PCR em Tempo Real: Guia Completo sobre PCR Quantitativo e Suas Aplicações

PCR EM TEMPO REAL PCR QUANTITATIVO PCR em tempo real X PCR Tradicional Starting Template PCR Round 1 2X Template PCR Round 2 4X Template Análise Realtime Constante detecção e monitoramento dos produtos de amplificação durante toda corrida emissão de fluorescência 3040 ciclos PCR tradicional Deteção do produto no gel de agarose Log DNA Log DNA ciclos ciclos Geométrica Geométrica Plateau Plateau Linear Linear Gel EtBr Gel EtBr Fases da PCR CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1024 11 2048 12 4096 13 8192 14 16384 15 32768 16 65536 17 131072 18 262144 19 524288 20 1048576 21 2097152 22 4194304 23 8388608 24 16777216 25 33554432 26 67108864 27 134217728 28 268435456 29 536870912 30 1073741824 31 1400000000 32 1500000000 33 1550000000 34 1580000000 0 200000000 400000000 600000000 800000000 1000000000 1200000000 1400000000 1600000000 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1000000000 10000000000 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA Vantagens PCR em Tempo Real PCR convencional Coleta de dados na fase exponencial SEM manipulação pósPCR Resultados quantitativos Requer concentrações de DNAcDNA 1000 x Tempo de reação reduzido Maior reprodutibilidade sensibilidade e precisão Coleta de dados na fase final da reação plateau Manipulação pósPCR Preparação de gel de agarose visualização Resultados qualitativos Requer concentrações maiores de DNAcDNA Muito tempo para obter resultados PCR EM TEMPO REAL REAL TIME É uma técnica de laboratório baseado na PCR que é usado para amplificar e simultaneamente quantificar uma molécula de DNA alvo Dois métodos podem ser utilizados na detecção de produtos de PCR em tempo real Nãoespecífico corantes fluorescentes intercalam com qualquer DNA duplahélice SyberGreen Sequência específica sondas de DNA que consiste de oligonucleotídeos que são rotuladas com um repórter fluorescente que permite a detecção somente após hibridização da sonda com o DNA alvo complementar Applied Biosystems 7500 RealTime PCR System Sistema TaqMan sequência específica A sonda é constituída por 2 fluoróforos Quencher fluorophore Q extremidade 3 Reporter R fluorophore extremidade 5 Ligação do primer e da sonda ao DNA após a desnaturação do DNA Taq polimerase adiciona nucleotídeos e remove a sonda TaqMan Isto separa o Reporter do Quencher permintindo que a energia liberada a partir do desligamento do repórter seja detectada através de um software TaqMan Denature Anneal Extend A seta indica o ciclo em que a reação ultrapassa o limite da reação negativa Quanto menor a quantidade de DNA molde no tubo de reação maior o número de ciclos necessários para ultrapassar o limite da negatividade A reação de PCR no TaqMan emprega em geral apenas duas temperaturas 94 oC para desnaturação e 60 oC para hibridização e extensão e o resultado da PCR pode ser obtido em menos de 30 minutos Gráfico obtido com o TaqMan O plot da amplificação mostra 3 fases distintas Linha basal não houve clivagem suficiente do coranterepórter para que se possa detectar a fluorescência ou seja não há produtos de PCR suficientes para detectar fluorescência Fase log a quantidade de amplicon dobra a cada ciclo Fase platô não há mais aumento no número de amplicons PCR EM TEMPO REAL Fluorescence copies Cycle Number copies crossing line Cycle Number log Concentration Detecção do produto gerado na amplificação com o corante fluorescente SYBR Green SYBR Green É um fluoróforo em suspensão intercalante de DNA dupla fita que emite uma fluorescência verde com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador Durante a PCR as moléculas do SYBR Green vão se ligando ao DNA recém sintetizado Um aumento da fluorescência é observado em tempo real o que possibilita o monitoramento contínuo da reação Primer SYBR Green Emitted Light Polymerase SYBR Green Denature Anneal Extend Taq O sistema de quantificação em tempo real tem tido as seguintes aplicações Análise de expressão gênicaRNA total RT PCR Identificação de alelos em DNA genômico Análise de seqüências virais bacterianas ou de protozoários a partir de várias fontes Análise de patógenos em alimentos Análise de produtos transgênicos Determinação de carga viral HIV HCV Acompanhamento de terapia Monitoramento pós terapia