RNAi - Mecanismos de Interferência e Aplicações Biologia Celular

ATIVIDADE NÃO PRESENCIAL DP BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR 2 MEDICINA PROF MARCUS VINICIUS DE OLIVEIRA Em 2006 os mecanismos de RNA de interferência ficaram bastante conhecidos por ter sido o tema dos pesquisadores que ganharam o prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia daquele ano Tecnicamente a interferência por RNA RNAi é conhecida por ser um mecanismo celular onde ocorre o silenciamento gênico pós transcricional sobre o RNA mensageiro Teremos uma fita dupla de RNA dsRNA double stranded RNA que será incorporada no citoplasma e se ligara a uma sequência de nucleotídeos no mRNA alvo causando um silenciamento por inibiçãodegradação da tradução do mRNA Os dsRNAs podem ser classificados de acordo com sua origem e função em miRNAs microRNAs conhecidos como dsRNA endógeno possuem 22 nucleotídeos e dentre suas funções a principal é o silenciamento pós transcricional inibidor da tradução do mRNAalvo em proteínas Atualmente ele é amplamente usado como regulador da expressão genica de animais e plantas Além disso os miRNAs tem genes que são transcritos pela RNA polimerase II e em seguida o microRNA primário primiRNA é clivado por um complexo proteico RNase III proteína Pasha ou DGCR8 siRNAs short interfering RNAs possuem dupla fita de 19 a 30 pb causam a degradação do RNA mensageiro alvo a partir do pareamento de sequencias complementares com o mesmo shRNAs short hairpin RNAs possuem fita dupla com estrutura semelhante aos miRNA Podem introduzidos já prontos na célula ou transcrito pela Dicer de forma semelhante ao miRNA O potencial conhecido do RNAi é sua capacidade no silenciamento de uma variedade de genes codificadores de proteínas e por ter uma alta especificidade esse método permite uma interferência em alelos relacionados a doenças que são diferentes dos alelos normais apenas por poucos nucleotídeos Visto isso o emprego do mesmo tem sido uma abordagem terapêutica promissora para o combate a expressão anormal de genes que contribuem para doenças infecções virais doenças autoimunes doenças genéticas dominantes e câncer Outrossim técnicas de edição genica são ferramentas de larga escala e parceiras na prevenção e promoção de doenças com elas conseguimos a produção de insulina atuam contra tumores malignos são usadas em vacinas e também tem seu uso para permitir o cultivo de plantas mais nutritivas e com mais agilidade entre outros Uma dessas técnicas é a ferramenta CRISPRCas9 Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas que tem um potencial para ser um instrumento de tratamento de várias enfermidades O sistema CRISPRcas9 foi descoberto por meio do estudo de mecanismos de defesa de bactérias onde endonucleases especificas Cas9 atuam na clivagem de genes do invasor e transformaos em sequencias de nucleotídeos menores que são inseridos em sítios do genoma bacteriano lócus CRISPR Fundamento a isso esse sistema vem sendo um dos recursos mais explorados para terapias genicas pois nesse lócus podem ocorrer processos de transcrição levando a uma sequencia de RNA direcionadora que tem a função de reconhecimento de genes através do pareamento de bases nitrogenadas e proteínas Cas formando um complexo de degradação do material genético invasor O sucesso nos estudos do sistema CRISPRcas9 se dá a sua facilidade de ajuste em diversas linhagens celulares e de uma variedade de organismos assim em estudos para o tratamento de patologias humanas esperase como resultado a reparação de mutações genéticas Dessa forma a técnica de duplo corte das cadeias de DNA DSB realizada pela Cas9 é a mais explorada e temos duas vias de reparo celular quando ocorre o DBS União de extremidades não homólogas NHEJ e o Reparo direcionado por homologia HDR A União de extremidades não homólogas NHEJ é um via de células eucarióticas nela ocorre a ligação das extremidades do DNA após a DBS unindo as duas pontas de forma direta Porem essa via tem maior chance de ocasionar mutações e por isso ela mais usada para a indução de mutações controladas ou inativação de genes alvos O Reparo direcionado por homologia HDR usa a homologia entre as extremidades usando um DNA que servirá como doador Essa via é mais maleável ou seja ela permite mais modificações de genes alvos incorporando sequencias de DNA ou reestabelecendo a função normal Assim sendo uma tecnologia nova ela é limitada por fatores bioéticas mas isso não impede seu estudo em modelos animais ou em culturas somáticas humanas Seu uso na cardiologia no silenciamento de genes PCSK9 através da via de União de extremidades não homólogas e no tratamento de hemoglobinopatias são as pesquisas que mais chamam atenção no âmbito acadêmico e que corrobora com o sucesso e fama que a mesma vem alcançando entre pesquisadores Results for the best high resolution image synthesis models with their inference time Gram matrix vectors per second parameters FID GAN trained 295 345 326 617 683 354 358 363 887 842 3398 350 743 791 LieConv l4 Double w64 LieConv l4 Double w64 LieConv l3 Double w128 LieConv l3 Bilou w32 K 3 points All our models are LieConv ours and use the double MLP layer representation Source data CIFAR10 LSUN bedroom Places 2 Wild Fire cifar fgst cycles sampling MAGAN Moving MNIST Time 50 100 150 200 Moving MNIST Time 50 100 150 200 Figure The top rows show example predictions by EM ours and LEGEND 12 Our EM model is trained on 10 frames while LEGEND outputs a distribution over 10 frames Our model can predict arbitrary more frames The bottom rows show frame difference compared to ground truth FID Fréchet Inception Distance was evaluated on 2500 generated samples after training for 300k iterations except for Dante 1 5M steps on ImageNet Numbers for StyleGAN2 23 and SAGAN 34 are copied from 23 SAM 963 Face recognition 994 Face landmark yaw agegender MaDGAN JFLEG GoaPV GANs lie latent layers results Cambridge reparameterization Untitled 27 USC VAE baseline PAR Ours FID Sampling FID Latent NN τ Dice Rubin face Varying style space semantic latent space GAN CNFA ten counts 4525 22 3356 1237 1583 38 217 34 4529 1563 2385 1248 820 612 90 623 8760 937 6261 95 6464 4982 1564 096 01 5373 1285 759 251 243 563 165 069 PEMA 09 022 005 053 1147 155 002 4506 018 055 385 947 459 344 38 51 151 165 063 118 325 086 1428 872 7544 1912 4354 954 5363 3315 543 792 325 553 95 836 5412 198 1052 285 302 814 356 216 2348 254 216 785 154 385 753 876 1502 546 2942 318 096 523 023 913 1504 044 1347 725 486 1254 1084 5275 1503 4326 1228 1018 2314 1056 5349 1264 5327 4761 978 2948 1256 4372 962 1017 6518 3558 1056 934 542 325 4219 048 973 785 647 325 582 256 392 794 278 1425 943 036 588 438 847 325 584 263 347 1425 934 Statistics PGGAN StyleGAN2 StyleGAN3 BigGAN VQVAE DDPM Inference time 1h 12m 1h16m FID 191 224 1737 Discussion 154 139 192 234 98 87 115 128 106 123 133 144 191 236 258 263 181 123 107 89 97 73 129 83 135 148 214 197 91 123 144 129 151 128 124 89 84 93 122 143 186 194 213 121 179 188 211 324 340 375 398 332 346 381 407 360 375 424 447 406 501 512 539 635 667 683 712 657 703 718 742 753 800 885 913 941 965 1111 1135 1170 1215 1228 1244 1297 1312 1355 1402 1427 1456 1479 1501 1528 1546 1559 1583 1627 1674 1701 1720 1746 1785 1836 1882 1927 1979 2023 2064 2098 2113 2155 2188 2216 2263 2302 2330 2367 2403 2448 2491 2524 2557 2594 2633 2670 2708 2745 2780 2819 2857 2891 2929 2965 3002 3040 3075 3113 3147 3183 3217 3256 3290 3324 3368 3398 3442 3475 3508 3543 3577 3612 3644 3683 3712 3751 3790 3823 3857 3892 3927 3956 3993 4031 4065 4102 4136 4171 4204 4239 4274 4301 4335 4369 4403 4438 4472 4507 4541 4575 4610 4644 4678 4713 4747 4782 4817 4851 4885 4920 4955 4989 5023 5058 5092 5127 5161 5198 5233 5268 5302 5337 5371 5406 5440 5475 5510 5544 5579 5613 5648 5683 5717 5751 5786 5821 5855 5890 5924 5959 5994 6028 6063 6097 6132 6167 6201 6236 6270 6305 6340 6374 6409 6443 6478 6512 6547 6582 6616 6650 6685 6719 6754 6789 6823 6858 6892 6927 6961 6996 7030 7065 7100 7134 7169 7203 7238 7273 7307 7342 7377 7411 7446 7480 7515 7550 7584 7619 7653 7688 7723 7757 7792 7826 7861 7896 7930 7965 8000 8034 8069 8103 RESUMOS FARMACOGENÉTICA A farmacogenética é uma área da genética que estuda como as variações genéticas entre indivíduos afetam a resposta aos medicamentos Ela investiga como os genes influenciam a maneira como o corpo metaboliza os medicamentos como eles são absorvidos distribuídos metabolizados e eliminados pelo organismo Cada pessoa possui um conjunto único de genes e essas variações genéticas podem influenciar a eficácia e a segurança dos medicamentos Alguns genes estão relacionados à produção de enzimas responsáveis pela metabolização dos fármacos enquanto outros genes podem afetar os receptores de medicamentos nas células A farmacogenética tem como objetivo personalizar o tratamento médico identificando os genes que podem influenciar a resposta a medicamentos específicos Com base nessa informação genética os médicos podem ajustar as doses de medicamentos ou selecionar medicamentos alternativos que sejam mais eficazes ou seguros para cada paciente Essa abordagem personalizada pode melhorar a eficácia dos tratamentos reduzir os efeitos colaterais e minimizar o uso de medicamentos ineficazes Além disso a farmacogenética pode ajudar a prever o risco de toxicidade de certos medicamentos em certos indivíduos permitindo uma prescrição mais segura No entanto é importante ressaltar que a farmacogenética ainda está em desenvolvimento e há muito a ser descoberto sobre as relações entre os genes e a resposta aos medicamentos O progresso nessa área requer pesquisas contínuas e a colaboração entre médicos geneticistas e farmacologistas Por fim a farmacogenética estuda como as variações genéticas podem influenciar a resposta aos medicamentos Ela busca personalizar o tratamento médico com base no perfil genético de cada paciente visando a eficácia e a segurança dos medicamentos prescritos SOROS E VACINAS Os soros e as vacinas são dois tipos de produtos biológicos utilizados para prevenir ou tratar doenças Embora sejam relacionados eles têm diferenças significativas em sua composição e aplicação Os soros são produtos derivados do plasma sanguíneo de animais ou humanos que contêm anticorpos específicos para combater determinadas doenças ou toxinas Eles são produzidos através da inoculação de um antígeno como um vírus ou uma toxina em um animal que desenvolve uma resposta imune e produz anticorpos O plasma sanguíneo contendo esses anticorpos é coletado e processado para obter um soro hiperimune rico em anticorpos específicos Esses soros podem ser administrados a indivíduos infectados ou expostos à doença para fornecer imunidade temporária e auxiliar na recuperação Por outro lado as vacinas são produtos que contêm antígenos inativados enfraquecidos ou partes de um microrganismo como um vírus ou uma bactéria capazes de estimular o sistema imunológico a produzir uma resposta imune As vacinas são projetadas para simular uma infecção real mas sem causar a doença completa Ao receber a vacina o sistema imunológico reconhece os antígenos presentes na vacina como invasores e produz uma resposta imune específica incluindo a produção de anticorpos Essa resposta imune cria uma memória imunológica permitindo que o corpo reconheça e combata eficientemente o microrganismo real no caso de uma exposição futura Em resumo os soros são derivados do plasma sanguíneo contendo anticorpos específicos enquanto as vacinas contêm antígenos capazes de estimular uma resposta imune Os soros são utilizados principalmente para tratar doenças específicas ou oferecer imunidade temporária enquanto as vacinas são usadas para prevenir doenças estimulando o sistema imunológico a produzir sua própria imunidade duradoura Ambos desempenham um papel importante na proteção e no tratamento de doenças mas suas aplicações e mecanismos de ação são diferentes Os soros e as vacinas são produzidos por processos complexos envolvendo etapas específicas que variam dependendo do tipo de produto e do organismo alvo A seguir as etapas envolvidas na produção de soros e vacinas Produção de soros Seleção do animal doador Em alguns casos os soros são produzidos a partir do plasma sanguíneo de animais como cavalos ou coelhos que são previamente selecionados e mantidos em condições controladas Imunização do animal O animal doador é imunizado com um antígeno específico que pode ser uma toxina ou um fragmento do organismo causador da doença Essa imunização estimula o sistema imunológico do animal a produzir anticorpos contra o antígeno Coleta do plasma sanguíneo Após um período de tempo determinado o plasma sanguíneo do animal imunizado é coletado O plasma contém os anticorpos produzidos pelo animal em resposta ao antígeno Purificação do soro O plasma sanguíneo é processado para separar o soro que contém os anticorpos desejados Esse soro é submetido a processos de purificação para remover impurezas e concentrar os anticorpos Testes de qualidade O soro é submetido a testes rigorosos para verificar sua qualidade potência e segurança antes de ser disponibilizado para uso Produção de vacinas Seleção do antígeno A vacina é desenvolvida com base em antígenos específicos como fragmentos do organismo causador da doença toxinas inativadas ou proteínas recombinantes Esses antígenos são selecionados para estimular uma resposta imunológica protetora contra a doença alvo Cultivo do antígeno Os antígenos são produzidos em laboratório utilizando técnicas de cultura de células ou microorganismos dependendo do tipo de vacina Essa etapa envolve a reprodução controlada dos organismos produtores do antígeno ou a síntese das proteínas recombinantes Inativação ou enfraquecimento Em certos tipos de vacinas os antígenos são inativados ou enfraquecidos para garantir que não causem a doença mas ainda estimulem uma resposta imunológica eficaz Formulação da vacina Os antígenos são combinados com outros componentes como adjuvantes que aumentam a resposta imunológica conservantes e estabilizadores para formar a vacina final Testes de qualidade A vacina passa por uma série de testes rigorosos para garantir sua eficácia segurança e qualidade Isso inclui testes de potência pureza esterilidade e estabilidade Embalagem e distribuição Após a aprovação nos testes de qualidade a vacina é embalada em frascos ou seringas adequadas e preparada para distribuição As vacinas são armazenadas e transportadas de acordo com as condições específicas recomendadas para manter sua eficácia REPLICAÇÃO A replicação é o processo pelo qual o material genético é copiado durante a divisão celular garantindo a transmissão precisa da informação genética para as células filhas Esse processo ocorre tanto em organismos unicelulares como bactérias quanto em organismos multicelulares incluindo plantas animais e seres humanos A replicação do DNA é semiconservativa o que significa que cada uma das duas fitas da molécula de DNA original serve como molde para a síntese de uma nova fita complementar O processo de replicação do DNA envolve várias etapas Desnaturação A molécula de DNA dupla hélice é desenrolada e separada em duas fitas individuais através da ação de enzimas chamadas helicases Essa etapa forma a chamada bolha de replicação Formação de primers Primers curtos compostos por RNA são sintetizados pela enzima primase Esses primers fornecem pontos de partida para a síntese das novas fitas de DNA Síntese da nova fita As fitas individuais do DNA servem como moldes para a síntese de novas fitas complementares A enzima DNA polimerase adiciona os nucleotídeos complementares às fitas de DNA seguindo a regra da complementariedade de bases A com T C com G A síntese ocorre na direção 5 3 Fusão das fitas À medida que as novas fitas de DNA são sintetizadas elas se juntam às fitas antigas complementares formando duas moléculas de DNA dupla hélice Revisão e reparo As enzimas de revisão e reparo de DNA verificam e corrigem possíveis erros que tenham ocorrido durante a replicação Ao final da replicação temos duas moléculas de DNA idênticas cada uma contendo uma das fitas antigas e uma fita nova Essas duas moléculas de DNA podem então ser distribuídas para as células filhas durante a divisão celular garantindo que cada célula tenha uma cópia completa e fiel do material genético A replicação do DNA é um processo crucial para a hereditariedade e a manutenção da integridade genômica Erros na replicação do DNA podem levar a mutações genéticas que podem ter consequências tanto negativas quanto positivas para a evolução e a adaptação dos organismos TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO A transcrição e a tradução são processos fundamentais para a expressão gênica e a síntese de proteínas nas células A transcrição é o processo pelo qual a informação genética contida no DNA é copiada para uma molécula de RNA mensageiro mRNA enquanto a tradução é o processo pelo qual o mRNA é decodificado em uma sequência de aminoácidos para a síntese de proteínas Transcrição Iniciação A enzima RNA polimerase se liga a uma região específica do DNA chamada promotor A RNA polimerase desenrola a dupla hélice de DNA e começa a sintetizar o RNA complementar a uma das fitas de DNA chamada fita molde Alongamento A RNA polimerase adiciona nucleotídeos complementares à fita molde formando uma molécula de RNA crescente A fita de RNA é sintetizada na direção 5 3 e é complementar à sequência de bases da fita molde de DNA Terminação A transcrição termina quando a RNA polimerase encontra uma sequência específica de bases no DNA chamada terminador Nesse ponto a RNA polimerase se dissocia do DNA e libera o mRNA recémsintetizado Tradução Iniciação O mRNA recémsintetizado se liga a um complexo de ribossomos que é composto por duas subunidades a subunidade menor e a subunidade maior O complexo de ribossomos se alinha ao mRNA no local onde a síntese da proteína deve começar conhecido como códon de iniciação Alongamento O ribossomo se move ao longo do mRNA lendo a sequência de códons conjuntos de três bases e recrutando moléculas de transferência de aminoácidos tRNA correspondentes a cada códon Os tRNAs trazem os aminoácidos para o ribossomo e se ligam ao códon correspondente no mRNA Uma enzima chamada peptidil transferase catalisa a formação de ligações peptídicas entre os aminoácidos construindo assim uma cadeia polipeptídica crescente Terminação A tradução termina quando o ribossomo alcança um códon de parada UAA UAG ou UGA no mRNA Nesse ponto a síntese da proteína é finalizada e a cadeia polipeptídica é liberada do ribossomo Após a tradução a cadeia polipeptídica passa por processos adicionais como dobramento e modificação póstraducional para se tornar uma proteína funcional A transcrição e a tradução são processos essenciais para a síntese de proteínas e a expressão gênica Eles permitem que a informação genética contida no DNA seja convertida em proteínas que desempenham papéis vitais em processos biológicos e na estrutura e função das células PCR E DIANÓSTICO MOLECULAR A Reação em Cadeia da Polimerase PCR é uma técnica amplamente utilizada na área de diagnóstico molecular Ela permite a amplificação de sequências específicas de DNA em larga escala permitindo a detecção de doenças identificação de patógenos análise de mutações genéticas entre outras aplicações O processo de PCR envolve várias etapas conforme exposto por ordem do primeiro ao último abaixo 1 Desnaturação A amostra de DNA é aquecida a uma temperatura elevada para separar as duas fitas de DNA 2 Anelamento de primers A temperatura é reduzida para permitir que os primers oligonucleotídeos curtos se liguem às sequências alvo específicas do DNA uma em cada fita 3 Extensão Uma enzima chamada DNA polimerase sintetiza novas fitas de DNA complementares às sequências alvo utilizando os primers como ponto de partida A DNA polimerase adiciona nucleotídeos à fita em crescimento estendendoa 4 Ciclos de amplificação O processo de desnaturação anelamento de primers e extensão é repetido várias vezes em ciclos para amplificar exponencialmente a quantidade de DNA alvo Cada ciclo dobra a quantidade de DNA presente Ao final da PCR são produzidas muitas cópias da sequência de DNA desejada Essas cópias podem ser analisadas de várias maneiras dependendo do objetivo do diagnóstico molecular No diagnóstico molecular a PCR pode ser combinada com outras técnicas para detecção ou análise de DNA Alguns métodos comuns incluem Eletroforese em gel As amostras amplificadas são separadas por tamanho em um gel eletroforético para identificar a presença da sequência alvo amplificada Hibridização de sondas Sondas de DNA marcadas com uma molécula fluorescente são utilizadas para identificar a presença de sequências específicas de DNA As sondas se ligam seletivamente ao DNA complementar permitindo a detecção da sequência alvo PCR em tempo real Também conhecida como PCR quantitativa permite a amplificação e detecção simultânea das sequências de DNA em tempo real Isso permite uma análise quantitativa da quantidade de DNA presente na amostra Sequenciamento de DNA Após a amplificação da sequência alvo por PCR o DNA pode ser submetido ao sequenciamento para determinar a sequência precisa dos nucleotídeos presentes A PCR e o diagnóstico molecular revolucionaram a medicina e a pesquisa científica permitindo uma detecção mais rápida sensível e precisa de doenças mutações genéticas e outros alvos moleculares Essa técnica desempenha um papel fundamental no diagnóstico precoce monitoramento de tratamento e desenvolvimento de terapias personalizadas RNA REGULADORES CRISPRCAS9 RNAI Os RNAs reguladores como CRISPRCas9 e RNAi são ferramentas poderosas na regulação da expressão gênica e na manipulação de genes em organismos vivos Eles desempenham um papel fundamental na pesquisa científica na terapia genética e na engenharia genética Aqui está um resumo sobre essas tecnologias CRISPRCas9 CRISPRCas9 é uma tecnologia baseada em RNA que permite editar de forma precisa e eficiente sequências de DNA em organismos vivos Ela é derivada do sistema imunológico de bactérias e arqueias que usam RNA guia para direcionar a enzima Cas9 a sequências específicas de DNA O RNA guia é projetado para ser complementar à sequência alvo de DNA e quando o complexo RNA guiaCas9 se liga a essa sequência a enzima pode cortar o DNA Uma vez que o DNA é cortado a célula pode reparar o dano por meio de diferentes mecanismos A edição genética pode ser realizada introduzindo um segmento de DNA novo durante o processo de reparo permitindo a inserção remoção ou substituição de genes específicos A tecnologia CRISPRCas9 tem sido amplamente utilizada em pesquisas para entender a função dos genes modelar doenças genéticas em animais desenvolver terapias genéticas e até mesmo explorar a edição genômica em embriões humanos RNAi Interferência de RNA RNAi é um processo natural de regulação gênica que envolve a degradação do RNA mensageiro mRNA específico impedindo sua tradução em proteínas Na RNAi pequenos fragmentos de RNA de cadeia dupla chamados pequenos RNAs interferentes siRNAs são introduzidos na célula ou são produzidos pela própria célula Os siRNAs se ligam a moléculas de mRNA complementares formando um complexo que é clivado por enzimas específicas Como resultado o mRNA é degradado e a síntese de proteínas correspondente é inibida O RNAi tem sido uma ferramenta importante na pesquisa para investigar a função dos genes identificar alvos terapêuticos estudar vias de sinalização celular e desenvolver terapias de silenciamento gênico Essa tecnologia também tem aplicação promissora na terapia gênica especialmente no tratamento de doenças causadas por genes defeituosos ou superexpressos Tanto o CRISPRCas9 quanto o RNAi são ferramentas revolucionárias que permitiram avanços significativos na compreensão e manipulação da genética Eles têm o potencial de impulsionar a pesquisa científica e abrir novas possibilidades para o tratamento de doenças genéticas no futuro