Lista Tecnologia do Dna Recombinante Resolvida-2022 1

Tecnologia do DNA recombinante 1. O que são endonucleases de restrição? Defina o que são sítios de restrição, comentando sobre as principais características das sequências de DNA dessas regiões. 2. Explique qual é a função das DNAs ligases. 3. Quais os principais elementos obrigatórios presentes em vetores plasmidiais modificados? Discuta a função de cada um deles para a sua utilização em experimentos de clonagem molecular. 4. O que é uma reação de PCR? Qual o objetivo? Quais os reagentes necessários? O que ocorre em cada etapa de um ciclo da PCR? 5. Qual técnica pode ser utilizada para verificar o resultado de uma PCR? Explique. 6. Sobre a transferência de genes em plantas, responda: a) O que é e em que organismo é encontrado o plasmídeo Ti? Comente sobre a região de TDNA. b) Porque é necessário que o plasmídeo Ti esteja “desarmado” para sua utilização biotecnológica? Em que região desse plasmídeo será inserido o inserto de interesse? c) Esquematize os passos para a transformação genética de plantas. 7. O que são “biofábricas”? Explique como pode ser realizada a transferência de genes para a obtenção de animais transgênicos. 8. Descreva o método de sequenciamento de DNA segundo Sanger e comente sobre a importância dos dideóxirribonucleotídeos nesse processo. Mutações gênicas 1. Defina o que é mutação, diferenciando “dano (lesão) no DNA” de “mutação no DNA”. 2. Diferencie uma transição de uma transversão. 3. Explique com exemplos o que são: a) Mutação silenciosa ou neutra; b) Mutação de sentido trocado; c) Mutação sem sentido. 4. O que são inserções e deleções? Qual a consequência quando este tipo de mutação ocorre em uma sequência codificante? 5. Para cada alternativa abaixo, assinale como Verdadeira ou Falsa e justifique sua resposta: a) A substituição de um nucleotídeo numa sequência codificante pode gerar uma proteína igual à proteína selvagem. b) A substituição de um nucleotídeo numa sequência codificante pode gerar uma proteína menor que a proteína selvagem. c) A substituição de um nucleotídeo numa sequência codificante pode gerar uma proteína maior que a proteína selvagem. 6. Explique como o experimento de Lederberg & Lederberg (1952) contribuiu para a definição de mutação como um processo aleatório e não-adaptativo. 7. Diferencie mutação somática de uma mutação germinativa. 8. Descreva como o tautomerismo das bases nitrogenadas pode levar a mutações durante o processo de replicação. 9. Descreva como a ação de agentes alquilantes podem provocar mutações no DNA. 10. Quais os principais tipos de fotoprodutos originados após lesão de DNA decorrente de exposição à radiação UV? 11. Explique a seguinte afirmação: “Mutações de substituição de bases que não causam efeito deletério são um dos principais mecanismos para gerar variabilidade genética.” Sistemas de reparo de DNA e Recombinação 1. Quais os principais sistemas de reparo encontrados nos organismos? Quais os tipos de dano que cada sistema é capaz de reparar? 2. Sobre o reparo direto dependente de luz, explique que tipo de dano esse mecanismo repara e qual a condição física indispensável para que ele ocorra. 3. Quais mecanismos de reparo podem ser utilizados para reparar bases de DNA que foram modificadas por agentes alquilantes? Como o dano é reparado em cada sistema? 4. Qual o sistema de reparo está sendo representado na figura abaixo e que tipo de enzimas são necessárias para que ocorram os passos 3, 4 e 5 desse sistema de reparo de dano? 5. Explique as 3 etapas básicas de um sistema de Reparo por Excisão de Nucleotídeos. 6. O mecanismo de reparo de pareamento incorreto requer enzimas capazes de reconhecer a fita de DNA que deverá servir como molde para o reparo. Como essas enzimas reconhecem essa fita em bactérias e por que isso é necessário? 7. Sobre o sistema SOS de reparo explique que enzima permite ultrapassar uma forquilha de replicação bloqueada. Comente sobre as características dessa enzima 8. Um técnico em radiologia trabalha rotineiramente com exames de raio X e, embora bem instruído, não utiliza EPI’s essenciais à sua proteção. Que tipos de danos ao DNA essa exposição aos raios X pode estar desencadeando? Quais os sistemas de reparo usados para corrigir esse dano? 9. O que é recombinação homóloga? Em quais funções celulares este mecanismo está envolvido? 10. Sobre o sistema de reparo por recombinação homóloga explique seu mecanismo de funcionamento e qual o principal tipo de lesão de DNA que repara. Regulação da Expressão Gênica 1. Diferencie expressão constitutiva de expressão regulada. 2. Dentre as etapas necessárias para a expressão de um gene, qual o principal ponto de regulação? Que outros pontos podem ser regulados? 3. Diferencie regulação positiva e negativa, e explique as diferentes formas de interação com o sinal molecular. 4. Proteínas regulatórias (ativadoras ou repressoras) ligam-se a sítios aleatórios do genoma? Comente. Regulação da Expressão Gênica em Procariotos 5. Como é a estrutura dos genes procarióticos? Quais as vantagens do genoma se organizar desta forma? 6. Caracterize as seguintes regiões em genes de procariotos (onde estão localizadas e/ou quais suas funções): (a) posição +1, (b) região -10, (c) região -35, (d) Operador (e) Sítio de ligação do ativador. Dica 1: para descrever a localização de uma região em relação a outra use os termos “a montante” para o que está a 5’ e “a jusante” para o que está a 3’. Dica 2: desenhar um esquema facilita a tarefa. 7. Sobre o operon lac, responda: a. Esquematize o Operon lac, explicando quais os produtos gênicos gerados e suas funções durante o metabolismo da lactose. b. Como funciona a regulação negativa do operon lac? c. Como funciona a regulação positiva do operon lac? Regulação da Expressão Gênica em Eucariotos 8. Comente a importância do complexo de remodelagem da cromatina na expressão gênica de eucariotos. 9. O que são e quais os principais tipos de modificações covalentes nas regiões N-terminais de histonas? Quais o impacto da acetilação na compactação da cromatina? 10. Descreva as principais funções dos ativadores transcricionais. 11. O que são e qual a função dos elementos acentuadores ou intensificadores? Universidade Federal do Paraná Setor de Ciências Biológicas Departamento de Genética 12. Como uma sequência intensificadora que se encontra a 5000 pb do promotor de um gene participa do processo de início de transcrição deste gene? 13. Como atuam os repressores transcricionais? 14. Em Arabidopsis, um gene de -tubulina (TUB1) é expresso nas raízes e outro gene de - tubulina (TUB8) é expresso nos tecidos vasculares. Sugira um mecanismo para explicar esta expressão histoespecífica. 15. O que são RNAs de interferência (RNAi)? Como atuam na regulação traducional de genes? Epigenética 1) O que é epigenética? Quais os principais mecanismos de herança epigenética? 2) Sobre a metilação do DNA, responda: a) O que são ilhas CpG? Onde ocorrem no genoma? b) Como ocorre a manutenção do padrão de metilação após a replicação do DNA? c) Como a metilação do DNA interfere na expressão de genes? 3) Por que a falta de metilação da região promotora do gene AGOUTI muda o fenótipo de camundongos? 3) O que é imprinting genômico? Proponha um exemplo hipotético para explicar a expressão de um gene que é regulado por esse mecanismo. 4) O gene SW controla a cor do pelo em Ewoks (espécie animal). O alelo SWC determina pelos castanhos e o alelo SWP determina pelos pretos. Este gene tem sua expressão regulada por imprinting genômico, sendo que o alelo de origem materna é inativado por metilação. A partir de um cruzamento entre uma fêmea SWPSWP e um macho SWCSWC nasceram dois filhotes, um macho e uma fêmea. Com base nestas informações responda: a) No cruzamento relatado acima, qual o genótipo e o fenótipo dos filhotes? b) Na fase adulta, como serão os gametas formados pelos filhotes? 5) De que maneira as modificações nas caudas das histonas estão envolvidas na regulação transcricional? Como a acetilação e a metilação afetam a transcrição gênica? Genética do Câncer 1) Explique a afirmação “O câncer é uma doença fundamentalmente genética, mas em geral, não é herdada.” 2) Por que o câncer é considerado uma doença de natureza multifatorial? 3) Por que uma maior exposição a mutágenos aumenta o risco do desenvolvimento de câncer? 4) Defina o que são proto-oncogenes: Descreva quais as funções normais dos produtos desses genes e explique como alterações nestes genes podem desregular o ciclo celular. 5) Defina o que são genes supressores de tumor: Descreva quais as funções normais dos produtos desses genes e explique como alterações nestes genes podem afetar o ciclo celular. 6) Uma mutação no oncogene celular ras pode causar câncer quando na condição heterozigota, mas uma mutação no gene supressor tumoral RB só pode causar câncer quando na condição homozigota. O que esta diferença entre mutações dominantes e recessivas significa sobre os papéis dos produtos gênicos de ras e RB em atividades celulares normais? 7) Por que mutações em genes que codificam para enzimas das vias de reparo de DNA podem aumentar a predisposição ao câncer? 7) Como translocações como a do cromossomo Philadelphia contribuem para o câncer? 8) Explique porque tanto a hiper quanto a hipometilação do DNA podem estar associadas a vários cânceres. Tecnologia do DNA recombinante 1.O que são endonucleases de restrição? Defina o que são sítios de restrição, comentando sobre as principais características das sequências de DNA dessas regiões. R: São enzimas capazes de reconhecer sequências específicas de nucleotídeos no DNA e cortá-las. Os sítios de restrição são justamente as sequências que podem ser reconhecidas e cortadas por essas endonucleases e tem como principais características a presença de 4 a 6 nucleotídeo e a simetria, que permite a leitura da sequência em ambas as direções. 2.Explique qual é a função das DNAs ligases. R: A função das DNA ligases é unir a extremidade 3’ da fita contínua de DNA à extremidade 5’ da fita descontínua ao final do processo de transcrição. 3. Quais os principais elementos obrigatórios presentes em vetores plasmidiais modificados? Discuta a função de cada um deles para a sua utilização em experimentos de clonagem molecular. R: Os principais elementos obrigatórios presentes são as origens de replicação que são sequências de DNA que interagem com a DNA polimerase para auxiliar a replicação, os genes que conferem resistência a antibióticos para que as bactérias que carregam os plasmídeos sejam selecionadas e as sequências de sítios de clonagem múltiplas que contém uma cópia de diversos sítios de restrição diferentes. 4.O que é uma reação de PCR? Qual o objetivo? Quais os reagentes necessários? O que ocorre em cada etapa de um ciclo da PCR? R: É um método de amplificação das moléculas de DNA in vitro que tem como objetivo a obtenção de grandes quantidades de genes a partir de uma pequena fração de material genético. Os reagentes necessários para que a reação ocorra são: a fita molde de DNA, primers que se ligam às sequências que devem ser traduzidas e uma DNA polimerase resistente à altas temperaturas. Cada ciclo da PCR é composto por etapas de aquecimento, que desnaturam o DNA com o objetivo de separar as fitas e incluir os primers, e etapas de resfriamento que permitem a adição dos nucleotídeos por meio da DNA polimerase. 5.Qual técnica pode ser utilizada para verificar o resultado de uma PCR? Explique. R: Diversas técnicas podem ser utilizadas para verificar o resultado de uma PCR, uma delas é a Hibridização com Oligonucleotídeos Alelo-específicos (ASO) ou Dot-blot. Consiste na fixação do produto da PCR em uma membrana para hibridizá-lo com oligonucleotídeos marcados que somente se ligarão se a sequência complementar estiver presente. Nessa técnica são usados oligonucleotídeos que detectam a sequência normal e a sequência mutante. 6. Sobre a transferência de genes em plantas, responda: a) O que é e em que organismo é encontrado o plasmídeo Ti? Comente sobre a região de TDNA. R: É um plasmídeo encontrado nas bactérias Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes utilizado para a transferência de material genético dessas bactérias para plantas. A região de T-DNA é a porção que será transferida na forma de um fio único e qualquer sequência de bases que estiver presente nessa região será transferida integralmente para a planta. b) Porque é necessário que o plasmídeo Ti esteja “desarmado” para sua utilização biotecnológica? Em que região desse plasmídeo será inserido o inserto de interesse? R: O plasmídeo Ti deve estar desarmado para que não induza tumores ou raízes em plantas. O inserto de interesse será inserido na região de T-DNA. c) Esquematize os passos para a transformação genética de plantas. R: O plasmídeo Ti possui genes que codificam múltiplas funções, quase todas envolvidas na transferência e integração de genes deste plasmídeo (T-DNA) no genoma da célula vegetal. A região T-DNA contém a porção de DNA que é transferida. Qualquer sequência de base inserida entre essas duas extremidades será totalmente transferida para a planta, independentemente de seu tamanho. Os genes de virulência (regiões vir) são responsáveis por codificar produtos gênicos que atuam na exportação de T-DNA de bactérias para plantas. Os plasmídeos Ti transferem apenas a região T-DNA, por isso é necessário remover esses genes do plasmídeo e inserir o gene de interesse. Isso é alcançado pela exclusão de genes T-DNA que codificam proteínas que controlam a síntese de carcinógenos vegetais. Além disso, é necessário introduzir genes que permitam a seleção de células transformadas, como genes que conferem resistência a antibióticos (genes marcadores selecionáveis). Assim, o primeiro passo no processo de transformação do gene Agrobacterium é obter um plasmídeo desarmado. A segunda etapa envolve a obtenção de um plasmídeo Ti contendo o gene de interesse na região T-DNA. 7. O que são “biofábricas”? Explique como pode ser realizada a transferência de genes para a obtenção de animais transgênicos. R: As biofábricas são estruturas de produção e laboratório que coproduzem microrganismos, como mudas de plantas, bactérias ou fungos, para controle biológico de pragas, indutores de resistência e estimulantes de plantas. Existem muitos métodos para manipulação genética de organismos: microinjeção de pronúcleo de DNA exógeno em óvulos fertilizados, transferência de DNA mediada por espermatozoides durante a fertilização in vitro, transferência de DNA mediada por lipossomas em células ou embriões, eletroporação de DNA em um zigoto ou embriões, injeção de células embrionárias previamente modificadas em blastocistos e transferência nuclear de células somáticas ou embrionárias também previamente modificadas geneticamente. 8. Descreva o método de sequenciamento de DNA segundo Sanger e comente sobre a importância dos dideóxirribonucleotídeos nesse processo. R: Esse método de sequenciamento se inicia com a hibridização de uma fita simples de DNA com um primer deoxinucleotídeo sintético marcado radioativamente que é então alongado em 4 reações separadamente contendo os 4 deoxinucleosídeos normais em quantidade 100x maior que um dos quatro dideoxinucleosídeos trifosfato que podem ser adicionados no lugar de qualquer deoxinucleosídeo normal, fazendo com que a elongação da cadeia pare, compondo uma importante parte desse processo. Assim, após determinado tempo, cada reação será composta por uma mistura de cadeias não terminadas a cada adição de dideoxinucleosídeo. Após isso, as reações são submetidas à eletroforese e utiliza-se autorradiografia para detecção dos fragmentos em bandas que permitem a leitura da sequência de bases no fragmento de DNA original. Mutações gênicas 1. Defina o que é mutação, diferenciando “dano (lesão) no DNA” de “mutação no DNA”. R: Mutação é qualquer alteração ocorrida na molécula de DNA que não tenha sido corrigida pelos mecanismos de reparo da célula. Já os danos ao DNA são alterações no material genético que podem ser reparadas para que a célula não entre em apoptose. 2. Diferencie uma transição de uma transversão. R: A transição ocorre quando uma purina é trocada por outra purina ou uma pirimidina é trocada por outra pirimidina, já a transversão ocorre quando uma purina é trocada por uma pirimidina e vice-versa. 3. Explique com exemplos o que são: a) Mutação silenciosa ou neutra; R: Ocorre quando a mutação do DNA não promove a produção de um aminoácido diferente durante a tradução, o que somente é possível devido ao fato do código genético ser degenerado. Por exemplo, a Prolina pode ser determinada pelos códons CCU, CCA, CCC e CCG. b) Mutação de sentido trocado; R: Nesse caso de mutação, o aminoácido produzido é diferente do que seria produzido em condições de normalidade. Um exemplo é a anemia falciforme, na qual o códon GAG é alterado para GTG no gene da cadeia beta, substituindo o ácido glutâmico por valina. c) Mutação sem sentido. R: Ocorre quando há a substituição de um códon que originaria um aminoácido por um códon de parada. Exemplo: troca de GUG por AUG. 4. O que são inserções e deleções? Qual a consequência quando este tipo de mutação ocorre em uma sequência codificante? R: São eventos caracterizados pela inserção ou deleção de um ou mais pares de base em uma determinada sequência. Mutações desse tipo alteram completamente o quadro de leitura, uma vez que essa leitura é feita de três em três bases, gerando proteínas com sequências de aminoácidos completamente diferentes. 5. Para cada alternativa abaixo, assinale como Verdadeira ou Falsa e justifique sua resposta: (V) a) A substituição de um nucleotídeo numa sequência codificante pode gerar uma proteína igual à proteína selvagem. R: Isso é possível devido ao fato do material genético ser degenerado, ou seja, alguns aminoácidos podem ser gerados por mais de um códon. É a base das mutações silenciosas. (V) b) A substituição de um nucleotídeo numa sequência codificante pode gerar uma proteína menor que a proteína selvagem. R: A substituição de um nucleotídeo pode gerar um códon de parada, fazendo com que a proteína seja menor que a proteína selvagem. É a base das mutações nonsense. (F) c) A substituição de um nucleotídeo numa sequência codificante pode gerar uma proteína maior que a proteína selvagem. R: Não é possível pois a substituição de um nucleotídeo não promove a adição de novos aminoácidos, portanto, as modificações estruturais promovidas nas proteínas mutantes de limitam à manutenção ou redução do tamanho. 6.Explique como o experimento de Lederberg & Lederberg (1952) contribuiu para a definição de mutação como um processo aleatório e não-adaptativo. R: No experimento, populações de bactérias eram cultivadas até formarem colônias em uma placa inicial. Após a formação dessas colônias, utilizou-se um pano para transferir parte das colônias para outra placa, formando uma placa com os mesmos organismos da placa inicial. As duas placas foram então acrescidas de penicilina, e notou-se que as mesmas colônias sobreviveram tanto na placa inicial como na “cópia”. Portanto, foi possível provar que a mutação que gerava resistência à penicilina já estava presente na população antes da introdução da substância, sendo então um processo aleatório e não-adaptativo. 7.Diferencie mutação somática de uma mutação germinativa. R: Mutações somáticas são mutações que acometem células somáticas de um organismo causando danos somente a esse organismo sem que sejam introduzidas novas formas alélicas na população. Já mutações germinativas ocorrem em células germinativas, ou seja, gametas, de modo que as alterações podem ser transmitidas às próximas gerações. 8. Descreva como o tautomerismo das bases nitrogenadas pode levar a mutações durante o processo de replicação. R: As bases nitrogenadas podem se apresentar, além da sua forma normal, em formato tautomérico. A timina e a guanina possuem como forma tautomérica a forma enol, e a citosina e adenina possuem a forma imino como tautomérica. Se alguma dessas bases se apresentar em seu formato tautomérico durante a replicação do DNA, pode ocorrer um pareamento errado de bases, conjugando a adenina com a citosina por exemplo, o que leva a mutações. 9.Descreva como a ação de agentes alquilantes podem provocar mutações no DNA. R: Agentes alquilantes são capazes de promover mudanças nas bases nitrogenadas por meio da inserção de radicais nessas bases. Um exemplo de agente alquilante são as nitrosaminas que transferem grupos metil ou etil para as bases nitrogenadas fazendo com que sua estrutura seja alterada e haja um pareamento errôneo entre as bases durante a replicação do DNA, promovendo então mutações 10. Quais os principais tipos de foto produtos originados após lesão de DNA decorrente de exposição à radiação UV? R: Dímeros de timina e conjugados de timina e citosina adjacentes e ligados covalentemente. 11. Explique a seguinte afirmação: “Mutações de substituição de bases que não causam efeito deletério são um dos principais mecanismos para gerar variabilidade genética.” R: Se a mutação não gera efeito deletério, o organismo é capaz de sobreviver e se adaptar ao meio em que vive, podendo então transmitir essa característica aos seus descendentes sem nenhum prejuízo à prole, introduzindo novas formas alélicas na população. Sistemas de reparo de DNA e Recombinação 1. Quais os principais sistemas de reparo encontrados nos organismos? Quais os tipos de dano que cada sistema é capaz de reparar? R: O Reparo Direto da lesão ao DNA é capaz de reparar erros que resultaram na formação de dímeros de pirimidinas e na adição de grupos metil ou etil às purinas. O reparo por excisão pode ocorrer por meio de 3 mecanismos – reparo por excisão de base, reparo por excisão de nucleotídeo e reparo de mau pareamento – e é capaz de corrigir erros de dimerização de pirimidinas, erros de bases pareadas erroneamente e erros de adição ou retirada de radicais das bases nitrogenadas. O Reparo pós-replicação é capaz de corrigir erros de dimerização de pirimidinas. O reparo por recombinação pode corrigir adições ou retiradas de nucleotídeos no DNA. 2. Sobre o reparo direto dependente de luz, explique que tipo de dano esse mecanismo repara e qual a condição física indispensável para que ele ocorra. R: Esse mecanismo é capaz de reparar lesões causadas pela formação de dímeros de pirimidina por meio da enzima fotoliase e necessita indispensavelmente de energia luminosa para que ocorra da forma correta. 3. Quais mecanismos de reparo podem ser utilizados para reparar bases de DNA que foram modificadas por agentes alquilantes? Como o dano é reparado em cada sistema? R: Podem ser utilizados o reparo direto da lesão, o reparo por excisão de base e o reparo por excisão de nucleotídeo. No reparo direto da lesão são utilizadas enzimas capazes de remover os radicais que foram adicionados às bases nitrogenadas, no reparo por excisão de base a retirada da base danificada é catalisada por enzimas como a DNA-glicosilase gerando um sítio apirimidínico ou apurínico que é então preenchido por DNA polímerase e DNA ligase, no reparo por excisão de nucleotídeo ocorre de forma semelhante ao reparo por excisão de base, entretanto, todo o nucleotídeo é substituído. 4. Qual o sistema de reparo está sendo representado na figura abaixo e que tipo de enzimas são necessárias para que ocorram os passos 3, 4 e 5 desse sistema de reparo de dano? R: A imagem esquematiza o reparo por excisão de nucleotídeo. Para que ocorram os passos 3, 4 e 5 são necessárias endonucleases, exonucleases, DNA polimerases e DNA ligases. 5. Explique as 3 etapas básicas de um sistema de Reparo por Excisão de Nucleotídeos. R: Primeiramente é feito o reconhecimento do fragmento danificado por meio de endonucleases e então é feita a excisão desse fragmento por exonucleases que quebram a ligação fosfodiéster em regiões que contém a lesão. Em seguida, uma DNA polimerase preenche a lacuna deixada utilizando a fita de DNA complementar. Por último, a DNA ligase conecta os fragmentos produzidos pela polimerase ao restante da molécula de DNA, completando o processo. 6. O mecanismo de reparo de pareamento incorreto requer enzimas capazes de reconhecer a fita de DNA que deverá servir como molde para o reparo. Como essas enzimas reconhecem essa fita em bactérias e por que isso é necessário? R: Essas enzimas devem fazer a distinção entre a fita molde e a fita recém sintetizada e isso é possível por meio do padrão de metilação. Como a fita recém sintetizada é uma cópia da fita molde, a diferença do padrão de metilação só é possível pois existe um tempo entre a replicação e a adição de grupamentos metil às citsinas específicas na nova fita. Esse reconhecimento é necessário para que a remoção de bases não seja aleatória, aumentando as chances de a mutação ser corrigida. 7. Sobre o sistema SOS de reparo explique que enzima permite ultrapassar uma forquilha de replicação bloqueada. Comente sobre as características dessa enzima R: DNA Polimerases não replicativas com atividade translesão (TLS). São uma classe de polimerases que possuem alta flexibilidade conformacional e com um sítio catalítico maior possibilitando sua modulação em distorções do material genético. São capazes de transpassar uma lesão sem removê-la, evitando a geração de uma instabilidade cromossômica. 8. Um técnico em radiologia trabalha rotineiramente com exames de raio X e, embora bem instruído, não utiliza EPI’s essenciais à sua proteção. Que tipos de danos ao DNA essa exposição aos raios X pode estar desencadeando? Quais os sistemas de reparo usados para corrigir esse dano? R: Essa exposição pode desencadear a formação de dímeros de pirimidinas e purinas no DNA. Para que seja corrigido esse erro deve ser feito o reparo por excisão de base ou de nucleotídeo. 9. O que é recombinação homóloga? Em quais funções celulares este mecanismo está envolvido? R: É a troca de sequências entre duas moléculas homólogas de DNA. Esse mecanismo está presente principalmente no crossing-over. 10. Sobre o sistema de reparo por recombinação homóloga explique seu mecanismo de funcionamento e qual o principal tipo de lesão de DNA que repara. R: Nesse tipo de reparo, fitas únicas são trocadas entre moléculas de DNA homólogas. Para que isso ocorra, são necessárias enzimas específicas e outras proteínas que participam do metabolismo do DNA. Na bactéria E. coli, a proteína RecA se liga ao DNA de fita única e forma um filamento de DNA-proteína que então se liga a outra molécula de DNA de fita dupla formando um complexo sem pareamento de bases, para que então a enzima RecBCD promova quebras na cadeia para então ocorrer a troca de sequências entre as fitas homólogas. Esse mecanismo é capaz de reparar inserções ou deleções de nucleotídeos no material genético. Regulação da Expressão Gênica 1. Diferencie expressão constitutiva de expressão regulada. R: Genes de expressão constitutiva são genes que se expressam independentemente do tipo celular, uma vez que regulam funções básicas da célula como a codificação e proteínas do citoesqueleto. Já os genes de expressão regulada são genes que são expressos apenas em determinadas células pois são atrelados às funções específicas de cada célula. 2. Dentre as etapas necessárias para a expressão de um gene, qual o principal ponto de regulação? Que outros pontos podem ser regulados? R: O principal ponto de regulação é a alteração dinâmica da estrutura da cromatina. Outros pontos de regulação da expressão de um gene envolvem a restrição da síntese de produtos gênicos precocemente e as modificações nas moléculas de RNAm. 3. Diferencie regulação positiva e negativa, e explique as diferentes formas de interação com o sinal molecular. R: A regulação positiva de um gene ocorre quando sua expressão é favorecida, já a expressão negativa ocorre quando há inibição da expressão de um gene. O sinal molecular induzido por proteínas de regulação positiva ou negativa podem induzir a dissociação do ativador ou do repressor ou podem ainda promover a ligação do ativador ou repressor ao DNA, para então inibir ou promover a transcrição. 4. Proteínas regulatórias (ativadoras ou repressoras) ligam-se a sítios aleatórios do genoma? Comente. R: Não. As proteínas ativadoras ou repressoras se ligam em regiões imediatamente antes das regiões promotoras de uma determinada sequência de DNA. Regulação da Expressão Gênica em Procariotos 5. Como é a estrutura dos genes procarióticos? Quais as vantagens do genoma se organizar desta forma? R: O genoma em procariotos é único, circular e haploide e não há a presença de membrana nuclear. Fragmentos de material genético são encontrados por toda a célula e são chamados de plasmídeos. A presença dos plasmídeos facilita a transferência de material genético entre os organismos e a ausência de membrana nuclear permite que a tradução e a transcrição sejam realizadas de maneira simultânea. 6. Caracterize as seguintes regiões em genes de procariotos (onde estão localizadas e/ou quais suas funções): (a) posição +1: É o ponto inicial de transcrição, onde a molécula de RNA começa a ser montada. (b) região -10: Localizada à montante da posição +1. É uma região promotora que serve para ligação do fator sigma para formar um sítio de acoplamento para a RNA polimerase. (c) região -35: Localizada à montante da posição +1. Também é uma região promotora e tem a mesma função da região -10. (d) Operador: Se localiza nas regiões promotoras para regular a expressão dessas regiões, possibilitando ou impedindo o início da transcrição. (e) Sítio de ligação do ativador. Se localizam à montante das regiões promotoras e são locais de ligação de fatores de transcrição. Dica 1: para descrever a localização de uma região em relação a outra use os termos “a montante” para o que está a 5’ e “a jusante” para o que está a 3’. Dica 2: desenhar um esquema facilita a tarefa. 7. Sobre o operon lac, responda: a. Esquematize o Operon lac, explicando quais os produtos gênicos gerados e suas funções durante o metabolismo da lactose. R: O óperon lac é responsável pelo metabolismo da lactose e produz as 3 enzimas necessárias para o aproveitamento da lactose como alimento: B-galactosidase (responsável pela clivagem da lactose em glicose e galactose), permease (responsável pelo transporte de lactose do meio extracelular para o meio intracelular) e transacetilase (que é capaz de transferir uma acetila do acetil CoA para a hidroxila do carbono 6 de um tiogalactosídeo) b. Como funciona a regulação negativa do operon lac? R: A regulação negativa do óperon lac se dá por meio da ligação do repressor lac ao operador, impedindo a síntese do RNAm policistrônico. c. Como funciona a regulação positiva do operon lac? R: A regulação positiva do óperon lac se dá quando a alolactose (metabólito da lactose) se liga ao repressor lac, gerando uma alteração conformacional que o desprende do promotor, permitindo que o RNAm seja traduzido. Regulação da Expressão Gênica em Eucariotos 8. Comente a importância do complexo de remodelagem da cromatina na expressão gênica de eucariotos. R: O complexo de remodelagem da cromatina é capaz de modificar a topologia dos nucleossomos, de modo a alterar a interação do DNA com as histonas. Na presença de ATP, esse complexo desloca temporariamente nucleossomos de uma região específica de DNA, permitindo que os fatores de transcrição tenham acesso aos seus respectivos promotores ampliando os níveis de transcrição. 9. O que são e quais os principais tipos de modificações covalentes nas regiões N-terminais de histonas? Quais o impacto da acetilação na compactação da cromatina? R: São alterações pós-traducionais que tem como objetivo alterar a flexibilidade da cromatina. As principais modificações são a acetilação, a fosforilação e ametilação. A acetilação das histonas reduz sua afinidade pelo DNA, fazendo com que a cromatina se torne menos compacta, facilitando os processos transcricionais. 10. Descreva as principais funções dos ativadores transcricionais. R: Tem a função de ativar as sequências reguladoras. Essa ativação permite que atuem em conjunto sobre o promotor, formando um complexo que é conectado ao DNA regulador e aos fatores gerais que ativam a RNA polimerase II que inicia a transcrição do gene. 11. O que são e qual a função dos elementos acentuadores ou intensificadores? R: São reguladores positivos que interagem com fatores proteicos específicos com o objetivo de aumentar os níveis de transcrição basal realizado pelos promotores centrais. 12. Como uma sequência intensificadora que se encontra a 5000 pb do promotor de um gene participa do processo de início de transcrição deste gene? R: Possivelmente pelo dobramento do DNA que possibilita a interação física entre esses grupos. 13. Como atuam os repressores transcricionais? R: Atuam se ligando aos operadores, impedindo a fixação da RNA polimerase ao promotor. 14. Em Arabidopsis, um gene de -tubulina (TUB1) é expresso nas raízes e outro gene de - tubulina (TUB8) é expresso nos tecidos vasculares. Sugira um mecanismo para explicar esta expressão histoespecífica. R: As condições do meio em que cada tecido se encontra podem ser capazes de ampliar ou inativar determinados fatores de transcrição responsáveis pela expressão dos genes de tubulina, fazendo com que sua expressão seja diferente nesses tecidos. 15. O que são RNAs de interferência (RNAi)? Como atuam na regulação traducional de genes? R: É um mecanismo de repressão gênica pós-transcricional mediado por pequenos RNAs de fita dupla. Esses RNAs de fita dupla são capazes de se ligar a uma sequência complementar de nucleotídeos localizada em um determinado RNAm, ocasionando a repressão dessa molécula por inibição da tradução ou sua degradação. Epigenética 1) O que é epigenética? Quais os principais mecanismos de herança epigenética? R: O termo epigenética se refere às características hereditárias associadas a modificações químicas da molécula de DNA. Os dois principais mecanismos de herança epigenética são a metilação do DNA e a modificação de histonas. 2) Sobre a metilação do DNA, responda: a) O que são ilhas CpG? Onde ocorrem no genoma? R: São regiões ricas em dinucleotídeos CG ligados covalentemente lado a lado e ocorrem em mais da metade das regiões promotoras dos genes. b) Como ocorre a manutenção do padrão de metilação após a replicação do DNA? R: Os sítios metilados do DNA parental funcionam como molde para a metilação do filamento pós-replicativo, garantindo que o padrão de metilação seja o mesmo do DNA parental. Esse processo é mediado pela enzima Dnmt1. c) Como a metilação do DNA interfere na expressão de genes? R: A repressão das ilhas CpG metiladas é mediada por proteínas de ligação às ilhas CpG metiladas (MBPs) que possuem a capacidade de se ligar ao DNA metilado e desestabilizar a interação entre fatores transcricionais e o DNA além de recrutarem fatores de compactação da cromatina. 3) Por que a falta de metilação da região promotora do gene AGOUTI muda o fenótipo de camundongos? R: Pois a metilação é um processo que impede a expressão do gene AGOUTI, logo, a falta dessa metilação permite que o gene se expresse, alterando a cor e aumentando a propensão a obesidade, diabetes e câncer em camundongos. 3) O que é imprinting genômico? Proponha um exemplo hipotético para explicar a expressão de um gene que é regulado por esse mecanismo. R: É um fenômeno no qual genes são expressos somente por um alelo devido a um padrão diferente de metilação em cada alelo, que pode ser do pai ou da mãe. Em um gene que controla a produção de uma proteína X com imprinting paternal, na qual o alelo P determina a produção dessa proteína e o alelo N determina a não produção, em um cruzamento PP macho com NN fêmea, nascerá um indivíduo que não tem a capacidade de produzir essa proteína. 4) O gene SW controla a cor do pelo em Ewoks (espécie animal). O alelo SWC determina pelos castanhos e o alelo SWP determina pelos pretos. Este gene tem sua expressão regulada por imprinting genômico, sendo que o alelo de origem materna é inativado por metilação. A partir de um cruzamento entre uma fêmea SWPSWP e um macho SWCSWC nasceram dois filhotes, um macho e uma fêmea. Com base nestas informações responda: a) No cruzamento relatado acima, qual o genótipo e o fenótipo dos filhotes? R: O genótipo dos filhotes é SWPSWC e seu fenótipo é ter pelos castanhos. b) Na fase adulta, como serão os gametas formados pelos filhotes? R: Tanto no macho como na fêmea, os gametas serão SWP e SWC, entretanto, no macho os gametas irão adquirir os genes SW sem o imprinting materno, adquirindo o padrão de metilação dos seus homólogos paternos. 5) De que maneira as modificações nas caudas das histonas estão envolvidas na regulação transcricional? Como a acetilação e a metilação afetam a transcrição gênica? R: As caudas das histonas estão expostas a diversas alterações pois se projetam para fora dos nucleossomos. Essas alterações são responsáveis por modificar a interação entre essas proteínas e o material genético, de modo a condensar ou descondensar a cromatina. Uma cromatina condensada impede a transcrição, assim como uma cromatina descondensada possibilita a atividade transcricional. A acetilação diminui o enovelamento da cromatina, propiciando a transcrição gênica, já a metilação atua de maneira oposta. Genética do Câncer 1) Explique a afirmação “O câncer é uma doença fundamentalmente genética, mas em geral, não é herdada.” R: É uma doença fundamentalmente genética pois existem genes capazes de suprimir tumores como o p53 e o pRB, assim como existem os proto-oncogenes que se ativados induzem o crescimento tumoral, entretanto, não é herdada uma vez que a expressão desses genes depende também de fatores ambientais. 2) Por que o câncer é considerado uma doença de natureza multifatorial? R: Pois pode ser desenvolvida a partir de uma gama de fatores como exposição a radiação, agentes alquilantes, proteínas virais e diversos outros. 3) Por que uma maior exposição a mutágenos aumenta o risco do desenvolvimento de câncer? R: Uma maior exposição a mutágenos implica em números maiores de lesões ao material genético de modo que essa grande quantidade de danos pode superar a capacidade de reparo das células, fazendo com que haja a supressão de genes que previnem o câncer e favorecendo a expressão de genes que atuam na divisão e crescimento celular. 4) Defina o que são proto-oncogenes: Descreva quais as funções normais dos produtos desses genes e explique como alterações nestes genes podem desregular o ciclo celular. R: Proto-oncogenes são genes presentes normalmente nas células que têm uma função definida associada ao crescimento celular e que quando apresentam mutação, tem sua expressão aumentada, se transformando em oncogenes. Seus produtos são responsáveis pela estimulação do crescimento, divisão e diferenciação celular, de modo que sua super expressão leva a estímulos intensos nesses processos, afetando pontos de checagem e de reparo e favorecendo a divisão celular desenfreada. 5) Defina o que são genes supressores de tumor: Descreva quais as funções normais dos produtos desses genes e explique como alterações nestes genes podem afetar o ciclo celular. R: São genes que participam do controle negativo do ciclo celular. Seus produtos atuam bloqueando a progressão do ciclo celular ou induzindo a morte celular em caso de erros ou quando a célula está sob estresse, de modo que a supressão dos genes supressores de tumor é responsável pelo crescimento e divisão celular desenfreados, causando o surgimento de tumores. 6) Uma mutação no oncogene celular ras pode causar câncer quando na condição heterozigota, mas uma mutação no gene supressor tumoral RB só pode causar câncer quando na condição homozigota. O que esta diferença entre mutações dominantes e recessivas significa sobre os papéis dos produtos gênicos de ras e RB em atividades celulares normais? R: Significa que cada gene somente se expressa em condições específicas, reduzindo as chances de carcinogênese. 7) Por que mutações em genes que codificam para enzimas das vias de reparo de DNA podem aumentar a predisposição ao câncer? R: Mutações em genes que codificam enzimas de reparo podem suprimir a expressão desses genes, fazendo com que o ciclo celular tenha prosseguimento mesmo diante de lesões no material genético. Essas lesões podem estar presentes em genes de supressão tumoral ou em oncogenes, favorecendo a oncogênese. 8) Como translocações como a do cromossomo Philadelphia contribuem para o câncer? R: Translocações causam a formação de novos genes que podem ser capazes de regular positivamente o ciclo celular, como é o caso do cromossomo Philadelphia que apresenta um gene resultado da fusão de 2 outros, gerando a proteína Bcr/Abl que leva à fosforilação de diversas outras proteínas estimulando o crescimento celular. 9) Explique porque tanto a hiper quanto a hipometilação do DNA podem estar associadas a vários cânceres. R: A hipermetilação é capaz de inativar genes supressores de tumor, levando, portanto, a uma regulação positiva exagerada do ciclo celular e induzindo o crescimento tumoral. A hipometilação é capaz de promover a expressão de oncogenes e proto-oncogenes que estariam inativados em condições de normalidade, fazendo com que a oncogênese seja favorecida em grandes escalas. Referências: MURRAY, P.R. Microbiologia Médica. 6 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010. PIMENTEL, G.; GALLO, M.M.; MOURA, C.V.; SANTOS-REBOUÇAS, C.B. Genética Essencial. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013 DE ROBERTIS, E. M. F.; HIB, J. Bases da biologia celular e molecular. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. ANDRADE, G. M.; SARTORETTO, L. M.; BRASILEIRO, A. C. M.Biologia molecular do processo de infecção por Agrobacterium spp. Fitopatologia Brasileira. v. 28, n. 5, p. 465-476, 2003. CLANCY, S. RNA transcription by RNA polymerase: prokaryotes vs eukaryotes. Nat Educ. v. 1 n. 1, p. 125, 2008.