Relatório de Biologia Molecular

Olá estudante Estamos aqui para informar o calendário acadêmico 20252 do Módulo A da disciplina Biologia Molecular D20252E Verifique abaixo as datas das avaliações Atividade de Aula Prática AV1 AV2 2ª chamada da AV2 e AV Final entre outras informações pertinentes a datas Início da disciplina do Módulo A 17112025 Prazo de envio da AV1 10122025 Lembrando que a AV1 é para ser realizada de acordo com os vídeos de aula prática disponibilizado aqui no portal Prazo de realização da Avaliação AV2 10122025 a 15122025 Prazo de realização da Segunda Chamada 16122025 a 18122025 Prazo de realização da Avaliação Final 27122025 a 30122025 RELATÓRIO DE PRÁTICA Nome e matrícula TEMA DE AULA EXTRAÇÃO DE DNA 1 INTRODUÇÃO O DNA ácido desoxirribonucleico é o material genético responsável por armazenar e transmitir informações hereditárias em todos os seres vivos A extração de DNA permite visualizar sua estrutura macroscópica reforçando conceitos como composição celular membranas organelas e processos químicos associados à lise celular O objetivo deste experimento foi extrair o DNA de morangos utilizando materiais simples permitindo observar as etapas necessárias para romper células liberar o DNA e tornálo visível sem o uso de equipamentos laboratoriais complexos 1 Materiais Utilizados Morango maduro Água Detergente neutro Sal Álcool etílico gelado 70 ou 96 Saco plástico ou recipiente para maceração Copo de béquer ou transparente Filtro de papel ou peneira fina Bastão palito ou agitador 2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL E OBSERVAÇÕES 31 ETAPA 1 MACERAÇÃO DO MORANGO Inserir foto da etapa aqui O morango foi colocado dentro de um saco plástico e esmagado até formar uma mistura pastosa homogênea Observação visual A polpa ficou líquida com coloração vermelha intensa e pequenos fragmentos de células Processo biológico envolvido Nesta etapa ocorre a ruptura mecânica dos tecidos vegetais rompendo paredes celulares e facilitando o acesso aos componentes internos incluindo o DNA A parede celular do morango rica em celulose começa a ser degradada fisicamente pela pressão aplicada 32 ETAPA 2 ADIÇÃO DA SOLUÇÃO EXTRATORA DETERGENTE SAL Inserir foto da etapa aqui O detergente e o sal foram adicionados e a mistura foi agitada levemente Observação visual A solução tornouse mais espessa e homogênea Processo biológico O detergente rompe a membrana plasmática e as membranas das organelas celulares como o núcleo ao dissolver os fosfolipídios presentes nessas estruturas O sal NaCl tem função de neutralizar cargas negativas do DNA permitindo sua futura aglomeração e precipitação 33 ETAPA 3 FILTRAÇÃO Inserir foto da etapa aqui A mistura foi filtrada para remover partículas sólidas Observação visual O filtrado apresentou aspecto líquido e translúcido com coloração rosada Processo biológico A filtração separa o material sólido restos celulares sementes fibras e parede celular da solução contendo o DNA diluído e proteínas dissolvidas 34 ETAPA 4 PRECIPITAÇÃO COM ÁLCOOL GELADO Inserir foto da etapa aqui Álcool gelado foi adicionado lentamente ao filtrado formando uma fase separada Observação visual Um material esbranquiçado e filamentoso começou a aparecer na interface entre o álcool e o filtrado esse material corresponde ao DNA precipitado Processo biológico O DNA é solúvel em água porém insolúvel em álcool frio Quando o álcool é adicionado o DNA precipita e se torna visível formando uma massa fibrosa 35 ETAPA 5 COLETA DO DNA Inserir foto da etapa aqui Com auxílio de um palito o DNA foi coletado Observação visual O DNA apresentou textura viscosa elástica e coloração esbranquiçada ou translúcida TEMA DE AULA ELETROFORESE 1 EQUIPAMENTOS E REAGENTES ESSENCIAIS COM FUNÇÃO EQUIPAMENTOS Inserir foto da etapa aqui 1 Fonte de alimentação power supply Fornece a diferença de potencial voltagem corrente que move as moléculas através do gel Deve permitir ajustar tensão V e preferencialmente corrente mA 2 Câmara de eletroforese gel box Contém o gel e o tampão durante a corrida possui eletrodos ânodocátodo e permite manter a polaridade correta 3 Molde casting tray e pente comb Moldam o gel o pente forma os poços onde as amostras são carregadas 4 Banho de aquecimento placa hotplate opcional Para dissolver o agarose uniformemente ao preparar o gel 5 Transiluminador UV ou leitor de luz azul bluelight Permite visualizar bandas de DNARNA após coloração A luz azul é mais segura quando usada com corantes que funcionam em luz visível 6 Câmara de imagem gel doc ou smartphone com suporte Fotografia e documentação das bandas 7 Micropipetas e ponteiras A aplicação precisa de amostras marcadores e tampões 8 Balança opcional e copos medidores Preparação de soluções e medição de massavolume 9 Centrífuga de bancada opcional Para clarificar amostras antes de carregar por ex retirar detritos 10EPI luvas óculos de proteção avental Segurança imprescindível quando se usa corantes ou trabalho com UV REAGENTESCONSUMÍVEIS Inserir foto da etapa aqui 1 Agarose ou acrilamida para PAGE Material do gel forma a matriz porosa que separa moléculas por tamanho 2 Tampão de corrida TAE ou TBE Mantém pH e condutividade elétrica fornece íons para a condução da corrente 3 Marcador de massa molecular DNA ladder marker Padrão com fragmentos de tamanhos conhecidos para estimar o tamanho das amostras 4 Corante de carga loading dye Contém glicerol para afundar a amostra no poço e corantes de acompanhamento tracking dyes que informam o progresso da corrida 5 Dye de coloração EtBr SYBR Safe GelRed GelGreen etc Torna o DNARNA visível sob luz UVazul EtBr é sensível porém mutagênico alternativas mais seguras existem 6 Água ultrapura e reagentes para preparar tampões Tris acético EDTA borato Componentes de TAETBE 7 Solventessoluções para preparação de amostras Ex tampão de PCR água formamida para géis desnaturantes de RNA SDS em gels nativos quando necessário 8 Redutordesnaturante para PAGE desnaturante Ex uréiaformamida para separar moléculas de RNAssDNA por tamanho sem estruturas secundárias 9 Etanolácido acético opcional Para fixação ou purificação posterior de bandas 2 ETAPAS DETALHADAS DO PROCEDIMENTO DA PREPARAÇÃO À VISUALIZAÇÃO A Preparação do gel 1 Escolha do tipo e concentração do gel agarose para DNA genômicoamplicons acrilamida para pequenos fragmentos ou alta resolução 2 Dissolução da agarose em tampão aquecendo até completo esfriamento inicial 3 Adição do corante podese misturar corante de coloração direto ao gel ex SYBR Safe ou corar após a corrida imersão do gel em solução de corante 4 Despejar o gel no molde e inserir o pente deixar solidificar em temperatura ambiente Inserir foto da etapa aqui B Preparação das amostras 1 Misturar amostra com loading dye proporção geralmente 15 ou conforme instrução O dye contém glicerol para densidade e corantes para monitoramento 2 Se necessário denaturar a amostra ex aquecer PCR products com formamida para certas aplicações para RNA ou quando se quer evitar estruturas secundárias 3 Centrifugar brevemente para coletar o conteúdo no fundo do tubo C Montagem da corrida 1 Retirar o pente e posicionar o gel na câmara cobrir com tampão de corrida até cobrir completamente o gel 2 Carregar as amostras nos poços com cuidado incluindo o marcador de massa em pelo menos um poço 3 Fechar a tampa e conectar a fonte certificar polaridade DNA migra para o ânodo positivo porque é negativo pelo grupo fosfato D Condições de corrida 1 Ajustar voltagem regra prática 510 Vcm volts por comprimento entre eletrodos Ex se distância eletrodos 8 cm usar 4080 V Para corridas rápidas podese usar tensões maiores mas com risco de aquecimento e perda de resolução 2 Tempo de corrida depende do tamanho esperado dos fragmentos e da voltagem monitorar pelas cores do tracking dye E Finalização e visualização 1 Desligar a fonte remover o gel da câmara 2 Coloração se não adicionada ao gel submergir o gel em solução de corante por tempo recomendado e depois lavar 3 Visualização colocar o gel no transiluminador UV ou sob luz azul e fotografar com gel doc Usar filtros adequados 4 Interpretação comparar bandas com ladder para estimar tamanho intensidade pode sugerir quantidade relativa F Observações e dicas práticas Evitar bolhas e vazamentos no gel casting bolhas nos poços prejudicam o carregamento Equilíbrio tampãogel sempre usar tampão fresco e suficiente para cobrir o gel Aquecimento evitar excesso de voltagem que aqueça o gel aquece bandas borradas Segurança ao usar EtBr tomar cuidado com descarte e usar luvas proteger olhospele contra UV Inserir foto da etapa aqui 3 IMPORTÂNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE GEL E IMPACTO NA RESOLUÇÃO PRINCÍPIO FÍSICO A matriz do gel atua como malha porosa moléculas menores passam mais facilmente pelos poros e migram mais rápido moléculas maiores retardam mais O tamanho médio dos poros depende da concentração do gel concentrações maiores poros menores melhor separação de moléculas pequenas concentrações menores poros maiores melhor migração e separação de fragmentos grandes Agarose faixa típica e aplicações 0305 separa fragmentos muito grandes 10 kb a dezenas de kb Usado para DNA genômico grande 0710 bom para fragmentos de 110 kb 1215 adequado para fragmentos de 5003000 bp PCR products comuns 20 ou mais separação de fragmentos pequenos 50500 bp para produtos de PCR curtos e fragmentos de restrição pequenos Observação acima de 3 agarose fica difícil de manejar para altíssima resolução de fragmentos 100 bp usase PAGE polímero de acrilamida Acrilamida PAGE PAGE oferece controle fino da concentração T e C e é usado quando alta resolução é necessária ex diferenciação de fragmentos com diferença de poucos nucleotídeos análise de proteínas ou eletroforese desnaturante para RNA Denaturing PAGE com uréia separa por tamanho sem interferência de estrutura secundária Concretamente como a concentração afeta resolução Concentração baixa poros grandes pequenas diferenças de tamanho entre fragmentos não serão resolvidas mas fragmentos grandes migrarão sem travar Concentração alta poros pequenos excelente resolução para fragmentos pequenos mas fragmentos grandes podem ficar retidos ou migrar muito lentamente formando bandas largas ou ausentes Tradeoff escolher a concentração que coloca os tamanhos de interesse no regime ótimo de separação geralmente querse que as bandas estejam no meio do gel com bom espaçamento entre elas