DNA Forense- Genotipagem e Identificação por Impressão Digital de DNA

Uma potente arma na medicina forense Um dos métodos mais precisos para a colocação de um indivíduo na cena de um crime é a digital O advento da tecnologia do DNA recombinante disponibilizou uma ferramenta muito mais potente a genotipagem do DNA também chamada de impressão digital do DNA ou perfil do DNA Como descrito pela primeira vez pelo geneticista inglês Alec Jeffreys em 1985 o método é baseado nos polimorfismos de sequência diferenças sutis na sequência entre os indivíduos em média 1 em cada 1000 pb Cada diferença do protótipo da sequência genômica humana primeira obtida ocorre em alguma fração da população humana cada pessoa possui algumas diferenças desse protótipo O trabalho forense concentrase nas diferenças dos comprimentos das sequências das repetições curtas em tandem STR do inglês short tandem repeat Um lócus STR é uma sequência curta de DNA repetida muitas vezes em tandem em um local específico do cromossomo em geral a sequência repetida tem 4 pb de comprimento Os loci mais usados na genotipagem STR são curtos 4 a 50 repetições 16 a 200 pb para repetições de tetranucleotídeos e possuem múltiplas variantes de comprimento na população humana Mais de 20000 lócus STR de tetranucleotídeos foram caracterizados no genoma humano Mais de um milhão de STRs de todos os tipos podem estar presentes no genoma humano representando cerca de 3 de todo o DNA humano O comprimento de uma determinada STR em um dado indivíduo pode ser definido com a ajuda da reação em cadeia da polimerase ver Figura 79 O uso da PCR também torna o procedimento sensível o suficiente para ser aplicado em amostras bastante pequenas muitas vezes coletadas nas cenas de crime As sequências de DNA que flanqueiam as STRs são únicas para cada tipo de STR e são idênticas exceto para mutações muito raras em todos os humanos Os iniciadores da PCR são direcionados para esse DNA flanqueador e são desenhados para amplificar o DNA por toda a STR Figura 1a Então o comprimento do produto da PCR reflete o comprimento da STR naquela amostra Como todo ser humano herda um cromossomo de cada par de cromossomos a partir de cada um dos pais os comprimentos das STRs nos dois cromossomos muitas vezes são diferentes gerando dois comprimentos de STR distintos para um indivíduo Os produtos de PCR são submetidos à eletroforese em um gel de poliacrilamida muito fino em um tubo capilar As bandas resultantes são convertidas em um conjunto de picos que revelam o tamanho de cada fragmento de PCR com acuidade e assim o comprimento da STR no alelo correspondente A análise de múltiplos loci de STR pode gerar um perfil que é único para um indivíduo Figura 1b Isso costuma ser reali Tabela 1 Propriedades dos loci utilizados para o banco de dados CODIS Nome do lócus Cromossomo Motivo repetido Comprimento da repetição médiaª Número de alelos observados CSF1PO 5 TAGA 516 20 FGA 4 CTTT 122512 80 THO1 11 TCAT 314 20 TPOX 2 GAAT 416 15 VWA 12 TCTGTCTA 1025 28 D3S1358 3 TCTGTCTA 821 24 D5S818 5 AGAT 718 15 D7S820 7 GATA 516 30 D8S1179 8 TCTATCTG 720 17 D13S317 13 TATC 516 17 D16S539 16 GATA 516 19 D18S51 18 AGAA 7392 51 D21S11 21 TCTATCTG 12412 82 Amelogeninaa X Y Não aplicável Fonte Adaptada de J M Butler Forensic DNA Typing 2nd ed Academic Press 2006 p 96 Colchetes indicam repetições alternativas ªComprimentos das repetições na população humana Repetições parciais ou imperfeitas são observadas em alguns alelos Número de diferentes alelos observados na população humana A análise cuidadosa do mesmo lócus em vários indivíduos é um prérequisito para o seu uso na tipagem de DNA forense A amelogenina é um gene de tamanho levemente diferente nos cromossomos X e Y utilizado para estabelecer o sexo zado com um kit disponível comercialmente que inclui iniciadores da PCR para cada lócus ligados a corantes para ajudar a distinguir os produtos diferentes da PCR A amplificação por PCR permite aos pesquisadores obter genótipos STR a partir de menos de 1 ng de DNA parcialmente degradado uma quantidade que pode ser obtida a partir de um único folículo piloso uma gota de sangue uma pequena amostra de sêmen ou amostras que podem ter meses ou mesmo anos de idade Quando bons genótipos STR são obtidos a chance de errar na identificação é menor do que 1 em 10 18 um quintilhão O uso forense bemsucedido da análise por STR demandou uma padronização primeiro alcançada no Reino Unido em 1995 O padrão americano chamado Combined DNA Index System CODIS Gerenciamento de Bancos de Perfis Genéticos estabelecido em 1998 é baseado em 13 loci STR bem estudados que devem estar presentes em qualquer experimento de tipagem de DNA realizado fora dos Estados Unidos Tabela 1 O gene para amelogenina também é usado como marcador na análise Presente nos cromossomos sexuais humanos esse gene possui um comprimento levemente diferente nos cromossomos X e Y A amplificação por PCR ao longo desse gene é capaz portanto de gerar produtos de tamanhos diferentes que podem revelar o sexo do doador do DNA No início de 2010 o banco de dados CODIS continha mais de 7 milhões de genótipos STR e auxiliou mais de 100000 investigadores forenses A genotipagem do DNA tem sido usada tanto para a condenação quanto para a absolvição de suspeitos e para o estabelecimento da paternidade com um grau extraordinário de certeza O impacto desses procedimentos nos casos de tribunais continuará crescendo à medida que os padrões vão sendo refinados e que os bancos de dados de genotipagem STR internacionais aumentam Até mesmo mistérios muito antigos podem ser resolvidos Em 1996 a genotipagem de STR ajudou a confirmar a identificação dos ossos do último czar da Rússia e de sua família que foi assassinada em 1918 FIGURA 1 a Os loci STR podem ser analisados por PCR Iniciadores adequados para PCR com um corante ligado para auxiliar na detecção subsequente são desenhados para se anelar com sequências em cada lado da STR e amplificar a região entre elas Se as sequências STR possuem comprimentos diferentes nos dois cromossomos de um par de cromossomos de um indivíduo resultarão dois produtos de PCR de comprimentos distintos b Os produtos de PCR a partir da amplificação de até 16 loci STR podem ser submetidos a um gel de poliacrilamida com um único capilar A determinação de qual lócus corresponde a qual sinal depende da cor do corante fluorescente ligado ao iniciador usado no processo e da amplitude de tamanho na qual o sinal aparece a amplitude de tamanho pode ser controlada pelas sequências aquelas mais próximas ou mais distantes das STR que são alvo dos iniciadores de PCR desenhados Fonte b Cortesia de Carol Bingham Promega Corporation Lócus D7S820 Amplificação por PCR Alelo 1 Alelo 2 Submeter fragmentos de PCR a gel em capilar Rastrear bandas do produto de PCR derivadas do lócus D7S820 Fragmentos de PCR submetidos a gel no capilar 105 bp 175 bp 245 bp 315 bp 385 bp 1800 1200 600 0 16plex Iniciador de PCR marcado pelo corante Sequências STR a b Biologia Molecular 231