Transcrição e Síntese de RNA: Conceitos Básicos e Mecanismos

Transcrição Profa Pricila da Silva Cunha Disciplina Biologia Molecular Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais Introdução RELEMBRANDO RNA macromolécula fita simples formada por nucleotídeos unidos por ligações fosfodiéster O RNA apresenta uma grande diversidade de funções RNA mensageiro mRNA codifica a sequência de aminoácidos de uma ou mais proteínas RNA transportador tRNA molécula adaptadora na síntese proteica RNA ribossomal rRNA componente dos ribossomos RNAs com funções regulatórias catalíticas ou que são precursores das três classes principais de RNA Transcrição Consiste na síntese de uma molécula de RNA fita simples complementar a uma das fitas do duplex de DNA fita molde Síntese de RNA dependente de DNA TRANSCRIÇÃO Principais características da transcrição O RNA é sintetizado na direção 5 3 Utiliza uma das fitas de DNA como molde Não requer iniciadores primers Envolve apenas segmentos limitados de uma molécula de DNA a célula transcreve o gene ou conjunto de genes que precisa naquele momento É catalisada pela RNApolimerase dependente de DNA O RNA é sintetizado pelas RNApolimerases O RNA É SINTETIZADO PELAS RNAPOLIMERASES A química e o mecanismo de síntese de RNA pela RNApolimerase dependente de DNA se assemelham fortemente àqueles usados pelas DNApolimerases Os nucleotídeos são selecionados por meio das interações de pareamento de bases WatsonCrick e por meio da geometria dos pares de bases A RNApolimerase não precisa de um iniciador para a síntese A iniciação ocorre quando a RNApolimerase se liga a sequências específicas de DNA denominadas promotores A RNApolimerase não possui atividade de exonuclease 35 atividade de revisão a taxa de erro de transcrição é de aproximadamente um erro a cada 104 a 105 ribonucleotídeos incorporados ao RNA Transcrição pela RNApolimerase em E coli Transcrição Mecanismo químico da síntese de RNA O RNA é sintetizado pelas RNApolimerases Transcrição pela RNApolimerase em E coli Durante a transcrição a RNA polimerase de E coli geralmente mantém 17 pb desenrolados Os híbridos RNADNA de 8 pb ocorrem nessa região desenrolada Durante a transcrição um pequeno segmento do duplex de DNA é desenrolado bolha de transcrição e um híbrido RNADNA é formado temporariamente O RNA é sintetizado pelas RNApolimerases O RNA é sintetizado a partir da fita molde e é idêntico em sequência com U no lugar de T à fita não molde ou fita codificadora IMPORTANTE A fita codificadora de um gene em particular pode estar situada em qualquer das fitas de um determinado cromossomo genoma de adenovírus O RNA é sintetizado pelas RNApolimerases Estrutura da RNApolimerase de E coli A RNApolimerase holoenzima de E coli é formada por 6 subunidades Cinco subunidades centrais α2ββω Uma subunidade que se liga transitoriamente ao centro da polimerase e a direciona para sítios de ligação específicos no DNA σ existem diferentes variantes da subunidade σ sendo que a mais comum é a σ70 RNApolimerase holoenzima da bactéria Thermus aquaticus estrutura muito semelhante àquela da RNApolimerase de E coli A síntese de RNA começa nos promotores A SÍNTESE DE RNA COMEÇA NOS PROMOTORES A RNApolimerase se liga a sequências específicas no DNA chamadas de promotores que dirigem a transcrição dos genes adjacentes Promotores de E coli se estendem entre as posições 70 e 30 E quais são as características do promotor reconhecido pela RNApolimerase contendo a subunidade σ70 Importante O sítio de início da transcrição é a posição 1 A síntese de RNA começa nos promotores Características dos promotores de E coli reconhecidos por uma RNApolimerase holoenzima contendo σ70 1 Presença de duas sequências consenso que são sítios de ligação para a subunidade σ70 Região 10 5TATAAT3 Região 35 5TTGACA3 2 Presença de uma sequência rica em AT que é sítio de ligação para a subunidade α Elemento UP upstream promoter promotor a montante se estende entre as posições 40 e 60 somente está presente nos promotores de genes altamente expressos Importante Por convenção as sequências regulatórias que controlam a transcrição são designadas pelas sequências na fita codificadora A síntese de RNA começa nos promotores Típicos promotores de E coli reconhecidos por uma RNApolimerase holoenzima contendo σ70 N qualquer nucleotídeo Sítio de início da transcrição 1 Início da transcrição e alongamento pela RNApolimerase de E coli Complexo aberto do interior da região 10 à posição 2 ou 3 A síntese de RNA começa nos promotores Ao empregar diferentes subunidades σ a bactéria pode coordenar a expressão de diferentes conjuntos de genes permitindo alterações importantes na fisiologia celular Término da transcrição em E coli Terminação independente de ρ Terminação dependente de ρ Transcrição em eucariotos Os eucariotos possuem três RNApolimerases RNApolimerase I Pol I síntese prérRNA rRNA 18S 28S e 58S RNApolimerase II Pol II síntese de mRNA e de alguns RNAs especializados RNApolimerase III Pol III síntese de tRNA rRNA 5S e alguns RNAs especializados TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS A Pol II opera em muitos promotores que não apresentam TATA box sequência Inr ou ambos Sequência Iniciadora Algumas sequências comuns em promotores reconhecidos pela Pol II A sequência dos promotores eucarióticos é mais variável do que a sequência dos promotores bacterianos Durante a transcrição a RNAPolimerase II é auxiliada por proteínas denominadas fatores de transcrição específicos de cada etapa Transcrição nos promotores da RNApolimerase II TBP ligação ao TATA box TFIIF ajuda a Pol II a se ligar nos seus promotores tanto pela interação com a TFIIB quanto reduzindo a ligação da polimerase a sítios inespecíficos no DNA TFIIH atividades de helicase desenrola o DNA na região Inr e de cinase fosforila o CTD da Pol II provocando uma mudança conformacional no complexo e iniciando a transcrição Transcrição em eucariotos IMPORTANTE Os dois modelos alostérico e de torpedo são provavelmente parte do verdadeiro mecanismo da Pol II de eucariotos Dois modelos foram propostos para explicar a terminação da transcrição pela RNA polimerase II Modelo alostérico Propõe que após a Pol II ultrapassar o sítio de adição da cauda poliA ela sofre mudanças conformacionais em virtude da dissociação dos fatores de alongamento eou associação dos fatores de terminação Este modelo é análogo ao modelo independente de ρ das bactérias Modelo de torpedo Sugere que o mRNA é clivado após o sítio de adição da cauda poliA levando à ligação de uma exonuclease ao RNA remanescente degradandoo e liberando a Pol II Esse modelo é similar à terminação dependente de ρ em bactérias Modelo de torpedo Transcrição em eucariotos IMPORTANTE O início da transcrição in vivo nos eucariotos requer proteínas adicionais incluindo o Complexo Mediador O complexo mediador ajuda a conectar proteínas ligadas às sequências estimuladoras localizadas distantes do promotor e o complexo de início da transcrição Processamento do mRNA em eucariotos PROCESSAMENTO DO mRNA EM EUCARIOTOS Visão geral do processamento do mRNA em uma célula eucarionte Processamento do mRNA em eucariotos quepe 5 Quepe 5 resíduo de 7metilguanosina ligado à extremidade 5 do mRNA por meio de uma ligação 55trifosfato Função ajuda a proteger o mRNA da degradação por nucleases além de participar da ligação do mRNA ao ribossomo para iniciar a tradução A maioria dos mRNAs de eucariotos tem um quepe na extremidade 5 ADIÇÃO DO QUEPE 5 Processamento do mRNA em eucariotos quepe 5 E como ocorre a síntese do quepe 5 A síntese do quepe 5 é feita por enzimas associadas ao CTD da Pol II O quepe 5 permanece ligado ao CTD por meio de uma associação com o complexo de ligação do quepe CBC Processamento do mRNA em eucariotos Splicing Os íntrons do grupo I sofrem autosplicing ribozimas Os íntrons do grupo I são encontrados em alguns genes nucleares mitocondriais e de cloroplastos que codificam rRNAs mRNAs e tRNAs Também são encontrados entre os raros exemplos de íntrons em bactérias SPLICING DOS ÍNTRONS DO GRUPO I O nucleófilo na primeira etapa do splicing dos íntrons do grupo I é o grupo 3OH de um resíduo de guanosina GMP GDP ou GTP Mecanismo de splicing de íntrons do grupo I Os íntrons do grupo II sofrem autosplicing ribozimas Os íntrons do grupo II são geralmente encontrados em transcritos primários de mRNAs mitocondriais ou de cloroplastos em fungos algas e plantas Também são encontrados entre os raros exemplos de íntrons em bactérias SPLICING DOS ÍNTRONS DO GRUPO II Processamento do mRNA em eucariotos Splicing O nucleófilo na primeira etapa do splicing dos íntrons do grupo II é o grupo 2OH de um resíduo A dentro do íntron Mecanismo de splicing de íntrons do grupo II Processamento do mRNA em eucariotos Splicing SPLICING DOS ÍNTRONS DO SPLICEOSSOMO Spliceossomo complexo enzimático formado por conjuntos de RNAproteínas especializados denominados pequenas ribonucleoproteínas nucleares snRNP O spliceossomo catalisa o splicing dos íntrons encontrados nos transcritos primários de mRNA nucleares terceira e maior classe de íntrons Os íntrons do spliceossomo geralmente têm a sequência 5GU e AG3 e essas sequências marcam os sítios em que o splicing ocorre Dentro do spliceossomo os íntrons sofrem splicing pelo mesmo mecanismo formador de laço dos íntrons do grupo II 5GU sítio de splicing na extremidade 5 do íntron 3AG sítio de splicing na extremidade 3 do íntron Resíduo de A que atua como nucleófilo na reação de splicing Processamento do mRNA em eucariotos Splicing Mecanismo de splicing catalisado pelo spliceossomo Processamento do mRNA em eucariotos Splicing O splicing assim como outras reações de processamento do RNA é fortemente coordenado com a transcrição Na quarta classe de íntrons encontrada em certos tRNAs a reação de splicing precisa de ATP e de uma endonuclease A endonuclease de splicing cliva as ligações fosfodiéster em ambas as extremidades do íntron e os dois éxons são ligados por um mecanismo semelhante à reação da DNAligase SPLICING DA QUARTA CLASSE DE ÍNTRONS Processamento do mRNA em eucariotos cauda poliA Cauda poliA filamento de 80 a 250 resíduos de adenosina A que é adicionado na extremidade 3 do mRNA Função ajuda a proteger o mRNA da degradação por nucleases além de servir como um sítio de ligação para proteínas específicas A maioria dos mRNAs de eucariotos tem uma cauda poliA na extremidade 3 ADIÇÃO DA CAUDA POLIA CURIOSIDADE Muitos mRNAs bacterianos também possuem caudas poliA mas essas caudas estimulam a degradação do mRNA em vez de protegêlo Processamento do mRNA em eucariotos cauda poliA 5AAUAAA3 sequência altamente conservada de 10 a 30 nucleotídeos no lado 5 a montante do sítio de adição da cauda poliA Adição da cauda poliA COORDENAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO mRNA EM EUCARIOTOS Éxon Quepe 5 Coordenação da transcrição e processamento do mRNA em eucariotos Processamento alternativo do mRNA em eucariotos PROCESSAMENTO ALTERNATIVO DO mRNA EM EUCARIOTOS Existem dois mecanismos de processamento alternativo do mRNA em eucariotos Presença de mais de um sítio de clivagem e poliadenilação no transcrito primário Padrões diferentes de splicing alternativo do transcrito primário Em ambos os mecanismos mRNA maduros diferentes são produzidos a partir do mesmo transcrito primário Isso ajuda a explicar por exemplo porque organismos tão complexos como os seres humanos possuem um número relativamente pequeno de genes codificadores de proteínas A comparação do genoma de um eucarioto com seu proteoma mostra que o número de proteínas excede o número de genes identificados Como isso é possível Processamento alternativo do mRNA Processamento alternativo do mRNA em eucariotos Processamento alternativo do transcrito primário do gene da calcitonina em ratos Calcitonina produzida na tireoide CGRP peptídeo relacionado ao gene da calcitonina produzido no cérebro Processamento póstranscricional de ncRNAs Muitos RNAs não codificadores ncRNAs são derivados de precursores maiores e também sofrem processamento póstranscricional clivagem splicing eou modificações de bases e açúcares PROCESSAMENTO PÓSTRANSCRICIONAL DE ncRNAS Algumas bases modificadas de rRNA e tRNA produzidas em reações póstranscricionais Processamento de rRNA em bactérias PROCESSAMENTO DE rRNA EM BACTÉRIAS Transcrito de préRNA 30S seu processamento produz rRNAs 16S 23S 5S e alguns tRNAs Processamento dos transcritos de préRNA 30S em bactérias Metilação traços corderosa Resíduos de uridina convertidos em pseudouridina traços azuis Resíduos de dihidrouridina traços pretos Processamento de rRNA em eucariotos PROCESSAMENTO DE rRNA EM EUCARIOTOS Transcrito de prérRNA 45S sintetizado pela RNApolimerase I e processado no nucléolo seu processamento produz rRNAs 18S 28S e 58S As reações de clivagem e todas as modificações de nucleosídeos tais como metilação e conversão de uridina em pseudouridina ou di hidrouridina são catalisadas por complexos de RNAproteínas denominados pequenas ribonucleoproteínas nucleolares snoRNPs rRNA 5S sintetizado como um transcrito separado pela RNApolimerase III Durante a transcrição o transcrito de prérRNA 45S é incorporado em um complexo préribossomal 90S nucleolar em que o processamento do rRNA e a montagem do ribossomo são fortemente associados Processamento de tRNA em bactérias e eucariotos O processamento dos precursores de tRNA em bactérias e eucariotos inclui Clivagem enzimática de nucleotídeos das extremidades 5 e 3 Adição do trinucleotídeo CCA3 na extremidade 3 dos tRNAs de eucariotos e dos tRNAs bacterianos que não apresentam essa sequência no transcrito primário Modificação de algumas bases por metilação desaminação ou redução Splicing para remoção de íntrons encontrados em alguns tRNAs de eucariotos PROCESSAMENTO DE tRNA EM BACTÉRIAS E EUCARIOTOS Transcrição reversa Características da transcriptase reversa Catalisa três reações diferentes 1 síntese de DNA dependente de RNA 2 degradação de RNA e 3 síntese de DNA dependente de DNA Precisa de um oligonucleotídeo iniciador Promove a síntese de DNA na direção 53 Não possui atividade de revisão exonuclease 35 Retrovírus vírus de RNA que transportam no interior da partícula viral uma transcriptase reversa CURIOSIDADE No laboratório a transcriptase reversa é utilizada para a síntese de DNA complementar cDNA a um molde de mRNA TRANSCRIÇÃO REVERSA A transcrição reversa consiste na síntese de DNA a partir de uma fita molde de RNA catalisada por uma DNApolimerase dependente de RNA denominada transcriptase reversa Transcrição reversa Retrovírus Infecção retroviral de uma célula de mamífero e integração do genoma viral no cromossomo do hospedeiro Transcrição reversa Telomerase A telomerase é uma transcriptase reversa especializada Os telômeros consistem em várias cópias em tandem de uma pequena sequência oligonucleotídica presente nas extremidades dos cromossomos lineares dos eucariotos Essa sequência tem a forma TxGy em uma fita e CyAx na fita complementar onde x e y estão geralmente na faixa de 1 a 4 A síntese dos telômeros é catalisada pela telomerase que atua como uma transcriptase reversa celular A telomerase utiliza um molde interno de RNA para a síntese da fita TxGy do telômero esse RNA tem repetições da sequência CyAx Nos eucariotos superiores incluindo mamíferos a extremidade de fita única dos telômeros é sequestrada em uma estrutura chamada de alça T que protege a extremidade 3 dos cromossomos da degradação por nucleases Transcrição reversa Telomerase Eletromicrografia de uma alça em T na extremidade de um cromossomo isolado do hepatócito de um camundongo Transcrição reversa Telomerase CURIOSIDADE Importante Células germinativas possuem telomerase e por isso os comprimentos dos telômeros são mantidos inalterados Experimentos in vitro mostraram uma relação linear e inversa entre o comprimento dos telômeros de fibroblastos em cultura e a idade dos indivíduos dos quais os fibroblastos foram retirados os telômeros nas células somáticas humanas encurtam gradualmente à medida que um indivíduo envelhece Quando a telomerase é introduzida em células somáticas humanas in vitro a duração da vida celular aumenta acentuadamente O encurtamento gradual dos telômeros seria a chave para o processo de envelhecimento Replicação do RNA REPLICAÇÃO DO RNA A replicação do RNA consiste na síntese de RNA a partir de uma fita molde de RNA catalisada por uma RNApolimerase dependente de RNA RNAreplicase Características da RNAreplicase Promove a síntese de RNA na direção 53 Não possui atividade de revisão exonuclease 35 A replicação de RNA é realizada por alguns bacteriófagos e vírus de RNA como o vírus influenza