Slide - Aula 17 Cromatografia Gasosa 2021-1

1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL UBERLÂNDIA CAMPUS DE PATOS DE MINAS ENGENHARIA DE ALIMENTOS QUÍMICA ANALÍTICA Prof. Dra. DJENAINE DE SOUZA 1) O que é a Cromatografia Gasosa 2) Instrumentos para Cromatografia Gasosa a) Sistema de Gás de Arraste; b) Sistema de Ingestão da Amostra; c) Colunas e fornos para colunas; d) Sistemas de detecção. 3) Aplicações 2 3 A cromatografia gasosa é uma técnica empregada na análise de substâncias voláteis e termicamente estáveis. Ao realizar-se uma separação por cromatografia gasosa, a amostra é vaporizada e injetada na cabeça da coluna cromatográfica. 1) O QUE É A CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) A eluição é feita por um fluxo de fase móvel gasosa inerte. A fase móvel não interage com as moléculas do analito; sua única função é transportar o analito através da coluna. Na cromatografia gasosa, os componentes de uma amostra vaporizada são separados em conseqüência de sua partição entre uma fase móvel gasosa e uma fase estacionária líquida ou sólida contida dentro da coluna. 1 2 3 2 4 Cromatografia gás-líquido (CGL) cromatografia gás-sólido (CGS) É baseada na partição do analito entre a fase móvel gasosa e uma fase líquida imobilizada na superfície de um material sólido inerte de recheio ou nas paredes de um tubo capilar. Na cromatografia gás-líquido, a fase móvel é um gás, enquanto a fase estacionária é um líquido retido na superfície de um sólido inerte por adsorção ou ligação química. Na cromatografia gás-sólido, a fase móvel é um gás, ao passo que a fase estacionária é um sólido que retém os analitos por adsorção física. Permite a separação de gases de baixa massa molecular, como os componentes do ar, sulfeto de hidrogênio, monóxido de carbono e óxido de nitrogênio. 5 CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e sejam termicamente estáveis. As amostras devem ser solúveis no gás de arraste. • Rapidez • Alto poder de separação • Separação de várias classes de compostos em uma análise • SENSIBILIDADE (ppm - ppb) • Facilidade de registrar dados • Variedade de detetor (SELETIVIDADE) • Amostras voláteis • Compostos termicamente estáveis 6 1 – Amostra é vaporizada na câmara de injeção da amostra. 2 – Amostra é eluída através da coluna utilizando-se um gás de arraste. 3 – A coluna é abrigada dentro de um forno termostatizado, para garantir a vaporização da amostra e uma boa eficiência na eluição. 4 – Amostra atravessa a coluna e chega a um detector (converte a quantidade de amostra em um sinal elétrico. 5 – Analisador e programador. Interface. 4 5 6 3 7 2) INSTRUMENTOS PARA CROMATOGRAFIA GASOSA a) Sistema de Gás de Arraste A fase móvel em cromatografia gasosa é denominada gás de arraste e deve ser quimicamente inerte. Ele não interage com a amostra, apenas a arrasta através da coluna. O hélio é a fase móvel gasosa mais comum, embora o argônio, o nitrogênio e o hidrogênio sejam também empregados. INERTE: Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito caros. COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento. estão disponíveis em cilindros pressurizados 9 Reguladores de pressão, manômetros e medidores de vazão são necessários para se controlar a vazão do gás. Regulador de vazão Cilindro de gás Regulador de pressão primário “Traps” para eliminar impurezas do gás Regulador de pressão secundário Medidor de vazão (Rotâmetro) As pressões de entrada situam-se na faixa de 10 a 50 psi (libras/polegada2) acima da pressão ambiente, o que produz vazões de 25 a 150 mL min–1 em colunas recheadas e de 1 a 25 mL min–1 para as colunas capilares de tubo aberto. As vazões serão constantes se a pressão de entrada permanecer constante. As vazões podem ser estabelecidas por meio de um rotâmetro colocado na cabeça da coluna. 7 8 9 4 10 Se a vazão é baixa ocorre alargamento das bandas devido a difusão longitudinal, entretanto se a vazão é muito alta ocorre o alargamento pela velocidade finita da transferência de massa. 11 b) Sistema de Ingestão da Amostra A eficiência da coluna requer que a amostra seja de tamanho adequado e introduzida como uma zona “estreita” de vapor; a injeção lenta ou de amostras muito volumosas causa o espalhamento das bandas e uma resolução pobre. Os líquidos são injetados utilizando-se SERINGAS ou VÁLVULAS DE AMOSTRAGEM. O injetor de amostra comumente é mantido a cerca de 50ºC acima do ponto de ebulição do componente menos volátil da amostra. 12 A porta de admissão da amostra ordinariamente é mantida a cerca de 50oC acima do ponto de ebulição do componente menos volátil da amostra. 10 11 12 5 13 Se os analitos de interesse constituem >0,1 % da amostra, é preferível, normalmente, utilizar-se injeção com divisão de fluxo. De 0,1 a 10% da amostra injetada alcançam a coluna cromatográfica. 14 Para a análise de traços, que constituem menos do que 0,01% da amostra, a injeção sem divisão de fluxo é apropriada. A amostra é diluída em um solvente. A temperatura inicial da coluna é ajustada em 40°C abaixo do ponto de ebulição do solvente, que, portanto, condensa no início da coluna. 80% da amostra injetada alcança a coluna cromatográfica. É usada para amostras que se decompõem acima dos seus pontos de ebulição e é preferida para análise quantitativa. A solução é injetada diretamente dentro da coluna sem passar através do injetor aquecido. 15 13 14 15 6 16 ∅ ∅∅ ∅ = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio) ∅ ∅∅ ∅ = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de µµµµ m) de FE líquida ou sólida c) Colunas e fornos para colunas Dois tipos gerais de colunas são encontrados em cromatografia gasosa: colunas empacotadas (recheadas) e colunas capilares. 17 A colunas de parede recoberta são simplesmente tubos capilares recobertos com uma fina camada de fase estacionária líquida. Nas colunas revestidas com suporte, a superfície interna do capilar é revestida com um filme fino (30 µm) de um material de suporte, com terra diatomácea. Esse tipo de coluna retém uma quantidade de fase estacionária muitas vezes maior que uma coluna de parede recoberta e assim apresenta maior capacidade de amostra. 18 As colunas capilares mais empregadas são as colunas tubulares abertas de sílica fundida (CTAS) – FSOT, do inglês fused-silica open tubular. Os capilares de sílica fundida são puxados a partir de sílica purificada especial que contém quantidades mínimas de óxidos metálicos. Esses capilares apresentam paredes muito mais finas que os de vidro. Os tubos têm sua resistência reforçada por meio do recobrimento externo de proteção de poliimida, o qual é aplicado à medida que o tubo capilar é puxado. As colunas resultantes são bastante flexíveis e podem ser enroladas em bobinas com diâmetros de poucas polegadas. • resistência física, • reatividade muito menor em relação aos componentes da amostra • flexibilidade. 16 17 18 7 19 As colunas recheadas são atualmente fabricadas de tubos de vidro ou metal; elas apresentam um comprimento típico entre 2 e 3 m e diâmetro interno de 2 a 4 mm. Esses tubos são densamente recheados com um material uniforme e finamente dividido, ou suporte sólido, que é recoberto com uma camada fina (0,05 a 1 mm) de fase estacionária líquida. Os tubos são enrolados na forma de bobinas com diâmetros aproximados de 15 cm para possibilitar uma termostatização conveniente no forno. 20 20 características de desempenho de colunas capilares de sílica fundida com outros tipos de colunas de parede recoberta, bem como com as de colunas com suporte revestido e recheadas. 21 21 Materiais Sólidos de Suporte em colunas recheadas O recheio, ou suporte sólido em uma coluna recheada, serve para fixar a fase estacionária líquida de forma que a maior área superficial possível esteja exposta à fase móvel. O suporte ideal consiste em pequenas partículas uniformes e esféricas com boa resistência mecânica e com uma área superficial de pelo menos 1 m2/g. o material deve ser inerte a temperaturas elevadas e deve ser molhado uniformemente pela fase líquida. Consiste em esqueletos de milhares de espécies de plantas unicelulares que habitaram os antigos lagos e mares). Esses materiais de suporte são freqüentemente tratados quimicamente com dimetilclorosilano, o qual produz uma camada de grupos metila. Esse tratamento reduz a tendência de o recheio absorver moléculas polares. Materiais Sólidos de Suporte em colunas recheadas O recheio, ou suporte sólido em uma coluna recheada, serve para fixar a fase estacionária líquida de forma que a maior área superficial possível esteja exposta à fase móvel. 19 20 21 8 22 Tamanho de Partículas dos Suportes A eficiência de uma coluna cromatográfica aumenta rapidamente com a diminuição do diâmetro de partícula do recheio. A diferença de pressão requerida para manter uma vazão aceitável do gás de arraste varia de forma inversa com o quadrado do diâmetro de partícula. 23 BAIXA VOLATILIDADE: idealmente, o ponto de ebulição do líquido deve ser pelo menos 100° C maior que a temperatura máxima de operação da coluna; ESTABILIDADE TÉRMICA; INÉRCIA QUÍMICA e CARACTERÍSTICAS DE SOLVENTE: apropriadas para que os valores de k e α para os solutos a serem resolvidos caiam dentro de uma faixa adequada. A escolha apropriada de uma fase estacionária é frequentemente crucial para o sucesso de uma separação. Materiais para fases estacionárias líquidas O tempo de retenção para um analito na coluna depende da sua constante de distribuição que, por sua vez, está relacionada com a natureza química da fase estacionária. Para separar os vários componentes de uma amostra, suas constantes de distribuição devem ser suficientemente diferentes para possibilitar uma separação bem definida. 24 A escolha da fase estacionária líquida é baseada na regra “semelhante dissolve semelhante”. Colunas polares são melhores para solutos polares e colunas apolares melhores para solutos apolares. As fases estacionárias polares contêm grupos como —CN, —CO e —OH. As fases estacionárias do tipo hidrocarbonetos e os dialquil siloxanos são apolares, enquanto as fases de poliésteres são altamente polares. os solutos de polaridade média englobam os éteres, as cetonas e os aldeídos. Os hidrocarbonetos saturados são apolares. 22 23 24 9 25 polidimetilsiloxano, os grupos —R são todos —CH3, definindo um líquido que é relativamente não-polar. uma fração dos grupos metílico é substituída por grupos funcionais como fenil (—C6H5), cianopropil(— C3H6CN) e trifluoropropil (—C3H6CF3). 26 Assim, a coluna é normalmente abrigada em um forno termostatizado. A temperatura ótima da coluna depende do ponto de ebulição da amostra e do grau de separação requerido. Efeitos da temperatura da coluna Se a temperatura da coluna é aumentada, a pressão de vapor do soluto aumenta e o tempo de retenção diminuí. Para as amostras com uma ampla faixa de ponto de ebulição, é desejável que se empregue uma programação de temperatura, pela qual a temperatura da coluna é aumentada, quer seja continuamente quer em etapas, à medida que a separação se processa. 25 26 27 10 O aumento da temperatura da coluna: - Diminui o tempo de retenção - Torna os picos mais finos 29 30 d) Sistemas de detecção DETECTOR é um dispositivo que indica os componentes separados pela coluna. Examinam continuamente o material, gerando um sinal na passagem de substâncias que foram separadas. 1. Sensibilidade adequada. Em geral, as sensibilidades nos detectores atuais situam- se na faixa de 10–8 a 10–15 g do soluto/s. 2. Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3. Resposta linear aos solutos que se estenda a várias ordens de grandeza. 4. Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400° C. 5. Um tempo de resposta curto e independente da vazão. 6. Uma alta confiabilidade e facilidade de uso. O detector deve, na medida do possível, tolerar a ação de operadores inexperientes. 7. Similaridade de resposta a todos os solutos ou, alternativamente, uma resposta altamente previsível e seletiva a uma ou mais classes de solutos. 8. Não deve destruir a amostra. 28 29 30 11 31 nenhum detector existente atualmente exibe todas essas características 32 o efluente da coluna é dirigido para uma pequena chama de ar/hidrogênio. A maioria dos compostos orgânicos produz íons e elétrons quando pirolizados à temperatura de uma chama ar/hidrogênio. A detecção envolve o monitoramento da corrente produzida pela coleta das espécies ionizadas ( portadores de carga). Poucas centenas de volts são aplicadas entre a ponta do queimador e um eletrodo, localizado acima da chama, serve para coletar os íons e elétrons. A corrente resultante (10–12 A) é medida com um picoamperímetro. 33 O detector de ionização exibe uma sensibilidade alta (10–13 g s–1), larga faixa linear de resposta (107) e baixo ruído. Geralmente é robusto e fácil de se usar. Uma desvantagem do detector de ionização em chama é que ele destrói a amostra durante a etapa de combustão. DIC responde à maioria dos hidrocarbonetos e não apresenta sensibilidade a substâncias que não sejam hidrocarbonetos, como H2, He, N2, O2, Co, CO2, H2O, NH3, NO, H2S E SIF4. Útil para a análise de amostras orgânicas, incluindo aquelas contaminadas com água e com óxidos de nitrogênio e enxofre. 31 32 33 12 34 A condutividade térmica consiste na capacidade do analito em transportar calor. O DCT consiste em uma fonte aquecida eletricamente cuja temperatura à potência elétrica constante depende da condutividade térmica do gás que a envolve. Filamento de tungstênio/rênio aquecido que tem uma determinada condutividade térmica (constante). Não há diferença de potencial elétrico. Quando o soluto emerge da coluna a condutividade térmica do fluxo gasoso diminui, o filamento torna-se mais quente e sua resistência elétrica aumenta. Mede-se a diferença de potencial elétrico na saída do amplificador. 35 Empregados para as amostras ambientais em virtude de ele responder seletivamente aos compostos orgânicos contendo halogênios, como pesticidas e bifenilas policloradas (eletrófilos). Um elétron do emissor causa a ionização do gás carregador freqüentemente nitrogênio) e a produção de uma rajada de elétrons (partículas β). Na ausência de espécies orgânicas, produz-se uma corrente constante entre um par de eletrodos em decorrência desse processo de ionização. Contudo, a corrente decresce significativamente na presença de moléculas orgânicas que contêm grupos funcionais eletronegativos que tendem a capturar elétrons. 36 2 - O gás de arraste entre no detector e é ionizado por elétrons de alta energia (raios β) emitidos por uma lâmina do isótopo radiativo de 63Ni. 3 - Um fluxo contínuo de elétrons lentos é estabelecido entre um anôdo (fonte radioativa β -emissora) e um catodo. 5 – Quando moléculas do analito com alta afinidade por elétrons entram no detector elas capturam alguns dos elétrons, reduzindo a corrente. 4 - Entrada da coluna contendo gás de arraste e a amostras 1- Raios β são emitidos por uma lâmina do isótopo radiativo de 63Ni. Para que a corrente que flui entre ânodo e cátodo seja constante, o detector se ajusta variando a frequência dos pulsos elétricos. 34 35 36 13 37 Um espectrômetro de massas mede a razão massa/carga (m/z) de íons que são produzidos pela amostra. A maioria dos íons produzidos apresenta uma carga unitária (z = 1), de forma que a maioria dos espectrometristas de massas refere-se à medida de massa dos íons quando, na verdade, a razão massa/carga é que é medida. Espectro de massas de uma molécula simples, CO2 O (m/z 16) CO (m/z 28) CO2 (m/z 44) C (m/z 12) 38 1 - As moléculas da amostra entram no espectrômetro de massas pelo sistema de entrada. Em CG, a amostra está na forma de vapor e a entrada deve ser interfaceada entre a pressão atmosférica do sistema de CG e a baixa pressão (10–5 a 10–8) do sistema do espectrômetro de massas. Um sistema complexo de vácuo é necessário para manter a pressão baixa. 2 - As moléculas da amostra entram em uma fonte de ionização que decompões a amostra em íons mais simples. 3 - Os íons das moléculas da amostra, denominados íons moleculares, íons de fragmentos e moléculas não-ionizadas, saem da fonte de ionização e vão para o analisador. 4 - O analisador serve para selecionar os íons de acordo com seus valores m/z. 5 - Os íons separados são então detectados e um gráfico contendo a intensidade do sinal gerado pelo íon versus m/z é produzido pelo sistema de dados. 39 1 - Os sólidos podem ser colocados na ponta de um bastão, inseridos na câmara de vácuo e evaporados ou sublimados por aquecimento. 2 - Os líquidos podem ser introduzidos através de entradas com fluxo controlado ou podem ser desorvidos de uma superfície sobre a qual foram colocados, formando um filme fino. Geralmente, as amostras para espectrometria de massas devem ser puras porque a fragmentação que ocorre leva a uma interpretação muito difícil de espectros de misturas. Diferentes métodos de introdução das amostras A cromatografia gasosa constitui uma forma ideal de introduzir misturas, pois os seus componentes são separados pela CG antes da sua introdução no espectrômetro de massas. 37 38 39 14 40 Umas das mais empregadas é de impacto de elétrons (IE). Nessa fonte, as moléculas são bombardeadas com um feixe de elétrons de alta energia. Isso produz íons positivos, íons negativos e espécies neutras. Os íons positivos são dirigidos para o analisador por repulsão eletrostática. O feixe de elétrons é tão energético que muitos fragmentos são produzidos. Esses fragmentos, contudo, são muito úteis na identificação das espécies moleculares que entram no espectrômetro de massas. Somente o impacto de elétrons e a ionização química são empregados junto à CG-MS. 41 O analisador de massas separa os íons de acordo com os valores de m/z. Os analisadores mais comuns para CG-EM são os filtros de massa tipo quadrupolo e os que empregam armadilha de íons (ion trap). Os espectrômetros de massas de alta resolução utilizam o analisador de duplo foco, o analisador de ressonância ciclotrônica ou o analisador de tempo de vôo. 42 Os íons são detectados após colidirem com a superfície de um detector. As colisões causam a emissão de elétrons, fótons ou outros íons. Estes podem ser medidos por detectores de carga ou radiação. FOTOMULTIPLICADORA é um detector de alta sensibilidade 40 41 42 15 43 44 3) APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA GASOSA • Análise de ácidos graxos e triglicerídeos • Análise de micotoxinas • Análise de compostos voláteis responsáveis pelo aroma característico de alimentos • Análise de açucares • Análise de amino ácidos • Análise de pesticidas • Biodiesel • Análise de fármacos. 43 44 45 Figura 13.10\nEspectros GS-MS del aceite esencial de Lantana camara. Monoterpenos oxigenados: 26.7% Di(?)-pi-esclareol (1.9%) Sesquiterpeno-H: 48.70% (40% amorfa-4, 11 dieno, 0.9% biciclogermacreno, 2.1% beta-sesquiphellandreno)\nCompuesto bifásico sin pigmento (faltante)\nCromo de 12 A" sq-10' zirconia de...