Variabilidade Genética do Aruanã na Amazônia Central - Estudo Genético

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS PRÓREITORIA DE PESQUISA E PÓSGRADUAÇÃO DEPARTAMENTO DE APOIO À PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO ARUANÃ Osteoglossum bicirrhosum NA AMAZÔNIA CENTRAL Bolsista Patrícia da Costa Gomes CNPq Manaus AM 2009 PATRÍCIA DA COSTA GOMES AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO ARUANÃ Osteoglossum bicirrhosum NA AMAZÔNIA CENTRAL Manaus AM 2009 Orientadora Prof Dra Izeni Pires Farias Coorientadora MSc Maria da Conceição F Santos LISTA DE FIGURAS Figura 01 Quantificação da extração de DNA total de aruanã O bicirrhosum em gel de agarose 08 282 283 284 285 286 12 Figura 02 Quantificação de DNA de aruanã O bicirrhosum amplificado utilizando primer ObF01 via PCR em gel de agarose 1 De acordo com a corrida deste gel o tamanho deste DNA amplificado pode variar de 266272 pb pares de bases 12 Figura 03 Genotipagem de dois indivíduos de aruanã O bicirrhosum das populações da localidade de Janauacá 13 LISTA DE TABELAS Tabela 01 Parâmetros populacionais por loci por população 14 Tabela 02 Parâmetros de diversidade genética e Equilíbrio de HardyWeinberg 15 Tabela 03 Resultado da análise de variância molecular 16 Tabela 04 Valores de Nm abaixo e FST acima 16 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO6 2 OBJETIVOS9 21 Objetivo Geral9 22 Objetivos Específicos9 3 MATERIAL E MÉTODOS10 31 Locais de Coleta10 32 Extração de DNA das Amostras10 33 Genotipagens das Amostras de Aruanã10 34 Análises das Genotipagens11 35 Análises dos Dados11 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO12 41 Locais de Coleta Extração de DNA e Amplificação das Amostras12 42 Análises das Genotipagens13 43 Análises dos Dados13 44 Análise da Variância Molecular AMOVA15 5 CONCLUSÃO17 6 REFERÊNCIAS18 1 INTRODUÇÃO A ordem dos Osteoglossiformes está representada por peixes predominantemente de água doce que ocorrem na Índia e África região IndoAustraliana América do Sul e América do Norte GREENWOOD et al 1966 Esta ordem está representada pela família Osteoglossidae ARAGÃO 1984 A família Osteoglossidae abriga a subfamília Osteoglossinae que está representada por um único gênero Osteoglossum que é compreendido pelo aruanã branco espécie Osteoglossum bicirrhosum CUVIER 1829 e aruanã preto Osteoglossum ferreirai Kanazawa 1966 O O bicirrhosum encontrase amplamente distribuído na Amazônia e Guianas CALA 1973 e segundo Schuwartz e Levy 1968 a sua distribuição pode estar relacionada com a qualidade da água O aruanã preto O ferreirai é encontrado em afluentes de águas ácidas do Rio Negro e o aruanã branco O bicirrhosum nos afluentes de águas alcalinas Por pertencerem à família Osteoglossidae os aruanãs são considerados como o único exemplo vivo dessa família primitiva A espécie O bicirrhosum possui características morfológicas e fisiológicas peculiares como corpo alongado e comprimido lateralmente completamente coberto com escamas tem uma boca grande e inclinada com dois barbelos A sua cor é cinza metálico com uma camada azul amarelo nadadeira anal vermelha e língua óssea GREENWWOOD et al 1966 Apresenta respiração aérea e um comportamento conhecido como mouth brooding nos quais ovos e alevinos são carregados na boca do macho NELSON 1994 O desenvolvimento larval dos filhotes de aruanã ocorre dentro da cavidade bucal do macho RABELLONETO 1999 Estas características atrativas do aruanã branco induzem a sua exploração por dois ramos de atividades econômicas da pesca para a alimentação e a comercialização como peixes ornamentais O pico anual da pesca do aruanã ocorre no período de seca pois os peixes tornamse mais concentrados e vulneráveis à pesca nos lagos visto que esta espécie possui um comportamento sedentário VIANA 2004 e possuem uma tendência a baixo fluxo gênico entre sistemas e formação de subgrupos populacionais BARTHEM e FABRÉ 2004 Logo vem sofrendo uma pesca excessiva pois como peixe ornamental apenas os alevinos ainda com saco vitelino são comercializados E no que diz respeito ao cuidado parental é feito exclusivamente pelos machos que incubam os filhotes na boca mouth brooder em português significa boca chocadeira Portanto quando ocorre a captura dos alevinos também são retirados da população os machos adultos uma vez que eles realizam cuidado parental RABELLO 1999 Devido a este grande interesse ornamental e alimentício é preciso conhecer a ecologia fisiologia e principalmente a estrutura genética das populações de aruanãs para que esta espécie não seja listada no CITES Convenção sobre o Comércio Internacional das Espécies da Fauna e da Flora Selvagens Ameaçadas de Extinção como ocorreu com a espécie asiática Scleropage formosus peixe dragão que faz parte da lista de 2006 dos seres vivos ameaçados de extinção Lista Vermelha da IUCN O aruanã asiático Scleropage formosus é uma das espécies mais caras no mercado de peixe ornamental O número de indivíduos no ambiente natural tem sido reduzido rapidamente devido à sobrepesca por isso a espécie tem sido listada como uma das ameaçadas pelo CITES desde 1975 YUE et al 2003 A extenuação da variabilidade genética dentro e entre populações pode ser um componente decisivo para a sobrevivência de uma espécie a médio e longo prazo A habilidade de uma espécie de se adaptar às constantes modificações do meio ambiente depende em grande parte do nível de diversidade genética encontrada na mesma FRANKHAM et al 2002 O estudo da variabilidade genética populacional e específica têm sido possível devido ao desenvolvimento de vários marcadores moleculares O uso das técnicas moleculares na pesquisa pesqueira tem aumentado nos últimos anos devido ao desenvolvimento das técnicas e também a conscientização do valor dos dados genéticos WARD e GRAVE 1995 Marcadores moleculares como os microssatélites são ferramentas seguras para se estimar parâmetros genéticos fundamentais ou características importantes para a conservação tais como estimativas do tamanho efetivo da população e a presença de populações que sofreram bottlenecks ou seja recente redução no tamanho populacional HEDRICK 2004 Segundo Shlotterer e Pemberton 1998 as sequências denominadas DNA microssatélite têm unidades de repetição de 1 a 6 nucleotídeos de comprimento repetidas em tandem Essas sequências são geralmente encontradas nas regiões não codificadoras do genoma sendo considerados marcadores neutros GOLDSTEIN e SHLÖTTERER 1999 Estes marcadores também chamados de simple sequence repeats ou SSR são hipervariáveis codominantes e revelam variações no comprimento entre os alelos PARKER et al 1998 SUNNUCKS 2000 Estes marcadores têm se mostrado informativos para responder uma série de questões na área de genética de populações e da conservação O uso das técnicas moleculares é importante para a genética da conservação sendo útil para populações exploradas comercialmente e para espécies ameaçadas de extinção tendo como função estudar a biodiversidade molecular de populações naturais das espécies sob o impacto antropogênico FRANKHAM et al 2002 como no caso dos aruanãs Considerando a importância econômica do aruanã O bicirrhosum e suas características comportamentais tais como baixa capacidade migratória sedentários desova em lagos e cuidado parental esta espécie tornase frágil e de alto risco com relação aos efeitos antropogênicos devendo sua biologia ser mais bem estudada para que tais espécies possam ser conservadas e manejadas de forma sustentável BARTHEM e FABRÉ 2004 Outra questão relevante é a unidade populacional explorada pela pesca A maioria das espécies importantes para a pesca comercial é razoavelmente bem conhecida mas pouco se sabe se os indivíduos destas estão agrupados numa única população ou estoque pesqueiro ou em várias populações BALEY e PETRERE 1989 BATISTA 2001 Desta forma tornase indispensável o conhecimento da genética populacional dos aruanãs através de análises moleculares para a contribuição da preservação e uso sustentável deste recurso na Amazônia Central 2 OBJETIVOS 21 Objetivo Geral Caracterizar a variabilidade genética de populações naturais de Osteoglossum bicirrhosum da Amazônia Central 22 Objetivos Específicos Caracterizar e avaliar a variabilidade genética das populações de aruanãs oriundos de rios da Amazônia Central por meio de marcadores nucleares de microssatélites Identificar a existência de populações geneticamente diferenciadas 3 MATERIAL E MÉTODOS 31 Locais de Coleta Foram utilizadas amostras de indivíduos provenientes de quatro localidades da bacia Amazônica Coari Janauacá Santarém e Tefé Essas amostras foram obtidas a partir de idas a campo coletando diretamente da pesca artesanal e em mercadosfeiras dos municípios ou comunidades arredores De cada exemplar foi coletado a nadadeira ou pedaço de tecido muscular e em seguida preservado em álcool 100 Foram utilizados 52 indivíduos e todas as amostras já se encontram depositadas na Coleção de Tecidos de Genética Animal CTGAICBUFAM 32 Extrações de DNA das Amostras O DNA de todas as amostras foi extraído utilizando o método FenolClorofórmio SAMBROOK et al 1989 Ao término da extração foi realizada a quantificação do DNA em gel de agarose 08 onde é feita a verificação da concentração de DNA obtida de cada amostra comparandoas com amostras de DNA com concentrações já conhecidas 33 Genotipagem das Amostras de Aruanã O DNA das amostras foi amplificado nas regiões ricas em microssatélites utilizando seis pares de primers ObA08 ObC04 ObF01 ObF06 Ob F09 e ObH06 desenvolvidos para aruanã O bicirrhosum SILVA et al 2009 As genotipagens foram feitas utilizando o método econômico de Schuelke 2000 que usa juntamente com o primer específico da região microssatélite uma seqüência chamada de cauda M13 marcado com fluorescência que possibilita a leitura no seqüenciador automático MegaBACETM 1000 GE Healthcare As condições das genotipagens foram realizadas em um volume final de 10 μL contendo 125 μL de tampão de PCR 10X 125 μL de dNTPs 25 mM 15 μL de MgCl2 25 mM 05 μL de primer forward 25 pmol 10 μL de primer reverse 25 pmol 05 μL de primer M13 marcado com FAM 25 pmol 04 μL de Taq DNA polimerase 1Uml e 1 μL de DNA 10 ngμL No termociclador as condições utilizadas foram 94 ºC por 1 minuto para a desnaturação inicial seguido por 35 ciclos de 94 ºC para a desnaturação por 20 segundos 60 e 65º C por 20 segundos para anelamento dos primers e 72º C por 30 segundos para extensão seguidas por outros 20 ciclos para anelamento dos primers M13 com as seguintes condições 94 C por 20 segundos para a desnaturação 53 C por 20 segundos que é a temperatura de anelamento do primer M13 72 C por 30 segundos para a extensão e uma extensão final de 30 minutos a 72 C sendo então mantidos a 10 ºC Em seguida os produtos de amplificação foram observados em gel de agarose a 1 corados com brometo de etídio e fotodocumentados Amostras que apresentaram intensidade de banda muito forte passaram por testes de diluições que variaram de 1 μL de PCR para 20 μL de água até 1 μL PCR para 150 μL de água 119 149 169 199 e 1149 Os fragmentos amplificados do PCR foram genotipados no seqüenciador automático MegaBACETM 1000 GE Healthcare usando protocolo recomendado pelo fabricante 34 Análises das Genotipagens A análise das genotipagens foi realizada no programa Fragment Profiler onde foi possível observar o tamanho dos alelos para cada indivíduo comparado ao padrão ET 400 ROX GE Healthcare 35 Análises dos Dados Para a análise dos dados foi utilizado o programa ARLEQUIN v31 EXCOFFIER ET al 2006 que calcula o número de alelos a heterozigosidade observada e heterozigosidade esperada de cada loco e o teste do equilíbrio de HardyWeinberg As medidas de estruturação genética foram realizadas utilizandose a Análise de Variância Molecular AMOVA Os coeficientes de endogamia FIS e de diferenciação genética FST e número de migrantes por geração Nm foram determinados utilizandose o programa ARLEQUIN v311 EXCOFFIER et al 2006 A significância dos métodos foi avaliada por testes de permutação 1000 réplicas e todos os níveis de significância para os testes envolvendo comparações múltiplas foram ajustados seguindo a correção de Bonferroni RICE 1989 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 41 Locais de Coleta Extração de DNA e Amplificação das Amostras Um total de 52 amostras de tecidos de aruanã foram coletadas abrangendo quatro localidadesrios de Coari Janauacá Santarém e Tefé De acordo com a quantificação do DNA Algumas das amostras foram diluídas por apresentarem grande concentração de DNA Figura 01 Segundo o teste de diluição onde a mais satisfatória foi a de 1uL de DNA para 99uL de água Figura 01 Quantificação da extração de DNA total de aruanã O bicirrhosum em gel de agarose 08 282 283 284 285 286 A amostra 01 da esquerda para a direita corresponde a um marcador padrão de DNA de peso molecular de 50 ng Após a quantificação o DNA foi utilizado para amplificação in vitro através da Reação de Polimerase em Cadeia PCR A quantificação dos produtos da PCR foram comparados com o marcador de 100 pb observado em gel de agorose 1 e corado com brometo de etídio onde foram visualizadas bandas intensas que depois foram diluídas Através dos testes a diluição de 1µL de DNA amplificado para 49µL de água foi a mais satisfatória para que os produtos amplificados fossem genotipados Figura 02 01 Figura 02 Quantificação de DNA de aruanã O bicirrhosum amplificado utilizando primer ObF01 via PCR em gel de agarose 1 De acordo com a corrida deste gel o tamanho deste DNA amplificado pode variar de 266272 pb pares de bases De acordo com o marcador de 100 pb as bandas dos produtos amplificados 0102 03 04 05 correram entre 200 e 300 pb 42 Análises das Genotipagens No programa Fragment Profiler foi possível a observação do tamanho dos alelos de cada indivíduo comparado ao padrão ET 400 ROX GE Healthcare Figura 03 No Fragment Profiler já é possível observar se o indivíduo é heterozigoto ou homozigoto de acordo com a presença dos alelos Figura 03 Genotipagem de dois indivíduos de aruanã O bicirrhosum da localidade de Janauacá D09 indivíduo homozigoto e D11 indivíduo heterozigoto com primer ObF09 analisada no programa Fragment Profiler 43 Análises dos Dados Foram analisados 6 loci de microssatélites que apresentaram um total de trinta e três alelos diferentes para as 4 populações estudadas O número de alelos por loco para todas as populações variou de 3 loco F06 a 9 loco F09 Entretanto apenas para população de Januacá o loco F01 mostrouse monomórfico Tabela 01 Dentro dos 52 indivíduos analisados o número de heterozigotos encontrados nas 4 populações Tefé Coari Janauacá e Santarém foram de 14 6 7 e 11 respectivamente enquanto que o número de homozigotos encontrados nessas populações foram de 4 6 4 e 0 respectivamente Os menores valores da heterozigosidade observada HO foram encontrados nas populações de Coari e Janauacá 0000 enquanto que o maior valor foi encontrado na população de Santarém 08181 A heterozigosidade esperada HE variou de 00625 a 05844 nas populações de Tefé e Santarém respectivamente Tabela 01 De acordo com os pressupostos de HardyWeinberg FRANKHAM et al 2008 a frequência dos alelos está dentro do esperado para a maioria dos loci estudados A08 C04 F06 F09 e H06 sugerindo uma boa qualidade desses loci como marcadores moleculares Somente nos loci F01 e F06 considerandose todas as localidades em conjunto foi observado valor de P significativo mesmo após a correção de Bonferroni P 0008 Tabela 01 Tabela 01 Parâmetros populacionais por loci por população A Numero de alelos HO Heterozigosidade Observada HE Heterozigosidade Esperada Valores significantes após a correção de Bonferroni P0008 A08 C04 F01 F06 F09 H06 Tefé A 3 4 3 2 5 2 HO 012500 052941 011765 006250 038889 029412 HE 023185 047950 011586 006250 039048 048663 P 019117 100000 100000 100000 062456 013783 Coari A 2 2 3 2 4 5 HO 016667 027273 000000 000000 033333 033333 HE 015942 036797 030435 018947 052536 052899 P 100000 043894 000234 005206 007685 004181 Janauacá A 3 3 1 2 4 2 HO 018182 027273 000000 036364 018182 HE 017749 043723 017316 056710 041558 P 100000 010787 004789 004841 010839 Santarém A 3 4 3 2 4 3 HO 009091 036364 009091 010000 060000 081818 HE 025541 045455 039394 010000 055263 058442 P 004596 061280 000764 100000 030762 010839 Todos A 6 5 5 3 9 5 HO 014000 038000 005882 004255 041176 039216 HE 020566 043879 020287 012263 049369 049796 P 003229 061756 000000 000038 003513 024378 Analisandose os parâmetros de diversidade genética verificouse que o menor valor está na população de Janauacá 0295094 que também apresenta a menor média no número de alelos 23 A maior variação gênica foi encontrada na população de Santarém 0422078 que juntamente com a população de Tefé apresentaram uma média de 31 de número de alelos para todos os loci estudados Tabela 02 Os resultados da heterogeneidade nos parâmetros de diversidade genética bem como os valores baixos para a diversidade gênica e heterozigosidades observados na tabela 02 devem ser vistos com cautela ao compararmos estes com valores observados em outros grupos de peixes AMADO 2008 LEÃO 2009 Os valores observados para o aruanã branco podem ser considerados muito baixos Somente com um trabalho incluindo um maior número de indivíduos de outras regiões e aumentando o número de loci poderemos sugerir se estes valores baixos podem estar associados a pesca predatória ou se é o reflexo da biologia da espécie Tabela 02 Parâmetros de diversidade genética e Equilíbrio de HardyWeinberg N número amostral Populações N Média Diversidade Gênica Média Nº de Alelos Média da HO HE Tefé 18 03904 04165 31 02529 02944 Coari 12 03795 02633 30 01843 03459 Janauacá 11 02950 01981 23 02000 03541 Santarém 11 04220 02865 31 03439 03901 Total 52 03488 02264 29 02375 03269 44 Análise da Variância Molecular AMOVA Os resultados da AMOVA global mostraram que a maior variação genética de aruanã é intrapopulacional do que entre as populações caracterizando uma população panmítica Tabela 03 O valor do FST para esta análise foi baixo e não significante FST 000803 P099 Tabela 03 Resultado da análise de variância molecular Tipos de variantes Componentes variantes Porcentagem de variação Entre populações 000763 087 Entre indivíduos dentro das populações 087989 10087 Total 087226 Desta maneira como esperado os valores para o índice de fixação FST referente às comparações par a par entre as localidades amostradas não mostraram ocorrência de populações geneticamente estruturadas Os valores encontrados para o FST são inversamente proporcionais aos valores de Nm ou seja quanto maior número de migrantes os valores de FST foram menores como pode ser mostrado na tabela 04 Estes resultados sugerem um alto fluxo gênico para o aruanã entre as localidades apresentadas nesse estudo Tais resultados são importantes do ponto de vista de possíveis projetos de manejo a serem realizados com a espécie uma vez que com populações não diferenciadas geneticamente podese promover translocações dos animais entre diferentes áreas e promover repovoamentos em regiões afetadas pela pesca predatória Atividades como estas que evitariam o colapso da espécie Quanto aos níveis de endogamia somente os indivíduos da população de Coari apresentaram nível alto e significante valor do FIS FIS 041752 P0001 o que pode estar caracterizando uma coleta feita com indivíduos mais relacionados Tabela 04 Valores de Nm abaixo e FST acima Tefé 1 Coari 2 Janauacá 3 Santarém 4 Tefé 1 000009 000676 000122 Coari 2 564218182 000654 002001 Janauacá 3 7346553 7599030 001508 Santarém 4 Infinito Infinito 3265979 5 CONCLUSÃO Este trabalho foi pioneiro no estudo com marcadores microssatélites para O bicirrhosum Os seis loci estudados apresentam grande qualidade como marcadores moleculares entretanto devese estudar a variabilidade de outros loci desenvolvidos para esta espécie para a confirmação e continuação deste trabalho Adicionalmente devese incluir também outras localidades na bacia Amazônica Nossas principais conclusões são Os níveis de variabilidade genética observados no aruanã podem ser considerados baixos e heterogêneos entre as diferentes localidades amostradas As populações de aruanãs analisadas não estão estruturadas geneticamente e formam uma única população panmítica Por fim recomendase a continuação deste trabalho para confirmar os padrões observados e responder a outras questões genéticas não só como os marcadores microssatélites como os mitocondriais 6 REFERÊNCIAS AMADO M V Caracterização Genética de Populações do Peixe Ornamental Acará Disco Symphysodon spp Cichlidae Perciformes Utilizando Marcadores Microssatélites Tese de doutorado Programa de Pósgraduação em Biotecnologia Universidade Federal do Amazonas Manaus Brasil 174p 2008 ARAGÃO L P Contribuição ao Estudo da Biologia do Aruanã Osteoglossum bicirrhosum Vandelli 1829 Do Lago Janauaçã Estado do Amazonas Brasil I Desenvolvimento e Alimentação Larval Osteichthys Osteoglossifornes Ciência Agronômica 17p 1984 BARTHEM R B e FABRÉ N N Biologia e Diversidade dos Recursos Pesqueiros da Amazônia In A Pesca e os Recursos 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amarelo compõe seu corpo os ovos por sua vez ficam incubados na boca do animal macho Por tais características ímpares dia procura é alta tanto para comércio como para alimentação Devido a cultura de tal animal não envolver alta procriação fatores como a pesca excessiva remetem a um desequilíbrio o que proporciona riscos ao ecossistema Embora essa raça de peixes ainda não segue na lista de animais em extinção é preciso compreender que se agentes ameaçadores continuarem logo estarão Outro fator que pode remeter a extinção desses animais é a baixa capacidade que eles possuem em se adaptar Para tanto pesquisadores vêm desenvolvendo a partir de mutações genéticas formas de compreender de forma mais aprofundada a conservação reprodução e sobrevivência de tais animais Nesse sentido se torna fundamental desenvolver e aprimorar novos estudos que viabilizem estratégias para conservação e reprodução de tais animais visando sua existência e diminuindo probabilidades de extinção This sign warns that the area may be slippery and advises caution It shows a symbol of a figure slipping with the text CAUTION SLIPPERY SURFACE