Calibração em Química Analítica - Curva Analítica e Tratamento Estatístico

TRATAMENTO ESTATÍSTICO E CURVA ANALÍTICA 1 Livro Fundamentos de Química Analítica Skoog capítulo 5 Livro Análise Química Quantitativa Harris capítulo 4 Livro Fundamentos de Química Analítica Skoog capítulo 7 Profa Fabiana Felix fabianafelixuflabr Curva Analítica 3 GQI 110 20241 SEGUNDAFEIRA À TARDE MÉTODOS DE CALIBRAÇÃO Sinais obtidos por equipamentos e instrumentos devem ser calibrados para evitar erros nas medidas Calibração de acordo com o INMETRO é o conjunto de operações que estabelece sob condições especificadas a relação entre os valores indicados por um instrumento de medição ou sistemas de medição ou valores representados por uma medida materializada ou material de referência e os valores correspondentes das grandezas estabelecidas por padrões MÉTODOS DE CALIBRAÇÃO Modos de calibração a Calibração Pontual determinase o valor de uma constante K com um único padrão a qual expressa a relação entre a medida instrumental e a concentração do analito de interesse Esta hipótese deve ser testada experimentalmente b Calibração Multipontual calibração com mais de dois padrões O método mais empregado consiste na calibração multipontual com até 5 níveis de concentração podendo apresentar uma relação linear sensibilidade constante na faixa de concentração de trabalho ou nãolinear sensibilidade é função da concentração do analito MÉTODOS DE CALIBRAÇÃO Para muitos tipos de análises químicas a resposta para o procedimento analítico deve ser avaliado para quantidades conhecidas de constituintes chamados padrões de forma que a resposta para uma quantidade desconhecida possa ser interpretada 1 Curva de calibração externa ou curva analítica 2 Curva de adição de padrão 3 Padrão interno BRANCO Os brancos indicam a interferência de outras espécies na amostra e os traços de analito encontrados nos reagentes usados na preservação preparação e análise Medidas frequentes de brancos também permitem detectar se analitos provenientes de amostras previamente analisadas estão contaminando as novas análises por estarem aderidos aos recipientes ou aos instrumentos 1Branco do método 2Branco para reagentes 3Branco de campo BRANCO Branco de método é uma amostra que contém todos os constituintes exceto o analito e deve ser usada durante todas as etapas do procedimento analítico Branco para reagente é semelhante ao branco de método mas ele não foi submetido a todos os procedimentos de preparo de amostra Branco de campo é semelhante a um branco de método mas ele foi exposto ao local de amostragem Obs O branco de método é a estimativa mais completa da contribuição do branco para a resposta analítica sendo que sua resposta deve ser subtraída da resposta de uma amostra real antes de calcularmos a quantidade de analito na amostra CALIBRAÇÃO PONTUAL Determinação de ácido ascórbico vitamina C em suco de laranja Branco sinal 010 unidade Padrão AA 2 µmol L¹ sinal 239 unidade sinal K AA padrão 239010 K 2 K 1145 unidade L µmol¹ Amostra AA x µmol L¹ sinal 611 unidade sinal K AA padrão 611010 1145 AA AA 524 µmol L¹ 10 CURVA DE CALIBRAÇÃO EXTERNA OU CURVA ANALÍTICA 11 CURVA DE CALIBRAÇÃO EXTERNA OU CURVA ANALÍTICA Pela curva de calibração y x Intersecção Δy Δx a intersecção b coeficiente angular Δy Δx Regressão linear Determinar a melhor reta que passa pelos pontos experimentais REGRESSÃO LINEAR OU MÉTODO DOS MÍNIMOS QUADRADOS A equação de uma linha reta é y a bx y variável dependente x variável independente b inclinação da reta a intersecção no eixo dos y b n Σ x 1 y 1 Σ x 1 Σ y 1 n Σ x 1² Σ x 1 ² a y b x y média de todos os valores de y 1 x média de todos os valores de x 1 Cálculo x computador Sinal Concentração Linear Regression for Data1B Y A B X Parameter Value Error A 024 034957 B 483 142712 R 099869 045129 5 00001 Computador Equação y 024 483x e r 09987 15 Análise de variância e Análise dos resíduos validade do modelo e a significância estatística da curva analítica ajustada Quanto mais próximo de 1 maior a probabilidade de que exista uma relação linear entre as variáveis x e y Valores de r que tendem a zero indicam que x e y não estão linearmente correlacionados 18 CURVA ANALÍTICA MÉTODO DE ADIÇÃO PADRÃO O sucesso do método da curva de calibração é muito dependente da exatidão com que são conhecidas as concentrações dos padrões e quão próxima a matriz dos padrões está da matriz das amostras a serem analisadas Infelizmente estabelecer esta similaridade de matriz entre amostras complexas e padrões geralmente é difícil ou impossível de ser feita e os efeitos da matriz levam a erros de interferência Para minimizar os efeitos da matriz normalmente é necessário separar o analito do interferente antes de obter a resposta medida do instrumento 19 CURVA ANALÍTICA MÉTODO DE ADIÇÃO PADRÃO 20 CURVA ANALÍTICA MÉTODO DE ADIÇÃO PADRÃO 21 CURVA ANALÍTICA MÉTODO DE ADIÇÃO PADRÃO Avaliando o efeito matriz Esta avaliação pode ser conduzida pela comparação das inclinações de 2 curvas uma em meio aquoso água ou branco e a outra em meio à matriz Considere os exemplos a seguir determinação de Cd2 em sangue e Ca2 em urina 22 CURVA ANALÍTICA MÉTODO DE ADIÇÃO PADRÃO 23 CURVA ANALÍTICA MÉTODO DE ADIÇÃO PADRÃO 24 CURVA ANALÍTICA MÉTODO DE ADIÇÃO PADRÃO 25 CURVA ANALÍTICA MÉTODO DE ADIÇÃO PADRÃO 26 CURVA ANALÍTICA MÉTODO DO PADRÃO INTERNO Padrão interno PI 27 CURVA ANALÍTICA MÉTODO DO PADRÃO INTERNO PADRÃO INTERNO PI Características 28 CURVA ANALÍTICA MÉTODO DO PADRÃO INTERNO S1 CA f S2 PI 29 CURVA ANALÍTICA MÉTODO DO PADRÃO INTERNO PADRÃO INTERNO PI Exemplo Determinação de Na e usando Li como PI ou Na Li Sinal normalizado Figuras de mérito 30 Livro Análise Química Quantitativa Harris capítulos 4 e 5 Livro Fundamentos de Química Analítica Skoog capítulo 8 Validação A validação de um método é o processo que demonstra que um método é aceitável para a finalidade que se destina Principais figuras de mérito avaliadas Especificidade Linearidade Exatidão Precisão Limite de detecção Limite de quantificação 31 Especificidade É a capacidade de um método analítico em distinguir o analito de todo o resto que possa estar presente na amostra Eletroforese separação das substâncias pela velocidade de migração na presença de um campo elétrico 32 Linearidade Mede o quanto uma curva analítica segue uma linha reta mostrando que a resposta é proporcional à quantidade do analito Uma medida superficial mas de uso comum da linearidade é o quadrado do coeficiente de correlação Coeficiente de determinação R2 ou Coeficiente de correlação r indicam o grau de ajuste dos dados à curva e não são os mais recomendados como indicadores de linearidade 33 Intervalo linear O intervalo ou a faixa linear de um metodo analitico e o intervalo de concentracao do analito em que a resposta e proporcional a concentracao O intervalo dinamico o intervalo de concentracao em que existe uma resposta mensuravel do analito mesmo se essa resposta nao for linear 34 Exatidão Define a proximidade do valor verdadeiro Algumas maneiras para verificar a exatidão incluem Analisar material de referência Comparar resultados provenientes de dois ou mais métodos analíticos diferentes Analisar um branco que foi propositalmente contaminado fortificação por uma quantidade conhecida de analito 35 Precisão É a repetibilidade de um resultado normalmente expressa por meio de um desviopadrão Existem diferentes tipos de precisão Precisão do instrumento observada quando a mesma quantidade de uma mesma amostra é repetidamente introduzida em um instrumento Precisão intrínseca do ensaio é avaliada quando uma mesma pessoa no mesmo dia analisa várias vezes alíquotas de um material homogêneo com um mesmo equipamento Cada análise é independente 36 Precisão intermediária é observada quando um ensaio é feito por pessoas diferentes instrumentos diferentes ou dias diferentes Precisão interlaboratorial reprodutibilidade é avaliada quando alíquotas da mesma amostra são analisadas em diferentes laboratórios por pessoas diferentes Tornase pior quando o teor de analito na amostra diminui 37 Limites de detecção e quantificação Limite de detecção É a menor quantidade de analito significativamente diferente de um branco Limite de Quantificação É a menor quantidade do analito que pode ser quantificada 38 EXERCÍCIOS 40 EXERCÍCIOS 1 O técnico de laboratório de uma empresa farmacêutica encontrou um frasco com rótulo descrito glicose Para fazer a conferência do mesmo o técnico resolveu fazer uma varredura utilizando o espectrofotômetro na região do visível e a figura abaixo mostra os resultados obtidos 505 nm Em seguida o técnico resolveu construir uma curva analítica num intervalo de concentração comum de análise corriqueira de glicose no laboratório Considerando a curva abaixo e o fato de que o valor lido para a absorbância da amostra foi de 0148 qual a concentração de glicose no frasco encontrado R 88 mg mL1 EXERCÍCIOS Os dados que seguem representam áreas relativas de picos obtidas para cromatogramas de soluções padrão de metilvinilcetona MVC Concentração de MVC mmolL Área Relativa de Pico 0500 376 150 916 250 1503 350 2042 450 2533 550 3197 a Utilizando qualquer programa de computador obtenha a melhor curva analítica com os dados fornecidos bem como a equação da curva e o coeficiente de correlação b Uma amostra contendo MVC gerou uma área relativa de pico de 103 Calcule a concentração de MVC nessa solução R 169 mmol L¹ y557x 09017 R²09988 Concentração MVCmmollL Área Relativa do Pico 42 EXERCÍCIOS a Construa a curva analítica para este experimento e dê os valores da regressão linear b Calcule a Ca2 em µg L1 de uma solução de soro no qual os potenciais medidos foram n 3 107 105 107 mV Verifique a precisão e confiabilidade do método utilizado R Ca2 5819 µg L1 média S 5196 CV 089 IC95 5819 1291 µg L1 c Considerando um valor aceitável de Ca 63110 µg L1 verifique a exatidão do método R Er 78 OBS Precisão CV S 𝑥 100 Exatidão Er Xi XvXv 100 Confiabilidade CV IC e Algarismos significativos O intervalo de confiança σ não conhecido é calculado pela equação No qual t de Student é um parâmetro tabelado que depende do número de graus de liberdade e do nível de confiança desejado 43 44 EXERCÍCIOS Com os dados acima qual a concentração do analito na amostra R 560 µg mL1 45 EXERCÍCIOS Com os dados acima qual a concentração do analito na amostra R 560 µg mL1 46 EXERCÍCIOS 5 Os dados que são mostrados na tabela a seguir referemse à análise cromatográfica de naftaleno C10H8 usando naftaleno deuterado C10D8 em que D é o isótopo 2H como padrão interno Os dois compostos saem da coluna em tempos praticamente iguais e são medidos por um espectrômetro de massas a Mostre os valores da regressão linear e b sendo a razão entre os picos do analito e padrão interno APAPI 0652 calcule a concentração em mg L1 de nafataleno na amostra R 598 mg mL1 47 EXERCÍCIOS 6 Em um experimento preliminar uma solução padrão contendo 00837 mol L1 de terbutalina e 00666 mol L1 de padrão interno fornece picos com áreas de AP 423 e API 347 Para analisar a amostra desconhecida 10 mL de uma solução 0146 mol L1 do padrão interno foram adicionados a 100 mL da amostra e a mistura foi diluída a 250 mL em balão volumétrico A mistura forneceu o cromatograma da figura abaixo para o qual Aamostra 553 e API 582 Encontre a concentração de terbutalina na amostra desconhecida Dica usar SanalitoAPI k AnalitoPI R 0144 mol L1 48 EXERCÍCIOS 7 O calcário pode ser encontrado na natureza sob a forma de calcário calcítico CaCO3 Para a determinação de 020 g de cálcio em amostra de calcário fezse uma abertura de amostra em meio ácido e a solução resultante foi transferida para um balão volumétrico de 100 mL bem como seu volume completado com água destilada Em seguida 10 mL desta solução foram transferidas para um Erlenmeyer de 250 mL com adição de 10 gotas de trietanolamina e aproximadamente 005 g de indicador apropriado foi adicionado Esta solução final foi titulada com EDTA 001 mol L1 em triplicata n 3 e os volumes gastos do titulante foram 220 221 e 220 mL Dados MMCa2 40 gmol Calcule a concentração em mm de calcário na amostra e verifique a precisão do método utilizado R C 4407 012 mm CV 026 e IC 4407 016