Propriedades Básicas da Replicação do DNA

Replicação do DNA Profa Pricila da Silva Cunha Disciplina Biologia Molecular Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais Propriedades básicas da replicação do DNA A replicação duplicação do DNA é o processo pelo qual uma molécula de DNA fita dupla é copiada para produzir duas moléculas de DNA idênticas à molécula mãe PROPRIEDADES BÁSICAS DA REPLICAÇÃO DO DNA A replicação do DNA segue um conjunto de regras fundamentais 1 A replicação do DNA é semiconservativa Cada fita de DNA funciona como molde para a síntese de uma nova fita produzindo duas novas moléculas de DNA cada qual com uma fita antiga e uma fita recém sintetizada Watson e Crick propuseram a hipótese de replicação semiconservativa logo após a publicação de seu artigo em 1953 sobre a estrutura do DNA e a hipótese foi comprovada por experimentos projetados e realizados por Matthew Meselson e Franklin Stahl em 1957 Propriedades básicas da replicação Experimento de MeselsonStahl Propriedades básicas da replicação do DNA 2 A replicação começa em uma origem e em geral segue bidirecionalmente John Cairns 1963 ao cultivar células de E coli em um meio contendo timidina marcada com trítio 3H produziu moléculas de DNA radioativas que permitiram a ele concluir que Ambas as fitas de DNA são replicadas simultaneamente A replicação de cromossomos bacterianos é bidirecional ambas as extremidades da volta possuem forquilhas de replicação ativas Forquilhas de replicação locais onde o DNA parental está sendo desenrolado e as fitas estão sendo rapidamente replicadas Ross Inman e colaboradores realizaram ensaios com o cromossomo do bacteriófago λ e demonstraram que o DNA poderia ser seletivamente desnaturado em sequências ricas em pares de bases A T Eles concluíram que A replicação sempre se inicia em um único ponto chamado de origem de replicação Propriedades básicas da replicação Visualização da replicação do DNA Estágios na replicação de DNA circular visualizados por microscopia eletrônica As eletromicrografias mostram imagens de plasmídeos de DNA sendo replicados a partir de uma única origem de replicação Propriedades básicas da replicação do DNA 3 A síntese de DNA ocorre na direção 53 e é semidescontínua Uma nova fita de DNA é sempre sintetizada na direção 53 dessa forma a fita molde é sempre lida a partir da extremidade 3 em direção à extremidade 5 A fita retardada é sintetizada descontinuamente em pequenos pedaços fragmentos de Okazaki em uma direção oposta àquela em que a forquilha de replicação se move E o que significa dizer que a síntese de DNA é semidescontínua A fita líder é sintetizada continuamente na direção adotada pela forquilha de replicação Mecanismo elucidado por Reiji Okazaki e colaboradores na década de 1960 Propriedades básicas da replicação do DNA Síntese de DNA semidescontínua e na direção 53 Enzimas e DNA Existem duas classes gerais de enzimas que degradam o DNA Exonucleases degradam os ácidos nucleicos a partir da extremidade 5 ou 3 Endonucleases iniciam a degradação em sítios internos específicos na molécula de ácido nucleico reduzindoa a fragmentos cada vez menores A síntese de DNA é realizada por enzimas denominadas DNApolimerases DNApolimerase I Primeira DNApolimerase a ser isolada e caracterizada DNApolimerase de E coli purificada e caracterizada por Arthur Kornberg e colaboradores em 1955 codificada pelo gene polA ENZIMAS E DNA IMPORTANTE Atualmente sabemos que o mecanismo de ação da DNApolimerase de E coli é comum ao de todas as DNApolimerases Síntese de DNA pela DNApolimerase SÍNTESE DE DNA PELA DNAPOLIMERASE Todas as DNApolimerases precisam de uma fita simples não pareada para atuar como molde Todas as DNApolimerases precisam de um primer iniciador Muitos iniciadores são oligonucleotídeos de RNA em vez de DNA IMPORTANTE Síntese de DNA pela DNApolimerase O sítio ativo da DNApolimerase apresenta duas partes Sítio de inserção local onde ocorre a adição de nucleotídeos Sítio de pósinserção local para onde o novo par de bases migra depois que o nucleotídeo foi adicionado Síntese de DNA pela DNApolimerase O núcleo da maioria das DNApolimerases tem um formato semelhante ao de uma mão humana que envolve o sítio ativo DNApolimerase I de Thermus aquaticus ligada ao DNA A replicação tem alto grau de precisão A REPLICAÇÃO TEM ALTO GRAU DE PRECISÃO A replicação do DNA ocorre com extraordinário grau de fidelidade Exemplo Em E coli um erro acontece apenas a cada 109 a 1010 nucleotídeos adicionados Para o cromossomo de E coli de aproximadamente 46 x 106 pb isso significa um erro a cada 1000 a 10000 replicações O que explica essa precisão na replicação do DNA 1 Seleção de bases Seleção a partir da geometria dos pares de bases A T e G C Bases pareadas incorretamente apresentam uma geometria que geralmente não é capaz de encaixar no sítio ativo da DNApolimerase A replicação tem alto grau de precisão 2 Atividade de exonuclease 3 5 atividade de revisão Remoção de nucleotídeos malpareados Mecanismo intrínseco a praticamente todas as DNApolimerases Na DNApolimerase I as atividades de polimerização e revisão possuem sítios ativos separados no interior do mesmo polipeptídeo Se a polimerase adicionar um nucleotídeo errado a translocação da enzima para a posição onde o próximo nucleotídeo seria adicionado é inibida Essa pausa fornece a oportunidade para uma correção A atividade de exonuclease 3 5 remove o nucleotídeo malpareado e a polimerase reinicia novamente 3 Reparo de malpareamento mismatch Sistema multienzimático que repara bases malpareadas mismatched que permaneceram após a replicação DNApolimerases de E coli DNAPOLIMERASES DE E coli A E coli organismo modelo utilizado nos estudos de replicação possui pelo menos cinco DNApolimerases 1 DNApolimerase I Pol I Possui três domínios Um domínio com atividade de polimerização Um domínio com atividade exonuclease 3 5 revisão Um domínio com atividade exonuclease 5 3 Fragmento de Klenow nome dado ao fragmento da DNApolimerase I que contém as atividades de polimerização e de revisão Função da DNApolimerase I promove uma reação chamada de tradução de corte nick translation processo importante no reparo de DNA e na remoção dos iniciadores de RNA durante a replicação DNApolimerases de E coli DNApolimerases de E coli Tradução de corte nick translation DNApolimerases de E coli 2 DNApolimerase II Pol II Possui dois domínios Um domínio com atividade de polimerização Um domínio com atividade de exonuclease 3 5 revisão Função da DNApolimerase II participa em um tipo de reparo do DNA recombinação homóloga 3 DNApolimerase III Pol III Possui dois domínios Um domínio com atividade de polimerização Um domínio com atividade de exonuclease 3 5 revisão Função da DNApolimerase III principal enzima da replicação em E coli DNApolimerases de E coli O complexo carregador de braçadeiras também é conhecido com complexo γ DNApolimerase III enzima sem as subunidades β braçadeiras β DNApolimerase III holoenzima enzima com as subunidades β DNApolimerases de E coli A braçadeira β aumenta a processividade da enzima pois evita a dissociação da DNApolimerase III do DNA As duas subunidades β da polimerase III de E coli formam uma braçadeira circular que envolve o DNA Arquitetura da DNApolimerase III de Ecoli DNApolimerases de E coli 4 DNApolimerase IV Pol IV e DNApolimerase V Pol V Ambas as enzimas somente foram identificadas em 1999 e estão envolvidas em uma forma incomum de reparo do DNA não possuem atividade revisora IMPORTANTE A replicação do DNA não depende apenas da DNApolimerase mas de várias enzimas e proteínas diferentes cada uma realizando uma tarefa específica O conjunto inteiro responsável pela replicação do DNA é denominado sistema de DNA replicase ou replissomo E quais são as principais enzimas e proteínas que fazem parte do replissomo Replissomo Principais enzimas e proteínas componentes do replissomo Helicases Proteínas DnaB promovem a separação das duas fitas de DNA utilizando energia do ATP Topoisomerases aliviam o estresse topológico gerado pela separação das duas fitas de DNA Proteínas de ligação ao DNA SSB ligamse ao DNA de fita simples mantendo as duas fitas separadas Primases proteína DnaG sintetizam os iniciadores de RNA DNAligases catalisam a formação de uma ligação fosfodiéster entre 3OH na extremidade de uma fita de DNA e 5P na extremidade da outra fita DNApolimerases Replicação do cromossomo de E coli REPLICAÇÃO DO CROMOSSOMO DE E coli A síntese de uma molécula de DNA pode ser dividida em três estágios iniciação alongamento e terminação Descrição de resultados obtidos a partir de experimentos in vitro utilizando proteínas purificadas de E coli os princípios básicos desse processo são altamente conservados em todos os sistemas de replicação Replicação do cromossomo de E coli ESTÁGIO 1 INICIAÇÃO Origem de replicação de E coli oriC possui 245 pb e contém elementos sequenciais de DNA que são altamente conservados entre origens de replicação bacterianas Elemento de desenrolamento de DNA DUE região rica em pares de bases A T Sítios R e Sítios I locais de ligação para a proteína DnaA pertencente à família AAA ATPase ATPases associadas a diversas atividades celulares A ligação de DnaA nos sítios R e I resulta na desnaturação da região DUE Sítio IHF local de ligação da proteína IHF que estimula a iniciação Sítio FIS local de ligação da proteína FIS que estimula a iniciação Origem de replicação de E coli oriC Replicação do cromossomo de E coli E como ocorre o início da replicação na oriC DnaB helicase separa as duas fitas de DNA desenrola o DNA DnaC proteína pertencente à família AAA ATPase e fundamental para a ligação da DnaB na origem de replicação Importante Uma vez ligadas ao DNA as helicases DnaB se movimentam em direções opostas criando duas forquilhas de replicação potenciais Replicação do cromossomo de E coli A oriC de E coli contém 11 sequências 5GATC Imediatamente após a replicação o DNA permanece hemimetilado as fitas parentais têm sequências 5GATC metiladas mas as fitas recentemente sintetizadas não Para que um novo ciclo de replicação tenha início é necessário que o DNA esteja totalmente metilado pela Dam metilase Replicação do cromossomo de E coli ESTÁGIO 2 ALONGAMENTO A fase de alongamento da replicação inclui dois eventos distintos porém relacionados a síntese da fita líder e a síntese da fita retardada IMPORTANTE A síntese dos iniciadores de RNA 10 a 60 nucleotídeos pela primase ocorre durante a síntese de ambas as fitas líder e retardada nesse último caso o iniciador de RNA é sintetizado antes de cada fragmento de Okazaki Algumas enzimas e proteínas importantes nesse estágio são DnaB helicase desenrola o DNA Proteínas de ligação ao DNA SSB ligamse ao DNA de fita simples mantendo as duas fitas separadas Primase DnaG sintetiza os iniciadores de RNA DNAtopoisomerase II DNA girase alivia o estresse topológico gerado pela separação das duas fitas de DNA Replicação do cromossomo de E coli DNApolimerase III sintetiza as novas fitas de DNA DNApolimerase I realiza a excisão do RNA iniciador atividade exonuclease 53 e sua substituição por DNA atividade de polimerase DNAligase catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre 3OH na extremidade de uma fita de DNA e 5P na extremidade da outra fita Primossomo unidade funcional do complexo de replicação formada pela helicase DnaB e pela primase DnaG E como ocorre o alongamento das fitas líder e retardada Síntese do DNA nas fitas líder e retardada Replicação do cromossomo de E coli Uma vez que um fragmento de Okazaki tenha se completado seu iniciador de RNA é removido e substituído por DNA pela DNApolimerase I e o corte remanescente é selado pela DNAligase Etapas finais na síntese dos segmentos da fita retardada Replicação do cromossomo de E coli Mecanismo de reação da DNAligase Replicação do cromossomo de E coli ESTÁGIO 3 TERMINAÇÃO As duas forquilhas de replicação se encontram em uma região que contém múltiplas cópias de uma sequência de 20 pb denominada Ter que funcionam como sítios de ligação para a proteína Tus Replicação do cromossomo de E coli Quando qualquer uma das forquilhas de replicação encontra um complexo TusTer ela para a outra forquilha para quando encontra a primeira forquilha já parada As poucas centenas finais de pb de DNA entre esses complexos proteicos são replicados formamse dois cromossomos circulares topologicamente interligados catenanos que são separados pela topoisomerase IV Replicação em células eucarióticas REPLICAÇÃO EM CÉLULAS EUCARIÓTICAS As características essenciais da replicação do DNA são as mesmas em eucariotos e procariotos entretanto tratase de um processo mais complexo nos eucariotos A replicação segue bidirecionalmente a partir de múltiplas origens de replicação nos cromossomos das células eucarióticas Origens de replicação apresentam uma estrutura bem caracterizada em alguns eucariotos inferiores mas são menos conhecidas em eucariotos superiores Exemplo A levedura S cerevisiae tem origens de replicação definidas denominadas sequências de replicação autônomas ARS ou replicadores que se estendem por aproximadamente 150 pb Montagem dos complexos préreplicativos préRC nas origens de replicação Carregamento da helicase MCM27 pelas proteínas ORC complexo de reconhecimento de origem CDC6 e CDT1 Replicação em células eucarióticas Montagem de um complexo préreplicativo em uma origem de replicação eucariótica Replicação em células eucarióticas DNApolimerases e proteínas associadas com a replicação dos cromossomos nucleares dos eucariotos DNApolimerase α atividade de polimerase e de primase Não possui atividade de revisão exonuclease 3 5 o que a torna inadequada para a replicação de DNA de alta fidelidade Atuação apenas na síntese de iniciadores de RNA DNApolimerase δ atividade de polimerase e de revisão Função análoga à da DNA polimerase III bacteriana síntese das fitas líder e retardada PCNA antígeno nuclear de proliferação celular proteína com função análoga à da braçadeira β aumenta a processividade da DNApolimerase δ Replicação em células eucarióticas DNApolimerase ε função análoga à da DNApolimerase I bacteriana remoção dos iniciadores de RNA e substituição por DNA RPA proteína de replicação A proteína com função análoga à das proteínas SSB da replicação bacteriana ligamse ao DNA de fita simples mantendo as duas fitas separadas RFC fator de replicação C complexo proteico com função semelhante ao complexo carregador de braçadeiras complexo γ bacteriano carregador de braçadeiras para PCNA que facilita a montagem dos complexos de replicação ativos IMPORTANTE Nos cromossomos eucariontes lineares o término da replicação envolve a síntese de estruturas especiais denominadas telômeros catalisada pela enzima telomerase