Cap 5 - Plantas Transgênicas

9\nPlantas transgênicas\n\nPlantas: vantagens e desvantagens para engenharia genética 324\nTransferência de genes para células vegetais 326\nAplicações da engenharia genética em plantas 330\nMelhoramento da planta e da colheita 330\nResistência a insetos 330\nResistência a vírus 333\nResistência a herbicidas 335\nRetardo na maturação dos frutos e fibras 337\nProdução de café descafeinado 339\nAlteração na cor de flores ornamentais 340\nAumento do valor nutritivo da planta 340\nTolerância ao sal 343\nOutros exemplos 344\nFábricas biológicas 344\nVacinas comestíveis 351\nFitoremediação 354\nBiocombustíveis 357\nSituação mundial das plantas transgênicas 358\nPerspectivas futuras 361\nResumo 363\n321 A modificação genética de plantas e animais é uma prática quase tão antiga quanto a própria civilização. Selecionar as sementes maiores para o plantio na próxima safra não deixa de ser um experimento genético, mesmo antes que os agricultores tivessem consciência disso. Das mutações que ocorrem casualmente em plantas e animais, o homem selecionou aquelas que são úteis ou interessantes e, por meio de engenhosos esquemas de cruzamento, essas características têm sido preservadas e estabelecidas. Dessa forma, a manipulação genética dos seres vivos tem sido realizada pela seleção dos melhores fenótipos e pelo cruzamento dirigido das classes parentais. A seleção cumulativa de características desejáveis, geração após geração, originou a diversidade hoje observada nos animais domésticos e nas plantas cultivadas.\n\nInicialmente, o processo de melhoramento genético era realizado de modo empírico. Entretanto, após a Segunda Guerra Mundial, com a melhor compreensão dos princípios genéticos, a incorporação de determinadas características no patrimônio genético de plantas e animais atingiu um nível profissional e, com isso, inúmeros sucessos foram alcançados. Os avanços genéticos nos processos de melhoramento, somados a maior mecanização, irrigação do solo, uso de fertilizantes e herbicidas, comumente empregados na agricultura moderna, e combate às pragas, causaram um dramático aumento na produtividade agrícola nas últimas décadas, que ficou conhecido como \"revolução verde\". Assim, a produção global de alimentos tem acompanhado a expansão da população mundial, permitindo até hoje que o trabalho de um número cada vez menor de produtores seja suficiente para suprir as necessidades do número crescente de habitantes.\n\nEntretanto, os métodos clássicos de melhoramento genético são lentos e incertos. Além disso, a introdução de um gene ou de um conjunto de genes, pelos métodos convencionais, requer repetidos cruzamentos, sendo, portanto, restrita às espécies com reprodução sexuada. Mais ainda, durante o processo de manipulação genética por cruzamentos forçados, outros genes também serão transferidos além daquele desejado. A engenharia genética supera essas dificuldades, acelerando o processo de domesticação de plantas e animais. Atualmente, uma combinação de técnicas permite isolar um gene específico que codifica uma característica desejada e transferir esse gene para outros organismos vivos a fim de adaptá-los aos nossos propósitos. O organismo que tem seu patrimônio genético alterado pela introdução de DNA exógeno é chamado de transgênico, enquanto o gene introduzido é denominado transgene e o conjunto de técnicas envolvidas nesse processo é designado transgenese. rística desejada e transferir esse gene para outros organismos vivos, a fim de adaptá-los aos nossos propósitos. O organismo que tem seu patrimônio genético alterado pela introdução de DNA exógeno é chamado de transgênico, enquanto o gene introduzido é denominado transgene e o conjunto de técnicas envolvidas nesse processo é designado transgênese.\n\nAo contrário dos métodos convencionais de cruzamento e seleção, na engenharia genética a transferência de genes não se limita a genes entre indivíduos de uma mesma espécie. A compatibilidade sexual, nesse caso, torna-se irrelevante. Além disso, permite que sejam introduzidas novas mudanças de modo muito mais preciso, com transferência de um único gene, enquanto cruzamentos convencionais envolvem mistura de milhares de genes, muitos dos quais com função desconhecida. Mais ainda, modificações genéticas podem ser realizadas em uma única geração, as quais, de outra forma, levariam dezenas ou centenas de gerações para serem estabelecidas, tornando o processo muito mais rápido. Outra vantagem do emprego de técnicas de engenharia genética é que podemos fazer com que os genes introduzidos sejam ativos somente em determinado estágio do desenvolvimento da planta ou em um órgão específico, tecido ou célula. Antes da introdução do gene, podemos também fazer mudanças específicas em sua sequência, de tal forma que a proteína por ele codificada apresente propriedades mais adequadas às nossas necessidades. E, finalmente, a natureza e a segurança da nova proteína produzida podem ser avaliadas antes de nos engajarmos em um programa de modificação genética de uma espécie vegetal. As mesmas vantagens aplicam-se a animais transgênicos.\n\nPlantas: vantagens e desvantagens para engenharia genética\n\nAs plantas apresentam uma série de características biológicas únicas, algumas significando vantagens, e outras, desvantagens, para a aplicação dos métodos de engenharia genética. As células vegetais apresentaram um invólucro rígido em torno da membrana celular (Figura 1.1B). Essa parede, composta de celulose, representa um grande empecilho para a introdução de um DNA exógeno. Além disso, em geral, as plantas crescem lentamente e apresentam gerações longas, especialmente se comparadas com os microorganismos. Outra desvantagem que os vegetais exibem para a manipulação genética é o tamanho muito grande do genoma. Algumas plantas exibem várias cópias de um cromossomo particular por célula ou várias cópias do genoma total em cada célula (poliploidia). Por exemplo, algumas espécies vegetais, nas quais se inclui a batata, apresentam um número cromossômico variando de 24 a 144 e o genoma haploide do milho (15 bilhões de pares de bases) é cinco vezes maior que o genoma humano. Isso pode confundir as análises genéticas, dificultando a observação de características recessivas. Por outro lado, algumas plantas apresentam grandes vantagens em relação aos animais para experimentos em engenharia genética. Muitas delas podem ser autofecundadas e, com isso, uma mutação presente em heterozigose pode ser transmitida gerando simultaneamente descendentes com o tipo selvagem, além de homozigotos e heterozigotos para a mutação. Além disso, como as plantas produzem um número grande de descendentes, mesmo mutações extremamente raras têm chance de ser detectadas. Mas, talvez, a característica mais notável que algumas plantas exibem seja a totipotência, isto é, a capacidade de se regenerarem em uma planta adulta completa a partir de uma única célula vegetal. Quando um tecido diferenciado é retirado de uma planta madura e colocado em meio de cultura estéril sob condições apropriadas (presença de hormônio de vegetal e nutrientes), as células frequentemente se desdiferenciam ao estado embrionário e crescem como uma massa altamente desorganizada, chamada callus. Se o callus for posteriormente transferido para um meio de cultura que favoreça a diferenciação (meio contendo hormônio vegetal apropriado), pequenas plantas irão se regenerar. Mais ainda, uma planta completa pode ser regenerada a partir de protoplastos, que são células vegetais onde a parede de célula foi retirada por meio de digestão enzimática. Esse extraordinário fenômeno representa a maior vantagem para a engenharia genética, pois, teoricamente, tudo que o geneticista deve fazer é transferir o gene desejado para uma célula, e a célula, geneticamente modificada, pode regenerar-se em uma planta transgênica. Entretanto, algumas plantas dicotiledôneas (aquelas cujas sementes têm dois cotilédones) são passíveis de crescer a partir de uma única célula. As plantas monocotiledôneas, que são as mais importantes eco- Transferência de genes para células vegetais Apesar de a parede de celulose representar uma barreira para a entrada de DNA em células vegetais, existe, na natureza, uma bactéria capaz de desempenhar essa função com grande eficiência. A Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria comum do solo e pode infectar certas plantas através de um ferimento (lesão do epiderme), provocando a proliferação descontrolada das células, o que forma um tumor. Mais ainda, essa bactéria é capaz de desviar o metabolismo da planta hospedeira, de tal forma que as células infectadas passam a sintetizar substâncias que, aparentemente, não interessam à planta, mas que são fundamentais para a bactéria, pois promovem a energia requerida para seu crescimento. Em outras palavras, a bactéria induz as células vegetais a trabalharem em benefício próprio. A capacidade de induzir tumores é controlada pela informação genética presente em um plasmídeo que a A. tumefacienscarrega, o qual é conhecido com plasmídeo Ti (Tumor inducing, isto é, plasmídeo indutor de tumor). O plasmídeo Ti é uma longa molécula circular de DNA, com aproximadamente 200kb, que se replica independentemente de DNA cromossômico da bactéria. Possui a propriedade única de injectar um segmento de seu DNA, o T-DNA, nas células da planta com as quais a bactéria entra em contato. Durante a infecção, o T-DNA (DNA transferido), contendo por volta de 23.000pb, é desprendido do plasmídeo e dirige-se para o núcleo da célula hospedeira, onde se integra ao cromossomo. A integração do T-DNA ocorre ao acaso no genoma da planta e, em muitos casos, suas múltiplas cópias podem integrar-se na mesma célula. Após a integração, o T-DNA passa a replicar-se como cromossomo da célula hospedeira. O segmento de T-DNA possui genes que estimulam o crescimento de tumor e que codificam as substâncias nutrientes importantes para a bactéria. No entanto, os genes que controlam a transferência do T-DNA, ou seja, aqueles resp- Infectação pela Agrobacterium tumefaciens em células vegetais, provocando o tumor devido à incorporação do T-DNA no genoma da planta. Os plasmídeos Ti desarmados, carregando o gene de interesse, são reintroduzidos nas bactérias A. tumefaciens, que serão utilizadas para infectar células indiferenciadas de callus em cultura, propostos pequenos discos recortados das folhas, cujas bordas são suscetíveis a infecções. Em qualquer uma dessas situações, uma planta adulta pode ser regenerada, com grau variável de dificuldade, na qual todas as células carregariam o gene exógeno transferido.\n\nEvidentemente, a transformação pelo T-DNA, embora represente um excelente sistema de transferência gênica, só é viável em plantas sujeitas à infecção pela bactéria A. tumefaciens, ou seja, os dicotiledôneas. Por muito tempo se considerou que as monocotiledôneas fossem resistentes à transformação por A. tumefaciens. Entretanto, como o refinamento do protocolo e adotando-se condições cuidadosamente controladas, foi possível transformar monocotiledôneas, como arroz e milho, utilizando A. tumefaciens. Outros métodos de transferência gênica em espécies vegetais incluem a microinjecção e a eletroporação, que serão discutidos no Capítulo 10. Entretanto, tais métodos exigem, como célula-alvo, protoplastos livres da parede celular, sendo assim apenas úteis somente nos casos em que é possível se regenerar uma planta adulta a partir de protoplastos. Um engenhoso método foi criado, o qual permite a transferência gênica para células vegetais intactas, incluindo cultura de células embrionárias ou de callus ou mesmo pequenos discos de folhas. Inicialmente, o DNA a ser transferido é precipit ado na superfície de diminutas partículas de tungstênio ou de ouro, que são, literalmente, atiradas no tecido-alvo. O processo funciona como se uma espingarda de chumbo fosse usada para bombardear micropartículas, com 1 a 4µm de diâmetro, diretamente para o interior da célula vegetal. Os microfósforos, causados pelo bombardeamento, não chegam a provocar lesões e os danos nas células e uma porção dos microfósforos, carregando DNA, atinge o núcleo das células causando a transformação (Figura 9.2). Uma vez dentro da célula, o DNA é liberado das partículas e integra-se ao DNA da planta. Estima-se que 10.000 células podem ser transformadas em cada procedimento de bombardeamento; entretanto, ao menos que o DNA seja realmente incorporado no genoma da planta, o DNA exógeno será eventualmente degradado. Por incrível que pareça, esse procedimento realmente funciona e tem sido utilizado com sucesso em espécies vegetais que se mostraram refratárias a outros métodos de transformação e/ou regeneração a partir de protoplastos, como as monocotiledôneas. Outra vantagem desse método é que permite a introdução de grandes segmentos de DNA em plantas usando vetor YAC (Capítulo 2). Isso possibilita a produção de plantas transgênicas com vários genes exógenos. Atualmente, o uso do vetor Ti e o método de bombardear são as técnicas preferidas pela maioria dos pesquisadores para a transferência de DNA em células de planta. 1–4μm\nMicropartículas de tungstênio\n\nGene clonado\nPlasmídeo\n\nDNA precipitado nas micropartículas\n\nDisparador\n\nCélulas ou tecido-alvo\n\nMicropartículas\n\nCâmara a vácuo\n\nVacúolo\n\nCitoplasma\n\nMicropartícula no interior da célula\n\nNúcleo\n\nParede celular\n\nFigura 9.2 - Transferência gênica por bombardeamento de micropartículas. bombardeamento são as técnicas preferidas pela maioria dos pesquisadores para a transferência de DNA em células de planta. Arabidopsis thaliana é uma planta pequena, sem maior significado agronômico, entretanto apresenta importantes vantagens para a manipulação genética.\n\n• Genoma pequeno e totalmente sequenciado em 2000.\n\n• Mapa genético extenso de todos os cinco cromossomos.\n\n• Ciclo de vida rápido (cerca de seis semanas da germinação às sementes maduras).\n\n• Produção abundante de sementes e fácil cultivo em espaço restrito.\n\n• Transformação eficiente pela Agrobacterium tumefaciens.\n\nPor essas razões, essa planta tem sido frequentemente usada no desenvolvimento de plantas transgênicas, mesmo que após a fase inicial de experimentos a transferência deva ser repetida na planta de interesse.\n\nAplicações da engenharia genética em plantas\n\nMelhoramento da planta e da colheita\n\nResistência a insetos – insetos predadores de plantas representam uma das causas de grandes prejuízos na agricultura. Aproximadamente 15% da produção agrícola mundial é perdida por ano devido ao ataque de insetos, sendo que essa taxa pode dobrar em países tropicais. Em situações extremas, a queda na produção pode chegar a 70%, como no caso de plantação de batata quando atacada pelo besouro Colorado, ou airmara-se ao cultivo de gafanhotos na África. Além disso, plantas atacadas por insetos são mais suscetíveis à infecção por fungos, uma vez que fungos patogênicos frequentemente invadem a planta carregados pelos insetos ou lesões provocadas por estes. Uma forma de se lidar com esse problema é utilizando inseticidas químicos que, entretanto, apresentam alto custo possibilidade que tem sido aplicada menos extensivamente e é contraestratégia nunca 100% efetiva. Por outro lado, a vantagem dos inseticidas biológicos é que atuam em concentrações muito baixas que tam perigos para os prováveis consumidores dos vegetais. A bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), comum no solo, produz uma proteína tóxica para as larvas de vários insetos. Entretanto, essa proteína não persiste no meio ambiente nem é prejudicial aos insetos não suscetíveis ou aos vertebrados e, portanto, representa uma forma segura de proteger as plantas. Na verdade, extratos dessa bactéria têm sido largamente aplicados por vários anos em plantações, mas, infelizmente, a produção para uso comercial ainda é restrita e o efeito de proteção às plantas dura por um curto período de tempo. Além disso, algumas pragas importantes economicamente se alimentam de tecidos internos do vegetal e assim são dificilmente controladas por toxinas da B. thuringiensis que tenham sido pulverizadas na superfície da planta.\n\nO gene de Bt, que codifica a proteína tóxica, pode ser transferido para plantas com a finalidade de torná-las resistentes a determinados insetos. A estratégia que tem sido utilizada é ligar o gene da toxina a sequências promotoras que assegurem sua expressão nas células vegetais e, com o auxílio do T-DNA, introduzir o gene em plantas que passarão a expressar grandes quantidades dessa proteína. Assim, quando a larva se alimenta da planta, durante a digestão, enzimas presentes em seu trato intestinal quebram a proteína gerando um fragmento ativo tóxico, que provoca a lise das células do epitélio intestinal, causando a morte de grande porcentagem das larvas. A herança mendeliana do gene Bt em plantas transgênicas indica a integração estável do gene no genoma da planta e os testes no campo demonstraram que, em alguns casos, as plantas transgênicas foram muito menos atacadas por insetos que plantas controle não transformadas, das quais perderam completamente as folhas. Além disso, a expressão do gene em todos os tecidos da planta garante proteção mesmo em regiões de difícil acesso à pulverização de inseticidas, como as raízes. Mais ainda, no caso da batata, a análise das plantas geneticamente transformadas indicou que o produto respeita os padrões de qualidade exigidos, inclusive o sabor. O desafio científico desses abordagens é fazer com que a planta expresse e sintetize uma forma funcional da toxina procariota em níveis suficientes para prevenir ataque por insetos. Em um esforço para se aumentar a expressão gênica, os pesquisadores têm provocado alterações no gene da toxina, de modo a tornar o processo de transcrição mais eficiente em plantas eucariotas ou a eliminar estruturas secundárias no mRNA. Plantas transgênicas transformadas com esses genes modificados chegaram a apresentar um nível de expressão da toxina 100 vezes maior que plantas que não foram transformadas com o gene selvagem. Mais ainda, o alto nível de síntese da toxina está diretamente relacionado com o aumento na atividade inseticida.