do gene ARG arg11 Alelo mutante específico do gene ARG1 ARG1 Alelo do tipo selvagem ARG1p Produto proteico do gene ARG1 Arg Linhagem que não necessita de arginina Arg Linhagem que necessita de arginina Homo sapiens mamífero ACH Gene que quando mutado causa acondroplasia ACH1 Alelo mutante dominância não especificada ACH Produto proteico do gene ACH natureza desconhecida FGFR3 Denominação recente para o gene da acondroplasia FGFR¹ ou FGFR31 ou FGFR3 1 Alelo mutante do FGFR3 dominância não especificada Proteína FGFR3 Receptor 3 do fator de crescimento de fibroblasto Mus musculus mamífero Tyrc Gene para tirosinase Tyrc Alelo do tipo selvagem desse gene Tyrcch ou Tyrcch Alelo mutante que causa a coloração chinchila Tyrc Produto proteico desse gene TYRC Fenótipo do tipo selvagem TYRCch Fenótipo chinchila Escherichia coli bactéria lacZ Gene em relação à utilização de lactose lacZ Alelo do tipo selvagem lacZ1 Alelo mutante LacZ Produto proteico desse gene Lac Linhagem capaz de utilizar a lactose fenótipo Lac Linhagem incapaz de utilizar a lactose fenótipo Arabidopsis thaliana planta YGR Gene que quando mutado produz folhas amareloesverdeadas YGR1 Gene YGR específico YGR1 Alelo do tipo selvagem ygr11 Alelo mutante recessivo específico de YGR1 ygr12D Alelo mutante dominante D específico de YGR1 YGR1 Produto proteico de YGR1 Ygr Fenótipo amareloesverdeado Ygr Fenótipo do tipo selvagem Apêndice B Recursos de bioinformática para genética e genômica Você certamente encontrará algo se procurar mas nem sempre é exatamente o que você estava procurando O Hobbit J R R Tolkien O campo da bioinformática engloba a utilização de ferramentas computadorizadas para refinar complexos conjuntos de dados Os dados genéticos e genômicos são tão diversos que se tornou um desafio considerável identificar sites com autoridade em relação a um tipo específico de informação Além disso o cenário dos softwares acessíveis pela Internet para a análise dessas informações está constantemente em alteração na medida em que ferramentas novas e mais poderosas são desenvolvidas Este apêndice destinase a fornecer alguns pontos de início valiosos para a exploração do universo em rápida expansão dos recursos online para genética e genômica 1 Busca por sites sobre genética e genômica Aqui estão listados diversos recursos centrais que contêm grandes listas de sites relevantes O periódico científico denominado Nucleic Acids Research NAR publica uma edição especial todo mês de janeiro listando uma ampla diversidade de recursos de bases de dados online em httpnaroupjournalsorg A Virtual Library tem subdivisões de organismosmodelo e genética com ricos arranjos de recursos de Internet em httpceolasorgVLmo O National Human Genome Research Institute NHGRI mantém uma lista de sites de genoma em httpwwwnhgrinihgov10000375 O Department of Energy DOE mantém um site do Human Genome Project em httpgenomicscienceenergygov O SwissProt mantém a página de links da Amos em httpexpasychalinkshtml 2 Bases de dados gerais Bases de dados de sequências de ácidos nucleicos e proteínas Por um acordo internacional três grupos colaboram para hospedar as sequências de DNA e mRNA primárias de todas as espécies o National Center for Biotechnology Information NCBI hospeda o GenBank o European Bioinformatics Institute EBI hospeda a biblioteca de dados do European Molecular Biology Laboratory EMBL e o National Institute of Genetics no Japão hospeda o DNA DataBase of Japan DDBJ Registros da sequência primária do DNA denominados acessos são apresentados por grupos de pesquisa individuais Além de proporcionar o acesso a esses registros de sequências de DNA esses sites fornecem muitos outros conjuntos de dados Por exemplo o NCBI também hospeda o RefSeq uma síntese resumida de informações sobre as sequências de DNA de genomas totalmente sequenciados e dos produtos gênicos codificados por essas sequências Muitas outras características importantes podem ser encontradas nos sites do NCBI EBI e da DDBJ As home pages e alguns outros sites importantes são NCBI httpwwwncbinlmnihgov NCBIGenomas httpwwwncbinlmnihgovGenomesindexhtml NCBIRefSeq httpwwwncbinlmnihgovrefseq The UCSC Genome Bioinformatics site httpgenomeucscedu Esse site excepcional contém referência sobre sequências e montagens de rascunhos relativas a uma grande coleção de genomas além de uma diversidade de ferramentas para explorálos O Genome Browser foca nos cromossomos demonstrando o trabalho de pesquisadores mundiais O Gene Sorter demonstra expressão homologia e outras informações sobre os grupos de genes que podem relacionarse de muitos modos Blat é uma ferramenta de alinhamento que mapeia rapidamente sequências no genoma O Table Browser proporciona o acesso às bases de dados subjacentes EBI httpwwwncbinlmnihgov DDBJ httpwwwddbjnigacjp A dura realidade é que com tanta informação biológica o objetivo de tornar esses recursos online transparentes para o usuário não é totalmente alcançado Portanto a exploração desses sites envolverá a familiarização do usuário com o conteúdo de cada um e a exploração de alguns dos modos pelos quais cada site ajuda o usuário a focar nos seus questionamentos de maneira a obter as respostas corretas Como exemplo do poder desses sites considere pesquisar sobre uma sequência de nucleotídios no NCBI As bases de dados em geral armazenam as informações em pastas separadas denominadas campos Ao utilizar questionamentos que limitam a pesquisa para o campo apropriado pode ser indagada uma questão mais direcionada Com a utilização da opção Limits uma frase de questionamento pode ser utilizada para identificar ou localizar uma dada espécie um tipo de sequência genômica ou de mRNA um símbolo gênico ou qualquer outra pesquisa de dados Os mecanismos de consulta normalmente apresentam capacidade de unir múltiplos questionamentos Por exemplo recuperar todos os registros de sequências de DNA da espécie Caenorhabditis elegans E que foram publicados após 1o de janeiro de 2000 Utilizando a opção History os resultados de múltiplos questionamentos podem ser reunidos de modo que apenas aqueles acertos comuns a múltiplos questionamentos serão recuperados Por meio da adequada utilização das opções de questionamento disponíveis em um site uma grande parte de falsopositivos pode ser eliminada de modo computadorizado sem descartar quaisquer dos acertos relevantes Tendo em vista que as previsões de sequências proteicas são uma parte natural da análise das sequências de DNA e mRNA esses mesmos sites proporcionam o acesso a uma diversidade de bases de dados de proteínas Uma base de dados de proteínas importante é SwissProtTrEMBL As sequências TrEMBL são previstas automaticamente a partir de sequências de DNA eou mRNA As sequências SwissProt contam com curadoria o que significa que cientistas especialistas revisam os resultados da análise computadorizada e tomam decisões fundamentadas a respeito dos resultados a ser aceitos ou rejeitados Além dos registros de sequências primárias de proteínas SwissProt também oferece bases de dados de domínios proteicos e assinaturas de proteínas cadeias de sequências de aminoácidos que são característicos de proteínas de um tipo em particular A home page de SwissProt é httpwwwebiacukswissprot Bases de dados de domínios proteicos Acreditase que as unidades funcionais existentes nas proteínas sejam regiões de dobramento local denominadas domínios A previsão de domínios em proteínas recentemente descobertas é um modo de adivinhar a sua função Surgiram diversas bases de dados de domínios proteicos que preveem os domínios de modos um pouco diferentes Algumas das bases de dados de domínios individuais são Pfam PROSITE PRINTS SMART ProDom TIGRFAMs BLOCKS e CDD A InterPro possibilita a consulta a múltiplas bases de dados de domínios proteicos simultaneamente e apresenta os resultados combinados Os sites em relação a algumas bases de dados de domínios são InterPro httpwwwebiacukinterpro Pfam httpwwwsangeracukSoftwarePfamindexshtml PROSITE httpwwwexpasychprosite PRINTS httpwwwbioinfmanacukdbbrowserPRINTS SMART httpwwwsmartemblheidelbergde ProDom httpwwwprodomprabifr TIGRFAMs httpwwwtigrorgTIGRFAMs BLOCKS httpwwwblocksfhcrcorg CDD httpwwwncbinlmnihgovStructurecddcddshtml Bases de dados de estruturas proteicas A representação das estruturas proteicas tridimensionais se tornou um aspecto importante da análise molecular global Bases de dados de estruturas tridimensionais estão disponíveis a partir dos principais sites de bases de dados de sequências de DNAproteína e de bases de dados de estruturas proteicas independentes notavelmente a Protein DataBase PDB O NCBI possui um aplicativo denominado Cn3D que auxilia na visualização dos dados da PDB PDB httpwwwrcsborgpdb Cn3D httpwwwncbinlmnihgovStructureCN3Dcn3dshtml 3 Bases de dados especializados Bases de dados genéticos de organismos específicos Com a finalidade de reunir algumas classes de informação genética e genômica especialmente informações fenotípicas é necessário o conhecimento especializado de uma espécie em particular Portanto surgiram os MOD bases de dados de organismosmodelo do inglês model organism databases para preencher esse papel em relação aos principais sistemas genéticos Essas incluem bases de dados de Saccharomyces cerevisiae SGD Caenorhabditis elegans WormBase Drosophila melanogaster FlyBase do peixezebra Danio rerio ZFIN do camundongo Mus musculus MGI do rato Rattus norvegicus RGD de Zea mays MaizeGDB e Arabidopsis thaliana TAIR As home pages desses MOD podem ser encontradas em SGD httpgenomewwwstanfordeduSaccharomyces WormBase httpwwwwormbaseorg FlyBase httpflybaseorg ZFIN httpzfinorg MGI httpwwwinformaticsjaxorg RGD httprgdmcwedu MaizeGDB httpwwwmaizegbdorg TAIR httpwwwarabidopsisorg Bases de dados de genética e genômica humanas Em virtude da importância da genética humana na clínica bem como na pesquisa básica surgiu um conjunto diverso de bases de dados de genética humana Esse conjunto inclui uma base de dados de doenças genéticas humanas denominada Online Mendelian Inheritance in Man OMIM uma base de dados com breve descrição dos genes humanos denominada GeneCards uma compilação de todas as mutações conhecidas nos genes humanos denominada Human Gene Mutation Database HGMD uma base de dados do mapa de sequências atual do genoma humano denominada Golden Path e alguns links para bases de dados de doenças genéticas humanas OMIM httpwwwomimorg GeneCards httpgenecardsorg HGMD httpwwwhgmdorg Golden Path httpgenomeucscedu Online Genetic Support Groups httpmostgeneorggeneticsgenetic supportgroupsdirectory Genetic Disease Information httpwwwgeneticallianceorgdiseaseinfosearchhtml The Encyclopedia of Genome Elements ENCODE httpgenomeucsceduENCODE Cancer Genome Project httpcancergenomenihgov Bases de dados do Projeto Genoma Os projetos genoma individuais também têm sites nos quais demonstram os seus resultados com frequência incluindo informações que não aparecem em qualquer outro site no mundo Os maiores centros de genoma com financiamento público incluem Whitehead InstituteMIT Center for Genome Research httpwww genomewimitedu Washington University School of Medicine Genome Sequencing Center httpgenomewustledu Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center httpwwwhgscbcmtmcedu Sanger Institute httpwwwsangeracuk DOE Joint Genomics Institute httpwwwjgidoegov International HapMap Project httphapmapncbinlmnihgov 4 Relações dos genes nas bases de dados e entre elas Os produtos gênicos podem relacionarse por compartilharem uma origem evolutiva comum uma função comum ou por participarem da mesma via BLAST Identificação de similaridades na sequência As evidências em relação a uma origem evolutiva comum advêm da identificação de similaridades entre duas ou mais sequências Uma das ferramentas mais importantes para a identificação de tais similaridades é a BLAST Basic Local Alignment Search Tool que foi desenvolvida pelo NCBI A BLAST é realmente uma série de programas e bases de dados relacionados na qual as correspondências locais entre trechos longos de sequências podem ser identificadas e classificadas A consulta a sequências de DNA ou proteínas similares por meio da BLAST é uma das primeiras coisas que um pesquisador faz com um gene recémsequenciado Diferentes bases de dados de sequências podem ser acessadas e organizadas pelo tipo de sequência genoma de referência atualizações recentes EST etc e uma espécie ou grupo taxonômico em particular pode ser especificado Uma rotina da BLAST correlaciona uma sequência indagada de nucleotídios traduzida em todos os seis quadros com uma base de dados de sequência de proteínas Outra correlaciona uma sequência indagada de proteína com a tradução de seis quadros de uma base de dados de sequências de nucleotídios Outras rotinas da BLAST são customizadas para identificar correspondências de padrões de sequências curtas ou alinhamentos pareados para triar segmentos de DNA do tamanho do genoma e assim por diante e podem ser acessadas por meio da mesma página NCBIBLAST httpwwwncbinlmnihgovBLAST Bases de dados de ontologia de função Outra abordagem para o desenvolvimento de relações entre os produtos gênicos é por meio da atribuição de papéis funcionais a esses produtos com base na evidência experimental ou previsão A apresentação de um modo comum para descrever esses papéis independentemente do sistema experimental é então de grande importância Um grupo de cientistas de diferentes bases de dados está trabalhando para desenvolver um conjunto comum de termos dispostos hierarquicamente uma ontologia em relação à função evento bioquímico ao processo evento celular para o qual uma proteína contribui e à localização subcelular localização de um produto em uma célula como um modo de descrever as atividades de um produto gênico Essa ontologia em particular é denominada Ontologia Gênica GO e muitas diferentes bases de dados de produtos gênicos atualmente incorporam os termos da GO Uma descrição total pode ser encontrada em httpwwwgeneontologyorg Bases de dados de vias Ainda outro modo de relacionar os produtos uns aos outros é por meio da sua atribuição a etapas nas vias bioquímicas ou celulares Diagramas de vias podem ser utilizados como modos organizados de apresentar as relações desses produtos entre si Algumas das tentativas mais avançadas de produzir as referidas bases de dados de vias incluem a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG e a Signal Transduction Database TRANSPATH KEGG httpwwwgenomeadjpkegg TRANSPATH httpgenexplaincomtranspath1 A Ver adenina adenosina abrigo seguro Sítio no genoma no qual é improvável que a inserção de um elemento de transposição cause uma mutação prevenindo assim o dano ao hospedeiro ação gênica Interação de alelos em um locus ação gênica aditiva Quando o valor de traço em relação à classe heterozigota em um QTL é exatamente intermediário entre os valores de traço em relação às duas classes homozigotas ação gênica dominante Situação em que o valor do traço em relação à classe heterozigota em um QTL é igual ao valor do traço em relação a uma das duas classes homozigotas acentuador enhancer Conjunto de proteínas reguladoras composto por fatores de transcrição que se ligam às sequências reguladoras de ação cis no DNA acentuassomo Montagem macromolecular responsável pela interação de elementos acentuadores e as regiões promotoras dos genes ácido desoxirribonucleico Ver DNA ácido ribonucleico Ver RNA adaptabilidade alélica Adaptabilidade média dos indivíduos que carreiam um alelo em particular É expressa pela equação WA pWAA qWAa adaptabilidade darwiniana Probabilidade relativa de sobrevivência e reprodução de um genótipo adaptabilidade média Média da adaptabilidade de todos os membros de uma população adaptação No sentido evolutivo alguma característica herdada do fenótipo de um indivíduo que melhora as suas chances de sobrevivência e reprodução no ambiente existente adenina A Base purina que pareia com a timina na duplahélice do DNA adenosina A Nucleosídio que contém a adenina como base adenosina monofosfato cíclico cAMP Molécula que contém uma ligação diéster entre os átomos de carbono 3 e 5 da parte ribose do nucleotídio Esse nucleotídio modificado não pode ser incorporado no DNA nem RNA Ele desempenha um papelchave como sinal intracelular na regulação de diversos processos agente intercalar Mutágeno que consegue se inserir entre as bases empilhadas no centro da duplahélice de DNA causando uma taxa elevada de mutações indel agrupamento pi Região nos genomas de vertebrados e invertebrados que codifica agrupamentos de piRNA alça de deleção Alça formada na meiose por meio do pareamento de um cromossomo normal e um cromossomo que contém uma deleção alça de inversão Alça formada por meio do pareamento meiótico de homólogos em um heterozigoto para inversão alelo Uma das diferentes formas de um gene que pode existir em um único locus alelo dominante Alelo que expressa seu efeito fenotípico até mesmo quando heterozigoto com um alelo recessivo portanto se A for dominante sobre a então AA e Aa apresentam o mesmo fenótipo alelo fixado Alelo em relação ao qual todos os membros da população em estudo são homozigotos e assim não existem outros alelos em relação a esse locus na população alelo letal Alelo cuja expressão resulta na morte do organismo que o expressa alelo neutro Alelo que não apresenta efeito sobre a adaptabilidade dos indivíduos que o possuem alelo nulo Alelo cujo efeito é a ausência de um produto gênico normal no nível molecular ou de uma função normal no nível fenotípico alelo pleiotrópico Alelo que afeta diversas propriedades diferentes de um organismo alelo recessivo Alelo cujo efeito fenotípico não é expresso em um heterozigoto alelos múltiplos Conjunto de formas de um gene que diferem em sua sequência de DNA em sua expressão ou em ambos alongamento Estágio da transcrição que segue o início e precede o término alopoliploide Ver anfidiploide alta frequência de recombinação celular Hfr Em E coli célula que apresenta seu fator de fertilidade integrado no cromossomo bacteriano uma célula doadora masculina Alu Elemento de transposição curto que compõe mais de 10 do genoma humano Os elementos Alu são retroelementos que não codificam proteínas e como tal são elementos não autônomos aminoácido Peptídio o elemento estrutural básico das proteínas ou dos polipeptídios aminoaciltRNA sintetase Enzima que une um aminoácido ao tRNA antes de sua utilização na tradução Existem 20 aminoaciltRNA diferentes um para cada aminoácido aminoterminal Extremidade de uma proteína que apresenta um grupo amino livre Uma proteína é sintetizada a partir da extremidade amino na extremidade de 5 de um mRNA até a extremidade carboxila próxima da extremidade de 3 do mRNA durante a tradução amostra Pequeno grupo de indivíduos ou observações que são representativos de uma população maior a partir da qual o grupo foi coletado amplificação Produção de muitas cópias de DNA a partir de uma região máster do DNA análise de heredogramas Dedução da herança monogênica de fenótipos humanos por meio do estudo da progênie de cruzamentos em uma família que com frequência abrange diversas gerações análogo de base Substância química cuja estrutura molecular mimetiza aquela de uma base do DNA em virtude da similaridade o análogo pode atuar como um mutágeno aneuploide Genoma que apresenta um número de cromossomos que difere do número cromossômico normal para a espécie em um pequeno número de cromossomos anfidiploide Alopoliploide um poliploide formado a partir da união de dois conjuntos cromossômicos separados e da sua subsequente duplicação anotação Identificação de todos os elementos funcionais de um genoma em particular anticódon Trinca de nucleotídios em uma molécula de tRNA que se alinha com um códon em particular no mRNA sob a influência do ribossomo o aminoácido carreado pelo tRNA é inserido em uma cadeia proteica crescente anticorpo Molécula proteica imunoglobulina produzida pelo sistema imune que reconhece uma substância em particular antígeno e se liga a ela antígeno nuclear de proliferação celular PCNA Parte do replissomo o PCNA é a versão eucariótica da proteína procariótica grampodeslizante clamp antiparalelo Termo utilizado para descrever as orientações opostas dos dois filamentos de uma duplahélice de DNA a extremidade de 5 de um filamento se alinha com a extremidade de 3 do outro filamento antiterminador Proteína que promove a continuação da transcrição ao prevenir o término da transcrição em sítios específicos no DNA apoptose Vias celulares responsáveis pela morte celular programada arcabouço 1 Estrutura central de um cromossomo à qual o solenoide do DNA está unido como alças composto amplamente pela topoisomerase 2 Em projetos genoma um conjunto ordenado de contigs no qual pode haver intervalos não sequenciados conectados por leituras de sequência de extremidades pareadas arquitetura genética Todos os fatores genéticos e ambientais que influenciam um traço asco Em um fungo saco que envolve uma tétrade ou uma óctade de ascósporos associação ampla de genoma GWA Mapeamento de associação que utiliza loci marcadores por todo o genoma atenuação Mecanismo regulador no qual o nível de transcrição de um óperon tal como trp é reduzido quando o produto final de uma via p ex triptofano é abundante a etapa regulada ocorre após o início da transcrição atenuador Região da sequência de RNA que forma estruturas secundárias alternativas que regulam o nível de transcrição dos óperons atenuados ativadora Proteína que quando ligada a um elemento de DNA regulador de ação cis tal como um operador ou um acentuador ativa a transcrição a partir de um promotor adjacente autofecundação Fertilizar ovos com espermatozoides do mesmo indivíduo autopoliploide Poliploide formado a partir da duplicação de um único genoma autorradiograma Padrão de manchas escuras em um filme fotográfico revelado ou em uma emulsão na técnica de autorradiografia auxotrófica Linhagem de microrganismos que proliferará apenas quando o meio for suplementado com uma substância específica não necessária para os organismos do tipo selvagem comparar com prototrófica BAC Cromossomo artificial bacteriano um plasmídio F modificado para atuar como um vetor de clonagem que consegue carrear grandes insertos bactéria lisogênica Célula bacteriana que contém um profago inerte inserido no cromossomo hospedeiro e que é replicada com ele bacteriófago fago Vírus que infecta bactérias balanceador Cromossomo com múltiplas inversões utilizado para reter as combinações alélicas favoráveis no homólogo não invertido balanço gênico Ideia de que um fenótipo normal exige uma proporção relativa de genes de 11 no genoma biblioteca de cDNA Biblioteca composta por cDNA que não necessariamente representa todos os mRNA biblioteca de DNAmolde Grupo de moléculas de DNA unifilamentar que pode ser amplificado em muitas cópias biblioteca genômica Biblioteca que engloba um genoma inteiro bioinformática Sistemas de informação e métodos analíticos computadorizados aplicados a problemas biológicos tais como a análise genômica bivalentes Dois cromossomos homólogos pareados na meiose bloqueadores do acentuador Elementos reguladores posicionados entre um promotor e um acentuador A sua presença previne que o promotor seja ativado pelo acentuador bolha de transcrição Sítio no qual a duplahélice é desenrolada de modo que a RNA polimerase possa utilizar um dos filamentos de DNA como um molde para a síntese de RNA boxe TATA Sequência de DNA observada em muitos genes eucarióticos que está localizada aproximadamente 30 pb upstream do sítio de início da transcrição C Ver citidina citosina caminhada cromossômica Método para a dissecção de grandes segmentos de DNA no qual um segmento de DNA clonado normalmente eucariótico é utilizado para triar clones de DNA recombinantes do mesmo banco genômico em relação aos outros clones que contêm sequências vizinhas caminho adaptativo Via da alteração evolutiva em etapas que resulta da seleção natural e do acúmulo de uma série de mutações cAMP Ver adenosina monofosfato cíclico câncer Classe de doença caracterizada pela proliferação rápida e descontrolada de células em um tecido de um eucarioto multitecidual Acreditase que os cânceres em geral sejam doenças genéticas das células somáticas que surgem por meio de mutações sequenciais que criam oncogenes e inativam os genes supressores de tumor cap Estrutura especial composta por um resíduo de 7metilguanosina ligado ao transcrito por três grupamentos fosfato que é adicionada no núcleo à extremidade 5 do mRNA eucariótico O cap protege o mRNA contra a degradação e é necessário para a tradução do mRNA no citoplasma CAP Ver proteína ativadora de catabólito característica Atributo de membros individuais de uma espécie em relação ao qual podem ser definidas diversas diferenças hereditárias carga genética Conjunto total de alelos deletérios em um genótipo individual cauda de histona Extremidade de uma proteína histona que se projeta a partir do cerne do nucleossomo e que está sujeita à modificação póstradução Ver também código de histona cauda poliA Sequência de nucleotídios adenina adicionada ao mRNA após a transcrição cDNA Ver DNA complementar célula F Em E coli célula que não apresenta fator de fertilidade uma célula feminina célula F Em E coli célula que apresenta um fator de fertilidade livre uma célula masculina centimorgan cM Ver unidade de mapa centro decodificador Região na pequena subunidade ribossômica na qual se decide se um aminoaciltRNA pode se ligar ao sítio A Essa decisão tem por base a complementaridade entre o anticódon do tRNA e o códon do mRNA centro peptidiltransferase Sítio na grande subunidade ribossômica no qual a ligação de dois aminoácidos é catalisada centrômero Região especializada do DNA em cada cromossomo eucariótico que atua como um sítio para a ligação de proteínas do cinetócoro ChIP Ver imunoprecipitação de cromatina ciclo lisogênico Ciclo de vida de uma bactéria normal quando ela é infectada por um fago λ do tipo selvagem e o genoma é integrado ao cromossomo bacteriano como um profago inerte ciclo lítico Ciclo de vida do bacteriófago que leva à lise da célula hospedeira citidina C Nucleosídio que contém citosina como a sua base citosina C Base pirimidina que pareia com a guanina citotipo M Estoques laboratoriais de Drosophila melanogaster com ausência completa do elemento de transposição P que é observado em estoques naturais citotipo P citotipo P Estoques naturais de Drosophila melanogaster que contêm de 20 a 50 cópias do elemento P Os estoques laboratoriais não apresentam nenhuma cópia Ver citotipo M clonagem posicional Identificação das sequências de DNA que codificam um gene de interesse com base no conhecimento da sua localização genética ou no mapa citogenético clone celular Membros de uma colônia que apresentam um ancestral genético único clone de DNA Seção do DNA que foi inserida em um vetor tal como um plasmídio ou um fago e em seguida foi replicada para produzir muitas cópias CNV Ver variação no número de cópias coativador Classe especial de complexo regulador eucariótico que atua como uma ponte para unir as proteínas reguladoras e a RNA polimerase II coc Ver coeficiente de coincidência código de histona Referese ao padrão de modificação p ex acetilação metilação fosforilação das caudas de histonas que podem carrear as informações necessárias para a correta montagem da cromatina código degenerado redundante Código genético no qual alguns aminoácidos podem ser codificados por mais de um códon cada código genético Conjunto de correspondências entre trincas de nucleotídios no RNA e aminoácidos na proteína codominância Situação na qual um heterozigoto demonstra igualmente os efeitos fenotípicos de ambos os alelos códon Trecho do RNA três nucleotídios de comprimento que codifica um único aminoácido coeficiente de autocruzamento F Probabilidade de que dois alelos em um locus em um indivíduo sejam idênticos por descendência coeficiente de coincidência coc Proporção do número observado de recombinantes duplos em relação ao número esperado coeficiente de correlação Medida estatística de associação que significa a extensão até a qual duas variáveis variam juntas coeficiente de seleção s Perda da adaptabilidade ou a desvantagem seletiva de um genótipo em relação a outro genótipo cointegrado Produto da fusão de dois elementos de transposição circulares para formar um círculo único e maior na transposição replicativa colônia Clone visível de células compensação de dose Processo em organismos que utilizam um mecanismo de determinação sexual cromossômico tal como XX versus XY que possibilita aos genes estruturais padrão no cromossomo sexual serem expressos nos mesmos níveis em indivíduos dos sexos feminino e masculino independentemente do número de cromossomos sexuais Em mamíferos a compensação de dose opera por meio da manutenção de apenas um único cromossomo X ativo em cada célula em Drosophila opera por meio da hiperativação do cromossomo X masculino complementação Produção do fenótipo do tipo selvagem quando dois genomas haploides totais ou parciais estão unidos na mesma célula complementação funcional resgate de mutante Utilização de um fragmento clonado de DNA do tipo selvagem para transformar um mutante no tipo selvagem utilizada na identificação de um clone que contém um gene específico complementar pares de bases Faz referência ao pareamento específico entre a adenina e a timina bem como entre a guanina e a citosina complexo de préiniciação PIC Complexo proteico eucariótico muito grande que abrange a RNA polimerase II e os seis fatores gerais de transcrição GTF cada um dos quais é um complexo de multiproteínas complexo gênico Grupo de genes adjacentes relacionados funcional e estruturalmente que surge tipicamente por meio de duplicação gênica no decorrer da evolução complexo mediador Complexo proteico que atua como um adaptador que interage com fatores de transcrição ligados a sítios reguladores e com fatores de iniciação gerais para a transcrição mediada pela RNA polimerase II conformação cis Em um heterozigoto que apresenta dois sítios mutantes em um gene ou em um aglomerado gênico o arranjo A1A2a1a2 conformação trans Em um heterozigoto com dois sítios mutantes em um gene ou em um aglomerado gênico o arranjo a1 a2 conjugação União de duas células bacterianas durante a qual o material cromossômico é transferido da célula doadora para a receptora controle negativo Regulação mediada por fatores que bloqueiam ou interrompem a transcrição controle positivo Regulação mediada por uma proteína que é necessária para a ativação de uma unidade de transcrição cópia e colagem Termo descritivo em relação a um mecanismo de transposição no qual um retrotranspóson da classe 1 é copiado do sítio doador e uma cópia de DNA bifilamentar é inserida colada em um novo sítioalvo Ver também corte e colagem corpúsculo de Barr Massa de coloração densa que representa um cromossomo X inativado correlação Tendência de uma variável a variar proporcionalmente a outra variável seja de modo positivo ou negativo correpressor Repressor que facilita a repressão gênica mas que por si próprio não é um repressor de ligação ao DNA corte e colagem Termo descritivo em relação a um mecanismo de transposição no qual um transpóson da classe 2 DNA é excisado cortado do sítio doador e inserido colado em um novo sítioalvo Ver também cópia e colagem cossupressão Fenômeno epigenético por meio do qual um transgene se torna reversivelmente inativado juntamente com a cópia do gene no cromossomo cotransdutores Dois alelos doadores que transduzem simultaneamente uma célula bacteriana a sua frequência é utilizada como uma medida da proximidade dos genes doadores no mapa cromossômico covariância Medida estatística da extensão até a qual duas variáveis alteram juntas É utilizada no cômputo do coeficiente de correlação entre duas variáveis cpDNA DNA de cloroplasto cromátide Uma das duas réplicas lado a lado produzidas pela divisão cromossômica cromatina Substância dos cromossomos atualmente sabese que inclui o DNA e as proteínas cromossômicas cromossomo Arranjo linear de uma extremidade até a outra de genes e outro DNA por vezes com proteínas e RNA associados cromossomo acêntrico Cromossomo que não apresenta centrômero cromossomo artificial bacteriano Ver BAC cromossomo dicêntrico Cromossomo com dois centrômeros cromossomo politênico Cromossomo gigante em tecidos específicos de alguns insetos produzido por meio de um processo endomitótico no qual os múltiplos conjuntos de DNA permanecem ligados em um número haploide de cromossomos cromossomo sexual Cromossomo cuja presença ou ausência está correlacionada ao sexo do portador um cromossomo que desempenha um papel na determinação do sexo cromossomo X Um de um par de cromossomos sexuais distinto do cromossomo Y cromossomo Y Um de um par de cromossomos sexuais distinto do cromossomo X cromossomos homeólogos Cromossomos parcialmente homólogos que normalmente indicam alguma homologia ancestral comum cromossomos homólogos Cromossomos que pareiam entre si na meiose ou cromossomos em diferentes espécies que retiveram a maior parte dos mesmos genes durante a sua evolução a partir de um ancestral comum crossing over Troca de partes cromossômicas correspondente entre homólogos por meio de quebra e reunião crRNA RNA transcrito a partir dos loci CRISPR que orientam um complexo proteico a degradar o ácido nucleico viral invasor complementar cruzamento Cruzamento deliberado de dois tipos parentais de organismos na análise genética cruzamento dihíbrido Cruzamento entre dois indivíduos identicamente heterozigotos em dois loci por exemplo ABab ABab cruzamento interrompido Técnica utilizada para mapear genes bacterianos por meio da determinação da sequência na qual os genes do doador entram nas células receptoras cruzamento monohíbrido Cruzamento entre dois indivíduos identicamente heterozigotos em um par de genes por exemplo Aa Aa cruzamento não preferencial Ver cruzamento preferencial negativo cruzamento preferencial negativo Cruzamento preferencial entre parceiros fenotipicamente não semelhantes cruzamento preferencial positivo Situação na qual fenótipos semelhantes cruzam mais comumente do que o esperado ao acaso cruzamentoteste Cruzamento de um organismo de genótipo desconhecido ou de um heterozigoto ou um heterozigoto múltiplo com um testador cruzamentoteste de três pontos cruzamentoteste de três fatores Cruzamentoteste no qual um genitor apresenta três pares de genes heterozigotos CTD Ver domínio carboxiterminal deleção Remoção de um segmento cromossômico de um conjunto cromossômico deleção intragênica Deleção dentro de um gene deleção multigênica Deleção de diversos genes adjacentes depressão por endocruzamento Redução no vigor e no sucesso reprodutivo decorrente do endocruzamento deriva Ver deriva genética aleatória deriva genética aleatória Alterações na frequência dos alelos que resultam em virtude de os genes que aparecem na descendência não serem uma amostragem perfeitamente representativa dos genes parentais desacetilase de histona Atividade enzimática que remove um grupo acetil da cauda de histona o que promove a repressão da transcrição gênica descoberta de gene Processo por meio do qual geneticistas encontram um conjunto de genes que afetam algum processo biológico de interesse por meio dos padrões de herança monogênica de seus alelos mutantes ou por meio de análise genômica desequilíbrio de ligação LD Desvio nas frequências de diferentes haplótipos em uma população das frequências esperadas se os alelos nos loci que definem os haplótipos estiverem aleatoriamente associados desoxirribose Açúcar pentose no arcabouço do DNA desvio Diferença do valor do traço em um indivíduo do valor médio do traço na população desvio genético Segmento de DNA regulador e proteínas reguladorass que se ligam a ele que controlam o estado da transcrição de um gene ou de um conjunto de genes desvio padrão Raiz quadrada da variância díade Par de cromátidesirmãs unidas no centrômero como na primeira divisão da meiose Dicer Complexo proteico que reconhece longas moléculas de RNA bifilamentar e as cliva em siRNA bifilamentares Dicer desempenha um papelchave no RNA de interferência diferencial de seleção S Diferença entre a média de uma população e a média dos membros individuais selecionados para serem os genitores da próxima geração dihíbrido Heterozigoto duplo tal como Aa Bb dimorfismo Polimorfismo com apenas duas formas diploide Célula que apresenta dois conjuntos cromossômicos ou organismo que apresenta dois conjuntos cromossômicos em cada uma de suas células diploide parcial Ver merozigoto direcionamento Característica de determinados elementos de transposição que facilita a sua inserção em regiões do genoma nas quais provavelmente eles não se inserem em um gene causando uma mutação disgenesia híbrida Síndrome que inclui esterilidade mutação quebra cromossômica e recombinação masculina na progênie híbrida de cruzamentos entre determinados isolados laboratoriais e naturais de Drosophila dissecção genética Utilização de recombinação e mutação para juntar os diversos componentes de uma determinada função biológica dissômico Haploide anormal que carreia duas cópias de um cromossomo distribuição de Poisson Distribuição matemática que fornece a probabilidade de observação de diversos números de um evento em particular em uma amostra quando a probabilidade média de um evento em qualquer estudo é muito pequena distribuição normal Distribuição contínua definida pela função de densidade normal com uma média e um desvio padrão especificados que demonstra as frequências esperadas em relação a diferentes valores de uma variável aleatória a curva sinusoidal diversidade gênica GD Probabilidade de que dois alelos coletados aleatoriamente do pool gênico sejam diferentes diversidade nucleotídica Heterozigosidade ou diversidade genética média em todos os sítios de nucleotídios em um gene ou em qualquer outro trecho de DNA DNA ácido desoxirribonucleico Cadeia de nucleotídios ligados que apresentam desoxirribose como seu açúcar Duas cadeias em uma forma de duplahélice são a substância fundamental da qual os genes são compostos DNA complementar cDNA DNA transcrito a partir de um modelo de RNA mensageiro por meio da ação da enzima transcriptase reversa DNA do cloroplasto cpDNA Pequeno componente genômico observado nos cloroplastos de plantas relacionado à fotossíntese e a outras funções que ocorrem na organela DNA doador Qualquer DNA utilizado na clonagem ou na transformação mediada por DNA DNA hemimetilado Sequência de DNA com um filamento metilado e um filamento não metilado DNA heterodúplex DNA no qual existe um par ou mais pares de nucleotídios malpareados em um gene em estudo DNA heteroplex DNA no qual existe um par de nucleotídios malpareado em um gene em estudo DNA ligase Enzima importante na replicação e no reparo do DNA que sela o arcabouço do DNA ao catalisar a formação de ligações fosfodiéster DNA mitocondrial mtDNA Subconjunto do genoma observado na mitocôndria especializado no fornecimento de algumas das funções da organela DNA recombinante Nova sequência de DNA formada por meio da combinação de duas moléculas de DNA não homólogas doadora Célula bacteriana utilizada em estudos de transmissão de DNA unidirecional para outras células exemplos são Hfr na conjugação e fonte de fago na transdução dominância completa Descreve um alelo que se expressa do mesmo modo em uma única cópia heterozigoto ou em cópia dupla homozitogo dominância incompleta Situação na qual um heterozigoto demonstra um fenótipo quantitativamente mas não exatamente intermediário entre os fenótipos homozigotos correspondentes Intermediário exato significa a ausência de dominância dominância parcial Ação gênica sob a qual o fenótipo dos heterozigotos é intermediário entre os dois homozigotos porém mais semelhante àquele de um dos homozigotos do que do outro dominância total Ver dominância completa dominante Fenótipo exibido por um heterozigoto domínio Região de uma proteína associada a uma função em particular Algumas proteínas contêm mais de um domínio domínio carboxiterminal CTD Cauda proteica da subunidade β da RNA polimerase II ela coordena o processamento dos prémRNA eucarióticos incluindo a adição do cap a recomposição e o término domínio de ativação Parte de um fator de transcrição necessário para a ativação da transcrição do genealvo pode se ligar aos componentes do maquinário de transcrição ou recrutar proteínas que modificam a estrutura da cromatina ou ambos domínio de ligação ao DNA Sítio em uma proteína de ligação ao DNA que interage diretamente com sequências de DNA específicas downstream Modo de descrever a localização relativa de um sítio em uma molécula de DNA ou RNA Um sítio downstream está localizado mais próximo da extremidade 3 de uma unidade de transcrição dsRNA Ver RNA bifilamentar duplahélice Estrutura do DNA proposta pela primeira vez por James Watson e Francis Crick com duas hélices entrelaçadas e unidas por ligações de hidrogênio entre as bases pareadas duplicação Mais de uma cópia de um segmento cromossômico em particular em um conjunto cromossômico duplicação do sítioalvo Sequência de DNA de repetição direta curta tipicamente de 2 a 10 pb de comprimento adjacente às extremidades de um elemento de transposição que foi gerado durante a integração do elemento no cromossomo hospedeiro duplicação em tandem Segmentos cromossômicos idênticos adjacentes duplicação gênica Duplicação de genes ou segmentos de DNA por meio da replicação errônea do DNA duplicação insercional Duplicação na qual a cópia extra não está adjacente à cópia normal duplicação segmentar Presença de duas ou mais grandes repetições não em tandem efeito aditivo Metade da diferença entre a média dos valores fenotípicos em relação às classes genotípicas homozigotas em um QTL efeito da dosagem gênica 1 Proporcionalidade da expressão de alguma função biológica e do número de cópias de um alelo presente na célula 2 Alteração no fenótipo causada por um número anormal de alelos do tipo selvagem observada nas mutações cromossômicas efeito de dominância Diferença entre o valor do traço em relação à classe heterozigota em um QTL e o ponto médio entre os valores do traço das duas classes homozigotas efeito de posição Descreve uma situação na qual a influência fenotípica de um gene é alterada por modificações na posição do gene no genoma efeito fundador Diferença aleatória na frequência de um alelo ou um genótipo em uma nova colônia em comparação à população parental que resulta de um pequeno número de fundadores efeito sinergístico Característica das proteínas reguladoras eucarióticas em relação à qual a ativação da transcrição mediada pela interação de diversas proteínas é maior do que a soma dos efeitos das proteínas considerados individualmente efetor alostérico Pequena molécula que se liga a um sítio alostérico elemento Ac Ver elemento Ativador elemento acentuador Sequência reguladora de ação cis que pode elevar os níveis de transcrição de um promotor adjacente Muitos acentuadores tecido específicos podem determinar os padrões espaciais de expressão gênica em eucariotos superiores Os acentuadores podem atuar em promotores ao longo de muitas dezenas de quilobases de DNA e podem estar a 5 ou 3 dos promotores que regulam elemento Ativador Ac Elemento de transposição de DNA da classe 2 assim denominado pela sua descobridora Barbara McClintock em virtude de ser necessário para ativar a quebra cromossômica no locus de dissociação Ds elemento autônomo Elemento de transposição que codifica as proteínas por exemplo transposase ou transcriptase reversa necessárias para a sua transposição e para a transposição de elementos não autônomos na mesma família elemento curto intercalado SINE Tipo de elemento de transposição da classe 1 que não codifica transcriptase reversa mas que se acredita utilizar a transcriptase reversa codificada pelos LINE Ver também Alu elemento da sequência de inserção IS Parte móvel do DNA bacteriano diversas centenas de pares de nucleotídios de comprimento capaz de inativar um gene no qual se insere elemento de ação cis Sítio em uma molécula de DNA ou RNA que atua como um sítio de ligação para uma proteína de ligação ao DNA ou RNA sequência específica O termo de ação cis indica que a ligação proteica a esse sítio afeta apenas as sequências de DNA ou RNA próximas na mesma molécula elemento de Dissociação Ds Elemento de transposição não autônomo denominado por Barbara McClintock em virtude de sua capacidade de quebrar o cromossomo 9 de milho mas apenas na presença de outro elemento denominado Ativador Ac elemento de transposição da classe 1 Elemento de transposição que se movimenta por meio de um RNA intermediário Também denominado elemento de RNA ou retroelemento elemento de transposição da classe 2 Elemento de transposição que se movimenta diretamente de um sítio no genoma até outro Também denominado elemento de DNA elemento DNA Elemento de transposição da classe 2 observado em procariotos e em eucariotos assim denominado em virtude da participação direta do elemento de DNA na transposição elemento IS Ver elemento da sequência de inserção elemento longo intercalado LINE Tipo de elemento de transposição da classe 1 que codifica uma transcriptase reversa Os LINE também são denominados retrotranspósons não de LTR elemento não autônomo Elemento de transposição que depende dos produtos proteicos de elementos autônomos para a sua mobilidade Dissociação Ds é um exemplo de um elemento de transposição não autônomo elemento P Elemento de transposição do DNA em Drosophila que foi utilizado como uma ferramenta para a mutagênese por inserção e para a transformação de linhagem germinativa elemento proximal do promotor Série de sítios de ligação de fatores de transcrição localizados próximos do promotor elemento tipo copia Elemento de transposição retrotranspóson de Drosophila que é flanqueado por longas repetições terminais e que tipicamente codifica uma transcriptase reversa elemento transponível miniatura com repetições invertidas MITE Tipo de transpóson de DNA não autônomo que pode ser formado por meio da deleção do gene da transposase de um elemento autônomo e alcançar números de cópias muito grandes elemento Ty Retrotranspóson LTR de levedura o primeiro isolado de qualquer organismo eletroforese em gel Método de separação molecular no qual o DNA o RNA ou proteínas são separadas em uma matriz de gel de acordo com o tamanho molecular com a utilização de um campo elétrico para direcionar as moléculas através do gel em um sentido predeterminado embrioide Pequena massa em divisão de células monoploides produzida a partir de uma célula destinada a se tornar uma célula de pólen por meio de sua exposição ao frio endocruzamento inbreeding Cruzamento entre parentes endogenoto Ver merozigoto engenharia genética Processo de produção de DNA modificado em um tubo de ensaio e de reintrodução desse DNA em organismos hospedeiros enzima de restrição Endonuclease que reconhece sequências de nucleotídios alvo específicas no DNA e que quebra a cadeia de DNA nesses pontos é conhecida uma diversidade dessas enzimas e elas são extensivamente utilizadas na engenharia genética enzima distributiva Enzima que consegue adicionar apenas um número limitado de nucleotídios antes da liberação do molde de DNA enzima processiva Conforme utilizada no Capítulo 7 descreve o comportamento da DNA polimerase III que pode realizar milhares de rodadas de catálise sem a dissociação de seu substrato o filamentomodelo de DNA epigenética Alterações químicas não genéticas em histonas ou no DNA que alteram a função gênica sem alterar a sequência do DNA epistasia Situação na qual a expressão fenotípica diferencial de um genótipo em um locus depende do genótipo em outro locus uma mutação que exerce a sua expressão enquanto cancela a expressão dos alelos de outro gene epistasia de sinal Dependência da vantagem ou desvantagem adaptativa de uma nova mutação nas mutações que foram fixadas anteriormente equilíbrio de HardyWeinberg Distribuição de frequências estável dos genótipos AA Aa e aa nas proporções de p² 2 pq e q² respectivamente em que p e q são as frequências dos alelos A e a que é consequência de um cruzamento aleatório na ausência de mutação migração seleção natural ou deriva aleatória equilíbrio de ligação Adequação perfeita das frequências de haplótipos em uma população às frequências esperadas se os alelos nos loci que definem os haplótipos estiverem aleatoriamente associados espécie dioécia Espécie de planta na qual os órgãos masculino e feminino estão em plantas separadas EST Ver etiqueta de sequência expressa estrutura populacional Divisão de uma espécie ou de uma população em múltiplas subpopulações geneticamente distintas estrutura primária de uma proteína Sequência de aminoácidos na cadeia polipeptídica estrutura quaternária de uma proteína Constituição multimérica de uma proteína estrutura secundária de uma proteína Arranjo em espiral ou ziguezague da cadeia polipeptídica estrutura terciária de uma proteína Dobramento ou enrolamento em espiral da estrutura secundária para formar uma molécula globular estrutura teta θ Estrutura intermediária na replicação de um cromossomo bacteriano circular estruturas reiteradas de maneira seriada Partes corporais que são membros de séries repetidas tais como dígitos costelas dentes membros e segmentos etiqueta de sequência expressa EST Clone de cDNA em relação ao qual apenas as extremidades 5 eou 3 foram sequenciadas utilizada para identificar extremidades de transcritos na análise genômica eucromatina Região cromossômica menos condensada que se acredita conter a maior parte dos genes normalmente funcionais euploide Célula que apresenta qualquer número de conjuntos cromossômicos completos ou um organismo individual composto por essas células evolução neutra Alterações evolutivas não adaptativas em virtude da deriva genética aleatória excisar Descreve o que um elemento de transposição realiza quando deixa um local cromossômico Também denominado transpor exconjugante Célula bacteriana feminina que acabou de se conjugar com uma masculina e que contenha um fragmento de DNA masculino exogenoto Ver merozigoto éxon Qualquer seção não um íntron da sequência codificadora de um gene em conjunto os éxons correspondem ao mRNA que é traduzido em proteína expansão de trincas Expansão de uma repetição de 3 pb a partir de um número de cópias relativamente baixo até um alto número de cópias que é responsável por uma diversidade de doenças genéticas tais como a síndrome do X frágil e a doença de Huntington experimento de pulso e caça Experimento no qual as células são cultivadas em meio radioativo durante um breve período o pulso e em seguida são transferidas para um meio não radioativo durante um período mais longo a caça expressão constitutiva Referese aos genes que são expressos continuamente independentemente das condições biológicas expressão gênica Processo por meio do qual a sequência de DNA de um gene é transcrita em RNA e em relação aos genes que codificam proteínas em um polipeptídio expressividade Grau até o qual um determinado genótipo é expresso no fenótipo extranuclear Referese a uma pequena fração especializada dos genomas eucarióticos observada em mitocôndrias ou cloroplastos extremidade carboxila Extremidade de uma proteína que apresenta um grupo carboxila livre A extremidade carboxila é codificada pela extremidade de 3 do mRNA e é a última parte da proteína a ser sintetizada na tradução fago Ver bacteriófago fago temperado Fago que pode se tornar um profago fago virulento Fago que não consegue se tornar um profago a infecção pelo referido fago sempre leva à lise da célula hospedeira família de genes Conjunto de genes em um genoma todos descendentes do mesmo gene ancestral fator de ação trans Molécula reguladora difusível quase sempre uma proteína que se liga a um elemento de ação cis específico fator de fertilidade fator F Epissomo bacteriano cuja presença confere capacidade de doador caráter masculino fator de iniciação Proteína necessária para o correto início da tradução fator de liberação RF Proteína que se liga ao sítio A do ribossomo quando um códon de fim está no mRNA fator de transcrição geral GTF Complexo proteico eucariótico que não participa na síntese do RNA mas que se liga à região promotora para atrair e posicionar corretamente a RNA polimerase II para o início da transcrição fator F Ver fator de fertilidade fator F Fator de fertilidade no qual uma parte do cromossomo bacteriano foi incorporada fatores R Plasmídios que carreiam genes que codificam resistência a diversos antibióticos fator sigma σ Proteína bacteriana que como parte da holoenzima RNA polimerase reconhece as regiões 10 e 35 de promotores bacterianos posicionando assim a holoenzima para iniciar a transcrição corretamente no sítio de início O fator σ se dissocia da holoenzima antes da síntese do RNA fenótipo 1 Forma assumida por alguma característica ou um grupo de características em um indivíduo específico 2 Manifestações externas detectáveis de um genótipo específico fenótipo instável Fenótipo caracterizado por reversão frequente seja de modo somático ou germinativo ou ambos em virtude da interação de elementos de transposição com um gene do hospedeiro filamento codificador Filamento não molde de uma molécula de DNA que apresenta a mesma sequência do transcrito de RNA filamento contínuo leading Na replicação do DNA o filamento que é sintetizado no sentido de 5 para 3 por meio da polimerização contínua na ponta 3 em crescimento filamento de RNA antissenso Filamento de RNA que apresenta uma sequência complementar a um filamento de RNA transcrito filamento descontínuo lagging Na replicação do DNA o filamento que é sintetizado aparentemente no sentido de 3 para 5 por meio da ligação de fragmentos curtos sintetizados individualmente no sentido de 5 para 3 filogenia História evolutiva de um grupo flutuação genética Alteração na frequência de um alelo em uma população que resulta de diferenças ao acaso nos números reais da progênie de diferentes genótipos produzidos por diferentes membros individuais fluxo gênico Ver migração forma ceto Ver mudança tautomérica forma enol Ver mudança tautomérica forma imino Ver mudança tautomérica forquilha de replicação Ponto no qual os dois filamentos de DNA são separados para possibilitar a replicação de cada filamento fosfato Íon formado por quatro átomos de oxigênio unidos a um átomo de fósforo ou o grupo químico formado pela união de um íon fosfato a outra espécie química por meio de uma ligação éster fosmídio Vetor que consegue carrear um inserto de 35 a 45 kb de DNA exógeno FR Ver frequência de recombinantes fragmento acêntrico Fragmento cromossômico que não apresenta centrômero fragmento de Okazaki Pequeno segmento de DNA unifilamentar sintetizado como parte do filamento descontínuo na replicação do DNA fragmento de restrição Fragmento de DNA que resulta do corte do DNA com uma enzima de restrição frequência alélica Medida do quanto um alelo é comum em uma população a proporção de todos os alelos daquele gene na população que são desse tipo específico frequência de recombinantes FR Proporção ou porcentagem de células ou indivíduos recombinantes frequência genotípica Proporção de indivíduos em uma população que apresentam um genótipo em particular função de mapeamento Fórmula que expressa a relação entre a distância em um mapa de ligação e a frequência de recombinantes G Ver guanina gargalo Período de uma ou diversas gerações consecutivas de contração no tamanho da população GD Ver diversidade gênica gene Unidade física e funcional fundamental da hereditariedade que carreia a informação de uma geração até a próxima um segmento de DNA composto por uma região transcrita e uma sequência reguladora que torna a transcrição possível gene candidato Gene que em virtude da sua posição cromossômica ou de alguma outra propriedade tornase um candidato a uma função em particular tal como risco de doença gene constitutivo Termo informal em relação a um gene cujo produto é necessário em todas as células e que realiza uma função fisiológica básica gene de efeito materno Gene que produz um efeito apenas quando presente na mãe gene de polaridade segmentar Em Drosophila membro de uma classe de genes que contribuem para os aspectos finais do estabelecimento do número correto de segmentos As mutações de polaridade do segmento causam perda ou alteração em uma parte comparável de cada um dos segmentos corporais gene de regra dos pares Em Drosophila um membro de uma classe de genes expressos em zigotos que atuam em um estágio intermediário no processo de estabelecimento do número correto de segmentos corporais As mutações de regra dos pares apresentam metade do número normal de segmentos em virtude da perda de segmentos alternados gene endógeno Gene normalmente presente em um organismo contrariamente a um gene exógeno de um organismo diferente que pode ser introduzido por meio de técnicas transgênicas gene essencial Gene sem pelo menos uma cópia da qual o organismo morre gene gap Em Drosophila classe de genes cardinais que são ativados no zigoto em resposta aos gradientes anteroposteriores das informações posicionais gene hemizigoto Gene presente em apenas uma cópia em um organismo diploide por exemplo um gene ligado ao X em um mamífero do sexo masculino gene repórter Gene cuja expressão fenotípica é de fácil monitoramento utilizado para estudar as atividades do promotor e do acentuador tecidoespecífico em transgenes gene SRY Gene da masculinidade que está localizado no cromossomo Y gene supressor de tumor Gene que codifica uma proteína que suprime a formação de tumor Acreditase que os alelos do tipo selvagem dos genes supressores de tumor atuem como reguladores negativos da proliferação celular genes controlados de maneira coordenada Genes cujos produtos são simultaneamente ativados ou reprimidos em paralelo genes Hox Membros dessa classe de genes são os genes homeóticos que contêm homeoboxes agrupados que controlam a identidade das partes corporais ao longo do eixo anteroposterior da maior parte dos animais bilaterais genética 1 Estudo dos genes 2 Estudo da hereditariedade genética de populações Estudo da variação genética nas populações e das alterações ao longo do tempo na quantidade ou na padronização daquela variação que resulta de mutação migração recombinação deriva genética aleatória seleção natural e sistemas de cruzamento genética direta Abordagem clássica da análise genética na qual os genes são identificados primeiramente por meio dos alelos mutantes e dos fenótipos mutantes e em seguida clonados e submetidos à análise molecular genética molecular Estudo dos processos moleculares subjacentes à estrutura e à função gênica genética quantitativa Subcampo da genética que estuda a herança de traços complexos ou quantitativos genética reversa Procedimento experimental que tem início com um segmento de DNA clonado ou uma sequência proteica e que o utiliza por meio de mutagênese direcionada para introduzir mutações programadas de volta no genoma para investigar a função genoma Complemento inteiro de material genético em um conjunto cromossômico genômica Clonagem e caracterização molecular de genomas inteiros genômica comparativa Análise das relações das sequências do genoma de duas ou mais espécies genômica funcional Estudo dos padrões de expressão de transcritos e proteínas e de interações moleculares no nível do genoma como um todo genômica pessoal Análise do genoma de um indivíduo para compreender melhor a sua ancestralidade ou a base genética de traços fenotípicos tal como o seu risco de desenvolver uma doença genótipo Composição alélica de um indivíduo ou de uma célula seja do genoma inteiro ou mais comumente de um determinado gene ou de um conjunto de genes geração F1 Primeira geração filial produzida pelo cruzamento de duas linhagens parentais geração F2 Segunda geração filial produzida por autofecundação ou intercruzamento da geração F1 geração parental Duas linhagens ou dois organismos que constituem o início de um experimento de cruzamento genético sua progênie constitui a geração F1 GGR Ver reparo genômico global grampo β beta clamp Proteína que circunda o DNA como uma rosquinha mantendo a enzima DNA pol III unida à molécula de DNA na forquilha de replicação grupo externo Taxa de saída de um grupo de organismos entre os quais as relações evolutivas estão sendo determinadas guanina G Base purina que pareia com a citosina GWA Ver associação ampla de genoma H Ver heterozigosidade haploide Célula que apresenta um conjunto cromossômico ou um organismo composto por essas células haplossuficiente Descreve um gene que em uma célula diploide consegue promover a função do tipo selvagem em apenas uma cópia dose haplótipo Tipo ou forma de um segmento haploide de um cromossomo conforme definido pelos alelos presentes nos loci daquele segmento HapMap Mapa de haplótipos do genoma inteiro helicase Enzima que quebra as ligações de hidrogênio no DNA e que desenrola o DNA durante a movimentação da forquilha de replicação herança complexa Tipo de herança exibida pelos traços afetados por uma mistura de fatores genéticos e ambientais Os traços contínuos tais como a altura tipicamente apresentam herança complexa herança epigenética Modificações herdáveis na função gênica não em virtude de alterações na sequência de bases do DNA do organismo Exemplos de herança epigenética são a paramutação a inativação do cromossomo X e o imprinting parental herança materna Tipo de herança uniparental no qual toda a progênie apresenta o genótipo e o fenótipo do genitor que atua como o sexo feminino herança simples Tipo de herança no qual apenas um gene ou alguns poucos genes estáão envolvidos e no qual o ambiente apresenta pouco ou nenhum efeito sobre o fenótipo os traços categóricos com frequência exibem herança simples herança uniparental Padrão de herança no qual a progênie apresenta o genótipo e o fenótipo de apenas um genitor por exemplo herança de genomas mitocondriais herdabilidade no sentido amplo H² Proporção da variância fenotípica total no nível populacional que é contribuição da variância genética herdabilidade no sentido restrito h² Proporção de variância fenotípica que pode ser atribuída à variância genética aditiva heterocárion Cultura de células composta por dois tipos nucleares diferentes em um citoplasma comum heterocromatina Regiões cromossômicas condensadas de coloração densa que se acredita serem em sua maior parte geneticamente inertes heterocromatina constitutiva Regiões cromossômicas de cromatina permanentemente condensada normalmente ao redor dos telômeros e dos centrômeros heterozigosidade Medida da variação genética em uma população em relação a um locus citada como a frequência de heterozigotos para esse locus heterozigoto Organismo que apresenta um par de genes em heterozigose heterozigoto para inversão Diploide com um homólogo normal e um invertido hexaploide Célula que apresenta seis conjuntos cromossômicos ou um organismo composto pelas referidas células Hfr Ver alta frequência de recombinação celular hibridizar 1 Formar um híbrido por meio da realização de um cruzamento 2 Parear filamentos complementares de ácidos nucleicos de diferentes fontes hiperacetilação Superabundância de grupos acetil ligados a determinados aminoácidos das caudas de histonas A cromatina transcricionalmente ativa normalmente é hiperacetilada hipoacetilação Carência de grupos acetil em determinados aminoácidos das caudas de histonas A cromatina transcricionalmente inativa normalmente é hipoacetilada hipótese multifatorial Hipótese que explica a variação quantitativa ao propor que os traços são controlados por um grande número de genes cada um com um pequeno efeito sobre o traço hipótese nula Em estatística a hipótese que está sendo testada que faz uma previsão a respeito dos resultados esperados de um experimento Se a probabilidade de observação dos resultados sob a hipótese nula for inferior a 005 a hipótese nula então é rejeitada hipótese um geneum polipeptídio Hipótese de meados do século 20 que originalmente propunha que cada gene sequência de nucleotídios codifica uma sequência polipeptídica em geral verdadeira com exceção do RNA funcional não traduzido histograma de frequência Curva de medidas na qual as frequências de diversas classes arbitrariamente delimitadas são plotadas histona Tipo de proteína básica que forma a unidade ao redor da qual o DNA está enrolado nos nucleossomos dos cromossomos eucarióticos holoenzima DNA polimerase III holoenzima DNA pol III Em E coli o grande complexo multissubunidades na forquilha de replicação composto por dois centros catalíticos e muitas proteínas acessórias holoenzima pol III Ver holoenzima DNA polimerase III holoenzima polimerase III Ver holoenzima DNA polimerase III holoenzima RNA polimerase Complexo de multissubunidades bacteriano composto por quatro subunidades do cerne da enzima mais o fator σ homeoboxe boxe homeótico Família de sequências de DNA de 180 pb consideravelmente semelhantes que codifica uma sequência polipeptídica denominada homeodomínio uma sequência de ligação ao DNA de sequência específica Embora o homeoboxe tenha sido descoberto pela primeira vez em todos os genes homeóticos atualmente sabese que codifica um motivo de ligação ao DNA muito mais difundido homeodomínio Família de sequências altamente conservadas de 60 aminoácidos de comprimento e encontradas em um grande número de fatores de transcrição que podem formar estruturas de hélicegirohélice e ligarse ao DNA de modo sequênciaespecífico homólogo Membro de um par de cromossomos homólogos homozigose Referese ao estado de carrear um par de alelos idênticos em um locus homozigoto Organismo com característica de homozigose homozigoto dominante Referese a um genótipo tal como AA homozigoto recessivo Referese a um genótipo tal como aa IBD Ver idêntico por ascendência idêntico por ascendência IBD Quando duas cópias de um gene em um indivíduo remontam à mesma cópia em um ancestral ilha CpG Dinucleotídios CG não metilados observados em agrupamentos próximos dos promotores gênicos impressão de DNA Padrão de bandeamento autorradiográfico produzido quando o DNA é digerido com uma enzima de restrição que corta uma família de VNTR número variável de repetições em tandem e um Southern blot do gel de eletroforese é hibridizado com uma sonda VNTR específica Contrariamente às impressões digitais verdadeiras esses padrões não são únicos de cada organismo individual imprinting genômico Fenômeno no qual um gene herdado de um dos genitores não é expresso muito embora ambas as cópias do gene sejam funcionais Os genes imprintados são metilados e inativados na formação dos gametas masculinos ou femininos imprinting materno Expressão de um gene apenas quando herdado do pai tendo em vista que a cópia do gene herdada da mãe é inativa em virtude da metilação no período de formação do gameta imprinting paterno Expressão de um gene apenas quando herdado da mãe tendo em vista que o alelo do gene herdado do pai é inativo em virtude da metilação no período de formação do gameta imunoprecipitação da cromatina ChIP Utilização de anticorpos para isolar regiões específicas da cromatina e para identificar as regiões do DNA às quais as proteínas reguladoras estão ligadas indução 1 Alívio da repressão de um gene ou de um conjunto de genes sob controle negativo 2 Interação de duas ou mais células ou dois ou mais tecidos que é necessária para que uma dessas células ou um desses tecidos altere o curso de seu desenvolvimento indução zigótica Súbita liberação de um fago lisogênico de um cromossomo Hfr quando o profago entra na célula F seguida pela subsequente lise da célula receptora indutor Agente ambiental que aciona a transcrição de um óperon infecção dupla mista Infecção de uma bactéria por dois fagos geneticamente diferentes infecção mista dupla Infecção de uma cultura bacteriana com dois fagos de genótipos diferentes inferência filogenética Determinação do estado de uma característica ou sentido da alteração em uma característica com base em sua distribuição em uma filogenia de organismos informação posicional Processo por meio do qual indicações químicas que estabelecem o destino celular ao longo de um eixo geográfico são estabelecidas em um embrião em desenvolvimento ou em um primórdio tecidual iniciação Primeiro estágio da transcrição ou da tradução A sua principal função na transcrição é posicionar corretamente a RNA polimerase antes do estágio de alongamento e na tradução é posicionar corretamente o primeiro aminoaciltRNA no sítio P iniciador tRNA especial que insere o primeiro aminoácido de uma cadeia polipeptídica no sítio P ribossômico no início da tradução O aminoácido carreado pelo iniciador em bactérias é a Nformilmetionina integração ectópica Em um organismo transgênico a inserção de um gene em outro sítio que não o seu locus habitual interatoma Conjunto total de interações moleculares dentro das células incluindo em particular interações de proteínas interferência Medida da independência dos crossovers entre si calculada por meio da subtração do coeficiente de coincidência de 1 íntron Ver sequência interveniente íntron autorremovível Primeiro exemplo de RNA catalítico nesse caso um íntron que pode ser removido de um transcrito sem o auxílio de uma enzima inversão Mutação cromossômica composta pela remoção de um segmento cromossômico por sua rotação em 180o e sua reinserção no mesmo local inversão paracêntrica Inversão que não inclui o centrômero inversão pericêntrica Inversão que inclui o centrômero isoformas Relacionadas por diferentes proteínas Podem ser originadas por meio da recomposição alternativa de um gene isolador de barreira Elemento de DNA que evita a difusão da heterocromatina ao atuar como um sítio de ligação para as proteínas que mantêm modificações da cromatina eucromática tais como a acetilação de histonas isolamento pela distância Desvio na escolha do parceiro para cruzamento que tem origem a partir da dimensão da distância geográfica entre os indivíduos fazendo com que os indivíduos estejam mais aptos a cruzar com um membro mais próximo do que com outro membro de sua espécie mais distante junção de pontas não homólogas NHEJ Mecanismo utilizado pelos eucariotos para reparar as quebras bifilamentares LD Ver desequilíbrio de ligação lei da segregação independente segunda lei de Mendel Pares de genes não ligados ou ligados de modo distante ao segregarem distribuemse independentemente na meiose lei da segregação igual primeira lei de Mendel Produção de números iguais 50 de cada alelo nos produtos meióticos p ex gametas de um meiócito heterozigoto lei de HardyWeinberg Equação utilizada para descrever a relação entre as frequências alélicas e genotípicas em uma população de cruzamento aleatório leituras de pontas pareadas Na montagem da sequência genômica pela estratégia de shotgun sequências de DNA que correspondem a ambas as extremidades de um inserto de DNA genômico em um clone recombinante lesão espontânea Dano do DNA que ocorre na ausência de exposição a mutágenos ocorre primariamente em virtude da ação mutagênica dos subprodutos do metabolismo celular letal sintético Referese a um mutante duplo que é letal embora as mutações únicas constituintes não sejam ligação ao sexo Localização de um gene em um cromossomo sexual ligação ao X Padrão de herança dos genes encontrados no cromossomo X mas não no cromossomo Y ligação ao Y Padrão de herança dos genes encontrados no cromossomo Y mas não no cromossomo X raro ligado Situação na qual dois genes estão mesmo cromossomo conforme deduzido por meio das frequências de recombinantes inferiores a 50 LINE Ver elemento longo intercalado linhagem pura Reserva composta por indivíduos geneticamente idênticos que foram totalmente autocruzados a partir de genitores comumns linhagem pura População de indivíduos na qual todos contêm um genótipo homozigoto totalmente idêntico linhagem quase isogênica Ver linhagens congênicas linhagens congênicas Linhagens ou estoques de uma espécie que são idênticas em seus genomas com exceção de uma pequena região de interesse lisado População de progênie de fago lise Ruptura e a morte de uma célula bacteriana na liberação da progênie de fago lisógena Ver bactéria lisogênica lncRNA Ver Longo RNA não codificador loci CRISPR Regiões em cromossomos bacterianos que contêm agrupamentos de repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas envolvidas na imunidade a vírus locus plural loci Ver locus gênico locus do traço quantitativo QTL Gene que contribui para a variação fenotípica em um traço que demonstra padrões complexos de herança tais como altura e peso locus gênico Local específico em um cromossomo no qual um gene está localizado longa repetição terminal LTR Repetição direta de uma sequência de DNA nas extremidades 5 e 3 de retrovírus e retrotranspósons longo RNA não codificador lncRNA Transcritos não codificadores de proteína que apresentam aproximadamente mais de 200 nucleotídios de comprimento LTR Ver longa repetição terminal LTR solo Única cópia de um LTR mapa cromossômico Representação de todos os cromossomos no genoma como linhas marcada com as posições dos genes conhecidos a partir de seus fenótipos mutantes mais marcadores moleculares Tem por base a análise da frequência de recombinantes mapa de associação Método para a localização dos loci dos traços quantitativos no genoma com base no desequilíbrio de ligação entre um locus marcador e o locus do traço quantitativo em uma população de cruzamento aleatório mapa de ligação Mapa cromossômico um mapa abstrato de loci cromossômicos que tem por base as frequências de recombinantes mapa de recombinação Mapa cromossômico no qual as posições dos loci demonstradas têm por base as frequências de recombinantes mapa físico Mapa ordenado e orientado de fragmentos de DNA clonados no genoma mapeamento de deleção Utilização de um conjunto de deleções conhecidas para mapear novas mutações recessivas por meio da pseudodominância mapeamento de locus do traço quantitativo Método para a localização de QTL no genoma e para a caracterização dos efeitos do QTL sobre a variação do traço mapeamento fino Encontro da localização genômica de um gene de interesse ou uma região funcional dentro de um gene com loci marcadores que estão muito estreitamente ligados a ele marca epigenética Alteração hereditária tal como a metilação do DNA ou uma modificação de histona que deixa a sequência do DNA inalterada marcação de transpóson Método utilizado para identificar e isolar um gene hospedeiro por meio da inserção de um elemento de transposição clonado no gene marcador genético Alelo utilizado como uma sonda experimental para acompanhar um organismo um tecido uma célula um núcleo um cromossomo ou um gene individual marcador microssatélite Diferença no DNA no mesmo locus em dois genomas que ocorre em virtude de comprimentos de repetições diferentes de um microssatélite marcador minissatélite Locus heterozigoto que representa um número variável de repetições em tandem de uma unidade com comprimento de 15 a 100 nucleotídios marcador não selecionado Em um experimento de recombinação bacteriana alelo marcado na progênie pela frequência da sua cossegregação com um alelo selecionado ligado matriz de leitura aberta ORF Seção do tamanho de um gene de um segmento de DNA sequenciado que inicia com um códon de iniciação e que termina com um códon de fim presumese que seja a sequência codificadora de um gene média Média aritmética meio mínimo Meio que contém apenas sais inorgânicos uma fonte de carbono e água meiócito Célula na qual ocorre a meiose meiose Duas divisões nucleares sucessivas com as divisões celulares correspondentes que produzem gametas em animais ou esporos sexuais em plantas e fungos que apresentam metade do material genético da célula original merozigoto Célula de E coli parcialmente diploide formada a partir de um cromossomo completo o endogenoto mais um fragmento o exogenoto metilação do DNA Adição de grupos metil a resíduos de DNA após a replicação microarranjo Conjunto de moléculas de DNA que contêm todos ou a maior parte dos genes em um genoma depositados em um pequeno chip de vidro microRNA miRNA Classe de RNA funcional que regula a quantidade de proteína produzida por um gene eucariótico microssatélite Locus composto por diversas cópias repetições de um motivo de sequência curta aproximadamente 2 a 6 pb Diferentes alelos apresentam diferentes números de repetições migração Movimentação de indivíduos ou gametas entre populações miRNA Ver microRNA mistura genética Mistura de genes que resulta quando os indivíduos apresentam ancestrais de mais de uma subpopulação MITE Ver elemento transponível miniatura com repetições invertidas mitose Tipo de divisão nuclear que ocorre na divisão celular que produz dois núcleosfilhos idênticos ao núcleo parental modificação de histona Alteração covalente de um ou mais resíduos de aminoácidos da proteína histona As modificações incluem acetilação fosforilação e metilação modificação póstradução PTM Alteração de resíduos de aminoácidos que ocorre após a proteína ter sido traduzida modificadora Mutação em um segundo locus que altera o grau de expressão de um gene mutado em um primeiro locus molde Molde molecular que forma a estrutura ou a sequência de outra molécula por exemplo a sequência de nucleotídios do DNA atua como um molde para controlar a sequência de nucleotídios do RNA durante a transcrição moléculafilha Um dos dois produtos da replicação do DNA composto por um filamentomolde e um filamento recémsintetizado monohíbrido Heterozigoto de locus único do tipo Aa monoploide Célula que apresenta apenas um conjunto cromossômico normalmente como uma aberração ou um organismo composto pelas referidas células monossômico Célula ou um organismo que é basicamente diploide mas que apresenta apenas uma cópia de um tipo cromossômico em particular e que portanto apresenta um número cromossômico de 2n 1 montagem de sequência Compilação de milhares ou milhões de leituras de sequências de DNA independentes em um conjunto de contigs e andaimes morfo Forma de um polimorfismo genético o morfo pode ser um fenótipo ou uma sequência molecular mRNA RNA mensageiro Molécula de RNA transcrita a partir do DNA de um gene uma proteína é traduzida a partir dessa molécula de RNA por meio da ação dos ribossomos mtDNA DNA mitocondrial mudança tautomérica Isomerização espontânea de uma base nitrogenada de sua forma ceto normal para uma forma alternativa enol ou imino de ligação ao hidrogênio mutação 1 Processo que produz um gene ou um conjunto cromossômico que difere daquele do tipo selvagem 2 Gene ou conjunto cromossômico que resulta de um referido processo mutação constitutiva Alteração em uma sequência de DNA que faz com que um gene que está reprimido por vezes seja expresso continuamente ou constitutivamente mutação cromossômica Qualquer tipo de alteração na estrutura ou no número de cromossomos mutação de ponto Mutação que altera a posição de uma única base em uma molécula de DNA ao convertêla em uma base diferente ou por meio da inserçãodeleção de uma única base em uma molécula de DNA mutação de sentido trocado Substituição de um par de nucleotídios em uma região codificadora de proteínas que leva à substituição de um aminoácido por outro aminoácido mutação espontânea Mutação que ocorre na ausência de exposição a mutágenos mutação hipomórfica leaky Mutação que confere um fenótipo mutante mas que ainda retém um nível baixo porém detectável de função do tipo selvagem mutação indel Mutação na qual um ou mais pares de nucleotídios são adicionados ou deletados mutação induzida Mutação que tem origem por meio da ação de um agente que aumenta a taxa na qual as mutações ocorrem mutação na matriz de leitura frameshift mutation Inserção ou deleção de um ou mais pares de nucleotídios que causa uma ruptura na matriz de leitura da tradução mutação negativa dominante Alelo mutante que em dose única um heterozigoto anula a função gênica por meio de um efeito espoliador sobre a proteína mutação nula Mutação que resulta em ausência completa da função do gene mutação sem sentido Substituição de um par de nucleotídios em uma região codificadora de proteína que altera um códon em relação a um aminoácido para um códon de término sem sentido mutação sinônima Mutação que altera um códon para um aminoácido em outro códon para o mesmo aminoácido Também denominada mutação silenciosa mutação termossensível Mutação condicional que produz o fenótipo mutante em uma faixa de temperaturas e o fenótipo do tipo selvagem em outra faixa de temperaturas mutagênese Experimento no qual organismos experimentais são tratados com um mutágeno e a sua progênie é examinada em relação a fenótipos mutantes específicos mutagênese por inserção Situação na qual uma mutação tem origem a partir da interrupção de um gene por um DNA exógeno tal como a partir de um construto transgênico ou de um elemento de transposição mutágeno Agente capaz de aumentar a taxa de mutação mutante Organismo ou uma célula que carreia uma mutação mutante duplo Genótipo com alelos mutantes de dois genes diferentes mutante resistente Mutante que consegue crescer em um ambiente normalmente tóxico NAHR Ver recombinação homóloga não alélica não disjunção Falha de homólogos na meiose ou de cromátides irmãs na mitose em se separar adequadamente para polos opostos ncRNA Ver RNA não codificador de proteína neofuncionalização Evolução de uma nova função por parte de um gene NER Ver sistema de reparo por excisão de nucleotídio NH Ver número de haplótipos NHEJ Ver junção de pontas não homólogas NLS Ver sequência de localização nuclear nocaute gênico Inativação de um gene por meio de uma mutação de ocorrência natural ou por meio da integração de um fragmento de DNA especialmente modificado e introduzido Em alguns sistemas a referida inativação é aleatória com a utilização de construtos transgênicos que se inserem em muitos locais diferentes no genoma Em outros sistemas pode ser realizado de modo direcionado Ver também nocaute gênico direcionado nocaute gênico direcionado Introdução de uma mutação nula em um gene por meio de uma alteração projetada em uma sequência de DNA clonada que em seguida é introduzida no genoma por meio de recombinação homóloga e da substituição do alelo normal Northern blot Transferência de moléculas de RNA separadas por eletroforese de um gel para uma membrana absorvente que em seguida é imersa em uma sonda marcada que se ligará ao RNA de interesse nucleossomo Unidade básica da estrutura cromossômica eucariótica uma esfera de oito moléculas de histonas envolta por duas voltas de DNA nucleotídio Molécula composta por uma base nitrogenada um açúcar e um grupo fosfato o elemento estrutural básico dos ácidos nucleicos nulissômico Referese a uma célula ou um organismo com um tipo cromossômico ausente com um número de cromossomos tal como n 1 ou 2n 2 número de haplótipos NH Contagem simples do número de haplótipos em um locus em uma população número variável de repetições em tandem VNTR Locus cromossômico no qual uma sequência repetida em particular está presente em diferentes números em diferentes indivíduos ou nos dois homólogos diferentes em um indivíduo diploide O Ver origem da replicação óctade Asco que contém oito ascósporos produzidos em espécies nas quais a tétrade normalmente é submetida a uma divisão mitótica pósmeiótica OGM Ver organismo geneticamente modificado oncogene Mutação de ganho de função que contribui para a produção de câncer oncoproteína Produto proteico de uma mutação em oncogene operador Região do DNA em uma extremidade de um óperon que atua como o sítio de ligação para uma proteína repressora óperon Conjunto de genes estruturais adjacentes cujo mRNA é sintetizado em um segmento mais os sinais reguladores adjacentes que afetam a transcrição dos genes estruturais ORF Ver matriz de leitura aberta organismo geneticamente modificado OGM Termo popular para um organismo transgênico especialmente aplicado a produtos agrícolas transgênicos organismo transgênico Organismo cujo genoma foi modificado por um novo DNA aplicado externamente origem O Ver origem da replicação origem da replicação O Ponto de uma sequência específica no qual a replicação do DNA é iniciada ortólogos Genes em diferentes espécies que evoluíram a partir de um gene ancestral comum por especiação oscilação wobble Capacidade de determinadas bases na terceira posição de um anticódon no tRNA de formar ligações de hidrogênio de diversos modos causando alinhamento com diversos diferentes códons possíveis padrão de segregação de primeira divisão padrão de MI Padrão linear de fenótipos de esporos dentro de um asco em relação a um par de alelos em particular produzido quando os alelos se dirigem para núcleos separados na primeira divisão meiótica demonstrando que não ocorreu nenhum crossover entre o par de alelos e o centrômero padrão de segregação de segunda divisão padrão MII Padrão de genótipos de ascósporos em relação a um par de genes que demonstra que os dois alelos separamse em núcleos diferentes apenas na segunda divisão meiótica como um resultado de um crossover entre aquele par de genes e o seu centrômero pode ser detectado apenas em um asco linear padrão MI Ver padrão de segregação de primeira divisão padrão MII Ver padrão de segregação de segunda divisão painel de descoberta Grupo de indivíduos utilizados para detectar sítios de nucleotídios variáveis comparandose as sequências genômicas parciais desses indivíduos entre si palíndromo de DNA Segmento de DNA no qual ambos os filamentos apresentam a mesma sequência de nucleotídios porém em orientação antiparalela par de genes Duas cópias de um tipo de gene em particular presente em uma célula diploide uma em cada conjunto cromossômico par de genes heterozigoto Par de genes que apresenta alelos diferentes nos dois conjuntos cromossômicos do indivíduo diploide por exemplo Aa ou A¹A² paradoxo de valor C Discrepância ou ausência de correlação entre o conteúdo de DNA de um organismo e a sua complexidade biológica parálogos Genes relacionados pela duplicação gênica em um genoma parcimônia Favorecimento da explicação mais simples que envolve o menor número de alterações evolutivas pareamento de filamento dependente de síntese SDSA Mecanismo livre de erro para a correção de quebras bifilamentares que ocorrem após a replicação de uma região cromossômica em uma célula em divisão partenogênese Produção de descendência por parte de uma fêmea sem a contribuição genética de um macho PCNA Ver antígeno nuclear de proliferação celular PCR Ver reação da cadeia de polimerase penetrância Proporção de indivíduos com um genótipo específico que manifesta aquele genótipo no nível do fenótipo pentaploide Organismo com cinco conjuntos de cromossomos pequeno RNA de interferência siRNA RNA bifilamentares curtos produzidos pela clivagem de RNA bifilamentares longos por Dicer pequeno RNA nuclear snRNA Qualquer um de diversos RNA curtos observados no núcleo eucariótico no qual auxiliam em eventos de processamento do RNA PEV Ver variegação por efeito de posição PIC Ver complexo de préiniciação pirimidina Tipo de base nitrogenada as bases pirimidinas no DNA são a citosina e a timina piRNA Ver RNA de interação piwi pirossequenciamento Tecnologia de sequenciamento do DNA que tem por base a geração e a detecção de um grupo pirofosfato liberado de um nucleotídio trifosfato placa Área clara em uma camada bacteriana deixada pela lise das bactérias por infecções progressivas por um fago e seus descendentes plaqueamento Difusão das células de um microrganismo bactéria fungo em uma placa de meio nutritivo para possibilitar que cada célula forme uma colônia visível plaqueamento em réplica Em genética microbiana modo para triar colônias dispostas em uma placa máster para verificar se elas são mutantes em outros ambientes é utilizada uma almofada de feltro para transferir as colônias para novas placas plasmídio Molécula de DNA extracromossômico que se replica de modo autônomo plasmídio F Ver fator F plasmídio R Plasmídio que contém um ou diversos transpósons que contêm genes de resistência plasmídio Ti Plasmídio circular de Agrobacterium tumifaciens que possibilita que a bactéria infecte células de plantas e produza um tumor tumor galha da coroa poligene locus do traço quantitativo Gene cujos alelos são capazes de interagir de modo aditivo com alelos em outros loci para afetar um fenótipo traço que demonstra uma distribuição contínua polimerase de bypass translesão DNA polimerase que consegue continuar a replicar o DNA passando por um sítio de dano que interromperia a replicação pela polimerase replicativa normal As polimerases de bypass contribuem para um mecanismo de tolerância aos danos denominado síntese de DNA translesão polimerases translesão Família de DNA polimerases que conseguem continuar a replicar o DNA além do sítio de uma lesão que interromperia a replicação pela polimerase replicativa normal Também conhecidas como polimerases de bypass polimorfismo Ocorrência em uma população de múltiplas formas de um traço ou de múltiplos alelos em um locus genético polimorfismo de nucleotídio único SNP Diferença em um par de nucleotídios em uma determinada localização nos genomas de dois ou mais indivíduos de ocorrência natural polimorfismo do comprimento de sequência simples SSLP Existência na população de indivíduos com diferentes números de cópias de uma sequência de DNA simples curta em um locus cromossômico polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição RFLP Diferença na sequência de DNA entre indivíduos ou haplótipos que é reconhecida como diferentes comprimentos de fragmentos de restrição Por exemplo a substituição de um par de nucleotídios pode causar a presença de um sítio de reconhecimento de enzima de restrição em um alelo de um gene e a ausência em outro Consequentemente uma sonda para essa região do DNA hibridizará com fragmentos de diferentes tamanhos no DNA digerido por enzima de restrição desses dois alelos polipeptídio Cadeia de aminoácidos ligados uma proteína poliploide Célula que apresenta três ou mais conjuntos cromossômicos ou um organismo composto pelas referidas células ponte anafásica Em um cromossomo dicêntrico o segmento entre os centrômeros que são puxados para os polos opostos na divisão nuclear ponte dicêntrica Em um cromossomo dicêntrico o segmento entre os centrômeros que é puxado para polos opostos na divisão nuclear pool gênico Soma total de todos os alelos nos membros reprodutivos de uma população em um determinado momento população 1 Grupo de indivíduos que cruzam entre si para produzir a próxima geração 2 Grupo de indivíduos a partir do qual uma amostra é coletada prémRNA Ver transcrito primário primase Enzima que produz primers de RNA na replicação do DNA primeira geração filial F1 Indivíduos da progênie que surge a partir de um cruzamento de duas linhagens diploides homozigotas primeira lei de Mendel lei da segregação igual Dois membros de um par de genes se segregam na meiose cada gameta apresenta uma probabilidade igual de obter qualquer membro do par de genes primer Oligonucleotídio de RNA ou DNA que pode atuar como um molde para a síntese do DNA pela DNA polimerase quando ligado a uma molécula de DNA mais longa primossomo Complexo proteico na forquilha de replicação cujo componente central é a primase probando Em um heredograma humano pessoa que primeiramente chamou a atenção do geneticista procarioto Organismo composto por uma célula procariótica tal como uma bactéria ou uma alga azulesverdeada processamento cotranscricional Transcrição e o processamento simultâneos do prémRNA eucariótico processamento de RNA Termo coletivo em relação às modificações do RNA eucariótico incluindo a adição do cap e a recomposição que são necessárias antes que o RNA possa ser transportado para o citoplasma para a tradução processamento póstransdução Modificações de grupos laterais de aminoácidos após uma proteína ter sido traduzida produto da meiose Uma das células normalmente quatro formadas nas duas divisões meióticas produtos de crossover Células que são produto de meiose com cromossomos que participaram de um crossover prófago Cromossomo de fago inserido como parte da estrutura linear do DNA cromossômico de uma bactéria projeto de fármaco baseado na estrutura Utilização de informação básica a respeito de processos celulares e do maquinário para desenvolver fármacos projeto genoma Esforço em grande escala com frequência multilaboratorial necessário para sequenciar um genoma complexo promotora Região reguladora que está a uma curta distância da extremidade 5 de um gene e que atua como o sítio de ligação para a RNA polimerase propriedade Aspecto característico de um organismo tal como o tamanho a coloração a forma ou a atividade enzimática proteína acessória Proteína associada à DNA polimerase III de E coli que não é parte do centro catalítico proteína ativadora de catabólito CAP Proteína que se une ao cAMP em baixas concentrações de glicose e que se liga ao promotor lac para facilitar a ação da RNA polimerase proteína de ligação ao boxe TATA TBP Fator de transcrição geral que se liga ao boxe TATA e auxilia na atração de outros fatores de transcrição gerais e da RNA polimerase II para promotores eucarióticos proteína de ligação unifilamentar SSB Proteína que se liga a DNA unifilamentares e que previne que a duplahélice seja formada novamente antes da replicação proteína fibrosa Proteína com forma linear tal como os componentes dos cabelos e dos músculos proteína globular Proteína com uma estrutura compacta tal como uma enzima ou um anticorpo proteoma Conjunto completo de genes codificadores de proteínas em um genoma protooncogene Correspondente celular normal de um gene que pode sofrer mutação e se tornar um oncogene dominante prototrófica Linhagem de organismos que proliferará em meio mínimo comparar com auxotrófica provírus DNA genômico de um retrovírus inserido cromossomicamente pseudodominância Súbito aparecimento de um fenótipo recessivo em um heredograma em virtude da deleção de um gene dominante que o mascarava pseudogene Gene inativo por mutação em relação ao qual não existe correspondente funcional em populações do tipo selvagem pseudogene processado Pseudogene que surgiu por meio da transcrição reversa de um mRNA maduro e de sua integração no genoma pseudoligação Aparecimento da ligação de dois genes em cromossomos translocados purina Tipo de base nitrogenada as bases purinas no DNA são a adenina e a guanina QTL Ver locus do traço quantitativo quebra bifilamentar Quebra do DNA que cliva o arcabouço açúcarfosfato de ambos os filamentos da duplahélice de DNA reação da cadeia de polimerase PCR Método in vitro para a amplificação de um segmento de DNA específico o qual utiliza dois primers que hibridizam com extremidades opostas do segmento em polaridade oposta e que durante ciclos sucessivos iniciam a replicação exponencial apenas daquele segmento rearranjo Produção de cromossomos anormais por meio da quebra e da reunião incorreta de segmentos cromossômicos exemplos são inversões deleções e translocações rearranjo balanceado Alteração na ordem gênica cromossômica que não remove ou duplica qualquer DNA As duas classes de rearranjos balanceados são as inversões e as translocações recíprocas rearranjo desbalanceado Rearranjo no qual ocorre um ganho ou uma perda de material cromossômico em um conjunto cromossômico receptora Célula bacteriana que recebe o DNA em uma transferência unilateral entre células exemplos são F em uma conjugação ou a célula transduzida em uma transdução mediada por fago recombinação 1 Em geral qualquer processo em uma célula diploide ou parcialmente diploide que gere novas combinações gênicas ou cromossômicas não observadas anteriormente naquela célula ou em seus genitores 2 Na meiose o processo que gera um produto haploide da meiose cujo genótipo é diferente de qualquer um dos dois genótipos haploides que constituíram o diploide meiótico recombinação de fago Produção de genótipos de fagos recombinantes como resultado da infecção dupla de uma célula bacteriana por diferentes genótipos de fagos parentais recombinação homóloga não alélica NAHR Crossing over entre unidades homólogas curtas observado em diferentes loci cromossômicos recombinação meiótica Recombinação em virtude da distribuição ou do crossing over na meiose recombinante Referese a um organismo ou uma célula individual que apresenta um genótipo produzido por recombinação recomposição alternativa Processo por meio do qual diferentes RNA mensageiros são produzidos a partir do mesmo transcrito primário por meio de variações no padrão de recomposição do transcrito Múltiplas isoformas de mRNA podem ser produzidas em uma única célula ou diferentes isoformas podem demonstrar diferentes padrões de expressão tecidoespecíficos Se os éxons alternativos estiverem localizados em matrizes de leitura abertas das isoformas de mRNA diferentes proteínas serão produzidas pelos mRNA alternativos recomposição do RNA Reação amplamente observada em eucariotos que remove íntrons e une éxons no RNA rede de haplótipos Rede que demonstra relações entre os haplótipos e as posições das mutações que definem os haplótipos nos ramos região 3 não traduzida 3 UTR Região do transcrito de RNA na extremidade 3 downstream do sítio de término da tradução região 5 não traduzida de 5 UTR Região do transcrito de RNA na extremidade 5 upstream do sítio de início da tradução regiões pseudoautossômicas 1 e 2 Pequenas regiões nas extremidades dos cromossomos sexuais X e Y elas são homólogas e sofrem pareamento e crossing over na meiose regra da soma A probabilidade de que um ou outro de dois eventos mutuamente exclusivos irá ocorrer é a soma das suas probabilidades individuais regra do produto A probabilidade de dois eventos independentes ocorrerem simultaneamente é o produto das probabilidades individuais regra GUAG Assim denominada em virtude dos dinucleotídios GU e AG estarem quase sempre nas extremidades 5 e 3 de íntrons respectivamente nas quais são reconhecidos por componentes do spliceossomo regulon Genes transcritos de um modo coordenado pela mesma proteína reguladora p ex fator sigma relógio molecular Taxa de substituição constante de aminoácidos em proteínas ou de nucleotídios em ácidos nucleicos durante o longo tempo evolutivo remoção e união splicing Reação que remove íntrons e une éxons no RNA remodelagem da cromatina Alterações na posição do nucleossomo ao longo do DNA reparo genômico global GGR Tipo de reparo por excisão de nucleotídio que ocorre em sequências não transcritas reparo por excisão de base Uma das diversas vias de reparo por excisão Nessa via distorções de pares de bases sutis são reparadas por meio da criação de sítios apurínicos seguida pela síntese de reparo reparo por excisão de nucleotídio acoplado à transcrição TCNER Tipo de reparo por excisão de nucleotídio que é ativado por complexos de transcrição parados e que corrige o dano ao DNA em regiões transcritas do genoma repetição de trinucleotídios Ver expansão de trincas replicação conservativa Modelo refutado de síntese de DNA que sugere que metade das moléculasfilhas de DNA devem apresentar ambos os filamentos compostos por nucleotídios recémpolimerizados replicação dispersiva Modelo refutado de síntese de DNA que sugere um entremeado mais ou menos aleatório de segmentos parentais e novos em moléculasfilhas de DNA replicação do DNA Processo de síntese de duas cópias idênticas de uma molécula de DNA a partir de uma cópia original replicação por círculo rolante Tipo de replicação utilizado por algumas moléculas de DNA circular em bactérias tais como plasmídios no qual o círculo aparenta rodar na medida em que desenrola um filamento contínuo replicação semiconservativa Modelo estabelecido de replicação do DNA no qual cada molécula bifilamentar é composta por um filamento parental e um filamento recémpolimerizado replissomo Máquina molecular na forquilha de replicação que coordena as diversas reações necessárias para a replicação rápida e precisa do DNA repressão de catabólito Inativação de um óperon causada pela presença de grandes quantidades do produto metabólico final do óperon repressor Proteína que se liga a um elemento de ação cis tal como um operador ou um silenciador prevenindo assim a transcrição a partir de um promotor adjacente resgate de mutante Ver complementação funcional resposta à seleção R Quantidade de alteração no valor médio de alguma característica fenotípica entre a geração parental e a geração da progênie como um resultado da seleção dos genitores retrotransposição Mecanismo de transposição caracterizado pelo fluxo reverso de informação do RNA para o DNA retrotranspóson Elemento de transposição que utiliza a transcriptase reversa para a transposição por meio de um RNA intermediário Ver elemento de transposição da classe 1 retrotranspóson LTR Tipo de elemento de transposição da classe 1 que termina em repetições terminais longas e codifica diversas proteínas incluindo a transcriptase reversa retrovírus Vírus de RNA que se replica primeiro sendo convertido em um DNA bifilamentar revertente Alelo com função do tipo selvagem que surge por meio da mutação de um alelo mutante causado por uma reversão completa do evento original ou por uma mutação compensatória em um segundo sítio RF Ver fator de liberação RFLP Ver polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição ribose Açúcar pentose do RNA ribossomo Organela complexa que catalisa a tradução do RNA mensageiro em uma sequência de aminoácidos composto por proteínas mais rRNA ribozima RNA com atividade enzimática por exemplo as moléculas de RNA autorrecompostas em Tetrahymena RISC complexo de silenciamento induzido por RNA Complexo proteico de multissubunidades que se associa com os siRNA e que é orientado até um mRNA alvo por meio da complementaridade de bases O mRNAalvo é clivado pela atividade do RISC RNA ácido ribonucleico Ácido nucleico unifilamentar semelhante ao DNA mas que apresenta o açúcar ribose em vez do açúcar desoxirribose e uracila em vez de timina como uma das bases RNA bifilamentar dsRNA Molécula de RNA composta por dois filamentos complementares RNA blotting Ver Northern blot RNA de interação piwi piRNA RNA transcrito a partir de agrupamentos de pi que auxilia na proteção da integridade dos genomas de plantas e animais e na prevenção da difusão de elementos de transposição para outros loci cromossômicos Os piRNA restringem os elementos de transposição em animais RNA de interferência RNAi Sistema em eucariotos para o controle da expressão gênica por meio da ação de siRNA e miRNA Ver silenciamento gênico RNA funcional Tipo de RNA que desempenha um papel sem ser traduzido RNA mensageiro Ver mRNA RNA mundial Denominação de uma teoria popular de que o RNA deve ter sido o material genético nas primeiras células tendo em vista que sabidamente apenas o RNA codifica informações genéticas e catalisa reações biológicas RNA não codificador de proteína ncRNA RNA que não é traduzido em proteína RNA polimerase Enzima que catalisa a síntese de um filamento de RNA a partir de um molde de DNA Eucariotos apresentam diversas classes de RNA polimerase os genes estruturais que codificam proteínas são transcritos pela RNA polimerase II RNA ribossômico Ver rRNA RNA transportador Ver tRNA RNAi Ver RNA de interferência rRNA RNA ribossômico Classe de moléculas de RNA codificadas no organizador nucleolar que apresentam um papel integrante porém pouco compreendido na estrutura e na função ribossômica s Ver coeficiente de seleção S Ver sítios segregantes ou diferencial de seleção SDSA Ver pareamento de filamento dependente de síntese segregação adjacente 1 Em uma translocação recíproca a passagem de um cromossomo translocado e de um normal para cada um dos polos segregação alternada Em uma translocação recíproca a passagem de ambos os cromossomos normais para um polo e de ambos os cromossomos translocados para o outro polo segregação citoplasmática Segregação na qual célulasfilhas geneticamente diferentes têm origem a partir de um genitor que é um citohet segregação independente Ver segunda lei de Mendel segunda geração filial F2 Progênie de um cruzamento entre dois indivíduos da geração F1 segunda lei de Mendel lei da segregação independente Pares de genes não ligados ou ligados de modo distante ao segregarem distribuemse independentemente na meiose seleção 1 Procedimento experimental no qual apenas um tipo específico de mutante consegue sobreviver 2 Produção de números médios diferentes de progênie por parte de genótipos diferentes em uma população como um resultado das diferentes propriedades fenotípicas daqueles genótipos seleção artificial Cruzamento de sucessivas gerações por meio da seleção humana deliberada de determinados fenótipos ou genótipos como os genitores de cada geração seleção balanceada Seleção natural que resulta em um equilíbrio com frequências alélicas intermediárias seleção cumulativa Situação em que a seleção natural promove múltiplas substituições que alteram a função de uma proteína ou de um elemento regulador por meio de rodadas repetidas de mutação e seleção seleção direcional Seleção que altera a frequência de um alelo em um sentido constante seja a favor ou contra a fixação desse alelo seleção natural Taxa de reprodução diferencial de diversos tipos em uma população como resultado de distintas características fisiológicas anatômicas ou comportamentais dos tipos seleção negativa Eliminação de um traço deletério de uma população por meio da seleção natural seleção positiva Processo por meio do qual um alelo favorável é trazido até uma frequência mais alta em uma população em virtude de os indivíduos que carreiam aquele alelo apresentarem descendência mais viável do que outros indivíduos seleção purificadora Seleção natural que remove variantes deletérias de uma sequência de DNA ou proteína reduzindo assim a diversidade genética semiesterilidade meiaesterilidade Fenótipo de um organismo heterozigoto em relação a determinados tipos de aberração cromossômica expressase como um número reduzido de gametas viáveis e portanto fertilidade reduzida sequência consenso Sequência de nucleotídios de um segmento de DNA que é derivada do alinhamento de sequências semelhantes seja do mesmo organismo seja de organismos diferentes e que determina o nucleotídio mais comum em cada posição sequência consenso Sequência de nucleotídios de um segmento de DNA que está de acordo com a maior parte das leituras de sequência do mesmo segmento de indivíduos diferentes sequência contig Grupo de segmentos clonados sobrepostos sequência de ativação upstream UAS Sequência de DNA de levedura localizada a 5 do promotor gênico um fator de transcrição se liga à UAS para regular positivamente a expressão gênica sequência de localização nuclear NLS Parte de uma proteína necessária para o seu transporte do citoplasma para o núcleo sequência de repetição invertida IR Sequência observada em uma forma idêntica porém invertida por exemplo nas extremidades opostas de um transpóson de DNA sequência interveniente Íntron segmento de função amplamente desconhecida dentro de um gene Esse segmento inicialmente é transcrito mas o transcrito não é observado no mRNA funcional sequência IR Ver sequência de repetição invertida sequência líder Sequência na extremidade 5 de um mRNA que não é traduzida em proteína sequência ShineDalgarno Sequência curta no RNA bacteriano que precede o códon AUG de iniciação e que atua para posicionar corretamente esse códon no sítio P do ribossomo pelo pareamento por meio da complementaridade de bases com a extremidade 3 do RNA 16S na subunidade ribossômica 30S sequência sinalizadora Sequência aminoterminal de uma proteína secretada é necessária para o transporte da proteína através da membrana celular sequenciamento de RNA Método utilizado para determinar as regiões transcritas de um genoma em alguma população celular específica amostra tecidual ou organismo sequenciamento de Sanger Ver sequenciamento didesóxi sequenciamento didesóxi Sanger Método mais popular de sequenciamento do DNA Utilizamse didesoxinucleotídios trifosfatos misturados com nucleotídios trifosfatos padrão para produzir uma série de filamentos de DNA cuja síntese é bloqueada em diferentes comprimentos Esse método tem sido incorporado em máquinas de síntese de DNA automatizadas Também denominado sequenciamento de Sanger em homenagem ao seu inventor Frederick Sanger série alélica Conjunto de alelos conhecidos de um gene Ver também alelos múltiplos sexo heterogamético Sexo que apresenta cromossomos sexuais heteromórficos p ex XY e que portanto produz dois tipos de gametas diferentes em relação aos cromossomos sexuais sexo homogamético Sexo com cromossomos sexuais homólogos p ex XX silenciamento epigenético Repressão da expressão de um gene em virtude de sua posição no cromossomo em vez de por meio de uma mutação na sua sequência de DNA O silenciamento epigenético pode ser herdado de uma geração celular para a próxima silenciamento gênico Gene que não é expresso em virtude de regulação epigenética Contrariamente aos genes mutantes em virtude de alterações na sequência do DNA os genes inativados por silenciamento podem ser reativados silenciamento gênico póstranscrição Ocorre quando o mRNA de um gene em particular é destruído ou sua tradução é bloqueada O mecanismo de silenciamento normalmente envolve RNAi ou miRNA silenciamento gênico transcricional Ocorre quando um gene não pode ser transcrito em virtude de estar localizado na heterocromatina síndrome de Cockayne Distúrbio genético causado por defeitos no sistema de reparo por excisão de nucleotídio e que leva a sintomas de envelhecimento precoce Indivíduos com síndrome de Cockayne apresentam uma mutação em uma de duas proteínas que se acredita reconhecerem os complexos de transcrição bloqueados em virtude do dano ao DNA síndrome de Down Fenótipo humano anormal que inclui o retardo mental em virtude de uma trissomia do cromossomo 21 mais comum em bebês nascidos de mães mais velhas síndrome de Klinefelter Fenótipo masculino humano anormal em virtude de um cromossomo X extra XXY síndrome de Turner Fenótipo feminino humano anormal produzido pela presença de apenas um cromossomo X XO SINE Ver elemento curto intercalado sintenia Situação na qual os genes estão dispostos em blocos semelhantes em diferentes espécies síntese de DNA translesão Mecanismo de tolerância a dano em eucariotos que utiliza polimerases de bypass para replicar o DNA além de um sítio de dano siRNA Ver pequeno RNA de interferência sistema de reparo de malpareamento Sistema para o reparo de dano ao DNA que já foi replicado sistema de reparo por excisão de nucleotídio NER Via de reparo por excisão que quebra as ligações fosfodiéster em cada lado de uma base danificada removendo aquela base e outras em cada um dos lados seguida pela replicação de reparo sistema seletivo Técnica de seleção mutacional que enriquece a frequência de genótipos específicos normalmente raros por meio do estabelecimento de condições ambientais que previnem o crescimento ou a sobrevivência de outros genótipos sistema SOS de reparo Processo propenso a erro por meio do qual uma polimerase de bypass realiza a replicação após o dano ao DNA em uma forquilha de replicação bloqueada por meio da inserção de bases inespecíficas sítio A Ver sítio de ligação de aminoaciltRNA sítio alostérico Sítio em uma proteína ao qual uma pequena molécula se liga causando uma alteração na conformação da proteína que modifica a atividade de seu sítio ativo sítio apurínico Sítio do DNA que perdeu um resíduo purina sítio ativo Parte de uma proteína que deve ser mantida em uma forma específica para que a proteína seja funcional por exemplo em uma enzima a parte à qual o substrato se liga sítio de inserção λ lambda Sítio no qual o prófago λ se insere no cromossomo de E coli sítio de ligação Região na qual o prófago se integra sítio de ligação de aminoaciltRNA Um sítio no ribossomo que se liga ao aminoaciltRNA de entrada O anticódon de cada aminoaciltRNA de entrada é complementar ao códon do mRNA Também denominado sítio A sítio de peptidil P Sítio no ribossomo ao qual um tRNA com a cadeia polipeptídica crescente está ligado sítio de saída E Sítio no ribossomo no qual o tRNA desacetilado pode ser observado sítio E Ver sítio de saída sítio P Ver sítio de peptidil sítios segregantes S Número de sítios de nucleotídios variáveis ou polimórficos em um conjunto de sequências de DNA homólogas SNP Ver polimorfismo de nucleotídio único SNP comum Polimorfismo de nucleotídio único SNP em relação ao qual o alelo menos comum ocorre a uma frequência de aproximadamente 5 ou mais SNP raro Polimorfismo de nucleotídio único SNP em relação ao qual o alelo menos comum ocorre a uma frequência inferior a 5 snRNA Ver pequeno RNA nuclear sonda Segmento de ácido nucleico marcado que pode ser utilizado para identificar moléculas de DNA específicas que apresentam a sequência complementar normalmente por meio de autorradiografia ou fluorescência Southern blot Transferência de fragmentos de DNA separados por eletroforese de um gel para uma folha absorvente tal como um papel essa folha em seguida é imersa em uma solução que contém uma sonda marcada que se ligará a um fragmento de interesse spliceossomo Complexo de processamento ribonucleoproteico que remove íntrons de mRNA eucarióticos SSB Ver proteína de ligação unifilamentar SSLP Ver polimorfismo de comprimento de sequência simples subfuncionalização Via de duplicação e mutação gênica que produz parálogos com funções complementares substituição gênica Inserção de um transgene geneticamente modificado no lugar de um gene residente com frequência realizada por meio de um crossover duplo substituição não conservativa Substituição de um par de nucleotídios em uma região codificadora de proteína que leva à substituição de um aminoácido por outro que apresenta propriedades químicas diferentes substituição não sinônima Alteração na sequência de DNA codificadora de proteína que causa a alteração de um aminoácido substituição sinônima Ver mutação sinônima subunidade Conforme utilizada no Capítulo 9 um polipeptídio único em uma proteína que contém múltiplos polipeptídios sulco menor Menor dos dois sulcos na duplahélice de DNA sulco principal Maior dos dois sulcos na duplahélice do DNA supercontig Ver arcabouço 2 supressor Mutação secundária que pode cancelar o efeito de uma mutação primária resultando em fenótipo do tipo selvagem tautomerização Ver mudança tautomérica taxa de mutação μ Probabilidade de que uma cópia de um alelo seja alterada para algum outro tipo alélico em uma geração TBP Ver proteína de ligação ao boxe TATA TCNER Ver reparo por excisão de nucleotídio acoplado à transcrição tecnologia do DNA Técnicas coletivas para a obtenção a amplificação e a manipulação de fragmentos de DNA específicos telomerase Enzima que com a utilização de um pequeno RNA especial como molde adiciona unidades repetitivas às extremidades de cromossomos lineares para prevenir o encurtamento após a replicação telômero Ponta ou extremidade de um cromossomo temperatura permissiva Temperatura na qual um alelo mutante sensível à temperatura é expresso do mesmo modo que o alelo do tipo selvagem temperatura restritiva Temperatura na qual uma mutação sensível à temperatura expressa o fenótipo mutante terapia gênica Correção de uma deficiência genética em uma célula por meio da adição de um novo DNA e sua inserção no genoma Diferentes técnicas apresentam o potencial de realizar a terapia gênica apenas em tecidos somáticos ou alternativamente de corrigir a deficiência genética no zigoto assim corrigindo também a linhagem germinativa terminação Último estágio da transcrição resulta na liberação do RNA e da RNA polimerase do molde de DNA término O fim representado pelo último monômero adicionado na síntese unidirecional de um polímero tal como RNA ou um polipeptídio testador Organismo homozigoto em relação a um ou mais alelos recessivos utilizado em um cruzamentoteste teste de Ames Modo de testar se um composto químico é mutagênico por meio da exposição de linhagens bacterianas mutantes especiais ao produto formado pela digestão daquele composto por parte de um extrato hepático e em seguida da contagem do número de colônias Apenas mutações novas presumivelmente produzidas pelo composto podem produzir revertentes para o tipo selvagem capazes de formar colônias teste de complementação Teste para determinar se duas mutações estão em genes diferentes elas se complementam ou no mesmo gene elas não se complementam teste de flutuação Teste utilizado em microrganismos para estabelecer a natureza aleatória da mutação ou para medir as taxas de mutação teste dihíbrido Método para a detecção de interações de proteínas tipicamente realizado em leveduras teste do quiquadrado χ² Teste estatístico utilizado para determinar a probabilidade de obtenção de proporções observadas ao acaso sob uma hipótese específica tétrade 1 Quatro cromátides homólogas em um feixe na primeira prófase meiótica e na metáfase 2 Quatro células haploides que são produtos de uma única meiose tetraploide Célula que apresenta quatro conjuntos cromossômicos um organismo composto pelas referidas células timina T Base pirimidina que pareia com a adenina tipo selvagem Genótipo ou fenótipo que é observado na natureza ou no estoque de laboratório padrão em relação a um determinado organismo Tn Ver transpóson toolkit genética Conjunto de genes responsável pela regulação do desenvolvimento animal amplamente composto por membros de vias de sinalização celular e fatores de transcrição topoisomerase Enzima que consegue cortar e formar novamente as espinhas dorsais de polinucleotídios no DNA para possibilitar que ele assuma uma configuração mais relaxada traço Mais ou menos sinônimo de fenótipo traço categórico Traço em relação ao qual os indivíduos podem ser classificados em grupos discretos ou descontínuos tal como hastes altas versus baixas nas ervilhas de Mendel traço complexo Traço que exibe herança complexa traço contínuo Traço que pode adotar um número possivelmente infinito de estados em uma variação contínua tal como a altura em seres humanos traço de limiar Traço categórico em relação ao qual a expressão dos diferentes estados fenotípicos depende de uma combinação de múltiplos fatores genéticos eou ambientais que posicionam um indivíduo acima ou abaixo de um valor crítico em relação à expressão do traço traço merístico Traço de contagem que adota uma diversidade de valores discretos traço quantitativo Qualquer traço que exibe herança complexa em virtude de ser controlado por uma mistura de fatores genéticos eou ambientais tradução Produção de um polipeptídio mediada por ribossomo e tRNA cuja sequência de aminoácidos é derivada da sequência de códons de uma molécula de mRNA transcrição Síntese de RNA a partir de um molde de DNA transcriptase reversa Enzima que catalisa a síntese de um filamento de DNA a partir de um molde de RNA transcrito Molécula de RNA copiada do filamentomolde de DNA pela RNA polimerase transcrito primário prémRNA RNA eucariótico antes de seu processamento transdução Movimento de genes de um doador bacteriano para um receptor bacteriano com um fago como vetor transdução especializada Situação na qual um fago em particular transduzirá apenas regiões específicas do cromossomo bacteriano transdução generalizada Capacidade de determinados fagos de transduzir qualquer gene no cromossomo bacteriano transformação Modificação direcionada de um genoma por meio da aplicação externa do DNA de uma célula de genótipo diferente transformação dupla Transformação simultânea por dois marcadores doadores diferentes transgene Gene que foi modificado por meio de técnicas de DNA recombinante aplicadas externamente e reintroduzido no genoma por meio de transformação da linhagem germinativa transição Tipo de substituição de par de nucleotídios no qual uma purina substitui outra purina ou no qual uma pirimidina substitui outra pirimidina por exemplo GC para AT transição alostérica Alteração da conformação de uma proteína em outra translocação Realocação de um segmento cromossômico para uma posição diferente no genoma transmissão horizontal Herança do DNA de outro membro da mesma geração transmissão vertical Herança do DNA de um membro de uma geração anterior transpor Moverse de um local no genoma para outro dizse de um elemento genético móvel transposase Enzima codificada por elementos de transposição que são submetidos à transposição conservativa transposição Processo por meio do qual elementos genéticos móveis se movimentam de um local no genoma para outro transposição conservativa Mecanismo de transposição que movimenta um elemento móvel até uma nova localização no genoma na medida em que ele é removido de sua localização anterior transposição replicativa Mecanismo de transposição que gera um novo elemento de inserção integrado em algum outro local no genoma ao mesmo tempo que deixa o elemento original no seu sítio de inserção original transpóson Tn Parte móvel do DNA que é flanqueada por sequências repetidas terminais e que tipicamente contém genes que codificam funções de transposição Os transpósons bacterianos podem ser simples ou compostos transpóson composto Tipo de elemento de transposição bacteriano que contém uma diversidade de genes que estão localizados entre dois elementos de sequência de inserção IS quase idênticos transpóson de DNA Ver elemento DNA transpóson simples Tipo de elemento de transposição bacteriano que contém uma diversidade de genes que estão localizados entre sequências repetidas curtas invertidas transversão Tipo de substituição de par de nucleotídios no qual uma pirimidina substitui uma purina ou viceversa por exemplo GC para TA triagem Procedimento de mutagênese no qual essencialmente toda a progênie que sofreu mutação é recuperada e avaliada individualmente em relação ao fenótipo mutante com frequência o fenótipo desejado é marcado de alguma maneira para possibilitar a sua detecção trinca Três pares de nucleotídios que compõem um códon triploide Célula que apresenta três conjuntos cromossômicos ou um organismo composto por tais células trissômico Basicamente um diploide com um cromossomo extra de um tipo que produz um número de cromossomos do tipo 2n 1 trivalente Referese ao arranjo de pareamento meiótico de três homólogos em um triploide ou trissômico tRNA RNA transportador ou de transferência Classe de pequenas moléculas de RNA que carregam aminoácidos específicos para o ribossomo durante a tradução um aminoácido é inserido na cadeia polipeptídica crescente quando o anticódon do tRNA correspondente pareia com um códon no mRNA que está sendo traduzido tRNA carregado Molécula de RNA transportador com um aminoácido ligado à sua extremidade 3 Também denominado aminoaciltRNA U Ver uracila uridina um Ver unidade de mapa UAS Ver sequência de ativação upstream ubiquitina Proteína que quando unida como uma cadeia multicópias a outra proteína marca essa proteína para a degradação por uma protease denominada proteassomo 26S A adição de resíduos de ubiquitina únicos a uma proteína pode alterar as interações proteínaproteína como no caso de PCNA e polimerases de bypass ubiquitinização Processo de adição de cadeias de ubiquitina a uma proteínaalvo para a degradação unidade de mapa um Distância entre dois pares de genes ligados na qual 1 dos produtos da meiose é recombinante uma unidade de distância em um mapa de ligação unidade de mapa genético um Distância no mapa cromossômico que corresponde à frequência de recombinantes de 1 univalente Cromossomo meiótico não pareado único conforme observado com frequência em trissômicos e triploides upstream Referese a uma sequência de DNA ou RNA localizada no lado 5 de um ponto de referência uracila U Base pirimidina no RNA no lugar da timina observada no DNA uridina U Nucleosídio que apresenta uracila como sua base UTR Ver região 3 não traduzida região 5 não traduzida valor adaptativo absoluto Número de progênie que um indivíduo apresenta valor adaptativo relativo Medida da adaptabilidade de um indivíduo ou um genótipo em relação a algum outro indivíduo ou genótipo normalmente o indivíduo ou genótipo mais adaptado na população Valor C Conteúdo de DNA de um genoma haploide valor produtivo Parte do desvio de um indivíduo da média da população que ocorre em virtude de efeitos aditivos e que é transmitida para a sua progênie variação genética aditiva Parte da variância genética em relação a um traço em uma população que é transmitida de modo previsível dos genitores para a progênie variação no número de cópias CNV Variação de um grande segmento de DNA entre cromossomos homólogos causada por diferenças no número de cópias em tandem de um gene único ou de múltiplos genes variância Medida estatística utilizada para mensurar o quanto os valores de traço dos indivíduos se desviam da média da população variância ambiental Parte da variação fenotípica entre os indivíduos em uma população que ocorre em virtude dos diferentes ambientes que os indivíduos vivenciaram variância genética Parte da variação fenotípica entre indivíduos em uma população que ocorre em virtude das diferenças genéticas entre os indivíduos variegação por efeito de posição PEV Variegação causada pela inativação de um gene em algumas células por meio de sua justaposição anormal com a heterocromatina vetor Ver vetor de clonagem vetor de clonagem Na clonagem o plasmídio ou cromossomo de fago utilizado para carrear o segmento de DNA clonado vigilância do genoma Coleção de mecanismos que reconhece e destrói ácidos nucleicos invasores ou transpósons ativos Ver também crRNA e piRNA vigor híbrido Situação na qual a F1 é maior ou mais saudável do que as suas duas linhagens parentais puras diferentes vírus Partícula composta por ácido nucleico e proteína que precisa infectar uma célula viva para replicar e se reproduzir VNTR Ver número variável de repetições em tandem XP Ver xeroderma pigmentoso xeroderma pigmentoso XP Distúrbio causado por mutações no sistema de reparo por excisão de nucleotídio acoplado à transcrição que leva ao frequente desenvolvimento de cânceres de pele zigoto Célula formada pela fusão de um ovócito e um espermatozoide a célula diploide única que se dividirá mitoticamente para criar um organismo diploide diferenciado Esta seção inclui respostas selecionadas dos Problemas Básicos e Problemas Desafiadores de todos os capítulos com exceção do Capítulo 1 As respostas dos problemas do Capítulo 1 não estão incluídas aqui pois são questões de discussão Capítulo 2 15 A PFGE separa as moléculas de DNA pelo tamanho Quando o DNA é cuidadosamente isolado de Neurospora que apresenta sete cromossomos diferentes devem ser produzidas sete bandas com a utilização dessa técnica De modo semelhante a ervilha apresenta sete cromossomos diferentes e produzirá sete bandas os cromossomos homólogos migrarão em conjunto como uma banda única 18 A funçãochave da mitose é gerar duas célulasfilhas geneticamente idênticas à célula parental original 22 Na medida em que as células se dividem por mitose cada cromossomo é composto por cromátidesirmãs idênticas que são separadas para formar células filhas geneticamente idênticas Embora a segunda divisão da meiose aparente ser um processo semelhante as cromátidesirmãs provavelmente serão diferentes uma da outra A recombinação nos estágios meióticos mais iniciais apresentará regiões de DNA permutadas entre os cromossomosirmãos e não irmãos de tal modo que as duas célulasfilhas dessa divisão tipicamente não são geneticamente idênticas 26 Sim Metade de nossa constituição é derivada de cada genitor metade da constituição genética de cada genitor é derivada de metade de cada um de seus genitores etc 30 d Sinapse pareamento cromossômico 35 A proporção da progênie é de aproximadamente 31 indicando cruzamento clássico entre heterozigotos Tendo em vista que a coloração preta B é dominante em relação à branca b Genitores Bb Bb Progênie 3 pretas1 branca 1 BB2 Bb1 bb 39 O fato de que aproximadamente metade da progênie F1 é de mutantes sugere que a mutação que resulta em três cotilédones é dominante e que o mutante original era heterozigoto Se C Alelo mutante e c Alelo do tipo selvagem o cruzamento é como segue P Cc cc F1 Cc três cotilédones cc dois cotilédones 44p o filho apresenta galactosemia p John é Gg p Martha é Gg p ambos os genitores transmitiram g para o filho 23 14 14 248 124 50a O distúrbio aparenta ser dominante tendo em vista que todos os indivíduos afetados apresentam um genitor afetado Se o traço fosse recessivo então I1 II 2 III1 e III8 deveriam todos ser portadores heterozigotos em relação ao alelo raro b Com a presunção de dominância os genótipos são I dd Dd II Dd dd Dd dd III dd Dd dd Dd dd dd Dd dd IV Dd dd Dd dd dd dd dd Dd dd c A probabilidade de um filho afetado Dd é igual a 12 e a probabilidade de um não afetado dd é igual a 12 Portanto a chance de ter quatro filhos não afetados tendo em vista que cada filho é um evento independente é de 12 12 12 12 116 56 a Os filhos do sexo masculino herdam o cromossomo X de suas mães A mãe apresenta os lóbulos das orelhas livres o filho apresenta os lóbulos das orelhas presos Se o alelo em relação aos lóbulos das orelhas livres for dominante e o alelo em relação aos presos for recessivo então a mãe poderá ser heterozigota em relação a esse traço e o gene pode ser ligado ao X b Não é possível a partir dos dados fornecidos decidir qual alelo é dominante Se os lóbulos das orelhas presos representarem traço dominante então o pai seria heterozigoto e o filho apresentaria uma chance de 50 de herdar o alelo dominante dos lóbulos presos Se os lóbulos das orelhas presos forem traço recessivo então o traço poderia ser autossômico ou ligado ao X mas em qualquer caso a mãe seria heterozigota 60 Estabeleça que H Hipofosfatemia e h Normal O cruzamento é HY hh produzindo Hh mulheres e hY homens A resposta é 0 65 a XCXc XcXc bp daltônica p homem 12 12 14 c As meninas serão 1 normal XCXc1 daltônica XcXc d O cruzamento é XCXc XcY produzindo 1 normal1 daltônico para ambos os sexos 73 a O heredograma sugere que o alelo que causa cabelos ruivos é recessivo tendo em vista que a maior parte dos indivíduos ruivos descendem de genitores sem esse traço b A observação das pessoas ao nosso redor faz com que o alelo pareça um pouco raro 77 Observe que apenas os homens são afetados e que em todos os casos com exceção de um o traço pode ser acompanhado pelo lado feminino Entretanto existe o exemplo de um homem afetado que apresenta filhos afetados Se o traço for ligado ao X a esposa desse homem deve ser portadora Dependendo de quão raro esse traço é na população geral isso pode ser improvável sugerindo que o distúrbio é causado por um alelo autossômico dominante com expressão limitada aos homens Capítulo 3 13 O genótipo das célulasfilhas será idêntico àquele da célula original f Aa Bb 18 A mitose produz célulasfilhas que apresentam o mesmo genótipo da célula original Aa Bb Cc 21 Seus filhos precisarão herdar o cromossomo 4 que contém o satélite probabilidade 12 o cromossomo 7 de coloração anormal probabilidade 12 e o cromossomo Y probabilidade 12 Para herdar todos os três a probabilidade é de 12 12 12 18 26 Com a presunção de segregação independente e relações de dominância e recessividade simples de todos os genes o número de classes genotípicas esperadas a partir da autofecundação de uma planta heterozigota em relação a n pares de genes é 3n e o número de classes fenotípicas esperadas é 2n 29 a e b O cruzamento 2 indica que roxo G é dominante em relação a verde g e o cruzamento 1 indica que cut P é dominante em relação a potato p Cruzamento 1 Gg Pp gg Pp Existem 3 cut1 potato e 1 roxo1 verde Cruzamento 2 Gg Pg Gg pp Existem 3 roxos1 verde e 1 cut1 potato Cruzamento 3 GG Pp gg Pp Não existem verdes e existem 3 cut1 potato Cruzamento 4 Gg PP gg pp Não existem potato e existe 1 roxo1 verde Cruzamento 5 Gg pp gg Pp Existe 1 cut1 potato e existe 1 roxo1 verde 34 Os cruzamentos são Cruzamento 1 fêmea intermitente macho do tipo selvagem toda a progênie intermitente Cruzamento 2 fêmea do tipo selvagem macho intermitente toda a progênie do tipo selvagem O mtDNA é herdado apenas da fêmea em Neurospora 40 a Deve haver nove classes correspondentes a 0 1 2 3 4 5 6 7 e 8 doses b Deve haver 13 classes correspondentes a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 e 12 doses 49 a e b Inicie com quaisquer duas das três linhagens e realize o seu cruzamento Se por exemplo você iniciar com aa BB CC AA bb CC toda progênie será Aa Bb CC O cruzamento de duas delas produzirá 9 A B CC 3 aa B CC 3 A bb CC 1 aa bb CC O genótipo aa bb CC apresenta dois dos genes em um estado homozigoto recessivo e é observado em 116 da descendência Se tal genótipo fosse cruzado com AA BB cc toda a progênie seria Aa Bb Cc O cruzamento de dois deles ou a autofecundação levaria a uma proporção de 279993331 e 164 da progênie seria o desejado aa bb cc Existem diversos caminhos diferentes para a obtenção de aa bb cc mas o apresentado aqui requer apenas quatro cruzamentos 56 a Estabeleça que B Braquidáctilo b Normal T Degustador e t Não degustador Os genótipos do casal são Bb Tt em relação ao homem e bb Tt em relação à mulher b Para que todos os quatro filhos sejam braquidáctilos p 124 116 c Para que nenhum dos quatro filhos seja braquidáctilo p 124 116 d Para que todos sejam degustadores p 344 81256 e Para que todos sejam não degustadores p 144 1256 f Para que todos sejam degustadores braquidáctilos p 12 344 814096 g A probabilidade de não ser um degustador braquidáctilo é de 1 a probabilidade de ser um degustador braquidáctilo ou 1 12 34 58 A probabilidade de que todos os quatro filhos sejam degustadores não braquidáctilos é de 584 6254096 h A probabilidade de que no mínimo um seja um degustador braquidáctilo é de 1 a probabilidade de nenhum ser um degustador braquidáctilo ou 1 584 Capítulo 4 13 P A dA d a Da D F1 A da D F2 1 A dA d fenótipo A d 2 A da D fenótipo A D 1 a Da D fenótipo a D 16 Tendo em vista que apenas os tipos parentais são recuperados os dois genes devem estar fortemente ligados e a recombinação deve ser muito rara Saber quanto da progênie estamos observando forneceria uma indicação do quão próximos os genes estão 21 a Os três genes estão ligados b Uma comparação dos parentais mais frequentes com os crossing overs duplos menos frequentes revela que a ordem dos genes é v p b Existiam 2200 recombinantes entre v e p e 1500 entre p e b A fórmula geral para unidades de mapa é um 100 número de recombinantesnúmero total de progênie Portanto as unidades de mapa entre v e p 100 220010000 22 um e as unidades de mapa entre p e b 100 150010000 15 um O mapa é c I 1 crossing overs duplos observadoscrossing overs duplos esperados 1 132022 015 10000 1 04 06 27 a b Sim c Dominante d Conforme desenhado o heredograma indica uma ligação Se não estiverem ligados esperamos que os fenótipos dos 10 filhos devam apresentar uma proporção de 1111 de Rh E Rh e Rh E e Rh e Existem realmente cinco Rh e quatro Rh E e um Rh e Se estiverem ligados esse último fenótipo representaria um recombinante e a distância entre os dois genes seria de 100 110 10 um Entretanto não existem dados suficientes para amparar fortemente tal conclusão 33 a Se os genes não estiverem ligados o cruzamento é P hyghyg herher hyghyg herher F1 hyghyg herher hyghyg herher F2 916 hyg her 316 hyg herher 316 hyghyg her 116 hyghyg herher Assim esperase que apenas 116 ou 625 das sementes germine b e c Não Mais do que o dobro das sementes esperadas germinou assim presumese que os genes estão ligados O cruzamento então é P hyg herhyg her hyg herhyg her F1 hyg herhyg her hyg herhyg her F2 13 hyg herhyg her Tendo em vista que essa classe representa a combinação de dois cromossomos parentais ela é igual a p hyg her p hyg her parentais² 013 e parentais 072 Assim recombinantes 1 072 028 Portanto um cruzamentoteste de hyg hyghyg her dará 36 hyg herhyg her 36 hyg herhyg her 14 hyg herhyg her 14 hyg herhyg her e 36 da progênie crescerá a classe hyg herhyg her 37 A fórmula para este problema é fi emmii na qual m 2 e i 0 1 ou 2 a f0 e2200 e2 0135 ou 135 b f1 e2211 e22 027 ou 27 c f2 e2222 e22 027 ou 27 43 a O cruzamento foi pro his que torna a primeira classe de tétrades DNP 6 ditipos não parentais a segunda classe de tétrades T 82 tetratipos e a terceira classe de tétrades DP 112 ditipos parentais Quando DP DNP você sabe que os dois genes estão ligados b A distância de mapa pode ser calculada utilizandose a fórmula FR DNP 12T 100 Nesse caso a frequência de DNP é 6200 ou 3 e a frequência de T é 82200 ou 41 A distância de mapa entre esses dois loci portanto é de 235 cM c Para corrigir em relação a múltiplos crossing overs pode ser utilizada a fórmula de Perkins Portanto a distância de mapa T 6 DNP 50 ou 041 018 50 295 cM 47 a O cruzamento é WeFWeF wEfwEf e a F1 é WeFwEf A progênie ww ee ff originada a partir de um cruzamentoteste dessa F1 deve ter herdado um dos cromossomos recombinantes de crossover duplo w e f Com a presunção de ausência de interferência a porcentagem esperada de crossing overs duplos é de 8 24 192 metade da qual é 096 b A obtenção de uma progênie ww ee ff a partir de uma autofecundação dessa F1 requer a herança independente de dois cromossomos w e f duplamente recombinantes As suas chances de ocorrência com base na resposta da parte a deste problema são de 096 096 0009 53 A resposta curta é que os resultados nos informam pouco a respeito da ligação Embora o número de recombinantes 3 seja inferior ao número de parentais 5 não se pode ter confiança no fato de que a FR é 50 O principal problema é que o tamanho da amostra é pequeno e assim apenas um indivíduo a mais ou a menos em uma classe genotípica pode afetar dramaticamente as proporções Até mesmo o teste de quiquadrado não é confiável nos referidos pequenos tamanhos de amostra Provavelmente é seguro dizer que não existe uma ligação forte tendo em vista que diversos recombinantes foram observados em uma amostra relativamente pequena Entretanto não se pode distinguir entre a ligação mais distante e a distribuição independente É necessário um tamanho de amostra maior 58 Os dados fornecidos em relação a cada um dos cruzamentosteste de três pontos podem ser utilizados para determinar a ordem dos genes quando se percebe que as classes recombinantes mais raras são o resultado de eventos de crossing overs duplo Uma comparação desses cromossomos com os tipos parentais revela que os alelos que foram permutados representam o gene no meio Por exemplo no conjunto de dados 1 os fenótipos mais comuns e a b c representam as combinações de alelos parentais Uma comparação desses fenótipos com os fenótipos mais raros desse conjunto de dados b c e a indica que o gene a é recombinante e que deve estar no meio A ordem dos genes é b a c Em relação ao conjunto de dados 2 b c e a os parentais devem ser comparados com e a b c os recombinantes mais raros para indicar que o gene a está no meio A ordem dos genes é b a c Em relação ao conjunto de dados 3 compare b e a c com a b e c que fornece a ordem de genes b a c Em relação ao conjunto de dados 4 compare c e a b com e a b c que fornece a ordem de genes a c b Em relação ao conjunto de dados 5 compare e a b c com c e a b que fornece a ordem de genes a c b 64 a O cruzamento 1 é reduzido para P AA BB DD aa bb dd F1 Aa Bb Dd aa bb dd A progênie do cruzamentoteste indica que esses três genes estão ligados CO Crossing over DCO Crossing over duplo Progênie do A B D 316 parental cruzamentoteste a b d 314 parental A B d 31 CO BD a b D 39 CO BD A b d 130 CO AB a B D 140 CO AB A b D 17 DCO a B d 13 DCO AB 100 130 140 17 131000 30 um BD 100 31 39 17 131000 10 um O cruzamento 2 é reduzido a P AA CC EE aa cc ee F1 Aa Cc Ee aa cc ee A progênie do cruzamentoteste indica que esses três genes estão ligados Progênie do A C E 243 parental cruzamentoteste a c e 237 parental A c e 62 CO AC a C E 58 CO AC A C e 155 CO CE a c E 165 CO CE a C e 46 DCO A c E 34 DCO AB 100 62 58 46 341000 20 um BD 100 155 165 46 341000 40 um O mapa que acomoda todos os dados é b Interferência I 1 DCO observadoDCO esperado Em relação ao cruzamento 1 I 1 30030 010 1000 1 1 0 nenhuma interferência Em relação ao cruzamento 2 I 1 80020 040 1000 1 1 0 nenhuma interferência 69 a e b Os dados amparam a segregação independente de dois genes denomineos arg1 e arg2 O cruzamento se torna arg1 arg2 arg1 arg2 e as tétrades resultantes são 40 DP 31 T 22 DNP arg1 arg2 arg1 arg2 arg1 arg2 arg1 arg2 arg1 arg2 arg1 arg2 arg1 arg2 arg1 arg2 arg1 arg2 arg1 arg2 arg1 arg2 arg1 arg2 Tendo em vista que DP DNP os genes não estão ligados Capítulo 5 19 Uma linhagem Hfr apresenta o fator de fertilidade F integrado no cromossomo Uma linhagem F apresenta o fator de fertilidade livre no citoplasma Uma linhagem F apresenta ausência do fator de fertilidade 23 Embora os experimentos de cruzamento interrompido forneçam a ordem dos genes ela será apenas em relação a marcadores razoavelmente distantes Portanto a mutação não pode ser localizada com precisão por meio dessa técnica A transdução generalizada fornecerá informações a respeito de marcadores muito próximos o que a torna uma escolha inadequada para os experimentos iniciais em virtude da quantidade maciça de triagens que precisariam ser realizadas Em conjunto as duas técnicas possibilitam primeiramente a localização do mutante cruzamento interrompido e em segundo lugar a determinação precisa da localização do mutante transdução generalizada na região geral 28 A melhor explicação é que o fator F integrado de Hfr forma uma alça fora do cromossomo bacteriano anormalmente e agora é um F que contém o gene pro Esse F é rapidamente transferido para as células F convertendoas em pro e F 33 O número esperado de recombinantes duplos é 001 0002 100000 2 Interferência 1 DCO observadoDCO esperado 1 52 15 Por definição a interferência é negativa 37 a Esse processo aparenta ser uma transdução especializada Ela é caracterizada pela transdução de marcadores específicos com base na posição da integração do profago Apenas aqueles genes próximos do sítio de integração são possíveis candidatos em relação à incorporação errônea em partículas de fagos que em seguida entregam esse DNA para as bactérias receptoras b Os únicos meios que ampararam o crescimento de colônias foram aqueles com ausência de cisteína ou leucina Esses meios são selecionados para transdutantes cys ou leu e indicam que o profago está localizado na região cys leu 42 Não Seria esperado que os loci ligados de modo próximo fossem cotransduzidos quanto maior a frequência de cotransdução mais próximos estão os loci Tendo em vista que apenas 1 de 858 metE era também pyrD os genes não estão ligados de modo próximo A única metE pyrD poderia ser o resultado de cotransdução poderia ser uma mutação espontânea de pyrD para pyrD ou o resultado da coinfecção por dois fagos transduzidos em separado 47 a Para determinar quais genes estão próximos compare as frequências de transformantes duplos O teste par a par fornece valores baixos sempre que B está incluído mas taxas razoavelmente altas quando qualquer outro fármaco que não B é incluído Esse achado sugere que o gene para resistência a B não está próximo dos outros três genes b Para determinar a ordem relativa dos genes para resistência a A C e D compare as frequências de transformantes duplos e triplos A frequência de resistência a AC é aproximadamente a mesma da resistência a ACD o que sugere fortemente que D está no meio Adicionalmente a frequência de corresistência a AD é mais alta do que a AC sugerindo que o gene para resistência a A está mais próximo de D do que de C e que a frequência de CD é mais alta do que de AC sugerindo que C está mais próximo de D do que de A 51 Para isolar as partículas de transdução especializadas do fago ϕ80 que carreavam lac os pesquisadores precisariam lisogenizar a linhagem com ϕ80 induzir o fago com UV e em seguida utilizar esses lisados para transduzir uma linhagem Lac para Lac As colônias Lac em seguida teriam sido utilizadas para produzir um novo lisado o qual teria sido altamente enriquecido com o fago transdutor lac Capítulo 6 13 Com a presunção de homozigose em relação ao gene normal o cruzamento é AA bb aa BB Os filhos seriam normais Aa Bb 16 a Vermelho b Roxo c 9 M1 M2 roxo 3 m1m1 M2 azul 3 M1 m2m2 vermelho 1 m1m1 m2m2 branco d Os alelos mutantes não produzem enzima funcional Entretanto enzima funcional suficiente pode ser produzida pelo único alelo do tipo selvagem de cada gene para sintetizar níveis normais de pigmento 20 a O cruzamento original foi um cruzamento dihíbrido Tanto oval quanto roxo devem representar um fenótipo de dominância incompleta b Um cruzamento longo roxo oval roxo é como segue P LL RR LL RR RR longo vermelho F1 LL RR longo roxo RR longo branco RR oval vermelho LL RR oval roxo RR oval branco 23 Genitores Filhos a AB O B b A O A c A AB AB d O O O 27 a Esperase que a proporção sexual seja de 11 b A genitora era heterozigota em relação a um alelo letal recessivo ligado ao X que resultaria em 50 menos machos do que fêmeas c Metade da progênie do sexo feminino deve ser heterozigota em relação ao alelo letal e metade deve ser homozigota em relação ao alelo não letal Cruze individualmente as fêmeas da F1 e determine a proporção sexual de sua progênie 30 a As mutações estão em dois genes diferentes tendo em vista que o heterocário é prototrófico as duas mutações complementaram uma à outra b leu1 leu2 e leu1 leu2 c Com a segregação independente espere leu1 leu2 leu1 leu2 leu1 leu2 leu1 leu2 34 a P Aa frizzle Aa frizzle F1 1 AA normal2 Aa frizzle1 aa lanosa b Se AA normal for cruzada com aa lanosa toda a descendência será Aa frizzle 36 É possível a produção de descendência preta a partir de dois genitores albinos recessivos puros se o albinismo resultar de mutações em dois genes diferentes Se o cruzamento for designado AA bb aa BB toda a descendência será Aa Bb e apresentará um fenótipo preto em virtude da complementação 40 O genitor roxo pode ser Aa bb ou aa Bb para essa resposta Presuma que o genitor roxo seja Aa bb O genitor azul deve ser Aa Bb 43 O cruzamento é cinza amarela ou A R A rr A progênie F1 é amarela preta cinza branca Em relação à progênie branca ambos os genitores devem carrear um alelo r e um a Agora o cruzamento pode ser reescrito como Aa Rr Aa rr 46 O cão marrom original é ww bb e o cão branco original é WW BB A progênie F1 é Ww Bb e a progênie F2 é 9 W B branca 3 ww B preta 3 W bb branca 1 ww bb marrom 50 Heredogramas como esse são bastante comuns Eles indicam ausência de penetrância em virtude de epistasia ou de efeitos ambientais O indivíduo A deve apresentar o gene autossômico dominante 52 a Estabeleça que WO Oval WS Falciforme e WR Redonda Os três cruzamentos são Cruzamento 1 WSWS WRY WSWR e WSY Cruzamento 2 WSWS WSY WSWR e WRY Cruzamento 3 WSWS WOY WOWS e WSY b WOWS WRY WOWR fêmea oval WSWR fêmea falciforme WOY macho oval WSY macho falciforme 55 a Os genótipos são P BB ii bb II F1 Bb Ii sem cerdas F2 9 B I sem cerdas 3 B ii retas 3 bb I sem cerdas 1 bb ii inclinadas b Os genótipos são Bb Ii Bb ii 58 Existe um total de 159 indivíduos na progênie que devem estar distribuídos em uma proporção de 9331 se os dois genes estiverem se distribuindo independentemente Você pode observar que Observadas Esperadas 88 P Q 90 32 P qq 30 25 pp Q 30 14 pp qq 10 61 a Está ocorrendo complementação por meio da qual um produto proveniente de uma linhagem se difunde para outra linhagem e possibilita o crescimento da segunda linhagem b Para que ocorra complementação a linhagem em crescimento deve apresentar um bloqueio que está presente mais inicialmente na via metabólica do que o bloqueio na linhagem a partir do qual a linhagem em crescimento está obtendo o produto para o crescimento c Os dados sugerem que a via metabólica é trpE trpD trpB d Sem triptofano não haveria crescimento e as células não teriam vivido durante tempo suficiente para gerar um produto que conseguisse se difundir 63 a A melhor explicação é que a síndrome de Marfan é herdada como um traço autossômico dominante b O heredograma demonstra tanto pleiotropia múltiplos traços afetados quanto expressividade variável grau variável de expressão do fenótipo c A pleiotropia indica que o produto gênico é necessário em uma diversidade de tecidos órgãos ou processos diferentes Quando o gene é mutante todos os tecidos que necessitam do produto do gene serão afetados A expressividade variável de um fenótipo em relação a um determinado genótipo indica a modificação por um ou mais outros genes influência aleatória ou efeitos ambientais 66 a Esse tipo de interação gênica é denominado epistasia O fenótipo de ee é epistático para os fenótipos de B ou bb b Os genótipos inferidos são como segue I 1 Bb Ee 2 Bb Ee II 1 bb Ee 2 Bb Ee 3 ee 4 bb E 5 Bb Ee 6 bb Ee III 1 Bb E 2 b ee 3 bb E 4 Bb E 5 bb E 6 Bb E 7 b ee 69 a Uma série alélica múltipla foi detectada superdupla única dupla b Embora a explicação em relação à parte a racionalize todos os cruzamentos ela não leva em consideração a esterilidade feminina ou a origem da planta superdupla a partir de uma variedade com flores duplas 71 a Um cruzamento trihíbrido forneceria uma proporção de 631 Portanto existem três loci R em segregação nesse cruzamento b P R1R1 R2R2 R3R3 r1r1 r2r2 r3r3 F1 R1r1 R2r2 R3r3 F2 27 R1 R2 R3 vermelho 9 R1 R2 r3r3 vermelho 9 R1 r2r2 R3 vermelho 9 r1r1 R2 R3 vermelho 3 R1 r2r2 r3r3 vermelho 3 r1r1 R2 r3r3 vermelho 3 r1r1 r2r2 R3 vermelho 1 r1r1 r2r2 r3r3 branco c 1 Para obter uma proporção de 11 apenas um dos genes pode ser heterozigoto Um cruzamento representativo é R1r1 r2r2 r3r3 r1r1 r2r2 r3r3 2 Para obter uma proporção de 3 vermelhos1 branco dois alelos devem estar segregando e não podem estar no mesmo gene Um cruzamento representativo é R1r1 R2r2 r3r3 r1r1 r2r2 r3r3 3 Para obter uma proporção de 7 vermelhos1 branco três alelos devem estar segregando e não podem estar no mesmo gene O cruzamento é R1r1 R2r2 R3r3 r1r1 r2r2 r3r3 d A fórmula é 1 14n em que n Número de loci que estão segregando nos cruzamentos representativos na parte c 75 a e b A epistasia está implicada e o genótipo branco homozigoto recessivo aparenta bloquear a produção da cor por parte de um segundo gene Presuma as relações de dominância a seguir vermelha laranja amarela Estabeleça que os alelos sejam designados como segue vermelha AR laranja AO amarela AY Os cruzamentos 1 a 3 agora se tornam P AOAO AYAY ARAR AOAO ARAR AYAY F1 AOAY ARAO ARAY F2 3 AO1 AYAY 3 AR1 AOAO 3 AR1 AYAY Cruzamento 4 para realizar esse cruzamento você deve adicionar um segundo gene Você também deve reescrever os cruzamentos 1 a 3 para incluir o segundo gene Estabeleça que B possibilite a expressão da cor e que b bloqueie a sua expressão produzindo branco Os primeiros três cruzamentos se tornam P AOAO BB AYAY BB ARAR BB AOAO BB ARAR BB AYAY BB F1 AOAY BB ARAO BB ARAY BB F2 3 AO BB1 AYAY BB 3 AR BB1 AOAO BB 3 AR BB1 AYAY BB O quarto cruzamento é P ARAR BB ARAR bb F1 ARAR Bb F2 3 ARAR B1 ARAR bb Cruzamento 5 para realizar esse cruzamento observe que não existe laranja Portanto os dois genitores devem carrear os alelos em relação à vermelha e à amarela e a expressão da vermelha deve estar bloqueada P AYAY BB ARAR bb F1 ARAY Bb F2 9 AR B vermelha 3 AR bb branca 3 AYAY B amarela 1 AYAY bb branca Cruzamento 6 esse cruzamento é idêntico ao cruzamento 5 com a exceção de que a laranja substitui a amarela P AOAO BB ARAR bb F1 ARAO Bb F2 9 AR B vermelha 3 AR bb branca 3 AOAO B laranja 1 AOAO bb branca Cruzamento 7 nesse cruzamento a amarela é suprimida por bb P ARAR BB AYAY bb F1 ARAY Bb F2 9 AR B vermelha 3 AR bb branca 3 AYAY B amarela 1 AYAY bb branca 77 a O intercruzamento de todas as linhagens mutantes que apresentam um fenótipo recessivo comum é a base do teste de complementação Esse teste é projetado para identificar o número de genes diferentes que conseguem mutar para um fenótipo em particular Nesse problema se a progênie de um determinado cruzamento ainda expressar o fenótipo oscilante as mutações falham em se complementar e são consideradas alelos do mesmo gene se a progênie for do tipo selvagem as mutações se complementam e as duas linhagens terão alelos mutantes de genes separados b Esses dados identificam cinco grupos de complementação genes c mutante 1 a1a1 bb cc dd ee embora apenas os alelos mutantes em geral sejam listados mutante 2 aa b2b2 cc dd ee mutante 5 a5a5 bb cc dd ee híbrido a1a5 bb cc dd ee fenótipo oscilante Conclusão 1 e 5 são ambos mutantes em relação ao gene A O cruzamento relevante aa b2b2 a2a2 b5b5 fornece o híbrido a seguir híbrido aa5 bb2 cc dd ee fenótipo tipo selvagem Conclusão 2 e 5 são mutantes em relação a diferentes genes Capítulo 7 6 A duplahélice do DNA é mantida unida por meio de dois tipos de ligações covalente e de hidrogênio As ligações covalentes são observadas dentro de cada filamento linear e ligam fortemente as bases os açúcares e os grupos fosfato dentro de cada componente e entre os componentes As ligações de hidrogênio são observadas entre os dois filamentos uma ligação de hidrogênio é formada entre uma base em um filamento e uma base no outro filamento em pareamento complementar Essas ligações de hidrogênio são individualmente fracas mas coletivamente são consideravelmente fortes 9 Helicases são enzimas que rompem as ligações de hidrogênio que mantêm os dois filamentos de DNA unidos em uma duplahélice Essa quebra é necessária para síntese de RNA e de DNA Topoisomerases são enzimas que criam e relaxam a superhelicoidização na duplahélice de DNA A própria super helicoidização é um resultado da torção da duplahélice de DNA quando os dois filamentos se separam 11 Não A informação do DNA depende de um mecanismo de realização de cópias fiéis As regras estritas da complementaridade asseguram que a replicação e a transcrição sejam reproduzíveis 13 O cromossomo se tornaria irremediavelmente fragmentado 15 b O RNA apresentaria maior probabilidade de conter erros 19 Se o DNA for bifilamentar A T G C e A T C G 100 Se T 15 então C 100 1522 35 20 Se o DNA for bifilamentar G C 24 e A T 26 24 Sim A replicação do DNA também é semiconservativa em eucariotos diploides 26 5CCTTAAGACTAACTACTTACTGGGATC3 28 Sem a telomerase funcional os telômeros seriam encurtados a cada ciclo de replicação levando à eventual perda de informação codificadora essencial e à morte De fato algumas observações atuais indicam que o declínio ou a perda da atividade da telomerase desempenha um papel no mecanismo do envelhecimento em seres humanos 30 As regras de Chargaff são A T e G C Tendo em vista que essas igualdades não são observadas a interpretação mais provável é que o DNA seja unifilamentar O fago primeiramente deveria sintetizar um filamento complementar antes que pudesse começar a realizar múltiplas cópias de si próprio Capítulo 8 11 Em procariotos a tradução inicia na extremidade 5 enquanto a extremidade 3 ainda está sendo sintetizada Em eucariotos o processamento revestimento recomposição está ocorrendo na extremidade 5 enquanto a extremidade 3 ainda está sendo sintetizada 17 Sim Tanto a replicação quanto a transcrição são realizadas por máquinas moleculares grandes e multissubunidades o replissomo e a RNA polimerase II respectivamente e ambas necessitam da atividade de helicase na forquilha da bolha Entretanto a transcrição procede em apenas um sentido e apenas um filamento de DNA é copiado 19 a A sequência original representa as sequências consenso 35 e 10 com o número correto de espaços intercalares de um promotor bacteriano O fator σ como parte da holoenzima RNA polimerase reconhece e se liga a essas sequências b As sequências mutadas transpostas não serão um sítio de ligação para o fator σ A orientação das duas regiões uma em relação à outra não está correta portanto elas não serão reconhecidas como um promotor 24 Íntrons autorremovíveis não são capazes de excisar a si próprios de um transcrito primário sem a necessidade de enzimas adicionais ou de uma fonte de energia Eles são um de muitos exemplos de moléculas de RNA que são catalíticas e em virtude dessa propriedade também são conhecidos como ribozimas Com essa função adicional o RNA é a única molécula biológica conhecida que codifica informação genética e catalisa reações biológicas Em termos mais simples a vida possivelmente teve início com uma molécula ou um grupo de moléculas de RNA que desenvolveram a capacidade de se autorreplicar 29 O RNA bifilamentar composto por um filamento com senso sentido e um filamento antissenso antissentido complementar pode ser utilizado por C elegans e provavelmente por todos os organismos para prevenir seletivamente a síntese do produto gênico codificado uma descoberta pela qual foi concedido o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2006 Esse processo denominado silenciamento gênico bloqueia a síntese da proteína codificada pelo gene endógeno e portanto é equivalente ao nocaute gênico Para testar se um mRNA específico codifica uma proteína embrionária essencial injetase o RNA bifilamentar produzido a partir do mRNA em zigotos ou embriões muito iniciais ativando assim a via do RNAi Os efeitos do nocaute do produto gênico especificado podem então ser acompanhados por meio da observação do que ocorre nesses embriões em comparação aos controles Se a proteína codificada for essencial o desenvolvimento embrionário deverá ser modificado quando o seu gene for silenciado Capítulo 9 13 a e b 5 UUG GGA AGC 3 c e d Com a presunção de que a matriz de leitura inicia na primeira base NH3 Leu Gly Ser COOH Em relação ao filamento inferior o mRNA é 5 GCU UCC CAA 3 e com a presunção de que a matriz de leitura inicia na primeira base a cadeia de aminoácidos correspondente é NH3 Ala Ser Gln COOH 17 Existem três códons em relação à isoleucina 5 AUU 3 5 AUC 3 e 5 AUA 3 Os possíveis anticódons são 3 UAA 5 complementar 3 UAG 5 complementar e 3 UAI 5 oscilante Embora seja complementar 5 UAU 3 também realizaria o pareamento de bases com 5 AUG 3 metionina em virtude da oscilação e portanto não seria uma alternativa aceitável 22 A estrutura quaternária ocorre em virtude de interações das subunidades de uma proteína Nesse exemplo a atividade enzimática que está sendo estudada pode ser aquela de uma proteína composta por duas subunidades diferentes Os polipeptídios das subunidades são codificados por genes separados e não ligados 26 Não A enzima pode necessitar de modificação póstradução para ser ativa As mutações nas enzimas necessárias para essas modificações não seriam mapeadas no gene da isocitrato liase 29 Com a presunção de que todas as três mutações do gene P são mutações sem sentido três possíveis códons de fim diferentes âmbar ocre ou opala podem ser a causa Uma mutação supressora seria específica para um tipo de códon sem sentido Por exemplo os supressores âmbar suprimiriam os mutantes âmbar mas não os opala ou ocre 33 As alterações de aminoácidos únicos podem resultar em alterações no dobramento das proteínas no direcionamento proteico ou em modificações pós tradução Quaisquer dessas alterações dariam origem aos resultados indicados 41 Se o anticódon em uma molécula de tRNA foi alterado por uma mutação até apresentar o comprimento de quatro bases com a quarta base no lado 5 do anticódon ele suprimiria a inserção As alterações no ribossomo também podem induzir o deslocamento da matriz de leitura 42 f d j e c i b h a g Capítulo 10 14 A ligase é uma enzima essencial dentro de todas as células que sela quebras no arcabouço de açúcar e fosfato do DNA Na replicação do DNA a ligase se une aos fragmentos de Okazaki para criar um filamento contínuo e na clonagem ela é utilizada para unir os diversos fragmentos de DNA ao vetor Se ela não fosse adicionada o vetor e o DNA clonado simplesmente desmoronariam 15 Cada ciclo dura 5 minutos e duplica o DNA Em 1 hora haveria 12 ciclos assim o DNA seria amplificado 212 4096 vezes 18 Você poderia isolar o DNA da planta transgênica suspeita e sondar em relação à presença do transgene por meio da hibridização de Southern 22 a O fenótipo transformado será mapeado no mesmo locus Se a substituição do gene ocorreu em virtude de um crossing over duplo as células transformadas não conterão o DNA vetor Se um crossing over único houver ocorrido o vetor inteiro agora será parte do cromossomo linear de Neurospora b O fenótipo transformado será mapeado para um locus diferente daquele do auxotrófico se o gene transformante tiver sido inserido ectopicamente i e em outro local A incorporação ectópica também seria inferida por meio da PCR reversa 23 O tamanho as translocações entre cromossomos conhecidos e a hibridização com sondas de localização conhecida podem todos ser úteis na identificação de qual banda em um gel de campo pulsado corresponde a um cromossomo em particular 33 A região do DNA que codifica a tirosinase no DNA genômico de camundongo normal contém dois sítios de EcoRI Portanto após a digestão com EcoRI três fragmentos de tamanhos diferentes hibridizam com o clone de cDNA Quando o DNA genômico de determinados camundongos albinos está sujeito à análise semelhante nenhum fragmento de DNA contém sequências complementares ao mesmo cDNA Esse resultado indica que esses camundongos apresentam ausência da capacidade de produzir tirosinase tendo em vista que o DNA que codifica a enzima deve ter sido deletado 36 As regiões promotora e de controle do gene de planta de interesse devem ser clonadas e unidas na orientação correta com o gene da glicuronidase que posiciona o gene repórter sob o mesmo controle de transcrição que o gene de interesse O texto descreve a metodologia utilizada para criar plantas transgênicas Transforme as células da planta com o construto do gene repórter e conforme discutido no texto cultiveas até plantas transgênicas O gene da glicuronidase agora será expresso no mesmo padrão de desenvolvimento que o gene de interesse e a sua expressão pode ser facilmente monitorada ban handose a planta em uma solução de XGluc e dosando o produto azul da reação Capítulo 11 9 Mutantes OC são alterações na sequência de DNA do operador que prejudicam a ligação do repressor lac Tendo em vista que um operador controla apenas os genes no mesmo filamento de DNA ele é cis no mesmo filamento 12 Um gene é desligado ou inativado pelo modulador normalmente denominado repressor no controle negativo e o repressor deve ser removido para que ocorra a transcrição Um gene é ligado pelo modulador normalmente denominado ativador no controle positivo e o ativador deve ser adicionado ou convertido em uma forma ativa para que ocorra a transcrição 21 A mutação S é uma alteração em lacI de tal modo que a proteína repressora se liga ao operador independentemente da presença do indutor Em outras palavras ela é uma mutação que inativa o sítio alostérico que se liga ao indutor mas não afeta a capacidade do repressor de se ligar ao sítio operador A dominância da mutação S ocorre em virtude da ligação do repressor mutante até mesmo sob circunstâncias nas quais o repressor normal não se liga ao DNA i e na presença do indutor As mutações reversas constitutivas que mapeiam em lacI são eventos mutacionais que inativam a capacidade desse repressor de se ligar ao operador As mutações reversas constitutivas que mapeiam no operador alteram a sequência do DNA operador de tal modo que ele não possibilitará a ligação a quaisquer moléculas repressoras repressor do tipo selvagem ou mutante 24 Todas as mutações em cI cII e cIII afetariam a lisogenia cI codifica o repressor cII codifica um ativador de PRE e cIII codifica uma proteína que protege cII da degradação Mutações em N um antifinalizador também afetariam a lisogenia tendo em vista que a sua função é necessária para a transcrição dos genes cII e cIII mas também é necessária para os genes que apresentam papéis na lise As mutações no gene que codifica a integrase int também afetariam a capacidade de um fago mutante de lisogenizar Capítulo 12 12 Em geral o estado fundamental de um gene bacteriano é ligado Portanto o início da transcrição é evitado ou reduzido se a ligação da RNA polimerase estiver bloqueada Contrariamente o estado fundamental de eucariotos é desligado Portanto o maquinário de transcrição incluindo a RNA polimerase II e os fatores de transcrição gerais correlatos não consegue se ligar ao promotor na ausência de outras proteínas reguladoras 16 Entre as mutações que poderiam prevenir que uma linhagem de levedura realizasse a alteração de seu tipo reprodutivo estariam as mutações nos genes HO e HMRa O gene HO codifica uma endonuclease que corta o DNA para iniciar a alteração e o locus HMRa contém o cassete de informação genética não expressa para o tipo reprodutivo MATa 19 O termo herança epigenética é utilizado para descrever as alterações herdáveis nas quais a própria sequência de DNA não é alterada Ele pode ser definido operacionalmente como a herança de estados da cromatina de uma geração celular até a próxima O imprinting genômico a inativação do cromossomo X e a variegação por efeito de posição são alguns exemplos 23 Acreditase que a herança da estrutura da cromatina seja responsável pela herança da informação epigenética Essa herança ocorre em virtude da herança do código de histonas e também pode incluir a herança dos padrões de metilação do DNA 36 Um gene não expresso em virtude da alteração da sua sequência de DNA nunca será expresso e será herdado de geração em geração Um gene inativado epigeneticamente ainda pode ser regulado A estrutura da cromatina pode ser alterada no decorrer do ciclo celular por exemplo quando fatores de transcrição modificam o código de histonas 38 A estrutura da cromatina afeta amplamente a expressão gênica Os transgenes inseridos em regiões de eucromatina apresentariam mais probabilidade de serem capazes de expressarse do que aqueles inseridos em regiões de heterocromatina Capítulo 13 12 O gene de regra dos pares primário eve evenskipped seria expresso em sete listras ao longo do eixo AP do blastoderma tardio 15 Se você diagramar esses resultados verificará que a deleção de um gene que atua posteriormente possibilita que os segmentos próximos mais anteriores estendamse em sentido posterior A deleção de um gene anterior não possibilita a extensão do segmento próximo mais posterior em um sentido anterior Os genes gap ativam o Ubx tanto no segmento torácico quanto no abdominal enquanto os genes abdA e AbdB são ativados apenas nos segmentos abdominal intermediário e posterior O funcionamento dos genes abdA e AbdB naqueles segmentos de algum modo evita a expressão de Ubx Entretanto se os genes abdA e AbdB forem deletados Ubx poderá ser expresso nessas regiões 18 a Um gene de regra dos pares b Observe a expressão do mRNA do gene candidato em um padrão repetido de sete listras ao longo do eixo AP do embrião em desenvolvimento c Não Um embrião mutante em relação ao gene gap Krüppel não teria muitos segmentos anteriores Esse efeito seria epistático sobre a expressão de um gene de regra dos pares 21 a O homeodomínio é um domínio proteico conservado que contém 60 aminoácidos observado em um número significativo de fatores de transcrição Qualquer proteína que contém um homeodomínio funcional é quase certamente um fator de transcrição de ligação a uma sequência específica de DNA b O gene eyeless denominado por seu fenótipo mutante regula o desenvolvimento dos olhos em Drosophila Você esperaria que ele fosse expresso apenas naquelas células que darão origem aos olhos Para testar essa previsão a localização da expressão do mRNA de eyeless deve ser visualizada utilizandose hibridização in situ e a da proteína Eyeless utilizandose métodos imunológicos Por meio da manipulação genética o gene eyeless pode ser expresso em tecidos nos quais ele não é ordinariamente expresso Por exemplo quando o eyeless é ativado em células que se destinam a formar as pernas olhos são formados nas pernas c Experimentos transgênicos demonstraram que o gene Small eye de camundongo e o gene eyeless de Drosophila são tão semelhantes que o gene de camundongos pode substituir o eyeless quando introduzido em Drosophila Assim como na resposta da parte b quando o gene Small eye de camundongo é expresso em Drosophila até mesmo em células que se destinam a formar pernas olhos são formados nas pernas Entretanto os olhos não são olhos de camundongo tendo em vista que o Small eye e o eyeless atuam como interruptores máster que ligam toda a cascata de genes necessária para a formação do olho nesse caso o conjunto de Drosophila para formar um olho de Drosophila 25 A proteína GLP1 está localizada nas duas células anteriores do embrião de quatro células de C elegans por meio da repressão de sua tradução nas duas células posteriores A repressão da tradução de GLP1 requer a região de controle espacial 3 UTR SCR A deleção da SCR possibilitará a expressão de glp1 tanto em células anteriores quanto posteriores Tanto em mutantes heterozigotos quanto em homozigotos você esperaria a expressão da proteína GLP1 em todas as células Capítulo 14 11 Tendo em vista que as bactérias apresentam genomas pequenos aproximadamente 3 Mb e essencialmente nenhuma sequência repetida a abordagem de shotgun do genoma inteiro seria utilizada 13 Um arcabouço também é denominado um supercontig Um contig é uma sequência de leituras sobrepostas montadas em uma unidade e um arcabouço é uma coleção de contigs unidos 18 Sim O operador é o local no qual o repressor se liga funcionalmente por meio de interações da sequência de DNA com a proteína repressora 23 Você pode determinar se o clone de cDNA é ou não um monstro por meio do alinhamento da sequência de cDNA com a sequência genômica Estão disponíveis programas de computador para a realização dos referidos alinhamentos A sequência é derivada de dois sítios diferentes O cDNA mapeia em uma região do tamanho do gene no genoma ou em duas regiões diferentes Os íntrons podem complicar a questão 27 a Tendo em vista que o código triplo é redundante podem ocorrer alterações na sequência de nucleotídios do DNA especialmente naqueles nucleotídios que codificam a terceira posição de um códon sem alteração da proteína codificada b Podese esperar que as sequências proteicas evoluam e divirjam mais lentamente do que os genes que as codificam 33 A montagem correta de regiões grandes e quase idênticas é problemática com qualquer método de sequenciamento genômico Entretanto o método shotgun de genoma inteiro é menos eficaz para encontrar essas regiões do que o método com base em clone Esse método também apresenta a vantagem adicional do fácil acesso aos clones suspeitos para a análise adicional 36 Quinze por cento são funções gênicas essenciais tais como as enzimas necessárias para a replicação do DNA ou a síntese de proteínas Vinte e cinco por cento são auxotróficos enzimas necessárias para a síntese de aminoácidos ou para o metabolismo de açúcares etc Sessenta por cento são redundantes ou vias não testadas genes para histonas tubulina RNA ribossômicos etc estão presentes em múltiplas cópias a levedura pode necessitar de muitos genes apenas em situações únicas especiais ou de outros modos que não são necessários para a vida em laboratório Capítulo 15 9 Boeke Fink e seus colaboradores demonstraram que a transposição do elemento Ty em leveduras ocorre por meio de um RNA intermediário Eles construíram um plasmídio com a utilização de um elemento Ty no qual inseriram não apenas um promotor que pode ser ativado por galactose mas também um íntron na região codificadora do elemento Ty Primeiramente a frequência de transposição foi amplamente aumentada por meio da adição de galactose que indicou que um aumento na transcrição e na produção de RNA estava correlacionado às taxas de transposição Mais importante após a transposição eles observaram que o DNA de Ty recémtransposto não apresentava sequência do íntron Tendo em vista que a remoção de íntron ocorre apenas durante o processamento do RNA deve ter havido um RNA intermediário no evento de transposição 13 Alguns elementos de transposição desenvolveram estratégias para se inserir em abrigos seguros regiões do genoma onde eles causarão danos mínimos Os abrigos seguros incluem genes duplicados tais como genes de tRNA ou rRNA e outros elementos de transposição Os abrigos seguros em genomas bacterianos podem ser sequências muito específicas entre os genes ou genes de rRNA repetidos 27 O corte desencontrado levará a uma duplicação de nove pares de bases no sítioalvo que flanqueia o transpóson inserido 30 Não seria uma surpresa observar um elemento SINE no íntron de um gene em vez de em um éxon O processamento do prémRNA removeria o elemento de transposição como parte do íntron e a tradução da enzima FB não seria efetuada Capítulo 16 8 Você precisa conhecer a matriz de leitura da possível mensagem 11 Com a presunção de substituições de pares de bases únicas CGG pode ser alterado para CGU CGA CGC ou AGG e ainda codificará a arginina 14 A lista de observações a seguir argumenta que o câncer é uma doença genética 1 Determinados cânceres são herdados como traços mendelianos simples altamente penetrantes 2 A maior parte dos agentes carcinogênicos também é mutagênica 3 Diversos oncogenes foram isolados a partir de vírus tumorais 4 Uma diversidade de genes que levam à suscetibilidade a tipos de câncer em particular foi mapeada isolada e estudada 5 Foram isolados oncogenes dominantes de células tumorais 6 Determinados cânceres estão altamente correlacionados com rearranjos cromossômicos específicos 17 O T malpareado seria corrigido para C e o ACG resultante após a transcrição seria 5 UGC 3 e codificaria a cisteína Ou se o outro filamento fosse corrigido ATG seria transcrito para 5 UAC 3 e codificaria a tirosina 24 Estão disponíveis muitos sistemas de reparo reversão direta reparo por excisão reparo acoplado à transcrição e junção de extremidades não homólogas 25 Sim ele é mutagênico Ele causará transições de CG para TA 35 a Uma ausência de revertentes sugere uma deleção ou uma inversão no gene b Para compreender esses dados relembre que metade da progênie deve ser originária do genitor do tipo selvagem Prototrófico A tendo em vista que 100 da progênie é prototrófica deve ter ocorrido uma reversão no sítio mutante original Prototrófico B metade da progênie é de prototróficos parentais e dos prototróficos remanescentes 28 são resultantes de nova mutação Observe que 28 são aproximadamente iguais aos 22 de auxotróficos A sugestão é de que tenha ocorrido uma mutação supressora não ligada produzindo a segregação independente com o mutante nic2 Prototrófico C existem 496 prototróficos revertentes os outros 500 são prototróficos parentais e quatro auxotróficos Isso sugere que uma mutação supressora tenha acontecido em um sítio muito próximo da mutação original e raramente tenha sido separada da mutação original por meio de recombinação 100 4 21000 08 um 38 O xeroderma pigmentoso é um distúrbio genético heterogêneo causado por mutações em qualquer um de diversos genes que participam no processo de NER reparo por excisão de nucleotídio Assim como atesta a descoberta de outra proteína na via NHEJ por meio de pesquisas na linhagem celular 2BN esse paciente pode apresentar uma mutação em um gene ainda desconhecido que codifique uma proteína necessária para NER Capítulo 17 21 MM N OO seria classificado como 2n 1 MM NN OO seria classificado como 2n e MMM NN PP seria classificado como 2n 1 24 Haveria um possível quadrivalente 27 Sete cromossomos 29 As células destinadas a se tornar grãos de pólen podem ser induzidas por meio de tratamento a frio para o crescimento como embrioides Esses embrioides em seguida podem ser cultivados em ágar para formar mudas monoploides 31 Sim 34 Não 36 Um fragmento acêntrico não pode ser alinhado ou movimentado na meiose ou na mitose e consequentemente é perdido 39 Deleções muito grandes tendem a ser letais provavelmente em virtude do desequilíbrio genômico ou da exposição de genes letais recessivos Portanto a alça de pareamento muito grande observada mais provavelmente é originária de uma inversão heterozigota 41 A síndrome de Williams é o resultado de uma deleção da região 7q1123 do cromossomo 7 A síndrome cri du chat é o resultado de uma deleção de uma parte significativa do braço curto do cromossomo 5 especificamente das bandas 5p152 e 5p153 Tanto a síndrome de Turner XO quanto a síndrome de Down trissomia do cromossomo 21 resultam da não disjunção meiótica O termo síndrome é utilizado para descrever um conjunto de fenótipos com frequência complexos e variados que em geral estão presentes juntos 46 A ordem é b a c e d f Alelo Banda b 1 a 2 c 3 e 4 d 5 f 6 47 Os dados sugerem que um dos pontos de quebra da inversão ou ambos estão localizados em um gene essencial causando uma mutação letal recessiva 50 a Quando cruzados com fêmeas amarelas os resultados seriam XeYe machos cinza XeXe fêmeas amarelas b Se o alelo e fosse translocado para um autossomo a progênie seria como segue em que A indica autossomo P AeA XeY AA XeXe F1 AeA XeXe fêmea cinza AeA XeY macho cinza AA XeXe fêmea amarela AA XeY macho amarelo 52 Síndrome de Klinefelter homem XXY Síndrome de Down trissomia do cromossomo 21 Síndrome de Turner mulher XO 56 a Se um hexaploide fosse cruzado com um tetraploide o resultado seria um pentaploide b O cruzamento de AA com aaaa para obter Aaa c O modo mais fácil é expor as células da planta Aa à colchicina durante uma divisão celular o que resultará em uma duplicação dos cromossomos para produzir AAaa d Cruze um hexaploide aaaaaa com um diploide AA para obter Aaaa 58 a A proporção de plantas com folhas normais e com folhas potato será de 51 b Se o gene não estiver no cromossomo 6 deverá haver uma proporção de 11 de plantas com folhas normais e com folhas potato 62 a A planta aberrante é semiestéril o que sugere uma inversão Tendo em vista que as frequências de recombinação df e yp na planta aberrante são normais a inversão deve implicar b a x b A obtenção de progênie recombinante quando houve uma inversão requer a ocorrência de um crossing over duplo dentro da região invertida ou de crossovers únicos entre f e a inversão que ocorreu em algum lugar entre f e b 64 A planta original é homozigota em relação a uma translocação entre os cromossomos 1 e 5 com os pontos de quebra muito próximos dos genes P e S Em virtude da ligação próxima foi observada uma proporção que sugere um cruzamento monohíbrido em vez de um cruzamento dihíbrido tanto com autopolinização quanto com cruzamentoteste Todos os gametas são férteis em virtude da homozigose planta original P Sp s testador p sp s Progênie F1 heterozigota em relação à translocação O modo mais fácil de testar essa hipótese é observar os cromossomos dos heterozigotos na meiose I 70 Os genitores originais devem ter apresentado a constituição cromossômica a seguir G hirsutum 26 grandes 26 pequenos G thurberi 26 pequenos G herbaceum 26 grandes O G hirsutum é um poliploide derivado de um cruzamento entre as duas espécies do Velho Mundo o que pode ser facilmente verificado por meio da observação dos cromossomos 72 a Perda de um X no feto em desenvolvimento após o estágio de duas células b Não disjunção que leva à síndrome de Klinefelter XXY seguida por um evento de não disjunção em uma célula envolvendo o cromossomo Y após o estágio de duas células resultando em XX e XXYY c Não disjunção do X no estágio de uma célula d Zigotos XX e XY fundidos a partir de fertilizações em separado de dois ovócitos ou de um ovócito e um corpúsculo polar por um espermatozoide contendo um X e outro contendo um Y e Não disjunção do X no estágio de duas células ou posteriormente 75 a Cada mutante é cruzado com o tipo selvagem ou m m As tétrades óctades resultantes demonstram segregação de 11 indicando que cada mutante é o resultado de uma mutação em um único gene b Os resultados do cruzamento das duas linhagens mutantes indicam que ambas as linhagens são mutantes em relação ao mesmo gene m1 m2 ou que elas são mutantes em genes diferentes porém estreitamente ligados m1 m2 m1 m2 c e d Tendo em vista que a progênie fenotipicamente preta pode resultar de não disjunção observe que nos casos C e D preto aparece em conjunto com esporos abortados o mutante 1 e o mutante 2 provavelmente são mutantes em genes diferentes porém estreitamente ligados Portanto o cruzamento é m1 m2 m1 m2 O caso A é uma tétrade DNP e seria o resultado de um crossing over duplo de quatro filamentos m1 m2 preto m1 m2 preto m1 m2 castanhoclaro m1 m2 castanhoclaro O caso B é um tetratipo e seria o resultado de um crossover único entre um dos genes e o centrômero m1 m2 preto m1 m2 castanhoclaro m1 m2 castanhoclaro m1 m2 castanhoclaro O caso C é o resultado da não disjunção na meiose I m1 m2 m1 m2 preto m1 m2 m1 m2 preto nenhum cromossomo aborto nenhum cromossomo aborto O caso D é o resultado de recombinação entre um dos genes e o centrômero seguida por não disjunção na meiose II Por exemplo m1 m2 m1 m2 preto nenhum cromossomo aborto m1 m2 castanhoclaro m1 m2 castanhoclaro Capítulo 18 7 A frequência de um alelo em uma população pode ser alterada por meio de seleção natural mutação migração e deriva genética 11 A frequência de b é q 02 e a frequência de B é p 1 q 08 A frequência de BB é p² 064 e a frequência de Bb é 2 pq 032 14 a p 05 05 10 05 10025 10 05 10 025 07 054 b 0008 13 002 002² 00102 21 probabilidade de fixação probabilidade de perda 1 26 a FI ³ 1 316 b ³ 1 FA assim FA 0 29 pA pa pB pb 05 Em equilíbrio a frequência de indivíduos duplamente heterozigotos é 2 pApa 2 pBpb 025 31 Antes da migração qA 01 e qB 03 nas duas populações Tendo em vista que as duas populações são iguais em número imediatamente após a migração qAB qA qB 01 03 02 No novo equilíbrio a frequência de homens afetados é q 02 e então a frequência de mulheres afetadas é q² 02² 004 O daltonismo é um traço ligado ao X 33 q² 0002 q 0045 Presumindo que F nos fundadores seja 00 F50 0222 ver Quadro 183 faa q² pqF 0012 37 4 50000 3 1084 50000 3 108 1 596 103 41 a 447 103 Custo genético sq² 05 447 103² 15 b 632 103 Custo genético sq² 05 632 103² 2 105 c Custo genético sq² 03 577 103² 105 Capítulo 19 7 Muitos traços variam mais ou menos continuamente ao longo de uma ampla gama Por exemplo a altura o peso a forma a cor a taxa reprodutiva a atividade metabólica etc variam quantitativa não qualitativamente A variação contínua com frequência pode ser representada por uma curva sinusoidal na qual o fenótipo médio é mais comum do que os extremos A variação descontínua descreve os fenótipos discretos e facilmente classificáveis da genética mendeliana simples o formato da semente os mutantes auxotróficos a anemia falciforme etc Esses traços com frequência demonstram uma relação simples entre o genótipo e o fenótipo embora traços descontínuos tais como afetado versus não afetado em relação a uma condição de doença também possam exibir herança complexa 9 A média é de 47 cerdas a variância é de 111 cerdas² e o desvio padrão é de 105 cerda 12 O cultivador não pode ter certeza de que essa população responderá ao cruzamento seletivo muito embora a herdabilidade no sentido amplo seja alta A herdabilidade no sentido amplo é a proporção da variância genética em relação à fenotípica A variância genética é a soma das variâncias aditiva e de dominância Apenas a variância aditiva é transmitida do genitor para a descendência A variância de dominância não é transmitida do genitor para a descendência Se toda a variância genética na população for de dominância então o cruzamento seletivo não será bemsucedido 18 par 98 1082 96 07 mm par 079 07 055 mm off 96 055 1015 mm 23 Ve 35 g² Vg na população B é 210 35 175 g² H² 175210 083 Capítulo 20 9 Os três princípios são 1 os indivíduos de qualquer população variam uns dos outros 2 a descendência se assemelha aos seus genitores mais do que se assemelha aos indivíduos não relacionados e 3 alguns tipos obtêm mais sucesso na sobrevivência e na reprodução do que outros tipos em um determinado ambiente 11 A taxa relativa de substituições sinônimas e não sinônimas não seria mais alta do que a esperada em um pseudogene de globina tendo em vista que um pseudogene é inativo e não apresenta função a ser preservada 13 Uma população não será diferenciada de outras por meio de autocruzamento local se μ 1N e assim N 1μ N 105 17 Quando alterações de aminoácidos forem direcionadas pela seleção adaptativa positiva deve haver um excesso de alterações não sinônimas O gene MC1R receptor de melanocortina 1 codifica uma proteínachave que controla a quantidade de melanina na pele e nos cabelos As populações asiáticas e europeias aparentam ter vivenciado a seleção adaptativa positiva em relação à pele menos pigmentada em relação às suas correspondentes africanas 19 Sequências não codificadoras Uma importante restrição na evolução gênica compreende os possíveis efeitos pleiotrópicos de mutações em regiões codificadoras Esses efeitos podem ser contornados por mutações em sequências reguladoras que desempenham um papel importante na evolução da forma corporal As alterações nas sequências não codificadoras proporcionam um mecanismo para alterar um aspecto da expressão gênica enquanto preservam o papel das proteínas pleiotrópicas em outros processos essenciais do desenvolvimento 21 a A mutação HbS surgiu independentemente em cinco haplótipos diferentes em regiões diferentes e em seguida aumentou até uma alta frequência c Duas linhagens independentes de bacteriófagos desenvolveram a capacidade de se reproduzir em altas temperaturas em um novo hospedeiro 23 Um novo gene originado por duplicação pode 1 desenvolver uma nova função 2 tornarse inativado ou 3 realizar parte da função original compartilhando a função total com o gene original 25 Para sítios polimórficos com uma espécie estabeleça que não sinônimo a e sinônimo b Para os sítios polimórficos entre as espécies estabeleça que não sinônimo c e sinônimo d Se a divergência ocorrer em virtude da evolução neutra então ab cd Se a divergência ocorrer em virtude da seleção então ab cd Entretanto nesse exemplo ab 2050 cd 218 que não corresponde a nenhuma expectativa Tendo em vista que a proporção de polimorfismos não sinônimos e sinônimos ab é relativamente alta o gene que está sendo estudado pode codificar uma proteína tolerante de diferenças relativamente menores entre espécies As diferenças relativamente menores entre espécies podem sugerir que a especiação foi um evento recente de modo que novos polimorfismos foram fixados em uma espécie que não são variantes na outra Mapa da Genética Índice de Organismosmodelo