Princípios de Bioquímica de Lehninger - 6ª Edição

Princípios de bioquímica de Lehninger chega à 6ª edição com a qualidade e os diferenciais que o tornaram um clássico na área o texto claro e objetivo as explicações cuidadosas de conceitos complexos e a compreensão dos meios pelos quais a bioquímica é entendida e aplicada atualmente o mantêm como a referência ideal na área A relevância da bioquímica nos mecanismos moleculares das doenças é destaque também nesta nova edição enfocando seu papel fundamental nos avanços da saúde e do bemestar humano e incorporando os mais recentes avanços científicos Visite a Área do Professor em para ter acesso às imagens da obra em formato PowerPoint extremamente úteis como recurso didático em sala de aula wwwgrupoacombr Em você terá acesso a recursos adicionais em inglês citados ao longo do livro wwwwhfreemancomlehninger6e Equipe de tradução Ana Beatriz Gorini da Veiga Capítulo 27 Professora adjunta da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre UFCSPA Doutora em Biologia Celular e Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS Angelica Rosat Consiglio Capítulo 11 Professora associada do Departamento de Biofísica do Instituto de Biociências e Professora do Programa de PósGraduação em Enfermagem da UFRGS Mestre e Doutora em Ciências Biológicas Fisiologia pela UFRGS Pósdoutora pela Tufts University EUA Carla Dalmaz Capítulos 18 e 22 Professora associada do Departamento de Bioquímica da UFRGS Doutora em Bioquímica pela Universidade Federal do Paraná UFPR Carlos Termignoni Capítulo 6 Professor associado do Centro de Biotecnologia e Departamento de Bioquímica da UFRGS Mestre e Doutor em Biologia Molecular pela Escola Paulista de Medicina Universidade Federal de São Paulo EPMUNIFESP Diego Bonatto Capítulos 25 e 26 Mestre e Doutor em Biologia Celular e Molecular pela UFRGS Hugo Verli Capítulo 3 Professor adjunto do Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia da UFRGS Doutor em Biologia Celular e Molecular pela UFRGS Lúcia Rebello Dillenburg Capítulos 19 e 20 Professora associada do Departamento de Botânica da UFRGS Doutora em Botânica pela University of Maryland College Park EUA Luís Fernando Marques Dorvillé Capítulos 3 9 25 26 e 28 Índice Professor adjunto de Ciências Biológicas do Departamento de Ciências da Universidade do Estado do Rio de Janeiro Doutor em Educação pela Universidade Federal Fluminense UFF Maria Luiza Saraiva Pereira Capítulos 8 e 24 Professora associada do Departamento de Bioquímica da UFRGS Mestre em Ciências Biológicas Bioquímica pela UFRGS Doutora em Biologia Molecular pela United Medical and Dental Schools of Guys and St Thomass Hospitals University of London United Kingdom UK Michele Bastiani Capítulos 7 12 e 16 Farmacêutica Mestre em Biologia Celular e Molecular pela UFRGS Doutora em Biologia Celular pelo Institute for Molecular Bioscience University of Queensland Austrália Renato Moreira Rosa Capítulos 9 e 28 Mestre e Doutor em Bioquímica pela UFRGS Sandra Estrazulas Farias Iniciais Capítulos 5 15 e 23 Abreviaturas Glossário e Créditos Professora associada do Departamento de Fisiologia e Centro de Biotecnologia da UFRGS Doutora em Bioquímica e Biologia Molecular pela EPMUNIFESP Simone Köbe de Oliveira Capítulos 4 10 13 14 17 e 21 Doutora em Ciências pela UFRGS PósDoutoranda em Biotecnologia e Biociências na Universidade Federal de Santa Catarina UFSC Tarso Ledur Kist Capítulos 1 e 2 Professor associado da UFRGS Doutor pela Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro PUCRio e PósDoutor pela Faculty of Science University of Ottawa Canadá e pelo Max Planck Institute for Molecular Genetics Berlim Alemanha Nelson6edIniciaisindd ii Nelson6edIniciaisindd ii 170414 1701 170414 1701 Professor of Biochemistry University of WisconsinMadison Professor of Biochemistry University of WisconsinMadison Revisão técnica desta edição Carlos Termignoni Capítulos 10 13 14 15 16 e 17 Professor associado do Centro de Biotecnologia e do Departamento de Bioquímica da UFRGS Mestre e Doutor em Biologia Molecular pela Escola Paulista de Medicina Universidade Federal de São Paulo EPMUNIFESP Gaby Renard Capítulos 5 8 9 25 26 e 27 Pesquisadora da Quatro G Pesquisa e Desenvolvimento Ltda TECNOPUC Mestre e Doutora em Ciências Biológicas Bioquímica pela UFRGS Maria Luiza Saraiva Pereira Capítulos 18 20 21 22 e 28 Iniciais Abreviaturas Glossário Créditos e Índice Professora associada do Departamento de Bioquímica da UFRGS Doutora em Biologia Molecular pela United Medical and Dental Schools of Guys and St Thomass Hospitals University of London United Kingdom UK Sandra Estrazulas Farias Capítulos 1 2 3 4 6 7 11 12 19 23 e 24 Professora associada do Departamento de Fisiologia e do Centro de Biotecnologia da UFRGS Doutora em Bioquímica e Biologia Molecular pela EPMUNIFESP 2014 Versão impressa desta obra 2014 Nelson6edIniciais6edeletronicaindd iii Nelson6edIniciais6edeletronicaindd iii 060614 1359 060614 1359 Reservados todos os direitos de publicação em língua portuguesa à ARTMED EDITORA LTDA uma empresa do GRUPO A EDUCAÇÃO SA Av Jerônimo de Ornelas 670 Santana 90040340 Porto Alegre RS Fone 51 30277000 Fax 51 30277070 É proibida a duplicação ou reprodução deste volume no todo ou em parte sob quaisquer formas ou por quaisquer meios eletrônico mecânico gravação fotocópia distribuição na Web e outros sem permissão expressa da Editora Unidade São Paulo Av Embaixador Macedo Soares 10735 Pavilhão 5 Cond Espace Center Vila Anastácio 05095035 São Paulo SP Fone 11 36651100 Fax 11 36671333 SAC 0800 7033444 wwwgrupoacombr IMPRESSO NO BRASIL PRINTED IN BRAZIL Obra originalmente publicada por WHFreeman and Company New York sob o título Lehninger principles of biochemistry 6th edition ISBN 9781429234146 First published in the United States by WHFreeman and Company New York Copyright 2013 WHFreeman and Company All rights reserved Gerente editorial Letícia Bispo de Lima Colaboraram nesta edição Editora Simone de Fraga Assistente editorial Mirela Favaretto Arte sobre capa original Márcio Monticelli Preparação de originais Henrique de Oliveira Guerra Leitura final Carine Garcia Prates e Heloísa Stefan Editoração Techbooks Catalogação na publicação Ana Paula M Magnus CRB 102052 N425p Nelson David L Princípios de bioquímica de Lehninger recurso eletrônico David L Nelson Michael M Cox tradução Ana Beatriz Gorini da Veiga et al revisão técnica Carlos Termignoni et al 6 ed Dados eletrônicos Porto Alegre Artmed 2014 Editado também como livro impresso em 2014 ISBN 9788582710739 1 Bioquímica I Cox Michael M II Título CDU 577 Nelson6edIniciais6edeletronicaindd iv Nelson6edIniciais6edeletronicaindd iv 060614 1359 060614 1359 Para nossos Professores Albert Finholt Arthur Kornberg David E Sheppard Earl K Nelson Eugene P Kennedy Harold B White Homer Knoss I Robert Lehman Paul R Burton Wesley A Pearson William P Jencks Nelson6edIniciaisindd v Nelson6edIniciaisindd v 170414 1701 170414 1701 Nota Assim como a medicina a bioquímica é uma ciência em constante evolução À medida que novas pesquisas e a própria experiência clínica ampliam o nosso conhecimento são necessárias modificações na terapêutica onde também se insere o uso de medicamentos Os autores desta obra consultaram as fontes consideradas confiáveis num esforço para oferecer informações completas e geralmente de acordo com os padrões aceitos à época da publicação Entretanto tendo em vista a possibilidade de falha humana ou de alterações nas ciências médicas os leitores devem confirmar estas informações com outras fontes Por exemplo e em particular os leitores são aconselhados a conferir a bula completa de qualquer medica mento que pretendam administrar para se certificar de que a informação contida neste livro está correta e de que não houve alteração na dose recomendada nem nas precauções e contraindicações para o seu uso Essa recomendação é par ticularmente importante em relação a medicamentos introduzidos recentemente no mercado farmacêutico ou raramente utilizados Nelson6edIniciaisindd vi Nelson6edIniciaisindd vi 170414 1701 170414 1701 Sobre os Autores David L Nelson nascido em Fairmont Minnesota formou se em Química e Biologia no St Olaf College em 1964 e obte ve o doutorado em Bioquímica pela Stanford Medical School sob a orientação de Arthur Kornberg Foi pósdoutorando na Harvard Medical School sob supervisão de Eugene P Kennedy um dos primeiros estudantes graduados de Albert Lehninger Em 1971 Nelson ingressou na University of WisconsinMadison e tornouse professor catedrático de bioquímica em 1982 Foi diretor do Center for Biology Education na University of WisconsinMadison por oito anos O trabalho de pesquisa de Nelson está focado nas transdu ções de sinal que regulam o movimento ciliar e a exocitose no protozoário Paramecium As enzimas envolvidas incluindo uma grande variedade de proteínascinases são os principais objetos de estudo Seu grupo de pesquisa tem utilizado purifi cação enzimática técnicas imunológicas microscopia eletrôni ca genética biologia molecular e eletrofisiologia para estudar esses processos David Nelson tem uma história notável como professor universitário e supervisor de pesquisa Por 40 anos lecionou cursos intensivos de bioquímica para estudantes de graduação em bioquímica avançada Também lecionou bioquímica para estudantes de enfermagem e cursos de graduação sobre es trutura e função de membrana e neurobiologia molecular Foi orientador de inúmeros trabalhos de doutorado mestrado e de graduação tendo recebido prêmios por sua docência incluin do o Prêmio Dreyfus TeacherScholar o Atwood Distinguished Professorship e o Prêmio Unterkofler Excellence in Teaching da University of Wisconsin Entre os anos de 1991 a 1992 foi professor visitante de química e biologia no Spelman College Seu segundo amor é a história motivo pelo qual começou a en sinar história da bioquímica para estudantes de graduação e a colecionar instrumentos científicos antigos para serem usados em um curso de técnicas de laboratório que ele ministra Michael M Cox nasceu em Wilmington Delaware No seu primeiro curso de bioquímica o livro Princípios de Bioquí mica de Lehninger teve uma grande influência no redirecio namento do seu fascínio pela biologia e o inspirou a seguir a carreira de bioquímico Depois de graduarse pela University of Delaware em 1974 Cox ingressou na Brandeis University onde realizou seu trabalho de doutorado com William P Jen cks Depois partiu para Stanford em 1979 para fazer o pósdou torado com I Robert Lehman Mudouse para a University of WisconsinMadison em 1983 e tornouse professor catedrático de bioquímica em 1992 O trabalho de doutorado de Cox foi sobre catálise geral acidobásica como um modelo para as reações catalisadas por enzimas Em Stanford começou a trabalhar com as enzimas envolvidas na recombinação genética O trabalho enfocava principalmente a proteína RecA com o desenvolvimento de métodos de purificação e ensaios que ainda estão em uso e o esclarecimento do processo de migração do DNA na descen dência O estudo das enzimas da recombinação genética per manece como tema central de sua pesquisa Michael Cox coordena um grande e ativo grupo de pesqui sa em Wisconsin investigando a enzimologia a topologia e a energética da recombinação genética Seu foco principal está no mecanismo de troca de fita de DNA mediada pela proteína RecA o papel do ATP no sistema RecA e a regulação do reparo por recombinação do DNA Parte do programa de pesquisa está focado nos organismos que exibem uma grande capacidade de reparo do DNA tal como Deinococcus radiodurans e a apli cação desses sistemas de reparo na biotecnologia Durante quase 30 anos Cox tem lecionado juntamente com David L Nelson em cursos intensivos de bioquímica para estudantes de graduação e sobre estrutura e topologia de DNA interações DNAproteína bem como a bioquímica da re combinação em cursos de pósgraduação Os projetos mais re centes consistem na organização de um novo curso sobre res ponsabilidade profissional para estudantes do primeiro ano da pósgraduação e o estabelecimento de um programa sistemáti co para atrair para o laboratório estudantes de bioquímica ta lentosos em um estágio inicial de suas carreiras universitárias Recebeu prêmios por suas atividades tanto de ensino como de pesquisa incluindo o Prêmio Dreyfus TeacherScholar em 1989 o Prêmio da Eli Lilly em química biológica e em 2009 o Prêmio Regents Teaching Excellence da University of Wiscon sin Ele é também muito ativo nos esforços nacionais de prover novas diretrizes para a educação em bioquímica no nível de graduação Seus hobbies incluem a transformação de 18 acres de uma fazenda no Wisconsin em um arboreto coleção de vi nhos e participação em projetos de prédios de laboratórios David L Nelson e Michael Cox Nelson6edIniciaisindd vii Nelson6edIniciaisindd vii 170414 1701 170414 1701 Nota sobre a Natureza da Ciência N o século XXI a educação científica com frequência deixa de lado o suporte filosófico da ciência ou confia em defi nições simplificadas demais Se você pretende seguir uma carreira em ciências pode ser útil considerar uma vez mais os termos ciência cientista e método científico Ciência é tanto um modo de pensar sobre o mundo natu ral como a soma das teorias e informações que resultam desse pensamento O poder e o sucesso da ciência resultam direta mente da confiança nas ideias a serem testadas informação sobre fenômenos naturais que podem ser observados medidos e reproduzidos além de teorias que têm valor prognóstico O progresso da ciência se baseia em uma suposição fundamental muitas vezes não explícita mas crucial para a empreitada a de que as leis que governam as forças e os fenômenos existentes no universo não estão sujeitas a mudanças O ganhador do Prê mio Nobel Jacques Monod se referiu a essa suposição como o postulado da objetividade Assim o mundo natural pode ser compreendido aplicandose um processo de questionamento o método científico A ciência não poderia ter sucesso em um universo que nos pregasse peças Diferentemente do postulado da objetividade a ciência não faz nenhuma afirmativa inviolá vel sobre o mundo natural Uma ideia científica útil é aquela que 1 tenha sido ou possa ser mensurada de maneira repro duzível e 2 pode ser utilizada para prever novos fenômenos de maneira precisa As ideias científicas podem assumir muitas formas Os ter mos que os cientistas utilizam para descrevêlas têm significa dos bem diferentes daqueles aplicados por não cientistas Uma hipótese é uma ideia ou afirmação que fornece uma explicação razoável ou testável para uma ou mais observações mas talvez não tenha ampla comprovação experimental Uma teoria cien tífica é muito mais do que um palpite É uma ideia comprovada até certo ponto e que fornece informações para um corpo de observações experimentais Uma teoria pode ser testada e de senvolvida constituindo assim uma base para avanços e ino vações Quando uma teoria científica é repetidamente testada e validada em várias frentes pode ser aceita como fato É importante ressaltar que aquilo que constitui a ciência ou uma ideia científica se define pelo fato de ser ou não publi cado na literatura científica após ter sido revisado por outros cientistas Cerca de 16 mil revistas científicas revisadas por cientistas publicam no mundo todo por volta de 14 milhão de artigos a cada ano uma rica e contínua safra de informações que é patrimônio de todo ser humano Cientistas são indivíduos que aplicam rigorosamente o método científico para compreender o mundo natural O fato de ser graduado em determinada disciplina não torna a pessoa um cientista nem a falta de tal graduação impede que alguém faça importantes contribuições científicas Um cientista pre cisa ter o ímpeto de desafiar uma ideia quando novos achados o exigem As ideias que um cientista aceita devem ser funda mentadas em observações reproduzíveis e mensuráveis rela tando essas observações com total honestidade O método científico é na realidade uma coleção de ca minhos todos levando a uma descoberta científica No caminho da hipótese e experimentação o cientista levanta uma hipóte se e a submete a um teste experimental Muitos processos com os quais os bioquímicos trabalham todos os dias foram desco bertos dessa maneira A estrutura do DNA elucidada por James Watson e Francis Crick levou à hipótese de que os pares de ba ses constituíam a base para a transferência de informações na síntese de polinucleotídeos Essa hipótese ajudou a inspirar a descoberta da DNApolimerase e da RNApolimerase Watson e Crick produziram sua estrutura do DNA por meio de um processo de construção de modelo e cálculo Não hou ve experimento real envolvido embora a construção do mo delo e os cálculos realizados tenham utilizado dados coletados por outros cientistas Muitos cientistas aventureiros aplicaram o processo de exploração e observação como um caminho para a descoberta Viagens históricas de descoberta entre elas a de Charles Darwin no HMS Beagle em 1831 ajudaram no mapeamento do planeta na catalogação dos seres vivos e modificaram a forma como encaramos o mundo Os cientistas modernos seguem um caminho semelhante quando exploram as profundezas do oceano ou lançam sondas para outros pla netas Um processo análogo ao da hipótese e experimentação é o da hipótese e dedução Crick fundamentou que deveria existir uma molécula adaptadora que facilitasse a tradução da informação do RNA mensageiro em proteína Essa hipótese do adaptador levou à descoberta do RNA de transferência por Mahlon Hoagland e Paul Zamecnik Nem todos os caminhos para a descoberta envolvem plane jamento Frequentemente a sorte também faz sua parte A des coberta da penicilina por Alexander Fleming em 1928 e dos RNA catalisadores por Thomas Cech no início dos anos 1980 foram duas descobertas feitas por um golpe de sorte embora alcançadas por cientistas bem preparados para explorálas A inspiração também pode levar a importantes avanços A rea ção em cadeia da polimerase PCR que atualmente constitui parte central da biotecnologia foi desenvolvida por Kary Mullis após um lampejo de inspiração durante uma viagem pelo norte da Califórnia em 1983 Esses diversos caminhos que levam à descoberta científi ca podem parecer um tanto diferentes mas têm importantes aspectos em comum Eles se concentram no mundo natural Baseiamse na observação eou experimentação reproduzí veis Todas as ideias palpites e fatos experimentais que se ori ginam dessas empreitadas podem ser testados e reproduzidos por cientistas em qualquer lugar do mundo Todos podem ser utilizados por outros cientistas para construir novas hipóteses e fazer novas descobertas Todos levam à informação que é incluída apropriadamente no mundo da ciência A compreen são do universo requer trabalho árduo Ao mesmo tempo ne nhuma jornada humana é mais empolgante e potencialmente recompensadora do que a tentativa às vezes bemsucedida de compreender parte do mundo natural Nelson6edIniciaisindd viii Nelson6edIniciaisindd viii 170414 1701 170414 1701 Prefácio À medida que completamos a 6 a edição da obra Princípios de Bioquímica de Lehninger somos novamente sur preendidos pelas mudanças extraordinárias no campo da bioquímica que ocorreram entre as edições O enorme volume de novas informações de sequenciamento de DNA de alto ren dimento cristalografia por raios X e a expressão gênica e ma nipulação de genes para citar somente três exemplos desafia tanto o pesquisador experiente como o estudante de bioquími ca principiante Nosso objetivo é atingir um equilíbrio incluir novos e interessantes resultados de pesquisas sem tornar o li vro muito pesado para os estudantes O principal critério para a inclusão é que o novo resultado ajude a ilustrar um importan te princípio da bioquímica A imagem da capa um mapa das transformações metabó licas conhecidas em uma mitocôndria ilustra a riqueza do ma terial disponível atualmente sobre as transformações bioquími cas Não é mais possível tratar as vias metabólicas como se ocorressem de modo isolado um único metabólito pode fazer parte simultaneamente de muitas vias em uma rede tridimen sional de transformações metabólicas A pesquisa bioquímica se concentra mais e mais nas interações entre essas vias na regulação de suas interações no nível do gene e da proteína e nos efeitos da regulação sobre as atividades da célula ou do organismo inteiro Esta edição de Princípios de Bioquímica de Lehninger reflete essa realidade Muito do conteúdo adicionado reflete a compreensão crescente e sofisticada sobre os mecanismos de regulação incluindo aqueles envolvidos na alteração da sínte se e da degradação de enzimas os responsáveis pelo controle e sincronização da síntese de DNA e do ciclo celular e aque les que integram o metabolismo dos carboidratos gorduras e proteínas ao longo do tempo em resposta a alterações no meio ambiente e nos diferentes tipos celulares Apesar do esforço para incorporar os últimos e principais avanços determinados aspectos do livro permanecem inalte rados Continuase enfatizando a relevância da bioquímica nos mecanismos moleculares das doenças destacando o seu pa pel fundamental no avanço da saúde e do bemestar humano A base metabólica do diabetes e os fatores que predispõem à doença é um tema especial Este tema está entremeado em muitos capítulos e serve para integrar a discussão do metabo lismo A teoria da evolução é a base sobre a qual repousam todas as ciências biológicas e a todo instante é ressaltado seu importante papel para a bioquímica O progresso em bioquímica em um grau significativo avan ça em paralelo com o desenvolvimento de técnicas e ferramen tas melhores Portanto destacamos alguns desses desenvolvi mentos cruciais O Capítulo 9 Tecnologias da informação com base em DNA em particular foi revisado de modo significativo para incluir os últimos avanços em genômica e no sequencia mento da próxima geração Por fim foi dedicada muita atenção para tornar o texto e as figuras ainda mais úteis aos estudantes que estão cursando bioquímica pela primeira vez Para aqueles que já conhecem o livro algumas dessas mudanças se tornam óbvias logo que o abrirem Em cada revisão deste livrotexto existe sempre o empe nho para manter a qualidade que tornou o texto original de Lehninger um clássico com redação clara explicações cuida dosas de conceitos complexos e a comunicação esclarecedora aos estudantes sobre os meios pelos quais a bioquímica é en tendida e praticada hoje Os autores escrevem juntos há quase 25 anos e pensam juntos sobre bioquímica há quase 30 Os mi lhares de estudantes na University of WisconsinMadison têm sido ao longo desses anos uma contínua fonte de ideias de como apresentar a bioquímica de forma mais clara servindo como fonte de inspiração e esclarecimento Esperase que esta 6 a edição do Lehninger esclareça e inspire a todos os atuais estudantes de bioquímica e quem sabe leve alguns deles a amar a bioquímica como nós a amamos Novas figuras A mudança mais óbvia no livro é a reformulação com pleta das figuras O objetivo foi aumentar a pedagogia utilizando recursos gráficos modernos para tornar o as sunto o mais claro possível Muitas figuras ilustram no vos tópicos e o estilo gráfico foi refeito e modernizado As características que definem as novas figuras incluem c Interpretação mais inteligente de figuras clás sicas são mais fáceis de ler e compreender ATP ATP ATP ATP ADP ADP ADP ADP ADP ADP GroES GroES GroEL ADP ADP ADP ADP ADP ADP 7Pi 7Pi 7 ATP 7 7 7 b a Proteína nativa Intermediário de enovelamento lento ou Intermediário de enovelamento entregue pela Hsp70ADP Intermediário de enovelamento entregue pela Hsp70ADP ATP ATP ATP ATP ATP ATP Hidrólise de ATP Hidrólise de ATP DP ADP ADP ADP ADP ATP ATP ATP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ADP ADP ADP ADP Chaperoninas no enovelamento de proteínas Nelson6edIniciaisindd ix Nelson6edIniciaisindd ix 170414 1701 170414 1701 x PREFÁCIO ➊ ➐ ➌ ➏ ➋ ➍ ➑ ➒ ➎ AcetilCoA Pi Oxaloacetato Amino ácidos NH3 Glicose6fosfato Fosfoenol piruvato Citrato AcetoacetilCoA Corpos cetônicos Glicose Ureia Ácidos graxos A degradação proteica gera aminoácidos glicogênicos A glicose é exportada para o cérebro através da cor rente sanguínea O excesso de corpos cetônicos acaba na urina Os ácidos graxos importados do tecido adiposo são oxidados como combustível produzindo acetilCoA Os corpos cetônicos são exportados através da corrente sanguínea para o cérebro que os usa como combustível A ureia é transportada para o rim e excretada na urina O intermediário do ciclo do ácido cítrico oxaloacetato é desviado para a gliconeogênese O acúmulo de acetilCoA favorece a síntese de corpos cetônicos A falta de oxaloacetato impede a entrada da acetilCoA no ciclo do ácido cítrico acetilCoA se acumula c Figuras que formam par com desenhos esquemáti cos geradas especificamente para este livro com esque mas de formas e cores internamente consistentes c Figuras com etapas numeradas e comentadas ajudam a explicar processos complexos e em muitos casos textos descritivos da legenda foram transferidos para a própria figura c Resumos ilustrados ajudam o estudante a lembrar o qua dro geral enquanto estuda as partes específicas Metabolismo energético no fígado durante jejum prolongado ou no diabetes melito não controlado Genômica atualizada As técnicas modernas da genômica transformaram nosso entendimento da bioquímica Nesta edição atualizamos significativamente a cobertura dos métodos genômicos e suas aplicações O Capítulo 9 Tecnologias da informação com base no DNA foi completamente revisado para incor porar os últimos métodos genômicos Muitos outros capítu los foram atualizados para refletir os avanços obtidos com esses métodos Entre os novos métodos genômicos discuti dos nesta edição estão c Sequenciamento de DNA de próxima geração incluin do os métodos e plataformas de sequenciamento Ilu mina e 454 Capítulo 9 c Aplicações da genômica incluindo o uso de haplótipos para rastrear migrações humanas e filogenética para localizar genes humanos associados com doenças here ditárias Capítulo 9 c Genotipagem forense e o uso de genômica personaliza da na medicina Capítulo 9 TACGGTCTC CCCCCCAGT dNTP incorporado T b c a 59 39 C T A A G C A G C T A A C C T G G T A C G T A C G T A C G T G C A G 59 39 C T A A G C A G C T A C T G T G C A 59 39 C T A A G C A G C T A C T G T G A 59 39 C T A A G C A G C T A C T G T G Adição do nucleotídeo guanina observação e registro da cor fluorescente Adição do nucleotídeo citosina observação e registro da cor fluorescente Remoção dos grupos bloqueadores e marcadores lavagem adição de nucleotídeos bloqueados marcados Remoção dos grupos bloqueadores e marcadores lavagem adição de nucleotídeos bloqueados marcados Remoção dos grupos bloqueadores marcadores lavagem adição de nucleotídeos bloqueados marcados Adição de nucleotídeos bloqueados marcados com fluorescência Adição do nucleotídeo adenina observação e registro da cor fluorescente Adição do nucleotídeo timina observação e registro da cor fluorescente Sequenciamento de próxima geração de terminação reversível Ciência nova Todos os capítulos foram inteiramente revisados e atualizados para incluir os avanços mais importantes na área e a informa ção necessária para um livro de bioquímica moderno Entre os tópicos novos e atualizados nesta edição estão c Evolução prebiótica fumarolas negras e o mundo do RNA Capítulo 1 c Proteínas desordenadas intrinsecamente Capítulo 4 c Análogos de estados de transição e inibição irreversível Capítulo 6 c Vias da coagulação sanguínea no contexto da regulação en zimática Capítulo 6 300 Ciclina A Sirtuína s100B bb 400 100 00 05 Pontuação PONDR 10 200 0 Resíduos de aminoácidos Cterminal Nterminal CBP domínio bromo b c a Ligação da extremidade carboxiterminal da p53 intrinsecamente desor denada aos seus parceiros Nelson6edIniciaisindd x Nelson6edIniciaisindd x 170414 1701 170414 1701 PREFÁCIO xi c Distribuição lipídica assimétrica nas bicamadas Capítulo 11 c Papel das proteínas da superfamília BAR na curvatura da membrana Capítulo 11 c Proteínas de suporte AKAPS e outras e seus papéis regu ladores Capítulo 12 c Espécies reativas de oxigênio como subprodutos e como sinais Capítulo 19 c Estrutura e função do centro metálico de geração de oxigê nio no FSII Capítulo 19 c Formação e transporte de lipoproteínas nos mamíferos in cluindo o papel da SCREBP SCAP e Insig na regulação do colesterol Capítulo 21 c Integração do metabolismo de carboidratos e lipídeos por PPAR SREBP mTORC1 e LXR Capítulos 21 23 c Creatina fosfato e o papel da creatinacinase na mobiliza ção do ATP para o citosol Capítulo 23 c Simbiontes microbianos no intestino e sua influência no metabolismo energético e na adipogênese Capítulo 23 c Nucleossomos sua modificação e posicionamento e a es trutura de ordem superior da cromatina Capítulo 24 c DNApolimerases e a recombinação homóloga eucariótica Capítulo 25 c Carregamento da RNApolimerase II Capítulo 26 c A natureza resistente a mutações do código genético Capítulo 27 c Regulação da expressão gênica dos eucariotos pelos miRNA Capítulos 26 e 28 c As alças do DNA o controle combinatório o remodela mento da cromatina e a regulação positiva nos eucariotos Capítulo 28 c Regulação da iniciação da transcrição nos eucariotos Capítulo 28 c Receptores nucleares ligantes de esteroides Capítulo 28 Novos métodos bioquímicos Uma avaliação da bioquímica muitas vezes requer uma com preensão de como é obtida a informação Alguns dos novos mé todos e atualizações descritos nesta edição são c Moderno sequenciamento de proteínas de Sanger e espec trometria de massas Capítulo 3 c Espectrometria de massas aplicada à proteômica à glicô mica à lipidômica e à metabolômica Capítulos 3 7 e 10 c Microarranjos de oligossacarídeos para explorar as intera ções proteínaoligossacarídeo e o código dos carboidratos Capítulo 7 c Métodos genômicos modernos Capítulo 9 c Engenharia genética de organismos fotossintéticos Capí tulo 20 c Uso de tomografia de emissão de pósitrons PET para vi sualizar tumores e tecido adiposo marrom Capítulo 23 c Desenvolvimento de linhagens bacterianas com códigos ge néticos alterados para a inserção de novos aminoácidos em sítios específicos nas proteínas Capítulo 27 Novas aplicações clínicas Este ícone é utilizado em todo o livro para indicar temas de interesse clínico Como professores nosso objetivo é que os estudantes aprendam a bioquímica e compreendam sua relevância para uma vida e um planeta mais saudáveis Muitas seções exploram o que sabemos sobre os mecanismos molecu lares das doenças Algumas das aplicações clínicas novas ou revisadas desta edição são c Quadro 46 Morte por enovelamento incorreto doenças priônicas c Síndromes de Paganini e de EhlersDanlos Capítulo 4 c Inibidores da protease do HIV e como os princípios enzimá ticos básicos influenciam seus desenhos Capítulo 6 c Cascata da coagulação sanguínea e hemofilia Capítulo 6 c A cura da doença do sono africana com um inibidor enzi mático suicida Capítulo 6 c Como os pesquisadores localizam os genes humanos envol vidos nas doenças hereditárias Capítulo 9 c Transportadores de resistência a multifármacos e sua im portância na medicina clínica Capítulo 11 c Progressão do câncer colorretal em múltiplas etapas Ca pítulo 12 c Metabolismo do colesterol doença cardiovascular e meca nismo de formação de placa na aterosclerose Capítulo 21 c Interação entre P450 e fármacos Capítulo 21 c HMGCoAredutase Capítulo 21 e Quadro 213 A hipóte se lipídica e o desenvolvimento das estatinas c Quadro 241 A cura de doenças pela inibição das topoisome rases descreve o uso de inibidores de topoisomerases no tra tamento de câncer e infecções bacterianas incluindo material sobre ciprofloxacina o antibiótico efetivo contra antraz c Célulastronco Capítulo 28 Nelson6edIniciaisindd xi Nelson6edIniciaisindd xi 170414 1701 170414 1701 xii PREFACIO Topico especial compreensao do metabolismo por meio da obesidade e do diabetes A obesidade e suas consequéncias para a satide doenga car P O diabetes melito originase por defeitos na producéo ou na diovascular e diabetes estao se tornando epidémicas no mun acao da insulina Capitulo 23 do motivo pelo qual incluiuse material novo sobre as cone Seao 234 A obesidade e a regulacao da massa corporal x0es bioquimicas entre obesidade e saude O foco no diabetes inclui uma nova discusso sobre 0 papel de TORC1 na re Proporciona um t6pico enegrade em todos os capitis sobre gulacao do crescimento celular metabolismo e seu controle assim esperase que o tema ins ay Seco 235 Obesidade sindrome metabdlica e diabetes do pire alguns estudantes a encontrar solucgdes para essa doenga tivo 2 discute o papel dos lipideos ectopicos e da inflama Algumas das secgdes e quadros que destacam a interacéo entre PO 4 pap DIMES CCLOP ao no desenvolvimento da resisténcia a insulina e 0 mane metabolismo obesidade e diabetes sao a oe jo do diabetes do tipo 2 com exercicios dieta e medicagao Diabetes nao tratado produz acidose potencialmente letal Capitulo 2 Magro Gordo Estado préinflamatério Inflamacao crénica Quadro 71 Dosagem da glicose sanguinea no diag TT TA ACunaan Abpsosaumentados Os macsoge se Zz roduzem proteina de infiltram no tecido nostico e no tratamento do diabetes apresenta a gli auritaiade aciposoemresposta mmacréfagos MPC1 Smee cagao da hemoglobina e AGE e seus papéis na patolo Aaipictospequenes Aptos mires oa gia do diabetes avangado Pe oe SVP fanmeeeserporac des 7 oo Aa MCP be CP SINFa acidos graxos Acaptacao da glicose é deficiente no diabetes melito mE Bass Re Stes e do tipo 1 Capitulo 14 fees fees fees fees todos racrpo mica As lS ectépicos de lipideos Os corpos cetdnicos sio produzidos em excesso du L fis sclnieset ne Oslipideosectépicos rante o jejum e no diabetes Capitulo 17 Glcose aM Glicose Glcose Glcose interferem com o movimento y ioc dace a Algumas mutagdes no genoma mitocondrial causam resisténeladinsulina doenga Capitulo 19 insulins com transprte insulins com transporte normal de glicose reduzido de glicose O diabetes pode ser resultado de defeitos nas mito céndrias das células B pancreaticas Capitulo 19 oo Co Adipdcitos com excesso de triacilglicerdis desencadeia inflamaao no P 0 tecido adiposo produz glicerol3fosfato por glice tecido gorduroso deposiao ectdpica de lipideos e resisténcia a insulina roneogénese Capitulo 21 Tépico especial evolucdo Quadro 93 Conhecendo os neandertais ao transportadores AB m ATP par nduzir o trans Cada vez que um bioquimico estuda uma via de desenvolvi pst vting ores ee an dad a b we ne Cn mento em nematddeos identifica partes essenciais do centro i b 0 de uma ampla varledade de substanclas Pp ativo de uma enzima pela determinagao de quais partes sao ulo conservadas entre as espécies ou procura 0 gene responsdvel Os sistemas de sinalizacao das plantas tém alguns dos mes por uma doena genética humana ele esta confiando na teoria mos componentes utilizados pelos microbios e mamiferos da evolucao As agéncias de fomento apoiam o trabalho com Capitulo 12 nematdédeos sabendo que os resultados serao relevantes para As enzimas da Boxidacao de diferentes organelas divergi os humanos A conservagao de residuos funcionais no sitio ati ram durante a evolucao Capitulo 17 vo de uma enzima transmite a historia compartilhada por cada Pm Seco 1910 A evolucdo da fotossintese oxigénica organismo no planeta Com mais frequéncia a procura por um As mitocéndri 1 tut rd gene responsavel por uma doenca é um exercicio sofisticado s mitocOndrias e os cloroplastos 9 uiram a partir de de filogenética A evolucdo 6 portanto um conceito funda bactérias endossimbioticas Capitulo 19 mental para a nossa disciplina Algumas das muitas secdes e Os fotossistemas I e II evoluiram a partir de fotossistemas quadros que tratam da evolucéo incluem bacterianos Capitulo 19 Secdo 15 Fundamentos evolutivos discute como a vida Asintese de RNA oferece pistas importantes sobre a evolu pode ter evolufdo e narra alguns dos marcos iniciais na evo cao bioquimica Capitulo 26 lugao das células eucaridticas Quadro 271 Excegdes que confirmam a regra variacées Osequenciamento gendmico nos informa sobre nossa hu naturais no cédigo genético manidade Capitulo 9 Quadro 272 De um mundo de RNA para um mundo de Comparacées gendmicas ajudam a localizar genes envolvi proteina dos com doengas Capitulo 9 Quadro 281 Sobre barbatanas asas bicos e outras curio As sequéncias gendémicas nos informam sobre nosso pas sidades sado e fornecem oportunidades para o futuro Capitulo 9 PREFÁCIO xiii Marcas no ensino de Lehninger Os estudantes que pela primeira vez entram em contato com a bioquímica frequentemente têm dificuldades com dois aspectoschave da disciplina abordar problemas quantitativos e recorrer aos seus conhecimentos de quí mica orgânica para entender bioquímica Eles também devem aprender uma linguagem complexa com conven ções que em geral não são apresentadas Para ajudar os estudantes a lidarem com esses desafios são fornecidos os seguintes auxílios para o estudo Foco em lógica química c Seção 132 Lógica química e reações bioquími cas comuns discute os tipos comuns de reações bio químicas que fundamentam todas as reações meta bólicas ajudando os estudantes a conectar a química orgânica com a bioquímica c NOVAS figuras de lógica química ressaltam a conservação dos mecanismos e ilustram os padrões que tornam mais fácil o aprendizado das vias As figuras de lógica química são fornecidas para cada uma das vias metabólicas centrais incluindo a gli cólise Figura 143 o ciclo do ácido cítrico Figura 167 e a oxidação dos ácidos graxos Figura 179 c MecanismosFigura expõem descrições gradati vas para ajudar os estudantes a entender o processo das reações Essas figuras usam um conjunto consistente de convenções introduzidas e explicadas em detalhes junto com o primeiro mecanismo enzimático descri to quimotripsina p 216217 Aconitase Fumarase Aconitase Malatodesidrogenase Citratosintase Isocitrato desidrogenase Complexo acetoglutarato desidrogenase SuccinilCoA sintatetase Succinatodesidrogenase Oxaloacetato AcetilCoA Malato Citrato Isocitrato SuccinilCoA Succinato Fumarato Ciclo do ácido cítrico aCetoglutarato cisAconitato ❶ ❸ ❹ ❺ ❻ ❼ ❽ CH3 C O SCoA H2O CoASH CH2 COO2 HO H C O CoASH H2O COO2 C COO2 CH CH2 COO2 C O CH2 COO2 COO2 C COO2 CH2 COO2 C H HO C COO2 CH2 COO2 C COO2 H CH2 COO2 CH2 COO2 COO2 O CO2 COO2 C CH2 CH2 COO2 CH2 COO2 COO2 HC HO COO2 COO2 CH CH2 CO2 SCoA CoASH CH2 H2O H2O 3 NADH GTP ATP GDP ADP 1 Pi FADH2 Condensação de Claisen grupo metil da acetilCoA convertido a metileno no citrato Desidrataçãoreidratação grupo OH do citrato reposicionado no isocitrato preparando para a descar boxilação da próxima etapa Fosforilação ao nível do substrato energia do tioéster conservada na ligação fosfoanidrido do GTP ou ATP Desidrogenação introdução da ligação dupla inicia a sequência de oxidação do metileno Hidratação adição de água à ligação dupla introduz o grupo OH para a próxima etapa de oxidação Desidrogenação oxidação do OH completa a sequência de oxidação carbonil gerado posicionado para facilitar a condensação de Claisen na próxima etapa Descarboxilação oxidativa mecanismo similar a piruvatodesidrogenase dependente do carbonil no carbono adjacente Descarboxilação oxidativa grupo OH oxidado a carbonil o que por sua vez facilita a descarboxilação por meio da estabilização do carbânion formado no carbono adjacente Reidratação As reações do ciclo do ácido cítrico Glicerol 3fosfato Indol Quinonoide Da serina Indol a b Túnel CH3 O COO2 P 1NH 1NH 1NH H Gliceraldeído 3fosfato N H CH CH CH2 P Indol3glicerolfosfato O H C OH NH3 CH CH Indol 1 N H COO2 C CH2 P O O C H O H CH2 PLP Subunidades a da tripto fanosintase Subunidades b da tripto fanosintase b Intermediário quinonoide CH3 COO2 P H O C 1 b N H CH2 C H B O H Indol H2C Aldimina com triptofano CH2 1 N H N H H N H CH3 P H O C N H CH2 O H b 1 COO2 N H CH2 C b 1 H OH Serina b a NH3 CH 1 COO2 bCH2 H2O N H Triptofano CH2 OH OH B HB b b b Aduto PLP aminoacrilato PLP H2O Enzima Uma clivagem aldólica produz indol e gliceraldeído 3 fosfato o PLP não é necessário O indol segue por um túnel entre as subunidades a e b A desidratação da serina forma um intermediário PLP aminoacrilato O indol condensase com o intermediário aminoacrilato 2 passos A ligação imina unindo o tripto fano e o PLP é hidrolisada Reação da triptofanosintase Nelson6edIniciaisindd xiii Nelson6edIniciaisindd xiii 170414 1701 170414 1701 xiv PREFÁCIO Ferramentas para resolução de problemas c Exemplos de problemas resolvidos incluídos no tex to ajudam os estudantes a aumentar sua capacidade de re solver problemas quantitativos revendo algumas das equa ções mais difíceis Novos exemplos aparecem nos Capítulos 1 2 e 19 c Mais de 600 novos problemas no final dos capítulos cerca de 25 novos fornecem aos estudantes uma opor tunidade adicional de praticar o que aprenderam c Problemas de análise de dados ao final de cada capí tulo colaboração de Brian White da University of Massa chusettsBoston estimulam os estudantes a resumir o que aprenderam e a aplicar seu conhecimento na interpretação de dados da literatura Convençõeschave Muitas das convenções tão necessárias para a compreensão de cada tópico bioquímico e da literatura bioquímica estão des tacadas Essas convençõeschave incluem enunciados claros sobre muitas hipóteses e convenções que os alunos em tese devem saber mas muitas vezes ninguém os informa a respeito p ex as sequências peptídicas são escritas da extremidade aminoterminal para a carboxiterminal da esquerda para a di reita as sequências nucleotídicas são escritas da extremidade 59 para a 39 da esquerda para a direita Recursos online c Visite a área do professor em wwwgrupoacombr para ter acesso a Power Point em português c Em wwwwhfreemancomlehninger6e há recursos online em inglês para estudantes e professores Os ícones no texto indicam a disponibilidade da animação relevante grá fico dinâmico com tutorial da estrutura molecular PROBLEMA RESOLVIDO 192 Estequiometria da produção de ATP efeito do tamanho do anel c a Se as mitocôndrias bovinas têm 8 subunidades c por anel c qual a razão predita de ATP formado por NADH oxidado b Qual o valor predito para as mitocôndrias de leveduras com 10 subunidades c c Quais os valores comparáveis de elétrons que entram na cadeia respiratória a partir do FADH2 Solução a A questão solicita a determinação de quantos ATP são produzidos por NADH Essa é outra forma de pedir para calcularmos a razão PO ou x na Equação 1911 Se o anel c tem 8 subunidades c então um rotação completa transferirá 8 prótons para a matriz e produzirá 3 moléculas de ATP Porém esta síntese também requer o transporte de 3 Pi para dentro da matriz ao custo de 1 próton cada acres centando mais 3 prótons ao número requerido Isso leva o custo total para 11 prótons 3 ATP 5 37 prótonsATP O valor consensual para o número de prótons bombeados para fora por par de elétrons transferidos do NADH é 10 ver Figura 1919 Assim oxidar 1 NADH produz 10 pró tons37 prótonsATP 5 27 ATP b Se o anel c tem 10 subunidades c então uma rotação completa transferirá 10 prótons para a matriz e produzirá 3 moléculas de ATP Acrescentando os 3 pró tons para transportar os 3 Pi para dentro da matriz traz o custo total para 13 prótons3 ATP 5 43 prótonsATP A oxidação de 1 NADH produz 10 prótons43 prótons ATP 5 23 ATP c Quando os elétrons entram na cadeia respiratória a partir do FADH2 na ubiquinona apenas 6 prótons estão disponíveis para impulsionar a síntese de ATP Isso muda os cálculos para as mitocôndrias bovinas para 6 pró tons37 prótonsATP 5 16 ATP por par de elétrons do FADH2 Para as mitocôndrias de leveduras o cálculo é 6 prótons43 prótonsATP 5 14 ATP por par de elé trons do FADH2 Esses valores calculados de x ou da razão PO definem uma faixa que inclui os valores experimentais de 25 ATP NADH e 15 ATPFADH2 e portanto esses valores serão usados ao longo deste livro Nelson6edIniciaisindd xiv Nelson6edIniciaisindd xiv 170414 1701 170414 1701 PREFÁCIO xv Agradecimentos Este livro é o resultado de um esforço conjunto e sua produ ção seria impossível sem a equipe da WH Freeman que nos apoiou em todas as etapas Susan Moran editora sênior de desenvolvimento Susan Winslow editora e Lauren Schultz editora sênior de aquisições ajudaram a desenvolver o pla no de revisão desta edição fizeram muitas sugestões úteis nos incentivaram e tentaram corajosamente e quase sempre com sucesso manternos dentro do cronograma Matthew Tontonoz editor de desenvolvimento nos forneceu opiniões extremamente úteis sobre muitos capítulos Nossa editora de projetos Jane ONeill de alguma forma manteve o livro em andamento ao longo da produção apesar dos nossos prazos e mudanças de última hora Agradecemos à diretora de arte Diana Blume pelo seu talento artístico no miolo e na capa do livro Agradecemos o trabalho dos antigos e atuais revisores entre eles Karen Taschek Liz Geller e Linda Strange Apesar de Linda não ter revisado esta edição suas contribuições des de a 1 a até a 5 a edição são ainda claramente evidentes no texto Agradecemos ao gerente de pesquisa de fotos Ted Szczepanski e à pesquisadora de fotos Elyse Rieder por sua ajuda na loca lização das imagens e a Courtney Lyons pela ajuda na direção das revisões e por fornecer assistência administrativa em mui tas ocasiões Também agradecemos a Allison Michael editora de mídia por reunir os componentes da mídia cada vez mais importantes para acompanhar o texto Nossa gratidão vai tam bém para Debbie Clare diretora associada de marketing por sua criatividade e bom humor na coordenação das vendas e no marketing Um agradecimento muito especial vai para Kate Parker que supervisionou as últimas três edições deste projeto e contribuiu muito para seu sucesso antes de mudar de ati vidade sentiremos falta de seus conhecimentos seu humor e seu excelente gosto por restaurantes Em Madison Brook Soltvedt é e tem sido em todas as edi ções nas quais trabalhamos nossa editora e crítica de primeira linha Ela é a primeira a ver os originais dos capítulos ajuda na escrita e no desenvolvimento das ilustrações garante consis tência interna ao conteúdo e à nomenclatura e mantém nosso desafio incitandonos de maneira mais ou menos gentil Shelley Lusetti da New Mexico State University leu o texto como o fez na 4 a e na 5 a edição e fez muitas sugestões que melhoraram o livro A parte visual desta edição incluindo os novos gráficos moleculares foi executada em Madison por Adam Steinberg o qual nos deu sugestões valiosas que levaram a ilustrações melhores e mais claras Sentimonos muito felizes por ter mos Brook Shelley e Adam em nossa equipe parceiros tão talentosos Também estamos profundamente agradecidos a Brian Whi te da University of MassachusettsBoston que escreveu as questões no final de cada capítulo Muitos colegas tiveram um papel especial por seu inte resse no projeto e por suas intervenções oportunas Destaca mos Jeffrey D Esko da University of California San Diego e Jack Kirsch e seus alunos da University of California Berke ley Charles G Hoogstraten da Michigan State University fez muitos comentários incisivos e úteis sobre o texto e as figu ras Também agradecemos a Jeffrey A Cohlberg da California State University em Long Beach por seus comentários críticos Muitos outros nos auxiliaram a dar forma a esta 6 a edição com seus comentários sugestões e críticas Somos profundamente gratos a todos eles Alan Attie University of WisconsinMadison Alejandra Stenger University of Illinois UrbanaChampaign Allen Nicholson Temple University Amy Stockert Ohio Northern University Andy LiWang University of California Merced Brent Feske Armstrong Atlantic State University Brian Bothner Montana State University Burt Goldberg New York University Chuan Xiao University of Texas El Paso David Hurley Gatton College of Pharmacy ETSU David Merkler University of South Florida Debra Moriarity University of Alabama Huntsville Dmitry Kolpashchikov University of Central Florida Donald Ourth University of Memphis Douglas Julin University of Maryland Douglas Root University of North Texas Eric Hegg Michigan State University Gerald Feigenson Cornell University Glenda Gillaspy Virginia Tech University Gregory Raner University of North Carolina Greensboro Greta Giles Georgia Gwinnett College Hunter Moseley University of Louisville James Blankenship Cornell University James Gober University of California Los Angeles James Ntambi University of WisconsinMadison Jeff DeJong University of Texas Dallas Johannes Rudolph University of Colorado Jon Stoltzfus Michigan State University Joseph Jez Washington University in St Louis Joseph Provost Minnesota State University Moorhead Julian Snow University of the Sciences Julie Gosse University of Maine Justin Hines Lafayette College Keith Dunker Indiana University Kelly Elkins Metropolitan State College of Denver Kelly Johanson Xavier University of Louisiana Kenneth Balazovich University of Michigan Kerry Smith Clemson University Kevin Siebenlist Marquette University Laura Zapanta University of Pittsburgh Laurens Anderson University of WisconsinMadison Lesley Greene Old Dominion University Lisa Rezende University of Arizona Marcello Forconi College of Charleston Margaret Glasner Texas AM University Mark Kearley Florida State University Mary Bryk Texas AM University Michael Mendenhall University of Kentucky Michael Yaffe Massachusetts Institute of Technology Michele McGuirl The University of Montana MinHao Kuo Michigan State University Neil Osheroff Vanderbilt University School of Medicine Nicole LaRondeLeBlanc University of Maryland Nelson6edIniciaisindd xv Nelson6edIniciaisindd xv 170414 1701 170414 1701 xvi PREFÁCIO Peter Hinkle Cornell University Phillip Ryals University of West Florida Pui Ho Colorado State University Richard Amasino University of WisconsinMadison Scott Lefler Arizona State University Sharada Buddha Saint Xavier University Terry Platt University of Rochester Thomas Marsh University of St Thomas Toni VidalPuig University of Cambridge Tracey Boncher Ferris State College of Pharmacy Wendy Pogozelski State University of New York Geneseo Wilson Francisco Arizona State University Não temos espaço aqui para agradecer a todas as pessoas cujos esforços contribuíram para o desenvolvimento deste livro Ofe recemos nosso sincero agradecimento e o livro pronto que eles ajudaram a completar Assumimos é claro total responsa bilidade por eventuais incorreções Queremos agradecer de modo especial aos nossos alunos da University of WisconsinMadison por suas inúmeras suges tões e comentários Se alguma coisa no livro não estiver bem eles não deixarão de nos informar Somos muito gratos aos es tudantes e ao pessoal de nossos grupos de pesquisa que nos ajudaram a equilibrar as demandas com o nosso tempo aos nossos colegas do Departamento de Bioquímica da University of WisconsinMadison que nos ajudaram com conselhos e crí ticas e a muitos estudantes e professores que nos escreveram para sugerir formas de melhorar o livro Esperamos que nossos leitores continuem nos proporcionando estímulo para futuras edições Finalmente expressamos nossa profunda gratidão às nos sas esposas Brook e Beth e a nossas famílias que tiveram ex traordinária paciência e nos apoiaram na redação do livro David L Nelson Michael M Cox Nelson6edIniciaisindd xvi Nelson6edIniciaisindd xvi 170414 1701 170414 1701 1 Fundamentos da Bioquímica 1 11 Fundamentos celulares 2 As células são as unidades estruturais e funcionais de todos os organismos vivos 3 As dimensões celulares são limitadas pela difusão 3 Existem três grupos distintos de vida 4 Os organismos diferem amplamente pelas suas fontes de energia e precursores biossintéticos 4 Células bacterianas e arqueanas compartilham propriedades comuns mas diferem em aspectos importantes 4 As células eucarióticas têm uma grande variedade de organelas providas de membranas que podem ser isoladas para estudo 6 O citoplasma é organizado pelo citoesqueleto e é altamente dinâmico 8 As células constroem estruturas supramoleculares 9 Estudos in vitro podem omitir interações importantes entre moléculas 9 12 Fundamentos químicos 11 Biomoléculas são compostos de carbono com uma grande variedade de grupos funcionais 12 QUADRO 11 Peso molecular massa molecular e suas unidades corretas 14 As células contêm um conjunto universal de moléculas pequenas 14 As macromoléculas são os principais constituintes das células 15 A estrutura tridimensional é descrita pela configuração e pela conformação 16 QUADRO 12 Louis Pasteur e atividade óptica In Vino Veritas 18 As interações entre as biomoléculas são estereoespecíficas 19 13 Fundamentos físicos 20 Os organismos vivos existem em um estado estacionário dinâmico e nunca em equilíbrio com o seu meio 21 Os organismos transformam energia e matéria de seu meio 21 O fluxo de elétrons fornece energia aos organismos 22 Criar e manter ordem requer trabalho e energia 22 QUADRO 13 Entropia as vantagens de ser desorganizado 22 Reações com ligações de acoplamento energético na biologia 24 Keq e DG são medidas da tendência das reações ocorrerem espontaneamente 25 As enzimas promovem sequências de reações químicas 27 O metabolismo é regulado para obter equilíbrio e economia 28 14 Fundamentos genéticos 29 A continuidade genética está contida em uma única molécula de DNA 29 A estrutura do DNA permite sua replicação e seu reparo com fidelidade quase perfeita 30 A sequência linear no DNA codifica proteínas com estrutura tridimensional 30 15 Fundamentos evolutivos 32 Mudanças nas instruções hereditárias possibilitam a evolução 32 As biomoléculas surgiram primeiro por evolução química 33 1 Fundamentos da Bioquímica 1 I ESTRUTURA E CATÁLISE 45 2 Água 47 3 Aminoácidos Peptídeos e Proteínas 75 4 Estrutura Tridimensional de Proteínas 115 5 Função Proteica 157 6 Enzimas 189 7 Carboidratos e Glicobiologia 243 8 Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos 281 9 Tecnologias da Informação com Base no DNA 313 10 Lipídeos 357 11 Membranas Biológicas e Transporte 385 12 Biossinalização 433 II BIOENERGÉTICA E METABOLISMO 501 13 Bioenergética e Tipos de Reações Bioquímicas 505 14 Glicólise Gliconeogênese e a Via das PentosesFosfato 543 15 Princípios da Regulação Metabólica 587 16 Ciclo do Ácido Cítrico 633 17 Catabolismo de Ácidos Graxos 667 18 Oxidação de Aminoácidos e Produção de Ureia 695 19 Fosforilação Oxidativa e Fotofosforilação 731 20 Biossíntese de Carboidratos em Plantas e Bactérias 799 21 Biossíntese de Lipídeos 833 22 Biossíntese de Aminoácidos Nucleotídeos e Moléculas Relacionadas 881 23 Regulação Hormonal e Integração do Metabolismo em Mamíferos 929 III VIAS DA INFORMAÇÃO 977 24 Genes e Cromossomos 979 25 Metabolismo do DNA 1009 26 Metabolismo de RNA 1057 27 Metabolismo das Proteínas 1103 28 Regulação da Expressão Gênica 1155 Sumário Sumário Detalhado Nelson6edIniciaisindd xvii Nelson6edIniciaisindd xvii 170414 1701 170414 1701 xviii SUMÁRIO DETALHADO RNA ou precursores relacionados podem ter sido os primeiros genes e catalisadores 34 A evolução biológica começou há mais de três bilhões e meio de anos 35 A primeira célula provavelmente usou combustíveis inorgânicos 35 Células eucarióticas evoluíram a partir de precursores mais simples por meio de vários estágios 36 A anatomia molecular revela relações evolutivas 37 A genômica funcional mostra a alocação de genes para processos celulares específicos 38 A comparação genômica apresenta importância crescente na biologia e na medicina humana 39 I ESTRUTURA E CATÁLISE 45 2 Água 47 21 Interações fracas em sistemas aquosos 47 As ligações de hidrogênio são responsáveis pelas propriedades incomuns da água 47 A água forma ligações de hidrogênio com solutos polares 49 A água interage eletrostaticamente com solutos carregados 50 A entropia aumenta quando uma substância cristalina se dissolve 51 Gases apolares são fracamente solúveis em água 51 Compostos apolares forçam mudanças energeticamente desfavoráveis na estrutura da água 51 As interações de van der Waals são atrações interatômicas fracas 53 Interações fracas são cruciais para a estrutura e a função das macromoléculas 54 Solutos afetam as propriedades coligativas de soluções aquosas 55 22 Ionização da água e de ácidos e bases fracas 58 A água pura é levemente ionizada 58 A ionização da água é expressa pela constante de equilíbrio 59 A escala de pH indica as concentrações de H 1 e OH 60 Ácidos e bases fracas têm constantes de dissociação ácidas características 61 As curvas de titulação revelam o pKa de ácidos fracos 62 23 Tamponamento contra mudanças no pH em sistemas biológicos 63 Tampões são misturas de ácidos fracos e suas bases conjugadas 64 A equação de HendersonHasselbalch relaciona o pH o pKa e a concentração do tampão 64 Ácidos ou bases fracas tamponam células e tecidos contra as mudanças de pH 65 Diabetes não tratado produz acidose que ameaça a vida 67 QUADRO 21 Sendo sua própria cobaia não tente isso em casa 68 24 A água como reagente 69 25 O ajuste do meio aquoso em organismos vivos 69 3 Aminoácidos Peptídeos e Proteínas 75 31 Aminoácidos 76 Aminoácidos compartilham características estruturais comuns 76 Os resíduos de aminoácidos em proteínas são estereoisômeros L 78 Aminoácidos podem ser classificados pelo grupo R 78 QUADRO 31 Absorção de luz por moléculas a Lei de LambertBeer 80 Aminoácidos incomuns também têm funções importantes 81 Aminoácidos podem agir como ácidos e bases 81 Aminoácidos têm curvas de titulação características 81 Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos 84 Aminoácidos diferem em suas propriedades acidobásicas 84 32 Peptídeos e proteínas 85 Peptídeos são cadeias de aminoácidos 85 Peptídeos podem ser diferenciados por seus comportamentos de ionização 86 Peptídeos e polipeptídeos biologicamente ativos ocorrem em uma ampla variação de tamanhos e composições 87 Algumas proteínas contêm outros grupos químicos além dos aminoácidos 89 33 Trabalhando com proteínas 89 Proteínas podem ser separadas e purificadas 89 Proteínas podem ser separadas e caracterizadas por eletroforese 92 Proteínas não separadas podem ser quantificadas 95 34 A estrutura de proteínas estrutura primária 96 A função de uma proteína depende de sua sequência de aminoácidos 97 As sequências de aminoácidos de milhões de proteínas foram determinadas 97 A química de proteínas é enriquecida por métodos derivados do clássico sequenciamento de polipeptídeos 98 A espectrometria de massa oferece um método alternativo para determinar sequências de aminoácidos 100 Pequenos peptídeos e proteínas podem ser sintetizados quimicamente 102 As sequências de aminoácidos fornecem importantes informações bioquímicas 104 Sequências de proteínas podem elucidar a história da vida na Terra 104 QUADRO 32 Sequências consenso e logos de sequências 105 4 Estrutura Tridimensional de Proteínas 115 41 Visão geral sobre a estrutura das proteínas 115 A conformação de uma proteína é estabilizada por interações fracas 116 A ligação peptídica é rígida e planar 117 42 Estrutura secundária das proteínas 119 A hélice a é uma estrutura secundária comum em proteínas 119 A sequência de aminoácidos afeta a estabilidade da hélice a 121 QUADRO 41 Distinção entre o giro para a direita e o giro para a esquerda 121 As conformações b organizam as cadeias polipeptídicas em forma de folha 123 Voltas b são comuns em proteínas 123 Estruturas secundárias comuns têm ângulos diedros característicos 123 As estruturas secundárias comuns podem ser identificadas por dicroísmo circular 124 43 Estruturas terciária e quaternária das proteínas 125 As proteínas fibrosas são adaptadas às funções estruturais 125 QUADRO 42 Ondulação permanente é engenharia bioquímica 127 Nelson6edIniciaisindd xviii Nelson6edIniciaisindd xviii 170414 1701 170414 1701 SUMÁRIO DETALHADO xix QUADRO 43 Por que marinheiros exploradores e universitários devem comer frutas e vegetais frescos 128 A diversidade estrutural reflete a diversidade funcional nas proteínas globulares 130 A mioglobina forneceu os indícios iniciais sobre a complexidade da estrutura globular proteica 131 QUADRO 44 O banco de dados de proteínas 132 As proteínas globulares têm uma diversidade de estruturas terciárias 133 QUADRO 45 Métodos de determinação da estrutura tridimensional de uma proteína 134 Motivos de proteínas são as bases da classificação estrutural 138 A estrutura quaternária varia de dímeros simples a grandes complexos 140 Algumas proteínas ou segmentos proteicos são intrinsecamente desordenados 141 44 Desnaturação e enovelamento das proteínas 143 A perda de estrutura da proteína resulta na perda de função 143 A sequência de aminoácidos determina a estrutura terciária 144 Os polipeptídeos dobramse rapidamente por um processo gradual 144 Algumas proteínas se dobram de forma assistida 146 Defeitos no enovelamento proteico fornecem a base molecular para uma ampla gama de doenças genéticas em humanos 148 QUADRO 46 Morte por enovelamento errado as doenças priônicas 150 5 Função Proteica 157 51 Interação reversível de uma proteína com um ligante proteínas de ligação ao oxigênio 158 O oxigênio ligase ao grupo prostético heme 158 As globinas são uma família de proteínas de ligação ao oxigênio 159 A mioglobina tem um único sítio de ligação ao oxigênio 159 As interações proteínaligante podem ser quantitativamente descritas 159 A estrutura da proteína afeta a forma de interação com o ligante 162 A hemoglobina transporta oxigênio no sangue 163 As subunidades da hemoglobina têm estrutura semelhante à da mioglobina 163 A hemoglobina sofre mudança estrutural quando se liga ao oxigênio 163 A hemoglobina se liga ao oxigênio de forma cooperativa 165 A interação cooperativa do ligante pode ser descrita em termos quantitativos 167 Dois modelos sugerem mecanismos para a ligação cooperativa 167 QUADRO 51 Monóxido de carbono um assassino furtivo 168 A hemoglobina também transporta H 1 e CO2 169 A ligação do oxigênio com a hemoglobina é regulada pelo 23bifosfoglicerato 171 A anemia falciforme é uma doença molecular da hemoglobina 172 52 Interações complementares entre proteínas e ligantes o sistema imune e as imunoglobulinas 174 A resposta imune caracteriza um conjunto de células e proteínas especializadas 174 Os anticorpos têm dois sítios idênticos de ligação ao antígeno 175 Os anticorpos se ligam ao antígeno de modo firme e específico 177 A interação antígenoanticorpo é a base para uma grande variedade de procedimentos analíticos importantes 178 53 Interações proteicas moduladas por energia química actina miosina e motores moleculares 179 A actina e a miosina são as principais proteínas do músculo 179 Proteínas adicionais organizam os filamentos finos e grossos em estruturas ordenadas 181 Os filamentos grossos de miosina deslizam sobre os filamentos finos de actina 182 6 Enzimas 189 61 Introdução às enzimas 189 A maioria das enzimas é proteína 190 As enzimas são classificadas segundo as reações que catalisam 190 62 Como as enzimas funcionam 191 As enzimas alteram a velocidade da reação não o equilíbrio 192 A velocidade e o equilíbrio da reação têm definições termodinâmicas precisas 194 Poucos princípios são suficientes para explicar o poder catalítico e a especificidade das enzimas 194 As interações fracas entre enzima e substrato são otimizadas no estado de transição 195 A energia de ligação contribui para a especificidade da reação e a catálise 197 Grupos catalíticos específicos contribuem para a catálise 198 63 A cinética enzimática como abordagem à compreensão do mecanismo 200 A concentração do substrato influi na velocidade das reações catalisadas por enzimas 200 A relação entre a concentração do substrato e a velocidade da reação pode ser expressa quantitativamente 202 Os parâmetros cinéticos são utilizados para comparar a atividade de enzimas 203 QUADRO 61 Transformações da equação de MichaelisMenten o gráfico de duplosrecíprocos 204 Muitas enzimas catalisam reações com dois ou mais substratos 206 A cinética do estado préestacionário pode fornecer evidências de etapas específicas das reações 206 As enzimas estão sujeitas à inibição reversível e irreversível 207 QUADRO 62 Testes cinéticos para determinar o mecanismo de inibição 209 QUADRO 63 Cura da doença do sono com um cavalo de Troia bioquímico 211 A atividade enzimática depende do pH 212 64 Exemplos de reações enzimáticas 214 O mecanismo da quimotripsina envolve a acilação e a desacilação de um resíduo de serina 214 O conhecimento do mecanismo das proteases levou a novos tratamentos para infecções por HIV 218 A hexocinase sofre um ajuste induzido quando o substrato se liga 219 O mecanismo de reação da enolase requer a presença de íons metálicos 220 Nelson6edIniciaisindd xix Nelson6edIniciaisindd xix 170414 1701 170414 1701 xx SUMÁRIO DETALHADO A lisozima utiliza duas reações sucessivas de deslocamento nucleofílico 220 O conhecimento de um mecanismo enzimático leva à produção de antibióticos úteis 224 65 Enzimas regulatórias 226 Enzimas alostéricas sofrem mudanças conformacionais em resposta à ligação de moduladores 226 As propriedades cinéticas das enzimas alostéricas desviamse do comportamento de MichaelisMenten 227 Algumas enzimas são reguladas por modificações covalentes reversíveis 228 Os grupos fosforil afetam a estrutura e a atividade catalítica das enzimas 229 Fosforilações múltiplas possibilitam um controle requintado da regulação 230 Algumas enzimas e outras proteínas são reguladas pela proteólise de precursores de enzimas 231 Uma cascata de zimogênios ativados proteoliticamente leva à coagulação do sangue 232 Algumas enzimas utilizam vários mecanismos regulatórios 234 7 Carboidratos e Glicobiologia 243 71 Monossacarídeos e dissacarídeos 243 As duas famílias de monossacarídeos são aldoses e cetoses 244 Monossacarídeos têm centros assimétricos 244 Os monossacarídeos comuns têm estruturas cíclicas 245 Os organismos contêm diversos derivados de hexose 248 QUADRO 71 Dosagem de glicose sanguínea no diagnóstico e no tratamento do diabetes 250 Os monossacarídeos são agentes redutores 251 Os dissacarídeos contêm uma ligação glicosídica 251 72 Polissacarídeos 253 QUADRO 72 O açúcar é doce assim como o são outras coisas mais 254 Alguns homopolissacarídeos são formas de estocagem de combustível 255 Alguns homopolissacarídeos têm funções estruturais 256 Fatores estéricos e ligações de hidrogênio influenciam o enovelamento dos homopolissacarídeos 257 As paredes celulares de bactérias e algas contêm heteropolissacarídeos estruturais 259 Os glicosaminoglicanos são heteropolissacarídeos da matriz extracelular 260 73 Glicoconjugados proteoglicanos glicoproteínas e glicoesfingolipídeos 263 Os proteoglicanos macromoléculas presentes na superfície celular e na matriz extracelular contêm glicosaminoglicanos 264 Glicoproteínas têm oligossacarídeos ligados covalentemente 266 Glicolipídeos e lipopolissacarídeos são componentes de membranas 268 74 Carboidratos como moléculas informativas o código dos açúcares 269 Lectinas são proteínas que leem o código dos açúcares e controlam muitos processos biológicos 269 As interações lectinacarboidrato são altamente específicas e frequentemente multivalentes 272 75 Trabalhando com carboidratos 274 8 Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos 281 81 Alguns dados básicos 281 Nucleotídeos e ácidos nucleicos têm pentoses e bases características 281 Ligações fosfodiéster ligam nucleotídeos consecutivos nos ácidos nucleicos 284 As propriedades das bases nucleotídicas afetam a estrutura tridimensional dos ácidos nucleicos 286 82 Estrutura dos ácidos nucleicos 287 O DNA é uma duplahélice que armazena informação genética 288 O DNA pode ocorrer em formas tridimensionais diferentes 290 Certas sequências de DNA adotam estruturas incomuns 291 RNAs mensageiros codificam para cadeias polipeptídicas 293 Muitos RNAs têm estruturas tridimensionais mais complexas 294 83 Química dos ácidos nucleicos 297 DNA e RNA duplashélices podem ser desnaturados 297 Ácidos nucleicos de espécies diferentes podem formar híbridos 298 Nucleotídeos e ácidos nucleicos sofrem transformações não enzimáticas 299 Algumas bases do DNA são metiladas 302 As sequências de longas hélices de DNA podem ser determinadas 302 A síntese química de DNA foi automatizada 304 84 Outras funções dos nucleotídeos 306 Os nucleotídeos carregam energia química nas células 306 Nucleotídeos da adenina são componentes de muitos cofatores enzimáticos 306 Alguns nucleotídeos são moléculas reguladoras 308 9 Tecnologias da Informação com Base no DNA 313 91 Estudo dos genes e seus produtos 314 Genes podem ser isolados por clonagem do DNA 314 Endonucleases de restrição e DNAligases produzem DNA recombinante 314 Os vetores de clonagem permitem a amplificação dos segmentos de DNA inseridos 317 Genes clonados podem ser expressos para amplificar a produção de proteínas 321 Muitos sistemas diferentes são utilizados para expressar proteínas recombinantes 322 A alteração de genes clonados produz proteínas alteradas 323 Marcadores terminais fornecem instrumentos para a purificação por afinidade 325 As sequências gênicas podem ser amplificadas com a reação em cadeia da polimerase 327 QUADRO 91 Poderosa ferramenta na medicina legal 329 92 Utilização de métodos com base no DNA para a compreensão das funções das proteínas 331 Bibliotecas de DNA são catálogos especializados de informação genética 332 Sequências ou relações estruturais fornecem informações sobre a função das proteínas 333 Proteínas de fusão e imunofluorescência podem localizar proteínas em células 333 Nelson6edIniciaisindd xx Nelson6edIniciaisindd xx 170414 1701 170414 1701 SUMÁRIO DETALHADO xxi Interações proteínaproteína ajudam a elucidar a função de proteínas 334 Microarranjos de DNA revelam padrões de expressão de RNA e outras informações 337 93 Genômica e história da humanidade 339 O sequenciamento genômico é auxiliado por novas gerações de métodos de sequenciamento de DNA 339 QUADRO 92 Medicina genômica personalizada 340 O genoma humano contém genes e muitos outros tipos de sequências 342 O sequenciamento do genoma dá informações sobre a humanidade 345 Comparações do genoma ajudam a localizar genes envolvidos em doenças 347 Sequências no genoma informam sobre o passado humano e fornecem oportunidades para o futuro 349 QUADRO 93 Conhecendo os neandertais 350 10 Lipídeos 357 101 Lipídeos de armazenamento 357 Os ácidos graxos são derivados de hidrocarbonetos 357 Os triacilgliceróis são ésteres de ácidos graxos do glicerol 360 Os triacilgliceróis armazenam energia e proporcionam isolamento térmico 360 A hidrogenação parcial dos óleos de cozinha produz ácidos graxos trans 361 As ceras servem como reservas de energia e como impermeabilizantes à água 362 102 Lipídeos estruturais em membranas 362 Os glicerofosfolipídeos são derivados do ácido fosfatídico 363 Alguns glicerofosfolipídeos têm ácidos graxos em ligação éter 364 Os cloroplastos contêm galactolipídeos e sulfolipídeos 365 Arqueias contêm lipídeos de membrana únicos 365 Os esfingolipídeos são derivados da esfingosina 366 Os esfingolipídeos nas superfícies celulares são sítios de reconhecimento biológico 367 Os fosfolipídeos e os esfingolipídeos são degradados nos lisossomos 368 Os esteróis têm quatro anéis de carbono fusionados 368 QUADRO 101 Acúmulos anormais de lipídeos de membrana algumas doenças humanas herdadas 369 103 Lipídeos como sinalizadores cofatores e pigmentos 370 Fosfatidilinositóis e derivados de esfingosina atuam como sinalizadores intercelulares 370 Os eicosanoides carregam mensagens a células próximas 371 Os hormônios esteroides carregam mensagens entre os tecidos 372 As plantas vasculares produzem milhares de sinais voláteis 372 As vitaminas A e D são precursoras de hormônios 373 As vitaminas E e K e as quinonas lipídicas são cofatores de oxirredução 374 Os dolicóis ativam precursores de açúcares para a biossíntese 375 Muitos pigmentos naturais são dienos conjugados a lipídeos 376 Os policetídeos são produtos naturais com atividades biológicas 376 104 Trabalhando com lipídeos 377 A extração de lipídeos requer solventes orgânicos 377 A cromatografia de adsorção separa lipídeos de polaridades diferentes 378 A cromatografia gasosalíquida separa misturas de derivados voláteis de lipídeos 378 A hidrólise específica auxilia na determinação das estruturas dos lipídeos 378 A espectrometria de massa revela a estrutura lipídica completa 378 O lipidoma procura catalogar todos os lipídeos e suas funções 379 11 Membranas Biológicas e Transporte 385 111 Composição e arquitetura das membranas 386 Cada tipo de membrana tem proteínas e lipídeos característicos 386 Todas as membranas biológicas compartilham algumas propriedades fundamentais 387 A bicamada lipídica é o elemento estrutural básico das membranas 387 Três tipos de proteínas de membrana diferem quanto às suas associações com a membrana 389 Muitas proteínas de membrana atravessam a bicamada lipídica 390 As proteínas integrais são mantidas na membrana por meio de interações hidrofóbicas com lipídeos 390 A topologia de uma proteína integral de membrana algumas vezes pode ser prevista a partir de sua sequência 391 Lipídeos ligados covalentemente ancoram algumas proteínas de membrana 394 112 Dinâmica da membrana 395 Grupos acil no interior da bicamada estão ordenados em graus variáveis 395 O movimento de lipídeos transbicamada requer catálise 396 Lipídeos e proteínas difundemse lateralmente na bicamada 397 Esfingolipídeos e colesterol agrupamse em balsas de membrana 398 A curvatura da membrana e a fusão são fundamentais para muitos processos biológicos 399 Proteínas integrais da membrana plasmática estão envolvidas na adesão de superfície na sinalização e em outros processos celulares 402 113 Transporte de solutos através da membrana 402 O transporte passivo é facilitado por proteínas de membrana 403 Transportadores e canais iônicos são fundamentalmente diferentes 404 O transportador de glicose de eritrócitos controla o transporte passivo 405 O trocador de cloretobicarbonato catalisa o cotransporte eletroneutro de ânions através da membrana plasmática 407 QUADRO 111 Defeito no transporte de glicose e água em duas formas de diabetes 408 O transporte ativo resulta em movimento de soluto contra um gradiente de concentração ou eletroquímico 409 ATPases do tipo P sofrem fosforilação durante seus ciclos catalíticos 410 Nelson6edIniciaisindd xxi Nelson6edIniciaisindd xxi 170414 1701 170414 1701 xxii SUMÁRIO DETALHADO ATPases do tipo V e do tipo F são bombas de prótons impulsionadas por ATP 412 Transportadores ABC usam ATP para impulsionar o transporte ativo de uma grande variedade de substratos 413 Gradientes iônicos provêm a energia necessária para o transporte ativo secundário 414 QUADRO 112 Um canal iônico defeituoso na fibrose cística 415 As aquaporinas formam canais hidrofílicos transmembrana para a passagem de água 418 Canais iônicos seletivos permitem o movimento rápido de íons através das membranas 420 A função do canal iônico é medida eletricamente 421 A estrutura do canal de K 1 revela a base de sua especificidade 422 Canais iônicos dependentes de portão são fundamentais na função neuronal 424 Canais iônicos defeituosos podem ter consequências fisiológicas graves 424 12 Biossinalização 433 121 Características gerais da transdução de sinal 433 QUADRO 121 A análise de Scatchard quantifica a interação receptorligante 435 122 Receptores associados a proteínas G e segundos mensageiros 437 O sistema receptor badrenérgico atua por meio do segundo mensageiro cAMP 438 QUADRO 122 Proteínas G comutadores binários na saúde e na doença 441 Diversos mecanismos levam ao término da resposta badrenérgica 444 O receptor badrenérgico é dessensibilizado pela fosforilação e pela associação com arrestina 445 O AMP cíclico age como segundo mensageiro para muitas moléculas reguladoras 446 Diacilglicerol inositoltrifosfato e Ca 21 têm funções relacionadas como segundos mensageiros 447 QUADRO 123 FRET a bioquímica vista em uma célula viva 448 O cálcio é um segundo mensageiro que pode ser localizado no tempo e no espaço 451 Os GPCR são responsáveis por mediar as ações de uma ampla variedade de sinais 452 123 Receptores tirosinacinases 453 A estimulação do receptor de insulina desencadeia uma cascata de reações de fosforilação de proteínas 453 O fosfolipídeo de membrana PIP3 age em uma ramificação da sinalização pela insulina 456 O sistema de sinalização via JAKSTAT também envolve atividade tirosinacinásica 457 As interconexões entre sistemas de sinalização são comuns e complexas 458 124 Receptores guanililciclases cGMP e proteínascinases G 459 125 Proteínas adaptadoras multivalentes e balsas lipídicas da membrana 460 Módulos proteicos se ligam aos resíduos de Tyr Ser ou Thr das proteínas associadas 460 Balsas lipídicas da membrana e cavéolas podem segregar proteínas sinalizadoras 463 126 Canais iônicos controlados por portões 464 Canais iônicos são a base da sinalização elétrica nas células excitáveis 464 Os canais iônicos controlados por voltagem produzem os potenciais de ação neuronais 465 O receptor de acetilcolina é um canal iônico controlado por ligante 467 Neurônios têm canais receptores que respondem a diferentes neurotransmissores 468 As toxinas são direcionadas a canais iônicos 468 127 Integrinas receptores bidirecionais da adesão celular 470 128 Regulação da transcrição por receptores nucleares de hormônios 471 129 Sinalização em microrganismos e plantas 473 A sinalização bacteriana requer fosforilação em um sistema binário 473 Os sistemas de sinalização de plantas têm alguns dos mesmos componentes utilizados por micróbios e mamíferos 473 As plantas detectam etileno por meio de um sistema binário e uma cascata de MAPK 475 Proteínascinases semelhantes a receptores transduzem os sinais de peptídeos 476 1210 Transdução sensorial na visão no olfato e no paladar 477 O sistema visual utiliza os mecanismos via GPCR clássicos 477 A rodopsina excitada age por meio da proteína G transducina para reduzir a concentração de cGMP 478 O sinal visual é rapidamente terminado 480 Cones são especializados em visão colorida 480 O olfato e o paladar dos vertebrados utilizam mecanismos similares ao sistema visual 481 QUADRO 124 Daltonismo o experimento de John Dalton após a sua morte 481 Os GPCR dos sistemas sensoriais compartilham algumas características com os GPCR dos sistemas de sinalização por hormônios 482 1211 Regulação do ciclo celular por proteínascinases 484 O ciclo celular tem quatro estágios 484 Os níveis de proteínascinases dependentes de ciclina oscilam 484 As CDK regulam a divisão celular pela fosforilação de proteínas cruciais 487 1212 Oncogenes genes supressores tumorais e morte celular programada 488 Os oncogenes são formas mutantes dos genes de proteínas que regulam o ciclo celular 489 Os defeitos em determinados genes eliminam a repressão normal da divisão celular 489 QUADRO 125 O desenvolvimento de inibidores de proteínascinases para o tratamento de câncer 490 A apoptose é o suicídio celular programado 492 II BIOENERGÉTICA E METABOLISMO 501 13 Bioenergética e Tipos de Reações Bioquímicas 505 131 Bioenergética e termodinâmica 506 As transformações biológicas de energia obedecem às leis da termodinâmica 506 As células necessitam de fontes de energia livre 507 Nelson6edIniciaisindd xxii Nelson6edIniciaisindd xxii 170414 1701 170414 1701 SUMÁRIO DETALHADO xxiii A variação da energia livre padrão está diretamente relacionada à constante de equilíbrio 507 A variação de energia livre real depende das concentrações dos reagentes e dos produtos 509 As variações de energia livre padrão são aditivas 510 132 Lógica química e reações bioquímicas comuns 511 As equações bioquímicas e químicas não são idênticas 517 133 Transferência de grupos fosforil e ATP 517 A variação de energia livre para a hidrólise do ATP é grande e negativa 518 Outros compostos fosforilados e tioésteres também apresentam energia livre de hidrólise elevada 520 O ATP fornece energia por transferência de grupos e não por simples hidrólise 522 O ATP doa grupos fosforil pirofosforil e adenilil 523 A montagem de macromoléculas informacionais requer energia 524 O ATP fornece energia para o transporte ativo e a contração muscular 525 QUADRO 131 Lampejos dos vagalumes indicadores incandescentes de ATP 525 As transfosforilações entre nucleotídeos ocorrem em todos os tipos celulares 526 O polifosfato inorgânico é um doador potencial de grupo fosforil 527 134 Reações biológicas de oxidaçãoredução 528 O fluxo de elétrons pode realizar trabalho biológico 528 As reações de oxidaçãoredução podem ser descritas como semirreações 528 As oxidações biológicas frequentemente envolvem desidrogenação 529 Os potenciais de redução medem a afinidade por elétrons 530 Os potenciais de redução padrão podem ser usados para calcular a variação de energia livre 531 A oxidação celular da glicose em dióxido de carbono requer transportadores de elétrons especializados 532 Alguns tipos de coenzimas e proteínas servem como transportadores universais de elétrons 532 NADH e NADPH atuam com as desidrogenases como transportadores solúveis de elétrons 532 A deficiência de niacina na dieta a forma vitamínica de NAD e NADP causa pelagra 535 Os nucleotídeos de flavina são fortemente ligados às flavoproteínas 535 14 Glicólise Gliconeogênese e a Via das PentosesFosfato 543 141 Glicólise 544 Uma visão geral a glicólise tem duas fases 544 A fase preparatória da glicólise requer ATP 548 A fase de pagamento da glicólise produz ATP e NADH 550 O balanço geral mostra um ganho líquido de ATP 555 A glicólise é precisamente regulada 555 QUADRO 141 Alta taxa da glicólise em tumores sugere alvos para quimioterapia e facilita o diagnóstico 556 A captação da glicose é deficiente no diabetes melito tipo 1 558 142 Vias alimentadoras da glicólise 558 Os polissacarídeos e os dissacarídeos da dieta sofrem hidrólise a monossacarídeos 558 O glicogênio endógeno e o amido são degradados por fosforólise 560 Outros monossacarídeos entram na via glicolítica em diversos pontos 561 143 Destinos do piruvato em condições anaeróbias fermentação 563 O piruvato é o receptor final de elétrons na fermentação láctica 563 QUADRO 142 Atletas jacarés e celacantos glicólise em concentrações limitantes de oxigênio 564 O etanol é o produto reduzido na fermentação alcoólica 565 A tiaminapirofosfato transporta grupos acetaldeído ativos 565 QUADRO 143 Fermentações etanólicas fabricando cerveja e produzindo biocombustíveis 566 As fermentações são usadas para produzir alguns alimentos comuns e reagentes químicos industriais 566 144 Gliconeogênese 568 A conversão de piruvato em fosfoenolpiruvato requer duas reações exergônicas 570 A conversão de frutose16bifostato a frutose6fosfato é o segundo contorno 572 A conversão de glicose6fosfato em glicose é o terceiro contorno 573 A gliconeogênese é energeticamente dispendiosa mas essencial 573 Os intermediários do ciclo do ácido cítrico e alguns aminoácidos são glicogênicos 574 Os mamíferos não podem converter ácidos graxos em glicose 574 A glicólise e a gliconeogênese são mutuamente reguladas 574 145 Oxidação da glicose pela via das pentosesfosfato 575 A fase oxidativa produz pentosesfosfato e NADPH 575 QUADRO 144 Por que Pitágoras não comia falafel deficiência da glicose6fosfatodesidrogenase 576 A fase não oxidativa recicla as pentosesfosfato a glicose6fosfato 577 A síndrome de WernickeKorsakoff é exacerbada por um defeito na transcetolase 580 A glicose6fosfato é repartida entre a glicólise e a via das pentosesfosfato 580 15 Princípios da Regulação Metabólica 587 151 Regulação das vias metabólicas 588 As células e os organismos mantêm um estado estável dinâmico 589 A quantidade de uma enzima e sua atividade catalítica podem ser reguladas 589 As reações longe do equilíbrio são pontos de regulação usuais nas células 592 Os nucleotídeos de adenina têm papéis especiais na regulação metabólica 594 152 Análise do controle metabólico 596 A contribuição de cada enzima para o fluxo através de uma via é determinada experimentalmente 596 O coeficiente de controle de fluxo quantifica o efeito de uma alteração na atividade enzimática sobre o fluxo metabólico por uma via 597 O coeficiente de elasticidade está relacionado com a capacidade de resposta da enzima a alterações na concentração do metabólito ou do regulador 597 O coeficiente de resposta expressa o efeito de um controlador externo sobre o fluxo de uma via 598 Nelson6edIniciaisindd xxiii Nelson6edIniciaisindd xxiii 170414 1701 170414 1701 xxiv SUMÁRIO DETALHADO QUADRO 151 Análise do controle metabólico aspectos quantitativos 598 A análise do controle metabólico foi aplicada ao metabolismo de carboidratos com resultados surpreendentes 599 A análise do controle metabólico sugere um método geral para o aumento do fluxo por uma via 600 153 Regulação coordenada da glicólise e da gliconeogênese 601 QUADRO 152 Isoenzimas proteínas diferentes que catalisam a mesma reação 602 As isoenzimas da hexocinase do músculo e do fígado são afetadas diferentemente por seu produto glicose6fosfato 602 A hexocinase IV glicocinase e a glicose6fosfatase são reguladas na transcrição 603 A regulação da fosfofrutocinase1 e da frutose16bifosfatase é recíproca 604 A frutose26bifosfato é um regulador alostérico potente da PFK1 e da FBPase1 605 A xilulose5fosfato é um reguladorchave do metabolismo dos carboidratos e das gorduras 606 A enzima glicolítica piruvatocinase é inibida alostericamente por ATP 606 A conversão gliconeogênica do piruvato a fosfoenolpiruvato está sob múltiplos tipos de regulação 608 A regulação transcricional da glicólise e da gliconeogênese altera o número de moléculas das enzimas 608 QUADRO 153 Mutações genéticas que originam formas raras de diabetes 611 154 Metabolismo do glicogênio nos animais 612 A degradação do glicogênio é catalisada pela glicogêniofosforilase 613 A glicose1fosfato pode entrar na glicólise ou no fígado repor a glicose sanguínea 614 O nucleotídeo de açúcar UDPglicose doa glicose para a síntese do glicogênio 615 QUADRO 154 Carl e Gerty Cori pioneiros no metabolismo e nas doenças do armazenamento do glicogênio 616 A glicogenina prepara os resíduos iniciais de glicose no glicogênio 619 155 Regulação coordenada da síntese e da degradação do glicogênio 620 A glicogêniofosforilase tem regulação alostérica e hormonal 621 A glicogêniosintase também é regulada por fosforilação e desfosforilação 623 A glicogêniosintasecinase 3 controla algumas ações da insulina 624 A fosfoproteínofosfatase 1 é central no metabolismo do glicogênio 624 Sinais alostéricos e hormonais coordenam integralmente o metabolismo dos carboidratos 624 O metabolismo de carboidratos e de lipídeos é integrado por mecanismos hormonais e alostéricos 626 16 Ciclo do Ácido Cítrico 633 161 Produção de acetilCoA acetato ativado 633 O piruvato é oxidado a acetilCoA e CO2 634 O complexo da piruvatodesidrogenase requer cinco coenzimas 634 O complexo da piruvatodesidrogenase consiste em três enzimas distintas 635 Na canalização do substrato o intermediário nunca deixa a superfície da enzima 636 162 Reações do ciclo do ácido cítrico 638 A sequência das reações do ciclo do ácido cítrico é quimicamente lógica 638 O ciclo do ácido cítrico tem oito etapas 640 QUADRO 161 Enzimas com mais de uma função 642 QUADRO 162 Sintases e sintetases ligases e liases cinases fosfatases e fosforilases sim os nomes são confusos 646 A energia das oxidações do ciclo é conservada de maneira eficiente 647 QUADRO 163 Citrato molécula simétrica que reage assimetricamente 648 Por que a oxidação do citrato é tão complicada 649 Os componentes do ciclo do ácido cítrico são importantes intermediários da biossíntese 650 Reações anapleróticas repõem os intermediários do ciclo do ácido cítrico 650 A biotina da piruvatocarboxilase transporta grupos CO2 651 163 Regulação do ciclo do ácido cítrico 653 A produção de acetilCoA pelo complexo piruvatodesidrogenase é regulada por mecanismos alostéricos e covalentes 654 O ciclo do ácido cítrico é regulado nas três etapas exergônicas 655 A canalização do substrato em complexos multienzimáticos pode ocorrer durante o ciclo do ácido cítrico 655 Algumas mutações em enzimas do ciclo do ácido cítrico levam ao desenvolvimento de câncer 656 164 Ciclo do glioxilato 656 O ciclo do glioxilato produz compostos de quatro carbonos a partir de acetato 657 Os ciclos do ácido cítrico e do glioxilato são regulados coordenadamente 658 17 Catabolismo de Ácidos Graxos 667 171 Digestão mobilização e transporte de gorduras 668 As gorduras da dieta são absorvidas no intestino delgado 668 Hormônios ativam a mobilização dos triacilgliceróis armazenados 669 Os ácidos graxos são ativados e transportados para dentro das mitocôndrias 670 172 Oxidação de ácidos graxos 672 A boxidação de ácidos graxos saturados tem quatro passos básicos 673 Os quatro passos da boxidação são repetidos para produzir acetilCoA e ATP 674 A acetilCoA pode ser oxidada ainda mais no ciclo do ácido cítrico 675 QUADRO 171 Ursos gordos realizam boxidação durante o sono 676 A oxidação de ácidos graxos insaturados requer duas reações adicionais 677 A oxidação completa de ácidos graxos de número ímpar requer três reações extras 677 A oxidação dos ácidos graxos é estritamente regulada 678 Fatores de transcrição ativam a síntese de proteínas do catabolismo de lipídeos 679 QUADRO 172 Coenzima B12 uma solução radical para um problema desconcertante 680 Nelson6edIniciaisindd xxiv Nelson6edIniciaisindd xxiv 170414 1701 170414 1701 SUMÁRIO DETALHADO xxv Defeitos genéticos nas acilCoAgraxodesidrogenases causam doenças graves 682 Os peroxissomos também realizam boxidação 682 Os peroxissomos e glioxissomos vegetais usam acetil CoA da boxidação como precursor biossintético 683 As enzimas da boxidação de organelas diferentes divergiram durante a evolução 683 A voxidação de ácidos graxos ocorre no retículo endoplasmático 684 O ácido fitânico sofre aoxidação nos peroxissomos 685 173 Corpos cetônicos 686 Os corpos cetônicos formados no fígado são exportados para outros órgãos como combustível 686 Os corpos cetônicos são produzidos em excesso no diabetes e durante o jejum 688 18 Oxidação de Aminoácidos e Produção de Ureia 695 181 Destinos metabólicos dos grupos amino 696 As proteínas da dieta são enzimaticamente degradadas até aminoácidos 697 O piridoxalfosfato participa da transferência de grupos aamino para o acetoglutarato 699 O glutamato libera seu grupo amino na forma de amônia no fígado 700 A glutamina transporta a amônia na corrente sanguínea 702 A alanina transporta a amônia dos músculos esqueléticos para o fígado 703 A amônia é tóxica para os animais 703 182 Excreção de nitrogênio e ciclo da ureia 704 A ureia é produzida a partir da amônia por meio de cinco etapas enzimáticas 704 Os ciclos do ácido cítrico e da ureia podem ser ligados 706 QUADRO 181 Ensaios para avaliar lesão tecidual 708 A atividade do ciclo da ureia é regulada em dois níveis 708 A interconexão de vias reduz o custo energético da síntese da ureia 708 Defeitos genéticos do ciclo da ureia podem ser fatais 709 183 Vias da degradação dos aminoácidos 710 Alguns aminoácidos são convertidos em glicose outros em corpos cetônicos 711 Diversos cofatores enzimáticos desempenham papéis importantes no catabolismo dos aminoácidos 712 Seis aminoácidos são degradados até piruvato 715 Sete aminoácidos são degradados produzindo acetilCoA 717 O catabolismo da fenilalanina é defeituoso geneticamente em algumas pessoas 719 Cinco aminoácidos são convertidos em acetoglutarato 721 Quatro aminoácidos são convertidos em succinilCoA 722 Os aminoácidos de cadeia ramificada não são degradados no fígado 723 A asparagina e o aspartato são degradados em oxaloacetato 724 QUADRO 182 Detetives científicos solucionam um assassinato misterioso 724 19 Fosforilação Oxidativa e Fotofosforilação 731 FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA 732 191 Reações de transferência de elétrons em mitocôndrias 732 Elétrons são canalizados para aceptores universais de elétrons 734 Os elétrons passam por uma série de carregadores ligados à membrana 735 Os carregadores de elétrons atuam em complexos multienzimáticos 737 Os complexos mitocondriais podem se associar em respirassomos 743 A energia da transferência de elétrons é eficazmente conservada em um gradiente de prótons 743 Espécies reativas de oxigênio são geradas durante a fosforilação oxidativa 745 As mitocôndrias vegetais têm mecanismos alternativos para oxidar NADH 746 QUADRO 191 Plantas quentes e malcheirosas e vias respiratórias alternativas 746 192 Síntese de ATP 747 A ATPsintase tem dois domínios funcionais Fo e F1 750 O ATP é estabilizado em relação ao ADP na superfície de F1 750 O gradiente de prótons impulsiona a liberação de ATP a partir da superfície da enzima 751 Cada subunidade b da ATPsintase pode assumir três diferentes conformações 752 A catálise rotacional é a chave para o mecanismo de alteração na ligação durante a síntese de ATP 752 De que forma o fluxo de prótons pelo complexo Fo produz movimento rotacional 755 O acoplamento quimiosmótico permite estequiometrias não integrais de consumo de O2 e de síntese de ATP 755 QUADRO 192 Microscopia de força atômica para visualizar as proteínas de membrana 756 A força prótonmotriz energiza o transporte ativo 757 Sistemas de lançadeiras conduzem indiretamente NADH citosólico para as mitocôndrias para oxidação 758 193 Regulação da fosforilação oxidativa 759 A fosforilação oxidativa é regulada pelas necessidades celulares de energia 760 Uma proteína inibitória impede a hidrólise de ATP durante a hipoxia 760 A hipoxia leva à produção de ERO e a várias respostas adaptativas 760 As vias produtoras de ATP são coordenadamente reguladas 761 194 Mitocôndrias na termogênese na síntese de esteroides e na apoptose 762 O desacoplamento em mitocôndrias do tecido adiposo marrom produz calor 762 Oxigenases P450 mitocondriais catalisam hidroxilações de esteroides 763 As mitocôndrias são de importância central para o início da apoptose 764 195 Genes mitocondriais suas origens e efeitos das mutações 765 As mitocôndrias evoluíram a partir de bactérias endossimbióticas 765 Mutações em DNA mitocondrial acumulamse ao longo de toda a vida do organismo 766 Algumas mutações nos genomas mitocondriais causam doenças 767 O diabetes pode resultar de defeitos nas mitocôndrias de células b pancreáticas 768 Nelson6edIniciaisindd xxv Nelson6edIniciaisindd xxv 170414 1701 170414 1701 xxvi SUMÁRIO DETALHADO FOTOSSÍNTESE CAPTURANDO ENERGIA LUMINOSA 769 196 Características gerais da fotofosforilação 769 A fotossíntese em plantas ocorre nos cloroplastos 769 A luz impulsiona o fluxo de elétrons nos cloroplastos 770 197 Absorção de luz 771 As clorofilas absorvem energia luminosa para a fotossíntese 771 Os pigmentos acessórios estendem a faixa de absorção de luz 773 A clorofila canaliza a energia absorvida para os centros de reação pela transferência de éxcitons 774 198 Evento fotoquímico central fluxo de elétrons promovido pela luz 776 As bactérias têm apenas um de dois tipos de centros de reação fotoquímicos 776 Fatores cinéticos e termodinâmicos impedem a dissipação da energia por conversão interna 778 Nas plantas dois centros de reação agem em sequência 779 As clorofilas antenas são fortemente integradas com os carregadores de elétrons 781 O complexo de citocromos b6 f liga os fotossistemas II e I 782 O fluxo cíclico de elétrons entre o PSI e o complexo de citocromos b6 f aumenta a produção de ATP em relação a NADPH 783 Transições de estado mudam a distribuição do LHCII entre os dois fotossistemas 783 A água é quebrada pelo complexo de liberação de oxigênio 784 199 Síntese de ATP pela fotofosforilação 786 Um gradiente de prótons acopla o fluxo de elétrons e a fosforilação 786 A estequiometria aproximada da fotofosforilação foi estabelecida 787 A ATPsintase dos cloroplastos é semelhante àquela das mitocôndrias 787 1910 Evolução da fotossíntese oxigênica 788 Os cloroplastos evoluíram a partir de antigas bactérias fotossintéticas 788 Em Halobacterium uma só proteína absorve luz e bombeia prótons para promover a síntese de ATP 789 20 Biossíntese de Carboidratos em Plantas e Bactérias 799 201 Síntese fotossintética de carboidratos 799 Os plastídeos são organelas exclusivas das células vegetais e das algas 800 A assimilação de dióxido de carbono ocorre em três estágios 801 A síntese de cada triosefosfato a partir do CO2 requer seis NADPH e nove ATP 808 Um sistema de transporte exporta triosesfosfato do cloroplasto e importa fosfato 809 Quatro enzimas do ciclo de Calvin são indiretamente ativadas pela luz 810 202 Fotorrespiração e as vias C4 e CAM 812 A fotorrespiração resulta da atividade de oxigenase da rubisco 812 A via de resgate do fosfoglicolato é onerosa 813 Em plantas C4 a fixação do CO2 e a atividade da rubisco são espacialmente separadas 815 QUADRO 201 A engenharia genética aumentará a eficiência de organismos fotossintéticos 816 Em plantas CAM a captura de CO2 e a ação da rubisco estão separadas temporalmente 818 203 Biossíntese de amido e sacarose 818 A ADPglicose é o substrato para a síntese de amido em plastídeos vegetais e para a síntese de glicogênio em bactérias 818 A UDPglicose é o substrato para a síntese de sacarose no citosol de células das folhas 819 A conversão de triosesfosfato em sacarose e amido é firmemente regulada 820 204 Síntese de polissacarídeos da parede celular celulose vegetal e peptideoglicano bacteriano 821 A celulose é sintetizada por estruturas supramoleculares na membrana plasmática 821 Oligossacarídeos ligados a lipídeos são precursores na síntese da parede celular bacteriana 823 205 Integração do metabolismo de carboidratos na célula vegetal 825 A gliconeogênese converte gorduras e proteínas em glicose nas sementes em germinação 825 Conjuntos pools de intermediários em comum conectam vias em diferentes organelas 826 21 Biossíntese de Lipídeos 833 211 Biossíntese de ácidos graxos e eicosanoides 833 A malonilCoA é formada a partir de acetilCoA e bicarbonato 833 A síntese dos ácidos graxos ocorre em uma sequência de reações que se repetem 834 A ácido graxosintase de mamíferos tem múltiplos sítios ativos 834 A ácido graxosintase recebe grupos acetila e malonila 836 As reações da ácido graxosintase são repetidas para formar palmitato 838 A síntese de ácidos graxos ocorre no citosol de muitos organismos mas nos cloroplastos das plantas 839 O acetato é transportado para fora da mitocôndria como citrato 840 A biossíntese de ácidos graxos é precisamente regulada 840 Os ácidos graxos saturados de cadeia longa são sintetizados a partir do palmitato 842 A dessaturação dos ácidos graxos requer uma oxidase de função mista 842 QUADRO 211 Oxidases de função mista enzimas do citocromo P450 e overdose de drogas 844 Os eicosanoides são formados a partir de ácidos graxos poliinsaturados de 20 carbonos 845 212 Biossíntese de triacilgliceróis 848 Os triacilgliceróis e os glicerofosfolipídeos são sintetizados a partir dos mesmos precursores 848 A biossíntese de triacilgliceróis nos animais é regulada por hormônios 849 O tecido adiposo gera glicerol3fosfato por meio da gliceroneogênese 850 As tiazolidinedionas tratam o diabetes tipo 2 aumentando a gliceroneogênese 852 Nelson6edIniciaisindd xxvi Nelson6edIniciaisindd xxvi 170414 1701 170414 1701 SUMÁRIO DETALHADO xxvii 213 Biossíntese de fosfolipídeos de membrana 852 As células dispõem de duas estratégias para o acoplamento dos grupos polares dos fosfolipídeos 852 A síntese dos fosfolipídeos em E coli utiliza CDPdiacilglicerol 853 Os eucariotos sintetizam fosfolipídeos aniônicos a partir de CDPdiacilglicerol 855 As vias eucarióticas para síntese de fosfatidilserina fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina são interrelacionadas 855 A síntese de plasmalogênio requer a formação de um álcool graxo unido por ligação éter 856 As vias de síntese de esfingolipídeos e glicerofosfolipídeos compartilham precursores e alguns mecanismos 857 Os lipídeos polares são direcionados para membranas celulares específicas 857 214 Colesterol esteroides e isoprenoides biossíntese regulação e transporte 859 O colesterol é formado a partir da acetilCoA em quatro etapas 860 O colesterol tem destinos diversos 864 O colesterol e outros lipídeos são transportados em lipoproteínas plasmáticas 864 QUADRO 212 Alelos da ApoE predizem a incidência da doença de Alzheimer 866 Os ésteres de colesterila entram na célula por endocitose mediada por receptor 868 O HDL realiza o transporte reverso de colesterol 869 A síntese e o transporte do colesterol são regulados em vários níveis 869 A desregulação do metabolismo de colesterol pode levar à doença cardiovascular 871 QUADRO 213 A hipótese lipídica e o desenvolvimento das estatinas 872 O transporte reverso do colesterol por HDL se opõe à formação da placa e da aterosclerose 873 Os hormônios esteroides são formados por clivagem da cadeia lateral e oxidação do colesterol 874 Os intermediários na biossíntese de colesterol têm muitos destinos alternativos 874 22 Biossíntese de Aminoácidos Nucleotídeos e Moléculas Relacionadas 881 221 Visão geral do metabolismo do nitrogênio 881 O ciclo do nitrogênio permite a manutenção de um conjunto de nitrogênio biologicamente disponível 882 A fixação do nitrogênio é realizada por enzimas do complexo da nitrogenase 882 QUADRO 221 Estilos de vida incomuns de seres obscuros porém abundantes 884 A amônia é incorporada em biomoléculas via glutamato e glutamina 888 A reação da glutaminasintetase é um ponto importante de regulação no metabolismo do nitrogênio 889 Diversas classes de reações desempenham papéis especiais na biossíntese de aminoácidos e nucleotídeos 890 222 Biossíntese de aminoácidos 891 O acetoglutarato origina glutamato glutamina prolina e arginina 892 Serina glicina e cisteína são derivadas do 3fosfoglicerato 892 Três aminoácidos não essenciais e seis aminoácidos essenciais são sintetizados a partir de oxaloacetato e piruvato 895 O corismato é um intermediáriochave na síntese de triptofano fenilalanina e tirosina 898 A biossíntese de histidina utiliza precursores da biossíntese de purinas 898 A biossíntese de aminoácidos está sob regulação alostérica 899 223 Moléculas derivadas de aminoácidos 902 A glicina é precursora das porfirinas 902 O grupo heme é fonte dos pigmentos biliares 904 QUADRO 222 Sobre reis e vampiros 906 Os aminoácidos são precursores da creatina e da glutationa 906 DAminoácidos são encontrados basicamente em bactérias 907 Aminoácidos aromáticos são precursores de muitas substâncias de origem vegetal 908 Aminas biológicas são produtos da descarboxilação dos aminoácidos 908 A arginina é precursora na síntese biológica de óxido nítrico 909 224 Biossíntese e degradação de nucleotídeos 910 A síntese de novo de nucleotídeos púricos inicia com o PRPP 912 A biossíntese de nucleotídeos púricos é regulada por retroalimentação negativa 914 Os nucleotídeos pirimídicos são sintetizados a partir de aspartato PRPP e carbamoilfosfato 915 A biossíntese de nucleotídeos pirimídicos é regulada por retroalimentação negativa 916 Nucleosídeos monofosfatados são convertidos em nucleosídeos trifosfatados 916 Os ribonucleotídeos são precursores dos desoxirribonucleotídeos 917 O timidilato é derivado do dCDP e do dUMP 920 A degradação de purinas e pirimidinas produz respectivamente ácido úrico e ureia 920 Bases púricas e pirimídicas são recicladas por vias de salvação 922 Excesso de ácido úrico causa gota 922 Muitos agentes quimioterápicos têm como alvo enzimas das vias de biossíntese de nucleotídeos 923 23 Regulação Hormonal e Integração do Metabolismo em Mamíferos 929 231 Hormônios estruturas diferentes para funções diferentes 929 A detecção e a purificação dos hormônios requerem um bioensaio 930 QUADRO 231 Como é descoberto um hormônio O árduo caminho até a insulina purificada 931 Os hormônios atuam por meio de receptores celulares específicos de alta afinidade 932 Os hormônios são quimicamente diferentes 933 A liberação de hormônios é regulada por uma hierarquia de sinais neuronais e hormonais 936 232 Metabolismo específico para cada tecido a divisão de trabalho 939 O fígado processa e distribui os nutrientes 939 Nelson6edIniciaisindd xxvii Nelson6edIniciaisindd xxvii 170414 1701 170414 1701 xxviii SUMÁRIO DETALHADO O tecido adiposo armazena e provê ácidos graxos 943 O tecido adiposo marrom é termogênico 944 Os músculos usam ATP para trabalho mecânico 944 QUADRO 232 Creatina e creatinacinase inestimáveis auxiliares do diagnóstico e amigas dos fisiculturistas 946 O cérebro usa a energia para a transmissão de impulsos elétricos 948 O sangue transporta oxigênio metabólitos e hormônios 949 233 Regulação hormonal do metabolismo energético 951 A insulina opõese a níveis altos de glicose sanguínea 951 As células b pancreáticas secretam insulina em resposta a alterações na glicose sanguínea 953 O glucagon opõese a níveis baixos de glicose sanguínea 955 O metabolismo é alterado durante o jejum e a inanição para prover combustível para o cérebro 956 A adrenalina sinaliza atividade iminente 958 O cortisol sinaliza estresse incluindo baixa glicose sanguínea 958 O diabetes melito resulta de defeitos na produção ou na ação da insulina 959 234 Obesidade e regulação da massa corporal 960 O tecido adiposo tem funções endócrinas importantes 960 A leptina estimula a produção de hormônios peptídicos anorexigênicos 962 A leptina dispara uma cascata de sinalização que regula a expressão gênica 962 O sistema da leptina pode ter evoluído para regular a resposta à fome 963 A insulina age no núcleo arqueado regulando a ingestão de alimento e a conservação de energia 963 A adiponectina age por meio da AMPK aumentando a sensibilidade à insulina 964 A atividade de mTORC1 coordena o crescimento celular com o fornecimento de nutrientes e energia 965 A dieta regula a expressão de genes essenciais para a manutenção da massa corporal 965 O comportamento alimentar é influenciado a curto prazo por grelina e PYY336 966 Os simbiontes microbianos do intestino influenciam no metabolismo energético e na adipogênese 968 235 Obesidade síndrome metabólica e diabetes tipo 2 968 No diabetes tipo 2 os tecidos se tornam insensíveis à insulina 968 O diabetes tipo 2 é controlado com dieta exercício e medicação 970 III VIAS DA INFORMAÇÃO 977 24 Genes e Cromossomos 979 241 Elementos cromossômicos 979 Os genes são segmentos de DNA que codificam cadeias polipeptídicas e RNA 979 As moléculas de DNA são muito mais longas do que o invólucro celular ou viral que as contém 980 Os genes eucarióticos e os cromossomos são muito complexos 984 242 DNA supertorcido 985 A maior parte do DNA celular se encontra subenrolado 986 O subenrolamento do DNA é definido pelo número de ligação topológico 988 As topoisomerases catalisam mudanças no número de ligação do DNA 989 A compactação do DNA necessita de uma forma especial de supertorção 990 QUADRO 241 Curando doenças pela inibição de topoisomerases 992 243 Estrutura dos cromossomos 994 A cromatina é formada por DNA e por proteínas 994 As histonas são proteínas básicas pequenas 995 Os nucleossomos são as unidades fundamentais da organização da cromatina 995 Os nucleossomos são condensados em estruturas com níveis de organização sucessivamente maiores 997 QUADRO 242 Epigenética estrutura dos nucleossomos e variantes de histonas 998 As estruturas condensadas dos cromossomos são mantidas pelas proteínas SMC 1000 O DNA das bactérias também é altamente organizado 1002 25 Metabolismo do DNA 1009 251 Replicação do DNA 1011 A replicação do DNA segue um conjunto de regras fundamentais 1011 O DNA é degradado por nucleases 1013 O DNA é sintetizado por DNApolimerases 1013 A replicação tem alto grau de precisão 1015 A E coli tem pelo menos cinco DNApolimerases 1016 A replicação do DNA precisa de muitas enzimas e fatores proteicos 1017 A replicação do cromossomo de E coli prossegue em estágios 1019 A replicação em células eucarióticas é semelhante porém mais complexa 1025 DNApolimerases virais fornecem alvos para a terapia antiviral 1026 252 Reparo do DNA 1027 As mutações estão ligadas ao câncer 1027 Todas as células têm sistemas de reparo de DNA múltiplos 1028 A interação das forquilhas de replicação com o dano do DNA pode levar à síntese de DNA translesão propensa a erro 1034 QUADRO 251 Reparo do DNA e câncer 1037 253 Recombinação do DNA 1038 A recombinação homóloga bacteriana é uma função de reparo do DNA 1039 A recombinação eucariótica homóloga é necessária para a segregação adequada de cromossomos durante a meiose 1041 A recombinação durante a meiose se inicia com quebras na fita dupla 1043 QUADRO 252 Por que a segregação adequada de cromossomos é importante 1045 A recombinação sítioespecífica resulta em rearranjos de DNA precisos 1046 Elementos genéticos de transposição se movem de um local para outro 1049 Os genes de imunoglobulinas se reúnem por recombinação 1049 Nelson6edIniciaisindd xxviii Nelson6edIniciaisindd xxviii 170414 1701 170414 1701 SUMÁRIO DETALHADO xxix 26 Metabolismo de RNA 1057 261 Síntese de RNA dependente de DNA 1058 O RNA é sintetizado pelas RNApolimerases 1058 A síntese de RNA começa nos promotores 1060 A transcrição é regulada em vários níveis 1061 QUADRO 261 A RNApolimerase deixa sua digital em um promotor 1062 Sequências específicas sinalizam a terminação da síntese de RNA 1063 As células eucariontes têm três tipos de RNApolimerases nucleares 1064 A RNApolimerase II precisa de muitos outros fatores proteicos para a sua atividade 1064 A RNApolimerase DNAdependente sofre inibição seletiva 1068 262 Processamento de RNA 1069 Os mRNAs de eucariontes recebem um quepe na extremidade 59 1070 Tanto íntrons quanto éxons são transcritos de DNA para RNA 1070 O RNA catalisa o splicing de íntrons 1070 Os mRNA de eucariontes tem uma estrutura da extremidade 39 característica 1075 Um gene pode dar origem a múltiplos produtos por meio do processamento diferencial do RNA 1075 RNA ribossomais e tRNAs também sofrem processamento 1077 Os RNAs com função especial sofrem vários tipos de processamento 1081 As enzimas de RNA são os catalisadores de alguns eventos no metabolismo de RNA 1082 Os mRNAs celulares são degradados em taxas diferentes 1084 A polinucleotídeofosforilase produz polímeros aleatórios semelhantes ao RNA 1085 263 Síntese de RNA e DNA dependente de RNA 1085 A transcriptase reversa produz DNA a partir de RNA viral 1086 Alguns retrovírus causam câncer e Aids 1088 Muitos transposons retrovírus e íntrons podem ter origem evolutiva comum 1088 A telomerase é uma transcriptase reversa especializada 1089 QUADRO 262 Combatendo a Aids com inibidores da transcriptase reversa do HIV 1089 Alguns RNAs virais são replicados por RNApolimerase dependente de RNA 1092 A síntese de RNA oferece pistas importantes para a evolução bioquímica 1092 QUADRO 263 O método SELEX para gerar polímeros de RNA com novas funções 1095 QUADRO 264 Universo de RNA em expansão com RNA TUF 1096 27 Metabolismo das Proteínas 1103 271 O código genético 1103 O código genético foi decifrado utilizandose moldes artificiais de mRNA 1104 A oscilação permite que alguns tRNA reconheçam mais de um códon 1108 QUADRO 271 Exceções que provam a regra variações naturais no código genético 1108 O código genético é resistente a mutações 1110 Mudança na fase da tradução e edição do RNA afetam a maneira como o código é lido 1111 272 Síntese proteica 1113 A biossíntese de proteínas ocorre em cinco estágios 1114 O ribossomo é uma complexa máquina supramolecular 1115 QUADRO 272 De um mundo de RNA para um mundo de proteína 1117 RNA transportadores têm características estruturais próprias 1118 Estágio 1 As aminoaciltRNAsintases ligam os aminoácidos corretos aos seus respectivos tRNA 1119 QUADRO 273 Expansões naturais e não naturais do código genético 1124 Estágio 2 Um aminoácido específico inicia a síntese de proteínas 1127 Estágio 3 As ligações peptídicas são formadas no estágio de alongamento 1129 QUADRO 274 Variação induzida do código genético supressão sem sentido 1134 Estágio 4 A terminação da síntese de polipeptídeos requer um sinal especial 1134 Estágio 5 As cadeias polipeptídicas recémsintetizadas sofrem enovelamento e processamento 1136 A síntese proteica é inibida por muitos antibióticos e toxinas 1138 273 Endereçamento e degradação das proteínas 1139 As modificações póstraducionais de muitas proteínas eucarióticas têm início no retículo endoplasmático 1140 A glicosilação tem um papelchave no endereçamento de proteínas 1141 As sequências sinal para o transporte nuclear não são clivadas 1143 As bactérias também usam sequências sinal para o endereçamento das proteínas 1145 As células importam proteínas por meio de endocitose mediada por receptor 1146 A degradação de proteínas é mediada por sistemas especializados em todas as células 1147 28 Regulação da Expressão Gênica 1155 281 Princípios da regulação gênica 1156 A RNApolimerase se liga ao DNA nos promotores 1156 A iniciação da transcrição é regulada por proteínas que se ligam aos promotores ou que estão próximas deles 1157 Muitos genes bacterianos são reunidos e regulados em óperons 1158 O óperon lac está sujeito à regulação negativa 1159 Proteínas regulatórias têm domínios separados de ligação de DNA 1160 Proteínas regulatórias também têm domínios de interação proteínaproteína 1163 282 Regulação da expressão gênica em bactérias 1165 O óperon lac sofre regulação positiva 1165 Muitos genes para as enzimas da biossíntese de aminoácidos são regulados pela atenuação da transcrição 1167 A indução da resposta SOS requer a destruição das proteínas repressoras 1169 A síntese de proteínas ribossomais é coordenada com a síntese de rRNA 1170 O funcionamento de alguns mRNA é regulado por pequenos RNA em cis ou em trans 1171 Alguns genes são regulados por recombinação genética 1173 283 Regulação da expressão gênica em eucariotos 1175 A cromatina ativa na transcrição é estruturalmente distinta da cromatina inativa 1175 Nelson6edIniciaisindd xxix Nelson6edIniciaisindd xxix 170414 1701 170414 1701 xxx SUMÁRIO DETALHADO A maioria dos promotores eucarióticos é regulada positivamente 1176 Ativadores de ligação de DNA e coativadores facilitam a montagem dos fatores gerais de transcrição 1177 Os genes do metabolismo da galactose em leveduras estão sujeitos tanto à regulação positiva quanto negativa 1180 Ativadores da transcrição têm estrutura modular 1181 A expressão gênica eucariótica pode ser regulada por sinais intercelulares e intracelulares 1182 A regulação pode resultar da fosforilação de fatores de transcrição nuclear 1184 Muitos mRNA de eucariotos estão sujeitos à repressão da tradução 1184 O silenciamento gênico póstranscrição é mediado por RNA de interferência 1185 A regulação da expressão gênica mediada por RNA assume várias formas em eucariotos 1186 O desenvolvimento é controlado por cascatas de proteínas regulatórias 1186 Célulastronco têm potencial de desenvolvimento que pode ser controlado 1191 QUADRO 281 Sobre barbatanas asas bicos e outras curiosidades 1194 Respostas Resumidas aos Problemas 1199 Glossário 1233 Créditos 1250 Índice 1259 Nelson6edIniciaisindd xxx Nelson6edIniciaisindd xxx 170414 1701 170414 1701 11 Fundamentos celulares 2 12 Fundamentos químicos 11 13 Fundamentos físicos 20 14 Fundamentos genéticos 29 15 Fundamentos evolutivos 32 H á cerca de catorze bilhões de anos o universo surgiu como uma explosão cataclísmica de partículas subatô micas quentes e ricas em energia Os elementos mais simples hidrogênio e hélio se formaram em segundos À medida que o universo se expandia e esfriava o material condensava sob a influência da gravidade para formar es trelas Algumas estrelas se tornaram enormes e então ex plodiram como supernovas liberando a energia necessária para promover a fusão de núcleos atômicos mais simples em mais complexos Átomos e moléculas formaram nuvens de partículas de pó e a sua agregação levou por fim à for mação de rochas planetoides e planetas Dessa maneira foram produzidos no decurso de bilhões de anos a própria Terra e os elementos químicos nela encontrados hoje Cer ca de quatro bilhões de anos atrás surgiu a vida micror ganismos simples com a capacidade de extrair energia de compostos químicos e mais tarde da luz solar Essa ener gia já era usada por eles para produzir um conjunto vasto de biomoléculas mais complexas a partir dos elementos simples e compostos encontrados na superfície terrestre Os seres humanos e todos os outros organismos vivos são feitos de poeira estelar A bioquímica questiona como as extraordinárias pro priedades dos organismos vivos se originaram a partir de milhares de biomoléculas diferentes Quando essas molé culas são isoladas e examinadas individualmente elas se guem todas as leis físicas e químicas que descrevem o com portamento da matéria inanimada Todos os processos que ocorrem nos organismos vivos também seguem todas as leis físicas e químicas O estudo da bioquímica mostra como o conjunto de moléculas inanimadas que constituem os orga nismos vivos interage para manter e perpetuar a vida exclu sivamente pelas leis físicas e químicas que regem o universo inanimado De fato os organismos vivos têm propriedades extraor dinárias propriedades que os distinguem muito das outras porções de matéria Mas quais são essas propriedades pecu liares dos organismos vivos Alto grau de complexidade química e organização microscópica Milhares de moléculas diferentes for mam as intricadas estruturas celulares internas Figura 11a Elas incluem polímeros muito longos cada qual com sua sequência característica de subunidades sua estrutura tridimensional única e seletividade muito es pecífica de parceiros para interação na célula Sistemas para extrair transformar e utilizar a energia do ambiente Figura 11b permitem aos or ganismos construir e manter suas intricadas estruturas assim como realizar trabalho mecânico químico osmó tico e elétrico o que neutraliza a tendência de toda a matéria de decair para um estado mais desorganizado entrando assim em equilíbrio com seu ambiente Funções definidas para cada um dos componen tes de um organismo e interações reguladas en tre eles Isso é válido não somente para as estruturas macroscópicas como folhas e ramos ou corações e pul mões mas também para as estruturas intracelulares microscópicas e os compostos químicos individuais A interação entre os componentes químicos de um orga nismo vivo é dinâmica mudanças em um componente causam mudanças coordenadas ou compensatórias em outro com o todo manifestando uma característica além daquelas de suas partes individuais O conjunto de mo léculas realiza um programa cujo resultado final é a re produção e a autopreservação do conjunto de moléculas em resumo a vida Mecanismos para sentir e responder às alterações no seu ambiente Os organismos constantemente se ajustam a essas mudanças por adaptações de sua quími ca interna ou de sua localização no ambiente Capacidade para se autorreplicar e automontar com precisão Figura 11c Uma célula bacteriana iso lada disposta em meio nutritivo estéril pode dar origem em 24 horas a um bilhão de filhas idênticas Cada cé 1 Fundamentos da Bioquímica Nelson6ed01indd 1 Nelson6ed01indd 1 020514 1714 020514 1714 2 DAVID L NELSON MICHAEL M COX lula contém milhares de moléculas diferentes muitas extremamente complexas mas cada bactéria é uma có pia fiel da original sendo sua construção totalmente di recionada a partir da informação contida no material ge nético da célula original Em uma escala maior a prole de um animal vertebrado mostra uma semelhança mar cante com a dos seus pais também como consequência da herança dos genes parentais Capacidade de se alterar ao longo do tempo por evolução gradual Os organismos alteram suas estra tégias de vida herdadas a passos muito pequenos para sobreviver em circunstâncias novas O resultado de eras de evolução é uma enorme diversidade de formas de vida muito diferentes superficialmente Figura 12 mas fundamentalmente relacionadas por sua ancestra lidade comum Essa unidade fundamental dos organis mos vivos se reflete na semelhança das sequências gêni cas e nas estruturas das proteínas Apesar dessas propriedades comuns e da unidade fun damental da vida que elas mostram é difícil fazer generali zações sobre os organismos vivos A Terra tem uma enorme diversidade de organismos Cada um dos inúmeros hábitats das fontes termais à tundra do Ártico dos intestinos dos animais hábitat de muitos microrganismos às casas de es tudantes existe um conjunto amplo de adaptações bioquí micas muito específicas nos organismos que vivem nesses hábitats adaptações que foram atingidas partindose de um arcabouço químico comum O texto deste livro para maior clareza às vezes se arrisca a fazer algumas generalizações as quais embora não perfeitas mostramse úteis Por vezes também aponta algumas exceções a essas generalizações as quais também podem se mostrar esclarecedoras A bioquímica descreve em termos moleculares as es truturas os mecanismos e os processos químicos compar tilhados por todos os organismos e estabelece princípios de organização que são a base da vida em todas as suas formas princípios esses referidos como a lógica molecular da vida Embora a bioquímica proporcione importantes escla recimentos e aplicações práticas na medicina na agricultu ra na nutrição e na indústria sua preocupação primordial é com o milagre da vida em si Neste capítulo introdutório é feita uma revisão dos fun damentos celulares químicos físicos e genéticos da bioquí mica e do importante princípio da evolução como a vida emergiu e evoluiu para essa diversidade de organismos de hoje À medida que você avançar na leitura do livro per ceberá a utilidade de retomar este capítulo de tempos em tempos para refrescar a sua memória sobre esse material básico 11 Fundamentos celulares A unidade e a diversidade dos organismos se tornam apa rentes mesmo em nível celular Os menores organismos a b c FIGURA 11 Algumas características da matéria viva a A comple xidade microscópica e a organização são visíveis nesse corte colorido artifi cialmente de tecido muscular de vertebrado produzido pelo microscópio eletrônico b Um falcão da pradaria capta nutrientes consumindo uma ave menor c A reprodução biológica ocorre com uma fidelidade quase perfeita FIGURA 12 Diferentes organismos vivos compartilham característi cas químicas comuns Aves animais selvagens plantas e microrganismos do solo compartilham com os humanos as mesmas unidades estruturais básicas células e os mesmos tipos de macromoléculas DNA RNA proteí nas feitas dos mesmos tipos de subunidades monoméricas nucleotídeos aminoácidos Eles utilizam as mesmas vias para a síntese dos componentes celulares compartilham o mesmo código genético e provêm dos mesmos ancestrais evolutivos Na figura é mostrado um detalhe de O jardim do Éden por Jan van Kessel o Jovem 16261679 Nelson6edbookindb 2 Nelson6edbookindb 2 020414 1841 020414 1841 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 3 consistem em células isoladas e são microscópicos Os or ganismos multicelulares maiores têm muitos tipos celulares diferentes os quais variam em tamanho forma e função es pecializada Apesar dessas diferenças óbvias todas as célu las dos organismos desde o mais simples ao mais complexo compartilham determinadas propriedades fundamentais que podem ser vistas em nível bioquímico As células são as unidades estruturais e funcionais de todos os organismos vivos Células de todos os tipos compartilham algumas caracte rísticas estruturais comuns Figura 13 A membrana plasmática define o contorno da célula separando seu conteúdo do ambiente Ela é composta por moléculas de lipídeos e proteínas que formam uma barreira fina resis tente flexível e hidrofóbica ao redor da célula A membrana é uma barreira para a passagem livre de íons inorgânicos e para a maioria de outros compostos carregados ou polares Proteínas de transporte na membrana plasmática permitem a passagem de determinados íons e moléculas proteínas re ceptoras transmitem sinais para o interior da célula e enzi mas de membrana participam em algumas rotas de reações Como os lipídeos individuais e as proteínas da membrana não estão covalentemente ligados toda a estrutura é ex traordinariamente flexível permitindo mudanças na forma e no tamanho da célula À medida que a célula cresce no vas moléculas de proteínas e de lipídeos são inseridas na membrana plasmática a divisão celular produz duas célu las cada qual com sua própria membrana O crescimento e a divisão celular fissão ocorrem sem perda da integridade da membrana O volume interno envolto pela membrana plasmática o citoplasma Figura 13 é composto por uma solução aquosa o citosol e uma grande variedade de partículas em suspensão com funções específicas Esses componentes particulados organelas envoltas por membrana como mito côndria e cloroplastos estruturas supramoleculares como ribossomos e proteossomos os sítios de síntese e degra dação das proteínas se sedimentam quando o citoplasma é centrifugado a 150000 g g é aceleração da gravidade na superfície terrestre O que sobra como fluido sobrenadan te é o citosol solução aquosa altamente concentrada que contém enzimas e as moléculas de RNA que as codificam os componentes aminoácidos e nucleotídeos que formam essas macromoléculas centenas de moléculas orgânicas pequenas chamadas de metabólitos intermediários em rotas biossintéticas e degradativas coenzimas compos tos essenciais em muitas reações catalisadas por enzimas e íons inorgânicos Todas as células têm pelo menos em algum momento de sua vida um nucleoide ou núcleo onde o genoma o conjunto completo de genes composto por DNA é replicado e armazenado com suas proteínas associadas Em bactérias e em arqueias o nucleoide não é separado do citoplasma por uma membrana o núcleo nos eucario tos é confinado dentro de uma dupla membrana o enve lope nuclear As células com envelope nuclear compõem o grande domínio dos Eukarya do grego eu verdade e karyon núcleo Os microrganismos sem membrana nuclear antes classificados como procariontes do grego pro antes são agora reconhecidos como pertencentes a dois grupos muito distintos Bacteria e Archaea descri tos a seguir As dimensões celulares são limitadas pela difusão A maioria das células é microscópica invisível a olho nu As células dos animais e das plantas têm um diâmetro ge ralmente de 5 a 100 mm e muitos microrganismos unice lulares têm comprimento de 1 a 2 mm ver na face inter na da contracapa as informações sobre as unidades e suas abreviaturas O que limita as dimensões de uma célula O limite inferior provavelmente é determinado pelo número mínimo de cada tipo de biomolécula requerido pela célu la As menores células certas bactérias conhecidas como micoplasmas têm diâmetro de 300 nm e volume de cerca de 10 14 mL Um único ribossomo bacteriano tem 20 nm na sua dimensão mais longa de forma que poucos ribossomos ocupam uma fração substancial do volume de uma célula de micoplasma O limite superior de tamanho celular provavelmente é determinado pela taxa de difusão das moléculas de soluto nos sistemas aquosos Por exemplo uma célula bacteriana que depende de reações de consumo de oxigênio para ex tração de energia deve obter oxigênio molecular por difu são a partir do ambiente através de sua membrana plasmá tica A célula é tão pequena e a relação entre sua área de superfície e seu volume é tão grande que cada parte do seu citoplasma é facilmente alcançada pelo O2 que se difunde para dentro dela Com o aumento do tamanho celular no entanto a relação áreavolume diminui até que o metabo lismo consuma O2 mais rapidamente do que o que pode ser suprido por difusão Assim o metabolismo que requer O2 tornase impossível quando o tamanho da célula aumenta além de certo ponto estabelecendo um limite superior teó rico para o tamanho das células O oxigênio é somente uma entre muitas espécies moleculares de baixo peso que pre cisam difundir de fora para várias regiões do seu interior e o mesmo argumento da razão áreavolume se aplica a cada uma delas Citoplasma Membrana plasmática Ribossomos Núcleo Nucleoide Membrana nuclear Organelas contidas por membrana 50 mm 1 mm Célula animal Célula bacteriana FIGURA 13 As características universais das células vivas Todas as células têm núcleo ou nucleoide membrana plasmática e citoplasma O ci tosol é definido como a porção do citoplasma que permanece no sobrena dante após rompimento suave da membrana plasmática e centrifugação do extrato resultante a 150000 g por 1 hora As células eucarióticas têm uma variedade de organelas contidas por membranas mitocôndrias e cloroplas tos e partículas maiores ribossomos p ex que são sedimentadas por esta centrifugação e podem ser recuperadas do precipitado Nelson6edbookindb 3 Nelson6edbookindb 3 020414 1841 020414 1841 4 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Existem três grupos distintos de vida Todos os organismos vivos se enquadram em três grandes grupos grupos que definem os três ramos da árvore evo lucionária da vida que se originou a partir de um ancestral comum Figura 14 Dois grandes grupos de microrga nismos unicelulares podem ser distinguidos em bases ge néticas e bioquímicas Bacteria e Archaea As bactérias habitam o solo as águas superficiais e os tecidos de orga nismos vivos ou em decomposição Muitas das arqueias reconhecidas na década de 1980 por Carl Woese como um grupo distinto habitam ambientes extremos lagos de sais fontes termais pântanos altamente ácidos e profundezas do oceano As evidências disponíveis sugerem que Bacteria e Archaea divergiram cedo na evolução Todos os organis mos eucariontes que formam o terceiro domínio Euka rya evoluíram a partir do mesmo ramo que deu origem a Archaea por isso os eucariontes são mais proximamente relacionados às archaeas do que às bactérias Dentro dos domínios Archaea e Bacteria existem sub grupos distinguíveis por seus hábitats Nos hábitats ae róbios com suprimento abundante de oxigênio alguns organismos residentes obtêm energia pela transferência de elétrons das moléculas de combustível para o oxigênio dentro da célula Outros ambientes são anaeróbios pra ticamente desprovidos de oxigênio e os microrganismos adaptados a esses ambientes obtêm energia pela transfe rência de elétrons para nitrato formando N2 sulfato for mando H2S ou CO2 formando CH4 Muitos organismos que evoluíram em ambientes anaeróbios são anaeróbios obrigatórios morrem quando expostos ao oxigênio Outros são anaeróbios facultativos capazes de viver com ou sem oxigênio Os organismos diferem amplamente pelas suas fontes de energia e precursores biossintéticos É possível classificar os organismos pela maneira como ob têm a energia e o carbono de que necessitam para sinteti zar o material celular conforme resumido na Figura 15 Existem duas categorias amplas com base nas fontes de energia fototróficos do grego trophe nutrição que captam e usam a luz solar e quimiotróficos que obtêm sua energia pela oxidação de um combustível químico Al guns quimiotróficos oxidam combustíveis inorgânicos por exemplo HS a S 0 enxofre elementar S 0 a SO4 NO2 a NO3 ou Fe 21 a Fe 31 Os fototróficos e os quimiotróficos podem ser subdivididos ainda mais os que podem sintetizar todas as suas biomoléculas diretamente do CO2 autotróficos e os que requerem nutrientes orgânicos previamente forma dos por outros organismos heterotróficos É possível descrever o modo de nutrição de um organismo pela combi nação desses termos Por exemplo cianobactérias são foto autotróficas humanos são quimioheterotróficos Distinções ainda mais sutis podem ser feitas pois muitos organismos podem obter energia e carbono de mais de uma fonte sob diferentes condições ambientais ou de desenvolvimento Células bacterianas e arqueanas compartilham propriedades comuns mas diferem em aspectos importantes Escherichia coli a bactéria mais estudada é geralmente um habitante inofensivo do trato intestinal humano A célu la de E coli Figura 16a é um ovoide com cerca de 2 mm de comprimento e um pouco menos de 1 mm de diâmetro Protobactérias bactérias púrpura Cianobactérias Flavobactérias Thermotogales Pyrodictium Thermoproteus Thermococcus Methanococcus Methanosarcina Halófilos Microsporídeos Flagelados Tricomonados Plantas Ciliados Fungos Diplomonados Animais Myxo grastria Entamoebas Archaea Último ancestral comum universal Bactérias gram positivas Bacteria Eukarya Bactérias verdes não sulfurosas Methanobacterium FIGURA 14 Filogenia dos três grupos da vida As relações filogenéti cas são frequentemente representadas por uma árvore genealógica deste tipo A base para esta árvore é a semelhança na sequência nucleotídica dos RNA dos ribossomos de cada grupo a distância entre os ramos representa o grau de diferença entre duas sequências quanto mais similar for a sequência mais próxima é a localização dos ramos As árvores filogenéticas também podem ser construídas a partir de semelhanças na sequência de aminoá cidos de uma única proteína entre as espécies Por exemplo as sequências da proteína GroEL proteína bacteriana que atua no enovelamento proteico são comparadas para gerar a árvore da Figura 335 A árvore da Figura 336 é a árvore consenso que usa várias comparações como estas para fazer a me lhor estimativa do relacionamento evolutivo de um grupo de organismos Nelson6edbookindb 4 Nelson6edbookindb 4 020414 1841 020414 1841 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 5 mas outras bactérias podem ser esféricas ou ter forma de bastonete Ela tem uma membrana externa protetora e uma membrana plasmática interna que envolve o citoplasma e o nucleoide Entre a membrana interna e a externa existe uma fina mas resistente camada de um polímero de alto peso molecular peptidoglicano que confere à célula sua forma e rigidez A membrana plasmática e as camadas ex ternas a ela constituem o envelope celular A membrana plasmática das bactérias consiste em uma bicamada fina de moléculas lipídicas impregnadas de proteínas As membra nas plasmáticas arqueanas têm arquitetura similar mas os lipídeos podem ser acentuadamente diferentes das bacté rias ver Figura 1012 Bactérias e arqueias têm especiali zações grupoespecíficas em seus envelopes celulares Fi gura 16bd Algumas bactérias chamadas grampositivas porque se coloram com o corante de Gram desenvolvido por Hans Peter Gram em 1882 têm uma camada espessa de peptidoglicanos na parte externa da sua membrana plas mática mas não apresentam uma membrana externa Já as bactérias gramnegativas têm uma membrana externa com posta de uma dupla camada lipídica na qual se encontram inseridos lipopolissacarídeos e proteínas chamadas porinas que proveem canais transmembrana para que compostos de baixo peso molecular e íons possam se difundir através dessa membrana externa As estruturas na parte externa da membrana plasmática das arqueias diferem de organis mo para organismo mas eles também têm uma camada de peptidoglicanos ou proteínas que conferem rigidez aos seus envelopes celulares O citoplasma da E coli contém cerca de 15000 ribosso mos várias cópias de 10 a milhares de cada uma das apro ximadamente 1000 diferentes enzimas talvez 1000 com postos orgânicos de massa molecular menor do que 1000 metabólitos e cofatores e uma variedade de íons inor gânicos O nucleoide contém uma única molécula de DNA circular e o citoplasma como na maioria das bactérias contém um ou mais segmentos de DNA circular chamados de plasmídeos Na natureza alguns plasmídeos conferem resistência a toxinas e antibióticos do ambiente No labora tório esses segmentos de DNA circular são práticos para a manipulação experimental e são ferramentas poderosas para a engenharia genética ver Capítulo 9 Outras espécies de Bacteria e também de Archaea contêm uma coleção similar de moléculas mas cada espé CO2 Compostos orgânicos CO2 Compostos orgânicos Todos os organismos Luz Química Fonte de energia Fototróficos Quimiotróficos Quimioheterotróficos Aceptor final de elétron Todos os animais a maioria dos fungos protistas e bactérias Bactérias fermentativas tais como Lactococcus lactis e Pseudomonas denitrificans por exemplo Usa H2O para reduzir CO2 Quimioautotróficos Bactérias oxidantes de hidrogênio enxofre ferro nitrogênio e monóxido de carbono Bactérias não sulfurosas verdes bactérias não sulfurosas purpuras Fotossíntese oxigênica plantas algas cianobactérias Bactérias fotossintéticas não oxigênicas bactérias verde e púrpura Fotoheterotróficos Fotoautotróficos Fonte de carbono Fonte de carbono O2 Sim Não Não O2 Compostos orgânicos Compostos inorgânicos FIGURA 15 Todos os organismos podem ser classificados de acordo com a fonte de energia luz solar ou compostos químicos oxidáveis e pela fonte de carbono usada para a síntese do material celular Nelson6edbookindb 5 Nelson6edbookindb 5 020414 1841 020414 1841 6 DAVID L NELSON MICHAEL M COX cie tem especializações físicas e metabólicas relacionadas ao nicho ambiental e fontes nutricionais Cianobactérias por exemplo têm membranas internas especializadas em capturar energia da luz Figura 1967 Muitas arqueias vivem em ambientes extremos e têm adaptações bio químicas para sobreviver em extremos de temperatura pressão ou concentração de sal Diferenças observadas na estrutura dos ribossomos deram a primeira indicação de que Bacteria e Archaea constituem grupos diferentes A maioria das bactérias inclusive E coli existe na forma de células individuais mas muitas vezes associadas a bio filmes ou películas nas quais inúmeras células se aderem umas às outras e ao mesmo tempo ao substrato sólido que fica junto ou próximo de uma superfície aquosa Células de algumas espécies de bactérias p ex mixobactéria mostram um comportamento social simples formando agregados multicelulares em resposta a sinais entre cé lulas vizinhas As células eucarióticas têm uma grande variedade de organelas providas de membranas que podem ser isoladas para estudo As células eucarióticas típicas Figura 17 são muito maiores do que as bactérias em geral de 5 a 100 mm de diâmetro com um volume de mil a um milhão de vezes maior do que o das bactérias As características que distin guem os eucariotos são o núcleo e uma grande variedade de organelas envoltas por membranas com funções específi cas Essa relação de organelas inclui a mitocôndria o sítio da maior parte das reações extratoras de energia da célula o retículo endoplasmático e aparelho de Golgi que desempenham papéis centrais na síntese e processamento de lipídeos e proteínas de membrana peroxissomos onde ácidos graxos de cadeia bem longa são oxidados e lisos somos preenchidos com enzimas digestivas para degradar os restos celulares não necessários Além dessas organelas Ribossomos Os ribossomos de bactérias e arqueias são menores do que dos eucarióticos mas têm a mesma função realizar a síntese de proteínas a partir de uma mensagem de RNA Nucleoide Contém uma ou várias moléculas de DNA longas e circulares Pili Proveem pontos de adesão à superfície de outras células Flagelos Propulsionam a célula pelos arredores Envelope celular As estruturas diferem a b Bactérias grampositivas Camada sólida Glicoproteína Polissacarídeo Lipoproteína Peptidoglicano Membrana plasmática Citoplasma Porina Lipoproteína Lipoproteína Periplasma Peptidoglicano Membrana plasmática LPS Membrana externa Citoplasma Camada sólida Glicoproteína Pseudo peptidoglicano Membrana plasmática Citoplasma c Bactérias gramnegativas mostradas à esquerda d Methanothermus arqueia extremamente tolerante ao calor FIGURA 16 Características estruturais comuns das células de bactérias e arqueias a Este desenho em escala da E coli serve para ilustrar algumas características comuns b O envelope celular das bac térias grampositivas é uma simples membrana com uma camada grossa e rígida de peptidoglicanos em sua superfície externa Uma variedade de polissacarídeos e outros polímeros complexos estão entrelaçados com os peptidoglicanos e recobrindo o todo ainda existe uma camada sólida e porosa de glicoproteínas c E coli é gramnegativa e tem uma dupla membrana Sua membrana externa tem um lipopolissacarídeo LPS na superfície externa e fosfolipídeos na superfície interna Esta membrana externa está impregnada de canais proteicas porinas que permitem a di fusão de pequenas moléculas através delas mas não de outras proteínas A membrana interna feita de fosfolipídeos e proteínas é impermeável a ambos às moléculas pequenas e grandes Entre a membrana interna e externa no periplasma existe uma camada delgada de peptidoglicanos que confere à célula forma e rigidez mas que não retém o corante de Gram d As membranas arqueanas variam em estrutura e composição mas todas têm membrana única cercada por uma camada externa que in clui uma estrutura tipo peptidoglicano uma concha de proteínas porosas camada sólida ou ambas Nelson6edbookindb 6 Nelson6edbookindb 6 020414 1841 020414 1841 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 7 Os ribossomos são máquinas de sintetizar proteínas O peroxissomo oxida ácidos graxos O lisossomo degrada restos intracelulares O transporte de vesículas faz o trânsito de proteínas e lipídeos entre o RE o aparelho de Golgi e a membrana plasmática O aparelho de Golgi processa empacota e envia proteínas para outras organelas ou para exportação O retículo endoplasmático liso REL é o local de síntese de lipídeos e de metabolismo de fármacos O núcleo contém os genes cromatina Ribossomos Envelope nuclear Citoesqueleto O citoesqueleto sustenta as células e auxilia no movimento das organelas Aparelho de Golgi O nucléolo é o local de síntese de RNA do ribossomo O retículo endoplasmático rugoso RER é um local de muita síntese proteica A mitocôndria oxida os combustíveis para produzir ATP A membrana plasmática separa a célula do meio e regula o movimento dos materiais para dentro e para fora da célula O cloroplasto absorve a luz solar e produz ATP e carboidratos Os grânulos de amido armazenam temporariamente os carboidratos produzidos na fotossíntese Os tilacoides são locais de síntese de ATP movida pela luz A parede celular dá forma e rigidez protegendo a célula da intumescência osmótica Parede celular de células adjacentes O plasmodesma permite a comunicação entre duas células vegetais O envelope nuclear separa a cromatina DNA 1 proteína do citoplasma O vacúolo degrada e recicla macromoléculas e armazena metabólitos a Célula animal b Célula vegetal O glioxissomo contém enzimas do ciclo do glioxilato FIGURA 17 Estrutura da célula eucariótica Ilustrações esquemáticas dos dois principais tipos de célula eucariótica a representação da célula animal e b representação da célula vegetal As células vegetais geralmen te têm diâmetro de 10 a 100 mm maiores do que as células animais que variam entre 5 e 30 mm As estruturas marcadas em vermelho são exclusivas das células animais as marcadas em verde são exclusivas das células vege tais Os microrganismos eucarióticos como protistas e fungos têm estrutu ras semelhantes às das células animais e vegetais mas muitos também têm organelas especializadas não ilustradas aqui Nelson6edbookindb 7 Nelson6edbookindb 7 020414 1841 020414 1841 8 DAVID L NELSON MICHAEL M COX as células vegetais também têm vacúolos que acumulam grandes quantidades de ácidos orgânicos e cloroplastos nos quais a luz solar realiza a síntese de ATP no processo da fotossíntese Figura 17 No citoplasma de muitas cé lulas estão presentes também grânulos ou gotículas conten do nutrientes armazenados como amido e gordura Em um avanço importante na bioquímica Albert Claude Christian de Duve e George Palade desenvolveram métodos para separar as organelas do citosol e elas entre si etapa essencial na investigação de suas estruturas e funções Em um processo típico de fracionamento Figura 18 as cé lulas ou tecidos em solução são suavemente rompidos por cisalhamento físico Esse tratamento rompe a membrana plasmática mas deixa intacta a maioria das organelas O ho mogeneizado é então centrifugado organelas como núcleo mitocôndria e lisossomos diferem em tamanho e por isso sedimentam em velocidades diferentes Esses métodos foram utilizados para estabelecer por exemplo que os lisossomos contêm enzimas degradativas as mitocôndrias contêm enzimas oxidativas e os cloroplas tos contêm pigmentos fotossintéticos O isolamento de uma organela rica em determinada enzima é com frequência a primeira etapa de purificação dessa enzima O citoplasma é organizado pelo citoesqueleto e é altamente dinâmico A microscopia de fluorescência revela vários tipos de fi lamentos proteicos atravessando a célula eucariótica em várias direções formando uma rede tridimensional interli gada o citoesqueleto Existem três tipos gerais de fila mentos citoplasmáticos filamentos de actina microtúbu los e filamentos intermediários Figura 19 que diferem em largura de 6 a 22 nm composição e função específica Todos os tipos conferem estrutura e organização ao cito plasma e forma à célula Os filamentos de actina e os micro túbulos também auxiliam na movimentação das organelas e da célula inteira Cada tipo de componente do citoesqueleto é compos to por subunidades proteicas simples que se associam de forma não covalente para formar filamentos de espessura uniforme Esses filamentos não são estruturas permanen tes sendo submetidos à constante desmontagem em suas subunidades e remontagem novamente em filamentos Sua localização na célula não é rigidamente fixa podendo mu dar drasticamente com a mitose a citocinese o movimento ameboide ou mudanças na forma celular A montagem a desmontagem e a localização de todos os tipos de filamen tos são reguladas por outras proteínas as quais servem para ligar ou reunir os filamentos ou para mover as orga nelas citoplasmáticas ao longo deles Bactérias contêm proteínas tipo actina que servem a funções semelhantes àquelas das células O quadro que emerge dessa breve vistoria da estrutura da célula eucariótica é o de uma célula com uma trama de fibras estruturais e um sistema complexo de compartimen tos envoltos por membranas Figura 17 Os filamentos se desmontam e se remontam em outro lugar As vesículas providas de membrana brotam de uma organela e se fun dem com outra As organelas se movem pelo citoplasma ao longo de filamentos proteicos e seu movimento é impul sionado por proteínas motoras dependentes de energia O sistema de endomembranas segrega processos metabó licos específicos e provê superfícies sobre as quais ocorrem determinadas reações catalisadas por enzimas A exocito se e a endocitose mecanismos de transporte para fora e para dentro da célula respectivamente que envolvem fusão e fissão de membranas produzem vias entre o ci toplasma e o meio circundante permitindo a secreção de Centrifugação a baixa velocidade 1000 g 10 min Sobrenadante centrifugado a velocidade média 20000 g 20 min Sobrenadante centrifugado a velocidade alta 80000 g 1 h Sobrenadante centrifugado a velocidade muito alta 150000 g 3 h Homogeneização do tecido Tecido homoge neizado Sedimento contém mitocôndrias lisossomos peroxissomos Sedimento contém microssomos fragmentos de RE pequenas vesículas Sedimento contém ribossomos macromoléculas grandes Sedimento contém células inteiras núcleos citoesqueleto membrana plasmática Sobrenadante contém proteínas solúveis Centrifugação diferencial FIGURA 18 Fracionamento subcelular de tecidos Um tecido como o hepático é homogeneizado mecanicamente para romper as células e dis persar seu conteúdo em um tampão aquoso O meio com sacarose tem uma pressão osmótica semelhante à das organelas equilibrando assim a difusão da água para dentro e para fora das organelas as quais intumesceriam e explodiriam em uma solução de osmolaridade mais baixa ver Figura 213 As partículas grandes e pequenas em suspensão podem ser separadas por centrifugação em diferentes velocidades As partículas maiores sedimentam com mais rapidez do que as partículas pequenas e o material solúvel não se sedimenta Pela escolha cuidadosa das condições de centrifugação as fra ções subcelulares podem ser separadas por caracterização bioquímica Nelson6edbookindb 8 Nelson6edbookindb 8 020414 1841 020414 1841 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 9 substâncias produzidas na célula e a captação de materiais extracelulares Essa organização do citoplasma embora complexa está longe de ser aleatória O movimento e o posicionamento das organelas e dos elementos do citoesqueleto estão sob firme regulação Em determinados estágios da vida a célula euca riótica é submetida a reorganizações drásticas conduzidas com exatidão como nos eventos da mitose As interações entre o citoesqueleto e as organelas são não covalentes são reversíveis e sujeitas à regulação em resposta a vários sinais intra e extracelulares As células constroem estruturas supramoleculares As macromoléculas e suas subunidades monoméricas dife rem muito em tamanho Figura 110 Uma molécula de alanina tem menos de 05 nm de comprimento Uma molé cula de hemoglobina a proteína transportadora de oxigênio dos eritrócitos células vermelhas do sangue consiste em subunidades contendo cerca de 600 resíduos de aminoáci dos em quatro longas cadeias dobradas em forma globular e associadas em uma estrutura de 55 nm de diâmetro As proteínas por sua vez são muito menores do que os ribos somos cerca de 20 nm de diâmetro os quais por sua vez são menores do que organelas como as mitocôndrias que têm 1000 nm de diâmetro É um grande salto das biomolé culas simples às estruturas celulares que podem ser vistas ao microscópio óptico A Figura 111 ilustra a hierarquia estrutural na organização celular As subunidades monoméricas das proteínas dos áci dos nucleicos e dos polissacarídeos são unidas por ligações covalentes Nos complexos supramoleculares contudo as macromoléculas são unidas por interações não covalentes individualmente muito mais fracas do que as covalentes Entre essas interações estão as ligações de hidrogênio entre grupos polares as interações iônicas entre gru pos carregados as interações hidrofóbicas entre grupos apolares em solução aquosa e as interações de van der Waals forças de London todas elas com energia muito menor do que as ligações covalentes Essas interações são descritas no Capítulo 2 O grande número de interações fracas entre as macromoléculas em complexos supramole culares estabilizam essas agregações gerando suas estru turas características Estudos in vitro podem omitir interações importantes entre moléculas Uma abordagem para o entendimento de um processo bio lógico é o estudo in vitro de moléculas purificadas no vidro no tubo de ensaio sem a interferência de outras moléculas presentes na célula intacta isto é in vivo no vivo Embora essa abordagem seja muito esclarecedora devese considerar que o interior de uma célula é total mente diferente do interior de um tubo de ensaio Os com ponentes interferentes eliminados na purificação podem ser cruciais para a função biológica ou para a regulação da molécula purificada Por exemplo estudos in vitro de enzimas puras são comumente realizados com concentra ções muito baixas da enzima em soluções aquosas sob agi tação Na célula uma enzima está dissolvida ou suspensa no citosol com consistência gelatinosa junto com milhares de outras proteínas e algumas delas se ligam à enzima e influenciam sua atividade Algumas enzimas são compo nentes de complexos multienzimáticos nos quais os rea gentes passam de uma enzima para a outra sem interagir com o solvente Quando todas as macromoléculas conhe a b FIGURA 19 Os três tipos de filamentos do citoesqueleto filamentos de actina microtúbulos e filamentos intermediários As estruturas ce lulares podem ser marcadas com um anticorpo que reconheça determinada proteína covalentemente ligado a um composto fluorescente As estruturas marcadas são visíveis quando a célula é observada sob um microscópio de fluorescência a Células endoteliais da artéria pulmonar bovina Feixes de filamentos de actina denominados fibras de estresse estão marcados em vermelho os microtúbulos irradiando a partir do centro da célula estão mar cados em verde e os cromossomos no núcleo estão marcados em azul b Célula de pulmão de salamandra em mitose Os microtúbulos verde ligados a estruturas chamadas de cinetócoros amarelo sobre os cromos somos condensados azul puxam os cromossomos para polos opostos ou centrossomos magenta da célula Os filamentos intermediários formados de queratina vermelho mantêm a estrutura da célula Nelson6edbookindb 9 Nelson6edbookindb 9 020414 1841 020414 1841 10 DAVID L NELSON MICHAEL M COX cidas de uma célula são representadas em suas dimensões e concentrações conhecidas Figura 112 fica claro que o citosol é bem ocupado e que a difusão de macromolécu las dentro do citosol deve ser mais lenta devido à colisão com outras estruturas grandes Em resumo certa molécu la pode ter um comportamento muito diferente na célula e in vitro Um desafio central na bioquímica é entender as influências da organização celular e das associações ma cromoleculares sobre a função das enzimas individuais e outras biomoléculas para entender a função in vivo as sim como in vitro RESUMO 11 Fundamentos celulares c Todas as células são delimitadas por uma membrana plasmática têm um citosol contendo metabólitos coen zimas íons inorgânicos e enzimas e têm um conjunto de genes contidos dentro de um nucleoide bactérias e arqueias ou de um núcleo eucariotos c Todos os organismos requerem uma fonte de energia para realizar o trabalho celular Os fototróficos obtêm energia da luz solar os quimiotróficos oxidam combus tíveis químicos transferindo elétrons para bons acep tores compostos inorgânicos compostos orgânicos ou oxigênio molecular c As células de bactérias e de arqueias contêm citosol nu cleoide e plasmídeos todos contidos dentro de um en velope celular As células eucarióticas têm núcleo e são Uracila Timina DRibose 2desóxi Dribose O H OH NH2 HOCH2 Citosina H H H OH H O H OH HOCH2 H H H OH OH Adenina Guanina COO2 Oleato Palmitato H CH2OH O HO OH DGlicose H H H OH OH H b Os componentes dos ácidos nucleicos c Alguns componentes dos lipídeos d O açúcar parental HO P O2 O OH Fosfato N Colina 1 CH2CH2OH CH3 CH3 CH3 Glicerol CH2OH CHOH CH2OH CH2 CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COO2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH CH a a a C NH2 C C CH HC N N N H N C O C C CH C HN N N H N C O O CH CH C HN N H O CH CH C N N H C O O CH C C HN N H H2N CH3 Bases nitrogenadas Açúcares de cinco carbonos Alanina Serina Aspartato Cisteína Histidina Tirosina a Alguns dos aminoácidos das proteínas FIGURA 110 Os compostos orgânicos a partir dos quais é formada a maior parte dos materiais celulares o ABC da bioquímica Estão mostrados aqui a seis dos 20 aminoácidos que formam todas as proteínas as cadeias laterais estão sombreadas em vermelho b as cinco bases nitro genadas os dois açúcares de cinco carbonos e os íons fosfato que formam os ácidos nucleicos c os cinco componentes dos lipídeos de membrana e d Dglicose o açúcar simples que forma a maioria dos carboidratos Ob serve que o fosfato é um componente dos ácidos nucleicos e dos lipídeos de membrana Nelson6edbookindb 10 Nelson6edbookindb 10 020414 1841 020414 1841 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 11 multicompartimentalizadas com determinados proces sos segregados em organelas específicas as organelas podem ser separadas e estudadas isoladamente c As proteínas do citoesqueleto se organizam em longos filamentos que dão forma e rigidez às células e servem como trilhos ao longo dos quais as organelas celulares se deslocam por toda a célula c Complexos supramoleculares unidos por interações não covalentes são parte de uma hierarquia de estruturas algumas delas visíveis ao microscópio óptico Quando moléculas individuais são removidas desses complexos para serem estudadas in vitro algumas interações im portantes na célula viva podem ser perdidas 12 Fundamentos químicos A bioquímica tenta explicar as formas e as funções bioló gicas em termos químicos No final do século XVIII os quí micos concluíram que a composição da matéria viva é im pressionantemente diferente daquela do mundo inanimado AntoineLaurent Lavoisier 17431794 percebeu a relati va simplicidade do mundo mineral e contrastoua com a complexidade dos mundos animal e vegetal Ele sabia que esses últimos eram constituídos de compostos ricos nos ele mentos carbono oxigênio nitrogênio e fósforo Durante a primeira metade do século XX investigações bioquímicas conduzidas em paralelo sobre a oxidação da glicose em leveduras e células de músculo animal revela ram semelhanças químicas marcantes nesses dois tipos celulares aparentemente muito distintos indicando que a queima da glicose em leveduras e células musculares envol ve os mesmos 10 intermediários químicos e as mesmas 10 enzimas Estudos subsequentes de muitos outros processos químicos em diferentes organismos confirmaram a gene ralidade dessa observação resumida em 1954 por Jacques Monod O que vale para a E coli também vale para um elefante A atual compreensão de que todos os organis mos têm uma origem evolutiva comum baseiase em parte nessa observação de que todos compartilhem dos mesmos processos e intermediários químicos o que muitas vezes é denominado de unidade bioquímica A célula e suas organelas Complexos supramoleculares Macromoléculas Unidades monoméricas Açúcares O CH2OH H O2 P 2O O O O CH2 NH2 H H N N H H OH H O COO2 C H3N H CH3 H O H OH CH2OH H HO OH OH H 1 Celulose Membrana plasmática Parede celular Nucleotídeos Aminoácidos Proteína Cromatina DNA FIGURA 111 Hierarquia estrutural na organização molecular das células As organelas e outras estruturas relativamente grandes das célu las são feitas de complexos supramoleculares que por sua vez são feitos de moléculas menores e de subunidades moleculares menores Por exemplo o núcleo desta célula de planta contém cromatina complexo supramo lecular que consiste em DNA e proteínas histonas O DNA é feito de su bunidades monoméricas simples nucleotídeos assim como as proteínas aminoácidos Envelope celular Flagelo Membrana externa Membrana interna Ribossomo DNA nucleoide FIGURA 112 A célula lotada Este desenho de David Goodsell é uma re presentação precisa dos tamanhos relativos e número de macromoléculas em uma região pequena da célula de E coli Este citosol concentrado repleto de proteínas e ácidos nucleicos é muito diferente de um extrato típico de células em estudos bioquímicos onde o citosol é diluído muitas vezes alte rando bastante a interação entre as macromoléculas Nelson6edbookindb 11 Nelson6edbookindb 11 020414 1841 020414 1841 12 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Menos de 30 entre os mais de 90 elementos químicos de ocorrência natural são essenciais para os organismos A maioria dos elementos da matéria viva tem um número atô mico relativamente baixo somente três têm números atô micos maiores do que o selênio 34 Figura 113 Os qua tro elementos químicos mais abundantes nos organismos vivos em termos de porcentagem do total de número de átomos são hidrogênio oxigênio nitrogênio e carbono que juntos constituem mais de 99 da massa das células Eles são os elementos mais leves capazes de formar de maneira eficiente uma duas três e quatro ligações em geral os ele mentos mais leves formam ligações mais fortes Os elemen tostraço Figura 113 representam uma fração minúscula do peso do corpo humano mas todos são essenciais à vida geralmente por serem essenciais para a função de proteí nas específicas incluindo muitas enzimas A capacidade de transporte de oxigênio da hemoglobina por exemplo é totalmente dependente de quatro íons ferro que somados representam somente 03 da massa total Biomoléculas são compostos de carbono com uma grande variedade de grupos funcionais A química dos organismos vivos está organizada em torno do carbono que contribui com mais da metade do peso seco das células O carbono pode formar ligações simples com átomos de hidrogênio assim como ligações simples e duplas com átomos de oxigênio e nitrogênio Figura 114 A capacidade dos átomos de carbono de formar ligações simples estáveis com até quatro outros átomos de carbono é de grande importância na biologia Dois átomos de car bono também podem compartilhar dois ou três pares de elétrons formando assim ligações duplas ou triplas As quatro ligações simples que podem ser formadas pelo átomo de carbono se projetam a partir do núcleo formando os quatro vértices de um tetraedro Figura 115 com ângulo de aproximadamente 1095 entre duas ligações quaisquer e comprimento médio de ligação de 0154 nm A rotação é livre em torno de cada ligação simples a menos que grupos muito grandes ou altamente carregados estejam ligados aos átomos de carbono Nesse caso a rotação pode ser limitada Já a ligação dupla é mais curta cerca de 0134 nm e rígida permitindo somente uma rotação limitada em torno do seu eixo Átomos de carbono covalentemente ligados em biomo léculas podem formar cadeias lineares ramificadas e estru turas cíclicas Aparentemente a versatilidade de ligação do carbono com outro carbono e com outros elementos foi o principal fator na seleção dos compostos de carbono para a maquinaria molecular das células durante a origem e a evolução dos organismos vivos Nenhum outro elemento químico consegue formar moléculas com tanta diversidade de tamanhos formas e composição A maioria das biomoléculas deriva dos hidrocarbonetos tendo átomos de hidrogênio substituídos por uma grande variedade de grupos funcionais que conferem propriedades químicas específicas à molécula formando diversas famílias de compostos orgânicos Exemplos típicos dessas biomolé culas são os álcoois que têm um ou mais grupos hidroxila aminas com grupos amina aldeídos e cetonas com gru pos carbonila e ácidos carboxílicos com grupos carboxi la Figura 116 Muitas biomoléculas são polifuncionais FIGURA 113 Elementos essenciais para a vida e a saúde dos animais Os elementos principais vermelho são componentes estrutu rais das células e dos tecidos e são necessários na dieta em uma quantidade de vários gramas por dia Para os elementostraço amarelo as quan tidades requeridas são muito menores para hu manos alguns miligramas por dia de Fe Cu e Zn são suficientes e quantidades ainda menores dos demais elementos As necessidades mínimas para plantas e microrganismos são semelhantes às mostradas aqui o que varia são as maneiras pelas quais eles adquirem esses elementos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 H He Li Be B C N O F Ne Na Mg Al Si P S Cl Ar K Ca Sc Ti V Cr Mn Fe Co Ni Cu Zn Ga Ge As Se Br Kr Rb Sr Y Zr Nb Mo Tc Ru Rh Pd Ag Cd In Sn Sb Te I Xe Cs Ba Hf Ta W Re Os Ir Pt Au Hg Tl Pb Bi Po At Rn Fr Ra Lantanídeos Actinídeos Elementos principais Elementostraço FIGURA 114 A versatilidade do carbono em formar ligações O carbono pode formar ligações cova lentes simples duplas e triplas indi cadas em vermelho particularmente com outros átomos de carbono Li gações triplas são raras em biomo léculas 1 C N C N C N H C H H H C 1 C 1 O C O C C O 1 C O C O O C 1 C C C C C C 1 C C C C C C 1 N C N C N C 1 C C C C C C Nelson6edbookindb 12 Nelson6edbookindb 12 020414 1841 020414 1841 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 13 a b 1095 1095 C C C c 120 X C C A B Y FIGURA 115 Geometria da ligação do carbono a Os átomos de carbono têm um arranjo tetraédrico bem característico para suas quatro ligações simples b A ligação simples carbonocarbono tem liberdade de rotação como mostrado para o composto etano CH3CH3 c Ligações duplas são mais curtas e não permitem rotação Os dois carbonos ligados por ligação dupla e os átomos designados por A B X e Y estão todos no mesmo plano rígido Metila R C H H H Éter R1 O R2 1N Guanidina R N H C N H H H H Etila R C H H C H H H Éster R1 C O O R2 Imidazol R N CH C HN H C Fenila R C H C C H H C C C H H O O H C H C Acetila R H Sulfidrila R S H Carbonila aldeído R C O H Anidrido dois ácidos carboxílicos R1 C O O C R2 O Dissulfeto R S S R2 1 Carbonila cetona R C O R2 1 N1 Amino protonado R H H H Tioéster R1 C O S R2 Carboxila R C O O2 Amida R C O N H H O2 Fosforila R O P O OH Hidroxila álcool R O H R R2 1 Imina N H C O2 O2 Fosfoanidrido R1 O R2 O P O P O R O Enol R C H H C H O R R2 1 Imina Nsubstituída base de Schiff N C R3 Anidrido misto de ácido carboxílico e ácido fosfórico também chamado de acilfosfato R C O O OH O2 O P FIGURA 116 Alguns grupos funcionais comuns em biomoléculas Os grupos funcionais estão pintados com uma cor usada para o elemento que caracteriza aquele grupo cinza para C cor salmão para O azul para N amarelo para S e cor de laranja para P Nesta figura e em todo o livro será usado R para representar qualquer substituinte Ele pode ser tão simples como um átomo de hidrogênio mas geralmente será um grupo contendo carbono Quando dois ou mais substituintes são mostrados em uma molé cula serão designados como R 1 R 2 e assim por diante Nelson6edbookindb 13 Nelson6edbookindb 13 020414 1841 020414 1841 14 DAVID L NELSON MICHAEL M COX contendo dois ou mais tipos de grupos funcionais Figu ra 117 cada qual com suas características químicas e de reação A personalidade química de um composto é determinada pela química de seu grupo funcional e pela sua disposição no espaço tridimensional As células contêm um conjunto universal de moléculas pequenas Existe uma coleção de aproximadamente mil moléculas orgânicas pequenas Mr 100 a 500 diferentes dissolvi das na fase aquosa citosol das células com concentração intracelular na faixa de nanomolar a milimolar ver Figura 154 Consultar no Quadro 11 a explicação sobre as vá rias maneiras de se referir às massas moleculares Esses são os metabólitos centrais das principais rotas metabó licas que ocorrem em quase todas as células isto é os metabólitos e as rotas que foram conservados durante o curso da evolução Essa coleção de moléculas inclui os ami noácidos comuns nucleotídeos açúcares e seus derivados fosforilados e ácidos mono di e tricarboxílicos As molé culas podem ser polares ou carregadas e são solúveis em água Elas estão aprisionadas no interior das células por que a membrana plasmática é impermeável a elas embora tipo imidazol amina fosfoanidrido Acetilcoenzima A hidroxila amida amida tioéster fosforila FIGURA 117 Vários grupos funcionais comuns em uma única biomolécula Acetilcoenzima A frequentemente abreviada como acetil CoA é uma carreadora de grupos acetila em algumas reações enzimáticas Os grupos funcionais são mostrados na fórmula estrutural Como será visto no Capítulo 2 alguns desses grupos funcionais podem existir nas formas protonadas ou não protonadas dependendo do pH No modelo de volume atômico N é azul C é preto P é cor de laranja O é cor salmão e H é branco O átomo amarelo no lado esquerdo é o enxofre da ligação tioéster importante na mediação entre a parte acetila e coenzima A QUADRO 11 Peso molecular massa molecular e suas unidades corretas Há duas maneiras comuns e equivalentes para descre ver massa molecular e as duas são usadas neste texto A primeira é peso molecular ou massa molecular rela tiva denominada Mr O peso molecular da substância é definido como a relação da massa da molécula da subs tância para um duodécimo da massa do carbono12 12C Visto que Mr é uma razão ela é adimensional não tem unidades associadas A segunda é a massa molecular denotada por m simplesmente a massa da molécula ou a massa molar dividida pelo número de Avogadro Essa massa molecular m é expressa em dáltons abreviado Da Um dálton é equivalente a um duodécimo da massa do carbono12 um quilodálton kDa é 1000 dáltons um megadálton MDa é um milhão de dáltons Considere por exemplo uma molécula com massa 1000 vezes superior à da água Podese dizer que essa mo lécula tem Mr 5 18000 ou m 5 18000 dáltons Podese também descrevêla como molécula com 18 kDa Entre tanto a expressão Mr 5 18000 dáltons é incorreta Outra unidade conveniente para descrever a massa de um único átomo ou molécula é a unidade de massa atômica antes denominada uma agora geralmente descrita como u Uma unidade de massa atômica 1 u é definida como um duodécimo da massa do átomo do carbono12 Experi mentalmente a medida da massa de um átomo de carbo no12 é 19926 3 10 23 g então 1 u 5 16606 3 10 24 g A unidade de massa atômica é conveniente para descrever a massa dos picos observados em espectrometria de massas ver Capítulo 3 página 100 Nelson6edbookindb 14 Nelson6edbookindb 14 020414 1841 020414 1841 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 15 transportadores de membrana específicos possam catalisar o deslocamento de algumas moléculas para dentro e para fora da célula ou entre compartimentos nas células euca rióticas A ocorrência universal dos mesmos conjuntos de compostos nas células vivas reflete a conservação evoluti va das rotas metabólicas que se desenvolveram nas células primitivas Existem outras biomoléculas pequenas específicas de certos tipos de células ou organismos Por exemplo plantas vasculares contêm além do conjunto universal moléculas pequenas chamadas de metabólitos secundários que exercem funções específicas para a vida da planta Esses metabólitos incluem compostos que dão às plantas seus aromas e cores característicos e compostos como morfina quinino nicotina e cafeína que são apreciados pelos seus efeitos fisiológicos em humanos mas usados para outros propósitos pelas plantas O conjunto completo de moléculas pequenas em uma dada célula sob um conjunto específico de condições tem sido chamado de metaboloma em analogia ao termo ge noma Metabolômica é a caracterização sistemática do metaboloma sob condições bem específicas como após a administração de um fármaco ou de um sinal biológico como insulina As macromoléculas são os principais constituintes das células Muitas moléculas biológicas são macromoléculas polí meros com peso molecular acima de 5000 montados a partir de precursores relativamente simples Polímeros mais curtos são chamados de oligômeros do grego oligos poucos Proteínas ácidos nucleicos e polissacarídeos são macromoléculas feitas de monômeros cujos pesos molecu lares são 500 ou menos A síntese de macromoléculas é a atividade que mais consome energia nas células As macro moléculas podem ainda sofrer processamentos adicionais que resultam em complexos supramoleculares formando unidades funcionais como os ribossomos A Tabela 11 mos tra as principais classes de biomoléculas em uma célula de E coli As proteínas que são polímeros longos de aminoácidos constituem a maior fração além da água da célula Algu mas proteínas têm atividade catalítica e funcionam como enzimas outras servem como elementos estruturais recep tores de sinal ou transportadores que carregam substâncias específicas para dentro ou para fora das células As proteí nas são talvez as mais versáteis de todas as biomoléculas um catálogo de suas mais variadas funções seria bem ex tenso O conjunto de todas as proteínas em funcionamento em determinada célula é chamado de proteoma da célula e proteômica é a caracterização sistemática dessa guarni ção total de proteínas observadas em um conjunto especí fico de condições Os ácidos nucleicos DNA e RNA são polímeros de nucleotídeos Eles armazenam e transmitem a informação genética e algumas moléculas de RNA apre sentam também função estrutural e catalítica em comple xos supramoleculares O genoma é a sequência completa do DNA da célula ou no caso do RNA viral o seu RNA e genômica é a caracterização da estrutura comparativa fun ção evolução e mapeamento dos genomas Os polissacarí deos polímeros de açúcares simples como a glicose apre sentam três funções principais depósitos de combustível de alto conteúdo energético componentes estruturais rígidos da parede celular em plantas e bactérias e elementos no reconhecimento extracelular que se ligam a proteínas de outras células Polímeros mais curtos de açúcares oligossa carídeos ligados a proteínas ou lipídeos na superfície da célula servem como sinais celulares específicos O glico ma da célula é o conjunto de todas as moléculas contendo carboidratos Os lipídeos derivados de hidrocarbonetos e insolúveis em água servem como componentes estruturais das membranas depósitos de combustível de alto conteúdo energético pigmentos e sinais intracelulares O conjunto de todas as moléculas contendo lipídeos em uma célula consti tui o seu lipidoma Com a aplicação de métodos sensíveis e elevado poder de resolução p ex espectrometria de massas é possível distinguir e quantificar centenas e mi lhares desses componentes e portanto quantificar as suas variações em resposta às alterações das condições sinais ou drogas A biologia de sistemas é uma abordagem que tenta integrar a informação da genômica proteômica glicômica e lipidômica para fornecer uma descrição molecular de todas as atividades da célula sob um conjunto de condições e as mudanças que ocorrem quando o sistema é perturbado por sinais externos por certas situações ou por mutações Proteínas polinucleotídeos e polissacarídeos apresen tam um grande número de subunidades monoméricas e como consequência alto peso molecular na faixa de 5000 até mais de 1 milhão para proteínas até vários bilhões para ácidos nucleicos e milhões para polissacarídeos como o amido Moléculas de lipídeos individuais são muito menores Mr entre 750 e 1500 e não são classificadas como ma cromoléculas mas podem associarse não covalentemente formando estruturas muito grandes Membranas celulares são formadas por grandes agregados não covalentes de mo léculas de lipídeos e proteínas Dadas as sequências características de suas subunidades ricas em informação as proteínas e os ácidos nucleicos são muitas vezes referidos como macromoléculas informacio nais Alguns oligossacarídeos como observado anteriormen te também servem como moléculas informacionais TABELA 11 Componentes moleculares de uma célula de E coli Porcentagem do peso total de célula Número aproximado de espécies moleculares diferentes Água 70 1 Proteínas 15 3000 Ácidos nucleicos DNA RNA 1 6 14 3000 Polissacarídeos 3 10 Lipídeos 2 20 Subunidades monomé ricas e intermediárias 2 500 Íons inorgânicos 1 20 Nelson6edbookindb 15 Nelson6edbookindb 15 020414 1841 020414 1841 16 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A estrutura tridimensional é descrita pela configuração e pela conformação As ligações covalentes e os grupos funcionais das biomolé culas são obviamente essenciais para o seu funcionamen to como também é o arranjo dos constituintes atômicos das moléculas no espaço tridimensional isto é sua estereoquí mica Compostos contendo carbono normalmente existem como estereoisômeros moléculas com as mesmas liga ções químicas e mesma fórmula molecular mas com dife rentes configurações Interações entre biomoléculas são invariavelmente estereoespecíficas exigindo configura ções específicas das moléculas interagentes A Figura 118 mostra três maneiras de ilustrar a este reoquímica ou configuração das moléculas simples O dia grama em perspectiva especifica a estereoquímica de forma inequívoca mas o ângulo das ligações e os comprimentos das ligações centro a centro são mais bem representados pelos modelos de esfera e bastão No modelo de volume atômico o raio de cada átomo é proporcional ao seu raio de van der Waals e os contornos do modelo definem o espa ço ocupado pela molécula o volume do espaço no qual os átomos das outras moléculas estão excluídos A configuração é conferida pela presença de 1 ligações duplas em torno das quais existe pouca ou nenhuma liber dade de rotação ou 2 pela presença de centros quirais em torno dos quais grupos substituintes são arranjados em uma orientação específica A característica que permite identifi car estereoisômeros é o fato de não poderem ser intercon vertidos sem quebrar temporariamente uma ou mais liga ções covalentes A Figura 119a mostra a configuração do ácido maleico e seu isômero ácido fumárico Esses compos tos são isômeros geométricos ou isômeros cistrans que diferem no arranjo de seus grupos substituintes com respeito à ligação dupla rígida não rotativa do latim cis neste lado grupos com ligações duplas do mesmo lado trans através de grupos em lados opostos O ácido ma a c b FIGURA 118 Representações das moléculas Três maneiras de repre sentar a estrutura do aminoácido alanina mostrado na forma iônica encon trada em pH neutro a Fórmula estrutural em perspectiva uma cunha sóli da representa uma ligação na qual o átomo se projeta para fora do plano do papel na direção do leitor a cunha tracejada representa a ligação estendida para trás do plano do papel b Modelo de esfera e bastão mos trando os comprimentos relativos das ligações e os ângulos das ligações c Modelo de volume atômico no qual cada átomo é mostrado com seu raio de van der Waals relativo correto FIGURA 119 Configuração de isômeros geométricos a Isômeros como o ácido maleico maleato em pH 7 e o ácido fumárico fumarato não podem ser interconvertidos sem quebrar ligações covalentes o que requer o gasto de muito mais energia do que a média da energia cinética das molécu las a temperaturas fisiológicas b Na retina dos vertebrados o evento inicial na detecção de luz é a absorção da luz visível pelo 11cisretinal A energia da luz absorvida em torno de 250 kJmol converte 11cisretinal em retinal todo trans provocando mudanças na célula da retina o que desencadeia o impulso nervoso Note que os átomos de hidrogênio são omitidos nos modelos de esfera e bastão Ácido maleico cis 11cisRetinal luz Ácido fumárico trans todotransRetinal b a Nelson6edbookindb 16 Nelson6edbookindb 16 020414 1841 020414 1841 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 17 leico maleato no pH neutro do citoplasma é o isômero cis e o ácido fumárico fumarato o isômero trans cada um dos compostos é bem definido e eles podem ser separados um do outro cada um possuindo propriedades químicas únicas Um sítio de ligação p ex em uma enzima complementar a uma dessas moléculas não será complementar à outra o que explica por que esses dois compostos têm papéis biológicos distintos apesar de sua constituição química similar No segundo tipo de estereoisômeros os quatro diferentes substituintes ligados a um átomo de carbono tetraédrico po dem ser arranjados em duas formas espaciais distintas isto é têm duas configurações Figura 120 produzindo dois estereoisômeros com propriedades químicas semelhantes ou idênticas porém diferindo em certas propriedades físicas e biológicas Um átomo de carbono com quatro substituintes diferentes é considerado assimétrico e carbonos assimétricos são chamados de centros quirais do grego chiros mão alguns estereoisômeros estão estruturalmente relacionados da mesma forma que a mão direita está relacionada com a es querda Uma molécula com somente um carbono quiral pode ter dois estereoisômeros quando dois ou mais n carbonos quirais estão presentes então podem existir 2 n estereoisô meros Estereoisômeros que são imagens especulares um do outro são chamados de enantiômeros Figura 120 Pares de estereoisômeros que não são imagens especulares um do outro são chamados de diastereoisômeros Figura 121 Como Louis Pasteur pela primeira vez observou em 1843 Quadro 12 os enantiômeros têm reatividades químicas quase idênticas mas diferem em uma propriedade física bem característica sua interação com a luz polarizada Em Y Y C B a A Y A C X B A C B X X Imagem especular da molécula original Molécula quiral a molécula girada não pode ser sobreposta à sua imagem especular Molécula original Molécula não quiral a molécula girada pode ser sobreposta à sua imagem especular Imagem especular da molécula original Molécula original X A C X B X A C X B b X A C X B FIGURA 120 Assimetria molecular moléculas quirais e não qui rais a Quando um átomo de carbono tem quatro grupos substituintes diferentes A B X Y estes podem estar arranjados de duas maneiras que representam imagens especulares não sobreponíveis enantiômeros O áto mo de carbono assimétrico é chamado de átomo quiral ou centro quiral b Quando um carbono tetraédrico tem somente três grupos diferentes isto é o mesmo grupo ocorre duas vezes somente uma configuração é possível e a molécula é simétrica ou não quiral Neste caso a molécula tem sua ima gem superposta na imagem especular a molécula do lado esquerdo pode girar no sentido antihorário quando vista de cima para baixo na direção da ligação de A com C para formar a molécula vista no espelho C CH3 CH3 H C H X Y C CH3 CH3 X C Y H H C CH3 CH3 H C Y X H Y C CH3 CH3 H C X H Diastereoisômeros imagens não especulares Enantiômeros imagens especulares Enantiômeros imagens especulares FIGURA 121 Enantiômeros e diastereoisômeros Existem quatro dife rentes estereoisômeros de 23butanos dissubstituídos n 5 2 carbonos assi métricos consequentemente 2 n 5 4 estereoisômeros Cada um é mostrado em um retângulo com a fórmula em perspectiva e o modelo de esfera e bastão que foi girado para a visualização de todos os grupos Dois pares de estereoisômeros são imagens especulares um do outro ou enantiômeros Outros pares não são imagens especulares sendo diastereoisômeros Nelson6edbookindb 17 Nelson6edbookindb 17 020414 1841 020414 1841 18 DAVID L NELSON MICHAEL M COX soluções separadas dois enantiômeros giram o plano da luz polarizada em direções opostas mas uma solução contendo concentrações equimolares de cada enantiômero mistura racêmica mostra atividade óptica rotatória nula Compos tos sem centros quirais não causam a rotação do plano de polarização da luz planopolarizada CONVENÇÃOCHAVE Dada a importância da estereoquímica nas reações entre biomoléculas ver adiante os bioquími cos são obrigados a dar nome e a representar a estrutura de cada biomolécula de forma que sua estereoquímica seja inequívoca Para compostos com mais de um centro quiral a nomenclatura mais usada é a do sistema RS Nesse siste ma a cada grupo funcional ligado a um carbono quiral é de signada uma escala de prioridade As prioridades de alguns substituintes comuns são OCH3 OH NH2 COOH CHO CH2OH CH3 H Para nomeação no sistema RS o átomo quiral é visto com o grupo de mais baixa prioridade grupo 4 no diagrama se guinte apontando para trás da página a partir do observador Se a prioridade dos outros três grupos 1 a 3 decresce no sentido horário então a configuração é R do latim rectus direito se decresce no sentido antihorário então a confi guração é S do latim sinister esquerdo Dessa maneira cada carbono quiral é designado como R ou S e a inclu são dessas designações no nome do composto fornece descri ção inequívoca da estereoquímica de cada centro quiral 1 4 3 2 Sentido antihorário S 1 4 3 2 Sentido horário R Outro sistema de nomenclatura para estereoisômeros o sistema D e L é descrito no Capítulo 3 A molécula com um centro quiral único dois isômeros de gliceraldeído p ex pode ser nomeada por qualquer um dos sistemas QUADRO 12 Louis Pasteur e atividade óptica In Vino Veritas Louis Pasteur descobriu o fenômeno da atividade óptica em 1843 durante sua investigação sobre os sedimentos cristali nos que se acumulavam nos barris de vinho forma de ácido tartárico chamado de ácido paratartárico também chamado de ácido racêmico do latim racemus cacho de uvas Ele usou pinças finas para separar dois tipos de cristais idênticos em forma mas com imagem especular um do outro Ambos os tipos provaram ter todas as pro priedades químicas do ácido tartárico mas em solução um tipo gira a luz planopola rizada para a esquerda levorrotatório e o outro para a direita dextrorrotatório Posteriormente Pasteur descreveu o expe rimento e sua interpretação Em corpos isoméricos os elementos e as propor ções nas quais eles são combinados são os mes mos somente o arranjo dos átomos é diferente Sabese por um lado que os arranjos molecula res dos dois ácidos tartáricos são assimétricos e por outro lado que esses arranjos são abso lutamente idênticos exceto que exibem assime tria em direções opostas Estariam os átomos do ácido dextro agrupados em forma de espiral dextrógira Ou estariam dispostos nas arestas de um tetraedro irregular Ou estariam dispos tos em um ou outro arranjo assimétrico citado Não se sabe Agora se sabe Estudos de cristalogra fia por raios X em 1951 confirmaram que as formas levorrotatória e dextrorrotatória do ácido tartárico são imagens especulares uma da outra no nível molecular e estabele ceram a configuração absoluta de cada uma Figura Q1 A mesma abordagem foi usa da para demonstrar que embora o aminoá cido alanina tenha duas formas estereoiso méricas designadas D e L nas proteínas a alanina existe exclusivamente em uma forma o isômero L ver Capítulo 3 Da palestra de Pasteurs na Société Chimique de Paris em 1883 citado em DuBos R 1976 Louis Pasteur Free Lance of Science p 95 Charles Scribners Sons New York Louis Pasteur 18221895 C HOOC1 HO 2 C 3 C 4 O OH H OH H C HOOC1 H 2 C 3 C 4 OOH OH OH H 2R3RÁcido tartárico dextrorrotatório 2S3SÁcido tartárico levorrotatório FIGURA Q1 Pasteur separou cristais de dois estereoisômeros de ácido tartárico e mostrou que soluções separadas de cada uma das formas fazem girar luz polarizada na mesma magnitude porém em direções opostas Estas formas dextrorrotatória e levorrotatória foram mais tarde demonstradas como os isômeros RR e SS representados aqui O siste ma RS de nomenclatura é explicado no texto Nelson6edbookindb 18 Nelson6edbookindb 18 020414 1841 020414 1841 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 19 CH2OH CH2OH CHO CHO H H C HO OH LGliceraldeído SGliceraldeído 2 1 4 3 Já a conformação molecular é diferente da configuração molecular pois os grupos são livres para assumir diferentes posições no espaço sem quebrar nenhuma ligação por causa da liberdade de rotação em torno das ligações simples Em hidrocarbonetos simples como o etano por exemplo há qua se completa liberdade de rotação em torno da ligação CC Muitas conformações diferentes e interconversíveis de eta no são possíveis dependendo do grau de rotação Figura 122 Mas duas conformações são de especial interesse a escalonada que é mais estável do que todas as outras e por tanto a predominante e a eclipsada que é a menos estável Essas duas formas conformacionais não podem ser isoladas uma da outra pois são facilmente interconversíveis Entre tanto a substituição de um ou mais átomos de hidrogênio em cada carbono por um grupo funcional que seja muito grande ou carregado eletricamente restringe a liberdade de rotação em torno da ligação CC Isso limita o número de conforma ções estáveis do derivado do etano por exemplo As interações entre as biomoléculas são estereoespecíficas Quando biomoléculas interagem o encaixe entre elas tem de ser estereoquimicamente correto A estrutura tridimen sional de biomoléculas grandes e pequenas a combinação de configuração e conformação é de máxima importância nas suas interações biológicas reagente com sua enzima hormônio com seu receptor na superfície da célula e um an tígeno com seu anticorpo específico por exemplo Figura 123 O estudo da estereoquímica biomolecular com mé todos físicos precisos é uma parte importante da pesquisa moderna da estrutura celular e da função bioquímica Nos organismos vivos as moléculas quirais normalmente estão presentes em somente uma de suas formas quirais Por exemplo nas proteínas os aminoácidos ocorrem somente como isômeros L e a glicose ocorre somente como isômero D As convenções para a denominação de estereoisômeros de aminoácidos estão descritas no Capítulo 3 e para açúcares no Capítulo 7 O sistema RS descrito anteriormente é mais usado para algumas biomoléculas Em contrapartida quan do um composto com um átomo de carbono assimétrico é quimicamente sintetizado em laboratório então a reação em geral produz todas as formas quirais possíveis uma mistura de formas D e L por exemplo Células vivas produzem so mente uma forma quiral de uma dada biomolécula porque as enzimas que as sintetizam também são quirais Estereoespecificidade a capacidade de distinguir entre estereoisômeros é uma propriedade das enzimas e de ou tras proteínas sendo um aspecto característico da lógica molecular das células vivas Se o sítio de ligação de uma proteína é complementar a um isômero do composto qui ral então ele não será complementar ao outro isômero da mesma forma que a luva para a mão esquerda não se ajusta à mão direita Alguns exemplos marcantes da capacidade dos sistemas biológicos de distinguir estereoisômeros são mostrados na Figura 124 As classes comuns de reações químicas encontradas na bioquímica estão descritas no Capítulo 13 a título de intro dução às reações do metabolismo RESUMO 12 Fundamentos químicos c Devido a sua versatilidade de ligação o carbono pode produzir amplas coleções de estruturas carbonocar bono com uma grande variedade de grupos funcionais 0 60 120 180 240 300 360 0 4 8 12 Energia potencial kJmol Ângulo de torção graus 121 kJmol FIGURA 122 Conformações Muitas conformações do etano são possíveis devido à liberdade de rotação em torno da ligação CC No modelo de esfera e bastão quando o átomo de carbono frontal sob o ponto de vista do leitor é gi rado com seus três hidrogênios em relação ao átomo de carbono de trás então a energia potencial da molécula aumenta ao máximo na forma completamente eclipsada nos ângulos de 0 120 etc e depois diminui ao mínimo na forma totalmente escalonada ângulos de torção de 60 180 etc Devido ao fato de as diferenças de energia serem suficientemente pequenas para permitir uma interconversão muito rápida entre as duas formas milhões de vezes por segun do as formas eclipsada e escalonada não podem ser isoladas uma da outra FIGURA 123 Encaixe complementar entre a macromolécula e uma molécula pequena A molécula de glicose se encaixa em uma cavidade na superfície da enzima hexocinase PDB ID 3B8A e é mantida nesta orien tação por várias interações não covalentes entre a proteína e o açúcar Esta representação da molécula de hexocinase é produzida com o auxílio de um software que calcula a forma da superfície externa de uma macromolécula definida pelo raio de van der Waals de todos os átomos da molécula ou pelo método do volume de exclusão do solvente que é o volume onde uma molécula de água não consegue penetrar Nelson6edbookindb 19 Nelson6edbookindb 19 020414 1841 020414 1841 20 DAVID L NELSON MICHAEL M COX esses grupos conferem às biomoléculas as suas proprie dades químicas e biológicas c Um conjunto universal de aproximadamente mil molé culas pequenas é encontrado em células vivas a inter conversão dessas moléculas nas rotas metabólicas cen trais se conservou ao longo da evolução c Proteínas e ácidos nucleicos são polímeros lineares feitos de subunidades monoméricas simples suas sequências contêm as informações que fornecem a cada molécula sua estrutura tridimensional e suas funções biológicas c A configuração molecular pode ser alterada somente mediante quebra de ligações covalentes Para um átomo de carbono com quatro substituintes diferentes carbo no quiral os grupos substituintes podem ser arranjados em duas diferentes formas gerando estereoisômeros com propriedades distintas Somente um dos estereoi sômeros é biologicamente ativo A conformação mole cular é a disposição dos átomos no espaço que pode ser mudada por rotação em torno de ligações simples sem quebrar ligações covalentes c Interações entre moléculas biológicas são quase invaria velmente estereoespecíficas elas requerem um ajuste próximo entre as estruturas complementares das molé culas interagentes 13 Fundamentos físicos Células e organismos vivos precisam realizar trabalho para se manterem vivos e se reproduzir As reações de síntese que ocorrem dentro das células como processos de síntese em uma fábrica exigem o consumo de energia O consu mo de energia também é necessário para o movimento de uma bactéria de um velocista olímpico para o brilho de um vagalume ou para a descarga elétrica de um peixe elétrico O armazenamento e a expressão de informação requerem energia sem a qual estruturas ricas em informação inevita velmente se tornam desordenadas e sem sentido No curso da evolução as células desenvolveram me canismos altamente eficientes para aproveitar a energia obtida da luz solar ou de combustíveis químicos nos vários processos que requerem energia para ser realizados Um dos objetivos da bioquímica é compreender em termos químicos e quantitativos os meios pelos quais a energia é extraída armazenada e canalizada para trabalho útil nas cé FIGURA 124 Estereoisômeros têm dife rentes efeitos em humanos a Dois este reoisômeros de carvona Rcarvona isolado do óleo de hortelã têm o cheiro característico da hortelã Scarvona isolado do óleo de se mentes de cominho tem o cheiro de cominho b O aspartame adoçante artificial é facilmen te distinguível pelos receptores de gosto do seu estereoisômero de gosto amargo apesar de os dois diferirem apenas pela configuração de um dos seus dois carbonos quirais c O medi camento antidepressivo citalopram nome co mercial Celexa inibidor seletivo da recaptação da serotonina é uma mistura racêmica dos dois estereoisômeros mas somente Scitalopram tem efeito terapêutico A preparação estereo quimicamente pura de Scitalopram oxalato de citalopram é vendida sob o nome comer cial de Lexapro Como se pode prever a dose efetiva de Lexapro é a metade da dose efetiva de Celexa a H2C C CH3 C CH2 H CH2 C O C CH3 CH H2C C H C CH3 CH2 CH2 C O C CH3 CH RCarvona hortelã SCarvona cominho b C 2OOC CH2 C NH3 C O N H C H C O OCH3 2OOC CH2 C 1 H3 C O N H C H C O OCH3 HC C H CH HC C CH2 CH 1N HC C H CH HC C CH2 CH H H LAspartilLfenilalanina metil éster aspartame doce LAspartilDfenilalanina metil éster amargo O F N C N C N SCitalopram terapeuticamente ativo O F N RCitalopram terapeuticamente inativo c Nelson6edbookindb 20 Nelson6edbookindb 20 020414 1841 020414 1841 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 21 lulas vivas As conversões de energia celular como todas as outras conversões de energia podem ser estudadas no contexto das leis da termodinâmica Os organismos vivos existem em um estado estacionário dinâmico e nunca em equilíbrio com o seu meio As moléculas e os íons contidos nos organismos vivos dife rem em tipo e concentração daqueles existentes no meio circundante Um paramécio em uma lagoa um tubarão no oceano uma bactéria no solo uma macieira no pomar to dos são diferentes na composição se comparados com o seu meio e uma vez atingida a sua maturidade eles mantêm uma composição aproximadamente constante apesar das constantes alterações no meio onde se encontram Apesar de a composição característica de um organismo mudar relativamente pouco ao longo do tempo a popula ção de moléculas dentro de um organismo está muito longe do estado estático Pequenas moléculas macromoléculas e complexos supramoleculares são continuamente sintetiza dos e degradados em reações químicas que envolvem um constante fluxo de massa e energia pelo sistema As molé culas de hemoglobina que carregam oxigênio dos seus pul mões para o seu cérebro neste momento foram sintetizadas no decorrer do último mês no decorrer do próximo mês elas serão todas degradadas e completamente substituídas por novas moléculas de hemoglobina A glicose que você ingeriu na sua última refeição está agora circulando na sua corrente sanguínea antes do final do dia essas moléculas de glicose em particular estarão todas convertidas em algo diferente dióxido de carbono ou gordura talvez sendo substituídas por um novo suprimento de glicose de forma que a concen tração de glicose sanguínea é mais ou menos constante ao longo de todo o dia As quantidades de hemoglobina e glicose no sangue permanecem quase constantes porque a taxa de síntese ou ingestão de cada uma contrabalança a sua taxa de degradação consumo ou conversão em algum outro produto A constância da concentração é o resultado do estado esta cionário dinâmico um estado estacionário que está fora do equilíbrio A manutenção desse estado requer investimento constante de energia quando a célula não consegue mais ob ter energia ela morre e começa a decair para o estado de equilíbrio com o seu meio A seguir será discutido o significa do exato de estado estacionário e equilíbrio Os organismos transformam energia e matéria de seu meio Para as reações químicas que ocorrem em solução podese definir o sistema como todos os reagentes e produtos o sol vente que os contêm e a atmosfera imediata em resumo tudo dentro de uma região definida do espaço O sistema e o seu meio juntos constituem o universo Se o sistema não troca nem matéria nem energia com seu meio então é cha mado de isolado Se o sistema troca energia mas não troca matéria com seu meio então é fechado se ele troca energia e matéria com seu meio então ele é um sistema aberto Um organismo vivo é um sistema aberto ele troca tanto matéria quanto energia com seu meio Organismos obtêm energia do meio de duas formas 1 absorvendo combus tíveis químicos como glicose do seu meio e extraindo energia pela oxidação desses combustíveis ver Quadro 13 Caso 2 ou 2 absorvendo energia da luz solar A primeira lei da termodinâmica descreve o princípio da conversão de energia em qualquer mudança física ou quí mica a quantidade total de energia no universo perma nece constante embora a forma da energia possa mudar Isso significa que quando a energia é usada pelo sistema ela não é gasta mas convertida de uma forma em outra por exemplo da energia potencial das ligações químicas em energia cinética de calor e movimento As células contêm sofisticados processos conversores de energia capazes de interconverter energia química eletromagnética mecânica e osmótica entre si com alta eficiência Figura 125 a b c d e Transfor mações de energia realizam trabalho Energia potencial Nutrientes do meio moléculas complexas como açúcares e gorduras Luz solar Transformações químicas dentro das células Trabalho celular síntese química trabalho mecânico gradientes elétrico e osmótico produção de luz transferência de informação genética Calor Desordem entropia aumentada no meio 22 O metabolismo produz compostos mais simples do que as moléculas combustíveis iniciais CO2 NH3 H2O HPO4 Desordem entropia diminuída no sistema Compostos simples polimerizam para formar macromoléculas ricas em informação DNA RNA proteínas FIGURA 125 Algumas interconversões de energia em organismos vivos À medida que a energia metabólica é gasta para realizar o trabalho celular o grau de desordem do sistema mais o do meio externo expresso quantitativamente como entropia cresce à medida que a energia potencial das moléculas nutrientes complexas decresce a Organismos vivos extraem energia do seu meio b convertem parte dela em formas de energia utilizá veis para produzir trabalho c devolvem parte da energia ao meio na forma de calor e d liberam como produto final moléculas que são menos orga nizadas do que o combustível de partida aumentando a entropia do univer so Um efeito de todas estas transformações é e o aumento da ordem alea toriedade diminuída do sistema na forma de macromoléculas complexas O tratamento quantitativo da entropia será retomado no Capítulo 13 Nelson6edbookindb 21 Nelson6edbookindb 21 020414 1841 020414 1841 22 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O fluxo de elétrons fornece energia aos organismos Praticamente todos os organismos vivos obtêm sua energia direta ou indiretamente da energia radiante da luz solar Nos fotoautotróficos a ruptura da molécula da água promo vida pela luz durante a fotossíntese libera seus elétrons para a redução do CO2 e a liberação de oxigênio na atmosfera luz redução do CO2 mediada pela luz Organismos não fotossintéticos quimiotróficos obtêm a energia que necessitam da oxidação de produtos ricos em energia armazenados em plantas e resultantes da fotossín tese passando então os elétrons adquiridos ao O2 atmosfé rico para formar água CO2 e outros produtos finais que são reciclados no meio ambiente energia oxidação da glicose produtora de energia Portanto autótrofos e heterótrofos participam do ciclo global de O2 e CO2 propulsionado em última instância pela luz solar tornando esses dois grandes grupos de organis mos interdependentes Praticamente toda a transdução de energia nas células pode ser relacionada a esse fluxo de elétrons de uma molécula a outra onde a energia po tencial eletroquímica escorrega de um potencial eletro químico mais alto para um mais baixo de forma análoga ao fluxo de elétrons em um circuito elétrico acionado por uma pilha Todas essas reações envolvidas no fluxo de elé trons são reações de oxirredução um reagente é oxida do perda de elétrons enquanto outro é reduzido ganho de elétrons Criar e manter ordem requer trabalho e energia Como destacado DNA RNA e proteínas são macromolécu las de informação a sequência exata de suas subunidades monoméricas contém informação tal como as letras desta frase Além de usar energia química para formar ligações covalentes entre essas subunidades as células precisam in vestir energia para ordenar as subunidades em sua sequên cia correta É extremamente improvável que aminoácidos em uma mistura venham a se condensar espontaneamente em um único tipo de proteína com uma sequência única Isso representa aumento da ordem em uma população de moléculas contudo de acordo com a segunda lei da termo O termo entropia que literalmente significa mudan ça em seu interior foi usado pela primeira vez em 1851 por Rudolf Clausius um dos formuladores da segunda lei da termodinâmica Uma definição quantitativa rigorosa de entropia envolve considerações probabilísticas e es tatísticas Entretanto sua natureza pode ser ilustrada qualitativamente por três exemplos simples cada um demonstrando um aspecto da entropia A chave para a descrição de entropia é a aleatoriedade e a desordem manifestadas de diferentes maneiras Caso 1 A chaleira e a dissipação do calor Sabese que o vapor gerado na água em ebulição pode realizar trabalho útil Contudo suponha que a chama sob a chaleira cheia de água a 100C sistema seja apagada na cozinha o meio À medida que a água da chaleira esfria nenhum trabalho é feito mas o calor passa da chaleira para o meio aumentando a tempera tura do meio cozinha por uma quantidade infinitesi mal até que o equilíbrio completo é alcançado Nesse momento todas as partes da chaleira e da cozinha estão precisamente na mesma temperatura A energia livre que estava concentrada na chaleira com água a 100C potencialmente capaz de realizar trabalho desapare ceu O seu equivalente de energia calorífica continua presente na chaleira 1 cozinha ie universo mas tornouse completamente aleatório Essa energia não está mais disponível para realizar trabalho porque não existem mais diferenças de temperatura dentro da co zinha Além disso o aumento da entropia da cozinha o meio é irreversível Sabese pela experiência do coti diano que o calor nunca passa espontaneamente da co zinha de volta para a chaleira para aumentar novamente a temperatura da água a 100C Caso 2 A oxidação da glicose Entropia é um estado não somente da energia mas da matéria Organismos aeróbios heterotróficos extraem energia livre da glicose obtida do meio pela oxidação da glicose com O2 que também é obtido do meio Os produ tos finais desse metabolismo oxidativo CO2 e H2O retor nam ao meio Nesse processo o meio sofre um aumento de entropia enquanto o organismo permanece em estado estacionário e não sofre mudanças em sua ordem interna Apesar de alguma entropia surgir da dissipação do calor a entropia resulta também de outro tipo de desordem ilustrado pela equação da oxidação da glicose C6H12O6 1 6O2 S 6CO2 1 6H2O Podese representar isto esquematicamente como 7 moléculas CO2 gás H2O líquido Glicose sólido O2 gás 12 moléculas QUADRO 13 Entropia as vantagens de ser desorganizado Nelson6edbookindb 22 Nelson6edbookindb 22 020414 1841 020414 1841 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 23 dinâmica a tendência na natureza é moverse no sentido oposto sempre de maior desordem no universo a entro pia total do universo está continuamente aumentando Para sintetizar macromoléculas a partir de suas unidades monoméricas energia livre precisa ser injetada no sistema neste caso a célula CONVENÇÃOCHAVE A aleatoriedade ou a desordem dos com ponentes de um sistema químico é expressa como entro pia S Quadro 13 Qualquer alteração na aleatoriedade do sistema é expressa como variação de entropia DS que por convenção possui um sinal positivo quando a aleatoriedade aumenta J Willard Gibbs que desenvolveu a teoria da varia ção de energia durante as rea ções químicas demonstrou que a energia livre total G de qualquer sistema fechado pode ser definida em termos de três quantidades entalpia H que expressa o número e os tipos de ligações entropia S e a tempe ratura absoluta T em Kelvin A definição de energia livre é G 5 H TS Quando uma reação química ocorre a uma temperatura constante a va riação da energia livre DG é determinada pela variação da entalpia DH refletindo o tipo e o número das ligações químicas e a formação e a quebra de interações não cova lentes e a variação da entropia DS que descreve a variação da aleatoriedade do sistema DG 5 DH TDS onde por definição DH é negativo para uma reação que libera calor reação exotérmica DH é positivo para uma reação que absorve calor reação endotérmica e DS é posi tivo para uma reação que aumenta a aleatoriedade do siste ma diminui a ordem Um processo tende a ocorrer espontaneamente somen te se DG for negativo se energia livre é liberada no proces so Já o funcionamento da célula depende basicamente de moléculas como proteínas e ácidos nucleicos para as quais a energia livre de formação é positiva as moléculas são me nos estáveis e mais altamente ordenadas do que a mistura de seus componentes monoméricos Para que essas rea ções consumidoras de energia endergônicas e portan to termodinamicamente desfavoráveis ocorram as células as acoplam a outras reações que liberam energia reações J Willard Gibbs 18391903 Os átomos contidos em 1 molécula de glicose mais 6 moléculas de oxigênio um total de 7 moléculas passam a ficar dispersos de forma mais aleatória após a reação de oxidação passando para um total de 12 moléculas 6CO2 1 6H2O Sempre que uma reação química resultar no aumen to do número de moléculas ou quando uma substância sólida é convertida em produtos líquidos ou gasosos que permitem maior liberdade de movimentação molecular que os sólidos a desordem molecular aumenta e em consequência a entropia também aumenta Caso 3 Informação e entropia A seguinte fala da peça Júlio Cesar ato IV Cena 3 é enunciada por Brutus quando ele percebe que precisa enfrentar o exército de Marco Antônio Ela é um arranjo não aleatório e rico em informações feito de 125 letras do alfabeto inglês There is a tide in the affairs of men Which taken at the flood leads on to fortune Omitted all the voyage of their life Is bound in shallows and in miseries Além do que esse trecho afirma abertamente carrega mui tos significados ocultos não somente refletindo uma com plexa sequência de eventos na peça mas também ecoando as ideias da peça sobre conflito ambição e a demanda por liderança Permeada com a compreensão de Shakespeare sobre a natureza humana ela é muito rica em informação a b c d e f g h i I k l m n o O r a d e f h i l m n o r a d e f h i l m n o r a d e f h i l n o r a d e f h i l n o r a d e f h i l n o a e f h i l n o a e h i n o a e i n o a e i o e i e i e e e e s t T u v w W y u s t s t s t s t s t s t s t t t t Contudo se essas 125 letras que fazem essa citação forem distribuídas em um padrão completamente aleató rio e caótico como mostrado no quadro acima elas não terão qualquer significado Assim as 125 letras contêm pouca ou nenhuma in formação mas são muito ricas em entropia Tais con siderações levaram à conclusão de que a informação é uma forma de energia tendo sido denominada entropia negativa De fato o ramo da matemática denominado teoria da informação que é básico para a programação lógica de computadores está intimamente relacionado à teoria termodinâmica Organismos vivos são estruturas altamente organizadas não aleatórias imensamente ri cas em informação e portanto pobres em entropia Nelson6edbookindb 23 Nelson6edbookindb 23 020414 1841 020414 1841 24 DAVID L NELSON MICHAEL M COX exergônicas de forma que o processo como um todo é exergônico a soma da variação da energia livre é negativa A fonte costumeira de energia livre em reações bioló gicas acopladas é a energia liberada pela quebra de fato hidrólise das ligações fosfoanidrido como aquelas presen tes no trifosfato de adenosina ATP Figura 126 e no tri fosfato de guanosina GTP Aqui cada P representa um grupo fosforila Aminoácidos S proteínas DG1 é positiva endergônica ATP S AMP 1 DG2 negativa exergônica ou ATP S ADP 1 Quando essas reações estão acopladas então a soma de DG1 com DG2 é negativa o processo como um todo é exer gônico Por esta estratégia de acoplamento as células con seguem sintetizar e manter os polímeros ricos em informa ção essenciais para a vida Reações com ligações de acoplamento energético na biologia A questão central em bioenergética estudo da transfor mação de energia em sistemas vivos é o meio através do qual a energia do metabolismo energético ou da captura de luz é acoplada às reações celulares que requerem energia Ao pensar em acoplamento energético é útil considerar um exemplo mecânico simples como mostra a Figura 127a Um objeto no topo de um plano inclinado tem certa quan tidade de energia potencial como consequência de sua ele vação Ele tende a deslizar para baixo ao longo do plano perdendo sua energia potencial de posição à medida que FIGURA 126 O trifosfato de adenosina ATP fornece energia Aqui cada P representa um grupo fosforila A remo ção do grupo fosforila terminal sombreado em cor salmão do ATP pela quebra da ligação fosfoanidrido para gerar difosfato de adenosina ADP e o íon fosfato inorgânico HPO4 2 é alta mente exergônica essa reação costuma ser acoplada a várias reações endergônicas nas células como no exemplo da Figura 127b O ATP também fornece energia para vários processos celulares pela clivagem que libera os dois fosfatos terminais re sultando em pirofosfato inorgânico H2P2O7 2 frequentemente abreviado como PPi P P P Adenosina Trifosfato de adenosina ATP 2O P O2 O O P O2 O O P O2 O O CH2 OH O H OH H H H HC CH NH2 C N C N N N Fosfafo inorgânico Pi O 1 OH P P Adenosina Difosfato de adenosina ADP 2 P O O 2 Pirofosfato inorgânico PPi 1 O P OH O P Adenosina Monofosfato de adenosina AMP 2 P O O 2 OH O FIGURA 127 Acoplamento energético em processos químicos e me cânicos a O movimento de queda de um objeto libera energia potencial que pode realizar trabalho mecânico A energia potencial disponibilizada pelo movimento de queda espontânea no processo exergônico vermelho pode ser acoplada ao processo endergônico representado pelo movimento ascendente de um segundo objeto azul b Na reação 1 a formação de glicose6fosfato a partir da glicose e do fosfato inorgânico Pi gera um pro duto com conteúdo energético maior que o dos reagentes Para esta reação endergônica DG é positivo Na reação 2 a quebra exergônica do trifosfato de adenosina ATP tem uma grande variação negativa de energia livre DG2 A terceira reação é a soma das reações 1 e 2 e a variação da energia livre DG3 é a soma aritmética de DG1 e DG2 Pelo fato de DG3 ser negativo o processo como um todo é exergônico e ocorre espontaneamente Trabalho realizado ao levantar o objeto Perda de energia potencial de posição DG 0 DG 0 b Exemplo químico a Exemplo mecânico Exergônico Endergônico Energia livre G Reação coordenada Reação 1 glicose 1 Pi glicose6fosfato Reação 2 ATP ADP 1 Pi Reação 3 glicose 1 ATP glicose6fosfato 1 ADP DG1 DG2 DG3 DG3 DG1 1 DG2 Nelson6edbookindb 24 Nelson6edbookindb 24 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 25 se aproxima do solo Quando um mecanismo com corda de puxar apropriado acopla o objeto em queda a outro menor então o movimento de deslize espontâneo do maior pode levantar o menor realizando certa quantidade de trabalho A quantidade de energia disponível para realizar trabalho é a variação de energia livre DG sendo sempre um pouco menor do que a quantidade teórica de energia liberada por que um pouco de energia é dissipado como calor decorren te do atrito Quanto maior a elevação de um objeto grande maior será a energia liberada DG com o deslizamento e maior a quantidade de trabalho que poderá ser realizado O objeto grande pode levantar o menor somente porque no início o objeto grande estava longe da sua posição de equilíbrio ele foi em algum momento anterior elevado acima do solo processo que precisou da injeção de energia Como isso se aplica às reações químicas Em sistemas fechados as reações químicas ocorrem espontaneamente até que o equilíbrio seja alcançado Quando um sistema está em equilíbrio a taxa de formação de produtos se igua la exatamente à taxa na qual os produtos são convertidos em reagentes Portanto não existe uma variação líquida na concentração de reagentes e produtos Quando um sistema se move do estado inicial ao estado de equilíbrio então a variação de energia é dada pela variação de energia livre DG quando não existe variação de temperatura ou pressão A magnitude de DG depende da reação química em particu lar e o quão longe do equilíbrio o sistema inicialmente estava Cada composto envolvido em uma reação química contém certa quantidade de energia potencial relaciona da ao tipo e ao número das suas ligações Nas reações que ocorrem espontaneamente os produtos têm menos energia livre que os reagentes portanto a reação libera energia li vre que por sua vez está disponível para realizar trabalho Essas reações são exergônicas ou exotérmicas o declínio na energia livre dos reagentes para os produtos é expresso como um valor negativo Reações endergônicas ou endo térmicas requerem uma injeção de energia e seus valores de DG são positivos Assim como no processo mecânico so mente parte da energia liberada na reação química exergô nica pode ser utilizada para realizar trabalho Em sistemas vivos parte da energia é dissipada como calor ou perdida como incremento de entropia Keq e DG são medidas da tendência das reações ocorrerem espontaneamente A tendência de uma reação química em se completar pode ser expressa como uma constante de equilíbrio Para uma reação na qual uma quantidade de a mols de A reagem com b mols de B para dar c mols de C e d mols de D aA 1 bB cC 1 dD a constante de equilíbrio Keq é dada por onde Aeq é a concentração de A Beq é a concentração de B e assim por diante quando o sistema alcançou o equi líbrio Um grande valor de Keq significa que a reação tende a prosseguir até que os reagentes estejam quase completa mente convertidos nos produtos PROBLEMA RESOLVIDO 11 ATP e ADP estão em equilíbrio nas células A constante de equilíbrio Keq para a reação seguinte é de 2 3 10 5 M ATP ADP 1 HPO4 2 Se as concentrações celulares medidas são ATP 5 5 mM ATP 5 05 mM e Pi 5 5 mM então estaria esta reação em equilíbrio na célula Solução A definição de constante de equilíbrio para esta rea ção é Keq 5 ADP PiATP Das concentrações celulares medidas e dadas acima pode se calcular a razão ação das massas Q Q 5 ADPPiATP 5 05 mM 3 5 mM 5 mM 5 05 mM 5 5 3 10 4 M Este valor está bem longe da constante de equilíbrio para a reação 2 3 10 5 M portanto a reação está muito longe do equilíbrio nas células ATP está muito alto e ADP muito abaixo do esperado para o equilíbrio Como pode uma célula manter a razão ATPADP tão longe do equilíbrio Ela o faz mediante a contínua extração de energia de nutrientes como glicose e a utilizando para fazer ATP a partir de ADP e Pi PROBLEMA RESOLVIDO 12 A reação de hexocinase está em equilíbrio nas células Para a reação catalisada pela enzima hexocinase temse Glicose 1 ATP glicose6fosfato 1 ADP A constante de equilíbrio Keq é 78 3 10 2 Em células de E coli vivas ATP 5 5 mM ADP 5 05 mM glicose 5 2 mM e glicose6fosfato 5 1 mM A reação está em equilíbrio em E coli Solução No equilíbrio Keq 5 78 3 10 2 5 ADPglicose6fosfatoATPglicose Em células vivas ADPglicose6fosfatoATPglicose 5 05 mM 3 1 mM 5 mM 3 2 mM 5 005 A reação está portanto afastada do equilíbrio a concentração celular dos produtos glicose6fosfato e ADP está muito mais baixa que o esperado no equilíbrio e a dos reagentes muito mais alta Logo a reação tende fortemente a se deslocar à direita Gibbs mostrou que DG a variação da energia livre para qualquer reação química é uma função da variação da ener gia livre padrão DG constante característica de cada reação específica e um termo que expressa a concentra ção inicial de reagentes e produtos 11 onde Ai é a concentração inicial de A e assim por diante R é a constante dos gases e T é a temperatura absoluta Nelson6edbookindb 25 Nelson6edbookindb 25 020414 1842 020414 1842 26 DAVID L NELSON MICHAEL M COX DG é uma medida da distância de um sistema da sua posição de equilíbrio Quando uma reação já alcançou o equilíbrio nenhuma força permanece e não consegue mais realizar trabalho DG 5 0 Para este caso especial Ai 5 Aeq e assim por diante para todos os reagentes e produtos e Substituindo DG por 0 e Ci cDi dAi a Bi b por Keq na Equação 11 obtémse a relação DG 5 RT ln Keq da qual podese ver que DG é simplesmente uma segunda maneira além de Keq de expressar a força de condução de uma reação Pelo fato de Keq poder ser experimentalmente medido então DG que é a constante termodinâmica ca racterística de cada reação pode ser determinada As unidades de DG e DG são joules por mol ou calo rias por mol Quando Keq 1 DG é maior em módulo e negativo quando Keq 1 então DG é maior e positivo A partir de uma tabela de valores tanto de Keq ou DG de terminados experimentalmente podese ver quais reações tendem a se completar e quais não Um cuidado deve ser tomado a respeito da interpreta ção de DG constantes termodinâmicas como estas indi cam onde o equilíbrio final de uma reação se encontra mas não com que rapidez esse equilíbrio vai ser alcançado As velocidades das reações são governadas pelos parâmetros cinéticos tópico que será considerado em detalhes no Ca pítulo 6 Nos organismos biológicos como no exemplo matemá tico da Figura 127a uma reação exergônica pode ser aco plada a uma reação endergônica para empurrar reações que seriam desfavoráveis A Figura 127b tipo de gráfico cha mado de diagrama de coordenada da reação ilustra esse princípio para a conversão da glicose em glicose6fosfato o primeiro passo da rota da oxidação da glicose A forma mais simples de produzir glicose6fosfato seria Reação 1 Glicose 1 Pi glicose6fosfato endergônica DG1 é positivo Aqui Pi é uma abreviação para fosfato inorgânico HPO4 2 Não se preocupe com a estrutura desses compostos agora pois serão descritos em detalhe adiante neste livro Essa reação não ocorre espontaneamente DG1 é positivo Uma segunda reação muito exergônica pode ocorrer em todas as células Reação 2 ATP ADP 1 Pi exergônica DG2 é negativo Essas duas reações químicas compartilham um intermediá rio comum Pi o qual é consumido na reação 1 e produzido na reação 2 Portanto as duas reações podem ser acopladas na forma de uma terceira reação que pode ser escrita como a soma das reações 1 e 2 com o intermediário comum Pi omitido de ambos os lados da equação Reação 3 Glicose 1 ATP glicose6fosfato 1 ADP Pelo fato de mais energia ser liberada na reação 2 do que é consumida na reação 1 a energia livre para a reação 3 DG3 é negativo e a síntese de glicose6fosfato pode consequen temente ocorrer na reação 3 PROBLEMA RESOLVIDO 13 As variações de energia livre são aditivas Dado que a variação da energia padrão para a reação glicose 1 Pi glicose6fosfato é 138 kJmol e que a variação da energia livre padrão da reação ATP ADP 1 Pi é 305 kJmol qual é a variação da energia livre para a reação gli cose 1 ATP glicose6fosfato 1 ADP Solução É possível escrever a equação para esta reação como a soma de duas outras reações 1 Glicose 1 Pi glicose 6fosfato DG1 5 138 kJmol 2 ATP ADP 1 Pi DG2 5 305 kJmol Soma Glicose 1 ATP S glicose6fosfato 1 ADP DGsoma 5 167 kJmol A variação da energia livre padrão de duas reações que se somam resultando em uma terceira é simplesmente a soma das duas reações individuais Um valor negativo para DG 167 kJmol indica que a reação tende a ocorrer espon taneamente O acoplamento de reações exergônicas e endergôni cas por meio de um intermediário comum é central nas trocas de energia nos sistemas vivos Como será visto reações que quebram ATP como a reação 2 da Figura 127b liberam energia que impelem muitos processos endergônicos nas células A quebra de ATP nas células é exergônica porque todos os seres vivos mantêm a con centração do ATP bem acima da sua concentração de equilíbrio É este desequilíbrio que permite ao ATP servir como principal carregador de energia nas células Como será visto em mais detalhes no Capítulo 13 não é a mera quebra de ATP que fornece energia para realizar as reações endergônicas em vez disso é a transferência do grupo fosforila do ATP para outra pequena molécula glicose no caso acima que conserva uma parte da ener gia potencial original no ATP PROBLEMA RESOLVIDO 14 O custo energético da síntese de ATP Se a constante de equilíbrio Keq para a reação ATP ADP 1 Pi é 222 3 10 5 M calcule a variação da energia livre padrão DG para a síntese de ATP a partir de ADP e Pi a 25 C Solução Primeiro calcule DG para a reação acima DG 5 RT ln Keq 5 8315 Jmol K298 Kln 222 3 10 5 5 305 kJmol Nelson6edbookindb 26 Nelson6edbookindb 26 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 27 Essa é a variação da energia livre padrão para a quebra de ATP em ADP e Pi A variação da energia livre padrão para a reação inversa tem o mesmo valor absoluto mas de si nal contrário A variação da energia livre padrão para o in verso da reação apresentada é portanto 305 kJmol Por tanto para sintetizar 1 mol de ATP sob condições normais 25 C concentração 1 M de ATP ADP e Pi no mínimo 305 kJ de energia deve ser fornecida De fato a variação de energia livre nas células aproximadamente 50 kJmol é maior do que isso porque as concentrações de ATP ADP e Pi nas células não são o padrão 1 M ver Problema Resolvido 132 p 519 PROBLEMA RESOLVIDO 15 Variação da energia livre padrão para a síntese de glicose6fosfato Qual é a variação da energia livre padrão DG sob con dições fisiológicas E coli cresce no intestino humano à 27C para a reação seguinte Glicose 1 ATP glicose6fosfato 1 ADP Solução Temse a relação DG 5 RT ln Keq e o valor de Keq para esta reação 78 3 10 2 Substituindo os valores de R T e Keq na equação resulta DG 5 8315 J mol K310 Kln 78 3 10 2 5 17 kJmol Note que esse valor é levemente diferente daquele do Pro blema Resolvido 13 Naquele cálculo assumiuse uma tem peratura de 25C 298 K ao passo que neste cálculo foi utilizada a temperatura fisiológica de 37C 310 K As enzimas promovem sequências de reações químicas Todas as macromoléculas biológicas são muito menos es táveis termodinamicamente se comparadas com suas uni dades monoméricas mas mesmo assim elas são cinetica mente estáveis suas quebras não catalisadas ocorrem tão lentamente ao longo de anos em vez de segundos que em uma escala de tempo típica de organismos vivos essas moléculas podem ser consideradas estáveis Praticamente todas as reações químicas das células ocorrem em uma taxa significativa somente quando na presença das enzimas biocatalisadores que como todos os outros catalisadores aumentam bastante a velocidade de reações químicas espe cíficas sem contudo serem consumidos no processo O caminho de reagentes a produtos invariavelmen te envolve uma barreira energética chamada de potencial de ativação Figura 128 que precisa ser superada para que alguma reação ocorra A quebra de ligações existen tes e a formação de novas geralmente requer em primeiro lugar a modificação das ligações existentes para criar um estado de transição que tem energia livre maior que a dos reagentes ou produtos O ponto mais alto no diagrama da coordenada de reação representa o estado de transi ção e a diferença de energia entre o reagente no seu esta do fundamental e em seu estado de transição consiste na energia de ativação DG Uma enzima catalisa a reação ao prover uma acomodação mais confortável ao estado de transição uma superfície que complementa o estado de transição em sua estereoquímica polaridade e carga A li gação da enzima ao estado de transição é exergônica e a energia liberada por essa ligação reduz a energia de ativa ção para a reação aumentando muito por consequência a sua velocidade Uma contribuição adicional à catálise ocorre quando dois ou mais reagentes se ligam à superfície da enzima pró ximos um do outro e em uma orientação estereoespecífica que favorece a reação Isso aumenta em várias ordens de grandeza a probabilidade de colisões produtivas entre rea gentes Como resultado desses fatores somados com vários outros discutidos no Capítulo 6 as reações catalisadas por enzimas normalmente ocorrem a velocidades 10 12 vezes mais rápidas que reações não catalisadas Isso é um trilhão de vezes mais rápido Catalisadores celulares são com algumas raras exce ções proteínas Algumas moléculas de RNA têm atividade enzimática como discutido nos Capítulos 26 e 27 Nova mente com algumas exceções cada enzima catalisa uma reação específica e cada reação no interior da célula é ca talisada por uma enzima diferente Portanto milhares de enzimas diferentes são necessárias em cada célula A mul tiplicidade de enzimas sua especificidade capacidade de diferenciar os reagentes uns dos outros e sua suscetibili dade de regulação dão às células a capacidade de diminuir seletivamente os potenciais de ativação Essa seletividade é crucial para a regulação efetiva dos processos celulares Ao permitir que reações específicas ocorram a velocidades significativas em momentos específicos as enzimas deter minam como a matéria e a energia são canalizadas nas ati vidades celulares Energia livre G Barreira de ativação estado de transição Reagentes A Produtos B não cat DG cat DG DG Coordenada da reação A B FIGURA 128 A energia se altera durante uma reação química Uma barreira de potencial também chamada de barreira de ativação represen tando o estado de transição ver Capítulo 6 precisa ser superada na con versão dos reagentes A nos produtos B mesmo que os produtos sejam mais estáveis do que os reagentes como indicado por uma variação grande e negativa da energia livre DG A energia necessária para transpor a barreira de potencial é chamada de energia de ativação DG As enzimas catalisam as reações diminuindo as barreiras de potencial Elas se ligam fortemente aos intermediários dos estados de transição e a energia de ligação desta interação efetivamente reduz a energia de ativação de DG não cat curva azul para DG cat curva vermelha Observe que a energia de ativação não está relacionada à variação da energia livre DG Nelson6edbookindb 27 Nelson6edbookindb 27 020414 1842 020414 1842 28 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os milhares de reações químicas catalisadas por enzi mas nas células são organizadas funcionalmente em muitas sequências de reações consecutivas chamadas de rotas nas quais o produto de uma reação se torna o reagente da seguinte Algumas rotas degradam nutrientes orgânicos em produtos finais simples para poder extrair energia química e convertêla em formas úteis à célula o conjunto dessas rea ções degradativas e produtoras de energia livre é designado catabolismo A energia liberada pelas reações catabólicas promove a síntese de ATP Como resultado a concentra ção celular de ATP está bem acima da sua concentração de equilíbrio de modo que o DG para quebra de ATP é grande e negativo Similarmente o catabolismo resulta na produ ção de carreadores de elétrons reduzidos NADH e NADPH ambos podendo doar elétrons em processos que geram ATP ou conduzir etapas redutoras em rotas biossintéticas Outras rotas iniciam com moléculas precursoras peque nas e as convertem progressivamente em moléculas maio res e mais complexas incluindo proteínas e ácidos nuclei cos Tais rotas sintéticas que invariavelmente requerem injeção de energia são coletivamente designadas anabolis mo O conjunto de redes de rotas catalisadas por enzimas tanto as catabólicas quanto as anabólicas constituem o me tabolismo celular O ATP e os nucleosídeos trifosfatados energicamente equivalentes trifosfato de cistidina CTP trifosfato de uridina UTP e trifosfato de guanosina GTP é o elo entre os componentes catabólicos e anabólicos dessa rede mostrado esquematicamente na Figura 129 As ro tas das reações catalisadas por enzimas que atuam sobre os principais constituintes das células proteínas gorduras açúcares e ácidos nucleicos são praticamente idênticas em todos os organismos vivos O metabolismo é regulado para obter equilíbrio e economia As células vivas não só sintetizam de forma simultânea mi lhares de tipos diferentes de carboidratos gorduras pro teínas e moléculas de ácidos nucleicos e suas subunidades mais simples como o fazem nas exatas proporções reque ridas pela célula sob uma dada circunstância Por exemplo durante o rápido crescimento celular os precursores de pro teínas e ácidos nucleicos devem ser feitos em grandes quan tidades ao passo que em células que não estão crescendo a demanda por esses precursores é muito menor As enzimas chave em cada rota metabólica são reguladas de modo que cada tipo de molécula precursora seja produzido na quan tidade apropriada às demandas momentâneas das células Considere por exemplo a rota que leva à síntese do ami noácido isoleucina um constituinte das proteínas em E coli A rota tem cinco passos catalisados por cinco enzimas dife rentes A a F representam os intermediários da rota A B C D E F Treonina Isoleucina Enzima 1 Se uma célula começa a produzir mais isoleucina do que ela necessita para a síntese de proteínas então a isoleu cina não usada se acumula e o acréscimo de sua concen tração inibe a atividade catalítica da primeira enzima da rota causando a imediata desaceleração da produção de isoleucina Essa retroalimentação inibitória mantém a produção e a utilização de cada intermediário em equilí brio ao longo do livro será usado para indicar inibição da reação enzimática Apesar de o conceito de rota discreta ser uma ferra menta importante para organizar o conhecimento do me tabolismo ele é muito simplificado Existem milhares de Trabalho osmótico Nutrientes armazenados Alimentos ingeridos Fótons do sol Demais tra balhos celulares Biomoléculas complexas Trabalho mecânico H2O NH3 CO2 P r o d ut os s im ple s pr ec ur s o r e s Rotas das reações catabólicas exergônicas Rotas das reações anabólicas endergônicas NADP1 ATP NADPH ADP FIGURA 129 O papel central do ATP e do NADPH no metabolismo O ATP é o intermediário químico compartilhado que conecta os proces sos celulares consumidores e fornecedores de energia Seu papel na cé lula é análogo ao do dinheiro na economia ele é produzidoadquirido nas reações exergônicas e gastoconsumido nas endergônicas O NADP H adenina nicotinamida dinucleotídeo fosfato é um cofator carreador de elétrons que capta elétrons de reações oxidativas e então os doa em uma ampla gama de reações de redução na biossíntese Esses cofatores essenciais às reações anabólicas presentes em concentrações relativa mente baixas precisam ser constantemente regenerados pelas reações catabólicas Nelson6edbookindb 28 Nelson6edbookindb 28 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 29 metabólitos intermediários na célula muitos dos quais fazem parte de mais de uma rota O metabolismo seria mais bem representado por uma rede de rotas interconec tadas e interdependentes A mudança na concentração de qualquer metabólito dá início a um efeito de ondulação influenciando o fluxo de materiais pelas outras rotas A tarefa de compreender essas complexas interações entre intermediários e rotas em termos quantitativos é desen corajadora mas a nova ênfase em biologia de sistemas discutida no Capítulo 15 começou a oferecer uma impor tante compreensão da regulação global do metabolismo As células regulam também a síntese de seus próprios catalisadores as enzimas em resposta ao aumento ou à di minuição da necessidade de um produto metabólito esse é o conteúdo do Capítulo 28 A expressão de genes a tradu ção da informação contida no DNA em proteínas ativas na célula e a síntese de enzimas são outros níveis de controle metabólico na célula Todos os níveis devem ser levados em conta na descrição do controle global do metabolismo celular RESUMO 13 Fundamentos físicos c Células vivas são sistemas abertos que trocam matéria e energia com o meio externo extraindo e canalizando energia para manterse no estado estacionário dinâmico longe do equilíbrio Energia é obtida do sol ou de com bustíveis químicos pela conversão da energia do fluxo de elétrons em ligações químicas no ATP c A tendência de uma reação química em prosseguir em direção ao equilíbrio pode ser expressa como função da energia livre DG que tem dois componentes a va riação da entalpia DH e a variação da entropia DS Essas variáveis estão relacionadas pela equação DG 5 DH T DS c Quando o DG de uma reação é negativo a reação é exer gônica e tende a caminhar para sua conclusão quando DG é positivo a reação é endergônica e tende a ir na di reção oposta Quando duas reações podem ser somadas para produzir uma terceira o DG da reação global é a soma dos DGs das duas reações separadas c As reações que convertem ATP em Pi e ADP ou em AMP e PPi são altamente exergônicas DG negativo e gran de em módulo Muitas reações celulares endergônicas são propulsionadas pelo seu acoplamento mediante um intermediário comum àquelas reações altamente exer gônicas c A variação da energia livre padrão DG é uma constan te física relacionada à constante de equilíbrio pela equa ção DG 5 RT In Keq c Muitas reações celulares ocorrem a velocidades apro priadas somente porque as enzimas estão presentes para catalisálas As enzimas atuam em parte pela es tabilização do estado de transição reduzindo a energia de ativação DG e aumentando a velocidade de reação em várias ordens de grandeza A atividade catalítica das enzimas nas células é regulada c Metabolismo é a soma de muitas sequências de reações interconectadas que interconvertem metabólitos celula res Cada sequência é regulada para suprir o que a célu la precisa em um dado momento e para gastar energia somente quando necessário 14 Fundamentos genéticos Talvez a propriedade mais marcante dos organismos e das células vivas seja sua capacidade de se reproduzir por in contáveis gerações com fidelidade quase perfeita Essa continuidade de traços herdados sugere constância ao longo de milhões de anos na estrutura das moléculas que contêm a informação genética Poucos registros históricos de civilizações sobreviveram por mil anos mesmo quando riscados em superfícies de cobre ou talhados em pedra Fi gura 130 Contudo existem boas evidências de que as instruções genéticas permaneceram praticamente intactas nos organismos vivos por períodos muito maiores muitas bactérias têm praticamente o mesmo tamanho forma e estrutura interna apresentando também o mesmo tipo de moléculas precursoras e enzimas das bactérias que viveram cerca de quatro bilhões de anos atrás Essa continuidade da estrutura e da composição é o resultado da continuidade da estrutura do material genético Entre as descobertas mais notáveis da biologia no sécu lo XX está a natureza química e a estrutura tridimensional do material genético ácido desoxirribonucleico DNA A sequência de subunidades monoméricas os nucleotídeos estritamente desoxirribonucleotídeos como discutido a seguir neste polímero linear codifica as instruções para formar todos os outros componentes celulares e fornece o molde para a produção de moléculas de DNA idênticas a serem distribuídas aos descendentes por ocasião da divi são celular A perpetuação de uma espécie biológica requer que sua informação genética seja mantida de modo estável expressa com exatidão na forma de produtos dos genes e reproduzida com o mínimo de erros O armazenamento a expressão e a reprodução efetivos da mensagem genética definem espécies individuais distinguem umas das outras e asseguram a sua continuidade em sucessivas gerações A continuidade genética está contida em uma única molécula de DNA O DNA é um polímero orgânico fino e longo a rara molé cula que é construída na escala atômica em uma dimensão largura na escala humana em outra comprimento uma molécula de DNA pode ter vários centímetros de compri mento Um esperma ou óvulo humano carregando a infor mação hereditária acumulada em bilhões de anos de evolu ção transmite essa herança na forma de moléculas de DNA nas quais a sequência linear de subunidades de nucleotí deos ligados covalentemente codifica a mensagem genética Normalmente quando são descritas as propriedades de espécies químicas é descrito o comportamento mé dio de um número muito grande de moléculas idênticas Embora seja difícil prever o comportamento de uma única molécula em uma população por exemplo de um Nelson6edbookindb 29 Nelson6edbookindb 29 020414 1842 020414 1842 30 DAVID L NELSON MICHAEL M COX picomol de compostos cerca de 6 3 10 11 moléculas o comportamento médio das moléculas é previsível porque muitas delas entram no cálculo da média O DNA celular é uma notável exceção O DNA que forma todo o material genético da E coli é uma única molécula contendo 464 milhões de pares de nucleotídeos Essa única molécula tem de ser replicada com perfeição nos mínimos deta lhes para que uma célula de E coli possa gerar descen dentes idênticos por divisão celular não existe espaço para tomar médias nesse processo O mesmo vale para todas as células O esperma humano traz para o óvulo que ele fertiliza somente uma molécula de DNA de cada um dos 23 cromossomos para se combinar com somente uma molécula de cada cromossomo correspondente no óvulo O resultado dessa união é altamente previsível um embrião com todos os seus 25000 genes feitos de 3 bilhões de pares de nucleotídeos intactos Um feito quí mico impressionante PROBLEMA RESOLVIDO 16 Fidelidade da replicação do DNA Calcule o número de vezes que o DNA de uma célula de E coli atual foi copiado desde que sua primeira célula bac teriana precursora surgiu há cerca de 35 bilhões de anos Para simplificar assuma que neste período a E coli sofreu em média uma divisão celular a cada 12 horas isto é supe restimado para a bactéria atual mas provavelmente subes timado para a bactéria ancestral Solução 1 geração12h 24 hdia 365 diasano 35 3 10 9 anos 5 26 3 10 12 gerações Uma única página deste livro contém cerca de 5000 ca racteres de tal forma que o livro inteiro contém 5 milhões de caracteres O cromossomo da E coli também contém 5 milhões de caracteres pares de nucleotídeos Se você fizer uma cópia manual deste livro e então passálo a um colega de classe para também fazer uma cópia manual e se essa cópia for passada para um terceiro colega de clas se para fazer a terceira cópia da cópia e assim por diante quanto cada cópia vai se assemelhar com o livro original Agora imagine o texto que resultaria ao se fazer cópias de cópias à mão alguns trilhões de vezes A estrutura do DNA permite sua replicação e seu reparo com fidelidade quase perfeita A capacidade dos seres vivos de preservar seu material ge nético e duplicálo para a próxima geração resulta da com plementaridade entre as duas fitas da molécula de DNA Figura 131 A unidade básica do DNA é um polímero linear de quatro subunidades monoméricas diferentes desoxirribonucleotídeos arranjados em uma sequência linear precisa Essa sequência linear codifica a informação genética Duas dessas fitas poliméricas estão torcidas uma em torno da outra formando a duplahélice de DNA na qual cada desoxirribonucleotídeo em uma fita pareia especifica mente com um desoxirribonucleotídeo complementar na fita oposta Antes de a célula se dividir as duas fitas de DNA se separam uma da outra e cada uma serve de molde para a síntese de uma nova fita complementar gerando duas mo léculas em forma de duplahélice idênticas uma para cada célulafilha Se qualquer uma das fitas é danificada então a continuidade da informação é assegurada pela informação presente na fita oposta que pode atuar como molde para reparar o dano A sequência linear no DNA codifica proteínas com estrutura tridimensional A informação no DNA é codificada na sequência linear unidimensional de subunidades de desoxirribonucleotí deos mas a expressão dessa informação resulta em uma célula tridimensional Essa transformação da informação de uma dimensão para três dimensões ocorre em duas fases Uma sequência linear de desoxirribonucleotídeos no DNA codifica por meio de um intermediário RNA a produção de uma proteína com a sequência linear de aminoácidos correspondente Figura 132 A proteína é enovelada em uma forma tridimensional particular deter minada pela sua sequência de aminoácidos e estabilizada principalmente por interações não covalentes Embora a forma final da proteína enovelada seja ditada pela sua se quência de aminoácidos o processo de enovelamento é as sistido por chaperonas moleculares ver Figura 430 A a b FIGURA 130 Duas inscrições antigas a O Prisma de Sennacherib inscrito em torno de 700 aC descreve em caracteres da linguagem assíria alguns eventos históricos durante o reinado do Rei Sennacherib O prisma contém cerca de 20000 caracteres pesa cerca de 50 kg e sobreviveu de for ma quase intacta por 2700 anos b Uma única molécula de DNA da bac téria E coli extravasando de uma célula rompida é centenas de vezes mais longa que a própria célula e contém codificada toda a informação necessá ria para especificar a estrutura e a função da célula O DNA bacteriano con tém cerca de 46 milhões de caracteres nucleotídeos pesa menos do que 10 10 g e sofreu somente algumas pequenas alterações durante os últimos milhões de anos as manchas amarelas e os pontos escuros nesta micrografia eletrônica colorida são artefatos da preparação Nelson6edbookindb 30 Nelson6edbookindb 30 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 31 estrutura tridimensional precisa ou conformação nativa de uma proteína é crucial para sua função Uma vez em sua conformação nativa a proteína pode associarse não covalentemente com outras macromolé culas outras proteínas ácidos nucleicos ou lipídeos para formar complexos supramoleculares como cromossomos ribossomos e membranas As moléculas individuais desses complexos têm sítios de ligação para cada uma com alta afinidade específica e dentro das células elas se agrupam espontaneamente em complexos funcionais Apesar de as sequências de aminoácidos das proteínas carregarem toda a informação necessária para alcançar a conformação nativa da proteína o enovelamento preciso e a automontagem também requerem o ambiente celular correto pH força iônica concentrações de íons metálicos e assim por diante Portanto a sequência de DNA sozinha não é suficiente para formar e manter uma célula comple tamente funcional RESUMO 14 Fundamentos genéticos c A informação genética é codificada na sequência li near de quatro tipos de desoxirribonucleotídeos no DNA c A duplahélice da molécula de DNA contém um molde interno para sua própria replicação e reparo Fita nova 1 Fita velha 2 Fita nova 2 Fita velha 1 Fita 2 G C T G A A T A T A T G A T C C A G T A T A T G C G C T G A A T A T A T G A T C C A T Fita 1 FIGURA 131 Complementaridade entre as duas fitas de DNA O DNA é um polímero linear de quatro tipos de desoxirribonucleotídeos ligados co valentemente desoxiadenilato A desoxiguanilato G desoxicitidilato C desoxitimidilato T Cada nucleotídeo com sua estrutura tridimensional úni ca pode se associar especificamente mas não covalentemente com outro nucleotídeo na fita complementar A sempre se associa com T e G com C Por tanto na molécula de DNA fita dupla toda a sequência de nucleotídeos em uma das fitas é complementar à sequência da outra As duas fitas mantidas juntas por ligações de hidrogênio representado por traços verticais em azul claro entre cada par de nucleotídeos complementar giram uma em torno da outra para formar a duplahélice de DNA Na replicação do DNA as duas fitas em azul se separam e duas fitas novas em corderosa são sintetizadas cada qual com uma sequência complementar às fitas originais O resultado são duas moléculas tipo duplahélice e cada uma idêntica ao DNA original Transcrição do DNA em RNA complementar DNA RNA mensageiro Hexocinase não dobrada Hexocinase cataliticamente ativa Tradução do RNA nos ribossomos em cadeias polipeptídicas Enovelamento da cadeia de polipeptídeo na estrutura nativa da hexocinase Gene da hexocinase ATP glicose ADP glicose6 fosfato FIGURA 132 Do DNA ao RNA do RNA à proteína e da proteína à enzima hexocinase A sequência linear de desoxirribonucleotídeos no DNA o gene que codifica a proteína hexocinase é primeiro transcrita em uma molécula de ácido ribonucleico RNA com uma sequência comple mentar de ribonucleotídeos A sequência do RNA RNA mensageiro é en tão traduzida na cadeia linear da proteína hexocinase que então se dobra na sua forma nativa tridimensional com o auxílio das chaperonas molecu lares Uma vez em sua forma nativa a hexocinase adquire sua atividade catalítica ela catalisa a fosforilação da glicose usando ATP como doador do grupo fosforila Nelson6edbookindb 31 Nelson6edbookindb 31 020414 1842 020414 1842 32 DAVID L NELSON MICHAEL M COX c Moléculas de DNA são extremamente grandes com massas moleculares de milhões ou bilhões c Apesar do tamanho enorme do DNA a sequência de nu cleotídeos nela é muito precisa e a manutenção dessa precisão no decorrer de períodos bem longos de tempo é a base da continuidade genética dos organismos c A sequência linear de aminoácidos em uma proteína que está codificada no DNA do gene dessa proteína produz a estrutura tridimensional específica da proteína processo que também depende das condições ambien tais c Macromoléculas individuais com afinidade específica por outras macromoléculas têm a capacidade de se au toorganizar em complexos supramoleculares 15 Fundamentos evolutivos Nada na biologia faz sentido exceto sob a luz da evolução Theodosius Dobzhansky The American Biology Teacher março de 1973 O grande progresso na bioquímica e na biologia molecular nas últimas décadas confirmou a validade da contundente generalização de Dobzhansky A notável semelhança das rotas metabólicas e das sequências de genes entre os três grupos da vida sugere fortemente que todos os organismos modernos derivaram de um ancestral evolutivo comum por meio de uma série de pequenas mudanças mutações cada uma conferindo uma vantagem seletiva a algum orga nismo em algum nicho ecológico Mudanças nas instruções hereditárias possibilitam a evolução Apesar da fidelidade quase perfeita na replicação genéti ca erros pouco frequentes não reparados no processo de replicação do DNA levam a mudanças na sequência de nu cleotídeos do DNA produzindo uma mutação genética e alterando as instruções para um componente celular Da nos reparados incorretamente em uma das fitas do DNA possuem o mesmo efeito Mutações no DNA passadas aos descendentes isto é mutações presentes nas células re produtivas podem ser danosas ou mesmo letais ao novo organismo ou célula elas podem por exemplo ser a causa da síntese de uma enzima defeituosa incapaz de catalisar uma reação metabólica essencial Ocasionalmente contu do uma mutação equipa melhor um organismo ou uma cé lula para sobreviver em um dado ambiente Figura 133 Uma enzima mutante pode ter adquirido por exemplo uma especificidade um pouco diferente que a torna agora capaz de usar um composto que previamente a célula estava in capacitada de metabolizar Se uma população de células estiver em um ambiente onde aquele composto é a única ou a mais abundante fonte de combustível disponível então a célula mutante terá vantagem competitiva sobre as célu FIGURA 133 Duplicação e mutação de genes um ca minho para gerar novas atividades enzimáticas Neste exemplo o único gene da hexocinase em um organismo hipotético pode acabar acidentalmente copiado duas vezes durante a replicação do DNA de modo que o organismo te nha duas cópias inteiras do gene uma delas desnecessária Ao longo de gerações à medida que o DNA com dois genes para a hexocinase é repetidamente replicado alguns erros raros podem ocorrer levando a mudanças na sequência de nucleotídeos do gene excedente e portanto da proteína que ele codifica Em alguns casos muito raros a proteína produzida a partir desse gene mutado é alterada de tal for ma que ela se liga a um novo substrato galactose neste caso hipotético A célula contendo o gene mutante adquire uma nova capacidade metabolizar a galactose permitindo lhe que sobreviva em um nicho ecológico que dispõe de galactose mas não de glicose Se a mutação ocorrer sem a duplicação do gene então a função original do produto do gene é perdida Um erro raro durante a replicação do DNA duplica o gene da hexocinase Um segundo erro raro resulta em uma mutação no segundo gene da hexocinase Hexocinase original a galactose não é substrato Hexocinase mutante com nova especificidade de substrato para a galactose Expressão do gene original Expressão do gene duplicado mutado ATP glicose ADP glicose 6fosfato DNA Gene da hexocinase ATP galactose ADP galactose 6fosfato Gene duplicado Mutação Gene original Nelson6edbookindb 32 Nelson6edbookindb 32 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 33 las não mutadas tipo selvagem da população A célula mutada e suas descendentes vão sobreviver e prosperar no novo ambiente enquanto as células do tipo selvagem vão definhar e ser eliminadas Isso é o que Darwin denominou de seleção natural o que muitas vezes é resumido como sobrevivência do mais adaptado Ocasionalmente uma segunda cópia de um gene intei ro é introduzida em um cromossomo como resultado da replicação defeituosa do cromossomo A segunda cópia é desnecessária e mutações nesse gene não serão deletérias podendo se tornar um meio pelo qual a célula pode evoluir produzindo um novo gene com uma nova função enquanto mantém o gene original e a sua função Sob essa óptica as moléculas de DNA dos organismos modernos são docu mentos históricos registros de uma longa jornada desde as primeiras células até os organismos modernos Contudo os registros históricos no DNA não estão completos no cur so da evolução muitas mutações devem ter sido apagadas ou reescritas Contudo as moléculas de DNA são a melhor fonte de história biológica disponível A frequência de er ros na replicação do DNA representa um equilíbrio entre muitos erros os quais gerariam célulasfilhas inviáveis e relativamente poucos que impediriam a variação genética que permite a sobrevivência das células mutantes em no vos nichos ecológicos Vários bilhões de anos de seleção natural acabaram re finando os sistemas celulares para tirar o máximo das pro priedades físicas e químicas das matériasprimas disponí veis As mutações genéticas ocasionais que ocorreram em indivíduos de uma população combinadas com a seleção natural resultaram na evolução para essa enorme varieda de de espécies observadas atualmente cada uma adaptada ao seu nicho ecológico particular As biomoléculas surgiram primeiro por evolução química Até aqui foi omitido o primeiro capítulo da história da evo lução o surgimento da primeira célula viva Os compostos orgânicos incluindo as biomoléculas básicas como aminoá cidos e carboidratos são encontrados se não for considera da sua ocorrência nos organismos vivos na crosta terrestre no mar e na atmosfera somente na quantidade de pequenos traços Então como o primeiro organismo vivo conseguiu adquirir seus blocos de construção orgânica característi cos De acordo com uma hipótese esses compostos foram criados pelo efeito de poderosas forças ambientais irradia ção ultravioleta relâmpagos e raios ou erupções vulcânicas sobre os gases da atmosfera terrestre prebiótica e sobre os solutos inorgânicos nas fontes hidrotermais superaque cidas nas profundezas do oceano Essa hipótese foi testada em um experimento clássico sobre a origem abiótica não biológica de biomoléculas orgânicas conduzido em 1953 por Stanley Miller no labo ratório de Harold Urey Miller submeteu uma mistura de gases supostamente existentes na terra prebiótica incluin do NH3 CH4 H2O e H2 a uma descarga elétrica produzida por um par de eletrodos para simular relâmpagos e raios por um período de uma semana ou mais e então analisou o conteúdo do frasco da reação fechada Figura 134 A fase gasosa da mistura continha CO e CO2 além dos gases de partida A fase líquida continha uma grande variedade de compostos orgânicos incluindo alguns aminoácidos ácidos orgânicos aldeídos e ácido cianídrico HCN Esse experimento mostrou a possibilidade da produção abióti ca de biomoléculas em um tempo relativamente curto e em condições relativamente brandas Quando as amostras de Eletrodos Condensador a Local da descarga ou arco elétrico 80 8C NH3 CH4 H2 H2O H2S HCN aminoácidos b FIGURA 134 Produção abiótica de biomoléculas a Aparelho de des cargas elétricas usado por Miller e Urey em experimentos demonstrando a formação abiótica de compostos orgânicos em condições atmosféricas pri mitivas Após submeter a mistura gasosa do sistema a descargas elétricas os produtos formados foram coletados por condensação Biomoléculas como aminoácidos estavam entre esses produtos b Stanley L Miller 19302007 usando seu aparelho de descargas elétricas Nelson6edbookindb 33 Nelson6edbookindb 33 020414 1842 020414 1842 34 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Miller cuidadosamente guardadas foram redescobertas em 2010 e examinadas com muito mais sensibilidade e técnicas com alto poder de resolução cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massas suas observações originais foram confirmadas e ampliadas significativamen te Resultados previamente não publicados por Miller e que incluíram H2S na mistura gasosa imitando as condições das atividades vulcânicas no fundo do mar Figura 135 mostraram a formação de 23 aminoácidos e 7 compostos organossulfurados bem como um grande número de outros compostos simples que podem ter servido como blocos de construção da evolução prebiótica Experimentos de laboratório mais refinados forneceram boas evidências de que muitos dos componentes químicos das células vivas incluindo polipeptídeos e moléculas pa recidas com o RNA podem se formar sob essas condições Polímeros de RNA podem atuar como catalisadores em rea ções biologicamente importantes ver Capítulos 26 e 27 e o RNA provavelmente exerceu um papel crucial na evolu ção prebiótica tanto como catalisador como repositório de informações RNA ou precursores relacionados podem ter sido os primeiros genes e catalisadores Nos organismos modernos ácidos nucleicos codificam a in formação genética que especifica a estrutura das enzimas e as enzimas catalisam a replicação e o reparo dos ácidos nu cleicos A dependência mútua dessas duas classes de bio moléculas traz a intrigante pergunta quem veio primeiro DNA ou proteína A resposta pode ser que ambos surgiram aproximada mente ao mesmo tempo e que o RNA precedeu ambos A descoberta de que moléculas de RNA podem atuar como catalisadoras da sua própria formação sugere que o RNA ou uma molécula similar pode ter sido o primeiro gene e o primeiro catalisador De acordo com esse cenário Figu ra 136 um dos primeiros estágios da evolução biológica foi a formação por acaso de uma molécula de RNA que pôde catalisar a formação de outra molécula de RNA com a mesma sequência uma autorreplicação um RNA auto perpetuante A concentração de uma molécula de RNA au torreplicante cresceria exponencialmente visto que uma molécula formou várias várias formaram muitas mais e assim por diante A fidelidade da autorreplicação presumi velmente não era perfeita de modo que o processo gerou variantes do RNA muitos dos quais podendo ser melhores para a autorreplicação Na competição por nucleotídeos a mais eficiente entre as sequências autorreplicantes ga nharia e os replicadores menos eficientes se extinguiriam da população FIGURA 135 Colunas quentes contendo material escuro Fontes termais no leito do oceano emitem água superaquecida e rica em minerais dissolvidos A coluna escura é formada quando o jato superaquecido encon tra a água fria do oceano causando a precipitação dos sulfitos dissolvidos Diversas formas de vida incluindo arqueias e alguns animais multicelulares surpreendentemente complexos são encontradas nas vizinhanças de tais termas que podem ter sido os sítios da biogênese inicial Formação prebiótica de compostos simples incluindo nucleotídeos a partir dos componentes primitivos da atmosfera ou dos gases das fendas de vulcões submersos Produção de moléculas de RNA curtas com sequências aleatórias Replicação seletiva de segmentos de RNA catalíticos autoduplicantes Síntese de peptídeos específicos catalisada por RNA Aumento do papel dos peptídeos na replicação do RNA coevolução do RNA e das proteínas Sistema de tradução primitiva se desenvolve com genoma de RNA e catalisadores RNAproteína RNA genômico começa a ser copiado em DNA Genoma de DNA tradução em complexos RNAproteína ribossomos com catalisadores de RNA e proteína FIGURA 136 Possível roteiro para o mundo do RNA Nelson6edbookindb 34 Nelson6edbookindb 34 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 35 A divisão de tarefas entre DNA depósito de informação genética e proteína catálise foi de acordo com a hipó tese do mundo do RNA um desenvolvimento posterior Novas variantes de moléculas de RNA autorreplicantes se desenvolveram com a capacidade adicional de catalisar a condensação de aminoácidos em peptídeos Eventual mente os peptídeos assim formados puderam reforçar a ca pacidade do RNA de se autorreplicar e o par molécula de RNA e peptídeo auxiliar poderia passar por modificações adicionais na sequência gerando sistemas autorreplicantes com eficiência crescente A interessante descoberta de que na maquinaria de síntese de proteínas nas células modernas ribossomos são as moléculas de RNA e não as proteínas que catalisam a formação das ligações peptídicas é consis tente com a hipótese do mundo do RNA Algum tempo após a evolução desse sistema primitivo de síntese de proteínas houve um desenvolvimento adicio nal moléculas de DNA com sequências complementares às moléculas de RNA autorreplicantes assumiram a função de conservar a informação genética e as moléculas de RNA evoluíram para exercer o seu papel na síntese de proteí nas Será explicado no Capítulo 8 por que o DNA é uma molécula mais estável que o RNA e portanto um reposi tório mais adequado à informação hereditária As proteí nas se revelaram catalisadores versáteis e com o passar do tempo assumiram a maior parte dessa função Compostos semelhantes a lipídeos presentes na mistura primordial for maram camadas relativamente impermeáveis ao redor das coleções de moléculas autorreplicantes A concentração de proteínas e ácidos nucleicos dentro desses invólucros lipí dicos favoreceu as interações moleculares necessárias para a autorreplicação O cenário do mundo de RNA é intelectualmente satisfa tório mas ele deixa uma questão sem resposta de onde vie ram os nucleotídeos necessários para fazer o RNA inicial Uma alternativa ao cenário de um mundo de RNA supõe que rotas metabólicas simples evoluíram primeiro talvez nas fontes termais do leito do oceano Um conjunto de rea ções químicas interrelacionadas nesses locais pode ter pro duzido os precursores antes do advento das membranas de lipídeos ou RNA Sem maiores evidências experimentais nenhuma dessas hipóteses pode ser desconsiderada A evolução biológica começou há mais de três bilhões e meio de anos A Terra se formou há cerca de 46 bilhões de anos e a pri meira evidência de vida data de mais de 35 bilhões de anos atrás Em 1996 cientistas trabalhando na Groenlândia en contraram evidências químicas de vida moléculas fósseis tão antigas quanto 385 bilhões de anos formas de carbono incrustadas em rochas que parecem ter uma origem niti damente biológica Em algum lugar da Terra durante seus primeiros bilhões de anos os primeiros organismos surgi ram capazes de replicar sua própria estrutura a partir de um molde RNA que foi o primeiro material genético Considerando que a atmosfera terrestre no alvorecer da vida estava praticamente desprovida de oxigênio e que exis tiam poucos microrganismos para decompor os compostos orgânicos formados pelos processos naturais então esses compostos eram relativamente estáveis Dada essa estabi lidade e a eternidade de tempo transcorrido o improvável se tornou inevitável vesículas lipídicas contendo compostos orgânicos e RNA autorreplicante deram origem às primeiras células protocélulas e essas protocélulas com maior ca pacidade de autorreplicação se tornaram mais numerosas Assim teve início o processo da evolução biológica A primeira célula provavelmente usou combustíveis inorgânicos As células primitivas surgiram em uma atmosfera redutora não existia oxigênio e provavelmente obtiveram energia de compostos inorgânicos como sulfeto ferroso e carbona to ferroso ambos abundantes na superfície terrestre Por exemplo a reação FeS 1 H2S FeS2 1 H2 produz energia suficiente para promover a síntese de ATP ou compostos semelhantes Os compostos orgânicos de que essas células primitivas precisavam podem ter surgido das ações não biológicas de raios e relâmpagos do calor dos vulcões ou do calor de fontes termais no leito do oceano so bre os componentes da atmosfera primitiva como CO CO2 N2 NH3 CH4 e outros Uma fonte alternativa de compostos orgânicos tem sido proposta o espaço extraterrestre Em 2006 a missão espacial Stardust poeira estelar trouxe fi nas partículas de poeira da cauda de um cometa a poeira continha uma variedade de compostos orgânicos inclusive o aminoácido simples glicina Os organismos unicelulares primitivos adquiriram gra dualmente a capacidade de extrair energia de compostos do seu meio e de usar esta energia para sintetizar a maio ria de suas moléculas precursoras tornandose portanto menos dependentes de fontes externas Um evento evolu tivo muito significante foi o desenvolvimento de pigmentos capazes de capturar a energia da luz do sol que pode ser usada para reduzir ou fixar CO2 para formar compostos orgânicos mais complexos O doador original de elétrons para estes processos fotossintéticos foi provavelmente o H2S produzindo enxofre elementar ou sulfato como sub produto mais tarde as células desenvolveram a capacidade enzimática de usar H2O como doador de elétrons nas rea ções fotossintéticas produzindo O2 como resíduo As ciano bactérias são os descendentes modernos desses primeiros produtores de oxigênio fotossintético Pelo fato de a atmosfera da Terra nos estágios iniciais da evolução biológica estar praticamente desprovida de oxigênio as primeiras células eram anaeróbias Sob tais condições organismos quimiotróficos podiam oxidar com postos orgânicos em CO2 passando elétrons não para o O2 mas para aceptores que produzem H2S como produto Com o surgimento de bactérias fotossintéticas produtoras de O2 a atmosfera se tornou progressivamente rica em oxigênio oxidante poderoso e tóxico para organismos anaeróbios Respondendo à pressão evolutiva ao que Lynn Margulis e Dorion Sagan chamaram de holocausto do oxigênio algu mas linhagens de microrganismos levaram ao surgimento de organismos aeróbios que obtêm energia passando elé trons das moléculas de combustível ao oxigênio Devido ao Nelson6edbookindb 35 Nelson6edbookindb 35 020414 1842 020414 1842 36 DAVID L NELSON MICHAEL M COX fato de a transferência de elétrons de moléculas orgânicas ao O2 liberar uma grande quantidade de energia os orga nismos aeróbios tiveram uma vantagem energética sobre seus equivalentes anaeróbios quando ambos competiam no ambiente contendo oxigênio Essa vantagem se traduziu na predominância de organismos aeróbios em ambientes ricos em O2 As bactérias e as arqueias modernas habitam pratica mente todos os nichos ecológicos da biosfera e existem organismos capazes de usar praticamente qualquer tipo de composto orgânico como fonte de carbono e energia Microrganismos fotossintéticos tanto em água salgada como em água doce captam energia solar e a utilizam para gerar carboidratos e todos os outros constituintes da cé lula que por sua vez são usados como alimento pelas ou tras formas de vida O processo de evolução continua e inclusive pode ser observado em laboratório com células bacterianas que se reproduzem muito rapidamente Uma linha interessante de pesquisa para estudar os mecanismos evolucionários consiste em tentar produzir bactérias sinté ticas no laboratório no qual o experimentador providencia cada componente purificado por conhecimento prévio O primeiro passo nessa direção consiste em determinar o nú mero mínimo de genes necessários para a vida examinan do o genoma da bactéria mais simples O menor genoma conhecido de uma bactéria de vida livre é de Mycobacte rium genitalium que contém 580000 pares de bases co dificando 483 genes Em 2010 cientistas do Instituto Craig Venter conseguiram sintetizar in vitro o cromossomo da bactéria e então incorporaram o cromossomo sintético em uma bactéria viva de outra espécie que por sua vez adqui riu as propriedades de Mycobacterium genitalium Essa tecnologia abre caminho para a produção de uma grande variedade de células sintéticas com o mínimo básico de ge nes essenciais para a vida Com uma célula dessas podese esperar o estudo em laboratório do processo evolucionário pelo qual as protocélulas gradualmente se diversificaram e se tornaram mais complexas Células eucarióticas evoluíram a partir de precursores mais simples por meio de vários estágios A partir de 15 bilhão de anos atrás os registros fósseis começaram a mostrar evidências de organismos maiores e mais complexos provavelmente as primeiras células eucari óticas Figura 137 Detalhes do caminho evolutivo de cé lulas não nucleadas para células nucleadas não podem ser deduzidos somente pelo registro fóssil mas as semelhanças bioquímicas e morfológicas dos organismos modernos suge rem uma sequência de eventos consistente com a evidência fóssil Três mudanças principais devem ter ocorrido Primeiro à medida que as células adquiriram mais DNA os mecanis mos necessários para o enrolamento compacto em torno de proteínas específicas formando complexos separados man tendo a capacidade de promover a divisão correta entre as célulasfilhas tornaramse mais elaborados Proteínas espe cializadas foram necessárias para estabilizar o DNA enrola do e para separar os complexos DNAproteína resultantes cromossomos durante a divisão celular Segundo à me dida que as células se torna ram maiores um sistema de membranas intracelular se desenvolveu incluindo uma dupla membrana envolven do o DNA Essa membrana segregou o processo nuclear de síntese de RNA a partir do molde de DNA do processo citoplasmático de síntese de proteínas nos ribossomos Finalmente de acordo com a hipótese agora amplamente aceita mas que teve muita resistência no início adiantada por Lynn Margulis as pri meiras células eucarióticas que eram incapazes de realizar fotossíntese ou metabolismo aeróbio englobaram bactérias aeróbias e bactérias fotossintéticas formando associações endossimbióticas que finalmente se tornaram permanen tes Figura 138 Algumas bactérias aeróbias evoluíram para as mitocôndrias dos eucariotos modernos e algumas cianobactérias fotossintéticas se tornaram os plastídeos como os cloroplastos das algas verdes os prováveis ances trais das células das plantas modernas 0 4500 Formação da Terra 4000 Formação de oceanos e continentes 3500 Surgimento de cianobactérias fotossintéticas produtoras de O2 Surgimento de bactérias sulfúricas fotossintéticas Surgimento de metanogênicos 2500 Surgimento das bactérias aeróbias Desenvolvimento da atmosfera rica em O2 1500 Surgimento de protistas os primeiros eucariontes Surgimento de algas vermelhas e verdes 1000 Surgimento de endossimbiontes mitocôndrias plastídeos 500 Diversificação de eucariotos multicelulares plantas fungos animais 3000 2000 Milhões de anos atrás FIGURA 137 Marcos da evolução da vida na Terra Lynn Margulis 19382011 Nelson6edbookindb 36 Nelson6edbookindb 36 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 37 Em algum estágio posterior da evolução os organismos unicelulares acharam vantajoso se agregar como aglomera dos adquirindo assim maior mobilidade eficiência ou su cesso reprodutivo se comparados com seus competidores unicelulares livres Uma evolução adicional desses organis mos agregados levou a associações permanentes entre célu las individuais e por fim à especialização dentro da colônia isto é à diferenciação celular As vantagens da especialização celular levaram à evo lução de organismos sempre mais complexos e altamen te diferenciados nos quais algumas células realizavam as funções sensoriais outras as funções digestivas outras as fotossintéticas ou reprodutivas e assim por diante Muitos organismos multicelulares modernos contêm centenas de tipos de células diferentes cada qual especializada para uma função de manutenção do organismo inteiro Meca nismos fundamentais que evoluíram primeiramente tive ram ainda refinamentos ulteriores e se embelezaram com a evolução Os mesmos mecanismos e estruturas básicas que sustentam o movimento dos cílios no Paramecium e do flagelo na Chlamydomonas são utilizados por exem plo pelos espermatozoides altamente diferenciados dos vertebrados A anatomia molecular revela relações evolutivas Agora os bioquímicos têm um tesouro de informações mui to rico e sempre crescente sobre a anatomia molecular das células que pode ser usado para analisar as relações evolutivas e refinar a teoria da evolução A sequência do genoma o conteúdo genético completo de um organismo foi determinada para centenas de bactérias para mais de 40 arqueias e para um número crescente de microrganis mos eucarióticos incluindo Saccharomyces cerevisiae e espécies de Plasmodium plantas incluindo Arabidop sis thaliana e arroz e animais multicelulares incluindo Caenorhabditis elegans um verme Drosophila me lanogaster a moscadasfrutas camundongo rato ca chorro chimpanzé e Homo sapiens Tabela 12 Com tais sequências em mãos uma comparação detalhada e quanti tativa entre as espécies pode fornecer uma visão profunda do processo evolutivo Até aqui a filogenia molecular deri vada da sequência de genes é consistente mas em alguns casos é até mais precisa que a filogenia clássica com base em estruturas macroscópicas Apesar de os organismos te rem continuamente divergido em sua anatomia bruta em nível molecular a unidade da vida se torna imediatamente clara estruturas e mecanismos moleculares são muito se melhantes desde os organismos mais simples aos mais com plexos Essas semelhanças são mais facilmente percebidas nas sequências tanto nas sequências de DNA que codifi cam proteínas como na própria sequência das proteínas Quando dois genes compartilham semelhanças de se quência facilmente detectáveis sequência de nucleotídeos no DNA ou sequência de aminoácidos na proteína que eles codificam suas sequências são ditas homólogas e as pro O metabolismo anaeróbio é ineficiente porque o combustível não é completamente oxidado Eucarioto anaeróbio ancestral Núcleo O metabolismo aeróbio é eficiente porque o combustível é oxidado em CO2 Bactéria aeróbia Genoma bacteriano Energia luminosa é usada para sintetizar biomoléculas a partir de CO2 Cianobactéria fotossintética Genoma de cianobactéria Eucarioto aeróbio Bactérias são engolfadas por eucariotos ancestrais e multiplicadas em seu interior Sistemas simbióticos podem agora executar catabolismo aeróbio Alguns genes bacterianos se moveram para o núcleo e as bactérias endossimbiontes se tornaram as mitocôndrias Eucarioto fotossintético Eucarioto não fotossintético Mitocôndria Cloroplasto Cianobactéria engolfada se torna um endossimbionte e se multiplica a nova célula pode produzir ATP usando energia da luz solar Com o tempo alguns genes da cianobactéria se deslocam para o núcleo e os endossimbiontes se tornam plastídeos cloroplastos FIGURA 138 Evolução dos eucariotos por endossimbiose O euca rioto primitivo um anaeróbio adquiriu uma bactéria púrpura endossimbi ótica em amarelo que levou consigo a capacidade de fazer o catabolismo aeróbio e se tornou com o tempo a mitocôndria Quando a cianobactéria fotossintética em verde se tornou endossimbionte de alguns eucariotos aeróbios então essas células se tornaram os precursores fotossintéticos das modernas plantas e das algas verdes Nelson6edbookindb 37 Nelson6edbookindb 37 020414 1842 020414 1842 38 DAVID L NELSON MICHAEL M COX teínas que eles codificam são homólogas Se dois genes homólogos ocorrem na mesma espécie então eles são di tos parálogos e os produtos proteicos também são parálo gos Presumese que os genes parálogos sejam derivados da duplicação gênica seguida por mudanças graduais nas sequências de ambas as cópias Tipicamente proteínas pa rálogas são semelhantes não somente em sequência mas também em sua estrutura tridimensional mas ambas adqui riram funções diferentes durante sua evolução Dois genes homólogos ou proteínas encontrados em espécies diferentes são ditos ortólogos e suas proteínas resultantes são ortólogas Normalmente as ortólogas têm a mesma função em ambos os organismos portan to quando um novo gene sequenciado de uma espécie é fortemente ortólogo com um gene de outra espécie en tão esse gene provavelmente codifica uma proteína com a mesma função em ambas as espécies Dessa forma a função do produto dos genes proteínas ou moléculas de RNA pode ser deduzida a partir da sequência genômica sem nenhuma caracterização bioquímica das moléculas em si Um genoma anotado tem além da própria se quência de DNA uma descrição da provável função do produto de cada gene deduzida por comparação com ou tras sequências genômicas e funções proteicas estabeleci das Às vezes podemse deduzir as capacidades metabó licas de um organismo somente pela sequência genômica isto é pela identificação das rotas conjunto de enzimas codificadas no genoma As diferenças entre as sequências de genes homólogos podem ser usadas como uma medida aproximada do distan ciamento entre duas espécies no curso da evolução ou há quanto tempo atrás o seu precursor evolutivo comum deu origem às duas linhas com destinos evolutivos diferentes Quanto maior o número de sequências diferentes mais an tiga a divergência na história evolutiva Podese construir uma filogenia árvore genealógica na qual a distância evo lutiva entre duas espécies quaisquer é representada por sua proximidade na árvore a Figura 14 é um exemplo No curso da evolução novos processos estruturas ou mecanismos regulatórios são adquiridos reflexos dos ge nomas alterados dos organismos em evolução O genoma de um eucarioto simples como a levedura deve ter genes relacionados à formação da sua membrana nuclear ge nes esses não presentes nas bactérias ou nas arqueias O genoma de um inseto deve conter genes que codificam proteínas envolvidas em especificar a segmentação ca racterística do seu corpo genes esses não presentes na levedura O genoma de todos os vertebrados deve com partilhar genes que especificam o desenvolvimento da coluna vertebral e o dos mamíferos deve ter genes pró prios necessários para o desenvolvimento da placenta uma característica dos mamíferos e assim por diante A comparação dos genomas completos das espécies de cada filo está levando à identificação de genes cruciais às mudanças evolutivas fundamentais no plano corporal e no desenvolvimento A genômica funcional mostra a alocação de genes para processos celulares específicos Quando a sequência de um genoma está completamente determinada e uma função é associada a cada gene então os geneticistas moleculares podem agrupar os genes de acordo com o processo síntese de DNA síntese de pro teína geração de ATP e assim por diante no qual eles fun cionam e também encontrar qual fração do genoma está TABELA 12 Alguns dos muitos organismos cujos genomas foram completamente sequenciados Organismo Tamanho do genoma pares de nucleotídeos Interesse biológico Mycoplasma genitalium 58 3 10 5 O menor organismo Helicobacter pylori 16 3 10 6 Causa úlcera gástrica Methanocaldococcus jannaschii 17 3 10 6 Arqueia cresce a 85C Haemophilus influenzae 19 3 10 6 Causa gripe bacteriana Synechocystis sp 39 3 10 6 Cianobactéria Bacillus subtilis 42 3 10 6 Bactéria comum do solo Escherichia coli 46 3 10 6 Algumas linhagens são patógenos humanos Saccharomyces cerevisiae 12 3 10 7 Eucarioto unicelular Caenorhabditis elegans 10 3 10 8 Verme redondo multicelular Arabidopsis thaliana 12 3 10 8 Planta modelo Drosophila melanogaster 18 3 10 8 Mosca de laboratório moscadafruta Mus musculus 27 3 10 9 Camundongo de laboratório Homo sapiens 30 3 10 9 Humano Fonte wwwncbinlmnihgovgenome Nelson6edbookindb 38 Nelson6edbookindb 38 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 39 alocada para cada uma das atividades celulares A maior ca tegoria de genes em E coli A thaliana e H sapiens con siste em genes até agora de função desconhecida o que representa mais de 40 dos genes de cada espécie As pro teínas de transporte que movem íons e pequenas moléculas através da membrana plasmática ocupam uma proporção significativa dos genes em todas as três espécies mais em bactérias e plantas que nos mamíferos 10 dos 4400 genes de E coli 8 dos 32000 genes de A thaliana e 4 de 25000 genes de H sapiens Os genes que codificam as proteínas e o RNA necessários para síntese de proteínas somam de 3 a 4 do genoma de E coli mas nas células mais complexas de A thaliana mais genes são ne cessários para endereçar as proteínas até a sua localização final nas células do que o requerido para as sintetizar cerca de 6 e 2 do genoma respectivamente Em geral quanto mais complexo o organismo maior a porção do seu genoma que codifica genes envolvidos na regulação de processos celulares e menor a porção dedicada aos processos básicos como geração de ATP e síntese proteica A comparação genômica apresenta importância crescente na biologia e na medicina humana Os genomas de chimpanzés e humanos são 999 idênticos mesmo assim as diferenças entre as duas espécies são enormes As poucas diferenças nos conteúdos genéticos devem explicar o domínio da linguagem em hu manos a extraordinária capacidade física dos chimpanzés e uma miríade de outras diferenças A comparação de geno mas está permitindo aos pesquisadores identificar genes candidatos conectados a divergências no programa de de senvolvimento de humanos e dos outros primatas e a emer gência de funções complexas como a linguagem Tudo se tornará mais claro somente quando o genoma de mais pri matas se tornar disponível para comparação com o genoma humano Da mesma forma as diferenças no conteúdo genético entre humanos são extremamente pequenas se compara das com as diferenças entre humanos e chimpanzés Mesmo assim essas poucas diferenças são responsáveis pelas dife renças dentro da espécie humana incluindo diferenças na saúde e na suscetibilidade a doenças crônicas Há muito a aprender sobre a variabilidade na sequência entre huma nos e a disponibilidade dessa informação genômica vai cer tamente transformar o diagnóstico e o tratamento médico Podese esperar que para algumas doenças genéticas os tratamentos paliativos até agora utilizados serão substituí dos por curas Podese esperar também que o alerta e a pre venção serão as medidas usadas quando suscetibilidades a doenças são detectadas por marcadores genéticos específi cos O atual histórico médico poderá ser substituído pelo prognóstico médico RESUMO 15 Fundamentos evolutivos c Ocasionalmente mutações herdadas geram organismos mais bem adaptados para sobreviver e com a reprodu ção em um dado nicho ecológico os seus descendentes passam a predominar na população desse nicho Esse processo de mutação e seleção é a base da evolução da rwiniana que vai da primeira célula a todos os organis mos modernos O grande número de genes compartilha dos por todos os seres vivos explica suas semelhanças fundamentais c A vida surgiu há cerca de 35 bilhões de anos mais pro vavelmente com a formação de um compartimento fe chado por membrana contendo uma molécula de RNA autorreplicante Os componentes das primeiras células podem ter sido produzidos perto de fontes termais no leito dos oceanos ou pela ação de raios e relâmpagos e altas temperaturas sobre moléculas atmosféricas sim ples como CO2 e NH3 c Os papéis catalíticos e genéticos exercidos pelos primei ros genomas de RNA foram ao longo do tempo sendo realizados por proteínas e DNA respectivamente c Células eucarióticas adquiriram a capacidade de promo ver a fotossíntese e a fosforilação oxidativa a partir de bactérias endossimbióticas Em organismos multicelula res alguns tipos de células diferenciadas se especializa ram em uma ou mais funções essenciais para a sobrevi vência do organismo c O conhecimento das sequências completas de nucleo tídeos dos genomas de organismos de diferentes ramos da árvore filogenética fornece compreensões mais pro fundas da evolução e oferece também grandes oportuni dades para a medicina humana Termoschave Todos os termos estão definidos no glossário metabólito 3 núcleo 3 genoma 3 eucariotos 3 bactéria 4 arqueia 4 citoesqueleto 8 estereoisômeros 16 configuração 16 centro quiral 17 conformação 19 entropia S 23 entalpia H 23 variação da energia livre DG 23 reação endergônica 23 reação exergônica 24 equilíbrio 25 variação da energia livre padrão DG 25 energia de ativação DG 27 catabolismo 28 anabolismo 28 metabolismo 28 biologia de sistemas 29 mutação 32 Leituras adicionais Geral Fruton JS 1999 Proteins Enzymes Genes The Interplay of Chemistry and Biochemistry Yale University Press New Haven Destacado historiador da bioquímica relata o desenvolvimento dessa ciência e discute seus impactos na medicina farmácia e agricultura Harold FM 2001 The Way of the Cell Molecules Organisms and the Order of Life Oxford University Press Oxford Nelson6edbookindb 39 Nelson6edbookindb 39 020414 1842 020414 1842 40 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Judson HF 1996 The Eighth Day of Creation The Makers of the Revolution in Biology expanded edn Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor NY Descrição muito clara e apropriada do surgimento da bioquímica e biologia molecular no século vinte Kornberg A 1987 The two cultures chemistry and biology Biochemistry 26 68886891 A importância de aplicar ferramentas químicas aos problemas biológicos descritos por um eminente especialista Monod J 1971 Chance and Necessity Alfred A Knopf Inc New York Paperback edition Vintage Books 1972 Publicado originalmente 1970 com o título Le hasard et la nécessité Editions du Seuil Paris Exploração das implicações filosóficas do conhecimento biológico Morowitz HJ 2002 The Emergence of Everything How the World Became Complex Oxford University Press Oxford Discussão curta e muito bem escrita sobre a emergência de organismos complexos a partir de precursores simples Pace NR 2001 The universal nature of biochemistry Proc Natl Acad Sci USA 98 805808 Breve discussão da definição mais sucinta de vida na Terra e em qualquer outro lugar Fundamentos celulares Hardin J Beroni GP Kleinsmith LJ 2011 Beckers World of the Cell 8th edn The BenjaminCummings Publishing Company Redwood City CA Excelente texto introdutório de biologia celular Hosking CR Schwartz JL 2009 The futures bright imaging cell biology in the 21st century Trends Cell Biol 19 553554 Editorial introdutório curto deste fascículo completo de Trends in Cell Biology que versa sobre novos métodos de obter imagem de células Lodish H Berk A Kaiser CA Krieger M Scott MR Bretscher A Ploegh H Amon A 2012 Molecular Cell Biology 7th edn W H Freeman and Company New York Texto excelente e útil para este e outros capítulos Sadava D Hillis DM Heller HC Berenbaum M 2010 Life The Science of Biology 9th edn W H Freeman and Company New York Wilson C Venditti R Rega LR Colanzi A DAngelo G DeMatteis MA 2011 The Golgi apparatus an organelle with multiple complex functions Biochem J 433 19 Excelente revisão de nível intermediário sobre o papel do aparelho de Golgi Fundamentos químicos Barta NS Stille JR 1994 Grasping the concepts of stereochemistry J Chem Educ 71 2023 Descrição clara do sistema RS para nomear estereoisômeros com sugestões práticas para determinar e recordar os tipos de isômeros Thall E 1996 When drug molecules look in the mirror J Chem Educ 73 481484 Diferenças biológicas entre isômeros R e S de fármacos Vollhardt KPC Shore NE 2011 Organic Chemistry Structure and Function 6th edn W H Freeman and Company New York Discussão atualizada sobre estereoquímica grupos funcionais reatividade e a química das principais classes de biomoléculas Fundamentos físicos Atkins PW de Paula J 2012 Physical Chemistry for the Life Sciences 2nd edn W H Freeman and Company New York Blum HF 1968 Times Arrow and Evolution 3rd edn Princeton University Press Princeton Excelente discussão de como a segunda lei da termodinâmica influenciou a evolução biológica Fundamentos genéticos Griffiths AJF Wessler SR Lewinton RC Carroll S 2008 An Introduction to Genetic Analysis 9th edn W H Freeman and Company New York Jacob F 1973 The Logic of Life A History of Heredity Pantheon Books Inc New York Originally published 1970 as La logique du vivant une histoire de lhérédité Editions Gallimard Paris Interessante relato histórico e filosófico dos eventos que levaram à atual compreensão molecular da vida Pierce B 2012 Genetics A Conceptual Approach 4th edn W H Freeman and Company New York Fundamentos evolutivos Adams JC 2009 Molecular and cellular evolution a celebration of the 200th anniversary of the birth of Charles Darwin Int J Biochem Cell Biol 41 249 Introdução editorial a 14 ensaios sobre aspectos da evolução molecular e celular que compõem essa edição da revista Brow JR Doolittle WF 1997 Archaea and the prokaryoteto eukaryote transition Microbiol Mol Biol Rev 61 456502 Discussão completa sobre os argumentos para colocar as archaeas no ramo filogenético que levou aos organismos multicelulares Budin I Szostak JW 2010 Expanding roles for diverse physical phenomena during the origin of life Annu Rev Biophysics 39 4563 Uma discussão cuidadosa dos fatores físicos que podem ter influenciado o curso da evolução prebiótica Carroll SB 2006 The Making of the Fittest DNA and the Ultimate Forensic Record of Evolution WW Norton Company Inc New York Cavicchioli R 2011 Archaeatimeline of the third domain Nat Rev Microbiol 9 5161 Descrição de nível intermediário da descoberta e investigação das archaeas de Duve C 1995 The beginnings of life on earth Am Sci 83 428437 Roteiro da sucessão dos passos químicos que levaram ao primeiro organismo vivo de Duve C 1996 The birth of complex cells Sci Am 274 April 5057 Evolution of Catalytic Function 1987 Cold Spring Harb Symp Quant Biol 52 Coleção de quase 100 artigos sobre todos os aspectos da evolução prebiótica e da evolução biológica inicial excelente fonte sobre evolução molecular Gesteland RF Atkins JF Cech TR eds 2006 The RNA World Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor NY Coleção de estimulantes revisões sobre uma ampla gama de tópicos relacionados ao roteiro do mundo do RNA Knoll AH 2003 Life on a Young Planet The First Three Billion Years of Evolution on Earth Princeton University Press Princeton Discussão dos estágios iniciais da evolução com ênfase na geoquímica do meio ambiente no qual ela ocorreu Lazcano A Miller SL 1996 The origin and early evolution of life prebiotic chemistry the prerrNA world and time Cell 85 793798 Nelson6edbookindb 40 Nelson6edbookindb 40 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 41 Breve revisão do desenvolvimento dos estudos da origem da vida atmosfera primitiva fontes hidrotermais submarinas origem autotrófica versus origem heterotrófica os mundos do RNA e pré RNA e o tempo requerido para a vida surgir Martin W Baross J Kelley D Russel MJ 2008 Hydrothermal vents and the origin of life Nat Rev Microbiol 6 805814 Miller SL 1987 Which organic compounds could have occurred on the prebiotic earth Cold Spring Harb Symp Quant Biol 52 1727 Resumo de experimentos de laboratório sobre evolução química pela pessoa que realizou o experimento original de MillerUrey Noireaux V Maeda YT Libchaber A 2011 Development of an artificial cell from selforganization to computation and self reproduction Proc Natl acad Sci USA 108 34733480 Discussão interessante dos passos que devem ser tomados do início ao fim para produzir uma célula viva Parker ET Cleaves HJ Dworkin JP Glavin DP Callahan M Aubrey A Lazcano A Bada JL 2011 Primordial synthesis of amines and amino acids in a 1958 Miller H2S rich spark discharge experiment Proc Natl Acad Sci USA 108 55265531 Reexame moderno das amostras geradas em experimentos de 1958 por Miller usando H2S como um dos gases atmosféricos Stiller JW 2007 Plastid endosymbiosis genome evolution and the origin of green plants Trends Plant Sci 12 391396 Woese CR 2002 On the evolution of cells Proc Natl Acad Sci USA 99 87428747 Revisão curta e clara Woese CR 2004 A new biology for a new century Microbiol Mol Biol Rev 68 173186 Desenvolvimento do pensamento atual sobre a evolução celular por um dos mais destacados pensadores dessa área Woese CR Kandler O Wheelis ML 1990 Towards a natural system of organisms proposal for the domains Archaea Bacteria and Eucarya Proc Natl Acad Sci USA 87 45764579 Os argumentos para dividir todos os organismos vivos em três grupos Problemas Seguem alguns problemas relacionados ao conteúdo do capí tulo Para solucionar os problemas de final de capítulo o lei tor pode consultar a contracapa da obra Cada problema tem um título para facilitar a referência e discussão Para todos os problemas numéricos mantenha em mente que as respostas devem ser expressas com número correto de algarismos signi ficativos Respostas resumidas estão no Apêndice B 1 O tamanho das células e seus componentes a Se você for ampliar uma célula 10000 vezes ampliação típica conseguida no microscópio eletrônico quão grande isso seria Considere que você está vendo uma célula eucariótica típica com um diâmetro celular de 50 mm b Se essa célula for uma célula muscular miócito quan tas moléculas de actina ela poderia conter Assuma que a cé lula é esférica e que mais nenhum outro componente celular está presente moléculas de actina são esféricas com 36 nm de diâmetro O volume da esfera é de 43 pr 3 c Se essa fosse uma célula do fígado hepatócito com as mesmas dimensões quantas mitocôndrias ela poderia conter Considere que a célula é esférica nenhum outro componente celular está presente e a mitocôndria é esférica com 15 mm de diâmetro d A glicose é o principal nutriente produtor de energia para a maioria das células Assumindo uma concentração ce lular de 1 mM isto é 1 milimolL calcule quantas moléculas de glicose podem estar presentes na nossa célula eucariótica hipotética e esférica O número de Avogadro o número de moléculas em 1 mol de substância não ionizada é 602 3 10 23 e Hexocinase é uma enzima importante no metabolismo da glicose Se a concentração de hexocinase nessa célula euca riótica for de 20 mM quantas moléculas de glicose estão pre sentes para cada molécula de hexocinase 2 Componentes da E coli Células de E coli em forma de bastão têm cerca de 2 mm de comprimento e 08 mm de diâmetro O volume de um cilindro é pr 2 h onde h é a altura do cilindro a Se a densidade média da E coli na maior parte água é 11 3 10 3 gL qual é a massa de uma única célula b E coli tem um envelope de proteção celular de 10 nm de espessura Qual porcentagem do volume total da bactéria é ocupada pelo envelope c E coli é capaz de crescer e se multiplicar rapidamente porque contém cerca de 15000 ribossomos esféricos diâme tros de 18 nm que realizam a síntese de proteínas Qual por centagem do volume celular é ocupada pelos ribossomos 3 Informação genética no DNA da E coli A informa ção genética contida no DNA consiste em uma sequência linear de unidades codificantes conhecida como códon Cada códon é uma sequência específica de três desoxirribonucleotídeos três pares de desoxirribonucleotídeos no DNA fita dupla e cada códon codifica uma unidade de aminoácido na proteína O peso molecular de uma molécula de DNA de E coli é de cerca de 31 3 10 9 gmol O peso molecular médio do par de nucleotí deo é 660 gmol e cada par de nucleotídeo contribui com 034 nm de comprimento do DNA a Calcule o comprimento de uma molécula de DNA da E coli Compare o comprimento da molécula de DNA com as di mensões da célula ver Problema 2 Como a molécula de DNA cabe dentro da célula b Assumindo que uma proteína média na E coli consiste em uma cadeia de 400 aminoácidos qual é o número máximo de proteínas que podem ser codificadas por uma molécula de DNA de E coli 4 A alta taxa do metabolismo bacteriano As células bacterianas têm taxa de metabolismo muito mais alta que as células animais Sob condições ideais algumas bactérias do bram de tamanho e se dividem a cada 20 minutos enquanto muitas células animais sob condições de crescimento rápido requerem 24 horas A alta taxa do metabolismo bacteriano re quer uma elevada relação área de superfícievolume celular a Por que a relação superfícievolume afeta a taxa máxi ma do metabolismo b Calcule a relação superfícievolume para a bactéria Neisseria gonorrhoeae esférica 05 mm de diâmetro res ponsável pela doença gonorreia Comparea com a relação superfícievolume da ameba globular uma grande célula eu cariótica 150 mm de diâmetro A área da superfície de uma esfera é dada por 4 pr 2 5 O transporte rápido dos axônios Os neurônios têm uma fina e longa extensão chamada de axônio estrutura es pecializada em conduzir sinais através do sistema nervoso do organismo Alguns axônios podem ter 2 m de comprimento p ex os axônios que se originam na medula espinal e ter Nelson6edbookindb 41 Nelson6edbookindb 41 020414 1842 020414 1842 42 DAVID L NELSON MICHAEL M COX minam nos músculos dos dedos dos pés Pequenas vesículas envoltas por membrana e que carregam materiais essenciais para o funcionamento do axônio se movem ao longo de micro túbulos do citoesqueleto desde o corpo celular até a extremi dade dos axônios Se a velocidade média de uma vesícula é de 1 ms quanto tempo levará para a vesícula se mover do corpo celular que está localizado na medula espinal até a ponta axo nal nos dedos 6 A vitamina C sintética é tão boa quanto a vitamina natural Uma alegação manifestada por alguns fornecedo res de alimentos naturais é a de que as vitaminas obtidas de fontes naturais são mais saudáveis do que as obtidas por síntese química Por exemplo o ácido Lascórbico vitamina C puro extraído dos frutos da roseira silvestre seria melhor do que o ácido Lascórbico puro produzido pela indústria química Existe alguma diferença entre as vitaminas das duas fontes Pode o corpo distinguir a fonte de origem das vitaminas 7 Identificação de grupos funcionais As Figuras 116 e 117 mostram alguns grupos funcionais comuns de biomolécu las Devido ao fato de as propriedades e atividades biológicas das biomoléculas serem basicamente determinadas pelos seus grupos funcionais é importante poder identificálas Em cada um dos compostos abaixo circule e identifique o nome de cada grupo funcional H H H H C C OH H H C OH H C C C O O P OH H H C C OH HO 2O COO2 COO2 O2 H H H H C OH H3N 1 H3N 1 NH3 1 CH3 H3C CH3 CH2 H C H H H H H C C C C C CH2 C C O O C O OH OH OH HO NH CH2OH CH2OH Etanolamina a Glicerol b c Fosfoenolpiruvato intermediário no metabolismo da glicose Treonina aminoácido d Pantotenato vitamina Dglicosamida e f 8 Atividade de fármacos e estereoquímica As di ferenças quantitativas na atividade biológica entre dois enantiômeros de um composto algumas vezes são enormes Por exemplo o isômero D do fármaco isoproterenol usado no tratamento de asma leve é de 50 a 80 vezes mais efetivo como broncodilatador do que o L isômero Identifique o centro quiral no isoproterenol Por que os dois enantiômeros têm bioativida des tão radicalmente diferentes Isoproterenol 9 Separação de biomoléculas No estudo de uma biomo lécula particular proteína ácido nucleico carboidrato ou lipí deo no laboratório o bioquímico primeiro precisa separála das outras moléculas da amostra isto é precisa purificála Técnicas de purificação específicas são descritas mais adiante no texto Entretanto olhandose as subunidades monoméricas de uma biomolécula temse alguma ideia sobre as caracterís ticas da molécula que vão permitir separála das outras molé culas Por exemplo como você separaria a aminoácidos de ácidos graxos e b nucleotídeos de glicose 10 Vida baseada em silício O silício está no mesmo gru po do carbono na tabela periódica e tal como o carbono pode formar até quatro ligações simples Muitas histórias de ficção científica tem se baseado na premissa da vida baseada em silí cio Será que isso é possível Quais características do silício o tornam menos adaptado que o carbono como elemento central de organização da vida Para responder considere o que você aprendeu sobre a versatilidade de ligação do carbono e con sulte um livrotexto introdutório de química inorgânica sobre propriedades de ligação do silício 11 A ação dos fármacos e a forma das moléculas Há alguns anos duas companhias farmacêuticas introdu ziram no mercado um fármaco sob os nomes comerciais Dexe drina e Benzedrina A estrutura do fármaco é mostrada abaixo As propriedades físicas análise de C H e N ponto de fu são solubilidade etc da Dexedrine e de Benzedrine eram idênticas A dose oral recomendada de Dexedrine que ainda está disponível era de 5 mgdia mas a dose recomendada de Benzedrine não mais disponível era duas vezes esse valor Aparentemente havia uma necessidade bem maior de Benze drina do que de Dexedrina para produzir a mesma resposta fisiológica Explique essa aparente contradição 12 Componentes de biomoléculas complexas A Fi gura 110 mostra os principais componentes de biomoléculas complexas Para cada uma das três importantes biomoléculas a seguir mostradas na sua forma ionizada em pH fisiológico identifique os constituintes a Trifosfato de guanosina GTP nucleotídeo rico em energia que serve como precursor do RNA P O O2 O P O O2 O O H 2 N C O NH NH2 H H H CH OH O H N N 2O O P O O2 Nelson6edbookindb 42 Nelson6edbookindb 42 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 43 b Encefalinametionina o ópio do cérebro HO CH2 C H NH2 C O N H C H H C O N H H C O N H C H C O N H C H C C S CH3 H2 H2 COO2 CH2 H C c Fosfatidilcolina componente de muitas membranas CH3 1N P O O2 O H C CH2 CH2 O CH2 O C O CH2 CH 7 C C O C CH214 CH3 H H O CH27 3 CH2 CH3 CH3 13 Determinação da estrutura de uma biomolécula Uma substância desconhecida X foi isolada de músculo de co elho Sua estrutura foi determinada a partir das seguintes ob servações e experimentos A análise qualitativa mostrou que X era inteiramente composta por C H e O Uma amostra de X foi pesada e oxidada completamente e H2O e CO2 produzidos fo ram medidos esta análise quantitativa revelou que X continha 4000 de C 671 de H e 5329 de O em peso A massa mole cular de X determinada por espectrometria de massa foi 9000 u unidades de massa atômica ver Quadro 11 Espectroscopia infravermelha mostrou que X continha uma dupla ligação X dis solveu prontamente em água produzindo uma solução ácida que demonstrou atividade óptica quando testada no polarímetro a Determine a fórmula empírica e molecular de X b Desenhe as possíveis estruturas de X que se ajustam à fórmula molecular e contêm uma ligação dupla Considere somente estruturas lineares e ramificadas e despreze estrutu ras cíclicas Observe que o oxigênio faz ligações muito pobres consigo mesmo c Qual é o significado estrutural da atividade óptica ob servada Quais estruturas em b são consistentes com a ob servação d Qual é o significado estrutural da observação de que a solução de X era ácida Quais estruturas em b são consisten tes com a observação e Qual é a estrutura de X Mais de uma estrutura é con sistente com todos os dados 14 Nomenclatura de estereoisômeros com um carbono quiral usando o sistema RS Propranolol é um composto quiral RPropranolol é usado como contraceptivo Spro pranolol é usado no tratamento da hipertensão Identifique o carbono quiral na estrutura abaixo Esse é o isômero R ou S Desenhe o outro isômero O N H OH 15 Nomenclatura de estereoisômeros com dois car bonos quirais usando o sistema RS O isômero RR do metilfenidato Ritalina é usado para tratar o transtorno de déficit de atençãohiperatividade TDAH O isômero SS é um antidepressivo Identifique os dois carbonos quirais na es trutura abaixo Este é o isômero RR ou SS Desenhe o outro isômero HN O H O Problemas de análise de dados 16 Interação de moléculas de sabor doce com recep tores para sabor Muitos compostos têm gosto doce para humanos O gosto doce resulta quando uma molécula se liga ao receptor doce um tipo de receptor de sabor na superfície de certas células da língua Quanto mais forte a ligação menor a concentração requerida para saturar o receptor e mais doce será o gosto da uma substância em uma dada concentração A energia livre padrão DG da reação de ligação entre uma molécula doce e um receptor para sabor doce pode ser medida em quilojoules ou quilocalorias por mol O gosto doce pode ser quantificado em unidades de doçu ra molar relativa DMR uma medida que compara a doçura de uma substância com a doçura da sacarose Por exemplo a sacarina tem uma DMR de 161 isso significa que a sacarina é 161 vezes mais doce que a sacarose Em termos práticos isso é medido pedindose a voluntários humanos para comparar a do çura de soluções contendo diferentes concentrações de cada composto Os gostos da sacarose e da sacarina são igualmente doces quando a sacarose está na concentração 161 vezes maior do que a da sacarina a Qual é a relação entre DMR e DG da reação de ligação Especificamente um DG mais negativo corresponde a uma DMR maior ou menor Explique seu raciocínio A seguir é mostrada a estrutura de 10 compostos todos de sabor doce para humanos A DMR e o DG de ligação ao recep tor para doce são dados para cada substância Desoxissacarose DMR 5 095 DG8 5 2667 kcalmol H H H H H H H H O O H OH OH OH OH OH HO HO O Sacarose DMR 5 1 DG8 5 2671 kcalmol H H HO H H H H H O O H OH OH OH OH OH HO HO O Nelson6edbookindb 43 Nelson6edbookindb 43 020414 1842 020414 1842 44 DAVID L NELSON MICHAEL M COX DTriptofano DMR 5 21 DG8 5 285 kcalmol OH N H O NH2 Sacarina DMR 5 161 DG8 5 297 kcalmol S O O O NH Aspartame DMR 5 172 DG8 5 297 kcalmol H N O O O O OH CH3 NH2 6CloroDtriptofano DMR 5 906 DG8 5 2107 kcalmol OH Cl N H O NH2 Alitame DMR 5 1937 DG8 5 2111 kcalmol H N H N O O OH NH2 O S Neotame DMR 5 11057 DG8 5 2121 kcalmol H N O O O O OH CH3 NH Tetrabromossacarose DMR 5 13012 DG8 5 2122 kcalmol H Br HO H H H H H O O H Br Br OH OH OH HO Br O Ácido sucrônico DMR 5 200000 DG 8 5 2138 kcalmol H N H N O2N C9H17 HN HO O Morini Bassoli e Temussi 2005 utilizaram métodos com putacionais frequentemente referidos como métodos in silico para modelar a ligação de moléculas doces a recepto res para doce b Por que é útil ter um modelo de computador para pre dizer a doçura de moléculas em vez de ensaios de sabor usan dose humanos e animais Em um trabalho anterior Schallenberger e Acree 1967 sugeriram que todas as moléculas doces incluem o grupo estru tural AHB no qual A e B são átomos eletronegativos sepa rados por uma distância maior que 25 Å 025 nm mas menor que 4 Å 04 nm H é um átomo de hidrogênio ligado a um dos átomos eletronegativos por uma ligação covalente c Dado que o comprimento de uma ligação simples típi ca é de cerca de 015 nm identifique os grupos AHB em cada molécula mostrada à esquerda d Com base em seus resultados de c dê duas objeções à afirmação de que moléculas contendo uma estrutura AHB terão gosto doce e Para duas das moléculas mostradas aqui o modelo AHB pode ser usado para explicar a diferença de valores de DMR e DG Quais são essas duas moléculas e como você as usaria para defender o modelo AHB f Muitas das moléculas têm estruturas parecidas mas va lores de DMR e DG muito diferentes Dê dois exemplos e use os para argumentar que o modelo AHB é incapaz de explicar as diferenças observadas na doçura Em seus estudos de modelos computacionais Morini e colaboradores usaram a estrutura tridimensional do receptor doce e um programa de modelagem de dinâmica molecular chamado de GRAMM para predizer o DG da ligação de mo léculas doces ao receptor de doce Primeiro eles treinaram seu modelo isto é aprimoraram os parâmetros de modo que os valores de DG preditos pelo modelo se ajustavam ao valor conhecido de DG para um conjunto de moléculas doces con junto de treino Em seguida testaram o modelo indagando a predição dos valores de DG para um novo conjunto de molé culas conjunto de teste g Por que Morini e colaboradores tiveram que testar seu modelo com um conjunto de moléculas diferentes do conjunto de moléculas usadas para treinar o modelo h Os pesquisadores constataram que os valores de DG previstos para o conjunto de teste diferiram dos valores corre tos na média em 13 kcalmol Usando os valores dados para as estruturas moleculares apresentadas estime o erro resul tante nos valores de DMR Referências Morini G Bassoli A Temussi PA 2005 From small sweeteners to sweet proteins anatomy of the binding sites of the human T1R2T1R3 receptor J Med Chem 48 55205529 Schallenberger RS Acree TE 1967 Molecular theory of sweet taste Nature 216 480482 Nelson6edbookindb 44 Nelson6edbookindb 44 020414 1842 020414 1842 2 Água 47 3 Aminoácidos Peptídeos e Proteínas 75 4 Estrutura tridimensional de proteínas 115 5 Função proteica 157 6 Enzimas 189 7 Carboidratos e glicobiologia 243 8 Nucleotídeos e ácidos nucleicos 281 9 Tecnologias de informação com base no DNA 313 10 Lipídeos 357 11 Membranas biológicas e transporte 385 12 Biossinalização 433 A bioquímica não é nada menos que a química da vida e sim a vida pode ser investigada analisada e com preendida Para iniciar todo estudante de bioquímica precisa tanto de uma linguagem quanto de alguns funda mentos isso é fornecido na Parte I Os capítulos da Parte I são dedicados à estrutura e à função das principais classes de constituintes celulares água Capítulo 2 aminoácidos e proteínas Capítulos 3 a 6 açúcares e polissacarídeos Capítulo 7 nucleotídeos e ácidos nucleicos Capítulo 8 ácidos graxos e lipídeos Ca pítulo 10 e finalmente membranas e proteínas sinalizado ras de membrana Capítulos 11 e 12 Também é discutida no contexto de estrutura e função a tecnologia utilizada para estudar cada tipo de biomolécula Um capítulo inteiro Capítulo 9 é dedicado às biotecnologias associadas com a clonagem e a genômica O Capítulo 2 aborda a água porque suas propriedades afetam a estrutura e a função de todos os outros constituin tes celulares Para cada classe de moléculas orgânicas pri meiro será considerada a química covalente das unidades monoméricas aminoácidos monossacarídeos nucleotí deos e ácidos graxos e então descrita a estrutura das ma cromoléculas e dos complexos supramoleculares derivados dessas Um tema relevante é que as macromoléculas poli méricas em sistemas vivos embora grandes são entidades químicas altamente ordenadas com sequências específicas de subunidades monoméricas que lhes conferem estruturas distintas e funcionais Esse tema fundamental pode ser sub dividido em três princípios interrelacionados 1 a estru tura única de cada macromolécula determina sua função 2 as interações não covalentes exercem o papel essencial na estrutura e por isso na função das macromoléculas e 3 as subunidades monoméricas em macromoléculas poli méricas ocorrem em sequências específicas representando uma forma de informação da qual o estado ordenado vivo depende A relação entre a estrutura e a função é especialmen te evidente em proteínas que exibem uma extraordinária diversidade de funções Uma determinada sequência poli mérica de aminoácidos produz uma estrutura fibrosa forte encontrada no cabelo e na lã outra produz uma proteína que transporta oxigênio no sangue uma terceira liga ou tras proteínas e catalisa a clivagem das ligações entre seus aminoácidos Similarmente as funções especiais de polis sacarídeos de ácidos nucleicos e de lipídeos podem ser compreendidas como o resultado direto da sua estrutura química com suas subunidades monoméricas característi cas ligadas precisamente para formar polímeros funcionais Açúcares ligados entre si se tornam depósitos de energia de fibras estruturais e de pontos para reconhecimentos mo leculares específicos nucleotídeos enfileirados ao longo do DNA ou do RNA fornecem as informações para um orga nismo inteiro e lipídeos agregados formam membranas O Capítulo 12 unifica a discussão da função das biomoléculas descrevendo como os sistemas sinalizadores específicos re gulam as atividades das biomoléculas dentro de uma cé lula dentro de um órgão e entre órgãos para manter um organismo em homeostasia PARTE I Estrutura e Catálise Nelson6ed02indd 45 Nelson6ed02indd 45 020514 1713 020514 1713 46 DAVID L NELSON MICHAEL M COX À medida que se passa das unidades monoméricas para os polímeros sempre maiores o foco químico muda de li gações covalentes para interações não covalentes As liga ções covalentes em nível monomérico e macromolecular impõem restrições ao formato assumido pelas biomoléculas grandes São as numerosas interações não covalentes con tudo que ditam a conformação nativa estável das moléculas grandes ao mesmo tempo em que permitem a flexibilidade necessária para a sua função biológica Como será visto in terações não covalentes são essenciais ao poder catalítico das enzimas à crítica interação entre bases complemen tares nos ácidos nucleicos e ao arranjo e propriedades de lipídeos e membranas O princípio de que sequências de subunidades monoméricas são ricas em informação fica mais evidente na discussão dos ácidos nucleicos Capítulo 8 No entanto as proteínas e alguns polímeros curtos de açúcares oligossacarídeos são também moléculas ricas em informação A sequência de aminoácidos é uma forma de informação que determina o enovelamento da proteína na sua estrutura tridimensional única que determina a sua função Alguns oligossacarídeos também têm sequências únicas e estruturas tridimensionais que são reconhecidas por outras macromoléculas Cada classe de moléculas tem uma hierarquia estrutural similar subunidades de estrutura fixa são conectadas por ligações de flexibilidade limitada para formar macromolé culas com estrutura tridimensional determinada por intera ções não covalentes Essas macromoléculas interagem para formar as estruturas supramoleculares e as organelas que permitem à célula desempenhar suas várias funções me tabólicas Juntas as moléculas descritas na Parte I são o material da vida Nelson6edbookindb 46 Nelson6edbookindb 46 020414 1842 020414 1842 21 Interações fracas em sistemas aquosos 47 22 Ionização da água e de ácidos e bases fracas 58 23 Tamponamento contra mudanças no pH em sistemas biológicos 63 24 Água como reagente 69 25 Ajuste do meio aquoso em organismos vivos 69 A água é a substância mais abundante nos sistemas vi vos constituindo mais de 70 do peso da maioria dos organismos O primeiro organismo vivo na Terra sem dúvida nasceu em ambiente aquoso e o curso da evolução tem sido moldado pelas propriedades do meio aquoso no qual a vida começou Este capítulo inicia com descrições das propriedades físicas e químicas da água às quais são adaptados todos os aspectos da estrutura e da função da célula As forças de atração entre as moléculas da água e a menor tendên cia da água em ionizar são de crucial importância para a estrutura e a função das biomoléculas Será revisado o tó pico da ionização em termos das constantes de equilíbrio pH e curvas de titulação sendo considerado como as so luções aquosas de ácidos fracos ou bases fracas e seus sais agem contra as mudanças de pH em sistemas biológicos A molécula de água e seus produtos de ionização H 1 e OH influenciam profundamente a estrutura a organização e as propriedades de todos os componentes celulares incluindo proteínas ácidos nucleicos e lipídeos As interações não co valentes responsáveis pela resistência e especificidade do reconhecimento entre as biomoléculas são decisivamente influenciadas pelas propriedades da água como solvente incluindo sua capacidade de formar ligações de hidrogênio com ela mesma e com solutos 21 Interações fracas em sistemas aquosos As ligações de hidrogênio entre moléculas de água forne cem as forças coesivas que fazem da água um líquido a tem peratura ambiente e um sólido cristalino gelo com arranjo altamente ordenado de moléculas em temperaturas frias As biomoléculas polares se dissolvem facilmente em água porque elas podem substituir interações entre as molécu las de água águaágua por interações energeticamente mais favoráveis entre a água e o soluto águasoluto Em contrapartida as biomoléculas apolares são muito pouco solúveis em água porque elas interferem nas interações do tipo águaágua mas são incapazes de formar interações do tipo águasoluto Em soluções aquosas moléculas apolares tendem a formar agregados Ligações de hidrogênio e in terações iônicas hidrofóbicas do grego medo de água e de van der Waals são individualmente fracas mas cole tivamente têm influência significativa nas estruturas tridi mensionais de proteínas ácidos nucleicos polissacarídeos e lipídeos de membranas As ligações de hidrogênio são responsáveis pelas propriedades incomuns da água A água tem ponto de fusão ebulição e calor de vaporização mais alto que os outros solventes comuns Tabela 21 Es sas propriedades incomuns são uma consequência da atra ção entre as moléculas de água adjacentes que oferecem à água líquida grande coesão interna A visualização da estru tura eletrônica da molécula de H2O revela a origem dessas atrações intermoleculares Cada átomo de hidrogênio de uma molécula de água compartilha um par de elétrons com o átomo central do oxi gênio A geometria da molécula é ditada pela forma dos or bitais eletrônicos mais externos do átomo de oxigênio que são similares aos orbitais ligantes sp 3 do carbono ver Figu ra 115 Esses orbitais descrevem um formato aproximado de tetraedro com um átomo de hidrogênio em cada um de dois vértices e pares de elétrons não compartilhados nos outros dois Figura 21a O ângulo de ligação HOH é de 1045 levemente menor que o ângulo 1095 de um tetraedro perfeito devido ao agrupamento dos orbitais não ligantes do átomo de oxigênio O núcleo do átomo de oxigênio atrai elétrons mais for temente que o núcleo de hidrogênio um próton ou seja o oxigênio é mais eletronegativo Isso significa que os elé trons compartilhados estão mais frequentemente nas vi zinhanças do átomo de oxigênio que os de hidrogênio O resultado desse compartilhamento desigual de elétrons é a formação de dois dipolos elétricos na molécula de água um ao longo de cada ligação OH cada hidrogênio carrega car ga parcial positiva d1 e o oxigênio carrega carga parcial negativa igual em magnitude à soma das duas cargas par ciais positivas 2d Como resultado existe uma atração 2 Água Nelson6ed02indd 47 Nelson6ed02indd 47 020514 1713 020514 1713 48 DAVID L NELSON MICHAEL M COX eletrostática entre o átomo de oxigênio de uma molécula de água e o hidrogênio de outra Figura 21b chamada de ligação de hidrogênio Ao longo deste livro as ligações de hidrogênio serão representadas com três linhas paralelas azuis como na Figura 21b Ligações de hidrogênio são relativamente fracas Aque las em água líquida têm energia de dissociação de li gação a energia requerida para quebrar uma ligação de cerca de 23 kJmol comparada com 470 kJmol para uma li gação covalente OH em água ou 348 kJmol para uma liga ção covalente CC A ligação de hidrogênio é cerca de 10 covalente devido às sobreposições nos orbitais de ligação e cerca de 90 eletrostática Em temperatura ambiente a energia térmica de uma solução aquosa a energia cinéti ca do movimento de átomos individuais e moléculas é da mesma ordem de magnitude que a requerida para quebrar ligações de hidrogênio Quando a água é aquecida o aumen to da temperatura se reflete no aumento da velocidade indi vidual das moléculas de água Em qualquer dado momento a maioria das moléculas na água líquida é ligada por hidro gênios mas o tempo de vida de cada ligação de hidrogênio é somente de 1 a 20 picossegundos 1 ps 5 10 12 s quando uma ligação de hidrogênio quebra outra ligação de hidro gênio se forma em 01 ps com a mesma molécula ou com outra A expressão flickering clusters agrupamentos osci lantes tem sido aplicada aos grupos de moléculas de água de vida curta interligadas por ligações de hidrogênio na água líquida A soma de todas as ligações de hidrogênio entre as moléculas de água confere à água líquida uma grande coesão interna Redes estendidas de moléculas de água unidas por ligações de hidrogênio também formam pontes entre solutos proteínas e ácidos nucleicos que permitem que as molécu las maiores interajam umas com as outras por distâncias de vários nanômetros sem se tocarem fisicamente O arranjo aproximadamente tetraédrico dos orbitais ao redor do átomo de oxigênio Figura 21a permite que cada molécula de água forme ligações de hidrogênio com até quatro moléculas de água vizinhas Na água líquida em temperatura ambiente e pressão atmosférica entretanto as moléculas de água estão desorganizadas e em movimento contínuo assim cada molécula forma ligação de hidrogê nio com somente 34 outras moléculas em média No gelo por outro lado cada molécula de água está fixa no espaço e forma ligações de hidrogênio com quatro outras moléculas formando uma estrutura de rede regular Figura 22 As ligações de hidrogênio são responsáveis pelo ponto de fusão relativamente alto da água pois muita energia térmica é ne cessária para quebrar uma proporção suficiente de ligações de hidrogênio de forma a desestabilizar a rede cristalina do gelo Tabela 21 Quando o gelo funde ou a água evapora o calor é retirado do sistema H2O sólido S H2O líquido DH 5 159 kJmol H2O líquido S H2O gasoso DH 5 1440 kJmol TABELA 21 Ponto de fusão ponto de ebulição e calor de vaporização de alguns solventes comuns Ponto de fusão ºC Ponto de ebulição ºC Calor de vaporização Jg Água 0 100 2260 Metanol CH3OH 98 65 1100 Etanol CH3CH2OH 117 78 854 Propanol CH3CH2CH2OC 127 97 687 Butanol CH3CH22CH2OC 90 117 590 Acetona CH3COCH3 95 56 523 Hexano CH3CH24CH3 98 69 423 Benzeno C6H6 6 80 394 Butano CH3CH22CH3 135 05 381 Clorofórmio CHCL3 63 61 247 A energia na forma de calor necessária para levar 10 g de um líquido no seu ponto de ebulição e na pressão atmosférica até seu estado gasoso na mesma temperatura Essa é uma medida direta da energia necessária para superar as forças de atração entre as moléculas na fase líquida 10458 Ligação de hidrogênio 0177 nm Ligação covalente 00965 nm H d1 d2 d2 d1 H O a b d1 d1 d2 d2 d1 d1 FIGURA 21 Estrutura da molécula de água a A natureza dipolar da molécula de água é mostrada em modelo de esfera e bastão as linhas tra cejadas representam os orbitais não ligantes Existe um arranjo aproximada mente tetraédrico dos pares de elétrons mais externos da camada ao redor do átomo de oxigênio os dois átomos de hidrogênio têm cargas parciais positivas localizadas d1 e o átomo de oxigênio tem carga parcial negativa d b Duas moléculas de H2O unidas por ligação de hidrogênio repre sentada aqui e ao longo deste livro por três linhas azuis entre o átomo de oxigênio da molécula mais acima e um átomo de hidrogênio da molécula mais abaixo As ligações de hidrogênio são mais longas e mais fracas que as ligações covalentes OH Nelson6edbookindb 48 Nelson6edbookindb 48 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 49 Durante a fusão ou a evaporação a entropia do sistema aquoso aumenta à medida que as disposições mais orde nadas das moléculas de água em forma de gelo passam a assumir disposições menos ordenadas no estado líquido ou completamente desordenadas no estado gasoso Em tem peratura ambiente tanto a fusão do gelo quanto a evapo ração da água ocorre espontaneamente a tendência das moléculas de água a associaremse por meio das ligações de hidrogênio é compensada pela tendência energética para a desordem Lembrese de que a energia livre DG deve ter um valor negativo para que um processo ocorra esponta neamente DG5 DH T DS onde DG representa a força motriz DH a variação de entalpia de formação e quebra de ligações e DS a variação no nível de desordem Como o DH é positivo para a fusão e a evaporação fica evidente que é o aumento na entropia DS que torna o DG negativo sendo responsável pela mudança de estado A água forma ligações de hidrogênio com solutos polares As ligações de hidrogênio não são exclusivas para a molé cula de água Elas se formam prontamente entre um áto mo eletronegativo aceptor de hidrogênio geralmente oxigênio ou nitrogênio e um átomo de hidrogênio ligado covalentemente a outro átomo eletronegativo doador de hidrogênio na mesma molécula ou em outra Figura 23 Átomos de hidrogênio covalentemente ligados a átomos de carbono não participam de ligações de hidrogênio porque o átomo de carbono é somente um pouco mais eletrone gativo que o hidrogênio e portanto a ligação CH é ape nas levemente polar A distinção explica por que o butanol CH3CH22CH2OH tem ponto de ebulição relativamente alto 117C enquanto o butano CH3CH22CH3 tem pon to de ebulição de apenas 05C O butanol tem um grupo polar hidroxila e portanto pode formar ligações de hidro gênio intermoleculares Biomoléculas polares não carrega das como os açúcares dissolvem rapidamente em água de vido ao efeito estabilizador das ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxila ou o oxigênio da carbonila do açúcar com as moléculas polares da água Alcoóis aldeídos ceto nas e compostos contendo ligações NH formam ligações de hidrogênio com moléculas de água Figura 24 e ten dem a ser solúveis em água FIGURA 22 Ligações de hidrogênio no gelo No gelo cada molécula de água forma quatro ligações de hidrogênio o máximo possível para uma molécula de água criando uma estrutura de rede regular Por outro lado na água líquida em temperatura ambiente e pressão atmosférica cada molécu la de água faz uma média de 34 ligações de hidrogênio com outras molécu las Essa rede cristalina regular faz o gelo ser menos denso que a água líquida portanto o gelo flutua na água líquida Doador de hidrogênio Aceptor de hidrogênio FIGURA 23 Ligações de hidrogênio comuns em sistemas biológicos O aceptor de hidrogênio geralmente é o oxigênio ou o nitrogênio o doador de hidrogênio é outro átomo eletronegativo Entre o grupo hidroxila de um álcool e água Entre o grupo carbonila de uma cetona e água Entre grupos peptídicos em polipeptídeos Entre bases complementares de DNA Timina Adenina FIGURA 24 Algumas ligações de hidrogênio de importância biológica Nelson6edbookindb 49 Nelson6edbookindb 49 020414 1842 020414 1842 50 DAVID L NELSON MICHAEL M COX As ligações de hidrogênio são mais fortes quando as mo léculas ligadas estão orientadas de forma a maximizar as interações eletrostáticas o que ocorre quando o átomo de hidrogênio e os dois átomos que o compartilham estão em linha reta isto é quando o átomo aceptor está alinhado com a ligação covalente entre o átomo doador e o hidrogênio Figura 25 Esse arranjo dispõe as cargas positivas do íon hidrogênio diretamente entre as duas cargas parciais negati vas As ligações de hidrogênio são portanto altamente dire cionais e capazes de manter duas moléculas ou grupos uni dos por ligações de hidrogênio em um arranjo de geometria específica Como será visto posteriormente essa proprieda de das ligações de hidrogênio confere estruturas tridimensio nais muito precisas a moléculas proteicas e ácidos nucleicos que têm muitas ligações de hidrogênio intramoleculares A água interage eletrostaticamente com solutos carregados A água é um solvente polar Ela dissolve prontamente a maioria das biomoléculas que em geral são compostos carregados ou polares Tabela 22 compostos que se dissolvem facilmente em água são hidrofílicos do grego que ama a água Em contrapartida solventes apolares como clorofórmio e benzeno são solventes ruins para bio moléculas polares mas dissolvem prontamente moléculas hidrofóbicas moléculas apolares como lipídeos e ceras A água dissolve sais como o NaCl pela hidratação e es tabilização dos íons Na 1 e Cl enfraquecendo as interações eletrostáticas entre eles e portanto neutralizando a sua tendência de se associar em uma rede cristalina Figura 26 A água também dissolve prontamente biomoléculas carregadas incluindo compostos com grupos funcionais como grupos carboxílicos ionizados COO aminas pro tonadas NH3 1 e ésteres de fosfato ou anidridos A água substitui as ligações de hidrogênio solutosoluto conectan do essas biomoléculas umas com as outras por ligações de hidrogênio solutoágua blindando as interações eletrostáti cas entre as moléculas de soluto A água é efetiva na blindagem de interações eletros táticas entre íons dissolvidos devido à sua alta constante dielétrica uma propriedade física que reflete o número de dipolos em um solvente A resistência ou força F das interações iônicas depende da magnitude das cargas Q da distância entre os grupos carregados r e da constante dielétrica que é adimensional do solvente no qual as interações ocorrem Para a água a 25C é 785 e para o solvente fortemente apolar benzeno é 46 Portanto as interações iônicas en tre os íons dissolvidos são muito mais fortes em ambiente menos polar A dependência do r 2 é tal que a atração ou repulsão iônica opera somente em pequenas distâncias na faixa de 10 a 40 nm dependendo da concentração do ele trólito quando o solvente é a água Ligação de hidrogênio forte Ligação de hidrogênio mais fraca FIGURA 25 Orientação das ligações de hidrogênio A atração entre as cargas elétricas parciais ver Figura 21 é máxima quando os três átomos en volvidos na ligação nesse caso O H e O estão dispostos em linha reta Quan do as partes ligadas por hidrogênio estão estruturalmente restritas p ex quando constituem parte de uma molécula de proteína isolada a geometria ideal talvez não seja possível e a ligação de hidrogênio resultante é mais fraca TABELA 22 Alguns exemplos de biomoléculas polares apolares e anfipáticas mostradas nas suas formas ionizadas em pH 7 Grupos polares Grupos apolares Apolar Polar Cera comum Glicose Anfipática Fenilalamina Glicina Aspartato Fosfatidilcolina Lactato Glicerol Nelson6edbookindb 50 Nelson6edbookindb 50 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 51 A entropia aumenta quando uma substância cristalina se dissolve Logo que um sal como o NaCl se dissolve os íons Na 1 e Cl abandonam a rede cristalina e adquirem uma liberdade mui to maior de movimento Figura 26 O aumento resultante na entropia do sistema grau de desordem é em grande par te responsável pela facilidade da dissolução dos sais como NaCl em água Em termos termodinâmicos a formação de uma solução ocorre com uma variação favorável de energia livre DG 5 DH T DS onde o DH tem baixo valor positivo e o T S tem alto valor positivo assim o DG é negativo Gases apolares são fracamente solúveis em água As moléculas de gases biologicamente importantes como CO2 O2 e N2 são apolares No caso de O2 e N2 os elétrons são compartilhados igualmente por ambos os átomos da li gação No CO2 cada ligação CO é polar mas os dois di polos estão em direções antagônicas e anulam um ao outro Tabela 23 A adição de moléculas da fase gasosa desor denada em uma solução aquosa restringe o movimento do gás e das moléculas de água e portanto representa um decréscimo de entropia A combinação entre a natureza apolar desses gases e o decréscimo de entropia quando eles entram na solução os tornam muito pouco solúveis em água Tabela 23 Alguns organismos têm proteínas transpor tadoras solúveis em água p ex hemoglobina e mioglobi na que facilitam o transporte de O2 O dióxido de carbono forma o ácido carbônico H2CO3 em solução aquosa que é transportado tanto como íon bicarbonato HCO3 como o íon bicarbonato livre solúvel em água 100 gL a 25C e ligado à hemoglobina Três outros gases NH3 NO e H2S também têm papéis biológicos em alguns organismos esses gases são polares se dissolvem facilmente em água e ioni zam em solução aquosa Compostos apolares forçam mudanças energeticamente desfavoráveis na estrutura da água Quando a água é misturada com benzeno ou hexano são formadas duas fases nenhum dos líquidos é solúvel no outro Compostos apolares como benzeno e hexano são hidrofóbicos incapazes de fazerem interações energeti camente favoráveis com moléculas de água podendo in terferir com as ligações de hidrogênio entre as moléculas de água Todas as moléculas ou íons em solução aquosa 1 Íon Na hidratado Íon Cl hidratado H2O Na1 Cl2 2 1 2 2 1 2 2 2 2 2 2 Observe a orientação não aleatória das moléculas de água 2 1 1 2 Cl2 2 Na1 2 FIGURA 26 A água como solvente A água dissol ve muitos sais cristalinos pela hidratação de seus íons A rede cristalina do NaCl é desfeita quando as moléculas de água se aglomeram ao redor dos íons Cl e Na 1 As car gas iônicas são parcialmente neutralizadas e as atrações eletrostáticas necessárias para a formação da rede são enfraquecidas TABELA 23 Solubilidade de alguns gases na água Gás Estrutura Polaridade Solubilidade em água gL Nitrogênio NN Apolar 0018 40ºC Oxigênio OO Apolar 0035 50ºC Dióxido de carbono Apolar 0097 45ºC Amônia Polar 900 10ºC Sulfeto de hidrogênio Polar 1860 40ºC As setas representam os dipolos elétricos existe uma carga parcial negativa d na ponta da seta e uma carga parcial positiva d 1 não mostrado aqui na outra extremidade Observe que as moléculas polares dissolvem melhor mesmo em temperaturas baixas que as moléculas apolares em temperaturas relativamente altas Nelson6edbookindb 51 Nelson6edbookindb 51 020414 1842 020414 1842 52 DAVID L NELSON MICHAEL M COX interferem com as ligações de hidrogênio de algumas mo léculas de água nas suas vizinhanças mas solutos polares ou carregados como NaCl compensam as interações de hidrogênio águaágua perdidas pela formação de novas in terações águasoluto A variação líquida em entalpia DH para a dissolução desses solutos geralmente é pequena Solutos hidrofóbicos entretanto não oferecem essa com pensação e a sua adição à água pode resultar em um pe queno ganho de entalpia a quebra das ligações de hidro gênio entre as moléculas de água retira energia do sistema requerendo a entrada de energia das vizinhanças Além da entrada de energia necessária a dissolução dos compostos hidrofóbicos em água produz um decréscimo mensurável na entropia As moléculas de água na vizinhança imedia ta de um soluto apolar são restringidas nas suas possíveis orientações já que formam um envoltório altamente orde nado no formato de gaiola ao redor de cada molécula do soluto Essas moléculas de água não estão altamente orien tadas como aquelas em clatratos compostos cristalinos de solutos apolares e água mas o efeito é o mesmo em am bos os casos o ordenamento das moléculas de água reduz a entropia O número de moléculas de água ordenadas e portanto a magnitude da redução da entropia são propor cionais à área da superfície do soluto hidrofóbico retido dentro da gaiola de moléculas de água A variação de ener gia livre para a dissolução de um soluto apolar é portanto desfavorável DG 5 DH T DS onde DH tem valor positivo DS tem valor negativo e DG é positivo Compostos anfipáticos contêm regiões polares ou carregadas e regiões apolares Tabela 22 Quando um composto anfipático é misturado com água a região polar hidrofílica interage favoravelmente com a água e tende a se dissolver mas a região apolar hidrofóbica tende a evitar con tato com a água Figura 27a As regiões apolares das mo léculas se aglomeram para apresentar a menor área hidro fóbica possível ao solvente aquoso e as regiões polares são arranjadas de forma a maximizar suas interações com o sol vente Figura 27b Essas estruturas estáveis de compostos anfipáticos em água chamados de micelas podem conter centenas ou milhares de moléculas As forças que mantêm as regiões apolares das moléculas unidas são chamadas de a Agrupamentos oscilantes de moléculas de H2O na fase aquosa Moléculas de água altamente ordenadas formam gaiolas ao redor das cadeias de grupos alquila hidrofóbicas Grupo polar hidrofílico O O C C H H H H O Grupo alquila hidrofóbico Dispersão de lipídeos em H2O Aglomerados de moléculas lipídicas Micelas b As moléculas de lipídeo forçam as moléculas de H2O circundantes a se tornarem altamente ordenadas Somente as porções lipídicas das extremidades do aglomerado forçam o ordenamento das moléculas de água Menos moléculas de H2O são ordenadas e a entropia aumenta Todos os grupos hidrofóbicos são afastados da água a superfície ordenada de moléculas de H2O é minimizada e a entropia aumenta mais FIGURA 27 Compostos anfipáticos em solução aquosa a Ácidos graxos de cadeia longa têm cadeias de grupos alquila muito hidrofóbicas cada qual envolta por uma camada de moléculas de água altamente orde nadas b Pela aglomeração conjunta em micelas as moléculas de ácidos graxos expõem a menor área superficial possível na água e menos molécu las de água serão necessárias na camada de água ordenada A energia ga nha pela liberação das moléculas de água até então imobilizadas estabiliza a micela Nelson6edbookindb 52 Nelson6edbookindb 52 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 53 interações hidrofóbicas A força das interações hidrofóbi cas não é decorrente de nenhuma atração intrínseca entre as partes apolares Em parte é resultado da maior estabili dade termodinâmica que o sistema atinge pela minimização do número de moléculas de água requeridas para envolver as porções hidrofóbicas das moléculas de soluto Muitas biomoléculas são anfipáticas proteínas pig mentos certas vitaminas e os esteroides e fosfolipídeos de membranas apresentam regiões polares e apolares As estruturas formadas por essas moléculas são estabilizadas por interações hidrofóbicas entre as regiões apolares As interações hidrofóbicas entre os lipídeos e entre lipídeos e proteínas são as mais importantes na determinação da estrutura de membranas biológicas Interações hidrofóbicas entre aminoácidos apolares também estabilizam as estrutu ras tridimensionais das proteínas As ligações de hidrogênio entre a água e os solutos po lares também causam um ordenamento das moléculas de água mas o efeito energético é menos significativo que com solutos apolares A ruptura de moléculas de água ordena das é parte da força motriz para a ligação de um substrato polar reagente a uma superfície polar complementar de uma enzima a entropia aumenta quando a enzima desloca moléculas de água ordenadas do substrato e o substrato desloca moléculas de água ordenadas da superfície da enzi ma Figura 28 As interações de van der Waals são atrações interatômicas fracas Quando dois átomos não carregados são colocados bem pró ximos um do outro as suas nuvens eletrônicas influenciam uma a outra Variações aleatórias nas posições dos elétrons ao redor do núcleo podem criar um dipolo transitório elétri co que induz à formação de um dipolo transiente de carga oposta no átomo mais próximo a ele Os dois dipolos atraem se fracamente um ao outro aproximando os dois núcleos Essas atrações fracas são chamadas de interações de van der Waals também conhecidas como forças de London À medida que os dois núcleos se aproximam as nuvens ele trônicas começam a repelir uma a outra Nesse ponto no qual a atração líquida é máxima dizse que o núcleo está em contato de van der Waals Cada átomo tem um raio de van der Waals característico uma medida do quão próximo um átomo permite que outro se aproxime Tabela 24 No caso dos modelos moleculares de volume atômico mostrados nes se livro os átomos estão representados em tamanhos pro porcionais aos seus raios de van der Waals Substrato Enzima Água desordenada deslocada pela interação entre enzima e substrato Água ordenada interagindo com substrato e enzima Interação enzimasubstrato estabilizada pelas ligações de hidrogênio e interações iônicas e hidrofóbicas FIGURA 28 A liberação de água ordenada favorece a formação de um complexo enzimasubstrato A enzima e o substrato quando separa dos forçam as moléculas de água vizinhas a formar uma camada ordenada A ligação do substrato com a enzima libera algumas dessas águas ordena das e o aumento resultante na entropia favorece termodinamicamente a formação do complexo enzimasubstrato ver p 198 TABELA 24 Raios de van der Waals e raios covalentes ligação simples de alguns elementos Elementos Raio de van der Waals nm Raio covalente para ligações simples nm H 011 0030 O 015 0066 N 015 0070 C 017 0077 S 018 0104 P 019 0110 I 021 0133 Fontes Para os raios de van der Waals Chauvin R 1992 Explicit periodic trend on van der Waals Radii J Phys Chem 96 91949197 Para os raios co valentes Pauling L 1960 Nature of the Chemical Bond 3rd edn Cornell University Press Ithaca NY Nota Os raios de van der Waals descrevem as dimensões de volume atômico dos átomos Quando dois átomos estão ligados covalentemente os raios atômicos no ponto da ligação são menores que os raios de van der Waals porque os átomos unidos são aproximados pelo par de elétrons compartilhados A distância entre os núcleos em uma interação de van der Waals ou uma ligação covalente é apro ximadamente igual à soma dos raios de van der Waals ou covalentes respectiva mente para os dois átomos Portanto o comprimento de uma ligação carbono carbono simples é de cerca de 0077 nm 1 0077 nm 5 0154 nm Nelson6edbookindb 53 Nelson6edbookindb 53 020414 1842 020414 1842 54 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Interações fracas são cruciais para a estrutura e a função das macromoléculas À medida que os métodos da química estrutural forem apli cados em problemas fisiológicos eu acredito será descoberto que a importância das ligações de hidrogênio para a fisiologia é maior do que qualquer outra característica estrutural Linus Pauling A natureza das ligações químicas 1939 As interações não covalentes descritas ligações de hidro gênio e interações iônicas hidrofóbicas e de van der Waals Tabela 25 são muito mais fracas que as ligações cova lentes É necessário o fornecimento de 350 kJ de energia para quebrar um mol 6 3 10 23 de ligações simples do tipo CC e cerca de 410 kJ de energia para quebrar um mol de ligações CH mas uma quantidade pequena como 4 kJ é suficiente para romper um mol de interações típicas de van der Waals As interações hidrofóbicas são também muito mais fracas que as ligações covalentes embora elas sejam substancialmente fortalecidas por um solvente alta mente polar p ex solução salina concentrada Intera ções iônicas e ligações de hidrogênio são variáveis em força dependendo da polaridade do solvente e do alinhamento dos átomos ligados ao hidrogênio mas são sempre muito mais fracas que as ligações covalentes Em solvente aquoso a 25ºC a energia térmica disponível pode ser da mesma or dem de grandeza que a força dessas interações fracas e as interações entre as moléculas de soluto e solvente água são quase tão favoráveis quanto as interações solutosoluto Consequentemente ligações de hidrogênio e interações iô nicas hidrofóbicas e de van der Waals estão continuamente se formando e quebrando Apesar de esses quatro tipos de interações serem in dividualmente fracos em relação às ligações covalentes o efeito cumulativo de muitas interações desse tipo pode ser muito significativo Por exemplo a ligação não covalente de uma enzima a um substrato pode envolver muitas ligações de hidrogênio e uma ou mais interações iônicas assim como interações hidrofóbicas e de van der Waals A formação de cada uma dessas ligações fracas contribui para um decrés cimo líquido de energia livre do sistema É possível calcular a estabilidade de uma interação não covalente como a das ligações de hidrogênio de uma molécula pequena com uma macromolécula a partir da energia de ligação a redução na energia do sistema quando a ligação ocorre A estabilidade como medida pela constante de equilíbrio da reação da liga ção ver a seguir varia exponencialmente com a energia de ligação Para desassociar duas biomoléculas como en zima e substrato que são associadas de forma não cova lente por meio de múltiplas interações fracas todas essas interações devem ser rompidas ao mesmo tempo Devido ao fato de as interações flutuarem aleatoriamente tais rup turas simultâneas são bem improváveis Portanto 5 ou 20 interações fracas concedem muito maior estabilidade mole cular em relação ao que poderia se esperar intuitivamente a partir de uma simples soma de todas as energias de ligação pequenas Macromoléculas como proteínas DNA e RNA contêm tantos sítios potenciais para ligações de hidrogênio ou in terações iônicas de van der Waals ou hidrofóbicas que os efeitos cumulativos dessas forças de ligação de menor or dem podem ser enormes Para macromoléculas a estrutura mais estável ou seja a nativa em geral é aquela em que as interações fracas são maximizadas O enovelamento de um único polipeptídeo ou uma cadeia polinucleotídica em sua forma tridimensional é determinado por esse princípio A ligação de um antígeno a um anticorpo específico de pende dos efeitos cumulativos de muitas interações fracas Como observado anteriormente a energia liberada quando uma enzima se liga não covalentemente ao seu substrato é a principal fonte do poder catalítico da enzima A ligação de um hormônio ou um neurotransmissor ao seu recep tor proteico celular é o resultado de múltiplas interações fracas Uma consequência do grande tamanho de enzimas e receptores em relação aos substratos e ligantes é que suas grandes superfícies geram muitas oportunidades para a formação de interações fracas No nível molecular a com plementaridade da interação entre as biomoléculas reflete a complementaridade e as forças de natureza fraca entre grupos polares carregados e hidrofóbicos na superfície das moléculas Quando a estrutura de uma proteína como a hemoglobi na Figura 29 é determinada por cristalografia ver Qua dro 45 moléculas de água são com frequência encontradas tão fortemente ligadas que fazem parte da estrutura do cris tal o mesmo é verdadeiro para a água em cristais de RNA ou DNA Essas moléculas de água ligadas que podem também ser detectadas em soluções aquosas por ressonância magné tica nuclear têm propriedades bem diferentes daquelas das moléculas da massa do solvente Elas não são por exemplo osmoticamente ativas ver a seguir Para muitas proteínas a presença de moléculas de água fortemente ligadas é essen TABELA 25 Os quatro tipos de interações não covalentes fracas entre biomoléculas em solvente aquoso Ligações de hidrogênio Entre grupos neutros Entre ligações peptídicas Interações iônicas Atração Repulsão Interações hidrofóbicas Interações de van der Waals Dois átomos quaisquer bem pró ximos um do outro Nelson6edbookindb 54 Nelson6edbookindb 54 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 55 cial para a sua função Na reaçãochave da fotossíntese por exemplo prótons correm através de uma membrana biológi ca na medida em que a luz direciona o fluxo de elétrons por uma série de proteínas transportadoras de elétrons ver Fi gura 1962 Uma dessas proteínas o citocromo f tem uma cadeia de cinco moléculas de água ligada Figura 210 que pode fornecer um caminho para os prótons se moverem através da membrana por um processo chamado de salto de prótons descrito a seguir Outra bomba de prótons movida pela luz a bacteriorrodopsina usa uma cadeia de moléculas de água precisamente orientadas no movimento de prótons através da membrana Figura 1969b Molécu las de hidrogênio fortemente ligadas também podem formar uma parte essencial do sítio de ligação de uma proteína com suas moléculas Na proteína arabinose bacterialligante por exemplo cinco moléculas de água formam ligações de hi drogênio que fornecem ligações cruzadas críticas entre o açúcar arabinose e os resíduos de aminoácido no local de ligação do açúcar Figura 211 Solutos afetam as propriedades coligativas de soluções aquosas Solutos de todos os tipos modificam algumas propriedades físicas do solvente a água a pressão de vapor o ponto de ebulição e de fusão ponto de congelamento e a pressão osmótica São chamadas de propriedades coligativas associadas porque o efeito de solutos nas quatro pro priedades tem o mesmo princípio a concentração da água é mais baixa nas soluções do que na água pura O efeito da concentração do soluto nas propriedades coligativas da água é independente das propriedades químicas do soluto dependendo somente do número de partículas de soluto moléculas íons para uma dada quantidade de água Por exemplo um composto como o NaCl que se dissocia em so lução tem um efeito na pressão osmótica duas vezes maior que o número de moléculas de um soluto não dissociado como a glicose a b FIGURA 29 Ligação da água na hemoglobina PDB ID 1A3N A estru tura cristalina da hemoglobina mostrada a com moléculas de água ligadas esferas vermelhas e b sem as moléculas de água As moléculas de água estão ligadas tão firmemente que afetam o padrão de difração de raios X apesar de serem partes fixas do cristal As duas subunidades a da hemo globina estão mostradas em cinza e as duas subunidades b em azul Cada subunidade tem um grupo heme ligado estrutura em bastão vermelho visível somente nas subunidades b nesta visualização A estrutura e a função da hemoglobina são discutidas em detalhes no Capítulo 5 Asn232 Arg156 Asn168 Asn153 Semi propionato NH2 Gln158 Gln59 Val60 Water H H H H H H H H N H O O O O O O O O O O N N N N HN HN Fe H H HO C C H H N Ala27 Pro231 FIGURA 210 Cadeias de água no citocromo f A água é ligada em um canal de prótons da proteína de membrana citocromo f que é parte da ma quinaria de fixação de energia da fotossíntese em cloroplastos ver Figura 19 61 Cinco moléculas de água estão unidas por ligações de hidrogênio umas às outras e aos grupos funcionais da proteína os átomos da cadeia peptídica de resíduos de valina prolina arginina e alanina e os grupos laterais de três resíduos de asparagina e dois resíduos de glutamina A proteína tem um grupo heme ligado ver Figura 51 e o íon ferro desse grupo facilita o fluxo de elétrons durante a fotossíntese O fluxo de elétrons é acoplado ao movi mento dos prótons pela membrana o que provavelmente envolve saltos de prótons ver Figura 214 por essa cadeia de moléculas de água ligadas O O Asn232 H H H H H H O H HO OH OH HO O N N N NH Asp235 O Asn205 Thr208 H H O N H HN H H N Gln11 Lys10 Asp90 O NH2 1 2 2 2 2 1 Glu14 O O Asp89 Met108 Met204 Arg151 Thr147 O O O O O O O H N FIGURA 211 Água unida por ligação de hidrogênio como parte do sítio de ligação do açúcar a uma proteína Na proteína ligante Larabi nose da bactéria E Coli cinco moléculas de água são componentes essen ciais na rede de ligações de hidrogênio entre o açúcar arabinose centro e no mínimo 13 resíduos de aminoácidos no local de ligação do açúcar Visto em três dimensões esses três grupos de interações constituem duas cama das de semiconexões resíduos de aminoácidos na primeira camada são mar cados em vermelho na segunda camada em verde Algumas ligações de hidrogênio são desenhadas mais longas que outras por clareza elas não são mais longas que as outras na realidade Nelson6edbookindb 55 Nelson6edbookindb 55 020414 1842 020414 1842 56 DAVID L NELSON MICHAEL M COX As moléculas de água tendem a se mover de uma re gião de maior concentração de água para uma de menor concentração de acordo com a tendência na natureza para um sistema se tornar desordenado Quando duas soluções aquosas são separadas por uma membrana semipermeável que permite a passagem de água mas não de moléculas de soluto a difusão das moléculas de água da região de maior concentração para a região de menor concentração de água produz pressão osmótica Figura 212 Pressão osmótica p medida como a força necessária para resistir ao movimento da água Figura 212c é aproximada pela equação de vant Hoff p 5 icRT na qual R é a constante dos gases e T a temperatura abso luta O símbolo i é fator de vant Hoff que é a medida de quanto de soluto se dissocia em duas ou mais espécies iô nicas O termo ic é a osmolaridade da solução o produto do fator de vant Hoff i e a concentração molar do soluto c Em soluções diluídas de NaCl o soluto se dissocia comple tamente em Na 1 e Cl dobrando o número de partículas de soluto sendo portanto i5 2 Para todos solutos não ioni záveis i 5 1 Para soluções com vários n solutos p é a soma da contribuição de cada espécie p 5 RT i1c1 1 i2c2 1 1 incn Osmose o movimento da água através de uma mem brana semipermeável ocasionado por diferenças na pressão osmótica é um fator importante na vida de grande parte das células As membranas plasmáticas são mais permeá veis à água que a maioria das outras moléculas pequenas íons e macromoléculas porque os canais proteicos aqua porinas ver Figura 1145 na membrana seletivamente permitem a passagem de água Soluções com osmolaridade igual à do citosol de uma célula são ditas isotônicas em relação àquela célula Circundada por uma solução isotôni ca uma célula nunca ganha ou perde água Figura 213 Em soluções hipertônicas com maior osmolaridade que o citosol a célula encolhe assim que a água se transfere para fora Em soluções hipotônicas com menor osmolari dade que o citosol a célula incha assim que a água entra Nos seus ambientes naturais as células geralmente contêm maior concentração de biomoléculas e íons que nas suas vi zinhanças logo a pressão osmótica tende a enviar a água para dentro das células Se não estiver de alguma forma contrabalançada essa invasão de água para dentro das cé lulas pode distender a membrana plasmática e no final cau sar o rompimento celular osmólise Muitos mecanismos estão envolvidos na prevenção des sa catástrofe Em bactérias e plantas a membrana plas mática é envolvida por uma parede de célula não expan sível com rigidez e força suficientes para resistir à pressão osmótica e prevenir a osmólise Alguns protistas de água doce que vivem em meio altamente hipotônico têm uma organela vacúolo contrátil que bombeia a água para fora da célula Em animais multicelulares o plasma sanguíneo e os fluidos intersticiais o fluido extracelular dos tecidos h Êmbolo Soluto não permeante dissolvido em água Água pura Força P que resiste à osmose Membrana semipermeável a b c FIGURA 212 Osmose e a medida da pressão osmótica a O estado inicial O tubo contém uma solução aquosa o béquer contém água pura e a membrana semipermeável permite a passagem de água mas não de soluto A água flui a partir do béquer para dentro do tubo para equalizar a sua concentração através da membrana b O estado final A água se moveu para a solução do composto não permeante diluiuo e aumentou o nível de água na coluna dentro do tubo No equilíbrio a força da gravidade que atua sobre a solução do tubo equilibra a tendência da água de se mover para dentro do tubo onde sua concentração é menor c A pressão osmótica p é medida como a força que deve ser aplicada para que a solução no tubo retorne ao nível que estava no béquer Essa força é proporcional à altura h da coluna em b b Célula em solução hipertônica a água se movimenta para fora e a célula encolhe c Célula em solução hipotônica a água se movimenta para dentro criando uma pressão para fora a célula incha podendo no final romperse a Célula em solução isotônica nenhum movimento de água resultante Solutos extracelulares Solutos intracelulares FIGURA 213 Efeito da osmolaridade extracelular no movimento da água através de uma membrana plasmática Quando uma célula em balanço osmótico com o meio circundante isto é uma célula em a um meio isotônico é transferida para b uma solução hipertônica ou c uma solução hipotônica a água tende a se mover através da membrana na dire ção que deve igualar a osmolaridade nos lados externo e interno da célula Nelson6edbookindb 56 Nelson6edbookindb 56 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 57 são mantidos em osmolaridade semelhante à do citosol A alta concentração de albumina e outras proteínas no plasma sanguíneo contribuem para a sua osmolaridade As células também bombeiam ativamente para fora Na 1 e outros íons para o fluido intersticial para que permaneça o equilíbrio osmótico com o meio circundante Como o efeito dos solutos na osmolaridade depende do número de partículas dissolvidas e não da sua massa as macromoléculas proteínas ácidos nucleicos polissaca rídeos têm efeito muito menor na osmolaridade de uma solução que teria uma massa equivalente dos seus compo nentes monoméricos Por exemplo um grama de um po lissacarídeo composto por 1000 unidades de glicose tem o mesmo efeito na osmolaridade que um miligrama de glicose O armazenamento de energia na forma de polissa carídeos amido ou glicogênio em vez de glicose ou outros açúcares simples evita um grande aumento na pressão os mótica nas células de armazenamento As plantas usam a pressão osmótica para atingir a rigi dez mecânica A alta concentração de soluto nos vacúolos das células da planta arrasta água para dentro das células Figura 213 mas a parede celular não é expansível e pre vine o inchamento em vez disso a pressão exercida contra a parede celular pressão de turgor aumenta enrijecendo a célula o tecido e o corpo da planta A alface da sua salada murcha devido à perda de água que reduziu a pressão de turgor A osmólise também tem consequências em protoco los de laboratório Mitocôndrias cloroplastos e lisossomos por exemplo estão revestidos por membranas semipermeá veis Ao isolar essas organelas a partir de células rompidas os bioquímicos devem fazer os fracionamentos em soluções isotônicas ver Figura 18 para prevenir entrada de água excessiva para dentro das organelas podendo causar o in chamento e por conseguinte o rompimento Tampões usa dos em fracionamento geralmente contêm concentrações suficientes de sacarose ou algum outro soluto inerte para proteger as organelas da osmólise PROBLEMA RESOLVIDO 21 Força osmótica de uma organela I Suponha que os principais solutos dos lisossomos intactos são KCl 01 M e NaCl 003 M Ao isolar os lisosso mos qual concentração de sacarose é requerida na solução externa em temperatura ambiente 25ºC para prevenir o inchamento e a lise das organelas Solução É preciso encontrar a concentração de sacarose que resulta em uma força osmótica igual à produzida pelos sais KCl e NaCl dentro dos lisossomos A equação para calcular a força osmótica a equação de vant Hoff é p 5 RT i1c1 1 i2c2 1 i3c3 1 1 incn na qual R é a constante dos gases 8315 Jmol K T é a tem peratura absoluta Kelvin c1 c2 e c3 são as concentrações molares de cada soluto e i1 i2 e i3 são os números de par tículas de cada soluto em solução i 5 2 para KCl e NaCl A pressão osmótica do conteúdo do lisossomo é plisossomo 5 RT iKClcKCl 1 iNaClcNaCl 5 RT 201 molL 1 2003 molL 5 RT 026 molL A pressão osmótica de uma solução de sacarose é dada por psacarose 5 RT isacarosecsacarose Nesse caso isacarose 5 1 porque a solução de sacarose não se ioniza Portanto psacarose 5 RT csacarose A força osmótica do conteúdo do lisossomo é igual à da so lução de sacarose quando psacarose 5 plisossomo RTcsacarose 5 RT 026 molL csacarose 5 026 molL Assim a concentração necessária de sacarose mmol 342 é 026 molL 342 gmol5 8892 gL Usando a precisão de um algarismo significativo para a concentração do solu to csacarose5009 kgL PROBLEMA RESOLVIDO 22 Força osmótica de uma organela II Suponha que se decida usar uma solução de um polissa carídeo como o glicogênio ver p 255 para equilibrar a pressão osmótica dos lisossomos descritos no Problema Resolvido 21 Considerando um polímero linear de 100 unidades de glicose calcule a quantidade desse polímero necessária para atingir a mesma pressão osmótica da so lução de sacarose do Problema 21 A Mr do polímero de glicose é 18000 e como a sacarose não se ioniza em solução Solução Como obtido no Problema Resolvido 21 psacarose 5 RT 026 molL Da mesma forma pglicogênio 5 RT iglicogêniocglicogênio 5 RT cglicogênio Para uma solução de glicogênio com força osmótica igual à da solução de sacarose pglicogênio 5 psacarose RT cglicogênio 5 RT 026 molL cglicogênio 5 026 molL 5 026 molL18000 gmol 5 468 kgL Ou considerando algarismos significativos cglicogênio5 5 kgL uma concentração absurdamente alta Como será visto mais adiante p 256 células do fígado e do músculo armazenam carboidratos não na forma de açú cares de baixa massa molecular como glicose ou sacarose mas na forma de glicogênio polímero de alta massa mole cular Isso permite que uma célula contenha maior massa de glicogênio com mínimo efeito na osmolaridade do citosol RESUMO 21 Interações fracas em sistemas aquosos c A diferença entre a eletronegatividade do H e a do O torna a água uma molécula muito polar capaz de for mar ligações de hidrogênio entre suas moléculas e com solutos As ligações de hidrogênio são curtas basica mente eletrostáticas e mais fracas que as ligações cova lentes A água é um bom solvente para solutos polares Nelson6edbookindb 57 Nelson6edbookindb 57 020414 1842 020414 1842 58 DAVID L NELSON MICHAEL M COX hidrofílicos com os quais forma ligações de hidrogê nio e para solutos carregados com os quais forma inte rações eletrostáticas c Compostos apolares hidrofóbicos se dissolvem fra camente em água eles não formam ligações de hi drogênio com o solvente e a sua presença força um ordenamento energeticamente desfavorável de molé culas de água nas suas superfícies hidrofóbicas Para minimizar a superfície exposta à água os compostos apolares como os lipídeos formam agregados micelas nos quais as porções hidrofóbicas são sequestradas no seu interior associandose por meio de interações hi drofóbicas e somente a parte mais polar interage com a água c Interações fracas e não covalentes em grande número influenciam decisivamente o enovelamento de macro moléculas como proteínas e ácidos nucleicos As confor mações mais estáveis são aquelas nas quais as ligações de hidrogênio são maximizadas dentro da molécula e entre a molécula e o solvente e nas quais as partes hi drofóbicas se agregam no interior das moléculas longe do solvente aquoso c As propriedades físicas das soluções aquosas são forte mente influenciadas pelas concentrações dos solutos Quando dois compartimentos aquosos são separados por uma membrana semipermeável como a membrana plasmática que separa uma célula do seu meio a água se move através da membrana para igualar a osmolari dade nos dois compartimentos Essa tendência da água em se mover através de uma membrana semipermeável produz a pressão osmótica 22 Ionização da água e de ácidos e bases fracas Embora muitas das propriedades de solvente da água pos sam ser explicadas em termos da molécula de água não carregada o pequeno grau de ionização da água em seus íons H 1 e OH deve também ser levado em considera ção Como todas as reações reversíveis a ionização da água pode ser descrita por uma constante de equilíbrio Quan do ácidos fracos são dissolvidos na água eles contribuem com um H 1 por ionização bases fracas consomem um H 1 se tornando protonadas Esses processos também são go vernados por constantes de equilíbrio A concentração total dos íons hidrogênio a partir de todas as fontes é experimen talmente mensurável sendo expressa como o pH da solu ção Para predizer o estado de ionização de solutos na água devemse considerar as constantes de equilíbrio relevantes para cada reação de ionização Por isso será feita uma bre ve discussão sobre a ionização da água e de ácidos e bases fracas dissolvidas em água A água pura é levemente ionizada As moléculas de água têm a leve tendência de sofrer uma ionização reversível produzindo um íon hidrogênio pró ton e um íon hidróxido gerando o equilíbrio H2O H 1 1 OH 21 Apesar de geralmente se mostrar o produto de dissociação da água como H 1 os prótons livres não existem em solu ção os íons hidrogênio formados em água são imediata mente hidratados para formar íons hidrônio H3O 1 As ligações de hidrogênio entre as moléculas de água fazem com que a hidratação dos prótons dissociados seja pratica mente instantânea A ionização da água pode ser medida pela sua con dutividade elétrica a água pura carrega corrente elétri ca enquanto o H3O 1 migra para o cátodo e OH para o ânodo O movimento dos íons hidrônio e hidróxido no campo elétrico é extremamente rápido comparado com o de outros íons como Na 1 K 1 e Cl Essa alta mobilidade iônica resulta do tipo de salto de prótons mostrado na Figura 214 Os prótons individuais não se movem para muito longe na solução mas uma série de prótons salta entre as moléculas de água ligadas por hidrogênio e gera um movimento líquido de prótons por uma longa distân cia em um tempo extremamente curto OH também se move rapidamente por saltos mas na direção oposta Como resultado da alta mobilidade iônica do H 1 reações acidobásicas em soluções aquosas são excepcionalmente rápidas Como observado anteriormente o salto de pró O O O O O O O H H Salto do próton Íon hidrônio entrega um próton Água aceita um próton e se torna um íon hidrônio H H H H H H H H H H H H H H O H FIGURA 214 Salto de prótons Pequenos saltos de prótons entre uma série de moléculas de água ligadas por hidrogênio resultam em um movi mento líquido extremamente rápido de um próton em uma longa distância Como o íon hidrônio parte de cima à esquerda doa um próton uma molé cula de água a certa distância à direita inferior adquire um se tornando um íon hidrônio O salto de prótons é muito mais rápido que a difusão verdadei ra e explica a mobilidade iônica incrivelmente alta dos íons H 1comparados com outros cátions monovalentes como Na 1 e K 1 Nelson6edbookindb 58 Nelson6edbookindb 58 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 59 tons muito provavelmente exerce uma função nas rea ções biológicas de transferência de prótons Figura 210 ver também Figura 1969b Desde que a ionização reversível é crucial para o papel da água na função celular deve haver meios de expressar a extensão da ionização da água em termos quantitativos Uma breve revisão de algumas propriedades de reações quí micas reversíveis mostra como isso pode ser feito A posição de equilíbrio de qualquer reação química é dada por sua constante de equilíbrio Keq algumas vezes expressa simplesmente por K Para a reação geral A 1 B C 1 D 22 a constante de equilíbrio Keq pode ser definida em termos da concentração dos reagentes A e B e dos produtos C e D no equilíbrio Estritamente falando os termos de concentração de vem ser expressos como atividades ou concentrações efetivas em soluções não ideais de cada espécie Exceto em trabalhos muito precisos entretanto a constante de equilíbrio pode ser aproximada pela medida das concen trações no equilíbrio Por razões além do escopo desta discussão as constantes de equilíbrio são adimensionais Apesar disso o texto continuará a utilizar as unidades de concentração M nas expressões da constante de equilí brio usadas nesse livro para lembrálos de que a molari dade é a unidade de concentração usada para o cálculo de Keq A constante de equilíbrio é fixa e característica para qualquer dada reação química em uma temperatura especí fica Ela define a composição final da mistura no equilíbrio independentemente das concentrações iniciais dos rea gentes e dos produtos Inversamente é possível calcular a constante de equilíbrio para uma dada reação em uma dada temperatura se forem conhecidas as concentrações de equilíbrio de todos os reagentes e produtos Como mostra do no Capítulo 1 p 26 a variação de energia livre padrão DGº é diretamente relacionada ao ln Keq A ionização da água é expressa pela constante de equilíbrio O grau de ionização da água no equilíbrio Equação 21 é baixo a 25ºC somente duas entre 10 9 moléculas na água pura são ionizadas a cada momento A constante de equilí brio para a ionização reversível da água é 23 Na água pura a 25ºC a concentração de água é 555 M gramas de H2O em 1 L divididas pela sua massa molecular grama 1000 gL18015 gmol sendo essencialmente constante em relação à concentração muito baixa de H 1 e OH de 1 3 10 7 M Portanto o valor de 555 M pode ser substituído na expressão da constante de equilíbrio Equa ção 23 gerando Rearranjando isso se torna 24 onde Kw designa o produto 555 M Keq que é o produto iônico da água a 25ºC O valor para o Keq determinado por medidas de condu tividade elétrica da água pura é 18 3 10 16 M a 25ºC Subs tituindo esse valor no Keq da Equação 24 temse o valor do produto iônico da água Kw 5 H 1OH 5 555 M18 3 10 16 M 5 10 3 10 14 M 2 Assim o produto H 1 OH em solução aquosa a 25ºC é sempre igual a 1 3 10 14 M 2 Quando existem concentrações iguais de H 1 e de OH como na água pura dizse que a so lução está em pH neutro Nesse pH a concentração de H 1 e de OH pode ser calculada a partir do produto iônico da água como se segue Kw 5 H 1OH 5 H 1 2 5 OH 2 Resolvendo para H 1 temse Como o produto iônico da água é constante quando H 1 é maior que 1 310 7 M a concentração de OH deve ser menor que 1 310 7 M e viceversa Quando a concentração de H 1 é muito alta como na solução de ácido clorídrico a concentração de OH deve ser bem baixa A partir do pro duto iônico da água podese calcular H 1 se for conhecida a concentração de OH e viceversa PROBLEMA RESOLVIDO 23 Cálculo de H 1 Qual é a concentração de H 1 em uma solução de 01 M de NaOH Solução Começase com a equação do produto iônico da água Kw 5 H 1OH Com OH 5 01 M resolvendo para a H 1 temse PROBLEMA RESOLVIDO 24 Cálculo de OH Qual é a concentração de OH em uma solução com uma concentração de H 1 de 13 3 10 4 M Solução Começase com a equação do produto iônico da água Kw 5 H 1OH Nelson6edbookindb 59 Nelson6edbookindb 59 020414 1842 020414 1842 60 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Com H 1 5 13 3 10 4 M resolvendo para a OH temse Em todos os cálculos certifiquese de arredondar a sua res posta para o número correto de algarismos significativos como acima A escala de pH indica as concentrações de H 1 e OH O produto iônico da água Kw é a base para a escala de pH Tabela 26 É um meio conveniente de designar a con centração de H 1 e portanto de OH em qualquer solução aquosa no intervalo de 10 M H 1 e 10 M OH O termo pH é definido pela expressão O símbolo p denota logaritmo negativo de Para uma so lução neutra a 25ºC na qual a concentração de íons hidro gênio é exatamente 10 3 10 7 M o pH pode ser calculado como se segue Observe que a concentração de H 1 deve ser expressa em termos molares M O valor de 7 para o pH de uma solução neutra não é um número escolhido arbitrariamente sendo derivado do valor absoluto do produto iônico da água a 25ºC que por uma coincidência conveniente é um valor inteiro Soluções com pH maior que 7 são alcalinas ou básicas a concentração de OH é maior que a de H 1 Inversamente soluções tendo pH menor que 7 são ácidas Lembrese que a escala de pH é logarítmica e não arit mética Se duas soluções diferem em pH por uma 1 uni dade isso significa que uma solução tem dez vezes mais a concentração de íons H 1 que a outra mas isso não indica a magnitude absoluta da diferença A Figura 215 fornece os valores de pH de alguns fluidos aquosos Um refrigerante de cola pH 30 ou um vinho tinto pH 37 têm uma con centração de íons H 1 de aproximadamente 10000 vezes a do sangue pH 74 O pH de uma solução aquosa pode ser medido por apro ximação usando vários tipos de indicadores coloridos in cluindo tornassol fenolftaleína e vermelho de fenol Essas substâncias passam por uma mudança de cor quando um próton se dissocia da molécula Determinações precisas do pH em laboratórios químicos ou clínicos são feitas com um eletrodo de vidro que é seletivamente sensível à concen tração dos íons H 1 mas insensível à concentração de Na 1 K 1 e outros cátions Em um pHmetro o sinal do eletrodo de vidro colocado em uma solução de teste é amplificado e comparado com o sinal gerado por uma solução de pH conhecido TABELA 26 A escala de pH H 1 M pH OH M pOH 10 01 0 10 14 14 10 1 1 10 13 13 10 2 2 10 12 12 10 3 3 10 11 11 10 4 4 10 10 10 10 5 5 10 9 9 10 6 6 10 8 8 10 7 7 10 7 7 10 8 8 10 6 6 10 9 9 10 5 5 10 10 10 10 4 4 10 11 11 10 3 3 10 12 12 10 2 2 10 13 13 10 1 1 10 14 14 10 01 0 A expressão pOH é algumas vezes usada para descrever a alcalinidade ou con centração de OH de uma solução o pOH é definido pela expressão pOH 5 log OH que é análoga à expressão para o pH Observe que em todos os casos pH 1 pOH 5 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Limpadores à base de alvejante Limpadores à base de amônia Solução de bicarbonato de sódio NaHCO3 Água do mar clara de ovo Sangue humano lágrimas Leite saliva Café preto Cerveja Vinho tinto Refrigerantes de cola vinagre Suco de limão Suco gástrico 1 M HCl 14 1 M NaOH Neutro Alcalinidade crescente Acidez crescente FIGURA 215 O pH de alguns fluidos aquosos Nelson6edbookindb 60 Nelson6edbookindb 60 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 61 A medida do pH é um dos procedimentos mais impor tantes e usados com mais frequência na bioquímica O pH afeta a estrutura e a atividade de macromoléculas bioló gicas por exemplo a atividade catalítica das enzimas é ex tremamente dependente do pH ver Figura 222 As medi das do pH do sangue e da urina são comumente usadas em diagnóstico médico O pH do plasma sanguíneo das pessoas com diabetes grave e não controlado é comumente abaixo do valor normal de 74 essa condição é chamada de acidose descrita com maior detalhes a seguir Em algu mas outras doenças o pH sanguíneo é mais alto que o nor mal uma condição conhecida como alcalose A acidose ou a alcalose extremas podem ameaçar a vida Ácidos e bases fracas têm constantes de dissociação ácidas características Os ácidos clorídrico sulfúrico e nítrico comumente chama dos de ácidos fortes são completamente ionizados em solu ções aquosas diluídas as bases fortes NaOH e KOH também são completamente ionizadas O que mais interessa aos bio químicos é o comportamento de ácidos e bases não comple tamente ionizados quando dissolvidos em água Eles estão presentes em sistemas biológicos e desempenham papéis importantes no metabolismo e na sua regulação O compor tamento de soluções aquosas de ácidos e bases fracas será mais bem compreendido definindo primeiramente alguns termos Os ácidos podem ser definidos como doadores de pró tons e as bases como aceptoras de prótons Quando um doador de prótons como o ácido acético CH3COOH perde um próton ele se torna o correspondente aceptor de pró tons nesse caso o ânion acetato CH3COO Um doador de prótons e seu correspondente aceptor de prótons consti tuem um par conjugado ácidobase Figura 216 con forme a reação reversível CH3COOH CH3COO 1 H 1 Cada ácido tem uma tendência característica de perder seu próton em uma solução aquosa e quanto mais forte for o ácido maior a tendência de perder seu próton A tendên cia de qualquer ácido HA de perder um próton e formar sua base conjugada A é definida pela constante de equi líbrio Keq para a reação reversível HA H 1 1 A para a qual Ácidos monopróticos Ácido acético Ka 5 174 3 1025 M Ácidos dipróticos Ácido carbônico Ka 5 170 3 1024 M Bicarbonato Ka 5 631 3 10211 M Ácidos tripróticos Ácido fosfórico Ka 5 725 3 1023 M Dihidrogêniofosfato Ka 5 138 3 1027 M Monohidrogêniofosfato Ka 5 398 3 10213 M Glicina grupo carboxila Ka 5 457 3 1023 M Glicina grupo amino Ka 5 251 3 10210 M Íon amônio Ka 5 562 3 10210 M pKa 5 476 pKa 5 377 pKa 5 102 pKa 5 925 pKa 5 214 pKa 5 686 pKa 5 124 pKa 5 234 pKa 5 960 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 pH CH3C OH O CH3C 1 O2 H1 O H2CO3 HCO3 2 1 H1 HCO3 2 CO3 22 1 H1 NH4 1 NH3 1 H1 H3PO4 H2PO4 2 1 H1 H2PO4 2 HPO4 22 1 H1 HPO4 22 PO4 32 1 H1 CH2C OH O CH2C 1 O2 H1 O NH3 1 NH3 1 CH2C O2 O CH2C 1 O2 H1 O NH3 1 NH2 FIGURA 216 Pares conjugados ácidobase consistem em um doador de prótons e um aceptor de prótons Alguns compostos como o ácido acético e íons amônio são monopróticos eles só podem doar um próton Outros são dipróticos ácido carbônico e glicina ou tripróticos ácido fosfóri co As reações de dissociação de cada par são mostradas onde elas ocorrem ao longo de um gradiente de pH A constante de equilíbrio ou dissociação Ka e seu logaritmo negativo o pKa são mostrados para cada reação Con sulte a p 67 para uma explicação sobre as aparentes discrepâncias dos valo res de pKa do ácido carbônico H2CO3 Nelson6edbookindb 61 Nelson6edbookindb 61 020414 1842 020414 1842 62 DAVID L NELSON MICHAEL M COX As constantes de equilíbrio para as reações de ionização são comumente chamadas de constantes de ionização ou constantes de dissociação ácidas frequentemente de signadas por Ka As constantes de dissociação de alguns áci dos são fornecidas na Figura 216 Ácidos mais fortes como os ácidos fosfórico e carbônico têm constantes de ioniza ção maiores ácidos mais fracos como o fosfato monohi drogenado HPO4 2 têm constantes de ionização menores Também presentes na Figura 216 estão os valores de pKa que é análogo ao pH e é definido pela equação Quanto mais forte a tendência de dissociar um próton mais forte será o ácido e mais baixo será o seu pKa Como será visto agora o pKa de qualquer ácido fraco pode ser determi nado facilmente As curvas de titulação revelam o pKa de ácidos fracos A titulação é usada para determinar a quantidade de um ácido em certa solução Um dado volume do ácido é titulado com uma solução de base forte geralmente hidróxido de sódio NaOH de concentração conhecida O NaOH é adi cionado em pequenos incrementos até o ácido ser consumi do neutralizado como determinado com um indicador ou um pHmetro A concentração do ácido na solução original pode ser calculada a partir do volume e da concentração de NaOH adicionado A quantidade de ácido e base na titula ção são comumente expressas em termo de equivalentes onde um equivalente é a quantidade de substância que irá reagir com ou suprir um mol de íons de hidrogênio em uma reação ácidobase Uma curva de pH contra a quantidade de NaOH adi cionada uma curva de titulação revela o pKa do ácido fraco Considere a titulação de uma solução 01 M de ácido acético com 01 M de NaOH a 25ºC Figura 217 Duas reações reversíveis de equilíbrio estão envolvidas no pro cesso aqui por simplicidade o ácido acético será designa do por HAc H2O H 1 1 OH 25 HAc H 1 1 Ac 26 O equilíbrio deve ocorrer simultaneamente obedecen do às características das constantes de equilíbrio que são respectivamente 27 28 No início da titulação antes da adição de NaOH o ácido acético já encontrase parcialmente ionizado em um valor que pode ser calculado a partir de sua constante de ioniza ção Equação 28 À medida que NaOH for sendo gradualmente introdu zido o íon OH adicionado se combina com os íons livres H 1 na solução para formar H2O em uma quantidade que satisfaz a relação de equilíbrio da Equação 27 Como os íons H 1 são removidos o HAc se dissocia um pouco mais para satisfazer sua própria constante de equilíbrio Equa ção 28 A titulação prossegue de forma que uma maior quantidade de HAc ioniza formando Ac na medida em que o NaOH é adicionado No ponto central da titulação no qual exatos 05 equivalentes de NaOH foram adiciona dos por equivalente do ácido metade do ácido acético ori ginal se dissociou de forma que a concentração de doado res de prótons HAc agora é igual à do aceptor de prótons Ac Nesse ponto central uma relação muito importante é estabelecida o pH da solução equimolar de ácido acéti co e de acetato é exatamente igual ao pKa do ácido acético pKa 5 476 Figuras 216 217 A base para essa rela ção que é válida para todos os ácidos fracos ficará clara em breve À medida que a titulação continua pela adição de mais NaOH o ácido acético não dissociado remanescente é con vertido em acetato O ponto final da titulação ocorre em pH próximo de 70 todo o ácido acético perdeu seus prótons para os íons OH para formar H2O e acetato Por meio da titulação os dois equilíbrios Equação 25 26 coexistem cada um obedecendo à sua constante de equilíbrio A Figura 218 compara as curvas de titulação de três ácidos fracos com constantes de ionização bem diferentes ácido acético pKa5 476 ácido fosfórico H2PO4 pKa 5 686 e íon amônio NH4 1 pKa 5 925 Embora as curvas 10 CH3COO2 CH3COOH pH 5 pKa 5 476 pH Região de tamponamento OH2 adicionado equivalentes 0 100 50 Percentual de titulação 9 8 7 3 2 1 00 02 03 04 05 06 07 08 09 01 CH3COOH 5 CH3COO2 pH 576 pH 376 6 5 4 FIGURA 217 A curva de titulação do ácido acético Depois da adição de cada incremento de NaOH à solução de ácido acético o pH da mistura é medido Esse valor é colocado em um gráfico em função da quantidade de NaOH adicionada expresso como a fração da concentração total requerida para converter todo o ácido acético CH3COOH na sua forma desprotonada acetato CH3COO Os pontos então obtidos geram a curva de titulação Nos retângulos estão mostradas as formas iônicas predominantes nos pontos designados No ponto central da titulação as concentrações de doadores de prótons e aceptores de prótons são iguais e o pH é numericamente igual ao pKa A zona sombreada é a região útil do poder tamponante geralmente entre 10 e 90 da titulação de um ácido fraco Nelson6edbookindb 62 Nelson6edbookindb 62 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 63 de titulação desses ácidos tenham a mesma forma elas são deslocadas ao longo do eixo do pH devido aos três ácidos possuírem diferentes forças O ácido acético com o maior Ka menor pKa dos três é o mais forte dos ácidos fracos perde seu próton mais prontamente ele já se encontra dissociado pela metade no pH 476 O dihidrogêniofosfato perde um próton menos prontamente estando dissociado pela metade no pH 686 O íon amônio é o ácido mais fraco dos três e só se encontra dissociado pela metade no pH 925 A curva de titulação de um ácido fraco mostra grafica mente que um ácido fraco e seu ânion um par conjugado ácidobase podem agir como um tampão conforme será descrito na próxima seção RESUMO 22 Ionização da água e de ácidos e bases fracas c A água pura se ioniza levemente formando número igual de íons hidrogênio íons hidrônio H3O 1 e íons hidróxi do A extensão da ionização é descrita pela constante de equilíbrio da qual o produto iô nico da água Kw é obtido A 25ºC Kw 5 H 1 OH 5 555 M Keq 5 10 14 M 2 c O pH de uma solução aquosa reflete em escala logarít mica a concentração de íons hidrogênio c Quanto maior a acidez de uma solução mais baixo é o pH Ácidos fracos se ionizam parcialmente para liberar um íon hidrogênio baixando portanto o pH de uma so lução aquosa Bases fracas aceitam um íon hidrogênio aumentando o pH A extensão desses processos é carac terística de cada ácido ou base fraca e é expressa como uma constante de dissociação ácida c O pKa expressa em uma escala logarítmica a força rela tiva de um ácido ou base fraca c Quanto mais forte o ácido menor é o seu valor de pKa quanto maior a base maior é o valor do pKa O pKa pode ser determinado experimentalmente é o pH no ponto central da curva de titulação para o ácido ou a base 23 Tamponamento contra mudanças no pH em sistemas biológicos Quase todos os processos biológicos são dependentes do pH uma pequena mudança no pH produz uma gran de mudança na velocidade do processo Isso é válido não somente para as muitas reações nas quais os íons H 1 são participantes diretos mas também para aquelas reações nas quais não existe aparentemente não há participação de íons H 1 As enzimas que catalisam reações celulares e muitas das moléculas nas quais elas agem contêm grupos ionizáveis com valores de pKa característicos Os grupos amino e carboxila protonados de aminoácidos e os grupos fosfato de nucleotídeos por exemplo agem como ácidos fracos o seu estado iônico é determinado pelo pH do meio circundante Quando um grupo ionizável é capturado no meio de uma proteína longe do solvente aquoso seu pKa ou o pKa aparente pode ser significativamente diferente do seu pH na água Como observado anteriormente as interações iônicas estão entre as forças que estabilizam a molécula da proteína e permitem que uma enzima reco nheça e se ligue ao seu substrato Células e organismos mantêm um pH citosólico especí fico e constante em geral perto de pH 7 mantendo bio moléculas em seu estado iônico otimizado Em organismos multicelulares o pH dos fluidos extracelulares também é rigorosamente regulado A constância do pH é atingida principalmente por tampões biológicos misturas de ácidos fracos e suas bases conjugadas 10 NH3 Ponto central da titulação Regiões de tampona mento pKa 5 925 NH3 NH1 45NH3 CH3COO2 pKa 5 686 pKa 5 476 CH3COOH 5 CH3COO2 CH3COOH pH 1025 576 376 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 00 05 04 03 02 01 06 07 08 09 H2PO4 2 5 HPO2 4 2 Fosfato Acetato NH4 1 H2PO4 2 825 786 586 HPO4 22 OH2 adicionado equivalentes 0 100 50 Percentual de titulação FIGURA 218 Comparação das curvas de titulação de três ácidos fra cos Aqui estão mostradas as curvas de titulação para CH3COOH H2PO4 e NH4 1 As formas iônicas predominantes nos pontos designados da titulação estão destacadas nos retângulos As regiões da capacidade tamponante estão indicadas à esquerda Os pares conjugados ácidobase são tampões efetivos entre aproximadamente 10 e 90 da neutralização das espécies do adoras de prótons Nelson6edbookindb 63 Nelson6edbookindb 63 020414 1842 020414 1842 64 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Tampões são misturas de ácidos fracos e suas bases conjugadas Tampões são sistemas aquosos que tendem a resistir a mudanças de pH quando pequenas quantidades de ácido H 1 ou base OH são adicionadas Um sistema tampão consiste em um ácido fraco o doador de prótons e sua base conjugada o aceptor de prótons Como um exem plo uma mistura de concentrações iguais de ácido acético e íons acetato encontradas no ponto central da titulação na Figura 217 é um sistema tampão Observe que a curva de titulação do ácido acético tem uma zona relativamente plana que se estende por cerca de uma unidade de pH em ambos os lados do seu pH do ponto central de 476 Nessa zona uma dada quantidade de H 1 ou OH adicionada ao sis tema tem muito menos efeito no pH que a mesma quantida de adicionada fora da zona Essa zona relativamente plana é a região de tamponamento do par tampão ácido acético acetato No ponto central da região de tamponamento no qual a concentração do doador de prótons ácido acético é exatamente igual à do aceptor de prótons acetato a for ça de tamponamento do sistema é máxima isto é seu pH muda menos pela adição de H 1 ou OH O pH nesse ponto na curva de titulação do ácido acético é igual ao seu pKa O pH do sistema tampão acetato muda levemente quando uma pequena quantidade de H 1 ou OH é adicionada mas essa mudança é muito pequena comparada com a mudança de pH que resultaria se a mesma quantidade de H 1 ou OH fosse adicionado à água pura ou a uma solução salina de um ácido forte e de uma base forte como NaCl que não tem poder tamponante O tamponamento resulta do equilíbrio entre duas rea ções reversíveis ocorrendo em uma solução de concentra ções quase iguais de doador de prótons e de seu aceptor de prótons conjugado A Figura 219 explica como um siste ma tampão funciona Sempre que H 1 ou OH é adicionado em um tampão o resultado é uma pequena mudança na razão das concentrações relativas dos ácidos fracos e seus ânions e portanto uma pequena mudança no pH O de créscimo na concentração de um componente do sistema é equilibrado exatamente pelo aumento do outro A soma dos componentes do tampão não muda somente a sua razão Cada par conjugado ácidobase tem uma zona de pH característica na qual é um tampão efetivo Figura 218 O par H2PO4 HPO4 2 tem um pKa de 686 e portanto pode servir como um sistema tampão efetivo entre os pHs 59 e 79 o par NH4 1NH3 com um pKa de 925 pode agir como um tampão em um intervalo de pH aproximado entre 83 e 103 A equação de HendersonHasselbalch relaciona o pH o pKa e a concentração do tampão As curvas de titulação do ácido acético H2PO4 e NH4 1 Fi gura 218 têm formas quase idênticas sugerindo que es sas curvas refletem uma lei ou relação fundamental De fato esse é o caso A forma da curva de titulação de qualquer áci do fraco é descrita pela equação de HendersonHasselbalch que é importante para o entendimento das ações do tampão e do equilíbrio acidobásico no sangue e nos tecidos dos ver tebrados Essa equação é simplesmente uma forma útil de reescrever a expressão para a constante de ionização de um ácido Para a ionização de um ácido fraco HA a equação de HendersonHasselbalch pode ser deduzida como se segue Primeiramente resolver para H 1 Usar o logaritmo negativo em ambos os lados da equação Substituir o pH por log H 1 e o pKa por log Ka Agora inverter log HAA o que envolve a mudança do sinal para obter a equação de HendersonHasselbalch 29 Essa equação é válida para as curvas de titulação de todos os ácidos fracos e permite deduzir algumas relações quan titativas importantes Por exemplo mostra por que o pKa de um ácido fraco é igual ao pH de uma solução no ponto central da titulação Nesse ponto HA 5 A e pH 5 pKa 1 log 1 5 pKa 1 0 5 pKa Kw 5 H1OH2 Ácido acético CH3COOH HAc Ac2 H1 OH2 H2O Acetato CH3COO2 H1Ac2 HAc Ka 5 FIGURA 219 O par ácido acéticoacetato como sistema tampão O sistema é capaz de absorver tanto H 1 quanto OH por meio da reversibili dade da reação de dissociação do ácido acético O doador de prótons ácido acético HAc contém uma reserva de H 1 que podem ser liberados para neutralizar uma adição de OH ao sistema formando H2O Isso acontece de vido ao produto H 1 OH exceder temporariamente o Kw 1 3 10 14 M 2 O equilíbrio rapidamente se ajusta para restaurar o produto a 1 3 10 14 M 2 a 25ºC reduzindo temporariamente a concentração de H 1 Agora o quocien te H 1AcHAc é menor que Ka então HAc se dissocia ainda mais para restaurar o equilíbrio Similarmente a base conjugada Ac pode reagir com íons H 1 adicionados ao sistema novamente as duas reações de ionização simultaneamente chegam ao equilíbrio Portanto o par conjugado ácido base como o ácido acético e o íon acetato tende a resistir a mudanças no pH quando pequenas quantidades de ácido ou base são adicionadas A ação tamponante é simplesmente a consequência de duas reações reversíveis acontecendo simultaneamente e atingindo os seus pontos de equilíbrio como determinado pelas suas constantes de equilíbrio Kw e Ka Nelson6edbookindb 64 Nelson6edbookindb 64 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 65 A equação de HendersonHasselbalch também permite 1 calcular o pKa dado o pH e a razão molar do doador e do aceptor de prótons 2 calcular o pH dado o pKa e a razão molar do doador e do aceptor de prótons e 3 calcular a razão molar entre doador e aceptor de prótons dados o pH e o pKa Ácidos ou bases fracas tamponam células e tecidos contra as mudanças de pH Os fluidos intracelulares ou extracelulares de organismos multicelulares têm como característica um pH quase cons tante A primeira linha de defesa dos organismos contra mu danças internas de pH é proporcionada por sistemas tampão O citoplasma da grande maioria das células contém altas concentrações de proteínas e essas proteínas contêm muitos aminoácidos com grupos funcionais que são ácidos fracos ou bases fracas Por exemplo a cadeia lateral da histidina Fi gura 220 tem um pKa de 60 e por isso pode existir tanto nas formas protonadas quanto nas desprotonadas próximo ao pH neutro Proteínas contendo resíduos de histidina por tanto são tampões efetivos próximo ao pH neutro PROBLEMA RESOLVIDO 25 Ionização da histidina Calcule a fração de histidina que tem a cadeia lateral imi dazólica protonada em pH de 73 Os valores de pKa para a histidina são pK1 5 18 pK2 imidazol 5 60 e pK35 92 ver Figura 312b Solução Os três grupos ionizáveis na histidina tem valores de pKa suficientemente diferentes de forma que o primei ro COOH é completamente ionizado antes do segundo imidazol protonado começar a dissociar um próton e o segundo ioniza completamente antes do terceiro NH3 1 começar a dissociar seu próton Com a equação de Hender sonHasselbalch é possível facilmente mostrar que um áci do fraco passa de 1 ionizado em 2 unidades de pH abaixo de seu pKa para 99 ionizado em 2 unidades de pH acima de seu pKa ver também Figura 312b No pH 73 o gru po carboxila da histidina está inteiramente desprotonado COO e o grupo aamino está completamente protona do Supõese que no pH 73 o único grupo que está par cialmente dissociado é o grupo imidazólico que pode estar protonado abreviado como HisH 1 ou não protonado His Aplicando a equação de HendersonHasselbalch Substituindo pK2 5 60 e pH 5 73 Isso dá a razão do His para HisH 1 20 para 1 nesse caso É necessário converter a fração da histidina que está na forma desprotonada His no pH 73 Essa fração é 2021 20 partes de His para cada 1 parte de HisH 1 em um total de 21 partes de histidina em qualquer forma ou cerca de 952 o resto 100 menos 952 é protonado aproxi madamente 5 Nucleotídeos como ATP assim como muitos metabóli tos de baixa massa molecular contêm grupos ionizáveis que podem contribuir para o poder tamponante do citoplasma Algumas organelas altamente especializadas e comparti mentos extracelulares apresentam altas concentrações de compostos que contribuem para a capacidade de tampona mento ácidos orgânicos tamponam os vacúolos das células das plantas amônia tampona a urina Dois tampões biológicos especialmente importantes são o sistema fosfato e o bicarbonato O tampão fosfato que age no citoplasma de todas as células consiste em H2PO4 como doador de prótons e HPO como aceptor de prótons O sistema tampão fosfato é mais efetivo em um pH perto de seu pKa de 686 Figuras 216 218 e portanto tende a resistir a mudanças de pH em um intervalo de 59 e 79 Esse é então um tampão efetivo em fluidos biológicos em mamíferos por exemplo fluidos extracelulares e a maioria dos compartimentos citoplasmáticos têm pH no intervalo de 69 a 74 PROBLEMA RESOLVIDO 26 Tampões fosfato a Qual é o pH de uma mistura de 0042 M de NaH2PO4 e 0058 M de Na2HPO4 Solução utilizase a equação de HendersonHasselbalch ex pressa aqui como Nesse caso o ácido a espécie que doa prótons é H2PO4 e a base conjugada a espécie que ganha um próton é HPO4 2 Substituindo as concentrações dadas de ácido e base conju gada e o pKa 686 pH 5 pH 7 Proteína Proteína FIGURA 220 Ionização da histidina O aminoácido histidina um com ponente das proteínas é um ácido fraco O pKa do nitrogênio protonado da cadeia lateral é 60 Nelson6ed02indd 65 Nelson6ed02indd 65 040614 1550 040614 1550 66 DAVID L NELSON MICHAEL M COX É possível verificar aproximadamente esse resultado Quando está presente mais base conjugada que ácido o áci do está mais que 50 titulado e portanto o pH está acima do pKa 686 onde o ácido está exatamente 50 titulado b Se 10 mL de solução NaOH 10 M é adicionado em um litro de tampão preparado como em a de quanto será a alteração do pH Solução Um litro do tampão contém 0042 mols de NaH2PO4 A adição de 10 mL de solução NaOH 10 M 0010 mol poderia titular uma quantidade equivalente 0010 mol de NaH2PO4 para Na2HPO4 resultando em 0032 mol de NaH2PO4 e 0068 mol de Na2HPO4 O novo pH é c Se 10 mL de solução NaOH 10 M é adicionado em um litro de água pura em pH 70 qual será o pH final Compare esse resultado com a resposta encontrada em b Solução O NaOH se dissocia completamente em Na 1 e OH gerando uma concentração de OH de 0010 molL 5 1 3 10 2 M O pOH é o logaritmo negativo de OH logo pOH 5 20 Dado que em todas as soluções pH 1 pOH 5 14 o pH da solução é 12 Assim uma quantidade de NaOH que aumenta o pH da água de 7 para 12 aumenta o pH de solução tamponada como em b de 70 para 72 Tal é o poder do tampona mento O plasma sanguíneo é tamponado em parte pelo siste ma tampão do bicarbonato consistindo em ácido carbônico H2CO3 como doador de prótons e bicarbonato HCO3 como aceptor de prótons K1 é a primeira de várias cons tantes de equilíbrio no sistema de tamponamento do bicar bonato Esse sistema tampão é mais complexo que outros pares ácidobase conjugados porque um de seus componentes ácido carbônico H2CO3 é formado a partir de dióxido de carbono dissolvido d e água em uma reação reversível O dióxido de carbono é um gás sob condições normais e CO2 dissolvido em uma solução aquosa está em equilíbrio com o CO2 em fase gasosa g O pH de uma solução tampão de bicarbonato depende da concentração de H2CO3 e HCO3 os componentes doador e receptor de prótons A concentração de H2CO3 por sua vez depende da concentração de CO2 na fase gasosa ou da pressão parcial de CO2 designada por pCO2 Portanto o pH de um tampão de bicarbonato exposto a uma fase gaso sa é determinado pela concentração de HCO3 na fase aquo sa e pela pCO2 na fase gasosa A solução tampão de bicarbonato é um tampão fisioló gico efetivo em pH próximo de 74 porque o H2CO3 do plasma sanguíneo está em equilíbrio com uma grande capa cidade de reserva de CO2 g no ar contido nos pulmões Como observado anteriormente esse sistema de tampona mento envolve três equilíbrios reversíveis nesse caso entre o CO2 gasoso nos pulmões e o bicarbonato HCO3 no plas ma sanguíneo Figura 221 O sangue pode recolher H 1 do ácido láctico produzido no tecido muscular durante um exercício vigoroso Alter nativamente ele pode perder H 1 na protonação do NH3 produzido durante o catabolismo das proteínas Quando H 1 é adicionado ao sangue à medida que passa pelos te cidos a reação 1 da Figura 221 caminha para um novo equilíbrio no qual a H2CO3 aumenta Isso por sua vez aumenta a CO2d no sangue reação 2 aumentando as sim a pressão parcial de CO2g no ar dos pulmões reação 3 o CO2 excedente é exalado Inversamente quando H 1 é perdido do sangue a situação oposta ocorre mais H2CO3 é dissociado em H 1 e HCO3 e portanto mais CO2 dos pul mões se dissolve dentro do plasma A taxa de respiração que é a taxa de inalação ou exalação pode ajustar rapi damente esses equilíbrios para manter o pH sanguíneo re lativamente constante A taxa de respiração é controlada pelo tronco encefálico no qual a detecção de aumento de pCO2 sanguíneo ou de diminuição do pH sanguíneo aciona uma respiração mais profunda e mais frequente No pH do plasma sanguíneo 74 muito pouco de H2CO3 está presente em comparação com HCO3 e a adição de uma pequena quantidade de base NH3 ou OH poderia titular esse H2CO3 exaurindo a capacidade tamponante O papel importante do H2CO3 pKa5 357 a 37ºC no tamponamento Fase aquosa sangue nos capilares H2CO HCO H 3 3 H2O H2O reação 2 CO2g reação 3 Fase gasosa no espaço aéreo pulmonar reação 1 CO2d FIGURA 221 O sistema tampão do bicarbonato O CO2 no espaço aéreo pulmonar está em equilíbrio com o tampão bicarbonato do plasma sanguíneo que circula pelos capilares pulmonares Como a concentração de CO2 dissolvido pode ser ajustada rapidamente por mudanças na taxa de res piração o sistema tampão bicarbonato do sangue está em estreito equilíbrio com um grande reservatório potencial de CO2 Nelson6edbookindb 66 Nelson6edbookindb 66 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 67 do plasma sanguíneo pH 74 parece inconsistente com a afirmação anterior de que um tampão é mais efetivo na escala de uma unidade de pH acima e abaixo do valor de pKa A explicação para esse paradoxo é o grande estoque de CO2d no sangue Seu rápido equilíbrio com H2CO3 resulta na formação adicional de H2CO3 É útil para medicina ter uma expressão simples do pH do sangue para CO2 dissolvido a qual é comumente monito rada ao longo do tempo junto de outros gases sanguíneos Podese definir uma constante Kh que é a constante de equilíbrio para a hidratação de CO2 para formar H2CO3 Então considerando o estoque de CO2d é possível ex pressar H2CO3 como KhCO2d e substituir H2CO3 na equação da dissociação ácida do H2CO3 Agora o equilíbrio total para a dissociação do H2CO3 pode ser expresso nesses termos É possível calcular o valor da nova constante Kcombinada e o correspondente pK aparente ou pKcombinado a partir dos valo res determinados experimentalmente de Kh 30 3 10 3 M e Ka 27 3 10 4 M a 37ºC Em análises clínicas é comum se referir ao CO2d como o ácido conjugado e usar o valor de 61 do pKa aparen te ou combinado para simplificar os cálculos de pH a partir da CO2d Nessa convenção onde pCO2 é expressa em quilopascais kPa pCO2 tem va lores de 46 a 67 kPa e 023 é o coeficiente de solubilida de correspondente para o CO2 na água portanto o termo 023 3 pCO2 12 kPa A HCO3 plasmática normalmente é de cerca de 24 mM Diabetes não tratado produz acidose que ameaça a vida O plasma sanguíneo humano normalmente tem um pH de 735 a 745 e muitas das enzimas que funcio nam no sangue evoluíram para ter máxima atividade nes se intervalo de pH Enzimas mostram máxima atividade catalítica em um pH característico chamado de pH óti mo Figura 222 Para ambos os lados desse pH ótimo a atividade catalítica com frequência declina rapidamen te Portanto uma pequena mudança no pH pode fazer uma grande diferença na taxa de algumas reações cruciais catalisadas por enzimas O controle biológico do pH das células e dos fluidos corpóreos é de importância central em todos os aspectos do metabolismo e atividades celula res e mudanças no pH sanguíneo têm consequências fi siológicas marcantes descritas com entusiasmo no Qua dro 21 Em indivíduos com diabetes melito não tratado a fal ta de insulina ou a insensibilidade à insulina dependendo do tipo de diabetes interrompe a captação de glicose do sangue para dentro dos tecidos e força os tecidos a arma zenar ácidos graxos como combustível principal Devido a razões que serão descritas em detalhes posteriormente ver Figura 2430 a dependência dos ácidos graxos resulta no acúmulo de altas concentrações de dois ácidos carboxíli cos o ácido bhidroxibutírico e o ácido acetoacético nível de 90 mg100 mL no plasma sanguíneo comparada com 3 mg100 mL nos indivíduos saudáveis excreção urinária de 5 g24 h comparada com 125 mg24 h nos contro les saudáveis A dissociação desses ácidos diminui o pH do plasma sanguíneo para valores de menos de 735 cau sando acidose Acidose grave leva a sintomas como dor de cabeça vômitos e diarreia seguido de estupor convulsões e coma provavelmente porque no valor de pH mais baixo algumas enzimas não funcionam da melhor forma Quan do um paciente apresenta alta glicose no sangue baixo pH plasmático e altos níveis de ácido bhidroxibutírico e ácido acetoacético na urina e no sangue o diabetes melito é o diagnóstico provável Outras condições também podem produzir acidose Jejum e inanição forçam o uso dos estoques de ácidos graxos para produção de energia com as mesmas conse quências geradas pelo diabetes Esforço físico exagerado 100 7 pH Percentual da atividade máxima Fosfatase alcalina 50 01 2 3 4 5 6 8 9 10 Pepsina Tripsina FIGURA 222 O pH ótimo de algumas enzimas A pepsina é uma enzima digestiva secretada no suco gástrico que tem pH 15 o que per mite à enzima funcionar de forma ótima A tripsina uma enzima digestiva que age no intestino delgado tem um pH ótimo que se assemelha ao pH neutro do lúmen do intestino delgado A fosfatase alcalina do tecido ósseo é uma enzima hidrolítica que presumivelmente auxilia na minera lização dos ossos Nelson6edbookindb 67 Nelson6edbookindb 67 020414 1842 020414 1842 68 DAVID L NELSON MICHAEL M COX como corrida para atletas ou ciclistas leva a um acúmu lo temporário de ácido láctico no sangue A deficiência renal resulta na diminuição da capacidade de regular os níveis de bicarbonato Doenças do pulmão como enfise ma pneumonia e asma reduzem a capacidade de dispo nibilidade do CO2 produzido por oxidação dos combustí veis nos tecidos com o resultante acúmulo de H2CO3 A acidose é tratada de acordo com a condição apresentada insulina para pessoas com diabetes esteroides ou anti bióticos para pessoas com doenças pulmonares Acidose grave pode ser revertida pela administração intravenosa de solução de bicarbonato PROBLEMA RESOLVIDO 27 Tratamento de acidose com bicarbonato Por que a administração intravenosa de uma solução de bi carbonato aumenta o pH do plasma sanguíneo Solução A razão entre HCO3 e CO2d determina o pH do tampão de bicarbonato de acordo com a equação Se HCO3 aumenta sem mudança no pCO2 o pH irá au mentar QUADRO 21 MEDICINA Sendo sua própria cobaia não tente isso em casa Este é um relato de J B S Haldane dos experimentos fisiológicos sobre o controle do pH sanguíneo do livro Mundos Possíveis Harper and Brothers 1928 Eu queria descobrir o que aconteceria com um ho mem se ele fosse mais ácido ou mais alcalino Poderse ia claro fazer experimentos em um coelho primeiro e alguns trabalhos haviam sido feitos nesse sentido mas é difícil de qualquer forma ter certeza como um coelho se sente Na verdade alguns coelhos não levavam a sério a possibilidade de cooperar comigo Um colega e eu então começamos a fazer expe rimentos em nós mesmos Meu colega Dr H W Da vies e eu nos tornamos alcalinos pela respiração e pela ingestão de tudo que contivesse mais de 8505 g de bi carbonato de sódio Tornamonos ácidos ficando senta dos em uma sala apertada contendo entre 6 e 7 de di óxido de carbono no ar Isso faz a respiração ficar como se recém tivéssemos terminado uma regata de remo e também dá uma tremenda dor de cabeça Duas horas foi o máximo de tempo que alguém conseguiu permane cer sob dióxido de carbono mesmo se a câmara de gás à nossa disposição não tivesse retido um odor irremovível de gás mostarda de alguns experimentos de guerra o qual faz lacrimejar quem quiser que entre nela A coisa mais óbvia a fazer foi tentar beber ácido clorídrico Se tomássemos concentrado isso dissolveria os dentes e queimaria a garganta razão pela qual eu quis deixálo difundirse suavemente em meu corpo A concentra ção maior que tive a coragem de ingerir foi aproxima damente uma parte do ácido comercial em cem partes de água mas meio litro foi o suficiente para mim pois irritou minha garganta e estômago enquanto meus cál culos mostravam que eu precisaria de um galão e meio para obter o efeito que eu desejava Argumentei que se cloreto de amônio fosse ingerido ele poderia se disso ciar parcialmente no corpo liberando ácido clorídrico Isso provaria estar correto o fígado transforma amônia em uma substância inofensiva chamada ureia antes que alcance o coração e o cérebro depois de absorvida pelo intestino O ácido clorídrico que foi deixado para trás combinase com o bicarbonato de sódio que existe em todos os tecidos produzindo cloreto de sódio e dióxido de carbono Esse gás foi produzido em mim dessa forma na taxa de 66 L por hora embora não por uma hora inteira nessa taxa Eu estava bem satisfeito de reproduzir em mim o tipo de respiração curta que ocorre nos estágios termi nais de doenças dos rins e diabetes Sabese há muito tempo que isso é devido ao envenenamento por ácido mas em cada caso o envenenamento é complicado por outras anormalidades químicas e não se tem certeza quais os sintomas são decorrentes do ácido em si A cena agora muda para Heidelberg onde Freuden berg e György estavam estudando o tétano em bebês ocorreu a eles que poderia ser bastante válido tentar o efeito de aumentar de forma incomum a acidez do cor po Visto que o tétano havia sido ocasionalmente ob servado em pacientes que foram tratados por outras queixas pela administração de doses muito altas de bicarbonato de sódio ou perderam grande quantidade de ácido clorídrico por constantes vômitos e se alcali nidade dos tecidos produzisse tétano a acidez poderia ser uma expectativa de cura Infelizmente dificilmente se curaria um bebê moribundo colocandoo em uma sala cheia de ácido carbônico e ainda menos com a indica ção de ingestão de ácido clorídrico então nada poderia resultar dessa ideia e eles estavam usando sais de lima não facilmente absorvidos no organismo os quais per turbam a digestão mas certamente foram benéficos em muitos casos de tétano Entretanto no momento em que leram o meu arti go sobre os efeitos do cloreto de amônio eles começa ram a administrálo aos bebês e ficaram encantados ao descobrir que o tétano era eliminado em poucas horas Desde então tem sido usado com sucesso na Inglaterra e na América tanto em crianças como em adultos Ele não remove a causa mas coloca o paciente em melhores condições de recuperação Nelson6edbookindb 68 Nelson6edbookindb 68 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 69 RESUMO 23 Tamponamento contra mudanças no pH em sistemas biológicos c Uma mistura de um ácido fraco ou base e seus sais resiste a mudanças de pH causadas pela adição de H 1 ou OH A mistura portanto funciona como tampão c O pH de uma solução de um ácido ou base fraca e seus sais é dado pela equação de HendersonHasselbalch equação c Em células e tecidos tampões de fosfatos e bicarbona tos mantêm os fluidos intracelulares e extracelulares em seu pH ótimo fisiológico que em geral é próximo de 7 As enzimas costumam ter atividade ótima nesse pH c Condições de saúde que diminuem o pH sanguíneo cau sando acidose ou aumentam causando alcalose podem ameaçar a vida 24 A água como reagente A água não é apenas o solvente no qual as reações químicas das células vivas ocorrem é muitas vezes um participante direto nessas reações A formação de ATP a partir de ADP e fosfato inorgânico é um exemplo de uma reação de con densação na qual os elementos da água são eliminados Figura 223 O reverso dessa reação clivagem acom panhada pela adição de elementos da água é uma rea ção de hidrólise As reações de hidrólise são também res ponsáveis pela despolimerização enzimática de proteínas carboidratos e ácidos nucleicos As reações de hidrólise catalisadas por enzimas chamadas de hidrolases são qua se sempre exergônicas pela produção de duas moléculas a partir de uma elas levam a um aumento do grau de desor dem do sistema A formação de polímeros celulares a partir de suas subunidades por simples reversão da hidrólise isto é por reações de condensação seria endergônica e por tanto não ocorre Como será visto as células evitam esse obstáculo termodinâmico pelo acoplamento das reações de condensação endergônicas a processos exergônicos como a quebra da ligação de anidrido no ATP Você está consumindo oxigênio à medida que está len do A água e o dióxido de carbono são os produtos finais de uma oxidação de combustível como a glicose A reação global pode ser descrita como A água metabólica formada pela oxidação de alimentos e gorduras armazenadas é na verdade suficiente para per mitir que alguns animais gerbilos ratoscanguru camelos sobrevivam por longos períodos de tempo em ambientes muito secos sem beber água O CO2 produzido por oxidação da glicose é convertido nos eritrócitos ao produto mais solúvel HCO3 em uma rea ção catalisada pela enzima anidrase carbônica Nessa reação a água não somente é um substrato mas tam bém age na transferência de prótons pela formação de uma rede de moléculas de água unidas por ligações de hidrogê nio onde ocorrem os saltos de prótons Figura 214 Plantas verdes e algas usam a energia da luz solar para quebrar a molécula de água no processo de fotossíntese Nessa reação A é uma espécie aceptora de elétrons que varia com o tipo de organismo fotossintético e a água serve como doador de elétrons em uma sequência de reações de oxidaçãoredução ver Figura 1959 fundamental para to dos os organismos vivos RESUMO 24 A água como reagente c A água é tanto o solvente no qual as reações metabólicas ocorrem quanto um reagente em muitos processos bio químicos incluindo hidrólise condensação e reações de oxidaçãoredução 25 O ajuste do meio aquoso em organismos vivos Os organismos estão efetivamente adaptados aos seus am bientes aquosos e desenvolveram meios de explorar as pro priedades incomuns peculiares da água O alto valor do calor específico da água a energia térmica necessária para aumentar a temperatura de 1 g de água em 1ºC é útil para células e organismos pois permite que a água atue como tampão térmico mantendo a temperatura de um orga nismo relativamente constante enquanto a temperatura do meio ambiente flutua e ocorre geração de calor como sub produto do metabolismo Além disso alguns vertebrados exploram o alto calor de vaporização da água Tabela 21 pelo uso do excesso de calor do corpo portanto perdem calor para evaporar o suor O alto grau de coesão interna da água líquida devido às ligações de hidrogênio é explo rado por plantas como meio de transportar nutrientes das raízes até as folhas durante o processo de transpiração Até a densidade do gelo menor que a da água líquida tem con sequências biológicas no ciclo da vida de organismos aquá ticos As lagoas congelam de cima para baixo e a camada de gelo isola a água de baixo do ar frio impedindoa e os or ganismos nela de congelar totalmente Mais fundamental a ATP ADP Fosfoanidrido FIGURA 223 Participação da água nas reações biológicas ATP é um fosfoanidrido formado pela reação de condensação perda de elementos da água entre ADP e fosfato R representa o monofosfato de adenosina AMP Esta reação de condensação requer energia A hidrólise do ATP adição de elementos da água para formar ADP e fosfato libera uma quantidade equi valente de energia Estas reações de condensação e hidrólise do ATP são so mente um dos exemplos do papel da água como reagente nos processos biológicos Nelson6edbookindb 69 Nelson6edbookindb 69 020414 1842 020414 1842 70 DAVID L NELSON MICHAEL M COX todos os organismos vivos é o fato de muitas propriedades físicas e químicas das macromoléculas celulares particular mente as proteínas e os ácidos nucleicos serem derivadas de suas interações com moléculas de água do meio circun dante A influência da água no curso da evolução biológica tem sido determinante e profunda Se formas de vida se de senvolveram em outro lugar no universo sua semelhança com as da Terra é improvável a menos que a água líquida também seja abundante em seu planeta de origem Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário ligação de hidrogênio 48 energia de dissociação de ligação 48 hidrofílico 50 hidrofóbico 50 anfipático 52 micelas 52 interações hidrofóbicas 53 forças de London 53 interações de van der Waals 53 osmolaridade 56 osmose 56 isotônico 56 hipertônico 56 hipotônico 56 constante de equilíbrio Keq 59 produto iônico da água Kw 59 pH 60 acidose 61 alcalose 61 par ácidobase conjugado 61 constante de dissociação ácida Ka 62 pKa 62 curva de titulação 62 tampão 64 região de tamponamento 64 equação de Henderson Hasselbalch 64 condensação 69 hidrólise 69 Leituras adicionais Gerais Ball P 2001 Lifes Matrix A Biography of Water University of California Press Berkeley CA Descrição muito acessível e divertida da água desde o Big Bang até seus diversos papéis na química da vida Denny MW 1993 Air and Water The Biology and Physics of Lifes Media Princeton University Press Princeton NJ Fantástica investigação sobre a relevância biológica das propriedades da água Eisenberg D Kauzmann W 1969 The Structure and Properties of Water Oxford University Press New York Tratamento clássico e avançado sobre as propriedades físico químicas da água e de interações hidrofóbicas Franks F Mathias SF eds 1982 Biophysics of Water John Wiley Sons Inc New York Ampla coleção de artigos sobre a estrutura da água pura e do citoplasma Gerstein M Levitt M 1998 Simulating water and the molecules of life Sci Am 279 November 100105 Descrição bem ilustrada do uso da simulação por computador para estudar as associações biologicamente importantes da água com proteínas e ácidos nucleicos Kandori H 2000 Role of internal water molecules in bacteriorhodopsin Biochim Biophys Acta 1460 177191 Revisão de nível intermediário sobre o papel das cadeias internas das moléculas de água no movimento de prótons através dessa proteína Kornblatt J Kornblatt J 1997 The role of water in recognition and catalysis by enzymes The Biochemist 19 3 1417 Resumo breve e útil sobre os modos pelos quais a água ligada às proteínas influencia a estrutura e a atividade proteica Lemieux RU 1996 How water provides the impetus for molecular recognition in aqueous solution Acc Chem Res 29 373380 Estudo sobre o papel da água na conexão do açúcar com proteínas Luecke H 2000 Atomic resolution structures of bacterio rhodopsin photocycle intermediates the role of discrete water molecules in the function of this lightdriven íon pump Biochim Biophys Acta 1460 133156 Revisão avançada sobre uma bomba de prótons que utiliza uma cadeia interna de moléculas de água Nicolls P 2000 Introduction the biology of the water molecule Cell Mol Life Sci 57 987992 Breve revisão sobre as propriedades da água apresentando muitas revisões avançadas publicadas no mesmo volume ver especialmente Pocker 2000 e Rand et al 2000 adiante Symons MC 2000 Spectroscopy of aqueous solutions protein and DNA interactions with water Cell Mol Life Sci 57 9991007 Wiggins PM 1990 Role of water in some biological processes Microbiol Rev 54 432449 Revisão sobre a água na biologia incluindo uma discussão da estrutura física da água líquida suas interações com biomoléculas e o estado da água nas células vivas Osmose Cayley DS Guttman HJ Record MT Jr 2000 Biophysical characterization of changes in amounts and activity of Escherichia coli cell and compartment water and turgor pressure in response to osmotic stress Biophys J 78 17481764 Investigação física avançada da fração de água citoplasmática da bactéria Escherichia coli cultivada em meios com osmolaridades diferentes Ver também Record et al 1998 abaixo Rand RP Parsegian VA Rau DC 2000 Intracellular osmotic action Cell Mol Life Sci 57 10181032 Revisão dos papéis da água na catálise enzimática revelados por estudos em solutos com pouca quantidade de água Record MT Jr Courtenay ES Cayley DS Guttman HJ 1998 Responses of E coli to osmotic stress large changes in amounts of cytoplasmic solutes and water Trends Biochem Sci 23 143148 Revisão de nível intermediário sobre os caminhos nos quais uma célula bacteriana se opõe às alterações na osmolaridade do seu ambiente Zonia L Munnik T 2007 Life under pressure hydrostatic pressure in cell growth and function Trends Plant Sci 12 9097 Interações fracas em sistemas aquosos Baldwin RL 2007 Energetics of protein folding J Mol Biol 371 282301 Discussão avançada dos fatores termodinâmicos incluindo interações fracas que determina o curso de dobras de proteínas Ball P 2008 Water as an active constituent in cell biology Chem Rev 108 74108 Discussão avançada sobre o papel da água nas estruturas e funções biológicas Blokzijl W Engberts JBFN 1993 Hydrophobic effects Opinions and facts Angew Chem Int Ed Engl 32 15451579 Análise importante avançada e monumental Chaplin M 2006 Do we underestimate the importance of water in cell biology Nat Rev Mol Cell Biol 7 861866 Nelson6edbookindb 70 Nelson6edbookindb 70 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 71 Fersht AR 1987 The hydrogen bond in molecular recognition Trends Biochem Sci 12 301304 Discussão quantitativa clara e breve da contribuição das ligações de hidrogênio ao reconhecimento molecular e à catálise enzimática Jeffrey GA 1997 An Introduction to Hydrogen Bonding Oxford University Press New York Discussão avançada e detalhada da estrutura e das propriedades de ligações de hidrogênio incluindo aquelas na água e nas biomoléculas Kauzmann W 1959 Some factors in the interpretation of protein denaturation Adv Protein Chem 14 163 Conhecimento clássico sobre a importância de interações hidrofóbicas na estabilidade de proteínas Ladbury J 1996 Just add water The effect of water on the specificity of proteinligand binding sites and its potential application to drug design Chem Biol 3 973980 Levy Y Onuchic JN 2006 Water mediation in protein folding and molecular recognition Annu Rev Biophys Biomol Struct 35 389415 Discussão avançada sobre o papel da água na estrutura das proteínas Martin TW Derewenda ZS 1999 The name is bondH bond Nat Struct Biol 6 403406 Breve revisão sobre a evidência de que as ligações de hidrogênio têm algum caráter covalente Pace CN 2009 Energectics of protein hydrogen bonds Nat Struct Mol Biol 16 681682 Breve descrição das contribuições históricas para compreender a força das ligações de hidrogênio em proteínas Pocker Y 2000 Water in enzyme reactions biophysical aspects of hydrationdehydration processes Cell Mol Life Sci 57 10081017 Revisão sobre o papel da água na catálise enzimática com a anidrase carbônica como exemplo de destaque Schwabe JWR 1997 The role of water in proteinDNA interactions Curr Opin Struct Biol 7 126134 Uma análise do papel da água tanto na especificidade quanto na afinidade de interações entre proteínas e DNA Stillinger FH 1980 Water revisited Science 209 451457 Breve revisão da estrutura física da água incluindo a importância de ligações de hidrogênio e a natureza das interações hidrofóbicas Tanford C 1978 The hydrophobic effect and the organization of living matter Science 200 10121018 Clássica revisão sobre as bases químicas e energéticas das interações hidrofóbicas entre biomoléculas em soluções aquosas Ácidos e bases fracas e tampões problemas para praticar Segel IH 1976 Biochemical Calculations 2nd edn John Wiley Sons Inc New York Problemas 1 Solubilidade do etanol em água Explique por que o eta nol CH3CH2OH é mais solúvel na água que o etano CH3CH3 2 Cálculo do pH a partir da concentração do íon hidro gênio Qual é o pH de uma solução com concentração de H 1 de a 175 3 10 5 molL b 650 3 10 10 molL c 10 3 10 4 molL d 150 3 10 5 molL 3 Cálculo da concentração de íons hidrogênio a partir do pH Qual é a concentração de H 1 de uma solução com pH de a 382 b 652 c 1111 4 Acidez do HCl gástrico No laboratório de um hospital uma amostra de 10 mL de suco gástrico obtida muitas horas depois de uma refeição foi titulada com 01 M NaOH até a neutralidade foram necessários 72 mL de NaOH O estômago do paciente não continha nenhuma comida ou be bida então se presume que não exista nenhum tampão presen te Qual era o pH do suco gástrico 5 Cálculo do pH de um ácido ou base forte a Es creva a reação de dissociação ácida para o ácido clorídrico b Calcule o pH de uma solução de 50 3 10 4 M de HCl c Escreva a reação de dissociação ácida para o hidróxido de sódio d Calcule o pH de uma solução de 7 0 3 10 5 M de NaOH 6 Cálculo do pH a partir da concentração de um áci do forte Calcule o pH de uma solução preparada pela di luição de 30 mL de HCl 25 M até um volume final de 100 mL com água 7 Medida dos níveis de acetilcolina pela mudança do pH A concentração de acetilcolina um neurotransmissor em uma amostra pode ser determinada a partir da mudança de pH que acompanha a sua hidrólise Quando a amostra é incuba da com a enzima acetilcolinesterase a acetilcolina é convertida a colina e ácido acético que se dissocia nas formas acetato e íon hidrogênio O2 1N Acetilcolina Colina Acetato H2O CH3 CH2 C O O CH2 CH3 CH3 CH3 1N H1 C O CH3 HO 1 1 CH3 CH3 CH3 CH2 CH2 Em uma análise típica 15 mL de uma solução aquosa contendo uma quantidade desconhecida de acetilcolina tinham pH 765 Quando incubada com acetilcolinesterase o pH da solução di minuiu para 687 Supondo que não havia tampão na mistura de teste determine o número de mols de acetilcolina em 15 mL de amostra 8 Significado físico do pKa Qual das soluções aquosas seguintes tem o menor pH 01 M de HCl 01 M de ácido acético pKa 5 486 e 01 M de ácido fórmico pKa5 375 9 Média de Ka e pKa a Um ácido forte tem tendência maior ou menor de perder seu próton para um ácido fraco b Um ácido forte tem Ka maior ou menor que um ácido fra co c Um ácido forte tem pKa maior ou menor que um ácido fraco 10 Vinagre simulado Uma maneira de fabricar vinagre não a preferida é pela preparação de uma solução de áci do acético o único componente ácido do vinagre em um pH correto ver Figura 215 e a adição de agentes condimen tares adequados O ácido acético Mr 60 é líquido a 25ºC com densidade de 1049 gmL Calcule o volume que deve ser adicionado à água destilada para fazer 1 L de vinagre simulado ver Figura 216 Nelson6edbookindb 71 Nelson6edbookindb 71 020414 1842 020414 1842 72 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 11 Identificando a base conjugada Qual é a base conju gada em cada um dos pares abaixo a RCOOH RCOO c H2PO4 H3PO4 b RNH2 RNH3 1 d H2CO3 HCO3 12 Cálculo do pH de uma mistura de um ácido fraco e sua base conjugada Calcule o pH de uma solução diluída que contém a razão molar entre o acetato de potássio e o ácido acé tico pKa 5 476 de a 21 b 13 c 51 d 11 e 110 13 Efeito do pH na solubilidade As propriedades alta mente polares das ligações de hidrogênio da água a tornam um excelente solvente para espécies iônicas carregadas Em con trapartida moléculas orgânicas não ionizadas e apolares como benzeno são relativamente insolúveis em água Em princípio a solubilidade aquosa de qualquer ácido ou base orgânica pode ser aumentada pela conversão das moléculas em suas espécies iônicas Por exemplo a solubilidade do ácido benzoico em água é baixa A adição de bicarbonato de sódio em uma mistura de água e ácido benzoico aumenta o pH e desprotona o ácido ben zoico formando benzoato que é totalmente solúvel em água Ácido benzoico Íon benzoato pKa 5 Os compostos a seguir são mais solúveis em solução aquosa de 01 M de NaOH ou 01 M de HCl Os prótons dissociados são mostrados em vermelho Íon piridina pKa 5 b c a bnaftol pKa 10 NAcetiltirosinametiléster pKa 10 14 Tratamento de erupções da pele causadas pela hera venenosa Toxodendron radicans Os componentes da hera venenosa que produzem uma coceira ca racterística são catecóis contendo cadeias longas alquil Se você fosse exposto à hera venenosa qual dos tratamentos abaixo você escolheria para aplicar na área afetada Justifique sua resposta a Lavar a área com água fria b Lavar a área com vinagre diluído ou suco de limão c Lavar a área com sabão e água d Lavar a área com sabão água e bicarbonato de sódio 15 pH e absorção de fármacos A aspirina é um áci do fraco com pKa de 35 o H ionizável é mostrado em vermelho Ela é absorvida para o sangue pelas células que revestem o estômago e o intestino delgado A absorção requer a pas sagem através da membrana plasmática cuja velocidade é determinada pela polaridade da molécula moléculas car regadas e altamente polares passam lentamente enquanto moléculas hidrofóbicas neutras passam rapidamente O pH do conteúdo estomacal é de cerca de 15 e o pH do con teúdo do intestino delgado é de aproximadamente 6 A maior quantidade de aspirina na corrente sanguínea foi absorvida no estômago ou no intestino delgado Justifique claramente a sua escolha 16 Cálculo do pH a partir das concentrações molares Qual é o pH de uma solução que contém 012 molL de NH4Cl e 003 molL de NaOH pKa do NH4 1NH3 é 925 17 Cálculo do pH após a titulação com um ácido fraco Um composto tem pKa de 74 Em 100 mL de uma solução de 10 M desse composto a pH 80 é adicionado 30 mL de uma solução 10 M de ácido clorídrico Qual é o pH da solução resultante 18 Propriedades de um tampão O aminoácido glicina é frequentemente usado como o ingrediente principal de um tampão em experimentos de bioquímica O grupo amino da gli cina que tem pKa de 96 pode existir tanto na forma protonada NH3 1 quanto como base livre NH2 devido ao equilíbrio reversível RNH3 1 RNH2 1 H 1 a Em qual intervalo de pH a glicina pode ser usada como tampão efetivo devido ao seu grupo amino b Em uma solução de 01 M de glicina em pH 9 qual a fra ção de glicina que tem os seus grupos amino na forma NH3 1 c Quanto de KOH 5 M deve ser adicionado em 1 L de uma solução de glicina de 01 M a pH 90 para mudar o pH para exa tamente 100 d Quando 99 da glicina estão na forma NH3 1 qual é a relação numérica entre o pH da solução e o pKa do grupo amino 19 Cálculo do pKa de um grupo ionizável por titulação Os valores pKa de um composto com dois grupos ionizáveis são pK1 5 410 e pK2 entre 7 e 10 Uma bioquímica tem 10 mL de uma solução 10 M desse composto com um pH em 800 Ela adiciona 100 mL de 100 M de HCl o que muda o pH para 320 Quanto é pK2 Nelson6edbookindb 72 Nelson6edbookindb 72 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 73 20 Cálculo do pH de uma solução de ácido poliprótico Histidina tem grupo ionizável com valores pKa de 18 60 e 92 como mostrado abaixo His 5 grupo imidazol Uma bioquí mica tem 100 mL de uma solução 0100 M de histidina com pH 540 Ela então adiciona 40 mL de 010 M HCl Qual é o pH da solução resultante 21 Cálculo do pH original a partir do pH final após titulação Uma bioquímica tem 100 mL de uma solução a 010 M de um ácido fraco com pKa de 63 Ela adiciona 60 mL de 10 M HCl o que muda o pH para 57 Qual é o pH original da solução 22 Preparação de um tampão fosfato Qual a razão mo lar de HPO4 2 para H2PO4 em solução que produziria um pH de 70 Ácido fosfórico H3PO4 um ácido triprótico tem três va lores de pKa 214 686 e 124 Dica somente um dos valores de pKa é relevante 23 Preparação de um tampãopadrão para calibra ção de um pHmetro O eletrodo de vidro usado em pH metros comerciais fornece uma resposta elétrica proporcio nal à concentração dos íons de hidrogênio Para converter essas respostas para uma leitura de pH o eletrodo deve ser calibrado com soluções padrão de concentração de H 1 co nhecida Determine a massa em gramas de fosfato ácido de sódio NaH2PO4 H2O MM 138 e fosfato de dissódico Na2H PO2 MM 142 necessária para preparar 1 L de um tampão padrão a pH 7 com concentração total de fosfato de 0100 M ver Figura 216 Ver no problema 22 os valores de pKa do ácido fosfórico 24 Cálculo da razão molar entre a base conjugada e o ácido fraco a partir do pH Para um ácido fraco com um pKa de 6 calcule a razão da base conjugada para o ácido em pH 50 25 Preparação de um tampão de força e pH conhe cidos Dadas as soluções de 010 M de ácido acético pKa 5 476 e acetato de sódio descreva como você poderia preparar 10 L de tampão de acetato de pH 40 26 Escolha de ácido fraco para tampão Qual des ses compostos seria o melhor tampão em pH 50 ácido fór mico pKa5 38 ácido acético pKa 5 476 ou etilamina pKa 5 90 Justifique brevemente sua resposta 27 Trabalhando com tampões Um tampão contém 0010 mol de ácido láctico pKa 5 386 e 0050 mol de lactato de sódio por litro a Calcule o pH do tampão b Calcule a mu dança no pH quando 5 mL de HCl 05 M é adicionado em 1 L de tampão c Que mudança de pH você esperaria se adicionasse a mesma quantidade HCl em 1 L de água pura 28 Uso das concentrações molares para cálculo do pH Qual é o pH de uma solução que contém 020 M de acetato de sódio e 060 M de ácido acético pKa 5 476 29 Preparação de um tampão acetato Calcule as con centrações de ácido acético pKa 5 476 e acetato de sódio necessárias para preparar uma solução tampão 02 M de pH5 50 30 pH de uma secreção de defesa de um inseto Você já deve ter ob servado um inseto que se defende dos inimigos pela secreção de um líquido cáustico Uma análise do líquido mostra uma concentração total de formato mais ácido fórmico Ka 5 18 3 10 4 de 145 M A concentração do íon formato é de 0015 M Qual é o pH da secreção 31 Cálculo de pKa Um composto desconhecido X tem um grupo car boxílico com pKa de 20 e outro grupo ionizável com pKa entre 5 e 8 Quando 75 mL de de NaOH 01 M é adicionado a 100 mL de uma solução 01 M de X em pH 20 o pH aumenta para 672 Calcule o pKa do segundo grupo ionizável de X 32 Formas iônicas da alanina A alanina é um ácido di prótico que pode sofrer duas reações de dissociação consultar na Tabela 31 os valores de pKa a Dada a estrutura parcial mente protonada ou zwitteriônica ver Figura 39 abaixo de senhe as estruturas químicas das outras duas formas da alanina que predominam em solução aquosa a forma totalmente pro tonada e a forma totalmente desprotonada Alanina H3N C H COO2 CH3 1 Qual das três formas possíveis da alanina pode estar presente em maior concentração em soluções com os seguintes pH b 10 c 62 d 802 e 119 Explique sua resposta de acordo com o pH relacionado aos dois valores de pKa 33 Controle do pH sanguíneo pela taxa de respiração a A pressão parcial do CO2 nos pulmões pode variar ra pidamente pela taxa de respiração e profundidade da respira ção Por exemplo um remédio comum para aliviar soluços é o aumento da concentração de CO2 nos pulmões Isso pode ser atingido prendendo a respiração respirando lenta e superfi cialmente hipoventilação ou respirando dentro de um saco de papel Sob essas condições o pCO2 no espaço aéreo dos pul mões sobe acima do normal Explique em termos qualitativos o efeito desses procedimentos no pH sanguíneo b Uma prática comum entre competidores de corrida de curta distância é a respiração rápida e profunda hiperventi lação por cerca de meio minuto para remover o excesso de CO2 de seus pulmões um pouco antes da corrida começar O pH sanguíneo pode aumentar para 76 Explique por que o pH sanguíneo aumenta c Durante uma corrida de curta distância os músculos produzem grande quantidade de ácido láctico CH3CHOH H3N CH COOH CH2 C H N CH C H N H 1 18 pK1 60 pK2 92 pK3 H3N 1 1 CH COO2 CH2 C H N CH C H N H 1 H3N 1 CH COO2 CH2 C H N CH C H N H2N CH COO2 CH2 C H N CH C H N COOH COO2 HisH1 His NH3 NH2 1 Grupo ionizante Nelson6edbookindb 73 Nelson6edbookindb 73 020414 1842 020414 1842 74 DAVID L NELSON MICHAEL M COX COOH Ka 5138 3 10 4 M a partir da glicose armazenada Ten do em vista esse fato por que a hiperventilação antes de uma corrida pode ser útil 34 Cálculo de pH sanguíneo a partir dos níveis de CO2 e bicarbonato Calcule o pH de uma amostra de plasma san guíneo com uma concentração de CO2 total de 269 mM e de bi carbonato de 256 mM Lembrese da p 67 que o pKa relevante do ácido carbônico é 61 35 Efeito de prender a respiração no pH sanguíneo O pH dos fluidos extracelulares é tamponado pela razão entre bicarbonato e ácido carbônico sanguíneo Prender a respira ção pode aumentar os níveis de CO2 no sangue Que efeito isso pode ter no pH dos fluidos extracelulares Explique mostran do a equaçãoões de equilíbrio relevantes para esse sistema tampão Problema de análise de dados 36 Surfactantes reversíveis Moléculas hidrofóbicas não se dissolvem bem em água Dado que a água é um solven te muito comum isso torna alguns processos muito difíceis retirar o resíduo oleoso de alimentos dos pratos limpar óleo derramado manter a fase oleosa e a aquosa das saladas bem misturadas e fazer reações químicas que envolvam componen tes hidrofílicos e hidrofóbicos Surfactantes são uma classe de compostos anfipáticos que incluem sabões detergentes e emulsificantes Com o uso de surfactantes compostos hidrofóbicos podem ser suspensos em soluções aquosas pela formação de micelas ver Figura 27 Uma micela tem um núcleo hidrofóbico consistindo em com postos hidrofóbicos e as caudas hidrofóbicas do surfactante as cabeças hidrofílicas do surfactante cobrem a superfície da micela Uma suspensão de micelas é chamada de emulsão Quanto mais hidrofílico o grupo que compõe a cabeça do sur factante mais poderoso ele é ou seja maior a sua capacidade de emulsificar material hidrofóbico Quando se utiliza sabão para remover a gordura de pratos sujos o sabão forma uma emulsão com a gordura facilmente re movida pela água por meio das interações com a cabeça hidro fílica das moléculas de sabão Da mesma forma um detergente pode ser usado para emulsificar óleo derramado para a remoção com água E emulsificantes em molhos industrializados de sala das mantêm o óleo suspenso na mistura à base de água Existem algumas situações nas quais seria muito útil ter um surfactante reversível uma molécula que poderia ser reversi velmente convertida nas formas surfactante e não surfactante a Imagine que esse surfactante coringa exista como você poderia usálo para limpar um derramamento de óleo e depois recuperar o óleo Liu e colaboradores descrevem um protótipo de surfactan te reversível no artigo de 2006 surfactantes reversíveis A re versibilidade é baseada na seguinte reação Forma amidina Forma amidínio b Dado que o pKa de um íon amidínio típico é 124 em qual direção esquerda ou direita você esperaria que o equilí brio da reação acima de deslocasse Ver na Figura 216 os va lores de pK2 relevantes Justifique sua resposta Dica lembre se da reação H2O 1 CO2 H2CO3 Liu e colaboradores produziram um surfactante reversível no qual R 5 C16H33 Eles não dão nenhum nome à molécula no artigo sendo aqui chamada de ssurf c A forma amidínio do ssurf é um surfactante poderoso a amidina não é Explique essa observação Liu e colaboradores descobriram que poderiam revezar en tre as duas formas do ssurf pela mudança do gás que eles bor bulhavam através de uma solução do surfactante Eles demons traram essa mudança pela medida da condutividade elétrica da solução de ssurf soluções aquosas de compostos iônicos apre sentam maior condutividade que soluções de compostos não iônicos Eles começaram com uma solução da forma amidina do ssurf em água Seus resultados estão demonstrados abaixo as linhas tracejadas indicam a mudança do gás usado A B Tempo min Gás borbulhado Condutividade elétrica 0 0 100 200 CO2 Ar CO2 Ar d Em qual forma a maior parte do ssurf encontrase no ponto A E no ponto B e Por que a condutividade elétrica aumenta do tempo 0 ao ponto A f Por que a condutividade elétrica decresceu do ponto A para o ponto B g Explique como você poderia usar ssurf para limpar e recuperar óleo de um derramamento de óleo Referência Liu Y Jessop PG Cunningham M Eckert CA Liotta CL 2006 Switchable surfactants Science 313 958960 Nelson6edbookindb 74 Nelson6edbookindb 74 020414 1842 020414 1842 31 Aminoácidos 76 32 Peptídeos e proteínas 85 33 Trabalhando com proteínas 89 34 A estrutura de proteínas estrutura primária 96 P roteínas controlam praticamente todos os processos que ocorrem em uma célula exibindo uma quase infi nita diversidade de funções Para explorar o mecanis mo molecular de um processo biológico um bioquímico estuda quase que inevitavelmente uma ou mais proteínas Proteínas são as macromoléculas biológicas mais abundan tes ocorrendo em todas as células e em todas as partes das células As proteínas também ocorrem em grande varieda de milhares de diferentes tipos podem ser encontrados em uma única célula Como os árbitros da função molecular as proteínas são os produtos finais mais importantes das vias de informação discutidas na Parte III deste livro As proteí nas são os instrumentos moleculares pelos quais a informa ção genética é expressa Subunidades monoméricas relativamente simples for necem a chave da estrutura de milhares de proteínas di ferentes As proteínas de cada organismo da mais simples das bactérias aos seres humanos são construídas a partir do mesmo conjunto onipresente de 20 aminoácidos Como cada um desses aminoácidos tem uma cadeia lateral com propriedades químicas características esse grupo de 20 moléculas precursoras pode ser considerado o alfabeto no qual a linguagem da estrutura proteica é lida Para gerar uma determinada proteína os aminoácidos se ligam de modo covalente em uma sequência linear caracte rística O mais marcante é que as células produzem proteí nas com propriedades e atividades completamente diferen tes ligando os mesmos 20 aminoácidos em combinações e sequências muito diferentes A partir desses blocos de cons trução diferentes organismos podem gerar produtos tão di versos como enzimas hormônios anticorpos transportado res fibras musculares proteínas das lentes dos olhos penas teias de aranha chifres de rinocerontes proteínas do leite antibióticos venenos de cogumelos e uma miríade de ou tras substâncias com atividades biológicas distintas Figura 31 Entre esses produtos de proteínas as enzimas são as mais variadas e especializadas Como catalisadoras de quase todas as reações celulares as enzimas são uma das chaves para compreensão da química da vida e assim fornecem um ponto central para qualquer curso de bioquímica Estruturas e funções de proteínas são os tópicos deste e dos próximos três capítulos Aqui primeiro é feita uma descrição das propriedades químicas fundamentais dos aminoácidos peptídeos e proteínas Também é abordado como um bioquímico trabalha com proteínas 3 Aminoácidos Peptídeos e Proteínas a c b FIGURA 31 Algumas funções de proteínas a A luz produzida por vagalumes é o resultado de uma reação envolvendo a proteína luciferina e ATP catalisada pela enzima luciferase ver Quadro 131 b Eritrócitos con têm grandes quantidades da proteína transportadora de oxigênio hemoglo bina c A proteína queratina produzida por todos os vertebrados é o com ponente estrutural principal de pelos escamas chifres lã unhas e penas O rinoceronte preto está próximo da extinção em ambiente natural devido à crença encontrada em algumas partes do mundo de que o pó do seu chifre tem propriedades afrodisíacas Na verdade as propriedades químicas do pó de chifre de rinoceronte não são diferentes daquelas do pó dos cascos de bovinos e das unhas humanas Nelson6ed03indd 75 Nelson6ed03indd 75 020514 1718 020514 1718 76 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 31 Aminoácidos Arquitetura proteica aminoácidos Proteínas são polímeros de aminoácidos com cada resíduo de aminoácido unido ao seu vizinho por um tipo específico de ligação covalente o termo resíduo reflete a perda de elementos de água quan do um aminoácido é unido a outro As proteínas podem ser degradadas hidrolisadas em seus aminoácidos constituin tes por vários métodos e os estudos mais iniciais de proteí nas naturalmente se concentraram nesses aminoácidos li vres delas derivados Vinte aminoácidos diferentes são comumente encontrados em proteínas O primeiro a ser descoberto foi a asparagina em 1806 O último dos 20 a ser descoberto treonina não havia sido identificado até 1938 Todos os aminoácidos têm nomes comuns ou triviais em al guns casos derivados da fonte da qual foram primeiramente isolados A asparagina foi descoberta pela primeira vez no aspargo e o glutamato no glúten do trigo a tirosina foi isola da a primeira vez a partir do queijo seu nome é derivado do grego tyros queijo e a glicina do grego glykos doce foi assim denominada devido ao seu sabor adocicado Aminoácidos compartilham características estruturais comuns Todos os 20 tipos de aminoácidos comuns são aaminoáci dos Eles têm um grupo carboxila e um grupo amino ligados ao mesmo átomo de carbono o carbono a Figura 32 Diferem uns dos outros em suas cadeias laterais ou grupos R que variam em estrutura tamanho e carga elétrica e que influenciam a solubilidade dos aminoácidos em água Além desses 20 aminoácidos há muitos outros menos comuns Alguns são resíduos modificados após a síntese de uma proteína outros são aminoácidos presentes em organismos vivos mas não como constituintes de proteínas Foram atri buídas aos aminoácidos comuns das proteínas abreviações de três letras e símbolos de uma letra Tabela 31 utiliza dos como abreviaturas para indicar a composição e a se quência de aminoácidos polimerizados em proteínas CONVENÇÃOCHAVE O código de três letras é transparente as abreviações em geral consistem nas três primeiras letras do nome do aminoácido O código de uma letra foi concebido por Margaret Oakley Dayhoff considerada por muitos a fundado ra do campo da bioinformática O código de uma letra reflete uma tentativa de reduzir o tamanho dos arquivos de dados em uma época da computação de cartões perfurados utiliza dos para descrever as sequências de aminoácidos Foi desen volvido para ser facilmente memorizado e a compreensão de sua origem pode ajudar os estudantes a fazer exatamente isso Para seis aminoácidos CHIMSV a primeira letra do nome do aminoácido é única e portanto utilizada como o símbolo Para cinco outros AGLPT a primeira letra não é única mas é atribuída ao aminoácido mais co mum em proteínas por exem plo leucina é mais comum do que lisina Para outros quatro a letra utilizada é foneticamen te sugestiva RFYW aRginina Fenilalanina tirosina do inglês tYrosine triptofano do inglês tWiptophan Os demais foram mais difíceis de nomear Para quatro DNEQ foram atribuí das letras encontradas em seus nomes ou sugeridas por eles as pártico do inglês asparDic asparagiNa glutâmico do inglês glutamEke glutamina do inglês Qtamine Faltava a lisi na Sobravam poucas letras no alfabeto e a letra K foi escolhi da porque era a mais próxima de L Para todos os aminoácidos comuns exceto a glicina o carbono a está ligado a quatro grupos diferentes um gru po carboxila um grupo amino um grupo R e um átomo de hidrogênio Figura 32 na glicina o grupo R é outro áto mo de hidrogênio O átomo de carbono a é portanto um centro quiral p 17 Em decorrência do arranjo tetraé drico dos orbitais de ligação em volta do átomo de carbono a os quatro grupos diferentes podem ocupar dois arran jos espaciais únicos e portanto os aminoácidos têm dois estereoisômeros possíveis Uma vez que elas são imagens especulares não sobreponíveis uma da outra Figura 33 Margaret Oakley Dayhoff 19251983 COO2 R Ca H H3N 1 FIGURA 32 Estrutura geral de um ami noácido Esta estrutura é comum a todos os tipos de aaminoácidos exceto um a prolina aminoácido cíclico é a exceção O grupo R ou cadeia lateral roxo ligado ao carbono a cinza é diferente em cada aminoácido a COO2 CH3 CH3 Ca Ca COO2 LAlanina DAlanina H3N 1 C COO2 CH3 H H C COO CH3 N 1 H3 b L Alanina DAlanina H3N 1 COO2 CH3 H H C COO2 2 CH3 N 1 H3 LAlanina DAlanina C c NH3 1 H H H3N 1 FIGURA 33 Estereoisomerismo em aaminoácidos a Os dois este reoisômeros da alanina L e Dalanina são imagens especulares não sobre postas um do outro enantiômeros b c Duas convenções diferentes para representar as configurações espaciais dos estereoisômeros Em fórmulas de perspectiva b as ligações sólidas em forma de cunha se projetam para fora do plano do papel com as ligações tracejadas por trás dele Em fórmulas de projeção c assumese que as ligações horizontais se projetam para fora do plano do papel e as ligações verticais para trás Entretanto fórmulas de projeção muitas vezes são usadas casualmente e nem sempre pretendem representar uma configuração estereoquímica específica Nelson6edbookindb 76 Nelson6edbookindb 76 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 77 as duas formas representam uma classe de estereoisômeros denominada enantiômeros ver Figura 120 Todas as moléculas com um centro quiral também são opticamente ativas isto é elas giram o plano da luz polarizada ver Quadro 12 CONVENÇÃOCHAVE Duas convenções são utilizadas para iden tificar os carbonos em um aminoácido prática que pode ser confusa Os carbonos adicionais em um grupo R são co mumente designados como b g d e assim por diante a partir do carbono a Para a maioria das outras moléculas orgânicas os átomos de carbono são simplesmente nume rados a partir de uma extremidade conferindo a mais alta prioridade C1 ao carbono com o substituinte contendo o átomo de maior número atômico Nessa última convenção o carbono carboxílico de um aminoácido seria o C1 e o car bono a seria o C2 Lisina CH2 1NH3 2OOC 1NH3 CH2 CH2 CH2 CH 2 3 4 5 6 1 e d g b a TABELA 31 Propriedades e convenções associadas a aminoácidos comuns encontrados em proteínas Valores de pKa Aminoácido Abreviação símbolo Mr pK1 COOH pK2 NH3 1 pKR grupo R pI Índice de hidropatia Ocorrência em proteínas Grupos R alifáticos apolares Glicina Gly G 75 234 960 597 04 72 Alanina Ala A 89 234 969 601 18 78 Prolina Pro P 115 199 1096 648 16 52 Valina Val V 117 232 962 597 42 66 Leucina Leu L 131 236 960 598 38 91 Isoleucina Ile I 131 236 968 602 45 53 Metionina Met M 149 228 921 574 19 23 Grupos R aromáticos Fenilalanina Phe F 165 183 913 548 28 39 Tirosina Tyr Y 181 220 911 1007 566 13 32 Triptofano Trp W 204 238 939 589 09 14 Grupos R polares não carregados Serina Ser S 105 221 915 568 08 68 Treonina Thr T 119 211 962 587 07 59 Cisteína Cys C 121 196 1028 818 507 25 19 Asparagina Asn N 132 202 880 541 35 43 Glutamina Gln Q 146 217 913 565 35 42 Grupos R carregados positivamente Lisina Lys K 146 218 895 1053 974 39 59 Histidina His H 155 182 917 600 759 32 23 Arginina Arg R 174 217 904 1248 1076 45 51 Grupos R carregados negativamente Aspartato Asp D 133 188 960 365 277 35 53 Glutamato Glu E 147 219 967 425 322 35 63 Os valores de Mr refletem as estruturas como mostradas na Figura 35 Os elementos da água Mr 18 são removidos quando o aminoácido é incorporado a um poli peptídeo Uma escala combinando hidrofobicidade e hidrofilicidade de grupos R Os valores refletem a energia livre DG de transferência da cadeia lateral do aminoácido de um solvente hidrofóbico para a água Esta transferência é favorável DG 0 valor negativo no índice para cadeias laterais de aminoácidos carregadas ou polares e desfavorável DG 0 valor positivo no índice para aminoácidos com cadeias laterais apolares ou mais hidrofóbicas Ver o Capítulo 11 A partir de Kyte J Doolittle RF 1982 A simple method for displaying the hydropathic character of a protein J Mol Biol 157 105132 Ocorrência média em mais de 1150 proteínas De Doolittle RF 1989 Redundancies in protein sequences Em Prediction of Protein Structure and the Prin ciples of Protein Conformation Fasman GD ed pp 599623 Plenum Press New York Em geral a cisteína é classificada como polar apesar de apresentar um índice hidropático positivo Isso reflete a capacidade do grupo sulfidril em atuar como ácido fraco e formar uma fraca ligação de hidrogênio com o oxigênio ou nitrogênio Nelson6edbookindb 77 Nelson6edbookindb 77 020414 1842 020414 1842 78 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Em alguns casos como aminoácidos com grupos R hete rocíclicos tal como a histidina o sistema de letras gre gas é ambíguo e a convenção numérica é então utilizada Para aminoácidos de cadeias laterais ramificadas carbonos equivalentes recebem números após as letras gregas Leu cina portanto tem carbonos d1 e d2 ver a estrutura na Figura 35 Uma nomenclatura especial foi desenvolvida para es pecificar a configuração absoluta dos quatro substi tuintes dos átomos de carbono assimétricos As configura ções absolutas de açúcares simples e de aminoácidos são especificadas pelo sistema D L Figura 34 com base na configuração absoluta do açúcar de três carbonos gli ceraldeído uma convenção proposta por Emil Fischer em 1891 Fischer sabia que grupos circundavam o carbono assimétrico do gliceraldeído mas teve de supor sua confi guração absoluta ele supôs corretamente como foi confir mado posteriormente por análises de difração de raios x Para todos os compostos quirais os estereoisômeros com configuração relacionada àquela do Lgliceraldeído são designados L e os estereoisômeros relacionados ao Dgli ceraldeído foram designados D Os grupos funcionais de Lalanina são combinados com aqueles de Lgliceraldeído pelo alinhamento daqueles que podem ser interconverti dos por reações químicas simples de etapa única Portan to o grupo carboxila de Lalanina ocupa a mesma posição ao redor do carbono quiral que o grupo aldeído de Lglice raldeído porque um aldeído é prontamente convertido em um grupo carboxila por meio de uma oxidação de etapa única Historicamente as designações semelhantes L e D eram utilizadas para levorrotatória rotação da luz polari zada à esquerda e dextrorrotatória rotação da luz pola rizada à direita Entretanto nem todos os Laminoácidos são levorrotatórios e a convenção mostrada na Figura 34 foi necessária para evitar potenciais ambiguidades sobre a configuração absoluta Pela convenção de Fischer L e D se referem apenas à configuração absoluta dos quatro substituintes em torno do carbono quiral e não às proprie dades ópticas da molécula Outro sistema para especificar a configuração ao redor de um centro quiral é o sistema RS utilizado na nomencla tura sistemática da química orgânica para descrever com mais exatidão a configuração das moléculas com mais de um centro quiral p 18 Os resíduos de aminoácidos em proteínas são estereoisômeros L Quase todos os compostos biológicos com centro quiral ocorrem naturalmente em apenas uma forma estereoisomé rica D ou L Os resíduos de aminoácidos em moléculas pro teicas são exclusivamente estereoisômeros L Os resíduos de Daminoácidos foram encontrados apenas em alguns peptídeos geralmente pequenos incluindo alguns peptí deos de paredes celulares bacterianas e certos antibióticos peptídicos É notável que praticamente todos os resíduos de ami noácidos em proteínas sejam estereoisômeros L Quando compostos quirais são formados em reações químicas co muns o resultado é uma mistura racêmica de isômeros D e L os quais são difíceis para um químico distinguir e separar Contudo para um sistema vivo os isômeros D e L são tão diferentes entre si quanto a mão direita é diferente da es querda A formação de subestruturas repetidas estáveis em proteínas Capítulo 4 geralmente exige que seus aminoá cidos constituintes sejam de uma série estereoquímica As células são capazes de sintetizar especificamente os isôme ros L de aminoácidos porque os sítios ativos de enzimas são assimétricos tornando estereoespecíficas as reações por elas catalisadas Aminoácidos podem ser classificados pelo grupo R O conhecimento das propriedades químicas dos aminoá cidos comuns é fundamental para a compreensão da bio química O tópico pode ser simplificado agrupandose os aminoácidos em cinco classes principais com base nas pro priedades dos seus grupos R Tabela 31 particularmente sua polaridade ou tendência para interagir com a água em pH biológico próximo do pH 70 A polaridade dos grupos R varia amplamente de apolar e hidrofóbico não hidros solúvel ao altamente polar e hidrofílico hidrossolúvel Alguns aminoácidos são um pouco difíceis de caracterizar ou não se encaixam perfeitamente em qualquer grupo par ticularmente glicina histidina e cisteína Suas atribuições a determinados grupos são o resultado de avaliações ponde radas em vez de absolutas As estruturas dos 20 aminoácidos comuns são mostra das na Figura 35 e algumas de suas propriedades são lis tadas na Tabela 31 Em cada classe há gradações de polari dade tamanho e forma dos grupos R Grupos R apolares alifáticos Os grupos R nesta classe de ami noácidos são apolares e hidrofóbicos As cadeias laterais de alanina valina leucina e isoleucina tendem a se agrupar no interior de proteínas estabilizando a estrutu ra proteica por meio de interações hidrofóbicas A glicina tem a estrutura mais simples Embora seja mais facilmente agrupada com os aminoácidos apolares sua cadeia lateral HO C 1CHO 3CH2OH H H C CHO CH2OH OH H3N 1 C COO2 CH3 H H C COO2 CH3 N 1 H3 LGliceraldeído DAlanina 2 DGliceraldeído LAlanina FIGURA 34 Relação estérica dos estereoisômeros de alanina à con figuração absoluta do Lgliceraldeído e do Dgliceraldeído Nestas fórmulas em perspectiva os carbonos são alinhados verticalmente com o átomo quiral no centro Os carbonos nestas moléculas são numerados de 1 a 3 de cima para baixo começando com o carbono do aldeído ou carboxi terminal vermelho como mostrado Quando apresentado desta maneira o grupo R do aminoácido nesse caso o grupo metil da alanina está sempre abaixo do carbono a Os Laminoácidos são aqueles com o grupo aamino na esquerda e os Daminoácidos com esse grupo na direita Nelson6edbookindb 78 Nelson6edbookindb 78 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 79 muito pequena não contribui realmente para interações hidrofóbicas A metionina um dos dois aminoácidos que contém enxofre tem um grupo tioéter ligeiramente apolar em sua cadeia lateral A prolina tem cadeia lateral alifática com estrutura cíclica distinta O grupo amino secundário imino de resíduos de prolina é mantido em uma configu ração rígida que reduz a flexibilidade estrutural de regiões polipeptídicas contendo prolina Grupos R aromáticos Fenilalanina tirosina e triptofano com suas cadeias laterais aromáticas são relativamente apolares hidrofóbicos Todos podem participar em in terações hidrofóbicas O grupo hidroxila da tirosina pode formar ligações de hidrogênio e é um importante grupo fun cional em algumas enzimas A tirosina e o triptofano são sig nificativamente mais polares do que a fenilalanina devido ao grupo hidroxila da tirosina e ao nitrogênio do anel indol do triptofano O triptofano a tirosina e em menor extensão a fenilala nina absorvem a luz ultravioleta Figura 36 ver também Quadro 31 Isso explica a forte absorbância de luz com comprimento de onda de 280 nm característica da maior parte das proteínas propriedade explorada por pesquisa dores na caracterização de proteínas Grupos R apolares alifáticos Glicina Alanina Valina Grupos R aromáticos Fenilalanina Tirosina Prolina Triptofano Grupos R polares não carregados Serina Grupos R carregados positivamente Lisina Arginina Histidina Grupos R carregados negativamente Aspartato Glutamato Glutamina Asparagina Cisteína H3N 1 C COO2 H H H3N 1 C COO2 CH3 H H3N 1 C COO2 C CH3 CH3 H H Leucina H3N 1 C COO2 C C CH3 CH3 H H2 H Metionina H3N 1 C COO2 C C S CH3 H2 H2 H H3N 1 C COO2 CH2 H OH Treonina H3N 1 C COO2 H C CH3 OH H H3N 1 C COO2 C SH H2 H H 2N 1 H 2C C COO2 H C CH 2 H 2 H3N 1 C COO2 C COO2 H2 H H3N 1 C COO2 C C COO2 H2 H2 H 1N C C C C H3N 1 C COO2 H H2 H2 H2 H2 H3 C N C C C H3N 1 C COO2 H H2 H2 H2 H NH2 N 1 H2 H3N 1 C COO2 C C C H2N O H2 H2 H H3N 1 C COO 2 C C H2N O H2 H H3N 1 C COO2 CH C NH 2 H C H N CH H3N 1 C COO2 CH2 H H3N 1 C COO2 C C CH H2 H NH Isoleucina H3 1 C COO2 H C C CH3 H2 H H N C 3 H3N 1 C COO2 CH2 H OH FIGURA 35 Os 20 aminoácidos comuns de proteínas As fórmulas es truturais mostram o estado de ionização que predomina em pH 70 As por ções não sombreadas são aquelas comuns a todos os aminoácidos aquelas sombreadas são os grupos R Embora o grupo R da histidina seja mostrado sem carga seu pKa ver a Tabela 31 é tal que uma pequena mas significativa fração desses grupos seja positivamente carregada em pH 70 A forma pro tonada da histidina é mostrada acima do gráfico na Figura 312b Nelson6edbookindb 79 Nelson6edbookindb 79 020414 1842 020414 1842 80 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Grupos R polares não carregados Os grupos R desses aminoá cidos são mais solúveis em água ou mais hidrofílicos do que aqueles dos aminoácidos apolares porque eles contêm grupos funcionais que formam ligações de hidrogênio com a água Essa classe de aminoácidos inclui a serina treoni na cisteína asparagina e glutamina Os grupos hidro xila da serina e treonina e os grupos amida da asparagina e glutamina contribuem para suas polaridades A cisteína é um caso isolado aqui porque sua polaridade devida ao seu grupo sulfidrila é bastante modesta A cisteína é um ácido Triptofano Comprimento de onda nm Absorbância 5 4 3 2 1 0 6 230 240 250 260 270 280 290 300 310 Tirosina Fenilalanina FIGURA 36 Absorção da luz ultravioleta por aminoácidos aromáti cos Comparação dos espectros de absorção de luz dos aminoácidos aro máticos triptofano tirosina e fenilalanina em pH 60 Os aminoácidos estão presentes em quantidades equimolares 10 3M sob condições idênticas A absorbância medida do triptofano é mais do que quatro vezes aquela da tirosina em um comprimento de onda de 280 nm Observe que a absorção luminosa máxima tanto para o triptofano quanto para a tirosina ocorre pró xima de 280 nm A absorção luminosa pela fenilalanina geralmente contribui pouco para as propriedades espectroscópicas das proteínas QUADRO 31 MÉTODOS Absorção de luz por moléculas a Lei de LambertBeer Uma ampla variedade de biomoléculas absorve a luz em comprimentos de onda característicos como o tripto fano que absorve a luz em 280 nm ver Figura 36 A medida da absorção da luz por um espectrofotôme tro é utilizada para detectar e identificar moléculas e para determinar suas concentrações em solução A fra ção da luz incidente absorvida por uma solução em um determinado comprimento de onda está relacionada à espessura da camada de absorção comprimento do caminho e à concentração da substância que absorve Figura 1 Essas duas relações são combinadas na lei de LambertBeer em que I0 é a intensidade da luz incidente I é a intensida de da luz transmitida a relação II0 o inverso da razão na equação é a transmitância é o coeficiente de extinção molar em unidades de litros por mol por centímetro c é a concentração da substância absorvida em mols por litro e l é o comprimento do caminho de luz da amostra absorvente de luz em centímetros A lei de LambertBeer pressupõe que a luz incidente é paralela e monocromática de um único comprimen to de onda e que as moléculas de solvente e soluto são orientadas aleatoriamente A expressão log I0I é deno minada absorbância e designada A É importante observar que cada milímetro sucessi vo do comprimento do caminho da solução absorvente em uma célula de 10 cm não absorve uma quantidade constante mas uma fração constante da luz que inci de sobre ela Entretanto com uma camada absorvente de comprimento de caminho fixo a absorbância A é diretamente proporcional à concentração do soluto absorvente O coeficiente de extinção molar varia com a natureza do composto absorvente do solvente e do comprimento de onda e também com o pH se a substância que absorve a luz está em equilíbrio com um estado de ionização que possui diferentes propriedades de absorção Intensidade da luz transmitida I Detector Monocromador Lâmpada Intensidade da luz incidente I0 Amostra em cubeta com c moleslitro de espécies absorvendo luz 0012 A 5 l FIGURA Q1 Os principais componentes de um espectrofotômetro A fonte de luz emite luz em um amplo espectro quando o monocromador seleciona e transmite luz de um comprimento de onda específico A luz monocromática passa através da amostra em uma cubeta de tamanho l e é absorvida pela amostra como uma proporção da concentra ção das espécies absorvendo luz A luz trans mitida é medida por um detector Nelson6edbookindb 80 Nelson6edbookindb 80 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 81 fraco e pode fazer fracas ligações de hidrogênio com o oxi gênio ou nitrogênio A asparagina e a glutamina são as amidas de dois outros aminoácidos também encontrados em proteínas aspartato e glutamato respectivamente nos quais a asparagina e a glutamina são facilmente hidrolisadas por ácido ou base A cisteína é prontamente oxidada para formar um aminoáci do dimérico ligado de modo covalente chamado cistina no qual duas moléculas ou resíduos de cisteína são ligadas por uma ligação dissulfeto Figura 37 Os resíduos ligados a dissulfetos são fortemente hidrofóbicos apolares As ligações dissulfeto desempenham um papel especial nas estruturas de muitas proteínas pela formação de liga ções covalentes entre partes de uma molécula polipeptídica ou entre duas cadeias polipeptídicas diferentes Grupos R carregados positivamente básicos Os grupos R mais hidrofílicos são aqueles carregados positivamente ou nega tivamente Os aminoácidos nos quais os grupos R têm uma carga positiva significativa em pH 70 são a lisina com um segundo grupo amino primário na posição em sua cadeia alifática a arginina com um grupo guanidínio positiva mente carregado e a histidina com um grupo imidazol aromático Como o único aminoácido comum que tem uma cadeia lateral ionizável com pKa próximo da neutralidade a histidina pode ser positivamente carregada forma proto nada ou não carregada em pH 70 Seus resíduos facilitam muitas reações catalisadas por enzimas funcionando como doadoresaceptores de prótons Grupos R carregados negativamente ácidos Os dois aminoáci dos que apresentam grupos R com carga negativa final em pH 70 são o aspartato e o glutamato cada um dos quais tem um segundo grupo carboxila Aminoácidos incomuns também têm funções importantes Além dos 20 aminoácidos comuns as proteínas podem con ter resíduos criados por modificações de resíduos comuns já incorporados em um polipeptídeo Figura 38a Entre esses aminoácidos incomuns estão a 4hidroxiprolina um derivado da prolina e a 5hidroxilisina derivada da lisina O primeiro é encontrado em proteínas da parede celular de células vegetais e ambos são encontrados no colágeno pro teína fibrosa de tecidos conectivos A 6Nmetillisina é um constituinte da miosina uma proteína contrátil do mús culo Outro aminoácido incomum importante é o gcarbo xiglutamato encontrado na proteína de coagulação pro trombina e em algumas outras proteínas que se ligam ao Ca 21 como parte de suas funções biológicas Mais complexa é a desmosina derivada de quatro resíduos Lys encontra da na proteína fibrosa elastina A selenocisteína é um caso especial Esse raro resíduo de aminoácido é introduzido durante a síntese proteica em vez de criado por uma modificação póssintética Contém selênio em vez do enxofre da cisteína Na verdade derivada de serina a selenocisteína é um constituinte de apenas al gumas poucas proteínas conhecidas Alguns resíduos de aminoácidos em uma proteína po dem ser modificados transitoriamente para alterar as fun ções da proteína A adição de grupos fosforil metil acetil adenilil ADPribosil ou outros grupos a resíduos de ami noácidos específicos pode aumentar ou diminuir a atividade de uma proteína Figura 38b A fosforilação é uma modi ficação reguladora particularmente comum A modificação covalente como uma estratégia reguladora em uma proteína é discutida com mais detalhe no Capítulo 6 Cerca de 300 aminoácidos adicionais foram encontra dos nas células Eles têm várias funções mas não são todos constituintes de proteínas A ornitina e a citrulina Figu ra 38c merecem atenção especial porque são intermediá rioschave metabólitos na biossíntese de arginina Capí tulo 22 e no ciclo da ureia Capítulo 18 Aminoácidos podem agir como ácidos e bases Os grupos amino e carboxila de aminoácidos em conjunto com os grupos ionizáveis R de alguns aminoácidos fun cionam como ácidos e bases fracos Quando um aminoáci do sem um grupo R ionizável é dissolvido em água em pH neutro ele permanece na solução como um íon bipolar ou zwitteríon do alemão íon híbrido que pode agir como ácido ou base Figura 39 Substâncias com essa natureza dupla ácidobase são anfotéricas e são fre quentemente chamadas de anfólitos a partir de eletró litos anfotéricos Um simples aaminoácido monoamino monocarboxílico como a alanina é um ácido diprótico quando completamente protonado ele tem dois grupos o grupo COOH e o grupo NH 1 3 que pode produzir dois prótons H C COO2 R H C COOH R 1NH3 1NH3 11 0 21 H1 H C COO2 R NH2 H1 Carga final Aminoácidos têm curvas de titulação características A titulação ácidobase envolve a adição ou remoção gra dual de prótons Capítulo 2 A Figura 310 mostra a curva de titulação de uma forma diprótica de glicina CH 2H1 1 2e2 2H1 1 2e2 COO2 COO2 H3N CH2 CH CH2 SH SH Cisteína Cistina Cisteína 1 NH3 1 CH COO2 COO2 H3N CH2 CH CH2 S S 1 NH3 1 FIGURA 37 Formação reversível de uma ligação dissulfeto pela oxi dação de duas moléculas de cisteína Ligações de dissulfeto entre resí duos Cys estabilizam as estruturas de muitas proteínas Nelson6edbookindb 81 Nelson6edbookindb 81 020414 1842 020414 1842 82 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os dois grupos ionizáveis de glicina o grupo carboxila e o grupo amino são titulados com uma base forte como NaOH O gráfico tem duas fases distintas correspon dendo à desprotonação de dois grupos diferentes na gli cina Cada uma das duas fases se assemelha ao formato da curva de titulação de um ácido monoprótico como o 4Hidroxiprolina H3N 1 CH2 C OH H CH2 CH2 C 1 NH3 H COO2 5Hidroxilisina CH3 NH CH2 CH2 CH2 CH2 CH COO 6NMetillisina 2OOC C COO2 H CH2 C 1NH3 H COO2 gCarboxiglutamato C H3N 1 2OOC H CH22 C H3N 1 COO2 H CH23 C N 1H3 COO H C C N 1 H24 H3N 1 COO2 H Desmosina HSe CH2 C 1NH3 H COO2 2 Selenocisteína a CH22 2 1NH3 OH N H2 1 COO2 N N b Fosfosserina 2O 2O P O CH2 C O 1NH3 H COO2 sNMetilarginina 1 C CH2 C 1NH3 H COO2 CH3 CH2 CH2 H2N HN NH 6NAcetilisina Fosfotirosina 2O 2O P O O CH2 C 1NH3 H COO2 Adenililtirosina CH2 C 1NH3 H COO2 CH2 CH2 CH2 C CH3 HN O Éster de metilglutamato CH2 C 1NH3 H COO2 CH2 C O H3C O Fosfotreonina 2O 2O P O 3 C O 1NH3 H CH CH COO2 CH2 C 1NH3 H COO2 N N NH2 H H H H OH O H O H2C O O O P 2O H3N CH2 CH2 CH2 C 1 1 NH3 H COO2 Ornitina H2N C O N H CH2 CH2 CH2 C 1NH3 H COO2 Citrulina c FIGURA 38 Aminoácidos raros a Alguns aminoácidos raros encontrados em proteínas Todos são derivados de ami noácidos comuns Grupos funcionais extras adicionados por reações de modificação são mostrados em vermelho A des mosina é formada a partir de quatro resíduos Lys os esque letos de carbono estão sombreados Observe o uso tanto de números quanto de letras gregas nos nomes dessas estruturas para identificar os átomos de carbono alterados b Modifica ções dos aminoácidos reversíveis envolvidos na regulação da atividade proteica A fosforilação é o tipo mais comum de mo dificação regulatória c Ornitina e citrulina não encontrados em proteínas são intermediários na biossíntese de arginina e no ciclo da ureia Nelson6edbookindb 82 Nelson6edbookindb 82 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 83 ácido acético ver Figura 217 e pode ser analisada do mesmo modo Em pH muito baixo a espécie iônica pre dominante de glicina é a forma completamente protona da 1H3NCH2COOH No primeiro estágio da titulação o grupo COOH de glicina perde seu próton No ponto médio desse estágio estão presentes concentrações equi molares de espécies doadoras 1H3NCH2COOH e aceptoras 1H3NCH2COO de prótons Como na ti tulação de qualquer ácido fraco um ponto de inflexão é alcançado nesse ponto médio onde o pH é igual ao pKa do grupo protonado que está sendo titulado ver Figura 218 Para a glicina o pH no ponto médio é 234 portan to seu grupo COOH tem um pKa marcado pK1 na Figu ra 310 de 234 lembrese do Capítulo 2 que pH e pKa são simplesmente notações convenientes para concentra ção de prótons e a constante de equilíbrio para ionização respectivamente O pKa é uma medida da tendência de um grupo doar um próton com essa tendência diminuin do dez vezes à medida que o pKa aumenta em uma unida de À medida que a titulação da glicina prossegue outro ponto importante é alcançado no pH 597 Aqui há outro ponto de inflexão no qual a remoção do primeiro próton está completa e a remoção do segundo apenas começou Nesse pH a glicina está presente em grande parte como o íon bipolar zwitteríon 1H3NCH2COO Em breve será analisado o significado desse ponto de inflexão na curva de titulação marcado como pI na Figura 310 O segundo estágio da titulação corresponde à remoção de um próton do grupo NH 1 3 da glicina O pH no ponto médio dessa fase é 960 igual ao pKa marcado pK2 na Figu ra 310 para o grupo NH 1 3 A titulação está completa em um pH de cerca de 12 no ponto em que a forma predomi nante de glicina é H2NCH2COO A partir da curva de titulação da glicina é possível obter várias informações importantes Em primeiro lugar ela for nece uma medida quantitativa do pKa de cada um dos dois grupos ionizáveis 234 para o grupo COOH e 960 para o grupo NH 1 3 Observe que o grupo carboxila da glicina é mais de cem vezes mais ácido mais facilmente ionizado do que o grupo carboxila do ácido acético que como foi visto no Capítulo 2 tem um pKa de 476 próximo da média para um grupo carboxila ligado a um hidrocarboneto alifático não substituído O pKa alterado da glicina é provocado pela repulsão entre o próton que está saindo e o grupo amino próximo positivamente carregado no átomo de carbono a como descrito na Figura 311 As cargas opostas no zwit teríon resultante estão estabilizadas De modo semelhante o pKa do grupo amino na glicina é alterado para baixo em relação ao pKa médio de um grupo amino Esse efeito se deve parcialmente aos átomos de oxigênio eletronegativos nos grupos carboxila que tendem a puxar os elétrons na direção deles aumentando a tendência do grupo amino em abrir mão de um próton Assim o grupo aamino tem um pKa menor do que o de um de uma amina alifática como a metilamina Figura 311 Em resumo o pKa de qualquer grupo funcional é em grande parte afetado por seu ambien te químico fenômeno algumas vezes explorado nos sítios ativos de enzimas para promover mecanismos de reação ex traordinariamente adaptados que dependem dos valores de pKa perturbados de grupos doadoresaceptores de prótons de resíduos específicos Forma não iônica Forma zwitteriônica C NH2 R H COOH C NH3 R H H C COO COO R NH3 H C COO R NH2 H Zwitteríon como ácido H C COOH R H C COO R NH3 H NH3 Zwitteríon como base FIGURA 39 Formas não iônicas e zwitteriônicas de aminoácidos A forma não iônica não ocorre em quantidades significativas em soluções aquosas O zwitteríon predomina em pH neutro Um zwitteríon pode atu ar tanto como ácido doador de prótons quanto como base aceptor de prótons N 1 N 1 C COOH H2 H3 C COO2 H2 H3 N C COO2 H2 H2 13 05 OH2 equivalentes pH 0 0 7 2 15 1 pK1 pK2 Glicina pK2 5 960 pK1 5 234 pI 5 597 FIGURA 310 Titulação de um aminoácido Aqui é mostrada a curva de titulação de 01 M de glicina a 25ºC As espécies iônicas que predominam em pontoschave na titulação são mostradas acima do gráfico Os retângulos sombreados centrados em torno de pK1 5 234 e pK2 5 960 indicam as regiões de maior poder de tamponamento Observe que 1 equivalente de OH 5 01 M de NaOH foi adicionado Nelson6edbookindb 83 Nelson6edbookindb 83 020414 1842 020414 1842 84 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A segunda informação fornecida pela curva de titula ção da glicina é que esse aminoácido tem duas regiões com poder de tamponamento Uma delas está na parte relati vamente achatada da curva se estendendo por aproxima damente 1 unidade de pH de cada lado do primeiro pKa de 234 indicando que a glicina é um bom tampão próxima desse pH A outra zona de tamponamento está centrada em volta do pH 960 observe que a glicina não é um bom tam pão no pH do líquido intracelular ou do sangue em torno de 74 Dentro das faixas de tamponamento da glicina a equação de HendersonHasselbalch p 64 pode ser utili zada para calcular as proporções de espécies de glicina pró tondoadoras e prótonaceptoras necessárias para preparar um tampão em um determinado pH Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos Outra importante peça de informação derivada da curva de titulação de um aminoácido é a relação entre a sua carga final e o pH da solução No pH de 597 o ponto de inflexão entre os dois estágios na sua curva de titulação a glicina está presente predominantemente em sua for ma bipolar totalmente ionizada mas sem carga elétrica final Figura 310 O pH característico no qual a carga elétrica final é zero é chamado de ponto isoelétrico ou pH isoelétrico designado por pI Para a glicina que não possui qualquer grupo ionizável em sua cadeia lateral o ponto isoelétrico é simplesmente a média aritmética dos dois valores de pKa Como evidenciado na Figura 310 a glicina tem uma carga final negativa em qualquer pH acima do seu pI e portanto irá se deslocar na direção do eletrodo positivo o ânodo quando colocada em um campo elétrico Em qualquer pH abaixo do seu pI a glicina tem uma carga final positiva e irá se deslocar em direção ao eletrodo negativo o cátodo Quanto mais distante for o pH de uma solução de glicina de seu ponto isoelétrico maior será a carga elétrica final da população de moléculas de glicina Em um pH igual a 10 por exemplo a glicina existe quase totalmente na for ma 1H3NCH2COOH com uma carga positiva final igual a 10 Em um pH de 234 onde há uma igual mistura de 1H3NCH2COOH e 1H3NCH2COO a média ou a carga final positiva é igual a 05 O sinal e a magnitude da carga final de qualquer aminoácido em qualquer pH podem ser previstos do mesmo modo Aminoácidos diferem em suas propriedades acidobásicas As propriedades compartilhadas de muitos aminoácidos permitem algumas generalizações simplificadas sobre seu comportamento acidobásico Em primeiro lugar todos os aminoácidos com um único grupo aamino um único gru po acarboxila e um grupo R não ionizável têm curvas de titulação semelhantes à da glicina Figura 310 Esses ami noácidos têm valores de pKa muito semelhantes mas não idênticos pKa do grupo COOH na faixa de 18 a 24 e pKa do grupo NH 1 3 na faixa de 88 a 110 Tabela 31 As diferenças nesses valores de pKa refletem os am bientes químicos impostos por seus grupos R Em segun do lugar os aminoácidos com um grupo R ionizável têm curvas de titulação mais complexas com três estágios correspondendo às três etapas possíveis de ionização as NH3 Grupos carboxila e amino substituídos por metil Ácido acético O pKa normal para um grupo carboxila é de cerca de 48 pKa 2 4 6 8 10 12 Metilamina O pKa normal para um grupo amino é de cerca de 106 Grupos amino e carboxil na glicina Aminoácido glicina Grupos com cargas opostas diminuem o pKa pela estabilização do zwitteríon Aminoácido glicina pKa 5 960 Átomos de oxigênio eletronegativos no grupo carboxila puxam os elétrons para longe do grupo amino reduzindo seu pKa CH3 COOH CH3 CH3 COO COO C H H NH2 COO C H H CH3 NH3 NH2 H H COOH H C H NH3 H H H H H H pKa 5 234 FIGURA 311 Efeito do ambiente químico no pKa Os valores de pKa para os grupos ionizáveis na glicina são mais baixos do que aqueles dos grupos simples de carboxila e o amino substituídos por metil Essas pertur bações do pKa se devem a interações intramoleculares Efeitos semelhantes podem ser causados por grupos químicos que possam estar posicionados próximos por exemplo no sítio ativo de uma enzima Nelson6edbookindb 84 Nelson6edbookindb 84 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 85 sim eles possuem três valores de pKa O estágio adicional para a titulação do grupo R ionizável se funde em algum grau com aquele para a titulação do grupo acarboxila para a titulação do grupo aamino ou ambos As curvas de titulação para dois aminoácidos desse grupo glutama to e histidina são mostradas na Figura 312 Os pontos isoelétricos refletem a natureza dos grupos R ionizáveis presentes Por exemplo o glutamato tem um pI de 322 consideravelmente mais baixo do que o da glicina Isso se deve à presença de dois grupos carboxila que na média de seus valores de pKa 322 contribuem para uma carga final de 1 que equilibra o 11 proveniente do grupo ami na Do mesmo modo o pI da histidina com dois grupos positivamente carregados quando protonados é de 759 a média dos valores de pKa dos grupos amina e imidazol muito mais alto do que aquele da glicina Por fim como apontado anteriormente sob a condição geral de exposição livre e aberta ao ambiente aquoso ape nas a histidina tem um grupo R pKa 5 60 que fornece um poder de tamponamento significativo próximo do pH neutro normalmente encontrado nos líquidos intracelula res e extracelulares da maior parte dos animais e bactérias Tabela 31 RESUMO 31 Aminoácidos c Os 20 aminoácidos comumente encontrados como re síduos em proteínas contêm um grupo acarboxila um grupo aamino e um grupo R característico substituído no átomo do carbono a O átomo de carbono a de to dos os aminoácidos exceto a glicina é assimétrico e portanto os aminoácidos podem existir em pelo menos duas formas estereoisoméricas Apenas os estereoisô meros L com uma configuração relacionada à configura ção absoluta da molécula de referência L gliceraldeído são encontrados em proteínas c Outros aminoácidos menos comuns também ocorrem tanto como constituintes de proteínas pela modifica ção de resíduos de aminoácidos comuns após a síntese proteica quanto como metabólitos livres c Os aminoácidos podem ser classificados em cinco ti pos com base na polaridade e carga em pH 7 de seus grupos R c Os aminoácidos variam em suas propriedades acido básicas e têm curvas de titulação características Ami noácidos monoamino monocarboxílicos com grupos R não ionizáveis são ácidos dipróticos 1H3NCHR COOH em pH baixo e existem em várias formas iôni cas diferentes à medida que o pH aumenta Aminoá cidos com grupos R ionizáveis têm espécies iônicas adicionais dependendo do pH do meio e do pKa do grupo R 32 Peptídeos e proteínas Agora o foco passa a ser os polímeros de aminoácidos os peptídeos e as proteínas Os polipeptídeos que ocorrem biologicamente variam em tamanho de pequenos a muito grandes consistindo em dois ou três a milhares de resíduos de aminoácidos ligados Aqui serão focalizadas as proprie dades químicas fundamentais desses polímeros Peptídeos são cadeias de aminoácidos Duas moléculas de aminoácidos podem ser ligadas de modo covalente por meio de uma ligação amida substi tuída denominada ligação peptídica a fim de produzir um dipeptídeo Tal ligação é formada pela remoção de elementos de água desidratação do grupo acarboxila de um aminoácido e do grupo aamino do outro Figura 313 A formação da ligação peptídica é um exemplo de H3N 1 N 1 N 1 C COOH C C COOH H2 H2 H pK1 pK2 pKR H3 C COO2 C C COOH H2 H2 H H3 C COO2 C C COO2 H2 H2 H H2N C COO2 C C COO2 H2 H2 H Carga final 11 0 21 22 10 8 6 4 2 0 Glutamato pK2 5 967 pKR 5 425 pI 5 pK1 5 322 219 10 20 30 pH OH2 equivalentes a H3N 1 C COOH CH2 H H3N 1 C COO2 CH2 H H3N 1 C COO2 CH2 H H2N C CH2 H pK2 5 917 pl 5 759 pKR 5 60 pK1 5 182 10 8 6 4 2 0 10 20 30 pH OH2 equivalentes b COO2 Histidina pK1 pKR pK2 12 11 0 21 C H N CH C H N 1 H C H N CH C H N 1 H C H N CH C H N C H N CH C H N FIGURA 312 Curvas de titulação para a glutamato e b histidina O grupo R do pKa é designado aqui como pKR Nelson6edbookindb 85 Nelson6edbookindb 85 020414 1842 020414 1842 86 DAVID L NELSON MICHAEL M COX uma reação de condensação uma classe comum de rea ções nas células vivas Em condições bioquímicas padrão o equilíbrio para a reação mostrada na Figura 313 favore ce os aminoácidos em relação ao dipeptídeo Para tornar a reação mais favorável termodinamicamente o grupo car boxila deve ser modificado ou ativado quimicamente de modo que o grupo hidroxila possa ser mais rapidamente eliminado Uma abordagem química para esse problema será destacada posteriormente neste capítulo A aborda gem biológica para a formação de ligações peptídicas é o tópico principal do Capítulo 27 Três aminoácidos podem ser unidos por duas ligações peptídicas para formar um tripeptídeo do mesmo modo quatro aminoácidos podem ser unidos para formar um te trapeptídeo cinco para formar um pentapeptídeo e assim por diante Quando alguns aminoácidos se ligam desse modo a estrutura é chamada de oligopeptídeo Quando muitos aminoácidos se ligam o produto é chamado de po lipeptídeo As proteínas podem ter milhares de resíduos de aminoácidos Embora os termos proteína e polipep tídeo sejam algumas vezes intercambiáveis as moléculas chamadas de polipeptídeos têm massas moleculares abaixo de 10000 e as chamadas de proteínas têm massas molecu lares mais elevadas A Figura 314 mostra a estrutura de um pentapeptí deo Como já observado uma unidade de aminoácido em um peptídeo é frequentemente chamada de resíduo a par te restante após a perda de elementos de água um áto mo de hidrogênio de seu grupo amino e a metade hidroxi la de seu grupo carboxila Em um peptídeo o resíduo de aminoácido na extremidade com um grupo aamino livre é chamado de resíduo aminoterminal ou Nterminal o resíduo na outra extremidade que tem um grupo carboxila livre é o resíduo carboxiterminal Cterminal CONVENÇÃOCHAVE Quando uma sequência de aminoáci dos de um peptídeo polipeptídeo ou proteína é exibida a extremidade aminoterminal é localizada à esquerda e a extremidade carboxiterminal à direita A sequência é lida da esquerda para a direita começando com a extremidade aminoterminal Embora a hidrólise de uma ligação peptídica seja uma reação exergônica ela só ocorre lentamente porque tem uma elevada energia de ativação p 27 Como resultado as ligações peptídicas em proteínas são muito estáveis com meiavida média t12 de cerca de 7 anos na maioria das condições intracelulares Peptídeos podem ser diferenciados por seus comportamentos de ionização Peptídeos contêm apenas um grupo aamino e um gru po acarboxila livres em extremidades opostas da cadeia Figura 315 Esses grupos se ionizam como nos ami noácidos livres embora as constantes de ionização sejam diferentes porque um grupo de carga oposta não é mais ligado ao carbono a Os grupos aamino e acarboxila de todos os aminoácidos não terminais são ligados covalen temente nas ligações peptídicas que não se ionizam e portanto não contribuem para o comportamento acido básico total dos peptídeos Entretanto os grupos R de H3N 1 C R1 H C O OH 1 H N H C R2 H COO2 H2O H2O H3N 1 C R1 H C O N H C R2 H COO2 FIGURA 313 Formação de uma ligação peptídica por condensação O grupo aamino de um aminoácido com grupo R 2 atua como nucleófi lo para deslocar o grupo hidroxila de outro aminoácido com grupo R 1 formando uma ligação peptídica sombreada Os grupos amino são bons nucleófilos mas o grupo hidroxila é um grupo de saída fraco e não pronta mente deslocado No pH fisiológico a reação mostrada aqui não ocorre em grau apreciável H3N 1 C CH2OH H C O N H C H H C O N H C CH2 H C O N H C CH3 H C OH N H C C C CH3 CH3 H H2 COO2 Extremidade aminoterminal Extremidade carboxiterminal O H FIGURA 314 O pentapetídeo serilgliciltirosilalanilleucina Ser GlyTyrAlaLeu ou SGYAL Os peptídeos são nomeados a partir do resí duo aminoterminal que por convenção é colocado à esquerda As ligações peptídicas são sombreadas os grupos R estão em corderosa Ala C COO2 NH O C C NH O C C NH O C C N 1 H3 H CH3 H CH2 CH2 COO2 H2 H CH2 CH2 CH2 CH2 N 1 H3 Lys Gly Glu FIGURA 315 Alanilglutamilglicillisina Este tetrapeptídeo tem um grupo aamino livre um grupo acarboxila livre e dois grupos R ionizáveis Os grupos ionizados em pH 70 estão em corderosa Nelson6edbookindb 86 Nelson6edbookindb 86 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 87 alguns aminoácidos podem se ionizar Tabela 31 e em um peptídeo esses contribuem para as propriedades acidobásicas gerais da molécula Figura 315 Assim o comportamento acidobásico de um peptídeo pode ser previsto a partir de seus grupos aamino e acarboxila livres combinado com a natureza e o número de seus gru pos R ionizáveis Como os aminoácidos livres os peptídeos têm curvas de titulação características e um pH isoelétrico característico pI que não se desloca em um campo isoelétrico Essas propriedades são exploradas em algumas das técnicas uti lizadas para separar peptídeos e proteínas como será visto mais adiante neste capítulo Deve ser enfatizado que o valor do pKa para um grupo R ionizável pode se alterar um pouco quando um aminoácido se torna um resíduo em um peptí deo A perda da carga nos grupos acarboxila e aamino as interações com outros grupos R do peptídeo e outros fato res ambientais podem afetar o pKa Os valores de pKa para os grupos R listados na Tabela 31 podem ser um guia útil para a variação do pH em que um determinado grupo irá se ionizar mas eles não podem ser estritamente aplicados aos peptídeos Peptídeos e polipeptídeos biologicamente ativos ocorrem em uma ampla variação de tamanhos e composições Nenhuma generalização pode ser feita sobre as massas mo leculares de peptídeos e proteínas biologicamente ativos em relação às suas funções Peptídeos que ocorrem natu ralmente variam em comprimento de dois a muitos milhares de resíduos de aminoácidos Mesmo os menores peptídeos podem ter efeitos biologicamente importantes Considere o dipeptídeo sintetizado comercialmente éster metílico de L aspartilLfenilalanina o adoçante artificial mais conhecido como aspartame ou NutraSweet H3N 1 C C COO2 H2 H C O N H C CH2 H C O OCH3 Éster metílico de LaspartilLfenilalanina aspartame Muitos peptídeos pequenos exercem seus efeitos em concentrações muito baixas Por exemplo vários hormô nios de vertebrados Capítulo 23 são peptídeos pequenos Esses incluem a ocitocina nove resíduos de aminoácidos secretada pela glândula neurohipófise que estimula as contrações uterinas e o fator de liberação de tireotropina três resíduos formado no hipotálamo e que estimula a liberação de outro hormônio tireotropina da glândula adenohipófise Alguns venenos extremamente tóxicos de cogumelos como a amanitina também são peptídeos pe quenos assim como muitos antibióticos Quão longo é o comprimento das cadeias polipeptídicas em proteínas Como a Tabela 32 mostra os comprimen tos variam consideravelmente O citocromo c humano tem 104 resíduos de aminoácidos ligados em uma única cadeia o quimotripsinogênio bovino tem 245 resíduos No extremo está a titina constituinte dos músculos de vertebrados que tem aproximadamente 27000 resíduos de aminoácidos e massa molecular de cerca de 3000000 A grande maioria das proteínas que ocorrem naturalmente é muito menor do que ela contendo menos de 2000 resíduos de aminoácidos Algumas proteínas consistem em apenas uma única ca deia polipeptídica porém outras chamadas de proteínas multissubunidade têm dois ou mais polipeptídeos as sociados de modo não covalente Tabela 32 As cadeias polipeptídicas individuais em uma proteína multissubunida de podem ser idênticas ou diferentes Se pelo menos duas TABELA 32 Dados moleculares de algumas proteínas Massa molecular Número de resíduos Número de cadeias polipeptídicas Citocromo c humano 12400 104 1 Ribonuclease A pâncreas bovino 13700 124 1 Lisozima clara de ovo de galinha 14300 129 1 Mioglobina coração de equinos 16700 153 1 Quimotripsina pâncreas bovino 25200 241 3 Quimotripsinogênio bovinos 25700 245 1 Hemoglobina humana 64500 574 4 Albumina sérica humana 66000 609 1 Hexocinase levedura 107900 972 2 RNApolimerase E coli 450000 4158 5 Apolipoproteína B humana 513000 4536 1 Glutaminasintetase E coli 619000 5628 12 Titina humana 2993000 26926 1 Nelson6edbookindb 87 Nelson6edbookindb 87 020414 1842 020414 1842 88 DAVID L NELSON MICHAEL M COX são idênticas a proteína é chamada de oligomérica e as unidades idênticas consistindo em uma ou mais cadeias polipeptídicas são chamadas de protômeros A hemoglo bina por exemplo tem quatro subunidades polipeptídicas duas cadeias a idênticas e duas cadeias b idênticas todas as quatro mantidas unidas por interações não covalentes Cada subunidade a é pareada de modo idêntico com uma subunidade b dentro da estrutura dessa proteína multissu bunidade de modo que a hemoglobina pode ser considera da tanto um tetrâmero de quatro subunidades de polipeptí deos quanto um dímero de protômeros ab Algumas proteínas contêm duas ou mais cadeias poli peptídicas ligadas covalentemente Por exemplo as duas cadeias polipeptídicas da insulina são unidas por ligações dissulfeto Em tais casos os polipeptídeos individuais não são considerados subunidades mas são comumente chama dos simplesmente de cadeias A composição de aminoácidos das proteínas também é muito variável Os 20 aminoácidos comuns quase nunca ocorrem em quantidades iguais em uma proteína Alguns aminoácidos podem ocorrer apenas uma vez ou estar au sentes em determinado tipo de proteína outros podem ocorrer em grande número A Tabela 33 mostra a compo sição de aminoácidos do citocromo c e do quimotripsinogê nio bovinos o último sendo o precursor inativo da enzima digestiva quimotripsina Essas duas proteínas com funções muito diferentes também diferem significativamente em números relativos de cada tipo de resíduo de aminoácido É possível calcular o número aproximado de resíduos de aminoácidos em uma simples proteína que não contenha quaisquer outros constituintes químicos dividindo a sua mas sa molecular por 110 Embora a massa molecular média dos 20 aminoácidos comuns seja de cerca de 138 os aminoácidos menores predominam na maioria das proteínas Levando em conta as proporções nas quais os vários aminoácidos ocorrem em uma proteína média Tabela 31 as médias são determi nadas pela pesquisa da composição dos aminoácidos de mais de 1000 proteínas diferentes a massa molecular média dos aminoácidos de uma proteína é mais próxima de 128 Como uma molécula de água Mr 18 é removida para criar cada ligação peptídica a massa molecular média de um resíduo de aminoácido em uma proteína é de cerca de 128 18 5 110 TABELA 33 Composição de aminoácidos de duas proteínas Citocromo c bovino Quimotripsinogênio bovino Aminoácido Número de resíduos por molécula Porcentagem do total Número de resíduos por molécula Porcentagem do total Ala 6 6 22 9 Arg 2 2 4 16 Asn 5 5 14 57 Asp 3 3 9 37 Cys 2 2 10 4 Gln 3 3 10 4 Glu 9 9 5 2 Gly 14 13 23 94 His 3 3 2 08 Ile 6 6 10 4 Leu 6 6 19 78 Lys 18 17 14 57 Met 2 2 2 08 Phe 4 4 6 24 Pro 4 4 9 37 Ser 1 1 28 114 Thr 8 8 23 94 Trp 1 1 8 33 Tyr 4 4 4 16 Val 3 3 23 94 Total 104 102 245 997 Nota Em algumas análises usuais como a hidrólise ácida Asp e Asn não são distinguidos um do outro sendo designados em conjunto como Asx ou B De forma semelhante quando Glu e Gln não podem ser distinguidos eles são designados juntos como Glx ou Z Adicionalmente Trp é destruído por hidrólise ácida Métodos adicionais devem ser utilizados para se obter uma avaliação precisa do conteúdo completo de aminoácidos Porcentagens não somam 100 em razão de arredondamentos Nelson6edbookindb 88 Nelson6edbookindb 88 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 89 Algumas proteínas contêm outros grupos químicos além dos aminoácidos Muitas proteínas como por exemplo as enzimas ribonu clease A e a quimotripsina contêm apenas resíduos de aminoácidos e nenhum outro constituinte químico elas são consideradas proteínas simples Entretanto algumas pro teínas contêm componentes químicos permanentemente associados além dos aminoácidos elas são chamadas de proteínas conjugadas A parte não aminoácido de uma proteína conjugada é normalmente chamada de grupo prostético As proteínas conjugadas são classificadas com base na natureza química de seus grupos prostéticos Ta bela 34 por exemplo lipoproteínas contêm lipídeos glicoproteínas contêm grupos de açúcares e metalopro teínas contêm um metal específico Algumas proteínas contêm mais de um grupo prostético Normalmente o grupo prostético desempenha um papel importante na função bio lógica da proteína RESUMO 32 Peptídeos e proteínas c Aminoácidos podem ser unidos de modo covalente por meio de ligações peptídicas para formar peptídeos e proteínas As células geralmente contêm milhares de proteínas diferentes cada uma com uma atividade bio lógica diferente c Proteínas podem ser cadeias peptídicas muito longas de 100 a muitos milhares de resíduos de aminoácidos Entretanto alguns peptídeos que ocorrem naturalmen te possuem apenas alguns poucos resíduos de aminoá cidos Algumas proteínas são compostas por várias ca deias polipeptídicas associadas de modo não covalente chamadas de subunidades c Proteínas simples produzem por hidrólise apenas ami noácidos proteínas conjugadas contêm além deles al guns outros componentes tais como um metal ou um grupo prostético 33 Trabalhando com proteínas A compreensão da estrutura e função de proteínas pelos bioquímicos derivou de estudos de muitas proteínas indivi duais Para estudar em detalhe uma proteína o pesquisador deve ser capaz de separála de outras proteínas na forma pura e deve dominar as técnicas para determinar suas pro priedades Os métodos necessários vêm da química de pro teínas disciplina tão antiga quanto a própria bioquímica e que mantém uma posição central na pesquisa bioquímica Proteínas podem ser separadas e purificadas Uma preparação pura é essencial para a determinação das propriedades e atividades de uma proteína Visto que as células contêm milhares de diferentes tipos de proteínas como uma proteína pode ser purificada Métodos clássicos para separação de proteínas se aproveitam das proprieda des que variam de uma proteína para outra incluindo o ta manho a carga e as propriedades de ligação Eles foram complementados nas últimas décadas por outros métodos envolvendo a clonagem do DNA e o sequenciamento do genoma que podem simplificar o processo de purificação de proteínas Os métodos mais recentes apresentados no Capítulo 9 frequentemente modificam artificialmente a proteína que está sendo purificada adicionando poucos ou muitos resíduos de aminoácidos a uma ou ambas as extre midades A conveniência portanto paga o preço de alterar potencialmente a atividade da proteína purificada A purifi cação de proteínas em seus estados nativos a forma como funcionam nas células depende geralmente dos métodos descritos aqui A fonte de uma proteína é geralmente um tecido ou uma célula microbiana A primeira etapa de qualquer procedi mento de purificação de proteína é romper essas células liberando suas proteínas em uma solução chamada de ex trato bruto Se necessário pode ser utilizada centrifuga ção diferencial para preparar frações subcelulares ou para isolar organelas específicas ver Figura 18 Uma vez prontos o extrato ou a preparação de organe las vários métodos estão disponíveis para purificar uma ou mais das proteínas neles contidas Em geral o extrato é submetido a tratamentos para separar as proteínas em di ferentes frações com base em uma propriedade tal como tamanho ou carga em um processo chamado de fraciona mento Etapas iniciais de fracionamento em uma purifica ção utilizam diferenças na solubilidade de proteínas que são uma função complexa do pH temperatura concentra TABELA 34 Proteínas conjugadas Classe Grupo prostético Exemplo Lipoproteínas Lipídeos b1Lipoproteína sanguínea Glicoproteínas Carboidratos Imunoglobulina G Fosfoproteínas Grupos fosfato Caseína do leite Hemoproteínas Heme porfirina férrica Hemoglobina Flavoproteínas Nucleotídeos de flavina Succinatodesidrogenase Metaloproteínas Ferro Zinco Cálcio Molibdênio Cobre Ferritina Álcooldesidrogenase Calmodulina Dinitrogenase Plastocianina Nelson6edbookindb 89 Nelson6edbookindb 89 020414 1842 020414 1842 90 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ção de sais e outros fatores A solubilidade de proteínas é reduzida em presença de alguns sais um efeito chamado de salting out A adição de certos sais na quantidade correta pode precipitar seletivamente algumas proteínas enquan to outras permanecem em solução Particularmente eficaz o sulfato de amônio NH42SO4 é muitas vezes utilizado para precipitar proteínas As proteínas assim precipitadas são removidas daquelas que permanecem em solução por centrifugação em baixa rotação Uma solução contendo a proteína de interesse geral mente precisa ser modificada adicionalmente antes que as etapas de purificação subsequentes sejam possíveis Por exemplo a diálise é um procedimento que separa proteí nas de solutos pequenos se aproveitando do tamanho maior das proteínas O extrato parcialmente purificado é colocado em uma bolsa ou tubo composto por uma membrana semi permeável Quando este é suspenso em um volume muito maior de uma solução tamponada de força iônica adequada a membrana permite a troca de sal e de solução tampão mas não de proteínas Assim a diálise retém as proteínas grandes no interior da bolsa membranosa ou tubo permi tindo que a concentração de outros solutos na preparação de proteínas se altere até ficarem em equilíbrio com a so lução fora da membrana A diálise pode ser utilizada por exemplo para remover o sulfato de amônio da preparação proteica Os métodos mais eficientes para fracionar proteínas uti lizam a cromatografia em coluna que se utiliza das dife renças na carga das proteínas tamanho afinidade de ligação e outras propriedades Figura 316 Um material sólido poroso com propriedades químicas adequadas fase estacio nária é mantido em uma coluna e uma solução tamponada fase móvel migra através dela A proteína dissolvida na mesma solução tampão que foi utilizada para estabelecer a fase móvel é colocada no topo da coluna A proteína então atravessa a matriz sólida como uma banda que se expande cada vez mais no interior da fase móvel maior Proteínas in dividuais migram com mais rapidez ou lentidão através da coluna dependendo de suas propriedades A cromatografia de troca iônica explora as diferen ças no sinal e magnitude da carga elétrica final de proteí nas em um determinado pH Figura 317a A matriz da coluna é um polímero sintético resina que contém gru pos carregados ligados aqueles ligados a grupos aniônicos são chamados de permutadores de cátions e aqueles ligados a grupos catiônicos são chamados de permutado res de ânions A afinidade de cada proteína pelos grupos carregados na coluna é afetada pelo pH que determina o estado de ionização da molécula e a concentração de íons de sais livres competindo na solução circundante A sepa ração pode ser otimizada por mudanças graduais no pH e ou na concentração de sal da fase móvel de modo a criar um gradiente de pH ou de sal Na cromatografia de tro ca catiônica a matriz sólida tem grupos carregados nega tivamente Na fase móvel as proteínas com uma carga final positiva migram através da matriz mais lentamente que aquelas proteínas com uma carga final negativa porque a migração das primeiras é mais retardada por sua interação com a fase estacionária Em colunas de troca iônica a expansão da banda de proteína na fase móvel a solução proteica é causada tanto pela separação de proteínas com diferentes proprie dades quanto pela dispersão por difusão À medida que o comprimento da coluna aumenta a resolução de dois tipos de proteínas com diferentes cargas finais geralmente me lhora Entretanto a velocidade na qual a solução protei ca pode fluir através da coluna geralmente diminui com o comprimento da coluna E à medida que a duração do Matriz sólida porosa fase estacionária Bomba Registrador Suporte poroso Reservatório Amostra proteica fase móvel A B C Efluente Tempo Coletor de frações Detector FIGURA 316 Cromatografia em coluna Os elementos padrão de uma coluna cromatográfica incluem um material poroso matriz sólido apoiado no interior de uma coluna geralmente feita de plástico ou vidro Uma solu ção a fase móvel flui através da matriz a fase estacionária A solução que sai da coluna o efluente é constantemente substituída pela solução fornecida por um reservatório no topo A solução de proteína a ser separada é coloca da no topo da coluna e deixada percolar pela matriz sólida Mais solução é adicionada no topo A solução proteica forma uma banda no interior da fase móvel que tem inicialmente a profundidade da solução de proteína aplica da à coluna À medida que as proteínas migram através da coluna mostra da aqui em cinco momentos diferentes elas são retardadas em diferentes graus por suas diferentes interações com o material da matriz A banda total de proteína portanto se amplia à medida que se move através da coluna Tipos individuais de proteínas como A B e C mostradas em azul vermelho e verde se separam gradualmente umas das outras formando bandas no interior da banda proteica mais larga A separação melhora ie aumenta a resolução à medida que o comprimento da coluna aumenta Entretanto cada banda proteica individual também se alarga com o tempo devido à dispersão por difusão processo que diminui a resolução Nesse exemplo a proteína A está bem separada da B e C mas a dispersão por difusão impede a separação completa de B e C sob essas condições Nelson6edbookindb 90 Nelson6edbookindb 90 020414 1842 020414 1842 PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA DE LEHNINGER 91 Bomba Bomba A mistura de proteinas é f my A mistura de proteinas adicionada a coluna contendo i 6 adicionada a coluna Tie permutadores de cations ie que contém um Ze F i polimero com a 4 Carga final positiva elevada Se Lo se ligagdes cruzadas lone Carga final positiva Le Carga final negativa Oo i Proteina a o Carga final negativa elevada te Y g o at 5 oo As proteinas movemse aN Ve f Gf f F cm 6 df ohh a oF 7 Fi através da coluna em Lt Gd Resina o Po velocidades determinadas Y lees N io por suas cargas finais no yy V yj bd Ee i pH utilizado Com Perr Ty XS a As moléculas de 4 permutadores de cations YY yj proteinas separamse 228 as proteinas com mais Wi 2 por tamanho moléculas e carga final negativa FS maiores passam mais movemse mais rapido e J 4 livremente aparecendo eluem mais cedo nas fracées iniciais Granulos de polimero Granulos de polimero poroso com grupos funcionais carregados negativamente i t J se So ell ae 123 45 6 123 45 6 a Cromatografia de troca iénica b Cromatografia de exclusao por tamanho Bomba Bomba Solugao de ligante é adicionadaacoluna i A mistura de proteinas é adicionada a coluna i E 6 Sg contendo um ligante fe o ml 80 90 covalentemente ligado ao gg Z e polimero especifico para s a E isa Pol a proteina de interesse a ft Ligante my ya e Of 7 b io oO b LV a r ce 44 hr Se DY et o et a oCo w Ea Pol JO OQ Proteina de a interesse eacanncnn ti ummcumnamcme om ee FIGURA317 Trés métodos cromatograficos usados na puri ala ficacao de proteinas a A cromatografia de troca idnica explora S 2 diferencas no sinal e na magnitude das cargas elétricas finais de ee JUV re IL proteinas em um determinado pH b A cromatografia de exclusado 123456789 123456789 por tamanho também chamada de filtraao em gel separa protei Proteinas nao desejadas sao A proteina de interesse é eluida nas de acordo com o tamanho A cromatografia de afinidade lavadas da coluna pela solucdo de ligante separa proteinas por suas especificidades de ligagao Detalhes adi c Cromatografia de afinidade cionais desses métodos sao fornecidos no texto 92 DAVID L NELSON MICHAEL M COX tempo dispendido na coluna aumenta a resolução pode diminuir como resultado da dispersão por difusão no in terior de cada banda proteica À medida que o conteúdo da solução proteica sai de uma coluna porções sucessivas frações desse efluente são coletadas em tubos de ensaio Cada fração pode ser testada para a presença da proteína de interesse assim como outras propriedades tais como a força iônica ou a concentração total de proteínas Todas as frações positivas para a proteína de interesse podem ser reunidas como o produto dessa etapa cromatográfica da purificação de proteínas PROBLEMA RESOLVIDO 31 Troca iônica de peptídeos Um bioquímico deseja separar dois peptídeos por cromato grafia por troca iônica No pH da fase móvel a ser utilizado na coluna um peptídeoA possui uma carga final de 3 em decorrência da presença de mais resíduos de Glu e Asp do que de Arg Lys e His O peptídeo B tem carga final de 11 Qual peptídeo irá eluir primeiro a partir de uma resina de troca catiônica Qual irá eluir primeiro a partir da resina de troca aniônica Solução Uma resina de troca catiônica possui cargas nega tivas e se liga a moléculas carregadas positivamente retar dando seu progresso pela coluna O peptídeo B com sua carga final positiva interagirá mais fortemente do que o peptídeo A com a resina de troca catiônica e portanto o peptídeo A irá eluir primeiro Na resina de troca aniônica o peptídeo B irá eluir primeiro O peptídeo A sendo carrega do negativamente será retardado por sua interação com a resina positivamente carregada A Figura 317 mostra duas outras variações da croma tografia em coluna além da troca iônica A cromatografia de exclusão por tamanho também chamada de filtração em gel Figura 317b separa as proteínas de acordo com o tamanho Neste método as proteínas grandes emergem da coluna mais cedo do que as proteínas menores resultado um tanto contrário ao esperado intuitivamente A fase sóli da consiste em grânulos de polímeros reticulados com po ros ou cavidades projetados com um determinado tamanho As proteínas grandes não podem entrar nas cavidades e assim tomam um caminho mais curto e mais rápido atra vés da coluna ao redor dos grânulos Proteínas pequenas penetram nas cavidades e são retardadas em seu caminho de labirintos através da coluna A cromatografia de exclu são por tamanho também pode ser utilizada para estimar o tamanho de uma proteína que está sendo purificada utili zando métodos semelhantes aos descritos na Figura 319 A cromatografia de afinidade se baseia na afinidade de ligação Figura 317c Os grânulos na coluna têm um grupo químico covalentemente ligado chamado de ligante um grupo ou molécula que se liga a uma macromolécula tal como uma proteína Quando uma mistura de proteínas é adicionada à coluna qualquer proteína com afinidade para esse ligante se liga aos grânulos e sua migração através da matriz é retardada Por exemplo se a função biológica de uma proteína envolve a ligação ao ATP então ligandose uma molécula que se assemelha ao ATP a esses grânulos na coluna criase uma matriz de afinidade que pode ajudar a purificar a proteína À medida que a solução proteica se desloca através da coluna as proteínas ligadoras de ATP incluindo a proteína de interesse se ligam à matriz Após a lavagem das proteínas que não se ligam na coluna a pro teína ligada é eluída por uma solução contendo uma alta concentração de sal ou um ligante livre nesse caso o ATP ou um análogo do ATP O sal enfraquece a ligação da pro teína ao ligante imobilizado interferindo com as interações iônicas O ligante livre compete com o ligante ligado aos grânulos liberando a proteína da matriz o produto proteico que elui da coluna é com frequência ligado ao ligante utili zado para eluílo Métodos cromatográficos são aperfeiçoados com a utilização de HPLC ou cromatografia líquida de alto desempenho A HPLC faz uso de bombas de alta pressão que aceleram o movimento das moléculas de proteína co luna abaixo bem como materiais cromatográficos de maior qualidade que podem suportar a força de esmagamento do fluxo pressurizado Reduzindo o tempo de trânsito na colu na a HPLC pode limitar a dispersão por difusão das bandas proteicas e assim melhorar muito a resolução A abordagem para purificação de uma proteína que não tenha sido previamente isolada é guiada tanto pelos prece dentes estabelecidos quanto pelo senso comum Na maioria dos casos vários métodos diferentes devem ser utilizados sequencialmente para purificar uma proteína completa mente cada método separando as proteínas com base em propriedades diferentes Por exemplo se uma etapa separa as proteínas ligadoras de ATP daquelas que não se ligam a ele então a próxima etapa deve separar as várias pro teínas ligadoras de ATP com base no tamanho ou na carga para isolar a proteína específica que é desejada A escolha dos métodos é um tanto empírica e muitas estratégias po dem ser tentadas antes que a mais eficaz seja encontrada Tentativas e erros podem ser frequentemente minimizados baseandose o novo procedimento em técnicas de purifica ção desenvolvidas para proteínas semelhantes Protocolos de purificação publicados estão disponíveis para muitos mi lhares de proteínas O senso comum determina que proce dimentos mais baratos tal como o salting out devam ser utilizados primeiro quando o volume total e o número de contaminantes são maiores Métodos cromatográficos são frequentemente impraticáveis nas fases iniciais porque a quantidade de meio cromatográfico necessário aumenta com o tamanho da amostra À medida que cada etapa de purificação se completa o tamanho da amostra geralmente se torna menor Tabela 35 tornando possível utilizar pro cedimentos cromatográficos mais sofisticados e caros em fases posteriores Proteínas podem ser separadas e caracterizadas por eletroforese Outra técnica importante para separação de proteínas se baseia na migração de proteínas carregadas em um campo elétrico um processo chamado de eletroforese Em ge ral esses procedimentos não são utilizados para purificar proteínas pois alternativas mais simples estão disponíveis e métodos eletroforéticos com frequência afetam adversa Nelson6edbookindb 92 Nelson6edbookindb 92 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 93 mente a estrutura e desse modo a função das proteínas Entretanto como um método analítico a eletroforese é ex tremamente importante Sua vantagem é que as proteínas podem ser visualizadas bem como separadas permitindo ao pesquisador estimar rapidamente o número de proteí nas diferentes em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação proteica específica A eletroforese também pode ser utilizada para determinar propriedades cruciais de uma proteína tal como seu ponto isoelétrico e estimar sua massa molecular Em geral a eletroforese de proteínas é realizada em géis compostos de polímeros reticulados de poliacrilamida Fi gura 318 O gel de poliacrilamida age como uma peneira molecular retardando a migração de proteínas aproximada mente em proporção à sua razão cargamassa A migração também pode ser afetada pela forma da proteína Na ele troforese a força que move a macromolécula é o potencial elétrico E A mobilidade eletroforética m de uma molécula é a razão de sua velocidade V em relação ao seu potencial elétrico A mobilidade eletroforética é também igual à carga TABELA 35 Tabela de purificação para uma enzima hipotética Procedimento ou etapa Volume da fração mL Proteína total mg Atividade unidades Atividade específica unidadesmg 1 Extrato celular bruto 1400 10000 100000 10 2 Precipitação com sulfato de amônio 280 3000 96000 32 3 Cromatografia de troca iônica 90 400 80000 200 4 Cromatografia de exclusão por tamanho 80 100 60000 600 5 Cromatografia de afinidade 6 3 45000 15000 Nota Todos os dados representam o estado da amostra após a realização do procedimento designado A atividade e a atividade específica são definidas na página 95 Poço Direção de migração a Amostra b 97400 66200 45000 31000 21500 14400 Padrões de Mr Marcadores Células não induzidas Células induzidas Extrato bruto solúvel Precipitado de NH42SO4 Troca aniônica Troca catiônica Proteína purificada FIGURA 318 Eletroforese a Diferentes amostras são colocadas em poços ou depressões no topo do gel de SDSpoliacrilamida As proteínas se movem para o gel quando um campo elétrico é aplicado O gel minimiza as correntes de convecção causadas pelos pequenos gradientes de tem peratura bem como movimentos proteicos além daqueles induzidos pelo campo elétrico b Proteínas podem ser visualizadas após eletroforese tra tando o gel com um corante como o azul Coomassie que se liga às proteí nas mas não ao gel em si Cada banda no gel representa uma proteína di ferente ou subunidade de proteína proteínas menores se movem através do gel mais rapidamente que as maiores e portanto são encontradas mais próximas da base do gel Esse gel ilustra a purificação da proteína RecA de Escherichia coli descrita no Capítulo 25 O gene para a proteína RecA foi clonado Capítulo 9 para que sua expressão síntese da proteína pudesse ser controlada A primeira canaleta mostra um conjunto de proteínas pa drão de Mr conhecido servindo como marcadores de massa molecular As duas canaletas seguintes mostram proteínas de células de E coli antes e depois que a síntese da proteína RecA foi induzida A quarta canaleta mos tra as proteínas presentes após sucessivas etapas de purificação A proteína purificada é uma cadeia polipeptídica única Mr 38000 como mostrado na canaleta mais à direita Nelson6edbookindb 93 Nelson6edbookindb 93 020414 1842 020414 1842 94 DAVID L NELSON MICHAEL M COX final Z da molécula dividida por seu coeficiente de fricção f que reflete em parte a forma de uma proteína Portanto A migração de uma proteína em um gel durante a eletro forese é portanto uma função do seu tamanho e formato Um método eletroforético comumente empregado para estimar a pureza e a massa molecular utiliza o detergente dodecil sulfato de sódio SDS dodecil significa uma cadeia de 12 carbonos CH211CH3 O S Na1 2O O O Dodecil sulfato de sódio SDS Uma proteína se ligará cerca de 14 vez sua massa de SDS aproximadamente uma molécula de SDS para cada resíduo de aminoácido Um SDS ligado contribui com uma grande carga final negativa tornando a carga intrínseca da proteína insignificante e conferindo a cada proteína uma razão carga massa semelhante Além disso a ligação de SDS desdobra parcialmente as proteínas de modo que a maior parte das proteínas ligadas ao SDS assume uma forma semelhante a bastonetes A eletroforese na presença de SDS portanto se para proteínas quase que exclusivamente com base em sua massa massa molecular com os peptídeos menores migran do mais rapidamente Após a eletroforese as proteínas são visualizadas pela adição de um corante como o azul de Coo massie que se liga às proteínas mas não ao gel em si Figura 318b Assim um pesquisador pode monitorar o progresso de um procedimento de purificação de proteínas à medida que o número de bandas de proteínas visíveis no gel diminui após cada nova fase de fracionamento Quando comparada às posições para as quais as proteínas de massa molecular co nhecido migram no gel a posição de uma proteína não identi ficada pode fornecer uma boa estimativa de sua massa mole cular Figura 319 Se a proteína tem duas ou mais subunidades diferentes as subunidades são geralmente sepa radas por tratamento com SDS e uma banda separada apare ce para cada uma delas Eletroforese em gel com SDS A focalização isoelétrica é um procedimento utiliza do para determinar o ponto isoelétrico pI de uma proteína Figura 320 Um gradiente de pH é estabelecido permi tindose que uma mistura de ácidos e bases orgânicas de baixo peso molecular anfólitos p 81 se distribuía em um campo elétrico gerado ao longo do gel Quando uma mistura de proteínas é aplicada cada proteína migra até alcançar o pH correspondente ao seu pI Proteínas com pontos isoelé tricos diferentes são assim distribuídas de modo diferente ao longo do gel A combinação da focalização isoelétrica com a eletro forese em SDS sequencialmente em um processo chamado de eletroforese bidimensional permite a resolução de misturas complexas de proteínas Figura 321 Esse é um método analítico mais sensível do que qualquer método eletroforético sozinho A eletroforese bidimensional separa proteínas de massa molecular idêntica que diferem em seu pI ou proteínas com valores de pl semelhantes mas com massas moleculares diferentes 200000 116250 97400 66200 45000 31000 21500 14400 Padrões de Mr Proteína desconhecida Miosina bGalactosidase Glicogêniofosforilase b Albumina sérica bovina Ovalbumina Anidrase carbônica Inibidor de tripsina de soja Lisozima 1 2 a log Mr Migração relativa Proteína desconhecida b FIGURA 319 Estimando a massa molecular de uma proteína A mo bilidade eletroforética de uma proteína em gel de SDSpoliacrilamida está relacionada à sua massa molecular Mr a Proteínaspadrão de massa mo lecular conhecido são sujeitas à eletroforese calha 1 Estas proteínas mar cadoras podem ser usadas para estimar a massa molecular de uma proteína desconhecida calha 2 b Um gráfico do log Mr das proteínas marcado ras versus migração relativa durante a eletroforese é linear permitindo que a massa molecular da proteína desconhecida seja lido a partir do gráfico De maneira semelhante um conjunto de proteínas padrão com tempos de retenção reproduzíveis em uma coluna de exclusão por tamanho pode ser usado para criar uma curva padrão de tempo de retenção versus log Mr O tempo de retenção de uma substância desconhecida na coluna pode ser comparado com sua curva padrão para obter um Mr aproximado Nelson6edbookindb 94 Nelson6edbookindb 94 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 95 Proteínas não separadas podem ser quantificadas Para purificar uma proteína é essencial possuir um meio para detectar e quantificar aquela proteína na presença de muitas outras proteínas em cada estágio do procedimento Frequentemente a purificação deve prosseguir na ausência de qualquer informação sobre o tamanho ou propriedades físicas da proteína ou sobre a fração da massa proteica total que ela representa no extrato Para proteínas que são enzi mas a quantidade de uma determinada solução ou extrato de tecido pode ser medida ou ensaiada em termos do efeito catalítico que a enzima produz isto é o aumento na taxa em que seu substrato é convertido para produtos de rea ção quando a enzima está presente Para esse propósito o pesquisador deve conhecer 1 a equação geral da reação catalisada 2 um procedimento analítico para determinar o desaparecimento do substrato ou o aparecimento de um produto de reação 3 se a enzima necessita de cofatores como íons metálicos ou coenzimas 4 a dependência da atividade enzimática da concentração do substrato 5 o pH ótimo e 6 uma zona de temperatura em que a enzima é estável e possui alta atividade Enzimas são geralmente analisadas em seu pH ótimo em alguma temperatura con veniente na faixa de 25 a 38C Altas concentrações de substrato também são geralmente utilizadas de modo que a velocidade de reação inicial medida experimentalmente é proporcional à concentração da enzima Capítulo 6 Por convenção internacional a unidade 10 de ativida de enzimática para a maior parte das enzimas é definida como a quantidade de enzima que leva à transformação de 10 mmol de substrato em produto por minuto a 25C sob condições ótimas de medição para algumas enzimas essa definição não é conveniente e uma unidade pode ser definida diferentemente O termo atividade se refere às unidades totais de enzima em uma solução A atividade específica é o número de unidades de enzimas por miligra ma de proteína total Figura 322 A atividade específica é uma medida de pureza enzimática ela aumenta durante a purificação de uma enzima e se torna máxima e constante quando a enzima é pura Tabela 35 p 93 Após cada etapa de purificação a atividade da prepara ção em unidades de atividade enzimática é analisada a quantidade total de proteína é determinada independente Um campo elétrico é aplicado pH 9 pH 3 pl descrescente 2 1 Após serem coradas as proteínas são mostradas distribuídas ao longo do gradiente de pH segundo seus valores de pH Uma amostra de proteína pode ser aplicada a uma extremidade de uma fita de gel com um gradiente de pH imobilizado Ou uma amostra de proteína em uma solução de anfólitos pode ser usada para reidratar uma fita de gel desidratada FIGURA 320 Focalização isoelétrica Essa técnica separa proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos Uma mistura de proteínas é colocada em uma fita de gel contendo um gradiente de pH imobilizado Com a apli cação de um campo elétrico as proteínas entram no gel e migram até que cada uma atinja um pH equivalente ao seu pl Lembrese que quando o pH 5 pl a carga final de uma proteína é zero Amostra de proteína Fita de gel Diminuição de pI Diminuição de Mr pH 9 pH 3 Proteínas separadas em primeira dimensão em fita de gel por focalização isoelétrica Proteínas separadas em segunda dimensão por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS FIGURA 321 Eletroforese bidimensional Em primeiro lugar as proteí nas são separadas por focalização isoelétrica em uma fita de gel fina O gel é colocado então horizontalmente em um segundo gel em forma de placa e as proteínas são separadas por eletroforese em gel de poliacrilamidaSDS A separação horizontal reflete diferenças no pl a separação vertical reflete diferenças na massa molecular O complemento proteico original é deste modo espalhado em duas dimensões Milhares de proteínas celulares po dem ser resolvidas usando essa técnica Manchas de proteínas individuais podem ser cortadas do gel e identificadas por espectrometria de massa ver Figuras 330 e 331 Nelson6edbookindb 95 Nelson6edbookindb 95 020414 1842 020414 1842 96 DAVID L NELSON MICHAEL M COX mente e a razão das duas fornece a atividade específica A atividade e a proteína total geralmente diminuem em cada etapa A atividade diminui porque há sempre alguma per da em consequência da inativação ou interações não ideais com materiais cromatográficos ou outras moléculas na so lução A proteína total diminui porque o objetivo é remover o máximo possível de proteína inespecífica e indesejada Em uma etapa bemsucedida a perda de proteína inespe cífica é muito maior que a perda de atividade portanto a atividade específica aumenta mesmo que a atividade total decaia Os dados estão reunidos em uma tabela de purifi cação semelhante à Tabela 35 Em geral uma proteína é considerada pura quando etapas de purificação adicionais não conseguem aumentar a atividade específica e quando apenas uma única espécie de proteína pode ser detectada p ex por eletroforese Para proteínas não enzimas outros métodos de quanti ficação são necessários Proteínas de transporte podem ser analisadas pela sua ligação à molécula que elas transportam e hormônios e toxinas pelo efeito biológico que produzem por exemplo hormônios de crescimento irão estimular o crescimento de certas células em cultura Algumas pro teínas estruturais representam uma grande fração de uma massa tecidual a ponto de ela ser rapidamente extraída e purificada sem um ensaio funcional As abordagens são tão variadas quanto as próprias proteínas RESUMO 33 Trabalhando com proteínas c Proteínas são separadas e purificadas com base nas di ferenças de suas propriedades Proteínas podem ser se letivamente precipitadas por mudanças no pH ou tem peratura e particularmente pela adição de certos sais Uma ampla gama de procedimentos cromatográficos faz uso de diferenças de tamanho afinidades de ligação carga e outras propriedades Essas incluem a troca iôni ca a exclusão por tamanho a afinidade e a cromatogra fia líquida de alto desempenho c Eletroforese separa proteínas com base na massa ou carga A eletroforese em gel SDS e a focalização isoelé trica podem ser utilizadas separadamente ou em combi nação para uma resolução mais alta c Todos os procedimentos de purificação exigem um mé todo para quantificação ou análise da proteína de in teresse na presença de outras proteínas A purificação pode ser monitorada por análise da atividade específica 34 A estrutura de proteínas estrutura primária A purificação de uma proteína é geralmente apenas um prelúdio para uma dissecção bioquímica detalhada de sua estrutura e função O que torna uma proteína uma enzima outra um hormônio outra uma proteína estrutural e ainda outra um anticorpo Como elas diferem quimicamente As distinções mais óbvias são estruturais e agora será aborda da a estrutura das proteínas A estrutura de grandes moléculas tais como proteí nas pode ser descrita em vários níveis de complexidade arranjada em um tipo de hierarquia conceitual Quatro ní veis de estrutura proteica são comumente definidos Fi gura 323 Uma descrição de todas as ligações covalentes FIGURA 322 Atividade versus atividade específica A diferença en tre esses termos pode ser ilustrada considerando dois béqueres contendo esferas Os béqueres contêm o mesmo número de esferas vermelhas mas números diferentes de esferas de outras cores Se as esferas representam proteínas ambos os béqueres contêm a mesma atividade da proteína repre sentada pelas esferas vermelhas O segundo béquer no entanto apresenta a atividade específica maior porque as esferas vermelhas representam uma fração mais alta do total FIGURA 323 Níveis de estrutura nas proteínas A estrutura primária consiste em uma sequência de aminoácidos unidos por ligações peptídicas e inclui quaisquer pontes dissulfeto O polipeptídeo resultante pode ser disposto em unidades de estrutura secun dária como em uma hélice a A hélice é uma parte da estrutura terciária do polipeptídeo dobrado que é ele mesmo uma das subuni dades que compõem a estrutura quaternária da proteína multissubunidade nesse caso a hemoglobina Estrutura primária Resíduos de aminoácidos hélice a Cadeia polipeptídica Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys Val Estrutura secundária Estrutura terciária Estrutura quaternária Subunidades reunidas Nelson6edbookindb 96 Nelson6edbookindb 96 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 97 principalmente ligações peptídicas e ligações dissulfeto ligando resíduos de aminoácidos em uma cadeia polipeptí dica é a sua estrutura primária O elemento mais impor tante da estrutura primária é a sequência de resíduos de aminoácidos A estrutura secundária se refere a arranjos particularmente estáveis de resíduos de aminoácidos dan do origem a padrões estruturais recorrentes A estrutura terciária descreve todos os aspectos do enovelamento tridimensional de um polipeptídeo Quando uma proteína tem duas ou mais subunidades polipeptídicas seus arran jos no espaço são chamados de estrutura quaternária Nossa exploração de proteínas por fim inclui máquinas proteicas complexas que consistem em dezenas de milha res de subunidades A estrutura primária é o foco do res tante deste capítulo os níveis mais elevados de estrutura são discutidos no Capítulo 4 As diferenças na estrutura primária podem ser especial mente informativas Cada proteína tem um número e uma sequência de resíduos de aminoácidos distintos Como será visto no Capítulo 4 a estrutura primária de uma proteína determina como ela se dobra em sua estrutura tridimen sional única e isso por sua vez determina a função da proteína Em primeiro lugar serão considerados os indícios empíricos de que a sequência de aminoácidos e a função da proteína são intimamente ligadas em seguida será des crito como a sequência de aminoácidos é determinada e finalmente serão destacados os múltiplos usos dessas in formações A função de uma proteína depende de sua sequência de aminoácidos A bactéria Escherichia coli produz mais de 3000 proteínas diferentes um ser humano tem 25000 genes que codi ficam um número muito maior de proteínas por meio de processos genéticos discutidos na Parte III deste livro Em ambos os casos cada tipo de proteína possui uma sequên cia de aminoácidos única que confere uma determinada es trutura tridimensional Essa estrutura por sua vez confere uma função específica Algumas observações simples ilustram a importância da estrutura primária ou a sequência de aminoácidos de uma proteína Em primeiro lugar como já observado as proteí nas com funções diferentes sempre possuem sequências de aminoácidos diferentes Em segundo lugar milhares de doenças genéticas humanas foram rastreadas para a pro dução de proteínas defeituosas O defeito pode variar de uma simples troca na sequência de aminoácidos como na anemia falciforme descrita no Capítulo 5 à deleção de uma porção maior da cadeia polipeptídica como na maior parte dos casos da distrofia muscular de Duchenne uma grande deleção no gene que codifica a proteína distrofina leva à produção de uma proteína encurtada e inativa Finalmen te comparando proteínas funcionalmente semelhantes de diferentes espécies foi descoberto que essas proteínas fre quentemente têm sequências de aminoácidos semelhantes Portanto uma ligação íntima entre a estrutura primária da proteína e sua função é evidente A sequência de aminoácidos é totalmente fixa ou inva riável para uma determinada proteína Não alguma flexi bilidade é possível Estimase que 20 a 30 das proteínas humanas sejam polimórficas possuindo variações nas sequências de aminoácidos na população humana Muitas dessas variações na sequência têm pouco ou nenhum efeito na função da proteína Além disso proteínas que desem penham funções muito semelhantes em espécies distante mente relacionadas podem ser muito diferentes no tama nho geral e na sequência de aminoácidos Embora a sequência de aminoácidos em algumas regiões da estrutura primária possa variar consideravelmente sem afetar a função biológica a maior parte das proteínas con tém regiões cruciais que são essenciais para suas funções e cuja sequência é portanto conservada A fração da se quência geral que é crítica varia de proteína para proteína complicando a tarefa de relacionar a sequência à estrutura tridimensional e a estrutura à função Antes de se conside rar esse problema com mais detalhe é preciso entretanto examinar como a informação da sequência é obtida As sequências de aminoácidos de milhões de proteínas foram determinadas Duas grandes descobertas de 1953 tiveram fundamental importância na história da bioquímica Nesse ano James D Watson e Francis Crick deduziram a estrutura em dupla hélice do DNA e propuseram uma base estrutural para sua replicação precisa Capítulo 8 Sua proposta ilumi nou a realidade molecular por trás da ideia de um gene No mesmo ano Frederick Sanger descobriu a sequência de resíduos de aminoácidos nas cadeias polipeptídicas do hormônio insulina Figura 324 surpreendendo muitos pesquisadores que pensavam há muito tempo que a deter minação da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo seria uma tarefa irremediavelmente difícil Rapidamente se tornou evidente que a sequência de nucleotídeos no DNA e a sequência de aminoácidos em proteínas estavam de al gum modo relacionadas Quase uma década após estas des cobertas o código genético foi elucidado relacionando a sequência de nucleotídeos do DNA à sequência de aminoá cidos em moléculas de proteínas Capítulo 27 As sequên cias de aminoácidos de proteínas são agora mais frequen temente derivadas indiretamente a partir das sequências de DNA em bancos de dados genômicos Entretanto uma série de técnicas derivadas de métodos tradicionais de sequenciamento de polipeptídeos ainda ocupa um lugar importante na química de proteínas Na sequência é re sumido o método tradicional e mencionadas algumas das técnicas derivadas dele Cadeia A COO2 S S S S S S GIVEQCCASVCSLYQLENYCN Cadeia B H3N COO2 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPLA 5 10 15 20 25 30 1 H3N 1 FIGURA 324 Sequência de aminoácidos da insulina bovina As duas cadeias de polipeptídeos estão unidas por ligações cruzadas de dissulfeto amarelo A cadeia A da insulina é idêntica em humanos porcos cães co elhos e cachalotes As cadeias B de vacas porcos cães bodes e cavalos são idênticas Nelson6edbookindb 97 Nelson6edbookindb 97 020414 1842 020414 1842 98 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A química de proteínas é enriquecida por métodos derivados do clássico sequenciamento de polipeptídeos Os métodos utilizados na década de 1950 por Fred Sanger para determinar a sequência da proteína insulina são resumi dos em sua forma moderna na Figura 325 Poucas proteí nas são sequenciadas desse modo atualmente pelo menos em sua totalidade Entretanto esses protocolos de sequen ciamento tradicionais têm proporcionado uma rica variedade de ferramentas para os bioquímicos e quase todas as etapas na Figura 325 fazem uso de métodos que são amplamente utilizados algumas vezes em contextos bastante diferentes Frederick Sanger 19182013 No esquema tradicional para sequenciamento de pro teínas grandes o resíduo aminoterminal do aminoácido foi inicialmente marcado e sua identidade determinada O grupo aaminoterminal pode ser marcado com 1fluoro24 dinitrobenzeno FDNB cloreto de dansila ou cloreto de dabsilo Figura 326 O processo de sequenciamento químico em si é baseado em um processo de duas etapas desenvolvido por Pehr Ed man Figura 327 O procedimento de degradação de Edman marca e remove apenas o resíduo aminoterminal de um peptídeo deixando todas as outras ligações peptídicas intactas O peptídeo reage com o fenilisotiocianato em con dições levemente alcalinas o que converte o aminoácido aminoterminal em um aduto de feniltiocarbamoil PTC A ligação peptídica próxima ao aduto de PTC é então clivada em uma etapa efetuada em ácido trifluoracético anídrico com remoção do aminoácido aminoterminal como um deri vado anilinotiazolinona O aminoácido aminoterminal deri vado é extraído com solventes orgânicos convertido em um derivado da feniltioidantoína mais estável por tratamento com ácido aquoso e em seguida identificado A utilização de reações sequenciais levadas a cabo em condições primei ro básicas e depois em condições ácidas fornece um meio de controlar todo o processo Cada reação com o amino ácido aminoterminal pode chegar essencialmente ao fim sem afetar qualquer outra ligação peptídica no peptídeo O processo se repete até que tipicamente 40 resíduos de aminoácidos sequenciais sejam identificados As reações da degradação de Edman foram automatizadas Determinar o amino terminal reagir com o FDNB O Gly está no aminoterminal Determinar a composição de aminoácidos por hidrólise ácida Selecione os reagentes de clivagem com base na presença de aminoácidosalvo na proteína Clivar em polipeptídeos menores com tripsina por exemplo 1 DCGGAHYLVLLAGPTIRSGTMR 2 AQGAFNPSCGVIQHAWIKMWILAAGTE 3 GGPVIATYEQDGGTSRYAPK 4 QGYASULAIEFTR Ordene outros por sobreposição com sequências de peptídeos obtidas pela clivagem da proteína com um reagente diferente tal como o brometo de cianogênio ou quimotripsina Determinar a ordem dos polipeptídeos na proteína O peptídeo 3 está na extremidade amino O peptídeo 3 está na extremidade carboxila ele não termina em um resíduo de aminoácido que define um sítio de clivagem de tripsina Proteína Sequenciar cada polipeptídeo FIGURA 325 Sequenciamento direto de proteínas Os procedimentos aqui apresentados foram aqueles desenvolvidos por Fred Sanger para se quenciar a insulina e têm sido usados posteriormente para várias proteínas adicionais FDNB é 1fluoro24dinitrobenzeno ver texto e Figura 326 N CH3 CH3 O2Cl Cloreto de dansila N CH3 CH3 NN Cloreto de dabsilo S O2Cl S O2N NO2 F FDNB FIGURA 326 Reagentes usados para modificar o grupo aamino do aminoácido terminal Nelson6edbookindb 98 Nelson6edbookindb 98 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 99 Para determinar a sequência de proteínas grandes os primeiros elaboradores de protocolos de sequenciamento tiveram que desenvolver métodos para eliminar as ligações dissulfeto e para clivar as proteínas com precisão em po lipeptídeos menores Duas abordagens para a degradação irreversível das ligações dissulfeto são destacadas na Figu ra 328 As enzimas chamadas proteases catalisam a cliva gem hidrolítica das ligações peptídicas Algumas proteases clivam apenas a ligação peptídica adjacente a determinados resíduos de aminoácidos Tabela 36 e portanto fragmen tam uma cadeia polipeptídica de uma maneira previsível e reproduzível Poucos reagentes químicos também clivam a ligação peptídica adjacente em resíduos específicos Entre as proteases a enzima digestiva tripsina catalisa a hidró N C S C NH R1 C O NH2 R2 C C Derivado do feniltiocarbamil O H H C N C N H S H C R1 Feniltioidantoína derivada do resíduo de aminoácido O S N C NH S CH C R1 O Anilinotiazolinona derivada do resíduo de aminoácido Peptídeo encurtado R 1 O C H C H N H C 2 O C H3N R3 Fenilisotiocianato Identificar o resíduo de aminoácido do polipeptídeo C NH Polipeptídeo pH elevado ➊ ➋ pH baixo pH baixo Purificar e reciclar o fragmento de peptídeo remanescente pelo processo de Edman Proteína FIGURA 327 A química do sequenciamento de proteínas desenvol vida por Pehr Edman A ligação peptídica mais próxima do aminoterminal da proteína ou polipeptídeo é clivada em duas etapas As duas etapas são levadas a cabo sob condições de reação muito diferentes condições básicas na etapa ➊ e ácidas na etapa ➋ permitindo que uma etapa prossiga até sua conclusão antes que a segunda se inicie Ponte dissulfeto cistina HC NH C O CH2 S S CH2 C O C HN H oxidação por ácido perfórmico redução por ditiotreitol HC NH C O CH2 S O O O2 2O S O O CH2 C O C HN H HC NH C O CH2 SH HS CH2 C O C HN H Resíduos de ácido cisteico Carboximetilação por iodoacetato HC NH C O CH2 S CH2 COO2 2OOC CH2 S CH2 C O C HN H Resíduos de cisteína carboximetilados CH2SH CHOH CHOH CH2SH Ditiotreitol DTT FIGURA 328 Quebrando as ligações dissulfeto em proteínas Dois mé todos comuns são ilustrados A oxidação de um resíduo de cisteína com ácido perfórmico produz dois resíduos do ácido cisteico Redução por ditiotreitol ou bmercaptoetanol para formar resíduos Cys deve ser seguida de modificação adicional dos grupos reativos SH para impedir a reformação da ligação dissul feto A carboximetilação por iodoacetato serve a esse propósito Nelson6edbookindb 99 Nelson6edbookindb 99 020414 1842 020414 1842 100 DAVID L NELSON MICHAEL M COX lise apenas daquelas ligações peptídicas em que o grupo carbonila é fornecido tanto por um resíduo de Lys quanto um de Arg independente do comprimento ou da sequência de aminoácidos da cadeia Um polipeptídeo com três resí duos Lys eou Arg irá normalmente gerar quatro peptídeos menores na clivagem com a tripsina Além disso todos ex ceto um deles terão um terminal carboxila Lys ou Arg A escolha de um reagente para clivar a proteína em peptídeos menores pode ser auxiliada primeiro determinandose o conteúdo de aminoácidos de toda a proteína empregando ácido para reduzir a proteína a seus aminoácidos consti tuintes A tripsina seria utilizada apenas em proteínas com um número adequado de resíduos de Lys ou Arg No sequenciamento clássico uma proteína grande seria clivada em fragmentos duas vezes utilizando uma protease ou um reagente de clivagem diferente a cada vez de modo que as extremidades finais dos fragmentos fossem diferen tes Ambos os conjuntos de fragmentos seriam purificados e sequenciados A ordem em que os fragmentos apareceram na proteína original poderia então ser determinada pela análise das sobreposições na sequência entre os dois con juntos de fragmentos Mesmo não sendo mais utilizados para sequenciar pro teínas inteiras os métodos de sequenciamento tradicionais ainda são valiosos no laboratório O sequenciamento de al guns aminoácidos a partir da terminação amino utilizando a química de Edman é frequentemente suficiente para con firmar a identidade de uma proteína conhecida que acabou de ser purificada ou para identificar uma proteína desco nhecida purificada com base em sua atividade incomum As técnicas empregadas nas etapas individuais do método de sequenciamento tradicional também são úteis para ou tros propósitos Por exemplo os métodos utilizados para quebrar as ligações dissulfeto podem também ser utilizados para desnaturar proteínas quando isto é necessário Além disso os esforços para marcar o resíduo de aminoácido ami noterminal levaram eventualmente ao desenvolvimento de uma série de reagentes que poderiam reagir com grupos es pecíficos em uma proteína Os mesmos reagentes utilizados para marcar o grupo aamino aminoterminal podem ser em pregados para marcar as aminas primárias dos resíduos Lys Figura 326 O grupo sulfidrila nos resíduos Cys pode ser modificado com iodoacetamidas maleimidas benzil halidas e bromometil cetonas Figura 329 Outros resíduos de aminoácidos podem ser modificados por reagentes ligados a um corante ou outra molécula para auxiliar na detecção da proteína ou em estudos funcionais A espectrometria de massa oferece um método alternativo para determinar sequências de aminoácidos Adaptações modernas da espectrometria de massa fornecem uma importante alternativa aos métodos de se quenciamento descritos anteriormente A espectrometria de massa pode fornecer uma medida altamente precisa da massa molecular de uma proteína mas também pode fazer muito mais Em especial algumas variantes da espectrome tria de massa podem fornecer muito rapidamente sequên cias de múltiplos pequenos segmentos de polipeptídeos 20 a 30 resíduos de aminoácidos em uma amostra de proteína O espectrômetro de massa tem sido há muito tempo uma ferramenta indispensável na química As moléculas a serem analisadas chamadas de analitos são inicialmente ionizadas no vácuo Quando as moléculas recémcarregadas são introduzidas em um campo elétrico eou magnético seus caminhos através do campo são uma função da razão de suas massas em relação às suas cargas mz Essa pro priedade medida de amostras ionizadas pode ser utilizada para deduzir a massa m do analito com muita precisão TABELA 36 Especificidade de alguns métodos comuns para fragmentação de cadeias polipeptídicas Reagente fonte biológica Pontos de quebra Tripsina pâncreas bovino Lys Arg C Protease submaxilar glândula submaxilar de camundongos Arg C Quimotripsina pâncreas bovino Phe Trp Tyr C Protease V8 de Staphylococcus aureus bactéria S aureus Asp Glu C AspNprotease bactéria Pseudomonas fragi Asp Glu N Pepsina estômago porcino Leu Phe Trp Tyr N Endopeptidase Lys C bactéria Lysobacter enzymogenes Lys C Brometo de cianogênio Met C Todos os reagentes com exceção do brometo de cianogênio são proteases Todos estão disponíveis a partir de fontes comerciais Resíduos fornecendo o ponto principal de reconhecimento para a protease ou reagentes a quebra da ligação peptídica ocorre ou no lado carbonílico C ou no lado amino N dos resíduos de aminoácidos indicados Iodoacetamida Brometo de benzila um hálido de benzila Cetonas bromometil o X pode variar Maleimida I CH2 C O NH2 Br O Br X C H N O O FIGURA 329 Reagentes usados para modificar os grupos sulfidrila dos resíduos Cys Ver também Figura 328 Nelson6edbookindb 100 Nelson6edbookindb 100 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 101 Embora a espectrometria de massa esteja sendo utili zada há muitos anos ela não poderia ser aplicada a macro moléculas tais como proteínas e ácidos nucleicos As me dições de mz são realizadas em moléculas na fase gasosa e o aquecimento e outros tratamentos necessários para transferir uma macromolécula para a fase gasosa geralmen te provocam sua rápida decomposição Em 1988 duas téc nicas diferentes foram desenvolvidas para superar esse pro blema Em uma as proteínas são colocadas em uma matriz absorvedora de luz Com um pulso curto de luz a laser as proteínas são ionizadas e em seguida dessorvidas da ma triz no sistema de vácuo Esse processo conhecido como espectrometria de massas de dessorçãoionização a laser assistida por matriz ou MALDI MS tem sido uti lizada com sucesso para medir a massa de uma ampla varie dade de macromoléculas Em um segundo e bemsucedido método as macromoléculas em solução são forçadas direta mente da fase líquida para a gasosa Uma solução de anali tos é passada através de uma agulha carregada que é manti da em um alto potencial elétrico dispersando a solução em uma névoa fina de microgotas carregadas Os solventes que circundam as macromoléculas evaporam rapidamente dei xando íons de macromoléculas carregadas multiplamente na fase gasosa Essa técnica é chamada de espectrometria de massa com ionização por eletroaspersão ou ESI MS Os prótons adicionados durante a passagem através da agulha fornecem carga adicional à macromolécula O mz da molécula pode ser analisado na câmara de vácuo A espectrometria de massa fornece uma riqueza de in formações para a pesquisa proteômica a enzimologia e a química de proteínas em geral As técnicas exigem apenas quantidades minúsculas de amostra de modo que podem ser rapidamente aplicadas a pequenas quantidades de pro teína que podem ser extraídas de uma eletroforese em gel bidimensional A medição precisa da massa molecular de uma proteína é crítica para sua identificação Uma vez que a massa de uma proteína seja conhecida precisamente a espectrometria de massa é um método conveniente e pre ciso para detectar alterações na massa devido à presença de cofatores ligados íons metálicos ligados modificações covalentes e assim por diante O processo para a determinação da massa molecular de uma proteína com ESI MS é ilustrado na Figura 330 À medida que é injetada na fase gasosa uma proteína adquire um número variável de prótons e portanto cargas positivas a partir do solvente A adição variável dessas cargas cria um espectro de espécies com diferentes razões massacarga Cada pico sucessivo corresponde a uma espécie que difere do seu pico vizinho por uma diferença de carga de 1 e uma diferença de massa de 1 1 próton A massa da proteína pode ser determinada a partir de dois picos consecutivos A espectrometria de massa também pode ser utilizada para sequenciar trechos curtos de polipeptídeos uma apli cação que surgiu como uma ferramenta inestimável para identificação rápida de proteínas desconhecidas A infor mação da sequência é extraída utilizandose uma técnica chamada de tandem MS ou MSMS Uma solução conten do a proteína investigada é inicialmente tratada com uma protease ou reagente químico para hidrolisála a uma mis tura de peptídeos menores A mistura em seguida é injeta da em um equipamento que é essencialmente formado por dois espectrômetros de massa em tandem Figura 331a em cima No primeiro a mistura de peptídeos é disposta de modo que apenas um dos vários tipos de peptídeos pro duzidos pela clivagem surge na outra extremidade A amostra do peptídeo selecionado cada molécula do qual possui uma carga em algum ponto ao longo de seu comprimento se desloca então através de uma câmara de vácuo entre os dois espectrômetros de massa Nesse com partimento de colisão o peptídeo é fragmentado adicional mente por impacto de alta energia com um gás de colisão tal como o hélio ou o argônio que é colocado na câmara de vácuo Cada peptídeo individual é quebrado em apenas um local em média Embora as quebras não sejam hidrolíticas a maior parte ocorre nas ligações peptídicas O segundo espectrômetro de massa mede em seguida as razões mz de todos os fragmentos carregados Esse pro cesso gera um ou mais conjuntos de picos Um determina do conjunto de picos Figura 331b consiste em todos os fragmentos carregados que foram gerados pela quebra do mesmo tipo de ligação mas em diferentes pontos no pep tídeo Um conjunto de picos inclui apenas os fragmentos nos quais a carga foi retida no lado aminoterminal das li gações quebradas outro inclui apenas os fragmentos nos Espectrômetro de massa 100 501 75 50 Intensidade relativa 25 0 800 1000 1200 mz 401 100 50 0 47000 48000 47342 301 1400 1600 Mr Interface de vácuo Capilar de vidro Amostra de solução Alta voltagem 1 b a FIGURA 330 Espectrometria de massa com ionização por eletro aspersão de uma proteína a Uma solução de proteína é dispersa em gotículas altamente carregadas pela passagem através de uma agulha sob a influência de um campo elétrico de alta voltagem As gotículas evaporam e os íons com prótons adicionados nesse caso entram no espectrômetro de massa para medição de mz O espectro gerado b é uma família de picos com cada pico sucessivo da direita para a esquerda correspondendo a uma espécie carregada com massa e carga aumentados em 1 A inserção mostra uma transformação desse espectro gerada por computador Nelson6edbookindb 101 Nelson6edbookindb 101 020414 1842 020414 1842 102 DAVID L NELSON MICHAEL M COX quais a carga foi retida no lado carboxiterminal das ligações quebradas Cada pico sucessivo em um determinado con junto tem um aminoácido a menos que o pico anterior A diferença na massa de pico para pico identifica o aminoá cido que foi perdido em cada caso revelando portanto a sequência do peptídeo As únicas ambiguidades envolvem a leucina e a isoleucina que têm a mesma massa Embora múltiplos conjuntos de picos sejam normalmente gerados os dois conjuntos mais proeminentes geralmente consistem em fragmentos carregados derivados da quebra das liga ções peptídicas A sequência de aminoácidos derivada de um conjunto pode ser confirmada pela outra melhorando a confiança na informação da sequência obtida Os vários métodos para obtenção da informação de se quências proteicas se complementam O procedimento da degradação de Edman é algumas vezes conveniente para obter a informação da sequência unicamente a partir do terminal amino de uma proteína ou peptídeo Entretanto ele é relativamente lento e requer uma amostra maior do que a espectrometria de massa A espectrometria de massa pode ser utilizada para pequenas quantidades de amostras e para amostras misturadas Ela fornece a informação da se quência mas os processos de fragmentação podem deixar lacunas imprevisíveis na sequência Embora a maior parte das sequências de proteínas seja atualmente extraída de se quências do DNA genômico Capítulo 9 empregandose a compreensão do código genético Capítulo 27 o sequen ciamento direto de proteínas é com frequência necessário para identificar amostras de proteínas desconhecidas Am bos os métodos de sequenciamento de proteínas permitem a identificação não ambígua de proteínas recémpurificadas A espectrometria de massa é o método de escolha para iden tificar proteínas que estão presentes em pequenas quanti dades Por exemplo a técnica é sensível o suficiente para analisar algumas centenas de nanogramas de proteínas que podem ser extraídos de uma única banda de proteína em um gel de poliacrilamida O sequenciamento direto por es pectrometria de massa também pode revelar a adição de grupos fosforil ou outras modificações Capítulo 6 O se quenciamento por qualquer um dos métodos pode revelar mudanças na sequência de proteínas que resultam da edição do RNA mensageiro em eucariontes Capítulo 26 Portanto todos esses métodos são parte de uma caixa de ferramentas robusta utilizada para investigar as proteínas e suas funções Pequenos peptídeos e proteínas podem ser sintetizados quimicamente Muitos peptídeos são potencialmente úteis como agentes farmacológicos e sua produção é de considerável impor tância comercial Há três modos de se obter um peptídeo 1 purificação a partir de tecidos tarefa frequentemente de difícil realização em consequência das concentrações infinitamente baixas de alguns peptídeos 2 engenharia genética Capítulo 9 ou 3 síntese química direta Atual mente técnicas poderosas tornam a síntese química direta uma opção atrativa em muitos casos Além das aplicações comerciais a síntese de porções peptídicas específicas de proteínas maiores é uma ferramenta cada vez mais impor tante no estudo da estrutura e função das proteínas A complexidade das proteínas torna as abordagens sin téticas tradicionais da química orgânica impraticáveis para peptídeos com mais de quatro ou cinco resíduos de ami noácidos Um problema é a dificuldade de purificação do produto após cada etapa O principal avanço nessa tecnologia foi fornecido por R Bruce Merrifield em 1962 Sua inovação foi sintetizar um pep tídeo enquanto o mantinha ligado a uma extremidade de um suporte sólido O suporte é um polímero insolúvel resina contido no interior de uma coluna semelhante ao utilizado b R1 R2 C H H2N R3 C H O O C O b y C N C H R4 C H C H N H O O O C C N H R5 C H N H R1 R2 C H H2N R3 C H O O C O C N C H R4 C H C H N H O O O C C N H R5 C H N H a MS2 Detector MS1 Célula de colisão Separação Ionização por eletroaspersão Ala 71 Pro 97 Tyr 163 Ser 87 LeuIIe 113 Ser 87 Ser 87 Ala 71 Gly 57 Asp 115 Ser 87 Gly 57 Ser 87 Ala 71 Ala 71 Val 99 Val 99 Gly 57 Val 99 LeuIIe 113 1997 Intensidade do sinal Massa mz GVLVVAASGNSGAGSISYPAR 1800 1400 1600 1200 1000 800 600 400 200 Quebra FIGURA 331 Obtendo informação da sequência proteica com MS em tandem a Após a hidrólise proteolítica uma solução proteica é injetada em um espectrômetro de massa MS1 Os diferentes peptídeos são dispos tos de modo que apenas um tipo é selecionado para análise adicional O peptídeo selecionado é fragmentado em uma câmara entre dois espectrô metros de massa e a mz para cada fragmento é medida no segundo es pectrômetro de massa MS2 Muitos dos íons gerados nessa segunda frag mentação resultam da quebra da ligação peptídica como mostrado Eles são chamados de íons tipo b ou íons tipo y dependendo se a carga é retida no lado aminoterminal ou carboxiterminal respectivamente b Espectro típico com picos representando os fragmentos de peptídeos gerados a partir de uma amostra de um peptídeo pequeno 21 resíduos Os picos marcados são íons tipo y derivados de resíduos de aminoácidos O número entre parênte ses acima de cada pico é a massa molecular do íon do aminoácido Os picos sucessivos diferem pela massa de um aminoácido particular no peptídeo original A sequência deduzida é mostrada no topo Nelson6edbookindb 102 Nelson6edbookindb 102 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 103 em procedimentos cromatográficos O peptídeo é construído sobre esse suporte um aminoácido de cada vez por meio de um conjunto padrão de reações em um ciclo repetitivo Fi gura 332 Em cada etapa sucessiva no ciclo grupos quími cos de proteção bloqueiam as reações indesejadas A tecnologia para a síntese de peptídeos químicos é atualmente automatizada Uma limitação importante do processo limitação compartilhada com o processo de se quenciamento da degradação de Edman é a eficiência de cada ciclo químico como pode ser observado calculando a Aminoácido 1 com grupo aamino protegido pelo grupo Fmoc Cl CH2 Esfera insolúvel de poliestireno N H C R1 H C Cl2 N H C R1 H C O O CH2 O grupo protetor é removido pela lavagem com solução contendo uma base orgânica moderada O grupo aamino do aminoácido 1 ataca o grupo carboxil ativado do aminoácido 2 para formar uma ligação peptídica N H C O N H Subproduto dicicloexilureia O peptídeo completo é desprotegido como na reação o TFA rompe a ligação éster entre o peptídeo e a resina N H C R2 H C O O2 O aminoácido 2 com o grupo aamino protegido é ativado no grupo carboxil pelo DCC H3 C R1 H C O O CH2 C Dicicloexilcarbodiimida DCC N H C R2 H C O O C NH N N H C R2 H C O N H C R1 H C O O CH2 H3N 1 N 1 C R H C O N H C R 2 H C O O2 1 F CH2 Ácido trifluoroacético TFA Ligação do aminoácido carboxiterminal ao grupo reativo na resina ➊ ➋ ➍ ➎ ➋ ➋ ➌ As reações de a são repetidas se necessário ➍ 1 O O2 N N Fmoc Fmoc Fmoc Fmoc Fmoc O2 R1 CH2 CH O N H C O Fmoc Resíduo de aminoácido C O FIGURA 332 Síntese química de um peptídeo em um suporte de políme ro insolúvel As reações ➊ a ➍ são necessárias para a formação de cada liga ção peptídica O grupo 9fluorenilmetoxicarbonila Fmoc sombreado em azul impede reações indesejadas no grupo aamino do resíduo sombreado em cor salmão A síntese química prossegue da terminação carboxila para a terminação amino o sentido inverso da síntese proteica in vivo Capítulo 27 R Bruce Merrifield 19212006 Nelson6edbookindb 103 Nelson6edbookindb 103 020414 1842 020414 1842 104 DAVID L NELSON MICHAEL M COX produção total de peptídeos de vários comprimentos quan do o rendimento por adição de cada novo aminoácido é de 960 versus 998 Tabela 37 A reação incompleta em uma fase pode levar à formação de uma impureza na forma de um peptídeo mais curto na próxima A química foi otimizada para permitir a sínte se de proteínas de 100 resíduos de aminoácidos em pou cos dias com rendimento razoável Uma abordagem muito semelhante é utilizada para a síntese de ácidos nucleicos ver Figura 835 É interessante notar que essa tecnologia impressionante como é ainda é pequena quando compara da aos processos biológicos A mesma proteína de 100 resí duos poderia ser sintetizada com extraordinária fidelidade em cerca de 5 segundos em uma célula bacteriana Vários métodos novos para a ligação união eficien te de peptídeos tornaram possível a reunião de peptídeos sintéticos em polipeptídeos maiores e proteínas Com es ses métodos novas formas de proteínas podem ser criadas com grupos químicos posicionados precisamente incluindo aquelas que normalmente não podem ser encontradas em uma proteína celular Essas novas formas fornecem novos caminhos para testar teorias de catálise enzimática para criar proteínas com novas propriedades químicas e para desenhar sequências de proteínas que irão se dobrar em estruturas particulares Esta última aplicação fornece o úl timo teste de nossa capacidade crescente de relacionar a estrutura primária de um peptídeo com a estrutura tridi mensional que ele assume na solução As sequências de aminoácidos fornecem importantes informações bioquímicas O conhecimento da sequência de aminoácidos em uma pro teína pode oferecer ideias sobre sua estrutura tridimensional e função localização celular e evolução A maior parte des tas ideias é derivada da procura de semelhanças entre uma proteína de interesse e as proteínas previamente estudadas Milhares de sequências são conhecidas e estão disponíveis em bancos de dados acessíveis pela internet Uma compara ção de uma sequência recentemente obtida com este grande banco de sequências armazenadas frequentemente revela re lações tanto surpreendentes quanto esclarecedoras Não é compreendido em detalhes como uma sequência de aminoácidos determina uma estrutura tridimensional e tampouco é possível sempre prever a função a partir da se quência Entretanto famílias de proteínas com algumas ca racterísticas estruturais ou funcionais compartilhadas podem ser prontamente identificadas com base nas semelhanças nas suas sequências de aminoácidos Proteínas individuais são associadas a famílias com base no grau de semelhança nas sequências de aminoácidos Membros de uma família são geralmente idênticos em 25 ou mais de suas sequências e as proteínas nessas famílias geralmente compartilham pelo menos algumas características estruturais e funcionais Al gumas famílias são definidas no entanto pelas identidades envolvendo somente alguns poucos resíduos de aminoáci dos que são críticos para uma determinada função Diversas subestruturas semelhantes ou domínios a serem defini dos com mais detalhes no Capítulo 4 ocorrem em muitas proteínas funcionalmente independentes Estes domínios com frequência se dobram em configurações estruturais que possuem um grau incomum de estabilidade ou que são espe cializadas para um ambiente específico Relações evolutivas também podem ser inferidas a partir das semelhanças estru turais e funcionais entre famílias de proteínas Certas sequências de aminoácidos funcionam como si nais que determinam a localização celular a modificação química e a meiavida de uma proteína Sequências de si nalização específicas frequentemente na porção aminoter minal são utilizadas para direcionar certas proteínas para a exportação a partir da célula outras proteínas são direcio nadas para a distribuição para o núcleo para a superfície celular o citosol ou outras localizações celulares Outras sequências atuam como sítios de ligação para grupos pros téticos tais como os grupos de açúcares em glicoproteínas e lipídeos em lipoproteínas Alguns desses sinais são bem caracterizados e são facilmente reconhecíveis na sequência de uma proteína recentemente caracterizada Capítulo 27 CONVENÇÃOCHAVE Muito da informação funcional encapsula da nas sequências de proteínas surge na forma de sequên cias consenso Este termo é aplicado a sequências de DNA RNA ou proteínas Quando uma série de sequências de ácidos nucleicos ou de proteínas relacionadas é compa rada uma sequência consenso é aquela que reflete a base ou o aminoácido mais frequente em cada posição Partes da sequência que apresentam concordância particularmente boa frequentemente representam domínios funcionais con servados evolutivamente Diversas ferramentas matemáti cas disponíveis na Internet podem ser utilizadas para gerar sequências consenso ou identificálas nos bancos de dados de sequências O Quadro 32 ilustra convenções comuns para a apresentação de sequências consenso Sequências de proteínas podem elucidar a história da vida na Terra A cadeia simples de letras que denota a sequência de ami noácidos de uma proteína tem uma riqueza surpreendente de informações À medida que mais sequências de proteí nas se tornaram disponíveis o desenvolvimento de métodos mais poderosos para extrair informações a partir delas se tornou um importante empreendimento bioquímico A aná lise das informações disponíveis nos muitos e sempre cres centes bancos de dados biológicos incluindo as sequências TABELA 37 Efeito do rendimento de cada etapa no rendimento global da síntese de peptídeos Rendimento geral do peptídeo final quando o rendimento de cada etapa é Número de resíduos no polipeptídeo final 960 998 11 66 98 21 44 96 31 29 94 51 13 90 100 18 82 Nelson6edbookindb 104 Nelson6edbookindb 104 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 105 de genes e proteínas e as estruturas de macromoléculas deram origem ao novo campo da bioinformática Um dos resultados dessa disciplina é um conjunto crescente de programas de computador muito rapidamente disponíveis na internet que podem ser utilizados por qualquer cien tista estudante ou leigo interessado no assunto A função de cada proteína depende de sua estrutura tridimensional que por sua vez é determinada em grande parte por sua estrutura primária Portanto a informação transmitida por uma sequência de proteínas é limitada apenas por nossa própria compreensão dos princípios estruturais e funcio nais As ferramentas de bioinformática em constante evo lução tornam possível identificar os segmentos funcionais em novas proteínas e ajudam a estabelecer tanto suas se quências quanto suas relações estruturais com proteínas já encontradas nos bancos de dados Em um nível diferente de investigação as sequências de proteínas estão começan do a demonstrar como as proteínas evoluíram e em última instância como a vida evoluiu neste planeta O campo da evolução molecular é frequentemente rela cionado a Emile Zuckerkandl e Linus Pauling cujos traba lhos em meados de 1960 introduziram o uso de sequências de nucleotídeos e proteínas para investigar a evolução A premissa não é tão simples quanto aparenta Se dois organis mos são proximamente relacionados as sequências de seus genes e proteínas devem ser semelhantes As sequências di vergem crescentemente à medida que a distância evolutiva entre dois organismos aumenta A promessa dessa aborda gem começou a ser compreendido na década de 1970 quan do Carl Woese utilizou sequências de RNA ribossomal para definir as arqueias como um grupo de organismos vivos dis tinto de bactérias e eucariotos ver Figura 14 As sequên QUADRO 32 Sequências consenso e logos de sequências Sequências consenso podem ser representadas de várias maneiras Para ilustrar dois tipos de convenções utiliza mos dois exemplos de sequências consenso mostrados na Figura 1 a estrutura de ligação ao ATP denominada alça P ver Quadro 122 e b estrutura de ligação ao Ca 21 denominada mão EF ver Figura 1211 As regras descritas aqui são adaptadas daquelas utilizadas pela comparação de sequências do website PROSITE expasy orgprosite elas utilizam os códigos padrão de uma letra para cada aminoácido a DWDNSILVFYWDENSTGDNQGHRKGP LIVMCDENQSTAGCx2DELIVMFYW AGx4GKST b 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 2 1 C N 3 4 3 1 0 2 Bits 4 5 6 7 8 C 2 1 N 3 4 0 2 Bits FIGURA Q1 Representações de duas sequências de consenso a Alça P estrutura ligadora de ATP b mão EF estrutura ligadora de Ca 21 Em um tipo de designação de sequência consenso mostrado na parte superior de a e b cada posição é separada de seu vizinho por um hífen Uma posição em que qualquer aminoácido é permitido é designada x As ambiguidades são indicadas listando os aminoácidos acei táveis para uma determinada posição entre colchetes Por exemplo em a AG significa Ala ou Gly Se todos exce to alguns aminoácidos são permitidos em uma posição os aminoácidos não permitidos são listados entre chaves Por exemplo em b W significa qualquer aminoácido exceto Trp A repetição de um elemento do padrão é in dicada seguindo esse elemento com um número ou uma série de números entre parênteses Em a por exemplo x4 significa xxxx x24 significaria xx ou xxx ou xxxx Quando um padrão é restrito ou ao grupo amino ou ao grupo carboxila terminal de uma sequência esse padrão começa com ou termina com respectivamen te não é o caso dos dois exemplos citados Um ponto termina o padrão Aplicando essas regras à sequência consenso em a tanto A como G podem ser encontrados na primeira posição Qualquer aminoácido pode ocupar as quatro próximas posições seguidos por um G e um K in variáveis A última posição pode ser um S ou T Logos de sequência fornecem uma representação mais informativa e gráfica do alinhamento de sequência múltipla de um aminoácido ou ácido nucleico Cada logo consiste em uma pilha de símbolos para cada posição na sequência A altura total da pilha em bits indica o grau de conservação da sequência naquela posição enquanto a altura de cada símbolo na pilha indica a frequência relati va daquele aminoácido ou nucleotídeo Para sequências de aminoácidos as cores representam as características do aminoácido polar G S T Y C Q N verde básico K R H azul ácido D E vermelho e hidrofóbico A V L I P W F M preto Neste esquema a classificação de ami noácidos é um pouco diferente daquela na Tabela 31 e na Figura 35 Os aminoácidos com cadeias laterais aromáti cas são agrupados às classificações apolares F W e pola res Y A glicina sempre difícil de agrupar é colocada no grupo polar Observe que quando múltiplos aminoácidos são aceitáveis em uma posição específica eles raramente ocorrem com igual probabilidade Um ou poucos em geral predominam A representação logo torna o predomínio claro e uma sequência conservada de uma proteína torna se óbvia Entretanto o logo obscurece alguns resíduos de aminoácidos que podem ser permitidos em uma posição tal como o Cys que ocorre ocasionalmente na posição 8 da mão EF em b Nelson6edbookindb 105 Nelson6edbookindb 105 020414 1842 020414 1842 106 DAVID L NELSON MICHAEL M COX cias de proteínas oferecem uma oportunidade para refinar significativamente a informação disponível Com o advento de projetos de genoma investigando organismos de bacté rias a seres humanos o número de sequências disponíveis está crescendo a uma velocidade enorme Essa informação pode ser utilizada para traçar a história biológica O desafio está em aprender a ler os hieróglifos genéticos A evolução não tomou um caminho linear simples As complexidades são abundantes em qualquer tentativa de extrair a informação evolutiva armazenada em sequências de proteínas Para determinada proteína os resíduos de aminoácidos essenciais para a atividade da proteína são conservados ao longo do tempo evolutivo Os resíduos me nos importantes para o funcionamento podem variar ao longo do tempo isto é um aminoácido pode ser substi tuído por outro e esses resíduos variáveis podem fornecer a informação para traçar a evolução Entretanto as subs tituições de aminoácidos não são sempre aleatórias Em algumas posições na estrutura primária a necessidade de manter a função proteica pode significar que apenas deter minadas substituições de aminoácidos podem ser toleradas Algumas proteínas têm resíduos de aminoácidos mais variá veis que outras Por essas e outras razões proteínas dife rentes podem evoluir em velocidades diferentes Outro fator complicador em traçar a história evolutiva é a rara transferência de um gene ou grupo de genes de um organismo para outro um processo denominado transfe rência gênica horizontal Os genes transferidos podem ser muito semelhantes aos genes dos quais eles foram de rivados no organismo original enquanto a maior parte dos outros genes nos mesmos dois organismos pode estar re lacionada de modo muito distante Um exemplo de trans ferência gênica horizontal é a recente rápida dispersão de genes de resistência a antibióticos em populações bacteria nas As proteínas derivadas desses genes transferidos não seriam bons candidatos para o estudo da evolução bacteria na pois compartilham apenas uma história evolutiva muito limitada com seus organismos hospedeiros O estudo da evolução molecular geralmente se concen tra em famílias de proteínas intimamente relacionadas Na maior parte dos casos as famílias escolhidas para análise têm funções essenciais no metabolismo celular que deviam ter estado presentes nas primeiras células viáveis reduzin do portanto enormemente a chance de que tenham sido introduzidas há relativamente pouco tempo por transferên cia gênica horizontal Por exemplo uma proteína chamada de EF1a fator de alongamento 1a está envolvida na sín tese de proteínas em todos os eucariontes Uma proteína semelhante EFTu com a mesma função é encontrada em bactérias As semelhanças na sequência e na função indi cam que a EF1a e a EFTu são membros de uma família de proteínas que compartilham um ancestral comum Os mem bros de famílias de proteínas são denominados proteínas homólogas ou homólogos O conceito de um homólogo pode ser mais aperfeiçoado Se duas proteínas em uma fa mília isto é dois homólogos estão presentes nas mesmas espécies elas são chamadas de parálogos Homólogos de espécies diferentes são denominados ortólogos O proces so de rastrear a evolução envolve primeiramente a iden tificação de famílias adequadas de proteínas homólogas e então sua utilização para reconstruir as vias evolutivas Os homólogos são identificados pelo uso de programas de computador cada vez mais potentes que comparam di retamente duas ou mais sequências de proteínas escolhidas ou pesquisam vastos bancos de dados para descobrir os pa rentes evolutivos de uma sequência proteica selecionada O processo de busca eletrônica pode ser entendido como o deslizamento de uma sequência sobre outra até que seja encontrada uma secção com boa correspondência Nesse alinhamento de sequências uma pontuação positiva é atri buída para cada posição onde os resíduos de aminoácidos nas duas sequências sejam idênticos o valor da pontuação varia de um programa para o outro para fornecer uma me dida da qualidade do alinhamento O processo tem certas complicações Algumas vezes as proteínas comparadas apre sentam correspondência por exemplo em dois segmentos de sequência e esses segmentos estão conectados por se quências menos relacionadas de comprimentos diferentes Assim os dois segmentos correspondentes não podem ser alinhados ao mesmo tempo Para contornar isso o progra ma de computador introduz lacunas em uma das sequên cias para registrar os segmentos correspondentes Figura 333 É claro que se for introduzido um número suficiente de lacunas quaisquer duas sequências poderiam ser coloca das em algum tipo de alinhamento Para evitar alinhamentos sem informações significativas os programas incluem pena lidades para cada lacuna introduzida reduzindo portanto a pontuação global do alinhamento Com um método de ten tativa e erro eletrônico o programa seleciona o alinhamento com a pontuação ideal que maximiza os resíduos de aminoá cidos idênticos enquanto minimiza a introdução de lacunas Com frequência encontrar aminoácidos idênticos é ina dequado para identificar proteínas relacionadas ou princi palmente para determinar o quão proximamente relaciona das são as proteínas em uma escala de tempo evolutiva Uma análise mais útil também leva em conta as propriedades químicas dos aminoácidos substituídos Muitas das diferen ças de aminoácidos no interior de uma família de proteínas podem ser conservativas isto é um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo com propriedades químicas se melhantes Por exemplo um resíduo Glu pode substituir em um membro da família o resíduo Asp encontrado em outra ambos os aminoácidos são carregados negativamente Tal substituição conservativa deveria logicamente receber uma T D G E N D R Q T T I I A L V L Y Y D D L L G G G G G G T T F F D D I V S S I I I L E E I L D G E D V G DGEKT T F F E E V V L R A S T T N A G G D D T N H R L L G G G G E D D D F F D D S Q R V L I I I H D Y H L L Escherichia coli Bacillus subtilis Intervalo FIGURA 333 Alinhando sequências de proteínas com o uso de inter valos Aqui é mostrada a sequência de alinhamento de uma curta secção das proteínas Hsp70 classe muito difundida de chaperonas dobradoras de proteínas de duas espécies de bactérias muito bem estudadas E coli e Ba cillus subtilis A introdução de um intervalo na sequência de B subtilis permite um melhor alinhamento dos resíduos de aminoácidos de cada lado do inter valo Resíduos de aminoácidos idênticos estão sombreados Nelson6edbookindb 106 Nelson6edbookindb 106 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 107 pontuação maior em um alinhamento de sequências do que uma substituição não conservativa tal como a substituição de um resíduo Asp por um resíduo hidrofóbico Phe Para a maioria dos esforços em encontrar homologias e explorar relações evolutivas as sequências de proteínas de rivadas tanto diretamente do sequenciamento proteico quan to do sequenciamento do DNA que codifica as proteínas são superiores às sequências de ácidos nucleicos não gênicas aquelas que não codificam uma proteína ou um RNA fun cional Para um ácido nucleico com seus quatro tipos di ferentes de resíduos o alinhamento aleatório de sequências não homólogas irá em geral produzir correspondências para no mínimo 25 das posições A introdução de algumas pou cas lacunas pode com frequência aumentar a fração de re síduos correspondentes para 40 ou mais e a probabilidade de alinhamentos aleatórios de sequências não relacionadas tornase bastante elevada Os 20 resíduos de aminoácidos diferentes nas proteínas reduzem muito a probabilidade de alinhamentos aleatórios não informativos desse tipo Os programas utilizados para gerar um alinhamento de sequências são complementados por métodos que tes tam a confiabilidade dos alinhamentos Um teste compu tadorizado comum consiste em embaralhar a sequência de aminoácidos de uma das proteínas que estiver sendo com parada para produzir uma sequência aleatória e então ins truir o programa a alinhar a sequência embaralhada com a outra não embaralhada Pontuações são designadas ao novo alinhamento e o processo de embaralhar e alinhar é repetido muitas vezes O alinhamento original antes de em baralhar deve ter uma pontuação significativamente maior do que qualquer uma daquelas pontuações geradas pelos alinhamentos aleatórios isso aumenta a confiança de que o alinhamento de sequências identificou um par de homólo gos Observe que a ausência de pontuação de alinhamento significativo não necessariamente significa que não exista relação evolutiva entre as duas proteínas Como será visto no Capítulo 4 as semelhanças de estruturas tridimensionais revelam algumas vezes relações evolutivas nas quais a ho mologia de sequências foi apagada pelo tempo Para utilizar uma família de proteínas para explorar a evolução os pesquisadores identificam membros da família com funções moleculares semelhantes na faixa mais ampla possível de organismos A informação da família pode então ser utilizada para rastrear a evolução desses organismos Ao analisar a divergência nas sequências de famílias de proteí nas selecionadas os investigadores podem separar os orga nismos em classes com base em suas relações evolutivas Esta informação deve ser conciliada com exames mais clás sicos da fisiologia e da bioquímica dos organismos Certos segmentos de uma sequência de proteínas po dem ser encontrados em organismos de um grupo taxonô mico mas não em outros grupos esses segmentos podem ser utilizados como sequênciasassinatura para o gru po no qual elas foram encontradas Um exemplo de uma sequênciaassinatura é a inserção de 12 aminoácidos próxi mos à terminação amino das proteínas EF1aEFTu em to das as arqueobactérias e eucariontes mas não em bactérias Figura 334 Essa assinatura particular é um dos muitos indícios bioquímicos que podem ajudar a estabelecer o re lacionamento evolutivo de eucariontes e arqueobactérias Sequênciasassinatura têm sido utilizadas para estabelecer relações evolutivas entre grupos de organismos em muitos níveis taxonômicos diferentes Ao considerar a sequência completa de uma proteína os pesquisadores podem atualmente construir árvores evolu tivas mais elaboradas com muitas espécies em cada grupo taxonômico A Figura 335 apresenta uma dessas árvores para bactérias com base na divergência de sequências na proteína GroEL proteína presente em todas as bactérias que auxilia no enovelamento adequado de proteínas A árvore pode ser aperfeiçoada utilizando as sequências de múltiplas proteínas e a complementação da informação de sequência com dados das propriedades bioquímicas e fisio lógicas exclusivas de cada espécie Há muitos métodos para gerar árvores cada método com suas próprias vantagens e desvantagens e diversas formas de representar as relações evolutivas resultantes Na Figura 335 as extremidades li vres das linhas são chamadas de nós externos cada um re presenta uma espécie atual que é marcada assim Os pontos onde duas linhas se unem os nós internos representam espécies ancestrais extintas Na maior parte das representa ções incluindo a Figura 335 os comprimentos das linhas que conectam os nós são proporcionais ao número de subs tituições de aminoácidos que separam uma espécie da outra Ao rastrear duas espécies conservadas a um nó interno co mum representando o ancestral comum das duas espécies o comprimento do ramo que conecta cada nó externo ao nó interno representa o número de substituições de aminoáci dos que separam uma espécie atual de seu ancestral A soma dos comprimentos de todos os segmentos de linhas que co nectam uma espécie conservada a outras espécies conserva das com ancestral comum reflete o número de substituições que separam as duas espécies conservadas Para determinar quanto tempo foi necessário para as várias espécies diver girem a árvore precisa ser calibrada para comparála com informações do registro fóssil e outras fontes À medida que mais informação de sequência tornase disponível nos bancos de dados é possível gerar árvores I I I I I I G G G G G G H H H H H H V V V V V V D D D D D D H H S S H H G G G G G G K K K K K K S S S S S T T T T T T T M L T T M L V V T T V T G G G G G A R R H H R A L L L L L L I I Y M Y Y E D K K T R C C G G G G S F G G V I I I P D D D E E K K H K R R V T T T I V I I I I E K E E T T Q E K K T T H A F F V V Halobacterium halobium Sulfolobus solfataricus Saccharomyces cerevisiae Homo sapiens Bacillus subtilis Escherichia coli Arqueobactérias Eucariontes Bactérias grampositivas Bactérias gramnegativas Sequênciaassinatura FIGURA 334 Uma sequênciaassinatura na família de proteínas EF1aEFTu A sequênciaassinatura no retângulo é uma inserção de 12 resíduos próxima do terminal amino da sequência Os resíduos que alinham em todas as espécies estão sombreados Tanto as arqueias quanto os euca riontes apresentam a assinatura embora as sequências de inserções sejam bem distintas para os dois grupos A variação na sequênciaassinatura reflete a divergência evolutiva significativa que ocorreu nesse ponto desde que ela apareceu primeiro em um ancestral comum de ambos os grupos Nelson6edbookindb 107 Nelson6edbookindb 107 020414 1842 020414 1842 108 DAVID L NELSON MICHAEL M COX evolutivas com base em múltiplas proteínas bem como aperfeiçoar essas árvores à medida que informação genô mica adicional emerge de métodos de análise cada vez mais sofisticados Todo esse trabalho tem o objetivo de criar uma árvore detalhada da vida que descreva a evolução e o paren tesco de cada organismo na Terra A história é um trabalho contínuo é claro Figura 336 As questões levantadas e respondidas são fundamentais para definir como os huma Leptospira interrogans Borrelia burgdorferi Espiroquetas Bacillus PS3 Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Clostridium acetobutylicum Clostridium perfringens Streptomyces albus gene Streptomyces coelicolor Mycobacterium leprae Mycobacterium tuberculosis baixo G C alto G C Bactérias grampositivas Cianobactérias e cloroplastos Cyanidium caldarium chl Synechocystis Ricinus communis chl Triticum aestivum chl Brassica napus chl Arabidopsis thaliana chl Zymomonas mobilis Agrobacterium tumefaciens 01 substituiçõeslocal Bradyrhizobium japonicum Rickettsia tsutsugamushi Neisseria gonorrhoeae Yersinia enterocolitica Salmonella typhi Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Legionella pneumophila Helicobacter pylori Porphyromonas gingivalis Chlamydia trachomatis Chlamydia psittaci Chlamydia Bacteroides Proteobactérias g a b d FIGURA 335 Árvore evolutiva derivada de comparações entre as sequências de aminoácidos Árvore evolutiva bacteriana com base na divergência de sequências observada na família de proteínas GroEL Tam bém estão incluídos nessa árvore parte inferior direita os cloroplastos de algumas espécies não bacterianas Euryarchaeota Crenarchaeota Cloroplastos Mitocôndrias Thermotogales Metamonda pex Giardia Parabasalia pex Trichomonas Cinetoplastídeos pex Trypanosoma Apicomplexa pex Plasmodium Euglena Entamoeba Microsporídeos Fungos Animais Plantas Micetozoários Korarchaeota Baixo G C grampositivas Alto G C gramnegativas Púrpuras d Púrpuras a Espiroquetas Fusobactérias FlexibacterBacterioides Cianobactérias Thermus Aquifex Púrpuras gb Eukarya Archaea LUCA Bacteria FIGURA 336 Árvore de consenso da vida A árvore mostrada aqui baseiase em análises de muitas sequências de proteínas e características genômicas adicionais A árvore apresenta apenas uma fração da informação disponível bem como apenas uma fração dos temas que ainda precisam ser solucionados Cada grupo existente mostrado é uma história evolutiva complexa em si mesma LUCA é o último ancestral comum universal do qual todas as outras formas de vida evoluíram As setas azul e verde indicam a assimilação endossimbiótica de tipos específicos de bactérias por células eucariontes para se tornarem mitocôndrias e cloroplastos respectivamente ver Figura 138 Nelson6edbookindb 108 Nelson6edbookindb 108 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 109 nos veem a si mesmos e ao mundo ao seu redor O campo da evolução molecular promete estar entre as mais vibrantes fronteiras científicas do século XXI RESUMO 34 A estrutura de proteínas estrutura primária c Diferenças na função de proteínas resultam de diferen ças na composição e na sequência de aminoácidos Al gumas variações na sequência podem ocorrer em uma proteína particular com pouco ou nenhum efeito em sua função c As sequências de aminoácidos são deduzidas pela frag mentação de polipeptídeos em peptídeos menores com reagentes conhecidos para clivar ligações peptídicas es pecíficas pela determinação das sequências de aminoá cidos de cada fragmento pelo procedimento automatiza do de degradação de Edman então pela ordenação dos fragmentos peptídicos pelo encontro de sobreposições de sequências entre os fragmentos gerados por diferen tes reagentes A sequência de uma proteína também pode ser deduzida a partir da sequência de nucleotídeos de seu gene correspondente no DNA ou por espectro metria de massa c Peptídeos e proteínas pequenas até cerca de 100 re síduos podem ser sintetizados quimicamente O pep tídeo é construído um resíduo de aminoácido por vez enquanto unido a um suporte sólido c Sequências proteicas são uma fonte rica de informação sobre a estrutura e a função da proteína bem como so bre a evolução da vida na Terra Métodos sofisticados estão sendo desenvolvidos para rastrear a evolução analisando as lentas mudanças resultantes nas sequên cias de aminoácidos de proteínas homólogas Termoschave Termos em negrito são definidos no glossário aminoácidos 76 resíduo 76 grupo R 76 centro quiral 76 enantiômeros 76 configuração absoluta 78 sistema D L 78 polaridade 78 absorbância A 80 zwitteríon 81 pH isoelétrico ponto isoelétrico pI 84 peptídeo 85 proteína 85 ligação peptídica 85 oligopeptídeo 86 polipeptídeo 86 proteína oligomérica 88 protômero 88 proteína conjugada 89 grupo prostético 89 extrato bruto 89 fração 89 fracionamento 89 diálise 90 cromatografia em coluna 90 cromatografia de troca iônica 90 cromatografia de exclusão por tamanho 92 cromatografia de afinidade 92 cromatografia líquida de alto desempenho HPLC 92 eletroforese 92 dodecil sulfato de sódio SDS 94 focalização isoelétrica 94 atividade específica 95 estrutura primária 97 estrutura secundária 97 estrutura terciária 97 estrutura quaternária 97 degradação de Edman 98 proteases 99 MALDI MS 101 ESI MS 101 sequência consenso 104 bioinformática 104 transferência gênica horizontal 106 proteínas homólogas 106 homólogos 106 parálogos 106 ortólogos 106 sequênciaassinatura 107 Leituras adicionais Aminoácidos Dougherty DA 2000 Unnatural amino acids as probes of protein structure and function Curr Opin Chem Biol 4 645652 Kreil G 1997 DAmino acids in animal peptides Annu Rev Biochem 66 337345 Detalhes da ocorrência destes estereoisômeros incomuns de aminoácidos Meister A 1965 Biochemistry of the Amino Acids 2nd edn Vols 1 and 2 Academic Press Inc New York Tratamento enciclopédico das propriedades da ocorrência e do metabolismo de aminoácidos Peptídeos e proteínas Creighton TE 1992 Proteins Structures and Molecular Properties 2nd edn W H Freeman and Company New York Fonte geral muito útil Trabalhando com proteínas Dunn MJ Corbett JM 1996 Twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis Methods Enzymol 271 177203 Descrição detalhada da tecnologia Kornberg A 1990 Why purify enzymes Methods Enzymol 182 15 O papel crucial dos métodos bioquímicos clássicos em uma nova era Scopes RK 1994 Protein Purification Principles and Practice 3rd edn SpringerVerlag New York Boa fonte para descrições mais completas sobre os princípios subjacentes à cromatografia e outros métodos Estrutura primária de proteínas e evolução Andersson L Blomberg L Flegel M Lepsa L Nilsson B Verlander M 2000 Largescale synthesis of peptides Biopolymers 55 227250 Discussão sobre as abordagens para a fabricação de peptídeos como produtos farmacêuticos Dell A Morris HR 2001 Glycoprotein structure determination by mass spectrometry Science 291 23512356 As glicoproteínas podem ser complexas a espectrometria de massa é um método preferido de classificação Delsuc F Brinkmann H Philippe H 2005 Phylogenomics and the reconstruction of the tree of life Nat Rev Genet 6 361375 Gogarten JP Townsend JP 2005 Horizontal gene transfer genome innovation and evolution Nat Rev Microbiol 3 679687 Gygi SP Aebersold R 2000 Mass spectrometry and proteomics Curr Opin Chem Biol 4 489494 Usos da espectrometria de massa para identificar e estudar as proteínas celulares Koonin EV Tatusov RL Galperin MY 1998 Beyond complete genomes from sequence to structure and function Curr Opin Struct Biol 8 355363 Boa discussão sobre os possíveis usos do aumento da quantidade de informações sobre sequências de proteínas Nelson6edbookindb 109 Nelson6edbookindb 109 020414 1842 020414 1842 110 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Li WH Graur D 2000 Fundamentals of Molecular Evolution 2nd edn Sinauer Associates Inc Sunderland MA Texto de fácil leitura descrevendo os métodos utilizados para a análise de sequências de proteínas e de ácidos nucleicos O Capítulo 5 fornece uma das melhores descrições disponíveis de como árvores evolutivas são construídas a partir de dados de sequências Mayo KH 2000 Recent advances in the design and construction of synthetic peptides for the love of basics or just for the technology of it Trends Biotechnol 18 212217 Miranda LP Alewood PF 2000 Challenges for protein chemical synthesis in the 21st century bridging genomics and proteomics Biopolymers 55 217226 Este e o artigo de Mayo acima descrevem como produzir peptídeos e unilos em conjuntos para tratar uma ampla faixa de problemas na bioquímica de proteínas Ramisetty SR Washburn MP 2011 Unraveling the dynamics of protein interactions with quantitative mass spectrometry Crit Rev BiochemMol Biol 46 216228 Rokas A Williams BL King N Carroll SB 2003 Genomescale approaches to resolving incongruence in molecular phylogenies Nature 425798804 Como as comparações de sequência de múltiplas proteínas podem produzir informação evolutiva precisa Sanger F 1988 Sequences sequences sequences Annu Rev Biochem 57 128 Bom relato histórico do desenvolvimento de métodos de sequenciamento Snel B Huynen MA Dutilh BE 2005 Genome trees and the nature of genome evolution Annu Rev Microbiol 59 191209 Steen H Mann M 2004 The ABCs and XYZs of peptide sequencing Nat Rev Mol Cell Biol 5 699711 Zuckerkandl E Pauling L 1965 Molecules as documents of evolutionary history J Theor Biol 8 357366 Muitos consideram este artigo como o fundador no campo da evolução molecular Problemas 1 Configuração absoluta da citrulina A citrulina isola da de melancias tem a estrutura apresentada a seguir Ela é um aminoácido D ou L Explique C C O H CH NH 2 NH2 2 2 H C N 1 H3 COO2 2 Relação entre a curva de titulação e as propriedades acidobásicas da glicina Uma solução de 100 mL de glici na a 01 M em pH 172 foi titulada com uma solução de 2 M de NaOH O pH foi monitorado e os resultados foram plotados como mostrado no gráfico Os pontoschave na titulação são designados de I a V Para cada uma das afirmações de a a o identifique o pontochave adequado na titulação e justifique sua escolha a A glicina está presente predominantemente como a es pécie 1H3NCH2COOH b A carga final média da glicina é 1 c Metade dos grupos amino está ionizado d O pH é igual ao pKa do grupo carboxila e O pH é igual ao pKa do grupo amino protonado f A glicina possui sua capacidade de tamponamento má xima g A carga final média da glicina é zero h O grupo carboxila foi completamente titulado primei ro ponto de equivalência i A glicina está completamente titulada segundo ponto de equivalência j A espécie predominante é 1H3NCH2COO k A carga final média da glicina é 1 l A glicina está presente predominantemente como uma mistura 5050 de 1H3NCH2COOH e 1H3NCH2COO m Este é o ponto isoelétrico n Este é o final da titulação o Estas são as piores regiões de pH para poder de tam ponamento 1130 V 960 IV III 234 I II 597 12 2 4 6 8 0 05 OH2 equivalentes pH 10 15 20 10 3 Quanta alanina está presente na forma da espé cie completamente sem carga Em um pH igual ao ponto isoelétrico da alanina a sua carga final é zero Duas estrutu ras podem ser desenhadas que apresentam carga final igual a zero mas a forma predominante de alanina em seu pI é zwitteriônica 1 C CH3 H3N H C O O2 Zwitteriônica Não carregada C CH3 H2N H C O OH a Por que a alanina é predominantemente zwitteriônica em vez de completamente não carregada em seu pI b Que fração de alanina está na forma completamente não carregada em seu pI Justifique suas suposições 4 Estado de ionização da histidina Cada grupo ioni zável de um aminoácido pode existir em um de dois estados carregado ou neutro A carga elétrica no grupo funcional é determinada pela relação entre seu pKa e o pH da solução Essa relação é descrita pela equação de HendersonHasselbalch a A histidina tem três grupos funcionais ionizáveis Escreva as equações de equilíbrio para suas três ionizações e assinale o pKa adequado para cada ionização Desenhe a estrutura da histidina em cada estado de ionização Qual é a carga final na molécula de histidina em cada estado de ionização b Desenhe as estruturas do estado de ionização predomi nante da histidina em pH 1 4 8 e 12 Observe que o estado de Nelson6edbookindb 110 Nelson6edbookindb 110 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 111 ionização pode ser aproximado tratandose cada grupo ionizá vel independentemente c Qual é a carga final da histidina em pH 1 4 8 e 12 Para cada pH a histidina irá migrar em direção ao ânodo 1 ou ao cátodo quando colocada em um campo elétrico 5 Separação de aminoácidos por cromatografia de troca iônica Misturas de aminoácidos podem ser analisa das primeiramente pela separação da mistura em seus com ponentes por uma cromatografia de troca iônica Os aminoá cidos inseridos em uma resina permutadora de cátions ver Figura 317a contendo grupos sulfonados SO 3 fluem pela resina em velocidades diferentes em consequência de dois fatores que influenciam seu movimento 1 atração iô nica entre os resíduos sulfonados na coluna e os grupos fun cionais carregados positivamente nos aminoácidos e 2 inte rações hidrofóbicas entre as cadeias laterais de aminoácidos e o esqueleto fortemente hidrofóbico da resina de poliesti reno Para cada par de aminoácidos listados determine qual será eluído primeiro em uma coluna permutadora de cátions por um tampão de pH 70 a Asp e Lys b Arg e Met c Glu e Val d Gly e Leu e Ser e Ala 6 Nomeando os estereoisômeros de isoleucina A es trutura do aminoácido isoleucina é H C H3N 1 C COO2 H CH2 CH3 CH3 a Quantos centros quirais ela tem b Quantos isômeros ópticos c Desenhe fórmulas em perspectiva para todos os isôme ros ópticos da isoleucina 7 Comparação dos valores de pKa de alanina e polia lanina A curva de titulação da alanina mostra a ionização de dois grupos funcionais com valores de pKa de 234 e 969 correspondendo à ionização do grupo carboxila e dos grupos amino protonados respectivamente A titulação de di tri e oli gopeptídeos maiores de alanina também mostra a ionização de somente dois grupos funcionais embora os valores experimen tais de pKa sejam diferentes A tendência nos valores de pKa está resumida na tabela Aminoácido ou peptídeo pK1 pK2 Ala 234 969 AlaAla 312 830 AlaAlaAla 339 803 AlaAlanAla n 4 342 794 a Desenhe a estrutura de AlaAlaAla Identifique os gru pos funcionais associados a pK1 e pK2 b Por que o valor de pK1 aumenta com cada resíduo Ala adicional no oligopeptídeo c Por que o valor de pK2 diminui com cada resíduo Ala adicional no oligopeptídeo 8 O tamanho das proteínas Qual é a massa molecular aproximada de uma proteína com 682 resíduos de aminoácidos em uma única cadeia polipeptídica 9 O número de resíduos de triptofano na albumina sé rica bovina Uma análise quantitativa de aminoácidos revela que a albumina sérica bovina BSA contém 058 de triptofa no Mr 204 por peso a Calcule a massa molecular mínima da BSA ie presu mindose que haja apenas um resíduo de Trp por molécula de proteína b A cromatografia de exclusão por tamanho da BSA for nece uma massa molecular estimada de BSA de 70000 Quan tos resíduos de Trp estão presentes em uma molécula de albu mina sérica 10 Composição de subunidades de uma proteína Uma proteína tem uma massa molecular de 400 kDa quando medida por cromatografia de exclusão por tamanho Quando submeti da a uma eletroforese em gel na presença de dodecil sulfato de sódio SDS a proteína fornece três bandas com massas mole culares de 180 160 e 60 kDa Quando a eletroforese é realizada na presença de SDS e ditiotreitol três bandas são novamente formadas desta vez com massas moleculares de 160 90 e 60 kDa Determine a composição das subunidades da proteína 11 Carga elétrica final de peptídeos Um peptídeo tem a sequência GluHisTrpSerGlyLeuArgProGly a Qual é a carga final da molécula em pH 3 8 e 11 Uti lize os valores de pKa para cadeias laterais e grupos amino e carboxila terminais como fornecidos na Tabela 31 b Estime o pI para este peptídeo 12 Ponto isoelétrico da pepsina Pepsina é o nome dado a uma mistura de diversas enzimas digestivas secretadas como proteínas precursoras maiores por glândulas no estômago Es sas glândulas também secretam ácido clorídrico que dissolve o material particulado no alimento permitindo à pepsina clivar de modo enzimático moléculas de proteínas individuais A mistura resultante de alimento HCl e enzimas digestivas é conhecida como quimo e apresenta pH próximo a 15 Qual pI você pode ria prever para as proteínas da pepsina Que grupos funcionais devem estar presentes para conferir esse pI à pepsina Quais aminoácidos nas proteínas iriam contribuir com tais grupos 13 Ponto isoelétrico de histonas As histonas são proteí nas encontradas no núcleo de células eucarióticas fortemente ligadas ao DNA com muitos grupos fosfato O pI das histonas é muito alto cerca de 108 Que resíduos de aminoácidos devem estar presentes em quantidades relativamente elevadas nas histonas De que forma esses resíduos contribuem para a forte ligação das histonas ao DNA 14 Solubilidade de polipeptídeos Um método para se parar polipeptídeos faz uso de suas diferentes solubilidades A solubilidade de polipeptídeos grandes em água depende da po laridade relativa de seus grupos R particularmente do número de grupos ionizáveis quanto mais grupos ionizáveis existirem mais solúvel será o polipeptídeo Qual de cada par de polipep tídeos a seguir é mais solúvel no pH indicado a Gly20 ou Glu20 em pH 70 b LysAla3 ou PheMet3 em pH 70 c AlaSerGly5 ou AsnSerHis5 em pH 60 d AlaAspGly5 ou AsnSerHis5 em pH 30 Nelson6edbookindb 111 Nelson6edbookindb 111 020414 1842 020414 1842 112 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 15 Purificação de uma enzima Um bioquímico descobre e purifica uma nova enzima gerando a tabela de purificação a seguir Procedimento Proteína total mg Atividade unidades 1 Extrato bruto 20000 4000000 2 Precipitação sal 5000 3000000 3 Precipitação pH 4000 1000000 4 Cromatografia de troca iônica 200 800000 5 Cromatografia de afinidade 50 750000 6 Cromatografia de exclusão por tamanho 45 675000 a A partir da informação contida na tabela calcule a ati vidade específica da enzima após cada procedimento de puri ficação b Qual dos procedimentos de purificação utilizados para essa enzima é mais eficaz ie fornece o maior aumento relati vo em pureza c Qual dos procedimentos de purificação é menos efetivo d Há alguma indicação com base nos resultados apresen tados na tabela de que a enzima está pura após a etapa 6 O que mais poderia ser feito para estimar a pureza da preparação da enzima 16 Diálise Uma proteína purificada está em um tampão Hepes N2hidróxietilpiperazinaN9ácido 2etanossulfô nico em pH 7 com 500 mM de NaCl Uma amostra 1 mL da solução de proteína é inserida em um tubo feito de membrana de diálise e dialisado contra 1 L do mesmo tampão Hepes com 0 mM de NaCl Moléculas pequenas e íons como Na 1 Cl e He pes podem se difundir através da membrana de diálise mas a proteína não a Uma vez que a diálise alcança o equilíbrio qual é a concentração de NaCl na amostra de proteína Assuma que nenhuma mudança de volume ocorra na amostra durante a diálise b Se a amostra de 1 mL original fosse dialisada duas ve zes sucessivamente contra 100 mL do mesmo tampão Hepes com 0 mM NaCl qual seria a concentração final de NaCl na amostra 17 Purificação de peptídeos Em pH 70 em que or dem os três peptídeos a seguir seriam eluídos em uma colu na preenchida com um polímero permutador de cátions Suas composições em aminoácidos são Peptídeo A Ala 10 Glu 5 Ser 5 Leu 10 Arg 10 His 5 Ile 10 Phe 5 Tyr 5 Lys 10 Gly 10 Pro 5 e Trp 10 Peptídeo B Ala 5 Val 5 Gly 10 Asp 5 Leu 5 Arg 5 Ile 5 Phe 5 Tyr 5 Lys 5 Trp 5 Ser 5 Thr 5 Glu 5 Asn 5 Pro 10 Met 5 e Cys 5 Peptídeo C Ala 10 Glu 10 Gly 5 Leu 5 Asp 10 Arg 5 Met 5 Cys 5 Tyr 5 Phe 5 His 5 Val 5 Pro 5 Thr 5 Ser 5 Asn 5 e Gln 5 18 Determinação da sequência do peptídeo cerebral leucina encefalina Um grupo de peptídeos que influencia a transmissão nervosa em certas partes do cérebro foi isolado de tecido cerebral normal Esses peptídeos são conhecidos como opioides porque se ligam a receptores específicos que também se ligam a fármacos opiáceos como a morfina e a naloxona Os opioides portanto mimetizam algumas propriedades dos fár macos opiáceos Alguns pesquisadores consideram que esses peptídeos sejam os analgésicos próprios do cérebro Utilizando as informações a seguir determine a sequência de aminoácidos do opioide leucina encefalina Explique como sua estrutura é consistente com cada uma das informações fornecidas a A hidrólise completa por 6 M de HCl a 110 oC seguida pela análise de aminoácidos indicou a presença de Gly Leu Phe e Tyr em uma razão molar de 2111 b O tratamento do peptídeo com 1fluoro24dinitroben zeno seguido pela hidrólise completa e cromatografia indicou a presença de um derivado 24dinitrofenila da tirosina Nenhu ma tirosina livre foi encontrada c A digestão completa do peptídeo com quimotripsina se guida por cromatografia forneceu tirosina e leucina livres mais um tripeptídeo contendo Phe e Gly em uma razão de 12 19 Estrutura do peptídeo antibiótico de Bacillus bre vis Extratos da bactéria Bacillus brevis contêm um peptídeo com propriedades antibióticas Esse peptídeo forma comple xos com íons metálicos e parece interromper o transporte iô nico através de membranas celulares de outras espécies bacte rianas matandoas A estrutura do peptídeo foi determinada a partir das seguintes observações a A hidrólise ácida completa do peptídeo seguida de aná lise de aminoácidos produziu quantidades equimolares de Leu Orn Phe Pro e Val Orn é ornitina um aminoácido que não está presente em proteínas mas aparece em alguns peptídeos Ela tem a seguinte estrutura CH2 CH2 CH2 C COO2 H3N H 1NH3 1 b A massa molecular do peptídeo foi estimada em apro ximadamente 1200 c O peptídeo não sofreu hidrólise quando tratado com a enzima carboxipeptidase Essa enzima catalisa a hidrólise do resíduo carboxiterminal de um polipeptídeo a menos que o re síduo seja Pro ou por alguma razão não contenha um grupo carboxila livre d O tratamento do peptídeo intacto com 1fluoro24di nitrobenzeno seguido por hidrólise completa e cromatografia produziu apenas aminoácidos livres e o seguinte derivado NO2 CH2 CH2 1NH3 O2N COO2 CH2 NH C H Dica o derivado de 24dinitrofenila envolve o grupo amino de uma cadeia lateral em vez de um grupo aamino e A hidrólise parcial do peptídeo seguida por separação cromatográfica e análise de sequência produziu os seguintes di e tripeptídeos o aminoácido aminoterminal está sempre à esquerda LeuPhe PhePro OrnLeu ValOrn ValOrnLeu PheProVal ProValOrn A partir das informações fornecidas acima deduza a sequência de aminoácidos do peptídeo antibiótico Mostre seu raciocínio Quando você tiver chegado a uma estrutura demonstre que ela é consistente com cada observação experimental Nelson6edbookindb 112 Nelson6edbookindb 112 020414 1842 020414 1842 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 113 20 Eficiência no sequenciamento de peptídeos Um peptídeo com a estrutura primária LysArgProLeuIleAsp GlyAla é sequenciado pelo procedimento de Edman Se cada ciclo de Edman tiver uma eficiência de 96 que porcentagem dos aminoácidos liberados no quarto ciclo será leucina Faça o cálculo uma segunda vez mas presuma uma eficiência de 99 para cada ciclo 21 Comparação de sequências Proteínas denominadas chaperonas moleculares descritas no Capítulo 4 auxiliam no processo de enovelamento proteico Uma classe de chapero nas encontrada em organismos desde bactérias a mamíferos é a proteína de choque térmico 90 Hsp90 Todas as chapero nas Hsp90 contêm uma sequênciaassinatura de 10 aminoá cidos que permite uma identificação rápida dessas proteínas em bancos de dados de sequências Duas representações dessa sequênciaassinatura são apresentadas a seguir YxNQHDKHRDEIVAFLMRED 4 5 6 7 8 9 10 2 1 N C 3 4 3 1 0 2 Bits a Nesta sequência que resíduos de aminoácidos não va riam conservados ao longo de todas as espécies b A qualis posiçãoões estão limitados aqueles ami noácidos com cadeias laterais carregadas positivamente Para cada posição qual aminoácido é mais comumente en contrado c Em quais posições as substituições estão restritas a aminoácidos com cadeias laterais carregadas negativamente Para cada posição qual aminoácido predomina d Há uma posição que pode ser qualquer aminoácido embora um aminoácido apareça com muito mais frequência do que qualquer outro Que posição é esta e qual aminoácido apa rece com mais frequência 22 Métodos cromatográficos Três aminoácidos cujas se quências são apresentadas a seguir utilizando o código de uma letra para seus aminoácidos estão presentes em uma mistura 1 ATKNRASCLVPKHGALMFWRHKQLVSDPILQKRQHIL VCRNAAG 2 GPYFGDEPLDVHDEPEEG 3 PHLLSAWKGMEGVGKSQSFAALIVILA Qual deles migraria mais lentamente durante a cromatografia através de a uma resina de troca iônica grânulos revestidos com grupos carregados positivamente b uma resina de troca iônica grânulos revestidos com grupos carregados negativamente c uma coluna de exclusão por tamanho filtração em gel projetada para separar peptídeos pequenos como esses d Quais os peptídeos que contêm os motivos de ligação ao ATP mostrados na sequência logo a seguir 4 5 6 7 8 C 2 1 N 3 4 0 2 Bits Problemas de análise de dados 23 Determinação da sequência de aminoácidos da in sulina A Figura 324 mostra a sequência de aminoácidos da insulina bovina Essa estrutura foi determinada por Frederick Sanger e colaboradores A maior parte desse trabalho está descrita em uma série de artigos publicados no Biochemical Journal de 1945 a 1955 Quando Sanger e seus colaboradores iniciaram seu traba lho em 1945 sabiase que a insulina era uma proteína pequena consistindo em duas ou quatro cadeias polipeptídicas ligadas por ligações dissulfeto Sanger e seus colaboradores desen volveram alguns poucos métodos simples para o estudo de se quências de proteínas Tratamento com FDNB O FDNB 1fluoro24dinitroben zeno reage com grupos amino livres exceto amida ou gua nidina em proteínas para produzir derivados dinitrofenil de aminoácidos 1 HF 1 O2N NO2 N H R NH2 R O2N NO2 F Amina FDNB DNPamina Hidrólise ácida Ferver uma proteína na presença de HCl a 10 por várias horas hidrolisa todas as suas ligações peptí dicas e amídicas Tratamentos curtos produzem polipeptíde os curtos quanto mais longo o tratamento mais completa é a quebra da proteína em seus aminoácidos Oxidação de cisteínas O tratamento de uma proteína com ácido perfórmico clivou todas as ligações dissulfeto e con verteu todos os resíduos Cys a resíduos de ácido cisteico ver Figura 328 Cromatografia em papel Esta versão mais primitiva da cromatografia em camada delgada ver Figura 1025 separava compostos com base em suas propriedades químicas permitin do a identificação de aminoácidos isolados e em alguns casos dipeptídeos A cromatografia em camada delgada também se para peptídeos maiores Como relatado em seu primeiro artigo 1945 Sanger promoveu a reação da insulina com o FDNB e hidrolisou a proteína resultante Ele encontrou muitos aminoácidos li vres mas apenas três aminoácidosDNP aDNPglicina o grupo DNP ligado ao grupo aamino aDNPfenilalanina e DNPlisina DNP ligado ao grupo amino Sanger inter pretou esses resultados indicando que a insulina tinha duas cadeias proteicas uma com Gly em sua extremidade ami noterminal e outra com Phe em sua extremidade aminoter minal Uma das duas cadeias também continha um resíduo Lys mas não na extremidade aminoterminal Ele nomeou a cadeia iniciada com o resíduo Gly de A e a cadeia iniciada com Phe de B a Explique como os resultados de Sanger apoiam suas conclusões b Esses resultados são consistentes com a estrutura co nhecida da insulina bovina ver Figura 324 Em um artigo posterior 1949 Sanger descreveu como ele utilizou essas técnicas para determinar os primeiros poucos aminoácidos extremidade aminoterminal de cada cadeia de insulina Para analisar a cadeia B por exemplo ele seguiu as seguintes etapas Nelson6edbookindb 113 Nelson6edbookindb 113 020414 1842 020414 1842 114 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 1 Oxidou a insulina para separar as cadeias A e B 2 Preparou uma amostra de cadeia B pura por cromato grafia em papel 3 Reagiu a cadeia B com FDNB 4 Submeteu a proteína à hidrólise ácida branda de modo a produzir peptídeos pequenos 5 Separou os peptídeosDNP dos peptídeos que não con tinham grupos DNP 6 Isolou quatro dos peptídeosDNP os quais foram nome ados B1 a B4 7 Submeteu à hidrólise intensa cada peptídeoDNP para obter os aminoácidos livres 8 Identificou os aminoácidos em cada peptídeo por cro matografia em papel Os resultados foram os seguintes B1 apenas aDNPfenilalanina B2 aDNPfenilalanina valina B3 ácido aspártico aDNPfenilalanina valina B4 ácido aspártico ácido glutâmico aDNPfenilalanina valina c Com base nesses dados quais são os primeiros quatro aminoácidos aminoterminais da cadeia B Explique seu ra ciocínio d Esse resultado coincide com a sequência conhecida da insulina bovina ver Figura 324 Explique quaisquer discre pâncias Sanger e colaboradores utilizaram esses e outros métodos relacionados para determinar a sequência completa das ca deias A e B Suas sequências para a cadeia A foram as seguin tes aminoterminal à esquerda GlyIleValGlxGlxCysCysAlaSerVal 10 5 1 20 15 CysSerLeuTyrGlxLeuGlxAsxTyrCysAsx Como a hidrólise ácida converteu todo Asn a Asp e todo Gln a Glu esses resíduos tiveram de ser denominados Asx e Glx respectivamente a identidade exata no peptídeo desconhe cida Sanger resolveu esse problema utilizando enzimas pro teases que clivam ligações peptídicas mas não as ligações amídicas nos resíduos Asn e Gln para preparar peptídeos curtos Ele então determinou o número de grupos amida pre sentes em cada peptídeo medindo a liberação de NH 1 4 quando o peptídeo era hidrolisado em ácido Alguns dos resultados obtidos para a cadeia A são mostrados a seguir Os peptídeos podem não ter sido completamente puros de modo que os números foram aproximados mas bons o bastante para os propósitos de Sanger Nome do peptídeo Sequência peptídica Número de grupos amida no peptídeo Ac1 CysAsx 07 Ap15 TyrGlxLeu 098 Ap14 TyrGlxLeuGlx 106 Ap3 AsxTyrCysAsx 210 Ap1 GlxAsxTyrCysAsx 194 Ap5pa1 GlyIleValGlx 015 Ap5 GlyIleValGlxGlxCysCysAla SerValCysSerLeu 116 e Com base nesses dados determine a sequência de ami noácidos da cadeia A Explique como você obteve sua resposta e a compare com a Figura 324 Referências Sanger F 1945 The free amino groups of insulin Biochem J 39 507515 Sanger F 1949 The terminal peptides of insulin Biochem J 45 563574 Nelson6edbookindb 114 Nelson6edbookindb 114 020414 1842 020414 1842 41 Visão geral sobre a estrutura das proteínas 115 42 Estrutura secundária das proteínas 119 43 Estruturas terciária e quaternária das proteínas 125 44 Desnaturação e enovelamento das proteínas 143 A s proteínas são moléculas grandes O esqueleto cova lente de uma proteína clássica é formado por centenas de ligações simples Como é possível a livre rotação entre várias dessas ligações a proteína consegue em prin cípio assumir um número de conformações praticamente incontáveis Entretanto cada proteína tem uma função quí mica e uma estrutura específica sugerindo que cada uma delas tenha uma estrutura tridimensional única Figura 41 Quão estável é essa estrutura quais fatores guiam sua formação e o que a mantém unida No final de 1920 várias proteínas foram cristalizadas incluindo a hemoglobina Mr 64500 e a enzima urease Mr 483000 Como geralmente o arranjo ordenado das moléculas em um cristal pode ocor rer somente se as unidades moleculares forem idênticas a descoberta de que várias proteínas poderiam ser cristali zadas era a evidência de que até mesmo proteínas muito grandes são entidades químicas separadas com estruturas únicas Essa conclusão revolucionou o pensamento sobre as proteínas e suas funções mas o conhecimento que ela gerou foi incompleto A estrutura proteica é sempre ma leável algumas vezes de forma surpreendente Mudanças na estrutura podem ser tão importantes para a função da proteína quanto a estrutura por si só Neste capítulo será examinada a estrutura das proteí nas São enfatizados seis temas Primeiro a estrutura tri dimensional ou seja as estruturas de uma proteína são determinadas por sua sequência de aminoácidos Segundo a função de uma proteína típica depende de sua estrutura Terceiro a maior parte das proteínas isoladas existem em um ou em um pequeno número de formas estruturalmente estáveis Quarto as forças mais importantes de estabiliza ção das estruturas específicas de uma dada proteína são as interações não covalentes Quinto dentre desse enor me número de estruturas únicas das proteínas podem ser reconhecidos alguns padrões estruturais comuns que aju dam a organizar o entendimento sobre a arquitetura das proteínas Sexto as estruturas proteicas não são estáticas Todas as proteínas passam por mudanças na conformação variando desde sutis até bastante significativas Partes de muitas proteínas possuem estruturas não discerníveis Para algumas proteínas a ausência de estrutura definida é fun damental para sua função 41 Visão geral sobre a estrutura das proteínas O arranjo espacial dos átomos em uma proteína ou qualquer parte da proteína é chamado de conformação As confor mações possíveis de uma proteína ou de qualquer segmento proteico incluem qualquer estado estrutural que ela pos sa assumir sem a quebra de suas ligações covalentes Uma mudança conformacional pode ocorrer por exemplo pela rotação sobre as ligações simples Das várias conformações teoricamente possíveis para uma proteína com centenas de ligações simples uma ou mais comumente poucas predo minam em condições biológicas A necessidade de múlti plas conformações estáveis reflete as mudanças que devem ocorrer na proteína quando ela se liga a outras moléculas ou catalisa reações As conformações que existem em determi nadas condições são normalmente aquelas termodinami camente mais estáveis isto é aquelas com energia livre de Gibbs G menores Proteínas dobradas em qualquer uma de suas conformações funcionais são chamadas de proteí nas nativas Para a grande maioria das proteínas uma estrutura em particular ou um pequeno grupo de estruturas é cru cial para a função No entanto em muitos casos partes das proteínas carecem de estruturas perceptíveis Esses seg 4 Estrutura Tridimensional de Proteínas FIGURA 41 Estrutura da enzima quimotripsina uma proteína glo bular A molécula de glicina em cinza é representada para comparação de tamanho As estruturas tridimensionais conhecidas das proteínas estão arquivadas no Protein Data Bank PDB ver Quadro 44 A imagem mostrada aqui foi elaborada utilizando os dados do PDB ID 6GCH Nelson6ed04indd 115 Nelson6ed04indd 115 020514 1718 020514 1718 116 DAVID L NELSON MICHAEL M COX mentos proteicos são intrinsecamente desordenados Em alguns casos proteínas inteiras são intrinsecamente desor denadas e ainda assim funcionais Quais os princípios que determinam as conformações mais estáveis de uma proteína típica Uma compreensão da conformação de proteínas pode ser construída passo a pas so a partir da discussão sobre estrutura primária no Capí tulo 3 passando pela consideração das estruturas secundá rias terciárias e quaternárias A essa abordagem clássica é preciso acrescentar a ênfase mais recente dada aos padrões comuns e classificáveis de enovelamento variavelmente chamados de estruturas supersecundárias enovelamentos ou motivos que estabelecem um importante contexto orga nizacional para esse esforço complexo A título de introdu ção serão apresentados alguns princípios básicos A conformação de uma proteína é estabilizada por interações fracas No contexto da estrutura de proteínas o termo estabi lidade pode ser definido como a tendência em manter a conformação nativa Proteínas nativas são apenas margi nalmente estáveis o DG que separa os estados dobrados e não dobrados em proteínas comuns sob condições fisio lógicas está na faixa de apenas 20 a 65 kJmol Uma dada cadeia polipeptídica pode teoricamente assumir inúmeras conformações e como resultado o estado não dobrado de uma proteína é caracterizado por um alto grau de entropia conformacional Essa entropia junto com as interações de ligações de hidrogênio dos diversos grupos da cadeia poli peptídica com o solvente água tendem a manter o estado não dobrado As interações químicas que contrabalançam esses efeitos e estabilizam a conformação nativa incluem ligações dissulfeto covalentes e interações fracas não co valentes descritas no Capítulo 2 ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas e iônicas Várias proteínas não têm ligações dissulfeto O ambiente dentro da maioria das células é altamente redutor devido à alta concentração de agentes redutores como a glutationa e a maior parte das sulfidrilas permanece então no estado reduzido Fora da célula o ambiente é frequentemente mais oxidante e a formação de dissulfeto é mais provável de ocorrer Em eucariotos as ligações dissulfeto são encon tradas principalmente em proteínas secretadas extrace lulares p ex o hormônio insulina As ligações dissulfeto também são incomuns em proteínas de bactérias Entretan to bactérias termofílicas assim como arquibactérias geral mente apresentam várias proteínas com ligações dissulfeto que as estabilizam Presumivelmente isso é uma adaptação para a vida a altas temperaturas Para todas as proteínas de todos os organismos as in terações fracas são especialmente importantes para o eno velamento das cadeias polipeptídicas em suas estruturas secundárias e terciárias A associação de múltiplos polipep tídeos para formar estruturas quaternárias também tem como base estas interações fracas Aproximadamente 200 a 460 kJmol são necessários para quebrar uma ligação covalente simples enquanto in terações fracas podem ser rompidas com apenas 04 a 30 kJmol Individualmente uma ligação covalente como as ligações dissulfeto conectando regiões distintas de uma única cadeia polipeptídica é claramente muito mais forte que uma interação fraca Entretanto por serem muito nu merosas são as interações fracas que predominam como forças estabilizadoras da estrutura proteica Em geral a conformação proteica de energia livre mais baixa ie de conformação mais estável é aquela com o número máximo de interações fracas A estabilidade de uma proteína não é simplesmente o somatório das energias livres de formação das diversas in terações fracas internas Para cada ligação de hidrogênio formada em uma proteína durante seu enovelamento uma ligação de hidrogênio de força equivalente entre o mes mo grupo e a água é quebrada A estabilidade resultante da contribuição de uma dada ligação de hidrogênio ou a diferença de energia livre entre os estados dobrado e não dobrado deve ser próxima de zero Interações iônicas po dem ser tanto estabilizadoras quanto desestabilizadoras Portanto é preciso olhar em outros lugares para entender por que uma determinada conformação nativa é favorável A partir de um exame cuidadoso da contribuição das in terações fracas na estabilidade das proteínas fica evidente que as interações hidrofóbicas geralmente predominam A água pura contém moléculas de H2O formando uma rede de ligações de hidrogênio Nenhuma outra molécula tem o potencial de ligação de hidrogênio da água e a presença de outras moléculas na solução aquosa rompe estas ligações de hidrogênio Quando a água envolve uma molécula hidro fóbica o arranjo ótimo de ligação de hidrogênio resulta em uma camada altamente estruturada ou camada de solva tação de água em torno da molécula ver Figura 27 O aumento da ordem das moléculas de água na camada de solvatação está correlacionado com uma redução desfavo rável na entropia da água Entretanto quando grupos apo lares se agrupam o tamanho da camada de solvatação dimi nui porque cada grupo não mais expõe toda sua superfície à solução O resultado é um aumento favorável de entropia Como descrito no Capítulo 2 esse aumento de entropia é a principal força termodinâmica que rege a associação de grupos hidrofóbicos em solução aquosa Cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicos tendem a se agrupar no interior das proteínas longe da água pense em uma gota de óleo na água A sequência de aminoácidos da maioria das proteí nas assim apresenta um conteúdo significativo de cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicos especialmente Leu Ile Val Phe e Trp Posicionamse de forma a se aglomerar quando a proteína é dobrada formando um núcleo hidrofó bico da proteína Sob condições fisiológicas a formação de ligações de hidrogênio em uma proteína é em grande parte dirigida pelo mesmo efeito entrópico Grupos polares normalmen te podem formar ligações de hidrogênio com a água e por isso são solúveis em água Entretanto o número de liga ções de hidrogênio por unidade de massa normalmente é maior para a água pura do que para qualquer outro líquido ou solução e há limites de solubilidade até para as molécu las mais polares pois sua presença causa uma diminuição no número total de ligações de hidrogênio por unidade de massa Portanto uma camada de solvatação até certo pon to também se forma em torno de moléculas polares Apesar Nelson6ed04indd 116 Nelson6ed04indd 116 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 117 de a energia de formação de uma ligação de hidrogênio in tramolecular entre dois grupos polares em uma macromo lécula ser em grande parte anulada pela eliminação de tais interações entre esses grupos polares e a água a liberação da água estruturada na forma de interações intramolecula res garante a força entrópica que leva ao enovelamento A maior parte da variação de energia livre na forma de intera ções fracas dentro da proteína é assim originária do aumen to de entropia na solução aquosa circundante resultante do confinamento das superfícies hidrofóbicas Isso mais do que contrabalança a grande perda de entropia conformacional pois o polipeptídeo é limitado à sua conformação dobrada As interações hidrofóbicas são importantes na estabi lização da conformação o interior de uma proteína geral mente é um núcleo altamente empacotado de cadeias la terais de aminoácidos hidrofóbicos Também é importante que cada grupo polar ou carregado no interior da proteína tenha um par adequado para fazer ligação de hidrogênio ou interação iônica Uma ligação de hidrogênio parece contri buir pouco para a estabilidade de uma estrutura nativa mas a presença de grupos que fazem ligações de hidrogênio sem par no núcleo hidrofóbico de uma proteína pode ser tão desestabilizadora que conformações contendo esse grupo são termodinamicamente insustentáveis A variação favo rável de energia livre resultante da combinação de vários desses grupos com parceiros na solução que os circunda pode ser maior do que a diferença de energia livre entre os estados dobrados e não dobrados Além disso ligações de hidrogênio entre grupos em uma proteína se formam coo perativamente a formação de uma torna mais provável a formação da próxima em estruturas secundárias repetidas que otimizam as ligações de hidrogênio como descrito a se guir Dessa forma as ligações de hidrogênio normalmente têm um importante papel na condução do processo de eno velamento de proteínas A interação entre grupos carregados com cargas opos tas que formam um par iônico ou uma ponte salina pode exercer tanto um efeito estabilizante quanto desestabili zante na estrutura da proteína Como no caso das ligações de hidrogênio cadeias laterais de aminoácidos carregados interagem com a água e com sais quando a proteína não está dobrada e a perda dessas interações deve ser consi derada quando se avalia o efeito da ponte salina na esta bilidade geral de uma proteína dobrada Entretanto a for ça de uma ponte salina aumenta à medida que se desloca para um ambiente com constante dielétrica mais baixa p 50 do solvente aquoso polar próximo a 80 para o interior apolar da proteína próximo a 4 Pontes salinas especialmente aquelas parcial ou totalmente internas na proteína podem assim proporcionar uma estabilização significativa da estrutura de uma proteína Essa tendência explica o aumento da ocorrência de pontes salinas internas nas proteínas de organismos termofílicos Interações iôni cas também limitam a flexibilidade estrutural e conferem uma singularidade a uma determinada estrutura proteica que as interações hidrofóbicas não específicas não conse guem proporcionar No ambiente atômico altamente empacotado de uma proteína mais um tipo de interação fraca pode ter um efei to significativo as interações de van der Waals p 54 As interações de van der Waals são interações dipolodipolo envolvendo os dipolos elétricos permanentes de grupos tal como as carbonilas dipolos transitórios derivados das flutu ações das nuvens de elétrons em torno de qualquer átomo e dipolos induzidos pela interação de um átomo com outro que contém um dipolo permanente ou transitório À medida que os átomos interagem um com o outro essas interações dipolodipolo fornecem uma força intermolecular atrativa que opera apenas sobre uma distância intermolecular limite 03 a 06 nm As interações de van der Waals são fracas e individualmente contribuem pouco para a estabilidade da proteína em geral No entanto em uma proteína bem empa cotada ou na interação de uma proteína com outra proteína ou com outra molécula em uma superfície complementar o número de tais interações pode ser substancial A maioria dos padrões estruturais resumidos neste capí tulo reflete duas regras simples 1 resíduos hidrofóbicos estão basicamente escondidos no interior da proteína lon ge da água e 2 o número de ligações de hidrogênio den tro da proteína é maximizado reduzindo assim o número de grupos capazes de fazer ligações de hidrogênio e grupos iônicos que não estão adequadamente pareados As proteí nas de membrana examinadas no Capítulo 11 e proteí nas intrinsecamente desordenadas ou que têm segmentos intrinsecamente desordenados seguem regras diferentes Isso reflete suas funções ou ambientes específicos mas as interações fracas ainda são elementos estruturais importan tes Por exemplo proteínas solúveis mas com segmentos intrinsecamente desordenados são ricas em cadeias late rais de aminoácidos carregados especialmente Arg Lys e Glu ou pequenos Gly e Ala gerando pouca ou nenhuma oportunidade para formação do núcleo hidrofóbico estável A ligação peptídica é rígida e planar Arquitetura das proteínas Estrutura primária As ligações cova lentes também impõem importantes restrições na confor mação de um polipeptídeo No final de 1930 Linus Pauling e Robert Corey iniciaram uma série de estudos que lança ram os fundamentos do entendimento atual sobre estrutura de proteínas Eles começaram com uma cuidadosa análise da ligação peptídica Os carbonos a de resíduos adjacentes de aminoácidos são separados por três ligações covalentes arranjados na Linus Pauling 19011994 Robert Corey 18971971 Nelson6ed04indd 117 Nelson6ed04indd 117 070414 1434 070414 1434 118 DAVID L NELSON MICHAEL M COX forma CaCNCa Estudos de difração de raios X de cristais de aminoácidos e de dipeptídeos e tripeptídeos sim ples mostraram que a ligação peptídica CN é de alguma forma mais curta que a ligação CN de uma amina simples e que os átomos associados à ligação peptídica são planares Isso indicava a ressonância ou o compartilhamento parcial de dois pares de elétrons entre o oxigênio carbonílico e o nitrogênio da amida Figura 42a O oxigênio tem uma carga parcial negativa e o hidrogênio ligado ao nitrogênio tem uma carga líquida parcial positiva formando um pe queno dipolo elétrico Os seis átomos do grupo peptídico estão em um único plano com o átomo de oxigênio do gru po carbonílico trans ao átomo de hidrogênio do nitrogênio da amida A partir destas observações Pauling e Corey con cluíram que as ligações peptídicas CN não podem girar livremente devido ao seu caráter parcial de ligação dupla A rotação é permitida ao redor das ligações NCa e CaC O esqueleto de uma cadeia polipeptídica pode então ser descrito como uma série de planos rígidos com planos con secutivos compartilhando um ponto comum de rotação no Ca Figura 42b As ligações peptídicas rígidas limitam a variação de conformações possíveis para uma cadeia poli peptídica A conformação da ligação peptídica é definida por três ângulos diedros também conhecidos como ângulos de tor ção chamados de f phi c psi e v ômega que refle tem a rotação sobre cada uma das três ligações que se re petem no esqueleto peptídico Um ângulo diedro é o ângulo da intersecção de dois planos No caso dos peptídeos os planos são definidos pelos vetores das ligações do esqueleto peptídico Dois vetores de ligações sucessivas descrevem um plano Três vetores de ligações sucessivas descrevem dois planos o vetor da ligação central é comum a ambos Figura 42c e o ângulo entre esses dois planos é medido para descrever a conformação da proteína CONVENÇÃOCHAVE Os ângulos diedros importantes para um peptídeo são definidos por três vetores das ligações que conectam quatro átomos consecutivos da cadeia principal esqueleto peptídico Figura 42c f envolve as ligações CNCaC com a rotação ocorrendo entre a ligação NCa e c envolve as ligações NCaCN Ambos f e c são definidos como 6180 o quando o polipeptídeo está completamente estendido e todos os grupos peptídicos es tão no mesmo plano Figura 42d Quando se observa ao longo do vetor da ligação central na direção da flecha do FIGURA 42 O grupo peptídico planar a Cada ligação peptídica tem algum caráter de ligação dupla devido à ressonância e não pode girar Em bora o átomo de N em uma ligação peptídica seja sempre representado com uma carga positiva parcial considerações cuidadosas dos orbitais de ligação e dos mecanismos quânticos indicam que o N tem uma carga líquida neutra ou levemente negativa b Três ligações separam os carbonos a consecuti vos em uma cadeia polipeptídica As ligações NCa e CaC podem girar sendo descritas pelos ângulos diedros designados f e c respectivamente A ligação peptídica CN não está livre para rotação Outras ligações simples do esqueleto também podem estar rotacionalmente obstruídas dependen do do tamanho e da carga dos grupos R c Átomos e planos que definem c d Por convenção f e c são iguais a 180 o ou 180 o quando o primeiro e o quarto átomos estão mais afastados e os peptídeos estão totalmente esten didos Ao longo da ligação que sofre rotação para qualquer um dos lados os ângulos f e c aumentam à medida que o quarto átomo gira no sentido horário em relação ao primeiro Algumas conformações mostradas aqui p ex 0 o são proibidas em uma proteína devido à sobreposição espacial dos átomos De b até d as esferas que representam os átomos são menores do que os raios de van der Waals para esta escala C O N H C O2 N H a Ca C O2 1 1 N H Ca a Ca C Ca C Extremidade aminoterminal NC C C CN C R C 124 Å 132 Å 146 Å 153 Å Extremidade carboxiterminal b N d Ca f f f a a a a c c c c C N N a c N N 2120 6180 120 260 60 0 Ca H O Nelson6ed04indd 118 Nelson6ed04indd 118 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 119 vetor como mostrado na Figura 42c para c os ângulos diedros aumentam à medida que o átomo distal quarto átomo gira no sentido horário Figura 42d A partir das posições 6180 o o ângulo diedro aumenta de 180 o para 0 o o ponto no qual o primeiro e o quarto átomos estão eclipsa dos A rotação pode continuar de 0 o a 1180 o mesma posi ção que 180 o para retornar a estrutura ao ponto de parti da O terceiro ângulo diedro v nem sempre é considerado Ele envolve as ligações CaCNCa A ligação central nesse caso é a ligação peptídica cuja rotação é restrita A ligação peptídica está normalmente 996 do tempo na conformação trans restringindo o v a um valor de 6180 o Em um caso raro de ligação peptídica cis v 5 0 o A princípio f e c podem ter qualquer valor entre 1180 o e 180 o mas diversos valores são proibidos por impedimen to estérico entre os átomos do esqueleto polipeptídico e as cadeias laterais dos aminoácidos A conformação na qual ambos f e c são 0 o Figura 42d é proibida por esta razão essa conformação é apenas um ponto de referência para a descrição dos ângulos diedros Valores permitidos de f e c tornamse evidentes quando c é colocado em um gráfico versus f no diagrama de Ramachandran Figura 43 introduzido por G N Ramachandran Os diagramas de Ra machandran são ferramentas muito úteis e de uso frequen te para testar a qualidade de estruturas tridimensionais de proteínas depositadas em bancos de dados internacionais RESUMO 41 Visão geral sobre a estrutura das proteínas c Uma proteína típica geralmente tem uma ou mais es truturas tridimensionais ou conformações que refletem sua função Algumas proteínas têm segmentos intrinse camente desordenados c A estrutura da proteína é estabilizada em grande parte por múltiplas interações fracas As interações hidrofó bicas derivadas do aumento da entropia da água cir cundante quando moléculas ou grupos apolares estão agrupados são os principais contribuintes para a es tabilização da forma globular da maioria das proteínas solúveis as interações de van der Waals também con tribuem As ligações de hidrogênio e interações iônicas são otimizadas nas estruturas termodinamicamente mais estáveis c Ligações covalentes não peptídicas particularmente li gações dissulfeto são importantes na estabilização da estrutura de algumas proteínas c A natureza das ligações covalentes no esqueleto poli peptídico estabelece restrições à estrutura A ligação peptídica tem um caráter parcial de ligação dupla que mantém todo o grupo peptídico de seis átomos em uma configuração planar rígida As ligações NCa e CaC podem girar para definir os ângulos diedros f e c res pectivamente c O diagrama de Ramachandran é uma descrição visual das combinações dos ângulos diedros f e c permitidos em um esqueleto peptídico ou não permitidos devido a impedimentos estéricos 42 Estrutura secundária das proteínas O termo estrutura secundária se refere a qualquer seg mento de uma cadeia polipeptídica e descreve o arranjo espacial de seus átomos na cadeia principal sem conside rar a posição de suas cadeias laterais ou sua relação com outros segmentos Uma estrutura secundária comum ocor re quando cada ângulo diedro f e c permanece igual ou quase igual ao longo do segmento Existem alguns tipos de estruturas secundárias que são particularmente estáveis e ocorrem extensamente em proteínas As mais conhecidas são as hélices a e as conformações b outro tipo comum é a volta b Quando um padrão regular não é observado a es trutura secundária algumas vezes é chamada de indefinida ou espiral aleatória Esta última entretanto não descreve adequadamente a estrutura desses segmentos O curso da maioria dos esqueletos polipeptídicos em uma proteína típi ca não é aleatório ele é altamente específico e inalterado na estrutura e na função de uma proteína em particular Aqui a discussão se concentra nas estruturas mais comuns A hélice a é uma estrutura secundária comum em proteínas Arquitetura proteica hélice a Pauling e Corey sabiam da im portância das ligações de hidrogênio na orientação de gru pos polares como os grupos CO e NH das ligações pep tídicas Também conheciam os resultados experimentais de William Astbury que em 1930 conduziu estudos pio 1180 120 60 0 260 2120 2180 1180 0 2180 c graus f graus FIGURA 43 Diagrama de Ramachandran para resíduos LAla A con formação dos peptídeos é definida pelos valores de f e c Conformações consideradas possíveis são aquelas que envolvem pouco ou nenhum impe dimento estérico com base nos cálculos dos raios de van der Waals conheci dos e dos ângulos diedros As áreas coloridas em azulescuro representam as conformações que não envolvem sobreposição estérica se os raios de van der Waals de cada átomo estão modelados como esferas rígidas e portanto são totalmente permitidas o azul médio indica as conformações permitidas se for possível a aproximação dos átomos mais 01 nm um leve choque o azul claro indica as conformações que são admitidas se for possível uma pequena flexibilidade poucos graus no ângulo diedro v que descreve a própria ligação peptídica geralmente presa a 180 As regiões em branco são conformações não permitidas A assimetria do diagrama é resultante da estereoquímica L dos resíduos de aminoácidos Os diagramas para outros resíduos L com cadeias la terais não ramificadas são quase idênticos Os limites permitidos para resíduos ramificados como Val Ile e Thr são um pouco menores do que para Ala O resí duo Gly que é estericamente menos impedido apresenta um limite bem mais amplo de conformações permitidas O limite para os resíduos Pro é muito mais restrito porque seu f é limitado entre 35 o e 85 o pela cadeia lateral cíclica Nelson6ed04indd 119 Nelson6ed04indd 119 070414 1434 070414 1434 120 DAVID L NELSON MICHAEL M COX neiros de proteínas com raios X Astbury demonstrou que proteínas que formam os cabelos e os espinhos do porco espinho a proteína fibrosa aqueratina têm uma estrutu ra regular que se repete a cada 515 a 52 Å O ângstrom Å em homenagem ao físico Anders J Ångström é igual a 01 nm Apesar de não ser uma unidade do SI ela é univer salmente utilizada pelos biólogos estruturais para descre ver as distâncias atômicas é aproximadamente o tamanho de uma ligação CH comum Com essa informação e seus dados sobre ligação peptídica e com a ajuda de modelos construídos de forma precisa Pauling e Corey iniciaram a determinação das conformações prováveis das moléculas de proteínas O primeiro avanço ocorreu em 1948 Pauling foi um pro fessor visitante na Universidade de Oxford ficou doente e se recolheu a seu apartamento por alguns dias para des cansar Entediado com a leitura disponível Pauling pegou alguns papéis e lápis para trabalhar em uma estrutura está vel plausível que poderia ser adotada por uma cadeia poli peptídica O modelo que ele desenvolveu confirmado mais tarde no trabalho com Corey e o colaborador Herman Bran son foi o arranjo mais simples que a cadeia polipeptídica pode assumir que maximiza o uso de ligações de hidrogênio internas É uma estrutura helicoidal que Pauling e Corey chamaram de hélice a Figura 44 Nessa estrutura o esqueleto polipeptídico é firmemente enrolado em torno de um eixo imaginário desenhado longitudinalmente no centro da hélice e os grupos R dos resíduos de aminoácidos se projetam para fora do esqueleto helicoidal A unidade que se repete forma uma volta de hélice que se estende por cerca de 54 Å ao longo do eixo levemente maior do que a periodicidade observada por Astbury na análise por raios X da queratina do cabelo Os átomos do esqueleto dos resí duos de aminoácidos em uma hélice a típica têm um grupo característico de ângulos diedros que definem a conforma ção da hélice a Tabela 41 e cada volta de hélice é forma da por 36 resíduos de aminoácidos Os segmentos de hélice a em proteínas normalmente se desviam um pouco desses ângulos diedros podendo até variar dentro de um mesmo segmento gerando curvaturas ou torções do eixo da héli ce Pauling e Corey consideraram as variantes da hélice a voltadas tanto para direita quanto para esquerda A eluci dação da estrutura tridimensional subsequente da hélice a da mioglobina e de outras proteínas mostrou que a hélice a voltada para direita é a forma comum Quadro 41 As hé lices a estendidas voltadas para esquerda são teoricamente menos estáveis e não foram observadas em proteínas A hélice a é a estrutura predominante nas aqueratinas De forma geral cerca de um quarto de todos os resíduos de aminoácidos das proteínas é encontrado em hélices a A fração exata varia muito de uma proteína para outra Por que as hélices a se formam mais facilmente do que qualquer outra conformação possível A resposta encontra se em parte no uso otimizado das ligações de hidrogênio b c d Carbono Hidrogênio Oxigênio Nitrogênio Grupo R 54 Å 36 resíduos a Extremidade carboxiterminal Extremidade aminoterminal 1 2 3 4 5 6 9 8 7 10 11 FIGURA 44 Modelos de hélice a mostrando os diferentes aspectos de sua estrutura a Modelo de esfera e bastão mostrando as ligações de hidrogênio internas da cadeia A unidade que se repete forma uma volta da hélice 36 resíduos b Hélice a vista de uma de suas extremidades ao longo do eixo central obtida a partir do PDB ID 4TNC Observe as posições dos gru pos R representados pelas esferas roxas Observe modelo de esfera e bastão que ressalta o arranjo helicoidal dá uma falsa impressão de que a hélice é oca pois as esferas não mostram os raios de van der Waals de cada um dos áto mos c Como este modelo de volume atômico mostra os átomos no centro da hélice a estão em contato estreito d Projeção da rotação helicoidal de uma hélice a Esta representação é colorida para a identificação de superfícies com determinadas propriedades Os resíduos em amarelo por exemplo po dem ser hidrofóbicos e fazer parte de uma interface entre a hélice mostrada aqui e outra parte do mesmo ou de outro polipeptídeo Os resíduos verme lhos negativo e azuis positivo ilustram o potencial de interação de cadeias laterais de cargas opostas separadas por dois resíduos na hélice Nelson6ed04indd 120 Nelson6ed04indd 120 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 121 internas A estrutura é estabilizada por uma ligação de hi drogênio entre o átomo de hidrogênio ligado ao átomo de nitrogênio eletronegativo de uma ligação peptídica e o áto mo de oxigênio eletronegativo da carbonila do quarto ami noácido no lado aminoterminal da ligação peptídica Figura 44a Na hélice a cada ligação peptídica exceto aquelas próximas às extremidades da hélice a participa de tais li gações de hidrogênio Cada volta sucessiva da hélice a é mantida por voltas adjacentes por três ou quatro ligações de hidrogênio conferindo uma significativa estabilidade à estrutura global Nas extremidades de um segmento a helicoidal sempre há três ou quatro grupos carbonila ou amino que não podem participar desse padrão helicoidal de ligações de hidrogênio Esses podem estar expostos ao sol vente circundante onde suas ligações de hidrogênio com a água ou com outras partes da proteína podem proteger a hélice e proporcionar os parceiros necessários para a liga ção de hidrogênio Outros experimentos mostraram que uma hélice a pode ser formada em polipeptídeos constituídos de L ou Dami noácidos Entretanto todos os resíduos devem ser de um mesmo estereoisômero um Daminoácido irá romper a es trutura regular formada por Laminoácidos e viceversa A forma mais estável de uma hélice a de Daminoácidos é a voltada para a esquerda PROBLEMA RESOLVIDO 41 Estrutura secundária e dimensões de uma proteína Qual é o comprimento de uma cadeia polipeptídica de 80 resíduos de aminoácidos em uma única hélice a Solução Uma hélice a ideal tem 36 resíduos por volta e o avanço ao longo do eixo helicoidal é de 54 Å Portanto o avanço sobre o eixo para cada resíduo de aminoácido é de 15 Å O comprimento do peptídeo é portanto 80 resíduos 3 15 Åresíduo 5 120 Å A sequência de aminoácidos afeta a estabilidade da hélice a Nem todos os polipeptídeos podem formar uma hélice a estável Cada resíduo de aminoácido em um polipeptídeo tem uma propensão intrínseca de formar uma hélice a Tabela 42 consequência das propriedades de seu gru po R e como elas interferem na capacidade de seus áto mos de conexão da cadeia principal em aceitar os ângulos f e c característicos A alanina apresenta a melhor ten dência a formar hélices a na maioria dos sistemasmodelo experimentais A posição de um resíduo de aminoácido em relação a seus vizinhos também é importante Interações entre ca deias laterais dos aminoácidos podem estabilizar ou deses tabilizar a estrutura ahelicoidal Por exemplo se uma ca deia polipeptídica possui uma longa sequência de resíduos TABELA 41 Ângulos f e c ideais para estruturas secundárias comuns em proteínas Estrutura f c Hélice a 57 47 Conformação b Antiparalela 139 1135 Paralela 119 1113 Tripla hélice de colágeno 51 1153 Volta b tipo I i 1 1 60 30 i 1 2 90 0 Volta b tipo II i 1 1 60 1120 i 1 2 180 0 Nota Nas proteínas reais os ângulos diedros frequentemente são um pouco di ferentes desses valores ideais Os ângulos i 1 1 e i 1 2 são aqueles para o segundo e terceiro resíduos de ami noácidos na volta b respectivamente QUADRO 41 MÉTODOS Distinção entre o giro para a direita e o giro para a esquerda Existe um método simples para determinar se uma es trutura helicoidal gira para a direita ou para a esquerda Faça uma associação com suas duas mãos com os pole gares esticados apontando para longe de você Olhando para a sua mão direita pense em uma hélice se enrolando ao longo de seu polegar direito na direção dos seus ou tros dedos dobrados conforme mostrado na figura sen tido horário A hélice resultante gira para a direita Sua mão esquerda representará uma hélice que gira para a esquerda no sentido antihorário à medida que se enrola em seu polegar Hélice com giro para a esquerda Hélice com giro para a direita Nelson6ed04indd 121 Nelson6ed04indd 121 070414 1434 070414 1434 122 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Glu esse segmento da cadeia não irá formar uma hélice a em pH 70 Os grupos carboxílicos carregados negati vamente dos resíduos Glu adjacentes repelemse mutua mente de forma tão forte que impedem a formação da héli ce a Pela mesma razão se existem muitos resíduos Lys e ou Arg com grupos R carregados positivamente em pH 70 eles também se repelem impedindo a formação da hélice a O volume e a forma dos resíduos Asn Ser Thr e Cys tam bém podem desestabilizar uma hélice a se estiverem muito próximos na cadeia A torção de uma hélice garante que ocorram interações críticas entre a cadeia lateral de um aminoácido e a cadeia lateral do terceiro às vezes quarto resíduo adiante para ambos os lados da hélice Isso fica claro quando a hélice a é representada como roda helicoidal Figura 44d Os aminoácidos carregados positivamente costumam ser en contrados a três resíduos de distância dos aminoácidos car regados negativamente possibilitando a formação de pares iônicos Dois aminoácidos aromáticos com frequência são espaçados de forma semelhante resultando em uma inte ração hidrofóbica Uma restrição à formação da hélice a é a presença de resíduos de Pro e Gly que apresentam a menor propen são em formar hélices a Na prolina o átomo de nitro gênio faz parte de um anel rígido ver Figura 48 e a rotação sobre a ligação NCa não é possível Dessa for ma um resíduo Pro gera uma torção que desestabiliza a hélice Além disso o átomo de nitrogênio do resíduo Pro em uma ligação peptídica não tem hidrogênio para participar em ligações com outros resíduos Por essas ra zões a prolina raramente é encontrada em uma hélice a A glicina com frequência não ocorre em hélices por outro motivo ela apresenta maior flexibilidade conformacional do que os outros aminoácidos Polímeros de glicina ten dem a formar estruturas espiraladas bem diferentes de uma hélice a Um último fator que afeta a estabilidade de uma hélice a é a identidade dos resíduos de aminoácido próximos às extremidades do segmento ahelicoidal do polipeptídeo Existe um pequeno dipolo elétrico em cada ligação peptí dica Figura 42a Esses dipolos estão alinhados através das ligações de hidrogênio da hélice resultando em um dipolo livre ao longo do eixo helicoidal que aumenta com o comprimento da hélice Figura 45 As cargas parcial mente positivas e negativas do dipolo da hélice ocorrem nos grupos amino e carbonil próximos às extremidades amino e carboxiterminal respectivamente Por isso aminoácidos carregados negativamente costumam ser encontrados pró ximos à extremidade aminoterminal do segmento helicoi dal onde apresentam interações estabilizantes com a carga positiva do dipolo da hélice um aminoácido positivamente carregado na extremidade aminoterminal desestabilizaria o sistema O oposto é verdade para a extremidade carboxiter minal do segmento helicoidal Resumindo cinco tipos de restrições influenciam a esta bilidade de uma hélice a 1 a tendência intrínseca de um resíduo de aminoácido de formar uma hélice a 2 as inte rações entre os grupos R especialmente aqueles espaçados por três ou quatro aminoácidos 3 os volumes de grupos R adjacentes 4 a ocorrência de resíduos Pro e Gly e 5 interações entre os resíduos de aminoácidos das extremi dades do segmento helicoidal e o dipolo elétrico inerente da hélice a A tendência de um determinado segmento de uma cadeia polipeptídica de formar uma hélice a depende portanto da identidade e da sequência de resíduos de ami noácidos do segmento TABELA 42 Tendência dos resíduos de aminoácidos em assumir a conformação de hélice a Aminoácido DDG o kJmol Aminoácido DDG o kJmol Ala 0 Leu 079 Arg 03 Lys 063 Asn 3 Met 088 Asp 25 Phe 20 Cys 3 Pro 4 Gln 13 Ser 22 Glu 14 Thr 24 Gly 46 Tyr 20 His 26 Trp 20 Ile 14 Val 21 Fontes Dados exceto para a prolina de Bryson JW Betz SF Lu HS Suich DJ Zhou HX ONeil KT e DeGrado WF 1995 Protein design a hierarchic approach Science 270 935 Dados sobre a prolina de Myers JK Pace CN e Scholtz JM 1997 Helix propensities are identical in proteins and peptides Biochemistry 36 10 926 DDG o é a diferença de variação de energia livre relativa àquela para a alanina necessária para que os resíduos de aminoácidos assumam a conformação em hé lice a Valores maiores refletem uma grande dificuldade para assumir a confor mação em hélice O conjunto de dados é derivado de múltiplos experimentos e sistemas experimentais FIGURA 45 Dipolo da hélice O dipolo elé trico da ligação peptídica ver Figura 42a é transmitido ao longo do segmento ahelicoidal pelas ligações de hidrogênio intracadeia resul tando em um dipolo da hélice Nesta ilustração os componentes amino e carbonil de cada liga ção peptídica estão indicados com os símbolos 1 e respectivamente Os componentes amino e carbonil das ligações peptídicas próximas às extremidades da região ahelicoidal que não participam de ligações de hidrogênio estão cir culados e mostrados em cores d d Extremidade carboxiterminal Extremidade aminoterminal Nelson6ed04indd 122 Nelson6ed04indd 122 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 123 As conformações b organizam as cadeias polipeptídicas em forma de folha Arquitetura proteica folha b Em 1951 Pauling e Corey re conheceram um segundo tipo de estrutura recorrente a conformação b Essa é uma conformação mais estendida das cadeias polipeptídicas e sua estrutura é de novo defini da pelos esqueletos dos átomos arranjados de acordo com grupo característico de ângulos diedro Tabela 41 Na conformação b o esqueleto da cadeia polipeptídica está es tendido em forma de ziguezague em vez de em estrutura helicoidal Figura 46 O arranjo de vários segmentos lado a lado os quais estão na conformação b é chamado de fo lha b A estrutura em ziguezague dos segmentos polipep tídicos individuais dá origem a uma aparência pregueada da folha em geral As ligações de hidrogênio são formadas en tre segmentos adjacentes da cadeia polipeptídica dentro da folha Os segmentos que formam a folha b normalmente estão próximos na cadeia polipeptídica mas também po dem estar bem distantes uns dos outros na sequência linear do polipeptídeo eles podem até estar em cadeias polipeptí dicas diferentes Os grupos R dos aminoácidos adjacentes se projetam da estrutura em ziguezague em direções opos tas criando um padrão alternado que pode ser observado na visão lateral da Figura 46 As cadeias polipeptídicas adjacentes em uma folha b podem ser tanto paralelas quanto antiparalelas apresen tando uma orientação aminocarboxiterminal igual ou opos ta respectivamente As estruturas são de alguma forma semelhantes apesar de o período de repetição ser menor na conformação paralela 65 Å versus 7 Å para a antipara lela e o padrão das ligações de hidrogênio ser diferente As ligações de hidrogênio intersegmentos são alinhadas ver Figura 25 na folha b antiparalela enquanto elas são dis torcidas ou não alinhadas na variante paralela As estrutu ras ideais exibem os ângulos de ligação dados na Tabela 41 esses valores variam um pouco nas proteínas verdadeiras resultando em uma variação estrutural conforme visto an teriormente para as hélices a Voltas b são comuns em proteínas Arquitetura proteica voltas b Em proteínas globulares que apresentam estrutura dobrada compacta alguns resíduos de aminoácidos estão em voltas ou alças onde a cadeia polipep tídica inverte sua direção Figura 47 Esses são elemen tos conectores que ligam estruturas sucessivas de hélices a e conformações b As voltas b são particularmente comuns e conectam as extremidades de dois segmentos adjacentes de uma folha b antiparalela A estrutura é uma volta de 180 o que envolve quatro resíduos de aminoácidos com o oxigênio carbonílico do primeiro resíduo formando uma ligação de hi drogênio com o hidrogênio do grupo amino do quarto resí duo Os grupos peptídicos dos dois resíduos centrais não participam de nenhuma ligação de hidrogênio interresídu os Vários tipos de voltas b têm sido descritas cada uma de finida pelos ângulos f e c das ligações que ligam os quatro resíduos de aminoácidos que formam a volta em particular Tabela 41 Os resíduos Gly e Pro frequentemente ocor rem em voltas b o primeiro porque é pequeno e flexível e o último porque as ligações peptídicas envolvendo o nitrogê nio imino da prolina facilmente assumem configuração cis Figura 48 forma particularmente acessível em uma vol ta fechada Os dois tipos de voltas b mostrados na Figura 47 são os mais comuns As voltas normalmente são encon tradas próximas à superfície das proteínas onde os grupos peptídicos dos dois resíduos de aminoácidos centrais da alça podem fazer ligação de hidrogênio com a água Muito menos comum é a volta g uma volta com três resíduos e ligação de hidrogênio entre o primeiro e o terceiro resíduo Estruturas secundárias comuns têm ângulos diedros característicos As hélices a e as conformações b são as principais estru turas secundárias que se repetem em um grande número de proteínas apesar de existirem outras estruturas que se repetem em algumas proteínas especializadas um exem plo é o colágeno ver Figura 413 Cada tipo de estrutura secundária pode ser completamente descrito pelos ângu los diedros f e c associados a cada resíduo Como mos b Folha b antiparalela a Folha b c Folha b paralela 7 Å 65 Å Cadeias laterais acima Cadeias laterais abaixo Visão superior Visão lateral Visão superior FIGURA 46 A conformação b das cadeias polipeptídicas Estas visões a lateral e b c superior mostram os grupos R saindo do plano da folha b e enfatizam a forma pregueada formada pelos planos das ligações peptídicas Um nome alternativo para esta estrutura é folha b pregueada As ligações de hidrogênio entre as cadeias adjacentes também são mostradas A orientação das cadeias adjacentes setas do aminoterminal para carboxiterminal pode ser a mesma ou oposta formando b folhas b antiparalelas ou c folhas b paralelas Nelson6ed04indd 123 Nelson6ed04indd 123 070414 1434 070414 1434 124 DAVID L NELSON MICHAEL M COX trado no diagrama de Ramachandran os ângulos diedros que definem a hélice a e a conformação b se encontram em uma região restrita de estruturas estericamente permi tidas Figura 49a A maioria dos valores de f e c obtidos de estruturas de proteínas conhecidas cai nas regiões es peradas com alta concentração próximo aos valores predi tos para as hélices a e as conformações b Figura 49b O único resíduo de aminoácido normalmente encontrado fora dessas regiões é a glicina Como sua cadeia lateral é peque na o resíduo Gly pode assumir diversas conformações este ricamente proibidas para os demais aminoácidos As estruturas secundárias comuns podem ser identificadas por dicroísmo circular Qualquer forma de assimetria estrutural em uma molécula leva a diferenças de absorção da luz circularmente polari 1 Volta b tipo I Volta b tipo II 2 3 4 1 2 3 4 R Ca Ca Ca Ca R R Gly Pro Ca FIGURA 47 Estruturas de voltas b Voltas b dos tipos I e II são as mais comuns distinguemse pelos ângulos f e c adotados pelo esqueleto pep tídico na volta ver Tabela 41 As voltas do tipo I ocorrem duas vezes mais do que as voltas do tipo II As voltas b do tipo II normalmente possuem uma Gly como terceiro resíduo Observe a ligação de hidrogênio entre os grupos peptídicos do primeiro e do quarto resíduos da volta Cada um dos resíduos de aminoácidos está identificado por grandes círculos azuis Nem todos os átomos de H estão mostrados Isômeros de prolina trans cis FIGURA 48 Isômeros trans e cis de uma ligação peptídica envolven do o nitrogênio imino da prolina Das ligações peptídicas entre resíduos de aminoácidos que não Pro mais de 9995 estão na configuração trans Para as ligações peptídicas envolvendo o nitrogênio imino da prolina no entanto cerca de 6 estão na configuração cis muitas delas ocorrem em voltas b Folhas b antiparalelas Hélice tripla do colágeno Folhas b torcidas para a direita Folhas b paralelas Hélice a de sentido antihorário Hélice a de sentido horário 1180 120 60 0 260 2120 2180 1180 0 2180 c graus f graus a b 1180 120 60 0 260 2120 2180 1180 0 2180 c graus f graus FIGURA 49 Diagrama de Ramachandran mostrando uma variedade de estruturas a Os valores de f e c de várias estruturas secundárias per mitidas estão sobrepostos no diagrama da Figura 43 Apesar de as hélices a de sentido antihorário com vários resíduos de aminoácidos serem teorica mente permitidas elas não têm sido observadas em proteínas b Os valores de f e c para todos os aminoácidos exceto Gly da enzima piruvatocinase isolada de coelho estão sobrepostos no diagrama das conformações teo ricamente permitidas Figura 43 Os pequenos e flexíveis resíduos de Gly foram excluídos pois em geral caem fora da região esperada em azul Nelson6ed04indd 124 Nelson6ed04indd 124 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 125 zada para a esquerda em relação à direita A medida desta diferença é chamada de espectroscopia de dicroísmo cir cular CD de circular dichroism Uma estrutura ordena da como de uma proteína dobrada resulta em um espectro de absorção que pode ter picos ou regiões com valores tanto positivos quanto negativos Para proteínas os espectros são obtidos na região de UV distante 190 a 250 nm A entida de que absorve luz ou cromóforo nessa região é a ligação peptídica um sinal é obtido quando esta ligação peptídica está em um ambiente dobrado A diferença em coeficiente de extinção molar ver Quadro 31 para a luz circularmente polarizada para a esquerda e para a direita D é colocada no gráfico em função do comprimento de onda As hélices a e as conformações b têm espectros de CD característicos Figura 410 Com o espectro de CD os bioquímicos po dem determinar se as proteínas estão dobradas corretamen te estimar a fração da proteína que assume qualquer uma das duas estruturas secundárias comuns e monitorar as tran sições entre os estados dobrados e não dobrados RESUMO 42 Estrutura secundária das proteínas c Estrutura secundária é o arranjo espacial dos átomos da cadeia principal em um determinado segmento da ca deia polipeptídica c As estruturas secundárias regulares mais comuns são as hélices a as conformações b e as voltas b c A estrutura secundária de um segmento polipeptídico pode ser completamente definida se seus ângulos f e c são conhecidos para todos os aminoácidos do segmento c A espectroscopia de dicroísmo circular é um método para a identificação das estruturas secundárias comuns e o monitoramento do enovelamento das proteínas 43 Estruturas terciária e quaternária das proteínas Arquitetura proteica Introdução da estrutura terciária O arranjo tridimensional total de todos os átomos de uma proteína é chamado de estrutura terciária Enquanto o termo es trutura secundária se refere ao arranjo espacial dos resí duos de aminoácidos adjacentes em um segmento polipep tídico a estrutura terciária inclui aspectos de alcance mais longo da sequência de aminoácidos Aminoácidos que estão bem distantes na sequência polipeptídica e em diferentes tipos de estruturas secundárias podem interagir na estrutu ra da proteína completamente dobrada A localização das curvaturas incluindo as voltas b nas cadeias polipeptídi cas e sua direção e seu ângulo são determinados pelo nú mero e pela localização de resíduos específicos que tendem a formálas como Pro Thr Ser e Gly Segmentos da cadeia polipeptídica que interagem entre si são mantidos em suas posições terciárias características por diferentes tipos de interações fracas e algumas vezes por ligações covalentes como ligações dissulfeto entre os segmentos Algumas proteínas contêm duas ou mais cadeias poli peptídicas distintas ou subunidades que podem ser idên ticas ou diferentes O arranjo destas subunidades proteicas em complexos tridimensionais constitui a estrutura qua ternária Considerando esses níveis mais altos de estrutura é conveniente designar dois grandes grupos nos quais mui tas proteínas podem ser classificadas proteínas fibrosas com cadeias polipeptídicas arranjadas em longos filamen tos ou folhas e proteínas globulares com cadeias poli peptídicas dobradas em forma esférica ou globular Os dois grupos são estruturalmente distintos As proteínas fibrosas em geral são formadas por um único tipo de estrutura se cundária e sua estrutura terciária é relativamente simples As proteínas globulares normalmente contêm diversos tipos de estruturas secundárias Os dois grupos também se di ferenciam funcionalmente as estruturas que garantem su porte forma e proteção externa aos vertebrados são feitas de proteínas fibrosas enquanto as enzimas e as proteínas reguladoras em sua maioria são proteínas globulares As proteínas fibrosas são adaptadas às funções estruturais Arquitetura proteica Estrutura terciária da proteína fibrosa A aqueratina o colágeno e a fibroína da seda ilustram bem a relação entre a estrutura da proteína e sua função biológica Tabela 43 As proteínas fibrosas compartilham proprie dades que dão força eou flexibilidade às estruturas nas quais ocorrem Em cada caso a unidade estrutural funda mental é um elemento simples de estrutura secundária que se repete Todas as proteínas fibrosas são insolúveis em água propriedade conferida pela alta concentração de resí duos de aminoácidos hidrofóbicos tanto no interior quanto na superfície da proteína Essas superfícies hidrofóbicas es tão em grande parte escondidas visto que muitas cadeias polipeptídicas similares são reunidas formando um comple xo supramolecular A simplicidade estrutural das proteínas fibrosas as torna particularmente interessantes para ilus Comprimento de onda nm Hélice a Conformação b Desnaturada 220 230 240 250 200 190 210 25 20 15 10 5 210 215 0 D FIGURA 410 Espectroscopia de dicroísmo circular CD Este espec tro mostra a polilisina inteiramente como hélice a como conformação b ou desnaturada espiral aleatória A unidade do eixo y é uma simplificação das unidades comumente utilizadas nos experimentos de CD Como as cur vas são diferentes para as hélices a as conformações b e a desnaturada o espectro de CD fornece a determinada proteína uma estimativa da fração da proteína formada pelas duas estruturas secundárias mais comuns O es pectro de CD da proteína nativa pode servir como referência para o estado enovelado e é útil no monitoramento da desnaturação ou de mudanças conformacionais resultantes de alterações nas condições de solução Nelson6ed04indd 125 Nelson6ed04indd 125 070414 1434 070414 1434 126 DAVID L NELSON MICHAEL M COX trar alguns dos princípios fundamentais da estrutura protei ca discutidos anteriormente aQueratina As aqueratinas foram desenvolvidas para for ça Encontradas somente em mamíferos essas proteínas constituem praticamente todo o peso seco de cabelos pe los unhas garras penas chifres cascos e grande parte da camada mais externa da pele As aqueratinas fazem parte de uma família mais ampla de proteínas chamadas de pro teínas de filamento intermediário FI Outras proteínas FI são encontradas no citoesqueleto de células animais Todas as proteínas FI têm função estrutural e compartilham das características estruturais das aqueratinas A hélice da aqueratina é uma hélice a voltada para a direita a mesma hélice encontrada em várias outras proteí nas Francis Crick e Linus Pauling no início de 1950 su geriram independentemente que as hélices a da querati na estavam arranjadas na forma de espiral enrolada Duas fibras de aqueratina orientadas em paralelo com seus aminoterminais na mesma extremidade são enroladas uma sobre a outra formando uma espiral enrolada supertorcida A supertorção amplifica a força da estrutura como um todo assim como as fibras são trançadas para formar uma corda forte Figura 411 A torção do eixo de uma hélice a para formar uma espiral enrolada explica a discrepância entre os 54 Å por volta preditos por Pauling e Corey e as estrutu ras repetidas a cada 515 a 52 Å observadas na difração de raios X do cabelo p 120 O sentido da hélice das estrutu ras supertorcidas é antihorário oposto ao da hélice a As superfícies onde as duas hélices a se tocam são formadas por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e seus grupos R se entrelaçam em um padrão regular interconectado Isso permite um arranjo próximo das cadeias polipeptídicas den tro da estrutura supertorcida no sentido antihorário Não é surpresa portanto que a aqueratina seja rica em resíduos hidrofóbicos Ala Val Leu Ile Met e Phe Um polipeptídeo na aqueratina com as cadeias em espi ral enrolada tem uma estrutura terciária relativamente sim ples dominada por uma estrutura secundária ahelicoidal com seu eixo enrolado em uma superhélice antihorária O entrelaçamento de dois peptídeos ahelicoidais é um exem plo de estrutura quaternária Espirais enroladas desse tipo são elementos estruturais comuns em proteínas filamentosas e na proteína muscular miosina ver Figura 527 A estrutu ra quaternária da aqueratina pode ser bem complexa Várias espirais enroladas podem ser associadas em grandes comple xos supramoleculares como o arranjo da aqueratina para formar o filamento intermediário do cabelo Figura 411b A resistência das proteínas fibrosas é aumentada pe las ligações covalentes entre as cadeias polipeptídicas nas cordas multihelicoidais e entre cadeias adjacentes em um arranjo supramolecular Nas aqueratinas as ligações entre as cadeias que estabilizam a estrutura quaternária são ligações dissulfeto Quadro 42 Nas aqueratinas mais Células Filamento intermediário Protofibrila Protofilamento Duas cadeias em espiral enrolada Hélice a b Corte transversal de um fio de cabelo a Protofibrila Protofilamento Duas cadeias em espiral enrolada 2030 Å Hélice a de queratina FIGURA 411 Estrutura do cabelo a A aqueratina do cabelo é uma longa hélice a com elementos mais densos próximos às extremidades ami no e carboxiterminais Os pares destas hélices são enrolados em um sentido antihorário para formar as duas cadeias em espiral enrolada Estas por sua vez se combinam em estruturas mais complexas chamadas de protofila mentos e protofibrilas Cerca de quatro protofibrilas 32 moléculas de a queratina ao todo se combinam para formar um filamento intermediário As duas cadeias em espiral enrolada das várias subestruturas também pare cem estar entrelaçadas mas a orientação destas torções e outros detalhes estruturais não são conhecidos b O cabelo é um conjunto de filamentos de aqueratina formado pelas subestruturas mostradas em a TABELA 43 Estrutura secundária e propriedades de algumas proteínas fibrosas Estrutura Características Exemplos de ocorrência Hélices a ligadas por ligações dissulfeto Estruturas de proteção insolúveis e resistentes com dureza e flexibilidade variáveis aQueratina de cabelos penas unhas Conformação b Filamentos macios e flexíveis Fibroínas de seda Hélice tripla de colágeno Grande resistência à tração sem elasticidade Colágeno de tendões matriz óssea Nelson6ed04indd 126 Nelson6ed04indd 126 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 127 duras e resistentes como as dos chifres dos rinocerontes até 18 dos resíduos são cisteínas envolvidas em ligações dissulfeto Colágeno Assim como as aqueratinas o colágeno evoluiu para garantir resistência Ele é encontrado nos tecidos co nectivos como os tendões as cartilagens a matriz orgâni ca dos ossos e na córnea dos olhos A hélice de colágeno é uma estrutura secundária única bem diferente da hélice a Ela gira para esquerda e tem três resíduos de aminoácidos por volta Figura 412 e Tabela 41 O colágeno também é uma espiral enrolada mas com estruturas terciária e qua ternária distintas três polipeptídeos separados chamados de cadeias a não confundir com hélices a são supertor cidos uns sobre os outros Figura 412c No colágeno a torção superhelicoidal tem sentido horário oposto ao da hélice antihorária das cadeias a Existem vários tipos de colágenos nos vertebrados Normalmente eles contêm em torno de 35 de Gly 11 de Ala e 21 de Pro e 4Hyp 4hidroxiprolina um amino ácido incomum ver Figura 38a A gelatina comestível é derivada do colágeno Tem baixo poder nutricional como proteína pois o colágeno tem uma quantidade muito baixa dos aminoácidos essenciais à dieta humana O conteúdo de aminoácidos incomuns do colágeno está relacionado com as restrições estruturais únicas de sua hélice A sequência de aminoácidos no colágeno geralmente é uma repetição de uma unidade tripeptídica GlyXY onde X normalmente é uma Pro e Y em geral é uma 4Hyp Somente os resíduos Gly podem ser acomodados nas junções muito apertadas entre as cadeias a individuais Figura 412d Os resíduos Pro e 4Hyp permitem a torção acentuada da hélice do co lágeno A sequência de aminoácidos e a estrutura quaterná ria supertorcida do colágeno permitem uma compactação muito justa de seus três polipeptídeos A 4hidroxiprolina tem um papel importante na estrutura do colágeno e na história do ser humano Quadro 43 QUADRO 42 Ondulação permanente é engenharia bioquímica Quando os cabelos são expostos ao calor úmido eles po dem ser esticados No nível molecular as hélices a da aqueratina do cabelo são esticadas até que cheguem a uma conformação b completamente estendida Com o res friamento espontâneo elas retornam para a conformação ahelicoidal A esticabilidade característica das aque ratinas e suas inúmeras ligações dissulfeto constituem a base dos processos da ondulação permanente Os cabelos que serão cacheados ou encrespados são inicialmente en rolados ao redor de uma forma com um formato adequa do Uma solução de um agente redutor normalmente um composto contendo um grupo tiol ou sulfidril SH é então aplicada com calor O agente redutor rompe as liga ções transversais pela redução de cada ligação dissulfeto em dois resíduos Cys O calor úmido quebra as ligações de hidrogênio e provoca o desenrolamento da estrutura da cadeia polipeptídica Depois de um tempo a solução redu tora é removida e um agente oxidante é adicionado para fazer novas ligações dissulfeto entre pares de resíduos Cys de cadeias adjacentes mas não dos mesmos pares de antes do tratamento Depois do cabelo lavado e resfria do as cadeias polipeptídicas voltam à sua conformação helicoidal As fibras do cabelo agora enrolam da forma desejada porque as novas ligações dissulfeto transversais exercem uma torção ou rotação sobre os feixes de hélices das fibras O mesmo processo pode ser usado para o alisa mento dos cabelos naturalmente crespos Um alisamento permanente de cabelo não é permanente de fato pois o cabelo cresce e no cabelo novo que substituirá o antigo a aqueratina tem o padrão natural de ligações dissulfeto SH SH SH SH SH SH HS HS HS HS HS HS S S S S S S S S S S S S SH HS HS SH HS SH SH HS SH HS HS S S S S S S S S reduz enrola oxida HS HS HS SH HS b c d a FIGURA 412 Estrutura do colágeno Obtida do PDB ID 1CGD a A ca deia a do colágeno tem uma estrutura secundária repetitiva que é única des ta proteína A sequência tripeptídica que se repete GlyXPro ou GlyX4Hyp adota uma estrutura helicoidal antihorária com três resíduos por volta A sequência repetida para gerar este modelo é a GlyPro4Hyp b Modelo de volume atômico da mesma cadeia a c Três destas hélices mostradas aqui em cinza azul e roxo se enrolam uma sobre as outras no sentido horário d A superhélice de colágeno formada por três cadeias mostrada a partir de uma das extremidades está representada em um modelo de esfera e bastão Os resíduos de Gly são mostrados em vermelho A glicina por ser pequena é necessária para uma junção firme na região onde as três cadeias estão em contato As esferas nesta ilustração não representam os raios de van der Wa als dos átomos individuais O centro da superhélice de três cadeias não é oco como aparece aqui mas sim firmemente compacto Nelson6ed04indd 127 Nelson6ed04indd 127 070414 1434 070414 1434 128 DAVID L NELSON MICHAEL M COX por um azar junto com a insalubridade do país onde nunca cai uma gota de chuva fomos acometidos pela doença que era tal que toda a carne de nossos braços murchou e a pele de nossas pernas ficou com manchas escuras com pedaços bolorentos como uma bota velha e uma carne esponjosa surgiu nas gengivas daqueles que pegaram a doença e ninguém escapou dela indo direto para as garras da morte O sinal era o seguinte quando o nariz começava a sangrar então a morte esta va próxima Memórias do Lorde de Joinville 1300 dC Essa passagem descreve a situação do exército de Luís IX no fim da Sétima Cruzada 12481254 quando o exército enfraquecido pelo escorbuto foi destruído pe los egípcios Qual a natureza desse mal que acometeu es ses soldados do décimo terceiro século O escorbuto é causado pela falta de vitamina C ou áci do ascórbico ascorbato A vitamina C é necessária para entre outras coisas a hidroxilação da prolina e da lisina no colágeno O escorbuto é uma doença caracterizada pela degeneração do tecido conectivo sendo que sua mani festação em estágio avançado inclui inúmeras pequenas hemorragias causadas por vasos sanguíneos frágeis perda dos dentes difícil cicatrização de feridas e reabertura de feridas antigas dor e degeneração dos ossos e no final falência cardíaca Casos mais brandos de deficiência de vitamina C são acompanhados de fadiga irritabilidade e aumento da gravidade das infecções do trato respiratório A maioria dos animais sintetiza grande quantidade de vi tamina C pela conversão da glicose em ascorbato em qua tro etapas enzimáticas Contudo no curso da evolução os humanos e alguns outros animais gorilas cobaias e mor cegos frugívoros perderam a última enzima dessa rota devendo obter o ascorbato da dieta A vitamina C é en contrada em uma grande variedade de frutas e vegetais Até 1800 entretanto ela estava ausente nos alimentos desidratados e outros suprimentos alimentares estocados para o inverno ou para longas viagens O escorbuto foi registrado pelos egípcios em 1500 aC e descrito em escritos de Hipócrates que datam do quinto século aC Entretanto ele não tornouse uma no tícia pública até as viagens de descobrimento europeias de 1500 a 1800 A primeira navegação ao redor do mundo 15191522 liderada por Ferdinand Magellan acabou com a perda de mais de 80 de sua tripulação para o escorbuto Durante a segunda viagem de Jacques Cartier para explorar o rio St Lawrence 15351536 a tripula ção foi ameaçada por um completo desastre até que um americano nativo ensinou os homens a fazer chá de cedro contendo vitamina C que curava e prevenia o escorbu to As epidemias de escorbuto nos invernos da Europa foram gradativamente sendo eliminadas no século XIX à medida que a cultura de batata originária da América do Sul foi disseminada Em 1747 James Lind cirurgião escocês da Marinha Real realizou o primeiro estudo clínico controlado regis trado na história Durante uma longa viagem no navio de guerra HMS Salisbury Lind selecionou 12 marinheiros com escorbuto e os dividiu em grupos de dois Todos os 12 receberam a mesma dieta exceto que cada um dos grupos recebeu um remédio diferente dentre os reco mendados na época para o escorbuto Os marinheiros que receberam limões e laranjas se recuperaram e vol taram ao trabalho Os marinheiros que receberam suco de maçã fervida tiveram uma pequena melhora Os outros continuaram a piorar O Trata do sobre escorbuto de Lind foi publicado em 1753 mas a inér cia permaneceu na Marinha real por mais 40 anos Em 1795 o Ministério da Marinha Britânica finalmente ordenou que fosse dada uma ração com suco con centrado de lima ou limão para todos os marinheiros britânicos O escorbuto continuou a ser um problema em algumas partes do mundo até 1932 quando o cientista húngaro Albert Szent Györgyi e W A Waugh e C G King da Universidade de Pittsburgh isolaram e sintetizaram o ácido ascórbico O ácido Lascórbico vitamina C é um pó branco ino doro e cristalino totalmente solúvel em água e relativa mente insolúvel em solventes orgânicos O pó seco longe da luz é estável por um tempo considerável O consumo diário apropriado dessa vitamina ainda é alvo de debates O valor recomendado nos Estados Unidos é 90 mg na Austrália e no Reino Unido o recomendado é 60 mg na Rússia são recomendados 125 mg Além das frutas cí tricas e praticamente todas as outras frutas frescas boas fontes de vitamina C incluem pimentas tomates batatas e brócolis A vitamina C de frutas e vegetais é destruída por supercozimento ou longa estocagem Por que o ascorbato é tão necessário para uma boa saúde De particular interesse é seu papel na formação de colágeno Como dito no texto o colágeno é formado por unidades repetidas de tripeptídeos GlyXY dos quais X e Y em geral são Pro e 4Hyp o derivado de prolina 4RLhidroxiprolina que tem um papel importante no entrelaçamento das fibras do colágeno e na manutenção de sua estrutura O anel de prolina normalmente é en contrado em duas conformações chamadas de Cgendo e Cgexo Figura Q1 A estrutura da hélice de colágeno necessita de resíduos de Pro na posição Y para estar na conformação Cgexo sendo essa conformação favorecida pela substituição do hidroxil no C4 da 4Hyp A estrutu ra de colágeno também requer que o resíduo Pro na po sição X tenha uma conformação Cgendo e a introdução QUADRO 43 MEDICINA Por que marinheiros exploradores e universitários devem comer frutas e vegetais frescos James Lind 17161794 cirurgião da marinha 17391748 Nelson6ed04indd 128 Nelson6ed04indd 128 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 129 da 4Hyp nessa posição pode desestabilizar a hélice Na ausência de vitamina C as células não conseguem hidro xilar a Pro da posição Y Isso leva a uma instabilidade do colágeno e aos problemas no tecido conectivo observa dos no escorbuto A hidroxilação de resíduos específicos de Pro no pró colágeno o precursor do colágeno requer a ação da enzima prolil 4hidroxilase Essa enzima Mr 5 240000 apresentase como um tetrâmero a2b2 em todos os ver tebrados A atividade de hidroxilação da prolina está nas subunidades a Cada subunidade a contém um átomo de ferro não hemínico Fe 21 e a enzima faz parte de uma classe de hidroxilases que necessitam de acetoglutarato em suas reações Em uma reação normal da prolil4hidroxilase Figu ra Q2a uma molécula de acetoglutarato e uma de O2 se ligam à enzima O acetoglutarato é oxidativamente decarboxilado para formar CO2 e succinato O átomo de oxigênio remanescente é então usado para hidroxilar o resíduo de Pro apropriado no prócolágeno Nenhum ascorbato é necessário nessa reação Entretanto a pro lil4hidroxilase também catalisa uma decarboxilação oxidativa de acetoglutarato não acoplada à hidroxila ção da prolina Figura Q2b Durante essa reação o Fe 21 do grupamento heme se oxida inativando a enzi ma e impedindo a hidroxilação da prolina O ascorbato consumido nessa reação é necessário para restaurar a atividade enzimática pela redução do ferro do grupa mento heme O escorbuto permanece sendo um problema ainda hoje não somente em regiões remotas onde os alimentos nutritivos são escassos mas surpreendentemente nos campi de universidades americanas Os únicos vegetais consumidos pelos estudantes são aqueles em saladas refogadas e os dias passam sem que esses jovens con sumam frutas frescas Um estudo de 1998 com 230 es tudantes da Arizona State University revelou que 10 deles tinham sérias deficiências de vitamina C e dois estudantes tinham níveis de vitamina C tão baixos que provavelmente tinham escorbuto Somente metade dos estudantes nessa pesquisa consumia a quantidade diária recomendada de vitamina C Então consuma vegetais e frutas frescos O N O N HO Cgendo prolina Cgexo 4hidroxiprolina FIGURA Q1 Conformação Cgendo da prolina e conformação Cgexo da 4hidroxiprolina C O HC H2 C H2COH HCOH HC HC C C HO OH a b CH2 CH2 CH2 O2 COOH COOH C O O O N Resíduo de Pro 1 1 aCetoglutarato aCetoglutarato Ascorbato C O HC OH C CH2 CH2 CO2 COOH COOH N H Resíduo de 4Hyp 1 1 Succinato CH2 CH2 CO2 COOH COOH 1 1 Succinato CH2 CH2 O2 COOH C O C 1 1 H2COH HCOH C C O Desidroascorbato O O O C COOH Fe21 Fe21 C H2 H2 C C H2 FIGURA Q2 Reações catalisadas pela prolil4hidroxilase a Reação usual acoplada à hidroxilação da prolina que não necessita de ascorbato O destino dos dois átomos de oxigênio do O2 é mostrado em vermelho b Reação não acoplada na qual o acetoglutarato sofre descarboxilação oxidativa sem a hidroxilação da prolina O ascorbato é consumido estequiometricamente neste processo à medida que é convertido a desidroascorbato prevenindo a oxidação do Fe 21 Nelson6ed04indd 129 Nelson6ed04indd 129 070414 1434 070414 1434 130 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O empacotamento compacto das cadeias a na hélice tri pla de colágeno garante uma resistência elástica maior do que aquela de uma barra de aço de mesma secção trans versal As fibrilas de colágeno Figura 413 são conjuntos de estruturas supramoleculares formados por triplas héli ces de moléculas de colágeno algumas vezes chamadas de moléculas de tropocolágeno associadas em uma grande variedade de formas para garantir diferentes graus de resis tência elástica As cadeias a e as fibrilas das moléculas de colágeno são interligadas por tipos incomuns de ligações co valentes envolvendo Lys HyLys 5hidroxilisina ver Figura 38a ou resíduos His presentes em algumas posições X e Y Essas ligações criam resíduos de aminoácidos incomuns como o desidrohidroxilisinonorleucina O caráter cada vez mais rígido e quebradiço do tecido conectivo envelhecido resulta do acúmulo de ligações covalentes transversais nas fibrilas de colágeno N OH CH2 CH CH2 CH2 C C O H H N N H O C CH CH2 CH2 CH2 CH Cadeia polipeptídica Cadeia polipeptídica Resíduo HyLys Resíduo de Lys sem o grupo amino norleucina Desidrohidroxilisinonorleucina Um mamífero tem mais de 30 variantes estruturais de colágeno específicas para cada tecido e diferentes em sequência e função Alguns defeitos genéticos na estrutura do colágeno em humanos ilustram a estreita relação entre a sequência de aminoácidos e a estrutura tridimensional nes ta proteína A osteogênese imperfeita é caracterizada pela formação anormal dos ossos em bebês pelo menos oito va riações dessa condição em diferentes graus de severidade ocorrem na população humana A síndrome de Eh lersDanlos é caracterizada por articulações soltas e pelo menos seis variantes ocorrem em humanos O compositor Niccolò Paganini 17821840 era famoso por sua destreza aparentemente impossível de tocar violino Ele sofria de uma variante da síndrome EhlersDanlos que lhe rendeu efetivamente juntas duplas Algumas variantes podem ser letais outras causam problemas por toda vida Todas as variantes de ambas as condições resultam da substituição de um resíduo de aminoácido com um grupo R volumoso como Cys ou Ser por um resíduo de Gly de uma cadeia a em uma ou outra proteína colágena um resí duo Gly diferente é substituído em cada uma das doenças Essas substituições de um único resíduo têm um efeito ca tastrófico na função do colágeno pois interrompem a re petição de GlyXY que garante ao colágeno sua estrutura helicoidal única Dada sua importância na hélice tripla do colágeno Figura 412d a Gly não pode ser substituída por outro resíduo de aminoácido sem um efeito substancial mente deletério na estrutura do colágeno Fibroína da seda A fibroína a proteína da seda é produzi da por insetos e aranhas Suas cadeias polipeptídicas estão predominantemente na conformação b A fibroína é rica em resíduos Ala e Gly permitindo um grande empacotamento das folhas b e um arranjo entrelaçado dos grupos R Figu ra 414 A estrutura global é estabilizada por extensivas ligações de hidrogênio entre todas as ligações peptídicas dos polipeptídeos de cada cadeia b assim como pela otimi zação das interações de van der Waals entre as cadeias A seda não é elástica porque sua conformação b já está bem estendida Figura 46 Entretanto a estrutura é flexível pois as cadeias estão unidas por inúmeras interações fracas em vez de ligações covalentes como ligações dissulfeto nas aqueratinas A diversidade estrutural reflete a diversidade funcional nas proteínas globulares Em uma proteína globular segmentos diferentes das ca deias polipeptídicas ou de múltiplas cadeias polipeptídi cas se dobram uns sobre os outros gerando uma forma mais compacta do que a observada para as proteínas fibro sas Figura 415 O enovelamento também garante a di versidade estrutural necessária às proteínas para realizar um grande leque de funções biológicas Proteínas globula res incluem enzimas proteínas transportadoras proteínas motoras proteínas reguladoras imunoglobulinas e proteí nas com muitas outras funções Inícios das moléculas de colágeno Secção da molécula de colágeno Estrias transversais 640 Å 64 nm 250 nm FIGURA 413 Estrutura das fibrilas de colágeno O colágeno Mr 300000 é uma molécula em forma de bastão com cerca de 3000 Å de com primento e apenas 15 Å de largura Suas três cadeias a helicoidais entrela çadas podem ter sequências diferentes cada cadeia tem aproximadamente 1000 resíduos de aminoácidos As fibrilas são feitas de moléculas de colá geno alinhadas de forma escalonada e com ligações cruzadas que garan tem resistência O alinhamento específico e o grau de ligações transversais variam com o tecido e formam estrias transversais características vistas por microscopia eletrônica No exemplo mostrado aqui o alinhamento dos gru pos iniciais de cada quatro moléculas produz estrias distantes 640 Å 64 nm umas das outras Nelson6ed04indd 130 Nelson6ed04indd 130 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 131 A presente discussão sobre proteínas globulares começa com os princípios vislumbrados a partir das primeiras estru turas de proteínas elucidadas Seguese uma detalhada des crição e classificação comparativa de subestruturas protei cas Tais discussões são possíveis somente devido à grande quantidade de informações disponíveis na Internet a partir de bancos de dados públicos particularmente do Banco de Dados de Proteínas Quadro 44 A mioglobina forneceu os indícios iniciais sobre a complexidade da estrutura globular proteica Arquitetura proteica Estrutura terciária de proteínas globulares pe quenas II Mioglobina O primeiro avanço no entendimento da estrutura tridimensional de uma proteína globular veio com os estudos de difração por raios X da mioglobina fei tos por John Kendrew e seus colaboradores em 1950 A mioglobina é uma proteína ligadora de oxigênio relativa mente pequena Mr 16700 das células musculares Ela funciona tanto para a estocagem de oxigênio quanto para facilitar a difusão do oxigênio nos tecidos musculares em contração A mioglobina contém uma única cadeia polipep tídica de 153 resíduos de aminoácidos de sequência conhe cida e um único grupo ferroprotoporfirina ou heme O mesmo grupo heme encontrado na mioglobina é encontra do na hemoglobina a proteína ligadora de oxigênio dos eri trócitos sendo responsável pela coloração vermelha amar ronzada tanto da mioglobina quanto da hemoglobina A mioglobina é particularmente abundante nos músculos de mamíferos mergulhadores como as baleias as focas e os botos tão abundante que os músculos destes animais são marrons A estocagem e a distribuição do oxigênio pela mioglobina do músculo permitem que animais que mergu lham permaneçam submersos por um longo período As FIGURA 414 Estrutura da seda As fibras do tecido da seda e das teias de aranhas são formadas principalmente pela proteína fibroína a A fibro ína consiste em camadas de folhas b antiparalelas ricas em resíduos Ala e Gly As pequenas cadeias laterais se encaixam e permitem um grande em pacotamento das fitas como mostrado no modelo de esferas e bastões Os segmentos mostrados seriam apenas uma pequena parte da fita de fibroína b As fitas da seda azul emergem das fiandeiras de uma aranha nesta mi crografia eletrônica em cores a b 70 mm Cadeias laterais de Gly Folhas b antiparalelas Cadeias laterais de Ala Hélice a 900 3 11 Å Forma globular nativa 100 3 60 Å Conformação b 2000 3 5 Å FIGURA 415 As estruturas proteicas globulares são compactas e variadas A albumina sérica humana Mr 64500 tem 585 resíduos em uma única cadeia São dadas aqui as dimensões aproximadas de uma de suas cadeias polipeptídicas se ela ocorresse em uma conformação b ou em uma hélice a Também é mostrado o tamanho da proteína em sua for ma globular nativa determinada por cristalografia por raios X a cadeia po lipeptídica deve estar com um enovelamento muito compacto para caber nestas dimensões Nelson6ed04indd 131 Nelson6ed04indd 131 070414 1434 070414 1434 132 DAVID L NELSON MICHAEL M COX atividades da mioglobina e de outras moléculas de globina são investigadas em detalhe no Capítulo 5 A Figura 416 mostra diversas representações estru turais da mioglobina ilustrando como a cadeia polipeptí dica é dobrada nas três dimensões sua estrutura terciá ria O grupo vermelho envolvido pela proteína é o heme O esqueleto da molécula de mioglobina consiste em oito segmentos de hélices a relativamente retas interrompi das por dobras algumas delas sendo voltas b A hélice a mais longa tem 23 resíduos de aminoácidos a mais curta apenas 7 Todas as hélices são voltadas para a direita Mais de 70 dos resíduos de mioglobina estão nessas regiões ahelicoidais As análises por raios X revelaram a posição precisa de cada um dos grupos R que preenchem quase todo o espaço dentro da cadeia dobrada não ocupada por átomos do esqueleto Várias conclusões importantes podem ser tiradas a par tir da estrutura da mioglobina As posições das cadeias late rais dos aminoácidos refletem uma estrutura cuja estabili dade é resultante de suas interações hidrofóbicas A maioria dos grupos R hidrofóbicos está no interior da molécula es condidos da exposição à água Exceto dois resíduos todos os outros grupos R polares estão na superfície externa da molécula e estão hidratados A molécula de mioglobina é tão compacta que em seu interior só há lugar para quatro moléculas de água Esse denso núcleo hidrofóbico é típico das proteínas globulares A fração de espaço ocupado pelos átomos em um líquido orgânico é de 04 a 06 Em uma pro teína globular essa fração é de cerca de 075 comparável com aquela do cristal em um cristal típico a fração é de 070 a 078 próximo do máximo teórico Nesse ambiente compacto as interações fracas são fortalecidas e reforçam umas às outras Por exemplo as cadeias apolares no núcleo estão tão próximas que as interações de curto alcance do tipo van der Waals têm uma contribuição significativa na estabilização das interações hidrofóbicas QUADRO 44 O banco de dados de proteínas Atualmente o número de estruturas proteicas tridimen sionais conhecidas está na casa das dezenas de milhares e mais do que dobra a cada dois anos Essa abundância de informações está revolucionando o entendimento sobre a estrutura de proteínas a relação estruturaatividade e as rotas evolutivas pelas quais as proteínas chegaram ao seu estado atual que podem ser vistas nas semelhanças que aparecem entre as famílias à medida que os bancos de dados de proteínas são examinados e classificados Um dos recursos mais importantes disponíveis aos bioquími cos é o Protein Data Bank PDB ou banco de dados de proteínas wwwpdborg O PDB é um arquivo de estruturas tridimensionais de macromoléculas biológicas determinadas experimen talmente contendo quase todas as estruturas macro moleculares proteínas RNA DNA etc elucidadas até o momento A cada estrutura é atribuído um código de identificação um código de quatro caracteres chama do de PDB ID Tais identificadores são fornecidos nas legendas das figuras para cada uma das estruturas de rivadas do PDB ilustradas nesse texto de forma que os estudantes e os professores podem explorar essas mes mas estruturas Os arquivos de dados no PDB descrevem as coordenadas espaciais de cada átomo cuja posição foi determinada muitas das estruturas catalogadas não estão completas Arquivos de dados adicionais forne cem informações de como as estruturas foram determi nadas e sua precisão As coordenadas atômicas podem ser convertidas em uma imagem da macromolécula com a ajuda de programas de visualização de estruturas Os estudantes são incentivados a acessar o PDB e explorar as estruturas usando programas de visualização refe renciados no banco de dados Os arquivos de estruturas macromoleculares também podem ser baixados e explo rados em seu computador usando programas livres tal como o Jmol a b c d FIGURA 416 Estrutura terciária da mioglobina de cachalote PDB ID 1MBO A orientação da proteína é igual de a a d o grupo heme é mostra do em vermelho Além de ilustrar a estrutura da mioglobina esta figura mos tra exemplos de diversas formas de apresentar a estrutura de uma proteína a Esqueleto polipeptídico na representação de fita introduzido por Jane Richardson destacando as estruturas secundárias As regiões de hélice a são evidentes b Imagem da superfície da proteína ela é útil na visualização de fendas onde outras moléculas podem se ligar à proteína c Representação da estrutura em fita incluindo as cadeias laterais em amarelo dos resíduos hidrofóbicos Leu Ile Val e Phe d Modelo de volume atômico com todas as cadeias laterais dos aminoácidos Cada átomo está representado por uma esfera que cobre o seu raio de van der Waals Os resíduos hidrofóbicos são novamente mostrados em amarelo a maioria está no interior da proteína e por isso não está visível Nelson6ed04indd 132 Nelson6ed04indd 132 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 133 A dedução da estrutura da mioglobina confirmou algu mas expectativas e introduziu alguns elementos novos à estrutura secundária Como predito por Pauling e Corey todas as ligações peptídicas estão em configuração planar trans As hélices a da mioglobina forneceram a primeira evidência experimental direta da existência desse tipo de estrutura secundária Três dos quatro resíduos Pro são en contrados em dobras O quarto resíduo Pro ocorre em uma hélice a onde ele cria uma torção necessária para o firme empacotamento da hélice O grupo heme planar repousa sobre uma fenda na molécu la de mioglobina O átomo de ferro no centro do grupo heme apresenta duas posições de ligação coordenação perpendi culares ao plano do heme Figura 417 Uma delas se liga ao grupo R de um resíduo de His na posição 93 a outra cor responde ao local onde a molécula de O2 se liga Dentro des sa fenda a acessibilidade do grupo heme ao solvente é bem restrita Isso é importante para a função pois grupos heme livres em uma solução oxigenada são rapidamente oxidados do estado ferroso Fe 21 que é ativo na ligação reversível com o O2 para o estado férrico Fe 31 que não se liga ao O2 À medida que as diferentes estruturas da mioglobina fo ram resolvidas os pesquisadores foram capazes de observar as mudanças estruturais que acompanham a ligação do oxi gênio ou de outra molécula e assim pela primeira vez de entender a correlação entre a estrutura de uma proteína e sua função Centenas de proteínas são agora submetidas a análises semelhantes Hoje a espectroscopia de ressonância magnética nuclear RMN e outras técnicas suplementam os dados de difração de raios X fornecendo mais informa ções sobre as estruturas das proteínas Quadro 45 Adicio nalmente o sequenciamento de DNA genômico de muitos organismos Capítulo 9 identificou milhares de genes que codificam proteínas de sequências conhecidas mas ainda de função desconhecida esse trabalho continua a passos largos As proteínas globulares têm uma diversidade de estruturas terciárias A partir do que se sabe sobre estruturas terciárias de cen tenas de proteínas globulares é claro que a mioglobina ilustra apenas uma das diversas formas em que a cadeia polipeptídica pode se dobrar A Tabela 44 mostra as pro porções de hélices a e conformações b expressas em por centagem de resíduos em cada um dos tipos em diversas proteínas globulares pequenas e de cadeia única Cada uma dessas proteínas tem uma estrutura diferente adap tada à sua função biológica particular mas como um todo elas compartilham diversas propriedades importantes com a mioglobina Cada uma delas está dobrada de forma com pacta e em cada caso as cadeias laterais hidrofóbicas dos aminoácidos estão orientadas na direção do centro da pro teína longe da água e suas cadeias laterais hidrofílicas se encontram na superfície As estruturas também são es tabilizadas por inúmeras ligações de hidrogênio e algumas interações iônicas Para os estudantes iniciantes as estruturas terciárias muito complexas das proteínas globulares algumas muito maiores do que a mioglobina são mais facilmente acessa das concentrandose nos padrões estruturais comuns re correntes em diferentes proteínas geralmente não relacio nadas A estrutura tridimensional de uma proteína globular típica pode ser considerada um conjunto de segmentos polipeptídicos em hélices a e conformações b ligados por segmentos conectores A estrutura pode ser então defi nida pela forma como os segmentos estão empilhados uns sobre os outros e como estão arranjados os segmentos que os conectam Para entender uma estrutura tridimensional completa é preciso analisar seu padrão de enovelamento Primei ro definemse dois importantes termos que descrevem os padrões de estruturas de proteínas ou elementos de uma cadeia polipeptídica seguindo então para as regras de enovelamento TABELA 44 Proporção aproximada de hélices a e conformações b em algumas proteínas de cadeia única Resíduos Proteína número total de resíduos Hélice a Conformação b Quimotripsina 247 14 45 Ribonuclease 124 26 35 Carboxipeptidase 307 38 17 Citocromo c 104 39 0 Lisozima 129 40 12 Mioglobina 153 78 0 Fonte Dados de Cantor CR e Schimmel PR 1980 Biophysical Chemistry Part I The Conformation of Biological Macromolecules p 100 WH Freeman and Company New York As proporções das cadeias polipeptídicas que não fazem parte de hélices a e conformações b consistem em curvaturas e espirais irregulares ou regiões esten didas Segmentos de hélice a e conformação b algumas vezes diferem um pouco de suas dimensões e geometrias usuais O C O O Fe CH3 CH a N CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 CH3 CH3 C H H C HC CH CH O C C C C C C C C C C C C C C C C N N N C CH2 2 2 b Fe O2 CH2 N NH FIGURA 417 O grupo heme Este grupo está presente na mioglobina hemoglobina citocromos e muitas outras proteínas as proteínas heme a O heme consiste em uma estrutura de anel orgânico complexo a protopor firina que liga um átomo de ferro no seu estado ferroso Fe 21 O átomo de ferro tem seis ligações coordenadas quatro delas no plano da molécula da porfirina e ligadas a ela e duas perpendiculares a ela b Na mioglobina e na hemoglobina uma das ligações perpendiculares está ligada a um átomo de nitrogênio de um resíduo His A outra está vaga servindo de sítio de ligação para a molécula de O2 Nelson6ed04indd 133 Nelson6ed04indd 133 070414 1434 070414 1434 134 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Difração de raios X O espaçamento dos átomos em um retículo cristalino pode ser determinado pela medida da localização e da intensidade dos pontos produzidos por um feixe de raios X de um dado comprimento de onda em um filme foto gráfico depois desse feixe ser difratado pelos elétrons dos átomos Por exemplo a análise por raios X de cristais de cloreto de sódio mostra que os íons Na 1 e Cl estão dispostos em um arranjo cúbico simples O espaçamen to de diferentes tipos de átomos em moléculas orgânicas complexas até mesmos as grandes como as proteínas também pode ser analisado por métodos de difração de raios X Entretanto essa técnica de análise de cristais de moléculas complexas é muito mais trabalhosa do que a de cristais de sais simples Quando o padrão de repetição do cristal é uma molécula tão grande quanto uma pro teína o número de átomos da molécula resulta em mi lhares de pontos de difração que precisam ser analisados por computador Considere como as imagens são geradas em um mi croscópio óptico A luz de uma fonte pontual é focalizada em um objeto O objeto espalha as ondas de luz e es tas ondas espalhadas são reagrupadas por uma série de lentes para gerar uma imagem aumentada do objeto O tamanho mínimo do objeto cuja estrutura pode ser deter minada desta forma isto é o poder de resolução do mi croscópio é determinado pelo comprimento de onda de luz neste caso luz visível com um comprimento de onda entre 400 e 700 nm Objetos menores do que a metade do comprimento de onda da luz incidente não têm reso lução Para resolver objetos tão pequenos quanto as pro teínas é necessário usar raios X com comprimentos de onda na faixa de 07 a 15 Å 007 a 015 nm Entretanto não há lentes que possam reagrupar os raios X para for mar a imagem Em vez disso o padrão de difração dos raios X é coletado diretamente e a imagem é recons truída por técnicas matemáticas A quantidade de informação obtida em uma cristalo grafia por raios X depende do grau de organização estru tural da amostra Alguns parâmetros importantes foram obtidos nos primeiros estudos de padrão de difração de proteínas fibrosas arranjadas de forma regular no cabelo e na lã Entretanto os feixes ordenados formados pelas proteínas fibrosas não são cristais as moléculas estão alinhadas lado a lado mas não estão todas orientadas na mesma direção Informações estruturais tridimensio nais mais detalhadas sobre proteínas necessitam de um cristal de proteína altamente ordenado As estruturas de muitas proteínas ainda permanecem desconhecidas sim plesmente porque se mostraram difíceis de cristalizar Os profissionais comparam a preparação de cristais com manter unida uma pilha de bolas de boliche com uma fita de celofane Operacionalmente existem vários passos em uma análise estrutural por raios X Figura Q1 Um cristal é colocado em um feixe de raios X entre a fonte de raios X e o detector e um conjunto de pontos chamados de re flexões é gerado Os pontos são gerados pela difração do feixe de raios X e cada átomo da molécula faz uma con tribuição para cada ponto Um mapa de densidade eletrô nica da proteína é reconstruído a partir do padrão total de difração por uma técnica matemática chamada de transformada de Fourier O computador age na verdade como lente computacional Um modelo da estrutura é então construído de acordo com o mapa de densidade eletrônica John Kendrew verificou que o padrão de difração de raios X da mioglobina cristalina isolada de músculos do cachalote é muito complexo com cerca de 25000 refle xões A análise computacional dessas reflexões ocorreu em etapas A resolução aumentou a cada etapa até que em 1959 as posições de quase todos os átomos diferen tes de hidrogênio foram determinadas A sequência de aminoácidos da proteína obtida por análise química foi consistente com o modelo molecular A estrutura de mi lhares de proteínas a maioria delas mais complexa que a mioglobina foi desde então determinada com um nível de resolução semelhante QUADRO 45 MÉTODOS Métodos de determinação da estrutura tridimensional de uma proteína c a b Nelson6ed04indd 134 Nelson6ed04indd 134 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 135 É claro que o ambiente físico em um cristal não é idêntico ao ambiente em solução ou em uma célula viva O cristal impõe uma média temporal e espacial na estru tura deduzida de sua análise e os estudos de difração de raios X fornecem poucas informações sobre os movimen tos moleculares no interior da proteína A conformação das proteínas em um cristal pode a princípio ser afeta da por fatores não fisiológicos como contatos proteína proteína dentro do cristal Entretanto quando estrutu ras derivadas da análise de cristais são comparadas com informações estruturais obtidas de outras formas como RMN descrita a seguir as estruturas derivadas do cris tal quase sempre representam a conformação funcional da proteína A cristalografia por raios X pode ser aplicada com sucesso a proteínas grandes demais para serem es truturalmente analisadas por RMN Ressonância magnética nuclear Uma vantagem dos estudos de ressonância magnética nuclear RMN é que eles são realizados com as macro moléculas em solução enquanto a cristalografia é limi tada a moléculas que podem ser cristalizadas A RMN também pode esclarecer o lado dinâmico da estrutura da proteína incluindo mudanças conformacionais enovela mento proteico e interação com outras moléculas A RMN é a manifestação do momento angular do spin nuclear uma propriedade quânticomecânica dos núcleos atômicos Somente alguns átomos incluindo 1H 13C 15N 19F e 31P apresentam o tipo de spin nuclear que gera sinal na RMN O spin nuclear gera um dipolo magnético Quando um campo magnético estático e for te é aplicado em uma solução contendo um único tipo de macromolécula os dipolos magnéticos são alinhados no campo em uma das duas orientações paralela bai xa energia ou antiparalela alta energia Um pequeno 10 ms pulso de energia eletromagnética de frequên cia adequada a frequência de ressonância que está dentro da faixa de radiofrequência é aplicado em cer tos ângulos aos núcleos alinhados no campo magnético Alguma energia é absorvida à medida que o núcleo muda para o estado de maior energia e o espectro de absorção resultante contém informações sobre a identidade do nú cleo e seu ambiente químico nas imediações Os dados de diversos desses experimentos com a amostra são reu nidos aumentando a relação sinalruído e é gerado um espectro de RMN como o da Figura Q2 O 1H é particularmente importante nos experimen tos de RMN pois é altamente sensível e naturalmente abundante Para macromoléculas o espectro de RMN de 1H pode ser bem complicado Até mesmo uma pe quena proteína pode conter centenas de átomos de 1H normalmente gerando um espectro de RMN unidimen sional muito complexo para ser analisado A análise es trutural de proteínas se tornou possível com o advento das técnicas de RMN bidimensionais Figura Q3 Es ses métodos permitem a medida do acoplamento de pendente da distância dos spins nucleares de átomos espacialmente próximos o efeito Overhauser nuclear NOE em um método chamado de NOESY ou o aco plamento dos spins nucleares de átomos conectados por ligações covalentes espectroscopia de correlação total ou TOCSY A tradução de um espectro de RMN bidimensional em uma estrutura tridimensional completa é um processo muito trabalhoso Os sinais de NOE fornecem algumas informações sobre as distâncias entre cada um dos áto d FIGURA Q1 Etapas da determinação da estrutura da mioglobina de ca chalote via cristalografia por raios X a O padrão da difração por raios X é gerado a partir de um cristal da proteína b Os dados obtidos pelo padrão de difração são utilizados para calcular um mapa de densidade eletrônica tridimensional Somente a densidade eletrônica do heme uma pequena parte da estrutura é mostrada aqui c As regiões de maior densidade eletrônica revelam a localização do núcleo atômico esta in formação é utilizada para construir a estrutura final Aqui a estrutura do heme é modelada em seu mapa de densidade eletrônica d A estrutura completa da mioglobina de cachalote incluindo o heme PDB ID 2MBW 100 80 60 40 20 00 220 Deslocamento químico de 1H ppm FIGURA Q2 Espectro de RMN unidimensional da globina do vermede sangue marinho Glycera sp Esta proteína e a mioglobina de cachalote são análogos estruturais muito próximos pertencendo à mesma família estrutural e compartilhando a função de transporte de oxigênio Continua na próxima página Nelson6ed04indd 135 Nelson6ed04indd 135 070414 1434 070414 1434 136 DAVID L NELSON MICHAEL M COX mos mas para esses valores de distâncias serem úteis os átomos que originam cada sinal devem ser identifica dos Os experimentos complementares de TOCSY podem ajudar na identificação de quais sinais de NOE refletem átomos que estão ligados por ligações covalentes Certos padrões de sinais de NOE têm sido associados com estru turas secundárias como hélices a A engenharia genéti ca Capítulo 9 pode ser usada para preparar proteínas que contenham isótopos raros como 13C ou 15N Os novos sinais de RMN produzidos por esses átomos e o acopla mento com os sinais de 1H resultantes dessa substituição auxiliam na designação de cada um dos sinais de 1H NOE O processo também é facilitado pelo conhecimento da sequência do polipeptídeo Para gerar a representação de uma estrutura tridi mensional os pesquisadores colocam em um computa dor as restrições de distância junto com as restrições geométricas conhecidas como quiralidade raios de van der Waals e distância e ângulo de ligação O computador gera então um conjunto de estruturas altamente rela cionadas que representa um conjunto de conformações consistentes com os valores observados no NOE Figura Q3c A incerteza das estruturas geradas por RMN é em parte um reflexo das vibrações moleculares dentro de uma proteína discutidas em mais detalhes no Capítulo 5 O erro experimental normal também influi As estruturas proteicas determinadas tanto por cris talografia por raios X quanto por RMN geralmente são bem coincidentes Em alguns casos a localização exata de algumas cadeias laterais de aminoácidos específicos da superfície da proteína é diferente normalmente devi do aos efeitos relacionados com o empacotamento entre proteínas adjacentes no cristal Juntas as duas técnicas são as responsáveis pelo rápido aumento da disponibili dade de informações estruturais sobre as macromolécu las de células vivas QUADRO 45 MÉTODOS Métodos de determinação da estrutura tridimensional de uma proteína Continuação 1 2 20 00 20 40 60 80 100 20 00 20 40 60 80 100 Deslocamento químico de 1H ppm Deslocamento químico de 1H ppm a 1 2 b c FIGURA Q3 Uso de RMN bidimensional para determinar a estrutura tridimensional da globina a mesma proteína usada para gerar os dados da Figura Q2 A diagonal em um espectro de RMN bidimensional é equi valente ao espectro unidimensional Os picos fora da diagonal são sinais de NOE gerados pelas interações de curto alcance dos átomos de 1H que podem gerar sinais bem distantes em um espectro unidimensional Duas destas interações são identificadas em a e suas identidades estão mos tradas em linhas azuis em b PDB ID 1VRF São desenhadas três linhas para a interação 2 entre um grupo metil da proteína e um hidrogênio do heme O grupo metil gira rapidamente de forma que cada um dos seus três hidrogênios contribui igualmente para a interação e para o sinal de RMN Tal informação é usada para determinar a estrutura tridimensional completa PDB ID 1VRE como em c As múltiplas linhas que mostram o esqueleto da proteína em c representam o conjunto de estruturas consistentes com os dados de distância da RMN A semelhança estrutural com a mioglobina Figura Q1 é evidente As proteínas estão orientadas da mesma forma nas duas figuras Nelson6ed04indd 136 Nelson6ed04indd 136 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 137 O primeiro termo é motivo também chamado de es trutura supersecundária ou enovelamento Um mo tivo ou enovelamento é um padrão de enovelamento identificável envolvendo dois ou mais elementos da estrutura secundária e a conexão ou conexões entre eles Um motivo pode ser muito simples tal como dois ele mentos de estrutura secundária dobrados um sobre o outro e representa apenas uma pequena parte de uma proteína Um exemplo é uma alça bab Figura 418a Um moti vo também pode ter uma estrutura bem elaborada envol vendo um grande número de segmentos proteicos dobrados juntos como o barril b Figura 418b Em alguns casos um único e grande motivo pode abranger toda a proteína Os termos motivo e enovelamento são frequentemente usados como sinônimos embora enovelamento seja mais comumente aplicado aos padrões de enovelamento ligeira mente mais complexos Os termos incluem qualquer padrão favorável de enovelamento sendo útil na descrição desses padrões O segmento definido como um motivo pode ou não ser estável independentemente Já foi mencionado um motivo bem estudado a espiral enrolada da estrutura da aqueratina também encontrado em outras proteínas O ar ranjo característico de oito hélices a na mioglobina é repro duzido em todas as globinas e é chamado de enovelamento de globina Observe que um motivo não é um elemento es trutural hierárquico que fica entre a estrutura secundária e a terciária Ele é simplesmente um padrão de enovelamen to O termo sinônimo estrutura supersecundária pode portanto causar confusão pois sugere uma hierarquia O segundo termo que descreve padrões estruturais é o domínio Um domínio como definido por Jane Richardson em 1981 é uma parte da cadeia polipeptídica que é inde pendentemente estável ou pode se movimentar como uma entidade isolada em relação ao resto da proteína Polipeptí deos com mais de algumas centenas de resíduos de aminoá cidos normalmente se dobram em dois ou mais domínios algumas vezes com diferentes funções Muitas vezes um domínio de uma proteína grande irá conservar sua estru tura tridimensional nativa mesmo quando separado p ex por uma clivagem proteolítica do resto da cadeia polipep tídica Em uma proteína com múltiplos domínios cada um deles pode aparecer como uma porção globular diferente Figura 419 mais frequentemente extensos contatos entre os domínios tornam difícil o discernimento entre eles Domínios diferentes em geral têm funções diferentes como a ligação de pequenas moléculas ou interação com outras proteínas Proteínas pequenas normalmente têm somente um domínio o domínio é a proteína O enovelamento dos polipeptídeos é sujeito a uma série de limitações físicas e químicas e várias regras foram pro postas a partir de estudos de padrões comuns de enovela mento proteico 1 As interações hidrofóbicas dão uma grande contri buição para a estabilidade da estrutura de proteí nas O ocultamento dos grupos R dos aminoácidos hidrofóbicos de modo a excluir a água necessita de pelo menos duas camadas de estrutura secun dária Motivos simples como a alça bab Figura 418a criam essas camadas 2 Quando ocorrem juntas em uma proteína as héli ces a e as folhas b geralmente são encontradas em camadas estruturais diferentes Isso porque o seg mento do esqueleto polipeptídico em conformação b Figura 46 não faz com facilidade ligações de hidrogênio com uma hélice a adjacente a ele 3 Segmentos adjacentes na sequência de aminoá cidos normalmente se posicionam de forma adja cente na estrutura dobrada Segmentos distantes do polipeptídeo podem se aproximar na estrutura terciária mas não é a regra 4 A conformação b é mais estável quando os seg mentos individuais são levemente torcidos para a direita Isso influencia tanto o arranjo das folhas b derivado dos segmentos supertorcidos quanto a forma da conexão do polipeptídeo entre elas Duas folhas b paralelas por exemplo devem ser conec tadas por uma fita cruzada Figura 420a Em princípio essa fita pode ter uma conformação no sentido horário ou antihorário mas em proteínas o mais comum é no sentido horário As conexões voltadas para a direita tendem a ser mais curtas do que as conexões voltadas para esquerda e tendem a dobrarse com um ângulo menor o que as torna mais fáceis de serem formadas A torção de folhas Barril b b Alça bab a FIGURA 418 Motivos estruturais a Um motivo simples a alça bab b Um motivo mais elaborado o barril b Este barril b é o único domínio da ahemolisina toxina que mata a célula criando um orifício em sua membra na da bactéria Staphylococcus aureus derivada do PDB ID 7AHL Ca2 FIGURA 419 Domínios estruturais do polipeptídeo troponina C PDB ID 4TNC Esta proteína ligadora de cálcio encontrada no músculo tem dois domínios ligadores de cálcio separados mostrados aqui em marrom e em azul Nelson6ed04indd 137 Nelson6ed04indd 137 070414 1434 070414 1434 138 DAVID L NELSON MICHAEL M COX b também resulta em uma torção característica das estruturas formadas por vários desses segmentos como pode ser observado no barril b Figura 418b e na folha b torcida Figura 420c que forma o nú cleo de várias estruturas maiores Seguindo essas regras motivos complexos podem ser construídos a partir daqueles mais simples Por exemplo uma série de alças bab arranjadas de tal forma que as fitas b de um barril formem um motivo particularmente comum e estável o barril ab Figura 421 Nessa es trutura cada segmento b paralelo é conectado ao seu vizi nho por um segmento ahelicoidal Todas as conexões são voltadas para direita O barril ab é encontrado em diversas enzimas geralmente com um sítio de ligação de um cofa tor ou substrato na forma de uma fenda próxima a uma das extremidades do barril Observe que domínios com padrão semelhante de enovelamento são ditos ter o mesmo motivo mesmo que suas hélices a e fitas b constituintes possam diferir em tamanho Motivos de proteínas são as bases da classificação estrutural Arquitetura proteica Estrutura terciária de proteínas globulares gran des IV Classificação estrutural das proteínas Como se vê a com preensão da complexidade da estrutura terciária é facilitada pela consideração das subestruturas Seguindo essa ideia os pesquisadores organizaram o conteúdo completo de bancos de dados proteicos de acordo com uma hierarquia dos níveis estruturais Todos esses bancos de dados se baseiam nos da dos e nas informações depositados no Protein Data Bank PDB Banco de Dados de Proteínas O banco de dados Structural Classification of Proteins SCOP ou Classificação Estrutural de Proteínas é um bom exemplo desta importante tendência na bioquímica No mais alto nível de classificação o banco de dados SCOP httpscopmrclmbcamacukscop utiliza um esquema já em uso com quatro classes de estrutu ras de proteínas toda a toda b ab com segmentos a e b intercalados ou alternados e a 1 b com regiões a e b um pouco separadas Cada classe inclui dezenas a centenas de diferentes combinações de enovelamentos motivos cons truídas a partir de subestruturas gradativamente identificá veis Alguns desses arranjos subestruturais são bem comuns outros foram encontrados em apenas uma proteína A Figura 422 mostra a variedade desses motivos distribuídos entre as quatro classes de estrutura de proteínas Essa é apenas uma pequena amostra das centenas de motivos conhecidos En tretanto o número de padrões de enovelamento não é infini to À medida que a velocidade na qual novas estruturas de proteínas são elucidadas a fração dessas estruturas que con têm novos motivos tem diminuído Ao todo devem existir menos de 1000 motivos diferentes A Figura 422 também mostra como as proteínas podem ser organizadas em função da presença dos vários motivos Os níveis de organização mais superiores classe e enovelamento são puramente es truturais Abaixo do nível de enovelamento ver o código de cores na Figura 422 a classificação tem como base as rela ções evolutivas Conexões comuns em um motivo de fitas b a Conexões cruzadas raramente observadas Conexões com sentido horário entre as fitas b b Conexões com sentido antihorário entre as fitas b muito raras c Folha b torcida FIGURA 420 Padrões de enovelamento estável em proteínas a Conexões entre fitas b em arranjos de folhas b As fitas aqui são visualizadas a partir de uma extremidade sem torção As linhas mais grossas representam as conexões nas extremidades mais próximas do observador as linhas mais finas representam as conexões nas extremidades mais distantes das fitas b As conexões em uma das extremidades p ex aquelas próximas ao obser vador raramente se cruzam umas com as outras Um exemplo de tal cruza mento raro está ilustrado na fita amarela da estrutura a direita b Devido à torção para a direita nas fitas b as conexões entre as fitas em geral são no sentido horário As conexões no sentido antihorário devem assumir ângulos mais agudos e são mais difíceis de serem formadas c Esta folha b torcida pertence a um domínio da fotoliase proteína que repara certos tipos de da nos ao DNA de E coli derivado do PDB ID 1DNP As alças de conexão foram removidas para que se foque no enovelamento da folha b Alça bab Barril ab FIGURA 421 A construção de domínios maiores a partir dos meno res O barril ab é um domínio que ocorre comumente sendo formado por repetições do motivo alça bab Este barril ab é um domínio da piruvato cinase enzima glicolítica de coelho derivada do PDB ID 1PKN Nelson6ed04indd 138 Nelson6ed04indd 138 070414 1434 070414 1434 1AO6 Albumina sérica Albumina sérica Albumina sérica Albumina sérica Humana Homo sapiens 1GAI Toroide aa Glicosiltransferase de seis grampos Glicoamilas Glicoamilasee Aspergillus awamori variante x100 1BCF Tipo ferritina Tipo ferritina Ferritina Bacterioferritina citocromo b1 Escherichia coli Todo a Identificador no PDB Enovelamento Superfamília Família Proteína Espécie 1CD8 Sanduíche b tipo imunoglobulina Imunoglobulina Conjunto de domínios V tipo domínio variável de anticorpo CD8 Humana Homo sapiens 1LXA Hélice b de fita única antihorária Enzimas tipo LpxA triméricas UDP Nacetilglicosaminaaciltransferase UDP Nacetilglicosaminaaciltransferase Escherichia coli 1PEX Hélice b de quatro pás Domínio tipo hemopexina Domínio tipo hemopexina Colagenase3 MMP13 domínio carboxiterminal Humana Homo sapiens Todo b 1DEH Domínio com enovelamento de Rossmann ligador de NADP Domínio com enovelamento de Rossmann ligador de NADP Domínio carboxiterminal das álcoolglicose desidrogenases Álcooldesidrogenase Humana Homo sapiens 1DUB ClpPcrotonase ClpPcrotonase Tipo crotonase EnoilCoAhidratase crotonase Rato Rattus norvegicus 1PFK Fosfofrutocinase Fosfofrutocinase Fosfofrutocinase Fosfofrutocinase ATPdependente Escherichia coli ab FIGURA 422 Organização das proteínas com base nos motivos Mostrados aqui estão apenas alguns das centenas de motivos estáveis co nhecidos divididos em quatro classes todo a todo b ab e a 1 b Os dados de classificação estrutural do banco de dados SCOP Structural Classification of Proteins httpscopmrclmbcamacukscop também são fornecidos ver código de cores O identificador no PDB listado inicialmente para cada estrutura corresponde ao código único de acesso de cada estrutura depo sitada no Protein Data Bank wwwpdborg O barril ab ver Figura 421 é outro motivo ab particularmente comum Continua na próxima página Nelson6ed04indd 139 Nelson6ed04indd 139 070414 1434 070414 1434 140 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Vários exemplos de domínios recorrentes ou motivos es truturais estão disponíveis revelando que a estrutura ter ciária das proteínas é mais conservada do que suas sequên cias de aminoácidos A comparação entre as estruturas de proteínas pode então fornecer muita informação sobre sua evolução Proteínas com significativa semelhança na estru tura primária eou com estrutura terciária e funções seme lhantes fazem parte de uma mesma família proteica Uma relação evolutiva forte normalmente é evidente em uma fa mília de proteínas Por exemplo a família globina apresenta muitas proteínas diferentes com similaridade estrutural e de sequência com a mioglobina como visto nas proteínas usa das nos exemplos do Quadro 45 e no Capítulo 5 Duas ou mais famílias com pouca similaridade na sequência de ami noácidos algumas vezes utilizam o mesmo motivo estrutural geral e apresentam semelhanças funcionais essas famílias são agrupadas como superfamílias Uma relação evolutiva entre as famílias em uma superfamília é considerada prová vel ainda que as diferenças temporais e funcionais resul tantes de diferentes pressões adaptativas possam ter su primido muitas das relações reveladoras entre sequências Uma família de proteínas pode estar distribuída em todos os três domínios de vida celular Bacteria Archaea e Eukarya sugerindo uma origem remota Muitas proteínas envolvidas no metabolismo intermediário e no metabolismo dos ácidos nucleicos e proteínas se encaixam nessa categoria Outras famílias podem estar presentes somente em um pequeno grupo de organismos indicando que aquela estrutura surgiu mais recentemente Rastrear a história natural dos motivos estruturais usando as classificações estruturais de bancos de dados como o SCOP fornece um grande complemento às análises de sequência na investigação da relação evolutiva O banco de dados SCOP é manualmente gerenciado com o objetivo de colocar as proteínas na sua rede evolutiva cor reta com base nas características estruturais conservadas Motivos estruturais se tornaram especialmente impor tantes na definição de famílias e superfamílias de proteí nas Sistemas aperfeiçoados de classificação e elucidação de proteínas inevitavelmente levaram à elucidação de novas relações funcionais Dada a importância das proteínas nos sistemas vivos essas comparações estruturais podem aju dar no esclarecimento de todos os aspectos da bioquímica da evolução de proteínas individuais até a história evolutiva de rotas metabólicas completas A estrutura quaternária varia de dímeros simples a grandes complexos Arquitetura proteica Estrutura quaternária Muitas proteínas têm múltiplas subunidades polipeptídicas de duas a cente nas A associação das cadeias polipeptídicas pode servir a uma variedade de funções Muitas proteínas com múltiplas subunidades podem ter funções reguladoras a ligação de pequenas moléculas pode afetar a interação entre as subu nidades causando grandes mudanças na atividade da pro teína em resposta a pequenas mudanças na concentração de substrato ou moléculas reguladoras Capítulo 6 Em outros casos subunidades distintas assumem funções dife rentes mas relacionadas como catálise e regulação Algu mas associações como nas proteínas fibrosas consideradas anteriormente neste capítulo e nas proteínas dos capsídeos dos vírus têm principalmente funções estruturais Algu mas associações proteicas muito grandes formam sítios de reações complexas envolvendo múltiplas etapas Por exem plo cada ribossomo o local onde ocorre a síntese de proteí nas incorpora dúzias de subunidades de proteínas com cer to número de moléculas de RNA Uma proteína de múltiplas subunidades também é cha mada de multímero Um multímero com apenas algumas subunidades é chamado de oligômero Se um multímero apresenta subunidades não idênticas a estrutura total da proteína pode ser assimétrica e bem complicada Entretanto a maioria dos multímeros apresenta subunidades idênticas ou grupos de subunidades não idênticas que se repetem ge ralmente em arranjos simétricos Como apresentado no Capí tulo 3 as unidades estruturais de repetição em uma proteína multimérica tanto de um único tipo de subunidade quanto de um grupo de subunidades são chamadas de protômero Muitas vezes são utilizadas letras gregas para distinguir as diferentes subunidades que fazem parte do protômero 2PIL Pilina Pilina Pilina Pilina Neisseria gonorrhoeae 1SYN TimidilatosintasedCMPhidroximetilase TimidilatosintasedCMPhidroximetilase TimidilatosintasedCMPhidroximetilase Timidilatosintase Escherichia coli 1EMA Tipo GFP Tipo GFP Proteínas fluorescentes Proteína verde fluorescente GFP do inglês green fluorescent protein Águaviva Aequorea victoria a 1 b Identificador no PDB Enovelamento Superfamília Família Proteína Espécie FIGURA 422 Continuação Nelson6ed04indd 140 Nelson6ed04indd 140 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 141 A primeira proteína oligomérica que teve sua estrutura tridimensional determinada foi a hemoglobina Mr 64500 que contém quatro cadeias polipeptídicas e quatro grupos prostéticos heme nos quais os átomos de ferro se apre sentam no estado ferroso Fe 21 Figura 417 A porção proteica a globina consiste em duas cadeias 141 resíduos em cada cadeia a e duas cadeias b 146 resíduos em cada cadeia Observe que neste caso a e b não se referem às estruturas secundárias Em uma prática que pode ser con fusa para o aluno iniciante as letras gregas a e b g e d e outras são frequentemente usadas para distinguir dois tipos diferentes de subunidades em uma proteína com múl tiplas subunidades independentemente de quais tipos de estruturas secundárias podem predominar nas subunida des Como a hemoglobina é quatro vezes maior do que a mioglobina foi necessário muito mais tempo e esforço para resolver sua estrutura tridimensional por análise de raios X o que foi finalmente obtido por Max Perutz John Ken drew e seus colegas em 1959 As subunidades da hemoglo bina estão organizadas em pares simétricos Figura 423 Cada par tem uma subunidade a e uma subunidade b A hemoglobina pode portanto ser descrita tanto como tet râmero quanto dímero de protômeros ab O papel dessas subunidades distintas na função da hemoglobina é ampla mente discutido no Capítulo 5 Algumas proteínas ou segmentos proteicos são intrinsecamente desordenados Apesar de décadas de progresso no entendimento da estru tura proteica muitas proteínas não podem ser cristalizadas tornando difícil a determinação de suas estruturas tridi mensionais por métodos considerados clássicos ver Qua dro 45 Mesmo quando cristalizadas partes da proteína estão suficientemente desordenadas no cristal de forma que a estrutura determinada não inclui essas partes Algu mas vezes isso se deve a características sutis da estrutura que tornam a cristalização difícil No entanto a razão pode ser mais simples algumas proteínas ou segmentos protei cos carecem de estruturas ordenadas em solução O conceito de que algumas proteínas funcionam na au sência de uma estrutura definida é um produto da reavalia ção dos dados envolvendo muitas proteínas diferentes Um terço de todas as proteínas humanas pode ser desestrutu rado ou possuem segmentos desestruturados significativos Todos os organismos possuem algumas proteínas que se encaixam nessa categoria As proteínas intrinsecamente desordenadas têm propriedades distintas das proteínas estruturadas clássicas Elas carecem de um núcleo hidrofó bico e ao contrário são caracterizadas por alta densidade de aminoácidos carregados como Lys Arg e Glu Resíduos de Pro também são proeminentes já que eles tendem a romper estruturas ordenadas A desordem estrutural e a alta densidade de cargas po dem facilitar a atividade de algumas proteínas como espa çadores isoladores ou elementos de ligação em estruturas maiores Outras proteínas desordenadas são sequestrado ras ligando íons e moléculas pequenas em solução e servin do de reservatórios ou depósitos de lixo No entanto muitas proteínas intrinsecamente desordenadas são o núcleo de importantes redes de interações proteicas A falta de uma estrutura ordenada pode facilitar um tipo de promiscuida de funcional permitindo a interação de uma proteína com múltiplos parceiros Algumas proteínas intrinsecamente de sordenadas atuam por inibir a atividade de outras proteínas por um mecanismo não usual por envolverse em torno de suas proteínasalvo Uma proteína desordenada pode ter algumas ou mesmo dúzias de proteínas parceiras A desor dem estrutural permite ao inibidor proteico se envolver em torno de múltiplos alvos de diferentes formas A proteína Max Perutz 19142002 esquerda e John Kendrew 19171997 a b FIGURA 423 Estrutura quaternária da desóxihemoglobina PDB ID 2HHB A análise por difração de raios X da desóxihe moglobina hemoglobina sem as moléculas de oxigênio ligadas aos grupos heme mostra como as quatro subunidades polipeptídicas estão agrupadas a Representação na forma de fitas revela os elementos estruturais se cundários da estrutura e a posição de todos os cofatores hemes b Modelo de contorno de superfície mostra a cavidade em que os cofatores hemes estão ligados e ajuda a vi sualizar o empacotamento das subunidades As subunidades a são mostradas em tons de cinza e as subunidades b em tons de azul Observe que os grupos heme em vermelho estão relativamente distantes entre si Nelson6ed04indd 141 Nelson6ed04indd 141 070414 1434 070414 1434 142 DAVID L NELSON MICHAEL M COX intrinsecamente desordenada p27 exerce um papelchave no controle da divisão celular em mamíferos Essa proteína carece de estrutura definida quando em solução Ela se en rola em torno e assim inibe a atividade de várias enzimas chamadas proteínascinases ver Capítulo 6 que facilitam a divisão A estrutura flexível da p27 a permite se acomodar às suas proteínasalvo distintas Células tumorais humanas que são simplesmente células que perderam a capacidade de controlar a divisão celular normalmente geralmente possuem níveis reduzidos de p27 quanto menor o nível de p27 pior é o prognóstico para o paciente de câncer Da mesma forma as proteínas intrinsecamente desordenadas estão frequentemente presentes como concentradores ou suportes no centro de redes proteicas que constituem as vias de sinalização Essas proteínas ou partes delas podem interagir com muitos parceiros diferentes Elas frequen temente assumem uma estrutura quando interagem com outras proteínas mas as estruturas que elas assumem po dem variar de acordo com o parceiro de ligação A proteína de mamíferos p53 também é fundamental no controle da divisão celular Ela tem segmentos estruturados e não es truturados e os segmentos distintos interagem com dúzias de outras proteínas Uma região não estruturada da p53 na extremidade carboxil interage com pelo menos quatro par ceiros diferentes e assume uma estrutura distinta em cada complexo Figura 424 RESUMO 43 Estruturas terciária e quaternária das proteínas c A estrutura terciária é a estrutura tridimensional da cadeia polipeptídica Muitas proteínas se encaixam em uma ou duas classes de proteínas em geral com base na estrutura terciária fibrosa e globular c As proteínas fibrosas utilizadas principalmente para funções estruturais são formadas por elementos de es trutura secundária que se repetem c As proteínas globulares têm estruturas terciárias mais complicadas geralmente contendo diversos tipos de es truturas secundárias na mesma cadeia polipeptídica A primeira estrutura de proteína globular a ser determi nada por métodos de difração de raios X foi a estrutura da mioglobina c As estruturas complexas das proteínas globulares po dem ser analisadas pela observação dos padrões de eno velamento chamados de motivos também chamados de enovelamentos ou estruturas supersecundárias Os milhares de estruturas proteicas conhecidos geralmen te são formados por um repertório de apenas poucas centenas de motivos Os domínios são regiões de uma cadeia polipeptídica que podem se dobrar de forma es tável e independente c A estrutura quaternária resulta de interações entre as subunidades de proteínas com múltiplas subunidades 300 Ciclina A Sirtuína s100B bb 400 100 00 05 Pontuação PONDR 10 200 0 Resíduos de aminoácidos Cterminal Nterminal CBP domínio bromo b c a FIGURA 424 Ligação da região carboxiterminal intrinsecamente desordenada da proteína p53 aos seus ligantes a A proteína p53 é composta por vários segmentos diferentes PDB ID 1XQH Apenas o domí nio central é bem organizado b A sequência linear da proteína p53 está representada na barra colorida O gráfico sobreposto apresenta um diagra ma da pontuação PONDR Predictor of Natural Disordered Regions Previsor de Regiões Naturalmente Desordenadas versus a sequência da proteína PONDR é um dos melhores algoritmos disponíveis para predizer a probabi lidade que um determinado resíduo de aminoácido está em uma região de desordem intrínseca com base na sequência de aminoácidos ao redor e na composição de aminoácidos Uma pontuação de 10 indica uma probabili dade de 100 que a proteína estará desordenada Nesta estrutura proteica o domínio central em bege está organizado As regiões aminoterminal azul e carboxiterminal vermelho estão desordenadas A extremidade da região carboxiterminal tem múltiplos ligadores e ela se dobra quando se liga a cada um deles no entanto a estrutura tridimensional assumida quando ocorre a ligação é diferente para cada uma das interações mostradas e por isso o segmento carboxiterminal resíduos de 11 a 20 está mostrado em cor dife rente em cada complexo ciclina A PDB ID 1H26 sirtuína PDB ID 1MA3 CBP domínio bromo PDB ID 1JSP s100B bb PDB ID 1DT7 Nelson6ed04indd 142 Nelson6ed04indd 142 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 143 multiméricas ou grandes associações de proteínas Al gumas proteínas multiméricas possuem unidades repe tidas formadas por uma única subunidade ou grupos de subunidades cada unidade chamada protômero c Algumas proteínas ou segmentos proteicos são intrin secamente desordenados carecendo de estruturas de finidas Essas proteínas têm composições distintas de aminoácidos que permitem uma estrutura mais flexível Algumas dessas proteínas desordenadas funcionam como componentes estruturais ou sequestradoras ou tras podem interagir com muitas proteínas parceiras servindo como inibidores versáteis ou como componen tes centrais de redes de interação de proteínas 44 Desnaturação e enovelamento das proteínas As proteínas têm uma existência surpreendentemente precá ria Como foi visto a conformação de uma proteína nativa é apenas marginalmente estável Além disso a maioria das pro teínas deve manter certa flexibilidade conformacional para funcionar A manutenção contínua do grupo ativo de proteí nas celulares necessárias em um dado conjunto de condi ções é chamada proteostase A proteostase celular requer a atividade coordenada de vias para síntese e enovelamento de proteínas o redobramento de proteínas parcialmente desdo bradas e o sequestro e degradação de proteínas irreversivel mente desdobradas Em todas as células essas redes envol vem centenas de enzimas e proteínas especializadas Como visto na Figura 425 a vida de uma proteína en globa muito mais do que sua síntese e degradação A estabi lidade marginal da maioria das proteínas pode produzir um balanço tênue entre os estados dobrados e desdobrados À medida que as proteínas são sintetizadas nos ribossomos Capítulo 27 elas devem dobrarse em sua conformação nativa Algumas vezes isso ocorre espontaneamente porém mais frequentemente isso ocorre com a assistência de en zimas e complexos especializados chamados chaperonas Muitos desses mesmos auxiliares do enovelamento atuam para redobrar proteínas que se tornaram transitoriamente desdobradas As proteínas inapropriadamente dobradas frequentemente expõem superfícies hidrofóbicas que as tornam pegajosas conduzindo à formação de agregados inativos Esses agregados podem perder suas funções nor mais mas não são inertes seu acúmulo nas células situa se no centro de doenças que vão de diabetes a doenças de Parkinson e Alzheimer Não surpreendentemente todas as células elaboraram vias de reciclagem eou degradação de proteínas irreversivelmente deformadas Agora serão abordadas as transições entre os estados dobrados e desdobrados e a rede de vias que controlam essas transições A perda de estrutura da proteína resulta na perda de função As estruturas proteicas evoluíram para atuar em determi nados ambientes celulares Condições diferentes daquelas da célula podem resultar em mudanças estruturais grandes ou pequenas na proteína A perda de estrutura tridimensio nal suficiente para causar a perda de função é chamada de desnaturação O estado desnaturado não necessariamen te corresponde ao desdobramento completo da proteína e à randomização da conformação Na maioria das condições as proteínas desnaturadas existem como um conjunto de estados parcialmente dobrados A maioria das proteínas pode ser desnaturada pelo calor que tem efeitos complexos nas muitas interações fracas da proteína principalmente sobre as ligações de hidrogênio Se a temperatura é aumentada lentamente a conformação da proteína em geral permanece intacta até que em uma estreita faixa de temperatura ocorre uma perda abrupta da estrutura e da função Figura 426 A mudança re pentina sugere que o desdobramento é um processo coo perativo a perda de estrutura em uma parte da proteína desestabiliza as outras partes Os efeitos do aquecimento sobre as proteínas não são facilmente preditos As proteí nas altamente termorresistentes de bactérias termofílicas e de arquibactérias evoluíram para funcionar na temperatura das fontes termais 100 oC Mesmo assim as estruturas dessas proteínas diferem pouco de suas proteínas homólo gas de bactérias como a Escherichia coli Não se sabe ao Ribossomo Polipeptídeo nascente Enovelamento intermediário Agregados amorfos Oligômeros Fragmentos peptídicos Fibrilas amiloides Proteína nativa Desdobramento Desdobramento Degradação Agregação Agregação Desagregação Chaperonas Chaperonas Chaperonas Remodelamento Sistema ubiquitina proteossomo Autofagia Enovelamento Fragmentos peptídicos Proteína mal dobrada FIGURA 425 Vias que contribuem para proteostase Três tipos de processos contribuem para proteostase Primeiro as proteínas são sintetiza das no ribossomo Segundo múltiplas vias contribuem para o enovelamento proteico muitas dessas envolvem a atividade de complexos chamados cha peronas As chaperonas incluindo as chaperoninas também contribuem para o redobramento de proteínas parcialmente ou transitoriamente desdo bradas Finalmente proteínas irreversivelmente desdobradas estão sujeitas ao sequestro e à degradação por várias vias adicionais As proteínas desdo bradas e os intermediários proteicos enovelados que escapam do controle de qualidade das chaperonas e das vias de degradação podem agregar for mando tanto agregados desordenados quanto agregados organizados do tipo amiloide que contribuem para doenças e processos de envelhecimento Nelson6ed04indd 143 Nelson6ed04indd 143 070414 1434 070414 1434 144 DAVID L NELSON MICHAEL M COX certo como essas pequenas diferenças garantem a estabili dade estrutural em altas temperaturas As proteínas também podem ser desnaturadas por pHs extremos por certos solventes orgânicos miscíveis como álcool ou acetona por certos solutos como ureia e hidroclo reto de guanidina ou por detergentes Cada um desses agen tes desnaturantes representa um tratamento relativamente brando já que nenhuma ligação covalente da cadeia polipep tídica é rompida Solventes orgânicos ureia e detergentes atuam principalmente rompendo as interações hidrofóbi cas que mantêm o núcleo estável das proteínas globulares a ureia também rompe as ligações de hidrogênio extremos de pH alteram a carga líquida da proteína causando repulsão eletrostática e o rompimento de algumas ligações de hidro gênio As estruturas desnaturadas resultantes desses vários tratamentos não são necessariamente as mesmas A desnaturação frequentemente leva à precipitação de proteínas uma consequência da formação de agregados proteicos pela exposição de superfícies hidrofóbicas asso ciadas Os agregados são com frequência altamente desor denados O precipitado proteico visto após ferver um ovo é um exemplo Agregados mais ordenados também são obser vados em algumas proteínas como será visto A sequência de aminoácidos determina a estrutura terciária A estrutura terciária de uma proteína globular é determi nada por sua sequência de aminoácidos A prova mais im portante disso vem dos experimentos que mostram que a desnaturação de algumas proteínas é reversível Certas proteínas globulares desnaturadas por temperatura extre mos de pH ou agentes desnaturantes reassumem suas es truturas nativas e suas atividades biológicas se retornarem às condições nas quais a conformação nativa é estável Esse processo é chamado de renaturação Um exemplo clássico é a desnaturação e a renaturação da ribonuclease A demonstradas por Christian Anfinsen nos anos 1950 A ribonuclease A purificada desnatura completa mente em uma solução concentrada de ureia na presença de um agente redutor O agente redutor rompe as quatro li gações dissulfeto resultando em oito resíduos Cys e a ureia rompe as interações hidrofóbicas de estabilização desta for ma liberando todo o polipeptídeo de sua conformação do brada A desnaturação da ribonuclease é acompanhada por uma completa perda de atividade catalítica Quando a ureia e o agente redutor são removidos a ribonuclease desnatura da aleatoriamente enrolada se dobra de modo espontâneo em sua estrutura terciária correta com restauração total de sua atividade catalítica Figura 427 O reenovelamento da ribonuclease é tão preciso que as quatro ligações dissul feto intramoleculares são restabelecidas na molécula rena turada nas mesmas posições da ribonuclease nativa Mais tarde resultados semelhantes foram obtidos utilizando a ribonuclease A cataliticamente ativa quimicamente sinteti zada Isso elimina a possibilidade de que algum contaminan te minoritário da preparação da ribonuclease purificada por Anfinsen tenha contribuído para a renaturação da enzima afastando assim qualquer dúvida que poderia restar de que essa enzima se dobra espontaneamente O experimento de Anfinsen forneceu a primeira evidên cia de que a sequência de aminoácidos de uma cadeia po lipeptídica contém todas as informações necessárias para o enovelamento da cadeia em sua estrutura tridimensional nativa Trabalhos posteriores demonstraram que somente uma minoria de proteínas muitas delas pequenas e estáveis por natureza se dobrará espontaneamente em sua forma nativa Apesar de todas as proteínas terem o potencial de se dobrar em sua estrutura nativa muitas delas necessitam de alguma assistência Os polipeptídeos dobramse rapidamente por um processo gradual Nas células vivas as proteínas são construídas a partir dos aminoácidos em uma velocidade muito alta Por exemplo as células de E coli podem fazer uma molécula de proteína Ribonuclease A a 80 100 60 40 20 0 20 40 60 80 100 Ribonuclease A Apomioglobina Temperatura ºC Porcentagem de desdobramento b 80 100 60 40 20 0 1 2 3 4 5 GdnHCl M Porcentagem de desdobramento Tm Tm FIGURA 426 Desnaturação de proteínas Os resultados correspondem a proteínas desnaturadas por duas modificações diferentes em seus ambientes Em cada caso a transição entre o estado dobrado e o estado não dobrado é abrupta sugerindo cooperatividade neste processo a Desnaturação térmica da apomioglobina mioglobina sem o grupo prostético heme de cavalo e da ribonuclease A com suas ligações dissulfeto intactas ver Figura 427 O ponto médio da faixa de temperatura em que ocorre a desnaturação é chamado de temperatura de fusão ou Tm A desnaturação da apomioglobina foi monitora da por dicroísmo circular ver Figura 410 que mede a quantidade de estrutu ra helicoidal na proteína A desnaturação da ribonuclease A foi acompanhada pelo monitoramento das mudanças na fluorescência intrínseca da proteína que é afetada pelas mudanças no ambiente dos resíduos de Trp b Desnatu ração da ribonuclease A com suas ligações dissulfeto intactas pelo hidroclore to de guanidina GdnHCl monitorado por dicroísmo circular Nelson6ed04indd 144 Nelson6ed04indd 144 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 145 completa biologicamente ativa com 100 resíduos de ami noácidos em 5 segundos a 37 oC No entanto a síntese das ligações peptídicas no ribossomo não é suficiente a pro teína deve dobrarse Como a cadeia polipeptídica chega à sua conformação nativa Suponhase de forma conservadora que cada um dos resíduos de aminoácidos pode assumir em média 10 conformações diferentes resultando em 10 100 conforma ções diferentes do polipeptídeo Suponhase também que a proteína se dobra espontaneamente por um processo aleatório no qual ela testa todas as conformações possí veis em torno de cada uma das ligações de seu esqueleto até encontrar sua forma nativa biologicamente ativa Se cada conformação fosse testada no menor tempo possível 10 13 segundos ou o tempo necessário para uma única vibração molecular levaria aproximadamente 10 77 anos para testar todas as possíveis conformações Claramente o enovelamento de proteínas não é um processo comple tamente aleatório de tentativa e erro Deve haver atalhos Esse problema foi apontado pela primeira vez por Cyrus Levinthal em 1968 sendo algumas vezes chamado de pa radoxo de Levinthal A rota de enovelamento de uma cadeia polipeptídica grande é muito complicada No entanto rápido progresso tem sido feito nesse campo o suficiente para produzir al goritmos robustos que podem frequentemente predizer a estrutura de proteínas menores com base em suas sequên cias de aminoácidos As principais vias de enovelamento são hierárquicas As estruturas secundárias locais se formam primeiro Certas sequências de aminoácidos se dobram prontamente em hélices a ou folhas b guiadas por restri ções como aquelas revisadas na discussão sobre estruturas secundárias Interações iônicas envolvendo grupos carre gados que normalmente estão próximos na sequência linear da cadeia polipeptídica podem ter um papel importante no direcionamento dos primeiros passos de enovelamento O arranjo de estruturas locais é seguido por interações de longo alcance entre por exemplo elementos da estrutura secundária que se aproximam para formar estruturas eno veladas estáveis As interações hidrofóbicas exercem um papel significativo ao longo do processo já que a agregação das cadeias laterais de aminoácidos apolares fornece uma estabilização entrópica a intermediários e por fim à estru tura enovelada final O processo continua até a formação de domínios completos e até que todo o polipeptídeo esteja dobrado Figura 428 Proteínas nas quais predominam as interações de curto alcance entre pares de resíduos ge ralmente localizados próximos um do outro na sequência polipeptídica tendem a se dobrar mais rapidamente do que 26 Remoção da ureia e do mercaptoetanol Adição de ureia e mercaptoetanol 84 40 95 110 58 65 72 110 95 HS HS HS HS HS SH SH SH 72 65 58 40 26 84 40 26 84 65 72 58 110 95 Estado nativo cataliticamente ativo Estado não dobrado inativo Ligações dissulfeto transversais reduzidas gerando resíduos Cys Estado nativo cataliticamente ativo Ligações dissulfeto transversais corretamente refeitas FIGURA 427 Renaturação da ribonuclease desnaturada e desdobra da A ureia desnatura a ribonuclease e o mercaptoetanol HOCH2CH2SH a reduz rompendo as ligações dissulfeto e liberando os oito resíduos de Cys A renaturação envolve o restabelecimento correto das ligações dissulfeto transversais MTYKLIL NGKTLKGE TTTEAVDAATAEKV FKQYANDN GVDGEWT YDDATKTF TVTE Sequência de aminoácidos de um peptídeo de 56 resíduos 815 617 2839 4354 4156 2856 156 120 3037 4552 FIGURA 428 Uma via de enovelamento proteico definida para uma proteína pequena Uma via hierárquica é mostrada com base em modela gem computacional Primeiro pequenas regiões de estrutura secundária são agrupadas e então gradualmente incorporadas em estruturas maiores O pro grama usado para este modelo tem tido muito êxito na predição da estrutura tridimensional de pequenas proteínas a partir de sua sequência de aminoáci dos Os números indicam os resíduos de aminoácidos desse peptídeo de 56 resíduos que adquiriu sua estrutura final em cada uma das etapas mostradas Nelson6ed04indd 145 Nelson6ed04indd 145 070414 1434 070414 1434 146 DAVID L NELSON MICHAEL M COX proteínas com padrões de enovelamento mais complexos e com mais interações de longo alcance entre os diferentes segmentos À medida que as proteínas com múltiplos do mínios são sintetizadas domínios próximos à extremidade aminoterminal sintetizadas primeiro podem se dobrar an tes do polipeptídeo inteiro ter sido montado Termodinamicamente o processo de enovelamento pode ser visto como um tipo de funil de energia livre Figura 429 Os estados não dobrados são caracterizados por um alto grau de entropia conformacional e energia livre relati vamente alta À medida que o enovelamento ocorre o es treitamento do funil reflete a diminuição do espaço confor macional que deve ser procurado à medida que a proteína se aproxima de seu estado nativo As pequenas depressões ao longo das paredes do funil de energia livre representam intermediários semiestáveis que podem tornar o processo de enovelamento um pouco mais lento No fundo do funil o conjunto de intermediários dobrados é reduzido a uma única conformação nativa ou a um pequeno conjunto de confor mações nativas Os funis podem ter uma variedade de for mas dependendo da complexidade da via de enovelamento da existência de intermediários semiestáveis e do potencial de intermediários em particular se reunirem em agregados de proteínas erroneamente dobradas Figura 429 A estabilidade termodinâmica não é igualmente distri buída na estrutura da proteína a molécula tem regiões de relativamente alta estabilidade e outras de estabilidade baixa ou desprezível Por exemplo uma proteína pode ter dois domínios estáveis ligados por um segmento inteira mente desordenado Regiões de menor estabilidade podem permitir à proteína alterar sua conformação entre dois ou mais estados Como será visto nos próximos dois capítulos variações na estabilidade em regiões de uma proteína são com frequência essenciais para sua função Proteínas ou segmentos proteicos intrinsecamente desordenados não se dobram de forma alguma À medida que o entendimento sobre estrutura e eno velamento de proteínas evolui programas computacionais sofisticados para a predição da estrutura das proteínas a partir da sequência de aminoácidos têm sido desenvolvi dos A predição da estrutura tridimensional das proteínas é uma das especialidades da bioinformática e os progressos nessa área são monitorados com um teste bianual chama do de competição CASP Critical Assessment of Structural Prediction ou Avaliação Crítica da Predição Estrutural Grupos de diversas partes do mundo tentam predizer a estrutura de certa proteína cuja estrutura já foi deter minada mas ainda não foi publicada Os grupos que têm mais sucesso são convidados a apresentar seus resultados na conferência da CASP O sucesso desses esforços está melhorando rapidamente Algumas proteínas se dobram de forma assistida Nem todas as proteínas se dobram espontaneamente à me dida que são sintetizadas dentro da célula O enovelamento de muitas proteínas necessita de chaperonas proteínas que interagem com polipeptídeos parcialmente dobrados ou dobrados de forma incorreta facilitando os mecanismos de enovelamento correto ou garantindo um microambien te adequado para ocorrer o enovelamento Vários tipos de chaperonas moleculares foram encontrados em organismos que vão desde bactérias até humanos As duas principais famílias de chaperonas ambas bem estudadas são a família da Hsp70 e as chaperoninas A família de proteínas Hsp70 geralmente tem massa molecular próxima de 70000 e são abundantes em células submetidas a altas temperaturas por isso a denomina a b c d N N N N FIGURA 429 Termodinâmica do enovelamento proteico mostrado como funil de energia livre À medida que as proteínas se dobram o espaço conformacional que pode ser explorado pela estrutura fica restrito Este é modelado como funil termodinâmico tridimensional com DG repre sentado como profundidade e com a estrutura nativa N no fundo ponto de menor energialivre O funil para determinada proteína pode ter uma variedade de formas dependendo do número e dos tipos de intermediá rios de enovelamento nas vias de enovelamento Qualquer intermediário de enovelamento com estabilidade significativa e um tempo de vida finita estaria representado como um mínimo de energialivre local uma depres são na superfície do funil a Um funil simples mas relativamente amplo e suave representa uma proteína com múltiplas vias de enovelamento ou seja a ordem em que as partes distintas da proteína se dobram seria de al guma forma aleatória mas que assume suas estruturas tridimensionais sem intermediários de enovelamento com estabilidade significativa b Este funil representa uma proteína mais comum com múltiplos intermediários de eno velamento possíveis com estabilidade significativa nas várias vias que levam à estrutura nativa c Uma proteína com estrutura nativa estável essencial mente sem intermediários de enovelamento com estabilidade significativa e apenas uma ou muito poucas vias de enovelamento produtivo está mos trada como um funil com uma depressão estreita levando à forma nativa d Uma proteína com intermediários de enovelamento com estabilidade substancial em praticamente qualquer via que leva ao estado nativo ou seja uma proteína na qual um motivo ou domínio particular sempre se dobra rapidamente mas as outras partes da proteína se dobram mais lentamente e em ordem aleatória está representada por um funil com uma depressão principal ao redor da depressão que leva à forma nativa Nelson6ed04indd 146 Nelson6ed04indd 146 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 147 ção proteínas de choque térmico do inglês heat shock proteins de Mr 70000 ou Hsp70 As proteínas Hsp70 se ligam a regiões não dobradas do peptídeo rico em resíduos hidrofóbicos Dessa forma essas chaperonas protegem da desnaturação pela temperatura tanto as moléculas de proteína quanto as novas moléculas de peptídeo que es tão sendo sintetizadas e ainda não estão dobradas As proteínas Hsp70 também bloqueiam o enovelamento de certas proteínas que devem permanecer não dobradas até que sejam deslocadas através da membrana como des crito no Capítulo 27 Algumas chaperonas também faci litam o arranjo quaternário de proteínas oligoméricas As proteínas Hsp70 se ligam aos polipeptídeos e os liberam em um ciclo que utiliza a energia da hidrólise do ATP e envolve diversas outras proteínas incluindo uma classe chamada de Hsp40 A Figura 430 ilustra um enovela mento assistido por chaperona como o elucidado para as chaperonas Hsp70 e Hsp40 eucarióticas A ligação de um peptídeo não dobrado à chaperona Hsp70 pode quebrar um agregado proteico ou prevenir a formação de um novo agregado Quando o peptídeo ligado é liberado ele tem a chance de retomar o enovelamento à sua estrutura nativa Se o enovelamento não ocorrer rápido o suficiente o po lipeptídeo pode ser ligado de novo e o processo se repete Alternativamente o polipeptídeo ligado a Hsp70 pode ser entregue a uma chaperonina Chaperoninas são complexos elaborados de proteínas necessários para o enovelamento de algumas proteínas celulares que não se dobram espontaneamente Em E coli estimase que de 10 a 15 das proteínas celulares ne cessitam do sistema de chaperoninas residentes chama do de GroELGroES para o enovelamento nas condições normais mais de 30 precisam de assistência quando as células são submetidas ao estresse por calor Em eucario tos o sistema de chaperoninas análogo chamase Hsp60 As chaperoninas se tornaram conhecidas quando foram consideradas necessárias para o crescimento de certos ví rus bacterianos por isso a designação Gro de growth Essa família de proteínas é estruturada como uma série de anéis de múltiplas subunidades formando duas câma ras orientadas uma de costas para a outra Uma proteína desdobrada primeiro se liga a uma superfície hidrofóbica exposta próxima a extremidade apical de uma câmara GroEL A proteína é então presa dentro da câmara fecha da transitoriamente pela tampa GroES Figura 431 A GroEL sofre mudanças conformacionais substanciais associadas à hidrólise lenta de ATP que também regula a ligação e a liberação de GroES Dentro da câmara uma proteína tem cerca de 10 segundos para se dobrar o tem po necessário para a hidrólise do ATP ligado A restrição de uma proteína dentro da câmara previne a agregação proteica inapropriada e também restringe o espaço con formacional que a cadeia polipeptídica pode explorar à medida que ela se enovela A proteína é liberada quando GroES se dissocia mas pode religar rapidamente para ou tro ciclo se o enovelamento não tiver sido completo As duas câmaras em um complexo GroEL se alternam na liga ção e liberação dos substratos polipeptídicos Em eucario tos o sistema Hsp60 utiliza um sistema semelhante para o enovelamento de proteínas No entanto em vez da tampa GroES protrusões dos domínios apicais das subunidades se flexionam e fecham a câmara O ciclo hidrolítico do ATP também é mais lento nos complexos Hsp60 dando mais tempo à proteína retida na câmara para o enovelamento Finalmente as rotas de enovelamento de algumas pro teínas requerem duas enzimas que catalisam reações de isomerização A proteína dissulfetoisomerase PDI é uma enzima amplamente distribuída que catalisa a inter conversão ou modificação de ligações dissulfeto até que as ligações da conformação nativa sejam formadas Entre suas funções a PDI catalisa a eliminação de intermediá rios dobrados com ligações dissulfeto transversais inade quadas A peptídeoprolilcistransisomerase PPI catalisa a interconversão de isômeros cis e trans de liga ções peptídicas de resíduos de Pro Figura 48 que pode representar um passo lento no enovelamento de proteínas que contêm algumas ligações peptídicas com Pro na con formação cis Intermediário de enovelamento ATP ADP Pi ATP Proteína Agregados Proteína nativa NEF Hsp40 Hsp70ATP aberta Baixa afinidade Hsp70ADP fechada Alta afinidade FIGURA 430 As chaperonas no enovelamento proteico A rota pela qual as chaperonas da classe Hsp70 se ligam aos polipeptídeos e os liberam é ilustrada pelas chaperonas eucarióticas Hsp70 e Hsp40 As chaperonas não promovem diretamente o enovelamento da proteína mas evitam a forma ção de agregados de peptídeos não dobrados As proteínas não dobradas ou parcialmente dobradas primeiro se ligam à forma aberta da Hsp70 ligada ao ATP PDB ID 2QXL A Hsp40 então interage com esse complexo e induz a hidrólise do ATP produzindo a forma fechada do complexo derivado de PDB ID 2KHO e 1DKZ na qual os domínios coloridos em cor de laranja e amarelo estão juntos como as duas partes de uma mandíbula mantendo presas par tes da proteína desdobrada A dissociação do ADP e a reciclagem de Hsp70 requer a interação com outra proteína um fator de troca de nucleotídeo NEF Em uma população de moléculas de polipeptídeos alguma fração das moléculas liberadas após a ligação transitória das proteínas parcialmente dobradas pela Hsp70 assumirá a conformação nativa As remanescentes são novamente ligadas pela Hsp 70 ou desviadas para o sistema das chapero ninas Hsp60 ver Figura 431 Em bactérias as chaperonas Hsp70 e Hsp40 são chamadas DnaK e DnaJ respectivamente DnaK e DnaJ foram primeiro identificadas como proteínas necessárias para a replicação in vitro de certas moléculas de DNA viral por isso a designação Dna Nelson6ed04indd 147 Nelson6ed04indd 147 070414 1434 070414 1434 148 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Defeitos no enovelamento proteico fornecem a base molecular para uma ampla gama de doenças genéticas em humanos Apesar da participação de muitos processos que assis tem o enovelamento proteico erros podem ocorrer De fato o enovelamento proteico errado é um problema subs tancial para a célula e um quarto ou mais de todos os poli peptídeos sintetizados é destruído por não se dobrar correta mente Em alguns casos os erros de enovelamento causam ou contribuem para o desenvolvimento de doenças graves Muitas condições incluindo diabetes do tipo 2 doença de Alzheimer doença de Huntington e doença de Parkinson estão associadas com um mecanismo de enovelamento errô neo uma proteína solúvel normalmente secretada pela célula é secretada em um estado de enovelamento errado sendo convertida em uma fibra amiloide extracelular insolúvel As doenças são coletivamente chamadas de amiloidoses As fibras são altamente ordenadas e não ramificadas com um diâmetro de 7 a 10 nm e alto conteúdo de estruturas do tipo folha b Os segmentos b são orientados de forma perpendicu lar ao eixo da fibra Em algumas fibras amiloides a estrutura geral apresenta duas camadas de folhas b longas como aque la mostrada para o peptídeo bamiloide na Figura 432 Muitas proteínas podem assumir a estrutura da fibrila amiloide como alternativa para sua conformação dobrada normal e a maioria dessas proteínas tem grande concentra ção de resíduos de aminoácidos aromáticos em uma região central das folhas b ou hélice a As proteínas são secreta das em uma conformação não totalmente dobrada O núcleo ou parte dele se dobra em uma folha b antes que o resto da proteína se dobre corretamente e as folhas b de duas ou mais moléculas de proteínas com enovelamento incompleto se associam para começar a formação de uma fibrila amiloi de A fibrila cresce no espaço extracelular Outras partes da proteína então se dobram de forma diferente ficando exter nas ao núcleo de folhas b da fibrila em formação O efeito dos aminoácidos aromáticos na estabilização da estrutura é mos trado na Figura 432c A maioria das moléculas proteicas se dobra corretamente por isso o surgimento dos sintomas das amiloidoses geralmente é muito lento Se uma pessoa herda uma mutação como a substituição de um resíduo aromático em uma posição que favorece a formação de fibrilas amiloi des os sintomas da doença podem começar mais cedo ATP ATP ATP ATP ADP ADP ADP ADP ADP ADP GroES GroES GroEL ADP ADP ADP ADP ADP ADP 7Pi 7Pi 7 ATP 7 7 7 b a Proteína nativa Intermediário de enovelamento lento ou Intermediário de enovelamento entregue pela Hsp70ADP Intermediário de enovelamento entregue pela Hsp70ADP ATP ATP ATP ATP ATP ATP Hidrólise de ATP Hidrólise de ATP DP ADP ADP ADP ADP ATP ATP ATP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ADP ADP ADP ADP FIGURA 431 As chaperoninas no enovelamento de proteínas a Mecanismo de ação proposto para as chaperoninas GroEL membro da famí lia de proteínas Hsp60 e GroES de E coli Cada complexo GroEL consiste em dois anéis heptaméricos que formam duas câmaras grandes cada subuni dade com Mr 57000 A GroES também um heptâmero subunidades de Mr 10000 bloqueia a entrada de uma das câmaras na GroEL depois da ligação dentro da câmara de uma proteína desdobrada A câmara com a proteína desdobrada é designada como cis o oposto é designado trans O enove lamento ocorre no interior da câmara cis durante o tempo que leva para hidrolisar os 7 ATP ligados às subunidades no anel heptamérico As molécu las de GroES e de ADP então se dissociam e a proteína é liberada As duas câmaras do sistema GroELHsp60 alternam a ligação e facilitam o enovela mento das proteínas clientes b Imagens da superfície e corte longitudinal do complexo GroELGroES PDB ID 1AON O corte abaixo ilustra o grande espaço interno no qual as outras proteínas se ligam Nelson6ed04indd 148 Nelson6ed04indd 148 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 149 Em eucariotos as proteínas destinadas à secreção ini ciam seu enovelamento no retículo endoplasmático RE conferir via no Capítulo 27 Quando ocorrem condições de estresse ou quando a síntese proteica ameaça sobrecar regar a capacidade de enovelamento proteico do RE pode ocorrer o acúmulo de proteínas desdobradas Essas condi ções disparam a resposta a proteínas não dobradas UPR de unfolded protein response Um conjunto de regulado res transcricionais que constituem a UPR alinha os vários sistemas por aumentar a concentração de chaperonas no RE ou por diminuir a taxa global de síntese proteica ou am bos Os agregados amiloides que se formam antes da UPR podem ser removidos Alguns são degradados por autofa gia Nesse processo eles são primeiro encapsulados em uma membrana e então o conteúdo da vesícula resultante é degradado após a fusão com um lisossomo citosólico Al ternativamente as proteínas erroneamente dobradas po dem ser degradadas por um sistema de proteases chamado sistema ubiquitinaproteossomo descrito no Capítulo 27 Defeitos em qualquer um desses sistemas diminuem a ca pacidade de lidar com proteínas erroneamente dobradas e aumentam a propensão para o desenvolvimento de doenças amiloides Algumas amiloidoses são sistêmicas envolvendo vários tecidos A mais simples é causada pela deposição de fibrilas formadas por cadeias leves de imunoglobulinas com enovela mento incorreto ver Capítulo 5 ou fragmentos de cadeias leves derivados da degradação proteolítica A idade média de aparecimento é de 65 anos Os pacientes têm sintomas como fadiga rouquidão inchaço e perda de peso e muitos morrem dentro de um ano após o diagnóstico Os rins e o coração geralmente são os órgãos mais afetados Algumas amiloido ses estão associadas com outros tipos de doenças Indiví duos com certas infecções crônicas ou doenças inflamatórias como artrite reumatoide tuberculose fibrose cística e alguns cânceres podem ter um grande aumento de secreção de um polipeptídeo próamiloide chamado de proteína amiloide sé rica A SAA do inglês serum amyloid A Essa proteína ou fragmentos dessa proteína se deposita no tecido conectivo do baço dos rins do fígado e ao redor do coração Indivíduos com essa condição conhecida como amiloidose sistêmica se cundária apresentam inúmeros sintomas dependendo dos órgãos inicialmente afetados A doença geralmente é fatal dentro de poucos anos Mais de 80 amiloidoses estão associa das com mutações na transtirretina proteína que se liga aos hormônios da tireoide e os transporta distribuindoos pelo corpo e cérebro Uma grande variedade de mutações nessa proteína leva à deposição amiloide concentrada ao redor de diferentes tecidos produzindo assim diferentes sintomas As amiloidoses também estão associadas com mutações here ditárias nas proteínas lisozima cadeia a do fibrinogênio A e apolipoproteínas AI e AII todas descritas nos capítulos posteriores Algumas doenças amiloides estão associadas com ór gãos específicos A proteína próamiloide geralmente é se cretada somente pelos tecidos afetados e sua alta concen tração local leva à deposição de amiloide ao redor do tecido embora algumas proteínas possam estar sistematicamente distribuídas Um lugar comum de deposição de amiloide é próximo às células das ilhotas b pancreáticas responsáveis pela secreção de insulina e regulação do metabolismo de glicose ver Figura 2326 A secreção pelas células b de um pequeno peptídeo 37 aminoácidos chamado de poli peptídeo amiloide das ilhotas PPAI ou IAPP do inglês islet amyloid polypeptide pode levar à deposição de amiloide ao redor das ilhotas destruindo gradualmente as células Um adulto saudável tem de 1 a 15 milhão de células b pan creáticas Com a perda progressiva dessas células a home Nativa Mal dobrada ou parcialmente desdobrada Autoassociação Desnaturada b c a Estrutura central da fibrila amiloide Outros arranjos de protofilamentos Peptídeo bamiloide Fibrilas amiloides Phe FIGURA 432 Formação das fibrilas amiloides causadoras de doenças a Moléculas de proteínas cuja estrutura normal inclui regiões de folhas b passam por enovelamento parcial Em um pequeno número de moléculas antes do enovelamento completo as regiões de folhas b de um polipeptídeo se associam com a mesma região de outro polipeptídeo formando o núcleo de um amiloide Outras moléculas de proteína lentamente se associam ao amiloide e o estendem para formar uma fibrila b O peptídeo bamiloide inicia como dois segmentos ahelicoidais de uma proteína maior A clivagem proteolítica desta proteína maior libera o peptídeo bamiloide relativamente instável que perde sua estrutura ahelicoidal Ele pode então lentamente ser organizado em fibrilas amiloides c que contribuem para as placas caracte rísticas no exterior do tecido nervoso das pessoas com doença de Alzheimer As cadeias laterais aromáticas mostradas aqui exercem um papel significativo na estabilização da estrutura amiloide A estrutura amiloide é rica em folhas b com as fitas b arranjadas perpendicularmente ao eixo da fibrila amiloide O peptídeo bamiloide assume a forma de duas camadas de folhas b paralelas estendidas Alguns peptídeos formadores de amiloide podem se dobrar na forma de hélices b voltadas para esquerda ver Figura 422 Nelson6ed04indd 149 Nelson6ed04indd 149 070414 1434 070414 1434 150 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ostase de glicose é afetada e no final quando 50 ou mais células são perdidas a condição evolui para diabetes melito do tipo 2 independente de insulina As doenças de deposição amiloide que induzem neuro degeneração especialmente em adultos idosos são uma classe especial de amiloidoses localizadas A doença de Alzheimer está associada com deposição amiloide extra celular pelos neurônios envolvendo o peptídeo amiloide b Figura 432b derivado de uma grande proteína trans membrana proteína precursora de amiloide b encontra da na maioria dos tecidos humanos Quando ele faz parte de uma proteína maior o peptídeo é composto por dois segmentos ahelicoidais que atravessam a membrana Quando os domínios externos e internos são clivados por proteases específicas o peptídeo bamiloide relativamen te instável deixa a membrana e perde sua estrutura ahe licoidal Ele pode então tomar a forma de duas camadas de folhas b paralelas estendidas que lentamente podem se reunir em fibrilas amiloides Figura 432c O depó sito dessas fibras amiloides parece ser a causa primária da doença de Alzheimer mas um segundo tipo de agrega do do tipo amiloide envolvendo a proteína chamada tau também ocorre intracelularmente nos neurônios em pessoas com doença de Alzheimer Mutações hereditárias na proteína tau não resultam em Alzheimer mas causam demência frontotemporal e parkinsonismo condição com sintomas que lembram a doença de Parkinson que pode ser igualmente devastadora Várias outras condições neurodegenerativas envolvem agregação intracelular de proteínas com enovelamento errado Na doença de Parkinson a forma mal dobrada da proteína asinucleína se agrega em massas esféricas filamentosas chamadas de corpos de Lewy A doença de Huntington envolve a proteína huntingtina que tem uma longa repetição de poliglutaminas Em alguns indivíduos essa repetição é maior do que o normal ocorrendo um tipo de agregação intracelular mais sutil Notavelmen te quando proteínas mutantes humanas envolvidas nas doenças de Parkinson e Huntington são expressas em Drosophila melanogaster as moscas demonstram de generação expressa como deterioração dos olhos tremo res e morte precoce Todos esses sintomas são altamente suprimidos se a expressão da chaperona Hsp70 também estiver aumentada Uma proteína cerebral dobrada de forma errada parece ser o agente causador de doenças cerebrais neurodege nerativas raras em mamíferos Talvez a mais conhecida seja a encefalopatia espongiforme bovina EEB ou BSE do inglês bovine spongiform encephalopathy também conhecida como doença da vaca louca Doenças relacio nadas incluem a kuru e a doença de CreutzfeldtJakob em humanos scrapie em ovinos e doença debilitante crônica em cervos e alces Essas doenças também são conhecidas como encefalopatias espongiformes porque o cérebro doente frequentemente se torna cheio de bura cos Figura Q1 A deterioração progressiva do cérebro leva a um espectro de sintomas neurológicos incluindo perda de peso comportamento errático problemas de postura equilíbrio e coordenação e perda da capacidade cognitiva Essas doenças são fatais Nos anos de 1960 pesquisadores descobriram que amostras de agentes causadores de doença pareciam não conter ácidos nucleicos Naquela época Tikvah Alper su geriu que o agente fosse uma proteína Inicialmente a ideia pareceu uma heresia Todos os agentes causadores de doenças conhecidos até aquele momento vírus bac térias fungos e assim por diante continham ácidos nu cleicos e sua virulência estava relacionada à reprodução genética e propagação Entretanto quatro décadas de investigações realizadas mais notavelmente por Stanley Prusiner forneceram evidências de que as encefalopatias espongiformes são diferentes Os agentes infecciosos foram identificados como uma única proteína Mr 28000 que Prusiner apelidou de proteína príon PrP O nome foi derivado de protei naceous infectious proteína infecciosa mas Prusiner achou que príon soava melhor do que proin A pro teína príon é um constituinte normal do tecido cerebral em todos os mamíferos Seu papel não é conhecido em detalhes mas deve ter uma função de sinalização mole cular Linhagens de camundongos sem o gene para PrP e por isso sem a proteína sofrem efeitos maléficos não óbvios A doença ocorre somente quando a PrP celular normal ou PrP C apresenta uma conformação alterada chamada de PrP Sc Sc significa scrapie A estrutura de PrP C caracterizase por duas hélices a A estrutura de QUADRO 46 MEDICINA Morte por enovelamento errado as doenças priônicas FIGURA Q1 Secção corada de córtex cerebral da necropsia de um paciente com a doença de CreutzfeldtJakob mostra a degeneração es pongiforme vacuolar a característica neurohistológica mais comum Os vacúolos amarelados são intracelulares e ocorrem majoritariamente em processos pré e póssinápticos de neurônios Os vacúolos nesta secção variam de 20 a 100 mm em diâmetro Nelson6ed04indd 150 Nelson6ed04indd 150 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 151 O mal enovelamento proteico não necessariamente sig nifica que a formação de amiloide cause doenças sérias Por exemplo a fibrose cística é causada por defeitos em uma proteína de membrana chamada de reguladora transmem brana da fibrose cística CFTR do inglês cystic fibrosis transmembrane conductance que atua como canal de íons cloreto A mutação mais comum que causa a fibrose cística é uma deleção de um resíduo Phe na posição 508 da CFTR que causa o enovelamento inapropriado da pro teína A maior parte dessa proteína é então degradada e sua função normal é perdida ver Quadro 112 Muitas das doenças relacionadas com mutações no colágeno p 130 também causam um enovelamento defeituoso Um tipo par ticular e famoso de enovelamento errado de proteína pode ser visto nas doenças priônicas Quadro 46 RESUMO 44 Desnaturação e enovelamento das proteínas c A manutenção do estado estável da coleção de proteínas celulares ativas necessárias em um conjunto de condi ções específicas chamada proteoestase envolve um conjunto elaborado de vias e processos que dobram re dobram e degradam cadeias polipeptídicas c A estrutura tridimensional e a função da maioria das proteínas podem ser destruídas pela desnaturação de monstrando uma relação entre estrutura e função Algu mas proteínas desnaturadas podem renaturar esponta neamente para formar proteínas biologicamente ativas mostrando que as estruturas terciárias são determina das pela sequência de aminoácidos c O enovelamento de proteínas nas células é geralmente hierárquico Inicialmente regiões de estrutura secundá ria podem se formar o que é seguido pelo enovelamento em motivos e domínios Grandes conjuntos de interme diários dobrados são rapidamente conduzidos a uma única conformação nativa c Para muitas proteínas o enovelamento é facilitado por chaperonas Hsp70 e por chaperoninas A formação de li gações dissulfeto e a isomerização cistrans de ligações peptídicas contendo Pro são catalisadas por enzimas es pecíficas c O enovelamento errado é a base molecular de uma grande variedade de doenças humanas incluindo as amiloidoses PrP Sc é muito diferente com a maior parte da estrutu ra convertida em folhas b semelhante à amiloide Figura Q2 A interação da PrP Sc com a PrP C converte a última em PrP Sc iniciando um efeito dominó no qual cada vez mais proteínas do cérebro se convertem na forma cau sadora da doença O mecanismo pelo qual a presença de PrP Sc resulta em encefalopatia espongiforme não é co nhecido A forma hereditária das doenças priônicas uma mu tação no gene que codifica a PrP produz uma mudança em um resíduo de aminoácido que acreditase tornar a conversão de PrP C em PrP Sc mais favorável Um completo entendimento das doenças priônicas aguarda novas in formações de como uma proteína príon afeta as funções cerebrais Informações estruturais sobre PrP estão come çando a fornecer indicativos quanto ao processo mole cular que permite às proteínas priônicas interagirem de forma a alterar sua conformação Figura Q2 PrPc Hélice C Hélice A Hélice C Hélice B Hélice C Hélice C Hélice C Hélice B Hélice B Hélice B Hélice B PrPSc modelo Proteína príon humana PrP Agregado de PrPSc modelo FIGURA Q2 Estrutura do domínio globular de uma PrP humana PDB ID 1QLX e dos modelos de PrP Sc mal dobrada na conformação causado ra de doença e de um agregado PrP Sc As hélices a estão marcadas para ajudar a ilustrar a mudança conformacional A hélice A é incorporada na estrutura da folha b da conformação mal dobrada Nelson6ed04indd 151 Nelson6ed04indd 151 070414 1434 070414 1434 152 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário conformação 115 conformação nativa 116 interações hidrofóbicas 116 camada de solvatação 116 grupo peptídico 118 diagrama de Ramachandran 119 estrutura secundária 119 hélice a 120 conformação b 123 folha b 123 volta b 123 espectroscopia de dicroísmo circular CD 125 estrutura terciária 125 estrutura quaternária 125 proteínas fibrosas 125 proteínas globulares 125 aQueratina 126 colágeno 127 fibroína da seda 130 Protein Data Bank PDB 132 motivo 137 enovelamento 137 domínio 137 família proteica 140 multímero 140 oligômero 140 protômero 140 proteínas intrinsecamente desordenadas 141 proteoestase 143 desnaturação 143 renaturação 144 chaperonas 146 Hsp70 146 chaperonina 146 proteína dissulfeto isomerase PDI 147 peptidilprolilcistrans isomerase PPI 147 amiloide 148 amiloidoses 148 autofagia 149 príon 150 Leituras adicionais Geral Anfinsen CB 1973 Principles that govern the folding of protein chains Science 181 223230 O autor revisa seu trabalho clássico sobre ribonuclease Creighton TE 1993 Proteins Structure and Molecular Properties 2 nd edn W H Freeman and Company New York Fonte abrangente e confiável Kendrew JC 1961 The threedimensional structure of a protein molecule Sci Am 205 December 96111 Descreve como a estrutura da mioglobina foi determinada e o que foi descoberto a partir dela Richardson JS 1981 The anatomy and taxonomy of protein structure Adv Protein Chem 34 167339 Excelente resumo sobre padrões e princípios estruturais de proteínas O autor iniciou a representação em fitas amplamente utilizada para estruturas de proteínas Estruturas secundária terciária e quaternária Beeby M OConnor BD Ryttersgaard C Boutz DR Perry LJ Yeates TO 2005 The genomics of disulfide bonding and protein stabilization in thermophiles PLoS Biol 3 e 309 Brown JH 2006 Breaking symmetry in protein dimmers designs and function Protein Sci 15 113 Dunker AK Kriwacki RW 2011 The orderly chaos of proteins Sci Am 304 April 6873 Um bom resumo do trabalho sobre proteínas que perderam sua estrutura intrínseca Herráez A 2006 Biomolecules in the computer Biochem Mol Biol Educ 34 255261 McPherson A 1989 Macromolecular crystals Sci Am 260 march 6269 Uma descrição de como macromoléculas como as proteínas são cristalizadas MilnerWhite EJ 1997 The partial charge of the nitrogen atom in peptide bonds Protein Sci 6 24772482 Ponting CP Russel RR 2002 The natural history of protein domains Annu Rev Biophys Biomol Struct 31 4571 Uma explicação de como bancos de dados estruturais podem ser utilizados para explorar a evolução Desnaturação e enovelamento de proteínas Chiti F Dobson CM 2006 Protein misfolding functional amyloid and human disease Annu Rev Biochem 75 333366 Dill KA Ozkan SB Shell MS Weikl TR 2008 The protein folding problem Annu Rev Biophys 37 289316 Grazit E 2005 Mechanisms of amyloid fibril selfassembly and inhibition FEBS J 272 59715978 Hartl FU Bracher A HayerHartl M 2011 Molecular chaperones in protein folding and proteostasis Nature 475 324332 Hoppener JWM Lips CJM 2006 Role of islet amyloid in type 2 diabetes melito Int J Biochem Cell Biol 38 726736 Kapinga HH Craig EA 2010 The HSP70 chaperone machinery J proteins as drivers of functional specificity Nat Rev Mol Cell Biol 11 579592 Norrby E 2011 Prions and proteinfolding diseases J Intern Med 270 114 Prusiner SB 1995 The prion disease Sci Am 272 January 4857 Um bom resumo da evidência que levou à hipótese do príon Selkoe DJ 2003 Folding proteins in fatal ways Nature 426 900904 Um bom resumo sobre amiloidoses Tang Y Chang H Roeben A Wischnewski D Wischnewski N Kerner M Hartl F HayerHartl M 2006 Structural features of the GroELGroES nanocage required form rapid folding of encapsulated protein Cell 125 903914 Tyedmers J Mogk A Bukau B 2010 Cellular strategies for controlling protein aggregation Nat RevMol Cell Biol 11 777788 Problemas 1 Propriedades da ligação peptídica Nos estudos de raios X de peptídeos cristalizados Linus Pauling e Robert Co rey constataram que a ligação CN da ligação peptídica tem um comprimento intermediário 132 Å entre uma ligação simples CN 149 Å e uma ligação dupla CN 127 Å Também observaram que a ligação peptídica é planar todos os quatro átomos ligados ao grupo CN estão no mesmo plano e que os dois átomos de carbono ligados ao CN são sempre trans um em relação ao outro em lados opostos da ligação peptídica a O que o comprimento da ligação CN da ligação pep tídica indica sobre sua força e sua ordem de ligação isto é se ela é simples dupla ou tripla b O que as observações de Pauling e Corey nos dizem a respeito da facilidade de rotação sobre o eixo CN da ligação peptídica Nelson6ed04indd 152 Nelson6ed04indd 152 070414 1434 070414 1434 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 153 2 Relações estruturais e funcionais em proteínas fi brosas William Astbury descobriu que o padrão de difração de raios X da lã mostra uma unidade estrutural repetida espa çada de 52 Å ao longo do comprimento da fibra de lã Quando ele fervia e esticava a lã o padrão de raios X mostrava uma nova unidade estrutural que se repetia com um espaçamento de 70 Å Ferver e esticar a lã e depois deixar que ela se retraia novamente resulta em um padrão de raios X consistente com o espaçamento original de 52 Å Apesar de as observações for necerem pistas importantes sobre a estrutura molecular da lã Astbury não foi capaz de interpretálas naquela época a Levando em conta o atual conhecimento sobre a estru tura da lã interprete as observações de Astbury b Quando blusões e meias de lã são lavados em água quen te ou aquecidos em uma máquina de secar eles encolhem Por outro lado a seda não encolhe em condições iguais Explique 3 Velocidade de síntese da aqueratina do cabelo O cabelo cresce com a velocidade de 15 a 20 cmano Todo esse crescimento está concentrado na base da fibra de cabelo onde os filamentos de aqueratina são sintetizados dentro das células vivas da epiderme sendo arranjados em estruturas com formato de cordas ver Figura 411 O elemento estrutural principal da aqueratina é a hélice a que tem 36 resíduos de aminoácidos por volta e avança 54 Å por volta ver Figura 44a Assumindo que a biossíntese de cadeias de queratina ahelicoidal é o fator limitante da velocidade de crescimento do cabelo calcule a ve locidade na qual as ligações peptídicas das cadeias de aquera tina devem ser sintetizadas ligações peptídicas por segundo para justificar o crescimento anual observado para o cabelo 4 Efeito do pH na conformação das estruturas secun dárias ahelicoidais O desdobramento da hélice a de um po lipeptídeo para formar uma estrutura enrolada aleatoriamente é acompanhado por um grande decréscimo em uma proprieda de chamada de rotação específica que mede a capacidade de uma solução de desviar a luz circularmente polarizada O po liglutamato polipeptídeo formado somente de resíduos LGlu tem uma conformação ahelicoidal em pH 3 Quando o pH sobe para 7 há uma grande perda da rotação específica da solução Da mesma forma a polilisina resíduos LLys forma uma hélice a em pH 10 mas quando o pH é diminuído para 7 a rotação específica também diminui como mostrado no gráfico a seguir 0 PoliGlu Conformação aleatória PoliLys pH Rotação específica 2 4 6 8 10 12 14 Hélice a Conformação aleatória Hélice a Qual é a explicação para o efeito da mudança de pH nas confor mações da poliGlu e da poliLys Por que a transição ocorre em uma faixa tão estreita de pH 5 Ligações dissulfeto determinam as propriedades de diversas proteínas Algumas proteínas naturais são ricas em ligações dissulfeto e suas propriedades mecânicas tensão elástica viscosidade dureza etc estão correlacionadas com o grau de ligações dissulfeto a A glutenina proteína do trigo rica em ligações dissul feto é responsável pelo caráter aderente e elástico da massa feita com farinha de trigo Similarmente a natureza dura e re sistente do casco da tartaruga é devida às inúmeras ligações dissulfeto de sua aqueratina Qual é a base molecular para a correlação entre o conteúdo de ligações dissulfeto e as proprie dades mecânicas da proteína b A maioria das proteínas globulares é desnaturada e per de sua atividade quando aquecida brevemente a 65 oC Entre tanto as proteínas globulares que contêm múltiplas ligações dissulfeto geralmente têm que ser aquecidas por mais tempo e a temperaturas mais altas para que desnaturem Uma dessas proteínas é o inibidor de tripsina pancreática bovina BPTI de bovine pancreatitic trypsin inhibitor que tem 58 resíduos de aminoácidos em uma única cadeia e contém três ligações dissulfeto No resfriamento de uma solução de BPTI desnatu rada a atividade da proteína é restaurada Qual é a base mole cular para essa propriedade 6 Ângulos diedros Uma série de ângulos de torção f e c que podem ser adotados pelo esqueleto peptídico está mostra da abaixo Qual desses corresponde ao f e c para uma hélice tripla de colágeno ideal Consulte a Figura 49 como guia a b c d e f 7 Sequência de aminoácidos e estrutura de proteínas O crescente entendimento de como as proteínas se dobram permite que os pesquisadores façam predições sobre a estru tura de uma proteína com base em dados sobre sua sequência primária de aminoácidos Considere a seguinte sequência de aminoácidos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ile Ala His Thr Tyr Gly Pro Phe Glu Ala 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Ala Met Cys Lys Trp Glu Ala Gln Pro Asp 21 22 23 24 25 26 27 28 Gly Met Glu Cys Ala Phe His Arg a Onde devem ocorrer dobras ou voltas b b Onde devem se formar ligações dissulfeto intramole culares c Assumindo que esta sequência é parte de uma proteína globular maior indique a localização provável na superfície externa ou no interior da proteína dos seguintes resíduos de aminoácido Asp Ile Thr Ala Gln Lys Explique sua resposta Dica observe o índice de hidropatia na Tabela 31 Nelson6ed04indd 153 Nelson6ed04indd 153 070414 1434 070414 1434 154 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 8 A bacteriorrodopsina em proteinas pirpuras de diwm perfringens é responsavel pela gangrena gasosa condi membrana Sob condigdes ambientais adequadas a arqui ao na qual o tecido animal tem sua estrutura destruida Essa bactéria Halobacterium halobium sintetiza uma proteina de bactéria secreta uma enzima que catalisa de maneira eficiente membrana M 26000 conhecida como bacteriorrodopsina a hidrdolise das ligagdes peptidicas indicadas em vermelho que é purpura devido a seu contetdo em retinal ver Figura 1021 Moléculas dessa proteina se agregam em manchas XGlyProY H30 purpuras na membrana celular A bacteriorrodopsina atua XCOO HNGlyProY como bomba de protons ativada pela luz que fornece energia para a6 fungoes da cella A anilise por raios X geese poem em que X e Y sAo qualquer um dos 20 aminodcidos cormuns lel a que de a del em sete ements br c a a a Como a secrecao dessa enzima contribui para a capacidade de be ten cada unl ce ake ae AS Gal e membrana celar de invasao desta bactéria nos tecidos humanos Por que essa en actéria espessura e Calcule o ntimero minimo de ima nao afeta a propria bactéria residuos de aminoacidos necessarios para um segmento de hé lice a atravessar completamente a membrana Estime afracdo 12 Numero de cadeias polipeptidicas em uma proteina proteica da bacteriorrodopsina que esta envolvida em hélices com mitltiplas subunidades Uma amostra 660 mg de transmembrana Use uma massa média de 110 para os resi uma proteina oligomérica de M 132000 foi tratada com um duos de aminoacido excesso de 1fluoro24dinitrobenzeno reagente de Sanger 9 T inolosia d trut d A mioglobi sob condigédes levemente alcalinas até que a reacgéo quimica se vot ogia a estrutura de proven di mos lo 4 completasse As ligagdes peptidicas da proteina foram entao naé um mo Ivo um Commo ou uma estrutura tricumensional completamente hidrolisadas pelo aquecimento com HCl con completa centrado O hidrolisado continha 55 mg do seguinte composto 10 Interpretando os diagramas de Ramachandran Exa mine as duas proteinas marcadas a e b abaixo Quais dos NO CHs CHs dois diagramas de Ramachandran marcados c e d é mais CH inas a provavel ser derivado de qual das proteinas Por qué ON NHCCOOH 11 Acao patogénica da bactéria que causa gangrena bf gasosa A bactéria anaerobia altamente patogénica Clostri a c 180 120 is oC 3 oF C hog me 2 60 Oo 120 1 8 180 180 0 180 é graus b d 180 ee or i See 120 iy i aa y 2 c f a i is 60 é a 120 oc A rf 180 180 0 180 é graus PRINCIPIOS DE BIOQUMICA DE LEHNINGER 155 Derivados 24dinitrofenil dos grupos aamino de outros ami no campo de busca adequado e submetao para andlise O que noacidos nao foram encontrados essa andalise lhe diz sobre a identidade da proteina a Explique como essa informacéo pode ser usada para b Tente utilizar diferentes porgdes da sequéncia de ami determinar o ntimero de cadeias polipeptidicas na proteina oli noacidos Vocé sempre obtém 0 mesmo resultado gomeérica c Uma grande variedade de sites da web fornece informa b Calcule o numero de cadeias polipeptidicas nesta pro Gdes sobre a estrutura tridimensional das proteinas Encontre teina informacoes sobre estruturas secundarias terciarias e quater c Que outra técnica de andlise de proteinas vocé poderia narias da proteina utilizando bancos de dados como o Protein utilizar para determinar se as cadeias dessa proteina séo iguais Data Bank PDB wwwpdborg ou o SCOP ou diferentes d Durante sua busca na internet o que vocé aprendeu 13 Predicao de estrutura secundaria Qual dos seguin sobre a funcao celular da proteina tes peptideos é mais propenso a assumir uma estrutura ahe licoidal Por que Problema de andlise de dados a LKAENDEAARAMSEA b CRAGGFPWDQPGTSN 16 Proteinas imagemespeculares Como apresentado no Capitulo 3 os residuos de aminoacidos em uma molécula 14 Fibras amiloides em doencas Diversas peque de proteina sAo exclusivamente estereoisOmeros L Nao esta nas moléculas aromaticas como o vermelho de fenol claro se essa seletividade é necessaria para o funcionamento utilizado como modelo de farmaco nao t6xico sao conheci correto da proteina ou se é um acidente da evolucao Para ex das por inibir a formagao de amiloides em sistemas modelo em plorar essa questdo Milton e colaboradores 1992 publicaram laboratorio Um objetivo da pesquisa desses pequenos compos um estudo de uma enzima inteiramente formada de estereoi tos aromaticos a identificagaéo de um farmaco que iniba de sOmeros D A enzima que eles escolheram foi a HIVprotease modo eficiente a formacao de amiloides no cérebro das pessoas enzima proteolitica sintetizada pelo HIV que converte as pré com a doenga de Alzheimer incipiente proteinas virais inativas em suas formas ativas a Sugira por que moléculas com substituintes aromaticos Anteriormente Wlodawer e colaboradores 1989 relata evitariam a formacao de amiloides ram a sintese completa da protease do HIV a partir de aminoa b Alguns pesquisadores sugeriram que um farmaco usada cidos L a enzima L usando 0 processo mostrado na Figura para tratar a doenga de Alzheimer também poderia ser efetivo 332 As proteases do HIV normais contém dois residuos Cys no tratamento de diabetes melito do tipo 2 Gndependente de nas posicées 67 e 95 Como a sintese quimica de proteinas con insulina Por que um unico farmaco poderia ser efetivo no tra tendo Cys é tecnicamente dificil Wlodawer e colaboradores tamento dessas duas doengas diferentes substitufram os dois residuos Cys da proteina pelo aminoacido sintético Acido Laaminovbutirico Aba Segundo os auto Tm rS ISSO foi feito para reduzir as dificuldades sintéticas asso Bioquimica na internet ciadas com a desprotecao da Cys e para facilitar o manuseio do 15 Modelagem de proteinas na internet Um grupo produto de pacientes com a doenca de Crohn doena inflamatoria a A estrutura do Aba é mostrada abaixo Por que essa é do intestino foi submetido a bidpsia das mucosas intestinais uma substituigao adequada para um residuo Cys Sob quais para identificar 0 agente causador da doenga Os pesquisa circunstancias ela nao seria adequada dores identificaram uma proteina que estava presente em ni veis mais altos nos pacientes com a doenga de Crohn do que O O em pacientes com outras doengas inflamatorias do intestino 7 ou no grupo controle A proteina foi isolada e a seguinte se l quéncia parcial de aminoacidos foi obtida leia da esquerda HCCHCH para a direita NH EAELCPDRCI HSFQNLGIQC VKKRDLEQAI Acido taaminonbutiri SQRIQTNNNP FQVPIEEQRG DYDLNAVRLC CEO Te QAMMINO TD UTTCO FQVTVRDPSG RPLRLPPVLP HPIFDNRAPN Wlodawer e colaboradores desnaturaram a proteina recém TAELKICRVN RNSGSCLGGD EIFLLCDKVQ sintetizada por dissolugao em 6 M de hidrocloreto de guani KEDIEVYPTG PGWEARGSFS QADVHRQVAI dina e entaéo permitiram 1 dob lent t VFRTPPYADP SLQAPVRVSM QLRRPSDREL a pen Te 8 SE GODEASSE SOMATMENNG SEPMEFQYLP DTDDRHRIEE KRKRTYETFK retirando a guanidina por didlise contra um tampao neutro SIMKKSPFSG PTDPRPPPRR IAVPSRSSAS glicerol 10 25 mM NaPO pH 7 VPKPAPPYP b Existem varias razOes para prever que uma proteina sintetizada desnaturada e dobrada dessa maneira nao seja ati a Vocé pode identificar esta proteina utilizando um banco va Dé trés razoes para isso de dados de proteinas da Internet Alguns bons lugares para c De maneira interessante a Lprotease resultante foi ati comegar sua busca incluem o Protein Information Resource va O que essa descoberta lhe informa sobre 0 papel das liga PIR httppirgeorgetownedu o Structural Classification des dissulfeto na molécula de protease do HIV nativa of Proteins SCOP httpscopmrclmbcamacukscop e 0 Em seus estudos Milton e colaboradores sintetizaram a Prosite httpprositeexpasyorg protease do HIV a partir de Daminoacidos utilizando o mesmo No banco de dados selecionado por vocé siga as indica protocolo do estudo anterior Wlodawer et al Formalmente codes para a ferramenta de comparacéo de sequéncias Colo existem trés possibilidades para o enovelamento da Dprotea que aproximadamente 30 residuos da sequéncia da proteina se resultaria em uma molécula com 1 o mesmo formato da 156 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Lprotease 2 a imagem especular da Lprotease ou 3 algu ma outra coisa possivelmente inativa d Para cada uma das possibilidades decida se elas são prováveis ou não e defenda a sua posição Na verdade a Dprotease foi ativa ela hidrolisou um subs trato sintético específico e foi inibida por inibidores especí ficos Para examinar a estrutura das D e Lenzimas Milton e colaboradores testaram a atividade das duas formas com as formas D e L de substratos peptídicos quirais e a capacidade de inibição pelas formas D e L de peptídeos quirais análogos ao substrato As duas formas também foram testadas quanto à inibição pelo inibidor aquiral azul de Evans Os resultados aparecem na tabela HIV protease Inibição Hidrólise do substrato Peptídeo inibidor Azul de Evans aquiral Dsubstrato Lsubstrato Dinibidor Linibidor Lprotease 2 1 2 1 1 Dprotease 1 2 1 2 1 e Qual dos três modelos propostos é sustentado pelos da dos Explique sua resposta f Por que o azul de Evans inibe as duas formas de protease g Você esperaria que a quimotripsina pudesse digerir a Dprotease h Você esperaria para qualquer enzima que a síntese to tal a partir de Daminoácidos seguida de renaturação resultas se em uma enzima ativa Explique sua resposta Referências Milton RC Milton SC Kent SB 1992 Total chemical synthesis of a Denzyme the enantiomers of HIV1 protease show demonstration of reciprocal chiral substrate specificity Science 256 14451448 Wlodawer A Miller M Jaskólski M Sathyanarayana BK Baldwin E Webwe IT Selk LM Clawson L Schneider J Kent SB 1989 Conserved folding in retroviral proteases crystal structure of a synthetic HIV1 protease Science 245 616621 Nelson6ed04indd 156 Nelson6ed04indd 156 070414 1434 070414 1434 51 Interação reversível de uma proteína com um ligante proteínas de ligação ao oxigênio 158 52 Interações complementares entre proteínas e ligantes o sistema imune e as imunoglobulinas 174 53 Interações proteicas moduladas por energia química actina miosina e motores moleculares 179 O conhecimento da estrutura tridimensional de uma proteína é importante para entender seu funciona mento no entanto a estrutura mostrada em duas di mensões em uma página é ilusoriamente estática As pro teínas são moléculas dinâmicas cujas funções dependem de modo quase invariável de interações com outras molé culas e essas interações são afetadas de maneiras fisiolo gicamente importantes por mudanças sutis ou súbitas na conformação proteica Este capítulo analisa de que forma as proteínas interagem com outras moléculas e como essas interações estão relacionadas com a estrutura dinâmica da proteína As interações moleculares são de extrema impor tância para a função proteica Como foi visto no capítulo anterior a função das proteínas fibrosas como elementos estruturais de células e tecidos depende de interações qua ternárias estáveis e de longa duração entre cadeias poli peptídicas idênticas Como será abordado neste capítulo as funções de muitas outras proteínas envolvem interações com uma grande variedade de moléculas diferentes A maioria dessas interações é transitória embora possa ser a base de processos fisiológicos complexos como o trans porte do oxigênio a função imune e a contração muscular tópicos examinados neste capítulo As proteínas que reali zam esses processos esclarecem os princípios essenciais da função proteica citados a seguir alguns deles já comenta dos no capítulo anterior As funções de muitas proteínas envolvem a ligação re versível com outras moléculas Uma molécula que inte rage de modo reversível com uma proteína é chamada de ligante que pode ser qualquer tipo de molécula incluindo outra proteína A natureza transitória das interações proteínaligante é fundamental para a vida pois permite que um organismo responda de maneira rápida e reversível a mudanças ambientais e condições metabólicas Um ligante interage com uma região da proteína cha mada de sítio de ligação que é complementar a ele em tamanho forma carga e caráter hidrofílico ou hidro fóbico Além disso a interação é específica a proteína pode diferenciar milhares de moléculas diferentes no seu ambiente e interagir seletivamente somente com uma ou algumas Determinada proteína pode ter sítios de ligação separados para vários ligantes diferentes Es sas interações moleculares específicas são cruciais na manutenção do alto grau de ordem em um sistema vivo Esta discussão exclui a ligação da água que pode in teragir fraca e inespecificamente com muitas partes de uma proteína O Capítulo 6 estuda a água como ligante específico para muitas enzimas As proteínas são flexíveis Mudanças na conformação podem ser sutis refletindo vibrações moleculares e pequenos movimentos de resíduos de aminoácidos por toda a proteína Assim dizse que uma proteína flexí vel está respirando Mudanças na conformação tam bém podem ser muito significativas com segmentos importantes da estrutura proteica movendose por uma distância de vários nanômetros Mudanças conformacio nais específicas frequentemente são essenciais para a função proteica A interação de uma proteína com seu ligante está aco plada a uma mudança de conformação da proteína que torna o sítio de ligação mais complementar ao ligante permitindo uma interação mais firme A adaptação es trutural que ocorre entre proteína e ligante é chamada de encaixe induzido Em uma proteína com várias subunidades mudanças conformacionais em uma delas com frequência afetam a conformação das demais As interações entre proteínas e ligantes podem ser re guladas geralmente por meio de interações específicas com um ou mais ligantes adicionais causando mudan ças conformacionais na proteína que afetam a interação com o primeiro ligante As enzimas representam um caso especial de função proteica Elas se ligam a outras moléculas e as transfor mam quimicamente ou seja catalisam reações As molé culas sobre as quais as enzimas exercem seus efeitos são 5 Função Proteica Nelson6ed05indd 157 Nelson6ed05indd 157 020514 1718 020514 1718 158 DAVID L NELSON MICHAEL M COX chamadas de substratos da reação em vez de ligantes e o sítio de ligação é chamado de sítio catalítico ou sítio ativo Este capítulo enfatiza as funções não catalíticas das proteínas No Capítulo 6 será estudada a catálise enzimá tica tópico central em bioquímica O leitor perceberá que os temas deste capítulo ligação especificidade e mudan ça conformacional continuarão no próximo capítulo com o acréscimo da participação das proteínas nas alterações químicas 51 Interação reversível de uma proteína com um ligante proteínas de ligação ao oxigênio A mioglobina e a hemoglobina talvez sejam as proteínas mais estudadas e melhor compreendidas Foram as pri meiras a ter sua estrutura tridimensional elucidada e ilus tram quase todos os aspectos do mais central dos proces sos bioquímicos a interação reversível de um ligante com uma proteína Esse modelo clássico de função proteica é muito útil para compreender como as proteínas funcio nam Proteínas de ligação ao oxigêniomioglobina armazenamen to de oxigênio O oxigênio ligase ao grupo prostético heme O oxigênio é pouco solúvel em soluções aquosas consultar Tabela 23 e não pode ser transportado para os tecidos em quantidade suficiente se estiver simplesmente dissolvido no plasma sanguíneo A difusão do oxigênio pelos tecidos tam bém não é eficiente em distâncias maiores do que alguns milímetros A evolução de animais maiores e multicelula res dependeu do desenvolvimento de proteínas capazes de transportar e armazenar oxigênio Contudo nenhuma ca deia lateral dos aminoácidos das proteínas é adaptada para a ligação reversível de moléculas de oxigênio Essa função é exercida por determinados metais de transição entre eles o cobre e o ferro que apresentam forte tendência para ligar oxigênio Os organismos multicelulares exploram as pro priedades dos metais sobretudo do ferro para o transporte do oxigênio Contudo o ferro livre promove a formação de espécies de oxigênio altamente reativas como as hidroxi las que podem danificar o DNA e outras macromoléculas Por isso o ferro usado nas células está ligado em formas que o sequestram eou o tornam menos reativo Nos orga nismos multicelulares especialmente aqueles nos quais o ferro na sua capacidade de transportar oxigênio deve ser transportado a grandes distâncias o ferro é incorporado em um grupo prostético chamado de heme ligado à pro teína Lembrese do Capítulo 3 que um grupo prostético é um composto associado permanentemente a uma proteína e que contribui para sua função O heme consiste em uma complexa estrutura orgâni ca em anel protoporfirina à qual se liga um único áto mo de ferro no estado ferroso Fe 21 Figura 51 Esse átomo de ferro tem seis ligações de coordenação quatro delas com os átomos de nitrogênio que fazem parte do sis tema plano do anel de porfirina e duas perpendiculares à porfirina Os átomos de nitrogênio coordenados que têm caráter de doador de elétrons ajudam a prevenir a con versão do ferro do heme para o estado férrico Fe 31 No estado Fe 21 o ferro liga oxigênio de forma reversível no estado Fe 31 ele não liga oxigênio O heme é encontrado em muitas proteínas transportadoras de oxigênio assim como em algumas proteínas que participam das reações de oxir redução transferência de elétrons como os citocromos Capítulo 19 As moléculas de heme livres não ligadas a uma pro teína deixam o Fe 21 com duas ligações de coordenação abertas A reação simultânea de uma molécula de O2 com duas moléculas de heme livres ou dois Fe 21 livres pode resultar em uma conversão irreversível de Fe 21 em Fe 31 Nas proteínas que contêm heme essa reação é impedida pelo sequestro do heme no interior da estrutura da pro teína Assim o acesso às duas ligações de coordenação abertas fica restrito Uma delas está ocupada pelo nitrogê Fe 2O C O O2 Fe CH3 CH N CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 CH3 CH3 C H H C CH CH O C C C C C C C C C C C C C C C N N N C CH2 b C a NH X N HN N X X X X X X X d c HC FIGURA 51 Heme O grupo heme está presente na mioglobina na hemo globina e em muitas outras proteínas designadas hemeproteínas O heme consiste em uma estrutura orgânica complexa em anel a protoporfirina IX com um átomo de ferro ligado no estado ferroso Fe 21 a As porfirinas das quais a protoporfirina IX é apenas um exemplo consistem em quatro anéis pirrólicos unidos por pontes de meteno com substituições em uma ou mais posições marcadas com X b c Duas representações do heme derivadas de PDB ID 1CCR O átomo de ferro tem seis ligações de coordenação quatro no plano do anel e ligadas ao sistema do anel planar da porfirina e d duas perpendiculares a ele Nelson6edbookindb 158 Nelson6edbookindb 158 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 159 nio da cadeia lateral de um resíduo de histidina A outra é o sítio de ligação para o oxigênio molecular O2 Figura 52 Quando o oxigênio se liga as propriedades eletrônicas do ferro são alteradas isso leva à mudança de cor do san gue venoso pobre em oxigênio roxoescuro para o verme lhobrilhante do sangue arterial rico em oxigênio Algumas moléculas pequenas como o monóxido de carbono CO e o óxido nítrico NO coordenam com o ferro do heme com maior afinidade do que o O2 Quando uma molécula de CO está ligada ao heme o O2 é excluído por isso o CO é alta mente tóxico para os organismos aeróbios tópico explora do mais adiante no Quadro 51 Pelo fato de envolverem e sequestrarem o heme as proteínas de ligação ao oxigênio regulam o acesso do CO e de outras moléculas pequenas ao ferro do heme As globinas são uma família de proteínas de ligação ao oxigênio As globinas formam uma ampla família de proteínas to das com estruturas primária e terciária semelhantes As globinas são comumente encontradas em todas as classes dos eucariotos e mesmo em algumas bactérias A maioria atua no armazenamento ou no transporte de oxigênio em bora algumas tenham um papel de sensores de oxigênio óxido nítrico ou monóxido de carbono O nematódeo sim ples Caenorhabditis elegans tem genes que codificam 33 diferentes globinas Nos humanos e em outros mamíferos existem pelo menos quatro tipos de globinas A mioglo bina monomérica facilita a difusão do oxigênio no tecido muscular A mioglobina é particularmente abundante nos músculos de mamíferos marinhos como as focas e as ba leias pois também exerce função de armazenamento de oxigênio em mergulhos prolongados A hemoglobina tetra mérica é responsável pelo transporte do oxigênio na cor rente sanguínea A neuroglobina monomérica se expressa em neurônios e ajuda a proteger o cérebro da hipóxia bai xo nível de oxigênio ou da isquemia restrição do supri mento de sangue A citoglobina outra globina monoméri ca é encontrada em altos níveis em uma gama de tecidos mas sua função não é conhecida A mioglobina tem um único sítio de ligação ao oxigênio A mioglobina Mr 16700 abreviada Mb consiste em um único polipeptídeo de 153 resíduos de aminoácidos com uma molécula de heme Como é típico de um polipeptídeo de globina a mioglobina é formada por oito segmentos a helicoidais conectados por inflexões Figura 53 Cerca de 78 dos resíduos de aminoácidos das proteínas estão nessas hélices a Qualquer discussão detalhada sobre a função proteica envolverá a estrutura proteica No caso da mioglobina pri meiro serão apresentadas certas regras estruturais carac terísticas das globinas Como pode ser visto na Figura 53 os segmentos helicoidais são denominados de A a H Um resíduo de aminoácido é designado pela posição na sequên cia de aminoácidos ou por sua localização na sequência de um segmento ahelicoidal específico Por exemplo o resí duo de His coordenado com o heme na mioglobina His 93 o 93 o resíduo a contar da extremidade aminoterminal da sequência polipeptídica é também chamado de His F8 o oitavo resíduo da hélice a F As inflexões na estrutura são designadas AB CD EF FG e assim por diante refletindo os respectivos segmentos conectados As interações proteínaligante podem ser quantitativamente descritas A função da mioglobina depende da capacidade da proteína de não somente ligar oxigênio mas também de liberálo quando e onde ele for necessário Como a função em bio química frequentemente gira em torno de uma interação CH2 C CH Vista da margem C N HN Fe O2 Resíduo de histidina Plano do sistema do anel da porfirina H FIGURA 52 Vista lateral do grupo heme Esta vista mostra as duas li gações de coordenação com o Fe 21 perpendiculares ao sistema de anel da porfirina Uma é ocupada por um resíduo de His também chamado de His proximal a outra é o sítio de ligação para o oxigênio As quatro ligações de coordenação remanescentes estão no plano do anel e ligadas ao sistema de anel planar da porfirina A EF F FG C CD D B G E GH AB H FIGURA 53 Mioglobina PDB ID 1MBO Os oito segmentos ahelicoidais mostrados aqui como cilindros estão marcados de A até H Os resíduos não helicoidais nas inflexões que os conectam estão marcados como AB CD EF e assim por diante indicando os segmentos que eles interconectam Algu mas inflexões incluindo BC e DE são abruptas e não contêm resíduos elas normalmente não estão marcadas O segmento curto visível entre D e E é um artefato da representação computacional O heme está ligado em um bolsão formado na maior parte pelas hélices E e F embora resíduos de ami noácidos de outros segmentos da proteína também participem Nelson6edbookindb 159 Nelson6edbookindb 159 020414 1843 020414 1843 160 DAVID L NELSON MICHAEL M COX proteínaligante reversível desse tipo uma descrição quan titativa dessa interação constitui a parte central de muitas investigações bioquímicas Em geral a ligação reversível de uma proteína P a um ligante L pode ser descrita por uma expressão de equi líbrio simples 51 A reação é caracterizada por uma constante de equilí brio Ka tal que 52 onde ka e kd são constantes de velocidade mais detalhes adiante O termo Ka é uma constante de associação não confundir com o Ka que significa a constante de dis sociação do ácido p 62 que descreve o equilíbrio entre o complexo e os seus componentes separados A constante de associação é uma medida da afinidade do ligante L pela proteína Ka tem unidades de M 1 um valor mais alto de Ka corresponde a uma afinidade mais alta do ligante pela proteína O termo de equilíbrio Ka é equivalente também à razão entre as velocidades das reações para a frente associação e reversa dissociação que formam o complexo PL A velo cidade de associação é descrita pela constante de velocida de ka e a dissociação pela constante de velocidade kd Con forme será discutido no capítulo seguinte as constantes de velocidade são constantes de proporcionalidade que des crevem a fração de um conjunto de reagentes que reage em um dado espaço de tempo Quando a reação envolve uma molécula como na reação de dissociação PL P 1 L a reação é de primeira ordem e a constante de velocidade kd tem unidade de tempo recíproca s 1 Quando a rea ção envolve duas moléculas como a reação de associação P 1 L PL ela é chamada de segunda ordem e a cons tante de velocidade ka tem unidades de M 1 s 1 CONVENÇÃOCHAVE As constantes de equilíbrio são escritas com K maiúsculo e as constantes de velocidade com k mi núsculo O rearranjo da primeira parte da Equação 52 mostra que a razão entre a proteína ligada e a livre é diretamente proporcional à concentração do ligante livre 53 Quando a concentração do ligante for muito maior do que a concentração dos sítios de interação com o ligante a interação com a proteína não altera de modo significativo a concentração do ligante livre não ligado isto é L permanece constante Essa condição é muito aplicável à maioria dos ligantes que interagem com proteínas nas cé lulas e simplifica a descrição do equilíbrio de ligação Agora é possível considerar o equilíbrio de ligação do ponto de vista da fração u teta dos sítios de interação com o ligante na proteína que estão ocupados pelo ligante sítios de interação ocupados total de sítios de interação 54 Substituindo KaLP por PL ver Equação 53 e rearran jando os termos obtémse 55 O valor de Ka pode ser determinado a partir de uma curva de u versus a concentração do ligante livre L Figura 54a Qualquer equação do tipo x 5 yy 1 z descreve uma hipérbole e concluise que u é uma função hiper bólica de L A fração dos sítios de interação ocupados pelo ligante se aproxima assintoticamente da saturação à medida que L aumenta A L na qual a metade dos sí tios disponíveis está ocupada ie u 5 05 corresponde a 1Ka No entanto é mais comum e intuitivamente mais sim ples considerar a constante de dissociação Kd que é a recíproca de Ka Kd 5 1 Ka sendo dada em unidades de concentração molar M Kd é a constante de equilíbrio para a liberação do ligante As expressões relevantes mu dam para 56 10 05 0 u 5 a Kd 10 L unidades arbitrárias 5 P50 10 pO2 kPa 10 05 0 u b FIGURA 54 Representação gráfica da interação com o ligante A fração ocupada dos sítios de interação com o ligante u é representada gra ficamente em relação à concentração do ligante livre Ambas as curvas são hipérboles retangulares a Curva de ligação hipotética para o ligante L A L na qual a metade dos sítios de ligação estão ocupados é equivalente a 1Ka ou Kd A curva tem uma assíntota horizontal quando u 5 1 e uma vertical não mostrada quando L 5 1Ka b Curva que descreve a ligação do oxigênio à mioglobina A pressão parcial do O2 no ar acima da solução é expressa em quilopascais kPa O oxigênio ligase fortemente à mioglobina com P50 de apenas 026 kPa Nelson6edbookindb 160 Nelson6edbookindb 160 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 161 57 58 Quando L for igual a Kd metade dos sítios estará ocupada À medida que L cai abaixo de Kd cada vez menos proteínas terão ligantes associados A L deve ser nove vezes maior do que Kd para que sejam ocupados 90 dos sítios disponíveis Na prática Kd é usado muito mais frequentemente do que Ka para expressar a afinidade de uma proteína por um ligante Observe que um valor mais baixo de Kd corres ponde a uma afinidade mais alta do ligante pela proteína A matemática pode ser reduzida às afirmações simples Kd é equivalente à concentração molar do ligante na qual a metade dos sítios de interação está ocupada Nesse ponto dizse que a proteína alcançou a metade da saturação com relação à interação com o ligante Quanto maior a força da interação proteica com o ligante mais baixa será a concen tração necessária do ligante para que metade dos sítios seja ocupada e assim mais baixo o valor de Kd Na Tabela 51 estão algumas constantes de dissociação representativas a escala mostra variações típicas das constantes de dissocia ção encontradas nos sistemas biológicos PROBLEMA RESOLVIDO 51 Constantes de dissociação receptorligante Duas proteínas X e Y interagem com o mesmo ligante A com as curvas de ligação mostradas abaixo X A mM 2 12 6 4 10 14 8 16 10 05 Y u Qual é a constante de dissociação Kd para cada proteína Qual das proteínas X ou Y tem a maior afinidade pelo li gante A TABELA 51 Algumas constantes de dissociação proteicas Proteína Ligante Kd M Avidina clara de ovo Biotina 1 3 10 15 Receptor de insulina humano Insulina 1 3 10 10 Imunoglobulina antiHIV humana gp41 proteína de superfície do HIV1 4 3 10 10 Proteína de ligação a níquel E coli Ni 21 1 3 10 7 Calmodulina rato Ca 21 3 3 10 6 2 3 10 5 Kd M 1022 baixa afinidade alta afinidade 10216 10214 10212 10210 Biotinaavidina Antígenoanticorpo Enzimasubstrato 1028 1026 1024 ProteínaDNA sequênciaespecífica Interações típicas receptorligante As barras coloridas indicam as variações das constantes de dissociação típicas de várias classes de interações nos sistemas biológicos Poucas interações como as que ocorrem entre a proteína avi dina e o cofator enzimático biotina estão fora das variações normais A interação biotinaavidina é tão forte que pode ser considerada irreversível As interações proteínaDNA sequênciaespecíficas refletem proteínas que se ligam a uma sequência nucleotídica específica no DNA em oposição à ligação não específica a qualquer sítio no ácido nucleico Uma constante de dissociação registrada é válida somente para as condições particulares da solução sob as quais foi medi da Os valores de Kd para uma interação proteínaligante podem ser alterados às vezes em várias ordens de magnitude por mudanças na concentração salina da solução no pH ou por outras por variáveis Esta imunoglobulina foi isolada como parte do esforço para desenvolver uma vacina contra o HIV As imunoglobulinas descritas adiante no capítulo são altamente variáveis e a Kd registrada aqui não deve ser considerada uma característica de todas as imunoglobulinas A calmodulina tem quatro sítios de ligação para o cálcio Os valores mostrados refletem os sítios de ligação com a menor e a maior afinidade observadas em um conjunto de medidas Nelson6edbookindb 161 Nelson6edbookindb 161 020414 1843 020414 1843 162 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Solução É possível determinar as constantes de dissociação pela análise do gráfico Uma vez que u representa a fração dos sítios de ligação ocupados pelo ligante a concentração do ligante na qual a metade dos sítios está ocupada isto é o ponto onde a curva de ligação cruza a linha onde u 5 05 é a constante de dissociação Para X Kd 5 2 mM para Y Kd 5 6 mM A proteína X tem maior afinidade pelo ligante já que está semissaturada a uma A mais baixa A ligação do oxigênio à mioglobina segue os padrões dis cutidos anteriormente No entanto como o oxigênio é um gás é necessário fazer alguns pequenos ajustes nas equa ções para que os experimentos no laboratório possam ser realizados de modo mais conveniente Em primeiro lugar substituise a concentração do oxigênio dissolvido pela L na Equação 58 a fim de obter 59 Visto que para qualquer ligante Kd é igual a O2 na qual a metade dos sítios de interação com o ligante está ocupada ou O205 a Equação 59 se torna 510 Em experimentos usando o oxigênio como ligante o que varia é a pressão parcial do oxigênio pO2 na fase gasosa sobre a solução pois isso é mais fácil de medir do que a con centração do O2 dissolvido na solução A concentração de uma substância volátil em solução é sempre proporcional à pressão parcial local do gás Assim definindo a pressão parcial do oxigênio na O205 como P50 a substituição na Equação 510 nos dá 511 A Figura 54b apresenta uma curva de interação para a mio globina que relaciona u com pO2 A estrutura da proteína afeta a forma de interação com o ligante A interação entre ligante e proteína raramente é tão sim ples como sugerem as equações apresentadas A interação é muito afetada pela estrutura da proteína e com frequência é acompanhada por mudanças conformacionais Por exem plo a especificidade com a qual o heme interage com seus diversos ligantes é alterada quando ele é um componente da mioglobina O monóxido de carbono se liga a três molé culas de heme livre mais de 20000 vezes melhor do que o O2 isto é o Kd ou a P50 para a ligação do CO ao heme livre é mais de 20000 vezes mais baixo do que para o O2 mas ele se liga somente 200 vezes melhor do que o O2 quan do o heme está ligado à mioglobina A diferença pode ser parcialmente explicada por impedimento estérico Quando o O2 se liga ao heme livre o eixo da molécula do oxigênio é posicionado em um ângulo em relação à ligação FeO Figura 55a Em contrapartida quando o CO se liga ao heme livre os átomos de Fe C e O se posicionam em linha reta Figura 55b Em ambos os casos a ligação reflete a geometria dos orbitais híbridos em cada ligante Na mioglo bina a His 64 His E7 no lado do heme onde o O2 se liga está longe demais para coordenar com o ferro do heme mas se relaciona com o ligante que estiver interagindo com o heme Esse resíduo chamado de His distal para distinguir de His proximal His F8 forma uma ligação de hidrogênio com o O2 Figura 55c mas pode ajudar a impedir a ligação linear do CO o que explica a redução seletiva na ligação do CO ao heme na mioglobina e na hemoglobina Uma redu ção na ligação do CO é fisiologicamente importante pois este gás é um subproduto pobre do metabolismo celular Outros fatores ainda não bem definidos também podem modular a interação do heme com o CO nessas proteínas A ligação do O2 ao heme da mioglobina também depen de dos movimentos moleculares ou respirações na estru tura da proteína A molécula de heme está profundamente enterrada no polipeptídeo dobrado sem um caminho direto para o trânsito do oxigênio da solução circundante para o sítio de interação com o ligante Se a proteína fosse rígida o O2 não entraria ou sairia do bolsão do heme em uma taxa Phe CD1 His E7 His F8 c Fe H O2 Val E11 a O X ƒ Fe ƒ O b O X ƒ Fe ƒ C FIGURA 55 Efeitos estéricos causados pela interação do ligante ao heme da mioglobina a O oxigênio ligase ao heme com o seu eixo for mando um ângulo uma conformação de ligação facilmente ajustada pela mioglobina b O monóxido de carbono ligase ao heme livre com seu eixo perpendicular ao plano do anel porfirínico O CO quando ligado ao heme na mioglobina é forçado a adotar um ângulo inadequado porque o arranjo perpendicular é bloqueado estericamente pela His E7 a His distal Este efeito enfraquece a ligação do CO à mioglobina c Outra visão do heme da mio globina derivada de PDB ID 1MBO mostrando o arranjo dos resíduos dos aminoácidoschave ao redor do heme O oxigênio ligase por uma ligação de hidrogênio à His distal His E7 His 64 facilitando a posterior ligação de O2 Nelson6edbookindb 162 Nelson6edbookindb 162 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 163 mensurável Contudo a flexibilização molecular rápida das cadeias laterais dos aminoácidos gera cavidades transitó rias na estrutura da proteína e o O2 entra e sai movendo se através dessas cavidades Simulações em computador de flutuações estruturais rápidas na mioglobina sugerem que existem muitas dessas vias Uma das principais é gera da pela rotação da cadeia lateral da His distal His 64 que ocorre em uma escala de tempo de nanossegundo 10 9 s Mesmo mudanças conformacionais sutis podem ser críticas para a atividade da proteína Na neuroglobina citoglobina e em algumas globinas en contradas em plantas e invertebrados a His distal His E7 está coordenada diretamente com o ferro do heme Nessas globinas o oxigênio ou outros ligantes devem deslocar a His distal no processo de ligação A hemoglobina transporta oxigênio no sangue Proteínas de ligação ao oxigêniohemoglobina transporte de oxigênio Quase todo o oxigênio carregado pelo sangue total em ani mais está ligado à hemoglobina e é transportado por ela nos eritrócitos Os eritrócitos humanos normais são pequenos discos bicôncavos 6 a 9 mm de diâmetro formados a partir de célulastronco precursoras chamadas de hemocitoblas tos No processo de maturação a célulatronco produz célu lasfilhas que produzem grandes quantidades de hemoglobi na perdendo em seguida suas organelas intracelulares núcleo mitocôndrias e retículo endoplasmático Os eritrócitos são portanto células vestigiais incompletas incapazes de se re produzir e nos humanos destinadas a viver por somente 120 dias Sua principal função é carregar hemoglobina dissolvida no citosol em concentração muito alta 34 do peso total A hemoglobina está cerca de 96 saturada com oxigê nio no sangue arterial que passa dos pulmões pelo coração até os tecidos periféricos No sangue venoso que retorna ao coração ela está somente cerca de 64 saturada As sim cada 100 mL de sangue que banha um tecido libera um terço do oxigênio que carrega ou 65 mL de O2 gasoso na pressão atmosférica e na temperatura corporal A mioglobina com sua curva hiperbólica de ligação ao oxi gênio Figura 54b é relativamente insensível a pequenas alterações na concentração do oxigênio dissolvido e por isso funciona bem como proteína de armazenamento de oxigê nio A hemoglobina com suas múltiplas subunidades e sítios de ligação para o O2 é mais adequada para o transporte do oxigênio Conforme será visto as interações entre as subuni dades de uma proteína multimérica permitem uma resposta altamente sensível a pequenas alterações na concentração do ligante As interações entre as subunidades da hemoglobina causam mudanças conformacionais que alteram a afinidade da proteína pelo oxigênio A modulação da ligação do oxigê nio permite que a proteína de transporte de O2 responda a alterações na demanda de oxigênio pelos tecidos As subunidades da hemoglobina têm estrutura semelhante à da mioglobina A hemoglobina Mr 64500 abreviada Hb é aproxima damente esférica com diâmetro de quase 55 nm É uma proteína tetramérica contendo quatro grupos prostéticos heme cada um associado com uma cadeia polipeptídica A hemoglobina do adulto contém dois tipos de globina duas cadeias a com 141 resíduos cada uma e duas cadeias b com 146 resíduos cada uma Apesar de menos da metade dos resíduos de aminoácidos ser idêntica na sequência poli peptídica das subunidades a e b a estrutura tridimensional dos dois tipos de subunidades é muito semelhante Além disso sua estrutura é muito semelhante à da mioglobina Figura 56 apesar de a sequência de aminoácidos dos três polipeptídeos ser idêntica apenas em 27 posições Fi gura 57 Os três polipeptídeos são membros da família proteica das globinas A convenção para a denominação de hélice descrita para a mioglobina também se aplica para os polipeptídeos da hemoglobina exceto pelo fato de a subunidade a não ter a hélice curta D O bolsão de ligação ao heme é composto na maior parte pelas hélices E e F em cada uma das subunidades A estrutura quaternária da hemoglobina caracteriza interações fortes entre as subunidades diferentes A in terface a1b1 e seu complemento a2b2 envolve mais de 30 resíduos e sua interação é suficientemente forte para que esses dímeros ab permaneçam intactos mesmo que o trata mento suave da hemoglobina com ureia separe o tetrâmero nos dímeros A interface a1b2 e a2b1 envolve 19 resíduos Figura 58 As interações hidrofóbicas predominam em todas as interfaces mas existem também muitas ligações de hidrogênio e alguns pares iônicos ou pontes salinas cuja importância será discutida adiante A hemoglobina sofre mudança estrutural quando se liga ao oxigênio A análise por raios X revelou duas conformações principais da hemoglobina o estado R e o estado T Embora o oxi gênio se ligue à hemoglobina nos dois estados ele tem mui to mais afinidade pela proteína no estado R A ligação do oxigênio estabiliza o estado R Experimentalmente quando o oxigênio não está presente o estado T é mais estável e é assim a conformação predominante da desoxiemoglo bina Originalmente T e R significavam tenso e relaxa do pois o estado T é estabilizado por um número maior de pares iônicos muitos dos quais ficam na interface a1b2 e a2b1 Figura 59 A ligação do O2 à subunidade da Grupo heme Mioglobina Subunidade b da hemoglobina FIGURA 56 Comparação entre a estrutura da mioglobina PDB ID 1MBO e a da subunidade b da hemoglobina derivada de PDB ID 1HGA Nelson6edbookindb 163 Nelson6edbookindb 163 020414 1843 020414 1843 164 DAVID L NELSON MICHAEL M COX L A T V L Mb Hba Hbb Mb Hba Hbb V V V E P L F F H A D E K R L L E A F L L S S T M V I L L E P P K M S S G G A E D7 A G G E H N E D E E1 S S N A C V W K K E A P I L L Q T S D Q K I L V L N A L V V H V C V V K K K V T V L K T K G A L L L H A A H H H E7 H A A V A L G G G S A H W W W V K K G19 R H H A G G T K K H L F K K K V V V P P G V V V L A L G A K A1 6 E G T D G D E E A A A A F F F D H N L L F H1 G T T V A V G T S A P P A G D A N D D A P G E E I A G A V V H Y V E19 L V L Q H Q G G G K A A G A A Q A G K H H A S A D E E K V L M L Y I A A G D D N D Q L L L H D N K K K I E G H M L A F V R R R E P K L L V L M L A N G E A A F F L E A T L S G K L V F1 L L F F V V B16 S S V K S A R S A C1 H F Y P A T K T N P P P L L D V A E T W A S S I L L T T Q D E A T A L K Q S L L H21 A S H E T R H H H F8 HC1 K K K C7 K Y F F9 A A C HC2 Y Y Y F F F T H D HC3 K R H D P E K K K E R H S H L L H26 L F F F K R H G K G I V V Y H D D G1 P D D Q L L L I P P G K S S K V E D1 T H T Y N N 1 1 1 20 20 20 40 40 40 60 60 60 80 80 80 100 100 100 120 120 120 140 140 140 141 146 153 A1 B1 NA1 somente Hba e Hbb His proximal His distal FIGURA 57 A sequência de aminoácidos da mioglobina de baleia e das cadeias a e b da hemoglobina humana As linhas tracejadas assi nalam os limites das hélices Para um alinhamento ótimo pequenas lacu nas tiveram que ser introduzidas nas duas sequências da Hb onde haviam aminoácidos presentes nas sequências usadas na comparação Com exce ção da hélice D que não existe na Hba esse alinhamento permite o uso da convenção de letras das hélices que enfatiza o posicionamento comum dos resíduos de aminoácidos que são idênticos nas três estruturas sombreados Os resíduos sombreados em cor salmão são conservados em todas as glo binas conhecidas Observe que a designação comum de letras e números das hélices para os aminoácidos não corresponde necessariamente a uma posição comum na sequência linear de aminoácidos nos polipeptídeos Por exemplo o resíduo His distal é His E7 nas três estruturas mas corresponde a His 64 His 68 e His 63 nas sequências lineares de Mb Hba e Hbb respectivamen te Os resíduos não helicoidais nas extremidades carboxi e amino além do primeiro A e do último H segmento ahelicoidal estão assinalados com NA e HC respectivamente a1 b1 a2 b2 FIGURA 58 Interações dominantes entre as subunidades da hemo globina PDB ID 1HGA Nesta representação as subunidades a estão em cinzaclaro e as subunidades b estão em cinzaescuro As interações mais fortes destacadas ocorrem entre subunidades diferentes Quando o oxigê nio se liga o contato a1b1 se altera um pouco mas existe uma grande altera ção no contato a1b2 com o rompimento de vários pares iônicos a Subunidade a Subunidade b Asp FG1 His HC3 Lys C5 COO2 COO2 COO2 Arg1 Lys1 Asp2 Arg1 Asp2 Lys1 His1 His1 Asp2 Asp2 HC3 HC3 FG1 H9 HC3 FG1 HC3 H9 C5 C5 COO2 b2 b1 a2 a1 b NH3 1 NH3 1 NH3 1 NH3 1 FIGURA 59 Alguns pares iônicos que estabilizam o estado T da desoxiemoglobina a Visão de perto de uma porção da molécula da desoxiemoglobina no estado T PDB ID 1HGA As interações entre os pa res iônicos His HC3 e Asp FG1 da subunidade b em azul e entre Lys C5 da subunidade a em cinza e His HC3 seu grupo acarboxílico da subunidade b estão indicadas com linhas tracejadas Lembre que HC3 é o resíduo car boxiterminal da subunidade b b As interações entre estes pares iônicos e entre outros não mostrados em a estão esquematizadas nesta representa ção das cadeias polipeptídicas estendidas da hemoglobina Nelson6edbookindb 164 Nelson6edbookindb 164 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 165 hemoglobina no estado T desencadeia uma mudança na conformação para o estado R Quando toda a proteína sofre essa transição a estrutura das subunidades individuais se altera pouco mas os pares de subunidades ab deslizam um sobre o outro e sofrem rotação estreitando o bolsão entre as subunidades b Figura 510 Nesse processo alguns dos pares iônicos que estabilizam o estado T são rompidos e alguns novos são formados Max Perutz propôs que a transição T S R é desenca deada por mudanças na posição de cadeias laterais de ami noácidoschave que circundam o heme No estado T a por firina é levemente pregueada fazendo com que o ferro do heme projetese um pouco para o lado da His proximal His F8 A ligação do O2 faz o heme assumir uma posição mais planar deslocando a posição da His proximal e da hélice F ligada Figura 511 Essas mudanças levam a ajustes nos pares iônicos na interface a1b2 A hemoglobina se liga ao oxigênio de forma cooperativa A hemoglobina deve se ligar com eficiência ao oxigênio nos pulmões onde a pO2 é cerca de 133 kPa e liberálo nos tecidos onde a pO2 é de 4 kPa A mioglobina ou qual quer proteína que se ligue ao oxigênio com uma curva de ligação hiperbólica é mal adaptada para essa função pelo motivo ilustrado na Figura 512 A proteína que se liga ao O2 com alta afinidade capta oxigênio de maneira eficiente nos pulmões mas não o libera muito nos tecidos Por sua vez se a proteína se liga ao oxigênio com afinidade sufi cientemente baixa para liberálo nos tecidos não o capta muito nos pulmões A hemoglobina resolve o problema passando por uma transição de um estado de baixa afinidade o estado T para um de alta afinidade o estado R à medida que mais molé culas de O2 vão sendo ligadas Como resultado a hemoglo bina tem uma curva de ligação ao oxigênio híbrida em forma de S ou sigmoide Figura 512 Proteínas com uma única cadeia polipeptídica com um único sítio de ligação não ge ram uma curva de ligação sigmoide mesmo se a ligação produzir uma mudança de conformação porque cada mo lécula do ligante interage de modo independente e não afe ta a interação de outra molécula Em contrapartida a liga ção do O2 às subunidades individuais da hemoglobina pode alterar a afinidade nas subunidades adjacentes A primeira molécula de O2 que interage com a desoxiemoglobina o faz Estado T Estado R Val FG5 Heme O2 Leu FG3 Hélice F Leu F4 His F8 FIGURA 511 Mudanças de conformação próximas ao heme pela li gação do O2 à desoxiemoglobina Derivado de PDB ID 1HGA e 1BBB Acreditase que a alteração da posição da hélice F quando o heme se liga ao O2 seja um dos ajustes que desencadeia a transição T S R His HC3 His HC3 His HC3 Estado T Estado R a1 b1 a2 b2 a1 b1 a2 b2 FIGURA 510 A transição T S R PDB ID 1HGA e 1BBB Nesta representa ção da desoxiemoglobina as subunidades b estão em azul e as subunidades a estão em cinza como na Figura 59 Cadeias laterais carregadas positiva mente e cadeias terminais envolvidas em pares iônicos estão mostradas em azul e suas parceiras carregadas negativamente em vermelho A Lys C5 de cada subunidade a e a Asp FG1 de cada subunidade b são visíveis mas não estão marcadas compare com a Figura 59a Observe que a molécula está com orientação ligeiramente diferente da Figura 59 A transição do estado T para o estado R altera de modo considerável os pares de subunidades afe tando determinados pares iônicos Mais perceptivelmente os resíduos de His HC3 na extremidade carboxiterminal das subunidades b que no estado T estão envolvidos em pares iônicos no estado R sofrem rotação em direção ao centro da molécula onde não estão mais em pares iônicos Outro resul tado significativo da transição T S R é um estreitamento do bolsão entre as subunidades b Nelson6edbookindb 165 Nelson6edbookindb 165 020414 1843 020414 1843 166 DAVID L NELSON MICHAEL M COX fracamente pois se liga a uma subunidade no estado T Sua ligação contudo leva a mudanças conformacionais trans feridas às subunidades adjacentes facilitando a ligação de moléculas adicionais de O2 De fato a transição T S R ocorre mais facilmente na segunda subunidade depois da ligação do O2 à primeira subunidade A última quarta mo lécula de O2 se liga ao heme de uma subunidade que já está no estado R e por isso se liga com afinidade muito mais alta do que a primeira Uma proteína alostérica é aquela em que a interação com um ligante em um sítio afeta as propriedades de liga ção de outro sítio na mesma proteína O termo alostérico deriva do grego allos outro e stereos sólido ou for ma Proteínas alostéricas são as que têm outras formas ou conformações induzidas pela interação com ligantes denominados moduladores A mudança conformacional in duzida pelos moduladores interconverte formas mais ativas e menos ativas da proteína Os moduladores das proteínas alostéricas podem ser inibidores ou ativadores Quando o ligante normal e o modulador são idênticos a in teração é chamada de homotrópica Quando o modulador é uma molécula diferente do ligante normal a interação é heterotrópica Algumas proteínas têm dois ou mais modu ladores e em função disso podem participar de interações homotrópicas e heterotrópicas A interação cooperativa de um ligante com uma pro teína multimérica como observado com a ligação do O2 à hemoglobina é uma forma de ligação alostérica A inte ração de um ligante afeta a afinidade de qualquer sítio de ligação ainda não ocupado e o O2 pode ser considerado como ligante e modulador homotrópico ativador Existe apenas um sítio de ligação para o O2 em cada subunidade de forma que os efeitos alostéricos que dão origem à coo peratividade são mediados por mudanças conformacionais transmitidas de uma subunidade à outra por interações subunidadesubunidade Uma curva sigmoide é sinal de ligação cooperativa Ela permite uma resposta muito mais sensível à concentração do ligante sendo importante para a função de muitas proteínas multiméricas O princípio da alosteria também se aplica às enzimas reguladoras como será visto no Capítulo 6 As mudanças conformacionais cooperativas depen dem de variações na estabilidade estrutural de diferentes partes da proteína conforme descrito no Capítulo 4 Os sítios de ligação de uma proteína consistem em segmentos estáveis próximos a segmentos relativamente instáveis sendo os últimos capazes de mudanças frequentes na conformação ou de desordem intrínseca Figura 513 4 8 12 16 pO2 kPa pO2 nos tecidos pO2 nos pulmões Transição do estado de baixa afinidade para o de alta afinidade Estado de baixa afinidade Estado de alta afinidade 10 08 06 02 04 0 u FIGURA 512 Curva sigmoide de ligação cooperativa A curva sig moide de ligação pode ser vista como uma curva híbrida que reflete a transi ção de um estado de baixa afinidade para um de alta afinidade Devido a sua ligação cooperativa evidenciada por uma curva sigmoide a hemoglobina é mais sensível às pequenas diferenças na concentração de O2 entre os tecidos e os pulmões o que lhe permite se ligar ao oxigênio nos pulmões onde a pO2 é alta e liberálo nos tecidos onde a pO2 é baixa Sítio de ligação Sítio de ligação Ligante Estável Menos estável Instável Sem ligante Os segmentos em corderosa são flexíveis poucas conformações facilitam a interação do ligante Os segmentos em verde são estáveis no estado de baixa afinidade Interação do ligante com uma subunidade A interação estabiliza a conformação de alta afinidade do segmento flexível agora mostrado em verde O restante do polipeptídeo adquire conformação de alta afinidade e essa mesma conformação é estabilizada na outra subunidade por meio de interações proteínaproteína A segunda molécula do ligante interage com a segunda subunidade Essa interação ocorre com uma afinidade mais alta do que a interação da primeira molécula originando uma cooperatividade positiva FIGURA 513 Mudanças estruturais em uma proteína multimérica no processo de interação cooperativa com o ligante A estabilidade estrutural não é uniforme em toda a molécula da proteína Aqui está mostra da uma proteína dimérica hipotética com regiões de alta em azul média em verde e baixa em vermelho estabilidade Os sítios de interação com o ligante são formados por segmentos de alta e baixa estabilidade de forma que a afinidade pelo ligante é relativamente baixa As mudanças conforma cionais que ocorrem pela interação com o ligante transformam a proteína de um estado de baixa afinidade para um de alta afinidade uma forma de encaixe induzido Nelson6edbookindb 166 Nelson6edbookindb 166 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 167 No momento da interação com o ligante as partes móveis do sítio de ligação na proteína devem ser estabilizadas em uma conformação particular afetando a conformação das subunidades polipeptídicas adjacentes Se o sítio de liga ção como um todo fosse altamente estável poucas mu danças estruturais ocorreriam nesse sítio ou seriam pro pagadas para outras partes da proteína após a interação com o ligante Como no caso da mioglobina outros ligantes além do oxigênio podem interagir com a hemoglobina Um exemplo importante é o CO que interage 250 vezes melhor com a proteína do que o O2 A exposição humana ao CO pode ter consequências trágicas Quadro 51 A interação cooperativa do ligante pode ser descrita em termos quantitativos A ligação cooperativa do oxigênio pela hemoglobina foi ana lisada pela primeira vez por Archibald Hill em 1910 Desse trabalho surgiu a abordagem geral para o estudo da inte ração cooperativa de ligantes com proteínas multiméricas Para uma proteína com n sítios de ligação o equilíbrio da Equação 51 tornase 512 e a expressão para a constante de associação tornase 513 A expressão para u ver Equação 58 é 514 Rearranjar e então tomar o log em ambos os lados resulta em 515 516 em que Kd 5 L n 05 A Equação 516 é a equação de Hill e uma curva do log u1 u versus log L é chamada de curva de Hill Com base na equação a curva de Hill deveria ter uma inclinação de n Contudo a inclinação determinada experimentalmente na verdade não reflete o número de sítios de ligação mas o grau de interação entre eles A inclinação de uma curva de Hill é por isso denominada nH o coeficiente de Hill que é a medida do grau de cooperatividade Se nH for igual a 1 a interação com o ligante não é cooperativa situação que pode surgir mes mo em uma proteína multimérica se as subunidades não se comunicam Um nH maior que 1 indica cooperativida de positiva Essa é a situação observada na hemoglobina na qual a interação com uma molécula do ligante facili ta a interação de outras O limite superior teórico para nH é alcançado quando nH 5 n Nesse caso a ligação é completamente cooperativa todos os sítios de ligação na proteína serão ocupados com os ligantes de maneira si multânea e não haverá em nenhuma situação proteínas parcialmente saturadas Esse limite nunca é alcançado na prática e o valor de nH é sempre menor do que o número real de sítios de ligação na proteína Um nH menor que 1 indica cooperatividade negativa na qual a interação de uma molécula de ligante impede a inte ração de outras São raros os casos bem documentados de cooperatividade negativa Para adaptar a equação de Hill à ligação do oxigênio com a hemoglobina é preciso substituir novamente L por pO2 e Kd por P n 50 517 As curvas de Hill para a mioglobina e a hemoglobina estão apresentadas na Figura 514 Dois modelos sugerem mecanismos para a ligação cooperativa Os bioquímicos têm hoje muitas informações sobre os es tados T e R da hemoglobina mas muito ainda permanece para ser estudado sobre como ocorre a transição T S R Dois modelos para a interação cooperativa de ligantes a proteínas com múltiplos sítios de ligação têm influenciado muito as considerações sobre esse problema O primeiro modelo foi proposto por Jacques Monod Jeffries Wyman e JeanPierre Changeux em 1965 sendo chamado de modelo MWC ou modelo combinado Fi gura 515a Esse modelo presume que as subunidades de uma proteína de ligação cooperativa são funcionalmen te idênticas que cada subunidade pode existir em pelo menos duas conformações e que todas as subunidades 3 log pO2 23 0 3 21 1 0 1 2 22 2 22 21 log 1 2 u u Hemoglobina nH 5 3 Hemoglobina estado de alta afinidade nH 5 1 Mioglobina nH 5 1 Hemoglobina estado de baixa afinidade nH 5 1 FIGURA 514 Curvas de Hill para a ligação do oxigênio à mioglobi na e à hemoglobina Quando nH 5 1 não há cooperatividade evidente O grau máximo de cooperatividade observado para a hemoglobina corres ponde a cerca de nH 5 3 Observe que embora isto indique um alto nível de cooperatividade nH é menor que n que é o número de sítios de ligação para o O2 na hemoglobina Isto é normal para uma proteína que exibe comporta mento alostérico de ligação Nelson6edbookindb 167 Nelson6edbookindb 167 020414 1843 020414 1843 168 DAVID L NELSON MICHAEL M COX sofrem transição de uma conformação para a outra simul taneamente Nesse modelo nenhuma proteína tem subuni dades em conformações diferentes As duas conformações estão em equilíbrio O ligante pode interagir com ambas as conformações mas interage com cada uma com afinidade diferente A interação sucessiva das moléculas do ligante à conformação de baixa afinidade mais estável na ausência do ligante torna mais provável a transição para a confor mação de alta afinidade No segundo modelo o modelo sequencial Figura 515b proposto em 1966 por Daniel Koshland e colabora dores a interação com o ligante pode induzir uma mudança de conformação em uma subunidade individual Essa mu dança provoca uma alteração similar em uma subunidade Lago Powell Arizona agosto de 2000 Uma família esta va aproveitando suas férias em uma casabarco alugada quando o gerador de eletricidade foi ligado para fazer funcionar um aparelho de arcondicionado e um televi sor Quinze minutos mais tarde dois irmãos com 8 e 11 anos pularam do convés da popa para nadar A abertu ra do exaustor do gerador estava situada imediatamente abaixo do convés espaço onde os dois foram nadar Em dois minutos os dois meninos foram envolvidos pelo mo nóxido de carbono que havia se concentrado no espaço abaixo do convés Os dois se intoxicaram e morreram afogados Essas mortes juntamente com uma série de outras mortes ocorridas na década de 1990 que tinham ligação com casasbarco de modelo semelhante levaram por fim ao recolhimento e à reestruturação da montagem do exaustor do gerador O monóxido de carbono CO gás incolor e inodo ro é responsável por mais da metade das mortes anuais por envenenamento no mundo Tem uma afinidade pela hemoglobina 250 vezes maior do que a do oxigênio Em consequência níveis relativamente baixos de CO podem ter efeitos substanciais e trágicos O complexo formado pela ligação do CO à hemoglobina é chamado de carbo xiemoglobina ou COHb Pequena parte do CO é produzida por processos na turais mas altos níveis localizados geralmente resultam de atividade humana Motores e exaustores de caldei ras são fontes importantes já que o CO é um subprodu to da combustão incompleta de combustíveis fósseis Somente nos Estados Unidos cerca de 4000 pessoas morrem por envenenamento por CO por ano de modo acidental ou intencional Muitas das mortes acidentais envolvem a produção não detectada de CO em ambien tes fechados por mau funcionamento ou vazamento de caldeiras domésticas liberando a substância dentro de casa No entanto o envenenamento também pode ocor rer em espaços abertos quando pessoas desavisadas inalam o CO do escapamento de geradores motores de popa motores de tratores veículos de recreação ou aparadores de grama Os níveis de CO na atmosfera raramente são pe rigosos variando de menos de 005 parte por milhão ppm em áreas não habitadas e remotas até 3 a 4 ppm em algumas cidades do hemisfério norte Nos Estados Unidos o limite de CO determinado pelo governo Oc cupational Safety and Health Administration OSHA em locais de trabalho é de 50 ppm por pessoa por turno de oito horas A forte ligação do CO à hemoglobina in dica que a COHb pode acumularse ao longo do tempo quando as pessoas são expostas a uma fonte constante e de baixo nível de CO Em média em indivíduos saudáveis menos de 1 da hemoglobina total está complexada como COHb Uma vez que o CO é um produto da fumaça do tabaco muitos fu mantes têm níveis de COHb na faixa de 3 a 8 do total da hemoglobina podendo aumentar para 15 nos fumantes inveterados Os níveis de COHb equilibramse em 50 nas pessoas que respiram ar contendo 570 ppm de CO por várias horas Métodos confiáveis foram desenvolvi dos para relacionar o conteúdo de CO na atmosfera com os níveis de COHb no sangue Figura Q1 Testes com casasbarco com escapamento do gerador semelhante ao responsável pelas mortes no Lago Powell mostraram níveis de CO alcançando de 6000 a 30000 ppm sob o convés e níveis de O2 sendo reduzidos de 21 para 12 no mesmo local Mesmo acima do convés foram detectados níveis de CO de 7200 ppm suficientemente altos para causar morte em poucos minutos Como uma pessoa é afetada pela COHb Em níveis de menos de 10 do total de hemoglobina raramente se observam sintomas Em 15 o indivíduo sente dor de cabeça leve Em 20 a 30 a dor de cabeça é forte QUADRO 51 MEDICINA Monóxido de carbono um assassino furtivo 14 100 8 h exercício leve 1 h exercício leve 8 h em repouso 1 h em repouso 12 COHb no sangue 10 8 6 4 2 0 0 20 40 Monóxido de carbono ppm 60 80 FIGURA Q1 Relação entre os níveis de COHb no sangue e a concentra ção de CO no ar ambiente São mostradas quatro condições diferentes comparandose os efeitos de exposição breve versus exposição prolon gada e exposição em repouso versus exposição durante exercício leve Nelson6edbookindb 168 Nelson6edbookindb 168 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 169 adjacente sendo mais provável a interação de uma segunda molécula do ligante Existem mais estados intermediários possíveis nesse modelo do que no modelo combinado Os dois não são mutuamente exclusivos o modelo combinado pode ser visto como o caso restritivo tudo ou nada do mo delo sequencial No Capítulo 6 esses modelos serão utiliza dos para investigar as enzimas alostéricas A hemoglobina também transporta H 1 e CO2 Além de carregar praticamente todo o oxigênio de que as células necessitam dos pulmões para os tecidos a hemo globina transporta dois produtos finais da respiração ce lular H 1 e CO2 dos tecidos para os pulmões e para os rins onde são excretados O CO2 produzido pela oxidação e geralmente acompanhada por náusea tontura con fusão desorientação e alguns distúrbios visuais esses sintomas costumam ser reversíveis pelo tratamento com oxigênio Em níveis de COHb de 30 a 50 os sintomas neurológicos tornamse mais graves e em níveis pró ximos de 50 o indivíduo perde a consciência e pode entrar em coma Pode seguirse deficiência respiratória Com a exposição prolongada alguns danos tornamse permanentes A morte normalmente ocorre quando os níveis de COHb ultrapassam 60 A necropsia nos me ninos que morreram no Lago Powell revelou níveis de COHb de 59 e 52 A ligação do CO à hemoglobina é afetada por muitos fatores incluindo exercício Figura Q1 e mudanças na pressão atmosférica relacionadas com a altitude Devido aos seus níveis basais de COHb mais altos os fumantes expostos a uma fonte de CO com frequência apresentam sintomas mais rapidamente do que os não fumantes Os indivíduos com doenças cardíacas pulmonares ou san guíneas que reduzem a disponibilidade do oxigênio para os tecidos também podem experimentar sintomas em ní veis mais baixos de exposição ao CO Os fetos são parti cularmente mais suscetíveis ao risco de envenenamento por CO pois a hemoglobina fetal tem uma afinidade pelo CO um pouco mais alta do que a hemoglobina do adulto Têm sido relatados casos de exposição ao CO nos quais o feto morre mas a mãe sobrevive Parece surpreendente que a perda da metade da nossa hemoglobina para a COHb possa ser fatal sabe se que as pessoas com qualquer uma das várias con dições de anemia conseguem viver razoavelmente bem com metade do total de hemoglobina ativa No entanto a ligação do CO faz mais do que remover proteína do reservatório disponível para se ligar ao oxigênio Ela também afeta a afinidade pelo oxigênio das subunidades remanescentes da hemoglobina Quando o CO se liga a uma ou duas subunidades do tetrâmero da hemoglobi na a afinidade pelo O2 é substancialmente aumentada nas subunidades restantes Figura Q2 Assim o tetrâ mero com duas moléculas de CO pode se ligar ao O2 de modo eficiente nos pulmões mas libera muito pouco nos tecidos A privação do oxigênio nos tecidos torna se grave rapidamente Para aumentar o problema os efeitos do CO não estão limitados à interferência com a função da hemoglobina O CO ligase a outras hemepro teínas e a uma grande variedade de metaloproteínas As consequências dessas interações ainda não estão bem explicadas mas podem ser responsáveis por alguns dos efeitos de longo prazo do envenenamento agudo mas não fatal por CO Na suspeita de envenenamento por CO é essencial que a pessoa seja levada para longe da fonte do gás mas isso nem sempre resulta em recuperação rápida Quan do um indivíduo é removido de um local poluído com CO para uma atmosfera normal o O2 começa a substi tuir o CO na hemoglobina mas os níveis de COHb di minuem muito lentamente pois a meiavida é de 2 a 65 horas dependendo dos fatores ambientais Porém se forem administrados por meio de uma máscara 100 de oxigênio a uma pressão de 3 atm 303 kPa a velo cidade de troca pode ser aumentada em quatro vezes e a meiavida para a troca O2CO pode ser reduzida para algumas dezenas de minutos Assim o tratamento rápi do por uma equipe médica adequadamente equipada é fundamental Os detectores de CO são altamente recomendados em todas as casas sendo uma medida simples e barata para evitar possíveis tragédias 08 100 06 04 02 0 Hb normal 50 COHb Indivíduo anêmico pO2 kPa 8 12 4 u pO2 nos tecidos pO2 nos pulmões FIGURA Q2 Várias curvas de ligação do oxigênio para hemoglobina normal para hemoglobina de um indivíduo anêmico com somente 50 de sua hemoglobina funcional e para hemoglobina de um indivíduo com 50 das subunidades ocupadas com CO A pO2 no pulmão e nos tecidos humanos está indicada Nelson6edbookindb 169 Nelson6edbookindb 169 020414 1843 020414 1843 170 DAVID L NELSON MICHAEL M COX dos combustíveis orgânicos na mitocôndria é hidratado e forma bicarbonato CO2 1 H2O H 1 1 HCO 3 Esta reação é catalisada pela anidrase carbônica en zima particularmente abundante nos eritrócitos O CO2 não é muito solúvel em solução aquosa é possível a formação de bolhas de CO2 nos tecidos e no sangue se ele não for convertido em bicarbonato Como podese observar pela reação catalisada pela anidrase carbônica a hidratação do CO2 resulta em aumento na concentração de H 1 uma redu ção no pH nos tecidos A ligação do O2 pela hemoglobina é profundamente influenciada pelo pH e pela concentração de CO2 de forma que a conversão desse gás em bicarbonato é fundamental na regulação da ligação do oxigênio e sua liberação no sangue A hemoglobina transporta para os pulmões e para os rins cerca de 40 do total do H 1 e 15 a 20 do CO2 forma do nos tecidos o restante do H 1 é absorvido pelo tampão bicarbonato do plasma e o restante do CO2 é transporta do como HCO 3 e CO2 dissolvidos A ligação do H 1 e do CO2 tem uma relação inversa com a ligação do oxigênio No pH relativamente baixo e na alta concentração de CO2 dos tecidos periféricos a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio diminui quando o H 1 e o CO2 se ligam e o O2 é liberado para os tecidos Nos capilares do pulmão ao contrário quando o CO2 é excretado e o pH do sangue consequentemente aumenta a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio aumenta e a proteína se liga a mais O2 para transportar para os tecidos periféricos Esse efeito do pH e da concentração de CO2 sobre a ligação e a liberação do oxigênio pela hemoglobina é chamado de efeito Bohr re ferência ao fisiologista dinamarquês que o descobriu em 1904 Christian Bohr pai de Niels Bohr O equilíbrio da ligação para a hemoglobina e uma molé cula de oxigênio pode ser designado pela reação Hb 1 O2 HbO2 mas essa não é uma relação completa Para considerar o efeito da concentração do H 1 neste equilíbrio de ligação a reação é reescrita como HHb 1 1 O2 HbO2 1 H 1 onde HHb 1 é a forma protonada da hemoglobina Esta equação nos diz que a curva de saturação da hemoglobina pelo O2 é influenciada pela concentração de H 1 Figura 516 A hemoglobina se liga tanto ao O2 quanto ao H 1 mas com afinidade inversa Quando a concentração do oxigênio é alta como nos pulmões a hemoglobina se liga ao O2 e libera prótons Quando a concentração é baixa como nos tecidos periféricos ela se liga ao H 1 e o O2 é liberado FIGURA 515 Dois modelos gerais para a interconversão de formas inativas e ativas de uma proteína durante a interação coo perativa com o ligante Embora os modelos possam ser aplicados para qualquer proteína incluindo qualquer enzima Capítulo 6 que exiba ligação cooperativa aqui são mostradas quatro subunidades porque o modelo foi origi nalmente proposto para a hemoglobina a No modelo combinado ou tudo ou nada modelo MWC postulase que todas as subunidades es tejam na mesma conformação todas na forma s baixa afinidade ou inativas ou na forma h alta afinidade ou ativas Dependendo do equi líbrio Keq entre as formas s e h a interação com uma ou mais moléculas do ligante L desviará o equilíbrio na direção da forma h As subunidades que ligam L estão sombreadas b No modelo se quencial cada subunidade individual pode estar na forma s ou na forma h Assim é possível um grande número de conformações L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L a b Todos Todos 10 05 0 u 4 2 0 6 8 10 pO2 kPa pH 74 pH 76 pH 72 FIGURA 516 Efeito do pH sobre a ligação do oxigênio à hemoglobina O pH do sangue é 76 nos pulmões e 72 nos tecidos As medidas experi mentais das ligações à hemoglobina frequentemente são realizadas a pH 74 Nelson6edbookindb 170 Nelson6edbookindb 170 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 171 O O2 e o H 1 não se ligam ao mesmo sítio na hemoglo bina O O2 se liga ao átomo de ferro do heme enquanto o H 1 se liga a qualquer um dos vários resíduos de aminoá cidos na proteína A principal contribuição para o efeito Bohr é feita pela His 146 His HC3 das subunidades b Esse resíduo quando protonado forma um dos pares iônicos com a Asp 94 Asp FG1 que auxilia na estabilização da desoxiemoglobina no estado T Figura 59 O par iônico estabiliza a forma protonada da His HC3 dando a esse re síduo uma pKa anormalmente alta no estado T A pKa di minui para seu valor normal de 60 no estado R porque o par iônico não pode se formar e esse resíduo está não protonado na oxiemoglobina a pH 76 o pH do sangue nos pulmões À medida que a concentração de H 1 aumenta a protonação da His HC3 promove a liberação do oxigênio por favorecer a transição para o estado T A protonação dos resíduos aminoterminais das subunidades a de de terminados resíduos de His e talvez de outros grupos tem efeito semelhante Assim as quatro cadeias polipeptídicas da hemoglobina se comunicam entre si não somente com relação à ligação do O2 aos seus grupos heme mas também com relação à ligação do H 1 a resíduos específicos Além disso a hemoglo bina se liga ao CO2 também de uma maneira inversamente relacionada à ligação do oxigênio O dióxido de carbono se liga como grupo carbamato ao grupo aamino da extremi dade aminoterminal de cada cadeia de globina formando carbaminoemoglobina N H2 O 1 ƒ O ƒ R C C O H Resíduo aminoterminal H1 O C ƒ ƒ R C C O H N H C ƒ O2 Resíduo carbaminoterminal Esta reação produz H 1 contribuindo para o efeito Bohr Os carbamatos ligados formam também pontes salinas adicionais não mostradas na Figura 59 que auxiliam na estabilização do estado T e promovem a liberação do oxigênio Quando a concentração do dióxido de carbono é alta como nos tecidos periféricos algum CO2 se liga à hemoglo bina e reduz a afinidade pelo O2 causando sua liberação Quando ao contrário a hemoglobina chega aos pulmões a alta concentração do oxigênio promove a ligação do O2 e a liberação do CO2 É a capacidade de transmitir informação da interação com o ligante de uma subunidade polipeptídi ca para as outras que faz a molécula de hemoglobina ser tão maravilhosamente adaptada na integração do transporte de O2 CO2 e H 1 pelos eritrócitos A ligação do oxigênio com a hemoglobina é regulada pelo 23bifosfoglicerato A interação do 23bifosfoglicerato BPG com as molé culas de hemoglobina aprimora a função desta sendo um exemplo de modulação alostérica heterotípica H 2O ƒ O2 O2 P C C P H ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ C H O O O O 2O O2 O 23Bifosfoglicerato O BPG está presente em concentração relativamente alta nos eritrócitos Quando a hemoglobina é isolada ela contém grande quantidade de BPG difícil de ser removida por completo Na verdade as curvas de ligação entre he moglobina e O2 examinadas até agora foram obtidas na pre sença de BPG Sabese que o BPG reduz muito a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio existe uma relação inversa entre a ligação do O2 e do BPG Por isso é possível descre ver outro processo de ligação para a hemoglobina HbBPG 1 O2 HbO2 1 BPG O BPG ligase a um sítio distante do sítio de ligação do oxigênio e regula a afinidade do O2 pela hemoglobina em relação à pO2 nos pulmões O BPG é importante na adapta ção fisiológica à pO2 mais baixa nas grandes altitudes Em um ser humano saudável ao nível do mar a ligação do O2 à hemoglobina é regulada de modo que a quantidade de O2 liberada nos tecidos se aproxime de 40 da quantida de máxima que o sangue é capaz de transportar Figura 517 Imagine que essa pessoa seja transportada repen tinamente do nível do mar para uma altitude de 4500 me tros onde a pO2 é muito mais baixa A liberação de O2 para os tecidos é reduzida No entanto após poucas horas na maior altitude a concentração de BPG no sangue começa a aumentar levando a uma redução na afinidade da hemo globina pelo O2 Esse ajuste no nível de BPG tem somente um pequeno efeito na ligação do O2 nos pulmões mas seu efeito é considerável na liberação do O2 nos tecidos Como resultado a liberação do oxigênio para os tecidos é restau rada para cerca de 40 do O2 que pode ser transportado pelo sangue A situação é revertida quando a pessoa retor na ao nível do mar A concentração de BPG nos eritrócitos aumenta também em pessoas que sofrem de hipoxia ou seja redução da oxigenação dos tecidos periféricos devido ao funcionamento inadequado dos pulmões ou do sistema circulatório O sítio de ligação do BPG na hemoglobina é a cavidade entre as subunidades b no estado T Figura 518 Essa cavidade é revestida por resíduos de aminoácidos com car gas positivas que interagem com os grupos do BPG carre gados negativamente Ao contrário do O2 somente uma molécula de BPG se liga a cada tetrâmero da hemoglobina O BPG reduz a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio por que estabiliza o estado T A transição ao estado R estreita o bolsão de ligação para o BPG impedindo sua ligação Na ausência do BPG a hemoglobina é convertida mais facil mente ao estado R Nelson6edbookindb 171 Nelson6edbookindb 171 020414 1843 020414 1843 172 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A regulação da ligação do oxigênio à hemoglobina pelo BPG tem importante função no desenvolvimento fetal Como o feto precisa captar oxigênio do sangue da mãe a hemoglobina fetal precisa ter maior afinidade pelo O2 do que a hemoglobina materna O feto sintetiza subunidades g em vez de b formando a hemoglobina a2g2 Esse tetrâmero tem uma afinidade muito mais baixa pelo BPG do que a he moglobina normal do adulto tendo uma afinidade mais alta pelo O2 Proteínas de ligação ao oxigênio a hemoglobina é suscetí vel à regulação alostérica A anemia falciforme é uma doença molecular da hemoglobina A anemia falciforme doença humana hereditária demonstra de forma impressionante a importância da sequência de aminoácidos na determinação das estru turas secundária terciária e quaternária das proteínas globulares e portanto suas funções biológicas Sabese que existem quase 500 variantes genéticas da hemoglobi na na população humana a maioria delas é muito rara A maior parte das variações consiste em diferenças em um único resíduo de aminoácido Os efeitos sobre a estrutura e a função da hemoglobina com frequência são pequenos mas às vezes podem ser extraordinários Cada variação é produto de alteração em um gene Os genes variantes são denominados alelos Como os humanos geralmente têm duas cópias de cada gene um indivíduo pode ter duas có pias de um alelo sendo portanto homozigoto para esse gene ou uma cópia de cada um de dois alelos diferentes portanto heterozigoto A anemia falciforme ocorre em indivíduos que herdaram o alelo para a hemoglobina falciforme de ambos os pais Os eritrócitos desses indivíduos são anormais e em menor nú mero O sangue contém muitos eritrócitos longos e finos em forma de foice além de um grande número de células imaturas Figura 519 Quando a hemoglobina das células falciformes chamada de hemoglobina S é desoxigenada ela tornase insolúvel e forma polímeros que se agregam em fibras tubulares Figura 520 A hemoglobina normal he moglobina A permanece solúvel após a desoxigenação As fibras insolúveis induzem a deformação dos eritrócitos e a proporção das células falciformes aumenta muito à medida que o sangue é desoxigenado As propriedades alteradas da hemoglobina S resultam da substituição de um único aminoácido Val em vez de 10 05 0 u 4 8 12 16 pO2 kPa BPG 5 mM no nível do mar pO2 nos tecidos pO2 nos pulmões 4500 m pO2 nos pulmões nível do mar 37 BPG 0 mM BPG 8 mM em grandes altitudes 4500 m 38 30 FIGURA 517 Efeito de BPG sobre a ligação do oxigênio à hemoglo bina A concentração de BPG no sangue humano normal é de 5 mM no nível do mar e 8 mM nas grandes altitudes Observe que a hemoglobina se liga muito fortemente ao oxigênio na ausência de BPG e a curva de ligação parece hiperbólica Na verdade o coeficiente de Hill medido para a coope ratividade da ligação do O2 se reduz muito pouco de 3 para cerca de 25 quando o BPG é removido da hemoglobina mas a parte ascendente da cur va sigmoide está confinada a uma região muito pequena próxima à origem No nível do mar a hemoglobina está quase totalmente saturada com O2 nos pulmões mas somente um pouco acima de 60 nos tecidos de forma que a quantidade de O2 liberada nos tecidos alcança cerca de 38 do máximo que pode ser transportado no sangue Em grandes altitudes a liberação do O2 é reduzida em um quarto para 30 do máximo Um aumento na con centração de BPG contudo reduz a afinidade da hemoglobina pelo O2 de forma que aproximadamente 37 do que pode ser transportado é liberado novamente para os tecidos BPG a b FIGURA 518 Ligação do BPG à desoxiemoglobina a A ligação do BPG estabiliza o estado T da desoxiemoglobina PDB ID 1B86 As cargas negativas do BPG interagem com vários grupos positivamente carregados mostrados em azul nesta imagem de contorno de superfície que circun dam o bolsão entre as subunidades b no estado T b O bolsão para ligação do BPG desaparece com a oxigenação que segue a transição para o estado R PDB ID 1BBB Compare com a Figura 510 Nelson6edbookindb 172 Nelson6edbookindb 172 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 173 Glu na posição 6 das duas cadeias b O grupo R da valina não tem carga ao passo que o glutamato tem carga negati va em pH 74 Por isso a hemoglobina S tem duas cargas negativas a menos do que a hemoglobina A uma a menos em cada cadeia b A substituição do resíduo Glu pelo Val cria um ponto de contato hidrofóbico adesivo na posição 6 da cadeia b que está na superfície externa da molécula Devido a esses pontos as moléculas de desoxiemoglobina S se associam anormalmente entre si formando os agrega dos longos e fibrosos característicos dessa enfermidade Proteínas de ligação ao oxigênio defeitos na hemoglobina causam doença genética séria A anemia falciforme como observado ocorre em indi víduos homozigotos para o alelo falciforme do gene que co difica a subunidade b da hemoglobina Os indivíduos que recebem o alelo falciforme apenas de um dos pais sendo portanto heterozigotos apresentam uma condição mais branda chamada de traço falciforme somente cerca de 1 de seus eritrócitos tornase falciforme com a desoxigena ção Esses indivíduos podem ter vida totalmente normal se evitarem exercícios vigorosos ou outros estresses do siste ma circulatório A anemia falciforme é dolorosa e fatal As pessoas com essa doença sofrem crises repetidas provocadas por es forço físico Tornamse fracas com vertigens e ofegantes sentem ruídos cardíacos e aumento na pulsação O con teúdo de hemoglobina do seu sangue é somente a metade do valor normal de 15 a 16 g100 mL porque as células falciformes são muito frágeis e se rompem com facilida de isso resulta em anemia falta de sangue Uma con sequência ainda mais grave é que os capilares ficam blo queados pelas células longas e com morfologia anormal causando muita dor e interferindo com a função normal dos capilares principal fator para a morte prematura de muitos pacientes Sem tratamento médico as pessoas com anemia falci forme geralmente morrem na infância Curiosamente a fre quência do alelo falciforme na população é muito alta em determinadas partes da África A investigação desse assun to levou à constatação de que nos indivíduos heterozigo tos o alelo confere resistência pequena mas significativa a formas letais da malária A seleção natural resultou em uma população de alelos que equilibra os efeitos deletérios da condição homozigota com a resistência à malária propiciada pela condição heterozigota a b 2 mm FIGURA 519 Comparação entre a eritrócitos normais uniformes e em forma de taça e b eritrócitos com formas variadas vistos na anemia falci forme que variam desde os normais até os pontudos ou em forma de foice Hemoglobina A Hemoglobina S Interação entre moléculas Formação de filamento Alinhamento e cristalização formação de fibras a2 b1 b2 a1 a2 b1 b2 a1 a b FIGURA 520 Hemoglobina normal e falciforme a As diferenças sutis entre a conformação da hemoglobina A e da hemoglobina S resultam da mudança de um único aminoácido nas cadeias b b Como resultado desta mudança a desoxiemoglobina S tem uma porção hidrofóbica na sua super fície o que causa a agregação das moléculas em filamentos que se associam em fibras insolúveis Nelson6edbookindb 173 Nelson6edbookindb 173 020414 1843 020414 1843 174 DAVID L NELSON MICHAEL M COX RESUMO 51 Interação reversível de uma proteína com um ligante proteínas de ligação ao oxigênio c A função proteica frequentemente necessita de intera ções com outras moléculas Uma proteína interage com uma molécula conhecida como ligante no seu sítio de ligação As proteínas sofrem alterações conformacionais quando interagem com o ligante processo chamado de encaixe induzido Em uma proteína multimérica a in teração do ligante com uma subunidade pode afetar a interação com as outras subunidades A interação com o ligante pode ser regulada c A mioglobina contém um grupo prostético heme que se liga ao oxigênio O heme consiste em um único átomo de Fe 21 coordenado no interior de uma porfirina O oxigê nio se liga reversivelmente à mioglobina essa ligação re versível simples pode ser descrita por uma constante de associação Ka ou uma constante de dissociação Kd Para uma proteína monomérica como a mioglobina a fração dos sítios de ligação ocupados pelo ligante é uma função hiperbólica da concentração do ligante c A hemoglobina adulta normal tem quatro subunidades contendo heme duas a e duas b semelhantes em estru tura entre si e com a mioglobina A hemoglobina existe em dois estados estruturais alternados T e R O estado T é mais estável quando o oxigênio não está ligado A li gação do oxigênio promove a transição para o estado R c A ligação do oxigênio à hemoglobina é alostérica e coo perativa Quando o O2 ocupa um sítio de ligação a he moglobina sofre mudanças conformacionais que afetam os outros sítios de ligação exemplo de comportamento alostérico As mudanças conformacionais entre os esta dos T e R mediadas pelas interações subunidadesubu nidade resultam em ligação cooperativa isto é repre sentado por uma curva de ligação sigmoide e pode ser analisado por uma curva de Hill c Dois modelos principais têm sido propostos para explicar a interação cooperativa de ligantes com proteínas multi méricas o modelo combinado e o modelo sequencial c A hemoglobina também se liga ao H 1 e ao CO2 resul tando na formação de pares iônicos que estabilizam o estado T e reduzem a afinidade da proteína pelo O2 o efeito Bohr A ligação do O2 à hemoglobina é modulada também pelo 23bifosfoglicerato que se liga ao estado T e o estabiliza c A anemia falciforme é uma doença genética causada pela substituição de um único aminoácido Glu 6 por Val 6 nas cadeias b da hemoglobina A mudança gera uma região hidrofóbica na superfície da hemoglobina que causa a agregação das moléculas em feixes de fi bras Essa condição homozigota resulta em graves com plicações médicas 52 Interações complementares entre proteínas e ligantes o sistema imune e as imunoglobulinas Foi visto como as conformações das proteínas de ligação ao oxigênio afetam e são afetadas pela interação de ligan tes pequenos O2 ou CO com o grupo heme No entanto a maioria das interações proteínaligante não envolve um grupo prostético Em vez disso o sítio de ligação com o ligante mais comumente se parece ao sítio de ligação da hemoglobina com o BPG uma fenda na proteína revesti da por resíduos de aminoácidos organizados para tornar a interação altamente específica A diferenciação eficaz entre os ligantes é a norma nos sítios de ligação mesmo quando os ligantes apresentam apenas pequenas diferen ças estruturais Todos os vertebrados têm um sistema imune capaz de fazer a distinção molecular entre próprio e não próprio e destruir o que for identificado como não próprio Dessa forma o sistema imune elimina vírus bactérias e outros patógenos e moléculas que possam representar ameaça ao organismo Em nível fisiológico a resposta imune constitui um conjunto intricado e coordenado de interações entre muitas classes de proteínas moléculas e tipos celulares No nível das proteínas individuais a resposta imune demonstra como um sistema bioquímico altamente sensível é desen volvido a partir de interações reversíveis entre ligantes e proteínas A resposta imune caracteriza um conjunto de células e proteínas especializadas A imunidade é realizada por uma grande variedade de leucócitos células brancas do sangue incluindo os ma crófagos e os linfócitos todos desenvolvidos na medula óssea a partir de célulastronco não diferenciadas Os linfó citos deixam a corrente sanguínea e patrulham os tecidos cada célula produzindo uma ou mais proteínas capazes de reconhecer e de se ligar a moléculas que poderiam sinalizar uma infecção A resposta imune consiste em dois sistemas comple mentares o sistema imune humoral e o celular O sistema imune humoral do latim humor fluido é dirigido para infecções bacterianas e vírus extracelulares encontrados nos fluidos do corpo mas também pode responder a pro teínas estranhas O sistema imune celular destrói células hospedeiras infectadas por vírus além de destruir alguns parasitas e tecidos estranhos No centro da resposta imune humoral estão proteínas solúveis chamadas de anticorpos ou imunoglobulinas abreviadas como Ig As imunoglobulinas se ligam a bacté rias vírus ou moléculas grandes identificadas como estra nhas e as conduzem para a destruição Constituindo 20 do total de proteínas sanguíneas as imunoglobulinas são pro duzidas pelos linfócitos B ou células B que completam seu desenvolvimento na medula óssea Os agentes no centro da resposta imune celular são uma classe de linfócitos T ou células T assim chama das porque os últimos estágios de seu desenvolvimento ocorrem no timo conhecidas como células T citotóxi cas células TC O reconhecimento de células infectadas ou de parasitas envolve proteínas chamadas de recepto res de células T na superfície das células T citotóxicas Os receptores são proteínas normalmente encontradas na superfície externa das células e que se estendem através da membrana plasmática eles reconhecem e interagem com ligantes extracelulares desencadeando mudanças no interior da célula Nelson6edbookindb 174 Nelson6edbookindb 174 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 175 Além das células T citotóxicas existem as células T auxiliares células TH de helper T cells cuja função é produzir proteínas sinalizadoras solúveis chamadas de citocinas as quais incluem as interleucinas As células TH interagem com os macrófagos e participam somente de modo indireto na destruição das células infectadas e dos patógenos estimulando a proliferação seletiva das células TC e B que podem se ligar a um antígeno específico Esse processo chamado de seleção clonal aumenta o número de células do sistema imune que podem responder a um patógeno específico A importância das células TH é ilustra da pela epidemia produzida pelo HIV vírus da imunode ficiência humana o vírus que causa a Aids síndrome da imunodeficiência adquirida Os alvos primários da infecção por HIV são as células TH cuja eliminação incapacita pro gressivamente todo o sistema imune A Tabela 52 resume as funções de alguns leucócitos do sistema imune Cada proteína de reconhecimento do sistema imune seja um receptor de célula T ou um anticorpo produzido pelas células B se liga especificamente a uma determinada estrutura química distinguindoa de todas as outras Os hu manos têm a capacidade de produzir mais de 10 8 anticorpos diferentes com diferentes especificidades de ligação Em decorrência dessa extraordinária diversidade qualquer es trutura química na superfície de um vírus ou de uma célula invasora terá a probabilidade de ser reconhecida por um ou mais anticorpos e interagir com eles A diversidade de anti corpos é derivada do rearranjo aleatório de um conjunto de segmentos de genes de imunoglobulina por meio dos meca nismos de recombinação gênica apresentados no Capítulo 25 ver Figura 2542 Um vocabulário especializado é usado para descrever as interações exclusivas entre os anticorpos ou receptores de células T e as moléculas com as quais se ligam Qualquer molécula ou patógeno capaz de induzir resposta imune chamase antígeno Um antígeno pode ser um vírus uma parede bacteriana uma proteína isolada ou outra macro molécula Um antígeno complexo pode interagir com vários anticorpos diferentes Um determinado anticorpo ou um receptor de célula T se liga somente a uma estrutura mole cular específica dentro do antígeno chamada de determi nante antigênico ou epítopo Seria improdutivo para o sistema imune responder a pequenas moléculas intermediários comuns e produtos do metabolismo celular Moléculas com massa molecular me nor que 5000 em geral não são reconhecidas como antíge nos No entanto quando as moléculas pequenas são uni das covalentemente a uma proteína grande no laboratório elas podem ser usadas para induzir uma resposta imune Essas moléculas pequenas são chamadas de haptenos Os anticorpos produzidos em resposta aos haptenos ligados a proteínas se ligarão às mesmas moléculas pequenas na sua forma livre Tais anticorpos são utilizados às vezes no de senvolvimento de testes analíticos descritos adiante neste capítulo ou como ligante específico na cromatografia de afinidade ver Figura 318c Agora será feita uma descri ção mais detalhada dos anticorpos e de suas propriedades de ligação Os anticorpos têm dois sítios idênticos de ligação ao antígeno A imunoglobulina G IgG é a principal classe de molé cula de anticorpo e é uma das proteínas mais abundantes no soro As IgG são formadas por quatro cadeias polipep tídicas duas cadeias pesadas grandes e duas cadeias leves unidas por ligações não covalentes e ligações dis sulfeto formando um complexo com massa molecular de 150000 As cadeias pesadas interagem em uma das extre midades e se ramificam para interagir separadamente com as cadeias leves formando uma molécula com o formato de Y Figura 521 As imunoglobulinas podem ser hidro lisadas por proteases nas dobradiças que separam a base da molécula de seus braços A hidrólise pela papaína libe ra o fragmento basal chamado de Fc porque geralmente cristaliza com facilidade e os dois ramos chamados de Fab do inglês antigenbinding ou seja os fragmentos de ligação ao antígeno Cada ramo tem um único sítio de ligação ao antígeno A estrutura básica das imunoglobulinas foi estabelecida por Gerald Edelman e Rodney Porter Cada cadeia é for mada por domínios identificáveis alguns são constantes em sequência e estrutura entre as IgG outros são variáveis Os domínios constantes têm uma estrutura característica conhecida como padrão de enovelamento das imuno globulinas motivo estrutural bem conservado em todas as proteínas da classe b Capítulo 4 Existem três domínios constantes em cada cadeia pesada e um em cada cadeia leve As cadeias leves e pesadas também têm cada uma de las um domínio variável no qual se encontra a maior parte da variabilidade na sequência de aminoácidos Os domínios variáveis se associam para formar o sítio de ligação ao antí geno Figura 521 permitindo a formação de um comple xo antígenoanticorpo Figura 522 Em muitos vertebrados a IgG é apenas uma das cin co classes de imunoglobulinas Cada classe tem um tipo característico de cadeia pesada denominados a d g e m para IgA IgD IgE IgG e IgM respectivamente Dois tipos de cadeia leve k e l ocorrem em todas as classes de imunoglobulinas A estrutura global da IgD e da IgE é semelhante à da IgG A IgM ocorre tanto como mo nômero a forma de ligação à membrana quanto como forma secretada que consiste em um pentâmero da sua TABELA 52 Alguns tipos de leucócitos associados com o sistema imune Tipo celular Função Macrófagos Ingerem por fagocitose células e partículas grandes Linfócitos B células B Produzem e secretam anticorpos Linfócitos T células T Células T citotóxicas TC Interagem com células hospedei ras infectadas por meio de recep tores na superfície das células T Células T auxiliares TH Interagem com macrófagos e se cretam citocinas interleucinas que estimulam a proliferação das células TC TH e B Nelson6edbookindb 175 Nelson6edbookindb 175 020414 1843 020414 1843 176 DAVID L NELSON MICHAEL M COX estrutura básica Figura 523 A IgA encontrada prin cipalmente em secreções como saliva lágrima e leite pode ser um monômero dímero ou trímero A IgM é o primeiro anticorpo sintetizado pelos linfócitos B e o prin cipal anticorpo nos estágios iniciais de uma resposta imu ne primária Algumas células B logo começam a produzir IgD com o mesmo sítio de ligação ao antígeno que a IgM produzida pela mesma célula mas sua função específica é menos clara A IgG descrita anteriormente é o principal anticorpo secundário na resposta imune que se inicia por uma clas se de células B chamadas de células B de memória Como parte do avanço da imunidade do organismo aos antígenos já encontrados e combatidos a IgG é a imunoglobulina mais S S S S S S S S a VL CH2 CH2 CH3 CH3 Fc Sítio de ligação ao antígeno CL Sítio de ligação ao antígeno C 5 domínio constante V 5 domínio variável H L 5 cadeias pesadas e leves Sítios de hidrólise pela papaína H3N1 H3N1 NH3 1 COO2 NH3 1 2OOC COO2 2OOC VL VH VH CH1 Fab CH1 CL Carboidrato ligado b FIGURA 521 Imunoglobulina G a Pares de cadeias leves e pesadas combinamse para formar uma molécula com formato de Y Dois sítios de ligação ao antígeno formamse pela combinação dos domínios variáveis de uma cadeia leve VL e de uma cadeia pesada VH A hidrólise com papaína separa as porções Fc e Fab da proteína na região da dobradiça A porção Fc também contém carboidratos ligados mostrados em b b Modelo em fita da primeira molécula completa de IgG cristalizada e analisada estrutural mente PDB ID 1IGT Apesar de a molécula ter duas cadeias pesadas idênti cas dois tons de azul e duas cadeias leves idênticas dois tons de vermelho ela cristaliza na conformação assimétrica mostrada aqui É possível que a flexibilidade conformacional seja importante para a função das imunoglo bulinas Antígeno Anticorpo Complexo antígenoanticorpo FIGURA 522 Ligação da IgG a um antígeno Os sítios de ligação na IgG frequentemente sofrem pequenas mudanças conformacionais para gerar um encaixe ótimo para o antígeno Este encaixe induzido é comum em mui tas interações proteínaligante Cadeia J Cadeias leves Cadeias pesadas m FIGURA 523 Pentâmero IgM de unidades de imunoglobulina O pentâmero é unido por ligações dissulfeto em amarelo A cadeia J é um polipeptídeo de Mr 20000 encontrado na IgA e na IgM Nelson6edbookindb 176 Nelson6edbookindb 176 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 177 abundante no sangue Quando a IgG se liga a uma bactéria invasora ou a um vírus ela ativa determinados leucócitos como os macrófagos para engolfar e destruir o invasor e também ativa alguns outros elementos da resposta imune Os receptores na superfície dos macrófagos reconhecem e se ligam à região Fc da IgG Quando esses receptores se ligam a um complexo patógenoanticorpo o macrófago en golfa por fagocitose o complexo Figura 524 A IgE tem um papel importante na resposta alérgica interagindo com basófilos leucócitos fagocíticos no sangue e com células secretoras de histamina chamadas de mastócitos altamente distribuídas nos tecidos Essa imuno globulina se liga por meio de sua região Fc a receptores especiais nos basófilos ou nos mastócitos Assim a IgE ser ve como receptor para o antígeno Se o antígeno estiver li gado as células são induzidas a secretar histamina e outras aminas com atividades biológicas que causam dilatação e aumento da permeabilidade dos vasos sanguíneos Acredi tase que esses efeitos sobre os vasos facilitem o movimen to das células e proteínas do sistema imune para o local da inflamação Também produzem os sintomas normalmente associados com alergias O pólen ou outros alérgenos são reconhecidos como estranhos desencadeando uma respos ta imune normalmente reservada para patógenos Os anticorpos se ligam ao antígeno de modo firme e específico A especificidade de ligação de um anticorpo é determinada pelos resíduos de aminoácidos nos domínios variáveis de suas cadeias leves e pesadas Muitos resíduos desses domí nios são variáveis de uma forma aleatória Alguns chama dos de hipervariáveis são bem mais suscetíveis à variação em especial os que revestem o sítio de ligação ao antíge no A especificidade é conferida pela complementaridade química entre o antígeno e o seu sítio específico de ligação em termos de forma e da localização dos grupos carrega dos apolares e com ligações de hidrogênio Por exemplo um sítio de ligação com um grupo de carga negativa pode se ligar a um antígeno com carga positiva na posição com plementar Em muitos exemplos a complementaridade é obtida de modo interativo uma vez que as estruturas do antígeno e do sítio de ligação são influenciadas mutua mente à medida que se aproximam As mudanças confor macionais no anticorpo eou no antígeno então permitem a interação completa entre os grupos complementares Esse é um exemplo de encaixe induzido O complexo for mado por um peptídeo derivado do HIV modelo de antíge no e uma molécula Fab mostrado na Figura 525 ilustra algumas dessas propriedades As mudanças na estrutura observadas após a ligação do antígeno são particularmente notáveis neste exemplo Uma interação antígenoanticorpo típica é muito forte caracterizada por valores de Kd tão baixos quanto 10 10 M lembrese de que uma Kd mais baixa corresponde a uma interação mais forte ver Tabela 51 A Kd reflete a ener gia derivada das várias interações de van der Waals iônicas hidrofóbicas e de ligações de hidrogênio que estabilizam a ligação A energia de ligação necessária para produzir uma Kd de 10 10 M é de cerca de 65 kJmol a Conformação sem antígeno ligado b Antígeno ligado mas não mostrado c Antígeno ligado mostrado FIGURA 525 Encaixe induzido na ligação de um antígeno à IgG A molécula mostrada em contorno de superfície é o fragmento Fab de uma IgG O antígeno é um pequeno peptídeo derivado do HIV Dois resíduos na cadeia pesada em azul e um na cadeia leve em vermelho estão coloridos para servirem de pontos de referência visual a Visão na direção do sítio de ligação ao antígeno do fragmento Fab na ausência do antígeno PDB ID 1GGC b A mesma visão mas com o fragmento Fab na conformação ligada PDB ID 1GGI o antígeno foi omitido para dar uma visão clara do sítio de ligação alterado Observe como a cavidade de ligação se alargou e vários grupos tiveram suas posições alteradas c A mesma visão de b mas com o antígeno no sítio de ligação desenhado como estrutura em bastão vermelho Fagocitose Vírus coberto por IgG Região Fc da IgG Receptor Fc Macrófago FIGURA 524 Fagocitose por um macrófago de um vírus ligado a an ticorpos A região Fc dos anticorpos ligados ao vírus se liga aos receptores Fc na superfície de um macrófago desencadeando o engolfamento e a des truição do vírus Nelson6edbookindb 177 Nelson6edbookindb 177 020414 1843 020414 1843 178 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A interação antígenoanticorpo é a base para uma grande variedade de procedimentos analíticos importantes A extraordinária afinidade de ligação e a especificidade dos anticorpos os tornam reagentes analíticos valiosos Dois tipos de preparação de anticorpos são utilizados policlo nal e monoclonal Os anticorpos policlonais são aqueles produzidos por muitos linfócitos B diferentes em resposta a um antígeno como uma proteína injetada em um animal As células na população de linfócitos B produzem anticorpos que se ligam a epítopos diferentes e específicos no antíge no Assim as preparações policlonais contêm uma mistura de anticorpos que reconhecem diferentes partes da pro teína Os anticorpos monoclonais em contrapartida são sintetizados por uma população de células B idênticas um clone em cultivo celular Esses anticorpos são homogê neos todos reconhecendo o mesmo epítopo A técnica para produção de anticorpos monoclonais foi desenvolvida por Georges Köhler e Cesar Milstein A especificidade dos anticorpos tem utilidades práticas Um determinado anticorpo pode ser ligado covalentemente a uma resina e usado em uma coluna cromatográfica como a mostrada na Figura 317c Quando uma mistura de proteínas é adicionada à coluna o anticorpo se liga especificamente à sua proteínaalvo e a retém na coluna enquanto as outras proteínas não são retidas A proteínaalvo é então eluída da resina por uma solução salina ou algum outro agente Essa é uma ferramenta potente na análise de proteínas Em outra técnica analítica versátil um anticorpo é liga do a um marcador radioativo ou algum outro reagente que o torna facilmente detectável Quando o anticorpo se liga à proteínaalvo o marcador revela a presença da proteína em uma solução ou a sua localização em um gel ou mesmo em uma célula viva Diversas variações desse procedimento estão ilustradas na Figura 526 FIGURA 526 Técnicas com anticorpo A reação específica de um anticorpo com o seu antígeno é a base de várias técnicas que identificam e quantificam uma proteína específica em uma amostra complexa a Uma representação esquemática do método geral b Um Elisa para testar a presença de anticorpos anti HSV vírus do herpes simples em amostras de sangue Os poços foram recobertos com o antígeno HSV ao qual se ligarão os anticorpos contra HSV O segundo anticorpo é uma antiIgG humana ligada à peroxida se Ao se completarem as etapas mostradas em a os poços com coloração amarelobrilhante são os que conterão as amostras de sangue com as maiores quan tidades de anticorpos antiHSV c Um imunoblot As canaletas 1 a 3 são de um gel de SDS amostras de está gios sucessivos na purificação de uma proteínacinase foram separadas e coradas com azul de Coomassie As canaletas 4 a 6 mostram as mesmas amostras mas que foram eletroforeticamente transferidas para uma mem brana de nitrocelulose após a separação no gel de SDS A membrana foi então sondada com anticorpo contra a proteínacinase Os números entre o gel e o imuno blot indicam a massa molecular Mr em milhares Cobrir a superfície com a amostra antígeno Bloquear com proteína não específica os sítios que não estão ocupados Incubar com o anticorpo primário contra o antígeno específico Incubar com o complexo anticorpo secundárioenzima que se liga ao anticorpo primário Adicionar substrato A formação de produto colorido indica a presença do antígeno específico ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ ➏ a b Elisa 974 662 450 310 215 144 c Gel SDS Imunoblot 1 2 3 6 5 4 Georges Köhler 19461995 Cesar Milstein 19272002 Nelson6edbookindb 178 Nelson6edbookindb 178 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 179 Um Elisa do inglês enzymelinked immunosorbent assay ou ensaio imunossorvente ligado a enzima pode ser usado para fazer uma triagem rápida da quantidade de um antígeno em uma amostra Figura 526b As proteínas da amostra são adsorvidas em uma superfície inerte geral mente uma placa de poliestireno com 96 poços A superfície é lavada com uma solução de uma proteína não específica de baixo custo em geral caseína de leite em pó sem gordu ra para bloquear a adsorção das proteínas introduzidas nas etapas subsequentes aos locais vazios da placa A superfície é então tratada com solução contendo o anticorpo primário um anticorpo contra a proteína de interesse Anticorpos não ligados são removidos por lavagem e a superfície é tra tada com uma solução contendo um anticorpo secundário contra o anticorpo primário ligado a uma enzima que catalisa uma reação que forma um produto colorido Após a remoção do anticorpo secundário não ligado é adicionado o substrato da enzima A formação do produto monitorada pela intensidade da cor é proporcional à concentração na amostra da proteína de interesse Em um ensaio de imunoblot também chamado de Western blot Figura 526c as proteínas separadas por eletroforese em gel são transferidas eletroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose A membrana é blo queada conforme descrito antes para o Elisa e tratada su cessivamente com o anticorpo primário com o anticorpo secundário ligado à enzima e com o substrato Um precipi tado colorido se forma somente na banda que contém a pro teína de interesse O imunoblot permite a detecção de um componente minoritário em uma amostra e fornece uma estimativa de sua massa molecular Imunoblot Outras facetas dos anticorpos serão abordadas em capí tulos posteriores Extremamente importantes em medicina os anticorpos podem esclarecer muito sobre a estrutura das proteínas e a ação dos genes RESUMO 52 Interações complementares entre proteínas e ligantes o sistema imune e as imunoglobulinas c A resposta imune é mediada por interações entre um grupo de leucócitos especializados e suas proteínas as sociadas Os linfócitos T produzem receptores de célu las T e os linfócitos B produzem imunoglobulinas Em um processo chamado de seleção clonal as células T au xiliares induzem a proliferação ou de células B e células T citotóxicas que produzem imunoglobulinas ou de re ceptores de células T que interagem com um antígeno específico c Os humanos têm cinco classes de imunoglobulinas cada uma com funções biológicas distintas A IgG é a clas se mais abundante sendo uma proteína em formato de Y com duas cadeias pesadas e duas cadeias leves Os domínios próximos da extremidade superior do Y são hipervariáveis dentro da vasta população das IgG e for mam dois sítios de ligação ao antígeno c Determinada imunoglobulina geralmente interage com uma parte somente chamada de epítopo de um antí geno grande A interação frequentemente envolve mu danças na conformação da IgG um encaixe induzido ao antígeno c A especificidade de ligação refinada das imunoglobu linas é explorada em técnicas analíticas como Elisa e imunoblot 53 Interações proteicas moduladas por energia química actina miosina e motores moleculares Os organismos se movem As células se movem As orga nelas e as macromoléculas se movem dentro das células A maioria desses movimentos resulta da atividade de uma classe fascinante de motores moleculares proteicos Abas tecidos com energia química geralmente derivada de ATP grandes agregados de proteínas motoras são submetidos a mudanças conformacionais cíclicas que se acumulam em uma força unificada e direcional força muito pequena que separa os cromossomos em uma célula em divisão e uma força imensa que impulsiona no ar um felino selvagem de um quarto de tonelada As interações entre as proteínas motoras como pode ser previsto caracterizam combinações complementares de interações de van der Waals iônicas hidrofóbicas e de ligações de hidrogênio nos sítios de ligação das proteínas Nas proteínas motoras no entanto essas interações alcan çam níveis extremamente altos de organização espacial e temporal As proteínas motoras constituem a base da contração muscular da migração das organelas ao longo dos micro túbulos da rotação dos flagelos bacterianos e do movi mento de algumas proteínas ao longo do DNA As proteí nas chamadas de cinesinas e dineínas movemse ao longo dos microtúbulos puxando organelas ou reorganizando os cromossomos durante a divisão celular Uma interação da dineína com os microtúbulos realiza o movimento dos cí lios e dos flagelos eucarióticos O movimento flagelar das bactérias envolve um motor rotacional complexo na base do flagelo ver Figura 1941 As helicases as polimerases e outras proteínas movemse ao longo do DNA ao realizarem suas funções no metabolismo do ácido nucleico Capítulo 25 Aqui o foco será o exemplo bem estudado das proteí nas contráteis do músculo esquelético dos vertebrados como um paradigma para a forma pela qual as proteínas transformam energia química em movimento A actina e a miosina são as principais proteínas do músculo A força contrátil do músculo é gerada pela interação de duas proteínas miosina e actina Organizadas em filamen tos submetidos a interações transitórias que deslizam uns sobre os outros para realizar a contração juntas a actina e a miosina compõem mais de 80 da massa proteica do músculo A miosina Mr 520000 tem seis subunidades duas cadeias pesadas cada qual com Mr 220000 e quatro ca deias leves cada qual com Mr 20000 As cadeias pesadas respondem pela maior parte da estrutura total Nas extre midades Cterminais estão organizadas como hélices a estendidas enroladas umas ao redor das outras em uma espiral fibrosa enrolada para a esquerda semelhante à da aqueratina Figura 527a Cada cadeia pesada tem Nelson6edbookindb 179 Nelson6edbookindb 179 020414 1843 020414 1843 180 DAVID L NELSON MICHAEL M COX nas extremidades Nterminais um domínio globular gran de contendo o sítio onde o ATP é hidrolisado As cadeias leves estão associadas com o domínio globular Quando a miosina é tratada com a protease tripsina por um período curto a maioria das fibras é hidrolisada dividindo a pro teína em componentes chamados de meromiosina leve e pesada Figura 527b O domínio globular chamado de subfragmento 1 da miosina ou S1 ou simplesmente ca beça de miosina é liberado da meromiosina pesada por hidrólise com papaína O fragmento S1 o domínio motor que torna possível a contração muscular pode ser crista lizado e sua estrutura completa conforme determinada por Ivan Rayment e Hazel Holden está mostrada na Fi gura 527c Nas células musculares as moléculas de miosina se agregam e formam estruturas chamadas de filamentos grossos Figura 528a Essas estruturas em forma de Miosina Meromiosina leve Meromiosina pesada S1 S1 S2 1 Tripsina b Papaína a 20 nm Duas hélices a supertorcidas Terminal carboxílico 2 nm Terminal amino Cadeias leves Cauda 150 nm Cabeças 17 nm c FIGURA 527 Miosina a A miosina tem duas cadeias pesadas em duas tonalidades de corderosa com os terminais carboxílicos formando uma espiral enrolada estendida cauda e os terminais amino formando domínios globulares cabeças Duas cadeias leves em azul associamse com cada ca beça de miosina b A hidrólise com tripsina e papaína separa as cabeças fragmentos S1 das caudas c Representação em fita do fragmento S1 a partir de coordenadas fornecidas por Ivan Rayment A cadeia pesada está em cinza e as duas cadeias leves estão em duas tonalidades de azul a Miosina 325 nm b Actina F Subunidades de actina G 36 nm Cabeça de miosina Filamento de actina c FIGURA 528 Os componentes principais do músculo a A miosina agregase e forma uma estrutura bipolar chamada de filamento grosso b A actina F é um conjunto filamentoso de monômeros de actina G que polime rizam dois a dois dando o aspecto de dois filamentos enrolados um sobre o outro em uma orientação à direita c Modelo de volume atômico de um filamento de actina em tonalidade de vermelho com cabeça de miosina em cinza e duas tonalidades de azul ligada a um monômero de actina den tro do filamento a partir de coordenadas fornecidas por Ivan Rayment Nelson6edbookindb 180 Nelson6edbookindb 180 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 181 bastão são o centro da unidade contrátil Dentro do filamen to grosso várias centenas de moléculas de miosina estão organizadas com suas caudas fibrosas associadas de modo a formar uma estrutura bipolar longa O domínio globular projetase de cada uma das extremidades dessa estrutura em arranjos regulares empilhados A segunda proteína importante do músculo actina é abundante em quase todas as células eucarióticas No músculo as moléculas da actina monomérica chamadas de actina G actina globular Mr 42000 se associam para formar um polímero longo chamado de actina F acti na filamentosa O filamento fino consiste em actina F Figura 528b juntamente com as proteínas troponina e tropomiosina apresentadas a seguir A parte filamentosa dos filamentos finos é montada pela adição sucessiva de moléculas monoméricas de actina a uma das extremida des Nesse processo cada monômero se liga ao ATP e o hidrolisa a ADP de forma que cada molécula de actina no filamento está complexada com ADP A hidrólise do ATP pela actina funciona somente na montagem dos filamentos ela não contribui de maneira direta para a energia gasta na contração muscular Cada monômero de actina no filamen to fino pode se ligar firme e especificamente a uma cabeça de miosina Figura 528c Proteínas adicionais organizam os filamentos finos e grossos em estruturas ordenadas O músculo esquelético consiste em feixes paralelos de fi bras musculares sendo cada fibra uma única célula mul tinucleada muito grande com 20 a 100 mm de diâmetro formada pela fusão de muitas células uma única fibra fre quentemente tem o comprimento do músculo Cada fibra contém cerca de 1000 miofibrilas com 2 mm de diâmetro cada uma consistindo em um grande número de filamentos finos e grossos regularmente organizados e complexados com outras proteínas Figura 529 Um sistema de vesí culas membranosas achatadas chamado de retículo sarco plasmático circunda cada miofibrila As fibras musculares ao microscópio eletrônico mostram regiões alternadas de alta e baixa densidade eletrônica chamadas de bandas A e bandas I Figura 529b c Essas bandas resultam da dis posição dos filamentos grossos e finos que estão alinhados e parcialmente sobrepostos A banda I é a região do feixe que em corte transversal contém somente filamentos fi nos A banda A mais escura estendese pelo comprimento do filamento grosso e inclui a região de sobreposição dos filamentos grossos e finos A banda I é dividida ao meio pela estrutura disco Z perpendicular aos filamentos finos ser vindo de âncora para a fixação desses filamentos A banda A também é dividida por uma linha fina a linha M ou disco M região de alta densidade eletrônica no centro dos fila mentos grossos A unidade contrátil completa que consiste em feixes de filamentos grossos intercalados nas duas ex tremidades com feixes de filamentos finos é chamada de sarcômero A organização dos feixes intercalados permi te o deslizamento dos filamentos entre si pelo mecanismo descrito a seguir o que causa o encurtamento progressivo dos sarcômeros Figura 530 Os filamentos finos estão fixados ao disco Z por uma das extremidades em um padrão regular A montagem inclui as proteínas musculares minoritárias aactinina desmi na e vimentina Os filamentos finos também contêm uma grande proteína chamada de nebulina com cerca de 7000 FIGURA 529 Músculo esquelético a As fibras musculares consistem em células isoladas alongadas e multinucleadas que se formam pela fusão de muitas células precur soras Elas são compostas por muitas miofi brilas para simplificar estão mostradas aqui somente seis envoltas pelo retículo sarco plasmático membranoso A organização dos filamentos finos e grossos confere à miofibrila uma aparência estriada Quando o músculo se contrai as bandas I estreitamse e os discos Z aproximamse conforme pode ser visto nas micrografias eletrônicas em b um músculo relaxado e c um músculo contraído a Núcleos Miofibrilas Capilares Sarcômero Retículo sarcoplasmático Banda I Banda A Feixes de fibras musculares Miofibrila Músculo Fibra muscular Disco Z Linha M b Banda I Banda A 18 mm 18 mm c Linha M Disco Z Disco Z Nelson6edbookindb 181 Nelson6edbookindb 181 020414 1843 020414 1843 182 DAVID L NELSON MICHAEL M COX resíduos de aminoácidos supostamente estruturada como hélice a suficientemente longa para estenderse por todo o comprimento do filamento A linha M organiza os filamen tos grossos da mesma maneira Eles contêm as proteínas paramiosina proteína C e proteína M Outra classe de proteínas chamada de titinas a cadeia polipeptídica única mais longa descoberta até agora a titina do músculo car díaco humano tem 26926 resíduos de aminoácidos liga os filamentos grossos ao disco Z conferindo organização adicional à estrutura global Acreditase que as proteínas nebulina e titina entre outras funções atuem como réguas moleculares regulando respectivamente o comprimento dos filamentos finos e grossos A titina se estende do disco Z até a linha M regulando o comprimento do próprio sarcô mero e prevenindo a superextensão do músculo O compri mento característico do sarcômero varia nos vertebrados de um tecido muscular para outro principalmente devido às variantes diferentes de titina dos tecidos Os filamentos grossos de miosina deslizam sobre os filamentos finos de actina A interação entre a actina e a miosina como a que existe entre todas as proteínas e seus ligantes envolve ligações fracas Quando o ATP não está ligado à miosina uma face da cabeça se liga firmemente à actina Figura 531 Quan do o ATP se liga ocorre uma série de mudanças conforma cionais coordenadas e cíclicas nas quais a miosina libera a subunidade de actina F e se liga a outra subunidade mais distante ao longo do filamento fino O ciclo tem quatro etapas principais Figura 531 Na etapa ➊ o ATP ligase à miosina e uma fenda se abre na molécula rompendo a interação actinamiosina e liberan do a actina Na etapa ➋ o ATP é hidrolisado causando na proteína uma mudança conformacional para um estado de alta energia que move a cabeça de miosina e muda sua orientação em relação ao filamento fino A miosina então se liga fracamente a uma subunidade de actina F mais próxima do disco Z em comparação com a que foi liberada imedia tamente antes Assim que o fosfato produzido na hidrólise do ATP é liberado da miosina na etapa ➌ ocorre outra mu dança de conformação na qual a fenda na miosina se fecha fortalecendo a ligação actinamiosina Isto é seguido rapida mente pela etapa ➍ movimento de força durante o qual a conformação da cabeça de miosina retorna ao estado de repouso original mudando sua orientação relativa à actina de forma a puxar sua cauda na direção do disco Z O ADP é então liberado para completar o ciclo Cada ciclo gera cer ca de 3 a 4 pN piconewtons de força e move o filamento grosso de 5 a 10 nm sobre o filamento fino Uma vez que existem muitas cabeças de miosina em um filamento grosso a cada momento algumas provavelmente 1 a 3 estão ligadas aos filamentos de actina Isso impede que os filamentos grossos escorreguem para trás quando uma cabeça de miosina individual libera a subunidade de actina à qual estava ligada Assim o filamento grosso desli za ativamente à frente passando sobre o filamento fino ad jacente Esse processo coordenado entre muitos sarcôme ros em uma fibra muscular produz a contração muscular A interação entre a actina e a miosina deve ser regulada de forma que a contração ocorra somente em resposta a sinais apropriados do sistema nervoso A regulação é me diada por um complexo de duas proteínas tropomiosina e troponina Figura 532 A tropomiosina se liga ao fila mento fino bloqueando os sítios de acoplamento para a ca beça de miosina A troponina é uma proteína que se liga ao Ca 21 O impulso nervoso causa liberação de Ca 21 do retículo sarcoplasmático O íon liberado se liga à troponina mais FIGURA 530 Contração mus cular Os filamentos grossos são estruturas bipolares criadas pela associação de muitas moléculas de miosina a A contração muscular ocorre pelo deslizamento dos fila mentos grossos sobre os finos de forma que os discos Z em bandas I vizinhas se aproximam b Os fila mentos grossos e finos são interca lados de modo que cada filamento grosso é circundado por seis fila mentos finos Filamento fino Filamento grosso Banda I Banda A Banda I Relaxado Contraído Disco Z a b Nelson6edbookindb 182 Nelson6edbookindb 182 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 183 uma interação proteínaligante e causa mudança confor macional nos complexos tropomiosinatroponina expondo os sítios de ligação à miosina nos filamentos finos Seguese a contração O músculo esquelético em atividade requer dois tipos de funções moleculares que são comuns nas proteínas li gação e catálise A interação actinamiosina que é uma in teração proteínaligante semelhante à das imunoglobulinas com o antígeno é reversível e não altera os participantes Quando o ATP se liga à miosina no entanto é hidrolisado a ADP e Pi A miosina não é somente uma proteína de ligação à actina ela é também uma ATPase uma enzima A função das enzimas na catálise das transformações químicas é o tópico do próximo capítulo RESUMO 53 Interações proteicas moduladas por energia química actina miosina e motores moleculares c As interações proteínaligante alcançam um grau espe cial de organização temporal e espacial com as proteínas motoras A contração muscular resulta de interações entre a miosina e a actina acopladas à hidrólise do ATP pela miosina c A miosina consiste em duas cadeias pesadas e quatro cadeias leves formando um domínio espiral enrolado fibroso cauda e um domínio globular cabeça As mo léculas de miosina são organizadas em filamentos gros sos que deslizam sobre os filamentos finos compostos principalmente por actina A hidrólise do ATP na mio sina é acoplada a uma série de mudanças conformacio nais na cabeça de miosina levando à sua dissociação de uma subunidade da actina F e sua associação com outra mais distante ao longo do filamento fino Assim a miosi na desliza ao longo dos filamentos de actina c A contração muscular é estimulada pela liberação de Ca 21 do retículo sarcoplasmático O Ca 21 se liga à pro teína troponina provocando uma mudança na confor mação do complexo troponinatropomiosina que desen cadeia o ciclo de interações actinamiosina O ATP se liga à cabeça de miosina causando sua dissociação da actina Com a hidrólise do ATP ocorre mudança conformacional ADP e Pi permanecem associados com a cabeça de miosina A cabeça de miosina se fixa ao filamento fino causando a liberação do Pi A liberação de Pi desencadeia um movimento de força mudança de conformação na cabeça de miosina que move os filamentos de actina e miosina um em relação ao outro ADP é liberado no processo Cabeça de miosina ➊ ➋ ➌ ➍ Filamento de actina Filamento grosso de miosina ATP ADP 1 Pi ADP ADP Pi ATP FIGURA 531 Mecanismo molecular da contração muscular Mu danças de conformação na cabeça de miosina acopladas a estágios do ci clo hidrolítico do ATP fazem a miosina dissociarse sucessivamente de uma unidade de actina e se associar com outra unidade mais distante ao longo do filamento Dessa forma as cabeças de miosina deslizam ao longo dos fi lamentos de actina movendo o conjunto de filamentos grossos para dentro do conjunto de filamentos finos ver Figura 530 Tropomiosina Troponina C Troponina I Actina Troponina T FIGURA 532 Regulação da contração muscular pela tropomiosina e troponina A tropomiosina e a troponina estão ligadas à actina F nos fila mentos finos No músculo relaxado estas duas proteínas organizamse ao redor dos filamentos de forma a bloquear os sítios de ligação da miosina A tropomiosina é uma hélice a de duas cadeias supertorcidas o mesmo mo tivo estrutural da aqueratina ver Figura 411 Ela forma polímeros cabeça cauda que se enrolam ao redor de duas cadeias de actina A troponina liga se ao complexo actinatropomiosina em intervalos regulares de 385 nm A troponina consiste em três subunidades diferentes I C e T A troponina I impede a ligação da cabeça de miosina à actina a troponina C tem um sítio de ligação para Ca 21 e a troponina T liga todo o complexo à tropomiosina Quando o músculo recebe um sinal neural para iniciar a contração o Ca 21 é liberado do retículo sarcoplasmático ver Figura 529a e se liga à troponina C Isso causa uma mudança conformacional na troponina C que altera as posições da troponina I e da tropomiosina e libera a inibição pela troponina I permitindo a contração muscular Nelson6edbookindb 183 Nelson6edbookindb 183 020414 1843 020414 1843 184 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário ligante 157 sítio de ligação 157 encaixe induzido 157 heme 158 porfirina 158 globinas 159 expressão de equilíbrio 160 constante de associação Ka 160 constante de dissociação Kd 160 proteína alostérica 166 equação de Hill 167 efeito Bohr 170 linfócitos 174 anticorpo 174 imunoglobulina 174 linfócito B ou célula B 174 linfócito T ou célula T 174 antígeno 175 epitopo 175 hapteno 175 padrão de enovelamento das imunoglobulinas 175 anticorpos policlonais 178 anticorpos monoclonais 178 Elisa 179 imunoblot 179 Western blot 179 miosina 179 actina 181 sarcômero 181 Leituras adicionais Proteínas de ligação ao oxigênio Changeux JP Edelstein SJ 2005 Allosteric mechanisms of signal transduction Science 308 14241428 Koder RL Anderson JLR Solomon LA Reddy KS Moser CC Dutton PL 2009 Design and engineering of an O2 transport protein Nature 458 305309 Koshland DE Jr Nemethy G Filmer D 1966 Comparison of experimental binding data and theoretical models in proteins containing subunits Biochemistry 6 365385 O artigo que apresentou o modelo sequencial Laberge M Yonetani T 2007 Common dynamics of globin family proteins IUBMB Life 59 528534 Monod J Wyman J Changeux JP 1965 On the nature of allosteric transitions a plausible model J Mol Biol 12 88118 O modelo combinado foi proposto pela primeira vez neste artigo que é considerado um marco Perutz MF Wilkinson AJ Paoli M Dodson GG 1998 The stereochemical mechanism of the cooperative effects in hemoglobin revisited Annu Rev Biophys Biomol Struct 27 134 Proteínas do sistema imune Cooper MD Alder MN 2006 The evolution of adaptive immune systems Cell 124 815822 Análise interessante rastreando as origens do nosso sistema imune Flajnik MF Kasahara M 2010 Origin and evolution of the adaptive immune system genetic events and selective pressures Nat Rev Genet 11 4759 Kindt TJ Osborne BA Goldsby RA 2007 Kuby Immunology 6th edn W H Freeman and Company New York Ploegh HL 1998 Viral strategies of immune evasion Science 280 248253 Yewdell JW Haeryfar SMM 2005 Understanding presentation of viral antigens to CD8 1 T cells in vivo the key to rational vaccine design Annu Rev Immunol 23 651682 Motores moleculares Geeves MA Holmes KC 1999 Structural mechanism of muscle contraction Annu Rev Biochem 68 687728 Geigel C Schmidt CF 2011 Moving into the cell singlemolecule studies of molecular motors in complex environments Nat Rev Mol Cell Biol 12 163176 Huxley HE 1998 Getting to grips with contraction the interplay of structure and biochemistry Trends Biochem Sci 23 8487 Interessante perspectiva histórica sobre a elucidação do mecanismo de contração muscular Molloy JE Veigel C 2003 Myosin motors walk the walk Science 300 20452046 Rayment I 1996 The structural basis of the myosin ATPase activity J Biol Chem 271 1585015853 Examina o mecanismo de contração muscular por uma perspectiva estrutural Rayment I Holden HM 1994 The threedimensional structure of a molecular motor Trends Biochem Sci 19 129134 Vale RD 2003 The molecular motor toolbox for intracellular transport Cell 112 467480 Problemas 1 Relação entre afinidade e constante de dissociação A proteína A tem um sítio de ligação para o ligante X com uma Kd de 10 6 M A proteína B tem um sítio de ligação para o mes mo ligante com uma Kd de 10 9 M Qual das proteínas tem a maior afinidade pelo ligante X Explique seu raciocínio Con verta a Kd em Ka para ambas as proteínas 2 Cooperatividade negativa Qual das seguintes situa ções produz uma curva de Hill com nH 10 Explique seu raciocínio em cada caso a A proteína tem múltiplas subunidades cada uma com um único sítio de interação com o ligante A ligação a um sítio reduz a afinidade dos outros sítios pelo ligante b A proteína é uma cadeia polipeptídica única com dois sítios de ligação e cada um tem uma afinidade diferente pelo ligante c A proteína é uma cadeia polipeptídica única com um único sítio de ligação Quando purificada a preparação protei ca é heterogênea contendo algumas moléculas parcialmente desnaturadas e assim com afinidade mais baixa pelo ligante 3 Afinidade da hemoglobina pelo oxigênio Qual é o efei to das seguintes mudanças sobre a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio a Redução no pH do plasma sanguíneo de 74 para 72 b Redução na pressão parcial de CO2 no pulmão de 6 kPa segurar a respiração para 2 kPa respiração normal c Au mento no nível de BPG de 5 mM nível do mar para 8 mM grande altitude d Aumento no CO de 1 parte por milhão ppm de uma atmosfera normal externa para 30 ppm em uma casa que tenha um forno com mau funcionamento ou com vazamento 4 Interação reversível com o ligante I A proteína calci neurina se liga à proteína calmodulina com uma taxa de asso ciação de 89 3 10 3 M 1s 1 e uma constante de dissociação total Kd de 10 nM Calcule a taxa de dissociação kd incluindo as unidades apropriadas 5 Interação reversível com o ligante II Três receptores proteicos de membrana se ligam firmemente a um hormônio Com base nos dados da tabela abaixo a qual é a Kd para a Nelson6edbookindb 184 Nelson6edbookindb 184 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 185 ligação do hormônio pela proteína 2 Inclusive unidades ade quadas b Qual dessas proteínas se liga mais firmemente ao seu hormônio Concentração de hormônio nM u Proteína 1 Proteína 2 Proteína 3 02 0048 029 017 05 011 05 033 1 02 067 05 4 05 089 08 10 071 095 091 20 083 097 095 50 093 099 098 6 Cooperatividade na hemoglobina Sob condições adequadas a hemoglobina se dissocia em suas quatro subu nidades A subunidade a isolada se liga ao O2 mas a curva de saturação para o O2 é hiperbólica e não sigmoide Além disso a ligação do oxigênio à subunidade a não é afetada pela presença de H 1 CO2 ou BPG Qual dessas observações revela a fonte da cooperatividade na hemoglobina 7 Comparação entre as hemoglobinas fetal e materna Estudos sobre o transporte de O2 em mamíferos prenhes mos tram que as curvas de saturação do O2 do sangue fetal e do sangue materno são muito diferentes quando medidas sob as mesmas condições Os eritrócitos fetais contêm uma variante estrutural da hemoglobina HbF que consiste em duas subuni dades a e duas subunidades g a2g2 enquanto os eritrócitos maternos contêm HbA a2b2 a Qual das hemoglobinas tem uma afinidade mais alta pelo O2 em condições fisiológicas HbA ou HbF Explique b Qual é o significado fisiológico das afinidades diferentes pelo O2 c Quando todo o BPG é cuidadosamente removido das amostras de HbA e HbF as curvas de saturação medidas e consequentemente a afinidade pelo O2 são deslocadas para a esquerda Contudo a HbA tem agora uma afinidade maior pelo oxigênio do que a HbF Quando o BPG é reintroduzido as curvas de saturação retornam ao normal conforme mostrado no gráfico Qual é o efeito do BPG sobre a afinidade da hemoglobina pelo O2 Como as informações dadas podem ser usadas para explicar as diferentes afinidades das hemoglobinas fetal e materna 10 05 0 4 2 6 8 10 pO2 kPa HbF 1BPG HbA 1BPG u 8 Variantes da hemoglobina Existem quase 500 variantes naturais da hemoglobina A maioria resulta da substituição de um único aminoácido em uma cadeia polipep tídica da globina Algumas variantes produzem doenças clíni cas embora nem todas tenham efeitos deletérios Seguese uma pequena amostra HbS Hb falciforme substitui um Glu por uma Val na superfície Hb Cowtown elimina um par iônico envolvido na estabiliza ção do estado T Hb Memphis substitui um resíduo polar sem carga por outro de tamanho semelhante na superfície Hb Bibba substitui uma Pro por uma Leu envolvida em uma hélice a Hb Milwaukee substitui um Glu por uma Val Hb Providence substitui uma Asn por uma Lys que normal mente se projeta para a cavidade central do tetrâmero Hb Philly substitui uma Phe por uma Tyr rompendo as liga ções de hidrogênio na interface a1b1 Explique suas escolhas para cada uma das seguintes afirmações a A Hb variante com menos probabilidade de causar sin tomas patológicos b As variantes mais prováveleis de terem valores de pI diferentes dos da HbA em um gel de focalização isoelétrica c As variantes mais prováveleis de mostrarem uma redução na ligação ao BPG e um aumento na afinidade total pelo oxigênio 9 Ligação do oxigênio e a estrutura da hemoglobina Um grupo de bioquímicos usa a engenharia genética para mo dificar a região da interface entre as subunidades da hemoglo bina As hemoglobinas variantes resultantes estão presentes em solução como dímeros ab poucas se alguma na forma de tetrâmeros a2b2 Essas variantes são capazes de se ligar ao oxigênio de forma mais fraca ou mais forte Explique sua resposta 10 Ligação reversível porém forte a um anticorpo Um anticorpo se liga a um antígeno com uma Kd de 5 3 10 8 M Em qual concentração do antígeno u será a 02 b 05 c 06 d 08 11 O uso de anticorpos para sondar a relação estrutu rafunção nas proteínas Um anticorpo monoclonal se liga à actina G mas não à actina F O que isso informa sobre o epíto po reconhecido pelo anticorpo 12 O sistema imune e as vacinas Um organismo hospedeiro necessita de tempo em geral alguns dias para montar uma resposta imune contra um antígeno novo mas as células de memória permitem uma resposta rápida con tra patógenos previamente encontrados Uma vacina para pro teger contra uma determinada infecção viral em geral consiste no vírus atenuado ou morto ou em proteínas isoladas da capa proteica viral A vacina quando injetada em um paciente hu mano geralmente não causa infecção ou doença mas ensina o sistema imune a reconhecer a partícula viral como um pató geno estimulando a produção de células de memória Em uma infecção subsequente essas células podem se ligar ao vírus e desencadear uma resposta imune rápida Alguns patógenos incluindo o HIV desenvolveram mecanismos para escapar da resposta imune tornando difícil ou impossível o desenvolvi mento de vacinas efetivas contra eles Que estratégia um pató geno usaria para escapar do sistema imune Suponha que os anticorpos eou os receptores de células T do hospedeiro este jam disponíveis para se ligar a qualquer estrutura na superfície do patógeno e que uma vez ligados o patógeno seja destruído 13 Como o ser humano se torna um cadáver Quan do um vertebrado morre seus músculos enrijecem pois são Nelson6edbookindb 185 Nelson6edbookindb 185 020414 1843 020414 1843 186 DAVID L NELSON MICHAEL M COX privados de ATP estado chamado rigor mortis Explique a base molecular do estado de rigidez 14 Os sarcômeros a partir de outro ponto de vista A simetria dos filamentos finos e grossos em um sarcômero é tal que geralmente seis filamentos finos circundam um filamento grosso em um arranjo hexagonal Desenhe um corte transver sal de uma miofibrila nos seguintes pontos a na linha M b toda a banda I c toda a região densa da banda A d toda a região menos densa da banda A adjacente à linha M ver Figura 529b c Bioquímica na internet 15 Lisozima e anticorpos Para perceber totalmente como as proteínas funcionam em uma célula é importante ter uma visão tridimensional de como as proteínas interagem com outros componentes celulares Felizmente isto é possível pela utilização de bancos de dados de proteínas com base na inter net e pelas vantagens da visualização molecular tridimensional com o uso do Jmol um visualizador grátis fácil de usar e com patível com a maioria dos sistemas operacionais e navegadores Neste exercício você vai examinar as interações entre a enzima lisozima Capítulo 4 e a porção Fab do anticorpo anti lisozima Use o identificador PDB 1FDL para explorar a estru tura do complexo lisozimafragmento Fab da IgG1 complexo antígenoanticorpo Para responder às seguintes questões use a informação da página Structure Summary no Protein Data Bank wwwrcsborg e examine a estrutura usando Jmol ou um visualizador similar a No modelo tridimensional qual cadeia corresponde ao fragmento do anticorpo e qual corresponde ao antígeno lisozima b Que tipo de estrutura secundária predomina neste fragmento Fab c Quantos resíduos de aminoácidos existem nas cadeias leves e nas cadeias pesadas do fragmento Fab E na lisozima Estime a porcentagem da lisozima que interage com o sítio de ligação ao antígeno do fragmento do anticorpo d Identifique os resíduos específicos de aminoácidos na lisozima e nas regiões variáveis das cadeias leves e pesadas do Fab que estão na interface antígenoanticorpo Os resíduos es tão contíguos na sequência primária das cadeias polipeptídicas 16 Explorando as interações reversíveis das proteí nas e dos ligantes com gráficos ao vivo Utilize os gráficos ao vivo para as Equações 58 511 514 e 516 para trabalhar nos exercícios que se seguem a Interação reversível de um ligante com uma proteína simples sem cooperatividade Para a Equação 58 monte um gráfico de u versus L eixo vertical e horizontal respectiva mente Examine as curvas geradas quando Kd é estabelecida em 5 10 20 e 100 mM Maior afinidade da proteína pelo ligante significa mais ligação em concentrações mais baixas do ligante Suponha que quatro proteínas diferentes exibam esses quatro valores de Kd para o ligante L Qual das proteínas terá a maior afinidade por L Examine a curva gerada quando Kd 5 10 mM Quanto au menta o u quando L aumenta de 02 para 04 mM Quanto au menta o u quando L aumenta de 40 para 80 mM Você pode fazer o mesmo exercício para a Equação 511 Converta L em pO2 e Kd em P50 Examine as curvas geradas quando P50 é estabelecido em 05 1 2 e 10 kPa Na curva gera da quando P50 5 1 kPa quanto o u altera quando a pO2 aumen ta de 002 para 004 kPa E de 4 para 8 kPa b Interação cooperativa de um ligante com uma proteína multimérica Usando a Equação 514 gere uma curva de liga ção para uma proteína e o ligante com Kd 5 10 mM e n 5 3 Observe a definição alterada de Kd na Equação 516 No mesmo gráfico adicione uma curva para uma proteína com Kd 5 20 mM e n 5 3 Agora veja como ambas as curvas mudam quando você muda para n 5 4 Gere gráficos de Hill Equação 516 para cada um desses casos Para Kd 5 10 mM e n 5 3 o que é u quando L 5 20 mM c Explore mais essas equações variando todos os parâ metros usados anteriormente Problema de análise de dados 17 Função proteica Durante a década de 1980 as es truturas da actina e da miosina eram conhecidas somente na resolução mostrada na Figura 528a b Embora os pesquisa dores soubessem que a porção S1 da miosina se liga à actina e hidrolisa ATP existia um grande debate sobre onde era gerada a força de contração na molécula da miosina Nessa época fo ram propostos dois modelos concorrentes para o mecanismo de geração de força No modelo da dobradiça S1 se liga à actina mas a for ça de tração era gerada pela contração da região de dobra diça na cauda de miosina A região de dobradiça está na por ção meromiosina pesada da molécula da miosina próximo de onde a meromiosina leve é hidrolisada pela tripsina ver Figura 527b Este é aproximadamente o ponto marcado como duas hélices a supertorcidas na Figura 527a No modelo S1 a força de tração era gerada na própria cabeça de S1 e a cauda servia somente para suporte estrutural Muitos experimentos foram realizados mas não forneceram evidências conclusivas Em 1987 na Universidade de Stanford James Spudich e colaboradores publicaram um estudo que em bora inconclusivo contribuiu para a resolução dessa controvérsia As técnicas do DNA recombinante não estavam suficien temente desenvolvidas para tratar este problema in vivo de modo que Spudich e colaboradores usaram um ensaio interes sante de motilidade in vitro A alga Nitella tem células ex tremamente longas com vários centímetros de comprimento e cerca de 1 mm de diâmetro Essas células têm fibras de actina ao longo do seu eixo maior e as células podem ser cortadas ao longo de seu comprimento para expor as fibras Spudich e seu grupo observaram que esferas revestidas com miosina cami nhavam ao longo dessas fibras na presença de ATP exatamen te como a miosina faz no músculo em contração Para esses experimentos eles usaram um método mais espe cífico de ligar a miosina às esferas As esferas eram agrupamen tos de bactérias mortas Staphylococcus aureus Essas células têm na sua superfície uma proteína que se liga à região Fc das moléculas de anticorpo Figura 521a Os anticorpos por sua vez se ligam a vários locais não conhecidos ao longo da cauda da molécula de miosina Os complexos esferaanticorpomiosina preparados com moléculas intactas de miosina se moveram ao longo das fibras de actina de Nitella na presença de ATP a Faça um desenho esquemático mostrando a aparência do complexo esferaanticorpomiosina no nível molecular b Por que é necessário ATP para as esferas se moverem ao longo das fibras de actina c Spudich e colaboradores usaram anticorpos que se li gam à cauda de miosina Por que esse experimento não teria sucesso caso fosse usado um anticorpo que interagisse com a porção de S1 que normalmente se liga à actina Nelson6edbookindb 186 Nelson6edbookindb 186 020414 1843 020414 1843 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 187 Para ajudar a identificar a parte da miosina responsável pela produção de força Spudich e colaboradores usaram tripsi na e produziram duas moléculas parciais de miosina ver Figu ra 527b 1 meromiosina pesada HMM obtida por digestão branda da miosina por tripsina HMM consiste em S1 mais a parte da cauda que inclui a dobradiça e 2 meromiosina pesa da curta SHMM obtida por digestão mais extensa da HMM SHMM consiste em S1 mais uma parte mais curta da cauda que não inclui a dobradiça Digestão rápida da miosina com tripsina produz HMM e meromiosina leve por quebra de uma única li gação peptídica específica na molécula da miosina d Por que a tripsina ataca essa ligação peptídica antes de qualquer outra na miosina Spudich e colaboradores prepararam complexos de es feraanticorpomiosina com quantidades variáveis de miosi na HMM e SHMM e mediram suas velocidades de desloca mento ao longo das fibras de actina da Nitella na presença de ATP O gráfico abaixo mostra seus resultados Densidade de miosina ou fragmentos de miosina ligados às esferas Miosina HMM SHMM 0 2 0 Velocidade das esferas mms e Qual dos modelos S1 ou dobradiça é consistente com esses resultados Explique seu raciocínio f Dê uma explicação plausível para o fato de a velocidade das esferas aumentar com o aumento da densidade da miosina g Dê uma explicação plausível para o fato de a velocidade das esferas alcançar um platô em alta densidade de miosina A digestão mais extensa pela tripsina necessária para a produção de SHMM tem um efeito colateral outra quebra es pecífica do esqueleto polipeptídico da miosina além da quebra na cauda Essa segunda quebra ocorre na cabeça S1 h Com base nessa informação por que é surpreendente que SHMM ainda seja capaz de mover as esferas ao longo das fibras de actina i Como se confirmou a estrutura terciária da cabeça S1 permanece intacta na SHMM Dê uma explicação plausível para o fato de a proteína permanecer intacta e funcional mesmo que o esqueleto polipeptídico tenha sido rompido e não seja mais contínuo Referência Hynes TR Block SM White BT Spudich JA 1987 Movement of myosin fragments in vitro domains involved in force production Cell 48 953963 Nelson6edbookindb 187 Nelson6edbookindb 187 020414 1843 020414 1843 Nelson6edbookindb 188 Nelson6edbookindb 188 020414 1843 020414 1843 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 61 Introdução às enzimas 189 62 Como as enzimas funcionam 191 63 A cinética enzimática como abordagem à compreensão do mecanismo 200 64 Exemplos de reações enzimáticas 214 65 Enzimas regulatórias 226 S ão duas as condições fundamentais para haver vida Primeiro o organismo deve ser capaz de se autorre plicar tópico considerado na Parte III segundo ele deve ser capaz de catalisar reações químicas com eficiên cia e seletividade A importância central da catálise pode parecer surpreendente mas é fácil de demonstrar Como foi descrito no Capítulo 1 os sistemas vivos fazem uso da energia do ambiente Muitos humanos por exemplo con somem quantidades substanciais de sacarose o açúcar comum como combustível geralmente na forma de co midas e bebidas doces A conversão de sacarose em CO2 e H2O em presença de oxigênio é um processo altamen te exergônico liberando energia livre que pode ser usada para pensar moverse sentir gostos e enxergar Entretan to um saco de açúcar pode permanecer na prateleira por anos a fio sem qualquer conversão evidente em CO2 e H2O Embora esse processo químico seja termodinamicamente favorável ele é muito lento Mesmo assim quando a sa carose é consumida por seres humanos ou por qualquer outro organismo ela libera sua energia química em se gundos A diferença é a catálise Sem catálise as reações químicas como aquelas da oxidação da sacarose poderão não ocorrer na escala de tempo adequada e então não po dem sustentar a vida Neste capítulo o foco se voltará para os catalisadores das reações dos sistemas biológicos as enzimas as pro teínas mais notáveis e mais altamente especializadas As enzimas têm um poder catalítico extraordinário geral mente muito maior do que os catalisadores sintéticos ou inorgânicos Elas têm um alto grau de especificidade para os seus respectivos substratos aceleram as reações quími cas e atuam em soluções aquosas sob condições suaves de temperatura e pH Poucos catalisadores não biológicos têm esse conjunto de propriedades As enzimas estão no centro de cada um dos processos bioquímicos Atuando em sequências organizadas elas ca talisam cada uma das reações das centenas de etapas que degradam as moléculas dos nutrientes que conservam e transformam energia química e que constroem as macro moléculas biológicas a partir de precursores elementares O estudo das enzimas tem imensa importância prática Em algumas doenças especialmente nas doenças genéticas hereditárias pode haver uma deficiência ou mesmo ausên cia total de uma ou mais enzimas Outras doenças podem ser causadas pela atividade excessiva de determinada en zima A determinação das atividades de enzimas no plas ma sanguíneo nas hemácias ou em amostras de tecidos é importante no diagnóstico de certas enfermidades Muitos medicamentos agem por interação com enzimas As enzi mas também são ferramentas importantes na engenharia química tecnologia de alimentos e agricultura O capítulo inicia com descrições das propriedades das enzimas e os princípios que embasam seu poder catalítico depois aborda a cinética enzimática disciplina que fornece muito do arcabouço para qualquer discussão a respeito de enzimas Serão dados exemplos específicos de mecanismos de ação de algumas enzimas de modo a ilustrar os princí pios apresentados no início do capítulo Por fim o capítulo discute como a atividade das enzimas é regulada 61 Introdução às enzimas Boa parte da história da bioquímica é a história da pesquisa sobre enzimas A catálise biológica foi reconhecida e des crita nos final dos anos de 1700 em estudos da digestão de carne por secreções do estômago A pesquisa continuou no século seguinte examinando a conversão do amido em açú car pela saliva e por vários extratos de plantas Por volta de 1850 Louis Pasteur concluiu que a fermentação de açú car em álcool por leveduras é catalisada por fermentos Ele postulou que esses fermentos eram inseparáveis da es trutura das células de levedura vivas Esse ponto de vista chamado de vitalismo prevaleceu por décadas Então em 1897 Eduard Buchner descreveu que extratos de levedura podiam fermentar açúcar em álcool provando que a fer mentação era feita por moléculas que continuavam ativas mesmo após serem removidas das células Os experimentos de Buchner ao mesmo tempo marcaram o final da visão vi talista e o alvorecer da ciência bioquímica Posteriormente Frederick W Kühne deu o nome de enzimas para as molé culas detectadas por Buchner 6 Enzimas Nelson6ed06indd 189 Nelson6ed06indd 189 020514 1717 020514 1717 190 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O isolamento e a cristalização da urease por James Su mner em 1926 foi uma quebra de paradigma nos estudos iniciais sobre enzimas Sumner descobriu que os cristais de urease constituíamse totalmente de proteína e postu lou que toda enzima é uma proteína Na ausência de outros exemplos essa ideia permaneceu controversa por algum tempo Somente na década de 1930 é que a conclusão de Sumner foi amplamente aceita isso depois que John Nor throp e Moses Kunitz cristalizaram a pepsina a tripsina e outras enzimas digestivas e descobriram que todas elas são proteínas Durante esse período J B S Haldane es creveu um tratado intitulado Enzymes Embora a natureza molecular das enzimas não estivesse totalmente reconheci da Haldane fez a notável suposição de que ligações fracas entre a enzima e seu substrato poderiam ser usadas para catalisar a reação Essa ideia ainda permanece essencial no conhecimento da catálise enzimática A partir da última parte do século XX milhares de en zimas foram purificadas suas estruturas elucidadas e seus mecanismos explicados A maioria das enzimas é proteína Exceto por um pequeno grupo de moléculas de RNA catalí ticas Capítulo 26 todas as enzimas são proteínas A ativi dade catalítica depende da integridade das suas conforma ções nativas Se uma enzima for desnaturada ou dissociada nas suas subunidades geralmente a atividade catalítica é perdida Se uma enzima for degradada até os aminoácidos que a compõem a atividade catalítica é sempre destruída Então as estruturas proteicas primária secundária terciá ria e quaternária das enzimas são essenciais para a ativida de catalítica As enzimas assim como as outras proteínas têm pesos moleculares variando de cerca de 12000 a mais de um mi lhão Algumas enzimas não necessitam de outros grupos químicos além dos seus próprios resíduos de aminoácidos Outras necessitam de um componente químico adicional denominado cofator que pode ser um ou mais íons inor gânicos como Fe 21 Mg 21 Mn 21 ou Zn 21 Tabela 61 ou uma molécula orgânica ou metalorgânica complexa deno minada coenzima As coenzimas agem como carreadores transitórios de grupos funcionais específicos Tabela 62 A maioria deles é derivada das vitaminas nutrientes or gânicos cuja presença na dieta é necessária em pequenas quantidades As coenzimas serão estu dadas com mais detalhe à medida que forem abordadas as vias metabólicas na Parte II Algumas enzimas necessitam tanto de uma coenzima quanto de um ou mais íons metálicos para terem ati vidade Uma coenzima ou um íon metá lico que se ligue muito firmemente ou mesmo covalentemente a uma enzima é denominado grupo prostético Uma enzima completa cataliticamente ativa junto com a sua coenzima eou íons me tálicos é denominada holoenzima A parte proteica de uma dessas enzimas é denominada apoenzima ou apoproteí na Finalmente algumas enzimas são modificadas covalen temente por fosforilação glicosilação e outros processos Muitas dessas modificações estão envolvidas na regulação da atividade enzimática As enzimas são classificadas segundo as reações que catalisam Muitas enzimas receberam seus nomes pela adição do sufi xo ase ao nome dos seus substratos ou a uma palavra que descreve sua atividade Assim a urease catalisa a hidrólise da ureia e a DNApolimerase catalisa a polimerização de nucleotídeos para formar DNA Outras enzimas foram ba tizadas pelos seus descobridores em razão de uma função ampla antes que fosse conhecida a reação específica ca talisada por elas Por exemplo uma enzima conhecida por atuar na digestão de alimentos foi denominada pepsina do grego pepsis digestão e a lisozima foi denominada pela sua capacidade de lisar degradar a parede de bactérias Outras foram ainda denominadas a partir de sua fonte a tripsina denominada em parte do grego tryein desgas tar foi obtida esfregando tecido pancreático com glicerina Às vezes a mesma enzima tem dois ou mais nomes ou duas enzimas têm o mesmo nome Devido a essa ambiguidade e também ao número cada vez maior de enzimas que são Eduard Buchner 18601917 James Sumner 18871955 J B S Haldane 18921964 TABELA 61 Alguns íons inorgânicos que servem de cofatores para enzimas Íons Enzimas Cu 21 Citocromooxidase Fe 21 ou Fe 31 Citocromooxidase catalase peroxidase K 1 Piruvatocinase Mg 21 Hexocinase glicose6fosfatase piruvatocinase Mn 21 Arginase ribonucleotídeoredutase Mo Dinitrogenase Ni 21 Urease Zn 21 Anidrase carbônica álcooldesidrogenase carboxipeptidases A e B Nelson6ed06indd 190 Nelson6ed06indd 190 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 191 descobertas os bioquímicos por meio de um acordo inter nacional adotaram um sistema de nomenclatura e classifi cação de enzimas Esse sistema divide as enzimas em seis classes cada uma com subclasses com base nos tipos de reações que catalisam Tabela 63 Um número de classifi cação de quatro partes e um nome sistemático que identifi ca a reação catalisada são especificados para cada enzima Como exemplo o nome sistemático da enzima que catalisa a reação ATP 1 Dglicose S ADP 1 Dglicose6fosfato é ATP glicosefosfotransferase indicando que ela catalisa a transferência de um grupo fosforribosil do ATP para a glico se Seu número da Comissão de Enzimas número E C do inglês Enzyme Commission é 2711 O primeiro número 2 indica o nome da classe transferase o segundo nú mero 7 a subclasse fosfotransferase o terceiro número 1 uma fosfotransferase que tem um grupo hidroxila como aceptor e o quarto número 1 Dglicose como o aceptor do grupo fosforil Para muitas enzimas é usado um nome comum com mais frequência hexocinase nesse caso espe cífico Uma lista completa com a descrição dos milhares de enzimas conhecidas é mantida pelo Comitê de Nomenclatu ra da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecu lar wwwchemqmulacukiubmbenzyme Este capítulo dedicase principalmente aos princípios e às propriedades comuns a todas as enzimas RESUMO 61 Introdução às enzimas c A vida depende de catalisadores poderosos e específi cos as enzimas Praticamente todas as reações bioquí micas são catalisadas por enzimas c Com a exceção de poucos RNA catalíticos todas as en zimas conhecidas são proteínas Muitas necessitam de coenzimas ou cofatores não proteicos para exercerem a atividade catalítica c As enzimas são classificadas segundo o tipo de reação que catalisam Todas as enzimas têm número E C e nome formais Muitas têm nomes comuns 62 Como as enzimas funcionam A catálise enzimática das reações é essencial para os siste mas vivos Nas condições biológicas relevantes as reações não catalisadas tendem a ser lentas a maioria das molé culas biológicas é muito estável nas condições internas das células com pH neutro temperaturas amenas e ambiente aquoso Além disso muitos processos químicos corriquei ros como a formação transitória de intermediários instáveis TABELA 62 Algumas coenzimas que servem como carreadores transitórios de átomos ou grupos funcionais específicos Coenzima Exemplo de grupo químico transferido Precursor presente na dieta de mamíferos Biocina CO2 Biotina Coenzima A Grupos acil Ácido pantotênico e outros compostos 59Desoxiadenosilcobalamina coenzima B12 Átomos de H e grupos alquil Vitamina B12 Flavinaadeninadinucleotídeo Elétrons Riboflavina vitamina B2 Lipoato Elétrons e grupos acil Não é necessário na dieta Nicotinamidaadeninadinucleotídeo Íon hidrido H Ácido nicotínico niacina Piridoxalfosfato Grupos amino Piridoxina vitamina B6 Tetrahidrofolato Grupos de um carbono Folato Tiaminapirofosfato Aldeídos Tiamina vitamina B1 Nota As estruturas e os modos de ação destas coenzimas estão descritos na Parte II TABELA 63 Classificação internacional das enzimas Classe n o Nome da classe Tipo de reação catalisada 1 Oxidorredutases Transferência de elétrons íons hidrido ou átomos de H 2 Transferases Reações de transferência de grupos 3 Hidrolases Reações de hidrólise transferência de grupos funcionais para a água 4 Liases Clivagem de CC CO CN ou outras ligações por eliminação rompimento de ligações duplas ou anéis ou adição de grupos a ligações duplas 5 Isomerases Transferência de grupos dentro de uma mesma molécula produzindo formas isoméricas 6 Ligases Formação de ligações CC CS CO e CN por reações de condensação acopladas à hidrólise de ATP ou cofatores similares Nelson6ed06indd 191 Nelson6ed06indd 191 070414 1433 070414 1433 192 DAVID L NELSON MICHAEL M COX carregados ou a colisão de duas ou mais moléculas exata mente na orientação exata necessária para que as reações ocorram são desfavoráveis ou improváveis no ambiente ce lular As reações necessárias para digerir os alimentos en viar sinais nervosos ou contrair os músculos simplesmente não ocorrem em velocidades adequadas sem catálise As enzimas contornam esses problemas ao proporciona rem um ambiente específico adequado para que uma dada reação possa ocorrer mais rapidamente A propriedade característica das reações catalisadas por enzimas é que a reação ocorre confinada em um bolsão da enzima denomi nado sítio ativo Figura 61 A molécula que liga no sítio ativo e sobre a qual a enzima age é denominada substra to O contorno da superfície do sítio ativo é delimitado por resíduos de aminoácidos com grupos nas cadeias laterais que ligam o substrato e que catalisam a sua transformação química Frequentemente o sítio ativo engloba o substrato sequestrandoo completamente da solução O complexo en zimasubstrato cuja existência foi primeiramente proposta por CharlesAdolphe Wurtz em 1880 é fundamental para a ação enzimática Também é o ponto de partida para o tra tamento matemático que define o comportamento cinético das reações catalisadas por enzimas e para a descrição teó rica dos mecanismos das enzimas As enzimas alteram a velocidade da reação não o equilíbrio Uma reação enzimática simples pode ser escrita como 61 onde E S e P representam enzima substrato e produto ES e EP são complexos transitórios da enzima com o substrato e com o produto Para entender a catálise devese primeiro avaliar a im portância de distinguir entre o equilíbrio e a velocidade de uma reação A função do catalisador é aumentar a veloci dade da reação A catálise não afeta o equilíbrio da rea ção Qualquer reação como S P pode ser descrita por um diagrama de coordenadas da reação Figura 62 que representa a variação de energia durante a reação A ener gia é descrita nos sistemas biológicos como foi discutido no Capítulo 1 em termos de energia livre G No diagra ma de coordenadas da reação a energia livre do sistema é colocada no gráfico em função do progresso da reação a coordenada da reação O ponto de partida tanto da rea ção direta quanto da reação reversa é denominado estado fundamental a contribuição que uma molécula média S ou P fornece para a energia livre do sistema sob dadas condições do sistema CONVENÇÃOCHAVE Para descrever a variação de energia livre das reações químicos definiram um conjunto de condições padrão temperatura de 298 K pressão parcial de cada gás de 1 atm ou 1013 kPa concentração de cada soluto de 1 M e expressam as mudanças de energia livre de um siste ma reagindo sob essas condições como DG a variação de energia livre padrão Uma vez que os sistemas bioquími cos geralmente envolvem concentrações de H 1 muito abai xo de 1 M bioquímicos definiram uma variação de ener gia livre padrão bioquímica DG9 a variação de energia livre padrão em pH 70 Essa definição será usada neste livro Uma definição mais completa de DG9 é fornecida no Capítulo 13 O equilíbrio entre S e P reflete a diferença entre as ener gias livres dos seus estados fundamentais No exemplo mos trado na Figura 62 a energia livre do estado fundamental de P é menor do que a de S e então DG9 para a reação é negativa reação exergônica e o equilíbrio favorece mais P que S A posição e a direção do equilíbrio não são afetadas pelos catalisadores Um equilíbrio favorável não significa que a conversão S S P ocorra em uma velocidade detectável A veloci dade da reação depende de um parâmetro totalmente diferente Há uma barreira energética entre S e P a ener gia necessária para alinhar os grupos reagentes para a Substrato Resíduoschave do sítio ativo FIGURA 61 Ligação de um substrato no sítio ativo de uma enzima A enzima quimotripsina com o substrato ligado PBD ID 7GCH Alguns dos resíduoschave do sítio ativo aparecem como uma mancha vermelha na su perfície da enzima Coordenada da reação Energia livre G Estado de transição S Estado fundamental P Estado fundamental DG S P DG P S DG98 FIGURA 62 Diagrama da coordenada da reação A energia livre do sis tema está colocada no gráfico versus o progresso da reação S S P Diagramas deste tipo descrevem as mudanças de energia durante a reação O eixo ho rizontal coordenada da reação reflete as mudanças químicas progressivas p ex quebra ou formação da ligação à medida que S é convertido em P As energias de ativação DG para as reações S S P e P S S estão indicadas DG9 é a variação total da energia livre padrão na direção S S P Nelson6ed06indd 192 Nelson6ed06indd 192 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 193 formação de cargas instáveis transitórias rearranjos de ligações e ainda outras transformações necessárias para que a reação ocorra em qualquer direção Isso é ilustrado pela curva de energia nas Figuras 62 e 63 Para que a reação ocorra as moléculas devem suplantar essa barrei ra e atingir um nível de energia mais alto O topo da curva de energia é um ponto a partir do qual o decaimento para o estado S ou para o estado P tem a mesma probabilidade de ocorrer nos dois casos a curva é descendente Isso é denominado estado de transição O estado de transição não é uma forma química com alguma estabilidade signi ficativa e não deve ser confundido com os intermediários da reação como ES ou EP O estado de transição é um momento molecular transitório em que eventos como a quebra de ligação a formação de ligação ou o desenvol vimento de carga ocorrem com a mesma probabilidade de seguirem tanto para formar novamente o substrato como para formar o produto A diferença entre os níveis energéticos do estado basal e do estado de transição é a energia de ativação DG A velocidade da reação re flete essa energia de ativação uma energia de ativação maior corresponde a uma reação mais lenta A velocidade da reação pode aumentar pela elevação da temperatura eou da pressão o que aumenta o número de moléculas com energia suficiente para suplantar a barreira energé tica Alternativamente a energia de ativação pode ser di minuída pela adição de um catalisador Figura 63 Os catalisadores aumentam a velocidade das reações por diminuírem as energias de ativação As enzimas não são exceções à regra de que os ca talisadores não afetam o equilíbrio da reação As flechas bidirecionais na Equação 61 indicam isso qualquer enzi ma que catalise a reação S S P também catalisa a reação P S S O papel da enzima é acelerar a interconversão entre S e P A enzima não é gasta no processo e o ponto de equilíbrio não é afetado Entretanto a reação atinge o equilíbrio muito mais rapidamente quando a enzima apropriada estiver presente pois a velocidade da reação é aumentada Esse princípio geral é ilustrado pela conversão de saca rose e oxigênio em dióxido de carbono e água C12H22O11 1 12 O2 12 CO2 1 11 H2O Essa conversão que ocorre por meio de uma série de rea ções separadas tem DG9 muito grande e negativo e no equilíbrio a quantidade de sacarose presente é desprezí vel Ainda assim a sacarose é um composto estável porque a barreira da energia de ativação que deve ser suplantada antes que reaja com oxigênio é bastante alta A sacarose pode ser armazenada em um recipiente com oxigênio qua se que indefinidamente sem reagir com ele Nas células entretanto a sacarose é prontamente degradada em CO2 e H2O em uma série de reações catalisadas por enzimas Essas enzimas não apenas aceleram as reações mas tam bém as organizam e as controlam de modo que boa parte da energia liberada é recuperada em outras formas quími cas sendo disponibilizada para as células realizarem outras tarefas A via de reações na qual a sacarose e outros açú cares é degradada constituiu a via primária de produção de energia das células As enzimas dessa via permitem que a sequência de reações ocorra em uma escala de tempo biologicamente útil As reações podem ter várias etapas incluindo a for mação e o consumo de espécies químicas transitórias de nominadas intermediários da reação 1 Qualquer espé cie da rota da reação que tenha uma vida química finita maior do que a vibração molecular 10 13 segundos é um intermediário da reação Quando a reação S P é catalisada por uma enzima os complexos ES e EP podem ser considerados intermediários mesmo que S e P sejam espécies químicas estáveis Equação 61 os complexos ES e EP ocupam vales no diagrama das coordenadas da reação Figura 63 Além disso no curso de uma rea ção catalisada por enzima geralmente existem interme diários químicos menos estáveis A interconversão entre dois intermediários da reação que ocorrem em sequência constitui uma etapa da reação Quando uma reação tem várias etapas a velocidade final é determinada pela etapa ou etapas com a maior energia de ativação Essa etapa é denominada etapa limitante da velocidade Em um caso simples a etapa limitante da velocidade é o ponto de maior energia no diagrama da interconversão entre S e P Na prática a etapa limitante da reação pode variar se gundo as condições de reação sendo que muitas enzimas podem ter várias etapas com energias de ativação simila res significando que todas essas etapas são parcialmente limitantes da velocidade A energia de ativação é uma barreira energética para as reações químicas Essas barreiras são cruciais para a pró pria vida A velocidade na qual uma molécula sofre uma determinada reação diminui à medida que a barreira da rea ção aumenta Sem essas barreiras energéticas as macro 1Neste capítulo etapa e intermediário referemse às espécies químicas na via de uma única reação catalisada por uma enzima No contexto de vias metabólicas envolvendo muitas enzimas discutido na Parte II esses termos são usados de maneira diferente Uma reação enzimática inteira ge ralmente é tomada como uma etapa da via e o produto de uma reação enzimática que é o substrato para a próxima enzima da via é referido como intermediário Coordenada da reação S P DG não catalisada DG catalisada ES EP Energia livre G Estado de transição FIGURA 63 Diagrama da coordenada da reação comparando uma reação catalisada por enzima com uma não catalisada Na reação S S P os intermediários ES e EP ocupam o nível mínimo na curva da pro gressão da energia de uma reação catalisada por uma enzima Os termos DG não catalisada e DG catalisada correspondem respectivamente à energia de ativação da reação não catalisada e à energia de ativação total da reação catalisada A energia de ativação é menor quando a reação é catalisada por uma enzima Nelson6ed06indd 193 Nelson6ed06indd 193 070414 1433 070414 1433 194 DAVID L NELSON MICHAEL M COX moléculas complexas poderiam reverter espontaneamente para formas moleculares mais simples e as estruturas com plexas e altamente ordenadas e os processos metabólicos das células não poderiam existir Durante o curso da evolu ção as enzimas desenvolveramse para diminuir seletiva mente as energias de ativação das reações necessárias para a sobrevivência celular A velocidade e o equilíbrio da reação têm definições termodinâmicas precisas O equilíbrio da reação está inexoravelmente ligado à va riação da energia livre padrão da reação DG9 e a veloci dade da reação está ligada à energia de ativação DG Uma introdução básica sobre essas relações termodinâmicas é a próxima etapa para compreender como as enzimas agem Um equilíbrio como S P é descrito por uma cons tante de equilíbrio Keq ou simplesmente K p 25 Nas condições padrão usadas para comparar os proces sos bioquímicos a constante de equilíbrio é designada K9eq ou K9 62 Segundo a termodinâmica a relação entre K9eq e DG9 pode ser descrita pela expressão 63 onde R é a constante dos gases 8315 Jmol K e T é a temperatura absoluta 298 K 25C A Equação 63 é de senvolvida e discutida com mais detalhes no Capítulo 13 Aqui o ponto importante é que a constante de equilíbrio é diretamente relacionada com o total da energia livre pa drão da reação Tabela 64 Um grande valor negativo de DG9 reflete um equilíbrio de reação favorável mas como foi observado isso não significa que a reação ocorrerá com velocidade alta A velocidade de uma reação é determinada pela con centração do reagente ou reagentes e por uma cons tante de velocidade normalmente designada por k Para uma reação unimolecular S S P a velocidade da reação V representando a quantidade de S que reage por unidade de tempo é expressa por uma equação de velocidade 64 Nessa reação a velocidade depende apenas da concentra ção de S sendo uma reação de primeira ordem O fator k é uma constante de proporcionalidade que reflete a proba bilidade de que a reação ocorra em determinado conjunto de condições pH temperatura etc Aqui k é a constan te de velocidade de primeira ordem e tem como unidade a recíproca do tempo como s 1 Se uma reação de primeira ordem tiver uma constante de velocidade k de 003 s 1 isso pode ser interpretado quantitativamente como que 3 do S disponível serão convertidos em P em 1 s Uma reação com uma constante de velocidade de 2000 s 1 ocorrerá em uma pequena fração de segundo Se a velocidade de reação depender da concentração de dois compostos diferentes ou se a reação for entre duas moléculas de um mesmo com posto a reação será de segunda ordem e k é a constante de velocidade de segunda ordem com unidade de M 1s 1 A equação da velocidade passa a ser 65 A partir da teoria do estado de transição podese derivar uma expressão relacionando a magnitude da constante de velocidade com a energia de ativação 66 onde k é a constante de Boltzmann e h é a constante de Planck Nesse momento o ponto importante é que a rela ção entre a constante de velocidade k e a energia de ativa ção DG é inversa e exponencial De maneira simples essa é a base para afirmar que energia de ativação mais baixa significa velocidade de reação mais rápida Depois de analisar o que as enzimas fazem é possível focalizar como elas o fazem Poucos princípios são suficientes para explicar o poder catalítico e a especificidade das enzimas As enzimas são catalisadores extraordinários O aumento de velocidade conferido pelas enzimas situase na faixa de 5 a 17 ordens de magnitude Tabela 65 As enzimas também são muito específicas distinguindo facilmente substratos com estruturas muito semelhantes Como é que esse enorme e altamente seletivo aumento de veloci dade pode ser explicado Qual é a fonte de energia para essa grande diminuição nas energias de ativação de rea ções específicas A resposta para essas questões tem duas partes distin tas embora interligadas A primeira parte baseiase no re arranjo de ligações covalentes durante a reação catalisada pela enzima Muitos tipos de reações químicas ocorrem en tre substratos e grupos funcionais da enzima cadeias espe cíficas de aminoácidos íons metálicos e coenzimas Gru pos funcionais catalíticos na enzima podem formar ligações covalentes transitórias com um substrato e ativálo para a reação ou um grupo pode ser transitoriamente transferi do do substrato para a enzima Geralmente essas reações TABELA 64 Relações entre K9eq e DG9 K9eq DG9 kJmol 10 6 342 10 5 285 10 4 228 10 3 171 10 2 114 10 1 57 1 0 10 1 57 10 2 114 10 3 171 Nota Esta relação é calculada a partir de DG9 5 RT ln K9eq Equação 63 Nelson6ed06indd 194 Nelson6ed06indd 194 070414 1433 070414 1433 PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA DE LEHNINGER 195 Alguns aumentos de velocidade proporcionados Esses termos sao essenciais para oO entendimento das enzi mas e constituem importante foco deste capitulo por enzimas Ciclofilina 0 As interagoes fracas entre enzima e substrato sao Anidrase carbonica ie otimizadas no estado de transicaéo Triosefosfatoisomerase 10 Como é que as enzimas utilizam a energia de ligacdo para Carboxipeptidase A 10 diminuirem a energia de ativacéo de uma reacao A forma Fosfoglicomutase 10 ao do complexo ES nao é por si s6 uma explicacgao embo SuccinilCoAtransferase 10 ra algumas das primeiras consideragées sobre os mecanis mos de acao das enzimas tenham comegado com essa ideia Urease 10 Estudos sobre a especificidade das enzimas realizados por Orotidinamonofosfatodescarboxilase 10 Emil Fischer 0 levaram a propor em 1894 que as enzimas seriam estruturalmente complementares aos seus subs tratos de modo a se encaixarem como uma chave em uma fechadura Figura 64 Essa ideia elegante de que uma ocorrem apenas no sitio ativo da enzima Interagoes cova interacao especifica portanto exclusiva entre duas molé lentes entre enzimas e substratos diminuem a energia de cylas biologicas seria mediada por superficies moleculares ativacao acelerando a reacao por fornecerem condigoes com formas complementares influenciou muito o desenvol para que a reagao ocorra por uma via alternativa de baixa yimento da bioquimica efetivamente essas interagdes sdo energia Os tipos especificos de rearranjos que ocorrem es centrais para muitos processos bioquimicos Entretanto a tao descritos na Segao 64 hip6tese da chave e fechadura pode ser enganadora quan A segunda parte da explicagao fundamentase em in teracdes ndo covalentes entre enzima e substrato E im portante lembrar Capitulo 4 que interacgédes fracas nao covalentes ajudam a estabilizar a estrutura das proteinas e Nao ligado fi NADP as interacgoes proteinaproteina Essas mesmas interagdes y he é 4 sao cruciais para a formacao de complexos entre proteinas a ar ew i e moléculas pequenas incluindo os substratos de enzimas 5 al Ny 4 Muito da energia necessaria para diminuir a energia de ati i 4 vacao provém de interagées fracas nao covalentes entre 6 f ae b substrato e enzima O que realmente distingue as enzimas a de outros catalisadores é a formacao de um complexo ES Pz A especifico A interacao entre substrato e enzima nesse com rs 4 N we of plexo é mediada pelas mesmas forcas que estabilizam a es Tetrahidrofolato off trutura das proteinas incluindo ligagdes de hidrogénio e in 4 teracoes hidrofébicas e idnicas Capitulo 4 A formacao de i cada interacao fraca no complexo ES é acompanhada pela bs liberagao de uma pequena quantidade de energia livre que estabiliza a interacgao A energia proveniente da interacao Ligado fn enzimasubstrato é denominada energia de ligacao AG ss i O seu significado abrange mais que uma simples interacao 4 Jy enzimasubstrato A energia de ligacdo é a principal fon i 7 h r te de energia livre utilizada pelas enzimas para a dimi j 7 nuicao da energia de ativacao das reacdes ri i Dois principios fundamentais interrelacionados possi Md rf bilitam uma explicacdo geral de como as enzimas utilizam a ek ee cat energia de ligagao nao covalente 5 ih 1 Muito do poder catalitico das enzimas provém ba J Py ii sicamente da energia livre liberada na formacao de muitas ligacgdes fracas e interacdes entre a enzima i i e seu substrato Essa energia de ligacao contribui tanto para a especificidade como também para a FIGURA 64 Complementaridade de formas entre o substrato e o catalise seu sitio de ligagdo na enzima A enzima dihidrofolatoredutase com o 2 Interacées fracas sao otimizadas no estado de tran seu substrato NADP em vermelho nao ligado acima e ligado abaixo sicio da reacdo Os sitios ativos das enzimas sao oO tetrahidrofolato em amarelo também é visivel PDB 1D TRA2 Neste modelo o NADP ligase a um bolsdo complementar a sua forma e as suas complementares no aos substratos por si mesmos ce 1 1 propriedades idnicas ilustragdo da hipdtese de chave e fechadura proposta mas aos estados de transigao pelos quais os subs por Emil Fischer para a agao enzimatica Na realidade a complementaridade tratos passam ao serem convertidos em produtos entre proteina e ligante neste caso o substrato raramente é perfeita como durante a reagao enzimatica visto no Capitulo 5 196 DAVID L NELSON MICHAEL M COX do aplicada a catdlise enzimatica Uma enzima totalmente néticas entre o bastao e a enzima Uma enzima desse tipo complementar ao seu substrato seria uma enzima muito po wmpede areacao porque estabiliza o substrato em vez de bre como se pode demonstrar desestabilizalo No diagrama de coordenadas da reacao Por exemplo considere uma reacao imaginaria a que Figura 65b esse tipo de complexo ES corresponderia a bra de um bastao de metal magnetizado a reagao niéo uma energia da qual o substrato teria dificuldade de esca catalisada esta mostrada na Figura 65a Duas enzimas par Uma enzima dessas seria inutil imaginarias duas bastonases poderiam catalisar essa A nocao moderna da catdlise enzimatica primeira reacao Ambas utilizam forgas magnéticas como paradig mente proposta por Michael Polanyi 1921 e Haldane ma para a energia de ligacao utilizada por enzimas reais 1930 foi elaborada por Linus Pauling em 1946 e por Primeiro sera desenhada uma enzima perfeitamente William P Jencks na década de 1970 Para poder catalisar complementar ao substrato Figura 65b O sitio ativo reagdes as enzimas devem ser complementares ao esta dessa bastonase 6 um bolsao delimitado por imas Para do de transicdo da reacao Isso significa que interagdes reagir quebrar o bastao deve atingir 0 estado de transi 6timas entre substratos e enzimas s6 ocorrem no estado cao da reacao mas o bastao se encaixa tao perfeitamente de transicao A Figura 65c demonstra como uma enzima ao sitio ativo que nao consegue se dobrar pois ao se do dessas pode funcionar O bastao de metal ligase a bas brar haveria a eliminacao de algumas das interagdes mag tonase mas apenas um subconjunto das interagdes mag a Sem enzima Substrato Estado de transicao Produto x a oO bastao metalico bastao curvado bastao quebrado ov AG 50 cat 5 Ss LR a 0 p eL4zL P Coordenada da reacao b Enzima complementar ao substrato Upwp Oo J Enzima vo AG nao cat 2 o Magnetos a AG cat eeeeo Poucos 2 YZ7 jo be pe wi QO XxAAA Ke produto ES 5 AGuy k Coordenada da reacao c Enzima complementar ao estado de transigao oO a re fs AG gv AG io cat M BB 5 4 y aFjt al aD ES s NW it wu Y P P Coordenada da reacao FIGURA 65 Proposta de uma enzima imaginaria bastonase que energia livre necessaria para curvar o bastao Os diagramas das coordenadas catalise a quebra de um bastao metalico a Antes da quebrao bas das reagées a direita mostram as consequéncias energéticas da comple tao primeiro deve ser curvado 0 estado de transicao Nos dois exemplos mentaridade ao substrato versus a complementaridade ao estado de transi de bastonase interagdes magnéticas representam as ligagdes fracas entrea do os complexos EP estao omitidos AG a diferenga entre as energias dos enzima e o substrato b A bastonase com um bolsdo magnético de estru estados de transido da reaao catalisada e da nao catalisada reflete a con tura complementar a do bastao 0 substrato estabiliza o substratoO curva tribuigao das interagdes magnéticas entre o bastao e a bastonase Quando mento é impedido pelas atragdes magnéticas entre o bastao e a bastonase a enzima for complementar ao substrato b o complexo ES é mais estavel c Uma enzima com bolsao complementar ao estado de transigdo da rea e tem menos energia livre no estado basal que o substrato isoladamente O ao ajuda a desestabilizar o bastao contribuindo para a catalise da reacao resultado 6 um aumento na energia de ativaao A energia de ligacdo das interagdes magnéticas compensa o aumento da PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 197 néticas possíveis é usado para formar o complexo ES O substrato ligado ainda deve ter aumento na energia livre para atingir o estado de transição Agora entretanto o aumento de energia livre necessário para tensionar o bas tão em uma curvatura e quebrar parcialmente a confor mação é compensado pago pelas interações energia de ligação que se formam entre a enzima e o substrato no estado de transição Muitas dessas interações envolvem partes do bastão distantes do ponto de quebra Assim as interações entre a bastonase e as regiões não reagentes do bastão fornecem parte da energia necessária para ca talisar a quebra do bastão Esse pagamento de energia traduzse em diminuição efetiva na energia de ativação e aumento na velocidade da reação As enzimas reais agem segundo um princípio análogo No complexo ES há a formação de interações fracas mas a completa complementaridade entre o substrato e a enzi ma ocorre apenas quando o substrato estiver no estado de transição A energia livre energia de ligação liberada du rante a formação dessas interações compensa parcialmente a energia necessária para atingir o topo da curva de energia A soma da energia de ativação DG desfavorável positiva e a energia de ligação favorável DGB negativa resulta em uma redução líquida da energia de ativação Figura 66 Mesmo quando ligado à enzima o estado de transição não é uma forma estável mas sim o curto período de tempo em que o substrato permanece no topo da curva de energia Reações catalisadas por enzimas são muito mais rápidas que os processos não catalisados pois a barreira energética a ser vencida é muito menor O princípio importante é que interações com ligações fracas entre a enzima e o subs trato fornecem uma substancial força propulsora para a catálise enzimática Os grupos presentes no substrato e envolvidos nessas ligações fracas podem atuar a alguma dis tância das ligações rompidas ou modificadas As interações fracas formadas apenas no estado de transição são as que fazem a principal contribuição para a catálise A necessidade de múltiplas interações fracas para impe lir a catálise ajuda a explicar por que as enzimas e algumas coenzimas são tão grandes A enzima deve fornecer grupos funcionais para as interações iônicas ligações de hidrogê nio e outras interações importantes e também deve posicio nar precisamente esses grupos de modo que a energia de ligação seja otimizada no estado de transição A formação de uma ligação adequada é atingida mais facilmente pelo posicionamento do substrato em uma cavidade o sítio ati vo onde é efetivamente removido da água O tamanho das proteínas reflete a necessidade de uma superestrutura para manter os grupos interativos posicionados adequadamente e para evitar o colapso da cavidade A energia de ligação contribui para a especificidade da reação e a catálise É possível demonstrar quantitativamente que a energia de ligação é responsável pela enorme aceleração na ve locidade proporcionada pelas enzimas A resposta é sim Como ponto de referência a Equação 66 permite calcular que nas condições normais das células DG deve ser di minuído em cerca de 57 kJmol para acelerar uma reação de primeira ordem por um fator de 10 A energia que é disponibilizada pela formação de uma única interação fraca geralmente é estimada em 4 a 30 kJmol A energia total disponibilizada por um certo número dessas interações é portanto suficiente para uma diminuição da energia de ati vação entre os 60 e os 100 kJmol necessários para explicar o grande aumento na velocidade das reações observado em muitas enzimas A mesma energia de ligação que fornece energia para a catálise também dá às enzimas sua especificidade isto é a capacidade de distinguir entre substratos e moléculas competidoras Conceitualmente especificidade é fácil de distinguir de catálise contudo essa diferenciação é mui to mais difícil de demonstrar experimentalmente pois a catálise e a especificidade provêm do mesmo fenômeno Se o sítio ativo de uma enzima tiver grupos funcionais or ganizados otimamente de modo que se forme uma grande variedade de interações fracas com determinado substra to no correspondente estado de transição a enzima não será capaz de interagir com a mesma intensidade com al guma outra molécula Por exemplo se o substrato tiver um grupo hidroxila que forme uma ligação de hidrogênio com um resíduo específico de Glu de uma enzima qual quer molécula que não tiver um grupo hidroxila naquela determinada posição será um substrato pobre para essa enzima Ainda qualquer molécula que tiver um grupo funcional extra para o qual a enzima não tenha um bol são ou um sítio de ligação provavelmente será excluída da enzima De maneira geral a especificidade deriva da formação de muitas interações fracas entre a enzima e a molécula específica do substrato A importância da energia de ligação para a catálise pode ser facilmente demonstrada Por exemplo a enzima glicolí tica triosefosfatoisomerase catalisa a interconversão entre gliceraldeído3fosfato e dihidroxiacetonafosfato Triose fosfato isomerase Gliceraldeído 3fosfato HC CH2OPO3 22 CH2OPO3 22 H2C C 1 HC OH 2 3 O Dihidroxiace tonafosfato OH O Coordenada da reação S P DG não cat DG cat ES EP DGB Energia livre G FIGURA 66 Papel da energia de ligação na catálise Para diminuir a energia de ativação da reação o sistema deve adquirir uma quantidade de energia equivalente ao valor da diminuição de DG Boa parte dessa energia vem da energia de ligação DGB proporcionada pela formação de interações fracas não covalentes entre substrato e enzima que ocorrem no estado de transição O papel de DGB é análogo ao de DGM da Figura 65 Nelson6ed06indd 197 Nelson6ed06indd 197 070414 1433 070414 1433 198 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Esta reação rearranja os grupos carbonila e hidroxila dos carbonos 1 e 2 Entretanto mais de 80 da aceleração da velocidade da reação catalisada pela enzima foi relaciona do com as interações enzimasubstrato envolvendo o gru po fosfato do carbono 3 do substrato Isso foi determina do comparando as reações catalisadas pela enzima usando como substratos gliceraldeído3fosfato e gliceraldeído sem grupo fosfato na posição 3 O princípio geral apresentado anteriormente pode ser ilustrado por vários mecanismos catalíticos bem conheci dos Esses mecanismos não são mutuamente excludentes de modo que uma mesma enzima pode incorporar vários tipos de mecanismos no seu mecanismo total de ação Considerando o que é necessário para a reação acon tecer verificase que fatores físicos e termodinâmicos pre ponderantes contribuem para DG a barreira para a reação Entre esses mecanismos é possível incluir 1 a entropia liberdade de movimento das moléculas em solução que reduz a possibilidade de que elas reajam entre si 2 a ca mada de solvatação das moléculas de água ligadas por liga ções de hidrogênio e que rodeiam e ajudam a estabilizar a maioria das moléculas biológicas em solução aquosa 3 a distorção dos substratos que ocorre em muitas reações 4 a necessidade de um alinhamento apropriado dos grupos funcionais catalíticos da enzima A energia de ligação pode ser usada para superar todas essas barreiras Primeiro uma grande restrição à mobilidade relativa de dois substratos prestes a reagir ou redução da en tropia é um benefício óbvio proporcionado pela ligação deles à enzima A energia de ligação mantém o substrato na orientação apropriada para reagir uma contribuição substancial para a catálise porque colisões produtivas entre as moléculas da solução podem ser muito raras Os substratos podem ser alinhados precisamente com a en zima com muitas interações fracas entre cada substrato e grupos estrategicamente posicionados na enzima fixando as moléculas de substrato na posição apropriada Estudos mostraram que restrições à mobilidade de dois reagentes podem produzir um aumento de várias ordens de grandeza na velocidade Figura 67 Segundo a formação de ligações fracas entre substrato e enzima resulta na dessolvatação do substrato Intera ções enzimasubstrato substituem a maioria das ligações de hidrogênio entre o substrato e as moléculas de água que são um impedimento para a reação Terceiro a energia de ligação envolvendo interações fracas que se formam ape nas no estado de transição da reação ajudam a compensar termodinamicamente qualquer distorção principalmente a redistribuição de elétrons de modo que então o substrato pode sofrer a reação Finalmente em geral a enzima também sofre uma mu dança de conformação quando o substrato se liga a ela in duzindo múltiplas interações fracas com o substrato Isso é chamado de ajuste induzido mecanismo postulado por Daniel Koshland em 1958 Esses movimentos podem afetar apenas uma pequena parte da enzima nas proximidades do sítio ativo ou podem envolver mudanças no posicionamen to de domínios inteiros da enzima Em geral uma rede de movimentos acoplados ocorre por toda a enzima que final mente leva às mudanças necessárias no sítio ativo O ajuste induzido serve para levar grupos funcionais específicos da enzima para uma posição apropriada para catalisar a rea ção As mudanças conformacionais também permitem a for mação de ligações fracas adicionais no estado de transição Em ambos os casos a nova conformação da enzima apre senta propriedades catalíticas aumentadas Como foi visto o ajuste induzido é uma característica comum da interação reversível de ligantes com proteínas Capítulo 5 O ajuste induzido também é importante para a interação de pratica mente todas as enzimas com seus substratos Grupos catalíticos específicos contribuem para a catálise Em muitas enzimas a energia de ligação utilizada para for mar o complexo ES é apenas um dos vários contribuintes para o mecanismo total de catálise Uma vez que o subs trato esteja ligado a uma enzima grupos funcionais catalí ticos posicionados de modo apropriado ajudam no rompi mento e na formação de ligações por vários mecanismos O C CH3 CH3 CH3 OR O C CH3 O2 1 k M21s21 2OR C C O O O Reação Aumento de velocidade a 1 k s21 2OR b O C C C C 105 M OR O2 O O O O k s21 2OR c 108 M C O O C O OR O2 C O C O O O FIGURA 67 Aumento da velocidade por redução da entropia A figu ra mostra reações de ésteres com grupos carboxilatos formando anidridos Em todos os casos o grupo R é o mesmo a Nesta reação bimolecular a constante k é de segunda ordem com unidades de M 1s 1 b Quando os dois grupos reagentes estão em uma mesma molécula e então têm menor liberdade de movimento a reação é muito mais rápida Nesta reação unimo lecular k tem unidade de s 1 Dividindo a constante de velocidade de b pela constante de velocidade de a obtémse um fator de aumento de veloci dade de 10 5 M O aumento de velocidade tem como unidade a molaridade pois neste caso uma reação unimolecular foi comparada com uma reação bimolecular Colocando de outra maneira se o reagente em b estiver em uma concentração de 1 M o comportamento dos grupos reativos será o mes mo que teria caso estivesse em uma concentração de 10 5 M Observe que a reação em b tem liberdade de rotação em três de suas ligações mostradas por meio de setas curvas mas mesmo assim isso representa uma redução substancial de entropia em relação a a Se as rotações das ligações que gi ram em b forem tolhidas como em c a entropia é reduzida ainda mais e a reação apresenta um aumento de velocidade de 10 8 M em relação a a Nelson6ed06indd 198 Nelson6ed06indd 198 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 199 incluindo catálise geral acidobásica catálise covalente e catálise por íons metálicos Esses mecanismos são diferen tes dos mecanismos com base na energia de ligação pois geralmente envolvem uma interação transitória covalente com o substrato ou a transferência de um grupo do subs trato ou para ele Catálise geral acidobásica A transferência de prótons é a rea ção mais comum em bioquímica No curso da maioria das reações que ocorrem nas células há transferência de um ou geralmente de muitos prótons Muitas reações bioquímicas envolvem a formação de intermediários carregados instá veis que tendem a quebraremse rapidamente nas espécies reagentes que os constituem impossibilitando assim a rea ção Figura 68 Intermediários carregados geralmen te podem ser estabilizados pela transferência de prótons para os substratos ou dos substratos ou intermediários formando uma espécie que se transforma mais rapidamen te em produtos O efeito da catálise por ácidos ou bases é geralmente estudado usando reações não enzimáticas como modelo Nessas reações não enzimáticas a transfe rência de prótons pode envolver apenas constituintes da água ou então de outros doadores ou aceptores fracos de próton Catalisadores que utilizam apenas íons H 1 H3O 1 ou OH presentes na água são chamados de catalisadores acidobásicos Se prótons forem transferidos entre o inter mediário e a água mais rapidamente do que a quebra do intermediário em reagentes o intermediário é estabilizado cada vez que se formar e nenhuma catálise adicional media da por outros aceptores ou doadores de prótons ocorrerá Em muitos casos entretanto apenas água é insuficiente O termo catálise geral acidobásica referese à transferên cia de prótons mediada por alguma outra molécula que não água Nas reações não catalisadas por enzimas que ocor rem em soluções aquosas a adição de ácidos ou bases for tes proporciona uma aceleração da velocidade observável somente se o intermediário instável da reação quebrarse em reagentes com mais rapidez do que a transferência de prótons apenas da água ou transferência de prótons para formar água Nessa situação muitos ácidos orgânicos fra cos podem suplementar a água como doadores de prótons ou então bases orgânicas fracas podem servir como acepto res de prótons No sítio ativo das enzimas onde moléculas de água tal vez não estejam disponíveis como doadoras ou aceptoras de prótons a catálise acidobásica geral tornase crucial Algu mas cadeias laterais de aminoácidos podem assumir o papel de agentes doadores e aceptores de prótons Figura 69 Esses grupos podem estar posicionados precisamente no sítio ativo da enzima de modo a possibilitar a transferência de prótons proporcionando um aumento de velocidade da ordem de 10 2 a 10 5 Esse tipo de catálise ocorre na grande maioria das enzimas 2 H2OH1 OH2 BH OH O H C N R4 R1 R2 R3 C H 1 Espécies reagentes O C R1 R2 R3 C 1 Produtos O H H N R4 H H C N R4 1 R1 R2 R3 C H H O O2 1 A HA B HOH HOH H C R1 R2 R3 C O O2 N1 H R4 H Quando a transferência de um próton de ou para H2O for mais rápida do que a velocidade de quebra dos intermediários a presença de outro doador ou aceptor de próton não aumenta a velocidade da reação Quando a transferência de um próton de ou para H2O for menor do que a velocidade de quebra dos intermediários apenas parte dos intermediários formados é estabilizada A presença de um doador HA ou aceptor B alternativo de prótons aumenta a velocidade da reação Sem catálise o intermediário carregado instável quebrase rapidamente formando os reagentes FIGURA 68 Como o catalisador contorna o incremento de cargas desfavoráveis durante a hidrólise de uma amida A hidrólise da liga ção amida mostrada aqui é a mesma reação catalisada pela quimotripsina e outras proteases O incremento de cargas é desfavorável e pode ser contor nado pela doação de um próton por parte de H3O 1 catálise ácida específica ou HA catálise ácida geral sendo que HA representa qualquer ácido De maneira semelhante a carga pode ser neutralizada pela subtração de um OH catálise básica específica ou de B catálise básica geral na qual B re presenta uma base qualquer Resíduo de aminoácido Forma geral ácida doador de próton Forma geral básica aceptor de próton Glu Asp Lys Arg Cys His Ser Tyr COO2 R H S2 R COO R OH R OH R O2 O2 R 1N H R R NH2 R H H R S H C CH R N HN C H 1 NH C CH R HN C H FIGURA 69 Aminoácidos na catálise geral acidobásica Muitas rea ções orgânicas são favorecidas por doadores ácidos gerais ou aceptores bases gerais de prótons Os sítios ativos de algumas enzimas têm grupos funcionais de aminoácidos como os mostrados aqui que podem participar dos processos catalíticos como doadores ou aceptores de prótons Nelson6ed06indd 199 Nelson6ed06indd 199 070414 1433 070414 1433 200 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Catálise covalente Na catálise covalente há a formação de uma ligação covalente transitória entre a enzima e o subs trato Considere a hidrólise de uma ligação entre os grupos A e B Na presença de um catalisador covalente enzima com gru po nucleofílico X a reação tornase Isso modifica o caminho da reação e resulta em catálise apenas quando o novo caminho tiver uma energia de ati vação menor do que a da reação não catalisada Ambas as novas etapas devem ser mais rápidas do que a reação não catalisada Várias cadeias laterais de aminoácidos incluindo as mostradas na Figura 69 e grupos funcionais de alguns cofatores de enzimas servem como agentes nucleofílicos na formação de ligações covalentes com substratos Esses complexos covalentes sempre passam por uma reação adi cional para regenerar a enzima livre A ligação covalente entre enzima e substrato pode ativar o substrato para uma reação posterior de um modo geralmente específico para um grupo ou uma coenzima Catálise por íons metálicos Metais tanto ligados firmemente à enzima quanto tomados da solução juntamente com o substrato podem participar na catálise de várias manei ras Interações iônicas entre metais ligados a enzimas e substratos podem ajudar a orientar o substrato para a rea ção ou estabilizar estados de transição carregados Esse tipo de uso de interações fracas entre metais e substratos é similar a alguns dos usos da energia de ligação enzima substrato descritos anteriormente Os metais também podem ser mediadores de reações de oxidorredução por mudanças reversíveis no estado de oxidação do íon me tálico Aproximadamente um terço de todas as enzimas conhecidas necessita de um ou mais íons metálicos para a atividade catalítica A maioria das enzimas combina várias estratégias de catálise para proporcionar um aumento na velocidade das reações Um bom exemplo é o uso de catálise covalente catálise geral acidobásica e estabilização do estado de tran sição na reação catalisada pela quimotripsina apresentada em detalhes na Seção 64 RESUMO 62 Como as enzimas funcionam c As enzimas são catalisadores altamente eficazes geral mente aumentando as velocidades de reação por um fa tor de 10 5 a 10 17 c As reações catalisadas por enzimas são caracterizadas pela formação de um complexo entre o substrato e a en zima complexo ES A ligação ao substrato ocorre em um bolsão da enzima denominado sítio ativo c A função das enzimas e dos outros catalisadores é dimi nuir a energia de ativação DG da reação aumentando assim a velocidade das reações O equilíbrio da reação não é afetado pela enzima c Uma parte significativa da energia utilizada no aumento da velocidade das reações proporcionada por enzimas provém de interações fracas ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas e iônicas entre substrato e en zima O sítio ativo das enzimas é estruturado de modo tal que algumas dessas ligações fracas ocorrem pre ferencialmente no estado de transição estabilizando esse estado A necessidade de interações múltiplas é uma das razões para o grande tamanho das enzimas A energia de ligação DGB é usada de diversas maneiras para diminuir a energia necessária para a ativação DG Ela pode ser usada por exemplo para diminuir a en tropia para a dessolvatação do substrato ou para pro vocar uma mudança conformacional na enzima ajuste induzido A energia de ligação também é responsável pela extraordinária especificidade das enzimas por seus substratos c Mecanismos catalíticos adicionais utilizados pelas enzi mas incluem a catálise geral acidobásica a catálise co valente e a catálise por íons metálicos A catálise geral mente envolve interações covalentes transitórias entre o substrato e a enzima ou a transferência de grupo da enzima ou para a enzima de modo a proporcionar um caminho novo e com menor energia de ativação para as reações Em qualquer dos casos as enzimas retor nam ao estado não ligado uma vez que a reação tenha se completado 63 A cinética enzimática como abordagem à compreensão do mecanismo Normalmente os bioquímicos utilizam várias abordagens para estudar o mecanismo de ação de enzimas purificadas A estrutura tridimensional das proteínas fornece informa ções importantes que são incrementadas pela química de proteínas e por modernos métodos de mutagênese sítio dirigida mudança na sequência de aminoácidos de uma proteína por engenharia genética ver Figura 910 Essas tecnologias permitem que os enzimologistas examinem o papel de aminoácidos individualmente na estrutura e na atividade de uma enzima Entretanto a abordagem mais antiga para entender o mecanismo das enzimas e que per manece ainda entre as mais importantes é determinar a velocidade da reação e como ela se modifica em resposta a mudanças nos parâmetros experimentais disciplina conhe cida como cinética enzimática A seguir será apresenta da uma breve introdução à cinética das reações catalisadas por enzimas Visões mais avançadas estão disponíveis nas fontes citadas ao final deste capítulo A concentração do substrato influi na velocidade das reações catalisadas por enzimas Um fatorchave que afeta a velocidade das reações catali sadas por enzimas é a concentração do substrato S En tretanto o estudo dos efeitos da concentração do subs trato é complicado pelo fato de S modificarse durante o curso de uma reação in vitro à medida que o substrato é convertido em produto Uma abordagem que simplifica os experimentos de cinética enzimática é medir a velocida de inicial designada como V0 Figura 610 Em uma Nelson6ed06indd 200 Nelson6ed06indd 200 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 201 reação típica a enzima pode estar presente em quanti dades nanomolares enquanto S pode estar em uma ordem de magnitude cinco ou seis vezes maior Se ape nas o início da reação for monitorado frequentemente os primeiros 60 segundos ou menos a mudança em S pode estar limitada a alguns poucos pontos percentuais e S pode ser considerada constante V0 pode ser explora do em função de S que é ajustada pelo investigador O efeito da variação de S sobre V0 quando a concentração da enzima é mantida constante está mostrado na Figura 611 Em concentrações relativamente baixas de substra to V0 aumenta quase linearmente com o aumento de S Em altas concentrações de substrato V0 aumenta em pe quenas quantidades em resposta ao aumento da S En fim é atingido um ponto além do qual o aumento de S leva a um aumento insignificantemente pequeno em V0 Essa região de V0 tipo platô está próxima à velocidade máxima Vmáx O complexo ES é a chave para entender este compor tamento catalítico e por isso foi o ponto inicial da nossa discussão sobre catálise O padrão da cinética mostrada na Figura 611 levou Victor Henri seguindo o caminho propos to por Wurtz a propor em 1903 que a combinação de uma enzima com a molécula do substrato formando um comple xo ES é uma etapa necessária na catálise enzimática Essa ideia foi ampliada em uma teoria geral de ação de enzimas particularmente por Leonor Michaelis e Maud Menten em 1913 Os dois postularam que a enzima primeiramente combinase de modo reversível com o substrato formando um complexo enzimasubstrato em uma etapa reversível e relativamente rápida 67 Então o complexo ES é rompido em uma segunda etapa mais lenta fornecendo a enzima livre e o produto P 68 Uma vez que a segunda reação por ser mais lenta Equação 68 limita a velocidade da reação total a velocidade total deve ser proporcional à concentração das espécies que rea gem na segunda etapa isto é ES Em determinado instante de uma reação catalisada por enzima a enzima existe em duas formas na forma livre ou não combinada E na forma combinada ES Em baixa S a maior parte da enzima está na forma não combinada E Assim a velocidade é proporcional à S porque o equilí brio da Equação 67 é deslocado na direção da formação de mais ES à medida que S aumenta A velocidade inicial má xima de uma reação catalisada Vmáx ocorre quando quase toda a enzima estiver presente como complexo ES e E é Leonor Michaelis 18751949 Maud Menten 18791960 Tempo S 10 mM S Km 05 mM S 02 mM Concentração de produto P FIGURA 610 Velocidades iniciais de reações catalisadas por enzi mas Uma enzima teórica catalisa a reação S P A enzima está presente em uma concentração suficiente para catalisar a reação a uma velocidade máxima Vmáx de 1 mMmin A constante de Michaelis Km explicada no texto é 05 mM Estão mostradas as curvas de progressão da reação para as concen trações abaixo exatamente no Km e acima dele A velocidade de uma reação catalisada por uma enzima diminui à medida que o substrato é convertido em produto A tangente de cada curva no tempo zero define a velocidade inicial V0 de cada uma das reações Velocidade inicial V0 mMmin Concentração de substrato S mM Km 1 Vmáx 2 Vmáx FIGURA 611 Efeito da concentração do substrato sobre a velocida de inicial de uma reação catalisada por enzima A velocidade máxima Vmáx é extrapolada a partir de gráficos como este pois a V0 aproximase mas nunca atinge a Vmáx A concentração do substrato na qual V0 é metade da Vmáx é o Km a constante de Michaelis A concentração da enzima em expe rimentos como este geralmente é tão baixa que S W E mesmo quando S é descrita como baixa ou relativamente baixa As unidades usadas neste gráfico são unidades típicas para reações não catalisadas e apenas ajudam a ilustrar o significado de V0 e S Observe que a curva descreve parte de uma hipérbole retangular com uma das assíntotas em Vmáx Caso a curva continu asse abaixo de S 5 0 ela se aproximaria da assíntota vertical em S 5 Km Nelson6ed06indd 201 Nelson6ed06indd 201 070414 1433 070414 1433 202 DAVID L NELSON MICHAEL M COX desprezível Nessas condições a enzima está saturada com o substrato e então um incremento de S não pro duz efeito na velocidade Essa condição ocorre quando S for alta o suficiente para que essencialmente toda a enzima livre se converta na forma ES Após o rompimento do com plexo ES fornecendo produto P a enzima fica livre para catalisar a reação de mais uma molécula do substrato e sob condições saturantes segue fazendo isso rapidamente O efeito da saturação é uma característica que diferencia a catálise enzimática sendo responsável pelo platô observado na Figura 611 Às vezes o padrão mostrado na Figura 611 é denominado cinética de saturação Logo que a enzima é misturada com um grande exces so de substrato há um período inicial o estado préesta cionário durante o qual a concentração de ES aumenta Normalmente esse período é muito curto para ser obser vado com facilidade demora apenas microssegundos e não é evidente na Figura 610 A reação rapidamente atinge o estado estacionário no qual ES e as concentrações de qualquer outro intermediário permanece constante ao lon go do tempo O conceito de estado estacionário foi introdu zido por GE Briggs e Haldane em 1925 A determinação de V0 geralmente reflete o estado estacionário Embora V0 limitese à parte inicial da reação a análise da velocidade inicial é denominada cinética do estado estacionário A relação entre a concentração do substrato e a velocidade da reação pode ser expressa quantitativamente A curva que expressa a relação entre S e V0 Figura 611 tem a mesma forma geral para a maioria das enzimas apro ximadamente uma hipérbole retangular e pode ser expres sa algebricamente pela equação de MichaelisMenten Mi chaelis e Menten deduziram essa equação partindo da sua hipótese básica de que a etapa limitante da velocidade em uma reação enzimática é a quebra do complexo ES em pro duto e enzima livre A equação é 69 Todos esses termos são facilmente determinados do ponto de vista experimental e a constante de Michaelis Km pode ser medida experimentalmente Agora serão examinadas as bases lógicas das etapas al gébricas de uma dedução moderna da equação de Micha elisMenten que inclui a hipótese do estado estacionário introduzida por Briggs e Haldane A dedução começa com as etapas básicas de formação e quebra de ES Equações 67 e 68 No início da reação a concentração do produto P é desprezível e permite simplificar considerando que a reação inversa P S S descrita por k2 pode ser ignorada Essa suposição não é crítica mas simplifica a dedução A reação total reduzse a 610 V0 é determinada pela quebra de ES formando o produto que é determinado por ES 611 Uma vez que ES da Equação 611 não pode ser determi nada facilmente devese iniciar encontrando uma expres são alternativa para este termo Primeiro será introduzido o termo Et representando a concentração total da enzima a soma da enzima livre e ligada ao substrato A enzima livre ou não ligada pode ser representada por Et ES Também porque S normalmente é muito maior que Et a quantidade de substrato ligado à enzima em um dado tem po é desprezível em comparação com a quantidade total de enzima S Tendo essas condições em mente as próximas etapas levam a uma expressão para V0 em termos de parâ metros facilmente mensuráveis Etapa 1 As velocidades de formação e quebra de ES são determinadas pelas etapas governadas pelas constantes k1 formação e k1 1 k12 quebra em reagentes e produtos respectivamente segundo as expressões Velocidade de formação de ES 612 Velocidade de quebra de ES 613 Etapa 2 Devese agora fazer uma suposição importante a velocidade inicial da reação reflete o estado estacionário no qual ES é constante Isto é a velocidade da formação de ES é igual à velocidade da quebra de ES Isso é chamado de hipótese do estado estacionário As expressões das Equações 612 e 613 são igualadas no estado estacionário resultando em 614 Etapa 3 Em uma série de etapas algébricas podese re solver a Equação 614 para ES Primeiro o lado esquerdo da equação é multiplicado e o lado direito é simplificado 615 Adicionando o termo k1ES S aos dois lados da equação e simplificando 616 Então a solução desta equação para ES é 617 Agora isso pode ser ainda mais simplificado combinando as constantes de velocidade em uma expressão 618 O termo k1 1 k2k1 é definido como constante de Mi chaelis Km Substituindo esse termo na Equação 618 a expressão é simplificada para 619 Etapa 4 Agora é possível expressar V0 em termos de ES Substituindo o lado direito da Equação 619 para ES na Equação 611 obtémse 620 Esta equação pode ser simplificada ainda mais Uma vez que a velocidade máxima ocorre quando a enzima está satu Nelson6ed06indd 202 Nelson6ed06indd 202 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 203 rada isto é com ES 5 Et Vmáx pode ser definida como k2Et A substituição desta equação na Equação 620 dá a Equação 69 Esta é a equação de MichaelisMenten a equação da velocidade da reação com um único substrato catalisada por uma enzima Ela define a relação quantitativa entre a velocidade inicial V0 a velocidade máxima Vmáx e a con centração inicial de substrato S todas em relação à cons tante de Michaelis Km Observe que Km tem unidades de concentração molar Será que a equação se ajusta às obser vações experimentais Sim Isso pode ser confirmado consi derando as situações limitantes nas quais S é muito alta ou muito baixa como está mostrado na Figura 612 Uma relação numérica importante emerge da equação de MichaelisMenten no caso especial quando V0 é exata mente metade da Vmáx Figura 612 Então 621 Dividindose por Vmáx obtémse 622 Resolvendo para Km obtémse Km 1 S 5 2S ou quando 623 Esta é uma definição prática e muito útil de Km Km equivale à concentração do substrato na qual V0 é metade da Vmáx A equação de MichaelisMenten Equação 69 pode ser transformada algebricamente em versões úteis para a de terminação prática de Km e Vmáx Quadro 61 e como será descrito posteriormente na análise da ação de inibidores ver Quadro 62 na p 209 Os parâmetros cinéticos são utilizados para comparar a atividade de enzimas É importante distinguir entre a equação de MichaelisMen ten e o mecanismo cinético específico no qual ela foi ba seada originalmente A equação descreve o comportamento cinético da grande maioria das enzimas sendo que todas as enzimas que exibem uma dependência hiperbólica de V0 sobre S são consideradas como seguindo a cinética de MichaelisMenten A regra prática de que Km 5 S quando V0 5 ½ Vmáx Equação 623 é válida para todas as enzimas que seguem a cinética de MichaelisMenten As enzimas regulatórias são as exceções mais importantes à cinética de MichaelisMenten assunto discutido na Seção 65 Entretanto a equação de MichaelisMenten não de pende do mecanismo de reação relativamente simples em duas etapas proposto por Michaelis e Menten Equação 610 Muitas das enzimas que seguem a cinética de Mi chaelisMenten têm mecanismos de reação muito diferen tes e mesmo enzimas que catalisam reações com seis ou oito etapas identificáveis geralmente apresentam o mesmo comportamento cinético de estado estacionário Mesmo que a Equação 623 seja verdadeira para muitas enzimas o significado verdadeiro tanto de Vmáx como de Km pode ser diferente para enzimas diferentes Essa é uma limitação im portante da abordagem do estado estacionário para expli car a cinética enzimática Os parâmetros Vmáx e Km podem ser obtidos experimentalmente para qualquer enzima mas fornecem pouca informação sobre o número as velocidades ou a natureza química das etapas da reação Apesar disso a cinética do estado estacionário é a linguagem padrão pela qual os bioquímicos comparam e caracterizam as eficiências catalíticas das enzimas Interpretação de Vmáx e Km A Figura 612 mostra um método gráfico simples para obter o valor aproximado de Km Um procedimento mais conveniente usando o gráfico duplo recíproco está mostrado no Quadro 61 O Km pode variar muito de acordo com a enzima e mesmo para substratos diferentes de uma mesma enzima Tabela 66 Algumas vezes o termo Km é usado em geral inapropriadamente como indicador da afinidade da enzima pelo seu substrato O significado verdadeiro do Km depende de aspectos espe cíficos do mecanismo da reação como o número e as veloci dades relativas das várias etapas Para uma reação de duas etapas 624 Quando k2 é a etapa limitante k2 V k1 e o km fica redu zido a k1k1 que é definido como a constante de disso ciação Kd do complexo ES Nessas condições Km repre senta uma medida da afinidade da enzima pelo substrato no complexo ES Entretanto esse cenário não se aplica para a maioria das enzimas Algumas vezes k2 W k1 e então Km 5 k2k1 Em outros casos k2 e k1 são compa ráveis e Km tornase uma função mais complexa de todas V0 mMmin V0 5 S mM Km 1 Vmáx 2 VmáxS Km V0 5 Vmáx FIGURA 612 Dependência da velocidade inicial da concentração de substrato Este gráfico mostra os parâmetros cinéticos que definem os limites da curva em S elevada e baixa Em baixa S Km W S e o termo S no denominador na equação de MichaelisMenten Equação 69 tornase desprezível A equação fica simplificada a V0 5 VmáxSKm e V0 apresenta uma dependência linear de S como observado aqui Em alta S quando S W Km o termo Km denominador na equação de Michaelis Menten tornase desprezível e a equação fica simplificada a V0 5 Vmáx o que é consistente com o platô observado em S elevada A equação de MichaelisMenten é portanto consistente com a dependência observada de V0 por S e a forma da curva é definida pelos termos VmáxKm em baixa S e Vmáx em alta S Nelson6ed06indd 203 Nelson6ed06indd 203 070414 1433 070414 1433 204 DAVID L NELSON MICHAEL M COX três constantes de velocidade Equação 624 A equação de MichaelisMenten e o comportamento característico de saturação continuam válidos mas Km não pode ser consi derado como uma simples medida da afinidade da enzima pelo substrato Mesmo em casos mais comuns nos quais a reação ocorre em várias etapas após a formação de ES o Km pode se tornar uma função muito complexa de muitas constantes de velocidade A grandeza Vmáx também varia muito entre enzimas di ferentes Se uma enzima reage pelo mecanismo de duas etapas de MichaelisMenten então Vmáx 5 k2Et onde k2 é a etapa limitante da velocidade Entretanto o número de etapas da reação e a identidade das etapas limitantes da ve locidade podem variar de acordo com a enzima Por exem plo considere a situação bem comum na qual a liberação do produto EP S E 1 P é a etapa limitante da velocidade No início da reação quando P é baixo a reação total pode ser descrita pelo esquema 625 Nesse caso na saturação a maior parte da enzima está na forma EP e Vmáx 5 k3Et Isso é útil para definir uma constante de velocidade mais geral kcat para descrever a etapa limitante de qualquer reação catalisada por enzimas na saturação Se a reação tiver várias etapas e uma delas for claramente a etapa limitante da velocidade kcat equi vale à constante de velocidade dessa etapa limitante Para o caso da reação simples correspondendo à equação 610 kcat 5 k2 Para a reação da Equação 625 kcat 5 k3 Quando várias etapas são parcialmente limitantes kcat pode tornar QUADRO 61 Transformações da equação de MichaelisMenten o gráfico de duplosrecíprocos A equação de MichaelisMenten pode ser transformada algebricamente em equações mais práticas para fazer gráficos com dados experimentais Uma transformação muito comum é deduzida simples mente tomando as recíprocas dos dois lados da equação de MichaelisMenten Separando os componentes do numerador no lado direito da equação obtémse que é simplificado para Essa forma da equação de MichaelisMenten é denomina da equação de LineweaverBurk No caso das enzimas que obedecem a relação de MichaelisMenten um gráfico de 1V0 versus 1S o duplorecíproco de um gráfico de V0 versus S é usado produz uma linha reta Figura Q1 Essa linha tem uma inclinação de KmVmáx no eixo 1V0 e uma intersecção de 1Km no eixo 1S A repre sentação duplorecíproca também denominada gráfico de LineweaverBurk tem a grande vantagem de permitir uma determinação mais acurada de Vmáx que pode ser ob tida apenas aproximadamente nos gráficos simples de V0 versus S ver Figura 612 Outras transformações da equação de MichaelisMen ten são feitas cada uma com uma vantagem específica para a análise de dados cinéticos Ver Problema 14 no final deste capítulo O gráfico duplorecíproco das velocidades de uma reação enzimática é muito útil para diferenciar en tre certos tipos de mecanismos de reação enzimática ver Figura 614 e na análise da inibição de enzimas ver Quadro 62 1 V0 1 mMmin 1 S 1 mM 1 Km 2 Inclinação 5 Vmáx Km Vmáx 1 FIGURA Q1 Gráfico duplorecíproco de LineweaverBurk TABELA 66 Km de algumas enzimas e seus substratos Enzima Substrato Km mM Hexocinase cérebro ATP DGlicose DFrutose 04 005 15 Anidrase carbônica HCO3 26 Quimotripsina Gliciltirosilglicina Nbenzoiltirosinamida 108 25 bGalactosidade DLactose 40 Treoninadesidratase LTreonina 50 Nelson6ed06indd 204 Nelson6ed06indd 204 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 205 se uma função complexa com várias das constantes de ve locidade que definem individualmente cada uma das etapas da reação Na equação de MichaelisMenten kcat 5 VmáxEt e a Equação 69 tornase 626 A constante kcat é a constante de primeira ordem da veloci dade tendo como unidade a recíproca do tempo Ela tam bém é chamada de número de renovação turnover sendo quando a enzima estiver saturada com o substrato equivalente ao número de moléculas de substrato conver tidas em produto por unidade de tempo por uma única molécula de enzima Os números de renovação de muitas enzimas estão apresentados na Tabela 67 Comparação entre eficiências e mecanismos catalíticos Os parâ metros cinéticos kcat e km são úteis para estudar e comparar enzimas diferentes independentemente se os mecanismos de reação são simples ou complexos Cada enzima tem va lores de kcat e Km que refletem o ambiente celular a concen tração de substrato normalmente encontrada in vivo pela enzima e a química da reação catalisada Os parâmetros kcat e Km também possibilitam que se avalie a eficiência cinética das enzimas embora individual mente cada um desses parâmetros seja insuficiente para isso Duas enzimas que catalisam reações diferentes podem ter o mesmo kcat número de renovação entretanto as velocidades dessas reações quando não catalisadas podem ser diferentes entre si e portanto o aumento de velocidade propiciado por cada enzima pode ser muito diferente Do ponto de vista experimental o Km de uma enzima tende a ser similar à concentração do substrato presente na célula O Km de uma enzima que atue sobre um substrato presente em concentrações muito baixas na célula geralmente é me nor do que o Km de uma enzima que age sobre um substrato mais abundante A melhor maneira de comparar as eficiências catalíticas de enzimas diferentes ou o número de vezes que diferen tes substratos são catalisados por uma mesma enzima é comparar a relação kcatKm para as duas reações Esse pa râmetro algumas vezes denominado constante de espe cificidade é a constante de velocidade para a conversão de E 1 S em E 1 P Quando S V Km a Equação 626 se reduz a 627 Nesse caso V0 depende da concentração dos dois reagen tes Et e S e consequentemente essa é a equação de velocidade de segunda ordem e a constante kcatKm é a constante de velocidade de segunda ordem com unidades M 1s 1 Há um limite superior para kcatKm imposto pela velo cidade com que E e S podem se difundir em soluções aquo sas O limite determinado pela difusão é de 10 8 a 10 9 M 1s 1 e muitas enzimas têm kcatKm próximo a esta faixa Tabela 68 Dizse que essas enzimas atingiram a perfeição cata lítica Observe que diferentes valores de kcat e Km podem levar a essa relação máxima PROBLEMA RESOLVIDO 61 Determinação do Km Foi descoberta uma enzima que catalisa a reação química TRISTEZA FELICIDADE Uma equipe de pesquisadores motivados dedicouse a es tudar uma enzima que denominaram de felicidase Eles verificaram que o kcat da felicidase é de 600 s 1 e realizaram vários experimentos TABELA 68 Enzimas cujos valores de kcatKm estão próximos ao limite imposto pela difusão 10 8 a 10 9 M 1s 1 Enzima Substrato kcat s 1 Km M kcatKm M 1s 1 Acetilcolinesterase Acetilcolina 14 3 10 4 9 3 10 5 16 3 10 8 Anidrase carbônica CO2 HCO3 1 3 10 6 4 3 10 5 12 3 10 2 26 3 10 2 83 3 10 7 15 3 10 7 Catalase H2O2 4 3 10 7 11 3 10 0 4 3 10 7 Crotonase CrotonilCoA 57 3 10 3 2 3 10 5 28 3 10 8 Fumarase Fumarato Malato 8 3 10 2 9 3 10 2 5 3 10 6 25 3 10 5 16 3 10 8 36 3 10 7 bLactamase Benzoilpenicilina 20 3 10 3 2 3 10 5 1 3 10 8 Fonte Fersht A 1999 Structure and Mechanism in Protein Science p 166 WH Freeman and Company Nova York TABELA 67 Número de renovação turnover kcat de algumas enzimas Enzima Substrato kcat s 1 Catalase H2O2 40000000 Anidrase carbônica HCO3 400000 Acetilcolinesterase Acetilcolina 14000 bLactamase Benzilpenicilina 2000 Fumarase Fumarato 800 Proteína RecA uma ATPase ATP 05 Nelson6ed06indd 205 Nelson6ed06indd 205 070414 1433 070414 1433 206 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A velocidade da reação V0 é 96 mMs 1 quando Et 5 20 nM e TRISTEZA 5 40 mM Calcule o Km para o substrato TRISTEZA Solução kcat Et S e V0 são conhecidos e desejase saber o valor de Km A Equação 626 na qual a equação de Michae lisMenten tem Vmáx substituído por kcatEt é a mais apro priada para resolver este problema Substituindo os valores na Equação 626 podese obter o valor de Km Após obter experiência em trabalhar com essa equação é possível identificar atalhos para resolver problemas como este Por exemplo podese calcular Vmáx sabendose que kcatEt 5 Vmáx neste caso 600 s 1 3 0020 mM 5 12 mM s 1 Um rearranjo simples da Equação 626 pela divisão de am bos os lados por Vmáx dá Então a relação V0Vmáx 5 96 mM s 1 12 mM s 1 5 SKm 1 S Isso simplifica o processo de calcular o Km dando 025S ou 10 mM PROBLEMA RESOLVIDO 62 Determinação de S Em outro experimento com a felicidase usando Et 5 10 nM a velocidade da reação V0 medida foi de 3 mM s 1 Qual a S usada nesse experimento Solução Usando a mesma lógica do Problema Resolvido 61 verificase que a Vmáx nessa concentração de enzima é 6 mM s 1 Observe que a V0 é exatamente metade da Vmáx Re corde que Km por definição é igual a S quando V0 5 ½Vmáx Então nesse problema S deve ser igual a Km ou 10 mM Se V0 tiver qualquer valor diferente de ½Vmáx simplesmente se usa a expressão V0Vmáx 5 SKm 1 S para obter S Muitas enzimas catalisam reações com dois ou mais substratos Foi visto como a S afeta a velocidade de uma reação en zimática simples S S P com apenas uma molécula de substrato Na maioria das reações enzimáticas entretan to duas e algumas vezes mais moléculas de substratos diferentes ligamse à enzima e participam da reação Por exemplo na reação catalisada pela hexocinase os substra tos são moléculas de ATP e glicose e os produtos são ADP e glicose6fosfato ATP 1 glicose S ADP 1 glicose6fosfato As velocidades dessas reações de bissubstrato também po dem ser analisadas pela abordagem de MichaelisMenten A hexocinase tem um Km característico para cada um dos seus substratos Tabela 66 As reações enzimáticas com dois substratos geralmente envolvem a transferência de um átomo de um grupo funcio nal de um substrato para o outro Essas reações ocorrem por vários mecanismos diferentes Em alguns casos ambos os substratos ligamse à enzima simultaneamente em algum ponto do curso da reação formando um complexo não co valente ternário Figura 613a Os substratos ligamse se gundo uma sequência aleatória ou em uma sequência com ordem específica Em outros casos o primeiro substrato é convertido em um produto que se dissocia antes que o se gundo substrato se ligue de modo que não há formação de um complexo ternário Um exemplo desse último caso é o mecanismo de pinguepongue ou de deslocamento duplo Figura 613b A cinética de estado estacionário geralmente ajuda a distinguir entre essas possibilidades Figura 614 A cinética do estado préestacionário pode fornecer evidências de etapas específicas das reações A cinética foi apresentada como o principal método de es tudo das etapas de uma reação enzimática e agora será Ordenado Ordem aleatória E ES1 ES2 P2 E 1 1 1 1 P1 a Reação enzimática envolvendo um grupo ternário E 1 S1 ES1 S2 P2 ES1S2 ES1S2 E P1 b Reação enzimática na qual não há formação de um complexo ternário E 1 S1 ES1 E P2 E9 1 S2 E9P1 E9S2 P1 FIGURA 613 Mecanismo comum das reações bissubstrato catalisa das por enzimas a A enzima e ambos os substratos juntamse formando um complexo ternário No caso de ligação ordenada o substrato 1 deve se ligar antes que o substrato 2 se ligue de modo produtivo No caso de ligação ao acaso os substratos podem se ligar em qualquer ordem b Há a for mação de um complexo enzimasubstrato o produto deixa o complexo a enzima modificada forma um segundo complexo com a molécula do outro substrato o segundo produto é liberado e a enzima é regenerada O subs trato 1 pode transferir um grupo funcional para a enzima formando uma enzima modificada covalentemente E9 que depois é transferido para o substrato 2 Esse mecanismo é denominado mecanismo de pinguepongue ou mecanismo de deslocamento duplo Nelson6ed06indd 206 Nelson6ed06indd 206 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 207 feita uma discussão preliminar sobre as limitações que os parâmetros cinéticos mais comuns têm em fornecerem es sas informações Os dois parâmetros experimentais mais importantes obtidos da cinética do estado estacionário são kcat e kcatKm A variação de kcat e kcatKm em função da varia ção de pH ou da temperatura pode fornecer informações adicionais sobre as etapas do caminho da reação No caso de reações de bissubstratos a cinética do estado estacio nário pode ajudar a determinar se um complexo ternário é formado durante a reação Figura 614 Geralmente para formar um quadro mais completo são necessários métodos cinéticos que vão além do alcance de um texto introdutório Aqui será apresentada brevemente uma das abordagens ci néticas mais importantes para o estudo de mecanismos de reações a cinética do estado préestacionário Uma descrição completa de uma reação catalisada por uma enzima requer a medida direta das velocidades de cada uma das etapas por exemplo a associação da enzima com o substrato formando o complexo ES Durante o estado préestacionário ver p 202 as velocidades de muitas das etapas da reação podem ser medidas independentemente e também podem ser observados os eventos que uma única molécula de substrato sofre durante a reação Como a fase de estado préestacionário costuma ser muito curta geral mente os experimentos necessitam de técnicas especiais para fazer misturas e obter amostras muito rapidamente Um dos objetivos é obter um quadro completo e quanti tativo das mudanças energéticas que ocorrem durante a reação Como ressaltado anteriormente as velocidades e os equilíbrios estão relacionados com a variação de energia livre durante a reação Outro objetivo é medir as velocida des das etapas individuais da reação Em muitos casos os pesquisadores foram capazes de registrar as velocidades de cada uma das muitas etapas da reação enzimática Alguns exemplos da aplicação da cinética do estado préestacio nário estão incluídos na descrição de enzimas específicas apresentada na Seção 64 As enzimas estão sujeitas à inibição reversível e irreversível Inibidores de enzimas são moléculas que interferem com a catálise diminuindo ou interrompendo as reações enzi máticas As enzimas catalisam quase todos os processos celulares e não deve surpreender que os inibidores de enzi mas estejam entre os medicamentos mais importantes Por exemplo a aspirina acetilsalicilato inibe a enzima que ca talisa a primeira etapa da síntese das prostaglandinas com postos envolvidos em vários processos inclusive em alguns que produzem dor O estudo dos inibidores enzimáticos também fornece rica informação sobre os mecanismos enzi máticos e tem ajudado a desvendar algumas vias metabóli cas Existem duas amplas classes de inibidores de enzimas reversíveis e irreversíveis Inibição reversível Um tipo muito comum de inibição re versível é denominado competitivo Figura 615a Um inibidor competitivo compete com o substrato pelo sítio ativo da enzima À medida que o inibidor I ocupa o sítio ativo ele impede que o substrato se ligue à enzima Muitos inibidores competitivos têm estrutura similar à estrutura do substrato e se combinam com a enzima formando um complexo EI mas que não leva à catálise Mesmo ligações desse tipo que sejam transitórias reduzem a eficiência da enzima Considerandose a geometria molecular dos ini bidores podese chegar a conclusões sobre quais as par tes do substrato normal que se ligam à enzima A inibição competitiva pode ser analisada quantitativamente usando cinética do estado estacionário Na presença de um inibi dor competitivo a equação de MichaelisMenten Equação 69 tornase 628 quando A Equação 628 descreve características importantes da inibição competitiva A variável determinada experimental mente aKm isto é o Km observado na presença do inibidor geralmente é denominada de Km aparente Uma vez que o inibidor ligase reversivelmente à enzi ma a competição pode ser deslocada em favor do substra Aumentando S2 1 V0 1 mMmin Aumentando S2 b 1 S1 1 mM a 1 S1 1 mM 1 V0 1 mMmin FIGURA 614 Análise da cinética de estado estacionário das reações bissubstrato Nestes gráficos duplorecíprocos ver Quadro 61 a concen tração do substrato 1 varia enquanto a concentração do substrato 2 é man tida constante Isso é repetido para vários valores de S2 gerando várias retas independentes a Retas que se interceptam indicam que um complexo ternário foi formado na reação b retas paralelas indicam uma via pingue pongue deslocamento duplo Nelson6ed06indd 207 Nelson6ed06indd 207 070414 1433 070414 1433 208 DAVID L NELSON MICHAEL M COX to simplesmente pela adição de mais substrato Quando S exceder muito a I é minimizada a probabilidade de uma molécula de inibidor se ligar à enzima e a reação apresen ta Vmáx normal Entretanto em S na qual V0 5 ½ Vmáx a presença do inibidor aumenta o valor do Km aparente por um fator a Esse efeito no Km aparente combinado com a ausência de efeito sobre Vmáx diagnostica uma inibição competitiva e é facilmente revelado por meio do gráfico duplorecíproco Quadro 62 A constante de equilíbrio para a ligação do inibidor KI pode ser obtida a partir do mesmo gráfico Um tratamento terapêutico com base na competição pelo sítio ativo é utilizado para tratar pacientes que ingeriram metanol um solvente utilizado em dutos de gás anticongelante A álcooldesidrogenase hepática converte metanol em formaldeído prejudicial para muitos tecidos A cegueira é uma consequência muito comum da ingestão de metanol pois os olhos são particularmente sensíveis ao for maldeído O etanol compete de maneira eficiente com o metanol como substrato alternativo da álcooldesidrogena se O efeito do etanol é como o de um inibidor competitivo com a diferença de que o etanol também é substrato para a álcooldesidrogenase e a sua concentração diminui à medi da que a enzima o converte em acetaldeído O tratamento do envenenamento por metanol é feito pela administração intravenosa lenta de etanol a uma velocidade que mante nha uma concentração controlada de etanol no sangue por várias horas A velocidade de formação de formaldeído di minui e durante esse tempo os rins filtram o metanol que é excretado inocuamente na urina Dois outros tipos de inibição reversível incompetitiva e mista muitas vezes definidas em termos de reações de um só substrato na prática são observados apenas em en zimas que têm dois ou mais substratos Um inibidor in competitivo Figura 615b ligase em um sítio distinto do sítio ativo do substrato e ao contrário do inibidor com petitivo ligase apenas ao complexo ES Na presença de um inibidor incompetitivo a equação de MichaelisMenten alterase para 629 onde Como descrito na Equação 629 em altas concentrações de substrato V0 aproximase de Vmáxa9 Então um inibidor in competitivo diminui a Vmáx medida O Km aparente também diminui porque a S necessária para atingir metade da Vmáx diminui por um fator de a9 Também no caso de um inibidor misto Figura 615c há ligação a um sítio distinto do sítio ativo ao qual o subs trato se liga Nesse caso o inibidor pode ligarse tanto à en zima quanto a ES A equação de velocidade que descreve a inibição mista é 630 onde a e a9 são definidas como anteriormente Em geral um inibidor afeta a ambos Km e Vmáx O caso especial em que a 5 a9 raramente encontrado experimentalmente é definido como inibição não competitiva O exame da Equação 630 mostra por que um inibidor não competitivo afeta Vmáx mas não Km A Equação 630 é uma expressão geral dos efeitos de inibidores reversíveis simplificando as expressões da ini bição competitiva e da inibição incompetitiva quando a9 5 10 ou a 5 10 respectivamente A partir dessa expressão podese resumir os efeitos dos inibidores sobre cada um E 1 S ES E 1 P S a Inibição competitiva c Inibição mista 1 I EI S I I S 1 I EI 1 S 1 I ESI KI E 1 S ES E 1 P I I S S I S I 1 I ESI KI9 KI9 E 1 S ES E 1 P S S I S b Inibição incompetitiva I KI9 FIGURA 615 Três tipos de inibição reversível a Inibidores competiti vos ligamse ao sítio ativo da enzima KI é a constante de equilíbrio da ligação do inibidor a E b Inibidores incompetitivos ligamse em sítios diferentes mas ligamse apenas ao complexo ES KI9 é a constante de equilíbrio para a ligação a ES c Inibidores mistos ligamse a sítios separados mas podem se ligar tanto a E quanto a ES Nelson6ed06indd 208 Nelson6ed06indd 208 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 209 dos parâmetros cinéticos No caso de todos os inibidores reversíveis Vmáx aparente 5 Vmáxa9 porque o lado direito da Equação 630 sempre simplificase para Vmáxa9 em con centrações de substrato suficientemente altas No caso dos inibidores competitivos a9 5 10 e assim pode ser igno rado Tomando essa expressão pela Vmáx aparente podese deduzir uma expressão geral para Km aparente que mostra como esse parâmetro modificase pela presença de inibido res reversíveis O Km aparente como sempre é igual à S na qual V0 é metade da Vmáx aparente ou de maneira mais geral quando V0 5 Vmáx2a9 Essa condição é encontrada quando S 5 aKma9 Então o Km aparente 5 aKma9 Essa expressão é mais simples quando a e a9 forem 10 tanto na inibição incompetitiva quanto na inibição competitiva como está resumido na Tabela 69 Na prática as inibições incompetitiva e mista são obser vadas apenas em enzimas com dois ou mais substratos S1 e S2 os quais são muito importantes na análise experimental dessas enzimas Se um inibidor ligarse ao sítio normalmen te ocupado por S1 ele atuará como um inibidor competi tivo em experimentos nos quais S1 varie Se um inibidor ligase ao sítio normalmente ocupado por S2 ele pode agir TABELA 69 Efeitos de inibidores reversíveis na Vmáx aparente e no Km aparente Tipo de inibidor Vmáx aparente Km aparente Sem inibidor Vmáx Km Competitivo Vmáx aKm Incompetitivo Vmáxa9 Kma9 Misto Vmáxa9 aKma QUADRO 62 Testes cinéticos para determinar o mecanismo de inibição O gráfico duplorecíproco ver Quadro 61 possibilita uma maneira fácil de determinar se o inibidor de uma enzima é competitivo incompetitivo ou misto Dois con juntos de experimentos devem ser feitos com a concen tração de enzima mantida constante em cada conjun to No primeiro conjunto de experimentos S também é mantida constante o que permite medir o efeito do aumento da concentração do inibidor I sobre a velo cidade inicial V0 não mostrado na figura No segundo conjunto de experimentos I é mantida constante e S varia Os resultados são usados para construir um gráfi co 1V0 versus 1S A Figura Q1 mostra um conjunto de gráficos duplo recíprocos um obtido na ausência de inibidor e dois com diferentes concentrações de um inibidor compe titivo O aumento na I produz uma família de curvas todas com uma intercepção comum no eixo 1V0 mas com inclinações diferentes Uma vez que a intercepção no eixo 1V0 corresponde a 1Vmáx sabese que Vmáx não varia devido à presença de um inibidor competitivo Isto é independentemente de qual seja a concentração de um inibidor competitivo há uma concentração de subs trato alta o suficiente que deslocará o inibidor do sítio ativo da enzima Na parte superior do gráfico é apresen tado o rearranjo da Equação 628 na qual cada gráfico foi baseado O valor de a pode ser calculado a partir da mudança na inclinação da curva em qualquer valor de I Conhecendose I e a podese calcular KI a partir da expressão No caso da inibição incompetitiva e da inibição mista gráficos similares de dados de velocidades dão as famílias de retas mostradas nas Figuras Q2 e Q3 Mudanças na intercepção nos eixos indicam mudanças em Vmáx e Km Inclinação 5 5 1 5 3 5 2 5 1 a a a Km Vmáx a Vmáx a 1 S 1 V0 Sem inibidor I 1 1 V0 1 Mmin m 1 S 1 mM Vmáx Km Vmáx 1 1 aKm 2 FIGURA Q1 Inibição competitiva I 15 2 1 1 V0 1 S Km Vmáx Vmáx 1 V0 1 Mmin 1 S 1 mM Km Vmáx FIGURA Q2 Inibição incompetitiva 1 V0 1 Mmin Sem inibidor m 1 V0 1 S Km Vmáx Vmáx 5 1 1 S 1 mM I a 2 Vmáx Km FIGURA Q3 Inibição mista Nelson6ed06indd 209 Nelson6ed06indd 209 070414 1433 070414 1433 210 DAVID L NELSON MICHAEL M COX como um inibidor misto ou incompetitivo de S1 O padrão real de inibição observado dependerá do quanto os eventos de ligação de S1 e S2 forem ordenados ou aleatórios Assim a ordem de ligação dos substratos e a ordem com que os produtos deixam o sítio ativo podem ser determinadas Ge ralmente o uso de um dos produtos da reação como inibi dor é muito informativo Se apenas um dos dois produtos da reação estiver presente a reação inversa não ocorre Entretanto um produto geralmente ligase a alguma parte do sítio ativo agindo como um inibidor Os enzimologistas podem fazer estudos cinéticos elaborados envolvendo dife rentes combinações e quantidades de produtos e inibidores de modo a obterem um quadro detalhado do mecanismo de uma reação bissubstrato PROBLEMA RESOLVIDO 63 Efeito de inibidores sobre Km Pesquisadores trabalhando com a enzima felicidase ver Problemas Resolvidos 61 e 62 p 205 206 descobriram que o composto ESTRESSE é um potente inibidor compe titivo da felicidase A presença de ESTRESSE 1 nM aumen ta o valor do Km medido da TRISTEZA por um fator de 2 Quais são os valores de a e a9 nessas condições Solução Relembre que o Km aparente o Km medido na pre sença de um inibidor competitivo é definido como aKm Uma vez que o Km para TRISTEZA aumenta por um fator de 2 na presença de ESTRESSE 1 nM o valor de a deve ser 2 O valor de a9 para um inibidor competitivo por definição é 1 Inibição irreversível Os inibidores irreversíveis ligamse covalentemente com ou destroem um grupo funcional da enzima essencial à atividade da enzima ou então formam uma associação não covalente estável A formação de uma ligação covalente entre um inibidor irreversível e uma enzi ma é uma possibilidade Os inibidores irreversíveis consti tuemse em outra ferramenta útil para estudar mecanismos de reação Algumas vezes é possível identificar aminoáci dos com funçõeschave no sítio ativo determinando quais resíduos de aminoácidos se ligam covalentemente ao inibi dor depois que a enzima é inativada Um exemplo está mos trado na Figura 616 Uma classe especial de inibidores irreversíveis é forma da pelos inativadores suicidas Esses compostos são re lativamente não reativos até que se liguem ao sítio ativo de uma enzima específica Um inativador suicida passa pelas primeiras etapas químicas de uma reação enzimática mas em vez de ser transformado no produto normal é converti do em um composto muito reativo que se combina irrever sivelmente com a enzima Esses compostos também são de nominados inativadores com base no mecanismo pois sequestram o mecanismo normal da reação para inativar a enzima Os inativadores suicidas desempenham um papel significativo no planejamento racional de fármacos uma abordagem moderna com base no conhecimento dos subs tratos e dos mecanismos de reação e usada pelos químicos para sintetizar novos agentes farmacêuticos Um inativador suicida bem planejado é específico para uma única enzima e permanece sem reatividade até que se ligue no sítio ativo da enzima de forma que os medicamentos desenvolvidos por meio dessa abordagem podem ter uma vantagem significa tiva devido aos poucos efeitos colaterais ver Quadro 63 Alguns exemplos de inibidores de importância médica estão descritos no final da Seção 64 Um inibidor irreversível não pode se ligar covalentemen te à enzima Ligação não covalente é suficiente caso essa ligação for tão forte que o inibidor só se dissociará raramen te Como é que um inibidor que se ligue fortemente pode ser desenvolvido Inicialmente é importante lembrar que as enzimas evoluíram de modo a se ligarem mais firmemente ao estado de transição das reações que catalisam Em prin cípio se alguém puder planejar uma molécula que se pareça com o estado de transição da reação essa molécula se ligará fortemente à enzima Mesmo que os estados de transição não possam ser observados diretamente químicos geral mente podem predizer a estrutura aproximada do estado de transição com base no acúmulo do conhecimento sobre os mecanismos da reação O estado de transição é por defini ção transitório e tão instável que é impossível medir direta mente as interações de ligação entre essa espécie e a enzi ma Em alguns casos porém é possível planejar moléculas estáveis que se assemelhem aos estados de transição Essas moléculas são denominadas de análogos do estado de transição Elas ligamse à enzima mais fortemente do que o substrato no complexo ES porque elas se encaixam melhor no sítio ativo ie formam um número maior de interações fracas do que o próprio substrato A ideia de análogos ao estado de transição foi proposta por Pauling na década de 1940 e vem sendo explorada usando algumas enzimas Por exemplo análogos ao estado de transição planejados para inibir a aldolase enzima da via glicolítica ligamse à enzi ma com mais de quatro ordens de magnitude de firmeza do que os substratos Figura 617 Esses experimentos têm a limitação que um análogo ao estado de transição não pode mimetizar perfeitamente um estado de transição Alguns análogos entretanto ligamse à enzimaalvo de 10 2 a 10 8 vezes mais fortemente que o substrato normal fornecendo 1 F O P H CH2 O O 1 F2 H1 CH O P CH2 O CH3 CH3 CH3 CH CH3 CH3 O H3C C H CH3 H3C Ser195 DIFP O O C H Enzima Enzima FIGURA 616 Inibição irreversível A reação da quimotripsina com di isopropilfluorofosfato DIFP que modifica a Ser 195 inibe a enzima irreversi velmente Isso levou à conclusão de que a Ser 195 é o resíduo de serina chave na quimotripsina Nelson6ed06indd 210 Nelson6ed06indd 210 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 211 QUADRO 63 MEDICINA Cura da doença do sono com um cavalo de Troia bioquímico A doença do sono ou tripanossomíase africana é causada por protistas eucarionte unicelular denominados de tri panossomos Figura Q1 Esta doença e outras doenças causadas por tripanossomos tem importância médica e econômica em muitos países em desenvolvimento Até o recente século XX a doença era praticamente incurável Vacinas eram ineficazes devido ao inusitado mecanismo de evasão ao sistema imune do hospedeiro A camada que reveste as células dos tripanossomos é coberta por uma única proteína que constitui o antígeno ao qual o sistema imune responde Entretanto por meio de um processo de recombinação genética ver Tabela 281 a intervalos frequentes algumas células da popula ção de tripanossomos infectantes mudam para uma nova proteína de revestimento a qual não é reconhecida pelo sistema imune Esse processo de mudança de revesti mento pode ocorrer centenas de vezes ao longo do tem po O resultado é uma infecção crônica cíclica a pessoa acometida tem febre que persiste enquanto o sistema imune ataca a primeira infecção os tripanosomos com o revestimento alterado tornamse a semente de uma se gunda infecção e a febre volta Esse ciclo pode se repetir por semanas e a pessoa enfraquece e pode vir a falecer Algumas das abordagens atuais para tratar a doença do sono baseiamse no conhecimento da enzimologia e do metabolismo Ao menos uma dessas abordagens envolve agentes farmacêuticos planejados como inibidores que atuam no mecanismo de inativadores de enzimas inati vadores suicidas Um ponto vulnerável do metabolismo dos tripanossomatídeos é a via de biossíntese de poliami nas As poliaminas espermina e espermidina com papel na compactação do DNA são necessárias em grandes quanti dades por células em rápido crescimento A primeira eta pa da síntese dessas poliaminas é catalisada pela ornitina descarboxilase enzima que para funcionar necessita de uma coenzima denominada de piridoxal fosfato O pirido xal fosfato PLP derivado da vitamina B6 faz uma ligação covalente ao aminoácido substrato da reação em que está envolvido e age como um aceptor de elétrons facilitando um grande número de reações ver Figura 2232 Nas cé lulas de mamífero a ornitinadescarboxilase tem um alto turnover isto é ciclos de degradação e síntese da enzima Em alguns tripanossomatídeos porém a enzima por ra zões não bem conhecidas é estável Ela não é substituí da por novas enzimas recémsintetizadas Um inibidor da ornitinadescarboxilase que se ligue permanentemente à enzima teria pouco efeito sobre as células humanas já que elas repõem rapidamente a enzima inativada mas teria um efeito adverso ao parasita As primeiras etapas da reação normalmente catalisa da pela ornitinadescarboxilase estão mostradas na Figu ra Q2 Uma vez liberado o CO2 o movimento de elétrons é revertido e a putrescina é produzida ver Figura 2232 FIGURA Q1 Trypanosoma brucei rhodesiense um dos vários tripanosso matídeos que causam a doença do sono africana O CH OH H3 N H 1 CH3 P O H2O CH C O CH2 N 1NH Ornitina Putrescina O CH OH H2 N H 1 CH3 P O CH23 CH C O O CH2 N NH2 Piridoxal fosfato 1 CH OH H2 N H CH3 P O CH CH2 N NH Base de Schiff CH23 CH23 CO2 H2O 1 H H 1 1 FIGURA Q2 Mecanismo da reação da ornitinadescarboxilase Continua na próxima página Nelson6ed06indd 211 Nelson6ed06indd 211 070414 1433 070414 1433 212 DAVID L NELSON MICHAEL M COX excelente evidência de que os sítios ativos das enzimas são realmente complementares aos estados de transição O con ceito de análogo ao estado de transição é importante para planejar novos fármacos Como será visto adiante os pode rosos fármacos antiHIV denominados de inibidores de pro teases foram planejados em parte como análogos do estado de transição que se ligam fortemente A atividade enzimática depende do pH As enzimas têm um pH ou uma faixa de pH ótimo no qual a atividade catalítica é máxima Figura 618 a atividade decresce em pH maior ou menor Isso não surpreende As cadeias laterais dos aminoácidos do sítio ativo podem fun cionar como ácidos ou bases fracas em funções críticas que dependem da manutenção de certo estado de ionização e em outras partes da proteína as cadeias laterais ionizáveis podem ter uma participação essencial nas interações que mantêm a estrutura proteica A remoção de um próton de um resíduo de His por exemplo pode eliminar uma intera ção iônica essencial na estabilização da conformação ativa da enzima Uma causa menos comum para a sensibilidade de uma enzima ao pH é a titulação de um grupo no substrato A faixa de pH na qual uma enzima sofre mudança na ati vidade pode fornecer uma pista para o tipo de resíduo de aminoácido envolvido ver Tabela 31 Uma mudança de atividade próxima a pH 70 por exemplo geralmente reflete a titulação de um resíduo de His Contudo os efeitos do pH devem ser interpretados com cautela No ambiente altamen te compacto e confinado das proteínas os valores de pKa das cadeias laterais das proteínas podem estar alterados de modo significativo Por exemplo uma carga positiva que esteja pró xima pode diminuir o pKa de um resíduo de Lys e uma carga negativa nas proximidades pode aumentálo Algumas vezes Com base nesse mecanismo foram planejados vários ina tivadores suicidas um deles é a difluorometilornitina DFMO A DFMO é relativamente inerte em solução Quando ela ligase à ornitinadescarboxilase a enzima é rapidamente inativada Figura Q3 O inibidor age proporcionando uma nova alternativa para receber os elétrons na forma dos dois átomos de flúor estrategica mente posicionados que são excelentes grupos de saída Em vez de fazer os elétrons se moverem para o anel da estrutura do PLP a reação leva à liberação de um átomo de flúor O S de um resíduo de cisteína do sítio ativo for ma então um complexo covalente com aduto altamente reativo do inibidor da PLP uma reação essencialmente irreversível Dessa maneira o inibidor faz o próprio me canismo de ação enzimática matar a enzima DFMO mostrouse altamente eficaz contra a doença do sono em testes clínicos e agora é utilizado para tra tar a doença do sono causada por Trypanosoma brucei gambiense Abordagens como essa se revelam muito promissoras para tratar uma vasta gama de doenças O planejamento de fármacos com base no mecanismo e na estrutura de enzimas pode complementar a metodologia tradicional de tentativa e erro no desenvolvimento de no vos agentes farmacêuticos 1 H2O DFMO F rearranjo adicional OH H2 N H 1 CH3 O CH C O O CH2 N NH2 Piridoxal fosfato 1 OH H2 N H CH3 P O CH CH2 N NH Emperrado P C CH F C F O C O CH F C 1 OH H2 CH3 P O CH CH2 N 1NH F C F 1 CysS C 1 OH H2 N H CH3 P O CH CH2 N NH C Base de Schiff O CH23 CH23 CH23 N H H H CH23 CysS CO2 1 F Enzima Enzima FIGURA Q3 Inibição da ornitinadescarboxilase por DFMO QUADRO 63 MEDICINA Cura da doença do sono com um cavalo de Troia bioquímico Continuação Nelson6ed06indd 212 Nelson6ed06indd 212 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 213 esses efeitos resultam em um valor de pKa desviado várias ordens de grandeza do valor quando o aminoácido está livre Por exemplo na enzima acetoacetatodescarboxilase devido aos efeitos eletrostáticos das cargas positivas presentes nas proximidades de um resíduo de Lys esse resíduo de Lys tem pKa de 66 comparado com 105 na lisina livre RESUMO 63 A cinética enzimática como abordagem à compreensão do mecanismo c A maioria das enzimas tem algumas propriedades cinéti cas em comum Quando o substrato é adicionado a uma enzima a reação rapidamente atinge um estado esta cionário no qual a velocidade pela qual o complexo ES se forma é compensada pela velocidade pela qual ES se decompõe Em concentração fixa de enzima à medida que a S aumenta a atividade do estado estacionário aumenta de maneira hiperbólica até se aproximar de uma velocidade máxima característica Vmáx na qual es sencialmente toda a enzima está na forma de um com plexo com o substrato c A concentração de substrato que resulta em uma velo cidade de reação igual à metade da Vmáx é a constante de Michaelis Km que é característica para cada enzima agindo sobre determinado substrato A equação de Mi chaelisMenten relaciona a velocidade inicial com S e Vmáx por meio da constante Km A cinética de MichaelisMenten também é denominada cinética do estado estacionário c Km e Vm têm significados diferentes para diferentes enzimas A velocidade limitante de uma reação cata lisada por uma enzima quando saturada é descrita pela constante kcat o número de renovação A relação kcatKm fornece uma boa medida da eficiência catalítica A equação de MichaelisMenten também é aplicável a reações de bissubstrato nas quais ocorrem etapas com um complexo ternário ou pinguepongue desloca mento duplo c A inibição reversível de uma enzima pode ser compe titiva incompetitiva ou mista Inibidores competitivos competem com o substrato para se ligarem reversivel mente ao sítio ativo mas não são transformados pela en zima Inibidores incompetitivos ligamse apenas ao com plexo ES em um sítio diferente do sítio ativo Inibidores mistos ligamse tanto a E quanto a ES novamente em um sítio distinto do sítio ativo Na inibição irreversível o inibidor ligase permanentemente ao sítio ativo pela for mação de uma ligação covalente ou por uma interação não covalente muito estável c Cada enzima tem um pH ótimo ou um intervalo de pH no qual a atividade é máxima Frutose 16bifosfato O C H OH H H OHOH O O Zn21 B C C C CH2 H2C P P P P P Dihidroxiacetonafosfato O C OH O CH2 H2C Gliceraldeído 3fosfato HC OH H O O C CH2 Estado de transição proposto Zn21 H1 H2C O2 C C H OH O H2C O2 C N OH O Análogo ao estado de transição fosfoglicolohidroxamato P FIGURA 617 Análogo do estado de transição Na glicólise uma al dolase de classe II encontrada em bactérias e fungos catalisa a quebra da frutose 16bifosfato formando gliceraldeído3fosfato e fosfato de dihidro xiacetona ver Figura 1416 para um exemplo de aldolase de classe I encon trada em animais e plantas superiores A reação ocorre como o reverso de um mecanismo do tipo de condensação aldólica O composto fosfoglicolo hidroxamato assemelhase ao estado de transição do enodiolato proposto e ligase à enzima aproximadamente 10000 vezes melhor que o produto dihidroxiacetonafosfato pH 2 4 6 log V0 Pepsina 8 10 Glicose6fosfatase FIGURA 618 Perfil de atividade em função do pH de duas enzimas As curvas foram construídas a partir de medidas das velocidades iniciais e as reações foram feitas em tampões com pH diferentes Uma vez que a escala de pH é logarítmica e representa mudanças de 10 vezes na H 1 as mudan ças em V0 também estão representadas no gráfico em escala logarítmica O pH ótimo para a atividade de uma enzima geralmente é próximo ao pH do ambiente no qual a enzima costuma ser encontrada A pepsina peptida se encontrada no estômago tem pH ótimo de cerca de 16 O pH do suco gástrico situase entre 1 e 2 A glicose6fosfatase dos hepatócitos células do fígado com pH ótimo de cerca de 78 é responsável pela liberação de glicose na corrente sanguínea O pH normal do citosol dos hepatócitos é de cerca de 72 Nelson6ed06indd 213 Nelson6ed06indd 213 070414 1433 070414 1433 214 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 64 Exemplos de reações enzimáticas Até agora o foco foi dirigido aos princípios gerais da catálise e à introdução de alguns dos parâmetros cinéticos usados para descrever a ação das enzimas Agora a discussão será centrada em alguns exemplos de mecanismos específicos de reações enzimáticas A compreensão dos mecanismos completos da ação de enzimas purificadas requer a identificação de todos os substratos cofatores produtos e reguladores Sobretudo necessita do conhecimento 1 da sequência temporal na qual são formados os intermediários ligados à enzima 2 da estrutura de cada intermediário e de cada estado de transição 3 das velocidades da interconversão entre os intermediários 4 da relação entre a estrutura da enzima e de cada intermediário e 5 da contribuição energética de todos os grupos reagentes que interagem com os comple xos intermediários e com os estados de transição Então provavelmente não há enzima da qual se tenha um conheci mento que englobe todos esses requisitos A seguir serão apresentados os mecanismos de quatro enzimas quimotripsina hexocinase enolase e lisozima Esses exemplos não foram escolhidos para cobrir todas as classes possíveis da química enzimática Foram escolhidos em parte porque estão entre as enzimas sobre as quais mais se conhece e em parte porque ilustram com clareza alguns dos princípios gerais resumidos neste capítulo A discussão se concentrará em princípios selecionados juntamente com alguns experimentoschave que contribuíram para estabe lecer estes princípios O exemplo da quimotripsina servirá para revisar a convenção usada para descrever os meca nismos enzimáticos Necessariamente muitos detalhes dos mecanismos e das evidências experimentais estão omitidos Apenas um livro não poderia documentar por completo a rica história dos experimentos realizados com essas enzi mas Ainda a contribuição especial das coenzimas para a atividade catalítica de muitas enzimas será vista apenas bre vemente As funções das coenzimas são quimicamente va riadas e cada coenzima está descrita em detalhes na Parte II O mecanismo da quimotripsina envolve a acilação e a desacilação de um resíduo de serina A quimotripsina pancreática bovina Mr 25191 é uma pro tease enzima que catalisa a hidrólise de ligações peptídicas Essa protease é específica para ligações peptídicas adjacen tes a resíduos de aminoácidos aromáticos Trp Phe Tyr A estrutura tridimensional da quimotripsina está mostrada na Figura 619 enfatizando os grupos funcionais do sítio ativo A reação catalisada por essa enzima é ilustrativa dos princípios da estabilização do estado de transição e também dá um exemplo clássico de catálise acidobásica e de catálise covalente A quimotripsina aumenta a velocidade da hidrólise da ligação peptídica por um fator de no mínimo 10 9 Ela não catalisa um ataque direto da água à ligação peptídica em vez disso formase um intermediário acilenzima covalente e transitório Assim a reação tem duas fases distintas Na fase de acilação a ligação peptídica é rompida e há a for mação de uma ligação éster entre o átomo de carbono da carbonila da ligação peptídica e a enzima Na fase de desa cilação a ligação éster é hidrolisada e a enzima não acilada é regenerada A primeira evidência de um intermediário acilenzima covalente veio da aplicação clássica da cinética de estado b c S 1 13 16 42 His57 Asp102 122 136 146 149 168 182 191 201 220 245 S Gly193 S S S S S S S S Ser195 Cadeia A Cadeia A Cadeia B Cadeia B Cadeia C Cadeia C 58 a d Ser195 Gly193 His57 Asp102 Substrato Bolsão hidrofóbico FIGURA 619 Estrutura da quimotripsina PDB 1D 7GCH a Represen tação da estrutura primária mostrando as ligações dissulfeto e os resíduos de aminoácidos cruciais para a catálise A proteína consiste em três cadeias polipeptídicas ligadas por ligações dissulfeto A numeração dos resíduos na quimotripsina com ausência dos resíduos 14 15 147 e 148 está explicada na Figura 638 Os resíduos de aminoácidos do sítio ativo ficam agrupados na estrutura tridimensional b Esquema da enzima enfatizando sua superfí cie O bolsão hidrofóbico ao qual as cadeias laterais dos aminoácidos aromá ticos do substrato se ligam está mostrado em amarelo Resíduoschave para o sítio ativo incluindo Ser 195 His 57 e Asp 102 estão em vermelho Os papéis desses resíduos na catálise estão ilustrados na Figura 622 c O esqueleto polipeptídico da estrutura está representado na forma de fita As ligações dissulfeto estão em amarelo as três cadeias estão coloridas como em a d Visão ampliada do sítio ativo da enzima com o substrato branco e ama relo ligado O grupo hidroxila da Ser 195 ataca o grupo carbonil do substrato os oxigênios estão em vermelho A carga negativa que se desenvolve nos oxigênios é estabilizada pelo bolsão do oxiânion nitrogênios das amidas da Ser 195 e da Gly 193 estão em azul como explicado na Figura 622 As cadeias laterais dos aminoácidos aromáticos do substrato amarelo encaixamse no bolsão hidrofóbico O nitrogênio da amida da ligação peptídica a ser clivada protuberante em relação ao observador e projetandose para o resto da ca deia do substrato polipeptídico está em branco Nelson6ed06indd 214 Nelson6ed06indd 214 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 215 préestacionário Além da sua ação sobre peptídeos a qui motripsina também catalisa a hidrólise de pequenos éste res e amidas Essas reações são muito mais lentas que a hidrólise de peptídeos porque no caso de substratos pe quenos menos energia de ligação está disponível e assim essas reações são mais fáceis de estudar Investigações rea lizadas por BS Hartley e BA Kilby em 1954 revelaram que a hidrólise do éster pnitrofenilacetato pela tripsina medida pela liberação de pnitrofenol ocorre com uma fase de explosão rápida inicial antes de nivelar a uma velo cidade menor Figura 620 Extrapolando para o tempo zero eles concluíram que a fase explosiva correspondia justamente à liberação de uma molécula de pnitrofenol por molécula de enzima presente Hartley e Kilby sugeri ram que isso seria o reflexo da rápida acilação de todas as moléculas de enzima com a liberação de pnitrofenol e a velocidade de renovação do ciclo de catálise da enzima sendo limitada por uma etapa de desacilação lenta Des de então resultados semelhantes foram encontrados para muitas outras enzimas A observação da fase explosiva for nece outro exemplo do uso da cinética para separar uma reação em suas etapas constituintes Outras características do mecanismo da quimotripsina foram descobertas pela análise da dependência da reação ao pH A relação entre a velocidade da reação catalisada pela quimotripsina e a variação do pH mostra um perfil em forma de sino Figura 621 As velocidades mostradas no gráfi co da Figura 621a são obtidas em baixas subsaturantes concentrações de substrato e portanto representam kcatKm ver Equação 627 p 205 Uma análise mais completa das velocidades a diferentes concentrações de substrato em cada pH permite que o pesquisador determine a contribui ção individual dos termos kcat e Km Figura 621b Depois de obter o valor de Km em cada valor de pH os pesquisadores podem fazer um gráfico usando os dados de 1Km Figura 621c Análises cinéticas e estruturais revelaram que as mudanças no kcat refletem o estado de ionização da His 57 A diminuição no kcat que ocorre em pH baixo é resultado da protonação da His 57 assim ela não pode tirar um próton da Ser 195 na etapa ➋ da reação ver Figura 622 Essa redu pNitrofenol molmol de enzima Tempo min 30 20 10 0 1 2 3 pNitrofenol Ácido acético pNitrofenilacetato rápido lento O C OH CH3 H2O 0 O O C CH3 O2N O OH O2N O C CH3 OH Enzima Enzima FIGURA 620 Evidência de um intermediário acilenzima fornecida pela cinética do estado préestacionário A hidrólise de pnitrofenilace tato pela quimotripsina é medida pela liberação de pnitrofenol um produto colorido Inicialmente a reação libera pnitrofenol de maneira muito rápida e próxima da estequiometria com a quantidade da enzima presente Isso reflete a rápida fase de acilação da enzima A velocidade subsequente é menor porque a renovação da enzima é limitada pela baixa velocidade da fase de desacilação 6 7 8 pH 9 10 v kcat 6 Km 1 7 8 pH 9 10 6 7 8 pH 9 10 a b c FIGURA 621 A dependência de pH da reação catalisada pela quimo tripsina a As relações entre velocidades da clivagem catalisada pela qui motripsina e o pH produzem uma curva de velocidade com um perfil na for ma de sino e com um pH ótimo de 80 A velocidade v colocada no gráfico é a velocidade em baixas concentrações de substrato e assim reflete o termo kcatKm O gráfico pode ser então separado nos seus componentes por meio de métodos cinéticos que determinam os termos kcat e Km separadamente em cada pH Quando isso é feito b e c fica claro que a transição logo acima de pH 70 devese a mudanças no kcat ao passo que a transição acima de pH 85 devese a mudanças em 1Km Estudos cinéticos e estruturais mostraram que a transição ilustrada em b e c reflete os estados de ionização da ca deia lateral da His 57 quando o substrato não está ligado e o grupo aamino da Ile 16 o amino terminal da cadeia B respectivamente Para uma atividade ótima a His 57 deve estar desprotonada e a Ile 16 deve estar protonada Nelson6ed06indd 215 Nelson6ed06indd 215 070414 1433 070414 1433 216 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Como interpretar mecanismos de reações Reavivar a memória Quando ocorre a ligação de um substrato a cadeia lateral do resíduo adjacente à ligação peptídica a ser clivada aninhase no bolsão hidrofóbico da enzima posicio nando a ligação peptídica para o ataque O segundo produto difundese do sítio ativo e a enzima livre é regenerada Produto 2 Nucleófilos Eletrófilos O S O H C N N HN C O R N C H R H R O O P O O R Átomo de carbono de um grupo carbonil o oxigênio mais eletro negativo do grupo carbonil empurra os elétrons para longe do carbono O grupo imina protonado ativado por um ataque nucleofílico ao carbono pela protonação de uma imina Fósforo de um grupo fosfato Próton Oxigênio carregado negativa mente como no grupo hidro xila desprotonado ou em um ácido carboxílico ionizado Sulfidril negativamente carregado Carbânion Grupo amina não carregado Imidazol Íon hidróxido AAnCCNCCNCCAAn H H H H H O R3 R1 O O R2 AAnCCNCCOH H H H O R3 O R2 C H N N His57 Gly193 C H HN AAn CHC O R3 R2 O Ser195 Complexo enzimaproduto 2 H O H O Asp102 C O O H N N His57 Gly193 Ser195 Bolsão hidrofóbico Sítio ativo Bolsão do oxiânion Substrato um polipeptídeo Quimotripsina enzima livre O H ➊ ➐ N H H N N H H N Os mecanismos das reações químicas que rastreiam a formação e a quebra de ligações covalentes são apre sentados com pontos e flechas curvas uma convenção informalmente conhecida como empurrão de elétrons Uma ligação covalente consiste em um par de elétrons compartilhado Elétrons não pertencentes à ligação e importantes para o mecanismo de reação são represen tados por pontos OH Setas curvas representam o movimento dos pares de elétrons Para o movimento de apenas um elétron como no caso da reação de um radical livre usase uma flecha com só uma ponta tipo anzol A maioria das reações envolve um par de elétrons como no mecanismo da quimotripsina Alguns átomos são mais eletronegativos que outros isto é eles atraem elétrons mais fortemente As eletro negatividades relativas dos átomos encontrados neste texto são Fe O N CS PH Por exemplo o compartilhamento dos dois pares de elétrons que formam a ligação do grupo CO carbonil não é equitativo o carbono é relativamente elétrondeficiente pois o oxigênio atrai mais os elétrons Muitas reações envolvem a reação de um átomo rico em elétrons nucleófilo com um átomo elétrondeficiente eletrófilo Alguns dos nucleófilos e eletrófilos mais comuns na bioquímica estão listados à direita Geralmente o mecanismo de uma reação iniciase em um par de elétrons não compartilhados de um nucleófilo Nos diagramas de mecanismos a flecha que mostra o empurrão de elétrons começa perto dos pontos que indicam o par de elétrons e aponta diretamente para o centro eletrofílico que é atacado Quando o par de elétrons não compartilhados confere uma carga negativa formal ao nucleófilo o próprio símbolo de carga negativa pode representar o par de elétrons não compartilhado e serve de início para a flecha No mecanismo da quimotripsina o par de elétrons nucleofílicos do complexo ES entre as etapas ➊ e ➋ é fornecido pelo oxigênio do grupo hidroxila da Ser 195 O começo da flecha curva é nesse par de elétrons 2 das 8 valências de elétrons do oxigênio da hidroxila O centro eletrofílico sob ataque é o carbono carbonílico da ligação peptídica a ser clivada Os átomos de C O e N tem um máximo de 8 elétrons de valência e o H tem um máximo de 2 Esses átomos ocasionalmente são encontrados em um estado instável com um número menor de elétrons que o máximo possível mas C O e N não podem ter mais do que 8 Então quando um par de elétrons da Ser 195 da tripsina ataca o carbono do carbonil do substrato um par de elétrons é deslocado da camada de valência do carbono não pode haver carbono com 5 ligações Esses elétrons movemse na direção do oxigênio do carbonil que é mais eletronegativo O oxigênio tem 8 elétrons de valência tanto antes como no final desse processo químico mas o número de elétrons compartilhado com o carbono é reduzido de 4 para 2 e o oxigênio do carbonil adquire uma carga negativa Na etapa seguinte o par de elétrons que confere carga negativa ao oxigênio retorna para formar novamente a ligação com o carbono e reestabelecer a ligação carboní lica Novamente um par de elétrons deve ser deslocado do carbono e agora esse par é o par de elétrons compartilhado com o grupo amino da ligação peptídica Isso quebra a ligação peptídica As etapas seguintes adotam um padrão semelhante Nelson6ed06indd 216 Nelson6ed06indd 216 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 217 HNCCAAn H H R1 O Complexo ES O H C H N H H O N His57 Gly193 C H HN H H O AAn CHC O R3 R2 O Intermediário acilenzima O C Ser195 H N H N His57 Gly193 C H R2 O Intermediário de vida curta desacilação HN AAn CHC O R3 O C Ser195 H N N His57 Gly193 C H O Ser195 R2 O Intermediário acilenzima HN AAn CHC O R3 O C Ser195 H N H N His57 Gly193 C H HN AAn CH R1 O R2 C O HN AAn CHC O R3 N H HN A instabilidade da carga negativa no oxigênio do carbonil do substrato leva ao colapso do interme diário tetraédrico a formação novamente de liga ção dupla com o carbono desloca a ligação entre o carbono e o grupo amino da ligação peptídica O grupo amino de saída é protonado pela His 57 facilitando o seu deslocamento Intermediário de vida curta acilação O H ➋ ➌ A interação entre a Ser 195 e a His 57 origina um íon alcó xido fortemente nucleofílico na Ser 195 o íon ataca o grupo carbonil peptídico formando uma acilenzima tetraédrica Isso é acompanhado pela formação de uma carga negativa de vida curta no oxi gênio do carbonil do substrato que é esta bilizado pela ligação de hidrogênio no bolsão do oxiânion A molécula de água que entra é desprotonada por catálise básica geral gerando um íon hidróxido fortemente nucleofílico O ataque do hidróxido à ligação éster da acilenzima gera um segundo interme diário tetraédrico e o oxi gênio no bolsão do oxiânion novamente adquire uma carga negativa O colapso do intermediário tetraédrico forma o segundo produto um ânion carboxilato e desloca a Ser 195 Produto 1 ➍ ➎ ➏ N H N H HN N H H N HN Gly193 Ser195 H N N His57 N H H N C C H HN HN AAn AAn CH R1 CHC O O R3 R2 C O MECANISMOFIGURA 622 Hidrólise de uma ligação peptídica pela quimotripsina A reação tem duas fases Na fase de acilação etapas ➊ a ➍ a formação de um intermediário covalente acil enzima é acoplada à clivagem da ligação peptídica Na fase de desacilação etapas ➎ a ➐ a desaci lação regenera a enzima livre Isso é essencialmente o reverso da fase de acilação com a água tendo no sentido oposto o papel do componente amino do substrato Mecanismo da quimotripsina O intermediário tetraédrico na reação da quimotripsina e o segundo intermediário formado pos teriormente algumas vezes são chamados de estados de transição o que pode gerar confusão Um intermediário é qualquer espécie química com um tempo de vida finito tempo de vida sendo defini do como um tempo maior do que o tempo da vibração molecular 10 13 segundos Um estado de transição é simplesmente a espécie de maior energia formada durante a coordenada da reação não tendo um tempo de vida finito Os intermediários tetraédricos formados na reação da quimotripsina lembram perfeitamente tanto energética como estruturalmente os estados de transição que levam à sua formação e rompimento Entretanto o intermediário representa um estágio de comprometi mento com a formação da ligação enquanto o estado de transição é parte do processo da reação No caso da quimotripsina devido à estreita relação entre o intermediário e o verdadeiro estado de tran sição a diferenciação entre eles normalmente é desconsiderada Além disso a interação do oxigênio negativamente carregado com os nitrogênios da amida no bolsão do oxiânion geralmente conside rado como estabilização do estado de transição também serve para estabilizar o intermediário Nem todos os intermediários têm uma vida tão curta para parecer um estado de transição O intermediário acilenzima da quimotripsina é muito mais estável e mais facilmente detectado e estudado não deve ser confundido com o estado de transição Nelson6ed06indd 217 Nelson6ed06indd 217 070414 1433 070414 1433 218 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ção na velocidade ilustra a importância da catálise geral aci dobásica no mecanismo da quimotripsina As mudanças no termo 1Km refletem a ionização do grupo aamino da Ile 16 na extremidade aminoterminal de uma das três cadeias po lipeptídicas da quimotripsina Esse grupo forma uma ponte salina com o Asp 194 o que estabiliza a conformação ativa da enzima Quando esse grupo perde seu próton em pH alto a ponte salina é eliminada e a mudança conformacional fe cha o bolsão hidrofóbico onde a cadeia lateral do aminoácido aromático do substrato se encaixa Figura 619 Os subs tratos já não podem mais se ligar de modo apropriado o que é medido cineticamente pelo aumento no Km Como pode ser visto na Figura 622 o nucleófilo da fase de acilação é o oxigênio da Ser 195 Proteases com um resíduo de serina desempenhando esse papel no mecanis mo de reação são denominadas serinoproteases O pKa do grupo hidroxila da Ser geralmente é muito alto para que em pH fisiológico a forma não protonada esteja pre sente em concentrações significativas Entretanto na qui motripsina a Ser 195 está associada a His 57 e Asp 102 por meio de uma rede de ligações de hidrogênio conhecida como tríade catalítica Quando um substrato peptídico ligase à quimotripsina uma mudança sutil na conformação com prime a ligação de hidrogênio entre His 57 e Asp 102 o que resulta em uma interação mais forte denominada ligação de hidrogênio de baixa barreira Essa interação mais forte aumenta o pKa da His 57 de 7 no caso da histidina livre para 12 possibilitando que o resíduo de His atue como uma base geral mais forte que pode remover o próton do grupo hidroxila da Ser 195 A desprotonação evita o apare cimento de uma carga positiva muito instável na hidroxila da Ser 195 e torna a cadeia lateral da Ser um nucleófilo forte Nos estágios finais da reação a His 57 também age como um doador de próton protonando o grupo amino que é libera do o grupo de saída do substrato À medida que o oxigênio da Ser 195 ataca o grupo car bonil do substrato um intermediário tetraédrico de vida muito curta se forma e o oxigênio do carbonil adquire uma carga negativa Figura 622 etapa ➋ Essa carga formada no interior de um bolsão da enzima denominado bolsão do oxiânion é estabilizada pelas ligações de hidrogênio forma das pelos grupos amida de duas ligações peptídicas do es queleto de carbono da quimotripsina Uma dessas ligações de hidrogênio formada pela Gly 193 está presente apenas nesse intermediário e no estado de transição para sua for mação e quebra Ela reduz a energia necessária para atingir esses estágios Esse é um exemplo de uso de energia de ligação para a catálise O conhecimento do mecanismo das proteases levou a novos tratamentos para infecções por HIV Novos agentes farmacêuticos quase sempre são feitos para inibir alguma enzima O grande sucesso de tera pias desenvolvidas para tratar infecções por HIV evidencia isso O vírus da imunodeficiência humana HIV é o agente que causa a síndrome da imunodeficiência adquirida Aids Estimase que no mundo todo em 2005 de 37 a 45 milhões de pessoas viviam com infecção por HIV com 39 a 66 mi lhões de novas infecções naquele ano e mais de 24 milhões de óbitos A Aids apareceu inicialmente como uma epidemia mundial na década de 1980 Logo em seguida o HIV foi des coberto e identificado como um retrovírus Os retrovírus possuem um genoma de RNA e uma enzima transcriptase reversa que utiliza diretamente RNA para fazer a síntese de um DNA complementar Os esforços para entender o HIV e desenvolver terapias para a infecção por HIV se beneficia ram de décadas de pesquisa básica tanto sobre mecanismos de enzimas quanto sobre as propriedades de outros retroví rus Retrovírus como o HIV tem um ciclo de vida relativa mente simples ver Figura 2632 O seu genoma de RNA é convertido em fita dupla de DNA em várias etapas catalisa das pela transcriptase reversa descrita no Capítulo 26 A fita dupla de DNA é inserida em um dos cromossomas do núcleo da célula hospedeira por uma enzima a integrase descrita no Capítulo 25 A cópia do genoma viral integrada no cromossomo pode ficar silenciosa indefinidamente Al ternativamente ela pode ser transcrita novamente em RNA o qual pode então ser traduzido em proteínas para formar novas partículas virais A maior parte dos genes de vírus é traduzida em grandes poliproteínas que são quebradas pela protease do vírus nas proteínas individuais necessárias para formar o vírus ver Figura 2633 Há apenas três enzimas críticas nesse ciclo transcriptase reversa integrase e prote ase Essas enzimas constituem portanto os alvos de fárma cos mais promissores Existem quatro subclasses principais de proteases Se rinoproteases como a quimotripsina e a tripsina cisteína proteases nas quais Cys tem um papel catalítico similar ao da Ser no sítio ativo formando um complexo covalente enzimasubstrato e aspárticoproteases e metaloproteases que não formam complexo covalente com o substrato A protease do HIV é uma aspárticoprotease Dois resíduos de Asp no sítio ativo facilitam um ataque direto da água sobre a ligação peptídica a ser clivada Figura 623 O produto inicial do ataque da água sobre o grupo carbonil da ligação peptídica é um intermediário tetraédrico instável à seme lhança do que foi visto na reação da quimotripsina Esse in termediário se assemelha em estrutura e energia ao estado de transição da reação Os fármacos que foram desenvolvi dos como inibidores da protease do HIV formam complexos não covalentes com a enzima mas eles se ligam à enzima tão fortemente que podem ser considerados como inibido res irreversíveis Essa ligação tão forte deriva em parte da sua estrutura planejada para ser análoga ao estado de transição O sucesso desses fármacos é uma questão que merece ser enfatizada Os princípios catalíticos que foram estudados nesse capítulo não são simplesmente ideias abs tratas a serem memorizadas suas aplicações salvam vidas A protease do HIV cliva ligações peptídicas entre resí duos de Phe e Pro com mais eficiência O sítio ativo então tem um bolsão para ligar grupos de aminoácidos aromáticos próximos à ligação a ser clivada Estruturas de vários inibi dores da protease do HIV estão mostradas na Figura 624 Embora pareça que há variação entre as estruturas todas elas têm uma estrutura central uma cadeia principal com um grupo hidroxila posicionado próximo a uma ramifica ção contendo um grupo benzil Essa organização visa o gru po benzil do bolsão de ligação aromático hidrofóbico O grupo benzil adjacente mimetiza o oxigênio negativamente carregado do intermediário tetraédrico da reação normal fornecendo um análogo do estado de transição O restan Nelson6ed06indd 218 Nelson6ed06indd 218 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 219 te da estrutura de cada inibidor foi planejado para ligar a várias cavidades ao longo da enzima reforçando a ligação total A disponibilidade desses fármacos eficazes aumentou enormemente o tempo e a qualidade de vida de milhões de pessoas com HIV e Aids A hexocinase sofre um ajuste induzido quando o substrato se liga A hexocinase de levedura Mr 107862 é uma enzima bis substrato que catalisa a reação reversível H CH2OH O H H H OH OH HO H OH hexocinase bDGlicose H CH2OPO3 O H H H OH OH HO Glicose6fosfato 22 H OH Mg ATP Mg ADP ATP e ADP sempre se ligam às enzimas em complexo com o íon metálico Mg 21 A hidroxila no C6 da glicose para onde o grupo gfosfo ril do ATP é transferido na reação da hexocinase é similar à água em reatividade química e a água entra livremente no sítio ativo da enzima Assim a hexocinase favorece a rea ção com a glicose por um fator de 10 6 A enzima consegue diferenciar as moléculas de glicose e de água devido a uma mudança conformacional na enzima que acontece quando o substrato correto se liga ao sítio ativo Figura 625 Por tanto a hexocinase é um bom exemplo de ajuste induzido Na ausência de glicose a enzima fica na conformação ina tiva com as cadeias laterais dos aminoácidos do sítio ati vo fora de posição para a reação Quando glicose mas não água e Mg ATP se ligam a energia de ligação decorrente desta interação induz mudança conformacional na hexoci nase para a forma cataliticamente ativa Esse modelo foi corroborado por estudos cinéticos O açúcar de cinco carbonos xilose estereoquimicamente si milar à glicose mas com um carbono a menos ligase à he xocinase embora em uma posição na qual ele não pode ser H2SO4 N N N O O NCCH33 OH H N HO CH3SO2 OH O OH HO CH3 O S N N H Indinavir Nelinavir Lopinavir Saquinavir CH3 CH3 H3C CH3 NH2 O O O O O O O OH OH N N N NH O N H N H H N H N H NCCH33 H NCCH33 H FIGURA 624 Inibidores da protease do HIV O grupo hidroxila corde rosa age como análogo do estado de transição mimetizando o intermediá rio tetraédrico O grupo benzil adjacente azul ajuda a posicionar o fármaco apropriadamente C C OH O O Asp25 Peptidases O2 C O O N O C C C H O H C C OH OH O O HO C O N Protease do HIV C C OH OH O O C HN C O2 2 O C C O C C C Asp25 Asp25 Asp25 Asp25 Asp25 Auxiliada por catálise geral básica a água ataca o carbono do carbonil gerando um intermediário tetraé drico estabilizado por ligação de hidrogênio O intermediário tetraédrico colapsa e o grupo amino de saída é protonado e expelido FIGURA 623 Mecanismo de ação da protease do HIV Dois resíduos de Asp do sítio ativo de diferentes subunidades agem como catalisador geral acidobásico facilitando o ataque da água sobre a ligação peptídica O intermediário tetraédrico instável formado no curso da reação está som breado em cor salmão Nelson6ed06indd 219 Nelson6ed06indd 219 070414 1433 070414 1433 220 DAVID L NELSON MICHAEL M COX fosforilado Apesar disso a adição de xilose à mistura de reação aumenta a velocidade da hidrólise de ATP Eviden temente a ligação da xilose é suficiente para induzir uma mudança na hexocinase para a conformação ativa e a en zima é enganada para fosforilar água A reação da hexo cinase também ilustra que a especificidade da enzima nem sempre é uma simples questão de ligar um composto e não outro No caso da hexocinase a especificidade é observada não para a formação do complexo ES mas para as veloci dades relativas das etapas seguintes da catálise A água não é excluída do sítio ativo mas as velocidades de reação au mentam muito na presença de um aceptor de grupo fosforil funcional a glicose H O C C C C CH2OH H HO H OH OH H C C C C CH2OH H HO H OH OH H OH H Xilose Glicose H O C O ajuste induzido é apenas um aspecto do mecanismo da hexocinase Assim como a quimotripsina a hexocinase utiliza várias estratégias catalíticas Por exemplo os resí duos de aminoácidos do sítio ativo aqueles trazidos para a posição correta na mudança conformacional decorrente da ligação do substrato participam de catálise geral acidobá sica e da estabilização do estado de transição O mecanismo de reação da enolase requer a presença de íons metálicos Outra enzima glicolítica a enolase catalisa a desidratação reversível de 2fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato O O O P ƒ 2 O 2 C CH2 2 O 1 H2O P enolase O O ƒ C H CH2 ƒ 2 O 2Fosfoglicerato Fosfoenolpiruvato O ƒ 2 O O 2 O HO C C ƒ Essa reação é um exemplo do uso de um cofator enzimá tico neste caso um íon metálico um exemplo da função coenzima foi dado no Quadro 63 A enolase de levedura Mr 93316 é um dímero com 436 resíduos de aminoáci dos em cada subunidade A reação da enolase ilustra um tipo de catálise por íon metálico e serve de exemplo de catálise geral acidobásica e de estabilização do estado de transição A reação ocorre em duas etapas Figura 626a Primeiro a Lys 345 age como catalisador geral aci dobásico tirando um próton do C2 do 2fosfoglicerato Então o Glu 211 age como um catalisador geral acidobási co doando um próton para o grupo de saída OH O próton do C2 do fosfoglicerato não é muito ácido e por tanto não pode ser removido facilmente Entretanto no sítio ativo o 2fosfoglicerato sofre interações iônicas fortes com dois íons Mg 21 que estão ligados Figura 626b au mentando fortemente a retirada de elétrons pelo carbonil Em conjunto esses efeitos fornecem aos prótons em C2 uma acidez suficiente baixando o pKa de modo que um dos elétrons pode ser abstraído para iniciar a reação À medida que o intermediário enolato instável se forma os íons metálicos agem como um escudo que protege as duas cargas negativas nos átomos de oxigênio do carbonil que existem transitoriamente com muita proximidade entre si Ligações de hidrogênio com outros resíduos de aminoáci dos do sítio ativo também contribuem para o mecanismo como um todo As várias interações estabilizam efetiva mente tanto o intermediário enolato quanto o estado de transição que antecede a sua formação A lisozima utiliza duas reações sucessivas de deslocamento nucleofílico A lisozima é um agente antibacteriano natural encontra do em lágrimas e na clara de ovo A lisozima da clara de ovo Mr 14296 é um monômero com 129 resíduos de aminoácidos Foi a primeira enzima a ter a estrutura tridi mensional determinada por David Phillips e colegas em 1965 A estrutura revelou a existência de quatro ligações a b Glicose ADP FIGURA 625 Ajuste induzido da hexocinase a A hexocinase tem uma estrutura em forma de U PDB ID 2YHX b As extremidades aproxi mamse uma da outra em uma mudança conformacional induzida pela liga ção de Dglicose derivado de PDB ID 1HKG e PDB ID 1GLK Nelson6ed06indd 220 Nelson6ed06indd 220 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 221 dissulfeto estabilizadoras e uma fenda contendo o sítio ativo Figura 627a Mais de cinco décadas de inves tigações permitiram a obtenção de um quadro detalha do da estrutura e da atividade dessa enzima e também mostram uma história interessante de como a ciência da bioquímica progride O substrato da lisozima é um peptidoglicano carboidra to encontrado na parede de muitas bactérias ver Figura 2030 A lisozima cliva a ligação CO glicosídica b1S4 ver p 252 entre dois tipos de resíduos de açúcares pre sentes na molécula ácido Nacetilmurâmico Mur2Ac e Nacetilglicosamina GlcNAc geralmente referidos como NAM e NAG respectivamente na literatura da pesquisa em enzimologia Figura 627b Seis resíduos do peptidogli cano onde Mur2Ac e GlcNAc se alternam ligamse no sítio ativo em sítios de ligação marcados de A a F Foram feitos modelos que mostram que a cadeia lateral lactil do Mur2Ac não consegue se acomodar nos sítios C e E restringindo a ligação de Mur2Ac apenas aos sítios B D e F Somente uma das ligações glicosídicas é clivada a ligação entre o resíduo de Mur2Ac no sítio D e o resíduo de GlcNAc no sítio E Os resíduoschave de aminoácidos no sítio ativo são Glu 35 e Asp 52 Figura 628a A reação consiste em uma substitui ção nucleofílica com o OH da água substituindo a GlcNAc no C1 do Mur2Ac A identificação dos resíduos do sítio ativo e a dispo nibilidade do conhecimento da estrutura da enzima per mitiram entender as etapas do mecanismo de reação na década de 1960 Entretanto evidências definitivas de um mecanismo exato enganaram os investigadores por quase quatro décadas Dois são os mecanismos quimicamente aceitáveis que podem gerar os produtos da clivagem de ligações glicosídicas mediadas pela lisozima Phillips e seus colegas propuseram um mecanismo de dissociação do tipo SN1 Figura 628a à esquerda no qual a GlcNAc inicialmente se dissocia na etapa ➀ deixando para trás como intermediário um cátion um carbocátion glicosil Nesse mecanismo o grupo de saída GlcNAc é protonado por catálise geral ácida pelo Glu 35 localizado no bolsão hidrofóbico que dá ao seu grupo carboxílico um pKa sur preendentemente alto O carbocátion é estabilizado por ressonância envolvendo o oxigênio do anel adjacente as sim como interações eletrostáticas com a carga negativa do Asp 52 que está próximo Na etapa ➁ a água ataca o C1 do Mur2Ac liberando o produto O mecanismo alternativo Figura 628a à direita envolve duas etapas consecutivas de deslocamentos diretos do tipo SN2 Na etapa ➊ o Asp 52 ataca o C1 do Mur2Ac deslocando GlcNAc Do mesmo modo que no primeiro mecanismo o Glu 35 age como um ácido geral protonando o grupo de saída GlcNAc Na etapa ➋ a água ataca o C1 do Mur2Ac para deslocar o Asp 52 gerando o produto O mecanismo de Phillips SN1 foi amplamente aceito por mais de três décadas Entretanto certo grau de con trovérsia persistiu e os testes continuaram Algumas vezes o método científico avança lentamente sendo difícil pla nejar experimentos que mostrem uma resposta definitiva Alguns dos primeiros argumentos contra o mecanismo de Phillips eram sugestivos mas não completamente persua sivos Por exemplo a meiavida do cátion glicosil proposto era estimada em 10 12 segundos apenas um pouco maior que a vibração molecular o que não é demorado o bastante para as necessidades de difusão das outras moléculas Mais importante ainda a lisozima pertence à família de enzimas MECANISMOFIGURA 626 Reação de duas etapas catalisada pela enolase a O mecanismo pelo qual a enolase converte 2fosfoglicerato 2PGA em fosfoenolpiruvato O grupo carboxil do 2PGA é coordenado no sítio ativo por dois íons magnésio b Relações entre o substrato 2PGA com Lys 345 Glu 211 e os íons Mg 21 do sítio ativo da enolase O nitrogênio está mos trado em azul o fósforo em cor de laranja e os átomos de hidrogênio não são mostrados PDB ID 1ONE ➊ ➋ 3 O C C H C H OH H H C O HO H Lys345 Glu211 Glu211 facilita a eliminação do grupo OH por catálise ácida geral 3 O C C O C H H 3 O C C H H C H OH O H N H C O HO Enolase Lys345 Glu211 Lys345 abstrai um próton por catálise geral básica Dois íons Mg21 estabilizam o intermediário enolato resultante HOH 2Fosfoglicerato ligado à enzima Intermediário enólico Fosfoenolpiruvato a 2PGA Mg21 Mg21 Enolase b Lys345 Glu211 Nelson6ed06indd 221 Nelson6ed06indd 221 070414 1433 070414 1433 222 DAVID L NELSON MICHAEL M COX conhecidas como glicosidases de retenção Além disso todos os membros catalisam reações cujos produtos têm a mesma configuração anomérica dos substratos a configu ração anomérica dos carboidratos é examinada no Capítu lo 7 e sabese têm intermediários covalentes reativos do tipo previsto na via alternativa SN2 Desse modo o meca nismo de Phillips é antagônico aos achados experimentais de enzimas semelhantes Um experimento foi decisivo para pender a balança em favor do mecanismo via SN2 relatado por Stephen Withers e colegas em 2001 Usando uma enzima mutante com o resíduo 35 alterado de Glu para Gln e substratos ar tificiais os quais combinados reduziram a velocidade das etapaschave da reação esses pesquisadores foram capa zes de estabilizar o intermediário covalente fugaz Por sua vez isso lhes permitiu observar diretamente o intermediá rio por meio de espectrometria de massas e cristalografia por raios X Figura 628b O mecanismo da lisozima estaria provado Não Uma característicachave do método científico como certa vez Albert Einstein resumiu é que mesmo uma infinidade de experimentos talvez não consiga provar que estou certo mas um único experimento pode provar que estou errado No caso do mecanismo da lisozima podese argumentar e muitos o fizeram que os substratos artificiais com substi tuições por flúor em C1 e C2 que foram usados para es tabilizar os intermediários covalentes poderiam alterar o curso da reação O flúor altamente eletronegativo poderia desestabilizar um íon oxocarbânion elétrondeficiente já formado no cátion glicosil intermediário que ocorre na via SN1 Mesmo assim a via SN2 é reconhecida hoje como o me canismo mais compatível com os dados disponíveis a a Asp52 Glu35 Polímero peptidoglicano NAc HOH2C HOH2C A B C D CH2OH RO Ligações de hidrogênio a resíduos no sítio de ligação da enzima AcN OH O O NAc OH O O O O CH2OH RO AcN O Sítio de clivagem AcN H lisozima Mur2Ac GlcNAc C C CH2OH H2O OH O H H H H O 1 4 AcN H C C CH2OH OH H HO H OH H H O RO O CH3CHCOO NAcAcN NH CH3 C O O O E F OH NAc O O HOH2C CH2OH RO AcN O Mur2Ac Mur2Ac GlcNAc GlcNAc Mur2Ac GlcNAc O b FIGURA 627 Lisozima da clara de ovo e a reação que ela catalisa a Representação da superfície da enzima com os resíduos do sítio ativo Glu 35 e Asp 53 representados em preto na forma de bastão e o substrato ligado representado em vermelho na forma de bastão PDB 1D 1LZE b Reação catalisada pela lisozima da clara de ovo Um segmento do polímero pep tidoglicano é mostrado com os sítios de ligação de A a F sombreados A ligação hidrolisada é a ligação glicolítica CO entre os resíduos de açúcar ligados aos sítios D e E indicada pela seta vermelha A reação de hidrólise está mostrada no detalhe com o caminho do oxigênio crítico da água em vermelho Mur2Ac é o ácido Nacetilmurâmico GlcNAc Nacetilglicosamina RO representa um grupo lactil ácido láctico NAc e AcN grupos N acetil ver legenda Nelson6ed06indd 222 Nelson6ed06indd 222 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 223 ➊ ➋ Peptidoglicano ligase ao sítio ativo da lisozima Lisozima Glu35 Mur2Ac GlcNAc Mecanismo SN1 Mecanismo SN2 a O C CH2OH H H H H C H H OH HO H CH2OH H NAc Primeiro produto O C H H OH HO H CH2OH H NAc Primeiro produto O CH2OH O Glu35 Mur2Ac GlcNAc O C CH2OH H H H H Glu35 O O Intermediário glicosil carbocátion Intermediário covalente C H H H Glu35 O O C H Glu35 O O C H Glu35 O O C H Glu 35 O Glu35 Intermediário covalente ligado ao sítio ativo Lisozima H H O O O Asp52 AcN C OH H O Segundo produto C H H H H RO AcN O O O Asp52 AcN C OH H O O O Asp52 AcN O O O Asp52 AcN O O O Asp52 AcN O O O Asp 52 AcN O O O O Asp52 b Asp Fluoreto em C2 52 O Asp 52 age como catalisador covalente deslocando diretamente a GlcNAc via um mecanismo SN2 O Glu 35 protona a glcNAc facilitando sua saída O Glu 35 age como catalisador básico geral facilitando o ataque SN2 pela água deslocando o Asp 52 e gerando o produto Um rearranjo produz um carbocátion glicosil A catálise ácida geral pelo Glu 52 protona o oxigênio da GlcNAc deslocado e facilita sua saída A catálise geral básica pelo Glu 35 facilita o ataque da água sobre o carbocátion glicosil formando o produto O H O H H O H H2O H OH O H H H2O ➁ ➀ MECANISMOFIGURA 628 Reação da lisozima Nesta reação descrita no texto a água é introduzida no produto pelo C1 do Mur2Ac na mesma con figuração que a ligação glicosídica original A reação é portanto uma subs tituição molecular com retenção da configuração a Duas vias propostas que potencialmente explicam a reação total e suas propriedades A via SN1 esquerda é o mecanismo original de Phillips A via SN2 direita é o mecanis mo mais consistente com os dados atuais b Representação da superfície do sítio ativo da lisozima com o intermediário covalente enzimasubstrato mostrado como estruturas em esfera e bastão Cadeias laterais dos resíduos do sítio ativo são mostradas como estruturas em esfera e bastão protuberan tes em relação às fitas PDB ID 1H6M Nelson6ed06indd 223 Nelson6ed06indd 223 070414 1433 070414 1433 224 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O conhecimento de um mecanismo enzimático leva à produção de antibióticos úteis A penicilina foi descoberta em 1928 por Alexander Fleming mas foram necessários ainda 15 anos para que esse composto relativamente instável fosse conhecido o suficiente para poder ser utilizado como agente terapêuti co no tratamento de infecções bacterianas A penicilina in terfere com a síntese do peptidoglicano descrita no Capí tulo 20 Figura 2031 o constituinte principal da rígida parede celular que protege as bactérias da lise osmótica O peptidoglicano é formado por polissacarídeos e peptídeos ligados por ligações cruzadas formadas em várias etapas incluindo uma reação de transpeptidase Figura 629 Essa é a reação inibida pela penicilina e por compostos se melhantes Figura 630a que mimetizam uma conforma ção do segmento DAlaDAla do precursor do peptidoglica no A ligação peptídica do precursor é substituída por um anel blactâmico altamente reativo Quando a penicilina li gase à transpeptidase a Ser do sítio ativo ataca o carbonil do anel blactâmico e gera um aduto covalente entre a peni cilina e a enzima Entretanto o grupo de saída permanece unido pois está ligado ao remanescente do anel blactâmi co Figura 630b O complexo covalente inibe irreversivel mente a enzima Isso por sua vez bloqueia a síntese da pa rede bacteriana e muitas bactérias morrem porque a frágil membrana interna rompese devido à pressão osmótica O uso da penicilina e de seus derivados pelo homem le vou ao surgimento de linhagens de bactérias patogênicas que expressam blactamases Figura 631a enzimas que clivam os antibióticos blactâmicos inativandoos Des se modo a bactéria tornase resistente a esses antibióticos Os genes dessas enzimas disseminaramse rapidamente entre as populações de bactérias submetidas à pressão seletiva imposta pelo uso muitas vezes excessivo dos antibióticos blactâmicos A medicina respondeu com o desenvolvimento de compostos como o ácido clavulânico um inativador suicida que inativa irreversivelmente essas blactamases Figura 631b O ácido clavulânico mimeti za a estrutura dos antibióticos blactâmicos formando um aduto covalente com a Ser do sítio ativo da blactamase Isso leva a um rearranjo que cria um derivado muito mais reativo que depois é atacado por outro nucleófilo no sítio ativo de modo a acilar e inativar a enzima irreversivelmen te A amoxicilina e o ácido clavulânico são combinados na formulação farmacêutica amplamente usada e comercia lizada sob o nome de Calvulin O ciclo da guerra química entre humanidade e bactérias continua sem tréguas Foram encontradas linhagens de bactérias patogênicas resistentes tanto à amoxicilina quanto ao ácido clavulânico refletindo mutações na blactamase que as tornam insensíveis ao áci do clavulânico Prevêse que o desenvolvimento de novos antibióticos venha a ser uma indústria em crescimento no futuro próximo RESUMO 64 Exemplos de reações enzimáticas c A quimotripsina é uma serinoprotease com mecanismo bem conhecido caracterizado por catálise geral acido básica catálise covalente e estabilização do estado de transição H LAla DGlu H2N Gly5N LLys C NH HC CH3 O O C O Ser n LLys H LAla DGlu H2N Gly5N n 2 a cadeia de peptidoglicano DAla DAla Ligaçao cruzada entre peptidoglicanos DAla LAla DGlu n LAla DGlu n DAla Gly5LLysDAlaGly5LLys NAcetilglicosamina GlcNAc Ácido Nacetilmurâmico Mur2NAc Ser OH DAla H Ser OH LAla DGlu H2N Gly5N LLys C NH HC CH3 O NH COO 1 a cadeia de peptidoglicano C O HC CH3 n DAla DAla Transpeptidase Transpeptidase Transpeptidase FIGURA 629 A reação da transpeptidase Esta reação que liga dois peptidoglicanos precursores em um polímero maior é facilitada por uma Ser no sítio ativo por meio de um mecanismo catalítico covalente similar ao da quimotripsina Observe que esse peptidoglicano é um dos poucos casos na natureza em que aparecem Daminoácidos A Ser do sítio ativo ataca o car bonil da ligação peptídica entre dois resíduos de DAla criando uma ligação éster ligação covalente entre o substrato e a enzima e liberando o resíduo terminal DAla Um grupo amino do segundo precursor peptidoglicano en tão ataca a ligação éster deslocando a enzima e ligando transversalmente os dois precursores entre si Nelson6ed06indd 224 Nelson6ed06indd 224 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 225 Estrutura geral das penicilinas Grupos R CH2 NH2 O CH2 CH HO Amoxicilina Penicilina V Penicilina G benzilpenicilina Cadeia lateral Anel tiazolínico Anel blactâmico a b Transpeptidase alterada de forma estável inativa CH3 CH3 C H H C N H C C O R S CH COOH C N H O Ser O C C N H C H O C O R S CH3 CH3 CH COOH C N Ser OH H Penicilina Trans peptidase Trans peptidase FIGURA 630 Inibição da transpeptidase por antibióticos blactâmi cos a Antibióticos blactâmicos apresentam um anel de cinco elementos tiazolidina fusionado a um anel blactâmico de quatro elementos Esse último anel é tensionado e inclui uma porção amida com papel crucial na inativação da síntese do peptidoglicano O grupo R varia nas diferentes penicilinas A peni cilina G foi a primeira a ser isolada e permanece até hoje uma das mais eficazes Devido à degradação no ambiente ácido do estômago ela deve ser administra da por via injetável Quase tão eficaz a penicilina V é estável em meio ácido por isso pode ser administrada por via oral A amoxicilina tem ampla faixa de ação e apresenta rápida absorção quando administrada por via oral sendo por isso o antibiótico blactâmico mais amplamente prescrito b Ataque da porção ami da do anel blactâmico pela Ser do sítio ativo da transpeptidase a um produto acilenzima covalente que é hidrolisado tão lentamente que a formação do aduto é quase irreversível e consequentemente a transpeptidase é inativada C C N H C H O C O R S CH3 CH3 CH COOH C N H2O Ser OH CH3 CH3 C H H C N H C C O R S CH COOH C N H O 2O Penicilina inativa CH3 CH3 C H H C N H C C O R S CH COOH C N H O Ser O Penicilina a bLactamase bLactamase bLactamase H2C C C O O CH2OH H CH COOH C C N H Ácido clavulânico H2C C C O CH2OH H CH COOH C C N H H1 OH Ser C C H C H Nu O CH2OH H CH COOH C N O O C O H H C H H1 O Ser C O CH COOH C CH CH2OH H CH HN b O Ser bLactamase inativa bLactamase bLactamase bLactamase FIGURA 631 bLactamases e inibição de blactamases a As blactamases promovem a clivagem do anel blactâmico dos antibióticos blactâmicos inativandoos b O ácido clavulânico é um inibidor suicida que usa o mecanismo químico normal das blactamases para formar uma espécie reativa no sítio ativo Esta espécie reativa é atacada por um grupo nucleofílico Nu no sítio ativo que acila irreversivelmente a enzima Nelson6ed06indd 225 Nelson6ed06indd 225 070414 1433 070414 1433 226 DAVID L NELSON MICHAEL M COX c A hexocinase é um exemplo excelente de ajuste induzi do como meio de usar a energia de ligação do substrato c A reação da enolase ocorre via catálise por íon metálico c A lisozima utiliza catálise covalente e catálise geral aci dobásica para promover duas reações sucessivas de des locamento nucleofílico c O conhecimento do mecanismo de ação das enzimas permite desenvolver medicamentos que inibam a ativi dade de enzimas 65 Enzimas regulatórias No metabolismo celular grupos de enzimas trabalham con juntamente em vias sequenciais para realizar um determi nado processo metabólico como a degradação da glicose a lactato por uma série de reações ou as muitas reações da síntese de aminoácidos a partir de precursores simples Nesses sistemas enzimáticos o produto da reação de uma enzima é o substrato da enzima seguinte A maioria das enzimas das vias metabólicas segue os padrões cinéticos que foram descritos Cada via entretan to inclui uma ou mais enzimas que influenciam em muito a velocidade de toda a sequência de reações Essas enzimas regulatórias têm a atividade catalítica aumentada ou dimi nuída em resposta a certos sinais Ajustes na velocidade das reações catalisadas por enzimas regulatórias e portanto ajustes na velocidade da sequência metabólica inteira per mitem que as células atendam às necessidades de energia e das biomoléculas de que precisam para crescer e se manter As atividades das enzimas regulatórias são moduladas de várias maneiras Enzimas alostéricas agem por meio de ligações reversíveis e não covalentes com compostos regulatórios denominados moduladores alostéricos ou efetores alostéricos que geralmente são metabólitos pequenos ou cofatores Outras enzimas são reguladas por modificações covalentes reversíveis As duas classes de enzimas regulatórias tendem a ser proteínas com subunida des múltiplas e em alguns casos os sítios regulatórios e o sítio ativo se encontram em subunidades separadas Os sistemas metabólicos têm ao menos dois outros mecanismos de regulação enzimática Algumas enzimas são estimuladas ou inibidas quando estão ligadas a proteínas regulatórias distintas Outras são ativadas quando segmentos peptídicos são removidos por proteólise Diferentemente da regula ção mediada por efetores a regulação por proteólise é ir reversível Exemplos importantes desses mecanismos são encontrados em processos fisiológicos como digestão coa gulação do sangue ação hormonal e visão O crescimento e a sobrevivência das células dependem do uso eficiente dos recursos disponíveis e essa eficiência é possibilitada pelas enzimas regulatórias Não há uma regra única para governar os diferentes tipos de regulação dos diferen tes sistemas Em certo grau a regulação alostérica não covalente talvez possibi lite os ajustes finos das vias metabólicas que constantemente são necessários e em níveis variando em decorrência das mu danças da atividade e das condições das células A regulação por modificações co valentes pode ser do tipo tudo ou nada normalmente no caso de proteólise ou então possibilitar mudanças sutis na atividade Vários tipos de regulação podem ocorrer em uma única enzima regulatória O restante deste capítulo dedica se à discussão desses métodos de regulação enzimática Enzimas alostéricas sofrem mudanças conformacionais em resposta à ligação de moduladores Como foi visto no Capítulo 5 proteínas alostéricas são aque las que possuem outras formas ou conformações induzidas pela ligação de moduladores O mesmo conceito se aplica a certas enzimas regulatórias pois mudanças conformacio nais induzidas por um ou mais moduladores interconvertem formas mais ativas e formas menos ativas da enzima Modu ladores de enzimas alostéricas podem ser inibitórios ou esti mulatórios Muitas vezes o modulador é o próprio substrato Enzimas regulatórias em que o substrato e o modulador são idênticos são denominadas homotrópicas O efeito é similar ao da ligação de O2 à hemoglobina Capítulo 5 No caso das enzimas a ligação do ligante ou do substrato provoca mu danças na conformação que afetam a atividade subsequente de outros sítios da proteína Em muitos casos as mudanças conformacionais convertem uma conformação relativamen te inativa geralmente denominada de estado T em uma conformação mais ativa estado R Quando o modulador é uma molécula diferente do substrato dizse que a enzima é heterotrópica Observe que os moduladores alostéricos não se confundem com os inibidores incompetitivos ou mistos Embora os últimos se liguem a um segundo sítio da enzima necessariamente não são mediadores de mudanças confor macionais entre formas ativas e inativas de modo que os efeitos cinéticos são distintos As propriedades das enzimas alostéricas são significati vamente diferentes das propriedades das enzimas não re gulatórias Parte das diferenças é estrutural Além do sítio ativo as enzimas alostéricas em geral têm um ou mais sítios regulatórios ou alostéricos para ligarem o modulador Fi gura 632 Da mesma maneira que o sítio ativo das enzi mas é específico para o seu substrato cada sítio regulatório é específico para o seu modulador Enzimas com vários mo duladores em geral têm sítios de ligação específicos para cada um deles Nas enzimas homotrópicas o sítio ativo e o sítio regulatório são os mesmos As enzimas alostéricas geralmente são maiores que as enzimas não alostéricas possuindo duas ou mais subunida des Um exemplo clássico é a aspartatotranscarbamoilase geralmente abreviada como ATCase que catalisa uma reação inicial na biossíntese dos nucleotídeos de pirimidi na a reação entre carbamoilfosfato e aspartato formando carbamoilaspartato Aspartato NCarbamoilaspartato CH2 C H COO2 COO2 H3N 1 O O C C CH N H COO2 2O H2N CH2 Pi 1 Carbamoil fosfato H2N O C O O2 O2 O P Aspartato transcarbamoilase Nelson6ed06indd 226 Nelson6ed06indd 226 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 227 A ATCase tem 12 cadeias polipeptídicas organizadas em 6 subunidades catalíticas organizadas como 2 complexos triméricos e 6 subunidades regulatórias organizadas como 3 complexos diméricos A Figura 633 mostra a estrutu ra quaternária dessa enzima deduzida da análise por raios X A enzima exibe comportamento alostérico detalhado a seguir à medida que as subunidades catalíticas funcionam cooperativamente As subunidades regulatórias têm sítios de ligação para ATP e CTP que funcionam como regula dores positivo e negativo respectivamente CTP é um dos produtos finais da via e a regulação negativa por CTP serve para limitar a ação da ATCase em condições nas quais CTP é abundante Por outro lado altas concentrações de ATP indicam que o metabolismo celular está robusto a célula está crescendo e uma quantidade adicional de nucleotídeos da pirimidina é necessária para apoiar a transcrição do RNA e replicação do DNA As propriedades cinéticas das enzimas alostéricas desviamse do comportamento de MichaelisMenten As enzimas alostéricas apresentam relações entre V0 e S diferentes daquelas da cinética de MichaelisMenten Elas apresentam saturação pelo substrato quando S é suficien temente alta mas algumas das enzimas alostéricas apresen tam um gráfico de V0 versus S Figura 634 que produz uma curva de saturação sigmoide em vez da curva de satu ração hiperbólica típica das enzimas não regulatórias Na curva de saturação sigmoide verificase um valor de S no qual V0 é metade da Vmáx mas que não é designado como Km pois a enzima não segue uma relação de Michaelis Menten hiperbólica Os símbolos S05 e K05 geralmente são usados para representar a concentração de substrato que dá uma velocidade que é metade da máxima das enzimas alostéricas Figura 634 O comportamento da cinética sigmoide em geral refle te interações cooperativas entre as subunidades protei cas Em outras palavras mudanças na estrutura de uma subunidade são convertidas em mudanças estruturais nas subunidades adjacentes efeito mediado por interações não covalentes na interface das subunidades Os princí pios que regem esse fenômeno são bem ilustrados em uma proteína que não é enzima a ligação do O2 à hemoglobina O comportamento de cinética sigmoide é explicado por modelos de interações sequenciais concatenadas entre as subunidades ver Figura 515 C R C R 1 S M M 2 M Enzima menos ativa M Modulador positivo S Substrato Enzima mais ativa C R S M Complexo enzimasubstrato ativo FIGURA 632 Interações entre as subunidades de enzimas alostéri cas e interações com inibidores e ativadores Em muitas enzimas alos téricas o sítio de ligação ao substrato e os sítios de ligaçãoões com o modulador estão em subunidades diferentes nas subunidades catalítica C e regulatória R respectivamente A ligação de um modulador M positivo estimulatório ao sítio específico na subunidade regulatória é comunicada à subunidade catalítica por meio de uma mudança conformacional Essa mu dança afeta a o sítio ativo que então é capaz de ligar o substrato S com afi nidade maior Quando o modulador dissociase da subunidade regulatória a enzima volta a sua forma inativa ou menos ativa a Estado inativo T b Estado ativo R CTP CTP 6 CTP 6 CTP FIGURA 633 A enzima regulatória aspartatotranscarbamoilase Es tão mostrados os estados a inativo T PDB ID 1RAB e b ativo R PDB ID 1F1B da enzima Esta enzima de regulação alostérica tem dois agrupamen tos catalíticos volumosos cada um com três cadeias polipeptídicas som breadas em azul e roxo e três agrupamentos regulatórios cada um com duas cadeias regulatórias bege e amarelo Os agrupamentos regulatórios formam os pontos de um triângulo não evidente nesta imagem rodeado pelas subunidades catalíticas Os sítios de ligação para os moduladores alos téricos incluindo CTP estão nas subunidades regulatórias A ligação com o modulador provoca grandes mudanças na conformação e na atividade da enzima O papel desta enzima na síntese de nucleotídeos e também deta lhes da sua regulação são discutidos no Capítulo 22 Nelson6ed06indd 227 Nelson6ed06indd 227 070414 1433 070414 1433 228 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A ATCase ilustra perfeitamente bem tanto o compor tamento da cinética homotrópica quanto da cinética hete rotrópica A ligação dos substratos aspartato e carbamoil fosfato à enzima leva gradualmente à transição do estado T relativamente inativo ao estado mais ativo R Isso é respon sável pela mudança sigmoidal e não hiperbólica em V0 com o aumento de S Uma característica da cinética sigmoide é a de que pequenas mudanças na concentração do modula dor podem levar a grandes mudanças na atividade A Figura 634a mostra como um aumento relativamente pequeno em S na fase de aclive da curva provoca um aumento compa rativamente grande em V0 A regulação heterotrópica da ATCase é devido à intera ção com ATP e CTP No caso de enzimas alostéricas hete rotrópicas um ativador pode fazer a curva se tornar mais próxima de uma hipérbole com diminuição no K05 mas sem mudança na Vmáx resultando em aumento na veloci dade de reação em uma concentração de substrato fixa No caso da ATCase a interação com ATP provoca isso e a enzima mostra uma curva V0 versus S característica do estado ativo R em concentrações suficientemente altas de ATP V0 é maior para qualquer valor de S Figura 634b Um modulador negativo inibidor produz uma curva de saturação pelo substrato muito mais sigmoidal com um aumento de K05 como é ilustrado pelos efeitos do CTP sobre a cinética da ATCase ver curvas do modulador ne gativo Figura 634b Outras enzimas alostéricas hetero trópicas respondem a um ativador aumentando a Vmáx com pequena mudança em K05 Figura 634c Portanto en zimas alostéricas heterotrópicas mostram diferentes tipos de respostas nas curvas atividadesubstrato pois algumas têm moduladores inibidores enquanto outras têm modu ladores ativadores e ainda outras como a ATCase têm os dois tipos de moduladores Algumas enzimas são reguladas por modificações covalentes reversíveis Em outra classe de enzimas regulatórias a atividade é mo dulada por modificações covalentes em um ou mais dos re síduos de aminoácidos da molécula da enzima Mais de 500 tipos diferentes de modificações covalentes foram encon trados nas proteínas Geralmente os grupos modificadores incluem fosforil acetil adenilil uridilil metil amida car boxil miristoíl palmitoíl prenil hidroxila sulfato e ribosi ladenosinadifosfato Figura 635 Existem até proteínas inteiras que são usadas como grupo modificador especial incluindo a ubiquitina e a sumo Esses diversos grupos ge ralmente são ligados e removidos às enzimas regulatórias por enzimas distintas A modificação de um resíduo de ami noácido de uma enzima faz efetivamente um novo resíduo de aminoácido com propriedades diferentes ser introduzido na enzima A introdução de uma carga pode alterar as pro priedades locais da enzima e introduzir uma mudança na conformação A introdução de um grupo hidrofóbico pode desencadear uma associação com uma membrana Normal mente essas mudanças são substanciais e podem ser críti cas para a função da enzima assim alterada A variedade de modificações nas enzimas é muito gran de para ser abordada em detalhes mas alguns exemplos po Estado pouco ativo T V0 m min S m V0 m min S m V0 m min S m K05 a K05 K05 K05 b Vmáx Vmáx Vmáx Vmáx Vmáx c K05 Estado altamente ativo R 1 Vmáx 2 1 Vmáx 2 1 Vmáx 2 FIGURA 634 Curvas de substratoatividade de enzimas alosté ricas representativas Três exemplos das respostas complexas das enzimas alostéricas aos seus moduladores a Curva sigmoide de uma enzima homotrópica na qual o substrato atua também como modulador positivo estimulatório ou ativador Observe a semelhança com a cur va de saturação com oxigênio da hemoglobina ver Figura 512 A curva sigmoide é uma curva híbrida na qual a enzima está presente primor dialmente no estado relativamente inativo T em baixa concentração de substrato e principalmente no estado mais ativo R em alta concentração de substrato As curvas dos estados puros T e R estão colocadas separa damente e coloridas b Efeitos de diferentes concentrações de um mo dulador positivo 1 e de um modulador negativo sobre uma enzima alostérica na qual há alteração de K05 sem haver alteração de Vmáx A curva central mostra a relação substratoatividade na ausência de modulador No caso da ATCase CTP é um modulador negativo e ATP modulador po sitivo c Tipo menos comum de modulação na qual Vmáx é alterada e K05 permanece praticamente constante Nelson6ed06indd 228 Nelson6ed06indd 228 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 229 dem ser citados Um exemplo de enzima regulada por me tilação é a proteína aceptora de metilas da quimiotaxia de bactérias Essa proteína é parte de um sistema que permite às bactérias nadarem na direção de um atraente como um açúcar ou se afastarem de um repelente químico O agen te metilante é a Sadenosilmetionina adoMet ver Figura 1818 A acetilação é uma modificação comum em apro ximadamente 80 das enzimas solúveis dos procariotos incluindo acetilação no aminoterminal A ubiquitina é adi cionada a proteínas como uma etiqueta que as marca para a degradação proteolítica ver Figura 2747 A ubiquitinação também pode ter uma função regulatória A proteína sumo é encontrada ligada a muitas proteínas nucleares de euca riotos com papéis na regulação da transcrição na estrutura da cromatina e no reparo do DNA A ADPribosilação é uma reação muito interessante que ocorre em certas proteínas A ADPribose é derivada da nicotinamidaadeninadinucleotídeo NAD ver Figura 838 Esse tipo de modificação ocorre na enzima bacteria na dinitrogenaseredutase e resulta na regulação da fixação biológica de nitrogênio um processo muito importante A toxina diftérica e a toxina do cólera são enzimas que ca talisam a ADPribosilação e a inativação de enzimas ou proteínas celulares importantes A fosforilação é provavelmente o tipo de modificação regulatória mais importante Estimase que um terço de to das as proteínas de uma célula eucariótica seja fosforilado de modo que um ou mais frequentemente vários eventos de fosforilação são parte de quase todos os processos regu latórios Algumas proteínas têm apenas um resíduo fosfori lado outras têm vários e poucas têm dezenas de sítios de fosforilação Esse modo de modificação covalente é funda mental em várias rotas regulatórias e portanto será discu tido aqui em detalhes e também no Capítulo 12 Todos esses tipos de modificações serão encontrados novamente em capítulos posteriores Os grupos fosforil afetam a estrutura e a atividade catalítica das enzimas A ligação de grupos fosforil a resíduos de aminoácidos es pecíficos de proteínas é catalisada por proteínascinases Nessas reações o grupo gfosforil provindo de um nucleo tídeo trifosfato geralmente ATP é transferido para um determinado resíduo de Ser Thr ou Tyr ocasionalmente também His da proteínaalvo Isso introduz um grupo car regado volumoso em uma região da proteína que é apenas moderadamente polar Os átomos de oxigênio do grupo fosforil podem formar ligações de hidrogênio com um ou mais grupos da proteína normalmente grupos amida do es queleto peptídico no começo de hélices a ou com o grupo guanidino carregado dos resíduos de Arg As duas cargas negativas de uma cadeia lateral fosforilada também podem repelir resíduos carregados negativamente Asp ou Glu das redondezas Quando a modificação da cadeia lateral se loca liza em uma região da enzima que seja crítica para estrutu ra tridimensional da enzima a fosforilação pode ter efeitos drásticos sobre a conformação e portanto sobre a ligação com o substrato e a catálise A remoção dos grupos fosforil dessas proteínas é catalisada por proteínafosfatases Metilação Glu Modificações covalentes Resíduosalvo O AcetilCoA HSCoA CCH3 Lys aamino aminoterminal Acetilação O MiristoilCoA HSCoA CCH212CH3 aamino aminoterminal Miristoilação Ubiquitinação Lys Arg Gln Cys diftamida uma His modificada ADPribosilação NAD nicotinamida H O P O H H H H OH O ƒ ƒ ƒ O2 O O P O ƒ O2 O CH2 H2C H OH H H H OH O Adenina Sadenosil homocisteína CH3 Sadenosil metionina HS N H O C U E2 HS E2 Ubiquitina ativada O U ativação CSE2 Ubiquitina ativada O U CSE2 U C O O Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Adenilação Tyr H ATP ƒ PPi P CH2 O O2 O O H H H Adenina H OH O O ATP ƒ ADP PO2 O2 Tyr Ser Thr His Fosforilação 2 FIGURA 635 Algumas reações de modificações em enzimas Nelson6ed06indd 229 Nelson6ed06indd 229 070414 1433 070414 1433 230 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Um exemplo importante de enzima regulada por fosfo rilação é constituído pela glicogêniofosforilase Mr 94500 do músculo e do fígado Capítulo 15 que catalisa a reação Glicosen Glicogênio 1 Pi glicosen1 Cadeia de glicogênio encurtada 1 glicose1fosfato A glicose1fosfato assim formada pode ser usada para a síntese de ATP no músculo ou ser convertida em glicose li vre no fígado Observe que a glicogêniofosforilase embora adicione um fosfato a um substrato ela mesma não é uma cinase porque não utiliza ATP ou qualquer outro nucleotí deo trifosfato como doador de fosfato na reação que cata lisa Entretanto ela é o substrato de uma proteínacinase que a fosforila Os grupos fosforil envolvidos na discussão abaixo são aqueles envolvidos na regulação da enzima e não na função catalítica A glicogêniofosforilase ocorre em duas formas a fosfo rilase a mais ativa e a fosforilase b menos ativa Figura 636 A fosforilase a tem duas subunidades cada uma com um resíduo específico de Ser que é fosforilado no grupo hidroxila Esses resíduos de serinafosfato são necessários para a atividade máxima da enzima Os grupos fosforil po dem ser removidos hidroliticamente por uma enzima distin ta denominada fosforilasefosfatase Fosforilase a mais ativa 1 2H2O Fosforilase b menos ativa 1 2Pi Nessa reação a fosforilase a é convertida em fosforilase b pela remoção de dois fosfatos covalentemente ligados a se rinas uma em cada subunidade da glicogêniofosforilase Por sua vez a fosforilase b pode ser reativada sendo mais uma vez transformada covalentemente na fosforilase a ativa por uma outra enzima a fosforilasecinase que catalisa a transferência de grupos fosforil do ATP para grupos hidroxila de dois resíduos de Ser específicos na fosforilase b 2ATP 1 fosforilase b menos ativa 2ADP 1 fosforilase a mais ativa A degradação do glicogênio no músculo esquelético e no fígado é regulada por variações na proporção entre as duas formas de glicogêniofosforilase As formas a e b diferem quanto às suas estruturas secundárias terciárias e quater nárias e consequentemente a atividade catalítica muda à medida que as duas formas se interconvertem A regulação da glicogêniofosforilase por fosforilação ilustra o efeito da adição de um grupo fosforil tanto na es trutura quanto na atividade catalítica No estado desfosfo rilado cada subunidade dessa enzima é dobrada de modo a colocar os 20 resíduos da extremidade aminoterminal in cluindo certo número de resíduos básicos em uma região contendo vários aminoácidos ácidos Isso produz uma in teração eletrostática que estabiliza a conformação A fos forilação da Ser 14 interfere com essa interação forçando o domínio aminoterminal para fora do ambiente ácido e para uma conformação que permite interações entre Ser e várias cadeias laterais de Arg sendo que a enzima é muito mais ativa nessa conformação A fosforilação de uma enzima pode afetar a catálise de outra maneira alterando a afinidade pelo substrato Por exemplo quando a isocitratodesidrogenase enzima do ci clo do ácido cítrico Capítulo 16 é fosforilada a repulsão eletrostática pelo grupo fosforil inibe a ligação do citrato ácido tricarboxílico no sítio ativo Fosforilações múltiplas possibilitam um controle requintado da regulação Os resíduos de Ser Thr ou Tyr geralmente fosforilados nas proteínas reguladas ocorrem em motivos estruturais comuns chamados de sequências de consenso reconheci dos por proteínascinases específicas Tabela 610 Algu mas cinases são basófilas preferindo fosforilar resíduos que têm vizinhança básica e outras têm preferências diferentes pelos substratos como um resíduo próximo a um resíduo de Pro Entretanto a sequência de aminoácidos não é o úni co fator importante que influencia o quanto determinado resíduo será fosforilado O enovelamento da proteína apro xima resíduos distantes na sequência primária e a estru tura tridimensional resultante pode estabelecer o quanto uma proteínacinase terá acesso a determinado resíduo e reconhecêlo como substrato Outro fator que influencia a especificidade de certas proteínascinases pelo substrato é a proximidade com outros resíduos fosforilados Geralmente a regulação por fosforilação é complexa Algumas proteínas possuem sequências de consenso reco nhecidas por proteínascinases diferentes cada uma delas fosforilando a proteína e alterando a atividade enzimática Em alguns casos a fosforilação é hierárquica certos resí duos podem ser fosforilados apenas se um resíduo vizinho já estiver fosforilado Por exemplo a glicogêniosintase a enzima que catalisa a condensação de monômeros de gli cose para formar glicogênio Capítulo 15 é inativada por fosforilação de resíduos de Ser específicos e também é mo P P 2ATP 2ADP Fosforilase b Fosforilase a Fosforilase fosfatase Fosforilase cinase 2Pi 2H2O OH OH FIGURA 636 Regulação da atividade da glicogêniofosforilase muscular por fosforilação Na forma mais ativa da enzima fosforilase a resíduos específicos de Ser um em cada subunidade estão fosforilados A fosforilase a é convertida na fosforilase b forma menos ativa pela perda en zimática desses grupos fosforil efetuada pela fosfoproteínafosfatase 1 PP1 A fosforilase b pode ser reconvertida reativada em fosforilase a pela ação da fosforilasecinase Nelson6ed06indd 230 Nelson6ed06indd 230 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 231 dulada por ao menos quatro outras proteínascinases que fosforilam quatro outros sítios na enzima Figura 637 A enzima não é substrato para a glicogêniosintasecinase 3 por exemplo a menos que um sítio tiver sido fosforilado pela caseínacinase II Algumas fosforilações inibem a glico gêniosintase mais que outras e algumas combinações de fosforilações são cumulativas Essas múltiplas fosforilações regulatórias fornecem o potencial para a modulação extre mamente sutil da atividade enzimática Para servir como mecanismo regulatório efetivo a fos forilação deve ser reversível Em geral grupos fosforil são adicionados e removidos por enzimas diferentes e desse modo o processo pode ser regulado separadamente As células contêm uma família de fosfoproteínafosfatases que hidrolisam ésteres de Ser Thr e Tyr liberando Pi As fosfoproteínafosfatases vistas até agora agem apenas sobre um grupo de fosfoproteínas e apresentam menor es pecificidade pelo substrato que as proteínascinases Algumas enzimas e outras proteínas são reguladas pela proteólise de precursores de enzimas No caso de algumas enzimas um precursor inativo deno minado zimogênio é hidrolisado formando a enzima ativa Muitas das enzimas proteolíticas proteases do estômago e do pâncreas são reguladas dessa maneira A quimotripsina e a tripsina são inicialmente sintetizadas como quimotrip sinogênio e tripsinogênio Figura 638 Clivagens espe cíficas provocam mudanças conformacionais que expõem o sítio ativo da enzima Como esse tipo de ativação é irre versível são necessários outros mecanismos para inativar essas enzimas As proteases são inibidas por proteínas inibidoras que se ligam firmemente aos seus sítios ativos Por exemplo o inibidor da tripsina pancreática Mr 6000 ligase à tripsina e a inibe A a1antiproteinase Mr 53000 inibe principalmente a elastase de neutrófilos neutrófilos são um tipo de leucócitos ou glóbulos brancos do sangue a elastase é uma protease que age sobre a elastina um com ponente de alguns tecidos conectivos A insuficiência de a1antiproteinase que pode ser uma das consequências do hábito de fumar tem sido associada com dano pulmonar incluindo o enfisema As proteases não são as únicas proteínas ativadas por proteólise Em outros casos entretanto os precursores não são chamados de zimogênios mas de maneira mais geral são denominados próproteínas ou próenzimas confor me for o caso Por exemplo o colágeno proteína do tecido conectivo é inicialmente sintetizado como precursor so TABELA 610 Sequências de consenso das proteínascinases Proteínacinase Sequência de consenso e resíduos fosforilados Proteínacinase A xRRKxSTB Proteínacinase G xRRKxSTx Proteínacinase C RK2xSTBRK2 Proteínacinase B xRxSTxK Ca 21calmodulinacinase I BxRx2STx3B Ca 21calmodulinacinase II BxRKx2STx2 Cinase da cadeia leve da miosina músculo liso K2Rx2SxB2 Fosforilasebcinase KRKQISVR Cinase regulada por sinal extracelular ERK PxSTP2 Proteínacinase dependente de ciclina cdc2 xSTPxKR Caseínacinase I SpTpx2STB Caseínacinase II xSTx2EDx Cinase do receptor badrenérgico DEnSTx3 Rodopsinacinase x2STEn Cinase do receptor de insulina xE3YM4K2SRGDYMTMQI GK3LPATGDYMNMSPVGD Cinase do receptor do fator de crescimento do epitélio EGF E4YFELV Fontes Pinna LA Ruzzene MH 1996 How do protein kinases recognize their substrates Biochim Biophys Acta 1314 191225 Kemp BE Pearson RB 1990 Protein kinase recognition sequence motifs Trends Biochem Sci 15 342346 Kennelly PJ Krebs EG 1991 Consensus sequences as substrate specificity determinants for protein kinases and protein phosphatases J Biol Chem 266 1555515558 Nota Estão mostradas as sequências de consenso deduzidas em caracteres normais e as sequências verdadeiras obtidas de substratos já conhecidos em itálico Os resíduos de Ser S Thr T ou Tyr Y que sofrem fosforilação estão em vermelho Todos os resíduos de aminoácidos estão mostrados segundo o código de abreviação de uma letra ver Tabela 31 3 representa qualquer aminoácido B qualquer aminoácido hidrofóbico Sp Tp e Yp são resíduos de Ser Thr e Tyr que já devem estar fosforilados para que a cinase reconheça o sítio O melhor sítioalvo tem dois resíduos de aminoácidos separando os resíduosalvo fosforilados de SerThr sítiosalvo separados por um ou três resíduos funcionam em nível reduzido Nelson6ed06indd 231 Nelson6ed06indd 231 070414 1433 070414 1433 232 DAVID L NELSON MICHAEL M COX lúvel o prócolágeno A coagulação do sangue é mediada por uma cascata complicada de ativações proteolíticas A fibrina a proteína do coágulo sanguíneo é produzida por proteólise do fibrinogênio a próproteína inativa A prote ase responsável por essa ativação é a trombina em muitos aspectos semelhante à quimotripsina a qual por sua vez é produzida por proteólise de uma próproteína nesse caso um zimogênio a protrombina Uma cascata de zimogênios ativados proteoliticamente leva à coagulação do sangue O coágulo sanguíneo é um agregado de fragmentos celu lares denominados plaquetas em ligações cruzadas e esta bilizado por fibras proteináceas formadas principalmente por fibrina Figura 639a A fibrina é derivada de um zimogênio denominado de fibrinogênio Depois das albu minas e globulinas o fibrinogênio geralmente é o terceiro tipo de proteína mais abundante no plasma sanguíneo A formação do coágulo sanguíneo é um exemplo bem estu dado de cascata regulatória mecanismo que proporcio na respostas muito sensíveis a e amplificação de um sinal molecular Essas vias também têm vários outros tipos de regulação Nas cascatas regulatórias um sinal leva à ativação de uma proteína X A proteína X catalisa a ativação da pro teína Y A proteína Y catalisa a ativação da proteína Z e assim por diante Uma vez que as proteínas X Y e Z são catalisadores e ativam muitas cópias da proteína seguinte na cascata o sinal é amplificado em cada etapa Em alguns casos a etapa de ativação envolve a clivagem proteolítica e portanto a etapa é efetivamente irreversível Em outros casos a ativação é por uma etapa de modificação como fos forilação facilmente reversível As cascatas regulatórias governam uma grande variedade de processos biológicos incluindo a determinação do destino das células durante o desenvolvimento a detecção da luz pelos bastonetes da retina a morte celular programada apoptose e a coagu lação sanguínea Cinase Grau de inativação da síntese Proteínacinase G Proteínacinase A Fosforilase b cinase Ca21calmodulina cinase Proteínacinase C Glicogêniosintase cinase 3 Glicogêniosintase cinase 4 Caseínacinase II Caseínacinase I 1A 1A 1B 2 4 1A 1B 2 2 1B 2 3A 3B 3C 2 5 Pelo menos nove 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 H 3N 1 A B C 3 4 5 1 COO 2 2 B A Sítios de fosforilação na glicogênio sintase Sítios de fosforilação FIGURA 637 Múltiplas fosforilações regulatórias A enzima glicogê niosintase tem pelo menos nove sítios separados localizados em cinco re giões suscetíveis à fosforilação por uma das proteínascinases celulares Por tanto a regulação dessa enzima não é binária ligadesliga mas é modulada finamente com uma grande amplitude em resposta a uma gama de sinais FIGURA 638 Ativação de zimogênios por clivagem proteolítica A figura mostra a formação de quimotripsina e tripsina a partir dos seus zi mogênios quimotripsinogênio e tripsinogênio As barras representam as sequências de aminoácidos das cadeias polipeptídicas com os números in dicando as posições relativas dos resíduos o resíduo de aminoácido amino terminal recebe o número 1 Os resíduos nas extremidades dos fragmentos polipeptídicos gerados pela proteólise estão indicados nas barras Observe que na forma ativa final alguns resíduos estão faltando Lembre que as três cadeias polipeptídicas A B e C da quimotripsina estão unidas por ligações dissulfeto ver Figura 619 Quimotripsinogênio inativo Tripsinogênio inativo tripsina enteropeptidase 245 Tripsina ativa pQuimotripsina ativa 245 229 1 7 1 1 Ile Arg Ile 15 16 pquimotripsina Ser14Arg15 1 Thr147Asn148 aQuimotripsina ativa 245 Leu Ile 13 16 1 149 146 Ala Tyr A C B LysIle Val1Asp4Lys6 6 7 229 autólise Nelson6ed06indd 232 Nelson6ed06indd 232 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 233 O fibrinogênio é um dímero de heterotrímeros a2b2g2 com três tipos diferentes mas evolutivamente relacionados de subunidades Figura 639b O fibrinogênio é converti do em fibrina e desse modo ativado para coagular o sangue pela remoção proteolítica dos 16 resíduos de aminoácidos das extremidades Nterminais de cada uma das cadeias a e dos 14 resíduos das extremidades Nterminais de cada ca deia b A remoção do peptídeo é catalisada pela trombina A nova extremidade Nterminal exposta das subunidades a e b se encaixa perfeitamente nos sítios de ligação das porções globulares das extremidades carboxiterminais das subunida des g e b respectivamente As interações são estabilizadas por ligações cruzadas geradas pela condensação de determi nados resíduos de Lys de uma subunidade com resíduos de Gln de outra subunidade catalisada por uma transglutamina se o fator XIIIa A fibra com ligações cruzadas resultante a fibrina ajuda a manter o coágulo firme A ativação do fibrinogênio produzindo fibrina é o ponto final de não apenas uma mas de duas cascatas re gulatórias interligadas Figura 640 Uma delas é cha mada de via de ativação por contato contato referese à interação de componenteschave desse sistema com fosfolipídeos aniônicos presentes na superfície de pla quetas no local da ferida Uma vez que todos os compo nentes dessa via estão presentes no plasma sanguíneo ela é também chamada de via intrínseca A segunda via é a via tecidual ou via extrínseca Um dos componentes principais dessa via a proteína fator tissular TF não está presente na corrente sanguínea A maioria dos fato res proteicos de ambas as vias são designados por núme ros romanos Muitos desses fatores são serinoproteases semelhantes à quimotripsina com os zimogênios precur sores sintetizados no fígado e exportados para o sangue Outros fatores são proteínas regulatórias que se ligam às serinoproteases e ajudam a ativálas A coagulação do sangue inicia com a ativação de pla quetas fragmentos celulares especializados sem núcleo circulantes no local da lesão Devido ao dano tecidual as moléculas de colágeno presentes abaixo da camada de cé lulas epiteliais que reveste cada vaso sanguíneo tornamse expostas ao sangue A ativação das plaquetas é principal mente desencadeada por interação com esse colágeno A ativação leva à apresentação de fosfolipídeos aniônicos na superfície das plaquetas e à liberação de moléculas sinali zadoras como as tromboxanas p 371 que ajudam a es timular a ativação de mais plaquetas As plaquetas ativadas agregamse no local da lesão formando um coágulo frouxo A estabilização do coágulo agora necessita da fibrina gerada pela cascata da coagulação b nó b nó b b b a a g g nó a nó a ligações cruzadas da fibrina a FIGURA 639 O papel da fibrina na coagulação sanguínea a O coá gulo de sangue consiste em um agregado de plaquetas células pequenas e coloridas mantidas coesas por moléculas de fibrina ligadas entre si por liga ções cruzadas Os eritrócitos vermelho são também aprisionados na matriz b O fibrinogênio uma proteína solúvel do plasma sanguíneo consiste em dois complexos de subunidades a b e g a2b2g2 A remoção do peptídeo aminoterminal das subunidades a e b não mostrado leva à formação de um complexo altamente organizado e com ligações cruzadas covalentes o que resulta na formação de fibras de fibrina Os nós são domínios globulares nas extremidades resultantes da proteólise das subunidades Via extrínseca VIII VIIIa V Va Fibrinogênio Monômero de fibrina Ca2 lesão vascular Trombina Trombomodulina Trombomodulina TFPI ATIII ATIII Proteína C C Proteína S S VIIa TF VII XIIIa XIII X Xa Protrombina Trombina Trombina Trombina Polímero de fibrina Polímero de fibrina com ligações cruzadas Via intrínseca XIa Ca2 Ca2 ATIII IX XI IXa ATIII FIGURA 640 A cascata da coagulação As interações cruzadas entre as vias intrínseca e extrínseca levam à clivagem do fibrinogênio levando à for mação de trombina ativa como mostrado As serinoproteases ativas estão mostradas em azul As setas verdes indicam etapas de ativação e as setas vermelhas indicam processos inibitórios Nelson6ed06indd 233 Nelson6ed06indd 233 070414 1433 070414 1433 234 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O papel da via extrínseca é o que vem antes A lesão do tecido expõe o plasma sanguíneo ao TF embebido gran demente nas membranas de fibroblastos e células do mús culo liso que estão logo abaixo da camada endotelial Há a formação de um complexo inicial entre TF e fator VII pre sente no plasma sanguíneo O fator VII é um zimogênio de serinoprotease e o TF é uma proteína regulatória que é necessária para a função do fator VII O fator VII é converti do na sua forma ativa fator VIIa por clivagem proteolítica catalisada pelo fator Xa outra serinoprotease Então o complexo TFVIIa cliva o fator X criando a sua respectiva forma ativa fator Xa Se TFVIIa é necessário para clivar X e Xa é necessário para clivar TFVII como então se inicia o processo todo Uma pequena quantidade de fator VIIa está presente no sangue o tempo todo quantidade suficiente para formar pequenas quantidades do complexo ativo TFVIIa imediata mente quando da lesão ao tecido Isso possibilita a formação de fator Xa e estabelece a alça de retroalimentação inicial Uma vez que os níveis de fator Xa começam a se elevar o fator Xa na forma de complexo com a proteína regulatória fator Va cliva a protrombina na forma ativa trombina e a trombina cliva o fibrinogênio A via extrínseca proporciona assim uma eclosão de trombina Entretanto o complexo TFVIIa é rapidamen te inativado pela proteína inibidora de fator tecidual TFPI A formação do coágulo é sustentada pela ativa ção de componentes da via intrínseca O fator IX é con vertido na serinoprotease ativa fator IXa pela protease TFVIIa durante o início da sequência da coagulação O fator IXa complexado com a proteína regulatória VIIIa é relativamente estável e proporciona uma enzima alter nativa para a conversão proteolítica do fator X a fator Xa Fator IXa ativado pode também ser produzido pela seri noprotease fator XIa A maior parte de XIa é gerada pela clivagem do zimogênio fator XI pela trombina em uma alça de retroalimentação Deixada sem controle a coagulação sanguínea pode acabar bloqueando os vasos sanguíneos provocando ata que cardíaco É necessário que haja uma regulação maior ainda À medida que o coágulo firme ou coágulo duro se forma vias regulatórias agem para limitar o tempo durante o qual a cascata da coagulação está ativa Além de clivar o fibrinogênio a trombina também forma um complexo com uma proteína embebida na superfície do lado vascular das células endoteliais a trombomodulina O complexo trombinatrombomodulina cliva o zimogênio da protease proteína C A proteína C ativada na forma de complexo com uma proteína regulatória proteína S cliva e inativa os fatores Va e VIIIa levando à supressão da cascata toda Outra proteína antitrombina III ATIII é um inibidor de serinoprotease ATIII forma um complexo covalente 11 entre um resíduo de Arg da ATII e o resíduo de Ser do sítio ativo de serinoproteases especialmente trombina e fator Xa Esses dois sistemas regulatórios de forma concatena da com TFPI ajudam a estabelecer um limiar ou nível de exposição ao TF necessário para ativar a cascata da coagu lação Indivíduos com defeitos genéticos que eliminam ou diminuem os níveis sanguíneos de proteína C ou de ATIII apresentam alto risco de trombose formação inapropriada de coágulos sanguíneos O controle da coagulação sanguínea exerce papéis im portantes em medicina especialmente para evitar que o sangue coagule durante cirurgias e em pacientes com ris co de ataque cardíaco ou trombose Do ponto de vista clíni co várias são as abordagens disponíveis A primeira apro veita outra característica de várias das proteínas da cascata da coagulação e que não foram ainda consideradas Os fato res VII IX X e a protrombina juntamente com as proteínas C e S têm sítios de ligação ao cálcio cruciais a suas respec tivas funções Nesse caso os sítios de ligação ao cálcio são formados por modificações de vários resíduos de Glu próxi mos à extremidade Nterminal dessas proteínas transfor mandoos em resíduos de gcarboxiglutamato abrevia tura Gla p 81 A modificação de Glu para Gla é catalisada por enzimas que dependem da atividade da vitamina K uma vitamina lipossolúvel p 374 O cálcio ligado a essas proteínas promove a aderência dessas proteínas a fosfolipí deos aniônicos que aparecem na superfície de plaquetas ativadas fazendo com que os fatores da coagulação se loca lizem na área onde o coágulo deve se formar Antagonistas da vitamina K como a varfarina Coumadina provaramse altamente eficientes como anticoagulantes Uma segunda abordagem para inibir a coagulação é a administração de heparina Heparinas são polissacarídeos altamente sulfa tados ver Figuras 722 e 723 Elas agem como anticoagu lantes por aumentarem a afinidade de ATIII pelo fator Xa e pela trombina facilitando a inativação desses elementos chave da cascata Finalmente a aspirina ácido acetilsali cílico p 845 é eficaz como anticoagulante A aspirina inibe a enzima cicloxigenase necessária para a produção de tromboxanas À medida que a aspirina reduz a liberação de tromboxanas pelas plaquetas a capacidade de agregação das plaquetas diminui Pessoas que nascem com deficiência em componentes da cascata da coagulação têm uma tendência ao sangra mento que varia desde leve até essencialmente incontro lável uma condição fatal Defeitos genéticos nos genes que codificam para proteínas necessárias para a coagulação sanguínea resultam em doenças conhecidas como hemofi lias A hemofilia A é uma doença ligada ao sexo que resulta da deficiência de fator VIII Ela é a hemofilia humana mais comum afetando um em cada 5000 homens no mundo todo O exemplo mais famoso de hemofilia A ocorre na no breza europeia A rainha Vitória 18191901 sem dúvida foi uma portadora O príncipe Leopoldo seu oitavo filho sofria de hemofilia A e morreu aos 31 anos após sofrer uma pequena queda Ao menos duas de suas filhas eram por tadoras e passaram o gene defeituoso para outras famílias reais europeias Figura 641 Algumas enzimas utilizam vários mecanismos regulatórios A glicogêniofosforilase catalisa a primeira reação da via que disponibiliza a glicose armazenada para a via do me tabolismo dos carboidratos que produz energia Capítulos 14 e 15 Essa é uma via metabólica muito importante e a Nelson6ed06indd 234 Nelson6ed06indd 234 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 235 sua regulação é correspondentemente complexa Embora a regulação primária da glicogêniofosforilase ocorra por mo dificações covalentes como foi resumido na Figura 636 a glicogêniofosforilase é também modulada alostericamente por AMP que é um ativador da fosforilase b por glicose6 fosfato e ainda por ATP ambos inibidores Além disso as enzimas que adicionam ou removem grupos fosforil são elas próprias reguladas pelos níveis dos hormônios que regulam os níveis de açúcar no sangue portanto todo o sistema é sensível a esses hormônios Figura 642 ver também Ca pítulos 15 e 23 Outras enzimas com regulação complexa são encontra das em entroncamentos importantes de vias metabólicas A glutaminasintetase de bactérias que catalisa a reação que introduz nitrogênio reduzido no metabolismo celular Capítulo 22 está entre as enzimas com regulação mais complexa conhecida Ela é regulada alostericamente por ao menos oito moduladores diferentes por modificações covalentes reversíveis e pela associação com outras proteí nas regulatórias mecanismo que será examinado em deta lhes quando for estudada a regulação de vias metabólicas específicas Qual é a vantagem de tamanha complexidade na regu lação da atividade enzimática Este capítulo foi iniciado enfatizando a importância fundamental da catálise para a existência da vida O controle da catálise também é crucial para a vida Se todas as possíveis reações de uma célula fossem catalisadas simultaneamente as macromo léculas e os metabólitos seriam rapidamente degradados em formas químicas muito mais simples Em vez disso as células catalisam apenas as reações que necessitam em determinado momento Quando há abundância de recur sos químicos as células sintetizam e armazenam glicose e outros metabólitos Quando os recursos químicos são es cassos as células usam essas reservas como combustível para o metabolismo celular A energia química é usada de forma econômica e parcelada nas várias vias metabólicas de acordo com as necessidades da célula A disponibili dade de catalisadores poderosos e específicos para cada reação torna possível a regulação dessas reações Isso por sua vez origina a complexa e altamente regulada sin fonia chamada de vida RESUMO 65 Enzimas regulatórias c A atividade das vias metabólicas nas células é regulada pelo controle da atividade de determinadas enzimas c A atividade das enzimas alostéricas é ajustada pela liga ção reversível de um modulador em um sítio regulatório O modulador pode ser o próprio substrato ou algum ou tro metabólito sendo que os efeitos do modulador po dem ser inibitórios ou estimulatórios O comportamento cinético das enzimas alostéricas reflete interações coo perativas entre as subunidades da enzima c Outras enzimas regulatórias são moduladas por modi ficações covalentes de grupos funcionais específicos que são necessários para a atividade A fosforilação de resíduos de determinados aminoácidos é uma maneira muito comum de regular a atividade de enzimas c Muitas enzimas proteolíticas são sintetizadas como pre cursores inativos denominados zimogênios que são ati vados por hidrólise a qual remove pequenos fragmentos peptídicos c As enzimas em pontos de cruzamento importantes de vias metabólicas podem ser reguladas por combinações complexas de efetores permitindo a coordenação das atividades de vias interconectadas Princesa Ana Príncipe Charles Diana Willian Harry Príncipe Andrew Príncipe Eduardo Rainha Elizabeth Príncipe Philip Irene Fred Alix Alice Leopoldo Eugênio Maurício Valdemar Homens normais Mulheres normais Homens hemofílicos Mulheres portadoras Possíveis homens hemofílicos Possíveis mulheres portadoras Henrique Alexis Família real da Rússia Família real da Espanha Família real da Inglaterra Rupert Afonso Gonzalo Alice Rainha Vitória Leopoldo Beatriz FIGURA 641 Famílias da realeza europeia e a herança da hemofilia A Homens estão indicados por quadrados e mulheres por círculos Homens acometidos de hemofilia estão representados por quadrados vermelhos e as mulheres supostamente portadoras por círculos em bege Nelson6ed06indd 235 Nelson6ed06indd 235 070414 1433 070414 1433 236 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário enzima 189 cofator 190 coenzima 190 grupo prostético 190 holoenzima 190 apoenzima 190 apoproteína 190 sítio ativo 192 substrato 192 estado fundamental 192 estado de transição 193 energia de ativação DG 193 intermediário da reação 193 etapa limitante da velocidade 193 constante de equilíbrio Keq 194 energia de ligação DGB 195 especificidade 197 ajuste induzido 198 catálise geral acidobásica 199 catálise covalente 200 cinética enzimática 200 velocidade inicial V0 200 Vmáx 201 estado préestacionário 202 estado estacionário 202 cinética do estado estacionário 202 hipótese do estado estacionário 202 constante de Michaelis Km 202 equação de Michaelis Menten 203 2ATP 2ADP Glicose 6fosfato ATP AMP Glicose 6fosfato ATP AMP Pi PP1 Insulina Insulina ATP PKA Fosforilase b Fosforilase a ADP H2O Fosforilase cinase Fosforilase cinase PPI1 P Pi 2Pi PP2B ADP ATP H2O 2H2O PPI1 P OH OH OH OH P P Glucagon cAMP PKA PP1 Glucagon cAMP FIGURA 642 Regulação da atividade da glicogêniofosforilase mus cular por fosforilação A atividade da glicogêniofosforilase no múscu lo é sujeita a um sistema de regulação de vários níveis envolvendo muito mais do que uma modificação covalente fosforilação como mostrado na Figura 636 A participação da regulação alostérica e uma cascata regula tória sensível ao balanço hormonal que age sobre as enzimas envolvidas na fosforilação e na desfosforilação também exercem um papel importan te A atividade das duas formas da enzima é alostericamente regulada por um ativador AMP e por inibidores glicose6fosfato e ATP que se ligam na enzima a sítios independentes As atividades da fosforilasecinase e da fosforilasefosfatase 1 PP1 também são reguladas por modificações cova lentes por uma via curta que responde aos hormônios glucagon e epine frina Um caminho leva à fosforilação da fosforilasecinase e do inibidor da fosfoproteínafosfatase 1 PPI1 A fosforilasecinase fosforilada é ativada e por sua vez fosforila e ativa a glicogêniofosforilase Simultaneamente a PPI1 fosforilada interage com a PP1 inibindoa A PPI1 também se man tém ativa fosforilada inibindo a fosfoproteínafosfatase 2B PP2B a enzima que a desfosforila inativandoa Desse modo o equilíbrio entre as formas a e b da glicogêniofosforilase deslocase para o lado de mais glicogênio fosforilase a ativa Observe que as duas formas de fosforilasecinase são ativadas em certo grau por íons Ca 21 não mostrado Esta via é discutida com mais detalhes nos Capítulos 14 15 e 23 Nelson6ed06indd 236 Nelson6ed06indd 236 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 237 cinética de Michaelis Menten 203 equação de Lineweaver Burk 204 constante de dissociação Kd 203 kcat 204 número de renovação turnover 205 inibição reversível 207 inibidor competitivo 207 inibidor incompetitivo 208 inibidor misto 208 inibição não competitiva 208 inibidores irreversíveis 210 inativadores suicidas 210 análogo do estado de transição 210 serinoproteases 218 enzima regulatória 226 enzima alostérica 226 modulador alostérico efetor alostérico 226 proteínascinases 229 proteínafosfatases 229 zimogênio 231 próproteínas próenzimas 231 cascata regulatória 232 fibrinogênio 233 trombina 233 fibrina 233 via intrínseca 233 via extrínseca 233 aspirina 234 Leituras adicionais Gerais Evolution of Catalytic Function 1987 Cold Spring Harb Sump Quant Biol52 Coleção de excelentes artigos sobre os princípios continua sendo muito útil Fersht A 1999 Structure and Mechanism in Protein Science A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding W H Freeman and Company New York Uma introdução concisa claramente apresentada Mais avançado Frey PA Hegeman AD 2006 Enzimatic Reaction Mechanisms Oxford University Press New York Fonte competente e atualizada das reações que ocorrem nos sistemas vivos Jencks WP 1987 Catalysis in Chemistry and Enzymology Dover Publications Inc New York Livro importante sobre o assunto Mais avançado Kornberg A 1989 For the Love of Emzymes the Odyssey of a Biochemistry Harvard University Press Cambridge MA Princípios da catálise Amyes TL ODonoghe AC Richard JP 2001 Contribution of phosphate intrinsic binding energy to the enzymatic rate aceleration for triosephosphate isomerase J Am Chem Soc 123 11 32511 326 Gutteridge A Thornton JM 2005 Understanding natures catalytic toolkit Trends Biochem Sci 30 622629 Uma boa discussão sobre de onde vem a energia de ligação e como ela é usada HammesSchiffer S Benkovic SJ 2006 Relating protein motion to catalysis Ann Rev Biochem 75 519541 Uma boa descrição sobre a importância do movimento das proteínas na catálise Hansen DE Raines RT 1999 Binding energy and enzymatic catalysis J Chem Edu 67 483489 Uma boa oportunidade para o estudante iniciante melhorar o entendimento dos princípios básicos Harris TK Turner GJ 2002 Structural basis of perturbed pKa values of catalytic groups in enzyme active sites IUBMB Life 53 8598 Kraut DA Caroll KS Herschlang D 2003 Challenges in enzyme mechanism and energetics Ann Rev Biochem 72 517571 Bom resumo sobre os princípios da catálise enzimática da maneira como ela é entendida hoje e sobre o que ainda se desconhece Schramm VL 1998 Enzymatic transition states and transition state analog design Ann Rev Biochem 67 693720 Ilustração muito boa dos princípios apresentados neste capítulo Williams DH 2010 Enzyme catalysis from improved packing in their transitionstate structures Curr Opin Chem Biol 14 666670 Wolfenden R 201 Benchmark reaction eras the stability of biologycal molecules in water and the evolution of catalytic power in enzymes Ann Rev Biochem 80 645667 Cinética Cleland WW 2002 Enzyme kinectics steady state In Encyclopedia of Life Sciences John Willey Sons IncWilley Interscience wwwelsnet Apresentação clara e concisa dos princípios básicos Raines RT Hansen DE 1988 An intuitive approach to steadystate kinetics J Chem Educ 65 757759 Exemplos de enzimas Babbit PC Gerit JA 1997 Understanding enzyme superfamilies chemistry as the fundamental determinant in the evolution o new catalytic activities J Biol Chem 27 30 59130 594 Descrição interessante da evolução de enzimas com diferentes especificidades catalíticas e o uso de um limitado repertório de motivos estruturais proteicos Babbit PC Hasson MS Wdekind JE Palmer DRJ Barret WC Reed GH Rayment I Ringe D Kenyon GL Gerlt JA 1996 The enolase superfamily a general strategy for enzymecatalyzed abstraction of the aprotons of carboxylic acids Biochemistry 35 16 4891 501 Kirby AJ 2002 The lysozyme mechanism sorted after 50 years Nat Struct Biol 8 737739 Bela discussão sobre o poder catalítico das enzimas e dos princípios envolvidos Enzimas regulatórias Chageux JP 2012 Allostery nad the MonodWymanChangeux model after 50 years Annu Rev Biophys 41 83113 Ehrmann M Clausen T 2004 Proteolysis as a regulatory mechanism Ann Rev Genet 38 709724 Hunter T Plownan GD 1997 The protein kinases of buding yeast six score and more Trends Biochem Sci 22 1822 Detalhes sobre a variedade destas importantes enzimas em um modelo eucarioto Johnson LN Barford D 1993 The effects of phosphorylation on the structure and function of proteins Ann Revb Biophys Biomol Struct 22 199232 Problemas 1 Preservando o sabor doce do milho O sabor doce do milho recémcolhido devese a um alto conteúdo de açúcar no grão O milho comprado em mercados vários dias depois de co lhido não é tão doce porque 50 do açúcar livre é convertido em amido no primeiro dia após a colheita Para manter a doçura do milho fresco depois de debulhado o milho pode ser imerso em água fervente por alguns minutos e então resfriado com água fria O milho processado dessa maneira e mantido congelado mantém a doçura Qual é a base bioquímica desse processo Nelson6ed06indd 237 Nelson6ed06indd 237 070414 1433 070414 1433 238 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 2 Concentração intracelular das enzimas Para ter uma ideia da concentração real das enzimas em uma célula bacteriana suponha que o citosol da célula contém a mesma concentração de 1000 enzimas diferentes e que cada pro teína tenha uma massa molecular de 100000 Suponha tam bém que a célula bacteriana seja um cilindro diâmetro de 10 mm comprimento de 20 mm que o citosol gravidade específica de 120 tenha 20 por peso de proteínas solú veis e que as proteínas solúveis sejam constituídas apenas de enzimas Calcule a concentração molar média de cada enzi ma nesta célula hipotética 3 Aumento da velocidade pela urease A enzima ure ase aumenta a velocidade da hidrólise da ureia em pH 80 e 20 oC por um fator de 10 14 Se uma dada quantidade de urease pode hidrolisar completamente certa quantidade de ureia em 5 minutos a 20 oC e pH 80 quanto tempo levaria para que essa mesma quantidade de ureia fosse hidrolisada sob as mesmas condições na ausência de urease Suponha que ambas as rea ções ocorram em sistemas estéreis de modo que a ureia não possa ser atacada por bactérias 4 Proteção das enzimas contra a desnaturação pelo calor Quando uma solução de enzima é aquecida há perda progressiva da atividade catalítica com o tempo devido à des naturação da enzima Uma solução da enzima hexocinase incu bada a 45 oC perde 50 da atividade em 12 minutos mas quan do incubada a 45 oC na presença de uma grande quantidade de um dos seus substratos ela perde apenas 3 da atividade em 12 minutos Sugira uma explicação para a desnaturação térmi ca da hexocinase retardar quando um dos seus substratos está presente 5 Exigências dos sítios ativos das enzimas A carboxi peptidase que remove sequencialmente resíduos de aminoá cidos carboxiterminais de substratos peptídicos é um poli peptídeo único de 307 aminoácidos Os dois grupos catalíticos essenciais do sítio ativo são fornecidos por Arg 145 e Glu 270 a Se a cadeia da carboxipeptidase fosse uma hélice a per feita quão distante em Å a Arg 145 estaria do Glu 270 Dica ver Figura 44a b Explique como então os dois resíduos de aminoácidos podem catalisar uma reação que ocorre em uma distância de poucos ângstroms 6 Ensaio quantitativo da lactatodesidrogenase A en zima muscular lactatodesidrogenase catalisa a reação O C C COO2 NADH CH3 CH3 1 1 COO2 1 NAD1 H1 OH H Lactato Piruvato NADH e NAD 1 são respectivamente a forma reduzida e a for ma oxidada da coenzima NAD Soluções de NADH mas não de NAD 1 absorvem luz em 340 nm Essa propriedade é usada para determinar a concentração de NADH em solução medindo em espectrofotômetro a quantidade de luz absorvida pela solu ção em 340 nm Explique como essas propriedades da NADH podem ser usadas para planejar um ensaio quantitativo da lac tatodesidrogenase 7 Efeito das enzimas sobre as reações Quais dos se guintes efeitos ocorreriam se uma enzima catalisasse a reação a Diminuição em K9eq b aumento em k1 c aumento em K9eq d aumento em DG e diminuição em DG f DG9 mais negativo g aumento de k2 8 Relações entre a velocidade da reação e a concen tração do substrato equação de MichaelisMenten a Qual a concentração de substrato para que uma enzima com kcat de 300 s 1 e Km de 00050 M opere com um quarto da velocidade máxima b Determine a fração da Vmáx que seria obtida nas seguin tes concentrações de substrato S ½ Km 2 Km e 10 Km c Enzimas que catalisam a reação X Y são isoladas de duas espécies de bactérias As enzimas possuem mesma Vmáx mas diferentes valores de Km para o substrato X A en zima A tem Km de 20 mM enquanto a enzima B tem Km de 05 mM O gráfico abaixo mostra as cinéticas das reações ca talisadas pela mesma concentração de cada uma das enzimas e com X 5 1 mM Qual curva corresponde a cada uma das enzimas Tempo Y 9 Aplicação da equação I de MichaelisMenten Um grupo de pesquisadores descobriu uma nova versão da felicida se que eles denominaram de felicidase que catalisa a reação química FELICIDADE TRISTEZA Os pesquisadores iniciaram a caracterização da enzima a No primeiro experimento com Et de 4 nM eles obser varam que a Vmáx é 16 mM s 1 Com base nesse experimento qual é o kcat da felicidase Coloque as unidades apropriadas b Em outro experimento com Et de 1 nM de FELICI DADE de 30 mM os pesquisadores observaram que V0 5 300 nM s 1 Qual o Km medido para a felicidase para o substrato FELICIDADE Coloque as unidades apropriadas c Pesquisas posteriores mostraram que a felicidase puri ficada que foi usada no primeiro experimento estava contami nada com um inibidor reversível denominado RAIVA Quando RAIVA foi totalmente removida da preparação de felicidase e os dois experimentos foram repetidos a Vmáx em a aumentou para 48 mM s 1 e o Km em b passou a 15 mM Para a inibição por RAIVA calcule os valores de a e a9 d Com base nas informações dadas diga qual é o tipo da inibição por RAIVA Nelson6ed06indd 238 Nelson6ed06indd 238 070414 1433 070414 1433 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 239 10 Aplicação da equação II de MichaelisMenten Ou tra enzima foi encontrada e ela catalisa a reação A B Os pesquisadores verificaram que o Km para o substrato A é 4 mM e o kcat é 20 min 1 a Em um experimento A 5 6 mM e a velocidade inicial V0 é 480 nM min 1 Qual foi a Et usada nesse experimento b Em outro experimento Et 5 05 mM e a V0 5 5 mM min 1 Qual a A usada no experimento c Foi verificado que o composto Z é um inibidor competi tivo muito potente dessa enzima com a de 10 Em um experi mento com a mesma Et usada na parte a mas com diferente A é adicionada uma quantidade de Z que reduz a velocidade V0 para 240 nM min 1 Qual a A usada no experimento d Com base nos parâmetros cinéticos dados podese concluir que essa enzima evoluiu atingindo a perfeição catalíti ca Explique brevemente a resposta usando os parâmetros cinéticos que definem a perfeição catalítica 11 Estimativa da Vmáx e do Km por inspeção Embora haja disponibilidade de métodos gráficos para a determinação precisa da Vmáx e do Km de uma reação catalisada por enzimas ver Quadro 61 algumas vezes essas grandezas podem ser rapidamente estimadas pelo exame dos valores de V0 aumen tando S Estime os valores de Vmáx e de Km da reação catalisa da por enzima na qual foram obtidos os seguintes dados S M V0 mMmin 25 3 10 6 28 40 3 10 6 40 1 3 10 5 70 2 3 10 5 95 4 3 10 5 112 1 3 10 4 128 2 3 10 3 139 1 3 10 2 140 12 Propriedades de uma enzima da síntese de pros taglandinas As prostaglandinas pertencem a uma classe de eicosanoides derivados de ácidos graxos com uma diversidade de ações extremamente potentes sobre os tecidos de vertebra dos São responsáveis pela produção de febre inflamação e dores associadas As prostaglandinas são derivadas do ácido araquidônico um ácido graxo de 20 carbonos por uma reação catalisada pela enzima prostaglandinaendoperóxidosintase Essa enzima uma ciclooxigenase utiliza oxigênio para con verter ácido araquidônico em PGG2 o precursor direto de mui tas prostaglandinas diferentes a síntese das prostaglandinas está descrita no Capítulo 21 a Os dados cinéticos abaixo são de uma reação catalisada pela prostaglandinaendoperóxidosintase Focando nas pri meiras duas colunas determine Vmáx e Km da enzima Ácido araquidônico mM Velocidade de formação de PGG2 mMmin Velocidade de formação de PGG2 em presença de 10 mgmL de ibuprofeno mMmin 05 235 1667 10 322 2525 15 369 3049 25 418 3704 35 440 3891 b Ibuprofeno é um inibidor da prostaglandinaendoperó xidosintase Ao inibir a síntese das prostaglandinas o ibupro feno reduz a inflamação e a dor Utilizando os dados da pri meira e da terceira coluna da tabela acima determine o tipo de inibição que o ibuprofeno provoca na endoperóxidosintase 13 Análise gráfica da Vmáx e do Km Os seguintes da dos foram obtidos em experimentos feitos durante um estudo sobre a atividade de uma peptidase intestinal sobre o substrato glicilglicina Glicilglicina 1 H2O S 2 glicina S mM Produto formado mmolmin 15 021 20 024 30 028 40 033 80 040 160 045 Use a análise gráfica ver Quadro 61 e o gráfico interativo as sociado para determinar o Km e a Vmáx desta preparação de enzima sobre esse substrato 14 Equação de EadieHofstee Existem várias maneiras de transformar a equação de MichaelisMenten e fazer gráfi cos com os dados cada uma delas com diferentes vantagens dependendo do conjunto de dados a ser analisado Uma das transformações da equação de MichaelisMenten é a equação de LineweaverBurk ou de duplorecíproco Multiplicando am bos os lados da equação de LineweaverBurk por Vmáx e rear ranjando obtémse a equação de EadieHofstee Um gráfico de V0 versus V0S para uma reação catalisada por uma enzima está mostrado a seguir A curva azul foi obtida na ausência de inibidor Quais das outras curvas A B ou C mos tram a atividade da enzima quando um inibidor competitivo é adicionado à mistura de reação Dica Ver Equação 630 A B C Vmáx V0 Inclinação 5 2Km V0 S Vmáx Km 15 O número de renovação da anidrase carbônica A anidrase carbônica dos eritrócitos Mr 30000 tem um dos nú meros de renovação mais altos conhecidos Ela catalisa a hidra tação reversível do CO2 Nelson6ed06indd 239 Nelson6ed06indd 239 070414 1433 070414 1433 240 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Este é um processo importante no transporte de CO2 dos te cidos para os pulmões Se 100 mg de anidrase carbônica pura catalisam a hidratação de 030 g de CO2 em 1 min a 37 oC em Vmáx qual é o número de renovação kcat da anidrase carbônica em unidades de min 1 16 Dedução da equação de equilíbrio da inibição com petitiva A equação de velocidade de uma enzima sujeita à inibição competitiva é Iniciando com uma nova definição de enzima total como e as definições de a e Ki fornecidas no texto deduza a equação de velocidade acima Use a derivação da equação de Michaelis Menten como um guia 17 Inibição irreversível das enzimas Muitas enzimas são inibidas irreversivelmente por íons de metais pesados como Hg 21 Cu 21 ou Ag 1 que podem reagir com grupos sulfidril para formar mercaptanas A afinidade de Ag 1 por grupos sulfidril é tão grande que Ag 1 pode ser utilizado para titular quantitativamente grupos SH A 100 mL de uma solução contendo 10 mgmL de enzima pura um pesquisador adicionou uma quantidade de AgNO3 suficiente para inativar completamente a enzima no total de 0342 mmol de AgNO3 Calcule a massa molecular mínima da enzima Por que o valor obtido dessa maneira pode dar apenas a massa molecular mínima 18 Aplicações clínicas de diferentes inibidores de enzimas O soro humano contém uma classe de en zimas conhecidas como fosfatases ácidas Elas hidrolisam éste res de fosfato biológicos sob condições levemente ácidas pH 50 O2 O2 O2 O2 O O O R P P R HO OH H2O 1 1 As fosfatases ácidas são produzidas por eritrócitos pelo fígado pelos rins pelo baço e pela glândula da próstata A enzima da próstata tem importância clínica porque um aumento da sua atividade no sangue pode ser um indicativo de câncer de prós tata A fosfatase da próstata é inibida fortemente pelo íon tarta rato enquanto as fosfatases dos outros tecidos não Como essa informação pode ser usada para desenvolver uma metodologia para medir a atividade da fosfatase ácida prostática no sangue 19 Inibição da anidrase carbônica por acetazola mida A anidrase carbônica é fortemente inibida pelo fármaco acetazolamida utilizado como diurético ie para au mentar a produção de urina e para diminuir a pressão exces sivamente alta no olho devido ao acúmulo de fluido intraocu lar no glaucoma A anidrase carbônica tem um papel importante nesse e em outros processos de secreção pois par ticipa na regulação do pH e do conteúdo de bicarbonato de vá rios fluidos corporais A curva experimental da velocidade ini cial como porcentagem de Vmáx dessa reação da anidrase carbônica versus S está ilustrada abaixo curva superior Quando o experimento é repetido na presença de acetazolami da é obtida a curva inferior A partir da inspeção das curvas e do seu conhecimento das propriedades cinéticas de inibidores competitivos e mistos determine a natureza da inibição por acetazolamida Explique o raciocínio usado V de Vmáx Sem inibidor Acetazolamida S mM 02 100 50 04 06 08 1 20 Efeitos dos inibidores reversíveis Derive a expres são do efeito de um inibidor reversível sobre o Km observado Km aparente 5 aKma9 Inicie com a Equação 630 e o conceito de que o Km aparente é equivalente a S quando V0 5 Vmáx2a9 21 pH ótimo da lisozima O sítio ativo da lisozima contém dois resíduos de aminoácidos essenciais para a catálise Glu 35 e Asp 52 Os valores de pKa dos carboxilas das cadeias laterais desses resíduos são 59 e 45 respectivamente Qual é o estado de ionização protonado ou desprotonado de cada resíduo em pH 52 o pH ótimo da lisozima Como os estados de ionização desses resíduos podem explicar o perfil pHatividade da lisozi ma mostrado a seguir 100 50 0 2 4 6 8 10 pH Atividade da máxima 22 Trabalhando com cinética Vá para o gráfico intera tivo do Capítulo 6 a Usando o gráfico interativo da Equação 69 crie um grá fico V versus S Use Vmáx 5 100 mM s 1 e Km 5 10 mM Quanto V0 aumenta quando S duplica de 02 para 04 mM Qual o V0 quando S 5 10 mM Quanto aumenta V0 quando S aumenta de 100 para 200 mM Observe como o gráfico muda quando os valores de Vmáx ou de Km diminuem pela metade ou duplicam b Usando o gráfico interativo para a Equação 630 e os parâmetros cinéticos em a crie um gráfico no qual tanto a como a9 são 10 Observe agora como o gráfico muda quando a 5 20 quando a9 5 30 e quando a 5 20 e a9 5 30 Nelson6ed06indd 240 Nelson6ed06indd 240 070414 1433 070414 1433 PRINCIPIOS DE BIOQUMICA DE LEHNINGER 241 c Usando o grafico interativo para a Equacaéo 630 e a envolve um grupo carboxil fortemente polarizado da molécula equacao de LineweaverBurk do Quadro 61 crie um grafico do piruvato conforme mostrado a seguir de LineweaverBurk duploreciproco para todos os casos em CH a e b Quando a 20 a interseccao de x deslocase para a direita ou para a esquerda Se a 20 ea 30 ainterseccao OC de x deslocase para a direita ou para a esquerda b oo Problema de analise de dados a Uma forma mutante da LDH na qual a Arg foi subs 23 Explorando e modificando a lactatodesidrogenase tituida por Gln apresenta apenas 5 da ligacao ao piruvato e O exame da estrutura das enzimas leva a hipoteses sobre as907 da atividade da enzima do tipo selvagem Elabore uma relacées entre os diferentes aminodcidos da estrutura proteica explicagao plausivel para os efeitos dessa mutaao e a fungao da proteina Uma maneira de testar essas hipdteses b A forma mutante da LDH na qual a Arg foi substi é usar a tecnologia do DNA recombinante para gerar versoes tulda por Lys apresenta apenas 005 do nivel de ligagao ao mutantes da enzima e entéo examinar a estrutura e a funcdo substrato da enzima do tipo selvagem Por que esse drastico dessas formas alteradas A tecnologia utilizada para isso esta feito causa surpresa a descrita no Capitulo 9 Na estrutura cristalina da LDH 0 grupo guanidino da Um exemplo desse tipo de andlise 6 0 trabalho de A R Arg e0 grupo carboxil do piruvato sao alinhados em uma Clarke e colegas sobre a enzima lactatodesidrogenase publi configuracao bifurcada coplanar Como mostrado Com base cado em 1989 A lactatodesidrogenase LDH catalisa a redu nessa informacao elabore uma exp licacao plausivel para o efei cao do piruvato por NADH formando lactato ver Secao 143 to dramatico da substituigao da Arg por Lys 250 9 Um esquema do sitio ativo da enzima é mostrado a seguir com d Uma forma mutante da LD H na qual alle foi substitu 0 piruvato no centro ida por Gln mostra uma ligagao diminuida com NADH Elabore uma explicacao plausivel para esse resultado Clarke e colegas também prepararam uma versao mutante Lactatodesidrogenase da LDH que ligaria e reduziria 0 oxaloacetato no lugar do piru GIn102 vato Eles fizeram uma tinica substituicdo trocando Gin por Arg A enzima resultante reduz oxaloacetato a malato e nao bo consegue mais reduzir piruvato a lactato Portanto a LDH é Ar ee O NH convertida em malatodesidrogenase NH or e Faga um esquema do sitio ativo deste mutante da LDH HCCOH com oxaloacetato ligado Ze f Por que essa enzima mutante usa agora oxaloacetato HN NH CHs H como substrato em vez de piruvato H 4 b H g Os autores ficaram surpresos com o fato de que a subs wore tituigao por um aminoacido maior no sitio ativo possibilita a His Si b Piruvato OX NONADED ligacgaéo de um substrato maior Formule uma explicacao plausi N Va vel para esse resultado H O oO s H H CH Oo H 4H FC b daz Referéncias Ox HN NH Bo 2 Clarke AR Atkinson T Holbrook JJ 1989 From Tle250 analysis to synthesis new ligant binding sites on the lactate Asp168 NH dehydrogenase framework Part I Trends Biochem Sci 14 Arg7 101105 Clarke AR Atkinson T Holbrook JJ 1989 From O mecanismo de reacao é similar a muitas redugdes de analysis to synthesis new ligant binding sites on the lactate NADH Figura 1324 De maneira geral ele o inverso das dehydrogenase framework Part II Trends Biochem Sci 14 etapas e mostradas na Figura 148 O estado de transigao 145148 Nelson6ed06indd 242 Nelson6ed06indd 242 070414 1433 070414 1433 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 71 Monossacarídeos e dissacarídeos 243 72 Polissacarídeos 253 73 Glicoconjugados proteoglicanos glicoproteínas e glicoesfingolipídeos 263 74 Carboidratos como moléculas informativas o código dos açúcares 269 75 Trabalhando com carboidratos 274 O s carboidratos são as biomoléculas mais abundantes na Terra A cada ano a fotossíntese converte mais de 100 bilhões de toneladas métricas de CO2 e H2O em celulose e outros produtos vegetais Alguns carboi dratos açúcar e amido são os principais elementos da dieta em muitas partes do mundo e sua oxidação é a prin cipal via de produção de energia na maioria das células não fotossintéticas Polímeros de carboidratos também chamados de glicanos agem como elementos estruturais e protetores nas paredes celulares bacterianas e vegetais e também nos tecidos conectivos animais Outros políme ros de carboidratos lubrificam as articulações e auxiliam o reconhecimento e a adesão intercelular Polímeros de carboidratos complexos covalentemente ligados a pro teínas ou lipídeos atuam como sinais que determinam a localização intracelular ou o destino metabólico dessas moléculas híbridas chamadas de glicoconjugados Este capítulo introduz as principais classes de carboidratos e glicoconjugados e traz alguns exemplos de seus muitos papéis estruturais e funcionais Carboidratos são polihidroxialdeídos ou polihidroxi cetonas ou substâncias que geram esses compostos quan do hidrolisadas Muitos carboidratos têm a fórmula empíri ca CH2On alguns também contêm nitrogênio fósforo ou enxofre Existem três classes principais de carboidratos mo nossacarídeos dissacarídeos e polissacarídeos a palavra sacarídeo é derivada do grego sakcharon que significa açúcar Os monossacarídeos ou açúcares simples são constituídos por uma única unidade polihidroxicetona ou polihidroxialdeído O monossacarídeo mais abundante na natureza é o açúcar de 6 carbonos Dglicose algumas vezes chamado de dextrose Monossacarídeos de quatro ou mais carbonos tendem a formar estruturas cíclicas Os oligossacarídeos consistem em cadeias curtas de unidades de monossacarídeos ou resíduos unidas por liga ções características chamadas de ligações glicosídicas Os mais abundantes são os dissacarídeos com duas unidades de monossacarídeos Um dissacarídeo típico é a sacarose açúcar de cana constituído pelos açúcares de seis car bonos Dglicose e Dfrutose Todos os monossacarídeos e dissacarídeos comuns têm nomes terminados com o sufixo ose Em células a maioria dos oligossacarídeos constituí dos por três ou mais unidades não ocorre como moléculas livres mas sim ligada a moléculas que não são açúcares li pídeos ou proteínas formando glicoconjugados Os polissacarídeos são polímeros de açúcar que con têm mais de 20 unidades de monossacarídeo alguns têm centenas ou milhares de unidades Alguns polissacarídeos como a celulose têm cadeias lineares outros como o glico gênio são ramificados Ambos são formados por unidades repetidas de Dglicose mas diferem no tipo de ligação gli cosídica e em consequência têm propriedades e funções biológicas notavelmente diferentes 71 Monossacarídeos e dissacarídeos Os mais simples dos carboidratos os monossacarídeos são aldeídos ou cetonas com dois ou mais grupos hidroxila os monossacarídeos de seis carbonos glicose e frutose têm cinco grupos hidroxila Muitos dos átomos de carbono aos quais os grupos hidroxila estão ligados são centros quirais o que origina os muitos estereoisômeros de açúcares en contrados na natureza Esse estereoisomerismo é biologi camente importante porque as enzimas que agem sobre os açúcares são absolutamente estereoespecíficas normal mente preferindo um estereoisômero a outro por três ou mais ordens de magnitude como demonstrado pelos seus valores de Km ou constantes de ligação É tão difícil encai xar o estereisômero errado dentro do sítio de ligação de uma enzima quanto é difícil colocar a sua luva esquerda na sua mão direita Inicialmente são descritas as famílias de monossacaríde os com esqueletos de três a sete carbonos suas estruturas as formas estereoisoméricas e os meios para representar as estruturas tridimensionais no papel Depois são discutidas algumas reações químicas dos grupos carbonil de monossa carídeos Uma dessas reações a adição de um grupo hidro 7 Carboidratos e Glicobiologia Nelson6ed07indd 243 Nelson6ed07indd 243 020514 1717 020514 1717 244 DAVID L NELSON MICHAEL M COX xila que é parte da mesma molécula gera formas cíclicas com esqueletos de quatro ou mais carbonos as formas que predominam em solução aquosa O fechamento desse anel cria um novo centro quiral adicionando ainda mais comple xidade a essa classe de compostos A nomenclatura para es pecificar sem ambiguidades a configuração de cada átomo de carbono em uma forma cíclica e os meios para represen tar essas estruturas no papel são portanto descritos com alguns detalhes essas informações serão úteis quando for discutido o metabolismo dos monossacarídeos na Parte II deste livro São apresentados também alguns importantes derivados de monossacarídeos encontrados em capítulos posteriores As duas famílias de monossacarídeos são aldoses e cetoses Os monossacarídeos são sólidos cristalinos e incolores plenamente solúveis em água mas insolúveis em solven tes apolares A maioria tem sabor adocicado ver Quadro 72 p 254 Os esqueletos dos monossacarídeos comuns são compostos por cadeias de carbono não ramificadas nas quais todos os átomos de carbono estão unidos por ligações simples Nessa forma de cadeia aberta um dos átomos de carbono está ligado duplamente a um áto mo de oxigênio formando um grupo carbonil os outros átomos de carbono estão ligados cada um a um grupo hidroxila Quando o grupo carbonil está na extremidade da cadeia de carbonos isto é em um grupo aldeído o monossacarídeo é uma aldose quando o grupo carbonil está em qualquer outra posição em um grupo cetona o monossacarídeo é uma cetose Os monossacarídeos mais simples são as duas trioses de três carbonos gliceralde ídos aldotrioses e dihidroxiacetonas cetotrioses ver Figura 71a Monossacarídeos com quatro cinco seis e sete átomos de carbono no esqueleto são chamados respectivamente de tetroses pentoses hexoses e heptoses Existem aldoses e cetoses para cada um desses comprimentos de cadeia al dotetroses e cetotetroses aldopentoses e cetopentoses e assim por diante As hexoses que incluem a aldohexose Dglicose e a cetohexose Dfrutose Figura 71b são os monossacarídeos mais comuns na natureza os produtos da fotossíntese e os intermediárioschave das sequências de reações produtoras de energia centrais da maioria dos organismos As aldopentoses Dribose e 2desóxiDribose Figura 71c são componentes dos nucleotídeos e dos áci dos nucleicos Capítulo 8 Monossacarídeos têm centros assimétricos Todos os monossacarídeos com exceção da dihidroxiace tona contêm um ou mais átomos de carbono assimétricos quirais e portanto ocorrem em formas isoméricas op ticamente ativas p 1718 A aldose mais simples o gli ceraldeído contém um centro quiral o átomo de carbono central e assim tem dois isômeros ópticos diferentes ou enantiômeros Figura 72 CONVENÇÃOCHAVE Um dos dois enantiômeros do gliceral deído é por convenção designado isômero D e o outro é isômero L Assim como para outras biomoléculas com centros quirais as configurações absolutas dos açúcares são conhecidas a partir de cristalografia por raios X Para representar estruturas tridimensionais de açúcares no papel em geral são utilizadas as fórmulas de projeção de Fischer Figura 72 Nas fórmulas de projeção de Fischer as ligações horizontais se projetam para fora do plano do papel em direção ao leitor as ligações verticais se projetam para trás do plano do papel distanciandose do leitor Geralmente uma molécula com n centros quirais pode ter 2 n estereoisômeros O gliceraldeído tem 2 1 5 2 as aldo hexoses com quatro centros quirais têm 2 4 5 16 Para cada um dos comprimentos de cadeia carbônica os este reoisômeros dos monossacarídeos podem ser divididos em dois grupos os quais diferem quanto à configuração do centro quiral mais distante do carbono do carbonil Aque les nos quais a configuração desse carbono de referência é a mesma daquela do Dgliceraldeído são designados isôme ros D e aqueles com a mesma configuração do Lgliceral deído são isômeros L Em outras palavras quando o grupo H C O OH Dihidroxiacetona cetotriose OH C C H H H H C OH OH C H H DGliceraldeído aldotriose O C H a b DFrutose cetohexose C O OH C C H C H H HO CH2OH H OH OH C H DGlicose aldohexose C OH C C H H HO CH2OH H OH OH C H O C H c 2DesóxiDribose aldopentose C OH O C H H CH2 OH C H DRibose aldopentose C OH C H H CH2OH OH OH C H CH2OH O C H FIGURA 71 Monossacarídeos representativos a Duas trioses uma aldose e uma cetose O grupo carbonil em cada molécula está som breado b Duas hexoses comuns c As pentoses componentes de áci dos nucleicos A Dribose é um componente do ácido ribonucleico RNA e a 2desóxiDribose é um componente do ácido desoxirribonucleico DNA Nelson6ed07indd 244 Nelson6ed07indd 244 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 245 hidroxila do carbono de referência está à direita dextro em uma fórmula de projeção que apresenta o carbono do carbonil no topo o açúcar é o isômero D quando está à esquerda levo é o isômero L Das 16 aldohexoses possí veis oito estão na forma D e oito na forma L Em sua maio ria as hexoses dos organismos vivos são isômeros D Por que isômeros D Uma questão interessante e sem resposta Lembre que todos os aminoácidos encontrados nas proteí nas são exclusivamente um dos dois isômeros possíveis L A base para essa preferência inicial por um dos isômeros durante a evolução também é desconhecida entretanto uma vez que um isômero tenha sido selecionado é pro vável que as enzimas em evolução retenham a preferência por aquele estereoisômero p 78 A Figura 73 apresenta as estruturas dos estereoisô meros D de todas as aldoses e cetoses que têm de três a seis átomos de carbono Os carbonos de um açúcar come çam a ser numerados a partir da extremidade da cadeia mais próxima ao grupo carbonil Cada uma das oito Daldo hexoses que diferem em estereoquímica em C2 C3 ou C4 tem nome próprio Dglicose Dgalactose Dmanose e assim por diante Figura 73a As cetoses de quatro e cinco carbonos são nomeadas pela inserção de ul ao nome da aldose correspondente por exemplo Dribulose é a cetopentose que corresponde à aldopentose Dribose A importância da ribulose será discutida no estudo da fi xação do CO2 atmosférico pelas plantas no Capítulo 20 As cetohexoses são nomeadas de maneira diferente por exemplo frutose do latim fructus fruto frutas são uma das fontes desse açúcar e sorbose de Sorbus o gênero da sorveira planta cujos frutos são ricos em álcoolaçúcar sorbitol Dois açúcares que diferem apenas na configura ção de um carbono são chamados de epímeros Dglicose e Dmanose que diferem apenas na estequiometria do C2 são epímeros assim como Dglicose e Dgalactose que di ferem em C4 ver Figura 74 Alguns açúcares ocorrem naturalmente na forma L exemplos são Larabinose e os isômeros L de alguns deriva dos de açúcar que comumente compõem glicoconjugados Seção 73 LArabinose Os monossacarídeos comuns têm estruturas cíclicas Por simplicidade até este momento foram representadas as estruturas de aldoses e cetoses como moléculas de ca deia aberta Figuras 73 e 74 Na verdade em solução aquosa as aldotetroses e todos os monossacarídeos com cinco ou mais átomos de carbono no esqueleto ocorrem predominantemente como estruturas cíclicas em anel nas quais o grupo carbonil está formando uma ligação co valente com o oxigênio de um grupo hidroxila presente na cadeia A formação dessas estruturas em anel é o resul tado de uma reação geral entre álcoois e aldeídos ou ce tonas para formar derivados chamados de hemiacetais ou hemicetais Duas moléculas de um álcool podem ser adicionadas ao carbono do carbonil o produto da primeira adição é um hemiacetal quando adicionado a uma aldo se ou um hemicetal quando adicionado a uma cetose Se os grupos OH e carbonil vierem da mesma molécula o resultado será um anel com cinco ou seis membros A adição de uma segunda molécula de álcool produz o acetal ou cetal completo Figura 75 e a ligação formada é uma ligação glicosídica Quando as duas moléculas reagentes forem monossacarídeos o acetal ou cetal formado será um dissacarídeo A reação com a primeira molécula de álcool cria um centro quiral adicional o carbono do carbonil Como o álcool pode ser adicionado de duas maneiras diferentes atacando a frente ou as costas do carbono do carbonil a reação pode produzir qualquer uma de duas configura Espelho CH2OH Modelos em esfera e bastão CH2OH CHO CHO OH H H OH CHO H C CH2OH HO LGliceraldeído Fórmulas em perspectiva LGliceraldeído C CH2OH H CHO CHO CHO OH H C CH2OH DGliceraldeído OH DGliceraldeído C CH2OH H HO Fórmulas de projeção de Fischer FIGURA 72 Três maneiras para representar os dois enantiômeros do gliceraldeído Os enantiômeros são imagens especulares um do outro Modelos de esfera e bastão mostram a verdadeira configuração das molécu las Lembrese de que nas fórmulas em perspectiva a extremidade larga da cunha sólida projetase para fora do plano do papel em direção ao leitor na cunha descontínua ela se estende para trás ver Figura 118 Nelson6ed07indd 245 Nelson6ed07indd 245 070414 1430 070414 1430 246 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ções estereoisoméricas denominadas a e b Por exemplo a Dglicose ocorre em solução na forma de hemiacetal in tramolecular no qual o grupo hidroxila livre do C5 rea giu com o C1 do aldeído gerando o carbono assimétrico e produzindo dois possíveis estereoisômeros designados a e b Figura 76 As formas isoméricas de monossaca rídeos que diferem apenas na configuração do átomo de carbono hemiacetal ou hemicetal são chamadas de anô meros e o átomo de carbono da carbonila é chamado de carbono anomérico a DAldoses Seis carbonos H C O OH CH2OH DAlose C H C OH C H OH H C OH H H C CH2OH DTalose H C OH C H H C HO HO HO O H C H C OH CH2OH DGulose H C OH C H H C OH HO O H C HO H C CH2OH DManose H C OH C H H C OH HO O H C H C OH CH2OH DGlicose H C OH C H OH H C HO O H C H C CH2OH DIdose H C OH C H H C OH HO HO O H C H C OH CH2OH DGalactose H C OH C H H C HO HO O H C H C CH2OH DAltrose H C OH C H OH H C OH HO O C H b DCetoses OH H O DRibulose CH2OH C CH2OH C OH H C OH H O DPsicose CH2OH C CH2OH C OH H C OH H C HO H O DFrutose CH2OH C CH2OH C OH H C OH H C H O DTagatose CH2OH C CH2OH C OH H C C H HO HO O DSorbose CH2OH C CH2OH C OH H C C H HO OH H Cinco carbonos Seis carbonos O DXilulose CH2OH C CH2OH C OH H C H HO Dihidroxiacetona CH2OH C CH2OH O Três carbonos Quatro carbonos OH H O DEritrulose CH2OH C CH2OH C Três carbonos O H C H C OH CH2OH DRibose H C OH C H OH H C O OH CH2OH DGliceraldeído H C H C O CH2OH DTreose C H C OH HO H H C O OH CH2OH DEritrose H C H C OH HO H C CH2OH DLixose H C OH C H HO O H C H C OH CH2OH DXilose H C OH C H HO O H C H C CH2OH DArabinose H C OH C H OH HO O H C Quatro carbonos Cinco carbonos FIGURA 73 Aldoses e cetoses As séries de a Daldoses e b Dcetoses têm de três a seis átomos de carbono mostradas como fórmulas de proje ção Os átomos de carbono em vermelho são centros quirais Em todos estes isômeros D o carbono quiral mais distante do carbono do carbonil apresenta a mesma configuração do carbono quiral do Dgliceraldeído Os açúcares com os nomes dentro de retângulos são os mais comuns na natureza você os encontrará novamente neste capítulo e em capítulos posteriores H C OH CH2OH C HO C C H CHO 6 1 2 3 4 5 H C OH CH2OH H C HO C OH H C H OH CHO 6 1 2 3 4 5 H C OH CH2OH H C HO C OH H C CHO 6 1 2 3 4 5 H OH H HO H HO DManose epímero em C2 DGlicose DGalactose epímero em C4 FIGURA 74 Epímeros DGlicose e dois de seus epímeros são mostrados como fórmulas de projeção Cada epímero difere da Dglicose na configura ção de um centro quiral sombreado em cor salmão ou azul Nelson6ed07indd 246 Nelson6ed07indd 246 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 247 Os compostos com anéis de seis membros são chamados de piranoses pois se assemelham ao composto em anel de seis membros pirano Figura 77 Os nomes sistemáticos para as duas formas em anel da Dglicose são aDglicopira nose e bDglicopiranose As cetohexoses como a frutose também ocorrem como compostos cíclicos com formas ano méricas a e b Nesses compostos o grupo da hidroxila em C5 ou C6 reage com o grupo da cetona em C2 formando um anel furanose ou piranose contendo uma ligação hemice tal Figura 75 A Dfrutose prontamente forma o anel fura nose Figura 77 o anômero mais comum desse açúcar em formas combinadas ou em derivados é a bDfrutofuranose As estruturas cíclicas dos açúcares são representadas mais corretamente pelas fórmulas em perspectiva de Haworth do que pelas projeções de Fisher comumente uti lizadas para as estruturas de açúcares lineares Nas proje ções de Haworth o anel de seis membros é inclinado para deixar seu plano quase perpendicular ao plano do papel com as ligações mais próximas do leitor representadas por linhas mais grossas do que aquelas representando as liga ções mais distantes como na Figura 77 CONVENÇÃOCHAVE Para converter uma fórmula de projeção de Fisher de qualquer Dhexose linear em uma fórmula em perspectiva de Haworth mostrando a estrutura cíclica da molécula desenhe o anel de seis membros cinco carbonos e um oxigênio na direita superior numere os átomos no sentido horário começando com o carbono anomérico e então coloque os grupos hidroxila H C OH CH2OH H C HO C OH H C H OH CHO 6 1 2 3 4 5 DGlicose Projeção de Fisher aDGlicopiranose Perspectiva de Haworth 1 2 3 4 H OH H H H O OH H HO OH 5 CH2OH 6 Se um grupo hidroxila estiver à direita na projeção de Fi sher ele é colocado apontando para baixo ou seja abaixo do plano do anel na perspectiva de Haworth se ele estiver à esquerda na projeção de Fisher é colocado apontando para cima ou seja acima do plano na perspectiva de Haworth O grupo CH2OH terminal projetase para cima no enan tiômero D e para baixo no enantiômero L A hidroxila no carbono anomérico pode apontar para cima ou para baixo Quando a hidroxila anomérica de uma Dhexose estiver no mesmo lado do anel que o C6 a estrutura é por definição b quando estiver do lado oposto do C6 a estrutura é a PROBLEMA RESOLVIDO 71 Conversão de projeções de Fisher a fórmulas em perspectiva de Haworth Desenhe as fórmulas em perspectiva de Haworth para D manose e Dgalactose H C OH CH2OH C HO C C H CHO 6 1 2 3 4 5 H C OH CH2OH H C HO C OH H C CHO 6 1 2 3 4 5 H OH H HO H HO DMannose DGalactose H C C OH H H 1 5 C CH2OH 6 C 4 OH 6 CH2OH C 5 HO H OH C H 3 H 4 C HO C 3 OH H H 2 OH C 1 5 CH2OH 6 C 4 O OH HO OH C H H C 3 H C H H 2 OH OH C 1 5 CH2OH 6 C 4 O HO OH C H H C 3 H C H H 2 OH OH H C O O C 1 H 2 DGlicose aDGlicopiranose bDGlicopiranose FIGURA 76 Formação das duas formas cíclicas da Dglicose A reação entre o grupo aldeído em C1 e o grupo hidroxila em C5 forma uma ligação hemiacetal produzindo um dos dois estereoisômeros os anômeros a e b que diferem apenas na estereoquímica do carbono hemiacetal Esta reação é reversível A interconversão dos anômeros a e b é chamada de mutarrotação R 3 C O HO 1 Cetal R 1 C OR 4 R 1 H Aldeído Hemicetal R 2 HO C H OH R 1 OR 3 Hemiacetal OR 3 R 2 R 1 C O R 2 Álcool 1 HOH 1 1 HOH C OH R 1 OR 2 Cetona Álcool C H Acetal OR 3 OR 2 HO R 4 R 2 R 1 HO R 4 HO R 3 HO R 3 FIGURA 75 Formação de hemiacetais e hemicetais Um aldeído ou uma cetona podem reagir com um álcool em uma razão de 11 para gerar um hemiacetal ou um hemicetal respectivamente criando um novo cen tro quiral no carbono da carbonila A substituição de uma segunda molé cula de álcool produz um acetal ou um cetal Quando o segundo álcool é parte de outra molécula de açúcar a ligação produzida é uma ligação glicosídica p 252 Nelson6ed07indd 247 Nelson6ed07indd 247 070414 1430 070414 1430 248 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Solução As piranoses são anéis de seis membros então co mece com estruturas de Haworth de seis membros com o átomo de oxigênio no topo à direita Numere os átomos de carbono no sentido horário começando com o carbono da aldose Para a manose coloque os grupos hidroxila nos C2 C3 e C4 para cima para cima e para baixo do anel respectivamente pois na projeção de Fisher elas estão no lado esquerdo esquerdo e direito da estrutura da mano se Para a Dgalactose os grupos hidroxila estão orienta dos para baixo para cima e para cima em C2 C3 e C4 respectivamente A hidroxila em C1 pode estar para cima ou para baixo existem duas configurações possíveis a e b para este carbono PROBLEMA RESOLVIDO 72 Desenhando fórmulas em perspectiva de Haworth para isômeros de açúcar Desenhe as fórmulas em perspectiva de Haworth para aD manose e bLgalactose Solução A fórmula em perspectiva de Haworth para a Dma nose do Problema Resolvido 71 pode ter o grupo hidroxi la em C1 apontando para cima ou para baixo De acordo com a convençãochave para a forma a a hidroxila em C1 aponta para baixo quando C6 está para cima como é o caso na Dmanose Para a bLgalactose use a representação de Fisher da Dgalactose ver Problema Resolvido 71 para desenhar a correta representação de Fisher da Lgalactose que é a sua imagem especular os grupos hidroxila em C2 C3 C4 e C5 estão à esquerda direita direita e esquerda respectivamen te Agora desenhe a perspectiva de Haworth um anel de seis membros no qual os grupos OH em C2 C3 e C4 estão orientados para cima para baixo e para baixo respectiva mente pois na representação de Fisher eles estão à esquer da direita e direita Como essa é a forma b o OH no car bono anomérico aponta para baixo mesmo lado que C5 Os anômeros a e b da Dglicose se interconvertem em solução aquosa por um processo chamado de mutarrota ção no qual uma forma em anel por exemplo o anômero a se abre brevemente na forma linear e então se fecha novamente produzindo o anômero b Figura 76 Portanto uma solução de aDglicose e uma solução de bDglicose formarão ao final misturas de equilíbrio idênticas as quais têm propriedades ópticas idênticas Essa mistura consiste em aproximadamente um terço de aDglicose dois terços de bDglicose e quantidades muito pequenas das formas linear e em anel de cinco membros glicofuranose Fórmulas em perspectiva de Haworth como aquelas da Figura 77 são comumente utilizadas para mostrar a este reoquímica das formas em anel de monossacarídeos Po rém o anel de seis membros piranose não é planar como a perspectiva de Haworth sugere mas tende a assumir uma de duas conformações em cadeira Figura 78 Relem bre do Capítulo 1 p 1819 em que duas conformações de uma molécula são interconversíveis sem quebra de li gações covalentes enquanto duas configurações podem ser interconvertidas somente com a quebra de uma ligação covalente Para interconverter as configurações a e b a li gação envolvendo o átomo de oxigênio do anel precisa ser rompida mas a interconversão de duas formas em cadei ra que são confôrmeros não requer quebra de ligações e não altera as configurações de nenhum dos carbonos do anel As estruturas tridimensionais específicas de unidades de monossacarídeos são importantes para a determinação das propriedades biológicas e das funções de alguns polis sacarídeos como será visto Os organismos contêm diversos derivados de hexose Além das hexoses simples como glicose galactose e mano se existe uma variedade de derivados de açúcar nos quais o grupo hidroxila do composto parental é substituído por outro grupamento ou um átomo de carbono é oxidado a um grupo carboxil Figura 79 Em glicosamina galactosa mina e manosamina a hidroxila no C2 do composto pa rental está substituído por um grupo amino Normalmente o grupo amino está condensado ao ácido acético como na Nacetilglicosamina Esse derivado da glicosamina compõe muitos polímeros estruturais incluindo aqueles da parede celular de bactérias A substituição de um hidrogênio por um grupo hidroxila no C6 da Lgalactose ou Lmanose ori gina Lfucose ou Lramnose respectivamente A Lfucose é encontrada nos oligossacarídeos complexos que compõem glicoproteínas e glicolipídeos a Lramnose é encontrada em polissacarídeos vegetais 2 5 3 1 4 6 HOCH2 HO O CH2OH OH H aDFrutofuranose H OH H HOCH2 HO O CH2OH OH H bDFrutofuranose H OH H bDGlicopiranose H OH H H H CH2OH O OH H HO OH aDGlicopiranose 1 2 3 4 H OH H H H O OH H HO OH 5 CH2OH 6 H2C CH HC O CH Pirano HC HC O CH C H Furano C H FIGURA 77 Piranoses e furanoses As formas piranose da Dglicose e as formas furanose da Dfrutose estão mostradas aqui como fórmulas em perspectiva de Haworth Os limites do anel mais próximos ao leitor são re presentados por linhas mais grossas Os grupos hidroxila abaixo do plano do anel nestas perspectivas de Haworth apareceriam à direita em uma projeção de Fischer compare com a Figura 76 Pirano e furano estão mostrados para comparações Nelson6ed07indd 248 Nelson6ed07indd 248 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 249 H CH2OH CH2OH OH CH2OH O O HO OH H OH H HO H H H H OH H H OH OH Eixo Eixo Duas possíveis formas em cadeira da bDglicopiranose a H H HO OH H HO H H H OH b O Eixo aDGlicopiranose FIGURA 78 Fórmulas conformacionais de piranoses a Duas formas em cadeira do anel piranose da bglicopiranose Dois confôrmeros como estes não são prontamente interconversíveis um aporte de cerca de 46 kJ de energia por mol de açúcar é necessário para forçar a interconversão das formas em cadeira Outra conformação o barco não mostrada é vista ape nas em derivados com substituintes muito grandes b A conformação em cadeira preferencial da aDglicopiranose CH2OH H O HO NH C PO3 Ácido Nacetilmurâmico R H OH H H H CH2 H OH HO DGliconodlactona OH H OH H H CH2OH H O HO NH2 bDManosamina H OH H H H CH2OH H O OH HO OH H OH H H H H2N H O OH H OH H H H O CH3 bDGlicose Ácido murâmico CH2OH H O OH HO NH C H OH H H H O CH3 R Família da glicose H OH HO aLRamnose OH H OH H H O C O O C H OH HO bDGlicuronato OH H OH H H H O O2 CH2OH CH2OH H Ácido Nacetilneuramínico ácido siálico OH H O O bDGlicosamina CH2OH H O OH HO NH2 H OH H H H bDGalactosamina CH2OH H O OH HO CH3 H OH H H H CH2OH HO R O2 O O H H HO bDGlicose6fosfato OH H OH H OH H O NH2 H OH HO bLFucose OH H OH H H H O CH3 H Aminoaçúcares Açúcares ácidos Desoxiaçúcares O OH CH2OH H HO DGliconato OH H H H C OH H HN CH3 C O R H H 22 NAcetilbDglicosamina 5 C OH H H OH C O2 COO C H O CH3 2 R5 FIGURA 79 Alguns derivados de hexose importantes na biologia Nos aminoaçúcares um grupo 2NH2 substitui um dos grupos 2OH na he xose parental A substituição de 2H por 2OH origina um desoxiaçúcar ob serve que os desoxiaçúcares mostrados aqui ocorrem como isômeros L na natureza Os açúcares ácidos contêm um grupo carboxilato o que confere carga negativa em pH neutro DGliconodlactona é o resultado da formação de uma ligação éster entre o grupo carboxilato em C1 e o grupo hidroxila em C5 também conhecido como o carbono d do Dgliconato Nelson6ed07indd 249 Nelson6ed07indd 249 070414 1430 070414 1430 250 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A oxidação do carbono do carbonil aldeído a carbo xil na glicose produz ácido glicônico utilizado na medicina como um contraíon inócuo para a administração de fárma cos positivamente carregados tais como o quinino ou íons tais como o Ca 21 Outras aldoses originarão outros ácidos aldônicos A oxidação do carbono na outra extremidade da cadeia carbônica C6 da glicose galactose ou manose forma o ácido urônico correspondente ácidos glicurôni co galacturônico ou manurônico Tanto os ácidos aldônicos como os urônicos formam ésteres intramoleculares estáveis chamados de lactonas Figura 79 embaixo à esquerda Os ácidos siálicos constituem uma família de açúcares com o mesmo esqueleto de nove carbonos Um deles o ácido Nacetilneuramínico frequentemente chamado apenas de ácido siálico é um derivado da Nacetilmanosamina que ocorre em muitas glicoproteínas e glicolipídeos animais Os grupos ácidos carboxílicos dos derivados de açúcar ácidos estão ionizados em pH 7 e esses compostos são portanto corretamente nomeados como carboxilatos glicuronato galacturonato e assim por diante Muito frequentemente durante a síntese e o metabolis mo de carboidratos os intermediários não são os próprios açúcares mas os seus derivados fosforilados A condensa ção do ácido fosfórico com um dos grupos hidroxila de um açúcar forma um éster de fosfato como na glicose6fosfato Figura 79 o primeiro metabólito da rota por meio da qual a maioria dos organismos oxida a glicose para energia Os açúcares fosforilados são relativamente estáveis em pH neutro e têm carga negativa Um dos efeitos da fosforilação intracelular de açúcares é o confinamento do açúcar den tro da célula a maioria das células não tem transportadores para açúcares fosforilados na membrana plasmática A fos A glicose é o principal combustível para o cérebro Quan do a quantidade de glicose que chega até o cérebro é muito baixa as consequências podem ser desastrosas letargia coma dano cerebral permanente e morte ver Figura 2324 Com a evolução os animais desenvolve ram mecanismos hormonais complexos para garantir que a concentração de glicose no sangue permaneça alta o suficiente aproximadamente 5 mM para satisfazer as necessidades cerebrais mas não alta demais já que ní veis elevados de glicose no sangue também podem ter consequências fisiológicas sérias Os indivíduos com diabetes melito dependente de insulina não produzem insulina suficiente o hormônio que normalmente atua para a redução da concentração de glicose no sangue e se o diabetes não for tratado os níveis de glicose sanguínea nesses indivíduos podem elevarse ficando algumas vezes maiores do que o nor mal Acreditase que esses altos níveis de glicose sejam pelo menos uma das causas das sérias consequências de longo prazo no diabetes não tratado insuficiência renal doenças cardiovasculares cegueira e cicatrização debili tada de modo que um dos objetivos da terapia é pro ver exatamente a quantidade de insulina suficiente por injeção para manter os níveis de glicose próximos do normal Para manter o balanço correto entre exercício dieta e insulina para cada indivíduo a concentração de glicose sanguínea deve ser dosada algumas vezes ao dia e a quantidade de insulina injetada deve ser ajustada de modo apropriado As concentrações de glicose no sangue e na urina podem ser determinadas por meio de um ensaio simples para açúcares redutores como a reação de Fehling que por muitos anos foi o teste diagnóstico padrão para dia betes Dosagens modernas precisam de apenas uma gota de sangue que é adicionada a uma fita de teste contendo a enzima glicoseoxidase que catalisa a seguinte reação DGlicose 1 O2 glicoseoxidase DGliconodlactona 1 H2O2 Uma segunda enzima uma peroxidase catalisa a reação do H2O2 com um composto incolor gerando um produ to colorido quantificado com um fotômetro simples que mostra a concentração de glicose no sangue Como os níveis de glicose sanguínea variam com os períodos de refeição e exercício essas dosagens em momentos específicos não refletem a glicose sanguínea média ao longo de horas ou dias de modo que eleva ções perigosas podem passar despercebidas A concen tração de média glicose pode ser estimada pelo seu efei to na hemoglobina a proteína carreadora de oxigênio dos eritrócitos p 163 Transportadores na membrana dos eritrócitos equilibram a concentração de glicose intracelular e plasmática de modo que a hemoglobina está constantemente exposta à concentração de glicose presente no sangue qualquer que seja essa concentra ção Uma reação não enzimática ocorre entre a glicose e os grupos amino primários da hemoglobina tanto a Val aminoterminal quanto os grupos amino dos resí duos de Lys Figura Q1 A velocidade desse processo é proporcional à concentração de glicose por isso essa reação pode ser usada como base para a estimativa do nível médio de glicose sanguínea ao longo de semanas A quantidade de hemoglobina glicada HbG circulante em qualquer momento reflete a concentração de glico se sanguínea média durante o período de vida do eri trócito cerca de 120 dias embora a concentração das últimas duas semanas seja a mais importante na deter minação do nível de HbG A extensão de glicação da hemoglobina chama da assim para distinguila da glicosilação a transferência enzimática de glicose a uma proteína é medida clini camente pela extração da hemoglobina de uma pequena amostra de sangue seguida pela separação eletroforéti ca de HbG e hemoglobina não modificada aproveitando a diferença de carga resultante da modificação dos grupos amino Valores de HbG normais são cerca de 5 da hemoglobina total correspondendo à glicose san QUADRO 71 MEDICINA Dosagem de glicose sanguínea no diagnóstico e no tratamento do diabetes Nelson6ed07indd 250 Nelson6ed07indd 250 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 251 forilação também ativa açúcares para subsequente transfor mação química Alguns derivados de açúcares fosforilados importantes são componentes dos nucleotídeos discutido no próximo capítulo Os monossacarídeos são agentes redutores Os monossacarídeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves como o íon cúprico Cu 21 O carbono do carbonil é oxidado a um grupo carbo xil A glicose e outros açúcares capazes de reduzir o íon cú prico são chamados de açúcares redutores O íon cúprico oxida a glicose e certos outros açúcares a uma complexa mistura de ácidos carboxílicos Essa é a base da reação de Fehling teste semiquantitativo para a presença de açúcar redutor que por muitos anos foi utilizado para detectar e dosar níveis elevados de glicose em pessoas com diabetes melito Hoje utilizamse métodos mais sensíveis que envol vem uma enzima imobilizada em uma tira de teste e reque rem apenas uma única gota de sangue Quadro 71 Os dissacarídeos contêm uma ligação glicosídica Os dissacarídeos como maltose lactose e sacarose consis tem em dois monossacarídeos unidos covalentemente por uma ligação Oglicosídica a qual é formada quando um grupo hidroxila de uma molécula de açúcar normalmente cíclica reage com o carbono anomérico de outro Figura 710 Essa reação representa a formação de um acetal a partir de um hemiacetal como a glicopiranose e um álcool um grupo hidroxila da segunda molécula de açúcar Figu ra 75 e o composto resultante é chamado de glicosídeo guínea igual a 120 mg100 mL Em pessoas com diabe tes não tratado entretanto esse valor pode ser tão alto quanto 13 indicando um nível de glicose sanguínea médio de cerca de 300 mg100 mL ou seja perigosamen te alto Um dos critérios para o sucesso em um programa individual de terapia com insulina quando começar fre quência e quantidade de insulina injetada é a manuten ção dos valores de HbG em cerca de 7 Na reação de glicação da hemoglobina a primeira eta pa formação de uma base de Schiff é seguida por uma série de rearranjos oxidações e desidratações da porção de carboidrato produzindo uma mistura heterogênea de AGE produtos finais de glicação avançada do inglês advanced glycation end products Esses produtos podem deixar o eritrócito e formar ligações cruzadas co valentes entre as proteínas interferindo com a função normal delas Figura Q1 O acúmulo de concentrações relativamente altas de AGE em pessoas com diabetes pode causar pela ligação cruzada de proteínas críticas problemas aos rins à retina e ao sistema cardiovascular sintomas que caracterizam a doença Esse processo pato gênico é um potencial alvo para a ação de fármacos HOCH2 H OH H H OH OH Glicose Hemoglobina H HO C5O 1 H2N2R ➊ HOCH2 H OH H H OH OH Base de Schiff H HO C5N2R HOCH2 H OH H H OH H OH HO C2N2R H H ➌ ➍ ➎ Cetoamina Hemoglobina glicada HbG Ligação cruzada de proteínas Dano aos rins à retina ao sistema cardiovascular AGEs HOCH2 H OH H H OH H O HO CH22N2R HOCH2 HO O HO H H OH H H CH22N2R 2a 2b FIGURA Q1 A reação não enzimática da gli cose com um grupo amino primário na hemo globina começa com ➊ a formação de uma base de Schiff a qual ➋ sofre um rearranjo para gerar um produto estável ➌ esta cetoa mina depois se converte em sua forma cíclica originando HbG ➍ Reações seguintes geram produtos finais de glicação avançada AGE como Ncarboximetillisina e metilglioxal compostos que ➎ danificam outras proteínas ao ligálas de modo cruzado causando altera ções patológicas Nelson6ed07indd 251 Nelson6ed07indd 251 070414 1430 070414 1430 252 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Ligações glicosídicas são prontamente hidrolisadas por áci do mas resistem à clivagem por base Assim os dissacarí deos podem ser hidrolisados para originar seus componen tes monossacarídicos livres por fervura em ácido diluído Ligações Nglicosídicas unem o carbono anomérico de um açúcar a um átomo de nitrogênio em glicoproteínas ver Figura 730 e nucleotídeos ver Figura 81 A oxidação de um açúcar pelo íon cúprico a reação que define um açúcar redutor ocorre apenas com a for ma linear a qual existe em equilíbrio com as formas cíclicas Quando o carbono anomérico está envolvido em uma ligação glicosídica ou seja quando o composto for um acetal ou cetal completo ver Figura 75 a fácil inter conversão entre as formas lineares e cíclicas mostrada na Figura 76 é impedida Como o carbono do carbonil pode ser oxidado somente quando o açúcar estiver em sua for ma linear a formação de uma ligação glicosídica gera um açúcar não redutor Na descrição de dissacarídeos ou polis sacarídeos a extremidade de uma cadeia com um carbono anomérico livre não envolvido em ligação glicosídica nor malmente é chamada de extremidade redutora O dissacarídeo maltose Figura 710 contém dois resí duos de Dglicose unidos por uma ligação glicosídica entre o C1 o carbono anomérico de um resíduo de glicose e o C4 do outro Como o dissacarídeo conserva um carbono anomérico livre o C1 do resíduo de glicose à direita na Fi gura 710 a maltose é um açúcar redutor A configuração do átomo de carbono anomérico na ligação glicosídica é a O resíduo de glicose com o carbono anomérico livre pode existir nas formas piranose a ou b CONVENÇÃOCHAVE Para nomear dissacarídeos redutores como a maltose de forma não ambígua e especialmente para nomear oligossacarídeos mais complexos algumas re gras devem ser seguidas Por convenção o nome descreve o composto escrito com a extremidade não redutora à es querda e é possível construir o nome na seguinte ordem 1 Dar a configuração a ou b do carbono anomérico que une a primeira unidade de monossacarídeo à esquerda com a segunda 2 Identificar o resíduo não redutor para distinguir entre estruturas em anel de cinco e seis mem bros inserir furano ou pirano no nome 3 Indicar en tre parênteses os dois átomos de carbono unidos pela li gação glicosídica usando uma seta para conectar os dois números por exemplo 1S4 mostra que o C1 do resíduo de açúcar nomeado primeiramente está unido ao C4 do segundo 4 Identificar o segundo resíduo Se houver um terceiro resíduo descrever a segunda ligação glicosídica se guindo as mesmas convenções Para encurtar a descrição de polissacarídeos complexos abreviações de três letras ou símbolos coloridos para os monossacarídeos frequen temente são utilizados como apresentado na Tabela 71 Seguindo essa convenção para a nomenclatura de oligossa carídeos a maltose é aDglicopiranosil1S4Dglicopira nose Como em sua maioria os açúcares encontrados neste livro são os enantiômeros D e a forma piranose das hexoses é predominante geralmente se utiliza uma versão abrevia da do nome formal desses compostos dando a configuração do carbono anomérico e nomeando os carbonos unidos pela ligação glicosídica Nesta nomenclatura abreviada a malto se é Glca1S4Glc O dissacarídeo lactose Figura 711 que produz Dgalactose e Dglicose quando hidrolisado ocorre natural mente no leite O carbono anomérico do resíduo de glicose está disponível para oxidação e portanto a lactose é um dissacarídeo redutor Seu nome abreviado é Galb1S4Glc A sacarose açúcar de mesa é um dissacarídeo de glico H OH OH H H H 1 CH2OH O H OH Álcool H2O Maltose aDglicopiranosil1S4Dglicopiranose H OH OH H H H CH2OH O H OH HO aDGlicose Condensação Acetal Hidrólise H2O 3 5 6 4 1 2 H OH OH H CH2OH O H OH HO 3 5 6 4 1 2 H OH OH H H CH2OH O H H H H O bDGlicose Hemiacetal Hemiacetal O H FIGURA 710 Formação da maltose Um dissacarídeo é formado a par tir de dois monossacarídeos aqui duas moléculas de Dglicose quando um OH álcool de uma molécula à direita se condensa com o hemiacetal in tramolecular da outra à esquerda com a eliminação de H2O e a formação de uma ligação glicosídica O inverso desta reação é uma hidrólise ataque da ligação glicosídica pela água A molécula de maltose mostrada aqui conser va um hemiacetal redutor no C1 não envolvido na ligação glicosídica Como a mutarrotação interconverte as formas a e b do hemiacetal as ligações nes ta posição algumas vezes são representadas por linhas onduladas conforme mostrado aqui para indicar que a estrutura pode ser tanto a quanto b TABELA 71 Símbolos e abreviações para monossacarídeos comuns e alguns de seus derivados Abequose Abe Ácido glicurônico GLcA Arabinose Ara Galactosamina GalN Frutose Fru Glicosamina GlcN Fucose Fuc NAcetilgalactosamina GalNAc Galactose Gal NAcetilglicosamina GlcNAc Glicose Glc Ácido idurônico IdoA Manose Man Ácido murâmico Mur Ramnose Ram Ácido Nacetilmurâmico Mur2Ac Ribose Rib Ácido Nacetilneuramínico um ácido siálico Neu5Ac Xilose Xil Nota Na convenção comumente utilizada as hexoses são representadas como círculos Nacetilhexosaminas são quadrados e hexosaminas são quadrados divi didos na diagonal Todos os açúcares com a configuração glico são azuis aque les com a configuração galacto são amarelos e os açúcares mano são verdes Outros substituintes podem ser adicionados conforme a necessidade sulfato S fosfato P Oacetil OAc ou Ometil OMe Nelson6ed07indd 252 Nelson6ed07indd 252 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 253 se e frutose sintetizado por plantas mas não por animais Ao contrário de maltose e lactose a sacarose não contém um átomo de carbono anomérico livre os carbonos ano méricos de ambas as unidades monossacarídicas estão en volvidos na ligação glicosídica Figura 711 A sacarose é assim um açúcar não redutor e sua estabilidade frente à oxidação a torna uma molécula adequada para o armaze namento e o transporte de energia em plantas Na nomen clatura abreviada uma seta com duas pontas conecta os símbolos que especificam os carbonos anoméricos e suas configurações Por exemplo o nome abreviado da sacarose é ou Glca142bFru ou Frub241aGlc A sacarose é o principal produto intermediário da fotossíntese em mui tas plantas ela é a principal maneira de transportar o açú car das folhas para as outras partes do corpo da planta A trealose Glca141aGlc Figura 711 dissacarídeo de Dglicose que como a sacarose é um açúcar não redutor é um constituinte importante do fluido circulante hemolin fa de insetos servindo como composto de armazenamento de energia A lactose dá ao leite o seu sabor adocicado e a sacarose obviamente é o açúcar de mesa A trealose tam bém é comercialmente utilizada como adoçante O Quadro 72 explica a detecção do sabor doce pelos humanos e o modo de ação dos adoçantes artificiais como o aspartame RESUMO 71 Monossacarídeos e dissacarídeos c Os açúcares também chamados de sacarídeos são compostos que contêm um grupo aldeído ou cetona e dois ou mais grupos hidroxila c Os monossacarídeos geralmente contêm alguns car bonos quirais e assim existem em várias formas es tereoquímicas as quais podem ser representadas no papel como projeções de Fischer Epímeros são açúca res que diferem na configuração de apenas um átomo de carbono c Os monossacarídeos comumente formam hemiacetais ou hemicetais internos nos quais o grupo aldeído ou ce tona se une a um grupo hidroxila da mesma molécula criando uma estrutura cíclica isso pode ser represen tado como uma fórmula em perspectiva de Haworth O átomo de carbono originalmente localizado no grupo al deído ou cetona o carbono anomérico pode assumir uma de duas configurações a e b interconversíveis por mutarrotação Na forma linear do monossacarídeo em equilíbrio com as formas cíclicas o carbono anomérico é facilmente oxidável tornando o composto um açúcar redutor c Um grupo hidroxila de um monossacarídeo pode ser adicionado ao carbono anomérico de um segundo mo nossacarídeo formando um acetal chamado de glicosí deo Nesse dissacarídeo a ligação glicosídica protege o carbono anomérico de oxidação tornandoo um açúcar não redutor c Oligossacarídeos são polímeros curtos com alguns mo nossacarídeos unidos por ligações glicosídicas Em uma das extremidades da cadeia a extremidade redutora está uma unidade de monossacarídeo com seu carbono anomérico não envolvido em uma ligação glicosídica c A nomenclatura comum para di ou oligossacarídeos es pecifica a ordem das unidades de monossacarídeos a configuração de cada carbono anomérico e os átomos de carbono participantes das ligaçãoões glicosídicas 72 Polissacarídeos A maioria dos carboidratos encontrados na natureza ocorre como polissacarídeos polímeros de média a alta massa mo lecular Mr 20000 Os polissacarídeos também chama dos de glicanos diferem uns dos outros na identidade das unidades de monossacarídeos repetidas no comprimento das cadeias nos tipos de ligações unindo as unidades e no grau de ramificação Os homopolissacarídeos contêm somente uma única espécie monomérica os heteropolis sacarídeos contêm dois ou mais tipos diferentes Figu ra 712 Alguns homopolissacarídeos como o amido e o glicogênio servem como formas de armazenamento para monossacarídeos utilizados como combustíveis Outros ho mopolissacarídeos como a celulose e a quitina atuam como elementos estruturais em paredes celulares de plantas e em exoesqueletos de animais Os heteropolissacarídeos Sacarose bDfrutofuranosil aDglicopiranosídeo 4 5 a 1 2 H HOCH2 H HO HO 3 5 6 4 1 2 H OH OH H H CH2OH O H H O 6 b Trealose aDglicopiranosil aDglicopiranosídeo 3 5 a 4 1 2 H OH OH H O H OH HO 3 5 6 4 1 2 H OH OH H H CH2OH O H H H H O 6 a O OH H CH2OH 3 Glca141aGlc Lactose forma b bDgalactopiranosil1S4bDglicopiranose Galb1S4Glc 3 5 b 4 1 2 H OH OH H CH2OH O H OH HO 3 5 6 4 1 2 H OH OH H H CH2OH O H H H H O 6 b HOCH2 Glca142bFru Fru2b4a1Glc FIGURA 711 Dois dissacarídeos comuns Como a maltose da Figura 710 estes dissacarídeos estão representados como perspectivas de Ha worth O nome comum o nome sistemático completo e a abreviação es tão mostrados para cada dissacarídeo A nomenclatura formal da sacarose nomeia a glicose como o glicosídeo parental embora a sacarose seja nor malmente representada como mostrado com a glicose à esquerda As duas nomenclaturas abreviadas mostradas para a sacarose são equivalentes K Nelson6ed07indd 253 Nelson6ed07indd 253 070414 1430 070414 1430 254 DAVID L NELSON MICHAEL M COX fornecem suporte extracelular para organismos de todos os reinos Por exemplo a camada rígida do envelope celu lar bacteriano o peptidoglicano é parcialmente composta por um heteropolissacarídeo construído por duas unidades alternadas de monossacarídeo ver Figura 2030 Nos teci dos animais o espaço extracelular é preenchido por alguns tipos de heteropolissacarídeos os quais formam uma matriz que conecta células individuais e fornece proteção forma e suporte para células tecidos e órgãos Ao contrário das proteínas os polissacarídeos geral mente não têm massas moleculares definidas Essa dife rença é uma consequência dos mecanismos de construção dos dois tipos de polímero Como será visto no Capítulo 27 as proteínas são sintetizadas a partir de um molde o RNA mensageiro com sequência e comprimento defi nidos por enzimas que seguem exatamente esse molde Para a síntese de polissacarídeos não existe molde em vez disso o programa de síntese de polissacarídeos é in trínseco às enzimas que catalisam a polimerização das unidades monoméricas e não há um ponto de parada específico no processo sintético os produtos portanto variam em comprimento O doce é um dos cinco sabores básicos que os huma nos podem sentir Figura Q1 os outros são azedo amargo salgado e umami O sabor doce é detectado por receptores proteicos presentes na membrana plas mática das células gustativas nas papilas gustativas da superfície da língua Em humanos dois genes bastante relacionados T1R2 e T1R3 codificam os receptores para o sabor doce Figura Q2 Quando uma molécula com uma estrutura compatível ligase a esses recepto res no domínio extracelular de uma célula gustativa ela desencadeia uma série de eventos dentro da célula in cluindo a ativação de uma proteína ligadora de GTP ver Figura 1242 que levam à emissão de um sinal elétrico para o cérebro que é então interpretado como doce Durante a evolução houve provavelmente a seleção para a capacidade de saborear os compostos presen tes nos alimentos contendo nutrientes importantes como os carboidratos que são o principal combustível QUADRO 72 O açúcar é doce assim como o são outras coisas mais Proteína ligada ao GTP inativa Proteína ligada ao GTP ativa T1R3 Glicose Sacarose Frutose Alitame Neotame Aspartame Sucralose Brazeína Brazeína CRD T1R2 FIGURA Q2 O receptor para substâncias com sabor doce com indi cação de suas regiões de interação com vários compostos doces setas curtas Cada receptor tem um domínio extracelular um domínio rico em cisteína CRD e um domínio de membrana com sete hélices transmem brana característica comum em receptores de sinalização Os adoçantes artificiais se ligam a apenas uma das duas subunidades do receptor os açúcares naturais se ligam às duas Consulte no Capítulo 1 Problema 14 as estruturas de muitos desses adoçantes artificiais FIGURA Q1 Um formidável estímulo para os receptores do sabor doce Homopolissacarídeos Não ramificado Ramificado Heteropolissacarídeos Dois tipos de monômeros não ramificado Múltiplos tipos de monômeros ramificado FIGURA 712 Homo e heteropolissacarídeos Os polissacarídeos po dem ser compostos por um dois ou alguns monossacarídeos diferentes em cadeias lineares ou ramificadas de vários comprimentos Nelson6ed07indd 254 Nelson6ed07indd 254 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 255 Alguns homopolissacarídeos são formas de estocagem de combustível Os polissacarídeos de armazenamento mais importantes são o amido em células vegetais e o glicogênio em célu las animais Ambos ocorrem intracelularmente em gran des agrupamentos ou grânulos As moléculas de amido e glicogênio são extremamente hidratadas pois têm muitos grupos hidroxila expostos e disponíveis para formarem li gações de hidrogênio com a água A maioria das células ve getais possui a capacidade de sintetizar amido ver Figura 202 e o seu armazenamento é especialmente abundante em tubérculos como a batata e em sementes O amido contém dois tipos de polímero de glicose ami lose e amilopectina Figura 713 A amilose consiste em cadeias longas não ramificadas de resíduos de Dglicose conectados por ligações a1S4 como na maltose A massa molecular dessas cadeias varia entre alguns milhares até mais de um milhão A amilopectina também tem mas sa molecular elevada até 200 milhões mas ao contrário da amilose é altamente ramificada As ligações glicosídicas que unem os resíduos de glicose sucessivos nas cadeias de amilopectina são a1S4 nos pontos de ramificação que ocorrem a cada 24 a 30 resíduos são ligações a1S6 O glicogênio é o principal polissacarídeo de armazena mento das células animais Como a amilopectina o glico gênio é um polímero de subunidades de glicose ligadas por ligações a1S4 com ligações a1S6 nas ramificações o glicogênio porém é mais ramificado em média a cada 8 a 12 resíduos e mais compacto do que o amido O glicogênio é especialmente abundante no fígado onde pode constituir até 7 do peso líquido ele também está presente no mús culo esquelético Nos hepatócitos o glicogênio é encon trado em grandes grânulos os quais são agrupamentos de grânulos menores compostos por moléculas únicas de glico gênio altamente ramificadas com massa molecular média de alguns milhões Esses grânulos de glicogênio também apresentam firmemente ligadas as enzimas responsáveis pela síntese e degradação do glicogênio Como cada ramificação do glicogênio termina com uma unidade de açúcar não redutora uma molécula de glicogê nio com n ramificações tem n 1 1 extremidades não re dutoras mas apenas uma extremidade redutora Quando o glicogênio é utilizado como fonte de energia as unidades de para a maioria dos organismos A maioria dos açúcares simples incluindo a sacarose a glicose e a frutose tem sabor doce mas existem outras classes de compostos que também se ligam aos receptores do sabor doce os aminoácidos glicina alanina e serina são suavemente doces e inócuos o nitrobenzeno e o etileno glicol têm um sabor doce forte porém são tóxicos Consulte no Quadro 182 um notável mistério médico envolvendo o envenenamento por etilenoglicol Alguns produtos naturais são extraordinariamente doces o esteviosídeo derivado de açúcar isolado das folhas da planta estévia Stevia rebaudiana Bertoni é algumas centenas de vezes mais doce do que o volume equivalente de saca rose açúcar de mesa e a pequena proteína 54 ami noácidos brazeína isolada dos frutos da trepadeira Pentadiplandra brazzeana Baillon com ocorrência no Gabão e em Camarões é 17000 vezes mais doce do que a sacarose em comparação molar Presumese que o sabor doce desses frutos encoraje o seu consumo por animais que então dispersam geograficamente as se mentes estimulando o crescimento de novas plantas Existe um grande interesse no desenvolvimento de adoçantes artificiais para auxiliar na redução do peso compostos que forneçam aos alimentos sabor doce sem adicionar as calorias encontradas nos açúcares O ado çante artificial aspartame demonstra a importância da estereoquímica na biologia Figura Q3 De acordo com um modelo simples para a ligação ao receptor do sabor doce a ligação envolve três sítios do receptor AH 1 B e X O sítio AH 1 contém algum grupo álcool ou amino que pode formar uma ligação de hidrogênio com uma carga parcialmente negativa como o oxigênio do carbo nil da molécula doce o ácido carboxílico do aspartame contém um oxigênio deste tipo O sítio B contém um grupo com um oxigênio parcialmente negativo disponível para formar uma ligação de hidrogênio com algum átomo parcialmente positivo da molécula doce tal como o grupo amino do aspartame O sítio X é orientado perpendicular mente aos outros dois grupos e é capaz de interagir com uma região hidrofóbica da molécula doce tal como o anel benzeno do aspartame Quando o pareamento match estiver correto como na Figura Q3 à esquerda o receptor do sabor doce será estimulado e o sinal doce será conduzido ao cérebro Quando o pareamento não estiver correto como na Figura Q3 à direita o receptor do sabor doce não será estimulado na verdade neste caso outro re ceptor para o sabor amargo será estimulado pelo este reoisômero errado do aspartame Estereoisomerismo realmente importa T1R2 Sabor doce LL ou SS Aspartame DL ou RS Aspartame B2 AH1 X Sabor amargo B2 AH1 X 1R2 LL ou Aspa B2 X B2 FIGURA Q3 A base estereoquímica para o sabor dos dois isômeros do aspartame Nelson6ed07indd 255 Nelson6ed07indd 255 070414 1430 070414 1430 256 DAVID L NELSON MICHAEL M COX glicose são removidas uma de cada vez a partir da extremi dade não redutora As enzimas de degradação que atuam somente em extremidades não redutoras podem trabalhar simultaneamente nas muitas ramificações acelerando a conversão do polímero em monossacarídeos Por que não armazenar a glicose em sua forma mono mérica Calculase que os hepatócitos armazenam uma concentração de glicogênio equivalente a 04 M de glicose A concentração existente de glicogênio que é insolúvel e contribui pouco para a osmolaridade do citosol é de cer ca de 001 mM Se o citosol contivesse 04 M de glicose a osmolaridade seria perigosamente elevada causando uma entrada osmótica de água que poderia romper a célula ver Figura 213 Além disso com a concentração de glicose interna igual a 04 M e a concentração externa igual a 5 mM a concentração no sangue de um mamífero a variação de energia livre para o transporte de glicose para dentro das células contra este gradiente de concentração tão alto seria proibitivamente grande As dextranas são polissacarídeos de bactérias e leve duras compostos por resíduos de Dglicose em ligações a1S6 todos têm ramificações a1S3 e alguns também têm ramificações a1S2 ou a1S4 A placa dentária formada por bactérias que crescem na superfície dos den tes é rica em dextranas as moléculas adesivas que permi tem às bactérias grudaremse nos dentes e umas às outras As dextranas também fornecem uma fonte de glicose para o metabolismo bacteriano Dextranas sintéticas são utili zadas em alguns produtos comerciais p ex Sephadex que servem para o fracionamento de proteínas por meio de cromatografia por exclusão de tamanho ver Figura 317b As dextranas nesses produtos são quimicamente ligadas por ligações cruzadas para formarem materiais insolúveis de vários tamanhos Alguns homopolissacarídeos têm funções estruturais A celulose substância fibrosa resistente e insolúvel em água é encontrada na parede celular de plantas particu larmente em caules troncos e todas as porções amadeira das do corpo da planta e constitui grande parte da mas sa da madeira e quase a totalidade da massa do algodão Como a amilose a celulose é um homopolissacarídeo linear e não ramificado constituído por 10000 a 15000 unidades de Dglicose Entretanto existe uma importante diferença na celulose os resíduos de Dglicose têm a configuração b Figura 714 enquanto na amilose a glicose está em configuração a Os resíduos de glicose na celulose estão ligados por ligações glicosídicas b1S4 ao contrário das ligações a1S4 da amilose Devido à essa diferença as moléculas individuais de celulose e amilose dobramse es pacialmente de maneiras diferentes dando a essas molécu las estruturas macroscópicas e propriedades físicas muito diferentes ver a seguir A natureza rígida e fibrosa da 4 1 H OH OH H CH2OH O H 4 a H OH OH H CH2OH H H H O 1 H H a H 4 a H OH OH H CH2OH O H H O 1 O a 3 5 2 O 6 H 4 H OH OH H CH2OH O H H O 1 a Amilose Extremidade redutora Extremidade não redutora c Extremidades redutoras Amilose Extremidades não redutoras Amilopectina Ponto de ramificação a1S6 6 O H 4 H OH OH H CH2OH O H H O 1 6 H 4 H OH OH H CH2 O H H O 1 O A Cadeia principal b Ramificação Ponto de ramificação a1S6 FIGURA 713 Glicogênio e amido a Segmento curto de amilose polí mero linear de resíduos de Dglicose em ligações a1S4 Uma única cadeia pode conter alguns milhares de resíduos de glicose A amilopectina tem trechos de resíduos ligados de maneira similar situados entre pontos de ra mificação O glicogênio tem a mesma estrutura básica porém é mais ramifi cado do que a amilopectina b Ponto de ramificação a1S6 no glicogênio ou na amilopectina c Agrupamento de amilose e amilopectina como o que supostamente ocorre nos grânulos de amido Fitas de amilopectina em preto formam estruturas em hélice dupla umas com as outras ou com fitas de amilose em azul A amilopectina tem pontos de ramificação a1S6 frequentes em vermelho Os resíduos de glicose nas extremidades não redutoras das ramificações mais externas são removidos enzimaticamente durante a mobilização do amido para produção de energia O glicogênio tem estrutura similar porém é mais ramificado e mais compacto Nelson6ed07indd 256 Nelson6ed07indd 256 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 257 celulose a torna útil para produtos comerciais como pape lão e material para isolamento e ela é um dos principais componentes dos tecidos de algodão e linho A celulose é também a matériaprima para a produção comercial de ce lofane e seda artificial rayon O glicogênio e o amido ingeridos na dieta são hidroli sados por aamilases e glicosidases enzimas presentes na saliva e no intestino que rompem ligações glicosídicas a1S4 entre as unidades de glicose A maioria dos animais vertebrados não consegue utilizar a celulose como uma fon te combustível pois eles carecem de uma enzima que hi drolise ligações b1S4 Os cupins digerem a celulose e portanto a madeira prontamente mas somente porque carregam no trato intestinal um microrganismo simbiótico Trichonympha que secreta celulase enzima que hidroli sa as ligações b1S4 Figura 715 Estudos de genética molecular têm revelado que os genes que codificam as en zimas para a degradação da celulose estão presentes nos genomas de uma ampla gama de animais invertebrados incluindo artrópodes e nematódeos Existe uma exceção importante para a ausência da celulase nos vertebrados os animais ruminantes tais como gado ovelhas e cabras car regam no rúmen o primeiro dos quatro compartimentos de seus estômagos microrganismos simbióticos que con seguem hidrolisar a celulose permitindo que estes animais degradem a celulose das gramíneas macias de sua dieta mas não de plantas arbustivas A fermentação no rúmen gera acetato propionato e bhidroxibutirato que o animal utiliza para sintetizar os açúcares do leite p 560 A biomassa tal como a gramínea Panicum virgatum rica em celulose pode ser utilizada como matériaprima para a fermentação de carboidratos a etanol para ser utili zado com um aditivo na gasolina A produção de biomassa anual na Terra realizada principalmente pelos organismos fotossintéticos é o equivalente energético de aproximada mente um trilhão de barris de petróleo quando convertida a etanol por meio da fermentação Devido à sua potencial utilidade para a conversão de biomassa em bioenergia as enzimas que degradam a celulose tais como a celulase es tão sob intensa investigação Complexos supramoleculares chamados celulosomos encontrados na superfície externa da bactéria Clostridium cellulolyticum incluem a subuni dade catalítica da celulase juntamente com proteínas que unem uma ou mais moléculas de celulase à superfície bac teriana e uma subunidade que se liga à celulose e a posicio na no sítio catalítico Uma fração principal da biomassa fotossintética está na porção amadeirada das plantas e árvores a qual consiste em celulose e outros polímeros derivados de carboidratos não facilmente digeríveis tanto química como biologica mente As ligninas por exemplo formam aproximadamen te 30 da massa da madeira Sintetizadas a partir de pre cursores que incluem a fenilalanina e a glicose as ligninas são polímeros complexos com ligações cruzadas covalentes com a celulose que complicam a digestão da celulose pela celulase Para que as plantas lenhosas sejam utilizadas para a produção de etanol a partir de biomassa maneiras melho res para digerir os componentes da madeira precisarão ser encontradas A quitina é um homopolissacarídeo linear composto por resíduos de Nacetilglicosamina em ligações b1S4 Figura 716 A única diferença química em comparação com a celulose é a substituição de um grupo de hidroxila em C2 por um grupo de amina acetilado A quitina forma fibras longas similares às fibras da celulose e como a celu lose não pode ser digerida por vertebrados A quitina é o principal componente dos exoesqueletos duros de aproxi madamente 1 milhão de espécies de artrópodes insetos lagostas e caranguejos por exemplo e é provavelmente o segundo polissacarídeo mais abundante na natureza depois da celulose estimase que 1 bilhão de toneladas de quitina são produzidas a cada ano na biosfera Fatores estéricos e ligações de hidrogênio influenciam o enovelamento dos homopolissacarídeos O enovelamento de polissacarídeos em três dimensões segue os mesmos princípios que governam a estrutura de polipeptídeos Subunidades com estrutura relativamente rí gida ditada por ligações covalentes formam estruturas ma cromoleculares tridimensionais estabilizadas por interações fracas dentro da própria molécula ou intermoleculares tais como ligações de hidrogênio interações hidrofóbicas inte rações de van der Waals e para polímeros com subunidades carregadas interações eletrostáticas Como os polissacarí deos têm muitos grupos hidroxila as ligações de hidrogênio OH HO Unidades de Dglicose ligadas por ligações b1S4 O O O HO OH O OH OH 4 6 5 2 1 3 O FIGURA 714 Celulose Duas unidades de uma cadeia de celulose os resíduos de Dglicose estão em ligações b1S4 As rígidas estruturas em cadeira podem rotar uma em relação à outra FIGURA 715 Degradação da celulose por Trichonympha protista do estômago dos cupins da madeira O Trichonympha produz a enzima ce lulase que hidrolisa as ligações glicosídicas b1S4 da celulose tornando a madeira uma fonte metabolizável de açúcar glicose para o protista e para o cupim Embora diversos invertebrados consigam digerir a celulose ape nas alguns vertebrados o fazem os ruminantes como o gado as ovelhas e as cabras os ruminantes são capazes de utilizar a celulose como alimento porque o primeiro dos seus quatro compartimentos estomacais o rúmen é colonizado por bactérias e protistas que secretam celulase Nelson6ed07indd 257 Nelson6ed07indd 257 070414 1430 070414 1430 258 DAVID L NELSON MICHAEL M COX têm uma influência especialmente importante em suas es truturas O glicogênio o amido e a celulose são compostos por subunidades de piranose o anel de seis membros as sim como os oligossacarídeos de glicoproteínas e glicolipí deos a serem discutidos a seguir Tais moléculas podem ser representadas como uma série de rígidos anéis de piranose conectados por um átomo de oxigênio que une dois átomos de carbono a ligação glicosídica Existe em princípio li vre rotação ao redor de ambas as ligações CO que ligam os resíduos Figura 714 porém como nos polipeptídeos ver Figuras 42 e 49 a rotação ao redor de cada ligação é limi tada pelo impedimento estérico gerado pelos substituintes As estruturas tridimensionais dessas moléculas podem ser descritas nos termos dos ângulos de diedro da ligação gli cosídica Figura 717 análogos aos ângulos f e c forma dos pela ligação peptídica ver Figura 42 O volume do anel de piranose e seus substituintes e os efeitos eletrônicos sobre o carbono anomérico cons tringem os ângulos f e c assim certas conformações são muito mais estáveis do que outras como pode ser mos trado por um mapa da energia em função destes ângulos Figura 718 A estrutura tridimensional mais estável para as cadeias ligadas por ligações a1S4 do amido e do glicogênio é uma hélice firmemente enrolada Figura 719 esta bilizada por ligações de hidrogênio entre as cadeias Na amilose que não é ramificada essa estrutura é regular o suficiente para permitir a cristalização e portanto a de terminação da estrutura por difração de raios X O plano médio de cada resíduo ao longo da cadeia da amilose for ma um ângulo de 60 o com o plano médio do resíduo pre decessor de modo que a estrutura em hélice tem seis re síduos por volta Para a amilose o centro da hélice tem FIGURA 716 Quitina a Segmento curto de quitina ho mopolímero de unidades de NacetilDglicosamina em liga ções b1S4 b Besouro Pelidnota punctata com sua arma dura exoesqueleto de quitina a b O H H H O HO 1 1 1 1 1 1 4 4 4 4 HO O O O O O CH2OH CH2OH HO O CH2OH O 6 6 5 O O C O CH2 HO HO O O HO CH2OH OH OH O HO HO HO f c f f c v c Celulose Repetições de b1S4Glc Amilose Repetições de a1S4Glc Dextrana Repetições de a1S6Glc com ramificações a1S3 não mostradas FIGURA 717 Conformação das ligações glicosídicas da celulose amilose e dextrana Os polímeros estão representados como rígidos anéis de piranose unidos por ligações glicosídicas com livre rotação ao redor des sas ligações Observe que na dextrana também existe livre rotação ao redor da ligação entre C5 e C6 o ângulo de torção v ômega Nelson6ed07indd 258 Nelson6ed07indd 258 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 259 precisamente as dimensões corretas para acomodar íons complexos de iodo I 3 e I5 formando um complexo azul intenso Essa interação é a base de um teste qualitativo comum para a presença de amilose Para a celulose a conformação mais estável é aquela na qual cada cadeira gira 180 o em relação aos vizinhos o que gera uma cadeia reta e estendida Todos os grupos OH es tão disponíveis para ligações de hidrogênio com as cadeias vizinhas Com algumas cadeias estendendose lado a lado uma rede estabilizada por ligações de hidrogênio interca deia e intracadeia produz fibras supramoleculares retas e estáveis com grande resistência à tensão Figura 720 Essa propriedade da celulose a tem feito uma substância útil para as civilizações por milênios Muitos produtos ma nufaturados incluindo papiro papel papelão viscose iso lantes e vários outros materiais úteis são derivados da ce lulose O conteúdo de água desses materiais é baixo porque o grande número de ligações de hidrogênio entre as cadeias das moléculas de celulose esgota sua capacidade para for mação de ligações de hidrogênio As paredes celulares de bactérias e algas contêm heteropolissacarídeos estruturais O componente rígido das paredes celulares bacterianas o peptidoglicano é um heteropolímero de resíduos alterna dos de Nacetilglicosamina e ácido Nacetilmurâmico uni dos por ligações b1S4 ver Figura 2030 Os polímeros lineares encontramse lado a lado na parede celular cruza damente ligados por peptídeos curtos cuja estrutura exata depende da espécie bacteriana As ligações cruzadas dos peptídeos juntam as cadeias de polissacarídeo em uma bai nha resistente peptidoglicano que envolve a célula inteira e impede o inchaço e a lise celular devidos à entrada osmó tica de água A enzima lisozima é bactericida por hidrolisar as ligações glicosídicas b1S4 entre Nacetilglicosamina d fc 5 3082408 d fc 5 21708 21708 a b c f FIGURA 718 Mapa das conformações mais comuns em oligossa carídeos e polissacarídeos Os ângulos de torção f e c ver Figura 717 que definem as relações espaciais entre anéis adjacentes podem em prin cípio ter qualquer valor entre 0 o e 360 o Na verdade alguns dos ângulos de torção originariam conformações estericamente impedidas enquanto outros originam conformações que maximizam a formação de ligações de hidrogênio a Quando a energia relativa S para cada valor de f e c é re presentada em um gráfico com os contornos de isoenergia mesma ener gia representados em intervalos de 1 kcalmol acima do estado de energia mínima o resultado é um mapa das conformações preferenciais Este mapa é análogo ao gráfico de Ramachandran para peptídeos ver Figuras 43 e 49 b Dois extremos energéticos para o dissacarídeo Galb1S3Gal estes valores estão representados no diagrama de energia a pelos círculos ver melho e azul O círculo vermelho indica a conformação menos favorecida o círculo azul indica a conformação mais favorecida As conformações conhe cidas dos três polissacarídeos mostrados na Figura 717 foram determina das por cristalografia por raios X e todas estão dentro das regiões de menor energia do mapa b CH2OH O HO Unidades de Dglicose ligadas por ligações a1S4 a OH HO CH2OH HO O O O FIGURA 719 A estrutura helicoidal do amido amilose a Na con formação mais estável por causa das rígidas cadeiras adjacentes a cadeia polissacarídica é curva em vez de reta como a da celulose ver Figura 714 b Modelo de um segmento da amilose para maior clareza os grupos hi droxila de apenas um resíduo de glicose estão representados Compare os dois resíduos sombreados em cor salmão com as estruturas químicas em a Pela conformação das ligações a1S4 na amilose na amilopectina e no gli cogênio estes polímeros formam estruturas firmes em hélice enrolada Estas estruturas compactas originam os densos grânulos de armazenamento de amido ou glicogênio observados em muitas células ver Figura 202 Nelson6ed07indd 259 Nelson6ed07indd 259 070414 1430 070414 1430 260 DAVID L NELSON MICHAEL M COX e ácido Nacetilmurâmico ver Figura 627 essa enzima é encontrada nas lágrimas dos seres humanos onde é pre sumivelmente uma defesa contra infecções bacterianas nos olhos e é também produzida por certos vírus de bactérias para garantir que o vírus seja liberado de dentro da célula bacteriana hospedeira etapa essencial do ciclo de infecção viral A penicilina e os antibióticos relacionados são bacte ricidas por impedirem a formação das ligações cruzadas tornando a parede celular muito fraca para resistir à lise osmótica ver p 224 Certas algas marinhas vermelhas têm paredes celulares que contêm ágar mistura de heteropolissacarídeos sulfa tados compostos por Dgalactose e um derivado de Lgalac tose unidos entre C3 e C6 por uma ligação éter O ágar é uma complexa mistura de polissacarídeos todos com o mesmo esqueleto estrutural mas sendo substituídos por di ferentes quantidades de sulfato e piruvato A agarose Mr 150000 é o componente do ágar que possui menos gru pamentos carregados sulfatos piruvatos Figura 721 Sua propriedade singular de formar géis a torna útil nos la boratórios de bioquímica Quando uma suspensão de agaro se em água é aquecida e depois resfriada a agarose forma uma hélice dupla duas moléculas em orientação paralela se enrolam uma na outra com uma volta da hélice a cada três resíduos moléculas de água ficam retidas na cavidade central Essas estruturas helicoidais se associam umas com as outras para formar um gel uma matriz tridimensional que retém grandes quantidades de água Géis de agarose são utilizados como suportes inertes para a separação ele troforética de ácidos nucleicos uma parte essencial do pro cesso de sequenciamento de DNA p 302 O ágar também é utilizado para formar uma superfície para o crescimento de colônias bacterianas Outra utilidade comercial do ágar é a produção de cápsulas nas quais alguns medicamentos e vitaminas são encapsulados o ágar seco dissolvese pronta mente no estômago e é metabolicamente inerte Os glicosaminoglicanos são heteropolissacarídeos da matriz extracelular O espaço extracelular dos tecidos dos animais multicelula res é preenchido com um material semelhante a gel a ma triz extracelular MEC também chamada de substân cia fundamental que mantém as células unidas e provê um meio poroso para a difusão de nutrientes e oxigênio para cada célula A MEC que circunda fibroblastos e outras cé lulas do tecido conectivo é composta por uma rede entre laçada de polissacarídeos e proteínas fibrosas como coláge nos elastinas e fibronectinas fibrilares A membrana basal é uma MEC especializada sobre a qual se assentam as células epiteliais ela é constituída por colágenos especializados lamininas e heteropolissacarídeos Esses heteropolissaca rídeos os glicosaminoglicanos formam uma família de polímeros lineares compostos por unidades de dissacarídeo repetidas Figura 722 Os glicosaminoglicanos são ex clusivos de animais e bactérias não sendo encontrados em plantas Um dos dois monossacarídeos é obrigatoriamente Nacetilglicosamina ou Nacetilgalactosamina o outro na maioria dos casos é um ácido urônico geralmente ácido D glicurônico ou ácido Lidurônico Alguns glicosaminoglica nos contêm grupos sulfato esterificados A combinação dos grupos sulfato com os grupos carboxilato dos resíduos de ácido urônico gera uma densidade muito grande de cargas negativas Para minimizar as forças de repulsão entre gru pos vizinhos carregados essas moléculas adotam em solu ção uma conformação estendida formando uma hélice em formato de bastão na qual os grupos carboxilato negativa mente carregados situamse em lados alternados da hélice como mostrado para a heparina na Figura 722 O formato de bastão estendido também leva à maior separação pos sível entre os grupos sulfato negativamente carregados O padrão de resíduos de açúcar sulfatados e não sulfatados específico para cada glicosaminoglicano proporciona que diferentes ligantes proteicos os quais se ligam eletrosta ticamente aos glicosaminaglicanos sejam reconhecidos especificamente Os glicosaminoglicanos sulfatados são li gados a proteínas extracelulares para formarem proteogli canos Seção 73 O glicosaminoglicano ácido hialurônico hialuronana contém resíduos alternados de ácido Dglicurônico e Nace 4 6 5 2 1 3 5 FIGURA 720 Cadeias de celulose Representação em escala de segmen tos de duas cadeias de celulose paralelas mostrando a conformação dos re síduos de Dglicose e as ligações de hidrogênio formando ligações cruzadas Na unidade de hexose embaixo à esquerda estão representados todos os átomos de hidrogênio nas outras três unidades de hexose os hidrogênios ligados ao carbono foram omitidos para maior clareza já que não participam de ligações de hidrogênio Agarose 3DGalb1S436anidroLGal2S unidades de repetição a1 HO OH O 3 3 1 2 2 5 5 4 6 6 O CH2OH OSO3 2 O O 1 4 CH2 O FIGURA 721 Agarose As unidades repetidas da agarose são constituídas por Dgalactose unidas por ligação b1S4 a 36anidroLgalactose na qual uma ligação éter conecta C3 e C6 Essas unidades são ligadas por ligações glicosídicas a1S3 formando polímeros com um comprimento de 600 a 700 resíduos Uma pequena fração dos resíduos de 36anidroLgalactose contém um éster de sulfato em C2 como mostrado aqui Os parênteses abertos no nome sistemático indicam que as unidades repetidas estendem se a partir das duas extremidades Nelson6ed07indd 260 Nelson6ed07indd 260 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 261 tilglicosamina Figura 722 Contendo até 50000 repeti ções da unidade dissacarídica básica o ácido hialurônico tem massa molecular de alguns milhões ele forma soluções claras altamente viscosas que funcionam como lubrifican tes no líquido sinovial das articulações e geram a consistên cia gelatinosa do humor vítreo nos olhos dos vertebrados a palavra grega hyalos significa vidro o ácido hialurônico pode ter aparência vítrea ou translúcida O ácido hialurô nico também é um componente da matriz extracelular de cartilagens e tendões onde auxilia na resistência à tensão e elasticidade devido à sua forte interação não covalente com outros componentes da matriz A hialuronidase enzima se cretada por certas bactérias patogênicas hidrolisa as liga ções glicosídicas do ácido hialurônico tornando os tecidos mais suscetíveis à infecção bacteriana Em muitas espécies animais uma enzima similar presente no espermatozoide hidrolisa o revestimento de glicosaminoglicano que envolve o óvulo permitindo a penetração do espermatozoide Os outros glicosaminoglicanos diferem do ácido hialurô nico em três aspectos em geral são polímeros muito mais curtos estão covalentemente ligados a proteínas específi cas proteoglicanos e uma ou as duas unidades monomé ricas são diferentes daquelas do ácido hialurônico O sul fato de condroitina do grego chondros cartilagem auxilia na resistência à tensão das cartilagens dos tendões dos ligamentos e das paredes da aorta O dermatansulfato do grego derma pele auxilia na flexibilidade da pele e também está presente em vasos sanguíneos e válvulas car díacas Nesse polímero muitos dos resíduos de glicuronato presentes no sulfato de condroitina estão substituídos por seu 5epímero LiduronatoIdoA H H H H H H H H H O HO HO OH OH OH OH OH OH COO2 COO2 O aLIduronato IdoA bDGlicuronato GlcA Os queratansulfatos do grego keras chifre não contêm ácido urônico e o conteúdo de sulfato é variável Estão presentes em cartilagens ossos e várias estruturas córneas formadas por células mortas chifres cabelos cas cos unhas e garras O heparansulfato do grego hépar fígado originalmente isolado de fígado de cachorro é sintetizado por todas as células animais e contém arranjos variados de açúcares sulfatados e não sulfatados Os seg mentos sulfatados da cadeia permitem a interação com um grande número de proteínas incluindo fatores de cresci H OH H CH2 O H H HO H CH2OH H H H H O H H CH2OH O H H OH OH H H H H OSO3 NH O O C CH3 Gal H O GlcNAc H H CH2OH O H HO H OH OH H H H b1S4 b1S4 b1S3 b1S3 b1S3 b1S4 a1S4 a1S4 H H COO2 NH O C CH3 GlcA H O COO2 O O O 2O3SO GlcA H OH NH O C CH3 Glicosaminoglicano Dissacarídeo repetido Segmento de heparina Número de dissacarídeos por cadeia Ácido hialurônico Condroitina 4sulfato Queratan sulfato 50000 2060 25 H GalNAc4S GlcNAc6S 2 O O H H CH2 O H H H H COO2 H H H O OSO3 NH H OH Heparina 1590 2 OSO3 2 OSO3 2 SO3 2 O GlcNS3S6S IdoA2S O FIGURA 722 Unidades repetidas de alguns glicosaminoglicanos comuns na matriz extracelular Os glicosaminoglicanos são copolíme ros de resíduos alternados de ácido urônico e aminoaçúcares o queratan sulfato é uma exceção com ésteres de sulfato presentes em diferentes posições exceto no ácido hialurônico Os grupos ionizados carboxilato e sulfato em vermelho nas fórmulas em perspectiva criam a alta carga nega tiva característica destes polímeros A heparina utilizada terapeuticamente contém principalmente ácido idurônico IdoA e uma proporção menor de ácido glicurônico GlcA não mostrado em geral sendo altamente sulfatada e de comprimento heterogêneo O modelo em volume atômico mostra um segmento da estrutura da heparina em solução como determinada por es pectroscopia de RMN PDB ID 1HPN Os carbonos no sulfato do ácido idurô nico estão em azul os carbonos no sulfato de glicosamina estão em verde O oxigênio e o enxofre estão representados nas cores vermelho e amarelo respectivamente Os átomos de hidrogênio não estão mostrados para maior clareza O heparansulfato não mostrado é similar à heparina mas contém uma proporção maior de GlcA e menos grupos sulfato distribuídos em um padrão menos regular Nelson6ed07indd 261 Nelson6ed07indd 261 070414 1430 070414 1430 262 DAVID L NELSON MICHAEL M COX mento e componentes da matriz extracelular assim como várias enzimas e fatores presentes no plasma A heparina é uma forma fracionada do heparansulfato derivada princi palmente de mastócitos tipo de leucócito Ela é um agen te terapêutico utilizado para inibir a coagulação sanguínea por sua capacidade de se ligar à antitrombina um inibidor de proteases A ligação da heparina leva a antitrombina a se ligar e inibir a trombina protease essencial para a coagula ção do sangue Essa interação é fortemente eletrostática a heparina tem a maior densidade de cargas negativas que a de qualquer macromolécula biológica conhecida Figu ra 723 A heparina purificada costuma ser adicionada a amostras de sangue coletadas para análises clínicas e ao sangue doado para transfusão para impedir a coagulação A Tabela 72 descreve a composição as propriedades as funções e a ocorrência dos polissacarídeos descritos na Seção 72 FIGURA 723 Interação entre um glicosaminoglicano e sua proteína ligante O fator 1 de crescimento de fibroblastos FGF1 seu receptor na superfície celular FGFR e um curto segmento de um glicosaminoglicano heparina foram cocristalizados para gerar a estrutura mostrada aqui PDB ID 1E0O As proteínas estão representadas por imagens de contorno da su perfície com as cores representando o potencial eletrostático predominante da superfície vermelho carga negativa azul carga positiva A heparina está representada no modelo de esfera e bastão com as cargas negativas SO 3 e COO atraídas para a superfície positiva azul da proteína FGF1 A hepari na foi utilizada neste experimento mas o glicosaminoglicano que se liga ao FGF1 in vivo é o heparansulfato presente na superfície celular Glicosaminoglicano heparina TABELA 72 Estruturas e funções de alguns polissacarídeos Polímero Tipo Unidade repetida Tamanho número de unidades monossacarídicas Funçãoimportância Amido Amilose Amilopectina Homo Homo a1S4Glc linear a1S4Glc com ramificações a1S6Glc a cada 2430 re síduos 505000 Até 10 6 Armazenamento de energia em plantas Glicogênio Homo a1S4Glc com ramificações a1S6Glc a cada 8 a 12 resíduos Até 50000 Armazenamento de energia em célu las bacterianas e animais Celulose Homo b1S4Glc Até 15000 Estrutural em plantas garante rigi dez e força às paredes celulares Quitina Homo b1S4GlcNAc Muito grande Estrutural em insetos aranhas e crustáceos garante rigidez e força ao citoesqueleto Dextrana Homo a1S6Glc com ramificações a1S3 Vários tamanhos Estrutural em bactérias adesão ex tracelular Peptidoglicano Hetero ligado a peptídeos 4Mur2Acb1S4GlcNAcb1 Muito grande Estrutural em bactérias garante ri gidez e força ao envelope celular Agarose Hetero 3DGalb1S436anidroL Gala1 1000 Estrutural em algas material da pa rede celular Ácido hialurônico glicosaminoglicano Hetero ácido 4GlcAb1S3GlcNAcb1 Até 100000 Estrutural em vertebrados na ma triz extracelular da pele e do tecido conectivo viscosidade e lubrificação em articulações Cada polímero está classificado como um homopolissacarídeo homo ou heteropolissacarídeo hetero Os nomes abreviados das unidades repetidas do peptidoglicano agarose e ácido hialurônico indicam que o polímero contém repetições desta unidade dissacarídica Por exemplo no peptidoglicano o GlcNAc de uma unidade dissacarídica está ligado em b1S4 ao primeiro resíduo da próxima unidade dissacarídica Nelson6ed07indd 262 Nelson6ed07indd 262 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 263 RESUMO 72 Polissacarídeos c Os polissacarídeos glicanos servem para o armazena mento de combustível e como componentes estruturais da parede celular e da matriz extracelular c Os homopolissacarídeos amido e glicogênio armazenam combustível em células vegetais animais e bacterianas São constituídos por Dglicose com ligações a1S4 e ambos contêm algumas ramificações c Os homopolissacarídeos celulose quitina e dextrana têm funções estruturais A celulose composta por resí duos de Dglicose em ligações b1S4 garante força e rigidez à parede celular de plantas A quitina um polí mero de Nacetilglicosamina com ligações b1S4 for talece o exoesqueleto de artrópodes A dextrana forma um revestimento aderente ao redor de certas bactérias c Os homopolissacarídeos se dobram em três dimensões A forma em cadeira do anel piranose é essencialmen te rígida de modo que a conformação dos polímeros é determinada pela rotação das ligações entre os anéis e o átomo de oxigênio na ligação glicosídica O amido e o glicogênio formam estruturas helicoidais com ligações de hidrogênio dentro da própria cadeia a celulose e a quitina formam fitas longas e retas que interagem com as fitas vizinhas c As paredes celulares de algas e bactérias são fortaleci das por heteropolissacarídeos peptidoglicano em bac térias ágar em algas O dissacarídeo que se repete no peptidoglicano é GlcNAcb1S4Mur2Ac no ágar é D Galb1S436anidroLGal c Os glicosaminoglicanos são heteropolissacarídeos ex tracelulares nos quais uma das duas unidades de mo nossacarídeo é um ácido urônico o queratansulfato é uma exceção e a outra é um aminoaçúcar Naceti lado Ésteres de sulfato em alguns dos grupos hidro xila e em alguns dos grupos amino de certos resíduos de glicosamina na heparina e no heparansulfato dão a esses polímeros uma alta densidade de cargas negati vas forçandoos a adotarem conformações estendidas Esses polímeros ácido hialurônico sulfato de condroi tina dermatansulfato e queratansulfato garantem à matriz extracelular viscosidade adesão e resistência à compressão 73 Glicoconjugados proteoglicanos glicoproteínas e glicoesfingolipídeos Além dos importantes papéis como armazenadores de com bustível amido glicogênio dextrana e como material es trutural celulose quitina peptidoglicanos os polissacarí deos e oligossacarídeos são transportadores de informação Alguns fornecem comunicação entre as células e a matriz extracelular circundante outros sinalizam proteínas para o transporte e a localização em organelas específicas ou para degradação quando a proteína é malformada ou supérflua e outros atuam como pontos de reconhecimento para molé culas de sinalização extracelulares fatores de crescimento por exemplo ou parasitas extracelulares bactérias e ví rus Em praticamente todas as células eucarióticas cadeias de oligossacarídeos específicos ligadas a componentes da membrana plasmática formam uma camada de carboidratos o glicocálice com alguns nanômetros de espessura que serve como uma superfície rica em informações que a cé lula expõe para o meio exterior Esses oligossacarídeos são componentes centrais para reconhecimento e adesão entre células migração celular durante o desenvolvimento coa gulação sanguínea resposta imune cicatrização de ferimen tos e outros processos celulares Na maioria desses casos o carboidrato que carrega a informação está covalentemente ligado a uma proteína ou lipídeo formando um glicoconju gado molécula biologicamente ativa Figura 724 Os proteoglicanos são macromoléculas da superfície celular ou da matriz extracelular nas quais uma ou mais cadeias de glicosaminoglicanos sulfatados estão covalen temente unidas a uma proteína de membrana ou a uma proteína secretada A cadeia de glicosaminoglicano pode ligarse a proteínas extracelulares por meio de interações eletrostáticas entre a proteína e os açúcares negativamente carregados do proteoglicano Os proteoglicanos são os prin cipais componentes de todas as matrizes extracelulares As glicoproteínas têm um ou alguns oligossacarídeos de complexidades variadas unidos covalentemente a uma proteína Costumam ser encontradas na superfície externa da membrana plasmática como parte do glicocálice na matriz extracelular e no sangue Nas células são encon tradas em organelas específicas como aparelho de Golgi grânulos de secreção e lisossomos As porções oligossaca rídicas das glicoproteínas são muito heterogêneas e assim como os glicosaminoglicanos são ricas em informação for Sulfato de condroitina Nglicano Oglicano Fora Proteoglicanos Glicoproteínas Glicoesfingolipídeos Dentro Membrana Heparansulfato COO COO NH3 NH3 GlcA IdoA GlcNAc Man Gal Glc Neu5Ac Fuc GalNAc Xilose Ser SerThr SerThr Asn Asn Ser FIGURA 724 Glicoconjugados As estruturas de alguns proteoglicanos glicoproteínas e glicoesfingolipídeos típicos descritos no texto Nelson6ed07indd 263 Nelson6ed07indd 263 070414 1430 070414 1430 264 DAVID L NELSON MICHAEL M COX mando locais extremamente específicos para o reconheci mento e a ligação de alta afinidade por proteínas ligantes de carboidratos chamadas de lectinas Algumas proteínas citosólicas e nucleares também podem ser glicosiladas Os glicoesfingolipídeos são componentes da membra na plasmática nos quais o grupo hidrofílico da cabeça é um oligossacarídeo Como nas glicoproteínas os oligossacarídeos servem como pontos específicos para o reconhecimento por lectinas O cérebro e os neurônios são ricos em glicoesfingoli pídeos os quais auxiliam na condução nervosa e na formação da mielina Os glicoesfingolipídeos também são importantes para a transdução de sinal celular Esfingolipídeos são discu tidos em mais detalhes nos Capítulos 10 e 11 Os proteoglicanos macromoléculas presentes na superfície celular e na matriz extracelular contêm glicosaminoglicanos As células de mamíferos sintetizam 40 tipos de proteoglica nos Essas moléculas agem como organizadores de tecidos e influenciam várias atividades celulares como a ativação de fatores de crescimento e a adesão A unidade básica dos proteoglicanos consiste em um cerne proteico pro teína central com um ou mais glicosaminoglicanos cova lentemente ligados O ponto para a ligação é um resíduo de Ser ao qual o glicosaminoglicano é unido por meio de uma ponte tetrassacarídica Figura 725 O resíduo de Ser geralmente está na sequência SerGlyXGly em que X é um resíduo de aminoácido embora nem todas as proteínas contendo essa sequência estejam ligadas a um glicosaminoglicano Muitos proteoglicanos são secretados para a MEC mas alguns são proteínas integrais de membrana ver Fi gura 117 Por exemplo a fina camada da MEC que se para grupos organizados de células de outros grupos a lâmina basal contém uma família de proteínas centrais Mr 20000 a 40000 cada qual com algumas cadeias de heparansulfato ligadas Existem duas famílias principais de proteoglicanos de membrana ligados a heparansulfa to Os sindecanos têm um único domínio transmembra na e um domínio extracelular que liga entre três e cinco cadeias de heparansulfato e em alguns casos sulfato de condroitina Figura 726a Os glipicanos são ligados à membrana por uma âncora lipídica um derivado do li pídeo de membrana fosfatidilinositol ver Figura 1115 Os sindecanos e os glipicanos podem ser liberados para o espaço extracelular Uma protease da MEC capaz de cli var proteínas perto da superfície da membrana libera os ectodomínios de sindecanos aqueles domínios externos à membrana plasmática e uma fosfolipase que cliva a co nexão com os lipídeos da membrana libera os glipicanos Esses mecanismos possibilitam que a célula altere rapida mente as características de sua superfície Esse processo Ser Gly X Gly GlcA S GalNAc4Sn S GlcA S Gal S Gal S Xyl S b1S3 b1S4 b1S3 b1S3 b1S4 Sulfato de condroitina Cerne proteico Amino terminal Carboxi terminal FIGURA 725 Estrutura dos proteoglicanos mostrando a ponte te trassacarídica Típica ligação tetrassacarídica em azul conecta um glico saminoglicano neste caso 4sulfato de condroitina em cor de laranja a um resíduo de Ser do cerne proteico O resíduo de xilose na extremidade redutora do ligante é unido por meio do carbono anomérico ao grupo hi droxila do resíduo de Ser Glipicano Sindecano Âncora de GPI Cerne proteico Sítio de clivagem Sulfato de condroitina a Exterior Interior Membrana Heparansulfato COO COO NH3 H3N Domínio NS Domínio NA b Heparansulfato GlcNAc GlcA GlcNS IdoA 2Osulfato 6Osulfato S S S S Domínio globular NS NS 2S NS 2S NS 2S NS 2S NS 2S NS 2S 6S 6S 6S 6S 2S 6S FIGURA 726 Duas famílias de proteoglicanos de membrana a Dia gramas esquemáticos de um sindecano e um glipicano na membrana plas mática Os sindecanos mantidos na membrana plasmática por interações hidrofóbicas entre uma sequência de resíduos de aminoácidos apolares e a membrana plasmática podem ser liberados por meio de um único corte proteolítico perto da superfície da membrana Em um sindecano típico o domínio extracelular está covalentemente unido por pontes tetrassacarídi cas como as mostradas na Figura 725 a três cadeias de heparansulfato e duas cadeias de sulfato de condroitina Os glipicanos são mantidos na mem brana por meio de um lipídeo de membrana covalentemente ligado âncora de GPI ver Figura 1115 porém são desprendidos se a ligação entre a por ção lipídica da âncora de GPI fosfatidilinositol e o oligossacarídeo ligado à proteína for clivada por uma fosfolipase Todos os glipicanos têm 14 resíduos de Cys conservados os quais formam ligações dissulfeto que estabilizam a porção proteica e duas ou três cadeias de glicosaminoglicanos ligadas pró ximo ao carboxiterminal em proximidade com a superfície da membrana b Ao longo de uma cadeia de heparansulfato as regiões ricas em açúcares sulfatados os domínios NS em verde alternamse com regiões que contêm principalmente resíduos de GlcNAc e GlcA não modificados os domínios NA em cinza Um dos domínios NS está mostrado com mais detalhes para ilus trar a alta densidade dos resíduos modificados GlcNS Nsulfoglicosamina com éster de sulfato no C6 e GlcA e IdoA com éster de sulfato em C2 O padrão de sulfatação exato dos domínios NS varia entre proteoglicanos Nelson6ed07indd 264 Nelson6ed07indd 264 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 265 de alteração é altamente regulado e está ativado nas célu las em proliferação tais como células cancerosas A libera ção dos proteoglicanos está envolvida no reconhecimento e na adesão intercelulares e na proliferação e na diferen ciação celulares Numerosos proteoglicanos de sulfato de condroitina e dermatansulfato também existem alguns como moléculas ligadas à membrana plasmática outros como produtos secretados para a MEC As cadeias de glicosaminoglicanos podem ligar uma variedade de ligantes extracelulares e assim modular a interação do ligante com receptores da superfície celu lar específicos Estudos detalhados com heparansulfato demonstram que a estrutura dos domínios não é aleató ria alguns domínios tipicamente com o comprimento de 3 a 8 unidades de dissacarídeo diferem dos domínios vizinhos em sequência e capacidade de ligar proteínas específicas Domínios altamente sulfatados chamados de domínios NS se alternam com domínios que têm re síduos de GlcNAc e GlcA não modificados domínios N acetilados ou NA Figura 726b O padrão exato de sulfatação nos domínios NS depende especificamente do proteoglicano dado o número de possíveis modificações do dímero GlcNAcIdoA ácido idurônico são possíveis pelo menos 32 unidades de dissacarídeo diferentes Além disso a mesma proteína central pode apresentar diferen tes estruturas de heparansulfato quando sintetizada em diferentes tipos celulares As moléculas de heparansulfato com domínios NS pre cisamente organizados se ligam especificamente a proteí nas extracelulares e moléculas de sinalização causando modificação nas suas atividades o que pode ser o resultado de uma alteração conformacional na proteína induzida pela ligação Figura 727a ou ocorrer devido à capacidade de domínios adjacentes do heparansulfato de se ligarem a duas proteínas diferentes aproximandoas e intensificando as interações proteínaproteína Figura 727b Um terceiro mecanismo de ação geral é a ligação de moléculas de sinali zação extracelulares fatores de crescimento por exemplo ao heparansulfato aumentando a concentração local des sas moléculas e facilitando a interação com os receptores de fatores de crescimento na superfície celular nesse caso o heparansulfato age como correceptor Figura 727c Por exemplo o fator de crescimento de fibroblastos FGF proteína sinalizadora extracelular que estimula a divisão celular ligase primeiramente à porção heparansulfato das moléculas de sindecano da membrana plasmática da célu laalvo O sindecano apresenta o FGF ao seu receptor da membrana celular de modo que apenas assim o FGF conse gue interagir produtivamente com seu receptor para ativar a divisão celular Finalmente em outro tipo de mecanismo os domínios NS interagem eletrostaticamente e de outras maneiras com diversas moléculas extracelulares solúveis mantendo altas concentrações dessas moléculas na superfí cie celular Figura 727d A importância de domínios sulfatados corretamente sintetizados no heparansulfato é demonstrada no camun dongo mutante nocaute que carece da enzima que sul fata a hidroxila do C2 do iduronato IdoA Esses animais nascem sem os rins e com anormalidades muito graves no desenvolvimento do esqueleto e dos olhos Outros estudos Uma mudança conformacional induzida na proteína antitrombina AT após sua ligação a um pentassacarídeo específico no domínio NS permite a interação de AT com o fator Xa da coagulação sanguínea impedindo a coagulação Os domínios NS interagem tanto com o fator de crescimento de fibroblastos FGF quanto com seu receptor unindo o complexo oligomérico e aumentando a eficácia de baixas concentrações de FGF A alta densidade de cargas negativas do heparansulfato atrai as moléculas de lipase lipoproteica positivamente carregadas e as retém por meio de interações eletrostáticas e interações de sequência específicas destas com os domínios NS A ligação de AT e trombina a dois domínios NS adjacentes aproxima as duas proteínas e favorece sua interação o que inibe a coagulação sanguínea a Ativação conformacional b Intensificação da interação proteínaproteína c Correceptor para ligantes extracelulares d Localizaçãoconcentração na superfície celular Membrana Lipase lipoproteica Domínio NS Fator Xa Heparan sulfato AT Domínio NS Trombina FGF ligante Dímero do receptor de FGF Membrana Cerne proteico Domínio NS FIGURA 727 Quatro tipos de proteínas que interagem com os domínios NS do heparansulfato Nelson6ed07indd 265 Nelson6ed07indd 265 070414 1430 070414 1430 266 DAVID L NELSON MICHAEL M COX mostram que proteoglicanos de membrana são importantes para a depuração de lipoproteínas no fígado Existem evi dências crescentes que a rota escolhida pelos axônios em desenvolvimento no sistema nervoso o circuito neuronal é influenciada por proteoglicanos contendo heparansulfato e sulfato de condroitina os quais fornecem indicações dire cionais para o crescimento do axônio Alguns proteoglicanos podem formar agregados proteoglicanos enormes grupos supramoleculares de muitas proteínas centrais todas ligadas a uma única mo lécula de ácido hialurônico A proteína central agrecana Mr 250000 tem múltiplas cadeias de sulfato de condroi tina e queratansulfato unidas a resíduos de Ser da proteína central por meio de ligações trissacarídicas gerando um monômero de agrecano com Mr 2 3 10 6 Quando cente nas ou mais dessas proteínas centrais decoradas se ligam a uma única molécula estendida de hialuronato Figura 728 o agregado proteoglicano resultante Mr 2 3 10 8 e a água de hidratação associada ocupam aproximadamen te o mesmo volume de uma célula bacteriana O agrecano interage fortemente com o colágeno da matriz extracelular das cartilagens contribuindo para o desenvolvimento a re sistência à tensão e a elasticidade desse tecido conectivo Entrelaçadas com esses enormes proteoglicanos ex tracelulares estão as proteínas fibrosas da matriz como colágeno elastina e fibronectina formando uma rede de ligações cruzadas que garantem força e elasticidade à toda a matriz extracelular Algumas dessas proteínas são multia desivas uma única proteína possui sítios de ligação para di ferentes moléculas da matriz A fibronectina por exemplo tem domínios separados que ligam fibrina heparansulfato colágeno e uma família de proteínas da membrana plasmá tica chamadas de integrinas que controlam a sinalização entre o interior celular e a matriz extracelular ver Figu ra 1229 O quadro geral de interações célulamatriz que emerge Figura 729 mostra um arranjo de interações entre moléculas celulares e extracelulares Essas intera ções não servem meramente para a ancoragem das célu las à matriz extracelular mas também proveem rotas que guiam a migração celular nos tecidos em desenvolvimento e propagam informações em ambas as direções através da membrana plasmática Glicoproteínas têm oligossacarídeos ligados covalentemente Glicoproteínas são conjugados carboidratoproteína nos quais os glicanos são menores ramificados e mais estrutu ralmente diversos do que os gigantescos glicosaminoglica nos dos proteoglicanos O carboidrato é ligado por meio de seu carbono anomérico por uma ligação glicosídica com o OH de um resíduo de Ser ou Thr Oligado ou por uma ligação Nglicosil com o nitrogênio da amida de um resíduo de Asn Nligado Figura 730 Algumas glicoproteí nas têm uma única cadeia de oligossacarídeo porém mui tas têm mais de uma o carboidrato pode constituir de 1 a 70 ou mais da massa da glicoproteína Aproximadamente metade de todas as proteínas de mamíferos é glicosilada e cerca de 1 de todos os genes de mamíferos codifica para enzimas envolvidas na síntese e na ligação dessas cadeias de oligossacarídeos Oligossacarídeos Nligados são geral Queratan sulfato Ácido hialurônico até 50000 dissacarídeos repetidos Sulfato de condroitina Proteína central agrecano Proteínas de ligação FIGURA 728 Agregado proteoglicano da matriz extracelular Dese nho esquemático de um proteoglicano com muitas moléculas de agrecano Uma molécula muito longa de ácido hialurônico está associada não cova lentemente com cerca de 100 moléculas da proteína central agrecano Cada molécula de agrecano contém muitas cadeias de sulfato de condroitina e queratansulfato ligadas covalentemente Proteínas de ligação nas junções entre cada proteína central e o esqueleto do ácido hialurônico controlam a interação proteína centralácido hialurônico A micrografia mostra uma única molécula de agrecano visualizada com um microscópio de força atômica ver Quadro 192 Proteoglicano Filamentos de actina Membrana plasmática Integrina Fibronectina Fibras de colágeno em ligações cruzadas FIGURA 729 Interações entre as células e a matriz extracelular A associação entre as células e os proteoglicanos da matriz extracelular é me diada por uma proteína de membrana integrina e por uma proteína extra celular fibronectina neste exemplo que tem sítios de ligação tanto para integrina quanto para proteoglicano Observe a proximidade na associação das fibras de colágeno com a fibronectina e o proteoglicano Nelson6ed07indd 266 Nelson6ed07indd 266 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 267 mente encontrados na sequência de consenso NPST nem todos os sítios potenciais são utilizados Consulte o Quadro 32 para convenções da representação de sequên cias de consenso Aparentemente não existe uma sequên cia consenso específica para os oligossacarídeos Oligados embora as regiões apresentando cadeias Oligadas tendam a ser ricas em resíduos de Gly Val e Pro Uma classe peculiar de glicoproteínas é encontrada no citoplasma e no núcleo nessas proteínas as posições gli cosiladas contêm somente resíduos únicos de Nacetilgli cosamina em ligações Oglicosídicas com o grupo hidroxila das cadeias laterais de Ser Essa modificação é reversível e ocorre frequentemente nos mesmos resíduos de Ser que se rão fosforilados em algum estágio da atividade proteica As duas modificações são mutuamente exclusivas e este tipo de glicosilação é importante para a regulação da atividade das proteínas Discutese a fosforilação de proteínas ampla mente no Capítulo 12 Como será visto no Capítulo 11 a superfície externa da membrana plasmática tem muitas glicoproteínas de mem brana as quais contêm arranjos de oligossacarídeos cova lentemente ligados de complexidade variada As mucinas são glicoproteínas de membrana ou secretadas que podem conter grandes números de cadeias de oligossacarídeos O ligadas Estão presentes na maioria das secreções sendo responsáveis pela característica escorregadia do muco A caracterização sistemática de todos os carboidratos componentes de uma determinada célula ou tecido incluin do aqueles ligados a proteínas ou lipídeos é chamada de glicômica Para as glicoproteínas isso também significa determinar quais proteínas são glicosiladas e onde na se quência de aminoácidos cada oligossacarídeo está ligado É um trabalho desafiador mas valoroso pelo potencial da compreensão dos padrões normais de glicosilação e das for mas nas quais eles podem ser alterados durante o desenvol vimento em doenças genéticas ou em câncer Os métodos atuais para a caracterização da totalidade dos carboidratos das células dependem muito de aplicações sofisticadas de espectrometria de massas ver Figura 739 As estruturas de um grande número de oligossacarídeos O e Nligados de diversas glicoproteínas são conhecidas as Figuras 724 e 730 apresentam alguns exemplos típicos Serão discutidos os mecanismos por meio dos quais pro teínas específicas adquirem porções oligossacarídicas no Capítulo 27 Muitas das proteínas secretadas por células eucarióti cas são glicoproteínas incluindo a maioria das proteínas do sangue Por exemplo as imunoglobulinas anticorpos e certos hormônios como o hormônio folículoestimulante o hormônio luteinizante e o hormônio estimulante da tireoi de são glicoproteínas Muitas proteínas do leite incluindo a principal proteína do soro do leite alactalbumina e algu mas das proteínas secretadas pelo pâncreas como a ribonu clease são glicosiladas assim como a maioria das proteínas contidas nos lisossomos Aos poucos as vantagens biológicas da adição de oligossacarídeos a proteínas estão sendo descobertas Os agrupamentos altamente hidrofílicos de carboidratos al teram a polaridade e a solubilidade das proteínas com as quais estão conjugados Cadeias de oligossacarídeos liga das a proteínas que foram recentemente sintetizadas no retículo endoplasmático RE e trabalhadas no aparelho de Golgi servem como marcadores do destino da proteína ver Figura 2739 e também para o controle da qualidade proteica marcando proteínas mal dobradas para a degra dação ver Figura 2740 Quando numerosas cadeias de oligossacarídeos negativamente carregadas se agrupam em uma única região de uma proteína a repulsão de car gas entre elas favorece a formação de uma estrutura es tendida em forma de bastão naquela região O volume e a carga negativa das cadeias de oligossacarídeos também protegem algumas proteínas do ataque por enzimas pro teolíticas Além desses efeitos físicos gerais sobre a es trutura das proteínas também existem efeitos biológicos específicos induzidos pelas cadeias de oligossacarídeos em glicoproteínas Seção 74 A importância da glicosilação em proteínas tornase evidente com a descoberta de pelo menos 18 diferentes distúrbios genéticos que afetam a gli cosilação em humanos Todos esses distúrbios causam gra ves problemas no desenvolvimento físico ou mental sendo às vezes fatal para o indivíduo GalNAc GlcNAc Ser Asn a Oligados b Nligados Exemplos Exemplos SerThr SerThr Asn Asn Asn GlcNAc Man Gal Neu5Ac GalNAc CH2 CH2 CH3 CH O HO H H H H H O O O OH NH NH C HOCH2 CH3 H O H H H H O O OH NH NH C O C CH2 CH C NH O O C FIGURA 730 Ligação de oligossacarídeos a glicoproteínas a Os oligossacarídeos Oligados formam uma ligação glicosídica com o grupo hidroxila de resíduos de Ser ou Thr em vermelho a ligação ilustrada aqui apresenta GalNAc como o açúcar da extremidade redutora do oligossa carídeo Uma cadeia simples e uma cadeia complexa estão mostradas b Os oligossacarídeos Nligados formam uma ligação Nglicosil com o nitrogê nio da amida de um resíduo de Asn em verde a ligação ilustrada aqui tem GlcNAc como o açúcar terminal Três tipos comuns de cadeias de oligossa carídeos Nligadas em glicoproteínas estão mostrados Uma descrição com pleta da estrutura do oligossacarídeo requer a especificação da posição e da estereoquímica a ou b de cada ligação glicosídica Nelson6ed07indd 267 Nelson6ed07indd 267 070414 1430 070414 1430 268 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Glicolipídeos e lipopolissacarídeos são componentes de membranas As glicoproteínas não são os únicos componentes celulares que exibem cadeias de oligossacarídeos alguns lipídeos também têm oligossacarídeos covalentemente ligados Os gangliosídeos são lipídeos de membrana das células euca rióticas nos quais o grupo polar a parte do lipídeo que for ma a superfície externa da membrana é um oligossacarídeo complexo contendo ácido siálico Figura 79 e outros re síduos de monossacarídeos Algumas das porções oligossa carídicas dos gangliosídeos como aquelas que determinam os grupos sanguíneos humanos ver Figura 1015 são idênticas àquelas encontradas em certas glicoproteínas as quais portanto também contribuem para o tipo do grupo sanguíneo Assim como as porções oligossacarídicas das gli coproteínas aquelas dos lipídeos de membrana são encon tradas comumente talvez sempre na superfície externa da membrana plasmática Lipopolissacarídeos são as moléculas dominantes da superfície da membrana externa de bactérias gramnegativas como Escherichia coli e Salmonella typhimurium Essas moléculas são o alvo primordial dos anticorpos produzidos pelo sistema imune dos vertebrados em resposta a uma infecção bacteriana e por essa razão são importantes na determinação dos sorotipos das linha gens bacterianas sorotipos são linhagens distintas pelas propriedades antigênicas Os lipopolissacarídeos de S typhimurium contêm seis ácidos graxos ligados a dois re síduos de glicosamina um dos quais é o ponto de ligação para um oligossacarídeo complexo Figura 731 E coli tem lipopolissacarídeos similares porém exclusivos A por ção lipídeo A dos lipopolissacarídeos de algumas bactérias é chamada de endotoxina sua toxicidade para humanos e ou tros animais é responsável pela pressão sanguínea perigosa mente baixa que ocorre na síndrome do choque tóxico re sultante de infecções por bactérias gramnegativas RESUMO 73 Glicoconjugados proteoglicanos glicoproteínas e glicoesfingolipídeos c Os proteoglicanos são glicoconjugados nos quais um ou mais glicanos grandes chamados de glicosamino glicanos sulfatados heparansulfato sulfato de con droitina dermatansulfato ou queratansulfato estão covalentemente ligados a uma proteína central Uni dos à superfície externa da membrana plasmática por meio de um peptídeo transmembrana ou um lipídeo ligado covalentemente os proteoglicanos fornecem pontos de adesão reconhecimento e transferência de informação entre as células ou entre as células e a ma triz extracelular c As glicoproteínas contêm oligossacarídeos covalente mente ligados a resíduos de Asp ou SerThr Em geral GlcNAc Oligossacarídeo central Lipídeo A Cadeia Oespecífica O 2O O O O O O O P O HO K H R A NH HN O O O O O HO O OH O O2 OH O O O OH P n10 K K K H R R R A A Man Glc Gal AbeOAc Rha Kdo Hep H H FIGURA 731 Lipopolissacarídeos bacterianos Dia grama esquemático do lipopolissacarídeo da membrana externa de Salmonella typhimurium Kdo é o ácido 3desóxi Dmanooctulosônico antes chamado de ácido cetodesóxi octônico Hep é LgliceroDmanoheptose AbeOAc é abe quose uma 36didesóxihexose acetilada em uma de suas hidroxilas Existem seis resíduos de ácidos graxos na porção li pídeo A da molécula Diferentes espécies bacterianas têm es truturas de lipopolissacarídeos sutilmente diferentes embora tenham em comum uma região lipídica lipídeo A também conhecida como endotoxina oligossacarídeo central e uma cadeia Oespecífica o principal determinante do sorotipo reatividade imunológica da bactéria As membranas exter nas das bactérias gramnegativas S typhimurium e E coli con têm tantas moléculas de lipopolissacarídeos que a superfície celular é praticamente coberta com cadeias Oespecíficas Nelson6ed07indd 268 Nelson6ed07indd 268 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 269 os glicanos são ramificados e menores do que os gli cosaminoglicanos Muitas proteínas extracelulares ou da superfície celular são glicoproteínas assim como a maioria das proteínas secretadas Os oligossacarídeos covalentemente ligados influenciam o enovelamento e a estabilidade das proteínas fornecem informações cruciais sobre o destino de proteínas recentemente sin tetizadas e permitem o reconhecimento específico por outras proteínas c A glicômica é a determinação da totalidade das molé culas contendo açúcar em uma célula ou tecido assim como a determinação da função de cada uma dessas moléculas c Glicolipídeos e glicoesfingolipídeos em plantas e animais e lipopolissacarídeos em bactérias são componentes do envelope celular com cadeias de oligossacarídeos ex postas na superfície externa da célula 74 Carboidratos como moléculas informativas o código dos açúcares A glicobiologia o estudo da estrutura e da função de gli coconjugados é uma das mais ativas e excitantes áreas da bioquímica e da biologia celular Cada vez fica mais claro que as células utilizam oligossacarídeos específicos para codificar importantes informações sobre o destino de pro teínas as interações célulacélula a diferenciação celu lar e o desenvolvimento de tecidos além de os utilizarem como sinais extracelulares A presente discussão utiliza somente alguns exemplos para ilustrar a diversidade de estruturas e o alcance de atividades biológicas dos glico conjugados No Capítulo 20 será discutida a biossíntese de polissacarídeos incluindo os peptidoglicanos e no Ca pítulo 27 a associação de cadeias de oligossacarídeos a glicoproteínas O aprimoramento dos métodos para a análise da es trutura de oligossacarídeos e polissacarídeos tem reve lado a extraordinária complexidade e diversidade dos oligossacarídeos de glicoproteínas e glicolipídeos Consi dere as cadeias de oligossacarídeos da Figura 730 típicas daquelas encontradas em muitas glicoproteínas A mais complexa delas contém 14 resíduos de monossacarídeos de quatro tipos diferentes variadamente ligados como 1S2 1S3 1S4 1S6 2S3 e 2S6 alguns com configuração a e alguns com configuração b Estru turas ramificadas não encontradas em ácidos nucleicos ou proteínas são comuns em oligossacarídeos Com a suposição razoável de que 20 subunidades de monossa carídeos diferentes estão disponíveis para a construção de oligossacarídeos estimase que muitos bilhões de oligossacarídeos hexaméricos diferentes sejam possíveis isso se compara com 64 3 10 7 20 6 diferentes hexapep tídeos possíveis com os 20 aminoácidos comuns e 4096 4 6 diferentes hexanucleotídeos possíveis com as quatro subunidades nucleotídicas Se permitirmos também as va riações em oligossacarídeos resultantes da sulfatação de um ou mais dos resíduos o número de oligossacarídeos possíveis aumenta em duas ordens de magnitude Na realidade apenas um subconjunto das possíveis combi nações é encontrado devido às restrições impostas por enzimas biossintéticas e disponibilidade de precursores Ainda assim a enorme riqueza de informações na estru tura dos glicanos não somente compete com a dos ácidos nucleicos na densidade de informações contidas em uma molécula de tamanho modesto mas também a supera em muito Cada um dos oligossacarídeos representados nas Figuras 724 e 730 têm configuração tridimensional úni ca uma palavra no código dos açúcares e legível para as proteínas com as quais eles interagem Lectinas são proteínas que leem o código dos açúcares e controlam muitos processos biológicos As lectinas encontradas em todos os organismos são pro teínas que ligam carboidratos com alta especificidade e com moderada a alta afinidade Participam de vários processos de reconhecimento celular sinalização e adesão e na desti nação intracelular de proteínas recentemente sintetizadas As lectinas de plantas abundantes em sementes provavel mente atuam como restringentes para insetos e outros pre dadores No laboratório lectinas vegetais purificadas são reagentes úteis para a detecção e a separação de glicanos e glicoproteínas ligados a diferentes oligossacarídeos Aqui serão discutidos apenas alguns exemplos dos papéis das lectinas em células animais Alguns hormônios peptídicos que circulam no sangue estão ligados a oligossacarídeos que influenciam fortemente suas meiasvidas na circulação Os hormônios luteinizante e tireotropina hormônios peptídicos produzidos na hipó fise têm oligossacarídeos Nligados que terminam com o dissacarídeo GalNAc4Sb1S4GlcNAc reconhecido por uma lectina receptor em hepatócitos GalNAc4S é uma Nacetilgalactosamina sulfatada no grupo OH do C4 A interação receptorhormônio é responsável por mediar a internalização e a destruição dos hormônios luteinizan te e tireotropina reduzindo suas concentrações no sangue Consequentemente os níveis sanguíneos desses hormônios passam por periódicas ascensões devidas à secreção pul sátil pela hipófise e quedas devidas à destruição contínua pelos hepatócitos Os resíduos de Neu5Ac um ácido siálico situados nas extremidades das cadeias de oligossacarídeos de muitas glicoproteínas do plasma Figura 724 protegem essas proteínas da captação e da degradação no fígado Por exemplo a ceruloplasmina glicoproteína sérica que con tém cobre tem algumas cadeias de oligossacarídeo termi nando com Neu5Ac O mecanismo que remove os resíduos de ácido siálico de glicoproteínas séricas não está claro A remoção pode ser causada pela atividade da enzima neu raminidase também chamada desialidase produzida por organismos invasores ou pela remoção lenta e constante por enzimas extracelulares A membrana plasmática dos hepatócitos possui moléculas de lectinas receptoras para assialoglicoproteínas assialo significando sem ácido si álico que se ligam especificamente a cadeias de oligossa carídeos com resíduos de galactose não mais protegidos por um resíduo terminal de Neu5Ac A interação receptor ceruloplasmina desencadeia a endocitose e a destruição de ceruloplasmina Nelson6ed07indd 269 Nelson6ed07indd 269 070414 1430 070414 1430 270 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Ácido Nacetilneuramínico Neu5Ac um ácido siálico OH H3C COO2 HO H H H HOH2C O O OH OH HN C C H H H H C Um mecanismo similar é aparentemente responsável pela remoção de eritrócitos velhos da corrente sanguí nea em mamíferos Eritrócitos sintetizados recentemen te têm algumas glicoproteínas de membrana com cadeias de oligossacarídeos que terminam em Neu5Ac Quando os resíduos de ácido siálico são removidos coletandose uma amostra de sangue de cobaias tratandoa com neu raminidase in vitro e reintroduzindoa na circulação os eritrócitos tratados desaparecem da circulação em poucas horas eritrócitos com oligossacarídeos intactos coletados e reintroduzidos sem tratamento com neuraminidase con tinuam a circular por dias Lectinas da superfície celular são importantes no de senvolvimento de algumas doenças humanas tanto as lectinas humanas quanto aquelas dos agentes infeccio sos As selectinas compõem uma família de lectinas da membrana plasmática que controlam o reconhecimento e a adesão célulacélula em diversos processos celulares Um desses processos é o movimento das células do sistema imune leucócitos através da parede dos capilares do san gue para os tecidos em sítios de infecção ou inflamação Figura 732 Em um sítio de infecção a selectinaP da superfície das células endoteliais dos capilares interage com um oligossacarídeo específico das glicoproteínas da su perfície dos leucócitos circulantes Essa interação desacele ra os leucócitos que rolam sobre o revestimento endotelial dos capilares Uma segunda interação entre moléculas de integrina p 470 da membrana plasmática dos leucócitos e uma proteína de adesão da superfície das células endote liais detém o leucócito e permite que ele atravesse a pare de do capilar entrando nos tecidos infectados para iniciar o ataque imune Duas outras selectinas participam dessa mi gração dos linfócitos a selectinaE da célula endotelial e a selectinaL do leucócito ligamse aos oligossacarídeos cor respondentes em leucócitos e células endoteliais respecti vamente Como as selectinas de humanos controlam as respostas inflamatórias na artrite reumatoide asma psoríase escle rose múltipla e rejeição de órgãos transplantados existe um grande interesse no desenvolvimento de fármacos que inibam a adesão celular mediada por selectinas Muitos car cinomas expressam um antígeno normalmente presente apenas em células fetais sialil Lewis X ou sialil Le X o qual quando liberado na circulação facilita a sobrevivência e a metástase das células tumorais Derivados de carboidratos que mimetizam a porção sialil Le x de sialoglicoproteínas ou que alteram a biossíntese deste oligossacarídeo podem tor narse fármacos específicos para selectinas eficazes no tra tamento de inflamações crônicas ou doenças metastáticas Alguns vírus que infectam animais incluindo o vírus in fluenza aderem às células hospedeiras por meio de inte rações com os oligossacarídeos apresentados na superfície dessas células A lectina do vírus influenza conhecida como proteína HA hemaglutinina é essencial para a entrada e a infecção viral Após a entrada e a replicação do vírus em uma célula hospedeira as partículas virais sintetizadas re centemente deixam a célula hospedeira envolvidas em uma porção da membrana plasmática Uma sialidase neurami Presa Rolando lentamente Adesão Extravasamento Rolando Glicoproteína ligante de selectinaP Célula endotelial do capilar Matriz subendotelial Glicoproteína ligante de integrina Integrina SelectinaP Sítio de inflamação Desacelerando Ligação da selectina Ligação da integrina Leucócito Fluxo sanguíneo FIGURA 732 Função das interações lectinaligante durante a movi mentação de leucócitos para um sítio de infecção ou ferimento Um leucócito movendose ao longo de um capilar é desacelerado por interações transitórias entre moléculas de selectinaP da membrana plasmática das cé lulas endoteliais do capilar e glicoproteínas ligantes de selectinaP da super fície do leucócito Por interagir com moléculas de selectinaP consecutivas o leucócito rola sobre a superfície do capilar Próximo a um sítio de inflamação interações mais fortes entre integrinas da superfície do leucócito e seus li gantes na superfície do capilar levam a uma adesão firme O leucócito para de rolar e sob a influência de sinais enviados a partir do sítio de inflamação começa a extravasar escapar através da parede do capilar movendose em direção ao sítio de inflamação Nelson6ed07indd 270 Nelson6ed07indd 270 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 271 nidase viral remove o resíduo de ácido siálico terminal dos oligossacarídeos da célula hospedeira liberando as partícu las virais da interação com a célula e evitando a agregação de uma partícula com a outra Outro ciclo de infecção pode então começar Os fármacos antivirais oseltamivir Tami flu e zanamivir Relenza utilizados clinicamente no tra tamento do influenza são análogos de açúcar e inibem a sialidase viral por competirem com os oligossacarídeos da célula hospedeira pela ligação à sialidase Figura 733 Isso impede a liberação do vírus da célula infectada e tam bém causa a agregação das partículas virais efeitos que evi tam um novo ciclo de infecção Alguns patógenos microbianos têm lectinas que contro lam a adesão bacteriana às células hospedeiras ou a entrada de toxinas para dentro das células Por exemplo a bacté ria Helicobacter pylori tem uma lectina em sua superfície que adere a oligossacarídeos da superfície das células do epitélio que revestem a superfície interna do estômago Fi gura 734 Entre os sítios de ligação reconhecidos pela lectina da H pylori está o oligossacarídeo Lewis b Le b presente nas glicoproteínas e glicolipídeos que definem o determinante do grupo sanguíneo do tipo O ver Figura 1015 Essa observação ajuda a explicar o grau algumas vezes maior de incidência de úlceras gástricas em pessoas His274 Glu276 Ácido Nacetilneuramínico Oseltamivir Ácido Nacetilneuramínico Zanamivir Oseltamivir Glu276 His274 Oseltamivir Glu276 Tyr274 b c d a FIGURA 733 O sítio de ligação para o ácido Nacetilneuramínico e para o fármaco antiviral oseltamivir na neuraminidase do in fluenza a O ligante normal desta enzima é um ácido siálico o ácido Nacetilneuramínico Os fármacos oseltamivir e zanamivir ocupam o mesmo sítio da enzima competitivamente inibindoa e bloqueando a liberação do vírus pela célula hospedeira b A interação normal com o ácido Nacetil neuramínico no sítio de ligação PDB ID 2BAT c O oseltamivir consegue encaixarse neste sítio empurrando um resíduo de Glu para fora PDB ID 2HU4 d Uma mutação no gene da neuraminidase do vírus influenza troca uma His próxima a este resíduo de Glu pela cadeia lateral maior de uma Tyr PDB ID 3CL0 Agora o oseltamivir não consegue empurrar o resíduo de Glu de maneira tão eficaz e ligase muito menos de maneira eficiente ao sítio de ligação o que torna o vírus mutante efetivamente resistente ao oseltamivir FIGURA 734 O desenvolvimento de uma úlcera Células de Helicobacter pylori se aderindo à superfície gástrica Essa bactéria causa úlceras por meio das interações entre uma lectina da superfície bacteriana e o oligossacarídeo Le b antígeno de grupo sanguíneo das células epiteliais que revestem a su perfície interna do estômago Nelson6ed07indd 271 Nelson6ed07indd 271 070414 1430 070414 1430 272 DAVID L NELSON MICHAEL M COX do tipo sanguíneo O do que naquelas do tipo A ou B a H pylori ataca as células epiteliais dessas pessoas de manei ra mais eficiente Análogos de oligossacarídeo Le b podem mostrarse úteis para o tratamento desse tipo de úlcera Administrados oralmente eles poderiam prevenir a adesão bacteriana e portanto a infecção por competirem com as glicoproteínas gástricas pela ligação à lectina bacteriana Algumas das mais devastadoras doenças parasitárias hu manas disseminadas em grande parte dos países em desen volvimento são causadas por microrganismos eucarióticos que apresentam na superfície oligossacarídeos incomuns que em alguns casos protegem os parasitas Entre esses or ganismos estão os tripanossomos responsáveis pela doença do sono africana e a doença de Chagas ver Quadro 63 Plasmodium falciparum o parasita da malária e Enta moeba histolytica o agente causador da disenteria ame boide A expectativa do descobrimento de fármacos que in terfiram com a síntese das cadeias desses oligossacarídeos incomuns e dessa maneira com a replicação dos parasitas tem recentemente inspirado muitos trabalhos sobre as ro tas de biossíntese destes oligossacarídeos As lectinas também agem intracelularmente ende reçando proteínas para seu transporte a localizações ce lulares específicas ver Capítulo 27 Por exemplo um oligossacarídeo contendo manose6fosfato reconhecido por uma lectina marca proteínas recémsintetizadas no aparelho de Golgi para sua transferência ao lisossomo ver Figura 2739 As interações lectinacarboidrato são altamente específicas e frequentemente multivalentes A alta densidade de informações contida na estrutura dos oligossacarídeos proporciona um código de açúcares com um número ilimitado de palavras pequenas o suficien te para serem lidas por uma única proteína Nos sítios de ligação a carboidratos as lectinas têm uma requintada complementaridade molecular que permite a interação somente com os carboidratos correspondentes corretos O resultado é uma especificidade extremamente alta nessas interações A afinidade entre um oligossacarídeo e um domínio individual de ligação a carboidratos DLC de uma lectina é algumas vezes modesta valores de Kd entre micromolar e milimolar mas a afinidade real é em muitos casos notavelmente aumentada pela multivalên cia da lectina na qual uma única molécula de lectina tem múltiplos DLC Em um agrupamento de oligossacarídeos como comumente encontrado em uma superfície de membrana por exemplo cada oligossacarídeo pode ocupar um dos DLC da lectina fortalecendo a interação Quando as células expressam múltiplas lectinas a força da interação pode ser muito alta possibilitando eventos altamente cooperativos como a adesão e o rolamento da célula Figura 732 Estudos cristalográficos por raios X da estrutura da lectina receptora de manose6fosfato revelam detalhes de sua interação com a manose6fosfato que explicam a especificidade da ligação e a função de um cátion divalen te na interação lectinaaçúcar Figura 735a A His 105 está formando ligações de hidrogênio com um dos átomos de oxigênio do fosfato Figura 735b Quando a proteína marcada com manose6fosfato chega ao lisossomo que tem um pH interno menor do que o do complexo de Gol gi o receptor perde a afinidade pela manose6fosfato A protonação da His 105 pode ser responsável por esta altera ção na ligação Além dessas interações extremamente específicas exis tem interações mais gerais que também contribuem para a ligação de muitos carboidratos às respectivas lectinas Por exemplo muitos açúcares têm um lado mais polar e um His105 Glu133 Gln66 Asp103 Asn104 Arg135 Tyr45 Tyr143 Arg111 Mn b a FIGURA 735 Detalhes de uma interação lectinacarboidrato a Estrutura do receptor de manose6fosfato bovino em complexo com ma nose6fosfato PDB ID 1M6P A proteína está representada pela imagem de contorno da superfície mostrando a superfície com predominância de carga negativa em vermelho ou positiva em azul A manose6fosfato está representada por uma estrutura em bastão um íon manganês está repre sentado por uma esfera violeta b Uma visão ampliada do sítio de ligação A manose6fosfato é unida por ligações de hidrogênio à Arg 111 e coordenada ao íon manganês mostrado com o menor raio de van der Waals para maior clareza Cada grupo hidroxila da manose é unido à proteína por meio de li gações de hidrogênio A His 105 que forma ligações de hidrogênio com o oxi gênio do fosfato da manose pode ser o resíduo que quando protonado em baixo pH induz o receptor a liberar a manose6fosfato dentro do lisossomo Nelson6ed07indd 272 Nelson6ed07indd 272 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 273 lado menos polar Figura 736 o lado mais polar forma li gações de hidrogênio com a lectina enquanto o lado menos polar forma interações hidrofóbicas com resíduos de ami noácidos apolares A soma de todas estas interações produz uma ligação de alta afinidade e garante a alta especificidade das lectinas a seus carboidratos A interação lectinacarboi drato constitui um modo de transferência de informação que é absolutamente central em muitos processos dentro e entre células A Figura 737 resume algumas das intera ções biológicas mediadas pelo código dos açúcares RESUMO 74 Carboidratos como moléculas informativas o código dos açúcares c Os monossacarídeos podem ser organizados em uma variedade quase ilimitada de oligossacarídeos os quais diferem na estereoquímica e na posição das ligações gli cosídicas no tipo de orientação dos grupos substituin tes e no número e no tipo de ramificações Os glicanos contêm muito mais densidade de informação do que os ácidos nucleicos ou as proteínas c As lectinas proteínas com domínios de ligação a car boidratos com especificidade alta são comumente en contradas na superfície externa das células onde ini ciam interações com outras células Em vertebrados oligossacarídeos marcados lidos por lectinas determi nam a taxa de degradação de certos hormônios peptídi cos proteínas da circulação e células sanguíneas c Patógenos bacterianos e virais e alguns parasitas euca rióticos aderemse às célulasalvo animais por meio da ligação de lectinas dos patógenos a oligossacarídeos da superfície da célulaalvo c A cristalografia por raios X de complexos lectinaaçúcar mostra a requintada complementaridade entre as duas moléculas o que garante a força e a especificidade das interações de lectinas com carboidratos FIGURA 737 Funções dos oligossacarídeos nos eventos de reconhecimento na superfície celular e nos sistemas de endomembranas a Os oligossa carídeos com estruturas únicas representados como correntes de hexágonos são componentes de várias glicoproteínas ou glicolipídeos na superfície externa de membranas plasmáticas Seus oligossacarídeos se ligam a lectinas do meio extracelular com alta especificidade e alta afinidade b Vírus que infectam células animais como o influenza ligamse a glicoproteínas da superfície celular na primeira etapa da infecção c Toxinas bacterianas como as do cólera e da coqueluche ligamse a um glicolipídeo da superfície antes de entrarem na célula d Algumas bactérias como a H pylori adereme a células animais e então as colonizam ou infectam e Selectinas lectinas da membrana plasmática de certas células controlam in terações célulacélula como aquelas dos leucócitos com as células endoteliais da parede capilar em um sítio de infecção f O receptorlectina para manose6fosfato do aparelho de Golgi trans se liga ao oligossacarídeo em en zimas lisossômicas selecionandoas para transferência ao lisossomo Vírus Cadeia de oligossacarídeo Proteína da membrana plasmática Glicolipídeo Receptorlectina para manose6fosfato Resíduo de manose6fosfato em uma proteína recentemente sintetizada Golgi trans Lisossomo Bactéria a b c f d e Toxina Leucócito SelectinaP Enzima Enzima H Lado hidrofóbico Porção indol do Trp Lado hidrofílico H H H H H H OH HO OH O O O CH2 FIGURA 736 Interações hidrofóbicas dos resíduos de açúcar Unida des de açúcar como a galactose têm um lado mais polar o topo da cadeira mostrada aqui com o oxigênio do anel e algumas hidroxilas disponível para a formação de ligações de hidrogênio com a lectina e um lado menos polar que pode formar interações hidrofóbicas com cadeias laterais apolares da proteína como o anel indol de resíduos de Trp Nelson6ed07indd 273 Nelson6ed07indd 273 070414 1430 070414 1430 274 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 75 Trabalhando com carboidratos A crescente compreensão da importância da estrutura dos oligossacarídeos no reconhecimento e na sinalização bioló gicos tem sido a força motriz por trás do desenvolvimento de métodos para a análise da estrutura e da estereoquími ca de oligossacarídeos complexos A análise de oligossa carídeos é complicada pois ao contrário de ácidos nuclei cos e proteínas os oligossacarídeos podem ser ramificados e unidos por diferentes ligações A alta densidade de cargas de muitos oligossacarídeos e polissacarídeos e a relativa instabilidade dos ésteres de sulfato nos glicosaminoglicanos causam ainda mais dificuldades Para polímeros simples lineares como a amilose as posições das ligações glicosídicas são determinadas pelo clássico método de metilação exaustiva o polímero intac to é tratado com iodeto de metil em meio fortemente bási co para a conversão de todas as hidroxilas livres a ésteres de metil estáveis em ácido e em seguida o polissacarídeo metilado é hidrolisado em ácido As únicas hidroxilas livres presentes nos monossacarídeos derivados dessa forma se rão aquelas participantes das ligações glicosídicas Para determinar a sequência dos resíduos de monossacarídeos incluindo quaisquer ramificações que estejam presentes exoglicosidases com especificidade conhecida são utiliza das para remover um resíduo de cada vez a partir das extremidades não redutoras A especificidade destas exoglicosidases muitas vezes possibilita a dedução da posi ção e da estereoquímica das ligações Para a análise das porções oligossacarídicas de glicopro teínas e glicolipídeos os oligossacarídeos são liberados por enzimas purificadas glicosidases que clivam especifica mente oligossacarídeos Oligados ou Nligados ou lipases que removem grupos da cabeça de lipídeos Alternativa mente glicanos Oligados podem ser liberados de glicopro teínas pelo tratamento com hidrazina As misturas de carboidratos resultantes são separadas em componentes individuais por vários métodos Figura 738 incluindo as mesmas técnicas utilizadas para a sepa ração de aminoácidos e proteínas precipitação fracionada por solventes e cromatografias de troca iônica e exclusão por tamanho ver Figura 317 Lectinas altamente puri ficadas unidas por covalência a um suporte insolúvel são comumente utilizadas em cromatografia por afinidade a carboidrato ver Figura 317c A hidrólise de oligossacarídeos e polissacarídeos em áci do forte origina uma mistura de monossacarídeos os quais podem ser identificados e quantificados por técnicas cro matográficas para obter a composição total do polímero Cada vez mais a análise de oligossacarídeos baseiase em espectrometria de massa e espectroscopia por RMN de alta resolução A espectrometria de massa por dessor ção e ionização a laser assistida por matriz MALDI MS de matrixassisted laser desorptionionization mass spectrometry e a espectrometria de massa em tandem MSMS ambas descritas no Capítulo 3 são facilmente aplicadas a compostos polares como os oligossacarídeos A MALDI MS é um método muito sensível para a determi nação da massa de um íon molecular neste caso a cadeia de oligossacarídeo inteira Figura 739 A MSMS revela a massa do íon molecular e de muitos de seus fragmentos os quais geralmente são o resultado da clivagem das ligações glicosídicas A análise exclusiva por RMN ver Quadro 45 especialmente para oligossacarídeos de tamanho modera do pode gerar muitas informações sobre sequência posi ção de ligações e configuração de carbonos anoméricos Por exemplo a estrutura do segmento de heparina mostrado em modelo de volume atômico na Figura 722 foi obtida por espectroscopia por RMN Procedimentos automatizados e instrumentos comerciais são utilizados para a determinação rotineira da estrutura de oligossacarídeos mas o sequencia mento de oligossacarídeos ramificados unidos por mais de um tipo de ligação permanece uma tarefa muito mais árdua do que a determinação de sequências lineares de proteínas e ácidos nucleicos Outra ferramenta importante no trabalho com carboi dratos é a síntese química que tem se mostrado uma abor dagem eficaz para a compreensão das funções biológicas de glicosaminoglicanos e oligossacarídeos A química envolvi da nessas sínteses é difícil mas os químicos de carboidratos agora podem sintetizar segmentos curtos de praticamente qualquer glicosaminoglicano com estereoquímica com primento de cadeia e padrão de sulfatação corretos e oligossacarídeos significativamente mais complexos do que aqueles mostrados na Figura 730 A síntese de oligossa carídeos em fase sólida tem como base os mesmos prin cípios e possui as mesmas vantagens que a síntese de peptídeos ver Figura 332 porém requer um conjunto de ferramentas únicas à química de carboidratos grupamen tos bloqueadores e grupamentos ativadores que permitem a síntese de ligações glicosídicas com o grupo hidroxila cor reto Abordagens sintéticas desse tipo representam uma área de grande interesse hoje já que é trabalhoso purificar oligossacarídeos específicos em quantidades adequadas a partir de fontes naturais Microarranjos de oligossacarídeos são utilizados para a identificação de proteínas com afinidade específica por determinados oligossacarídeos O princípio é o mesmo dos microarranjos de DNA Figuras 922 e 923 porém os problemas técnicos são mais desafiadores Microgotículas de oligossacarídeos puros são aderidas a uma lâmina de vi dro e a lâmina é exposta a uma lectina em potencial pro teína ligadora de glicano que tenha sido marcada com uma molécula fluorescente Figura 740 Após a remoção de toda a proteína não adsorvida a observação dos microar ranjos com um microscópio de fluorescência identifica os oligossacarídeos que a lectina reconheceu e a quantifica ção da fluorescência fornece uma estimativa da afinidade entre a lectina e o oligossacarídeo RESUMO 75 Trabalhando com carboidratos c O estabelecimento da estrutura completa de oligossa carídeos e polissacarídeos requer a determinação da sequência linear das posições das ramificações da configuração de cada unidade de monossacarídeo e das posições das ligações glicosídicas um problema mais complexo do que a análise de proteínas e ácidos nucleicos c As estruturas de oligossacarídeos e polissacarídeos em geral são determinadas por uma combinação de méto dos a hidrólise enzimática específica para determinar Nelson6ed07indd 274 Nelson6ed07indd 274 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 275 Mistura de oligossacarídeos Liberação dos oligossacarídeos com endoglicosidase 1 Cromatografia de troca iônica 2 Filtração em gel 3 Cromatografia de afinidade à lectina Oligossacarídeos separados Polissacarídeos purificados Metilação exaustiva com CH3I base forte Carboidrato totalmente metilado Monossacarídeos Hidrólise com ácido forte Oligossacarídeos menores Hidrólise enzimática com glicosidases específicas RMN e espectrometria de massas Hidrólise em ácido gera monossacarídeos metilados em cada OH com exceção daqueles participantes de ligações glicosídicas Posições das ligações glicosídicas Cromatografia líquida de alto desempenho ou derivatização e cromatografia gasosa líquida Composição da mistura Tipos e quantidades das unidades de monossacarídeos Separação dos fragmentos na mistura Sequência dos monossacarídeos posição e configuração das ligações glicosídicas Cada oligossacarídeo submetido à metilação ou análise enzimática Glicoproteína ou glicolipídeo Sequência dos monossacarídeos posição e configuração das ligações glicosídicas FIGURA 738 Métodos para análise de carboidratos Um carboidrato purificado no primeiro estágio da análise frequentemente necessita de todas as quatro rotas analíticas para a caracterização completa 0 20 40 60 80 4100 3580 3060 mz 2540 2020 1500 Intensidade relativa 100 15799 17840 19881 21922 22442 22852 23959 24593 26633 24893 28374 29084 32865 34605 37356 40836 39096 Man GlcNAc Gal Fuc FIGURA 739 Separação e quantificação dos oligossacarídeos em um grupo de glicoproteínas Neste experimento uma mistura de proteínas extraídas de tecido renal foi tratada para a liberação dos oligossacarídeos a partir das glicoproteínas e os oligossacarídeos foram analisados por es pectrometria de massa por dessorção e ionização a laser assistida por matriz MALDI MS Cada oligossacarídeo distinto produz um pico em sua massa molecular e a área sob a curva reflete a quantidade daquele oligossacarídeo O oligossacarídeo mais proeminente aqui massa de 28374 u é composto por 13 resíduos de açúcar outros oligossacarídeos contendo desde apenas 7 resíduos ou até 19 resíduos também foram resolvidos por este método Nelson6ed07indd 275 Nelson6ed07indd 275 070414 1430 070414 1430 276 DAVID L NELSON MICHAEL M COX a estereoquímica da ligação glicosídica e para produzir fragmentos menores para análises adicionais a metila ção para localizar as ligações glicosídicas e a clivagem gradual para determinar a sequência e a configuração dos carbonos anoméricos c A espectrometria de massa e a espectroscopia por RMN de alta resolução apropriadas para pequenas amostras de carboidrato geram informações essenciais sobre se quência configuração dos carbonos anoméricos e ou tros carbonos e posições das ligações glicosídicas c Métodos para síntese em fase sólida produzem oligossa carídeos específicos muito valiosos na exploração das interações lectinaoligossacarídeo e com potencial de se tornar clinicamente úteis c Microarranjos de oligossacarídeos puros são úteis para a determinação da especificidade e da afinidade da liga ção das lectinas a oligossacarídeos específicos Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário glicoconjugado 243 carboidrato 243 monossacarídeo 243 oligossacarídeo 243 dissacarídeo 243 polissacarídeo 243 aldose 244 cetose 244 fórmulas de projeção de Fischer 244 epímeros 245 hemiacetais 245 hemicetais 245 anômeros 246 carbono anomérico 246 piranose 246 furanose 247 fórmulas em perspectiva de Haworth 247 mutarrotação 248 açúcar redutor 251 glicação da hemoglobina 250 ligações Oglicosídicas 251 extremidade redutora 252 glicano 253 amido 255 glicogênio 255 celulose 256 matriz extracelular MEC 260 glicosaminoglicano 260 ácido hialurônico 260 sulfato de condroitina 261 heparansulfato 261 proteoglicano 263 glicoproteína 263 glicoesfingolipídeo 264 sindecano 264 glipicano 264 glicômica 267 lectina 269 selectinas 270 microarranjos de oligossacarídeos 274 Leituras adicionais Geral AssadiPorter FM Maillet EL Radek JT Quijaada J Markley JL Max M 2010 Key amino acid residues involved in multipoint binding interactions between brazzein a sweet protein and the T1R2T1R3 human sweet receptor J Mol Biol 398 584599 Hayes JE 2007 Transdisciplinary perspectives on sweetness Chemosens Percept 1 4857 Descrição da teoria do sabor doce discutida no Quadro 72 Varki A Cummings RD Esko JD Freeze HHStanley P Bertozzi CR Hart GW Etzler ME eds 2009 Essentials of Glycobiology 2nd edn Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor NY Microarranjo de oligossacarídeo Ligação Amostra com proteína ligante de glicano marcada com fluorescência Lavar e observar FIGURA 740 Microarranjos de oligossacarídeos para determinar a especificidade e a afinidade da ligação de carboidratos por lecti nas Soluções de amostras de oligossacarídeos puros sintetizados ou isola dos da natureza são colocadas em gotículas microscópicas sobre uma lâmina de vidro e aderidas por meio de um espaçador inerte Cada ponto representa um oligossacarídeo diferente A amostra de proteína a ser testada para sua afi nidade por oligossacarídeos é primeiramente conjugada a um marcador fluo rescente e então a amostra é vertida sobre a lâmina equilibrada e qualquer proteína não adsorvida é removida A observação do microarranjo com um microscópio de fluorescência mostra quais pontos apresentam proteína ad sorvida brilham em verde e a análise da intensidade de florescência permite uma estimativa grosseira da afinidade da ligação proteínaoligossacarídeo Nelson6ed07indd 276 Nelson6ed07indd 276 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 277 Estrutura biossíntese metabolismo e função de glicosaminoglicanos proteoglicanos glicoproteínas e glicolipídeos todos apresentados em um nível intermediário e muito bem ilustrado O livro está disponível gratuitamente online wwwncbinlmnihgovbooksNBK1908 Watanabe H Tokuda G 2010 Cellulolytic systems in insects Annu Rev Entomol 55 609632 Glicosaminoglicanos e proteoglicanos Bishop JR Schuksz M Esko JD 2007 Heparan sulfate proteoglycans finetune mammalian physiology Nature 446 10301037 Couchman JR 2010 Transmembrane signaling proteoglycans Annu Rev Cell Dev Biol 26 89114 Revisão avançada da função dos proteoglicanos na transdução de sinal em vertebrados Fears CY Woods A 2006 The role of syndecans in disease and wound healing Matrix Biol 25 443456 Revisão em nível intermediário Frantz C Stewart KM Weaver VM 2010 The extracellular matrix at a glance J Cell Sci 123 41954200 Resumo em forma de pôster sobre a matriz extracelular Kirkpatrick CA Selleck SB 2007 Heparan sulfate proteoglycans at a glance J Cell Sci 120 18291832 Resumo em forma de pôster com muitas informações úteis sobre os proteoglicanos ManonJensen T Itoh Y Couchman JR 2010 Proteoglycans in health and disease the multiple roles of syndecan shedding FEBS J 277 38763889 Roseman S 2001 Reflections on glycobiology J Biol Chem 276 4152741542 Ótima revisão sobre a história dos estudos em carboidratos e glicosaminoglicanos escrita por um dos maiores estudiosos desta área Glicoproteínas Boraston A Mulloy B 2010 Structural glycobiology biosynthesis recognition events and new methods Curr Opin Struct Biol 20 533535 Introdução editorial a uma série de excelente revisões publicadas nesta edição sobre estes assuntos Luac G Zoldos V 2010 Protein glycosylationan evolutionary crossroad between genes and environment Mol Biol Syst 6 23722379 Discussão detalhada sobre os fatores que determinam se e onde uma proteína será glicosilada Molinaro M 2007 Nglycan structure dictates extension of protein folding or onset of disposal Nat Chem Biol 3 313320 Revisão em nível intermediário sobre a importância da glicosilação de proteínas no complexo de Golgi Sharon N Gallagher J 2009 Curr Opin Struct Biol 19 495497 Introdução editorial a uma série de boas revisões sobre glicoproteínas e glicolipídeos publicadas nesta edição da revista Weerapana E Imperiali B 2006 Asparaginelinked protein glycosylation from eukaryotic to prokaryotic systems Glycobiology 16 91R101R Revisão em nível intermediário sobre o processo biossintético da glicosilação de proteínas Glicobiologia e o código dos açúcares Boraston AB Bolam DN Gilbert HJ Davies GJ 2004 Carbohydratebinding modules finetuning polysaccharide recognition Biochem J 382 769781 Excelente revisão sobre as bases estruturais para a especificidade de proteínas ligantes de açúcar Gabius HJ Andre S JimenezBarbero J Romero A Solis D 2011 From lectin structure to functional glycomics principles of the sugar code Trends Biochem Sci 36 298313 Revisão em nível intermediário sobre a base estrutural para o reconhecimento de açúcares pelas lectinas Ghosh P Dahms NM Kornfeld S 2003 Mannose 6phosphate receptors new twists in the tale Nat Rev Mol Cell Biol 4 202212 Hebert DN Garman SC Molinari M 2005 The glycan code of the endoplasmic reticulum asparaginelinked carbohydrates as protein maturation and quality control tags Trends Cell Biol 15 364370 Revisão em nível intermediário Helenius A Aebi M 2004 Roles of Nlinked glycans in the endoplasmic reticulum Annu Rev Biochem 73 10191049 Lütteke T BohneLang A Loss A Goetz T Frank M von der Lieth CW 2006 Glycosciencesde an internet portal to support glycomics and glycobiology research Glycobiology 16 71R81R McEver RP Zhu C 2010 Rolling cell adhesion Annu Rev Cell Dev Biol 26 363396 Taylor ME Drickamer K 2006 Introduction to Glycobiol ogy 2nd edn Oxford University Press Oxford Trabalhando com carboidratos Fukuda M ed 2006 Functional Glycomics Methods in Enzymology Vol 417 Academic Press Inc New York Fukuda M ed 2006 Glycobiology Methods in Enzymology Vol 415 Academic Press Inc New York Fukuda M ed 2006 Glycomics Methods in Enzymology Vol 416 Academic Press Inc New York Jay A 1996 The methylation reaction in carbohydrate analysis J Carbohydr Chem 15 897923 Paulson JC Blixt O Collins BE 2006 Sweet spots in functional glycomics Nat Chem Biol 2 238248 Revisão em nível intermediário sobre as ferramentas desenvolvidas recentemente em glicobiologia Zaia J 2008 Mass spectrometry and the emerging field of glycomics Chem Biol 15 881892 Excelente introdução ao uso de espectrometria de massa para o estudo da estrutura e da função dos glicanos Problemas 1 Álcoolaçúcares Nos derivados de monossacarídeos conhecidos como álcoolaçúcares o oxigênio do carbonil está reduzido a um grupo hidroxila Por exemplo o Dgliceraldeído pode ser reduzido a glicerol Entretanto este açúcar não é mais designado D ou L Por quê 2 Reconhecendo epímeros Usando a Figura 73 identifi que os epímeros de a Dalose b Dgulose e c Dribose em C2 C3 e C4 3 Pontos de fusão de derivados osazona de monos sacarídeos Muitos carboidratos reagem com fenilidrazina C6H5NHNH2 para formar derivados cristalinos de cor amare lobrilhante conhecidos como osazonas Nelson6ed07indd 277 Nelson6ed07indd 277 070414 1430 070414 1430 278 DAVID L NELSON MICHAEL M COX HO H H H H O OH OH OH H C C C C C CH2OH Glicose HO H H NNHC6H5 OH OH H C H C C C C CH2OH NNHC6H5 Derivado osazona da glicose C6H5NHNH2 As temperaturas de fusão desses derivados são facilmente determinadas e são características para cada osazona Essas informações foram utilizadas para auxiliar na identificação de monossacarídeos antes do desenvolvimento de HPLC ou cro matografia líquidagasosa Estão listados abaixo os pontos de fusão PFs de alguns derivados aldoseosazona Monossacarídeo PF do monossacarídeo anidro oC PF do derivado osazona oC Glicose 146 205 Manose 132 205 Galactose 165168 201 Talose 128130 201 Como a tabela mostra certos pares de derivados têm os mesmos pontos de fusão embora os monossacarídeos originais não pos suam Por que glicose e manose e similarmente galactose e ta lose formam derivados osazona com o mesmo ponto de fusão 4 Configuração e conformação Quais ligações na aD glicose devem ser rompidas para que sua configuração mude para bDglicose Quais ligações convertem Dglicose a Dma nose Quais ligações convertem uma forma em cadeira de D glicose à outra 5 Desoxiaçúcares A D2desoxigalactose é a mesma molé cula química que a D2desoxiglicose Explique 6 Estruturas de açúcares Descreva as características es truturais comuns e as diferenças para cada par a celulose e glicogênio b Dglicose e Dfrutose c maltose e sacarose 7 Açúcares redutores Desenhe a fórmula estrutural para aDglicosil1S6Dmanosamina e circule a parte dessa es trutura que torna o composto um açúcar redutor 8 Hemiacetal e ligações glicosídicas Explique a dife rença entre um hemiacetal e um glicosídeo 9 Gosto de mel A frutose do mel está principalmente na forma bDpiranose Este é um dos carboidratos mais doces que se conhece em torno de duas vezes mais doce do que a glicose a forma bDfuranose da frutose é muito menos doce A doçura do mel gradualmente diminui em altas temperaturas Também o xarope de milho com alto conteúdo de frutose pro duto comercial no qual muito da glicose do xarope de milho é convertido em frutose é utilizado para adoçar bebidas frias mas não quentes Que propriedade química da frutose poderia ser responsável por essas duas observações 10 A glicoseoxidase na determinação da glicose sanguínea A enzima glicoseoxidase isolada do fungo Penicillium notatum catalisa a oxidação de bDglicose a D gliconodlactona Essa enzima é altamente específica para o anômero b da glicose e não afeta o anômero a Apesar dessa especificidade a reação catalisada pela glicoseoxidase é co mumente utilizada em um ensaio clínico para glicose sanguínea total isto é para soluções contendo uma mistura de a e bD glicose Quais são as condições necessárias para tornar isso possível Além de possibilitar a detecção de pequenas quanti dades de glicose que vantagem a glicoseoxidase oferece sobre o reagente de Fehling para a dosagem de glicose sanguínea 11 A invertase inverte a sacarose A hidrólise da sacarose rotação específica 1665 o gera uma mistura equi molar de Dglicose rotação específica 1525 o e Dfrutose rotação específica 92 o Ver no Problema 4 detalhes sobre rotação específica a Sugira uma maneira conveniente para determinar a taxa de hidrólise de sacarose por uma preparação de enzima extraída do revestimento do intestino delgado b Explique por que na indústria alimentícia uma mistura equimolar de Dglicose e Dfrutose formada pela hidrólise da sacarose é chamada de açúcar invertido c A enzima invertase agora geralmente chamada de sa carase é deixada agir sobre uma solução de 10 01 gmL de sacarose até a hidrólise estar completa Qual será a rotação óptica da solução observada em um tubo de 10 cm Ignore a pequena contribuição possível da enzima 12 Fabricação de chocolates com recheio líquido A manufatura de chocolates contendo um centro líquido é uma interessante aplicação da engenharia enzimática O recheio lí quido consiste principalmente em uma solução aquosa de açú cares rica em frutose para garantir a doçura O dilema técnico é o seguinte o revestimento de chocolate deve ser preparado vertendo chocolate derretido quente sobre um centro sólido ou quase sólido ainda que o produto final deva ter um centro líquido rico em frutose Sugira uma maneira para resolver esse problema Dica A sacarose é muito menos solúvel do que uma mistura de glicose e frutose 13 Anômeros da sacarose A lactose existe em duas for mas anoméricas mas nenhuma forma anomérica da sacarose é conhecida Por quê 14 Gentiobiose Gentiobiose DGlcb1S6DGlc é um dis sacarídeo encontrado em alguns glicosídeos vegetais Desenhe a estrutura da gentiobiose com base em seu nome abreviado A gentiobiose é um açúcar redutor Sofre mutarrotação 15 Identificação de açúcares redutores NacetilbD glicosamina Figura 79 é um açúcar redutor E Dgliconato O dissacarídeo GlcNa141aGlc é um açúcar redutor 16 Digestão da celulose A celulose poderia ser uma for ma de glicose extremamente abundante e barata porém os seres humanos não conseguem digerila Por quê Se lhe ofere cessem uma maneira que permitisse adquirir esta capacidade você aceitaria ou não e por qual motivo 17 Propriedades físicas da celulose e do glicogênio A celulose praticamente pura obtida dos fios das sementes de Gossypium algodão é resistente fibrosa e completamente insolúvel em água Em contrapartida o glicogênio extraído de músculo ou fígado se dispersa prontamente em água quente formando uma solução turva Apesar das propriedades físicas marcadamente diferentes ambas as substâncias são polímeros de Dglicose em ligações 1S4 com massa molecular compará vel Quais características estruturais desses dois polissacarídeos Nelson6ed07indd 278 Nelson6ed07indd 278 070414 1430 070414 1430 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 279 geram suas diferentes propriedades físicas Explique as vanta gens biológicas das respectivas propriedades de cada polímero 18 Dimensões de um polissacarídeo Compare as di mensões de uma molécula de celulose e uma molécula de ami lose cada uma com Mr de 200000 19 Velocidade de crescimento do bambu Os caules do bambu gramínea tropical podem crescer a 03 mdia sob con dições ótimas Dado que os caules são compostos quase que inteiramente por fibras de celulose orientadas no sentido do crescimento calcule o número de resíduos de açúcar que de vem ser enzimaticamente adicionados a cada segundo às ca deias crescentes de celulose para produzir essa velocidade de crescimento Cada unidade de Dglicose contribui com 05 nm para o comprimento de uma molécula de celulose 20 Glicogênio como armazenamento de energia por quanto tempo uma ave cinegética consegue voar Desde a antiguidade tem se observado que certas aves cinegéticas como o galo silvestre a codorna e o faisão são facilmente le vadas à fadiga O historiador grego Xenofonte escreveu As abetardas Otis tarda podem ser capturadas se você for rápi do em incitálas pois voarão apenas uma curta distância como perdizes e em breve se cansarão e sua carne é deliciosa Os músculos de voo das aves cinegéticas dependem quase que in teiramente do uso de glicose1fosfato para energia na forma de ATP ver Capítulo 14 A glicose1fosfato é produzida pela clivagem do glicogênio armazenado no músculo catalisada pela enzima glicogêniofosforilase A taxa de produção de ATP é limitada pela taxa na qual o glicogênio pode ser degradado Durante um voo de pânico a taxa de clivagem do glicogênio das aves de caça é bastante alta cerca de 120 mmolmin de glicose1fosfato produzidos por grama de tecido Dado que os músculos de voo normalmente contêm aproximadamente 035 de glicogênio por peso calcule por quanto tempo uma ave cinegética pode voar Presuma que a massa molecular mé dia de um resíduo de glicose no glicogênio seja de 162 gmol 21 Estabilidade relativa de dois confôrmeros Expli que por que as duas estruturas mostradas na Figura 718b são tão diferentes energeticamente em estabilidade Dica ver Figura 122 22 Volume do sulfato de condroitina em solução Uma função crucial do sulfato de condroitina é agir como lubrifican te em articulações esqueléticas pela criação de um meio gela tinoso elástico e resistente à fricção e ao choque Essa função parece estar relacionada a uma propriedade peculiar do sulfato de condroitina o volume ocupado por uma molécula é muito maior em solução do que quando em sólido desidratado Por que o volume é tão maior em solução 23 Interações da heparina A heparina um glicosa minoglicano negativamente carregado é utilizada como anticoagulante Ela age pela ligação a algumas proteínas plas máticas incluindo antitrombina III um inibidor da coagulação sanguínea A ligação 11 da heparina à antitrombina III parece causar uma alteração na conformação da proteína que aumen ta bastante sua capacidade de inibir a coagulação Quais resí duos de aminoácidos da antitrombina III provavelmente intera gem com a heparina 24 Permutações de um trissacarídeo Pense sobre como estimar o número de possíveis trissacarídeos compostos por Nacetilglicosamina4sulfato GlcNAc4S e ácido glicurônico GlcA e desenhe 10 deles 25 Efeito do ácido siálico sobre eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS Suponha que você tem quatro formas de uma proteína todas com sequências de aminoácidos idênticas porém contendo zero uma duas ou três cadeias de oligossacarídeos cada qual terminando com um único resíduo de ácido siálico Desenhe o padrão que você esperaria em um gel caso uma mistura dessas quatro glicoproteínas fosse resol vida por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS ver Figura 318 e corada para proteínas Identifique todas as ban das em seu desenho 26 Conteúdo de informação dos oligossacarídeos A porção carboidrato de algumas glicoproteínas pode servir como um sítio para o reconhecimento celular Para desempe nhar esta função os oligossacarídeos devem ter o potencial para existir em uma grande variedade de formas O que pode ria produzir uma maior variedade de estruturas oligopeptíde os compostos por cinco diferentes resíduos de aminoácidos ou oligossacarídeos compostos por cinco resíduos de monossaca rídeos diferentes Explique 27 Determinação do conteúdo de ramificações na ami lopectina A quantidade de ramificações número de ligações glicosídicas a1S6 na amilopectina pode ser determinada pelo seguinte procedimento Uma amostra de amilopectina é exaustivamente metilada tratada com um agente metilante iodeto de metil que substitui o hidrogênio da hidroxila de cada açúcar por um grupo metil convertendo OH a OCH3 Todas as ligações glicosídicas na amostra tratada são então hidrolisadas em uma solução aquosa ácida e a quantidade de 23diOmetilglicose assim formada é determinada C H 3 O H O CH2 CH3 O O H H H OH H 23DiOmetilglicose H OH a Explique o princípio desse procedimento para a de terminação do número de pontos de ramificação a1S6 na amilopectina O que acontece com os resíduos de glicose não ramificados da amilopectina durante o processo de metilação e hidrólise b Uma amostra de 258 mg de amilopectina tratada como descrito acima produziu 124 mg de 23diOmetilglicose De termine a porcentagem de resíduos de glicose da amilopectina que continha uma ramificação a1S6 Assuma que a massa molecular média de um resíduo de glicose na amilopectina é 162 gmol 28 Análise estrutural de um polissacarídeo Um po lissacarídeo de estrutura desconhecida foi isolado submetido à metilação exaustiva e hidrolisado A análise dos produtos mostrou três açúcares metilados 234triOmetilDglicose 24diOmetilDglicose e 2346tetraOmetilDglicose na proporção 2011 Qual é a estrutura do polissacarídeo Problema de análise de dados 29 Determinação da estrutura dos antígenos do gru po sanguíneo ABO O sistema ABO dos grupos sanguíneos humanos foi descoberto em 1901 e em 1924 foi mostrado que Nelson6ed07indd 279 Nelson6ed07indd 279 070414 1430 070414 1430 280 DAVID L NELSON MICHAEL M COX esta característica é herdada em um único locus gênico com três alelos Em 1960 W T J Morgan publicou um artigo revi sando o que era conhecido sobre a estrutura das moléculas dos antígenos ABO naquela época Quando o artigo foi publicado as estruturas completas dos antígenos A B e O ainda não eram conhecidas este artigo é um exemplo da construção do co nhecimento científico Em qualquer tentativa para determinar a estrutura de um composto biológico desconhecido os pesquisadores devem li dar com dois problemas fundamentais 1 Se você não sabe o que é como sabe que está puro 2 Se você não sabe o que é como sabe que as condições de extração e purificação não alteraram a estrutura Morgan examinou o problema 1 por meio de alguns métodos Um método é descrito em seu arti go p 312 como observação de valores analíticos constantes após testes de solubilização fracionada Neste caso valores analíticos são medidas de composição química ponto de fu são e assim por diante a Com base em seu entendimento das técnicas químicas o que Morgan quis dizer com testes de solubilização fracionada b Por que os valores analíticos obtidos após testes de so lubilização fracionada de uma substância pura seriam cons tantes e aqueles de uma substância impura não seriam cons tantes Morgan examinou o problema 2 utilizando um ensaio que mede a atividade imune da substância presente em diferentes amostras c Por que é importante para os estudos de Morgan e es pecialmente para examinar o problema 2 que este ensaio de atividade seja quantitativo dosando o nível de atividade em vez de simplesmente qualitativo determinando a presença ou a ausência da substância A estrutura dos antígenos do grupo sanguíneo está mos trada na Figura 1015 Em seu artigo p 314 Morgan listou algumas propriedades dos três antígenos A B e O que eram conhecidas naquela época 1 O antígeno do tipo B tem um conteúdo de galactose maior do que os antígenos A ou O 2 O antígeno do tipo A contém mais aminoaçúcares do que os antígenos B ou O 3 A razão glicosaminagalactosamina para o antígeno A é aproximadamente 12 e para o antígeno B é cerca de 25 d Qualis dessas conclusões ésão consistentes com as estruturas conhecidas dos antígenos do grupo sanguíneo e Como você explicaria as discrepâncias entre os resulta dos de Morgan e as estruturas conhecidas Em um trabalho posterior Morgan e seus colaboradores utilizaram uma inteligente estratégia para adquirir informações estruturais sobre os antígenos do grupo sanguíneo Haviam sido encontradas enzimas que degradariam os antígenos es pecificamente Entretanto essas enzimas estavam disponíveis apenas como preparações enzimáticas brutas possivelmente contendo mais de uma enzima com especificidade desconhe cida A degradação dos antígenos do tipo sanguíneo por estas enzimas brutas poderia ser inibida pela adição à reação de mo léculas de açúcar específicas Apenas açúcares encontrados nos antígenos do tipo sanguíneo causariam essa inibição Uma preparação enzimática isolada do protozoário Trichomonas foetus degradaria todos os três antígenos sendo inibida pela adição de açúcares específicos Os resultados desses estudos estão resumidos na tabela a seguir mostrando a porcentagem de substrato que permaneceu inalterada quando a enzima de T foetus agiu sobre os antígenos do grupo sanguíneo na presença de açúcares Açúcar adicionado Substrato inalterado Antígeno A Antígeno B Antígeno O Controle sem açúcar 3 1 1 LFucose 3 1 100 DFucose 3 1 1 LGalactose 3 1 3 DGalactose 6 100 1 NAcetilglicosamina 3 1 1 NAcetilgalactosamina 100 6 1 Para o antígeno O a comparação entre os resultados do controle e da Lfucose mostra que a Lfucose inibe a degrada ção do antígeno Esse é um exemplo de inibição pelo produto na qual um excesso do produto da reação desloca o equilíbrio da reação impedindo a adicional hidrólise do substrato f Embora o antígeno O contenha galactose Nacetilgli cosamina e Nacetilgalactosamina nenhum desses açúcares inibiu a degradação desse antígeno Com base nesse resultado a preparação enzimática de T foetus é uma endoglicosidase ou uma exoglicosidase Endoglicosidases clivam ligações en tre resíduos internos exoglicosidases removem um resíduo de cada vez a partir da extremidade de um polímero Explique seu raciocínio g Quais dos resultados em f e g são consistentes com as estruturas mostradas na Figura 1015 Explique seu racio cínio Referência Morgan WTJ 1960 The Croonian Lecture a contribution to human biochemical genetics the chemical basis of bloodgroup specificity Proc R Soc Lond B Biol Sci 151 308347 Nelson6ed07indd 280 Nelson6ed07indd 280 070414 1430 070414 1430 81 Alguns dados básicos 281 82 Estrutura dos ácidos nucleicos 287 83 Química dos ácidos nucleicos 297 84 Outras funções dos nucleotídeos 306 N ucleotídeos apresentam uma variedade de funções no metabolismo celular Eles são a moeda energética nas transações metabólicas são as ligações químicas essenciais nas respostas da célula a hormônios e a outros estímulos extracelulares e também são os componentes estruturais de uma estrutura ordenada de cofatores enzi máticos e intermediários metabólicos E por último mas não menos importante eles são os constituintes dos ácidos nucleicos ácido desoxirribonucleico DNA e ácido ribo nucleico RNA os repositórios moleculares da informação genética A estrutura de cada proteína e em última análi se de cada biomolécula e componente celular é o produto da informação programada na sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos da célula A capacidade de armazenar e transmitir a informação genética de uma geração a outra é uma condição fundamental para a vida Este capítulo fornece uma visão geral da natureza quí mica dos nucleotídeos e ácidos nucleicos encontrados na maioria das células uma abordagem mais detalhada da fun ção dos ácidos nucleicos é o foco da Parte III deste texto 81 Alguns dados básicos Nucleotídeos os blocos de construção dos ácidos nucleicos A se quência de aminoácidos de cada proteína na célula e a se quência nucleotídica de cada RNA são especificadas pela sequência nucleotídica do DNA da célula Um segmento de uma molécula de DNA que contém a informação necessária para a síntese de um produto biologicamente funcional seja proteína ou RNA é denominado gene Uma célula costuma ter muitos milhares de genes e moléculas de DNA não sur preendentemente tendem a ser muito grandes O armaze namento e a transferência da informação biológica são as únicas funções conhecidas do DNA O RNA tem uma ampla variedade de funções e mui tas classes são encontradas nas células Os RNA ribos somais rRNAs são componentes dos ribossomos os complexos que executam a síntese proteica Os RNAs mensageiros mRNAs são intermediários carregando a informação genética de um ou poucos genes para o ri bossomo onde as proteínas correspondentes podem ser sintetizadas Os RNAs transportadores tRNAs são moléculas adaptadoras que traduzem fielmente a infor mação no mRNA em uma sequência específica de aminoá cidos Além dessas classes maiores existe uma grande va riedade de tipos de RNA com funções especiais descritos detalhadamente na Parte III Nucleotídeos e ácidos nucleicos têm pentoses e bases características Os nucleotídeos apresentam três componentes caracte rísticos 1 uma base nitrogenada contendo nitrogênio 2 uma pentose e 3 um ou mais fosfatos Figura 81 A molécula sem o grupo fosfato é denominada nucleosídeo As bases nitrogenadas são derivadas de dois compostos re 8 Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos O H OH CH2 H H H OH O P O2 2O O 29 b 49 39 59 19 Pentose Base púrica ou pirimídica Fosfato a HC N C N C H N H C N CH 9 6 3 2 5 4 1 7 8 C N H CH H N C H 6 1 4 5 2 3 C Pirimidina Purina b FIGURA 81 Estrutura de nucleotídeos a A estrutura geral mostrando a convenção numérica do anel de pentose Esse é um ribonucleotídeo Nos desoxirribonucleotídeos o grupo OH no carbono 29 vermelho é subs tituído por H b Os compostos ancestrais das bases pirimídicas e púricas dos nucleotídeos e dos ácidos nucleicos mostrando a convenção numérica Nelson6ed08indd 281 Nelson6ed08indd 281 020514 1716 020514 1716 282 DAVID L NELSON MICHAEL M COX lacionados a pirimidina e a purina As bases e as pento ses dos nucleotídeos comuns são compostos heterocíclicos CONVENÇÃOCHAVE Os átomos de carbono e de nitrogênio nas estruturas relacionadas são numerados convencio nalmente para facilitar a denominação e a identificação dos muitos compostos derivados A convenção para o anel da pentose segue as regras descritas no Capítulo 7 mas nas pentoses dos nucleotídeos e nucleosídeos os núme ros dos carbonos recebem a designação de um apóstrofo 9 para diferenciálos dos átomos numerados nas bases nitrogenadas A base de um nucleotídeo é ligada covalentemente no N1 das pirimidinas e no N9 das purinas por uma ligação Nbglicosídica ao carbono 19 da pentose e o fosfato é este rificado no carbono 59 A ligação Nbglicosídica é formada pela remoção dos elementos de água um grupo hidroxila da pentose e o hidrogênio da base como na formação da ligação Oglicosídica ver Figura 730 Tanto o DNA quanto o RNA contêm duas bases púricas principais adenina A e guanina G e duas pirimídi cas No DNA e no RNA uma das pirimidinas é a citosina C mas a segunda pirimidina não é a mesma nos dois é a timina T no DNA e a uracila U no RNA Apenas rara mente a timina é encontrada no RNA ou a uracila no DNA As estruturas das cinco principais bases estão mostradas na Figura 82 e a nomenclatura de seus nucleotídeos e nucleosídeos correspondentes está resumida na Tabela 81 Os ácidos nucleicos têm dois tipos de pentoses As re correntes unidades desoxirribonucleotídicas do DNA con têm 29desóxiDribose e as unidades ribonucleotídicas do RNA contêm Dribose Nos nucleotídeos ambos os tipos de pentoses estão na sua forma bfuranose anel fechado com cinco átomos Como mostra a Figura 83 o anel de pento se não é planar mas ocorre em uma série de conformações geralmente descritas como pregueadas CONVENÇÃOCHAVE Embora o DNA e do RNA pareçam ter duas diferenças pentoses diferentes e a presença de ura cila no RNA e timina no DNA é a pentose que define a identidade do ácido nucleico Se o ácido nucleico contém 29desoxiDribose é DNA por definição embora possa apresentar alguma uracila Da mesma forma se o ácido nu cleico contém Dribose é RNA independentemente da sua composição de base A Figura 84 mostra as estruturas e os nomes dos qua tro principais desoxirribonucleotídeos desoxirribo nucleosídeo 59monofosfato as unidades estruturais dos DNAs e os quatro principais ribonucleotídeos ribonucle osídeo 59monofosfato as unidades estruturais dos RNAs TABELA 81 Nomenclatura de nucleotídeo e de ácido nucleico Base Nucleosídeo Nucleotídeo Ácido nucleico Purinas Adenina Adenosina Adenilato RNA Desoxiadenosina Desoxiadenilato DNA Guanina Guanosina Guanilato RNA Desoxiguanosina Desoxiguanilato DNA Pirimidinas Citosina Citidina Citidilato RNA Desoxicitidina Desoxicitidilato DNA Timina Timidina ou desoxitimidina Timidilato ou desoxitimidilato DNA Uracila Uridina Uridilato RNA Nota Nucleosídeo e nucleotídeo são termos genéricos que incluem ambas as formas ribo ou desoxirribo Também ribonucleosídeos ou ribonucleotídeos são aqui designados simplesmente como nucleosídeos e nucleotídeos p ex riboadenosina como adenosina e desoxirribonucleosídeos e desoxirribonucleotídeos como deso xinucleosídeos e desoxinucleotídeos p ex desoxirriboadenosina como desoxiadenosina Ambas as formas de denominação são aceitas mas os nomes mais curtos são mais comumente usados A timina é uma exceção ribotimidina é usado para descrever sua ocorrência incomum no RNA Purinas Guanina Adenina HC N C N C N H C N CH NH2 H C N C N C H2N N H C N CH O Pirimidinas Citosina H C N CH N C CH NH2 O Uracila RNA C N C H N C C O O H H H Timina DNA C N CH N C C H O O H CH3 FIGURA 82 Principais bases púricas e pirimídicas dos ácidos nuclei cos Alguns dos nomes comuns dessas bases refletem as circunstâncias das suas descobertas A guanina por exemplo foi primeiramente isolada de guano esterco de pássaro e a timina foi isolada originariamente de tecido do timo Nelson6ed08indd 282 Nelson6ed08indd 282 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 283 H C O OH CH2OH H C C C H H OH OH CH2 O H OH H OH OH H H OH Aldeído bFuranose a 19 19 29 C29 endo 59 49 49 39 C39 exo C39 endo 59 b C29 exo Base Base FIGURA 83 Conformação da ribose a Em solução as formas de ca deia reta aldeído e em anel bfuranose da ribose livre estão em equilíbrio O RNA contém apenas a forma em anel a bDribofuranose A desoxirribose sofre uma interconversão semelhante em solução mas no DNA existe ape nas a b29desoxiDribofuranose b Os anéis de ribofuranose nos nucleotí deos podem existir em quatro diferentes conformações pregueadas Em to dos os casos quatro dos cinco átomos estão em uma forma planar O quinto átomo C29 ou C39 está no mesmo lado endo ou no lado oposto exo do plano em relação ao átomo de C59 a Desoxirribonucleotídeos T dT dTMP Desoxitimidina Nucleotídeo Desoxiadenilato desoxiadenosina 59monofosfato Desoxiguanilato desoxiguanosina 59monofosfato Desoxitimidilato desoxitimidina 59monofosfato Símbolos A dA dAMP Nucleosídeo Desoxiadenosina G dG dGMP Desoxiguanosina Desoxicitidilato desoxicitidina 59monofosfato C dC dCMP Desoxicitidina CH2 O 2O OH H P CH3 O2 HN N H H H H O O O O O CH2 N O O OH H P NH2 O2 N N N H H H H O O CH2 O 2O OH H P HN H2N O2 N N N H H H H O O CH2 O 2O OH H P NH2 O2 N N H H H H O O O b Ribonucleotídeos U UMP C CMP Uridina Nucleotídeo Guanilato guanosina 59monofosfato Uridilato uridina 59monofosfato Citidilato citidina 59monofosfato Símbolos Nucleosídeo Adenilato adenosina 59monofosfato A AMP Adenosina G GMP Guanosina Citidina O CH2 N O 2O OH H P NH2 O2 N N N H H H O O CH2 O 2O OH H P HN H2N O2 N N N H H H O O CH2 O 2O OH H P O2 N N H H H O O CH2 O 2O OH H P NH2 O2 N N H H H O O O OH OH OH OH H O O FIGURA 84 Desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos dos ácidos nucleicos Todos os nucleotídeos estão mostrados nas suas formas livres em pH 70 As unidades nucleotídicas do DNA a são em geral simbolizadas como A G T e C e algumas vezes como dA dG dT e dC aquelas do RNA b como A G U e C Na sua forma livre os desoxirribonucleotídeos são comu mente abreviadas como dAMP dGMP dTMP e dCMP os ribonucleotídeos AMP GMP TMP e CMP Para cada nucleotídeo os nomes comuns são segui dos pelo nome completo entre parênteses Todas as abreviaturas assumem que o grupamento fosfato está na posição 59 A porção nucleosídica de cada molécula está sombreada em cor salmão Nesta e nas próximas ilustrações os carbonos do anel não estão mostrados Nelson6ed08indd 283 Nelson6ed08indd 283 070414 1429 070414 1429 284 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Embora os nucleotídeos que contêm as principais pu rinas e pirimidinas sejam os mais comuns o DNA e o RNA também contêm algumas bases secundárias Figura 85 No DNA as mais comuns delas são as formas metiladas das bases principais em alguns DNA virais algumas bases podem ser hidroximetiladas ou glicosiladas As bases alte radas ou raras na molécula de DNA muitas vezes apresen tam funções na regulação ou na proteção da informação genética Bases secundárias de muitos tipos também são encontradas nos RNAs especialmente nos tRNAs ver Fi guras 825 e 2622 CONVENÇÃOCHAVE A nomenclatura para as bases secundá rias pode ser confusa Assim como as bases principais mui tas têm nomes comuns hipoxantina por exemplo mos trada como seu nucleosídeo inosina na Figura 85 Quando um átomo no anel púrico ou pirimídico é substituído a con venção usual utilizada aqui é simplesmente para indicar a posição no anel do átomo substituído pelo seu número por exemplo 5metilcitosina 7metilguanina e 5hidroximetil citosina mostrados como nucleosídeos na Figura 85 O elemento ao qual o átomo substituído é ligado N C O não é identificado A convenção muda quando o átomo substi tuído é exocíclico não se encontra dentro da estrutura cí clica nesse caso o tipo de átomo é identificado e a posição no anel no qual ele é ligado é indicada por sobrescrito O nitrogênio amino ligado ao C6 da adenina é N 6 da mesma forma o oxigênio da carbonila e o nitrogênio amino no C6 e no C2 da guanina são O 6 e N 2 respectivamente Exemplos dessa nomenclatura são N 6metiladenosina e N 2metilgua nosina Figura 85 As células também contêm nucleotídeos com grupos fosfato em posições diferentes do carbono 59 Figura 86 Os ribonucleosídeos 2939monofosfato cíclicos são in termediários isoláveis e os ribonucleosídeos 39monofos fato são os produtos finais de hidrólise do RNA por certas ribonucleases Outras variações são adenosina 3959mono fosfato cíclico cAMP e guanosina 3959monofosfato cícli co cGMP considerados no final deste capítulo Ligações fosfodiéster ligam nucleotídeos consecutivos nos ácidos nucleicos Os nucleotídeos consecutivos de ambos DNA e RNA são ligados covalentemente por pontes de grupos fosfato nas quais o grupo 59fosfato de uma unidade nucleotídica é ligado ao grupo 39hidroxila do próximo nucleotídeo criando uma ligação fosfodiéster Figura 87 Por tanto o esqueleto covalente dos ácidos nucleicos con siste em fosfatos e resíduos de pentose alternados e as a N2Metilguanosina 5Hidroximetilcitidina N6Metiladenosina 5Metilcitidina N NH2 O CH2OH 5 N Ribose HN N N N H O H3C 2 N Ribose N NH2 O CH3 5 N Ribose CH3 NH N N N 6 N Ribose HN N1 N O b 7Metilguanosina 4Tiouridina N N N O H2N Inosina Pseudouridina N CH3 HN O O O S HN 7 4 5 HN Ribose N Ribose Ribose N Ribose H FIGURA 85 Algumas bases púricas e pirimídicas secundárias mos tradas como nucleosídeos a Bases secundárias do DNA A 5metilciti dina ocorre no DNA de animais e de plantas superiores a N 6metiladenosina no DNA bacteriano e a 5hidroximetilcitidina no DNA de animais e bactérias infectadas por determinados bacteriófagos b Algumas bases secundárias do tRNA A inosina contém a base hipoxantina Observe que a pseudouridi na como a uridina contém uracila elas são diferentes no ponto de ligação à ribose na uridina a uracila é ligada pelo N1 o ponto de ligação usual para pirimidinas na pseudouridina pelo C5 Adenosina 59monofosfato Adenosina 29monofosfato CH2 O 2O OH H P O2 H H H O O OH 39 29 49 19 59 Adenina CH2 O 2O H P O2 H H H O O OH 29 Adenina HO Adenosina 2939 monofosfato cíclico Adenosina 39monofosfato CH2 O 2O H P O2 H H H O O OH 39 Adenina HO CH2 O H P O2 H H H O 39 29 Adenina HO O O FIGURA 86 Algumas adenosina monofosfatos Adenosina 29mono fosfato adenosina 39monofosfato e adenosina 2939monofosfato cíclico são formados por hidrólise enzimática e alcalina do RNA Nelson6ed08indd 284 Nelson6ed08indd 284 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 285 bases nitrogenadas podem ser consideradas como grupos laterais ligados ao esqueleto em intervalos regulares O esqueleto do DNA e do RNA são hidrofílicos Os grupos hidroxila dos resíduos de açúcar formam ligações de hidrogênio com a água Os grupos fosfato com um pKa próximo a 0 são completamente ionizados e carregados negativamente em pH 7 e as cargas negativas são de um modo geral neutralizadas pelas interações iônicas com cargas positivas nas proteínas nos íons metálicos e nas poliaminas CONVENÇÃOCHAVE Todas as ligações fosfodiéster no DNA e no RNA têm a mesma orientação ao longo da cadeia Figura 87 conferindo a cada fita do ácido nucleico uma polarida de específica e extremidades 59 e 39 diferentes Por defini ção a extremidade 59 não apresenta um nucleotídeo na posição 59 e a extremidade 39 não apresenta um nucleo tídeo na posição 39 Outros grupos mais frequentemente um ou mais fosfatos podem estar presentes em uma ou em ambas as extremidades A orientação 59 para 39 de uma fita de ácido nucleico referese a uma extremidade da fita não a orientação da ligação fosfodiéster individual ligando seus nucleotídeos constituintes O esqueleto covalente do DNA e do RNA está sujeito a hidrólise lenta e não enzimática das ligações fosfodiés ter No tubo de ensaio o RNA é hidrolisado rapidamente em condições alcalinas mas não o DNA os grupamentos 29hidroxila no RNA ausentes no DNA estão diretamen te envolvidos nesse processo Os nucleotídeos 2939mo nofosfato cíclicos são os primeiros produtos da ação de álcalis sobre o RNA e são rapidamente hidrolisados para gerar uma mistura de 29 e 39nucleosídeos monofosfato Figura 88 As sequências nucleotídicas dos ácidos nucleicos po dem ser representadas esquematicamente como ilustrado a seguir por um segmento de DNA com cinco unidades nu cleotídicas Os grupos fosfato são simbolizados pelo e O2 RNA CH2 O 2O H P H OH H O 39 59 U H O CH2 O 2O H P H H O O 39 59 G H O CH2 O 2O H P H H O O 39 59 H O H O Extremidade 59 O2 CH2 O 2O H P H H H O 39 59 A H O CH2 O 2O H P H H H O O 39 59 T H O CH2 O 2O H P H H H O O 39 59 G H O H O Extremidade 59 Extremidade 39 Extremidade 39 C 59 39 DNA Ligação fosfodiéster OH OH FIGURA 87 Ligações fosfodiéster no esqueleto covalente do DNA e do RNA As ligações fosfodiéster uma das quais está sombreada no DNA ligam unidades nucleotídicas sucessivas O esqueleto de pentose e grupa mentos fosfato alternados nos dois tipos de ácidos nucleicos é altamente polar As extremidades 59 e 39 da macromolécula podem estar livres ou po dem estar ligados a um grupo fosforil FIGURA 88 Hidrólise de RNA em condições alca linas O grupamento 29hidroxila atua como grupa mento nucleofílico no deslocamento intramolecular O derivado 2939monofosfato cíclico é mais hidrolisado para gerar uma mistura de nucleosídeos 29 e 39mono fosfato O DNA o qual não apresenta grupamentos 29hi droxila é estável em condições semelhantes Derivado 2939monofosfato cíclico Mistura de derivados 29 e 39monofosfato RNA RNA encurtado H P H H H O 2OH O O CH2 O H P H H H O O Base1 O O 2O H CH2 O H P H H H O O Base2 O 2O H O P 2O CH2 H H H H O O Base2 O H O P 2O OH 1 Base1 O P O 2O CH2 2O O H2O O Nelson6ed08indd 285 Nelson6ed08indd 285 070414 1429 070414 1429 286 DAVID L NELSON MICHAEL M COX cada desoxirribose é simbolizada por uma linha vertical a partir do C19 na parte superior para o C59 na parte inferior mas lembrese de que nos ácidos nucleicos o açúcar está sempre na sua forma de anel fechado de bfuranose As linhas de conexão entre os nucleotídeos as quais passam pelo estão desenhadas diagonalmente a partir do cen tro C39 da desoxirribose de um nucleotídeo para a parte inferior C59 do próximo nucleotídeo A P C P G P T P A P OH Extremidade 59 Extremidade 39 Algumas representações mais simples desse pentadesoxirri bonucleotídeo são pACGTAOH pApCpGpTpA e pACGTA CONVENÇÃOCHAVE A sequência de uma fita simples de ácido nucleico é sempre escrita com a sua extremidade 59 à es querda e com a extremidade 39 à direita isto é na direção 59S39 Um ácido nucleico pequeno é denominado oligonu cleotídeo A definição de pequeno é um tanto arbitrária mas polímeros contendo 50 nucleotídeos ou menos em ge ral são chamados de oligonucleotídeos Um ácido nucleico maior é chamado de polinucleotídeo As propriedades das bases nucleotídicas afetam a estrutura tridimensional dos ácidos nucleicos Purinas e pirimidinas livres são compostos fracamente básicos e por isso são chamados de bases As purinas e as pirimidinas comuns no DNA e no RNA são moléculas aromáticas Figura 82 uma propriedade com conse quências importantes para a estrutura a distribuição dos elétrons e a absorção de luz dos ácidos nucleicos O des locamento dos elétrons entre os átomos no anel confere à maioria das ligações caráter parcial de ligação dupla O resultado é que as pirimidinas são moléculas planares e as purinas são muito próximas a uma estrutura planar com uma leve prega Bases púricas e pirimídicas livres podem existir em duas ou mais formas tautoméricas dependen do do pH A uracila por exemplo ocorre nas formas lac tâmicas lactímicas e lactímicas duplas Figura 89 As estruturas mostradas na Figura 82 são os tautômeros que predominam em pH 70 Todas as bases nucleotídicas ab sorvem luz UV e os ácidos nucleicos são caracterizados por uma forte absorção em comprimentos de onda próxi mos a 260 nm Figura 810 As bases púricas e pirimídicas são hidrofóbicas e relati vamente insolúveis em água perto do pH neutro da célula Em pH ácido ou alcalino as bases tornamse carregadas e sua solubilidade em água aumenta Interações de empilha mento hidrofóbicas em que duas ou mais bases são posicio nadas com os planos de seus anéis em paralelo como pilha de moedas são uma das duas formas mais importantes de interação entre bases nos ácidos nucleicos O empilhamen to também envolve a combinação de interações dipolodi polo e de van der Waals entre as bases O empilhamento de bases ajuda a minimizar o contato das bases com a água e interações de empilhamento de bases são muito importan tes na estabilização da estrutura tridimensional dos ácidos nucleicos como descrito posteriormente Os grupos funcionais das purinas e das pirimidinas são anéis nitrogenados grupos carbonila e grupos amino exo cíclicos As ligações de hidrogênio envolvendo os grupos amino e carbonila são a forma mais importante de interação entre duas e ocasionalmente três ou quatro cadeias com Lactâmico O HN O N H H O N OH N N OH HO N Lactímico Lactímico duplo Uracila FIGURA 89 Formas tautoméricas da uracila A forma lactâmica predo mina em pH 70 as outras formas tornamse mais proeminentes quando o pH diminui As outras pirimidinas livres e as purinas livres também têm for mas tautoméricas mas são mais raramente encontradas FIGURA 810 Espectro de absorção dos nucleotídeos co muns Os espectros são mostrados de acordo com a variação nos coeficientes de extinção molar pelo comprimento de onda Os coefi cientes de extinção molar em 260 nm e pH 70 260 estão listados na tabela Os espectros dos ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos correspondentes assim como os nucleosídeos são essencialmente idênticos Para misturas de nucleotídeos o comprimento de onda de 260 nm linha vertical tracejada é usado para medidas de absorção 14000 12000 10000 8000 6000 AMP Coeficiente de extinção molar em 260 nm e260 M21cm21 15400 GMP 11700 UMP 9900 dTMP 9200 CMP 7500 4000 2000 Coeficiente de extinção molar e 280 270 260 250 240 230 Comprimento de onda nm Nelson6ed08indd 286 Nelson6ed08indd 286 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 287 plementares de ácidos nucleicos Os padrões mais comuns de ligações de hidrogênio são aqueles definidos por James D Watson e Francis Crick em 1953 nos quais A ligase especifi camente a T ou U e G ligase a C Figura 811 Esses dois tipos de pares de bases predominam no DNA de fita dupla e no RNA e os tautômeros mostrados na Figura 82 são res ponsáveis por esses padrões É esse pareamento específico de bases que permite a duplicação da informação genética como será discutido posteriormente neste capítulo James D Watson Francis Crick 19162004 RESUMO 81 Alguns dados básicos c Um nucleotídeo é constituído por uma base nitrogena da purina ou pirimidina um açúcar pentose e um ou mais grupos fosfato Os ácidos nucleicos são polímeros de nucleotídeos unidos por ligações fosfodiéster entre o grupo 59hidroxila de uma pentose e o grupo 39hidro xila da próxima pentose c Existem dois tipos de ácidos nucleicos RNA e DNA Os nucleotídeos no RNA contêm ribose e as bases pirimídi cas comuns são a uracila e a citosina No DNA os nucleo tídeos contêm 29desoxirribose e as bases pirimídicas co muns são a timina e a citosina As purinas primárias são adenina e guanina tanto no RNA quanto no DNA 82 Estrutura dos ácidos nucleicos A descoberta da estrutura do DNA por Watson e Crick em 1953 deu origem a disciplinas completamente novas e in fluenciou o rumo de muitas já estabelecidas Nesta seção o foco principal será a estrutura do DNA alguns dos eventos que conduziram para a sua descoberta e aprimoramentos mais recentes na nossa compreensão do DNA A estrutura do RNA também é apresentada Como no caso da estrutura proteica Capítulo 4 muitas vezes é útil descrever a estrutura de ácidos nucleicos em termos de níveis de complexidade hierárquicos primário secundário terciário A estrutura primária dos ácidos nu cleicos é sua estrutura covalente e sequência nucleotídica Qualquer estrutura regular e estável adotada por alguns ou todos os nucleotídeos em um ácido nucleico pode ser considerada como estrutura secundária Todas as estrutu ras consideradas no restante deste capítulo se classificam como estruturas secundárias O enovelamento complexo de grandes cromossomos dentro da cromatina eucariótica e o nucleoide bacteriano ou o elaborado enovelamento de FIGURA 811 Padrões de ligações de hidrogênio no pareamento de bases definido por Watson e Crick Aqui como em outras partes no livro as ligações de hidrogênio estão representadas por três linhas azuis C C C C G G G G A A A A A T T T T T 59 39 59 39 108 A N C O C N C H C C H C N C N C 111 A 28 A 29 A 29 A 30 A 30 A H N C O CH3 C O N H N C H C C H N C C N C H N C N O N H H H H Adenina Timina Guanina Citosina N H C19 C19 C19 H H N C N C19 Nelson6ed08indd 287 Nelson6ed08indd 287 070414 1429 070414 1429 288 DAVID L NELSON MICHAEL M COX grandes moléculas de tRNA ou rRNA geralmente são consi derados estruturas terciárias A estrutura terciária do DNA é discutida no Capítulo 24 e a estrutura terciária do RNA é considerada no Capítulo 26 O DNA é uma duplahélice que armazena informação genética O DNA foi inicialmente isolado e caracterizado por Friedri ch Miescher em 1868 Ele chamou a substância contendo fósforo de nucleína Até os anos de 1940 com o trabalho de Oswald T Avery Colin MacLeod e Maclyn McCarty não existia uma evidência convincente de que o DNA fosse o material genético Avery e seus colegas descobriram que DNA extraído de uma linhagem virulenta patogênica da bactéria Streptococcus pneumoniae e injetado em uma linhagem não virulenta da mesma bactéria transformava a linhagem não virulenta em virulenta Eles concluíram que o DNA da linhagem virulenta carregava a informação genéti ca para virulência Então em 1952 experimentos de Alfred D Hershey e Martha Chase que estudaram a infecção de células bacterianas por um vírus bacteriófago com DNA ou proteína marcados radioativamente acabaram qualquer dúvida remanescente de que o DNA e não a proteína por tava a informação genética Outra pista importante para a estrutura do DNA veio do trabalho de Erwin Chargaff e seus colegas no final dos anos de 1940 Eles descobriram que as quatro bases nucleotídi cas do DNA eram encontradas em proporções diferentes nos DNAs de organismos diferentes e que as quantidades de certas bases estavam relacionadas Esses dados cole tados a partir de DNAs de uma variedade muito grande de espécies conduziram Chargaff às seguintes conclusões 1 A composição de bases do DNA em geral varia de uma espécie para a outra 2 Amostras de DNA isoladas de diferentes tecidos da mesma espécie têm a mesma composição de bases 3 A composição de bases de DNA em uma dada espé cie não muda com a idade do organismo seu estado nutricional ou a mudança de ambiente 4 Em todos os DNAs celulares independentemente da espécie o número de resíduos da adenosina é igual ao número de resíduos da timidina isto é A 5 T e o número de resíduos de guanosina é igual ao número de resíduos de citidina G 5 C Dessas correlações concluise que a soma dos resíduos de purina é igual à soma dos resíduos de pirimidina isto é A 1 G 5 T 1 C Essas relações quantitativas algumas vezes denomina das regras de Chargaff foram confirmadas por muitos ou tros pesquisadores Elas foram a chave para estabelecer a estrutura tridimensional do DNA e para levantar pistas da forma como a informação genética está codificada no DNA e é transmitida de uma geração para a outra Para esclarecer melhor sobre a estrutura do DNA Rosa lind Franklin e Maurice Wilkins usaram o método eficaz da difração por raios X ver Quadro 45 para analisar fibras de DNA Eles demonstraram no início dos anos de 1950 que o DNA produz um padrão de difração por raios X característi co Figura 812 A partir desse padrão deduziuse que as moléculas de DNA são helicoidais com duas periodicidades ao longo de seu eixo mais longo a primária de 34 Å e a secundária de 34 Å O problema então era propor o modelo tridimensional de uma molécula de DNA que pudesse ser compatível não apenas com os dados de difração de raios X mas também com a equivalência de bases AT e GC específica descoberta por Chargaff e com as outras proprie dades químicas do DNA Rosalind Franklin 19201958 Maurice Wilkins 19162004 James Watson e Francis Crick contaram com essas in formações acumuladas sobre o DNA para deduzir sua estru tura Em 1953 eles postularam o modelo tridimensional da estrutura do DNA que levava em consideração todos as da dos disponíveis O modelo consiste em duas cadeias de DNA helicoidais enroladas em torno do mesmo eixo para formar uma duplahélice de orientação à direita ver no Quadro 41 uma explicação sobre a orientação à direita e à esquerda da estrutura helicoidal Os esqueletos hidrofílicos de grupos fosfato e desoxirribose alternados estão no lado de fora da duplahélice orientados para a água circundante O anel fu ranosídico de cada desoxirribose está na conformação C29 endo As bases pirimídicas e púricas das duas fitas estão empilhadas dentro da duplahélice com suas estruturas hi drofóbicas em forma de anel e quase planares muito perto uma da outra e perpendiculares ao eixo longitudinal O pa reamento perfeito das duas fitas cria um sulco maior e um FIGURA 812 Padrão de difração por raios X de fibras do DNA As marcas formando uma cruz no centro demonstram a estrutura helicoidal As bandas pesadas na esquerda e na direita originamse das bases recorrentes Nelson6ed08indd 288 Nelson6ed08indd 288 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 289 sulco menor na superfície do duplex Figura 813 Cada base nucleotídica de uma fita está pareada no mesmo plano com a base da outra fita Watson e Crick descobriram que os pares de bases unidos por ligações de hidrogênio de G com C e de A com T mostrados na Figura 811 são aqueles que melhor se enquadram dentro da estrutura fornecendo uma base lógica para a regra de Chargaff que em qualquer DNA G 5 C e A 5 T É importante notar que podem ser formadas três ligações de hidrogênio entre G e C simbolizadas GC mas apenas duas podem ser formadas entre A e T simbo lizadas AT Essa é uma razão para a descoberta de que a separação das fitas pareadas do DNA é mais difícil quanto maior for a razão do pareamento de bases GC para AT Outros pareamentos de bases tendem em vários graus a desestabilizar a estrutura dupla helicoidal Quando Watson e Crick construíram seu modelo eles tiveram que decidir inicialmente se as fitas de DNA seriam paralelas ou antiparalelas se suas ligações fosfodiéster 3959 iriam seguir no mesmo sentido ou em sentidos opos tos Uma orientação antiparalela produziu o modelo mais convincente e trabalhos posteriores com DNApolimerases Capítulo 25 produziram evidências experimentais de que as fitas eram mesmo antiparalelas um achado confirmado posteriormente por análise de raios X Para explicar a periodicidade nos padrões de difração de raios X das fibras de DNA Watson e Crick manipularam modelos moleculares para chegar à estrutura em que a dis tância entre as bases empilhadas verticalmente no interior da duplahélice seria de 34 Å uma distância de repetição secundária de aproximadamente 34 Å foi atribuída para a presença de 10 pares de bases em cada volta completa da duplahélice Em solução aquosa a estrutura é um pouco diferente daquela nas fibras havendo 105 pares de bases por volta helicoidal Figura 813 Como mostra a Figura 814 as duas cadeias polinu cleotídicas antiparalelas da duplahélice de DNA não são idênticas nem na sua sequência de bases e nem na sua com posição Elas são complementares entre si Sempre que a adenina está presente em uma cadeia a timina é encontra da na outra da mesma forma sempre que a guanina está presente em uma cadeia a citosina é encontrada na outra A duplahélice de DNA ou duplex é mantida por duas forças como descrito anteriormente ligações de hidrogênio entre os pares de bases complementares Figura 811 e in terações de empilhamento de bases A complementaridade entre as cadeias de DNA é atribuída à ligação de hidrogênio entre os pares de bases As interações de empilhamento de bases as quais são muito inespecíficas no que diz respeito à identidade das bases empilhadas determinam a maior con tribuição para a estabilidade da duplahélice Os aspectos importantes do modelo da duplahélice da estrutura do DNA são mantidos em grande parte por evi dências biológicas e químicas Além disso o modelo sugere imediatamente um mecanismo para a transmissão da infor mação genética O aspecto principal do modelo é a comple mentaridade das duas cadeias de DNA Como Watson e Crick foram capazes de visualizar muito antes da disponibilidade de dados confirmatórios essa estrutura poderia ser replicada de forma lógica pela 1 separação das duas cadeias e 2 síntese de uma cadeia complementar a cada uma delas Uma vez que em cada nova cadeia os nucleotídeos são unidos na sequência especificada pelas regras de pareamento de bases descritas anteriormente cada cadeia preexistente funciona 34 Å 36 Å 20 Å Sulco maior Sulco menor a b c FIGURA 813 Modelo de WatsonCrick para a estrutura do DNA O modelo original proposto por Watson e Crick tinha 10 pares de bases ou 34 Å 34 nm por volta da hélice medidas subsequentes revelaram 105 pares de bases ou 36 Å 36 nm por volta a Representação esquemática mostrando as dimensões da hélice b Representação em bastão mostrando o esquele to e o empilhamento de bases c Modelo de volume atômico FIGURA 814 Complementarida de das cadeias na duplahélice de DNA As cadeias antiparalelas com plementares do DNA seguem as regras propostas por Watson e Crick As cadeias antiparalelas pareadas por bases são di ferentes na sua composição de bases a cadeia da esquerda tem a composição A3T2G1C3 a da direita A2T3G3C1 Elas tam bém se diferenciam na sequência quando cada cadeia é lida na direção 59 S 39 Ob serve as equivalências de bases A 5 T e G 5 C no duplex 39 C C C C G G G G A A A A A T T T T T 59 59 39 Nelson6ed08indd 289 Nelson6ed08indd 289 070414 1429 070414 1429 290 DAVID L NELSON MICHAEL M COX como molde para direcionar a síntese de uma cadeia comple mentar Figura 815 Essas suposições foram confirmadas experimentalmente inaugurando uma revolução da nossa compreensão da hereditariedade biológica PROBLEMA RESOLVIDO 81 Pareamento de bases no DNA Em amostras de DNA isoladas de duas espécies de bacté rias não identificadas X e Y adenina constitui 32 e 17 respectivamente do total de bases Que proporção relativa de adenina guanina timina e citosina você esperaria en contrar nas duas amostras de DNA Que suposições você fez Uma dessas espécies foi isolada de uma fonte de água quente 64ºC Qual espécie é a mais provável de ser uma bactéria termofílica e por quê Solução Para qualquer duplahélice de DNA A 5 T e G 5 C O DNA da espécie X tem 32 de A e portanto deve conter 32 de T Isso totaliza 64 das bases e deixa 36 para pareamento GC 18 de G e 18 de C A amostra da espécie Y com 17 de A deve conter 17 de T totali zando 34 dos pares de bases Os 66 restantes de bases são então distribuídos igualmente assumindo que ambas as moléculas de DNA estão na forma de duplahélice Quanto maior o conteúdo G 1 C da molécula de DNA maior é a temperatura de fusão A espécie Y como apresen ta o DNA com o maior conteúdo G 1 C 66 é a bactéria termofílica mais provável seu DNA tem a maior tempera tura de fusão e portanto é mais estável na temperatura da fonte de água quente O DNA pode ocorrer em formas tridimensionais diferentes O DNA é uma molécula extremamente flexível Rotação considerável é possível em torno de vários tipos de ligações no esqueleto açúcarfosfato fosfodesoxirribose e flutua ção térmica pode produzir enovelamento alongamento e desnaturação fusão das cadeias Muitas variações signifi cativas da estrutura de DNA de Watson e Crick são encon tradas no DNA celular algumas ou todas elas podem ser importantes no metabolismo de DNA Essas variações es truturais geralmente não afetam as propriedadeschave do DNA descritas por Watson e Crick complementaridade das cadeias cadeias antiparalelas e a exigência do pareamento AT e GC Variação estrutural no DNA reflete três aspectos as di ferentes conformações possíveis da desoxirribose a rotação em torno das ligações contíguas que constituem o esqueleto de fosfodesoxirribose Figura 816a e a rotação livre em torno da ligação C19Nglicosídica Figura 816b Devido a restrições estéricas as purinas nos nucleotídeos púricos estão restritas a duas conformações estáveis com respeito à desoxirribose denominadas syn e anti Figura 816b As pirimidinas geralmente estão restritas à conformação anti devido a interferências estéricas entre o açúcar e o oxigênio da carbonila no C2 da pirimidina Cadeias filhas Cadeia mãe Cadeia mãe Nova Nova 59 39 FIGURA 815 Replicação do DNA como sugerido por Watson e Cri ck As cadeias mãe ou preexistentes são separadas e cada uma é o molde para a biossíntese de uma cadeia filha complementar em corderosa Base 1 2 3 4 5 6 7 59 39 a synAdenosina antiAdenosina b antiCitidina O HOCH2 NH2 H H H H H OH OH H N N N N O HOCH2 NH2 H HOCH2 H OH OH H N N N N H H O NH2 OH OH H N O N FIGURA 816 Variação estrutural no DNA a A conformação de um nu cleotídeo no DNA é afetada pela rotação de aproximadamente sete ligações diferentes Seis dessas ligações giram livremente Uma rotação limitada da li gação 4 origina uma dobra no anel Essa conformação é endo ou exo depen dendo se o átomo encontrase no mesmo lado do plano como C59 ou no lado oposto ver Figura 83b b Para bases púricas nos nucleotídeos apenas duas conformações relacionadas às unidades de ribose ligadas são permiti das estericamente anti ou syn As pirimidinas ocorrem na conformação anti Nelson6ed08indd 290 Nelson6ed08indd 290 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 291 A estrutura de Watson e Crick também é conhecida como forma B do DNA ou BDNA A forma B é a estrutura mais estável para uma molécula de DNA de sequência alea tória sob condições fisiológicas sendo desta forma o ponto de referência padrão em qualquer estudo das propriedades do DNA Duas variantes estruturais que tiveram suas estru turas cristalográficas bem caracterizadas são as formas A e Z Essas três conformações de DNA estão mostradas na Figura 817 com um resumo das suas propriedades A for ma A é favorecida em muitas soluções que são relativamen te livres de água O DNA é ainda organizado na forma de duplahélice à direita mas a hélice é mais larga e o número de bases por volta helicoidal é 11 em vez de 105 como no BDNA O plano dos pares de bases no ADNA está inclinado em cerca de 20º relativo aos pares de bases do BDNA então os pares de bases no ADNA não estão perfeitamente per pendiculares ao eixo da hélice Essas mudanças estruturais aprofundam o sulco maior enquanto fazem o sulco menor mais superficial Os reagentes usados para promover crista lização de DNA tendem a desidratálo e assim a maioria das moléculas de DNA pequenas tende a cristalizar na forma A A forma Z do DNA é um afastamento mais radical da estrutura B a diferença mais óbvia é a rotação helicoidal à esquerda Nessa forma são encontrados 12 pares de bases por volta helicoidal e a estrutura aparece mais delgada e alongada O esqueleto de DNA adquire uma aparência de ziguezague Certas sequências nucleotídicas dobram em hélices Z à esquerda muito mais facilmente que outras Exemplos eminentes são sequências em que pirimidinas alternam com purinas especialmente alternando resíduos de C e G ou 5metilC e G Para formar a hélice à esquerda no ZDNA os resíduos púricos mudam para a conformação syn alternando com pirimidinas na conformação anti O sulco maior é pouco aparente no ZDNA e o o sulco menor é estreito e profundo A ocorrência do ADNA em células é duvidosa mas exis tem evidências para algumas pequenas extensões trechos do ZDNA em bactérias e em eucariotos Esses trechos de ZDNA podem ter um papel até agora não definido na re gulação da expressão de alguns genes ou em recombinação genética Certas sequências de DNA adotam estruturas incomuns Outras variações estruturais dependentes de sequência en contradas em cromossomos grandes podem afetar a função e o metabolismo dos segmentos de DNA em suas adjacên cias Por exemplo ocorrem curvaturas na hélice de DNA sempre que quatro ou mais resíduos de adenosina apare cem sucessivamente em uma cadeia Seis adenosinas uma após a outra produzem uma curvatura de cerca de 18º A curvatura observada nessa e em outras sequências pode ser importante na ligação de algumas proteínas ao DNA Um tipo de sequência de DNA bem comum é um pa líndromo Um palíndromo é uma palavra ou frase escrita de forma idêntica se for lida da esquerda para a direita ou viceversa dois exemplos são OMISSÍSSIMO e LUZ AZUL O termo é aplicado a regiões de DNA com repetições invertidas de sequências de bases tendo simetria dupla Forma A Forma B Forma Z 28 ÅÅ Forma A Forma B Forma C Orientação da hélice À direita À direita À esquerda Diâmetro 26 Å 20 Å 18 Å Pares de bases por volta helicoidal 11 105 12 Incremento na hélice por par de bases 26 A 34 A 37 A Torção da hélice por volta helicoidal 20 6 7 Conformação do C39 endo C29 endo C29 endo em anel de ribose pirimidinas C39 endo em purinas Conformação da Anti Anti Anti em ligação glicosídica pirimidinas syn em purinas FIGURA 817 Comparação das formas A B e Z do DNA Cada estrutura mostrada aqui tem 36 pares de bases As riboses e as bases estão em amare lo O esqueleto fosfodiéster está representado como uma corda azul Azul é a cor usada para representar cadeias de DNA nos capítulos seguintes A tabela resume algumas propriedades das três formas do DNA Nelson6ed08indd 291 Nelson6ed08indd 291 070414 1429 070414 1429 292 DAVID L NELSON MICHAEL M COX nas duas cadeias de DNA Figura 818 Tais sequências são autocomplementares dentro de cada cadeia e conse quentemente têm potencial para formar estruturas cru ciformes em formato de cruz ou em grampo Figura 819 Quando a repetição invertida ocorre dentro de cada cadeia individual de DNA a sequência é denominada repetição de imagem especular As repetições de ima gem especular não têm sequências complementares den tro da mesma cadeia e não formam grampos ou estruturas cruciformes Sequências desses tipos são encontradas em praticamente cada grande molécula de DNA e podem abranger poucos pares de bases ou milhares O número de palíndromos que ocorrem como cruciformes em célu las não é conhecido embora algumas estruturas crucifor mes tenham sido demonstradas in vivo em Escherichia coli As sequências autocomplementares produzem eno velamentos de cadeias simples de DNA ou RNA isoladas em solução para se dobrar em estruturas complexas con tendo múltiplos grampos Algumas estruturas de DNA incomuns envolvem três ou até mesmo quatro cadeias de DNA Os nucleotídeos parti cipantes de um par de bases do tipo WatsonCrick Figu ra 811 podem formar ligações de hidrogênio adicionais especialmente com grupos funcionais ancorados no sulco maior Por exemplo um resíduo de citidina se protonado pode parear com o resíduo de guanina de um par nucleotí dico GC Figura 820 uma timidina pode parear com a adenosina de um par AT O N7 o O 6 e o N 6 das purinas os átomos que participam na ligação de hidrogênio do tri plex de DNA frequentemente são denominados posições de Hoogsteen e o pareamento do tipo não WatsonCrick é chamado de pareamento de Hoogsteen em homena gem a Karst Hoogsteen que em 1963 reconheceu pela pri meira vez o potencial desses pareamentos incomuns O pa reamento de Hoogsteen permite a formação de triplex de DNA Os triplex mostrados na Figura 820 a b são mais estáveis em pH baixo porque o trio CG C 1 requer uma citosina protonada No triplex o pKa dessa citosina é 75 diferente do seu valor normal de 42 Os triplex também se formam mais facilmente em sequências longas contendo somente pirimidinas ou somente purinas em uma dada ca deia Alguns triplex de DNA contêm duas cadeias púricas e uma cadeia pirimídica outros contêm duas cadeias púricas e uma cadeia pirimídica Quatro cadeias de DNA também podem parear para for mar um tetraplex quadruplex mas isso ocorre facilmente apenas para sequências de DNA com uma proporção muito alta de resíduos de guanosina Figura 820c d O tetraplex da guanosina ou tetraplex G é bastante estável em uma faixa ampla de condições A orientação das cadeias em um tetraplex pode variar como mostrado na Figura 820e No DNA de células vivas sítios reconhecidos por mui tas proteínas ligantes de DNA em sequências específicas Capítulo 28 estão organizados como palíndromos e se quências polipirimídicas ou polipúricas que podem formar hélices triplas são encontradas dentro de regiões envolvi T 5 5 3 3 T A G C A C G T G C T A A A A T C G T G C A C G A T T T T A G C A C C A C G A T T A A T C G T G G T G C T A A Palíndromo Repetições de imagem especular FIGURA 818 Palíndromos e repetições de imagem especular Palín dromos são sequências de ácidos nucleicos de fita dupla com simetria dupla A fim de sobrepor uma repetição sequência sombreada na outra ela deve ser girada 180º em torno do eixo horizontal e então 180º em torno do eixo vertical como mostrado pelas setas coloridas Uma repetição de imagem es pecular por outro lado tem uma sequência simétrica dentro de cada cadeia Sobrepor uma repetição na outra requer apenas uma única rotação de 180º em torno do eixo vertical Grampo 39 59 G C G A T A C T C A T C G C A T 39 A T C G C A 59 C T T A G C G T A C a Cruciforme 39 59 G C G A T A C T C A T C G C A T T G A G 59 39 39 A T C G C A 59 C T T A G C G T A C T G C G A T A C G C T A T G A G 59 39 b A C G C T A A G C G T T FIGURA 819 Grampos e estruturas cruciformes Sequências de DNA ou RNA palindrômicas podem formar estruturas alternativas com parea mento de bases intracadeia a Quando somente uma única cadeia de DNA ou RNA está envolvida a estrutura é chamada de grampo b Quando am bas as cadeias do duplex de DNA estão envolvidas a estrutura é denomina da cruciforme O sombreamento azulado realça sequências assimétricas que podem parear com sequências complementares tanto na mesma cadeia quanto na cadeia complementar Nelson6ed08indd 292 Nelson6ed08indd 292 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 293 das na regulação de expressão de alguns genes eucarió ticos A princípio cadeias de DNA sintéticas desenhadas para parear com essas sequências para formar triplex de DNA podem interromper a expressão gênica Essa aborda gem para controlar o metabolismo celular é de interesse comercial pela sua potencial aplicação na medicina e na agricultura RNAs mensageiros codificam para cadeias polipeptídicas Agora o foco será a expressão da informação genética que o DNA contém O RNA a segunda maior forma de ácidos nucleicos nas células tem muitas funções Na expressão gênica o RNA atua como intermediário pelo uso da infor mação codificada no DNA para especificar a sequência de aminoácidos da proteína funcional Uma vez que o DNA de eucariotos é basicamente con finado no núcleo enquanto a síntese proteica ocorre nos ribossomos no citoplasma alguma outra molécula que não o DNA deve carregar a mensagem genética do núcleo para o citoplasma Já por volta da década de 1950 o RNA foi considerado o candidato lógico o RNA é encontrado tanto no núcleo quanto no citoplasma e um aumento na síntese proteica é acompanhado por um aumento na quantidade de RNA citoplásmico e um aumento da sua taxa de renovação Essas e outras observações levaram vários pesquisadores a sugerir que o RNA carrega a informação genética do DNA para a maquinaria biossintética proteica do ribossomo Em 1961 François Jacob e Jacques Monod apresentaram uma descrição consistente e essencialmente correta de muitos aspectos desse processo Eles propuseram o nome RNA FIGURA 820 Estruturas de DNA contendo três ou quatro cadeias de DNA a Padrões de pareamento de bases em uma forma bem caracteri zada de triplex de DNA O par de Hoogsteen em cada caso é mostrado em vermelho b DNA helicoidal triplo contendo duas cadeias pirimídicas ver melho e branco sequência TTCCT e uma cadeia púrica azul sequência AA GGAA derivado do PDB ID 1BCE As cadeias em azul e em branco são anti paralelas e pareadas pelo padrão normal de pareamento de WatsonCrick A terceira cadeia toda pirimídica vermelho é paralela à cadeia púrica e pare ada por meio de ligações de hidrogênio do tipo não WatsonCrick O triplex é visto lateralmente mostrando seis tripletes c Padrão do pareamento de bases na estrutura tetraplex da guanosina d Quatro tetrapletes sucessivos de uma estrutura tetraplex G PDB ID 244D e Possíveis variantes na orien tação das cadeias em um tetraplex G CH3 CH3 O N O H N N H H N H N N C19 19C C19 N N N O O T A T a N N1 O H N O H H H N H N N C19 19C C19 N H H N N N O H N C G C1 b H Tetraplex de guanosina c H H N N O C19 N N N H H H N N N N 19C N O C19 N N N N O N H H H O C19 N H H N N N N H d Paralela Antiparalela e Nelson6ed08indd 293 Nelson6ed08indd 293 070414 1429 070414 1429 294 DAVID L NELSON MICHAEL M COX mensageiro mRNA para aquela porção do RNA celular total que carrega a informação genética do DNA para os ri bossomos onde os mensageiros fornecem os moldes que especificam as sequências de aminoácidos nas cadeias poli peptídicas Embora os mRNAs de diferentes genes possam variar muito em tamanho os mRNAs de um gene em par ticular geralmente têm um tamanho definido O processo de formação de um mRNA a partir de um molde de DNA é conhecido como transcrição Em bactérias e arquibactérias uma única molécula de mRNA pode codificar para uma ou várias cadeias polipep tídicas Se ela carrega o código para somente um polipeptí deo o mRNA é monocistrônico se ela codifica para dois ou mais polipeptídeos diferentes o mRNA é policistrôni co Em eucariotos a maioria dos mRNAs é monocistrônica Para a finalidade dessa discussão cistron referese a um gene O termo por si só tem raízes históricas na ciência da genética e sua definição genética formal vai além do escopo deste texto O comprimento mínimo de um mRNA é deter minado pelo comprimento da cadeia polipeptídica para a qual ele codifica Por exemplo uma cadeia polipeptídica de 100 resíduos de aminoácidos requer uma sequência codifi cante de RNA de pelo menos 300 nucleotídeos porque cada aminoácido é codificado por um grupo de três nucleotídeos este e outros detalhes de síntese proteica serão discutidos no Capítulo 27 Entretanto mRNAs transcritos a partir de DNA são sempre um pouco mais longos que o comprimen to necessário para a codificação simples de uma sequência ou sequências polipeptídica A porção adicional não codi ficante do RNA inclui sequências que regulam a síntese pro teica A Figura 821 resume a estrutura geral de mRNAs bacterianos Muitos RNAs têm estruturas tridimensionais mais complexas O RNA mensageiro é somente uma de várias classes de RNA celular RNAs transportadores são moléculas adaptadoras na síntese proteica ligadas covalentemente a um amino ácido em uma extremidade elas pareiam com um mRNA de forma que os aminoácidos são unidos a um polipeptí deo crescente na sequência correta RNAs ribossômicos são componentes dos ribossomos Existe também uma gran de variedade de RNA de função especial incluindo alguns chamados ribozimas que têm atividade enzimática Todos os RNAs serão considerados detalhadamente no Capítulo 26 As funções diversas e muitas vezes complexas desses RNAs refletem a diversidade de uma estrutura muito mais rica do que a observada em moléculas de DNA O produto de transcrição do DNA é sempre RNA de fita simples A cadeia simples tende a assumir a conformação helicoidal à direita dominada por interações de empilha mento de bases Figura 822 as quais são mais fortes en tre duas purinas do que entre uma purina e uma pirimidina ou entre duas pirimidinas A interação purinapurina é tão forte que uma pirimidina separando duas purinas é muitas vezes deslocada do padrão de empilhamento de forma que as purinas possam interagir Qualquer sequência autocom plementar na molécula produz estruturas mais complexas O RNA pode fazer pareamento de bases com regiões com plementares de RNA ou de DNA O pareamento de bases é igual ao padrão para DNA G pareia com C e A pareia com U ou com o ocasional resíduo de T em alguns RNA Uma diferença é que o pareamento de bases entre resíduos de G e U incomum no DNA é permitido no RNA ver Figu ra 824 quando sequências complementares nas duas ca deias simples de RNA pareiam uma com a outra As cadeias pareadas no RNA ou nos duplex RNADNA são antiparale las como no DNA Quando duas cadeiras de RNA com sequências perfei tamente complementares estão pareadas a estrutura pre dominante de cadeia dupla é uma duplahélice de forma A à direita As estruturas tridimensionais de muitos RNAs como aquelas das proteínas são complexas e únicas Inte rações fracas especialmente interações de empilhamento ajudam a estabilizar as estruturas de RNA assim como elas fazem no DNA Hélices na forma Z foram feitas em labora tório sob condições de alta salinidade e alta temperatura A forma B do RNA ainda não foi observada Quebras na hé lice normal de forma A causadas pelo pareamento incorreto 59 Gene a Monocistrônico 39 59 Gene 1 Gene 2 Gene 3 b Policistrônico 39 FIGURA 821 mRNA bacteriano Diagrama esquemático mostrando mRNA a monocistrônico e b policistrônico de bactérias Segmentos em vermelho representam RNA que codifica para um produto gênico segmen tos em cinza representam RNA não codificante No transcrito policistrônico o RNA não codificante separa os três genes FIGURA 822 Padrão típico de empilhamento à direita de RNA de fita simples As bases estão mostradas em amarelo os átomos de fosfato em cor de laranja e as riboses e os oxigênios dos fosfatos em verde Verde é usado para representar cadeias de RNA nos capítulos seguintes assim como azul é usado para o DNA Nelson6ed08indd 294 Nelson6ed08indd 294 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 295 ou não pareamento de bases em uma ou ambas as cadeias são comuns e resultam em protuberâncias ou alças inter nas Figura 823 Alças do tipo grampos formamse entre sequências autocomplementares palindrômicas vizinhas O potencial para estruturas helicoidais de pareamento de bases em muitos RNAs é muito grande Figura 824 e os grampos resultantes são o tipo mais comum de estrutura secundária no RNA Sequências de bases específicas pe quenas assim como UUCG são muitas vezes encontradas no final de grampos de RNA e são conhecidas por formarem alças particularmente firmes e estáveis Tais sequências po dem agir como pontos de partida para o enovelamento de uma molécula de RNA na sua estrutura tridimensional exa ta Outras contribuições são feitas pelas ligações de hidro gênio que não fazem parte do pareamento de bases padrão do tipo WatsonCrick Por exemplo o grupo 29hidroxila da ribose pode formar ligações de hidrogênio com outros grupos Algumas dessas propriedades são evidentes na es trutura do RNA transportador de fenilalanina de levedura o tRNA responsável pela inserção de resíduos de Phe nos polipeptídeos e em duas enzimas de RNA ou ribozimas cujas funções assim como das enzimas proteicas depen dem das suas estruturas tridimensionais Figura 825 a b U C C U U G C C A G U U U G G GG C C C C C C G A A A A A A A A U A C C A A G C U C A G G G C A A G U G A G C G G A U G G Fita simples Alça interna Protuberância Grampo Duplahélice em forma de grampo FIGURA 823 Estrutura secundária de RNA a Protuberância alça in terna e grampo b As regiões pareadas geralmente têm uma hélice direita na forma A como mostrado no grampo derivado do PDB ID 1GID G U C A C C A G U G C A A C A G A G A G C A A C A G U G A 180 A G G C G C 120 A C G G G C G C C C A 240 A U G G C C A G C G C C G A U C C C G C C G G G G A U C G G U G G C A 160 A G G 140 A A A G C C C G G C G G U G G A 220 A A U G G C G G C U G U G C C G A C G G U A 200 A A C C G G 100 A A G G C A G G 80 C C C U A A G A A U G G G C C C A C G A U A A A G U C C G G G C A G G C U G C U U G U A G A U A G A G G A G G A G G C U U C G GG C A A C A U A C U G A C A G A C U G U C G G G A C G G C A G G C G C U U C G U G G G G C C C C G N H O NH2 N N N N O N H O Guanina Uracila C C G G A A A U A G G C C C A A G G U U C A G U G C U A A C G U G C C G C 280 A 260 G U G G G U A 300 C A A G C G U G C C G G G U A G U U G A C 330 U A C C A G U C G A A G G U C A G U U U C G A C C U 377 360 1 C U A U U C G C G C C A A G A C A G C A C 20 60 C G G U A U U G G G C U U 40 A C FIGURA 824 Estruturas helicoidais de pareamento de bases no RNA A possível estrutura secundária do componente RNA M1 da enzima RNase P de E coli com muitos grampos está mostrada aqui A RNase P a qual também contém um componente proteico não mostrado funciona no processamento dos RNAs transportadores ver Figura 2626 Os dois col chetes indicam sequências complementares adicionais que podem estar pareadas na estrutura tridimensional Os pontos azuis indicam pares de ba ses GU do tipo não WatsonCrick inserção no quadro Observe que pares de bases GU são permitidos somente quando cadeias présintetizadas de RNA se dobram ou se anelam umas com as outras Não há RNApolimerases as enzimas que sintetizam RNA a partir de um molde de DNA para inserir uma U tendo como molde uma G ou viceversa durante a síntese de RNA Nelson6ed08indd 295 Nelson6ed08indd 295 070414 1429 070414 1429 296 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A análise da estrutura do RNA e a relação entre estrutura e função compõem um campo emergente de pesquisa com muitas das mesmas complexidades da análise de estrutura proteica A importância da compreensão da estrutura do RNA cresce à medida que surgem mais informações sobre o grande número de papéis funcionais das moléculas de RNA RESUMO 82 Estrutura dos ácidos nucleicos c Muitas linhas de evidência demonstram que o DNA car rega a informação genética Alguns dos primeiros indí cios vieram do experimento de AveryMacLeodMcCarty o qual demonstrou que o DNA isolado de uma linhagem bacteriana pode entrar em células de outra linhagem e transformálas dotandoas com algumas característi cas hereditárias do doador O experimento de Hershey Chase demonstrou que o DNA de um vírus bacteriano mas não a sua cobertura proteica carrega a mensagem genética para a replicação do vírus na célula hospedeira c Reunindo todas as informações Watson e Crick postu laram que o DNA nativo é constituído por duas cadeias Adenina 7Metilguanina Guanina Citosina Ribose Ribose Ribose Ribose Ribose Ribose Ribose Ribose Ribose Ribose Uracila Adenina Adenina N2Dimetilguanina a b c FIGURA 825 Estrutura tridimensional do RNA a Estrutura tridimen sional do tRNA de fenilalanina em levedura PDB ID 1TRA Alguns padrões de pareamento de bases incomuns encontrados neste tRNA estão mostrados Observe também o envolvimento do oxigênio de uma ligação fosfodiéster da ribose em um arranjo de ligação de hidrogênio e um grupo 29hidroxila da ribose em outro ambos em vermelho b Ribozima cabeçademartelo denominada desta forma devido à estrutura secundária no sítio ativo que parece a cabeça de um martelo obtida de certos vírus de plantas obtida de PDB ID 1MME Ribozimas ou enzimas de RNA catalisam uma variedade de reações principalmente do metabolismo de RNA e na síntese proteica As estruturas tridimensionais complexas desses RNAs refletem a complexidade inerente na catálise como descrito para enzimas proteicas no Capítulo 6 c Segmento de mRNA conhecido como íntron de um protozoário ciliado Te trahymena thermophila obtido do PDB ID 1GRZ Esse íntron uma ribozima catalisa sua própria excisão do meio dos éxons em uma cadeia de mRNA discutido no Capítulo 26 Nelson6ed08indd 296 Nelson6ed08indd 296 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 297 antiparalelas em uma organização de duplahélice com orientação à direita Pares de bases complementares AT e GC são formados por ligações de hidrogê nio dentro da hélice Os pares de bases são empilhados perpendicularmente ao longo do eixo da duplahélice a uma distância de 34 Å com 105 pares de bases por volta c O DNA pode existir em várias formas estruturais Duas variações da forma de WatsonCrick ou BDNA são ADNA e ZDNA Algumas variações estruturais de pendentes de sequência causam enovelamentos na molécula de DNA As cadeias de DNA com sequências específicas podem formar grampos ou estruturas cruci formes ou triplex de DNA ou tetraplex de DNA c O RNA mensageiro transfere a informação genética do DNA para os ribossomos para a síntese proteica O RNA transportador e o RNA ribossômico também estão en volvidos na síntese proteica O RNA pode ser comple xo estruturalmente cadeias simples de RNA podem se dobrar em grampos regiões de cadeia dupla ou alças complexas 83 Química dos ácidos nucleicos O papel do DNA como repositório da informação gené tica depende em parte da sua estabilidade inerente As transformações químicas que ocorrem geralmente são muito lentas na ausência de um catalisador enzimático Entretanto o armazenamento de longo prazo da informa ção inalterada é tão importante para a célula que mesmo reações muito lentas que alteram a estrutura do DNA po dem ser fisiologicamente significativas Processos como carcinogênese e envelhecimento podem estar intimamen te ligados ao acúmulo lento e irreversível de alterações no DNA Outras alterações não destrutivas também ocorrem e são essenciais para a função como a separa ção das cadeias que deve preceder a replicação do DNA ou a transcrição Além de proporcionar maior compreen são dos processos fisiológicos nosso conhecimento da química dos ácidos nucleicos nos concedeu um conjunto poderoso de tecnologias que tem aplicações em biologia molecular na medicina e na ciência forense Agora serão examinadas as propriedades químicas do DNA e algumas dessas tecnologias DNA e RNA duplashélices podem ser desnaturados Soluções de DNA nativo isolado cuidadosamente podem ser muito viscosas em pH 70 e em temperatura ambiente 25ºC Quando essa solução é submetida a valores de pH extremos ou a temperaturas acima de 80ºC sua viscosidade diminui drasticamente indicando que o DNA sofreu uma mudança física Da mesma forma que calor e valores de pH extremos desnaturam proteínas globulares eles também causam desnaturação ou fusão da duplahélice do DNA Rompimento das ligações de hidrogênio entre pares de bases e de bases empilhadas causam desenrolamento da duplahélice para formar duas cadeias simples completa mente separadas uma da outra pela molécula inteira ou de parte da molécula desnaturação parcial Nenhuma ligação covalente no DNA é rompida Figura 826 A renaturação da molécula do DNA é um processo rá pido de uma etapa contanto que um segmento helicoidal duplo de pouco mais de uma dúzia de resíduos ainda man tenha as duas cadeias unidas Quando a temperatura ou o pH retornam para a faixa em que a maioria dos organis mos vivem os segmentos desenrolados das duas cadeias espontaneamente se enrolam ou pareiam para produzir o duplex intacto Figura 826 Entretanto se as duas ca deias são separadas completamente a renaturação ocor re em duas etapas Na primeira relativamente lenta as duas cadeias acham uma à outra por colisões aleatórias e formam um segmento pequeno de duplahélice comple mentar A segunda etapa é muito mais rápida as bases não pareadas remanescentes vêm sucessivamente se apresen tando como pares de bases e as duas cadeias se unem como se fosse o fechamento de um zíper para formar a duplahélice A estreita interação entre bases empilhadas nos ácidos nucleicos tem o efeito de diminuir sua absorção em luz UV em comparação com a da solução com a mesma concen tração de nucleotídeos livres e a absorção diminui ain da mais quando duas cadeias complementares de ácidos nucleicos estão pareadas Isso é chamado de efeito hipo crômico A desnaturação de um ácido nucleico de cadeia dupla produz o resultado oposto aumento na absorção de Desnaturação DNA de duplahélice DNA parcialmente desnaturado Cadeias de DNA separadas em espirais aleatórias Pareamento Separação das cadeias Associação das cadeias por pareamento de bases FIGURA 826 Desnaturação reversível e anelamento renaturação do DNA Nelson6ed08indd 297 Nelson6ed08indd 297 070414 1429 070414 1429 298 DAVID L NELSON MICHAEL M COX nominado efeito hipercrômico A transição entre DNA de cadeia dupla e a forma desnaturada de cadeia única pode ser então detectada pelo monitoramento da absorção de luz UV a 260 nm Moléculas de DNA bacteriano ou viral em solução des naturam quando são aquecidas vagarosamente Figura 827 Cada espécie de DNA apresenta uma temperatura de desnaturação característica ou ponto de fusão tm for malmente a temperatura na qual a metade do DNA está presente na forma de cadeias únicas separadas quanto maior o seu conteúdo de pares de bases GC mais alto o ponto de fusão deste DNA Isso é devido ao fato de o pareamento de bases GC com três ligações de hidro gênio necessitar de mais calor para se dissociar do que o pareamento de bases AT Portanto o ponto de fusão da molécula de DNA determinada sob condições fixas de pH e força iônica pode produzir uma estimativa da sua com posição de bases Se as condições desnaturantes forem controladas cuidadosamente regiões que são ricas em pa reamentos de bases AT serão especificamente desnatu radas enquanto a maior parte do DNA permanece como cadeia dupla Essas regiões desnaturadas denominadas bolhas podem ser visualizadas em microscopia eletrônica Figura 828 Observe que na separação das cadeias do DNA que ocorre in vivo durante processos como replica ção de DNA e transcrição os sítios onde esses processos iniciam são muitas vezes ricos em pares de bases AT como será visto a seguir Os duplex de duas cadeias de RNA ou uma cadeia de RNA e uma cadeia de DNA híbrido RNADNA também podem ser desnaturados Especialmente os duplex de RNA são mais estáveis que duplex de DNA Em pH neutro a des naturação de RNA de cadeia dupla muitas vezes necessita de temperaturas de 20ºC ou mais altas do que as tempe raturas necessárias para a desnaturação de uma molécula de DNA com sequência semelhante A estabilidade de um híbrido RNADNA geralmente é intermediária entre a do RNA e a do DNA As bases físicas para essas diferenças em estabilidade térmica são desconhecidas Ácidos nucleicos de espécies diferentes podem formar híbridos A capacidade de duas cadeias de DNA parearem uma com a outra pode ser usada para identificar sequências de DNA semelhantes em duas espécies distintas ou no genoma de uma mesma espécie Se os duplex de DNA isolados de célu las humanas e de células murinas são completamente des naturados por aquecimento sendo então misturados e man tidos em temperaturas em torno de 25ºC abaixo do seu tm por muitas horas grande quantidade do DNA irá se parear A taxa de pareamento do DNA é afetada pela temperatura pelo comprimento e pela concentração dos fragmentos de DNA a serem pareados pela concentração de sais na mistu ra de reação e pelas propriedades da sua própria sequência 3 m m FIGURA 828 DNA parcialmente desnaturado Este DNA foi parcial mente desnaturado sendo então fixado para evitar renaturação durante o preparo da amostra O método do sombreamento utilizado para visualizar o DNA nesta micrografia eletrônica aumenta seu diâmetro em aproximada mente cinco vezes e suprime a maioria dos detalhes da hélice Entretanto medidas de comprimento podem ser obtidas e regiões de fita simples são facilmente distinguíveis de regiões de fita dupla As setas apontam para al gumas bolhas de fita simples onde a desnaturação ocorreu As regiões que desnaturam são altamente reproduzíveis e são ricas em pareamentos de bases AT 50 0 100 Desnaturação 75 80 85 Temperatura C a tm tm 20 40 60 80 0 100 G C dos nucleotídeos totais 110 100 90 80 70 60 tm C b FIGURA 827 Desnaturação do DNA pelo calor a As curvas de desna turação ou fusão de duas amostras de DNA A temperatura no ponto médio da transição tm é o ponto de fusão que depende do pH da força iônica e do tamanho e da composição de bases do DNA b Relação entre tm e o conteúdo G 1 C do DNA Nelson6ed08indd 298 Nelson6ed08indd 298 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 299 isto é complexidade e conteúdo GC A temperatura é especialmente importante Se for muito baixa sequências curtas de moléculas de DNA com semelhanças coincidentes em partes distantes e heterólogas irão se parear improdu tivamente e interferir com o alinhamento geral de cadeias complementares de DNA Temperaturas muito altas irão fa vorecer a desnaturação A maioria do reanelamento ocorre entre cadeias complementares de DNA murino para formar duplex de DNA murino do mesmo modo a maioria das ca deias de DNA humano pareia com cadeias complementares de DNA humano Entretanto algumas cadeias de DNA mu rino irão se associar com cadeias de DNA humano para dar origem a duplex híbridos nos quais segmentos de cadeia de DNA murino formam regiões de pareamento de bases com segmentos de cadeia de DNA humano Figura 829 Isso reflete uma herança evolutiva comum organismos dife rentes em geral têm muitas proteínas e RNAs com funções semelhantes e frequentemente estruturas semelhantes Em muitos casos os DNAs que codificam essas proteínas e RNAs têm sequências semelhantes Quanto mais próxima a relação evolutiva entre duas espécies mais facilmente seus DNAs irão hibridizar Por exemplo DNA humano hibridiza muito mais facilmente com DNA murino do que com DNA de levedura A hibridização de cadeias de DNA de fontes distintas constitui o princípio básico para um poderoso conjunto de metodologias essenciais para a prática moderna de gené tica molecular Uma sequência de DNA específica ou um gene pode ser identificado na presença de muitas outras sequências se já existir uma cadeia de DNA complemen tar geralmente marcada de alguma forma adequada para hibridizar com ela Capítulo 9 O DNA complementar pode ser de uma espécie diferente ou da mesma espécie ou pode ser sintetizado quimicamente no laboratório usan do técnicas descritas a seguir neste capítulo Técnicas de hibridização podem ser adaptadas para detectar um RNA em vez de um DNA O isolamento e a identificação de ge nes específicos e RNA se baseiam nessas técnicas de hi bridização Aplicações dessa tecnologia tornam possível a identificação de um indivíduo com base em um único fio de cabelo deixado na cena de um crime ou a predição do início de uma doença décadas antes do aparecimento dos sintomas ver Quadro 91 Nucleotídeos e ácidos nucleicos sofrem transformações não enzimáticas Purinas e pirimidinas juntamente com os nucleotí deos dos quais elas são parte sofrem alterações es pontâneas na sua estrutura covalente O índice dessas rea ções em geral é muito lento mas essas reações são fisiologicamente significativas devido à tolerância muito baixa da célula para alterações em sua informação genéti ca Alterações na estrutura do DNA que produzem mudan ças permanentes na informação genética codificadas pelo DNA são chamadas de mutações e muitas evidências su gerem uma ligação estreita entre o acúmulo de mutações em um organismo individual e os processos de envelheci mento e carcinogênese Várias bases nucleotídicas sofrem perda espontânea de seus grupamentos amino exocíclicos desaminação Fi gura 830a Por exemplo em condições celulares típicas a desaminação da citosina no DNA a uracila ocorre em aproximadamente um em cada 10 7 resíduos de citidina em 24 horas Isso corresponde a cerca de 100 eventos espontâ neos por dia em média em uma célula de mamífero A de saminação de adenina e guanina ocorre em taxas de cerca de 1100 A reação lenta de desaminação da citosina parece inó cua o suficiente mas é quase seguramente a razão pela qual o DNA contém timina em vez de uracila O produto da desaminação da citosina uracila é rapidamente re conhecido como estranho no DNA sendo removido pelo sistema de reparo Capítulo 25 Se o DNA normalmente tivesse uracila o reconhecimento de uracilas resultantes da desaminação da citosina seria mais difícil e uracilas não reparadas conduziriam a mudanças permanentes na sequência fazendo o pareamento com adeninas durante a replicação A desaminação de citosina gradualmente con duziria a uma diminuição nos pares de bases GC e a um aumento nos pares de bases AU no DNA de todas as células Através dos milênios a desaminação de citosina poderia eliminar pares de bases GC e o código genético que depende desses pares de bases O estabelecimento da timina como uma das quatro bases no DNA pode ter sido um dos pontos cruciais de reviravolta na evolução tornando possível o armazenamento de longo prazo da in formação genética Amostra 1 Amostra 2 Duplex da amostra 1 Duplex da amostra 2 Duplex híbrido Mistura e resfria FIGURA 829 Hibridização do DNA Duas amostras de DNA para serem comparadas são completamente desnaturadas pelo calor Quando as duas soluções são misturadas e resfriadas lentamente as cadeias de DNA de cada amostra irão se associar com seus parceiros complementares normais e se anelar para formar duplex Se dois DNA têm semelhança de sequência signi ficativa eles também tendem a formar duplex parciais ou híbridos um com o outro quanto maior a semelhança de sequência entre dois DNAs maior o número de híbridos formados A formação de híbridos pode ser medida de várias maneiras Um dos DNAs geralmente é marcado com um isótopo radioativo para simplificar sua detecção e as medidas Nelson6ed08indd 299 Nelson6ed08indd 299 070414 1429 070414 1429 300 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Outra reação importante nos desoxirribonucleotídeos é a hidrólise da ligação Nbglicosídica entre a base e a pento se para criar uma lesão no DNA chamada de sítio AP apu rínico apirimidínico ou sítio abásico Figura 830b Isso ocorre a uma taxa maior para purinas do que para pirimidi nas Cerca de uma em cada 10 5 purinas 10000 por célula de mamíferos é perdida do DNA a cada 24 horas em con dições celulares típicas A depurinação de ribonucleotídeos e do RNA é muito mais lenta e em geral não é considerada fisiologicamente significativa No tubo de ensaio a perda de purinas pode ser acelerada por ácido diluído Incubação de DNA em pH 3 causa remoção seletiva de bases púricas resultando no derivado denominado ácido apurínico Outras reações são promovidas pela radiação A luz UV induz a condensação de dois grupos etilenos para formar um anel ciclobutano Na célula a mesma reação entre bases pirimídicas adjacentes nos ácidos nucleicos forma dímeros pirimídicos ciclobutanos Isso ocorre mais frequentemente entre resíduos de timina adjacentes na mesma hélice de DNA Figura 831 Um segundo tipo de dímero de piri midinas chamado de fotoproduto 64 também é formado durante irradiação UV Radiações ionizantes raios X e raios gama podem causar abertura de anel e fragmentação de bases assim como quebras dos esqueletos covalentes dos ácidos nucleicos Praticamente todas as formas de vida são expostas a ra diação de alta energia capaz de causar mudanças químicas no DNA Sabese que a radiação UV curta com comprimen to de ondas de 200 a 400 nm que compõe uma porção significativa do espectro solar causa a formação de dímeros de pirimidina e outras mudanças químicas no DNA de bac térias e de células da pele humana Humanos estão sujeitos constantemente a um campo de radiações ionizantes na for ma de raios cósmicos os quais podem penetrar profunda mente na terra assim como às radiações emitidas por ele mentos radioativos como rádio plutônio urânio radônio 14C e 3H Raios X usados em exames médicos e dentais e na radioterapia de câncer e outras doenças são outra forma de radiação ionizante É estimado que radiações ionizantes e UV sejam responsáveis por cerca de 10 de todo dano no DNA causado por agentes ambientais O DNA também pode ser danificado por reagentes quí micos introduzidos no ambiente como produtos de ativida de industrial Tais produtos podem não ser prejudiciais por si só mas podem ser metabolizados pelas células em formas que o são Existem duas classes principais desses compos 3 a Desaminação 3 2 2 2 2 CH N HN Hipoxantina Uracila N Citosina O CH N O N Xantina N O N O HN NH NH N N N NH Timina 5Metilcitosina O HN O O N N N N Adenina Guanina O N H N N O N N N H N O HN HN FIGURA 830 Algumas reações não enzimáticas bem caracterizadas dos nucleotídeos a Reações de desaminação Apenas a base está mos trada b Depurinação em que uma purina é perdida pela hidrólise da liga ção Nbglicosídica A perda de pirimidinas ocorre por meio de uma reação semelhante mas muito mais lentamente A lesão resultante com a deso xirribose presente e a base ausente é chamada de sítio abásico ou sítio AP sítio apurínico ou raramente apirimidínico A desoxirribose remanescente após a depurinação é rapidamente convertida de bfuranose para a forma aldeídica ver Figura 83 desestabilizando ainda mais o DNA nessa posição Reações não enzimáticas adicionais estão ilustradas nas Figuras 831 e 832 Guanina Resíduo apurínico Resíduo de guanosina no DNA b Depurinação N H HN N O N N N H2O O N H2N HN O P O2 CH2 H H2N O O H H H H O O O P O2 CH2 H O O H H H H O O 1 OH Nelson6ed08indd 300 Nelson6ed08indd 300 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 301 tos Figura 832 1 agentes desaminantes especial mente ácido nitroso HNO2 ou compostos que podem ser metabolizados a ácido nitroso ou nitritos e 2 agentes al quilantes O ácido nitroso formado a partir de precursores orgâ nicos como nitrosaminas e a partir de sais de nitrito e de nitratos é um potente acelerador de desaminação de bases O bissulfito tem efeitos semelhantes Ambos os agentes são usados como conservantes em alimentos processados para evitar o crescimento de bactérias tóxicas Eles não parecem aumentar significativamente os riscos de câncer quando usados dessa forma talvez pelo fato de serem usados em pequenas quantidades e representarem apenas uma peque na contribuição para os níveis de dano no DNA O risco potencial para a saúde de alimentos estragados seria muito maior se esses conservantes não fossem usados Luz UV Luz UV Timinas adjacentes Dímero de timinas ciclobutano Fotoproduto 64 a OH C N H OH C O C C H N O C N H CH3 C O C C H N O C N H CH3 C O C C H N O C N H CH3 C O C C H N O C N H CH3 C O C C H N O C N H CH3 C O C C H N 4 6 CH3 5 6 6 5 N P P P b T T Dobra A A FIGURA 831 Formação de dímeros de pirimidinas induzidos por luz UV a Um tipo de reação à esquerda resulta na formação de um anel ci clobutil envolvendo C5 e C6 de resíduos de pirimidinas adjacentes Uma reação alternativa à direita resulta no fotoproduto 64 com uma ligação en tre C6 de uma pirimidina e C4 da pirimidina vizinha b A formação de um dímero de pirimidinas ciclobutano introduz um ângulo ou dobra no DNA PDB ID 1TTD FIGURA 832 Agentes químicos que causam dano ao DNA a Precursores de ácido nitroso que promovem reações de desaminação b Agentes alquilantes Apenas a Sadenosilmetionina age enzi maticamente a Precursores do ácido nitroso Nitrito de sódio Nitrato de sódio Nitrosamina b Agentes alquilantes Dimetilnitrosamina Gás de mostarda Dimetilsulfato SAdenosilmetionina Metionina adenosina Nelson6ed08indd 301 Nelson6ed08indd 301 070414 1429 070414 1429 302 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Agentes alquilantes podem alterar certas bases do DNA Por exemplo o reagente químico dimetilsulfato Figura 832b pode metilar a guanina para produzir O 6metilguani na a qual não pode parear com a citosina Tautômeros de guanina O6Metilguanina CH32SO4 N N N H2N HN O N N N H2N H H N O N N N OCH3 H H N H2N 6 6 6 Muitas reações semelhantes são realizadas por agentes al quilantes normalmente presentes nas células como Sade nosilmetionina A fonte mais importante de alterações mutagênicas no DNA é o dano oxidativo Espécies reativas de oxigênio como peróxido de hidrogênio radicais hidroxila e radi cais superóxidos surgem durante irradiação ou como um subproduto do metabolismo aeróbio Dessas espécies os radicais hidroxila são responsáveis pela maioria dos danos oxidativos no DNA As células têm um sistema de defesa elaborado para destruir espécies reativas de oxigênio in cluindo enzimas como a catalase e a superóxidodesmutase que convertem espécies reativas de oxigênio a produtos inofensivos Entretanto uma fração desses oxidantes ine vitavelmente escapa das defesas celulares e o dano ao DNA ocorre por meio de um grande e complexo grupo de rea ções que variam de oxidação da desoxirribose e das bases a quebras na hélice Estimativas precisas da extensão desse dano não estão disponíveis mas cada dia o DNA de cada célula humana está sujeito a milhares de reações oxidativas que causam dano Isso é apenas uma amostra das reações mais conhecidas que causam dano ao DNA Muitos compostos carcinogêni cos nos alimentos na água e no ar exercem seus efeitos cancerígenos por modificações das bases do DNA Apesar disso a integridade do DNA como polímero é mais bem mantida do que a do RNA e da proteína pois o DNA é a úni ca macromolécula que se beneficia de sistemas de reparo bioquímicos Esses processos de reparo descritos no Ca pítulo 25 diminuem muito o impacto do dano ao DNA Algumas bases do DNA são metiladas Certas bases nucleotídicas em moléculas de DNA são meti ladas enzimaticamente A adenina e a citosina são metiladas com mais frequência do que guanina e timina A metilação geralmente é restrita a certas sequências ou regiões da mo lécula de DNA Em alguns casos a função da metilação é bem conhecida em outros a função permanece obscura Todas as metilases de DNA conhecidas usam Sadenosilme tionina como doador de um grupo metila Figura 832b A E coli tem dois sistemas notáveis de metilação Um serve como parte de um mecanismo de defesa que ajuda a célula a distinguir seu DNA do DNA exógeno por marcar seu pró prio DNA com grupos metila e destruir o DNA exógeno sem os grupos metila isso é conhecido como um sistema de modificaçãorestrição ver p 314 O outro sistema metila resíduos de adenosina dentro da sequência 59GATC39 a N 6metiladenosina Figura 85a Isso é mediado pela Dam DNA adenine methylation metilase um componente de um sistema que repara pares de bases mal pareados for mados ocasionalmente durante a replicação do DNA ver Figura 2521 Em células eucarióticas em torno de 5 dos resíduos de citidina no DNA são metilados a 5metilcitidina Figura 85a A metilação é mais comum em sequências CpG pro duzindo metilCpG simetricamente em ambas as hélices do DNA A extensão da metilação em sequências CpG varia de acordo com a região molecular em grandes moléculas de DNA eucariótico As sequências de longas hélices de DNA podem ser determinadas Por sua capacidade de ser um repositório de informação a propriedade mais importante de uma molécula de DNA é a sua sequência de nucleotídeos Até o final dos anos de 1970 a determinação da sequência de um ácido nucleico contendo até mesmo 5 ou 10 nucleotídeos era muito traba lhosa O desenvolvimento de duas novas técnicas em 1977 uma por Alan Maxam e Walter Gilbert e a outra por Frede rick Sanger tornou possível o sequenciamento de molécu las grandes de DNA com uma tranquilidade não imaginada poucos anos antes As técnicas contavam com um melhor conhecimento da química dos nucleotídeos e do metabolis mo do DNA e em métodos eletroforéticos para separação das cadeias de DNA diferindo em tamanho por apenas um nucleotídeo A eletroforese de DNA é semelhante a das pro teínas ver Figura 318 Poliacrilamida muitas vezes é usa da como a matriz do gel para pequenas moléculas de DNA até poucas centenas de nucleotídeos agarose geralmente é usada para fragmentos maiores de DNA Em ambos os sequenciamentos de MaxamGilbert e de Sanger o princípio geral é reduzir o DNA a quatro grupos de fragmentos marcados A reação que produz cada um desses grupos é baseespecífica de forma que os compri mentos dos fragmentos correspondem a posições de uma determinada base na sequência de DNA Por exemplo para um oligonucleotídeo com a sequência pAATCGACT mar cado na extremidade 59 a extremidade à esquerda uma reação que quebra o DNA após cada resíduo de C irá gerar dois fragmentos marcados um fragmento de quatro nucleo tídeos e um fragmento de sete nucleotídeos uma reação que quebra o DNA após cada resíduo de G irá produzir ape nas um fragmento marcado de cinco nucleotídeos Devido aos fragmentos serem marcados radioativamente nas suas extremidades 59 apenas o fragmento no lado 59 da quebra é visualizado Os tamanhos dos fragmentos correspondem às posições relativas dos resíduos de C e G na sequência Quando os grupos de fragmentos que correspondem a cada uma das quatro bases são separados eletroforeticamente lado a lado eles produzem uma escada de bandas na qual a sequência pode ser lida diretamente Figura 833 Aqui Nelson6ed08indd 302 Nelson6ed08indd 302 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 303 a P P dATP dGTP 39 P P P OH A P P P P P P P P A T C G G C OH A OH G P C P C P G P T 59 Cadeia do iniciador Cadeia molde P P T C FIGURA 833 Sequenciamento de DNA pelo método de Sanger Esse método utiliza o mecanismo de síntese de DNA pela DNApolime rase Capítulo 25 a As DNApolimerases necessitam de um iniciador uma cadeia oligonucleotídica curta ao qual os nucleotídeos serão adicionados e uma cadeiamolde para guiar a seleção de cada novo nucleotídeo Nas células o grupo 39hidroxila do iniciador reage com um desoxinucleosídeo trifosfato dNTP que está entrando para formar uma nova ligação fosfodiéster b O procedimento do sequenciamen to de Sanger usa análogos de didesoxinucleosídeos trifosfatos ddNTP para interromper a síntese de DNA O método de Sanger também é conhecido como o método didesóxi Quando um ddNTP é introduzido no lugar de um dNTP o alongamento da cadeia para após a adição do análogo porque falta o grupo 39hidroxila necessário para o próximo passo c O DNA a ser sequenciado é usado como a cadeiamolde e um iniciador curto marcado radioativamente ou com fluorescência pareia com ele Pela adição de pequenas quantidades de um único ddNTP por exemplo ddCTP a um sistema normal de reação as cadeias sintetizadas serão prematuramente terminadas em determinadas posições quando um dC ocorre normalmente Dado o excesso de dCTP sobre o ddCTP a chance do análogo ser incorporado sempre que dC deve ser adicionado é pequena Entretanto ddCTP está presente em quantidades suficientes para assegurar que cada nova cadeia tenha uma probabilidade alta de adquirir pelo menos um ddC em algum ponto durante a síntese O re sultado é uma solução contendo uma mistura de fragmentos marcados cada um deles terminando com um resíduo de C Cada resíduo de C na sequência produz um grupo de fragmentos de um tamanho específi co de forma que os fragmentos de tamanhos diferentes separados por eletroforese demonstram a localização do resíduo de C Esse procedi mento é repetido separadamente para cada um dos quatro ddNTP e a sequência pode ser lida diretamente do autorradiograma do gel Como pequenos fragmentos de DNA migram mais rapidamente os fragmen tos próximos à parte inferior do gel representam as posições dos nu cleotídeos mais próximas do iniciador a extremidade 59 e a sequência é lida na direção 59S39 da parte inferior para a parte superior Observe que a sequência obtida é aquela da cadeia complementar à cadeia que está sendo analisada O 2O b CH2 H O2 P O2 O2 O P O O O P O O H H H H H Base Análogo ddNTP Autorradiograma da eletroforese em gel c 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 GATTCGAGCTGddA GATTCGddA GddA GATTCGAGddC GATTddC GATTCGAGCTddG GATTCGAddG GATTCddG ddG GATTCGAGCddT GATddT GAddT A G T C G A G C T T A G 39 Sequência da cadeia complementar ddATP ddCTP ddGTP ddTTP 1 dCTP dGTP dATP dTTP 59 39 CTAAGCTCGACT OH Iniciador Molde A C G T Nelson6ed08indd 303 Nelson6ed08indd 303 070414 1429 070414 1429 304 DAVID L NELSON MICHAEL M COX é ilustrado apenas o método de Sanger o mais fácil tecni camente e mais difundido Esse método requer a síntese enzimática de uma cadeia complementar de DNA à cadeia que está sendo analisada usando um iniciador marcado radioativamente e didesoxinucleotídeos Desde que esses primeiros métodos práticos de se quenciamento de DNA apareceram a metodologia melho rou rapidamente Muito desse avanço foi alimentado pelo Projeto Genoma Humano descrito no Capítulo 9 Uma variação do método de sequenciamento de Sanger em que os didesoxinucleotídeos usados para cada reação são marcados com diferentes marcadores fluorescentes colo ridos Figura 834 foi usada nos esforços iniciais para automatizar grandes esforços de sequenciamento de DNA Com essa tecnologia os pesquisadores podem se quenciar moléculas de DNA contendo milhares de nucleo tídeos em poucas horas Essa estratégia foi usada maciça mente nos esforços iniciais para sequenciar genomas inteiros de organismos e é ainda usado para sequencia mento de rotina de genes ou segmentos de DNA Entre tanto sequenciamentos genômicos modernos usam agora métodos muito mais eficientes muitas vezes chamados de próxima geração ou sequenciamento de próxima ge ração Eles estão descritos no Capítulo 9 Sequenciamen to didesóxi de DNA A síntese química de DNA foi automatizada Um importante avanço prático na química de ácidos nu cleicos foi a síntese rápida e precisa de oligonucleotídeos pequenos de sequência conhecida Os métodos foram desenvolvidos por H Gobind Khorana e seus colegas nos anos de 1970 Refinamentos introduzidos por Robert Letsinger e Marvin Caruthers conduziram à química agora usada em larga escala denominada método de fosforami dita Figura 835 A síntese é conduzida com a cadeia em crescimento fixada a um suporte sólido usando funda mentos semelhantes àqueles usados por Merrifield para a síntese de peptídeos ver Figura 332 sendo facilmente automatizada A eficiência de cada etapa é muito alta per mitindo a síntese rotineira de polímeros contendo 70 ou 80 nucleotídeos e em alguns laboratórios cadeias muito mais longas A disponibilidade de polímeros de DNA re lativamente baratos com sequências prédesenhadas está tendo um impacto poderoso em todas as áreas da bioquí mica Capítulo 9 FIGURA 834 Estratégia para automação de reações de sequencia mento de DNA Cada didesoxinucleotídeo usado no método de Sanger pode ser acoplado a uma molécula fluorescente que concede uma cor espe cífica a todos os fragmentos terminados naquele nucleotídeo Todos os qua tro ddNTP marcados são adicionados em um tubo único Os fragmentos de DNA coloridos resultantes são então separados por tamanho em um único gel eletroforético contido em um tubo capilar aprimoramento da eletrofo rese em gel que permite separações mais rápidas Todos os fragmentos de um determinado tamanho migram pelo gel do tubo capilar em um único pico e a cor associada com cada pico é detectada usando um feixe de laser A sequência de DNA é lida pela determinação da sequência de cores nos picos à medida que passam pelo detector Essa informação é alimentada direta mente a um computador o qual determina a sequência DNApolimerase quatro dNTP quatro ddNTP Segmentos de DNA marcados com corante fluorescente copiados do molde com sequência desconhecida Migração do DNA Segmentos marcados com corante fluorescente aplicados a um gel capilar e submetidos a eletroforese Detector 39 Desnaturação Iniciador Sonda de sequência desconhecida A T C G G Laser Feixe de laser Resultado gerado por computador após a passagem das bandas pelo detector T A T T G G C C C T G T T T G A T G G T G G T T C C G A A A T C G G Nelson6ed08indd 304 Nelson6ed08indd 304 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 305 2 H Próximo nucleotídeo adicionado N1 CH 2CH 2 H N CHCH3 2CH CH3 H O P H H H Base2 O Nucleotídeo ativado na posição 39 CH2 H O O CH3 CH3 2 NC CH2 Grupo protetor cianoetil Subproduto diisopropilamino Fosforamidita DMT Grupo ativador diisopropilamino Nucleosídeo acoplado ao suporte de sílica ➊ ➋ ➎ ➏ ➐ ➌ ➍ Repita os passos ➋ a ➌ até que todos os resíduos tenham sido adicionados CH2 H O H H H Base1 O OH H 39 59 DMT Nucleosídeo protegido na hidroxila 59 R Si O H O H H H Base1 O H CH2 H DMT O CH2 H O H H Base1 O H R Si H O H O P H H Base2 O R Si CH2 H O H H H H Base1 O CH2 H O O O H 2 NC CH2 DMT O H O P H H H Base2 O R Si CH2 H O H H H H Base1 O CH2 H O O 2 NC CH2 DMT Oxidação para formar triéster DMT Grupo protetor removido 59 39 Cadeia oligonucleotídica Remoção dos grupos protetores das bases Remoção dos grupos cianoetil dos fosfatos Corte da cadeia do suporte de sílica FIGURA 835 Síntese química de DNA pelo método do fosforamidi ta A síntese de DNA automatizada é conceitualmente semelhante à síntese de polipeptídeos em um suporte sólido O oligonucleotídeo é sintetizado no suporte sólido sílica um nucleotídeo por vez em uma série repetida de reações químicas com precursores nucleotídicos adequadamente protegi dos ➊ O primeiro nucleosídeo o qual formará a extremidade 39 é acoplado ao suporte de sílica na hidroxila39 por meio de um grupamento ligante R sendo protegido na hidroxila59 com um grupo dimetoxitritil DMT lábil em ácido Os grupos reativos em todas as bases também são protegidos quimi camente ➋ O grupo DMT protetor é removido pela lavagem da coluna com ácido o grupo DMT é colorido então essa reação pode ser acompanhada espectrofotometricamente ➌ O próximo nucleotídeo tem uma fosforami dita na posição 39 um fosfito trivalente ao contrário do fosfato pentavalente mais oxidado normalmente presente nos ácidos nucleicos com um oxigê nio ligado substituído por um grupo amino ou uma amina substituída Na variante comum mostrada um dos oxigênios da fosforamidita é ligado à de soxirribose o outro é protegido por um grupo cianoetil e a terceira posição é ocupada pelo grupo diisopropilamino facilmente deslocável A reação com o nucleotídeo imobilizado forma uma ligação 5939 e o grupo diisopropi lamino é eliminado Na etapa ➍ a ligação fosfito é oxidada com iodo para produzir uma ligação fosfotriéster As reações ➋ a ➍ são repetidas até que todos os nucleotídeos tenham sido adicionados Em cada etapa o excesso de nucleotídeos é removido antes da adição do próximo nucleotídeo Nas etapas ➎ e ➏ os grupos protetores remanescentes nas bases e nos fosfatos são removidos e no ➐ o oligonucleotídeo é separado do suporte sólido e purificado A síntese química de RNA é um pouco mais complicada devido à necessidade de proteger o grupo hidroxila 29 da ribose sem afetar a reativi dade do grupo hidroxila 39 Nelson6ed08indd 305 Nelson6ed08indd 305 070414 1429 070414 1429 306 DAVID L NELSON MICHAEL M COX RESUMO 83 Química dos ácidos nucleicos c O DNA nativo passa por desenrolamento reversível e separação de cadeias fusão sob aquecimento ou em pH extremos DNAs ricos em pares GC têm ponto de fusão maior do que DNAs ricos em pares AT c DNAs de cadeia simples desnaturados de duas espécies podem formar um duplex híbrido sendo que o grau de hibridização depende da extensão de sequências seme lhantes A hibridização é a base de técnicas importantes usadas no estudo e no isolamento de genes específicos e RNA c O DNA é um polímero relativamente estável Reações espontâneas como a desaminação de certas bases a hidrólise da ligação Nglicosídica baseaçúcar a forma ção de dímeros de pirimidina induzida por radiação e o dano oxidativo ocorrem em taxas muito baixas mas são importantes devido à tolerância muito baixa da célula a mudanças no material genético c Sequências de DNA podem ser determinadas por uma variedade de métodos modernos c Oligonucleotídeos de sequências conhecidas podem ser sintetizados rápida e acuradamente 84 Outras funções dos nucleotídeos Além das suas funções como subunidades dos ácidos nucleicos os nucleotídeos têm uma variedade de outras funções em cada célula como carreadores de energia componentes de cofatores enzimáticos e mensageiros químicos Os nucleotídeos carregam energia química nas células O grupo fosfato ligado covalentemente na hidroxila 59 de um ribonucleotídeo pode ter um ou dois fosfatos adi cionais ligados As moléculas resultantes são conhecidas como nucleosídeos mono di e trifosfatos Figura 836 Iniciando a partir da ribose os três fosfatos geralmente são rotulados a b e g A hidrólise de nucleosídeos trifosfatos produz a energia química para direcionar muitas reações celulares A adenosina 59trifosfato ATP é sem dúvida o mais amplamente utilizado em algumas reações mas UTP GTP e CTP também são usados em algumas reações Os nucleosídeos trifosfatos também servem como os precur sores ativados na síntese de DNA e de RNA como descrito nos Capítulos 25 e 26 A estrutura do grupo trifosfato é a responsável pela energia liberada durante a hidrólise do ATP e de outros nu cleosídeos trifosfatos A ligação entre a ribose e o fosfato a é uma ligação éster As ligações ab e bg são fosfoanídricas Figura 837 A hidrólise de ligações éster rende cerca de 14 kJmol em condições padrão ao passo que a hidrólise de cada ligação anidrido produz cerca de 30 kJmol A hidróli se do ATP muitas vezes exerce uma função termodinâmica importante na biossíntese Quando acoplada a uma reação com variação de energia livre positiva a hidrólise do ATP muda o equilíbrio do processo geral para favorecer a forma ção do produto lembrese da relação entre a constante de equilíbrio e a variação de energia livre descrita pela Equa ção 63 na p 194 Nucleotídeos da adenina são componentes de muitos cofatores enzimáticos Uma série de cofatores enzimáticos que serve a uma ampla gama de funções químicas inclui a adenosina como parte de suas estruturas Figura 838 Eles não são estrutural mente relacionados exceto pela presença de adenosina Em nenhum desses cofatores a porção da adenosina par ticipa diretamente da função principal mas a remoção da adenosina em geral resulta em uma redução drástica da atividade do cofator Por exemplo a remoção do nucleotí deo adenina 39fosfoadenosinadifosfato da acetoacetil CoA a coenzima A derivada do acetoacetato reduz sua reatividade como substrato para a bcetoacilCoAtrans ferase enzima do metabolismo dos lipídeos por um fator de 10 6 Apesar dessa exigência por adenosina não ter sido investigada detalhadamente ela deve envolver a energia de ligação entre a enzima e o substrato ou cofator que é usada na catálise e na estabilização do complexo enzima substrato inicial Capítulo 6 No caso da bcetoacilCoA transferase a porção nucleotídica da coenzima A parece O 2O CH2 H O2 P O2 O2 O P O O O P O O H H H H Base O OH a b g NMP NDP NTP Abreviaturas dos ribonucleosídeos 59fosfato Base Mono Di Tri Adenina Guanina Citosina Timina AMP GMP CMP UMP ADP GDP CDP UDP ATP GTP CTP UTP Abreviaturas dos desoxirribonucleosídeos 59fosfato Base Mono Di Tri Adenina Guanina Citosina Uracila dAMP dGMP dCMP dTMP dADP dGDP dCDP dTDP dATP dGTP dCTP dTTP FIGURA 836 Nucleosídeos fosfatos Estrutura geral dos nucleosídeos 59mono di e trifosfatos NMP NDP e NTP e suas abreviaturaspadrão Nos didesoxirribonucleosídeos fosfatos dNMP dNDP e dNTP a pentose é 29de sóxiDribose Nelson6ed08indd 306 Nelson6ed08indd 306 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 307 ser uma alavanca de ligação que ajuda a puxar o substra to acetoacetilCoA para o sítio ativo Funções semelhan tes podem ser encontradas para a porção nucleosídica de outros cofatores nucleotídicos Por que a adenosina é usada nessas estruturas em vez de outras moléculas grandes A resposta nesse caso pode envolver uma forma de economia evolutiva Certamente a adenosina não é a única que contribui para a quantidade de energia potencial de ligação A importância da adeno sina provavelmente não está tanto em alguma caracterís tica química especial mas na vantagem evolutiva de usar um composto para múltiplas funções Uma vez que o ATP tornouse a fonte universal de energia química foram de senvolvidos sistemas para sintetizar ATP em maior quan tidade do que outros nucleotídeos Por ser abundante se torna a escolha lógica para a incorporação em uma ampla variedade de estruturas A economia se estende à estrutu O 2O CH3 H O2 P O2 O2 O P O O P O O H H H H Adenina O OH Anidrido Anidrido Éster ATP CH2 O O O O C C H3C H3C O O C CH3 Anidrido acético um anidrido do ácido carboxílico Metilacetato um éster do ácido carboxílico FIGURA 837 Ligações de éster de fosfato e fosfoanidrido do ATP A hidrólise de uma ligação anidrido produz mais energia do que a hidrólise do éster O anidrido do ácido carboxílico e o éster do ácido carboxílico estão mostrados para comparação 2O H P O H H N NH2 N N N N C H H C H3 O O H Coenzima A CH2 CHOH CHOH CHOH CH2 O O 1 O O O P O2 CH2 H O N O N N C H3 NH2 Riboflavina O2 O2 O O P H O OH CH2 O O CH3 C CH2 N C C C CH2 N CH2 CH2 H H HS O CH3 59 P O O O2 O2 39Fosfoadenosina difosfato 3PADP Ácido pantotênico bMercaptoetilamina P H O H H N NH2 N N N H O H 29 49 19 39 CH2 O Nicotinamidaadeninadinucleotídeo NAD1 H O H H N N N N H OH H CH2 O NH2 Flavinaadeninadinucleotídeo FAD H O H H N H OH H CH2 O Nicotinamida O P 2O O O O P O2 O O FIGURA 838 Algumas coenzimas que contêm adenosina A porção adenosina está sombreada em cor salmão A coenzima A CoA funciona em reações de transferência de grupos acil o grupo acil como o grupo acetil ou acetoacetil é acoplado à CoA por meio de uma ligação tioéster à porção bmercaptoetanolamina NAD 1 atua nas transferências de hidretos e FAD a forma ativa da vitamina B2 riboflavina em transferências de elétrons Outra coenzima que incorpora adenosina é a 59desoxiadenosilcobalamina a for ma ativa da vitamina B12 ver Quadro 172 a qual participa em transferências de grupos intramoleculares entre carbonos adjacentes Nelson6ed08indd 307 Nelson6ed08indd 307 070414 1429 070414 1429 308 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ra da proteína Um domínio proteico único que liga adeno sina pode ser usado em enzimas diferentes Tal domínio denominado cavidade de ligação de nucleotídeo é encontrado em muitas enzimas que ligam ATP e cofatores nucleotídicos Alguns nucleotídeos são moléculas reguladoras Células respondem a seu ambiente por receberem avisos dos hormônios ou outros sinais químicos externos A intera ção desses sinais químicos extracelulares primeiros men sageiros com receptores na superfície da célula muitas ve zes leva à produção de segundos mensageiros dentro da célula os quais por sua vez conduzem a mudanças adap tativas no interior da célula Capítulo 12 Muitas vezes o segundo mensageiro é um nucleotídeo Figura 839 Um dos mais comuns é a adenosina 3959monofosfato cí clico AMP cíclico ou cAMP formado a partir de ATP em uma reação catalisada pela adenililciclase uma enzima associada com a face interna da membrana plasmática O AMP cíclico exerce funções reguladoras em todas as células fora do reino vegetal A guanosina 3959monofosfato cíclico cGMP ocorre em muitas células e também tem funções reguladoras Outro nucleotídeo regulador ppGpp Figura 839 é produzido em bactérias como resposta a uma redução de velocidade da síntese proteica durante a falta de aminoáci dos Esse nucleotídeo inibe a síntese de moléculas de rRNA e tRNA ver Figura 2822 necessárias para a síntese pro teica prevenindo a produção desnecessária desses ácidos nucleicos RESUMO 84 Outras funções dos nucleotídeos c O ATP é o carregador central de energia química nas células A presença de uma porção adenosina em uma variedade de cofatores enzimáticos pode ser relaciona da a necessidades de energia de ligação c O AMP cíclico formado a partir de ATP em uma reação catalisada pela adenililciclase é um segundo mensagei ro comum produzido em resposta a hormônios e outros sinais químicos Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário gene 281 RNA ribossômico rRNA 281 RNA mensageiro mRNA 281 RNA transportador tRNA 281 nucleotídeo 281 nucleosídeo 281 pirimidina 282 purina 282 desoxirribonucleotí deo 282 ribonucleotídeo 283 ligação fosfodiéster 284 extremidade 59 285 extremidade 39 285 oligonucleotídeo 286 polinucleotídeo 286 par de bases 287 sulco maior 289 sulco menor 289 forma B do DNA 291 forma A do DNA 291 forma Z do DNA 291 palíndromo 291 grampo 292 cruciforme 292 triplex de DNA 292 tetraplex G 292 transcrição 294 mRNA monocistrônico 294 mRNA policistrônico 294 mutação 299 segundo mensageiro 308 adenosina 3959monofosfato cíclico AMP cíclico cAMP 308 Leituras adicionais Geral Cox MM Doudna JA O9Donnell M 2012 Molecular Biology Principlas and Practice W H Freeman and Company New York O melhor lugar para aprofundar o aprendizado sobre a estrutura e a função dos ácidos nucleicos Friedberg EC Walker GC Siede W Wood RD Schultz R A Ellenberger T 2006 DNA Repair and Mutagenesis 2nd edn ASM Press Washington DC Boa fonte de informações adicionais sobre a química de nucleotídeos e ácidos nucleicos O2 O O O 59 P H O H H H H 39 CH2 O Adenina Adenosina 39 59monofosfato cíclico AMP cíclico cAMP Guanina O2 O O O 59 P H O H H H H 39 CH2 O Guanosina 39 59monofosfato cíclico GMP cíclico cGMP 2O P O2 P O P O O O2 O O P 2O O O2 2O O O 59 H O H H H H 39 CH2 O Guanina Guanosina 59difosfato 39difosfato guanosina tetrafosfato ppGpp FIGURA 839 Três nucleotídeos reguladores Nelson6ed08indd 308 Nelson6ed08indd 308 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 309 Histórico Judson HF 1996 The Eighth Day of Creation Makers of the Revolution in Biology expanded edn Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor NY Olby RC 1994 The Path to the Double Helix The Discovery of DNA Dover Publications Inc New York Sayre A 1978 Rosalind Franklin and DNA WW Norton Co Inc New York Watson JD 1968 The Double Helix A Personal Account of the Discovery of the Structure of DNA Atheneum New York Paper back edition Touchstone Books 2001 Estrutura dos ácidos nucleicos FrankKamenetskii MD Mirkin SM 1995 Triplex DNA structures Annu Rev Biochem 64 6595 Holbrook SR 2008 Structural principles from large RNA Annu Rev Biophys 37 445464 Keniry MA 2000 Quadruplex structures in nucleic acids Biopolymers 56 123146 Bom resumo das propriedades estruturais dos quadruplex Química dos ácidos nucleicos Bonetta L 2006 Genome sequencing in the fast Lane Nat Methods 3 141147 Este artigo introduz uma nova geração de métodos de sequenciamento descritos no Capítulo 9 Collins AR 1999 Oxidative damage antioxidants and cancer Bioessays 21 238246 Cooke MS Evans MD Dizdaroglu M Lunt J 2003 Oxidative DNA damage mechanisms mutation and disease FASEB J 17 11951214 Imlay JA 2008 Cellular defenses against superoxide and hydrogen peroxide Annu Rev Biochem 77 755776 Marnett LJ Plastaras JP 2001 Endogenous DNA damage and mutation Trends Genet 17 214221 ATP como carreador de energia Jencks WP 1987 Economics of enzyme catalysis Cold Spring Harb Symp Quant Biol 52 6573 Artigo relativamente curto mas cheio de conhecimentos Problemas 1 Estrutura de nucleotídeos Quais posições no anel pu rínico dos nucleotídeos purínicos do DNA têm potencial para formar ligações de hidrogênio mas não estão envolvidas no pa reamento de base de WatsonCrick 2 Sequência de bases das fitas de DNA complementar Uma cadeia de um DNA de fita dupla tem a sequência 59GCG CAATATTTCTCAAAATATTGCGC39 Escreva a sequência de bases da fita complementar Que tipo especial de sequência está contido nesse segmento de DNA O DNA de cadeia dupla tem potencial para formar algumas estruturas alternativas 3 DNA do corpo humano Calcule o peso em gramas de uma molécula de DNA de fita dupla esticada da Terra até a Lua 320000 km A duplahélice de DNA pesa em torno de 1 3 10 18 g por 1000 pares de nucleotídeos cada par de bases abrange 34 Å Para uma comparação interessante seu corpo contém aproximadamente 05 g de DNA 4 Enovelamento do DNA Assuma que um trecho de poliA de cinco pares de bases produz um enovelamento de 20º em uma cadeia de DNA Calcule o enovelamento total líquido produzido no DNA se o par de bases do centro o terceiro dos cinco de dois trechos dA5 sucessivos estiver lo calizado a a uma distância de 10 pares de bases b a uma distância de 15 pares de bases Assuma 10 pares de bases por volta na duplahélice de DNA 5 Distinção entre estrutura de DNA e estrutura de RNA Grampos podem ser formados na sequência palindrômi ca de cadeia única de ambos RNA ou DNA Qual é a diferença entre estrutura helicoidal de um grampo longo e completamen te pareado exceto na extremidade no RNA e um grampo se melhante no DNA 6 Química de nucleotídeos As células de muitos orga nismos eucarióticos têm sistemas altamente especializados que reparam especificamente pareamentos incorretos GT no DNA O pareamento incorreto é reparado para formar o par de bases GC não AT Esse mecanismo de reparo do parea mento incorreto GT ocorre além de um sistema mais geral que repara quase todos os pareamentos incorretos Sugira por que as células necessitam de um sistema especializado para reparar o pareamento incorreto GT 7 Desnaturação de ácidos nucleicos Um oligonucleotí deo de duplex de DNA em que uma das cadeias tem a sequên cia TAATACGACTCACTATAGGG tem temperatura de fusão tm de 59C Se um oligonucleotídeo de duplex de RNA de sequência idêntica substituindo U por T é sintetizado a tem peratura de fusão será mais alta ou mais baixa 8 Dano espontâneo no DNA A hidrólise da ligação N glicosídica entre a desoxirribose e uma purina no DNA cria um sítio AP Um sítio AP gera uma desestabilização termodinâmica maior do que a criada por qualquer pareamento incorreto no DNA Esse efeito não está completamente elucidado Examine a estrutura de um sítio AP ver Figura 830b e descreva algu mas consequências químicas dessa perda da base 9 Predição da estrutura de ácido nucleico a partir de sua sequência Parte de um cromossomo sequenciado tem a sequência em uma fita ATTGCATCCGCGCGTGCGCGCGC GATCCCGTTACTTTCCG Qual parte dessa sequência é a mais provável de assumir a conformação Z 10 Estrutura do ácido nucleico Explique por que a ab sorção de luz UV pelo DNA de fita dupla aumenta efeito hiper crômico quando o DNA é desnaturado 11 Determinação de concentração de proteína em uma solução contendo proteínas e ácidos nucleicos A concentração de proteína ou ácidos nucleicos em uma solução contendo ambos pode ser estimada pelo uso de suas diferen tes propriedades de absorção de luz proteínas absorvem mais intensamente em 280 nm e ácidos nucleicos em 260 nm Es timativas de suas respectivas concentrações em uma mistura podem ser feitas medindo a absorbância A da solução a 280 e 260 nm e usando a tabela na próxima página a qual dá R280260 a razão das absorbâncias a 280 e 260 nm a porcentagem da massa total que é ácido nucleico e o fator F que corrige a lei tura a A280 e dá uma estimativa mais correta de proteína A con centração de proteína em mgmL 5 F 3 A280 supondo que a cubeta tenha um caminho óptico de 1 cm Calcule a concen tração de proteína em uma solução de A280 5 069 e A260 5 094 Nelson6ed08indd 309 Nelson6ed08indd 309 070414 1429 070414 1429 310 DAVID L NELSON MICHAEL M COX R280260 Proporção de ácido nucleico F 175 000 1116 163 025 1081 152 050 1054 140 075 1023 136 100 0994 130 125 0970 125 150 0944 116 200 0899 109 250 0852 103 300 0814 0979 350 0776 0939 400 0743 0874 500 0682 0846 550 0656 0822 600 0632 0804 650 0607 0784 700 0585 0767 750 0565 0753 800 0545 0730 900 0508 0705 1000 0478 0671 1200 0422 0644 1400 0377 0615 1700 0322 0595 2000 0278 12 Solubilidade dos componentes de DNA Desenhe as seguintes estruturas e ordene suas solubilidades relativas em água desde a mais solúvel até a menos solúvel desoxirribo se guanina fosfato Como essas solubilidades são consistentes com a estrutura tridimensional do DNA de fita dupla 13 Lógica do sequenciamento de Sanger No método de Sanger didesóxi para sequenciamento de DNA uma peque na quantidade de didesoxirribonucleotídeo trifosfato como ddCTP é adicionada à reação de sequenciamento junto com uma grande quantidade do correspondente dCTP Qual seria o resultado esperado se o dCTP fosse omitido 14 Sequenciamento de DNA O seguinte fragmento de DNA foi sequenciado pelo método de Sanger O asterisco ver melho indica um marcador fluorescente 59 39OH 39 ATTACGCAAGGACATTAGAC59 Uma amostra de DNA reagiu com a DNApolimerase e com cada uma das misturas de nucleotídeos em tampão apropria do listadas abaixo Didesoxinucleotídeos ddNTP foram adi cionados em quantidades relativamente pequenas 1 dATP dTTP dCTP dGTP ddTTP 2 dATP dTTP dCTP dGTP ddGTP 3 dATP dCTP dGTP ddTTP 4 dATP dTTP dCTP dGTP O DNA resultante da reação foi separado por eletroforese em gel de agarose e foram localizadas as bandas fluorescen tes O padrão de bandas resultante da mistura de nucleotí deos 1 está abaixo Supondo que todas as misturas fossem separadas no mesmo gel qual seria a aparência das canale tas 2 3 e 4 Eletroforese 1 2 3 4 15 Fosfodiesterase de veneno de serpentes Uma exo nuclease é uma enzima que cliva nucleotídeos sequencialmen te a partir da extremidade de uma cadeia polinucleotídica A fosfodiesterase de veneno de serpentes a qual hidrolisa nu cleotídeos a partir da extremidade 39 de qualquer nucleotídeo com um grupo 39hidroxila livre cliva entre o 39 hidroxila da ribose ou da desoxirribose e o grupo fosforil do próximo nu cleotídeo Ela age no RNA ou DNA de cadeia simples e não tem especificidade de base Essa enzima foi usada em experimen tos de determinação de sequência antes do desenvolvimento de técnicas modernas de sequenciamento de ácidos nucleicos Quais são os produtos da digestão parcial pela fosfodiesterase de veneno de serpente de um oligonucleotídeo com a seguinte sequência 59GCGCCAUUGC39OH 16 Preservação do DNA em endosporos bacterianos Os endosporos de bactérias se formam quando o ambiente não mais permite o metabolismo celular ativo Na bactéria de solo Bacillus subtilis por exemplo o processo de esporulação começa quando um ou mais nutrientes estiverem esgotados O produto final é uma estrutura pequena e metabolicamente dormente que pode sobreviver quase que indefinidamente sem nenhum metabolismo detectável Os esporos têm mecanismos que evitam o acúmulo de mutações potencialmente letais no seu metabolismo por períodos de dormência que podem ultra passar 1000 anos Os esporos de B subtilis são muito mais re sistentes ao calor à radiação UV e a agentes oxidantes agen tes mutagênicos todos eles promovem mutações do que a bactéria em crescimento a Um fator que evita potencial dano ao DNA é a grande diminuição no seu conteúdo de água Como isso afetaria alguns tipos de mutações b Os endosporos têm uma categoria de proteínas deno minada pequenas proteínas solúveis em ácido SASP do inglês small acidsoluble proteins que se ligam ao DNA evitan do a formação de dímeros do tipo ciclobutano O que causa a formação de dímeros de ciclobutano e por que os endosporos de bactérias necessitam de mecanismos que previnam a sua formação Nelson6ed08indd 310 Nelson6ed08indd 310 070414 1429 070414 1429 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 311 17 Síntese de oligonucleotídeos No esquema da Figura 835 cada nova base a ser adicionada ao oligonucleotídeo que está sendo alongado é modificada de forma que o seu grupo 39 hidroxila é ativado e o grupo 59 hidroxila está ligado a um grupo dimetoxitritil DMT Qual é a função do grupo DMT na base que está sendo adicionada Bioquímica na internet 18 A estrutura do DNA A elucidação da estrutura tri dimensional do DNA ajudou os pesquisadores a entender como essa molécula carrega informação que pode ser fiel mente replicada de uma geração para a próxima Para ver a estrutura secundária do DNA de fita dupla vá ao site do Protein Data Bank wwwpdborg Use os identificadores do PDB listados abaixo para ver os resumos da estrutura para as duas formas de DNA Abra as estruturas usando Jmol li gado ao Display Options e use os controles no menu do Jmol acessado com o controlclick ou clique no logo do Jmol no canto inferior direito da tela do monitor para com pletar os exercícios a seguir Recorra ao link de ajuda do Jmol se necessário a Obtenha o arquivo da 141D uma sequência de DNA al tamente conservada e repetitiva da extremidade do genoma do HIV1 o vírus que causa a Aids Mostre a molécula na forma de estrutura de esfera e bastão e os elementos em cores dife rentes Identifique o esqueleto açúcarfosfato para cada cadeia do duplex de DNA Localize e identifique bases individuais Identifique a extremidade 59 de cada cadeia Localize o sulco maior e o sulco menor Essa hélice está voltada para a direita ou para a esquerda b Obtenha o arquivo da 145D um DNA com a confor mação Z Mostre a molécula como na forma de estrutura de esfera e bastão e os elementos em cores diferentes Identifi que o esqueleto açúcarfosfato para cada cadeia do duplex de DNA Essa hélice está voltada para a direita ou para a es querda c Para avaliar precisamente a estrutura secundária de DNA ver molécula na forma tridimensional No control menu escolha Select All então Style Stereographic Crosseye ou Walleye Você verá duas imagens da molécula de DNA Coloque o seu nariz a aproximadamente 25 centí metros do monitor e olhe a ponta do seu nariz com os olhos cruzados ou as margens opostas da tela do monitor com os olhos para os lados No fundo você poderá ver três imagens da hélice de DNA Mude o foco do olhar para a imagem do meio que aparecerá em três dimensões Lembrese que apenas um dos dois autores deste livro consegue fazer isso Problema de análise de dados 19 Estudos de Chargaff da estrutura do DNA A se ção do capítulo DNA é uma duplahélice que armazena infor mação genética inclui um resumo dos principais achados de Erwin Chargaff e seus colegas listados como quatro conclu sões Regras de Chargaff p 288 Neste problema você irá examinar os dados que Chargaff coletou para sustentar essas conclusões Em um artigo Chargaff 1950 descreveu seus métodos analíticos e alguns resultados preliminares Resumidamente ele tratou as amostras de DNA com ácido para remover as ba ses separou as bases por cromatografia de papel e mediu a quantidade de cada base por espectroscopia de UV Seus resul tados estão mostrados nas três tabelas a seguir A relação mo lar é a razão entre o número de moles de cada base na amostra pelo número de moles de fosfato na amostra isso dá a fração do número total de bases representada por cada base espe cífica O rendimento é a soma das quatro bases a soma das relações molares A recuperação completa de todas as bases no DNA daria um rendimento de 10 Relação molar no DNA de boi Timo Baço Fígado Base Prep 1 Prep 2 Prep 3 Prep 1 Prep 2 Prep 1 Adenina 026 028 030 025 026 026 Guanina 021 024 022 020 021 020 Citosina 016 018 017 015 017 Timina 025 024 025 024 024 Rendimento 088 094 094 084 088 Relação molar no DNA humano Esperma Timo Fígado Base Prep 1 Prep 2 Prep 1 Normal Carcinoma Adenina 029 027 028 027 027 Guanina 018 017 019 019 018 Citosina 018 018 016 015 Timina 031 030 028 027 Rendimento 096 092 091 087 Relação molar no DNA de microrganismos Levedura Bacilo da tuberculose aviária Base Prep 1 Prep 2 Prep 1 Adenina 024 030 012 Guanina 014 018 028 Citosina 013 015 026 Timina 025 029 011 Rendimento 076 092 077 a Com base nestes dados Chargaff concluiu que até agora nenhuma diferença foi encontrada na composição do DNA dos diferentes tecidos de uma mesma espécie Isso corresponde à conclusão 2 mencionada neste capítulo Entre tanto uma visão cética dos mesmos dados poderia concluir com certeza eles parecem diferentes Se você fosse Chargaff como usaria os dados para convencer algum cético a mudar de ideia b A composição de bases do DNA de células hepáticas normais e de células hepáticas cancerosas hepatocarcinoma não foi significativamente diferente Você esperaria que a téc nica de Chargaff fosse capaz de detectar uma diferença entre o DNA de células normais e o de células cancerosas Justifique a sua explicação Como você pode imaginar os dados de Chargaff não foram completamente convincentes Ele continuou a aprimorar suas técnicas como descrito no artigo posterior Chargaff 1951 em que ele descreveu relações molares de bases no DNA de vários organismos Nelson6ed08indd 311 Nelson6ed08indd 311 070414 1429 070414 1429 312 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Fonte AG TC AT GC Purinapirimidina Boi 129 143 104 100 11 Humanos 156 175 100 100 10 Galinha 145 129 106 091 099 Salmão 143 143 102 102 102 Trigo 122 118 100 097 099 Levedura 167 192 103 120 10 Haemophilus in fluenzae tipo c 174 154 107 091 10 E coli K12 105 095 109 099 10 Bacilo da tuberculose aviária 04 04 109 108 11 Serratia marcescens 07 07 095 086 09 Bacillus schatz 07 06 112 089 10 c De acordo com Chargaff como exposto na conclusão 1 neste capítulo A composição de bases do DNA geralmente va ria de uma espécie para a outra Dê um argumento com base nos dados apresentados até agora que sustente essa conclusão d De acordo com a conclusão 4 Em todos os DNA ce lulares independentemente da espécie A 1 G 5 T 1 C Dê um argumento com base nos dados apresentados até agora que sustente essa conclusão Parte da intenção de Chargaff foi refutar a hipótese do tetranucleotídeo Essa era a ideia de que o DNA era um polí mero monótono de tetranucleotídeos AGCTn e portanto in capaz de conter informação de sequências Apesar de os dados apresentados anteriormente demonstrarem que o DNA não pode ser simplesmente um tetranucleotídeo se fosse todas as amostras teriam relações molares de 025 para cada base ainda seria possível que o DNA de diferentes organismos fosse levemente mais complexo na forma de sequências repetidas mas ainda monótono Para tratar dessa questão Chargaff pegou DNA de germe de trigo e o tratou com a enzima desoxirribonuclease por di ferentes períodos Em cada intervalo de tempo uma parte do DNA foi convertida a fragmentos pequenos e os fragmentos grandes restantes foram chamados de cerne Na tabela abai xo o percentual de 19 do cerne corresponde aos fragmen tos grandes remanescentes quando 81 do DNA foram degra dados 8 do cerne correspondem aos fragmentos grandes remanescentes após 92 de degradação Base DNA intacto 19 do cerne 8 do cerne Adenina 027 033 035 Guanina 022 020 020 Citosina 022 016 014 Timina 027 026 023 Rendimento 098 095 092 e Como você usaria esses dados para argumentar que o DNA de germe de trigo não é uma sequência repetitiva monó tona Referências Chargaff E 1950 Chemical specificity of nucleic acids and mechanism of their enzymic degradation Experimentia 6 201209 Chargaff E 1951 Structure and function of nucleic acids as cell constituents Fed Proc 10 654659 Nelson6ed08indd 312 Nelson6ed08indd 312 070414 1429 070414 1429 91 Estudo dos genes e seus produtos 314 92 Utilização de métodos com base no DNA para a compreensão das funções das proteínas 331 93 Genômica e história da humanidade 339 A complexidade das moléculas e dos sistemas apresen tados neste livro pode algumas vezes ocultar uma realidade bioquímica o que se aprendeu é apenas o começo Novos lipídeos proteínas carboidratos e ácidos nucleicos são descobertos a cada dia e com frequência não se tem nenhuma ideia sobre suas funções Quantos ainda serão descobertos e quais serão suas funções Até mesmo moléculas bem caracterizadas continuam a desafiar os pes quisadores com inúmeras questões mecânicas e funcionais não resolvidas Os milhares de sequências genômicas com pletas já conhecidas fornecem uma estimativa da imensidão da tarefa à frente Simplesmente não são conhecidas as fun ções da maior parte do DNA em geral incluindo a metade ou mais dos genes em um genoma típico Essas mesmas sequências genômicas também fornecem uma oportuni dade sem precedentes Não há maior fonte de informações sobre uma célula ou organismo do que as inseridas em seu próprio DNA A tarefa de extrair essas informações originou sofisticadas tecnologias com base no DNA que agora estão no centro de quase toda a história da bioquímica Essas tec nologias serão abordadas em cada um dos tópicos explora dos nos próximos capítulos Como objetos de estudo as moléculas de DNA apresentam um problema espe cial seu tamanho Sem dúvida os cro mossomos são as maiores biomoléculas na célula Como um pesquisador descobre a informação que procura quando só uma pequena parte de um cromossomo inclui milhões ou até bilhões de pares de bases contíguos Soluções para esses problemas começaram a surgir na década de 1970 Décadas de avanços por milhares de cientistas que trabalham em genética bio química biologia celular e físicoquímica se uniram nos laboratórios de Paul Berg Herbert Boyer e Stanley Cohen para pro duzir técnicas de detecção isolamento preparação e estu do de pequenos segmentos de DNA derivados de cromos somos muito maiores As técnicas para a clonagem de DNA pavimentaram o caminho para o moderno campo da genô mica e de forma mais ampla para muitas das tecnologias que contribuem para a biologia de sistemas o estudo da bioquímica na escala de todas as células e organismos Cada aluno ou instrutor quando considera os temas apresentados neste capítulo deparase com um conflito Primeiro os métodos aqui descritos foram possíveis graças aos avanços na compreensão do metabolismo do DNA e do RNA Assim é preciso entender alguns conceitos fun damentais da replicação do DNA transcrição do RNA sín tese de proteínas e regulação gênica para entender como esses métodos funcionam Ao mesmo tempo no entanto a bioquímica moderna se baseia nesses mesmos métodos de modo que uma abordagem atual sobre qualquer aspecto da disciplina tornase muito difícil sem uma introdução ade quada a eles Apresentar esses métodos no início do livro é reconhecer que eles estão intrinsecamente interligados tanto aos avanços que lhes deram origem quanto às mais novas descobertas que eles hoje tornam possíveis Esses conceitos básicos e necessários fazem da presente discus são não apenas uma introdução à tecnologia mas também uma prévia de muitos dos fundamentos da bioquímica do DNA e do RNA encontrados em capítulos posteriores Inicialmente são destacados os princípios de clonagem do DNA e em seguida ilustrados a variedade de aplicações 9 Tecnologias da Informação com Base no DNA Paul Berg Herbert Boyer Stanley N Cohen Nelson6ed09indd 313 Nelson6ed09indd 313 020514 1715 020514 1715 314 DAVID L NELSON MICHAEL M COX e o potencial de muitas das tecnologias mais recentes que apoiam e aceleram o avanço da bioquímica 91 Estudo dos genes e seus produtos Uma pesquisadora isolou uma nova enzima que é a chave para uma doença humana Ela espera isolar grandes quan tidades da proteína a fim de cristalizála para seu estudo e análise estrutural Deseja alterar os resíduos de aminoá cidos em seu sítio ativo para compreender a reação que a enzima catalisa Ela prepara um sofisticado programa de pesquisa para elucidar como essa enzima interage e é regu lada por outras proteínas na célula Tudo isso e muito mais se torna possível se ela conseguir obter o gene que codifica sua enzima Infelizmente esse gene tem apenas alguns mi lhares de pares de bases no interior de um cromossomo hu mano com um tamanho medido em centenas de milhares de pares de bases Como ela vai isolar o pequeno segmento de que necessita e então estudálo A resposta encontra se na clonagem do DNA e em métodos desenvolvidos para manipular genes clonados Genes podem ser isolados por clonagem do DNA Um clone é uma cópia idêntica Esse termo foi original mente aplicado a células de um único tipo isoladas e cultivadas para criar uma população de células idênticas Quando aplicado ao DNA um clone representa muitas cópias idênticas de um segmento particular do gene Em resumo a pesquisadora deve cortar o gene do cromosso mo maior anexálo a uma porção muito menor de DNA transportador e permitir que microrganismos façam mui tas cópias dessa porção para ela Esse é o processo de clo nagem de DNA O resultado é a amplificação seletiva de um determinado gene ou segmento de DNA facilitando seu isolamento e estudo Classicamente a clonagem de DNA a partir de qualquer organismo envolve cinco proce dimentos gerais 1 Cortar o DNAalvo em locais precisos Endonu cleases específicas de sequência endonucleases de restrição fornecem as tesouras moleculares neces sárias 2 Selecionar uma pequena molécula transporta dora de DNA capaz de autorreplicação Esses DNAs são chamados vetores de clonagem veto res são agentes de entrega São geralmente plas mídeos ou DNAs virais 3 Juntar dois fragmentos de DNA de modo co valente A enzima DNAligase liga o vetor de clo nagem e o DNA a ser clonado Moléculas de DNA compostas por segmentos ligados de modo covalen te a partir de duas ou mais fontes são chamadas de DNAs recombinantes 4 Transportar o DNA recombinante do tubo de en saio para uma célula hospedeira que irá propor cionar a maquinaria enzimática para a replicação do DNA 5 Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contêm DNA recombinante Os métodos utilizados para realizar essas e outras tarefas relacionadas são coletivamente chamados de tecnologia do DNA recombinante ou de modo mais informal de en genharia genética Grande parte dessa discussão inicial incidirá sobre a clonagem de DNA na bactéria Escherichia coli o primeiro organismo utilizado para o trabalho de DNA recombinante e ainda a célula hospedeira mais comum A E coli apre senta muitas vantagens o metabolismo do seu DNA como muitos outros de seus processos bioquímicos é bem com preendido muitos vetores de clonagem que ocorrem natu ralmente associados à E coli como plasmídeos e bacteri ófagos vírus bacterianos também chamado de fagos são bem caracterizados e existem técnicas para transportar o DNA rapidamente de uma célula bacteriana a outra Os princípios aqui discutidos são amplamente aplicáveis à clo nagem de DNA em outros organismos tópico discutido em mais detalhes adiante na seção Endonucleases de restrição e DNAligases produzem DNA recombinante Particularmente importante para a tecnologia do DNA re combinante é um conjunto de enzimas Tabela 91 que se tornou disponível ao longo de décadas de pesquisa sobre o metabolismo de ácidos nucleicos Duas classes de enzi mas estão no centro da abordagem clássica para a geração e propagação da molécula de DNA recombinante Figura 91 Em primeiro lugar as endonucleases de restrição também chamadas de enzimas de restrição reconhecem e clivam o DNA em sequências específicas sequências de re conhecimento ou sítios de restrição para gerar um conjun to de fragmentos menores Em segundo lugar o fragmento do DNA a ser clonado é unido a um vetor de clonagem ade quado por meio de DNAligases para ligar as moléculas de DNA O vetor recombinante é então introduzido em uma célula hospedeira que amplifica o fragmento no curso de muitas gerações de divisão celular Endonucleases de restrição são encontradas em um grande número de espécies bacterianas No início da déca da de 1960 Werner Arber descobriu que a função biológica dessas enzimas consiste em reconhecer e clivar o DNA exó geno o DNA de um vírus infeccioso por exemplo afirma se que tal DNA está restrito No DNA da célula hospedeira a sequência que poderia ser reconhecida por sua própria endonuclease de restrição é protegida da digestão pela me tilação do DNA catalisada por uma metilase específica A endonuclease de restrição e a metilase correspondente são chamadas algumas vezes de sistema de restriçãomodi ficação Há três tipos de endonucleases de restrição designa das I II e III Os tipos I e III são complexos geralmente grandes com múltiplas subunidades contendo atividades tanto de endonuclease quanto de metilase As endonucle ases de restrição tipo I clivam o DNA em sítios aleatórios que podem estar a mais de 1000 pares de base pb da sequência de reconhecimento As endonucleases de res trição tipo III clivam o DNA a cerca de 25 pb da sequência de reconhecimento Ambos os tipos se movem ao longo Nelson6edbookindb 314 Nelson6edbookindb 314 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 315 do DNA em uma reação que precisa da energia do ATP As endonucleases de restrição tipo II isoladas pela primeira vez por Hamilton Smith em 1970 são mais sim ples não requerem ATP e catalisam a clivagem hidrolítica de ligações fosfodiésteres específicas no DNA dentro da própria sequência de reconhecimento A extraordinária utilidade desse grupo de endonucleases de restrição foi demonstrada por Daniel Nathans que primeiro as utilizou para desenvolver novos métodos de mapeamento e análise de genes e genomas Milhares de endonucleases de restrição tipo II foram descobertos em diferentes espécies bacterianas e mais de 100 sequências de DNA diferentes são reconhecidas por uma ou mais dessas enzimas As sequências de reconheci mento têm em geral 4 a 6 pb de comprimento e são palin drômicas ver Figura 818 A Tabela 92 lista as sequências reconhecidas por algumas endonucleases tipo II Algumas endonucleases de restrição fazem cortes co ordenados nas duas fitas do DNA deixando dois a quatro nucleotídeos de uma fita sem par em cada extremidade resultante Essas fitas sem pares são chamadas de extre midades adesivas Figura 92a pois formam pares de bases entre si ou com extremidades adesivas complementa res de outros fragmentos de DNA Outras endonucleases de restrição clivam ambas as fitas do DNA nas ligações fosfodi ésteres opostas sem deixar nenhuma base sem par nas ex tremidades frequentemente chamadas de extremidades cegas Figura 92b O tamanho médio dos fragmentos de DNA produzidos pela clivagem do DNA genômico com uma endonuclease de TABELA 91 Algumas enzimas usadas na tecnologia do DNA recombinante Enzimas Função Endonucleases de restrição tipo II Clivam DNA em sequências de bases específicas DNAligase Liga duas moléculas ou fragmentos de DNA DNApolimerase I E coli Preenche lacunas em DNA de fita dupla com adição de nucleotídeos às extremidades 39 Transcriptase reversa Faz uma cópia de DNA a partir de uma molécula de RNA Polinucleotídeocinase Adiciona um fosfato à extremidade 59OH de um polinucleotídeo para marcála ou permitir ligação Terminaltransferase Adiciona caudas de homopolímeros às extremidades 39OH de um duplex linear Exonuclease III Remove resíduos nucleotídicos das extremidades 39 de uma fita de DNA Exonuclease do bacteriófago l Remove resíduos nucleotídicos das extremidades 59 de um duplex de DNA para expor as ex tremidades 39 de fita simples Fosfatase alcalina Remove fosfatos terminais das extremidades 59ou 39 ou ambas FIGURA 91 Ilustração esquemática da clonagem do DNA Um ve tor de clonagem e cromossomos eucarióticos são clivados separadamente com a mesma endonuclease de restrição um único cromossomo é mostra do para fins de simplificação Os fragmentos a serem clonados são então ligados ao vetor de clonagem O DNA recombinante resultante apenas um vetor recombinante é mostrado aqui é introduzido em uma célula hospe deira onde pode ser propagado clonado Observe que este desenho não está em escala o tamanho do cromossomo de E coli em relação àquele de um típico vetor de clonagem como um plasmídeo é muito maior do que o mostrado aqui Vetor de clonagem plasmídeo Vetor recombinante DNA hospedeiro Cromossomo eucariótico ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ DNAligase O vetor de clonagem é clivado pela endonuclease de restrição O fragmento de DNA de interesse é obtido pela clivagem do cromossomo com uma endonuclease de restrição Os fragmentos são ligados ao vetor de clonagem preparado O DNA é introduzido na célula hospedeira A propagação clonagem da célula transformada produz várias cópias do DNA recombinante Nelson6edbookindb 315 Nelson6edbookindb 315 020414 1845 020414 1845 316 DAVID L NELSON MICHAEL M COX restrição depende da frequência na qual um sítio específico de restrição ocorre na molécula do DNA que por sua vez depende muito do tamanho da sequência de reconhecimento Em uma molécula de DNA com sequência aleatória na qual todos os quatro nucleotídeos são igualmente abundan tes uma sequência de 6 pb reconhecida por uma endonu clease de restrição como BamHI pode ocorrer em média uma vez a cada 4 6 4096 pb Enzimas que reconhecem uma sequência de 4 pb produzem fragmentos de DNA menores a partir de uma molécula de DNA com sequência aleatória uma sequência de reconhecimento desse tamanho ocorreria mais ou menos a cada 4 4 256 pb Em moléculas naturais de DNA sequências de reconhecimento específicas tendem a ocorrer com menos frequência do que essas porque as sequências nucleotídicas no DNA não são aleatórias e os quatro nucleotídeos não são igualmente abundantes Em experimentos laboratoriais o tamanho médio de fragmentos produzidos pela clivagem por endonucleases de restrição de um DNA grande pode ser aumentado simplesmente termi nando a reação antes de se completar o processo o resul tado é chamado de digestão parcial O tamanho médio do fragmento também pode ser aumentado utilizandose uma classe especial de endonucleases chamadas de endonucle ases homing ver Figura 2637 Elas reconhecem e clivam sequências de DNA muito maiores 14 a 20 pb Uma vez que a molécula de DNA tenha sido clivada em fragmentos um determinado fragmento de tamanho conhecido pode ser parcialmente purificado por meio de eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida p 302 ou por HPLC p 92 Para um genoma típico de mamífero entretanto a clivagem por endonucleases de restrição ge ralmente produz um número muito grande de fragmentos de DNA diferentes para permitir o isolamento adequado de um segmento específico Uma etapa intermediária co mum na clonagem de um gene específico ou segmento de DNA é a construção de uma biblioteca de DNA descrita na Seção 92 Após o isolamento do fragmento de DNAalvo a DNA ligase pode ser utilizada para unilo a um vetor de clona gem digerido de modo semelhante isto é um vetor dige rido pela mesma endonuclease de restrição um fragmento gerado por EcoRI por exemplo em geral não irá se unir a um fragmento gerado por BamHI Como descrito mais de talhadamente no Capítulo 25 ver Figura 2516 a DNA ligase catalisa a formação de novas ligações fosfodiésteres em uma reação que utiliza ATP ou um cofator semelhante O pareamento de bases das extremidades adesivas comple mentares facilita muito a reação da ligação Figura 92a As extremidades cegas também podem ser ligadas embora com menos eficiência Os pesquisadores podem criar no vas sequências de DNA inserindo fragmentos sintéticos de DNA chamados de linkers entre as extremidades que es tão sendo ligadas Fragmentos de DNA inseridos com múlti plas sequências de reconhecimento para endonucleases de restrição frequentemente úteis como pontos para inserção posterior de DNA adicional por clivagem e ligação são cha mados de polilinkers Figura 92c A eficácia das extremidades adesivas em unir seletiva mente dois fragmentos de DNA foi revelada nos primeiros experimentos de DNA recombinante Antes que as endonu cleases estivessem amplamente disponíveis alguns pesqui sadores descobriram que podiam gerar extremidades ade sivas pela ação combinada da exonuclease do bacteriófago l e da enzima terminaltransferase Tabela 91 Eram adi TABELA 92 Sequências de reconhecimento para algumas endonucleases de restrição tipo II BamHI HindIII ClaI NotI EcoRI PstI EcoRV PvuII HaeIII Tth111I Nota As setas indicam as ligações de fosfodiéster clivadas por cada endonuclease de restrição Os asteriscos indicam bases metiladas pela metilase correspondente quando conhecida N denota qualquer base Observe que o nome de cada enzima consiste em uma abreviação de três letras em itálico da espécie bacteriana da qual ela deriva por vezes seguida por designação da linhagem e de números romanos para distinguir diferentes endonucleases de restrição isoladas das mesmas espécies bacterianas Então BamH I é a primeira I endonuclease de restrição caracterizada isolada da linhagem H do Bacyllus amyloliquefaciens Nelson6edbookindb 316 Nelson6edbookindb 316 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 317 cionadas caudas homopoliméricas aos fragmentos a serem unidos Peter Lobban e Dale Kaiser utilizaram esse método em 1971 nos primeiros experimentos para unir fragmentos de DNA de ocorrência natural Métodos semelhantes foram utilizados logo após no laboratório de Paul Berg para unir segmentos de DNA do vírus de símios 40 SV40 ao DNA derivado de bacteriófago l criando assim a primeira mo lécula de DNA recombinante com segmentos de DNA de espécies diferentes Os vetores de clonagem permitem a amplificação dos segmentos de DNA inseridos Os princípios que regem a liberação de DNA recombinan te em uma forma clonável a uma célula hospedeira e sua posterior amplificação nessa célula são bem ilustrados con siderandose dois vetores de clonagem comuns os plasmí deos e os cromossomos artificiais de bactérias utilizados em experimentos com E coli e um vetor usado para clonar segmentos de DNA grandes em levedura Plasmídeos Um plasmídeo é uma molécula de DNA circular que se replica separadamente do cromossomo hospedeiro A grande variedade de plasmídeos bacterianos que ocorre naturalmente varia de tamanho de 5000 a 400000 pb Mui tos dos plasmídeos encontrados em populações bacterianas são um pouco mais do que parasitas moleculares seme lhantes aos vírus mas com capacidade mais limitada de se transferir de uma célula para outra Para sobreviver na célu la hospedeira os plasmídeos incorporam várias sequências especializadas que os tornam capazes de utilizar a energia das células para sua própria replicação e expressão gênica Os plasmídeos de ocorrência natural têm um papel simbiótico na célula são capazes de fornecer genes que conferem resistência a antibióticos ou que realizam novas funções para a célula Por exemplo o plasmídeo Ti de Agro FIGURA 92 Clivagem de moléculas de DNA por endonucleases de restrição As endonucleases de restrição reconhecem e clivam apenas sequências específicas deixando tanto as extremidades adesivas a com fitas simples salientes quanto as extremidades cegas b Os fragmentos podem se ligar a outros DNA como o vetor de clonagem clivado um plas mídeo mostrado aqui Esta reação é facilitada pela renaturação das extre midades adesivas complementares A ligação é menos eficiente para os fragmentos de DNA com extremidades cegas do que para aqueles com extremidades adesivas complementares e os fragmentos de DNA com di ferentes extremidades adesivas não complementares geralmente não se ligam c Um fragmento de DNA sintético com sequências de reconheci mento para várias endonucleases de restrição pode ser inserido em um plasmídeo que foi clivado por uma endonuclease de restrição A inserção é chamada de linker uma inserção com múltiplos sítios de restrição é chama da de polilinker Endonucleases de restrição Sítio de clivagem Sítio de clivagem Sequências de reconhecimento DNA cromossômico Extremidades cegas b DNAligase Endonuclease de restrição EcoRI Endonuclease de restrição PvuII Extremidades adesivas a Vetor de clonagem plasmidial clivado com EcoRI e PvuII Polilinker sintético c Polilinker S m a I DNAligase HindIII BamHI P s tI H i n dI II B a m H I E c o RI E c o RI PstI SmaI EcoRI extremidade adesiva EcoRI extremidade adesiva Vetor de clonagem plasmidial clivado com EcoRI Nelson6edbookindb 317 Nelson6edbookindb 317 020414 1845 020414 1845 318 DAVID L NELSON MICHAEL M COX bacterium tumefaciens torna a bactéria hospedeira capaz de colonizar as células de plantas e se utilizar de sua ener gia As mesmas propriedades que tornam os plasmídeos capazes de sobreviverem em um hospedeiro bacteriano ou eucariótico são úteis para os biólogos moleculares desen volverem um vetor para a clonagem de um segmento es pecífico de DNA O clássico plasmídeo de E coli pBR322 desenvolvido em 1977 é um bom exemplo de um plasmídeo com características úteis em quase todos os vetores de clo nagem Figura 93 1 O plasmídeo pBR322 tem uma origem de replica ção ou ori uma sequência onde a replicação é ini ciada por enzimas celulares ver Capítulo 25 Essa sequência é necessária para propagar o plasmídeo Um sistema regulatório associado limita a replica ção para manter o pBR322 em um nível de 10 a 20 cópias por célula 2 O plasmídeo contém genes que conferem resistên cia aos antibióticos tetraciclina Tet R e ampicilina Amp R permitindo a seleção de células que con têm o plasmídeo intacto ou uma versão recombi nante do plasmídeo discutida a seguir 3 Várias sequências de reconhecimento únicas no pBR322 são alvo para endonucleases de restrição PstI EcoRI BamHI SalI e PvuII fornecendo sí tios onde o plasmídeo pode ser cortado e inserido em um DNA exógeno 4 O pequeno tamanho do plasmídeo 4361 pb fa cilita sua entrada nas células e a manipulação bio química do DNA Esse pequeno tamanho foi gerado simplesmente cortandose muitos segmentos de DNA a partir de um plasmídeo parental maior se quências que o biólogo molecular não necessita As origens de replicação inseridas em vetores de plas mídeos comuns foram originalmente derivadas de plasmí deos que ocorrem naturalmente Como em pBR322 cada uma dessas origens é regulada para manter um número de cópias do plasmídeo específico Dependendo da origem utilizada o número de cópias do plasmídeo pode variar de uma a centenas ou milhares por célula proporcionando muitas opções para os investigadores Dois plasmídeos di ferentes não podem funcionar na mesma célula utilizando a mesma origem de replicação porque a regulação de um irá interferir com a replicação do outro Esses plasmídeos são considerados incompatíveis Quando um pesquisador dese ja introduzir dois ou mais plasmídeos diferentes em uma célula bacteriana cada plasmídeo deve ter uma origem de replicação diferente No laboratório os pequenos plasmídeos podem ser in troduzidos em células bacterianas em um processo chama do de transformação As células frequentemente E coli mas outras espécies bacterianas também são utilizadas e o DNA plasmidial são incubados juntos a 0C em uma solução de cloreto de cálcio e em seguida submetidos a choque térmico alterando rapidamente a temperatura para entre 37C e 43C Por motivos não muito bem compreendidos algumas das células tratadas desse modo captam o DNA plasmidial Algumas espécies de bactérias como o Acine tobacter baylyi são naturalmente competentes na capta ção do DNA e não necessitam de tratamento com cloreto de cálcio choque térmico Em um método alternativo as células incubadas com o DNA plasmidial são submetidas a um pulso elétrico de alta voltagem Esse método chamado de eletroporação torna a membrana bacteriana tempora riamente permeável a moléculas grandes Independente da abordagem relativamente poucas cé lulas captam o DNA plasmidial de modo que um método é necessário para identificar aquelas que o fazem A estra tégia é utilizar um dos dois tipos de genes no plasmídeo chamados de marcadores de seleção e triagem Os marca dores de seleção podem permitir tanto o crescimento de uma célula seleção positiva quanto matar a célula sele ção negativa sob um conjunto definido de condições O plasmídeo pBR322 fornece exemplos das seleções positiva e negativa Figura 94 Um marcador de triagem é um gene que codifica uma proteína que leva a célula a produzir uma molécula colorida ou fluorescente As células não são prejudicadas quando o gene está presente e as células que transportam o plasmídeo são facilmente identificadas pelas colônias coloridas ou fluorescentes que produzem A transformação de células bacterianas normais com DNA purificado processo pouco eficaz tornase menos bemsucedida com o aumento do tamanho do plasmídeo sendo difícil clonar segmentos de DNA maiores do que cer ca de 15000 pb quando os plasmídeos são utilizados como o vetor Para ilustrar a utilização de um plasmídeo como vetor de clonagem considere um gene bacteriano típico que codifi ca uma recombinase chamada de proteína RecA ver Capí tulo 25 Na maior parte das bactérias o gene que codifica RecA é um dos milhares de outros genes em um cromos Origem de replicação ori pBR322 4361 pb PvuII SalI BamHI EcoRI PstI Resistência à ampicilina AmpR Resistência à tetraciclina TetR FIGURA 93 O plasmídeo construído de E coli pBR322 Observe a lo calização de alguns importantes sítios de restrição para PstI EcoRI BamHI SalI e PvuII genes com resistência para ampicilina e tetraciclina e a origem de replicação ori Construído em 1977 este foi um dos plasmídeos expres samente projetados para clonagem em E coli Nelson6edbookindb 318 Nelson6edbookindb 318 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 319 somo com milhares de pares de bases de comprimento O gene recA tem um pouco mais de 1000 pb de comprimen to Um plasmídeo seria uma boa escolha para a clonagem de um gene desse tamanho Como descrito posteriormente o gene clonado pode ser modificado de vários modos e as variantes do gene podem ser expressas em níveis elevados para permitir a purificação da proteína codificada Cromossomos artificiais bacterianos Projetos de sequencia mento de grandes genomas frequentemente exigem a clo nagem de segmentos de DNA mais longos do que normal mente podem ser incorporados em vetores de clonagem plasmidiais padrão tais como o pBR322 Para atender a essa necessidade foram desenvolvidos vetores plasmidiais com características especiais que permitem a clonagem de segmentos muito longos normalmente de 100000 a 300000 pb de DNA Quando esses grandes segmentos de DNA clonado são adicionados esses vetores são suficien temente grandes para serem considerados cromossomos e são chamados de cromossomos artificiais bacterianos ou BAC Figura 95 Um vetor BAC sem qualquer DNA clonado inserido é um plasmídeo relativamente simples em geral não muito maior do que outros vetores plasmidiais Para acomodar segmentos de DNA clonado muito longos os vetores BAC têm origens estáveis de replicação que mantêm o plasmí deo em uma ou duas cópias por célula O baixo número de cópias é útil para a clonagem de grandes segmentos de DNA porque limita as oportunidades de reações de recom binação indesejadas que podem de modo imprevisto alte rar grandes DNAs clonados ao longo do tempo Os BACs também incluem genes par que codificam proteínas as quais direcionam a distribuição confiável de cromossomos recombinantes para as célulasfilhas na divisão celular au mentando assim a probabilidade de cada uma delas trans portar uma cópia mesmo quando algumas cópias estão pre sentes O vetor BAC inclui tanto os marcadores de seleção quanto os marcadores de triagem O vetor BAC mostrado na Figura 95 contém um gene que confere resistência ao antibiótico cloranfenicol Cm R A seleção positiva para ve tores contendo células ocorre em placas de ágar contendo esse antibiótico Um gene lacZ necessário para a produção da enzima bgalactosidase é um marcador de triagem ca paz de revelar as células que contêm os plasmídeos agora cromossomos que incorporam os segmentos de DNA clo nados A bgalactosidase catalisa a conversão da molécula incolor 5bromo4cloro3indolbDgalactopiranosídeo X gal a um produto azul Se o gene intacto for expresso a colônia que o contém será azul Se a expressão do gene é interrompida pela introdução de um segmento de DNA clo nado a colônia será branca Cromossomos artificiais de levedura Assim como no caso de E coli a genética de leveduras é uma área de conhecimento bem desenvolvida O genoma de Saccharomyces cerevi siae contém apenas 14 3 10 6 pb menos que quatro vezes o tamanho do cromossomo de E coli e sua sequência in teira é conhecida A levedura também é muito fácil de ser mantida e cultivada em larga escala em um laboratório Ve tores plasmidiais têm sido construídos para leveduras em pregando os mesmos princípios que se aplicam para o uso de vetores de E coli Métodos convenientes para mover o Endonuclease de restrição PstI Plasmídeos pBR322 ampR tetR DNA exógeno DNAligase Ágar contendo tetraciclina controle Colônias com plasmídeos recombinantes Plasmídeo incorporado Transformação de células de E coli Ágar contendo tetraciclina Ágar contendo ampicilina tetraciclina Todas as colônias têm plasmídeos Seleção de células transformadas Colônias transferidas para testagem ❶ ❷ ❸ ❹ ❺ O pBR322 é clivado no elemento ampR por PstI Os fragmentos de DNA clonados são ligados ao pBR322 clivado Onde a ligação é bemsucedida o elemento ampR é interrompido O elemento tetR permanece intacto Células de E coli são transformadas e então cultivadas em placas de ágar contendo tetraciclina para isolar as linhagens que incorporaram o plasmídeo Colônias individuais são transferidas para posições correspondentes em placas adicionais Uma placa contém tetraciclina a outra tetraciclina e ampicilina As células que crescem em tetraciclina mas não em tetraciclina ampicilina contêm plasmídeos recombinantes com resistência à ampicilina interrompida portanto o DNA exógeno Células com pBR322 mas sem DNA exógeno mantêm a resistência à ampicilina e crescem em ambas as placas FIGURA 94 Utilização do pBR322 para clonar DNA exógeno em E coli e identificar as células que o contêm Clonagem de plasmídeo Nelson6edbookindb 319 Nelson6edbookindb 319 020414 1845 020414 1845 320 DAVID L NELSON MICHAEL M COX DNA para dentro e para fora das células de levedura permi tem o estudo de muitos aspectos da bioquímica de células eucarióticas Alguns plasmídeos recombinantes incorporam múltiplas origens de replicação e outros elementos que lhes permitem ser utilizados em mais de uma espécie p ex em leveduras e em E coli Esses plasmídeos que podem ser propagados em células de duas ou mais espécies são chamados de vetores shuttle As pesquisas em grandes genomas e a necessidade as sociada de vetores de clonagem de alta capacidade leva ram ao desenvolvimento de cromossomos artificiais de levedura ou YAC Figura 96 Os vetores YAC contêm todos os elementos necessários para manter um cromos somo eucariótico no núcleo da levedura uma origem de replicação de levedura dois marcadores de seleção e se quências especializadas derivadas de telômeros e do cen trômero necessárias para a estabilidade e a segregação adequadas dos cromossomos na divisão celular ver Capí tulo 24 Na preparação para seu uso na clonagem o vetor é propagado como um plasmídeo bacteriano circular e en tão isolado e purificado A clivagem com endonuclease de restrição BamHI na Figura 96 remove um segmento do DNA entre duas sequências de telômeros TEL deixan do os telômeros nas extremidades do DNA linearizado A clivagem em outro sítio interno por EcoRI na Figura 96 divide o vetor em dois segmentos de DNA chamados de braços do vetor cada qual com um marcador de seleção diferente O DNA genômico a ser clonado é preparado por diges tão parcial com endonucleases de restrição para obter um tamanho de fragmento adequado Em seguida os frag mentos genômicos são separados por eletroforese em gel de campo pulsado uma variação da eletroforese em gel ver Figura 318 que separa os segmentos de DNA muito grandes Os fragmentos de DNA de tamanho ade quado até cerca de 2 3 10 6 pb são misturados com os braços do vetor preparado e ligados A mistura de ligação é então utilizada para transformar células prétratadas para degradar parcialmente suas paredes celulares com essas moléculas de DNA muito grandes que agora têm estru tura e tamanho para serem consideradas cromossomos de levedura A cultura em um meio que exige a presen ça de ambos os genes marcadores de seleção assegura o crescimento somente das células de levedura que contêm um cromossomo artificial com grande inserção colocada entre os dois braços do vetor Figura 96 A estabilidade dos clones YAC aumenta com o comprimento do segmen to de DNA clonado até certo ponto Aqueles contendo inserções com mais de 150000 pb são quase tão estáveis quanto cromossomos celulares normais ao passo que os com inserções de menos de 100000 pb de comprimento são gradativamente perdidos durante a mitose portanto em geral não existe nenhum clone de células de levedura carregando apenas as extremidades de dois vetores liga FIGURA 95 Cromossomos artificiais bacterianos BAC como veto res de clonagem O vetor é um plasmídeo relativamente simples com uma origem de replicação ori que direciona a replicação Os genes par derivados de um tipo de plasmídeo chamado de plasmídeo F auxiliam na distribuição dos plasmídeos para as célulasfilhas na divisão celular Isso aumenta a probabilidade de cada célulafilha carregar uma cópia do plas mídeo mesmo quando poucas cópias estão presentes O baixo número de cópias é útil na clonagem de grandes segmentos de DNA porque limita as oportunidades para que reações de recombinação indesejadas possam al terar de modo imprevisível grandes DNAs clonados ao longo do tempo O BAC inclui marcadores de seleção Um gene lacZ necessário à produção da enzima bgalactosidase se situa na região de clonagem de tal modo que ele é inativado pelas inserções de DNA clonado A introdução de BACs recom binantes nas células por eletroporação é promovida pelo de uso de células com uma parede celular alterada mais porosa Os DNAs recombinantes são triados para resistência ao antibiótico cloranfenicol Cm R As placas também contêm Xgal um substrato para bgalactosidase que gera um produto azul As colônias com bgalactosidase ativas e portanto nenhum DNA inserido no vetor BAC se tornam azuis as colônias sem atividade de bgalactosidase e portanto com o DNA desejado inserido são brancas CmR Vetor BAC ori Endonuclease de restrição DNAligase Grande fragmento de DNA com extremidades adesivas adequadas As colônias com BAC recombinante são brancas Ágar contendo cloranfenicol e Xgal Eletroporação BAC recombinante Seleção de células CmR Sítios de clonagem com lacZ Genes par de plasmídeo F Gene lacZ vermelho interrompido nenhuma bgalactosidase produzida Nelson6edbookindb 320 Nelson6edbookindb 320 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 321 dos juntos ou vetores com apenas inserções curtas Os YAC sem um telômero em cada uma das extremidades se degradam rapidamente Como acontece com os BACs os vetores YAC podem ser utilizados para clonar segmentos de DNA muito longos Além disso o DNA clonado em um YAC pode ser modifica do para o estudo de funções de sequências especializadas no metabolismo de cromossomos mecanismos de regula ção e expressão gênica e muitos outros problemas na biolo gia molecular eucariótica Genes clonados podem ser expressos para amplificar a produção de proteínas Frequentemente o produto de um gene clonado mais que o próprio gene é o interesse principal sobretudo quando a proteína tem valor comercial terapêutico ou de pesquisa Os bioquímicos utilizam proteínas purificadas para muitos fins incluindo a descoberta do seu funcionamento o estu do de mecanismos de reação a geração de anticorpos para as proteínas a reconstituição de atividades celulares com plexas no tubo de ensaio com componentes purificados e o exame de parceiros de ligação de proteínas Com uma com preensão maior sobre os fundamentos do DNA do RNA e do metabolismo proteico e sua regulação em um organismo hospedeiro como a E coli ou leveduras os pesquisadores manipulam células para expressar genes clonados a fim de estudar seus produtos proteicos O objetivo geral é modi ficar as sequências ao redor de um gene clonado para en ganar o organismo hospedeiro a fim de produzir o produto proteico do gene frequentemente em níveis muito eleva dos A superexpressão de uma proteína torna sua purifica ção subsequente muito mais fácil Como exemplo será utilizada a expressão de uma pro teína eucariótica em uma bactéria Os genes eucarióticos têm sequências circundantes necessárias para sua transcri ção e regulação nas células dos quais são derivados mas essas sequências não funcionam em bactérias Assim os genes eucarióticos não têm os elementos de sequência de DNA necessários para sua expressão controlada em célu las bacterianas promotores sequências que informam à RNApolimerase onde se ligar para iniciar a síntese de mRNA sítios de ligação de ribossomos sequências que permitem a tradução de mRNA para proteína e sequências regulatórias adicionais Portanto as sequências regulató rias bacterianas adequadas para a transcrição e tradução devem ser inseridas no DNA vetor nas posições corretas em relação ao gene eucariótico Em alguns casos genes clona dos são expressos de maneira tão eficiente que seus produ tos proteicos representam 10 ou mais da proteína celular Nessas concentrações algumas proteínas estranhas podem matar a célula hospedeira geralmente E coli portanto a expressão do gene clonado deve ser limitada a poucas horas antes da coleta das células Vetores de clonagem com sinais de transcrição e tra dução necessários à expressão regulada de um gene clo nado são chamados de vetores de expressão A taxa de expressão do gene clonado é controlada pela substituição do promotor normal e sequências regulatórias do gene por versões mais eficientes e convenientes fornecidas pelo ve tor Geralmente um promotor bem caracterizado e seus elementos regulatórios são posicionados próximos a vários sítios de restrição exclusivos para a clonagem de modo que Fragmentos de DNA genômico gerados por digestão incompleta por EcoRI EcoRI BamHI BamHI CEN ori Marcador de seleção Y TEL TEL Vetor YAC TEL X ori EcoRI CEN Y TEL ori CEN TEL X Y TEL Ligação YAC Transformação Parede celular digerida por enzimas Célula de levedura Esferoplasto de levedura Levedura com clone de YAC Marcador de seleção X A digestão por BamHI cria cromossomos lineares com extremidades teloméricas Selecionado para X e Y A digestão por EcoRI cria dois braços cada qual com um marcador de seleção X ou Y FIGURA 96 Construção de um cromossomo artificial de levedura YAC Um vetor YAC inclui uma origem de replicação ori um centrômero CEN dois telômeros TEL e marcadores de seleção X e Y A digestão por BamHI e EcoRI gera dois braços de DNA separados cada um com uma ex tremidade telomérica e um marcador de seleção Um grande segmento de DNA p ex até 2 3 10 6 pb de um genoma humano se liga aos dois braços para criar um cromossomo artificial de levedura O YAC transforma as células de levedura preparadas pela remoção da parede celular para formar esfe roplastos e as células são selecionadas para X e Y as células sobreviventes propagam as inserções de DNA Nelson6edbookindb 321 Nelson6edbookindb 321 020414 1845 020414 1845 322 DAVID L NELSON MICHAEL M COX genes inseridos nos sítios de restrição sejam expressos a partir desses elementos do promotor regulado Figura 97 Alguns desses vetores incorporam outras caracterís ticas tais como um sítio de ligação de ribossomos bacte rianos para potencializar a tradução do mRNA derivado do gene Capítulo 27 ou uma sequência de terminação da transcrição Capítulo 26 Muitos sistemas diferentes são utilizados para expressar proteínas recombinantes Todo organismo vivo tem a capacidade de expressar genes em seu DNA genômico portanto em princípio qualquer or ganismo pode ser um hospedeiro para expressar proteínas de espécies diferentes heterólogas De fato quase todos os tipos de organismos são utilizados para esse fim e cada tipo de hospedeiro tem um conjunto próprio de vantagens e desvantagens Bactérias As bactérias especialmente E coli são os hos pedeiros mais comuns para a expressão de proteínas As sequências regulatórias que determinam a expressão gêni ca em E coli e em muitas outras bactérias são bem com preendidas e podem ser aproveitadas para expressar pro teínas clonadas em níveis elevados As bactérias são fáceis de armazenar e cultivar em laboratório em meios de cultivo baratos Também existem métodos eficientes para colocar DNA em bactérias e extrair o DNA delas As bactérias podem ser cultivadas em grandes quantidades em fermentadores comerciais fornecendo uma rica fonte de proteínas clona das Entretanto existem problemas Quando expressas em bactérias algumas proteínas heterólogas não se dobram cor retamente e muitas não fazem as ligações covalentes ou a clivagem proteolítica necessárias à sua atividade Devido a certas características de uma sequência gênica dificilmente um gene específico também se expressa em bactérias Por exemplo regiões intrinsecamente desordenadas são mais comuns em proteínas eucarióticas Expressas em bactérias muitas proteínas eucarióticas se agregam em precipitados celulares insolúveis chamados de corpos de inclusão Por essas e muitas outras razões algumas proteínas eucarióti cas são inativas quando purificadas de bactérias ou não se expressam de modo algum Para ajudar a lidar com alguns desses problemas novas linhagens bacterianas hospedeiras são regularmente desenvolvidas para incluir melhorias como a presença de chaperonas proteicas eucarióticas ou enzimas que modifiquem as proteínas eucarióticas Há muitos sistemas especializados para expressar pro teínas em bactérias O promotor e as sequências regulató rias associadas ao óperon lactose ver Capítulo 28 são com frequência fusionados ao gene de interesse para direcio nar a transcrição O gene clonado será transcrito quando a lactose for adicionada ao meio de cultivo Entretanto a regulação no sistema lactose é frouxa ela não é desligada completamente quando a lactose está ausente problema potencial se o produto do gene clonado for tóxico para as células hospedeiras A transcrição a partir do promotor Lac também não é muito eficiente para algumas aplicações Um sistema alternativo utiliza um promotor e a RNApo limerase encontrada em um vírus bacteriano chamado de bacteriófago T7 Se o gene clonado for fusionado a um pro motor T7 ele não será transcrito pela RNApolimerase de E coli mas pela RNApolimerase T7 O gene que codifica essa polimerase é clonado separadamente na mesma célula em uma construção que proporciona uma regulação rigoro sa permitindo a produção controlada da RNApolimerase Sítio de ligação do ribossomo ori P O Polilinker Sequência de terminação da transcrição Marcador genético selecionável p ex resistência a antibióticos Sequências do promotor P e operador O bacteriano Gene codificando o repressor que se liga a O e regula P FIGURA 97 Sequências de DNA em um típico vetor de expressão de E coli O gene a ser expresso é inserido em um dos sítios de restrição no polilinker perto do promotor P com a extremidade do gene codifican do a terminação amina da proteína posicionada o mais perto possível do promotor O promotor permite a transcrição eficiente do gene inserido e a sequência de transcriçãoterminação algumas vezes aumenta a quantidade e a estabilidade do mRNA produzido O operador O permite a regulação por um repressor que se liga a ele O sítio de ligação do ribossomo fornece sinais de sequências para a tradução eficiente do mRNA derivado do gene O marcador selecionado permite a seleção de células contendo o DNA re combinante 97000 Mr 66000 45000 RecA 31000 Não induzido Induzido FIGURA 98 Expressão regulada da proteína RecA em uma célula bac teriana O gene que codifica a proteína RecA fusionado com o promotor T7 do bacteriófago é clonado em um vetor de expressão Em condições normais de crescimento não induzido nenhuma proteína RecA aparece Quando a RNApolimerase de T7 é induzida na célula o gene recA é expresso e grandes quantidades da proteína RecA são produzidas As posições dos marcadores de peso molecular padrão que correm no mesmo gel são indicadas Nelson6edbookindb 322 Nelson6edbookindb 322 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 323 T7 A polimerase também é muito eficiente e direciona ní veis elevados de expressão da maioria dos genes fusionados no promotor T7 Esse sistema é utilizado para expressar a proteína RecA em células bacterianas Figura 98 Leveduras A levedura Saccharomyces cerevisiae é prova velmente o organismo eucariótico mais bem compreendido e um dos mais fáceis de cultivar e manipular em laboratório Como as bactérias essa levedura pode crescer em meios simples e baratos A levedura tem paredes celulares resis tentes que são difíceis de romper para introduzir vetores de DNA assim as bactérias são mais convenientes para fa zer a maior parte da engenharia genética e manutenção de vetores É por isso que o vetor de leveduras foi propagado pela primeira vez em bactérias Existem vários excelentes vetores de transporte para esse fim Os princípios subjacentes à expressão de uma pro teína em leveduras são os mesmos daqueles em bactérias Os genes clonados devem ser ligados aos promotores que podem direcionar a expressão de alto nível em leveduras Por exemplo os genes da levedura GAL1 e GAL10 são re gulados pela célula de modo a serem expressos quando as células da levedura são cultivadas em meios com galactose mas desligados quando as células são cultivadas em glicose Assim se um gene heterólogo é expresso utilizando as mes mas sequências reguladoras a expressão desse gene pode ser controlada simplesmente pela escolha de um meio ade quado para o crescimento celular Alguns dos mesmos problemas que acompanham a ex pressão de proteínas em bactérias também ocorrem em leveduras Proteínas heterólogas podem não se dobrar cor retamente a levedura talvez não tenha as enzimas necessá rias para modificar as proteínas em suas formas ativas ou a expressão de proteínas pode ser dificultada por algumas características da sequência gênica Entretanto como o S cerevisiae é um eucarioto a expressão de genes eucarióti cos especialmente os genes de leveduras é algumas vezes mais eficiente nesse hospedeiro do que em bactérias O eno velamento e a modificação dos produtos também podem ser mais precisos do que nas proteínas expressas em bactérias Insetos e vírus de insetos Os baculovírus são vírus de insetos com genomas de DNA de cadeia dupla Ao infectarem larvas de insetos hospedeiras agem como parasitas matando as larvas e transformandoas em fábricas de produção de vírus No final do processo de infecção os vírus produzem grandes quantidades de duas proteínas p10 e poliedrina nenhuma das quais é necessária para a produção do vírus em células de inseto cultivadas Os genes para ambas as proteínas podem ser substituídos pelo gene de uma proteína heteróloga Quan do o vírus recombinante resultante é utilizado para infectar células ou larvas de insetos a proteína heteróloga é frequen temente produzida em níveis muito elevados até 25 do total de proteínas presentes no final do ciclo de infecção O nucleopoliedrovírus multicapsídeo Autographa ca lifornica AcMNPV é o baculovírus mais utilizado para a expressão de proteínas Ele tem um genoma grande de mais 134000 pb para a clonagem direta A purificação de vírus também é complicada Esses problemas foram resol vidos com a criação de bacmídeos DNA circulares gran des que incluem todo o genoma do baculovírus além das sequências que permitem a replicação do bacmídeo em E coli Figura 99 O gene de interesse é clonado em um plasmídeo menor e combinado com o plasmídeo maior por recombinação sítioespecífica in vivo ver Figura 2537 O bacmídeo recombinante é então isolado e transfectado para as células de insetos o termo transfecção é utiliza do quando o DNA utilizado para a transformação inclui se quências virais e leva à replicação viral seguido por uma recuperação da proteína assim que termina o ciclo de in fecção Uma grande variedade de sistemas de bacmídeos está disponível comercialmente Os sistemas de baculovírus não são bemsucedidos com todas as proteínas Entretanto com esses sistemas as células de insetos algumas vezes re plicam com sucesso os padrões de modificação de proteína de eucariotos superiores e produzem proteínas eucarióticas ativas corretamente modificadas Células de mamíferos em cultura O modo mais conveniente para se introduzir genes clonados em uma célula de mamí fero é por meio de vírus Esse método tem a vantagem de utilizar a capacidade natural de um vírus para inserir seu DNA ou RNA em uma célula e por vezes no cromossomo celular Diversos vírus de mamíferos geneticamente modifi cados estão disponíveis como vetores incluindo o adenoví rus e retrovírus humanos O gene de interesse é clonado de modo que a sua expressão seja controlada por um promotor do vírus O vírus utiliza seus mecanismos de infecção na turais para introduzir o genoma recombinante nas células onde se expressa a proteína clonada Esses sistemas têm a vantagem de as proteínas serem expressas transitoria mente se o DNA viral for mantido separadamente a partir do genoma da célula hospedeira e por fim degradado ou permanentemente se o DNA viral for integrado no genoma da célula hospedeira Com a escolha correta da célula hos pedeira a modificação póstradução adequada da proteína para sua forma ativa pode ser assegurada Entretanto o crescimento de células de mamíferos em culturas de teci dos é muito caro e essa tecnologia é geralmente utilizada para testar a função de uma proteína in vivo em vez de produzir uma proteína em grandes quantidades A alteração de genes clonados produz proteínas alteradas Técnicas de clonagem podem ser utilizadas não só para pro duzir mais proteínas mas para produzir produtos proteicos alterados sutilmente ou de forma drástica a partir de suas formas nativas Aminoácidos específicos podem ser substi tuídos individualmente por mutagênese sítiodireciona da Essa técnica melhorou substancialmente as pesquisas sobre proteínas ao permitir que os investigadores façam alterações específicas na estrutura primária e analisem os efeitos dessas alterações no enovelamento na estrutura tri dimensional e na atividade de proteínas Essa abordagem poderosa para estudar a estrutura e função das proteínas muda a sequência de aminoácidos pela alteração da se quência de DNA do gene clonado Se os sítios de restrição adequados se situam ao lado da sequência a ser alterada os pesquisadores podem simplesmente remover um segmento de DNA e substituílo por um sintético idêntico ao original exceto para a mudança desejada Figura 910a Nelson6edbookindb 323 Nelson6edbookindb 323 020414 1845 020414 1845 324 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Na ausência de sítios de restrição adequadamente loca lizados a mutagênese oligonucleotídeodirecionada pode criar uma alteração específica na sequência de DNA Figura 910b Duas cadeias de DNA curtas sintetizadas de modo complementar cada uma com a alteração de base desejada são renaturadas em cadeias opostas do gene clo nado dentro de um vetor de DNA circular adequado O mal pareamento de um único par de bases em 30 a 40 pb não im pede a renaturação Os dois oligonucleotídeos renaturados sintetizam o primeiro DNA em ambas as direções ao redor do vetor de plasmídeo criando duas fitas complementares que contêm a mutação Após vários ciclos de amplificação seletiva utilizando uma técnica chamada de reação em ca deia da polimerase PCR descrita na p 327 a mutação contendo o DNA predomina na população e pode ser utili zada para transformar bactérias A maior parte das bacté rias transformadas terá plasmídeos portadores da mutação Se necessário o molde do DNA do plasmídeo não mutante pode ser seletivamente eliminado por clivagem com a en zima de restrição Dpnl O plasmídeomolde geralmente isolado a partir de um tipo selvagem de E coli tem um resíduo A metilado em cada cópia do palíndromo de quatro nucleótidos GATC chamado de sítio dam ver Figura 25 21 O novo DNA contendo a mutação não tem resíduos A metilados porque a replicação é realizada in vitro A Dpnl cliva seletivamente o DNA na sequência GATC apenas se o resíduo A de uma ou ambas as cadeias for metilado isto é ela degrada apenas o molde No caso do gene recA bacteriano o produto desse gene a proteína RecA tem várias atividades ver Seção 253 Ela liga e forma uma estrutura filamentosa no DNA alinha dois DNAs de sequências semelhantes e hidrolisa o ATP Um resíduo de aminoácido especial na RecA polipeptídeo de 352 resíduos o resíduo Lys na posição 72 está envolvido na hidrólise do ATP Alterando o Lys 72 para uma Arg uma variante da proteína RecA é criada e irá ligar mas não hi drolisar o ATP Figura 910c A engenharia e a purificação dessa proteína variante RecA tem facilitado a investigação sobre os papéis da hidrólise do ATP no funcionamento des sa proteína Em genes podem ser introduzidas alterações que en volvem mais de um par de bases Grandes partes de um gene podem ser excluídas cortandose um segmento com endonucleases de restrição e ligando as porções remanes centes para formar um gene menor Por exemplo se uma proteína tiver dois domínios o segmento do gene que co difica um dos domínios pode ser removido para produzir uma proteína que agora tem apenas um dos dois originais FIGURA 99 Clonagem com baculovírus a Aqui é mostrada a constru ção de um vetor típico utilizado para a expressão de proteínas em baculoví rus O gene de interesse é clonado em um plasmídeo pequeno esquerda entre dois sítios att reconhecidos pela recombinase sítioespecífica sendo em seguida introduzido no vetor do baculovírus por recombinação sítio específica ver Figura 2537 Isso gera um produto de DNA circular utilizado para infectar as células de uma larva de inseto O gene de interesse é expres so durante o ciclo de infecção abaixo de um promotor que normalmente expressa uma proteína de revestimento de baculovírus em níveis muito ele vados b As fotografias mostram à esquerda uma larva de inseto infectada com o vetor do baculovírus recombinante expressando uma proteína que produz cor vermelha e à direita uma larva não infectada a b att att Plasmídeo pequeno Plasmídeo pequeno Plasmídeo pequeno Sítios de clonagem att att att att att att Genes de interesse Genes de interesse Células de insetos transfectadas Colheita de baculovírus recombinante Células de insetos transfectadas para produção de proteínas Larva infectada pelo vetor Larva tipo selvagem Baculovírus DNA Baculovírus DNA Baculovírus DNA Reação de recombinase Sequências de DNA necessárias para a manutenção do plasmídeo na bactéria Nelson6edbookindb 324 Nelson6edbookindb 324 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 325 Partes dos dois genes diferentes podem ser ligadas para criar novas combinações o produto desse gene fusiona do é chamado de proteína de fusão Pesquisadores têm métodos engenhosos para realizar praticamente qualquer alteração genética in vitro Após a reintrodução do DNA alterado na célula eles investigam as consequências dessa alteração Marcadores terminais fornecem instrumentos para a purificação por afinidade A cromatografia de afinidade é um dos métodos mais efi cientes para a purificação de proteínas ver Figura 317c Infelizmente muitas proteínas não se ligam a um ligan te que possa ser convenientemente imobilizado em uma matriz de coluna Entretanto o gene para quase todas as proteínas pode ser alterado para expressar uma proteína de fusão purificada por cromatografia de afinidade O gene que codifica a proteínaalvo é fusionado com um gene que codifica um peptídeo ou proteína que se liga a um ligante simples e estável com elevada afinidade e especificidade O peptídeo ou proteína utilizado para essa finalidade é deno minado marcador As sequências dos marcadores são adi cionadas a genes de tal modo que as proteínas resultantes tenham marcadores em seu grupo amino ou carboxila ter minal A Tabela 93 lista alguns dos peptídeos ou proteínas comumente utilizados como marcadores TABELA 93 Caudas proteicas comumente usadas Marcadores proteicos peptídicos Massa molecular kDa Ligante imobilizado Proteína A 59 Porção Fc da IgG His6 08 Ni 21 GlutationaStransfera se GST 26 Glutationa Proteína ligante de maltose 41 Maltose bGalactosidase 116 pAminofenilbDtio galactosídeo TPEG Domínio ligante de quitina 57 Quitina X Mutante recA K72R c Vetor recombinante Mutação X X X X X X X Plasmídeo Gene Sítioalvo para a mutação Plasmídeo mutado com fitas cortadas Oligonucleotídeos iniciadores T C C C C C C G C G G A Tipo selvagem de recA A A A A T T T T C C C C C C G C G G A A T T T C G C a Mutagênese sítiodirecionada b Mutagênese oligonucleotídeodirecionada Clivagem com endonuclease de restrição Inserção de segmento de DNA sintético contendo a mutação Desnaturação e renaturação de oligonucleotídeos iniciadores com a mutação Utilização de DNApolimerase para ampliar e incorporar os oligonucleotídeos iniciadores mutagênicos Digestão de DNAmolde parental não mutado com nuclease metilaçãoespecífica e renaturação de fitas recémsintetizadas Transformação para dsDNA nas células As células reparam os cortes no plasmídeo mutado FIGURA 910 Duas abordagens para a mutagênese sítiodirecionada a Um segmento sintético de DNA substitui um frag mento removido por uma endonuclease de restrição b Um par de oligonucleotídeos sin téticos e complementares com uma mudança de sequência específica em uma posição é hibridizado a um plasmídeo cir cular com uma cópia clonada do gene que será alterado Os oligonucleo tídeos mutados atuam como iniciadores para a síntese de todo o compri mento da cópia de DNA duplex do plasmídeo que contém a mudança de sequência específica Essas cópias de plasmídeos são então utilizadas para transformar as células c Resultados de um sequenciador automatizado ver Figura 834 mostrando as sequências de um tipo selvagem de gene recA superior e um gene recA alterado inferior com o triplo códon na posição 72 alterado de AAA para CGC especificando um Arg R em vez de um resíduo Lys K Nelson6edbookindb 325 Nelson6edbookindb 325 020414 1845 020414 1845 326 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O procedimento geral pode ser ilustrado focalizando um sistema que utiliza a glutationaStransferase GST Figu ra 911 A GST é uma pequena enzima Mr 26000 que se liga fortemente e de modo específico à glutationa Quando a sequência do gene de GST é fusionada ao genealvo a pro teína de fusão adquire a capacidade de se ligar à glutationa A proteína de fusão é expressa em um organismo hospedei ro tal como uma bactéria e um extrato bruto é preparado Uma coluna é preenchida com matriz porosa que consiste em um ligante glutationa imobilizado por esferas microscópicas de um polímero reticulado estável como a agarose À medi da que o extrato bruto se infiltra por essa matriz a proteína de fusão é imobilizada por sua ligação à glutationa As outras proteínas no extrato são lavadas e descartadas da coluna A interação entre GST e glutationa é firme porém não covalen te permitindo que a proteína de fusão seja eluída suavemente da coluna com uma solução que contém alta concentração de sais ou de glutationa livre para competir com o ligante imo bilizado pela ligação com a GST A proteína de fusão é obtida muitas vezes com boa produção e alta pureza Em alguns sis temas disponíveis comercialmente o marcador pode ser re movido em grande parte ou totalmente da proteína de fusão purificada por uma protease que cliva uma sequência próxima da junção entre a proteínaalvo e seu marcador Um marcador mais curto com ampla aplicação consiste em uma sequência simples de seis ou mais resíduos His Es ses marcadores de histidina ou marcadores His se ligam de FIGURA 911 Utilização de proteínas marcadas na purificação de proteí nas a A glutationaStransferase GST é uma pequena enzima que liga a gluta tiona resíduo de glutamato no qual um dipeptídeo CysGly se liga ao carbono da carboxila da cadeia lateral de Glu daí sua abreviação GSH b O marcador de GST se fusiona ao terminal carboxila da pro teína por meio de engenharia genética A proteína marcada expressa na célula está presente no extrato bruto quando as células são lisadas O extrato é submetido à cromatografia de afinidade ver Figura 317c por uma matriz com glutationa imobilizada A proteína marcada com GST se liga à glutationa retardando sua migração pela coluna enquanto as ou tras proteínas são lavadas rapidamente Depois a proteína marcada é eluída com uma solução contendo uma concentra ção elevada de sal ou livre de glutationa gGluCysGly Transcrição Gene para proteínaalvo Gene para proteína de fusão Expressão da proteína de fusão na célula Preparação de extrato celular contendo proteínas de fusão como parte da mistura proteica celular Gene para GST a b Glutationa GSH GlutationaStransferase GST Proteínas de fusão são eluídas pela solução de glutationa A mistura proteica é adicionada à coluna A solução livre de glutationa é adicionada à coluna Bomba 4 5 6 7 8 9 8 9 Outras proteínas passam pela coluna Bomba 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 A glutationa no meio se liga ao marcador de GST Marcador de GST Nelson6edbookindb 326 Nelson6edbookindb 326 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 327 modo firme e especificamente aos íons de níquel A matriz da cromatografia com íons de Ni 21 imobilizados pode ser utilizada para separar rapidamente uma proteína marcada com His de outras proteínas no extrato Alguns dos marca dores maiores como a proteína de ligação de maltose pro porcionam estabilidade e solubilidade adicionais permitin do a purificação de proteínas clonadas que de outro modo seriam inativas em consequência de um enovelamento ina dequado ou insolubilidade A cromatografia de afinidade utilizando marcadores ter minais é um método poderoso e conveniente Os marcado res têm sido utilizados com sucesso em milhares de estu dos publicados em muitos casos seria impossível purificar e estudar a proteína sem o marcador Entretanto mesmo os marcadores muito pequenos afetam as propriedades das proteínas ligadas a eles de modo a influenciar os resultados do estudo Por exemplo um marcador pode afetar adver samente o enovelamento de proteínas Mesmo se o marca dor for removido por uma protease um ou alguns resíduos de aminoácidos adicionais ficam por trás da proteínaalvo afetando ou não a atividade da proteína Os tipos de experi mentos a serem realizados e os resultados obtidos a partir deles devem ser sempre avaliados com o auxílio de contro les bem desenhados para avaliar o efeito de um marcador no funcionamento de uma proteína As sequências gênicas podem ser amplificadas com a reação em cadeia da polimerase Os projetos do genoma mundial geram bancos de dados in ternacionais que contêm as sequências genômicas comple tas de centenas de organismos e proporcionam um acesso sem precedentes à informação da sequência gênica Essa por sua vez simplifica o processo de clonagem de genes in dividuais para análises mais detalhadas Se a sequência de pelo menos porções da extremidade de um segmento de DNA de interesse é conhecida o número de cópias do seg mento de DNA pode ser muito amplificado com a reação em cadeia da polimerase PCR processo concebido por Kary Mullis em 1983 O DNA amplificado pode então ser clonado por métodos descritos anteriormente ou pode ser utilizado em vários procedimentos analíticos O procedimento de PCR tem uma simplicidade elegante Baseiase em DNApolimerases que sintetizam fitas de DNA a partir de desoxirribonucleotídeos utilizando um molde de DNA Capítulo 25 Todas as DNApolimerases sintetizam DNA na direção 59S 39 ver Figura 833a Além disso as DNApolimerases não sintetizam DNA novo mas ao con trário devem adicionar nucleotídeos a fitas preexistentes denominadas oligonucleotídeos iniciadores primers Dois oligonucleotídeos sintéticos são preparados complementares às sequências em fitas opostas ao DNAalvo em posições que definem as extremidades do segmento a ser amplificado Os oligonucleotídeos servem como iniciadores de replicação que podem ser estendidos por uma DNApolimerase As extremi dades 39 dos iniciadores hibridizados são orientadas uma para a outra e posicionadas para a síntese do DNA pelo segmento de DNA Figura 912a A PCR básica necessita de quatro componentes uma amostra de DNA contendo o segmento a ser amplificado o par de oligonucleotídeos iniciadores sinté ticos desoxinucleotídeos trifosfatos dNTPs e DNApolime rase A mistura de reação é aquecida brevemente para desna turar o DNA separando as duas fitas A mistura é resfriada de modo a que os oligonucleotídeos iniciadores possam renatu rar com o DNA A concentração elevada de oligonucleotídeos iniciadores aumenta a probabilidade de renaturação com cada fita do DNA desnaturado antes que as duas fitas de DNA presentes em concentração muito menor possam renaturar entre si O segmento é em seguida replicado seletivamente pela DNApolimerase utilizando o conjunto de dNTPs O ci clo de aquecimento resfriamento e replicação é repetido 25 a 30 vezes em algumas horas em um processo automatizado amplificando o segmento de DNA entre os oligonucleotídeos iniciadores até que ele possa ser rapidamente analisado ou clonado Cada ciclo multiplica a quantidade de segmento de DNA por um fator de 2 de modo que a concentração do DNA cresça exponencialmente Após 20 ciclos o segmento de DNA foi amplificado mais de um milhão de vezes 2 20 após 30 ciclos mais de um bilhão de vezes Todo o DNA restante na amostra permanece sem amplificação A PCR utiliza uma DNApolimerase termoestável que se mantém ativa após cada etapa de aquecimento e não precisa ser reabastecida Por meio de um desenho cuidadoso dos oligonucleo tídeos iniciadores utilizados para a PCR o segmento am plificado pode ser modificado pela inclusão em cada ex tremidade de DNA adicional que não está presente no cromossomoalvo Por exemplo sítios de clivagem para en donucleases de restrição podem ser incluídos para facilitar a posterior clonagem do DNA amplificado Figura 912b Essa tecnologia é muito sensível a PCR pode detectar e amplificar tão pouco quanto uma molécula de DNA em quase todo tipo de amostra A estrutura em duplahélice do DNA torna a molécula altamente estável e de fato o DNA se degrada lentamente ao longo do tempo ver Capítulo 8 Entretanto a PCR permitiu a clonagem bemsucedida de segmentos de DNA raros e não degradados de amostras de mais de 40000 anos Os pesquisadores utilizaram a técnica para clonar fragmentos de DNA dos restos mumificados de seres humanos e animais extintos como o mamute criando os novos campos da arqueologia e paleontologia molecular O DNA de locais de sepultamento foi amplificado por PCR e utilizado para rastrear migrações de humanos antigos Epidemiologistas podem utilizar amostras de DNA de rema nescentes humanos potencializadas por PCR para rastrear a evolução de vírus patogênicos humanos Assim além da sua utilidade para a clonagem de DNA a PCR é uma fer ramenta poderosa na medicina forense Quadro 91 Ela pode ser utilizada para detectar infecções virais antes que provoquem sintomas A PCR é uma ferramenta importante para o aconselhamento genético de potenciais pais de famí lia com condições genéticas hereditárias importantes Dada a extrema sensibilidade dos métodos de PCR a contaminação de amostras se constitui em um sério pro blema Em muitas aplicações incluindo os testes de DNA forense e de arqueologia as amostras controle asseguram que o DNA amplificado não seja derivado do pesquisador ou de bactérias contaminantes Muitas adaptações especializadas de PCR aumentaram a utilidade do método Por exemplo as sequências no RNA podem ser amplificadas se o primeiro ciclo de PCR utilizar Nelson6edbookindb 327 Nelson6edbookindb 327 020414 1845 020414 1845 328 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 39 59 Região do DNAalvo que será amplificada 39 39 59 59 59 59 39 59 39 59 39 59 a 59 59 59GAATTC 59GAATTC CTTAAG59 CTTAAG59 Replicação PCR Endonuclease EcoRI 59GAATTC GAAT T C 39 CT TAAG59 39C T TAAG AATTC G CTTAA G b ❶ ❷ Aquecimento para separar as fitas ❶ Anelamento dos oligonucleotídeos iniciadores contendo regiões não complementares com sítio de clivagem para endonuclease de restrição ❷ ➌ A síntese do DNA etapa ❸ é catalisada pela DNApoli merase termoestável ainda presente Aquecimento para separar as fitas Adição de oligonucleotídeos iniciadores sintéticos resfriamento Adição de Taq DNApolimerase termoestável para catalisar a síntese do DNA 5 3 Repetição das etapas ❶ e ❷ Repetição das etapas de ❶ até ❸ Após 20 ciclos a sequênciaalvo foi amplificada em cerca de 106 vezes Clonagem por inserção em um sítio de EcoRI em um vetor de clonagem FIGURA 912 Amplificação de um segmento de DNA pela reação em cadeia da polimerase PCR a O procedimento de PCR tem três etapas As fitas de DNA são ➊ separadas pelo calor em seguida ➋ renaturadas em um excesso de iniciadores de DNA sintético curto cor de laranja que ficam ao lado da região que será amplificada azulescuro ➌ um DNA novo é sin tetizado pela polimerização catalisada pela DNApolimerase As três etapas se repetem por 25 a 30 ciclos A Taq DNApolimerase termoestável de Ther mus aquaticus espécie de bactéria que cresce em fontes termais não é des naturada pelas etapas de calor b O DNA amplificado por PCR pode ser clonado Os oligonucleotídeos iniciadores podem incluir extremidades não complementares que tenham um sítio para clivagem por uma endonuclea se de restrição Embora essas partes dos oligonucleotídeos iniciadores não se anelem ao DNAalvo o processo de PCR os incorpora no DNA que é amplifi cado A clivagem dos fragmentos amplificados nesses sítios cria as extremi dades adesivas utilizadas na ligação do DNA amplificado com o vetor de clonagem Reação em cadeia da polimerase Nelson6edbookindb 328 Nelson6edbookindb 328 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 329 QUADRO 91 MÉTODOS Poderosa ferramenta na medicina legal Um dos métodos mais precisos para a colocação de um indivíduo na cena de um crime é a impressão digital O advento da tecnologia do DNA recombinante disponi bilizou uma ferramenta muito mais poderosa a geno tipagem de DNA também chamada de DNA finger printing ou perfis de DNA O método se baseia nos polimorfismos da sequência diferenças sutis na se quência entre os indivíduos um em cada 1000 pb em média O uso dessas diferenças para identificação foren se foi descrito pela primeira vez pelo geneticista inglês Alec Jeffreys em 1985 Cada diferença em relação ao protótipo de sequência do genoma humano o primeiro obtido ocorre em alguma fração na população humana cada pessoa tem algumas diferenças em relação a esse protótipo O trabalho forense moderno concentrase em diferenças nos comprimentos das sequências repetições curtas em tandem STR A STR é uma sequência de DNA curta repetida muitas vezes em tandem em um local es pecífico em um cromossomo geralmente a sequência repetida tem 4 pb de comprimento Os loci STR mais frequentemente utilizados na genotipagem de DNA são curtos 4 a 50 repetições de comprimento 16 a 200 pb para repetições de tetranucleotídeos e têm múltiplas variantes de comprimento na população humana Mais de 20000 loci STR de tetranucleotídeos foram caracteriza dos e mais de um milhão de STR de todos os tipos podem estar presentes no genoma humano o que representa cerca de 3 de todo o DNA humano Continua na próxima página FIGURA Q1 a Os loci STR podem ser analisados por PCR Oligonucleo tídeos iniciadores adequados com um corante ligado para auxiliar na detecção subsequente são direcionados para sequências em cada lado da STR e a região entre eles é amplificada Normalmente os indivíduos possuem dois alelos diferentes em um determinado locus cada um her dado de um dos pais Se as sequências STR possuem comprimentos dife rentes nos dois cromossomos de um indivíduo resultarão dois produtos de PCR de comprimentos diferentes b São mostrados os produtos de PCR a partir da amplificação do loci 16 STR submetidos à eletroforese ca pilar em um gel de poliacrilamida Determinados loci são marcados com oligonucleotídeos iniciadores marcados com apenas um de três corantes fluorescentes diferentes seis loci com um corante verde cinco com um corante azul e cinco com um amarelo corados aqui com uma tinta preta para visualização A determinação de qual locus corresponde a qual si nal depende da cor do corante fluorescente ligado ao oligonucleotídeo iniciador usado no processo e da variação de tamanho no qual o sinal aparece a variação de tamanho pode ser controlada pelas sequências mais próximas ou mais distantes da STR que são marcadas pelos oligonu cleotídeos iniciadores designados Fragmentos de PCR submetidos ao gel de capilaridade Rastreamento de produtos de PCR derivados do locus D75820 a b 16plex 105 pb 1800 1200 600 0 175 pb 245 pb 315 pb 385 pb Amplificação por PCR Submete fragmentos de PCR a eletroforese capilar em gel Locus D7S820 Alelo 2 Alelo 1 Sequências STR Oligonucleotídeo iniciador para PCR marcado com corante 39 59 39 59 Nelson6edbookindb 329 Nelson6edbookindb 329 020414 1845 020414 1845 330 DAVID L NELSON MICHAEL M COX QUADRO 91 MÉTODOS Poderosa ferramenta na medicina legal Continuação O comprimento de uma STR particular em um indivíduo específico pode ser determinado com o auxílio da reação em cadeia da polimerase ver Figura 912 O uso de PCR também torna o procedimento sensível o suficiente para ser aplicado a amostras muito pequenas de DNA recolhidas muitas vezes em cenas de crime As sequências de DNA que acompanham as STR são exclusivas para cada locus STR e idênticas exceto para mutações extremamente raras em todos os humanos Os oligonucleotídeos iniciadores da PCR são direcionados para esse DNA que acompanha a STR e são projetados para amplificar o DNA ao longo da STR Figura Q1a O comprimento do produto da PCR portanto refle te o comprimento da STR nessa amostra Como cada ser humano herda um cromossomo de cada par de cromosso mos de cada progenitor os comprimentos de STR nos dois cromossomos são frequentemente diferentes gerando dois comprimentos de STR diferentes a partir de um indivíduo Os produtos de PCR são submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida muito fino em um tubo capilar As bandas resultantes são convertidas em um conjunto de picos que revelam com precisão o tamanho de cada fragmento de PCR e assim o comprimento da STR no alelo correspondente A análise de múltiplos loci STR pode produzir um perfil exclu sivo para um indivíduo Figura Q1b Isso normalmente é realizado com um kit disponível comercialmente que inclui oligonucleotídeos iniciadores de PCR únicos para cada lo cus ligados a corantes coloridos para ajudar a distinguir os diferentes produtos de PCR A amplificação por PCR permi te aos investigadores obter genótipos de STR de menos de 1 ng de DNA parcialmente degradado quantidade que pode ser obtida a partir de um único folículo piloso uma gota de sangue uma pequena amostra de sêmen ou amostras com meses ou até mesmo vários anos de idade Quando bons genótipos de STR são obtidos a possibilidade de erros de identificação é inferior a 1 em 10 18 quintilhão A utilização forense bemsucedida da análise de STR necessitou de padronização conseguida pela primeira vez no Reino Unido em 1995 O padrão dos EUA Com bined DNA Index System CODIS sistema combinado do índice do DNA criado em 1998 baseiase em 13 loci STR bem estudados que devem estar presentes em qualquer experimento de tipagem de DNA realizado nos Estados Unidos Tabela Q1 O gene amelogenina tam bém é utilizado como marcador nas análises Presente em cromossomos sexuais humanos esse gene tem um comprimento um pouco diferente nos cromossomos X e Y Assim a amplificação por PCR por meio desse gene gera produtos de diferentes tamanhos que revelam o sexo do doador de DNA Até o início de 2010 o banco de dados CODIS continha mais de 7 milhões de genótipos de STR e tinha auxiliado mais de 100000 investigações forenses A genotipagem de DNA é utilizada tanto para condenar ou para absolver suspeitos e para estabelecer a paterni dade com um extraordinário grau de certeza O impacto desses procedimentos em casos de tribunal continuará a crescer à medida que os padrões forem aprimorados e os bancos de dados internacionais de genotipagem STR aumentarem Mesmo casos misteriosos muito antigos po derão ser resolvidos Em 1996 o fingerprinting de DNA ajudou a confirmar a identificação dos ossos do último czar russo e de sua família que foram assassinados em 1918 TABELA Q1 Propriedades dos loci utilizados para o banco de dados CODIS Locus Cromossomo Motivo de repetição Comprimento da repetição média Número de alelos observados CSF1PO 5 TAGA 516 20 FGA 4 CTTT 122512 80 TH01 11 TCAT 314 20 TPOX 2 GAAT 416 15 VWA 12 TCTGTCTA 1025 28 D3S1358 3 TCTGTCTA 821 24 D5S818 5 AGAT 718 15 D7S820 7 GATA 516 30 D8S1179 8 TCTATCTG 720 17 D13S317 13 TATC 516 17 D16S539 16 GATA 516 19 D18S51 18 AGAA 7392 51 D21S11 21 TCTATCTG 12412 82 Amelogenin X Y Não aplicado Fonte Adaptado a partir de Butter JM 2005 Forensic DNA Typing 2nd edn Academic Press San Diego p 96 Comprimentos repetidos observados na população humana As repetições parciais ou imperfeitas podem ser incluídas em alguns alelos Número de diferentes alelos observados desde 2005 na população humana A análise cuidadosa de um locus em vários indivíduos é um prérequisito para seu uso na tipagem forense do DNA A amelogenina é um gene de tamanho levemente diferente no cromossomo X e Y utilizado para estabelecer o gênero Nelson6edbookindb 330 Nelson6edbookindb 330 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 331 a transcriptase reversa uma enzima que funciona como uma DNApolimerase ver Figura 833a mas utiliza o RNA como molde Figura 912 Após a síntese da fita de DNA a partir do molde de RNA os ciclos restantes podem ser fei tos com DNApolimerases utilizando protocolos padrão de PCR Essa PCR pela transcriptase reversa RTPCR pode ser utilizada por exemplo para detectar sequências derivadas de células vivas que fazem a transcrição de seu DNA em RNA em oposição a tecidos mortos Protocolos de PCR também podem ser quantitativos para estimar o número de cópias relativas a sequências es pecíficas em uma amostra O método é chamado de PCR quantitativa ou qPCR Se uma sequência de DNA estiver presente em quantidades maiores que as habituais em uma amostra por exemplo se alguns genes são amplificados em células tumorais a qPCR pode revelar o aumento da representação daquela sequência Em resumo a PCR é rea lizada na presença de uma sonda que emite um sinal fluo rescente quando o produto de PCR está presente Figura 913 Se a sequência de interesse está presente em níveis mais elevados do que em outras sequências na amostra o sinal de PCR irá atingir um limiar predeterminado mais rá pido A PCR de transcriptase reversa e a PCR em tempo real podem ser combinadas para determinar as concentra ções relativas de uma molécula específica de RNA em uma célula em diferentes condições ambientais Finalmente a PCR facilitou o desenvolvimento de no vos procedimentos poderosos de sequenciamento de DNA como será visto RESUMO 91 Estudo dos genes e seus produtos c A clonagem do DNA e a engenharia genética envolvem a clivagem do DNA e o conjunto de segmentos de DNA em novas combinações DNA recombinante c A clonagem envolve cortar o DNA em fragmentos com enzimas selecionar e possivelmente modificar um frag mento de interesse inserir o fragmento de DNA em um vetor de clonagem adequado transferir o vetor com o DNA inserido em uma célula hospedeira para a repli cação e identificar e selecionar células que contêm o fragmento de DNA c Enzimas essenciais na clonagem gênica incluem endo nucleases de restrição especialmente as enzimas tipo II e a DNAligase c Vetores de clonagem incluem plasmídeos e para as in serções de DNA mais longas cromossomos artificiais de bactérias BAC e cromossomos artificiais de leveduras YAC c Técnicas de engenharia genética manipulam células para expressar eou alterar genes clonados c As proteínas ou peptídeos podem se ligar a uma pro teína de interesse alterando o seu gene clonado crian do uma proteína de fusão Os segmentos de peptídeos adicionais podem ser utilizados para detectar a proteína ou purificála utilizando métodos de cromatografia de afinidade convenientes c A reação em cadeia da polimerase PCR permite a amplificação de segmentos escolhidos de DNA ou RNA para estudo detalhado ou clonagem 92 Utilização de métodos com base no DNA para a compreensão das funções das proteínas A função das proteínas pode ser descrita em três níveis A função fenotípica descreve os efeitos de uma proteína em todo o organismo Por exemplo a perda de proteínas pode levar a um crescimento mais lento do organismo a uma alteração no padrão de desenvolvimento ou até mesmo O sinal do fluoróforo é suprimido quando a sonda forma um grampo semiestável A sonda se liga preferencialmente ao DNAalvo o fluoróforo é separado da molécula supressora e o sinal fluorescente aumenta b a 0 0 2 20 40 Número de ciclos de PCR Fluoróforo Sonda DNAalvo Molécula supressora Limite Linha de base Não molde Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Fase exponencial Platô CT Sinal unidades arbitrárias 1 FIGURA 913 PCR quantitativa A PCR pode ser utilizada quantitativa mente monitorandose cuidadosamente o progresso da amplificação da PCR e determinando quando um segmento de DNA foi amplificado para um nível limite específico a A quantidade de produto de PCR presente é determinada medindose o nível de uma sonda fluorescente ligada a um oli gonucleotídeo repórter complementar ao segmento de DNA que está sendo amplificado A fluorescência da sonda não é detectada inicialmente porque um supressor de fluorescência é ligado ao mesmo nucleotídeo Quando o oligonucleotídeo repórter se pareia com seu complemento em uma cópia do segmento de DNA amplificado o fluoróforo se separa da molécula supressora e a fluorescência aparece b À medida que prossegue a reação de PCR a quantidade de segmento de DNAalvo aumenta exponencialmente e o sinal fluorescente também aumenta exponencialmente à medida que as sondas de oligonucleotídeos se ligam aos segmentos amplificados Após vários ci clos de PCR o sinal alcança um platô à medida que um ou mais componentes da reação se extinguem Quando um segmento está presente em quanti dades maiores em uma amostra do que em outra sua amplificação atinge um limiar predefinido A linha Não molde segue o lento aumento no sinal de fundo observado em um controle que não inclui uma amostra de DNA adicionada CT é o número de ciclos no qual o limiar é ultrapassado primeiro Nelson6edbookindb 331 Nelson6edbookindb 331 020414 1845 020414 1845 332 DAVID L NELSON MICHAEL M COX à morte do organismo A função celular é a descrição de uma rede de interações em que as proteínas participam no nível celular A identificação de interações com outras pro teínas na célula pode ajudar a definir os tipos de processos metabólicos nos quais a proteína participa Finalmente a função molecular referese à atividade bioquímica precisa de uma proteína incluindo detalhes como as reações que uma enzima catalisa ou os ligantes que ligam a um receptor O desafio de compreender as funções de milhares de pro teínas não caracterizadas ou mal caracterizadas encontra das em uma célula comum originou uma grande variedade de técnicas Os métodos com base no DNA são uma contri buição fundamental para esse esforço e fornecem informa ções em todos os três níveis Bibliotecas de DNA são catálogos especializados de informação genética Uma biblioteca de DNA é uma coleção de clones de DNA reunidos para fins de sequenciamento do genoma desco berta de genes ou a determinação da função de um gene proteína A biblioteca pode ter diversas formas dependen do da fonte de DNA e do propósito final da biblioteca A maior é uma biblioteca genômica produzida quando o genoma completo de um organismo é clivado em milhares de fragmentos Todos os fragmentos são clo nados por inserção de cada fragmento em um vetor de clonagem Isso cria uma mistura complexa de vetores recombinantes cada um com um fragmento clonado di ferente A primeira etapa é a digestão parcial do DNA por endonucleases de restrição de forma que qualquer sequência apareça em fragmentos em um número limita do de tamanhos uma faixa de tamanhos compatível com o vetor de clonagem para assegurar que praticamente todas as sequências estejam representadas entre os clo nes na biblioteca Os fragmentos muito grandes ou muito pequenos para a clonagem são removidos por centrifuga ção ou eletroforese O vetor de clonagem como BAC ou YAC é clivado com a mesma endonuclease de restrição utilizada para digerir o DNA e ligado aos fragmentos de DNA genômico A mistura de DNA ligado é então utilizada para transformar células bacterianas ou de leveduras para produzir uma biblioteca de células cada qual abrigando uma molécula diferente de DNA recombinante Idealmen te todo o DNA no genoma em estudo é representado na biblioteca Cada célula bacteriana ou de levedura cresce em uma colônia ou clone de células idênticas cada célu la com o mesmo plasmídeo recombinante um dos muitos representados na biblioteca total Os esforços para definir a função de um gene ou pro teína muitas vezes se utilizam de bibliotecas mais espe cializadas Um exemplo é uma biblioteca que inclui ape nas as sequências de DNA expressas isto é transcritas em um RNA em determinado organismo ou mesmo em apenas algumas células ou tecidos Essa biblioteca não tem o DNA não codificante que faz parte de grande par te de muitos genomas eucarióticos Em primeiro lugar o pesquisador extrai o mRNA de um organismo ou de cé lulas específicas de um organismo e em seguida prepa ra os DNA complementares cDNA Essa reação em múltiplas etapas mostrada na Figura 914 depende da transcriptase reversa que sintetiza DNA a partir de um molde de RNA Os fragmentos de DNA de cadeia dupla resultante são inseridos num vetor adequado e clonados criando uma população de clones chamada de biblio teca de cDNA O aparecimento de um gene para uma determinada proteína nessa biblioteca implica que ele é expresso nas células e sob as condições utilizadas para gerar a biblioteca 59 A A A A A A A A A A A A A A A A T T T T T T T T A A A A A A A A T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T mRNA 59 39 59 Híbrido de mRNADNA 39 39 59 39 A transcriptase reversa e o dNTP produzem uma fita de DNA complementar O mRNA é degradado com álcalis Para iniciar a síntese de uma segunda fita um oligonucleotídeo de sequência conhecida frequen temente se liga à extremidade 39 de cDNA A A A A A A A A T T T T T T T T 59 DNA duplo 39 A DNApolimerase I e o dNTP estendem o oligonucleotídeo iniciador para produzir o DNA de fita dupla O molde de mRNA é anelado ao oligonucleotídeo iniciador sintético oligo dT FIGURA 914 Construindo uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA O conteúdo total de mRNA de uma célula inclui os transcritos de milhares de genes e os cDNAs gerados desse mRNA são correspondente mente heterogêneos A transcriptase reversa pode sintetizar DNA em um molde de RNA ou DNA ver Figura 2632 Para iniciar a síntese da segunda fita de DNA os oligonucleotídeos de sequência conhecida se ligam à extre midade 39 da primeira fita e o cDNA de fita dupla então produzido é clonado em um plasmídeo Nelson6edbookindb 332 Nelson6edbookindb 332 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 333 Sequências ou relações estruturais fornecem informações sobre a função das proteínas Uma razão importante para se sequenciar muitos genomas é fornecer um banco de dados capaz de atribuir funções de genes por comparações do genoma empreendimento conhecido como genômica comparativa Algumas vezes um gene recémdescoberto é relatado por homologias de sequências de um gene previamente estudado em outra ou na mesma espécie e a sua função pode ser total ou parcial mente definida por essa relação Os genes que ocorrem em espécies diferentes mas têm uma sequência e uma relação funcional clara entre si são chamados ortólogos Genes com relações semelhantes entre si dentro de uma única es pécie são chamados de parálogos Se a função de um gene foi caracterizada para uma espécie essa informação pode ser utilizada para ao menos atribuir provisoriamente a fun ção do gene para o ortólogo encontrado em uma segunda espécie A correlação é mais fácil de ser realizada quando se comparam genomas de espécies com relativa proximidade como camundongos e humanos embora muitos genes clara mente ortólogos tenham sido identificados em espécies tão distantes quanto as bactérias e os seres humanos Algumas vezes até mesmo a ordem dos genes em um cromossomo é conservada ao longo de grandes segmentos de genomas de espécies estreitamente relacionadas Figura 915 A ordem gênica conservada chamada sintenia fornece evi dência adicional para uma relação ortóloga entre genes em locais idênticos dentro dos segmentos relacionados Alternativamente algumas sequências associadas a determinados motivos estruturais Capítulo 4 podem ser identificadas em uma proteína A presença de um motivo estrutural pode ajudar a definir a função molecular suge rindo que uma proteína por exemplo catalisa a hidrólise de ATP ligase ao DNA ou forma um complexo com íons de zinco Essas relações são determinadas com a ajuda de pro gramas de computador sofisticados limitados apenas pela informação atual sobre a estrutura do gene e da proteína e pela capacidade para associar sequências com motivos es truturais determinados Proteínas de fusão e imunofluorescência podem localizar proteínas em células Muitas vezes uma pista importante para a função de um pro duto gênico surge pela determinação de sua localização no interior da célula Por exemplo uma proteína que se encontra exclusivamente no núcleo pode estar envolvida em processos exclusivos dessa organela tais como transcrição replicação ou condensação da cromatina Com frequência pesquisado res modificam geneticamente proteínas de fusão com a fina lidade de localizar uma proteína na célula ou organismo Al gumas das fusões mais úteis envolvem a ligação de proteínas marcadoras que permitem ao investigador determinar a lo calização por visualização direta ou por imunofluorescência Um marcador particularmente útil é a proteína flu orescente verde GFP Um genealvo que codifica a proteína de interesse fusionado ao gene de GFP gera uma proteína de fusão altamente fluorescente ela literalmente acende quando exposta à luz azul e pode ser visualizada diretamente em uma célula viva A GFP é uma proteína de rivada da águaviva Aequorea victoria ver Quadro 123 Figura 1 Ela tem estrutura em barril b e o fluoróforo o componente fluorescente da proteína está no centro do barril Figura 916a O fluoróforo é derivado de um rear ranjo e oxidação de vários resíduos de aminoácidos Como essa reação é autocatalítica e não exige outras proteínas ou outros cofatores além do oxigênio molecular ver Quadro 123 Figura 3 a GFP é prontamente clonada em uma for ma ativa em quase todas as células Apenas algumas molé culas dessa proteína podem ser observadas ao microscópio permitindo o estudo de sua localização e movimentos em uma célula Uma cuidadosa modificação genética da pro teína associada ao isolamento de proteínas fluorescentes relacionadas provenientes de outros celenterados mari nhos disponibilizou uma ampla variedade dessas proteínas em um conjunto de cores Figura 916b e outras carac terísticas brilho estabilidade Com essa tecnologia por exemplo a proteína GLR1 receptor de glutamato do tecido nervoso foi visualizada como proteína de fusão GLR1GFP no nematódeo Caenorhabditis elegans Figura 916c Em muitos casos a visualização de uma proteína de fu são GFP em uma célula viva real não é possível prática ou desejável A proteína de fusão GFP pode estar inativa ou pode não ser expressa em níveis suficientes para permitir a visualização Nesse caso a imunofluorescência é um método alternativo para a visualização da proteína endó gena inalterada Esse método requer a fixação e por tanto a morte da célula A proteína de interesse é algu mas vezes expressa como uma proteína de fusão com um marcador de epítopo sequência proteica curta que se liga firmemente a um anticorpo bem caracterizado e dispo nível comercialmente As moléculas fluorescentes fluoro cromos estão ligadas a esse anticorpo Mais comumente a proteínaalvo permanece inalterada Essa proteína está ligada por um anticorpo que é específico para ela Em se guida um segundo anticorpo é adicionado e se liga espe cificamente ao primeiro e é o segundo anticorpo que tem os fluorocromos ligados Figura 917a Uma varia ção desse método de visualização indireta é ligar moléculas de biotina ao primeiro anticorpo e em seguida adicionar estreptavidina proteína bacteriana intimamente relaciona Cromossomo 2 de camundongo Epb72 Psmb7 Dnm Lmx1b Cdk9 Stxbp1 Ak1 Lcn2 Cromossomo 9 humano EPB72 PSMB7 DNM1 LMX1B CDK9 STXBP1 AK1 LCN2 FIGURA 915 Sintenia em genomas humanos e de camundongos Segmentos grandes dos dois genomas têm genes intimamente relaciona dos alinhados na mesma ordem nos cromossomos Nos segmentos curtos do cromossomo 9 humano e no cromossomo 2 de camundongo os genes exibem alto grau de homologia assim como a mesma ordem no gene Os di ferentes esquemas de letras para os nomes dos genes simplesmente refletem as diferentes convenções de nomenclatura nas duas espécies Nelson6edbookindb 333 Nelson6edbookindb 333 020414 1845 020414 1845 334 DAVID L NELSON MICHAEL M COX da à avidina proteína que se liga à biotina ver Tabela 51 complexada com fluorocromos A interação entre a biotina e a estreptavidina é uma das interações mais fortes e mais específicas conhecidas e o potencial para adicionar múlti plos fluorocromos para cada proteínaalvo confere a esse método uma grande sensibilidade Bibliotecas de cDNA altamente especializadas Figura 914 podem ser feitas por clonagem de cDNA ou de frag mentos de cDNA em um vetor que se fusiona a cada se quência de cDNA com a sequência para um marcador cha mado de gene repórter O gene fusionado é frequentemente chamado de construtor repórter Por exemplo todos os genes na biblioteca podem ser fusionados com o gene da GFP Figura 918 Cada célula na biblioteca expressa um desses genes fusionados A localização celular do produto de qualquer gene representado na biblioteca será revelada em forma de focos de luz em células que expressam o gene fusionado adequado em níveis suficientes supondose que o gene mantenha a sua função e localização normal Interações proteínaproteína ajudam a elucidar a função de proteínas Outra chave para definir a função de uma proteína especí fica é determinar o quê se liga a essa proteína No caso de interações proteínaproteína a associação de uma proteína b c Cabeça Cauda Dorsal Ventral a FIGURA 916 Proteína fluorescente verde GFP a A proteína GFP PDB ID 1GFL derivada da águaviva Aequorea victoria tem estrutura em barril b o fluoróforo apresentado como modelo de volume atômico é o centro do barril b Variantes de GFP estão disponíveis atualmente em quase todas as cores do espectro visível c Uma proteína de fusão GLR1GFP tem brilho fluorescente verde brilhante no verme nematódeo Caenorhabditis ele gans à esquerda A GLR1 é um receptor de glutamato do tecido nervoso gotas de gordura autofluorescente se colorem falsamente de magenta As membranas das células de E coli à direita são coradas com corante fluo rescente vermelho As células estão expressando uma proteína que se liga a um plasmídeo residente fusionado com GFP Os pontos verdes indicam as posições dos plasmídeos FIGURA 917 Imunofluorescência indireta a A proteína de interesse se liga ao anticorpo primário e um anticorpo secundário é adicionado este segundo anticorpo com um ou mais grupos fluorescentes ligados se liga ao primeiro Múltiplos anticorpos secundários podem se ligar ao anticorpo pri mário amplificando o sinal Se a proteína de interesse está no interior de uma célula a célula é fixada e permeabilizada e os dois anticorpos são adiciona dos em sucessão b O resultado final é uma imagem na qual os pontos bri lhantes indicam a localização da proteína ou proteínas de interesse na célula As imagens mostram um núcleo de um fibroblasto humano sucessivamente corado com anticorpos e marcadores fluorescentes para DNApolimerase para PCNA importante proteína acessória da polimerase e para bromodeso xiuridina BrdU análogo de nucleotídeo A BrdU adicionada como um breve pulso identifica as regiões de replicação ativa de DNA Os padrões de colora ção mostram que a DNApolimerase e o PCNA se colocalizam em regiões de síntese de DNA ativa Uma dessas regiões é visível no quadro branco a b DNApolimerase e PCNA Proteína de interesse Anticorpo primário Anticorpo secundário Corante fluorescente BrdU Fusão de DNApolimerase e e PCNA Nelson6edbookindb 334 Nelson6edbookindb 334 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 335 de função desconhecida àquela cuja função é conhecida pode fornecer uma culpa por associação útil e atraente As técnicas utilizadas nesse esforço são bastante variadas Purificação de complexos de proteínas Com a construção de bibliotecas de cDNA em que cada gene é fusionado a um marcador de epítopo os investigadores podem precipitar o produto proteico de um gene por meio de sua complexação com o anticorpo que se liga ao epítopo processo denominado imunoprecipitação Figura 919 Se a proteína marcada é expressa em células outras proteínas que se ligam a ela também precipitam com ela A identificação de proteínas associadas revela algumas das interações proteínaproteína da proteína marcada Há muitas variações desse processo Por exemplo um extrato bruto de células que expressa uma proteína marcada é adicionado a uma coluna contendo anti corpos imobilizados ver na Figura 317c uma descrição de cromatografia de afinidade A proteína marcada se liga ao anticorpo e às vezes proteínas que interagem com a pro teína marcada também são retidas na coluna A conexão entre a proteína e o marcador é clivada com uma protease específica e os complexos de proteínas são eluídos a partir da coluna e analisados Os pesquisadores utilizam esses mé todos para definir redes complexas de interações no interior de uma célula Em princípio o método cromatográfico para analisar interações proteínaproteína é utilizado com qual quer tipo de marcador de proteína marcador His GST etc que possa ser imobilizado em meio cromatográfico adequado A seletividade desse método foi potencializada com os marcadores de purificação por afinidade em tandem TAP Dois marcadores consecutivos são fusionados a uma proteínaalvo e a proteína de fusão é expressa em uma célula Figura 920 O primeiro marcador é a proteína A encontrada na superfície da bactéria Staphylococcus aureus que se liga firmemente à imunoglobulina G IgG de mamíferos O segundo marcador é frequentemente um peptídeo de ligação de calmodulina Um extrato bruto con tendo a proteína de fusão marcadora de TAP é passado por uma matriz de coluna com anticorpos IgG fixados que se ligam à proteína A A maior parte das proteínas celula res não ligadas é lavada pela coluna mas as proteínas que normalmente interagem com a proteínaalvo na célula são retidas O primeiro marcador é então clivado a partir da proteína de fusão com uma protease altamente específica a protease TEV e a proteínaalvo de fusão encurtada e quais quer outras proteínas associadas de modo não covalente à proteínaalvo são eluídas na coluna O eluente então passa por uma segunda coluna contendo uma matriz com calmo dulina fixada que liga o segundo marcador Proteínas liga das frouxamente voltam a ser lavadas ao longo da coluna Após a clivagem do segundo marcador a proteínaalvo é eluída ao longo da coluna com suas proteínas associadas As duas etapas de purificação consecutivas eliminam todos os contaminantes fracamente ligados Falsospositivos são minimizados e as interações proteicas que persistem em ambas as etapas podem ser funcionalmente significativas Análise de duploshídridos em leveduras Um método genético sofisticado para definir interações proteínaproteína se ba seia nas propriedades da proteína Gal4 Gal4p ver Figura 2830 que ativa a transcrição de genes GAL em genes de leveduras que codificam as enzimas do metabolismo da ga lactose A Gal4p tem dois domínios um que se liga a uma sequência específica de DNA e outro que ativa a RNApoli merase para sintetizar mRNA a partir de um gene adjacente Transcrição Construto repórter GFP Promotor cDNA FIGURA 918 Bibliotecas especializadas de DNA A clonagem de um cDNA próximo ao gene de GFP cria um construto repórter A transcrição prossegue por meio do gene de interesse o cDNA inserido e o gene repór ter aqui o de GFP e o transcrito de mRNA é expresso como uma proteína de fusão Parte da proteína GFP é visível ao microscópio com fluorescência Embora seja mostrado apenas um exemplo milhares de genes podem ser fusionados com GFP em construtos similares e armazenados em bibliotecas nas quais cada célula ou organismo na biblioteca expressa uma proteína diferente fusionada à GFP Se a proteína de fusão é adequadamente expressa sua localização na célula ou organismo pode ser avaliada A fotografia mostra um nematódeo contendo uma proteína de fusão GFP expressa apenas nos quatro neurônios de toque que percorrem o comprimento do seu corpo Expressão de proteína marcada na célula Precipitação de proteína marcada com anticorpo específico Separação de proteínas precipitadas Identificação de novas proteínas no imunoprecipitado Produção do extrato celular Transcrição Marcador de epítopo Promotor cDNA Imunoprecipitado Marcadores de tamanho Proteína marcada pura Imunoprecipitado FIGURA 919 O uso de marcadores de epítopos para estudar inte rações proteínaproteína O gene de interesse é clonado próximo a um gene para um marcador de epítopo e a proteína de fusão resultante é pre cipitada por anticorpos para o epítopo Todas as outras proteínas que intera gem com a proteína marcada também precipitam contribuindo assim para elucidar as interações proteínaproteína Nelson6edbookindb 335 Nelson6edbookindb 335 020414 1845 020414 1845 336 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os dois domínios de Gal4p são estáveis quando separados mas a ativação da RNApolimerase exige a interação com o domínio de ativação que por sua vez necessita de posicio namento próximo do domínio de ligação do DNA Assim os domínios devem ser reunidos para funcionar corretamente Na análise de duplohíbrido em leveduras as regiões codificadoras de proteínas gênicas analisadas são fusiona das ao gene da levedura tanto ao domínio de ligação do DNA quanto ao domínio de ativação de Gal4p e os genes resul tantes expressam várias proteínas de fusão Figura 921 Se uma proteína fusionada ao domínio de ligação do DNA in terage com uma proteína fusionada ao domínio de ativação a transcrição é ativada O gene repórter transcrito por essa ativação é geralmente o que produz uma proteína necessária para o cultivo ou uma enzima que catalisa uma reação com um produto colorido Desse modo quando cultivadas em meio adequado as células que contêm um par de proteínas em interação são facilmente distinguidas das células que não o têm Uma biblioteca pode ser configurada com uma linha gem de levedura específica na qual cada célula na biblioteca tem um gene fusionado com o gene do domínio de ligação do DNA de Gal4p e muitos desses genes estão representados na Proteínas que não interagem com a solução eluída alvo Clivagem da proteína A pela protease TEV O extrato de células passa pela primeira coluna de afinidade de IgG que se liga ao marcador de proteína A Solução eluída com proteínas ligadas frouxamente A proteínaalvo é eluída A solução eluída passa pela coluna de afinidade com calmodulina Solução eluída de proteínaalvo com excesso de calmodulina Marcadores TAP Sítio de clivagem da protease TEV Peptídeo ligador de calmodulina Proteína alvo Proteína A Extrato bruto de células contendo as proteínas que interagem com a proteínaalvo Protease TEV Grânulos de IgG Grânulos de IgG Grânulos de calmodulina Complexos proteicos eluídos FIGURA 920 Marcadores por purificação de afinidade em tandem TAP Uma proteína marcada com TAP e proteínas associadas são isoladas por duas purificações de afinidade consecutivas conforme descrito no texto Gene repórter Sítio de ligação de Gal4P Domínio de ativação 4P Transcrição aumentada Gene repórter a Proteína Y Linhagem 1 de levedura com fusões com o domínio de ligação de DNAGal4P Linhagem 2 de levedura com fusões com o domínio de ativação de Gal4P b Acasalamento para produzir células diploides Sequenciamento das proteínas de fusão para identificar as proteínas que estão interagindo Colônias sobreviventes Semeadura em meio que necessita de interação entre os domínios de ligação e ativação para sobrevivência da célula Domínio de ligação DNAGal4P Proteína X RNApolimerase FIGURA 921 Análise de duplohíbrido em leveduras a O objetivo é reunir o domínio de ligação do DNA e o domínio de ativação da proteína de levedura Gal4 Gal4p pela interação de duas proteínas X e Y à qual um dos domínios se funde Esta interação é acompanhada pela expressão de um gene repórter b As duas fusões de genes são criadas em linhagens de leveduras separadas sendo então colocadas para reproduzir A mistura que sofre repro dução é semeada em um meio em que as leveduras não podem sobreviver a menos que o gene repórter seja expresso Assim todas as colônias sobrevi ventes têm proteínas de fusão interagindo O sequenciamento das proteínas de fusão nas colônias sobreviventes revela quais proteínas estão interagindo Nelson6edbookindb 336 Nelson6edbookindb 336 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 337 biblioteca Em uma segunda linhagem de leveduras um gene de interesse é fusionado com o gene para o domínio de ativa ção de Gal4p As linhagens de leveduras são reproduzidas e as células diploides individuais são cultivadas em colônias As únicas células que crescem no meio seletivo e produzem a cor adequada são aquelas em que o gene de interesse está liga do a um parceiro permitindo a transcrição do gene repórter Isso permite a triagem em larga escala de proteínas celulares que interagem com a proteínaalvo A proteína de interação fusionada com o domínio de ligação do DNA de Gal4p pre sente em uma determinada colônia selecionada pode ser ra pidamente identificada por sequenciamento de DNA do gene da proteína de fusão Alguns resultados falsos positivos ocor rem devido à formação de complexos multiproteicos Essas técnicas para a determinação da localização ce lular e interações moleculares fornecem pistas importan tes para a função da proteína Entretanto elas não subs tituem a bioquímica clássica Simplesmente fornecem aos pesquisadores um acesso rápido a novos e importantes problemas biológicos Quando combinadas às ferramentas da bioquímica e biologia molecular em evolução simultâ nea as técnicas descritas aqui aceleram a descoberta não apenas de novas proteínas mas de novos processos e me canismos biológicos Microarranjos de DNA revelam padrões de expressão de RNA e outras informações Os principais refinamentos posteriores da tecnologia de bi bliotecas de DNA a PCR e a hibridização se uniram no de senvolvimento de microarranjos de DNA que permitem a triagem rápida e simultânea de muitos milhares de genes Segmentos de DNA de genes de sequências conhecidas com algumas dezenas de centenas de pares de bases de compri mento são amplificados por PCR Dispositivos robóticos então depositam quantidades precisas de nanolitros de so luções de DNA sobre uma superfície sólida de poucos centí metros quadrados em um arranjo predefinido com cada um dos milhares de pontos contendo sequências derivadas de um determinado gene Uma estratégia alternativa e cada vez mais comum para a síntese de DNA diretamente sobre uma superfície sólida utiliza a fotolitografia Figura 922 O ar ranjo resultante muitas vezes chamado de um chip pode incluir sequências derivadas de cada gene de um genoma G G G G C C C C C C C C C C G G G A A A A A A C G T A G G T A G C C G C G C C T G ➊ ➌ ➌ ➋ Superfície sólida Programação das sequências desejadas Luz Luz 1 2 3 4 Tela opaca sobre os pontos 1 2 e 3 Tela opaca sobre os pontos 1 e 3 Muito mais ciclos Solução contendo C C ativado G G G G G G G A ➋ Solução contendo G G ativado A A A A A A A A A A ➌ ➋ Luz Tela opaca sobre os pontos 2 e 4 Solução contendo A A ativada A G G A FIGURA 922 Fotolitografia para criar um microarranjo de DNA ➊ Um computador é programado com as sequências de oligonucleotídeos de sejadas ➋ Os grupos reativos ligados a uma superfície sólida são inicialmen te inativados pelos grupos de bloqueio fotoativos que podem ser removidos por um flash de luz Uma tela opaca bloqueia a luz de algumas áreas da su perfície impedindo sua ativação Outras áreas ou pontos são expostos ➌ Uma solução contendo um nucleotídeo ativado p ex A é lavada sobre os pontos O grupo 59hidroxila do nucleotídeo é bloqueado para impedir rea ções indesejadas e o nucleotídeo se liga aos grupos de superfície em pontos apropriados sobre seu grupo 39hidroxila A superfície é lavada sucessiva mente com soluções contendo cada nucleotídeo ativado remanescente G C T Os grupos bloqueadores 59 em cada nucleotídeo limitam as reações à adição de um nucleotídeo por vez e esses grupos também podem ser removidos pela luz Quando cada ponto tem um nucleotídeo um segundo nucleotídeo pode ser adicionado para ampliar o nucleotídeo nascente em cada ponto utilizando telas e luz para assegurar que serão adicionados os nucleotídeos em cada ponto da sequência correta Este processo continua até que as sequências necessárias sejam construídas em cada um dos milha res de pontos no microarranjo do DNA Nelson6edbookindb 337 Nelson6edbookindb 337 020414 1845 020414 1845 338 DAVID L NELSON MICHAEL M COX bacteriano ou de levedura ou de famílias de genes selecio nados a partir de um genoma maior Quando construído o microarranjo pode ser sondado com mRNA ou cDNA a partir de um determinado tipo celular ou cultura de células para identificar os genes que são expressos nessas células Um microarranjo pode fornecer um panorama de todos os genes de um organismo informando ao pesquisador sobre os genes expressos em determinada fase do desenvolvimen to de um organismo ou em um conjunto particular de condi ções ambientais Por exemplo o complemento total de mRNA pode ser isolado a partir de células em duas fases diferentes de desenvolvimento e convertido a cDNA com transcriptase reversa Desoxirribonucleotídeos marcados por fluorescência podem ser utilizados para tornar uma amostra de cDNA fluo rescente vermelha e outra verde Figura 923 O cDNA das duas amostras é misturado e utilizado para fazer uma sonda no microarranjo Cada cDNA se anela em um único ponto no microarranjo correspondendo ao gene que codifica o mRNA que deu origem ao cDNA Pontos que apresentam fluorescên cia verde representam genes que produzem mRNA em níveis mais elevados em um estágio de desenvolvimento aqueles que apresentam fluorescência vermelha representam genes expressos em níveis mais elevados em outra fase Se um gene produz mRNA em igual abundância em ambas as fases de de senvolvimento o ponto correspondente apresenta fluorescên cia amarela Utilizando uma mistura de duas amostras para medir a abundância de sequências relativa e não absoluta o método corrige as variações na quantidade de DNA original mente depositado em cada ponto do gráfico bem como outras possíveis inconsistências entre pontos no microarranjo Os pontos que apresentam fluorescência fornecem um panorama de todos os genes expressos nas células no momento em que foram colhidos expressão gênica examinada em uma esca la do genoma total Para um gene de função desconhecida o tempo e as circunstâncias da sua expressão podem fornecer pistas importantes sobre o seu papel na célula Essas tecno logias também revelam a expressão de muitos tipos de RNA especializados tais como microRNA miRNA Capítulo 26 e RNA de interferência pequenos siRNA Capítulo 28 Um exemplo dessa técnica é ilustrado na Figura 924 que mostra os resultados impressionantes produzidos pelos experimentos de microarranjos Os segmentos de cada um dos cerca de 6500 genes no genoma de leveduras comple tamente sequenciado foram amplificados separadamente por PCR e cada segmento foi depositado em um padrão definido para criar o microarranjo Em certo sentido esse arranjo fornece uma visão instantânea do panorama do fun cionamento da totalidade do genoma da levedura em um conjunto de condições RESUMO 92 Utilização de métodos com base no DNA para a compreensão das funções das proteínas c As proteínas são estudadas no nível da função fenotípi ca celular ou molecular c As bibliotecas de DNA são um prelúdio para muitos ti pos de investigações que produzem informação sobre a função de proteínas c Fusionando um gene de interesse com os genes que co dificam a proteína fluorescente verde ou marcadores de epítopos os pesquisadores podem visualizar a localiza ção celular do produto gênico tanto diretamente quan to por meio de imunofluorescência c As interações de uma proteína com outras proteínas ou com o RNA podem ser investigadas por meio de marca FIGURA 923 Experimento com microarranjo de DNA Um microarran jo pode ser preparado a partir de qualquer sequência conhecida de DNA de qualquer fonte Quando o DNA se liga a um suporte sólido outros ácidos nucleicos marcados com fluorescência podem servir como sondas para o microarranjo Aqui amostras de mRNA foi retiradas de células de um sapo em dois estágios diferentes de desenvolvimento Isolamento de mRNA a partir de células em dois estágios de desenvolvimento cada amostra de mRNA representa todos os genes expressos nas células nesse estágio Conversão de mRNA em cDNA pela transcriptase reversa utilizando desoxirri bonucleotídeos trifosfatos marcados com fluorescência Adição de cDNA ao microarranjo cDNA fluorescente se anela em sequências complementares no microarranjo Cada ponto fluorescente representa um gene expresso na célula mRNA Girino Óvulo fertilizado cDNA Microarranjo de DNA Expressão mais elevada em um único estágio celular em verde Expressão mais elevada no estágio de girino em vermelho Expressão não modificada em amarelo Transcriptase reversa Remoção de cDNA não hibridizado Nelson6edbookindb 338 Nelson6edbookindb 338 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 339 dores de epítopos e imunoprecipitação ou cromatogra fia de afinidade A análise de duplohíbrido de levedura fornece sondas de interações moleculares in vivo c Os microarranjos podem revelar padrões de expressão gênica que se alteram em resposta a estímulos estágio de desenvolvimento ou condições celulares 93 Genômica e história da humanidade Os métodos de sequenciamento de DNA descritos no Capí tulo 8 levaram às primeiras sequências genômicas completas de espécies bacterianas na década de 1990 Duas sequências do genoma humano completo surgiram em 2001 Uma delas foi gerada por um esforço de financiamento público liderado inicialmente por James Watson e posteriormente por Francis Collins Em paralelo esforços privados foram liderados por Craig Venter Essas conquistas se refletiram em mais de uma década de intensos esforços coordenados em dezenas de la boratórios ao redor do mundo e foram apenas o começo Os bancos de dados de sequências de DNA contêm agora as se quências genômicas completas de milhares de organismos de todos os tipos Só agora esses vastos recursos de informação começam a ser compilados de modo eficaz O sequenciamento genômico é auxiliado por novas gerações de métodos de sequenciamento de DNA As tecnologias de sequenciamento de DNA continuam a evoluir Um genoma humano completo pode agora ser se quenciado em um ou dois dias e um genoma bacteriano em poucas horas O dia em que a sequência genômica de um indivíduo se tornar parte rotineira do registro médico de uma pessoa está próximo Quadro 92 Esses avan ços se tornaram possíveis com métodos chamados de se quenciamento de última geração ou nextgen Às vezes a estratégia de sequenciamento é semelhante ou bastante diferente da utilizada no método de Sanger descrito no Ca pítulo 8 As inovações permitiram uma miniaturização do procedimento um grande aumento na escala e uma dimi nuição correspondente no custo Uma sequência genômica é gerada em várias etapas Primeiro as sequências genômicas são quebradas em locais aleatórios por cisalhamento para gerar fragmentos de algu mas centenas de pares de bases de comprimento Os oligo nucleotídeos sintéticos são ligados às extremidades de todos os fragmentos fornecendo um ponto de referência conhe cido em cada molécula de DNA Os fragmentos individuais são então imobilizados em uma superfície sólida e cada um é amplificado utilizandose a PCR Figura 912 A superfí cie sólida é parte de um canal que permite que as soluções líquidas possam fluir sobre as amostras O resultado é uma superfície sólida de apenas alguns centímetros com milhões de grupamentos de DNA ligados cada grupo contendo múl tiplas cópias de uma única sequência de DNA derivada de um ou de outro fragmento de DNA genômico aleatório A eficiência é decorrente do sequenciamento de todos esses milhões de grupamentos ao mesmo tempo com os dados de cada grupo capturados e armazenados em um computador Dois sequenciadores de última geração amplamente utilizados empregam diferentes estratégias para realizar as reações de sequenciamento Um deles o sequenciamento 454 os números se referem a um código utilizado na fase de desenvolvimento da tecnologia e não têm significado científico utiliza uma estratégia chamada de pirossequen ciamento na qual a adição de nucleotídeos é detectada com flashes de luz Figura 925 Os quatro desoxinucleosíde os trifosfato inalterados são pulsados para a superfície de reação um de cada vez em uma sequência de repetição A solução de nucleotídeos fica retida na superfície apenas o tempo suficiente para que a DNApolimerase possa adicio nar esses nucleotídeos em qualquer grupo em que eles se jam complementares à próxima basemolde na sequência O excesso de nucleotídeos é destruído rapidamente pela en FIGURA 924 Imagem ampliada de um microarranjo de DNA Cada ponto brilhante contém o DNA dos cerca de 6500 genes do genoma de levedura S cerevisiae com cada gene representado no arranjo As sondas do microarranjo são os ácidos nucleicos marcados com fluorescência deriva dos de mRNA obtidos nas células em crescimento nos meios de cultura em verde e 5 horas após o início da formação dos esporos em vermelho Os pontos verdes representam os genes expressos em níveis elevados durante o crescimento os pontos vermelhos os genes expressos em níveis elevados durante a esporulação Os pontos amarelos representam os genes que não mudam seu nível de expressão durante a esporulação Esta imagem está au mentada na verdade o microarranjo mede apenas 18 3 18 cm Francis S Collins J Craig Venter Nelson6edbookindb 339 Nelson6edbookindb 339 020414 1845 020414 1845 340 DAVID L NELSON MICHAEL M COX zima apirase antes que o próximo nucleotídeo pulse Quan do um nucleotídeo específico é adicionado com sucesso às cadeias de um agrupamento o pirofosfato é liberado como um supbroduto Outra enzima na solução que banha a su perfície é a sulfurilase que converte o pirofosfato em ATP O aparecimento do ATP fornece por fim o sinal de que um nucleotídeo foi adicionado ao DNA Também estão pre sentes no meio a enzima denominada luciferase e uma mo lécula do substrato a luciferina a luciferase é a enzima que gera o flash de luz produzido por vagalumes ver Quadro 131 Quando o ATP é gerado a luciferase catalisa uma rea ção com a luciferina que resulta em um pequeno flash de luz Quando muitos flashes pequenos ocorrem em um gru po a luz emitida pode ser gravada em uma imagem captura da Por exemplo quando o dCTP é adicionado à solução os flashes irão ocorrer apenas nos grupos onde G está presente no molde e C é o próximo nucleotídeo a ser adicionado à cadeia de DNA em formação Se houver uma fita de 2 3 ou 4 QUADRO 92 MEDICINA Medicina genômica personalizada Os gêmeos californianos Noah e Alexis Beery nasceram com sintomas de paralisia cerebral Os tratamentos não surtiram efeito Insatisfeitos com o diagnóstico e o trata mento os pais dos gêmeos Joe e Retta os levaram com a idade de 5 anos a um especialista em Michigan que os diagnosticou com uma rara condição genética chamada de distonia responsiva à DOPA Um regime de tratamento suprimiu com sucesso os sintomas e permitiu que os gê meos levassem uma vida normal Entretanto aos 12 anos Alexis desenvolveu tosse severa e dificuldades para res pirar que novamente pareciam ameaçar a vida da menina Em um episódio os paramédicos tiveram que reanimála duas vezes Os sintomas não pareciam estar relacionados à distonia Seria Noah o próximo Frustrados e profun damente preocupados os pais dos gêmeos procuraram o sequenciamento completo do genoma tanto de Noah quanto de Alexis Essa decisão aparentemente incomum foi natural para a família Beery Joe era o presidente da Life Technologies desenvolvedores de tecnologias de sequenciamentos em uso por muitos grandes centros de sequenciamento de DNA Os casos de Noah e Alexis fo ram assumidos por Matthew Bainbridge e sua equipe no Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center em Houston Texas Os resultados mostraramse decisivos Os gêmeos apresentavam mutações em seus genomas que produziram não somente uma deficiência na DOPA mas também uma deficiência potencial na pro dução do hormônio serotonina Um pequeno ajuste na te rapia de Alexis lhe proporcionou o fim dos sintomas que colocavam sua vida em risco e o mesmo tratamento foi oferecido ao seu irmão Os dois irmãos agora levam uma vida normal O primeiro projeto de sequenciamento do genoma humano foi concluído em 2001 após 12 anos a um custo de US 3 bilhões Esse custo caiu Figura Q1 e hoje genomas humanos completos são comuns O objetivo de 1000 dólares por genoma por pessoa está no horizonte e promete tornar essa tecnologia amplamente disponível Como a maioria das alterações genômicas que afetam a saúde humana está em genes codificadores de proteínas suposição que pode ser contestada nos próximos anos uma alternativa mais barata é simplesmente sequenciar o 1 do genoma que representa as regiões codificadoras éxons de genes ou o exoma Essa primeira sequência do genoma humano veio de um genoma haploide derivado de um amálgama de DNA de vários seres humanos diferentes A conclusão de uma sequência de alta qualidade em 2004 estabeleceu essa sequência como o genoma humano de referência Se quências do genoma humano concluídas posteriormente muitas de genomas diploides individuais demonstraram o quanto existe de variação genética individual Em relação à sequência de referência um ser humano comum tem cerca de 35 milhões de SNP cerca de 60 desses são he terozigotos presentes apenas em um dos dois cromosso mos e algumas outras centenas de milhares de diferenças na forma de pequenas inserções e deleções e alterações no número de cópias repetidas Apenas uma pequena porção 5000 a 10000 dos SNP afeta as sequências de aminoáci dos das proteínas codificadas pelos genes Essa complexidade assegura que pelo menos no curto prazo o diagnóstico bemsucedido de uma con dição pelo sequenciamento de todo o genoma será uma exceção e não a regra Entretanto poucas disciplinas avançam tão rapidamente quanto a genômica humana O número de casos de sucesso aumenta rapidamente à medida que a tecnologia se torna mais amplamente dis ponível e se aprimora a capacidade das análises genômi cas para reconhecer alterações genéticas causadoras de doenças Custo por genoma 104 105 106 107 108 103 2001 2003 2005 2007 Lei de Moore 2009 2011 FIGURA Q1 Desde janeiro de 2008 o custo do sequenciamento do ge noma humano tem diminuído mais rápido do que o declínio projetado no custo do processamento de dados pelo computador Lei de Moore Nelson6edbookindb 340 Nelson6edbookindb 340 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 341 Nenhum flash de luz dATP degradado pela apirase A sulfurilase converte o pirofosfato em ATP Na presença de ATP a luciferase reage com a luciferina A base é incorporada o pirofosfato é liberado 59 39 C A A A A C C T C T T C T G G A A A G G A A G A G T C A G T 59 39 C A A C T C T G G G G G G P P P P S S P P A 2 1 Intensidade de luz relativa GG T C Sequência do nucleotídeo Nucleotídeo adicionado TT C C G A A G G Pulso em dATP Pulso em dGTP Flash de luz a b G T A C G T C A A G AGGTCGTTCAG CAGTTCAG Sequência de DNA em grupos circulados dNTP adicionado Resultados da incorporação do dNTP duplicado em lampejos 23 mais brilhantes resíduos G no molde um número semelhante de resíduos C serão adicionados à fita em formação em um ciclo Isso será registrado como uma amplitude de flash nesse grupo 2 3 ou 4 vezes maior do que quando apenas um resíduo C é adicio nado Do mesmo modo quando é adicionado dGTP ocorrem flashes em um conjunto diferente de grupos marcandoos como grupos em que G é o próximo nucleotídeo adicionado à sequência O comprimento do DNA que pode ser sequen ciado com confiança em um grupo único por esse método muitas vezes chamado de comprimento lido ou read normalmente é de 400 a 500 nucleotídeos como no início de 2012 e está sendo constantemente aperfeiçoado O sequenciador Illumina é o método alternativo e utiliza uma técnica conhecida como sequenciamento de termina ção reversível Figura 926 Um oligonucleotídeo inicia dor de sequenciamento especial é adicionado que é com plementar aos oligonucleotídeos de sequência conhecida que foram ligados às extremidades dos fragmentos de DNA em cada grupo como descrito anteriormente Além disso nucleotídeos terminadores marcados com fluorescência e DNApolimerase são adicionados A polimerase adiciona o nucleotídeo adequado às fitas em cada grupo cada tipo de nucleotídeo A T G ou C transportando um marcador flu orescente diferente Esses nucleotídeos terminadores têm grupos de bloqueio ligados às estremidades 39 permitindo apenas a adição de um nucleotídeo a cada fita Em seguida raios lasers excitam todos os marcadores fluorescentes e uma imagem de toda a superfície revela a cor e portanto a identidade da base adicionada a cada grupo O marcador fluorescente e os grupos de bloqueio são então removidos química ou fotoliticamente em preparação para a adição de um novo nucleotídeo para cada grupo Os procedimentos de sequenciamento são realizados em etapas Os compri mentos lidos são mais curtos para esse método normal mente de 100 a 200 nucleotídeos por grupo Essas tecnologias são manifestações modernas de um método de sequenciamento genômico às vezes chamado de sequenciamento shotgun Muitas cópias do DNA genômico FIGURA 925 Pirossequenciamento de última geração a O piros sequenciamento utiliza as enzimas sulfurilase ver Figura 2215 e luciferase ver Quadro 131 para detectar a adição de nucleotídeos com flashes de luz O gráfico mostra as intensidades de luz observadas durante ciclos sucessivos de sequenciamento para um segmento de DNA imobilizado em um ponto específico de uma placa de microtitulação e no topo a sequência de nu cleotídeos do DNA derivada deles b Uma imagem de uma parte muito pequena de um ciclo do sequenciamento 454 Cada segmento individual de DNA a ser sequenciado é ligado a um microgrânulo de captura de DNA em seguida amplificado no grânulo por PCR Cada grânulo é imerso em uma emulsão e colocado em um micropoço 29 mm em uma placa de micro titulação A reação de luciferina e do ATP com a luciferase produz flashes de luz quando um nucleotídeo é adicionado a um grupo de DNA específico em um determinado poço Os círculos representam o mesmo grupo após múl tiplos ciclos Nesse caso a leitura do ciclo de cima ou de baixo da esquerda para a direita ao longo de cada seta fornece a sequência para esse grupo Nelson6edbookindb 341 Nelson6edbookindb 341 020414 1845 020414 1845 342 DAVID L NELSON MICHAEL M COX são cortadas para gerar cada conjunto de fragmentos As sim um determinado segmento curto do genoma pode estar presente em dezenas ou mesmo centenas de diferentes gru pos sequenciados Entretanto não há qualquer marcação sobre um fragmento individual para revelar a procedência do genoma Traduzir as sequências desses milhões de frag mentos em uma sequência genômica requer o alinhamento computadorizado de sequências de fragmentos que se so brepõem Figura 927 As sobreposições permitem rastre ar a sequência ao longo de um cromossomo no computador de um fragmento para outro Isso permite a montagem de sequências contíguas chamadas de contigs Em um exer cício de sequenciamento genômico bemsucedido muitos contigs podem se estender por milhões de pares de bases São necessárias estratégias especiais para preencher as la cunas inevitáveis e para lidar com as sequências repetitivas O genoma humano contém genes e muitos outros tipos de sequências Métodos novos e mais eficientes para o sequenciamento de DNA produziram uma explosão de novas sequências genô micas Elas são armazenadas e disponibilizadas em vários bancos de dados acessíveis publicamente Uma boa aborda gem para esses recursos pode ser encontrada no National Center for Biotechnology Information NCBI wwwncbi nlmnihgov A análise dessa riqueza crescente de infor mações genômicas está em curso O que revela o genoma humano e sua comparação com o de outros organismos Em alguns aspectos o ser humano não é tão complicado como se imaginava A estimativa de décadas atrás de que os seres humanos tivessem cerca de 100000 genes nos apro ximadamente 32 3 10 9 pares de bases do genoma humano foi suplantada pela descoberta de que existem apenas cerca de 25000 genes codificadores de proteínas menos do que o dobro do número em uma moscadasfrutas 136 mil não muito mais do que em um nematódeo 20000 e menos do que em uma planta de arroz 38000 Em outros aspectos entretanto o ser humano é mais complexo do que se pensava anteriormente O estudo da estrutura dos cromossomos eucarióticos e das sequências do genoma revelou que muitos se não a maioria dos ge nes eucarióticos contêm um ou mais segmentos de DNA intervenientes que não codificam a sequência de aminoá TACGGTCTC CCCCCCAGT dNTP incorporado T b c a 59 39 C T A A G C A G C T A A C C T G G T A C G T A C G T A C G T G C A G 59 39 C T A A G C A G C T A C T G T G C A 59 39 C T A A G C A G C T A C T G T G A 59 39 C T A A G C A G C T A C T G T G Adição do nucleotídeo guanina observação e registro da cor fluorescente Adição do nucleotídeo citosina observação e registro da cor fluorescente Remoção dos grupos bloqueadores e marcadores lavagem adição de nucleotídeos bloqueados marcados Remoção dos grupos bloqueadores e marcadores lavagem adição de nucleotídeos bloqueados marcados Remoção dos grupos bloqueadores marcadores lavagem adição de nucleotídeos bloqueados marcados Adição de nucleotídeos bloqueados marcados com fluorescência Adição do nucleotídeo adenina observação e registro da cor fluorescente Adição do nucleotídeo timina observação e registro da cor fluorescente FIGURA 926 Sequenciamento de terminação reversível de última geração a O méto do de terminação reversível utiliza marcadores fluorescentes para identificar nucleotídeos Gru pos de bloqueio em cada nucleotídeo marcado com fluorescência evitam a adição de múltiplos nucleotídeos por ciclo b Seis ciclos sucessivos a partir de uma parte muito pequena de um sequenciamento Illumina Cada ponto colorido representa a localização de um oligonucleotí deo de DNA fixo na superfície da célula de fluxo Os grupos circulados representam o mesmo ponto na superfície após ciclos sucessivos e fornecem as sequências indicadas Os dados são automaticamente gravados e digitalmente analisados c Célula de fluxo típica utilizada para um sequenciador de última geração Milhões de fragmentos de DNA podem ser sequenciados simultaneamente em cada um dos oito canais Nelson6edbookindb 342 Nelson6edbookindb 342 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 343 cidos do produto polipeptídico Essas inserções não tra duzidas interrompem por outro lado a relação colinear entre a sequência de nucleotídeos do gene e a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado Esses segmen tos de DNA não traduzidos são chamados de sequências intervenientes ou íntrons e os segmentos codificado res são chamados de éxons Figura 928 Poucos genes bacterianos contêm íntrons Os íntrons são removidos do transcrito de RNA primário e os éxons são unidos para ge rar um transcrito que pode ser traduzido juntamente em um produto proteico ver Capítulo 26 Um éxon muitas ve zes mas nem sempre codifica um único domínio de uma proteína maior com vários domínios Modos alternativos de expressão gênica e splicing do RNA permitem a produção de várias combinações de éxons que levam à produção de mais de uma proteína a partir de um único gene Os seres humanos compartilham muitos tipos de domínios de pro FIGURA 927 Montagem da sequência Em uma sequência genômica cada par de bases do genoma costuma ser representado em vários frequen temente dezenas dos fragmentos sequenciados chamados de reads É mos trada uma pequena parte da sequência de uma nova variante de espécie de E coli com os reads gerados por um sequenciador 454 Os números no topo representam as posições dos pares de bases genômicos em relação a um 0 definido arbitrariamente Todas as sequências são provenientes de um contig longo denominado 356 Os reads são representados por setas horizontais com identificadores atribuídos por computador listados para cada um à esquerda Segmentos de fita de DNA são sequenciados alea toriamente com sequências obtidas de uma fita 59S39 da esquerda para a direita representadas por setas sólidas e sequências obtidas de outra fita 59S39 da direita para a esquerda representadas por linhas pontilhadas As últimas sequências são automaticamente relatadas como seus complemen tos quando são fundidas com o conjunto de dados em geral O limiar de cobertura na parte superior é uma medida da qualidade da sequência A barra verde maior indica as sequências que foram obtidas em número de vezes suficientes para gerar alta fidelidade nos resultados A profundidade da linha de cobertura indica quantas vezes um determinado par de bases aparece em um read sequenciado A barra azul vertical denota uma parte da sequência destacada na linha de sequência na parte inferior da figura O relatório estatístico de SNP no detalhe é uma lista de posições onde poli morfismos de nucleotídeos únicos parecem estar presentes em alguns dos reads Esses supostos SNP são muitas vezes verificados por sequenciamento adicional Eles são indicados nos reads por marcas verticais finas azuis nas linhas horizontais de cada read Transcrito de mRNA mRNA spliced Íntron A 5UTR 3UTR Éxon 2 Éxon 3 3 Éxon 4 Éxon 5 Íntron B Splicing de íntrons A B C D Íntron C Éxon 1 1 2 4 5 Íntron D FIGURA 928 Íntrons e éxons Esse transcrito de gene contém cinco éxons e quatro íntrons ao longo das regiões 59e 39 não traduzidas 59URT e 39URT O splicing remove os íntrons para criar um produto de mRNA para a tradução na proteína Nelson6edbookindb 343 Nelson6edbookindb 343 020414 1845 020414 1845 344 DAVID L NELSON MICHAEL M COX teínas com plantas vermes e moscas mas esses domínios são utilizados em arranjos mais complexos gerando assim proteínas mais complexas Nos mamíferos e em alguns outros eucariotos um gene normal tem uma proporção muito maior de DNA íntron do que DNA éxon na maioria dos casos a função dos íntrons não é clara Apenas cerca de 15 do DNA humano é co dificador ou DNA éxon transportando informação para os produtos proteicos Figura 929a Entretanto quando os íntrons muito maiores são incluídos na contagem cerca de 30 do genoma humano consiste nesses genes Vários es forços estão em curso para categorizar os genes codificado res de proteínas por função Figura 929b A relativa escassez de genes no genoma humano deixa uma grande quantidade de DNA inexplicado Grande parte do DNA no gene está na forma de sequências repetidas de vários tipos Talvez o mais surpreendente seja que cerca de metade do genoma humano é constituída por sequências moderadamente repetidas derivadas de elementos trans poníveis segmentos de DNA que vão de algumas centenas a vários milhares de pares de bases de comprimento que podem se mover de um local para outro no genoma Origi nalmente descobertos no milho por Barbara McClintock os elementos transponíveis ou transposons são uma espécie de parasita molecular Eles fazem sua casa nos genomas de essencialmente todos os organismos de modo eficiente e em grande parte passivo Muitos transposons contêm genes que codificam proteínas que catalisam o próprio processo de transposição como detalhado nos Capítulos 25 e 26 Existem múltiplas classes de transposons no genoma humano Alguns são ativos movendose em frequência baixa mas a maioria é inativo relíquias evolutivas alteradas por mutações Uma vez que os genes codificadores de proteínas in cluindo éxons e íntrons e transposons sejam levados em conta talvez restem cerca de 25 do DNA total A maior parcela disso consiste em sequências únicas encontradas entre genes codificadores de proteínas Como descrito no Capítulo 26 praticamente todos esses segmentos de DNA são transcritos em RNA em pelo menos algumas células hu manas Novas classes de RNA funcionais codificadas por genes cuja existência era previamente insuspeita estão sendo descobertas em um ritmo acelerado Muitos genes codificadores de RNA funcionais são difíceis de identificar pelos métodos automatizados em particular quando os pro dutos de RNA não foram caracterizados Entretanto os ge nes codificadores de RNA são claramente uma característi ca marcante dessas regiões genômicas que de outro modo seriam desconhecidas Outros 3 ou menos do genoma humano são compos tos de sequências altamente repetitivas chamadas de repe tições de sequências simples SSR Geralmente com menos de 10 pb de comprimento uma SSR é algumas vezes repetida milhões de vezes por célula e tem uma importância funcional identificável no metabolismo de células humanas Os exemplos mais importantes de DNA SSR ocorrem em centrômeros e telômeros ver Capítulo 24 Entretanto re petições longas de sequências simples também ocorrem por todo o genoma O que todas essas informações nos revelam sobre as se melhanças e diferenças entre os seres humanos individuais Dentro da população humana há milhões de variações de base única chamadas de polimorfismos de nucleotídeo único ou SNP pronunciase snips Cada ser humano difere do próximo em média em 1 em cada 1000 pb Mui tas dessas variações estão na forma de SNP mas também ocorre uma grande variedade de deleções maiores inser ções e pequenos rearranjos na população humana A partir dessas diferenças genéticas muitas vezes sutis surgem as variações humanas perceptíveis diferenças na cor do ca belo estatura visão alergias tamanho do pé e até certo grau desconhecido comportamento O processo de recombinação genética e a segrega ção cromossômica durante a meiose tendem a misturar e combinar essas pequenas variações genéticas para que diferentes combinações de genes sejam herdadas ver Ca pítulo 25 Quando duas dessas variações genéticas estão em cromossomos diferentes as variantes específicas que possam ser herdadas por um determinado indivíduo são o resultado do acaso Se as variantes genéticas estão no mes mo cromossomo a chance delas serem herdadas em con junto é uma função inversa da distância entre elas Grupos de SNP e outras diferenças genéticas próximas no mesmo cromossomo são raramente afetados por recombinação e costumam ser herdados juntos esses grupos são conheci dos como haplótipos Os haplótipos fornecem marcadores a Genoma humano tipos de sequências de DNA Íntrons 259 Genes codificadores de proteínas 15 LINE 204 Desconhecido 374 SINE 131 Fator de transcrição 70 Enzimas 162 Citoesqueleto 3 Ligação ao ácido nucleico 98 Receptores 52 Transporte 34 Regulação 41 Sinalização 27 Estruturas extracelulares 3 Imunoproteínas 13 Proteínas de membrana 24 Miscelânea 45 Outros transposons 112 Repetições de sequência simples 3 Duplicações de segmento 5 Sequências repetitivas longas centrômeros telômeros 8 Miscelânea de sequências únicas 116 b Genoma humano genes codificadores de proteínas FIGURA 929 Panorama do genoma humano a Este gráfico setorial mostra as proporções de vários tipos de sequências no genoma humano Os transposons incluindos os SINE e LINE são descritos nos Capítulo 25 e 26 b Os aproximadamente 25000 genes codificadores de proteínas no genoma humano podem ser classificados pelo tipo de proteína que codificam Nelson6edbookindb 344 Nelson6edbookindb 344 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 345 convenientes para algumas populações humanas e indiví duos dentro das populações Para definir um haplótipo são necessárias várias eta pas Em primeiro lugar as posições que contêm SNP na população humana são identificadas em amostras de DNA genômico a partir de múltiplos indivíduos Figura 930a Cada SNP pode ser separado do seguinte por muitos milhares de pares de bases Em segundo lugar os SNP relativamente próximos em um cromossomo e por tanto geralmente herdados juntos são compilados em haplótipos Figura 930b Cada haplótipo consiste nas bases específicas encontradas nas várias posições do SNP no haplótipo definido Finalmente SNP marcadores um subconjunto de SNP que define todo o haplótipo são es colhidos para identificar cada haplótipo individualmente Figura 930c Por meio do sequenciamento de apenas essas posições marcadoras em amostras genômicas de po pulações humanas os pesquisadores rapidamente identi ficam quais haplótipos estão presentes em cada indivíduo Haplótipos especialmente estáveis existem no genoma mitocondrial que sendo herdados pela mãe nunca so frem recombinação meiótica e no cromossomo Y mascu lino apenas 3 dos quais são homólogos ao cromossomo X e portanto sujeitos a recombinação O sequenciamento do genoma dá informações sobre a humanidade A finalidade principal da maioria dos projetos de sequen ciamento do genoma é identificar elementos genéticos conservados de significado funcional como as sequências conservadas dos éxons regiões reguladoras e outras carac terísticas genômicas como centrômeros e telômeros Um dos principais objetivos do sequenciamento do genoma humano é a identificação das diferenças entre o genoma humano e dos outros organismos Embora o genoma hu mano esteja intimamente relacionado a genomas de outros mamíferos em amplos segmentos de cada cromossomo as diferenças de uns poucos porcentuais em bilhões de pares de bases adicionam milhões de distinções genéticas A pes quisa sobre essas diferenças utilizando técnicas genômicas comparativas revela a base molecular de doenças genéticas humanas e ajuda a identificar genes alterações gênicas e outras características genômicas exclusivamente humanas e assim contribuir para definir características humanas como cérebro grande habilidades linguísticas a capacidade de produzir ferramentas ou o bipedalismo As sequências do genoma de parentes biológicos mais próximos os chimpanzés e bonobos oferecem algumas pis tas importantes e ilustram o processo comparativo Os seres humanos e os chimpanzés compartilharam um ancestral co mum cerca de 7 milhões de anos atrás As diferenças genô micas entre as duas espécies são de dois tipos mudanças de pares de base SNP e rearranjos genômicos maiores de muitos tipos Os SNP em regiões codificadoras de proteínas com frequência resultam em mudanças nos aminoácidos que podem ser utilizadas para construir uma árvore filogenética Figura 931a Os segmentos de cromossomos podem se inverter ao longo do processo evolutivo Os processos que levam a tais inversões são complicados e raros mas a linha gem humana tem segmentos longos de DNA invertidos em relação a outros primatas em função de processos nos cro mossomos 1 12 15 16 e 18 Fusões cromossômicas também podem ocorrer Na linhagem humana dois cromossomos en contrados em outras linhagens de primatas se fusionaram para formar o único cromossomo 2 humano Figura 931b a SNP b Haplótipos c SNP marcador Cromossomo A SNP SNP SNP Milhares de pares de bases Milhares de pares de bases Milhares de pares de bases Indivíduo 1 Indivíduo 2 Indivíduo 3 Indivíduo 4 Haplótipo 1 Haplótipo 2 Haplótipo 3 Haplótipo 4 FIGURA 930 Identificação de haplótipos a Polimorfismos de nucleo tídeo único SNP ou posições no genoma humano onde as sequências va riam de um indivíduo para outro são identificadas em amostras genômicas e b grupos de SNP relativamente próximos uns dos outros em um cromosso mo dentro de algumas dezenas de milhares de pares de bases são compila dos em um haplótipo Os SNP irão variar na população em geral assim como nos quatro indivíduos fictícios mostrados nos painéis a e b Entretanto os SNP escolhidos para definir um haplótipo são frequentemente os mesmos na maioria dos indivíduos de uma determinada população c SNP definido res de haplótipos SNP marcadores podem ser utilizados para simplificar o processo de identificação de um haplótipo de um indivíduo sequenciando 3 SNP definidores em vez de todos os 20 Se os SNP marcadores mostrados em vermelho claro forem sequenciados os nucleotídeos A T e G nas três posições sucessivas do SNP marcador poderiam ser característicos de uma população nativa de um local no norte da Europa enquanto os nucleotídeos G T e C nessas três mesmas posições genômicas poderiam ser encontrados em uma população da Ásia Múltiplos haplótipos deste tipo são utilizados para rastrear migrações humanas préhistóricas ver Figura 935 Nelson6edbookindb 345 Nelson6edbookindb 345 020414 1845 020414 1845 346 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Assim a linhagem humana tem 23 pares de cromossomos em vez dos 24 pares normais em outros primatas Quando essa fusão apareceu na linha que conduz aos seres huma nos ela representou uma grande barreira para o cruzamen to com outros primatas que não a apresentavam Sem considerar os transposons e os grandes rearran jos cromossômicos os genomas humanos e de chimpanzés publicados diferem em apenas 123 no nível de pares de bases em comparação com a variação de 01 de um ser humano para outro Sem considerar mais variações nas posições onde existe um polimorfismo conhecido tanto na população humana quanto na de chimpanzés essas pouco provavelmente refletem uma mudança evolutiva que define uma nova espécie as diferenças aumentam para cerca de 106 ou cerca de 1 em cada 100 pb Essa pequena porcen tagem se traduz em mais de 30 milhões de mudanças de pa res de base algumas das quais afetam a função de proteínas e a regulação gênica Os rearranjos genômicos que ajudam a distinguir os chimpanzés e os seres humanos incluem 5 milhões de inserções curtas ou deleções envolvendo alguns pares de bases cada bem como um número substancial de inserções maiores deleções inversões ou duplicações que podem envolver muitos milhares de pares de bases Quan do inserções de transposons importante fonte de variação genômica são incluídas as diferenças entre os genomas humano e de chimpanzé aumentam para cerca de 90 mi lhões de pb representando outros 3 desses genomas Com efeito cada espécie tem segmentos de DNA constituindo 40 a 45 milhões de pb totalmente exclusivos para esse genoma particular com inserções cromossômicas maiores duplica ções e outros rearranjos que afetam mais pares de bases do que fazem as mudanças de nucleotídeo único Portanto as diferenças genômicas totais entre chimpanzés e humanos equivalem a cerca de 4 de seus genomas Classificar as diferenças genômicas relevantes para ca racterísticas exclusivamente humanas é uma tarefa desen corajadora Se as duas espécies compartilham um ancestral comum então assumindo uma taxa de evolução semelhante em ambas as linhagens metade das mudanças representa mudanças na linhagem dos chimpanzés e a outra metade alterações na linhagem humana Quando se observa uma diferença como descrever qual variante era aquela presen te no ancestral comum Uma maneira é comparar ambas as sequências do genoma com as de organismos relacionados mais distantemente chamados de grupos externos Consi dere um locus X onde existe uma diferença entre o genoma humano e o do chimpanzé Figura 932 A linhagem do orangotango um grupo externo divergiu da de chimpanzés e humanos antes do ancestral comum chimpanzéhumano Se a sequência no locus X é idêntica em orangotangos e chimpanzés essa sequência estava provavelmente presente no ancestral chimpanzéhumano e a sequência observada em humanos é específica para a linhagem humana As se quências idênticas em seres humanos e nos orangotangos podem ser eliminadas como candidatas para características genômicas humanas específicas A importância de compara ções com grupos externos intimamente relacionados origi nou novos esforços para sequenciar o genoma de orangotan gos macacos e muitas outras espécies de primatas 171 G R 184 A V 204 S A 213 G E 228 P A 359 S C 444 P T 679 I V 535 N S 545 A T 691 T S 265 A T 267 A V 348 A V 83 D N 312 V M Humanos Cromossomo 2 humano Chimpanzé Chimpanzés Bonobos a b Cromossomo 2q Cromossomo 2p FIGURA 931 Alterações genômicas na linhagem humana a Esta árvore evolutiva para primatas é derivada de sequências para o receptor de progesterona que ajudam a regular muitos eventos na reprodução O gene que codifica essa proteína sofreu mais alterações evolutivas do que a maioria Mudanças nos aminoácidos associadas unicamente a humanos chimpanzés e bonobos são listadas pelo número de resíduos ao lado de cada ramo b Os genes nos cromossomos de chimpanzés 2p e 2q são homólogos àqueles no cromossomo 2 humano indicando que em algum ponto na linhagem que leva aos humanos os dois cromossomos se fusionaram em um Humano Ancestral Ancestral Chimpanzé b a Gene X Gene X Humano Chimpanzé Gene X Gene X Gene X Orangotango grupo externo Gene X FIGURA 932 Determinação das alterações de sequências únicas para uma linhagem ancestral a São comparadas as sequências do mesmo gene hipotético em humanos e chimpanzés A sequência deste gene em seu último ancestral comum é desconhecida b O genoma do orangotango é utilizado como um grupo externo A sequência do gene do orangotango é idêntica à do gene do chimpanzé Isso significa que a muta ção que leva a diferenças entre humanos e chimpanzés quase certamente ocorreu na linhagem que conduziu aos humanos modernos e o ancestral comum de humanos e chimpanzés e orangotangos tinha a sequência ago ra encontrada em chimpanzés Nelson6edbookindb 346 Nelson6edbookindb 346 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 347 A busca pelas bases genéticas de características hu manas especiais tais como a função cerebral avançada beneficiase de duas abordagens complementares As pri meiras pesquisas de regiões genômicas mostram alterações extremas a partir de outros primatas Essas incluem várias duplicações de genes ou a adição de segmentos genômicos grandes não presentes em outros primatas A segunda abor dagem analisa genes conhecidos envolvidos em condições humanas relevantes Para a função cerebral por exemplo podese examinar genes que quando mutados contribuem para os transtornos cognitivos ou outros distúrbios mentais Notavelmente as análises da linhagem humana ainda não detectaram um enriquecimento de modificações ge néticas nos genes que codificam proteínas envolvidas no desenvolvimento ou no tamanho cerebral Em primatas a maioria dos genes que funcionam exclusivamente no cére bro é ainda mais altamente conservada do que os genes que funcionam em outros tecidos Entretanto algumas diferen ças na expressão gênica são observadas Quando as mudan ças em regiões genômicas relacionadas à regulação gênica são analisadas os genes envolvidos no desenvolvimento neural e nutrição são desproporcionalmente afetados Di versos genes codificadores de RNA alguns com expressão concentrada no cérebro também mostram evidências de evolução acelerada Figura 933 As muitas novas classes de RNA que estão sendo descobertas ver Capítulo 26 pro vavelmente irão mudar radicalmente a perspectiva sobre como a evolução altera o funcionamento dos sistemas de seres vivos É cada vez mais evidente que os genes expres sos talvez não sejam tão importantes como quando onde e quanto deles é expresso Comparações do genoma ajudam a localizar genes envolvidos em doenças O Projeto Genoma Humano tem cumprido o seu poten cial para acelerar a descoberta de genes subjacentes a doenças genéticas mais de 1600 doenças genéticas humanas já tiveram seus genes específicos mapeados Com o uso de um método denominado análise de ligação o gene envolvi do em uma doença é mapeado em relação aos polimorfismos genéticos bem caracterizados que ocorrem em todo o genoma humano A busca muitas vezes começa com uma ou mais fa mílias grandes que incluam vários indivíduos afetados por determinada doença ao longo de várias gerações A aborda gem mais comum é basicamente um exercício de filogenética o estudo de parentesco evolutivo entre grupos de organis mos e está profundamente enraizada em conceitos deriva dos da biologia evolutiva É possível ilustrar descrevendo a busca de um gene envolvido na doença de Alzheimer Cerca de 10 de todos os casos dessa doença nos Estados Unidos resultam de uma predisposição hereditária Vários genes dife rentes que foram descobertos quando mutados podem levar ao aparecimento precoce da doença de Alzheimer Um desses genes PS1 codifica a proteína presenilina1 e para sua des coberta a análise de ligação foi muito utilizada Assim como os haplótipos dependem dos SNP que se encontram juntos em um cromossomo a análise de ligação envolve a busca dos SNP que se encontram próximos do gene de interesse Nesse tipo de estudo os pesquisadores se concentram nas famílias afetadas pela doença e pro curam famílias nas quais as amostras de DNA podem ser obtidas a partir de indivíduos de várias gerações As amos tras de DNA são coletadas tanto dos membros da família afetados quanto dos não afetados Em primeiro lugar os pesquisadores localizam a região associada à doença em um cromossomo específico utilizando conjuntos chama dos painéis de localizações genômicas onde SNP comuns ou outras alterações genômicas mapeadas ocorrem em uma proporção significativa da população humana Assim muitos mas não todos os humanos diferem na sequência genômica nesses locais Utilizando um painel que inclua vários loci SNP bem caracterizados mapeados para cada cromossomo os investigadores comparam os genótipos de indivíduos com e sem a doença se concentrando princi palmente nos familiares próximos Para a doença de Al zheimer duas das muitas linhagens familiares utilizadas para procurar esse gene no início da década de 1990 são mostradas na Figura 934 Utilizando essas linhagens os investigadores descobriram variantes SNP específicas herdadas no mesmo ou quase no mesmo padrão que o gene causador da doença O gene responsável pode gra dualmente ser localizado em um único cromossomo se a herança das variantes específicas de SNP no cromossomo se refletir perto da herança da condição da doença Uma localização mais detalhada de um gene em um cromosso mo causador de doença se baseia em métodos estatísticos para correlacionar a herança de polimorfismos adicionais mais próximos no espaço com a ocorrência da doença se concentrando sobre um painel mais denso de polimorfis mos que se sabe que ocorre no cromossomo de interesse Quanto mais próximo um marcador está localizado do gene de uma doença maior a probabilidade dele ter sido herda do junto com esse gene Esse processo pode indicar uma Humano Chimpanzé Gorila Orangotango Macaco Camundongo Cão Boi Ornitorrinco Gambá Galinha Locus HAR1F 20 30 40 Posição 50 FIGURA 933 Evolução acelerada em alguns genes humanos O locus HAR1F especifica um RNA não codificador que é altamente conservado em vertebrados Em humanos o gene HAR1F exi be um número incomum de mutações vermelho claro sombreado fornecendo evidência de evo lução acelerada Nelson6edbookindb 347 Nelson6edbookindb 347 020414 1845 020414 1845 348 DAVID L NELSON MICHAEL M COX região do cromossomo que contém o gene No exemplo da doença de Alzheimer a análise de ligação indicou que o gene causador da doença estava em algum lugar próximo a um locus de SNP chamado D14S43 Figura 934c As etapas finais da pesquisa para o gene da doença uti lizam novamente o banco de dados do genoma humano A região local que contém o gene é examinada e os seus ge nes são identificados O DNA de muitos indivíduos alguns com a doença e outros sem a doença é sequenciado nessa região Com o número crescente de indivíduos analisados esse processo gradual leva à identificação das variantes ge néticas consistentemente presentes em indivíduos com a doença e ausentes em indivíduos não afetados A pesquisa pode ser auxiliada por uma compreensão da função dos ge nes na regiãoalvo porque vias metabólicas específicas po dem ser mais propensas a produzir a doença do que outras Em 1995 o gene no cromossomo 14 associado à doença de Alzheimer foi identificado como o gene S182 O produto desse gene foi denominado de presenilina1 e o próprio gene depois foi renomeado para PS1 41 48 45 47 43 77 13 13 21 31 22 23 12 12 112 112 241 242 243 321 322 323 111 111 a Família L c b 36 30 D64 63 45 58 41 39 39 39 56 53 49 41 44 40 41 41 84 78 48 D61 D66 D61 D57 D59 D50 Família SNW Em direção ao telômero Em direção ao centrômero D60 52 54 80 50 50 73 50 D56 76 72 48 D53 D51 53 67 56 D14S50 D14S54 D14D49 D14S47 D14S52 D14S43 D14S53 D14S55 D14S48 PI AACT D14S51 TCRD 161 75 117 126 207 25 92 16 135 56 D14S1 D14S53 D14S61 D14S76 D14S289 D14S258 1 Mb Escala aproximada D14S77 Região de interesse S182 D14S277 D14S4371 D14S268 FIGURA 934 Análise de ligação na descoberta de genes de doen ças a Estes heredogramas para duas famílias afetadas pelo início precoce da doença de Alzheimer se baseiam nos dados disponíveis no momento do estudo Os símbolos vermelhos representam os indivíduos afetados as bar ras indicam as mortes antes ou logo no início do estudo O número acima de cada símbolo corresponde à idade da pessoa tanto no tempo do estudo quanto no momento da morte indicada com a letra D Para proteger a pri vacidade da família o gênero não é indicado b Cromossomo 14 com ban das criadas por alguns corantes As posições dos marcadores de cromosso mos são mostradas à direita com a distância genética entre eles apresentada em uma medida de distância genética chamada de centimorgans refletindo a frequência de recombinação entre eles O TCRD receptor delta de célula T e PI AACT a1antiquimotripsina são genes com alterações na população humana que foram utilizados como marcadores juntamente com os SNP no mapeamento de cromossomos c A partir da comparação do DNA dos membros de famílias afetadas e não afetadas uma região de interesse que contém 19 genes expressos foi finalmente definida próxima do marcador D14S43 O gene marcado S182 em vermelho codifica a presenilina1 Nelson6edbookindb 348 Nelson6edbookindb 348 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 349 Mais complexos são os casos em que a doença é causada pela presença de mutações em dois genes diferentes ne nhum dos quais isoladamente é capaz de causar a doença ou quando uma condição específica é potencializada por uma mutação de outra maneira inócua em outro gene A identificação dos genes e mutações responsáveis por essas doenças digênicas é extremamente difícil e essas doenças algumas vezes só são possíveis de serem documentadas dentro de populações pequenas isoladas e altamente puras Os bancos de dados do genoma abrem caminhos alter nativos para a identificação de genes de doenças especial mente quando a informação bioquímica sobre a doença é conhecida No caso da doença de Alzheimer um acúmulo de proteína b amiloide no sistema límbico e nos córtices de associação do cérebro é pelo menos parcialmente respon sável pelos sintomas Defeitos na presenilina1 e em uma proteína relacionada a presenilina2 codificada por um gene no cromossomo 1 conduzem a níveis corticais eleva dos de proteína b amiloide Bancos de dados se concentram em catalogar tal informação funcional sobre os produtos proteicos de genes e nas redes de interação de proteínas localização de SNP e outros dados proporcionando um ca minho rápido para a identificação de genes candidatos a determinada doença Um pesquisador com certo conheci mento sobre os tipos de enzimas ou outras proteínas que contribuem para a doença pode utilizar esses bancos de dados para gerar uma lista de genes conhecidos que codi ficam proteínas com funções relevantes genes adicionais não caracterizados com relações de ortólogos ou parálogos aos genes nesta lista uma lista de proteínas conhecidas que interagem com as proteínasalvo ou ortólogos em outros or ganismos e um mapa de posições de genes Com os dados de linhagens de famílias selecionadas uma pequena lista de genes potencialmente relevantes pode muitas vezes ser ra pidamente determinada Essas abordagens não se limitam a doenças humanas Os mesmos métodos podem ser utilizados para identificar os genes envolvidos em doenças ou genes que produzem características desejáveis em outros animais e plantas Sequências no genoma informam sobre o passado humano e fornecem oportunidades para o futuro Cerca de 70000 anos atrás um pequeno grupo de seres humanos na África atravessou o Mar Vermelho em direção à Ásia Talvez incentivados por alguma inovação na cons trução de pequenos barcos ou conduzidos por conflitos ou fome ou simplesmente curiosos eles atravessaram a bar reira de água Essa colonização inicial talvez envolvendo 1000 indivíduos começou uma jornada que só parou quan do os seres humanos chegaram à Terra do Fogo no extre mo sul da América do Sul muitos milhares de anos mais tarde No processo uma população estabelecida a partir de uma expansão de hominídeos na Eurásia incluindo o Homo neanderthalensis foi deslocada Os neandertais desapare ceram assim como o Homo erectus e outras linhas de homi nídeos antes deles A história do aparecimento dos seres humanos moder nos pela primeira vez na África algumas centenas de milha res de anos atrás e suas migrações à medida que eles por fim se irradiaram para fora de África está escrita no DNA Com a utilização de sequências genômicas de várias espé cies a evolução de primatas e hominídeos se tornou mais ní tida Utilizando haplótipos presentes em populações huma nas existentes é possível traçar as migrações dos intrépidos antepassados humanos em todo o planeta Figura 935 60 50 45 40 35 30 25 20 10 M3 M4 M130 M130 M174 M122 M20 M175 M69 M169 M91 M2 M60 M96 M172 M304 M343 LLY22 M17 M170 M9 M89 M201 M173 M35 Origem M242 M45 Aproximadamente primeiro aparecimento do marcador kya FIGURA 935 Os caminhos das migrações humanas Quando uma pe quena parte de uma população humana migra para fora de um grande gru po ela carrega apenas parte de toda sua diversidade genética Assim alguns haplótipos estarão presentes no grupo que migrou mas não todos eles Ao mesmo tempo mutações podem criar novos haplótipos ao longo do tem po Este mapa foi gerado a partir de análises de marcadores genéticos ha plótipos definidos pelos números M ou LLY no cromossomo Y As amostras genéticas foram colhidas de populações indígenas há muito estabelecidas em pontos geográficos ao longo das rotas assinaladas Os haplótipos que aparecem subitamente ao longo do caminho de migração refletindo novas mudanças mutações em localizações genômicas de SNP específicas em algumas populações isoladas são chamados de eventos fundadores Eles permitem aos pesquisadores rastrearem as migrações a partir desse ponto uma vez que outras populações com o novo haplótipo foram provavelmen te descendentes da população fundadora A abreviação kya significa milha res de anos atrás Nelson6edbookindb 349 Nelson6edbookindb 349 020414 1845 020414 1845 350 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os seres humanos modernos e os neandertais convive ram na Europa e Ásia há relativamente recentes 30 mil anos As populações ancestrais humanas e neandertais divergiram há cerca de 370000 anos antes do apareci mento dos seres humanos anatomicamente modernos Os neandertais utilizavam ferramentas viviam em pe quenos grupos e enterravam seus mortos Dos paren tes hominídeos conhecidos dos humanos modernos os neandertais são os mais próximos Durante centenas de milênios eles habitaram grande parte da Europa e Ásia Ocidental Figura Q1 Se o genoma do chimpanzé in forme algo sobre o que é ser humano talvez o genoma neandertal informe mais Ossos enterrados que perma necem sendo retirados de cemitérios são fragmentos de DNA do genoma neandertal As tecnologias desenvolvi das para uso em ciência forense ver Quadro 91 e estu dos de DNA arqueológico foram combinados para iniciar um projeto genoma neandertal Esse esforço é diferente dos projetos genoma que visam espécies existentes O DNA neandertal está pre sente em pequenas quantidades contaminadas com o DNA de outros animais e de bactérias Como se pode chegar até ele e como estar certo de que as sequências são realmente de neandertais As respostas foram re veladas por aplicações inovadoras da biotecnologia Es sencialmente as pequenas quantidades de fragmentos de DNA encontradas em um osso neandertal ou outros restos são clonadas em uma biblioteca e os segmentos de DNA são sequenciados de forma aleatória inclusive os contaminantes Os resultados do sequenciamento são comparados com o banco de dados do genoma huma no e do chimpanzé existentes Os segmentos derivados de DNA neandertal são rapidamente diferenciados dos segmentos derivados de bactérias ou insetos por análise computadorizada porque eles têm sequências estreita mente relacionadas ao DNA humano e do chimpanzé Quando uma coleção de segmentos de DNA neandertal QUADRO 93 MÉTODOS Conhecendo os neandertais Shanidar Amud Tabun Krapina Vindija La ChapelleauxSaints ArcysurCure Le Moustier MoulaGuercy Figueira Brava Saccopastore Neanderthal Külra Sipka Erd Molodovo FIGURA Q1 Os neandertais ocuparam grande parte da Europa e Ásia Ocidental até cerca de 30000 anos atrás Os principais sítios arqueoló gicos neandertais estão aqui mostrados Observe que o grupo foi assim chamado por causa do sítio em Neanderthal na Alemanha Os neandertais não foram simplesmente deslocados Ocor reu alguma mistura Utilizandose métodos sensíveis com base em PCR agora está disponível uma sequência quase completa do genoma de neandertais Quadro 93 Sabese que cerca de 4 dos genomas humanos de não africanos são derivados de neandertais Algumas populações huma nas também adquiriram o DNA genômico de outro grupo recentemente descoberto os denisovanos O DNA de ne andertais forneceu aos humanos um sistema imune mais complexo tornandonos mais resistentes à infecção mas também um pouco mais suscetíveis a doenças autoimunes A história do passado humano está gradualmente tomando forma à medida que mais genomas humanos dos vivos hoje e daqueles que viveram em milênios passados estão sendo reunidos A promessa médica de sequências genômicas pessoais cresce à medida que mais genes subjacentes a doenças he reditárias são definidos O conhecimento de sequências ge nômicas também oferece a possibilidade de alterálos Atual mente é comum modificar sequências de DNA de organismos a partir de bactérias e leveduras para plantas e mamíferos para fins de investigação e comercialização Os esforços para Nelson6edbookindb 350 Nelson6edbookindb 350 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 351 é sequenciada pode ser utilizada como sonda para iden tificar os fragmentos de sequência em amostras antigas que se sobrepõem a esses fragmentos conhecidos O po tencial problema de contaminação com o DNA humano moderno estreitamente relacionado pode ser controlado pela análise do DNA mitocondrial As populações huma nas têm haplótipos facilmente identificáveis conjuntos distintos de diferenças genômicas ver Figura 930 no seu DNA mitocondrial e a análise de amostras de nean dertais mostrou que o DNA mitocondrial neandertal tem seus próprios haplótipos distintos A presença nas amos tras neandertais de algumas diferenças encontradas em pares de bases no banco de dados do chimpanzé mas não no banco de dados humano é mais uma evidência de que as sequências de hominídeos não humanos foram encontradas A conclusão dessa tarefa desafiadora está no horizon te O projeto de sequenciamento do genoma neandertal revelado no início de 2009 abrangeu mais de 60 das sequências genômicas O sequenciamento final vai exigir um pouco mais de tempo Os dados fornecem evidências de que os humanos modernos e os neandertais que foram a fonte desse DNA compartilharam um ancestral comum cerca de 700000 anos atrás Figura Q2 A análise do DNA mitocondrial sugere que os dois grupos continua ram no mesmo caminho com algum fluxo gênico entre eles ao longo de mais 300 mil anos As linhagens se se pararam com a aparência de humanos anatomicamente modernos embora hoje existam evidências para algum entrelaçamento das linhagens um pouco mais tarde Bibliotecas expandidas de DNA neandertal de dife rentes conjuntos de restos mortais devem finalmente permitir uma análise da diversidade genética neandertal e talvez migrações de neandertais oferecendo um fasci nante olhar sobre o nosso passado hominídeo Dados fósseis Dados genômicos Linhagem evolutiva das sequências referência dos humanos e dos neandertais Linhagem evolutiva das populações humanas ancestrais e neandertais Neandertal Humano moderno 8 kya Vestígios neandertais conhecidos mais recentes 41 kya Primeiros humanos modernos na Europa 195 kya Primeiros humanos modernos anatomicamente conhecidos 370 kya Divisão das populações humana e neandertal ancestrais 706 kya Momento de coalescência das sequências de referência dos humanos e neandertais FIGURA Q2 Esta linha do tempo mostra a divergência das sequências genômicas linhas pretas humanas e neandertais e das populações hu manas ancestrais e neandertais em amarelo Os dados genômicos for necem evidências para alguma intermistura das populações até cerca de 45000 anos atrás Eventoschave na evolução humana são marcados curar doenças humanas hereditárias com terapia genética ainda não atingiram todo seu potencial mas tecnologias para o fornecimento de genes estão constantemente se aperfei çoando Poucas disciplinas científicas afetarão o futuro da espécie humana mais do que a genômica moderna RESUMO 93 Genômica e história da humanidade c Métodos de sequenciamento de última geração têm re duzido muito o tempo necessário para gerar sequências genômicas completas c Cerca de 30 do DNA no genoma humano estão nos éxons e íntrons dos genes que codificam proteínas Cerca de me tade do DNA é derivada de transposons parasitas Muito do restante codifica RNA de muitos tipos Sequências re petidas simples compõem o centrômero e telômeros c As alterações de genes que definem a humanidade po dem ser discernidas em parte pela genômica comparati va utilizandose outros primatas c A genômica comparativa também é utilizada para loca lizar as alterações no gene que definem doenças here Nelson6edbookindb 351 Nelson6edbookindb 351 020414 1845 020414 1845 352 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ditárias e pode ser utilizada para estudar a evolução e a migração de nossos ancestrais humanos ao longo de milênios Termoschave Termos em negrito são definidos no glossário genômica 313 biologia de sistemas 313 clonagem 314 vetor 314 DNA recombinante 314 engenharia genética 314 endonucleases de restrição 314 DNAligases 314 plasmídeo 317 cromossomo artificial bacteriano BAC 319 cromossomo artificial de leveduras YAC 319 vetor de expressão 321 baculovírus 323 bacmídeo 323 mutagênese sítio direcionada 323 proteína de fusão 325 marcador 325 reação em cadeia da polimerase PCR 327 repetições curtas em tandem STR 329 PCR quantitativa qPCR 331 biblioteca de DNA 332 biblioteca genômica 332 DNA complementar cDNA 332 biblioteca de cDNA 332 genômica comparativa 333 ortólogos 333 parálogos 333 sintenia 333 marcador de epítopo 333 análise de duplohíbrido em leveduras 336 microarranjo de DNA 337 contig 342 polimorfismo de nucleotídeo único SNP 344 haplótipo 345 Leituras adicionais Geral Jackson DA Symons RH Berg P 1972 Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of simian virus 40 circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose óperon of Escherichia coli Proc Natl Acad Sci USA 69 29042909 O primeiro experimento com DNA recombinante ligando o DNA de duas espécies Lobban PE Kaiser AD 1973 Enzymatic endtoend joining of DNA molecules J Mol Biol 78 453471 Relato do primeiro experimento com DNA recombinante Estudo dos genes e seus produtos Arnheim N Erlich H 1992 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forensics evidence Crit Rev Microbiol 31 233254 Como a biotecnologia é utilizada contra o bioterrorismo Koonin EV 2005 Orthologs paralogs and evolutionary genomics Annu Rev Genet 39 309338 Boa descrição de parte da genômica comparativa básica Stoughton RB 2005 Applications of DNA microarrays in biology Annu Rev Biochem 74 5382 Terpe K 2006 Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems App Microbiol Biotechnol 72 211222 Yooseph S Sutton G Rusch DB Halpern AL Williamson SJ Remington K Eisen JA Heidelberg KB Manning G Li W et al 2007 The Sorcerer II global ocean sampling expedition expanding the universe of protein families PLoS Biol 5 e16 Artigo que compõe uma série originada de um esforço ambicioso para provar a biodiversidade microbiana em todos os oceanos do mundo Genômica e história da humanidade Alkan C Sajjadian S Eichler EE 2011 Limitations of nextgeneration genome sequence assembly Nat Methods 8 6165 Callaway E 2011 Ancient DNA reveals secrets of human history Nature 476 136137 Carr PA Church GM 2009 Genome engineering Nat Biotechnol 27 11511162 Carroll SB 2003 Genetics and the making of Homo sapiens Nature 422 849857 GonzagaJauregui C Lupski JR Gibbs RA 2012 Human genome sequencing in health and disease Annu RevMed 63 3561 Green ED Guyer MS 2011 Charting a course for genomic medicine from base pairs to bedside Nature 470 204213 Kay MA 2011 Stateof theart genebased therapies the road ahead Nat Rev Genet 12 316328 Lander ES 2011 Initial impact of the sequencing of the human genome Nature 470 187197 Metzker ML 2010 Sequencing technologies the next generation Nat Rev Genet 11 3146 Perkel JM 2011 Synthetic genomics building a better bacterium Science 331 16281630 Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL et al 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova cave in Siberia Nature 468 10531060 Os neandertais não foram os únicos outros grupos de hominídeos que os humanos encontraram em sua viagem através do continente asiático Stoneking M Krause J 2011 Learning about human population history from ancient and modern genomes Nat Rev Genet 12 603614 Nelson6edbookindb 352 Nelson6edbookindb 352 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 353 Problemas 1 Produção de DNA clonado Quando liga dois ou mais fragmentos de DNA um pesquisador pode ajustar a sequên cia na junção de vários modos diferentes como será visto nos exercícios a seguir a Desenhe a estrutura de cada extremidade de um frag mento linear de DNA produzido por digestão com a enzima de restrição EcoRI inclua aquelas sequências remanescentes da sequência de reconhecimento da enzima EcoRI b Desenhe a estrutura resultante da reação dessa se quência final com a DNApolimerase I e os quatro desoxinucle osídeos trifosfatos ver Figura 833 c Desenhe a sequência produzida na junção que se forma se as duas extremidades com a estrutura obtida em b forem ligadas ver Figura 2516 d Desenhe a estrutura produzida se a estrutura obtida em a for tratada com uma nuclease que degrade apenas DNA de fita simples e Desenhe a sequência da junção produzida se uma ex tremidade com a estrutura b for ligada a uma extremidade com a estrutura d f Desenhe a estrutura da extremidade de um fragmento linear de DNA que foi produzido por digestão com a enzima de restrição PvuII inclua aquelas sequências remanescentes da sequência de reconhecimento da enzima PvuII g Desenhe a sequência da junção produzida se uma ex tremidade com estrutura b estiver ligada a uma extremidade com a estrutura f h Suponha que você sintetize um fragmento de DNA duplo curto com qualquer sequência desejada Com esse fragmento sintético e os procedimentos descritos de a até g crie um protocolo que permita remover um sítio de restrição de EcoRI de uma molécula de DNA e incorporar um novo sítio de restrição de BamHI aproximadamente no mesmo local ver Figura 92 i Desenhe quatro fragmentos sintéticos curtos diferentes de DNA de fita dupla que permitam a ligação da estrutura a com um fragmento de DNA produzido por digestão com a enzi ma de restrição PstI Em um desses fragmentos desenhe a se quência de modo que a junção final contenha as sequências de reconhecimento tanto para EcoRI quanto para PstI No segun do e terceiro fragmentos desenhe a sequência de modo que a junção contenha apenas a sequência de reconhecimento EcoRI e PstI respectivamente Desenhe a sequência do quarto frag mento de modo que nem EcoRI ou PstI apareçam na junção 2 Seleção de plasmídeos recombinantes Quando se clona um fragmento de DNA exógeno em um plasmídeo é fre quentemente útil inserir o fragmento em um sítio que inter rompa um marcador de seleção como o gene de resistência à tetraciclina de pBR322 A perda da função do gene inter rompido pode ser utilizada para identificar os clones que con têm os plasmídeos recombinantes com o DNA exógeno Com o vetor bacteriófago l isso não é necessário pois é muito fácil distinguir os vetores que incorporaram fragmentos grandes de DNA exógeno daqueles que não o incorporam Como esses ve tores recombinantes podem ser identificados 3 Clonagem de DNA O vetor de clonagem plasmídeo pBR322 ver Figura 93 é clivado com a endonuclease de res trição PstI Um fragmento de DNA isolado de um genoma eu cariótico também obtido por clivagem com PstI é adicionado ao vetor preparado e ligado A mistura de DNA ligado é então utilizada para transformar bactérias e as bactérias que contêm os plasmídeos são selecionadas pelo crescimento em presença de tetraciclina a Além do plasmídeo recombinante desejado quais ou tros tipos de plasmídeos podem ser encontrados entre as bac térias transformadas que são resistentes à tetraciclina Como podem ser diferenciados b O fragmento de DNA clonado tem um tamanho de 1000 pb e um sítio de EcoRI a 250 pb de uma extremidade Três plasmídeos recombinantes diferentes foram clivados com EcoRI e analisados por eletroforese em gel com os padrões mostrados a seguir O que cada padrão de restrição nos infor ma a respeito do DNA clonado Note que em pBR322 os sítios de restrição de EcoRI e PstI estão distantes cerca de 750 pb O plasmídeo inteiro sem o clone inserido tem um tamanho de 4361 pb Marcadores de tamanho na canaleta 4 possuem o número de nucleotídeos observado 750 Eletroforese 1 2 3 4 3000 1000 250 Comprimento em nucleotídeos 500 1500 5000 4 Enzimas de restrição A sequência parcial de uma fita de uma molécula de DNA de fita dupla é Os sítios de clivagem para as enzimas de restrição EcoRI e PstI são mostrados a seguir Escreva a sequência de ambas as fitas do fragmento de DNA criado quando o DNA é clivado tanto por EcoRI como por PstI A fita superior de seu fragmento de DNA duplo deve ser deri vada da sequência da fita mostrada a seguir 5 Desenhando um teste diagnóstico para uma doença genética A doença de Huntington DH é um distúrbio hereditário neurodegenerativo caracterizado por um dano gradual e irreversível das funções psicológicas moto ras e cognitivas Os sintomas normalmente aparecem na meia idade mas podem ocorrer em praticamente qualquer idade O curso da doença pode durar de 15 a 20 anos As bases mole culares da doença se tornam cada vez mais bem compreendi das A mutação genética subjacente à DH foi identificada em um gene codificador de uma proteína Mr 350000 de função desconhecida Em indivíduos que não desenvolverão DH a re Nelson6edbookindb 353 Nelson6edbookindb 353 020414 1845 020414 1845 354 DAVID L NELSON MICHAEL M COX gião do gene que codifica a porção aminoterminal da proteína tem uma sequência de códons CAG para glutamina que se repetem de 6 a 39 vezes em sucessão Em indivíduos com iní cio da doença na vida adulta esse códon é normalmente repe tido de 40 a 55 vezes Em indivíduos com início da doença na infância esse códon se repete mais de 70 vezes O compri mento dessa simples repetição de trinucleotídeos indica se o indivíduo desenvolverá DH e a idade aproximada em que os primeiros sintomas aparecerão Uma pequena porção da sequência codificadora da porção aminoterminal do gene da DH de 3143 códons é mostrada a seguir A sequência de nucleotídeos do DNA está mostrada em preto a sequência de aminoácidos correspondente ao gene está mostrada em azul e a repetição CAG está sombreada Uti lizando a Figura 277 para traduzir o código genético desenhe um teste com base em PCR para DH utilizando uma amostra de sangue Presuma que o oligonucleotídeo iniciador da PCR deva ter 25 nucleotídeos de comprimento Por convenção a menos que seja especificada uma sequência de DNA codificadora de uma proteína é mostrada com a fita codificadora a sequência idêntica ao mRNA transcrito desse gene superior que é lida de 59 para 39 da esquerda para a direita ATGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC M 307 1 A T L E K L M K A F E S L K S CAGCAGTTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG Q 358 18 Q F Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q F CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCG Q 409 35 Q Q Q Q Q Q Q Q P P P P P P P P CCGCCTCCTCAGCTTCCTCAGCCGCCGCCG P 460 52 P P Q L P Q P P P Fonte The Huntingtons Disease Collaborative Research Group 1993 A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntingtons disease chro mosomes Cell 72 971983 6 Utilizando PCR para detectar moléculas de DNA cir cular Em uma espécie de protista ciliado um segmento do DNA genômico é algumas vezes excluído A exclusão é uma reação geneticamente programada associada à reprodução ce lular Um pesquisador propôs a exclusão do DNA em um tipo de recombinação chamada de recombinação sítioespecífica em que ambas as extremidades do segmento de DNA se ligam e o DNA excluído acaba formando um produto de reação de DNA circular reação proposta Sugira como o pesquisador poderia utilizar a reação em cadeia da polimerase PCR para detectar a presença da forma circu lar do DNA excluído em um extrato do protista 7 Plantas brilhantes Quando cresce em solo comum de jardim e com abastecimento de água normal uma planta mo dificada geneticamente para expressar a proteína fluorescen te verde ver Figura 916 brilhará no escuro enquanto uma planta modificada geneticamente para expressar luciferase de vagalume não ficará brilhante Explique essas observações 8 Desenhando oligonucleotídeos iniciadores para PCR Uma fita de uma sequência de DNA cromossomal é mos trada na parte superior da próxima coluna Um investigador deseja amplificar e isolar um fragmento de DNA definido pelo segmento mostrado em vermelho utilizando a reação em ca deia da polimerase Desenhe dois oligonucleotídeos iniciadores de PCR cada com 20 nucleotídeos de comprimento que pos sam ser utilizados para amplificar esse segmento de DNA 9 Mapeando um segmento de cromossomo Um grupo de clones sobrepostos denominados de A a F é isolado de uma região de um cromossomo Cada um dos clones é clivado sepa radamente por uma enzima e os fragmentos são separados por eletroforese em gel de agarose com os resultados apresenta dos a seguir Há nove fragmentos de restrição diferentes nessa região do cromossomo com um subconjunto aparecendo em cada clone Utilizando essa informação deduza a ordem dos fragmentos de restrição no cromossomo Eletroforese A B C D E F Nove fragmentos de restrição 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Clones sobrepostos 10 Imunofluorescência No protocolo mais comum para de tecção por imunofluorescência de proteínas celulares um inves tigador utiliza dois anticorpos O primeiro se liga especificamente à proteína de interesse O segundo é marcado com fluorocromos para facilitar a visualização e se liga ao primeiro anticorpo Em princípio seria possível simplesmente marcar o primeiro anticor po e pular uma etapa Por que utilizar dois anticorpos sucessivos 11 Análise duplohíbrido em leveduras Você é um pes quisador que acaba de descobrir uma nova proteína em um fungo Planeje um experimento de duplohíbrido em leveduras para identificar as outras proteínas na célula do fungo com as quais sua proteína interage e explique como isso pode ajudálo a determinar a função da sua proteína 12 Uso da fotolitografia para fazer um microarranjo de DNA A Figura 922 mostra os primeiros passos no proces so de produção de um microarranjo ou chip de DNA usando Nelson6edbookindb 354 Nelson6edbookindb 354 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 355 fotolitografia Descreva os próximos passos necessários para a obtenção das sequências desejadas sequência de quatro nucleotídeos diferentes em cada um dos quatro pontos mos trada no primeiro painel da figura Após cada etapa mostre a sequência de nucleotídeos resultante ligada a cada posição 13 Sequenciamento genômico Em grandes projetos de sequenciamento genômico os dados iniciais geralmente reve lam lacunas onde não foi obtida nenhuma informação sobre a sequência Para fechar essas lacunas oligonucleotídeos inicia dores de DNA complementares à fita de extremidade 59 ie idêntica à sequência da fita de extremidade 39 na extremidade de cada contig são extremamente úteis Explique como esses oli gonucleotídeos iniciadores podem ser utilizados 14 Uso de grupos externos em genômica comparativa Uma proteína hipotética é encontrada em orangotangos chim panzés e seres humanos com as seguintes sequências verme lho indica as diferenças de resíduos de aminoácidos Humano ATSAAGYDEWEGGKVLIHL KLQNRGALL ELDIGAV Orangotango ATSAAGWDEWEGGKVLIHLDGKLQNRGALL ELDIGAV Chimpanzé ATSAAGWDEWEGGKILIHLDGKLQNRGALL ELDIGAV Traços indicam uma exclusão os resíduos estão faltando nessa sequência Qual é a sequência mais provável da proteína presente no último ancestral comum de chimpanzés e seres humanos 15 Encontrando genes de doenças Você é um ca çador de genes tentando encontrar a base genética de uma doença hereditária rara O exame de seis linhagens de fa mílias afetadas pela doença fornece resultados inconsistentes Para duas das famílias a doença é coherdada com marcadores no cromossomo 7 Para as outras quatro famílias a doença é coherdada com marcadores no cromossomo 12 Explique como isso pode ocorrer Problema de análise de dados 16 HincII A primeira endonuclease de restrição A descoberta da primeira endonuclease de restrição e o seu uso prático foram descritos em dois artigos científicos publicados em 1970 No primeiro trabalho Smith e Wilcox descreveram o isolamento de uma enzima que clivava o DNA de fita dupla Eles inicialmente demonstraram a atividade de nuclease da en zima medindo a redução da viscosidade de amostras de DNA tratadas com essa enzima a Por que o tratamento com a nuclease reduz a viscosida de de uma solução de DNA Os autores determinaram se a enzima era uma endo ou exonuclease por meio do tratamento da enzima com DNA mar cado com P 32 e em seguida adicionando ácido tricloroacético TCA Nessas condições utilizadas em seus experimentos os nucleotídeos livres são solúveis em TCA enquanto os oligonu cleotídeos precipitam b Não se formou nenhum material marcado com P 32 solú vel em TCA após o tratamento do DNA marcado com P 32 com a nuclease Com base nesse resultado essa enzima é uma endo ou exonuclease Justifique sua argumentação Quando um po linucleotídeo é clivado o fosfato geralmente não é removido e permanece ligado na extremidade 59 ou 39 do fragmento de DNA resultante Smith e Wilcox determinaram a localização do fos fato no fragmento formado pela nuclease nas seguintes etapas 1 Tratar o DNA não marcado com a nuclease 2 Tratar uma amostra A do produto com gP 32ATP e polinucleotídeo cinase que pode ligar o gfosfato do ATP a uma 59OH mas não para um 59fosfato ou para 39OH ou 39fosfato Medir a quantidade de P 32 incor porado no DNA 3 Tratar outra amostra B do produto da etapa 1 com fosfatase alcalina que remove grupos fosfato das ex tremidades 59 e 39 livres seguida por polinucleotídeo cinase e gP 32ATP Medir a quantidade de P 32 incorpo rado no DNA c Smith e Wilcox descobriram que a amostra A tinha 136 contagensminuto de P 32 a amostra B tinha 3740 contagensmi nuto A clivagem pela nuclease deixou o fosfato na extremidade 59 ou 39 dos fragmentos de DNA Justifique sua argumentação d O tratamento do DNA do bacteriófago T7 com a nucle ase gerou cerca de 40 fragmentos específicos de comprimentos variados Como esse resultado pode ser consistente com o fato de a enzima reconhecer uma sequência específica no DNA em vez de realizar uma clivagem da fita dupla em regiões aleatórias Nesse ponto havia duas possibilidades para a clivagem sí tioespecífica a clivagem poderia ocorrer no sítio de reconhe cimento 1 ou próxima ao sítio de reconhecimento 2 mas não dentro da sequência reconhecida Para direcionar essa investigação Kelly e Smith determinaram a sequência das ex tremidades 59 dos fragmentos de DNA gerados pela nuclease nas seguintes etapas 1 Tratar o DNA do fago T7 com a enzima 2 Tratar os fragmentos resultantes com fosfatase alcalina para remover os fosfatos das extremidades 59 3 Tratar os fragmentos desfosforilados com polinucleotí deo cinase e gP 32ATP para marcar as extremidades 59 4 Tratar as moléculas marcadas com DNases para que brálas em uma mistura de mono bi e trinucleotídeos 5 Determinar a sequência dos mono bi e trinucleotídeos marcados comparandoos com oligonucleotídeos de se quência conhecida por cromatografia de camada delgada Os produtos marcados foram identificados como mononu cleotídeos A e G dinucleotídeos 59 ApA 39 e 59 GpA 39 trinucleotídeos 59 ApApC 39 e 59 GpApC 39 e Qual modelo de clivagem é consistente com esses re sultados Explique sua argumentação Kelly e Smith tentaram determinar a sequência das extre midades 39 dos fragmentos Constataram uma mistura de 59 TpC 39 e 59TpT 39 Eles não determinaram a sequência de nenhum dos trinucleotídeos na extremidade 39 f Com base nesses dados qual é a sequência de reconhe cimento para a nuclease e em qual ponto na sequência o esque leto de DNA é clivado Utilize a Tabela 92 como modelo para sua resposta Referências Kelly TJ Smith HO 1970 A restriction enzyme from Haemophilus influenzae II Base sequence of the recognition site J Mol Biol 51 393409 Smith HO Wilcox KW 1970 A restriction enzyme from Haemophilus influenzae I Purification and general properties J Mol Biol 51 379391 Nelson6edbookindb 355 Nelson6edbookindb 355 020414 1845 020414 1845 Nelson6edbookindb 356 Nelson6edbookindb 356 020414 1845 020414 1845 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 101 Lipídeos de armazenamento 357 102 Lipídeos estruturais em membranas 362 103 Lipídeos como sinalizadores cofatores e pigmentos 370 104 Trabalhando com lipídeos 377 O s lipídeos biológicos são um grupo de compostos qui micamente diversos cuja característica em comum que os define é a insolubilidade em água As funções biológicas dos lipídeos são tão diversas quanto a sua quími ca Gorduras e óleos são as principais formas de armazena mento de energia em muitos organismos Os fosfolipídeos e os esteróis são os principais elementos estruturais das membranas biológicas Outros lipídeos embora presentes em quantidades relativamente pequenas desempenham papéis cruciais como cofatores enzimáticos transportado res de elétrons pigmentos fotossensíveis âncoras hidrofó bicas para proteínas chaperonas para auxiliar no enovela mento de proteínas de membrana agentes emulsificantes no trato digestivo hormônios e mensageiros intracelulares Este capítulo apresenta os lipídeos mais representativo de cada um dos tipos de lipídeos organizados de acordo com suas funções com ênfase na estrutura química e nas pro priedades físicas Embora a discussão siga uma organiza ção funcional os milhares de lipídeos diferentes também podem ser organizados em oito categorias gerais de acordo com sua estrutura química ver Tabela 103 A geração de energia pela oxidação de lipídeos será abordada no Capítu lo 17 e sua síntese no Capítulo 21 101 Lipídeos de armazenamento As gorduras e os óleos utilizados de modo quase univer sal como formas de armazenamento de energia nos orga nismos vivos são derivados de ácidos graxos Os ácidos graxos são derivados de hidrocarbonetos com estado de oxidação quase tão baixo ou seja altamente reduzido quanto os hidrocarbonetos nos combustíveis fósseis A oxidação celular de ácidos graxos a CO2 e H2O assim como a combustão controlada e rápida de combustíveis fósseis em motores de combustão interna é altamente exergônica Neste capítulo são apresentadas as estruturas e a no menclatura dos ácidos graxos mais encontrados em orga nismos vivos Dois tipos de compostos que contêm ácidos graxos os triacilgliceróis e as ceras são descritos para ilus trar a diversidade de estrutura e propriedades físicas dessa família de compostos Os ácidos graxos são derivados de hidrocarbonetos Os ácidos graxos são ácidos carboxílicos com cadeias hidro carbonadas de comprimento variando de 4 a 36 carbonos C4 a C36 Em alguns ácidos graxos essa cadeia é totalmen te saturada não contém ligações duplas e não ramificada em outros a cadeia contém uma ou mais ligações duplas Tabela 101 Alguns poucos contêm anéis de três carbo nos grupos hidroxila ou ramificações de grupos metila CONVENÇÃOCHAVE Uma nomenclatura simplificada para áci dos graxos não ramificados especifica o comprimento da cadeia e o número de ligações duplas separados por dois pontos Figura 101a por exemplo o ácido palmítico saturado e com 16 carbonos é abreviado 160 e o ácido 10 Lipídeos O 1 2 3 4 9 10 18 a 2O a 181D9 ácido cis9octadecenoico b 205D58111417 ácido eicosapentaenoico EPA um ácido graxo ômega3 C O 1 2 3 4 5 6 a v 2O C 7 8 9 10 11 12 13 14 15 7 6 16 17 18 20 4 5 3 2 19 1 FIGURA 101 Duas convenções para a nomenclatura de ácidos gra xos a A nomenclaturapadrão designa o número 1 para o carbono da car boxila C1 e a letra a para o carbono ligado a ele Cada segmento linear em ziguezague representa uma ligação simples entre carbonos adjacentes As posições de quaisquer ligações duplas são indicadas pelo D seguido de um número sobrescrito que indica o carbono de número mais baixo na ligação dupla b Para ácidos graxos poliinsaturados uma convenção alternativa numera os carbonos na direção oposta designando o número 1 ao carbono da metila na outra extremidade da cadeia este carbono também é desig nado v ômega a última letra do alfabeto grego As posições das ligações duplas são indicadas em relação ao carbono v Nelson6ed10indd 357 Nelson6ed10indd 357 020514 1715 020514 1715 358 DAVID L NELSON MICHAEL M COX oleico com 18 carbonos e uma ligação dupla é 181 A po sição de qualquer ligação dupla é especificada em relação ao carbono carboxílico o qual recebe o número 1 pelos nú meros sobrescritos ao D delta um ácido graxo com 20 carbonos e uma ligação dupla entre C9 e C10 sendo C1 o carbono da carboxila e outra entre C12 e C13 é desig nado 202D 912 Os ácidos graxos de ocorrência mais comum apresen tam um número par de átomos de carbono em uma cadeia não ramificada de 12 a 24 carbonos Tabela 101 Como será visto no Capítulo 21 o número par de carbonos resul ta do modo como esses compostos são sintetizados o que envolve condensações sucessivas de unidades de dois car bonos acetato Também há um padrão comum na localização das li gações duplas na maioria dos ácidos graxos monoinsatu rados a ligação dupla ocorre entre C9 e C10 D 9 e as outras ligações duplas dos ácidos graxos poliinsaturados geralmente são D 12 e D 15 O ácido araquidônico é uma exceção a essa generalização As ligações duplas dos ácidos graxos poliinsaturados quase nunca são conju gadas alternando ligações simples e duplas como em CHCHCHCH mas são separadas por um grupo metileno CHCHCH2CHCH Figura 101b Em quase todos os ácidos graxos insaturados que ocorrem naturalmente as ligações duplas encontramse em confi guração cis Ácidos graxos trans são produzidos pela fer mentação no rúmen de animais leiteiros e são obtidos dos laticínios e da carne TABELA 101 Alguns ácidos graxos que ocorrem naturalmente estrutura propriedades e nomenclatura Esqueleto de carbono Estrutura Nome sistemático Nome comum derivação Ponto de fusão C Solubilidade a 30C mgg solvente Água Benzeno 120 CH3CH210COOH Ácido ndodecanoico Ácido láurico do latim laurus árvore de louro 442 0063 2600 140 CH3CH212COOH Ácido ntetradecanoico Ácido mirístico do latim Myristica gênero da noz moscada 539 0024 874 160 CH3CH214COOH Ácido nhexadecanoico Ácido palmítico do latim palma palmeira 631 00083 348 180 CH3CH216COOH Ácido noctadecanoico Ácido esteárico do grego stear gordura dura 696 00034 124 200 CH3CH218COOH Ácido neicosanoico Ácido araquídico do latim Arachis gênero de legu minosa 765 240 CH3CH222COOH Ácido ntetracosanoico Ácido lignocérico do latim lignum madeira 1 cera 860 161D 9 CH3CH25CH CH CH27COOH Ácido cis9hexadece noico Ácido palmitoleico 1 a 05 181D 9 CH3CH27CH CH CH27COOH Ácido cis9octadece noico Ácido oleico do latim oleum óleo 134 182D 912 CH3CH24CH CHCH2 CH CHCH27COOH Ácido ciscis912 octadecadienoico Ácido linoleico do grego linon linho 15 183D 91215 CH3CH2CH CHCH2CH CHCH2CH CHCH27COOH Ácido cisciscis912 15octadecatrienoico Ácido alinolênico 11 204D 58 1114 CH3CH24CH CHCH2 CH CHCH2CH CHCH2 CH CHCH23COOH Ácido cisciscis cis5811 14eicosa tetraenoico Ácido araquidônico 495 Todos os ácidos estão apresentados em sua forma não ionizada Em pH 7 todos os ácidos graxos livres apresentam um carboxilato ionizado Observe que a numera ção dos átomos de carbono começa no carbono do carboxila O prefixo n indica a estrutura normal não ramificada Por exemplo dodecanoico simplesmente indica 12 átomos de carbono os quais poderiam estar dispos tos em várias formas ramificadas ndodecanoico especifica a forma linear não ramificada Para ácidos graxos insaturados a configuração de cada ligação dupla está indicada em ácidos graxos biológicos a configuração é quase sempre cis Nelson6edbookindb 358 Nelson6edbookindb 358 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 359 CONVENÇÃOCHAVE A família de ácidos graxos poliinsa turados AGPI com uma ligação dupla entre o terceiro e o quarto carbono a partir da extremidade da cadeia com grupo metila é de importância especial na nutrição humana Como o papel fisiológico dos ácidos graxos poliinsaturados está relacionado mais à posição da primeira ligação dupla próxima à extremidade da cadeia com o grupo metila em vez da extremidade contendo a carboxila uma nomencla tura alternativa algumas vezes é utilizada para esses ácidos graxos O carbono do grupo metila isto é o carbono mais distante do grupo carboxila é chamado de carbono v e recebe o número 1 Figura 101b Nessa convenção os áci dos graxos poliinsaturados com uma ligação dupla entre C3 e C4 são chamados de ácidos graxos ômega3 v3 e aqueles com a ligação dupla entre C6 e C7 são ácidos graxos ômega6 v6 Embora os seres humanos não disponham da capacida de de sintetizar o ácido ômega3AGPIalinolênico ALA 183 D 91215 na convenção padrão ele é necessário e portanto deve ser obtido a partir da dieta A partir do ALA os seres humanos podem sintetizar dois outros AGPI ômega3 importantes no funcionamento celular o ácido eicosapentae noico EPA 205D 58111417 mostrado na Figura 101b e o ácido docosaexaenoico DHA 226D 4710131619 Um dese quilíbrio entre os AGPI ômega6 e ômega3 na dieta está asso ciado a um risco aumentado de doenças cardiovasculares A proporção ótima de AGPI ômega6 para ômega3 na dieta está entre 11 e 41 mas a proporção nas dietas da maioria dos norteamericanos está mais próxima de 101 a 301 A dieta mediterrânea que tem sido associada com a diminui ção do risco de doenças cardíacas é mais rica em AGPI ôme ga3 obtidos em vegetais folhosos saladas e óleos de peixe Esses óleos são especialmente ricos em EPA e DHA e suple mentos com óleo de peixe são frequentemente prescritos para indivíduos com histórico de doença cardiovascular As propriedades físicas dos ácidos graxos e dos compos tos que os contêm são determinadas em grande parte pelo comprimento e pelo grau de insaturação da cadeia hidrocar bonada A cadeia hidrocarbonada apolar é responsável pela baixa solubilidade dos ácidos graxos na água O ácido láuri co 120 Mr 200 por exemplo tem solubilidade em água de 0063 mgg muito menor do que a da glicose Mr 180 que é de 1100 mgg Quanto mais longa for a cadeia acila do ácido graxo e quanto menos ligações duplas ela tiver mais baixa é a solubilidade em água O grupo ácido carboxílico é polar e ionizado em pH neutro e conta para a pequena solubilidade dos ácidos graxos de cadeia curta em água Os pontos de fusão também são muito influenciados pelo comprimento e grau de insaturação da cadeia hidrocarbona da À temperatura ambiente 25C os ácidos graxos satu rados de 120 a 240 têm consistência de cera enquanto os ácidos graxos insaturados de mesmo comprimento são líqui dos oleosos Essa diferença nos pontos de fusão devese a diferentes graus de empacotamento das moléculas dos áci dos graxos Figura 102 Nos compostos completamente saturados a rotação livre em torno de cada ligação carbono carbono dá grande flexibilidade à cadeia hidrocarbonada a conformação mais estável é a forma completamente esten dida na qual o impedimento estérico dos átomos vizinhos é minimizado Essas moléculas podem agruparse de forma compacta em arranjos quase cristalinos com os átomos ao longo de todo o seu comprimento em interações de van der Waals com os átomos de moléculas vizinhas Em ácidos gra xos insaturados uma ligação dupla cis força uma dobra na cadeia hidrocarbonada Ácidos graxos com uma ou várias dessas dobras não podem agruparse tão firmemente quanto os ácidos graxos totalmente saturados e as interações en tre eles são portanto mais fracas Como é necessário menos energia térmica para desordenar esses arranjos fracamente ordenados dos ácidos graxos insaturados eles têm pontos de fusão consideravelmente mais baixos que os ácidos graxos saturados de mesmo comprimento de cadeia Tabela 101 Em vertebrados os ácidos graxos livres ácidos graxos não esterificados com um grupo carboxilato livre circulam no sangue ligados de modo não covalente a uma proteína carreadora a albumina sérica No entanto os ácidos graxos estão presentes no plasma sanguíneo principalmente como derivados do ácido carboxílico como ésteres ou amidas Devido à ausência do grupo carboxilato carregado esses derivados de ácidos graxos geralmente são ainda menos so lúveis em água do que os ácidos graxos livres a Grupo carboxil Cadeia hidrocarbonada C 2O O b C 2O O c Ácidos graxos saturados d Mistura de ácidos graxos saturados e insaturados FIGURA 102 O empacotamento de ácidos graxos em agregados estáveis A extensão do empacotamento depende do grau de saturação a Duas representações do ácido esteárico completamente saturado 180 estearato em pH 7 em sua conformação normal estendida b A ligação dupla cis em vermelho no ácido oleico 181D 9 oleato restringe a rotação e introduz uma dobra rígida na cauda hidrocarbonada Todas as outras liga ções na cadeia estão livres para rotação c Os ácidos graxos completamente saturados na forma estendida empacotamse em arranjos quase cristalinos estabilizados por muitas interações hidrofóbicas d A presença de um ou mais ácidos graxos com ligações duplas cis em vermelho interfere nesse agrupamento compacto e resulta em agregados menos estáveis Nelson6edbookindb 359 Nelson6edbookindb 359 020414 1845 020414 1845 360 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os triacilgliceróis são ésteres de ácidos graxos do glicerol Os lipídeos mais simples construídos a partir de ácidos gra xos são os triacilgliceróis também chamados de trigli cerídeos gorduras ou gorduras neutras Os triacilgliceróis são compostos por três ácidos graxos cada um em ligação éster com uma molécula de glicerol Figura 103 Aque les que contêm o mesmo tipo de ácido graxo em todas as três posições são chamados de triacilgliceróis simples e sua nomenclatura é derivada do ácido graxo que contêm Os triacilgliceróis simples de 160 180 e 181 por exemplo são tripalmitina triestearina e trioleína respectivamente A maioria dos triacilgliceróis de ocorrência natural é mista pois contém dois ou três ácidos graxos diferentes Para dar nome a esses compostos sem gerar ambiguidade o nome e a posição de cada ácido graxo devem ser especificados Como as hidroxilas polares do glicerol e os carboxila tos polares dos ácidos graxos estão em ligações éster os triacilgliceróis são moléculas apolares hidrofóbicas essen cialmente insolúveis em água Os lipídeos têm densidades específicas mais baixas do que a água o que explica por que as misturas de óleo e água p ex tempero de salada com azeite e vinagre têm duas fases o óleo com densidade es pecífica mais baixa flutua sobre a fase aquosa Os triacilgliceróis armazenam energia e proporcionam isolamento térmico Na maioria das células eucarióticas os triacilgliceróis for mam uma fase separada de gotículas microscópicas de óleo no citosol aquoso servindo como depósitos de combustível metabólico Em vertebrados os adipócitos células especia lizadas armazenam grandes quantidades de triacilgliceróis em gotículas de gordura que quase preenchem a célula Fi gura 104a Os triacilgliceróis também são armazenados como óleos nas sementes de vários tipos de plantas for necendo energia e precursores biossintéticos durante a germinação da semente Figura 104b Os adipócitos e as sementes em germinação contêm lipases enzimas que ca talisam a hidrólise dos triacilgliceróis armazenados liberan do ácidos graxos para serem transportados para os locais onde são necessários como combustível Existem duas vantagens significativas em se usar tria cilgliceróis para o armazenamento de combustível em vez de polissacarídeos como o glicogênio e o amido Primeiro os átomos de carbono dos ácidos graxos estão mais reduzi C O O 1CH2 3 2 O C O H CH2 O C O 1estearoil 2linoleoil 3palmitoil glicerol um triacilglicerol misto Glicerol HO CH2 OH H CH2 OH C C 1 3 2 FIGURA 103 O glicerol e um triacilglicerol O triacilglicerol misto mos trado aqui tem três ácidos graxos diferentes ligados à cadeia do glicerol Quando o glicerol apresenta ácidos graxos diferentes em C1 e C3 o C2 é um centro quiral p 17 125 mm a 3 mm b FIGURA 104 Depósitos de gordura nas células a Secção transversal de tecido adiposo branco de humanos Cada célula contém uma gotícula de gordura branco tão grande que espreme o núcleo corado em verme lho contra a membrana plasmática b Secção transversal de uma célula de cotilédone de uma semente da planta Arabidopsis As estruturas grandes e escuras são corpos proteicos que estão rodeados por gordura de armazena mento nos corpos oleosos de coloração clara Nelson6edbookindb 360 Nelson6edbookindb 360 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 361 dos do que os dos açúcares e a oxidação de um grama de triacilgliceróis libera mais do que o dobro de energia do que a oxidação de um grama de carboidratos Segundo como os triacilgliceróis são hidrofóbicos e portanto não hidra tados o organismo que carrega gordura como combustível não precisa carregar o peso extra da água da hidratação que está associada aos polissacarídeos armazenados 2 g por grama de polissacarídeo Os seres humanos apresentam tecido adiposo composto principalmente por adipócitos sob a pele na cavidade abdominal e nas glândulas mamá rias As pessoas moderadamente obesas com 15 a 20 kg de triacilgliceróis depositados em seus adipócitos poderiam suprir suas necessidades energéticas por meses utilizan do seus depósitos de gordura Em contrapartida o corpo humano consegue armazenar na forma de glicogênio me nos do que a quantidade de energia utilizada em um dia Os carboidratos como a glicose oferecem certas vantagens como fontes rápidas de energia metabólica uma das quais é a sua solubilidade imediata em água Em alguns animais os triacilgliceróis armazenados sob a pele servem tanto de es toques de energia quanto de isolamento contra baixas tem peraturas Focas morsas pinguins e outros animais polares de sangue quente apresentam sua superfície amplamente coberta por triacilgliceróis Em animais hibernantes como os ursos as enormes reservas de energia acumuladas antes da hibernação servem para dois propósitos isolamento tér mico e reserva de energia ver Quadro 171 A hidrogenação parcial dos óleos de cozinha produz ácidos graxos trans A maioria das gorduras naturais como as dos óleos vegetais dos laticínios e da gordura animal são mistu ras complexas de triacilgliceróis simples e mistos que con têm uma variedade de ácidos graxos que diferem no com primento da cadeia e no grau de saturação Figura 105 Os óleos vegetais como o óleo de milho e o azeite de oliva são compostos em grande parte por triacilgliceróis com áci dos graxos insaturados e portanto são líquidos à tempera tura ambiente Os triacilgliceróis que contêm somente áci dos graxos saturados como a triestearina o componente mais importante da gordura da carne bovina são sólidos brancos e gordurosos à temperatura ambiente Quando alimentos ricos em lipídeos são expostos por muito tempo ao oxigênio do ar eles podem estragar e tornaremse rançosos O gosto e o cheiro desagradáveis associados à rancidez resultam da clivagem oxidativa das ligações duplas em ácidos graxos insaturados que produz aldeídos e ácidos carboxílicos de menor comprimento de cadeia e portanto de maior volatilidade esses compostos se dispersam prontamente pelo ar até o seu nariz Para au mentar o prazo de validade de óleos vegetais de cozinha e para aumentar a sua estabilidade às altas temperaturas utilizadas na fritura os óleos vegetais são preparados por hidrogenação parcial Esse processo converte muitas das ligações duplas cis dos ácidos graxos em ligações simples e aumenta o ponto de fusão dos óleos de forma que eles fi cam mais próximos do estado sólido à temperatura ambien te a margarina é produzida assim a partir de óleo vegetal A hidrogenação parcial tem outro efeito indesejado algu mas ligações duplas cis são convertidas em ligações duplas trans Hoje existem fortes evidências de que o consumo de ácidos graxos trans pela dieta frequentemente chamados de gorduras trans leva a uma maior incidência de doen ças cardiovasculares e que evitar essas gorduras na dieta reduz consideravelmente o risco de doenças cardíacas Os ácidos graxos trans da dieta aumentam o nível de triacilgli ceróis e de colesterol LDL o colesterol ruim no sangue e diminuem o nível de colesterol HDL o colesterol bom Essas mudanças por si só são suficientes para aumentar o risco de doenças cardíacas mas podem ter mais efeitos ad versos Parecem por exemplo aumentar a resposta infla matória do corpo o que é outro fator de risco para doenças cardíacas Ver no Capítulo 21 uma descrição do colesterol LDL e HDL lipoproteína de baixa e de alta densidade e seus efeitos na saúde Muitos alimentos em fastfoods são fritos em óleos ve getais parcialmente hidrogenados e portanto contêm al tos níveis de ácidos graxos trans Tabela 102 Em vista dos efeitos prejudiciais dessas gorduras alguns países Dinamarca e algumas cidades Nova York e Filadélfia restringiram com severidade o uso de óleos parcialmente hidrogenados em restaurantes Batatas fritas preparadas em restaurantes de fastfood na Dinamarca agora contêm quantidades quase indetectáveis de ácidos graxos trans enquanto o mesmo produto preparado nos Estados Unidos contém de 5 a 10 g de ácidos graxos trans por porção Ta bela 102 Os efeitos deletérios das gorduras trans ocor rem no consumo de 2 a 7 gdia 20 a 60 kcal no consumo calórico diário de 2000 kcal note que uma caloria nutricio nal é equivalente à quilocaloria usada por químicos e bio químicos então uma dieta de 2000 calorias é equivalente a uma dieta de 2000 kcal Uma única porção de batatas fritas em um restaurante estadunidense pode conter essa quantidade de ácidos graxos trans Muitos outros alimentos prontos assados e lanches nas prateleiras de supermerca dos contêm níveis comparativamente altos de ácidos graxos trans Ácidos graxos do total Gorduras naturais a 25C Azeite de oliva líquido Manteiga sólido mole Gordura da carne bovina sólido duro 20 40 60 80 100 C16 e C18 saturado C16 e C18 insaturado C4 a C14 saturado FIGURA 105 Composição de ácidos graxos de três gorduras alimen tares Azeite de oliva manteiga e gordura da carne bovina consistem em misturas de triacilgliceróis diferindo em sua composição de ácidos graxos Os pontos de fusão dessas gorduras e portanto o seu estado físico à tem peratura ambiente 25C variam de acordo com sua composição de áci dos graxos O azeite de oliva tem uma alta proporção de ácidos graxos insa turados de cadeia longa C16 e C18 o que explica seu estado líquido a 25C A maior proporção de ácidos graxos saturados de cadeia longa C16 e C18 na manteiga aumenta seu ponto de fusão então a manteiga é um sólido mole à temperatura ambiente A gordura da carne bovina com uma proporção ainda maior de ácidos graxos saturados de cadeia longa é um sólido duro Nelson6edbookindb 361 Nelson6edbookindb 361 020414 1845 020414 1845 362 DAVID L NELSON MICHAEL M COX As ceras servem como reservas de energia e como impermeabilizantes à água As ceras biológicas são ésteres de ácidos graxos saturados e insaturados de cadeia longa C14 a C36 com alcoóis de cadeia longa C16 a C30 Figura 106 Seus pontos de fu são 60 a 100C geralmente são mais altos do que os dos triacilgliceróis No plâncton microrganismos de vida livre na base da cadeia alimentar dos animais marinhos as ceras são a principal forma de armazenamento de combustível metabólico As ceras também servem para uma diversidade de ou tras funções relacionadas às suas propriedades impermea bilizantes e sua consistência firme Certas glândulas da pele de vertebrados secretam ceras para proteger os pelos e a pele e mantêlos flexíveis lubrificados e impermeáveis As aves particularmente as aquáticas secretam ceras por suas glândulas uropigiais para manter suas penas impermeáveis à água As folhas lustrosas do azevinho do rododendro da hera venenosa e de muitas outras plantas tropicais são co bertas por uma camada grossa de ceras que impede a eva poração excessiva de água e as protege contra parasitas As ceras biológicas têm várias aplicações em indústrias como a farmacêutica e a cosmética entre outras A lanolina da lã de cordeiro a cera de abelhas Figura 106 a cera de carnaúba palmeira brasileira e a cera extraída do óleo do cachalote espécie de baleia são amplamente utilizadas na manufatura de loções pomadas e polidores RESUMO 101 Lipídeos de armazenamento c Os lipídeos são componentes celulares insolúveis em água de estruturas diversas que podem ser extraídos dos tecidos por solventes apolares c Quase todos os ácidos graxos os componentes hidro carbonados de muitos lipídeos têm um número par de átomos de carbono geralmente 12 a 24 eles são satu rados ou insaturados com ligações duplas quase sempre na configuração cis c Os triacilgliceróis contêm três moléculas de ácidos gra xos esterificadas aos três grupos hidroxila do glicerol Os triacilgliceróis simples contêm somente um tipo de ácido graxo os mistos contêm dois ou três tipos Eles são principalmente gorduras de reserva estando pre sentes em muitos alimentos c A hidrogenação parcial de óleos vegetais na indústria alimentícia converte algumas ligações duplas cis para a configuração trans Ácidos graxos trans na dieta são um importante fator de risco para doenças cardíacas co ronarianas 102 Lipídeos estruturais em membranas A característica central na arquitetura das membranas bio lógicas é uma dupla camada de lipídeos que atua como bar reira à passagem de moléculas polares e íons Os lipídeos de membrana são anfipáticos uma extremidade da molécula é hidrofóbica e a outra é hidrofílica Suas interações hidrofó bicas entre si e suas interações hidrofílicas com a água di recionam o seu empacotamento em camadas chamadas de bicamadas de membrana Esta seção descreve cinco tipos gerais de lipídeos de membrana glicerofosfolipídeos nos quais as regiões hidrofóbicas são compostas por dois ácidos graxos ligados ao glicerol galactolipídeos e sulfolipídeos que também contêm dois ácidos graxos esterificados com o TABELA 102 Ácidos graxos trans em alguns fastfoods e lanches Conteúdo de ácidos graxos trans Em uma porção típica g Em de ácidos graxos totais Batatas fritas 4761 2836 Hambúrguer de peixe empanado 56 28 Nuggets de frango empanados 50 25 Pizza 11 9 Salgadinhos de milho 16 22 Sonho 27 25 Muffin 07 14 Barra de chocolate 02 2 Fonte Adaptada da Tabela 1 em Mozaffarian D Katan MB Ascherio PH Stampfer MJ Willet WC 2006 Trans fatty acids and cardiovascular disease N Engl J Med 354 16041605 Nota Dados para alimentos preparados com óleo vegetal parcialmente hidroge nado nos Estados Unidos em 2002 CH3CH214 C O O CH2 CH228 CH3 Ácido palmítico a 1Triacontanol b FIGURA 106 Cera biológica a Triacontanoilpalmitato o principal componente da cera de abelha é um éster de ácido palmítico com o álcool triacontanol b Favo de mel construído com cera de abelha firme a 25C e completamente impermeável à água Nelson6edbookindb 362 Nelson6edbookindb 362 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 363 glicerol mas não apresentam os fosfatos característicos dos fosfolipídeos lipídeos tetraéter em arqueia nos quais duas cadeias muito longas de alquilas estão unidas por ligação éter ao glicerol em ambas as extremidades esfingolipídeos nos quais um único ácido graxo está ligado a uma amina graxa a esfingosina e esteróis compostos caracterizados por um sistema rígido de quatro anéis hidrocarbonados fu sionados As porções hidrofílicas nesses compostos anfipáticos podem ser tão simples quanto um único grupo OH em uma extremidade do sistema de anéis do esterol ou po dem ser bem mais complexas Nos glicerofosfolipídeos e alguns esfingolipídeos o grupo cabeça polar está unido à porção hidrofóbica por uma ligação fosfodiéster esses são os fosfolipídeos Outros esfingolipídeos não apresentam fosfato mas têm um açúcar simples ou um oligossacarídeo complexo em suas extremidades polares esses são os glicolipídeos Figura 107 Nesses grupos de lipídeos de membrana uma enorme diversidade resulta de várias combinações de caudas de ácidos graxos e cabeças polares O arranjo desses lipídeos nas membranas e seus papéis estruturais e funcionais são considerados no pró ximo capítulo Os glicerofosfolipídeos são derivados do ácido fosfatídico Os glicerofosfolipídeos também chamados de fosfo glicerídeos são lipídeos de membrana nos quais dois áci dos graxos estão unidos por ligação éster ao primeiro e ao segundo carbono do glicerol e um grupo fortemente polar ou carregado está unido por ligação fosfodiéster ao terceiro carbono O glicerol é próquiral não apresenta carbonos assimétricos mas a ligação de fosfato a uma ex tremidade converteo em um composto quiral que pode ser chamado corretamente de Lglicerol3fosfato Dglice rol1fosfato ou snglicerol3fosfato Figura 108 Os glicerofosfolipídeos são denominados como derivados do composto precursor o ácido fosfatídico Figura 109 de acordo com o álcool polar no grupo cabeça A fosfati dilcolina e a fosfatidiletanolamina têm colina e etanolami na como grupos cabeça polares por exemplo Em todos esses compostos o grupo cabeça está unido ao glicerol por uma ligação fosfodiéster na qual o grupo fosfato tem carga negativa em pH neutro O álcool polar pode estar carregado negativamente assim como no fosfatidilinosi tol45bifosfato neutro fosfatidilserina ou carregado positivamente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina Como será visto no Capítulo 11 essas cargas contribuem de modo significativo para as propriedades de superfície das membranas Como os ácidos graxos nos glicerofosfolipídeos podem ser qualquer um de uma ampla variedade um dado fos folipídeo pex fosfatidilcolina pode consistir em várias Lipídeos de armazenamento neutro Lipídeos de membrana polar Fosfolipídeos Glicolipídeos Triacilgliceróis Glicerofosfolipídeos Esfingolipídeos Esfingolipídeos Álcool Esfingosina Lipídeos éter de arqueias Glicerol Glicerol Ácido graxo Ácido graxo Ácido graxo Ácido graxo Ácido graxo Ácido graxo Ácido graxo Diftanil Ácido graxo Ácido graxo PO4 PO4 PO4 PO4 Colina Esfingosina Glicerol Glicerol Diftanil Glicerol SO4 Glicerol Galactolipídeos sulfolipídeos Mono ou oligossacarídeo Mono ou dissacarídeo ligação éter FIGURA 107 Alguns tipos comuns de lipídeos de armazenamento e de membrana Todos os tipos de lipídeos representados aqui têm ou gli cerol ou esfingosina como esqueleto em cor salmão ao qual estão ligados um ou mais grupos alquila de cadeia longa em amarelo e um grupo cabeça polar em azul Em triacilgliceróis glicerofosfolipídeos galactolipídeos e sul folipídeos os grupos alquilas são ácidos graxos em ligação éster Os esfingo lipídeos contêm um único ácido graxo em ligação amida com o esqueleto de esfingosina Os lipídeos de membrana de arqueias são variáveis aqueles representados aqui têm duas cadeias alquilas muito longas e ramificadas cada extremidade em ligação éter com a porção glicerol Nos fosfolipídeos o grupo cabeça polar está unido por meio de ligação fosfodiéster enquanto os glicolipídeos têm uma ligação glicosídica direta entre o açúcar do grupo cabeça e o esqueleto de glicerol Lglicerol3fosfato snglicerol3fosfato 1CH2OH 2C H HO 3CH2 O O2 O O2 P O HO 1 3 2 HO H O2 O2 O P FIGURA 108 LGlicerol3fosfato o esqueleto dos fosfolipídeos O glicerol por si só não é quiral visto que ele tem um plano de simetria atra vés de C2 No entanto o glicerol é próquiral pode ser convertido em um composto quiral por adição de um substituinte como o fosfato a qualquer um dos grupos CH2OH Uma nomenclatura não ambígua para o glicerol fosfato é o sistema D L descrito na p 78 no qual os isômeros são denomi nados de acordo com suas relações estereoquímicas aos isômeros do glice raldeído Por este sistema o estereoisômero do glicerolfosfato encontrado na maioria dos lipídeos é corretamente denominado Lglicerol3fosfato ou Dglicerol1fosfato Outra forma para especificar estereoisômeros é o siste ma sn número estereoespecífico no qual C1 é por definição o grupo do composto próquiral que ocupa a posição próS A forma comum de glice rolfosfato em fosfolipídeos é por esse sistema snglicerol3fosfato e que C2 está na configuração R Em arqueias o glicerol nos lipídeos está na outra configuração ou seja Dglicerol3fosfato Nelson6edbookindb 363 Nelson6edbookindb 363 020414 1845 020414 1845 364 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O Acido graxo saturado Glicerol p ex Acido palmitico ox Acido graxo insaturado 0 Grupo cabeca p ex Acido oleico substituinte Acidos graxos Nome do Carga liquida glicerofosfolipideo Nome do XO Formula do grupo X em pH 7 Acido fosfatidico H 2 Fosfatidiletanolamina Etanolamina SNH Fosfatidilcolina Colina ps 0 O Fosfatidilserina Serina Kho 1 Lt NH Fosfatidilgl I Gl I HO tidilali s 4 osfatidilglicero icero on OH OPo3 Fosfatidilinositol45bisfosfato mioinositol45bisfosfato Vr 4 OH HO H Cardiolipi Fosfatidilgli I l i 2 aralolipina osratidliglicero Ron O FIGURA 109 Glicerofosfolipideos Os glicerofosfolipideos comuns sioNa cardiolipina dois acidos fosfatidicos compartilham um Unico glicerol R e diacilglicerdis ligados a grupos alcool por ligagao fosfodiéster O acido fosfa R so grupos acil graxos Observe que cada um dos ésteres de fosfato no tidico um fosfomonoéster o composto precursor Cada derivado é deno fosfatidilinositol45bisfosfato tem uma carga de cerca de 15 um de seus minado de acordo com o grupo alcool X cabega com o prefixo fosfatidil grupos OH esta apenas parcialmente ionizado em pH 70 espécies moleculares cada qual com seu complemento Alguns glicerofosfolipideos tém acidos graxos unico de acidos graxos A distribuigao de espécies mole li 50 ét culares é especifica para diferentes organismos diferentes m ligacao eter tecidos do mesmo organismo e diferentes glicerofosfolipi Alguns tecidos animais e organismos unicelulares sao ricos deos na mesma célula ou tecido Em geral os glicerofos em lipideos éter nos quais uma das duas cadeias de acila folipideos contém um acido graxo saturado CouCem esta unida ao glicerol em ligagao éter em vez de éster A ca C1 e um Acido graxo insaturado C 0U Cy em C2 Com deia com ligacao éter pode ser saturada como nos lipideos poucas excecées 0 significado biol6gico da variagéo dos éter de alquila ou pode conter uma ligagao dupla entre C1 Acidos graxos e dos grupos cabeca ainda nao esté com e C2 como nos plasmalogénios Figura 1010 O teci preendido do cardiaco de vertebrados é especialmente rico em lipideos PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 365 éter cerca de metade dos fosfolipídeos do coração é plas malogênio As membranas de bactérias halofílicas protistas ciliados e de certos invertebrados também contêm altas pro porções de lipídeos éter O significado funcional dos lipídeos éter nessas membranas é desconhecido talvez sua resistên cia às fosfolipases que clivam ácidos graxos com ligação éster de lipídeos de membrana seja importante em alguns casos Ao menos um lipídeo éter o fator ativador de pla quetas é um potente sinalizador molecular Ele é li berado de leucócitos chamados basófilos e estimula a agre gação de plaquetas e a liberação de serotonina um vasoconstritor das plaquetas Também exerce vários efei tos no fígado no músculo liso no coração nos tecidos ute rinos e pulmonares desempenhando também um importan te papel na inflamação e na resposta alérgica Os cloroplastos contêm galactolipídeos e sulfolipídeos O segundo grupo de lipídeos de membrana é aquele que pre domina nas células vegetais os galactolipídeos nos quais um ou dois resíduos de galactose estão conectados por uma ligação glicosídica ao C3 de um 12diacilglicerol Figura 1011 ver também Figura 107 Os galactolipídeos estão localizados nas membranas dos tilacoides membranas in ternas dos cloroplastos eles compõem de 70 a 80 do to tal dos lipídeos de membrana de uma planta vascular e são provavelmente os lipídeos de membrana mais abundantes na biosfera O fosfato frequentemente é o nutriente limitan te das plantas no solo talvez a pressão evolutiva para con servar fosfato para papéis mais críticos tenha favorecido as plantas que produzem lipídeos sem fosfato As membranas das plantas também contêm sulfolipídeos nos quais um re síduo de glicose sulfonado está unido a um diacilglicerol em ligação glicosídica O grupo sulfonato apresenta uma carga negativa como aquela do grupo fosfato em fosfolipídeos Arqueias contêm lipídeos de membrana únicos Algumas arqueias que vivem em nichos ecológicos em con dições extremas altas temperaturas água em ebulição baixo pH alta força iônica por exemplo têm lipídeos de membrana que contêm hidrocarbonetos de cadeia longa 32 carbonos ramificada ligados em cada extremidade ao gli cerol Figura 1012 por meio de ligações éter muito mais estáveis à hidrólise em pH baixo e à alta temperatura do que as ligações éster encontradas nos lipídeos das bactérias e dos eucariotos Em sua fórmula completamente esten dida os lipídeos éster de arqueias apresentam o dobro do comprimento dos fosfolipídeos e esfingolipídeos e podem transpassar a largura total da membrana plasmática Em FIGURA 1010 Lipídeos éter Os plasmalogênios têm uma ca deia alquenila em ligação éter em que a maioria dos glicerofos folipídeos tem um ácido graxo em ligação éster compare com a Figura 109 O fator ativador de plaquetas tem uma longa cadeia de alquila em ligação éter no C1 do glicerol mas C2 está em liga ção éster com ácido acético o que torna o composto muito mais hidrossolúvel que a maioria dos glicerofosfolipídeos e plasmalogê nios O grupo álcool cabeça é a etanolamina nos plasmalogênios e a colina no fator ativador de plaquetas Etanolamina Plasmalogênio Alceno com ligação éter O2 NH3 O O O C O O P O 1 Colina Acetil éster N Fator ativador de plaquetas 1 Alcano com ligação éter O2 O O O H O O P O Monogalactosildiacilglicerol MGDG OH HO OH OH O HO HO OH O O HO HO OH OH O O O O O H O Digalactosildiacilglicerol DGDG O O O O H O FIGURA 1011 Dois galactolipídeos de membrana dos tilacoides de cloroplasto Nos monogalactosildiacilgliceróis MGDG e digalactosildiacil gliceróis DGDG os grupos acilas estão polinsaturados e os gruposcabeça são não carregados Nelson6edbookindb 365 Nelson6edbookindb 365 020414 1845 020414 1845 366 DAVID L NELSON MICHAEL M COX cada extremidade da molécula estendida há um grupo polar que consiste em glicerol ligado a fosfato ou a resíduos de açúcar O nome geral desses compostos gliceroldialquil gliceroltetraéteres GDGT reflete sua estrutura única A porção glicerol dos lipídeos das arqueias não é o mesmo estereoisômero dos lipídeos de bactérias e de eucariotos o carbono central está na configuração R em arqueias e na configuração S em bactérias e eucariotos Figura 108 Os esfingolipídeos são derivados da esfingosina Os esfingolipídeos a quarta grande classe de lipídeos de membrana também têm um grupo cabeça polar e duas cau das apolares contudo ao contrário dos glicerofosfolipídeos e galactolipídeos não contêm glicerol Os esfingolipídeos são compostos por uma molécula de aminoálcool esfingo sina de cadeia longa também chamada de 4esfingenina ou um de seus derivados uma molécula de um ácido graxo de cadeia longa e um grupo polar unido por uma ligação glicosídica em alguns casos e uma ligação fosfodiéster em outros Figura 1013 Os carbonos C1 C2 e C3 da molécula de esfingosina são estruturalmente análogos aos três carbonos do glicerol nos glicerofosfolipídeos Quando um ácido graxo é unido em ligação amida ao NH2 no C2 o composto resultante é uma ceramida estruturalmente similar ao diacilglicerol A ce ramida é o precursor estrutural de todos os esfingolipídeos Há três subclasses de esfingolipídeos todos derivados da ceramida mas diferindo em seus grupos cabeça esfin gomielinas glicolipídeos neutros não carregados e gan gliosídeos As esfingomielinas contêm fosfocolina ou fosfoetanolamina como grupo cabeça polar sendo assim classificadas junto com os glicerofosfolipídeos como fosfoli pídeos Figura 107 Realmente as esfingomielinas se pa recem com as fosfatidilcolinas em suas propriedades gerais e na estrutura tridimensional e por não terem carga líquida em seus grupos cabeça Figura 1014 As esfingomieli nas presentes nas membranas plasmáticas das células ani mais são especialmente proeminentes na mielina bainha membranosa que envolve e isola os axônios de alguns neu rônios daí o nome esfingomielinas Os glicoesfingolipídeos que ocorrem amplamente na face externa das membranas plasmáticas possuem grupos cabeça com um ou mais açúcares conectados diretamente ao OH no C1 da porção ceramida eles não contêm fosfato Os cerebrosídeos têm um único açúcar ligado à ceramida os que têm galactose são caracteristicamente encontrados nas membranas plasmáticas das células em tecido neural e os que têm glicose nas membranas plasmáticas das células em tecidos não neurais Os globosídeos são glicoesfingo lipídeos com dois ou mais açúcares geralmente Dglicose Dgalactose ou NacetilDgalactosamina Os cerebrosíde os e globosídeos são às vezes chamados de glicolipídeos neutros pois não têm carga em pH 7 Os gangliosídeos os esfingolipídeos mais complexos têm oligossacarídeos como grupo cabeça polar e um ou mais resíduos do ácido Nacetilneuramínico Neu5Ac um ácido siálico frequentemente chamado apenas de ácido siálico nas terminações O ácido siálico dá aos gangliosí deos a carga negativa em pH 7 que os distingue dos globo sídeos Os gangliosídeos com um resíduo de ácido siálico estão na série GM M de mono os com dois estão na série GD D de di e assim por diante GT três resíduos de ácido siálico GQ quatro Ácido Nacetilneuramínico ácido siálico Neu5Ac OH H3C COO2 HO H H HOH2C O O OH OH HN C C H H H C O H2C CH2 CH2 CH2 C H O H2C HC O CH2OH O HCOH P aGlcb12Gal1 Glicerol Grupos difitanila Glicerol fosfato Glicerol O 2O O O O 2 1 3 FIGURA 1012 Um lipídeo de membrana atípico encontrado apenas em algumas arqueias Neste lipídeo difitanila tetraéter as porções difita nilas em amarelo são hidrocarbonetos longos compostos por oito grupos isopreno de cinco carbonos condensados extremidade a extremidade so bre a condensação de unidades isopreno ver Figura 2136 também com pare os grupos difitanilas com as cadeias laterais de fitóis de 20 carbonos das clorofilas na Figura 1949a Nesta forma estendida os grupos difitanila são aproximadamente duas vezes maiores do que o comprimento de um ácido graxo de 16 carbonos geralmente encontrado nos lipídeos de mem brana das bactérias e dos eucariotos As porções de glicerol nos lipídeos de arqueias estão na configuração R ao contrário das bactérias e dos eucariotos que têm configuração S Os lipídeos de arqueias diferem nos substituintes dos gliceróis Na molécula aqui representada um glicerol está ligado ao dis sacarídeo aglicopiranosil1 S 2bgalactofuranose o outro glicerol está ligado a um grupo glicerolfosfato Nelson6edbookindb 366 Nelson6edbookindb 366 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 367 Os esfingolipídeos nas superfícies celulares são sítios de reconhecimento biológico Quando os esfingolipídeos foram descobertos há mais de um século pelo médico e químico Johann Thudichum o seu papel biológico parecia tão enigmático quanto a Esfin ge e ele os batizou em homenagem a esse monumento Em humanos pelo menos 60 esfingolipídeos diferentes foram identificados nas membranas celulares Muitos são espe cialmente proeminentes na membrana plasmática dos neu Johann Thudichum 18291901 Nome do esfingolipídeo Ceramida Esfingomielina Glicolipídeos neutros Glicosilcerebrosídeo Lactosilceramida globosídeo Gangliosídeo GM2 Fórmula de X P O O2 O CH2 CH2 N 1CH33 CH2OH H O H H OH H O OH H H H Grupocabeça substituinte X Ácido graxo Esfingosina OH 3 1 2 NH O O Fosfocolina Glicose Di tri ou tetrassacarídeo Oligossacarídeo complexo Nome de XO FIGURA 1013 Esfingolipídeos Os três primeiros carbonos na extremi dade polar da esfingosina são análogos aos três carbonos do glicerol nos glicerofosfolipídeos O grupo amino em C2 apresenta um ácido graxo em ligação amida O ácido graxo geralmente é saturado ou monoinsaturado com 16 18 22 ou 24 átomos de carbono A ceramida é o composto precur sor para esse grupo Os outros esfingolipídeos diferem no grupo polar da cabeça X ligado em C1 Os gangliosídeos têm grupos de oligossacarídeos muito complexos Os símbolos padrão para os açúcares são usados nesta figura como mostra a Tabela 71 FIGURA 1014 As estruturas moleculares de duas classes semelhantes de lipídeos de membrana A fosfatidilcolina glicerofosfolipídeo e a esfingomielina es fingolipídeo possuem dimensões e propriedades físicas si milares mas presumivelmente exercem papéis diferentes nas membranas Esfingomielina Fosfatidilcolina Fosfocolina Fosfocolina O2 N1 O O O O H O O P O N1 O HN H H OH O2 O O P O Nelson6edbookindb 367 Nelson6edbookindb 367 020414 1845 020414 1845 368 DAVID L NELSON MICHAEL M COX rônios e alguns são claramente sítios de reconhecimento na superfície celular mas uma função específica para apenas alguns poucos esfingolipídeos já foi descoberta As porções de carboidrato de certos esfingolipídeos definem os grupos sanguíneos humanos e portanto definem o tipo de sangue que os indivíduos podem receber seguramente nas transfu sões sanguíneas Figura 1015 Os gangliosídeos estão concentrados na superfície ex terna das células onde apresentam pontos de reconheci mento para moléculas extracelulares ou superfícies de cé lulas vizinhas Os tipos e as quantidades de gangliosídeos na membrana plasmática mudam consideravelmente durante o desenvolvimento embrionário A formação de tumores induz a síntese de um novo complemento de gangliosíde os e descobriuse que concentrações muito baixas de um gangliosídeo específico induzem a diferenciação de células neuronais tumorais em cultura A investigação dos papéis biológicos de diversos gangliosídeos continua sendo uma área em desenvolvimento para pesquisas futuras Os fosfolipídeos e os esfingolipídeos são degradados nos lisossomos A maioria das células degrada e repõe seus lipídeos de membrana Para cada ligação hidrolisável em um glicerofos folipídeo há uma enzima hidrolítica específica no lisossomo Figura 1016 As fosfolipases do tipo A removem um dos dois ácidos graxos produzindo um lisofosfolipídeo Essas esterases não atacam a ligação éter dos plasmalogênios As lisofosfolipases removem o ácido graxo restante Os gangliosídeos são degradados por um conjunto de enzimas lisossomais que catalisam a remoção gradual das unidades de açúcar produzindo finalmente uma ceramida Um defeito genético em qualquer uma dessas enzimas hi drolíticas leva ao acúmulo de gangliosídeos na célula com graves consequências médicas Quadro 101 Os esteróis têm quatro anéis de carbono fusionados Os esteróis são lipídeos estruturais presentes nas membra nas da maioria das células eucarióticas A estrutura carac terística desse quinto grupo de lipídeos de membrana é o núcleo esteroide que consiste em quatro anéis fusionados três com seis carbonos e um com cinco Figura 1017 O núcleo esteroide é quase planar e é relativamente rígido os anéis fusionados não permitem rotação em torno das ligações CC O colesterol o principal esterol nos tecidos animais é anfipático com um grupo cabeça polar o grupo hidroxila em C3 e um corpo hidrocarbonado apolar o núcleo esteroide e a cadeia lateral hidrocarbonada no C17 tão longa quanto um ácido graxo de 16 carbonos em sua forma estendida Es Ceramida Antígeno O Antígeno A Antígeno B Esfingosina Ácido graxo FIGURA 1015 Glicoesfingolipídeos como determinantes dos grupos sanguíneos Os grupos sanguíneos humanos O A B são determinados em parte pelos grupos de oligossacarídeo da cabeça desses glicoesfingolipídeos Os mesmos três oligossacarídeos também são encon trados ligados a certas proteínas do sangue de indivíduos dos tipos sanguí neos O A e B respectivamente Os símbolospadrão para açúcares são utili zados aqui ver Tabela 71 Fosfatidilinositol45bisfosfato Fosfolipase A1 Fosfolipase C Fosfolipase D O P O 3C 2C 1CH2 O C O H O C O H2 O2 O H OH OH HO H H H O P O P H H Fosfolipase A2 FIGURA 1016 As especificidades das fosfolipases As fosfolipases A1 e A2 hidrolisam as ligações éster de glicerofosfolipídeos intactos nos carbonos C1 e C2 do glicerol respectivamente Quando um dos ácidos graxos é re movido por uma fosfolipase do tipo A o segundo ácido graxo é removido por uma lisofosfolipase não mostrada Cada uma das fosfolipases C e D rompe uma das ligações fosfodiéster no grupo cabeça Algumas fosfolipases atuam em somente um tipo de glicerofosfolipídeo como o fosfatidilinositol 45bi fosfato mostrado aqui ou a fosfatidilcolina outras são menos específicas A B C D Grupo cabeça polar Núcleo esteroide Cadeia lateral alquila 1 5 11 4 2 8 3 19 9 7 6 10 13 12 17 16 18 20 21 22 23 24 25 26 27 15 14 HO H H H H H FIGURA 1017 Colesterol Na estrutura química do colesterol os anéis são denominados A a D para simplificar a referência aos derivados do núcleo esteroide os átomos de carbono estão numerados em azul O grupo hidro xila do C3 sombreado em azul é o grupo cabeça polar Para armazenar e transportar o esterol esse grupo hidroxila se condensa com um ácido graxo para formar um éster de esterol Nelson6edbookindb 368 Nelson6edbookindb 368 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 369 teróis similares são encontrados em outros eucariotos estig masterol em plantas e ergosterol em fungos por exemplo As bactérias não conseguem sintetizar esteróis algumas poucas espécies de bactéria no entanto podem incorporar esteróis exógenos em suas membranas Os esteróis de todos os euca riotos são sintetizados a partir de subunidades de isopreno simples de cinco carbonos assim como as vitaminas liposso lúveis as quinonas e os dolicóis descritos na Seção 103 Além de seus papéis como constituintes de membrana os esteróis servem como precursores para uma diversidade QUADRO 101 MEDICINA Acúmulos anormais de lipídeos de membrana algumas doenças humanas herdadas Os lipídeos polares das membranas sofrem constante re novação metabólica turnover e a sua taxa de síntese normalmente é contrabalançada por sua taxa de degrada ção A degradação dos lipídeos é promovida por enzimas hidrolíticas nos lisossomos sendo cada enzima capaz de hidrolisar uma ligação específica Quando a degradação de esfingolipídeos é prejudicada por um defeito em uma des sas enzimas Figura Q1 os produtos da degradação par cial se acumulam nos tecidos causando doenças graves Por exemplo a doença de NiemannPick é causada por um defeito genético raro na enzima esfingomielina se que cliva a fosfocolina da esfingomielina A esfingo mielina se acumula no encéfalo no baço e no fígado A doença se torna evidente em bebês e causa deficiência intelectual e morte prematura Mais comum é a doença de TaySachs na qual o gangliosídeo GM2 se acumula no encéfalo e no baço Figura Q2 devido à falta da enzima hexosaminidase A Os sintomas da doença de TaySachs são retardo progressivo no desenvolvimento paralisia cegueira e morte até os 3 ou 4 anos de idade O aconselhamento genético pode prever e evitar muitas doenças hereditárias Os testes nos futuros pais podem detectar enzimas anormais então testes de DNA podem determinar a natureza exata do defeito e o risco que ele representa para os descendentes Uma vez que ocorra a gravidez as células fetais obtidas por amostra de parte da placenta da vilosidade coriônica ou do líquido amniótico amniocentese podem ser testadas FIGURA Q1 Rotas de degradação de GM1 globosídeo e esfingo mielina a ceramida Um defeito na enzima que hidrolisa um passo em particular está indicado por a doença que resulta do acúmulo de produtos de degradação parcial está indicada 1 mm FIGURA Q2 Eletromicrografia de uma porção de uma célula do en céfalo de um bebê com a doença de TaySachs obtida post mortem mostrando depósitos anormais de gangliosídeo no lisossomo Ceramida Fosfocolina Ceramida bgalactosidase agalactosidase A bgalactosidase GM1 Gangliosidose generalizada Glicocerebrosidase Ceramida Doença de Gaucher Hexosaminidase A Doença de TaySachs GM2 Hexosaminidase A e B Doença de Sandhoff Globosídeo Doença de Fabry Gangliosídeo neuraminidase GM3 Esfingomielinase Esfingomielina Fosfocolina Doença de NiemannPick Glc Gal GalNAc Neu5Ac Ceramida Ceramida Ceramida Ceramida Ceramida Ceramida Nelson6edbookindb 369 Nelson6edbookindb 369 020414 1845 020414 1845 370 DAVID L NELSON MICHAEL M COX de produtos com atividades biológicas específicas Os hor mônios esteroides por exemplo são sinalizadores biológi cos potentes que regulam a expressão gênica Os ácidos biliares são derivados polares do colesterol que atuam como detergentes no intestino emulsificando as gorduras da dieta para tornálas mais acessíveis às lipases digestivas Ácido taurocólico um ácido biliar HO OH 17 C O NH CH2 CH2 SO3 2 OH Taurina O colesterol e outros esteróis voltarão a ser abordados em capítulos posteriores para considerar o papel estrutu ral do colesterol em membranas biológicas Capítulo 11 a sinalização por hormônios esteroides Capítulo 12 e a notável rota de biossíntese do colesterol e o transporte do colesterol por carreadores lipoproteicos Capítulo 21 RESUMO 102 Lipídeos estruturais em membranas c Os lipídeos polares com grupos polares e caudas apola res são importantes componentes das membranas Os mais abundantes são os glicerofosfolipídeos que con têm ácidos graxos esterificados a dois dos grupos hidro xila do glicerol e um segundo álcool o grupo cabeça esterificado à terceira hidroxila do glicerol via uma liga ção fosfodiéster Outros lipídeos polares são os esteróis c Os glicerofosfolipídeos diferem na estrutura de seu grupo cabeça os glicerofosfolipídeos comuns são a fosfatidile tanolamina e a fosfatidilcolina Os grupos polares dos gli cerofosfolipídeos estão carregados em pH próximo de 7 c As membranas dos cloroplastos são ricas em galactolipí deos compostos de diacilglicerol com um ou dois resí duos de galactose ligados e sulfolipídeos diacilgliceróis com um resíduo de açúcar sulfonado ligado e portanto um grupo cabeça carregado negativamente c Algumas arqueias têm lipídeos de membrana únicos com grupos alquila de cadeia longa em ligação éter ao glicerol em ambas as extremidades e com resíduos de açúcar e ou fosfato ligados ao glicerol para fornecer um grupo ca beça polar ou carregado Esses lipídeos são estáveis nas condições extremas nas quais essas arqueias vivem c Os esfingolipídeos contêm esfingosina um aminoálcool alifático de cadeia longa mas não contêm glicerol A es fingomielina tem além de ácido fosfórico e colina duas longas cadeias hidrocarbonadas uma que provém de um ácido graxo e outra que provém de uma esfingosina Três outras classes de esfingolipídeos são cerebrosíde os globosídeos e gangliosídeos que contêm componen tes formados por açúcares c Os esterois têm quatro anéis fusionados e um grupo hi droxila O colesterol o principal esterol em animais é tanto um componente estrutural das membranas quanto um precursor para uma ampla variedade de esteroides 103 Lipídeos como sinalizadores cofatores e pigmentos As duas classes funcionais de lipídeos consideradas até agora são importantes componentes celulares os lipídeos de membrana compõem de 5 a 10 da massa seca da maioria das células e os lipídeos de armazenamento mais de 80 da massa de um adipócito Com algumas exceções importantes esses lipídeos desempenham um papel pas sivo na célula os combustíveis lipídicos formam barreiras impermeáveis em volta das células e dos compartimentos celulares Outro grupo de lipídeos presente em quanti dades bem menores tem papéis ativos no tráfego meta bólico como metabólitos e mensageiros Alguns servem como sinalizadores potentes como hormônios carrega dos no sangue de um tecido a outro ou como mensagei ros intracelulares gerados em resposta a uma sinalização extracelular hormônio ou fator de crescimento Outros funcionam como cofatores enzimáticos em reações de transferência de elétrons nos cloroplastos e nas mitocôn drias ou na transferência de porções de açúcar em várias reações de glicosilação Um terceiro grupo consiste em lipídeos com um sistema de ligações duplas conjugadas moléculas de pigmento que absorvem a luz visível Alguns deles atuam como pigmentos fotossensíveis na visão e na fotossíntese outros produzem colorações naturais como o alaranjado das abóboras e cenouras e o amarelo das penas dos canários Finalmente um grupo muito grande de lipí deos voláteis produzidos nas plantas serve de sinalizador que é transportado pelo ar permitindo às plantas comuni caremse umas com as outras atraírem animais amigos e dissuadirem inimigos Esta seção descreve alguns repre sentantes desses lipídeos biologicamente ativos Em ca pítulos posteriores sua síntese e seus papéis ecológicos serão considerados em maior detalhe Fosfatidilinositóis e derivados de esfingosina atuam como sinalizadores intercelulares O fosfatidilinositol e seus derivados fosforilados atuam em vários níveis para regular a estrutura celular e o metabolis mo O fosfatidilinositol45bifosfato Figura 1016 na face citoplasmática interna da membrana plasmática serve como um reservatório de moléculas mensageiras que são liberadas dentro da célula em resposta a sinais extracelu lares interagindo com receptores de superfície específicos Os sinais extracelulares como o hormônio vasopressina ativam uma fosfolipase C específica na membrana a qual hidrolisa o fosfatidilinositol45bifosfato liberando dois produtos que atuam como mensageiros intracelulares o inositol145trifosfato IP3 que é solúvel em água e o diacilglicerol que permanece associado à membrana plas mática O IP3 provoca a liberação de Ca 21 do retículo endo plasmático e a combinação do diacilglicerol e da elevada concentração de Ca 21 citosólica ativa a enzima proteína cinase C Pela fosforilação de proteínas específicas essa enzima ativa a resposta celular ao sinal extracelular Esse mecanismo de sinalização é descrito mais detalhadamente no Capítulo 12 ver Figura 1210 Fosfolipídeos de inositol também servem como pontos de nucleação para complexos supramoleculares envolvidos Nelson6edbookindb 370 Nelson6edbookindb 370 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 371 na sinalização ou na exocitose Certas proteínas sinaliza doras ligamse especificamente ao fosfatidilinositol345 trifosfato na membrana plasmática iniciando a formação de complexos multienzimáticos na superfície citosólica da membrana A formação de fosfatidilinositol345trifosfato em resposta a sinais extracelulares portanto agrupa as proteínas em complexos de sinalização na superfície da membrana plasmática ver Figura 1216 Os esfingolipídeos de membrana também podem servir como fontes de mensageiros intracelulares Tanto a cera mida quanto a esfingomielina Figura 1013 são potentes reguladores das proteínascinases e a ceramida ou seus derivados estão envolvidos na regulação da divisão celular diferenciação migração e morte celular programada tam bém chamada de apoptose ver Capítulo 12 Os eicosanoides carregam mensagens a células próximas Os eicosanoides são hormônios parácrinos substân cias que atuam somente em células próximas ao pon to de síntese dos hormônios em vez de serem transporta das no sangue para atuar em células de outros tecidos ou órgãos Esses derivados de ácidos graxos têm vários efeitos significativos nos tecidos dos vertebrados Estão envolvidos na função reprodutiva na inflamação na febre e na dor as sociadas aos ferimentos ou à doenças na formação de coá gulos sanguíneos e na regulação da pressão sanguínea na secreção de ácido gástrico e em vários outros processos im portantes na saúde ou na doença de humanos Todos os eicosanoides são derivados do ácido araqui dônico 204D 581114 Figura 1018 o ácido graxo poli insaturado de 20 carbonos a partir do qual eles levam seu nome geral do grego eikosi vinte Há três classes de eicosanoides prostaglandinas tromboxanos e leucotrienos As prostaglandinas PG contêm um anel de cinco carbonos que se origina da cadeia do ácido araquidônico Seu nome deriva da glândula próstata o tecido a partir do qual elas foram isoladas pela primeira vez por Bengt Sa muelsson e Sune Bergström Dois grupos de prostaglandi nas foram definidos originalmente PGE solúvel em éter e PGF solúvel em tampão fosfato Cada grupo contém nu merosos subtipos denominados PGE1 PGE2 PGF1 e assim por diante As prostaglandinas apresentam diversas fun ções Algumas estimulam a contração da musculatura lisa do útero durante a menstruação e o trabalho de parto Ou tras afetam o fluxo sanguíneo a órgãos específicos o ciclo sonovigília e a sensibilidade de certos tecidos a hormônios como a epinefrina e o glucagon As prostaglandinas de um terceiro grupo elevam a temperatura corporal produzindo a febre e causam inflamação e dor Os tromboxanos têm um anel de seis membros que contém éter São produzidos pelas plaquetas também chamadas de trombócitos e atuam na formação dos coá gulos e na redução do fluxo sanguíneo no local do coágu lo Como mostrado por John Vane os antiinflamatórios não esteroides AINEs ácido acetilsalicílico ibuprofeno e meclofenamato por exemplo inibem a enzima prosta glandina H2sintase também chamada de ciclooxigenase ou COX que catalisa um dos passos iniciais na rota do araquidonato às prostaglandinas e aos tromboxanos Fi gura 1018 ver também Figura 2115 Os leucotrienos encontrados pela primeira vez em leucócitos contêm três ligações duplas conjugadas e são poderosos sinalizadores biológicos Por exemplo o leuco FIGURA 1018 O ácido araquidônico e alguns derivados de ei cosanoides O ácido araquidônico araquidonato em pH 7 é o pre cursor dos eicosanoides incluindo as prostaglandinas os tromboxanos e os leucotrienos Na prostaglandina E1 o C8 e o C12 do araquidonato se jun tam para formar o característico anel com cinco membros No tromboxano A2 o C8 e o C12 se juntam e um átomo de oxigênio é adicionado para for mar o anel de seis membros O leucotrieno A4 tem uma série de três ligações duplas conjugadas Os antiinflamatórios não esteroides AINEs como a as pirina e o ibuprofeno bloqueiam a formação de prostaglandinas e trombo xanos a partir do araquidonato pela inibição da enzima ciclooxigenase prostaglandina H2sintase John Vane 19272004 Sune Bergström 19162004 e Bengt Samuelsson Prostaglandina E1 PGE1 Tromboxano A2 Leucotrieno A4 Araquidonato AINEs 1 O2 8 11 5 14 O O2 O O 8 12 O OH HO O2 O O2 8 12 O OH O O Nelson6edbookindb 371 Nelson6edbookindb 371 020414 1845 020414 1845 372 DAVID L NELSON MICHAEL M COX trieno D4 derivado do leucotrieno A4 induz a contração da musculatura lisa que envolve as vias aéreas até o pulmão A produção excessiva de leucotrienos causa a crise de asma e a síntese de leucotrienos é um dos alvos dos fármacos an tiasmáticos como a prednisona A forte contração da mus culatura lisa dos pulmões que ocorre durante o choque ana filático é parte da reação alérgica potencialmente fatal em indivíduos hipersensíveis a ferroadas de abelha penicilina ou outros agentes Os hormônios esteroides carregam mensagens entre os tecidos Os esteroides são derivados oxidados dos esteróis eles têm o núcleo esterol mas não a cadeia alquila ligada ao anel D do colesterol Os hormônios esteroides circulam pela corrente sanguínea em carreadores proteicos do local onde foram produzidos até os tecidosalvo onde entram nas células ligamse a receptores proteicos altamente específi cos no núcleo e causam mudanças na expressão gênica e portanto no metabolismo Como os hormônios têm afinidade muito alta por seus receptores concentrações muito baixas nanomolar ou menos são suficientes para produzir respos tas nos tecidosalvo Os principais grupos de hormônios este roides são os hormônios sexuais masculinos e femininos e os hormônios produzidos pelo córtex suprarrenal cortisol e al dosterona Figura 1019 A prednisona e a prednisolona são fármacos esteroides com atividades antiinflamatórias potentes mediadas em parte pela inibição da liberação do araquidonato pela fosfolipase A2 e pela consequente inibição da síntese de leucotrienos prostaglandinas e tromboxanos Elas têm uma série de aplicações médicas incluindo o trata mento de asma e de artrite reumatoide As plantas vasculares contêm o brassinolídeo tipo es teroide Figura 1019 potente regulador do crescimen to que aumenta a taxa de alongamento do caule e afeta a orientação das microfibrilas de celulose na parede celular durante o crescimento As plantas vasculares produzem milhares de sinais voláteis As plantas produzem literalmente milhares de diferentes compostos lipofílicos substâncias voláteis utilizadas para atrair os polinizadores para repelir herbívoros para atrair organismos que defendem a planta contra herbívoros e para a comunicação com outras plantas O jasmonato por exem plo ver Figura 1233 derivado do ácido graxo 183D 91215 em lipídeos de membrana ativa as defesas da planta em res posta ao dano infligido por insetos O metil éster de jasmo nato dá a fragrância característica do óleo de jasmim ampla mente utilizado na indústria de perfume Muitos dos voláteis das plantas são derivados de ácidos graxos ou de compostos feitos pela condensação de unidades isopreno de cinco car bonos eles incluem geraniol o cheiro característico dos ge Brassinolídeo brassinosteroide Testosterona O H H H OH O O H H H H H HO HO H OH OH Cortisol O O H H H OH OH HO Aldosterona O O O H H H OH HO bEstradiol HO H H H OH Prednisolona O O H H H OH OH HO Prednisona O O OH O H H H OH FIGURA 1019 Esteroides derivados do coles terol A testosterona o hormônio sexual masculi no é produzida nos testículos O estradiol um dos hormô nios sexuais femininos é produzido nos ovários e na placenta O cortisol e a aldosterona são hormônios sinteti zados no córtex da glândula suprarrenal eles regulam o metabolismo da glicose e a excreção de sal respectiva mente A prednisona e a prednisolona são esteroides sin téticos utilizados como agentes antiinflamatórios O bras sinolídeo é um regulador do crescimento encontrado em plantas vasculares Nelson6edbookindb 372 Nelson6edbookindb 372 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 373 rânios bpineno pinheiros limoneno limões mentol e carvona ver Figura 124a para citar alguns Isopreno CH3 C CH CH2 CH2 As vitaminas A e D são precursoras de hormônios Durante o primeiro terço do século XX um grande foco de pesquisa em química fisiológica foi a identifica ção das vitaminas compostos essenciais para a saúde do homem e de outros vertebrados mas que não podem ser sintetizados por esses animais e devem portanto ser obti dos da dieta Os primeiros estudos nutricionais identifica ram duas classes gerais desse tipo de composto os que eram solúveis em solventes orgânicos apolares vitaminas liposso lúveis e os que podiam ser extraídos dos alimentos com sol ventes aquosos vitaminas hidrossolúveis Posteriormente o grupo lipossolúvel foi dividido nos quatro grupos das vita minas A D E e K todos compostos isoprenoides sintetiza dos pela condensação de múltiplas unidades de isopreno Dois deles D e A servem como precursores de hormônios A vitamina D3 também chamada de colecalciferol normalmente é formada na pele a partir de 7desidrocoles terol em uma reação fotoquímica catalisada pelo compo nente UV da luz solar Figura 1020a A vitamina D3 não é biologicamente ativa mas é convertida por enzimas no fígado e no rim a 1a25dihidroxivitamina D3 calcitriol hormônio que regula a captação de cálcio no intestino e os níveis de cálcio no rim e nos ossos A deficiência de vitami na D leva à formação defeituosa dos ossos e a uma doença chamada raquitismo para a qual a administração de vitami na D produz uma cura dramática Figura 1020b A vita mina D2 ergocalcificerol é um produto comercial formado pela radiação com UV do ergosterol de levedura A vitami na D2 é estruturalmente similar à D3 com leve modificação da cadeia lateral ligada ao anel D do esterol Ambas têm os mesmos efeitos biológicos e a D2 é comumente adicionada ao leite e à manteiga como suplemento alimentar Como os hormônios esteroides o produto do metabolismo da vita mina D 1a25dihidroxivitamina D3 regula a expressão gênica interagindo com receptores proteicos nucleares es pecíficos p 11821183 A vitamina A retinol em suas várias formas funcio na como um hormônio e como pigmento fotossensível do olho dos vertebrados Figura 1021 Atuando por meio de proteínas receptoras no núcleo da célula o derivado da vi tamina A ácido retinoico regula a expressão gênica no de senvolvimento do tecido epitelial incluindo a pele O ácido retinoico é o composto ativo no fármaco tretinoína Retin A utilizado no tratamento de acne grave e rugas na pele O retinal outro derivado da vitamina A é o pigmento que inicia a resposta dos bastonetes e dos cones da retina à luz produzindo um sinal neuronal para o cérebro Esse papel do retinal é descrito em detalhes no Capítulo 12 FIGURA 1020 A produção da vitamina D3 e o metabolismo a O colecalciferol vitamina D3 é produzido na pele pela radiação UV sobre o 7desidrocolesterol que rompe a ligação que está em cor salmão No fígado um grupo hidroxila é adicionado ao C25 no rim uma segunda hidroxilação em C1 produz o hormônio ativo 1a25dihidroxivitamina D3 Este hormônio regula o metabolismo do Ca 21 no rim no intestino e nos os sos b A vitamina D da dieta evita o raquitismo uma doença comum em climas frios em que as roupas pesadas bloqueiam o componente UV da luz solar necessário para a produção da vitamina D3 na pele Neste detalhe de um grande mural de John Steuart Curry Os benefícios sociais da pesquisa bio química 1943 as pessoas e os animais à esquerda representam os efeitos da nutrição pobre incluindo as pernas arqueadas de um menino com raquitis mo clássico À direita estão as pessoas e os animais mais saudáveis com os benefícios sociais da pesquisa incluindo o uso da vitamina D para prevenir e tratar o raquitismo Este mural está no Departamento de Bioquímica na Universidade de WisconsinMadison 1a25Dihidroxivitamina D3 calcitriol Luz UV 2 passos na pele a Colecalciferol vitamina D3 1 passo no fígado 1 passo no rim 7Desidrocolesterol 1 5 11 4 2 8 3 19 7 6 10 13 12 17 18 20 21 22 23 24 25 26 27 14 16 15 9 HO H H H H 1 10 5 2 4 3 HO 14 13 12 17 15 16 6 7 8 11 9 18 19 20 21 22 23 24 25 27 26 H H HO OH 1 25 H OH H H H b Nelson6edbookindb 373 Nelson6edbookindb 373 020414 1845 020414 1845 374 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A vitamina A foi primeiro isolada de óleos de fígado de peixe fígado ovos leite integral e manteiga também são boas fontes Em vertebrados o bcaroteno o pigmento que dá às cenouras à batatadoce e a outros vegetais amarelos a sua cor característica pode ser convertido enzimatica mente a vitamina A A deficiência dessa vitamina ocasiona vários sintomas em humanos incluindo secura da pele dos olhos e das membranas mucosas desenvolvimento e cres cimento retardados e cegueira noturna frequente sintoma inicial no diagnóstico de deficiência de vitamina A As vitaminas E e K e as quinonas lipídicas são cofatores de oxirredução A vitamina E é o nome coletivo para um grupo de lipídeos relacionados chamados tocoferóis que con têm um anel aromático substituído e uma cadeia lateral longa de isoprenoide Figura 1022a Por serem hidrofó bicos os tocoferóis se associam com as membranas celula res com os depósitos de lipídeos e com as lipoproteínas no sangue Os tocoferóis são antioxidantes biológicos O anel aromático reage com as formas mais reativas de radicais de oxigênio e outros radicais livres e as destrói protegendo os ácidos graxos insaturados da oxidação e impedindo o dano oxidativo aos lipídeos de membrana o que pode causar fra gilidade celular Os tocoferóis são encontrados nos ovos e nos óleos vegetais e são especialmente abundantes no ger me de trigo Animais de laboratório alimentados com dietas deficientes em vitamina E desenvolvem pele escamosa fra queza muscular e esterilidade A deficiência de vitamina E em humanos é muito rara o principal sintoma é a fragilida de dos eritrócitos O anel aromático da vitamina K Figura 1022b pas sa por um ciclo de oxidação e redução durante a formação da protrombina ativa proteína do plasma sanguíneo essen cial na coagulação A protrombina é uma enzima proteolí tica que quebra ligações peptídicas na proteína sanguínea fibrinogênio para convertêla em fibrina a proteína fibro sa insolúvel que une os coágulos sanguíneos ver Figura 639 Henrik Dam e Edward A Doisy descobriram que a deficiência de vitamina K retarda a coagulação sanguínea o que pode ser fatal A deficiência dessa vitamina é muito incomum em humanos com exceção de uma pequena por centagem de bebês que sofrem da doença hemorrágica do recémnascido condição potencialmente fatal Nos Estados Unidos os recémnascidos recebem rotineiramente uma injeção de 1 mg de vitamina K A vitamina K1 filoquino na é encontrada nas folhas de plantas verdes uma forma relacionada a vitamina K2 menaquinona é produzida por bactérias que vivem no intestino de vertebrados bCaroteno Vitamina A1 retinol Ponto de clivagem C Oxidação de álcool a aldeído 11cisRetinal pigmento fotossensível Sinal neuronal para o cérebro Retinal todotrans 12 CH2OH 15 2 7 11 6 12 C 11 11 Luz visível O H O H a b e d Oxidação de aldeído a ácido Ácido retinoico Sinal hormonal para as células epiteliais c FIGURA 1021 Vitamina A1 seu precursor e derivados a bCaroteno é o precursor da vitamina A1 Unidades estruturais de isopreno estão indica das por linhas tracejadas vermelhas ver p 373 A clivagem do bcaroteno gera duas moléculas de vitamina A1 retinol b A oxidação no C15 con verte o retinol a aldeído retinal c e uma oxidação posterior produz ácido retinoico d hormônio que regula a expressão gênica O retinal se combina com a proteína opsina para formar rodopsina não mostrada pigmento fo tossensível amplamente disseminado na natureza No escuro o retinal da ro dopsina está na forma 11cis c Quando a molécula de rodopsina é excitada pela luz visível o 11cisretinal passa por uma série de reações fotoquímicas que o convertem em retinal todotrans e forçando uma mudança na forma da molécula de rodopsina inteira Essa transformação no bastonete da retina dos vertebrados emite um sinal elétrico para o cérebro que é a base da trans dução visual tópico a ser tratado com mais detalhe no Capítulo 12 Nelson6edbookindb 374 Nelson6edbookindb 374 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 375 Henrik Dam 18951976 Edward A Doisy 18931986 A warfarina Figura 1022c composto sintético que inibe a formação de protrombina ativa é particularmente venenosa para ratos causando a morte por sangramento interno Ironicamente esse potente raticida também é um fármaco anticoagulante inestimável para tratar humanos em risco por coagulação sanguínea excessiva como os pa cientes cirúrgicos e aqueles com trombose coronária A ubiquinona também chamada de coenzima Q e a plastoquinona Figura 1022d e são isoprenoides que funcionam como transportadores lipofílicos de elétrons em reações de oxirredução que levam à síntese de ATP na mi tocôndria e nos cloroplastos respectivamente Ambas po dem aceitar um ou dois elétrons e um ou dois prótons ver Figura 193 Os dolicóis ativam precursores de açúcares para a biossíntese Durante a montagem dos carboidratos complexos das pa redes celulares bacterianas e durante a adição de unidades de polissacarídeo a certas proteínas glicoproteínas e lipí deos glicolipídeos em eucariotos as unidades de açúcar a serem adicionadas são quimicamente ativadas pela ligação a alcoóis isoprenoides chamados de dolicóis Figura 10 22f Esses compostos têm fortes interações hidrofóbicas com lipídeos de membrana ancorando na membrana os açúcares ligados onde participam de reações de transfe rência de açúcares HO CH3 O CH2 CH2 CH2 C CH3 H CH2 CH2 CH2 C CH3 H CH2 CH2 CH2 C CH3 H CH3 O H C 3 H C 3 H CO 3 H CO 3 CH2 CH C CH3 CH2 CH2 CH2 C CH3 H CH2 2 CH2 CH2 C CH3 H CH3 O OH C CH H2 C CH3 O CH3 CH2 CH C CH3 CH2 CH2 CH C CH3 CH2 n CH2 CH C CH3 CH3 O CH2 CH C CH3 CH2 HO CH2 CH2 C CH3 H CH2 CH2 CH C CH3 CH2 n CH2 CH C CH3 CH3 CH3 CH3 O CH3 O O O H3C CH2 CH C CH3 CH2 n CH2 CH C CH3 CH3 2 1 1 2 2 1 2 1 b Vitamina K1 cofator da coagulação sanguínea filoquinona d Ubiquinona transportador de elétrons da mitocôndria coenzima Q n 5 4 a 8 e Plastoquinona transportador de elétrons do cloroplasto n 5 4 a 8 f Dolicol transportador de açúcar n 5 9 a 22 a Vitamina E antioxidante c Varfarina anticoagulante sanguíneo O FIGURA 1022 Alguns outros compostos isoprenoides biologicamente ativos ou derivados As unidades derivadas do isopreno estão indicadas com linhas vermelhas tracejadas Na maioria dos tecidos de mamíferos a ubiquinona também chamada de coenzima Q tem 10 unidades de isopreno Os dolicóis dos animais têm de 17 a 21 unidades de isopreno 85 a 105 átomos de carbo no os dolicóis bacterianos têm 11 e os de plantas e fungos têm de 14 a 24 Nelson6edbookindb 375 Nelson6edbookindb 375 020414 1845 020414 1845 376 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Muitos pigmentos naturais são dienos conjugados a lipídeos Os dienos conjugados possuem cadeias de carbono com liga ções simples e duplas alternadas Como esse arranjo estru tural permite o movimento dos elétrons os compostos po dem ser excitados por radiações eletromagnéticas de baixa energia luz visível dando a eles cores visíveis para huma nos e outros animais O caroteno Figura 1021 é amarelo alaranjado compostos similares dão às penas das aves seus vistosos vermelhos alaranjados e amarelos Figura 1023 Como os esteróis esteroides dolicóis vitaminas A E D e K ubiquinona e plastoquinona esses pigmentos são sinteti zados a partir de derivados de isopreno de cinco carbonos a rota biossintética é descrita em detalhes no Capítulo 21 Os policetídeos são produtos naturais com atividades biológicas Os policetídeos são um grupo de lipídeos diversos com vias biossintéticas semelhantes condensação de Claisen àquelas dos ácidos graxos São metabólitos secundá rios compostos não essenciais para o metabolismo de um organismo mas com algumas funções subsidiárias que dão aos seus produtores uma vantagem em algum nicho ecológico Muitos policetídeos têm utilidade na medicina como antibióticos eritromicina antifúngicos anfoterici na B ou inibidores da síntese do colesterol lovastatina Figura 1024 OH O O HO Cantaxantina vermelho vivo Zeaxantina amarelo vivo FIGURA 1023 Lipídeos como pigmentos nas plantas e nas penas das aves Compostos com sistemas conjugados longos absorvem luz na região visível do espectro As diferenças sutis na química desses compostos pro duzem pigmentos de cores notavelmente diferentes As aves adquirem os pigmentos que dão as cores vermelha ou amarela às suas penas comendo materiais de plantas que contêm pigmentos carotenoides como a cantaxan tina e a zeaxantina As diferenças na pigmentação entre machos e fêmeas de aves são resultado de diferenças na absorção e no processamento intestinal dos carotenoides Eritromicina antibiótico Anfotericina B antifúngico OH O OH OH OH OH OH OH OH O O O O HO NH2 OH HO O OH OH HO O O O NCH32 HO OH H H H O OH O O O Lovastatina estatina O O H H H HO O O FIGURA 1024 Três produtos naturais poli cetídeos usados na medicina humana Nelson6edbookindb 376 Nelson6edbookindb 376 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 377 RESUMO 103 Lipídeos como sinalizadores cofatores e pigmentos c Alguns tipos de lipídeos embora presentes em quanti dades relativamente baixas desempenham papéis cru ciais como cofatores ou sinalizadores c O fosfatidilinositolbifosfato é hidrolisado para pro duzir dois mensageiros intracelulares o diacilglicerol e o inositol145trifosfato O fosfatidilinositol345 trifosfato é um ponto de nucleação para complexos proteicos supramoleculares envolvidos na sinalização biológica c As prostaglandinas os tromboxanos e os leucotrienos os eicosanoides derivados do araquidonato são hor mônios extremamente potentes c Os hormônios esteroides tal como os hormônios se xuais são derivados dos esteróis Servem como pode rosos sinalizadores biológicos alterando a expressão gênica nas células alvos c As vitaminas D A E e K são compostos lipossolúveis constituídos por unidades de isopreno Todos desempe nham papéis essenciais no metabolismo ou na fisiologia dos animais A vitamina D é precursora de um hormônio que regula o metabolismo do cálcio A vitamina A forne ce o pigmento fotossensível do olho dos vertebrados e é um regulador da expressão gênica durante o crescimen to das células epiteliais A vitamina E funciona na prote ção dos lipídeos de membrana contra o dano oxidativo e a vitamina K é essencial no processo de coagulação sanguínea c As ubiquinonas e as plastoquinonas também derivadas de isoprenoides são transportadores de elétrons nas mitocôndrias e nos cloroplastos respectivamente c Os dolicóis ativam e ancoram os açúcares às membra nas celulares os grupos açúcar são então utilizados na síntese de carboidratos complexos glicolipídeos e gli coproteínas c Os dienos conjugados a lipídeos servem como pigmen tos nas flores e nos frutos e dão às penas das aves suas cores vistosas c Os policetídeos são produtos naturais amplamente usa dos na medicina 104 Trabalhando com lipídeos Como os lipídeos são insolúveis em água sua extração e seu posterior fracionamento requerem o uso de solventes orgânicos e de algumas técnicas pouco utilizadas na purifi cação de moléculas hidrossolúveis como as proteínas e os carboidratos Em geral misturas complexas de lipídeos são separadas por diferenças na polaridade ou na solubilidade em solventes apolares Os lipídeos que contêm ácidos gra xos ligados a éster ou amida podem ser hidrolisados pelo tratamento com ácido ou base ou com enzimas hidrolíticas específicas fosfolipases glicosidases para liberar seus componentes para análise Alguns métodos comumente utilizados nas análises de lipídeos são mostrados na Figura 1025 e discutidos a seguir A extração de lipídeos requer solventes orgânicos Os lipídeos neutros triacilgliceróis ceras pigmentos etc são prontamente extraídos dos tecidos com éter etílico clorofórmio ou benzeno solventes que não permitem a agregação causada pelas interações hidrofóbicas Os lipí Espectrometria de massa com tipos condições e modos de monitoramento diferentes Homogeneizado em clorofórmiometanolágua Células Metanol água Clorofórmio lipídeos Cromatografia de adsorção cromatografia gasosa HPLC Lipidoma Espectrometria direta do extrato total Tecido Cromatografia em camada delgada b a c Separa as principais classes primeiro Usa o método rápido FIGURA 1025 Procedimentos comuns na extração na separação e na identificação de lipídeos celulares a O tecido é homogeneizado em uma mistura de clorofórmiometanolágua que gera duas fases com a adi ção de água e a remoção dos sedimentos não extraíveis por centrifugação b As principais classes dos lipídeos extraídos na fase clorofórmio podem ser primeiro separados por cromatografia de camada delgada CCD na qual os lipídeos são carregados para cima em uma placa de sílica coberta de gel por uma frente ascendente de solvente com os lipídeos menos polares migrando mais do que os lipídeos mais polares ou carregados ou por cromatografia de adsorção em uma coluna de sílica gel em que passam solventes de polaridade crescente Por exemplo cromatografia em coluna com solventes apropriados pode ser usada para separar espécies lipídicas intimamente relacionadas tal como fosfatidilserina fosfatidilglicerol e fosfatidilinositol Uma vez separados os ácidos graxos complementares a cada lipídeo podem ser determinados por espectrometria de massa c Alternativamente no método rápido um extrato de lipídeos não fracionado pode ser diretamente submetido à espectrometria de massa de alta resolução de diferentes tipos e sob condições distintas para determinar a composição total de todos os lipídeos o lipidoma Nelson6edbookindb 377 Nelson6edbookindb 377 020414 1845 020414 1845 378 DAVID L NELSON MICHAEL M COX deos de membrana são mais bem extraídos por solventes orgânicos mais polares como o etanol ou o metanol que reduzem as interações hidrofóbicas entre as moléculas lipí dicas enquanto também enfraquecem as ligações de hidro gênio e as interações eletrostáticas que ligam os lipídeos de membrana às proteínas de membrana Um extrator bastan te utilizado é uma mistura de clorofórmio metanol e água inicialmente em proporções de volume 1208 que são miscíveis produzindo uma única fase Depois que o tecido é homogeneizado nesse solvente para extrair todos os lipí deos mais água é adicionada ao extrato resultante e a mis tura separase em duas fases metanolágua fase de cima e clorofórmio fase de baixo Os lipídeos permanecem na camada com clorofórmio e as moléculas mais polares como as proteínas e os açúcares repartemse na camada de metanolágua Figura 1025a A cromatografia de adsorção separa lipídeos de polaridades diferentes Misturas complexas de lipídeos dos tecidos podem ser fra cionadas por procedimentos cromatográficos com base nas diferentes polaridades de cada classe de lipídeo Figura 10 25b Na cromatografia de adsorção um material insolúvel polar como sílica gel forma de ácido silícico SiOH4 é co locado em uma coluna de vidro e a mistura de lipídeos na solução de clorofórmio é aplicada no topo da coluna Na cromatografia líquida de alto desempenho a alta pressão força os solventes através da coluna que tem um diâmetro menor Os lipídeos polares se ligam fortemente ao ácido silícico e os lipídeos neutros passam diretamente através da coluna e emergem na primeira eluição com clorofórmio Os lipídeos polares são então eluídos em ordem crescente de polaridade lavando a coluna com solventes de polarida de progressivamente mais alta Lipídeos polares não carre gados p ex cerebrosídeos são eluídos com acetona e lipídeos muito polares ou carregados como os glicerofosfo lipídeos são eluídos com metanol A cromatografia em camada delgada em ácido silícico aplica o mesmo princípio Figura 1025b Uma fina camada de sílica gel é espalhada sobre uma placa de vidro à qual ela se adere Uma pequena amostra de lipídeos dissolvidos em clorofórmio é aplicada perto de uma das margens da placa que é imersa em um recipiente raso com um solvente orgâ nico ou uma mistura de solventes o conjunto é colocado em uma câmara saturada com vapor do solvente À medida que o solvente ascende pela placa por capilaridade ele carrega os lipídeos com ele Os lipídeos menos polares migram mais pois têm menor tendência a se ligarem ao ácido silícico Os lipídeos separados podem ser detectados pela pulverização da placa com um corante rodamina que emite fluorescên cia quando associado aos lipídeos ou pela exposição da pla ca a vapores de iodo O iodo reage reversivelmente com as ligações duplas nos ácidos graxos de forma que os lipídeos que contêm ácidos graxos insaturados desenvolvem uma coloração amarela ou marrom Vários outros reagentes de pulverização também são úteis na detecção de lipídeos es pecíficos Para análise subsequente as regiões que contêm lipídeos isolados podem ser raspadas da placa e os lipídeos podem ser recuperados por meio de extração com um sol vente orgânico A cromatografia gasosalíquida separa misturas de derivados voláteis de lipídeos A cromatografia gasosalíquida separa os componentes de uma mistura de acordo com suas tendências relativas a dissol veremse no material inerte contido na coluna cromatográfica ou a volatilizaremse e migrarem através da coluna carrega dos por uma corrente de um gás inerte como o hélio Alguns lipídeos são naturalmente voláteis mas a maioria necessita ser primeiro derivatizada para aumentar sua volatilidade ie diminuir seu ponto de ebulição Para uma análise dos ácidos graxos em uma amostra de fosfolipídeos os lipídeos são pri meiro transesterificados aquecidos em uma mistura de meta nolHCl ou metanolNaOH para converter os ácidos graxos es terificados com o glicerol nos seus respectivos metil ésteres Esses metil ésteres de acilas graxas são então aplicados em coluna cromatográfica de gáslíquido e a coluna é aquecida para volatilizar os compostos Os ésteres de acilas graxas mais solúveis no material da coluna repartemse dissolvemse naquele material os lipídeos menos solúveis são carregados pela corrente de gás inerte e emergem primeiro da coluna A ordem de eluição depende da natureza do adsorvente sólido na coluna e do ponto de ebulição dos componentes da mistu ra lipídica Utilizandose essas técnicas as misturas de ácidos graxos de vários comprimentos de cadeia e vários graus de insaturação podem ser completamente separadas A hidrólise específica auxilia na determinação das estruturas dos lipídeos Algumas classes de lipídeos são suscetíveis à degradação sob condições específicas Por exemplo todos os ácidos graxos com ligação éster nos triacilgliceróis os fosfolipídeos e os ésteres de esterol são liberados em tratamento fraca mente ácido ou alcalino e em condições mais extremas de hidrólise há liberação dos ácidos graxos ligados com ligação amida como ocorre nos esfingolipídeos As enzimas que es pecificamente hidrolisam certos lipídeos também são úteis na determinação da estrutura dos lipídeos As fosfolipases A C e D Figura 1016 clivam ligações particulares nos fos folipídeos e geram produtos com solubilidades e comporta mentos cromatográficos característicos A fosfolipase C por exemplo libera um álcool fosforilado solúvel em água como a fosfocolina da fosfatidilcolina e um diacilglicerol solúvel em clorofórmio cada qual podendo ser caracterizado se paradamente para determinar a estrutura do fosfolipídeo intacto A combinação da hidrólise específica com a carac terização dos produtos pelas cromatografias em camada del gada gasosalíquida e de alto desempenho frequentemente permite a determinação de uma estrutura lipídica A espectrometria de massa revela a estrutura lipídica completa Para se estabelecer sem ambiguidade o comprimento de uma cadeia hidrocarbonada ou a posição das ligações du plas a análise espectrométrica de massa dos lipídeos ou de seus derivados voláteis é fundamental As propriedades químicas de lipídeos similares p ex dois ácidos graxos de comprimentos similares insaturados em posições diferen tes ou dois isoprenoides com números diferentes de unida Nelson6edbookindb 378 Nelson6edbookindb 378 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 379 des de isopreno são muito parecidas e a ordem de eluição dos vários procedimentos cromatográficos frequentemente não muda entre eles No entanto quando o eluato de uma coluna cromatográfica é amostrado por espectrometria de massa os componentes de uma mistura lipídica podem ser separados simultaneamente e identificados por seus pa drões únicos de fragmentação Figura 1026 Com o au mento da resolução da espectroscopia de massa é possível identificar lipídeos individuais em misturas bastante com plexas sem primeiro fracionar os lipídeos do extrato bruto Esse método Figura 1025c evita perdas durante a sepa ração preliminar das subclasses de lipídeos e é mais rápido O lipidoma procura catalogar todos os lipídeos e suas funções Na exploração dos papéis biológicos dos lipídeos nas célu las e nos tecidos é importante saber quais estão presen tes e em quais proporções e saber como essa composição lipídica muda com o desenvolvimento embrionário com a doença ou durante o tratamento com fármacos Devido aos milhares de lipídeos diferentes que ocorrem naturalmente os bioquímicos que trabalham com lipídeos propuseram um novo sistema de nomenclatura com o propósito de tornar mais fácil a compilação e a localização nas bases de dados de composição lipídica O sistema coloca cada lipídeo em um de oito grupos químicos Tabela 103 designados por duas letras Dentro desses grupos distinções mais refina das são indicadas por classes e subclasses numeradas Por exemplo todas as glicerofosfocolinas são GP01 o subgrupo de glicerofosfocolinas com dois ácidos graxos em ligação éster é designado GP0101 com um ácido graxo em ligação éter na posição 1 e um em ligação éster na posição 2 o sub grupo é designado GP0102 Ácidos graxos específicos são designados por números que dão a cada lipídeo seu próprio identificador único de forma que cada lipídeo individual bem como tipos ainda não descobertos pode ser descrito sem ambiguidade em termos de um identificador de 12 ca racteres Um fator utilizado na classificação é a natureza do precursor biossintético Por exemplo lipídeos prenóis p ex dolicóis e vitaminas E e K são formados a partir de precursores isoprenil Os policetídeos incluem alguns produtos naturais muitos tóxicos com rotas biossintéticas relacionadas às dos ácidos graxos As oito categorias quí micas na Tabela 103 não coincidem perfeitamente com as divisões de acordo com a função biológica utilizadas neste capítulo Por exemplo os lipídeos estruturais das membra nas incluem tanto os glicerofosfolipídeos quanto os esfingo lipídeos categorias separadas na Tabela 103 Cada método de categorização tem suas vantagens A aplicação de técnicas de espectrometria de massa com alta capacidade e alta resolução pode fornecer catálogos quantitativos de todos os lipídeos presentes em um tipo de célula específico sob condições particulares o lipidoma e das maneiras nas quais o lipidoma muda com a diferencia ção doenças como o câncer ou tratamento com fármacos N Abundância 90 100 0 80 70 60 60 80 100 120 140 160 55 67 92 108 123 151 164 178 206 220 260 234 274 300 314 356 371 92 108 164 206 234 274 314 342 178 220 260 300 328 356 328 M 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 mz 50 40 30 20 10 H C H O O C FIGURA 1026 Determinação da estrutura de ácidos graxos por es pectrometria de massa O ácido graxo é convertido primeiro em um derivado que minimiza a migração das ligações duplas quando a molécula é fragmentada pelo bombardeamento de elétrons O derivado aqui apre sentado é um éster de picolinil do ácido linoleico 182D 912 MR 371 no qual o álcool é o picolinol em vermelho Quando bombardeada com uma corrente de elétrons essa molécula é volatilizada e convertida a um íon precursor M 1 Mr 371 no qual o átomo N possui a carga positiva e uma série de fragmentos menores produzidos pela quebra de ligações CC em áci dos graxos O espectrômetro de massa separa esses fragmentos carregados de acordo com a sua razão massacarga mz Para revisar os princípios da espectrometria de massa ver p 100102 Os íons proeminentes em mz 5 92 108 151 e 164 contêm o anel de piridina do picolinol e vários fragmentos do grupo carboxil mostrando que o composto é de fato um éster de picolinil O íon molecular M 1 mz 5 371 con firma a presença de um ácido graxo de C18 com duas ligações duplas A série uniforme de íons de 14 unidades de massa molecular u de distância represen ta a perda sucessiva de cada grupo metil e metileno da extremidade metilada da cadeia de acila começando no C18 a extremidade direita da molécula é mostrada aqui até que o íon atinja mz 5 300 Isso é seguido por uma lacuna de 26 u para os carbonos da ligação dupla terminal em mz 5 274 uma lacuna de 14 u mais adiante para o grupo metileno do C11 em mz 5 260 e assim por diante Dessa maneira a estrutura inteira é determinada ainda que esses dados isolados não revelem a configuração cis ou trans das ligações duplas Nelson6edbookindb 379 Nelson6edbookindb 379 020414 1845 020414 1845 380 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Uma célula animal contém mais do que mil espécies diferen tes de lipídeos cada qual presumivelmente com uma função específica Um crescente número de lipídeos possui suas funções conhecidas mas a grande parte ainda inexplorada do lipidoma oferece uma rica fonte de novos problemas para a próxima geração de bioquímicos e biólogos celulares RESUMO 104 Trabalhando com lipídeos c Na determinação da composição de lipídeos eles devem ser primeiro extraídos dos tecidos com solventes orgâ nicos e separados por cromatografias em camada delga da gáslíquido ou de alto desempenho c Fosfolipases específicas para uma das ligações em um fosfolipídeo podem ser utilizadas para gerar compostos mais simples para análise subsequente c Os lipídeos individuais são identificados por seu com portamento cromatográfico por sua suscetibilidade à hidrólise por enzimas específicas ou por espectrometria de massa c A espectrometria de massa de alta resolução permite a análise de misturas brutas de lipídeos sem préfracio namento c A lipidômica combina poderosas técnicas de análise para determinar o complemento completo dos lipídeos em uma célula ou tecido o lipidoma e para montar ba ses de dados de diferentes tipos celulares e sob diferen tes condições Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário ácido graxo 357 ácidos graxos poli insaturados AGPI 359 triacilglicerol 360 lipases 360 fosfolipídeo 363 glicolipídeo 363 glicerofosfolipídeo 363 lipídeo éter 364 plasmalogênio 364 galactolipídeo 365 esfingolipídeo 366 ceramida 366 esfingomielina 366 glicoesfingolipídeo 366 cerebrosídeo 366 globosídeo 366 gangliosídeo 366 esterol 368 colesterol 368 prostaglandina 371 tromboxano 371 leucotrieno 371 vitamina 373 vitamina D3 373 colecalciferol 373 vitamina A retinol 373 vitamina E 374 tocoferol 374 vitamina K 374 dolicol 375 policetídeo 376 lipidoma 379 Leituras adicionais Geral Fahy E Subramaniam S Brown HA Glass CK Merrill AH Jr Murphy RC Raetz CRH Russell DW Seyama Y Shaw W et al 2005 A comprehensive classification system for lipids J Lipid Res 46 839862 Novo sistema de nomenclatura para lipídeos biológicos que os separa em oito categorias principais A referência definitiva sobre a classificação de lipídeos Gurr MI Harwood JL Frayn KN 2002 Lipid Biochemistry An Introduction 5th edn Blackwell Science Ltd Oxford Boa fonte geral da estrutura e do metabolismo de lipídeos de nível intermediário Lipid Maps Nature Lipidomics Gateway wwwlipidmapsorg Tutoriais e aulas sobre a estrutura e a função lipídica métodos lipidômicos e banco de dados sobre as estruturas e propriedades dos lipídeos Vance JE Vance DE eds 2008 Biochemistry of Lipids Lipoproteins and Membranes 5ed Elsevier Science Publishing Co Inc New York Excelente coleção de revisões sobre vários aspectos da estrutura da biossíntese e da função dos lipídeos Lipídeos como nutrientes Angerer P von Schacky C 2000 Omega3 polyunsaturated fatty acids and the cardiovascular system Curr Opin Lipidol 11 5763 Covington MB 2004 Omega3 fatty acids Am Fam Physician 70 133140 Sucinto relato sobre a descoberta de que os ácidos graxos ômega3 reduzem o risco de doenças cardiovasculares de Logeril M Salen P Martin JL Monjaud I Delaye J Mamelle N 1999 Mediterranean diet traditional risk factors and the rate of cardiovascular complications after myocardial infarction final report of the Lyon Diet Heart Study Circulation 99 779785 Lavie CJ Milani RV Mehra MR Ventura HO 2009 Omega3 polyunsaturated fatty acids and cardiovascular diseases J Am Coll Cardiol 54 585594 TABELA 103 As oito principais categorias dos lipídeos biológicos Categoria Código da categoria Exemplos Ácidos graxos FA Oleato estearoilCoA palmitoilcarnitina Glicerolipídeos GL Di e triacilgliceróis Glicerofosfolipídeos GP Fosfatidilcolina fosfatidilserina fosfatidiletanolamina Esfingolipídeos SP Esfingomielina gangliosídeo GM2 Lipídeos de esterol ST Colesterol progesterona e ácidos biliares Lipídeos de prenol PR Farnesol geraniol retinol ubiquinona Sacarolipídeos SL Lipopolissacarídeo Poliquetídeos PK Tetraciclina eritromicina e aflatoxina B1 Nelson6edbookindb 380 Nelson6edbookindb 380 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 381 Mello MM 2009 New York Citys war on fat N Engl J Med 360 2015 2020 Aspectos legais e éticos da proibição de ácidos graxos trans em restaurantes Mozaffarian D Katan MB Ascherio PH Stampfer MJ Willet WC 2006 Trans fatty acids and cardiovascular disease N Engl J Med 354 16011613 Um resumo da evidência de que os ácidos graxos trans da dieta predispõem à doença cardíaca coronária Lipídeos estruturais em membranas Bogdanov M Dowhan W 1999 Lipidassisted protein folding J Biol Chem 274 3682736830 Pequena revisão do papel dos lipídeos de membrana no enovelamento das proteínas de membrana Dowhan W 1997 Molecular basis for membrane phospholipid diversity why are there so many lipids Annu Rev Biochem 66 199232 Jacquemet A Barbeau J Lemiegre L Benvegnu T 2009 Archaeal tetraether bipolar lipids structures functions and applications Biochimie 91 711717 Valle D Beaudet AL Vogelstein BKinzler KW Antonarakis SE Ballabio A eds 2006 Scrivers Online Metabolic Molecular Bases of Inherited Disease wwwommbidcom Essa enciclopédia médica clássica editada em 2001 em um conjunto de quatro volumes agora é mantida atualizada online Contém descrições definitivas dos aspectos clínicos bioquímicos e genéticos de centenas de doenças metabólicas humanas uma fonte de credibilidade e uma leitura fascinante A Parte 16 Distúrbios lissosomais inclui 24 artigos sobre várias doenças do metabolismo dos lipídeos Lipídeos como sinalizadores cofatores e pigmentos Bell RM Exton JH Prescott SM eds 1996 Lipid Second Messengers Handbook of Lipid Research Vol 8 Plenum Press New York Berkner KL Runge KW 2004 The physiology of vitamin K nutriture and vitamin Kdependent protein function in atherosclerosis J Thromb Haemost 2 21182132 Binkley NC Suttie JW 1995 Vitamin K nutrition and osteoporosis J Nutr 125 18121821 BrigeliusFlohé R Traber MG 1999 Vitamin E function and metabolism FASEB J 13 11451155 Chojnacki T Dallner G 1988 The biological role of dolichol Biochem J 251 19 Clouse SD 2002 Brassinosteroid signal transduction clarifying the pathway from ligand perception to gene expression Mol Cell 10 973982 DeLuca HF 2008 Evolution of our understanding of vitamin D Nutr Rev 66 S73S87 Dicke M van Loon JJA Soler R 2009 Chemical complexity of volatiles from plants induced by multiple attack Nat Chem Biol 5 317324 Holick MF 2007 Vitamin D deficiency N Engl J Med 357 266281 James DJ Khodthong C Kowalchyk JA Martin TF 2010 Phosphatidylinositol 45bisphosphate regulation of SNARE function in membrane fusion mediated by CAPS Adv Enzyme Regul 50 6270 Jones MB Rosenberg JN Betenbaugh MJ Krag SS 2009 Structure and synthesis of polyisoprenoids used in Nglycosylation across the three domains of life Biochim Biophys Acta 1790 485494 Revisão em nível intermediário sobre o papel dos dolicóis na glicosilação Lee D 2007 Natures Palette The Science of Plant Color University of Chicago Press Chicago IL Fascinante livro de nível intermediário sobre lipídeos como pigmentos biológicos Rosen H GonzalezCabrera PJ Sanna M G Brown S 2009 Sphingosine 1phosphate receptor signaling 78 743768 Annu Rev Biochem Suttie JW 1993 Synthesis of vitamin Kdependent proteins FASEB J 7 445452 Descreve a base bioquímica para a necessidade de vitamina K na coagulação sanguínea e a importância da carboxilação na síntese da trombina a proteína da coagulação sanguínea Weber H 2002 Fatty acidderived signals in plants Trends Plant Sci 7 217224 Wymann MP Schneiter R 2008 Lipid signaling in disease Nat Rev Mol Cell Biol 9 162176 Trabalhando com lipídeos Christie WW 1998 Gas chromatographymass spectrometry methods for structural analysis of fatty acids Lipids 33 343353 Detalhada descrição dos métodos utilizados para obter dados como os apresentados na Figura 1026 Christie WW 2003 Lipid Analysis 3rd edn The Oily Press Bridgwater England Dennis EA Deems RA Harkewicz R Quehenberger O Brown HA Milne SB Myers DS Glass CK Hardiman G Reichart D et al 2010 A mouse macrophage lipidome J Biol Chem 285 3997639985 Artigo científico que descreve as variações do lipidoma de macrófagos Harkewicz R Dennis EA 2011 Applications of mass spectrometry to lipids and membranes Annu Rev Biochem 80 301325 Discussão avançada sobre a espectroscopia de massa e lipidômica Murphy RC Gasskell SJ 2011 New applications of mass spectrometry in lipid analysis J Biol Chem 286 2542725433 Watson AD 2006 Lipidomics a global approach to lipid analysis in biological systems J Lipid Res 47 21012111 Revisão de nível intermediário das classes de lipídeos seus métodos de extração e separação e os métodos de identificação e quantificação de todos os lipídeos de uma determinada célula tecido ou organela por espectrometria de massa Problemas 1 Definição operacional de lipídeos De que maneira a definição de lipídeo difere dos tipos de definição utilizados para outras biomoléculas como os aminoácidos os ácidos nu cleicos e as proteínas 2 Pontos de fusão dos lipídeos Os pontos de fusão de uma série de ácidos graxos de 18 carbonos são ácido esteá rico 696C ácido oleico 134C ácido linoleico 5 C e ácido linolênico 11C a Que aspecto estrutural desses ácidos graxos de 18 car bonos pode ser correlacionado com o ponto de fusão b Desenhe todos os triacilgliceróis possíveis que podem ser construídos a partir de glicerol ácido palmítico e ácido olei co Classifiqueos em ordem crescente de ponto de fusão Nelson6edbookindb 381 Nelson6edbookindb 381 020414 1845 020414 1845 382 DAVID L NELSON MICHAEL M COX c Ácidos graxos de cadeia ramificada são encontrados em alguns lipídeos de membrana bacterianos A sua presença au menta ou diminui a fluidez das membranas isto é diminui ou aumenta o seu ponto de fusão Por quê 3 Preparação de molho béarnaise Durante a prepara ção do molho béarnaise as gemas de ovo são incorporadas na manteiga derretida para estabilizar o molho e evitar a se paração O agente estabilizante nas gemas de ovo é a lecitina fosfatidilcolina Explique por que isso funciona 4 Unidades de isopreno em isoprenoides O geraniol o farnesol e o esqualeno são chamados de isoprenoides porque são sintetizados a partir de unidades isopreno de cinco carbo nos Em cada composto circule as unidades de cinco carbonos representando as unidades de isopreno ver Figura 1022 Geraniol OH Farnesol OH Esqualeno 5 Denominando os estereoisômeros de lipídeos Os dois compostos abaixo são estereoisômeros da carvona com propriedades bem diferentes o da esquerda tem cheiro de hor telã e o da direita tem cheiro de alcaravia Denomine os com postos utilizando o sistema RS Hortelã H O CH2 Alcaravia H O CH2 6 Designação RS para a alanina e o lactato Desenhe utilizando a notação de fórmula em perspectiva e indique os isômeros R e S do ácido 2aminopropanoico alanina e do ácido 2hidroxipropanoico ácido láctico Ácido 2aminopropanoico alanina C H2N CH3 H COOH Ácido 2hidroxipropanoico ácido láctico C HO CH3 H COOH 7 Componentes hidrofóbicos e hidrofílicos dos lipí deos de membrana Uma característica estrutural comum dos lipídeos de membrana é a sua natureza anfipática Por exemplo na fosfatidilcolina as duas cadeias de ácidos gra xos são hidrofóbicas e o grupo cabeça fosfocolina é hidro fílico Para cada um dos próximos lipídeos de membrana denomine os componentes que servem como unidades hi drofóbica e hidrofílica a fosfatidiletanolamina b esfin gomielina c galactosilcerebrosídeo d gangliosídeo e colesterol 8 Estrutura do ácido graxo ômega6 Desenhe a estru tura do ácido graxo ômega6 161 9 Hidrogenação catalítica dos óleos A hidrogenação catalítica utilizada na indústria alimentícia converte as liga ções duplas nos ácidos graxos dos triacilgliceróis do óleo a CH2CH2 Como isso afeta as propriedades físicas dos óleos 10 Labilidade alcalina dos triacilgliceróis Um procedi mento comum para limpar a caixa de gordura da pia de cozinha consiste em adicionar um produto que contém hidróxido de sódio Explique por que isso funciona 11 Deduzindo a estrutura lipídica a partir da compo sição A análise da composição de certo lipídeo mostra que ele tem exatamente um mol de ácido graxo por mol de fosfato inorgânico Ele pode ser um glicerofosfolipídeo Um gangliosí deo Uma esfingomielina 12 Deduzindo a estrutura do lipídeo a partir da pro porção molar dos componentes A hidrólise completa de um glicerofosfolipídeo gera glicerol dois ácidos graxos 161D 9 e 160 ácido fosfórico e serina em proporção molar 11111 Denomine esse lipídeo e desenhe sua estrutura 13 Impermeabilidade das ceras Que propriedade das cutículas cerosas que recobrem as folhas das plantas deixa a cutícula impermeável à água 14 Ação das fosfolipases As peçonhas de uma es pécie de cascavel Crotalus adamanteus e a da naja da Índia contêm a fosfolipase A2 que catalisa a hidrólise de ácidos graxos na posição C2 dos glicerofosfolipídeos O produto da degradação do fosfolipídeo dessa reação é a lisolecitina leciti na é a fosfatidilcolina Em altas concentrações esse e outros lisofosfolipídeos atuam como detergentes dissolvendo as membranas dos eritrócitos e lisando as células A hemólise em grandes proporções pode pôr a vida em risco a Todos os detergentes são anfipáticos Quais são as por ções hidrofílicas e hidrofóbicas da lisolecitina b A dor e a inflamação causadas pela mordida de cobra podem ser tratadas com certos esteroides Em que se funda menta esse tratamento c Embora os altos níveis de fosfolipase A2 na peçonha possam ser letais essa enzima é necessária para vários proces sos metabólicos normais Quais são eles 15 Os lipídeos na determinação do grupo sanguí neo Foi visto na Figura 1015 que a estrutura dos glicoesfin golipídeos determina os grupos sanguíneos A B e O em huma nos Também é verdade que as glicoproteínas determinam os grupos sanguíneos Como podem ambas as afirmações serem verdadeiras 16 Mensageiros intracelulares dos fosfatidilinosi tóis Quando o hormônio vasopressina estimula a clivagem de fosfatidilinositol45bifosfato pela fosfolipase C sensível a hor Nelson6edbookindb 382 Nelson6edbookindb 382 020414 1845 020414 1845 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 383 mônios dois produtos são formados Quais são eles Compare suas propriedades e suas solubilidades em água e prediga se algum deles se difundiria rapidamente no citosol 17 Armazenamento de vitaminas lipossolúveis Ao contrário das vitaminas hidrossolúveis que devem ser parte da nossa dieta diária as vitaminas lipossolúveis podem ser ar mazenadas no corpo em quantidades suficientes para muitos meses Sugira uma explicação para essa diferença 18 Hidrólise de lipídeos Denomine os produtos da hidró lise branda com NaOH diluído do a 1estearoil23dipalmi toilglicerol b 1palmitoil2oleoilfosfatidilcolina 19 Efeitos da polaridade na solubilidade Classifique as moléculas seguintes em ordem crescente de solubilidade em água um triacilglicerol um diacilglicerol e um monoacilglice rol todos contendo apenas ácido palmítico 20 Separação cromatográfica de lipídeos Uma mistu ra de lipídeos é aplicada a uma coluna de sílica gel que é en tão lavada com solventes de polaridade crescente A mistura consiste em fosfatidilserina fosfatidiletanolamina fosfatidil colina palmitato de colesteril éster de esterol esfingomie lina palmitato ntetradecanol triacilglicerol e colesterol Em que ordem os lipídeos vão eluir da coluna Explique o seu raciocínio 21 Identificação de lipídeos desconhecidos Johann Thudichum que exercia medicina em Londres cerca de 100 anos atrás também se aventurava na química de lipídeos em seu tempo livre Ele isolou uma variedade de lipídeos do tecido neural e caracterizou e identificou muitos deles Seus frascos dos lipídeos isolados cuidadosamente selados e identificados foram redescobertos muitos anos depois a Como você confirmaria usando técnicas não disponí veis para Thudichum que os frascos identificados como es fingomielina e cerebrosídeo realmente continham esses compostos b Como você distinguiria a esfingomielina da fosfatidilco lina por testes químicos físicos ou enzimáticos 22 Ninhidrina para detectar lipídeos em placas de TLC A ninhidrina reage especificamente com aminas primá rias para formar um produto roxoazulado Um cromatograma em camada delgada de lipídeos do fígado de ratos é pulveriza do com ninhidrina e deixase que a coloração se desenvolva Quais fosfolipídeos podem ser detectados dessa forma Problema de análise de dados 23 Determinando a estrutura do lipídeo anormal na doença de TaySachs A Figura Q1 do Quadro 101 mostra a rota de degradação de gangliosídeos em indivíduos saudáveis normais e em indivíduos com certas doenças genéticas Al guns dos dados nos quais a figura está baseada foram apresen tados em um artigo de Lars Svennerholm 1962 Observe que o açúcar Neu5Ac o ácido Nacetilneuramínico representado na figura do Quadro 101 como é um ácido siálico Svennerholm relatou que aproximadamente 90 dos mo nosialiogangliosídeos isolados do cérebro de uma pessoa nor mal consistiam em um composto com ceramida hexose N acetilgalactosamina e ácido Nacetilneuramínico na proporção molar de 1311 a Qual dos gangliosídeos GM1 a GM3 e globosídeo da Figura Q1 do Quadro 101 se encaixa nessa descrição Expli que o seu raciocínio b Svennerholm relatou que 90 dos gangliosídeos de um paciente com a doença de TaySachs tinham uma proporção molar dos mesmos quatro componentes dados anteriormen te de 1211 Isso é consistente com a figura do Quadro 101 Explique o seu raciocínio Para determinar a estrutura em maior detalhe Sven nerholm tratou os gangliosídeos com neuraminidase para remover o ácido Nacetilneuramínico Isso resultou em um asialogangliosídeo que era muito mais fácil de analisar Ele hidrolisouo com ácido coletou os produtos que continham ce ramida e determinou a proporção molar dos açúcares em cada produto Ele fez isso tanto para os gangliosídeos de pessoas normais quanto para os daquelas com a doença de TaySachs Os seus resultados são mostrados abaixo Gangliosídeo Ceramida Glicose Galactose Galactosamina Normal Fragmento 1 1 1 0 0 Fragmento 2 1 1 1 0 Fragmento 3 1 1 1 1 Fragmento 4 1 1 2 1 TaySachs Fragmento 1 1 1 0 0 Fragmento 2 1 1 1 0 Fragmento 3 1 1 1 1 c Com base nesses dados o que você pode concluir sobre a estrutura do gangliosídeo normal Isso é consistente com a estrutura no Quadro 101 Explique o seu raciocínio d O que você pode concluir sobre a estrutura do ganglio sídeo de TaySachs Isso é consistente com a estrutura no Qua dro 101 Explique o seu raciocínio Svennerholm também relatou o trabalho de outros pes quisadores que permetilaram o asialogangliosídeo normal Permetilação é o mesmo que uma metilação exaustiva um grupo metil é adicionado a todos os grupos hidroxila de um açúcar Eles encontraram os seguintes açúcares permetilados 236trimetilglicopiranose 2346tetrametilgalactopiranose 246trimetilgalactopiranose e 46dimetil2desóxi2amino galactopiranose e A qual açúcar do GM1 cada um dos açúcares permetila dos corresponde Explique o seu raciocínio f Com base em todos os dados apresentados até aqui que partes de informação sobre a estrutura do gangliosídeo normal estão faltando Referência Svennerholm L 1962 The chemical structure of normal human brain and TaySachs gangliosides Biochem Biophys Res Comm 9 436441 Nelson6edbookindb 383 Nelson6edbookindb 383 020414 1845 020414 1845 Nelson6edbookindb 384 Nelson6edbookindb 384 020414 1845 020414 1845 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 111 Composição e arquitetura das membranas 386 112 Dinâmica da membrana 395 113 Transporte de solutos através da membrana 402 A primeira célula provavelmente passou a existir quan do uma membrana se formou envolvendo um peque no volume de solução aquosa e separandoa do resto do universo Membranas definem os limites externos das células e controlam o tráfego molecular por esses limites Figura 111 em células eucarióticas elas dividem o es paço interno em compartimentos para separar processos e componentes Organizam sequências de reações complexas e são fundamentais tanto para a conservação de energia biológica quanto para a comunicação célulacélula As ati vidades biológicas das membranas devemse às suas pro priedades físicas notáveis As membranas são flexíveis au tosselantes e seletivamente permeáveis a solutos polares A flexibilidade das membranas permite que a forma mude ao acompanhar o crescimento e o movimento da célula como no movimento ameboide Com a sua capacidade de se rom per e resselar duas membranas podem se fundir como na exocitose ou um compartimento envolvido por uma única membrana pode sofrer fissão e produzir dois compartimen tos selados como na endocitose ou na divisão celular sem gerar grandes vazamentos através das superfícies celulares Pelo fato de serem seletivamente permeáveis as membra nas retêm certos compostos e íons dentro das células e dentro de compartimentos celulares específicos enquanto excluem outros As membranas não são barreiras meramente passivas Elas incluem um arranjo de proteínas especializadas na promoção ou catálise de vários processos celulares Na superfície celular transportadores movem solutos orgâ nicos e íons inorgânicos específicos através da membra na receptores captam sinais extracelulares e disparam mudanças moleculares na célula moléculas de adesão mantêm células vizinhas juntas Dentro da célula as membranas organizam processos celulares como a sín tese de lipídeos e certas proteínas assim como a trans dução de energia na mitocôndria e nos cloroplastos Por consistirem em apenas duas camadas de moléculas as membranas são muito finas essencialmente bidimensio nais Colisões intermoleculares são muito mais prováveis nesse espaço bidimensional do que em um espaço tridi mensional de forma que a eficiência dos processos cata lisados por enzimas organizados dentro das membranas é muito aumentada Este capítulo primeiro descreve a composição das membranas celulares e a sua arquitetura química as es truturas moleculares que propiciam suas funções biológi cas A seguir serão consideradas as características dinâmi cas notáveis das membranas nas quais lipídeos e proteínas movemse em relação uns aos outros A adesão celular a endocitose e a fusão de membrana que acompanham a se creção de neurotransmissores ilustram o papel dinâmico das proteínas de membrana Então segue para a passagem de solutos mediada por proteínas através da membrana via transportadores e canais iônicos Em capítulos seguintes serão discutidos o papel das membranas na transdução de sinal Capítulos 12 e 23 a transdução de energia Capí tulo 19 a síntese de lipídeos Capítulo 21 e a síntese de proteínas Capítulo 27 11 Membranas Biológicas e Transporte Retículo endoplasmático Mitocôndria Grânulo secretor Membrana nuclear FIGURA 111 Membranas biológicas Esta micrografia eletrônica de uma célula do pâncreas exócrino em secção fina mostra vários comparti mentos formados ou circundados por membranas o retículo endoplasmáti co a mitocôndria os grânulos secretores e a membrana nuclear Nelson6ed11indd 385 Nelson6ed11indd 385 020514 1724 020514 1724 386 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 111 Composição e arquitetura das membranas Uma abordagem para se compreender a função da mem brana é estudar sua composição determinar por exemplo quais componentes são comuns a todas as membranas e quais são exclusivos a membranas com funções específicas Assim antes de descrever a estrutura e a função da mem brana cabe analisar seus componentes moleculares proteí nas e lipídeos polares que são responsáveis por quase toda a massa das membranas biológicas e carboidratos presen tes como parte de glicoproteínas e glicolipídeos Cada tipo de membrana tem proteínas e lipídeos característicos A proporção relativa de proteína e lipídeo varia de acordo com o tipo da membrana Tabela 111 refletindo a diversi dade das funções biológicas Por exemplo certos neurônios têm uma bainha de mielina uma extensão da membrana plasmática que se enrola ao redor da célula várias vezes e age como isolante elétrico passivo A bainha de mielina consiste principalmente em lipídeos enquanto membranas plasmáticas de bactérias e membranas de mitocôndrias e cloroplastos sítios de muitos processos catalisados por en zimas contêm mais proteínas do que lipídeos em massa por massa total Para os estudos de composição da membrana a pri meira tarefa é isolar uma membrana selecionada Quando células eucarióticas são sujeitas à ruptura mecânica suas membranas plasmáticas rompemse e fragmentamse libe rando componentes citoplasmáticos e organelas ligadas à membrana como mitocôndrias cloroplastos lisossomos e núcleos Organelas intactas e fragmentos de membranas plasmáticas podem ser isolados com o uso das técnicas des critas no Capítulo 1 ver Figura 18 e no Problema Resol vido 21 p 57 Claramente as células têm mecanismos para controlar os tipos e as quantidades de lipídeos de membrana que elas sintetizam bem como para direcionar lipídeos espe cíficos a organelas particulares Todos os reinos todas as espécies todos os tecidos ou tipos celulares e as organe las de cada tipo celular têm um conjunto característico de lipídeos de membrana Membranas plasmáticas por exemplo são enriquecidas com colesterol e não contêm cardiolipinas detectáveis Figura 112 membranas mi tocondriais contêm muito pouco colesterol e esfingolipí deos mas contêm fosfatidilglicerol e cardiolipina que são sintetizados dentro da mitocôndria Exceto por alguns poucos casos o significado funcional dessas combinações ainda não é conhecido 0 Plasmática Lisossômica Nuclear Tipo de membrana no hepatócito de rato RE rugoso RE liso Golgi Mitocondrial interna Mitocondrial externa 20 40 Porcentagem de lipídeos na membrana Colesterol 60 80 100 Cardiolipina Lipídeos secundários Esfingolipídeo Fosfatidilcolina Fosfatidiletanolamina FIGURA 112 Composição lipídica da membrana plasmática e mem branas de organelas de hepatócito de rato A especialização funcional de cada tipo de membrana aparece refletida na sua composição lipídica única O colesterol é proeminente na membrana plasmática mas raramen te é detectável em membranas mitocondriais A cardiolipina é o principal componente da membrana mitocondrial interna mas não da membrana plasmática A fosfatidilserina o fosfatidilinositol e o fosfatidilglicerol são componentes relativamente secundários na maioria das membranas mas exercem funções cruciais o fosfatidilinositol e seus derivados por exemplo são importantes na transdução de sinal desencadeada por hormônios Os esfingolipídeos a fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina estão presentes na maioria das membranas porém em proporções variáveis Os glicolipíde os que são os principais componentes das membranas dos cloroplastos de plantas estão praticamente ausentes nas células animais TABELA 111 Principais componentes das membranas plasmáticas em vários organismos Componentes por peso Proteína Fosfolipídeo Esterol Tipo de esterol Outros lipídeos Bainha de mielina humana 30 30 19 Colesterol Galactolipídeos plasmalogênios Fígado de camundongo 45 27 25 Colesterol Folha do milho 47 26 7 Sitosterol Galactolipídeos Levedura 52 7 4 Ergosterol Triacilgliceróis ésteres de esteril Paramécio protista ciliado 56 40 4 Estigmasterol E coli 75 25 0 Nota Os valores não totalizam 100 em nenhum dos casos pois há outros componentes além de proteínas fosfolipídeos e esteróis as plantas por exemplo têm altos níveis de glicolipídeos Nelson6ed11indd 386 Nelson6ed11indd 386 070414 1420 070414 1420 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 387 A composição proteica das membranas de diferentes origens varia ainda mais amplamente do que a sua composi ção lipídica refletindo uma especialização funcional Além disso algumas proteínas de membrana são covalentemente ligadas aos oligossacarídeos Por exemplo na glicoforina glicoproteína da membrana plasmática do eritrócito 60 de sua massa consiste em oligossacarídeos complexos cova lentemente ligados a resíduos de aminoácidos específicos Resíduos de Ser Thr e Asn são os pontos de ligação mais comuns ver Figura 730 As porções de açúcar das gli coproteínas de superfície influenciam o enovelamento das proteínas assim como suas estabilidades e destinos intrace lulares desempenhando um papel significativo na interação específica de ligantes com os receptores glicoproteicos de superfície ver Figura 737 Algumas proteínas de membrana são covalentemente ligadas a um ou mais lipídeos que servem como âncoras hi drofóbicas para fixar as proteínas à membrana como ainda será visto Todas as membranas biológicas compartilham algumas propriedades fundamentais As membranas são impermeáveis para a maioria dos solu tos polares ou carregados mas são permeáveis a compos tos apolares Elas têm de 5 a 8 nm 50 a 80 Å de espes sura quando proteínas protuberantes em ambos os lados são incluídas e apresentam aparência trilaminar quando vistas em secção transversal em microscópio eletrônico A evidência conjunta por microscopia eletrônica e estu dos da composição química assim como estudos físicos da permeabilidade e do movimento de moléculas proteicas e lipídicas individuais em membranas levou ao desenvolvi mento do modelo do mosaico fluido para a estrutura das membranas biológicas Figura 113 Os fosfolipídeos for mam uma bicamada na qual as regiões apolares das molé culas lipídicas em cada camada são orientadas para o cen tro da bicamada e seus grupos polares são orientados para fora interagindo com a fase aquosa de cada lado As proteí nas estão embebidas nessa lâmina da bicamada mantidas por interações hidrofóbicas entre os lipídeos de membrana e os domínios hidrofóbicos nas proteínas Algumas pro teínas projetamse apenas de um lado da membrana en quanto outras expõem seus domínios em ambos os lados A orientação das proteínas na bicamada é assimétrica con ferindo à membrana uma lateralização os domínios pro teicos expostos em um lado da membrana são diferentes daqueles expostos do outro lado refletindo uma assimetria funcional As unidades lipídicas e proteicas individuais na membrana formam um mosaico fluido com um padrão que ao contrário de um mosaico de ladrilhos de cerâmica em argamassa é livre para mudar constantemente O mosaico da membrana é fluido porque a maioria das interações en tre seus componentes é não covalente deixando moléculas proteicas e lipídicas livres para se movimentarem lateral mente no plano da membrana A seguir serão abordadas algumas das características do modelo do mosaico fluido em mais detalhes e analisadas as evidências experimentais que sustentam o modelo básico mas que precisou ser aprimorado de várias formas A bicamada lipídica é o elemento estrutural básico das membranas Os glicerofosfolipídeos os esfingolipídeos e os esteróis são praticamente insolúveis em água Quando mistura dos com água eles espontaneamente formam agregados lipídicos microscópicos agrupandose com suas porções hidrofóbicas em contato entre si e com seus grupos hi drofílicos interagindo com a água circundante Esse agru pamento reduz a superfície hidrofóbica exposta à água e assim minimiza o número de moléculas da camada de água ordenada na interface lipídeoágua ver Figura 27 resultando em aumento de entropia Interações hidrofóbi cas entre moléculas lipídicas provêm uma força propulso ra termodinâmica para a formação e a manutenção desses agregados Dependendo das condições exatas e da natureza dos lipídeos três tipos de agregados de lipídeos podem ser formados quando lipídeos anfipáticos são misturados com água Figura 114 Micelas são estruturas esféricas que contêm desde poucas dúzias até alguns poucos milhares de moléculas anfipáticas Essas moléculas dispõemse com suas regiões hidrofóbicas agregadas na parte interna en quanto a água é excluída e com seus grupos polares hidro fílicos na superfície em contato com a água A formação de micelas é favorecida quando a área de secção transversal do grupo polar é maior do que das cadeias lateralis acil como nos ácidos graxos lisofosfolipídeos fosfolipídeos com um ácido graxo a menos e detergentes como o dodecil sulfato de sódio SDS p 94 Um segundo tipo de agregado lipídico na água é a bica mada na qual duas camadas monolipídicas formam uma lâmina bidimensional A formação da bicamada é favorecida quando as áreas de secção transversal dos grupos polares e as cadeias acil laterais são similares como no caso dos gli cerofosfolipídeos e dos esfingolipídeos As porções hidrofó bicas em cada monocamada excluídas da água interagem Bicamada lipídica Proteína periférica Proteína integral hélice transmembrana única Proteína periférica covalentemente ligada ao lipídeo Cadeias de oligossacarídeos de glicoproteínas Proteína ancorada por GPI Grupos polares das cabeças de fosfolipídeos Esterol Glicolipídeos Fora Dentro Esfingolipídeo FIGURA 113 Modelo do mosaico fluido para a estrutura da membrana plasmática As cadeias acil no interior da membrana formam uma região hi drofóbica fluida As proteínas integrais flutuam nesse mar de lipídeos mantidas por interações hidrofóbicas com as cadeias laterais de resíduos de seus aminoá cidos apolares Tanto as proteínas quanto os lipídeos são livres para se moverem lateralmente no plano da bicamada mas o movimento de um lado ao outro da bicamada é restrito As porções de carboidrato ligadas a algumas proteínas e lipídeos da membrana plasmática são expostas na superfície extracelular Nelson6ed11indd 387 Nelson6ed11indd 387 070414 1420 070414 1420 388 DAVID L NELSON MICHAEL M COX entre si Os grupos polares hidrofílicos interagem com a água em cada superfície da bicamada Devido ao fato de as bordas das regiões hidrofóbicas Figura 114b estarem em contato com a água a lâmina da bicamada é relativamente instável e dobrase espontaneamente sobre si mesma para formar uma esfera oca a vesícula Figura 114c A super fície contínua das vesículas elimina a exposição de regiões hidrofóbicas permitindo às bicamadas alcançarem o máxi mo de estabilidade quando em meio aquoso A formação de vesículas também cria compartimentos aquosos separados É provável que os precursores das primeiras células vivas tenham apresentado semelhanças com as vesículas lipídi cas com seus conteúdos aquosos separados do meio cir cundante por uma casca hidrofóbica A bicamada lipídica tem 3 nm 30 Å de espessura O cerne hidrocarbonado composto por CH2 e CH3 dos grupos acil é tão apolar quanto o decano e vesículas for madas em laboratório a partir de lipídeos puros liposso mos são essencialmente impermeáveis a solutos polares assim como é a bicamada lipídica de membranas biológi cas embora membranas biológicas como será visto sejam permeáveis a solutos para os quais tenham transportadores específicos Os lipídeos das membranas plasmáticas são distribuídos assimetricamente entre as duas lâminas da bicamada em bora a assimetria não seja absoluta ao contrário das pro teínas de membrana Na membrana plasmática de eritróci to por exemplo lipídeos contendo colina fosfatidilcolina e esfingomielina geralmente são encontrados na lâmina externa extracelular ou exoplasmática Figura 115 enquanto a fosfatidilserina a fosfatidiletanolamina e os fosfatidilinositóis são muito mais comuns na lâmina interna lado citoplasmático O fluxo de componentes de mem brana a partir do retículo endoplasmático atravessando o aparelho de Golgi e rumando à membrana plasmática via vesículas transportadoras é acompanhado por mudanças na composição lipídica e disposição ao longo da membrana Figura 116 A fosfatidilcolina é o principal fosfolipídeo no lúmen da monocamada da membrana do Golgi mas em vesículas transportadoras a fosfatidilcolina tem sido ampla mente substituída por esfingolipídeos e colesterol os quais na fusão das vesículas transportadoras com a membrana plasmática compõem a maioria dos lipídeos na monocama da externa da membrana plasmática Mudanças na distribuição dos lipídeos entre as lâminas da membrana plasmática geram consequências biológicas Unidades individuais têm a forma de cunha secção transversal da cabeça maior do que a da cadeia lateral Unidades individuais são cilíndricas secções transversais da cabeça e da cadeia lateral são iguais c Vesícula b Bicamada a Micela Cavidade aquosa FIGURA 114 Agregados lipídicos anfipáticos formados na água a Em micelas as cadeias hidrofóbicas dos ácidos graxos são sequestradas no núcleo da esfera Praticamente não há água no interior hidrofóbico b Na bicamada aberta todas as cadeias laterais acil exceto aquelas das margens da lâmina estão protegidas da interação com a água c Quando a bica mada bidimensional se dobra sobre ela mesma ela forma uma bicamada fechada uma vesícula oca tridimensional lipossomo envolvendo uma ca vidade aquosa Fosfatidilinositol 4fosfato Fosfatidilinositol Fosfatidilinositol 45bifosfato Ácido fosfatídico 5 Fosfatidilserina 15 Esfingomielina 23 Fosfatidilcolina 27 Fosfatidiletanolamina 30 100 Lâmina interna Lâmina externa 0 Percentual de distribuição na membrana Fosfolipídeo de membrana do eritrócito Percentual de fosfolipídeo total na membrana 100 FIGURA 115 Distribuição assimétrica de fosfolipídeos entre as mo nocamadas interna e externa da membrana plasmática de eritrócito A distribuição de um fosfolipídeo específico é determinada ao se tratar a célula intacta com fosfolipase C que não pode alcançar os lipídeos da mo nocamada lâmina interna mas remove os grupos polares das cabeças dos lipídeos na monocamada externa A proporção de cada grupo polar liberado fornece uma estimativa da fração de cada lipídeo na monocamada externa Nelson6ed11indd 388 Nelson6ed11indd 388 070414 1420 070414 1420 PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA DE LEHNINGER 389 Membrana plasmatica Esfingolipideos ee eS eee eaten SURE eaten a colesterol oO a sxe Vesicula de oR GON COO OOOCOOOCO af A Nal As transporte be 4 nee ne He UN ge GY eee SS PAATOIWGCUT RANI fee oe fof ys eS Fosfatidiletalnolamina a i at e fosfatidilserina it Ro gee Fase Fosfatidilcolina rare Bt 5 eee c z esfingolipideos colesterol ge a HANS SCOUT NTs e oDeahenoOnenee aa 3 aE eee SEE USEEE Cee bat a et i i ch ran Ni TOG ee Rede fF Oe ee aN TransGolgi ff ANITA AM AAT At i Raa Tino eee ra ence TN HE Ssesessseseesseceues iat amas UE Ne foe E AEE ESTEE STI He Fosfatidiletalnolamina frosts e fosfatidilserina gos Ss dat gop se Y ae ek ee Fosfatidiletalnolamina fet fe eo ee vet va et oe Stee fosfatidilserina cS Se ee Nee fof fae at Rose se fae gee ie Vie a Peas va it aN pet ot jet TE MIN 4 Sie vy AAAEARAIARRAS cad at ee iF Fosfatidilcolina iat i feo fr Aen ef q iy ee FIGURA116 A distribuigao de lipideos na membrana em uma célu duas monocamadas de uma dada membrana podem também diferir quan la tipica Cada membrana tem sua composiao caracteristica propriae as to a Sua Composiao Por exemplo apenas quando a fosfatidilserina se move para na associamse a membrana por interacoes eletrostaticas a lamina externa na membrana plasmatica 6 que a plaqueta e ligagdes de hidrogénio com dominios hidrofilicos de pro é capaz de exercer seu papel na formagao de coagulo san teinas integrais e com grupos polares dos lipideos de mem guineo Para muitos outros tipos celulares a exposicao da fosfatidilserina na superficie externa marca a célula para a destruiao por morte celular programada O movimento de Proteinas moléculas de fosfolipideos através da bicamada é catalisado periféricas sf roteinas e regulado por proteinas especificas ver Figura 1117 anfitropicas C4 Mudanga no pH Ac ti agente quelante Regulaca Trés tipos de proteinas de membrana diferem quanto as urencatonago OS ines suas associacoes com a membrana Proteinas integrais de membrana sio firmemente as par Co sociadas a bicamada lipidica sendo removiveis apenas por KOK NMS LKQ NOOARQDONOGOOOG FENMIOVIVETS Vat VaV ain TWeV Vala nn Va av Yala agentes que interferem com reacées hidrofébicas como INVA I NN 1 i NA detergentes solventes organicos ou agentes desnaturan it Ae Ht iy in i fT RN vinNhy ny tes Figura 117 Proteinas periféricas de membra Wu UY Il i I ul NU eeelee Yoo eeleseelene Fosfolipase C FIGURA117 Proteinas periféricas integrais e anfitropicas Proteinas a de membrana podem ser operacionalmente distinguidas pelas condigdes GE requeridas para liberalas da membrana A maioria das proteinas periféricas é liberada com mudangas no pH ou na forga idnica pela remocao de calcio Detergente Proteina ancorada por agentes quelantes ou pela adicao de ureia ou carbonato As proteinas ie por GPI integrais podem ser extraidas com detergentes que rompem as interagdes Vis PD hidrofébicas com a bicamada lipidica e formam agregados semelhantes WZ to Proteoglicano a micelas ao redor das moléculas proteicas individuais Proteinas integrais J K QD ligadas covalentemente a um lipideo de membrana como 0 glicosilfos S A fatidilinositol GPI ver Figura 1115 podem ser liberadas pelo tratamento 77 eS com fosfolipase C Proteinas anfitrépicas algumas vezes sdo associadas com whe Y Proteina integral membranas e algumas vezes nao dependendo de algum tipo de processo a dominio hidrofébico regulatorio como a palmitoilagdo reversivel coberto com detergente 390 DAVID L NELSON MICHAEL M COX brana Podem ser liberadas por tratamentos relativamente brandos que interferem com as interações eletrostáticas ou quebram as ligações de hidrogênio um agente comumente usado é o carbonato com pH alto Proteínas anfitrópi cas são encontradas tanto no citosol quanto em associação com membranas Suas afinidades pelas membranas resul tam em alguns casos das interações não covalentes das proteínas com uma proteína ou lipídeo de membrana e em outros casos da presença de um ou mais lipídeos covalen temente ligados à proteína anfitrópica ver Figura 1115 Geralmente a associação reversível das proteínas anfitró picas com a membrana é regulada por exemplo a fosforila ção ou a ligação de um ligante pode forçar a uma mudança conformacional na proteína expondo o sítio de ligação da membrana inacessível anteriormente Muitas proteínas de membrana atravessam a bicamada lipídica A topologia das proteínas de membrana a localização dos domínios da proteína em relação à bicamada lipídica pode ser determinada com compostos que reagem com as cadeias laterais das proteínas mas que não conseguem atravessar a membrana compostos químicos polares que reagem com aminas primárias de resíduos Lys por exemplo ou enzimas como a tripsina que clivam proteínas mas não conseguem atravessar a membrana O eritrócito humano é conveniente para tais estudos pois ele não tem organelas envolvidas por membranas a membrana plasmática é a única membrana presente Se a proteína de membrana de um eritrócito in tacto reage com um composto impermeável à membrana essa proteína deve ter no mínimo um domínio exposto à face externa extracelular da membrana A tripsina cliva os domínios extracelulares mas não afeta o domínio inseri do dentro da bicamada ou exposto apenas à face interna a menos que a membrana plasmática seja rompida de forma a tornar esses domínios acessíveis à enzima Experimentos com tais reagentes específicos para aná lise da topologia mostram que a glicoproteína de eritrócito glicoforina atravessa a membrana plasmática Seu domí nio aminoterminal contendo as cadeias de carboidratos está na superfície externa e é clivado pela tripsina A extre midade carboxiterminal projetase para o interior da célula onde não pode reagir com reagentes impermeantes Tanto o domínio aminoterminal quanto o carboxiterminal con têm muitos resíduos de aminoácidos polares ou carregados e são portanto hidrofílicos Entretanto um segmento no centro da proteína resíduos 75 a 93 contém muitos resí duos de aminoácidos hidrofóbicos indicando que a glicofo rina tenha um segmento transmembrana disposto conforme mostrado na Figura 118 Esses experimentos não cristalográficos também re velaram que a orientação da glicoforina é assimétrica na membrana seu segmento aminoterminal está sempre no lado de fora Estudos semelhantes com outras proteínas de membrana mostram que cada uma delas tem uma orienta ção específica na bicamada conferindo à membrana uma lateralidade distinta Para a glicoforina e para todas as ou tras glicoproteínas de membrana plasmática os domínios glicosilados são encontrados invariavelmente na face extra celular da bicamada Como será visto o arranjo assimétri co das proteínas de membrana resulta em uma assimetria funcional Todas as moléculas de uma determinada bomba iônica por exemplo têm a mesma orientação na membrana e bombeiam íons na mesma direção As proteínas integrais são mantidas na membrana por meio de interações hidrofóbicas com lipídeos A firme ligação das proteínas integrais à membrana é resul tado de interações hidrofóbicas entre lipídeos de membra na e domínios hidrofóbicos das proteínas Algumas proteí nas têm uma única sequência hidrofóbica no meio como a glicoforina ou nas extremidades aminoterminal ou carbo xiterminal Outras têm sequências hidrofóbicas múltiplas em que cada uma delas quando em conformação ahelicoi Dentro Fora Extremidade carboxiterminal 60 74 95 131 Extremidade amino terminal Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Thr Thr Ser Ser Ser Val Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Thr Asp Asn His Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Glu Glu Arg Val Gln Leu Ala His Phe Ser Pro Glu Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro Asp Val Thr Asp Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ser Asp Gln His 1 FIGURA 118 Disposição transbicamada da glicoforina em um eri trócito Um domínio hidrofílico contendo todos os resíduos de açúcar encontrase na superfície externa da membrana e outro domínio hidrofílico projetase da face interna da membrana Cada hexágono vermelho repre senta um tetrassacarídeo contendo dois Neu5Ac ácido siálico Gal e Gal NAc ligado a um resíduo de Ser ou Thr o hexágono azul representa um oligossacarídeo ligado a um resíduo de Asn O tamanho relativo das unida des de oligossacarídeos é maior do que mostrado aqui Um segmento de 19 resíduos hidrofóbicos resíduos 75 a 93 forma uma hélice a que atravessa a bicamada da membrana ver Figura 1112a O segmento formado pelos resíduos 64 a 74 tem alguns resíduos hidrofóbicos e provavelmente penetra a face externa da bicamada lipídica como mostrado Nelson6ed11indd 390 Nelson6ed11indd 390 070414 1420 070414 1420 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 391 dal é longa o suficiente para atravessar a bicamada lipídica Figura 119 Uma das mais bem estudadas proteínas que atravessa a membrana a bacteriorrodopsina tem sete sequências inter nas muito hidrofóbicas atravessando sete vezes a bicamada lipídica A bacteriorrodopsina é uma bomba de prótons acio nada pela luz densamente empacotada em arranjos regula res na membrana roxa da bactéria Halobacterium salina rum A cristalografia por raios X revela uma estrutura com sete segmentos ahelicoidais cada um deles atravessando a bicamada lipídica conectados por alças não helicoidais nas faces interna e externa da membrana Figura 1110 Na sequência de aminoácidos da bacteriorrodopsina podem ser identificados sete segmentos com aproximadamente 20 re síduos hidrofóbicos cada um deles formando uma hélice a que atravessa a bicamada As sete hélices estão aglomeradas e orientadas de modo não bem perpendicular ao plano da membrana um padrão que conforme será visto no Capí tulo 12 é um motivo comum em proteínas de membrana envolvidas com recepção de sinal Interações hidrofóbicas entre aminoácidos apolares e grupos acil graxos dos lipídeos de membrana ancoram firmemente a proteína à membrana Proteínas de membrana cristalizadas resolvidas ie suas estruturas moleculares deduzidas por cristalografia geralmente incluem moléculas de fosfolipídeos o que pre sume estarem posicionadas nos cristais assim como estão nas membranas nativas Muitas dessas moléculas de fosfo lipídeos se encontram na superfície proteica seus grupos polares interagindo com resíduos de aminoácidos polares nas interfaces águamembrana interna e externa e suas ca deias laterais associadas com resíduos apolares Esses lipí deos anelares formam uma bicamada em forma de concha ou em anel ao redor da proteína estando orientados de forma parecida ao esperado para os fosfolipídeos em uma bicamada Figura 1111 Outros fosfolipídeos são en contrados nas interfaces entre monômeros de proteínas de membrana de multissubunidades onde eles formam um selamento oleoso Outros ainda estão inseridos no interior de uma proteína de membrana geralmente com seus gru pos polares bem abaixo do plano da bicamada Por exem plo a succinatodesidrogenase complexo II encontrado em mitocôndrias ver Figura 1910 tem várias moléculas de fosfolipídeos inseridas no seu interior A topologia de uma proteína integral de membrana algumas vezes pode ser prevista a partir de sua sequência A determinação da estrutura tridimensional de uma pro teína de membrana isto é sua topologia geralmente é muito mais difícil do que determinar sua sequência de ami noácidos tanto diretamente quanto por sequenciamento do gene As sequências de aminoácidos de milhares de pro teínas de membrana são conhecidas porém relativamente poucas estruturas tridimensionais têm sido estabelecidas por cristalografia ou espectroscopia por RMN A presença de sequências intactas com mais de 20 resíduos hidrofóbi cos em uma proteína de membrana em geral é tida como evidência de que essas sequências atravessam a bicamada lipídica atuando como âncoras hidrofóbicas ou formando canais transmembrana Praticamente todas as proteínas in tegrais têm pelo menos uma sequência desse tipo A aplica ção dessa lógica a sequências genômicas inteiras leva à con clusão de que em muitas espécies de 20 a 30 de todas as proteínas são proteínas integrais de membrana Dentro Fora Tipo I Tipo II Tipo III Tipo IV Tipo VI Tipo V NH3 H3N COO OOC FIGURA 119 Proteínas integrais de membrana Para proteínas de membrana plasmática conhecidas as relações espaciais dos domínios das proteínas na bicamada lipídica se enquadram em seis categorias As proteí nas dos tipos I e II têm uma única hélice transmembrana o domínio ami noterminal está fora da célula na proteína do tipo I e dentro na do tipo II Proteínas do tipo III têm múltiplas hélices transmembrana em um único polipeptídeo Em proteínas do tipo IV os domínios transmembrana de vá rios polipeptídeos diferentes agrupamse para formar um canal através da membrana As proteínas do tipo V são sustentadas na bicamada em especial por lipídeos ligados covalentemente ver Figura 1115 e proteínas do tipo VI possuem tanto hélices transmembrana quanto âncoras lipídicas Nesta figura e nas demais figuras deste livro são representados os seg mentos proteicos transmembrana em suas conformações mais prováveis as hélices a com seis a sete voltas Algumas vezes essas hélices são mostradas apenas como cilindros Como relativamente poucas estruturas proteicas de membrana foram deduzidas por cristalografia por raios X a representação de domínios extramembrana é arbitrária e não se encontra necessariamente em escala Extremidade aminoterminal Extremidade carboxiterminal Dentro Fora FIGURA 1110 Bacteriorrodopsina proteína que atravessa a mem brana PDB ID 2AT9 A cadeia polipeptídica única dobrase em sete hélices a hidrofóbicas cada uma das quais atravessa a bicamada lipídica de forma aproximadamente perpendicular ao plano da membrana As sete hélices a transmembrana são agrupadas e o espaço ao redor e entre elas é preen chido com cadeias acila dos lipídeos de membrana O pigmento retinal que absorve a luz ver Figura 1021 está profundamente inserido na membrana em contato com vários segmentos helicoidais não mostrado As cores das hélices correspondem às do diagrama de hidropatia na Figura 1112b Nelson6ed11indd 391 Nelson6ed11indd 391 070414 1420 070414 1420 392 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O que é possível prever sobre a estrutura secundária das porções da proteína integral que atravessam a membra na Uma sequência em hélice a de 20 a 25 resíduos é longa o suficiente para atravessar a espessura 30 Å da bicamada lipídica lembrese que o comprimento de uma hélice a é de 15 Å 015 nm por resíduo de aminoácido Uma cadeia polipeptídica rodeada por lipídeos sem moléculas de água às quais possa se ligar por ligações de hidrogênio tende a formar hélices a ou folhas b nas quais ligações de hidrogê nio intracadeia são maximizadas Se as cadeias laterais de todos os aminoácidos em uma hélice forem apolares inte rações hidrofóbicas com lipídeos circundantes estabilizarão a hélice Vários métodos simples de análise de sequência de DNA geram previsões razoavelmente precisas quanto à estrutu ra secundária de proteínas transmembrana A polaridade relativa de cada aminoácido tem sido determinada experi mentalmente pela medida da variação de energia livre que acompanha o movimento da cadeia lateral do aminoácido de um solvente hidrofóbico para a água Essa energia livre de transferência que pode ser expressa como índice de hidropatia ver Tabela 31 varia desde muito exergônica para resíduos carregados ou polares até muito endergônica para aminoácidos com cadeias laterais de hidrocarbone tos aromáticos ou alifáticos O índice de hidropatia geral hidrofobicidade de uma sequência de aminoácidos é es timado pela soma das energias livres de transferência dos resíduos na sequência Para examinar a sequência de um polipeptídeo para segmentos potenciais que atravessam a membrana investigadores calculam o índice de hidropatia para segmentos sucessivos chamados de janelas de um determinado tamanho de 7 a 20 resíduos Para uma janela de sete resíduos por exemplo os índices médios para os resíduos 1 a 7 2 a 8 3 a 9 e assim por diante são represen tados como na Figura 1112 representado para o resíduo a Aquaporina de ovelha Fosfolipídeos b Vo da ATPase do tipo V FIGURA 1111 Lipídeos anelares associados com duas proteínas integrais de membrana a A estrutura cristalina da aquaporina de ovelha PDB ID 2B6O um canal aquoso transmembrana inclui uma ca mada de fosfolipídeos posicionados com seus grupos polares em azul nas posições esperadas nas superfícies interna e externa da membrana e suas cadeias acil hidrofóbicas em dourado associadas intimamente com a superfície da proteína exposta à bicamada O lipídeo forma um selamento oleoso ao redor da proteína que é ilustrado pela representa ção de uma superfície azulescura b A estrutura cristalina do complexo proteico integral Vo da Na 1ATPase do tipo V de Enterococcus hirae PDB ID 2BL2 tem 10 subunidades idênticas cada uma com quatro hélices transmembrana que circundam uma cavidade central preenchida com fosfatidilglicerol PG Aqui cinco das subunidades foram retiradas para expor as moléculas de PG associadas com cada subunidade ao redor do interior dessa estrutura Índice de hidropatia a Glicoforina Hidrofóbico Hidrofílico 23 0 3 0 50 100 0 50 100 130 130 Número do resíduo Hidrofóbico Hidrofílico 23 0 3 50 100 150 50 100 150 200 200 250 250 10 1 2 3 4 5 6 7 10 Índice de hidropatia b Bacteriorrodopsina Número do resíduo FIGURA 1112 Gráfico de hidropatia O índice de hidropatia médio ver Tabela 31 é representado em relação ao número do resíduo para duas proteínas integrais de membrana O índice de hidropatia para cada resíduo de aminoácido em uma sequência de comprimento definido ou janela é usado para calcular a hidropatia média para aquela janela O eixo horizontal mostra o número do resíduo no meio da janela a A glicoforina de eritró cito humano tem uma única sequência hidrofóbica entre os resíduos 75 e 93 em amarelo compare isto com a Figura 118 b A bacteriorrodopsi na conhecida a partir de estudos físicos independentes por ter sete hélices transmembrana ver Figura 1110 tem sete regiões hidrofóbicas Observe entretanto que o gráfico de hidropatia é ambíguo na região dos segmentos 6 e 7 A cristalografia por raios X confirmou que essa região tem dois seg mentos transmembrana Nelson6ed11indd 392 Nelson6ed11indd 392 070414 1420 070414 1420 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 393 do meio em cada janela p ex resíduo 4 para resíduos de 1 a 7 Presumese que uma região com mais de 20 resíduos com alto índice de hidropatia seja um segmento transmem brana Quando as sequências de proteínas de membrana com estruturas tridimensionais conhecidas são examinadas dessa forma é encontrada uma correspondência razoavel mente boa entre os segmentos conhecidos que atravessam a membrana e os previstos A análise de hidropatia prevê uma hélice hidrofóbica única para a glicoforina Figura 11 12a e sete segmentos transmembrana para a bacteriorro dopsina Figura 1112b em concordância com os estudos experimentais Com base na sequência de aminoácidos e nos gráficos de hidropatia acreditase que muitas das proteínas de trans porte descritas neste capítulo tenham múltiplas regiões helicoidais que atravessam a membrana ou seja elas são proteínas integrais do tipo III ou IV Figura 119 Quando as previsões são consistentes com os estudos químicos de localização proteica como aqueles descritos anteriormente para a glicoforina e a bacteriorrodopsina melhor justifica se a suposição de que as regiões hidrofóbicas correspon dam a domínios que atravessam a membrana Outra característica notável de muitas proteínas trans membrana com estrutura conhecida é a presença de resí duos de Tyr e Trp na interface entre lipídeo e água Figura 1113 As cadeias laterais desses resíduos servem aparen temente como âncoras na interface da membrana capazes de interagir simultaneamente com a fase lipídica central e as fases aquosas em ambos os lados da membrana Outra generalização sobre a localização do aminoácido em relação à bicamada é descrita como a regra do positivodentro os resíduos positivamente carregados de Lys His e Arg das proteínas de membrana ocorrem mais comumente na face citoplasmática das membranas Nem todas as proteínas integrais de membrana são com postas por hélices a transmembrana Outro motivo estru tural comum em proteínas de membrana de bactérias é o barril b ver Figura 418b no qual 20 ou mais segmentos transmembrana formam folhas b que guarnecem um cilin dro Figura 1114 Os mesmos fatores que favorecem a formação de hélices a no interior hidrofóbico da bicamada lipídica também estabilizam os barris b quando não há mo léculas de água disponíveis para formar ligações de hidro gênio com o oxigênio do carbonil e o nitrogênio da ligação peptídica o número máximo de ligações de hidrogênio in tracadeia fornece a conformação mais estável Folhas pla nares b não maximizam essas interações e geralmente não são encontradas no interior da membrana Os barris b per mitem todas as ligações de hidrogênio e são aparentemente comuns entre as proteínas de membrana As porinas pro teínas que permitem que certos solutos polares atravessem a membrana externa de bactérias gramnegativas como a E coli têm barris b com muitas fitas revestindo uma pas sagem polar transmembrana A membrana externa de mi tocôndrias e cloroplastos também contém uma variedade de barris b Um polipeptídeo é mais estendido na conformação b do que em hélice a apenas sete a nove resíduos da con formação b são necessários para atravessar a membrana Canal de K Maltoporina Fosfolipase A da membrana externa OmpX Fosfoporina E Resíduos carregados Trp Tyr FIGURA 1113 Resíduos de Tyr e Trp de proteínas de membrana aglo merados na interface águalipídeo As estruturas detalhadas dessas cin co proteínas integrais de membrana são conhecidas a partir de estudos cris talográficos O canal de K 1 PDB ID 1BL8 é da bactéria Streptomyces lividans ver Figura 1147 maltoporina PDB ID 1AF6 a fosfolipase A da membrana externa OmpLA PDB ID 1QD5 OmpX PDB ID 1QJ9 e fosfoporina E PDB ID 1PHO são proteínas da membrana externa da E coli Resíduos de Tyr e Trp são predominantemente encontrados onde a região apolar das cadeias acil se encontra com a região do grupo polar Resíduos carregados Lys Arg Glu Asp são encontrados quase exclusivamente em fases aquosas FepA OmpLA Maltoporina FIGURA 1114 Proteínas de membrana com estrutura de barril b Três proteínas da membrana externa da E coli são mostradas vistas no plano da membrana A FepA PDB ID 1FEP envolvida com a captação de fer ro tem 22 fitas b que atravessam a membrana A OmpLA derivada do PDB ID 1QD5 uma fosfolipase é um barril b de 12 fitas que existe como dímero na membrana A maltoporina derivada do PDB ID 1MAL um transportador de maltose é um trímero em que cada monômero consiste em 16 fitas b Nelson6ed11indd 393 Nelson6ed11indd 393 070414 1420 070414 1420 394 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Lembre que na conformação b as cadeias laterais proje tamse alternadamente para cima e para baixo da folha ver Figura 46 Nas fitas b das proteínas de membrana cada segundo resíduo do segmento que atravessa a mem brana é hidrofóbico e interage com a bicamada lipídica cadeias laterais aromáticas são comumente encontradas na interface lipídeoproteína Os outros resíduos podem ou não ser hidrofílicos O gráfico de hidropatia não é útil na previsão de segmentos transmembrana para proteínas com motivos em barril b mas à medida que os dados dos motivos conhecidos de barril b aumentam a previsão de conformações b transmembrana com base na sequência tornase factível Por exemplo a análise de sequência previu corretamente que algumas proteínas da membra na externa de bactérias gramnegativas Figura 1114 contêm barris b Lipídeos ligados covalentemente ancoram algumas proteínas de membrana Algumas proteínas de membrana contêm um ou mais li pídeos ligados covalentemente que podem ser de vários tipos ácidos graxos de cadeia longa isoprenoides este róis ou derivados glicosilados do fosfatidilinositol GPIs Figura 1115 O lipídeo anexado provê uma âncora hi drofóbica que se insere na bicamada lipídica e segura a proteína na superfície da membrana A intensidade da in teração hidrofóbica entre a bicamada e a cadeia de hidro carboneto ligada a uma proteína é suficiente apenas para ancorar a proteína de forma segura mas muitas proteínas têm mais de uma porção lipídica ligada Outras intera ções como a atração iônica de resíduos de Lys carregados positivamente nas proteínas e grupos polares carregados negativamente nos lipídeos provavelmente contribuem para a estabilidade da ligação A associação dessas pro teínas ligadas a lipídeos com a membrana certamente é mais fraca do que a das proteínas integrais de membrana sendo pelo menos no caso da palmitoilação da cisteína reversível O lipídeo ligado pode ter um papel mais específico além de meramente ancorar a proteína à membrana Na mem brana plasmática proteínas com âncora de GPI estão exclu sivamente no lado de fora da membrana e ficam agregadas em certas regiões como discutido adiante no capítulo p 399 enquanto outros tipos de proteínas ligadas a lipídeos ligadas a grupos farnesil ou geranilgeranil Figura 1115 estão exclusivamente na face interna Em células epiteliais polarizadas como as células epiteliais intestinais ver Fi gura 1143 nas quais as superfícies apicais e basais têm papéis diferentes as proteínas ancoradas por GPI são dire cionadas especificamente à superfície apical A ligação de um lipídeo específico a uma proteína de membrana recém sintetizada tem a função de orientar a proteína para sua localização correta na membrana FIGURA 1115 Proteínas de membrana ligadas a lipídeos Lipídeos ligados covalen temente ancoram proteínas de membrana à bicamada lipídica Um grupo palmitoil apa rece ligado via ligação tioéster a um resíduo de Cys Um grupo Nmiristoil geralmente é ligado a um aminoterminal Gly típico de uma proteína que também tenha um segmento transmembrana hidrofóbico os grupos farnesil e geranilgeranil ligados a resíduos de Cys carboxiterminais são isoprenoides de 15 e 20 carbonos respectivamente O resíduo de Cys carboxiterminal é invariavelmente metilado Âncoras de glicosilfosfatidilinositol GPI são derivadas do fosfatidilinositol no qual o inositol conduz um oligossacarídeo peque no covalentemente ligado por meio da fosfoetanolamina ao resíduo carboxiterminal de uma proteína Proteínas ancoradas por GPI estão sempre na face extracelular da membrana plasmática Proteínas de membrana farnesiladas e palmitoiladas são encontradas na super fície interna da membrana plasmática e proteínas miristoiladas possuem domínios tanto dentro quanto fora da membrana CH2 S O O C Cys H3N H3N COO2 COO2 C CH2 NH C O O O P O O O C O O NH C OCH3 NH3 CH2 S CH 1 1 1 CH2 CH2 CH2 NH HC CH2 O O O C C O Inositol O GlcNAc O P O O Man Man Man Man Âncora de GPI na extremidade carboxiterminal Dentro Fora Grupo palmitoil em Cys ou Ser interno Grupo Nmiristoil em Gly aminoterminal Grupo farnesil ou geranilgeranil em Cys carboxiterminal Nelson6ed11indd 394 Nelson6ed11indd 394 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 395 RESUMO 111 Composição e arquitetura das membranas c As membranas biológicas definem limites celulares divi dem células em compartimentos separados organizam sequências de reações complexas e atuam na recepção de sinal e na transformação de energia c As membranas são compostas por lipídeos e proteínas em combinações variáveis particulares para cada espé cie tipo celular e organela A bicamada lipídica é a uni dade estrutural básica c As proteínas periféricas de membrana são frouxamente associadas à membrana por interações eletrostáticas e ligações de hidrogênio ou por âncoras lipídicas ligadas covalentemente As proteínas integrais associamse fir memente à membrana por interações hidrofóbicas entre a bicamada lipídica e as suas cadeias laterais de aminoá cidos apolares que estão orientadas para o exterior da molécula proteica Proteínas anfitrópicas associamse reversivelmente com a membrana c Muitas proteínas de membrana atravessam várias vezes a bicamada lipídica com sequências hidrofóbicas de cerca de 20 resíduos de aminoácidos formando hélices a transmembrana Barris b de muitas fitas também são comuns em proteínas integrais em membrana de bacté rias Resíduos de Tyr e Trp de proteínas transmembrana são comumente encontrados na interface lipídeoágua c Os lipídeos e as proteínas de membrana são inseridos na bicamada com lateralização específica portanto as membranas são estrutural e funcionalmente assimé tricas Glicoproteínas de membranas plasmáticas es tão sempre orientadas com o domínio que apresenta oligossacarídeos na superfície extracelular 112 Dinâmica da membrana Uma característica marcante de todas as membranas bio lógicas é a sua flexibilidade sua capacidade de mudar de forma sem perder sua integridade e gerar vazamento A base dessa propriedade está nas interações não covalentes entre lipídeos na bicamada e na mobilidade permitida aos lipídeos individuais por não estarem covalentemente anco rados uns aos outros Agora o foco será a dinâmica da mem brana os movimentos que ocorrem e as estruturas transitó rias permitidas por esses movimentos Grupos acil no interior da bicamada estão ordenados em graus variáveis Embora a estrutura da bicamada lipídica seja estável suas moléculas individuais de fosfolipídeos têm muita liberdade de movimento Figura 1116 dependendo da tempera tura e da composição lipídica Abaixo de temperaturas fi siológicas normais os lipídeos formam um estado líquido ordenado Lo semissólido na bicamada no qual todos os tipos de movimento de moléculas individuais estão for temente limitados a bicamada é paracristalina Figura 1116a Acima de temperaturas fisiológicas cadeias indi viduais de hidrocarbonetos de ácidos graxos estão em movi mento constante produzido pela rotação em torno das liga ções carbonocarbono das cadeias laterais acil longas e pela difusão lateral de moléculas lipídicas individuais no plano da bicamada Esse é o estado líquido desordenado Ld Figura 1116b Na transição do estado Lo para o estado Ld a forma e as dimensões gerais da bicamada são mantidas o que muda é o grau de movimento lateral e rotacional permitido às moléculas lipídicas individuais Em temperaturas na faixa fisiológica para mamíferos cerca de 20 a 40ºC ácidos graxos saturados de cadeia longa como 160 e 180 tendem a agruparse em uma fase gel Lo mas as dobras nos ácidos graxos insaturados ver Figura 102 interferem com o agrupamento favorecendo o estado Ld Grupos acil graxos de cadeias mais curtas têm o mesmo efeito O conteúdo de esterol de uma membrana que varia muito de acordo com o organismo e a organe la Tabela 111 é outro determinante importante do es tado do lipídeo Esteróis como o colesterol apresentam efeitos paradoxais na fluidez da bicamada eles interagem com fosfolipídeos contendo cadeias acil graxas insaturadas compactandoas e limitando seus movimentos na bicamada A associação de esteróis com esfingolipídeos e fosfolipídeos com cadeias acil graxas saturadas longas tende a fluidifi car a bicamada que sem o colesterol adotaria o estado Lo Em membranas biológicas compostas por uma variedade de fosfolipídeos e esfingolipídeos o colesterol tende a se associar com esfingolipídeos e formar regiões no estado Lo rodeado por regiões pobres em colesterol no estado Ld ver discussão sobre balsas de membrana a seguir O calor produz movimento térmico das cadeias laterais transição Lo Ld a Estado líquido ordenado Lo b Estado líquido desordenado Ld FIGURA 1116 Dois estados extremos da bicamada lipídica a No estado ordenado líquido Lo os grupos polares das cabeças são arranjados uniformemente na superfície e as cadeias acila quase não apresentam movi mento estando agrupadas em uma geometria regular b No estado líquido desordenado Ld ou estado fluido cadeias acila sofrem muito mais movimen tação térmica e não apresentam organização regular O estado dos lipídeos em membranas biológicas é mantido entre esses extremos Nelson6ed11indd 395 Nelson6ed11indd 395 070414 1421 070414 1421 396 DAVID L NELSON MICHAEL M COX As células regulam sua composição lipídica para conse guir uma fluidez de membrana constante sob várias condi ções de crescimento Por exemplo bactérias sintetizam mais ácidos graxos insaturados e menos saturados quando culti vadas em baixas temperaturas quando comparadas àquelas cultivadas em temperaturas mais altas Tabela 112 Como resultado desse ajustamento na composição lipídica mem branas de bactérias cultivadas em altas ou baixas tempera turas têm aproximadamente o mesmo grau de fluidez Isso é presumivelmente essencial para a função de muitas pro teínas enzimas transportadores e receptores que atuam dentro da bicamada lipídica O movimento de lipídeos transbicamada requer catálise Em temperaturas fisiológicas a difusão transbicamada ou movimento de pontacabeça flipflop de uma molécula lipídica de uma lâmina da bicamada para a outra Figura 1117a ocorre muito lentamente ou nem ocorre na maio ria das membranas embora a difusão lateral no plano da bicamada seja muito rápida Figura 1117b O movimento transbicamada requer que um grupo polar ou carregado dei xe seu meio aquoso e movase para o interior hidrofóbico da bicamada processo com grande variação de energia livre positiva Há entretanto situações em que tal movimento é essencial Por exemplo no retículo endoplasmático RE glicerofosfolipídeos de membrana são sintetizados na super fície citosólica enquanto esfingolipídeos são sintetizados ou modificados na superfície luminal Para saírem de seu local de síntese e atingirem seu ponto de deposição final esses lipídeos devem passar por uma difusão de pontacabeça A disposição assimétrica de tipos lipídicos na bicamada prevê a existência de flipases flopases e flipflopases Fi gura 1117c que facilitam o movimento de lipídeos trans bicamada provendo um caminho que é energeticamente mais favorável e muito mais rápido do que o movimento não catalisado A combinação de biossíntese assimétrica dos li pídeos de membrana difusão flipflop não catalisada muito lenta e presença de trasladadores lipídicos dependentes de energia pode ser responsável pela assimetria transbicama da na composição lipídica mostrada na Figura 115 Além de contribuir na assimetria da composição o transporte de lipídeos dependente de energia para uma lâmina da bica mada pode pela criação de uma superfície maior em um lado da bicamada ser importante na geração da curvatura da membrana essencial para o brotamento de vesículas As flipases catalisam o traslado dos aminofosfolipíde os fosfatidiletanolamina e fosfatidilserina da lâmina extra celular para a citosólica contribuindo para a distribuição TABELA 112 Composição de ácidos graxos de células de E coli cultivadas a diferentes temperaturas Porcentagem dos ácidos graxos totais 10ºC 20ºC 30ºC 40ºC Ácido mirístico 140 4 4 4 8 Ácido palmítico 160 18 25 29 48 Ácido palmitoleico 161 26 24 23 9 Ácido oleico 181 38 34 30 12 Ácido hidroximirístico 13 10 10 8 Razão entre insaturados e saturados 29 20 16 038 Fonte Dados de Marr AG Ingraham JL 1962 Effect of temperature on the composition of fatty acids in Escherichia coli J Bacteriol 84 1260 A composição exata de ácidos graxos depende não apenas da temperatura de crescimento mas também do estágio de crescimento e da composição do meio de crescimento Razões calculadas como porcentagem total de 161 mais 181 dividido pela porcentagem de 140 mais 160 O ácido hidroximirístico foi omitido deste cálculo c Traslado transbicamada catalisado Fora Dentro Flipase ATPase tipo P move PE e PS da lâmina externa para a citosólica ATP ADP Pi b Difusão não catalisada lateral muito rápida 1 mms muito lenta t em dias 12 a Difusão não catalisada transbicamada flipflop Flopase Transportador ABC move fosfolipídeos da lâmina citosólica para a externa ATP ADP Pi Flipflopase move lipídeos nas duas direções para o equilíbrio NH3 Ca2 FIGURA 1117 Movimento de fosfolipídeos isolados na bicama da a O movimento não catalisado de uma lâmina para a outra é muito lento mas b a difusão lateral na lâmina é muito rápida sem precisar de catálise c Três tipos de trasladadores de fosfolipídeos na membrana plas mática PE é a fosfatidiletanolamina PS é a fosfatidilserina Nelson6ed11indd 396 Nelson6ed11indd 396 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 397 assimétrica de fosfolipídeos fosfatidiletanolamina e fos fatidilserina principalmente na lâmina citosólica e esfin golipídeos e fosfatidilcolina na lâmina externa Manter a fosfatidilserina na lâmina extracelular é importante sua ex posição na superfície celular externa desencadeia apoptose morte celular programada ver Capítulo 12 e engolfamen to por macrófagos com receptores para fosfatidilserina Fli pases também agem no RE onde elas movem fosfolipídeos recémsintetizados do seu local de síntese na lâmina citosó lica para a lâmina luminal As flipases consomem aproxima damente um ATP por molécula de fosfolipídeo trasladada sendo estrutural e funcionalmente relacionadas às ATPases do tipo P transportadores ativos descritas na página 410 Dois outros tipos de atividades de translocação de lipí deos são conhecidas mas menos bem caracterizadas As flo pases movimentam fosfolipídeos da membrana plasmática da lâmina citosólica para a extracelular e assim como as fli pases são dependentes de ATP As flopases são membros da família de transportadores ABC descrita na página 413 em que todos transportam ativamente substratos hidrofóbicos para fora através da membrana plasmática As flipflopases são proteínas que movem qualquer fosfolipídeo da membra na através da bicamada a favor do gradiente de concentra ção da lâmina com maior concentração para a lâmina com menor concentração sua atividade não depende de ATP A atividade da flipflopase leva a uma distribuição aleatória controlada da composição dos grupos polares nas duas faces da bicamada A atividade aumenta muito com o aumento da concentração do Ca 21 citosólico que pode resultar de ati vação celular dano celular ou apoptose como comentado anteriormente a exposição da fosfatidilserina na superfície externa sinaliza a célula para apoptose e engolfamento por macrófagos Finalmente acreditase que um grupo de pro teínas que age principalmente na movimentação de fosfati dilinositóis através das bicamadas lipídicas as proteínas de transferência do fosfatidilinositol tenha um importante pa pel na sinalização lipídica e no tráfego de membrana Lipídeos e proteínas difundemse lateralmente na bicamada Moléculas lipídicas individuais podem moverse lateralmen te no plano da membrana trocando de lugar com suas mo léculas lipídicas vizinhas Isto é elas possuem movimento browniano dentro da bicamada Figura 1117b que pode ser muito rápido Uma molécula na lâmina externa da mem brana plasmática de eritrócito por exemplo pode difundir se lateralmente de forma tão rápida que ela circunavega o eritrócito em segundos Essa difusão lateral rápida no plano da bicamada tende a tornar aleatórias as posições das molé culas individuais em poucos segundos A difusão lateral pode ser mostrada experimentalmente ao se anexar sondas fluorescentes aos grupos polares dos lipídeos e usando microscopia de fluorescência para acom panhar as sondas no decorrer do tempo Figura 1118 Em uma das técnicas uma pequena região 5 mm 2 de uma superfície celular com lipídeos marcados por fluorescência é descorada por uma intensa radiação de forma que o pe FIGURA 1118 Medida da velocidade de difusão lateral de lipídeos pela recuperação da fluorescência após fotodescoloração FRAP Os lipídeos na lâmina externa da membrana plasmática são marcados pela rea ção com uma sonda impermeante à membrana em vermelho de modo que a superfície é identificada uniformemente quando vista sob um mi croscópio de fluorescência Uma área pequena é descorada pela irradiação com um feixe de laser intenso e tornase não fluorescente Com o passar do tempo moléculas lipídicas marcadas difundemse para a região desco rada que se torna então novamente fluorescente Os pesquisadores podem acompanhar o curso temporal do retorno da fluorescência e determinar um coeficiente de difusão para o lipídeo marcado As velocidades de difusão são geralmente altas um lipídeo que se move com essa velocidade poderia cir cunavegar uma célula de E coli em um segundo O método FRAP também pode ser usado para medir a difusão lateral de proteínas de membrana Célula Sonda fluorescente em lipídeos A célula reage com a sonda fluorescente para identificar lipídeos Visão da superfície com microscopia de fluorescência Medida da velocidade de retorno da fluorescência Após um tempo fosfolipídeos não descorados difundemse para a área descorada O feixe de laser intenso descora uma área pequena Nelson6ed11indd 397 Nelson6ed11indd 397 070414 1421 070414 1421 398 DAVID L NELSON MICHAEL M COX daço irradiado não fluoresça mais quando visto com uma luz menos intensa no microscópio de fluorescência Entretanto dentro de milissegundos a região recupera sua fluorescên cia na medida em que moléculas lipídicas não descoradas difundemse para a parte descorada e as moléculas lipídicas descoradas difundemse e afastamse dali A velocidade de recuperação da fluorescência após a fotodescoloração ou FRAP de fluorescence recovery after photobleaching é uma medida da velocidade de difusão lateral dos lipídeos Usando a técnica de FRAP pesquisadores mostraram que alguns lipídeos de membrana difundemse lateralmente em velocidades de até 1 mms Outra técnica o rastreamento de partícula única permi te acompanhar o movimento de uma única molécula lipídi ca na membrana plasmática em uma escala de tempo muito menor Resultados desses estudos confirmam uma difusão lateral rápida em pequenas regiões não conectadas da su perfície celular e mostram que o movimento dessa região para uma região próxima difusão por salto é inibido lipídeos de membrana comportamse como se estivessem encurralados por cercas que eles podem ocasionalmente atravessar por difusão Figura 1119 Muitas proteínas de membrana movemse como se flu tuassem em um mar de lipídeos Assim como os lipídeos de membrana essas proteínas estão livres para se difundirem lateralmente no plano da bicamada e estão em constante movimento como mostrado pela técnica de FRAP em pro teínas de superfície identificadas por fluorescência Algumas proteínas de membrana se associam e formam grandes agre gados regiões na superfície da célula ou da organela nos quais moléculas proteicas não se movem em relação umas às outras por exemplo receptores de acetilcolina formam re giões densas quase cristalinas nas membranas plasmáticas neuronais em sinapses Outras proteínas de membrana são ancoradas às estruturas internas para impedir sua difusão livre Na membrana de eritrócito tanto a glicoforina quanto o trocador cloretobicarbonato p 407 são ligados à espec trina uma proteína filamentosa do citoesqueleto Figura 1120 Uma possível explicação para o padrão de difusão lateral das moléculas lipídicas mostrado na Figura 1119 é que as proteínas de membrana imobilizadas pelas suas as sociações com a espectrina formam cercas que definem as regiões de movimento lipídico relativamente irrestrito Esfingolipídeos e colesterol agrupamse em balsas de membrana Foi constatado que a difusão de lipídeos de membrana de uma lâmina da bicamada para a outra é muito lenta a me nos que seja catalisada e que diferentes espécies lipídicas da membrana plasmática são assimetricamente distribuí das nas duas lâminas da bicamada Figura 115 Mesmo em uma única lâmina da membrana a distribuição lipídica não é uniforme Os glicoesfingolipídeos cerebrosídeos e gangliosídeos que geralmente contêm cadeias longas de ácidos graxos saturados formam agregados transitórios na lâmina externa que excluem glicerofosfolipídeos que por sua vez normalmente contêm um grupo acil graxo insatu rado e um grupo acil saturado menor Os grupos acil satu rados longos de esfingolipídeos podem formar associações mais estáveis e compactas com o sistema de anéis longo do colesterol do que as cadeias mais curtas e geralmente in saturadas de fosfolipídeos Os microdomínios colesterol 01 mm Fim Início FIGURA 1119 Difusão de moléculas lipídicas individuais O movi mento em uma superfície celular de uma única molécula lipídica marcada com fluorescência é registrado em vídeo por microscopia de fluorescência com uma resolução temporal de 25 ms equivalente a 40000 quadross A trajetória mostrada aqui representa uma molécula acompanhada durante 56 ms 2250 quadros a trilha inicia na área roxa e continua pela azul verde e cor de laranja O padrão de movimento indica uma difusão rápida em uma região confinada com aproximadamente 250 nm de diâmetro mostrado em uma única cor com saltos ocasionais para uma região adjacente Essa observação sugere que os lipídeos estejam encurralados por cercas molecu lares que eles podem pular ocasionalmente Proteínas trocadoras de cloretobicarbonato Glicoforina Membrana plasmática Anquirina Espectrina Complexo juncional actina Trajetória de uma única molécula lipídica Fora Dentro FIGURA 1120 Movimento restrito do trocador de cloretobicarbonato e da glicoforina do eritrócito As proteínas atravessam a membrana e são amarradas à espectrina uma proteína do citoesqueleto por outra proteína a anquirina limitando sua mobilidade lateral A anquirina está ancorada na mem brana por uma cadeia lateral pamitoil ligada covalentemente à proteína ver Fi gura 1115 A espectrina uma proteína filamentosa longa é unida por ligação cruzada a complexos juncionais contendo actina Uma rede de moléculas de espectrina em ligação cruzada associada à face citosplasmática da membrana plasmática estabiliza a membrana tornandoa resistente à deformação Essa rede de proteínas de membrana ancoradas pode formar o curral sugerido no experimento mostrado na Figura 1119 as trajetórias lipídicas mostradas aqui estão confinadas a diferentes regiões definidas pelas proteínas de membrana amarradas Ocasionalmente a molécula lipídica trajetória verde salta de um curral para outro trajetória azul e depois para outro trajetória vermelha Nelson6ed11indd 398 Nelson6ed11indd 398 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 399 esfingolipídeos na monocamada externa da membrana plasmática são levemente mais espessos e mais ordenados menos fluidos do que os microdomínios vizinhos ricos em fosfolipídeos sendo mais difíceis de serem dissolvidos com detergentes não iônicos eles comportamse como balsas de esfingolipídeos líquidos ordenados à deriva em um ocea no de fosfolipídeos líquidos desordenados Figura 1121 Essas balsas lipídicas são notavelmente enriquecidas em duas classes de proteínas integrais de membrana aquelas an coradas à membrana por duas cadeias longas de ácidos graxos saturados ligados covalentemente por resíduos de Cys dois grupos palmitoil ou um grupo palmitoil e um grupo miristoil e proteínas ancoradas por GPI Figura 1115 Presumi velmente essas âncoras lipídicas assim como as cadeias acil longas e saturadas dos esfingolipídeos formam associações mais estáveis com o colesterol e com os longos grupos acil em balsas do que com os fosfolipídeos vizinhos É notável que outras proteínas ligadas a lipídeos aquelas com grupos iso prenil ligados covalentemente como o farnesil não estejam preferencialmente associadas com a lâmina externa das bal sas de esfingolipídeoscolesterol Figura 1121 Os domínios balsa e mar da membrana plasmática não são rigidamente separados as proteínas de membrana podem moverse para dentro e para fora das balsas lipídicas em uma escala de tem po de segundos Contudo em uma escala de tempo menor microssegundos mais relevante para muitos processos bio químicos mediados pela membrana muitas dessas proteínas residem principalmente em uma balsa É possível estimar a fração da superfície celular ocu pada por balsas pela fração da membrana plasmática que resiste à solubilização por detergente fração que pode al cançar até 50 em alguns casos as balsas cobrem metade do oceano Medidas indiretas em fibroblastos em cultura sugerem um diâmetro aproximado de 50 nm para uma balsa individual que corresponde a uma região contendo alguns milhares de esfingolipídeos e talvez 10 a 50 proteínas de membrana Como a maioria das células expressa mais do que 50 tipos diferentes de proteínas plasmáticas é provável que uma única balsa contenha apenas um subconjunto de proteínas de membrana e que essa segregação de proteínas de membrana seja significativa do ponto de vista funcional Para um processo que envolve a interação de duas proteí nas de membrana a presença delas em uma única balsa au mentaria muito a probabilidade de colisão Alguns recepto res de membrana e proteínas de sinalização por exemplo parecem estar juntos em balsas de membrana Experimen tos mostram que a sinalização por essas proteínas pode ser interrompida por manipulações que removem o colesterol da membrana plasmática e destroem as balsas lipídicas A caveolina é uma proteína integral de membrana com dois domínios globulares conectados por um domínio hidro fóbico em forma de grampo de cabelo que liga a proteína à lâmina citoplasmática da membrana plasmática Três gru pos palmitoil ligados ao domínio globular carboxiterminal posteriormente ancoramna à membrana A caveolina na realidade uma família de caveolinas relacionadas forma dí meros e associase a regiões enriquecidas com colesterol na membrana e a presença de dímeros de caveolina força a bi camada lipídica associada a se curvar para dentro formando cavéolas pequenas cavernas na superfície da célula Fi gura 1122 As cavéolas são balsas incomuns elas envol vem as duas lâminas da bicamada a lâmina citoplasmática a partir da qual o domínio globular da caveolina se projeta e a lâmina extracelular uma balsa de esfingolipídeocolesterol típica associada com proteínas ancoradas por GPI As cavéo las estão envolvidas com várias funções celulares incluindo o tráfego de membrana no interior celular e a transdução de sinais externos em respostas celulares Os receptores para a insulina e outros fatores de crescimento assim como certas proteínas ligadas ao GPI e proteínascinases associadas à si nalização transmembrana parecem estar localizados em bal sas e talvez em cavéolas Serão discutidos alguns possíveis papéis das balsas em sinalização no Capítulo 12 A curvatura da membrana e a fusão são fundamentais para muitos processos biológicos A caveolina não é única em sua capacidade de induzir cur vatura em membranas Mudanças de curvatura são fun damentais para uma das mais notáveis características das membranas biológicas a capacidade de se fundir com ou tras membranas sem perder suas continuidades Embora as membranas sejam estáveis elas não são estáticas Dentro do sistema de endomembranas eucarióticas que inclui a mem brana nuclear o retículo endoplasmático o aparelho de Gol gi e várias vesículas pequenas os compartimentos mem branosos se reorganizam constantemente Vesículas brotam do RE para carregar lipídeos e proteínas recémsintetizados para organelas e para a membrana plasmática Exocitose endocitose divisão celular fusão do óvulo com espermato zoide e entrada de vírus envolto por membrana na sua célu la hospedeira envolvem a reorganização de membrana na qual a operação fundamental é a fusão de dois segmentos de membrana sem perda de continuidade Figura 1123 A maioria desses processos começa com um aumento local Proteína prenilada Caveolina Colesterol Balsa enriquecida com esfingolipídeos colesterol Proteína ancorada por GPI Proteína duplamente acilada Dentro Fora Grupos acil palmitoil miristoil FIGURA 1121 Microdomínios na membrana balsas Associações estáveis de esfingolipídeos e colesterol na lâmina externa produzem um microdomínio levemente mais espesso do que em outras regiões da mem brana que é enriquecido com tipos específicos de proteínas de membrana Proteínas ancoradas por GPI são salientes na lâmina externa dessas balsas e proteínas com um ou vários desses grupos acil de cadeia longa ligados covalentemente são comuns na lâmina interna Balsas curvadas para dentro chamadas cavéolas são especialmente enriquecidas com a proteína caveo lina ver Figura 1122 Proteínas ligadas com o grupo prenil como a Ras ver Quadro 122 tendem a ser excluídas das balsas Nelson6ed11indd 399 Nelson6ed11indd 399 070414 1421 070414 1421 400 DAVID L NELSON MICHAEL M COX na curvatura da membrana Uma proteína que é intrinseca mente curva pode forçar a curvatura da bicamada ao ligar se nela Figura 1124 a energia de ligação provê uma força impulsora para aumentar a curvatura da bicamada De forma alternativa múltiplas subunidades de uma proteína de suporte podem ser montadas em complexos supramo leculares curvos e estabilizar curvas que espontaneamente se formam na bicamada Por exemplo uma superfamília de proteínas contendo domínios BAR que ganharam esse nome devido aos três primeiros membros da família a serem identificados BIN1 anfifisina e RVS167 podem agruparse de forma crescente adquirindo o formato de um andaime que se liga à superfície da membrana forçando ou favore cendo a curvatura da membrana Domínios BAR consistem em espirais enroladas que formam dímeros curvos longos e finos com uma superfície côncava carregada positivamente que tende a formar interações iônicas com os grupos polares carregados negativamente das cabeças dos fosfolipídeos de membrana Figura 1124 Algumas dessas proteínas BAR também têm uma região helicoidal que se insere em uma lâ mina da bicamada expandindo sua área em relação à outra lâmina forçando a curvatura A fusão específica de duas membranas requer que 1 elas se reconheçam mutuamente 2 as suas superfícies tornemse justapostas o que requer a remoção de molécu las de água normalmente associadas aos grupos polares das cabeças dos lipídeos 3 as estruturas das suas bicamadas sejam localmente rompidas resultando em fusão da lâmina externa de cada membrana hemifusão e 4 suas bicama das fundamse para formar uma bicamada contínua única A fusão que ocorre na endocitose mediada por receptor ou secreção regulada também requer que 5 o processo seja desencadeado em tempo adequado ou em resposta a um si nal específico Proteínas integrais chamadas de proteínas de fusão medeiam esses eventos proporcionando reco nhecimento específico e uma distorção local transitória da estrutura da bicamada que favorece a fusão de membrana Observe que essas proteínas de fusão não têm relação com os produtos codificados por dois genes fusionados também chamados de proteínas de fusão discutidos no Capítulo 9 Um exemplo bem estudado de fusão de membrana é o que ocorre nas sinapses quando vesículas intracelula Cavéola Dentro Fora a b Membrana plasmática Dímero de caveolina seis porções de acil graxo e oito de colesterol FIGURA 1122 A caveolina força a curvatura da membrana para den tro Cavéolas são pequenas invaginações na membrana plasmática como aparece em a uma micrografia eletrônica de um adipócito identificado na superfície com um marcador eletrodenso b Desenho mostrando a locali zação e o papel da caveolina em causar a curvatura da membrana para den tro Cada monômero de caveolina possui um domínio hidrofóbico central e três grupos acil de cadeia longa em vermelho que seguram a molécula no interior da membrana plasmática Quando vários dímeros de caveolina são concentrados em uma pequena região uma balsa eles forçam a curvatura na bicamada lipídica formando a cavéola Moléculas de colesterol na bica mada são mostradas em cor de laranja Brotamento de vesículas do aparelho de Golgi Fusão de endossomo e lisossomo Infecção viral Fusão de óvulo e espermatozoide Fusão de vacúolos pequenos plantas Separação de duas membranas plasmáticas na divisão celular Exocitose Endocitose FIGURA 1123 Fusão de membrana A fusão de duas membranas é fun damental em uma grande variedade de processos celulares envolvendo or ganelas e a membrana plasmática Nelson6ed11indd 400 Nelson6ed11indd 400 070414 1421 070414 1421 PRINCIPIOS DE BIOQUMICA DE LEHNINGER 401 a Citosol Vesicula Vesicula preenchida com ft 4 secretora 7 a neurotransmissor aproximase ok aE Gs oes 2s da membrana plasmatica eet A TAT TT re ee a Le Dae eel Dea pA saa UOT Sha IT at een gr et ravi via nO Li ne ae Bi A ul Li ten 2 Moléculas do neurotransmissor GE TOU aero RN Ce o Or SOS Ft vSNARE ek Wee Be ae Bae tSNARE Proteina com curvatura intrinseca e alta o densidade de carga positiva na superficie ee Membrana plasmatica céncava interage com os grupos polares carregados negativamente das cabecas SNAP25 dos fosfolipideos favorecendo a curvatura da bicamada vSNARE e tSNARE ligamse uma a a outra fechando em ziper a partir da b Pa extremidade aminoterminal e ooo aproximando as membranas eee a as pL ni aires rae au 4 a fs Raa A AME ny van tn Ze Saar ree irs 1 UO OOCOOOE DC hu ee i FRAG Bae Se OP ra Pa Wee Sag i fae ee O fechamento em ziper causa Soe es curvatura e tensdo lateral nas bicamadas favorecendo a hemifusaéo Proteina com uma ou varias hélices entre as laminas externas anfipaticas inseridas em uma lamina da oe ae bicamada aglomera os lipideos daquele ate lado forgando a membrana a curvarse SEXEKEKES KEXEXEXEX a c or we aaah Fie Ed ve 5 Hemifusdo as laminas externas de gaia Pe oes FE ue ambas as membranas entram 5 ecococemrn gras i j em contato CERAM LUNIA TT Ra ee BTN NEA Tt ee ee GLa nines XXX RERLKLKKD BP NOOO LN Te tl 3 en Mes al a See Ce er ee Proteinas com dominios BAR podem se o polimerizar em uma superestrutura que favorece e mantém a curvatura ts oo A fusdéo completa cria um poro de FIGURA1124 Trés modelos de curvatura de membrana induzida por mss i fusao proteina Dy res carregadas com neurotransmissores se fundem com a O poro se alarga o contetido da membrana plasmatica Esse processo envolve uma familia vesicula é liberado para fora da de proteinas chamadas de SNARE receptores de SNAP célula de SNAP Receptors Figura 1125 As SNARE da face citoplasmatica das vesiculas sao chamadas de vSNARE aquelas da membranaalvo com a qual a vesicula se fun igi e de a membrana plasmdatica durante a exocitose so as 8s a eS tSN E Duas outras proteinas a proteina de fusao sen FIGURA 1125 Fusao da membrana durante a liberagdo de neuro sivel a Netilmaleimida NSF de NEMsensitive fusion e transmissor na sinapse A membrana da vesicula secretora contém a a proteina de ligagao a NSF soltivel 25 SNAP25 de Soluble sinaptobrevina vSNARE em vermelho A membranaalvo plasmatica con NSF Attachment protein 25 também estao envolvidas témasintaxina tSNARE em azul e SNAP25 em roxo Quando um aumento Durante a fusdo a vSNARE e a tSNARE se ligam uma alocal de Ca sinaliza liberagdo do neurotransmissor vSNARE SNAP25 e outra e sofrem uma mudanca estrutural que produz um rae interagern formanio um fens er olado de quate neces a apo feixe de bastonetes longos e finos feitos de hélices de am se hemifusdo unindo as monocamadas externas das duas membra bas as SNARE e de duas helices de SNAP25 Figura 1125 nas para entdo completar a fusdo da membrana e liberar 0 neurotransmis As duas SNARE inicialmente interagem em suas extremida sor O NSF fator Netilmaleimida sensivel a fusdo atua na desmontagem do des e entao fecham em ziper em um feixe de hélices Essa complexo SNARE quando a fusdo é completa 402 DAVID L NELSON MICHAEL M COX mudança estrutural faz as duas membranas entrarem em contato e inicia a fusão de suas bicamadas lipídicas O complexo de SNARE e SNAP25 é o alvo da poderosa toxina Clostridium botulinum protease que cliva ligações específicas nessas proteínas impedindo a neurotransmis são e causando a morte do organismo Devido à sua alta especificidade para essas proteínas a toxina botulínica pu rificada tem servido como poderosa ferramenta para o deta lhamento do mecanismo de liberação de neurotransmissor in vivo e in vitro Proteínas integrais da membrana plasmática estão envolvidas na adesão de superfície na sinalização e em outros processos celulares Várias famílias de proteínas integrais na membrana plasmá tica proveem pontos específicos de ligação entre células ou entre a célula e as proteínas da matriz extracelular As inte grinas são proteínas de adesão à superfície que controlam a interação da célula com a matriz extracelular e com ou tras células incluindo alguns patógenos Integrinas também carregam sinais em ambos os sentidos através da membra na plasmática integrando informação sobre os meios extra e intracelular Todas as integrinas são proteínas heterodi méricas compostas por duas subunidades distintas a e b cada uma ancorada à membrana plasmática por uma única hélice transmembrana Os grandes domínios extracelulares das subunidades a e b combinamse para formar um sítio de ligação específico para proteínas extracelulares como o colágeno e a fibronectina que contêm um determinan te comum de ligação à integrina a sequência ArgGlyAsp RGD As funções de sinalização das integrinas serão dis cutidas em mais detalhes no Capítulo 12 p 470 Outras proteínas da membrana plasmática envolvidas na adesão à superfície são as caderinas que sofrem intera ções homofílicas do mesmo tipo com caderinas idênti cas em uma célula adjacente As selectinas têm domínios extracelulares que na presença de Ca 21 ligam polissacarí deos específicos à superfície de uma célula adjacente As selectinas estão presentes principalmente em vários tipos de células sanguíneas e nas células endoteliais que reves tem os vasos sanguíneos ver Figura 732 Elas são parte essencial do processo de coagulação sanguínea Proteínas integrais de membrana participam em muitos outros processos celulares Servem de transportadores e ca nais iônicos discutido na Seção 113 e de receptores para hormônios neurotransmissores e fatores de crescimento Capítulo 12 São fundamentais para a fosforilação oxidativa e a fotofosforilação Capítulo 19 assim como o reconheci mento célulacélula e célulaantígeno no sistema imune Ca pítulo 5 Proteínas integrais têm papéis importantes na fusão de membranas que acompanha a exocitose a endocitose e a entrada de muitos tipos de vírus nas células hospedeiras RESUMO 112 Dinâmica da membrana c Os lipídeos das membranas biológicas podem existir em estados líquido ordenado ou líquido desordenado neste último caso o movimento térmico das cadeias acil torna o interior da bicamada fluido A fluidez é afetada pela temperatura composição de ácidos graxos e conteúdo de esteroides c A difusão de pontacabeça flipflop de lipídeos entre as lâminas interna e externa da membrana é muito len ta exceto quando especificamente catalisada por flipa ses flopases ou flipflopases c Os lipídeos e as proteínas podem difundirse lateral mente no plano da membrana mas essa mobilidade é limitada por interações das proteínas de membrana com estruturas do citoesqueleto e interações dos lipídeos com balsas lipídicas Uma classe de balsas lipídicas con siste em esfingolipídeos e colesterol com um conjunto de proteínas de membrana ligadas ao GPI ou a várias porções de acil graxos de cadeia longa c A caveolina é uma proteína integral de membrana que se associa com a lâmina interna da membrana plasmá tica forçandoa a curvarse para dentro e formar uma cavéola provavelmente envolvida com transporte de membrana e sinalização c Proteínas específicas contendo domínios BAR causam curvaturas locais na membrana e controlam a fusão de duas membranas que acompanha processos como a en docitose a exocitose e a invasão viral c As integrinas são proteínas transmembrana da membra na plasmática que agem tanto para ligar as células entre si quanto para conduzir mensagens entre a matriz ex tracelular e o citoplasma 113 Transporte de solutos através da membrana Toda célula viva deve obter materiais brutos de seu ambien te para a biossíntese e a produção de energia devendo li berar os produtos de seu metabolismo para o meio Alguns compostos apolares podem dissolverse na bicamada lipídi ca e atravessar a membrana sem auxílio mas para o movi mento transmembrana de qualquer composto polar ou íon uma proteína de membrana é essencial Em alguns casos a proteína de membrana simplesmente facilita a difusão do soluto a favor de seu gradiente de concentração mas o transporte também pode ocorrer contra um gradiente de concentração de carga elétrica ou ambos e nesse caso o processo requer energia Figura 1126 A energia pode vir diretamente da hidrólise de ATP ou pode ser suprida na forma de um soluto movendose a favor de seu gradiente eletroquímico que provê energia suficiente para conduzir outro soluto contra o seu gradiente Os íons também podem se mover através da membrana via canais iônicos formados por proteínas ou eles podem ser transportados por ionó foros moléculas pequenas que mascaram a carga dos íons e os permitem difundir através da bicamada lipídica Com poucas exceções o tráfego de pequenas moléculas através da membrana plasmática é mediado por proteínas como canais transmembrana carreadores ou bombas Dentro da célula eucariótica diferentes compartimentos têm diferen tes concentrações de íons e de intermediários e produtos metabólicos que também devem atravessar membranas intracelulares em processos mediados por proteínas e alta mente regulados Nelson6ed11indd 402 Nelson6ed11indd 402 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 403 O transporte passivo é facilitado por proteínas de membrana Quando dois compartimentos aquosos contendo concentra ções desiguais de um composto solúvel ou íon são separados por uma divisória permeável membrana o soluto se move por difusão simples da região de maior concentração através da membrana para a região de menor concentra ção até que os dois compartimentos tenham concentrações iguais de soluto Figura 1127a Quando íons de cargas opostas são separados por uma membrana permeável exis te um gradiente elétrico transmembrana um potencial de membrana Vm expresso em milivolts Esse potencial de membrana produz uma força que se opõe ao movimento de íons que aumenta o Vm e que impulsiona o movimento de íons que reduz o Vm Figura 1127b Assim a direção na qual solutos carregados tendem a se mover espontanea mente através da membrana depende tanto do gradiente químico a diferença na concentração de soluto quanto do gradiente elétrico Vm através da membrana Juntos esses dois fatores são chamados de gradiente eletroquímico ou potencial eletroquímico Esse comportamento de so lutos está de acordo com a segunda lei da termodinâmica moléculas tendem a assumir espontaneamente a distribui ção de maior aleatoriedade e mais baixa energia Para atravessar a bicamada lipídica um soluto polar ou carregado deve primeiro abandonar as interações com as moléculas de água da sua camada de hidratação e então difundirse por cerca de 3 nm 30 Å por uma substância lipídeo em que é muito pouco solúvel Figura 1128 A energia usada para livrarse da camada de hidratação e para mover o composto polar da água para o lipídeo e de pois através da bicamada lipídica é recuperada à medida que o composto deixa a membrana do outro lado e é rei dratado Entretanto o estágio intermediário da passagem transmembrana é um estado de alta energia comparável ao estado de transição em uma reação química catalisada por enzima Em ambos os casos uma barreira de ativação deve ser superada para alcançar o estágio intermediário Figura 1128 compare com a Figura 63 A energia de ativação DG para o traslado de um soluto polar através da bica mada é tão grande que bicamadas lipídicas puras são prati camente impermeáveis a espécies polares e carregadas no período relevante para o crescimento e a divisão celular Proteínas de membrana reduzem a energia de ativação para o transporte de compostos polares e íons ao prover um caminho alternativo para solutos específicos através da membrana Proteínas que promovem essa difusão facili Sfora Sdentro Sdentro Sfora Sdentro Sdentro Íon Íon Íon Íon Íon Íon Sfora Sfora ATP ADP Pi Difusão facilitada a favor do gradiente eletroquímico Difusão simples apenas compostos apolares a favor do gradiente de concentração Transporte ativo primário contra o gradiente eletroquímico impulsionado por ATP Transporte ativo secundário contra o gradiente eletroquímico impulsionado pelo movimento iônico a favor de seu gradiente Canal iônico a favor do gradiente eletroquímico pode ser aberto por um ligante ou um íon Transporte iônico mediado por ionóforo a favor do gradiente eletroquímico FIGURA 1126 Resumo dos tipos de transportadores Alguns tipos io nóforos canais iônicos e transportadores passivos simplesmente aceleram o movimento do soluto através da membrana a favor de seu gradiente eletro químico enquanto outros transportadores ativos podem bombear solutos contra o gradiente usando o ATP ou o gradiente de um soluto secundário para prover energia C1 C2 Antes do equilíbrio Fluxo efetivo C1 C1 C2 No equilíbrio Não há fluxo efetivo a Vm 0 Antes do equilíbrio Vm 0 No equilíbrio b C2 C1 C2 FIGURA 1127 Movimento de solutos através de uma membrana permeável a O movimento efetivo de um soluto eletricamente neutro é dirigido para o lado de menor concentração de soluto até o equilíbrio ser alcançado As concentrações de soluto nos lados esquerdo e direito da membrana são designadas por C1 e C2 A taxa de movimento de solutos transmembrana indicada pelas setas é proporcional à razão entre as con centrações b O movimento efetivo de um soluto carregado eletricamente é determinado pela combinação do potencial elétrico Vm e pela razão entre as concentrações químicas C2C1 através da membrana o movimento iôni co resultante continua até o potencial eletroquímico chegar a zero Nelson6ed11indd 403 Nelson6ed11indd 403 070414 1421 070414 1421 404 DAVID L NELSON MICHAEL M COX tada ou transporte passivo não são enzimas no sentido comum os seus substratos são deslocados de um compar timento para outro mas não são quimicamente alterados Proteínas de membrana que aceleram o movimento do solu to através da membrana pela difusão facilitada são chama das de transportadores ou permeases Assim como as enzimas os transportadores ligamse aos seus substratos com especificidade estereoquímica por meio de múltiplas interações fracas não covalentes A variação de energia livre negativa associada a essas intera ções fracas DGligação contrabalança a variação de energia livre positiva que acompanha a perda de água de hidra tação do substrato DGdesidratação diminuindo o DG para a passagem transmembrana Figura 1128 Os transporta dores atravessam várias vezes a bicamada lipídica forman do uma via transmembrana revestida com cadeias laterais de aminoácidos hidrofílicos As vias proporcionam uma rota alternativa para um substrato específico moverse através da bicamada lipídica sem precisar dissolverse na bicamada reduzindo o DG para a difusão transmembrana O resultado é um aumento de várias a muitas ordens de magnitude na velocidade de passagem transmembrana do substrato Transportadores e canais iônicos são fundamentalmente diferentes Sabese a partir de estudos genômicos que os transporta dores constituem uma fração significativa entre todas as proteínas codificadas em genomas de organismos tanto simples quanto complexos É provável que existam alguns milhares ou mais de diferentes genes no genoma humano codificando proteínas que permitem que moléculas e íons atravessem a membrana Essas proteínas pertencem a duas categorias muito amplas transportadores e canais Figu ra 1129 Os transportadores de moléculas e íons ligam seus substratos com uma especificidade muito alta cata lisam transporte a velocidades bem abaixo dos limites da difusão livre e são saturáveis no mesmo sentido que as en zimas existe uma determinada concentração de substrato acima da qual um posterior aumento não aumentará a velo cidade de transporte Os canais em geral permitem movi mento transmembrana de íons em velocidades com ordens de magnitude maiores do que aquela típica dos transporta dores velocidades que se aproximam ao limite da difusão livre dezenas de milhões de íons por segundo por canal Os canais mostram geralmente alguma especificidade para um íon mas não são saturáveis pelo íon ao contrário da cinética de saturação vista em transportadores A direção do movimento do íon por um canal iônico é determinada Energia livre G ΔGdifusão simples transporte Difusão simples sem transportador Difusão com transportador Transportador Soluto hidratado b a ΔG FIGURA 1128 Variação de energia que acompanha a passagem de um soluto hidrofílico através da bicamada lipídica de uma membra na biológica a Na difusão simples a remoção da camada de hidratação é altamente endergônica e a energia de ativação DG para difusão através da bicamada é muito alta b Uma proteína transportadora reduz o DG para a difusão transmembrana do soluto Isso ocorre pela formação de interações não covalentes com o soluto desidratado pela substituição das ligações de hidrogênio com água e pelo estabelecimento de uma via hidrofílica trans membrana a Canal iônico portão único Portão fechado Portão aberto Um portão abrese O outro portão se abre b Transportador bomba os portões se alternam FIGURA 1129 Diferenças entre canais e transportadores a Em um canal iônico um poro transmembrana está aberto ou fechado dependendo da posição do único portão Quando ele estiver aberto íons passam através dele com uma velocidade limitada apenas pela taxa de difusão máxima do equilíbrio b Transportadores bombas possuem dois portões que nun ca estão abertos ao mesmo tempo O movimento de um substrato um íon ou uma pequena molécula através da membrana é portanto limitado pelo tempo necessário para um portão abrir e fechar em um lado da membra na e para o segundo portão abrir A velocidade de movimento através dos canais iônicos pode ter ordens de magnitude acima da velocidade de mo vimento através das bombas porém os canais permitem o fluxo dos íons apenas a favor de seus gradientes eletroquímicos enquanto bombas podem mover substratos contra o seu gradiente de concentração Nelson6ed11indd 404 Nelson6ed11indd 404 070414 1421 070414 1421 PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA DE LEHNINGER 405 pela carga do ion e pelo gradiente eletroquimico através da de GLUT para distinguilo do transportador de glicose membrana Dentro de cada uma dessas categorias estao as relacionado em outros tecidos é uma proteina integral familias de varios tipos definidas nao apenas pelas suas se de membrana do tipo III dv 45000 com 12 segmen quéncias primarias mas pelas suas estruturas secundarias tos hidrofdbicos e se acredita que cada segmento forme Entre os transportadores alguns simplesmente facilitam a uma hélice que atravessa a membrana A estrutura deta difusao a favor do gradiente de concentragao eles sao os Ihada do GLUT 1 ainda nao é conhecida mas um modelo transportadores passivos Transportadores ativos po plausivel sugere que um conjunto lado a lado de varias dem conduzir substratos através da membrana contraum hélices produza um canal transmembrana revestido com gradiente de concentragao alguns usando energia forneci residuos hidrofilicos que podem fazer ligagdes de hidro da diretamente por uma reacao quimica transportadores génio coma glicose 4 medida que ela se move através do ativos primarios e alguns acoplando o transporte ladeira poro aquoso Figura 1130 acima de um substrato com o transporte ladeira abaixo de O processo do transporte de glicose pode ser descri outro transportadores ativos secundarios Agora serao to por sua analogia com uma reacao enzimatica na qual consideradas algumas das principais familias de transporta o substrato seria a glicose fora da célula S 0 pro dores e canais mais representativas e bem estudadas Vocé duto seria a glicose dentro SgontoJ a enzima seria o encontrara algumas dessas no Capitulo 12 quando sera dis transportador T Quando a velocidade inicial de captacéo cutida a sinalizagao transmembrana e novamente em capi de glicose é medida em funcao da concentragao externa de tulos seguintes no contexto das vias metabdlicas nas quais glicose Figura 1131 a curva resultante é hiperbdlica eles participam em altas concentragées externas de glicose a velocidade de captagao se aproxima de V Formalmente tal processo 0 transportador de glicose de eritrécitos controla o de transporte pode ser descrito pelas equagoes i k transporte passivo Stora Ty Stora Ty O metabolismo produtor de energia em eritrécitos de 1 pende de um suprimento constante de glicose do plasma kal ial ks sanguineo no qual a concentragao de glicose é mantida kg em torno de 5 mM A glicose entra no eritrécito por di Sgentro Ts ks Scentro Te fusao facilitada por meio de um transportador especifico de glicose a uma velocidade aproximadamente 50000 na qual k k e assim por diante sao as constantes de vezes maior do que a difusao transmembrana nao catali velocidade para as reacoes direta e inversa para cada etapa sada O transportador de glicose do eritrécito chamado T 6a conformagao do transportador na qual o sitio de liga a b c Ser Leu Val Thr Asn Phe lle Polar Carregado 2 a Fora g ee 3 oS cb hc Be Ds 9 OG eh Cotes Costs Oct Cott J See os Sep op Gee ee os 6 he 6 e Dentro if 5 ar oa f F P Le 2 3 COO FIGURA 1130 Topologia da membrana do transportador de glicose na sequéncia linear estao conectados e cada residuo é colocado ao redor da GLUT1 a As hélices transmembrana estado representadas aqui como filei roda na posigao que ocupa na hélice recorde que 36 residuos sao necessa ras obliquas angulares com trés ou quatro residuos de aminodacidos cada rios para fazer uma volta completa na hélice a Neste exemplo os residuos fileira representando uma volta da hélice a Nove das doze hélices contém polares em azul estao em um lado da hélice e os residuos hidrofébicos em trés ou mais residuos polares ou carregados em azul ou vermelho geral amarelo estao no outro Isso é por definigdo uma hélice anfipatica A mente separados por varios residuos hidrofébicos em amarelo Esta repre associagao lado a lado de quatro hélices anfipaticas cada qual com sua face sentacdo de topologia nao tem a intenao de ilustrar a estrutura em trés orientada para o centro da cavidade central pode produzir um canal trans dimensoées b Um diagrama de uma roda helicoidal mostra a distribuigao membrana revestido com residuos polares e carregados Este canal oferece de residuos polares e apolares na superficie de um segmento helicoidal A muitas oportunidades para ligacdes de hidrogénio com a glicose a medida hélice é representada no diagrama supostamente observada ao longo de que ela se move pelo canal seu eixo a partir de sua extremidade aminoterminal Os residuos adjacentes 406 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ção da glicose se posiciona para fora e T2 é a conformação na qual ele se posiciona para dentro Os passos estão resu midos na Figura 1132 Já que cada etapa nessa sequência é reversível o transportador é em princípio capaz de mo ver a glicose para dentro ou para fora da célula Entretan to com o GLUT1 a glicose sempre se move a favor de seu gradiente de concentração que normalmente significa para dentro da célula A glicose que entra na célula em geral é metabolizada imediatamente e a concentração de glico se intracelular é portanto mantida baixa em relação à sua concentração no sangue As equações da velocidade do transporte de glicose po dem ser derivadas exatamente como para as reações catali sadas por enzimas Capítulo 6 produzindo uma expressão análoga à equação de MichaelisMenten V0 5 VmáxSfora Kt 1 Sfora 111 onde V0 é a velocidade inicial de acúmulo da glicose dentro da célula quando a sua concentração no meio circundante é Sfora e Kt Ktransporte é uma constante análoga à cons tante de Michaelis uma combinação de constantes de ve locidade que é característica de cada sistema de transpor te Essa equação descreve a velocidade inicial observada quando Sdentro 5 0 Assim como ocorre no caso das rea ções catalisadas por enzimas o gráfico de 1V0 em função de 1Sfora resulta em uma reta crescente da qual podese obter valores de Kt e Vmáx Figura 1131b Quando Sfora 5 Kt a taxa de captação é ½Vmáx o sistema de transporte está meio saturado A concentração de glicose no sangue é de 45 a 5 mM próximo a Kt o que garante que GLUT1 esteja quase saturado com o substrato e opere próximo da Vmáx Como não há formação ou rompimento de ligações químicas na conversão de Sfora para Sdentro nem o subs trato nem o produto são intrinsecamente mais está veis o processo de entrada é portanto completamente reversível À medida que Sdentro se aproxima de Sfora as velocidades de entrada e saída tornamse iguais Tal sis tema é então incapaz de acumular glicose dentro da célu la em concentrações acima daquela do meio que a circun da ele simplesmente equilibra a glicose nos dois lados da membrana muito mais rapidamente do que ocorreria na ausência de um transportador específico O GLUT1 é específico para a Dglicose com Kt medido no valor apro ximado de 6 mM Para os análogos próximos Dmanose e Dgalactose que diferem apenas em um grupo hidroxil os valores de Kt são 20 e 30 mM respectivamente e para a Lglicose Kt excede 3000 mM Assim o GLUT1 tem as três características do transporte passivo altas taxas de difusão a favor do gradiente de concentração saturabili dade e especificidade Doze transportadores passivos de glicose estão codifi cados no genoma humano cada um com suas propriedades cinéticas únicas padrões de distribuição no tecido e função Tabela 113 No fígado o GLUT2 transporta glicose para fora dos hepatócitos quando o glicogênio no fígado é degra dado para repor glicose sanguínea O GLUT2 tem um gran de Kt 17 mM ou maior e pode portanto responder a níveis aumentados de glicose intracelular produzidos pela de gradação do glicogênio com o aumento do transporte para Concentração extracelular de glicose Sfora mM Velocidade inicial da entrada de glicose V0 mMmin Vmáx Vmáx Kt a 1 2 1 Sfora 1 mM Kt 1 Vmáx 1 2 1 mMmin 1 V0 b FIGURA 1131 Cinética do transporte da glicose para dentro do eri trócito a A velocidade inicial de entrada de glicose no eritrócito V0 de pende da concentração inicial de glicose do lado de fora Sfora b Gráfico duplorecíproco dos dados em a A cinética da difusão facilitada é análoga à cinética da reação catalisada por uma enzima Compare esses gráficos com a Figura 611 e com a Figura Q1 no Quadro 61 Note que Kt é análogo a Km a constante de Michaelis DGlicose Fora Dentro T1 T1 T2 T2 T1 1 2 3 4 FIGURA 1132 Modelo de transporte de glicose para dentro do eri trócito pelo GLUT1 O transportador existe em duas conformações T1 com o sítio de ligação de glicose exposto na superfície externa da mem brana plasmática e T2 com o sítio de ligação exposto na superfície interna O transporte de glicose ocorre em quatro passos ➊ A glicose do plasma sanguíneo se liga ao sítio estereoespecífico em T1 isso reduz a energia de ati vação para ➋ uma mudança conformacional a partir de glicosefora T1 para gli cosedentro T2 efetuando a passagem transmembrana da glicose ➌ A glicose é liberada de T2 para o citoplasma e ➍ o transportador retorna à conformação T1 pronto para transportar outra molécula de glicose Nelson6ed11indd 406 Nelson6ed11indd 406 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 407 fora O músculo esquelético o músculo cardíaco e o tecido adiposo têm ainda outro transportador de glicose o GLUT4 Kt 5 5 mM que é diferente em relação à sua resposta à insulina sua atividade aumenta quando a insulina sinaliza uma alta concentração de glicose sanguínea aumentando a taxa de captação de glicose pelo músculo e tecido adipo so o Quadro 111 descreve o efeito da insulina sobre esse transportador O trocador de cloretobicarbonato catalisa o cotransporte eletroneutro de ânions através da membrana plasmática O eritrócito contém outro sistema de difusão facilitada um trocador de ânion que é essencial ao transporte de CO2 de tecidos como o músculo esquelético e o fígado para os pul mões O CO2 eliminado a partir da respiração dos tecidos e liberado no plasma sanguíneo entra no eritrócito onde é convertido em bicarbonato HCO3 2 pela enzima anidrase carbônica Recorde que o HCO3 2 é o tampão principal do pH sanguíneo ver Figura 221 O HCO3 2 retorna ao plasma sanguíneo para ser transportado aos pulmões Figura 11 33 Como o HCO3 2 é muito mais solúvel no plasma sanguí neo do que o CO2 esta via indireta aumenta a capacidade do sangue de carregar o dióxido de carbono dos tecidos aos pulmões Nos pulmões o HCO3 2 reentra no eritrócito e é convertido em CO2 quando então é finalmente liberado no espaço pulmonar e exalado Para ser efetivo esse transpor te requer um movimento muito rápido de HCO3 2 através da membrana do eritrócito O trocador de cloretobicarbonato também cha mado de proteína trocadora de ânion TA aumenta a taxa de transporte através da membrana do eritrócito em mais de um milhão de vezes Assim como o transpor TABELA 113 Transportadores de glicose em humanos Transportador Tecidos onde está expresso Kt mM Função GLUT1 Ubíquo 3 Captação basal de glicose GLUT2 Fígado ilhotas pancreáticas intestino 17 No fígado e rim remoção do excesso de glicose do sangue no pâncreas regulação da liberação de insulina GLUT3 Cérebro neuronal testículo esperma 14 Captação basal de glicose GLUT4 Músculo gordura coração 5 Atividade aumentada pela insulina GLUT5 Intestino principalmente testículo rim 6 Transporte principalmente de frutose GLUT6 Baço leucócitos cérebro 5 Possivelmente sem função de transporte GLUT7 Intestino delgado colo 03 GLUT8 Testículo 2 GLUT9 Fígado rim 06 GLUT10 Coração pulmão cérebro fígado músculo pâncreas rim 03 GLUT11 Coração músculo esquelético rim 016 GLUT12 Músculo esquelético coração próstata in testino delgado Kt para a glicose exceto quando especificado a partir de Augustin R 2010 The protein family of glucose transpot facilitators its not only about glucose after all IUBMB Life 62 315333 O traço indica uma função incerta KM para a frutose KM para a 2desoxiglicose CO2 1 H2O CO2 1 H2O 1 H Cl 2 2 1 HCO3 1 H Cl HCO3 CO2 2 2 2 2 1 2 2 CO2 HCO3 Cl HCO3 Cl anidrase carbônica anidrase carbônica O dióxido de carbono produzido pelo catabolismo entra no eritrócito O bicarbonato se dissolve no plasma sanguíneo O dióxido de carbono deixa o eritrócito e é exalado O bicarbonato entra no eritrócito a partir do plasma sanguíneo Proteína trocadora de cloreto bicarbonato Na respiração tecidual Nos pulmões FIGURA 1133 Trocador de cloretobicarbonato da membrana do eri trócito Esse sistema de cotransporte permite a entrada e a saída do HCO3 2 sem alterar o potencial de membrana Sua função é aumentar a capacidade do sangue de transportar CO2 A metade superior da figura ilustra os eventos que ocorrem na respiração nos tecidos a metade inferior os eventos que ocorrem nos pulmões Nelson6ed11indd 407 Nelson6ed11indd 407 070414 1421 070414 1421 408 DAVID L NELSON MICHAEL M COX QUADRO 111 MEDICINA Defeito no transporte de glicose e água em duas formas de diabetes Quando a ingestão de uma refeição rica em carboidratos gera uma concentração de glicose sanguínea excedente àquela comum entre as refeições cerca de 5 mM o ex cesso de glicose é captado pelos miócitos dos músculos cardíaco e esquelético que a armazenam como glicogê nio e pelos adipócitos que a convertem em triacilglice róis A captação de glicose pelos miócitos e adipócitos é mediada pelo transportador de glicose GLUT4 Entre as refeições alguns GLUT4 estão presentes na membrana plasmática mas a maioria encontrase sequestrada nas membranas de pequenas vesículas intracelulares Figu ra Q1 A insulina liberada pelo pâncreas em resposta à alta concentração de glicose sanguínea desencadeia o movimento dessas vesículas intracelulares à membrana plasmática com a qual elas se fundem levando as molé culas de GLUT4 para a membrana plasmática ver Figura 1216 Com mais moléculas de GLUT4 em ação a taxa de captação de glicose aumenta em 15 vezes ou mais Quando os níveis de glicose sanguínea retornam ao nor mal a liberação de insulina tornase lenta e a maioria das moléculas de GLUT4 é removida da membrana plasmáti ca e armazenada em vesículas No diabetes melito do tipo I dependente de insu lina a incapacidade em liberar insulina e portanto mobilizar transportadores de glicose resulta em baixas taxas de captação de glicose pelo músculo e tecido adipo so Uma consequência é o período prolongado de glicose sanguínea alta após uma refeição rica em carboidratos Essa condição é a base para o teste de tolerância à glico se usado para diagnosticar o diabetes Capítulo 23 A permeabilidade à água das células epiteliais que re vestem o ducto coletor renal ocorre devido à presença de uma aquaporina AQP2 em suas membranas plasmá ticas apicais voltadas para o lúmen do ducto A vaso pressina hormônio antidiurético ADH de antidiuretic hormone regula a retenção de água pela mobilização de moléculas de AQP2 armazenadas em membranas de vesí culas dentro das células epiteliais assim como a insulina mobiliza o GLUT4 no músculo e no tecido adiposo Quan do as vesículas se fundem com a membrana plasmática das células epiteliais a permeabilidade à água aumenta muito e mais água é reabsorvida do ducto coletor e re torna ao sangue Quando o nível de vasopressina dimi nui AQP2 é ressequestrada nas vesículas reduzindo a retenção de água Na doença relativamente rara de dia betes insípido um defeito genético na AQP2 leva a uma deficiência na reabsorção de água pelo rim O resultado é a excreção de volumes copiosos de urina muito diluída Se o indivíduo beber água suficiente para repor o que foi perdido pela urina não há consequências sérias do ponto de vista médico porém a ingestão insuficiente de água leva à desidratação e desequilíbrio nos eletrólitos sanguí neos que pode levar à fadiga dor de cabeça dor muscu lar ou até mesmo à morte Transportador de glicose Membrana plasmática Receptor de insulina Insulina Quando a insulina interage com seu receptor vesículas se movem para a superfície e se fundem com a membrana plasmática aumentando o número de transportadores de glicose na membrana plasmática Porções do endossomo enriquecidas com transportadores de glicose se desprendem na forma de pequenas vesículas prontas para retornar à superfície quando os níveis de insulina aumentarem novamente ➊ Transportadores de glicose armazenados dentro das células em vesículas membranosas Quando o nível de insulina diminui os transportadores de glicose são removidos da membrana plasmática por endocitose formando pequenas vesículas As vesículas menores se fundem com um endossomo maior ➎ ➋ ➌ ➍ FIGURA Q1 O transporte de glicose para um miócito pelo GLUT4 é regulado pela insulina Nelson6ed11indd 408 Nelson6ed11indd 408 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 409 tador de glicose ela é uma proteína integral que provavel mente atravessa a membrana pelo menos 12 vezes Essa proteína é responsável por mediar o movimento simultâ neo de dois ânions para cada íon de HCO3 2 que se move em uma direção um íon Cl 2 se move na direção contrá ria sem transferência efetiva de carga a troca é eletro neutra O acoplamento entre os movimentos de Cl 2 e de HCO3 2 é obrigatório na ausência do cloreto o transpor te de bicarbonato para Em relação a isso o trocador de ânions é típico desses sistemas chamados de sistemas de cotransporte que simultaneamente carregam dois solutos através da membrana Figura 1134 Quando como nesse caso os dois substratos movemse em dire ções opostas o processo é antiporte No simporte dois substratos movemse simultaneamente na mesma dire ção Transportadores que carregam apenas um substrato como o transportador de glicose do eritrócito são conhe cidos como sistemas uniporte O genoma humano tem genes para três trocadores de cloretobicarbonato muito parecidos todos com a mes ma previsão de topologia transmembrana Os eritrócitos contêm o transportador TA1 o TA2 é proeminente no fí gado e o TA3 está presente em membranas plasmáticas no cérebro no coração e na retina Trocadores de ânions semelhantes também são encontrados em plantas e mi crorganismos O transporte ativo resulta em movimento de soluto contra um gradiente de concentração ou eletroquímico No transporte passivo as espécies transportadas sempre se movem a favor de seu gradiente eletroquímico e não se acumulam além da concentração de equilíbrio Em contra posição o transporte ativo resulta em acúmulo de soluto acima do ponto de equilíbrio O transporte ativo é termodi namicamente desfavorável endergônico e ocorre apenas acoplado direta ou indiretamente a um processo exergô nico como a absorção de luz solar uma reação de oxidação uma hidrólise de ATP ou o fluxo concomitante de alguma outra espécie química a favor de seu gradiente eletroquími co No transporte ativo primário o acúmulo de soluto é acoplado diretamente a uma reação química exergônica como na conversão de ATP a ADP 1 Pi Figura 1135 O transporte ativo secundário ocorre quando o transporte endergônico morro acima de um soluto está acoplado a um fluxo exergônico morro abaixo de um soluto di ferente que era originalmente bombeado para cima pelo transporte ativo primário A quantidade de energia necessária para o transporte de um soluto contra o gradiente pode ser calculada a partir do gradiente inicial de concentração A equação geral para a variação de energia livre no processo químico que converte S a P é DG 5 DG9 o 1 RT ln PS 112 onde DG9 0 é a variação de energia livre padrão R é a cons tante dos gases 8315 Jmol K e T é a temperatura ab soluta Quando a reação é simplesmente o transporte de um soluto de uma região onde sua concentração é C1 para uma região onde sua concentração é C2 não há formação ou rompimento de ligações e DG9 o é zero A variação de ener gia livre para o transporte DGt é então DGt 5 RT ln C2C1 113 Se houver uma diferença de 10 vezes na concentração entre dois compartimentos o custo para movimentar 1 mol de um soluto não carregado a 25ºC morro acima através da mem brana que separa os dois compartimentos é DGt 5 8315 Jmol K298K ln 101 5 5700 Jmol 5 57 kJmol A Equação 113 serve para todos os solutos não carregados S Uniporte Simporte Antiporte Cotransporte S1 S2 S2 S1 FIGURA 1134 Três classes gerais de sistemas de transporte Os trans portadores diferem no número de solutos substratos transportados e na direção na qual cada soluto se move Exemplos dos três tipos de transporta dores são discutidos no texto Observe que essa classificação não informa se esses processos requerem energia transporte ativo ou se são independen tes de energia transporte passivo S1 S1 S1 S1 S2 S2 a Transporte ativo primário b Transporte ativo secundário ATP ATP ADP Pi ADP Pi FIGURA 1135 Dois tipos de transporte ativo a No transporte ativo primário a energia liberada pela hidrólise de ATP impulsiona o movimento de soluto S1 contra o gradiente eletroquímico b No transporte ativo se cundário o gradiente de um íon X S1 geralmente Na 1 se estabelece por transporte ativo primário O movimento de X S1 a favor de seu gradiente eletroquímico provê agora energia para impulsionar o cotransporte de um segundo soluto S2 contra seu gradiente eletroquímico Nelson6ed11indd 409 Nelson6ed11indd 409 070414 1421 070414 1421 410 DAVID L NELSON MICHAEL M COX PROBLEMA RESOLVIDO 111 Custo de energia para bombear um soluto não carregado Calcule o custo de energia variação de energia livre para bombear um soluto não carregado contra um gradiente de concentração de 10 3 10 4 vezes a 25ºC Solução Comece com a Equação 113 Substitua C2C1 por 10 3 10 4 R por 8315 Jmol K e T por 298 K DGt 5 RT ln C2C1 5 8315 Jmol K 298 K ln 10 3 10 4 5 23 kJmol Quando o soluto é um íon seu movimento sem o acom panhamento de um contraíon resulta em uma separação endergônica de cargas positivas e negativas produzindo um potencial elétrico dizse que tal transporte é eletrogê nico O custo energético de mover um íon depende do po tencial eletroquímico Figura 1127 a soma dos gradientes químico e elétrico DGt 5 RT ln C2C1 1 Z Dc 114 onde Z é a carga do íon é a constante de Faraday 96480 JV mol e Dc é o potencial elétrico transmembrana em volts As células eucarióticas têm potenciais de membrana plasmática geralmente da ordem de 005 V sendo o lado interno negativo em relação ao externo de modo que o segundo termo da Equação 114 pode contribuir significati vamente na variação de energia livre total para o transpor te do íon A maioria das células mantém uma diferença de mais de 10 vezes na concentração de íons através das mem branas plasmática ou intracelular e para muitas células e tecidos o transporte ativo é portanto o principal processo de consumo de energia PROBLEMA RESOLVIDO 112 Custo de energia para bombear um soluto carregado Calcule o custo de energia variação de energia livre para bombear o Ca 21 do citosol onde sua concentração é de aproximadamente 10 3 10 27 M para o fluido extracelu lar onde a sua concentração é aproximadamente 10 mM Suponha uma temperatura de 37ºC temperatura corporal dos mamíferos e um potencial transmembrana padrão de 50 mV negativo dentro para a membrana plasmática Solução Neste cálculo tanto o gradiente de concentração quanto o potencial elétrico devem ser levados em conside ração Na Equação 114 substitua R por 8315 Jmol K e T por 310 K C2 por 10 3 10 23 C1 por 10 3 10 27 Z por 96500 JV mol por 12 carga do íon Ca 21 e Dc por 0050 V Observe que o potencial transmembrana é 50 mV negativo dentro de modo que a variação do potencial quando o íon se move de dentro para fora é de 50 mV O mecanismo de transporte ativo é de fundamental im portância em biologia Como será visto no Capítulo 19 o ATP é formado nas mitocôndrias e nos cloroplastos por um mecanismo que é essencialmente um transporte iônico mo vido a ATP operando de forma reversa A energia que se tor na disponível pelo fluxo espontâneo de prótons através da membrana pode ser calculada a partir da Equação 114 lem bre que DG para o fluxo para baixo do gradiente eletroquí mico tem um valor negativo e DG para o transporte de íons contra o gradiente eletroquímico tem um valor positivo ATPases do tipo P sofrem fosforilação durante seus ciclos catalíticos A família de transportadores ativos chamados de ATPases do tipo P são transportadores de cátions que são fosfori lados de forma reversível por ATP por isso o nome tipo P como parte do ciclo de transporte A fosforilação força uma mudança conformacional que é fundamental para o movi mento do cátion através da membrana O genoma humano codifica pelo menos 70 ATPases do tipo P que possuem se melhanças quanto à sequência de aminoácidos e topologia especialmente perto do resíduo Asp que sofre fosforilação Todas são proteínas integrais com 8 ou 10 regiões prediti vas que atravessam a membrana em um único polipeptídeo tipo III na Figura 119 e todas são sensíveis à inibição pelo vanadato análogo do fosfato Vanadato V O2 OH O Fosfato P O2 OH O O2 O2 As ATPases do tipo P são muito comuns em eucariotos e bactérias A Na 1K 1ATPase de células animais antiporte para os íons Na 1 e K 1 e a H 1ATPase da membrana plas mática de plantas e fungos determinam o potencial ele troquímico transmembrana nas células ao estabelecer os gradientes iônicos através da membrana Esses gradientes proporcionam a força propulsora para o transporte ativo se cundário e também formam a base da sinalização elétrica em neurônios Em tecidos animais a bomba Ca 21 ATPase do retículo sarcoplasmáticoendoplasmático SER CA de sarcoplasmic and endoplasmic reticulum cal cium e a bomba Ca 21ATPase da membrana plasmática são uniportadores dos íons Ca 21 que juntos mantêm o nível citosólico de Ca 21 abaixo de 1 mM Células parietais que re Nelson6ed11indd 410 Nelson6ed11indd 410 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 411 vestem o estômago de mamíferos têm uma ATPase do tipo P que bombeia H 1 e K 1 através da membrana plasmática acidificando o conteúdo do estômago As flipases lipídicas como mencionado anteriormente são estrutural e funcio nalmente relacionadas aos transportadores do tipo P As bactérias e eucariotos usam ATPases do tipo P para bom bear íons metálicos pesados tóxicos como o Cd 21 e o Cu 21 para fora As bombas do tipo P têm estruturas Figura 1136 e mecanismos semelhantes O mecanismo postulado para as ATPases do tipo P leva em consideração as grandes mudan ças conformacionais e a fosforilaçãodesfosforilação do re síduo crítico Asp no domínio P que ocorrem durante o ciclo catalítico Para a bomba SERCA Figura 1137 cada ciclo catalítico move dois íons Ca 21 através da membrana e con Fora Dentro Fora Dentro Domínios transmembrana T S Domínio atuador A HATPase da membrana plasmática Na KATPase H KATPase gástrica Domínio de ligação a nucleotídeo N Domínio de fosforilação P a c Ca2ATPase bomba SERCA b A N P T S FIGURA 1136 A estrutura geral das ATPases do tipo P a As ATPases do tipo P possuem três domínios citoplasmáticos A N e P e dois domínios transmembrana T e S que consistem em múltiplas hélices O domínio N nu cleotídeo liga ATP e Mg 2 e tem atividade de proteínacinase que fosforila o resíduo Asp específico encontrado no domínio P fosforilado de todas ATPa ses do tipo P O domínio A atuador possui atividade de proteína fosfatase e remove o grupo fosforil do resíduo Asp em cada ciclo catalítico da bomba O domínio transporte T com seis hélices transmembrana inclui a estrutura transportadora de íon e mais outras quatro hélices transmembrana apóiam o domínio S que provém o suporte fisico ao domínio de transporte e pode ter outra função especializada em certas ATPases do tipo P Os sítios de ligação para os íons a serem transportados estão próximos ao meio da membrana 40 a 50 Å do resíduo Asp fosforilado assim a fosforilaçãodesfosforilação do Asp não afeta diretamente a ligação do íon O domínio A comunica movimentos dos domínios N e P aos sítios de ligação dos íons b Uma representação em fita da Ca 2 ATPase bomba SERCA PDB 1T5S O ATP se liga ao domínio N e os íons Ca 2 a serem transportados ligamse ao domínio T c Outras ATPases do tipo P possuem estruturas de domínios e provavelmente mecanismos como a bomba SERCA a Na K ATPase PDB ID 3KDP a H ATPase da membrana plas mática PDB ID 3B8C e a H K ATPase gástrica derivada do PDB ID 3IXZ verte um ATP a ADP e Pi O ATP tem duas funções nesse me canismo um catalítico e outro modulatório O papel da ligação do ATP seguida da transferência do fosforil à enzima é promover a interconversão de duas con formações E1 e E2 do trans portador Na conformação E1 dois sítios de ligação do Ca 21 são expostos ao lado citosólico do RE ou retículo sarcoplasmático e ligam o Ca 21 com grande afini dade A ligação de ATP e a fos forilação do Asp conduzem a uma mudança conformacional de E1 a E2 na qual os sítios de ligação do Ca 21 são agora expostos ao lado luminal da membrana e sua afinidade pelo Ca 21 é muito reduzida causando a liberação de Ca 21 para o lúmen Por meio desse mecanismo a energia liberada pela hidrólise de ATP durante um ciclo de fosforilaçãodesfos forilação mobiliza o Ca 21 através da membrana contra um grande gradiente eletroquímico Uma variação desse mecanismo básico é vista na Na 1K 1ATPase da membrana plasmática descoberta por Jens Skou em 1957 Esse cotransportador acopla fosfori laçãodesfosforilação do resíduo Asp crítico ao movimento simultâneo tanto de Na 1 quanto de K 1 contra seus gra dientes eletroquímicos A Na 1K 1ATPase é responsável por manter baixa a concentração de Na 1 e alta a de K 1 na célula em relação ao fluido extracelular Figura 1138 Para cada molécula de ATP convertida a ADP e Pi o trans Jens Skou Nelson6ed11indd 411 Nelson6ed11indd 411 070414 1421 070414 1421 412 DAVID L NELSON MICHAEL M COX portador desloca dois íons K 1 para dentro e três íons Na 1 para fora através da membrana plasmática O cotransporte é portanto eletrogênico ele cria uma separação líquida de cargas através da membrana em animais isso produz o potencial de membrana de 250 a 270 mV o lado de dentro é negativo em re lação ao de fora que é característico da maioria das células e é essencial para a condução do potencial de ação em neurônios O papel fundamental da Na 1K 1 ATPase é refletido na energia investida nesta única reação aproximadamente 25 do consumo total de energia de um ser humano em repouso ATPases do tipo V e do tipo F são bombas de prótons impulsionadas por ATP ATPases do tipo V classe de ATPase transporta dora de prótons são responsáveis por acidificarem compartimentos intracelulares em muitos orga nismos assim o V vem de vacuolar Bombas de prótons desse tipo mantêm o pH entre 3 e 6 nos vacúolos de fungos e plantas superiores bem abai xo daquele do citosol pH 75 ATPases do tipo V são também responsáveis pela acidificação de li sossomos endossomos do aparelho de Golgi e de vesículas secretoras em células animais Todas as ATPases do tipo V apresentam uma estrutura com plexa semelhante com um domínio Vo integral transmembrana que serve como canal de prótons e um domínio periférico V1 que contém o sítio de ligação de ATP e a atividade da ATPase Figura 11 39a A estrutura é semelhante à das ATPases do tipo F já bem caracterizadas Os transportadores ATPases do tipo F ativos ca talisam a passagem transmembrana de prótons mor ro acima impulsionados pela hidrólise de ATP A de signação do tipo F provém da identificação dessas ATPases com fatores acoplados à energia O comple xo proteico integral de membrana Fo Figura 11 39b o subscrito o indica sua inibição pelo fármaco O domínio A se move causando a liberação de ADP O domínio P se torna desfosfo rilado O domínio A é restaurado Os domínios P T e S são restaurados na confor mação E1 Ligação de Ca2 e ATP domínio N se move Grupo fosforil transferido ao domínio P do Asp351 A fosforilação leva a mudanças conformacionais liberando Ca2 para o lúmen ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ ➐ ➏ E1P E1 E2P E2 Ca2 Mg2 Pi T S A A A N Ca2 Mg2 P P ADP ATP ADP P Mg2 P FIGURA 1137 Mecanismo postulado para a bomba SERCA O ciclo do transporte começa com a proteína na conformação E1 com os sítios de ligação ao Ca 21 expostos para o citosol Dois íons Ca 21 se ligam e então o ATP se liga ao transportador e fosforila o Asp 351 for mando E1P A fosforilação favorece a segunda conformação E2P na qual os sítios de ligação ao Ca 21 agora com uma afinidade reduzida ao Ca 21 estão acessíveis do outro lado da membrana espaço extra celular ou lúmen e o Ca 21 se difunde para fora Finalmente E2P é desfosforilado retornando a proteína à conformação E1 para outro ciclo de transporte FIGURA 1138 Papel da Na 1K 1ATPase em células ani mais Em células animais o sistema de transporte ativo é respon sável principalmente pelo estabelecimento e manutenção das con centrações intracelulares de Na 1 e K 1 e pela geração do potencial de membrana Ele faz isso ao movimentar três Na 1 para fora da célula para cada dois K 1 que move para dentro O potencial elétrico através da membrana plasmática é fundamental na sinalização de neurô nios e o gradiente de Na 1 é usado para impulsionar morro acima o cotransporte de solutos em muitos tipos celulares Potencial de membrana 5 250 a 270 mV 3 Na1 2 K1 Citosol K1 5 140 mM Na1 5 12 mM Fluido extracelular ou plasma sanguíneo K1 5 4 mM Na1 5 145 mM Na1K1ATPase ATP ADP 1 Pi 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Nelson6ed11indd 412 Nelson6ed11indd 412 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 413 oligomicina provê uma via transmembrana para prótons e a proteína periférica F1 o subscrito 1 indica que esse foi o primeiro entre vários fatores isolados da mitocôndria usa a energia do ATP para mover prótons morro acima para uma região de maior concentração de H 1 A organização FoF1 das bombas de prótons deve ter se desenvolvido muito precocemente na evolução Bactérias como a E coli usam uma ATPase FoF1 complexa na sua membrana plasmática para bombear prótons para fora e as arquibactérias têm uma bomba de prótons semelhante a ATPase AoA1 Como todas as enzimas as ATPases do tipo F catalisam suas reações em ambas as direções Assim um gradiente de prótons suficientemente grande pode suprir a energia para conduzir a reação reversa a síntese de ATP Figura 11 39b Quando funcionam nesse sentido as ATPases do tipo F são mais apropriadamente chamadas de ATPsintases As ATPsintases são fundamentais para a produção de ATP na mitocôndria durante a fosforilação oxidativa e em cloro plastos durante a fotofosforilação assim como em bactérias e arquibactérias O gradiente de prótons necessário para conduzir a síntese de ATP é produzido por outros tipos de bombas de prótons energizadas pela oxidação do substrato ou luz solar Será feita uma descrição detalhada desses pro cessos no Capítulo 19 p 750 Transportadores ABC usam ATP para impulsionar o transporte ativo de uma grande variedade de substratos Os transportadores ABC Figura 1140 constituem uma grande família de transportadores dependentes de ATP que bombeiam aminoácidos peptídeos proteí nas íons metálicos vários lipídeos sais biliares e mui tos compostos hidrofóbicos incluindo fármacos para fora das células contra um gradiente de concentração Um trans portador ABC em humanos o transportador multifárma cos MDR1 de multidrug transporter também chamado de glicoproteína P é responsável pela impressionante resistência de certos tumores a alguns fármacos antitumor geralmente eficazes O MDR1 tem especificidade ampla para compostos hidrofóbicos incluindo por exemplo os fárma cos quimioterápicos adriamicina doxorrubicina e vinblasti na Ao bombear esses fármacos para fora da célula o trans portador impede o seu acúmulo no tumor e assim bloqueia seus efeitos terapêuticos O MDR1 Figura 1140a é uma proteína integral de membrana Mr 170000 com duas me tades homólogas cada uma delas com seis hélices trans membrana e um domínio de ligação a ATP cassete que dão o nome à família ABC sigla do inglês ATPBinding Cassette ou transportadores cassete de ligação ao ATP A superexpressão de MDR1 está associada com a falha no tra tamento de câncer de fígado rim e colo Um transportador ABC relacionado o ABCC1 está superexpresso em células cancerosas de próstata pulmão e mama resistentes ao fár maco Inibidores altamente seletivos de transportadores multifármacos que se poderia esperar serem capazes de au mentar a efetividade dos fármacos antitumor caso contrário seriam bombeados para fora das células tumorais são obje tos de descobertas e modelagens de fármacos atuais Por que transportadores multifármacos têm sido conservados na evolução O MDR1 impede a entrada de compostos tóxicos na membrana placentária e na barreira sanguecérebro que de outra forma lesariam o feto ou o cérebro Transportadores ABC também estão presentes em ani mais mais simples e em plantas e microrganismos A leve ATP ADP 1Pi A A B B B c c c c c Região não homóloga da subunidade A Citosol Lúmen do vacúolo Citosol Matriz mitocondrial A a e a a b b b g a d H H FO F1 VO V1 b b2 c10 a d H H FIGURA 1139 Duas bombas de prótons com estruturas similares a A ATPase H 1 VoV1 usa ATP para bombear prótons para dentro de vacúo los e lisossomos criando seus pHs internos baixos Ela tem um domínio in tegral inserido na membrana Vo em cor de laranja que inclui subunidades múltiplas idênticas e um domínio periférico que se projeta para o citosol e que contém o sítio de hidrólise de ATP localizado em três subunidades idênticas B em roxo b A ATPase FoF1ATPsintase da mitocôndria possui um domínio integral Fo em cor de laranja com múltiplas cópias da subuni dade c e um domínio periférico F1 que consiste em três subunidades a três subunidades b e uma haste central unidas ao domínio integral Fo e presumivelmente Vo fornecem um canal transmembrana pelo qual prótons são bombeados à medida que o ATP é hidrolisado na subunidade b de F1 subunidades B de V1 O mecanismo notável pelo qual a hidrólise de ATP é acoplada ao movimento do próton é descrito em detalhe no Capítulo 19 Ele envolve a rotação de Fo no plano da membrana As estruturas da ATPase VoV1 e seus análogos ATPase AoA1 de arqueias e ATPase CFoCF1 de cloroplastos são essencialmente semelhantes às da ATPase FoF1 e os me canismos também estão conservados Um transportador de próton impul sionado por ATP também pode catalisar a síntese de ATP setas vermelhas à medida que prótons fluem a favor de seu gradiente eletroquímico Essa é a reação central no processo de fosforilação oxidativa e fotofosforilação ambos descritos em detalhe no Capítulo 19 Nelson6ed11indd 413 Nelson6ed11indd 413 040614 1553 040614 1553 414 DAVID L NELSON MICHAEL M COX dura tem 31 genes que codificam os transportadores ABC a Drosophila tem 56 e a E coli tem 80 representando 2 de todo seu genoma Transportadores ABC usados pela E coli e outras bactérias para importar vitaminas essenciais como a B12 Figura 1140b são presumivelmente precurso res evolutivos dos MDRs de células animais A presença dos transportadores ABC que conferem resistência aos antibió ticos em micróbios patogênicos Pseudomonas aerugino sa Staphylococcus aureus Candida albicans Neisseria gonorrhoeae e Plasmodium falciparum é uma preocu pação séria de saúde pública e faz esses transportadores se rem alvos interessantes para a modelagem de fármacos Todos os transportadores ABC possuem dois domínios de ligação a nucleotídeos NBD de nucleotide binding do mains e dois domínios transmembrana contendo múltiplas hélices transmembrana Em alguns casos todos esses domí nios se apresentam como um único e longo polipeptídeo ou tros transportadores ABC possuem duas subunidades cada uma contribuindo com um NBD e um domínio com seis hé lices transmembrana Muitos transportadores ABC estão na membrana plasmática mas alguns tipos também são encon trados no retículo endoplasmático em membranas de mito côndrias e lisossomos A proteína CFTR ver Quadro 112 é um caso interessante de canal iônico para o Cl 2 acionado pela hidrólise de ATP que é aparentemente derivado de um transportador ABC no qual a evolução eliminou a função de bomba mas manteve a de canal funcional Os NBD de todas as proteínas ABC são semelhantes em sequência e presumivelmente em estrutura tridimensional eles são o motor molecular conservado que pode ser aco plado a uma grande variedade de bombas e canais Quando acoplado a uma bomba o motor movido a ATP desloca so lutos contra o gradiente de concentração A estequiometria das bombas ABC é de aproximadamente um ATP hidroli sado por molécula de substrato transportado mas nem o mecanismo de acoplamento nem o sítio de ligação do subs trato estão completamente bem compreendidos Alguns transportadores ABC têm especificidade mui to alta para um único substrato outros são mais pro míscuos O genoma humano contém no mínimo 48 genes que codificam os transportadores ABC muitos dos quais estão envolvidos com a manutenção da bicamada lipídica e com o transporte de esteróis derivados de esteróis e ácidos graxos por todo o corpo As flipases que movem lipídeos de membrana de uma lâmina da bicamada para a outra são transportadores ABC e a maquinaria celular para exportar o excesso de colesterol inclui um transportador ABC Muta ções em genes que codificam algumas dessas proteínas con tribuem para várias doenças genéticas incluindo fibrose cística Quadro 112 doença de Tangier p 874 degene ração da retina anemia e falência do fígado Gradientes iônicos provêm a energia necessária para o transporte ativo secundário Os gradientes iônicos formados pelo transporte primário de Na 1 ou H 1 podem prover a força propulsora para o cotrans porte de outros solutos Muitos tipos celulares contêm siste mas de transporte que acoplam o fluxo espontâneo morro abaixo de íons ao bombeamento simultâneo morro acima de outro íon açúcar ou aminoácido Tabela 114 b a c Citoplasma Periplasma NBD Citoplasma Espaço extracelular Citoplasma Espaço extracelular Domínios de ligação a nucleotídeos NBD TMD Voltado para dentro Voltado para fora Proteína de ligação ao substrato Substrato TMD ADP NBD ATP Domínios transmembrana TMD FIGURA 1140 Dois transportadores ABC a O transportador multifár macos de células animais MDR1 também chamado de glicoproteína P PDB IB 3G60 responsável por bombear uma variedade de fármacos antitumor para fora de células humanas tem duas metades homólogas em azul e azulclaro cada uma com seis hélices transmembrana em dois domínios transmembra na TMD de transmembrane domain em azul e um domínio citoplasmático de ligação a nucleotídeos NBD de nucleotidebinding domains em verme lho b O importador da vitamina B12 BtuCD PDB ID 1 L7V da E coli é um homodímero com 10 hélices transmembrana em azul e azulclaro em cada monômero e dois domínios NBD em vermelho que se estendem para o ci toplasma c Mecanismos propostos para o acoplamento da hidrólise de ATP ao transporte da vitamina B12 no transportador ABC da E coli O substrato é trazido ao transportador no lado periplasmático por uma proteína de ligação específica do substrato Com o ATP ligado aos sítios NBD o transportador abrese para o lado de fora periplasma mas no momento que o substrato se liga e o ATP hidrolisa para ADP 1 Pi uma mudança conformacional expõe o substrato à superfície interna e ele difundese do transportador para o citosol Nelson6ed11indd 414 Nelson6ed11indd 414 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 415 QUADRO 112 MEDICINA Um canal iônico defeituoso na fibrose cística A fibrose cística FC é uma doença hereditária huma na séria e relativamente comum Cerca de 5 de todos os americanos brancos são portadores tendo uma cópia defeituosa do gene e uma normal Apenas indivíduos com duas cópias defeituosas apresentam sintomas severos da doença obstrução dos tratos gastrintestinal e respirató rio geralmente levando a uma infecção bacteriana das vias aéreas e morte devido à insuficiência respiratória antes dos 30 anos Na FC a camada fina de muco que cobre as superfícies internas dos pulmões está espessa obstruindo o fluxo de ar e proporcionando um refúgio para bactérias patogênicas particularmente Staphylo coccus aureus e Pseudomonas aeruginosa O gene defeituoso em pacientes com FC foi descoberto em 1989 Ele codifica a proteína de membrana chamada de regulador de condutância transmembrana da fibrose cística CFTR de cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Essa proteína possui dois segmentos cada um contendo seis hélices transmembrana dois domínios de li gação a nucleotídeos NBDs e uma região regulatória Fi gura Q1 O CFTR é portanto muito semelhante a outras proteínas transportadoras ABC exceto que funciona como um canal iônico para o íon Cl 2 não como uma bomba O canal conduz Cl 2 através da membrana plasmática quando ambos NBDs tiverem ligado o ATP e fecha quando o ATP em um dos NBDs for hidrolisado a ADP e Pi O ca nal de Cl 2 é posteriormente regulado pela fosforilação de vários resíduos de Ser no domínio regulatório catalisado pela proteínocinase dependente de cAMP Capítulo 12 Quando o domínio regulatório não é fosforilado o canal de Cl 2 está fechado A mutação responsável pela FC em 70 dos casos resulta em deleção do resíduo de Phe na posição 508 A proteína resultante dobra incorretamente o que interfere com sua inserção na membrana plasmáti ca resultando em um movimento reduzido de Cl 2 e H2O através da membrana plasmática de células epiteliais que revestem as vias aéreas Figura Q2 e o trato digestório assim como glândulas exócrinas pâncreas glândulas su doríparas ductos biliares e canais deferentes A secreção líquida é essencial para manter o muco na superfície dos alvéolos pulmonares na viscosidade exata para capturar e eliminar microrganimos que são inalados A exportação diminuída de Cl 2 é acompanhada pela exportação diminuída de água das células tornando o muco desidratado espesso e excessivamente pegajoso na superfície das células Em circunstâncias normais os cí lios das células epiteliais que revestem a superfície interna dos pulmões removem constantemente as bactérias que se instalam nesse muco mas o muco espesso em indiví duos com FC impe de esse processo Isso acarreta infec ções frequentes por bactérias como S aureus e P aerugi nosa causando um dano progressivo aos pulmões e efi ciência respiratória reduzida Insufi ciência respirató ria é comumente a causa de morte em pessoas com FC Dentro Fora H3N NBD1 NBD2 Domínio R P Ser Cl2 Cl2 2OOC 2OOC 2OOC H3N Canal fechado Domínio R fosforilado Nenhum ATP ligado aos NBD Canal aberto Domínio R fosforilado ATP ligado aos NBD Canal fechado Domínio R desfosforilado Nenhum ATP ligado aos NBD H3N ATP ATP ATP ADP Pi P P P Phe508 FIGURA Q1 Três estados do regulador de condutância transmembrana da fibrose cística CFTR A proteína tem dois segmentos cada qual com seis hélices transmembrana e três domínios funcionalmente significativos se estendem a partir da superfície citoplasmática NBD1 e NBD2 em verde são domínios de ligação nucleotídica que ligam ATP e um domínio regula tório R em azul é o sítio de fosforilação pela proteínacinase dependente de cAMP Quando esse domínio R é fosforilado mas o ATP não se liga aos NBD esquerda o canal está fechado A ligação do ATP abre o canal cen tro até que o ATP ligado seja hidrolisado Quando o domínio regulatório está desfosforilado direita ele se liga ao domínio NBD e impede a ligação de ATP e a abertura do canal A mutação que mais comumente ocorre levando à FC é a deleção da Phe 508 no domínio NBD1 esquerda O CFTR é um transportador ABC típico em tudo exceto em dois aspectos a maioria dos transportadores ABC não possui domínio regulatório e o CFTR atua como um canal iônico para Cl 2 não como um transportador típico FIGURA Q2 O muco na superfície dos pulmões aprisiona as bactérias Em pulmões sadios mostrado aqui estas bactérias são mortas e varridas para fora pela ação dos cílios Na FC este mecanismo está prejudicado resultando em infecções recorrentes e lesão progressiva dos pulmões Nelson6ed11indd 415 Nelson6ed11indd 415 070414 1421 070414 1421 416 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O transportador de lactose lactosepermease ou galactosídeopermease da E coli é o protótipo bem estu dado de cotransportadores impulsionados por prótons Essa proteína consiste em uma cadeia polipeptídica única 417 resíduos que funciona como um monômero transportando um próton e uma molécula de lactose para a célula com acú mulo resultante de lactose Figura 1141 A E coli nor malmente produz um gradiente de prótons e cargas através da membrana plasmática pela oxidação de combustíveis e uso da energia de oxidação para bombear prótons para fora Esse mecanismo é discutido em detalhe no Capítulo 19 A bicamada lipídica é impermeável a prótons mas o transpor tador de lactose provê um caminho para a reentrada dos pró tons e a lactose é simultaneamente carregada para dentro da célula por simporte O acúmulo endergônico de lactose é portanto acoplado ao fluxo exergônico de prótons para dentro da célula com variação de energia livre total negativa O transportador de lactose é um membro da superfa mília facilitadora principal SFP de transportadores que compreende 28 famílias Quase todas as proteínas nes sa superfamília têm 12 domínios transmembrana algumas poucas exceções têm 14 As proteínas compartilham rela tivamente pouca homologia de sequência mas a semelhan ça entre as suas estruturas secundárias e a topologia sugere uma estrutura terciária comum A resolução cristalográfica do transportador de lactose da E coli dá uma ideia dessa estrutura geral Figura 1142a A proteína tem 12 héli ces transmembrana e alças de conexão projetamse para o citoplasma ou para o espaço periplasmático entre a mem brana plasmática e a membrana externa ou parede celular As seis hélices aminoterminais e as seis carboxiterminais formam domínios muito semelhantes para produzir uma estrutura com simetria aproximadamente dupla Na forma cristalizada da proteína uma grande cavidade aquosa é ex posta no lado citoplasmático da membrana O sítio de liga ção do substrato encontrase na cavidade mais ou menos no centro da membrana O lado do transportador voltado para fora face periplasmática é firmemente fechado e ne nhum canal é grande o suficiente para permitir a entrada de lactose O mecanismo proposto para a passagem transmem brana do substrato Figura 1142b envolve um movimento oscilatório entre os dois domínios impulsionado pela liga ção do substrato e pelo movimento dos prótons expondo o domínio de ligação ao substrato alternativamente ao cito plasma e ao periplasma Esse modelo de banana oscilante é semelhante ao mostrado na Figura 1132 para o GLUT1 Como o movimento de prótons para dentro da célula está acoplado à captação de lactose Estudos genéticos extensos do transportador de lactose estabeleceram que TABELA 114 Sistemas de cotransporte movidos por gradientes de Na 1 ou H 1 Organismotecido tipo celular Soluto transportado movendose contra seu gradiente Soluto cotransportado movendose a favor de seu gradiente Tipo de transporte E Coli Lactose Prolina Ácidos dicar boxílicos H 1 H 1 H 1 Simporte Simporte Simporte Intestino rim vertebrados Glicose Aminoácidos Na 1 Na 1 Simporte Simporte Células de verte brados muitos tipos Ca 21 Na 1 Antiporte Plantas supe riores K 1 H 1 Antiporte Fungos Neuros pora K 1 H 1 Antiporte Lactose fora Transportador de lactose permease Bomba de próton inibida por CN2 Lactose dentro H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 a 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 Combustível CO2 Lactosedentro Tempo b Lactosemeio Transporte ativo 1 CN2 ou mutação em Glu325 ou Arg302 Efluxo Inibição da oxidação do combustível pelo CN2 FIGURA 1141 Captação de lactose na E coli a O transporte primário de H 1 para fora da célula impulsionado pela oxidação de uma grande varie dade de combustíveis estabelece tanto um gradiente de prótons quanto um gradiente elétrico negativo dentro através da membrana O transpor te ativo secundário de lactose para dentro da célula envolve o simporte de H 1 e de lactose pelo transportador de lactose A captação de lactose contra o seu gradiente é completamente dependente desse influxo de prótons impulsionado pelo gradiente eletroquímico b Quando as reações me tabólicas de oxidação produtoras de energia são bloqueadas pelo cianeto CN 2 o transportador de lactose permite o equilíbrio de lactose através da membrana via transporte passivo Mutações que afetam o Glu 325 ou a Arg 302 apresentam o mesmo efeito que o cianeto A linha pontilhada representa a concentração de lactose no meio circundante Nelson6ed11indd 416 Nelson6ed11indd 416 070414 1421 070414 1421 PRINCIPIOS DE BIOQUMICA DE LEHNINGER 417 fr if YY lay Ps TA Me 7 2 Citoplasma y Qa 2 SK e008 Pd Y 5 ih S teens rf iN Tanne S vd ie Sess Sape il i ps E vA Wi 7 ih iil Ay eg ik NV MEME IYO pep HAVE TITS NAV WN ea pe oe y IN I I I we WW SSS FQ TES Oe gt ae oO 7 Espaco ed Q a periplasmatico b FIGURA 1142 O transportador de lactose lactosepermease daF conformacao postulada do transportador PDB ID 2CEQ relacionada a pri coli a Representagao em forma de fita em uma visdo paralela ao plano meira por uma mudanga conformacional grande e reversivel na qual o sitio da membrana que mostra as 12 hélices transmembrana dispostas em dois de ligacao do substrato é exposto primeiro ao periplasma de onde a lactose dominios aproximadamente simétricos em diferentes tons de roxo Na for é captada e entao ao citoplasma para onde a lactose é liberada A intercon ma da proteina para a qual a estrutura cristalina foi determinada o substrato versdo entre as duas formas é conduzida por mudangas no pareamento de acucar em vermelho esta ligado préximo ao centro da membrana ondeo cadeias laterais carregadas protonaveis como as do Glu e da Arg em acucar esta exposto ao citoplasma derivado do PDB ID 1PV7b Asegunda verde o que é afetado pelo gradiente de prdétons transmembrana dos 417 residuos da proteina apenas 6 eram absolutamen des projecdes finas e longas da membrana plasmatica que te essenciais para o cotransporte de H e lactose alguns aumentam muito a drea da superficie exposta ao contetido para a ligagao da lactose outros para o transporte do pr6 intestinal Simportadores Naglicose na membrana ton A mutagao em qualquer um dos dois residuos Glu e plasmatica apical captam a glicose do intestino em um pro Arg Figura 1142 resulta em uma proteina ainda capaz cesso impulsionado pelo fluxo morro abaixo do Na de catalisar a difusao facilitada da lactose mas incapaz de acoplar o fluxo de H ao transporte de lactose morro aci 2Na fora BUCOSC or 2NA dentro BUCOSC dentro ma Um efeito semelhante é observado em células do tipo A energia requerida para esse Processo Se origina de duas selvagem néo mutadas quando sua capacidade de gerar fontes a concentragao de Na maior fora do que dentro 0 um gradiente de protons é bloqueada com CN o transpor Potencial quimico e o potencial de membrana elétrico tador faz difusao facilitada normalmente mas nio consegue que negativo dentro e portanto atrai Na para dentro bombear lactose contra o gradiente de concentracao Fi gura 1141b O equilibrio entre as duas conformagoes do PROBLEMARESOLVIDO 113 Energética do bombeamento pelo transportador de lactose é afetado por mudangas no parea simporte mento de carga entre as cadeias laterais de Glu e Arg Em células epiteliais do intestino a glicose e certos ami Calcule a razio maxima entre glicose dentro 8licose QUe noacidos sao acumulados por simporte com Na afavor pode ser conseguida pelo simportador de Naglicose da do gradiente de Na estabelecido pela NaKATPase da membrana plasméatica de uma célula epitelial quando Na membrana plasmatica Figura 1143 A superficie apical 12 mM a Na 145 mm o potencial de membrana da célula epitelial intestinal é coberta com microvilosida 6 50 mV negativo dentro e a temperatura é 37C Solugao Usando a Equacao 114 p 412 podemos calcular a energia inerente ao gradiente eletroquimico de Na isto Superficie apical Superficie basal é o custo para deslocar um fon Na contra o seu gradiente J Na Lumen 7 Sangue AG RT In NA Joo ZFAW intestinal ac Na Jaentro Substituise entao os valorespadrao de R T e J os valo Microvilosidades 2Kt res dados de Na expressos em concentracao molar 1 para Z porque o Na tem carga positiva e 0050 V para p Oo I eat Aw Observe que o potencial de membrana é 50 mV ne R a ss Cre t oA os gativo dentro e isso significa que quando o ion se desloca 2Na Ca NatKt de dentro para fora a mudanga no potencial é 50 mV 4 ATPase ort Glicose Ne Glicose O si Pe dor d FIGURA 1143 Transporte de glicose em células epiteliais do intes Simportaaia li co it tino A glicose é cotransportada com Na para dentro da célula epitelial de Na glicose y 2 Al através da membrana plasmatica apical Ela se desloca ao longo da célula impulsionasi hi eta i para a superficie basal onde passa para o sangue via GLUT2 um uniportador pela alta Na i BBOTTO albalxo passivo de glicose A NaKATPase continua a bombear Na para fora para extracelular manter 0 gradiente de Na que impulsiona a captacdo de glicose 418 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Quando o Na 1 entra novamente na célula ele libera o po tencial eletroquímico criado ao bombeálo para fora o DG para reentrada é 2112 kJmol de Na 1 Essa é a energia potencial por mol de Na 1 que está disponível para bombear a glicose Dado que dois íons Na 1 se deslocam para o interior da célula a favor de seus gradientes eletroquímicos para cada glicose transportada por simporte a energia disponível para bombear 1 mol de glicose é 2 3 112 kJmol 5 224 kJmol Agora é pos sível calcular a razão de concentração máxima de glicose que pode ser obtida por essa bomba a partir da Equação 113 p 411 dentro fora Rearranjando e substituindose os valores de DGt R e T obtémse dentro dentro fora fora glicose glicose glicose glicose Assim o cotransportador pode bombear glicose para den tro até que sua concentração no interior da célula epitelial seja aproximadamente 6000 vezes maior do que fora no intestino Essa é uma razão teórica máxima supondo um acoplamento perfeitamente eficiente de reentrada de Na 1 e de captação de glicose À medida que a glicose é bombeada do intestino para a célula epitelial na superfície apical ela é simultaneamente transferida da célula para o sangue por transporte passivo por meio do transportador de glicose GLUT2 na superfí cie basal Figura 1143 O papel crucial do Na 1 nos siste mas de simporte e antiporte como aqui citado requer um bombeamento constante de Na 1 para fora para manter o gradiente de Na 1 transmembrana Devido ao papel essencial dos gradientes iônicos no transporte ativo e na conservação de energia com postos que colapsam gradientes iônicos através da membra na são venenos efetivos e aqueles específicos para micror ganismos infecciosos podem servir como antibióticos Uma substância desse tipo é a valinomicina um pequeno peptí deo cíclico que neutraliza a carga do K 1 ao circundálo com seis oxigênios carbonílicos Figura 1144 O peptídeo hi drofóbico age então como lançadeira carregando o K 1 a favor de seu gradiente de concentração e reduzindo aquele gradiente Compostos que lançam íons através da membra na dessa forma são chamados de ionóforos transportado res de íons Tanto a valinomicina quanto a monensina um ionóforo carregador de Na 1 são antibióticos eles matam células microbianas por desacoplar o processo de transpor te ativo secundário das reações de conservação de energia A monensina é amplamente utilizada como agente antifún gico e antiparasitário As aquaporinas formam canais hidrofílicos transmembrana para a passagem de água Peter Agre Uma família de proteínas inte grais de membrana descoberta por Peter Agre as aquaporinas AQP provêm canais para movi mentos rápidos de moléculas de água através de todas as mem branas plasmáticas Aquaporinas são encontradas em todos os or ganismos e múltiplos genes de aquaporinas estão geralmente presentes codificando proteínas similares mas não idênticas Onze aquaporinas são conheci das em mamíferos cada uma com papel e localização específicos Tabela 115 Os eri trócitos que incham e murcham rapidamente em resposta a mudanças abruptas na osmolaridade extracelular à medi da que o sangue passa pela medula renal possuem uma alta densidade de aquaporinas em sua membrana plasmática 2 3 10 5 cópias de AQP1 por célula A secreção de água pelas glândulas exócrinas que produzem suor saliva e lágri mas ocorre por meio das aquaporinas Sete aquaporinas di ferentes exercem funções na produção de urina e na reten ção de água no néfron a unidade funcional do rim Cada AQP renal tem uma localização específica no néfron e cada uma tem propriedades e características regulatórias especí ficas Por exemplo a AQP2 nas células epiteliais dos ductos coletores renais é regulada pela vasopressina também cha mada de hormônio antidiurético mais água é reabsorvida K FIGURA 1144 Valinomicina peptídeo ionóforo que liga K 1 Nessa imagem o contorno da superfície aparece como um envelope amarelo atra vés do qual estão visíveis uma estrutura em bastões do peptídeo e um íon de K 1 em verde Os átomos de oxigênio em vermelho que ligam K 1 fazem parte de uma cavidade hidrofílica central Cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicos em amarelo cobrem o lado de fora da molécula Como o ex terior do complexo K 1valinomicina é hidrofóbico o complexo prontamente difundese através da membrana carregando o K 1 a favor de seu gradiente de concentração A dissipação do gradiente iônico transmembrana resul tante mata as células microbianas fazendo com que a valinomicina seja um antibiótico potente Nelson6ed11indd 418 Nelson6ed11indd 418 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 419 no rim quando os níveis de vasopressina estiverem altos Camundongos mutantes sem o gene da AQP1 apresentam uma eliminação urinária aumentada poliúria e uma capa cidade reduzida em concentrar a urina resultado da per meabilidade diminuída à água no túbulo proximal Em hu manos as AQP com defeitos genéticos são conhecidas por serem responsáveis por uma grande variedade de doenças incluindo uma forma relativamente rara de diabetes que é acompanhada por poliúria Quadro 111 Moléculas de água fluem por um canal de AQP1 a uma taxa aproximada de 10 9 s 21 Para comparação o mais alto número de renovação para uma enzima é o da catalase 4 3 10 7 s 21 e muitas enzimas têm números de renovação entre 1 s 21 e 10 4 s 21 ver Tabela 67 A baixa energia de ativação para a passagem de água pelos canais de aquaporina DG 15 kJmol sugere que a água deslocase pelos canais em um fluxo contínuo no sentido definido pelo gradiente osmótico Para uma discussão sobre osmose ver p 56 As aquaporinas não permitem a passagem de prótons íons hidrônio H3O 1 que poderiam colapsar os gradientes ele troquímicos da membrana Qual é a base dessa seletividade extraordinária Encontrase essa resposta na estrutura da AQP1 deter minada por cristalografia por raios X A AQP1 Figura 11 45a consiste em quatro monômeros idênticos cada um com Mr 5 28000 e cada um deles forma um poro trans membrana com um diâmetro suficiente para permitir a pas sagem de moléculas de água em fila única Cada monôme ro tem seis segmentos helicoidais transmembrana e duas hélices menores ambas contendo a sequência AsnProAla NPA As seis hélices transmembrana formam um poro ao longo do monômero e duas alças curtas contendo as se quências NPA se estendem a partir de lados opostos para o centro da bicamada Suas regiões NPA se sobrepõem no centro da membrana para formar parte do filtro de espe cificidade a estrutura que permite que apenas a água o atravesse Figura 1145b O canal de água se estreita até um diâmetro de 28 Å próximo ao centro da membrana restringindo severamente o tamanho das moléculas que podem passar por ali A carga positiva de um resíduo de Arg altamente conservado nesse afunilamento impede a passagem de cátions como o H3O 1 Os resíduos que revestem o canal de cada monômero de AQP1 geralmente são apolares mas oxigênios carbonílicos no esqueleto do peptídeo projetandose para a parte es treita do canal em intervalos podem fazer ligações de hi drogênio com moléculas de água individuais à medida que atravessam o canal os dois resíduos de Asn Asn 76 e Asn 192 nas alças NPA também formam ligações de hidrogênio com a água A estrutura do canal não possibilita a formação de uma cadeia de moléculas de água próxima o suficiente para permitir o salto de prótons ver Figura 214 que poderia efetivamente movimentar prótons através da membrana Resíduos críticos de Arg e His e dipolos elétricos formados pelas hélices curtas das alças NPA provêm cargas positivas que repelem quaisquer prótons que poderiam vazar pelo poro impedindo ligações de hidrogênio entre moléculas de água adjacentes TABELA 115 Características de permeabilidade e distribuição predominante de aquaporinas conhecidas de mamíferos Aquaporina Permeante permeabilidade Distribuição no tecido Distribuição subcelular AQP0 Água baixa Cristalino Membrana plasmática AQP1 Água alta Eritrócito rim pulmão endotélio vas cular cérebro olhos Membrana plasmática AQP2 Água alta Rim vaso deferente Membrana plasmática apical vesículas intracelulares AQP3 Água alta glicerol alta ureia mo derada Rim pele pulmão olhos colo Membrana plasmática basolateral AQP4 Água alta Cérebro músculo rim pulmão estô mago intestino delgado Membrana plasmática basolateral AQP5 Água alta Glândula salivar glândula lacrimal glândula sudorípara pulmão córnea Membrana plasmática apical AQP6 Água baixa ânions NO3 2 Cl 2 Rim Vesículas intracelulares AQP7 Água alta glicerol alta ureia alta Tecido adiposo rim testículo Membrana plasmática AQP8 Água alta Testículo rim fígado pâncreas intesti no delgado colo Membrana plasmática vesículas intra celulares AQP9 Água baixa glicerol alta ureia alta arsenito Fígado leucócito cérebro testículo Membrana plasmática AQP10 Água baixa glicerol alta ureia alta Intestino delgado Vesículas intracelulares Fonte Dados extraídos de King LS Kozono D Agre P 2004 From structure to disease the evolving tale of aquaporin biology Nat Rev Mol Cell Biol 5 688 Aquaporinas presentes principalmente na membrana apical ou basolateral estão indicadas como localizadas em uma dessas membranas aquelas presentes em ambas as membranas são descritas como localizadas na membrana plasmática AQP8 também poderia ser permeada pela ureia Nelson6ed11indd 419 Nelson6ed11indd 419 070414 1421 070414 1421 420 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Uma aquaporina isolada de espinafre é conhecida como portão aberto quando dois resíduos de Ser críticos pró ximos à extremidade intracelular do canal são fosforilados e fechado quando são desfosforilados Ambas as estruturas aberta e fechada foram determinadas por cristalografia A fosforilação favorece a conformação que pressiona dois re síduos de Leu próximos e um resíduo de His para o interior do canal bloqueando o movimento de água além daquele ponto e efetivamente fechando o canal Outras aquaporinas são reguladas de outras formas permitindo mudanças rápi das na permeabilidade da membrana à água Embora em geral altamente específicas para a água algu mas AQP também permitem a passagem de glicerol ou ureia em altas taxas Tabela 115 acreditase que essas AQP se jam importantes no metabolismo do glicerol A AQP7 por exemplo encontrada em membranas plasmáticas de adipó citos células de gordura transportam glicerol de maneira eficiente Camundongos com AQP7 defeituosa desenvolvem obesidade e diabetes não dependente de insulina presumi velmente como resultado de sua incapacidade de deslocar o glicerol para dentro ou para fora dos adipócitos à medida que os triacilgliceróis são convertidos em ácidos graxos livres e glicerol e que o glicerol é acilado a triacilglicerol Canais iônicos seletivos permitem o movimento rápido de íons através das membranas Canais iônicos seletivos primeiramente reconhecidos em neurônios estando também presentes na membrana plasmática de todas as células assim como nas membra nas intracelulares em eucariotos proporcionam outro mecanismo para deslocar íons inorgânicos através da mem brana Canais iônicos junto com as bombas iônicas como a Na 1K 1ATPase determinam a permeabilidade da mem brana plasmática a íons específicos e regulam a concen tração citosólica de íons e o potencial de membrana Em neurônios mudanças muito rápidas na atividade dos canais iônicos causam mudanças no potencial de membrana po tenciais de ação que carregam sinais de uma extremidade do neurônio para a outra Em miócitos a abertura rápida de canais de Ca 21 no retículo sarcoplasmático libera o Ca 21 que desencadeia a contração muscular As funções de sina lização de canais iônicos serão abordadas no Capítulo 12 Aqui será descrita a base estrutural para a função do canal iônico usando exemplos como o canal de K 1 controlado por voltagem o canal de Na 1 neuronal e o canal iônico receptor de acetilcolina Fora Dentro b a Repulsão eletrostática Arg195 His180 Asn192 Asn76 Restrição de tamanho Reorientação do dipolo da água FIGURA 1145 Aquaporina A proteína é um tetrâmero de subunidades idênticas cada qual com um poro transmembrana a Um monômero da aquaporina de espinafre SoPIP21 derivado do PDB ID 2B5F visto no plano da membrana As hélices formam um poro central e dois segmentos heli coidais curtos em verde contêm as sequências AsnProAla NPA encon tradas em todas as aquaporinas que formam parte do canal de água b Esse desenho de aquaporina 1 bovina derivado do PDB ID 1J4N mostra que o poro em marrom preenchido com moléculas de água mostradas em vermelho e branco se estreita em His 180 para um diâmetro de 28 Å aproximadamente o tamanho da molécula de água limitando a passa gem de moléculas maiores do que H2O A carga positiva de Arg 195 repele cátions incluindo o H3O 1 impedindo sua passagem pelo poro As duas hé lices curtas mostradas em verde estão orientadas com seus dipolos carre gados positivamente apontando para o poro de forma a forçar a molécula de água a se reorientar à medida que o atravessa isso quebra as cadeias de ligações de hidrogênio nas moléculas de água impedindo a passagem de prótons pelo salto de prótons Nelson6ed11indd 420 Nelson6ed11indd 420 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 421 ou picoampère usandose microeletrodos e amplificadores apropriados Na técnica de fixação de membrana patch clamping desenvolvida por Erwin Neher e Bert Sakmann em 1976 correntes muito pequenas são medidas através de uma região muito pequena da superfície da membrana con tendo apenas uma ou poucas moléculas de canais iônicos Figura 1146 O pesquisador pode medir a intensidade e a duração da corrente que flui durante uma abertura do canal iônico e pode determinar o quão frequente o canal se abre e como essa frequência pode ser afetada por potencial de membrana ligantes regulatórios toxinas e outros agen tes Estudos de fixação de membrana mostraram que uma quantia de 10 4 íons pode se deslocar por um único canal iô nico em 1 ms Tal fluxo iônico representa uma amplificação imensa do sinal inicial por exemplo apenas duas moléculas de acetilcolina são necessárias para abrir o canal receptor como descrito a seguir Erwin Neher Bert Sakmann Canais iônicos são distintos de transportadores iônicos em pelo menos três aspectos Primeiro a velocidade de flu xo pelos canais pode ser várias ordens de magnitude maior do que o número de renovação para o transportador 10 7 a 10 8 íonss para um canal iônico aproximandose do máxi mo teórico para difusão irrestrita Em contrapartida a ve locidade de renovação da Na 1K 1ATPase é de aproximada mente 100 s 21 Segundo canais iônicos não são saturáveis as velocidades não se aproximam de um máximo em con centração alta de substrato Terceiro eles são abertos em resposta a algum evento celular Em canais controlados por ligante geralmente oligoméricos a ligação de uma pequena molécula extracelular ou intracelular força uma transição alostérica na proteína que abre ou fecha o ca nal Em canais iônicos controlados por voltagem uma mudança no potencial elétrico transmembrana Vm causa uma movimentação no domínio da proteína carregada em relação à membrana abrindo ou fechando o canal Ambos os tipos de controles ou portões podem ser muito rápidos Um canal geralmente se abre em uma fração de milissegun do e pode permanecer aberto durante apenas milissegun dos tornando esses dispositivos moleculares efetivos para a transmissão muito rápida de sinal no sistema nervoso A função do canal iônico é medida eletricamente Como um único canal iônico permanece aberto durante apenas alguns poucos milissegundos monitorar esse pro cesso está além do limite da maioria das medidas bioquími cas Portanto fluxos iônicos devem ser medidos eletrica mente tanto como variações em Vm na faixa de milivolt quanto como corrente elétrica na faixa de microampère FIGURA 1146 Medida elétrica da função do canal iônico A atividade de um canal iônico é estimada por meio uma medida do fluxo de íons através do canal usandose a técnica de fixação de membrana Uma micropipeta é pressionada contra a superfície celular e uma pressão negativa aplicada na pipeta forma um se lamento por pressão entre a pipeta e a membrana À medida que a pipeta é puxada da célula ela puxa também um pedaço muito pequeno da membrana que pode conter um ou poucos canais iônicos Depois de colocar o pedaço da membrana mantido pela pipeta em solução aquosa o pesquisador pode medir a atividade do canal na forma de corrente elétrica que flui entre o conteúdo da pipeta e a solução aquosa Na prática um circuito é montado de for ma a fixar o potencial transmembrana em um determinado valor e então se mede a corrente que deve fluir para manter essa voltagem Com detectores de corrente altamente sensíveis os pesquisadores podem medir a corrente que flui por um único canal iônico geral mente de poucos picoampéres O traçado mostra a corrente através de um único canal receptor de acetilcolina em função do tempo em milissegundos revelando o quão rápido o canal abre e fecha o quão frequentemente ele se abre e por quanto tempo permanece aberto Deflexão para baixo representa abertura do canal Fixar o Vm em valores diferentes permite determinar o efeito do potencial de membrana sobre esses parâmetros da função do canal Equipamento eletrônico para manter o potencial de membrana Vm constante e medir a corrente fluindo através da membrana Micropipeta aplicada firmemente à membrana plasmática Pedaço da membrana retirado da célula Pedaço da membrana colocado em solução aquosa Canal Eletrodos Micropipeta Pedaço de membrana 2pA 50 ms Nelson6ed11indd 421 Nelson6ed11indd 421 070414 1421 070414 1421 422 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A estrutura do canal de K revelaa base de sua varios residuos de aminoacidos carregados negativamente sees que talvez aumentem a concentracaéo local de cations como especificidade K e Na O caminho iénico através da membrana inicia na ae Aestrutura do canal de potassio superficie interna como um canal largo preenchido com agua da bactéria Streptomyces livi no qual o fon retém a sua esfera de hidratacao A estabilizacdo dans determinada cristalogra posterior é fornecida pelas hélices curtas na regido do poro ficamente por Roderick Mackin de cada subunidade com as cargas negativas parciais de seus 4 non em 1998 fornece dipolos elétricos apontando para o K no canal Em cerca de me informagées importantes sobre dois tereos desse caminho através da membrana esse canal 4 como os canais idnicos funcio estreitase na regiao do filtro de seletividade forcando o fon x iE nam A sequéncia desse canal a abandonar suas moléculas de dgua de hidratacaio Atomos idnico de bactéria esta relacio de oxigénio carbonilicos no esqueleto do filtro de seletivida ee is nada com a de todos os outros de substituem as moléculas de Agua na esfera de hidratacao canais de potassio conhecidose formando uma série perfeita de camadas de coordenacéo serve como protétipo para tais pela qual o K se move Essa interacio favoravel com 0 filtro canais incluindo 0 canal de K nao é possivel para 0 Na j4 que ele é muito pequeno para Roderick MacKinnon controlado por voltagem de fazer contato com todos os possiveis ligantes de oxigénio A neurdnios Entre os membros estabilizacéio preferencial de K é a base para a seletividade dessa familia de proteinas as semelhangas nas sequéncias do filtro e mutacdes que alteram os residuos nessa parte da so maiores na regiao do poro que contém o filtro de seprotefna eliminam a seletividade idnica do canal Os sitios de letividade iénica que permite ao K raio de 133 A atra ligaco ao K do filtro sao flexiveis o suficiente para colapsar vessar 10 vezes mais prontamente do que 0 Na raio de 095 A a uma velocidade que se aproxima do limite te6 rico para difusdo livre em torno de 10 ionss O canal de K consiste em quatro subunidades idénticas que atravessam a membrana e formam um cone dentro de Esqueletos dos oxigénios um cone que circunda 0 canal idnico com a porao larga fi carbonilicos formam nal do cone duplo voltada para o lado extracelular Figura uma gaiola na qual o 1147a Cada subunidade tem duas hélices a transmembra K se encaixa Sitios alternados de Kt na assim como uma terceira hélice mais curta que contribui elouacdseiee ocupados em azul ou verde para a regiao do poro O cone externo é formado por uma das de hidratacdo hélices transmembrana de cada subunidade O cone interno Dipolo em formado pelas outras quatro hélices transmembrana circun hélice estabiliza da o canal idnico e cria o filtro de seletividade idnica Visto Fora N okt de forma perpendicular ao plano da membrana visualizase Q o canal central como amplo o suficiente para acomodar um at QQ L fC 4 Ay ion metalico nao hidratado como o potassio Figura 1147b ay eS spe as z Ay Tanto a especificidade idnica quanto o alto fluxo através Y NY do canal sao compreendidos a partir do que conhecemos da If CTT EV JA estrutura do canal Figura 1147c Nas superficiesinternae WT NUT S externa da membrana plasmatica aentrada paraocanaltem 6 ee A 7 Fora 2 Y wa el C o Q004 ue 00 Pr aD IDI Ne 1 9 a Mey Ai ai be Vestibulo grande WALA 1 6 ehin aa Il oa type preenchido com MND at g NTA a Be 5 Dentro agua permite a WAU ge ba 4 as hidratagao de K HIV WV A gl WD i h A Pa 0000 0006 BG Dentro T O e Kt com moléculas de agua de hidratacao a b c FIGURA1147 Ocanal de K de Streptomyces lividans PDBID 1BL8a as quatro subunidades dispostas ao redor de um canal central largo o suficien Visto do plano da membrana o canal consiste em oito hélices transmembrana te para um Unico fon K passar Diagrama de um canal de K em seccdo duas de cada uma das quatro subunidades idénticas formando um cone com transversal mostrando as caracteristicas estruturais criticas para a fungao Os sua parte final larga voltada para o espaco extracelular As hélices internas do oxigénios carbonilicos em vermelho no filtro de seletividade do esqueleto do cone com coloracdo mais suave revestem o canal transmembrana e as héli peptideo projetamse para o canal interagindo e estabilizando o fon K que ces externas interagem com a bicamada lipidica Segmentos curtos de cada passa por ali Esses ligantes estado perfeitamente posicionados para interagirem subunidade convergem na porcao final aberta do cone para formar um filtro de com cada um dos cada quatro fons de K mas nado com os fons menores de seletividade b Nesta visdo perpendicular ao plano da membrana aparecem Na Essa interacdo preferencial com o K é a base da seletividade idnica PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 423 de forma a acomodar qualquer Na 1 que entre no canal e essa mudança conformacional fecha o canal Há quatro sítios possíveis de ligação ao K 1 ao longo do filtro de seletividade cada um composto por uma gaiola de oxigênio que provê os ligantes para os íons K 1 Figura 1147c Na estrutura cristalina dois íons K 1 são visíveis dentro do filtro de seletividade distantes um do outro em cerca de 75 Å e duas moléculas de água ocupam as posições não preenchidas Íons K 1 passam pelo filtro em fila única a repulsão eletrostática mútua entre eles provavelmente equi libra a interação de cada íon com o filtro de seletividade e os mantém em movimento O movimento de dois íons K 1 é combinado primeiro eles ocupam as posições 1 e 3 e depois saltam para as posições 2 e 4 A diferença energética entre essas duas configurações 1 3 e 2 4 é muito pequena ener geticamente o poro de seletividade não é uma série de mor ros e vales mas uma superfície plana que é ideal para o mo vimento rápido do íon através do canal A estrutura do canal parece ter sido otimizada durante a evolução para proporcio nar velocidades máximas de fluxo e alta especificidade Canais de K 1 controlados por voltagem são estruturas mais complexas do que aquela ilustrada na Figura 1147 mas são variações do mesmo tema Por exemplo os ca nais de K 1 controlados por voltagem da família Shaker em mamíferos possuem um canal iônico semelhante ao canal bacteriano mostrado na Figura 1147 mas com um domínio proteico adicional sensível ao potencial de membrana que se move em resposta à mudança de potencial e ao se mo ver desencadeia a abertura ou o fechamento do canal de K 1 Figura 1148 A hélice transmembrana crítica no domí NH3 H3N S5 S5 S6 S6 S4 S4 S3 S3 S2 S2 S1 S1 COO2 2OOC S4 S5 S5 S4 S1S3 S1S3 S1S3 Sensor de voltagem Visão pela face interna K K K Aberto a c d b Fechado S6 S6 90 Fora Dentro K FIGURA 1148 Base estrutural para a abertura controlada por volta gem no canal de K 1 PDB ID 2A79 Essa estrutura cristalina do complexo da subunidade Kv12b2 do cérebro de rato mostra o canal de K 1 básico conforme o mostrado na Figura 1147 com a maquinaria extra necessária para tornar o canal sensível para abrir de acordo com o potencial de mem brana quatro extensões helicoidais transmembrana de cada subunidade e quatro subunidades b O complexo inteiro visto a no plano da membrana e b perpendicular ao plano observado de fora da membrana é representa do como na Figura 1147 com cada subunidade em uma cor diferente cada uma das quatro subunidades é colorida com a mesma cor da subunidade com a qual se associa Em b cada hélice transmembrana de uma subuni dade em vermelho é numerada de S1 a S6 S5 e S6 de cada uma das qua tro subunidades formam o canal propriamente dito e são comparáveis às duas hélices transmembrana de cada subunidade na Figura 1147 S1 a S4 são quatro hélices transmembrana A hélice S4 contém os resíduos de Arg altamente conservados e se acredita que seja a parte principal que se mo vimenta no mecanismo sensível à voltagem c Um diagrama esquemático do canal controlado por voltagem mostrando a estrutura básica do poro centro e as estruturas extras que tornam o canal sensível à voltagem a héli ce S4 que contém os resíduos de Arg está em cor de laranja Para maior cla reza as subunidades b não são mostradas nesta visualização Na membrana em repouso o potencial elétrico transmembrana negativo dentro exerce uma atração sobre as cadeias laterais das Arg carregadas positivamente em S4 em direção ao lado citosólico Quando a membrana é despolarizada a atração é reduzida e com a reversão completa do potencial de membrana S4 é empurrado em direção ao lado extracelular d Esse movimento de S4 está fisicamente acoplado à abertura e ao fechamento do canal de K 1 que está mostrado aqui em suas conformações aberta e fechada Embora o K 1 esteja presente no canal fechado o poro fecha na base próximo ao citosol impedindo a passagem de K 1 Nelson6ed11indd 423 Nelson6ed11indd 423 070414 1421 070414 1421 424 DAVID L NELSON MICHAEL M COX nio sensível à voltagem dos canais de K 1 de Shaker contém quatro resíduos de Arg as cargas positivas nesses resíduos fazem com que a hélice se mova em relação à membrana em resposta a mudanças no campo elétrico transmembrana o potencial de membrana As células também têm canais que conduzem especifi camente Na 1 ou Ca 21 e excluem K 1 Em cada caso a ca pacidade de diferenciar cátions requer tanto uma cavidade no sítio de ligação somente com o tamanho correto nem muito grande nem muito pequena para acomodar o íon quanto o posicionamento preciso dentro da cavidade dos oxigênios carbonílicos que podem substituir a camada de hidratação dos íons Esse ajuste pode ser conseguido com moléculas menores do que proteínas por exemplo a va linomicina Figura 1144 pode prover o encaixe preciso que dá alta especificidade para a ligação de um íon em vez de outro Os químicos têm projetado moléculas pequenas com especificidade muito alta para a ligação de Li 1 raio de 060 Å Na 1 raio de 095 Å K 1 raio de 133 Å ou Rb 1 raio de 148 Å As versões biológicas entretanto as proteínas de canais não apenas ligam especificamente mas conduzem íons através de membranas de uma forma controlada Canais iônicos dependentes de portão são fundamentais na função neuronal Praticamente toda a sinalização rápida entre neurônios e seus tecidosalvo como o músculo é mediada pela abertu ra e o fechamento rápido de canais iônicos nas membranas plasmáticas Por exemplo canais de Na 1 em membranas plasmáticas neuronais percebem o gradiente elétrico trans membrana e respondem a mudanças por abertura ou fecha mento Esses canais iônicos controlados por voltagem são geralmente muito seletivos para o Na 1 em relação a outros cátions mono ou divalentes por um fator de 100 ou mais e têm velocidades de fluxo muito altas 10 7 íonss Fe chados no estado de repouso os canais de Na 1 são abertos ativados pela redução do potencial de membrana eles sofrem então uma inativação muito rápida Alguns milisse gundos após a abertura um canal fecha e permanece inati vo por vários milissegundos A ativação seguida pela inati vação é a base da sinalização neuronal ver Figura 1226 Outro canal iônico muito bem estudado é o receptor nicotínico da acetilcolina que atua na passagem de um sinal elétrico de um neurônio motor para uma fibra mus cular na junção neuromuscular sinalizando para o mús culo contrair A acetilcolina liberada pelo neurônio motor difundese alguns poucos micrômetros para a membrana plasmática do miócito onde se liga a um receptor de acetil colina Isso força uma mudança conformacional no recep tor causando a abertura de seu canal iônico O movimento resultante de íons carregados positivamente para dentro do miócito despolariza a membrana plasmática e desencadeia a contração O receptor da acetilcolina permite ao Na 1 ao Ca 21 e ao K 1 atravessarem o canal com a mesma facilidade porém outros cátions e todos os ânions são incapazes de passar O movimento de Na 1 através do canal iônico recep tor da acetilcolina é insaturável sua velocidade é linear em relação à Na 1 extracelular e muito rápido aproximada mente 2 3 10 7 íonss em condições fisiológicas CH2 CH3 1N Acetilcolina O CH2 C CH3 CH3 O CH3 O canal receptor para a acetilcolina é típico entre mui tos outros canais iônicos que produzem ou respondem a si nais elétricos ele tem um portão que abre em resposta à estimulação por uma molécula sinalizadora e um mecanis mo temporizador intrínseco que fecha o portão após uma fração de segundo Assim o sinal da acetilcolina é transi tório característica essencial para a condução elétrica do sinal Com base em semelhanças entre as sequências de ami noácidos de outros canais iônicos controlados por ligante e o receptor da acetilcolina canais receptores neuronais que respondem às moléculas sinalizadoras extracelulares ácido γaminobutírico GABA glicina e serotonina são agrupa dos na superfamília do receptor da acetilcolina e provavel mente compartilham a estrutura tridimensional e os me canismos de portão Os receptores GABAA e da glicina são canais aniônicos específicos para ânions Cl 2 ou HCO3 2 ao passo que o receptor da serotonina assim como o receptor da acetilcolina é cátionespecífico Outra classe de canais iônicos controlados por ligante responde a ligantes intracelulares 35mononucleotídeo de guanosina cíclico cGMP no olho de vertebrado cGMP e cAMP em neurônios olfatórios e ATP e inositol 145tri fosfato IP3 em muitos tipos celulares Esses canais são compostos por subunidades múltiplas cada uma com seis domínios helicoidais transmembrana As funções de sinali zação desses canais iônicos serão discutidas no Capítulo 12 A Tabela 116 mostra alguns transportadores discutidos em outros capítulos no contexto das vias onde atuam Canais iônicos defeituosos podem ter consequências fisiológicas graves A importância de canais iônicos em processos fisioló gicos é claramente evidenciada a partir de efeitos de mutações em proteínas de canais iônicos específicos Tabe la 117 Quadro 112 Defeitos genéticos em canais de Na 1 controlados por voltagem da membrana plasmática de mió cito resultam em doenças em que os músculos são periodi camente paralisados como na paralisia periódica hiperca lêmica ou enrijecidos como na paramiotonia congênita A fibrose cística é o resultado de uma mutação que altera um aminoácido na proteína CFTR um canal iônico de Cl 2 o processo defeituoso aqui não está na neurotransmissão mas na secreção de varias células glandulares exócrinas com atividades vinculadas ao fluxo de íons Cl 2 Muitas toxinas que ocorrem naturalmente atuam em canais iônicos e a potência dessas toxinas ilustra a impor tância da função do canal iônico normal A tetrodotoxina produzida pelo baiacu Sphaeroides rubripes e a saxito xina produzida pelo dinoflagelado Gonyaulax que causa as marés vermelhas atuam ligandose aos canais de Na 1 com abertura de portão controlada por voltagem em neurô nios impedindo os potenciais de ação normais O baiacu é Nelson6ed11indd 424 Nelson6ed11indd 424 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 425 TABELA 116 Sistemas de transporte descritos em outros locais deste texto Sistema de transporte e local Figura Função Antiportador do nucleotídeo adenina na membrana inter na mitocondrial 1930 Importa ADP substrato para a fosforilação oxidativa e exporta ATP produto Receptorcanal de acetilcolina 1228 Sinaliza contração muscular Transportador de acilcarnitinacarnitina na membrana mitocondrial interna 176 Importa ácidos graxos para a matriz para oxidação b Simportador de PiH 1 na membrana mitocondrial interna 1930 Fornece Pi para a fosforilação oxidativa Transportador do malatoacetoglutarato na membrana mitocondrial interna 1931 Inicia o transporte de equivalentes redutores como ma lato da matriz para o citosol Transportador glutamatoaspartato da membrana mito condrial interna 1931 Completa o transporte iniciado pela lançadeira malatoa cetoglutarato Transportador de citrato na membrana mitocondrial interna 2110 Provê citrato citosólico como fonte de acetilCoA para síntese de lipídeos Transportador de piruvato na membrana mitocondrial interna 2110 É parte do mecanismo de transporte do citrato da matriz para o citosol Transportador de ácidos graxos na membrana plasmática de miócito 173 Importa ácidos graxos para combustível Transportadores de prótons dos complexos I III e IV na membrana mitocondrial interna 1916 Atuam como mecanismos de conservação de energia na fosforilação oxidativa convertendo fluxo de elétrons em gradiente de prótons Termogenina proteína 1 desacopladora um poro de prótons na membrana mitocondrial interna 1936 2334 Permite a dissipação do gradiente de prótons na mito côndria como forma de termogênese eou eliminação de excesso de combustível Complexo citocromo bf um transportador de próton da membrana tilacoide do cloroplasto 1961 Atua como bomba de prótons movida pelo fluxo de elé trons pelo esquema Z fonte de gradiente de prótons para a síntese de ATP na fotossíntese Bacteriorrodopsina uma bomba de prótons impulsionada pela luz 1969 É uma fonte de gradiente de prótons impulsionada pela luz para a síntese de ATP em bactérias halofílicas ATPase FoF1 ATPsintase na membrana mitocondrial interna tilacoide do cloroplasto e membrana plasmática bacteriana 1925 1962a 1966 Interconversão de energia do gradiente de prótons e do ATP durante a fosforilação oxidativa e fotofosforilação Antiportador Pitriosefosfato na membrana interna de cloroplasto 2015 2016 Exporta produto fotossintético do estroma importa Pi para a síntese de ATP Transportador de proteína bacteriana 2744 Exporta proteínas secretadas através da membrana plas mática Trasladase proteica do RE 2738 Transporta proteínas para o RE com destino à membrana plasmática secreção ou organelas Trasladase proteica no poro nuclear 2742 Permuta proteínas entre o núcleo e o citoplasma Receptor LDL em membrana plasmática celular animal 2141 Importa por endocitose mediada por receptor partículas que carregam lipídeo Transportador de glicose de membrana plasmática da célula animal regulado pela insulina 1216 Aumenta a capacidade do tecido muscular e adiposo na captação de excesso de glicose a partir do sangue Canal de Ca 21 controlado por IP3 no RE 1210 Permite a sinalização via alteração de Ca 21 citosólico Canal de Ca 21 controlado por cGMP dos cones e bastone tes da retina 1237 Permite a sinalização via rodopsina ligada a fosfodiestera se dependente de cAMP em olho de vertebrados Canal de Na 1 controlado por voltagem 1226 Cria potenciais de ação na transmissão neuronal de sinal Nelson6ed11indd 425 Nelson6ed11indd 425 070414 1421 070414 1421 426 DAVID L NELSON MICHAEL M COX um ingrediente da iguaria japonesa fugu que pode ser pre parada apenas por cozinheiros especialmente treinados para separar o petisco suculento do veneno mortal Ingerir um marisco que tenha se alimentado de Gonyaulax também pode ser fatal os mariscos não são sensíveis à saxitoxina mas ela se concentra em seus músculos o que os torna al tamente venenosos a organismos mais elevados na cadeia alimentar O veneno da serpente mamba preta contém den drotoxina que interfere com os canais de K 1 controlados por voltagem A tubocurarina o componente ativo do cura re usado como veneno em flechas na região amazônica e duas outras toxinas de venenos de serpentes a cobrotoxina e a bungarotoxina bloqueiam o receptor da acetilcolina ou impedem a abertura de seu canal iônico Todas essas toxinas causam paralisia e possivelmente a morte pelo bloqueio de sinais dos nervos para os músculos Olhando pelo lado oti mista a afinidade extremamente alta da bungarotoxina pelo receptor da acetilcolina Kd 5 10 215 M tem se mostrado útil experimentalmente a toxina radiomarcada foi usada para quantificar o receptor durante sua purificação RESUMO 113 Transporte de solutos através da membrana c O movimento de compostos polares e de íons através de membranas biológicas requer proteínas transporta doras Alguns transportadores simplesmente facilitam a difusão passiva através da membrana a partir de um lado com concentração mais alta para o lado com con centração mais baixa Outros transportam solutos con tra o gradiente eletroquímico isso requer uma fonte de energia metabólica c Os carreadores da mesma forma que as enzimas apre sentam saturação e estereoespecificidade para seus substratos O transporte via tais sistemas pode ser passivo ou ativo O transporte ativo primário é movido por ATP ou por reações de transferência de elétrons o transporte ativo secundário é movido pelo fluxo aco plado de dois solutos um dos quais geralmente H 1 ou Na 1 flui a favor de seu gradiente eletroquímico en quanto o outro é levado contra o seu gradiente c Os transportadores GLUT como o GLUT1 de eritrócitos carregam glicose para as células por difusão facilitada Esses transportadores são uniportadores carregando apenas um substrato Simportadores permitem a passa gem simultânea de duas substâncias no mesmo sentido Exemplos o transportador de lactose da E coli movi do pela energia de um gradiente de prótons simporte lactoseH 1 e o transportador de glicose das células epiteliais no intestino impulsionado pelo gradiente de Na 1 simporte glicoseNa 1 Antiportadores controlam a passagem simultânea de duas substâncias em sentidos opostos exemplos são o trocador de cloretobicarbona to em eritrócitos e a Na 1K 1ATPase ubíqua c Em células animais a Na 1K 1ATPase mantém as dife renças nas concentrações extracelular e citosólica de Na 1 e K 1 e o gradiente resultante de Na 1 é usado como fonte de energia para uma variedade de processos de transporte ativo secundário c A Na 1K 1ATPase da membrana plasmática e os trans portadores de Ca 21 dos retículos sarcoplasmático e endoplasmático as bombas SERCA são exemplos de ATPases do tipo P elas sofrem fosforilação reversível durante o seu ciclo catalítico Bombas de próton ATPa ses do tipo F ATPsintases são fundamentais nos me canismos de conservação de energia em mitocôndrias e cloroplastos ATPases do tipo V produzem gradientes de prótons através de algumas membranas intracelulares incluindo membranas vacuolares de plantas c Transportadores ABC carregam uma grande variedade de substratos incluindo muitos fármacos para fora das células usando ATP como fonte de energia c Ionóforos são moléculas solúveis em lipídeos que ligam íons específicos e os carregam passivamente através de TABELA 117 Algumas doenças resultantes de defeitos em canais iônicos Canal iônico Gene afetado Doença Na 1 portão controlado por voltagem músculo esquelético SCN4A Paralisia periódica hipercalêmica ou paramiotonia congênita Na 1 portão controlado por voltagem neuronal SCN1A Epilepsia generalizada com convulsões febris Na 1 portão controlado por voltagem músculo cardíaco SCN5A Síndrome 3 do QT longo Ca 21 neuronal CACNA1A Enxaqueca hemiplégica familiar Ca 21 portão controlado por voltagem retina CACNA1F Cegueira noturna estacionária congênita Ca 21 policistina1 PKD1 Doença renal policística K 1 neuronal KCNQ4 Surdez dominante K 1 portão controlado por voltagem neuronal KCNQ2 Convulsões neonatais familiares benignas Cátion não específico portão controlado por cGMP retinal CNCG1 Retinite pigmentosa Receptor de acetilcolina músculo esquelético CHRNA1 Síndrome miastênica congênita Cl 2 CFTR Fibrose cística Nelson6ed11indd 426 Nelson6ed11indd 426 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 427 membranas dissipando a energia dos gradientes eletro químicos c A água atravessa a membrana pelas aquaporinas Algu mas aquaporinas são reguladas algumas também trans portam glicerol ou ureia c Canais iônicos provêm poros hidrofílicos pelos quais íons selecionados podem se difundir diminuindo seus gradientes elétricos ou químicos eles têm a caracte rística de serem insaturáveis têm velocidades de fluxo muito altas e são altamente específicos para um deter minado íon A maioria funciona com portão controla do por voltagem ou ligante O canal de Na 1 neuronal é controlado por voltagem e o canal iônico receptor de acetilcolina é controlado por esse neurotransmissor o qual desencadeia mudanças conformacionais que abrem e fecham o caminho transmembrana Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário modelo do mosaico fluido 387 micela 387 bicamada 387 vesícula 388 proteínas integrais de membrana 389 proteínas periféricas de membrana 389 proteínas anfitrópicas 390 lipídeo anelar 391 índice de hidropatia 392 regra do positivodentro 393 barril b 393 porina 393 estado líquido desordenado Ld 395 estado líquido ordenado Lo 395 flipases 396 flopases 397 flipflopases 397 FRAP 398 microdomínios 398 balsas 399 proteína ancorada por GPI 399 caveolina 399 cavéola 399 domínio BAR 400 proteína de fusão 400 vSNARE 401 tSNARE 401 selectinas 402 difusão simples 403 potencial de membrana Vm 403 gradiente eletroquímico 403 potencial eletroquímico 403 difusão facilitada 403 transporte passivo 404 transportadores 404 permeases 404 canais 404 Kt Ktransporte 406 eletroneutro 409 sistemas de cotransporte 409 antiporte 409 simporte 409 uniporte 409 transporte ativo 409 eletrogênico 410 ATPases do tipo P 410 bomba SERCA 410 Na 1K 1ATPase 411 ATPases do tipo V 412 ATPases do tipo F 412 ATPsintase 413 transportadores ABC 413 transportadores multifármacos 413 transportador de lactose 416 superfamília facilitadora principal SFP 416 simportadores Na 1 glicose 417 ionóforo 418 aquaporinas AQP 418 canal iônico seletivo 420 canais controlados por ligante 421 canais iônicos controlados por voltagem 421 fixação de membrana 421 receptor nicotínico de acetilcolina 424 Leituras adicionais Composição e arquitetura de membranas Dowhan W 1997 Molecular basis for membrane phospholipids diversity why are there so many lipids Annu Rev Biochem 66 199232 Ediden M 2002 Lipids on the frontier a century of cellmembrane bilayers Nat Rev Mol Cell Biol 4 414418 Pequena revisão de como a noção da bicamada lipídica da membrana foi desenvolvida e confirmada Leventis PA Grinstein S 2010 The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes Annu Rev Biophys 39 407427 Maxfield RR van Meer G 2010 Cholesterol the central lipid of mammalian cells Curr Opin Cell Biol 22 422429 Von Heijne G 2006 Membrane protein topology Nat Rev Mol Cell Biol 7 909918 White SH Ladokhin AS Jayasinghe S Hristova K 2001 How membranes shape protein structure J Biol Chem 276 3239532398 Breve revisão de nível intermediário sobre as forças que moldam as hélices transmembrana Wimley WC 2003 The versatile b barrel membrane protein Curr Opin Struct Biol 13 18 Revisão de nível intermediário Zeh K Thein M 2010 Porins in prokaryotes and eukaryotes common themes and variations Biochem J 431 1322 Revisão de nível intermediário das porinas barril b Dinâmica da membrana Daleke DL 2007 Phospholipid flippases J Biol Chem 282 821825 Revisão de nível intermediário Deveaux PF LopezMontero I Bryde S 2006 Proteins involved in lipid translocation in eukaryotic cells Chem Phys Lipids 141 119132 Didier M Lenne PF Rigneault H He HT 2006 Dynamics in the plasma membrane how to combine fluidity and order Embo J 25 34463457 Revisão de nível intermediário sobre estudos de dinâmica de membrana com sondas fluorescentes e outras sondas Frost A Unger VM De Camilli P 2009 The BAR domain superfamily membranemolding macromolecules Cell 137 191196 Frye LD Ediden M 1970 The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mousehuman heterokaryons J Cell Sci 7 319335 Demonstração clássica da mobilidade das proteínas de membrana Graham TR 2004 Flippases and vesiclemediated protein transport Trends Cell Biol 14 670677 Revisão de nível intermediário da função da flipase Graham TR Kozlov MM 2010 Interplay of proteins and lipids in generating membrane curvature Curr Opin Cell Biol 22 430436 Hannich JT Umebayashi K Riezman H 2011 Distribution and function of sterols and sphingolipids In The Biology of Lipids Trafficking Regulation and Function Simons K ed Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor NY also in CSH Perspect Cell Biol doi101101 cshperspecta004762 Nelson6ed11indd 427 Nelson6ed11indd 427 070414 1421 070414 1421 428 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Jahn R Scheller RH 2006 SNAREs engines for membrane fusion Nat Rev Cell Mol Biol 7 631643 Excelente revisão de nível intermediário do papel das SNARE na fusão de membrana e do mecanismo de fusão propriamente dito Janmey PA Kunnunen PKJ 2006 Biophysical properties of lipids and dynamic membranes Trends Cell Biol 16 538546 Leventis PA Grinstein S 2010 The distrbution and function of phosphatidylserine in cellular membranes Annu Rev Biophys 39 407427 Revisão avançada que inclui discussão sobre flipases Lingwood D Simons K 2010 Lipid rafts as a membrane organizing principle Science 327 4650 MacCallum JL Tieleman DP 2011 Hydrophobicity scales a thermodynamic looking glass into lipidprotein interactions Trends Biochem Sci 36 653662 Revisão de nível intermediário sobre vários métodos de determinação da hidrofobicidade de aminoácidos Marguet D Lenne PF Rigneault H He HT 2006 Dynamics in the plasma membrane how to combine fluidity and order EMBO J 25 34463457 Revisão de nível intermediário dos métodos e resultados de estudos sobre movimentos moleculares na membrana Martens S McMahon HT 2008 Mechanisms of membrane fusion disparate players and common principles Nat Rev Mol Cell Biol 9 543566 Niessen CM Leckband D Yap AS 2011 Tissue organization by cadherin adhesion molecules dynamic molecular and cellular mechanisms of morphogenetic regulation Physiol Rev 91 691731 Palmgren MG Nissen P 2011 Ptypes ATPases Annu Rev Biophys 40 243266 Revisão avançada de transportadores que incluem flipases do tipo P4 Palsdottir H Hunte C 2004 Lipids in membrane protein structures Biochim Biophys Acta 1666 218 Parton RG Simons K 2007 The multiple faces of caveolae Nat Rev Cell Mol Biol 8 185194 Phillips R Ursel T Wiggins P Sens P 2009 Emerging roles for lipids in shaping membraneprotein function Nature 459 379385 Revisão de nível intermediário Qualman B Koch D Kessels MM 2011 Lets go bananas revisiting the endocytic BAR code EMBO J 30 35013515 Revisão de nível intermediário sobre a ação dos domínios BAR em causar curvatura na membrana Quinn PJ Wolf C 2009 The liquid ordered phase in membranes Biochim Biophys Acta 1788 3346 Revisão avançada sobre o estado dos lipídeos de membrana Essa é uma entre as 26 revisões excelentes que aparecem nessa edição da revista sobre todos os aspectos do estado dos lipídeos em membranas biológicas Sanyal S Menson AK 2009 Flipping lipids why an whats the reason for ACS Chem Biol 4 895909 Revisão de nível intermediário sobre flipases em biogênese da membrana Sezgin E Schwille P 2011 Fluorescence technique to study lipid dynamics In The Biology of Lipids Trafficking Regulation and Function Simons K ed Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor NY also in CSH Perspect Cell Biol doi101101 cshperspecta009803 Simons K Sampaio JL 2011 Membrane organization and lipid rafts In The Biology of Lipids Trafficking Regulation and Function Simons K ed Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor NY also in CSH Perspect Cell Biol doi101101 cshperspect a004697 Tanaka K FujimuraKamada K Yamamoto T 2011 Functions of phospholipids flippases J Biochem 149 131143 Revisão de nível intermediário sobre a estrutura e função da flipase van der Velden LM van de Graaf SFJ Klomp LWJ 2010 Biochemical and cellular functions of P4 ATPases Biochem J 431 111 Revisão de nível intermediário sobre as flipases P4ATPase van Deurs B Roepstorff K Hommelgaard AM Sandpit K 2003 Caveolae anchored multifunctional platforms in the lipid ocean Trends Cell Biol 13 92100 van Meer G 2011 Dynamic transbilayer lipid assymetry In The Biology of Lipids Trafficking Regulation and Function Simons K ed Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor NY also in CSH Perspect Cell Biol doi101101cshperspect a004671 Wickner W Shekmana R 2010 Membrane fusion Nat Struct Mol Biol 15 658664 Revisão breve e acessível das moléculas envolvidas na fusão de membrana Zhang YM Rock CO 2008 Membrane lipid homeostasis in bacteria Nat Rev Microbiol 6 222233 Zimmerberg J Kozlov MM 2006 How proteins produce cellular membrane curvature Nat Rev Cell Mol Biol 7 919 Transportadores Augustin R 2010 The protein family of glucose transport facilitators its not only about glucose after all IUBMB Life 62 315333 Revisão avançada sobre a estrutura e função das proteínas GLUT Brini M Carafoli E 2009 Calcium pumps in health and disease Physiol Rev 89 13411378 Bublitz M Poulson H Preben Morth J Nissen P 2010 In and out of the cation pumps Ptype ATPase structure revisited Curr Opin Struct Biol 20 431439 Bublitz M Preben Morth J Nissen P 2011 Ptype ATPases at a glance J Cell Sci 124 25152519 Fujiyoshi Y Mitsuoka K de Groot BL Philippsen A Grubmuller H Agre P Engel A 2002 Structure and function of water channels Curr Opin Struct Biol 12 509515 Guan L Kaback HR 2006 Lessons from lactose permease Annu Rev Biophys Biomol Struct 35 6791 Hoffman NJ Elmendorf JS 2011 Signaling cytoskeletal and membrane mechanisms regulating GLUT4 exocytosis Trends Endocrinol Metab 22 110116 Jones PM OMara ML George AM 2001 ABC transporters a riddle wrapped in a mystery inside an enigma Trends Biochem Sci 34 520531 Revisão de nível intermediário da estrutura e função do transportador de ATP Kjellbom P Larsson C Johansson I Karlsson M Johanson U 1999 Aquaporins and water homeostasis in plants Trends Plant Sci 4 308314 Revisão de nível intermediário Preben Morth J Pedersen B BuchPedersen MJ Andersen JP Vilsen B Palmgren MG Nissen P 2011 Nelson6ed11indd 428 Nelson6ed11indd 428 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 429 A structural overview of the plasma membrane Na 1K 1ATPase and H 1 ATPase íon pumps Nat Rev Mol Cell Biol 12 6070 Rees DC Johnson E Lewinson O 2009 ABC transporters the power to change Nat Rev Mol Cell Biol 10 218227 Sui H Han BG Lee JK Walian P Jap B K 2001 Structural basis of waterspecific transport through the AQP1 water channel Nature 414 872878 Solução com alta resolução da estrutura da aquaporina por cristalografia por raios X Thorens B Mueckler M 2010 Glucose transporters in the 21st century Am J Physiol Endocrinol Metab 298 E141E145 Revisão de nível intermediário dos facilitadores de glicose Toyoshima C Mizutani T 2004 Crystal structure of the calcium pump with a bound ATP analogue Nature 430 529535 Toyoshima C Nomura H Tsuda T 2004 Lumenal gating mechanism revealed in calcium pump crystal structures with phosphate analogs Nature 432 361368 Os materiais suplementares disponíveis junto com a versão desse artigo incluem um filme excelente do suposto mecanismo de portão Watson RT Pessin JE 2006 Bridging the GAP between insulin signaling and GLUT4 translocation Trends Biochem Sci 31 215222 Revisão de nível intermediário da regulação do transporte de glicose através do GLUT4 Wright EM Loo DDF Hirayama BA 2011 Biology of human sodium glucose transporters Physiol Rev 91 733794 Revisão avançada da bioquímica e fisiologia dos cotransportadores de Na 1glicose Zeth K Thein M 2010 Porins in prokaryotes and eukaryotes common themes and variations Biochem J 431 1322 Canais iônicos Ashcroft FM 2006 From molecule to malady Nature 440 440447 Pequena revisão de muitos casos conhecidos nos quais os defeitos genéticos em canais iônicos levam a doenças em humanos Doyle DA Cabral KM Pfuetzner RA Kuo A Gulbis JM Cohen SL Chait BT MacKinnon R 1998 The structure of the potassium channel molecular basis of K 1 conduction and selectivity Science 280 6977 A primeira estrutura cristalina de um canal iônico é descrita Gadsby DC Vergani P Csanady L 2006 The ABC protein turned chloride channel whose failure causes cystic fibrosis Nature 440 477483 Essa é uma entre as sete excelentes revisões de canais iônicos publicada nessa edição da Nature Gouaux E MacKinnon R 2005 Principles of selective íon transport in channels and pumps Science 310 14611465 Pequena revisão de características arquitetônicas de canais e bombas que dão a cada proteína a sua especificidade iônica Guggino WB Stanton BA 2006 New insights into cystic fibrosis molecular switches that regulate CFTR Nat Rev Mol Cell Biol 7 426436 Hille B 2001 Icn channels of Excitable Membranes 3rd edn Sinauer Associates Sunderland MA Texto de nível intermediário enfatizando a função dos canais iônicos Jiang Y Lee A Chen J Ruta V Cadene M Chait BT MacKinnon R 2003 Xray structure of a voltagedependent K 1 channel Nature 423 3341 King LS Kozono D Agre P 2004 From structure to disease the evolving tale of aquaporin biology Nat Rev Cell Mol Biol 5 687698 Revisão de nível intermediário da localização das aquaporinas nos tecidos de mamíferos e dos impactos dos defeitos das aquaporinas na fisiologia Lee AG East JM 2001 What the structure of a calcium pump tell us about its mechanism Biochem J 356 665683 Long SB Campbell EB MacKinnon R 2005 Crystal structure of a mammalian voltagedependent Shaker family K 1 channel Science 309 897902 Neher E Sakmann B 1992 The patch clamp technique Sci Am March 266 4451 Descrição clara dos métodos eletrofisiológicos usados para medir a atividade de um único canal iônico pelos vencedores do Prêmio Nobel que desenvolveram essa técnica Tombola F Pathak MM Isacoff EY 2006 How does voltage open an íon channel Annu Rev Cell Dev Biol 22 2352 Revisão avançada dos mecanismos de portão controlado por voltagem dos canais iônicos Verkman AS 2011 Aquaporins at a glance J Cell Sci 124 2107 2112 Revisão de nível intermediário em estilo pôster da estrutura e função da aquaporina Problemas 1 Determinando a área de secção transversal de uma molécula lipídica Quando fosfolipídeos são dispostos sua vemente na superfície da água eles se orientam na interface arágua com seus grupos polares na água e suas caudas hi drofóbicas no ar Um dispositivo experimental a foi criado de forma a reduzir a área da superfície disponível para uma camada de lipídeos Medindose a força necessária para agru par os lipídeos é possível determinar quando as moléculas estão compactadas firmemente em uma monocamada contí nua ao se aproximar dessa área a força necessária para uma posterior redução da área da superfície aumenta repentina mente b Como você usaria esse dispositivo para determi nar a área média ocupada por uma única molécula lipídica na monocamada Força dinacm Força aplicada aqui para comprimir a monocamada a b Área nm 2molécula 10 20 30 40 02 06 10 14 Nelson6ed11indd 429 Nelson6ed11indd 429 070414 1421 070414 1421 430 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 2 Evidência de uma bicamada lipídica Em 1925 E Gorter e F Grendel usaram um dispositivo como o descrito no Problema 1 para determinar a área da superfície de uma mo nocamada lipídica formada pelos lipídeos extraídos de eritró citos de várias espécies de animais Usaram um microscópio para medir as dimensões das células individuais e a partir daí calcularam a média da área da superfície de um eritrócito Ob tiveram os dados mostrados na tabela É justificada a conclu são desses investigadores de que os cromócitos eritrócitos estão cobertos por uma camada de substâncias gordurosas com espessura correspondente a duas moléculas ou seja a bicamada lipídica Animal Volume de células empacotadas mL Número de células por mm 3 Área total da superfície da monocamada lipídica das células m 2 Área total da superfície de uma célula mm 2 Cachorro 40 8000000 62 98 Ovelha 10 9900000 60 298 Homem 1 4740000 092 994 Fonte Dados obtidos de Gorter E Grendel F 1925 On bimolecular layers of lipoids on the chromocytes of the blood J Exp Med 41 439443 3 Número de moléculas de detergente por micela Quando uma pequena quantidade do detergente dodecil sulfa to de sódio SDS Na 1CH3CH211OSO3 2 é dissolvida em água os íons do detergente entram na solução como espécies mo noméricas À medida que mais detergente é adicionado uma concentração é alcançada concentração micelar crítica na qual os monômeros se associam para formarem micelas A con centração micelar crítica de SDS é 82 mM As micelas têm uma massa média de partícula a soma das massas moleculares dos monômeros constituintes de 18000 Calcule o número de mo léculas do detergente na micela média 4 Propriedades dos lipídeos e das bicamadas lipídi cas Bicamadas lipídicas formadas entre duas fases aquosas têm essa propriedade importante elas formam lâminas bidi mensionais a borda de cada uma se fecha sobre a outra e elas sofrem autosselamento para formar vesículas lipossomos a Que propriedades dos lipídeos são responsáveis por essa propriedade das bicamadas Explique b Quais são as consequências dessa propriedade para a estrutura de membranas biológicas 5 Comprimento da molécula de ácido graxo A distância na ligação carbonocarbono para carbonos em ligação simples como em uma cadeia acil graxa saturada é de cerca de 15 Å Es time o comprimento de uma única molécula de palmitato na sua forma completamente estendida Se duas moléculas de palmita to forem colocadas alinhadas e com as extremidades em contato como o seu comprimento total poderia se comparar com a espes sura da bicamada lipídica em uma membrana biológica 6 Dependência da temperatura na difusão lateral O experimento descrito na Figura 1118 foi realizado a 37ºC Se o experimento tivesse ocorrido a 10ºC que efeito você esperaria na taxa de difusão Por quê 7 Síntese de suco gástrico energética O suco gástri co pH 15 é produzido pelo bombeamento de HCl do plasma sanguíneo pH 74 para o estômago Calcule a quantidade de energia livre requerida para concentrar o H 1 em 1 L de suco gástrico a 37ºC Nas condições celulares quantos moles de ATP devem ser hidrolisados para prover essa quantidade de energia livre A variação na energia livre da hidrólise de ATP em condições celulares é de aproximadamente 258 kJmol como explicado no Capítulo 13 Ignore os efeitos do poten cial elétrico transmembrana 8 Energética da Na 1K 1ATPase Dada uma célula de ver tebrado típica com potencial de membrana de 20070 V nega tivo dentro qual é a variação na energia livre para transportar 1 mol de Na 1 da célula para o sangue a 37 ºC Suponha que a concentração de Na 1 dentro da célula seja de 12 mM e que no plasma sanguíneo seja de 145 mM 9 Ação da ouabaína no tecido renal A ouabaína inibe especificamente a atividade da Na 1K 1ATPase de tecidos ani mais mas não se sabe quanto à inibição de qualquer outra en zima Quando a ouabaína é adicionada a fatias finas de tecido renal vivo ela inibe o consumo de oxigênio em 66 Por quê O que essa observação nos diz sobre o uso de energia respira tória pelo tecido renal 10 Energética do simporte Suponha que você tenha determinado experimentalmente que o sistema de transporte celular para a glicose conduzido pelo simporte de Na 1 possa acumular glicose até atingir concentrações 25 vezes maiores do que aquela do meio externo quando a Na 1 externa era apenas 10 vezes maior do que a Na 1 no meio intracelular Isso violaria as leis da termodinâmica Se não como você explicaria essa observação 11 Localização de uma proteína de membrana As se guintes observações se referem a uma proteína de membrana desconhecida X Ela pode ser extraída a partir da ruptura de membranas de eritrócitos em uma solução salina concentrada podendo ser hidrolisada em fragmentos por enzimas proteolí ticas O tratamento de eritrócitos com enzimas proteolíticas seguido pela ruptura e a extração dos componentes da mem brana produz uma X intacta Entretanto o tratamento de fan tasmas de eritrócitos que consistem em apenas membranas plasmáticas produzidas pela ruptura de células e a remoção da hemoglobina com enzimas proteolíticas seguido pela ruptu ra e a extração produz X extensivamente fragmentada O que essas observações indicam sobre a localização de X na mem brana As propriedades de X se parecem com as das proteínas integrais de membrana ou com as periféricas 12 Autosselamento da membrana Membranas celula res são autosselantes se elas forem perfuradas ou rompidas mecanicamente elas resselam rápida e automaticamente Que propriedades da membrana são responsáveis por essa caracte rística importante 13 Temperatura de fusão de lipídeos Lipídeos de mem brana em amostras de tecidos obtidos de diferentes partes da perna de um veado apresentam diferentes composições de áci dos graxos Os lipídeos de membrana de tecido próximo aos cascos contêm uma proporção maior de ácidos graxos insa turados do que aqueles de tecido da parte superior da perna Qual é o significado dessa observação 14 Difusão flipflop A lâmina interna monocamada da membrana de eritrócito humano consiste predominantemente em fosfatidiletanolamina e fosfatidilserina A lâmina externa consiste predominantemente em fosfatidilcolina e esfingomie lina Embora os componentes fosfolipídicos da membrana pos sam difundir na bicamada fluida essa lateralidade é sempre preservada Como Nelson6ed11indd 430 Nelson6ed11indd 430 070414 1421 070414 1421 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 431 15 Permeabilidade da membrana Em pH 7 o triptofano atravessa a bicamada lipídica com cerca de um milésimo da taxa do indol um composto estreitamente relacionado N H Sugira uma explicação para essa observação 16 Fluxo de água através de uma aquaporina Um eri trócito humano tem aproximadamente 2 3 10 5 monômeros de AQP1 Se moléculas de água fluírem através da membrana a uma taxa de 5 3 10 8 por tetrâmero de AQP1 por segundo e o volume de um eritrócito for 5 3 10 211 mL o quão rapidamente poderia um eritrócito reduzir seu volume à metade como encon trado em alta osmolaridade 1 M no fluido intersticial da medula renal Suponha que o eritrócito consista unicamente em água 17 Marcação do transportador de lactose Um trans portador bacteriano de lactose altamente específico para a lactose contém um resíduo de Cys que é essencial para a sua atividade de transporte A reação covalente de Netilmaleimida NEM com este resíduo de Cys inativa irreversivelmente o transportador Uma alta concentração de lactose no meio im pede a inativação pela NEM presumivelmente por proteger estericamente o resíduo de Cys que se encontra no sítio de ligação da lactose ou próximo a ele Você não sabe mais nada sobre a proteína transportadora Sugira um experimento que possa permitir a determinação da Mr do polipeptídeo transpor tador contendo Cys 18 Previsão da topologia da proteína de membrana a partir da sequência Você clonou o gene para uma proteína de eritrócito humano que suspeita ser uma proteína de mem brana A partir da sequência de nucleotídeos do gene você co nhece a sequência de aminoácidos A partir desta sequência somente como você avaliaria a possibilidade de que a proteína seja uma proteína integral de membrana Suponha que a pro teína seja uma proteína integral do tipo I ou II Sugira experi mentos bioquímicos ou químicos que permitiriam determinar qual é o seu tipo 19 Captação intestinal de leucina Você está estudando a captação de Lleucina pelas células epiteliais do intestino de camundongo Medidas da taxa de captação de Lleucina e vá rios de seus análogos com ou sem Na 1 no tampão do ensaio produzem os resultados dados na tabela O que você pode con cluir sobre as propriedades e o mecanismo do transportador de leucina Você esperaria que a captação de Lleucina fosse inibida pela ouabaína Substrato Captação na presença de Na 1 Captação na ausência de Na 1 Vmáx Kt mM Vmáx Kt mM LLeucina 420 024 23 02 DLeucina 310 47 5 47 LValina 225 031 19 031 20 Efeito de um ionóforo no transporte ativo Consi dere o transportador de leucina descrito no Problema 19 A Vmáx eou Kt mudaria se você adicionasse um ionóforo de Na 1 à solução do ensaio contendo Na 1 Explique 21 Densidade de superfície de uma proteína de membrana A E coli pode ser induzida a produzir aproxi madamente 10000 cópias do transportador de lactose Mr 31000 por célula Considere a E coli como um cilindro de 1 mm de diâmetro e 2 mm de comprimento Que fração da su perfície da membrana plasmática é ocupada pelas moléculas transportadoras de lactose Explique como você chegou a essa conclusão 22 Uso do diagrama da roda helicoidal Uma roda heli coidal é uma representação em duas dimensões de uma héli ce uma visão ao longo de seu eixo central ver Figura 1130b ver também a Figura 44d Use o diagrama da roda helicoidal mostrado aqui para determinar a distribuição de resíduos de aminoácidos em um segmento de hélice com a sequência Val AspArgValPheSerAsnValCysThrHisLeuLysThrLeu GlnAspLys 1 O que você pode dizer sobre as propriedades da superfície dessa hélice Que orientação da hélice você esperaria na estru tura terciária da proteína integral de membrana 23 Espécies moleculares na membrana da E coli A membrana plasmática da E coli é composta por cerca de 75 de proteína e 25 de fosfolipídeo em relação ao peso Quantas moléculas de lipídeos de membrana estão presentes para cada molécula de proteína de membrana Considere uma Mr média de proteína de 50000 e uma Mr média de fosfolipídeo de 750 O que mais você precisaria saber para estimar a fração da super fície da membrana que é coberta por lipídeos Bioquímica na internet 24 Topologia das proteínas de membrana O receptor para o hormônio epinefrina em células animais é uma proteína integral de membrana Mr 64000 que se acredita ter sete re giões que atravessem a membrana a Mostre que a proteína desse tamanho é capaz de atra vessar a membrana sete vezes b Dada a sequência de aminoácidos da proteína como você poderia prever quais regiões proteicas formam as hélices que atravessam a membrana c Acesse o Banco de Dados de Proteínas wwwpdborg Use o identificador PDB 1DEP para buscar a página de dados para uma porção do receptor badrenérgico um tipo de recep tor para a epinefrina isolado de peru Usando Jmol para ex Nelson6ed11indd 431 Nelson6ed11indd 431 070414 1421 070414 1421 432 DAVID L NELSON MICHAEL M COX plorar a estrutura preveja se essa porção do receptor está lo calizada dentro da membrana ou em sua superfície Explique d Busque os dados para uma porção de outro receptor o receptor da acetilcolina em neurônios e miócitos usando o identificador PDB 1A11 Da mesma forma que em c preveja onde esta porção do receptor está localizada e explique sua resposta Se você não usou o PDB ver Quadro 44 p 132 para mais informações Problema de análise de dados 25 O modelo do mosaico fluido da estrutura da mem brana biológica A Figura 113 mostra o modelo de mosaico fluido da estrutura da membrana biológica aceito atualmente Esse modelo foi apresentado em detalhe em um artigo de revi são por S J Singer em 1971 No artigo Singer apresentou os três modelos da estrutura de membrana que foram propostos naquela época A B C A O Modelo de DavsonDanielliRobertson Esse era o mo delo mais amplamente aceito em 1971 quando a revisão de Singer foi publicada Nesse modelo os fosfolipídeos estão ar ranjados como uma bicamada Proteínas são encontradas em ambas as superfícies da bicamada ligadas a ela por interações iônicas entre grupos polares carregados dos fosfolipídeos e grupos carregados das proteínas Não há proteínas no interior da bicamada B O Modelo da Subunidade Lipoproteica de Benson Aqui as proteínas são globulares e a membrana é uma mistura de proteína e lipídeo As caudas hidrofóbicas dos lipídeos estão embebidas nas partes hidrofóbicas das proteínas Os grupos polares lipídicos estão expostos ao solvente Não há bicamada lipídica C O Modelo do Mosaico da Proteína GlobularLipídeo Esse é o modelo mostrado na Figura 113 Os lipídeos formam uma bicamada e as proteínas estão embebidas nela algumas se es tendendo através da bicamada e outras não As proteínas estão ancoradas na bicamada por interações hidrofóbicas entre as caudas hidrofóbicas dos lipídeos e as porções hidrofóbicas da proteína Considerando os dados disponíveis a seguir considere como cada parte de informação se encaixa com cada um dos três modelos da estrutura da membrana Qualis modelos ésão mantidos quais não são e que restrições você tem so bre os dados ou suas interpretações Explique seu raciocínio a Quando as células foram fixadas coradas com tetróxido de ósmio e examinadas sob microscopia eletrônica as mem branas mostram uma aparência de via férrea com duas li nhas escuras separadas por um espaço claro b O valor encontrado para a espessura das membranas das células fixadas e coradas da mesma forma foi de 5 a 9 nm A espessura de uma bicamada fosfolipídica nua sem proteí nas foi de 4 a 45 nm A espessura de uma única monocamada de proteínas era de cerca de 1 nm c Singer escreveu em seu artigo A composição média de aminoácidos das proteínas de membrana não é distinguí vel daquela das proteínas solúveis Em particular uma fração substancial de resíduos é hidrofóbica p 165 d Como descrito nos Problemas 1 e 2 deste capítulo pes quisadores extraíram membranas de células extraíram os lipí deos e compararam a área da monocamada lipídica com a área da membrana da célula original A interpretação dos resultados tornouse complicada pela questão ilustrada no gráfico do Pro blema 1 a área da monocamada dependia da força usada para presssionála Com pressões muito leves a razão entre a área da monocamada e a área da membrana estava em torno de 20 Com pressões mais altas supostamente como as encontradas em células a razão era substancialmente mais baixa e Espectroscopia de dicroísmo circular utiliza mudanças na polarização da luz UV para fazer inferências quanto à es trutura secundária da proteína ver Figura 410 Em média essa técnica mostrou que as proteínas de membrana têm uma grande quantidade de hélices a e pouca ou nenhuma folha b Esse achado foi consistente com a maioria das proteínas de membrana que possuíam estrutura globular f A fosfolipase C é uma enzima que remove o grupo po lar incluindo o fosfato de fosfolipídeos Em vários estudos o tratamento de membranas intactas com fosfolipase C removeu cerca de 70 dos grupos polares sem interromper a estrutura de via férrea da membrana g Singer descreveu em seu artigo um estudo no qual a glicoproteína com massa molecular aproximada de 31000 em membranas de células sanguíneas vermelhas era hidrolisada em glicopeptídeos solúveis com massa molecular aproximada de 10000 após tratamento tríptico de membranas enquan to as demais porções eram bastante hidrofóbicas p 199 O tratamento com tripsina não causou mudanças grosseiras nas membranas que permaneceram intactas A revisão de Singer também incluiu muitos outros estudos nessa área No final entretanto os dados disponíveis em 1971 não provavam conclusivamente que o Modelo C estava correto À medida que mais dados foram se acumulando esse modelo da estrutura da membrana foi sendo aceito pela comunidade científica Referência Singer SJ 1971 The molecular organization of biological membranes In Structure and Function of Biological Membranes Rothfield LI ed pp 145222 Academic Press Inc New York Nelson6ed11indd 432 Nelson6ed11indd 432 070414 1421 070414 1421 121 Características gerais da transdução de sinal 433 122 Receptores associados a proteínas G e segundos mensageiros 437 123 Receptores tirosinacinases 453 124 Receptores guanililciclases cGMP e proteínascinases G 459 125 Proteínas adaptadoras multivalentes e balsas lipídicas da membrana 460 126 Canais iônicos controlados por portões 464 127 Integrinas receptores bidirecionais da adesão celular 470 128 Regulação da transcrição por receptores de hormônios nucleares 471 129 Sinalização em microrganismos e plantas 473 1210 Transdução sensorial na visão no olfato e no paladar 477 1211 Regulação do ciclo celular por proteínascinases 484 1212 Oncogenes genes supressores tumorais e morte celular programada 488 A capacidade das células em receber e responder a sinais para além da membrana plasmática é fundamental à vida As células bacterianas recebem mensagens cons tantes de proteínas de membrana que atuam como recepto res de informação monitorando o meio externo em relação a pH força osmótica disponibilidade de alimento oxigênio e luz e presença de substâncias químicas nocivas predado res ou competidores por alimento Esses sinais provocam respostas apropriadas como o movimento na direção do alimento ou na direção oposta das substâncias tóxicas ou a formação de esporos em um ambiente exaurido de nutrien tes Nos organismos multicelulares células com diferentes funções trocam vários sinais entre si As células vegetais respondem a hormônios do crescimento e a variações na luz solar As células animais trocam informações sobre a con centração de íons e glicose nos fluidos extracelulares as atividades metabólicas interdependentes que ocorrem em diferentes tecidos e no embrião a localização correta das células durante o desenvolvimento Em todos esses casos o sinal representa informações detectadas por receptores específicos e convertidas em resposta celular que sempre envolve um processo químico Essa conversão de informa ção em alteração química a transdução de sinal é uma propriedade universal das células vivas 121 Características gerais da transdução de sinal Transdutores de sinal são notavelmente específicos e ex tremamente sensíveis A especificidade é alcançada por uma complementaridade molecular precisa entre as molé culas sinalizadoras e receptoras Figura 121a media da pelos mesmos tipos de forças fracas não covalentes que controlam as interações enzimasubstrato e antígeno anticorpo Os organismos multicelulares têm um grau de especificidade adicional porque os receptores de um dado sinal ou os alvos intracelulares de uma dada rota de si nalização estão presentes em apenas alguns tipos celula res O hormônio liberador de tireotropina por exemplo desencadeia respostas nas células da adenohipófise mas não nos hepatócitos que carecem de receptores para esse hormônio A adrenalina altera o metabolismo do glicogênio nos hepatócitos mas não nos adipócitos nesse caso os dois tipos celulares têm receptores para esse hormônio porém enquanto os hepatócitos contêm glicogênio e a en zima que metaboliza o glicogênio que é controlada pela adrenalina os adipócitos não contêm nem um nem outro Os adipócitos respondem à adrenalina liberando ácidos graxos a partir de triacilgliceróis e exportandoos a outros tecidos São três os fatores responsáveis pela extraordinária sensibilidade da transdução de sinal a alta afinidade dos receptores para as moléculas sinalizadoras a cooperati vidade frequentemente mas nem sempre da interação ligantereceptor e a amplificação do sinal por cascatas en zimáticas A afinidade entre o sinal ligante e o receptor pode ser expressa na forma da constante de dissociação Kd comumente 10 210M ou menos ou seja o receptor detecta concentrações picomolares da molécula sinalizadora As in terações receptorligante são quantificadas pela análise de 12 Biossinalização Nelson6ed12indd 433 Nelson6ed12indd 433 020514 1733 020514 1733 434 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Scatchard que fornece uma medida quantitativa da afinida de Kd e o número de sítios de interação com o ligante em uma amostra do receptor Quadro 121 A cooperatividade nas interações receptorligante causa grandes alterações na ativação do receptor em res posta a pequenas alterações na concentração do ligante lembrese do efeito da cooperatividade na ligação do oxi gênio à hemoglobina ver Figura 512 A amplificação ocorre quando uma enzima associada a um receptor de si nal é ativada e por sua vez catalisa a ativação de muitas moléculas de uma segunda enzima ativando muitas molé culas de uma terceira enzima e assim por diante em uma cascata enzimática Figura 121b Essas cascatas po dem produzir amplificações de várias ordens de magnitude em milissegundos A resposta a um sinal também deve ser cessada de modo que os efeitos a jusante sejam proporcio nais à intensidade do estímulo original A modularidade das proteínas de sinalização permite que a célula misture e combine um conjunto de moléculas 3 d DessensibilizaçãoAdaptação A ativação do receptor dispara um circuito de retroalimentação que desliga o receptor ou o remove da superfície celular c Modularidade Proteínas com afinidades multivalentes formam diversos complexos de sinalização a partir de partes intercambiáveis A fosforilação fornece pontos de interação reversíveis e Integração Quando dois sinais apresentam efeitos opostos sobre uma característica metabólica como por exemplo a concentração de um segundo mensageiro X ou o potencial de membrana Vm a regulação é consequência da ativação integrada dos dois de ambos receptores a Espeficidade A molécula sinalizadora se encaixa no sítio de ligação do receptor complementar outros sinais não se encaixam b Amplificação Quando enzimas ativam enzimas o número de moléculas afetadas aumenta geometricamente na cascata enzimática Sinal Resposta Receptor Resposta Enzima 3 3 Enzima 2 2 Enzima 1 2 Sinal 3 3 3 3 3 3 3 S1 S2 Resposta Sinal Receptor 1 Sinal 1 Receptor 2 Sinal 2 Receptor P P X ou Vm Net DX ou DVm X ou Vm Resposta FIGURA 121 Cinco características dos sistemas de transdução de sinal sinalizadoras para a criação de complexos com diferentes funções ou localizações celulares Muitas proteínas sinaliza doras têm múltiplos domínios que reconhecem característi cas específicas de outras proteínas ou do citoesqueleto ou da membrana plasmática e a multivalência resultante dos módulos individuais possibilita a montagem de uma ampla variedade de complexos multienzimáticos Um tema co mum em tais interações é a ligação de uma proteína de sina lização modular a resíduos fosforilados em outra proteína a interação resultante pode ser regulada pela fosforilação ou desfosforilação da proteína parceira Figura 121c Proteínas de ancoragem sem atividade enzimática com afinidade por diversas enzimas que interagem em cascatas aproximam essas proteínas garantindo sua interação em locais celulares e momentos específicos A sensibilidade dos sistemas receptores está sujeita a modificações Quando um sinal está presente continua mente ocorre a dessensibilização do sistema receptor Figura 121d quando o estímulo diminui ficando abai xo de certo limite o sistema tornase novamente sensível Pense no que acontece no seu sistema de transdução visual quando você passa de um lugar com muita luz solar para um quarto escuro ou da escuridão para a luz Uma última característica notável dos sistemas de trans dução de sinal é a integração Figura 121e a capacidade de um sistema de receber múltiplos sinais e produzir uma resposta unificada apropriada às necessidades da célula ou do organismo Diferentes rotas de sinalização se comuni cam umas com as outras em diferentes níveis gerando uma Nelson6edbookindb 434 Nelson6edbookindb 434 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 435 QUADRO 121 MÉTODOS A análise de Scatchard quantifica a interação receptorligante As ações celulares de um hormônio iniciamse quando o hormônio ligante L se liga específica e firmemente à sua proteína receptora R na célulaalvo A ligação é mediada por interações não covalentes ligações de hi drogênio hidrofóbicas e eletrostáticas entre as superfí cies complementares do ligante e do receptor A intera ção receptorligante causa uma alteração conformacional que altera a atividade biológica do receptor que pode ser uma enzima um regulador de enzima um canal iônico ou um regulador de expressão gênica A interação receptorligante é descrita pela equação Esta ligação como a de uma enzima ao seu substrato de pende das concentrações dos componentes interagentes e pode ser descrita por uma constante de equilíbrio onde Ka é a constante de associação e Kd é a constante de dissociação Assim como a ligação enzimasubstrato a interação receptorligante é saturável À medida que mais ligante é adicionado a uma quantidade fixa de receptor uma fra ção cada vez maior de moléculas do receptor é ocupada pelo ligante Figura Q1a Uma medida aproximada da afinidade é dada pela concentração do ligante necessária para proporcionar 50 de saturação do receptor Ao usar a análise de Scatchard da interação receptorligante é possível estimar a constante de dissociação Kd e o número de sítios de ligação do receptor em uma dada preparação Quando a ligação atinge o equilíbrio o número total de sí tios de ligação possíveis Bmáx igualase ao número de sí tios não ocupados representado pela R mais o número de sítios ocupados pelo ligante RL isto é Bmáx 5 R 1 RL O número de sítios não ligados pode ser expresso em termos de sítios totais menos os sítios ocupados R 5 Bmáx 2 RL A expressão de equilíbrío pode ser descrita máx Rearranjando para obter a razão ligantereceptor sobre ligante livre não ligado obtémse ligado máx máx livre Verificase que de acordo com esta forma de inclinação intercepção da equação um gráfico de ligante ligado ligante livre versus ligante ligado deve ser uma linha reta com uma inclinação de 2Ka 21Kd e uma inter cepção na abcissa de Bmáx que é o número total de sítios de ligação Figura Q1b As interações hormônioligante tipicamente têm valores de Kd de 10 29 a 10 211M o que corresponde a uma ligação muito firme A análise de Scatchard é confiável para os casos mais simples mas assim como nos gráficos de Lineweaver Burk para enzimas quando o receptor é uma proteína alostérica as curvas desviamse da linearidade Hormônio ligado RL Hormônio total adicionado L 1 RL Ligação total Ligação específica Ligação inespecífica a Hormônio ligado Hormônio livre RL L Hormônio ligado RL b Inclinação 5 2 1 Kd Bmáx FIGURA Q1 Análise de Scatchard para uma interação receptorligante Um ligante radiomarcado L um hormônio por exemplo é adiciona do em várias concentrações a uma quantidade fixa de receptor R e a fração do hormônio ligado ao receptor é determinada pela separação do complexo receptorhormônio RL do hormônio livre a A curva de RL versus L 1 RL hormônio total adicionado é hiperbólica subindo para o máximo de RL à medida que os sítios do re ceptor tornamse saturados Para aferir os sítios de ligação não saturáveis inespecíficos p ex hormônios eicosanoides ligamse inespecificamente à bicamada lipídica uma série de outros experimentos de ligação é necessária Um grande excesso de hormônio não marcado é adicionado juntamente com a solução diluída do hormônio marcado As moléculas não marcadas competem com as moléculas marcadas pela ligação específica aos sítios saturáveis do receptor mas não pela ligação inespe cífica O valor real da ligação específica é obtido ao se subtrair a ligação inespecífica da ligação total b Uma curva linear de RLL versus RL fornece a Kd e Bmáx do complexo receptorhormônio Compare essas curvas com aquelas da Vo versus S e 1Vo versus 1S do complexo enzimasubstrato ver Figura 612 Quadro 61 Nelson6edbookindb 435 Nelson6edbookindb 435 030414 0743 030414 0743 436 DAVID L NELSON MICHAEL M COX complexa conversa cruzada que mantém a homeostase da célula ou do organismo Uma das revelações da pesquisa sobre sinalização é o grau excepcional de conservação dos mecanismos de si nalização durante a evolução Embora o número de sinais biológicos diferentes Tabela 121 provavelmente seja da ordem de milhares e os tipos de respostas provocadas por esses sinais também sejam numerosos a maquinaria de transdução de todos esses sinais tem como base cerca de 10 tipos básicos de componentes proteicos Este capítulo mostra alguns exemplos das principais classes de mecanismos de sinalização examinando como eles são integrados em funções biológicas específicas como a transmissão de sinais nervosos respostas a hormônios e fatores de crescimento os sentidos da visão do olfato e do paladar e o controle do ciclo celular Frequentemente o resultado final de uma rota de sinalização é a fosforilação de algumas proteínas específicas na célulaalvo que têm suas atividades alteradas e assim alteram as atividades da célu la Ao longo desta discussão será dada ênfase à conserva ção dos mecanismos fundamentais da transdução de sinais biológicos e à adaptação desses mecanismos básicos a uma ampla gama de rotas de sinalização Serão abordados detalhes moleculares de vários siste mas representativos de transdução de sinal classificados de acordo com o tipo de receptor O gatilho de cada sistema é diferente mas as características gerais da transdução de sinal são comuns a todos um sinal interage com o receptor o receptor ativado interage com a maquinaria celular pro duzindo um segundo sinal ou uma alteração na atividade de uma proteína celular a atividade metabólica da célulaalvo sofre uma modificação e finalmente o evento de transdu ção termina Para ilustrar essas características gerais dos sistemas sinalizadores serão examinados exemplos de seis tipos básicos de receptores Figura 122 1 Receptores associados a proteínas G que ativam indiretamente por meio de proteínas de ligação ao GTP ou proteínas G enzimas que geram segun dos mensageiros intracelulares Esse tipo de recep tor é ilustrado pelo sistema receptor badrenérgico que detecta adrenalina Seção 122 TABELA 121 Alguns sinais aos quais as células respondem Antígenos Glicoproteínas oligossa carídeos da superfície celular Sinais de desenvolvimento Componentes da matriz ex tracelular Fatores de crescimento Hormônios Hipóxia Luz Toque mecânico Microrganismos insetos patógenos Neurotransmissores Nutrientes Odores Feromônios Sabores Receptor associado à proteína G A interação do ligante externo L ao receptor R ativa uma proteína intracelular ligadora de GTP G que regula uma enzima Enz que gera um segundo mensageiro X 1 Canal iônico com portão Abrese e fechase em resposta à concentração do ligante sinalizador ou potencial de membrana 5 Receptor guanililciclase A interação do ligante ao domínio extracelular estimula a formação do segundo mensageiro GMP cíclico Receptor nuclear A ligação do hormônio permite ao receptor regular a expressão de genes específicos 3 Receptor tirosinacinases A interação do ligante ativa a atividade tirosinacinase por autofosforilação 2a Íon L Membrana plasmática Envelope nuclear Cascata de cinases GTP cGMP L L DNA mRNA Proteína DNA mRNA Proteína Receptor de adesão Liga moléculas na matriz extracelular altera a conformação modificando sua interação com o citoesqueleto 4 2b A cinase ativa um fator de transcrição alterando a expressão gênica 6 X G G Enz L L L L R R L L L FIGURA 122 Os seis tipos gerais de transdutores de sinal Nelson6edbookindb 436 Nelson6edbookindb 436 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 437 2 Receptores tirosinascinases receptores da mem brana plasmática que também são enzimas Quan do um desses receptores é ativado pelo seu ligante extracelular ele catalisa a fosforilação de diversas proteínas citosólicas ou da membrana plasmática O receptor de insulina é um exemplo Seção 123 o re ceptor do fator de crescimento da epiderme EGFR de epidermal growth factor receptor é outro 3 Receptores guanililciclases que também são re ceptores da membrana plasmática com um domínio enzimático citoplasmático O segundo mensageiro intracelular para esses receptores o monofosfato de guanosina cíclico cGMP ativa uma proteína cinase citosólica que fosforila proteínas celulares alterando suas atividades Seção 124 4 Canais iônicos com portões na membrana plas mática que abrem e fecham por isso o termo por tões em resposta à interação de ligantes químicos ou alterações no potencial transmembrana Esses são os transdutores de sinal mais simples O canal iônico do receptor de acetilcolina é um exemplo desse mecanismo Seção 126 5 Receptores de adesão que interagem com com ponentes macromoleculares da matriz extracelular como o colágeno e transmitem instruções para o sistema do citoesqueleto sobre migração ou adesão à matriz As integrinas ilustram esse tipo de meca nismo de transdução Seção 127 6 Receptores nucleares que interagem com ligantes específicos como o hormônio estrogênio e alte ram a taxa em que genes específicos são transcritos e traduzidos em proteínas celulares Funcionando por mecanismos intimamente relacionados à regu lação da expressão gênica os hormônios esteroides serão considerados aqui apenas sucintamente Se ção 128 com uma discussão detalhada de suas ações no Capítulo 28 Ao começar esta discussão sobre sinalização biológica tornamse necessárias algumas observações sobre a nomen clatura de proteínas sinalizadoras Em geral essas proteí nas são descobertas em determinado contexto e chamadas de acordo com esse contexto sendo então implicadas em uma gama mais ampla de funções biológicas para as quais seu nome original não auxilia mais Por exemplo a proteína retinoblastoma pRb foi identificada inicialmente como lo cal de uma mutação que contribui para o câncer de retina retinoblastoma mas agora se sabe que atua em muitas rotas essenciais para a divisão celular em todas as células não somente nas da retina A alguns genes e proteínas são dados nomes não comprometedores a proteína supressora tumoral p53 por exemplo é uma proteína de 53 kDa mas esse nome não fornece indícios da sua grande importância na regulação da divisão celular e no desenvolvimento do câncer Este capítulo define em linhas gerais os nomes des sas proteínas à medida que elas aparecem apresentando os nomes comumente usados pelos pesquisadores da área Não desanime se não conseguir graválos de primeira RESUMO 121 Características gerais da transdução de sinal c Todas as células têm mecanismos de transdução de sinal específicos e altamente sensíveis que foram conserva dos durante a evolução c Vários estímulos atuam por meio de receptores protei cos específicos c Os receptores ligam a molécula sinalizadora e iniciam um processo que amplifica o sinal integrao com o sinal de outros receptores e transmite a informação pela cé lula Se o sinal persiste a dessensibilização do receptor reduz ou cessa a resposta c Os organismos multicelulares têm seis tipos básicos de mecanismos sinalizadores proteínas da membrana plas mática que atuam por meio de proteínas G receptores tirosinacinases receptores guanililciclases que atuam por meio de proteínascinases canais iônicos com por tões receptores de adesão que transmitem informação entre a matriz extracelular e o citoesqueleto e recepto res nucleares que ligam esteroides e alteram a expres são gênica 122 Receptores associados a proteínas G e segundos mensageiros Os receptores associados a proteínas G GPCR de G proteincoupled receptors como o nome implica são receptores associados a um membro da família de proteí nas de ligação a nucleotídeos de guanosina proteí nas G Três componentes essenciais definem a transdu ção de sinalização via GPCR um receptor na membrana plasmática com sete segmentos helicoidais transmembra na uma proteína G que alterna entre as formas ativa liga da a GTP e inativa ligada a GDP e uma enzima efetora ou canal iônico na membrana plasmática que é regulada pela proteína G ativada A proteína G estimulada pelo re ceptor ativado troca o GDP ligado a ela por GTP e então dissociase do receptor ocupado e ligase à enzima efetora vizinha alterando sua atividade A enzima ativada então gera um segundo mensageiro que afeta alvos a jusante O genoma humano codifica cerca de 350 GPCR que detec tam hormônios fatores de crescimento e outros ligantes endógenos e talvez 500 que atuam como receptores olfa tivos e gustativos Os GPCR têm sido implicados em muitas doenças humanas comuns incluindo alergias depressão ce gueira diabetes e várias deficiências cardiovasculares com sérias consequências para a saúde Quase metade de todos os fármacos no mercado tem como alvo algum GPCR Por exemplo o receptor badrenérgico que con trola os efeitos da adrenalina é o alvo dos bloqueadores beta prescritos para condições tão diversas como hiper tensão arritmia cardíaca glaucoma ansiedade e enxaque ca Pelo menos 150 dos GPCR encontrados no genoma humano ainda são receptores órfãos seus ligantes natu rais ainda não foram identificados e nada se sabe sobre sua biologia O receptor badrenérgico cuja biologia e farma Nelson6edbookindb 437 Nelson6edbookindb 437 030414 0743 030414 0743 438 DAVID L NELSON MICHAEL M COX cologia são bemcompreendidas é o protótipo de todos os GPCR e nossa discussão sobre os sistemas transdutores de sinal iniciase com ele O sistema receptor badrenérgico atua por meio do segundo mensageiro cAMP A adrenalina dispara o alarme quando alguma ameaça exi ge que o organismo mobilize sua maquinaria de geração de energia ela sinaliza a necessidade de lutar ou fugir A ação da adrenalina é iniciada quando o hormônio ligase ao seu receptor proteico na membrana plasmática de uma célula sensível à adrenalina Os receptores adrenérgi cos são de quatro tipos básicos a1 a2 b1 e b2 definidos pelas diferenças nas afinidades e respostas a um grupo de agonistas e antagonistas Os agonistas são análogos es truturais que se ligam a um receptor e mimetizam o efeito normal do ligante natural os antagonistas são análogos que se ligam ao receptor sem disparar o efeito normal e desta forma bloqueiam os efeitos dos agonistas incluindo o ligante biológico Em alguns casos a afinidade do recep tor por agonistas ou antagonistas sintéticos é maior do que pelo agonista natural Figura 123 Os quatro tipos de receptores adrenérgicos são encontrados em tecidosalvo diferentes e controlam respostas diferentes à adrenalina Aqui serão apresentados os receptores badrenérgicos do músculo do fígado e do tecido adiposo Esses recep tores controlam alterações no metabolismo energético conforme descrito no Capítulo 23 incluindo o aumento na degradação de glicogênio e gordura Os receptores adre nérgicos dos subtipos b1 e b2 atuam por meio do mesmo mecanismo assim neste texto badrenérgico aplicase a ambos os tipos Como todos os GPCR o receptor badrenérgico é uma proteína integral com sete regiões hidrofóbicas helicoidais com 20 a 28 resíduos de aminoácidos que atravessam a membrana plasmática sete vezes assim originando o nome alternativo receptores heptahelicoidais para os GPCR A ligação da adrenalina ao sítio no receptor mergulhado na membrana plasmática Figura 124a etapa ➊ promove uma alteração conformacional no domínio intracelular do receptor que afeta sua interação com uma proteína G as sociada promovendo a dissociação do GDP e a ligação do GTP etapa ➋ Em todos os GPCR a proteína G é hetero trimérica composta por três subunidades diferentes a b e g Tais proteínas G são portanto conhecidas como proteí nas G triméricas Neste caso é a subunidade a que se liga ao GDP ou GTP e transmite o sinal do receptor ativado para a proteína efetora Como esta proteína G ativa o seu efetor ela é chamada de proteína G estimulatória ou Gs As sim como outras proteínas G Quadro 122 a Gs funciona como um comutador biológico quando o sítio de ligação a nucleotídeos na Gs na subunidade a é ocupado por GTP a Gs é ativada e pode ativar sua proteína efetora neste caso a adenililciclase com GDP ligado ao sítio a Gs é inativada Na forma ativa as subunidades b e γ da Gs dissociamse sob a forma de um dímero bγ da subunidade a e a Gsa com o GTP ligado movese no plano da membrana do receptor a uma molécula de adenililciclase próxima etapa ➌ A Gsa é mantida na membrana pela ligação covalente a um grupo palmitoil ver Figura 1115 A adenililciclase é uma proteína integral da membra na plasmática com o sítio ativo na face citoplasmática A associação de Gsa ativa com a adenililciclase estimula a ci clase a catalisar a síntese de cAMP a partir de ATP Figura 124a etapa ➍ e Figura 124b elevando a cAMP citosóli ca A interação entre Gsa e adenililciclase é possível apenas quando Gsaestá ligada a GTP O estímulo por Gsa é autolimitante Gsa tem uma ativi dade GTPásica intrínseca que inativa a si mesma por meio da conversão a GDP do GTP ligado Figura 125 A Gsa agora inativa dissociase da adenililciclase causando a inativação da ciclase A Gsa reassociase com o dímero bγ Gsbγ e a Gs inativa está novamente disponível para intera gir com um receptor ligado ao hormônio O papel de Gsa como um comutador proteico biológico não é exclusivo Diversas proteínas G agem como comuta dores binários em sistemas de sinalização com GPCR e em muitos processos que envolvem fusão ou fissão de membra nas Quadro 122 Proteínas G triméricas comutadores ligades liga moleculares A adrenalina exerce seus efeitos a jusante pelo au mento na cAMP que resulta da ativação da adenililci clase O AMP cíclico por sua vez ativa alostericamente a proteínacinase dependente de cAMP também cha mada de proteínacinase A ou PKA Figura 124a eta pa ➎ a qual catalisa a fosforilação de resíduos de Ser ou Thr em proteínasalvo incluindo a cinase da glicogênio fosforilase b Essa enzima está ativa quando fosforilada HO OH CH CH2 CH3 NH HO HO OH CH CH2 CH3 CH3 NH CH OH CH CH2 CH3 CH3 NH CH CH2 HO Adrenalina Isoproterenol agonista Propanolol antagonista Kd mM 5 04 00046 O FIGURA 123 Adrenalina e seus análogos sintéticos A adrenalina é li berada da glândula suprarrenal e regula o metabolismo energético no mús culo no fígado e no tecido adiposo Também atua como neurotransmissor nos neurônios adrenérgicos e sua afinidade pelo receptor se expressa sob a forma de uma constante de dissociação para o complexo receptorligante O isoproterenol e propanolol são análogos sintéticos o primeiro um agonista com afinidade pelo receptor maior do que a da adrenalina e o segundo um antagonista com afinidade extremamente alta Nelson6edbookindb 438 Nelson6edbookindb 438 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 439 e pode iniciar o processo de mobilização do glicogênio a partir dos seus estoques no músculo e no fígado na ex pectativa da necessidade de energia como é sinalizado pela adrenalina A forma inativa da PKA contém duas subunidades cata líticas idênticas C e duas subunidades de regulação R Figura 126a O complexo tetramérico R2C2 é cataliti camente inativo pois um domínio autoinibitório em cada Gsa GTP ATP cAMP 59AMP Adenilil ciclase Dentro Fora Gsa Gsb Gsg GDP GTP GDP O complexo receptorhormônio causa a substituição do GDP ligado à Gsa por GTP ativando a Gsa A adrenalina ligase ao seu receptor específico A Gsa ativada separase de Gsbg e movese para junto à adenililciclase ativandoa Muitas subunidades de Gsa podem ser ativadas por um receptor ocupado A fosforilação de proteínas celulares pela PKA causa a resposta celular à adrenalina O AMPc ativa a PKA A adenililciclase catalisa a formação de cAMP O cAMP é degradado revertendo a ativação da PKA C N Receptor badrenérgico a Nucleotídeo cíclicofosfodiesterase ➋ ➌ ➍ ➎ ➐ ➏ ➊ 2O P P O O2 O2 O O H P O2 O O O H H H N O OH O H N N N CH NH2 2 ATP Adenosina 59monofosfato AMP H P O2 O O H H H N O O O H N N N CH2 59 2 H P O2 O O O H H H N O OH O H N N N CH NH2 2 59 Adenosina 3959 monofosfato cíclico cAMP NH2 39 39 PPi Adenilil ciclase H2O Nucleotídeo cíclicofosfodiesterase b FIGURA 124 A transdução do sinal da adrenalina a rota badrenér gica a O mecanismo que acopla a ligação da adrenalina ao seu recep tor com a ativação da adenililciclase AC as sete etapas são discutidas em maior detalhe no texto A mesma molécula de adenililciclase na membrana plasmática pode ser regulada por uma proteína G estimulatória Gs confor me mostrado ou uma proteína G inibitória Gia não mostrado A Gs e a Gi estão sob a influência de hormônios diferentes Os hormônios que induzem a ligação do GTP à Gi causam inibição da adenililciclase resultando em uma diminuição da cAMP celular b A ação combinada das enzimas que cata lisam as etapas 4 e 7 a síntese e a hidrólise do cAMP pela adenililciclase e pela fosfodiesterase do cAMP respectivamente Nelson6edbookindb 439 Nelson6edbookindb 439 030414 0743 030414 0743 440 DAVID L NELSON MICHAEL M COX subunidade R ocupa a fenda de ligação ao substrato de cada subunidade C Quando as subunidades R estão ligadas a cAMP elas passam por uma alteração na conformação que afasta o domínio autoinibitório de R do domínio catalítico de C e o complexo R2C2 se dissocia originando duas subu nidades C livres e cataliticamente ativas Esse mesmo me canismo básico o deslocamento de um domínio inibitório controla a ativação alostérica pelos segundos mensageiros de muitos tipos de proteínascinases como nas Figuras 12 14 e 1222 por exemplo A estrutura da fenda de ligação ao substrato na PKA é o protótipo para todas as proteínas cinases conhecidas Figura 126b certos resíduos nessa fenda são idênticos em todas as mais de 1000 proteínas cinases conhecidas O sítio de ligação do ATP de cada subunidade catalítica posiciona perfeitamente o ATP para a transferência de seu grupo fosfato terminal g para o OH da cadeia lateral de um resíduo de Ser ou Thr FIGURA 125 O comutador GTPase As proteínas G alternam entre a li gação a GDP desligada e GTP ligada A atividade GTPásica intrínseca da proteína em muitos casos estimulada pelas proteínas RGS reguladores da sinalização por proteínas G ver Quadro 122 determina quão rapidamente o GTP ligado é hidrolisado a GDP e assim por quanto tempo a proteína G permanece ativa g b g b a a a Pi ➊ Gs está inativa quando ligada a GDP ela não pode ativar a adenilil ciclase ➋ Contato entre Gs e o complexo hormônio receptor causa a substituição do GDP ligado por GTP ➌ Gs ligada a GTP se dissocia em subunidades a e bg GsaGTP é ativada ela pode ativar a adenilil ciclase ➍ O GTP ligado a Gsa é hidrolisado pela atividade GTPásica intrínseca da proteína desta forma Gsa inativa a si mesma A subunidade a inativa reassociase com a subunidade bg GTP Adenilil ciclase GTP GDP GDP Gs GPCR a GDP GDP Sequência inibidora Sequência inibidora Subunidade de regulação R Subunidade de regulação Fenda de ligação ao substrato agora disponível Fenda de ligação ao substrato Subunidade catalítica C Subunidade catalítica Fenda de ligação ao substrato R R 2 cAMP 2 cAMP C C AKAP PKA Domínio de dimerização Lóbulo menor ligação ao ATP Lóbulo maior ligação ao substrato proteico b 4 cAMP 4 cAMP a C FIGURA 126 Ativação da proteínacinase dependente de cAMP PKA a Quando a cAMP está baixa as duas subunidades de regulação idênticas R em vermelho se associam com as duas subunidades catalíticas idênticas C Neste complexo R2C2 as sequências inibidoras das subunidades R se inserem na fenda de ligação ao substrato das subunidades C e impedem a ligação dos substratos o complexo está portanto cataliticamente inativo As sequências aminoterminais das subunidades R interagem para a formação de um dímero R2 o sítio de ligação para uma proteína de ancoragem para a ci nase A AKAP descrita posteriormente no texto Quando a cAMP aumenta em resposta a um sinal hormonal cada subunidade R se liga a duas moléculas de cAMP e sofre uma drástica reorganização que afasta a sequência inibidora da subunidade C abrindo a fenda de ligação ao substrato e liberando cada subunidade C na forma cataliticamente ativa b Estrutura cristalográfica mos trando parte do complexo R2C2 identidade no PDB 1U7E uma subunidade C e parte da subunidade R A região aminoterminal de dimerização da subuni dade R foi omitida para simplicidade O lóbulo menor de C contém o sítio de ligação a ATP e o lóbulo maior circunda e define a fenda na qual o substrato proteico se liga e é fosforilado em um resíduo de Ser ou Thr sendo o grupo fosfato transferido a partir do ATP Nesta forma inativa a sequência inibidora de R bloqueia a fenda de ligação ao substrato de C inativandoa Nelson6edbookindb 440 Nelson6edbookindb 440 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 441 QUADRO 122 MEDICINA Proteínas G comutadores binários na saúde e na doença Alfred G Gilman e Martin Rodbell Figura Q1 descobri ram as funções cruciais das proteínas de ligação a nucleo tídeos de guanosina proteínas G em vários processos celulares incluindo percepção sensorial sinalização na divisão celular crescimento e diferenciação movimentos intracelulares de proteínas e vesículas membranosas e síntese proteica O genoma humano codifica aproxima damente 200 dessas proteínas que diferem em tamanho e estrutura de subunidades localização intracelular e função Porém todas as proteínas G compartilham uma característica comum elas podem ser ativadas e após um breve período autoinativarse atuando como comu tadores moleculares binários com temporizador integra do Essa superfamília de proteínas inclui as proteínas G heterotriméricas envolvidas na sinalização adrenérgica Gs e Gi e da visão transducina proteínas G pequenas como as envolvidas na sinalização da insulina Ras e ou tras que atuam no tráfego de vesículas ARF e Rab no transporte para dentro e fora do núcleo Ran ver Figura 2742 e na sincronia do ciclo celular Rho e muitas pro teínas envolvidas na síntese proteica fator de iniciação IF2 e fatores de alongamento EFTu e EFG ver Capítulo 26 Muitas proteínas G têm lipídeos ligados covalente mente que lhes conferem afinidade pelas membranas e determinam suas localizações na célula Todas as proteínas G têm a mesma estrutura central e usam o mesmo mecanismo que as faz ciclar entre uma conformação inativa favorecida quando há GDP ligado e uma conformação ativa favorecida quando há GTP li gado Utilizase a proteína Ras 20 kDa unidade sina lizadora mínima como protótipo para todos os membros dessa superfamília Figura Q2 Na conformação ligada a GTP a proteína G expõe re giões previamente escondidas chamadas de comutador I e comutador II que interagem com proteínas a ju sante na rota sinalizadora até que a proteína G se autoi native ao hidrolisar seu GTP a GDP Um ponto determi nante na conformação da proteína G é o fosfato γ do GTP que interage com a região chamada de alça P de ligação a fosfato phosphatebinding Figura Q3 Na Ras o FIGURA Q1 Alfred G Gilman esquerda e Martin Rodbell 19251998 Suas conferências do Prêmio Nobel sobre a descoberta e exploração das proteínas G estão disponíveis em wwwnobelprizeorg Comutador II Comutador I Gly60 Alça P Ala146 Thr35 Análogo do GTP Mg Mg2 2 Mg2 FIGURA Q2 A proteína Ras o protótipo para todas as proteínas G PDB ID 5P21 O Mg 21GTP é mantido por resíduos críticos na alça P de ligação ao fosfato em azul e pela Thr 35 na região comutadora I em vermelho e Gly 60 na região comutadora II em verde A Ala 146 é responsável pela especificidade de GTP no lugar de ATP Nesta estrutura o análogo não hidrolisável do GTP GppNHP está presente no sítio de ligação do GTP P P 2 O 2O O O Rib Guanina O O O P 2 2 O O Gly60 Thr35 O Alça P Comutador II Comutador I FIGURA Q3 Quando o GTP ligado é hidrolisado pelas atividades GTPási cas da Ras e sua GAP a perda das ligações de hidrogênio com Thr 35 e Gly 60 permite que as regiões comutadoras I e II relaxem a uma conformação na qual elas não mais estão disponíveis para interagirem com alvos a jusante como Raf Continua na próxima página Nelson6edbookindb 441 Nelson6edbookindb 441 030414 0743 030414 0743 442 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Como indicado na Figura 124a etapa ➏ a PKA regu la algumas enzimas a jusante na rota de sinalização Tabe la 122 Embora esses alvos a jusante tenham diferentes funções eles compartilham uma região de similaridade de sequência próxima ao resíduo de Ser ou Thr que é fosfo rilado sequência que os marca para a regulação por PKA A fenda de ligação ao substrato da PKA reconhece essas sequências e a enzima fosforila o resíduo de Ser ou Thr fosfato γ do GTP ligase a um resíduo de Lys na alça P e a dois resíduos críticos Thr 35 no comutador I e Gly 60 no comutador II que formam ligações de hidrogênio com os oxigênios do fosfato γ do GTP Essas ligações de hidrogê nio funcionam como um par de molas que seguram a pro teína na sua conformação ativa Quando o GTP é hidroli sado a GDP e o Pi é liberado essas ligações de hidrogênio são perdidas a proteína relaxa para a sua conformação inativa escondendo os sítios que interagem com outros parceiros quando no estado ativo A Ala 146 forma ligações de hidrogênio com o oxigênio da guanosina permitindo a ligação de GTP mas não de ATP A atividade GTPásica intrínseca das proteínas G é au mentada em até 10 5 vezes pelas proteínas ativadoras de GTPases GAP de GTPase activator proteins também chamadas no caso das proteínas G heterotri méricas reguladores da sinalização por proteínas G RGS de regulators of G protein signaling Figu ra 4 Assim GAP e RGS determinam por quanto tempo o comutador permanece ligado Elas contribuem com um resíduo de Arg essencial que penetra no sítio ativo GTPásico da proteína G e auxilia na catálise O proces so intrinsecamente lento de substituição do GDP ligado por GTP ativando a proteína é catalisado pelos fatores de troca de nucleotídeos de guanosina GEF de guanosine nucleotideexchange factors associados às proteínas G Figura Q4 Como as proteínas G desempenham funções cruciais em muitos processos de sinalização não é surpreendente que defeitos nessas proteínas levem a diversas doenças Em cerca de 25 de todos os cânceres humanos pro porção muito maior em certos tipos de câncer há uma mutação na proteína Ras tipicamente em um dos resí duos críticos próximos ao sítio de ligação a GTP ou na alça P que praticamente anula a atividade GTPásica Uma vez ativadas pela ligação de GTP essas proteínas Ras permanecem constitutivamente ativas promoven do a divisão celular em células que não deveriam estar se dividindo O gene supressor tumoral NF1 codifica para uma GAP que intensifica a atividade GTPásica da Ras normal As mutações em NF1 que resultam em uma GAP não funcional deixam Ras apenas com sua ativida de GTPásica intrínseca uma vez ativada pela ligação de GTP a Ras permanece ativa continuando a enviar o sinal dividamse Proteínas G heterotriméricas defeituosas também po dem levar a doenças Mutações no gene que codifica a subunidade a de Gs a qual controla alterações na cAMP em resposta a estímulos hormonais pode resultar em uma proteína Gs que está permanentemente ativa ou per manentemente inativa As mutações ativadoras em ge ral ocorrem nos resíduos cruciais para a atividade GTPá sica elas levam a uma cAMP continuamente elevada com consequências a jusante incluindo a proliferação ce lular indesejada Por exemplo tais mutações são encon tradas em cerca de 40 dos tumores da hipófise ade nomas Os indivíduos com mutações inativadoras em Ga não respondem aos hormônios que atuam via cAMP como o hormônio da tireoide As mutações no gene para a subunidade a da transducina Ta que está envol vida na sinalização da visão causam um tipo de cegueira noturna aparentemente devido à interação defeituosa entre a subunidade Ta e a fosfodiesterase do segmento externo dos bastonetes ver Figura 1239 Uma variação na sequência do gene que codifica para a subunidade b de uma proteína G heterotrimérica é comumente encon trada em indivíduos com hipertensão pressão sanguínea elevada e suspeitase que essa variante gênica esteja envolvida em obesidade e aterosclerose As bactérias patogênicas que causam cólera e coque luche produzem toxinas que atacam proteínas G interfe rindo com a sinalização normal das células hospedeiras A toxina do cólera secretada pelo Vibrio cholerae no in testino da pessoa infectada é uma proteína heterodimé QUADRO 122 MEDICINA Proteínas G comutadores binários na saúde e na doença Continuação GTP GTP GDP GDP Rh bAR Sos etc GAP RGS etc Moduladores da atividade GTPásica Fatores de troca GTPGDP GEF Proteína G inativa Proteína G ativa cGMP PDE AC Raf etc Enzimas efetoras a jusante Pi FIGURA Q4 Os fatores que regulam a atividade das proteínas G em verde As proteínas G inativas tanto as proteínas G pequenas como a Ras quanto as proteínas G heterotriméricas como a Gs interagem com fatores de troca GTPGDP GEF em vermelho frequentemente são recep tores ativados como rodopsina receptores badrenérgicos e Sos a montante sendo ativadas pela ligação de GTP Nesta forma as proteínas G ativam enzimas efetoras a jusante em azul enzimas como a cGMP fosfodiesterase adenililciclase e Raf As proteínas ativadoras de GTPase GAP no caso das proteínas G pequenas e os reguladores da sinalização por proteínas G RGS em amarelo ao modularem a atividade GTPásica das proteínas G determinam quanto tempo elas permanecem ativas Nelson6edbookindb 442 Nelson6edbookindb 442 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 443 A comparação das sequências de várias proteínas que são substratos para a PKA gerou a sequência consenso os resíduos vizinhos necessários para marcar um resíduo de Ser ou Thr para fosforilação ver Tabela 122 Como em muitas rotas de sinalização a transdução de sinal pela adenililciclase envolve várias etapas que ampli ficam o sinal hormonal original Figura 127 Primeiro a ligação de uma molécula de hormônio a uma molécula de rica A subunidade B reconhece e ligase a gangliosídeos específicos na superfície das células do epitélio intesti nal fornecendo uma via para a entrada da subunidade A nessas células Após a entrada a subunidade A é quebra da em dois fragmentos o fragmento A1 e o fragmento A2 A1 então associase com o fator de ribosilação de ADP ARF6 pequena proteína G das células hospedeiras por meio de resíduos nas regiões comutadoras I e II as quais estão acessíveis apenas quando ARF6 está em sua for ma ativa ligada a GTP Essa associação com ARF6 ativa A1 que catalisa a transferência de ADPribose do NAD 1 ao resíduo de Arg crítico da alça P da subunidade a de Gs Figura 5 A ADPribosilação bloqueia a atividade GTPásica de Gs e assim torna Gs permanentemente ativa Isso resulta na contínua ativação da adenililciclase das células do epitélio intestinal cAMP cronicamente ele vada e PKA cronicamente ativa A PKA fosforila o canal de Cl CFTR ver Quadro 112 e um trocador de Na 1H 1 das células do epitélio intestinal O resultante efluxo de NaCl provoca uma perda massiva de água pelo intestino à medida que as células respondem ao desequilíbrio os mótico que se estabelece A severa desidratação e a per da de eletrólitos são as principais patologias do cólera Elas podem ser fatais na ausência de uma rápida terapia de reidratação A toxina pertussis produzida por Bordetella per tussis catalisa a ADPribosilação da subunidade a de Gi impedindo a troca GDPGTP e bloqueando a inibição da adenililciclase por Gi A bactéria infecta o trato respira tório onde destrói as células do epitélio ciliar que nor malmente removem o muco Sem a ação ciliar uma tosse forte é necessária para a limpeza do trato respiratório isso origina os nomes tosse comprida ou tosse espasmó dica que disseminam a bactéria para outras pessoas dessa doença Ainda não está claro como o defeito na sinalização por proteína G causa a morte das células do epitélio ciliar Dado o grande número de receptores associados a proteínas G no genoma humano é provável que estu dos futuros revelem muito mais exemplos de como os defeitos na sinalização por proteínas G afetam a saúde humana Gs Gs CH2 O OH P O2 H N H H H NH2 O O H O O C O 2 P O2 O O Rib Adenina 1 NH2 C NAD 1 1 Toxina do cólera CH2 OH P O2 H H H H O O H O O O P O2 O O O Rib Adenina N Arg NH ADPribose Gs normal A atividade GTPásica finaliza a sinalização do receptor para a adenililciclase b a a b g g Gs ADPribosilada A atividade GTPásica está inativada Gs ativa constantemente a adenililciclase NH Arg FIGURA Q5 As toxinas bacterianas que causam cólera e coqueluche toxina pertussis são enzimas que catalisam a transferência da porção ADPribose do NAD 1 a um resíduo de Arg de Gs no caso da toxina do cólera como mostrado aqui ou a um resíduo de Cys de Gi toxina pertussis As proteínas G assim modificadas não respondem aos estímulos hormonais normais A patologia de ambas as doenças é causada pela regulação alterada da adenilil ciclase e superprodução de cAMP Nelson6edbookindb 443 Nelson6edbookindb 443 030414 0743 030414 0743 444 DAVID L NELSON MICHAEL M COX receptor ativa cataliticamente muitas moléculas Gs que se associam com o receptor ativado uma após a outra Depois pela ativação de uma molécula de adenililciclase cada mo lécula de Gsa estimula a síntese catalítica de muitas molé culas de cAMP O segundo mensageiro cAMP então ativa a PKA e cada molécula da enzima catalisa a fosforilação de muitas moléculas da proteínaalvo a cinase da fosforilase b na Figura 127 Essa cinase ativa a glicogêniofosforilase b o que leva à rápida mobilização de glicose a partir de gli cogênio O efeito líquido da cascata é a amplificação do sinal hormonal em várias ordens de magnitude o que justifica a necessidade de concentrações muito baixas de adrenalina ou qualquer outro hormônio para a atividade hormonal Diversos mecanismos levam ao término da resposta badrenérgica Para ser funcional um sistema de transdução de sinal deve ser desligado após o término do estímulo pelo hormônio ou por outra molécula e os mecanismos para a desativação do sinal são intrínsecos a todos os sistemas de sinalização A maioria dos sistemas também se adapta à presença con TABELA 122 Algumas enzimas e outras proteínas reguladas por fosforilação dependente de cAMP por PKA Enzimaproteína Sequência fosforilada Rotaprocesso regulado Glicogêniosintase RASCTSSS Síntese de glicogênio Cinase da fosforilase b subunidade a subunidade b VEFRRLSI RTKRSGSV Degradação de glicogênio Piruvatocinase de fígado de rato GVLRRASVAZL Glicólise Complexo piruvatodesidrogenase tipo L GYLRRASV Piruvato a acetilCoA Lipase sensível a hormônio PMRRSV Mobilização de triacilgliceróis e oxidação de ácidos graxos Fosfofrutocinase2frutose26bifosfatase LQRRRGSSIPQ Glicólisegliconeogênese Tirosinahidroxilase FIGRRQSL Síntese de Ldopa dopamina noradrenalina e adrenalina Histona H1 AKRKASGPPVS Condensação do DNA Histona H2B KKAKASRKESYSVYVYK Condensação do DNA Fosfolambano cardíaco regulador da bomba cardíaca AIRRAST Ca 21 intracelular Inibidor 1 da proteínafosfatase1 IRRRRPTP Desfosforilação de proteínas Sequência consenso da PKA xRRKxSTB Muitas O resíduo de S ou T fosforilado está mostrado em vermelho Todos os resíduos estão mostrados na abreviação de uma letra ver Tabela 31 x é qualquer aminoácido B é qualquer aminoácido hidrofóbico Ver no Quadro 32 as convenções na descrição de sequências consenso 1 molécula Complexo adre nalinareceptor 1 molécula PKA ativa PKA inativa 100 moléculas Cinase da fosforilase b ativa 1000 moléculas Cinase da fosforilase b inativa Glicogênio fosforilase a ativa 10000 moléculas Glicogênio fosforilase b inativa Glicogênio Glicose 1fosfato Hepatócito ATP AMP cíclico Adenilil ciclase 200 moléculas 10 moléculas Glicose no sangue Glicose 100000 moléculas Adrenalina 100000 moléculas GSa FIGURA 127 A cascata da adrenalina A adrenalina desencadeia uma série de reações nos hepatócitos nas quais catalisadores ativam catalisado res resultando em uma grande amplificação do sinal hormonal original Os números de moléculas mostrados simplesmente ilustram a amplificação e são quase certamente meras estimativas A ligação de uma molécula de adrenalina a um receptor badrenérgico ativa diversas possivelmente cen tenas de proteínas G uma após a outra e cada qual ativa uma molécula da enzima adenililciclase A adenililciclase atua cataliticamente produzindo muitas moléculas de cAMP para cada adenililciclase ativada Como são ne cessárias duas moléculas de cAMP para ativar uma subunidade catalítica de PKA esta etapa não amplifica o sinal Nelson6edbookindb 444 Nelson6edbookindb 444 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 445 tínua do sinal por tornarse menos sensível no processo de dessensibilização O sistema badrenérgico ilustra ambos Quando a concentração de adrenalina na corrente sanguí nea diminui ficando menor que a da Kd do receptor o hor mônio se dissocia do receptor e este reassume a conforma ção inativa na qual não mais consegue ativar Gs Uma segunda maneira de extinguir a resposta ao es tímulo badrenérgico é pela hidrólise do GTP ligado à subunidade Ga catalisada pela atividade GTPásica intrín seca da proteína G A conversão do GTP ligado em GDP favorece o retorno de Ga à conformação na qual ela ligase às subunidades Gbγ a conformação em que a proteína G é incapaz de interagir com a adenililciclase ou estimulála Isso encerra a produção de cAMP A taxa de inativação de Gs depende da atividade GTPásica que é bastante fraca na subunidade Ga isolada Entretanto as proteínas ativa doras de GTPase GAP ativam fortemente essa atividade de GTPase levando à inativação mais rápida da proteína G ver Quadro 122 As próprias GAP podem ser reguladas por outros fatores estabelecendo uma regulação mais pre cisa da resposta ao estímulo badrenérgico Um terceiro mecanismo para o término da resposta é a remoção do se gundo mensageiro a hidrólise do cAMP a 5AMP sem ati vidade como segundo mensageiro pela fosfodiesterase de nucleotídeo cíclico a cAMPfosfodiesterase Figura 124a etapa ➐ 124b Por último ao final da rota de sinalização os efeitos me tabólicos que resultam da fosforilação enzimática são rever tidos pela ação de fosfoproteínafosfatases que hidrolisam resíduos de Ser Thr ou Tyr fosforilados liberando fosfato inorgânico Pi Cerca de 150 genes do genoma humano co dificam para fosfoproteínafosfatases menos do que o nú mero de genes que codificam proteínascinases 500 Al gumas dessas fosfatases são sabidamente reguladas outras podem agir constitutivamente Quando a cAMP diminui e a PKA retorna à forma inativa etapa ➐ na Figura 124a o equilíbrio entre fosforilação e desfosforilação é deslocado na direção da desfosforilação por essas fosfatases O receptor badrenérgico é dessensibilizado pela fosforilação e pela associação com arrestina Os mecanismos para o término da sinalização descritos an teriormente se iniciam com o término do estímulo Um me canismo diferente a dessensibilização suprime a resposta mesmo enquanto o sinal persiste A dessensibilização do receptor badrenérgico é mediada por uma proteínacinase que fosforila o receptor no domínio intracelular que nor malmente interage com Gs Figura 128 Quando o re ceptor é ocupado pela adrenalina a cinase do receptor badrenérgico ou bARK de badrenergic receptor ki nase também chamada de GRK2 ver seguir fosforila FIGURA 128 Dessensibilização do receptor badrenérgico na presença constante de adrenalina Este processo é mediado por duas proteínas cinase do receptor badrenérgico bARK e barrestina barr também chamada de arrestina2 A ligação de adrenalina E ao receptor badrenérgico promove a dissociação entre Gsbg e Gsa não mostrado Gsbg recruta bARK para a membrana onde fosforila resíduos de Ser na extremidade carboxiterminal do receptor barrestina barr se liga ao domínio carboxiterminal fosforilado do receptor O complexo receptorarrestina entra na célula por endocitose Na vesícula endocítica a arrestina dissociase o receptor é desfosforilado e retorna à superfície celular ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ E Gs g b Gs g b E E P Membrana plasmática P P P P P bARK barr P P Nelson6edbookindb 445 Nelson6edbookindb 445 030414 0743 030414 0743 446 DAVID L NELSON MICHAEL M COX alguns resíduos de Ser próximos à extremidade carboxi terminal do receptor localizada na face citoplasmática da membrana plasmática Geralmente situada no citosol a bARK é recrutada à membrana plasmática pela associação com as subunidades Gsbγ estando assim posicionada para fosforilar o receptor A fosforilação do receptor cria um sítio de ligação para a proteína barrestina ou barr também chamada de arrestina2 e a ligação de barrestina impe de de maneira eficiente a interação adicional entre o recep tor e a proteína G A ligação de barrestina também facilita o sequestro do receptor a remoção das moléculas do re ceptor da membrana plasmática por endocitose em peque nas vesículas intracelulares O complexo arrestinareceptor recruta duas proteínas envolvidas na formação de vesículas ver Figura 2745 o complexo AP2 e a clatrina que ini ciam a invaginação da membrana levando à formação de endossomos contendo o receptor adrenérgico Nesse es tado os receptores não são acessíveis à adrenalina e são portanto inativos Os receptores nessas vesículas endocíti cas serão por fim desfosforilados e retornarão à membrana plasmática completando o circuito e tornando o sistema novamente sensível à adrenalina A cinase do receptor b adrenérgico é um membro de uma família de cinases dos receptores associados a proteínas G GRK de G pro teincoupled receptor kinases e todas fosforilam GPCR nos domínios citoplasmáticos carboxiterminais e atuam si milarmente à bARK na dessensibilização e ressensibilização dos receptores Pelo menos cinco GRK diferentes e quatro diferentes arrestinas são codificadas no genoma humano cada GRK é capaz de dessensibilizar um subconjunto espe cífico de GPCR e cada arrestina pode interagir com muitos tipos diferentes de receptores fosforilados O AMP cíclico age como segundo mensageiro para muitas moléculas reguladoras A adrenalina é somente um de muitos hormônios fatores de crescimento e outras moléculas reguladoras que atuam por alteração na cAMP intracelular e desta maneira na atividade da PKA Tabela 123 Por exemplo o glucagon se liga ao seu receptor na membrana plasmática dos adi pócitos ativando via uma proteína Gs a adenililciclase A PKA estimulada pelo resultante aumento na cAMP fosfo rila e ativa duas proteínas essenciais para a mobilização dos ácidos graxos dos depósitos de gordura ver Figura 173 Similarmente o hormônio peptídico ACTH hormônio adre nocorticotrópico de adrenocorticotropic hormone tam bém chamado de corticotropina produzido pela hipófise anterior se liga a receptores específicos no córtex suprar renal ativando a adenililciclase e elevando a cAMP in tracelular A PKA então fosforila e ativa diversas enzimas necessárias para a síntese de cortisol e outros hormônios esteroides Em muitos tipos de células a subunidade cata lítica da PKA também pode transportarse para dentro do núcleo onde fosforila a proteína de ligação do elemento de resposta a cAMP CREB de cAMP response element binding protein que altera a expressão de genes especí ficos regulados por cAMP Alguns hormônios agem por meio da inibição da ade nililciclase desta maneira reduzindo a cAMP e supri mindo a fosforilação de proteínas Por exemplo a ligação da somatostatina ao seu receptor causa a ativação de uma proteína G inibitória ou Gi estruturalmente homólo ga a Gs que inibe a adenililciclase e diminui a cAMP A somatostatina portanto contrabalança os efeitos do glu cagon No tecido adiposo a prostaglandina E1 PGE1 ver Figura 1018 inibe a adenililciclase reduzindo a cAMP e retardando a mobilização das reservas lipídicas iniciada por adrenalina e glucagon Em outros tecidos a PGE1 esti mula a síntese de cAMP seus receptores estão acoplados à adenililciclase por uma proteína G estimulatória Gs Nos tecidos com receptores a2adrenérgicos a adrenalina dimi nui a cAMP nesse caso os receptores estão acoplados à adenililciclase por meio de uma proteína G inibitória Gi Em resumo um sinal extracelular como a adrenalina ou a PGE1 pode ter efeitos completamente diferentes em dife rentes tecidos ou tipos celulares dependendo de três fato res o tipo de receptor no tecido o tipo de proteína G Gs ou Gi ao qual o receptor está acoplado e o conjunto de en zimasalvo da PKA nas células Somando as influências que tendem a aumentar e diminuir a cAMP a célula integra os sinais previamente mencionados como característica geral dos mecanismos de transdução de sinal Figura 121e Outro fator que explica de que modo tantos sinais dife rentes podem ser mediados por um único segundo mensa geiro cAMP é a restrição dos processos de sinalização a regiões específicas da célula por meio das proteínas adap tadoras proteínas não catalisadoras que agrupam outras moléculas de proteínas que agem em conjunto descritas em mais detalhes a seguir AKAP de A kinase ancho ring proteins ou proteínas de ancoragem da cinase TABELA 123 Alguns sinais que utilizam cAMP como segundo mensageiro Corticotropina ACTH Hormônio liberador de corticotropina CRH Dopamina D1 D2 Adrenalina badrenérgico Hormônio folículoestimulante FSH Glucagon Histamina H2 Hormônio luteinizante LH Hormônio estimulante de melanócitos MSH Odorantes muitos Hormônio da paratireoide Prostaglandinas E1 E2 PGE1 PGE2 Serotonina 5HT1a 5HT2 Somatostatina Moléculas de sabor doce amargo Hormônio estimulante da tireoide Nota Subtipos dos receptores entre colchetes Os subtipos podem ter diferen tes mecanismos de transdução Por exemplo a serotonina é detectada em alguns tecidos por receptores dos subtipos 5HT1a e 5HT1b que agem via adenilil ciclase e cAMP e em outros tecidos pelo receptor do subtipo 5HT1c que age pelo mecanismo da fosfolipase CIP3 ver Tabela 124 Nelson6edbookindb 446 Nelson6edbookindb 446 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 447 A são proteínas adaptadoras multivalentes uma região da proteína se liga às subunidades R da PKA ver Figura 126a e outra a uma estrutura específica da célula confinando a PKA à adjacência daquela estrutura Por exemplo AKAP específicas ligam PKA a microtúbulos filamentos de acti na canais iônicos mitocôndrias ou núcleo Diferentes tipos celulares têm diferentes complementos de AKAP de ma neira que cAMP pode estimular a fosforilação de proteínas mitocondriais em uma célula e a fosforilação de filamentos de actina em outra Em alguns casos uma AKAP conecta a PKA à enzima que leva à ativação da PKA adenililciclase ou que extingue a ação da PKA cAMPfosfodiesterase ou fosfoproteínafosfatase Figura 129 A grande proximi dade dessas enzimas de ativação e inativação presumivel mente desencadeia uma resposta muito breve e extrema mente localizada É agora evidente que para entender completamente a sinalização celular pesquisadores necessitam de ferra mentas suficientemente precisas para detectar e estudar os aspectos espaciais e temporais dos processos de sina lização no nível subcelular e em tempo real Para os estu dos da localização intracelular das variações bioquímicas a bioquímica encontra a biologia celular e as técnicas que cruzam esta fronteira têm se mostrado essenciais para a compreensão das rotas de sinalização As sondas fluores centes têm encontrado ampla aplicação nos estudos so bre sinalização A marcação de proteínas funcionais com marcador fluorescente como a proteína fluorescente ver de GFP de green fluorescent protein revela as locali zações subcelulares ver Figura 916c As variações no estado de associação de duas proteínas como as subuni dades R e C da PKA podem ser estimadas pela medida da transferência não radioativa de energia entre sondas fluorescentes ligadas a cada proteína técnica chamada de transferência de energia por ressonância de fluorescên cia FRET de fluorescence resonance energy transfer Quadro 123 Diacilglicerol inositoltrifosfato e Ca 21 têm funções relacionadas como segundos mensageiros Uma segunda ampla classe de GPCR se acopla por meio de uma proteína G a uma fosfolipase C PLC da mem brana plasmática a qual é específica para o fosfolipídeo de membrana fosfatidilinositol45bifosfato ou PIP2 ver Fi gura 1016 Quando um dos hormônios que agem por esse mecanismo Tabela 124 ligase ao receptor específico na membrana plasmática Figura 1210 etapa ➊ o comple xo receptorhormônio catalisa a troca de GDP por GTP em uma proteína G associada Gq etapa ➋ ativandoa de ma neira muito semelhante à ativação de Gs pelo receptor adre nérgico Figura 124 A proteína Gq ativada ativa a PLC específica para PIP2 Figura 1210 etapa ➌ que catalisa etapa ➍ a produção de dois potentes segundos mensa geiros diacilglicerol e inositol145trifosfato ou IP3 não o confunda com PIP3 p 456 C Adenilil ciclase Gs Receptor badrenérgico PP2A C cAMP ATP ATP Pi R R C C PKA Palmitoil PIP3 AKAP5 Proteína alvo P FIGURA 129 A nucleação de complexos supramoleculares pelas proteínas de ancoragem da cinase A AKAP A AKAP5 pertence a uma família de proteínas que atuam como arcabouços multivalentes manten do as subunidades catalíticas da PKA por meio da interação da AKAP com as subunidades reguladoras da PKA próximas a uma região ou estrutura celular específica A AKAP5 é direcionada às balsas lipídicas na superfície citoplasmática da membrana plasmática por dois grupos palmitoil ligados covalentemente e por um sítio de ligação ao fosfatidilinositol345trifosfato PIP3 A AKAP5 também tem sítios de ligação para o receptor badrenérgico adenililciclase PKA e uma fosfoproteínafosfatase PP2A aproximando to das estas proteínas no plano da membrana Quando a adrenalina ligase ao receptor badrenérgico Gsa induz a produção de cAMP pela adenililciclase que chega rapidamente e com muito pouca diluição até a PKA próxima A PKA fosforila sua proteínaalvo alterando sua atividade até que a fosfoprote ínafosfatase remova o grupo fosfato e retorne a proteínaalvo ao seu estado préestímulo As AKAP neste e em outros casos originam uma alta concen tração local de enzimas e segundos mensageiros de modo que o circuito de sinalização permanece extremamente localizado e a duração do sinal é limitada TABELA 124 Alguns sinais que atuam por meio de fosfolipase C IP3 e Ca 21 Acetilcolina muscarínico M1 Peptídeo liberador de gastrina Fator de crescimento derivado de plaquetas PDGF Agonistas a1adrenérgicos Glutamato Serotonina 5HT1c Angiogenina Hormônio liberador de gonadotropina GRH Hormônio liberador de tireotropina TRH Angiotensina II Histamina H1 Hormônio antidiurético ATP P2x P2y Luz Drosophila Auxina Ocitocina Nota Subtipos dos receptores estão entre colchetes ver nota de rodapé da Tabela 123 Nelson6edbookindb 447 Nelson6edbookindb 447 030414 0743 030414 0743 As sondas fluorescentes são comumente utilizadas para a rápida detecção de variações biológicas em células vi vas isoladas Elas podem ser desenvolvidas de modo a informarem quase que instantaneamente dentro de na nossegundos as variações nas concentrações celulares de um segundo mensageiro ou na atividade de uma pro teínacinase Além disso a microscopia de fluorescência apresenta resolução suficiente para revelar em qual local da célula tais alterações estão acontecendo Em um pro cedimento muito utilizado as sondas fluorescentes são derivadas de uma proteína fluorescente que ocorre na turalmente a proteína fluorescente verde GFP da águaviva Aequorea victoria Figura Q1 Quando excitada pela absorção de um fóton de luz a GFP emite um fóton isto é fluoresce na região do verde do espectro O centro de absorçãoemissão de luz da GFP seu cromóforo é constituído por uma forma oxidada do tripeptídeo Ser 65Tyr 66Gly 67Figura Q2 A oxidação do tripeptídeo é catalisada pela própria proteína GFP Figu ra Q3 de maneira que é possível clonar essa proteína em praticamente qualquer célula onde ela pode agir como um marcador fluorescente para qualquer proteína à qual ela esteja fusionada ver Figura 918 Variantes da GFP com diferentes espectros de fluorescência são gerados por engenharia genética Por exemplo na pro teína fluorescente amarela YFP de yellow fluorescent protein a Ala 206 da GFP é substituída por um resíduo de Lys alterando o comprimento de onda de absorção da luz e a fluorescência Outras variantes da GFP têm fluo rescência azul BFP ou ciano CFP e uma proteína re lacionada tem fluorescência vermelha mRFP1 Figura Q4 A GFP e suas variantes são estruturas compactas que mantêm a capacidade de se dobrar se na conforma ção nativa em barril b mesmo quando fusionadas a outra proteína Essas proteínas híbridas agem como réguas es pectroscópicas para estimar as distâncias entre proteínas que interagem dentro da célula e indiretamente para es timar as concentrações locais de compostos que alterem as distâncias entre duas proteínas Uma molécula fluorescente excitada como a GFP ou a YFP pode gastar a energia do fóton absorvido de duas ma neiras 1 por fluorescência emitindo um fóton com com primento de onda levemente maior menor energia do que o da luz excitante ou 2 por transferência de energia por ressonância de fluorescência FRET na qual a energia da molécula excitada o doador passa diretamente a uma molécula próxima o aceptor sem a emissão de um fóton excitando o aceptor Figura Q5 O aceptor pode então decair ao estado fundamental por fluorescência o fóton emitido tem um comprimento de onda maior menor energia do que o da luz excitante original e a emissão flu orescente do doador Esse segundo modo de decaimento FRET é possível apenas quando doador e aceptor estão próximos um do outro dentro de 1 a 50 Å a eficiência da FRET é inversamente proporcional à sexta potência da distância entre doador e aceptor Portanto variações muito pequenas na distância entre doador e aceptor são registra das como variações muito grandes na FRET medida como a fluorescência emitida pela molécula aceptora quando o doador é excitado Com detectores de luz suficientemente sensíveis este sinal fluorescente pode ser localizado em re giões específicas de uma célula viva isolada A FRET tem sido utilizada para medir a cAMP em células vivas O gene da GFP é fusionado com aquele da subunidade reguladora R da proteínacinase de pendente de cAMP PKA e o gene da BFP é fusionado àquele da subunidade catalítica C Figura Q6 Quan do essas duas proteínas híbridas são expressas em uma célula a BFP doador excitação a 380 nm emissão a 460 QUADRO 123 MÉTODOS FRET a bioquímica vista em uma célula viva FIGURA Q1 Aequorea victoria águaviva abundante na região de Puget Sound no Estado de Washington EUA Cromóforo Ser65Tyr66Gly67 FIGURA Q2 A proteína fluorescente verde GFP com o cromóforo fluo rescente representado na forma de esfera e bastão derivado da estrutura 1GFL do PDB Cromóforo maduro Ser Gly N HN H1 O HO O N O Gly HN HO OH C Ser Tyr HO N O Gly N Ser H H H1 N O Gly N HO OH C Ser O2 H2O2 múltiplas etapas FIGURA Q3 O cromóforo da GFP é derivado de uma série de três aminoácidos Ser 65Tyr 66Gly 67 A maturação do cromóforo envolve um rearranjo interno acoplado a uma reação de oxidação que ocorre em múltiplas etapas Um mecanismo resumido está mostrado aqui Nelson6edbookindb 448 Nelson6edbookindb 448 030414 0743 030414 0743 nm e a GFP aceptor excitação a 475 nm emissão a 545 nm estão suficientemente próximas na PKA inativa tetrâmero R2C2 para ocasionarem FRET Sempre que a cAMP celular aumenta o complexo R2C2 se dissocia em R2 e 2C e o sinal da FRET é perdido pois o doador e o aceptor estão agora muito distantes para uma FRET eficiente Vista sob um microscópio de fluorescência a região de cAMP mais alta apresenta um sinal da GFP mínimo e um sinal da BFP mais alto A medida da razão entre a emissão a 460 nm e a 545 nm fornece uma medida sensível da variação na cAMP Determinando essa razão em todas as regiões da célula os pesquisadores produ zem uma falsa imagem colorida da célula na qual a razão ou a cAMP relativa está representada pela intensidade da cor As imagens gravadas em intervalos de tempo re velam as variações na cAMP ao longo do tempo Uma variação dessa tecnologia tem sido utilizada para medir a atividade da PKA em uma célula viva Figura Q7 Os pesquisadores criaram um alvo para a fosfori lação pela PKA por meio da síntese de uma proteína hí brida que contém quatro elementos YFP aceptor um peptídeo curto com um resíduo de Ser circundado pela sequência consenso da PKA um domínio de ligação a Ser chamado de 1433 e CFP doador Quando o resíduo de Ser não está fosforilado o domínio 1433 não tem afinidade por ele e a proteína híbrida existe em uma forma estendida com o doador e o aceptor muito afastados para a geração de um sinal da FRET Sempre que a PKA estiver ativa dentro da célula o resíduo de Ser da proteína híbrida será fosforilado e o domínio 1433 se ligará a Ser Desta maneira YFP e CFP se aproximam e um sinal da FRET pode ser detectado com um microscó pio de fluorescência revelando a presença da PKA ativa 100 BFP CFP GFP mRFP1 80 60 Fluorescência relativa 40 20 0 400 500 600 Comprimento de onda nm 700 YFP FIGURA Q4 Espectro de emissão das variantes da GFP 433 nm 433 nm 476 nm 527 nm CFP YFP interação proteínaproteína Proteínas híbridas produzidas por engenharia genética FRET FIGURA Q5 Quando a proteína doadora CFP é excitada com luz mo nocromática com comprimento de onda de 433 nm ela emite luz flu orescente de 476 nm à esquerda Quando a proteína em vermelho fusionada a CFP e a proteína em roxo fusionada a YFP interagem a CFP e a YFP ficam suficientemente próximas para permitir a transferência de energia por ressonância de fluorescência FRET entre elas Agora quando a CFP absorve luz de 433 nm em vez de fluorescer a 476 nm ela transfere a energia diretamente para a YFP que então fluoresce em seu compri mento de onda de emissão característico 527 nm A razão entre a emis são de luz de 527 e 476 nm é portanto uma medida da interação entre as proteínas vermelha e a roxa 460 nm 380 nm ativa sem emissão a 545 nm 380 nm 545 nm BFP 380 nm inativa Proteínacinase dependente de cAMP PKA GFP FRET cAMP cAMP R R C CC FIGURA Q6 Medida da cAMP com FRET A fusão de genes cria proteí nas híbridas que exibem FRET quando as subunidades reguladora R e catalítica C da PKA estão associadas baixa cAMP Quando a cAMP aumenta as subunidades se dissociam e a FRET cessa A razão entre a emissão a 460 nm subunidades dissociadas e 545 nm subunidades complexadas portanto fornece uma medida sensível da cAMP ATP sequência consenso da PKA 1433 domínio de ligação à fosfosserina ADP PKA YFP 433 nm 476 nm CFP Ser 433 nm FRET 527 nm P FIGURA Q7 Medida da atividade da PKA com FRET Uma proteína pro duzida por engenharia genética une YFP e CFP por meio de um peptídeo que contém um resíduo de Ser circundado pela sequência consenso para fosforilação pela PKA e o domínio 1433 de ligação a Ser A PKA ati vada fosforila o resíduo de Ser que se associa com o domínio de ligação 1433 aproximando as proteínas fluorescentes suficientemente para permitir a ocorrência da FRET e revelando a presença de PKA ativa Nelson6edbookindb 449 Nelson6edbookindb 449 030414 0743 030414 0743 450 DAVID L NELSON MICHAEL M COX H P O O O H H H H H H H 4 3 2 1 6 Inositol145trifosfato IP3 O O O O P O O P O O O OH O 5 O O inositoltrifosfato composto solúvel em água difun dese da membrana plasmática para o retículo endoplasmá tico RE onde se liga a canais de Ca 21 específicos contro lados por IP3 abrindoos A ação da bomba SERCA ver p 410 assegura que a Ca 21 no RE permaneça várias ordens de magnitude mais alta do que a concentração citosólica de modo que quando esses canais de Ca 21 são abertos o Ca 21 flui para o citosol Figura 1210 etapa ➎ e a Ca 21 cito sólica rapidamente aumenta para aproximadamente 10 6 M Uma consequência da Ca 21 elevada é a ativação da pro teínacinase C PKC O diacilglicerol atua em conjunto com o Ca 21 para a ativação da PKC e portanto o Ca 21 tam bém age como segundo mensageiro etapa ➏ A ativação envolve o afastamento de um domínio da PKC o domínio do pseudossubstrato de sua posição na região de ligação ao substrato da enzima possibilitando que a enzima se li gue e fosforile as proteínas que contenham uma sequência consenso da PKC resíduos de Ser ou Thr inseridos em uma sequência de aminoácidos reconhecida pela PKC eta pa ➐ Existem diversas isoenzimas da PKC cada uma com distribuição tecidual especificidade para a proteínaalvo e função características Seus alvos incluem proteínas do citoesqueleto enzimas e proteínas nucleares que regulam Fosfolipase C PLC PIP2 O hormônio H ligase a um receptor específico O receptor ocupado leva à troca de GDP por GTP na Gqa Gqa ligada a GTP movese até a PLC e a ativa A PLC ativa cliva PIP2 em IP3 e diacilglicerol Retículo endoplasmático O IP3 ligase a um canal de Ca21 controlado por receptor específico liberando o Ca21 sequestrado O diacilglicerol e o Ca21ativam a proteínacinase C na superfície da membrana plasmática Proteína cinase C IP3 Ca21 Canal de Ca21 Membrana plasmática Espaço extracelular Citosol A fosforilação de proteínas celulares pela proteínacinase C desencadeia algumas das respostas celulares ao hormônio Receptor Gqa Gqa H GDP GDP GTP GTP ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ ➏ ➐ Diacilglicerol FIGURA 1210 Fosfolipase C e IP3 ativadas por hormônio Dois segun dos mensageiros intracelulares são produzidos pelo sistema de fosfatidil inositol sensível a hormônio inositol145trifosfato IP3 e diacilglicerol são originados pela clivagem do fosfatidilinositol45bifosfato PIP2 Ambos contribuem para a ativação da proteínacinase C Pelo aumento da Ca 21 citosólica o IP3 também ativa outras enzimas dependentes de Ca 21 assim o Ca 21 também atua como segundo mensageiro Nelson6edbookindb 450 Nelson6edbookindb 450 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 451 a expressão gênica Em conjunto esta família de enzimas desempenha uma ampla variedade de ações na célula afe tando por exemplo a função neuronal e imunológica e a regulação da divisão celular O cálcio é um segundo mensageiro que pode ser localizado no tempo e no espaço Existem muitas variações do esquema básico de sinaliza ção pelo Ca 21 Em muitos tipos de células que respondem a sinais extracelulares o Ca 21 age como um segundo men sageiro que inicia respostas intracelulares como a exocito se nos neurônios e nas células endócrinas a contração nos músculos e os rearranjos do citoesqueleto durante o movi mento ameboide Nas células não estimuladas a Ca 21 ci tosólica é mantida muito baixa 10 27 M por meio da ação de bombas de Ca 21 localizadas no RE na mitocôndria e na membrana plasmática como discutido em mais detalhes a seguir Estímulos hormonais neurais ou outros estímulos causam o influxo de Ca 21 para dentro da célula por meio de canais de Ca 21 específicos da membrana plasmática ou causam a liberação do Ca 21 sequestrado no RE ou na mito côndria elevando em qualquer um dos casos a Ca 21 cito sólica e iniciando uma resposta celular Variações na Ca 21 intracelular são detectadas por pro teínas ligantes de Ca 21 que regulam uma grande variedade de enzimas dependentes de Ca 21 A calmodulina CaM Mr 17000 é uma proteína ácida com quatro sítios de liga ção a Ca 21 de alta afinidade Quando a Ca 21 intracelular aumenta para cerca de 10 6 M 1 μM a ligação do Ca 21 à calmodulina leva a mudanças na conformação da proteína Figura 1211a A calmodulina se associa com diversas proteínas e no estado ligado ao Ca 21 modula suas ativida des Figura 1211b Ela é um membro de uma família de proteínas de ligação ao Ca 21 que também inclui a troponina ver Figura 532 que inicia a contração do músculo esque lético em resposta à elevação na Ca 21 Essa família apre senta em comum uma estrutura de ligação ao Ca 21 a mão EF Figura 1211c A calmodulina é uma subunidade integral das proteínas cinases dependentes de Ca 21calmodulina CaMcina ses dos tipos I a IV Quando a Ca 21 intracelular aumenta em resposta a um estímulo a calmodulina se liga ao Ca 21 sofre uma mudança na conformação e ativa a CaMcinase A cinase então fosforila enzimasalvo regulando suas ativi dades A calmodulina também é uma subunidade de regula ção da cinase da fosforilase b do músculo ativada por Ca 21 Desse modo o Ca 21 inicia as contrações musculares que re querem ATP ao mesmo tempo em que ativa a degradação do glicogênio fornecendo o combustível para a síntese de ATP Muitas outras enzimas também são moduladas pelo Ca 21 por meio da calmodulina Tabela 125 A atividade do segundo mensageiro Ca 21 assim como a do cAMP pode ser espacial mente restrita depois que sua liberação inicia uma resposta local o Ca 21 geralmente é removido antes que possa difun dirse para regiões mais distantes da célula Com muita frequência o nível de Ca 21 não apenas au menta e então diminui mas em vez disso oscila durante um período de alguns segundos Figura 1212 ainda que a concentração extracelular do hormônio que desencadeia a resposta permaneça constante O mecanismo que origina as Mão EF a b Ca2 Hélice E Hélice central longa Hélice F Domínio helicoidal de uma proteína regulada por calmodulina Hélice central longa c FIGURA 1211 Calmodulina A calmodulina proteína mediadora de mui tas reações enzimáticas estimuladas pelo Ca 21 tem quatro sítios de ligação ao Ca 21 de alta afinidade Kd 01 a 1 μM a Modelo em fitas da estrutura cristalográfica da calmodulina PDB ID 1CLL Os quatro sítios de ligação ao Ca 21 estão ocupados pelo íon em roxo O domínio aminoterminal está à esquerda o domínio carboxiterminal está à direita b A calmodulina asso ciada ao domínio helicoidal em vermelho da proteínacinase dependente de calmodulina II uma das muitas enzimas que ela regula PDB ID 1CDL Observe que a longa hélice a central da calmodulina visível em a dobrase para trás com a ligação do domínio helicoidal do substrato A hélice central da calmodulina é claramente mais flexível em solução do que no cristal c Cada um dos quatro sítios de ligação ao Ca 21 ocorre em um motivo hélice alçahélice chamado de mão EF também encontrado em muitas outras pro teínas de ligação ao Ca 21 TABELA 125 Algumas proteínas reguladas por Ca 21 e calmodulina Adenililciclase cérebro Proteínascinases dependentes de Ca 21calmodulina CaM cinases I a IV Canal de Na 1 dependente de Ca 21 Paramecium Canal de liberação de Ca 21 do retículo sarcoplasmático Calcineurina fosfoproteínafosfatase 2B cAMPfosfodiesterase Canal olfativo regulado por cAMP Canais de Ca 21 e Na 1 regulados por cGMP cones e bastonetes Glutamatodescarboxilase Cinases da cadeia leve da miosina NAD 1cinase Óxido nítricosintase Fosfatidilinositol3cinase ATPase de Ca 21 da membrana plasmática bomba de Ca 21 RNAhelicase p68 Nelson6edbookindb 451 Nelson6edbookindb 451 030414 0743 030414 0743 452 DAVID L NELSON MICHAEL M COX oscilações na Ca 21 presumivelmente envolve a regulação por retroalimentação pelo Ca 21 em alguma parte do processo de liberação de Ca 21 Qualquer que seja o mecanismo o efeito é que um tipo de sinal concentração de hormônio por exem plo é convertido em outro frequência e amplitude de picos de Ca 21 intracelular O sinal do Ca 21 decresce conforme o íon se difunde para longe da fonte inicial canal de Ca 21 é sequestrado no RE ou é bombeado para fora da célula Existe uma interconexão significativa entre os sistemas de sinalização do Ca 21 e do cAMP Em alguns tecidos tanto a enzima que produz cAMP adenililciclase quanto a en zima que degrada cAMP fosfodiesterose são estimuladas por Ca 21 Variações espaciais e temporais na Ca 21 podem portanto produzir variações transitórias e localizadas na cAMP Anteriormente foi mencionado que a PKA a enzi ma que responde ao cAMP frequentemente é parte de um complexo supramolecular altamente localizado agrupado sobre proteínas de ancoragem como as AKAP Essa locali zação subcelular das enzimasalvo combinada aos gradien tes espaciais e temporais nas Ca 21 e cAMP permite que a célula responda a diferentes sinais por meio de variações metabólicas sutis localizadas no tempo e no espaço Os GPCR são responsáveis por mediar as ações de uma ampla variedade de sinais O genoma humano codifica aproximadamente 1000 re ceptores acoplados a proteínas G reconhecíveis por seus sete segmentos transmembrana helicoidais e por determi nados resíduos altamente conservados Cada um desses é seletivamente expresso em determinados tipos celulares ou sob determinadas condições Juntos eles permitem que as células e tecidos respondam a uma ampla gama de estí mulos diferentes incluindo diversas aminas de baixa massa molecular peptídeos proteínas eicosanoides e outros lipí deos assim como luz e compostos detectados pelo olfato e gustação A determinação das estruturas de vários GPCR por cristalografia Figura 1213 incluindo o receptor badrenérgico com sua proteína G e o receptor de hista mina tem gerado grande interesse tanto a respeito dos mecanismos de transdução quanto a respeito das possibi lidades de alterar as atividades desses receptores com fár macos Esses dois receptores são os alvos de uma variedade de amplamente utilizados betabloqueadores e antihistamí nicos respectivamente As semelhanças nas estruturas dos GPCR vão além do padrão com sete hélices transmembrana comum as estruturas de cinco GPCR diferentes são quase sobreponíveis Figura 1213c Claramente algum fator na sua estrutura tridimensional os torna transdutores eficazes para muitos sinais diferentes RESUMO 122 Receptores associados a proteínas G e segundos mensageiros c Receptores associados a proteínas G GPCR compar tilham um arranjo estrutural comum com sete hélices transmembrana e agem por meio de proteínas G hetero triméricas Após a interação com o ligante os GPCR ca talisam a troca de GDP por GTP na proteína G causando a dissociação da subunidade Ga a subunidade Ga então estimula ou inibe a atividade de uma enzima efetora afe tando o nível do segundo mensageiro produzido c O receptor badrenérgico ativa uma proteína G estimu latória Gs ativando a adenililciclase e elevando a con centração do segundo mensageiro cAMP O cAMP es timula a fosforilação de enzimasalvo importantes pela proteínacinase dependente de cAMP alterando suas atividades c Cascatas enzimáticas nas quais uma única molécula de hormônio ativa um catalisador que ativa outro catalisa dor e assim por diante resultam em uma grande ampli ficação do sinal o que é característico dos sistemas de receptores de hormônios c A concentração de cAMP é ao final reduzida pela cAMPfosfodiesterase e a proteína Gs desliga a si mes ma pela hidrólise do GTP ligado a GDP funcionando como um comutador binário autolimitante 0 05 10 Ca21 mM a Ca21 citosólica nM Tempo s 0 b 100 100 200 300 400 600 200 300 400 500 FIGURA 1212 O desencadeamento das oscilações na Ca 21 in tracelular por sinais extracelulares a Um corante fura que mostra alterações na fluorescência quando se liga ao Ca 21 difundese para dentro das células e a emissão de luz instantânea é medida por microscopia de fluorescência A intensidade da fluorescência está representada por cores a escala de cores relaciona a intensidade da cor com a Ca 21 permitindo a determinação da Ca 21 absoluta Neste caso timócitos células do timo foram estimulados com ATP extracelular o que eleva a Ca 21 intracelular A resposta das células é heterogênea algumas apresentam Ca 21 intracelular alta em vermelho e outras muito mais baixa em azul b Quando uma sonda como esta é utilizada em um único hepatócito o agonista noradre nalina cuja adição está marcada pela seta causa oscilações na Ca 21 de 200 a 500 nM Oscilações similares são induzidas em outros tipos celulares por outros sinais extracelulares Nelson6edbookindb 452 Nelson6edbookindb 452 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 453 c Quando o sinal da adrenalina persiste a proteínacinase específica para o receptor badrenérgico e a barrestina dessensibilizam temporariamente o receptor e levam à sua internalização em vesículas intracelulares c Alguns receptores estimulam a adenililciclase por meio de Gs outros a inibem por meio de Gi Portanto a cAMP celular reflete a entrada integrada de dois ou mais sinais c Proteínas adaptadoras não catalisadoras como as AKAP aproximam as proteínas envolvidas em um pro cesso de sinalização aumentando a eficiência de suas interações e em alguns casos confinando o processo a uma localização subcelular específica c Alguns GPCR atuam por meio de uma fosfolipase C da membrana plasmática que cliva PIP2 em diacilglicerol e IP3 Pela abertura de canais de Ca 21 no retículo endo plasmático o IP3 eleva a Ca 21 intracelular O diacilgli cerol e o Ca 21 agem em conjunto para ativar a proteína cinase C a qual fosforila proteínas celulares específicas e assim modula suas atividades A Ca 21 também re gula frequentemente via calmodulina muitas outras enzimas e proteínas envolvidas em secreção rearranjos do citoesqueleto ou contrações 123 Receptores tirosinacinases Os receptores tirosinacinases RTK de receptor tyrosi ne kinases uma grande família de receptores da membrana plasmática com atividade cinásica intrínseca transduzem os sinais extracelulares por um mecanismo fundamentalmente diferente daquele dos GPCR Os RTK têm um domínio de interação com o ligante na face extracelular da membrana plasmática e um sítio ativo enzimático na face citoplasmá tica conectados por um único segmento transmembrana O domínio citoplasmático é uma proteínacinase que fosforila resíduos de Tyr em proteínasalvo específicas uma tirosina cinase Os receptores da insulina e do fator de crescimento da epiderme são os protótipos desse grupo A estimulação do receptor de insulina desencadeia uma cascata de reações de fosforilação de proteínas A insulina regula tanto as enzimas do metabolismo quanto a expressão gênica Ela não entra nas células mas inicia um sinal que viaja por uma rota ramificada desde o receptor na membrana plasmática até as enzimas sensíveis à insulina no citosol e também até o núcleo onde estimula a transcri ção de genes específicos O receptor proteico de insulina INSR de insulin receptor ativo é constituído por duas subunidades a idênticas que se projetam para fora da face externa da membrana plasmática e por duas subunidades b transmembrana com as regiões carboxiterminais proje tandose para dentro do citosol um dímero de monômeros ab Figura 1214 As subunidades a contêm o domínio de ligação à insulina e os domínios intracelulares das subu nidades b contêm a atividade proteínacinásica que trans fere um grupo fosfato do ATP para o grupo hidroxil de resí duos de Tyr em proteínasalvo específicas A sinalização por meio do INSR é iniciada quando a ligação de uma molécula de insulina entre as duas subunidades do dímero ativa a ati vidade Tyrcinásica e cada subunidade b fosforila três resí duos de Tyr críticos próximos ao carboxiterminal da outra subunidade b no dímero ab2 Essa autofosforilação ex põe o sítio ativo da enzima para que ela possa fosforilar os resíduos de Tyr em outras proteínasalvo O mecanismo de ativação da proteínacinase do INSR é similar àquele des crito para PKA e PKC uma região do domínio citoplasmá tico sequência autoinibitória que geralmente oclui o sítio d c a Gsa Gsb Gsg Sítio de ligação ao ligante Doxepina no sítio de ligação ao ligante Receptor b2adrenérgico Receptor de histamina H1 b Análogo da morfina no sítio de ligação ao ligante Receptor de opioide m Dentro Fora FIGURA 1213 O receptor badrenérgico e alguns outros GPCR a O receptor b2adrenérgico e sua proteína G trimérica associada Gs PDB ID 3SN6 O agonista ligado adrenalina está mostrado em amarelo e as su bunidades de Gs estão em três tons de verde b O receptor de opioide m PDB ID 4DKL o alvo da morfina e da codeína com um análogo da morfina no sítio de ligação ao ligante c O receptor de histamina H1 com doxepi na ligada PDB ID 3RZE d As estruturas de cinco GPCR sobrepostas para mostrar a extraordinária conservação da estrutura Estão mostrados o recep tor de adenosina A2A humano em cor de laranja PDB ID 3EML o receptor b1adrenérgico de peru em azul PDB ID 2VT4 o receptor b2adrenérgico humano em verde PDB ID 2RH1 a rodopsina de lula em amarelo PDB ID 2Z73 e a rodopsina bovina em vermelho PDB ID 1U19 Nelson6edbookindb 453 Nelson6edbookindb 453 030414 0743 030414 0743 454 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ativo afastase do sítio ativo após ser fosforilada abrindo o sítio para a ligação de proteínasalvo Figura 1214 Quando o INSR é autofosforilado Figura 1215 etapa ➊ um de seus alvos é o substrato do receptor de insulina1 IRS1 de insulin receptor substrate1 etapa ➋ Uma vez fosforilado em alguns de seus resíduos de Tyr o IRS1 torna se o ponto de nucleação para um complexo de proteínas etapa ➌ que leva a mensagem do receptor de insulina para os alvos finais no citosol e no núcleo por meio de uma longa série de proteínas intermediárias Primeiro um resíduo de Tyr do IRS1 se liga ao domínio SH2 da proteína Grb2 SH2 é a abreviação de Src homology 2 homologia a SRC 2 assim nomeado porque a sequência de um domínio SH2 é si milar àquela da Src pronunciase sarc outra Tyrcinase Di versas proteínas de sinalização contêm domínios SH2 todas as quais ligam resíduos de Tyr em uma proteína associada Grb2 é uma proteína adaptadora sem atividade enzimática intrínseca Sua função é aproximar duas proteínas neste caso IRS1 e a proteína Sos que devem interagir para que a transdução de sinal seja possível Além do domínio SH2 liga ção de Tyr a Grb2 também contém um segundo domínio de ligação à proteína SH3 que se liga a uma região rica em prolina da Sos recrutando a Sos para o crescente complexo receptor Quando ligada a Grb2 a Sos atua como fator de tro ca de nucleotídeos de guanosina GEF catalisando a substi tuição do GDP ligado por GTP na proteína G Ras Insulina Insulina Visão do topo Visão lateral Domínio tirosinacinase inativo não fosforilado a Visão do topo Visão lateral b c d A alça de ativação bloqueia o sítio de ligação ao substrato Tyr1158 Tyr1162 Tyr1163 Asp1132 Asp1132 Proteína alvo Tyr1158 Tyr1162 Tyr1163 A alça de ativação triplamente fosforilada movese drasticamente criando espaço para a proteínaalvo no sítio de ligação ao substrato Domínio tirosinacinase ativo triplamente fosforilado Insulina P P P FIGURA 1214 Ativação da tirosinacinase do receptor de insulina por autofosforilação a A região de ligação à insulina do receptor de insuli na situase fora da célula e compreende b duas subunidades a e as por ções extracelulares de duas subunidades b entrelaçadas para formar o sítio de ligação à insulina representado pelo modelo de contorno da superfície da estrutura cristalográfica derivado da estrutura com identidade no PDB 2DTG A estrutura cristalográfica do domínio transmembrana ainda não foi resolvida A ligação da insulina em vermelho PDB ID 2CEU é comunicada por meio da hélice transmembrana de cada subunidade b aos domínios Tyr cinase conectados e localizados dentro da célula ativandoos a fosforilarem um ao outro em três resíduos de Tyr c PDB ID 1IRK Na forma inativa do domínio Tyrcinase antes da fosforilação dos resíduos de Tyr a alça de ati vação em azulpetróleo acomodase no sítio ativo e nenhum dos resíduos de Tyr críticos estruturas em esfera e bastão em branco e vermelho são fos forilados Esta conformação é estabilizada por ligações de hidrogênio entre a Tyr 1162 e o Asp 1132 d PDB ID 1IR3 A ativação da Tyrcinase permite que cada subunidade b fosforile três resíduos de Tyr Tyr 1158 Tyr 1162 e Tyr 1163 na outra subunidade b Os grupos fosfato estão ilustrados em cor de laranja e verme lho A introdução de três resíduos de Tyr altamente carregados força uma mudança de 30 Å na posição da alça de ativação afastandoa do sítio de liga ção ao substrato que fica disponível para ligar e fosforilar uma proteínaalvo Nelson6edbookindb 454 Nelson6edbookindb 454 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 455 A Ras é o protótipo de uma família de proteínas G pequenas que controlam uma ampla variedade de trans duções de sinal ver Quadro 122 Como a proteína G trimérica que opera com o sistema badrenérgico Figura 125 a Ras pode existir em uma conformação ligada a GTP ativa ou ligada a GDP inativa porém a Ras 20 kDa atua como monômero Quando ligada ao GTP a Ras pode ativar uma proteínacinase Raf1 Figura 1215 etapa ➍ a primeira de três proteínascinases Raf1 MEK e ERK que formam uma cascata na qual cada cinase ativa a pró xima por fosforilação etapa ➎ As proteínascinases MEK e ERK são ativadas pela fosforilação de um resíduo de Thr e um resíduo de Tyr Quando ativada a ERK controla alguns dos efeitos biológicos da insulina entrando no núcleo e fos forilando fatores de transcrição como o Elk1 etapa ➏ que modula a transcrição de aproximadamente 100 genes regu lados pela insulina etapa ➐ alguns dos quais codificam proteínas essenciais para a divisão celular Dessa maneira a insulina atua como fator de crescimento As proteínas Raf1 MEK e ERK são membros de três famílias maiores para as quais diversas nomenclaturas têm sido utilizadas ERK está na família das MAPK proteínas cinases ativadas por mitógenos de mitogenactivated protein kinases mitógenos são sinais extracelulares que induzem mitose e divisão celular Logo após a descoberta da primeira enzima MAPK foi descoberto que esta enzima era ativada por outra proteínacinase que foi então nome ada MAPcinasecinase a MEK pertence a esta família e quando uma terceira cinase que ativava a MAPcinasecinase foi encontrada sua família recebeu o jocoso nome de MAP cinasecinasecinase a Raf1 está nessa família Um pouco menos complicadas são as abreviações para as três famílias MAPK MAPKK MAPKKK As cinases nas famílias MAPK e MAPKKK são específicas para resíduos de Ser ou Thr e as MAPKK nesse caso a MEK fosforilam um resíduo de Ser e um de Tyr de seu substrato uma MAPK nesse caso a ERK Atualmente bioquímicos estão conscientes de que a rota da insulina é somente um exemplo de uma estratégia mais abrangente na qual os sinais hormonais por rotas si milares àquela mostrada na Figura 1215 resultam na fos forilação de enzimasalvo por proteínascinases O alvo da fosforilação com frequência é outra proteínacinase que então fosforila uma terceira proteínacinase e assim por diante O resultado é uma cascata de reações que amplifica o sinal inicial em muitas ordens de magnitude ver Figura 121b As cascatas das MAPK Figura 1215 controlam a sinalização iniciada por diversos fatores de crescimento como o fator de crescimento derivado de plaquetas PDGF de plateletderived growth factor e o fator de crescimen to da epiderme EGF de epidermal growth factor Outra estratégia geral exemplificada pela rota do receptor de in sulina é a utilização de proteínas adaptadoras não enzimáti cas para a união dos componentes de uma via de sinalização ramificada as quais serão apresentadas agora FIGURA 1215 Regulação da expressão gê nica pela insulina por meio de uma cascata de MAPcinases O receptor de insulina INSR consiste em duas subunidades a na face externa da membrana plasmática e duas subunidades b que atravessam a membrana e projetamse para dentro do citosol A ligação da insulina à subuni dade a provoca uma mudança conformacional que permite a autofosforilação dos resíduos de Tyr no domínio carboxiterminal das subunidades b A autofosforilação também ativa o domínio Tyr cinase que então catalisa a fosforilação de outras proteínasalvo A rota de sinalização por meio da qual a insulina regula a expressão de genes espe cíficos envolve uma cascata de proteínascinases em que cada uma delas ativa a próxima O INSR é uma proteínacinase específica para Tyr as outras cinases todas mostradas em azul fosforilam resí duos de Ser ou Thr MEK é uma cinase com dupla especificidade que fosforila tanto um resíduo de Thr quanto um resíduo de Ser na cinase com re gulação extracelular ERK de extracellular regulated kinase MEK é a cinase ativada por mitógeno ativa dora de ERK de mitogenactivated ERKactivated ki nase e SRF é o fator de resposta ao soro de serum response factor O receptor de insulina ligase à insulina e sofre autofosforilação nos resíduos de Tyr carboxiterminais O receptor de insulina fosforila IRS1 em resíduos de Tyr O domínio SH2 de Grb2 ligase à P Tyr de IRS1 Sos ligase à Grb2 e então à Ras causando a liberação do GDP e a ligação de GTP pela Ras A Raf1 fosforila a MEK em dois resíduos de Ser ativandoa A MEK fosforila a ERK em um resíduo de Thr e um de Tyr ativandoa A ERK movese para o núcleo e fosforila fatores de transcrição nucleares como Elk1 ativandoos O Elk1 fosforilado unese a SRF para estimular a transcrição e a tradução de um conjunto de genes necessários para a divisão celular A Ras ativada ligase à Raf1 ativandoa ➋ ➍ ➏ ➐ ➌ ➎ ➊ Insulina a b P P P P P P P P P P P Grb2 Sos Ras GTP GDP Raf1 MEK ERK ERK MEK P P IRS1 IRS1 Citosol Núcleo DNA mRNA P P P ERK Elk1 SRF Elk1 SRF Proteína Nelson6edbookindb 455 Nelson6edbookindb 455 030414 0743 030414 0743 456 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O fosfolipídeo de membrana PIP3 age em uma ramificação da sinalização pela insulina A rota de sinalização da insulina ramificase em IRS1 Fi gura 1215 etapa ➋ Grb2 não é a única proteína que se associa com o IRS1 A enzima fosfoinositídeo3cinase PI3K ligase a IRS1 por meio do domínio SH2 da PI3K Figura 1216 Uma vez ativada a PI3K converte o lipí deo de membrana fosfatidilinositol45bifosfato PIP2 a fosfatidilinositol345trifosfato PIP3 A cabeça polar do PIP3 multiplamente carregada que se projeta da face cito plasmática da membrana plasmática é o ponto inicial para uma segunda ramificação da sinalização envolvendo outra cascata de proteínascinases Quando ligada a PIP3 a prote ínacinase B PKB também chamada de Akt é fosforilada e ativada por outra proteínacinase a PDK1 A PKB ativa da então fosforila resíduos de Ser ou Thr em suas prote ínasalvo uma das quais sendo a glicogêniosintasecinase GSK3 Na forma ativa não fosforilada a GSK3 fosforila a glicogêniosintase inativandoa e deste modo contribuin do para a redução na síntese de glicogênio Esse mecanis mo é apenas parte da explicação para os efeitos da insulina sobre o metabolismo do glicogênio Quando fosforilada pela PKB a GSK3 é inativada Assim impedindo a inativa ção da glicogêniosintase no fígado e no músculo a cascata de fosforilações de proteínas iniciada pela insulina estimu la a síntese de glicogênio Figura 1216 Em uma terceira ramificação da sinalização nos tecidos muscular e adiposo a PKB inicia o movimento mediado por clatrina dos trans portadores de glicose GLUT4 de vesículas internas para a membrana plasmática estimulando a captação da glicose da corrente sanguínea Figura 1216 etapa ➎ ver também o Quadro 111 Como em todas as rotas de sinalização existe um me canismo para o término da atividade da rota da PI3K PKB Uma fosfatase específica para PIP3 PTEN em huma nos remove o grupo fosfato da posição 3 do PIP3 e gera PIP2 que não serve como sítio de ligação para a PKB e a cadeia de sinalização é rompida Em diversos tipos de cân cer o gene para a PTEN com frequência encontrase muta do resultando em um circuito de regulação defeituoso e ní veis anormalmente elevados de PIP3 e de atividade da PKB O resultado parece ser um sinal contínuo para a divisão ce lular e consequentemente para o crescimento tumoral O receptor de insulina é o protótipo de diversos re ceptores enzimáticos com estrutura similar e atividade de RTK Figura 1217 Os receptores para EGF e PDGF por exemplo apresentam semelhanças em estrutura e sequên cia com o INSR e ambos têm uma atividade Tyrcinásica que fosforila IRS1 Muitos desses receptores dimerizam após a interação com o ligante o INSR é uma exceção pois já é um dímero ab2 antes da ligação da insulina O protô O IRS1 fosforilado pelo receptor de insulina ativa a PI3K ligandose ao domínio SH2 A PI3K converte PIP2 em PIP3 A GSK3 inativada por fosforilação não consegue converter a glicogêniosintase GS em sua forma inativa por fosforilação de maneira que a GS permanece ativa A síntese de glicogênio a partir de glicose é acelerada A PKB ligada ao PIP3 é fosforilada pela PDK1 não mostrado Uma vez ativada a PKB fosforila a GSK3 em um resíduo de Ser inativandoa A PKB estimula o movimento do transportador de glicose GLUT4 de vesículas membranosas internas para a membrana plasmática aumentando a captação de glicose P P PKB PI3K PIP2 PIP3 P GS inativa GSK3 ativa GSK3 inativa GS ativa IRS1 Glicose GLUT4 ➊ ➌ ➍ ➎ Glicogênio ➋ P P P P FIGURA 1216 Ação da insulina na síntese de glicogênio e no movi mento de GLUT4 para a membrana plasmática A ativação da PI3cina se PI3K pelo IRS1 fosforilado sinaliza por meio da proteínacinase B PKB o movimento do transportador de glicose GLUT4 para a membrana plasmáti ca e a ativação da glicogêniosintase Nelson6edbookindb 456 Nelson6edbookindb 456 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 457 mero do receptor de insulina é uma unidade ab A ligação de proteínas adaptadoras como Grb2 a resíduos de Tyr é um mecanismo comum para a promoção das interações proteínaproteína iniciadas pelos RTK tópico que será no vamente abordado na Seção 125 Além dos muitos receptores que atuam como proteínas cinases específicas para Tyr os RTK algumas proteínas de membrana semelhantes a receptores têm atividade de Tyrfosfatase Com base nas estruturas dessas proteínas é possível deduzir que seus ligantes são componentes da matriz extracelular ou moléculas da superfície de outras cé lulas Ainda que suas funções em sinalização não sejam tão bem compreendidas quanto as funções dos RTK essas mo léculas claramente têm o potencial para reverter as ações dos sinais que estimulam os RTK O que impeliu a evolução de uma maquinaria de regula ção tão complicada Esse sistema permite que um receptor ativado ative diversas moléculas de IRS1 amplificando o sinal da insulina e possibilita a integração de sinais prove nientes de diferentes receptores como EGFR e PDGFR cada um dos quais podendo fosforilar IRS1 Além disso como IRS1 pode ativar qualquer uma das várias proteínas que contêm domínios SH2 um único receptor que atue por meio de IRS1 pode iniciar duas ou mais rotas de sinaliza ção a insulina afeta a expressão gênica por meio da rota Grb2SosRasMAPK e afeta o metabolismo do glicogênio e o transporte de glicose por meio da rota PI3KPKB Por fim existem diferentes proteínas IRS estreitamente relacio nadas IRS2 IRS3 cada uma com distribuição tecidual e função características enriquecendo ainda mais as possibi lidades de sinalização em rotas iniciadas por RTK O sistema de sinalização via JAKSTAT também envolve atividade tirosinacinásica Uma variação do sistema fundamental dos receptores Tyr cinases são os receptores que não têm atividade cinásica intrínseca mas que quando ocupados pelo ligante se li gam a uma Tyrcinase citosólica Um exemplo é o sistema que regula a formação de eritrócitos em mamíferos O si nal para o desenvolvimento ou citocina nesse sistema é a eritropoietina EPO uma proteína com 165 aminoácidos produzida nos rins Quando a EPO se liga ao seu receptor na membrana plasmática Figura 1218 o receptor di Domínio de interação com o ligante Domínio tirosina cinase Domínio rico em cisteína Domínio rico em leucina Domínio semelhante à Ig Região rica em AspGlu Fora Dentro INSR VEGFR b a PDGFR EGFR TrkA FGFR FIGURA 1217 Receptores tirosinacinases Os receptores de fatores de crescimento que sinalizam por meio da atividade Tyrcinásica incluem os re ceptores de insulina INSR o fator de crescimento vascular endotelial VEGFRo fator de crescimento derivado de plaquetas PDGFR do fator de crescimento da epiderme EGFR do fator de crescimento neural de alta afinidade TrkA e do fator de crescimento de fibroblastos FGFR Todos estes receptores têm um do mínio Tyrcinase na face citoplasmática da membrana plasmática em azul O domínio extracelular é exclusivo para cada tipo de receptor refletindo as espe cificidades dos diferentes fatores de crescimento Estes domínios extracelulares são tipicamente combinações de motivos estruturais como os segmentos ricos em cisteína ou ricos em leucina e os segmentos contendo um dos diversos mo tivos comuns às imunoglobulinas domínios semelhantes à Ig ver Figura 422 Muitos outros receptores deste tipo estão codificados no genoma humano cada qual com domínio extracelular e especificidade para o ligante diferentes Domínio SH2 dimerização NLS Afeta a expressão gênica Cascata das MAPK MAPK Núcleo Citosol a b Eritropoietina P P P P P P P STAT P STAT P STAT P STAT P STAT STAT Grb2 SHC JAK JAK Receptor de EPO FIGURA 1218 O mecanismo de transdução via JAKSTAT do receptor de eritropoietina A ligação da eritropoietina EPO leva à dimerização do receptor de EPO permitindo que a JAK uma Tyrcinase solúvel liguese ao domínio interno do receptor e fosforileo em diversos resíduos de Tyr a Em uma rota de sinalização o domínio SH2 da proteína STAT5 se liga a resíduos de Tyr do receptor aproximandoo da JAK Em seguida à fosforilação do STAT5 pela JAK duas moléculas de STAT5 dimerizam cada uma ligandose ao resíduo Tyr da outra deste modo expondo uma sequência de locali zação nuclear NLS de nuclear localization sequence que direciona o dímero para transporte ao núcleo No núcleo o STAT5 estimula a expressão de genes controlados por EPO b Em uma segunda rota de sinalização após a ligação de EPO e autofosforilação de JAK a proteína adaptadora SHC ligase a Tyr do receptor e Grb2 então ligase a SHC e ativa a cascata das MAPK como no sistema da insulina ver Figura 1215 Nelson6edbookindb 457 Nelson6edbookindb 457 030414 0743 030414 0743 458 DAVID L NELSON MICHAEL M COX meriza e o dímero pode se ligar e ativar a proteínacinase solúvel JAK de Janus kinase A JAK ativada fosforila diversos resíduos de Tyr no domínio citoplasmático do re ceptor de EPO Uma família de fatores de transcrição cole tivamente chamados de STAT de signal transducers and activators of transcription transdutores de sinal e ativa dores da transcrição é também alvo da JAK Um domínio SH2 no STAT5 se liga a resíduos de Tyr no receptor de EPO posicionando o STAT para fosforilação pela JAK em resposta a EPO O STAT5 fosforilado forma dímeros expon do um sinal que faz com que seja transportado para dentro do núcleo No núcleo o STAT5 induz a expressão transcri ção de genes específicos essenciais para a maturação dos eritrócitos Esse sistema JAKSTAT também é utilizado por outras rotas de sinalização incluindo a do hormônio lepti na descrita em detalhes no Capítulo 23 ver Figura 2336 A JAK ativada também pode estimular por meio de Grb2 a cascata das MAPK Figura 1218b que leva a alterações na expressão de genes específicos A Src é outra proteína Tyrcinase solúvel que se associa com determinados receptores quando eles estão interagin do com seus ligantes O domínio característico de ligação a Tyr foi primeiramente descrito na proteína Src sendo depois chamado de domínio de homologia a Src SH2 As interconexões entre sistemas de sinalização são comuns e complexas Embora por simplicidade tenham sido analisadas rotas de sinalização distintas como sequências separadas de eventos que levam a consequências metabólicas separadas existe na verdade uma extensa interconexão entre os sistemas de sinalização O circuito de regulação que governa o me tabolismo é ricamente entrelaçado e estratificado A análise das rotas de sinalização da insulina e da adrenalina foi rea lizada separadamente porém elas não trabalham indepen dentemente A insulina contrapõe os efeitos metabólicos da adrenalina na maioria dos tecidos e a ativação da rota de si nalização da insulina atenua diretamente o sistema de sina lização do receptor badrenérgico Por exemplo a cinase do INSR fosforila diretamente dois resíduos de Tyr na porção citoplasmática do receptor b2adrenérgico e a PKB ativada pela insulina Figura 1219 fosforila dois resíduos de Ser da mesma região A fosforilação desses quatro resíduos de sencadeia a internalização mediada por clatrina do receptor b2adrenérgico retirandoo da membrana plasmática e dimi nuindo a sensibilidade da célula à adrenalina Um segundo tipo de interconexão entre esses receptores ocorre quando os resíduos de Tyr do receptor b2adrenérgico fosforila dos pelo INSR servem como pontos de nucleação para pro teínas contendo domínios SH2 como a Grb2 Figura 1219 lado esquerdo A ativação da MAPK ERK pela insulina ver Figura 1215 é de 5 a 10 vezes maior na presença do recep tor b2adrenérgico presumivelmente devido a essa interco nexão Os sistemas de sinalização que utilizam cAMP e Ca 21 também apresentam uma extensa interação cada um des ses segundos mensageiros afeta a geração e a concentração do outro Um dos maiores desafios da biologia de sistemas é elucidar os efeitos dessas interações nas respostas metabóli cas gerais de cada tecido uma tarefa assustadora RESUMO 123 Receptores tirosinacinases c O receptor de insulina INSR é o protótipo dos recep tores enzimáticos com atividade Tyrcinásica Quando a insulina se liga cada unidade ab do INSR fosforila a subunidade b da unidade associada ativando a função Tyrcinásica do receptor A cinase catalisa a fosforilação de resíduos de Tyr em outras proteínas como IRS1 c Os resíduos de fosfotirosina em IRS1 servem como sí tios de ligação para proteínas contendo domínios SH2 Algumas dessas proteínas como a Grb2 têm dois ou mais domínios de ligação a proteínas e podem atuar como adaptadores que aproximam outras proteínas c A Sos ligada à Grb2 catalisa a troca GDPGTP na Ras uma proteína G pequena a qual por sua vez ativa Grb2 Sos Ras Raf1 Expressão gênica alterada ERK MEK IRS1 PKB Citosol Núcleo GPCR Receptor badrenérgico Internalização do GPCR resposta reduzida do GPCR SHC P P Y P Insulina a b P P P P Y Y S S P P P P Y Y S S P P P P FIGURA 1219 Interconexão entre o receptor de insulina e o receptor b2adrenérgico ou outro GPCR Quando o INSR é ativado pela ligação da insulina sua Tyrcinase fosforila diretamente o receptor b2adrenérgico à direita em dois resíduos de Tyr Tyr 350 e Tyr 364 próximos ao carboxiterminal e indiretamente por meio da ativação da proteínacinase B PKB ver Figura 1216 causa a fos forilação de dois resíduos de Ser na mesma região O efeito destas fosforilações é a internalização do receptor adrenérgico reduzindo a resposta ao estímulo adrenérgico Alternativamente à esquerda a fosforilação catalisada pelo INSR de um GPCR um receptor adrenér gico ou outro receptor em uma Tyr carboxiterminal cria o ponto de nucleação para a ativação da cascata das MAPK ver Figura 1215 com a Grb2 atuando como proteína adaptadora Neste caso o INSR utiliza o GPCR para intensificar seu próprio sinal Nelson6edbookindb 458 Nelson6edbookindb 458 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 459 uma cascata de MAPK que termina com a fosforilação de proteínasalvo no citosol e no núcleo O resultado são mudanças metabólicas específicas e alterações na expressão gênica c A enzima PI3K ativada pela interação com IRS1 con verte o lipídeo de membrana PIP2 em PIP3 tornandoo um ponto de nucleação para proteínas e ramificando a rota de sinalização da insulina c No sistema de sinalização via JAKSTAT uma proteína Tyrcinase solúvel JAK é ativada pela associação com um receptor e então fosforila o fator de transcrição STAT que entra no núcleo e altera a expressão de um conjunto de genes c Existem extensas interconexões entre as rotas de sina lização possibilitando a integração e a regulagem exata de múltiplos efeitos hormonais 124 Receptores guanililciclases cGMP e proteínascinases G As guanililciclases Figura 1220 são enzimas receptoras que quando ativadas convertem GTP no segundo mensa geiro monofosfato cíclico de 35guanosina GMP cí clico cGMP O H P O O P O P H H H N O O PPi O O O O O O O H N N HN CH2 5 Monofosfato cíclico de 35guanosina cGMP H P O O O O H H H N O OH O O H N N HN CH NH2 NH2 2 GTP 3 Muitas das ações do cGMP em animais são mediadas pela proteínacinase dependente de cGMP também chamada de proteínacinase G PKG Quando ativa da por cGMP a PKG fosforila resíduos de Ser e Thr em proteínasalvoOs domínios de regulação e catalítico des sa enzima estão contidos em um único polipeptídeo Mr 80000 Parte do domínio de regulação se encaixa firme mente na fenda de ligação ao substrato A ligação de cGMP força a saída desse pseudossubstrato do sítio de ligação abrindo o sítio para proteínasalvo contendo a sequência consenso da PKG O GMP cíclico transmite diferentes mensagens em dife rentes tecidos Nos rins e no intestino leva a alterações no transporte de íons e retenção de água no músculo cardíaco tipo de músculo liso ele sinaliza relaxamento no cérebro ele pode estar envolvido no desenvolvimento e na função cerebral em adultos A guanililciclase renal é ativada pelo hormônio peptídico fator natriurético atrial ANF de atrial natriuretic factor liberado pelas células do átrio cardíaco quando o coração está estirado pelo aumento do volume sanguíneo Transportado até os rins pelo sangue o ANF ativa a guanililciclase nas células dos ductos cole tores Figura 1220a O aumento resultante na cGMP desencadeia um aumento na excreção renal de Na 1 e con sequentemente de água impelida pela variação na pressão osmótica A perda de água reduz o volume de sangue opon dose ao estímulo que inicialmente causou a secreção de ANF O músculo liso vascular também possui um receptor guanililciclase para o ANF quando ligado a esse receptor o ANF causa o relaxamento vasodilatação dos vasos san guíneos o que aumenta o fluxo de sangue enquanto diminui a pressão sanguínea a b Domínios receptores de interação a ligantes extracelulares Receptores de guanilina e endotoxina Domínios catalíticos formadores de cGMP intracelulares Guanililciclases transmembrânicas Guanililciclase solúvel e ativada por NO Receptor de ANF Sítio de interação com o ligante ANF Heme Fe GTP cGMP FIGURA 1220 Dois tipos de guanililciclase que participam da trans dução de sinal a Um tipo é um homodímero com um único segmento transmembrana em cada monômero o qual conecta o domínio extracelular de interação com o ligante e o domínio intracelular guanililciclase Os re ceptores deste tipo sao utilizados para detectar dois ligantes extracelulares o fator natriurético atrial ANF com receptores em células dos ductos cole tores renais e do músculo liso vascular e a guanilina hormônio peptídico produzido no intestino com receptores em células do epitélio intestinal O receptor de guanilina também é alvo de uma toxina bacteriana que causa diarreia severa b O outro tipo é uma enzima solúvel que contém heme e é ativada por óxido nítrico NO intracelular esta forma está presente em muitos tecidos incluindo o músculo liso do coração e dos vasos sanguíneos Nelson6edbookindb 459 Nelson6edbookindb 459 030414 0743 030414 0743 460 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Um receptor guanililciclase similar presente na mem brana plasmática das células epiteliais que revestem o intestino é ativado pelo peptídeo guanilina Figura 1220a que regula a secreção de Cl no intestino Esse receptor também é o alvo de uma endotoxina proteica termoestável produzida por Escherichia coli e outras bactérias gramnegativas O aumento na cGMP causado pela endotoxina eleva a secreção de Cl e consequente mente diminui a reabsorção de água pelo epitélio intesti nal causando diarreia Um tipo diferente de guanililciclase é uma proteína citosólica fortemente associada a um grupo heme Figura 1220b enzima ativada por óxido nítrico NO de nitric oxide O óxido nítrico é produzido a partir de arginina pela enzima NOsintase dependente de Ca 21 presente em mui tos tecidos de mamíferos difundindose da célula de ori gem para as células próximas Citrulina NH2 NH3 O NH CH23 CH COO NADP NADPH O NOsintase 2 Ca2 Arginina NH2 NH3 C NH CH23 CH COO NH2 C NO O NO é suficientemente apolar para atravessar as mem branas plasmáticas sem um transportador Na célulaalvo ele se liga ao grupo heme da guanililciclase e ativa a produ ção de cGMP No coração uma proteínacinase dependente de cGMP reduz o vigor das contrações por meio do estímulo de bombas de íons que removem o Ca 21 do citosol O relaxamento do músculo cardíaco induzido por NO é uma resposta do mesmo tipo daquela provocada pela nitroglicerina e outros nitrovasodilatadores receitados para o alívio de angina pectoris a dor causada pela con tração de um coração privado de O2 devido ao bloqueio das artérias coronárias O óxido nítrico é instável e sua ação é breve dentro de segundos após a formação ele é oxidado a nitrito ou nitrato Os nitrovasodilatadores produzem um re laxamento prolongado do músculo cardíaco porque são me tabolizados ao longo de algumas horas gerando uma libera ção constante de NO O valor da nitroglicerina para o tratamento de angina foi descoberto acidentalmente nas fábricas que produziam nitroglicerina para uso como explo sivo na década de 1860 Os trabalhadores com angina rela taram que os sintomas eram muito reduzidos durante a se mana de trabalho e que aumentavam durante os finais de semana Os médicos tratando desses pacientes ouviram essa história com tanta frequência que fizeram a conexão e assim foi descoberto um medicamento Os efeitos da síntese de cGMP elevada diminuem quando o estímulo cessa pois uma fosfodiesterase espe cífica cGMPPDE converte o cGMP ao inativo 5GMP Os humanos têm diferentes isoformas da cGMPPDE com diferentes distribuições teciduais A isoforma dos vasos sanguíneos do pênis é inibida pelo fármaco sildenafil Via gra o qual portanto mantém a cGMP elevada após ter sido aumentada por um estímulo apropriado justificando a utilidade desse fármaco para o tratamento da disfunção erétil Sildenafil Viagra S O O O N N N N N HN O O GMP cíclico tem outro modo de ação no olho dos ver tebrados ele causa a abertura de canais iônicos específicos nos cones e bastonetes da retina A função do cGMP será abordada na discussão sobre a visão na Seção 1210 RESUMO 124 Receptores guanililciclases cGMP e proteínas cinases G c Diversos sinais incluindo o fator natriurético atrial e a guanilina agem por meio de receptores enzimáticos com atividade de guanililciclase O cGMP produzido dessa maneira é um segundo mensageiro que ativa a proteínacinase dependente de cGMP PKG Essa en zima altera o metabolismo por meio da fosforilação de enzimasalvo específicas c O óxido nítrico é um mensageiro de vida curta que esti mula uma guanililciclase solúvel elevando a cGMP e ativando a PKG 125 Proteínas adaptadoras multivalentes e balsas lipídicas da membrana Duas generalizações emergiram dos estudos sobre os sis temas de sinalização como aqueles discutidos até este momento 1 proteínascinases que fosforilam resíduos de Tyr Ser e Thr são essenciais para a sinalização dire tamente afetando as atividades de um grande número de substratos proteicos por meio de sua fosforilação e 2 as interações proteínaproteína que resultam da fosforilação reversível de resíduos de Tyr Ser e Thr em proteínas sina lizadoras criam sítios de ancoragem para outras proteí nas que causam efeitos indiretos em proteínas a jusante na rota de sinalização Na verdade muitas proteínas de sinalização são multivalentes elas podem interagir com diversas proteínas diferentes simultaneamente para for mar complexos de sinalização multiproteicos Esta seção apresenta alguns exemplos que ilustram os princípios ge rais das interações proteicas dependentes de fosforilação em rotas de sinalização Módulos proteicos se ligam aos resíduos de Tyr Ser ou Thr das proteínas associadas A proteína Grb2 da rota de sinalização da insulina Figuras 1215 e 1219 ligase por meio do domínio SH2 a outras proteínas que apresentem resíduos de Tyr expostos O ge Nelson6edbookindb 460 Nelson6edbookindb 460 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 461 noma humano codifica pelo menos 87 proteínas que contêm SH2 muitas já conhecidas por participarem da sinalização celular O resíduo de Tyr ligase a uma fenda profunda do domínio SH2 com cada um dos oxigênios do fosfato par ticipando de ligações de hidrogênio ou interações eletrostá ticas as cargas positivas de dois resíduos de Arg são muito importantes para a ligação As diferenças sutis na estrutura dos domínios SH2 são responsáveis pela especificidade da interação das proteínas contendo SH2 com as várias pro teínas que contêm Tyr O domínio SH2 tipicamente in terage com uma Tyr à qual é atribuída a posição 0 e com os próximos três resíduos em direção ao carboxitermi nal designados 11 12 13 Alguns domínios SH2 Src Fyn Hck Nck preferem resíduos negativamente carrega dos nas posições 11 e 12 outros PLCg1 SHP2 têm uma longa fenda hidrofóbica que se liga a resíduos alifáticos nas posições 11 a 15 Essas diferenças definem as diferentes especificidades das subclasses de domínios SH2 Os domínios de ligação a fosfotirosina domínios PTB de phosphotyrosinebinding domain Figura 1221 tam bém se associam a proteínas com Tyr porém suas sequên cias críticas e sua estrutura tridimensional os distinguem dos domínios SH2 O genoma humano codifica 24 proteínas que contêm domínios PTB incluindo o IRS1 com sua função como proteína adaptadora na transdução do sinal da insulina já comentada Figura 1215 Os sítios de ligação a Tyr dos domínios SH2 e PTB nas proteínas às quais eles asso ciamse são criados por Tyrcinases e eliminados por prote ínatirosinafosfatases fosfotirosinafosfatases PTPases Outras proteínascinases sinalizadoras incluindo PKA PKC PKG e membros da cascata das MAPK fosforilam re síduos de Ser ou Thr nas proteínasalvo as quais em alguns casos adquirem a capacidade de interagir com outras pro teínas por meio do resíduo fosforilado desencadeando um processo subsequente Uma sopa de letrinhas de domí nios que se ligam aos resíduos de Ser ou Thr tem sido identificadas e certamente outras ainda serão encontradas Cada domínio protege uma determinada sequência ao redor do resíduo fosforilado de maneira que os domínios repre sentam famílias com sítios de reconhecimento altamente específicos capazes de ligarse a um subconjunto específico de proteínas fosforiladas Em alguns casos a região de uma proteína que se liga a Tyr de um substrato proteico está encoberta pela inte ração com uma Tyr na mesma proteína Por exemplo a proteína Tyrcinase solúvel Src quando fosforilada em um resíduo de Tyr crítico tornase inativa um domínio SH2 que deveria ligarse ao substrato proteico ligase ao invés à Tyr interna Quando esse resíduo de Tyr é hidrolisado por uma fosfoproteínafosfatase a atividade Tyrcinásica da Src é ativada Figura 1222a Similarmente a glicogênio sintasecinase3 GSK3 de glycogen synthase kinase 3 está inativa quando fosforilada em um resíduo de Ser do Tirosina interativa Proteína associada FIGURA 1221 Interação de um domínio PTB com um resíduo de P Tyr de uma proteína associada Identidade no PDB 1SHC O domínio PTB está representado como uma superfície molecular em azul O resíduo de Tyr da proteína associada em vermelho se projeta para dentro de um bolso de ligação no domínio PTB onde ele é firmemente mantido por meio de múltiplas interações não covalentes SH3 SH2 P Tyr Tyr Pro Pro Pro P P P Tyr OH Tyr OH Tyr OH Tyr OH Ser OH Ser OH Ser OH Ser Ser a b Autoinibidas SH3 SH2 Ativas substrato posicionado para fosforilação Glicogênio sintase Sítio ativo Sítio ativo Src GSK3 FIGURA 1222 O mecanismo de autoinibição de Src e GSK3 a Na forma ativa da Tyrcinase Src um domínio SH2 ligase a uma Tyr do subs trato proteico e um domínio SH3 ligase a uma região do substrato rica em prolina alinhando o sítio ativo da cinase com alguns resíduosalvo de Tyr no substrato parte superior Quando a Src é fosforilada em um resíduo de Tyr específico parte inferior o domínio SH2 ligase a Tyr interna em vez de ligarse a Tyr do substrato e o domínio SH3 ligase a uma região inter na rica em prolina impedindo a efetiva ligação enzimasubstrato a enzima está portanto autoinibida b Na forma ativa da glicogêniosintasecinase3 GSK3 um domínio de ligação a Ser interno está disponível para ligar a Ser do substrato a glicogêniosintase e deste modo posicionar a cina se para forforilar os resíduos de Ser vizinhos parte superior A fosforilação de um resíduo de Ser interno permite que um segmento interno da cinase ocupe o sítio de ligação a Ser bloqueando a ligação do substrato parte inferior Nelson6edbookindb 461 Nelson6edbookindb 461 030414 0743 030414 0743 462 DAVID L NELSON MICHAEL M COX domínio autoinibitório Figura 1222b A desfosforilação desse domínio libera a enzima para ligarse e depois fosfo rilar suas proteínasalvo Além dos três resíduos comumente fosforilados em pro teínas existe uma quarta estrutura a partir da qual se formam complexos supramoleculares de proteínas sinalizadoras o grupo polar fosforilado dos fosfatidilinositóis da membrana Muitas proteínas de sinalização contêm domínios como SH3 e PH domínio de homologia à plextrina de plextrin homo logy que se ligam firmemente ao PIP3 que se projeta a partir da face interna da membrana plasmática Sempre que a enzi ma PI3K gerar esse grupo polar fosforilado como acontece em resposta ao sinal da insulina proteínas que se ligam a PIP3 irão agruparse na superfície da membrana A maioria das proteínas envolvidas em sinalização na membrana plasmática tem um ou mais domínios de ligação a proteínas ou fosfolipídeos muitas têm três ou mais sen do portanto multivalentes nas interações com outras pro teínas sinalizadoras A Figura 1223 mostra apenas algu mas das proteínas multivalentes conhecidas por participar da sinalização Muitos dos complexos incluem componentes com domínios de ligação à membrana Considerando que tantos processos de sinalização estabelecemse na super fície interna da membrana plasmática as moléculas que devem colidir para produzir a resposta sinalizadora estão efetivamente confinadas a um espaço bidimensional a su perfície da membrana as colisões aqui são muito mais pro váveis do que no espaço tridimensional do citosol Em resumo um quadro extraordinário de rotas de sina lização tem emergido a partir dos estudos de muitas proteí nas sinalizadoras e seus múltiplos domínios de ligação Um sinal inicial resulta na fosforilação do receptor ou de uma proteínaalvo iniciando o agrupamento de grandes comple xos multiproteicos unidos sobre arcabouços com capacida des de ligação multivalentes Alguns desses complexos con têm diferentes proteínascinases que ativam umas às outras em sequência produzindo uma cascata de fosforilações e uma grande amplificação do sinal inicial As interações en tre as cinases destas cascatas não são deixadas ao acaso das colisões aleatórias no espaço tridimensional Na cascata Adaptador Adaptador Cinase Sinalização pela Ras Fosfatase Regulação do sinal Transcrição Sinalização pelo segundo mensageiro fosfolipídico Alvos da ligação Proteína rica em prolina ou lipídeo de membrana PIP3 Tyr PIP3 Fosfolipídeos dependentes de Ca2 DNA Ativação da transcrição Domínio carboxiterminal marcando a proteína para ligação de ubiquitina Grb2 Shc SH3 PTB Tyrcinase Src SH2 SH3 SH2 SH2 SH3 Tyrfosfatase Shp2 SH2 SH2 SH3 SH2 SH2 C2 PH RasGAP ativadora de GTPase SH2 DNA STAT SH2 SH3 SH2 C2 PH PH PH PLC PLCg PLC TA SH2 SOCS SOCS Tyr P P FIGURA 1223 Alguns módulos de ligação de proteínas sinalizado ras Cada proteína está representada por uma linha com a extremidade aminoterminal à esquerda os símbolos indicam a localização de domínios conservados as especificidades estão listadas na legenda abreviações estão explicadas no texto os retângulos em verde indicam atividades catalíticas O nome de cada proteína está mostrado na extremidade carboxiterminal Estas proteínas sinalizadoras interagem com proteínas fosforiladas ou fos folipídeos em diversos arranjos e combinações para formar complexos de sinalização integrados Nelson6edbookindb 462 Nelson6edbookindb 462 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 463 das MAPK por exemplo uma proteína de ancoragem KSR liga as três cinases MAPK MAPKK e MAPKKK garan tindo sua proximidade e a orientação correta e até mesmo conferindo propriedades alostéricas às interações entre as cinases o que torna essa série de fosforilações sensível a estímulos muitos pequenos Figura 1224 As fosfotirosinafosfatases removem o fosfato dos resíduos de Tyr revertendo o efeito da fosforilação Algumas delas são proteínas de membrana similares a receptores presumivelmente controladas por fatores ex tracelulares ainda não identificados outras PTPases são solúveis e contêm domínios SH2 Além disso as células animais têm proteínas Ser e Thrfosfatases que re vertem os efeitos de proteínascinases específicas para Ser e Thr É possível observar assim que a sinalização ocorre em circuitos proteicos os quais efetivamente conectam o receptor do sinal ao efetor da resposta podendo ser desli gados instantaneamente pela hidrólise de uma única liga ção éster de fosfato a montante A multivalência das proteínas sinalizadoras possibilita a montagem de muitas combinações diferentes de módu los de sinalização sendo cada combinação apropriada para sinais tipos celulares e circunstâncias metabólicas especí ficas gerando diversos circuitos de sinalização de extraor dinária complexidade Balsas lipídicas da membrana e cavéolas podem segregar proteínas sinalizadoras As balsas lipídicas Capítulo 11 são regiões da bicamada da membrana enriquecidas em esfingolipídeos esteróis e cer tas proteínas incluindo muitas proteínas unidas à bicamada por meio de âncoras de GPI O receptor badrenérgico é se gregado em balsas que contêm proteínas G adenililciclase PKA e uma proteínafosfatase específica PP2 que em con junto fornecem uma unidade de sinalização altamente in tegrada Pela segregação em uma pequena região da mem brana plasmática de todos os elementos necessários para responder a um sinal e para extinguilo a célula é capaz de produzir uma lufada de segundo mensageiro extrema mente curta e localizada Alguns RTK EGFR e PDGFR parecem estar localiza dos em balsas lipídicas sendo muito provável que este iso lamento seja funcionalmente significativo Quando o coles terol é removido das balsas pelo tratamento da membrana com ciclodextrina que se liga e remove o colesterol as balsas são danificadas e as rotas de sinalização via RTK se tornam defeituosas Caso um RTK seja fosforilado em uma balsa e a única PTPase localmente disponível para reverter essa fosforila ção esteja em outra balsa a desfosforilação do RTK é re tardada ou impedida As interações entre proteínas adap tadoras podem ser suficientemente fortes para recrutar para dentro de uma balsa uma proteína sinalizadora que normalmente não se localiza na balsa ou pode mesmo ser forte o suficiente para remover um receptor de uma balsa Por exemplo em fibroblastos isolados o EGFR geralmente está concentrado em balsas especializadas chamadas cavé olas ver Figura 1122 porém o tratamento com EGF leva à saída do receptor da balsa Essa migração é dependente da atividade proteínacinásica do receptor receptores mu tantes que carecem desta atividade permanecem na balsa durante o tratamento com EGF A caveolina uma proteína integral da membrana localizada nas cavéolas é fosforilada em resíduos de Tyr em resposta à insulina e o EGFR agora ativado pode recrutar para a balsa seus parceiros de liga ção A segregação espacial de proteínas sinalizadoras em balsas adiciona outra dimensão aos já complexos processos iniciados pelos sinais extracelulares RESUMO 125 Proteínas adaptadoras multivalentes e balsas lipídicas da membrana c Muitas proteínas sinalizadoras apresentam domínios que se ligam aos resíduos de Tyr Ser ou Thr fosforilados a P P P Raf MEK KSR Erk Resposta intensa Estímulo b P P Raf MEK KSR Erk Resposta fraca Estímulo Fosforilação da MEK Tempo KSR mutante carecendo dos sítios de fosforilação pela Erk Tipo selvagem FIGURA 1224 Uma proteína de ancoragem de levedura que organi za e regula uma cascata de proteínascinases a A proteína de anco ragem KSR tem sítios de ligação para cada uma das três cinases da cascata da RafMEKErk Por ligar todas elas nas orientações apropriadas a proteína de ancoragem torna as interações entre estas proteínas rápidas e eficien tes Quando a Erk é ativada à esquerda ela fosforila o sítio de ligação da Raf à direita forçando uma mudança conformacional que desloca a Raf e portanto impede a fosforilação da MEK O resultado desta regulação por retroalimentação é a fosforilação temporária da MEK b Nas células de leve dura com uma KSR mutante carecendo dos sítios de fosforilação curva em vermelho a retroalimentação não ocorre originando uma curva de tempo diferente para a sinalização Nelson6edbookindb 463 Nelson6edbookindb 463 030414 0743 030414 0743 464 DAVID L NELSON MICHAEL M COX em outras proteínas a especificidade de ligação para cada domínio é determinada pelas sequências adjacen tes ao resíduo fosforilado do substrato c Domínios SH2 e PTB se ligam a proteínas que conte nham resíduos de Tyr outros domínios se ligam aos resíduos de Ser e Thr em diferentes contextos c Domínios SH3 e PH se ligam ao fosfolipídeo de membra na PIP3 c Muitas proteínas de sinalização são multivalentes com diversos módulos de ligação diferentes As cé lulas criam um grande número de complexos de si nalização multiproteicos por meio da combinação das especificidades de substratos das várias proteínas cinases com as especificidades de domínios que se ligam a resíduos de Ser Thr ou Tyr fosforilados e com fosfatases que podem inativar rapidamente uma rota de sinalização c Balsas de membrana e cavéolas sequestram grupos de proteínas sinalizadoras em pequenas regiões da mem brana plasmática intensificando suas interações e tor nando a sinalização mais eficiente 126 Canais iônicos controlados por portões Canais iônicos são a base da sinalização elétrica nas células excitáveis Certas células dos organismos multicelulares são exci táveis elas podem detectar um sinal externo convertê lo em um sinal elétrico especificamente uma alteração do potencial da membrana e passálo adiante As células excitáveis desempenham papéis essenciais na condução nervosa na contração muscular na secreção hormonal nos processos sensoriais no aprendizado e na memória A excitabilidade de células sensoriais de neurônios e de miócitos depende de canais iônicos transdutores de sinal que fornecem uma rota regulada para o movimento de íons inorgânicos como Na 1 K 1 Ca 21 e Cl através da membra na plasmática em resposta a vários estímulos Relembre do Capítulo 11 que esses canais iônicos são controlados por portões podem estar abertos ou fechados depen dendo do receptor associado estar ativado pela interação com seu ligante específico um neurotransmissor por exemplo ou por uma variação no potencial elétrico trans membrana Vm A Na 1K 1ATPase é eletrogênica ela cria um desequilíbrio de cargas através da membrana plasmá tica por transportar 3 Na 1 para fora da célula para cada 2 K 1 transportados para dentro Figura 1225a tornando o interior negativo em relação ao exterior A membrana assim é dita polarizada CONVENÇÃOCHAVE Vm é negativo quando o interior da célula é negativo em relação ao exterior Para uma célula animal típica Vm 5 250 a 270 mV Como os canais iônicos geralmente permitem a passa gem de ânions ou de cátions mas não de ambos o fluxo dos íons por um canal causa uma redistribuição de cargas nos dois lados da membrana alterando Vm A entrada de um íon positivamente carregado tal como o Na 1 ou a saída de um íon negativamente carregado como o Cl despolariza a membrana e aproxima Vm de zero Inversamente a saída de K 1hiperpolariza a membrana e Vm tornase mais negativo Esses fluxos iônicos pelos canais são passivos ao contrário do transporte ativo efetuado pela de Na 1K 1ATPase A direção do fluxo iônico espontâneo por uma membra na polarizada é determinada pelo potencial eletroquímico de membrana para aquele íon o qual possui dois compo nentes a diferença na concentração C do íon nos dois lados da membrana e a diferença no potencial elétrico expressa em milivolts A força ΔG que causa a passagem espontânea de um cátion p ex Na 1 para dentro da célula por meio de um canal iônico é uma função da razão de sua concentração nos dois lados da membrana CdentroCfora e da diferença no potencial elétrico Vm ou Dc ΔG 5 RT ln CdentroCfora 1 Z Vm 121 Potencial de membrana 5 250 a 270 mV 3 Na1 2 K1 Na1K1ATPase ATP ADP 1 Pi 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Baixa Baixa Alta Alta Alta Alta Baixa Os íons tendem a se mover a favor dos seus gradientes eletroquímicos através da membrana polarizada Cl2 Ca21 K1 Na1 Membrana plasmática A ATPase de Na1K1 eletrogênica forma o potencial de membrana a b Baixa FIGURA 1225 Potencial elétrico transmembrana a A ATPase de Na 1K 1 eletrogênica produz um potencial elétrico transmembrana de aproxi madamente 260 mV interior negativo b As setas azuis indicam a direção na qual os íons tendem a moverse espontaneamente através da membrana plasmática de uma célula animal impelidos por uma combinação dos gra dientes químicos e elétricos O gradiente químico impele Na 1 e Ca 21 para dentro causando despolarização e K 1 para fora causando hiperpolariza ção O gradiente elétrico impele Cl para fora contra o seu gradiente de con centração causando despolarização Nelson6edbookindb 464 Nelson6edbookindb 464 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 465 onde R é a constante dos gases T a temperatura absoluta Z a carga do íon e a constante de Faraday Observe que o sinal da carga do íon determina o sinal do segundo termo da Equação 121 Em um neurônio ou miócito típico as concentrações de Na 1 K 1 Ca 21 e Cl 2 no citosol são muito diferentes daquelas do fluido extracelular Tabela 126 Dadas essas diferenças nas concentrações o Vm em repou so de aproximadamente 260 mV e a relação mostrada na Equação 121 a abertura de um canal de Na 1 ou Ca 21 re sultará em um fluxo espontâneo de Na 1 ou Ca 21 para den tro da célula e em despolarização enquanto a abertura de um canal de K 1 resultará em um fluxo espontâneo de K 1 para fora da célula e em hiperpolarização Figura 12 25b O K 1 nesse caso movese contra o gradiente elé trico devido à grande diferença de concentração dentro e fora da célula que cria uma força química mais potente e impele o íon para fora Uma determinada espécie iônica continua a fluir por um canal enquanto a combinação entre gradiente de con centração e potencial elétrico provê uma força propulso ra Por exemplo à medida que o Na 1 flui a favor de seu gradiente de concentração ele despolariza a membrana Quando o potencial de membrana atingir 170 mV o efeito deste potencial de membrana resistência à entrada adi cional de Na 1 iguala o efeito do gradiente da Na 1 que promove a entrada de Na 1 Nesse potencial de equilíbrio E a força propulsora DG que tende a mover íons Na 1 é zero O potencial de equilíbrio é diferente para cada es pécie iônica pois os gradientes de concentração são dife rentes O número de íons que deve fluir para produzir uma va riação fisiologicamente significativa no potencial de mem brana é ínfimo em relação às concentrações de Na 1 K 1 e Cl nas células e no fluido extracelular de modo que os flu xos iônicos que ocorrem durante a sinalização em células excitáveis essencialmente não têm efeito algum sobre as concentrações desses íons Essa situação é diferente para o Ca 21 como a Ca 21 intracelular geralmente é muito baixa 10 7 M a entrada de Ca 21 pode alterar de modo significa tivo a Ca 21 citosólica O potencial de membrana de uma célula em um dado tempo é o resultado dos tipos e números de canais iôni cos abertos naquele momento Na maioria das células em repouso mais canais de K 1 do que canais de Na 1 Cl ou Ca 21 estão abertos e portanto o potencial de repouso é mais próximo do E para o K 1 298 mV do que daquele para qualquer outro íon Quando os canais de Na 1 Ca 21 ou Cl 2 se abrem o potencial de membrana movese na direção do E para o íon em questão O tempo preciso de abertura e fechamento de canais iônicos e as variações transitórias resultantes no potencial de membrana são a base da sinali zação elétrica por meio da qual o sistema nervoso estimula o músculo esquelético a contrair o coração a bater ou as glândulas secretoras a liberarem seus conteúdos Além dis so muitos hormônios exercem seus efeitos pela alteração do potencial de membrana das célulasalvo Esses mecanis mos não estão limitados às células animais canais iônicos desempenham funções importantes nas respostas de bacté rias protistas e plantas aos sinais do ambiente Para ilustrar a ação dos canais iônicos na sinalização célulacélula serão descritos os mecanismos pelos quais um neurônio passa adiante um sinal ao longo de todo o seu comprimento e atravessa uma sinapse até o próximo neurô nio ou até um miócito em um circuito celular utilizando a acetilcolina como neurotransmissor Os canais iônicos controlados por voltagem produzem os potenciais de ação neuronais A sinalização no sistema nervoso é efetuada por redes de neurônios células especializadas que transferem um impul so elétrico potencial de ação a partir de uma extremidade da célula o corpo celular ao longo de uma extensão ci toplasmática alongada o axônio O sinal elétrico desen cadeia a liberação de moléculas de neurotransmissores na sinapse transferindo o sinal para a próxima célula no circuito Três tipos de canais iônicos controlados por voltagem são essenciais a esse mecanismo de sinalização Ao longo de todo o comprimento do axônio estão canais de Na 1 controlados por voltagem Figura 1226 que permanecem fechados quando a membrana está em re pouso Vm 5 260 mV mas se abrem brevemente quan do a membrana é despolarizada localmente em resposta à acetilcolina ou algum outro neurotransmissor Também distribuídos ao longo do axônio estão canais de K 1 con trolados por voltagem os quais se abrem uma fração de segundo mais tarde em resposta à despolarização quando os canais de Na 1 próximos se abrem O fluxo despolarizante de Na 1 para dentro do axônio influxo é portanto rapida mente contrabalançado por um fluxo repolarizante de K 1 para fora do axônio efluxo Na extremidade distal do axô nio estão canais de Ca 21 controlados por voltagem que se abrem quando chega a onda de despolarização etapa ➊ e repolarização etapa ➋ causada pelas atividades dos canais de Na 1 e K 1 desencadeando a liberação do neuro transmissor acetilcolina que transmite o sinal para outro neurônio dispare um potencial de ação ou para uma fibra muscular contraia TABELA 126 Concentrações de íons em células e fluidos extracelulares mM Tipo celular K 1 Na 1 Ca 21 Cl 1 Dentro Fora Dentro Fora Dentro Fora Dentro Fora Axônio de lula 400 20 50 440 04 10 40150 560 Músculo de sapo 124 23 104 109 01 21 15 78 Nelson6edbookindb 465 Nelson6edbookindb 465 030414 0743 030414 0743 466 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os canais de Na 1 controlados por voltagem são alta mente seletivos para o Na 1 em comparação a outros cá tions por um fator de 100 vezes ou mais e apresentam uma velocidade de fluxo muito alta 10 7 íonss Depois de aberto ativado por uma redução no potencial elétri co transmembrana um canal de Na 1 passa por uma inati vação extremamente rápida dentro de milissegundos o canal fecha e permanece inativo por muitos milissegundos Como os canais de K 1 controlados por voltagem se abrem em resposta à despolarização induzida pela abertura dos canais de Na 1 etapa ➊ na Figura 1226 a entrada de K 1 repolariza localmente a membrana restabelece o poten cial de membrana com o interior negativo etapa ➋ Um curto pulso de despolarização portanto viaja pelo axônio conforme a despolarização localizada desencadeia a breve abertura dos canais de Na 1 e posteriormente dos canais de K 1 vizinhos O curto período refratário que se segue à abertura de cada canal de Na 1 durante o qual ele não pode abrirse novamente assegura que uma onda de des polarização unidirecional o potencial de ação percorra a célula nervosa a partir do corpo celular e em direção à ponta do axônio Quando a onda de despolarização atinge os canais de Ca 21 controlados por voltagem eles se abrem etapa ➌ e o Ca 21 entra a partir do espaço extracelular O aumento na Ca 21 citoplasmática então provoca a liberação de acetil colina para dentro da fenda sináptica por exocitose eta pa ➍ A acetilcolina se difunde até a célula póssináptica outro neurônio ou um miócito onde se liga aos seus re ceptores e inicia a despolarização Dessa maneira a mensa gem é transmitida à próxima célula do circuito Observase portanto que os canais iônicos controlados transmitem os sinais elétricos de duas maneiras pela variação da concen tração citoplasmática de um íon como o Ca 21 que então atua como segundo mensageiro intracelular ou pela varia ção do Vm que altera outras proteínas da membrana sensí veis ao Vm A passagem de um sinal elétrico por um neurô nio e deste para outro neurônio ilustra ambos os tipos de mecanismo A estrutura e o mecanismo dos canais de K 1 controla dos por voltagem foram discutidos com algum detalhe na Seção 113 ver Figuras 1147 e 1148 Aqui serão aborda dos os canais de Na 1 O componente essencial de um canal de Na 1 é um único e grande polipeptídeo 1840 resíduos de aminoácidos organizado em quatro domínios agrupa dos ao redor de um canal central Figura 1227a b que origina uma passagem para o Na 1 através da membrana A especificidade desta passagem para o Na 1 é efetuada por uma região do poro composta pelos segmentos entre as hélices transmembrana 5 e 6 de cada domínio que se do Despolarização Vesículas secretoras contendo acetilcolina Axônio do neurônio présináptico Canal de Na1 controlado por voltagem Canal de K1 controlado por voltagem Fenda sináptica Canais iônicos do receptor de acetilcolina Potencial de ação Corpo celular do neurônio póssináptico Canal de Ca21 controlado por voltagem Na1 Na1 Ca21 Na1Ca21 Ca21 Na1 Na1 K1 K1 K1 1 1 1 2 1 2 1 1 1 2 2 1 1 2 1 1 2 2 1 1 2 2 1 1 2 2 1 2 2 2 1 1 2 1 2 1 2 1 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1 ➊ ➌ Repolarização ➋ ➍ ➏ ➎ FIGURA 1226 Função dos canais iônicos controlados por voltagem e controlados por ligante na transmissão neural Inicialmente a mem brana plasmática do neurônio présináptico está polarizada interior negati vo pela ação da Na 1K 1ATPase eletrogênica que bombeia 3 Na 1 para fora da célula para cada 2 K 1 bombeados para dentro ver Figura 1225 ➊ A es timulação deste neurônio não mostrada causa o avanço de um potencial de ação ao longo do axônio setas azuis que se distancia do corpo celular A abertura de um canal de Na 1 controlado por voltagem permite a entra da de Na 1 e a despolarização local resultante causa a abertura dos canais de Na 1 adjacentes e assim por diante A direcionalidade do movimento do potencial de ação é garantida pelo breve período refratário subsequente à abertura de cada canal de Na 1 controlado por voltagem ➋ Uma fração de segundo após a passagem do potencial de ação por um ponto do axônio canais de K 1 controlados por voltagem se abrem permitindo a saída de K 1 o que causa a despolarização da membrana setas vermelhas preparando a para o próximo potencial de ação Para maior clareza os canais de Na 1 e os canais de K 1 estão ilustrados em lados opostos do axônio ambos os tipos de canais estão distribuídos de maneira uniforme na membrana do axônio ➌ Quando a onda de despolarização atinge a extremidade do axônio ca nais de Ca 21 controlados por voltagem se abrem permitindo a entrada de Ca 21 ➍ O resultante aumento na Ca 21 interna desencadeia a liberação por exocitose do neurotransmissor acetilcolina para dentro da fenda sináptica ➎ A acetilcolina ligase a um receptor no neurônio ou miócito póssináp tico levando à abertura de seu canal iônico controlado por ligante ➏ Na 1 e Ca 21 extracelular entram por meio deste canal despolarizando a célula pós sináptica O sinal elétrico deste modo foi transferido para o corpo celular do neurônio ou miócito póssináptico e irá deslocarse ao longo do axônio até um terceiro neurônio ou miócito por meio desta mesma sequência de eventos Nelson6edbookindb 466 Nelson6edbookindb 466 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 467 bram para dentro do canal A hélice 4 de cada domínio tem uma alta densidade de resíduos de Arg positivamente carre gados acreditase que esse segmento movase para dentro da membrana em resposta a variações na voltagem trans membrana do potencial de repouso de cerca de 260 mV para aproximadamente 130 mV O movimento da hélice 4 inicia a abertura do canal e essa é a base do controle por voltagem Figura 1227c Imaginase que a inativação do canal durante o período refratário ocorra por um mecanismo de bola e corrente o termo se refere à bola de ferro que era antigamente acor rentada à perna dos prisioneiros Um domínio proteico na superfície citoplasmática do canal de Na 1 o portão que controla a inativação a bola é preso ao canal por um curto segmento do polipeptídeo a corrente Figura 12 27b Esse domínio está livre para se movimentar quando o canal está fechado porém quando ele se abre um sítio na face interna do canal tornase disponível para a ligação da bola acorrentada bloqueando o canal O comprimento da corrente parece determinar por quanto tempo um canal iônico permanece aberto quanto maior a corrente maior o período aberto Outros canais iônicos podem ser inativados por um mecanismo similar O receptor de acetilcolina é um canal iônico controlado por ligante O receptor nicotínico de acetilcolina controla a pas sagem do sinal de um neurônio eletricamente excitado em alguns tipos de sinapses e em junções neuromusculares entre um neurônio motor e uma fibra muscular desen FIGURA 1227 Canais de Na 1 controlados por voltagem em neurô nios Os canais de sódio de diferentes tecidos e organismos têm uma gran de variedade de subunidades porém apenas a subunidade principal a é essencial a A subunidade a é uma proteína grande com quatro domínios homólogos I a IV mostrados separados para ilustrar as diferentes partes cada um contendo seis hélices transmembrana 1 a 6 A hélice 4 de cada do mínio em azul é o sensor de voltagem supõese que a hélice 6 em cor de laranja seja o portão que controla a ativação Os segmentos entre as hélices 5 e 6 a região do poro em vermelho formam o filtro de seletividade e o segmento conectando os domínios III e IV em verde é o portão que contro la a inativação b PDB ID 3RW0 Estrutura de um canal de Na 1 controlado por voltagem da bactéria Arcobacter butzleri mas provavelmente similar aos canais dos neurônios de vertebrados com abertura em forma de funil no lado extracelular filtro de seletividade de íons cavidade central aquosa e o domínio de ativação no lado citoplasmático c Uma visão esquemática do canal de Na 1 Os quatro domínios são enrolados ao redor de um canal trans membrana central revestido com resíduos de aminoácidos polares As qua tro regiões do poro em vermelho aproximamse da superfície extracelular para formar o filtro de seletividade que é conservado em todos os canais de Na 1 O filtro garante ao canal a capacidade de discriminar entre o Na 1 e outros íons de tamanho similar O portão controlador da inativação em ver de se fecha linhas pontilhadas logo após a abertura do portão controlador da ativação d O mecanismo sensor da voltagem envolve o movimento perpendicular em relação ao plano da membrana da hélice 4 em resposta a uma variação no potencial transmembrana Como mostrado no painel supe rior a forte carga positiva da hélice 4 possibilita que ela seja atraída para den tro da célula em resposta ao potencial de membrana Vm quando o interior é negativo A despolarização reduz esta atração e a hélice 4 relaxa movendo se em direção ao exterior painel inferior Este movimento é comunicado ao portão que controla a ativação em cor de laranja induzindo alterações conformacionais que abrem o canal Dentro Fora 1 2345 6 2OOC Domínio Portão de controle da inativação Funil extracelular Filtro de seletividade Cavidade central Portão de controle da ativação Sensor de voltagem Portão de controle da inativação I II III IV NH3 1 a Filtro de seletividade poro II III IV Portão de controle da ativação Sensor de voltagem Corrente 1 2 3 4 5 6 Portão de controle da inativação aberto I c b Fora Dentro 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Fora Dentro Portão de controle da ativação Membrana polarizada canal fechado Canal iônico aquoso Membrana despolarizada canal aberto Sensor de voltagem Na1 Na1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 d Filtro de seletividade região do poro Nelson6edbookindb 467 Nelson6edbookindb 467 030414 0743 030414 0743 468 DAVID L NELSON MICHAEL M COX cadeando a contração muscular Os receptores nicotíni cos de acetilcolina foram originalmente distinguidos dos receptores muscarínicos de acetilcolina pela sensibilidade dos primeiros à nicotina e dos muscarínicos ao alcaloide muscarina presente em cogumelos São estrutural e funcio nalmente diferentes A acetilcolina liberada pelo neurônio présináptico ou pelo neurônio motor se difunde por alguns micrômetros até a membrana plasmática do neurônio pós sináptico ou do miócito onde se liga ao receptor de acetil colina Isso força uma mudança conformacional no recep tor causando a abertura de seu canal iônico O movimento resultante de cátions para dentro da célula despolariza a membrana plasmática Em uma fibra muscular isso inicia a contração O receptor de acetilcolina permite a pronta passagem de íons Na 1 Ca 21 e K 1 porém outros cátions e todos os ânions são incapazes de passar O movimento de Na 1 pelo canal iônico do receptor de acetilcolina é insatu rável a velocidade é linear em relação à Na 1 extracelular e muito rápido cerca de 2 3 10 7 íonss sob condições fi siológicas CH2 CH3 N Acetilcolina O CH2 C CH3 H3C O CH3 Como outros canais iônicos controlados por portões o receptor de acetilcolina se abre em resposta à estimu lação pela molécula sinalizadora e possui um mecanismo de cronometragem intrínseco que fecha o portão milisse gundos após sua abertura Assim o sinal da acetilcolina é transitório comprovadamente uma propriedade essen cial para a condução dos sinais elétricos As alterações estruturais que formam a base do controle dos receptores de acetilcolina são compreendidas mas não o mecanis mo exato de dessensibilização por meio do qual o ca nal permanece fechado mesmo na presença contínua de acetilcolina O receptor nicotínico de acetilcolina tem cinco subuni dades a2bgd cada uma das quais com quatro segmentos helicoidais transmembrana M1 a M4 Figura 1228 As cinco subunidades com sequências e estruturas terciárias similares circundam um poro central que é revestido pe las hélices M2 O poro apresenta cerca de 20 Å de largura nas porções do canal que se projetam das superfícies cito plasmáticas e extracelulares porém estreitase conforme atravessa a bicamada lipídica Próximo ao centro da bica mada está um anel de cadeias laterais volumosas e hidro fóbicas de resíduos de Leu das hélices M2 posicionadas tão próximas umas das outras que impedem a passagem de íons pelo canal Figura 1228d A ligação da acetilcoli na aos sítios em cada subunidade a força todas as hélices M2 a girarem levemente movendo os volumosos resíduos de Leu para o lado e substituindoos por resíduos menores e polares O alargamento do poro permite a passagem de íons Na 1 e Ca 21 Neurônios têm canais receptores que respondem a diferentes neurotransmissores As células animais especialmente aquelas do sistema ner voso contêm uma grande variedade de canais iônicos con trolados por ligante voltagem ou ambos Os receptores que são eles mesmos canais iônicos são classificados como io notrópicos para distinguilos dos receptores que geram um segundo mensageiro receptores metabotrópicos Até agora o foco tem sido a acetilcolina como neurotransmis sor mas existem muitos outros 5hidroxitriptamina sero tonina glutamato e glicina podem agir por meio de canais receptores estruturalmente relacionados ao receptor de acetilcolina A serotonina e o glutamato desencadeiam a abertura de canais de cátions K 1 Na 1 Ca 21 enquanto a glicina abre canais específicos para Cl 2 Canais de cátions e ânions distinguemse por diferenças sutis nos resíduos de aminoácidos que revestem o canal hidrofílico Os canais de cátions têm cadeias laterais negativamente carregadas de Glu e Asp em posições críticas Quando alguns desses resíduos ácidos são experimentalmente substituídos por re síduos básicos o canal de cátions é convertido em um canal de ânions Dependendo do íon que passa pelo canal a interação com o ligante neurotransmissor daquele canal resulta na despolarização ou na hiperpolarização da célulaalvo Um único neurônio normalmente recebe sinais de muitos ou tros neurônios cada qual liberando seu próprio neurotrans missor característico com o efeito despolarizante ou hiper polarizante característico O Vm da célulaalvo portanto reflete o sinal integrado Figura 121e de múltiplos neu rônios A célula responde com um potencial de ação apenas se esse sinal integrado somarse até uma despolarização suficientemente grande Os canais receptores de acetilcolina glicina glutamato e ácido γaminobutírico GABA são controlados por ligan tes extracelulares Segundos mensageiros intracelulares como cAMP cGMP IP3 Ca 21 e ATP regulam canais iô nicos de outra classe que como será visto na Seção 1210 participam das transduções sensoriais da visão do olfato e do paladar As toxinas são direcionadas a canais iônicos Muitas das toxinas mais potentes da natureza atuam sobre canais iônicos Por exemplo a dendrotoxina da serpente mamba negra bloqueia a ação dos canais de K 1 controla dos por voltagem a tetrodotoxina produzida pelo baiacu age sobre canais de Na 1 controlados por voltagem e a co brotoxina desativa os canais iônicos receptores de acetil colina Por que no curso da evolução os canais iônicos se tornaram o alvo preferencial de toxinas em vez de algum alvo metabólico essencial como enzima crucial para o me tabolismo energético Os canais iônicos são amplificadores excepcionais a abertura de um único canal pode permitir o fluxo de 10 milhões de íons por segundo Em consequência relativa mente poucas moléculas de uma proteína de canal iônico são necessárias por neurônio para as funções de sinaliza Nelson6edbookindb 468 Nelson6edbookindb 468 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 469 ção Isso significa que um número relativamente pequeno de moléculas de toxina com alta afinidade por canais iôni cos agindo do exterior celular pode ter um efeito muito pronunciado sobre a neurossinalização do corpo inteiro Um efeito comparável via uma enzima metabólica tipica mente presente nas células em concentrações muito maio res do que os canais iônicos exigiria muito mais cópias da molécula de toxina RESUMO 126 Canais iônicos controlados por portões c Canais iônicos controlados pelo potencial de membrana ou por ligantes são cruciais para a sinalização em neurô nios e outras células c Os canais de Na 1 e K 1 controlados por voltagem das membranas neuronais conduzem o potencial de ação ao longo do axônio na forma de uma onda de despolariza ção entrada de Na 1 seguida pela repolarização saída de K 1 c O mecanismo de controle dos canais sensíveis a volta gem envolve o movimento perpendicular ao plano da membrana de um peptídeo transmembrana com alta densidade de cargas devido à presença de Arg ou ou tros resíduos carregados c A chegada de um potencial de ação à extremidade distal de um neurônio présináptico desencadeia a liberação de neurotransmissor O neurotransmissor acetilcolina por exemplo difundese até o neurônio póssináptico ou miócito na junção neuromuscular ligase a recep tores específicos na membrana plasmática e provoca uma variação no Vm COO2 NH3 a b c Fechado 2 Acetilcolina d e Aberto Grandes cadeias laterais hidrofóbicas de Leu das hélices M2 fecham o canal A ligação de duas moléculas de acetilcolina causa a torção das hélices M2 As hélices M2 agora apresentam resíduos polares menores revestindo o canal M2 As hélices M2 anfipáticas circundam o canal A subunidade dobrase em quatro hélices a transmembrana Fora Dentro M1 M3 M4 M2 Sítios de ligação a acetilcolina Sítios de ligação a acetilcolina Hélices M2 Hélices M34 d d a g g b b a a a FIGURA 1228 O canal iônico receptor de acetilcolina a Cada uma das cinco subunidades homólogas a2bγδ tem quatro hélices transmem brana M1 a M4 As hélices M2 são anfipáticas as outras contêm principal mente resíduos hidrofóbicos b As cinco subunidades são arranjadas ao redor de um canal transmembrana central que é revestido pelos resíduos polares das hélices M2 Na extremidade superior e na inferior do canal estão anéis de resíduos de aminoácidos negativamente carregados c Modelo molecular do receptor de acetilcolina com base na estrutura determinada por raios X de uma proteína relacionada a proteína de ligação à acetilcolina de um molusco PDB ID 1UV6 d Esta ilustração de um corte transversal pelo centro das hélices M2 mostra cinco cadeias laterais de Leu em ama relo uma de cada hélice M2 projetandose para dentro do canal e cons tringindoo a um diâmetro pequeno demais para permitir a passagem de Ca 21 Na 1 ou K 1 Quando ambos os sítios de ligação a acetilcolina um em cada subunidade a estão ocupados ocorre uma mudança conformacio nal À medida que as hélices M2 se torcem levemente os cinco resíduos de Leu são afastados do canal e são substituídos por resíduos polares menores em azul Este mecanismo de controle abre o canal permitindo a passagem de Ca 21 Na 1 ou K 1 e Modelo molecular do receptor de acetilcolina visto perpendicularmente à membrana mostrando o pequeno poro central que permite a passagem de íons Nelson6edbookindb 469 Nelson6edbookindb 469 030414 0743 030414 0743 470 DAVID L NELSON MICHAEL M COX c O receptor de acetilcolina de neurônios e miócitos é um canal iônico controlado por ligante a ligação da acetil colina provoca uma mudança conformacional que abre o canal a íons Na 1 e Ca 21 c As neurotoxinas produzidas por muitos organismos ata cam canais iônicos e assim têm ação rápida e letal 127 Integrinas receptores bidirecionais da adesão celular As integrinas são proteínas da membrana plasmática que controlam a adesão das células umas às outras e à matriz extracelular e transmitem sinais em ambas as direções através da membrana Figura 1229 O genoma de ma míferos codifica 18 subunidades a diferentes e 8 subuni dades b diferentes encontradas em uma ampla gama de combinações com variadas especificidades para ligantes em vários tecidos Cada uma das 24 integrinas diferentes encontradas até agora parece desempenhar uma função distinta Como as integrinas podem informar às células so bre a vizinhança extracelular elas desempenham funções cruciais em processos que requerem interações celulares seletivas como o desenvolvimento embrionário a coagula ção sanguínea o funcionamento das células imunológicas a diferenciação celular normal e o crescimento e a metás tase tumorais Os ligantes extracelulares que interagem com as in tegrinas incluem colágeno fibrinogênio fibronectina e muitas outras proteínas que têm a sequência reconhecida pelas integrinas ArgGlyAsp RGD utilizando as abre viações de uma única letra dos aminoácidos As curtas extensões citoplasmáticas das subunidades a e b inte ragem com as proteínas do citoesqueleto logo abaixo da membrana plasmática talina aactinina vinculina paxi lina e outras modulando a montagem das estruturas do citoesqueleto com base em actina A dupla associação das integrinas com a matriz extracelular e o citoesqueleto per mite que a célula integre as informações sobre o ambiente extracelular e intracelular além de coordenar o posiciona mento do citoesqueleto com os sítios de adesão extracelu lares Com essa propriedade as integrinas governam a for ma a mobilidade a polaridade e a diferenciação de muitos tipos celulares Na sinalização de fora para dentro os domínios extracelulares de uma integrina passam por mudanças conformacionais globais dramáticas quando o ligante interage com um sítio localizado muitos ângstroms distante das hélices transmembrana Essas mudanças de alguma maneira alteram a disposição das caudas citoplas máticas das subunidades a e b alterando suas interações com proteínas intracelulares e assim conduzindo o sinal para dentro da célula A conformação e a adesividade dos domínios extrace lulares das integrinas também são drasticamente afetadas pela sinalização de dentro para fora iniciada por sinais de dentro da célula Em uma conformação os domínios ex tracelulares não apresentam afinidade pelas proteínas da matriz extracelular mas sinais celulares podem favorecer O colágeno da matriz extracelular origina um sinal de fora para dentro ➊ A talina do citoesqueleto origina um sinal de dentro para fora ➌ Respostas adesão e migração celular montagem da matriz extracelular ➍ Respostas estabelecimento da polaridade celular sobrevivência e proliferação alterações do citoesqueleto e expressão gênica ➋ Citoesqueleto Talina Integrina Integrina inativa a b Fora Dentro Colágeno FIGURA 1229 A sinalização em duas vias pelas integrinas Todas as integrinas têm uma subunidade a e uma subunidade b cada uma com uma curta extensão citoplasmática uma única hélice transmembrana e um gran de domínio extracelular com o sítio de interação com o ligante A subuni dade b em roxo é rica em resíduos de Cys e apresenta muitas ligações dissulfeto intracadeia Em muitas integrinas a subunidade a em corde rosa tem alguns sítios de ligação a cátions divalentes como Ca 21 essenciais para a atividade de interação com o ligante No estado inativo o domínio extracelular está dobrado sobre si mesmo no centro O contato com um ligante extracelular colágeno ou heparansulfato por exemplo endireita o domínio extracelular e afasta as caudas citosólicas das subunidades a e b à esquerda alterando suas interações com proteínas intracelulares como a talina que por sua vez conectam as integrinas aos filamentos de actina do citoesqueleto Na sinalização de dentro para fora o contato do domínio citosólico com a talina produz um desdobramento dramático do domínio extracelular à direita e um aumento em sua afinidade pelos parceiros de ligação extracelulares permitindo interações com proteínas extracelulares ou proteoglicanos e alterando a adesão da célula à matriz extracelular Os ligantes proteicos da matriz extracelular têm a sequência RGD reconhecida pelas integrinas Nelson6edbookindb 470 Nelson6edbookindb 470 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 471 outra conformação na qual as integrinas aderem firmemen te às proteínas extracelulares Figura 1229 A regulação da adesividade é crucial para a migração dos leucócitos ao sítio de uma infecção ver Figura 732 para as interações entre células do sistema imune e para a fagocitose por macrófagos Durante uma resposta imune por exemplo as integrinas dos leucócitos são ativa das expondo os sítios extracelulares de interação com o ligante a partir do interior da célula por uma rota de sinali zação iniciada por citocinas sinais extracelulares de desen volvimento Uma vez ativadas as integrinas podem mediar a ligação dos leucócitos a outras células do sistema imune ou podem marcar células para a fagocitose A mutação no gene da integrina que codifica a subunidade b conhecida como CD18 é a causa da deficiência de adesão leucocitária rara doença genética humana na qual os leucócitos não con seguem atravessar os vasos sanguíneos para chegar aos sí tios de infecção Bebês com defeitos graves em CD18 geral mente morrem por infecções antes dos dois anos Uma integrina específica de plaquetas aIIbb3 está en volvida tanto na coagulação sanguínea normal quanto na patológica O dano aos vasos sanguíneos no local de um ferimento expõe sítios de ligação de alta afinidade se quências RGD na trombina e colágeno por exemplo às integrinas das plaquetas que aderem à lesão a outras pla quetas e à proteína da coagulação fibrinogênio levando à formação do coágulo que impede o sangramento adicional As mutações nas subunidades a ou b da integrina aIIbb3 das plaquetas causam uma doença plaquetária conhecida como trombastenia de Glanzmann na qual os indivíduos sangram excessivamente após um ferimento relativamente pequeno O excesso de coagulação sanguínea também é in desejável A agregação plaquetária desregulada pode levar à formação patológica de coágulos sanguíneos resultando no bloqueio das artérias que suprem sangue ao coração e ao cérebro e aumentando o risco de ataque cardíaco e derrame Fármacos como tirofiban e eptifibatide que blo queiam os sítios externos de interação com o ligante da integrina das plaquetas reduzem a formação de coágulos e são úteis no tratamento e na prevenção de ataques car díacos e derrames Quando os tumores entram em metástase as células tu morais perdem a adesão ao tecido original e invadem novos locais As alterações na adesão da célula tumoral e o desen volvimento de novos vasos sanguíneos angiogênese para suprir o tumor em novo local são modulados por integrinas específicas Essas proteínas são portanto potenciais alvos para fármacos que suprimam a migração e o remanejamen to das células tumorais RESUMO 127 Integrinas receptores bidirecionais de adesão celular c As integrinas compõem uma família de receptores dimé ricos ab da membrana plasmática que interagem com macromoléculas extracelulares e com o citoesqueleto transmitindo sinais para dentro e para fora da célula c A forma ativa e a inativa de uma integrina diferem na conformação dos domínios extracelulares Eventos e sinais intracelulares podem interconverter as formas ativas e inativas c As integrinas controlam diferentes aspectos da resposta imune coagulação sanguínea e angiogênese e partici pam da metástase tumoral 128 Regulação da transcrição por receptores nucleares de hormônios Os hormônios esteroides o ácido retinoico retinoide e os hormônios da tireoide formam um grande grupo de hormô nios ligantes de receptores que exercem pelo menos par te de seus efeitos por meio de um mecanismo fundamental mente diferente daquele de outros hormônios eles atuam no núcleo e alteram a expressão gênica Esse modo de ação será detalhado no Capítulo 28 juntamente com outros me canismos para a regulação da expressão gênica Aqui apre sentase uma concisa visão geral Os hormônios esteroides estrogênio progesterona e cortisol por exemplo excessivamente hidrofóbicos para se dissolverem no sangue são transportados do ponto de liberação até os tecidosalvo por proteínas transportadoras específicas Nas célulasalvo esses hormônios atravessam a membrana plasmática por simples difusão e se ligam a receptores proteicos específicos no núcleo Figura 12 30 Os receptores dos hormônios esteroides sem o ligante aporreceptores frequentemente agem como supresso res da transcrição dos genesalvo A ligação do hormônio induz alterações na conformação do receptor proteico de modo que ele tornase capaz de interagir com sequências reguladoras específicas no DNA chamadas de elementos de resposta a hormônio HRE de hormone response elements e assim alterar a expressão gênica ver Figura 2833 O complexo receptorhormônio acoplado intensifi ca a expressão de genes específicos adjacentes aos HRE com o auxílio de diversas outras proteínas essenciais à transcrição Horas ou dias são necessários para que esses reguladores exerçam completamente seus efeitos o tem po necessário para que as alterações na síntese de RNA e na posterior síntese de proteínas tornemse evidentes no metabolismo alterado A especificidade da interação esteroidereceptor é explorada pelo uso do fármaco tamoxifeno para o tratamento de câncer de mama Em alguns tipos de câncer de mama a divisão das células cancerosas depende da presença contínua de estrogênio O tamoxifeno é um anta gonista do estrogênio ele compete com o estrogênio pela ligação ao receptor de estrogênio porém o complexo ta moxifenoreceptor possui pouco ou nenhum efeito sobre a expressão gênica Consequentemente a administração de tamoxifeno após cirurgia ou durante quimioterapia de sacelera ou para o crescimento das células cancerosas re manescentes nos casos de câncer de mama dependentes do hormônio Outro análogo de esteroide o fármaco mife pristona RU486 ligase ao receptor de progesterona e bloqueia a ação desse hormônio essencial para a implan tação do óvulo fecundado no útero e assim age como con traceptivo Nelson6edbookindb 471 Nelson6edbookindb 471 030414 0743 030414 0743 472 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O CH3 N CH3 CH3 Tamoxifeno O N CH3 H3C CH3 Mifepristona RU 486 OH C C CH3 Certos efeitos dos esteroides parecem ocorrer rápido demais para serem resultantes da alteração da síntese de proteínas via mecanismo clássico de ação dos hormônios esteroides por meio de receptores nucleares Por exemplo a dilatação dos vasos sanguíneos mediada pelo estrogênio é sabidamente independente da transcrição gênica ou síntese proteica assim como o é a redução na cAMP celular indu zida por esteroides Acreditase que outro mecanismo de transdução de sinal envolvendo receptores da membrana plasmática seja o responsável por alguns desses efeitos RESUMO 128 Regulação da transcrição por receptores nucleares de hormônios c Os hormônios esteroides entram nas células e se ligam a receptores proteicos específicos c O complexo hormônioreceptor se liga a regiões espe cíficas do DNA os elementos de resposta a hormônio e interage com outras proteínas para regular a expressão dos genes próximos c Certos efeitos dos hormônios esteroides podem ocorrer por uma rota de sinalização diferente e mais rápida ➊ Hormônios transportados até o tecidoalvo por proteínas transportadoras séricas difundemse pela membrana plasmática e ligamse a receptores proteicos específicos no núcleo ➌ O receptor atrai proteínas coativadoras ou correpressoras e com elas regula a transcrição dos genes adjacentes aumentando ou diminuindo a taxa de formação do mRNA ➍ Os níveis alterados do produto gênico regulado pelo hormônio produzem a resposta celular ao hormônio ➋ A ligação do hormônio altera a conformação do receptor ele forma homo ou heterodímeros com outros complexos hormônioreceptor e se liga a regiões reguladoras específicas chamadas de elementos de resposta a hormônio HRE no DNA adjacente a genes específicos ➊ ➋ ➌ ➍ Membrana plasmática Núcleo Citosol Receptor nuclear RNA polimerase HRE DNA Gene Transcrição mRNA Tradução nos ribossomos Nova proteína Função celular alterada Hormônio Proteína transportadora sérica ligada ao hormônio FIGURA 1230 Mecanismo geral por meio do qual os hormônios esteroides e da tireoide retinoides e vitamina D regulam a expressão gêni ca Os detalhes da transcrição e síntese proteica estão descritos nos Capítulos 26 e 27 Alguns esteroides também agem por meio de receptores da membra na plasmática por um mecanismo completamente diferente Nelson6edbookindb 472 Nelson6edbookindb 472 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 473 129 Sinalização em microrganismos e plantas Muito do que se mencionou até agora sobre sinalização é pertinente aos tecidos de mamíferos ou às células em cultura isoladas de tais tecidos Bactérias arquibactérias microrganismos eucarióticos e plantas vasculares também devem responder a uma variedade de sinais externos O2 nutrientes luz substâncias químicas nocivas e assim por diante Agora será realizado um breve exame dos tipos de maquinaria de sinalização utilizados por microrganismos e plantas A sinalização bacteriana requer fosforilação em um sistema binário Em estudos pioneiros sobre quimiotaxia em bactérias Ju lius Adler mostrou que Escherichia coli responde aos nu trientes em seu ambiente in cluindo açúcares e aminoácidos movendose em direção a eles impulsionada por um ou mais flagelos Uma família de proteí nas de membrana tem domínios de ligação na face externa da membrana plasmática aos quais atraentes específicos açúcares ou aminoácidos se ligam Figura 1231 A intera ção com o ligante leva à fosfori lação em um resíduo de His do domínio citosólico de um recep tor com atividade cinásica intrínseca Esse primeiro com ponente do sistema binário o receptor histidinacina se então catalisa a transferência do grupo fosfato do resíduo de His para um resíduo de Asp em uma segunda proteína solúvel o regulador da resposta Essa fosfo proteína movese até a base do flagelo transferindo o sinal recebido pelo receptor da membrana O flagelo é impulsio nado por um motor giratório que pode impelir a célula atra vés do meio ou parála dependendo da direção da rotação do motor A variação na concentração de atraente ao longo do tempo sinalizada por meio do receptor possibilita que a célula determine se está movendose na direção da fonte do atraente ou se está afastandose dele Se o movimento estiver em direção ao atraente o regulador da resposta si naliza à célula para continuar em linha reta corrida se estiver afastandose a célula tropeça momentaneamente adotando uma nova direção A repetição desse comporta mento resulta em uma rota aleatória influenciada pelo movimento em direção à concentração aumentada do atraente E coli não detecta somente açúcares e aminoácidos mas também O2 extremos de temperatura e outros fatores ambientais utilizando esse sistema binário básico Os siste mas binários têm sido encontrados em muitas outras bacté rias grampositivas e gramnegativas e em arquibactérias assim como em protistas e fungos Esse mecanismo de si nalização evidentemente desenvolveuse cedo no curso da evolução celular e tem se mantido Vários sistemas de sinalização utilizados por células animais também têm análogos em bactérias À medida que sequências completas dos genomas de um maior número de bactérias diferentes tornamse conhecidas pesquisa dores têm descoberto genes que codificam para proteínas similares às proteínas Sercinases ou Tyrcinases proteínas semelhantes a Ras reguladas pela ligação de GTP e proteí nas com domínios SH3 Os receptores Tyrcinase ainda não foram encontrados em bactérias mas resíduos de Tyr de fato ocorrem em algumas bactérias Os sistemas de sinalização de plantas têm alguns dos mesmos componentes utilizados por micróbios e mamíferos Como os animais as plantas vasculares devem ter um meio de comunicação entre os tecidos para coordenar e dirigir Julius Adler Atraente ReceptorHiscinase componente 1 His His His ATP ADP E coli Regulador da resposta componente 2 Membrana plasmática Motor giratório controla o flagelo A forma fosforilada do componente 2 reverte a direção do motor Asp Asp P P c b a Atraente Tropeço Tropeço Corrida Rotação no sentido antihorário Corrida Rotação no sentido horário Tropeço FIGURA 1231 O mecanismo de sinalização binário na quimiota xia bacteriana a Quando colocada próximo a uma fonte de um so luto atraente a E coli movese de forma errática tendendo na direção do atraente b Os flagelos têm estruturas helicoidais intrínsecas e quando todos os flagelos giram no sentido antihorário suas hélices torcemse jun tas e movemse em concerto propelindo a célula à frente em uma corrida Quando os flagelos giram no sentido horário os feixes de flagelos separam se e a célula escorrega momentaneamente até que a rotação no sentido antihorário recomece e a célula volte a nadar adiante em uma nova direção randômica Quando a célula está movendose na direção do atraente ela apresenta menos tropeços e portanto corridas mais longas quando ela está se afastando os frequentes tropeços resultam em movimento na di reção do atraente c A rotação dos flagelos é controlada por um sistema binário constituído por um receptor histidinacinase e uma proteína efetora Quando um ligante atraente ligase ao domínio receptor do receptor ligado à membrana uma proteína Hiscinase no domínio citosólico componente 1 é ativada e autofosforila um resíduo de His Este grupo fosfato é então transferido a um resíduo de Asp do componente 2 Após a fosforilação o componente 2 movese até a base do flagelo onde ele causa a rotação no sentido antihorário dos flagelos levando a uma corrida Nelson6edbookindb 473 Nelson6edbookindb 473 030414 0743 030414 0743 474 DAVID L NELSON MICHAEL M COX o crescimento e o desenvolvimento para adaptaremse às condições de O2 nutrientes temperatura e disponibilidade de água e para alertar sobre a presença de agentes quí micos nocivos e de patógenos Figura 1232 Pelo me nos um bilhão de anos de evolução se passou desde que os ramos dos eucariotos para plantas e animais divergiram o que se reflete nas diferenças em mecanismos de sinali zação alguns mecanismos vegetais são conservados isto é são similares àqueles dos animais proteínascinases proteínas adaptadoras nucleotídeos cíclicos bombas iôni cas eletrogênicas e canais controlados por portões alguns são similares aos sistemas binários das bactérias e alguns são exclusivos das plantas mecanismos sensíveis à luz que refletem as mudanças sazonais no ângulo e portanto na cor da luz solar por exemplo Tabela 127 O genoma da planta Arabidopsis thaliana codifica cerca de 1000 proteínas SerThrcinases incluindo aproximadamente 60 MAPK e quase 400 receptores associados à membrana com atividade cinásica que fosforilam resíduos de Ser ou Thr uma grande variedade de proteínasfosfatases proteínas adaptadoras que formam arcabouços sobre os quais proteí nas agrupamse em complexos de sinalização enzimas para a síntese e a degradação de nucleotídeos cíclicos e 100 ou mais canais iônicos incluindo cerca de 20 controlados por nucleotídeos cíclicos Os fosfolipídeos de inositol estão pre sentes assim como as cinases que os interconvertem por meio da fosforilação dos grupos inositol Mesmo conside rando que a Arabidopsis tem múltiplas cópias de muitos Luz Temperatura Umidade Vento Insetos Herbívoros Patógenos Patógenos Parasitos Microrganismos O2 Minerais Moléculas tóxicas Disponibilidade de água CO2 C2H4 Gravidade FIGURA 1232 Alguns estímulos que desencadeiam respostas em plantas TABELA 127 Componentes da sinalização presentes em mamíferos plantas ou bactérias Componente da sinalização Mamíferos Plantas Bactérias Canais iônicos 1 1 1 Bombas de íons eletrogênicas 1 1 1 Hiscinases binárias 1 1 1 Adenililciclase 1 1 1 Guanililciclase 1 1 Receptores proteínascinases SerThr 1 1 Ca 21 como segundo mensageiro 1 1 Canais de Ca 21 1 1 Calmodulina proteína de ligação a CaM 1 1 2 Cascata de MAPK 1 1 2 Canais controlados por nucleotídeos cíclicos 1 1 2 Canais de Ca 21 controlados por IP3 1 1 2 Fosfatidilinositolcinases 1 1 2 GPCR 1 12 1 Proteínas G triméricas 1 12 2 Fosfolipase C específica para PI 1 2 Receptores tirosinacinases 1 2 Domínios SH2 1 Receptores nucleares para esteroides 1 2 2 Proteínacinase A 1 2 2 Proteínacinase G 1 2 2 Nelson6edbookindb 474 Nelson6edbookindb 474 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 475 genes a presença desse grande número certamente reflete uma ampla gama de potencial para sinalização Entretanto alguns tipos de proteínas de sinalização comuns aos tecidos animais não estão presentes em plan tas ou estão representados por apenas poucos genes Por exemplo as proteínascinases dependentes de nucleotídeos cíclicos PKA e PKG parecem estar ausentes Os genes para as proteínas G heterotriméricas e Tyrcinase são mui to menos abundantes no genoma vegetal e os genes para os GPCR a maior família de proteínas do genoma humano 1000 genes estão muito escassamente representados no genoma de plantas Os receptores nucleares para este roides que se ligam ao DNA certamente não são abundan tes e muitos podem estar ausentes em plantas Embora as plantas careçam do mecanismo sensível à luz mais ampla mente conservado presente nos animais a rodopsina que utiliza o retinal como pigmento elas apresentam uma rica coleção de outros mecanismos para a detecção da luz não encontrada nos tecidos animais por exemplo fitocromos e criptocromos Capítulo 19 Os tipos de componentes que induzem a sinalização em plantas são similares a certas moléculas sinalizadoras de animais Figura 1233 Em vez de prostaglandinas as plantas utilizam jasmonato em vez de hormônios esteroi des brassinoesteroides Aproximadamente 100 pequenos peptídeos diferentes agem como sinalizadores em plantas e ambos plantas e animais utilizam compostos derivados de aminoácidos aromáticos como sinalizadores As plantas detectam etileno por meio de um sistema binário e uma cascata de MAPK O hormônio vegetal gasoso etileno CH25CH2 que estimu la o amadurecimento dos frutos entre outras funções age por meio de receptores relacionados em sequência primária aos receptores Hiscinases dos sistemas binários bacterianos e provavelmente tenham evoluído deles Em Arabidopsis o sistema de sinalização binário compreende uma única pro teína integral da membrana do retículo endoplasmático não da membrana plasmática O etileno se difunde para dentro da célula pela membrana plasmática e então para dentro do RE O primeiro componente a jusante modulado pela sinali zação do etileno é uma proteína SerThrcinase CTR1 Fi gura 1234 com sequência homóloga a Raf a proteínacina se que inicia a cascata das MAPK na resposta de mamíferos à insulina ver Figura 1215 Em plantas na ausência de etileno a cinase CTR1 está ativa e inibe a cascata de MAPK inibindo a transcrição dos genes responsivos a etileno A ex posição ao etileno inativa a cinase CTR1 ativando a cascata de MAPK que leva à ativação do fator de transcrição EIN3 O EIN3 ativo estimula a síntese de um segundo fator de trans O COO2 Jasmonato Plantas Animais O COO2 COO2 Prostaglandina E1 OH H O 8 12 OH Estradiol HO Brassinolídeo brassinoesteroide HO H O O HO OH OH Serotonina 5hidroxitriptamina HO N H Indol3acetato auxina N H 1 NH3 FIGURA 1233 Semelhanças estruturais entre moléculas sinalizado ras de plantas e animais Citosol Lúmen do RE Núcleo Cascata de MAPK DNA mRNA DNA mRNA Proteínas de resposta ao etileno Etileno Receptor de etileno Sistema binário Retículo endoplasmático CTR1 MAPKKK EIN2 EIN3 1 1 2 2 ERF1 FIGURA 1234 Mecanismo de transdução para a detecção de etileno pelas plantas O receptor de etileno em corderosa no retículo endo plasmático é um sistema binário contido em uma única proteína com um domínio receptor componente 1 e um domínio regulador da resposta componente 2 O receptor controla de forma ainda desconhecida a ativi dade de CTR1 uma proteínacinase similar a MAPKKK e portanto presumi velmente parte de uma cascata de MAPK O CTR1 é um regulador negativo da resposta ao etileno quando CTR1 está inativo o sinal do etileno é trans mitido pelo produto gênico EIN2 considerada uma proteína do envelope nuclear causando um aumento na síntese do fator de transcrição ERF1 Este fator estimula a expressão de proteínas específicas para a resposta ao etileno Nelson6edbookindb 475 Nelson6edbookindb 475 030414 0743 030414 0743 476 DAVID L NELSON MICHAEL M COX crição ERF1 que por sua vez ativa os genes responsivos ao etileno os produtos gênicos alteram processos que vão desde o desenvolvimento das sementes até o amadurecimen to dos frutos Apesar de aparentemente derivado do sistema de sinalização binário bacteriano o sistema do etileno em Arabidopsis é diferente porque a atividade Hiscinásica que define o componente 1 em bactérias não é essencial à trans dução de sinal em Arabdopsis Proteínascinases semelhantes a receptores transduzem os sinais de peptídeos Um elemento comum da sinalização em plantas envolve as cinases semelhantes a receptores RLK de receptor like kinases que têm um único segmento helicoidal na membrana plasmática que conecta um domínio receptor na face externa da célula com uma proteína SerThrcinase na face citoplasmática Esse tipo de receptor participa dos mecanismos de defesa desencadeados pela infecção por patógenos bacterianos Figura 1235a O sinal para ati var os genes necessários para a defesa contra a infecção é um peptídeo flg22 liberado pela degradação da flage lina a principal proteína do flagelo bacteriano A ligação da flg22 ao receptor FLS2 da Arabidopsis induz a dime rização do receptor e a autofosforilação em resíduos de Ser e Thr e o efeito a jusante é a ativação de uma cascata de MAPK como aquela descrita anteriormente para a ação da insulina A cinase final nesta cascata ativa um fator de transcrição específico iniciando a síntese das proteínas que defendem contra a infecção bacteriana As etapas en tre a fosforilação do receptor e a cascata de MAPK ainda não estão elucidadas Uma fosfoproteínafosfatase KAPP associase ao receptor ativo e o inativa por desfosforilação para extinguir a resposta A cascata de MAPK na defesa das plantas contra pató genos bacterianos é extraordinariamente similar à resposta imune inata em mamíferos Figura 1235b iniciada pelo li popolissacarídeo bacteriano e mediada por receptores tipo Toll TLR de Tolllike receptors nome derivado de um mutante de Drosophila originalmente chamado de Toll em alemão louco os TLR foram posteriormente encontra dos em muitos outros organismos e mostrouse que agem durante o desenvolvimento embrionário Outros recepto res de membrana utilizam mecanismos similares para ativar uma cascata de MAPK culminando na ativação de fatores de transcrição e consequente expressão de genes essen ciais à resposta de defesa Presumese que a maioria das várias centenas de RLK em plantas age de maneiras similares a interação com o ligante induz a dimerização e a autofosforilação e a cinase receptora ativada desencadeia as respostas subsequentes por meio da fosforilação de resíduos de Ser ou Thr em pro teínaschave RESUMO 129 Sinalização em microrganismos e plantas c As bactérias e os microrganismos eucarióticos têm di versos sistemas sensoriais que os permitem testar e res ponder ao ambiente No sistema binário um receptor Hiscinase reconhece o sinal e autofosforila um resíduo de His fosforilando então um resíduo de Asp do regula dor da resposta c As plantas respondem a muitos estímulos ambientais e fazem uso de hormônios e fatores de crescimento para coordenar o desenvolvimento e as atividades metabó licas de seus tecidos Os genomas vegetais codificam centenas de proteínas de sinalização incluindo algumas muito similares às de mamíferos c Mecanismos de sinalização binários comuns em bacté rias são encontrados em formas modificadas em plan tas utilizados na detecção de luz e de sinais químicos c As cinases semelhantes a receptores RLK de plantas participam da detecção de uma grande variedade de estímulos incluindo brassinoesteroides peptídeos ori ginados de patógenos e sinais de desenvolvimento As RLK autofosforilam resíduos de SerThr e então ativam proteínas a jusante que em alguns casos são cascatas de MAPK O resultado final é o aumento da transcrição de genes específicos a b Planta Arabidopsis Fora Dentro Mamífero Receptor FLS2 dimérico flg22 Domínio proteínacinase Fatores de transcrição WRKY22 29 Proteínas da resposta imune Fatores de transcrição Jun Fos Fator de transcrição NFkB Proteínas da resposta imune Cascata de MAPK Proteína cinase IRAK FlagelinaReceptores LPS tipo Toll Ser Thr Cascata de MAPK Cascata de MAPK P FIGURA 1235 Semelhanças entre as rotas de sinalização que iniciam as respostas imunológicas em plantas e animais a Em Arabidopsis thaliana o peptídeo flg22 derivado do flagelo de um patógeno bacteriano ligase ao seu receptor FLS na membrana plasmática levando à formação de dímeros do receptor e causando a autofosforilação do domínio cinásico citosólico em um resíduo de Ser ou Thr não em uma Tyr Assim ativada a proteínacinase fosforila proteínas a jusante não mostradas O receptor ativado também ativa por meios desconhecidos uma cascata de MAPK que leva à fosforilação de uma proteína nuclear que normalmente inibe os fatores de transcrição WRKY22 e 29 esta fosforilação causa a degradação proteolítica do inibidor e libera os fatores de transcrição para estimularem a expressão dos genes relacionados com a resposta imune b Em mamíferos um lipopolissacarídeo bacteriano tóxico LPS ver Figura 731 é detectado por receptores da membrana plasmática que então se associam e ativam uma proteínacinase solúvel IRAK A principal proteína flagelar de bactérias patogênicas age por meio de um receptor semelhante também ativando IRAK A IRAK ativada inicia duas cascatas de MAPK distintas que terminam no núcleo levando à síntese das proteínas necessárias para a resposta imune Jun Fos e NFκB são fatores de transcrição Nelson6edbookindb 476 Nelson6edbookindb 476 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 477 1210 Transdução sensorial na visão no olfato e no paladar A detecção de luz odores e sabores visão olfato e pala dar respectivamente em animais é realizada por neurô nios sensoriais especializados que utilizam mecanismos de transdução de sinal fundamentalmente similares àqueles que detectam hormônios neurotransmissores e fatores de crescimento Um sinal sensorial inicial é bastante amplifica do por mecanismos que incluem canais iônicos controlados por portões e segundos mensageiros intracelulares o siste ma se adapta à estimulação contínua alterando sua sensi bilidade ao estímulo dessensibilização e as informações sensoriais vindas de diversos receptores são integradas an tes do sinal final ser enviado ao cérebro O sistema visual utiliza os mecanismos via GPCR clássicos A luz que entra por meio da pupila do olho dos vertebra dos é irradiada sobre um grupo altamente organizado de neurônios sensíveis à luz Figura 1236 Esses neurô nios sensíveis à luz são de dois tipos bastonetes cerca de 10 9 por retina que são sensíveis a baixos níveis de luz mas não conseguem discriminar as cores e cones cer ca de 3 3 10 6 por retina que são menos sensíveis à luz mas podem diferenciar as cores Os dois tipos celulares são neurônios sensoriais especializados longos e estreitos com dois compartimentos celulares distintos o segmento externo contém dúzias de discos membranosos carrega dos com receptores proteicos e o cromóforo fotossensível retinal o segmento interno contém o núcleo e muitas mitocôndrias que produzem o ATP essencial para a foto transdução Como outros neurônios bastonetes e cones apresentam um potencial elétrico transmembrana Vm produzido pelo bombeamento eletrogênico da Na 1K 1ATPase da membrana plasmática do segmento interno Figura 1237 Também contribui para o potencial de membrana um canal iônico do segmento externo que permite a passagem tanto de Na 1 quanto de Ca 21 e que é controlado aberto por cGMP No escuro os cones contêm cGMP suficiente para manter esse canal aberto O potencial de membrana é portanto determi nado pela diferença entre a quantidade de Na 1 e K 1 bombea dos pelo segmento interno que polariza a membrana e pelo influxo de Na 1 pelo canal iônico do segmento externo que tende a despolarizar a membrana O princípio da sinalização nos bastonetes ou nos co nes é uma redução na cGMP induzida pela luz que cau sa o fechamento do canal iônico controlado por cGMP A membrana plasmática então tornase hiperpolarizada pela Na 1K 1ATPase Os bastonetes e cones formam si napses com neurônios interconectores Figura 1236 que transmitem a informação sobre a atividade elétrica para os neurônios ganglionares próximos da superfície interna da retina Os neurônios ganglionares integram as informações provenientes de muitos bastonetes ou cones e enviam o sinal resultante pelo nervo óptico ao córtex visual do cérebro A transdução da visão inicia quando a luz incide na ro dopsina da qual muitos milhares de moléculas estão pre sentes em cada um dos discos do segmento externo dos bastonetes e cones A rodopsina Mr 40000 é uma pro teína integral de membrana com sete hélices a que cruzam a membrana Figura 1238 a arquitetura característi ca dos GPCR O pigmento absorvente de luz cromóforo 11cisretinal é covalentemente unido à opsina a proteína componente da rodopsina por meio da formação de uma base de Schiff com um resíduo de Lys A molécula de reti nal situase próximo ao meio da bicamada Figura 1238 orientada com seu eixo longo aproximadamente no plano da membrana Quando um fóton é absorvido pelo compo nente retinal da rodopsina a energia causa uma alteração fotoquímica 11cisretinal é convertido a retinaltodo trans ver Figuras 119b e 1021 Essa alteração na es trutura do cromóforo força mudanças conformacionais na molécula de rodopsina o primeiro estágio da transdução visual O retinal é derivado da vitamina A1 retinol produzi da a partir de bcaroteno ver Figura 1021 A defi ciência de vitamina A na dieta leva à cegueira noturna a incapacidade de adaptarse a baixos níveis de luz relativa mente comum em alguns países em desenvolvimento Su plementos de vitamina A ou alimentos ricos em caroteno como cenoura suprem a vitamina A e revertem a cegueira noturna Luz Cristalino Olho Retina Nervo óptico Bastonete Cone Para o nervo óptico Neurônios ganglionares Neurônios interconectores Luz FIGURA 1236 Recepção da luz no olho dos vertebrados O cristalino foca a luz sobre a retina composta por camadas de neurônios Os neurônios fotossensoriais primários são bastonetes em amarelo responsáveis pela alta resolução da visão e pela visão noturna e cones de três subtipos em cor salmão que iniciam a visão colorida Os bastonetes e cones formam si napses com diversas fileiras de neurônios interconectores que transmitem e integram sinais elétricos Os sinais por fim passam dos neurônios ganglio nares por meio do nervo óptico ao cérebro Observe que a luz deve passar pelas camadas de neurônios ganglionares e neurônios interconectores antes de atingir os cones e bastonetes Nelson6edbookindb 477 Nelson6edbookindb 477 030414 0743 030414 0743 478 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A rodopsina excitada age por meio da proteína G transducina para reduzir a concentração de cGMP Na conformação excitada a rodopsina interage com uma segunda proteína transducina que está suspensa próxi mo à face citoplasmática da membrana do disco Figura 12 38 A transducina T pertence à mesma família de proteí nas heterotriméricas ligadoras de GTP como Gs e Gi Apesar de ser especializada na transdução visual a transducina compartilha muitas características funcionais com Gs e Gi Ela pode ligarse tanto a GDP quanto a GTP No escuro li FIGURA 1237 Hiperpolarização dos bastonetes induzida pela luz Os bastonetes são compostos por um segmento externo preenchido com pilhas de discos membranosos não mostrado contendo o fotorrecep tor rodopsina e um segmento interno que contém o núcleo e outras orga nelas não mostrado O segmento interno forma sinapses com neurônios interconectores ver Figura 1236 Os cones apresentam uma estrutura simi lar O ATP do segmento interno impulsiona a Na 1K 1ATPase que cria um po tencial elétrico transmembrana bombeando 3 Na 1 para fora da célula para cada 2 K 1 bombeados para dentro O potencial de membrana é reduzido pelo influxo de Na 1 e Ca 21 por meio de canais de cátions controlados por cGMP na membrana plasmática do segmento externo Quando a rodopsina absorve luz ela provoca a degradação do cGMP pontos verdes no segmen to externo causando o fechamento do canal iônico Sem o influxo de cátions por este canal a célula tornase hiperpolarizada Este sinal elétrico passa para o cérebro pelas fileiras de neurônios mostradas na Figura 1236 Segmento interno Segmento externo Na Canal iônico aberto Luz Vm45 mV Vm75 mV cGMP Canal iônico aberto Sinal elétrico Ca2 Na Ca2 Na Na Na K ATPase Gsa Gsb Gsg Citosol Cromóforo 11cisretinal Tra nsd uci na Com par timent odo disc o Rodopsina FIGURA 1238 Complexo da rodopsina com a proteína G transduci na PDB ID 1BAC A rodopsina em vermelho tem sete hélices transmem brana inseridas nas membranas dos discos dos segmentos externos dos bastonetes estando orientada com a extremidade carboxiterminal na face citosólica e a aminoterminal dentro do disco O cromóforo 11cisretinal estrutura em amarelo em volume atômico unido pela formação de uma base de Schiff com a Lys 256 da sétima hélice situase próximo ao centro da bicamada Esta localização é similar àquela do sítio de ligação da adrenalina no receptor badrenérgico Diversos resíduos de Ser e Thr próximos à extre midade carboxiterminal são substratos para as fosforilações que são parte do mecanismo de dessensibilização da rodopsina As alças citosólicas que interagem com a proteína G transducina estão mostradas em cor de laranja as posições exatas ainda não são conhecidas As três subunidades da trans ducina em verde estão mostradas em sua provável disposição A rodopsina é palmitoilada na extremidade carboxiterminal e as subunidades a e γ da transducina são unidas a lipídeos em amarelo que auxiliam no ancoramen to na membrana Nelson6edbookindb 478 Nelson6edbookindb 478 030414 0743 030414 0743 PRINCIPIOS DE BIOQUMICA DE LEHNINGER 479 gada a GDP as trés subunidades da proteina T Tze T a enzima e ligase a T e a atividade da enzima imediata permanecem unidas e nenhum sinal é enviado Quando a mente aumenta em algumas ordens de magnitude Cada rodopsina é excitada pela luz ela interage com atransdu molécula da PDE ativa degrada muitas moléculas de cGMP cina catalisando a substituicéo do GDP por GTP do citosol ao biologicamente inativo 5GMP diminuindo a cGMP no Figura 1239 etapas e A transducina entéo disso segmento externo em uma fracao de segundo Nessa nova ciase em Te Ty ea TGTP transmite 0 sinal do receptor cGMP mais baixa o canal iénico controlado por cGMP fe aos x 2 excitado para o proximo elemento da rota de transducéo cha bloqueando a reentrada de Na e Ca para o segmento uma cGMPfosfodiesterase esta enzima converte cGMP a externo e hiperpolarizando a membrana do bastonete ou 5GMP etapas e Observe que esta nio 6éamesma cone etapa Por meio desse processo o estimulo ini fosfodiesterase de nucleotideo ciclico que hidrolisao cAMP cial um foton modifica o V da célula Quanto maior a para o término da resposta Badrenérgica Umaisoformade iluminacao do bastonete maior a sua hiperpolarizacgao A PDE especifica para cGMP é exclusiva das células visuais hiperpolarizagao é percebida pelos neurénios interconecto da retina res da retina que passam 0 sinal integrado para as células A PDE da retina é uma proteina periférica com o sitio ganglionares as quais emitem ax6nios para o cérebro por ativo na face citoplasmatica da membrana do disco No es meio do nervo 6ptico curo uma subunidade inibitoria firmemente ligada supri Algumas das etapas do processo de transducao visual me de maneira muito eficaz a atividade da PDE Quando resultam em uma gigantesca amplificagao do sinal Cada a TGTP encontra a PDE a subunidade inibitoria deixa molécula de rodopsina excitada ativa pelo menos 500 mo Aabsorgao de luz Arodopsina ativada TGTP ativa a cGMP APDEativadareduza converte 11cis catalisa a substituigao fosfodiesterase PDE cGMP para abaixo do retinal a retinal do GDP pelo GTP na por ligarse a elae nivel necessario para todotrans ativan transducina T que remover sua subunidade manter o canal de Basto do a rodopsina Rh entado dissociase em inibitoria I cations aberto nete TGTP e Tg oop 3GMP Ye SM oi Ty y Z o cGMP N arP poe U cGMP Nat Ca c 4 Oscanais de cations Ca2t fecham impedindo a a entrada de Nat e Ca a membrana é hiperpolarizada Este sinal é passado ao cérebro OD Oefluxo continuo de Ca2 por meio Recoy do trocador de NaCa reduza Ce Ca2 citosdlica 2 r 2 GTP Ca cGMP LCa 4 Nat I I weenennene CGMP A rodopsinacinase RK Lentamente aarrestina Areducao da Ca fosforila a rodopsina dissociase a rodopsina é ativa a guanililciclase descorada a Ca desfosforilada e o retinal GC e inibe a PDE a Memb ea recoverina Recov todotrans é substituido cGMP elevase até o isen tical estimulam esta reacao A por 11cisretinal A nivel do escuro plasmatica arrestina Arr ligase a rodopsina esta pronta para reabrindo os canais de extremidade outro ciclo de cations e retornando carboxiterminal fototransdugao V 20 nivel préestimulo fosforilada inativando a rodopsina FIGURA1239 Consequéncias moleculares daabsorcgao do féton pela figura etapas a descreve a excitacao a inferior mostra as etapas apds rodopsina no segmento externo do bastonete A metade superior da a iluminagao a recuperado etapas e e a adaptacao etapas e O 480 DAVID L NELSON MICHAEL M COX léculas de transducina cada uma das quais podendo ativar uma molécula de PDE Essa fosfodiesterase tem uma taxa de processamento extraordinariamente alta cada molécula ativada hidrolisando 4200 moléculas de cGMP por segun do A ligação de cGMP aos canais iônicos controlados por cGMP é cooperativa e uma variação relativamente pequena na cGMP portanto resulta em uma grande alteração da condutância iônica O resultado dessas amplificações é uma excelente sensibilidade à luz A absorção de um único fóton fecha 1000 ou mais canais iônicos e altera o potencial de membrana da célula em cerca de 1 mV O sinal visual é rapidamente terminado À medida que seus olhos movemse ao longo desta linha as imagens na retina das primeiras palavras desaparecem rapidamente antes de você ver a próxima série de pa lavras Nesse curto intervalo muitos fenômenos bioquí micos aconteceram Muito rapidamente após o término da iluminação dos bastonetes ou cones o sistema fotos sensível se desliga A subunidade a da transducina li gada a GTP tem atividade GTPásica intrínseca Dentro de milissegundos após a redução na intensidade da luz o GTP é hidrolisado e Ta reassociase com Tbγ A subuni dade inibitória da PDE que estava ligada a TaGTP é li berada e reassociase com a enzima inibindo fortemente sua atividade Para retornar a cGMP ao nível do escuro a enzima guanililciclase converte GTP a cGMP etapa ➐ da Figura 1239 em uma reação que é inibida pela alta Ca 21 100 nM Os níveis de cálcio diminuem durante a iluminação porque a Ca 21 do estado de equilíbrio no segmento ex terno é o resultado do bombeamento de Ca 21 para fora da célula pelo trocador de Na 1Ca 21 ver Figura 1237 e do influxo de Ca 21 por meio dos canais controlados por cGMP abertos No escuro isso gera uma Ca 21 de aproximada mente 500 nM suficiente para inibir a síntese de cGMP Após uma breve iluminação a entrada de Ca 21 é reduzida e a Ca 21 diminui etapa ➏ A inibição da guanililciclase pelo Ca 21 é revertida a ciclase converte GTP a cGMP e o sistema retorna ao estado préestímulo etapa ➐ A própria rodopsina também é alterada em resposta à iluminação prolongada A mudança conformacional indu zida pela absorção da luz expõe alguns resíduos de Thr e Ser no domínio carboxiterminal Esses resíduos são rapi damente fosforilados pela rodopsinacinase etapa ➑ da Figura 1239 que é funcional e estruturalmente homóloga à cinase badrenérgica bARK que dessensibiliza o recep tor badrenérgico Figura 128 A proteína ligante de Ca 21 recoverina inibe a rodopsinacinase em altas Ca 21 mas a inibição é revertida quando a Ca 21 diminui após a ilu minação como descrito anteriormente O domínio carbo xiterminal fosforilado da rodopsina é ligado pela proteína arrestina 1 impedindo a interação adicional entre a ro dopsina ativada e a transducina A arrestina 1 é um homó logo muito próximo da arrestina 2 barr Figura 128 Em uma escala de tempo relativamente longa segundos a mi nutos o retinal todo trans de uma molécula de rodopsina ativada é removido e substituído por 11cisretinal reci clando a rodopsina para outro ciclo de excitação etapa ➒ da Figura 1239 Cones são especializados em visão colorida A visão colorida envolve uma rota de transdução sensorial nos cones que é essencialmente idêntica àquela descrita anterior mente porém iniciada por fotorreceptores ligeiramente dife rentes Três tipos de cones são especializados na detecção da luz de diferentes regiões do espectro utilizando três proteínas fotorreceptoras relacionadas opsinas Cada cone expressa somente um tipo de opsina mas cada um desses tipos é es treitamente relacionado à rodopsina em tamanho sequência de aminoácidos e presumivelmente estrutura tridimensio nal As diferenças entre as opsinas entretanto são grandes o bastante para colocarem o cromóforo 11cisretinal em três ambientes levemente diferentes com o resultado que os três fotorreceptores apresentam espectros de absorção diferentes Figura 1240 Cores e tons são diferenciados por meio da integração das informações vindas dos três tipos de cones cada um contendo um dos três tipos de receptores O daltonismo ou seja a incapacidade de distinguir entre vermelho e verde é uma característica genética hereditária relativamente comum em humanos Os diversos tipos de daltonismo são o resultado de diferentes tipos de mutações na opsina Uma das formas é devida à perda do fotorreceptor para vermelho os indivíduos afetados são di cromatas vermelho enxergam apenas duas das cores primárias Outros carecem do pigmento verde e são dicro matas verde Em alguns casos os fotorreceptores para vermelho e verde estão presentes mas apresentam uma al teração na sequência de aminoácidos que causa uma mu dança no espectro de absorção resultando na visão anor mal das cores Dependendo de qual pigmento estiver alterado os indivíduos são tricromatas com anomalia para o vermelho ou tricromatas com anomalia para o verde O estudo dos genes dos receptores visuais possibili tou o diagnóstico do daltonismo em um famoso paciente mais de um século após a sua morte Quadro 124 Pigmento azul Rodopsina Pigmento vermelho 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Absorbância relativa 400 450 500 550 600 650 Pigmento verde Comprimento de onda nm FIGURA 1240 O espectro de absorção da rodopsina purificada e dos receptores para vermelho verde e azul dos cones Os espectros dos receptores obtidos a partir de cones individuais isolados de cadáveres apresentam picos em cerca de 420 530 e 560 nm e a máxima absorção da rodopsina é em aproximadamente 500 nm Para referência o espectro visível dos humanos é de cerca de 380 a 750 nm Nelson6edbookindb 480 Nelson6edbookindb 480 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 481 O olfato e o paladar dos vertebrados utilizam mecanismos similares ao sistema visual As células sensoriais que detectam odores e sabores têm muito em comum com os bastonetes e os cones Os neu rônios olfativos têm cílios longos e finos que se estendem a partir de uma extremidade da célula para dentro de uma camada de muco que recobre a célula Esses cílios repre sentam uma grande área de superfície para a interação com os sinais olfativos Os receptores para os estímulos olfativos são proteínas da membrana ciliar com a familiar estrutura dos GPCR de sete hélices a transmembrana O sinal olfativo pode ser qualquer um dos muitos compostos voláteis para os quais existem receptores proteicos espe cíficos Nossa capacidade para discriminar odores é devida às centenas de diferentes receptores olfativos na língua e nas vias nasais e à capacidade cerebral de integrar as informações vindas de diferentes tipos de receptores ol fativos para o reconhecimento de um padrão híbrido estendendo nossa gama de discriminação para muito além do número de receptores O estímulo olfativo chega às células sensoriais pela di fusão no ar Na camada de muco que recobre os neurônios olfativos a molécula odorante ligase diretamente a um receptor olfativo ou ligase a uma proteína específica que transporta o odorante até o receptor Figura 1241 A interação entre odorante e receptor provoca uma alteração na conformação do receptor que resulta na substituição do GDP por GTP em uma proteína G Golf análoga à transdu cina e à Gs do sistema badrenérgico A Golf ativada então ativa a adenililciclase da membrana ciliar que sintetiza cAMP a partir de ATP elevando a cAMP local Os canais de Na 1 e Ca 21 controlados por cAMP da membrana ciliar se abrem e a entrada de Na 1 e Ca 21 causa uma pequena des polarização chamada de potencial do receptor Se um número suficiente de moléculas odorantes encontra os re ceptores o potencial do receptor será forte o bastante para induzir um neurônio a disparar um potencial de ação Isso é transmitido ao cérebro em diversas etapas e registrado como um odor específico Todos esses eventos acontecem em 100 a 200 ms Quando o estímulo olfativo não está mais presente a maquinaria de transdução se desliga de diferentes manei ras Uma cAMPfosfodiesterase retorna a cAMP ao nível préestímulo A Golf hidrolisa o GTP a GDP portanto inati vandose A fosforilação do receptor por uma cinase espe cífica impede sua interação com a Golf por um mecanismo análogo àquele utilizado para dessensibilizar o receptor b adrenérgico e a rodopsina E por último alguns odorantes são enzimaticamente destruídos por oxidases O sentido do paladar em vertebrados reflete a atividade dos neurônios gustativos agrupados nas papilas gustativas da superfície da língua Nesses neurônios sensoriais GPCR estão acoplados à proteína G heterotrimérica gostoducina muito semelhante à transducina dos bastonetes e cones As moléculas de sabor doce são aquelas que se ligam aos re ceptores em papilas gustativas doces Quando a molécula de sabor se liga a gostoducina é ativada pela substituição do GDP por GTP estimulando então a produção de cAMP pela adenililciclase A resultante elevação na cAMP ativa a PKA que fosforila canais de K 1 na membrana plasmática causando seu fechamento A redução na saída de K 1 despo lariza a célula Figura 1242 enviando um sinal elétrico para o cérebro Outras papilas gustativas são especializadas na detecção de moléculas de sabor amargo azedo salgado ou umami o sabor de certos aminoácidos como o glutama to utilizando várias combinações de segundos mensagei ros e canais iônicos nos mecanismos de transdução QUADRO 124 MEDICINA Daltonismo o experimento de John Dalton após a sua morte O químico John Dalton famoso pela teoria atômica era daltônico Ele imaginava ser provável que o humor ví treo de seus olhos o fluido que preenche o globo ocular atrás do cristalino fosse de cor azulada diferentemen te do fluido incolor dos olhos normais Ele propôs que após sua morte seus olhos fossem dissecados e a cor do humor vítreo determinada Seu desejo foi cumprido No dia seguinte à morte de Dalton em julho de 1844 Joseph Ransome dissecou os olhos e descobriu que o humor vítreo era perfeitamente incolor Ransome como muitos cientistas era relutante em jogar amostras no lixo Ele colocou os olhos de Dalton em um frasco com preservativo onde permaneceram por um século e meio Figura Q1 Então na metade da década de 1990 biólogos mo leculares na Inglaterra retiraram pequenas amostras das retinas de Dalton e extraíram o DNA Utilizando as conhecidas sequências dos genes das opsinas dos re ceptores para luz vermelha e verde eles amplificaram as sequências relevantes utilizando as técnicas des critas no Capítulo 9 e determinaram que Dalton tinha o gene da opsina para o fotopigmento vermelho mas carecia do gene da opsina para o fotopigmento verde Dalton era um dicromata verde Assim 150 anos de pois de sua morte o experimento que Dalton iniciou conjeturando sobre a causa de seu daltonismo foi finalmente terminado FIGURA Q1 Os olhos de Dalton Nelson6edbookindb 481 Nelson6edbookindb 481 030414 0743 030414 0743 482 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os GPCR dos sistemas sensoriais compartilham algumas características com os GPCR dos sistemas de sinalização por hormônios Até o presente momento foram analisados diversos tipos de sistemas de sinalização sinalização hormonal visão olfato e paladar nos quais receptores de membrana estão acoplados por meio de proteínas G a enzimas que pro duzem segundos mensageiros Como já foi sugerido neste texto os mecanismos de sinalização devem ter surgido nos primórdios da evolução estudos genômicos têm revelado centenas de genes codificando GPCR em vertebrados O O O BP a GTP OR AC Dendrito Neurônio olfativo Cílios Camada de muco Ar Axônio Membrana ciliar cAMP ATP Ca2 Cl O b g a GDP GDP GTP O odorante O chega até a camada de muco e se liga diretamente a um receptor olfativo OR ou a uma proteína de ligação BP que o transporta até o OR ➊ O OR ativado catalisa a troca GDPGTP em uma proteína G Golf causando sua dissociação em a e bg ➋ GaGTP ativa a adenililciclase que catalisa a síntese de cAMP elevando a cAMP ➌ Canais de cátions controlados por cAMP se abrem O Ca2 entra elevando a Ca2 interna ➍ Golfa hidrolisa o GTP a GDP desligando a si mesma A PDE hidrolisa o cAMP A cinase do receptor fosforila o OR inativandoo O odorante é removido pelo metabolismo ➐ O Ca2 reduz a afinidade do canal de cátions por cAMP diminuindo a sensibilidade do sistema ao odorante ➏ Canais de cloreto controlados por Ca2 se abrem A saída de Cl despolariza a célula emitindo um sinal elétrico ao cérebro ➎ Golf Golf FIGURA 1241 Os eventos moleculares do olfato Estas interações ocorrem nos cílios das células receptoras do olfato P Membrana basolateral Membrana apical GTP a a Ggust b g GDP AC S SR cAMP ATP GDP GTP PKA K ➊ Uma molécula de sabor doce S se liga ao receptor para sabor doce SR ativando a proteína G gostoducina Ggust ➋ A subunidade a da gostoducina ativa a adenililciclase AC da membrana apical elevando a AMPc ➌ A PKA ativada por cAMP fosforila um canal de K da membrana basolateral fechandoo O efluxo reduzido de K despolariza a célula enviando um sinal elétrico para o cérebro Células gustativas FIGURA 1242 Mecanismo de transdução para sabores doces Nelson6edbookindb 482 Nelson6edbookindb 482 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 483 em artrópodes Drosophila e mosquito e no nematódeo Caenorhabditis elegans Mesmo a levedura comum Sac charomyces utiliza GPCR e proteínas G para detectar o tipo sexual oposto Padrões gerais têm sido conservados e a introdução de diversidade tem dado aos organismos mo dernos a capacidade de responder a uma ampla gama de estímulos Tabela 128 Dos aproximadamente 29000 ge nes no genoma humano cerca de 1000 codificam GPCR incluindo centenas para os estímulos do olfato e muitos receptores órfãos para os quais o ligante natural ainda não é conhecido Todos os sistemas de transdução de sinal bem estuda dos que agem por meio de proteínas G heterotriméricas compartilham algumas propriedades comuns que refletem sua relação evolutiva Figura 1243 Os receptores têm sete segmentos transmembrana um domínio geralmente a alça entre as hélices transmembrana 6 e 7 que interage com uma proteína G e um domínio carboxiterminal cito plasmático reversivelmente fosforilado em alguns resíduos de Ser ou Thr O sítio de interação com o ligante ou no caso de re cepção da luz o receptor de luz está profundamente inserido na membrana e é composto por resíduos de di ferentes segmentos transmembrana A interação com o ligante ou a luz induz uma alteração na conformação do receptor expondo um domínio que pode interagir com uma proteína G As proteínas G heterotriméricas ativam ou inibem enzimas efetoras adenililciclase PDE ou PLC que afetam a concentração de um segundo mensa geiro cAMP cGMP IP3 ou Ca 21 Nos sistemas detectores de hormônios o produto final é uma proteínacinase ati vada que regula algum processo celular por meio da fos forilação de uma proteína fundamental àquele processo Nos neurônios sensoriais o produto final é uma variação no potencial de membrana e um consequente sinal elétri co que passa para outro neurônio da rota que conecta a célula sensorial ao cérebro Todos esses sistemas são autoinativantes O GTP é convertido a GDP pela atividade GTPásica intrínseca das proteínas G frequentemente aumentada pelas proteínas TABELA 128 Alguns sinais que agem por meio de GPCR Aminas Acetilcolina muscarínico Dopamina Epinefrinaadrenalina Histamina Serotonina Peptídeos Angiotensina Bombesina Bradicinina Quimiocinas Colecistocinina CCK Endotelina Hormônio liberador de gona dotrofina Interleucina8 Melanocortina Neuropeptídeo Y Neurotensina Opioides Orexina Somatostatina Taquicinina Hormônio liberador de tireo tropina Urotensina II Hormônios proteicos Hormônio folículoestimu lante Gonadotrofina Hormônio coriônico gonado tróficolutropina Tireotropina Prostanoides Prostaciclinas Prostaglandinas Tromboxano Outros Canabinoides Lisoesfingolipídeos Melatonina Estímulos olfatórios Rodopsina P Vasopressina Luz Odorantes VR Gi AC Rh T PDE cAMP OR1 Golf PLC IP3 OR2 Golf AC cAMP PKA Adrenalina b AR Gs AC cAMP cGMP PKA Moléculas de sabor doce SR Ggust AC cAMP PKA PCa2Na PCa2Na PCa2 PK FIGURA 1243 Características comuns dos sistemas de sinalização que detectam hormônios luz odores e sabores Os GPCR garantem a especificidade ao sinal e sua interação com as proteínas G provê a am plificação do sinal As proteínas G heterotriméricas ativam as enzimas efe toras adenililciclase AC fosfolipase C PLC e fosfodiesterases PDE que degradam cAMP ou cGMP As variações na concentração dos segundos mensageiros cAMP cGMP IP3 resultam na alteração de atividades enzi máticas por fosforilação ou alterações na permeabilidade P das mem branas da superfície celular a Ca 21 Na 1 e K 1 A resultante despolarização ou hiperpolarização da célula sensorial o sinal passa por grupos de neu rônios aos centros sensoriais do cérebro Nos casos mais bem estudados a dessensibilização inclui a fosforilação do receptor e a ligação de uma proteína arrestina que interrompe as interações entre receptor e proteína G VR é o receptor de vasopressina bAR é o receptor badrenérgico Abre viações para outros receptores e proteínas G estão conforme ilustrações anteriores Nelson6edbookindb 483 Nelson6edbookindb 483 030414 0743 030414 0743 484 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ativadoras de GTPase GAP ou proteínas RGS regulado res da sinalização por proteínas G ver Figura 125 e Figura Q4 do Quadro 122 Em alguns casos as enzimas efeto ras que são os alvos da modulação pelas proteínas G tam bém atuam como GAP O mecanismo de dessensibilização que envolve a fosforilação da região carboxiterminal segui da pela ligação da arrestina é amplamente distribuído e pode ser universal RESUMO 1210 Transdução sensorial na visão no olfato e no paladar c Visão olfato e paladar em vertebrados fazem uso de GPCR que agem por meio de proteínas G heterotriméri cas para alterar o Vm de neurônios sensoriais c Nos bastonetes e cones da retina a luz ativa a rodopsi na a qual ativa a proteína G transducina A subunidade a liberada da transducina ativa uma fosfodiesterase de cGMP que diminui a cGMP e desta maneira fecha ca nais iônicos dependentes de cGMP no segmento exter no do neurônio A resultante hiperpolarização do basto nete ou cone conduz o sinal para o próximo neurônio da rota e ao final para o cérebro c Nos neurônios olfativos o estímulo que age por meio de GPCR e proteínas G provoca um aumento na cAMP pela ativação da adenililciclase ou um aumento na Ca 21 pela ativação da PLC Esses segundos mensa geiros afetam canais iônicos e portanto Vm c Os neurônios gustativos têm GPCR que respondem a moléculas de sabor por meio da alteração nos níveis de cAMP que altera Vm por meio do controle de canais iônicos c Existe um alto grau de conservação das proteínas de sinalização e dos mecanismos de transdução entre os sistemas de sinalização e entre as espécies 1211 Regulação do ciclo celular por proteínascinases Uma das manifestações mais evidentes das rotas de sina lização é a regulação do ciclo celular eucariótico Durante o crescimento embrionário e o desenvolvimento posterior a divisão celular acontece em praticamente todos os teci dos Nos organismos adultos a maioria dos tecidos tornase quiescente A decisão de uma célula de dividirse ou não é de grande importância para o organismo Quando os me canismos de regulação que limitam a divisão celular estão defeituosos e as células dividemse desordenadamente o resultado é catastrófico câncer A divisão celular correta requer uma sequência organizada de eventos bioquímicos que asseguram a cada célulafilha um conjunto completo das moléculas necessárias para a vida As investigações so bre o controle da divisão celular em diversas células euca rióticas têm revelado mecanismos de regulação universais Os mecanismos de sinalização muito semelhantes àqueles discutidos anteriormente são fundamentais para determi nar se e quando uma célula passa pela divisão celular ga rantindo também a passagem ordenada pelos estágios do ciclo celular O ciclo celular tem quatro estágios A divisão celular que segue a mitose em eucariotos ocorre em quatro etapas bem definidas Figura 1244 Na fase S síntese o DNA é replicado para gerar as cópias para am bas as célulasfilhas Na fase G2 G indica o intervalo entre divisões do inglês gap novas proteínas são sintetizadas e a célula praticamente dobra de tamanho Na fase M mito se o envelope nuclear materno se desfaz os cromossomos pareados são puxados para os polos opostos da célula cada conjunto de cromossomos é circundado por um envelope nuclear recémformado e a citocinese divide a célula pela metade originando duas célulasfilhas ver Figura 2424 Nos tecidos embrionários ou naqueles de proliferação rá pida cada célulafilha se divide novamente mas somente após um período de espera G1 Nas células animais em cultura o processo completo consome cerca de 24 horas Depois de passar pela mitose e entrar em G1 a célula entra em outro ciclo de divisão ou para de se dividir en trando em uma fase quiescente G0 que pode durar horas dias ou todo o período de vida da célula Quando uma célula em G0 começa a dividirse novamente ela reentra no ciclo de divisão pela fase G1 As células diferenciadas como he patócitos ou adipócitos adquiriram forma e função espe cializadas elas permanecem na fase G0 As célulastronco retêm o potencial de divisão e diferenciação em qualquer um de vários tipos celulares Os níveis de proteínascinases dependentes de ciclina oscilam A sincronia do ciclo celular é controlada por uma família de proteínascinases cujas atividades variam em resposta a si G1 612 h S 68 h G2 34 h M 1 h Fase G1 Síntese de RNA e proteínas Sem síntese de DNA Ponto de restrição Uma célula que passe deste ponto está comprometida a passar para a fase S Ponto de reentrada Uma célula retornando de G0 entra no início da fase G1 Fase G0 Células completamente diferenciadas saem do ciclo celular indefinidamente Fase M A mitose divisão nuclear e a citocinese divisão celular originam duas célulasfilhas Fase G2 Sem síntese de DNA A síntese de RNA e proteínas continua Fase S A síntese de DNA dobra a quantidade de DNA na célula RNA e proteínas também são sintetizados G0 FIGURA 1244 O ciclo celular eucariótico As durações em horas dos quatro estágios variam porém as apresentadas aqui são típicas Nelson6edbookindb 484 Nelson6edbookindb 484 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 485 nais celulares Por meio da fosforilação de proteínas especí ficas em intervalos de tempo precisamente cronometrados estas proteínascinases coordenam as atividades metabó licas da célula para efetuar a divisão celular ordenada As cinases são heterodímeros com uma subunidade de regu lação a ciclina e uma subunidade catalítica a proteína cinase dependente de ciclina CDK de cyclindepen dent protein kinase Na ausência da ciclina a subunidade catalítica é praticamente inativa Quando a ciclina se liga o sítio catalítico se abre um resíduo essencial para a catálise tornase acessível Figura 1245 e a atividade cinásica da subunidade catalítica aumenta 10000 vezes As células animais têm pelo menos 10 ciclinas diferentes designadas A B e assim por diante e pelo menos 8 CDK de CDK1 a CDK8 que trabalham em diferentes combinações em pon tos específicos do ciclo celular As plantas também utilizam uma família de CDK para regular a divisão celular nas raí zes e meristemas dos brotos os principais tecidos nos quais ocorre divisão Em uma população de células animais dividindose sin cronizadamente as atividades de algumas CDK apresentam marcadas oscilações Figura 1246 Essas oscilações são o resultado de quatro mecanismos de regulação das ativi dades das CDK fosforilação ou desfosforilação da CDK degradação controlada da subunidade ciclina síntese pe riódica de CDK e ciclinas e a ação das proteínas inibidoras específicas de CDK A ativação e a inativação precisamente cronometradas de uma série de CDK produzem os sinais que agem como o relógiomestre que orquestra os even tos da divisão celular normal e garante que um estágio seja completado antes que o próximo inicie Regulação das CDK por fosforilação A atividade de uma CDK é notavelmente afetada pela fosforilação e desfosforilação de dois resíduos críticos da proteína Figura 1247a A fos forilação da Tyr 15 próxima à extremidade aminoterminal torna a CDK2 inativa o resíduo de Tyr está no sítio de ligação ao ATP da cinase e o grupo fosfato negativamente carregado bloqueia a entrada do ATP Uma fosfatase espe cífica uma PTPase desfosforila este resíduo de Tyr permitindo a ligação do ATP A fosforilação da Thr 160 na alça T da CDK catalisada por outra proteínacinase força a saída da alça T da fenda de ligação do substrato permi tindo a ligação de uma proteínaalvo específica a jusante e a sua fosforilação pela CDK ver Figura 1245c a CDK2 inativa CDK2 inativa Subunidade ciclina CDK2 ativa ATP Alça T Hélice aminoterminal Glu51 Glu51 b c ATP Alça T Alça T ATP Glu51 Arg50 Arg126 Thr160 fosforilada Arg150 FIGURA 1245 Ativação das proteínascinases dependentes de ci clinas CDK pelas ciclinas e por fosforilação As CDK uma família de enzimas relacionadas estão ativas somente quando associadas com as cicli nas outra família de proteínas A estrutura do cristal de CDK2 com e sem a ciclina revela as bases desta ativação a Sem a ciclina PDB ID 1HCK a CDK2 dobrase de maneira que um segmento a alça T obstrui o sítio de ligação para os substratos proteicos e assim inibe a atividade cinásica da proteína O sítio de ligação para o ATP também é próximo à alça T b Quando a ciclina se liga PDB ID 1FIN ela força alterações conformacionais que afastam a alça T do sítio ativo e reorienta uma hélice aminoterminal trazendo um resíduo crucial para a catálise Glu 51 para dentro do sítio ativo c A fosforilação de um resíduo de Thr na alça T produz um resíduo negativamente carregado estabilizado pela interação com três resíduos de Arg mantendo a CDK na conformação ativa PDB ID 1JST Nelson6edbookindb 485 Nelson6edbookindb 485 030414 0743 030414 0743 486 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A presença de quebras de fita simples de DNA causa a parada do ciclo celular em G2 pela regulação de uma CDK específica Uma proteínacinase específica chamada de Rad3 em levedura ativada pelas quebras de fita simples inicia uma cascata que leva à inativação da PTPase que desfosforila a Tyr 15 da CDK A CDK permanece inativa e a célula permanece parada em G2 incapaz de dividirse até que o DNA seja reparado e os efeitos da cascata sejam revertidos A degradação controlada das ciclinas A proteólise altamente específica e precisamente cronometrada das ciclinas mi tóticas regula a atividade das CDK durante todo o ciclo celular A progressão pela mitose requer primeiramente a ativação e então a destruição das ciclinas A e B que ati vam a subunidade catalítica da CDK da fase M Essas cicli nas apresentam próximo à extremidade aminoterminal a sequência ArgThrAlaLeuGlyAspIleGlyAsn a caixa de destruição que as marca para a degradação O uso de caixa remete à prática comum na diagramação de se Atividade cinásica Tempo G1 S G2 M Ciclina ECDK2 Ciclina ACDK2 Ciclina BCDK1 G1 FIGURA 1246 As variações nas atividades das CDK específicas duran te o ciclo celular em animais A atividade da ciclina ECDK2 tem um pico próximo ao limite entre as fases G1 e S quando a enzima ativa desencadeia a síntese das enzimas necessárias para a síntese de DNA ver Figura 1249 A atividade da ciclina ACDK2 aumenta durante as fases S e G2 e então diminui repentinamente na fase M quando a ciclina BCDK1 apresenta um pico U Ciclina U U U U Ciclina Tyr A ciclina não está presente a CDK está inativa A síntese de ciclina causa seu acúmulo O complexo ciclinaCDK formase mas a fosforilação da Tyr15 bloqueia o sítio de ligação do ATP ainda inativo A fosforilação da Thr160 na alça T e a remoção do grupo fosfato da Tyr15 ativa o complexo ciclinaCDK muitas vezes ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ ➏ ➑ ➐ A ciclina é degradada pelo proteassomo levando à inativação da CDK A CDK fosforila uma fosfatase que ativa mais moléculas de CDK A CDK fosforila a DBRP ativandoa A DBRP estimula a adição de moléculas de ubiquitina à ciclina pela ubiquitinaligase Pi CDK CDK CDK Tyr Thr Thr Ciclina CDK Fosfatase Fosfatase DBRP DBRP P P P P P P a b FIGURA 1247 Regulação das CDK por fosforilação e proteólise a A proteínacinase dependente de ciclina ativada no momento da mitose a CDK da fase M possui uma alça T que pode dobrarse para dentro do sítio de ligação ao substrato Quando a Thr 160 da alça T está fosforilada a alça movese para fora do sítio de ligação do substrato ativando a CDK muitas vezes etapa ➍ b O complexo ciclinaCDK ativo inicia sua própria inativação pela fosforilação da DBRP proteína de reconhecimento de caixas de destruição etapa ➏ A DBRP e a ubiquitinaligase então unem diversas moléculas de ubiquitina U à ciclina etapa ➐ marcandoa para a destruição pelos proteassomos complexos enzimáticos proteolíticos etapa ➑ Nelson6edbookindb 486 Nelson6edbookindb 486 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 487 quências de ácidos nucleicos ou proteínas de representar uma curta sequência com função específica em uma caixa Isso não implica nenhuma estrutura tridimensional A pro teína DBRP proteína de reconhecimento de caixas de des truição de destruction box recognizing protein reco nhece essa sequência e inicia o processo de degradação da ciclina aproximando a ciclina de outra proteína a ubiqui tina A ciclina e a ubiquitina ativada são covalentemente unidas pela enzima ubiquitinaligase Figura 1247b Mais algumas moléculas de ubiquitina são assim anexadas forne cendo o sinal para um complexo enzimático proteolítico ou proteassomo degradar a ciclina O que controla o momento correto para a degradação da ciclina Uma alça de retroalimentação ocorre dentro do processo geral mostrado na Figura 1247 A elevada ativi dade da CDK etapa ➍ culmina na proteólise da ciclina etapa ➑ A ciclina recémsintetizada se associa e ativa a CDK que fosforila e ativa a DBRP A DBRP ativa então leva à proteólise da ciclina O decréscimo no nível de ciclina causa um declínio na atividade da CDK e a atividade da DBRP também é reduzida por desfosforilação e inativação lentas e constantes com a ajuda de uma DBRPfosfatase O nível de ciclina é ao final restaurado pela síntese de novas moléculas de ciclina A função da ubiquitina e dos proteassomos não se limi ta à regulação das ciclinas como será visto no Capítulo 27 também envolve a renovação das proteínas celulares pro cesso fundamental para a manutenção celular A síntese regulada de CDK e ciclinas O terceiro mecanismo para a alteração da atividade das CDK é a regulação da taxa de síntese de ciclinas ou CDK ou de ambas Por exemplo ci clina D ciclina E CDK2 e CDK4 são sintetizadas apenas quando um fator de transcrição específico E2F está pre sente no núcleo para ativar a transcrição destes genes A síntese de E2F é por sua vez regulada por sinais extracelu lares como fatores de crescimento e citocinas sinais de desenvolvimento que induzem a divisão celular compos tos identificados como essenciais para a divisão das células de mamíferos em cultura Eles induzem a síntese de fato res de transcrição nucleares específicos e essenciais para a expressão das enzimas de síntese do DNA Os fatores de crescimento induzem a fosforilação das proteínas nucleares Jun e Fos fatores de transcrição que promovem a síntese de uma grande variedade de produtos gênicos incluindo ci clinas CDK e E2F Por sua vez E2F controla a expressão de diversas enzimas essenciais para a síntese de desoxinucle otídeos e DNA possibilitando que as células entrem na fase S Figura 1248 Inibição das CDK Finalmente inibidores proteicos específi cos se ligam e inativam CDK específicas Uma dessas pro teínas é a p21 discutida a seguir Esses quatro mecanismos de controle modulam a ati vidade de CDK específicas as quais por sua vez contro lam se a célula irá se dividir diferenciar se tornar quies cente permanentemente ou começar um novo ciclo de divisão após um período de quiescência Os detalhes da regulação do ciclo celular como o número de diferentes ciclinas e cinases e as combinações nas quais elas agem diferem de espécie para espécie porém o mecanismo bá sico tem sido conservado na evolução de todas as células eucarióticas As CDK regulam a divisão celular pela fosforilação de proteínas cruciais Foi examinado como as células mantêm um rigoroso con trole da atividade das CDK mas como a atividade das CDK controla o ciclo celular A lista de proteínasalvo reguladas pelas CDK continua a crescer e muitas ainda estão para serem descobertas É possível porém obser var um padrão geral por trás da regulação pelas CDK pelo exame do efeito das CDK sobre a estrutura da lamina e da miosina e também sobre a atividade da proteína do retinoblastoma A estrutura do envelope nuclear é mantida em parte por redes altamente organizadas de filamentos intermediários compostos pela proteína lamina O desmantelamento do en velope nuclear antes da segregação das cromátidesirmãs na mitose é parcialmente devido à fosforilação da lamina por uma CDK que causa a despolimerização dos filamentos de lamina Um segundo alvo da cinase é a maquinaria contrátil impelida por ATP actina e miosina que separa uma cé lula em divisão em duas partes iguais durante a citocine se Após a divisão a CDK fosforila uma pequena subuni dade de regulação da miosina causando a dissociação da miosina dos filamentos de actina e inativando a maqui Fatores de crescimento citocinas Fosforilação de Jun e Fos no núcleo Regulação da transcrição Passagem da fase G1 para a fase S Cascata de MAPK Fator de transcrição E2F Regulação da transcrição Ciclinas CDK Enzimas para a síntese de DNA FIGURA 1248 Regulação da divisão celular por fatores de cresci mento A rota entre os fatores de crescimento e a divisão celular passa pela cascata enzimática que ativa MAPK a fosforilação dos fatores de transcrição nucleares Jun e Fos e a atividade do fator de transcrição E2F que promove a síntese de algumas enzimas essenciais à síntese de DNA Nelson6edbookindb 487 Nelson6edbookindb 487 030414 0743 030414 0743 488 DAVID L NELSON MICHAEL M COX naria contrátil A posterior desfosforilação possibilita a remontagem do aparato contrátil para a próxima rodada de citocinese Um terceiro substrato da CDK muito importante é a proteína do retinoblastoma pRb quando é detectado dano no DNA essa proteína participa de um mecanismo que cessa a divisão celular em G1 Figura 1249 No meada em função da linhagem celular tumoral em que foi descoberta a pRb atua na maioria dos tipos celulares tal vez em todos para regular a divisão celular em resposta a uma grande variedade de estímulos A pRb não fosforilada se liga ao fator de transcrição E2F enquanto ligado a pRb o E2F não consegue estimular a transcrição de um grupo de genes necessários para a síntese de DNA os genes da DNApolimerase a da ribonucleotídeoredutase e de outras proteínas ver Capítulo 25 Nesse estágio o ciclo celular não pode progredir da fase G1 para a fase S a fase que com promete a célula com a mitose e a divisão celular O meca nismo de bloqueio pRbE2F é interrompido quando pRb é fosforilada pela ciclina ECDK2 o que ocorre em resposta a um sinal para o avanço da divisão celular Quando as proteínascinases ATM e ATR detectam dano no DNA sinalizado pela presença da proteína MRN em um local com quebra na fita dupla elas fosforilam p53 ativan doa para atuar como um fator de transcrição que estimula a síntese da proteína p21 Figura 1249 Essa proteína ini be a atividade cinásica da ciclina ECDK2 Na presença de p21 a pRb permanece não fosforilada e ligada a E2F blo queando a atividade desse fator de transcrição e a célula fica parada em G1 Isso garante à célula tempo para reparar o DNA antes de entrar na fase S evitando a potencialmente desastrosa transferência de um genoma defeituoso a uma ou ambas as célulasfilhas Quando o dano é sério demais para permitir o reparo eficaz essa mesma maquinaria inicia um processo apoptose descrita a seguir que leva à mor te da célula prevenindo o possível desenvolvimento de um câncer RESUMO 1211 Regulação do ciclo celular por proteínascinases c A progressão durante o ciclo celular é regulada pelas proteínascinases dependentes de ciclina CDK que agem em pontos específicos do ciclo fosforilando prote ínaschave e modulando suas atividades A subunidade catalítica das CDK permanece inativa quando não asso ciada com a subunidade de regulação ciclina c A atividade de um complexo ciclinaCDK varia durante o ciclo celular pela síntese diferenciada das CDK degra dação específica de ciclinas fosforilação e desfosforila ção de resíduos críticos nas CDK e ligação de inibidores proteicos a complexos ciclinaCDK específicos c Entre os alvos fosforilados pelas ciclinaCDK estão pro teínas do envelope nuclear e proteínas necessárias para a citocinese e o reparo do DNA 1212 Oncogenes genes supressores tumorais e morte celular programada Tumores e cânceres são o resultado da divisão celular descontrolada Normalmente a divisão celular é regulada por uma família de fatores de crescimento extracelulares proteínas que levam células em repouso a dividiremse e em alguns casos diferenciaremse O resultado é um equi líbrio entre a formação de novas células como as células da pele que morrem e são repostas em um ciclo de pou cas semanas ou os leucócitos repostos em um ciclo de poucos dias e a destruição celular Quando esse equilíbrio é perturbado por defeitos nas proteínas de regulação o resultado algumas vezes é a formação de um clone celular que se divide repetidamente e sem regulação um tumor até que sua presença interfira com o funcionamento dos Divisão celular bloqueada por p53 A divisão celular ocorre normalmente CDK2 Inativo CDK2 Ativo Ciclina E Quebra na fita dupla de DNA DNA intacto p21 p21 pRb P pRb pRb E2F Inativo E2F Enzimas para a síntese de DNA regulação da transcrição regulação da transcrição leva a p21 Passagem de G1 a S Ativo Ciclina E MRN ATM ATR p53 Ativo FIGURA 1249 Regulação da passagem de G1 a S pela fosforilação de pRb O fator de transcrição E2F promove a transcrição dos genes de cer tas enzimas essenciais para a síntese do DNA A proteína do retinoblastoma pRb pode ligarse a E2F embaixo à esquerda inativandoo e impedindo a transcrição destes genes A fosforilação da pRb pela CDK2 impedea de ligar se e inativar E2F e os genes são transcritos possibilitando a divisão celular O dano ao DNA da célula em cima à esquerda provoca uma série de eventos que inativam a CDK2 bloqueando a divisão celular Quando a proteína MRN detecta dano no DNA ela ativa duas proteínascinases ATM e ATR e elas fos forilam e ativam o fator de transcrição a proteína p53 A p53 ativa promove a síntese de outra proteína p21 um inibidor de CDK2 A inibição da CDK2 interrompe a fosforilação de pRb que portanto continua a ligarse e inibir E2F Com E2F inativado os genes essenciais para a divisão celular não são transcritos e a divisão celular é bloqueada Quando o DNA estiver reparado esta inibição é liberada e a célula dividese Nelson6edbookindb 488 Nelson6edbookindb 488 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 489 tecidos normais um câncer A causa direta é quase sem pre um defeito genético em uma ou mais das proteínas que regulam a divisão celular Em alguns casos um gene defei tuoso é herdado de um dos pais em outros casos a muta ção ocorre quando um composto tóxico do meio ambiente composto mutagênico ou carcinogênico ou mesmo a ra diação de alta energia interage com o DNA de uma única célula danificao e introduz uma mutação Na maioria dos casos existem ambas as contribuições hereditária e am biental e mais de uma mutação é necessária para causar a completa desregulação da divisão e o desenvolvimento de câncer Os oncogenes são formas mutantes dos genes de proteínas que regulam o ciclo celular Os oncogenes foram originalmente descritos em ví rus causadores de tumor sendo posteriormente des coberto que eram derivados de genes das células hospedei ras animais os protooncogenes que codificam proteínas reguladoras do crescimento Durante uma infecção viral a sequência de DNA de um protooncogene do hospedeiro é algumas vezes copiada para dentro do genoma viral onde ela prolifera juntamente com o vírus Nos ciclos de infecção seguintes os protooncogenes podem se tornar defeituo sos por mutações ou deleções Os vírus diferentemente das células animais não têm mecanismos efetivos para a correção de erros durante a replicação do DNA de modo que acumulam mutações rapidamente Quando um vírus portando um oncogene infecta uma nova célula hospedei ra o DNA viral e o oncogene pode ser incorporado ao DNA da célula hospedeira na qual ele pode agora interferir na regulação da divisão celular Em um mecanismo alterna tivo não viral uma única célula em um tecido exposto a compostos carcinogênicos pode sofrer um dano ao DNA que torne uma de suas proteínas reguladoras defeituosa com o mesmo efeito do mecanismo oncogênico falhas na regulação da divisão celular As mutações que originam oncogenes são geneticamen te dominantes se um cromossomo de um par contiver um gene defeituoso o produto daquele gene enviará o sinal dividase o que poderá resultar em um tumor O defei to oncogênico pode estar em qualquer uma das proteínas envolvidas na comunicação do sinal dividase Os onco genes descobertos até este momento incluem aqueles que codificam proteínas secretórias fatores de crescimento proteínas transmembrana receptores proteínas citoplas máticas proteínas G e proteínascinases e os fatores de transcrição nucleares que controlam a expressão dos genes essenciais para a divisão celular Jun Fos Alguns oncogenes codificam receptores de superfície com sítios de ligação ao sinal defeituosos ou ausentes de maneira que sua atividade Tyrcinásica intrínseca está des regulada Por exemplo a oncoproteína ErbB é essencial mente idêntica ao receptor normal do fator de crescimento da epiderme exceto que ErbB carece do domínio amino terminal que normalmente ligase a EGF Figura 1250 e consequentemente transmite o sinal dividase estando o EGF presente ou não As mutações em erbB2 o gene de um receptor Tyrcinase relacionado a ErbB são comumente associadas com os cânceres do epitélio glandular em mama estômago e ovário Consulte uma explicação sobre o uso de abreviações na denominação de genes e seus produtos no Capítulo 25 O importante papel desempenhado pelas proteínasci nases nos processos de sinalização relacionados à divisão celular normal e anormal as coloca como um dos principais alvos no desenvolvimento de fármacos para o tratamento de câncer Quadro 125 Formas mutantes da proteína G Ras são comuns em células tumorais O oncogene ras codifica uma proteína que normalmente se liga ao GTP porém sem atividade GTPásica A proteína Ras mutante está portan to sempre na forma ativada ligada a GTP independen temente dos sinais que cheguem por meio dos receptores normais O resultado pode ser o crescimento desregulado As mutações no ras estão associadas com 30 a 50 dos car cinomas de pulmão e colo e com mais de 90 dos carcino mas pancreáticos Os defeitos em determinados genes eliminam a repressão normal da divisão celular Os genes supressores tumorais codificam proteí nas que normalmente reprimem a divisão celular As mutações em um ou mais desses genes pode levar à forma ção de tumores O crescimento desregulado devido a genes supressores tumorais defeituosos ao contrário do que ocor re com os oncogenes é geneticamente recessivo os tumo res se formam somente se ambos os cromossomos de um par contiverem o gene defeituoso Isso ocorre porque a fun ção desses genes é impedir a divisão celular e se uma das cópias do gene para uma de tais proteínas estiver normal a inibição normal da divisão ocorre Em uma pessoa que her da uma cópia correta e uma cópia defeituosa todas as célu las têm uma cópia defeituosa do gene Se qualquer uma das 10 12 células somáticas sofrer uma mutação na cópia correta um tumor pode crescer a partir dessa célula duplamente mutada As mutações nas duas cópias dos genes de pRb Fora Dentro Domínio de ligação ao EGF Sítio de ligação ao EGF vazio a tirosina cinase está inativa A ligação do EGF ativa a tirosinacinase A tirosinacinase está sempre ativa Domínio tirosinacinase EGF Espaço extracelular Receptor de EGF normal Proteína ErbB FIGURA 1250 Receptores defeituosos de EGF codificados por onco genes O produto do oncogene erbB a proteína ErbB é uma versão trunca da do receptor normal para o fator de crescimento da epiderme EGF O do mínio intracelular apresenta a estrutura normalmente induzida pela ligação do EGF porém a proteína carece do sítio extracelular de ligação a EGF Não sendo regulada pelo EGF a ErbB continuamente sinaliza a divisão celular Nelson6edbookindb 489 Nelson6edbookindb 489 030414 0743 030414 0743 490 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Quando uma única célula se divide sem qualquer limitação regulatória ela originará no final um clone de células tão grande que ele interferirá com as funções fisiológicas nor mais Figura Q1 Isso é câncer uma das principais cau sas de morte nos países desenvolvidos e em expansão nos países em desenvolvimento Em todos os tipos de câncer a regulação normal da divisão celular tornase disfuncional devido aos defeitos em um ou mais genes Por exemplo os genes que codificam proteínas que normalmente emi tem sinais intermitentes para a divisão celular tornamse oncogenes originando proteínas sinalizadoras constituti vamente ativas ou os genes que codificam proteínas que normalmente reprimem a divisão celular genes supresso res tumorais são mutados e acabam originando proteínas que carecem dessa função de controle Em muitos tumo res ambos os tipos de mutações ocorrem Muitos oncogenes e genes supressores tumorais codi ficam proteínascinases ou proteínas que atuam nas rotas de sinalização em posições a jusante às proteínascinases É portanto lógico imaginar que inibidores específicos de proteínascinases mostrarseiam úteis para o tratamento de câncer Por exemplo uma forma mutante do receptor de EGF é um receptor Tyrcinase RTK constantemen te ativo sinalizando a divisão celular caso o EGF esteja presente ou não ver Figura 1250 Em cerca de 30 das mulheres com câncer de mama invasivo uma muta ção no gene do receptor HER2neu origina um RTK com a atividade aumentada em até 100 vezes Outro RTK o receptor do fator de crescimento endotelial vas cular VEGFR de vascular endothelial growth factor receptor deve ser ativado para que a formação de no vos vasos sanguíneos angiogênese forneça a um tumor sólido seu próprio suprimento de sangue e a inibição do VEGFR pode privar um tumor de nutrientes essenciais As Tyrcinases que não participam de receptores também podem ser mutadas resultando em constante sinalização e divisão celular desregulada Por exemplo o oncogene Abl do vírus da leucemia de Abelson de Abelson leuke mia virus é associado à leucemia mieloide aguda uma doença sanguínea relativamente rara 5000 casos por ano nos Estados Unidos Outro grupo de oncogenes co difica proteínascinases dependentes de ciclina desregu ladas Em cada um desses casos inibidores específicos de proteínascinases poderiam ser valiosos agentes quimiote rápicos para o tratamento da doença Não surpreendente mente esforços enormes para o desenvolvimento desses inibidores estão sendo feitos Como abordar esse desafio As proteínascinases de todos os tipos apresentam uma notável conservação da estrutura do sítio ativo To das compartilham as características da estrutura proto típica da PKA mostradas na Figura Q2 dois lobos que circundam o sítio ativo com uma alça P que auxilia no alinhamento e na ligação dos grupos fosfato do ATP uma alça de ativação que se move para a abertura do sítio ativo ao substrato proteico e uma hélice C que muda de posi ção quando a enzima é ativada trazendo os resíduos da fenda de ligação ao substrato até suas posições de ligação Os inibidores de proteínascinases mais simples são os análogos de ATP que ocupam o sítio de ligação do ATP mas não servem como doadores de grupos fosfato Muitos desses compostos são conhecidos porém sua uti lidade clínica é limitada pela falta de seletividade ini bem praticamente todas as proteínascinases e provoca riam efeitos colaterais intoleráveis QUADRO 125 MEDICINA O desenvolvimento de inibidores de proteínascinases para o tratamento de câncer FIGURA Q1 A divisão desregulada de uma única célula do colo levou a um câncer primário que metastatizou para o fígado Os cânceres secun dários são visualizados como manchas brancas neste fígado obtido em uma necropsia Alça de ativação Hélice C Alça P Lobo amino terminal Lobo carboxi terminal ATP Mg2 Inibidor PD318088 na fenda de ligação ao substrato Alça catalítica FIGURA Q2 As características conservadas do sítio ativo das proteínas cinases PDB ID 1S91 Os lobos aminoterminal e carboxiterminal circun dam o sítio ativo da enzima próximos à alça catalítica e ao sítio onde o ATP se liga A alça de ativação desta e de muitas outras cinases é fosfo rilada e então afastase do sítio ativo para expor a fenda de ligação ao substrato a qual nesta imagem está ocupada por um inibidor específico desta enzima PD318088 A alça P é essencial para a ligação do ATP e a hélice C também deve estar corretamente alinhada para a ligação do ATP e a atividade cinásica Nelson6edbookindb 490 Nelson6edbookindb 490 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 491 Maior seletividade é encontrada nos compostos que ocupam parte do sítio de ligação do ATP porém intera gem também fora desse sítio com regiões da proteína exclusivas da proteínacinasealvo Uma terceira es tratégia possível tem como base o fato de que embora as conformações ativas de todas as proteínascinases sejam semelhantes suas conformações inativas não o são Os fármacos direcionados à conformação inativa de uma proteínacinase específica impedem sua con versão à forma ativa e apresentam maior especificidade de ação Uma quarta abordagem utiliza a grande espe cificidade dos anticorpos Por exemplo anticorpos mo noclonais p 178 que se ligam às porções extracelu lares de RTK específicos poderiam eliminar a atividade cinásica do receptor por impedirem a dimerização ou por causarem sua remoção da superfície celular Em al guns casos um anticorpo seletivamente ligado à super fície de células cancerosas poderia estimular o sistema imune a atacar aquelas células A pesquisa por fármacos ativos contra proteínas cinases específicas tem produzido resultados encora jadores Por exemplo o mesilato de imatinibe Glivec Figura Q3a uma das pequenas moléculas inibidoras tem se mostrado praticamente 100 eficaz em causar a regressão em pacientes nos estágios iniciais de leu cemia mieloide crônica O erlotinibe Tarceva Figura Q3b direcionado ao EGFR é efetivo no tratamento de câncer de pulmão de células não pequenas NSCLC de nonsmallcell lung cancer avançado Como muitos sistemas de sinalização para a divisão celular envolvem mais de uma proteínacinase os inibidores que agem sobre diferentes proteínascinases podem ser úteis para o tratamento de câncer O sunitinibe Sutent e o sora fenibe Nexavar têm diversas proteínascinases como alvos incluindo VEGFR e PDGFR Esses dois fármacos estão em uso clínico em pacientes com tumores estro mais gastrintestinais e adenocarcinoma renal avançado respectivamente O trastuzumabe Herceptin o cetu ximabe Erbitux e o bevacizumabe Avastin são an ticorpos monoclonais direcionados a HER2neu EGFR e VEGFR respectivamente os três fármacos estão em uso clínico para determinados tipos de câncer O co nhecimento detalhado da estrutura ao redor do sítio de ligação do ATP torna possível o desenho de fármacos que inibam uma proteínacinase específica por 1 blo quear o sítio de ligação do ATP crítico enquanto 2 interagem com resíduos ao redor desse sítio que sejam únicos para essa proteínacinase em particular Pelo menos mais outros 100 compostos estão em fase préclínica Entre os fármacos em fase de avalia ção estão alguns obtidos a partir de fontes naturais e alguns produzidos por síntese química A indirubina é um componente de um preparado de ervas chinês tra dicionalmente utilizado para tratar certas leucemias ela inibe CDK2 e CDK5 A roscovitina Figura Q3d uma adenina substituída tem um anel benzil que a tor na altamente específica como um inibidor da CDK2 Com algumas centenas de potenciais fármacos anticâncer en trando na fase de testes clínicos é realista imaginar que alguns se mostrarão mais efetivos ou mais específicos do que os fármacos atualmente em uso c ATP ligado a CDK2 d Roscovitina ligado a CDK2 a Imatinibe Glivec ligado a Abl b Erlotinibe Tarceva ligado ao EGFR N N O O O O N H Erlotinibe Tarceva HN NH N N N N N O Imatinibe Glivec Roscovitina HN NH OH CH3 H3C CH3 N N N N FIGURA Q3 Alguns inibidores de proteínascinases atualmente em tes tes clínicos ou em uso clínico mostrando sua ligação à proteínaalvo a O imatinibe se liga ao sítio ativo da cinase do oncogene Abl PDB ID 1IEP ele ocupa tanto o sítio de ligação ao ATP quanto uma região adjacente a este sítio b O erlotinibe se liga ao sítio ativo do EGFR PDB ID 1M17 c d A roscovitina é um inibidor da cinase dependente de ciclina CDK2 está mos trada aqui a ligação normal MgATP c no sítio ativo PDB ID 1S9I e a ligação da roscovitina d que impede a ligação do ATP PDB ID 2A4L Nelson6edbookindb 491 Nelson6edbookindb 491 030414 0743 030414 0743 492 DAVID L NELSON MICHAEL M COX p53 ou p21 originam células nas quais a repressão normal da divisão celular é perdida e um tumor é formado O retinoblastoma ocorre em crianças e causa cegueira caso não tratado cirurgicamente As células de um retino blastoma têm duas formas defeituosas do gene Rb dois alelos defeituosos Crianças muito novas que desenvolvem retinoblastoma em geral apresentam múltiplos tumores em ambos os olhos Essas crianças herdaram uma cópia defei tuosa do gene Rb que está presente em todas as células cada tumor é derivado de uma única célula da retina que sofreu uma mutação em sua cópia correta do gene Rb Um feto com os dois alelos mutantes em todas as células não sobrevive As pessoas com retinoblastoma que sobrevivem à infância mais tarde também apresentam uma alta incidên cia de cânceres de pulmão próstata e mama Um evento muito menos provável é que uma pessoa nascida com duas cópias corretas do gene Rb sofra muta ções independentes em ambas as cópias na mesma célu la Alguns indivíduos de fato desenvolvem retinoblastomas mais tarde na infância em geral apresentando um tumor em um dos olhos Esses indivíduos presumivelmente nas ceram com as duas cópias alelos corretas de Rb em todas as células mas ambos os alelos Rb foram mutados em uma única célula da retina levando a um tumor Após a idade aproximada de três anos as células da retina param de se dividir e os retinoblastomas em idades mais avançadas são extremamente raros Genes de estabilidade também chamados de genes de manutenção codificam proteínas que atuam no reparo dos principais defeitos genéticos que resultam da replicação aberrante do DNA da radiação ionizante ou de compostos carcinogênicos do ambiente As mutações nesses genes le vam a uma alta frequência de danos não reparados muta ções em outros genes incluindo protooncogenes e genes supressores tumorais portanto levando ao câncer Entre os genes de estabilidade estão o ATM ver Figura 1249 a família de genes XP na qual mutações levam ao xeroderma pigmentoso e os genes BRCA1 associados a alguns tipos de câncer de mama ver Quadro 251 As mutações no gene da p53 também causam tumores em mais de 90 dos carcinomas cutâneos de células escamosas cânceres de pele e em aproximadamente 50 de todos os outros cân ceres humanos o p53 está defeituoso Os indivíduos extre mamente raros os quais herdam uma cópia defeituosa de p53 geralmente apresentam a síndrome de LiFraumeni com múltiplos cânceres de mama cérebro ossos sangue pulmão e pele que surgem com alta frequência na infância A explicação para os múltiplos tumores nesse caso é a mes ma das mutações do gene Rb um indivíduo nascido com uma cópia defeituosa do p53 em todas as células somáticas tem a probabilidade de sofrer uma segunda mutação no p53 em mais de uma célula durante a vida Em resumo três classes de defeitos contribuem para o desenvolvimento de câncer oncogenes nos quais o defeito é o equivalente a um pedal acelerador de um carro sendo sempre pressionado com o motor funcionando em veloci dade total genes supressores tumorais nos quais o defeito causa o equivalente a uma falha nos freios e genes de esta bilidade mutados com o defeito levando a danos não repa rados na maquinaria de replicação celular o equivalente a um mecânico destreinado As mutações em oncogenes e genes supressores tumo rais não apresentam um efeito tudo ou nada Em alguns cân ceres talvez em todos a progressão de uma célula normal a um tumor maligno requer o acúmulo de mutações algumas vezes ao longo de décadas nenhuma das quais por si só é responsável pelo resultado final Por exemplo o desen volvimento de câncer colorretal apresenta alguns estágios distintos cada um associado a uma mutação Figura 12 51 Se uma célula epitelial do colo sofrer uma mutação em ambas as cópias do gene supressor tumoral APC polipose adenomatosa do colo de adenomatous polyposis coli ela começa a dividirse mais rapidamente do que o normal e produz um clone dela mesma um pólipo benigno adenoma em estágio inicial Por razões ainda desconhecidas as mu tações no APC resultam em instabilidade cromossômica e regiões inteiras de um cromossomo são perdidas ou rearran jadas durante a divisão celular Essa instabilidade pode levar a outra mutação comumente no gene ras que converte o clone em um adenoma em estágio intermediário Uma ter ceira mutação frequentemente no gene supressor tumoral DCC leva a um adenoma em estágio avançado Somente quando ambas as cópias do p53 estiverem defeituosas essa massa de células se tornará um carcinoma um tumor ma ligno com risco de morte A sequência completa portanto requer pelo menos sete ataques genéticos dois em cada um dos três genes supressores tumorais APC DCC e p53 e um no protooncogene ras É plausível que existam tam bém outras rotas para o câncer colorretal mas o princípio de que a malignidade máxima resulta somente de múltiplas mutações provavelmente seja verdadeiro para todas elas Quando um pólipo é detectado no estágio de adenoma ini cial e as células contendo as primeiras mutações são cirurgi camente removidas adenomas avançados e carcinomas não se desenvolverão por esta razão a importância da detecção precoce As células e os organismos também têm seus siste mas de detecção precoce Por exemplo as proteínas ATM e ATR descritas na Seção 1211 podem detectar danos no DNA extensos demais para serem reparados com sucesso Essas proteínas iniciam então por uma rota que inclui a p53 o processo de apoptose no qual uma célula que se tor nou perigosa para o organismo mata a si mesma A apoptose é o suicídio celular programado Muitas células podem controlar precisamente o momen to de sua própria morte pelo processo de morte celular programada ou apoptose do termo grego para queda como a queda das folhas no outono Um estímulo para a apoptose são danos irreparáveis no DNA A morte celular programada também ocorre durante o desenvolvimento embrionário quando algumas células devem morrer para dar a um tecido ou órgão sua forma final A modelagem dos dedos a partir do apêndice arredondado dos membros re quer a morte precisamente cronometrada das células entre os ossos em desenvolvimento Durante o desenvolvimento do nematódeo C elegans a partir de um óvulo fecundado exatamente 131 células de um total de 1090 células somá ticas embrionárias devem ser eliminadas por morte celular programada para que o corpo do adulto seja construído A apoptose também tem funções em outros processos que não o desenvolvimento Se uma célula produtora de Nelson6edbookindb 492 Nelson6edbookindb 492 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 493 anticorpos origina anticorpos contra uma proteína ou gli coproteína normalmente presente no organismo aquela célula é submetida à morte celular programada no timo mecanismo essencial para a eliminação de autoanticorpos a causa de muitas doenças autoimunes A descamação mensal da parede do útero menstruação é outro exem plo da mediação da morte celular normal por apoptose A queda das folhas no outono é o resultado da apoptose de células específicas do caule Algumas vezes o suicídio ce lular não é programado mas ocorre em resposta a circuns tâncias biológicas que ameaçam o resto do organismo Por exemplo uma célula infectada por vírus que morre antes de completar o ciclo de infecção viral restringe a disseminação do vírus para as células próximas Alguns tipos de estres se como calor hiperosmolaridade luz UV e radiação gama também provocam o suicídio celular presumivelmente o organismo estará melhor se quaisquer células aberrantes potencialmente mutadas estiverem mortas Os mecanismos de regulação que iniciam a apoptose envolvem algumas das mesmas proteínas que regulam o ci clo celular O sinal para o suicídio com frequência chega do exterior por meio de um receptor da superfície celular O fator de necrose tumoral TNF de tumor necrosis factor produzido pelas células do sistema imune interage com as células por meio de receptores específicos para TNF Esses receptores têm sítios de ligação a TNF na superfície exter na da membrana plasmática e um domínio de morte 80 resíduos de aminoácidos que transmitem o sinal autodes trutivo através da membrana até proteínas citosólicas como a TRADD domínio de morte associado ao receptor de TNF de TNF receptorassociated death domain Figura 12 52 Outro receptor Fas tem um domínio de morte seme lhante que permite sua interação com a proteína citosólica FADD domínio de morte associado a Fas de Fasassocia ted death domain a qual ativa a protease citosólica cas pase 8 Essa enzima pertence a uma família de proteases que estão envolvidas na apoptose todas são sintetizadas como próenzimas inativas todas têm um resíduo de Cys crítico no sítio ativo e todas hidrolisam as proteínasalvo no lado carboxiterminal de resíduos de Asp específicos daí o nome caspase para Cys e Asp Quando a caspase 8 uma caspase iniciadora é ati vada por um sinal apoptótico transmitido pelo FADD ela amplifica sua ativação pela clivagem de sua própria for Mediadores oncogênicos ativados no câncer colorretal Fatores supressores tumorais desativados no câncer colorretal Epitélio normal COX2 15PGDH TGFb fator de crescimento tumoral b EGFR receptor do fator de crescimento da epiderme Epitélio Músculo liso Tecido conectivo Progressão Fatores de crescimento Adenoma inicial Adenoma avançado Câncer MMR reparo de DNA TP53 p53 KRAS BRAF SMAD4 TGFBR2 PI3K CDC4 proteólise dependente de ubiquitina Genes APC bcatenina Metástase Epitélio n Epitélio culo liso onectivo gressão FIGURA 1251 As múltiplas etapas da transição de uma célula epite lial normal a um câncer colorretal Uma série de mutações em oncoge nes em verde ou em genes supressores tumorais em vermelho progres sivamente levam à diminuição do controle da divisão celular culminando com a formação de um tumor ativo o qual pode algumas vezes formar me tástases espalharse do local inicial para outras regiões do corpo A mutação do gene MMR causa defeitos no reparo do DNA e consequentemente uma maior taxa de mutações Mutações em ambas as cópias do gene supressor tumoral APC levam à formação de agrupamentos de células epiteliais que se multiplicam muito rapidamente adenoma em estágio inicial O oncogene CDC4 resulta em defeitos na ubiquitinação que é essencial para a regulação das cinases dependentes de ciclina ver Figura 1247 Os oncogenes KRAS e BRAF codificam as proteínas ras e raf ver Figura 1215 e esta disfunção adi cional da sinalização leva à formação de um adenoma avançado que pode ser detectado por colonoscopia como um pólipo benigno Mutações onco gênicas no gene PI3K que codifica a enzima fosfoinositídeo3cinase ou no gene PTEN que regula a síntese desta enzima reforçam ainda mais o sinal dividase agora Quando uma célula em um dos pólipos sofrer outras muta ções por exemplo nos genes supressores tumorais DCC e p53 ver Figura 12 49 tumores progressivamente agressivos se formam Finalmente mutações em outros genes supressores tumorais como SMAD4 levam a um tumor maligno e algumas vezes a um tumor metastático que pode disseminarse para outros tecidos Um segundo tipo de mutação que afete a produção ou ação de fatores de crescimento ou seus receptores abaixo pode aumentar os efeitos deletérios Mutações no EGFR receptor do fator de crescimento da epiderme ou no TGFb fator de crescimento tumoral b favorecem o crescimento descontrolado assim como o fazem mutações nas enzimas que produzem certas prostaglandinas COX2 ciclooxigenase ver p 845846 ou na enzima 15PGDH 15hidroxiprostaglandinadesidrogenase A maioria dos tumores malignos de outros tecidos provavelmente resulta de uma série de mutações como estas embora não necessariamente nestes genes espe cíficos ou nesta mesma ordem Nelson6edbookindb 493 Nelson6edbookindb 493 030414 0743 030414 0743 494 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ma de próenzima As mitocôndrias são um dos alvos da caspase 8 ativada A protease causa a liberação de certas proteínas contidas entre a membrana mitocondrial inter na e a externa citocromo c Capítulo 19 e várias caspa ses efetoras O citocromo c ligase à forma próenzima da enzima efetora caspase 9 e estimula sua ativação pro teolítica A caspase 9 ativada por sua vez catalisa a des truição em larga escala de proteínas celulares uma das principais causas da morte celular apoptótica Um alvo es pecífico da ação das caspases é uma desoxirribonuclease ativada por caspase Na apoptose os produtos monoméricos da degradação de proteínas e DNA aminoácidos e nucleotídeos são li berados por um processo controlado que permite que eles sejam captados e reutilizados pelas células vizinhas A apoptose portanto possibilita que o organismo elimine uma célula desnecessária ou potencialmente perigosa sem desperdiçar seus componentes RESUMO 1212 Oncogenes genes supressores tumorais e morte celular programada c Os oncogenes codificam proteínas de sinalização defei tuosas Pela emissão contínua do sinal para a divisão celular elas levam à formação de tumores Os oncoge nes são geneticamente dominantes e podem codificar fatores de crescimento receptores proteínas G pro teínascinases ou reguladores nucleares da transcrição defeituosos c Os genes supressores tumorais codificam proteínas re guladoras que normalmente inibem a divisão celular mutações nestes genes são geneticamente recessivas mas podem levar à formação de tumores c O câncer geralmente é o resultado de um acúmulo de mutações em oncogenes e genes supressores tumorais c Quando genes de estabilidade que codificam proteínas necessárias para o reparo de danos genéticos são muta dos outras mutações ficam sem reparo incluindo muta ções em protooncogenes e genes supressores tumorais que podem levar ao câncer c A apoptose é a morte celular programada e controlada que ocorre normalmente durante o desenvolvimen to e a vida adulta para livrar o organismo de células desnecessárias danificadas ou infectadas A apopto se pode ser iniciada por sinais extracelulares como o TNF que agem por meio de receptores da membrana plasmática FIGURA 1252 Os eventos iniciais da apoptose Sinais que desenca deiam a apoptose de fora da célula Fas e TNFa ligamse a receptores es pecíficos na membrana plasmática FasR e TNFaR Os receptores ocupados interagem com as proteínas citosólicas FADD e TRADD por meio de uma sequência de 80 aminoácidos chamada o domínio de morte presente tan to nos receptores quanto nestes alvos citosólicos que são assim ativados A ativação de FADD e TRADD inicia uma cascata proteolítica que leva à apop tose FADD e TRADD ativam a caspase 8 cuja ação libera o citocromo c da mitocôndria o qual juntamente com a proteína Apaf1 ativa a caspase 9 desencadeando a apoptose Procaspase9 Caspase9 Procaspase8 Procaspase8 Caspase8 Ligante de Fas FADD Receptor deTNFa TNFa TRADD Mitocôndria Membrana plasmática Citocromo c Apaf1 Apoptossomo Caspases 3 6 7 Apoptose Domínios de morte Receptor Fas Nelson6edbookindb 494 Nelson6edbookindb 494 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 495 Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário transdução de sinal 433 especificidade 433 cooperatividade 434 amplificação 434 cascata enzimática 434 modularidade 434 proteínas de ancoragem 434 dessensibilização 434 integração 434 análise de Scatchard 435 receptores associados a proteínas G GPCR 437 proteínas ligadoras de nucleotídeos de guanosina 437 proteínas G 437 segundo mensageiro 437 agonista 438 antagonista 438 receptores badrenérgicos 438 receptores hepta helicoidais 438 proteína G estimulatória Gs 438 adenililciclase 438 proteínacinase dependente de cAMP proteínacinase A PKA 438 alça P 441 proteína ativadora de GTPasesGAP 442 regulador da sinalização por proteínas G RGS 442 fator de troca de nucleotídeos de guanosina GEF 442 sequência consenso 443 barrestina barr arrestina 2 446 cinases dos receptores associados a proteínas G GRK 446 proteína de ligação do elemento de resposta a cAMP CREB 446 proteína G inibitória Gi 446 proteínas adaptadoras 446 AKAP proteínas de ancoragem da cinase A 447 fosfolipase C 447 inositol145trifosfato IP3 447 proteína fluorescente verde GFP 448 transferência de energia por ressonância de fluorescência FRET 448 proteínacinase C 450 calmodulina CaM 451 proteínascinases dependentes de Ca 21 calmodulina CaM cinases 451 receptores tirosina cinases RTK 453 autofosforilação 453 domínio SH2 454 proteínas G pequenas 455 MAPK 455 citocina 457 monofosfato cíclico de 35guanosina GMP cíclico cGMP 459 proteínacinase dependente de cGMP proteínacinase G PKG 459 fator natriurético atrial ANF 459 NOsintase 460 angina pectoris 460 domínios PTB 461 canais iônicos controlados por voltagem 465 receptor nicotínico de acetilcolina 467 ionotrópico 468 integrina 470 elemento de resposta a hormônios HRE 471 sistemas binários 473 receptor histidina cinase 473 regulador da resposta 473 cinases semelhantes a receptores RLK 476 retinal 477 rodopsina 477 opsina 477 transducina 478 rodopsinacinase 480 potencial do receptor 481 gostoducina 481 ciclina 485 proteínacinase dependente de ciclina CDK 485 ubiquitina 487 proteassomo 487 fatores de crescimento 487 proteína do retinoblastoma pRb 488 oncogene 489 protooncogene 489 genes supressores tumorais 489 morte celular programada 492 apoptose 492 Leituras adicionais Geral Cohen P 2000 The regulation of protein function by multisite phosphorylationa 25 year update Trends Biochem Sci 25 596601 Descrição histórica sobre a fosforilação de proteínas Giepmans BNG Adams SR Ellisman MH Tsien RY 2006 The fluorescent toolbox for assessing protein location and function Science 312 217224 Uma revisão curta em nível intermediário sobre FRET Gomperts B Kramer IM Tatham PER 2009 Signal Transduction 2nd edn Academic Press New York Clara e lindamente ilustrada descrição de todos os sistemas de sinalização discutidos neste capítulo Marks F Klingmüller U MüllerDecker K 2009 Cellular Signal Processing An Introduction to the Molecular Mechanisms of Signal Transduction Garland Science New York Pawson T Scott JD 2005 Protein phosphorylation in signaling50 years and counting Trends Biochem Sci 30 286290 Receptores associados a proteínas G GPCR Aktories K 2011 Bacterial protein toxins that modify host regulatory GTPases Nat Rev Microbiol 9 487498 Awais M Ozawa T 2011 Illuminating intracellular signaling and molecules for single cell analyisis Mol Biosyst 7 13761387 Revisão em nível intermediário sobre métodos para a utilização de marcadores fluorescentes em biologia celular e bioquímica Beene DL Scott JD 2007 Akinase anchoring proteins take shape Curr Opin Cell Biol 19 192198 Birnbaumer L 2007 The discovery of signal transduction by G proteins a personal account and an overview of the initial findings and contributions that led to our present understanding Biochim Biophys Acta Biomembr 1768 756771 Escribá PV 2007 G proteincoupled receptors signaling mechanisms and pathophysiological relevance Biochim Biophys Acta Biomembr 1768 747 Introdução editorial a uma série de 20 artigos sobre GPCR Francis SH Blount MA Corbin JD 2011 Mammalian cyclic nucleotide phosphodiesterases molecular mechanisms and physiological function Physiol Rev 91 651690 Kobilka BK 2011 Structural insights into adrenergic receptor function and pharmacology Trends Pharmacol Sci 32 213218 Revisão em nível intermediário Kremers GJ Gilbert SG Cranfill PJ Davidson MW Piston DW 2011 Fluorescent proteins at a glance J Cell Sci 124 157160 Breve revisão sobre a metodologia para a utilização de proteínas marcadas com fluorescência Lefkowitz RJ 2007 Introduction to special section on arrestins Annu Rev Physiol 69 Este artigo introduz cinco excelentes revisões aprofundadas sobre as funções da arrestina Malumbres M 2011 Physiological relevance of cell cycle kinases Physiol Rev 91 9731007 Nelson6edbookindb 495 Nelson6edbookindb 495 030414 0743 030414 0743 496 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Revisão avançada e extensa sobre as funções das proteínas cinases na regulação do ciclo celular e seus papéis em câncer Pearce LR Komander D Alessi DR 2010 The nuts and bolts of AGC protein kinases Nat Rev Mol Cell Biol 11 922 Revisão avançada sobre as famílias das cinases PKA PKC e PKG Pinna LA Ruzzene M 1996 How do protein kinases recognize their substrates Biochim Biophys Acta 1314 191225 Revisão aprofundada sobre os elementos incluindo as sequências consenso que originam as especificidades das proteínascinases Rasmussen SGF DeVree BT Zou Y Kruse AC Chung KY Kobilka TS Thian FS Chae PS Pardon E Calinski D et al 2011 Crystal structure of the b2 adrenergic receptorGs protein complex Nature 477 549555 A determinação definitiva da estrutura e da interação entre o receptor e a proteína G Receptores enzimáticos Garbers DL Chrisman TD Wiegn P Katafuchi T Albanesi JP Bielinski V Barylko B Redfield MM Burnett JC Jr 2006 Membrane guanylyl cyclase receptors an update Trends Endocrinol Metab 17 251258 Karnoub AE Weinberg RA 2008 Ras oncogenes split personalities Nat Rev Mol Cell Biol 9 517531 Lemmon MA Schlessinger J 2010 Cell signaling by receptor tyrosine kinases Cell 141 11171134 Misono KS Philo JS Arakawa T Ogata CM Qiu Y Ogawa H Young HS 2011 Structure signaling mechanism and regulation of the natriuretic peptide receptor guanylate cyclase FEBS J 278 18181829 Proteínas adaptadoras e balsas lipídicas da membrana Dehmelt L Bastiaens PIH 2010 Spatial organization of intracellular communication insights from imaging Nat Rev Mol Cell Biol 11 440452 Good MC Zalatan JG Lim WA 2011 Scaffold proteins hubs for controlling the flow of cellular information Science 332 680686 Revisão em nível intermediário sobre a estrutura e função das proteínas de ancoragem SchwarzRomond T Gorski SA 2010 Focus on the spatial organization of signaling EMBO J 29 26752676 Introdução editorial a uma coleção de oito excelentes revisões sobre os aspectos espaciais da sinalização Smith FD Scott JD 2006 Anchored cAMP signaling onward and upward A short history of compartmentalized cAMP signal transduction Eur J Cell Biol 85 582592 Revisão curta em nível intermediário que apresenta um exemplar inteiro do periódico sobre o tópico AKAP e sinalização por cAMP Canais iônicos de receptores Ver também Capítulo 11 Leituras Adicionais Canais Iônicos Ashcroft FM 2006 From molecule to malady Nature 440 440447 Revisão curta em nível intermediário sobre as doenças humanas associadas com defeitos em canais iônicos Changeux JP 2010 Allosteric receptors from electric organ to cognition Annu Rev Pharmacol Toxicol 50 138 Grigoryan G Moore DT DeGrado WF 2011 Transmembrane communication general principles and lessons from the structure and function of the M2 proton channel K 1 channels and integrin receptors Annu Rev Biochem 80 211237 Revisão aprofundada e enriquecedora Tombola F Pathak MM Isacoff EY 2006 How does voltage open an íon channel Annu Rev Cell Dev Biol 22 2352 Íons cálcio na sinalização Berridge MJ 2009 Inositol trisphosphate and calcium signalling mechanisms Biochim Biophys Acta Mol Cell Res 1793 933940 Bunney TD Katan M 2011 PLC regulation emerging pictures for molecular mechanisms Trends Biochem Sci 36 8896 Revisão intermediária sobre a fosfolipase C na sinalização do Ca 21IP3 Chazin WJ 2011 Relating form and function of EFhand calcium binding proteins Acc Chem Res 44 171179 Chin D Means AR 2000 Calmodulin a prototypical calcium receptor Trends Cell Biol 10 322328 Haiech J Heizmann C Krebs J eds 2009 10th European Symposium on Calcium Biochim Biophys Acta Mol Cell Res 1793 9311114 Todos os artigos neste volume tratam sobre a sinalização por meio do cálcio Parekh AB 2011 Decoding cytosolic Ca2 oscillations Trends Biochem Sci 36 7887 Integrinas Harburger DS Calderwood DA 2009 Integrin signaling at a glance J Cell Sci 122 159163 Revisão em forma de pôster da sinalização das integrinas Valdembri D Sandri C Santambrogio M Serini G 2011 Regulation of integrins by conformation and traffic it takes two to tango Mol Biosyst 7 25392546 Receptores e ação de hormônios esteroides Biggins JB Koh JT 2007 Chemical biology of steroid and nuclear hormone receptors Curr Opin Chem Biol 11 99110 Huang P Chandra V Rastinejad F 2010 Structural overview of the nuclear receptor superfamily insights into physiology and therapeutics Annu Rev Physiol 72 247272 Sinalização em plantas e bactérias Chen YF Etheridge N Schaller GE 2005 Ethylene signal transduction Ann Botany 95 901915 Revisão em nível intermediário Clouse SD 2011 Brassinosteroid signal transduction from receptor kinase activation to transcriptional networks regulating plant development Plant Cell 23 12191230 Cutler SR Rodriguez PL Finkelstein RR Abrams S 2010 Abscisic acid emergence of a core signaling network Annu Rev Plant Biol 61 651679 Dodd AN Kudla J Sanders D 2010 The language of calcium signaling Annu Rev Plant Biol 61 593620 Ferreira FJ Kieber JJ 2005 Cytokinin signaling Curr Opin Plant Biol 8 518525 Paciorek T Friml J 2006 Auxin signaling J Cell Sci 119 11991202 Pauwels L Goossens A 2011 The JAZ proteins a crucial interface in the jasmonate signaling cascade Plant Cell 23 30893100 Perry J Koteva K Wright G 2011 Receptor domains of two component signal transduction systems Mol Biosyst 7 13881398 Rodriguez MCS Petersen M Mundy J 2010 Mitogenactivated protein kinase signaling in plants Annu Rev Plant Biol 61 621649 Nelson6edbookindb 496 Nelson6edbookindb 496 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 497 Stepanova AN Alonso JM 2009 Ethylene signaling and response where different regulatory modules meet Curr Opin Plant Biol 12 548555 Wang Z 2010 From receptors to responses in plants Curr Opin Plant Biol 13 485488 Introdução editorial a uma série de artigos sobre sinalização em plantas todos publicados neste exemplar Visão olfato e paladar Kaupp UB 2010 Olfactory signalling in vertebrates and insects differences and commonalities Nat Rev Neurosci 11 188200 Smith SO 2010 Structure and activation of the visual pigment rhodopsin Annu Rev Biophys 39 309328 Revisão aprofundada Yarmolinsky DA Zuker CS Ryba NJP 2009 Common sense about taste from mammals to insects Cell 139 234244 Ciclo celular e câncer Bublil EM Yarden Y 2007 The EGF receptor family spearheading a merger of signaling and therapeutics Curr Opin Cell Biol 19 124134 Clarke PR Allan LA 2009 Cellcycle control in the face of damagea matter of life or death Trends Cell Biol 19 8998 Revisão intermediária sobre as funções de ATP p53 e outras proteínas de regulação no ciclo celular Dorsam RT Gutkind JS 2007 Gproteincoupled receptors and cancer Nature Rev Cancer 7 7994 Levine AJ Oren M 2009 The first 30 years of p53 growing ever more complex Nat Rev Cancer 9 749758 Perspectiva histórica dos estudos de p53 e câncer Ma HT Poon RYC 2011 How protein kinases coordinate mitosis in animal cells Biochem J 435 1731 Malumbres M 2011 Physiological relevance of cell cycle kinases Physiol Rev 91 9731007 Revisão aprofundada sobre as funções das CDK e outras proteínascinases no controle do ciclo celular Markowitz SD Bertagnolli MM 2009 Molecular basis of colorectal cancer N Engl J Med 361 24492460 Novak B Kapuy O DomingoSananes MR Tyson JJ 2010 Regulated protein kinases and phosphatases in cell cycle decisions Curr Opin Cell Biol 22 801808 PylayevaGupta Y Grabocka E BarSagi D 2011 RAS oncogenes weaving a tumorigenic web Nat Rev Cancer 11 761774 Apoptose Wylie AH 2010 Where O death is thy sting A brief review of apoptosis biology Mol Neurobiol 42 49 Problemas 1 Experimentos com hormônios em sistemas livres de células Nos anos de 1950 Earl W Sutherland Jr e seus colegas conduziram experimentos pioneiros para a elucidação do mecanismo de ação da adrenalina e do glucagon Com base no que você aprendeu neste capítulo sobre a ação hormonal interprete cada um dos experimentos descritos abaixo Iden tifique a substância X e comente a importância dos resultados a A adição de adrenalina a um homogeneizado de fígado normal resultou em um aumento na atividade da glicogênio fosforilase Entretanto quando o homogeneizado foi primeira mente centrifugado em alta rotação e a adrenalina ou o glucagon foram adicionados à fração sobrenadante que continha a fosfo rilase não ocorreu nenhum aumento na atividade da fosforilase b Quando a fração particulada da centrifugação em a foi tratada com adrenalina a substância X foi produzida A substância foi isolada e purificada Ao contrário da adrenalina a substância X ativou a glicogêniofosforilase quando adicio nada à fração sobrenadante do homogeneizado centrifugado c A substância X era termoestável isto é o tratamento com calor não afetou sua capacidade de ativar a fosforilase Dica seria este o caso se a substância X fosse uma proteína A substância X era praticamente idêntica a um composto ob tido quando ATP puro era tratado com hidróxido de bário A Figura 86 será útil 2 A ação de dibutirilcAMP versus cAMP em células in tactas A ação fisiológica da adrenalina deveria em princípio ser mimetizada pela adição de cAMP às célulasalvo Na prá tica a adição de cAMP a célulasalvo intactas provoca apenas uma resposta fisiológica mínima Por quê Quando o derivado estruturalmente relacionado dibutirilcAMP mostrado abaixo é adicionado às células intactas a resposta fisiológica esperada é prontamente aparente Explique a base das diferenças das respostas celulares a essas duas substâncias O dibutirilcAMP é largamente utilizado nos estudos sobre a função do cAMP DibutirilcAMP Monofosfato cíclico de N 6O 2dibutiril35adenosina CH22CH3 CH2 C CH22CH3 C O O O O O H H H H N NH N N N O P O O 3 Efeito da toxina do cólera sobre a adenililci clase A bactéria gramnegativa Vibrio cholerae produz uma proteína a toxina do cólera Mr 90000 responsável pelos sintomas característicos do cólera extensa perda de água e Na 1 corporais devido à contínua e debilitante diarreia Se os fluidos corporais e o Na 1 não são repostos a doença resulta em desi dratação grave não tratada frequentemente é fatal Quando a toxina do cólera ganha acesso ao trato intestinal humano ela se liga fortemente a sítios específicos da membrana plasmática das células epiteliais que revestem o intestino delgado levando à ativação prolongada horas ou dias da adenililciclase a Qual é o efeito da toxina do cólera sobre a cAMP das células intestinais b Com base nas informações sugira como o cAMP atua normalmente nas células do epitélio intestinal c Sugira um possível tratamento para o cólera 4 Mutações na PKA Explique como mutações nas su bunidades R ou C da proteínacinase dependente de cAMP PKA poderiam levar a a uma PKA permanentemente ativa ou b uma PKA permanentemente inativa Nelson6edbookindb 497 Nelson6edbookindb 497 030414 0743 030414 0743 498 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 5 O efeito terapêutico do albuterol Os sintomas respiratórios da asma são resultantes da constrição dos brônquios e bronquíolos dos pulmões causada pela contração do músculo liso de suas paredes Essa constrição pode ser rever tida pelo aumento da cAMP no músculo liso Explique o efeito terapêutico do albuterol um agonista badrenérgico administra do por inalação para asma Você esperaria alguns efeitos cola terais para este fármaco Como alguém poderia projetar um fármaco melhor que não apresentasse esses efeitos colaterais 6 Término da sinalização hormonal Os sinais transmi tidos por hormônios devem ao final ser encerrados Descreva alguns mecanismos diferentes para o término da sinalização 7 Utilizando FRET para explorar as interações prote ínaproteína in vivo A Figura 128 mostra a interação entre a barrestina e o receptor badrenérgico Como você utilizaria a FRET ver Quadro 123 para demonstrar esta interação em células vivas Que proteínas você fusionaria Quais comprimen tos de onda você utilizaria para iluminar as células e com quais você monitoraria O que você esperaria observar caso a intera ção ocorresse E caso não ocorresse Como você poderia expli car a falha dessa abordagem para demonstrar esta interação 8 Injeção de EGTA EGTA ácido etileno glicolbisb aminoetiléterNNNNtetracético é um agente quelante com alta afinidade e especificidade para Ca 21 Pela microinjeção de uma célula com uma solução apropriada de Ca 21EGTA um pesquisador pode impedir que a Ca 21 citosólica aumente acima de 10 7M Como a microinjeção de EGTA afetaria a resposta celu lar ao hormônio antidiurético ver Tabela 124 E ao glucagon 9 Amplificação dos sinais hormonais Descreva todas as fontes de amplificação do sistema do receptor de insulina 10 Mutações no ras Como uma mutação no ras que leve à síntese de uma proteína Ras sem atividade GTPásica afetaria a resposta celular à insulina 11 Diferenças entre proteínas G Compare a proteína Gs que participa da transdução do sinal vindo dos receptores badre nérgicos com Ras Que propriedades elas compartilham Em que são diferentes Qual é a diferença funcional entre Gs e Gi 12 Os mecanismos de regulação das proteínascina ses Identifique oito tipos gerais de proteínascinases encon tradas em células eucarióticas e explique que fator é direta mente responsável pela ativação de cada tipo 13 Análogos não hidrolisáveis do GTP Muitas enzimas podem hidrolisar o GTP entre os fosfatos b e γ O análogo do GTP bγimidoguanosina 5trifosfato GppNHp mostrado abaixo não pode ser hidrolisado entre os fosfatos b e γ GppNHp bgimidoguanosina 5trifosfato CH2 O O OH OH H H H H N O N HN H2N N O2 P O O O2 P O 2O P O 2O H N Prediga o efeito sobre a resposta celular ao estímulo b adrenérgico da microinjeção de GppNHp em um miócito 14 O uso da ligação de uma toxina para a purificação de uma proteína de canal A abungarotoxina é uma poten te neurotoxina encontrada no veneno de uma serpente vene nosa Bungarus multicinctus Ela se liga com alta especifici dade ao receptor proteico nicotínico de acetilcolina AChR e impede a abertura do canal iônico Essa interação foi utilizada para a purificação do AChR a partir do órgão elétrico do peixe elétrico a Esboce uma estratégia para o uso de abungarotoxina covalentemente ligada a uma resina cromatográfica para a pu rificação da proteína AChR Dica ver Figura 317c b Esboce uma estratégia para o uso de 125Iabungaroto xina para a purificação da proteína AChR 15 Potencial de membrana de repouso Vários inver tebrados incomuns incluindo bivalves gigantes mexilhões e poliquetas vivem nas fontes hidrotermais nas profundezas do oceano onde a temperatura é de 60 oC a O músculo adutor de um bivalve gigante apresenta um potencial de membrana de repouso igual a 95 mV Dadas as composições iônicas intracelular e extracelular mostradas abaixo você prediria esse potencial de membrana Por quê Íon Concentração mM Intracelular Extracelular Na 1 50 440 K 1 400 20 Cl 21 560 Ca 21 04 10 b Assuma que a membrana do músculo adutor é perme ável a apenas um dos íons listados acima Qual íon poderia de terminar o Vm 16 O potencial de membrana em óvulos de sapo A fertilização de um oócito de sapo por um espermatozoide pro voca variações iônicas similares àquelas observadas em neu rônios durante o deslocamento do potencial de ação e inicia os eventos que resultam em divisão celular e desenvolvimento embrionário Os oócitos podem ser estimulados a dividiremse sem a ocorrência da fertilização ao serem colocados em uma solução de 80 mM KCl a água de uma lagoa normalmente con tém 9 mM KCl a Calcule em quanto a alteração na KCl extracelular va ria o potencial de membrana do oócito Dica assuma que o oócito contém 120 mM K 1 e é permeável somente a K 1 Assu ma uma temperatura de 20 oC b Quando esse experimento é repetido em água livre de Ca 21 o aumento na KCl não tem efeito algum O que isso su gere a respeito do mecanismo do efeito do KCl 17 A excitação provocada pela hiperpolarização Na maioria dos neurônios a despolarização da membrana leva à abertura de canais iônicos dependentes de voltagem à ge ração de um potencial de ação e finalmente ao influxo de Ca 21 que causa a liberação do neurotransmissor na extre midade terminal do axônio Formule uma estratégia celular pela qual a hiperpolarização nos bastonetes poderia pro duzir a excitação da rota de transdução da visão e a passa gem do sinal visual ao cérebro Dica a rota de sinalização neuronal em organismos mais evoluídos compreende uma série de neurônios que transmite a informação ao cérebro ver Figura 1236 O sinal liberado por um neurônio para o neurônio seguinte póssináptico pode ser tanto excitatório quanto inibitório Nelson6edbookindb 498 Nelson6edbookindb 498 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 499 18 Canalopatias genéticas Existem muitos dis túrbios genéticos que resultam de defeitos em canais iô nicos Explique para cada um dos seguintes como o defeito molecular pode levar aos sintomas descritos a Uma mutação de perda de função no gene que codifica a subunidade a do canal de cátions controlado por cGMP dos co nes da retina leva à completa incapacidade de distinguir cores b Alelos de perda de função do gene que codifica a subunidade a do canal de K 1 controlado por ATP mostrado na Figura 2328 levam a uma condição conhecida como hiperin sulinemia congênita a persistência de altos níveis de insulina no sangue c As mutações que afetam a subunidade b do canal de K 1 controlado por ATP e impedem a ligação do ATP levam ao diabetes neonatal a persistência de baixos níveis de insulina no sangue em bebês recémnascidos 19 A dessensibilização da visão A doença de Ogu chi é uma forma hereditária de cegueira noturna Os indi víduos afetados recuperam lentamente a visão após um clarão de luz brilhante contra um fundo escuro como os faróis de um carro em uma autoestrada Sugira qualis defeitos moleculares podem estar envolvidos na doença de Ogu chi Explique em termos moleculares como esse defeito seria responsável pela cegueira noturna 20 Efeito de um análogo de cGMP permeante em basto netes Um análogo do cGMP 8BrcGMP permeante às mem branas celulares é degradado lentamente pela atividade da PDE de um bastonete sendo tão eficaz quanto o cGMP para a abertu ra do canal iônico do segmento externo da célula Se você prepa rar uma suspensão de bastonetes em um tampão contendo uma 8BrcGMP relativamente alta e então iluminar as células en quanto mede o potencial de membrana o que você observaria 21 As sensações de quente e frio no paladar As sensa ções de quente e frio são transduzidas por um grupo de canais iônicos controlados pela temperatura Por exemplo TRPV1 TRPV3 e TRPM8 estão normalmente fechados mas se abrem sob as seguintes condições TRPV1 em 43C TRPV3 em 33C e TRPM8 em 25C Esses canais são expressos em neu rônios sensoriais conhecidos por serem responsáveis pela sen sação da temperatura a Proponha um modelo razoável para explicar como a ex posição de um neurônio sensorial contendo TRPV1 a uma alta temperatura leva a uma sensação de calor b A capsaicina um dos ingredientes ativos das pimentas quentes é um agonista de TRPV1 A capsaicina apresenta 50 de ativação da resposta do TRPV1 em uma concentração ou seja tem um EC50 de 32 nM Explique por que poucas go tas de um molho apimentado podem dar a sensação de muito quente sem de fato queimar você c O mentol um dos ingredientes ativos da hortelã é um agonista do TRPM8 EC50 5 30 mM e do TRPV3 EC50 5 20 mM Que sensação você esperaria do contato com baixos ní veis de mentol E com altos níveis 22 Oncogenes genes supressores tumorais e tu mores Apresente para as seguintes situações uma ex plicação plausível de como elas poderiam levar à divisão celular irrestrita a As células do câncer de colo frequentemente contêm mutações no gene que codifica o receptor de prostaglandina E2 A PGE2 é um fator de crescimento requerido para a divisão das células do trato gastrintestinal b O sarcoma de Kaposi tumor comum em pessoas com Aids não tratada é causado por um vírus portador de um gene para uma proteína semelhante aos receptores de quimiocinas CXCR1 e CXCR2 As quimiocinas são fatores de crescimento célulaespecíficos c Adenovírus um vírus tumoral porta um gene para a proteína E1A que se liga à proteína do retinoblastoma pRb Dica ver Figura 1249 d Uma importante característica de muitos oncogenes e genes supressores tumorais é sua especificidade ao tipo celu lar Por exemplo mutações no receptor de PGE2 não são en contradas em tumores de pulmão Explique essa observação Lembre que a PGE2 age por meio de um GPCR da membrana plasmática 23 Mutações em genes supressores tumorais e onco genes Explique por que mutações em genes supressores tu morais são recessivas ambas as cópias do gene devem estar defeituosas para que a regulação da divisão celular seja defei tuosa enquanto mutações em oncogenes são dominantes 24 Retinoblastoma em crianças Explique por que algumas crianças com retinoblastoma desenvolvem múl tiplos tumores da retina em ambos os olhos enquanto outras apresentam um único tumor em um único olho 25 A especificidade de um sinal para um único tipo celular Discuta a validade do seguinte argumento Uma mo lécula sinalizadora hormônio fator de crescimento ou neuro transmissor induz respostas idênticas em diferentes tipos de célulasalvo se elas contiverem receptores idênticos Problema de análise de dados 26 Explorando a sensação do paladar em camundon gos A Figura 1242 mostra a rota de transdução de sinal para o sabor doce em mamíferos Sabores agradáveis são uma adaptação evolutiva para encorajar os animais a consumirem alimentos nutritivos Zhao e coautores 2003 examinaram as duas principais sensações prazerosas do paladar doce e uma mi O umami distinto sabor salgado induzido por aminoáci dos em especial aspartato e glutamato provavelmente esti mula os animais a consumirem alimentos ricos em proteína O glutamato monossódico MSG de monosodium glutamate é um realçador de sabor que explora essa sensibilidade Na época em que o artigo foi publicado receptores protei cos específicos de sabor marcados como SR na Figura 1242 para doce e umami haviam sido parcialmente caracterizados Três dessas proteínas eram conhecidas T1R1 T1R2 e T1R3 as quais atuavam como complexos receptores heterodiméri cos T1R1T1R3 foi preliminarmente identificado como o re ceptor para umami e T1R2T1R3 como o receptor para doce Não estava claro como a sensação do paladar era codificada e enviada ao cérebro e dois possíveis modelos haviam sido suge ridos No modelo com base nas células cada uma das células sensoriais de sabor expressa apenas um tipo de receptor isto é existem células doces células amargas células umami e assim por diante e cada tipo celular envia sua informação ao cérebro via um nervo diferente O cérebro sabe qual sabor é detectado pela identidade da fibra nervosa que transmite a mensagem No modelo com base no receptor cada célula sen sorial de sabor expressa diferentes tipos de receptores e envia diferentes mensagens ao longo da mesma fibra nervosa ao cé rebro e a mensagem é dependente de qual receptor é ativado Também não estava claro naquela época se havia alguma inte Nelson6edbookindb 499 Nelson6edbookindb 499 030414 0743 030414 0743 500 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ração entre as diferentes sensações do paladar ou se partes de um sistema sensorial do paladar eram necessárias para as outras sensações do paladar a Trabalhos anteriores haviam mostrado que diferentes receptores proteicos de sabor são expressos em conjuntos não sobrepostos de células receptoras de sabor Que modelo estes trabalhos apoiam Explique seu raciocínio Zhao e colegas construíram um grupo de camundongos nocaute camundongos homozigotos para os alelos de per da de função para um dos três receptores proteicos T1R1 T1R2 ou T1R3 e camundongos duplonocaute com T1R2 e T1R3 não funcionais Os pesquisadores mediram a percepção do sabor nesses camundongos por meio da medida da taxa de consumo de soluções contendo moléculas de sabores di ferentes Os camundongos lambem o bico de uma mamadeira com solução de sabor agradável mais frequentemente do que o de uma com solução de sabor desagradável Os pesquisadores mediram taxas de consumo relativas quão frequentemente os camundongos lamberam uma solução de amostra em compara ção com a água Uma taxa de lambida relativa igual a 1 indica sem preferência 1 uma aversão 1 uma preferência b Todas as quatro linhagens de camundongos nocaute apresentaram as mesmas respostas que os camundongos do tipo selvagem aos sabores salgado e amargo Quais das ques tões acima foram analisadas neste experimento O que você conclui a partir desses resultados Os pesquisadores então estudaram a recepção do sabor umami pela medida das taxas de consumo de diferentes quan tidades de MSG na solução de alimentação entre as diferentes linhagens de camundongo Observe que as soluções também continham monofosfato de inosina IMP um potente intensi ficador da recepção do sabor umami e um ingrediente comum do macarrão instantâneo tipo lámen juntamente com o MSG e amelorida que suprime o sabor salgado agradável conferido pelo sódio do MSG Os resultados estão mostrados no gráfico MSG 1 IMP 1 amelorida mM Tipo selvagem e nocaute para T1R2 Nocaute para T1R1 e nocaute para T1R3 1 10 100 10 1 Taxa de consumo relativo c Esses resultados são consistentes com o receptor do sabor umami compreendendo um heterodímero de T1R1 e T1R3 Por quê d Que modelo da codificação dos sabores esses resulta dos apoiam Explique seu raciocínio Zhao e colegas então conduziram uma série de experi mentos similares utilizando a sacarose como sabor doce Os resultados são mostrados abaixo Sacarose mM Tipo selvagem e nocaute para T1R1 Nocaute para T1R3 Duplonocaute para T1R2T1R3 Nocaute para T1R2 1 100 1000 20 1 Taxa de consumo relativo e Esses dados são consistentes com o receptor do sabor doce compreendendo um heterodímero de T1R2 e T1R3 Por quê f Houve algumas respostas inesperadas em concentra ções de glicose muito altas Como essas respostas dificultam a ideia de um sistema heterodimérico como o apresentado an teriormente Além dos açúcares os humanos também sentem outros compostos p ex os peptídeos monelina e aspartame como doces camundongos não sentem estes peptídeos como do ces Zhao e colegas inseriram no genoma do camundongo nocaute para T1R2 uma cópia do gene de T1R2 humano sob o controle do promotor do T1R2 do camundongo Esses ca mundongos modificados agora sentiam monelina e sacarina como doces Os pesquisadores foram além inserindo nos ca mundongos nocaute para T1R1 a proteína RASSL receptor ligado à proteína G para o opioide sintético espiradolina o gene da RASSL estava sob o controle de um promotor que poderia ser induzido pela administração de tetraciclina aos camundongos Esses camundongos não tinham preferência por espiradolina na ausência de tetraciclina na presença de tetraciclina mostravam uma forte preferência por concentra ções nanomolares de espiradolina g Como esses resultados fortalecem as conclusões de Zhao e colegas sobre o mecanismo da sensação do paladar Referência Zhao GQ Zhang Y Hoon MA Chandrashekar J Erlenbach I Ryba NJP Zuker C 2003 The receptors for mammalian sweet and umami taste Cell 115 255266 Nelson6edbookindb 500 Nelson6edbookindb 500 030414 0743 030414 0743 13 Bioenergética e tipos de reações bioquímicas 505 14 Glicólise gliconeogênese e a via das pentosesfosfato 543 15 Princípios da regulação metabólica 587 16 Ciclo do ácido cítrico 633 17 Catabolismo de ácidos graxos 667 18 Oxidação de aminoácidos e produção de ureia 695 19 Fosforilação oxidativa e fotofosforilação 731 20 Biossíntese de carboidratos em plantas e bactérias 799 21 Biossíntese de lipídeos 833 22 Biossíntese de aminoácidos nucleotídeos e moléculas relacionadas 881 23 Regulação hormonal e integração do metabolismo em mamíferos 929 O metabolismo é uma atividade celular altamente coor denada em que muitos sistemas multienzimáticos vias metabólicas cooperam para 1 obter energia química capturando energia solar ou degradando nutrien tes energeticamente ricos obtidos do meio ambiente 2 converter as moléculas dos nutrientes em moléculas com características próprias de cada célula incluindo precur sores de macromoléculas 3 polimerizar precursores monoméricos em macromoléculas proteínas ácidos nu cleicos e polissacarídeos e 4 sintetizar e degradar as biomoléculas necessárias para as funções celulares espe cializadas como lipídeos de membrana mensageiros intra celulares e pigmentos Embora o metabolismo englobe centenas de diferentes reações catalisadas por enzimas o grande objetivo da Par te II é o estudo das principais vias metabólicas poucas em número e notavelmente semelhantes em todas as formas de vida Os organismos vivos podem ser divididos em dois grandes grupos de acordo com a forma química pela qual obtêm carbono do meio ambiente Os autotróficos como bactérias fotossintéticas algas verdes e plantas vasculares podem usar o dióxido de carbono da atmosfera como sua única fonte de carbono a partir do qual formam todas as suas biomoléculas constituídas de carbono ver Figura 15 Alguns organismos autotróficos como as cianobactérias também podem utilizar nitrogênio atmosférico para gerar todos os seus componentes nitrogenados Os heterotrófi cos não conseguem utilizar o dióxido de carbono atmosfé rico e devem obter carbono a partir do ambiente na forma de moléculas orgânicas relativamente complexas como a glicose Os animais multicelulares e a maioria dos micror ganismos são heterotróficos As células e os organismos au totróficos são relativamente autossuficientes enquanto as células e os organismos heterotróficos por necessitarem de carbono em formas mais complexas dependem de produ tos de outros organismos Muitos organismos autotróficos são fotossintéticos e obtêm sua energia da luz solar enquanto organismos hete rotróficos obtêm sua energia a partir da degradação de nu trientes orgânicos produzidos por autotróficos Em nossa biosfera os autotróficos e heterotróficos vivem juntos em um ciclo vasto e interdependente em que os organismos autotróficos usam o dióxido de carbono atmosférico para construir suas biomoléculas orgânicas alguns deles geran PARTE II Bioenergética e Metabolismo Nelson6ed13indd 501 Nelson6ed13indd 501 020514 1723 020514 1723 502 DAVID L NELSON MICHAEL M COX do oxigênio a partir da água durante o processo Os orga nismos heterotróficos por sua vez utilizam os produtos orgânicos dos autotróficos como nutrientes e devolvem dióxido de carbono para a atmosfera Algumas das reações de oxidação que produzem dióxido de carbono também consomem oxigênio convertendoo em água Assim car bono oxigênio e água são constantemente reciclados en tre os mundos heterotrófico e autotrófico com a energia solar como a força que impulsiona esse processo global Figura 1 Todos os organismos vivos também exigem uma fonte de nitrogênio necessária para a síntese de aminoácidos nucleotídeos e outros componentes As bactérias e as plan tas geralmente podem usar amônia ou nitrato como única fonte de nitrogênio mas os vertebrados devem obter nitro gênio na forma de aminoácidos ou de outros compostos or gânicos Somente alguns organismos as cianobactérias e muitas espécies de bactérias do solo que vivem simbiotica mente sobre as raízes de algumas plantas são capazes de converter fixar nitrogênio atmosférico N2 em amônia Outras bactérias as bactérias nitrificantes oxidam amônia em nitritos e nitratos e outras ainda convertem nitrato a N2 As bactérias anamox convertem amônia e nitrito em N2 Portanto além dos ciclos globais de carbono e oxigênio um ciclo de nitrogênio opera na biosfera movimentando enor mes quantidades de nitrogênio Figura 2 A reciclagem de carbono oxigênio e nitrogênio que em última análise envolve todas as espécies depende do equilíbrio adequado entre as atividades dos produtores autotróficos e consu midores heterotróficos em nossa biosfera Esses ciclos de matéria são impulsionados por um enor me fluxo de energia na biosfera iniciando com a captura da energia solar pelos organismos fotossintéticos e a utilização dessa energia para gerar carboidratos ricos em energia e outros nutrientes orgânicos esses nutrientes são então usados como fontes de energia por organismos heterotrófi cos Nos processos metabólicos e em todas as transforma ções energéticas existe uma perda de energia útil energia livre e um aumento inevitável na quantidade de energia não utilizável calor e entropia Ao contrário da reciclagem de matéria portanto a energia flui em uma direção através da biosfera os organismos não conseguem reciclar energia útil a partir da energia dissipada na forma de calor e en tropia Carbono oxigênio e nitrogênio são reciclados conti nuamente mas energia é constantemente transformada em formas não utilizáveis como o calor O metabolismo a soma de todas as transformações químicas que ocorrem em uma célula ou em um organismo ocorre por meio de uma série de reações catalisadas por enzimas que constituem as vias metabólicas Cada uma das etapas consecutivas em uma via metabólica produz uma pequena alteração química específica em geral a remoção a transferência ou a adição de um átomo particular ou um grupo funcional O precursor é convertido em um produ to por meio de uma série de intermediários metabólicos chamados de metabólitos O termo metabolismo inter mediário frequentemente é aplicado às atividades combi nadas de todas as vias metabólicas que interconvertem pre cursores metabólitos e produtos de baixo peso molecular em geral Mr 1000 O catabolismo é a fase de degradação do metabolis mo na qual moléculas nutrientes orgânicas carboidratos gorduras e proteínas são convertidas em produtos finais menores e mais simples como ácido láctico CO2 e NH3 As vias catabólicas liberam energia e parte dessa energia é conservada na forma de ATP e de transportadores de elétrons reduzidos NADH NADPH e FADH2 o restante é perdido como calor No anabolismo também chamado de biossíntese precursores pequenos e simples formam moléculas maiores e mais complexas incluindo lipídeos polissacarídeos proteínas e ácidos nucleicos As reações anabólicas necessitam de fornecimento de energia geral mente na forma de potencial de transferência do grupo fosforil do ATP e do poder redutor de NADH NADPH e FADH2 Figura 3 Heterotróficos Autotróficos fotossintetizantes P r o d u t o s o r g â n i c o s O2 CO2 H2O FIGURA 1 Ciclo do dióxido de carbono e do oxigênio entre o domí nio autotrófico fotossintético e o heterotrófico na biosfera O fluxo de massa por esse ciclo é enorme 4 3 10 11 toneladas de carbono são recicla das anualmente na biosfera Bactérias e arqueias fixadoras de nitrogênio Bactérias Anamox Bactérias arqueias e fungos desnitrificantes Bactérias nitrificantes Bactérias e arqueias nitrificantes Plantas Plantas Animais NH 1 4 Amônia NO 2 2 Nitrito NO 2 3 Nitrato N2 na atmosfera Aminoácidos FIGURA 2 Ciclo do nitrogênio na biosfera O nitrogênio N2 gasoso compreende mais de 80 da atmosfera da Terra Nelson6edbookindb 502 Nelson6edbookindb 502 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 503 Algumas vias metabólicas são lineares e algumas são ra mificadas gerando múltiplos produtos finais úteis a partir de um único precursor ou convertendo vários precursores em um único produto Em geral as vias catabólicas são convergentes e as vias anabólicas são divergentes Figura 4 Algumas vias são cíclicas um composto inicial da via é regenerado em uma série de reações que converte outro componente inicial em um produto Serão analisados exem plos de cada tipo de via nos capítulos a seguir A maioria das células tem as enzimas para realizar tanto a degradação quanto a síntese das categorias importantes de biomoléculas ácidos graxos por exemplo No entanto a síntese e a degradação simultâneas de ácidos graxos se riam inúteis e isso é evitado pela regulação recíproca das sequências de reações anabólicas e catabólicas quando uma sequência está ativa a outra está suprimida Tal regu lação não poderia ocorrer se as vias anabólicas e catabóli cas fossem catalisadas por exatamente o mesmo grupo de enzimas operando em um sentido para o anabolismo e no sentido oposto para o catabolismo a inibição de uma enzi ma envolvida no catabolismo também inibiria a sequência de reações no sentido do anabolismo As vias catabólicas e anabólicas que conectam os mesmos produtos finais p ex glicose S S piruvato e piruvato S S glicose podem empregar muitas das mesmas enzimas mas invariavelmen te pelo menos uma das etapas é catalisada por enzimas di ferentes nos sentidos catabólico e anabólico e essas enzi mas constituem pontos de regulação independentes Além disso a fim de que as vias anabólicas e catabólicas sejam essencialmente irreversíveis pelo menos uma das reações específicas de cada sentido deve ser termodinamicamente muito favorável em outras palavras uma reação cuja rea ção inversa é muito desfavorável Como contribuição adi cional à regulação independente das sequências de reações anabólicas e catabólicas elas geralmente ocorrem em com partimentos celulares distintos por exemplo o catabolismo de ácidos graxos na mitocôndria e a síntese dos ácidos gra xos no citosol As concentrações de intermediários enzi mas e reguladores podem ser mantidas em diferentes níveis nesses compartimentos distintos Como as vias metabólicas são cineticamente controladas pela concentração do subs trato conjuntos separados de intermediários anabólicos e catabólicos também contribuem para o controle das taxas metabólicas Esses recursos que separam os processos ana bólicos e catabólicos serão de interesse particular em nossa discussão sobre o metabolismo As vias metabólicas são reguladas em vários níveis den tro e fora das células A regulação mais imediata é a dispo nibilidade de substrato quando a concentração intracelu lar do substrato de uma enzima está próxima ou abaixo do Km como é o caso comumente a velocidade de reação depende muito da concentração do substrato ver Figura 611 Um segundo tipo de controle rápido dentro da célula é a regulação alostérica p 226 por um intermediário me tabólico ou por uma coenzima um aminoácido ou ATP por exemplo que sinaliza o estado metabólico no interior da célula Quando a célula contém uma quantidade de asparta to por exemplo suficiente para suas necessidades imedia tas ou quando os níveis celulares de ATP indicam não ser necessário o consumo adicional de combustível no momen to esse sinais inibem alostericamente a atividade de uma ou mais enzimas nas vias pertinentes Em organismos mul ticelulares as atividades metabólicas de tecidos diferentes são reguladas e integradas por fatores de crescimento e hormônios que atuam de fora da célula Em alguns casos essa regulação ocorre quase que instantaneamente algu mas vezes em menos de um milissegundo por alterações nos níveis dos mensageiros intracelulares que por sua vez modificam a atividade de enzimas intracelulares por meca nismos alostéricos ou por modificações covalentes como a fosforilação Em outros casos o sinal extracelular modifica a concentração celular de uma enzima alterando a velocida de de sua síntese ou degradação de tal forma que o efeito é visto apenas em minutos ou horas A Parte II inicia com uma discussão sobre os princípios energéticos básicos que governam todo o metabolismo Ca pítulo 13 Em seguida aborda as principais vias metabóli cas pelas quais as células obtêm energia a partir da oxida ção de vários combustíveis Capítulos 14 a 19 O Capítulo 19 é o ponto principal da discussão sobre o metabolismo ele trata do acoplamento de energia quimiosmótica meca nismo universal em que um potencial eletroquímico trans Moléculas precursoras Aminoácidos Açúcares Ácidos graxos Bases nitrogenadas Nutrientes energéticos Carboidratos Gorduras Proteínas Anabolismo ATP NADH NADPH FADH2 Catabolismo Energia química ADP 1 HPO 2 NAD 1 NADP 1 FAD Macromoléculas celulares Proteínas Polissacarídeos Lipídeos Ácidos nucleicos Produtos finais sem energia CO2 H2O NH3 FIGURA 3 A relação energética entre as vias catabólicas e anabóli cas As vias catabólicas liberam energia química na forma de ATP NADH NADPH e FADH2 Esses transportadores de energia são usados em vias ana bólicas para converter precursores pequenos em macromoléculas celulares Nelson6edbookindb 503 Nelson6edbookindb 503 030414 0743 030414 0743 504 DAVID L NELSON MICHAEL M COX membrana produzido tanto por oxidação de substratos como por absorção de luz promove a síntese de ATP Os Capítulos 20 a 22 descrevem as principais vias ana bólicas pelas quais as células utilizam a energia do ATP para produzir carboidratos lipídeos aminoácidos e nucleotídeos a partir de precursores mais simples O Capítulo 23 volta a abordar o estudo das vias metabólicas como elas ocorrem em todos os organismos de Escherichia coli a humanos e considera como elas são reguladas e integradas por me canismos hormonais nos mamíferos No momento em que o foco de estudo será o metabo lismo intermediário uma observação final Não esqueça de que uma grande quantidade das reações descritas nestas páginas ocorre e tem funções fundamentais em organis mos vivos A cada reação e a cada via que você encontrar questione o que essa transformação química faz pelo or ganismo Como essa via se conecta com as outras vias que operam simultaneamente na mesma célula para produzir a energia e os produtos necessários para a manutenção e o crescimento da célula Como os diferentes níveis dos me canismos de regulação cooperam para o balanço metabólico e o fornecimento e consumo de energia alcançando o es tado de equilíbrio dinâmico da vida Estudando com essa perspectiva o metabolismo proporciona dados fascinantes e reveladores sobre a vida com aplicações incontáveis na medicina agricultura e biotecnologia Borracha Ácidos biliares Hormônios esteroides a Catabolismo convergente b Anabolismo divergente Oxaloacetato CO2 CO2 c Via cíclica Acetato acetilCoA Citrato Piruvato Glicose Glicogênio Fosfolipídeos Alanina Ácidos graxos Leucina Fenilalanina Isoleucina Amido Serina Sacarose Eicosanoides Fosfolipídeos Pigmentos carotenoides Vitamina K Triacilgliceróis Ésteres de colesteril Triacilgliceróis Mevalonato Isopentenil pirofosfato Ácidos graxos AcetoacetilCoA DiacilglicerolCDP Colesterol FIGURA 4 Três tipos de vias metabólicas não linea res a Convergente catabólica b divergente anabólica e c cíclica Em c um dos compostos de partida no caso o oxaloacetato é regenerado e reingressa na via O acetato um intermediário metabólico chave é o produto da degradação de uma variedade de combustíveis a serve de precursor de um grande número de produtos b e é consumido na via ca tabólica conhecida como o ciclo do ácido cítrico c Nelson6edbookindb 504 Nelson6edbookindb 504 030414 0743 030414 0743 131 Bioenergética e termodinâmica 506 132 Lógica química e reações bioquímicas comuns 511 133 Transferência de grupos fosforil e ATP 517 134 Reações biológicas de oxidaçãoredução 528 A s células e os organismos vivos devem realizar traba lho para permanecer vivos crescer e se reproduzir A capacidade de controlar a energia e direcionála para o trabalho biológico é uma propriedade fundamental de todos os organismos vivos essa capacidade deve ter sido adquiri da muito cedo no curso da evolução celular Os organismos modernos realizam uma notável variedade de transduções da energia conversões de uma forma de energia em outra Usam a energia química dos combustíveis para sintetizar macromoléculas complexas altamente organizadas a par tir de precursores simples Também convertem a energia química dos combustíveis em gradientes de concentração e em gradientes elétricos em movimento e calor e em alguns organismos como o vagalume e peixes do fundo do mar em luz Os organismos fotossintéticos transformam a energia luminosa em todas essas outras formas de energia Os mecanismos químicos envolvidos nas transduções biológicas de energia têm fascinado e desafiado biólogos por séculos a fio O químico francês Antoine Lavoisier reconheceu que de alguma forma os animais transformam os combustíveis químicos alimentos em calor e que esse processo de respiração é essencial para a vida Ele ob servou que em geral a respiração é nada mais que a combustão lenta de carbono e hidrogênio seme lhante à que ocorre em uma lâmpada ou vela acesa e desse ponto de vista animais que respiram são corpos com bustíveis que queimam e consomem a si próprios Al guém poderia dizer que essa analogia entre combustão e respiração não passou despercebida pelos poetas ou ainda pelos filósofos da antiguidade já tendo sido re latada e interpretada por eles Esse fogo roubado dos céus essa tocha de Prometeu não representa apenas uma ideia engenhosa e poética ela é um retrato fiel das operações da natureza pelo menos para os animais que respiram portanto alguns podem dizer com os antigos que a tocha da vida ilumina a si mesma no momento em que a criança respira pela primeira vez e ela só se extin gue na morte 1 A partir do século XX aumentou a compreensão sobre a química relacionada à tocha da vida As transduções biológicas de energia obedecem às mesmas leis químicas e físicas que governam todos os outros processos naturais Portanto é fundamental para um estudante de bioquímica entender essas leis e como elas se aplicam no fluxo de ener gia na biosfera Este capítulo começa revisando as leis da termodinâmi ca e a relação quantitativa entre energia livre entalpia e entropia Em seguida revisa os tipos comuns de reações bioquímicas que ocorrem em células vivas reações que controlam armazenam transferem e liberam a energia ad quirida pelos organismos do seu meio ambiente Focaliza então as reações com funções especiais nas trocas bioló gicas de energia particularmente aquelas envolvendo ATP Finalmente considera a importância das reações de oxida çãoredução em células vivas as variações energéticas nas transferências biológicas de elétrons e os transportadores de elétrons comumente utilizados como cofatores nestes processos 1Memorial redigido por Armand Seguir e Antoine Lavoisier 1789 citado em Lavoisier A 1862 Oeuvres de Lavoisier Imprimerie Impériale Paris 13 Bioenergética e Tipos de Reações Bioquímicas Antoine Lavoisier 17431794 Nelson6ed13indd 505 Nelson6ed13indd 505 020514 1723 020514 1723 506 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 131 Bioenergética e termodinâmica Bioenergética é o estudo quantitativo das transduções energéticas que ocorrem em células vivas mudança de uma forma de energia a outra bem como da natureza e da função dos processos químicos envolvidos nessas transdu ções Embora muitos dos princípios da termodinâmica te nham sido introduzidos em capítulos anteriores podendo assim já serem familiares a você uma revisão dos aspectos quantitativos desses princípios será útil As transformações biológicas de energia obedecem às leis da termodinâmica Muitas observações quantitativas feitas por físicos e quími cos sobre a interconversão de diferentes formas de energia levaram no século XIX à formulação das duas leis funda mentais da termodinâmica A primeira lei é o princípio da conservação da energia para qualquer mudança física ou química a quantidade total de energia no universo permanece constante a energia pode mudar de forma ou pode ser transportada de uma região para outra mas não pode ser criada ou destruída A segunda lei da termodinâmica que pode ser enunciada de diferentes for mas diz que o universo sempre tende para o aumento da desordem em todos os processos naturais a entropia do universo aumenta Agora na segunda lei da termodinâmica Organismos vivos são formados por uma coleção de moléculas cujo grau de organização é muito maior que o dos componentes do seu meio ambiente a partir dos quais eles são formados e os organismos produzem e mantêm a organização aparentemente imunes a segunda lei da termodinâmica No entanto os organismos não violam a segunda lei eles operam em rigorosa concordância com ela Para discutir as aplicações da segunda lei aos sistemas biológicos devese primeiro definir esses sistemas e o seu meio ambiente O sistema reagente é a coleção de componentes que es tão sendo submetidos a um determinado processo químico ou físico pode ser um organismo uma célula ou dois com postos reagentes Juntos o sistema reagente e o seu meio ambiente constituem o universo No laboratório alguns processos físicos e químicos podem ser realizados isolados ou em sistemas fechados nos quais não existe troca de ma terial ou energia com o meio No entanto células vivas e organismos são sistemas abertos trocando tanto matéria quanto energia com o seu meio ambiente os sistemas bioló gicos jamais atingem o equilíbrio com o seu meio ambiente e a constante interação entre o sistema e o meio explica como os organismos podem se autoorganizar enquanto operam de acordo com a segunda lei da termodinâmica No Capítulo 1 p 23 foram definidos três parâmetros termodinâmicos que descrevem as trocas de energia que ocorrem em reações químicas Energia livre de Gibbs G expressa a quantidade de energia capaz de realizar trabalho durante uma reação à temperatura e pressão constantes Quando uma reação ocorre com a liberação de energia livre ou seja quan do o sistema se transforma de modo a possuir menos energia livre a variação da energia livre DG possui um valor negativo e a reação é chamada de exergônica Nas reações endergônicas o sistema adquire energia livre e o DG é positivo Entalpia H é o conteúdo de calor do sistema rea gente Ela reflete o número e o tipo de ligações químicas nos reagentes e produtos Quando uma reação química libera calor ela é denominada exotérmica o conteúdo de calor dos produtos é menor do que o dos reagentes e DH possui por convenção um valor negativo Os siste mas reagentes que captam calor do meio são endotérmi cos e possuem valores positivos de DH Entropia S é uma expressão quantitativa da alea toriedade ou desordem de um sistema ver Quadro 13 Quando os produtos de uma reação são menos comple xos e mais desordenados do que os reagentes a reação ocorre com ganho de entropia As unidades de DG e DH são joulesmol ou caloriasmol lembre que 1 cal 5 4184 J a unidade de entropia é jou lesmol Kelvin Jmol K Tabela 131 Sob as condições existentes nos sistemas biológicos in cluindo temperatura e pressão constantes as variações de energia livre entalpia e entropia estão quantitativamente relacionadas pela equação DG 5 DH 2 TDS 131 em que DG é a variação da energia livre de Gibbs do siste ma reagente DH é a variação da entalpia do sistema T é a temperatura absoluta e DS é a variação na entropia do sistema Por convenção DS possui sinal positivo quando a entropia aumenta e DH como mencionado anteriormente possui sinal negativo quando o sistema libera calor para o meio Qualquer uma dessas condições típicas de processos Nelson6edbookindb 506 Nelson6edbookindb 506 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 507 energeticamente favoráveis tendem a tornar negativo o va lor de DG De fato o valor de DG de um sistema reagente espontâneo é sempre negativo A segunda lei da termodinâmica afirma que a entropia do universo aumenta durante todos os processos químicos e físicos embora o aumento da entropia não ocorra necessa riamente no próprio sistema reagente A organização pro duzida dentro das células à medida que elas crescem e se dividem é mais do que compensada pela desordem gerada no meio no curso do crescimento e da divisão ver Quadro 13 caso 2 Em resumo os organismos vivos preservam sua organização interna por captarem a energia livre do meio na forma de nutrientes ou luz solar e devolverem a ele uma quantidade de energia igual na forma de calor e entropia As células necessitam de fontes de energia livre As células são sistemas isotérmicos elas funcionam es sencialmente em temperaturas constantes e também em pressão constante O fluxo de calor não é uma fonte de energia para as células já que o calor é capaz de realizar trabalho somente quando passa por uma região ou por um objeto com temperatura inferior A energia que as células podem e devem utilizar é a energia livre descrita como uma função da energia livre de Gibbs G que permite predizer o sentido das reações químicas sua posição de equilíbrio exa ta e a quantidade de trabalho que elas podem em teoria realizar em temperatura e pressão constantes As células heterotróficas adquirem energia livre a partir das moléculas de nutrientes e as células fotossintetizantes adquirem ener gia livre da radiação solar absorvida Os dois tipos de células tranformam essa energia livre em ATP e em outros com postos ricos em energia capazes de fornecer energia para a realização de trabalho biológico em temperatura constante A variação da energia livre padrão está diretamente relacionada à constante de equilíbrio A composição de um sistema reagente uma mistura de reagentes e produtos químicos tende à variação contínua até que o equilíbrio seja atingido Nas concentrações de equilíbrio dos reagentes e dos produtos as velocidades das reações direta e inversa são exatamente as mesmas e não ocorre variação líquida adicional do sistema As concentra ções dos reagentes e dos produtos no equilíbrio definem a constante de equilíbrio Keq p 25 Na reação geral aA 1 bB cC 1 dD onde a b c e d são o número de molécu las de A B C e D que participam da reação a constante de equilíbrio é dada por 132 onde A B C e D são as concentrações molares dos componentes da reação no ponto de equilíbrio Quando o sistema reagente não está em equilíbrio a tendência em direção ao equilíbrio representa uma força motriz cuja intensidade pode ser expressa como a variação de energia livre para a reação DG Em condiçõespadrão 298 K 5 25C quando os reagentes e os produtos estão presentes em concentração igual a 1 M ou para os gases em pressão parcial de 1013 quilopascais kPa ou 1 atm a força que move o sistema na direção do equilíbrio é definida como a variação de energia livre padrão DG Por esta de finição o estadopadrão para as reações que envolvem íons hidrogênio é H 1 5 1 M ou pH 0 A maior parte das reações bioquímicas no entanto ocorre em soluções aquosas devi damente tamponadas em valores de pH próximos a 7 tanto o pH como a concentração da água 555 M são essencial mente constantes CONVENÇÃOCHAVE Para conveniência dos cálculos os bio químicos definem o estadopadrão como diferente daquele utilizado por químicos e físicos no estadopadrão bioquími co H 1 é 10 27 M pH 7 e H2O é 555 M Para as reações que envolvem Mg 21 que inclui a maioria daquelas nas quais o ATP é um reagente a Mg 21 em solução é comumente considerada constante em 1 mM As constantes físicas com base nesse estadopadrão bio químico são chamadas de constantespadrão aparentes e são escritas com uma apóstrofe como DG9 e K9eq para distinguilas das constantes não aparentes utilizadas pelos químicos e físicos Note que a maioria dos outros livros texto usa o símbolo DG9 em vez de DG9 O uso de DG9 recomendado por um comitê internacional de químicos e bioquímicos visa enfatizar que a energia livre aparente DG9 é o critério para o equilíbrio Por simplicidade daqui por diante essas constantes aparentes serão chamadas de variações de energia livre padrão CONVENÇÃOCHAVE Em uma outra convenção para simpli ficação utilizada pelos bioquímicos quando H2O H 1 eou Mg 21 são reagentes ou produtos as suas concentrações não são incluídas nas equações como na Equação 132 mas es tão incorporadas nas constantes K9eq e DG9 Assim como a K9eq é uma constante física característica para cada reação DG9 também é uma constante Conforme TABELA 131 Algumas constantes físicas e unidades utilizadas na termodinâmica Constante de Boltzmann k 5 1381 3 10 223 JK Número de Avogadro N 5 6022 3 10 23 mol 21 Constante de Faraday 5 96480 JV mol Constante dos gases R 5 8315 Jmol K 5 1987 calmol K A unidade de DG e DH é Jmol ou calmol A unidade de DS é Jmol K ou calmol K 1 cal 5 4184 J A unidade de temperatura absoluta T é o grau Kelvin K 25C 5 298 K A 25C RT 5 2478 kJmol 5 0592 kcalmol Nelson6edbookindb 507 Nelson6edbookindb 507 030414 0743 030414 0743 508 DAVID L NELSON MICHAEL M COX foi mencionado no Capítulo 6 existe uma relação simples entre K9eq e DG9 DG9 5 2RT ln K9eq 133 A variação de energia livre padrão de uma reação quí mica é simplesmente uma forma matemática alternati va para expressar sua constante de equilíbrio A Tabela 132 mostra a relação entre DG9 e K9eq Se a constante de equilíbrio para uma determinada reação for igual a 10 a variação de energia livre padrão dessa reação é igual a zero o logaritmo natural de 10 é zero Se a K9eq de uma reação for maior que 10 seu DG9 é negativo Se K9eq for menor que 10 seu DG9 é positivo Como a relação entre DG9 e K9eq é exponencial variações relativamente pequenas em DG9 correspondem a uma grande mudança em K9eq Pode ser útil pensar na variação de energia livre de ou tra forma DG9 é a diferença entre o conteúdo de energia livre dos produtos e o conteúdo de energia livre dos rea gentes em condiçõespadrão Quando DG9 é negativo os produtos contêm menos energia livre do que os reagen tes e a reação ocorrerá espontaneamente em condições padrão todas as reações químicas tendem a seguir no sentido que resulta em um decréscimo na energia livre do sistema Um valor positivo de DG9 significa que os produ tos da reação contêm mais energia livre do que os reagen tes e essa reação tenderá a seguir no sentido inverso se iniciarmos com concentrações iguais a 10 M para todos os componentes condiçõespadrão A Tabela 133 resume esses pontos PROBLEMA RESOLVIDO 131 Cálculo de DG9 Calcule a variação de energia livre padrão da reação catali sada pela enzima fosfoglicomutase Glicose1fosfato glicose6fosfato sendo que iniciando a reação com 20 mM de glicose1 fosfato e ausência de glicose6fosfato o equilíbrio final da mistura a 25C e pH 70 contém 10 mM de glicose1fosfato e 19 mM de glicose6fosfato A reação no sentido da for mação de glicose6fosfato ocorre com perda ou ganho de energia livre Solução Primeiro calculase a constante de equilíbrio glicose6fosfato glicose1fosfato Agora é possível calcular a variação de energia livre padrão Como a variação de energia livre padrão é negativa a con versão de glicose1fosfato em glicose6fosfato ocorre com perda liberação de energia livre Para a reação inversa o DG9 contém a mesma magnitude mas o sinal oposto A Tabela 134 fornece a variação de energia livre padrão para algumas reações químicas representativas Note que a hidrólise de ésteres simples amidas peptídeos e glicosíde os assim como os rearranjos e as eliminações ocorre com variações relativamente pequenas de energia livre padrão enquanto a hidrólise de anidridos ácidos é acompanhada pelo decréscimo relativamente grande da energia livre pa drão A oxidação completa de compostos orgânicos como a glicose ou o palmitato em CO2 e H2O reações que requerem muitas etapas nas células resulta em um decréscimo muito grande da energia livre padrão No entanto as variações de energia livre padrão como aquelas da Tabela 134 indicam o quanto de energia livre está disponível a partir de uma reação em condiçõespadrão Para descrever a energia li berada sob as condições existentes nas células é essencial uma expressão para a variação de energia livre real TABELA 132 Relação entre as constantes de equilíbrio e as variações de energia livre das reações químicas K9eq DG9 kJmol kcalmol 10 3 2171 241 10 2 2114 227 10 1 257 214 1 00 00 10 21 57 14 10 22 114 27 10 23 171 41 10 24 228 55 10 25 285 68 10 26 342 82 Embora joules e quilojoules sejam as unidades padrão de energia e as utilizadas neste texto algumas vezes os bioquímicos e nutricionistas expressam os valores de DG9 em quilocalorias por mol Consequentemente foram incluídos valores tanto em quilojoules como em quilocalorias nesta tabela e nas Tabelas 134 e 136 Para converter quilojoules em quilocalorias divida o número de quilojoules por 4184 TABELA 133 Relação entre os valores de K9eq e DG9 e o sentido das reações químicas Quando K9eq é DG9 é Iniciando com 1 M de todos os componentes a reação 10 negativo ocorre no sentido direto 10 zero está no equilíbrio 10 positivo ocorre no sentido inverso Nelson6edbookindb 508 Nelson6edbookindb 508 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 509 A variação de energia livre real depende das concentrações dos reagentes e dos produtos É preciso ter cuidado ao distinguir entre duas grandezas diferentes a variação de energia livre real DG e a varia ção de energia livre padrão DG9 Cada reação química possui uma variação de energia livre padrão característi ca que pode ser positiva negativa ou nula dependendo da constante de equilíbrio da reação A variação de ener gia livre padrão nos diz em que sentido e até onde uma dada reação deve seguir para atingir o equilíbrio quando a concentração inicial de cada componente é 10 M em pH 70 temperatura de 25C e pressão de 1013 kPa 1 atm Assim DG9 é constante tendo um valor carac terístico e imutável para uma dada reação No entanto a variação da energia livre real DG é uma função das concentrações dos reagentes e produtos e da tempera tura que prevalece durante a reação e nenhum desses parâmetros será necessariamente igual às condiçõespa drão como definidas anteriormente Além disso o DG de qualquer reação que ocorra espontaneamente em direção ao seu equilíbrio é sempre negativo tornase menos ne gativo ao longo da reação e é zero no ponto de equilíbrio indicando que não pode mais ser realizado trabalho pela reação DG e DG9 para uma determinada reação aA 1 bB cC 1 dD estão relacionados pela equação 134 na qual os termos em vermelho são aqueles que realmente prevalecem no sistema em observação A concentração dos termos nessa equação expressa o efeito comumente cha mado de ação das massas e o termo C cD dA aB b é cha mado de razão da ação das massas Q Assim a Equação 134 pode ser expressa como DG 5 DG9 1 RT ln Q Como exemplo supõese que a reação A 1 B C 1 D esteja TABELA 134 Variações de energia livre padrão de algumas reações químicas Tipo de reação DG9 kJmol kcalmol Reações de hidrólise Anidridos de ácidos Anidrido acético 1 H2O 2 acetato ATP 1 H2O ADP 1 Pi ATP 1 H2O AMP 1 PPi PPi 1 H2O 2Pi UDPglicose 1 H2O UMP 1 glicose1fosfato 2911 2305 2456 2192 2430 2218 273 2109 246 2103 Ésteres Acetato de etila 1 H2O etanol 1 acetato Glicose6fosfato 1 H2O glicose 1 Pi 2196 2138 247 233 Amidas e peptídeos Glutamina 1 H2O glutamato 1 NH 1 4 Glicilgliena 1 H2O 2 glicina 2142 292 234 222 Glicosídeos Maltose 1 H2O 2 glicose Lactose 1 H2O glicose 1 galactose 2155 2159 237 238 Rearranjos Glicose1fosfato glicose6fosfato Frutose6fosfato glicose6fosfato 273 217 217 204 Eliminação de água Malato fumarato 1 H2O 31 08 Oxidação com oxigênio molecular Glicose 1 6O2 6CO2 1 6H2O Palmitato 1 23O2 16CO2 1 16H2O 22840 29770 2686 22338 Nelson6edbookindb 509 Nelson6edbookindb 509 030414 0743 030414 0743 510 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ocorrendo em condiçõespadrão de temperatura 25C e pressão 1013 kPa mas que as concentrações de A B C e D não sejam iguais e nenhum dos componentes esteja presente na concentraçãopadrão de 10 M Para determi nar a variação de energia livre real DG nessa condição não padrão de concentração à medida que a reação ocorre da esquerda para a direita simplesmente aplicamse as con centrações reais de A B C e D na Equação 134 os valo res de R T e DG9 são os valorespadrão DG é negativo e se aproxima do zero à medida que a reação evolui já que as concentrações reais de A e B diminuem e as concentra ções de C e D aumentam Note que quando a reação está no equilíbrio quando não há mais força que estimule a reação em nenhum dos sentidos e DG é zero a Equação 134 reduzse a ou DG9 5 2RT ln K9eq que é a equação que relaciona a variação de energia livre padrão e a constante de equilíbrio Equação 133 O critério para avaliar a espontaneidade de uma reação é o valor de DG e não de DG9 Uma reação com DG9 po sitivo pode ocorrer no sentido direto se o DG for negativo Isto é possível se o termo RT ln produtosreagentes na Equação 134 for negativo e possuir valor absoluto maior que DG9 Por exemplo a remoção imediata dos produtos de uma reação pode manter a relação produtosreagen tes muito abaixo de 1 de forma que o termo RT ln produ tosreagentes apresenta um grande valor negativo DG9 e DG são expressões da quantidade máxima de energia li vre que uma dada reação pode teoricamente liberar uma quantidade de energia que poderia ser utilizável apenas me diante a presença de um dispositivo muito eficiente para captála ou dirigila Já que tal dispositivo não é factível parte da energia sempre é perdida para a entropia durante qualquer processo a quantidade de trabalho realizada pela reação a temperatura e pressão constantes é sempre menor que a quantidade teoricamente disponível Outro ponto importante é que algumas reações termo dinamicamente favoráveis ou seja reações em que o DG9 é grande e negativo não ocorrem em velocidades mensu ráveis Por exemplo a combustão da lenha em CO2 e H2O é muito favorável termodinamicamente mas a lenha perma nece estável por anos já que a energia de ativação ver Fi guras 62 e 63 para a reação de combustão é maior do que a energia disponível à temperatura ambiente Se a energia de ativação necessária é fornecida p ex por um fósforo aceso a combustão terá início convertendo a madeira nos produtos mais estáveis CO2 e H2O e liberando energia nas formas de calor e luz O calor liberado por essa reação exo térmica fornece a energia de ativação para a combustão das regiões vizinhas à lenha o processo é autopropagável Em células vivas as reações que seriam extremamente lentas caso não fossem catalisadas prosseguem não pelo fornecimento de calor adicional mas sim pela redução da energia de ativação pelo uso de enzimas Uma enzima for nece uma via de reação alternativa com energia de ativação menor do que a reação não catalisada de tal forma que à temperatura ambiente uma grande fração das moléculas de substrato possui energia térmica suficiente para supe rar a barreira de ativação aumentando drasticamente a velocidade da reação A variação de energia livre para uma reação é independente da via pela qual a reação ocorre ela depende apenas da natureza e das concentra ções dos reagentes iniciais e produtos finais Portanto as enzimas não podem alterar as constantes de equilíbrio mas o que elas fazem é aumentar a velocidade pela qual a reação ocorre no sentido determinado pela termodinâmica ver Seção 62 As variações de energia livre padrão são aditivas No caso de duas reações químicas sequenciais A B e B C cada reação possui sua própria constante de equilíbrio e cada uma possui sua variação de energia livre padrão característica DG91 e DG92 Como as duas reações são sequenciais B é cancelado resultando na reação geral A C que possui sua própria constante de equilíbrio e consequentemente sua própria variação de energia livre padrão DG9 total Os valores de DG9 de reações químicas sequenciais são aditivos Para a reação geral A C o DG9 total é a soma das variações de energia livre padrão indi viduais DG91 e DG92 das duas reações separadas DG9 total 5 DG91 1 DG92 Este princípio da bioenergética explica como uma reação termodinamicamente desfavorável endergônica pode ocorrer no sentido direto acoplandoa a uma reação alta mente exergônica por meio de um intermediário comum Por exemplo a síntese de glicose6fosfato é o primeiro passo na utilização de glicose em muitos organismos Glicose 1 Pi glicose6fosfato 1 H2O DG9º 5 138 kJmol O valor positivo de DG9 indica que em condiçõespadrão a reação não tenderá a ocorrer espontaneamente no sentido representado Outra reação celular a hidrólise de ATP em ADP e Pi é muito exergônica ATP 1 H2O S ADP 1 Pi DG9º 5 2305 kJmol Essas duas reações compartilham os intermediários co muns Pi e H2O e podem ser expressas como reações se quenciais Nelson6edbookindb 510 Nelson6edbookindb 510 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 511 A variação de energia livre padrão global é obtida pelo so matório dos valores de DG9 para as reações individuais DG9º 5 138 kJmol 1 2305 kJmol 5 2 167 kJmol A reação global é exergônica Neste caso a energia arma zenada no ATP é utilizada para promover a síntese de gli cose6fosfato ainda que sua formação a partir de glicose e fosfato inorgânico Pi seja endergônica A via de formação de glicose6fosfato a partir de glicose pela transferência de grupo fosforil do ATP é diferente das reações 1 e 2 des critas anteriormente embora o resultado final seja equiva lente ao somatório das duas reações Nos cálculos termodi nâmicos tudo o que importa é o estado do sistema no início e no final do processo o caminho entre os estados inicial e final é irrelevante Foi mencionado que DG9 é uma forma de expressar a constante de equilíbrio para uma reação Para a reação 1 anterior Note que a H2O não está incluída nessa expressão e assu mese que a sua concentração 555 M mantémse inalte rada durante a reação A constante de equilíbrio para a hi drólise de ATP é Portanto a constante de equilíbrio para as duas reações acopladas é Este cálculo ilustra um ponto importante sobre as cons tantes de equilíbrio embora os valores de DG9 para duas reações cujo somatório resulte em uma terceira sejam adi tivos o K9eq para a reação global é o produto dos valores dos K9eq individuais das duas reações As constantes de equilíbrio são multiplicativas Devido ao acoplamento da hidrólise de ATP à síntese de glicose6fosfato o K9eq para a formação de glicose6fosfato a partir de glicose aumenta na ordem de 2 3 10 5 Esta estratégia envolvendo intermediários comuns é utilizada por todas as células vivas na síntese de interme diários metabólicos e de componentes celulares Obviamen te a estratégia funciona apenas se compostos como o ATP estiverem continuamente disponíveis Nos capítulos se guintes serão consideradas algumas das mais importantes vias celulares para a produção de ATP RESUMO 131 Bioenergética e termodinâmica c As células vivas realizam trabalho constantemente Elas necessitam de energia para manter suas estru turas altamente organizadas sintetizar componentes celulares gerar correntes elétricas e muitos outros processos c A bioenergética é o estudo quantitativo das relações de energia e conversões energéticas em sistemas biológi cos As transformações biológicas de energia obedecem às leis da termodinâmica c Todas as reações químicas são influenciadas por duas forças a tendência de atingir o estado de ligação mais estável para o qual a entalpia H é uma expressão útil e a tendência de atingir o mais alto grau de desordem expresso pela entropia S A força motriz líquida de uma reação é o DG a variação de energia livre que represen ta o efeito líquido desses dois fatores DG 5 DH 2 TDS c A variação de energia livre padrão aparente DG9 é uma constante física característica para uma dada rea ção e pode ser calculada a partir da constante de equilí brio da reação DG9 5 2RT ln K9eq c A variação de energia livre real DG é uma variável que depende de DG9 e das concentrações dos reagen tes e dos produtos DG 5 DG9 1 RT lnprodutos reagentes c Quando DG é elevado e negativo a reação tende a se guir no sentido direto quando DG é elevado e positivo a reação tende a seguir no sentido inverso quando DG 5 zero o sistema está em equílibrio c A variação de energia livre de uma reação é independen te da via pela qual a reação ocorre As variações de ener gia livre são aditivas a reação química final resultante de sucessivas reações que compartilham intermediários comuns possui uma variação de energia livre global que é a soma dos valores de DG para as reações individuais 132 Lógica química e reações bioquímicas comuns As transduções biológicas de energia abordadas neste livro são reações químicas A química celular não abran ge todo tipo de reação estudada em um curso típico de química orgânica Quais reações ocorrem em sistemas biológicos e quais não é algo determinado por 1 sua re levância para um sistema metabólico em particular e 2 sua velocidade As duas considerações são importantes no formato das vias metabólicas que serão estudadas ao longo deste livro Uma reação relevante é aquela que faz uso de um substrato disponível e o converte em um produto útil No entanto mesmo uma reação potencialmente relevante pode não ocorrer Algumas transformações químicas são muito lentas possuem energias de ativação muito altas para contribuir com os sistemas vivos mesmo com a ajuda de poderosos catalisadores enzimáticos As reações que ocorrem nas células representam uma caixa de ferra mentas que a evolução teria utilizado para construir as vias metabólicas que contornam as reações impossíveis Aprender a reconhecer as reações plausíveis pode ser uma ótima ajuda para desenvolver um conhecimento profundo em bioquímica Nelson6edbookindb 511 Nelson6edbookindb 511 030414 0743 030414 0743 512 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Mesmo assim o número de reações metabólicas que ocor rem em uma célula típica pode parecer exagerado A maior parte das células tem a capacidade de realizar milhares de reações específicas catalisadas por enzimas por exemplo a transformação de um nutriente simples como a glicose em aminoácidos nucleotídeos ou lipídeos a extração de energia a partir da oxidação de combustíveis ou a polimerização de subunidades monoméricas em macromoléculas Para estudar essas reações é essencial alguma organi zação Existem padrões na química da vida você não preci sa estudar todas as reações individuais para compreender a lógica molecular da bioquímica A maior parte das reações nas células vivas pertence a uma das cinco categorias ge rais 1 reações que criam ou quebram ligações carbono carbono 2 rearranjos internos isomerizações e elimina ções 3 reações com radicais livres 4 transferência de grupos e 5 oxidaçãoredução A seguir cada uma dessas categorias será discutida em maior detalhe Nos capítulos posteriores serão citados alguns exemplos de cada tipo de reação Note que os cinco tipos de reações não são mutua mente excludentes por exemplo uma reação de isomeri zação pode envolver um intermediário do tipo radical livre No entanto antes de dar continuidade é preciso revi sar dois princípios químicos básicos Primeiro uma ligação covalente consiste em um par de elétrons compartilhados e a ligação pode ser rompida em geral de duas formas Fi gura 131 Na clivagem homolítica cada átomo deixa a ligação na forma de um radical carregando um elétron desemparelhado Na clivagem heterolítica que é a mais comum um átomo retém os dois elétrons da ligação As espécies mais frequentemente geradas quando as ligações CC e CH são clivadas estão ilustradas na Figura 131 Carbânions carbocátions e íons hidreto são altamente ins táveis como será visto essa instabilidade caracteriza a quí mica desses íons O segundo princípio básico é que muitas reações bio químicas envolvem interações entre nucleófilos grupos funcionais ricos em elétrons e capazes de doálos e ele trófilos grupos funcionais deficientes em elétrons e que os procuram Os nucleófilos doam elétrons e combinam se com os eletrófilos Nucleófilos e eletrófilos comuns em biologia estão representados na Figura 132 Note que um átomo de carbono pode agir tanto como um nucleófilo quanto um eletrófilo dependendo das ligações e dos grupos funcionais que o rodeiam Reações que criam ou quebram ligações carbonocarbono A cliva gem heterolítica de uma ligação CC gera um carbânion e um carbocátion Figura 131 Inversamente a formação de uma ligação CC envolve a combinação de um carbâ C C Radicais de carbono C 1 C C H Próton Carbânion C 1 H Clivagem heterolítica C H Radical de carbono C 1 H Clivagem homolítica C H Hidreto Carbocátion C 1 C C Carbocátion Carbânion C 1 C Átomo de H H FIGURA 131 Dois mecanismos para a clivagem de uma ligação CC ou CH Em uma clivagem homolítica cada átomo mantém um dos elé trons da ligação resultando na formação de radicais de carbono carbonos contendo elétrons não pareados ou átomos de hidrogênio não carregados Em uma clivagem heterolítica um dos átomos retém os dois elétrons da li gação Isso pode resultar na formação de carbânions carbocátions prótons ou íons hidreto Nucleófilos Eletrófilos N HN S C O H O C O R N C H R H R P R Fósforo de um grupo fosfato Próton Sulfidril carregada negativamente Carbânion Grupo amino descarregado Imidazol Íon hidróxido O O O O Oxigênio negativamente carregado como em um grupo hidroxil desprotonado ou um ácido carboxílico ionizado Átomo de carbono de um grupo carbonil o oxigênio mais eletronegativo do grupo carbonil retira elétrons do carbono Grupo imino protonado ativado devido ao ataque nucleofílico ao carbono pela protonação da imina N FIGURA 132 Nucleófilos e eletrófilos comuns em reações bioquími cas Os mecanismos de reações químicas que descrevem a formação e a quebra de ligações covalentes estão representados por pontos e setas cur vas uma convenção informalmente conhecida como trajetória do elétron Uma ligação covalente consiste em um par de elétrons compartilhado Os elétrons importantes para o mecanismo da reação que não participam da li gação estão representados por pontos As setas curvas representam o movimento do par de elétrons Para o movimento de um único elétron como em uma reação com radical livre é usada uma seta de ponta única tipo anzol A maioria dos passos da reação envolve um par de elé trons não compartilhado Nelson6edbookindb 512 Nelson6edbookindb 512 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 513 nion nucleofílico e um carbocátion eletrofílico Carbânions e carbocátions geralmente são tão instáveis que a sua for mação como intermediários de reação pode ser energetica mente inacessível mesmo com catálise enzimática Para a finalidade da bioquímica celular essas reações impossíveis a não ser que seja fornecido um auxílio químico na forma de grupos funcionais contendo átomos eletronegativos O e N que podem alterar a estrutura eletrônica dos átomos de carbonos adjacentes de modo a estabilizar e facilitar a formação dos intermediários carbânion e carbocátion Os grupos carbonil são particularmente importantes nas transformações químicas das vias metabólicas O áto mo de carbono de um grupo carbonil possui uma carga positiva parcial devido à propriedade de retirar elétrons do oxigênio carbonílico sendo portanto um carbono ele trofílico Figura 133a Um grupo carbonil pode então facilitar a formação de um carbânion em um carbono adja cente por deslocar as cargas negativas do carbânion Figu ra 133b Um grupo imino ver Figura 116 pode ter uma função similar Figura 133c A capacidade de deslocar elétrons dos grupos carbonil e imino pode ainda ser poten cializada por catálise ácida ou por um íon metálico como o Mg 21 Figura 133d A importância do grupo carbonil é evidente nas três principais classes de reações em que ligações CC são for madas ou quebradas Figura 134 condensações aldóli cas condensação de Claisen e descarboxilações Em cada tipo de reação um intermediário carbânion é estabilizado por um grupo carbonil e em muitos casos outro grupo car bonil fornece o eletrófilo com o qual o carbânion nucleofí lico reage A condensação aldólica é uma rota comum para a formação de ligações CC a reação da aldolase na glicó lise que converte um composto de seis átomos de carbono em dois compostos de três átomos de carbono é o inverso de uma condensação aldólica ver Figura 146 Em uma condensação de Claisen o carbânion é estabilizado pelo carbonil de um tioéster adjacente um exemplo é a sínte se de citrato no ciclo do ácido cítrico ver Figura 169 A descarboxilação também envolve geralmente a geração de um carbânion estabilizado por um grupo carbonil um exemplo é a reação da acetoacetatodescarboxilase que leva à formação de corpos cetônicos durante o catabolismo dos ácidos graxos ver Figura 1719 Todas as vias meta bólicas estão organizadas em torno da introdução de um grupo carbonil em uma localização particular de modo que uma ligação carbonocarbono adjacente possa ser formada ou clivada Em algumas reações uma imina ou um cofator especializado como piridoxalfosfato exerce a função de retirar elétrons do grupo carbonil O intermediário carbocátion que ocorre em algumas reações que formam ou clivam ligações CC é gerado pela eliminação de um grupo de saída muito bom como o pi rofosfato ver as reações de transferência de grupos a se guir Um exemplo é a reação da preniltransferase Figura 135 uma etapa inicial na via de biossíntese do colesterol Rearranjos internos isomerizações e eliminações Outro tipo co mum de reação celular é um rearranjo intramolecular em que a redistribuição de elétrons resulta em alterações de muitos tipos diferentes sem alterar o estado de oxidação global da molécula Por exemplo grupos diferentes em uma molécula podem sofrer oxidaçãoredução sem variar o estado líquido de oxidação da molécula grupos conten do ligação dupla podem sofrer um rearranjo cistrans ou as posições das ligações duplas podem ser mudadas Um exemplo de uma isomerização envolvendo oxidaçãoredu ção é a formação de frutose6fosfato a partir de glicose6 C a O C C C C b O O c C C C NH2 C C C NH2 Me2 d C O HA C O FIGURA 133 Propriedades químicas do grupo carbonil a O átomo de carbono de um grupo carbonil é um eletrófilo devido à capacidade de retirar elétrons do átomo de oxigênio eletronegativo resultando em uma estrutura em que o carbono tem carga positiva parcial b No interior de uma molécula o deslocamento dos elétrons para um grupo carbonil facilita e estabiliza a formação de um carbânion em um carbono adjacente c As iminas atuam como os grupos carbonil facilitando a retirada dos elétrons d Os grupos carbonil não atuam sempre sozinhos sua capacidade como escoadouro de elétrons frequentemente é potencializada pela interação com um íon metálico Me 21 como Mg 21 ou com um ácido HA 1 2 R1 C Condensação aldólica C O R2 H C R3 R4 O H1 R1 C C O R2 H C R3 R4 OH CoAS C Condensação de Claisen C O H H C R1 S R2 S R2 H O H1 CoAS C C O H H C R1 O R C Descarboxilação de um bceto ácido C O H H C O O2 H1 R C C O H H H CO2 2 FIGURA 134 Algumas reações comuns de formação e quebra de li gações CC em sistemas biológicos Tanto para a condensação aldólica como para a condensação de Claisen um carbânion atua como nucleófilo e o carbono de um grupo carbonil atua como eletrófilo O carbânion é es tabilizado em cada caso por outro grupo carbonil no carbono adjacente ao carbânion Na reação de descarboxilação um carbânion é formado no car bono sombreado em azul quando o CO2 é liberado A reação não ocorreria em velocidade adequada sem o efeito estabilizador do carbonil adjacente ao carbânion Em qualquer lugar em que um carbânion é mostrado assume se também a presença de uma ressonância estabilizadora com o carbonil adjacente como representado na Figura 133b Uma imina Figura 133c ou outro grupo removedor de elétrons incluindo certos cofatores enzimáticos como o piridoxal pode substituir o grupo carbonil na estabilização dos car bânions Nelson6edbookindb 513 Nelson6edbookindb 513 030414 0743 030414 0743 514 DAVID L NELSON MICHAEL M COX fosfato na glicólise Figura 136 esta reação é discutida em detalhes no Capítulo 14 C1 é reduzido aldeído para álcool e C2 é oxidado álcool para cetona A Figura 13 6b mostra os detalhes dos movimentos dos elétrons neste tipo de isomerização Um rearranjo cistrans está ilustrado na reação da prolilcistransisomerase no enovelamento de certas proteínas ver Figura 48 Uma simples mudan ça de uma ligação CC ocorre durante o metabolismo do ácido oleico um ácido graxo comum ver Figura 1710 Alguns exemplos espetaculares de reposicionamento de duplas ligações ocorrem na biossíntese do colesterol ver Figura 2133 Um exemplo de uma reação de eliminação que não afeta o estado de oxidação global é a perda de água por um ál cool resultando na introdução de uma ligação CC R C C H H OH R1 H2O H H C H2O H R C R1 Reações similares podem resultar de eliminações em aminas Reações envolvendo radicais livres Antigamente considerada rara a clivagem homolítica de ligações covalentes com ge ração de radicais livres é atualmente encontrada em uma ampla gama de processos bioquímicos Alguns exemplos são isomerizações que fazem uso de adenosilcobalamina vitamina B12 ou Sadenosilmetionina que são iniciadas com um radical 59desoxiadenosil ver a reação da metil malonilCoAmutase no Quadro 172 certas reações de descarboxilação iniciadas por radicais Figura 137 al gumas reações da redutase como a catalisada pela ribonu PPi Isopentenil pirofosfato P 2O O O2 P O O C O O2 Dimetilalilpirofosfato C CH3 CH3 C H2 H H1 C C CH3 CH3 H P 2O 1C O O2 P O O C O O2 Isopentenilpirofosfato Carbocátion dimetilalílico C CH3 H2 CH2 C H2 H H C Geranilpirofosfato P 2O O O2 P O O O O2 FIGURA 135 Os carbocátions na formação da ligação carbonocar bono Em uma das primeiras etapas da biossíntese do colesterol a enzima preniltransferase catalisa a condensação de isopentenilpirofosfato e dimetil pirofosfato formando geranilpirofosfato ver Figura 2136 A reação é ini ciada pela eliminação do pirofosfato do dimetilpirofosfato para gerar um carbocátion estabilizado por ressonância com a ligação CC adjacente H 1C 2C B1 H O OH Glicose6fosfato B2 H C C H O OH C OH H C H OH C H OH C H H O P O2 O O2 H 1C 2C OH O Frutose6fosfato Intermediário enediol H C OH H C H OH C H OH C H H O P O2 O O2 a b Fosfoexose isomerase ➊ B1 retira um próton ➍ B2 retira um próton possibilitando a formação de uma ligação CO ➋ Isso possibilita a formação de uma ligação dupla CC ➌ Elétrons do grupo carbonil formam uma ligação OH com o íon hidrogênio doado por B2 ➎ Um par de elétrons é deslocado da ligação CC para formar uma ligação CH com o próton doado por B1 C B1 H H C H O O H C OH H C O B1 B2 B2 FIGURA 136 As reações de isomerização e eliminação a Conversão de glicose6fosfato a frutose6fosfato reação do metabolismo de açúcares catalisada pela fosfoexoseisomerase b Esta reação ocorre por meio de um intermediário enediol Os quadros em cor salmão indicam a via de oxidação da esquerda para a direita B1 e B2 são grupos ionizáveis da enzima eles são capazes de doar e receber prótons atuando como ácidos ou bases à medi da que a reação ocorre Nelson6edbookindb 514 Nelson6edbookindb 514 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 515 cleotídeoredutase ver Figura 2241 e algumas reações de rearranjo como as catalisadas pela DNAfotoliase ver Figura 2526 Reações de transferência de grupos A transferência de grupos acil glicosil e fosforil de um nucleófilo para outro é comum em células vivas A transferência de grupo acil geralmente envolve a adição de um nucleófilo ao carbono do carbonil de um grupo acil para formar um intermediário tetraédrico R C Intermediário tetraédrico O Y X R C O2 Y X R C O Y X2 A reação da quimotripsina é um exemplo de transfe rência de grupo acil ver Figura 622 A transferência de grupos glicosil envolve a substituição nucleofílica no C1 do anel de um açúcar que é o átomo central de um ace tal Em princípio a substituição poderia prosseguir por via SN1 ou SN2 como descrito na Figura 628 para a enzima lisozima A transferência de grupos fosforil exerce função espe cial em vias metabólicas e essas reações de transferência são discutidas em detalhes na Seção 133 Um tema geral no metabolismo é a ligação de um bom grupo de saída a um intermediário metabólico a fim de ativálo para as reações subsequentes Entre os melhores grupos de saída em reações de substituição nucleofílica estão o ortofosfato inorgânico a forma ionizada de H3PO4 em pH neutro uma mistura de H2PO4 2 e HPO4 22 geralmente abreviado como Pi e o pirofosfato inorgânico P2O7 42 abreviado como PPi os ésteres e os anidridos do ácido fosfórico são efetiva mente ativados para reação A substituição nucleofílica tornase mais favorável pela ligação de um grupo fosforil a um grupo de saída pobre como o hidroxil OH As subs tituições nucleofílicas nas quais o grupo fosforil PO3 22 atua como um grupo de saída ocorrem em centenas de reações metabólicas O fósforo pode formar cinco ligações covalentes A re presentação convencional de Pi Figura 138a com três e2 CO2 Coproporfirinogênio III H R R NH 1 H3C X 2OOC Radical coproporfirinogenil III 2XH 1 H3C R R NH 2OOC Protoporfirinogênio IX H3C R R NH FIGURA 137 Uma reação de descarboxilação iniciada por radicais livres A biossíntese do heme ver Figura 2226 em Escherichia coli inclui uma etapa de descarboxilação em que a cadeia lateral propionil do inter mediário coproporfirinogênio III é convertida na cadeia lateral vinil do pro toporfirinogênio IX Quando a bactéria está crescendo anaerobiamente a enzima independente de oxigênio coproporfirinogênio IIIoxidase também chamada de proteína HemN promove a descarboxilação pelo mecanismo de radical livre mostrado aqui O receptor do elétron liberado não é conheci do Para simplificar são mostradas apenas as porções relevantes das grandes moléculas de coproporfirinogênio III e protoporfirinogênio as estruturas completas são mostradas na Figura 2226 Quando E coli está crescendo na presença de oxigênio esta reação é uma descarboxilação oxidativa sendo catalisada por uma enzima diferente O O O 32 P O b O P O O O O2 O P O2 O2 2O O O2 P 2O O2 O2 P O O2 O2 2O O2 P O a c Adenina Ribose O O P O P O2 HO R O2 P O O2 O2 O O Glicose ATP Adenina Ribose O O P O 2O P O O2 1 O2 P R O2 2O O O ADP Glicose6fosfato um ésterfosfato O O O P W Z d OH Z 5 R W 5 ADP FIGURA 138 Transferência de grupos fosforil alguns dos participan tes a Em uma representação inadequada de Pi três oxigênios estão liga dos ao fósforo por ligações simples e o quarto está ligado por ligação dupla possibilitando as quatro estruturas de ressonância diferentes mostradas aqui b As estruturas de ressonância de Pi podem ser representadas mais acurada mente mostrando todas as quatro ligações fósforooxigênio com caráter de ligação dupla parcial os orbitais híbridos assim representados estão arranja dos em um tetraedro com o P na posição central c Quando um nucleófilo Z neste caso a OH do C6 da glicose ataca o ATP ele desloca ADP W Nesta reação SN2 um intermediário pentacovalente d é formado transitoriamente Nelson6edbookindb 515 Nelson6edbookindb 515 030414 0743 030414 0743 516 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ligações PO e uma ligação PO é conveniente mas não é acurada No Pi quatro ligações fósforooxigênio equiva lentes compartilham parcialmente o caráter de ligação du pla e o ânion tem uma estrutura tetraédrica Figura 13 8b Como o oxigênio é mais eletronegativo que o fósforo o compartilhamento dos elétrons é desigual o fósforo central fica com uma carga positiva parcial e portanto atua como um eletrófilo Em um número muito grande de reações me tabólicas um grupo fosforil PO3 22 é transferido do ATP para um álcool formando um éster fosfato Figura 138c ou para um ácido carboxílico formando um anidrido misto Quando um nucleófilo ataca o átomo de fósforo eletrofíli co do ATP formase um intermediário de reação com uma estrutura pentacovalente relativamente estável Figura 13 8d Com a partida do grupo de saída ADP a transferên cia de um grupo fosforil está completa A grande família de enzimas que catalisam a transferência de grupos fosforil com o ATP como doador é chamada de cinase do grego kinein mover A hexocinase por exemplo move um grupo fosforil do ATP para a glicose Os grupos fosforil não são os únicos grupos que ativam moléculas para reação Os tioálcoois tióis em que o áto mo de oxigênio de um álcool é substituído por um átomo de enxofre também são bons grupos de saída Os tióis ativam os ácidos carboxílicos pela formação de tioésteres ou tiol ésteres Em capítulos posteriores serão discutidas diversas reações inclusive aquelas catalisadas pela acil graxosinte tase na síntese de lipídeos ver Figura 212 em que a subs tituição nucleofílica no carbono do carbonil de um tioéster resulta na transferência do grupo acil para outra região Reações de oxidaçãoredução Os átomos de carbono podem existir em cinco estados de oxidação dependendo dos ele mentos com que eles compartilham os elétrons Figura 139 e as transições entre esses estados de oxidação são de importância crucial no metabolismo as reações de oxi daçãoredução são o tópico da Seção 134 Em muitas oxi dações biológicas um composto perde dois elétrons e dois íons hidrogênio ou seja dois átomos de hidrogênio essas reações são comumente chamadas de desidrogenações e as enzimas que as catalisam são chamadas de desidrogena ses Figura 1310 Em algumas oxidações biológicas mas não em todas um átomo de carbono é covalentemente liga do a um átomo de oxigênio As enzimas que catalisam essas oxidações geralmente são chamadas de oxidases ou se o átomo de oxigênio é derivado diretamente de um oxigênio molecular O2 oxigenases Cada oxidação deve ser acompanhada por uma re dução em que um receptor de elétrons recebe os elé trons removidos na oxidação As reações de oxidação geralmente liberam energia pense em uma fogueira os compostos na madeira são oxidados por moléculas de oxigênio do ar A maioria das células vivas obtém ener gia necessária para o trabalho celular pela oxidação de combustíveis metabólicos como carboidratos ou gorduras os organismos fotossintéticos também podem captar e usar a energia da luz solar As vias catabólicas que libe ram energia descritas nos Capítulos 14 a 19 são sequên cias de reações oxidativas que resultam na transferência de elétrons das moléculas combustíveis para o oxigênio por meio de uma série de transportadores de elétrons A alta afinidade do O2 por elétrons torna o processo global de transferência de elétrons altamente exergônico for necendo energia que leva à síntese de ATP o objetivo central do catabolismo Muitas das reações dessas cinco classes são facilitadas por cofatores na forma de coenzimas e metais vitamina B12 Sadenosilmetionina folato nicotinamida e ferro são alguns exemplos Os cofatores ligamse às enzimas em alguns casos reversivelmente em outros casos quase irre versivelmente e conferem a elas a capacidade de promo ver um tipo particular de reação química p 190 A maior parte dos cofatores participa em uma estreita faixa de reações diretamente relacionadas Os capítulos seguintes apresentam e discutem cada cofator biologicamente im portante Os cofatores fornecem outra forma de organizar o estudo dos processos bioquímicos já que as reações fa cilitadas por um determinado cofator costumam ser meca nisticamente relacionadas CH2 Alcano CH3 CH2 CH2 Álcool Aldeído cetona Ácido carboxílico Dióxido de carbono CH2OH O HR C CH2 O O O OH C C FIGURA 139 Os níveis de oxidação do carbono em biomolécu las Cada composto é formado por oxidação do carbono em vermelho no composto mostrado imediatamente acima O dióxido de carbono é a forma de carbono mais altamente oxidado encontrada em sistemas vivos CH3 Lactato Piruvato Lactato desidrogenase CH3 CH OH C C C O O O2 2H1 2e2 1 2H1 2e2 1 O O2 FIGURA 1310 Uma reação de oxidaçãoredução Está representada aqui a oxidação do lactato a piruvato Nesta desidrogenação dois elétrons e dois íons hidrogênio o equivalente a dois átomos de hidrogênio são re movidos do C2 do lactato um álcool formando piruvato uma cetona Nas células a reação é catalisada pela lactatodesidrogenase e os elétrons são transferidos para o cofator dinucleotídeo de nicotinamidaadenina NAD Esta reação é totalmente reversível o piruvato pode ser reduzido pela trans ferência dos elétrons do cofator Nelson6edbookindb 516 Nelson6edbookindb 516 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 517 As equações bioquímicas e químicas não são idênticas Os bioquímicos representam as equações metabólicas de forma simplificada e isso é particularmente evidente para as reações envolvendo ATP Os compostos fosforilados po dem existir em vários estados de ionização e conforme já mencionado as diferentes espécies podem ligar Mg 21 Por exemplo em pH 70 e 2 mM de Mg 21 o ATP existe na forma de ATP 42 HATP 32 H2ATP 22 MgHATP 2 e Mg2ATP Conside rando a função biológica do ATP no entanto nem sempre há interesse em todos esses detalhes e assim considera se o ATP como uma entidade constituída pela soma des sas espécies e representase sua hidrólise como a equação bioquímica ATP 1 H2O ADP 1 Pi na qual ATP ADP e Pi correspondem ao somatório das es pécies A constante de equilíbrio padrão aparente corres pondente K9eq 5 ADPPiATP depende do pH e da con centração de Mg 21 livre Note que H 1 e Mg 21 não aparecem na equação bioquímica pois são mantidos constantes Por tanto uma equação bioquímica não inclui necessariamente o equilíbrio de H Mg ou de cargas embora ela inclua o equi líbrio entre todos os outros elementos envolvidos na reação C N O e P na equação acima É possível escrever uma equação química que inclui o equilíbrio de todos os elementos e cargas Por exemplo quando o ATP é hidrolisado em valores de pH acima de 85 na ausência de Mg 21 a reação química é representada por ATP 42 1 H2O S ADP 32 1 HPO4 22 1 H 1 A constante de equilíbrio correspondente K9eq 5 ADP 32 HPO4 22H 1ATP 42 depende apenas da temperatura da pressão e da força iônica As duas formas de representar uma reação metabólica são relevantes em bioquímica As equações químicas são utilizadas quando se quer levar em consideração todos os átomos e cargas em uma reação como quando se estuda o mecanismo de uma reação química As equações bioquí micas são utilizadas para determinar em qual sentido uma reação ocorrerá espontaneamente dado um valor de pH e Mg 21 específicos ou para calcular a constante de equilí brio da reação Ao longo deste livro serão utilizadas equações bioquí micas a não ser quando o foco for o mecanismo químico envolvido sendo utilizados os valores de DG9 e K9eq deter minados em pH 7 e 1 mM de Mg 21 RESUMO 132 Lógica química e reações bioquímicas comuns c Os sistemas vivos fazem uso de um grande número de reações químicas que podem ser classificadas em cinco tipos gerais c Os grupos carbonil exercem função especial nas reações que formam ou clivam ligações CC Os intermediários carbânions são comuns e estabilizados por grupos car bonil adjacentes ou menos frequentemente por grupos imino e certos cofatores c A redistribuição dos elétrons pode produzir rearranjos internos isomerizações e eliminações Essas reações incluem oxidaçãoredução intramolecular alteração do arranjo cistrans de ligações duplas e transposições de ligações duplas c A clivagem homolítica de ligações covalentes com a ge ração de radicais livres ocorre em algumas vias como em certas reações de isomerização descarboxilação re dutase e rearranjos c As reações de transferência de grupos fosforil são um tipo especialmente importante de transferência de gru pos nas células necessário para a ativação de moléculas para as reações que de outra forma seriam altamente desfavoráveis c As reações de oxidaçãoredução envolvem a perda ou o ganho de elétrons um reagente ganha elétrons e é re duzido enquanto outro perde elétrons e é oxidado As reações de oxidação geralmente liberam energia e são importantes no catabolismo 133 Transferência de grupos fosforil e ATP Uma vez tendo sido apresentados alguns princípios fun damentais da variação de energia em sistemas químicos sendo revisadas as classes comuns de reações agora é possível examinar o ciclo de energia nas células e a fun ção especial do ATP como a moeda energética que re laciona catabolismo e anabolismo ver Figura 129 As células heterotróficas obtêm energia livre de forma quí mica pelo catabolismo de moléculas de nutrientes e elas usam essa energia para fazer ATP a partir de ADP e Pi O ATP então doa parte da sua energia química para pro cessos endergônicos como a síntese de intermediários metabólicos e de macromoléculas a partir de precursores menores para o transporte de substâncias por meio de membranas contra gradientes de concentração e para o movimento mecânico Essa doação de energia do ATP ge ralmente envolve a sua participação covalente na reação com a eventual conversão de ATP em ADP e Pi ou em algumas reações em AMP e 2 Pi Serão discutidas aqui as bases químicas para a grande variação de energia livre que acompanha a hidrólise de ATP e de outros compos tos de fosfato altamente energéticos e será mostrado que a maior parte dos casos de doação de energia por ATP envolve a transferência de grupo e não simplesmente a hidrólise de ATP Para ilustrar a gama de transduções de energia em que o ATP fornece a energia será abordada a síntese de macromoléculas ricas em informação o trans porte de solutos através das membranas e o movimento produzido pela contração muscular Nelson6edbookindb 517 Nelson6edbookindb 517 030414 0743 030414 0743 518 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A variação de energia livre para a hidrólise do ATP é grande e negativa A Figura 1311 resume as bases químicas da energia livre padrão da hidrólise de ATP relativamente grande e nega tiva A hidrólise da ligação do anidrido do ácido fosfórico fosfoanidrido terminal do ATP separa um dos três fos fatos negativamente carregados aliviando assim parte da repulsão eletrostática no ATP o Pi liberado é estabilizado pela geração de formas de ressonância que não são possí veis no ATP A variação de energia livre para hidrólise de ATP é 2305 kJmol em condições padrão mas a energia livre real da hi drólise do ATP DG em células vivas é muito diferente as concentrações celulares de ATP ADP e Pi não são idênticas e são muito mais baixas do que 10 M das condiçõespadrão Tabela 135 Além disso o Mg 21 no citosol liga ATP e ADP Figura 1312 e para a maioria das reações enzimáticas que envolve ATP como doador de grupo fosforil o verda deiro substrato é MgATP 22 O DG9 relevante é portanto aquele da hidrólise de MgATP 22 Podese calcular o DG para a hidrólise de ATP usando os dados da Tabela 135 A energia livre real para a hidrólise de ATP em condições intracelulares frequentemente é chamada de potencial de fosforilação DGp FIGURA 1311 Bases químicas para a grande variação de energia livre associada à hidrólise de ATP ➊ A separação de cargas resultante da hidrólise atenua a repulsão eletrostática entre as quatro cargas negativas do ATP ➋ O fosfato inorgânico liberado Pi é estabilizado pela formação de um híbrido de ressonância em que cada uma das quatro ligações fósforo oxigênio apresenta o mesmo grau do caráter de ligação dupla e os íons hidrogênio não se encontram permanentemente associados a nenhum dos átomos de oxigênio Certo grau de estabilização por ressonância também ocorre nos fosfatos envolvidos nas ligações éster ou anidrido mas em me nor quantidade que no Pi Um terceiro fator não mostrado que favorece a hidrólise de ATP é o maior grau de solvatação hidratação dos produtos Pi e ADP em relação ao ATP que proporciona uma estabilização adicional dos produtos em relação aos reagentes ADP321 HPO4 22 1 H1 DG98 5 2305 kJmol ATP42 1 H2O ƒ P P 2 O ƒ 2 O O O Rib Adenina O O HO ƒ 2 O O O Rib Adenina P 2OP ƒ 2 O O O H1 1 P ƒ O2 O 2OP ƒ 2 O O O ƒ P 2 O O O O Rib Adenina ATP42 ADP22 ADP32 H O H Pi 2 OP ƒ O O O OP ƒ 2 O O 32 OH Estabilização por ressonância ƒ H1 Ionização Hidrólise com alívio da repulsão entre as cargas ➊ ➋ d2 d2 d2 d2 TABELA 135 Concentrações de nucleotídeos de adenina fosfato inorgânico e fosfocreatina em algumas células Concentração mM ATP ADP AMP Pi PCr Hepatócito de rato 338 132 029 48 0 Miócito de rato 805 093 004 805 28 Neurônio de rato 259 073 006 272 47 Eritrócito humano 225 025 002 165 0 E coli 790 104 082 79 0 Para os eritrócitos as concentrações são aquelas do citosol eritrócitos humanos não possuem nú cleo e mitocôndria Nos outros tipos celulares os dados são para o conteúdo total da célula embora o citosol e a mitocôndria possuam concentrações muito diferentes de ADP PCR é fosfocreatina dis cutida na p 526 Este valor reflete a concentração total o valor real de ADP livre deve ser muito menor p 519 P Mg21 ƒ 2 P O ƒ O O O Rib Adenina P Mg21 ƒ O2 O 2OP ƒ 2 O O O P 2 O O O O Rib Adenina Á Á Á Á O 2 O 2 O ƒ MgATP22 MgADP2 FIGURA 1312 Mg 21 e ATP A formação dos comple xos com o Mg 21 isola parcialmente as cargas negativas e influencia a conformação dos grupos fosfato em nu cleotídeos como ATP e ADP Nelson6edbookindb 518 Nelson6edbookindb 518 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 519 Como as concentrações de ATP ADP e Pi diferem de um tipo de célula para a outra os valores de DGp para a hi drólise do ATP também são diferentes Além disso em uma célula específica DGp pode variar com o tempo dependen do das condições metabólicas da célula e de como elas in terferem nas concentrações de ATP ADP Pi e H 1 pH É possível calcular a variação de energia livre real para qual quer reação metabólica nas condições em que ela ocorre na célula desde que sejam conhecidas as concentrações de todos os reagentes e produtos da reação além de outros fatores como pH temperatura e Mg 21 que podem afetar a variação de energia livre real Para complicar ainda mais o assunto as concentrações totais de ATP ADP Pi e H 1 em uma célula podem ser subs tancialmente maiores que as concentrações livres que são os valores termodinamicamente relevantes A diferença se deve à ligação forte de ATP ADP e Pi a proteínas celulares Por exemplo a ADP livre no músculo em repouso tem sido alternadamente estimada entre 1 e 37 mM Utilizando o va lor de 25 mM do Problema Resolvido 132 obterseia um valor de DGp de 264 kJmol O cálculo do valor exato de DGp no entanto talvez seja menos instrutivo do que a pos sível generalização sobre as variações de energia livre real in vivo a energia liberada pela hidrólise do ATP é maior do que a variação de energia livre padrão DG9 Nas discussões seguintes será usado o valor de DG9 para a hidrólise de ATP já que esse valor permite a compa ração na mesma base com os valores energéticos de outras reações celulares No entanto sempre tenha em mente que em células vivas o DG é a quantidade relevante para a hidrólise do ATP e todas as outras reações e pode ser bem diferente do DG9 Agora é preciso fazer uma observação importante so bre os níveis de ATP É mostrado e discutido adiante como as propriedades químicas do ATP o tornam uma forma conveniente de moeda de energia nas células Con tudo não são meramente as propriedades químicas in trínsecas da molécula que dão ao ATP essa capacidade de direcionar as reações metabólicas e outros processos que requerem energia Ainda mais importante é que ao longo da evolução ocorreu uma pressão de seleção muito forte a favor de mecanismos regulatórios que mantenham as concentrações de ATP muito abaixo das concentrações de equilíbrio da reação de hidrólise Quando o nível de ATP diminui não apenas a quantidade de combustível diminui mas o combustível por si só perde seu potencial o DG da sua hidrólise ou seja seu potencial de fosforila ção DGp está diminuído Como as discussões sobre as vias metabólicas que produzem e consomem ATP mostra rão as células vivas desenvolveram mecanismos elabora dos o que frequentemente pode nos parecer à custa de eficiência e de bom senso para manter altas concentra ções de ATP PROBLEMA RESOLVIDO 132 Cálculo do DGp Calcule a energia livre real para a hidrólise de ATP DGp em eritrócitos humanos A energia livre padrão para a hidrólise do ATP é 2305 kJmol e as concentrações de ATP ADP e Pi em eritróci tos estão mostradas na Tabela 135 Assuma que o pH é 70 e a temperatura é 37C temperatura corporal O que isso revela sobre a quantidade de energia necessária para sintetizar ATP sob as mesmas condições celulares Solução As concentrações de ATP ADP e Pi em eritrócitos humanos são de 225 025 e 165 mM respectivamente A energia livre real para a hidrólise do ATP sob essas condições é dada pela re lação ver Equação 134 Substituindo os valores apropriados obtémse Note que a resposta final foi arredondada para o número correto de dígitos significativos 525 arredondado para 52 de acordo com regras de arredondamento de números que terminam em 5 para o dígito inferior mais próximo Assim a variação de energia livre real DGp para hidrólise de ATP em eritrócitos intactos 252 kJmol é muito maior do que a variação de energia livre padrão 2305 kJmol Da mesma forma a energia livre necessária para sintetizar ATP a partir de ADP e Pi sob as condições que prevalecem nos eritrócitos seria de 52 kJmol Nelson6edbookindb 519 Nelson6edbookindb 519 030414 0743 030414 0743 520 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Outros compostos fosforilados e tioésteres também apresentam energia livre de hidrólise elevada O fosfoenolpiruvato PEP Figura 1313 contém uma liga ção ésterfosfato que sofre hidrólise para gerar a forma enó lica do piruvato e esse produto direto pode tautomerizarse gerando a forma cetônica mais estável Como o reagente PEP tem apenas uma forma enol e o produto piruvato contém duas formas possíveis o produto é estabilizado em relação ao reagente Este é o fator que mais contribui para a elevada energia livre padrão de hidrólise do fosfoenolpiru vato DG9 5 2619 kJmol Outro composto de três átomos de carbono o 13bi fosfoglicerato Figura 1314 tem uma ligação anidrido entre o C1 do grupo carboxil e um ácido fosfórico A hi drólise desse acilfosfato é acompanhada por uma variação de energia livre elevada e negativa DG9 5 2493 kJmol que pode mais uma vez ser explicada nos termos da estru tura dos reagentes e produtos Quando H2O é adicionada à ligação anidrido do 13bifosfoglicerato um dos produtos diretos o ácido3fosfoglicérico pode perder um próton ge rando um íon carboxilato o 3fosfoglicerato o qual contém duas formas de ressonância igualmente prováveis Figura 1314 A remoção do produto direto ácido3fosfoglicéri co e a formação do íon estabilizado por ressonância favore cem a reação no sentido direto Na fosfocreatina Figura 1315 a ligação PN pode ser hidrolisada para gerar creatina livre e Pi A liberação de Pi e a estabilização por ressonância da creatina favore cem a reação no sentido direto A variação de energia livre padrão da hidrólise da fosfocreatina também é elevada 2430 kJmol Em todas essas reações em que ocorre a liberação de fosfato as várias formas de ressonância disponíveis para o Pi Figura 1311 estabilizam esse produto em relação ao reagente contribuindo para uma variação de energia livre Tautomerização Piruvato forma cetônica PEP32 1 H2O PEP piruvato 2 1 HPO4 22 Piruvato forma enólica C OH O 2O C CH2 C O 2O C CH3 O Hidrólise 2O P C O 2O CH2 O O C O2 H2O Pi DG98 5 2619 kJmol FIGURA 1313 Hidrólise do fosfoenolpiruva to PEP Catalisada pela piruvatocinase esta reação é seguida pela tautomerização espontânea do produto o piruvato A tautomerização não é possível no PEP e assim os produtos da hidrólise são estabilizados em relação aos reagentes Tam bém ocorre a estabilização por ressonância do Pi como mostrado na Figura 1311 Ácido 3fosfoglicérico Hidrólise CHOH CH2 O P O C O 2O OH O2 H1 H2O Pi Ionização 3Fosfoglicerato P O2 2O O2 O O CHOH CH2 O P O C O 3 1 2 2O Estabilização por ressonância CHOH CH2 O P O C O 2O O2 O O d d2 2 13Bifosfoglicerato 42 1 H2O 3fosfoglicerato32 1 HPO4 22 1 H1 DG98 5 2493 kJmol FIGURA 1314 Hidrólise do 13bi fosfoglicerato O produto direto da hidrólise do 13bifosfoglicerato é o ácido 3fosfoglicérico o qual apresenta um grupo ácido carboxílico não disso ciado Sua dissociação favorece as es truturas de ressonância que estabilizam o produto em relação aos reagentes A estabilização por ressonância do Pi re presenta uma contribuição adicional à variação de energia livre negativa COO2 Estabilização por ressonância Pi Hidrólise CH2 H2O CH3 Creatina H2N C N 1NH2 N H2N COO2 CH2 CH3 C 2O 1NH2 COO2 P CH2 N H C CH3 O N O2 Fosfocreatina H2N d1 d1 d1 creatina 1 HPO4 22 Fosfocreatina 22 1 H2O DG98 5 2430 kJmol FIGURA 1315 Hidrólise da fosfo creatina A quebra da ligação PN da fosfocreatina gera creatina a qual é estabilizada pela formação de um híbri do de ressonância O outro produto o Pi também é estabilizado por ressonância Nelson6edbookindb 520 Nelson6edbookindb 520 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 521 negativa A Tabela 136 apresenta a energia livre padrão de hidrólise para alguns compostos fosforilados de importân cia biológica Os tioésteres em que um átomo de enxofre substi tui o oxigênio na ligação éster também têm energia livre padrão de hidrólise elevada e negativa A acetilcoenzima A ou acetilCoA Figura 1316 é um dos muitos tio ésteres importantes no metabolismo O grupo acil nesses compostos é ativado por reações de transacilação con densação ou oxidaçãoredução Os tioésteres sofrem mui to menos estabilização por ressonância do que os ésteres de oxigênio consequentemente a diferença de energia livre entre o reagente e os seus produtos de hidrólise que são estabilizados por ressonância é maior para os tioés teres do que para os ésteres de oxigênio relacionados Figura 1317 Em ambos os casos a hidrólise do éster gera um ácido carboxílico que pode ionizar e assumir vá rios estados de ressonância Somados esses fatores re sultam em um DG9 de hidrólise da acetilCoA 2314 kJ mol elevado e negativo Em resumo para as reações de hidrólise com variações de energia livre padrão elevadas e negativas os produtos são mais estáveis do que os reagentes por uma ou mais das seguintes razões 1 a tensão de ligação dos reagentes devido à repulsão eletrostática é aliviada pela separação de cargas como para o ATP 2 os produtos são estabilizados por ionização como no ATP nos acilfosfatos e nos tioés TABELA 136 Valores de energia livre padrão de hidrólise de alguns compostos fosforilados e da acetilCoA um tioéster DG9 kJmol kcalmol Fosfoenolpiruvato 13bifosfoglicerato 2619 2148 13Bifosfoglicerato S3fosfoglicerato 1 Pi 2493 2118 Fosfocreatina 2430 2103 ADP S AMP 1 Pi 2328 278 ATP S ADP 1 Pi 2305 273 ATP S AMP 1 PPi 2456 2109 AMP S adenosina 1 Pi 2142 234 PPi S 2Pi 2192 240 Glicose3fosfato 2209 250 Frutose6fosfato 2159 238 Glicose6fosfato 2138 233 Glicerol3fosfato 292 222 AcetilCoA 2314 275 Fonte Dados extraídos na maior parte de Jencks W P 1976 Handbook of Biochemistry and Molecular Biology 3rd ed Fasman GD ed Physical and Chemical Data vol 1 p 296304 CRC Press Boca Raton FL O valor da energia livre para a hidrólise de PPi foi extraído de Frey PA Arabshahi A 1995 Standard freeenergy change for the hydrolysis of the abphosphoa nhydride in ATP Biochemistry 34 11 30711 310 CH3 acetato2 1 CoA C O OH Acetato AcetilCoA H2O Estabilização por ressonância CoASH Hidrólise Ionização SCoA CH3 C O CH3 C O AcetilCoA Ácido acético H1 O 1 H2O 1 H1 d2 d2 DG98 5 2314 kJmol FIGURA 1316 Hidrólise da acetilcoenzima A A acetilCoA é um tio éster com energia livre padrão de hidrólise elevada e negativa Os tioésteres contêm um átomo de enxofre na posição ocupada por um átomo de oxigê nio nos ésteres A estrutura completa da coenzima A CoA ou CoASH está representada na Figura 838 O CH3 C CH3 O C Tioéster O R OH Estabilização extra do éster do oxigênio por ressonância CH3 C O O R 1 R OH CH3 C O S SH Energia livre G Estabilização por ressonância Éster de oxigênio CH3 C O OH 1 R R DG para a hidrólise do éster de oxigênio DG para a hidrólise do tioéster d2 d1 FIGURA 1317 Energia livre de hidrólise para tioésteres e ésteres de oxigênio Os produtos de ambos os tipos de reação de hidró lise têm aproximadamente o mesmo conteúdo de energia livre G mas o tioéster tem conteúdo de energia livre maior que o éster de oxigênio A sobreposição de orbitais entre os átomos de O e C possibilita a estabilização por ressonância dos ésteres de oxigênio a sobreposição de orbitais entre os átomos de S e C é pouco expressiva e gera pouca estabilização por ressonância Nelson6edbookindb 521 Nelson6edbookindb 521 030414 0743 030414 0743 522 DAVID L NELSON MICHAEL M COX teres 3 os produtos são estabilizados por isomerização tautomerização como para o PEP eou 4 os produtos são estabilizados por ressonância como para a creatina li berada da fosfocreatina o íon carboxilato liberado do acil fosfato e dos tioésteres e o fosfato Pi liberado das liga ções anidrido ou éster O ATP fornece energia por transferência de grupos e não por simples hidrólise Ao longo deste livro você encontrará reações ou processos para os quais o ATP fornece energia A contribuição do ATP para essas reações é comumente indicada como na Figura 1318a com uma seta simples mostrando a conversão de ATP em ADP e Pi ou em alguns casos de ATP em AMP e pirofosfato PPi Quando representadas dessa forma essas reações de ATP parecem ser reações de hidrólise simples na qual a água desloca Pi ou PPi e somos tentados a dizer que a reação dependente de ATP é impulsionada pela hi drólise do ATP Entretanto este não é o caso A hidrólise de ATP por de per si geralmente realiza nada mais do que a liberação de calor que não pode impulsionar um processo químico em um sistema isotérmico As reações represen tadas por setas simples como aquela da Figura 1318a quase sempre indicam um processo em duas etapas Figu ra 1318b em que parte da molécula de ATP ou seja um grupo fosforil ou pirofosforil ou a porção adenilato AMP é primeiro transferida para uma molécula de substrato ou para um resíduo de aminoácido de uma enzima tornando se covalentemente acoplada ao substrato ou à enzima aumentando dessa forma seu conteúdo de energia livre Em seguida em uma segunda etapa a porção com fosfato transferida na primeira etapa é deslocada gerando Pi PPi ou AMP Assim o ATP participa covalentemente da reação enzimática para a qual ele fornece energia livre No entanto alguns processos envolvem a hidrólise dire ta do ATP ou GTP Por exemplo a ligação não covalente de ATP ou GTP seguida da sua hidrólise a ADP ou GDP e Pi pode fornecer a energia para promover a alternância de algumas proteínas entre duas conformações produzindo movimento mecânico Isso ocorre na contração muscular ver Figura 531 e no movimento de enzimas ao longo do DNA ver Figura 2531 ou no deslocamento dos ribosso mos ao longo do RNA mensageiro ver Figura 2731 As reações dependentes de energia catalisadas por helicases proteína RecA e algumas topoisomerases Capítulo 25 também envolvem a hidrólise direta de ligações fosfoanidri do As AAA1 ATPases envolvidas na replicação do DNA e em outros processos descritos no Capítulo 25 usam a hidró lise do ATP para ciclar proteínas associadas entre as formas ativa e inativa As proteínas ligadoras de GTP que agem em vias de sinalização hidrolisam GTP diretamente para im pulsionar mudanças conformacionais que extinguem sinais desencadeados por hormônios ou por outros fatores extra celulares Capítulo 12 Os compostos de fosfato encontrados em organismos vi vos podem ser um tanto arbitrariamente divididos em dois grupos com base em suas energias livres padrão de hidrólise Figura 1319 Os compostos de alta energia têm DG9 de hidrólise mais negativo do que 225 kJmol os compos tos de baixa energia têm DG9 menos negativo Com base nesse critério ATP com DG9 de hidrólise de 2305 kJmol 273 kcalmol é um composto de alta energia glicose6 fosfato com DG9 de hidrólise de 2138 kJmol 233 kcal mol é um composto de baixa energia O termo ligação de fosfato de alta energia por muito tempo usado pelos bioquímicos para descrever a ligação PO quebrada em reações de hidrólise é incorreto e en ganoso já que sugere erroneamente que a ligação por si mesma contém a energia De fato a quebra de todas as ligações químicas requer um fornecimento de energia A energia livre liberada pela hidrólise de compostos de fos fato não vem da quebra da ligação especificamente ela resulta dos produtos da reação com menor conteúdo de energia livre do que os reagentes Para simplificar algu mas vezes será utilizado o termo composto de fosfato de alta energia em referência ao ATP ou a outro composto de fosfato com energia livre padrão de hidrólise elevada e negativa Como as variações de energia livre das reações se quenciais são aditivas ver Seção 131 qualquer com posto fosforilado pode ser sintetizado acoplandose a reação de síntese à quebra de outro composto fosforila do com uma energia livre de hidrólise mais negativa Por exemplo como a clivagem de Pi a partir de fosfoenolpi ruvato libera mais energia do que a necessária para im pulsionar a condensação de Pi com ADP a doação direta i a Escrita como reação de uma etapa ➊ ➋ NH2 ATP ADP O NH3 NH3 O2 ATP ADP 1 P P 2O Pi Glutamato Glutamil fosfato ligado à enzima Glutamina b Reação de duas etapas 1 CH2 CH CH H3N C O 2 COO2 1 CH2 H3N 1 1 CH2 CH H3N C O CH2 COO2 C O O O2 CH CH2 COO2 FIGURA 1318 A hidrólise de ATP em duas etapas a A contribuição do ATP para uma reação frequentemente é representada como etapa única mas ela é quase sempre um processo em duas etapas b É representada aqui a reação catalisada pela enzima dependente de ATP a glutaminasinte tase ➊ Um grupo fosforil é transferido do ATP para a glutamina então ➋ o grupo fosforil é deslocado pelo NH3 e liberado como Pi Nelson6edbookindb 522 Nelson6edbookindb 522 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 523 de um grupo fosforil de PEP para ADP é termodinamica mente possível Note que enquanto a reação global está representada como a soma algébrica das duas primeiras reações na reali dade essa é uma terceira reação distinta que não envolve Pi o PEP doa um grupo fosforil diretamente ao ADP Os com postos fosforilados são dotados de alto ou baixo potencial de transferência de grupo fosforil com base em sua energia livre padrão de hidrólise como listado na Tabela 136 O potencial de transferência do grupo fosforil do PEP é muito elevado o do ATP é elevado e o da glicose6fosfato é baixo Figura 1319 Uma grande parte do catabolismo é direcionada para a síntese de compostos de fosfato de alta energia mas sua formação não é um objetivo em si eles são os meios para ativação de uma ampla variedade de compostos utilizados nas reações químicas subsequentes A transferência de um grupo fosforil a um composto agrega efetivamente energia livre a este composto de modo que ele passa a ter mais energia livre para liberála durante as transformações quí micas subsequentes Antes foi descrito como a síntese de glicose6fosfato está associada à transferência de grupo fosforil do ATP O próximo capítulo mostra como essa fos forilação da glicose ativa ou prepara a glicose para as reações catabólicas que ocorrem em praticamente todas as células vivas Devido à sua posição intermediária na escala de potencial de transferência de grupo o ATP é capaz de transferir energia dos compostos de fosfato de alta energia produzidos pelo catabolismo para compostos como a gli cose convertendoos em espécies mais reativas Assim o ATP serve como a moeda universal de energia em todas as células vivas Uma característica mais química do ATP é crucial para sua função no metabolismo embora em solução aquosa o ATP seja termodinamicamente instável sendo portanto um bom doador de grupos fosforil ele é cineticamente estável Devido à enorme energia de ativação 200 a 400 kJmol necessária para a clivagem não enzimática de sua ligação fosfoanidrido o ATP não é capaz de doar esponta neamente grupos fosforil para a água ou para as centenas de outras potenciais moléculas aceptoras na célula A trans ferência dos grupos fosforil do ATP ocorre somente quando estão presentes enzimas específicas para reduzir a energia de ativação A célula é portanto capaz de regular a dispo nibilidade de energia transportada pelo ATP por meio da regulação das várias enzimas que atuam sobre ele O ATP doa grupos fosforil pirofosforil e adenilil As reações do ATP geralmente são substituições nucleofíli cas SN2 ver Seção 132 em que o nucleófilo pode ser por exemplo o oxigênio de um álcool ou de um carboxilato ou um nitrogênio da creatina ou da cadeia lateral de arginina ou histidina Os três fosfatos do ATP são suscetíveis ao ata que nucleofílico Figura 1320 e cada posição de ataque resulta em um tipo diferente de produto O ataque nucleofílico por um álcool sobre o gfosfato Figura 1320a desloca ADP e produz um novo ésterfos fato Estudos realizados com reagentes marcados com 18O mostraram que a ligação de oxigênio no novo composto é Fosfocreatina 1 2 210 Fosfoenolpiruvato 270 13Bifosfoglicerato 260 230 250 240 220 ATP Compostos de baixa energia Compostos de alta energia 0 Pi P O CHOH C CH2 3 2 1 P P Rib Glicerol P P P Glicose 6 Adenina COO2 C CH2 P P P O O O NH2 COO CH2 N H C CH3 N FIGURA 1319 Classificação dos compostos de fosfato biológicos por energia livre padrão de hidrólise A figura apresenta os grupos fos foril representados por partindo de doadores de grupo fosforil de alta energia passando por ATP até moléculas receptoras como glicose e glice rol formando seus derivados fosfatados de baixa energia a localização de cada grupo fosforil do composto doador ao longo da escala indica apro ximadamente a DG9 de hidrólise Este fluxo de grupos fosforil catalisado pelas cinases ocorre com uma perda global de energia livre em condições intracelulares A hidrólise de compostos de fosfato de baixa energia libera Pi que apresenta um potencial de transferência de grupo fosforil ainda menor conforme definido no texto Nelson6edbookindb 523 Nelson6edbookindb 523 030414 0743 030414 0743 524 DAVID L NELSON MICHAEL M COX derivada do álcool e não do ATP o grupo transferido do ATP é consequentemente um fosforil PO3 22 e não um fosfato OPO3 22 A transferência de grupos fosforil do ATP para o glutamato Figura 1318 ou para a glicose p 219 envolve um ataque na posição g da molécula de ATP O ataque ao fosfato b do ATP desloca AMP e transfere um grupo pirofosforil não pirofosfato ao nucleófilo ata cante Figura 1320b Por exemplo a formação de 5fos foribosil1pirofosfato p 892 um intermediáriochave na síntese dos nucleotídeos é resultante do ataque de uma OH da ribose sobre um fosfato b O ataque nucleofílico na posição a do ATP desloca PPi e transfere adenilato 59AMP como um grupo adenilil Figu ra 1320c a reação é uma adenililação uma das palavras mais truncadas da linguagem bioquímica Note que a hi drólise da ligação ab fosfoanidrido libera consideravelmen te mais energia 46 kJmol do que a hidrólise da ligação bg 31 kJmol Tabela 136 Além disso o PPi formado como subproduto da adenililação é hidrolisado a dois Pi pela enzima ubíqua pirofosfatase inorgânica liberando 19 kJ mol e fornecendo portanto energia adicional de arranque para a reação de adenililação De fato as duas ligações fosfo anidrido do ATP são rompidas na reação global As reações de adenililação são portanto termodinamicamente muito favoráveis Quando a energia do ATP é utilizada para promo ver uma reação metabólica particularmente desfavorável a adenililação com frequência é o mecanismo de acoplamento de energia A ativação de ácidos graxos é um bom exemplo dessa estratégia de acoplamento de energia A primeira etapa na ativação de um ácido graxo seja para a oxidação com geração de energia ou para o uso na síntese de lipídeos mais complexos é a formação de seu éster tiol ver Figura 175 A condensação direta de um ácido graxo com a coenzima A é endergônica mas a for mação da acilCoA graxo tornase exergônica pela remoção sequencial de dois grupos fosforil do ATP Primeiramen te o adenilato AMP é transferido do ATP para o grupo carboxil do ácido graxo formando um anidrido misto acil graxoadenilato e liberando PPi O grupo tiol da coenzima A então desloca o grupo adenilil e forma um tioéster com o ácido graxo A soma dessas duas reações é energeticamen te equivalente à hidrólise exergônica do ATP em AMP e PPi DG9 5 2456 kJmol e à formação endergônica de acil CoA graxo DG9 5 2314 kJmol A formação de acilCoA graxo tornase energeticamente favorável pela hidrólise do PPi pela pirofosfatase inorgânica Assim na ativação de um ácido graxo as duas ligações fosfoanidrido do ATP são rom pidas O DG9 resultante é a soma dos valores de DG9 para a quebra dessas ligações ou seja 2456 kJmol 1 2192 kJmol ATP 1 2H2O S AMP 1 2Pi DG9º 5 2648 kJmol A ativação de aminoácidos que precede sua polimeriza ção em proteínas ver Figura 2719 é realizada por um gru po análogo de reações em que a coenzima A é substituída por uma molécula de RNA de transferência Uma utilização interessante da clivagem de ATP em AMP e PPi ocorre no vagalume que utiliza ATP como fonte de energia para a produção de lampejos de luz Quadro 131 A montagem de macromoléculas informacionais requer energia Quando precursores simples se reúnem formando polí meros de alta massa molecular com sequências definidas DNA RNA proteínas como descrito em detalhe na Par te III é necessário energia tanto para a condensação das unidades monoméricas quanto para a criação de sequên cias ordenadas Os precursores para a síntese de DNA e RNA são os nucleosídeostrifosfato e a polimerização é acompanhada pela clivagem da ligação fosfoanidrido entre os fosfatos a e b com a liberação de PPi Figura 1320 As unidades monoméricas transferidas para o polímero em crescimento nessas reações são adenilato AMP guanilato GMP citidilato CMP ou uridilato UMP para a sínte se de RNA e seus análogos desóxi com TMP no lugar de UMP para a síntese de DNA Como mencionado anterior mente a ativação dos aminoácidos para a síntese de pro FIGURA 1320 Reações de deslocamento nucleofílico do ATP Qualquer um dos três átomos de P a b ou g pode servir como o alvo eletrofílico para o ataque nucleofílico neste caso pelo nucleófilo marcado R 18O O nucleófilo pode ser um álcool ROH um grupo carboxil RCOO 2 ou um fosfoanidrido p ex um nucleosídeo mono ou difosfato a Quando o oxigênio do nucleófilo ataca a posição g a ligação de oxigênio do produto está marcada indicando que o gru po transferido do ATP é um fosforil PO3 22 e não um fosfa to OPO3 22 b O ataque na posição b desloca AMP e leva à transferência de um grupo pirofosforil não pirofosfato para o nucleófilo c O ataque na posição a desloca PPi e transfere o grupo adenilil para o nucleófilo Três posições no ATP atacáveis pelo nucleófilo R 18Ö O O P O2 Rib Adenina 2O Transferência de pirofosforil b Transferência de fosforil a Transferência de adenilil c Rib Adenina g b a R18O R18O R18O R18O R18O R18O 1 1 1 ADP AMP PPi O O P O2 O O P O2 O O2 P O2 O O P O2 O O P O2 O O2 P O2 Nelson6edbookindb 524 Nelson6edbookindb 524 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 525 teínas envolve a doação de grupos adenilil do ATP e o Ca pítulo 27 mostra que várias etapas da síntese de proteínas no ribossomo também são acompanhadas pela hidrólise de GTP Em todos esses casos a quebra exergônica de um nu cleosídeotrifosfato está acoplada ao processo endergônico de sintetizar um polímero de sequência específica O ATP fornece energia para o transporte ativo e a contração muscular O ATP é capaz de fornecer energia para transportar um íon ou uma molécula por uma membrana para outro com partimento aquoso onde sua concentração é mais elevada ver Figura 1138 Os processos de transporte são os prin cipais consumidores de energia nos rins e no cérebro hu mano por exemplo dois terços da energia consumida quan do em repouso são usados para bombear Na 1 e K 1 através da membrana plasmática por meio da Na 1K 1 ATPase O transporte de Na 1 e K 1 é movido por fosforilação e desfos forilação cíclica da proteína transportadora sendo o ATP o doador de grupo fosforil A fosforilação dependente de Na 1 da Na 1K 1ATPase induz uma alteração na conformação da proteína e a desfosforilação dependente de K 1 favorece o retorno à conformação original Cada ciclo no processo de transporte resulta na conversão de ATP em ADP e Pi sendo a variação da energia livre da hidrólise do ATP responsável pelas alterações cíclicas na conformação da proteína que re sultam no bombeamento eletrogênico de Na 1 e K 1 Note que nesse caso o ATP interage covalentemente pela transferên cia de grupo fosforil para a enzima e não para o substrato QUADRO 131 Lampejos dos vagalumes indicadores incandescentes de ATP A bioluminescência requer consideráveis quantidades de energia No vagalume o ATP é utilizado em um grupo de reações que convertem energia química em energia luminosa Em 1950 a partir de milhares de vagalumes coletados por crianças em Baltimore e arredores William McElroy e seus colaboradores da Universidade Johns Hopkins isolaram os principais componentes bioquími cos a luciferina ácido carboxílico complexo e a luci ferase enzima A geração de um lampejo de luz requer a ativação de luciferina por uma reação enzimática en volvendo a clivagem de pirofosfato do ATP para formar luciferiladenilato Figura Q1 Na presença de oxigênio molecular e luciferase a luciferina sofre descarboxilação oxidativa um processo em várias etapas formando oxi luciferina Esse processo é acompanhado pela emissão de luz A cor do lampejo de luz difere de acordo com a espécie de vagalume e parece ser determinada por di ferenças na estrutura da luciferase A luciferina é rege nerada a partir da oxiluciferina em uma série de reações subsequentes No laboratório a luciferina e a luciferase purificadas de vagalume são utilizadas para medir quantidades mui to pequenas de ATP através da intensidade de luz produ zida Quantidades tão pequenas quanto alguns picomoles 10 12 mol de ATP podem ser detectados dessa forma A técnica de pirossequenciamento de DNA é baseada em flashes de luz originários da reação da luciferina luciferase para detectar a presença de ATP após a adi ção de nucleotídeos a uma fita de DNA em crescimento Ver Figura 925 Vagalume besouro da família Lampyridae S P O O O2 N HO S C Oxiluciferina Reações de regeneração CO2 1 AMP Luciferase luz O2 AMP N H H ATP S N HO S COO2 N Adenina O Rib PPi Luciferina Adenilato de luciferil O H H H H S N HO S N O FIGURA Q1 Componentes importantes no ciclo de bioluminescência do vagalume Nelson6edbookindb 525 Nelson6edbookindb 525 030414 0743 030414 0743 526 DAVID L NELSON MICHAEL M COX No sistema contrátil das células do músculo esquelético a miosina e a actina são proteínas especializadas em trans duzir a energia química do ATP em movimento ver Figura 531 O ATP ligase fortemente mas não covalentemente a uma determinada conformação da miosina mantendo a proteína nessa conformação Quando a miosina catalisa a hidrólise do ATP ligado ADP e Pi se dissociam permitindo o relaxamento da proteína em uma segunda conformação até que outra molécula de ATP se ligue A ligação e a subse quente hidrólise do ATP pela miosinaATPase fornecem a energia que impulsiona as mudanças cíclicas na confor mação da cabeça de miosina A variação na conformação de muitas moléculas de miosina individuais resulta no desliza mento das fibras de miosina ao longo dos filamentos de ac tina ver Figura 530 o que leva à contração macroscópica da fibra muscular Como mencionado anteriormente essa produção de movimento mecânico com o gasto de ATP é um dos poucos casos em que a hidrólise de ATP por si e não a transferência de grupos do ATP é a fonte da energia química em um processo acoplado As transfosforilações entre nucleotídeos ocorrem em todos os tipos celulares Embora o ATP tenha sido focalizado como a moeda energé tica da célula e o doador de grupos fosforil todos os outros nucleosídeostrifosfato GTP UTP e CTP e todos os deso xinucleotídeostrifosfato dATP dGTP dTTP e dCTP são energeticamente equivalentes ao ATP As variações de ener gia livre padrão associadas à hidrólise de suas ligações fos foanidrida são praticamente idênticas àquelas do ATP mos tradas na Tabela 136 Na preparação para as suas diferentes funções biológicas esses outros nucleotídeos são gerados e mantidos na forma de nucleosídeostrifosfato NTP por transferência de grupo fosforil aos nucleosídeosdifosfato correspondentes NDP e nucleosídeosmonofosfato NMP O ATP é o principal composto de fosfato de alta ener gia produzido pelo catabolismo nos processos de glicólise fosforilação oxidativa e nas células fotossintéticas foto fosforilação Diversas enzimas são capazes de transportar grupos fosforil do ATP para outros nucleosídeos A nucle osídeodifosfatocinase encontrada em todas as células catalisa a reação Embora essa reação seja totalmente reversível a relação ATPADP relativamente alta nas células em geral im pulsiona a reação para a direita com a formação líquida de NTP e dNTP Na realidade a enzima catalisa a transfe rência de grupo fosforil em duas etapas constituindo um exemplo clássico de um mecanismo de deslocamento du plo pinguepongue Figura 1321 ver também Figura 613b Primeiramente a transferência de um grupo fosfo ril do ATP ao resíduo de His do sítio ativo gera um interme diário fosfoenzima a seguir o grupo fosforil é transferido do resíduo de His para um receptor NDP Como a enzima não é específica para a base do NDP e funciona igualmente bem sobre dNDP e NDP ela pode sintetizar todos os NTP e dNTP desde que sejam fornecidos os NDP corresponden tes e uma fonte de ATP A transferência de grupos fosforil do ATP resulta em um acúmulo de ADP por exemplo quando o músculo está contraindo vigorosamente ADP se acumula e interfere com a contração dependente de ATP Durante períodos de intensa demanda por ATP a célula reduz a concentração de ADP e ao mesmo tempo repõe ATP pela ação da ade nilatocinase Esta reação é totalmente reversível de modo que após o término da demanda intensa por ATP a enzima pode reci clar AMP convertendoo em ADP que pode ser então fos forilado a ATP na mitocôndria Uma enzima semelhante a guanilatocinase converte GMP em GDP com gasto de ATP Por meio de vias como essas a energia conservada na pro dução catabólica de ATP é utilizada para suprir a célula com todos os NTP e dNTP necessários A fosfocreatina PCr Figura 1315 também chamada de creatinafosfato atua como uma fonte imediata de gru pos fosforil para a síntese rápida de ATP a partir de ADP A concentração de PCr no músculo esquelético é de cerca de 30 mM quase 10 vezes a concentração de ATP e em outros tecidos como músculo liso cérebro e rins a PCr é de 5 a 10 mM A enzima creatinacinase catalisa a reação reversível Quando uma súbita demanda por energia esgota o ATP o reservatório de PCr é utilizado para a reposição de ATP a uma velocidade consideravelmente maior do que a síntese P P P Adenosina ATP P P Adenosina ADP P P P P Enz His Enz His Pingue Pongue Nucleosídeo qualquer NTP ou dNTP P P Nucleosídeo qualquer NDP ou dNDP FIGURA 1321 O mecanismo pinguepongue da nucleosídeodifosfatocinase A enzima liga seu primeiro substrato ATP em nosso exemplo e um grupo fosforil é transferido para a cadeia lateral de um resíduo de His O ADP sai e outro nucleosídeo ou desoxinucleosídeo difosfato o substitui sendo convertido ao trifosfato correspondente por transferência do grupo fosforil do resíduo fosfohistidina Nelson6edbookindb 526 Nelson6edbookindb 526 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 527 de ATP pelas vias catabólicas Quando a demanda por ener gia diminui o ATP produzido por catabolismo é utilizado para reconstituir o reservatório de PCr pela reação inversa da creatinacinase ver Quadro 232 Os organismos infe riores utilizam outras moléculas semelhantes à PCr coleti vamente chamadas de fosfágenos como reservatórios de grupos fosforil O polifosfato inorgânico é um doador potencial de grupo fosforil O polifosfato inorgânico poliP ou poliPn no qual n é o número de resíduos ortofosfatos é um polímero linear composto de dezenas ou centenas de resíduos de Pi li gados por meio de ligações fosfoanidrido Esse polímero presente em todos os organismos pode acumularse em níveis elevados em algumas células Em leveduras por exemplo a quantidade de poliP acumulada nos vacúolos representaria se distribuída uniformemente por toda cé lula uma concentração de 200 mM Compare com as con centrações de outros doadores de grupos fosforil listados na Tabela 135 Uma função potencial do poliP é atuar como fosfáge no um reservatório de grupos fosforil que pode ser usado para gerar ATP assim como a creatinafosfato é utilizada no músculo O poliP tem aproximadamente o mesmo potencial de transferência de grupo fosforil que o PPi O polifosfato mais curto PPi n 5 2 pode atuar como fonte de energia para o transporte ativo de H 1 através da membrana do vacúolo em células vegetais O PPi é o doador de grupo fosforil para pelo menos uma forma da enzima fosfofrutocinase em plantas uma função exercida por ATP em animais e micróbios p 550 A descoberta de altas concentrações de poliP em condensados vulcâni cos e em fontes de vapor sugere que ele pode ter servido como fonte de energia em tempos prebióticos e na evolu ção celular inicial Em bactérias a enzima polifosfatocinase1 PPK1 catalisa a reação reversível poliP poliP por um mecanismo envolvendo um intermediário fosfo histidina ligado à enzima lembrese do mecanismo da nu cleosídeodifosfatocinase descrito na Figura 1321 Uma segunda enzima a polifosfatocinase2 PPK2 catalisa a síntese reversível de GTP ou ATP a partir de polifosfato e GDP ou ADP poliP poliP Imaginase que a PPK2 atue principalmente no sentido da síntese de GTP e ATP e que a PPK1 atue no sentido da síntese do polifosfato PPK1 e PPK2 estão presentes em uma ampla variedade de bactérias incluindo muitas espé cies patogênicas Em bactérias os níveis elevados de poliP têm sido re lacionados com a indução da expressão de genes envolvi dos na adaptação do organismo às condições de inanição ou outras ameaças à sobrevivência Em Escherichia coli por exemplo ocorre o acúmulo de poliP quando as células estão carentes de aminoácidos ou Pi e esse acúmulo con fere uma vantagem de sobrevivência A deleção dos genes que codificam as polifosfatocinases reduz a capacidade de certas bactérias patogênicas de invadir os tecidos animais Essas enzimas podem portanto ser alvos adequados no de senvolvimento de novos antibióticos Nenhum gene de levedura codifica uma proteína se melhante à PPK todavia quatro genes não relacionados aos genes da PPK de bactérias são necessários para a síntese do polifosfato O mecanismo de síntese do polifos fato em eucariotos parece ser bem diferente daquele em bactérias RESUMO 133 Transferência de grupos fosforil e ATP c O ATP é a conexão química entre catabolismo e ana bolismo Ele é a moeda energética das células vivas A conversão exergônica de ATP em ADP e Pi ou em AMP e PPi está acoplada a muitas reações e processos en dergônicos c A hidrólise direta de ATP é a fonte de energia em al guns processos impulsionados por mudanças conforma cionais mas em geral não é a hidrólise de ATP e sim a transferência de um grupo fosforil pirofosforil ou adeni lil do ATP a um substrato ou a uma enzima que acopla a energia da quebra do ATP às transformações endergôni cas de substratos c Por meio dessas reações de transferência de grupo o ATP fornece energia para as reações anabólicas in cluindo a síntese de macromoléculas informacionais e para o transporte de moléculas e íons através das membranas contra gradientes de concentração e de potencial elétrico c Para manter seu elevado potencial de transferência de grupos a concentração de ATP deve ser mantida muito acima da concentração de equilíbrio das reações gera doras de energia do catabolismo c As células contêm outros metabólitos com energia livre de hidrólise elevada e negativa incluindo fosfoenolpi ruvato 13bifosfoglicerato e fosfocreatina Esses com postos de alta energia como o ATP possuem elevado potencial de transferência de grupos fosforil Os tioéste res também possuem elevada energia livre de hidrólise c O polifosfato inorgânico presente em todas as células pode atuar como um reservatório de grupos fosforil com elevado potencial de transferência de grupos Nelson6edbookindb 527 Nelson6edbookindb 527 030414 0743 030414 0743 528 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 134 Reações biológicas de oxidaçãoredução A transferência de grupos fosforil é uma característica cen tral do metabolismo Igualmente importante é outro tipo de transferência a de elétrons nas reações de oxidaçãoredu ção Essas reações envolvem a perda de elétrons por uma espécie química que é oxidada e o ganho de elétrons por outra espécie que é reduzida O fluxo de elétrons nas rea ções de oxidaçãoredução é responsável direta ou indire tamente por todo trabalho realizado por organismos vivos Em organismos não fotossintéticos as fontes de elétrons são os compostos reduzidos alimentos em organismos fotos sintéticos o doador de elétrons inicial é uma espécie quími ca excitada pela absorção de luz O caminho do fluxo de elé trons no metabolismo é complexo Os elétrons movemse de diferentes intermediários metabólicos para transportadores de elétrons especializados em reações catalisadas enzima ticamente Os transportadores por sua vez doam elétrons para receptores com afinidade maior por elétrons com a li beração de energia As células contêm uma grande varieda de de transdutores moleculares de energia que convertem a energia do fluxo de elétrons em trabalho útil Inicialmente será discutido como o trabalho pode ser realizado por uma força eletromotriz considerando em se guida as bases teóricas e experimentais para medir as va riações de energia em reações de oxidação em termos de força eletromotriz e a relação entre essa força expressa em volts e a variação de energia livre expressa em joules Para finalizar serão descritas as estruturas e a química da oxidaçãoredução dos transportadores especializados de elétrons mais comuns os quais você encontrará repetida mente nos capítulos seguintes O fluxo de elétrons pode realizar trabalho biológico Sempre que se usa um motor elétrico uma lâmpada ou um aquecedor elétrico ou ainda quando uma faísca promove a combustão da gasolina em um motor de automóveis usase o fluxo de elétrons para realizar trabalho No circuito que forne ce energia a um motor a fonte de elétrons pode ser uma bate ria contendo duas espécies químicas com afinidades diferen tes por elétrons Os fios elétricos proporcionam um caminho para o fluxo dos elétrons entre as espécies químicas localiza das em um polo da bateria por meio do motor até as espécies químicas localizadas no outro polo da bateria Como as duas espécies químicas diferem em suas afinidades por elétrons eles fluem espontaneamente ao longo do circuito impulsiona dos por uma força proporcional à diferença de afinidade por elétrons a força eletromotriz fem A fem geralmente al guns volts é capaz de realizar trabalho caso um transdutor de energia apropriado nesse caso um motor seja incluído no circuito O motor pode ser acoplado a uma grande variedade de equipamentos mecânicos para realizar trabalho útil As células vivas têm um circuito biológico análogo com compostos relativamente reduzidos por exemplo a gli cose como fonte de elétrons À medida que a glicose é enzi maticamente oxidada os elétrons liberados fluem de modo espontâneo por uma série de intermediários transportado res de elétrons para outras espécies químicas como o O2 Esse fluxo de elétrons é exergônico já que o O2 tem maior afinidade por elétrons do que os intermediários transpor tadores de elétrons A fem resultante fornece energia para uma grande variedade de transdutores moleculares de energia enzimas e outras proteínas que realizam trabalho biológico Na mitocôndria por exemplo enzimas ligadas à membrana acoplam o fluxo de elétrons à produção de uma diferença de pH transmembrana além de um potencial elé trico transmembrana realizando trabalho osmótico e elé trico O gradiente de prótons assim formado tem energia potencial algumas vezes chamada de força prótonmotriz em analogia à força eletromotriz Outra enzima a ATP sintetase localizada na membrana interna da mitocôndria usa a força prótonmotriz para realizar trabalho químico a síntese de ATP a partir de ADP e Pi à medida que os prótons fluem espontaneamente através da membrana Similarmen te enzimas localizadas na membrana em E coli convertem fem em força prótonmotriz que é posteriormente utiliza da para impulsionar o movimento flagelar Os princípios da eletroquímica que governam as variações de energia nos circuitos macroscópicos como um motor elétrico e uma ba teria se aplicam com a mesma validade para processos mo leculares associados ao fluxo de elétrons em células vivas As reações de oxidaçãoredução podem ser descritas como semirreações Embora a oxidação e a redução ocorram em conjunto para descrever a transferência de elétrons é conveniente consi derar as duas metades de uma reação de oxidaçãoredução separadamente Por exemplo a oxidação do íon ferro pelo íon cobre Fe 21 1 Cu 21 Fe 31 1 Cu 1 pode ser descrita nos termos de duas semirreações 1 Fe 21 Fe 31 1 e 2 2 Cu 21 1 e 2 Cu 1 A molécula doadora de elétrons em uma reação de oxida çãoredução é chamada de agente redutor ou simplesmen te redutor a molécula receptora de elétrons é o agente oxidante ou simplesmente oxidante Determinado agente como um íon ferro que existe no estado ferroso Fe 21 ou férrico Fe 31 atua como par conjugado oxidanteredutor par redox assim como um ácido e a base correspondente atuam como par conjugado ácidobase Lembrese do Capí tulo 2 que existe uma equação geral das reações acidobá sicas doador de próton H 1 1 aceptor de próton Nas reações redox existe uma equação geral similar doador de elétrons redutor e 2 1 aceptor de elétrons oxidan te Na semirreação reversível acima 1 Fe 21 é o doador de elétrons e Fe 31 é o aceptor de elétrons juntos Fe 21 e Fe 31 constituem um par conjugado redox As transferências de elétrons nas reações de oxidação redução de compostos orgânicos não são fundamental mente diferentes daquelas das espécies inorgânicas Consi dere a oxidação de um açúcar redutor um aldeído ou uma cetona pelo íon cobre Nelson6edbookindb 528 Nelson6edbookindb 528 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 529 Esta equação global pode ser expressa como duas se mirreações Como são removidos dois elétrons do carbono do aldeído a segunda metade da reação a redução por um elétron do íon cúprico a cuproso deve ser multiplicada por dois para equilibrar a equação global As oxidações biológicas frequentemente envolvem desidrogenação Nas células vivas o carbono encontrase em diferentes es tados de oxidação Figura 1322 Quando um átomo de carbono compartilha um par de elétrons com outro átomo normalmente H C S N ou O o compartilhamento é de sigual em favor do átomo mais eletronegativo A ordem crescente de eletronegatividade é H C S N O De forma muito simplificada porém útil o átomo mais eletro negativo possui os elétrons da ligação que ele comparti lha com o outro átomo Por exemplo no metano CH4 o carbono é mais eletronegativo que os quatro hidrogênios ligados a ele portanto o átomo de carbono possui os oito elétrons da ligação Figura 1322 No etano os elétrons da ligação CC são igualmente compartilhados portanto cada átomo de carbono possui apenas sete dos seus oito elétrons de ligação No etanol C1 é menos eletronegativo que o oxigênio ao qual ele está ligado e assim o átomo de O possui os dois elétrons da ligação CO deixando C1 com apenas cinco elétrons de ligação Com a perda formal de cada um dos elétrons possuídos o átomo de carbono sofre oxidação mesmo quando o oxigênio não está envol vido como na conversão de um alcano CH2CH2 em um alceno CHCH Neste caso a oxidação perda de elétrons coincide com a perda de hidrogênio Em sistemas biológicos como mencionado anteriormen te neste capítulo a oxidação muitas vezes é sinônimo de desidrogenação e muitas enzimas que catalisam reações de oxidação são desidrogenases Note que os compostos mais reduzidos na Figura 1322 superior são mais ricos em hidrogênio do que em oxigênio enquanto os compos tos mais oxidados inferior contêm mais oxigênios e me nos hidrogênios Nem todas as reações de oxidaçãoredução envolvem carbono Por exemplo na conversão de nitrogênio mole cular em amônia 6H 1 1 6e 2 1 N2 S 2NH3 os átomos de nitrogênio são reduzidos Os elétrons são transferidos de uma molécula doadora de elétrons para outra aceptora de elétrons por meio de uma das quatro vias 1 Diretamente como elétrons Por exemplo o par re dox Fe 21Fe 31 pode transferir um elétron para o par redox Cu 1Cu 21 Fe 21 1 Cu 21 Fe 31 1 Cu 1 Metano 8 H H H H C Etano alcano 7 H H H C H H H C Etanol álcool 5 H H H C H H C H O Acetileno alcino 5 H H C C Eteno alceno 6 C C H H H H Acetaldeído aldeído 3 H H H C O C H Formaldeído 4 H H C O Monóxido de carbono 2 C O Dióxido de carbono 0 O C O Ácido fórmico ácido carboxílico 2 H H C O O Ácido acético ácido carboxílico 1 H H H C C H O O Acetona cetona 2 H H H C H H C O C H FIGURA 1322 Diferentes níveis de oxidação dos compostos de car bono na biosfera Para aproximar o nível de oxidação desses compostos concentrese no átomo de carbono em vermelho e em seus elétrons de liga ção Quando este carbono estiver ligado a um átomo de H menos eletrone gativo os dois elétrons da ligação em vermelho serão cedidos ao carbono Quando o carbono estiver ligado a outro carbono os elétrons da ligação se rão igualmente compartilhados de modo que um dos dois elétrons é cedido ao carbono em vermelho Quando o carbono em vermelho estiver ligado a um átomo de O mais eletronegativo os elétrons da ligação são cedidos ao oxigênio O número à direita de cada composto é o número de elétrons per tencentes ao carbono em vermelho uma expressão aproximada do grau de oxidação de cada composto À medida que o carbono em vermelho sofre oxidação perde elétrons o número tornase menor Assim o estado de oxi dação aumenta da parte superior para a inferior da lista Nelson6edbookindb 529 Nelson6edbookindb 529 030414 0743 030414 0743 530 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 2 Como átomos de hidrogênio Lembrese que o áto mo de hidrogênio consiste em um próton H 1 e um único elétron e 2 Neste caso a equação geral é AH2 A 1 2e 2 1 2H 1 onde AH2 é o doador de hidrogênioelétron Não confunda a reação acima com a dissociação de um ácido que envolve um próton e nenhum elétron AH2 e A juntos constituem um par conjugado redox AAH2 o qual é capaz de reduzir outro composto B ou par redox BBH2 por transferência de áto mos de hidrogênio AH 2 1 B A 1 BH 2 3 Como um íon hidreto H 2 o qual contém dois elétrons Isso ocorre no caso de desidrogenases li gadas à NAD descritas posteriormente 4 Pela combinação direta com oxigênio Neste caso o oxigênio combina com um redutor orgânico e é covalentemente incorporado no produto como na oxidação de um hidrocarboneto em um álcool RCH3 1 O2 RCH2OH O hidrocarboneto é o doador de elétrons e o átomo de oxigênio é o aceptor de elétrons Todos os quatro tipos de transferência de elétrons ocor rem nas células O termo equivalente redutor é comu mente usado para designar um único equivalente eletrôni co que participa de uma reação de oxidaçãoredução não importando se este equivalente é um elétron em si parte de um átomo de hidrogênio ou mesmo um íon hidreto ou ainda se a transferência do elétron ocorre em uma rea ção com oxigênio gerando um produto oxigenado Como as moléculas combustíveis biológicas geralmente sofrem desidrogenação enzimática perdendo dois equivalentes redutores de cada vez e já que cada átomo de oxigênio é capaz de receber dois equivalentes redutores os bioquí micos por convenção referemse à unidade de oxidação biológica como dois equivalentes redutores que passam do substrato para o oxigênio Os potenciais de redução medem a afinidade por elétrons Quando dois pares conjugados redox estão juntos em so lução a transferência de elétrons do par doador para o par aceptor pode ocorrer espontaneamente A tendência para que a reação ocorra depende da afinidade relativa do acep tor de elétrons de cada par redox pelos elétrons O poten cial de redução padrão E a medida em volts dessa afinidade pode ser determinado em um experimento como o descrito na Figura 1323 Os eletroquímicos escolheram como um padrão de referência a semirreação H 1 1 e 2 H2 Ao eletrodo em que essa semirreação ocorre chamado semicélula é atribuído arbitrariamente um potencial de redução padrão E 5 000 V Quando esse eletrodo de hi drogênio está conectado por meio de um circuito exter no a outra semicélula em que as espécies oxidadas e suas espécies reduzidas correspondentes estão presentes em concentraçõespadrão 25C cada soluto a 1 M e cada gás a 1013 kPa os elétrons tendem a fluir pelo circuito ex terno partindo da semicélula de menor valor de E para a semicélula de maior valor de E Por convenção a uma semicélula que retira elétrons de uma célula padrão de hi drogênio é designado um valor positivo de E e àquela que doa elétrons para a célula de hidrogênio um valor negati vo Quando duas semicélulas estão conectadas aquela com maior valor de E mais positiva será reduzida ela tem o maior potencial de redução O potencial de redução de uma semicélula não depen de apenas das espécies químicas presentes mas também de suas atividades estimadas por suas concentrações Há aproximadamente um século Walther Nernst derivou uma equação que relaciona o potencial de redução pa drão E ao potencial de redução real E em qualquer Ponte salina solução de KCl Aparelho para medir a fem Célula de referência com fem conhecida o eletrodo de hidrogênio com H2 gasoso a pressão de 1013 kPa está em equilíbrio com o eletrodo contendo H11 M Célula de teste contendo concentrações de 1 M das espécies oxidadas e reduzidas do par redox a ser examinado H2 gás pressão padrão 1 2 FIGURA 1323 Medida do potencial de redução padrão E9 de um par redox Os elétrons fluem do eletrodo de teste para o eletrodo de refe rência ou viceversa A semicélula de referência é o eletrodo de hidrogênio como representado aqui a pH zero A força eletromotriz fem deste eletrodo é designada 000 V Em pH 70 25C na célula de teste o E9 do eletrodo de hidrogênio é 20414 V O sentido do fluxo dos elétrons depende da pressão relativa dos elétrons ou do potencial das duas células Uma ponte salina con tendo uma solução de KCl saturada fornece um caminho para o movimento dos íons entre a célula de teste e a célula de referência A partir da fem ob servada e a fem conhecida da célula de referência o aparelho é capaz de medir a fem da célula de teste contendo o par redox A célula que recebe os elétrons tem por convenção o potencial de redução mais positivo Nelson6edbookindb 530 Nelson6edbookindb 530 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 531 concentração das espécies oxidadas e reduzidas em uma célula viva elétron aceptor elétron doador 135 onde R e T têm seus significados usuais n é o número de elétrons transferidos por molécula e é a constante de Faraday Tabela 131 A 298 K 25C essa expressão reduzse a elétron aceptor elétron doador 136 CONVENÇÃOCHAVE Muitas semirreações de interesse dos bio químicos envolvem prótons Como na definição de DG9 os bioquímicos definem o estadopadrão para as reações de oxidaçãoredução como pH 7 e expressam como poten cial de redução padrão transformado E9 o potencial de redução padrão a pH 7 e 25C Por convenção o DE9 para qualquer reação redox é dado pelo valor de E9 do aceptor de elétrons menos o valor de E9 do doador de elétrons Os potenciais de redução padrão apresentados na Tabe la 137 e utilizados ao longo deste livro são valores de E9 sendo assim válidos apenas para sistemas em pH neutro Cada valor representa a diferença de potencial quando o par conjugado redox em concentrações de 1 M 25C e pH 7 está conectado com o eletrodopadrão de hidrogênio pH 0 Note na Tabela 137 que quando o par conjugado 2H 1 H2 em pH 7 está conectado com o eletrodopadrão de hidro gênio pH 0 os elétrons tendem a fluir partindo da célula com pH 7 para a célulapadrão pH 0 o valor de E9 para o par 2H 1H2 é 20414 V Os potenciais de redução padrão podem ser usados para calcular a variação de energia livre Por que os potenciais de redução são tão úteis para os bioquí micos Quando os valores de E são determinados para duas semicélulas quaisquer em relação ao eletrodopadrão de hi drogênio também são conhecidos os potenciais de redução de uma semicélula em relação à outra Assim é possível pre dizer o sentido em que os elétrons tenderão a fluir quando as duas semicélulas estão conectadas por um circuito externo ou quando os componentes das duas semicélulas estão pre sentes na mesma solução Os elétrons tendem a fluir para a célula com o valor de E mais positivo e a intensidade dessa tendência é proporcional à diferença no potencial de redu ção DE A energia que se torna disponível por esse fluxo de elétrons espontâneo a variação de energia livre DG para a reação de oxidaçãoredução é proporcional ao DE DG 5 2n DE ou DG9 5 2n DE9 137 onde n é o número de elétrons transferidos na reação Essa equação permite calcular a variação de energia livre real para qualquer reação de oxidaçãoredução a partir dos va lores de E9 apresentados em uma tabela de potenciais de redução Tabela 137 e das concentrações das espécies envolvidas na reação TABELA 137 Potenciais de redução padrão de algumas semirreações de importância biológica Semirreação E9V ½O2 1 2H 1 1 2e 2 H2O 0816 Fe 31 1 e 2 Fe 21 0771 NO3 2 1 2H 1 1 2e 2 NO2 2 1 H2O 0421 Citocromo ƒ Fe 31 1 e 2 citocromo ƒ Fe 21 0365 Fe CN6 32 ferricianeto 1 e 2 Fe CN6 42 036 Citocromo a3 Fe 31 1 e 2 citocromo a3 Fe 21 035 O2 1 2H 1 1 2e 2 H2O2 0295 Citocromo a Fe 31 1 e 2 citocromo a Fe 21 029 Citocromo c Fe 31 1 e 2 citocromo c Fe 21 0254 Citocromo c1 Fe 31 1 e 2 citocromo c1 Fe 21 022 Citocromo b Fe 31 1 e 2 citocromo b Fe 21 0077 Ubiquinona 1 2H 1 1 2e 2 ubiquinol 1 H2 0045 Fumarato 22 1 2H 1 1 2e 2 succinato 22 0031 2H 1 1 2e 2 H2 em condições padrão pH 0 0000 CrotonilCoA 1 2H 1 1 2e 2 butirilCoA 20015 Oxaloacetato 22 1 2H 1 1 2e 2 malato 22 20166 Piruvato 2 1 2H 1 1 2e 2 lactato 2 20185 Acetaldeído 1 2H 1 1 2e 2 etanol 20197 FAD1 2H 1 1 2e 2 FADH2 20219 Glutationa 1 2H 1 1 2e 2 2 glutationas reduzidas 2023 S 1 2H 1 1 2e 2 H2S 20243 Ácido lipoico 1 2H 1 1 2e 2 ácido dihidrolipoico 2029 NAD 1 1 2H 1 1 2e 2 NADH 20320 NADP 1 1 H 1 1 2e 2 NADPH 20324 Acetoacetato 1 2H 1 1 2e 2 bhidroxibutirato 20346 acetoglutarato 1 CO 2 1 2H 1 1 2e 2 isocitrato 2038 2H 1 1 2e 2 H2 em pH 7 20414 Ferredoxina Fe 31 1 e 2 ferredoxina Fe 21 20432 Fonte Dados extraídos na maior parte de Loach R A 1976 Handbook of Biochemistry and Molecular Biology 3rd ed Fasman GD ed Physical and Chemical Data vol 1 p 122130 CRC Press Boca Raton FL Este é o valor para FAD livre FAD ligado a uma flavoproteína específica p ex succinatodesidrogenase possui um E9 diferente que depende do ambiente em que a proteína está Nelson6edbookindb 531 Nelson6edbookindb 531 030414 0743 030414 0743 532 DAVID L NELSON MICHAEL M COX PROBLEMA RESOLVIDO 133 Cálculo de DG9 e DG de uma reação redox Calcule a variação de energia livre padrão DG9 para a rea ção em que o acetaldeído é reduzido pelo transportador de elétron biológico NADH Acetaldeído 1 NADH 1 H 1 etanol 1 NAD 1 Em seguida calcule a variação de energia livre real DG quando a acetaldeído e a NADH forem de 1 M e a etanol e a NAD 1 forem de 01 M As semirreações relevantes e seus valores de E9 são 1 Acetaldeído 1 2H 1 1 2e 2 etanol E9º 5 20197 V 2 NAD 1 1 2H 1 1 2e 2 NADH 1 H 1 E9º 5 20320 V Lembrese que por convenção DE9 é o valor de E9 do aceptor de elétrons menos o E9 do doador de elétrons Solução Como o acetaldeído é o aceptor dos elétrons n 5 2 vindos do NADH DE9 5 20197 V 2 20320 V 5 0123 V Portanto DG9º 5 2n DE9º 5 22965 kJV mol0123 V 5 2237 kJmol Esta é a variação de energia livre para a reação de oxidação redução a 25C e pH 7 quando acetaldeído etanol NAD 1 e NADH estão presentes em concentrações de 10 M Para calcular o DG quando a acetaldeído e a NADH forem de 1 M e a etanol e a NAD 1 forem de 01 M utili zamse a Equação 134 e a variação de energia livre padrão calculada acima acetaldeído Esta é a variação de energia livre real dos pares redox nas concentrações especificadas A oxidação celular da glicose em dióxido de carbono requer transportadores de elétrons especializados Os princípios da energética da oxidaçãoredução descritos anteriormente aplicamse às muitas reações metabólicas que envolvem a transferência de elétrons Por exemplo em muitos organismos a oxidação da glicose fornece energia para a síntese de ATP A oxidação completa da glicose C6H12O6 1 6O2 6CO2 1 6H2O apresenta um DG9 de 22840 kJmol Esse valor indica uma liberação de energia livre muito maior do que a ne cessária para a síntese de ATP nas células 50 a 60 kJmol ver Problema Resolvido 132 As células não convertem glicose em CO2 em uma única reação com elevada liberação de energia mas sim por meio de uma série de reações con troladas sendo que algumas delas são oxidações A energia livre liberada nessas etapas de oxidação é da mesma ordem de magnitude que a necessária para a síntese de ATP a par tir de ADP com alguma energia extra Os elétrons removi dos nessas etapas de oxidação são transferidos para coenzi mas especializadas em transportar elétrons como NAD 1 e FAD descritos a seguir Alguns tipos de coenzimas e proteínas servem como transportadores universais de elétrons O grande número de enzimas que catalisam as oxida ções celulares direciona os elétrons das suas centenas de substratos diferentes para apenas alguns poucos tipos de transportadores de elétrons universais A redução desses transportadores em processos catabólicos resulta na con versão de energia livre liberada pela oxidação do substrato NAD NADP FMN e FAD são coenzimas solúveis em água que sofrem oxidações e reduções reversíveis em muitas das reações de transferência de elétrons do metabolismo Os nucleotídeos NAD e NADP movemse facilmente de uma enzima para outra os nucleotídeos de flavina FMN e FAD em geral são fortemente ligados às enzimas chamadas de flavoproteínas para as quais eles servem de grupos pros téticos As quinonas lipossolúveis como a ubiquinona e a plastoquinona atuam como transportadores de elétrons e doadores de prótons no meio não aquoso das membranas As proteínas ferroenxofre e citocromos as quais têm gru pos prostéticos fortemente ligados e que sofrem oxidação e redução reversíveis também atuam como transportadores de elétrons em muitas reações de oxidaçãoredução Algu mas dessas proteínas são hidrossolúveis enquanto outras são periféricas ou integrais de membrana ver Figura 117 Arremata este capítulo uma descrição de algumas ca racterísticas químicas das coenzimas nucleotídicas e de al gumas das enzimas desidrogenases e flavoproteínas que as utilizam A química de oxidaçãoredução das quinonas das proteínas ferroenxofre e dos citocromos será discutida no Capítulo 19 NADH e NADPH atuam com as desidrogenases como transportadores solúveis de elétrons O dinucleotídeo de nicotinamidaadenina NAD de nicoti namide adenine dinucleotide NAD 1 na sua forma oxida da e seu análogo dinucleotídeo de nicotinamidaadenina fosfato NADP de nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NADP 1 quando oxidado são constituídos de dois nucleotídeos cujos grupos fosfato são unidos por uma ligação fosfoanidrido Figura 1324a Como o anel de nicotinamida lembra a piridina algumas vezes esses com postos são chamados de nucleotídeos de piridina A vitamina niacina é a fonte da porção nicotinamida dessas moléculas As duas coenzimas sofrem redução reversível do anel de nicotinamida Figura 1324 Enquanto uma molécula do substrato sofre oxidação desidrogenação liberando Nelson6edbookindb 532 Nelson6edbookindb 532 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 533 dois átomos de hidrogênio a forma oxidada do nucleotídeo NAD 1 ou NADP 1 recebe um íon hidreto H 2 o equiva lente a um próton e dois elétrons e é reduzida a NADH ou NADPH O segundo próton retirado do substrato é li berado para o solvente aquoso As semirreações para esses cofatores nucleotídicos são NAD 1 1 2e 2 1 2H 1 NADH 1 H 1 NADP 1 1 2e 2 1 2H1 NADPH 1 H 1 A redução de NAD 1 ou NADP 1 converte o anel benzenoi de da porção nicotinamida com uma carga positiva fixa no nitrogênio do anel na forma quinoide nitrogênio sem carga Os nucleotídeos reduzidos absorvem luz a 340 nm mas as formas oxidadas não Figura 1324b essa diferença na absorção é utilizada pelos bioquímicos para analisar rea ções envolvendo essas coenzimas Note que o sinal positivo nas abreviações NAD 1 e NADP 1 não indica a carga líquida dessas moléculas na realidade ambas são negativamente carregadas mas sim que o anel de nicotinamida está em sua forma oxidada com uma carga positiva no átomo de nitrogênio Nas abreviações NADH e NADPH o H indica o íon hidreto adicionado Para referirse a esses nucleotídeos sem especificar seu estado de oxidação utilizamse NAD e NADP A concentração total de NAD 1 e NADH na maioria dos tecidos é de cerca de 10 5 M a de NADP 1 1 NADPH é em torno de 10 6 M Em muitas células e tecidos a relação en tre NAD 1 oxidado e NADH reduzido é elevada favore cendo a transferência do íon hidreto de um substrato para o NAD 1 formando NADH Por outro lado NADPH geral mente está presente em maior concentração que NADP 1 favorecendo a transferência do íon hidreto do NADPH para um substrato Isso reflete as funções metabólicas especializadas das duas coenzimas NAD 1 geralmente atua em oxidações como parte de uma reação catabó lica NADPH é a coenzima comum em reduções quase sempre como parte de uma reação anabólica Algumas en zimas são capazes de utilizar ambas as coenzimas mas a maioria demonstra uma forte preferência por uma em rela ção à outra Além disso os processos nos quais esses dois cofatores atuam são segregados em células eucarióticas por exemplo a oxidação de combustíveis como piruvato ácidos graxos e acetoácidos derivados dos aminoácidos ocorre na matriz mitocondrial enquanto os processos biossintéticos redutores como a síntese de ácidos graxos ocorrem no citosol Essa especialização funcional e de lo calização permite que a célula mantenha dois grupos dis tintos de transportadores de elétrons com duas funções também distintas São conhecidas mais de 200 enzimas que catalisam rea ções em que NAD 1 ou NADP 1 recebem um íon hidreto de um substrato reduzido ou reações em que NADPH ou NADH doam um íon hidreto a um substrato oxidado As reações gerais são AH2 1 NAD 1 A 1 NADH 1 H 1 A 1 NADPH 1 H1 AH2 1 NADP 1 H 2H1 H H1 C A 1 N NH2 H N C NH2 B O H C A NH2 N B O H B H H H O R R Oxidado NAD 1 Reduzido NADH CH2 P OP OH H O H H OH NH2 P O O2 O O O P O CH2 OH H H H H OH O O2 O Lado B N b N N H N ou NADH reduzido 1 No NADP 1 este grupo hidroxil é esterificado com fosfato 2e2 Absorbância NAD1 Lado A oxidado 10 Comprimento de onda nm 00 220 240 260 280 300 320 340 360 380 a 06 04 02 08 Adenina FIGURA 1324 NAD e NADP a O dinucleotídeo de nicotinamida adenina NAD 1 e seu análogo fosforilado NADP 1 sofrem redução a NADH e NADPH recebendo um íon hidreto dois elétrons e um próton de um substrato oxidável O íon hidreto é adicionado tanto à porção anterior lado A quando à porção posterior lado B do anel planar da nicotinamida ver Tabela 138 b Espectro de absorção no UV de NAD 1 e NADH A redução do anel de nicotinamida gera uma banda de absorção ampla com máximo em 340 nm A produção de NADH durante uma reação enzimática pode ser convenientemente monitorada observandose o aparecimento da banda de absorção em 340 nm coeficiente de extinção molar 340 5 6200 M 21cm 21 Nelson6edbookindb 533 Nelson6edbookindb 533 030414 0743 030414 0743 534 DAVID L NELSON MICHAEL M COX nas quais AH2 é o substrato reduzido e A é o substrato oxi dado A nomenclatura geral para as enzimas desse tipo é oxidorredutase também comumente chamadas de desi drogenases Por exemplo a álcooldesidrogenase catalisa a primeira etapa do catabolismo do etanol em que o etanol é oxidado a acetaldeído Note que um dos átomos de carbono do etanol perdeu um hidrogênio o composto foi oxidado de álcool a aldeído ve rifique novamente na Figura 1322 os estados de oxidação do carbono Quando NAD 1 ou NADP 1 estiver reduzido em princí pio o íon hidreto poderia ser transferido para qualquer um dos lados do anel de nicotinamida para a parte da frente lado A ou para a parte de trás lado B como represen tado na Figura 1324a Estudos com substratos marcados isotopicamente demonstraram que uma dada enzima pode catalisar transferências do tipo A ou do tipo B mas nunca ambas Por exemplo a álcooldesidrogenase de leveduras e a lactatodesidrogenase de coração de vertebrados transfe rem um íon hidreto para o ou removem um íon hidreto do lado A do anel de nicotinamida elas são classificadas como desidrogenases do tipo A para distinguilas de outro grupo de enzimas que transferem um íon hidreto para o ou remo vem um íon hidreto do lado B do anel de nicotinamida Ta bela 138 A especificidade por um lado ou por outro pode ser muito expressiva por exemplo a lactatodesidrogenase prefere o lado A por um fator de 5 3 10 7 Os princípios para essa preferência têm como base a posição exata dos grupos enzimáticos envolvidos na ligação de hidrogênio com o gru po CONH2 da nicotinamida A maioria das desidrogenases que utilizam NAD ou NADP liga o cofator em um domínio proteico conservado chamado de estrutura de Rossmann de Michael Rossmann que deduziu a estrutura da lactatodesidrogenase e foi o pri meiro a descrever esse motivo estrutural A estrutura de Rossmann consiste geralmente em uma folha b com seis fi tas paralelas e quatro hélices a associadas Figura 1325 A associação entre a desidrogenase e NAD ou NADP é relativamente fraca a coenzima difundese facilmente de uma enzima para a outra atuando como transportador hi drossolúvel de elétrons de um metabólito para outro Por a b Estrutura de Rossmann 2 Estrutura de Rossmann 1 NAD FIGURA 1325 A estrutura de Rossmann Este motivo estrutural é en contrado no sítio de ligação a NAD de muitas desidrogenases a Consiste em um par de motivos estruturalmente semelhantes apenas um deles está mostrado aqui cada um contendo três folhas b paralelas e duas hélices a babab b Domínio de ligação ao nucleotídeo da enzima lactato desidrogenase derivado do PDB ID 3LDH com NAD estrutura em esferae bastão ligado em uma conformação estendida por ligações de hidrogênio e pontes salinas aos motivos babab pareados da estrutura de Rossmann sombras em vermelho e azul TABELA 138 Estereoespecificidade das desidrogenases que utilizam NAD 1 ou NADP 1 como coenzimas Enzima Coenzima Especificidade estereoquímica para o anel de nicotinamida A e B Página do texto Isocitratodesidrogenase NAD 1 A 643 aCetoglutaratodesidrogenase NAD 1 B 644 Glicose6fosfatodesidrogenase NADP 1 B 577 Malatodesidrogenase NAD 1 A 647 Glutamatodesidrogenase NAD 1 ou NADP 1 B 702 Gliceraldeído3fosfatodesidrogenase NAD 1 B 553 Lactatodesidrogenase NAD 1 A 563 Álcooldesidrogenase NAD 1 A 565 Nelson6edbookindb 534 Nelson6edbookindb 534 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 535 exemplo na produção de álcool durante a fermentação da glicose pelas células de leveduras um íon hidreto é remo vido do gliceraldeído3fosfato por uma enzima a gliceral deído3fosfatodesidrogenase uma enzima tipo B e trans ferido para NAD 1 O NADH produzido deixa a superfície da enzima e difundese para outra enzima a álcooldesidro genase uma enzima tipo A que transfere um íon hidreto para o acetaldeído produzindo etanol Gliceraldeído3fosfato Gliceraldeído3fosfato fosfoglicerato fosfoglicerato etanol Acetaldeído etanol acetaldeído Soma Note que na reação global não existe produção ou consumo líquido de NAD 1 ou NADH as coenzimas atuam catalitica mente e são repetidamente recicladas sem variação líquida na concentração de NAD 1 1 NADH A deficiência de niacina na dieta a forma vitamínica de NAD e NADP causa pelagra Como mencionado no Capítulo 6 e ainda a ser esmiu çado nos capítulos seguintes a maioria das coenzimas é derivada de substâncias chamadas de vitaminas Os anéis semelhantes à piridina de NAD e NADP são derivados da vitamina niacina ácido nicotínico Figura 1326 sinteti zada a partir do triptofano Os humanos geralmente são in capazes de sintetizar quantidades suficientes de niacina em especial as pessoas com dieta pobre em triptofano p ex o milho tem baixo conteúdo de triptofano A deficiên cia de niacina que afeta todas as desidrogenases depen dentes de NADP causa uma patologia humana grave cha mada de pelagra pele áspera em italiano e uma doença relacionada em caninos chamada de língua negra Essa patologia é caracterizada pelos três D dermatite diarreia e demência em muitos casos seguidas de morte Há um século a pelagra era uma doença comum entre humanos no sul dos Estados Unidos onde o milho era a base da dieta aproximadamente 100000 pes soas foram afetadas e em torno de 10000 morreram em razão dessa doença entre 1912 e 1916 Em 1920 Joseph Goldber ger demonstrou que a pelagra é causada por uma deficiência na dieta e em 1937 Frank Strong D Wayne Woolley e Conrad Elvehjem identificaram a niaci na como o agente curativo para a língua negra A suplementação da dieta humana com esse pro duto de baixo custo erradicou a pelagra nas populações do mun do desenvolvido com uma ex ceção significativa as pessoas que sofrem de alcoolismo ou as que ingerem quantidades signi ficativas de álcool Nesses indi víduos a absorção intestinal de niacina é muito reduzida e as necessidades calóricas com fre quência são supridas pelo álcool contido nas bebidas destiladas praticamente destituídas de vi taminas inclusive niacina Em algumas partes do mundo in cluindo o Deccan Plateau na Ín dia a pelagra ainda ocorre na população em geral especial mente entre pessoas que vivem na pobreza Os nucleotídeos de flavina são fortemente ligados às flavoproteínas As flavoproteínas Tabela 13 9 são enzimas que catalisam reações de oxidaçãoredução utilizando como coenzima tanto os mononucleotídeos de flavina FMN de flavin mononucleotides quanto os di nucleotídeos de flavinaadenina FAD de flavin adenine dinucleotides Figura 1327 Essas coenzimas os nu cleotídeos de flavina são derivadas da vitamina ribo flavina A estrutura de anéis fusionados dos nucleotídeos de flavina anel de isoaloxazina sofre redução reversível recebendo um ou dois elétrons na forma de um ou dois átomos de hidrogênio cada átomo um elétron mais um próton de um substrato reduzido As formas totalmen te reduzidas são abreviadas FADH2 e FMNH2 Quando um nucleotídeo de flavina totalmente oxidado recebe apenas um elétron um átomo de hidrogênio é produzida a for ma semiquinona do anel de isoaloxazina abreviado como FADH e FMNH Como os nucleotídeos de flavina possuem características químicas ligeiramente diferentes daquelas das coenzimas nicotinamidas a capacidade de participar O O2 N C O N NH2 1NH3 CH3 CH2 CH COO2 C N N N H Niacina ácido nicotínico Nicotina Nicotinamida Triptofano FIGURA 1326 Niacina ácido nicotínico e seu derivado nicotinami da O precursor biossintético desses compostos é o triptofano No labora tório o ácido nicotínico foi produzido pela primeira vez por oxidação do produto natural a nicotina daí seu nome Tanto o ácido nicotínico quanto a nicotinamida são capazes de curar a pelagra mas a nicotina do cigarro ou de outras fontes não tem atividade curativa Frank Strong 19081993 D Wayne Woolley 19141966 Conrad Elvehjem 19011962 Nelson6edbookindb 535 Nelson6edbookindb 535 030414 0743 030414 0743 536 DAVID L NELSON MICHAEL M COX na transferência de um ou dois elétrons as flavoproteínas estão envolvidas em uma diversidade maior de reações do que as desidrogenases ligadas a NADP Assim como as coenzimas nicotinamidas Figura 1324 a redução dos nucleotídeos de flavina é acompanhada por uma mudança da sua principal banda de absorção de luz mais uma vez útil aos bioquímicos que desejam monitorar reações envolvendo essas coenzimas As flavoproteínas completamente reduzidas que receberam dois elétrons geralmente possuem um máximo de absorção em 360 nm Quando parcialmente reduzidas um elétron elas apresen tam outro máximo de absorção em cerca de 450 nm quan do totalmente oxidadas a flavina tem um máximo em 370 nm e 440 nm Na maioria das flavoproteínas o nucleotídeo de flavina encontrase fortemente ligado à proteína e em algumas enzimas como na succinatodesidrogenase ele está liga do covalentemente Essas coenzimas fortemente ligadas são apropriadamente chamadas de grupos prostéticos Elas não transferem elétrons por difusão de uma enzima para a outra em vez disso elas fornecem um meio pelo qual as flavoproteínas podem reter os elétrons tempora riamente enquanto catalisam a transferência do elétron de um substrato reduzido para um aceptor de elétrons Uma característica importante das flavoproteínas é a variabilidade do potencial de redução padrão E9 do nucleotídeo de flavina ligado A forte associação entre a enzima e o grupo prostético confere ao anel de flavina um potencial de redução típico da flavoproteína em par ticular algumas vezes bastante diferente do potencial de redução do nucleotídeo de flavina livre O FAD ligado à succinatodesidrogenase por exemplo tem um valor de E9 próximo de 00 V comparado com 20219 V para o FAD livre o valor de E9 para outras flavoproteínas varia de 2040 V a 1006 V As flavoproteínas frequentemen te são muito complexas algumas possuem além de um nucleotídeo de flavina íons inorgânicos fortemente liga dos p ex ferro ou molibdênio capazes de participar da transferência de elétrons Certas flavoproteínas têm funções bastante diferentes como receptores de luz Os criptocromos família de fla voproteínas amplamente distribuídas nos filos eucarióticos são responsáveis por mediar os efeitos da luz azul sobre o desenvolvimento das plantas e nos mamíferos os efeitos da luz sobre o ritmo circadiano oscilações fisiológicas e bio TABELA 139 Algumas enzimas flavoproteínas que utilizam coenzimas de nucleotídeos de flavina Enzima Nucleotídeo de flavina Página do texto AcilCoAdesidrogenase FAD 673 Dihidrolipoildesidrogenase FAD 637 Succinatodesidrogenase FAD 646 Glicerol3fosfatodesidrogenase FAD 759 Tiorredoxinaredutase FAD 917 NADHdesidrogenase Complexo I FMN 738739 Glicolatooxidase FMN 813 OH N H H OH R H NH HCOH N O O N HCOH HCOH P O O O P O O H N N N O NH N N N O R NH N N N O H O H H FAD FMN 1 2O 2O Dinucleotídeo de flavinaadenina FAD e mononucleotídeo de flavina FMN CH2 NH2 CH2 CH2 CH3 CH3 Anel de isoaloxazina H1 e2 H11 e2 CH3 CH3 N 1 O 2 FADH FMNH semiquinona CH3 CH3 FADH2 FMNH2 completamente reduzido FIGURA 1327 Formas oxidadas e reduzidas de FAD e FMN O FMN é a estrutura que está acima da linha pontilhada na estrutura do FAD forma oxidada Os nucleotídeos de flavina recebem dois átomos de hidrogênio dois elétrons e dois prótons ambos aparecem no sistema de anel da flavi na Quando o FAD ou o FMN recebe apenas um átomo de hidrogênio forma se a semiquinona um radical livre estável Nelson6edbookindb 536 Nelson6edbookindb 536 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 537 químicas em um período de 24 horas Os criptocromos são homólogos de outra família de flavoproteínas as fotoliases Encontradas em bactérias e em eucariotos as fotoliases utilizam a energia absorvida da luz para reparar defeitos químicos no DNA No Capítulo 19 serão estudadas as funções das flavo proteínas como transportadoras de elétrons bem como suas funções na fosforilação oxidativa em cloroplastos As reações da fotoliase serão descritas no Capítulo 25 RESUMO 134 Reações biológicas de oxidaçãoredução c Em muitos organismos o processo central de conserva ção de energia é a oxidação gradual da glicose em CO2 de forma que parte da energia de oxidação é conservada no ATP à medida que os elétrons passam para o O2 c As reações biológicas de oxidaçãoredução podem ser descritas em termos de duas semirreações cada uma com um potencial de redução padrão E9 característico c Quando duas semicélulas eletroquímicas estão conecta das cada uma contendo os componentes de uma semir reação os elétrons tendem a fluir para a semicélula com o maior potencial de redução A força dessa tendência é proporcional à diferença entre os dois potenciais de redução DE sendo uma função das concentrações das espécies oxidadas e reduzidas c A variação de energia livre padrão para uma reação de oxidaçãoredução é diretamente proporcional à diferen ça dos potenciais de redução padrão das duas semicélu las DG9 5 2n DE9 c Muitas reações biológicas de oxidação são desidroge nações em que um ou dois átomos de hidrogênio H 1 1 e 2 são transferidos de um substrato para um aceptor de hidrogênio Reações de oxidaçãoredução em célu las vivas envolvem transportadores especializados de elétrons c NAD e NADP são as coenzimas livremente difusíveis de muitas desidrogenases Tanto NAD 1 quanto NADP 1 aceitam dois elétrons e um próton c FAD e FMN os nucleotídeos de flavina atuam como grupos prostéticos fortemente ligados às flavoproteínas Eles são capazes de aceitar um ou dois elétrons e um ou dois prótons As flavoproteínas também servem como receptores de luz em criptocromos e fotoliases Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário autotrófico 501 heterotrófico 501 metabolismo 502 vias metabólicas 502 metabólito 502 metabolismo intermediário 502 catabolismo 502 anabolismo 502 constantespadrão aparentes 507 clivagem homolítica 512 radical 512 clivagem heterolítica 512 nucleófilo 512 eletrófilo 512 carbânion 512 carbocátion 512 condensação aldólica 513 condensação de Claisen 513 cinases 516 potencial de fosforilação DGp 518 tioéster 521 adenilação 524 pirofosfatase inorgânica 524 nucleosídeodifosfato cinase 526 adenilatocinase 526 creatinacinase 526 fosfágenos 527 polifosfatocinase1 cinase2 527 força eletromotriz fem 528 par conjugado redox 528 desidrogenação 529 desidrogenases 529 equivalente redutor 530 potencial de redução padrão E9 530 nucleotídeo de piridina 532 oxidorredutase 534 flavoproteína 535 nucleotídeos de flavina 535 criptocromo 536 fotoliase 537 Leituras adicionais Bioenergética e termodinâmica Atkins PW 1984 The Second Law Scientific American Books Inc New York Discussão bem ilustrada e elementar da segunda lei e suas implicações Atkinson DE 1977 Cellular Energy Metabolism and Its Regulation Academic Press Inc New York Clássico tratamento do papel de ATP ADP e AMP no controle da taxa do metabolismo Bergethon PR 1998 The Physical Basis of Biochemistry Springer Verlag New York Os capítulos 11 ao 13 deste livro e os livros de Tinoco e colaboradores e van Holde e colaboradores listados na sequência são excelentes referências gerais sobre bioquímica física com boas discussões das aplicações da termodinâmica em bioquímica Edsall JT Gutfreund H 1983 Biothermodynamics The Study of Biochemical Processes at Equilibrium John Wiley Sons Inc New York Hammes G 2000 Thermodynamics and Kinetics for the Biological Sciences John Wiley Sons Inc New York Claramente escrita bem ilustrada com exemplos e problemas excelentes Harold FM 1986 The Vital Force A Study of Bioenergetics W H Freeman and Company New York Bela e clara discussão sobre a termodinâmica em processos biológicos Harris DA 1995 Bioenergetics at a Glance Blackwell Science Oxford Haynie DT Biological Thermodynamics Cambridge University Press Cambridge Loewenstein WR The Touchstone of Life Molecular Information Cell Communication and the Foundations of Life Oxford University Press New York Discussão primorosamente escrita sobre relação entre a entropia e a informação Nicholls DG Ferguson SJ 2002 Bioenergetics 3 Academic Press Inc New York Discussão clara bem ilustrada de nível intermediário sobre a teoria da bioenergética e os mecanismos das transduções de energia Tinoco I Jr Sauer K Wang JC Puglisi JD 2002 Physical Chemistry Principles and Applications in Biological Sciences 4th ed PrenticeHall Inc Upper Saddle River NJ Os capítulos 2 ao 5 envolvem termodinâmica Nelson6edbookindb 537 Nelson6edbookindb 537 030414 0743 030414 0743 538 DAVID L NELSON MICHAEL M COX van Holde KE Johnson C Ho PS 2006 Principles of Physical Biochemistry 2nd ed PrenticeHall Inc Upper Saddle River NJ Os capítulos 2 e 3 são especialmente relevantes Lógica química e reações bioquímicas comuns Frey PA 2001 Radical mechanisms of enzymatic catalysis Annu Rev Biochem 70 121148 Uma pesquisa muito útil sobre as reações que ocorrem via radical livre Frey PA Hegeman AD 2006 Enzymatic Reaction Mechanisms Oxford University Press New York Uma fonte oficial e atualizada sobre as reações que ocorrem em sistemas vivos Gutteridge A Thornton JM 2005 Understanding natures catalytic toolkit Trends Biochem Sci 11 622629 Kraut DA Carroll KS Herschlag D 2003 Challenges in enzyme mechanism and energetics Annu Rev Biochem 72 517571 Um bom resumo sobre os princípios da catálise enzimática tal como atualmente entendida e o que ainda não é compreendido Transferência de grupos fosforil e ATP Alberty RA 1994 Biochemical thermodynamics Biochim Biophys Acta 1207 111 Explica a diferença entre as equações bioquímicas e químicas além do cálculo e do significado das propriedades termodinâmicas transformadas para o ATP e outros campostos fosforilados Bridger WA Henderson JF 1983 Cell ATP John Wiley Sons Inc New York A química do ATP seu papel na regulação do metabolismo e suas funções catabólicas e anabólicas Brown MRW Kornberg A 2004 Inorganic polyphosphate in the origin and survival of species Proc Natl Acad Sci USA 101 1608516087 Fraley CD Rashid MH Lee SSK Gottschalk R Harrison J Wood PJ Brown MRW Kornberg A 2007 A polyphosphate kinase 1 ppk1 mutant of Pseudomonas aeruginosa exhibits multiple ultrastructural and functional defects Proc Natl Acad Sci USA 104 35263531 Frey PA Arabshahi A 1995 Standard freeenergy change for the hydrolysis of the abphosphoanhydride bridge in ATP Biochemistry 34 1130711310 Hanson RW 1989 The role of ATP in metabolism Biochem Educ 17 8692 Resumo excelente da química e da biologia do ATP Kalckar HM 1991 Fifty years of biological research from oxidative phosphorylation to energy requiring transport regulation Annu Rev Biochem 60 137 Uma discussão em nível intermediário sobre a história dos estudos do ATP em que o autor era o personagem principal Kornberg A 1999 Inorganic polyphosphate a molecule of many functions Annu Rev Biochem 68 89125 Lipmann F 1941 Metabolic generation and utilization of phosphate bond energy Adv Enzymol 11 99162 Clássica discussão sobre o papel dos compostos de fosfato de alta energia na biologia Pullman B Pullman A 1960 Electronic structure of energy rich phosphates Radiat Res Suppl 2 160181 Discussão avançada sobre a química do ATP e outros compostos ricos em energia Rees DC Howard JB 1999 Structural bioenergetics and energy transduction mechanisms J Mol Biol 293 343350 Discussão sobre as bases estruturais para o acoplamento eficiente de dois processos energéticos através de mudanças em estados conformacionais Veech RL Lawson JWR Cornell NW Krebs HA 1979 Cytosolic phosphorylation potential J Biol Chem 254 65386547 Determinação experimental das concentrações de ATP de ADP e de Pi no cérebro no músculo e no fígado e também uma discussão sobre as dificuldades em determinar a real variação de energia para a síntese de ATP nas células Westheimer FH 1987 Why nature chose phosphates Science 235 11731178 Uma descrição química sobre a adequação química única dos ésteres de fosfato e dos anidridos nas reações metabólicas Reações biológicas de oxidaçãoredução Cashmore AR Jarillo JA Wu YJ Liu D 1999 Cryptochromes blue light receptors for plants and animals Science 284 760765 Dolphin D Avramovic O Poulson R eds 1987 Pyridine Nucleotide Coenzymes Chemical Biochemical and Medical Aspects John Wiley Sons Inc New York Excelente coleção com dois volumes de revisões oficiais Entre as mais úteis estão os capítulos do Kaplan Westheimer Veech e Ohno e Ushio Fraaije MW Mattevi A 2000 Flavoenzymes diverse catalysts with recurrent features Trends Biochem Sci 25 126132 Hosler JP FergusonMiller S Mills DS 2006 Energy transduction proton transfer through the respiratory complexes Annu Rev Biochem 75 165187 Massey V 1994 Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins J Biol Chem 269 2245922462 Breve revisão sobre a química das interações entre flavina oxigênio em flavoproteínas Rees DC 2002 Great metalloclusters in enzymology Annu Rev Biochem 71 221246 Uma revisão avançada sobre os tipos de aglomerados de íons metálicos encontrados em enzimas e seus modos de ação Roehm KH 2001 Electron carriers proteins and cofactors in oxidative phosphorylation In Encyclopedia of Life Sciences John Wiley Sons IncWiley InterScience wwwelsnet Uma boa visão global sobre as diferentes classes de transportadores de elétrons que participam da respiração Williams RE Bruce NC 2002 New uses for an old en zymethe old yellow enzyme family of flavoenzymes Microbiology 148 16071614 Problemas 1 Variações na entropia durante o desenvolvimento do ovo Considere um sistema consistindo em um ovo em uma incubadora A clara e a gema do ovo contêm proteínas carboidratos e lipídeos Se fertilizado o ovo é transformado de uma única célula em um organismo complexo Discuta esse processo irreversível em termos da variação de entropia do sis tema do meio e do universo Não esqueça de definir primeiro claramente o sistema e o meio 2 Cálculo do DG9 de uma constante de equilíbrio Cal cule a variação de energia livre padrão para cada uma das se Nelson6edbookindb 538 Nelson6edbookindb 538 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 539 guintes reações enzimáticas metabolicamente importantes utilizando as constantes de equilíbrio dadas para as reações a 25C e pH 70 3 Cálculo da constante de equilíbrio a partir do DG9 Calcule a constante de equilíbrio K9eq para cada uma das rea ções seguintes a pH 70 e 25C usando os valores de DG9 na Tabela 134 4 Determinação experimental de K9eq e DG9 Se uma so lução de glicose1fosfato de 01 M a 25C é incubada com uma quantidade catalítica de fosfoglicomutase a glicose1fosfato é transformada em glicose6fosfato No equilíbrio as concentra ções dos componentes da reação são Calcule K9eq e DG9 para essa reação 5 Determinação experimental de DG9 para a hidrólise de ATP Uma medida direta da variação da energia livre pa drão associada com a hidrólise de ATP é tecnicamente difícil já que é complicado medir com precisão a quantidade mínima de ATP remanescente no equilíbrio No entanto o valor de DG9 pode ser calculado indiretamente a partir das constantes de equilíbrio de duas outras reações enzimáticas com constantes de equilíbrio menos favoráveis Glicose6fosfato 1 H2O glicose 1 Pi K9eq 5 270 ATP 1 glicose ADP 1 glicose6fosfato K9eq 5 890 Usando essa informação para as constantes de equilíbrio deter minadas a 25C calcule a energia livre padrão para a hidrólise de ATP 6 Diferença entre DG9 e DG Considere a seguinte inter conversão que ocorre na glicólise Capítulo 14 Frutose6fostato glicose6fosfato K9eq 5 197 a Qual é o DG9 para a reação K9eq medido a 25C b Se a concentração de frutose6fosfato é ajustada para 15 M e a da glicose6fosfato é ajustada para 05 M qual é o DG c Por que DG9 e DG são diferentes 7 Energia livre de hidrólise do CTP Compare a estrutu ra do nucleosídeo trifosfato CTP com a estrutura do ATP Trifosfato de adenosina ATP OH N H H OH H O O P O O 2 H N N N O O P O 2 O O P O 2 2O CH2 NH2 Trifosfato de citidina CTP O OH H H OH H O O P O O 2 H NH N O O P O 2 O O P O 2 2O CH2 NH2 Agora prediga os valores de K9eq e DG9 para a seguinte reação ATP 1 CDP ADP 1 CTP 8 Dependência de DG em relação ao pH A energia livre liberada pela hidrólise do ATP em condiçõespadrão é 2305 kJmol Se ATP é hidrolisado em condiçõespadrão porém em pH 50 a energia livre liberada é maior ou menor Explique Use o gráfico interativo para explorar essa relação 9 O DG9 para reações acopladas Glicose1fosfato é con vertida em frutose6fosfato em duas reações sucessivas Glicose1fosfato glicose6fosfato Glicose6fosfato frutose6fosfato Usando os valores de DG9 da Tabela 134 calcule a constante de equilíbrio K9eq para a soma das duas reações Glicose1fosfato S frutose6fosfato 10 Efeito da relação ATPADP sobre a energia livre de hidrólise do ATP Utilizando a Equação 134 construa o gráfico DG contra ln Q razão da ação das massas a 25C para as concentrações de ATP ADP e Pi dadas na tabela abaixo DG9 para a reação é 2305 kJmol Use o resultado do gráfico para explicar por que o metabolismo é regulado para manter alta a razão ATPADP Concentração mM ATP 5 3 1 02 5 ADP 02 22 42 50 25 Pi 10 121 141 149 10 11 Estratégia para superar reações desfavoráveis aco plamento químico dependente de ATP A fosforilação da gli cose a glicose6fosfato é a etapa inicial no catabolismo da glico se A fosforilação direta da glicose por Pi é descrita pela equação Glicose 1 Pi glicose6fosfato 1 H2O DG9 5 138 kJmol Nelson6edbookindb 539 Nelson6edbookindb 539 030414 0743 030414 0743 540 DAVID L NELSON MICHAEL M COX a Calcule a constante de equilíbrio para a reação a 37C No hepatócito de rato as concentrações fisiológicas de glicose e Pi são mantidas a 48 mM aproximadamente Qual é a con centração de equilíbrio de glicose6fosfato obtida pela fosfori lação direta da glicose por Pi Esta reação representa um passo metabólico aceitável para o catabolismo da glicose Explique b Em princípio pelo menos uma forma de aumentar a concentração de glicose6fosfato é direcionar o equilíbrio da reação para a direita elevando as concentrações intracelula res de glicose e Pi Assumindo uma concentração fixa de Pi em 48 mM quão elevada teria que ser a concentração de glicose intracelular para gerar uma concentração de equilíbrio de gli cose6fosfato de 250 mM a concentração fisiológica normal Esse caminho seria fisiologicamente aceitável dado que a solu bilidade máxima da glicose é menor que 1 M c A fosforilação da glicose na célula está acoplada à hi drólise de ATP isto é parte da energia livre da hidrólise de ATP é usada para fosforilar a glicose Calcule K9eq a 37C para a reação global Para a fosforilação da glicose dependente de ATP qual é a concentração de gli cose necessária para atingir uma concentração intracelular de 250 mM de glicose6fosfato quando as concentrações de ATP e ADP são de 338 mM e 132 mM respectivamente Esse pro cesso de acoplamento produz uma rota adequada pelo menos em princípio para a fosforilação da glicose na célula Explique d Embora o acoplamento da hidrólise de ATP à fosforila ção de glicose faça sentido termodinamicamente ainda não foi especificado como esse acoplamento ocorre Dado que o aco plamento requer um intermediário comum uma rota possível é o uso da hidrólise do ATP para elevar a concentração intrace lular de Pi e assim impulsionar a fosforilação desfavorável da glicose por Pi Essa rota é viável Pense sobre a solubilidade dos intermediários metabólicos e A fosforilação da glicose acoplada ao ATP é catalisa da em hepatócitos pela enzima glicocinase Essa enzima liga ATP e glicose formando um complexo glicoseATPenzima e o grupo fosforil é transferido diretamente do ATP para a glicose Explique as vantagens dessa rota 12 Cálculos de DG9 para as reações acopladas ao ATP A partir dos dados na Tabela 136 calcule o valor de DG9 para as seguintes reações a Fosfocreatina 1 ADP creatina 1 ATP b ATP 1 frutose ADP 1 frutose6fosfato 13 Acoplamento da hidrólise de ATP a uma reação desfavorável Para explorar as consequências do acoplamen to da hidrólise de ATP a uma reação bioquímica termodinami camente desfavorável em condições fisiológicas considere a transformação hipotética X S Y em que DG9 5 200 kJmol a Qual é a razão YX no equilíbrio b Suponha que X e Y participem de uma sequência de rea ções durante a hidrólise de ATP em ADP e Pi A reação global é X 1 ATP 1 H2O Y 1 ADP 1 Pi Calcule a relação YX para essa reação no equilíbrio Assuma que a temperatura é de 25C e as concentrações no equilíbrio de ATP ADP e Pi são de 1 M c Sabese que ATP ADP e Pi não são 1 M em condi ções fisiológicas Calcule YX para a reação acoplada ao ATP quando os valores de ATP ADP e Pi são aqueles encontra dos nos miócitos de ratos Tabela 135 14 Cálculos de DG em concentrações fisiológicas Cal cule o DG real fisiológico para a reação Fosfocreatina 1 ADP creatina 1 ATP a 37C como ocorre no citosol dos neurônios com 47 mM de fosfocreatina 10 mM de creatina 073 mM de ADP e 26 mM de ATP 15 Energia livre necessária para a síntese de ATP em condições fisiológicas No citosol de hepatócitos de ratos a temperatura é de 37C e a razão da ação das massas Q é Calcule a energia livre necessária para a síntese de ATP em um hepatócito de rato 16 Lógica química Na via glicolítica um açúcar de seis carbonos frutose16bifosfato é clivado para formar dois açúcares de três carbonos que sofrem metabolismo adicional ver Figura 146 Nesta via ocorre isomerização da glicose6 fosfato a frutose6fosfato mostrada abaixo dois passos an tes da reação de clivagem o passo seguinte é a fosforilação de frutose6fosfato a frutose16bifosfato p 549 O H H C C O C C C H H HO O H H O H H 22 CH2OPO3 H C C O H H C H C C O HO O H H O H H 22 CH2OPO3 Glicose6fosfato Frutose6fosfato Fosfoexose isomerase O que a isomerização faz a partir de uma perspectiva bioquí mica Dica considere o que poderia acontecer se a ligação de clivagem CC procedesse sem a isomerização 17 Mecanismos de reação enzimática I A lactato desidrogenase é uma das muitas enzimas que necessitam de NADH como coenzima Ela catalisa a conversão de piruvato em lactato NADH 1 H 1 NAD 1 H C HO C O 2 O C O O 2 C O lactato desidrogenase CH3 CH3 Piruvato LLactato Represente o mecanismo dessa reação mostre setas da trajetória dos elétrons Dica esta é uma reação comum por todo o metabolismo o mecanismo é semelhante àquele ca talisado por outras desidrogenases que usam NADH como a álcooldesidrogenase Nelson6edbookindb 540 Nelson6edbookindb 540 030414 0743 030414 0743 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 541 18 Mecanismos de reação enzimática II As reações bioquímicas frequentemente parecem mais complicadas do que elas realmente são Na via das pentosesfosfato Capítulo 14 sedoeptulose7fosfato e gliceraldeído3fosfato reagem formando eritrose4fosfato e frutose6fosfato em uma reação catalisada pela transaldolase 1 Gliceraldeído3 fosfato Eritrose4 fosfato Frutose 6fosfato Transaldolase O C 1 H C CH2OPO3 22 H OH C H OH C CH2OPO3 22 H OH C CH2OPO3 22 H OH C O H C H OH C HO H Sedoeptulose7 fosfato C H OH C H OH C CH2OPO3 22 H OH C HO H CH2OH C O CH2OH C O Represente um mecanismo para essa reação mostre setas da trajetória dos elétrons Dica olhe mais uma vez as condensa ções aldólicas e então considere o nome dessa enzima 19 A utilização diária de ATP por humanos adultos a Um total de 305 kJmol de energia livre é necessário para sintetizar ATP a partir de ADP e Pi quando os reagentes e produtos estão a concentrações de 1 M e a temperatura é de 25C estadopadrão Como as concentrações fisiológicas reais de ATP ADP e Pi não são de 1 M e a temperatura é de 37C a energia livre necessária para sintetizar ATP em con dições fisiológicas é diferente do DG9 Calcule a energia livre necessária para sintetizar ATP no hepatócito humano quando as concentrações fisiológicas de ATP ADP e Pi são de 35 15 e 50 mM respectivamente b Um adulto de 68 kg requer uma ingesta calórica de 2000 kcal 8360 kJ de alimento por dia 24 horas O alimen to é metabolizado e a energia livre é utilizada para sintetizar ATP que por sua vez fornece energia para o trabalho quími co e mecânico diário do corpo Assumindo que a eficiência de conversão da energia do alimento em ATP é de 50 calcule a massa de ATP usada por um humano adulto em 24 horas Qual a porcentagem da massa corporal que esse valor representa c Embora indivíduos adultos sintetizem uma grande quantidade de ATP diariamente sua massa corporal estrutu ra e composição não varia significativamente durante esse pe ríodo Explique essa aparente contradição 20 Taxas de reciclagem dos fosfatos g e b do ATP Se uma quantidade pequena de ATP marcado com fósforo radiati vo na posição terminal g 32PATP for adicionada a um extrato de levedura cerca de metade da radioatividade do 32P é encon trada no Pi em poucos minutos mas a concentração de ATP permanece inalterada Explique Se o mesmo experimento é realizado utilizando ATP marcado com 32P na posição central b 32PATP o 32P não aparece em Pi em tão curto período de tempo Por quê 21 A clivagem de ATP em AMP e PPi durante o meta bolismo A síntese da forma ativada do acetato acetilCoA é realizada em um processo dependente de ATP Acetato 1 CoA 1 ATP acetilCoA 1 AMP 1 PPi a O DG9 para a hidrólise de acetilCoA em acetato e CoA é 2322 kJmol e o para a hidrólise de ATP em AMP e PPi é 2305 kJmol Calcule o DG9 para a síntese dependente de ATP de acetilCoA b Quase todas as células contêm a enzima pirofosfata se inorgânica que catalisa a hidrólise de PPi em Pi Qual o efeito da presença dessa enzima na síntese de acetilCoA Explique 22 Energia para o bombeamento de H 1 As células pa rietais que recobrem o estômago contêm bombas na mem brana que transportam íons hidrogênio do citosol pH 70 para o estômago contribuindo para acidificar o suco gástrico pH 10 Calcule a energia livre necessária para transportar 1 mol de íons hidrogênio por essas bombas Dica consultar Capítulo 11 Assuma uma temperatura de 37C 23 Potenciais de redução padrão O potencial de redu ção padrão E9 de qualquer par redox é definido para a reação da semicélula agente oxidante 1 n elétrons agente redutor Os valores de E9 para os pares conjugados redox NAD 1NADH e piruvatolactato são 2032 V e 2019 V respectivamente a Qual par redox apresenta a maior tendência em perder elétrons Explique b Qual é o agente oxidante mais forte Explique c Iniciando com reagentes e produtos em concentrações iguais a 1 M em pH 70 e a 25C em qual sentido a reação se guinte ocorrerá Piruvato 1 NADH 1 H 1 lactato 1 NAD 1 d Qual é a variação de energia livre padrão DG9 para a conversão de piruvato em lactato e Qual a constante de equilíbrio K9eq para essa reação 24 Extensão da energia da cadeia respiratória A transferência de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial pode ser representada pela equação da reação global a Calcule DE9 para a reação global da transferência de elétrons mitocondrial Use os valores de E9 da Tabela 137 b Calcule DG9 para essa reação c Quantas moléculas de ATP podem teoricamente ser geradas por essa reação se a energia livre para a síntese de ATP nas condições celulares é de 52 kJmol 25 Dependência da força eletromotriz sobre as con centrações Calcule a força eletromotriz em volts regis trada por um eletrodo imerso em uma solução contendo as seguintes misturas de NAD 1 e NADH em pH 70 e 25C com relação à semicélula de E9 00 V a 10 mM NAD 1 e 10 mM NADH Nelson6edbookindb 541 Nelson6edbookindb 541 030414 0743 030414 0743 542 DAVID L NELSON MICHAEL M COX b 10 mM NAD 1 e 10 mM NADH c 10 mM NAD 1 e 10 mM NADH 26 A afinidade por elétrons dos compostos Relacione as seguintes substâncias em ordem crescente de tendência em receber elétrons a acetoglutarato 1 CO2 gerando isocitra to b oxaloacetato c O2 d NADP 1 27 Sentido das reações de oxidaçãoredução Qual das reações a seguir você esperaria que ocorresse no sentido re presentado em condiçõespadrão na presença das enzimas apropriadas a Malato 1 NAD 1 oxaloacetato 1 NADH 1 H 1 b Acetoacetato 1 NADH 1 H 1 bhidroxibutirato 1 NAD 1 c Piruvato 1 NADH 1 H 1 lactato 1 NAD 1 d Piruvato 1 bhidroxibutirato actato 1 acetoacetato e Malato 1 piruvato oxaloacetato 1 lactato f Acetaldeído 1 succinato etanol 1 fumarato Problema de análise de dados 28 A termodinâmica pode ser complicada A termodi nâmica é uma área de estudo desafiadora e com muitas opor tunidades para confusão Um exemplo interessante é encon trado em um artigo dos pesquisadores Robinson Hampson Munro e Vaney publicado no periódico Science em 1993 Ro binson e colaboradores estudaram o movimento de pequenas moléculas entre células vizinhas do sistema nervoso por meio de canais entre as células junções tipo fenda Eles demons traram que o corante amarelo Lucifer pequena molécula car regada negativamente e a biocitina pequena molécula zwit teriônica movemse em apenas um sentido entre dois tipos particulares de células da glia célula não neuronal do sistema nervoso O corante injetado em astrócitos passaria rapida mente para astrócitos oligodendrócitos ou células de Müller adjacentes mas o corante injetado em oligodendrócitos ou em células de Müller passaria lentamente se passasse para os astrócitos Todos esses tipos celulares estão conectados por junções tipo fenda Embora este não tenha sido o ponto central do artigo os autores apresentaram um modelo molecular de como esse transporte em sentido único deve ocorrer como demonstrado em sua Figura 3 Astrócito Astrócito Oligodendrócito Oligodendrócito A B Lêse na legenda da figura Modelo de difusão do coran te em sentido único entre oligodendrócitos e astrócitos aco plados com base nas diferenças de diâmetro dos poros de conexão Como um peixe em uma armadilha as moléculas de corante círculos pretos passam de um astrócito para um oli godendrócito A mas não são capazes de voltar no sentido oposto B Embora esse artigo tenha passado pela revisão de uma re vista científica muito respeitada foram enviadas várias cartas ao editor 1994 mostrando que o modelo de Robinson e cola boradores violara a segunda lei da termodinâmica a Explique como o modelo viola a segunda lei Dica con sidere o que aconteceria com a entropia do sistema com con centrações iniciais iguais de corante nos astrócitos e oligoden drócitos conectados pelas junções tipo fenda semelhantes à armadilha de peixe b Explique por que esse modelo não funciona para molé culas pequenas embora permita apanhar peixes c Explique por que uma armadilha de peixe funciona para peixes d Forneça dois mecanismos plausíveis para o transporte em sentido único das moléculas de corante entre as células que não violem a segunda lei da termodinâmica Referências Letters to the editor 1994 Science 265 10171019 Robinson SR Hampson ECGM Munro MN Vaney DI 1993 Unidirectional coupling of gap junctions between neuroglia Science 262 10721074 Nelson6edbookindb 542 Nelson6edbookindb 542 030414 0743 030414 0743 141 Glicólise 544 142 Vias alimentadoras da glicólise 558 143 Destinos do piruvato em condições anaeróbias fermentação 563 144 Gliconeogênese 568 145 Oxidação da glicose pela via das pentosesfosfato 575 A glicose ocupa posição central no metabolismo de plan tas animais e muitos microrganismos Ela é relativa mente rica em energia potencial e por isso é um bom combustível a oxidação completa da glicose a dióxido de carbono e água ocorre com uma variação da energia livre padrão de 22840 kJmol Por meio do armazenamento da glicose na forma de polímero de alta massa molecular como o amido e o glicogênio a célula pode estocar grandes quan tidades de unidades de hexose enquanto mantém a osmo laridade citosólica relativamente baixa Quando a demanda de energia aumenta a glicose pode ser liberada desses po límeros de armazenamento intracelulares e utilizada para produzir ATP de maneira aeróbia ou anaeróbia A glicose além de excelente combustível também é um precursor admiravelmente versátil capaz de suprir uma enorme variedade de intermediários metabólicos em reações biossintéticas Uma bactéria como a Escherichia coli pode obter a partir da glicose os esqueletos carbôni cos para cada aminoácido nucleotídeo coenzima ácido graxo ou outro intermediário metabólico necessário para o seu crescimento Um estudo abrangente dos destinos metabólicos da glicose compreenderia centenas ou milha res de transformações químicas Em animais e em vegetais vasculares a glicose tem quatro destinos principais ela pode ser usada na síntese de polissacarídeos complexos direcionados ao espaço extracelular ser armazenada nas células como polissacarídeo ou como sacarose ser oxi dada a compostos de três átomos de carbonos piruvato por meio da glicólise para fornecer ATP e intermediários metabólicos ou ser oxidada pela via das pentosesfosfato fosfogliconato produzindo ribose5fosfato para a síntese de ácidos nucleicos e NADPH para processos biossintéti cos redutores Figura 141 Os organismos sem acesso à glicose de outras fontes devem sintetizála Os organismos fotossintéticos sinteti zam glicose inicialmente por redução do CO2 atmosférico a trioses e em seguida por conversão das trioses em glicose As células não fotossintéticas produzem glicose a partir de precursores simples com três ou quatro átomos de carbono pelo processo de gliconeogênese que reverte a glicólise em uma via que utiliza muitas enzimas glicolíticas Este capítulo descreve as reações individuais da glicó lise da gliconeogênese e da via das pentosesfosfato e o significado funcional de cada via Descreve também os vá rios destinos metabólicos do piruvato produzido na glicóli se Entre eles estão incluídas as fermentações utilizadas por muitos organismos em nichos anaeróbios para produzir ATP e industrialmente exploradas como fontes de etanol ácido láctico e outros produtos úteis comercialmente Além disso o capítulo aborda as vias que disponibilizam vários açúcares mono di e polissacarídeos para a via glicolítica A 14 Glicólise Gliconeogênese e a Via das PentosesFosfato Ribose5fosfato Piruvato Glicogênio amido sacarose Matriz extracelular e polissacarídeos da parede celular Oxidação pela via da pentosefosfato Oxidação por glicólise Glicose Armazenamento Síntese de polímeros estruturais FIGURA 141 As principais vias de utilização da glicose Embora não sejam os únicos destinos possíveis da glicose essas quatro vias são as mais significativas em termos de quantidade de glicose que flui através delas na maioria das células Nelson6ed14indd 543 Nelson6ed14indd 543 020514 1722 020514 1722 544 DAVID L NELSON MICHAEL M COX discussão sobre o metabolismo da glicose continua no Capí tulo 15 onde os processos de síntese e degradação de car boidratos são utilizados para ilustrar os diversos mecanis mos pelos quais os organismos regulam as vias metabólicas As vias biossintéticas que utilizam a glicose para produção dos polissacarídeos da matriz extracelular da parede celu lar e dos polissacarídeos de armazenamento são discutidas no Capítulo 20 141 Glicólise Na glicólise do grego glykys doce ou açúcar e lysis quebra uma molécula de glicose é degradada em uma série de reações catalisadas por enzimas gerando duas moléculas do composto de três átomos de carbono o pi ruvato Durante as reações sequenciais da glicólise parte da energia livre da glicose é conservada na forma de ATP e NADH A glicólise foi a primeira via metabólica a ser eluci dada e provavelmente seja a mais bem entendida Desde a descoberta da fermentação em 1897 por Eduard Buchner em extratos de células de levedura até a elucidação da via completa em leveduras por Otto Warburg e Hans von EulerChelpin e em músculo por Gustav Embden e Otto Meyerhof na década de 1930 as reações da glicólise em extratos de leveduras e de músculo foram o objetivo prin cipal da pesquisa bioquímica A mudança filosófica que acompanhou essas descobertas foi anunciada por Jacques Loeb em 1906 Por meio da descoberta de Buchner a biologia foi li bertada de outro fragmento de misticismo A cisão do açúcar em CO2 e álcool não é mais o efeito de um prin cípio vital mas sim a quebra do açúcar da cana pela invertase A história desse problema é instrutiva pois serve de alerta quanto a considerar problemas como além do nosso alcance porque ainda não tiveram uma solução O desenvolvimento de métodos de purificação de en zimas a descoberta e o reconhecimento da importância de coenzimas como o NAD e a descoberta do crucial pa pel metabólico do ATP e de outros compostos fosforilados resultaram dos estudos da glicólise Enzimas glicolíticas de muitas espécies foram purificadas e minuciosamente estudadas A glicólise é uma via central quase universal do cata bolismo da glicose a via com o maior fluxo de carbono na maioria das células A quebra glicolítica da glicose é a úni ca fonte de energia metabólica em alguns tecidos e células de mamíferos p ex eritrócitos medula renal cérebro e esperma Alguns tecidos vegetais modificados para o ar mazenamento de amido como os tubérculos da batata e algumas plantas aquáticas p ex agrião derivam a maior parte de sua energia da glicólise muitos microrganismos anaeróbios são totalmente dependentes da glicólise Fermentação é um termo geral para a degradação anaeróbia da glicose ou de outros nutrientes orgânicos para obtenção de energia conservada como ATP Como os organismos vivos surgiram inicialmente em uma atmosfera sem oxigênio a quebra anaeróbia da glicose provavelmen te seja o mais antigo mecanismo biológico de obtenção de energia a partir de moléculas orgânicas combustíveis O sequenciamento do genoma de vários organismos revelou que algumas arquibactérias e alguns microrganismos para sitas são deficientes em uma ou mais enzimas da glicólise mas possuem as enzimas essenciais da via provavelmente realizem formas variantes de glicólise No curso da evolu ção a sequência dessas reações químicas foi completamen te conservada as enzimas glicolíticas dos vertebrados são estreitamente similares na sequência de aminoácidos e na estrutura tridimensional às suas homólogas em levedura e no espinafre A glicólise difere entre as espécies apenas nos detalhes de sua regulação e no destino metabólico subse quente do piruvato formado Os princípios termodinâmicos e os tipos de mecanismos regulatórios que governam a gli cólise são comuns a todas as vias do metabolismo celular A via glicolítica de importância central por si só também pode servir de modelo para muitos aspectos das vias discu tidas ao longo deste livro Antes de estudar cada etapa da via em seus detalhes convém examinar a glicólise como um todo Uma visão geral a glicólise tem duas fases A quebra da glicose formada por seis átomos de carbono em duas moléculas de piruvato cada uma com três carbo nos ocorre em 10 etapas sendo que as primeiras 5 cons tituem a fase preparatória Figura 142a Nessas rea ções a glicose é inicialmente fosforilada no grupo hidroxil ligado ao C6 etapa ➊ A Dglicose6 fosfato assim formada é convertida a Dfrutose6fosfato etapa ➋ a qual é novamente fosforilada desta vez em C1 para formar Dfrutose16bifosfato etapa ➌ Nas duas reações de fosfori lação o ATP é o doador de grupos fos foril Como todos os açúcares formados na glicólise são isômeros D omitese a designação D exceto quando o objetivo é enfatizar sua estereoquímica A frutose16bifosfato é dividida em duas moléculas de três carbonos a di hidroxiacetonafosfato e o gliceraldeí do3fosfato etapa ➍ essa é a etapa de lise que dá nome à via A dihidroxiace tonafosfato é isomerizada a uma segun Hans von EulerChelpin 18731964 Gustav Embden 18741933 Otto Meyerhof 18841951 Nelson6ed14indd 544 Nelson6ed14indd 544 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 545 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hexocinase Fosfofrutocinase1 Piruvato cinase Fosfohexose isomerase Aldolase Tiosefosfato isomerase Gliceraldeído3 fosfato desidrogenase Fosfoglicerato cinase Fosfoglicerato mutase Enolase a Fase preparatória b Fase de pagamento Primeira reação preparativa Segunda reação preparativa Oxidação e fosforilação Clivagem do açúcarfosfato com 6 carbonos em 2 açúcaresfosfato com 3 carbonos Primeira reação formadora de ATP fosforilação no nível do substrato Segunda reação formadora de ATP fosforilação no nível do substrato Fosforilação da glicose e sua conversão a gliceraldeído3fosfato Conversão oxidativa do gliceraldeído3fosfato em piruvato e formação acoplada de ATP e NADH Glicose Glicose6fosfato Frutose6fosfato Frutose16bifosfato Gliceraldeído3fosfato 2 Gliceraldeído3 fosfato 2 2 2 2 2 2 13bifosfoglicerato 2 3fosfoglicerato 2 2fosfoglicerato 2 Fosfoenolpiruvato 2 Piruvato Dihidroxiacetonafosfato 2Pi 2 NADH 1 2H1 2NAD1 2 ATP 2ADP 2 ATP 2ADP 2H2O ADP ATP ADP ATP O H H OH H H HO CH2 OH HO O H H H OH OH H H HO O OH H O H HO H O CH2 OH CH2 OH O H OH O H CH2 HO H C CH2 O CH2 OH H O CH2 O C OH CH2 O CH2 O CH2 CH O OH C CH2 CH O OH C 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 OH OH C O H O O CH2 CH OH O2 O C O2 O CH OH C O CH2 O2 O P P P P P P P P CH2 OH CH O C O H P P P P 2 C C O CH3 O2 O FIGURA 142 As duas fases da glicólise Para cada molécula de glicose que passa pela fase preparatória a duas moléculas de gliceraldeído3fos fato são formadas as duas passam pela fase de pagamento b O piruvato é o produto final da segunda fase da glicólise Para cada molécula de glicose dois ATP são consumidos na fase preparatória e quatro ATP são produzidos na fase de pagamento dando um rendimento líquido de dois ATP por mo lécula de glicose convertida em piruvato As reações numeradas correspon dem aos títulos numerados discutidos no texto Lembrese que cada grupo fosforil representado aqui como possui duas cargas negativas PO3 22 Nelson6ed14indd 545 Nelson6ed14indd 545 070414 1427 070414 1427 546 DAVID L NELSON MICHAEL M COX da molécula de gliceraldeído3fosfato etapa ➎ finalizan do a primeira fase da glicólise Note que duas moléculas de ATP são consumidas antes da clivagem da glicose em duas partes de três carbonos haverá depois um bom retorno para esse investimento Resumindo na fase preparatória da glicólise a energia do ATP é consumida aumentando o con teúdo de energia livre dos intermediários e as cadeias de carbono de todas as hexoses metabolizadas são convertidas a um produto comum o gliceraldeído3fosfato O ganho de energia provém da fase de pagamento da glicólise Figura 142b Cada molécula de gliceradeído3 fosfato é oxidada e fosforilada por fosfato inorgânico não por ATP para formar 13bifosfoglicerato etapa ➏ Ocor re liberação de energia quando as duas moléculas de 13bi fosfoglicerato são convertidas a duas moléculas de piruvato etapas ➐ a ➓ Grande parte dessa energia é conservada pela fosforilação acoplada de quatro moléculas de ADP a ATP O rendimento líquido são duas moléculas de ATP por molécula de glicose utilizada já que duas moléculas de ATP foram consumidas na fase preparatória A energia tam bém é conservada na fase de pagamento com a formação de duas moléculas do transportador de elétrons NADH por molécula de glicose Nas reações seguintes da glicólise três tipos de trans formações químicas são particularmente notáveis 1 a de gradação do esqueleto carbônico da glicose para produzir piruvato 2 a fosforilação de ADP a ATP pelos compostos com alto potencial de transferência de grupos fosforil for mados durante a glicólise e 3 a transferência de um íon hidreto para o NAD 1 formando NADH A lógica química global da via está descrita na Figura 143 Destinos do piruvato Com exceção de algumas variações in teressantes entre as bactérias o piruvato formado na glicó lise é mais adiante metabolizado por três rotas catabólicas Em organismos aeróbios ou em tecidos em condições aeró bias a glicólise é apenas o primeiro estágio da degradação completa da glicose Figura 144 O piruvato é oxidado com a perda de seu grupo carboxil na forma de CO2 para gerar o grupo acetil da acetilcoenzima A o grupo acetil é então completamente oxidado a CO2 no ciclo do ácido cítri co Capítulo 16 Os elétrons originados dessas oxidações são transferidos ao O2 por uma cadeia de transportadores na mitocôndria formando H2O A energia liberada nas rea ções de transferência de elétrons impulsiona a síntese de ATP na mitocôndria Capítulo 19 O segundo destino do piruvato é a sua redução a lactato por meio da fermentação láctica Quando em contração vigorosa o músculo esquelético trabalha em condições de baixa pressão de oxigênio hipoxia em que NADH não pode ser reoxidado a NAD 1 mas NAD 1 é necessário como aceptor de elétron para a oxidação do piruvato Sob essas condições o piruvato é reduzido a lactato recebendo os elétrons do NADH dessa forma regenerando o NAD 1 ne cessário para continuar a glicólise Certos tecidos e tipos celulares p ex retina e eritrócitos convertem glicose a lactato mesmo em condições aeróbias e o lactato também é o produto da glicólise em condições anaeróbias em alguns microrganismos Figura 144 A terceira rota principal do catabolismo do piruvato leva à produção de etanol Em alguns tecidos vegetais e em certos invertebrados protistas e microrganismos como le vedura da fabricação da cerveja e do pão o piruvato é con vertido em hipoxia ou condições anaeróbias em etanol e CO2 um processo chamado de fermentação etanólica alcoólica Figura 144 A oxidação do piruvato é um processo catabólico im portante mas o piruvato também tem destinos anabólicos Ele pode por exemplo prover o esqueleto carbônico para a síntese do aminoácido alanina ou para a síntese de ácidos graxos Essas reações anabólicas do piruvato serão retoma das em capítulos posteriores A formação de ATP e NADH acoplada à glicólise Durante a glicóli se parte da energia da molécula de glicose é conservada na forma de ATP enquanto a maior parte permanece no pro duto o piruvato A equação geral da glicólise é Glicose 1 2NAD 1 1 2ADP 1 2Pi 2 piruvato 1 2NADH 1 2H 1 1 2ATP 1 2H2O 141 Para cada molécula de glicose degradada a piruvato duas moléculas de ATP são geradas a partir de ADP e Pi e duas moléculas de NADH são produzidas pela redução de NAD 1 O aceptor de hidrogênio nessa reação é NAD 1 ver Figura 1324 ligado a uma estrutura de Rossmann como mostra do na Figura 1325 A redução de NAD 1 ocorre pela transfe rência enzimática de um íon hidreto H 2 do grupo aldeído do gliceraldeído3fosfato para o anel de nicotinamida de NAD 1 gerando a coenzima NADH reduzida O outro átomo de hidrogênio da molécula de substrato é liberado para a solução como H 1 Agora podese dividir a equação da glicólise em dois processos a conversão de glicose a piruvato exergônica Glicose 1 2NAD 1 S 2 piruvato 1 2NADH 1 2H 1 142 DG19º 5 2146 kJmol e a formação de ATP a partir de ADP e Pi endergônica 2ADP 1 2Pi 2ATP 1 2H2O 143 DG29º 5 2305 kJmol 1 610 kJmol A soma das Equações 142 e 143 fornece a variação da energia livre padrão total da glicólise DGs9 o DGs9º 5 DG19º 1 DG29º 5 2146 kJmol 1 61 kJmol 5 285 kJmol Sob condiçõespadrão e sob as condições intracelulares não padrão a glicólise é um processo essencialmente ir reversível conduzido até a conclusão por um grande de créscimo líquido de energia livre A energia remanescente do piruvato A glicólise libera apenas uma pequena fração da energia total disponível na molécu la de glicose as duas moléculas de piruvato formadas pela glicólise ainda contêm a maior parte da energia potencial química existente na glicose energia que pode ser extraída por reações oxidativas no ciclo do ácido cítrico Capítulo 16 e na fosforilação oxidativa Capítulo 19 Nelson6ed14indd 546 Nelson6ed14indd 546 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 547 A importância dos intermediários fosforilados Cada um dos nove intermediários glicolíticos entre a glicose e o piruvato são fosforilados Figura 142 Os grupos fosforil parecem ter três funções 1 Como a membrana plasmática geralmente não tem transportadores para açúcares fosforilados os in termediários glicolíticos fosforilados não podem sair da célula Depois da fosforilação inicial não é necessária energia adicional para reter os inter mediários fosforilados na célula apesar da grande diferença entre as suas concentrações intra e extra celular 2 Os grupos fosforil são componentes essenciais na conservação enzimática da energia metabólica A energia liberada na quebra das ligações de fosfoani drido como aquelas do ATP é parcialmente con servada na formação de ésteres de fosfato como glicose6fosfato Compostos de fosfato de alta energia formados na glicólise 13bifosfoglicerato e fosfoenolpiruvato doam grupos fosforil ao ADP para formar ATP 3 A energia de ligação resultante do acoplamento de grupos fosfato ao sítio ativo de enzimas reduz a energia de ativação e aumenta a especificidade das reações enzimáticas Capítulo 6 Os grupamentos fosfato do ADP do ATP e dos intermediários glico líticos formam complexos com Mg 21 e os sítios de ligação ao substrato de muitas enzimas glicolíticas são específicos para esses complexos A maior par te das enzimas da glicólise requer Mg 21 para sua atividade FIGURA 143 A lógica química da via glicolítica Nessa versão simplificada da via cada molécula está representada na forma linear com os átomos de carbono e hidrogênio não descritos para salientar as transformações químicas Lembrese de que glicose e frutose estão presentes principalmente em suas formas cíclicas quando em solução apesar de estarem transitoriamente na forma linear nos sítios ativos de algumas enzimas dessa via A fase preparatória etapas ➊ a ➎ converte a glicose com 6 áto mos de carbonos em duas unidades de 3 átomos de carbonos cada uma delas fosforilada A oxidação das unidades de 3 átomos de carbo nos é iniciada na fase de pagamento Para produzir piruvato as etapas químicas devem ocorrer na ordem mostrada O OH OH 3 OH OH OH 1 2 4 5 6 O OH OH OH OH O Glicose6fosfato Frutose6fosfato Glicose P HO O OH OH OH O Frutose16bisfosfato Gliceraldeído3fosfato Dihidroxiacetona fosfato 13bifosfoglicerato 3fosfoglicerato 2fosfoglicerato Fosfoenolpiruvato P O O OH OH OH O P P O OH O P O OH O O P O OH 2O O P O 2O OH O P ATP ADP ATP ADP ADP ATP ADP ATP O 2O O P O 2O O NAD1 Pi NADH O O OH P P Piruvato A fosforilação ocorre em C6 já que C1 é um grupo carbonil e não pode ser fosforilado A fosforilação da glicose garante que os intermediários da via permaneçam na célula O C1 agora com um grupo hidroxil pode ser fosforilado Isso garante que os dois produtos da clivagem da ligação CC são fosforilados e interconversíveis O grupo carbonil em C2 facilita a clivagem da ligação CC na localização correta para formar dois produtos de 3 carbonos por meio da reação inversa da condensação aldólica Produção de ATP O grupo fosforil remanescente movese de C2 para C3 configurando as etapas finais da via Produção de ATP A isomerização move o grupo carbonil para o C2 um prérequisito para as etapas ➌ e ➍ Interconversão dos dois produtos da etapa ➍ converge os dois produtos em uma única via A fosforilação oxidativa do gliceraldeído3fosfato com a produção de um NADH é um prérequisito para a produção de ATP na etapa ➐ A desidratação ativa o grupo fosforil para transferência para o ADP na etapa ➓ ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ ➏ ➐ ➑ ➒ ➓ Nelson6ed14indd 547 Nelson6ed14indd 547 070414 1427 070414 1427 548 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A fase preparatória da glicólise requer ATP Na fase preparatória da glicólise duas moléculas de ATP são consumidas e a cadeia carbônica da hexose é clivada em duas triosesfosfato A compreensão de que as hexoses fosforiladas são intermediárias na glicólise foi conseguida lentamente e por um feliz acaso Em 1906 Arthur Harden e William Young testaram suas hipóteses de que inibidores de enzimas proteolíticas estabilizariam as enzimas da fer mentação da glicose em extratos de leveduras Adicionaram soro sanguíneo conhecido por conter inibidores de enzi mas proteolíticas a extratos de levedura e observaram o estímulo predito do metabolismo da glicose No entanto em um experimento de controle realizado com a intenção de demonstrar que ferver o soro destrói a atividade estimulan te eles descobriram que o soro fervido foi tão efetivo em es timular a glicólise quanto o soro não fervido Exames cuida dosos e testes do conteúdo do soro fervido revelaram que o fosfato inorgânico foi o responsável pela estimulação Har den e Young logo perceberam que a glicose adicionada ao seu extrato de levedura era convertida a hexosebifosfato o éster de HardenYoung identificado como frutose16 bifosfato Esse foi o início de uma longa série de investi gações sobre o papel dos ésteres orgânicos e anidridos de fosfato em bioquímica que levaram ao nosso entendimento atual do papel central da transferência de grupos fosforil em biologia ➊ A fosforilação da glicose Na primeira etapa da glicólise a glicose é ativada para as reações subsequentes pela fosfori lação em C6 formando glicose6fosfato com ATP como doador de grupo fosforil DG98 5 2167 kJmol O OPO3 22 H OH HO H H H OH H CH2 OH H OH HO H H H OH H CH2 OH O OH ATP ADP Glicose Glicose6fosfato Hexocinase Mg21 5 6 4 1 2 3 Esta reação irreversível em condições intracelulares é ca talisada pela hexocinase Lembrese de que cinases são enzimas que catalisam a transferência do grupo fosforil ter minal do ATP a um aceptor nucleofílico ver Figura 1320 As cinases são uma subclasse das transferases ver Tabela 63 O aceptor no caso da hexocinase é uma hexose geral mente a Dglicose embora a hexocinase também catalise a fosforilação de outras hexoses comuns como Dfrutose e Dmanose em alguns tecidos A hexocinase como muitas outras cinases requer Mg 21 para sua atividade já que o verdadeiro substrato da enzima não é ATP 4 mas sim o complexo MgATP 22 ver Figura 13 12 O Mg 21 protege as cargas negativas do grupo fosforil do ATP tornando o átomo de fósforo terminal um alvo mais fácil para o ataque nucleofílico por um grupo OH da glico se A hexocinase sofre uma profunda mudança na sua con formação um ajuste induzido quando ela se liga à molécula de glicose dois domínios da proteína aproximamse um do outro cerca de 8 Å quando o ATP se liga ver Figura 625 Esse movimento aproxima o ATP de uma molécula de glico se também ligada à enzima e bloqueia o acesso de água do solvente que caso contrário poderia entrar no sítio ativo e atacar hidrolisar as ligações fosfoanidridas do ATP As sim como as outras nove enzimas da glicólise a hexocinase é uma proteína solúvel e citosólica A hexocinase está presente em praticamente todos os organismos O genoma humano codifica quatro hexocina ses diferentes I a IV e todas elas catalisam a mesma rea ção Duas ou mais enzimas que catalisam a mesma reação mas são codificadas por genes diferentes são chamadas de isoenzimas ver Quadro 152 Uma das isoenzimas 2 AcetilCoA Fermentação até lactato no músculo em contração vigorosa nos eritrócitos em algumas outras células e em alguns microrganismos Animais vegetais e muitas células microbianas sob condições aeróbias Fermentação até etanol na levedura Glicose 2 Piruvato 4CO2 1 4H2O 2 Etanol 1 2CO2 2 Lactato Glicólise 10 reações sucessivas Condições aeróbias 2CO2 Ciclo do ácido cítrico Hipoxia ou condições anaeróbias Hipoxia ou condições anaeróbias FIGURA 144 Os três destinos catabólicos possíveis do piruvato for mado na glicólise O piruvato também serve como precursor em muitas reações anabólicas não mostradas aqui Arthur Harden 18651940 William Young 18781942 Nelson6ed14indd 548 Nelson6ed14indd 548 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 549 presente em hepatócitos a hexocinase IV também cha mada de glicocinase difere de outras formas de hexoci nase com relação à cinética e às propriedades regulatórias com consequências fisiológicas importantes descritas na Seção 153 ➋ A conversão de glicose6fosfato a frutose6fosfato A enzima fosfohexoseisomerase fosfoglicoseisomerase ca talisa a isomerização reversível da glicose6fosfato aldo se a frutose6fosfato cetose Fosfohexose isomerase DG98 5 17 kJmol O HO OH H H OH H CH2 OH H OH HO H H H OH H OH Glicose6fosfato Frutose6fosfato 4 2 1 3 6 5 4 3 2 1 O 6 5 CH2OPO3 22 CH2OPO3 22 Mg21 O mecanismo dessa reação envolve um intermediário enediol Figura 145 A reação ocorre facilmente em am bos os sentidos como previsto pela variação relativamente pequena da energia livre padrão ➌ A fosforilação da frutose6fosfato a frutose16bifosfato Na segunda das duas reações preparatórias da glicólise a en zima fosfofrutocinase1 PFK1 catalisa a transferência de um grupo fosforil do ATP para a frutose6fosfato for mando frutose16bifosfato DG98 5 2142 kJmol OPO3 22 Fosfofrutocinase1 PFK1 O HO H H OH H CH2 OH OH Frutose6fosfato Frutose16bifosfato O H H OH H CH2 OH HO 6 5 4 3 6 1 5 4 3 2 1 2 CH2OPO3 22 CH2OPO3 22 ATP ADP Mg21 CONVENÇÃOCHAVE Compostos com dois grupos fosfato ou fosforil acoplados em diferentes posições da molécula são chamados de bifosfatos ou compostos bifosfo por exem plo frutose16bifosfato e 13bifosfoglicerato Compos tos com dois fosfatos ligados como grupo pirofosforil são chamados de difosfatos por exemplo adenosinadifosfato ADP Regras similares são aplicadas para nomear trifos fatos como inositol145trifosfato ver p 450 e trifosfa tos como adenosinatrifosfato ATP 2C 1C 1 2 2 3 3 4 4 5 5 Fosfohexose isomerase Intermediário cisenediol H OH HO H H 2 2 H OH OH Glicose6 fosfato HO H H OH H OH Frutose6 fosfato O Ligação e abertura do anel A remoção do próton pelo Glu do sítio ativo B leva à formação do cisenediol A catálise ácida pelo mesmo Glu facilita a formação de frutose6 fosfato Dissociação e fechamento do anel 6CH2OPO3 6CH2OPO3 6CH2OPO3 1CH2OH O H B HO3CH OH H H H4COH H5COH 2 B HOCH C C O H OH H HCOH HCOH OH H BH HOCH C C O H H HCOH HCOH CH2OPO3 2 CH2OPO3 2 O ➊ ➋ ➌ ➍ FIGURA 145 A reação da fosfohexoseisomerase As reações de abertura e fechamento do anel etapas ➊ e ➍ são catalisadas por um resí duo de His do sítio ativo por mecanismos omitidos aqui para simplificação O próton em vermelhoclaro inicialmente em C2 tornase mais facilmente removível pela retirada do elétron pelo grupo carbonil adjacente e pelos grupos hidroxilas vizinhos Após sua transferência do C2 para o resíduo de Glu do sítio ativo um ácido fraco o próton é livremente trocado com a solu ção ao redor ou seja o próton removido de C2 na etapa ➋ não é necessaria mente o mesmo adicionado ao C1 na etapa ➌ Mecanismo da fosfohexose isomerase Nelson6ed14indd 549 Nelson6ed14indd 549 070414 1427 070414 1427 550 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A enzima que forma a frutose16bifosfato é chamada de PFK1 para distinguila de uma segunda enzima PFK 2 que catalisa a formação de frutose26bifosfato a par tir de frutose6fosfato em uma via distinta os papéis da PFK2 e da frutose26bifosfato são discutidos no Capítulo 15 A reação com PFK1 é essencialmente irreversível em condições celulares e essa é a primeira etapa comprometi da da via glicolítica a glicose6fosfato e a frutose6fosfato têm outros destinos possíveis mas a frutose16bifosfato é direcionada para a glicólise Certos protistas e bactérias têm e talvez todos os ve getais tenham uma fosfofrutocinase que utiliza pirofosfato PPi não ATP como o grupo fosforil doador na síntese de frutose16bifosfato A fosfofrutocinase1 está sujeita a uma complexa mo dulação alostérica sua atividade estará aumentada sempre que o suprimento de ATP da célula estiver prejudicado ou quando ocorrer acúmulo dos produtos da degradação de ATP ADP e AMP particularmente o último A enzima es tará inibida sempre que a célula tiver muito ATP e estiver bem suprida por outro combustível como ácidos graxos Em alguns organismos a frutose26bifosfato não con fundir com o produto da reação com PFK1 a frutose16 bifosfato é um ativador alostérico potente de PFK1 A ribulose5fosfato intermediário da via das pentosesfosfa to discutido posteriormente neste capítulo também ativa indiretamente a fosfofrutocinase As múltiplas esferas de regulação dessa etapa da glicólise serão discutidas em deta lhe no Capítulo 15 ➍ A clivagem da frutose16bifosfato A enzima frutose16 bifosfatoaldolase muitas vezes chamada simplesmente de aldolase catalisa uma condensação aldólica reversível ver Figura 134 A frutose16bifosfato é clivada para a formação de duas triosesfosfato diferentes a aldose gli ceraldeído3fosfato e a cetose dihidroxiacetonafos fato DG98 5 238 kJmol CHOH Gliceraldeído3 fosfato 1 Aldolase C O H OH C CH2 O Dihidroxiacetona fosfato O H H OH H OH Frutose16bifosfato HO 1 1 2 2 5 5 4 4 3 3 6 6 CH2OPO3 22 CH2OPO3 22 CH2OPO3 22 CH2OPO3 22 Existem duas classes de aldolases As aldolases da classe I encontradas em animais e vegetais utilizam o mecanismo mostrado na Figura 146 As enzimas da classe II de fungos e bactérias não formam a base de Schiff intermediária Em vez disso um íon zinco no sítio ativo está coordenado com o oxigênio do carbonil em C2 o Zn 21 polariza o grupo carbonil e estabiliza o intermediá rio enolato gerado na etapa de clivagem da ligação CC ver Figura 617 Embora a reação da aldolase tenha uma variação da energia livre padrão fortemente positiva no sentido de cli var a frutose16bifosfato nas baixas concentrações dos reagentes presentes na célula a variação real da energia livre é pequena e a reação da aldolase é prontamente re versível Será visto posteriormente que a aldolase age no sentido reverso durante o processo de gliconeogênese ver Figura 1417 ➎ A interconversão das triosesfosfato Apenas uma das duas triosesfosfato formada pela aldolase o gliceraldeído3 fosfato pode ser diretamente degradada nas etapas sub sequentes da glicólise O outro produto a dihidroxia cetonafosfato é rápida e reversivelmente convertida a gliceraldeído3fosfato pela quinta enzima da sequência glicolítica a triosefosfatoisomerase HCOH Gliceraldeído3 fosfato Triosefosfato isomerase C CH2 O H OH C O Dihidroxiacetona fosfato CH2OPO3 22 CH2OPO3 22 DG98 5 75 kJmol O mecanismo de reação é similar ao da reação promovi da pela fosfohexoseisomerase na etapa ➋ da glicólise Fi gura 145 Depois da reação da triosefosfatoisomerase os átomos de carbono derivados de C1 C2 e C3 da glicose inicial são quimicamente indistinguíveis de C6 C5 e C4 respectivamente Figura 147 as duas metades da gli cose geram gliceraldeído3fosfato Essa reação completa a fase preparatória da glicólise A molécula de hexose foi fosforilada em C1 e C6 e então clivada para formar duas moléculas de gliceraldeído3 fosfato A fase de pagamento da glicólise produz ATP e NADH A fase de pagamento da glicólise Figura 142b inclui as etapas de fosforilação que conservam energia nas quais parte da energia química da molécula da glicose é conser vada na forma de ATP e NADH Lembrese de que uma mo lécula de glicose rende duas moléculas de gliceraldeído3 fosfato e as duas metades da molécula de glicose seguem a mesma via na segunda fase da glicólise A conversão das duas moléculas de gliceraldeído3fosfato a duas moléculas de piruvato é acompanhada pela formação de quatro mo léculas de ATP a partir de ADP No entanto o rendimento Nelson6ed14indd 550 Nelson6ed14indd 550 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 551 líquido de ATP por molécula de glicose consumida é de ape nas dois já que dois ATP foram consumidos na fase prepa ratória da glicólise para fosforilar as duas extremidades da molécula da hexose ➏ A oxidação do gliceraldeído3fosfato a 13bifosfoglicerato A primeira etapa da fase de pagamento é a oxidação do glice raldeído3fosfato a 13bifosfoglicerato catalisada pela enzima gliceraldeído3fosfatodesidrogenase DG98 5 63 kJmol HCOH 13Bifosfoglicerato C O O 2 O P O 2 O NAD1 H1 Gliceraldeído3 fosfatodesidrogenase Fosfato inorgânico 1 1 Gliceraldeído3 fosfato NADH O O P HO 2 2 O C O H HCOH CH2OPO3 22 CH2OPO3 22 ➋ ➊ ➌ ➍ ➎ 2C H 1CH2OPO3 O H H H2O Aldolase CH2OPO3 2 2 CH2OPO3 2 Frutose16bifosfato CH2OPO3 2 CH2OPO3 2 CH2OPO3 2 CH2OPO3 2 Primeiro produto liberado Segundo produto liberado CH2OPO3 2 O H C HCOH HO H H HO H OH O Ligação e abertura do anel CH2OPO3 C O 2 CH2OH H N H Lys HO3CH O H B B A H5COH 6CH2OPO3 2 N H H HOCH HCOH C B B A HC H O CH2OPO3 2 H4C H O H N H Lys H B A N H Lys HOCH C B BH HCOH CH2OPO3 2 A HC H O N H Lys C C B H O H H Intermediário covalente enzimaenamina H B A N H Lys C C H H HO B H B A H2O B Gliceraldeído3 fosfato Base de Schiff protonada Base de Schiff protonada A Lys do sítio ativo ataca o carbonil do substrato levando à formação de um intermediário tetraédrico A troca de prótons com o meio restaura a enzima Isomerização Dihidroxiacetona fosfato O rearranjo leva à formação de uma base de Schiff protonada na enzima o deslocamento do elétron facilita as etapas subsequentes A base de Schiff é hidrolisada no inverso da sua formação A clivagem da ligação CC inverso da condensação aldólica leva à liberação do primeiro produto FIGURA 146 A reação da aldolase de classe I A reação mostrada aqui é o inverso de uma condensação aldólica Observe que a clivagem entre C3 e C4 depende da presença do grupo carbonil em C2 que é convertido a uma imina no sítio ativo da enzima A e B representam os resíduos de ami noácidos que servem como ácido A ou base B Nelson6ed14indd 551 Nelson6ed14indd 551 070414 1427 070414 1427 552 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Esta é a primeira das duas reações de conservação de energia da glicólise que no final leva à formação de ATP O grupo aldeído do gliceraldeído3fosfato é oxidado não em um grupamento carboxil livre mas em um anidrido de ácido carboxílico com ácido fosfórico Esse tipo de anidrido chamado de acilfosfato tem energia livre padrão de hi drólise muito alta DG9º 5 2493 kJmol ver Figura 1314 Tabela 136 A maior parte da energia livre de oxidação do grupo aldeído do gliceraldeído3fosfato é conservada pela formação do grupamento acilfosfato no C1 do 13bifosfo glicerato O gliceraldeído3fosfato é covalentemente ligado à desidrogenase durante a reação Figura 148 O grupo aldeído do gliceraldeído3fosfato reage com o grupamen to SH de um resíduo de Cys essencial no sítio ativo em reação análoga à formação de um hemiacetal ver Figura 75 nesse caso produzindo um tiohemiacetal A reação do resíduo de Cys essencial com um metal pesado como o Hg 21 inibe a enzima irreversivelmente A quantidade de NAD 1 em uma célula 10 5 M é muito menor que a quantidade de glicose metabolizada em pou cos minutos A via glicolítica pararia se o NADH formado nesta etapa da glicólise não fosse continuamente reoxidado e reciclado A discussão sobre a reciclagem de NAD 1 será retomada posteriormente neste capítulo ➐ A transferência de grupo fosforil de 13bifosfoglicerato a ADP A enzima fosfogliceratocinase transfere o grupo fosforil de alta energia do grupo carboxil do 13bifosfoglicerato para o ADP formando ATP e 3fosfoglicerato Mg21 Fosfogliceratocinase O O P 2 2 2 1 O O O OPO3 2 C HCOH CH2 Adenina Rib 13Bifosfoglicerato ADP P P O O P 2 2 2 2 OPO3 2 O C HCOH CH2 1 O O O P Adenina Rib O ATP 3Fosfoglicerato P DG98 5 2185 kJmol Observe que a fosfogliceratocinase tem esse nome devi do à reação inversa na qual ela transfere um grupo fosforil do ATP para o 3fosfoglicerato Como todas as enzimas ela cata lisa a reação em ambos os sentidos Essa enzima age no sen tido sugerido pelo seu nome durante a gliconeogênese ver O OH OH CH2 C CH2 C C C P CH2 O O O H OH OH H C C CH2 OH P O O O CH2 P H C 6 1 2 3 4 5 b Reações subsequentes da glicólise Dihidroxiacetona fosfato 4 ou 3 5 ou 2 6 ou 1 4 5 6 Derivado dos carbonos da glicose Frutose16bifosfato Triosefosfatoisomerase H HO CH2 C C O O 1 2 3 H P 1 2 3 Derivado dos carbonos da glicose Derivado dos carbonos da glicose Gliceraldeído3 fosfato a P DGliceraldeído 3fosfato Aldolase H H FIGURA 147 Destino dos carbonos da glicose na formação de gliceraldeído3fosfato a A origem dos carbonos nos dois compostos de três carbonos nas reações da aldolase e da triosefosfatoisomerase O produto final das duas reações é gliceraldeído3fosfato duas moléculas b Cada carbono do gliceraldeído3fosfato é derivado de um ou outro dos dois átomos de carbono específicos da glicose Note que a numeração dos átomos de carbono do gliceraldeído3fosfato difere daquela da glicose da qual ele é derivado No gliceraldeído3fosfato o grupo funcional mais complexo o grupo carbonil é especificado como C1 Esta troca de numeração é importante para interpretar os experimentos com glicose em que um único carbono é marcado com radioisótopo Ver Problemas 6 e 9 no final deste capítulo Nelson6ed14indd 552 Nelson6ed14indd 552 070414 1427 070414 1427 PRINCIPIOS DE BIOQUMICA DE LEHNINGER 553 CHOPOS NAD Gliceraldeido3 NAD HOOH fosfato Cc AN Gliceraldeido3 fosfato 7 Formagao do complexo 7 desid A Seer og en Cys enzimasubstrato A Cys do Cys sitio ativo tem um pK reduzido 55 em vez de 8 Formagao de uma ligacao quando NAD esta ligado covalente tiohemiacetal estando na forma tiolato entre o substrato e 0 grupo mais reativa S do residuo de Cys NADt CHOPOS CHOPOS scot HCOH Peo boo A ligagao tioéster covalente Pog entre o substrato ea enzima c OPOs sofre fosfordlise ataque por ys 13bifosfoglicerato P liberando o segundo a produto 13bifosfoglicerato Ointermediario enzimasubstrato é oxidado pelo NAD ligado CHOPS Oo ao sitio ativo ll NAD me NADH CHOPOS P NAD O 1 HCOH Lo b r Ss NADH Ss O NADH formado deixa 0 sitio Cys ativo e é substituido por outra Cys molécula de NAD FIGURA148 A reagao da gliceraldeido3fosfatodesidrogenase Figura 1417 e durante a fixacao de CO fotossintético ver Quando a lei da agao das massas é menor que 10 seu Figura 204 Na glicélise a reacao que ela catalisa prossegue logaritmo natural tem sinal negativo No citosol onde es como mostrado anteriormente no sentido da sintese de ATP sas reacdes ocorrem a razio NADHNAD é pequena As etapas e da glicélise constituem um processo contribuindo para um baixo valor de Q A etapa por con de acoplamento de energia em que 13bifosfoglicerato sumir o produto da etapa 13bifosfoglicerato mantém um intermediario comum ele é formado na primeira reacgao qa 13bifosfoglicerato relativamente baixa no equilfbrio e que seria endergénica se isolada e seu grupo acilfosfato assim mantém Q pequeno para o processo global de aco transferido ao ADP na segunda reacaéo que extremamen plamento de energia Quando Q é pequeno a contribuicao te exergonica A soma dessas duas reagoes é de In Q pode tornar AG fortemente negativo Essa é sim Gliceraldeido3fosfato ADP P NAD plesmente outra forma de mostrar como as duas reacées as 3fosfoglicerato ATP NADH H etapas e sao acopladas por meio de um intermediario AG 122kJmol Comum O resultado do acoplamento dessas reagdes ambas Portanto a reacao global exergonica reversiveis em condigées celulares é que a energia libe Lembrese do Capitulo 13 de que a variagao de energiali pada da oxidacao de um aldefdo a um grupo carboxilato vre real AG determinada pela variacao de energia livre pa conservada pela formacao acoplada de ATP a partir de drao AG e pela lei da agao das massas Q que éarelagao Appe P A formagao de ATP pela transferéncia do grupo produtosreagentes ver Equagao 134 Para a etapa fosforil de um substrato como o 13bifosfoglicerato é AG AG RTIN chamada de fosforilacao no nivel do substrato para distinguir esse mecanismo daquele da fosforilagao li AG RT In 13bifosfogliceratoNADH gada a respiracao As fosforilagées no nivel do substra gliceraldeido3fosfatoPNAD to envolvem enzimas soltveis e intermediarios quimicos nesse caso 13bifosfoglicerato As fosforilagées ligadas Note que a H nao esta incluida em Q Em calculos bioqui a respiragao por outro lado envolvem enzimas ligadas a micos a H é considerada uma constante 10me essa membrana e gradientes transmembrana de protons Ca constante esta incluida na definigaéo de AG p 507 pitulo 19 554 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ➑ A conversão de 3fosfoglicerato a 2fosfoglicerato A enzima fosfogliceratomutase catalisa o deslocamento reversível do grupo fosforil entre C2 e C3 do glicerato Mg 21 é essen cial para essa reação DG98 5 44 kJmol O 2 2 C HC CH2 O Fosfoglicerato mutase O O C HC CH2 3Fosfoglicerato 2Fosfoglicerato O OH OH O PO3 22 PO3 22 Mg21 A reação ocorre em duas etapas Figura 149 O grupo fosforil inicialmente acoplado a um resíduo de His da muta se é transferido a um grupo hidroxil em C2 do 3fosfoglice rato formando 23bifosfoglicerato 23BPG O grupo fos foril em C3 do 23BPG é então transferido para o mesmo resíduo de His produzindo 2fosfoglicerato e regenerando a enzima fosforilada A fosfogliceratomutase é inicialmen te fosforilada pela transferência de um fosforil de 23BPG necessário em pequenas quantidades para iniciar o ciclo ca talítico e é continuamente regenerado por esse ciclo ➒ A desidratação de 2fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato Na se gunda reação glicolítica que gera um composto com alto po tencial de transferência de grupamento fosforil a primeira foi a etapa ➏ a enolase promove a remoção reversível de uma molécula de água do 2fosfoglicerato para gerar fosfo enolpiruvato PEP DG98 5 75 kJmol O 2 2 C CH2 H2O Enolase O C H CH2 2Fosfoglicerato Fosfoenolpiruvato O O HO C C OPO3 22 OPO3 22 O mecanismo da reação da enolase envolve um intermediá rio enólico estabilizado por Mg 21 ver Figura 626 A reação converte um composto com relativamente baixo potencial de transferência de grupo fosforil o DG9º para a hidrólise de 2fosfoglicerato é 2176 kJmol para um com alto potencial de transferência de grupo fosforil o DG9º para a hidrólise de PEP é 2619 kJmol ver Figura 1313 Tabela 136 ➓ A transferência de um grupo fosforil do fosfoenolpiruvato para ADP A última etapa na glicólise é a transferência do grupo fosforil do fosfoenolpiruvato ao ADP catalisada pela piru vatocinase que exige K 1 e Mg 21 ou Mn 21 DG98 5 2314 kJmol P O P O O P 2 2 2 2 O C C CH3 1 O O O P Adenina Rib Piruvato cinase O O C C CH2 P P Adenina Rib O 2 1 ATP Fosfoenolpiruvato Piruvato ADP O 2 O O O Mg21 K1 2OOC H H2C O H C O 2Fosfoglicerato His N His N HN 1 N H 2OOC H H2C O PO3 22 C O 23Bifosfoglicerato 23BPG His N His HN PO3 22 PO3 22 22O3P 2OOC H H2C O PO3 22 C O H 3Fosfoglicerato His N 22O3P His N HN Fosfogliceratomutase ➊ ➋ Ocorre a transferência de um grupo fosforil entre uma His do sítio ativo e o C2 OH do substrato Uma segunda His do sítio ativo age como um catalisador geral básico A transferência de grupo fosforil de C3 do substrato para a primeira His do sítio ativo A segunda His do sítio ativo age como um catalisador geral ácido 1 1 H N N H N H FIGURA 149 A reação da fosfogliceratomutase Nelson6ed14indd 554 Nelson6ed14indd 554 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 555 Nesta fosforilação no nível do substrato o piruvato re sultante aparece inicialmente em sua forma enólica depois tautomeriza de modo rápido e não enzimático à sua forma cetônica que predomina em pH 70 Tautomerização Piruvato forma enólica Piruvato forma cetônica 2 O C CH2 O OH C O 2 C CH3 O O C A reação global tem grande variação negativa da energia livre padrão devido em grande parte à conversão espon tânea da forma enólica do piruvato à forma cetônica ver Figura 1313 Aproximadamente metade da energia libera da pela hidrólise de PEP DG9º 5 2619 kJmol é conser vada na formação da ligação fosfoanidrido do ATP DG9º 5 2305 kJmol e o restante 231 4 kJmol constitui uma grande força que empurra a reação no sentido da síntese de ATP A regulação da piruvatocinase será discutida no Capítulo 15 O balanço geral mostra um ganho líquido de ATP Agora podese construir um balanço da glicólise para de monstrar 1 o destino do esqueleto de carbono da glicose 2 a entrada de Pi e ADP e a saída de ATP e 3 o caminho dos elétrons nas reações de oxidaçãoredução O lado es querdo da equação que se segue mostra todas as entradas de ATP NAD 1 ADP e Pi ver Figura 142 e o lado direito mostra todas as saídas lembrese de que cada molécula de glicose rende duas moléculas de piruvato Glicose 1 2ATP 1 2NAD 1 1 4ADP 1 2Pi 2 piruvato 1 2ADP 1 2NADH 1 2H 1 1 4ATP 1 2H2O Cancelando os termos comuns nos dois lados da equação é obtida a equação global para a glicólise em condições aeróbias Glicose 1 2NAD 1 1 2ADP 1 2Pi 2 piruvato 1 2NADH 1 2H 1 1 2ATP 1 2H2O As duas moléculas de NADH formadas pela glicólise no citosol são em condições aeróbias reoxidadas a NAD 1 pela transferência de seus elétrons para a cadeia de transporte de elétrons que em células eucarióticas está localizada na mitocôndria A cadeia de transporte de elétrons conduz es ses elétrons para o seu destino final o O2 2NADH 1 2H 1 1 O2 2NAD 1 1 2H2O A transferência de elétrons do NADH para o O2 na mito côndria fornece a energia para a síntese de ATP pela fosfo rilação ligada à respiração Capítulo 19 No processo glicolítico em geral uma molécula de glico se é convertida a duas moléculas de piruvato a via do car bono Duas moléulas de ADP e duas de Pi são convertidas a duas moléculas de ATP a via dos grupos fosforil Quatro elétrons na forma de íons hidreto são transferidos de duas moléculas de gliceraldeído3fosfato para duas de NAD 1 a via dos elétrons A glicólise é precisamente regulada Durante seus estudos sobre a fermentação da glicose por leveduras Louis Pasteur descobriu que tanto a velocidade quanto a quantidade total de glicose consumida é muitas vezes maior em condições anaeróbias do que em aeróbias Estudos posteriores com músculo confirmaram a grande variação nas taxas da glicólise anaeróbia e aeróbia As bases bioquímicas para esse efeito Pasteur agora estão claras O rendimento de ATP da glicólise em condições anaeró bias 2 ATP por molécula de glicose é muito menor do que aquele a partir da oxidação completa da glicose a CO2 em condições aeróbias 30 ou 32 ATP por glicose ver Tabela 195 Portanto para produzir a mesma quantidade de ATP é necessário consumir cerca de 15 vezes mais glicose em condições anaeróbias do que aeróbias O fluxo de glicose pela via glicolítica é regulado para manter os níveis de ATP praticamente constantes assim como quantidades adequadas dos intermediários glicolíti cos que possuem papéis biossintéticos O ajuste neces sário na velocidade da glicólise é alcançado pela intera ção complexa entre o consumo de ATP a regeneração de NADH e a regulação alostérica de algumas enzimas glicolí ticas incluindo a hexocinase a PFK1 e a piruvatocinase e as flutuações segundo a segundo das concentrações dos metabólitoschave que refletem o equilíbrio celular entre a produção e o consumo de ATP Em uma escala de tempo um pouco maior a glicólise é regulada pelos hor mônios glucagon adrenalina e insulina e por variações na expressão de genes de várias enzimas glicolíticas Um caso especialmente interessante de regulação anormal da glicó lise é visto no câncer O bioquímico alemão Otto Warburg foi o primeiro em 1928 a observar que tumores de pra ticamente todos os tipos possuem velocidade da glicólise muito maior que a de tecidos normais mesmo quando oxigênio está disponível Esse efeito Warburg é a base de vários métodos de detecção e tratamento do câncer Quadro 141 Warburg é considerado o bioquímico mais importante da primeira metade do século XX Ele fez contribuições inspi radoras em muitas outras áreas da bioquímica incluindo respi ração fotossíntese e enzimolo gia do metabolismo intermediá rio Iniciando em 1930 Warburg e seus colaboradores purifica ram e cristalizaram sete enzimas da glicólise A equipe de War burg desenvolveu uma ferra menta experimental que revolu cionou os estudos bioquímicos do metabolismo oxidativo o ma nômetro de Warburg que mede diretamente o consumo de oxi gênio dos tecidos por monitorar variações no volume de gás e assim permite medidas quan titativas de qualquer enzima com atividade oxidativa Otto Warburg 18831970 Nelson6ed14indd 555 Nelson6ed14indd 555 070414 1427 070414 1427 556 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Em muitos tipos de tumores encontrados em humanos e em outros animais a captação e a degradação de gli cose ocorrem cerca de 10 vezes mais rápido do que em tecidos normais não cancerosos A maior parte das cé lulas tumorais cresce em condições de hipoxia ie com suprimento de oxigênio limitado devido à falta pelo menos inicialmente das redes capilares que suprem com oxigênio suficiente Células cancerosas localizadas a mais de 100 a 200 mm dos capilares mais próximos dependem somente da glicose sem oxidação adicional de piruvato para a maior parte da produção de ATP O rendimento de energia 2 ATP por glicose é mui to menor do que o que pode ser obtido pela oxidação completa do piruvato a CO2 na mitocôndria cerca de 30 ATP por glicose Capítulo 19 Portanto para fazer a mesma quantidade de ATP as células tumorais devem captar muito mais glicose do que as células nor mais convertendoa a piruvato e depois a lactato enquanto reciclam NADH É provável que as duas etapas iniciais na transformação de uma célula nor mal em uma célula tumoral sejam 1 a mudança para a dependência da glicólise na produção de ATP e 2 o desenvolvimento de tolerância a pH baixo no fluido extracelular causado pela libera ção do produto final da glicólise o ácido láctico Em geral quanto mais agressivo é o tumor maior é a taxa de glicólise Esse aumento da glicólise é alcançado ao me nos em parte pelo aumento da síntese das enzimas glicolíticas e dos transportadores da membrana plasmática GLUT1 e GLUT3 ver Tabela 113 que carregam a glicose para a célula Lembrese de que GLUT1 e GLUT3 não são dependentes de insu lina O fator de transcrição induzível por hi poxia HIF1 de hypoxiainducible transcrip tion factor é uma proteína que regula a síntese de mRNA estimulando a produção de pelo menos oito enzimas glicolíticas e dos transportadores de glico se quando a oferta de glicose está limitada Figura Q1 Com a alta velocidade de glicólise resultan te as células tumorais podem sobreviver em con dições anaeróbias até que o suprimento de vasos sanguíneos alcance o tumor em crescimento Outra proteína induzida por HIF1 é o hormônio peptídi co VEGF fator de crescimento vascular endotelial de vascular endothelial growth factor que esti mula o crescimento dos vasos sanguíneos angiogêne se em direção do tumor Existe também a evidência de que a proteína supres sora de tumor p53 mutada na maior parte dos tipos de câncer ver Seção 1212 controla a síntese e a monta gem das proteínas mitocondriais essenciais para o trans porte dos elétrons ao O2 As células com p53 mutada são deficientes no transporte de elétrons na mitocôndria e são forçadas a depender mais significativamente da gli cólise para a produção de ATP Figura Q1 Essa dependência maior dos tumores pela glicólise em comparação aos tecidos normais sugere uma possibi lidade de terapia anticâncer inibidores da glicólise pode riam atingir e matar tumores por esgotar seu suprimento de ATP Três inibidores da hexocinase mostramse pro missores como agentes quimioterápicos 2desoxiglicose QUADRO 141 MEDICINA Alta taxa da glicólise em tumores sugere alvos para quimioterapia e facilita o diagnóstico FIGURA Q1 O metabolismo anaeróbio da glicose em células tu morais rende muito menos ATP 2 por glicose do que a oxidação completa a CO2 que ocorre em células saudáveis em condições aeróbias 30 ATP por glicose de forma que uma célula tumoral deve consumir muito mais glicose para produzir a mesma quan tidade de ATP Os transportadores de glicose e a maior parte das enzimas glicolíticas estão superexpressos em tumores Compostos que inibem as enzimas hexocinase glicose6fosfatodesidrogena se ou transcetolase bloqueiam a produção de ATP pela glicólise privando assim a célula cancerosa de energia e matandoa 2Desoxiglicose Lonidamina 3Bromopiruvato Ácido 6aminonicotínico Oxitiamina Hipoxia Câncer p53 Hexocinase GLUT1 GLUT3 Captação de glicose Glicose Câncer HIF1 Hipoxia Glicose6 fosfato 6Fosfogliconato Xilulose5 fosfato Gliceraldeído3 fosfato Piruvato Glicose6 fosfato desidrogenase Transcetolase Respiração aeróbia Mitocôndria 30 ATPglicose 2 ATPglicose 3 CO2 Enzimas glicolíticas Nelson6ed14indd 556 Nelson6ed14indd 556 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 557 lonidamina e 3bromopiruvato Por impedir a formação de glicose6fosfato esses compostos não apenas privam as células tumorais de ATP glicoliticamente produzido mas também evitam a formação de pentosesfosfato pela via das pentosesfosfato que também inicia com glico se6fosfato Na ausência de pentosesfosfato a célula não consegue sintetizar os nucleotídeos essenciais para a síntese de DNA e de RNA e assim não consegue cres cer nem se dividir Outro fármaco anticâncer já aprovado para o uso clínico é o imatinibe Gleevec descrito no Quadro 125 Ele inibe uma tirosinacinase específica impedindo a síntese aumentada da hexocinase que nor malmente é ativada por essa cinase específica O análogo de tiamina oxitiamina que bloqueia a ação de uma enzi ma tipo transcetolase que converte a xilulose5fosfato a gliceraldeído3fosfato Figura Q1 está em triagem préclínica como fármaco antitumoral A alta taxa glicolítica em células tumorais também tem utilidade para diagnósticos As taxas relativas em que os tecidos captam glicose podem ser usadas em al guns casos para identificar a localização de tumores Em tomografia por emissão de pósitrons PET de positron emission tomography injetase nos pacientes um aná logo inofensivo da glicose isotopicamente marcado que é captado mas não metabolizado pelos tecidos O com posto marcado é a 2flúor2desoxiglicose FdG em que o grupo hidroxil em C2 da glicose é substituído por 18F Figura Q2 Esse composto é captado pelos transporta dores GLUT sendo um bom substrato para a hexocinase mas não pode ser convertido ao intermediário enediol na reação da fosfohexoseisomerase ver Figura 145 e consequentemente se acumula como 6fosfoFdG A ex tensão do seu acúmulo depende da sua taxa de captação e fosforilação que como citado anteriomente costuma ser 10 ou mais vezes maior em tumores do que em teci dos normais O decaimento do 18F libera pósitrons dois por átomo de 18F que podem ser detectados por uma série de detectores sensíveis localizados ao redor do cor po o que permite a localização acurada de 6fosfoFdG acumulado Figura Q3 HO O 18F OH HO HO ATP 18F2Flúor2desoxiglicose FdG 18F6Fosfo2flúor2desoxiglicose 6FosfoFdG ADP Hexocinase 18F 3 4 5 2 6 1 O OH HO HO O 2O O O2 P FIGURA Q2 A fosforilação da 2flúor2desoxiglicose marcada com 18F pela hexocinase mantém o FdG na célula como 6fosfoFdG onde sua presença pode ser detectada por emissão de pósitrons do 18F FIGURA Q3 Detecção de tecidos cancerosos por tomografia por emis são de pósitrons PET O paciente adulto do sexo masculino sofreu re moção cirúrgica de um câncer de pele primário melanoma maligno A imagem à esquerda obtida do corpo todo por tomografia computado rizada varredura por TC mostra a localização dos tecidos moles e ossos O painel central é uma varredura por PET após o paciente ter ingerido 2flúor2desoxiglicose FdG marcada com 18F Os pontos escuros indi cam regiões de alta utilização da glicose Como esperado o cérebro e a bexiga estão fortemente marcados o cérebro porque utiliza a maior parte da glicose consumida pelo corpo e a bexiga porque o 6fosfoFdG marcado com 18F é excretado na urina Quando a intensidade da marca ção na varredura por PET é traduzida em cor falsa a intensidade aumenta de verde para amarelo para vermelho e a imagem é sobreposta à var redura por TC a imagem resultante direita revela câncer nos ossos da coluna vertebral superior no fígado e em algumas regiões musculares todos resultantes da propagação do melanoma maligno primário Nelson6ed14indd 557 Nelson6ed14indd 557 070414 1427 070414 1427 558 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Treinado em química de carboidratos no laboratório do notável Emil Fischer que recebeu o Prêmio Nobel em Química em 1902 Warburg ganhou o Prêmio Nobel de Fi siologia e Medicina em 1931 Vários dos estudantes e co laboradores de Warburg também foram agraciados com Prêmios Nobel Otto Meyerhof em 1922 Hans Krebs e Fritz Lipmann em 1953 e Hugo Theorell em 1955 O laboratório de Meyerhof forneceu treinamento para Lipmann e para muitos outros ganhadores do Prêmio Nobel Severo Ochoa 1959 Andre Lwoff 1965 e George Wald 1967 A captação da glicose é deficiente no diabetes melito tipo 1 O metabolismo de glicose em mamíferos é limitado pela taxa de captação da glicose pelas células e sua fosforilação pela hexocinase A captação da glicose do sangue é mediada pela família GLUT de transportadores de glicose ver Tabela 113 Os transportadores nos he patócitos GLUT1 GLUT2 e nos neurônios cerebrais GLUT3 estão sempre presentes nas membranas plas máticas Por outro lado o principal transportador de gli cose nas células do músculo esquelético músculo car díaco e tecido adiposo GLUT4 está armazenado em pequenas vesículas intracelulares e se desloca para a membrana plasmática apenas em resposta a um sinal de insulina Figura 1410 Esse mecanismo de sinalização da insulina foi discutido no Capítulo 12 ver Figura 12 16 Portanto em músculo esquelético coração e tecido adiposo a captação e o metabolismo da glicose depen dem da liberação normal de insulina pelas células b pan creáticas em resposta à quantidade elevada de glicose no sangue ver Figura 2326 Os indivíduos com diabetes melito tipo 1 também cha mado de diabetes dependente de insulina têm pouquíssi mas células b e são incapazes de liberar insulina suficiente para desencadear a captação de glicose pelas células do músculo esquelético do coração ou do tecido adiposo As sim após uma refeição contendo carboidratos a glicose se acumula a níveis anormalmente altos no sangue condição conhecida como hiperglicemia Incapazes de captar glicose o músculo e o tecido adiposo utilizam os ácidos graxos ar mazenados nos triacilgliceróis como seu principal combus tível No fígado a acetilCoA derivada da degradação desses ácidos graxos é convertida a corpos cetônicos acetoa cetato e bhidroxibutirato que são exportados e levados a outros tecidos para serem utilizados como combustível Capítulo 17 Esses compostos são especialmente críticos para o cérebro que utiliza os corpos cetônicos como com bustível alternativo quando glicose está indisponível Os ácidos graxos não conseguem atravessar a barreira hema toencefálica e por isso não servem de combustível para os neurônios do cérebro Em pacientes com diabetes tipo 1 não tratados a super produção de acetoacetato e bhidroxibutirato leva a seu acú mulo no sangue e a consequente redução do pH sanguíneo leva à cetoacidose uma condição potencialmente letal A administração de insulina reverte esta sequência de eventos GLUT4 se desloca para a membrana plasmática dos hepató citos e adipócitos a glicose é captada e fosforilada por essas células e o nível de glicose no sangue decresce reduzindo potencialmente a produção de corpos cetônicos O diabetes melito tem efeitos profundos no metabolis mo de carboidratos e lipídeos Esse tópico será retomado no Capítulo 23 após considerar o metabolismo de lipídeos Capítulos 17 e 21 RESUMO 141 Glicólise c A glicólise é uma via quase universal pela qual uma mo lécula de glicose é oxidada a duas moléculas de piruva to com energia conservada na forma de ATP e NADH c As 10 enzimas glicolíticas estão no citosol e os 10 in termediários são compostos fosforilados de três ou seis carbonos c Na fase preparatória da glicólise ATP é consumido para a conversão de glicose em frutose16bifosfato A liga ção entre C3 e C4 é então clivada para gerar duas mo léculas de triosefosfato c Na fase de pagamento cada uma das duas moléculas de gliceraldeído3fosfato derivada da glicose sofre oxida ção em C1 a energia dessa reação de oxidação é con servada na forma de um NADH e dois ATP por triose fosfato oxidada A equação para o processo global é Glicose 1 2NAD 1 1 2ADP 1 2Pi 2 piruvato 1 2NADH 1 2H 1 1 2ATP 1 2H2O c A glicólise é rigidamente regulada de forma coordenada com outras vias geradoras de energia para garantir um suprimento constante de ATP c No diabetes tipo 1 a captação deficiente de glicose pelo músculo e tecido adiposo tem efeitos profundos sobre o metabolismo de carboidratos e gorduras 142 Vias alimentadoras da glicólise Muitos carboidratos além da glicose encontram seus des tinos catabólicos na glicólise após serem transformados em um dos intermediários glicolíticos Os mais significati vos são os polissacarídeos de armazenamento glicogênio e amido contidos nas células endógenos ou obtidos da dieta os dissacarídeos maltose lactose trealose e saca rose e os monossacarídeos frutose manose e galactose Figura 1411 Os polissacarídeos e os dissacarídeos da dieta sofrem hidrólise a monossacarídeos Para a maioria dos seres humanos o amido é a principal fonte de carboidratos na dieta Figura 1411 A digestão inicia na boca onde a aamilase salivar hidrolisa as liga ções glicosídicas internas a1S4 do amido produzindo fragmentos polissacarídicos curtos ou oligossacarídeos Note que nessa reação de hidrólise a água e não Pi é a espécie atacante No estômago a aamilase salivar é inativada pelo pH baixo mas uma segunda forma de a amilase secretada pelo pâncreas no intestino delgado Nelson6ed14indd 558 Nelson6ed14indd 558 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 559 continua o processo de degradação A aamilase pancreá tica gera principalmente maltose e maltotriose os di e trissacarídeos de glicose e oligossacarídeos chamados de dextrinaslimite fragmentos de amilopectina conten do pontos de ramificação a1S6 A maltose e as dex trinas são degradadas até glicose por enzimas do epité lio intestinal com borda em escova as microvilosidades das células epiteliais do intestino que aumentam muito a área da superfície intestinal O glicogênio da dieta tem essencialmente a mesma estrutura do amido e sua diges tão segue a mesma via Como foi visto no Capítulo 7 a maioria dos animais não pode digerir celulose devido à falta da enzima celulase que cliva as ligações glicosídicas b1S4 da celulose Em ani mais ruminantes o estômago estendido inclui uma câmara onde microrganismos simbióticos que produzem celulase degradam celulose em moléculas de glicose Esses micror ganismos utilizam a glicose resultante por meio de fermen Membrana plasmática GLUT4 Glicose Gota de gordura Ácido graxo Triacilglicerol Glicose entra por meio de GLUT4 Hexocinase fosforila a glicose Glicólise Cetoacidose acetoacetato bhidroxibutirato Oxidação do piruvato pelo ciclo do ácido cítrico Glicose6fosfato Via das pentoses fosfato Ribulose5fosfato Piruvato CO2 CO2 Fosforilação oxidativa na mitocôndria Vesículas contendo GLUT4 fundemse com a membrana plasmática A mobilização de triacilglicerol fornece ácidos graxos como combustível alternativo A transferência de elétrons nas mitocôndrias direciona a síntese de ATP 30 ATP 2 ATP ➍ ➊ Pâncreas secreta insulina Principal defeito no diabetes IRS Receptor de insulina ativado PI3K PKB ➋ ➌ ➎ ➏ ➐ ➑ ➓ ➒ FIGURA 1410 Efeito do diabetes tipo 1 sobre o metabolismo dos carboidratos e das gorduras em um adipócito Normal mente a insulina desencadeia a inserção de transportadores GLUT4 na membrana plasmática pela fusão de vesículas contendo GLUT4 com a mem brana permitindo a captação de glicose do sangue Quando os níveis de in sulina diminuem no sangue GLUT4 é ressequestrado em vesículas por endo citose No diabetes melito tipo 1 dependente de insulina a inserção de GLUT4 nas membranas assim como outros processos normalmente estimu lados por insulina estão inibidos como indicado por X A deficiência de insu lina impede a captação de glicose por GLUT4 como consequência as células são privadas de glicose enquanto ela está elevada na corrente sanguínea Sem glicose para o suprimento de energia os adipócitos degradam triacilgli ceróis estocados em gotas de gordura e fornecem os ácidos graxos resultan tes para outros tecidos para a produção mitocondrial de ATP Dois subprodu tos da oxidação dos ácidos graxos acumulamse no fígado acetoacetato e bhidroxibutirato ver p 686 e são liberados na corrente sanguínea forne cendo combustível para o cérebro mas também diminuindo o pH do san gue causando cetoacidose A mesma sequência de eventos ocorre no mús culo exceto que os miócitos não estocam triacilgliceróis mas captam os ácidos graxos que são liberados na corrente sanguínea pelos adipócitos Nelson6ed14indd 559 Nelson6ed14indd 559 070414 1427 070414 1427 560 DAVID L NELSON MICHAEL M COX tação anaeróbia produzindo grandes quantidades de pro pionato Esse propionato serve como material de partida para a gliconeogênese que gera a maior parte da lactose do leite O glicogênio endógeno e o amido são degradados por fosforólise Os estoques de glicogênio em tecidos animais principal mente no fígado e no músculo esquelético em micror ganismos ou em tecidos vegetais podem ser mobilizados para o uso da mesma célula por uma reação fosfolítica ca talisada pela glicogêniofosforilase amidofosforilase em vegetais Figura 1412 Essas enzimas catalisam o ataque por Pi sobre a ligação glicosídica a1S4 que une os dois últimos resíduos de glicose na extremidade não re dutora gerando glicose1fosfato e um polímero com uma unidade de glicose a menos A fosforólise preserva parte da energia da ligação glicosídica do ésterfosfato da glico se1fosfato A glicogêniofosforilase ou amidofosforilase age repetidamente até alcançar um ponto de ramificação a1S6 ver Figura 713 onde cessa sua ação Uma enzi ma de desramificação remove as ramificações Os meca nismos e o controle da degradação de glicogênio são descri tos em maior detalhe no Capítulo 15 A glicose1fosfato produzida pela glicogêniofosforilase é convertida a glicose6fosfato pela fosfoglicomutase que catalisa a reação reversível Glicose1fosfato Glicose6fosfato A fosfoglicomutase utiliza basicamente o mesmo mecanis mo que a fosfogliceratomutase Figura 149 ambas en volvem um intermediário bifosfato e a enzima é transito riamente fosforilada em cada ciclo catalítico O nome geral mutase é dado a enzimas que catalisam a transferência de um grupo funcional de uma posição para outra na mesma molécula As mutases são uma subclasse das isomerases enzimas que interconvertem estereoisômeros ou isômeros estruturais ou de posição ver Tabela 63 A glicose6fos fato formada na reação da fosfoglicomutase pode entrar na glicólise ou em outra via como a via das pentosesfosfato descrita na Seção 145 O H H H H OH CH2OH Gliceraldeído3 fosfato Sacarase Frutose1 fosfato aldolase UDPgalactose H2O CH2OH O H H H OH HO OH O HO H H H H OH H CH2OH DGlicose DGalactose DManose DFrutose OH OH OH HOCH2 Glicogênio da dieta amido Glicose1 fosfato Lactose Manose6fosfato Pi Glicose 6 fosfato Sacarose Trealose Fosfoglicomutase Lactase aamilase Trealase UDPglicose O HO H H H H OH H CH2OH OH OH H O O H H ATP Hexocinase ATP ATP Fosfomanoseisomerase Frutose16 bifosfato Triosefosfato isomerase Frutose1fosfato ATP Frutocinase Gliceraldeído 1 Dihidroxiacetona fosfato Triosecinase Hexocinase ATP Frutose 6fosfato Hexocinase Fosforilase Glicogênio endógeno FIGURA 1411 Entrada de glicogênio amido dissacarídeos e hexoses da dieta no estágio preparatório da glicólise Nelson6ed14indd 560 Nelson6ed14indd 560 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 561 PROBLEMA RESOLVIDO 141 Economia de energia para a quebra do glicogênio por fosforólise Calcule a economia de energia em moléculas de ATP por monômeros de glicose obtida pela quebra do glicogênio por fosforólise em vez de hidrólise para iniciar o processo de glicólise Solução A fosforólise produz uma glicose fosforilada gli cose1fosfato que é então convertida a glicose6fosfato sem gasto da energia celular 1 ATP necessária para a formação de glicose6fosfato a partir de glicose livre Por tanto é consumido apenas 1 ATP por monômero de glicose na fase preparatória em comparação com 2 ATP consumi dos quando a glicólise inicia com glicose livre Consequen temente a célula ganha 3 ATP por monômero de glicose 4 ATP produzidos na fase de pagamento menos 1 ATP usado na fase preparatória em vez de 2 uma economia de 1 ATP por monômero de glicose A quebra de polissacarídeos da dieta como o glicogênio e o amido no trato gastrintestinal por fosforólise em vez de hidrólise não produziria ganho de energia açúcares fos fatados não são transportados para dentro das células que revestem o intestino devendo primeiro ser desfosforilados a açúcar livre Os dissacarídeos devem ser hidrolisados a monossaca rídeos antes de entrar na célula Dissacarídeos intestinais e dextrinas são hidrolisados por enzimas acopladas à superfí cie externa das células epiteliais intestinais Dextrina 1 nH2O dextrinase n Dglicose Maltose 1 H2O maltase 2 Dglicose Lactose 1 H2O lactase Dgalactose 1 Dglicose Sacarose 1 H2O sacarase Dfrutose 1 Dglicose Trealose 1 H2O trealase 2 Dglicose Os monossacarídeos assim formados são transportados ativamente para as células epiteliais ver Figura 1143 em seguida passam para o sangue e são transportados para vá rios tecidos onde são fosforilados e entram na sequência glicolítica A intolerância à lactose comum entre adultos na maior parte das populações humanas exceto aquelas originárias do norte da Europa e alguns países da África é devida ao desaparecimento após a infância da maior parte ou de toda atividade lactásica das células epiteliais intesti nais Na ausência de lactase intestinal a lactose não pode ser completamente digerida e absorvida no intestino delga do passando para o intestino grosso onde bactérias a con vertem em produtos tóxicos que causam cãibras abdominais e diarreia O problema é ainda mais complicado porque a lactose não digerida e seus metabólitos aumentam a osmola ridade do conteúdo intestinal favorecendo a retenção de água no intestino Na maioria dos lugares do mundo onde a intolerância à lactose é prevalente o leite não é usado como alimento para adultos embora os produtos do leite prédige ridos com lactase estejam comercialmente disponíveis em alguns países Em certas patologias humanas estão ausen tes algumas ou todas as dissacaridases intestinais Nesses casos o distúrbio digestivo ocasionado pelos dissacarídeos da dieta pode ser minimizado por uma dieta controlada Outros monossacarídeos entram na via glicolítica em diversos pontos Na maior parte dos organismos outras hexoses além da gli cose podem sofrer glicólise após a conversão a um derivado fosforilado A Dfrutose presente na forma livre em muitas frutas e formada pela hidrólise da sacarose no intestino del gado de vertebrados é fosforilada pela hexocinase Esta é a principal via de entrada da frutose na glicólise nos músculos e nos rins No fígado a frutose entra por uma via diferente A enzima hepática frutocinase catalisa a fosfori lação da frutose em C1 em vez de C6 HO OH OH O2 O2 OH O O O H H H H H P Glicogênio amido n unidades de glicose Glicogênioamido fosforilase O2 O2 O P Extremidade não redutora CH2OH OH OH O O H H H H H H CH2OH HO OH OH O O H H H H H Glicogênio amido n1 unidades de glicose HO CH2OH OH OH O O H H H H H H CH2OH 1 Glicose1fosfato FIGURA 1412 Degradação do glicogênio intracelular pela glicogê niofosforilase A enzima catalisa o ataque pelo fosfato inorgânico em cor salmão sobre o resíduo glicosil terminal em azul na extremidade não redu tora de uma molécula de glicogênio liberando glicose1fosfato e formando uma molécula de glicogênio com um resíduo de glicose a menos A reação é uma fosforólise não hidrólise Nelson6ed14indd 561 Nelson6ed14indd 561 070414 1427 070414 1427 562 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A frutose1fosfato é então clivada a gliceraldeído e di hidroxiacetonafosfato pela frutose1fosfatoaldolase 1 Gliceraldeído Frutose1fosfato aldolase Frutose1fosfato Dihidroxiacetona fosfato O ƒ ƒ ƒ HCOH H CH2OH C ƒ HCOH CH2OH ƒ HCOH O HOCH C ƒ ƒ ƒ 1 2 3 4 5 6 CH2OPO3 22 ƒ ƒ O C CH2OH CH2OPO3 22 A dihidroxiacetonafosfato é convertida a gliceralde ído3fosfato pela enzima glicolítica triosefosfatoisome rase O gliceraldeído é fosforilado pelo ATP e pela triose cinase a gliceraldeído3fosfato Assim os dois produtos da hidrólise da frutose1fosfato entram na via glicolítica como gliceraldeído3fosfato A Dgalactose produto da hidrólise da lactose açúcar do leite passa pela corrente sanguínea do intestino para o fígado onde é primeiro fosforilada em C1 à custa de ATP pela enzima galactocinase A galactose1fosfato é então convertida ao seu epíme ro em C4 a glicose1fosfato por um conjunto de reações nas quais que o difosfato de uridina UDP funciona como coenzima transportadora de grupos hexoses Figu ra 1413 A epimerização envolve primeiro a oxidação do grupo OH em C4 para uma cetona em seguida a redu ção da cetona para um OH com inversão da configura ção em C4 NAD é o cofator tanto para a oxidação como para a redução A deficiência de qualquer uma das três enzimas dessa via causa galactosemia em humanos Na galactosemia por deficiência de galactocinase altas concentrações de galac tose são encontradas no sangue e na urina Os indivíduos afetados desenvolvem catarata durante a infância causada pela deposição no cristalino de um metabólito da galactose o galactitol DGalactitol CH2OH CH2OH OH H C OH H C HO H C HO H C Os outros sintomas dessa patologia são relativamente leves e a limitação rigorosa de galactose na dieta diminui de modo significativo sua severidade A galactosemia por deficiência da transferase é mais séria ela é caracterizada por retardo do crescimento na infância anormalidade na fala deficiência mental e dano H H H OH CH2OH O HO H OH H H H OH H O CH2OH P O O O H OH Glicose1fosfato UDPglicosegalactose1 fosfatouridiltransferase Mg21 UDPglicose Galactocinase ADP ATP Galactose UDP glicose HO H H HO H H H OH CH2OH O H OH Galactose1fosfato UDPgalactose 4 4 UDP O UDP H H H OH CH2OH O O H OH UDP NAD1 NADH 1 H1 UDPglicose4 epimerase NAD1 NADH 1 H1 UDPglicose4 epimerase FIGURA 1413 Conversão da galactose em glicose1fosfato A con versão ocorre por meio de um derivado açúcarnucleotídeo a UDPgalacto se que é formado quando galactose1fosfato desloca glicose1fosfato da UDPglicose A UDPgalactose é então convertida pela UDPglicose4epi merase a UDPglicose em uma reação que envolve a oxidação de C4 em cor salmão pelo NAD 1 e então a redução de C4 por NADH o resultado é a inversão da configuração em C4 A UDPglicose é regenerada por meio de um novo ciclo das mesmas reações O efeito líquido desse ciclo é a conver são de galactose1fosfato a glicose1fosfato não há produção ou consumo líquido de UDPglicose ou UDPgalactose Nelson6ed14indd 562 Nelson6ed14indd 562 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 563 hepático que pode ser fatal mesmo quando a galacto se é retirada da dieta A galactosemia por deficiência da epimerase leva a sintomas similares porém é menos grave quando a galactose da dieta é cuidadosamente controlada A Dmanose liberada na ingestão de vários polissaca rídeos e glicoproteínas dos alimentos pode ser fosforilada em C6 pela hexocinase fosfato A manose6fosfato é isomerizada pela fosfomanose isomerase gerando frutose6fosfato intermediário da glicólise RESUMO 142 Vias alimentadoras da glicólise c O glicogênio e o amido endógenos as formas de armaze namento da glicose entram na glicólise em um processo de duas etapas A clivagem fosforolítica de um resíduo de glicose de uma extremidade do polímero formando glicose1fosfato é catalisada pela glicogêniofosforila se ou pela amidofosforilase A fosfoglicomutase então converte a glicose1fosfato em glicose6fosfato que pode entrar na glicólise c Os polissacarídeos e os dissacarídeos ingeridos são con vertidos a monossacarídeos por enzimas hidrolíticas in testinais e os monossacarídeos então entram nas célu las intestinais e são transportados para o fígado ou para outros tecidos c Várias Dhexoses incluindo a frutose a galactose e a manose podem entrar na glicólise Cada uma delas é fosforilada e convertida a glicose6fosfato frutose6 fosfato ou frutose1fosfato c A conversão de galactose1fosfato a glicose1fosfato envolve dois derivados nucleotídicos UDPgalactose e UDPglicose Defeitos genéticos em qualquer das três enzimas que catalisam a conversão de galactose em gli cose1fosfato resultam em galactosemias de severidade variada 143 Destinos do piruvato em condições anaeróbias fermentação Em condições aeróbias o piruvato formado na etapa final da glicólise é oxidado a acetato acetilCoA que entra no ciclo do ácido cítrico e é oxidado a CO2 e H2O O NADH formado pela desidrogenação do gliceraldeído3fosfato é finalmente reoxidado a NAD 1 pela transferência de seus elétrons ao O2 na respiração mitocondrial No entanto em condições de hipoxia pouco oxigênio assim como no músculo esquelético muito ativo nos tecidos vegetais submersos nos tumores sólidos ou nas bactérias lácticas o NADH gerado pela glicólise não pode ser reoxidado pelo O2 A falha na regeneração de NAD 1 deixaria a célula carente de aceptor de elétrons para a oxidação de glice raldeído3fosfato e as reações geradoras de energia da glicólise cessariam Portanto NAD 1 deve ser regenerado de outra forma As células primitivas que viviam em uma atmosfera pra ticamente desprovida de oxigênio tiveram que desenvolver estratégias para extrair energia de moléculas combustíveis em condições anaeróbias A maioria dos organismos moder nos reteve a capacidade de regenerar NAD 1 continuamente durante a glicólise anaeróbia pela transferência de elétrons do NADH para formar um produto final reduzido como lac tato ou etanol O piruvato é o receptor final de elétrons na fermentação láctica Quando tecidos animais não podem ser supridos com oxigê nio suficiente para realizar a oxidação aeróbia do piruvato e do NADH produzidos na glicólise NAD 1 é regenerado a partir de NADH pela redução do piruvato a lactato Como mencionado antes alguns tecidos e tipos celulares como os eritrócitos que não possuem mitocôndria e portanto não podem oxidar piruvato até CO2 produzem lactato a partir de glicose mesmo em condições aeróbias A redução do piruvato por essa via é catalisada pela lactatodesidro genase que forma o isômero L do lactato em pH 7 NAD DG98 5 2251 kJmol O 2 2 C CH3 HO O C CH3 Piruvato O O O C C Lactato desidrogenase H LLactato NADH 1 H1 1 O equilíbrio global da reação favorece bastante a formação de lactato como mostrado pela grande variação negativa da energia livre padrão Na glicólise a desidrogenação de duas moléculas de gli ceraldeído3fosfato derivado de cada molécula de glicose converte duas moléculas de NAD 1 a duas de NADH Como a redução de duas moléculas de piruvato em duas de lacta to regenera duas moléculas de NAD 1 não ocorre variação líquida de NAD 1 ou NADH 2 Piruvato 2 Lactato Glicose 2NADH 2NAD1 O lactato formado pelo músculo esquelético em ati vidade ou pelos eritrócitos pode ser reciclado ele é transportado pelo sangue até o fígado onde é convertido em glicose durante a recuperação da atividade muscular exaustiva Quando o lactato é produzido em grande quan tidade durante a contração muscular vigorosa p ex durante uma arrancada a acidificação resultante da io nização do ácido láctico nos músculos e no sangue limita o período de atividade vigorosa Os atletas mais bem con dicionados só podem correr por um minuto em velocidade máxima Quadro 142 Nelson6ed14indd 563 Nelson6ed14indd 563 070414 1427 070414 1427 564 DAVID L NELSON MICHAEL M COX QUADRO 142 Atletas jacarés e celacantos glicólise em concentrações limitantes de oxigênio Os vertebrados são em sua maior parte organismos es sencialmente aeróbios eles convertem glicose em piru vato pela glicólise depois utilizam o oxigênio molecular para oxidar o piruvato a CO2 e H2O O catabolismo anae róbio da glicose a lactato ocorre durante curtos pulsos de atividade muscular extrema por exemplo em uma corrida de 100 m durante a qual o oxigênio não pode ser transportado para os músculos com a rapidez suficiente para oxidar o piruvato Assim os músculos utilizam seus estoques de glicose glicogênio como combustível para gerar ATP por fermentação com lactato como produto final Na arrancada de uma corrida a concentração de lactato no sangue aumenta muito No fígado ele é len tamente convertido em glicose pela gliconeogênese no período de descanso ou recuperação quando então o oxigênio é consumido em taxas gradualmente menores até a velocidade da respiração retornar ao normal O ex cesso de oxigênio consumido no período de recupera ção representa a reposição do débito de oxigênio Essa é a quantidade de oxigênio necessária para suprir ATP para a gliconeogênese durante a recuperação da respi ração para regenerar o glicogênio tomado emprestado do fígado e do músculo para realizar atividade muscular intensa na corrida de velocidade O ciclo de reações que incluem a conversão de glicose em lactato no músculo e a conversão de lactato em glicose no fígado é chamado de ciclo de Cori em homenagem a Carl e Gerty Cori cujos estudos nas décadas de 1930 e 1940 elucidaram a via e seu papel ver Quadro 154 O sistema circulatório da maioria dos vertebrados pequenos consegue transportar oxigênio para os mús culos com rapidez suficiente para evitar o uso anaeróbio de glicogênio muscular Por exemplo os pássaros mi grantes com frequência voam grandes distâncias em alta velocidade sem descansar e sem incorrer em débito de oxigênio Muitos animais velozes de tamanho moderado também mantêm essencialmente um metabolismo aeró bio em seus músculos esqueléticos No entanto o siste ma circulatório de animais de grande porte incluindo o homem não consegue sustentar o metabolismo aeróbio nos músculos esqueléticos por longos períodos de ativi dade muscular intensa Esses animais em geral movem se lentamente em circunstâncias normais e desenvol vem atividade muscular intensa apenas em emergências muito graves já que tal pulso de atividade requer longo período de recuperação para repor o débito de oxigênio Os jacarés e os crocodilos por exemplo são normal mente animais lentos No entanto quando provocados eles sofrem mudanças à velocidade da luz e podem dar chicotadas violentas com suas caudas poderosas Es ses pulsos de atividade intensa são curtos e devem ser seguidos por longos períodos de recuperação Os mo vimentos rápidos de emergência requerem fermenta ção láctica para gerar ATP nos músculos esqueléticos Os estoques musculares de glicogênio são rapidamente consumidos na atividade muscular intensa e o lactato atinge concentrações muito altas em miócitos e no flui do extracelular Enquanto um atleta treinado pode se recuperar de uma corrida de 100 m em 30 minutos ou menos um jacaré pode precisar de muitas horas de des canso e de consumo extra de oxigênio para limpar o ex cesso de lactato de seu sangue e regenerar o glicogênio muscular após um pulso de atividade Outros animais de grande porte como os elefantes e os rinocerontes têm características metabólicas simi lares às dos mamíferos aquáticos como as baleias e as focas Os dinossauros e outros animais de porte enorme agora extintos provavelmente dependiam da fermenta ção láctica para fornecer energia para a atividade mus cular seguida de períodos muito longos de recuperação em que ficavam vulneráveis ao ataque por predadores menores mais capazes de utilizar oxigênio e assim mais bem adaptados para atividades musculares contínuas e sustentadas Explorações do altomar revelaram muitas espécies de vida marinha em grandes profundidades oceânicas onde a concentração de oxigênio é quase zero Por exem plo o celacanto primitivo peixe grande encontrado em profundidades de 4000 m ou mais na costa da África do Sul tem metabolismo essencialmente anaeróbio em quase todos os tecidos Ele converte carboidratos em lactato e em outros produtos sendo que a maior parte deles deve ser excretada Alguns vertebrados marinhos fermentam glicose a etanol e CO2 para gerar ATP Nelson6ed14indd 564 Nelson6ed14indd 564 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 565 Embora a conversão de glicose em lactato compreenda duas etapas de oxidaçãoredução não ocorre variação líqui da no estado de oxidação do carbono na glicose C6H12O6 e no ácido láctico C3H6O3 a relação HC é a mesma To davia parte da energia da molécula da glicose é extraída pela sua conversão em lactato o suficiente para dar um rendimento líquido de duas moléculas de ATP para cada molécula de glicose consumida Fermentação é o termo geral para esse processo que extrai energia como ATP mas não consome oxigênio nem varia as concentrações de NAD 1 ou NADH As fermentações são realizadas por uma grande variedade de organismos muitos deles ocupando nichos anaeróbios e produzindo diversos produtos finais alguns com aproveitamento comercial O etanol é o produto reduzido na fermentação alcoólica Leveduras e outros microrganismos fermentam glicose em etanol e CO2 em vez de lactato A glicose é convertida a piruvato pela glicólise e o piruvato é convertido a etanol e CO2 em um processo de duas etapas O OH NAD O C CH3 Piruvato H O C Álcool desidrogenase NADH 1 H CO2 TPP Mg21 CH3 Acetaldeído Piruvato descarboxilase O2 1 1 C CH2 CH3 Etanol Na primeira etapa o piruvato é descarboxilado em uma rea ção irreversível catalisada pela piruvatodescarboxilase Essa reação é uma descarboxilação simples e não envolve a oxidação do piruvato A piruvatodescarboxilase requer Mg 21 e contém uma coenzima fortemente ligada a tiamina pirofosfato discutida a seguir Na segunda etapa o acetal deído é reduzido a etanol pela ação da álcooldesidroge nase com o poder redutor fornecido pelo NADH derivado da desidrogenação do gliceraldeído3fosfato Essa reação é um caso bem estudado de transferência de grupo hidreto do NADH Figura 1414 Etanol e CO2 são então os pro dutos finais da fermentação etanólica e a equação geral é Glicose 1 2ADP 1 2Pi S 2 etanol 1 2CO2 1 2ATP 1 2H2O Como na fermentação láctica não existe variação líqui da na razão entre átomos de hidrogênio e carbono quan do a glicose razão HC 5 126 5 2 é fermentada a duas moléculas de etanol e duas de CO2 razão HC combina da512652 Em todas as fermentações a razão HC dos reagentes e dos produtos permanece a mesma A piruvatodescarboxilase está presente na levedura utilizada para fabricação de cerveja e pão Saccharomyces cerevisiae e em todos os organismos que fermentam gli cose em etanol incluindo algumas plantas O CO2 produ zido pela piruvatodescarboxilase na levedura da cerveja é responsável pela efervescência característica do champa nhe A antiga arte de fazer cerveja envolve vários proces sos enzimáticos além das reações da fermentação alcoólica Quadro 143 Na panificação o CO2 liberado pela piru vatodescarboxilase quando a levedura é misturada com o açúcar fermentável faz a massa crescer A enzima está ausente em tecidos de vertebrados e em outros organismos que realizam fermentação láctica A álcooldesidrogenase está presente em muitos orga nismos que metabolizam etanol incluindo o homem No fígado ela catalisa a oxidação do etanol ingerido ou produ zido por microrganismos intestinais com a concomitante redução de NAD 1 a NADH Nesse caso a reação segue no sentido oposto àquele envolvido na produção de etanol pela fermentação A tiaminapirofosfato transporta grupos acetaldeído ativos A reação da piruvatodescarboxilase proporciona nos so primeiro encontro com a tiaminapirofosfato TPP Figura 1415 coenzima derivada da vitamina B1 A deficiência de vitamina B1 na dieta humana leva a uma patologia conhecida como beribéri caracterizada pelo acú mulo de fluidos corporais inchaço dor paralisia e em úl tima instância morte A tiaminapirofosfato exerce um papel importante na clivagem de ligações adjacentes ao grupo carboxila como a descarboxilação de acetoácidos e em rearranjos quími cos em que um grupo acetaldeído ativado é transferido de um átomo de carbono para outro Tabela 141 A porção funcional da TPP o anel tiazólico contém um próton rela tivamente ácido em C2 A perda desse próton produz um carbânion que é a espécie ativa nas reações dependentes de TPP Figura 1415 O carbânion ligase prontamente ao grupo carbonil e o anel tiazólico está consequentemente posicionado para atuar como escoadouro de elétrons o que facilita grandemente as reações como a descarboxila ção catalisada pela piruvatodescarboxilase N H H C O NH2 NADH NAD Etanol Acetaldeído CH3 H R H N R C O NH2 C Zn2 O C H H OH CH3 H Álcool desidrogenase Zn 21 do sítio ativo polariza o oxigênio do carbonil do acetaldeído permitindo a transferência de um íon hidreto em vermelho do NADH O intermediário reduzido adquire um próton do meio em azul para formar etanol FIGURA 1414 A reação da álcooldesidrogenase Mecanismo da álcool desidrogenase Nelson6ed14indd 565 Nelson6ed14indd 565 070414 1427 070414 1427 566 DAVID L NELSON MICHAEL M COX As fermentações são usadas para produzir alguns alimentos comuns e reagentes químicos industriais Há milênios a humanidade aprendeu a usar a fermentação na produção e na conservação de alimentos Certos mi crorganismos presentes em alimentos naturais fermentam os carboidratos e geram produtos metabólicos que dão aos alimentos sua forma textura e sabor característicos Os iogurtes já conhecidos no período bíblico são produzidos quando a bactéria Lactobacillus bulgaricus fermenta os carboidratos do leite produzindo ácido láctico a diminui ção do pH resultante causa a precipitação das proteínas do leite produzindo a textura espessa e o sabor ácido do io gurte não adoçado Outra bactéria a Propionibacterium freudenreichii fermenta o leite produzindo ácido propi ônico e CO2 o ácido propiônico precipita as proteínas do leite e as bolhas de CO2 formam os furos característicos do queijo suíço Muitos outros produtos alimentares são QUADRO 143 Fermentações etanólicas fabricando cerveja e produzindo biocombustíveis A produção de cerveja foi uma ciência aprendida cedo na história da humanidade sendo mais tarde aprimorada para a produção em larga escala Os cervejeiros fabricam a cerveja por meio da fermentação etanólica de carboi dratos presentes em grãos de cereais sementes como a cevada realizada pelas enzimas glicolíticas das levedu ras Os carboidratos grandes polissacarídeos devem ser primeiro degradados a dissacarídeos e monossacarídeos No processo chamado de maltagem as sementes da ceva da germinam até formarem as enzimas hidrolíticas neces sárias para a quebra dos polissacarídeos Nesse ponto a germinação é interrompida por aquecimento controlado O produto é o malte o qual contém enzimas que cata lisam a hidrólise das ligações b da celulose e de outros polissacarídeos da parede celular da casca da cevada e enzimas como a aamilase e a maltase Em seguida o cervejeiro prepara o mosto o meio nu triente necessário para a fermentação pelas células das leveduras O malte é misturado com água sendo então macerado Isso permite que as enzimas formadas no processo de maltagem hidrolisem os polissacarídeos dos cereais para formar maltose glicose e outros açúcares simples solúveis em meio aquoso O material celular res tante é separado e o mosto líquido é fervido com lúpulo para dar o sabor O mosto é resfriado e então aerado Agora são adicionadas células de levedura No mos to aeróbio as leveduras crescem e se reproduzem mui to rapidamente usando a energia obtida dos açúcares disponíveis Não é formado etanol durante esse estágio porque as leveduras amplamente supridas com oxigênio oxidam o piruvato formado pela glicólise em CO2 e H2O por meio do ciclo do ácido cítrico Quando todo o oxi gênio dissolvido existente no tanque de fermentação do mosto tiver sido consumido as leveduras mudam para o metabolismo anaeróbio e a partir desse ponto elas fer mentam os açúcares em etanol e CO2 O processo de fer mentação é controlado em parte pela concentração de etanol formado pelo pH e pela quantidade remanescente de açúcar Após a fermentação ter sido interrompida as células são removidas e a cerveja crua está pronta para o processamento final Nas etapas finais da fabricação da cerveja é ajusta da a quantidade de espuma ou colarinho resultante de proteínas dissolvidas Geralmente isto é controlado por enzimas proteolíticas que surgem do processo de malta gem Caso essas enzimas atuem sobre as proteínas por longo período de tempo a cerveja terá colarinho mui to pequeno e ficará choca se elas não agirem por um tempo suficiente a cerveja ficará turva quando gelada Algumas vezes são adicionadas enzimas proteolíticas de outras fontes para controlar a espuma Grande parte da tecnologia desenvolvida para a pro dução de bebidas alcoólicas em larga escala encontra aplicação em um problema inteiramente diferente a produção de etanol como combustível renovável Com a redução contínua dos estoques conhecidos de combus tíveis fósseis e o aumento do custo do combustível para motores de combustão interna existe o aumento do in teresse no uso de etanol como um combustível substitu to ou um complemento A principal vantagem do etanol como combustível é que ele pode ser produzido a partir de fontes relativamente baratas e renováveis ricas em sacarose amido ou celulose amido de milho ou trigo sacarose de beterraba ou cana e celulose de palha de resíduos de indústrias florestais ou de resíduos sólidos domésticos Geralmente a matériaprima é convertida quimicamente primeiro a monossacarídeos então forne cidos como alimento a uma linhagem robusta de levedura em um fermentador em escala industrial Figura Q1 A fermentação pode render não apenas etanol para com bustível mas também subprodutos como proteínas que podem ser usadas para alimentação de animais FIGURA Q1 Fermentações em escala industrial para a produção de bio combustível e outros produtos são realizadas em tanques que compor tam milhares de litros de meio Nelson6ed14indd 566 Nelson6ed14indd 566 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 567 resultantes de fermentações picles chucrute salsicha molho de soja e uma variedade de pratos típicos como kimchi Coreia tempoyak Indonésia kefir Rússia dahi Índia e pozol México A redução do pH associa da à fermentação também ajuda a preservar os alimentos já que a maioria dos microrganismos que causam a dete rioração dos alimentos não cresce em pH baixo Na agri cultura subprodutos vegetais como os colmos de milho são mantidos para o uso na alimentação de animais sendo embalados em grandes silos com acesso de ar limitado a fermentação microbiana produz ácidos que diminuem o pH A silagem resultante desse processo de fermentação pode ser utilizada como alimento animal por longos perío dos sem estragar Em 1910 Chaim Weizmann posteriormente o primeiro presidente de Israel descobriu que a bactéria Clostridium acetobutyricum fermenta amido em butanol e acetona Essa descoberta abriu o campo das fermentações indus triais em que alguns materiais facilmente disponíveis ricos em carboidratos p ex amido de milho ou melaço são fornecidos a uma cultura pura de microrganismos espe cíficos que os fermenta a um produto de valor comercial O P NH2 CH2 O2 2 2 2 2 2 a b Anel de tiazol Acetaldeído ativo CH3 N CH2 N CH2 O O O P OH O C C CH3 NH2 CH2 N N H CH3 5 4 3 2 1 H O Tiaminapirofosfato TPP Hidroxietiltiaminapirofosfato N 1 1 CH3 S O P O CH2 CH2 O O O P O C O N CH3 S R R Estabilização por ressonância CH3 OH CH3 N c OH C H CH3 C CO2 2 O OH C Hidroxietil TPP C CH3 O H C C CH3 S R R C N CH3 S R R C N CH3 S R R C N CH3 S H O 1 1 1 1 9 9 9 9 2 2 H1 O C2 do anel de tiazol da TPP se ioniza O carbânion TPP ataca o grupo carbonil do piruvato A descarboxilação é facilitada pelo deslocamento do elétron no anel tiazólico de TPP A protonação gera hidroxietilTPP A eliminação do cátion tiazol gera acetaldeído Acetaldeído CH3 C H O C Piruvato Carbânion TPP R R N CH3 S R R C H N CH3 S 2 2 C C O CH3 O O 1 1 9 9 H1 H1 H1 TPP ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ FIGURA 1415 Tiaminapirofosfato TPP e seu papel na descarboxi lação do piruvato a TPP é a forma de coenzima da vitamina B1 tiami na O átomo de carbono reativo no anel de tiazol da TPP está mostrado em vermelho Na reação catalisada pela piruvatodescarboxilase dois dos três carbonos do piruvato são transitoriamente transportados pela TPP na forma de um grupo hidroxietil ou acetaldeído ativo b que é subsequentemen te liberado como acetaldeído c O anel de tiazol da TPP estabiliza interme diários carbânion provendo uma estrutura eletrofílica deficiente em elé trons em que os elétrons do carbânion podem ser deslocados por ressonância As estruturas com essa propriedade frequentemente chama das de escoadouros de elétrons desempenham um importante papel em muitas reações bioquímicas aqui facilitando a clivagem da reação carbo nocarbono Mecanismo tiaminapirofosfato Nelson6ed14indd 567 Nelson6ed14indd 567 070414 1427 070414 1427 568 DAVID L NELSON MICHAEL M COX maior O etanol usado para fazer gasohol mistura de 10 de etanol e 90 de gasolina é produzido por fermentação microbiológica assim como os ácidos fórmico acético pro piônico butírico e succínico e os álcoois glicerol metanol isopropanol butanol e butanediol Em geral essas fermen tações são desenvolvidas em grandes tanques fechados em que a temperatura e o acesso de ar são controlados para favorecer a multiplicação dos organismos desejados e ex cluir organismos contaminantes A beleza das fermentações industriais está no fato de que as transformações químicas complexas e de múltiplas etapas são realizadas com grande rendimento e com poucos subprodutos por fábricas quí micas que se autorreproduzem as células microbianas Para algumas fermentações industriais foi desenvolvida a tecnologia para imobilizar as células em um suporte inerte passar a matériaprima continuamente pelo leito de células imobilizadas e coletar o produto desejado no efluente um sonho dos engenheiros RESUMO 143 Destinos do piruvato em condições anaeróbias fermentação c O NADH formado na glicólise deve ser reciclado para regenerar NAD 1 necessário como receptor de elétrons na primeira etapa da fase de pagamento Em condições aeróbias os elétrons passam do NADH para o O2 na res piração mitocondrial c Em condições anaeróbias ou de hipoxia muitos orga nismos regeneram NAD 1 pelo transporte de elétrons do NADH para o piruvato formando lactato Outros organismos como as leveduras regeneram NAD 1 pela redução de piruvato em etanol e CO2 Nesses proces sos anaeróbios fermentações não ocorre oxidação ou redução líquida dos carbonos da glicose c Uma grande variedade de microrganismos pode fermen tar o açúcar de alimentos frescos resultando em mu danças de pH sabor e textura protegendo os alimentos da deterioração As fermentações são usadas na indús tria para produzir uma ampla variedade de compostos orgânicos comercialmente valiosos a partir de matérias primas baratas 144 Gliconeogênese O papel central da glicose no metabolismo surgiu cedo na evolução e esse açúcar permanece sendo combustível qua se universal e unidade estrutural nos organismos atuais desde micróbios até humanos Em mamíferos alguns teci dos dependem quase completamente de glicose para sua energia metabólica Para o cérebro humano e o sistema ner voso assim como para os eritrócitos os testículos a medu la renal e os tecidos embrionários a glicose do sangue é a principal ou a única fonte de combustível Apenas o cérebro requer em média 120 g de glicose por dia mais da metade de toda a glicose estocada como glicogênio nos músculos e no fígado No entanto o suprimento de glicose a partir desses estoques não é sempre suficiente entre as refeições e durante períodos de jejum mais longos ou após exercí cio vigoroso o glicogênio se esgota Para esses períodos os organismos precisam de um método para sintetizar glico se a partir de precursores que não são carboidratos Isso é realizado por uma via chamada de gliconeogênese nova formação de açúcar que converte em glicose o piruvato e os compostos relacionados com três e quatro carbonos A gliconeogênese ocorre em todos os animais vegetais fungos e microrganismos As reações são essencialmente as mesmas em todos os tecidos e em todas as espécies Os pre cursores importantes da glicose em animais são compostos de três carbonos como o lactato o piruvato e o glicerol as sim como certos aminoácidos Figura 1416 Em mamí feros a gliconeogênese ocorre principalmente no fígado e em menor extensão no córtex renal e nas células epiteliais que revestem internamente o intestino delgado A glicose assim produzida passa para o sangue e vai suprir outros te cidos Após exercícios vigorosos o lactato produzido pela glicólise anaeróbia no músculo esquelético retorna para o fígado e é convertido a glicose que volta para os músculos e é convertida a glicogênio circuito chamado de ciclo de Cori Quadro 142 ver também Figura 2319 Em plantas oriundas de sementes as gorduras e as proteínas estoca das nas sementes são convertidas por vias que incluem a gliconeogênese ao dissacarídeo sacarose para o transporte ao longo da planta em desenvolvimento A glicose e seus derivados são precursores para a síntese da parede celular TABELA 141 Algumas reações dependentes de TPP Enzima Vias Ligação clivada Ligação formada Piruvatodescarboxilase Fermentação alcoólica Piruvatodesidrogenase aCetoglutaratodesidrogenase Síntese de acetilCoA Ciclo do ácido cítrico Transcetolase Reações de fixação de carbono Via das pentosesfosfato Nelson6ed14indd 568 Nelson6ed14indd 568 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 569 nucleotídeos coenzimas e uma série de outros metabólitos essenciais das plantas Em muitos microrganismos a glico neogênese inicia a partir de compostos orgânicos simples de dois ou três carbonos como acetato lactato e propiona to presentes em seu meio de crescimento Embora as reações da gliconeogênese sejam as mesmas em todos os organismos o contexto metabólico e a regu lação da via diferem de uma espécie para outra e de teci do para tecido Nesta seção analisase a gliconeogênese e como ela ocorre no fígado de mamíferos No Capítulo 20 é mostrado como organismos fotossintéticos usam essa via para converter os produtos primários da fotossíntese em glicose para ser estocada como sacarose ou amido A gliconeogênese e a glicólise não são vias idênticas cor rendo em direções opostas embora compartilhem várias etapas Figura 1417 sete das 10 reações enzimáticas da gliconeogênese são o inverso das reações glicolíticas No Glicoproteínas Glicose sanguínea Glicogênio Aminoácidos glicogênicos Ciclo do ácido cítrico Glicose6fosfato Outros monossacarídeos Sacarose Dissacarídeos Piruvato Lactato Fosfoenol piruvato 3Fosfoglicerato Fixação do CO2 Triacilgliceróis Glicerol Animais Plantas Amido Energia FIGURA 1416 Síntese de carboidratos a partir de precursores sim ples A via a partir de fosfoenolpiruvato até glicose6fosfato é comum para a conversão biossintética de muitos precursores diferentes de carboidratos de animais e plantas A via partindo de piruvato a fosfoenolpiruvato passa por oxaloacetato um intermediário do ciclo do ácido cítrico discutido no Capítulo 16 Qualquer composto que possa ser convertido a piruvato ou oxaloacetato pode consequentemente servir como material inicial para a gliconeogênese Isso inclui alanina e aspartato que podem ser converti dos a piruvato e oxaloacetato respectivamente e outros aminoácidos que também podem gerar fragmentos de três ou quatro carbonos os chamados aminoácidos glicogênicos ver Tabela 144 ver também Figura 1815 Plan tas e bactérias fotossintetizantes são as únicas capazes de converter CO2 em carboidratos usando o ciclo de Calvin ver Seção 201 Hexocinase Fosfofrutocinase1 Piruvato cinase Glicose6 fosfatase Frutose16 bifosfatase1 Piruvato carboxilase PEP carboxicinase Glicose Pi Glicose 6fosfato Frutose6 fosfato Frutose16 bifosfato 2 Gliceraldeído3 fosfato 2 13Bifosfoglicerato 2 3Fosfoglicerato 2 2Fosfoglicerato 2 Fosfoenolpiruvato 2 Oxaloacetato Dihidroxiacetona fosfato Dihidroxiacetona fosfato Gliconeogênese Glicólise ATP ADP H2O Pi ATP ADP H2O 2Pi 2NADH 1 2H 1 2ADP 2GDP 2GTP 2NAD 1 2Pi 2NADH 1 2H 1 2NAD 1 2ATP 2ADP 2ATP 2ADP 2ATP 2ADP 2 Piruvato 2ATP FIGURA 1417 Vias opostas da glicólise e da gliconeogênese em fíga do de rato As reações da glicólise estão do lado esquerdo em vermelho a via oposta a gliconeogênese está mostrada do lado direito em azul Os principais pontos de regulação da gliconeogênese representados aqui são discutidos posteriormente neste capítulo e em detalhe no Capítulo 15 A Fi gura 1420 ilustra uma rota alternativa para a produção de oxaloacetato na mitocôndria Nelson6ed14indd 569 Nelson6ed14indd 569 070414 1427 070414 1427 570 DAVID L NELSON MICHAEL M COX entanto três reações da glicólise são essencialmente irre versíveis e não podem ser utilizadas na gliconeogênese a conversão de glicose em glicose6fosfato pela hexocinase a fosforilação da frutose6fosfato em frutose16bifosfato pela fosfofrutocinase1 e a conversão de fosfoenolpiruvato em piruvato pela piruvatocinase Figura 1417 Nas célu las essas três reações são caracterizadas por uma grande variação negativa da energia livre enquanto outras reações glicolíticas têm DG próximo de zero Tabela 142 Na glico neogênese as três etapas irreversíveis são contornadas por um grupo distinto de enzimas catalisando reações suficien temente exergônicas para serem efetivamente irreversíveis no sentido da síntese de glicose Assim tanto a glicólise quanto a gliconeogênese são processos irreversíveis nas cé lulas Em animais as duas vias ocorrem principalmente no citosol necessitando de regulação recíproca e coordenada A regulação separada das duas vias é atingida por meio de controles exercidos nas etapas enzimáticas existentes em apenas uma das vias Inicialmente consideramse as três reações de contor no da gliconeogênese Tenha em mente que contorno referese ao contorno das reações irreversíveis da via gli colítica A conversão de piruvato em fosfoenolpiruvato requer duas reações exergônicas A primeira reação de contorno da gliconeogênese é a con versão de piruvato em fosfoenolpiruvato PEP Essa rea ção não pode ocorrer por uma simples inversão da reação da piruvatocinase da glicólise p 554 que tem uma grande variação negativa da energia livre e é portanto irreversível em condições que prevalecem nas células intactas Tabela 142 etapa ➓ Assim a fosforilação do piruvato é alcança da por uma sequência de reações de desvio que em euca riotos requer enzimas existentes tanto no citosol como nas mitocôndrias Como será visto a via representada na Figura 1417 e descrita em detalhes aqui é uma das duas rotas que levam de piruvato a PEP essa é a via predominante quan do piruvato e alanina são os precursores glicogênicos Uma segunda via descrita posteriormente predomina quando o lactato é o precursor glicogênico O piruvato é primeiro transportado do citosol para a mitocôndria ou é gerado dentro da mitocôndria a partir da transaminação da alanina nessa reação o grupamento a amino é transferido da alanina gerando piruvato para um acetoácido carboxílico reações de transaminação são dis cutidas em detalhe no Capítulo 18 A seguir a piruvato carboxilase uma enzima mitocondrial que requer a coen zima biotina converte o piruvato a oxaloacetato Figura 1418 Piruvato 1 HCO3 2 1 ATP Oxaloacetato 1 ADP 1 Pi 144 A reação de carboxilação envolve biotina como transporta dor de bicarbonato ativado como representado na Figura 1419 o mecanismo de reação está esquematizado na Fi gura 1617 Note que HCO3 2 é formado pela ionização do ácido carbônico formado a partir de CO2 1 H2O HCO3 2 é fosforilado por ATP para formar um anidrido híbrido car boxifosfato a seguir a biotina desloca o fosfato na forma ção de carboxibiotina A piruvatocarboxilase é a primeira enzima de regu lação na via gliconeogênica necessitando de acetilCoA como efetor positivo AcetilCoA é produzida pela oxida ção de ácidos graxos Capítulo 17 e seu acúmulo sinaliza a disponibilidade de ácidos graxos como combustíveis Como será visto no Capítulo 16 ver Figura 1616 a rea ção da piruvatocarboxilase pode reconstituir interme diários de outra via metabólica central o ciclo do ácido cítrico Como a membrana mitocondrial não tem transportador para o oxaloacetato antes de ser exportado para o citosol o oxaloacetato formado a partir do piruvato deve ser redu TABELA 142 Variação de energia livre das reações glicolíticas em eritrócitos Etapa da reação glicolítica DG9 kJmol DG kJmol ➊ Glicose 1 ATP glicose6fosfato 1 ADP 2167 2334 ➋ Glicose6fosfato frutose6fosfato 17 0 a 25 ➌ Frutose6fosfato 1 ATP frutose16bifosfato 1 ADP 2142 2222 ➍ Frutose16bifosfato dihidroxiacetonafosfato 1 gliceraldeído3fosfato 238 26 a 0 ➎ Dihidroxiacetonafosfato gliceraldeído3fosfato 75 0 a 4 ➏ Gliceraldeído3fosfato 1 Pi 1 NAD 1 13bifosfoglicerato 1 NADH 1 H 1 63 22 a 2 ➐ 13Bifosfoglicerato 1 ADP 3fosfoglicerato 1 ATP 2188 0 a 2 ➑ 3Fosfoglicerato 2fosfoglicerato 44 0 a 08 ➒ 2Fosfoglicerato fosfoenolpiruvato 1 H2O 75 0 a 33 ➓ Fosfoenolpiruvato 1 ADP piruvato 1 ATP 2314 2167 Nota DG9 é a variação de energia livre padrão como definido no Capítulo 13 p 507508 DG é a variação de energia livre calculada a partir das concentrações reais dos intermediários glicolíticos presentes em condições fisiológicas nos eritrócitos em pH 7 As reações glicolíticas de contorno da gliconeogênese estão mostradas em vermelho As equações bioquímicas não são necessariamente equilibradas para H ou carga p 517 Nelson6ed14indd 570 Nelson6ed14indd 570 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 571 zido a malato pela malatodesidrogenase mitocondrial com o consumo de NADH Oxaloacetato 1 NADH 1 H 1 Lmalato 1 NAD 1 145 A variação de energia livre padrão para esta reação é muito alta mas em condições fisiológicas inclusive uma concentração muito baixa de oxaloacetato o DG 0 e a reação é prontamente reversível A malatodesidrogenase mitocondrial age tanto na gliconeogênese como no ciclo do ácido cítrico mas o fluxo global dos metabólitos nos dois processos ocorre em sentidos opostos O malato deixa a mitocôndria por meio de um transpor tador específico presente na membrana mitocondrial inter na ver Figura 1931 e no citosol ele é reoxidado a oxaloa cetato com a produção de NADH citosólico Malato 1 NAD 1 oxaloacetato 1 NADH 1 H 1 146 O oxaloacetato é então convertido a PEP pela fosfoe nolpiruvatocarboxicinase Figura 1418 Esta reação é dependente de Mg 21 e requer GTP como doador de grupo fosforil Oxaloacetato 1 GTP PEP 1 CO2 1 GDP 147 A reação é reversível em condições intracelulares a for mação de um composto de fosfato de alta energia PEP é balanceada pela hidrólise de outro composto GTP FIGURA 1418 Síntese de fosfoenolpiruvato a partir de piruvato a Na mitocôndria o piruvato é convertido a oxaloacetato em uma reação de pendente de biotina catalisada pela piruvatocarboxilase b No citosol oxaloacetato é convertido a fosfoenolpiruvato pela PEPcarboxicinase O CO2 incorporado na reação da piruvatocarboxilase é perdido aqui como CO2 A descarboxilação leva a um rearranjo de elétrons que facilita o ataque do oxigênio do carbonil da porção piruvato sobre o fosfato g do GTP PO3 HO C 2O b C O C Oxaloacetato O O2 O2 C ATP C 1 O Guanosina PEP carboxicinase Piruvato Biotina Piruvato carboxilase CH3 ADP 1 Pi O Fosfoenolpiruvato O COO2 P O 22 O O P O O2 P O O2 O2 O Bicarbonato O C O2 CO2 1 GTP GDP CH2 C O CH2 O2 a Oxaloacetato NH O N NH O S N NH O S Lys Piruvatocarboxilase ATP ADP Pi Sítio 2 Sítio 1 O braço biotinilLys longo desloca o CO2 do sítio 1 para o sítio 2 Piruvato Oxaloacetato O O O C C CH2 O O O C C CH2 HCO3 CO2 O O C C O O C O O FIGURA 1419 Papel da biotina na reação da piruvatocarboxilase O cofator está covalentemente ligado à enzima por uma ligação amida com o grupo amino de um resíduo de Lys formando uma biotinilenzima A rea ção ocorre em duas fases em dois sítios diferentes da enzima No sítio cata lítico 1 o íon bicarbonato é convertido a CO2 com gasto de ATP Em seguida o CO2 reage com a biotina formando carboxibiotinilenzima O braço longo composto pela biotina e a cadeia lateral da Lys transporta o CO2 da carboxi biotinilenzima para o sítio catalítico 2 na superfície da enzima onde o CO2 é liberado e reage com o piruvato formando oxaloacetato e regenerando o complexo biotinilenzima A função geral dos braços flexíveis no transporte de intermediários de reação entre sítios ativos de enzimas está descrita na Figura 1618 e os detalhes do mecanismo da reação da piruvatocarboxilase estão mostrados na Figura 1617 Mecanismos semelhantes ocorrem em ou tras reações de carboxilação dependentes de biotina como as catalisadas pela propionilCoAcarboxilase ver Figura 1712 e acetilCoAcarboxilase ver Figura 211 Nelson6ed14indd 571 Nelson6ed14indd 571 070414 1427 070414 1427 572 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A equação global para esse conjunto de reações de contor no é a soma das Equações 144 até 147 Piruvato 1 ATP 1 GTP 1 HCO3 2 PEP 1 ADP 1 GDP 1 Pi 1 CO2 148 DG9º 5 09 kJmol Dois grupos fosfato de alta energia um do ATP e um do GTP cada um rendendo em torno de 50 kJmol em condi ções celulares devem ser gastos para fosforilar uma molé cula de piruvato a PEP Ao contrário quando PEP é conver tido a piruvato durante a glicólise apenas um ATP é gerado a partir de ADP Embora a variação da energia livre padrão DG9 o da via de duas etapas da conversão de piruvato em PEP seja de 09 kJmol a variação de energia livre real DG calculada a partir das medidas das concentrações ce lulares dos intermediários é altamente negativa 225 kJ mol isso é consequência do consumo rápido de PEP em outras reações de modo que sua concentração permanece relativamente baixa A reação é assim efetivamente irrever sível na célula Observe que o CO2 adicionado ao piruvato na etapa ca talisada pela piruvatocarboxilase é a mesma molécula per dida na reação da PEPcarboxicinase Figura 1418b Essa sequência de carboxilaçãodescarboxilação representa uma forma de ativação do piruvato em que a descarboxilação do oxaloacetato facilita a formação de PEP No Capítulo 21 será visto como uma sequência similar de carboxilaçãodes carboxilação é usada para ativar acetilCoA para a síntese de ácidos graxos ver Figura 211 Existe uma lógica na rota dessas reações na mitocôn dria A relação NADHNAD 1 no citosol é 8 3 10 24 cerca de 10 5 vezes menor do que na mitocôndria Como o NADH citosólico é consumido na gliconeogênese na conversão de 13bifosfoglicerato em gliceraldeído3fosfato Figura 14 17 a biossíntese de glicose não pode ocorrer a menos que o NADH esteja disponível O transporte de malato da mito côndria ao citosol e a sua conversão a oxaloacetato transfe re efetivamente equivalentes redutores para o citosol onde eles são escassos Consequentemente essa transformação de piruvato em PEP proporciona um importante equilíbrio entre NADH produzido e consumido no citosol durante a gliconeogênese Um segundo contorno piruvato S PEP predomina quando o lactato é o precursor glicogênico Figura 14 20 Essa via faz uso do lactato produzido pela glicólise nos eritrócitos ou no músculo em anaerobiose por exemplo sendo particularmente importante em vertebrados após exercício vigoroso Quadro 142 A conversão de lactato em piruvato no citosol de hepatócitos gera NADH e a ex portação de equivalentes redutores como malato da mi tocôndria é consequentemente desnecessária Depois que o piruvato produzido na reação da lactatodesidrogenase é transportado para a mitocôndria ele é convertido a oxa loacetato pela piruvatocarboxilase como descrito antes Esse oxaloacetato no entanto é convertido diretamente a PEP pela isoenzima mitocondrial da PEPcarboxicinase e o PEP é transportado para fora da mitocôndria para dar continuidade à via gliconeogênica As isoenzimas mitocon driais e citosólicas da PEPcarboxicinase são codificadas por genes separados nos cromossomos nucleares propor cionando outro exemplo de duas enzimas distintas catali sando a mesma reação mas em localizações celulares ou com papéis metabólicos diferentes lembrese das isoenzi mas da hexocinase A conversão de frutose16bifostato a frutose6fosfato é o segundo contorno A segunda reação glicolítica que não pode participar da gli coneogênese é a fosforilação da frutose6fosfato pela PFK 1 Tabela 142 etapa ➌ Como essa reação é altamente exergônica e por isso irreversível em células intactas a geração de frutose6fosfato a partir de frutose16bifosfa to Figura 1417 é catalisada por uma enzima diferente dependente de Mg 21 a frutose16bifosfatase FBPa se1 que promove a hidrólise essencialmente irreversível Malato desidrogenase citosólica Malato desidrogenase mitocondrial PEP carboxicinase citosólica PEPcarboxicinase mitocondrial Piruvato carboxilase Lactato desidrogenase Piruvato carboxilase Piruvato Piruvato Oxaloacetato Malato Malato Oxaloacetato CO2 PEP CO2 Oxaloacetato Piruvato Lactato PEP CO2 NAD Mitocôndria Citosol Piruvato NADH H NAD NADH H NAD NADH H CO2 FIGURA 1420 Vias alternativas da transformação do piruvato em fosfoenolpiruvato A importância relativa das duas vias depende da dis ponibilidade de lactato ou piruvato e das necessidades citosólicas de NADH para gliconeogênese A via à direita predomina quando o lactato é o precur sor já que NADH citosólico é gerado na reação da lactatodesidrogenase e não pode ser transportado para fora da mitocôndria ver texto A necessi dade de ATP para a piruvatocarboxilase e GTP para PEPcarboxicinase ver Figura 1417 está omitida para simplificação Nelson6ed14indd 572 Nelson6ed14indd 572 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 573 do fostato em C1 não a transferência do grupo fosforil para o ADP Frutose16bifosfato 1 H2O Frutose6fosfato 1 Pi DG9º 5 2163 kJmol A FBPase1 é assim chamada para distinguila de outra en zima similar FBPase2 com função de regulação discuti da no Capítulo 15 A conversão de glicose6fosfato em glicose é o terceiro contorno O terceiro contorno é a reação final da gliconeogênese a desfosforilação da glicose6fosfato para formar glicose Fi gura 1417 O inverso da reação da hexocinase p 548 exigiria a transferência de um grupo fosforil da glicose6 fosfato para ADP formando ATP reação energeticamente desfavorável Tabela 142 etapa ➊ A reação catalisada pela glicose6fosfatase não requer a síntese de ATP sen do a hidrólise simples de uma ligação éster fosfato Glicose6fosfato 1 H2O glicose 1 Pi DG9º 5 2138 kJmol Essa enzima ativada por Mg 21 é encontrada no lúmen do retículo endoplasmático de hepatócitos de células renais e das células epiteliais do intestino delgado ver Figura 1530 mas não é encontrada em outros tecidos que são portanto incapazes de fornecer glicose para o sangue Se outros tecidos tivessem a glicose6fosfatase essa atividade enzimática hidrolisaria a glicose6fosfato necessária para a glicólise nesses tecidos A glicose produzida pela gliconeo gênese no fígado nos rins ou ingerida na dieta é entregue a esses outros tecidos inclusive o cérebro e os músculos pela corrente sanguínea A gliconeogênese é energeticamente dispendiosa mas essencial A soma das reações biossintéticas que levam de piruvato até glicose livre no sangue Tabela 143 é 2 Piruvato 1 4ATP 1 2NADH 1 2H 1 1 4H2O glicose 1 4ADP 1 2GDP 1 6Pi 1 2NAD 1 149 Para cada molécula de glicose formada a partir do piruvato seis grupos fosfato de alta energia são consumidos quatro na forma de ATP e dois na forma de GTP Além disso duas moléculas de NADH são necessárias para a redução de duas moléculas de 13bifosfoglicerato Evidentemente a Equa ção 149 não é simplesmente o inverso da equação para a conversão de glicose em piruvato pela glicólise que exigiria apenas duas moléculas de ATP Glicose 1 2ADP 1 2Pi 1 NAD1 2 piruvato 1 2ATP 1 2NADH 1 2H 1 2H2O A síntese de glicose a partir de piruvato é um processo relativamente dispendioso A maior parte desse alto custo energético é necessária para assegurar a irreversibilidade da gliconeogênese Em condições intracelulares a varia ção de energia livre padrão da glicólise é pelo menos 263 kJmol Nas mesmas condições o DG global da gliconeo gênese é 216 kJmol Logo tanto a glicólise como a glico neogênese são processos essencialmente irreversíveis nas células Uma segunda vantagem em investir energia para converter piruvato em glicose é que se o piruvato fosse excretado seu considerável potencial para formação de ATP pela completa oxidação aeróbia seria perdido mais de 10 ATP são formados por piruvato como será visto no Capítulo 16 TABELA 143 Reações sequenciais na gliconeogênese a partir do piruvato Piruvato 1 HCO3 2 1 ATP oxaloacetato 1 ADP 1 Pi 32 Oxaloacetato 1 GTP fosfoenolpiruvato 1 CO2 1 GDP 32 Fosfoenolpiruvato 1 H2O 2fosfoglicerato 32 2Fosfoglicerato 3fosfoglicerato 32 3Fosfoglicerato 1 ATP 13bifosfoglicerato 1 ADP 32 13Bifosfoglicerato 1 NADH 1 H 1 gliceraldeído3fosfato 1 NAD 1 1 Pi 32 Gliceraldeído3fosfato dihidroxiacetonafosfato Gliceraldeído3fosfato 1 dihidroxiacetonafosfato frutose16bifosfato Frutose16bifosfato frutose6fosfato 1 Pi Frutose6fosfato glicose6fosfato Glicose6fosfato 1 H2O glicose 1 Pi Soma 2 Piruvato 1 4ATP 1 2GTP 1 2NADH 1 2H 1 1 4H2O glicose 1 4ADP 1 2GDP 1 6Pi 1 2NAD 1 Nota As reações de contorno estão em vermelho todas as outras reações são etapas reversíveis da glicólise Os números à direita indicam que a reação é para ser contada duas vezes já que dois precursores de três carbonos são necessários para fazer uma molécula de glicose As reações necessárias para substituir o NADH citosólico consumido na reação da gliceraldeído3fosfatodesidrogenase a conversão de lactato a piruvato no citosol ou o transporte de equivalentes redutores da mitocôndria para o citosol na forma de malato não estão consideradas neste resumo As equações bioquímicas não estão necessariamente equilibradas para H e carga elétrica p 517 Nelson6ed14indd 573 Nelson6ed14indd 573 070414 1427 070414 1427 574 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os intermediários do ciclo do ácido cítrico e alguns aminoácidos são glicogênicos A via biossintética para a formação de glicose descrita an teriormente permite a síntese líquida de glicose não ape nas a partir de piruvato mas também dos intermediários do ciclo do ácido cítrico com quatro cinco e seis carbonos Capítulo 16 Citrato isocitrato acetoglutarato succinil CoA succinato fumarato e malato todos são intermediá rios do ciclo do ácido cítrico que podem sofrer oxidação a oxaloacetato ver Figura 167 Alguns ou todos os átomos de carbono da maior parte dos aminoácidos derivados das proteínas são basicamente catabolizados a piruvato ou em intermediários do ciclo do ácido cítrico Tais aminoácidos podem portanto ser convertidos a glicose e são chamados de glicogênicos Tabela 144 A alanina e a glutamina as principais moléculas que transportam grupos amino de tecidos extrahepáticos até o fígado ver Figura 189 são aminoácidos glicogênicos particularmente importantes em mamíferos Após a retirada de seus grupos amino da mito côndria dos hepatócitos os esqueletos de carbono rema nescentes piruvato e acetoglutarato respectivamente são prontamente canalizados para a gliconeogênese Os mamíferos não podem converter ácidos graxos em glicose Nos mamíferos não ocorre a conversão líquida de ácidos graxos em glicose Como será visto no Capítulo 17 o ca tabolismo da maior parte dos ácidos graxos gera apenas acetilCoA Os mamíferos não podem usar a acetilCoA como um precursor de glicose já que a reação da piruva todesidrogenase é irreversível e as células não possuem outra via para converter acetilCoA em piruvato Os ve getais as leveduras e muitas bactérias possuem uma via o ciclo do glioxilato ver Figura 1622 para converter acetilCoA em oxaloacetato portanto esses organismos podem utilizar ácidos graxos como matériaprima para a gliconeogênese Isso é importante durante a germinação das sementes por exemplo antes de o desenvolvimento das folhas e a fotossíntese fornecerem energia e carboi dratos as plântulas contam com os estoques de óleo das sementes para a produção de energia e para a biossíntese da parede celular Apesar de os mamíferos não converterem ácidos graxos em carboidrato eles podem usar a pequena quantidade de glicerol produzido na quebra das gorduras triacilglice róis para a gliconeogênese A fosforilação do glicerol pela glicerolcinase seguida pela oxidação do carbono central gera dihidroxiacetonafosfato intermediário da gliconeo gênese no fígado Como será visto no Capítulo 21 o glicerolfosfato é um intermediário essencial na síntese de triacilgliceróis nos adipócitos mas essas células carecem da glicerolcinase e portanto não podem simplesmente fosforilar o glicerol Em vez disso os adipócitos realizam uma versão truncada da gliconeogênese conhecida como gliceroneogênese a conversão de piruvato em dihidroxiacetonafosfato pe las reações iniciais da gliconeogênese seguida pela redu ção da dihidroxiacetonafosfato em glicerolfosfato ver Figura 2121 A glicólise e a gliconeogênese são mutuamente reguladas Se a glicólise a conversão de glicose em piruvato e a gli coneogênese a conversão de piruvato em glicose ocorres sem simultaneamente em altas taxas o resultado seria o consumo de ATP e a produção de calor Por exemplo PFK 1 e FBPase1 catalisam reações opostas A soma dessas duas reações é ATP 1 H2O ADP 1 Pi 1 calor Essas duas reações enzimáticas e várias outras nas duas vias são reguladas alostericamente e por modificações co valentes fosforilação No Capítulo 15 serão vistos os me canismos desta regulação em detalhe Por ora basta dizer que as vias são reguladas de forma que quando o fluxo de glicose por meio da glicólise aumenta o fluxo de piruvato em direção à glicose diminui e viceversa RESUMO 144 Gliconeogênese c A gliconeogênese é um processo ubíquo e de múltiplas etapas em que a glicose é produzida a partir de lacta to piruvato ou oxaloacetato ou qualquer composto incluindo os intermediários do ciclo do ácido cítrico que possa ser convertido a um desses intermediários Sete etapas da gliconeogênese são catalisadas pelas TABELA 144 Aminoácidos glicogênicos agrupados conforme o local de entrada Piruvato Alanina Cisteína Glicina Serina Treonina Triptofano aCetoglutarato Arginina Glutamato Glutamina Histidina Prolina SuccinilCoA Isoleucina Metionina Treonina Valina Fumarato Fenilalanina Tirosina Oxaloacetato Asparagina Aspartato Nota Todos esses aminoácidos são precursores da glicose sanguínea ou do gli cogênio hepático já que eles podem ser convertidos a piruvato ou intermediários do ciclo do ácido cítrico Dos 20 aminoácidos comuns apenas a leucina e a lisina são incapazes de fornecer carbonos para a síntese líquida de glicose Esses aminoácidos também são cetogênicos ver Figura 1815 Nelson6ed14indd 574 Nelson6ed14indd 574 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 575 mesmas enzimas usadas na glicólise essas são as rea ções reversíveis c Três etapas irreversíveis na glicólise são contornadas por reações catalisadas pelas enzimas gliconeogênicas 1 a conversão de piruvato em PEP via oxaloacetato catalisada pela piruvatocarboxilase e pela PEPcarbo xicinase 2 a desfosforilação da frutose16bifosfato pela FBPase1 e 3 a desfosforilação da glicose6fos fato pela glicose6fosfatase c A formação de uma molécula de glicose a partir de piru vato requer 4 ATP 2 GTP e 2NADH o que é dispendioso c Em mamíferos a gliconeogênese no fígado nos rins e no intestino delgado gera glicose para uso pelo cérebro músculos e eritrócitos c A piruvatocarboxilase é estimulada por acetilCoA au mentando a taxa da gliconeogênese quando as células dispõem do fornecimento adequado de outros substra tos ácidos graxos para a produção de energia c Os animais não conseguem converter acetilCoA deri vado dos ácidos graxos em glicose vegetais e micror ganismos sim c A glicólise e a gliconeogênese são mutuamente regula das para prevenir o gasto operacional com as duas vias ao mesmo tempo 145 Oxidação da glicose pela via das pentosesfosfato Na maioria dos tecidos animais o principal destino ca tabólico da glicose6fosfato é a degradação glicolítica até piruvato cuja maior parte é então oxidada pelo ciclo do ácido cítrico levando enfim à formação de ATP No entanto a glicose6fosfato tem outros destinos catabólicos que le vam a produtos especializados necessários para a célula De grande importância em alguns tecidos é a oxidação da glicose6fosfato até pentosesfosfato pela via das pento sesfosfato também chamada de via do fosfogliconato ou via da hexosemonofosfato Figura 1421 Nessa via de oxidação NADP 1 é o aceptor de elétrons gerando NADPH As células que se dividem rapidamente como aquelas da medula óssea da pele e da mucosa intestinal assim como aquelas de tumores utilizam a pentose ribo se5fosfato para fazer RNA DNA e coenzimas como ATP NADH FADH2 e coenzima A Em outros tecidos o produto essencial da via das pentosesfosfato não é pentose mas o doador de elétrons NADPH necessário para as reduções biossintéticas ou para contrapor os efeitos deletérios dos radicais de oxigênio Os tecidos em que ocorre a síntese de grande quantidade de ácidos graxos fígado tecido adiposo glândulas mamárias durante a lactação ou a síntese muito ativa de colesterol e hormônios esteroides fígado glândulas suprarrenais e gônadas utilizam o NADPH produzido por essa via Os eritrócitos e as células da córnea e do cristalino estão di retamente expostos ao oxigênio e por isso aos efeitos da nosos dos radicais livres gerados pelo oxigênio Por manter um ambiente redutor uma relação alta de NADPH para NADP 1 assim como da forma reduzida para a forma oxidada da glutationa essas células podem impedir ou recuperar o dano oxidativo de proteínas lipídeos e outras moléculas sensíveis Nos eritrócitos o NADPH produzido pela via das pentosesfosfato é tão importante em impedir o dano oxida tivo que um defeito genético na glicose6fosfatodesidro genase a primeira enzima da via pode causar levando a sérias consequências médicas Quadro 144 A fase oxidativa produz pentosesfosfato e NADPH A primeira reação da via das pentosesfosfato Figura 14 22 é a oxidação da glicose6fosfato pela glicose6fos fatodesidrogenase G6PD para formar 6fosfoglicona dlactona um éster intramolecular NADP 1 é o aceptor de elétrons e o equilíbrio global está muito deslocado no sentido da formação de NADPH A lactona é hidrolisada ao ácido livre 6fosfogliconato por uma lactonase específica que sofre oxidação e descarboxilação pela 6fosfoglicona todesidrogenase para formar a cetopentose ribulose5 fosfato a reação gera uma segunda molécula de NADPH Essa ribulose5fosfato é importante na regulação da glicó lise e da gliconeogênese como será visto no Capítulo 15 A fosfopentoseisomerase converte a ribulose5fosfato ao seu isômero aldose ribose5fosfato Em alguns tecidos Fase não oxidativa Fase oxidativa Glicose6fosfato 6Fosfogliconato CO2 Ribulose5fosfato Ribose5fosfato Nucleotídeos coenzimas DNA RNA NADP1 NADPH NADPH 2 GSH GSSG Ácidos graxos esteróis etc Precursores Transcetolase transaldolase Glutationa redutase Biossíntese redutora NADP1 NADPH FIGURA 1421 Esquema geral da via das pentosesfosfato O NADH formado na fase oxidativa é utilizado para produzir glutationa GSSG ver Quadro 144 e dar suporte para a biossíntese redutora O outro produto da fase oxidativa é a ribose5fosfato que serve como precursor para nucleotí deos coenzimas e ácidos nucleicos Em células que não estão utilizando a ribose5fosfato para a biossíntese a fase não oxidativa regenera seis mo léculas da pentose em cinco moléculas da hexose glicose6fosfato permi tindo a produção contínua de NADPH e convertendo glicose6fosfato em seis ciclos a CO2 Nelson6ed14indd 575 Nelson6ed14indd 575 070414 1427 070414 1427 576 DAVID L NELSON MICHAEL M COX a via das pentosesfosfato termina nesse ponto e a equação global é Glicose6fosfato 1 2NADP 1 1 H2O ribose5fosfato 1 CO2 1 2NADPH 1 2H 1 O resultado líquido é a produção de NADPH agente redutor para as reações biossintéticas e ribose5fosfato precursor para a síntese de nucleotídeos QUADRO 144 MEDICINA Por que Pitágoras não comia falafel deficiência da glicose6fosfatodesidrogenase O feijãofava ingrediente do falafel tem sido uma im portante fonte de alimento no Mediterrâneo e no Orien te Médio desde a Antiguidade O filósofo e matemático grego Pitágoras proibia seus seguidores de alimentarse de fava talvez porque ela deixasse muitas pessoas doen tes com uma condição chamada de favismo que pode ser fatal No favismo os eritrócitos começam a sofrer lise 24 a 48 horas após a ingestão dos feijões liberando hemo globina livre no sangue podendo resultar em icterícia e algumas vezes em falência renal Sintomas similares po dem ocorrer com a ingestão do fármaco contra a malária primaquina ou antibióticos de sulfa ou após a exposição a certos herbicidas Esses sintomas têm uma base ge nética a deficiência de glicose6fosfatodesidrogenase G6PD que afeta em torno de 400 milhões de pessoas em todo o mundo A maioria dos indivíduos deficientes em G6PD é assintomática Apenas a combinação da de ficiência de G6PD e certos fatores ambientais produz as manifestações clínicas A glicose6fosfatodesidrogenase catalisa a primei ra etapa da via das pentosesfosfato ver Figura 1422 que produz NADPH Esse agente redutor essencial em muitas vias biossintéticas também protege as células do dano oxidativo causado pelo peróxido de hidrogênio H2O2 e pelos radicais livres superóxido agentes oxi dantes altamente reativos gerados como subprodutos metabólicos e pela ação de fármacos como a primaquina e produtos naturais como a divicina o ingrediente tóxi co do feijãofava Durante a destoxificação normal H2O2 é convertido a H2O pela glutationa reduzida sob a ação da glutationaperoxidase e a glutationa oxidada é con vertida de volta à forma reduzida por glutationaredutase e NADPH Figura Q1 O H2O2 também é degradado a H2O e O2 pela catalase que também requer NADPH Em indivíduos deficientes em G6PD a produção de NADPH está diminuída e a destoxificação do H2O2 está inibida Os danos celulares resultantes são peroxidação de lipídeos levando à degradação das membranas dos eritrócitos e oxidação de proteínas e do DNA A distribuição geográfica da deficiência de G6PD é instrutiva Frequências tão altas quanto 25 ocorrem na África tropical em partes do Oriente Médio e sul da Ásia áreas onde a malária é mais prevalente Além de tais observações epidemiológicas estudos mostram que o crescimento do parasita causador da malária Plasmo dium falciparum é inibido em eritrócitos deficientes em G6PD O parasita é muito sensível ao dano oxidativo e morre por um nível de estresse oxidativo tolerável ao hospedeiro humano deficiente em G6PD Já que a van tagem da resistência à malária equilibra a desvantagem da baixa resistência ao dano oxidativo a seleção natural mantém o genótipo deficiente em G6PD em populações humanas onde a malária é prevalente Apenas em con dições insuportáveis de estresse oxidativo causado por fármacos herbicidas ou divicina a deficiência de G6PD causa problemas médicos graves Supõese que um fármaco antimalária como a prima quina atue causando estresse oxidativo ao parasita É irônico que os fármacos contra a malária possam causar doenças em humanos pelo mesmo mecanismo bioquími co que leva à resistência à malária A divicina também age como fármaco antimalária e a ingestão de feijãofava pode proteger contra a malária Recusandose a comer falafel muitos pitagóricos com atividade normal da G6PD talvez inconscientemente tenham aumentado o risco de contrair malária Respiração mitocondrial radiação ionizante sulfa medicamentos herbicidas antimaláricos divicina Danos oxidativos para lipídeos proteínas DNA O2 2 O2 2H1 H1 e2 OH H2O2 H2O 2H2O Radical superóxido Peróxido de hidrogênio Radical livre hidroxil NADP1 NADPH H1 1 Glicose6 fosfato 2GSH GSSG 6Fosfo gliconodlactona Glicose6 fosfato desidrogenase G6PD Glutationa redutase Glutationaperoxidase e2 FIGURA Q1 Papel do NADPH e da glutationa na proteção das células con tra derivados de oxigênio altamente reativos A glutationa reduzida GSH protege a célula por destruir o peróxido de hidrogênio e os radicais livres hidroxil A regeneração de GSH a partir de sua forma oxidada GSSG requer a produção de NADPH na reação da glicose6fosfatodesidrogenase Nelson6ed14indd 576 Nelson6ed14indd 576 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 577 A fase não oxidativa recicla as pentosesfosfato a glicose6fosfato Em tecidos que requerem principalmente NADPH as pentosesfosfato produzidas na fase oxidativa da via são recicladas em glicose6fosfato Nessa fase não oxidativa a ribulose5fosfato é primeiro epimerizada a xilulose5 fosfato CH2OH O C OH H OH H C C CH2OPO3 22 CH2OH O C HO H OH H C C CH2OPO3 22 Ribulose5 fosfato epimerase Ribulose5 fosfato Xilulose5fosfato A seguir em uma série de rearranjos dos esqueletos de carbono Figura 1423 seis moléculas de açúcarfos fato de cinco átomos de carbono são convertidas a cinco moléculas de açúcarfosfato com seis átomos de carbono completando o ciclo e permitindo a oxidação contínua de glicose6fosfato com a produção de NADPH A reciclagem contínua leva finalmente à conversão de glicose6fosfato a seis CO2 Duas enzimas exclusivas da via das pentoses fosfato agem nessas interconversões de açúcares a trans cetolase e a transaldolase A transcetolase catalisa a transferência de um fragmento de dois carbonos de uma cetose doadora a uma aldose aceptora Figura 1424a Em sua primeira aparição na via das pentosesfosfato a transcetolase transfere C1 e C2 da xilulose5fosfato para a ribose5fosfato formando o produto de sete carbo nos sedoeptulose7fosfato Figura 1424b O fragmento de três carbonos remanescente da xilulose é o gliceralde ído3fosfato Em seguida a transaldolase catalisa uma reação se melhante à reação da aldolase na glicólise um fragmento de três carbonos é removido da sedoeptulose7fosfato e condensado com o gliceraldeído3fosfato formando frutose6fosfato e a tetrose eritrose4fosfato Figura 1425 Neste ponto a transcetolase age novamente for mando frutose6fosfato e gliceraldeído3fosfato a partir de eritrose4fosfato e xilulose5fosfato Figura 1426 Duas moléculas de gliceraldeído3fosfato formadas por duas repetições dessas reações podem ser convertidas a uma molécula de frutose16bifosfato como na glico neogênese Figura 1417 e finalmente a FBPase1 e a fosfohexoseisomerase convertem frutose16bifosfato a glicose6fosfato No total seis pentosesfosfato são con vertidas a cinco hexosesfosfato Figura 1423b agora o ciclo está completo A transcetolase requer o cofator tiaminapirofosfato TPP que estabiliza um carbânion de dois carbonos nes sa reação Figura 1427a da mesma forma que o faz na reação da piruvatodescarboxilase Figura 1415 A transaldolase usa a cadeia lateral de uma Lys para formar a base de Schiff com o grupo carbonil de seu substrato a cetose dessa forma estabilizando o carbânion Figura 1427b que é central para o mecanismo da reação 1H1 6fosfogliconato desidrogenase CO2 NADP1 NADPH DRibose 5fosfato 3 HCOH ƒ ƒ HCOH ƒ CH2OPO22 ƒ HCOH CHO CH2OH O C 3 DRibulose 5fosfato ƒ 22 ƒ HCOH ƒ ƒ HCOH CH2OPO HCOH ƒ Glicose6 fosfato ƒ ƒ HCOH HOCH HCOH ƒ ƒ HC O 3 22 CH2OPO HOCH O ƒ O2 C 6Fosfogliconato ƒ HCOH ƒ ƒ HCOH ƒ HCOH 3 22 CH2OPO Fosfopentose isomerase Lactonase H2O Glicose6fosfato desidrogenase 1 H1 NADP1 NADPH Mg21 Mg21 Mg21 HC O 6Fosfoglicono dlactona ƒ O C HOCH ƒ HCOH ƒ ƒ HCOH ƒ 3 22 CH2OPO FIGURA 1422 Reações oxidativas da via das pentosesfosfato Os produtos finais são ribose5fosfato CO2 e NADPH Nelson6ed14indd 577 Nelson6ed14indd 577 070414 1427 070414 1427 578 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Sedoeptulose7 fosfato Frutose16 difosfatase Gliceraldeído3 fosfato Frutose 6 fosfato Eritrose4 fosfato Xilulose5 fosfato Transcetolase Transaldolase Transcetolase Xilulose5 fosfato Gliceraldeído3 fosfato Frutose6 fosfato Glicose 6fosfato Aldolase Triosefosfato isomerase Ribose 5fosfato Epimerase a Fosfohexose isomerase Reações oxidativas da via das pentosesfosfato 6C 6C 6C 6C b 7C 5C 5C 4C 3C 6C 3C 5C 4C 3C 7C 3C Isomerase 5C 5C 5C FIGURA 1423 Reações não oxidativas da via das pentosesfosfato a Essas reações convertem pentosesfosfato a hexosesfosfato permitindo a continuação das reações de oxidação ver Figura 1422 A transcetolase e a transaldolase são específicas dessa via as outras enzimas também participam das vias glicolítica e gliconeogênica b Diagrama esquemático mostrando a via a partir de seis pentoses 6C a cinco hexoses 5C Note que isto envolve dois grupos de interconversões mostrados em a Todas as reações mostradas aqui são reversíveis setas unidirecionais são usadas apenas para deixar claro o sentido das reações durante a oxidação contínua da glicose6fosfato Nas reações independentes de luz da fotossíntese o sentido dessas reações é invertido ver Figura 2010 C O CHOH Cetose doadora Aldose aceptora TPP Transcetolase a CH2OH R2 C O R1 CHOH R1 CH2OH C O R2 O C H H Xilulose5 fosfato Ribose5 fosfato Gliceraldeído3 fosfato Sedoeptulose7 fosfato TPP Transcetolase b C O CH2OH C O O C C H H OH C H OH C CH2OPO3 2 H OH H C H OH C H OH C CH2OPO3 2 H OH C CH2OPO3 2 H OH C HO H C CH2OPO3 2 CH2OH C O C HO H H OH FIGURA 1424 A primeira reação catalisada pela transcetolase a A reação geral catalisada pela transcetolase é a transferência de um grupo de dois carbonos transportado temporariamente pela TPP ligada à enzima de uma cetose doadora para uma aldose aceptora b Conversão de duas pentoses fosfato em uma triosefosfato e um açúcarfosfato de sete carbonos sedoeptulose7fosfato Nelson6ed14indd 578 Nelson6ed14indd 578 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 579 O processo descrito na Figura 1422 é conhecido como a via oxidativa das pentosesfosfato A primeira e a terceira etapa são oxidações com grandes variações ne gativas de energia livre padrão e são essencialmente irre versíveis na célula As reações da parte não oxidativa da via das pentosesfosfato Figura 1423 são prontamente reversíveis e assim também proporcionam uma maneira de converter hexosesfosfato a pentosesfosfato Como será visto no Capítulo 20 o processo que converte hexoses fosfato a pentosesfosfato é crucial para a fixação fotos sintética de CO2 pelas plantas Essa via a via redutora das pentosesfosfato é essencialmente o inverso das reações mostradas na Figura 1423 e utiliza muitas das mesmas enzimas Todas as enzimas da via das pentosesfosfato estão lo calizadas no citosol como aquelas da glicólise e a maioria das enzimas da gliconeogênese De fato essas três vias estão conectadas por meio de vários intermediários e en zimas compartilhados O gliceraldeído3fosfato formado pela ação da transcetolase é prontamente convertido a di hidroxiacetonafosfato pela enzima glicolítica triosefosfa toisomerase e essas duas trioses podem ser unidas pela aldolase como na gliconeogênese formando frutose16bi fosfato Alternativamente a triosefosfato pode ser oxidada a piruvato pelas reações glicolíticas O destino das trioses é determinado pelas necessidades relativas das células por pentosesfosfato NADPH e ATP 1 Gliceraldeído3 fosfato Eritrose4 fosfato Frutose6 fosfato Transaldolase O C 1 H C CH2OPO3 22 H OH C H OH C CH2OPO3 22 H OH C CH2OPO3 22 H OH C O H C H OH C HO H Sedoeptulose7 fosfato C H OH C H OH C CH2OPO3 22 H OH C HO H CH2OH C O CH2OH C O FIGURA 1425 A reação catalisada pela transaldolase 1 Gliceraldeído3 fosfato Eritrose4 fosfato Frutose6 fosfato Transcetolase 1 C CH2OPO3 22 H OH O C H C H OH C H OH C CH2OPO3 22 H OH C CH2OPO3 22 H OH C O H C HO H Xilulose5 fosfato C H OH CH2OPO3 22 C HO H CH2OH C O CH2OH C O TPP FIGURA 1426 A segunda reação catalisada pela transcetolase a Transcetolase b Transaldolase OH C2 C2 HOH2C C C C C R N N H S TPP H R9 CH3 CH2OH 2 1 3 4 5 OH HOH2C C R N S R9 CH3 Estabilização por ressonância Estabilização por ressonância 1 1 Lys Lys OH C N H H CH2OH OH Base de Schiff protonada FIGURA 1427 Intermediários carbânions estabilizados por intera ções covalentes com a transcetolase e a transaldolase a O anel da TPP estabiliza o carbânion no grupo hidroxietil transportado pela transceto lase ver Figura 1415 para a química da ação da TPP b Na reação da transal dolase a base de Schiff protonada formada entre o grupo amino da cadeia lateral de uma Lys e o substrato estabiliza o carbânion C3 formado após a clivagem aldólica Nelson6ed14indd 579 Nelson6ed14indd 579 070414 1427 070414 1427 580 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A síndrome de WernickeKorsakoff é exacerbada por um defeito na transcetolase A síndrome de WernickeKorsakoff é um distúrbio cau sado por uma deficiência grave de tiamina componen te da TPP A síndrome é mais comum entre pessoas alcoóla tras do que na população em geral porque o consumo crônico e intenso de álcool interfere com a absorção intestinal de tiamina A síndrome pode ser exacerbada por uma mutação no gene da transcetolase que resulta em uma enzima com baixa afinidade por TPP uma afinidade dez vezes menor que a normal Esse defeito torna os indivíduos muito mais sensíveis à deficiência de tiamina mesmo uma deficiência moderada de tiamina tolerável por indivíduos com transce tolase não mutada faz o nível de TPP cair abaixo daquele necessário para saturar a enzima O resultado é uma redução da velocidade de toda via das pentosesfosfato Em pessoas com a síndrome de WernickeKorsakoff isso resulta no agra vamento dos sintomas que podem incluir perda severa da memória confusão mental e paralisia parcial A glicose6fosfato é repartida entre a glicólise e a via das pentosesfosfato A entrada da glicose6fosfato na glicólise ou na via das pentosesfosfato depende das necessidades momentâne as da célula e da concentração de NADP 1 no citosol Na ausência deste aceptor de elétrons a primeira reação da via das pentosesfosfato catalisada por G6PD não pode prosseguir Quando a célula está convertendo rapidamente NADPH em NADP 1 em reduções biossintéticas o nível de NADP 1 elevase estimulando alostericamente G6PD e des sa forma aumentando o fluxo de glicose6fosfato pela via das pentosesfosfato Figura 1428 Quando a demanda por NADPH é menor o nível de NADP 1 diminui a via das pentosesfosfato também diminui e a glicose6fosfato é usada para alimentar a glicólise RESUMO 145 Oxidação da glicose pela via das pentosesfosfato c A via oxidativa das pentosesfosfato via do fosfoglico nato ou via da hexosemonofosfato realiza a oxidação e a descarboxilação da glicose6fosfato em C1 redu zindo NADP 1 em NADPH e produzindo as pentoses fosfato c O NADPH fornece a força redutora para as reações bios sintéticas e a ribose5fosfato é um precursor para a síntese de nucleotídeos e ácidos nucleicos Tecidos em crescimento rápido e tecidos realizando biossíntese ati va de ácidos graxos colesterol ou hormônios esteroides enviam mais glicose6fosfato para a via das pentoses fosfato do que os tecidos com menor demanda por pen tosesfosfato e poder redutor c A primeira fase da via das pentosesfosfato consiste em duas oxidações que convertem glicose6fosfato a ribu lose5fosfato e reduzem NADP 1 a NADPH A segunda fase compreende etapas não oxidativas que convertem pentosesfosfato a glicose6fosfato que inicia o ciclo novamente c Na segunda fase a transcetolase com TPP como co fator e a transaldolase catalisam a interconversão de açúcares de três quatro cinco seis e sete átomos de carbono com a conversão reversível de seis pentoses fosfato a cinco hexosesfosfato Nas reações de fixação de carbono da fotossíntese as mesmas enzimas catali sam o processo inverso a via redutora das pentoses fosfato a conversão de cinco hexosesfosfato a seis pentosesfosfato c Um defeito genético da transcetolase provoca a diminui ção da sua afinidade por TPP e agrava a síndrome de WernickeKorsakoff c A entrada de glicose6fosfato na via glicolítica ou na via das pentosesfosfato é basicamente determinada pelas concentrações relativas de NADP 1 e NADPH Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário glicólise 544 fermentação 544 fermentação láctica 546 hipoxia 546 fermentação etanólica alcoólica 546 isoenzimas 548 acilfosfato 552 fosforilação no nível do substrato 553 fosforilação ligada à respiração 553 fosfoenolpiruvato PEP 554 mutases 560 isomerases 560 intolerância à lactose 561 galactosemia 562 tiaminapirofosfato TPP 565 gliconeogênese 568 biotina 570 via das pentoses fosfato 575 via do fosfogliconato 575 via da hexose monofosfato 575 Glicose Glicose6 fosfato Via das pentoses fosfato 6fosfo gliconolactona Pentoses fosfato Glicólise ATP NADPH NADPH FIGURA 1428 Papel do NADPH na regulação da partilha da glico se6fosfato entre a glicólise e a via das pentosesfosfato Quando NADPH é formado mais rápido do que está sendo consumido para biossín tese e redução da glutationa ver Figura 1421 a NADPH aumenta e inibe a primeira enzima da via das pentosesfosfato Como resultado mais glicose6 fosfato está disponível para glicólise Nelson6ed14indd 580 Nelson6ed14indd 580 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 581 Leituras adicionais Geral Fruton JS 1999 Proteins Genes and Enzymes The Interplay of Chemistry and Biology Yale University Press New Haven Este texto inclui uma detalhada consideração histórica sobre a pesquisa em glicólise Glicólise Boiteux A Hess B 1981 Design of glycolysis Philos Trans R Soc Lond Ser B Biol Sci 293 522 Uma revisão de nível intermediário da via e da visão clássica de seu controle Dandekar T Schuster S Snel B Huynen M Bork P 1999 Pathway alignment application to the comparative analysis of glycolytic enzymes Biochem J 343 115124 Uma revisão de nível intermediário sobre a visão bioinformática da evolução da glicólise Dang CV Semenza GL 1999 Oncogenic alterations of metabolism Trends Biochem Sci 24 6872 Uma breve revisão sobre as bases moleculares para o aumento da glicólise em tumores Erlandsen H Abola EE Stevens RC 2000 Combining structural genomics and enzymology completing the picture in metabolic pathways and enzyme active sites Curr Opin Struct Biol 10 719730 Uma revisão de nível intermediário sobre as estruturas das enzimas glicolíticas Gatenby RA Gillies RJ 2004 Why do cancers have high aerobic glycolysis Nat Rev Cancer 4 891899 Hardie DG 2000 Metabolic control a new solution to an old problem Curr Biol 10 R757R759 Harris AL 2002 Hypoxiaa key regulatory factor in tumour growth Nat Rev Cancer 2 3847 Heinrich R MelendezHevia E Montero F Nuno JC Stephani A Waddell TD 1999 The structural design of glycolysis an evolutionary approach Biochem Soc Trans 27 294298 Herling A König M Bulik S Holzhütter HG 2011 Enzymatic features of the glucose metabolism in tumor cells FEBS J 278 24362459 Keith B Simon MC 2007 Hypoxiainducible factors stem cells and cancer Cell 129 465472 Revisão de nível intermediário Knowles J Albery WJ 1977 Perfection in enzyme catalysis the energetics of triose phosphate isomerase Acc Chem Res 10 105111 Kresge N Simoni RD Hill RL 2005 Otto Fritz Meyerhof and the elucidation of the glycolytic pathway J Biol Chem 280 e3 Uma breve revisão sobre os artigos clássicos que também estão disponíveis online Kritikou E 2006 p53 turns on the energy switch Nat Rev Mol Cell Biol 7 552553 Pelicano H Martin DS Zu RH Huang P 2006 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publicação em 2001 como um conjunto de quatro volumes agora é mantida online wwwommbidcom Ela contém descrições dos aspectos clínicos bioquímicos e genéticos de centenas de doenças metabólicas humanas uma fonte autorizada e leitura fascinante Wood T 1985 The Pentose Phosphate Pathway Academic Press Inc Orlando FL Wood T 1986 Physiological functions of the pentose phosphate pathway Cell Biochem Funct 4 241247 Problemas 1 Equação para a fase preparatória da glicólise Es creva equações bioquímicas equilibradas para todas as reações do catabolismo da glicose em duas moléculas de gliceraldeí do3fosfato a fase preparatória da glicólise incluindo a va riação de energia livre padrão para cada reação Depois es creva a equação global ou líquida para a fase preparatória da glicólise com a variação de energia livre padrão líquida 2 Fase de pagamento da glicólise em músculo esque lético No músculo esquelético em atividade sob condições anaeróbias o gliceraldeído3fosfato é convertido a piruvato a fase de pagamento da glicólise e o piruvato é reduzido a lac tato Escreva as equações equilibradas para todas as reações desse processo com a variação de energia livre padrão para cada reação Depois escreva a equação global ou líquida para a fase de pagamento da glicólise com o lactato como produto final incluindo a variação de energia livre padrão líquida 3 Os transportadores GLUT Compare a localização de GLUT4 com a de GLUT2 e GLUT3 e explique por que essas localizações são importantes na resposta do músculo do tecido adiposo do cérebro e do fígado à insulina 4 Produção de etanol em leveduras As leveduras S cerevisiae quando crescem anaerobiamente em meio com glicose convertem piruvato em acetaldeído e então reduzem o acetaldeído em etanol usando elétrons do NADH Escreva a equação para a segunda reação e calcule sua constante de equilíbrio a 25C utilizando os potenciais de redução padrão que estão na Tabela 137 5 Variações energéticas da reação da aldolase A aldo lase catalisa a reação glicolítica Frutose16bifosfato gliceraldeído3fosfato 1 dihidroxiacetonafosfato A variação de energia livre padrão para esta reação no sentido descrito é 1238 kJmol As concentrações dos três interme diários no hepatócito de um mamífero são frutose16bifosfa to 14 3 10 25 M gliceraldeído3fosfato 3 3 10 26 M dihidro xiacetonafosfato 16 3 10 25 M Qual é a variação de energia livre para essa reação na temperatura corporal 37C 6 O caminho dos átomos na fermentação Um experi mento de pulso e caça usando fontes de carbono marcadas com 14C é realizado em extrato de levedura mantida em condi ções rigorosas de anaerobiose para produzir etanol O experi mento consiste na incubação de pequena quantidade do subs trato marcado com 14C o pulso com o extrato de levedura apenas o tempo necessário para cada intermediário da via de fermentação tornarse marcado A marcação é então caçada ao longo da via pela adição de excesso de glicose não marcada A caça impede efetivamente qualquer entrada adicional de gli cose marcada na via a Se 1 14Cglicose glicose marcada em C1 com 14C é utilizada como substrato qual é a localização do 14C no etanol produzido Explique b Onde teria que estar localizado 14C na glicose inicial para assegurar que toda atividade do 14C seja liberada como 14CO2 durante a fermentação a etanol Explique 7 O calor das fermentações Os fermentadores indus triais de larga escala geralmente requerem resfriamento cons tante e eficaz Por quê 8 A fermentação para a produção de molho de soja Molho de soja é preparado por fermentação de uma mistura salgada de feijão de soja e trigo com vários microrganismos incluindo leveduras ao longo de um período de 8 a 12 meses O molho resultante depois da remoção dos sólidos é rico em lactato e etanol Como esses dois compostos são produzidos Para evitar que o molho de soja tenha um gosto forte de vina gre vinagre é ácido acético diluído o oxigênio deve ser man tido fora do tanque de fermentação Por quê Nelson6ed14indd 582 Nelson6ed14indd 582 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 583 9 Equivalência das triosesfosfato Gliceraldeído3 fosfato marcado com 14C foi adicionado a um extrato de le vedura Após um curto período de tempo foi isolada fruto se16bifosfato marcada com 14C em C3 e C4 Qual era a localização do 14C no gliceraldeído3fosfato inicial De onde veio a segunda marcação com 14C na frutose16bifosfato Explique 10 Atalho da glicólise Suponha que você descobriu uma levedura mutante cuja via glicolítica foi encurtada devido à presença de uma nova enzima que catalisa a reação Gliceraldeído3fosfato 1 H2O 3Fosfoglicerato NAD1 NADH1 H1 O encurtamento da via glicolítica resultante beneficiaria a cé lula Explique 11 Papel da lactatodesidrogenase Durante ativida de intensa a demanda por ATP no tecido muscular aumenta muito Nos músculos das pernas do coelho ou no músculo das asas do peru o ATP é produzido quase exclusivamente por fer mentação láctica O ATP é formado na fase de pagamento da glicólise por meio de duas reações promovidas pela fosfogli ceratocinase e pela piruvatocinase Suponha que o músculo esquelético seja desprovido da lactatodesidrogenase Poderia ele desenvolver atividade física vigorosa ou seja gerar ATP em alta taxa pela glicólise Explique 12 Eficiência da produção de ATP no músculo A trans formação de glicose a lactato nos miócitos libera apenas em torno de 7 da energia livre liberada quando a glicose é com pletamente oxidada a CO2 e H2O Isso significa que a glicólise anaeróbia no músculo é um desperdício de glicose Explique 13 Variação da energia livre para a oxidação das trio sesfosfato A oxidação do gliceraldeído3fosfato a 13bi fosfoglicerato catalisada pela gliceraldeído3fosfatodesidro genase ocorre com uma constante de equilíbrio desfavorável K9eq 5 008 DG9 5 63 kJmol mas o fluxo por esse ponto da via glicolítica ocorre facilmente Como a célula supera o equilí brio desfavorável 14 Envenenamento por arsenato A arsenato é estru tural e quimicamente similar ao fosfato inorgânico Pi e muitas enzimas que necessitam de fosfato também usariam o arsenato No entanto os compostos orgânicos de arsenato são menos estáveis do que os compostos de fosfato análogos Por exemplo acilarsenatos se decompõem rapidamente por hidrólise O 1 2 O O O 2 As O C R H2O O 1 1 2 O O O 2 1 2 As O C R H HO Por outro lado acilfosfatos como o 13bifosfoglicerato são mais estáveis e são transformados nas células por meio de ação enzimática a Antecipe o efeito na reação líquida catalisada pela gliceraldeído3fosfatodesidrogenase se o fosfato fosse subs tituído por arsenato b Qual seria a consequência para um organismo se o fos fato fosse substituído por arsenato O arsenato é muito tóxico para a maioria dos organismos Explique por quê 15 Necessidade de fosfato para a fermentação alcoó lica Em 1906 Harden e Young em uma série de estudos clás sicos sobre a fermentação da glicose a etanol e CO2 por extratos de leveduras de cerveja fizeram as seguintes observações 1 Fosfato inorgânico foi essencial para a fermentação quando o suprimento de fosfato esgotava a fermentação parava antes que toda a glicose fosse utilizada 2 Durante a fermentação nessas condições havia acúmulo de etanol CO2 e uma hexose bifosfato 3 Quando arsenato era substituído por fosfato a hexosebifosfato não se acumulava e a fermentação ocorria até que toda glicose fosse convertida a etanol e CO2 a Por que a fermentação cessa quando o suprimento de fosfato se esgota b Por que etanol e CO2 se acumulam A conversão de piruvato em etanol e CO2 é essencial Por quê Identifique a hexosebifosfato que se acumula Por que ela se acumula c Por que a substituição de fosfato por arsenato previne o acúmulo da hexosebifosfato mas permite que a fermentação a etanol e CO2 se complete ver Problema 14 16 Papel da vitamina niacina Adultos engajados em exercício físico intenso requerem para nutrição adequada uma ingestão de cerca de 160 g de carboidrato diariamente mas apenas em torno de 20 mg de niacina Dado o papel da niacina na glicólise como você explica essa observação 17 Síntese do glicerolfosfato O glicerol3fosfato ne cessário para a síntese de glicerofosfolipídeos pode ser sinte tizado a partir de um intermediário glicolítico Proponha uma sequência de reações para essa conversão 18 Gravidade dos sintomas clínicos devido à de ficiência de enzimas Os sintomas clínicos das duas formas de galactosemia deficiência de galactocinase ou de UDPglicosegalactose1fosfatouridiltransferase mostram severidades radicalmente diferentes Embora os dois tipos pro voquem desconforto gástrico após a ingestão de leite a defi ciência da transferase também leva a disfunções do fígado dos rins do baço do cérebro e finalmente à morte Quais produtos se acumulam no sangue e nos tecidos em cada tipo de deficiên cia enzimática Estime as toxicidades relativas desses produ tos a partir da informação acima 19 Definhamento dos músculos durante o jejum prolon gado Uma consequência do jejum prolongado é a redução da massa muscular O que acontece com as proteínas musculares 20 A via dos átomos na gliconeogênese Um extrato de fígado capaz de realizar todas as reações metabólicas normais do fígado é incubado por um curto período em experimentos distintos com os seguintes precursores marcados com 14C a 14CBicarbonato b 114CPiruvato HO 14C O O C O 14COO CH3 Nelson6ed14indd 583 Nelson6ed14indd 583 070414 1427 070414 1427 584 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Trace a via de cada precursor ao longo da gliconeogênese In dique a localização do 14C em todos os intermediários e no pro duto a glicose 21 Custo energético de um ciclo de glicólise e glico neogênese Qual é o custo em equivalentes de ATP de transformar glicose em piruvato pela via glicolítica e de este voltar à glicose pela gliconeogênese 22 Relação entre gliconeogênese e glicólise Por que é importante que a gliconeogênese não seja o inverso exato da glicólise 23 Variações energéticas da reação da piruvatoci nase Explique em termos bioenergéticos como a conversão de piruvato a fosfoenolpiruvato na gliconeogênese supera a grande variação negativa da energia livre padrão da reação da piruvatocinase na glicólise 24 Substratos glicogênicos Um procedimento comum para determinar a eficiência de um composto como precursor de glicose em mamíferos é manter um animal faminto até que os estoques de glicogênio do fígado sejam consumidos e então administrar o composto em questão O substrato que levar a um aumento líquido do glicogênio hepático é chamado de gli cogênico porque ele deve ser primeiro convertido a glicose6 fosfato Mostre por meio de reações enzimáticas conhecidas quais substratos a seguir são glicogênicos a Succinato OOC CH2 CH2 b Glicerol CH2 OH C OH H CH2 OH c AcetilCoA CH3 C SCoA d Piruvato CH3 C O O COO e Butirato CH3 CH2 CH2 COO COO 25 O etanol afeta os níveis de glicose no sangue O consumo de álcool etanol especialmente após perío dos de atividade intensa ou depois de várias horas sem comer resulta em uma deficiência de glicose no sangue uma condição conhecida como hipoglicemia A primeira etapa no metabolis mo do etanol pelo fígado é a oxidação a acetaldeído catalisada pela álcooldesidrogenase hepática CH3CH2OH 1 NAD 1 CH3CHO 1 NADH 1 H 1 Explique como essa reação inibe a transformação de lactato em piruvato Por que isso leva à hipoglicemia 26 Níveis de lactato no sangue durante exercício in tenso As concentrações de lactato no plasma sanguíneo an tes durante e depois de uma corrida de 400 m estão mostradas no gráfico a O que causa o rápido aumento na concentração de lactato b O que causa o declínio da concentração de lactato após o término da corrida Por que o declínio ocorre mais lentamen te do que o aumento c Por que a concentração de lactato não é zero durante o estado de repouso 0 150 Tempo min 100 50 60 40 Antes 0 200 Corrida Depois 20 Lactato no sangue mM 27 Relação entre frutose16bifosfato e os ní veis de lactato no sangue Um defeito congênito na enzima hepática 16bifosfatase resulta em níveis de lactato anormalmente altos no plasma sanguíneo Explique 28 Efeito da florizina no metabolismo dos carboidra tos A florizina um glicosídeo tóxico da casca da pereira blo queia a reabsorção normal de glicose no túbulo renal fazendo com que a glicose presente no sangue seja quase completa mente excretada na urina Em um experimento ratos alimen tados com florizina e succinato de sódio excretaram cerca de 05 mol de glicose sintetizada por gliconeogênese para cada 1 mol de succinato de sódio ingerido Como o succinato é trans formado em glicose Explique a estequiometria O C O OH OH OH HO H OH H H OH H HOCH2 CH2 H O Florizina CH2 29 Excesso de captação de oxigênio durante a glico neogênese O lactato absorvido pelo fígado é convertido em glicose com o consumo de 6 móis de ATP por mol de glicose produzida A extensão desse processo em uma preparação de fígado de rato pode ser monitorada pela administração de 14C lactato e pela medida da quantidade de 14Cglicose produzida Como a estequiometria entre o consumo de O2 e a produção de ATP é conhecida cerca de 5 ATP por O2 podese predizer o consumo extra de O2 acima da velocidade normal quando uma dada quantidade de lactato é administrada No entanto quando o O2 extra utilizado na síntese de glicose a partir de lactato é efetivamente medido é sempre maior que o predito pela relação estequiométrica conhecida Sugira uma explica ção possível para essa observação Nelson6ed14indd 584 Nelson6ed14indd 584 070414 1427 070414 1427 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 585 30 Papel da via das pentosesfosfato Se a oxidação da glicose6fosfato pela via das pentosesfosfato estivesse sendo utilizada para gerar principalmente NADPH para reações de biossíntese o outro produto ribose5fosfato se acumularia Que problemas isto poderia causar Problema de análise de dados 31 Criando um sistema de fermentação A fermentação de matéria vegetal para a produção de etanol combustível é um método potencial para reduzir o uso de combustíveis fósseis e assim as emissões de CO2 que levam ao aquecimento global Muitos microrganismos podem degradar celulose e então fer mentar a glicose a etanol No entanto muitas fontes potenciais de celulose incluindo resíduos da agricultura e switchgrass Panicum virgatum gramínea perene nativa da América do Norte também contêm quantidades substanciais de arabino se que não é tão facilmente fermentada DArabinose H O C C C C CH2OH H H HO H OH OH A Escherichia coli é capaz de fermentar arabinose a eta nol mas a bactéria não é naturalmente tolerante a altos níveis de etanol dessa forma limitando sua utilidade para a produ ção de etanol comercial Outra bactéria Zymomomas mobi lis é naturalmente tolerante a altos níveis de etanol mas não pode fermentar arabinose Deanda Zhang Eddy e Picataggio 1996 descreveram seus esforços para combinar as principais características úteis desses dois organismos introduzindo os genes das enzimas metabolizadoras de arabinose de E coli em Z mobilis a Por que essa é uma estratégia mais simples que o inver so criar E coli mais tolerante a etanol Deanda e colaboradores inseriram cinco genes de E coli no genoma de Z mobilis araA codifica Larabinoseisomera se que interconverte Larabinose em Lribulose araB Lribu locinase que usa ATP para fosforilar Lribulose em C5 araD Lribulose5fosfatoepimerase que interconverte Lribulose5 fosfato em Lxilulose5fosfato talB transaldolase e tktA transcetolase b Descreva brevemente a transformação química catali sada por cada uma das três enzimas ara e quando possível indique uma enzima discutida neste capítulo que realize uma reação análoga Os cinco genes de E coli inseridos em Z mobilis permi tiram a entrada da arabinose na fase não oxidativa da via das pentosesfosfato Figura 1423 na qual ela foi convertida em glicose6fosfato e fermentada a etanol c As três enzimas converteram enfim a arabinose em que açúcar d O produto da parte c alimenta a via mostrada na Fi gura 1423 Combinando as cinco enzimas de E coli listadas com as enzimas dessa via descreva a via global para a fermen tação de seis moléculas de arabinose a etanol e Qual é a estequiometria da fermentação de seis molé culas de arabinose a etanol e CO2 Quantas moléculas de ATP você esperaria que essa reação gerasse f Zymomonas mobilis utiliza uma via para a fermenta ção etanólica levemente diferente daquela descrita neste ca pítulo Como resultado o rendimento de ATP esperado é ape nas 1 ATP por molécula de arabinose Apesar disso ser menos benéfico para a bactéria é melhor para a produção de etanol Por quê Outro açúcar comumente encontrado em material vegetal é a xilose DXilose H O C C C C CH2OH H HO H OH OH H g Quais enzimas adicionais você precisaria introduzir na linhagem de Z mobilis modificada descrita anteriormente para capacitála a usar xilose assim como arabinose para pro duzir etanol Você não precisa nomear as enzimas elas nem mesmo devem existir apenas cite as reações que elas preci sariam catalisar Referência Deanda K Zhang M Eddy C Picataggio S 1996 Development of an arabinosefermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering Appl Environ Microbiol 62 44654470 Nelson6ed14indd 585 Nelson6ed14indd 585 070414 1427 070414 1427 Nelson6ed14indd 586 Nelson6ed14indd 586 070414 1427 070414 1427 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 151 Regulação das vias metabólicas 588 152 Análise do controle metabólico 596 153 Regulação coordenada da glicólise e da gliconeogênese 601 154 Metabolismo do glicogênio nos animais 612 155 Regulação coordenada da síntese e da degradação do glicogênio 620 A regulação metabólica tema central em bioquímica é um dos aspectos mais marcantes dos organismos vivos Entre os milhares de reações catalisadas por enzimas que ocorrem nas células é provável que não exista uma que escape de alguma forma de regulação Essa necessidade de regular cada aspecto do metabolismo celular se torna clara quando se examina a complexidade das sequências de rea ções metabólicas Embora para o estudante de bioquímica seja conveniente dividir os processos metabólicos em vias que desempenham papéis distintos na economia celular tal separação não existe na célula viva Ao contrário cada via discutida neste livro está indissociavelmente entrelaçada em uma rede multidimensional de reações com todas as outras vias celulares Figura 151 Por exemplo no Ca pítulo 14 foram discutidos quatro destinos possíveis para a glicose6fosfato em um hepatócito degradação pela glicólise para a produção de ATP degradação na via das pentosesfosfato para a produção de NADPH e pentoses fosfato usados na síntese de polissacarídeos complexos da matriz extracelular ou hidrólise em glicose e fosfato para repor a glicose sanguínea Na verdade a glicose6fosfato tem outros destinos possíveis nos hepatócitos ela pode por exemplo ser usada para a síntese de outros açúcares como glicosamina galactose galactosamina fucose e ácido neu ramínico para a glicosilação de proteínas ou pode ser par cialmente degradada para fornecer acetilCoA para a sín tese de ácidos graxos e esteróis E a bactéria Escherichia coli pode usar a glicose para produzir o esqueleto carbônico de cada um dos seus vários milhares de tipos de moléculas Quando uma célula qualquer utiliza a glicose6fosfato para um propósito essa decisão afeta todas as outras vias nas quais esse açúcar é precursor ou intermediário qualquer mudança na distribuição da glicose6fosfato para uma via afeta direta ou indiretamente o fluxo de metabólitos por todas as outras Tais mudanças na distribuição são comuns na vida das células Louis Pasteur foi o primeiro a descrever o aumen to de mais de 10 vezes no consumo de glicose em uma cultura de leveduras quando a cultura foi transferida da condição aeróbia para a anaeróbia Esse efeito Pasteur ocorre sem mudança significativa nas concentrações de ATP ou da maioria das centenas de intermediários meta bólicos e produtos derivados da glicose Ocorre efeito se melhante nas células do músculo esquelético quando um corredor dispara na linha de largada A capacidade da cé lula de executar simultaneamente todos esses processos metabólicos conectados obter cada produto na quanti dade necessária e no tempo certo diante de grandes per turbações do meio externo e sem gerar sobras é uma impressionante realização Este capítulo utiliza o metabolismo da glicose para ilustrar alguns princípios gerais da regulação metabólica Primeiro aborda as funções gerais da regulação na manu tenção da homeostasia metabólica e apresenta a análise do controle metabólico um sistema de análise quantitativa de interações metabólicas complexas Descreve as proprieda des reguladoras específicas das enzimas do metabolismo da glicose no Capítulo 14 descreve as atividades catalíticas das enzimas da glicólise e da gliconeogênese Também dis cute as propriedades catalíticas e reguladoras das enzimas da síntese e da degradação do glicogênio um dos casos me lhor estudados de regulação metabólica Observe que ao selecionar o metabolismo de carboidratos para ilustrar os princípios da regulação metabólica foi separado artificial mente o metabolismo das gorduras e dos carboidratos Na verdade essas duas atividades estão firmemente integra das como será visto no Capítulo 23 15 Princípios da Regulação Metabólica Nelson6ed15indd 587 Nelson6ed15indd 587 020514 1722 020514 1722 588 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 151 Regulação das vias metabólicas As vias do metabolismo da glicose fornecem na direção ca tabólica a energia essencial para se opor às forças de en tropia e na direção anabólica precursores biossintéticos e uma forma de armazenamento da energia metabólica Essas reações são tão importantes para a sobrevivência que me canismos reguladores muito complexos evoluíram para as segurar que os metabólitos se desloquem ao longo de cada via na direção e na velocidade corretas para combinar exa tamente com as condições variáveis da célula ou do orga nismo Quando as condições externas se alteram são feitos ajustes na velocidade do fluxo metabólico ao longo de uma via completa por uma grande variedade de mecanismos que operam em escalas de tempo diferentes As condições mudam às vezes de forma drástica Por exemplo a demanda por ATP nos músculos de voo dos in setos aumenta 100 vezes em poucos segundos quando o in seto alça voo Nos humanos a disponibilidade de oxigênio pode ser reduzida devido à hipoxia redução da liberação de oxigênio aos tecidos ou à isquemia redução do fluxo sanguíneo para os tecidos As proporções relativas de car boidrato gordura e proteína na dieta variam de acordo com a refeição e o suprimento de combustíveis obtido na dieta é intermitente o que exige ajustes metabólicos entre as re feições e durante períodos de jejum A cicatrização exige Metabolismo de outros aminoácidos Metabolismo dos aminoácidos Metabolismo dos lipídeos Metabolismo dos carboidratos Metabolismo energético Biossíntese e metabolismo de glicanos Metabolismo de cofatores e vitaminas Metabolismo dos nucleotídeos VIAS METABÓLICAS Biossíntese de metabólitos secundários Biodegradação de xenobióticos FIGURA 151 O metabolismo como malha tridimensional Uma típica célula eucariótica tem a capacidade de produzir cerca de 30000 proteínas dife rentes que catalisam milhares de reações diferentes envolvendo muitas centenas de metabólitos muitos deles compartilhados por mais de uma via Nesta imagem resumida e muito simplificada das vias metabólicas cada ponto representa um composto intermediário e cada linha de conexão representa uma reação enzimática Consulte no banco de dados KEGG PATHWAY wwwgenomeadjpkeggpathwaymapmap01100html um diagrama do metabolismo mais realístico e muito mais complexo Neste mapa interativo cada ponto pode ser clicado para se obter dados adicionais sobre o composto e as enzimas das quais ele é substrato A capa deste livro mostra as reações entrelaçadas que ocorrem na mitocôndria Nelson6edbookindb 588 Nelson6edbookindb 588 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 589 quantidades muito grandes de energia e de precursores biossintéticos As células e os organismos mantêm um estado estável dinâmico Combustíveis como glicose entram na célula e resíduos como o CO2 saem dela mas a massa e a composição total de uma célula de um órgão ou de um animal adulto não se alteram de modo significativo ao longo do tempo as célu las e os organismos existem em um estado estável dinâmi co Para cada reação metabólica em uma via o substrato é fornecido pela reação precedente na mesma velocidade na qual é convertido em produto Assim apesar de a velo cidade v da vazão metabólica ou fluxo por essa etapa da via poder ser alta e variável a concentração do subs trato S permanece constante Assim para a reação em duas etapas quando v1 5 v2 S é constante Por exemplo alterações na v1 da entrada da glicose no sangue a partir de várias fontes é equilibrada por alterações na v2 da captação da glicose por vários tecidos a partir do sangue de forma que a concentração do açúcar no sangue S se mantém quase constante em 5 mM Isso é homeostasia no nível molecular As falhas nos mecanismos homeostáticos são frequentemente a causa de doenças humanas No diabe tes melito por exemplo a regulação da concentração san guínea da glicose é deficiente como resultado da falta ou da insensibilidade à insulina com consequências clínicas profundas Quando a perturbação externa não é meramente tran sitória ou quando um tipo de célula se transforma em outro os ajustes na composição celular e no metabolis mo podem ser mais drásticos e requererem mudanças permanentes e significativas na alocação de energia e de precursores sintéticos para alcançar um novo estado es tável dinâmico Considere por exemplo a diferenciação de célulastronco em eritrócitos na medula óssea A célu la precursora contém um núcleo mitocôndrias além de pouca ou nenhuma hemoglobina enquanto o eritrócito totalmente diferenciado contém uma grande quantidade de hemoglobina mas não tem núcleo nem mitocôndrias a composição celular mudou permanentemente em respos ta aos sinais externos de desenvolvimento que acompa nham as mudanças no metabolismo Essa diferenciação celular requer uma regulação precisa dos níveis de cada proteína da célula Ao longo da evolução os organismos adquiriram uma coleção admirável de mecanismos reguladores para a ma nutenção da homeostasia nos níveis molecular celular e de organismo o que se reflete na proporção de genes que co dificam a maquinaria reguladora Nos seres humanos cerca de 4000 genes 12 de todos os genes codificam pro teínas reguladoras incluindo uma grande variedade de re ceptores de reguladores da expressão gênica e mais de 500 proteínascinases diferentes Em muitos casos os mecanis mos reguladores se sobrepõem uma enzima está sujeita à regulação por vários mecanismos diferentes A quantidade de uma enzima e sua atividade catalítica podem ser reguladas O fluxo de uma reação catalisada por uma enzima pode ser modulado por alterações no número de moléculas da enzi ma ou por alterações na atividade catalítica de cada uma das moléculas já presentes na reação Tais alterações ocor rem em uma escala de tempo de milissegundos até muitas horas em resposta a sinais de dentro ou de fora da célula Mudanças alostéricas muito rápidas na atividade enzimática em geral são desencadeadas localmente por alterações na concentração local de uma molécula pequena um subs trato da via na qual essa reação é uma das etapas p ex glicose na glicólise um produto da via ATP da glicólise ou um metabólitochave ou cofator como o NADH que in dica o estado metabólico da célula Segundos mensageiros como AMP cíclico e Ca 21 gerados intracelularmente em resposta a sinais extracelulares hormônios citocinas e as sim por diante também controlam a regulação alostérica em uma escala de tempo levemente mais lenta determina da pela velocidade dos mecanismos de transdução de sinal ver Capítulo 12 Os sinais extracelulares Figura 152 ➊ podem ser hormonais p ex insulina ou adrenalina ou neuronais acetilcolina ou podem ser fatores de crescimento ou ci tocinas O número de moléculas de determinada enzima em uma célula é função das taxas relativas de síntese e degra dação desta enzima A taxa de síntese pode ser ajustada pela ativação em resposta a alguns sinais externos de um fator de transcrição Figura 152 ➋ descrito em mais deta lhes no Capítulo 28 Os fatores de transcrição são pro teínas nucleares que quando ativadas se ligam a regiões específicas do DNA elementos de resposta próximas a um promotor gênico ponto de início de transcrição do gene e ativam ou reprimem a transcrição do gene levando ao aumento ou à redução da síntese da proteína codificada A ativação de um fator de transcrição às vezes resulta de sua interação com um ligante específico ou de sua fosfo rilação ou desfosforilação Cada gene é controlado por um ou mais elementos de resposta reconhecidos por fatores de transcrição específicos Os genes que têm vários elementos de resposta são controlados por vários fatores de transcri ção diferentes respondendo a vários sinais diferentes Gru pos de genes que codificam proteínas que atuam em con junto como as enzimas da glicólise ou da gliconeogênese frequentemente compartilham sequências de elementos de resposta comuns de modo que um único sinal agindo por meio de um determinado fator de transcrição ativa ou reprime todos esses genes em conjunto A regulação do me tabolismo de carboidratos por fatores de transcrição espe cíficos está descrita na Seção 153 A estabilidade dos RNA mensageiros mRNA sua resis tência à degradação por ribonucleases celulares Figura 15 2 ➌ varia e a quantidade de um dado mRNA na célula é função de sua taxa de síntese e degradação Capítulo 26 A taxa na qual um mRNA é traduzido em proteína pelos ribos somos Figura 152 ➍ também é regulada e depende de vários fatores descritos em detalhe no Capítulo 27 Observe que um aumento de n vezes em um mRNA nem sempre significa um aumento n de vezes no seu produto proteico Nelson6edbookindb 589 Nelson6edbookindb 589 030414 0744 030414 0744 590 DAVID L NELSON MICHAEL M COX As moléculas proteicas uma vez sintetizadas têm um tempo de vida finito que pode variar de alguns minutos até muitos dias Tabela 151 A taxa de degradação pro teica Figura 152 ➎ difere de uma enzima para outra e depende das condições da célula Algumas proteínas são marcadas pela ligação covalente de ubiquitina para serem degradadas nos proteassomos conforme será discutido no Capítulo 27 p ex o caso da ciclina na Figura 1247 A reciclagem rápida síntese seguida de degradação é ener geticamente dispendiosa mas proteínas com meiavida curta podem alcançar novos níveis de estado estável muito mais rapidamente do que aquelas com meiavida longa e os benefícios dessa capacidade de resposta rápida devem equilibrar ou exceder o custo para a célula Outra maneira de alterar a atividade efetiva de uma en zima é sequestrála e a seu substrato em compartimentos diferentes Figura 152 ➏ No músculo por exemplo a hexocinase só pode agir sobre a glicose quando esta entra no miócito vinda do sangue e a taxa de entrada depende da atividade dos transportadores de glicose ver Tabela 11 3 na membrana plasmática Dentro da célula os compar timentos envoltos por membranas segregam determinadas enzimas e sistemas enzimáticos e o fator limitante da ação enzimática será o transporte do substrato através dessas membranas intracelulares Por esses vários mecanismos de regulação do nível en zimático as células podem alterar drasticamente a quan tidade total de suas enzimas em resposta a mudanças nas condições metabólicas Nos vertebrados o fígado é o tecido mais adaptável por exemplo a mudança de uma dieta rica em carboidratos para uma rica em lipídeos afeta a transcri ção de centenas de genes e consequentemente os níveis de centenas de proteínas Essas alterações totais na expressão gênica podem ser quantificadas pelo uso de microarranjos de DNA ver Figura 923 que revelam a quantidade to tal de mRNA presentes em certo tipo celular ou órgão o transcriptoma ou por eletroforese bidimensional ver Figura 321 que mostra a totalidade de proteínas de um tipo celular ou de um órgão seu proteoma Ambas as técnicas proporcionam grande compreensão da regulação metabólica O efeito das alterações no proteoma é com fre Cinase Fosfatase ➊ ➍ ➒ ➑ ➐ ➏ ➎ ➌ ➋ ➓ Receptor Sinais extracelulares Transcrição de genes específicos Núcleo mRNA mRNA Enzima DNA Fator de transcrição Tradução do mRNA no ribossomo Degradação proteica ubiquitina proteassomo Degradação do mRNA P Enzima sequestrada em uma organela subcelular Retículo endoplasmático A enzima se associa com a proteína reguladora Proteína reguladora A enzima sofre fosforilaçãodesfosforilação S L L L Produto S A enzima interage com o ligante L efetor alostérico A enzima se liga ao substrato S FIGURA 152 Fatores que afetam a atividade das enzimas A ativida de total de uma enzima pode ser mudada pela alteração do número de mo léculas na célula ou sua atividade efetiva em um compartimento subcelular ➊ a ➏ ou pela modulação da atividade de moléculas já existentes ➐ a ➓ conforme está detalhado no texto Uma enzima pode ser influenciada por uma combinação destes fatores TABELA 151 Meiavida média das proteínas nos tecidos de mamíferos Tecido Meiavida dias Fígado 09 Rim 17 Coração 41 Cérebro 46 Músculo 107 Nelson6edbookindb 590 Nelson6edbookindb 590 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 591 quência uma mudança no conjunto de metabólitos de baixa massa molecular o metaboloma Figura 153 O meta boloma de E coli crescendo com glicose é dominado por poucas classes de metabólitos glutamato 49 nucleotí deos principalmente ribonucleosídeos trifosfato 15 intermediários da glicólise do ciclo do ácido cítrico e da via das pentosesfosfato vias centrais do metabolismo do car bono 15 e glutationas e fatores redox 9 Logo que os mecanismos reguladores que envolvem a síntese e a degradação de proteínas produzem um deter minado número de moléculas de cada enzima na célula a atividade dessas enzimas pode ser regulada ainda de várias outras maneiras pela concentração do substrato pela pre sença de efetores alostéricos por modificações covalentes ou por ligação de proteínas reguladoras por todas essas maneiras a atividade de uma molécula de enzima pode ser alterada Figura 152 ➐ a ➓ Todas as enzimas são sensíveis à concentração de seus substratos Figura 152 ➐ Recorde que no caso mais simples enzima que segue a cinética de Michaelis Menten a velocidade inicial da reação é a metade da ve locidade máxima quando o substrato está presente em uma concentração igual ao Km ie quando metade da enzima está saturada com o substrato A atividade é reduzida com S mais baixa e quando S Km a velocidade da reação é linearmente dependente da S Essa relação entre S e Km é importante porque as con centrações intracelulares do substrato estão frequentemen te na mesma faixa do Km ou mais baixas Por exemplo a atividade de hexocinase se altera com a glicose e a con centração intracelular de glicose varia com sua concentra ção no sangue Conforme será visto as diferentes formas isoenzimas da hexocinase têm diferentes valores de Km sendo por isso afetadas de modo diferente por mudanças na concentração intracelular de glicose que fisiologica mente fazem sentido Para muitas transferências de grupos fosforil do ATP e para as reações redox que usam NADPH ou NAD 1 a concentração do metabólito está bem acima do Km Figura 154 esses cofatores não parecem ser o fator limitante em tais reações PROBLEMA RESOLVIDO 151 Atividade de um transportador de glicose Se Kt o equivalente ao Km para o transportador da glicose no fígado GLUT2 for 40 mM calcule o efeito do aumento da concentração da glicose sanguínea de 3 mM para 10 mM na velocidade do seu fluxo para o hepatócito Solução Utilizase a Equação 111 p 406 para calcular a velocidade inicial fluxo da captação da glicose Em 3 mM de glicose Em 10 mM de glicose Assim uma elevação da glicose sanguínea de 3 mM para 10 mM aumenta a taxa de influxo do açúcar em um hepató cito por um fator de 020007 3 Outros UDPglicose UDPNacetilglicosamina Outro carbono central 6fosfogliconato Hexosesfosfato Frutose16bifosfato Dissulfeto de glutationa Glutationa Outro redox NAD Aspartato Glutamato Valina Glutamina dTTP GTP UTP ATP CTP Outros nucleotídeos Alanina Outros aminoácidos Aminoácido Nucleotídeos NADPH Glutationas Vias centrais do metabolismo do carbono Outros intermediários das vias centrais do metabolismo do carbono FIGURA 153 O metaboloma da Ecoli crescendo em glicose Resumo das quantidades dos 103 metabólitos medidas por uma combinaçãp de cro matografia líquida e espectrometria de massas em tandem LCMSMS 100 NAD ATP NADPH Reações de degradação Vias centrais do metabolismo do carbono Outro 102 104 Concentração do metabólito M 106 108 106 108 104 Km M 102 100 FIGURA 154 Comparação entre o Km e a concentração do substrato de algumas enzimas metabólicas As concentrações dos metabólitos medidas na Ecoli crescendo em glicose estão colocados no gráfico contra os Km conhecidos das enzimas que consomem estes metabólitos A linha sólida é a da unidade na qual a concentração do metabólito 5 Km e as linhas tra cejadas correspondem a um desvio de dez vezes da linha da unidade Nelson6edbookindb 591 Nelson6edbookindb 591 030414 0744 030414 0744 592 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A atividade enzimática pode ser tanto aumentada como reduzida por um efetor alostérico Figura 152 ➑ ver Figura 634 Os efetores alostéricos convertem cinéticas hiperbóli cas em sigmoides ou viceversa p ex ver Figura 1516b Na parte mais íngreme da curva sigmoide uma pequena alte ração na concentração do substrato ou do efetor alostérico pode ter um grande impacto na velocidade da reação Re corde do Capítulo 5 p 167 que a cooperatividade de uma enzima alostérica pode ser expressa como um coeficiente de Hill com coeficientes mais altos significando maior coopera tividade Para uma enzima alostérica com coeficiente de Hill de 4 a atividade aumenta de 10 para 90 da Vmáx com ape nas 3 vezes de aumento da S comparado com o aumento de 81 vezes na S necessário para uma enzima sem os efeitos cooperativos coeficiente de Hill de 1 Tabela 152 As modificações covalentes das enzimas ou de outras proteínas Figura 152 ➒ ocorrem em segundos ou minu tos após um sinal regulador extracelular As modificações mais comuns são fosforilação e desfosforilação Figura 155 a metade das proteínas de uma célula eucariótica é fosforilada em alguma situação A fosforilação por uma proteínacinase específica pode afetar as características eletrostáticas do sítio ativo da enzima provocando o des locamento de uma região inibidora da enzima para fora do sítio ativo alterando a interação da enzima com outras proteínas ou forçar mudanças conformacionais que se tra duzem em alterações na Vmáx ou no Km Para que as modi ficações covalentes sejam úteis na regulação a célula deve ser capaz de fazer a enzima alterada retornar ao seu estado original de atividade A família das fosfoproteínafosfatases que estão pelo menos algumas delas sob regulação catali sa a desfosforilação das proteínas Finalmente muitas enzimas são reguladas pela asso ciação e dissociação de outra proteína reguladora Figura 152 ➓ Por exemplo a proteínacinase A dependente de AMP cíclico PKA ver Figura 126 é inativa até que a liga ção com o cAMP separe a subunidade reguladora inibido ra da catalítica da enzima Esses vários mecanismos que alteram o fluxo por uma etapa de uma via metabólica não são mutuamente exclusi vos É muito comum que uma enzima isolada seja regulada no nível de transcrição e também por mecanismos alostéri cos e covalentes As combinações proporcionam regulação rápida fácil e eficaz em resposta a uma ampla gama de per turbações e sinais Nas discussões que seguem é útil pensar em mudanças na atividade enzimática servindo a dois papéis distintos mas complementares Usase o termo regulação metabólica para abranger processos que servem para manter a home ostasia no nível molecular para manter algum parâmetro celular p ex concentração de um metabólito em estado de equilíbrio ao longo do tempo mesmo que o fluxo dos me tabólitos se altere ao longo da via O termo controle meta bólico se refere a um processo que conduz a uma alteração no resultado de uma via metabólica ao longo do tempo em resposta a um sinal externo ou uma mudança nas condições A distinção embora útil nem sempre é fácil de ser feita As reações longe do equilíbrio são pontos de regulação usuais nas células Para algumas etapas de uma via metabólica a reação está próxima do equilíbrio com a célula no seu estado estável dinâmico Figura 156 O fluxo líquido de metabólitos TABELA 152 Relação entre o coeficiente de Hill e o efeito da concentração do substrato sobre a velocidade da reação de enzimas alostéricas Coeficiente de Hill nH Mudança requerida na S para aumentar a V0 de 10 para 99 da Vmáx 05 3 6600 10 3 81 20 3 9 30 3 43 40 3 3 SerThrTyr SerThrTyr ATP ADP OH Substrato proteico Pi Fosfoproteína fosfatase H2O O P O O O Proteínacinase FIGURA 155 Fosforilação e desfosforilação de proteínas As prote ínacinases transferem um grupo fosforil do ATP para resíduos de Ser Thr ou Tyr em uma enzima ou outro substrato proteico As proteínafosfatases removem o grupo fosforil como Pi V 5 1001 V 5 200 V 5 500 ➊ ➋ ➌ V 5 001 V 5 190 V 5 490 10 Velocidade líquida 10 10 A B C D FIGURA 156 Etapas fora do equilíbrio e próximas do equilíbrio em uma via metabólica As etapas ➋ e ➌ desta via estão próximas do equi líbrio na célula para cada etapa a velocidade V da reação para a frente é levemente maior do que a velocidade da reação reversa de modo que a velo cidade líquida para a frente 10 é relativamente baixa e a variação de energia livre DG é próxima de zero Um aumento na C ou na D pode reverter a direção destas etapas A etapa ➊ é mantida longe do equilíbrio na célula sua velocidade para a frente é muito maior do que a da reação reversa A veloci dade líquida da etapa ➊ 10 é muito maior do que a da reação reversa 001 e é idêntica à velocidade líquida das etapas ➋ e ➌ quando a via está operan do no estado de equilíbrio dinâmico A etapa ➊ tem um DG negativo grande Nelson6edbookindb 592 Nelson6edbookindb 592 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 593 nessas etapas é a pequena diferença entre a velocidade da reação direta e da reação inversa velocidades muito simila res quando a reação está próxima do equilíbrio Pequenas alterações nas concentrações do substrato ou do produto podem produzir grande alteração na taxa líquida podendo mesmo mudar a direção do fluxo líquido É possível iden tificar essas reações próximas do equilíbrio em uma célu la comparando a razão da ação das massas Q com a constante de equilíbrio para a reação K9eq Recorde que na reação A 1 B S C 1 D Q 5 CDAB Quando Q e K9eq estiverem dentro de 1 a 2 ordens de grandeza entre si a reação está próxima do equilíbrio Esse é o caso em 6 das 10 etapas da via glicolítica Tabela 153 Outras reações na célula estão longe do equilíbrio Por exemplo K9eq para a reação da fosfofrutocinase1 PFK1 é de cerca de 1000 mas Q frutose16bifos fatoADPfrutose6fosfatoATP em um hepatócito no estado estável é de cerca de 01 Tabela 153 Isto é a reação está tão longe do equilíbrio que o processo é exergônico sob condições celulares e tende a ir adiante A reação é mantida longe do equilíbrio porque sob condi ções correntes de concentrações de substrato de produ to e de efetor a taxa de conversão da frutose6fosfato a frutose16bifosfato está limitada pela atividade da PFK 1 ela própria limitada pelo número de moléculas de PFK 1 presentes e pela ação dos efetores alostéricos Assim a taxa líquida da reação direta catalisada pela enzima é igual ao fluxo líquido dos intermediários glicolíticos por outras etapas da via e o fluxo inverso pela PFK1 perma nece próximo de zero A célula não pode permitir reações com grandes cons tantes de equilíbrio para alcançar o equilíbrio Se frutose6 fosfato ATP e ADP na célula forem mantidas em níveis típicos concentrações milimolares baixas e for permitido à reação da PFK1 alcançar o equilíbrio por uma elevação na frutose16bifosfato a concentração desse produto se elevará para a faixa molar causando destruição osmótica da célula Considere outro caso se fosse permitido à reação ATP S ADP 1 Pi se aproximar do equilíbrio a variação real de energia livre DG9 para essa reação DGp ver Problema Resolvido 132 p 519 se aproximaria de zero e o ATP per deria o potencial de transferência do grupo fosforil de alta energia que é valioso para a célula Por isso é essencial que as enzimas que catalisam a degradação do ATP e outras rea ções altamente exergônicas sejam sensíveis à regulação de forma que quando as mudanças metabólicas forem forçadas por condições externas o fluxo por essas enzimas seja ajus tado para assegurar que a ATP permaneça muito acima do seu nível de equilíbrio Quando tais mudanças metabólicas ocorrem as atividades das enzimas em todas as vias interco nectadas se ajustam para manter as etapas críticas longe do equilíbrio Assim não é surpreendente que muitas enzimas como a PFK1 que catalisam reações altamente exergôni cas estejam sujeitas a uma grande variedade de mecanismos reguladores refinados A multiplicidade desses ajustes é tão grande que é impossível prever só pelo exame das proprie dades de uma enzima qualquer em uma via se essa enzima tem uma grande influência no fluxo líquido por toda a via Esse problema complexo pode ser abordado pela análise do controle metabólico conforme descrito na Seção 152 TABELA 153 Constantes de equilíbrio coeficientes de ação das massas e variações da energia livre das enzimas do metabolismo de carboidratos Enzima K9eq Razão da ação das massas Q Reação próxima do equilíbrio in vivo DG9 kJmol DG9 kJmol no coração Fígado Coração Hexocinase 1 3 10 3 2 3 10 22 8 3 10 22 Não 217 227 PFK1 10 3 10 3 9 3 10 22 3 3 10 22 Não 214 223 Aldolase 10 3 10 24 12 3 10 26 9 3 10 26 Sim 124 260 Triosefosfatoisomerase 4 3 10 22 24 3 10 21 Sim 175 138 Gliceraldeído3fosfato desidrogenase 1 fosfogliceratocinase 2 3 10 3 6 3 10 2 90 Sim 213 135 Fosfogliceratomutase 1 3 10 21 1 3 10 21 12 3 10 21 Sim 144 106 Enolase 3 29 14 Sim 232 205 Piruvatocinase 2 3 10 4 7 3 10 21 40 Não 231 217 Fosfoglicoseisomerase 4 3 10 21 31 3 10 21 24 3 10 21 Sim 122 214 Piruvatocarboxilase 1 PEPcarboxicinase 7 1 3 10 23 Não 250 223 Glicose6fosfatase 85 3 10 2 12 3 10 2 Sim 217 250 Fonte K9eq e Q de Newsholme EA e Start C 1973 Regulation in Metabolism Wiley Press New York p 97 263 DG e DG9 foram calculados a partir destes dados Para simplificar qualquer reação na qual o valor absoluto do DG calculado seja menor do que 6 é considerada próxima do equilíbrio Dados não disponíveis Nelson6edbookindb 593 Nelson6edbookindb 593 030414 0744 030414 0744 594 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os nucleotídeos de adenina têm papéis especiais na regulação metabólica Talvez nada seja mais importante para uma célula após a proteção de seu DNA contra danos do que a manutenção de um suprimento e de uma concentração de ATP cons tantes Muitas enzimas que utilizam ATP têm valores de Km entre 01 e 1 mM sendo que a concentração de ATP em uma célula típica é de 5 a 10 mM Figura 154 Se a ATP di minuir significativamente essas enzimas não estarão total mente saturadas pelo seu substrato ATP e a velocidade de centenas de reações que envolvem ATP seria reduzida Figura 157 a célula provavelmente não sobreviveria a esse efeito cinético sobre tantas reações Existe também um efeito termodinâmico importante na redução da ATP Uma vez que o ATP é convertido em ADP ou AMP quando é gasto para realizar trabalho ce lular a relação ATPADP afeta profundamente todas as reações que utilizam estes cofatores O mesmo é verdadei ro para outros cofatores importantes como NADHNAD 1 e NADPHNADP 1 Considere por exemplo a reação catali sada pela hexocinase Observe que esta expressão somente é verdadeira quando os reagentes e os produtos estiverem nas suas concentra ções de equilíbrio quando DG9 5 0 Em qualquer outra combinação de concentrações DG9 não é zero Recorde do Capítulo 13 que a razão dos produtos e substratos a razão da ação das massas Q determina a magnitude e o sinal de DG9 e por isso a força motriz DG9 da reação Uma vez que uma alteração nessa força motriz influen cia profundamente cada reação que envolve ATP os orga nismos evoluíram sob intensa pressão para desenvolver me canismos reguladores que respondam à razão ATPADP A concentração de AMP é um indicador ainda mais sen sível do estado energético da célula do que a ATP As cé lulas normalmente têm uma concentração muito mais alta de ATP 5 a 10 mM do que de AMP 01 mM Quando alguns processos p ex contração muscular consomem ATP o AMP é produzido em duas etapas Primeiro a hidró lise do ATP produz ADP e depois a reação catalisada pela adenilatocinase produz AMP 2ADP AMP 1 ATP Se o ATP for consumido de forma que sua concentração di minua 10 o aumento relativo na AMP é muito maior do que na ADP Tabela 154 Por isso não é surpreendente que muitos processos reguladores sejam comandados por alterações na AMP O mediador mais importante da regu lação por AMP provavelmente seja a proteínacinase ati vada por AMP AMPK que responde a um aumento na AMP pela fosforilação de enzimaschave regulando assim suas atividades A elevação da AMP pode ser causada por um suprimento reduzido de nutrientes ou pelo aumento do exercício A ação da AMPK não confundir com a proteína cinase dependente de AMP cíclico ver Seção 155 au menta o transporte de glicose e ativa a glicólise e a oxidação dos ácidos graxos enquanto suprime os processos que re querem energia como a síntese de ácidos graxos colesterol e proteínas Figura 158 A AMPK é discutida adiante e os mecanismos detalhados pelos quais ela realiza essas mudanças serão analisados no Capítulo 23 Centenas de intermediários metabólicos além do ATP de vem estar presentes na célula em concentrações apropriadas Para tomar somente um exemplo os intermediários glicolíti cos dihidroxiacetonafosfato e 3fosfoglicerato são respec tivamente precursores de triacilgliceróis e serina Quando esses produtos são necessários a taxa de glicólise deve se Velocidade inicial V unidades arbitrárias Concentração de ATP mM 5 10 15 20 25 30 35 40 1 Vmáx 2 Vmáx FIGURA 157 Efeito da concentração de ATP na velocidade inicial da reação de uma enzima dependente de ATP típica Estes dados experi mentais produzem um Km de 5 mM para o ATP A concentração de ATP nos tecidos animais é de aproximadamente 5 mM TABELA 154 Variações relativas na ATP e na AMP quando o ATP é consumido Nucleotídeo de adenina Concentração antes da depleção de ATP mM Concentração após a depleção de ATP mM Variação relativa ATP 50 45 10 ADP 10 10 0 AMP 01 06 600 Nelson6edbookindb 594 Nelson6edbookindb 594 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 595 ajustar para fornecêlos sem reduzir a produção glicolítica de ATP Isso também ocorre na manutenção dos níveis de outros cofatores importantes como NADH e NADPH mudanças na sua razão da ação das massas isto é na relação entre cofator reduzido e oxidado têm efeitos sobre o metabolismo As prioridades no nível do organismo é claro também impulsionaram a evolução dos mecanismos reguladores O cérebro dos animais quase não possui estoques de fontes de energia dependendo de um suprimento constante de glico se do sangue Se a glicose sanguínea diminuir da sua con centração normal de 4 a 5 mM para a metade desse nível o resultado é confusão mental e uma redução de cinco vezes pode levar ao coma e à morte Para proteger contra mu danças na concentração sanguínea de glicose a liberação dos hormônios insulina e glucagon provocada pela glicose sanguínea alta ou baixa respectivamente causa mudanças metabólicas que tendem a fazer a concentração sanguínea da glicose voltar ao normal Outras pressões seletivas devem ter agido ao longo da evolução selecionando mecanismos reguladores que cum prem o que segue 1 Maximizar a eficiência da utilização dos combustíveis por impedir o funcionamento simultâneo de vias em direções opostas como glicólise e gliconeogênese 2 Separar os metabólitos apropriadamente em vias alternativas como a glicólise e a via das pento sesfosfato 3 Mobilizar o combustível mais adequado para as ne cessidades imediatas do organismo glicose ácidos graxos glicogênio ou aminoácidos 4 Reduzir vias biossintéticas quando seus produtos se acumulam Os capítulos remanescentes deste livro apresentam muitos exemplos de cada um dos tipos de mecanismos reguladores RESUMO 151 Regulação das vias metabólicas c Em uma célula metabolicamente ativa no estado está vel os intermediários são formados e utilizados em ta xas iguais Quando uma perturbação transitória altera a taxa de formação ou de utilização de um metabólito alterações compensatórias nas atividades das enzimas reconduzem o sistema ao estado estável c As células regulam seu metabolismo por meio de uma grande variedade de mecanismos em uma escala de tempo que varia de menos de um milissegundo até dias tanto pela mudança na atividade de moléculas enzimá ticas preexistentes quanto pela mudança no número de moléculas de uma enzima específica c Vários sinais ativam ou inativam fatores de transcri ção que atuam no núcleo e regulam a expressão gêni ca Mudanças no transcriptoma levam a mudanças no proteoma e por fim no metaboloma de uma célula ou tecido Célula b pancreática Cérebro hipotálamo AMP ATP Exercício Leptina adiponectina Secreção de insulina Captação de ácidos graxos oxidação Captação de glicose Biogênese mitocondrial Síntese de ácidos graxos Síntese de colesterol Síntese de ácidos graxos Lipólise Oxidação de ácidos graxos Captação de glicose Glicólise Ingestão de alimento SNS Coração Tecido adiposo Músculo esquelético Fígado AMPK FIGURA 158 Papel da proteínacinase ativada por AMP AMPK no metabolismo de carboidratos e de gorduras A AMPK é ativada por AMP elevada ou por ATP reduzida pelo exercício pelo sistema nervoso simpático SNS ou por hormônios peptídicos produzidos no tecido adiposo leptina e adiponectina descritos em mais detalhe no Capítulo 23 A AMPK quando ativada fosforila proteínasalvo e altera o metabolismo de uma grande variedade de tecidos distanciandoo dos processos que consomem energia como a síntese de glicogênio de ácidos graxos e de colesterol alte ra o metabolismo nos tecidos extrahepáticos para o uso de ácidos graxos como combustível e desencadeia a gliconeogênese no fígado para fornecer glicose para o cérebro No hipotálamo a AMPK estimula o comportamento de alimentação para fornecer mais combustível com a dieta Nelson6edbookindb 595 Nelson6edbookindb 595 030414 0744 030414 0744 596 DAVID L NELSON MICHAEL M COX c Nos processos com múltiplas etapas como a glicólise determinadas reações estão em equilíbrio no estado es tável as velocidades dessas reações aumentam e dimi nuem com a concentração do substrato Outras reações estão fora do equilíbrio essas etapas são os pontos de regulação global da via c Os mecanismos reguladores mantêm níveis praticamen te constantes de metabólitoschave como ATP e NADH nas células e de glicose no sangue enquanto adaptam o uso ou a produção de glicose às necessidades variáveis do organismo c Os níveis de ATP e de AMP são um reflexo sensível do estado energético da célula e quando a razão ATP AMP diminui a proteínacinase ativada por AMP AMPK desencadeia uma grande variedade de respos tas celulares para elevar a ATP e reduzir a AMP 152 Análise do controle metabólico Estudos detalhados da regula ção metabólica só se tornaram possíveis depois da elucidação das etapas químicas básicas das vias e da caracterização das en zimas responsáveis Tendo como ponto de partida a descoberta de Eduard Buchner por volta de 1900 de que um extrato de células de levedura poderia con verter glicose em etanol e CO2 o impulso principal da pesquisa bioquímica foi decifrar as etapas pelas quais essa transformação ocorria e purificar e caracteri zar as enzimas que catalisavam cada etapa Na metade do século XX todas as 10 enzimas da via glicolítica estavam purificadas e caracterizadas Nos 50 anos seguintes se aprendeu muito sobre a regulação des tas enzimas por sinais extra e intracelulares por meio dos mecanismos covalentes e alostéricos descritos neste ca pítulo O critério convencional era que em uma via linear como a glicólise a catálise por uma das enzimas deveria ser a mais lenta determinando desse modo a velocidade do fluxo metabólico por toda a via No caso da glicólise a PFK1 foi considerada a enzima de velocidade limitante porque se sabe que é regulada pela frutose16bifosfatase e outros efetores alostéricos Com o advento da tecnologia da engenharia genética se tornou possível testar essa hipótese da única etapa deter minante da velocidade pelo aumento da concentração da enzima que catalisa a etapa limitante da velocidade em uma via e pela determinação do aumento proporcional do fluxo ao longo da via Com frequência não aumenta a solu ção simples uma única etapa determinante da velocidade está errada Atualmente está claro que na maioria das vias o controle do fluxo é distribuído entre várias enzimas e o grau com que cada uma contribui para o controle varia com as condições metabólicas o suprimento do material de partida p ex glicose o suprimento de oxigênio a neces sidade de outros produtos derivados de intermediários da via como a glicose6fosfato para a via das pentosesfosfato em células que sintetizam grande quantidade de nucleotí deos os efeitos dos metabólitos com funções reguladoras e o estado hormonal do organismo os níveis de insulina e glucagon entre outros fatores Por que o interesse nos fatores que limitam o fluxo por uma via Para entender a ação dos hormônios ou de fárma cos ou a patologia que resulta de uma falha na regulação metabólica é preciso saber onde é exercido o controle Se os pesquisadores desejam desenvolver um fármaco que es timule ou iniba uma via o alvo lógico é a enzima que tenha o maior impacto no fluxo por esta via A bioengenharia de um microrganismo para produzir uma grande quantidade de um produto de valor comercial p 321 requer um co nhecimento do que limita o fluxo de metabólitos para este produto A contribuição de cada enzima para o fluxo através de uma via é determinada experimentalmente Existem várias maneiras de determinar experimental mente como uma variação na atividade de uma enzima em uma via afeta o fluxo metabólico por essa via Considere os resultados experimentais mostrados na Figura 159 Quando uma amostra de fígado de rato foi homogeneizada para liberar todas as enzimas solúveis o extrato realizou a conversão glicolítica da glicose em frutose16bifosfato a uma velocidade mensurável Para simplificar esse ex perimento está focado somente na primeira parte da via glicolítica Quando foram adicionadas ao extrato quanti Eduard Buchner 18601917 Fluxo glicolítico 010 008 006 004 002 000 0 05 10 15 Enzima adicionada unidades arbitrárias 20 25 30 Hexocinase IV Fosfofrutocinase1 Fosfohexoseisomerase FIGURA 159 Dependência do fluxo glicolítico sobre enzimas adicio nadas em um homogeneizado de fígado de rato Enzimas purificadas nas quantidades mostradas no eixo do x foram adicionadas a um extrato de fígado realizando glicólise O aumento no fluxo ao longo da via é mostrado no eixo do y Nelson6edbookindb 596 Nelson6edbookindb 596 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 597 dades crescentes de hexocinase IV glicocinase purifica da a velocidade da glicólise aumentou gradualmente A adição de PFK1 purificada também aumentou a velocida de da glicólise mas não tão dramaticamente quanto a he xocinase A adição de fosfohexoseisomerase purificada não teve efeito Esses resultados sugerem que ambas a hexocinase e a PFK1 contribuem para determinar o fluxo pela via hexocinase mais do que PFK1 e que a fosfo hexoseisomerase não Experimentos semelhantes podem ser feitos em célu las intactas ou em organismos usando inibidores ou ativa dores específicos para alterar a atividade de uma enzima e observar ao mesmo tempo o efeito sobre o fluxo pela via A quantidade de uma enzima também pode ser alterada geneticamente a bioengenharia pode produzir uma célula que faça cópias extras da enzima em estudo ou ter uma versão da enzima menos ativa do que a enzima normal O aumento genético da concentração de uma enzima às vezes causa efeitos significativos no fluxo e às vezes não tem efeito Três parâmetros críticos que juntos descrevem a capa cidade de resposta de uma via a mudanças nas condições metabólicas estão no centro da análise do controle me tabólico Agora será feita uma descrição qualitativa desses parâmetros e de seu significado no contexto de uma célu la viva O Quadro 151 fornece uma descrição quantitativa mais rigorosa O coeficiente de controle de fluxo quantifica o efeito de uma alteração na atividade enzimática sobre o fluxo metabólico por uma via Dados quantitativos sobre fluxo metabólico obtidos con forme a descrição da Figura 159 podem ser usados para calcular um coeficiente de controle de fluxo C para cada uma das enzimas de uma via Esse coeficiente ex pressa a contribuição relativa de cada enzima na deter minação da velocidade na qual os metabólitos fluem pela via isto é o fluxo J C pode ter qualquer valor de 00 para enzimas sem impacto sobre o fluxo a 10 para en zimas que determinam totalmente o fluxo Uma enzima também pode ter um coeficiente negativo de controle de fluxo Em uma via ramificada uma enzima em um ramo pelo fato de remover intermediários de outro ramo pode ter um impacto negativo sobre o fluxo por esse outro ramo Figura 1510 C não é uma constante não sendo intrín seco a uma única enzima é uma função de todo o siste ma de enzimas e seu valor depende da concentração dos substratos e dos efetores Quando dados reais de experimentos de glicólise em extratos de fígado de rato Figura 159 foram submetidos a esse tipo de análise os pesquisadores constataram coefi cientes de controle de fluxo para as enzimas nas concen trações encontradas no extrato de 079 para a hexocinase 021 para a PFK1 e 00 para a fosfohexoseisomerase Não é por acaso que esses valores somam 10 é possível mostrar que para qualquer via completa a soma dos coeficientes de controle de fluxo deve ser igual à unidade O coeficiente de elasticidade está relacionado com a capacidade de resposta da enzima a alterações na concentração do metabólito ou do regulador Um segundo parâmetro o coeficiente de elasticidade expressa quantitativamente a capacidade de resposta de uma única enzima a alterações na concentração de um metabólito ou de um regulador é função das propriedades cinéticas intrínsecas da enzima Por exemplo uma enzima com típica cinética de MichaelisMenten mostra uma res posta hiperbólica ao aumento da concentração do substrato Figura 1511 Em baixas concentrações do substrato p ex Km 01 cada incremento na concentração do substrato resulta em um aumento comparável na atividade enzimá tica produzindo um próximo de 10 Em concentrações de substrato relativamente altas p ex Km 10 o aumento da concentração do substrato tem efeito pequeno sobre a velocidade da reação porque a enzima já está saturada com o substrato A elasticidade nesse caso se aproxima de zero Para enzimas alostéricas que apresentam cooperatividade positiva pode exceder 10 mas não excede o coeficiente de Hill que está entre 10 e 40 A B C D E C4 5 202 C1 5 03 C2 5 00 C3 5 09 FIGURA 1510 O coeficiente de controle de fluxo C em uma via me tabólica ramificada Nesta via simples o intermediário B tem dois des tinos alternativos À medida que a reação B S E remove B da via A S D ela controla esta via o que resulta em um coeficiente de controle de fluxo para a enzima que catalisa a etapa B S E Observe que a soma dos quatro coeficientes é igual a 10 como deve ser para qualquer sistema de enzimas definido Vmáx V Km S 00 10 FIGURA 1511 Coeficiente de elasticidade de uma enzima com a cinética de MichaelisMenten Em concentrações do substrato bem abaixo do Km cada aumento na S produz um grande aumento correspon dente na velocidade da reação V Nesta região da curva a enzima tem um de 10 Em S Km o aumento da S tem pequeno efeito sobre a V neste caso está próximo de zero Nelson6edbookindb 597 Nelson6edbookindb 597 030414 0744 030414 0744 598 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O coeficiente de resposta expressa o efeito de um controlador externo sobre o fluxo de uma via Também é possível derivar uma expressão quantitativa para o impacto relativo de um fator externo hormônio ou fator de crescimento que não é nem metabólito nem uma en zima da via sobre o fluxo pela via O experimento mede o fluxo pela via nesse caso glicólise em vários níveis do parâmetro P p ex concentração de insulina para obter o coeficiente de resposta R que expressa a alteração no fluxo quando P insulina se altera Esses três coeficientes C e R estão relacionados de uma maneira simples a capacidade de resposta R de uma via a um fator externo que afeta uma determinada enzima é uma função de 1 quão sensível é a via a mudanças na atividade desta enzima o coeficiente de controle de fluxo C e 2 quão sensível é a enzima específica a mudanças no fator controlador externo a elasticidade R 5 C Cada enzima da via pode ser examinada desta forma e os efeitos de qualquer um de vários fatores externos sobre o fluxo na via podem ser determinados separadamente As Os fatores que influenciam a circulação dos intermediá rios fluxo ao longo de uma via podem ser determinados quantitativamente de modo experimental sendo expres sos em termos úteis para a predição da alteração no flu xo quando ocorrer alteração de algum fator envolvido na via Considere a sequência de reações simples na Figura Q1 na qual um substrato X p ex glicose é converti do em várias etapas em um produto Z talvez piruvato formado na glicólise Uma das enzimas tardias na rota é uma desidrogenase ydh que atua sobre o substrato Y Uma vez que a atividade da desidrogenase é facilmente medida ver Figura 1324 é possível usar o fluxo J por essa etapa Jydh para medir o fluxo ao longo de toda a via Manipulase experimentalmente o nível de uma en zima inicial na via xase que atua sobre o substrato X e medese o fluxo ao longo da via Jydh para vários níveis da enzima xase X xase ydh Jxase Jydh S1 S6 multietapa Y Z multietapa FIGURA Q1 Fluxo ao longo de uma via multienzimática hipotética A relação entre o fluxo pela via de X a Z na célula intacta e a concentração de cada enzima da via deve ser hiperbólica sem fluxo quando a atividade enzimática for infinitamente baixa e com fluxo próximo ao máximo quando a atividade enzimática for muito alta Em uma curva de Jydh contra a concentração da xase Exase a mu dança no fluxo com uma pequena alteração no nível da enzima é JydhExase que é simplesmente a inclinação da tangente da curva em qualquer concentração da en zima Exase e que tende a zero na Exase saturante Em baixa Exase a inclinação é íngreme o fluxo aumenta com cada incremento na atividade enzimática Em Exase muito alta a inclinação é muito menor o sistema é menos responsi vo à adição de xase porque ela já está presente em exces so em relação às outras enzimas da via Usase a relação JydhExase para mostrar quantita tivamente a dependência do fluxo ao longo da via Jydh sobre Exase No entanto sua utilidade é limitada porque o seu valor depende das unidades usadas para expres sar fluxo e atividade enzimática Pela expressão das mu danças fracionais no fluxo e na atividade enzimática JydhJydh e Exase Exase se obtém uma equação unificado ra para o coeficiente de controle de fluxo C neste caso 1 Isto pode ser rearranjado para que é matematicamente idêntico a Esta equação sugere um meio gráfico simples de deter minar o coeficiente de controle de fluxo é a inclina ção da tangente da curva de Jydh versus ln de Exase que pode ser obtido pela utilização dos dados experimentais da Figura Q2a em outro gráfico para se obter a Figura Q2b Observe que não é uma constante ele depen de da Exase inicial a partir da qual acontece a alteração no nível enzimático Para os casos mostrados na Figura Q2 é de 10 na Exase mais baixa mas somente cerca de 02 em alta Exase Um valor próximo de 10 para significa que a concentração da enzima determina total mente o fluxo pela via um valor próximo de 00 significa que a concentração da enzima não limita o fluxo pela via Alterações na atividade da enzima não terão forte efeito sobre o fluxo a menos que o coeficiente de controle de fluxo seja maior do que 05 A elasticidade de uma enzima é uma medida de como a atividade catalítica dessa enzima se altera com a alteração da concentração do metabólito substrato produto ou efetor A medida é obtida a partir de uma cur va experimental da velocidade da reação catalisada pela enzima versus a concentração do metabólito nas con centrações prevalentes na célula Usando argumentos análogos aos utilizados para deduzir C é possível mostrar que é a inclinação da tangente da curva de ln V versus ln substrato produto ou efetor QUADRO 151 MÉTODOS Análise do controle metabólico aspectos quantitativos Nelson6edbookindb 598 Nelson6edbookindb 598 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 599 sim em princípio é possível predizer de que maneira será alterado o fluxo do substrato por uma série de etapas enzi máticas quando existe uma alteração em um ou mais fatores controladores externos à via O Quadro 151 mostra como esses conceitos qualitativos são tratados quantitativamente A análise do controle metabólico foi aplicada ao metabolismo de carboidratos com resultados surpreendentes A análise do controle metabólico proporciona uma estrutu ra que permite pensar quantitativamente sobre regulação interpretar o significado das propriedades reguladoras de cada enzima em uma via identificar as etapas que mais afetam o fluxo pela via e distinguir entre os mecanismos reguladores que atuam na manutenção das concentrações dos metabólitos e os mecanismos de controle que alteram efetivamente o fluxo da via A análise da via glicolítica em leveduras por exemplo revelou um coeficiente de contro le de fluxo para a PFK1 inesperadamente baixo o qual como se percebe foi determinado como o ponto principal do controle do fluxo a etapa determinante da velocidade na glicólise A elevação experimental do nível da PFK1 em cinco vezes leva a uma alteração no fluxo pela glicólise Para uma enzima com a cinética de MichaelisMenten típica o valor de varia de 1 desde concentrações de substrato muito abaixo do Km a próximo de 0 quando se aproxima da Vmáx As enzimas alostéricas podem ter elas ticidade maior que 10 mas não maior que seu coeficien te de Hill p 167 Finalmente o efeito dos controladores externos à própria via isto é não metabólitos pode ser medido e expresso como o coeficiente de resposta R A alte ração no fluxo ao longo da via é medida por mudanças na concentração do parâmetro controlador P e R é de finido de forma análoga à da Equação 1 produzindo a expressão Usando a mesma lógica e os métodos gráficos descritos anteriormente para determinar C obtémse R como a in clinação da tangente da curva de ln J versus ln P Os três coeficientes descritos estão relacionados des ta maneira simples Assim a capacidade de resposta de cada enzima em uma via a uma alteração em um fator controlador exter no é uma função simples de duas coisas o coeficiente de controle variável que expressa o quanto essa enzima influencia o fluxo sob um dado conjunto de condições e a elasticidade propriedade intrínseca da enzima que reflete a sua sensibilidade à concentração do substrato e do efetor Fluxo Jydh e j Jydh Exase ln Jydh ln e ln j ln Jydh ln Exase 5 C Jydh xase a b Concentração da enzima Exase ln Exase FIGURA Q2 Coeficiente de controle de fluxo a Variação típica do trajeto do fluxo Jydh medido na etapa catalisada pela enzima ydh como uma função da quantidade da enzima xase Exase que catalisa uma etapa mais inicial na via O coeficiente de controle de fluxo em ej é a inclinação do produto da tangente da curva Jydh Exase e a relação fator de inclinação ej b Em um gráfico de duplo logaritmo da mesma curva o coeficiente de controle de fluxo é a inclinação da tangente da curva Nelson6edbookindb 599 Nelson6edbookindb 599 030414 0744 030414 0744 600 DAVID L NELSON MICHAEL M COX de menos de 10 sugerindo que o papel real da regulação pela PFK1 não é controlar o fluxo pela glicólise mas me diar a homeostasia de metabólitos para prevenir grandes mudanças na concentração dos metabólitos quando o fluxo pela glicólise aumenta em resposta à glicose sanguínea alta ou à insulina Relembre que o estudo da glicólise em extrato de fígado Figura 159 também produziu um coeficiente de controle de fluxo que discordou do conhecimento con vencional mostrou que a hexocinase e não a PFK1 é mais influente no ajuste do fluxo ao longo da glicólise Devese observar aqui que o extrato de fígado não é equivalente a um hepatócito a maneira ideal de estudar o controle do flu xo é manipulando uma enzima de cada vez na célula viva Isso já é possível em muitos casos Os pesquisadores usaram ressonância magnética nu clear RMN como uma maneira não invasiva de deter minar a concentração de glicogênio e de metabólitos nas cinco etapas da via desde a glicose no sangue até o glico gênio nos miócitos Figura 1512 de músculo de rato e de humanos Descobriram que o coeficiente de controle de fluxo pela glicogêniosintase foi menor do que para o transportador de glicose GLUT4 ou para a hexocinase Discutemse a glicogêniosintase e outras enzimas do metabolismo do glicogênio nas Seções 154 e 155 Esse achado contradiz o conhecimento convencional de que a glicogêniosintase é o local do controle do fluxo e suge re que a importância da fosforilaçãodesfosforilação dessa enzima esteja relacionada com a manutenção da homeos tasia de metabólitos isto é regulação e não controle Dois metabólitos dessa via glicose e glicose6fosfato são intermediárioschave em outras vias incluindo a glicólise a via das pentosesfosfato e a síntese da glicosamina A análise do controle metabólico sugere que quando o nível da glicose sanguínea se eleva a insulina atua no músculo para 1 aumentar o transporte da glicose para as células levando GLUT4 para a membrana plasmática 2 induzir a síntese de hexocinase e 3 ativar a glicogêniosintase por modificação covalente ver Figura 1541 Os dois primei ros efeitos da insulina aumentam o fluxo de glicose pela via controle e o terceiro serve para adaptar a atividade da glicogêniosintase de modo que os níveis de metabóli tos p ex glicose6fosfato não aumentem drasticamen te com o fluxo aumentado regulação A análise do controle metabólico sugere um método geral para o aumento do fluxo por uma via Como um pesquisador pode manipular uma célula para aumentar o fluxo sem alterar as concentrações dos outros metabólitos ou os fluxos ao longo de outras vias Mais de três décadas atrás Henrik Kacser previu com base na aná lise do controle metabólico que isso seria possível pelo au mento da concentração de cada enzima da via A predição foi confirmada em vários testes experimentais e também concorda com a maneira pela qual as células normalmente controlam os fluxos ao longo das vias Por exemplo ratos alimentados com dieta rica em proteína eliminam o excesso de grupos amino convertendoos em ureia no ciclo da ureia Capítulo 18 Com essa mudança da dieta a produção de ureia aumenta quatro vezes e as enzimas do ciclo da ureia aumentam de duas a três vezes De modo similar quando o aumento da oxidação dos ácidos graxos é desencadeado pela ativação do receptor g ativado por proliferador de pe roxissomo PPARg fator de transcrição ativado por ligante ver Figura 2122 aumenta a síntese de toda a série de enzimas de oxidação dos ácidos graxos Com o crescimento do uso de microarranjos de DNA no estudo da expressão de grupos completos de genes em resposta a várias pertur bações logo se saberia se esse é um mecanismo geral pelo qual as células realizam ajustes de longo prazo no fluxo ao longo de vias específicas RESUMO 152 Análise do controle metabólico c A análise do controle metabólico mostra que a veloci dade do fluxo metabólico por uma via se distribui entre várias enzimas na via c O coeficiente de controle de fluxo C é uma medida de terminada experimentalmente do efeito da concentra ção de uma enzima sobre o fluxo por uma via multienzi mática Não é uma característica intrínseca da enzima mas do sistema como um todo c O coeficiente de elasticidade de uma enzima é uma medida determinada experimentalmente de sua capa cidade de resposta a alterações na concentração de um metabólito ou de uma molécula reguladora c O coeficiente de resposta R é uma medida determina da experimentalmente da alteração no fluxo por uma via Membrana plasmática Capilar Glicose Insulina UDPglicose Glicose1fosfato Glicose6fosfato Miócito GLUT4 Glicose Glicogênio Glicogêniosintase Hexocinase FIGURA 1512 Controle da síntese de glicogênio no músculo a partir da glicose sanguínea A insulina afeta três das cinco etapas desta via mas é o efeito sobre o transporte e sobre a atividade da hexocinase que aumen ta o fluxo para o glicogênio e não a mudança na atividade da glicogênio sintase Nelson6edbookindb 600 Nelson6edbookindb 600 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 601 em resposta a um hormônio regulador ou a um segundo mensageiro É uma função de C e de R 5 C c Algumas enzimas reguladas controlam o fluxo ao longo de uma via enquanto outras reequilibram o nível dos metabólitos em resposta a alterações no fluxo A pri meira atividade é controle a segunda de reequilíbrio é regulação c A análise do controle metabólico prevê e os experimen tos confirmam que o fluxo na direção de um produto específico é aumentado de maneira mais eficiente pela elevação da concentração de todas as enzimas da via 153 Regulação coordenada da glicólise e da gliconeogênese Nos mamíferos a gliconeogênese acontece principal mente no fígado onde tem o papel de fornecer glicose para exportar para outros tecidos quando se exaurem os estoques de glicogênio e quando não há disponibilidade de glicose na dieta Conforme discutido no Capítulo 14 a gli coneogênese utiliza várias das enzimas que atuam na glicó lise mas não é simplesmente o seu reverso Sete reações glicolíticas são livremente reversíveis e as enzimas que catalisam estas reações também atuam na gliconeogênese Figura 1513 Três reações da glicólise de tão exergô nicas são essencialmente irreversíveis as catalisadas por hexocinase PFK1 e piruvatocinase As três reações têm um DG9 grande e negativo a Tabela 153 mostra os valo res no músculo cardíaco A gliconeogênese usa desvios em cada uma dessas etapas irreversíveis por exemplo a conversão da frutose16bifosfato em frutose6fosfato é catalisada pela frutose16bifosfatase FBPase1 Cada uma dessas reações de desvio também tem um DG9 grande e negativo Em cada um dos três pontos onde as reações glicolí ticas são desviadas por reações gliconeogênicas alterna tivas a operação simultânea de ambas as vias consome ATP sem realizar nenhum trabalho químico ou biológico Por exemplo a PFK1 e a FBPase1 catalisam reações opostas A soma destas duas reações é ATP 1 H2O ADP 1 Pi 1 calor isto é hidrólise de ATP sem realizar nenhuma atividade metabólica útil Se estas duas reações prosseguirem si multaneamente em uma velocidade alta na mesma célula uma grande quantidade de energia será dissipada na for ma de calor Esse processo antieconômico é denominado ciclo fútil No entanto como será visto mais tarde tais ciclos podem proporcionar vantagens em vias de controle e o termo ciclo de substrato é uma denominação melhor Ciclos de substrato semelhantes também ocorrem com os outros dois grupos de reações de desvio na gliconeogênese Figura 1513 Agora serão analisados com mais detalhe os mecanis mos que regulam a glicólise e a gliconeogênese nos três pontos nos quais essas vias divergem Hexocinase Glicose6 fosfatase Fosfofrutocinase1 Frutose16 bifosfatase1 Piruvato carboxilase PEP carboxicinase Piruvato cinase Fosfohexose isomerase Aldolase Triosefosfato isomerase Triosefosfato isomerase Gliceraldeído3 fosfato desidrogenase Fosfoglicerato cinase Fosfoglicerato mutase Enolase Fosfohexose isomerase Aldolase Gliceraldeído3 fosfato desidrogenase Fosfoglicerato cinase Fosfoglicerato mutase Enolase Glicose Glicose 6fosfato Frutose6 fosfato Frutose16 bifosfato 2 Gliceraldeído3 fosfato 2 13Bifosfoglicerato 2 3Fosfoglicerato 2 2Fosfoglicerato 2 Fosfoenolpiruvato 2 Oxaloacetato Dihidroxiacetona fosfato Dihidroxiacetona fosfato Gliconeogênese Glicólise 2 Piruvato FIGURA 1513 Glicólise e gliconeogênese Vias opostas da glicólise em corderosa e da gliconeogênese em azul no fígado de rato Três etapas são catalisadas por enzimas diferentes na gliconeogênese as reações de desvio e na glicólise sete etapas são catalisadas pelas mesmas enzimas nas duas vias Para simplificar os cofatores foram omitidos Nelson6edbookindb 601 Nelson6edbookindb 601 030414 0744 030414 0744 602 DAVID L NELSON MICHAEL M COX As isoenzimas da hexocinase do músculo e do fígado são afetadas diferentemente por seu produto glicose6fosfato A hexocinase que catalisa a entrada da glicose na via glicolítica é uma enzima reguladora Os humanos têm quatro isoenzimas designadas de I a IV codificadas por quatro diferentes genes As isoenzimas são proteínas diferentes que catalisam a mesma reação Quadro 15 2 A isoenzima da hexocinase predominante dos mióci tos hexocinase II tem alta afinidade pela glicose ela atinge a metade da saturação em 01 mM Uma vez que a glicose que entra nos miócitos a partir do sangue onde sua concentração é de 4 a 5 mM gera uma concentração intracelular de glicose suficientemente alta para saturar a hexocinase I a enzima normalmente age na sua velocida de máxima ou próxima dela A hexocinase I do múscu lo e a hexocinase II são inibidas alostericamente por seu produto a glicose6fosfato de forma que sempre que a concentração intracelular de glicose se eleva acima do seu nível normal essas enzimas são temporária e reversi velmente inibidas levando a velocidade da formação da glicose6fosfato ao equilíbrio com a velocidade de sua utilização e reestabelecendo o estado estável QUADRO 152 Isoenzimas proteínas diferentes que catalisam a mesma reação As quatro formas de hexocinase encontradas nos teci dos de mamíferos são apenas um exemplo de uma situa ção biológica comum a mesma reação sendo catalisada por duas ou mais formas moleculares diferentes da mes ma enzima Essas múltiplas formas chamadas de isozi mas ou isoenzimas podem ocorrer na mesma espécie no mesmo tecido até na mesma célula As diferentes formas isoformas da enzima geralmente diferem nas propriedades cinéticas ou reguladoras no cofator utili zado p ex NADH ou NADPH no caso das isoenzimas desidrogenases ou na sua distribuição subcelular so lúvel ou ligada à membrana As isoenzimas podem ter sequências de aminoácidos similares mas não idênticas e em muitos casos elas compartilham claramente uma origem evolutiva comum Uma das primeiras enzimas para a qual se encontrou isoenzimas foi a lactatodesidrogenase LDH p 563 que existe nos tecidos dos vertebrados em pelo menos cinco formas diferentes separáveis por eletroforese To das as isoenzimas de LDH têm quatro cadeias polipep tídicas cada uma com Mr de 33500 e cada tipo tem uma proporção diferente de dois tipos de polipeptídeos A cadeia M de músculo e a cadeia H de coração são codificadas por dois genes diferentes A isoenzima predominante no músculo esquelético possui quatro cadeias M e no coração a isoenzima pre dominante possui quatro cadeias H Outros tecidos têm combinações dos cinco tipos possíveis de LDH Tipo Composição Localização LDH1 HHHH Coração e eritrócito LDH2 HHHM Coração e eritrócito LDH3 HHMM Cérebro e rim LDH4 HMMM Músculo esquelético e fígado LDH5 MMMM Músculo esquelético e fígado As diferenças no conteúdo das isoenzimas entre os tecidos podem ser usadas para avaliar o tempo e a extensão do dano cardíaco em consequência de um infar to do miocárdio ataque cardíaco O dano ao tecido car díaco resulta na liberação de LDH para o sangue Logo após um ataque cardíaco o nível sanguíneo total de LDH aumenta e existe mais LDH2 do que LDH1 Após 12 ho ras as quantidades de LDH1 e de LDH2 são muito seme lhantes e após 24 horas existe mais LDH1 do que LDH2 Essa mudança na relação LDH1LDH2 combinada com o aumento da concentração sanguínea de outra enzima cardíaca a creatinacinase é evidência muito forte de um infarto do miocárdio recente As diferentes isoenzimas de LDH apresentam valores de Vmáx e de Km significativamente diferentes em especial para o piruvato As propriedades da LDH4 favorecem a redução rápida de concentrações muito baixas de piruva to a lactato no músculo esquelético enquanto as proprie dades da isoenzima LDH1 favorecem a oxidação rápida do lactato a piruvato no coração Em geral a distribuição das diferentes isoenzimas de uma dada enzima reflete pelo menos quatro fatores 1 Padrões metabólicos diferentes em órgãos diferentes Para a glicogêniofosforilase as iso enzimas no músculo esquelético e no fígado têm propriedades reguladoras diferentes refletindo os diferentes papéis da degradação do glicogênio nesses dois tecidos 2 Localizações e papéis metabólicos diferentes para isoenzimas na mesma célula As isoen zimas da isocitratodesidrogenase do citosol e da mitocôndria são um exemplo Capítulo 16 3 Estágios de desenvolvimento diferentes em tecidos fetais ou embrionários e em tecidos adultos Por exemplo o fígado fetal tem uma distribuição característica da isoenzima LDH que se altera à medida que o órgão se desenvolve na sua forma adulta Algumas enzimas do cata bolismo da glicose em células malignas cance rígenas ocorrem como suas isoenzimas fetais e não adultas 4 Respostas diferentes de isoenzimas aos mo duladores alostéricos Esta diferença é útil na regulação mais fina das taxas metabólicas A hexocinase IV glicocinase do fígado e as suas isoenzimas de outros tecidos diferem na sua sen sibilidade à inibição pela glicose6fosfato Nelson6edbookindb 602 Nelson6edbookindb 602 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 603 As diferentes isoenzimas de hexocinase do fígado e do músculo refletem os diferentes papéis desses órgãos no metabolismo de carboidratos o músculo consome glico se usandoa para produção de energia enquanto o fígado mantém a homeostasia da glicose sanguínea produzindo ou consumindo o açúcar dependendo da sua concen tração sanguínea prevalente A isoenzima da hexocinase predominante no fígado é a hexocinase IV glicocina se que difere das hexocinases IIII de músculo em três importantes aspectos Em primeiro lugar a concentração de glicose na qual a hexocinase IV atinge a metade da sa turação 10 mM é maior do que sua concentração normal no sangue Uma vez que um transportador de glicose efi ciente nos hepatócitos GLUT2 equilibra rapidamente a concentração de glicose no citosol e no sangue ver na Figura 1130 a cinética do mesmo transportador GLUT2 em eritrócitos o alto Km da hexocinase IV permite sua regulação direta pelo nível de glicose sanguínea Figura 1514 Quando a glicose sanguínea é alta como aconte ce após uma refeição rica em carboidratos o excesso de glicose é transportado para os hepatócitos onde a hexoci nase IV o converte a glicose6fosfato Como a hexocinase não está saturada em 10 mM de glicose sua atividade con tinua aumentando à medida que a concentração da glico se se eleva para 10 mM ou mais Sob condições de glicose sanguínea baixa a concentração do açúcar no hepatócito é baixa em relação ao Km da hexocinase IV e a glicose gerada pela gliconeogênese deixa a célula antes de ficar retida pela fosforilação Em segundo lugar a hexocinase IV não é inibida pela glicose6fosfato e por isso pode continuar agindo quando o acúmulo do substrato inibe completamente as hexocina ses IIII Finalmente a hexocinase IV está sujeita à inibição pela interação reversível com uma proteína reguladora es pecífica do fígado Figura 1515 A ligação é muito mais forte na presença do efetor alostérico frutose6fosfato A glicose compete com a frutose6fosfato e causa a disso ciação da proteína reguladora da hexocinase removendo a inibição Imediatamente após uma refeição rica em carboi dratos quando a glicose sanguínea estiver alta ela entra nos hepatócitos via GLUT2 e ativa a hexocinase por esse mecanismo Durante o jejum quando os níveis de glicose no sangue diminuem para menos de 5 mM a frutose6 fosfato provoca a inibição da hexocinase IV pela proteína reguladora de forma que o fígado não compete com outros órgãos pela glicose escassa O mecanismo de inibição pela proteína reguladora é interessante a proteína ancora a en zima dentro do núcleo onde ela fica segregada das outras enzimas da glicólise no citosol Figura 1515 Quando a concentração da glicose no citosol se eleva ela equilibra com a glicose no núcleo pelo transporte por meio dos poros nucleares A glicose causa a dissociação da proteína regu ladora e a hexocinase passa para o citosol e inicia a fosfo rilação da glicose A hexocinase IV glicocinase e a glicose6fosfatase são reguladas na transcrição A hexocinase também é regulada ao nível de síntese pro teica As condições que demandam uma produção maior de energia baixa ATP alta AMP contração muscular vigorosa ou maior consumo de glicose p ex glicose san guínea alta causam aumento na transcrição do gene da hexocinase IV A glicose6fosfatase a enzima gliconeogê nica que faz o desvio da etapa da hexocinase na glicólise é 10 0 5 10 Concentração de glicose mM 15 20 Atividade enzimática relativa Hexocinase IV glicocinase Hexocinase I FIGURA 1514 Comparação entre as propriedades cinéticas da he xocinase IV glicocinase e da hexocinase I Observe a característica sigmoide para a curva da hexocinase IV e o Km muito mais baixo para a he xocinase I Quando a glicose sanguínea se eleva acima de 5 mM a atividade da hexocinase IV aumenta mas a hexocinase I já está agindo próximo de sua Vmáx e não pode responder ao aumento da concentração da glicose As hexocinases I II e III têm propriedades cinéticas semelhantes Glicose6fosfato Frutose6fosfato Hexocinase IV Hexocinase IV Glicose GLUT2 Membrana plasmática Citosol Núcleo Proteína reguladora Glicose Capilar FIGURA 1515 Regulação da hexocina se IV glicocinase por sequestro no nú cleo O inibidor proteico da hexocinase IV é uma proteína de ligação nuclear que carrega a enzima para dentro do núcleo quando a concentração da frutose6fosfato está alta no fígado e a libera para o citosol quando a con centração da glicose está alta Nelson6edbookindb 603 Nelson6edbookindb 603 030414 0744 030414 0744 604 DAVID L NELSON MICHAEL M COX regulada no nível da transcrição por fatores que demandam aumento na produção de glicose glicose sanguínea baixa sinalização por glucagon A regulação da transcrição des tas duas enzimas juntamente com outras enzimas da glicó lise e da gliconeogênese está descrita a seguir A regulação da fosfofrutocinase1 e da frutose16bifosfatase é recíproca Conforme observado a glicose6fosfato pode circular na glicólise ou por várias outras vias incluindo na via de sín tese do glicogênio ou na via das pentosesfosfato A reação metabolicamente irreversível catalisada pela PFK1 é a eta pa que compromete a glicose com a glicólise Essa enzima complexa tem além dos seus sítios de ligação ao substrato vários sítios reguladores aos quais se ligam os ativadores ou os inibidores alostéricos O ATP não é somente um substrato para a PFK1 sendo também um produto final da via glicolítica Quando a con centração celular alta de ATP sinaliza que ele está sendo produzido mais rapidamente do está sendo consumido o mesmo inibe a PFK1 por se ligar a um sítio alostérico na enzima o que reduz sua afinidade pelo substrato frutose6 fosfato Figura 1516 ADP e AMP cujas concentrações aumentam à medida que o consumo de ATP suplanta a pro dução atuam alostericamente para liberar a inibição pelo ATP Esses efeitos se combinam para produzir atividade en zimática mais elevada quando o ADP e o AMP se acumulam e mais baixa quando o ATP se acumula O citrato a forma ionizada do ácido cítrico interme diáriochave na oxidação aeróbia do piruvato dos ácidos graxos e dos aminoácidos é também um regulador alos térico da PFK1 concentração alta de citrato aumenta o efeito inibidor do ATP reduzindo ainda mais o fluxo de glicose pela glicólise Nesse caso assim como em vários outros encontrados adiante o citrato serve como sinal in tracelular de que a célula está satisfazendo suas necessi dades de energia metabólica pela oxidação de ácidos gra xos e proteínas A etapa correspondente na gliconeogênese é a conver são da frutose16bifosfato em frutose6fosfato Figura 1517 A enzima que catalisa essa reação FBPase1 é fortemente inibida alostericamente pelo AMP quando o suprimento de ATP da célula está baixo corresponden do a uma alta AMP diminui a síntese de glicose que requer ATP Assim essas etapas opostas nas vias glicolítica e glico neogênica catalisadas por PFK1 e FBPase1 são re guladas de uma forma coordenada e recíproca Em geral quando há concentração suficiente de acetilCoA ou de citrato produto da condensação da acetilCoA com oxa loacetato ou quando uma alta proporção do adenilato da célula está na forma de ATP a gliconeogênese é favorecida Quando o nível de AMP aumenta isso promove a glicóli se pela estimulação da PFK1 e como será visto na Seção 155 promove a degradação do glicogênio pela ativação da glicogêniofosforilase a Frutose6 fosfato 1 ATP Frutose16 bifosfato citrato ATP AMP ADP frutose26 bifosfato 1 ADP c Atividade da PFK1 Frutose6fosfato b Alta ATP Baixa ATP ADP ADP Frutose16 bifosfato Subunidade 3 Reguladores alostéricos ATP Reguladores alostéricos ATP Subunidade 1 Subunidade 2 Subunidade 4 FIGURA 1516 A fosfofrutocinase1 PFK1 e sua regulação a Ima gem de contorno de superfície da PFK1 de E coli mostrando suas quatro subunidades idênticas PDB ID 1PFK Cada subunidade tem seu próprio sítio catalítico no qual os produtos ADP e frutose 16bifosfato modelos de esfera e bastão respectivamente em vermelho e amarelo quase entram em con tato e seus próprios sítios de ligação ao regulador alostérico ATP escondido na proteína nas posições indicadas b Regulação alostérica da PFK1 de músculo pelo ATP ilustrada pela curva substratoatividade Em baixa ATP a K05 para a frutose6fosfato é relativamente baixa permitindo que a enzima atue em uma velocidade alta em frutose6fosfato relativamente baixa Re lembre do Capítulo 6 que K05 é o Km para as enzimas reguladoras Quando a ATP é alta K05 para a frutose6fosfato é muito aumentada conforme indi cado pela relação sigmoide entre a concentração do substrato e a atividade da enzima c Resumo dos reguladores que afetam a atividade da PFK1 Nelson6edbookindb 604 Nelson6edbookindb 604 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 605 A frutose26bifosfato é um regulador alostérico potente da PFK1 e da FBPase1 O papel especial do fígado na manutenção de um nível constante de glicose sanguínea requer mecanismos regu ladores adicionais para coordenar a produção e o consumo de glicose Quando o nível de glicose no sangue diminui o hormônio glucagon sinaliza para o fígado produzir e liberar mais glicose e parar de consumila para suas próprias ne cessidades Uma das fontes de glicose é o glicogênio arma zenado no fígado outra fonte é via gliconeogênese usando piruvato lactato glicerol ou determinados aminoácidos como material de partida Quando a glicose sanguínea está alta a insulina sinaliza para o fígado usar o açúcar como combustível e como precursor na síntese e no armazena mento de glicogênio e triacilglicerol A regulação hormonal rápida da glicólise e da gliconeo gênese é mediada pela frutose26bifosfato efetor alos térico das enzimas PFK1 e FBPase1 H CH2 P HO 2O O H H OH CH2 OH P O O O Frutose26bifosfato O O2 O2 O2 Quando a frutose26bifosfato se liga ao seu sítio alosté rico na PFK1 ela aumenta a afinidade dessa enzima pelo seu substrato frutose6fosfato e reduz a afinidade pelos inibidores alostéricos ATP e citrato Figura 1518 Em Frutose6fosfato ATP ADP AMP citrato Frutose16bifosfato ATP ADP Gliconeogênese Glicólise PFK1 FBPase1 Pi H2O FIGURA 1517 Regulação da frutose16bifosfatase FBPase1 e da fosfofrutocinase1 PFK1 O importante papel da frutose26bifosfato na regulação deste ciclo de substrato está detalhado nas figuras subsequentes Atividade da PFK1 da Vmáx 0 100 Frutose6fosfato mM a c 80 60 40 20 005 01 02 04 07 10 20 Atividade da FBPase1 da Vmáx 0 100 b 80 60 40 20 50 100 0 0 40 1F26BP 2F26BP 2F26BP 1F26BP Frutose16bifosfato mM Frutose6fosfato F26BP Frutose16bifosfato ATP ADP Gliconeogênese Glicólise PFK1 FBPase1 Pi H2O FIGURA 1518 Papel da frutose26bifosfato na regulação da glicólise e da gliconeogênese A frutose26bifosfato F26BP tem efeitos opostos sobre a atividade enzimática da fosfofrutocinase1 PFK1 enzima glicolítica e da frutose16bifosfatase FBPase1 enzima gliconeogênica a A atividade da PFK1 na ausência de F26BP curva azul é a metade da máxima quando a concentração da frutose6fosfato é 2 mM isto é K05 5 2 mM Quando 013 mM de F26BP está presente curva vermelha K05 para a frutose6fosfato é so mente 008 mM Assim a F26BP ativa a PFK1 por aumentar sua afinidade apa rente pela frutose6fosfato ver Figura 1516b b A atividade da FBPase1 é inibida por 1 mM de F26BP sendo fortemente inibida por 25 mM Na ausência do seu inibidor curva azul K05 para a frutose16bifosfato é 5 mM mas na presença de 25 mM de F26BP curva vermelha K05 é 70 mM A frutose26 bifosfato também torna a FBPase1 mais sensível à inibição por outro regula dor alostérico AMP c Resumo da regulação por F26BP Nelson6edbookindb 605 Nelson6edbookindb 605 030414 0744 030414 0744 606 DAVID L NELSON MICHAEL M COX concentrações fisiológicas de seus substratos ATP e fruto se6fosfato e de seus efetores positivos ou negativos ATP AMP citrato a PFK1 está praticamente inativa na ausên cia da frutose26bifosfato que tem efeito oposto sobre a FBPase1 ela reduz a afinidade pelo seu substrato Figura 1518b reduzindo a gliconeogênese A concentração celular do regulador alostérico fruto se26bifosfato é ajustada pelas taxas relativas de sua for mação e degradação Figura 1519a Ela se forma pela fosforilação da frutose6fosfato catalisada pela fosfofru tocinase2 PFK2 e é degradada pela frutose26bi fosfatase FBPase2 Observe que essas enzimas são distintas da PFK1 e a FBPase1 que catalisam respecti vamente a síntese e a degradação da frutose16bifosfato PFK2 e FBPase2 são duas atividades enzimáticas separa das de uma única proteína bifuncional O equilíbrio dessas duas atividades no fígado que determina o nível celular da frutose26bifosfato é regulado pelo glucagon e pela insu lina Figura 1519b Conforme visto no Capítulo 12 p 446 o glucagon esti mula a adenililciclase do fígado a sintetizar 3959AMP cícli co cAMP a partir de ATP O AMP cíclico ativa a proteína cinase dependente de cAMP a qual transfere um grupo fosforil do ATP para a proteína bifuncional PFK2FBPa se2 A fosforilação desta proteína aumenta sua atividade de FBPase2 e inibe a atividade de PFK2 Dessa forma o glu cagon reduz o nível celular de frutose26bifosfato inibin do a glicólise e estimulando a gliconeogênese A produção de mais glicose permite ao fígado repor a glicose sanguínea em resposta ao glucagon A insulina tem o efeito oposto estimulando a atividade de uma fosfoproteínafosfatase que catalisa a remoção do grupo fosforil da proteína bifuncional PFK2FBPase2 ativando sua atividade de PFK2 aumen tando o nível de frutose26bifosfato estimulando a glicóli se e inibindo a gliconeogênese A xilulose5fosfato é um reguladorchave do metabolismo dos carboidratos e das gorduras Outro mecanismo regulador atua também por meio do con trole do nível de frutose26bifosfato No fígado de mamí feros a xilulose5fosfato p 577 um produto da via das pentosesfosfato via das hexosesmonofosfato controla o aumento da glicólise que se segue à ingestão de uma refei ção rica em carboidratos A concentração da xilulose5fos fato aumenta à medida que a glicose que entra no fígado é convertida em glicose6fosfato e entra tanto na via glicolí tica como na das pentosesfosfato A xilulose5fosfato ativa a fosfoproteínafosfatase 2A PP2A Figura 1520 a qual desfosforila a enzima bifuncional PFK2FBPase2 Figura 1519 A desfosforilação ativa a PFK2 e inibe a FBPase2 e o aumento na concentração da frutose26bifosfato esti mula a glicólise e inibe a gliconeogênese A glicólise aumen tada impulsiona a produção de acetilCoA enquanto o fluxo aumentado de hexoses pela via das pentosesfosfato gera NADPH AcetilCoA e NADPH são os materiais de partida para a síntese de ácidos graxos e que sabese de longa data aumentam drasticamente em resposta à ingestão de uma refeição rica em carboidratos A xilulose5fosfato também aumenta a síntese de todas as enzimas necessárias na sín tese de ácidos graxos satisfazendo a predição a partir da análise do controle metabólico Esse efeito será esmiuçado na discussão sobre a integração do metabolismo de carboi dratos e gorduras no Capítulo 23 A enzima glicolítica piruvatocinase é inibida alostericamente por ATP Nos vertebrados são encontradas pelo menos três isoenzi mas da piruvatocinase que diferem na sua distribuição te cidual e nas suas respostas aos moduladores Altas concen Frutose26bifosfato Frutose6fosfato PFK2 FBPase2 a ATP ADP Pi ADP ATP H2O Pi Glucagon cAMP F26BP Estimula a glicólise inibe a gliconeogênese Inibe a glicólise estimula a gliconeogênese Proteínacinase dependente de cAMP Fosfo proteína fosfatase Insulina FBPase2 inativa PFK2 ativa OH PFK2 inativa FBPase2 ativa F26BP b O P O2 O2 O FIGURA 1519 Regulação do nível da frutose26bifosfato a A con centração celular do regulador frutose26bifosfato F26BF é determinada pelas taxas de sua síntese pela fosfofrutocinase2 PFK2 e sua degradação pela frutose26bifosfatase FBPase2 b Ambas as atividades enzimáticas são parte da mesma cadeia polipeptídica sendo reciprocamente reguladas pela insulina e pelo glucagon Nelson6edbookindb 606 Nelson6edbookindb 606 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 607 trações de ATP acetilCoA e ácidos graxos de cadeia longa sinais de suprimento abundante de energia inibem alos tericamente todas as isoenzimas da piruvatocinase Figu ra 1521 A isoenzima do fígado forma L mas não a do músculo forma M está sujeita à regulação adicional por fosforilação Quando a redução da glicose sanguínea cau Subunidade catalítica Subunidade reguladora Inibidor 2 Mn2 Suporte subunidade A a b Subunidade 2 reguladora Subunidade 1 reguladora Superfície 2 de reconhecimento do substrato Superfície 1 de reconhecimento do substrato Holoenzima 1 Holoenzima 2 Suportesubunidade A Subunidade catalítica FIGURA 1520 Estrutura e ação da fosfoproteínafosfatase 2A PP2A a A subunidade catalítica tem dois íons Mn 21 no seu sítio ativo posicionados próximos à superfície de reconhecimento do substrato forma da pela interface entre a subunidade catalítica e a reguladora PDB ID 2NPP A microcistinaLR mostrada aqui em vermelho é um inibidor específico de PP2A A subunidade catalítica e a reguladora repousam em um suporte a subunidade A que as posiciona uma em relação à outra e forma o sítio de reconhecimento do substrato b A PP2A reconhece várias proteínasalvo e sua especificidade é proporcionada pela subunidade reguladora As várias subunidades reguladoras se encaixam no suporte que contém a subunidade catalítica e cada subunidade reguladora cria seu sítio exclusivo de ligação ao substrato Somente o fígado Todos os tecidos glicolíticos incluindo o fígado Glucagon ADP ADP ATP ATP ATP acetilCoA ácidos graxos de cadeia longa PKA P Piruvato cinase LM Piruvato cinase L inativa H2O PP Pi PEP Piruvato transaminação Alanina F16BP 6 etapas FIGURA 1521 Regulação da piruvatocinase A enzima é inibida alos tericamente por ATP acetilCoA e ácidos graxos de cadeia longa sinais de um suprimento abundante de energia e o acúmulo de frutose16bifosfato desencadeia sua ativação O acúmulo de alanina que é sintetizada a partir do piruvato em uma única etapa inibe alostericamente a piruvatocinase reduzindo a velocidade de produção de piruvato na glicólise A isoenzima do fígado forma L também é regulada hormonalmente O glucagon ativa a proteínacinase dependente de AMP cíclico PKA ver Figura 1537 que fosforila a isoenzima L da piruvatocinase inativandoa Quando os níveis de glucagon diminuem uma proteínafosfatase PP desfosforila a piruvatoci nase ativandoa Este mecanismo impede que o fígado degrade glicose pela glicólise quando a glicose sanguínea estiver baixa em vez disso o fígado exporta glicose A isoenzima do músculo forma M não é afetada por esse mecanismo de fosforilação Nelson6edbookindb 607 Nelson6edbookindb 607 030414 0744 030414 0744 608 DAVID L NELSON MICHAEL M COX sa a liberação de glucagon a proteínacinase dependente de cAMP fosforila a isoenzima L inativandoa Isso causa uma redução no uso da glicose como combustível no fígado poupandoa para exportála para o cérebro e outros órgãos No músculo o efeito do aumento da cAMP é bem diferen te Em resposta à adrenalina o cAMP ativa a degradação do glicogênio e a glicólise e fornece o combustível necessário para a resposta de luta ou fuga A conversão gliconeogênica do piruvato a fosfoenolpiruvato está sob múltiplos tipos de regulação Na via de piruvato a glicose o primeiro ponto de controle determina o destino do piruvato na mitocôndria sua con versão em acetilCoA pelo complexo da piruvatodesidro genase para suprir o ciclo do ácido cítrico Capítulo 16 ou em oxaloacetato pela piruvatocarboxilase para iniciar o processo de gliconeogênese Figura 1522 Quando os ácidos graxos estão disponíveis como combustíveis sua de gradação nas mitocôndrias do fígado gera acetilCoA sinal de que não é necessária oxidação adicional de glicose para combustível A acetilCoA é um modulador alostérico po sitivo da piruvatocarboxilase e negativo da piruvatodesi drogenase por meio de uma proteínacinase que inativa a desidrogenase Quando as necessidades energéticas da cé lula estão satisfeitas a fosforilação oxidativa é reduzida a concentração de NADH aumenta em relação à de NAD 1 e inibe o ciclo do ácido cítrico e a acetilCoA se acumula A concentração aumentada da acetilCoA inibe o complexo da piruvatodesidrogenase diminuindo a formação de acetil CoA a partir de piruvato e estimula a gliconeogênese pela ativação da piruvatocarboxilase permitindo a conversão do excesso de piruvato em oxaloacetato e no final em gli cose O oxaloacetato assim formado é convertido em fosfo enolpiruvato PEP na reação catalisada pela PEPcarbo xicinase Figura 1513 Nos mamíferos a regulação dessa enzimachave ocorre principalmente no nível de sua síntese e degradação em resposta a sinais hormonais e dietéticos O jejum ou níveis elevados de glucagon agem por meio do cAMP para aumentar a taxa de transcrição e estabilizar o mRNA A insulina e a glicose sanguínea alta têm efeitos opostos Discutese adiante a regulação transcricional com mais detalhes Essas mudanças geralmente desencadeadas por um sinal de fora da célula dieta hormônios aconte cem em escala de tempo de minutos ou horas A regulação transcricional da glicólise e da gliconeogênese altera o número de moléculas das enzimas A maioria das ações reguladoras discutidas até agora é me diada por mecanismos rápidos e reversíveis efeitos alos téricos alterações covalentes fosforilação da enzima ou ligação a uma proteína reguladora Outro conjunto de pro cessos reguladores envolve alterações no número de mo léculas de uma enzima na célula por meio de mudanças no equilíbrio entre síntese e degradação da enzima e a discus são a seguir vai tratar da regulação da transcrição por meio de fatores de transcrição ativados por sinais No Capítulo 12 encontramse receptores nucleares e fa tores de transcrição no contexto da sinalização por insulina Esse hormônio age por meio de seu receptor na membrana plasmática para ativar pelo menos duas vias de sinalização distintas cada uma envolvendo a ativação de uma proteína cinase A MAPcinase ERK por exemplo fosforila os fato res de transcrição SRF e Elk1 ver Figura 1215 os quais estimulam a síntese de enzimas necessárias para o cresci mento e a divisão celular A proteínacinase B PKB tam bém chamada de Akt fosforila outro conjunto de fatores de transcrição p ex PDX1 que estimulam a síntese de enzimas que metabolizam carboidratos e as gorduras que se formam e são armazenadas em consequência de um exces so de ingestão de carboidratos Nas células b pancreáticas a PDX1 também estimula a síntese da própria insulina Mais de 150 genes são regulados pela insulina os hu manos têm pelo menos sete tipos gerais de elementos de resposta à insulina cada um deles reconhecido por um subconjunto de fatores de transcrição ativados pela insu lina sob condições variadas A insulina estimula a trans crição dos genes que codificam as hexocinases II e IV a PFK1 a piruvatocinase e a PFK2FBPase2 todas en volvidas na glicólise e na sua regulação várias enzimas da síntese dos ácidos graxos a glicose6fosfatodesidrogena Oxaloacetato piruvato carboxilase Gliconeogênese Glicose Piruvato complexo piruvato desidrogenase AcetilCoA Ciclo do ácido cítrico CO2 Energia FIGURA 1522 Dois destinos alternativos para o piruvato O piruvato pode ser convertido em glicose e glicogênio via gliconeogênese ou oxidado a acetilCoA para a produção de energia A primeira enzima de cada via é regulada alostericamente a acetilCoA produzida tanto pela oxidação dos ácidos graxos como pelo complexo da piruvatodesidrogenase estimula a piruvatocarboxilase e inibe a piruvatodesidrogenase Nelson6edbookindb 608 Nelson6edbookindb 608 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 609 se e a 6fosfogliconatodesidrogenase que são enzimas da via das pentosesfosfato que geram o NADPH requerido para a síntese dos ácidos graxos A insulina também re duz a expressão dos genes que codificam duas enzimas da gliconeogênese PEPcarboxicinase e glicose6fosfatase Tabela 155 Um fator de transcrição importante para o metabolis mo dos carboidratos é a ChREBP proteína de ligação ao elemento de resposta aos carboidratos de Car bohydrate Response Element Binding Protein Figura 1523 expressada principalmente no fígado no tecido adiposo e no rim Ela serve para coordenar a síntese das enzimas necessárias na síntese dos carboidratos e das gor duras ChREBP no seu estado inativo é fosforilada e se localiza no citosol Quando a fosfoproteínafosfatase PP2A Figura 1520 remove o grupo fosforil do ChREBP o fator de transcrição pode entrar no núcleo Ali uma PP2A nu clear remove outro grupo fosforil e o fator se liga a uma proteína Mlx ativando a síntese de várias enzimas piru vatocinase ácido graxosintase e acetilCoAcarboxilase a primeira enzima da via de síntese dos ácidos graxos TABELA 155 Alguns dos genes regulados pela insulina Alteração na expressão gênica Via Expressão aumentada Hexocinase II Glicólise Hexocinase IV Glicólise Fosfofrutocinase I PFK1 Glicólise Piruvatocinase Glicólise PFK2FBPase2 Regulação da glicólisegliconeogênese Glicose6fosfatodesidrogenase Via das pentosesfosfato NAPDH 6Fosfogliconatodesidrogenase Via das pentosesfosfato NAPDH Piruvatodesidrogenase Síntese dos ácidos graxos AcetilCoAcarboxilase Síntese dos ácidos graxos Enzima málica Síntese dos ácidos graxos NADPH ATPcitratoliase Síntese dos ácidos graxos fornece acetilCoA Complexo sintase de ácidos graxos Síntese dos ácidos graxos EstearoilCoAdesidrogenase Insaturação dos ácidos graxos AcilCoAgliceroltransferases Síntese de triacilglicerol Expressão reduzida PEPcarboxicinase Gliconeogênese Glicose6fosfatase subunidade catalítica Glicose liberada para o sangue FIGURA 1523 Mecanismo de regulação gênica pelo fator de transcri ção ChREBP Quando um fator ChREBP é fosforilado em um resíduo de Ser e um de Thr no citosol de um hepatócito ele não pode entrar no núcleo A desfosforilação de Ser pela proteínafosfatase PP2A permite que ChREBP entre no núcleo onde uma segunda desfosforilação de Thr ativa o fator de forma que ele consiga se associar com a proteína Mlx ChREBPMlx se liga agora ao elemento de resposta aos carboidratos ChoRE no promotor e es timula a transcrição PP2A é ativada alostericamente pela xilulose5fosfato um intermediário da via das pentosesfosfato GLUT2 Citosol Glicose Glicose Glicose6 fosfato Xilulose5 fosfato P Hexocinase IV glicocinase PP2A P ChREBP P ChREBP Pi Xilulose5 fosfato PP2A P ChREBP ChREBP Mlx mRNA Mlx ChREBP Mlx ChREBP Pi Núcleo Membrana plasmática ChoRE Nelson6edbookindb 609 Nelson6edbookindb 609 030414 0744 030414 0744 610 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A xilulose5fosfato que controla a atividade da PP2A e assim forma basicamente a síntese desse grupo de enzimas metabólicas é um intermediário da via das pen tosesfosfato Figura 1423 Quando a concentração da glicose no sangue está alta ela entra no fígado e é fosfori lada pela hexocinase IV A glicose6fosfato assim formada pode entrar ou na via glicolítica ou na via das pentoses fosfato Nesta última duas oxidações iniciais produzem a xilulose5fosfato a qual serve como um sinal de que as vias de utilização da glicose estão bem supridas de subs trato Isso é obtido pela ativação alostérica da PP2A a qual desfosforila a ChREBP permitindo ao fator de transcrição a ativação de genes das enzimas da glicólise e da síntese de gorduras Figura 1523 A glicólise gera piruvato e a conversão do piruvato em acetilCoA fornece o material de partida para a síntese dos ácidos graxos a acetilCoAcar boxilase converte acetilCoA em malonilCoA o primei ro intermediário comprometido com a via de síntese dos ácidos graxos O complexo da ácido graxosintase produz ácidos graxos que são exportados para o tecido adiposo e armazenados na forma de triacilgliceróis Capítulo 21 Dessa maneira o excesso de carboidrato da dieta é arma zenado como gordura Outro fator de transcrição no fígado SREBP1c mem bro da família das proteínas de ligação ao elemento re gulador dos esteróis SREBP de Sterol Regulatory Ele ment Binding Protein ver Figura 2144 ativa a síntese da piruvatocinase hexocinase IV lipase lipoproteica ace tilCoAcarboxilase e do complexo da ácido graxosintase que converte a acetilCoA produzida a partir do piruvato em ácidos graxos para o armazenamento nos adipócitos A síntese da SREBP1c é estimulada pela insulina e inibida pelo glucagon A SREBP1c também reprime a expressão de várias enzimas gliconeogênicas glicose6fosfatase PEPcarboxicinase e FBPase1 O fator de transcrição CREB proteína de ligação ao elemento de resposta ao cAMP de Cyclic AMP Response Element Binding protein ativa a síntese da glicose6fosfatase e da PEPcarboxicinase em resposta ao aumento da cAMP desencadeado pelo glucagon Em contrapartida a inativação de outros fatores de trans crição estimulada pela insulina inibe a síntese de várias enzimas gliconeogênicas no fígado PEPcarboxicinase frutose16bifosfatase transportador da glicose6fosfato do retículo endoplasmático e a glicose6fosfatase Por exemplo FOXO1 de forkhead box other estimula a síntese das enzimas gliconeogênicas e reprime a síntese das enzimas da glicólise da via das pentosesfosfato e da síntese dos triacilgliceróis Figura 1524 Na sua forma não fosforilada FOXO1 age como um fator de transcrição nuclear Em resposta à insulina esse fator deixa o núcleo e no citosol é fosforilado pela PKB sendo marcado com ubiquitina e degradado no proteassomo O glucagon im pede a fosforilação pela PKB e FOXO1 permanece ativo no núcleo Embora os processos descritos anteriormente pareçam complicados a regulação dos genes que codificam as enzi mas do metabolismo dos carboidratos e das gorduras vem a ser muito mais complexa e aprimorada do que aparece aqui Múltiplos fatores de transcrição podem agir sobre um mesmo promotor múltiplas proteínascinases e fosfatases podem ativar ou inativar estes fatores e uma grande va riedade de fatores acessórios proteicos modula a atividade dos fatores de transcrição Essa complexidade pode ser evidenciada por exemplo no gene que codifica a PEP carboxicinase um caso de controle transcricional muito bem estudado Sua região promotora Figura 1525 tem mais de 15 elementos de resposta que são reconhecidos por pelo menos uma dúzia de fatores de transcrição co nhecidos e com provavelmente mais a serem descobertos Os fatores de transcrição agem em associação sobre esta região promotora e em centenas de outros promotores para regular de forma mais exata os níveis de centenas de enzimas metabólicas coordenando suas atividades no me tabolismo dos carboidratos e das gorduras A importância crucial dos fatores de transcrição na regulação metabóli ca se torna clara pela observação dos efeitos de mutações nesses genes Por exemplo pelo menos cinco tipos dife rentes de diabetes juvenil iniciado na maturidade MODY de MaturityOnset Diabetes of the Young são associa dos com mutações em fatores de transcrição específicos Quadro 153 Fosfoproteína fosfatase Insulina Ubiquitina Citosol Núcleo PKB P FOXO1 FOXO1 FOXO1 Proteossomo Membrana plasmática DNA mRNA PEPcarboxicinase Glicose6fosfatase Pi FIGURA 1524 Mecanismo de regulação gênica pelo fator de transcri ção FOXO1 A insulina ativa a cascata de sinalização mostrada na Figura 12 16 levando à ativação da proteínacinase B PKB FOXO1 é fosforilado pela PKB no citosol e o fator fosforilado é marcado pela adição de ubiquitinas para degradação no proteassomo O FOXO1 que permanece não fosforilado ou que é desfosforilado entra no núcleo se liga a um elemento de resposta e desencadeia a transcrição dos genes associados Por isso a insulina tem o efeito de desligar a expressão destes genes os quais incluem a PEPcarboxi cinase e a glicose6fosfatase Nelson6edbookindb 610 Nelson6edbookindb 610 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 611 Mediador mRNA TBP FOXO1 PPARg2 SREBP1 SREBP1 HNF3b GR HNF3b DNA dAF2 dAF1 SRE AF1 AF2 GRE TRE SRE P4 P3II CRE P3I P2 P1 TATA FOXO1 HNF4a COUPTF RAR NFkB T3R FosJun FosJun ATF3 CREB CEBP CEBP NF1 HNF1 300 1 1500 Fatores de transcrição FOXO1 forkhead box other 1 PPARg2 receptor g2 ativado por proliferador de peroxissomo HNF3b fator 3b nuclear hepático SREBP1 proteína 1 de ligação ao elemento de resposta aos esteróis HNF4a fator 4a nuclear hepático COUPTF fator de transcriçãopromotor a montante da ovoalbumina de galinha RAR receptor do ácido retinoico GR receptor de glicocorticoide T3R receptor do hormônio tireóideo CEBP CAATproteína de ligação intensificadora HNF1 fator nuclear hepático1 NF1 fator nuclear 1 ATF3 fator ativador de transcrição 3 CREB proteína de ligação ao elemento de resposta ao cAMP NFkB fator nuclear kB TBP proteína de ligação à TATAbox TFIIH fator de transcrição IIH Elementos de resposta e sítios reguladores de ligação no promotor dAF2 fator 2 acessório distal dAF1 fator 1 acessório distal SRE elemento regulador de esteróis AF1 fator 1 acessório AF2 fator 2 acessório GRE elemento regulador de glicocorticoides TRE elemento regulador do hormônio tireóideo CRE elemento regulador de cAMP TFIIH Pol II FIGURA 1525 A região promotora do gene da PEPcarboxicinase mostrando a complexidade da regulação deste gene Este diagrama mostra os fatores de transcrição os ícones menores ligados ao DNA relacio nados com a regulação da transcrição do gene da PEPcarboxicinase O nível de expressão deste gene depende de sinais combinados que afetam todos estes fatores que podem refletir a disponibilidade de nutrientes o nível de glicose sanguínea e outras circunstâncias que afetam a necessidade da cé lula por esta enzima em um período em particular P1 P2 P3I P3II e P4 são sítios de ligação a proteínas identificados por footprinting com DNase I ver Quadro 261 A TATAbox é o ponto de montagem do complexo de transcri ção da RNApolimerase II Pol II Continua na próxima página O termo diabetes descreve grande variedade de condi ções clínicas que têm em comum a produção excessiva de urina O Quadro 112 descreve o diabetes insípido no qual a reabsorção defectiva de água pelos rins é resul tado de uma mutação no gene da aquaporina Diabetes melito se refere especificamente à doença na qual a me tabolização da glicose está comprometida seja devido à incapacidade do pâncreas de produzir insulina ou à resis tência dos tecidos à ação da insulina Existem dois tipos comuns de diabetes melito O tipo 1 também chamado de diabetes melito dependente de insulina IDDM de insulindependent diabetes melli tus é causado por um ataque autoimune às células b pancreáticas produtoras de insulina As pessoas com IDDM devem usar insulina injetável ou por inalação para compensar a perda das células b O IDDM se desenvolve na infância ou na adolescência um nome mais antigo da doença é diabetes juvenil O tipo 2 também chamado de diabetes melito não dependente de insulina NIDDM de noninsulindependent diabetes mellitus se desen volve em adultos com mais de 40 anos É muito mais co mum do que o IDDM e sua ocorrência na população está fortemente relacionada com a obesidade A atual epi demia de obesidade nos países mais desenvolvidos traz com ela o presságio de uma epidemia de NIDDM propor cionando um forte incentivo para o estudo das relações entre a obesidade e o desencadeamento do NIDDM nos níveis genético e bioquímico Após completar o exame do metabolismo das gorduras e das proteínas nos últimos capítulos o Capítulo 23 retoma a discussão do diabetes que tem um amplo efeito no metabolismo dos carboidra tos das gorduras e das proteínas Aqui será estudado outro tipo de diabetes no qual o metabolismo dos carboidratos e das gorduras está altera do diabetes juvenil com início na maturidade MODY no qual uma mutação genética afeta um fator de trans crição importante na transmissão do sinal da insulina para o núcleo ou afeta uma enzima que responde à in QUADRO 153 MEDICINA Mutações genéticas que originam formas raras de diabetes Nelson6edbookindb 611 Nelson6edbookindb 611 030414 0744 030414 0744 612 DAVID L NELSON MICHAEL M COX RESUMO 153 Regulação coordenada da glicólise e da gliconeogênese c A gliconeogênese e a glicólise compartilham sete enzi mas que catalisam as reações livremente reversíveis das vias Nas outras três etapas a reação direta e a inversa são catalisadas por enzimas diferentes e esses são os pontos de regulação das duas vias c A hexocinase IV glicocinase tem propriedades ciné ticas relacionadas com seu papel especial no fígado li berar glicose para o sangue quando a glicose sanguínea está baixa além de captar e metabolizar a glicose quan do ela estiver alta no sangue c A PFK1 é inibida alostericamente por ATP e citrato Na maioria dos tecidos dos mamíferos incluindo o fígado a frutose26bifosfato é um ativador alostérico dessa enzima c A piruvatocinase é inibida alostericamente por ATP e a isoenzima do fígado também é inibida por fosforilação dependente de cAMP c A gliconeogênese é regulada no nível da piruvatocarbo xilase ativada por acetilCoA e da FBPase1 inibida por frutose26bifosfato e AMP c Para limitar a alternância de substrato entre a glicóli se e a gliconeogênese as duas vias estão sob controle alostérico recíproco obtido principalmente pelos efei tos opostos da frutose26bifosfato sobre a PFK1 e a FBPase1 c O glucagon ou a adrenalina reduzem a frutose26bi fosfato pela elevação da cAMP e promoção da fosfo rilação da enzima bifuncional PFK2FBPase2 A insu lina aumenta a frutose26bifosfato pela ativação da fosfoproteínafosfatase que desfosforila e assim ativa a PFK2 c A xilulose5fosfato um intermediário da via das pen tosesfosfato ativa a fosfoproteínafosfatase PP2A que desfosforila várias proteínasalvo incluindo PFK2 FBPase2 deslocando o equilíbrio no sentido da capta ção de glicose síntese de glicogênio e síntese de lipí deos no fígado c Os fatores de transcrição ChREBP CREB SREBP e FOXO1 agem no núcleo na regulação da expressão de genes específicos que codificam enzimas das vias glico lítica e gliconeogênica A insulina e o glucagon atuam antagonicamente na ativação desses fatores ligando e desligando dessa forma um grande número de genes 154 Metabolismo do glicogênio nos animais A presente discussão sobre a regulação metabólica usando o metabolismo dos carboidratos como principal exemplo aborda agora a síntese e a degradação do glicogênio Esta seção focaliza as vias metabólicas a Seção 155 aborda os mecanismos reguladores Nos organismos desde as bactérias até as plantas e os vertebrados o excesso de glicose é convertido em formas poliméricas de armazenamento glicogênio nos vertebra dos e em muitos microrganismos amido nas plantas Nos vertebrados o glicogênio é encontrado principalmente no fígado e no músculo esquelético podendo representar até 10 do peso do fígado e 1 a 2 do peso do músculo Se toda essa glicose fosse dissolvida no citosol de um hepatóci to sua concentração seria de cerca de 04 M suficiente para influenciar nas propriedades osmóticas da célula Quando armazenada na forma de um grande polímero glicogênio sulina No MODY2 uma mutação no gene da hexocinase IV glicocinase afeta o fígado e o pâncreas órgãos nos quais esta é a principal isoforma da hexocinase A glico cinase das células b pancreáticas funciona como sensor de glicose Normalmente quando a glicose sanguínea aumenta aumentam também seus níveis nas células b sendo que uma vez que a glicocinase tem um Km relati vamente alto para a glicose sua atividade aumenta com a elevação dos níveis de glicose no sangue O metabo lismo da glicose6fosfato formada nessa reação eleva o nível de ATP nas células b e isso causa a liberação de insulina pelo mecanismo mostrado na Figura 2327 Em pessoas sadias a concentração sanguínea de glicose de 5 mM causa essa liberação do hormônio mas pessoas com mutações inativantes em ambas as cópias do gene da glicocinase têm limiares muito altos para a liberação da insulina e em consequência apresentam hipergli cemia severa desde o nascimento diabetes neonatal permanente Em pessoas com uma cópia mutada e uma normal o limiar de glicose para a liberação da insulina se eleva para cerca de 7 mM Essas pessoas têm níveis de glicose sanguínea ligeiramente acima do normal elas geralmente têm hiperglicemia leve e não apresentam outros sintomas Essa condição MODY2 geralmente é descoberta por acaso durante análise rotineira de glicose sanguínea Existem pelo menos outros cinco tipos de MODY cada um deles como resultado de mutações inativantes em algum dos fatores de transcrição essenciais para o desenvolvimento normal e a função das células b pan creáticas As pessoas com essas mutações apresentam redução na produção de insulina e os defeitos associados à homeostasia da glicose sanguínea em graus variados Em MODY1 e MODY3 os defeitos são suficientemente graves para produzir as complicações de longo prazo as sociadas com IDDM e NIDDM problemas cardiovascula res insuficiência renal e cegueira MODY4 5 e 6 são for mas menos graves da doença Em conjunto as doenças MODY representam uma pequena porcentagem de casos de NIDDM Pessoas com mutações no próprio gene da insulina também são casos muito raros elas apresentam defeitos de gravidade variada na sinalização da insulina QUADRO 153 MEDICINA Mutações genéticas que originam formas raras de diabetes Continuação Nelson6edbookindb 612 Nelson6edbookindb 612 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 613 contudo a mesma massa de glicose tem uma concentração de apenas 001 mM O glicogênio é armazenado em grandes grânulos citosólicos A partícula básica do glicogênio a par tícula b tem um diâmetro de cerca de 21 nm e consiste em 55000 resíduos de glicose com cerca de 2000 extremidades não redutoras De 20 a 40 dessas partículas se agrupam para formar as rosetas a facilmente visíveis ao microscópio em amostras de tecidos de animais bem alimentados Figura 1526 mas que desaparecem após um jejum de 24 horas O glicogênio do músculo fornece uma fonte de ener gia rápida para o metabolismo aeróbio e anaeróbio O gli cogênio muscular pode ser gasto em menos de uma hora durante atividade intensa O glicogênio hepático serve como um reservatório de glicose para os outros tecidos quando não há glicose disponível entre as refeições ou no jejum isto é especialmente importante para os neurô nios do cérebro que não podem usar ácidos graxos como combustível O glicogênio do fígado pode ser exaurido de 12 a 24 horas Nos humanos a quantidade total de energia armazenada na forma de glicogênio é muito menor do que a quantidade armazenada como gordura triacilglicerol ver Tabela 235 mas as gorduras nos mamíferos não podem ser convertidas em glicose e não podem ser meta bolizadas anaerobiamente Os grânulos de glicogênio são agregados complexos de glicogênio mais as enzimas que os sintetizam e os degradam assim como a maquinaria de regulação dessas enzimas Os mecanismos gerais de armazenamento e mobilização do glicogênio são os mesmos no músculo e no fígado mas as enzimas diferem em aspectos sutis mas importantes que refletem os papéis diferentes do glicogênio nesses dois teci dos O glicogênio também é obtido da dieta e degradado no intestino e isso envolve um conjunto separado de enzimas hidrolíticas que convertem glicogênio em glicose livre O amido da dieta é hidrolisado de forma semelhante A pre sente discussão se inicia com a degradação do glicogênio em glicose1fosfato glicogenólise e em seguida aborda a sua síntese glicogênese A degradação do glicogênio é catalisada pela glicogêniofosforilase No músculo esquelético e no fígado as unidades de glico se das ramificações externas do glicogênio entram na via glicolítica pela ação de três enzimas glicogêniofosforilase enzima de desramificação do glicogênio e fosfoglicomutase A glicogêniofosforilase catalisa a reação na qual uma liga ção glicosídica a1S4 entre dois resíduos de glicose em uma extremidade não redutora do glicogênio é atacada por um fosfato inorgânico Pi removendo o resíduo terminal na forma de aDglicose1fosfato Figura 1527 Essa FIGURA 1526 Grânulos de glicogênio em um hepatócito O glicogê nio a forma de armazenamento de carboidratos aparece como partículas eletrodensas geralmente na forma de agregados ou rosetas Nos hepató citos o glicogênio está intimamente associado com os túbulos do retícu lo endoplasmático liso Muitas mitocôndrias também são evidentes nesta micrografia 1 O Glicogênio com um resíduo de glicose a menos glicosen21 Cadeia de glicogênio glicosen P O2 O2 Glicose1fosfato 3 2 4 1 6 O Extremidade não redutora 5 O O HO H H H H OH H CH2OH CH2OH CH2OH OH O H H H H OH H OH O Extremidade não redutora O O HO H H H H OH H CH2OH CH2OH OH O H H H H OH H OH O O H H H H OH H OH 3 2 4 1 6 O 5 O HO H H H H OH H CH2OH OH Glicogênio fosforilase Pi FIGURA 1527 Remoção pela glicogênio fosforilase de um resíduo de glicose da extremidade não redutora de uma cadeia de glicogênio Este processo é repetitivo a enzima remove sucessivos resíduos de glicose até que alcance a quarta unidade de glicose antes de um ponto de ramificação ver Figura 1528 Nelson6edbookindb 613 Nelson6edbookindb 613 030414 0744 030414 0744 614 DAVID L NELSON MICHAEL M COX reação de fosforólise é diferente da hidrólise das ligações glicosídicas pela amilase durante a degradação intestinal do glicogênio e do amido da dieta Na fosforólise parte da energia da ligação glicosídica é preservada pela formação do éster de fosfato glicose1fosfato ver Seção 142 O piridoxalfosfato é um cofator essencial na reação da glicogêniofosforilase seu grupo fosfato atua como catalisa dor ácido geral promovendo o ataque pelo Pi sobre a liga ção glicosídica Esse papel do piridoxalfosfato é incomum seu papel mais característico é o de cofator no metabolismo dos aminoácidos ver Figura 186 A glicogêniofosforilase age repetidamente sobre as ex tremidades não redutoras das ramificações do glicogênio até que alcance um ponto a quatro resíduos de glicose de um ponto de ramificação a1S6 ver Figura 713 onde interrompe sua ação A degradação pela glicogêniofosfo rilase continua somente depois que a enzima de desra mificação conhecida formalmente como oligo a1S6 a a1S4 glicantransferase catalisa duas reações suces sivas que removem as ramificações Figura 1528 Logo que as ramificações são removidas e o resíduo glicosil na posição C6 é hidrolisado a atividade da glicogêniofosfori lase pode continuar A glicose1fosfato pode entrar na glicólise ou no fígado repor a glicose sanguínea A glicose1fosfato o produto final da reação da glicogênio fosforilase é convertida em glicose6fosfato pela fosfo glicomutase que catalisa a reação reversível Glicose1fosfato glicose6fosfato A enzima inicialmente fosforilada em um resíduo de Ser doa um grupo fosforil ao C6 do substrato e aceita um grupo fosforil do C1 Figura 1529 A glicose6fosfato formada no músculo esquelético a partir do glicogênio pode entrar na glicólise e serve como fonte de energia para a contração muscular No fígado a de gradação do glicogênio serve a um propósito diferente libe rar glicose para o sangue quando o nível de glicose sanguí nea diminui como acontece entre as refeições Isso requer Moléculas de glicose1fosfato Atividade de glicosidase a1S6 da enzima de desramificação Atividade de transferase da enzima de desramificação Polímero a 1S4 não ramificado substrato para nova ação da fosforilase Glicogênio fosforilase Ligação a 1S6 Extremidades não redutoras Glicogênio Glicose FIGURA 1528 Degradação do glicogênio próximo a um ponto de rami ficação a1S6 Seguindose à remoção sequencial dos resíduos terminais de glicose pela glicogêniofosforilase ver Figura 1527 os resíduos próximos a uma ramificação são removidos por um processo em duas etapas que requer a enzima de desramificação bifuncional Na primeira a atividade de transferase da enzima remove um bloco de três resíduos de glicose da ramificação para uma extremidade não redutora próxima à qual é religado por uma ligação a1S4 O resíduo remanescente no ponto de ramificação em ligação a1S6 é então liberado como glicose livre pela atividade de glicosidase a1S6 da enzima de desramificação Os resíduos de glicose são mostrados na forma con densada que omite os grupos H OH e CH2OH dos anéis piranosídicos Glicose1 fosfato Fosfoglicomutase OPO3 2 H2COH H H HO OH H H HO H O Ser Ser Glicose16 bifosfato OPO3 2 H2COPO3 2 H2COPO3 2 H H HO OH H H HO H O HO Ser Glicose6 fosfato H H HO OH H H HO H O OH 2O3PO 2O3PO ➊ ➋ FIGURA 1529 A reação catalisada pela fosfoglicomutase A reação começa com a enzima fosforilada em um resíduo de Ser Na etapa ➊ a en zima doa seu grupo fosforil em azul para a glicose1fosfato produzindo glicose16bifosfato Na etapa ➋ o grupo fosforil no C1 da glicose16bi fosfato em vermelho é transferido de volta para a enzima restaurando a fosfoenzima e produzindo glicose6fosfato Nelson6edbookindb 614 Nelson6edbookindb 614 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 615 a presença da enzima glicose6fosfatase no fígado e no rim mas não em outros tecidos A enzima é uma proteína in tegral da membrana do retículo endoplasmático contendo preditivamente nove hélices transmembrana com seu sítio ativo no lado lumenal do retículo A glicose6fosfato for mada no citosol é transportada para o lúmen do retículo por um transportador específico T1 Figura 1530 e hidrolisada na superfície lumenal pela glicose6fosfatase Acreditase que os produtos resultantes Pi e glicose sejam transportados de volta para o citosol por dois transportado res diferentes T2 e T3 e a glicose deixa o hepatócito pelo transportador GLUT2 na membrana plasmática Observe que por ter o sítio ativo da enzima no lúmen do retículo a célula separa essa reação do processo de glicólise que acontece no citosol e poderia ser abortado pela ação da gli cose6fosfatase Defeitos genéticos na glicose6fosfatase ou no T1 levam a perturbações sérias no metabolismo do glicogênio resultando na doença de depósito de glicogênio tipo Ia Quadro 154 O músculo e o tecido adiposo não conseguem converter a glicose6fosfato formada pela degradação do glicogênio em glicose pois não têm a enzima glicose6fosfatase por isso esses tecidos não fornecem glicose para o sangue O nucleotídeo de açúcar UDPglicose doa glicose para a síntese do glicogênio Muitas das reações pelas quais as hexoses são transformadas ou poli merizadas envolvem nucleotídeos de açúcar compostos nos quais o carbono anômero do açúcar é ativa do pela união a um nucleotídeo por meio de uma ligação éster de fosfa to Os nucleotídeos de açúcar são os substratos para a polimerização de monossacarídeos em dissacarí deos glicogênio amido celulose e polissacarídeos extracelulares mais complexos Também são intermedi árioschave na produção das amino hexoses e desoxihexoses encontradas em alguns desses polissacarídeos e na síntese da vitamina C ácido Lascór bico O papel dos nucleotídeos de açúcar na biossíntese do glicogênio e em muitos outros derivados de carboidratos foi descoberto em 1953 pelo bioquímico argentino Luis Leloir Grupo Dglicosil O HN OH H H HO H CH2OH O P O O H P O O CH2 H H OH H N O O OH H H O HO O O UDPglicose um nucleotídeo de açúcar Uridina A adequação dos nucleotídeos de açúcar para as rea ções biossintéticas tem origem em várias propriedades 1 Sua formação é metabolicamente irreversível contribuindo para a irreversibilidade das vias biossintéticas em que são intermediários A con densação de um nucleosídeotrifosfato com uma hexose1fosfato para formar um nucleotídeo de açúcar tem uma pequena variação de energia li vre positiva mas a reação libera PPi que é rapi damente hidrolisado pela pirofosfatase inorgânica Figura 1531 em uma reação fortemente exer gônica DG9 5 192 kJmol Isso mantém baixa a concentração de PPi garantindo que na célula a variação de energia livre real seja vantajosa De fato a remoção rápida do produto conduzida pela grande variação de energia livre negativa da hi drólise de PPi impulsiona a reação sintética para Luis Leloir 19061987 Citosol Lúmen do RE G6P G6P Transportador de G6P T1 Glicose6 fosfatase Transportador de glicose T2 Glicose Glicose Pi Pi Membrana plasmática GLUT2 Capilar Concentração sanguínea de glicose aumentada Transportador de Pi T3 FIGURA 1530 Hidrólise da glicose6fosfato pela gli cose 6fosfatase do retícu lo endoplasmático RE O sítio catalítico da glicose6 fosfatase está voltado para o lúmen do RE Um transporta dor T1 de glicose6fosfato G6P leva o substrato do cito sol para o lúmen e os produ tos glicose e Pi passam para o citosol por meio de trans portadores específicos T2 e T3 A glicose deixa a célula via transportador GLUT2 da membrana plasmática Nelson6edbookindb 615 Nelson6edbookindb 615 030414 0744 030414 0744 616 DAVID L NELSON MICHAEL M COX a frente estratégia comum nas reações biológicas de polimerização 2 Embora as transformações químicas dos nucleotí deos de açúcar não envolvam os átomos do próprio nucleotídeo essa parte da molécula tem muitos grupos que podem interagir covalentemente com enzimas a energia livre adicional de ligação pode contribuir de modo significativo para a atividade catalítica Capítulo 6 ver também p 306307 3 Assim como o fosfato o grupo nucleotidil p ex UMP ou AMP é um excelente grupo de fácil elimi nação facilitando o ataque nucleofílico pela ativa ção do carbono do açúcar ao qual está ligado 4 Pela marcação de algumas hexoses com grupos nucleotidil as células podem deixálas confinadas em um reservatório para uma finalidade p ex sín tese de glicogênio separadas das hexosesfosfato destinadas a outra finalidade como a glicólise A síntese do glicogênio ocorre em quase todos os teci dos animais mas é mais importante no fígado e no músculo esquelético O ponto de partida para a síntese do glicogênio Muito do que está escrito nos livrostexto atuais de bio química sobre o metabolismo do glicogênio foi descober to entre 1925 e 1950 pelo admirável casal Carl F Cori e Gerty T Cori Ambos se formaram em medicina na Eu ropa no final da I Guerra Mundial ela completou os es tudos prémédicos e a escola de medicina em um ano Eles deixaram a Europa juntos em 1922 e estabeleceram laboratórios de pesquisa nos Estados Unidos primei ro por nove anos em Buffalo Nova York onde é hoje o Roswell Park Memorial Institute e de 1931 até o final de suas vidas na Universidade de Washington em St Louis Nos seus estudos fisiológicos iniciais sobre a origem e o destino do glicogênio no músculo dos animais os Cori demonstraram a conversão do glicogênio em lactato no tecido o deslocamento do lactato pelo sangue para o fíga do e sua reconversão aí em glicogênio rota que se tor nou conhecida como o ciclo de Cori ver Figura 2319 Seguindo essas informações no nível bioquímico o casal mostrou que o glicogênio era mobilizado em uma reação de fosforólise catalisada pela enzima descoberta por eles a glicogêniofosforilase Os Cori identificaram o produto dessa reação o éster de Cori como glicose1fosfato e mostraram que esse produto podia ser reincorporado em glicogênio pela reação inversa Embora isso não provasse que essa era a reação usada pelas células para sintetizar glicogênio foi a primeira demonstração in vitro da sín tese de uma macromolécula a partir de subunidades mo noméricas simples o que inspirou outros a procurar en zimas polimerizadoras Arthur Kornberg descobridor da primeira DNApolimerase falou sobre sua experiência no laboratório dos Cori Foi a glicogêniofosforilase e não o pareamento de bases que me levou à DNApolimerase Gerty Cori passou a se interessar por doenças genéticas humanas nas quais o fígado armazenava um excesso de glicogênio Ela conseguiu identificar o defeito bioquímico de várias dessas doenças e mostrou que elas po diam ser diagnosticadas por meio de testes das en zimas do metabolismo do glicogênio em pequenas amos tras de tecidos obtidas por biópsias A Tabela Q1 resume o conhecimento atual sobre 13 doenças genéticas desse tipo Carl e Gerty compartilharam o Prêmio Nobel em Fi siologia ou Medicina em 1947 com Bernardo Houssay da Argentina que foi premiado por seus estudos sobre a re gulação hormonal do metabolismo dos carboidratos Os laboratórios Cori em St Louis se tornaram um centro in ternacional de pesquisa bioquímica nas décadas de 1940 e 1950 e pelo menos seis cientistas que estudaram com os Cori receberam o Nobel Arthur Kornberg pela sínte se do DNA 1959 Severo Ochoa pela síntese do RNA 1959 Luis Leloir pelo papel dos nucleotídeos de açúcar na síntese dos polissacarídeos 1970 Earl Sutherland pela descoberta do cAMP na regulação do metabolismo dos carboidratos 1971 Christian de Duve pelo fracio namento subcelular 1974 e Edwin Krebs pela desco berta da fosforilasecinase 1991 QUADRO 154 Carl e Gerty Cori pioneiros no metabolismo e nas doenças do armazenamento do glicogênio Os Cori no laboratório de Gerty Cori por volta de 1947 Nelson6edbookindb 616 Nelson6edbookindb 616 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 617 é a glicose6fosfato Como foi visto esta pode ser derivada da glicose livre em uma reação catalisada pelas isoenzimas hexocinase I e hexocinase II no músculo e hexocinase IV glicocinase no fígado DGlicose 1 ATP Dglicose6fosfato 1 ADP No entanto parte da glicose ingerida faz uma via mais indireta para o glicogênio Ela é captada primeiro pelos eritrócitos e transformada glicoliticamente em lactato que é captado pelo fígado e convertido em glicose6fosfato pela gliconeogênese Para iniciar a síntese do glicogênio a glicose6fosfato é convertida em glicose1fosfato na reação da fosfoglico mutase Glicose6fosfato glicose1fosfato O produto desta reação é convertido em UDPglicose pela ação da UDPglicosepirofosforilase em uma etapa fundamental da biossíntese do glicogênio Glicose1fosfato 1 UTP UDPglicose 1 PPi TABELA Q1 Doenças do armazenamento de glicogênio em humanos Tipo nome Enzima afetada Principal órgão afetado Sintomas Tipo 0 Glicogêniosintase Fígado Glicose sanguínea baixa corpos cetônicos altos morte prematura Tipo Ia von Gierke Glicose6fosfatase Fígado Fígado aumentado insuficiência renal Tipo Ib Glicose6fosfatotranslocase microssomal Fígado Como em Ia também suscetibili dade alta a infecções bacterianas Tipo Ic Transportador microssomal de Pi Fígado Como em Ia Tipo II Pompe Glicosidase lisossomal Músculo cardíaco e esquelético Forma infantil morte aos 2 anos forma juvenil defeitos muscu lares miopatia forma adulta como na distrofia muscular Tipo IIIa Cori ou Forbes Enzima de desramificação Fígado músculo cardíaco e es quelético Aumento do fígado em crianças miopatia Tipo IIIb Enzima de desramificação hepática enzima normal no músculo Fígado Aumento do fígado em crianças Tipo IV Andersen Enzima de ramificação Fígado músculo esquelético Fígado e pâncreas aumentados mioglobina na urina Tipo V McArdle Fosforilase do músculo Músculo esquelético Cãibras induzidas pelo exercício e dor mioglobina na urina Tipo VI Hers Fosforilase do fígado Fígado Fígado aumentado Tipo VII Tarui PFK1 do músculo Músculo eritrócitos Como no tipo V também anemia hemolítica Tipo VIb VIII ou IX Fosforilasecinase Fígado leucócitos músculo Fígado aumentado Tipo XI FanconiBickel Transportador de glicose GLUT2 Fígado Deficiência no desenvolvimento fígado aumentado raquitismo disfunção renal Nelson6edbookindb 617 Nelson6edbookindb 617 030414 0744 030414 0744 618 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Observe que essa enzima é denominada pela reação in versa na célula a reação ocorre no sentido da formação da UDPglicose porque o pirofosfato é hidrolisado rapidamen te pela pirofosfatase inorgânica Figura 1531 A UDPglicose é o doador imediato dos resíduos de glicose na reação catalisada pela glicogêniosintase que promove a transferência da glicose da UDPglicose para uma extremidade não redutora de uma molécula ra mificada de glicogênio Figura 1532 O equilíbrio total da via desde a glicose6fosfato até o glicogênio acrescido de uma unidade de glicose favorece muito a síntese do polímero Açúcar O P 2O 1 Ribose Base Açúcarfosfato Pirofosforilase de NTPaçúcar Pirofosfatase inorgânica Nucleotídeo de açúcar NDPaçúcar NTP Fosfato Pi Pirofosfato PPi O2 OH P O P O2 O O P O O2 O O2 O P 2O O P O O2 O O2 O2 Açúcar O O2 P O2 O O Ribose Base O2 O P O P 2O O O 2O Reação líquida açúcarfosfato 1 NTP NDPaçúcar 1 2Pi 2 FIGURA 1531 Formação de um nucleotídeo de açúcar Ocorre uma reação de condensação entre um nucleosídeotrifosfato NTP e um açúcarfosfato O oxigênio carregado negativamente no açúcar fosfato serve como nucleófilo atacando o fosfato a do nucleosídeo trifosfato e deslocando pirofosfato A hidrólise de PPi pela pirofosfa tase inorgânica impulsiona a reação para a frente O HO 3 5 6 4 1 2 H OH HO H H CH2OH H O H O 2O P O P O O O2 UDPglicose Glicogêniosintase H 4 1 H OH OH H H CH2OH O H O CH2 Uracila O H OH OH H H CH2OH O H 1 H OH H H 4 HO H OH O O H 4 1 H OH OH H H CH2OH O H O CH2OH O H 1 H OH H H 4 HO H OH O O UDP CH2OH O H OH H H 4 H OH Extremidade não redutora Glicogênio alongado com n 1 1 resíduos 1 O H H Extremidade não redutora da cadeia do glicogênio com n resíduos n 4 FIGURA 1532 Síntese do glicogênio A cadeia do glicogênio é alonga da pela glicogêniosintase A enzima transfere o resíduo de glicose da UDP glicose para a extremidade não redutora de uma ramificação ver Figura 713 para fazer uma nova ligação a1S4 Nelson6edbookindb 618 Nelson6edbookindb 618 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 619 A glicogêniosintase não pode formar as ligações a1S6 encontradas nos pontos de ramificação do glicogê nio as quais são formadas pela enzima de ramificação tam bém chamada de amilo 1S4 a 1S6 transglicosila se ou glicosil4S6transferase A enzima de ramificação do glicogênio catalisa a transferência de um fragmento ter minal de 6 a 7 resíduos de glicose da extremidade não redu tora de uma ramificação de glicogênio contendo pelo me nos 11 resíduos para o grupo hidroxil C6 de um resíduo de glicose em uma posição mais interna da mesma ou de outra cadeia de glicogênio criando assim uma nova ramificação Figura 1533 Resíduos adicionais de glicose podem ser ligados à nova ramificação pela glicogêniosintase O efeito biológico da ramificação é tornar a molécula mais solúvel e aumentar o número de sítios acessíveis à glicogêniofos forilase e à glicogêniosintase as quais agem somente nas extremidades não redutoras A glicogenina prepara os resíduos iniciais de glicose no glicogênio A glicogêniosintase não consegue iniciar uma cadeia de glicogênio de novo Ela necessita de um iniciador ge ralmente uma cadeia poliglicosídica em a1S4 ou uma ramificação que tenha pelo menos oito resíduos de glico se Então como se inicia uma nova molécula de glicogê nio A intrigante proteína glicogenina Figura 1534 é ao mesmo tempo o iniciador sobre o qual são montadas novas cadeias e a enzima que catalisa essa montagem A primeira etapa na síntese de uma nova molécula de gli cogênio é a transferência de um resíduo de glicose da UDPglicose para o grupo hidroxil da Tyr 194 da glicogeni na catalisada pela atividade glicosiltransferase intrínseca da proteína Figura 1535 A cadeia nascente se alonga pela adição sequencial de mais sete resíduos de glicose cada um derivado de uma UDPglicose as reações são catalisadas pela atividade de extensão de cadeia da glico genina Neste ponto a glicogêniosintase age alongando ainda mais a cadeia de glicogênio A glicogenina permane ce escondida dentro da partícula b unida covalentemente à única extremidade redutora da molécula de glicogênio Figura 1535b As consequências clínicas de uma mu tação no gene da glicogenina que suprime essa atividade de polimerização da proteína incluem fadiga muscular e fraqueza depleção do glicogênio no fígado e batimento cardíaco irregular arritmia cardíaca RESUMO 154 Metabolismo do glicogênio nos animais c O glicogênio é armazenado no músculo e no fígado sob a forma de grandes partículas Dentro das partículas es O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O HO HO HO Enzima de ramificação do glicogênio Núcleo do glicogênio Núcleo do glicogênio Extremidade não redutora 1 6 Ponto de ramificação Extremidade não redutora Extremidade não redutora a 1 4 a FIGURA 1533 Síntese da ramificação do glicogênio A enzima de ra mificação do glicogênio também chamada de amilo1S41S6transgli cosilase ou glicosil4S6transferase forma um novo ponto de ramificação durante a síntese do glicogênio Mn2 UDPglicose Asp162 Tyr194 Mn2 UDPglicose Asp162 Tyr194 FIGURA 1534 Estrutura da glicogenina PDB 1D 1LL2 A glicogenina muscular Mr 37000 forma dímeros em solução Os humanos têm uma se gunda isoforma no fígado glicogenina2 O substrato UDPglicose está liga do a uma estrutura de Rossmann próximo da extremidade aminoterminal e a alguma distância do resíduo de Tyr 194 15 Å da Tyr no mesmo monômero 12 Å da Tyr no parceiro dimérico Cada UDPglicose está ligada por meio de seus fosfatos a um íon de Mn 21 que é essencial para a catálise Acreditase que o Mn 21 atue como aceptor de pares de elétrons ácido de Lewis para estabilizar o grupo de fácil eliminação UDP A ligação glicosídica no produto tem a mesma configuração no C1 da glicose que no substrato UDPglicose sugerindo que a transferência da glicose do UDP para a Tyr 194 ocorra em duas etapas A primeira provavelmente é um ataque nucleofílico pela Asp 162 formando um intermediário temporário com a configuração invertida Um segundo ataque nucleofílico pela Tyr 194 restabelece a configuração inicial Nelson6edbookindb 619 Nelson6edbookindb 619 030414 0744 030414 0744 620 DAVID L NELSON MICHAEL M COX tão as enzimas que metabolizam o glicogênio bem como as enzimas reguladoras c A glicogêniofosforilase catalisa a fosforólise nas extremi dades não redutoras das cadeias do glicogênio produzin do glicose1fosfato A enzima de desramificação trans fere as ramificações para as cadeias principais e libera o resíduo da ramificação a1S6 como glicose livre c A fosfofrutomutase interconverte a glicose1fosfato em glicose6fosfato que pode entrar na glicólise ou ser convertida no fígado em glicose livre pela glicose6fos fatase do retículo endoplasmático sendo liberada para repor a glicose sanguínea c O nucleotídeo de açúcar UDPglicose doa resíduos de glicose para a extremidade não redutora do glicogênio na reação catalisada pela glicogêniosintase Uma enzi ma de ramificação distinta produz as ligações a1S6 nos pontos de ramificação c Novas partículas de glicogênio se iniciam com a forma ção autocatalítica de uma ligação glicosídica entre a gli cose da UDPglicose e um resíduo de Tyr na proteína glicogenina seguida pela adição de vários resíduos de glicose para formar um iniciador que pode sofrer os efei tos da glicogêniosintase 155 Regulação coordenada da síntese e da degradação do glicogênio Conforme foi visto a mobilização dos estoques de glico gênio é realizada pela glicogêniofosforilase que degrada glicogênio a glicose1fosfato Figura 1527 A glicogênio fosforilase proporciona um caso especialmente esclare cedor de regulação enzimática Esse foi um dos primeiros exemplos conhecidos de uma enzima regulada alosterica mente e a primeira enzima que se revelou ser controlada O O O P CH2OH H H HO OH H H HO H O O O O O P O O O P CH2OH H H HO OH H H HO H O O O O O P CH2OH H HO OH H H HO H O O a HO Tyr194 Glicogenina Ribose Uracila UDPglicose UDPglicose UDP Atividade glicosiltransferase Atividade de extensão de cadeia Repete seis vezes Ribose Uracila UDPglicose UDP b Cada cadeia possui 12 a 14 resíduos de glicose glicogenina iniciador segunda camada quarta camada terceira camada camada externa não ramificada G G FIGURA 1535 A glicogenina e a estrutura da partícula de glicogênio a A glicogenina catalisa duas reações diferentes O ataque inicial pelo grupo hidro xílico da Tyr 194 sobre o C1 da parte glicosil da UDPglicose resulta em um resíduo de Tyr glicosilado O C1 de outra molécula de UDPglicose é agora atacado pelo grupo hidroxílico do C4 da glicose terminal e essa sequência se repete até for mar uma molécula nascente de glicogênio com oito resíduos de glicose unidos por ligações glicosídicas a1S4 b Estrutura da partícula de glicogênio Inician do com uma molécula de glicogenina central as cadeias de glicogênio 12 a 14 resíduos se distribuem em camadas As cadeias internas têm cada uma duas ramificações a1S6 As cadeias na camada mais externa não são ramificadas Existem 12 camadas em uma partícula madura de glicogênio estão mostradas aqui somente cinco consistindo em cerca de 55000 resíduos de glicose em uma molécula com cerca de 21 nm de diâmetro e Mr 1 3 10 7 Nelson6edbookindb 620 Nelson6edbookindb 620 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 621 por fosforilação reversível Ela foi também uma das primei ras enzimas alostéricas cuja estrutura tridimensional deta lhada das formas ativa e inativa foi esclarecida por estudos de cristalografia por raios X A glicogêniofosforilase é tam bém outro exemplo de como as isoenzimas desempenham seu papel tecidoespecífico A glicogêniofosforilase tem regulação alostérica e hormonal No final de 1930 Carl e Gerty Cori Quadro 154 descobriram que a glicogêniofosforilase do músculo esquelético existe em duas formas interconversíveis glicogênio fosforilase a cataliticamente ativa e glicogêniofosforilase b menos ativa Figura 1536 Estudos subsequentes feitos por Earl Sutherland mostraram que a fosforilase b predomina no múscu lo em repouso mas que durante uma atividade muscular vigorosa a adrenalina desencadeia a fosfori lação de um resíduo específico de Ser na fosforilase b convertendoa em sua forma mais ativa fosforilase a Observe que a glicogêniofosforilase com fre quência é referida simplesmente como fosforilase muito respeitada por ter sido a primeira fosforilase a ser desco berta o nome reduzido tem persistido no uso generalizado e na literatura A enzima fosforilasebcinase responsável pela ati vação da fosforilase pela transferência de um grupo fos foril para seu resíduo de Ser é ela própria ativada por adrenalina ou glucagon por uma série de etapas mostra das na Figura 1537 Sutherland descobriu o segundo mensageiro cAMP cuja concentração aumenta em res posta ao estímulo pela adrenalina no músculo ou pelo glucagon no fígado Concentrações elevadas de cAMP iniciam uma cascata enzimática na qual um catalisa dor ativa um segundo catalisador que ativa mais um ca talisador ver Seção 121 Tais cascatas permitem uma grande amplificação do sinal inicial ver retângulos em corderosa na Figura 1537 O aumento da cAMP ativa a proteínacinase dependente de cAMP também chamada de proteínacinase A PKA Por sua vez a PKA fosforila e ativa a fosforilasebcinase que catalisa a fosforilação dos resíduos de Ser nas duas subunidades idênticas da glicogêniofosforilase ativandoa e estimulando assim a degradação do glicogênio No músculo isso fornece com bustível para a glicólise sustentar a contração muscular para a resposta de luta ou fuga sinalizada pela adrenalina No fígado a degradação do glicogênio age contra a baixa glicose sanguínea sinalizada pelo glucagon liberando gli cose Essas diferentes funções se refletem em diferenças sutis nos mecanismos reguladores no músculo e no fíga do As glicogêniofosforilases do fígado e do músculo são isoenzimas codificadas por genes diferentes e diferem em suas propriedades reguladoras No músculo há dois mecanismos alostéricos de controle que se sobrepõem à regulação da fosforilase por modifica ção covalente Figura 1537 O Ca 21 o sinal para a contra ção muscular se liga à fosforilasebcinase ativandoa pro movendo a conversão da fosforilase b para sua forma ativa a O Ca 21 se liga à subunidade d da fosforilasebcinase uma calmodulina ver Figura 1211 O AMP que se acumula no músculo em contração vigorosa como resultado da degra dação do ATP se liga à fosforilase e a ativa acelerando a liberação da glicose1fosfato a partir do glicogênio Quando os níveis de ATP estão adequados o ATP bloqueia o sítio alostérico ao qual o AMP se liga causando a inativação da fosforilase Quando o músculo retorna ao repouso uma segunda enzima a fosforilaseafosfatase também chamada de fosfoproteínafosfatase 1 PP1 remove os grupos fos foril da fosforilase a convertendoa em sua forma menos ativa a fosforilase b À semelhança da enzima do músculo a glicogênio fosforilase do fígado é regulada hormonalmente por fosforilaçãodesfosforilação e alostericamente A forma desfosforilada é totalmente inativa Quando o nível de gli cose sanguínea está muito baixo o glucagon agindo por meio do mecanismo de cascata mostrado na Figura 15 37 ativa a fosforilasebcinase que por sua vez converte a fosforilase b em sua forma ativa a iniciando a liberação da glicose para o sangue Quando o nível retorna ao nor mal a glicose entra nos hepatócitos e se liga a um sítio alostérico inibitório na fosforilase a Essa ligação também produz uma mudança de conformação que expõe os re Earl W Sutherland Jr 19151974 CH2 OH CH2 OH 2ATP 2Pi 2H2O 2ADP Fosforilasebcinase Glucagon fígado adrenalina Ca2 AMP músculo Fosforilaseafosfatase PP1 Fosforilase b menos ativa Cadeia lateral de Ser14 Cadeia lateral de Ser14 CH2 CH2 O O Fosforilase a ativa P P FIGURA 1536 Regulação da glicogêniofosforilase muscular por modificação covalente Na forma mais ativa da enzima fosforilase a os resíduos de Ser 14 um de cada subunidade estão fosforilados A fosforilase a é convertida em sua forma menos ativa fosforilase b por perda enzimática destes grupos fosforil catalisada pela fosforilaseafosfatase também conhe cida como fosfoproteínafosfatase 1 PP1 A fosforilase b pode ser reconverti da reativada em fosforilase a pela ação da fosforilasebcinase Ver também a Figura 642 sobre a regulação da glicogêniofosforilase Nelson6edbookindb 621 Nelson6edbookindb 621 030414 0744 030414 0744 622 DAVID L NELSON MICHAEL M COX síduos fosforilados de Ser à PP1 que catalisa a desfos forilação da fosforilase causando sua inativação Figura 1538 O sítio alostérico para a glicose permite à glico gêniofosforilase hepática atuar como seu próprio sensor de glicose e responder adequadamente às alterações na glicose sanguínea Glicogênio fosforilase b inativa Fosforilaseb cinase inativa Fosforilaseb cinase ativa PKA inativa PKA ativa Adrenalina Gs ATP Hepatócito Glucagon AMP cíclico 20x moléculas x moléculas 10x moléculas 100x moléculas 1000x moléculas 10000x moléculas 10000x moléculas Glicogênio fosforilase a ativa Glicose1fosfato Ca2 Adenililciclase AMP Glicogênio Glicólise Contração muscular Glicose Glicose sanguínea Miócito a FIGURA 1537 Mecanismo de cascata da ação da adre nalina e do glucagon Tanto a adrenalina nos miócitos à es querda como o glucagon nos hepatócitos à direita ligamse a receptores específicos de superfície e ativam uma proteína de ligação a GTP Gsa ver Figura 124 Esta proteína quando ativa da provoca uma elevação na cAMP o que ativa PKA Isto inicia uma cascata de fosforilações PKA ativa a fosforilasebcinase que ativa a glicogêniofosforilase Tais cascatas causam uma grande amplificação do sinal inicial os números nos retângu los em cor salmão são provavelmente uma subestimativa do aumento real do número de moléculas em cada estágio da cas cata A degradação do glicogênio decorrente fornece glicose que no miócito pode suprir o ATP via glicólise para a contra ção muscular e no hepatócito é liberada para o sangue para se opor à glicose sanguínea baixa ativa CH2 O P Sítios alostéricos vazios 2 Glicose CH2 O CH2 O P Fosforilasea fosfatase PP1 2Pi Glc CH2 CH2 OH OH menos ativa Glc Glc Glc CH2 O P P Insulina Fosforilase a Fosforilase a Fosforilase b FIGURA 1538 A glicogêniofosforilase do fígado como sensor de gli cose A ligação da glicose a um sítio alostérico da isoenzima da fosforilase do fígado induz uma mudança conformacional que expõe seus resíduos de Ser fosforilados à ação da fosforilasefosfatase PP1 Esta fosfatase converte a fosforilase a em fosforilase b reduzindo claramente a atividade de fosforilase e diminuindo a degradação do glicogênio em resposta à alta glicose san guínea A insulina também age indiretamente na estimulação da PP1 e na diminuição da degradação do glicogênio Nelson6edbookindb 622 Nelson6edbookindb 622 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 623 A glicogêniosintase também é regulada por fosforilação e desfosforilação Tal como a glicogêniofosforilase a glicogêniosintase pode existir nas formas fosforilada e desfosforilada Figura 15 39 Sua forma ativa glicogêniosintase a é não fosfo rilada A fosforilação das cadeias laterais hidroxílicas de vários resíduos de Ser de ambas as subunidades converte a glicogêniosintase a em glicogêniosintase b que é inati va na ausência da glicose seu ativador alostérico A glicogê niosintase é impressionante por sua capacidade de ser fos forilada em vários resíduos por pelo menos 11 diferentes proteínascinases A cinase reguladora mais importante é a glicogêniosintasecinase 3 GSK3 que adiciona gru pos fosforil a três resíduos de Ser próximos à extremidade carboxílica da glicogêniosintase inativandoa fortemente A ação da GSK3 é hierárquica ela só pode fosforilar a gli cogêniosintase depois que outra proteínacinase caseína cinase II CKII tenha fosforilado a glicogêniosintase em um resíduo próximo evento chamado de preparação Figura 1540a No fígado a conversão da glicogêniosintase b em sua forma ativa é promovida pela PP1 que se encontra ligada à partícula de glicogênio A PP1 remove os grupos fosfo ril dos três resíduos fosforilados pela GSK3 A glicose6 fosfato se liga a um sítio alostérico na glicogêniosintase b tornando a enzima um substrato melhor para a desfosfori lação pela PP1 e causando sua inativação Por analogia com a glicogêniofosforilase que age como sensor de glicose a Insulina ADP ATP 3ADP 3ATP GSK3 CKII HO HO HO Glicogênio sintase a Glicogênio sintase b Inativa PP1 3Pi Ativa Glicose Insulina Glicose6 fosfato Glucagon adrenalina Fosfosserinas próximas à extremidade carboxiterminal P P P FIGURA 1539 Efeitos da GSK3 sobre a atividade da glicogênio sintase A forma ativa glicogêniosintase a tem três resíduos de Ser pró ximos à sua extremidade carboxílica que são fosforilados pela glicogênio sintasecinase 3 GSK3 Isto a converte na sua forma inativa b A ação da GSK3 requer uma fosforilação prévia preparação pela caseínacinase CKII A insulina desencadeia a ativação da glicogêniosintase b por bloquear a atividade da GSK3 consultar via na Figura 1216 e ativar uma fosfoprote ínafosfatase PP1 no músculo outra fosfatase no fígado No músculo a adrenalina ativa a PKA que fosforila a proteína de associação ao glicogênio GM ver Figura 1542 em um sítio que causa a dissociação da PP1 do glico gênio A glicose6fosfato favorece a desfosforilação da glicogêniosintase por se ligar a ela e promover uma conformação que é um bom substra to para a PP1 A glicose também promove a desfosforilação a ligação da glicose à glicogêniofosforilase a força uma mudança conformacional que favorece a desfosforilação da glicogêniofosforilase b aliviando assim a ini bição da PP1 ver Figura 1541 a GSK3 Arg96 Arg180 Lys205 P P P P H H H ATP A S S S S S S S V L R Q E E E D 4 0 4 8 Glicogênio sintase Sítio ativo Sítio de preparação fosforilado pela caseínacinase II Resíduos de Ser fosforilados na glicogêniosintase O O O O P O H O H O H O GSK3 b R T Pseudossubstrato R P H3N S T F E S C A 4 0 O O O O P FIGURA 1540 Preparação para a fosforilação da glicogêniosintase pela GSK3 a A glicogêniosintasecinase 3 se associa primeiramente com seu substrato glicogêniosintase por interação entre os três resíduos carregados positivamente Arg 96 Arg 180 Lys 205 e um resíduo de fosfosserina na posição 14 no substrato Para orientação o resíduo de Ser ou Thr a ser fosforilado no substrato está marcado com índice 0 Os resíduos no lado ami noterminal deste resíduo estão numerados como 21 22 e assim por dian te os resíduos no lado carboxiterminal estão numerados como 11 12 e as sim por diante Essa associação alinha o sítio ativo da enzima com o resíduo de Ser na posição 0 que ela fosforila Isto cria um novo sítio de preparação e a enzima se desloca ao longo da proteína para fosforilar a Ser na posição 24 e a seguir a Ser na posição 28 b A GSK3 tem um resíduo de Ser próxi mo de sua extremidade aminoterminal que pode ser fosforilado pela PKA ou pela PKB ver Figura 1541 Isto produz uma região de pseudossubstrato na GSK3 que se dobra para o sítio de preparação e torna o sítio ativo inacessível a outro substrato proteico inibindo a GSK3 até que a PP1 remova o grupo fosforil do pseudossubstrato Outras proteínas que são substrato para a GSK3 também têm um sítio de preparação na posição 14 que deve ser fosforilado por outra proteínacinase antes que a GSK possa agir sobre elas Consulte também as Figuras 637 e 1222b sobre a regulação da glicogêniosintase Nelson6edbookindb 623 Nelson6edbookindb 623 030414 0744 030414 0744 624 DAVID L NELSON MICHAEL M COX glicogêniosintase pode ser considerada um sensor de glico se6fosfato No músculo uma fosfatase diferente pode ter o mesmo papel desempenhado pela PP1 no fígado ativando a glicogêniosintase por desfosforilação A glicogêniosintasecinase 3 controla algumas ações da insulina Conforme visto no Capítulo 12 a insulina desencadeia mu danças intracelulares pela ativação de uma proteínacinase PKB que por sua vez fosforila e inativa a GSK3 Figu ra 1541 ver também Figura 1216 A fosforilação de um resíduo de Ser próximo da extremidade aminoterminal da GSK3 converte esta região da proteína em um pseudos substrato que se dobra para dentro do sítio ao qual normal mente se liga o resíduo de Ser fosforilado Figura 1540b Isso impede a GSK3 de se ligar ao sítio de preparação do substrato verdadeiro inativando assim a enzima e fazendo pender o equilíbrio em favor da desfosforilação da glicogê niosintase pela PP1 A glicogêniofosforilase também pode afetar a fosforilação da glicogêniosintase a glicogênio fosforilase ativada inibe PP1 diretamente impedindoa de ativar a glicogêniosintase Figura 1539 Embora tenha sido descoberta pelo seu papel no me tabolismo do glicogênio daí o nome glicogêniosintase cinase a GSK3 tem um papel muito mais abrangente que o de regulação da glicogêniosintase Ela é responsável por mediar a sinalização pela insulina e outros fatores de cresci mento e nutrientes atuando na especificação dos destinos celulares durante o desenvolvimento embrionário Entre os seus alvos estão proteínas do citoesqueleto e proteínas essenciais para a síntese de mRNA e de proteínas Esses alvos assim como a glicogêniosintase precisam sofrer uma fosforilação preparatória por outra proteínacinase para que possam ser fosforilados pela GSK3 A fosfoproteínofosfatase 1 é central no metabolismo do glicogênio Uma única enzima PP1 pode remover grupos fosforil das três enzimas que são fosforiladas em resposta ao glucagon no fígado e à adrenalina no fígado e no músculo fosfo rilasecinase glicogêniofosforilase e glicogêniosintase A insulina estimula a síntese do glicogênio por ativar a PP1 e inativar a GSK3 A fosfoproteínofosfatase 1 não existe livre no cito sol Ela está firmemente ligada às suas proteínasalvo por uma proteína da família das proteínas de associação ao glicogênio que se liga ao glicogênio e às três enzimas glicogêniofosforilase fosforilasecinase e glicogênio sintase Figura 1542 A própria PP1 está sujeita à regulação covalente e alostérica ela é inativada quando fosforilada pela PKA e é ativada alostericamente pela glicose6fosfato Sinais alostéricos e hormonais coordenam integralmente o metabolismo dos carboidratos Após abordar os mecanismos que regulam as enzimas indi viduais agora é possível considerar as variações totais no metabolismo dos carboidratos que ocorrem no estado bem alimentado durante o jejum e na resposta de luta ou fuga sinalizados respectivamente por insulina glucagon e adre nalina É preciso destacar dois casos nos quais a regulação tem finalidades diferentes 1 o papel dos hepatócitos no suprimento de glicose para o sangue e 2 o uso egoísta dos carboidratos como combustível pelos tecidos extrahe páticos simbolizados pelo músculo esquelético miócitos para manter suas próprias atividades Após a ingestão de uma refeição rica em carboidra tos a elevação da glicose sanguínea provoca a liberação PP1 Ativa Inativa 3Pi Citosol OH OH OH PKB P GSK3 GSK3 P P P PIP3 PIP2 PDK1 Insulina Receptor de insulina OH IRS1 IRS1 P PI3K Membrana plasmática Glicogênio sintase b Glicogênio sintase a Inativa Ativa FIGURA 1541 O caminho a partir da insulina até a GSK3 e a glicogêniosintase A ligação da insulina ao seu receptor ati va nele uma tirosinaproteínacinase que fosforila o substrato1 do receptor da insulina IRS1 A fosfotirosina nessa proteína é então ligada pela fosfatidilinositol3cinase PI3K que converte na membrana o fosfatidilinositol45bifosfato PIP2 em fosfatidi linositol345trifosfato PIP3 Uma proteínacinase PDK1 que é ativada quando ligada ao PIP3 ativa uma segunda proteínaci nase PKB que fosforila a glicogêniosintasecinase 3 GSK3 na sua região de pseudossubstrato inativandoa pelos mecanismos mostrados na Figura 1540b A inativação da GSK3 permite que a fosfoproteínafosfatase 1 PP1 desfosforile e ative a glicogênio sintase Dessa forma a insulina estimula a síntese do glicogênio Consulte na Figura 1216 mais detalhes sobre a ação da insulina Nelson6edbookindb 624 Nelson6edbookindb 624 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 625 de insulina Figura 1543 parte superior Nos hepa tócitos a insulina tem dois efeitos imediatos ela inativa a GSK3 agindo por meio da cascata mostrada na Figura 1541 e ativa uma proteínafosfatase talvez a PP1 Essas duas ações ativam totalmente a glicogêniosintase A PP1 também inativa a glicogêniofosforilase a e a fosforilase cinase pela desfosforilação de ambas interrompendo de forma efetiva a degradação do glicogênio A glicose entra no hepatócito por meio do transportador de alta capaci dade GLUT2 sempre presente na membrana plasmáti ca e a glicose intracelular elevada leva à dissociação da hexocinase IV glicocinase de sua proteína reguladora nuclear Figura 1515 A hexocinase IV entra no citosol e fosforila a glicose estimulando a glicólise além de for necer o precursor para a síntese de glicogênio Sob essas condições os hepatócitos usam o excesso de glicose do sangue para sintetizar glicogênio até o limite de 10 do peso total do fígado Entre as refeições ou durante um jejum prolongado a queda da glicose sanguínea provoca a liberação de glu cagon o qual agindo por meio da cascata mostrada na Figura 1537 ativa a PKA Essa enzima controla todos os efeitos do glucagon Figura 1543 parte inferior Ela fos forila a fosforilasecinase ativandoa e levando à ativação da glicogêniofosforilase Ela fosforila a glicogêniosin tase inativandoa e bloqueando a síntese de glicogênio Ela fosforila a PFK2FBPase2 levando a uma redução na concentração do regulador frutose26bifosfato que tem o efeito de inativar a enzima glicolítica PFK1 e de ativar a enzima gliconeogênica FBPase1 E ela fosforila e inativa a enzima glicolítica piruvatocinase Sob essas con dições o fígado produz glicose6fosfato pela degradação do glicogênio e pela gliconeogênese e para de usar a gli Fosforilasecinase GM Glicogênio fosforilase Glicogênio sintase PKA Cinase sensível à insulina Inibidor 1 Adrenalina Grânulo de glicogênio Inibidor 1 fosforilado se liga à PP1 e a inativa Insulina GM PP1 PP1 P GM P P P P ➊ ➋ FIGURA 1542 Proteína de associação ao glicogênio GM A proteína GM de associação ao glicogênio pertence à família de proteínas que ligam outras proteínas incluindo PP1 às partículas de glicogênio A GM pode ser fosforilada em dois sítios diferentes em resposta à insulina ou adre nalina ➊ A fosforilação no sítio 1 estimulada pela insulina ativa a PP1 que desfosforila a fosforilasecinase a glicogênio fosforilase e a glicogêniosintase ➋ A fosforilação no sítio 2 estimulada pela adrenalina causa a dissociação de PP1 da partícula de glicogênio impedindo seu acesso à glicogênio fosforilase e à glicogêniosintase A PKA também fosforila uma proteína inibidor 1 que quando fosforilada inibe a PP1 Desta forma a insulina inibe a degradação do glicogê nio e estimula a sua síntese e a adrenalina ou o glucagon no fígado tem o efeito oposto FIGURA 1543 Regulação do metabolismo de carboidratos no fígado As setas indicam as relações causais entre as mudanças que elas conectam Por exemplo uma seta de TA para cB significa que uma redução de A causa um aumento de B As setas vermelhas conectam eventos resultantes da gli cose sanguínea alta as setas azuis conectam eventos resultantes da glicose sanguínea baixa Glicose sanguínea alta Insulina Proteínacinase sensível à insulina Fosforilase cinase PKB GSK3 PP1 Glicogênio fosforilase Degradação do glicogênio Síntese do glicogênio Glicólise Degradação do glicogênio Síntese do glicogênio Glicogênio fosforilase Fosforilase cinase FBPase2 PFK2 PKA cAMP Glucagon Glicose sanguínea baixa Piruvato cinase L Glicogênio sintase PFK1 F26BP Glicogênio sintase Síntese de hexocinase II PFK1 piruvatocinase GLUT2 Glicoseinterna Glicólise Nelson6edbookindb 625 Nelson6edbookindb 625 030414 0744 030414 0744 626 DAVID L NELSON MICHAEL M COX cose na glicólise ou na síntese de glicogênio maximizando a quantidade de glicose que pode liberar para o sangue Essa liberação de glicose é possível somente no fígado e no rim porque outros tecidos não têm glicose6fosfatase Figura 1530 A fisiologia do músculo esquelético difere da do fígado em três aspectos importantes para a nossa discussão so bre regulação metabólica Figura 1544 1 o músculo usa seu glicogênio armazenado somente para suas próprias necessidades 2 quando passa do repouso para a contra ção vigorosa o músculo sofre mudanças muito grandes em sua demanda por ATP a qual é suprida pela glicólise 3 o músculo não tem a maquinaria enzimática para a glico neogênese A regulação do metabolismo de carboidratos no músculo reflete essas diferenças em relação ao fígado Em primeiro lugar os miócitos não têm receptores para o gluca gon Em segundo lugar a isoenzima muscular da piruvato cinase não é fosforilada pela PKA e assim a glicólise não é interrompida quando a cAMP estiver alta Na verdade o cAMP aumenta a velocidade da glicólise no músculo provavelmente por ativar a glicogêniofosforilase Quando a adrenalina é liberada no sangue em situações de luta ou fuga a PKA é ativada pela elevação da cAMP e fosforila e ativa a glicogêniofosforilasecinase As consequentes fos forilação e ativação da glicogêniofosforilase resultam em degradação mais rápida do glicogênio A adrenalina não é liberada em condições de baixo estresse mas com cada es tímulo neuronal da contração muscular a Ca 21 aumenta brevemente e ativa a fosforilasecinase por meio de sua su bunidade de calmodulina A elevação da insulina provoca aumento na síntese do glicogênio nos miócitos pela ativação da PP1 e inativação da GSK3 Ao contrário dos hepatócitos os miócitos têm uma reserva de transportadores GLUT4 sequestrada em vesí culas intracelulares A insulina provoca seu deslocamento para a membrana plasmática ver Figura 1216 onde eles permitem o aumento na captação de glicose Consequente mente os miócitos ajudam a baixar a glicose sanguínea em resposta à insulina porque aumentam a taxa de captação de glicose a síntese de glicogênio e a glicólise O metabolismo de carboidratos e de lipídeos é integrado por mecanismos hormonais e alostéricos Apesar de complexa a regulação do metabolismo de car boidratos está longe da história completa do metabolismo energético O metabolismo das gorduras e dos ácidos gra xos está intimamente ligado ao dos carboidratos Sinais hor monais como insulina e alterações na dieta ou exercício são igualmente importantes na regulação do metabolismo das gorduras e na integração com o dos carboidratos O Capítu lo 23 volta a abordar essa integração metabólica global não antes de serem estudadas as vias metabólicas das gorduras e dos aminoácidos Capítulos 17 e 18 A mensagem que se deseja transmitir aqui é que as vias metabólicas estão sujeitas a controles reguladores complexos extremamen te sensíveis a alterações nas condições metabólicas Esses mecanismos agem no ajuste do fluxo de metabólitos por vá rias vias metabólicas conforme a necessidade da célula e do organismo e o fazem sem causar alterações importantes nas concentrações dos intermediários compartilhados por outras vias RESUMO 155 Regulação coordenada da síntese e da degradação do glicogênio c A glicogêniofosforilase é ativada em resposta ao gluca gon ou à adrenalina que aumentam a cAMP e ativam PKA A PKA fosforila e ativa a fosforilasecinase que converte a glicogêniofosforilase b em sua forma ativa a A fosfoproteínofosfatase 1 PP1 reverte a fosforila ção da glicogêniofosforilase a inativandoa A glicose se liga à isoenzima hepática da glicogêniofosforilase a o que favorece sua desfosforilação e inativação c A glicogêniosintase a é inativada por fosforilação catali sada pela GSK3 A insulina bloqueia a GSK3 A PP1 que é ativada pela insulina reverte a inibição pela desfosfo rilação da glicogêniosintase b c A insulina aumenta a captação da glicose pelos miócitos e adipócitos por provocar o deslocamento do transpor tador GLUT4 para a membrana plasmática c A insulina estimula a síntese das hexocinases II e IV PFK1 piruvatocinase e várias enzimas envolvidas na síntese de lipídeos A insulina estimula a síntese de gli cogênio no músculo e no fígado c No fígado o glucagon estimula a degradação do glico gênio e a gliconeogênese enquanto bloqueia a glicólise poupando dessa forma glicose para exportála para o cérebro e outros tecidos c No músculo a insulina estimula a degradação do gli cogênio e a glicólise fornecendo ATP para sustentar a contração Adrenalina Glucagon Fígado Músculo Glicogênio Glicogênio Glicogenólise Glicose6 fosfato Glicose6 fosfato Glicose sanguínea Glicólise Gliconeogênese Piruvato Piruvato FIGURA 1544 Diferenças na regulação do metabolismo de carboi dratos no fígado e no músculo No fígado glucagon indicando baixa glicose sanguínea ou adrenalina sinalizando a necessidade de lutar ou cor rer têm o efeito de maximizar a saída da glicose para a corrente sanguínea No músculo a adrenalina aumenta a degradação do glicogênio e a glicólise que juntas fornecem combustível para a produção do ATP necessário na contração muscular Nelson6edbookindb 626 Nelson6edbookindb 626 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 627 Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário glicose6fosfato 587 fluxo 589 homeostasia 589 diferenciação celular 589 fator de transcrição 589 elemento de resposta 589 reciclagem 590 transcriptoma 590 proteoma 590 metaboloma 591 regulação metabólica 592 controle metabólico 592 razão da ação das massas Q 593 adenilatocinase 594 proteínacinase ativada por AMP AMPK 594 coeficiente de controle de fluxo C 597 598 coeficiente de elasticidade 597 598 coeficiente de resposta R 598 gliconeogênese 601 ciclo fútil 601 ciclo de substrato 601 hexocinase II 602 hexocinase I 602 hexocinase IV 603 GLUT2 603 glucagon 605 frutose26bifosfato 605 fosfofrutocinase2 PFK2 606 frutose26bifosfatase FBPase2 606 proteína de ligação ao elemento de resposta aos carboidratos ChREBP 609 proteína de ligação ao elemento regulador dos esteróis SREBP 610 proteína de ligação ao elemento de resposta ao cAMP cíclico CREB 610 FOXO1 610 glicogenólise 613 glicogênese 613 aDglicose1fosfato 613 enzima de desramificação 614 oligo a1S6 a a1S4 glicantransferase 614 fosfoglicomutase 614 nucleotídeos de açúcar 615 UDPglicose pirofosforilase 617 amilo1S41S6 transglicosilase 619 glicogenina 619 glicogêniofosforilase a 621 glicogêniofosforilase b 621 cascata enzimática 621 fosforilasebcinase 621 fosfoproteínafosfatase 1 PP1 621 glicogêniosintase a 623 glicogêniosintase b 623 glicogêniosintasecinase 3 GSK3 623 caseínacinase II CKII 623 preparação 623 proteínas de associação ao glicogênio 624 Leituras adicionais Regulação das vias metabólicas Desvergne B Michalik L Wahli W 2006 Transcriptional regulation of metabolism Physiol Rev 86 465514 Revisão avançada e abrangente Gibson D Harris RA 2001 Metabolic Regulation in Mammals Taylor Francis New York Excelente e agradável relato sobre a regulação metabólica Li X Snyder M 2011 Metabolites as global regulators a new view of protein regulation Bioessays 33 485489 Naïmi M Arous C Obberghen E 2010 Energetic cell sensors a key to metabolic homeostasis Trends Endocrinol Med 21 7582 Storey KB ed 2004 Functional Metabolism Regulation and Adaptation WileyLiss Inc Hoboken NJ Excelente discussão dos princípios da regulação metabólica transdução de sinal controle de transcrição e metabolismo energético na saúde e na doença Análise do controle metabólico Castrillo JI Oliver SG 2007 Metabolic control in the eukaryotic cell a systems biology perspective Meth Microbiol 36 527549 doi101016S0580951706360217 Fell DA 1992 Metabolic control analysis a survey of its theoretical and experimental development Biochem J 286 313 330 Relatório claro dos princípios da análise do controle metabólico Fell DA 1997 Understanding the Control of Metabolism Portland Press Ltd London Exposição excelente e clara da regulação metabólica do ponto de vista da análise do controle metabólico Se você for ler apenas uma publicação sobre análise do controle metabólico esta deve ser a escolhida Heinrich R Rapoport TA 1974 A linear steadystate treatment of enzymatic chains general properties control and effector strength Eur J Biochem 42 8995 Declarações iniciais dos princípios da análise do controle metabólico Consulte também o artigo de Kacser Burns citado abaixo Jeffrey FMH Rajagopal A Maloy CR Sherry AD 1991 13CNMR a simple yet comprehensive method for analysis of intermediary metabolism Trends Biochem Sci 16 510 Revisão concisa de nível intermediário Kacser H Burns JA 1973 The control of flux Symp Soc Exp Biol 32 65104 Artigo clássico na área Ver também o artigo de Heinrich Rapoport citado acima Kacser H Burns JA Fell DA 1995 The control of flux 21 years on Biochem Soc Trans 23 341366 Saavedra E RodriguezEnriquesz S Quezada H Jasso Chavez R MorenoSanchez R 2011 Rational design of strategies based on metabolic control analysis In Comprehensive Biotechnology 2nd edn Vol 1 MooYoung M Butler M Webb C Moreira A Grodzinski B Cui ZE and Agathos S eds pp 511524 Pergamon Press Elmsford NY Schilling CH Schuster S Palsson BO Heinrich R 1999 Metabolic pathway analysis basic concepts and scientific applications in the postgenomic era Biotechnol Prog 15 296303 Discussão breve e avançada sobre os tratamentos teóricos que tentam encontrar maneiras de manipular o metabolismo para aperfeiçoar a formação de produtos metabólicos Schuster S Fell DA Dandekar T 2000 A general definition of metabolic pathways useful for systematic organization and analysis of complex metabolic networks Nat Biotechnol 18 326332 Análise interessante e provocativa da interação entre a via das pentosesfosfato e a glicólise sob o ponto de vista teórico Sohn SB Kim TY Kim JM Park JM Lee SY 2011 Metabolic control In Comprehensive Biotechnology 2nd edn Vol 2 MooYoung M Butler M Webb C Moreira A Grodzinski B Cui ZF and Agathos S eds pp 853861 Pergamon Press Elmsford NY Varma A Palsson BO 1994 Metabolic flux balancing basic concepts scientific and practical use BioTechnology 12 99498 Westerhoff HV Hofmeyr JHS Kholodenko BN 1994 Getting to the inside of cells using metabolic control analysis Biophys Chem 50 273283 Nelson6edbookindb 627 Nelson6edbookindb 627 030414 0744 030414 0744 628 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Regulação coordenada da glicólise e da gliconeogênese Armoni M Harel C Karnieli E 2007 Transcriptional regulation of the GLUT4 gene from PPARgamMa and FOXO1 to FFA and inflamMation Trends Endocrinol Metab 18 100107 Barthel A Schmoll D Unterman TG 2005 FoxO proteins in insulin action and metabolism Trends Endocrinol Metab 16 183189 Revisão de nível intermediário dos efeitos dos fatores de transcrição sobre o metabolismo dos carboidratos Brady MJ Pessin JE Saltiel AR 1999 Spatial compartmentalization in the regulation of glucose metabolism by insulin Trends Endocrinol Metab 10 408413 Revisão de nível intermediário Carling D 2004 The AMPactivated protein kinase cascade a unifying system for energy control Trends Biochem Sci 29 1824 Revisão de nível intermediário da AMPK e seu papel no metabolismo energético de la Iglesia N Mukhtar M Seoane J Guinovart JJ Agius L 2000 The role of the regulatory protein of glucokinase in the glucose sensory mechanism of the hepatocyte J Biol Chem 275 1059710603 Relato da determinação experimental dos coeficientes de controle de fluxo para a glicocinase e a proteína reguladora da glicocinase nos hepatócitos Dean L McEntyre J 2004 The Genetic Landscape of Diabetes National Center for Biotechnology Information wwwncbi nlmnihgovbooksbvfcgirid5diabetes Um livro excelente de leitura muito agradável e disponível na Internet gratuito Inclui uma introdução ao diabetes a história dos estudos sobre diabetes e capítulos sobre os fatores genéticos em IDDM NIDDM e MODY Desverne B Michalik L Wahli W 2006 Transcriptional regulation of metabolism Physiol Rev 86 465514 Revisão avançada e extensa dos fatores de transcrição incluindo aqueles que regulam o metabolismo dos carboidratos e das gorduras Grüning NM Lehrach H Ralser M 2010 Regulatory crosstalk of the metabolic network Trends Biochem Sci 35 220227 Hardie DG 2007 AMPactivated protein kinase as a drug target Annu Rev Pharmacol Toxicol 47 185210 Revisão avançada com ênfase sobre o possível papel desta enzima no diabetes tipo II Herman MA Kahn BB 2006 Glucose transport and sensing in the maintenance of glucose homeostasis and metabolic harmony J Clin Invest 116 17671775 Revisão de nível intermediário lindamente ilustrada Hers HG Van Schaftingen E 1982 Fructose 26bisphosphate 2 years after its discovery Biochem J 206 112 Descrição clássica desta molécula reguladora e de seu papel na regulação do metabolismo dos carboidratos Hue L Rider MH 1987 Role of fructose 26bisphosphate in the control of glycolysis in mammalian tissues Biochem J 245 313324 Jorgensen SB Richter EA Wojtaszewski JFP 2006 Role of AMPK in skeletal muscle metabolic regulation and adaptation in relation to exercise J Physiol 574 1731 Kahn BB Alquier T Carling D Hardie DG 2005 AMP activated protein kinase ancient energy gauge provides clues to modern understanding of metabolism Cell Metab 1 1525 Revisão de nível intermediário muito bem ilustrada Long YC Zierath JR 2006 AMPactivated protein kinase signaling in metabolic regulation J Clin Invest 116 17761783 Revisão curta e avançada sobre o papel da AMPK no metabolismo incluindo dados sobre camundongos nocaute Nordlie RC Foster JD Lange AJ 1999 Regulation of glucose production by the liver Annu Rev Nutr 19 379406 Revisão avançada Okar DA Manzano A NavarroSabate A Riera L Bartrons R Lange AJ 2001 PFK2FBPase2 maker and breaker of the essential biofactor fructose26bisphosphate Trends Biochem Sci 26 3035 Pilkis SJ Granner DK 1992 Molecular physiology of the regulation of hepatic gluconeogenesis and glycolysis Annu Rev Physiol 54 885909 Postic C Dentin R Denechaud PD Girard J 2007 ChREBP a transcriptional regulator of glucose and lipid metabolism Annu Rev Nutr 27 179192 Revisão avançada sobre o papel do fator de transcrição ChREBP no metabolismo dos carboidratos Rider MH Bartrons R 2010 Fructose 26bisphosphate the last milestone of the 20th century in metabolic control Biochem J doi101042BJ20091921 Schirmer T Evans PR 1990 Structural basis of the allosteric behavior of phosphofructokinase Nature 343 140145 Towle HC 2005 Glucose as a regulator of eukaryotic gene transcription Trends Endocrinol Metab 16 489494 Revisão de nível intermediário Towler MC Hardie DG 2007 AMPactivated protein kinase in metabolic control and insulin signaling Circ Res 100 328341 van Shaftingen E Gerin I 2002 The glucose6phosphatase system Biochem J 362 513532 Veech RL 2003 A humble hexose monophosphate pathway metabolite regulates short and longterm control of lipogenesis Proc Natl Acad Sci USA 100 55785580 Revisão breve do trabalho do laboratório de K Uyeda sobre o papel da xilulose5fosfato no metabolismo dos carboidratos e das gorduras Os artigos de Uyeda estão citados nesta revisão Yamada K Noguchi T 1999 Nutrient and hormonal regulation of pyruvate kinase gene expression Biochem J 337 111 Metabolismo do glicogênio nos animais Moslemi AR Lindberg C Nilsson J Tajsharghi H Andersson B Oldfors A 2010 Glycogenin1 deficiency and inactivated priming of glycogen synthesis N Engl J Med 362 12031210 Whelan WJ 1976 On the origin of primer for glycogen synthesis Trends Biochem Sci 1 1315 Revisão de nível intermediário da descoberta das propriedades e do papel da glicogenina Regulação coordenada da síntese e da degradação do glicogênio Aiston S Hampson L GomezFoix AM Guinovart JJ Agius L 2001 Hepatic glycogen synthesis is highly sensitive to phosphorylase activity evidence from metabolic control analysis J Biol Chem 276 2385823866 Jope RS Johnson GVW 2004 The glamour and gloom of glycogen synthase kinase3 Trends Biochem Sci 29 95102 Revisão de nível intermediário muito bem ilustrada Nelson6edbookindb 628 Nelson6edbookindb 628 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 629 Problemas 1 Medida das concentrações intracelulares dos meta bólitos A medida das concentrações intracelulares dos meta bólitos em uma célula viva apresenta grandes dificuldades ex perimentais geralmente a célula deve ser destruída para que possam ser medidas as concentrações dos metabólitos Além disso as enzimas catalisam interconversões metabólicas mui to rapidamente de forma que um problema comum associado com essas medidas é que os dados não refletem as concentra ções fisiológicas dos metabólitos mas sim as concentrações no equilíbrio Uma técnica experimental confiável requer que to das as reações catalisadas pelas enzimas sejam interrompidas instantaneamente no tecido intacto para que os intermediários metabólicos não sofram alteração Esse objetivo é alcançado pela compressão rápida do tecido entre grandes placas de alu mínio resfriadas com nitrogênio líquido 2190C processo chamado de compressão e congelamento Após o congela mento que interrompe instantaneamente a ação enzimática o tecido é pulverizado e as enzimas são inativadas por precipi tação com ácido perclórico O precipitado é removido por cen trifugação e os metabólitos são analisados no extrato sobrena dante límpido Para calcular as concentrações intracelulares o volume intracelular é determinado a partir do conteúdo total de água do tecido e de uma medida do volume extracelular As concentrações intracelulares dos substratos e dos pro dutos da reação da fosfofrutocinase1 em tecido cardíaco isola do de rato estão na tabela abaixo Metabólito Concentração mM Frutose6fosfato 870 Frutose16bifosfato 220 ATP 11400 ADP 1320 Fonte Williamson JR 1965 Glycolytic control mechanisms I Inhibi tion of glycolysis by acetate and pyruvate in the isolated perfused rat heart J Biol Chem 240 23082321 Calculada como mmolmL de água intracelular a Calcule Q frutose16bifosfatoADPfrutose6fosfa toATP da reação da PFK1 sob condições fisiológicas b Dado o DG9 de 2142 kJmol para a reação da PFK1 calcule a constante de equilíbrio dessa reação c Compare os valores de Q e K9eq A reação fisiológica está longe ou próxima do equilíbrio Explique O que este experimento sugere sobre o papel da PFK1 como enzima reguladora 2 Todas as reações metabólicas estão em equilíbrio a O fosfoenolpiruvato PEP é um dos dois doadores de grupos fosforil na síntese de ATP durante a glicólise Nos eritrócitos humanos a concentração do ATP no estado estável é 224 mM a do ADP é 025 mM e a do piruvato é 0051 mM Calcule a concentração de PEP a 25C supondo que a reação da piruvatocinase ver Figura 1313 está em equilíbrio na célula b A concentração fisiológica de PEP nos eritrócitos hu manos é 0023 mM Comparea com o valor obtido em a Ex plique o significado dessa diferença 3 Efeito do suprimento de O2 sobre a velocidade da glicólise As etapas reguladas da glicólise na célula intacta podem ser identificadas pelo estudo do catabolismo da glicose nos tecidos ou nos órgãos inteiros Por exemplo o consumo de glicose pelo músculo cardíaco pode ser medido pela circula ção artificial de sangue através de um coração intacto isolado e pela medida da concentração da glicose antes e depois de o sangue passar pelo coração Se o sangue circulante é desoxige nado o músculo cardíaco consome glicose em uma velocidade constante Quando se adiciona oxigênio ao sangue a velocida de do consumo de glicose diminui drasticamente sendo então mantida na velocidade mais baixa Explique 4 Regulação da PFK1 O efeito do ATP sobre a enzima alostérica PFK1 está mostrado abaixo Para certa concentra ção de frutose6fosfato a atividade da PFK1 aumenta com o aumento da concentração de ATP até um ponto além do qual o aumento da concentração do ATP inibe a enzima Atividade da da Vmáx ATP ATP alta 100 80 60 40 20 0 ADP baixa a Explique como o ATP pode ser tanto substrato como inibidor para a PFK1 Como a enzima é regulada por ATP b De que forma a glicólise é regulada pelos níveis de ATP c A inibição da PFK1 pelo ATP diminui quando a con centração de ADP é alta conforme mostrado na ilustração Como essa observação pode ser explicada 5 Concentração celular de glicose A concentração da glicose no plasma sanguíneo humano é mantida em cerca de 5 mM A concentração da glicose livre dentro de um miócito é muito mais baixa Por que a concentração na célula é tão bai xa O que acontece com a glicose após entrar na célula A gli cose é administrada intravenosamente como fonte de alimento em determinadas situações clínicas Dado que a transformação da glicose em glicose6fosfato consome ATP por que não ad ministrar glicose6fosfato 6 Atividade enzimática e função fisiológica A Vmáx da glicogêniofosforilase do músculo esquelético é muito maior do que a Vmáx da mesma enzima do tecido hepático a Qual é a função fisiológica da glicogêniofosforilase no mús culo esquelético E no tecido hepático b Por que a Vmáx da enzima do músculo precisa ser maior do que a da enzima do fígado 7 Equilíbrio da glicogêniofosforilase A glicogênio fosforilase catalisa a remoção de glicose do glicogênio O DG9 para esta reação é 31 kJmol a Calcule a razão entre a Pi e a glicose1fosfato quando a reação está em equilíbrio Dica A remoção de unidades de glicose do glicogênio não altera a concentração do glicogênio b A razão Piglicose1fosfato medida nos miócitos em condições fisiológicas é maior que 1001 O que isso indica a respeito da direção do fluxo metabólico pela reação da glicogê niofosforilase no músculo c Por que as razões no equilíbrio e em condições fisio lógicas são diferentes Qual é o possível significado para essa diferença Nelson6edbookindb 629 Nelson6edbookindb 629 030414 0744 030414 0744 630 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 8 Regulação da glicogêniofosforilase No tecido mus cular a taxa de conversão do glicogênio em glicose6fosfato é determinada pela razão entre a fosforilase a ativa e a fosfori lase b menos ativa Determine o que acontece à taxa de de gradação do glicogênio se uma preparação de músculo conten do glicogêniofosforilase for tratada com a fosforilasecinase e ATP b PP1 c adrenalina 9 Degradação do glicogênio em músculo de coelho O uso intracelular da glicose e do glicogênio é rigidamente regu lado em quatro pontos Para comparar a regulação da glicólise com oxigênio abundante e escasso considere a utilização da glicose e do glicogênio pelo músculo da perna de coelho em duas condições fisiológicas coelho em repouso com baixa de manda por ATP e coelho que vê seu inimigo mortal o coiote e dispara para sua toca Para cada condição determine os níveis relativos alto intermediário baixo de AMP ATP citrato e acetilCoA e descreva como esses níveis afetam o fluxo de me tabólitos pela glicólise com a regulação de enzimas específicas Em períodos de estresse o músculo da perna do coelho produz a maior parte do ATP por glicólise anaeróbia fermentação a lactato e muito pouco por oxidação da acetilCoA derivada da degradação das gorduras 10 A degradação do glicogênio em pássaros migrató rios Ao contrário do coelho e sua corrida curta os pássaros migratórios requerem energia por longos períodos de tempo Os patos por exemplo geralmente voam vários milhares de quilômetros durante sua migração anual Os músculos de voo dos pássaros migratórios têm alta capacidade oxidativa e ob têm o ATP necessário por meio da oxidação da acetilCoA ob tida das gorduras via ciclo do ácido cítrico Compare a regula ção da glicólise no músculo durante intensa atividade de curta duração como no caso do coelho em fuga e durante uma ativi dade prolongada como no caso do pato migratório Por que a regulação deve ser diferente nestes dois casos 11 Defeitos enzimáticos no metabolismo dos car boidratos Seguese o resumo do estudo de quatro ca sos clínicos Determine para cada caso qual enzima está com defeito e indique a partir da lista fornecida no final do proble ma o tratamento apropriado Justifique suas escolhas Respon da às perguntas em cada estudo de caso Talvez você necessi te recorrer a informações do Capítulo 14 Caso A O paciente apresenta vômito e diarreia logo após a ingestão de leite O teste de tolerância à lactose é realizado O paciente ingere uma quantidade padrão de lactose e as con centrações plasmáticas de glicose e de galactose são medidas a intervalos Nas pessoas com metabolismo de carboidratos normal os níveis aumentam até o máximo em cerca de 1 hora e então diminuem As concentrações sanguíneas de glicose e de galactose do paciente não aumentaram durante o teste Por que a glicose e a galactose aumentam no sangue e depois diminuem durante o teste em pessoas saudáveis Por que não aumentam no paciente Caso B O paciente apresenta vômito e diarreia após a inges tão de leite No seu sangue foi encontrada uma baixa concentra ção de glicose mas uma concentração muito mais alta do que o normal de açúcares redutores O exame de urina deu positivo para galactose Por que a concentração de açúcares redutores está alta no sangue Por que a galactose aparece na urina Caso C O paciente se queixa de cãibras musculares dolori das quando executa exercício físico extenuante mas não tem outros sintomas Uma biópsia de músculo indica concentração de glicogênio muito mais alta do que o normal Por que o glico gênio se acumula Caso D O paciente está letárgico seu fígado está aumen tado e uma biópsia do órgão mostra quantidade excessiva de glicogênio Ele também tem um nível de glicose sanguínea mais baixo do que o normal Qual é a razão da glicose sanguínea baixa neste paciente Enzima com defeito a PFK1 muscular b Fosfomanoseisomerase c Galactose1fosfatouridiltransferase d Glicogêniofosforilase hepática e Triosecinase f Lactase da mucosa intestinal g Maltase da mucosa intestinal h Enzima de desramificação muscular Tratamento 1 Corrida diária de 5 km 2 Dieta livre de gorduras 3 Dieta com baixa lactose 4 Evitar exercícios extenuantes 5 Grandes doses de niacina o precursor de NAD 1 6 Alimentação frequente pequenas porções de uma dieta normal 12 Efeitos da insuficiência de insulina em uma pessoa diabética Um homem com diabetes depen dente de insulina é levado à emergência em estado quase co matoso Enquanto passava férias em um local isolado ele per deu a medicação de insulina e estava há dois dias sem tomar o hormônio a Para cada tecido listado abaixo cada uma das vias está mais rápida mais lenta ou inalterada neste paciente em com paração com o nível normal obtido pela administração de quan tidades apropriadas de insulina b Para cada via descreva pelo menos um mecanismo de controle responsável pela mudança prevista Tecido e via 1 Adiposo síntese de ácidos graxos 2 Muscular glicólise síntese de ácidos graxos síntese de glicogênio 3 Hepático glicólise gliconeogênese síntese de glicogê nio síntese de ácidos graxos via das pentosesfosfato 13 Metabólitos sanguíneos na insuficiência de insulina Prediga para o paciente descrito no Problema 12 os níveis dos seguintes metabólitos no seu sangue antes do tratamento na emergência em relação aos níveis mantidos du rante o tratamento com insulina a glicose b corpos cetôni cos c ácidos graxos livres 14 Efeitos metabólicos de enzimas mutantes Prediga e explique o efeito de cada um dos seguintes defeitos cau sados por mutações sobre o metabolismo do glicogênio a perda do sítio de ligação ao cAMP na subunidade reguladora da proteínacinase A PKA b perda do inibidor da proteína fosfatase inibidor 1 na Figura 1542 c superexpressão da fosforilasecinase b no fígado d receptores de glucagon alte rados no fígado 15 Controle hormonal do metabolismo energéti co Entre o seu jantar e o café da manhã sua glicose sanguí nea diminui e seu fígado tornase um produtor de glicose em Nelson6edbookindb 630 Nelson6edbookindb 630 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 631 vez de consumidor Descreva a base hormonal para essa troca e explique como a mudança hormonal desencadeia a produção de glicose pelo fígado 16 Metabolismo alterado em camundongos manipula dos geneticamente Os pesquisadores podem manipular os genes de um camundongo de forma que um único gene em um único tecido produz ou uma proteína inativa camundongo no caute ou uma proteína sempre constitutivamente ativa Que efeitos sobre o metabolismo podem ser previstos para camun dongos com as seguintes alterações genéticas a nocaute da enzima de desramificação do glicogênio no fígado b nocaute da hexocinase IV no fígado c nocaute da FBPase2 no fígado d FBPase constitutivamente ativa no fígado e AMPK cons titutivamente ativa no músculo f ChREBP constitutivamente ativa no fígado Problema de análise de dados 17 Estrutura ótima do glicogênio As células muscula res precisam de acesso rápido a grandes quantidades de glico se durante o exercício intenso Esta glicose é armazenada no fígado e no músculo esquelético na forma polimérica como par tículas de glicogênio A partícula típica contém cerca de 55000 resíduos de glicose ver Figura 1535b MeléndezHevia Wa ddell e Shelton 1993 exploraram alguns aspectos teóricos da estrutura do glicogênio conforme descrito neste problema a A concentração celular de glicogênio no fígado é de cerca de 001 mM Que concentração celular de glicose livre se ria necessária para armazenar uma quantidade equivalente de glicose Por que essa concentração de glicose representa um problema para a célula A glicose é liberada do glicogênio pela glicogêniofosfori lase enzima que pode remover moléculas de glicose uma de cada vez da extremidade de uma cadeia de glicogênio As ca deias de glicogênio são ramificadas ver Figuras 1528 e 15 35b e o grau de ramificação o número de ramificações por cadeia tem uma influência poderosa sobre a velocidade com que a glicogêniofosforilase libera glicose b Por que um grau de ramificação muito baixo isto é abaixo de um nível ótimo reduz a velocidade de liberação de glicose Dica Considere o caso extremo de uma cadeia não ramificada com 55000 resíduos de glicose c Por que um grau de ramificação muito alto também reduz a velocidade de liberação de glicose Dica Pense nas restrições físicas MeléndezHevia e colaboradores fizeram uma série de cál culos e chegaram à conclusão que duas ramificações por cadeia ver Figura 1535b são o número ótimo para as restrições des critas acima Isso é o que se encontra no glicogênio armazena do no músculo e no fígado Para determinar o número ótimo de resíduos de glicose por cadeia MeléndezHevia e colaboradores consideraram dois parâmetroschave que definem a estrutura de uma partícula de glicogênio t 5 número de camadas de cadeias de glicose em uma partícula a molécula da Figura 1535b tem cinco cama das gc 5 número de resíduos de glicose em cada cadeia Eles decidiram encontrar os valores de t e gc que poderiam maximi zar três quantidades 1 a quantidade de glicose armazenada na partícula GT por unidade de volume 2 o número de ca deias de glicose não ramificadas CA por unidade de volume ie o número de cadeias na camada mais externa acessível à glicogêniofosforilase e 3 a quantidade de glicose disponível para a fosforilase nestas cadeias não ramificadas GPT d Mostre que CA 5 2 t 2 1 Esse é o número de cadeias dis poníveis para a glicogêniofosforilase antes da ação da enzima de desramificação e Mostre que CT o número total de cadeias na partícula é dado por CT 5 2 t 2 1 Assim GT 5 gcCT 5 gc2 t 2 1 o nú mero total de resíduos de glicose na partícula f A glicogêniofosforilase não pode remover glicoses de cadeias de glicogênio que tenham menos de cinco resíduos de glicose Mostre que GPT 5 gc 2 42 t 2 1 Essa é a quantidade de glicose disponível para a glicogêniofosforilase g Com base no tamanho dos resíduos de glicose e na locali zação das ramificações a espessura de uma camada de glicogê nio é 012 gc nm 1 035 nm Mostre que o volume de uma partí cula Vs é dado pela equação MeléndezHevia e colaboradores determinaram então os valores ótimos de t e gc aqueles que dão o valor máximo para a função de qualidade que maximiza GT CA e GPT enquanto minimiza Eles constataram que o valor óti mo de gc é independente de t h Escolha um valor de t entre 5 e 15 para encontrar o valor máximo de gc Como esse valor é comparado com o de gc encontrado no glicogênio hepático ver Figura 1535b Dica Talvez seja útil usar um programa de planilha Referência MeléndezHevia E Waddell TG Shelton ED 1993 Optimization of molecular design in the evolution of metabolism the glycogen molecule Biochem J 295 477483 Nelson6edbookindb 631 Nelson6edbookindb 631 030414 0744 030414 0744 Nelson6edbookindb 632 Nelson6edbookindb 632 030414 0744 030414 0744 Esta página foi 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referiremse ao processo molecu lar por meio do qual as células consomem O2 e produzem CO2 processo mais precisamente denominado respira ção celular A respiração celular acontece em três estágios princi pais Figura 161 No primeiro moléculas combustíveis orgânicas glicose ácidos graxos e alguns aminoácidos são oxidadas para produzirem fragmentos de dois carbonos na forma do grupo acetil da acetilcoenzima A acetilCoA No segundo estágio os grupos acetil entram no ciclo do áci do cítrico que os oxida enzimaticamente a CO2 a energia liberada é conservada nos transportadores de elétrons re duzidos NADH e FADH2 No terceiro estágio da respiração estas coenzimas reduzidas são oxidadas doando prótons H 1 e elétrons Os elétrons são transferidos ao O2 o acep tor final de elétrons por meio de uma cadeia de moléculas transportadoras de elétrons conhecida como cadeia res piratória No curso da transferência de elétrons a grande quantidade de energia liberada é conservada na forma de ATP por um processo chamado de fosforilação oxidativa Capítulo 19 A respiração é mais complexa do que a glicó lise e acreditase que tenha evoluído muito mais tardiamen te após o surgimento das cianobactérias As atividades me tabólicas das cianobactérias são responsáveis pelo aumento dos níveis de oxigênio na atmosfera terrestre um momento decisivo na história evolutiva Primeiro será abordada a conversão de piruvato a gru pos acetil e então a entrada destes grupos no ciclo do ácido cítrico também chamado de ciclo do ácido tri carboxílico TCA de tricarboxylic acid ou ciclo de Krebs em homenagem ao seu descobridor Hans Krebs A seguir serão examinadas as reações do ciclo e as enzimas que as catalisam Já que os intermediários do ciclo do ácido cítrico também são desviados como precursores biossin téticos serão consideradas algumas maneiras pelas quais esses intermediários são repostos O ciclo do ácido cítrico é um pivô do metabolismo com vias catabólicas chegando e vias anabólicas partindo sen do cuidadosamente regulado em coordenação com outras vias O capítulo termina com uma descrição da via do glio xilato uma sequência meta bólica presente em certos or ganismos que utiliza algumas das mesmas enzimas e reações utilizadas pelo ciclo do ácido cítrico causando a síntese lí quida de glicose a partir dos triacilgliceróis armazenados 161 Produção de acetilCoA acetato ativado Em organismos aeróbios glicose e outros açúcares ácidos graxos e a maioria dos aminoácidos são finalmente oxida dos a CO2 e H2O pelo ciclo do ácido cítrico e pela cadeia respiratória Antes de entrarem no ciclo do ácido cítrico os esqueletos de carbono dos açúcares e ácidos graxos são convertidos ao grupo acetil da acetilCoA a forma na qual a maioria dos combustíveis entra no ciclo Os carbonos de muitos aminoácidos também entram no ciclo dessa manei ra embora alguns aminoácidos sejam convertidos a outros intermediários do ciclo Aqui o foco será em como o piru vato derivado da glicose e de outros açúcares pela glicólise 16 Ciclo do Ácido Cítrico Hans Krebs 19001981 Nelson6ed16indd 633 Nelson6ed16indd 633 020514 1721 020514 1721 634 DAVID L NELSON MICHAEL M COX é oxidado a acetilCoA e CO2 pelo complexo da piruvato desidrogenase PDH de pyruvate dehydrogenase um grupo de enzimas múltiplas cópias de três enzimas loca lizado nas mitocôndrias de células eucarióticas e no citosol de bactérias O exame cuidadoso desse complexo enzimático é gra tificante sob diversos aspectos O complexo da PDH é um exemplo clássico e muito estudado de um complexo mul tienzimático no qual uma série de intermediários químicos permanece ligada às moléculas de enzima à medida que o substrato é transformado no produto final Cinco cofatores quatro derivados de vitaminas participam do mecanismo da reação A regulação desse complexo enzimático também ilustra como uma combinação de modificações covalentes e mecanismos alostéricos resulta em um fluxo precisamen te regulado em uma etapa metabólica Finalmente o com plexo da PDH é o protótipo para dois outros importantes complexos enzimáticos acetoglutaratodesidrogenase do ciclo do ácido cítrico e acetoácidodesidrogenase de ca deia ramificada das vias de oxidação de alguns aminoáci dos ver Figura 1828 A notável similaridade na estrutura de proteínas na exigência de cofator e nos mecanismos de reação desses três complexos inquestionavelmente reflete uma origem evolutiva comum O piruvato é oxidado a acetilCoA e CO2 A reação geral catalisada pelo complexo da piruvatodesi drogenase é uma descarboxilação oxidativa um pro cesso de oxidação irreversível no qual o grupo carboxil é removido do piruvato na forma de uma molécula de CO2 e os dois carbonos remanescentes são convertidos ao grupo acetil da acetilCoA Figura 162 O NADH formado nessa reação doa um íon hidreto H 2 para a cadeia respiratória Figura 161 que transferirá os dois elétrons ao oxigênio ou em microrganismos anaeróbios a um aceptor de elé trons alternativo como nitrato ou sulfato A transferência de elétrons do NADH ao oxigênio gera ao final 25 molécu las de ATP por par de elétrons A irreversibilidade da rea ção do complexo da PDH foi demonstrada por experimen tos com marcação isotópica o complexo não pode religar CO2 radioativamente marcado à acetilCoA para formar uma molécula de piruvato com o carboxil marcado O complexo da piruvatodesidrogenase requer cinco coenzimas A combinação de desidrogenação e descarboxilação do pi ruvato ao grupo acetil da acetilCoA Figura 162 requer a ação sequencial de três enzimas diferentes e cinco coenzi mas diferentes ou grupos prostéticos pirofosfato de tiami na TPP de thiamine pyrophosphate dinucleotídeo de flavinaadenina FAD de flavin adenine dinucleotide coenzima A CoA algumas vezes denominada CoASH para enfatizar a função do grupo SH dinucleotídeo de nico tinamidaadenina NAD de nicotinamide adenine dinu cleotide e lipoato Quatro vitaminas diferentes essenciais à nutrição humana são componentes vitais desse sistema tiamina no TPP riboflavina no FAD niacina no NAD Complexo da piruvato desidrogenase transportadores de e2 reduzidos Cadeia respiratória transferência de elétrons Estágio 3 Transferência de elétrons e fosforilação oxidativa Ciclo do ácido cítrico Estágio 2 Oxidação da acetilCoA AcetilCoA Oxaloacetato Piruvato Glicólise Ácidos graxos Amino ácidos e2 Estágio 1 Produção de acetilCoA e2 e2 e2 e2 e2 e2 e2 e2 Glicose Citrato NADH FADH2 ATP ADP Pi H2O CO2 CO2 CO2 2H 1 2O2 FIGURA 161 Catabolismo de proteínas gorduras e carboidratos durante os três estágios da respiração celular Estágio 1 a oxidação de ácidos graxos glicose e alguns aminoácidos gera acetilCoA Estágio 2 a oxidação dos grupos acetil no ciclo do ácido cítrico inclui quatro etapas nas quais os elétrons são removidos Estágio 3 os elétrons carreados por NADH e FADH2 convergem para uma cadeia de transportadores de elétrons mitocondrial ou em bactérias ligados à membrana plasmática a cadeia respiratória reduzindo no final O2 a H2O Este fluxo de elétrons impele a produção de ATP DG98 5 2334 kJmol 1 CoASH NADH AcetilCoA O C SCoA NAD1 C Piruvato CH3 O O C 2 O CH3 CO2 Complexo da piruvatodesidrogenase E1 1 E2 1 E3 TPP lipoate FAD FIGURA 162 Reação geral catalisada pelo complexo da piruvato desidrogenase As cinco enzimas participantes desta reação e as três en zimas que formam o complexo são discutidas no texto Nelson6edbookindb 634 Nelson6edbookindb 634 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 635 e pantotenato na CoA Foram descritas anteriormente as funções de FAD e NAD como transportadores de elétrons Capítulo 13 e verificouse que o TPP era a coenzima da piruvatodescarboxilase ver Figura 1415 A coenzima A Figura 163 tem um grupo tiol reativo SH que é crucial para a função da CoA como transpor tador de acilas em diferentes reações metabólicas Grupos acil são covalentemente ligados ao grupo tiol formando tioésteres Devido às energias de ativação padrão relati vamente altas ver Figuras 1316 1317 os tioésteres têm um alto potencial para a transferência do grupo acil e po dem doar estes grupos a diversas moléculas aceptoras O grupo acil unido à coenzima A pode portanto ser conside rado ativado para transferência O quinto cofator do complexo da PDH o lipoato Fi gura 164 tem dois grupos tiol que podem ser reversi velmente oxidados por uma ligação dissulfeto SS similar àquela entre dois resíduos de Cys em uma proteína Devido à sua capacidade de participar de reações de oxi dação e redução o lipoato atua como transportador de elé trons hidrogênio e como transportador de acilas como será visto O complexo da piruvatodesidrogenase consiste em três enzimas distintas O complexo da PDH contém três enzimas piruvatode sidrogenase E1 dihidrolipoiltransacetilase E2 e dihidrolipoildesidrogenase E3 cada uma presente em múltiplas cópias O número de cópias de cada enzima e portanto o tamanho do complexo varia entre espécies O complexo da PDH isolado de mamíferos apresenta um diâmetro de cerca de 50 nm mais de cinco vezes o ta manho de um ribossomo inteiro e grande o suficiente para ser visto por microscopia eletrônica Figura 165a Na enzima bovina 60 cópias idênticas de E2 formam um do decaedro pentagonal o centro com um diâmetro de apro ximadamente 25 nm Figura 165b O centro da enzima de Escherichia coli contém 24 cópias de E2 E2 é o ponto de conexão para o grupo prostético lipoato unido ao grupo amino de um resíduo de Lys por uma ligação amida Fi gura 164 E2 tem três domínios funcionalmente distintos Figura 165c o domínio lipoil na porção aminoterminal contendo os resíduos de lipoilLys o domínio de liga ção a E1 e E3 na porção central e o domínio aciltransfe rase na porção central mais interna o qual contém o sítio ativo da aciltransferase O complexo da PDH de levedura tem um único domínio lipoil ligado ao lioato mas o com plexo em mamíferos tem dois e em E coli três Figura N NH2 N N N O H H H OH H Grupo tiol reativo O 2 O P O 49 19 OH 59 29 O C O O 2 O O N O CH2 C P HS CH3 C CH2 CH3 O P H C CH2 CH2 O C N H CH2 CoA H Ribose 39fosfato AcetilCoA Difosfato de 39fosfoadenosina Ácido pantotênico bMercaptoetilamina Coenzima A Adenina CH2 O2 S O CH3 O2 39 FIGURA 163 Coenzima A CoA Um grupo hidroxil do ácido pantotêni co está unido a uma molécula de ADP modificada por uma ligação fosfoés ter e seu grupo carboxil está ligado à bmercaptoetilamina por uma ligação amida O grupo hidroxil na posição 39 da molécula de ADP tem um grupo fosfato que não está presente no ADP livre O grupo SH da molécula de mercaptoetilamina forma um tioéster com o acetato para formar a acetil coenzima A acetilCoA à esquerda embaixo CH2 CH O CH2 CH N H CH3 CH2 CH2 CH2 C S CH2 CH2 CH2 C O S HS HN O CH2 CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH CH2 CH2 HS C S HS Resíduo de Lys em E2 Ácido lipoico Forma oxidada Forma reduzida Forma acetilada Cadeia polipeptídica da E2 dihidrolipoil transacetilase FIGURA 164 Ácido lipoico lipoato em ligação amida com um resí duo de Lys A porção lipoillisina é o grupo prostético da dihidrolipoiltran sacetilase E2 do complexo da PDH O grupo lipoil ocorre na forma oxidada dissulfeto e reduzida ditiol e atua como transportador de hidrogênio e grupo acetil ou outro grupo acil Nelson6edbookindb 635 Nelson6edbookindb 635 030414 0744 030414 0744 636 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 165c Os domínios de E2 são separados por conectores sequências de 20 a 30 resíduos de aminoácidos ricos em Ala e Pro e intercalados com resíduos carregados esses co nectores tendem a assumir formas estendidas mantendo os três domínios afastados O sítio ativo de E1 está ligado ao TPP e o de E3 está liga do ao FAD Duas proteínas de regulação também fazem par te do complexo uma proteínacinase e uma fosfoproteína fosfatase como discutido a seguir Essa estrutura E1E2E3 básica tem sido conservada durante a evolução e é utilizada em diversas reações metabólicas similares incluindo a oxi dação do acetoglutarato no ciclo do ácido cítrico descrita a seguir e a oxidação dos acetoácidos derivados da degra dação dos aminoácidos de cadeia ramificada valina isoleu cina e leucina ver Figura 1828 Dentro de uma determi nada espécie a E3 do complexo da PDH é idêntica à E3 dos outros dois complexos enzimáticos A ligação do lipoato à extremidade da cadeia lateral de uma Lys em E2 gera um braço longo e flexível que pode se estender do sítio ativo de E1 até os sítios ativos de E2 e E3 possivelmente a uma distância de 5 nm ou maior Na canalização do substrato o intermediário nunca deixa a superfície da enzima A Figura 166 mostra esquematicamente como o com plexo da piruvatodesidrogenase conduz as cinco reações consecutivas para a descarboxilação e desidrogenação do piruvato A etapa ➊ é essencialmente idêntica à reação catalisada pela piruvatodescarboxilase ver Figura 14 15c o C1 do piruvato é liberado como CO2 e o C2 que no piruvato está no estado de oxidação de um aldeído é unido ao TPP como um grupo hidroxietil A primeira etapa é a mais lenta e consequentemente limita a velo cidade da reação global Ela também é o ponto no qual o complexo da PDH confirma sua especificidade ao subs trato Na etapa ➋ o grupo hidroxietil é oxidado ao nível de um ácido carboxílico acetato Os dois elétrons re FIGURA 165 Complexo da piruvatodesidrogenase a Micrografia crioeletrônica de complexos da PDH isolados de rins de bovino Na micros copia crioeletrônica as amostras biológicas são visualizadas em tempera turas extremamente baixas isto evita os potenciais artefatos introduzidos pelos processos usuais de desidratação fixação e coloração b Imagem tridimensional do complexo da PDH mostrando a estruturação das subu nidades E1 piruvatodesidrogenase E2 dihidrolipoiltransacetilase e E3 dihidrolipoildesidrogenase Esta imagem foi reconstruída pela análise de um grande número de imagens como aquelas em a em combinação com estudos cristalográficos das subunidades individuais O centro em verde consiste em 60 moléculas de E2 arranjadas em 20 trímeros que formam um dodecaedro pentagonal O domínio lipoil de E2 em azul estendese para fora para conectarse aos sítios ativos das moléculas de E1 em amarelo ar ranjadas ao redor do centro de E2 Algumas subunidades E3 em vermelho também estão unidas ao centro no qual um braço flexível de E2 pode alcan çar seus sítios ativos Um asterisco marca o local onde um grupo lipoil está ligado ao domínio lipoil de E2 Para tornar a estrutura mais clara aproxima damente metade da porção frontal do complexo foi removida Este mode lo foi preparado por ZH Zhou e colaboradores 2001 em outro modelo proposto por JLS Milne e colaboradores 2002 as subunidades de E3 estão localizadas mais perifericamente ver Leituras Adicionais c E2 consiste em três tipos de domínios conectados por polipeptídeos curtos um domínio catalítico aciltransferase um domínio de ligação envolvido na ligação de E2 a E1 e E3 e um ou mais dependendo da espécie domínios lipoil 50 nm a E1 E2 E3 10 nm E1 E2 E3 b O número de domínios lipoil varia com a espécie E coli 3 Mamíferos 2 Levedura 1 Domínio lipoil Domínio aciltransferase região central interna C N Domínio de ligação envolvido nas ligações E2E1 e E2E3 Conector polipeptídico flexível c Nelson6edbookindb 636 Nelson6edbookindb 636 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 637 movidos nessa reação reduzem a SS de um grupo lipoil em E2 a dois grupos tiol SH O acetil produzido nesta reação de oxidaçãoredução é primeiramente este rificado a um dos grupos SH do lipoil e então transes terificada a CoA para formar acetilCoA etapa ➌ Desse modo a energia da oxidação impele a formação de um tioéster de acetato altamente energético As reações re manescentes catalisadas pelo complexo da PDH por E3 nas etapas ➍ e ➎ são transferências de elétrons neces sárias para a regeneração da forma oxidada dissulfeto do grupo lipoil de E2 preparando o complexo enzimático para um novo ciclo de oxidação Os elétrons removidos do grupo hidroxietil derivado do piruvato são passados ao NAD 1 pelo FAD Essenciais ao mecanismo do complexo da PDH são os braços flexíveis de lipoillisina de E2 que recebem os dois elétrons e o grupo acetil de E1 e os passam a E3 Todas essas enzimas e coenzimas estão agrupadas permitindo que os intermediários reajam rapidamente sem afasta remse da superfície do complexo enzimático A sequên cia de cinco reações mostrada na Figura 166 é assim um exemplo de canalização do substrato Os interme diários da sequência em múltiplas etapas nunca deixam o complexo e a concentração local do substrato de E2 é mantida muito alta A canalização também evita o roubo do grupo acetil ativado por outras enzimas que utilizam esse grupo como substrato Como será visto um mecanis mo similar de aprisionamento da canalização do substrato entre sítios ativos é utilizado por algumas outras enzimas com lipoato biotina ou moléculas similares a CoA servin do como cofatores Como pode ser previsto mutações nos genes das su bunidades do complexo da PDH ou uma deficiência de tiamina na dieta podem ter graves consequências Animais com deficiência de tiamina são incapazes de oxi dar o piruvato normalmente Isso é especialmente impor tante para o cérebro que costuma obter toda sua energia por meio da oxidação aeróbia da glicose em uma via que necessariamente inclui a oxidação do piruvato O beri béri doença resultante da deficiência de tiamina carac terizase pela perda da função neural Essa doença ocorre principalmente em populações cuja dieta consiste basica mente em arroz branco polido que carece da casca onde a maioria da tiamina do arroz é encontrada Pessoas que consomem habitualmente grandes quantidades de ál cool também podem desenvolver deficiência de tiamina pois a maior parte da dieta ingerida consiste nas calorias vazias sem vitaminas das bebidas destiladas Um nível de piruvato sanguíneo elevado frequentemente é um indi cativo de defeitos na oxidação do piruvato devido a uma destas causas RESUMO 161 Produção de acetilCoA acetato ativado c Piruvato o produto da glicólise é convertido a acetil CoA o material de partida para o ciclo do ácido cítrico pelo complexo da piruvatodesidrogenase c O complexo da PDH é composto por múltiplas cópias de três enzimas piruvatodesidrogenase E1 ligada ao cofator TPP dihidrolipoiltransacetilase E2 covalen temente ligada ao grupo lipoil e dihidrolipoildesidro genase E3 com os cofatores FAD e NAD c E1 catalisa a primeira descarboxilação do piruvato pro duzindo hidroxietilTPP e então a oxidação do grupo hi droxietil a um grupo acetil Os elétrons dessa oxidação reduzem o dissulfeto do lipoato ligado a E2 e o grupo Acil lipoillisina Lipoillisina oxidada Lipoillisina reduzida CoASH TPP CO2 Piruvato HidroxietilTPP Piruvato desidrogenase E1 ❶ ❷ ❸ ❹ ❺ Dihidrolipoil transacetilase E2 Dihidrolipoil desidrogenase E3 TPP Lys AcetilCoA O CH3 SCoA C O CH3 C O O C CHOH CH3 FAD FADH2 SH SH NADH H NAD S S C CH3 S SH O FIGURA 166 Descarboxilação oxidativa do piruvato a acetilCoA pelo complexo da PDH O destino da molécula de piruvato está impresso em vermelho Na etapa ➊ o piruvato reage com o pirofosfato de tiamina TPP ligado à piruvatodesidrogenase E1 sendo descarboxilado ao deriva do hidroxietil ver Figura 1415 A piruvatodesidrogenase também processa a etapa ➋ a transferência de dois elétrons e do grupo acetil a partir do TPP para a forma oxidada do grupo lipoillisina do centro do complexo dihidro lipoiltransacetilase E2 formando o acetiltioéster do grupo lipoil reduzido A etapa ➌ é uma transesterificação na qual o grupo SH da CoA substi tui o grupo SH de E2 produzindo acetilCoA e a forma completamente reduzida ditiol do grupo lipoil Na etapa ➍ a dihidrolipoildesidrogenase E3 promove a transferência de dois átomos de hidrogênio dos grupos lipoil reduzidos de E2 ao grupo prostético FAD de E3 restaurando a forma oxidada do grupo lipoillisina de E2 Na etapa ➎ o FADH2 reduzido de E3 transfere um íon hidreto ao NAD 1 formando NADH O complexo enzimático está agora pronto para outro ciclo catalítico As cores das subunidades correspondem àquelas na Figura 165b Nelson6edbookindb 637 Nelson6edbookindb 637 030414 0744 030414 0744 638 DAVID L NELSON MICHAEL M COX acetil é transferido em uma ligação tioéster a um grupo SH do lipoato reduzido c E2 catalisa a transferência do grupo acetil para a coenzi ma A formando acetilCoA c E3 catalisa a regeneração da forma dissulfeto oxidada do lipoato os elétrons passam primeiramente ao FAD e então ao NAD 1 c Os longos braços de lipoillisina movemse livremente entre o sítio ativo de E1 e os sítios ativos de E2 e E3 prendendo os intermediários ao complexo enzimático e possibilitando a canalização do substrato c A organização do complexo da PDH é muito similar àquela dos complexos enzimáticos que catalisam a oxi dação do acetoglutarato e dos acetoácidos de cadeia ramificada 162 Reações do ciclo do ácido cítrico Agora serão focalizados os processos por meio dos quais a acetilCoA é oxidada Essa transformação química é realizada pelo ciclo do ácido cítrico a primeira via cícli ca descoberta Figura 167 Para iniciar uma rodada do ciclo a acetilCoA doa seu grupo acetil ao composto de quatro carbonos oxaloacetato formando o composto de seis carbonos citrato O citrato é em seguida transforma do a isocitrato também uma molécula com seis carbonos o qual é desidrogenado com a perda de CO2 para produzir o composto de cinco carbonos acetoglutarato também chamado de oxoglutarato O acetoglutarato perde uma segunda molécula de CO2 originando ao final o compos to de quatro carbonos succinato O succcinato é então convertido por quatro etapas enzimáticas ao composto de quatro carbonos oxaloacetato que está assim pronto para reagir com outra molécula de acetilCoA Em cada ro dada do ciclo entra um grupo acetil dois carbonos na for ma de acetilCoA e são removidas duas moléculas de CO2 uma molécula de oxaloacetato é utilizada para a formação do citrato e uma molécula de oxaloacetato é regenerada Não ocorre nenhuma remoção líquida de oxaloacetato teoricamente uma molécula de oxaloacetato pode parti cipar da oxidação de um número infinito de grupos acetil e na verdade o oxaloacetato está presente nas células em concentrações muito baixas Quatro das oito etapas deste processo são oxidações nas quais a energia da oxidação é conservada de maneira muito eficiente na forma das coen zimas reduzidas NADH e FADH2 Como mencionado antes embora o ciclo do ácido cítrico seja fundamental ao metabolismo gerador de energia sua função não está limitada à conservação energética Inter mediários do ciclo com quatro e cinco carbonos servem como precursores para uma ampla variedade de produtos Para repor os intermediários removidos com este propósito as células utilizam reações anapleróticas de reposição as quais são descritas a seguir Eugene Kennedy e Albert Lehninger mostraram em 1948 que em eucariotos o conjunto inteiro das reações do ciclo do ácido cítrico acontece na mitocôndria Foi mos trado que as mitocôndrias isoladas não apenas continham todas as enzimas e coenzimas necessárias para o ciclo do ácido cítrico mas também todas as enzimas e proteínas necessárias para o último estágio da respiração a trans ferência de elétrons e a síntese de ATP pela fosforilação oxidativa Como será visto nos capítulos posteriores a mi tocôndria também contém as enzimas para a conversão de ácidos graxos e alguns aminoácidos em acetilCoA e para a conversão oxidativa de outros aminoácidos em aceto glutarato succinilCoA ou oxaloacetato Dessa maneira em eucariotos não fotossintéticos a mitocôndria é o local onde ocorre a maioria das reações oxidativas geradoras de energia e a síntese acoplada de ATP Em eucariotos fotos sintéticos a mitocôndria é o principal local de produção de ATP no escuro porém à luz do dia os cloroplastos geram a maior parte do ATP desses organismos Em bactérias as enzimas do ciclo do ácido cítrico estão no citosol e a membrana plasmática desempenha uma função semelhan te àquela da membrana mitocondrial interna para a síntese de ATP Capítulo 19 A sequência das reações do ciclo do ácido cítrico é quimicamente lógica A acetilCoA produzida pela quebra de carboidratos gordu ras e proteínas deve ser completamente oxidada a CO2 para que o máximo da energia potencial possa ser extraído des tes combustíveis No entanto a oxidação direta do acetato ou da acetilCoA a CO2 não é bioquimicamente possível A descarboxilação deste ácido com dois carbonos produziria CO2 e metano CH4 O metano é quimicamente estável e com exceção de certas bactérias metanotróficas que cres cem em nichos ricos em metano organismos nao possuem os cofatores e enzimas necessários para a oxidação do me tano Os grupos metileno CH2 entretanto são pron tamente metabolizados pelos sistemas enzimáticos presen tes na maioria dos organismos Nas sequências de oxidação típicas estão envolvidos dois grupos metileno adjacentes CH2CH2 sendo pelo menos um desses adjacente a um grupo carbonil Como foi observado no Capítulo 13 p 513 os grupos carbonil são particularmente importantes nas transformações químicas das rotas metabólicas O car bono do grupo carbonil tem uma carga parcial positiva devi da à capacidade de atrair elétrons do oxigênio do carbonil e é portanto um centro eletrofílico Um grupo carbonil pode facilitar a formação de um carbânion em um carbono adja cente pelo deslocamento da carga negativa do carbânion O ciclo do ácido cítrico mostra um exemplo da oxidação de um grupo metileno quando o succinato é oxidado etapas ➏ a ➑ na Figura 167 formando um grupo carbonil no oxaloacetato que é quimicamente mais reativo do que o metano ou um grupo metileno Em resumo para a acetilCoA ser oxidada de maneira eficiente o seu grupo metil deve estar ligado a alguma coi sa A primeira etapa do ciclo do ácido cítrico resolve ele gantemente o problema do grupo metil pouco reativo por meio da condensação da acetilCoA com o oxaloacetato O carbonil do oxaloacetato atua como centro eletrofílico que é atacado pelo carbono do grupo metil da acetilCoA em uma condensação de Claisen p 513 para a forma Nelson6edbookindb 638 Nelson6edbookindb 638 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 639 ção do citrato etapa ➊ na Figura 167 O grupo metil do acetato é convertido a metileno no ácido cítrico Esse ácido tricarboxílico então prontamente passa por uma série de oxidações que eliminam dois carbonos na forma de CO2 Observe que todas as etapas levando à quebra ou à formação de ligações carbonocarbono etapas ➊ ➌ e Aconitase Fumarase Aconitase Malatodesidrogenase Citratosintase Isocitrato desidrogenase Complexo acetoglutarato desidrogenase SuccinilCoA sintatetase Succinatodesidrogenase Oxaloacetato AcetilCoA Malato Citrato Isocitrato SuccinilCoA Succinato Fumarato Ciclo do ácido cítrico aCetoglutarato cisAconitato ❶ ❸ ❹ ❺ ❻ ❼ ❽ CH3 C O SCoA H2O CoASH CH2 COO2 HO H C O CoASH H2O COO2 C COO2 CH CH2 COO2 C O CH2 COO2 COO2 C COO2 CH2 COO2 C H HO C COO2 CH2 COO2 C COO2 H CH2 COO2 CH2 COO2 COO2 O CO2 COO2 C CH2 CH2 COO2 CH2 COO2 COO2 HC HO COO2 COO2 CH CH2 CO2 SCoA CoASH CH2 H2O H2O 3 NADH GTP ATP GDP ADP 1 Pi FADH2 Condensação de Claisen grupo metil da acetilCoA convertido a metileno no citrato Desidrataçãoreidratação grupo OH do citrato reposicionado no isocitrato preparando para a descar boxilação da próxima etapa Fosforilação ao nível do substrato energia do tioéster conservada na ligação fosfoanidrido do GTP ou ATP Desidrogenação introdução da ligação dupla inicia a sequência de oxidação do metileno Hidratação adição de água à ligação dupla introduz o grupo OH para a próxima etapa de oxidação Desidrogenação oxidação do OH completa a sequência de oxidação carbonil gerado posicionado para facilitar a condensação de Claisen na próxima etapa Descarboxilação oxidativa mecanismo similar a piruvatodesidrogenase dependente do carbonil no carbono adjacente Descarboxilação oxidativa grupo OH oxidado a carbonil o que por sua vez facilita a descarboxilação por meio da estabilização do carbânion formado no carbono adjacente Reidratação FIGURA 167 Reações do ciclo do ácido cítrico Os átomos de carbono sombreados em cor salmão são aqueles derivados do acetato da acetilCoA durante a primeira rodada do ciclo estes não são os carbonos liberados na forma de CO2 durante a primeira rodada Observe que no succinato e no fumarato o grupo de dois carbonos derivado do acetato não pode mais ser especificamente indicado como succinato e fumarato são moléculas simé tricas C1 e C2 são indistinguíveis de C4 e C3 O número ao lado de cada etapa de reação corresponde a um tópico numerado nas p 640647 As setas em vermelho mostram onde a energia é conservada pela transferência de elétrons ao FAD ou NAD 1 formando FADH2 ou NADH 1 H 1 As etapas ➊ ➌ e ➍ são essencialmente irreversíveis na célula todas as outras etapas são reversíveis O nucleosídeo trifosfatado produzido na etapa ➎ pode ser tanto ATP quanto GTP dependendo da isoenzima de succinilCoAsintetase que está catalisando a reação Nelson6edbookindb 639 Nelson6edbookindb 639 030414 0744 030414 0744 640 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ➍ dependem de grupos carbonil apropriadamente posi cionados Como em todas as rotas metabólicas existe uma lógica química na sequência das etapas do ciclo do ácido cítrico cada etapa envolve ou uma oxidação que conserve energia ou ela é um prelúdio necessário para a oxidação colocando grupos funcionais em posições que facilitem a oxidação ou a descarboxilação oxidativa À medida que for aprendendo as etapas do ciclo relembre o raciocínio quí mico para cada uma isso tornará o processo mais fácil de entender e lembrar O ciclo do ácido cítrico tem oito etapas No exame das oito etapas de reação consecutivas do ciclo do ácido cítrico será dada especial ênfase nas transforma ções químicas que ocorrem à medida que o citrato formado a partir de acetilCoA e oxaloacetato é oxidado produzindo CO2 e em como a energia dessa oxidação é conservada nas coenzimas reduzidas NADH e FADH2 ➊ Formação do citrato A primeira reação do ciclo é a con densação de acetilCoA e oxaloacetato para a formação do citrato catalisada pela citratosintase DG98 5 2322 kJmol Citratosintase SCoA 1 CoASH COO2 O C COO2 H2O CH2 AcetilCoA CH3 C O Oxaloacetato Citrato HO COO2 C COO2 CH2 O2 O C CH2 Nessa reação o carbono do metil do grupo acetil é uni do ao grupo carbonil C2 do oxaloacetato CitroilCoA é o intermediário transitoriamente formado no sítio ativo da enzima ver Figura 169 Esse intermediário é rapida mente hidrolisado em CoA livre e citrato que são libera dos do sítio ativo A hidrólise desse intermediário tioéster de alta energia torna a reação direta altamente exergôni ca A grande e negativa variação de energia livre padrão da reação da citratosintase é fundamental para o funciona mento do ciclo pois como mencionado anteriormente a concentração de oxaloacetato normalmente é muito baixa A CoA liberada nessa reação é reciclada para participar da descarboxilação oxidativa de outra molécula de piruvato pelo complexo PDH A citratosintase mitocondrial foi cristalizada e analisa da por difração de raios X na presença e na ausência de substratos e inibidores Figura 168 Cada subunidade dos homodímeros da enzima é um único polipeptídeo com dois domínios um deles grande e rígido e o outro menor e mais flexível com o sítio ativo entre eles Oxaloacetato o primeiro substrato a se ligar à enzima induz uma grande alteração conformacional no domínio flexível criando um sítio de ligação para o segundo substrato acetilCoA Quan do o citroilCoA é formado no sítio ativo da enzima outra alteração conformacional causa a hidrólise do tioéster libe rando CoASH Esse encaixe induzido da enzima primeiro ao substrato e posteriormente ao intermediário da reação diminui a probabilidade de que a clivagem da ligação tioés ter da acetilCoA seja prematura e improdutiva Os estudos cinéticos da enzima são consistentes com este mecanismo bissubstrato ordenado ver Figura 613 A reação catalisa da pela citratosintase é fundamentalmente uma conden sação de Claisen p 513 envolvendo um tioéster e uma cetona oxaloacetato Figura 169 Análogo da acetilCoA Análogo da acetilCoA Oxaloacetato Oxaloacetato a b FIGURA 168 Estrutura da citratosintase O domínio flexível de cada subunidade passa por uma alteração conformacional após a ligação ao oxa loacetato criando um sítio de ligação para a acetilCoA a Forma aberta da enzima isolada PDB ID 5CSC b forma fechada ligada ao oxaloacetato e a um análogo estável da acetilCoA carboximetilCoA derivada de PDB ID 5CTS Nestas representações uma subunidade está colorida em bege e a outra em verde Nelson6edbookindb 640 Nelson6edbookindb 640 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 641 ➋ Formação de isocitrato via cisaconitato A enzima aconi tase mais formalmente aconitatohidratase catalisa a transformação reversível do citrato a isocitrato pela for mação intermediária do ácido tricarboxílico cisaconitato o qual normalmente não se dissocia do sítio ativo A aco nitase pode promover a adição reversível de H2O à ligacão dupla do cisaconitato ligado à enzima de duas maneiras diferentes uma levando a citrato e a outra a isocitrato DG98 5 133 kJmol HO H2O H CH2 COO2 H C COO2 C COO2 H2O Isocitrato Aconitase CH2 COO2 H C COO2 C COO2 HO H CH2 COO2 H C COO2 C COO2 Citrato Aconitase cisAconitato Embora a mistura em equilíbrio a pH 74 e 25 oC contenha menos de 10 de isocitrato na célula a reação é deslo cada para a direita porque o isocitrato é rapidamente consumido na próxima etapa do ciclo o que diminui sua concentração no estado estacionário A aconitase contém um centro de ferroenxofre Figura 1610 que atua tanto na ligação do substrato ao sítio ativo quanto na adi ção ou na remoção catalítica de H2O Em células exauri das de ferro a aconitase perde o centro de ferroenxofre e adquire uma nova função na regulação da homeostase do ferro A aconitase é uma de muitas enzimas caracterizadas por realizar mais de uma função enzimas moonlighting Quadro 161 ➌ Oxidação do isocitrato a acetoglutarato e CO2 Na próxima etapa a isocitratodesidrogenase catalisa a descarbo xilação oxidativa do citrato para formar acetoglutarato Figura 1611 O Mn 21 presente no sítio ativo interage O O H N H N Asp375 Citratosintase His274 O H O Asp375 O O H2C C COO HC H H CoA AcetilCoA CitroilCoA S C O HC H C CoA CoASH S C CH2 H N H N His320 H O HC H CoA Intermediário enol S C COO Oxaloacetato H2C C O COO COO CH2 H2O COO Citrato COO HC H C COO HO COO COO H N H N His274 HO N H N N His320 N H H N His274 N H His320 His274 His320 Asp375 Asp375 ❶ ❷ ❸ A ligação tioéster na acetilCoA ativa os hidrogênios do metil O Asp375 remove um próton do grupo metil formando um intermediário enolato O intermediário é estabilizado por ligações de hidrogênio eou protonação pela His274 a protonação completa está mostrada O enolato rearranjase para atacar o carbono do carbonil do oxaloacetato com a His274 posicionada para recuperar o próton que ela previamente cedeu A His320 atua como ácido A condensação resultante produz citroilCoA O tioéster é posteriormente hidrolisado regenerando a CoASH e produzindo citrato MECANISMOFIGURA 169 Citratosintase Na reação da citratosintase em mamíferos o oxaloacetato ligase primeiro em uma sequência de reação estritamente ordenada Esta ligação inicia uma alteração na conformação que abre o sítio de ligação para a acetilCoA O oxaloacetato está especifica mente orientado no sítio ativo da citratosintase pela interação de seus dois carboxilatos com dois resíduos positivamente carregados de Arg não mos trados aqui Mecanismo da citratosintase Nelson6edbookindb 641 Nelson6edbookindb 641 030414 0744 030414 0744 642 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A máxima um geneuma enzima formulada por George Beadle e Edward Tatum em 1940 ver Capítulo 24 seguiu incontestada durante grande parte do século XX assim como ocorreu com a hipótese associada de que cada pro teína possui apenas uma função Recentemente porém muitas exceções admiráveis a essa simples fórmula foram descobertas situações nas quais uma única proteína codi ficada por um único gene é claramente moonlighting cumprindo mais de uma função dentro da célula A aconi tase é uma dessas proteínas ela atua tanto como enzima quanto como regulador da síntese proteica As células eucarióticas têm duas isoenzimas da aco nitase A isoenzima mitocondrial converte citrato a iso citrato no ciclo do ácido cítrico A isoenzima citosólica possui duas funções Ela catalisa a conversão de citrato a isocitrato fornecendo o substrato para uma isocitrato desidrogenase citosólica que produz NADPH com poder redutor para a síntese de ácidos graxos e outros proces sos anabólicos no citosol Também tem uma função na homeostase celular do ferro Todas as células devem obter o ferro para a atividade das muitas proteínas que o requerem como cofator Em humanos a deficiência grave de ferro resulta em anemia em suprimento insuficiente de eritrócitos e em uma redu ção da capacidade transportadora de oxigênio que podem ser fatais O excesso de ferro também é prejudicial ele se deposita e danifica o fígado na hemocromatose e em outras doenças O ferro ingerido na dieta é transportado na corrente sanguínea pela proteína transferrina e entra nas células por meio da endocitose mediada pelo recep tor de transferrina Uma vez dentro da célula o ferro é utilizado na síntese de hemes citocromos proteínas FeS e outras proteínas dependentes de Fe e o excesso de fer ro é armazenado em ligação com a proteína ferritina Os níveis de tranferrina receptor de transferrina e ferritina são portanto cruciais para a homeostase celular de ferro A síntese dessas três proteínas é regulada em resposta à disponibilidade de ferro e a aconitase em uma de suas funções desempenha uma funçãochave na regulação A aconitase tem um agrupamento FeS essencial no sítio ativo ver Figura 1610 Quando uma célula é exau rida de ferro esse agrupamento FeS é desmantelado e a enzima perde sua atividade como aconitase Entretanto a apoenzima apoaconitase carecendo do agrupamento Fe S assim formada adquire agora sua segunda atividade a capacidade de ligarse a sequências específicas nos mRNA do receptor de transferrina e da ferritina regulando dessa maneira a síntese proteica ao nível da tradução Duas pro teínas reguladoras de ferro IRP1 e IRP2 IRP de iron regulation protein foram descobertas independente mente como reguladoras do metabolismo do ferro Como provado posteriormente IRP1 é idêntica à apoaconitase citosólica e IRP2 é muito semelhante a IRP1 em estrutu ra e função porém ao contrário de IRP1 IRP2 não pode ser convertida à aconitase enzimaticamente ativa Ambas IRP1 e IRP2 se ligam a regiões nos mRNA que codificam a ferritina e o receptor de transferrina com consequên cias sobre a mobilização e a captação de ferro Essas se quências no mRNA fazem parte de estruturas em grampo p 292 chamadas de elementos de resposta a ferro IRE de iron response elements localizadas nas extre QUADRO 161 Enzimas com mais de uma função AAAAn ferro baixa ferro alta A IRP está ligada ao elemento de resposta a ferro IRE mRNA da ferritina IRE IREs 59 39 Sim Reprimida Diminuída Ativada Aumentada Tradução do mRNA da ferritina Síntese de ferritina Aumentada Aumentada Diminuída Diminuída Estabilidade do mRNA do TfR Síntese de TfR IRP1 IRP2 Aconitase AAAAn mRNA do receptor de transferrina TfR 59 39 Não FIGURA Q1 O efeito de IRP1 e IRP2 sobre os mRNA da ferritina e do receptor de trans ferrina FIGURA 1610 Centro de ferroenxofre da aconitase O centro de ferroenxofre está em vermelho e a molécula de citrato está em azul Três resíduos de Cys da enzima ligam três átomos de ferro o quarto ferro está ligado a um dos grupos carboxil do citrato e também interage não cova lentemente com um grupo hidroxil do citrato ligação descontínua Um resíduo básico B na enzima auxilia no posicionamento do citrato no sítio ativo O centro de ferroenxofre atua na ligação do substrato e na catálise As propriedades gerais das proteínas ferroenxofre estão discutidas no Ca pítulo 19 ver Figura 195 S Fe O H O H C CH2 COO2 2OOC C C H O O H H S Fe Fe S Fe S Citrato S S Cys S Cys Cys B Nelson6edbookindb 642 Nelson6edbookindb 642 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 643 midades 39 e 59 dos mRNA Figura Q1 Quando ligadas à sequência IRE da região 59 não traduzida do mRNA da ferritina as IRP bloqueiam a síntese de ferritina quando ligadas às sequências IRE da região 39 não traduzida do mRNA do receptor de transferrina as IRP estabilizam o mRNA impedindo sua degradação e possibilitando a sín tese de mais cópias da proteína receptora por molécula de mRNA Assim em células com deficiência de ferro a cap tação de ferro tornase mais eficiente e o armazenamento de ferro ligado à ferritina é reduzido Quando a concen tração celular de ferro retorna aos níveis normais IRP1 é convertida a aconitase e IRP2 é degradada por proteólise encerrando a resposta aos baixos níveis de ferro A aconitase enzimaticamente ativa e a apoaconitase com atividade reguladora na segunda jornada da pro teína apresentam estruturas diferentes Como aconitase ativa a proteína tem dois lóbulos que se fecham ao re dor do agrupamento FeS como IRP1 os dois lóbulos se abrem expondo o sítio de ligação ao mRNA Figura Q2 A aconitase é apenas uma de uma lista crescente de enzimas conhecidas ou presumidas por realizarem uma segunda função Muitas das enzimas glicolíticas estão incluídas nesse grupo A piruvatocinase atua no núcleo para regular a transcrição de genes responsivos ao hor mônio da tireoide A gliceraldeído3fosfatodesidroge nase atua tanto como uracilaDNAglicosilase afetando o reparo de DNA danificado quanto como regulador da transcrição da histona H2B O cristalino dos olhos dos vertebrados apresenta algumas enzimas glicolíticas mul tifuncionais incluindo a fosfogliceratocinase triosefos fatoisomerase e lactatodesidrogenase Até recentemente a descoberta de que uma proteína tem mais de uma função era principalmente uma ques tão de sorte dois grupos de pesquisadores estudando duas questões não relacionadas descobriam que suas proteínas tinham propriedades similares as comparavam cuidadosamente e descobriam que elas eram idênticas Com o crescimento das bases de dados com sequências de DNA e de proteínas anotadas os pesquisadores ago ra podem investigar deliberadamente a multifuncionali dade das proteínas procurando nas bases de dados por qualquer outra proteína com a mesma sequência que a proteína sob estudo porém com função diferente Isso também significa que uma proteína anotada nas bases de dados como exercendo uma determinada função não necessariamente tenha apenas aquela função O conhe cimento de proteínas com mais de uma função também pode explicar alguns resultados intrigantes experimen tos nos quais uma proteína com uma função conhecida é inativada por uma mutação mas os organismos mutantes resultantes apresentam um fenótipo sem uma relação ób via com aquela função a b FeS RNA FIGURA Q2 As duas formas da aconitaseIRP1 citosólica com duas fun ções distintas a Na aconitase os dois lóbulos principais estão fechados e o agrupamento FeS está completamente coberto a proteína está re presentada de forma transparente para exibir o agrupamento FeS PDB ID 2B3Y b Na IRP1 os lóbulos se abrem expondo um sítio de ligação à estrutura em grampo do mRNA do substrato PDB ID 2IPY COO2 CH2 H H C C HO Isocitrato O isocitrato é oxidado pela transferência do hidreto ao NAD1 ou NADP1 dependendo da isoenzima da isocitrato desidrogenase A descarboxilação é facilitada pela re moção dos elétrons pelo carbonil adjacente e pelo Mn21 coordenado O rearranjo do intermediário enol gera acetoglutarato Oxalosuccinato aCetoglutarato NADP1 NADPH 1 H1 H1 Isocitrato desidrogenase Mn21 C O2 C O O2 O COO2 CH2 CO2 H O C C C O2 C O O2 O COO2 CH2 H O C H C C O2 O Mn21 COO2 CH2 H C C O2 C O2 O MECANISMOFIGURA 1611 Isocitratodesidrogenase Nesta reação o substrato isocitrato perde um carbono por descarboxilação oxidativa Ver Fi gura 1414 para mais informações sobre reações de transferência de hidretos envolvendo NAD 1 e NADP 1 Nelson6edbookindb 643 Nelson6edbookindb 643 030414 0744 030414 0744 644 DAVID L NELSON MICHAEL M COX com o grupo carbonil do oxalosuccinato intermediário que é formado transitoriamente mas só deixa o sítio ativo quando a descarboxilação o converte em acetoglutarato O Mn 21 também estabiliza o enol formado transitoriamente por descarboxilação Em todas as células existem duas formas diferentes de isocitratodesidrogenase uma que exige NAD 1 como acep tor de elétrons e outra que exige NADP 1 As reações gerais são em outros aspectos idênticas Em células eucarióti cas a enzima dependente de NAD encontrase na matriz mitocondrial e participa do ciclo do ácido cítrico A prin cipal função da enzima dependente de NADP encontrada na matriz mitocondrial e no citosol possivelmente seja a produção de NADPH essencial para as reações redutoras anabólicas ➍ Oxidação do acetoglutarato a succinilCoA e CO2 A etapa seguinte é outra descarboxilação oxidativa na qual o a cetoglutarato é convertido a succinilCoA e CO2 pela ação do complexo da acetoglutaratodesidrogena se NAD 1 é o aceptor de elétrons e CoA é o transportador do grupo succinil A energia da oxidação do acetoglu tarato é conservada pela formação da ligação tioéster da succinilCoA C O SCoA CH2 CH2 COO2 Complexo da acetoglutaratodesidrogenase CoASH NAD1 NADH COO2 C O CH2 CH2 COO2 aCetoglutarato SuccinilCoA CO2 1 DG98 5 2335 kJmol Essa reação é essencialmente idêntica à reação da piruvato desidrogenase discutida anteriormente e à sequência de reações responsável pela degradação dos aminoácidos com cadeia ramificada Figura 1612 O complexo acetoglu taratodesidrogenase é bastante semelhante ao complexo da PDH em estrutura e função O complexo acetogluta ratodesidrogenase incorpora três enzimas homólogas às E1 E2 e E3 do complexo da PDH e também contém TPP e lipoato ligado à enzima FAD NAD e coenzima A Ambos os complexos são certamente derivados de um ancestral evo lutivo comum Embora os componentes E1 dos dois com plexos sejam estruturalmente similares suas sequências de aminoácidos diferem e naturalmente eles apresentam es pecificidades de ligação diferentes E1 do complexo da PDH ligase ao piruvato e E1 do complexo da acetoglutarato desidrogenase ligase ao acetoglutarato Os componentes E2 dos dois complexos também são muito similares ambos contendo lipoil ligado covalentemente As subunidades E3 são idênticas nos dois complexos enzimáticos O complexo que degrada acetoácidos com cadeias ramificadas ver Fi gura 1828 catalisa a mesma sequência de reações utilizan do os mesmos cinco cofatores Esse é um exemplo claro de evolução divergente na qual os genes que codificam para uma enzima com uma especificidade de substrato originam durante a evolução enzimas proximamente relacionadas com especificidades de substrato diferentes mas com o mesmo mecanismo enzimático ➎ Conversão de succinilCoA a succinato A succinilCoA como a acetilCoA tem uma ligação tioéster com uma energia livre padrão de hidrólise grande e negativa DG9 o 236 kJmol Na próxima etapa do ciclo do ácido cítrico a ener gia liberada pelo rompimento dessa ligação é utilizada para impelir a síntese de uma ligação fosfoanidrido no GTP ou ATP com um DG9 o de apenas 229 kJmol O succinato é formado neste processo aCetoglutarato Ciclo do ácido cítrico Complexo da piruvatodesidrogenase Oxidação da isoleucina leucina valina SuccinilCoA aCetoácido da isoleucina aMetilbutirilCoA CH2 CO2 O CH2 C 2OOC 2OOC COO2 CH3 C COO2 CH2 CH2 C CH3 CH2 CH C COO2 O AcetilCoA CO2 O CH3 O C O C O CO2 CH3 CH3 CH2 CH CH3 NADH NADH NAD1 NAD1 NAD1 SCoA SCoA SCoA SCoA SCoA SCoA NADH Piruvato FIGURA 1612 Um mecanismo conservado para a descarboxilação oxidativa As rotas mostradas empregam os mesmos cinco cofatores piro fosfato de tiamina coenzima A lipoato FAD e NAD 1 complexos multienzi máticos muito parecidos e o mesmo mecanismo enzimático para efetuar a descarboxilação do piruvato pelo complexo da piruvatodesidrogenase do acetoglutarato no ciclo do ácido cítrico e do esqueleto de carbono dos três aminoácidos ramificados isoleucina mostrado aqui leucina e valina Uma quarta reação catalisada pela glicinadescarboxilase envolve um me canismo muito semelhante ver Figura 2022 Nelson6edbookindb 644 Nelson6edbookindb 644 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 645 DG98 5 229 kJmol SCoA CH2 COO2 C O CH2 CH2 COO2 SuccinilCoA CH2 COO2 Succinato SuccinilCoAsintetase GTP CoASH GDP 1 Pi A enzima que catalisa essa reação reversível é chamada de succinilCoAsintetase ou succinatotiocinase ambos os nomes indicam a participação de um nucleosídeo trifos fatado na reação Quadro 162 Essa reação que poupa energia envolve uma etapa intermediária na qual a própria molécula da enzima é fosforilada em um resíduo de His no sítio ativo Figura 1613a Esse grupo fosfato que tem alto potencial de transferência de grupo é transferido ao ADP ou GDP para a formação de ATP ou GTP As células animais têm duas isoenzimas da succinilCoAsintetase uma específi ca para ADP e outra para GDP A enzima contém duas subunidades a Mr 32000 que tem o resíduo de His His 246 e o sítio de ligação para CoA e b Mr 42000 que confere a especificidade por ADP ou GDP O sítio ativo se situa na interface entre as subunidades A estrutura do cristal da succinilCoAsintetase revela duas hélices elé tricas uma em cada subunidade orientadas de maneira que seus dipolos elétricos posicionem as cargas parciais positivas próximas ao resíduo His carregado negati vamente Figura 1613b estabilizando o intermediário fosfoenzima Relembre a função similar das hélices bi polares na estabilização dos íons K 1 no canal de K 1 ver Figura 1147 A formação de ATP ou GTP à custa da energia libe rada pela descarboxilação oxidativa do acetoglutarato é uma fosforilação ao nível do substrato como a síntese de ATP nas reações glicolíticas catalisadas por gliceraldeído3 fosfatodesidrogenase e piruvatocinase ver Figura 142 O GTP formado pela succinilCoAsintetase pode doar o grupo fosfato terminal ao ADP para formar ATP em uma reação reversível catalisada pela nucleosídeodifosfato cinase p 526 GTP 1 ADP GDP 1 ATP DG9 o 5 0 kJmol Desse modo o resultado líquido da atividade de cada isoen zima da succinilCoAsintetase é a conservação de energia como ATP Não há variação de energia livre na reação da nucleosídeodifosfatocinase ATP e GTP são energetica mente equivalentes FIGURA 1613 A reação da succinilCoAsintetase a Na etapa ➊ a CoA da succinilCoA ligada à enzima é substituída por um grupo fosfato for mando um acilfosfato de alta energia Na etapa ➋ o succinilfosfato doa o grupo fosfato para um resíduo de His da enzima originando uma fosfo histidilenzima de alta energia Na etapa ➌ o grupo fosfato é transferido do resíduo de His ao fosfato terminal do GDP ou ADP formando GTP ou ATP b Sítio ativo da succinilCoAsintetase de E coli derivado da estrutura de PDB ID 1SCU O sítio ativo inclui parte de ambas as subunidades a em azul e b em marrom As hélices carregadas azul marrom posicionam as cargas parciais positivas do dipolo da hélice próximas ao grupo fosfato de His 246 na cadeia a estabilizando a enzima com a fosfohistidina As enzimas de mamíferos e bactérias apresentam sequências de aminoácidos e estrutu ras tridimensionais similares P Pi SuccinilCoAsintetase P ❶ ❷ ➌ Coenzima A Hélice elétrica da subunidade b Subunidade b Subunidade a Grupo fosfato Hélice elétrica da subunidade a P His246 SuccinilCoA Succinato Fosfohistidilenzima b CH2 O C SCoA CH2 C O O2 CH2 O C CH2 C O 2O O2 CoASH GDP GTP Enzima ligada ao succinilfosfato His CH2 His His O O2 C CH2 O C O a Nelson6edbookindb 645 Nelson6edbookindb 645 030414 0744 030414 0744 646 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ➏ Oxidação do succinato a fumarato O succinato formado a partir da succinilCoA é oxidado a fumarato pela flavopro teína succinatodesidrogenase DG98 5 0 kJmol COO2 Succinato Succinatodesidrogenase FAD H2 Fumarato H2C2H H2C2H COO2 FAD OOC 2 COO2 C C H H Em eucariotos a succinatodesidrogenase está firme mente ligada à membrana mitocondrial interna em bac térias está ligada à membrana plasmática A enzima con tém três grupos ferroenxofre diferentes e uma molécula de FAD covalentemente ligada ver Figura 1910 Os elétrons do succinato passam pelo FAD e pelos centros de ferroenxofre antes de entrarem na cadeia de trans portadores de elétrons da membrana mitocondrial inter na da membrana plasmática em bactérias O fluxo dos elétrons do succinato ao longo desses transportadores até o aceptor de elétrons final O2 é acoplado à síntese de aproximadamente 15 molécula de ATP por par de elé trons fosforilação acoplada à respiração Malonato aná logo do succinato normalmente ausente nas células é um forte inibidor competitivo da succinatodesidrogenase e sua adição à mitocôndria bloqueia a atividade do ciclo do ácido cítrico QUADRO 162 Sintases e sintetases ligases e liases cinases fosfatases e fosforilases sim os nomes são confusos A citratosintase é uma das muitas enzimas que catalisam reações de condensação que geram um produto quimi camente mais complexo do que os precursores Sinta ses catalisam reações de condensação nas quais nenhum nucleosídeo trifosfatado ATP GTP e assim por diante é necessário como fonte de energia Sintetases catalisam reações de condensação que de fato utilizam ATP ou ou tro nucleosídeo trifosfatado como uma fonte de energia para a reação sintética A succinilCoAsintetase é uma destas enzimas Ligases do latim ligare amarrar são enzimas que catalisam reações de condensação nas quais dois átomos são unidos utilizando ATP ou outra fonte de energia Portanto sintetases são ligases A DNAligase por exemplo conserta quebras em moléculas de DNA utilizando energia suprida por ATP ou NAD 1 essa enzi ma é largamente utilizada na engenharia genética para unir pedaços de DNA Ligases não devem ser confundi das com liases enzimas que catalisam clivagens ou na reação inversa adições nas quais ocorrem rearranjos eletrônicos O complexo da PDH que remove o CO2 da molécula de piruvato em uma reação de oxidação é um membro da ampla classe das liases O nome cinase é aplicado a enzimas que transferem um grupo fosfato de um nucleosídeo trifosfatado como o ATP para uma molécula aceptora um açúcar como a hexocinase e a glicocinase uma proteína como a glico gêniofosforilasecinase outro nucleotídeo como a nu cleosídeodifosfatocinase ou um intermediário metabó lico como o oxaloacetato como a PEPcarboxicinase A reação catalisada por uma cinase é uma fosforilação Por outro lado a fosforólise é uma reação de substituição na qual o fosfato inorgânico ataca uma ligação química e é covalentemente ligado à molécula no ponto de quebra da ligação Tais reações são catalisadas por fosforilases A glicogêniofosforilase por exemplo catalisa a fosforólise do glicogênio produzindo glicose1fosfato A desfosfo rilação remoção de um grupo fosfato a partir de um és ter de fosfato é catalisada por fosfatases que utilizam a água como espécie atacante A frutosebifosfatase1 converte frutose16bifosfato a frutose6fosfato na gli coneogênese e a fosforilaseafosfatase retira os grupos fosfato dos resíduos de fosfosserina na glicogêniofosfori lase fosforilada Ufa Infelizmente essas descrições dos tipos de enzimas se sobrepõem e muitas enzimas são comumente chama das por dois ou mais nomes A succinilCoAsintetase por exemplo também é chamada de succinatotiocinase a enzima é uma sintetase no ciclo do ácido cítrico e uma cinase quando age no sentido da síntese de succinilCoA Isso expõe outra fonte de confusão na nomenclatura de enzimas Uma enzima pode ter sido descoberta com a utilização de um experimento no qual por exemplo A é convertido em B A enzima é então chamada de acordo com essa reação Trabalhos posteriores entretanto po dem mostrar que na célula a enzima funciona principal mente convertendo B a A Geralmente o primeiro nome continua a ser utilizado embora a função metabólica da enzima fosse mais bem descrita nomeandoa pela reação inversa A enzima glicolítica piruvatocinase ilustra esta situação p 554 Para um principiante na bioquímica essa duplicação da nomenclatura pode ser desorientado ra Comissões internacionais têm feito esforços heroicos para sistematizar a nomenclatura das enzimas ver Tabe la 63 para um breve resumo do sistema porém alguns nomes sistemáticos são muito longos e complicados e não são utilizados no dia a dia bioquímico Ao longo deste livro tentouse utilizar os nomes en zimáticos mais comumente utilizados pelos bioquímicos e chamar a atenção para os casos nos quais uma enzima tem mais de um nome amplamente utilizado Para infor mações atualizadas sobre a nomenclatura enzimática re corra às recomendações da Comissão de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecu lar Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology wwwchemqmw acukiubmbnomenclature Nelson6edbookindb 646 Nelson6edbookindb 646 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 647 C O CH2 Succinato C O O2 O2 C O CH2 Malonato C O O2 O2 CH2 ➐ Hidratação do fumarato a malato A hidratação reversível do fumarato a Lmalato é catalisada pela fumarase for malmente fumaratohidratase O estado de transição dessa reação é um carbânion DG98 5 238 kJmol Carbânion do estado de transição Fumarase OH2 Fumarase H1 Fumarato OOC 2 COO2 C C H H OH OOC 2 C C COO2 2 H H OH OOC 2 C C COO2 H H H LMalato Essa enzima é altamente estereoespecífica ela catalisa a hidratação da ligação dupla trans do fumarato mas não a da ligação dupla cis do maleato o isômero cis do fuma rato Na direção inversa de Lmalato para fumarato a fumarase é igualmente estereoespecífica Dmalato não é um substrato Fumarato C COO2 Maleato CH2 2OOC DMalato LMalato H H H C C COO2 H COO2 C C OH H COO2 COO2 CH2 HO COO2 C H COO2 ➑ Oxidação do malato a oxaloacetato Na última reação do ci clo do ácido cítrico a Lmalatodesidrogenase ligada ao NAD catalisa a oxidação de Lmalato a oxaloacetato DG98 5 297 kJmol C CH2 COO2 Lmalatodesidrogenase NAD1 NADH 1 H1 O L Malato Oxaloacetato COO2 COO2 C CH2 COO2 H HO O equilíbrio dessa reação é muito deslocado para a esquer da sob as condições termodinâmicas padrão porém nas células intactas o oxaloacetato é continuamente removido pela reação altamente exergônica da citratosintase etapa ➋ da Figura 167 Isso mantém a concentração celular de oxaloacetato extremamente baixa 10 26M deslocando a reação da malatodesidrogenase no sentido da formação de oxaloacetato Embora as reações individuais do ciclo do ácido cítrico te nham sido inicialmente elucidadas in vitro utilizando teci do muscular macerado a via e sua regulação também têm sido intensamente estudadas in vivo Com a utilização de precursores marcados radioativamente como 14Cpiruva to e 14Cacetato os pesquisadores têm delineado o destino de átomos de carbono individuais durante o ciclo do ácido cítrico Alguns dos experimentos iniciais com isótopos en tretanto produziram resultados inesperados que origina ram considerável controvérsia sobre a via e o mecanismo do ciclo do ácido cítrico Na verdade esses experimentos pareciam inicialmente mostrar que o citrato não era o pri meiro ácido tricarboxílico formado O Quadro 163 conta alguns detalhes desse episódio da história da pesquisa do ciclo do ácido cítrico O fluxo metabólico ao longo do ciclo agora pode ser monitorado em tecidos vivos com o uso de precursores marcados com 13C e espectroscopia por RMN Como o sinal de RMN é exclusivo do composto contendo 13C os bioquímicos podem determinar o movimento dos carbonos dos precursores em cada intermediário do ciclo e em compostos derivados destes intermediários Essa téc nica é bastante promissora para os estudos da regulação do ciclo do ácido cítrico e suas interconexões com outras vias metabólicas como a glicólise A energia das oxidações do ciclo é conservada de maneira eficiente Até aqui foi esmiuçada uma rodada completa do ciclo do ácido cítrico Figura 1614 Um grupo acetil com dois carbonos entra no ciclo combinandose com o oxaloaceta to Dois átomos de carbono saem do ciclo na forma de CO2 pela oxidação do isocitrato e do acetoglutarato A energia liberada por estas oxidações foi conservada pela redução de três NAD 1 e um FAD e pela produção de um ATP ou GTP No final do ciclo uma molécula de oxaloacetato foi regene rada Lembre que os dois átomos de carbono que emergem como CO2 não são os mesmos dois carbonos que entraram na forma de grupo acetil rodadas adicionais são necessá rias para que estes carbonos sejam liberados na forma de CO2 Figura 167 Nelson6edbookindb 647 Nelson6edbookindb 647 030414 0744 030414 0744 648 DAVID L NELSON MICHAEL M COX QUADRO 163 Citrato molécula simétrica que reage assimetricamente Quando os compostos enriquecidos no isótopo de carbo no pesado 13C e nos isótopos de carbono radioativos 11C e 14C se tornaram disponíveis cerca de 60 anos atrás eles foram imediatamente utilizados para definir o rumo dos átomos de carbono durante o ciclo do ácido cítrico Um desses experimentos desencadeou a controvérsia sobre a função do citrato Acetato marcado no grupo carboxil designado 1 14Cacetato foi incubado sob condições aeróbias com uma preparação de tecido animal O aceta to é enzimaticamente convertido a acetilCoA nos tecidos animais e a via do carbono do carboxil marcado agora presente no grupo acetil poderia assim ser determinada durante o ciclo de reações aCetoglutarato foi isolado do tecido após a incubação sendo então degradado quimi camente por meio de reações químicas conhecidas para estabelecer as posiçãoões do carbono isotópico Esperavase que a condensação de oxaloacetato não marcado com acetato marcado no carboxil produzisse ci trato marcado em um dos dois grupos carboxil primários O citrato é uma molécula simétrica seus dois grupos car boxil terminais são indistinguíveis Consequentemente era esperado que metade das moléculas de citrato marcadas originasse acetoglutarato marcado no grupo carboxil a e que a outra metade originasse acetoglutarato marcado no grupo carboxil g isto é esperavase que o acetoglutarato isolado fosse uma mistura dos dois tipos de moléculas mar cadas Figura Q1 vias ➊ e ➋ Contrariando essas expec tativas o acetoglutarato marcado isolado da suspensão de tecido continha 14C somente no grupo carboxil g Figura Q1 via ➊ Os investigadores concluíram que o citrato ou qualquer outra molécula simétrica não poderia ser um in termediário da via entre acetato e acetoglutarato Em vez disso um ácido tricarboxílico assimétrico presumivelmen te cisaconitato ou isocitrato deveria ser o primeiro pro duto formado pela condensação de acetato e oxaloacetato Em 1948 entretanto Alexandre Ogston mostrou que embora o citrato não tenha centro quiral ver Figura 120 ele tem potencial para reagir assimetricamente se a enzima com a qual ele interage possuir um sítio ati vo assimétrico Ele sugeriu que o sítio ativo da aconitase tinha três pontos aos quais o citrato deveria estar liga do e que o citrato deveria posicionarse de maneira a se unir especificamente a esses três pontos Como visto na Figura Q2 a ligação do citrato aos três pontos poderia ocorrer de uma maneira apenas e isso acarretaria na for mação de um único tipo de acetoglutarato marcado Mo léculas orgânicas como o citrato sem centro quiral mas potencialmente capazes de reagirem assimetricamente com um sítio ativo assimétrico são atualmente chamadas de moléculas próquirais CH3 14COO2 C CH2 O COO2 COO2 CH2 14COO2 C CH2 HO COO2 COO2 CH2 14COO2 CH HO COO2 CH COO2 CH 14COO2 CH HO COO2 COO2 1 Acetato marcado Oxaloacetato Citrato marcado Isocitrato CH2 14COO2 CH2 C 14COO2 CH O CH2 COO2 COO2 Apenas este produto foi formado Esta segunda forma de acetoglutarato marcado também era esperada mas não foi formada ❶ ❷ C O COO2 g b a g b a CH2 FIGURA Q1 Incorporação do carbono isotópico 14C do grupo acetil mar cado ao acetoglutarato durante o ciclo do ácido cítrico Os átomos de car bono do grupo acetil reagente estão representados em vermelho CH2COO2 HO C COO2 Z X Y a c Ligação suscetível CH2COO2 Z C Z X Y b Z C X9 Y9 Z9 Esta ligação não pode ser posicionada corretamente e não é atacada Esta ligação pode ser posicionada corretamente e é atacada O sítio ativo tem pontos de ligação comple mentares FIGURA Q2 A natureza próquiral do citrato a Estrutura do citrato b representação esquemática do citrato X 5 2OH Y 5 2COO 2 Z 5 2CH2COO 2 c Encaixe complementar correto do citrato ao sítio de liga ção da aconitase Existe apenas uma maneira na qual os três grupos espe cificados do citrato podem encaixarse aos três pontos do sítio de ligação Portanto apenas um dos dois grupos 2CH2COO 2 ligase à aconitase Nelson6edbookindb 648 Nelson6edbookindb 648 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 649 Embora o ciclo do ácido cítrico gere diretamente so mente um ATP por rodada na conversão de succinilCoA a succinato as quatro etapas de oxidação do ciclo abas tecem a cadeia respiratória via NADH e FADH2 com um grande fluxo de elétrons e assim levam à formação de um grande número de moléculas de ATP durante a forforilação oxidativa Foi visto no Capítulo 14 que o rendimento energético da produção de duas moléculas de piruvato a partir de uma molécula de glicose é de 2 ATP e 2 NADH Na fosforilação oxidativa Capítulo 19 a passagem de dois elétrons do NADH ao O2 impele a formação de aproximadamente 25 ATP e a passagem de dois elétrons do FADH2 ao O2 rende cerca de 15 ATP Essa estequiometria nos permite calcular o rendimento global em ATP da oxidação completa da gli cose Quando ambas as moléculas de piruvato são oxidadas a 6 CO2 via complexo da piruvatodesidrogenase e ciclo do ácido cítrico e os elétrons são transferidos ao O2 via fosfori lação oxidativa 32 ATPs são obtidos por molécula de glico se Tabela 161 Em números redondos isto representa a conservação de 32 3 305 kJmol 5 976 kJmol ou 34 do máximo teórico de cerca de 2840 kJmol disponibilizados pela oxidação completa da glicose Esses cálculos utilizam as variações de energia livre padrão quando corrigidos para a energia livre de fato requerida para a formação de ATP dentro das células ver Problema Resolvido 132 p 519 a eficiência calculada do processo aproximase de 65 Por que a oxidação do citrato é tão complicada Um processo cíclico em oito etapas para a oxidação de simples grupos acetil de dois carbonos a CO2 pode parecer desnecessariamente complicado e em discordância com o princípio biológico de economia máxima A função do ci clo do ácido cítrico entretanto não se restringe à oxidação do acetato Essa via é o pivô do metabolismo intermediário Produtos finais com quatro e cinco carbonos originários de muitos processos catabólicos são utilizados para alimenta rem o ciclo e servirem como combustíveis Oxaloacetato e acetoglutarato por exemplo são produzidos a partir de aspartato e glutamato respectivamente quando proteínas TABELA 161 Estequiometria da redução de coenzimas e formação de ATP na oxidação aeróbia da glicose via glicólise reação do complexo da piruvatodesidrogenase ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa Reação Número de ATP ou coenzimas reduzidas diretamente formados Número de ATP formados no final do processo Glicose glicose6fosfato 1 ATP 1 Frutose6fosfato frutose16bifosfato 1 ATP 1 2 Gliceraldeído3fosfato 2 13bifosfoglicerato 2 NADH 3 ou 5 2 13Bifosfoglicerato 2 3fosfoglicerato 2 ATP 2 2 Fosfoenolpiruvato 2 piruvato 2 ATP 2 2 Piruvato 2 acetilCoA 2 NADH 5 2 Isocitrato 2 acetoglutarato 2 NADH 5 2 aCetoglutarato 2 succinilCoA 2 NADH 5 2 SuccinilCoA 2 succinato A ATP ou 2 GTP 2 2 Succinato 2 fumarato 2 FADH2 3 2 Malato 2 oxaloacetato 2 NADH 5 Total 3032 Calculado como 25 ATP por NADH e 15 ATP por FADH2 Um valor negativo indica consumo O número formado é 3 ou 5 dependendo do mecanismo utilizado para a transferência de equivalentes de NADH do citosol para a matriz mitocondrial ver Figuras 1930 e 1931 CO2 CO2 AcetilCoA Citrato Isocitrato Cetoglutarato SuccinilCoA Fumarato Malato Oxaloacetato NADH NADH GTP ATP FADH2 NADH Succinato Ciclo do ácido cítrico a FIGURA 1614 Produtos de uma rodada do ciclo do ácido cítrico A cada rodada do ciclo do ácido cítrico três moléculas de NADH uma de FADH2 uma de GTP ATP e duas de CO2 são liberadas em reações de des carboxilação oxidativa Aqui e em algumas das figuras seguintes todas as reações do ciclo estão representadas como se elas ocorressem em apenas uma direção lembrese entretanto que a maioria das reações são reversíveis ver Figura 167 Nelson6edbookindb 649 Nelson6edbookindb 649 030414 0744 030414 0744 650 DAVID L NELSON MICHAEL M COX são degradadas Sob determinadas circunstâncias metabó licas intermediários são drenados do ciclo para serem uti lizados como precursores em diferentes vias biossintéticas O ciclo do ácido cítrico como todas as outras vias meta bólicas é um produto da evolução e essa evolução ocorreu em grande parte antes do surgimento dos organismos aeró bios Ele não necessariamente representa a via mais curta entre acetato e CO2 mas é a via que ao longo do tempo tem conferido a maior vantagem seletiva Anaeróbios primitivos muito provavelmente utilizavam algumas das reações do ciclo do ácido cítrico em processos biossintéticos lineares Na verdade alguns microrganismos atuais utilizam um ci clo do ácido cítrico incompleto não como fonte de energia mas de precursores biossintéticos Figura 1615 Esses organismos utilizam as três primeiras reações do ciclo para sintetizarem acetoglutarato porém como carecem de a cetoglutaratodesidrogenase não podem realizar o conjunto completo das reações do ciclo do ácido cítrico O que esses organismos de fato possuem são as quatro enzimas que cata lisam a conversão reversível de oxaloacetato a succinilCoA e podem produzir malato fumarato succinato e succinilCoA a partir de oxaloacetato em uma inversão do sentido normal oxidativo do fluxo do ciclo Essa via é uma fermentação e o NADH produzido pela oxidação do isocitrato é reciclado a NAD 1 pela redução do oxaloacetato a succinato Com a evolução das cianobactérias que produzem O2 a partir de água a atmosfera da Terra tornouse aeróbia e os organismos sofreram uma pressão seletiva para o desenvol vimento do metabolismo aeróbio o qual é muito mais efi ciente do que a fermentação anaeróbia Os componentes do ciclo do ácido cítrico são importantes intermediários da biossíntese Em organismos aeróbios o ciclo do ácido cítrico é uma via anfibólica ou seja que serve a processos catabólicos e anabólicos Além do papel no catabolismo oxidativo de car boidratos ácidos graxos e aminoácidos o ciclo fornece pre cursores para muitas vias de biossíntese Figura 1616 por meio das reações que serviram a esse mesmo propósito em ancestrais anaeróbios aCetoglutarato e oxaloacetato podem por exemplo ser os precursores dos aminoácidos aspartato e glutamato por simples transaminação Capítulo 22 Por meio do aspartato e do glutamato os carbonos do oxaloacetato e acetoglutarato são então utilizados para a síntese de outros aminoácidos assim como para a síntese de nucleotídeos de purinas e pirimidinas O oxaloacetato é convertido em glicose na gliconeogênese ver Figura 15 13 A succinilCoA é um intermediário central para a sín tese do anel porfirínico dos grupos heme que agem como transportadores de oxigênio na hemoglobina e na mioglo bina e transportadores de elétrons nos citocromos ver Figura 2225 E o citrato produzido por alguns organismos é utilizado comercialmente para uma grande variedade de propósitos Reações anapleróticas repõem os intermediários do ciclo do ácido cítrico Conforme os intermediários do ciclo do ácido cítrico são removidos para servirem como precursores na biossíntese eles são repostos por reações anapleróticas Figura 16 16 Tabela 162 Sob circunstâncias normais há um equilí brio dinâmico nas reações que desviam os intermediários a outras vias e os repõem de modo que as concentrações dos intermediários do ciclo do ácido cítrico permaneçam quase constantes A Tabela 162 mostra as reações anapleróticas mais co muns as quais em vários tecidos e organismos convertem ou piruvato ou fosfoenolpiruvato a oxaloacetato ou mala to A reação anaplerótica mais importante no fígado e nos rins de mamíferos é a carboxilação reversível do piruvato pelo CO2 para a formação de oxaloacetato catalisada pela piruvatocarboxilase Quando o ciclo do ácido cítrico está deficiente em oxaloacetato ou qualquer outro inter mediário o piruvato é carboxilado para produzir mais oxa loacetato A adição enzimática de um grupo carboxil ao pi ruvato requer energia que é suprida pelo ATP a energia livre necessária para unir um grupo carboxil ao piruvato é aproximadamente igual à energia livre disponibilizada pelo ATP A piruvatocarboxilase é uma enzima de regulação es sencialmente inativa na ausência de acetilCoA seu modu lador alostérico positivo Sempre que a acetilCoA o com bustível do ciclo do ácido cítrico está presente em excesso ela estimula a reação da piruvatocarboxilase para a pro dução de mais oxaloacetato permitindo que o ciclo utilize mais acetilCoA na reação da citratosintase As outras reações anapleróticas mostradas na Tabela 162 também são reguladas de modo a manter o nível dos intermediários suficientemente alto para sustentar a ativi Cetoglutarato Produtos da biossíntese aminoácidos nucleotídeos heme etc SuccinilCoA PEP ou piruvato CO2 AcetilCoA Citrato Oxaloacetato Malato Fumarato Isocitrato Succinato a FIGURA 1615 Precursores biossintéticos produzidos por um ciclo do ácido cítrico incompleto em bactérias anaeróbias Estes organismos anaeróbios carecem de acetoglutaratodesidrogenase e portanto não podem efetuar o ciclo do ácido cítrico completo aCetoglutarato e succinil CoA são precursores em diversas vias biossintéticas Ver Figura 1614 para o sentido normal destas reações no ciclo do ácido cítrico Nelson6edbookindb 650 Nelson6edbookindb 650 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 651 dade do ciclo do ácido cítrico A fosfoenolpiruvatocarbo xilase por exemplo é ativada pelo intermediário glicolíti co frutose16bifosfato que se acumula quando o ciclo do ácido cítrico processa muito lentamente o piruvato gerado pela glicólise A biotina da piruvatocarboxilase transporta grupos CO2 A reação da piruvatocarboxilase requer a vitamina bioti na Figura 1617 que é o grupo prostético da enzima A biotina tem uma funçãochave em muitas reações de car boxilação Ela é um transportador especializado dos gru pos de um carbono em sua forma mais oxidada CO2 A transferência de grupos de um carbono em formas mais reduzidas é mediada por outros cofatores particularmente tetrahidrofolato e Sadenosilmetionina como descrito no Capítulo 18 Os grupos carboxil são ativados em uma rea ção que une o CO2 à biotina ligada à enzima com consumo de ATP Esse CO2 ativado passa a um aceptor piruvato nesse caso em uma reação de carboxilação A piruvatocarboxilase tem quatro subunidades idên ticas cada uma contendo uma molécula de biotina ligada covalentemente por uma ligação amida com o grupo amino de um resíduo de Lys específico presente no sítio ativo da enzima A carboxilação do piruvato ocorre em duas etapas TABELA 162 Reações anapleróticas Reação Tecidosorganismos Piruvato 1 HCO3 1 ATP Piruvatocarboxilase oxaloacetato 1 ADP 1 Pi Fígado rins Fosfoenolpiruvato 1 CO2 1 GDP PEPcarboxicinase oxaloacetato 1 GTP Coração músculo esquelético Fosfoenolpiruvato 1 HCO3 PEPcarboxilase oxaloacetato 1 Pi Vegetais superiores leveduras bactérias Piruvato 1 HCO3 1 NADPH Enzima málica malato 1 NADP 1 Amplamente distribuída em eucariotos e bactérias Fosfoenolpiruvato PEP PEPcarboxilase PEPcarboxicinase Piruvatocarboxilase Porfirinas heme Glutamato Purinas Arginina Prolina Glutamina Pirimidinas Aspartato Asparagina Serina Glicina Cisteína Fenilalanina Tirosina Triptofano Glicose Ácidos graxos esteróis Piruvato Enzima málica Piruvato aCetoglutarato Malato SuccinilCoA Oxaloacetato AcetilCoA Citrato Ciclo do ácido cítrico FIGURA 1616 Papel do ciclo do ácido cítrico no anabolismo Inter mediários do ciclo do ácido cítrico são desviados como precursores de mui tas vias biossintéticas Em vermelho aparecem quatro reações anapleróticas que repõem os intermediários do ciclo esgotados ver Tabela 162 Nelson6edbookindb 651 Nelson6edbookindb 651 030414 0744 030414 0744 652 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Figura 1617 primeiro um grupo carboxil derivado do HCO3 2 é ligado à biotina sendo então transferido ao piru vato para formar oxaloacetato Essas duas etapas ocorrem em sítios ativos separados o longo e flexível braço da bio tina transfere os grupos carboxil ativados do primeiro sítio ativo em um dos monômeros do tetrâmero ao segundo no monômero adjacente funcionando muito similarmen te ao longo braço de lipoillisina de E2 no complexo da PDH Figura 166 e ao longo braço da porção similar a CoA da proteína transportadora de acilas envolvida na síntese de HN NH O S Sítio catalítico 2 O O P P O O O NH Lys O P ATP ADP Carboxifosfato Pi C Bicarbonato Lisina biotinilada Piruvato carboxilase HO O H C CH2 C O O O O O C C CH2 C O O O HN NH O S Pi S O N NH O S NH H O C O O NH O C O O C O O O O P O O C O O H N HN O S NH O C O O Piruvato Oxaloacetato N HN O S NH O C CH2 C O O O C O O NH Enolpiruvato HN O S NH O Adenina Rib S O P O O NH Lys O ATP ATP Lisina bi i i biotinilada l Piruvato to carbboxilase Sítio catalítico 1 Carboxibiotinilenzima ❶ ❷ ❸ ❹ ❺ ❻ 7 O bicarbonato é ativado pelo ATP formando carboxifosfato O carboxifosfato é transformado em CO2 O CO2 reage com a biotina formando carboxibiotina A biotina transporta o CO2 de um sítio ativo a outro A biotina é descarboxilada O piruvato é convertido a sua forma enólica O enolpiruvato reage com CO2 formando oxaloacetato O oxaloacetato é liberado MECANISMOFIGURA 1617 O papel da biotina na reação catalisada pela piruvatocarboxilase A biotina está ligada à enzima por uma liga ção amida com o grupo amino de um resíduo de Lys formando a enzi ma biotinilada A reação de carboxilação mediada pela biotina ocorre em duas fases geralmente catalisadas em sítios ativos separados da enzima como exemplificado pela reação da piruvatocarboxilase Na primeira fase etapas ➊ a ➌ o bicarbonato é convertido a CO2 mais ativo sendo então utilizado para carboxilar a biotina A biotina atua como um transportador carregando o CO2 de um sítio ativo ao outro localizado em um monômero adjacente da enzima tetramérica etapa ➍ Na segunda fase etapas ➎ a ➐ catalisada neste segundo sítio ativo o CO2 reage com o piruvato para formar oxaloacetato Nelson6edbookindb 652 Nelson6edbookindb 652 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 653 ácidos graxos ver Figura 215 essas proteínas são com paradas na Figura 1618 O lipoato a biotina e o pantote nato entram nas células por meio do mesmo transportador todos se tornam covalentemente ligados a proteínas por reações similares e todos originam um conector flexível que possibilita que os intermediários da reação se movam de um sítio ativo a outro em um complexo enzimático sem dissociaremse do complexo isto é todos participam da canalização do substrato A biotina é uma vitamina essencial da dieta humana ela é abundante em muitos alimentos e é sintetizada por bactérias intestinais A deficiência de biotina é rara mas pode algumas vezes ser causada por uma dieta rica em ovos crus A clara do ovo contém grande quantidade da proteína avidina Mr 70000 que se liga com muita afini dade à biotina e impede sua absorção no intestino A avidi na do ovo pode ser um mecanismo de defesa para o poten cial embrião da ave inibindo o crescimento de bactérias Quando os ovos são cozidos a avidina é desnaturada e portanto inativada juntamente com todas as outras pro teínas da clara do ovo A avidina purificada é um reagente muito útil na bioquímica e na biologia celular Uma pro teína covalentemente ligada à biotina obtida experimen talmente ou produzida in vivo pode ser purificada por cromatografia de afinidade ver Figura 317c com base na forte afinidade da biotina pela avidina A proteína é então eluída da coluna com excesso de biotina livre A afinidade muito alta da biotina pela avidina também é utilizada em laboratório para unir duas estruturas agindo como cola molecular ver Figura 1927 RESUMO 162 Reações do ciclo do ácido cítrico c O ciclo do ácido cítrico ciclo de Krebs ciclo do áci do tricarboxílico TCA é uma via catabólica central e praticamente universal por meio da qual os compos tos derivados da degradação de carboidratos gorduras e proteínas são oxidados a CO2 com a maior parte da energia da oxidação temporariamente armazenada nos transportadores de elétrons FADH2 e NADH Durante o metabolismo aeróbio esses elétrons são transferidos ao O2 e a energia do fluxo de elétrons é capturada na forma de ATP c A acetilCoA entra no ciclo do ácido cítrico na mitocôn dria de eucariotos no citosol em bactérias quando a citratosintase catalisa sua condensação com o oxaloa cetato para a formação de citrato c Em sete reações sequenciais incluindo duas descarbo xilações o ciclo do ácido cítrico converte citrato a oxa loacetato e libera dois CO2 A via é cíclica de modo que os intermediários não são exauridos para cada oxaloa cetato consumido na via um é produzido c Para cada acetilCoA oxidada pelo ciclo do ácido cítri co o ganho de energia consiste em três moléculas de NADH uma de FADH2 e um nucleosídeo trifosfatado ATP ou GTP c Além da acetilCoA qualquer composto que origine um intermediário do ciclo do ácido cítrico com quatro ou cinco carbonos por exemplo os produtos da degrada ção de muitos aminoácidos podem ser oxidados pelo ciclo c O ciclo do ácido cítrico é anfibólico servindo ao catabo lismo e ao anabolismo os intermediários do ciclo podem ser desviados e utilizados como material de partida para diversos produtos da biossíntese c Quando os intermediários são desviados do ciclo do ácido cítrico para outras vias eles são repostos por al gumas reações anapleróticas que produzem interme diários de quatro carbonos por meio da carboxilação de compostos de três carbonos essas reações são catalisa das por piruvatocarboxilase PEPcarboxicinase PEP carboxilase e enzima málica Enzimas que catalisam carboxilações comumente utilizam a biotina para ativar o CO2 e transportálo a aceptores como piruvato ou fos foenolpiruvato 163 Regulação do ciclo do ácido cítrico Como foi analisado no Capítulo 15 a regulação de enzimas chave em vias metabólicas por meio de efetores alostéri cos e modificação covalente garante a produção dos inter mediários nas taxas necessárias para manter a célula em um estado de equilíbrio estável enquanto evita o desperdí cio de uma superprodução O fluxo de átomos de carbono que entram no ciclo do ácido cítrico a partir do piruvato e também durante o curso do ciclo está sob constante regu lação em dois níveis a conversão de piruvato a acetilCoA o material de partida do ciclo a reação da piruvatodesi drogenase e a entrada da acetilCoA no ciclo a reação S S S O O N N N H N H N H H C NH HN HS CH3 CH3 Dihidrolipoil transacetilase E2 C O O O N H OH O2 C O O O O Ser Proteína transpor tadora de grupo acil P O Lipoato Biotina Pantotenato bMercapto etilamina Resíduo de Lys Resíduo de Lys H C Piruvato carboxilase FIGURA 1618 Conectores biológicos Os cofatores lipoato biotina e a combinação de bmercaptoetilamina e pantotenato formam longos bra ços flexíveis em azul nas enzimas às quais estão covalentemente ligados atuando como conectores que movem os intermediários de um sítio ativo ao outro O grupo sombreado em vermelho é em cada caso o ponto de ligação do intermediário ativado ao conector Nelson6edbookindb 653 Nelson6edbookindb 653 030414 0744 030414 0744 654 DAVID L NELSON MICHAEL M COX da citratosintase A acetilCoA também é produzida por outras vias que não a reação do complexo da PDH a maio ria das células produz acetilCoA pela oxidação de ácidos graxos e certos aminoácidos e a disponibilidade de inter mediários a partir dessas vias é importante para a regulação da oxidação do piruvato e do ciclo do ácido cítrico O ciclo também é regulado nas reações da isocitratodesidrogenase e da acetoglutaratodesidrogenase A produção de acetilCoA pelo complexo piruvatodesidrogenase é regulada por mecanismos alostéricos e covalentes O complexo da PDH de mamíferos é fortemente inibido por ATP e por acetilCoA e NADH os produtos da reação cata lisada pelo complexo Figura 1619 A inibição alostérica da oxidação do piruvato é muito aumentada quando ácidos graxos de cadeia longa estão disponíveis AMP CoA e NAD 1 se acumulam quando muito pouco acetato flui para dentro do ciclo ativando alostericamente o complexo da PDH Portanto essa enzima é desativada quando o combustível está disponível em grande quantidade na forma de ácidos graxos e acetilCoA e quando as razões celulares ATP ADP e NADHNAD 1 estão elevadas e a enzima é ati vada novamente quando a demanda de energia está alta e a célula necessita de um maior fluxo de acetilCoA para o ciclo do ácido cítrico Em mamíferos esses mecanismos de regulação alosté ricos são complementados por um segundo nível de regu lação a modificação covalente das proteínas O complexo da PDH é inibido pela fosforilação reversível de um resíduo de Ser específico em uma das duas subunidades E1 Como mencionado anteriormente além das enzimas E1 E2 e E3 o complexo da PDH de mamíferos contém duas proteínas de regulação cujo único propósito é regular a atividade do complexo A piruvatodesidrogenasecinase fosforila e des sa maneira inativa E1 enquanto uma fosfoproteínafosfata se específica remove o grupo fosfato por hidrólise e desta maneira ativa E1 A cinase é alostericamente ativada por ATP quando a ATP está elevada refletindo um suprimen to de energia adequado o complexo da PDH é inativado pela fosforilação de E1 Quando ATP diminui a atividade da cinase diminui e a ação da fosfatase remove o grupo fos fato de E1 ativando o complexo O complexo da PDH de plantas localizado na matriz mitocondrial e em plastídeos é inibido por seus produtos FIGURA 1619 Regulação do fluxo dos metabólitos a par tir do complexo da PDH durante o ciclo do ácido cítrico em mamíferos O complexo da PDH é alostericamente ini bido quando as razões ATPADP NADHNAD 1 e acetil CoACoA estão elevadas indicando um estado metabólico com energia suficiente Quando estas razões decrescem o re sultado é a ativação alostérica da oxidação do piruvato A veloci dade do fluxo pelo ciclo do ácido cítrico pode ser limitada pela disponibilidade dos substratos da citratosintase oxaloacetato e acetilCoA ou de NAD 1 o qual é exaurido pela conversão a NADH retardando as três etapas de oxidação dependentes de NAD A inibição por retroalimentação por succinilCoA citrato e ATP também diminui a velocidade do ciclo pela inibição de etapas iniciais No tecido muscular o Ca 21 estimula a contração e como mostrado aqui estimula o metabolismo gerador de energia para repor o ATP consumido durante a contração NADH FADH2 AcetilCoA Citrato Isocitrato Cetoglutarato SuccinilCoA Malato Oxaloacetato Piruvato Complexo da piruvato desidrogenase ATP acetilCoA NADH ácidos graxos AMP CoA NAD1 Ca21 citratosintase NADH succinilCoA citrato ATP ADP Isocitrato desidrogenase ATP Ca21 ADP SuccinilCoA NADH Ca21 Complexo da acetoglutarato desidrogenase Succinato desidrogenase Malatodesidrogenase GTP ATP Ciclo do ácido cítrico a Nelson6edbookindb 654 Nelson6edbookindb 654 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 655 NADH e acetilCoA A enzima mitocondrial vegetal também é regulada pela fosforilação reversível o piruvato inibe a cinase ativando o complexo da PDH e NH4 1 estimula a ci nase causando a inativação do complexo O complexo da PDH de E coli está sob regulação alostérica similar àquela da enzima de mamíferos mas não parece ser regulado por fosforilação O ciclo do ácido cítrico é regulado nas três etapas exergônicas O fluxo de metabólitos durante o curso do ciclo do ácido cítrico é mantido sob regulação rigorosa Três fatores con trolam a velocidade do fluxo no ciclo disponibilidade de substrato inibição pelos produtos acumulados e inibição alostérica por retroalimentação das enzimas que catalisam as etapas iniciais do ciclo Cada uma das três etapas fortemente exergônicas do ciclo aquelas catalisadas por citratosintase isocitrato desidrogenase e acetoglutaratodesidrogenase Figura 1619 podem tornarse a etapa limitante da velocidade sob algumas circunstâncias A disponibilidade dos subs tratos da citratosintase acetilCoA e oxaloacetato va ria com o estado metabólico da célula e às vezes limi ta a taxa de formação de citrato O NADH produto da oxidação do citrato e do acetoglutarato acumulase sob determinadas condições e em alta NADHNAD 1 am bas as reações de desidrogenação são fortemente inibi das pela ação das massas Na célula de maneira similar a reação da malatodesidrogenase está essencialmente em equilíbrio ou seja é limitada pelo substrato e quando a NADHNAD 1 está alta a concentração de oxaloaceta to está baixa desacelerando a primeira etapa do ciclo O acúmulo de produto inibe as três etapas limitantes do ci clo a succinilCoA inibe a acetoglutaratodesidrogenase e também a citratosintase o citrato bloqueia a citrato sintase e o produto final ATP inibe a citratosintase e a isocitratodesidrogenase A inibição da citratosintase pelo ATP é abrandada por ADP um ativador alostérico dessa enzima Nos músculos dos vertebrados Ca 21 o si nalizador para a contração e o aumento concomitante na demanda de ATP ativa a isocitratodesidrogenase e a a cetoglutaratodesidrogenase assim como ativa o comple xo da PDH Dessa forma as concentrações dos substratos e dos intermediários do ciclo do ácido cítrico ajustam o fluxo dessa via para a velocidade que forneça as concen trações ótimas de ATP e NADH Sob condições normais as velocidades da glicólise e do ciclo do ácido cítrico estão integradas de modo que a quan tidade de glicose metabolizada a piruvato seja exatamente a quantidade suficiente para suprir o ciclo do ácido cítri co com o seu combustível os grupos acetil da acetilCoA Piruvato lactato e acetilCoA normalmente são mantidos nas concentrações do estado estacionário A velocidade da glicólise é vinculada à velocidade do ciclo do ácido cítrico não apenas por meio da inibição pelos altos níveis de ATP e NADH os quais são comuns a ambos os estágios da oxida ção da glicose a via glicolítica e a respiração mas também é regulada pela concentração de citrato Citrato o produto da primeira etapa do ciclo do ácido cítrico é um importan te inibidor alostérico da fosfofrutocinase1 na via glicolítica ver Figura 1516 A canalização do substrato em complexos multienzimáticos pode ocorrer durante o ciclo do ácido cítrico Embora as enzimas do ciclo do ácido cítrico normalmen te sejam descritas como componentes solúveis da matriz mitocondrial exceto pela succinatodesidrogenase que é ligada à membrana evidências crescentes sugerem que dentro da mitocôndria essas enzimas existem como com plexos multienzimáticos A abordagem clássica da enzimo logia a purificação de proteínas isoladas a partir de ex tratos de células lisadas foi utilizada com grande sucesso para as enzimas do ciclo do ácido cítrico Entretanto a primeira vítima da lise celular é o alto nível de organiza ção da célula as interações não covalentes e reversíveis de uma proteína com a outra ou entre enzimas e algum componente estrutural como membranas microtúbulos ou microfilamentos Quando as células são rompidas seus conteúdos incluindo enzimas são diluídos 100 ou 1000 vezes Figura 1620 Vários tipos de evidências sugerem que nas células os complexos multienzimáticos asseguram a passagem No citosol altas concentrações das enzimas 1 2 e 3 favorecem sua associação Em um extrato de células lisadas a diluição com solução tampão reduz as concentrações das enzimas 1 2 e 3 favorecendo sua dissociação FIGURA 1620 A diluição de uma solução contendo um complexo proteico não ligado covalentemente como um constituído por três enzimas ilustra das aqui em vermelho azul e verde favorece a dissociação do complexo em seus constituintes Nelson6edbookindb 655 Nelson6edbookindb 655 030414 0744 030414 0744 656 DAVID L NELSON MICHAEL M COX eficiente do produto de uma reação enzimática para a próxima enzima da via Tais complexos são chamados de metabolons Certas enzimas do ciclo do ácido cítri co têm sido isoladas em conjunto como complexos su pramoleculares ou têm sido encontradas em associação com a membrana mitocondrial interna ou se difundem na matriz mitocondrial mais lentamente do que o espe rado para proteínas isoladas em solução Existem fortes evidências da canalização de substratos por complexos multienzimáticos em outras vias metabólicas e muitas enzimas consideradas solúveis provavelmente atuam na célula em complexos altamente organizados que ca nalizam intermediários Outros exemplos de canalização serão fornecidos na discussão da biossíntese de aminoá cidos e nucleotídeos no Capítulo 22 Algumas mutações em enzimas do ciclo do ácido cítrico levam ao desenvolvimento de câncer Quando os mecanismos da regulação de uma via como o ciclo do ácido cítrico são afetados por uma perturbação metabólica importante o resultado pode ser uma doença grave São raríssimas as mutações nas enzi mas do ciclo do ácido cítrico em humanos e outros mamí feros mas quando ocorrem são devastadoras Defeitos genéticos no gene da fumarase levam a tumores no mús culo liso leiomas e nos rins mutações na succinatodesi drogenase levam a tumores da glândula suprarrenal feo cromocitomas Nas células em cultura com essas mutações o fumarato no caso das mutações na fumara se e em menor extensão o succinato no caso das muta ções na succinatodesidrogenase acumulamse e esse acúmulo induz a expressão do fator de transcrição induzí vel por hipoxia HIF1a HIF de hipoxiainducible trans cription factor ver Quadro 141 O mecanismo que leva à formação do tumor pode ser a geração de um estado de pseudohipoxia Nas células com essas mutações ocor re maior expressão dos genes normalmente regulados por HIF1a Esses efeitos das mutações nos genes da fumarase e da succinatodesidrogenase os definem como genes su pressores de tumor p 489 Outra conexão marcante entre os intermediários do ciclo do ácido cítrico e câncer é a descoberta que em muitos tumores das células da glia gliomas a isocitra todesidrogenase dependente de NADPH apresenta um defeito genético incomum A enzima mutante perde sua atividade normal converte isocitrato a acetoglutarato mas ganha uma nova atividade ela converte acetoglu tarato a 2hidroxiglutarato Figura 1621 que acumula nas células tumorais aCetoglutarato e Fe 31 são cofatores essenciais para uma família de histonasdesmetilases que alteram a expressão gênica por meio da remoção de gru pos metil de resíduos de Arg e Lys nas histonas que orga nizam o DNA nuclear Por competir com o acetoglutarato pela ligação às histonasdesmetilases o 2hidroxiglutarato inibe a atividade dessas enzimas A inibição das histonas desmetilases por sua vez interfere com a regulação gê nica normal levando ao crescimento descontrolado das células da glia RESUMO 163 Regulação do ciclo do ácido cítrico c A velocidade global do ciclo do ácido cítrico é controlada pela taxa de conversão do piruvato a acetilCoA e pelo fluxo pelas enzimas citratosintase isocitratodesidro genase e acetoglutaratodesidrogenase Esses fluxos são determinados pelas concentrações dos substratos e dos produtos os produtos finais ATP e NADH são inibi dores e os substratos NAD 1 e ADP são estimuladores c A produção de acetilCoA para o ciclo do ácido cítrico pelo complexo da PDH é inibida alostericamente pelos metabólitos que sinalizam a suficiência de energia meta bólica ATP acetilCoA NADH e ácidos graxos sendo estimulada pelos metabólitos que indicam um supri mento de energia reduzido AMP NAD 1 CoA c Os complexos formados por enzimas em sequência em uma via possibilitam a canalização do substrato entre essas enzimas 164 Ciclo do glioxilato Os vertebrados não conseguem converter ácidos graxos ou o acetato derivado deles a carboidratos As conversões de fosfoenolpiruvato a piruvato p 554 e de piruvato a acetil CoA Figura 162 de tão exergônicas são essencialmente irreversíveis Se uma célula não consegue converter acetato a fosfoenolpiruvato o acetato não pode ser o material de partida para a via gliconeogênica que leva de fosfoenolpi ruvato a glicose ver Figura 1513 Sem essa capacidade NADP1 NADP1 NADPH 1 H1 NADPH 1 H1 CO2 Isocitrato CH2 COO2 C C COO2 COO2 H H HO aCetoglutarato CH2 COO2 CH2 C COO2 O 2Hidroxiglutarato CH2 COO2 CH2 C COO2 H HO Isocitratodesidrogenase Tipo selvagem Mutante FIGURA 1621 Uma isocitratodesidrogenase mutante adquire uma nova função A isocitratodesidrogenase do tipo selvagem catalisa a con versão de isocitrato a acetoglutarato porém mutações que alteram o sítio de ligação do isocitrato levam a perda da função da atividade enzimática normal e ao ganho de uma nova atividade conversão de acetoglutarato a 2hidroxiglutarato O acúmulo deste produto inibe a histonadesmetilase alterando a regulação gênica e levando a tumores das células gliares no cérebro Nelson6edbookindb 656 Nelson6edbookindb 656 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 657 portanto uma célula ou organismo é incapaz de converter combustíveis ou metabólitos que são degradados a acetato ácidos graxos e certos aminoácidos em carboidratos Como mencionado na discussão sobre reações anaple róticas Tabela 162 o fosfoenolpiruvato pode ser sinte tizado a partir de oxaloacetato em uma reação reversível catalisada pela PEPcarboxicinase Oxaloacetato 1 GTP fosfoenolpiruvato 1 CO2 1 GDP Como os átomos de carbono das moléculas de acetato que entram no ciclo do ácido cítrico aparecem oito etapas de pois no oxaloacetato pode parecer que esta via pode pro duzir oxaloacetato a partir de acetato e assim originar fosfoenolpiruvato para a gliconeogênese Contudo como mostrado por um exame da estequiometria do ciclo do áci do cítrico não há conversão líquida de acetato a oxaloace tato nos vertebrados para cada dois carbonos que entram no ciclo na forma de acetilCoA dois são liberados na forma de CO2 Em muitos organismos que não os vertebrados o ciclo do glioxilato funciona como mecanismo para a conver são de acetato a carboidratos O ciclo do glioxilato produz compostos de quatro carbonos a partir de acetato Em plantas certos invertebrados e alguns microrganismos incluindo E coli e levedura o acetato pode ser tanto um combustível rico em energia como uma fonte de fosfoenol piruvato para a síntese de carboidratos Nesses organismos as enzimas do ciclo do glioxilato catalisam a conversão líquida de acetato a succinato ou outros intermediários de quatro carbonos do ciclo do ácido cítrico 2 AcetilCoA 1 NAD 1 1 2H2O succinato 1 2CoA 1 NADH 1 H 1 No ciclo do glioxilato a acetilCoA é condensada com o oxaloacetato para formar citrato e o citrato é convertido a isocitrato exatamente como no ciclo do ácido cítrico A próxima etapa porém não é a quebra do isocitrato pela isocitratodesidrogenase mas a clivagem do isocitrato pela isocitratoliase formando succinato e glioxilato O glioxilato então é condensado com uma segunda mo lécula de acetilCoA para a geração de malato em uma reação catalisada pela malatosintase O malato é pos teriormente oxidado a oxaloacetato o qual pode ser con densado com outra molécula de acetilCoA para iniciar outra volta do ciclo Figura 1622 Cada volta do ciclo do glioxilato consome duas moléculas de acetilCoA e pro duz uma molécula de succinato que está então dispo nível aos propósitos biossintéticos O succinato pode ser convertido via fumarato e malato a oxaloacetato o qual pode então ser convertido a fosfoenolpiruvato pela PEP carboxicinase e assim a glicose pela gliconeogênese Os vertebrados não têm as enzimas específicas do ciclo do glioxilato isocitratoliase e malatosintase e portanto não conseguem realizar a síntese líquida de glicose a par tir de lipídeos Em plantas as enzimas do ciclo do glioxilato estão se questradas em organelas delimitadas por membrana cha madas de glioxissomos os quais são peroxissomos espe cializados Figura 1623 As enzimas comuns ao ciclo do ácido cítrico e do glioxilato têm duas isoenzimas uma espe cífica das mitocôndrias outra específica dos glioxissomos Os glioxissomos nem sempre estão presentes em todos os tecidos vegetais Eles se desenvolvem nas sementes ricas em lipídeos durante a germinação antes de a planta adqui rir a capacidade de produzir glicose pela fotossíntese Além das enzimas do ciclo do glioxilato os glioxissomos contêm todas as enzimas necessárias para a degradação dos ácidos graxos estocados nos óleos das sementes ver Figura 17 14 A acetilCoA formada pela degradação dos lipídeos é convertida a succinato via ciclo do glioxilato e o succinato é exportado para a mitocôndria onde as enzimas do ciclo do ácido cítrico o transformam em malato Uma isoenzima citosólica da malatodesidrogenase oxida malato a oxaloa cetato um precursor para a gliconeogênese As sementes em germinação podem assim converter em glicose os car bonos dos lipídeos estocados C CH2 NADH NAD1 O COO2 COO2 C CH2 HO COO2 CH2 COO2 COO2 Citrato CH CH2 COO2 COO2 CH2 COO2 CH2 COO2 CH COO2 HO C C O O H O2 CH2 COO2 COO2 CH HO Isocitrato Succinato Oxaloacetato CH3 O C SCoA AcetilCoA AcetilCoA CH3 O C SCoA Malato Glioxilato Citratosintase Isocitratoliase Malatosintase Malatodesidrogenase Aconitase Ciclo do glioxilato FIGURA 1622 Ciclo do glioxilato A citratosintase a aconitase e a malatodesidrogenase do ciclo do glioxilato são isoenzimas das enzimas do ciclo do ácido cítrico isocitratoliase e malatosintase são exclusivas do ciclo do glioxilato Observe que dois grupos acetil em cor salmão entram no ciclo e quatro carbonos saem na forma de succinato em azul O ciclo do glioxilato foi elucidado por Hans Kornberg e Neil Madsen no laboratório de Hans Krebs Nelson6edbookindb 657 Nelson6edbookindb 657 030414 0744 030414 0744 658 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os ciclos do ácido cítrico e do glioxilato são regulados coordenadamente Nas sementes em germinação as transformações enzimá ticas dos ácidos dicarboxílico e tricarboxílico ocorrem em três compartimentos intracelulares mitocôndrias glioxis somos e citosol Existe um constante intercâmbio de meta bólitos entre esses compartimentos Figura 1624 O esqueleto de carbono do oxaloacetato originado pelo ciclo do ácido cítrico na mitocôndria é transportado ao glioxissomo na forma de aspartato O aspartato é convertido a oxaloacetato que se condensa com a acetilCoA derivada da degradação dos ácidos graxos O citrato assim formado é convertido a isocitrato pela aconitase sendo então dividido em glioxilato e succinato pela isocitratoliase O succinato retorna à mitocôndria entra novamente no ciclo do ácido cítrico e é transformado em malato que vai para o citosol e é oxidado pela malatodesidrogenase citosólica a oxalo acetato O oxaloacetato é convertido via gliconeogênese a hexoses e sacarose as quais podem ser transportadas às raízes e aos brotos em crescimento Quatro vias distintas participam destas conversões degradação dos ácidos gra xos a acetilCoA nos glioxissomos ciclo do glioxilato nos glioxissomos ciclo do ácido cítrico nas mitocôndrias e gliconeogênese no citosol O compartilhamento de intermediários comuns requer que essas vias sejam reguladas de forma coordenada O isocitrato é um intermediário crucial no ponto de ramifica ção entre os ciclos do glioxilato e do ácido cítrico Figura 1625 A isocitratodesidrogenase é regulada por modifi cação covalente uma proteínacinase específica fosforila e assim inativa a desidrogenase Essa inativação desvia isoci trato para o ciclo do glioxilato onde ele inicia a via sintéti ca para a produção de glicose Uma fosfoproteínafosfatase remove o grupo fosfato da isocitratodesidrogenase reati vando a enzima e lançando mais isocitrato para geração de energia pelo ciclo do ácido cítrico As atividades cinásica e fosfatásica de regulação são atividades enzimáticas separa das de um único polipeptídeo Algumas bactérias incluindo E coli têm o conjunto completo de enzimas para o ciclos do glioxilato e do áci do cítrico no citosol podendo portanto crescer utilizan do acetato como única fonte de carbono e energia A fos foproteínafosfatase que ativa a isocitratodesidrogenase é estimulada por intermediários do ciclo do ácido cítrico e da glicólise sendo inibida pelos indicadores de suprimento Corpo lipídico Glioxissomo Mitocôndrias FIGURA 1623 Micrografia eletrônica de uma semente de pepino em germinação mostrando glioxissomo mitocôndrias e corpos lipídicos cir cundantes Mitocôndria Hexoses AcetilCoA Ácidos graxos Triacilgliceróis Corpo lipídico Gliconeogênese Glioxissomo Ácidos graxos Malato Oxaloacetato Sacarose Succinato Citosol Citrato Fumarato Malato Ciclo do ácido cítrico Oxaloacetato Succinato AcetilCoA Isocitrato Oxaloacetato Malato Ciclo do glioxilato Glioxilato Citrato FIGURA 1624 Relações entre os ciclos do glioxilato e do ácido cítrico As reações do ciclo do glioxilato nos glioxissomos acontecem simultanea mente entrelaçandose com as reações do ciclo do ácido cítrico nas mito côndrias conforme os intermediários passam por estes compartimentos A conversão de succinato a oxaloacetato é catalisada pelas enzimas do ciclo do ácido cítrico A oxidação de ácidos graxos a acetilCoA está descrita no Capítulo 17 a síntese de hexoses a partir de oxaloacetato está descrita no Capítulo 20 Nelson6edbookindb 658 Nelson6edbookindb 658 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 659 reduzido de energia Figura 1625 Os mesmos metabóli tos inibem a atividade cinásica do polipeptídeo bifuncional Desse modo o acúmulo de intermediários das principais vias de produção de energia indicando o esgotamento de energia resulta na ativação da isocitratodesidrogenase Quando a concentração desses reguladores diminui sinali zando um fluxo suficiente para a produção de energia pelo ciclo do ácido cítrico a isocitratodesidrogenase é inativada pela proteínacinase Os mesmos intermediários da glicólise e do ciclo do ácido cítrico que ativam a isocitratodesidrogenase são inibidores alóstericos da isocitratoliase Quando o meta bolismo gerador de energia está suficientemente rápido e mantém baixas as concentrações dos intermediários glico líticos e do ciclo do ácido cítrico a isocitratodesidrogena se é inativada a inibição da isocitratoliase é abrandada e o isocitrato flui para a via do glioxilato para ser utilizado na biossíntese de carboidratos aminoácidos e outros compo nentes celulares RESUMO 164 Ciclo do glioxilato c O ciclo do glioxilato está ativo nas sementes em germi nação de algumas plantas e em certos microrganismos que conseguem viver utilizando acetato como a única fonte de carbono Nas plantas essa via ocorre nos glio xissomos dos brotos Ela inclui algumas enzimas do ci clo do ácido cítrico e duas enzimas adicionais isocitra toliase e malatosintase c No ciclo do glioxilato o desvio das duas etapas de des carboxilação do ciclo do ácido cítrico torna possível a formação líquida de succinato oxaloacetato e outros intermediários do ciclo do ácido cítrico a partir de ace tilCoA O oxaloacetato formado deste modo pode ser utilizado para a síntese de glicose via gliconeogênese c Os vertebrados carecem das enzimas do ciclo do glioxi lato e não conseguem sintetizar glicose a partir do ace tato ou dos ácidos graxos que dão origem à acetilCoA c A participação alternada do isocitrato do ciclo do ácido cítrico e do ciclo do glioxilato é controlada no nível da isocitratodesidrogenase a qual é regulada por fosfori lação reversível Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário respiração 633 respiração celular 633 ciclo do ácido cítrico 633 ciclo do ácido tricarboxílico TCA 633 ciclo de Krebs 633 complexo da piruvato desidrogenase PDH 634 descarboxilação oxidati va 634 tioéster 635 lipoato 635 canalização do substrato 637 centro de ferroenxofre 641 moonlighting 642 complexo da acetoglutarato desidrogenase 644 nucleosídeodifosfato cinase 645 sintases 646 sintetases 646 ligases 646 liases 646 cinases 646 fosforilases 646 fosfatases 646 molécula próquiral 648 via anfibólica 650 reação anaplerótica 650 biotina 651 avidina 653 metabolon 656 ciclo do glioxilato 657 Leituras adicionais Geral Holmes FL 1990 1993 Hans Krebs Vol 1 Formation of a Scientific Life 19001933 Vol 2 Architect of Intermediary Metabolism 19331937 Oxford University Press Oxford Biografia da trajetória científica e pessoal de Krebs escrita por um célebre historiador da ciência com a descrição completa do trabalho que revelou os ciclos da ureia e do ácido cítrico Kay J Weitzman PDJ eds 1987 Krebs Citric Acid Cycle Half a Century and Still Turning Biochemical Society Symposium 54 The Biochemical Society London Proteína cinase Isocitrato desidrogenase Isocitratoliase Fosfatase ATP AcetilCoA Isocitrato NADH FADH2 Fosforilação oxidativa Aminoácidos nucleotídeos Oxaloacetato Gliconeogênese Glicose Intermediários do ciclo do ácido cítrico e da glicólise AMP ADP Intermediários do ciclo do ácido cítrico e da glicólise AMP ADP aCetoglutarato Succinato glioxilato Ciclo do ácido cítrico Ciclo do glioxilato FIGURA 1625 Regulação coordenada dos ciclos do glioxilato e do ácido cítrico A regulação da atividade da isocitratodesidrogenase de termina o participação alternada do isocitrato entre os ciclos do glioxilato e do ácido cítrico Quando a enzima está inativada por fosforilação por uma proteínacinase específica o isocitrato é direcionado para reações biossin téticas via ciclo do glioxilato Quando a enzima é ativada por desfosforilação por uma fosfatase específica o isocitrato entra no ciclo do ácido cítrico e ATP é produzido Nelson6edbookindb 659 Nelson6edbookindb 659 030414 0744 030414 0744 660 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Livro com múltiplos autores sobre o ciclo do ácido cítrico incluindo genética molecular mecanismos de regulação variações do ciclo em microrganismos de nichos ecológicos incomuns e evolução da via Especialmente relevantes são os capítulos de H Gest As raízes evolutivas do ciclo do ácido cítrico em procariotos WH Holms Controle do fluxo por meio do ciclo do ácido cítrico e o desvio do glioxilato em Escherichia coli e RN Perham et al Complexos da acetoácidodesidrogenases Complexo da piruvatodesidrogenase Harris RA BowkerKinley MM Huang B Wu P 2002 Regulation of the activity of the pyruvate dehydrogenase complex Adv Enzyme Regul 42 249259 Milne JLS Shi D Rosenthal PB Sunshine JS Domingo GJ Wu X Brooks BR Perham RN Henderson R Subramaniam S 2002 Molecular architecture and mechanism of an icosahedral pyruvate dehydrogenase complex a multifunctional catalytic machine EMBO J 21 55875598 Bela ilustração do poder da metodologia para a reconstrução de imagens aliada à microscopia crioeletrônica aqui utilizada para desenvolver um modelo plausível da estrutura do complexo da PDH Compare este modelo com aquele no artigo de Zhou et al a seguir Perham RN 2000 Swinging arms and swinging domains in multifunctional enzymes catalytic machines for multistep reactions Annu Rev Biochem 69 9611004 Revisão sobre o papel dos braços flexíveis contendo lipoato biotina e pantotenato na canalização do substrato em complexos multienzimáticos Zhou ZH McCarthy DB OConner CM Reed LJ Stoops JK 2001 The remarkable structural and functional organization of the eukaryotic pyruvate dehydrogenase complexes Proc Natl Acad Sci USA 98 1480214807 Outro artigo impressionante no qual a reconstrução de imagens e a microscopia crioeletrônica originam um modelo para o complexo da PDH Compare este modelo com aquele no artigo de Milne et al anteriormente Enzimas do ciclo do ácido cítrico de la Fuente JM RamírezRodríguez V CabreraPonce JL HerreraEstrella L 1997 Aluminum tolerance in transgenic plants by alteration of citrate synthesis Science 276 15661568 Fraser MD James MN Bridger WA Wolodko WT 1999 A detailed structural description of Escherichia coli succinyl CoA synthetase J Mol Biol 285 16331653 Veja também a errata em J Mol Biol 288 501 1998 Goward CR Nicholls DJ 1994 Malate dehydrogenase a model for structure evolution and catalysis Protein Sci 3 1883 1888 Uma curta e boa revisão Hagerhall C 1997 Succinate quinone oxidoreductases variations on a conserved theme Biochim Biophys Acta 1320 107141 Uma revisão sobre a estrutura e a função das succinato desidrogenases Hanson RW 2009 Thematic minireview series a perspective on the biology of phosphoenolpyruvate carboxykinase 55 years after its discovery J Biol Chem 284 2702127023 Introdução editorial a uma série de revisões curtas sobre a PEP carboxicinase neste exemplar da revista Jitrapakdee S St Maurice M Rayment I Cleland WW Wallace JC Attwood PV 2008 Structure mechanism and regulation of pyruvate carboxylase Biochem J 413 369387 Ma JF Ryan PR Delhaize E 2001 Aluminium tolerance in plants and the complexing role of organic acids Trends Plant Sci 6 273278 Matte A Tari LW Goldie H Delbaere LTJ 1997 Structure and mechanism of phosphoenolpyruvate carboxykinase J Biol Chem 272 81058108 Ovadi J Srere P 2000 Macromolecular compartmentation and channeling Int Rev Cytol 192 255280 Aprofundada revisão sobre as evidências em canalização e metabolons Prensner JR Chinnaiyan AM 2011 Metabolism unhinged IDH mutations in cancer Nat Med 17 291293 Sucinta revisão sobre as mutações da isocitratodesidrogenase associadas com câncer Remington SJ 1992 Structure and mechanism of citrate synthase Curr Top Cell Regul 33 209229 Completa revisão sobre a enzima citratosintase Singer TP Johnson MK 1985 The prosthetic groups of succinate dehydrogenase 30 years from discovery to identification FEBS Lett 190 189198 Descrição da estrutura e da função dos centros de ferroenxofre na succinatodesidrogenase Weigand G Remington SJ 1986 Citrate synthase structure control and mechanism Annu Rev Biophys Biophys Chem 15 97117 Wolodko WT Fraser ME James MNG Bridger WA 1994 The crystal structure of succinylCoA synthetase from Escherichia coli at 25Å resolution J Biol Chem 269 10883 10890 Yang J Kalhan SC Hanson RW 2009 What is the metabolic role of phosphenolpyruvate carboxykinase J Biol Chem 284 2702527029 Breve revisão sobre as diversas funções desta enzima Enzimas com mais de uma função Eisenstein RS 2000 Iron regulatory proteins and the molecular control of mammalian iron metabolism Annu Rev Nutr 20 627662 Flores CL Gancedo C 2011 Unraveling moonlighting functions with yeasts IUBMB Life 63 457462 Jeffery CJ 1999 Moonlighting proteins Trends Biochem Sci 24 811 Kim JW Dang CV 2006 Multifaceted roles of glycolytic enzymes Trends Biochem Sci 30 142150 Revisão em nível intermediário sobre as enzimas com mais de uma função Rouault TA 2006 The role of iron regulatory proteins in mammalian iron homeostasis and disease Nat Chem Biol 2 406414 Revisão avançada Regulação do ciclo do ácido cítrico Briere JJ Favier J GimenezRoqueplo AP Rustin P 2006 Tricarboxylic acid cycle dysfunction as a cause of human diseases and tumor formation Am J Physiol Cell Physiol 291 11141120 Revisão em nível intermediário sobre os efeitos clínicos das mutações na succinatodesidrogenase na fumarase e na acetoglutaratodesidrogenase Hansford RG 1980 Control of mitochondrial substrate oxidation Curr Top Bioenerget 10 217278 Detalhada revisão sobre a regulação do ciclo do ácido cítrico Kaplan NO 1985 The role of pyridine nucleotides in regulating cellular metabolism Curr Top Cell Regul 26 371381 Excelente discussão geral sobre a importância da razão NADH NAD 1 na regulação celular Nelson6edbookindb 660 Nelson6edbookindb 660 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 661 King A Selak MA Gottlieb E 2006 Succinate dehydrogenase and fumarate hydratase linking mitochondrial dysfunction and cancer Oncogene 25 46754682 Reed LJ Damuni Z Merryfield ML 1985 Regulation of mammalian pyruvate and branchedchain aketo acid dehydrogenase complexes by phosphorylationdephosphorylation Curr Top Cell Regul 27 4149 Ciclo do glioxilato Eastmond PJ Graham IA 2001 Reexamining the role of the glyoxylate cycle in oilseeds Trends Plant Sci 6 7277 Revisão em nível intermediário sobre os estudos do ciclo do glioxilato em Arabidopsis Holms WH 1986 The central metabolic pathways of Escherichia coli relationship between flux and control at a branch point efficiency of conversion to biomass and excretion of acetate Curr Top Cell Regul 28 69106 Problemas 1 O balancete do ciclo do ácido cítrico O ciclo do ácido cítrico tem oito enzimas citratosintase aconitase isocitrato desidrogenase acetoglutaratodesidrogenase succinilCoA sintetase succinatodesidrogenase fumarase e malatodesi drogenase a Escreva uma equação equilibrada para a reação catali sada por cada enzima b Identifique os cofatores necessários para cada reação enzimática c Para cada enzima determine qual dos seguintes descre ve o tipo de reaçãoões catalisadas condensação formação de ligação carbonocarbono desidratação perda de água hi dratação adição de água descarboxilação perda de CO2 oxi daçãoredução fosforilação em nível de substrato isomerização d Escreva uma reação líquida equilibrada para o catabo lismo de acetilCoA a CO2 2 Equação líquida da glicólise e do ciclo do ácido cí trico Escreva a equação bioquímica líquida do metabolismo de uma molécula de glicose pela glicólise e pelo ciclo do ácido cítrico incluindo todos os cofatores 3 A identificação das reações de oxidação e redução Uma estratégia bioquímica de muitos organismos vivos é a oxi dação gradual de compostos orgânicos a CO2 e H2O e a conser vação da maior parte da energia assim produzida na forma de ATP É importante ser capaz de reconhecer os processos de oxidação e redução do metabolismo A redução de uma mo lécula orgânica é o resultado da hidrogenação de uma ligação dupla Equação 1 abaixo ou de uma ligação simples com cli vagem concomitante Equação 2 Por outro lado a oxidação é o resultado da desidrogenação Nas reações bioquímicas redox as coenzimas NAD e FAD desidrogenamhidrogenam molécu las orgânicas na presença das enzimas apropriadas O Etanol Redução C CH3 C O CH3 H H H 1 H H H O H C CH3 H Oxidação Redução Oxidação Acetaldeído H 1 O Acetaldeído Redução C CH3 C O O2 CH3 H H1 1 H H H1 O H C 1 CH3 H Oxidação Redução Oxidação Acetato 2 1 O2 H O H Para cada uma das transformações metabólicas de a a h de termine se ocorreu uma oxidação ou uma redução Equilibre cada transformação pela inserção de HH e onde necessário H2O Acetato Succinato Piruvato Tolueno Fumarato Benzoato h Metanol Glicerol Dihidroxiacetona Gliceraldeído Glicerato Dióxido de carbono Formaldeído Formato Formaldeído Formato a b c d e f g Nelson6edbookindb 661 Nelson6edbookindb 661 030414 0744 030414 0744 662 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 4 Relação entre a liberação de energia e o estado de oxidação do carbono Uma célula eucariótica pode utilizar glicose C6H12O6 e ácido hexanoico C6H14O2 como combustí veis para a respiração celular Com base nas fórmulas estrutu rais qual substância libera mais energia por grama na combus tão completa a CO2 e H2O 5 Coenzimas de nicotinamida como transportadores redox reversíveis As coenzimas de nicotinamida ver Fi gura 1324 podem com os substratos adequados e na pre sença da desidrogenase apropriada sofrer reações reversíveis de oxidaçãoredução Nessas reações NADH 1 H 1 atua como fonte de hidrogênio como descrito no Problema 3 Sempre que a coenzima for oxidada o substrato deve ser simultaneamente reduzido Substrato 1 NADH 1 H 1 produto 1 NAD 1 Oxidado Reduzido Reduzido Oxidado Para cada uma das reações de a a f determine se o subs trato foi oxidado reduzido ou se o estado de oxidação não foi alterado ver Problema 3 Caso uma variação redox tenha ocorrido equilibre a reação com a quantidade necessária de NAD 1 NADH H 1 e H2O O objetivo é reconhecer quando uma coenzima redox é necessária em uma reação metabólica Etanol Acetaldeído Gliceraldeído3fosfato a b c d e f Malato 13Bifosfoglicerato Oxaloacetato Acetaldeído Piruvato Acetona Acetoacetato Acetato Piruvato 6 Cofatores e mecanismo da piruvatodesidrogenase Descreva a função de cada cofator envolvido na reação catali sada pelo complexo da piruvatodesidrogenase 7 Deficiência de tiamina Indivíduos com dieta deficitária em tiamina têm níveis relativamente altos de piruvato na corren te sanguínea Explique esse fenômeno em termos bioquímicos 8 A reação da isocitratodesidrogenase Qual o tipo de reação química envolvido na conversão de isocitrato a aceto glutarato Identifique e descreva a função de todos os cofato res Que outras reaçãoões do ciclo do ácido cítrico ésão desse mesmo tipo 9 Estímulo do consumo de oxigênio por oxaloacetato e malato No início dos anos de 1930 Albert SzentGyörgyi publicou a interessante observação de que a adição de pe quenas quantidades de oxaloacetato ou malato a suspensões de um macerado do músculo peitoral de pombo estimulava o consumo de oxigênio da preparação Surpreendentemente a quantidade de oxigênio consumida era cerca de sete vezes maior do que a quantidade necessária para a oxidação com pleta a CO2 e H2O do oxaloacetato ou malato adicionado Por que a adição de oxaloacetato ou malato estimula o consumo de oxigênio Por que a quantidade de oxigênio consumida era tão maior do que a quantidade necessária para oxidar completa mente o oxaloacetato ou malato adicionado 10 Formação de oxaloacetato na mitocôndria Na últi ma reação do ciclo do ácido cítrico o malato é desidrogenado para regenerar o oxaloacetato necessário para a entrada de acetilCoA no ciclo LMalato 1 NAD 1 oxaloacetato 1 NADH 1 H 1 DG9 5 300 kJmol a Calcule a constante de equilíbrio a 25C para esta reação b Como o DG9º assume um pH padrão igual a 7 a cons tante de equilíbrio calculada em a corresponde a A medida da concentração de Lmalato nas mitocôndrias de fígado de rato é aproximadamente 020 mM quando NAD 1 NADH é igual a 10 Calcule a concentração de oxaloacetato nessas mitocôndrias em pH 7 c Para estimar a magnitude da concentração mitocon drial de oxaloacetato calcule o número de moléculas de oxalo acetato em uma única mitocôndria do fígado de rato Assuma que a mitocôndria é uma esfera com 20 mm de diâmetro 11 Cofatores do ciclo do ácido cítrico Suponha que você tenha preparado um extrato mitocondrial que contém todas as enzimas solúveis da matriz mas que perdeu por diá lise todos os cofatores de baixa massa molecular O que você deve adicionar ao extrato para que a preparação oxide acetil CoA a CO2 12 Deficiência de riboflavina Como uma deficiência de riboflavina afetaria o funcionamento do ciclo do ácido cítrico Explique sua resposta 13 Conteúdo de oxaloacetato Que fatores poderiam di minuir a quantidade de oxaloacetato disponível para a atividade do ciclo do ácido cítrico Como o oxaloacetato pode ser reposto 14 Rendimento energético do ciclo do ácido cítrico A reação catalisada pela succinilCoAsintetase produz o com posto de alta energia GTP Como a energia livre contida no GTP é incorporada ao conteúdo celular de ATP Nelson6edbookindb 662 Nelson6edbookindb 662 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 663 15 Estudos sobre respiração em mitocôndrias isoladas A respiração celular pode ser estudada em mitocôndrias isola das pela medida do consumo de oxigênio sob diferentes condi ções Se 001 M de malonato de sódio é adicionado a mitocôn drias respirando ativamente e utilizando piruvato como fonte de combustível a respiração rapidamente para e um interme diário metabólico se acumula a Qual é a estrutura desse intermediário b Explique por que ele se acumula c Explique por que o consumo de oxigênio para d Além da remoção do malonato como essa inibição da respiração pode ser superada Explique 16 Estudos com marcação em mitocôndrias isoladas As vias metabólicas dos compostos orgânicos têm sido fre quentemente delineadas pelo uso de um substrato marcado radioativamente com o posterior acompanhamento do destino desse marcador a Como você poderia determinar se a glicose adiciona da a uma suspensão de mitocôndrias isoladas é metabolizada a CO2 e H2O b Suponha que você adicione um breve pulso de 3 14C piruvato marcado na posição do metil às mitocôndrias Após uma rodada do ciclo do ácido cítrico qual é a posição do 14C no oxaloacetato Explique seguindo o marcador 14C ao longo da via Quantas rodadas do ciclo são necessárias para que todo o 3 14Cpiruvato seja liberado na forma de CO2 17 A via do CO2 na gliconeogênese Na primeira etapa da gliconeogênese a conversão de piruvato a fosfoenolpiruva to PEP o piruvato é carboxilado pela piruvatocarboxilase a oxaloacetato depois descarboxilado a PEP pela PEPcarbo xicinase Capítulo 14 Como a adição de CO2 é seguida pela perda de CO2 você poderia esperar que em experimentos com marcadores o 14C do 14CO2 não fosse incorporado ao PEP gli cose ou qualquer outro intermediário da gliconeogênese En tretanto pesquisadores observaram que quando uma prepara ção de fígado de rato sintetiza glicose na presença de 14CO2 o 14C lentamente aparece no PEP e no devido tempo aparece no C3 e no C4 da glicose Como o marcador 14C é incorporado ao PEP e à glicose Dica Durante a gliconeogênese na presença de 14CO2 vários intermediários do ciclo do ácido cítrico com quatro carbonos também se tornam marcados 18 Catabolismo da 1 14Cglicose Uma cultura bacteria na respirando ativamente é incubada brevemente com 1 14C glicose e os intermediários do ciclo do ácido cítrico e da via glicolítica são isolados Em que posição está o 14C em cada um dos intermediários listados abaixo Considere apenas a incor poração inicial de 14C na primeira passagem da glicose marca da pelas vias a Frutose16bifosfato b Gliceraldeído3fosfato c Fosfoenolpiruvato d AcetilCoA e Citrato f aCetoglutarato g Oxaloacetato 19 O papel da vitamina tiamina Pessoas com beri béri doença causada pela deficiência de tiamina apre sentam níveis sanguíneos elevados de piruvato e acetogluta rato especialmente após consumirem uma refeição rica em glicose Como esses resultados se relacionam à deficiência de tiamina 20 A síntese de oxaloacetato pelo ciclo do ácido cítrico O oxaloacetato é formado na última etapa do ciclo do ácido cítrico pela oxidação do Lmalato dependente de NAD 1 A síntese líquida de oxaloacetato a partir de acetilCoA poderia ocorrer com o uso somente de enzimas e cofatores do ciclo do ácido cítrico sem o esgotamento dos intermediários do ciclo Explique Como o oxaloacetato que é desviado do ciclo para reações biossintéticas é reposto 21 O esgotamento de oxaloacetato O fígado de mamí feros pode efetuar a gliconeogênese utilizando oxaloacetato como material de partida Capítulo 14 A operação do ciclo do ácido cítrico seria afetada pela intensa utilização de oxaloace tato para a gliconeogênese Explique sua resposta 22 O modo de ação do rodenticida fluoroacetato O flu oroacetato comercialmente preparado para o controle de roe dores também é produzido por uma planta sulafricana Após entrar na célula o fluoroacetato é convertido a fluoroacetilCoA em uma reação catalisada pela enzima acetatotiocinase O efeito tóxico do fluoroacetato foi estudado em um expe rimento utilizando o coração isolado e intacto de rato Após o coração ser perfundido com fluoroacetato 022 mM as ta xas medidas de captação de glicose e a glicólise diminuíram e glicose6fosfato e frutose6fosfato ficaram acumuladas O exame dos intermediários do ciclo do ácido cítrico revelou que essas concentrações estavam abaixo do normal exceto pelo citrato com uma concentração 10 vezes maior do que o normal a Onde ocorreu o bloqueio do ciclo do ácido cítrico O que causou o acúmulo de citrato e o esgotamento dos outros intermediários b A fluoroacetilCoA é enzimaticamente transformada pelo ciclo do ácido cítrico Qual é a estrutura do produto final do metabolismo do fluoroacetato Por que ele bloqueia o ciclo do ácido cítrico Como a inibição pode ser superada c Nos experimentos de perfusão cardíaca por que a cap tação de glicose e a glicólise diminuíram Por que as hexoses monofosfatadas se acumularam d Por que o fluoroacetato é um veneno letal 23 A síntese de Lmalato na produção de vinho A acidez de alguns vinhos é devida às altas concentrações de L malato Escreva uma sequência de reações mostrando como células de leveduras sintetizam Lmalato a partir de glicose sob condições anaeróbias na presença de CO2 dissolvido HCO3 2 Observe que a reação global dessa fermentação não pode en volver o consumo de coenzimas de nicotinamida ou interme diários do ciclo do ácido cítrico 24 Síntese líquida de acetoglutarato O acetogluta rato desempenha um papel crucial na biossíntese de alguns aminoácidos Escreva a sequência de reações enzimáticas que poderiam resultar na síntese líquida de acetoglutarato a partir de piruvato A sequência de reações proposta não deve envolver o consumo líquido de outros intermediários do ciclo do ácido cítrico Escreva uma equação para a reação global e identifique a fonte de cada reagente 25 Vias anfibólicas Explique dando exemplos o signifi cado da afirmação de que o ciclo do ácido cítrico é anfibólico Nelson6edbookindb 663 Nelson6edbookindb 663 030414 0744 030414 0744 664 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 26 Regulação do complexo da piruvatodesidrogenase Nos tecidos animais a taxa de conversão de piruvato a acetil CoA é regulada pela razão entre o complexo da PDH ativo e fosforilado e inativo e desfosforilado Determine o que acon tece com a velocidade desta reação quando uma preparação de mitocôndrias de músculo de coelho contendo o comple xo da PDH é tratada com a piruvatodesidrogenasecinase ATP e NADH b piruvatodesidrogenasefosfatase e Ca 21 c malonato 27 A síntese comercial de ácido cítrico O ácido cítrico é utilizado como agente flavorizante em refrigerantes sucos de frutas e em muitos outros alimentos Ao redor do mundo o mercado do ácido cítrico está estimado em centenas de mi lhões de dólares por ano A produção comercial utiliza o fungo Aspergillus niger que metaboliza a sacarose sob condições cuidadosamente controladas a O rendimento de ácido cítrico depende muito da con centração de FeCl3 no meio de cultura como indicado no gráfi co Por que o rendimento decresce quando a concentração de Fe 31 está acima ou abaixo do valor ótimo de 05 mgL 1 2 3 4 5 90 80 70 60 50 Rendimento de ácido cítrico FeCl3 mgL b Escreva a sequência de reações pelas quais A niger sintetiza ácido cítrico a partir de sacarose Escreva uma equa ção para a reação global c O processo comercial requer que o meio de cultura seja aerado Em outras palavras o processo é uma fermentação ou um processo aeróbio Explique 28 Regulação da citratosintase Na presença de quanti dades saturantes de oxaloacetato a atividade da citratosintase do tecido cardíaco de porco mostra uma dependência sigmoi de da concentração de acetilCoA como mostrado no gráfico abaixo Quando succinilCoA é adicionado a curva é deslocada para a direita e a dependência sigmoide é mais pronunciada Sem adição de succinilCoA Atividade de Vmáx 100 80 60 40 20 20 40 60 80 100 120 Com adição de succinilCoA AcetilCoA mM Com base nessas observações sugira como a succinilCoA re gula a atividade da citratosintase Dica ver Figura 634 Por que a succinilCoA é um sinal apropriado para a regulação do ciclo do ácido cítrico Como a regulação da citratosintase con trola a taxa de respiração celular no tecido cardíaco de porco 29 Regulação da piruvatocarboxilase A carboxilação do piruvato pela piruvatocarboxilase ocorre em uma velocida de muito baixa a não ser que acetilCoA um modulador alosté rico positivo esteja presente Logo após uma refeição rica em ácidos graxos triacilgliceróis mas baixa em carboidratos gli cose como essa propriedade de regulação desativa a oxidação de glicose a CO2 e H2O mas aumenta a oxidação de acetilCoA derivada de ácidos graxos 30 A relação entre respiração e ciclo do ácido cítrico Embora o oxigênio não participe diretamente do ciclo do áci do cítrico o ciclo somente opera quando O2 está presente Por quê 31 O efeito da NADHNAD 1 sobre o ciclo do ácido cítrico Como você espera que a operação do ciclo do ácido cí trico responda a um rápido aumento da razão NADHNAD 1 na matriz mitocondrial Por quê 32 A termodinâmica da reação da citratosintase nas células O citrato é formado pela condensação de acetilCoA e oxaloacetato catalisada pela citratosintase Oxaloacetato 1 acetilCoA 1 H2O citrato 1 CoA 1 H 1 Em mitocôndrias de coração de rato a pH 7 e 25 oC as con centrações de reagentes e produtos são oxaloacetato 1 mM acetilCoA 1 mM citrato 220 mM e CoA 65 mM A variação de energia livre padrão da reação da citratosintase é 2322 kJmol Qual é o sentido do fluxo de metabólitos na reação da citratosintase nas células cardíacas de rato Explique 33 As reações do complexo da piruvatodesidrogenase Duas das etapas da descarboxilação oxidativa do piruvato etapas ➍ e ➎ na Figura 166 não envolvem nenhum dos três carbonos do piruvato ainda que eles sejam essenciais para o funcionamento do complexo da PDH Explique 34 Mutantes do ciclo do ácido cítrico Existem mui tos exemplos de doenças humanas nas quais uma ou outra atividade enzimática está ausente devido a mutações gené ticas Entretanto doenças nas quais indivíduos careçam de uma das enzimas do ciclo do ácido cítrico são extremamente raras Por quê 35 Partição entre os ciclos do ácido cítrico e do glio xilato Em um organismo como E coli que tem o ciclo do ácido cítrico e o ciclo do glioxilato o que determina em qual dessas vias o isocitrato entrará Problema de análise de dados 36 Como o ciclo do ácido cítrico foi determinado A bioquímica detalhada do ciclo do ácido cítrico foi determinada por diversos pesquisadores ao longo de décadas Em um artigo de 1937 Krebs e Johnson resumiram seu trabalho e o trabalho de outros na primeira descrição publicada dessa via Os métodos utilizados por esses pesquisadores eram muito diferentes dos da bioquímica moderna Marcadores radioativos não estavam comumente disponíveis até os anos de 1940 de modo que Krebs e outros pesquisadores tiveram que utilizar técnicas sem marcadores para elucidar a via Utilizando amos tras frescas de músculo peitoral de pombo eles determinaram o consumo de oxigênio preparando uma suspensão do mús culo macerado em tampão em um frasco lacrado e medindo Nelson6edbookindb 664 Nelson6edbookindb 664 030414 0744 030414 0744 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 665 o volume em mL de oxigênio consumido sob diferentes con dições Eles mediram os níveis de substratos intermediários tratando as amostras com ácido para a remoção das proteínas contaminantes e a seguir dosaram as quantidades de várias moléculas orgânicas pequenas As duas observaçõeschave que levaram Krebs e colaboradores a proporem o ciclo do ácido cítrico em vez de uma via linear como a glicólise foram feitas nos seguintes experimentos Experimento I Eles incubaram 460 mg de músculo ma cerado em 3 mL de tampão a 40 oC por 150 minutos A adição de citrato aumentou o consumo de O2 em 893 mL em compa ração com as amostras sem citrato Eles calcularam com base no consumo de O2 durante a respiração de outros compostos contendo carbono que o consumo de O2 esperado para a res piração completa desta quantidade de citrato seria de apenas 302 mL Experimento II Eles mediram o consumo de O2 por 460 mg de músculo macerado em 3 mL de tampão quando incu bado com citrato eou 1fosfoglicerol glicerol1fosfato o qual sabiase ser prontamente oxidado pela respiração celu lar a 40 oC por 140 minutos Os resultados estão mostrados na tabela Amostra Substratos adicionados mL de O2 absorvidos 1 Sem substrato extra 342 2 03 mL de 02 M 1fosfoglicerol 757 3 015 mL de 002 M citrato 431 4 03 mL de 02 M 1fosfoglicerol e 015 mL de 002 M citrato 1385 a Por que o consumo de O2 é uma boa medida da respi ração celular b Por que a amostra 1 tecido muscular não suplementa do consome oxigênio c Com base nos resultados das amostras 2 e 3 você pode concluir que 1fosfoglicerol e citrato atuam como substratos para a respiração celular neste sistema Explique seu racio cínio d Krebs e colaboradores utilizaram estes experimentos para argumentar que o citrato era catalítico isto é que au xiliava as amostras de tecido muscular a metabolizar o 1fosfo glicerol de forma mais completa Como você utilizaria os resul tados deles para aprofundar esse argumento e Krebs e colaboradores também argumentaram que o citrato não era simplesmente consumido mas deveria ser rege nerado Portanto as reações deveriam formar um ciclo em vez de uma via linear Como você aprofundaria esse argumento Outros pesquisadores haviam observado que o arsenato AsO4 23 inibia a acetoglutaratodesidrogenase e que o malo nato inibia a succinatodesidrogenase f Krebs e colaboradores observaram que as amostras de tecido muscular tratadas com arsenato e citrato consumiriam o citrato apenas na presença de oxigênio e sob essas condições oxigênio seria consumido Com base na via da Figura 167 a que molécula o citrato era convertido neste experimento e por que as amostras consumiam oxigênio Em seu artigo Krebs e Johnson também relataram o se guinte 1 Na presença de arsenato 548 mmol de citrato eram convertidos a 507 mmol de acetoglutarato 2 Na pre sença de malonato o citrato era quantitativamente convertido a grandes quantidades de succinato e pequenas quantidades de acetoglutarato 3 A adição de oxaloacetato na ausência de oxigênio levava à produção de uma grande quantidade de citrato essa quantidade era aumentada quando glicose tam bém fosse adicionada Outros pesquisadores haviam descoberto a seguinte rota em preparações similares de tecido muscular Succinato fumarato malato oxaloacetato piruvato g Com base somente nos dados apresentados neste pro blema qual é a ordem dos intermediários no ciclo do ácido cítrico Como isso se compara à Figura 167 Explique seu ra ciocínio h Por que era importante mostrar a conversão quantita tiva de citrato a acetoglutarato O artigo de Krebs e Johnson também apresenta outros re sultados que elucidaram a maioria dos componentes ausentes do ciclo O único componente que ficou indeterminado foi a molécula que reage com oxaloacetato para formar citrato Referência Krebs HA Johnson WA 1937 The role of citric acid in intermediate metabolism in animal tissues Enzymologia 4 148156 Reimpresso 1980 em FEBS Lett 117 Suppl K2K10 Nelson6edbookindb 665 Nelson6edbookindb 665 030414 0744 030414 0744 Nelson6edbookindb 666 Nelson6edbookindb 666 030414 0744 030414 0744 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 171 Digestão mobilização e transporte de gorduras 668 172 Oxidação de ácidos graxos 672 173 Corpos cetônicos 686 A oxidação dos ácidos graxos de cadeia longa à acetil CoA é uma via central de geração de energia em mui tos organismos e tecidos No coração e no fígado de mamíferos por exemplo ela fornece até 80 das necessi dades energéticas em todas as circunstâncias fisiológicas Os elétrons retirados dos ácidos graxos durante a oxidação passam pela cadeia respiratória levando à síntese de ATP a acetilCoA produzida a partir dos ácidos graxos pode ser completamente oxidada a CO2 no ciclo do ácido cítrico resultando em mais conservação de energia Em algumas espécies e em alguns tecidos a acetilCoA tem destinos al ternativos No fígado a acetilCoA pode ser convertida em corpos cetônicos combustíveis solúveis em água exporta dos para o cérebro e para outros tecidos quando glicose não está disponível Em vegetais superiores a acetilCoA serve principalmente de precursor biossintético e apenas secun dariamente como combustível Embora o papel biológico da oxidação dos ácidos graxos varie de acordo com o organis mo o mecanismo é essencialmente o mesmo O processo repetitivo de quatro etapas chamado de boxidação por meio do qual os ácidos graxos são convertidos em acetil CoA é o tópico principal deste capítulo No Capítulo 10 foram descritas as propriedades dos tria cilgliceróis também chamados de triglicerídeos ou gordu ras neutras que os tornam especialmente adequados como combustíveis de armazenamento As cadeias alquilas lon gas de seus ácidos graxos constituintes são essencialmente hidrocarbonetos estruturas altamente reduzidas com uma energia de oxidação completa 38 kJg mais de duas ve zes maior que a produzida pelo mesmo peso de carboidra tos ou proteínas Essa vantagem é composta pela extrema insolubilidade dos lipídeos em água os triacilgliceróis ce lulares se agregam em gotículas lipídicas que não aumen tam a osmolaridade do citosol e não são solvatadas Nos polissacarídeos de armazenamento ao contrário a água de solvatação pode ser responsável por dois terços do peso total das moléculas armazenadas E devido a sua relativa inércia química os triacilgliceróis podem ser armazenados em grande quantidade nas células sem o risco de reações químicas indesejáveis com outros constituintes celulares As propriedades que tornam os triacilgliceróis compos tos de armazenamento adequados no entanto apresentam problemas em seu papel como combustível Por serem in solúveis em água os triacilgliceróis ingeridos devem ser emulsificados antes que possam ser digeridos por enzimas hidrossolúveis no intestino e os triacilgliceróis absorvidos no instestino ou mobilizados dos tecidos de armazenamen to devem ser carregados no sangue ligados a proteínas que neutralizam a sua insolubilidade Para superar a relativa es tabilidade das ligações CC em um ácido graxo o grupo carboxil do C1 é ativado pela ligação à coenzima A que permite a oxidação gradativa do grupo acil graxo na posição C3 ou b daí o nome boxidação Este capítulo inicia com uma breve discussão sobre as fontes de ácidos graxos e sobre as vias pelas quais eles se deslocam até o seu sítio de oxidação com ênfase espe cial no processo em vertebrados Em seguida descreve as etapas químicas da oxidação dos ácidos graxos nas mito côndrias A oxidação completa dos ácidos graxos a CO2 e H2O ocorre em três etapas a oxidação dos ácidos graxos de cadeia longa a fragmentos de dois carbonos na forma de acetilCoA boxidação a oxidação de acetilCoA a CO2 no ciclo do ácido cítrico Capítulo 16 e a transferência de elétrons dos transportadores de elétrons reduzidos à ca deia respiratória mitocondrial Capítulo 19 Neste capítu lo será apresentada a primeira dessas etapas A discussão sobre a boxidação inicia com o caso simples no qual um ácido graxo completamente saturado com um número par de átomos de carbono é degradado a acetilCoA Então são analisadas brevemente as transformações extras necessá rias para a degradação de ácidos graxos insaturados e áci dos graxos com um número ímpar de carbonos Finalmente são discutidas as variações sobre o tema da boxidação nas organelas especializadas peroxissomos e glioxissomos e duas vias menos comuns do catabolismo de ácidos graxos as oxidações v e a O capítulo é concluído com uma des crição de um destino alternativo para a acetilCoA formada pela boxidação em vertebrados a produção de corpos ce tônicos no fígado 17 Catabolismo de Ácidos Graxos Nelson6ed17indd 667 Nelson6ed17indd 667 020514 1721 020514 1721 668 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 171 Digestão mobilização e transporte de gorduras As células podem obter combustíveis de ácidos graxos de três fontes gorduras consumidas na dieta gorduras arma zenadas nas células como gotículas de lipídeos e gorduras sintetizadas em um órgão para exportação a outro Algu mas espécies utilizam as três fontes sob várias circunstân cias outras utilizam uma ou duas delas Os vertebrados por exemplo obtêm gorduras na dieta mobilizam gorduras armazenadas em tecidos especializados tecido adiposo consistindo em células chamadas adipócitos e no fígado convertem o excesso dos carboidratos da dieta em gordu ra para a exportação aos outos tecidos Em média 40 ou mais das necessidades energéticas diárias das pessoas que vivem em países altamente industrializados são supridos pe los triacilgliceróis da dieta embora a maioria das diretrizes nutricionais recomende que o consumo calórico diário de gorduras não ultrapasse 30 Os triacilgliceróis fornecem mais da metade das necessidades energéticas de alguns ór gãos particularmente o fígado o coração e a musculatura esquelética em repouso Os triacilgliceróis armazenados são praticamente a única fonte de energia dos animais hiber nantes e das aves migratórias Os protistas obtêm gorduras consumindo organismos mais abaixo na cadeia alimentar e alguns também armazenam gorduras como gotículas citosó licas de lipídeos As plantas vasculares mobilizam gorduras armazenadas nas sementes durante a germinação mas não dependem de gorduras para a obtenção de energia As gorduras da dieta são absorvidas no intestino delgado Nos vertebrados antes que os triacilgliceróis possam ser absorvidos através da parede intestinal eles precisam ser convertidos de partículas de gordura macroscópicas inso lúveis em micelas microscópicas finamente dispersas Essa solubilização é realizada pelos sais biliares como o ácido taurocólico p 370 que são sintetizados a partir do coles terol no fígado armazenados na vesícula biliar e liberados no intestino delgado após a ingestão de uma refeição gordu rosa Os sais biliares são compostos anfipáticos que atuam como detergentes biológicos convertendo as gorduras da dieta em micelas mistas de sais biliares e triacilgliceróis Figura 171 etapa ➊ A formação de micelas aumenta muito a fração das moléculas de lipídeo acessíveis à ação das lipases hidrossolúveis no intestino e a ação das lipases converte os triacilgliceróis em monoacilgliceróis monogli cerídeos e diacilgliceróis diglicerídeos ácidos graxos li vres e glicerol etapa ➋ Esses produtos da ação da lipase se difundem para dentro das células epiteliais que reves tem a superfície intestinal a mucosa intestinal etapa ➌ ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ ➏ ➐ ➑ Os ácidos graxos são oxidados como combustíveis ou esterificados novamente para armazenamento Os triacilgliceróis são incorporados com colesterol e apolipoproteínas nos quilomícrons Vesícula biliar Os sais biliares emulsificam as gorduras da dieta no intestino delgado formando micelas mistas Intestino delgado As lipases intestinais degradam os triacilgliceróis Os ácidos graxos e outros produtos da degradação são absorvidos pela mucosa intestinal e convertidos em triacilgliceróis Mucosa intestinal Quilomícron A lipase lipoproteica ativada por apoCII nos capilares converte triacilgliceróis em ácidos graxos e glicerol Os quilomícrons movemse pelo sistema linfático e pela corrente sanguínea para os tecidos Lipase lipoproteica Os ácidos graxos entram nas células ApoCII Miócito ou adipócito ATP CO2 Armazenamento Gorduras ingeridas na dieta Capilar FIGURA 171 O processamento dos lipídeos da dieta em vertebrados A digestão e a absorção dos lipídeos da dieta ocorrem no intestino delgado e os ácidos graxos liberados dos triacilgliceróis são empacotados e distribuídos para os músculos e o tecido adiposo Os oito passos são discutidos no texto Nelson6edbookindb 668 Nelson6edbookindb 668 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 669 onde são reconvertidos em triacilgliceróis e empacotados com o colesterol da dieta e proteínas específicas em agre gados de lipoproteínas chamados quilomícrons Figura 172 ver também a Figura 171 etapa ➍ As apolipoproteínas são proteínas de ligação a lipí deos no sangue responsáveis pelo transporte de triacilgli ceróis fosfolipídeos colesterol e ésteres de colesterol entre os órgãos As apolipoproteínas apo significa destacado ou separado designando a proteína em sua forma livre de lipídeos se combinam com os lipídeos para formar várias classes de partículas de lipoproteína que são agregados esféricos com lipídeos hidrofóbicos no centro e cadeias la terais hidrofílicas de proteínas e grupos polares de lipídeos na superfície Várias combinações de lipídeos e proteínas produzem partículas de densidades diferentes variando de quilomícrons e lipoproteínas de densidade muito baixa VLDL de very low density lipoproteins a lipoproteínas de densidade muito alta VHDL de very high density li poproteins que podem ser separadas por ultracentrifu gação As estruturas dessas partículas de lipoproteínas e seus papéis no transporte de lipídeos estão detalhadas no Capítulo 21 As porções proteicas das lipoproteínas são reconhecidas por receptores nas superfícies celulares Na absorção de li pídeos no intestino os quilomícrons que contêm a apolipo proteína CII apoCII se deslocam da mucosa intestinal para o sistema linfático e então entram no sangue que os carrega para os músculos e o tecido adiposo Figura 171 etapa ➎ Nos capilares desses tecidos a enzima extracelu lar lipase lipoproteica ativada pela apoCII hidrolisa os triacilgliceróis em ácidos graxos e glicerol etapa ➏ absor vidos pelas células nos tecidosalvo etapa ➐ No músculo os ácidos graxos são oxidados para obter energia no tecido adiposo eles são reesterificados para armazenamento na forma de triacilgliceróis etapa ➑ Os remanescentes dos quilomícrons desprovidos da maioria dos seus triacilgliceróis mas ainda contendo coles terol e apolipoproteínas se deslocam pelo sangue até o fíga do onde são captados por endocitose mediada pelos recep tores específicos para as suas respectivas apolipoproteínas Os triacilgliceróis que entram no fígado por essa via podem ser oxidados para fornecer energia ou precursores para a síntese de corpos cetônicos como descrito na Seção 173 Quando a dieta contém mais ácidos graxos do que o neces sário imediatamente como combustível ou como precurso res o fígado os converte em triacilgliceróis empacotados com apolipoproteínas específicas formando VLDL As VLDL são transportadas pelo sangue até o tecido adiposo onde os triacilgliceróis são removidos da circulação e armazenados em gotículas lipídicas dentro dos adipócitos Hormônios ativam a mobilização dos triacilgliceróis armazenados Os lipídeos neutros são armazenados nos adipócitos e nas células que sintetizam esteroides do córtex da suprar renal dos ovários e dos testículos na forma de gotículas lipídicas com um centro de ésteres de esteróis e triacilgli ceróis envoltos por uma monocamada de fosfolipídeos A superfície dessas gotículas é revestidas por perilipinas família de proteínas que restringem o acesso às gotículas lipídicas evitando a mobilização prematura dos lipídeos Quando hormônios sinalizam a necessidade de energia me tabólica os triacilgliceróis armazenados no tecido adiposo são mobilizados retirados do armazenamento e trans portados aos tecidos musculatura esquelética coração e córtex renal nos quais os ácidos graxos podem ser oxida dos para a produção de energia Os hormônios adrenalina e glucagon secretados em resposta aos baixos níveis de glicose ou atividade iminente estimulam a enzima adeni lil ciclase na membrana plasmática dos adipócitos Figu ra 173 que produz o segundo mensageiro intracelular AMP cíclico cAMP ver Figura 124 A proteínacinase dependente de cAMP PKA leva à mudanças que abrem a gotícula de lipídeo para a atividade de três lipases que atuam sobre tri di e monoacilgliceróis liberando ácidos graxos e glicerol Os ácidos graxos assim liberados ácidos graxos li vres FFA de free fatty acids passam dos adipócitos para o sangue onde eles se ligam à albumina sérica Figura 173 Essa proteína Mr 66000 que representa cerca da metade da proteína sérica total se liga não covalentemente a até 10 ácidos graxos por monômero de proteína Ligados a essa proteína solúvel os ácidos graxos que de outra ma neira seriam insolúveis são transportados aos tecido como o músculo esquelético o coração e o córtex renal Nesses tecidosalvo os ácidos graxos se dissociam da albumina e são levados por transportadores da membrana plasmática para dentro das células para servir de combustível O glice rol liberado pela ação da lipase é fosforilado e oxidado a di hidroxiacetona fosfato que pode entrar nas vias glicolítica ou gliconeogênica Alternativamente o glicerol fosfato pode ser usado na síntese de triacilgliceróis ou de fosfolipídeos Cerca de 95 da energia biologicamente disponível dos triacilgliceróis residem nas suas três cadeias longas de ácidos graxos apenas 5 são fornecidos pela porção gli cerol O glicerol liberado pela ação da lipase é fosforilado Apolipoproteínas B48 CIII CII Fosfolipídeos Colesterol Triacilgliceróis e ésteres de colesterol FIGURA 172 Estrutura molecular de um quilomícron A superfície é formada por uma camada de fosfolipídeos com os grupos polares em conta to com a fase aquosa Os triacilgliceróis sequestrados no interior em amare lo representam mais de 80 da massa do quilomícron Várias apolipoprote ínas que se projetam da superfície B48 CIII CII atuam como sinalizadores na absorção e no metabolismo do conteúdo dos quilomícrons O diâmetro dos quilomícrons varia de aproximadamente 100 a 500 nm Nelson6edbookindb 669 Nelson6edbookindb 669 030414 0745 030414 0745 670 DAVID L NELSON MICHAEL M COX pela glicerolcinase Figura 174 e o glicerol3fosfato resultante é oxidado a dihidroxiacetona fosfato A enzima glicolítica triosefosfatoisomerase converte esse composto em gliceraldeído3fosfato que é oxidado na glicólise Os ácidos graxos são ativados e transportados para dentro das mitocôndrias As enzimas da oxidação de ácidos graxos nas células ani mais estão localizadas na matriz mitocondrial como de monstrado em 1948 por Eugene P Kennedy e Albert Leh ninger Os ácidos graxos com comprimento de cadeia de 12 carbonos ou menos entram na mitocôndria sem a ajuda de transportadores de membrana Aqueles com 14 carbonos ou mais que constituem a maioria dos ácidos graxos livres obtidos na dieta ou liberados do tecido adiposo não conse guem passar livremente através das membranas mitocon driais primeiro eles precisam passar pelas três reações enzimáticas do ciclo da carnitina A primeira reação é catalisada por uma família de isoenzimas isoenzimas dife rentes específicas para ácidos graxos de cadeia carbonada curta intermediária ou longa presente na membrana mito condrial externa as acilCoAsintetases que catalisam a reação geral Ácido graxo 1 CoA 1 ATP acilCoA graxo 1 AMP 1 PPi Assim as acilCoAsintetases catalisam a formação de uma ligação tioéster entre o grupo carboxil do ácido graxo e o grupo tiol da coenzima A para produzir um acilCoA gra xo acoplado à clivagem do ATP em AMP e PPi Lembre se da descrição dessa reação no Capítulo 13 para ilustrar como a energia livre liberada pela clivagem das ligações fosfoanidrido do ATP pode ser acoplada à formação de um composto de alta energia p 524 A reação ocorre em dois passos e envolve um intermediário acilgraxoadenilato Figura 175 As acilgraxosCoA como a acetilCoA são compostos de alta energia a sua hidrólise a ácidos graxos livres e CoA tem uma grande variação negativa de energia livre padrão DG9 5 231 kJmol A formação de uma acilCoA graxo tornase favorável pela hidrólise de duas ligações de alta energia do ATP o pirofosfato formado na reação de ativa ção é imediatamente hidrolisado pela pirofosfatase inorgâ nica lado esquerdo da Figura 175 que puxa a reação de P P ❶ ❷ ❹ ❺ ❸ ➒ ❻ ➑ ❼ Corrente sanguínea P P P P P Adipócito Miócito Gotícula de lipídeo Perilipina cAMP PKA ATP Glucagon CO2 Albumina sérica ATP Transportador de ácidos graxos Adenilil ciclase Ácidos graxos b oxidação ciclo do ácido cítrico cadeia respiratória Monoacilglicerol Diacilglicerol Triacilglicerol Lipase sensível a hormônio ATGL MGL CGI CGI CGI HSL HSL Receptor Gs FIGURA 173 Mobilização dos triacilgliceróis armazenados no tecido adiposo Quando os baixos níveis de glicose no sangue ativam a liberação de glucagon ➊ o hormônio se liga ao seu receptor na membrana do adi pócito e assim ➋ estimula a adenililciclase via uma proteína G a produzir cAMP Isso ativa a PKA que fosforila ➌ a lipase sensível a hormônio HSL de hormonesensitive lipase e ➍ as moléculas de perilipina na superfície da go tícula lipídica A fosforilação da perilipina causa a ➎ dissociação da proteína CGI da perilipina A CGI então se associa com a enzima triacilglicerol lipase no adipócito ATGL de adipose triacylglycerol lipase ativandoa A triacilglicerol lipase ativada ➏ converte triacilgliceróis em diacilgliceróis A perilipina fosfo rilada se associa com a lipase sensível a hormônios fosforilada permitindo o acesso à superfície da gotícula lipídica onde ➐ ela hidrolisa os diacilgliceróis em monoacilgliceróis Uma terceira lipase a monoacilglicerol lipase MGL de monoacylglycerol lipase ➑ hidrolisa os monoacilgliceróis ➒ Os ácidos graxos saem do adipócito se ligam à albumina sérica no sangue e são transporta dos no sangue eles são liberados da albumina e ➓ entram em um miócito por meio de um transportador específico de ácidos graxos 11 No miócito os ácidos graxos são oxidados a CO2 e a energia da oxidação é conservada em ATP que abastece a contração muscular e outros tipos de metabolismo que necessitam de energia no miócito Nelson6edbookindb 670 Nelson6edbookindb 670 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 671 ativação precedente no sentido da formação de acilCoA graxo A reação total é Ácido graxo 1 CoA 1 ATP acilCoA graxo 1 AMP 1 2Pi 171 DG9 5 234 kJmol Os ésteres de acilCoA graxo formados no lado cito sólico da membrana externa da mitocôndria podem ser transportados para dentro da mitocôndria e oxidados para produzir ATP ou podem ser utilizados no citosol para sin tetizar lipídeos de membrana Os ácidos graxos destinados a oxidação mitocondrial estão transitoriamente ligados ao grupo hidroxil da carnitina formando acilgraxocarnitina a segunda reação do ciclo CH2 CH CH2 CH3 N1 CH3 COO2 Carnitina CH3 OH Essa transesterificação é catalisada pela carnitina acil transferase I na membrana externa Ou a acilCoA passa através da membrana externa e é convertida no éster de carnitina no espaço intermembrana Figura 176 ou o és ter de carnitina é formado na face citosólica da membrana externa e então deslocado através da membrana externa para o espaço intermembrana as evidências atuais não revelam Em qualquer um dos casos a passagem para o es paço intermembrana o espaço entre a membrana externa e a interna ocorre por meio de grandes poros formados pela proteína porina na membrana externa O éster de acilgraxocarnitina então entra na matriz por difusão faci litada através do transportador acilcarnitinacarnitina da membrana mitocondrial interna Figura 176 No terceiro e último passo do circuito da carnitina o gru po acilgraxo é enzimaticamente transferido da carnitina para a conezima A intramitocondrial pela carnitinaaciltrans ferase II Essa isoenzima localizada na face citosólica da membrana mitocondrial interna regenera a acilCoA graxo e a libera juntamente com a carnitina livre dentro da matriz Figura 176 A carnitina retorna ao espaço intermembrana por meio do transportador acilcarnitinacarnitina CH2 HO C H P O2 CH2OH HO C H CH2OH O O2 O CH2 C P O2 CH2OH O O2 O O CH2 C P O2 O O2 O C O H OH H Glicerol ATP ADP NADH 1 H1 NAD1 DGliceraldeído3 fosfato Dihidroxiacetona fosfato LGlicerol3 fosfato Glicerol cinase Glicólise Triosefosfato isomerase Glicerol3fosfato desidrogenase CH2OH FIGURA 174 A entrada do glicerol na via glicolítica MECANISMOFIGURA 175 Conversão de um ácido graxo em uma acilCoA graxo A conver são é catalisada pela acilCoA graxosintetase e pela pirofosfatase inorgânica A ativação dos ácidos gra xos pela formação do derivado de acilCoA graxo ocorre em duas etapas A reação total é altamente exergônica Mecanismo de acilCoA graxosintetase 2Pi P 2O O O O2 P O O O2 P O O O2 Adenosina R O2 O C AcilCoA graxo AcilCoA graxo sintetase Ácido graxo O íon carboxilato é adenilado pelo ATP para formar um aciladenilato graxo e PPi O PPi é imediatamente hidrolisado a duas moléculas de Pi O grupo tiol da coenzima A ataca o aciladenilato anidrido misto deslocando o AMP e formando o tioéster acilCoA graxo P O O Adenosina O2 O O R C 1 2O P O O O2 P O O2 O2 AMP Pirofosfatase inorgânica O R C Aciladenilatograxo ligado à enzima SCoA CoASH Pirofosfato AcilCoA graxo sintetase ATP DG98 5 219 kJmol DG98 5 215 kJmol para o processo de dois passos Nelson6edbookindb 671 Nelson6edbookindb 671 030414 0745 030414 0745 672 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Esse processo de três passos para transferir os ácidos graxos para dentro da mitocôndria esterificação com CoA transesterificação com carnitina seguida de transporte e transesterificação de volta a CoA liga dois reservatórios de coenzima A e de acilCoA graxo um no citosol e o outro na mitocôndria Esses reservatórios têm funções diferentes A coenzima A na matriz mitocondrial é amplamente utiliza da na degradação oxidativa do piruvato dos ácidos graxos e de alguns aminoácidos enquanto a coenzima A citosólica é utilizada na biossíntese de ácidos graxos ver Figura 21 10 A acilCoA graxo no reservatório citosólico pode ser utilizada para síntese de lipídeos de membrana ou pode ser transportada para dentro da matriz mitocondrial para oxi dação e produção de ATP A conversão ao éster de carnitina compromete a porção acilgraxo com o destino oxidativo O processo de entrada mediado pela carnitina é o passo limitante para a oxidação dos ácidos graxos na mitocôndria e como discutido mais adiante é um ponto de regulação Uma vez dentro da mitocôndria a acilCoA graxo sofre os efeitos de um conjunto de enzimas da matriz RESUMO 171 Digestão mobilização e transporte de gorduras c Os ácidos graxos dos triacilgliceróis fornecem uma gran de fração da energia oxidativa nos animais Os triacilgli ceróis da dieta são emulsificados no intestino delgado por sais biliares hidrolisados pelas lipases intestinais absorvidos pelas células epiteliais intestinais recon vertidos em triacilgliceróis e então transformados em quilimícrons pela combinação com apolipoproteínas es pecíficas c Os quilomícrons distribuem os triacilgliceróis aos te cidos onde a lipase lipoproteica libera ácidos graxos livres para a entrada nas células Os triacilgliceróis ar mazenados no tecido adiposo são mobilizados por uma lipase de triacilglicerol sensível a hormônio Os ácidos graxos liberados se ligam à albumina sérica e são trans portados no sangue para o coração para musculatura esquelética e outros tecidos que utilizam ácidos graxos como combustíveis c Uma vez dentro das células os ácidos graxos são ativa dos na membrana mitocondrial externa pela conversão em tioésteres de acilCoA graxos A acilCoA graxo que será oxidada entra na mitocôndria em três passos pelo ciclo da carnitina 172 Oxidação de ácidos graxos Conforme observado anteriormente a oxidação mitocon drial dos ácidos graxos ocorre em três etapas Figura 177 Na primeira etapa boxidação os ácidos graxos sofrem remoção oxidativa de sucessivas unidades de dois carbonos na forma de acetilCoA começando pela extremi dade carboxílica da cadeia acilgraxo Por exemplo o ácido palmítico de 16 carbonos palmitato em pH 7 passa sete vezes pela sequência oxidativa perdendo dois carbonos como acetilCoA em cada passagem Ao final de sete ciclos os dois últimos carbonos do palmitato originalmente C15 e C16 permanecem como acetilCoA O resultado global é a conversão da cadeia de 16 carbonos do palmitato em oito grupos acetil de dois carbonos das moléculas de acetilCoA A formação de cada acetilCoA requer a remoção de quatro átomos de hidrogênio dois pares de elétrons e quatro H 1 da porção acilgraxo pelas desidrogenases Na segunda etapa da oxidação de ácidos graxos os gru pos acetil da acetilCoA são oxidados a CO2 no ciclo do ácido cítrico que também ocorre na matriz mitocondrial A acetil CoA derivada dos ácidos graxos então entra em uma via de oxidação final comum com a acetilCoA derivada da glicose precedente da glicólise e da oxidação do piruvato ver Figu ra 161 As duas primeiras etapas da oxidação dos ácidos graxos produzem os transportadores de elétrons reduzidos NADH e FADH2 que na terceira etapa doam elétrons para a cadeia respiratória mitocondrial por meio da qual os elé trons passam para o oxigênio com a fosforilação concomitan R C O R C O Matriz Carnitina Transportador Carnitina SCoA CoASH Carnitina aciltransferase II Carnitina Carnitina R C O R C O SCoA CoASH Carnitina aciltransferase I Espaço intermembrana Citosol Membrana mitocondrial interna Membrana mitocondrial externa FIGURA 176 Entrada de ácido graxo na mitocôndria pelo transpor tador acilcarnitinacarnitina Após a formação da acilcarnitinagraxo na membrana externa ou no espaço intermembrana ela se desloca para a matriz pela difusão facilitada por meio do transportador na membrana in terna Na matriz o grupo acila é transferido para a coenzima A mitocondrial tornando a carnitina livre para retornar ao espaço intermembrana pelo mes mo transportador A aciltransferase I é inibida por malonilCoA o primeiro intermediário na síntese de ácidos graxos ver Figura 212 Essa inibição evita a síntese e a degradação simultâneas dos ácidos graxos Nelson6edbookindb 672 Nelson6edbookindb 672 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 673 te de ADP a ATP Figura 177 A energia liberada pela oxi dação dos ácidos graxos é portanto conservada como ATP Agora será analisada com mais atenção a primeira etapa da oxidação dos ácidos graxos começando com o caso sim ples de uma cadeia acilgraxo saturada com um número par de carbonos então passando para os casos um pouco mais complexos das cadeias insaturadas ou de número ímpar Também será abordada a regulação da oxidação de ácidos graxos os processos boxidativos que ocorrem nas outras organelas que não na mitocôndria e finalmente duas ma neiras menos comuns de catabolismo de ácidos graxos a aoxidação e a voxidação A boxidação de ácidos graxos saturados tem quatro passos básicos Quatro reações catalisadas por enzimas constituem a pri meira etapa da oxidação de ácidos graxos Figura 178a Primeiro a desidrogenação da acilCoA graxo produz uma ligação dupla entre os átomos de carbono a e b C2 e C3 produzindo uma transD 2enoilCoA o símbolo D 2 desig na a posição da ligação dupla você pode querer rever a no menclatura dos ácidos graxos p 357 Observe que a nova ligação dupla tem configuração trans enquanto as ligações duplas nos ácidos graxos insaturados que ocorrem natural mente com frequência estão na configuração cis O signifi cado dessa diferença será analisado mais tarde NADH FADH2 Cadeia respiratória transferência de elétrons Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 16CO2 Ciclo do ácido cítrico 8 AcetilCoA CH2 64e2 28e2 CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C CH2 O O b Oxidação e2 ATP ADP Pi H2O 2H 1 2O2 FIGURA 177 Etapas da oxidação de ácidos graxos Etapa 1 Um ácido graxo de cadeia longa é oxidado para produzir resíduos de acetil na forma de acetilCoA Esse processo é chamado de boxidação Etapa 2 Os grupos acetil são oxidados a CO2 no ciclo do ácido cítrico Etapa 3 Os elétrons derivados das oxidações das etapas 1 e 2 passam ao O2 por meio da cadeia respiratória mito condrial fornecendo a energia para a síntese de ATP por fosforilação oxidativa CH2 CH3 O CH2 AcilCoA miristoilCoA a SCoA b AcilCoA acetiltransferase tiolase CoASH C C CH2 SCoA C O PalmitoilCoA AcilCoA desidrogenase FADH2 FAD H2O R CH2 O transD EnoilCoA 2 SCoA C C C H CH2 H R CH2 O LbHidroxiacilCoA SCoA bhidroxiacilCoA desidrogenase NADH 1 H1 NAD1 C C OH H CH2 O C16 R R CH2 O bCetoacil CoA SCoA C C CH2 O SCoA 1 b Acetil C14 R C12 C10 C8 C6 C14 Acetil CoA Acetil CoA Acetil CoA Acetil CoA Acetil CoA a C4 CoA Acetil CoA Acetil CoA EnoilCoA hidratase FIGURA 178 A via da boxidação a Em cada passagem por essa se quência de quatro passos um resíduo acetil sombreado em cor salmão é removido na forma de acetilCoA da extremidade carboxílica da cadeia acil graxo nesse exemplo o palmitato C16 que entra como palmitoilCoA b Mais seis passagens pela via produzem mais sete moléculas de acetilCoA a sétima vinda dos dois últimos átomos de carbono da cadeia de 16 carbonos Oito moléculas de acetilCoA são formadas no total Nelson6edbookindb 673 Nelson6edbookindb 673 030414 0745 030414 0745 674 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Esse primeiro passo é catalisado por três isoenzimas da acilCoA desidrogenase cada uma específica para uma sé rie de comprimentos de cadeia acilgraxo acilCoA desidro genase de cadeia muito longa VLCAD de verylongchain acylCoA dehydrogenase atuando em ácidos graxos de 12 a 18 carbonos de cadeia média MCAD de mediumchain acylCoA dehydrogenase atuando em ácidos graxos de 4 a 14 carbonos e de cadeia curta SCAD de shortchain acylCoA dehydrogenase atuando em ácidos gaxos de 4 a 8 carbonos As três isoenzimas são flavoproteínas com FAD ver Figura 1327 como grupo prostético Os elétrons re movidos da acilCoA graxo são transferidos para o FAD e a forma reduzida da desidrogenase imediatamente doa seus elétrons a um transportador de elétrons da cadeia respirató ria mitocondrial a flavoproteína de transferência de elé trons ETF de eletrontransferring protein ver Figura 198 A oxidação catalisada por uma acilCoA desidrogenase é análoga à desidrogenação do succinato no ciclo do ácido cítrico p 646 em ambas as reações a enzima está ligada à membrana interna uma ligação dupla é introduzida em um ácido carboxílico entre os carbonos a e b FAD é o aceptor de elétrons e os elétrons das reações por fim entram na cadeia respiratória e passam para o O2 com a síntese concomitante de cerca de 15 moléculas de ATP por par de elétrons No segundo passo do ciclo da boxidação Figura 17 8a água é adicionada à ligação dupla da transD 2enoil CoA para formar o estereoisômero L da bhidroxiacilCoA 3hidroxiacilCoA Essa reação catalisada pela enoil CoA hidratase é análoga à reação da fumarase no ciclo do ácido cítrico no qual H2O é adicionada a uma ligação dupla ab p647 No terceiro passo LbhidroxiacilCoA é desidrogenada para formar bcetoacilCoA pela ação da bhidroxiacil CoA desidrogenase NAD 1 é o aceptor de elétrons Essa enzima é específica para o estereisômero L da hidroxiacil CoA O NADH formado na reação doa seus elétrons para a NADHdesidrogenase um transportador de elétrons da cadeia respiratória e ATP é formado a partir de ADP à me dida que os elétrons passam para o O2 A reação catalisada pela bhidroxiacilCoA desidrogenase é análoga à reação da malatodesidrogenase do ciclo do ácido cítrico p 647 O quarto e último passo do ciclo da boxidação é cata lisado pela acilCoAacetiltransferase mais comumente chamada de tiolase que promove a reação de bcetoacil CoA com uma molécula de coenzima A livre para separar o fragmento de dois carbonos da extremidade carboxílica do ácido graxo original como acetilCoA O outro produto é o tioéster de coenzima A do ácido graxo agora encurtado em dois átomos de carbono Figura 178a Essa reação é chamada de tiólise por analogia ao processo de hidrólise já que a bcetoacilCoA é clivada pela reação com o grupo tiol da coenzima A A reação da tiolase é o reverso da condensa ção de Claisen ver Figura 134 As três últimas etapas dessa sequência de quatro passos são catalisadas por dois conjuntos de enzimas sendo que as enzimas utilizadas vão depender do comprimento da cadeia acilgraxo Para cadeias com 12 carbonos ou mais as reações são catalisadas por um complexo multienzimático associado à membrana interna da mitocôndria a proteína trifuncio nal TFP de trifunctional protein A TFP é um hetero octâmero de subunidades a4b4 Cada subunidade a possui duas atividades a enoilCoAhidratase e a bhidroxiaxilCoA desidrogenase as subunidades b possuem a atividade tiola se Essa associação íntima de três enzimas pode permitir uma canalização eficiente do substrato de um sítio ativo para ou tro sem a difusão dos intermediários para longe da superfície enzimática Quando a TFP tiver encurtado a cadeia acilgraxo para 12 carbonos ou menos as próximas oxidações são catali sadas por um conjunto de quatro enzimas solúveis na matriz Como salientado anteriormente a ligação simples entre grupos metileno CH2 nos ácidos graxos é relativa mente estável A sequência da boxidação é um mecanis mo elegante para desestabilizar e quebrar essas ligações As três primeiras reações da boxidação criam uma ligação CC muito menos estável na qual o carbono a C2 está ligado a dois carbonos carbonílicos o intermediário bceto acilCoA A função cetona do carbono b C3 faz dele um bom alvo para ataque nucleofílico pelo SH da coenzima A catalisado pela tiolase A acidez do hidrogênio a e a estabili zação por ressonância do carbânion gerado pela saída desse hidrogênio tornam o CH2COSCoA terminal um bom grupo de saída facilitando a quebra da ligação ab Já foi vista uma sequência de reações praticamente idênticas a essas quatro etapas da oxidação dos ácidos gra xos nas etapas de reação do ciclo do ácido cítrico entre succinato e oxaloacetato ver Figura 167 Uma sequência de reação praticamente idêntica ocorre também nas vias pelas quais os aminoácidos de cadeia lateral ramificada iso leucina leucina e valina são oxidados como combustíveis ver Figura 1828 A Figura 179 mostra as característi cas comuns dessas três sequências quase certamente um exemplo da conservação de um mecanismo por duplicação gênica e evolução de uma nova especificidade nos produtos enzimáticos dos genes duplicados Os quatro passos da boxidação são repetidos para produzir acetilCoA e ATP Em uma passagem pela sequência da boxidação uma mo lécula de acetilCoA dois pares de elétrons e quatro pró tons H 1 são removidos da acilCoA graxo de cadeia longa encurtandoa em dois átomos de carbono A equação para uma passagem iniciando com o éster da coenzima A do exemplo palmitato é PalmitoilCoA 1 CoA 1 FAD 1 NAD 1 1 H2O miristoilCoA 1 acetilCoA 1 FADH2 1 NADH 1 H 1 172 Seguindo a remoção de uma unidade de acetilCoA da pal mitoilCoA o tioéster de coenzima A do ácido graxo encur tado agora o miristato com 14 carbonos permanece A miristoilCoA pode agora passar por outro conjunto de qua tro reações da boxidação exatamente análogo ao primeiro para produzir outra molécula de acetilCoA e lauroilCoA o tioéster de coenzima A do laurato de 12 carbonos Ao todo sete passagens pela sequência da boxidação são neces sárias para oxidar uma molécula de palmitoilCoA em oito moléculas de acetilCoA Figura 178b A equação total é PalmitoilCoA 1 7CoA 1 7FAD 1 7NAD 1 1 7H2O 8 acetilCoA 1 7FADH2 1 7NADH 1 7H 1 173 Nelson6edbookindb 674 Nelson6edbookindb 674 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 675 Cada molécula de FADH2 formada durante a oxidação do ácido graxo doa um par de elétrons para a ETF da cadeia respiratória e cerca de 15 molécula de ATP são geradas durante a transferência de cada par de elétrons para o O2 Do mesmo modo cada molécula de NADH formada doa um par de elétrons para a NADHdesidrogenase mitocondrial e a transferência subsequente de cada par de elétrons para o O2 resulta na formação de aproximadamente 25 molécu las de ATP Assim quatro moléculas de ATP são formadas para cada unidade de dois carbonos removida em uma pas sagem pela sequência Observe que água também é produ zida nesse processo A transferência de elétrons do NADH ou FADH2 para o O2 produz uma H2O por par de elétrons A redução do O2 pelo NADH também consome um H 1 por molécula de NADH NADH 1 H 1 1 ½O2 NAD 1 1 H2O Em animais hibernantes a oxidação de ácidos graxos for nece energia metabólica calor e água todos essenciais para a sobrevivência de um animal que não come nem bebe por longos períodos Quadro 171 Os camelos obtêm água para suplementar o escasso suprimento disponível no seu ambiente natural pela oxidação de gorduras armazena das em suas corcovas A equação total para a oxidação da palmitoilCoA em oito moléculas de acetilCoA incluindo as transferências de elétrons e as fosforilações oxidativas é PalmitoilCoA 1 7CoA 1 7O2 1 28Pi 1 28ADP 8 acetilCoA 1 28ATP 1 7H2O 174 A acetilCoA pode ser oxidada ainda mais no ciclo do ácido cítrico A acetilCoA produzida a partir da oxidação dos ácidos graxos pode ser oxidada a CO2 e H2O pelo ciclo do ácido cítrico A equação abaixo representa o balancete para a segunda etapa da oxidação da palmitoilCoA junto com as fosforilações acopladas da terceira etapa 8 AcetilCoA 1 16O2 1 80Pi 1 80ADP 8CoA 1 80ATP 1 16CO2 1 16H2O 175 Combinando as Equações 174 e 175 obtémse a equação total para a oxidação completa da palmitoilCoA em dióxido de carbono e água PalmitoilCoA 1 23O2 1 108Pi 1 108ADP CoA 1 108ATP 1 16CO2 1 23H2O 176 A Tabela 171 resume a formação de NADH FADH2 e ATP nos passos sucessivos da oxidação da palmitoilCoA Ob serve que como a ativação do palmitato a palmitoilCoA quebra duas ligações fosfoanidrido do ATP Figura 175 o custo energético de ativar um ácido graxo é equivalente a 2 ATP e o ganho líquido por molécula de palmitato são 106 ATP A variação da energialivre padrão para a oxidação do palmitato a CO2 e H2O é aproximadamente 9800 kJmol Sob condições padrão a energia recuperada na forma de energia da ligação fosfato do ATP é 106 3 305 kJmol 5 3230 kJmol cerca de 33 do máximo teórico Entretanto Oxidação de isoleucina leucina valina Ciclo do ácido cítrico b oxidação FIGURA 179 A sequência de reações conservadas para introduir uma função carbonil no carbono b e formar uma carboxila A via de boxidação para formar acilCoA graxo a via de succinato a oxaloacetato no ciclo do ácido cítrico e a via pelo qual os esqueletos de carbonos desamina dos da isoleucina leucina e valina são oxidados como combustíveis usam as mesmas sequências de reações Nelson6edbookindb 675 Nelson6edbookindb 675 030414 0745 030414 0745 676 DAVID L NELSON MICHAEL M COX QUADRO 171 Ursos gordos realizam boxidação durante o sono Muitos animais dependem da gordura armazenada para obter energia durante a hibernação em períodos migra tórios e em outras situações envolvendo ajustes meta bólicos radicais Um dos ajustes mais pronunciados do metabolismo de gorduras ocorre nos ursospardos em hibernação Esses animais permanecem em estado con tínuo de dormência por períodos de até sete meses Dife rente da maioria das espécies hibernante o urso mantém a temperatura corporal entre 32 e 35C próxima ao nível normal não hibernando Embora gaste aproximada mente 25000 kJdia 6000 kcaldia o urso não come bebe urina ou defeca por meses seguidos Estudos experimentais mostraram que os ursos pardos em hibernação utilizam a gordura corporal como seu único combustível A oxidação das gorduras produz energia suficiente para manter a temperatura corporal a síntese ativa de aminoácidos e proteínas e outras atividades que requerem energia como o trans porte de membrana A oxidação das gorduras também libera grandes quantidades de água como descrito no texto que repõem a água perdida na respiração O glicerol liberado pela degradação dos triacilgliceróis é convertido em glicose sanguínea pela gliconeogênese A ureia formada durante a degradação de aminoácidos é reabsorvida nos rins e reciclada os grupos aminos são reutilizados para produzir novos aminoácidos para man ter as proteínas corporais Os ursos armazenam uma enorme quantidade de gor dura corporal quando em preparação para o seu longo sono Um ursopardo adulto consome cerca de 38000 kJ dia durante o final da primavera e o verão mas à medida que o inverno se aproxima ele come durante 20 horas por dia consumindo até 84000 kJ por dia Essa mudança na alimentação é uma resposta a uma mudança sazonal na secreção de hormônios Grandes quantidades de triacil gliceróis são formadas a partir da grande ingestão de car boidratos durante o período de engorda Outras espécies hibernantes incluindo o minúsculo arganaz camundon go silvestre também acumulam grandes quantidades de gordura corporal Um ursopardo prepara seu ninho de hibernação perto do rio McNeil no Canadá TABELA 171 Produção de ATP durante a oxidação de uma molécula de palmitoilCoA em CO2 e H2O Enzima que catalisa o passo de oxidação Quantidade de NADH ou FADH2 formado Quantidade de ATP formado no final AcilCoAdesidrogenase 7 FADH2 105 bHidroxiacilCoAdesidrogenase 7 NADH 175 Isocitratodesidrogenase 8 NADH 20 aCetoglutaratodesidrogenase 8 NADH 20 SuccinilCoAsintetase 8 Succinatodesidrogenase 8 FADH2 12 Malatodesidrogenase 8 NADH 20 Total 108 Esses cálculos pressupõem que a fosforilação oxidativa mitocondrial produz 15 ATP por FADH2 oxidado e 25 ATP por NADH oxidado O GTP produzido diretamente nesse passo produz ATP na reação catalisada pela nucleosídeodifosfatocinase p 526 Nelson6edbookindb 676 Nelson6edbookindb 676 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 677 quando as mudanças de energialivre são calculadas a partir das concentrações reais de reagentes e produtos nas condi ções intracelulares ver Problema Resolvido 132 p 519 a recuperação de energialivre é maior que 60 a conserva ção de energia é notavelmente eficiente A oxidação de ácidos graxos insaturados requer duas reações adicionais A sequência descrita de oxidação dos ácidos graxos é típi ca quando o ácido graxo é saturado ou seja tem apenas ligações simples na sua cadeia de carbonos Entretanto a maioria dos ácidos graxos nos triacilgliceróis e fosfolipí deos de animais e plantas é insaturada tendo uma ou mais ligações duplas Essas ligações estão na configuração cis e não podem sofrer a ação da enoilCoA hidratase a enzima que catalisa a adição de H2O às ligações duplas trans da D 2enoilCoA gerada durante a boxidação Duas enzimas auxiliares são necessárias para a boxidação dos ácidos graxos insaturados comuns uma isomerase e uma redu tase Essas reações auxiliares podem ser ilustradas com dois exemplos O oleato é um ácido graxo abundante monoinsaturado com 18 átomos de carbono e com uma ligação dupla cis entre C9 e C10 simbolizada por D 9 No primeiro pas so de oxidação o oleato é convertido a oleoilCoA e como os ácidos graxos saturados entra na matriz mitocondrial pelo ciclo da carnitina Figura 176 A oleoilCoA então passa três vezes pelo ciclo de oxidação dos ácidos graxos para produzir três moléculas de acetilCoA e o éster de coenzima A de um ácido graxo insaturado de 12 átomos de carbono D 3 a cisD 3dodecenoilCoA Figura 1710 Esse produto não pode servir de substrato para a enoil CoAhidratase que atua apenas em ligações duplas trans A enzima auxiliar D 3 D 2enoilCoAisomerase isomeriza a cisD 3enoilCoA a transD 2enoilCoA que é convertida pela enoilCoAhidratase à LbhidroxiacilCoA correspon dente transD 2dodecenoilCoA Esse intermediário en tão sofre a ação das enzimas restantes da boxidação para produzir acetilCoA e o éster de coenzima A de um ácido graxo saturado de 10 carbonos o decanoilCoA Esse últi mo sofre quatro passagens pela via de boxidação para pro duzir mais cinco moléculas de acetilCoA No total nove acetilCoA são produzidas a partir de uma molécula de ole ato de 18 carbonos A outra enzima auxiliar uma redutase é necessária para a oxidação de ácidos graxos poliinsaturados por exemplo o linoleato de 18 carbonos que tem configuração cisD 9 cisD 12 Figura 1711 A linoleoilCoA sofre três passagens pela sequência de boxidação para produzir três moléculas de acetilCoA e o éster de coenzima A de um áci do graxo insaturado de 12 carbonos com uma configuração cisD 3cisD 6 Esse intermediário não pode ser utilizado pe las enzimas da via da boxidação suas ligações duplas estão na posição errada e possuem uma configuração errada cis não trans Entretanto a ação combinada da enoilCoAiso merase e da 24dienoilCoAredutase como mostrado na Figura 1711 permite e reentrada desse intermediário na via da boxidação e a sua degradação a 6 acetilCoA O resultado global é a conversão de linoleato a nove moléculas de acetilCoA A oxidação completa de ácidos graxos de número ímpar requer três reações extras Embora a maioria dos lipídeos de ocorrência natural conte nha ácidos graxos com um número par de átomos de carbo no os ácidos graxos com um número ímpar de carbonos são comuns nos lipídeos de muitas plantas e de alguns organis mos marinhos O gado e outros animais ruminantes formam grandes quantidades de propionato de três carbonos CH3CH2COO 2 durante a fermentação dos carboi dratos no rúmen O propionato é absorvido pelo sangue e oxidado pelo fígado e outros tecidos Pequenas quantidades de propionato são adicionadas como um inibidor de mofo em alguns pães e cereais entrando assim na dieta humana Ácidos graxos de cadeia longa de número ímpar são oxi dados na mesma via que os ácidos de número par iniciando na extremidade carboxil da cadeia Entretanto o substra to para a última passagem pela sequência de boxidação é um acilCoA graxo com um ácido graxo de cinco carbonos 18 1 9 SCoA O C boxidação cinco ciclos SCoA H C H O D 3 D 2enoilCoAisomerase SCoA H C O H boxidação três ciclos 3 AcetilCoA 6 AcetilCoA OleoilCoA transD2 DodecenoilCoA cisD3 DodecenoilCoA 12 12 FIGURA 1710 Oxidação de um ácido graxo monoinsaturado O ácido oleico como oleoilCoA D 9 é o exemplo utilizado aqui A oxidação requer uma enzima adicional enoilCoAisomerase para reposicionar a ligação dupla convertendo o isômero cis em um isômero trans um intermediário normal na boxidação Nelson6edbookindb 677 Nelson6edbookindb 677 030414 0745 030414 0745 678 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Quando é oxidado e clivado os produtos são acetilCoA e propionilCoA A acetilCoA pode ser oxidada no ciclo do ácido cítrico é claro mas a propionilCoA entra em uma via diferente contendo três enzimas A propionilCoA é primeiro carboxilada para formar o estereoisômero D da metilmalonilCoA Figura 1712 pela propionilCoAcarboxilase que contém biotina como cofator Nessa reação enzimática como na reação da piruvatocarboxilase ver Figura 1617 o CO2 ou seu íon hidratado HCO3 2 é ativado pela ligação à biotina antes de sua transferência para o substrato nesse caso a porção propionato A formação do intermediário carboxibiotina requer energia que é fornecida pelo ATP A Dmetilmalo nilCoA assim formada é enzimaticamente epimerizada ao seu estereoisômero L pela metilmalonilCoAepimerase Figura 1712 A LmetilmalonilCoA então sofre um rear ranjo intramolecular para formar succinilCoA que pode entrar no ciclo do ácido cítrico Esse rearranjo é catalisado pela metilmalonilCoAmutase que requer como coen zima 59desoxiadenosilcobalamina ou coenzima B12 que é derivada da vitamina B12 cobalamina O Quadro 172 descreve o papel da coenzima B12 nessa notável rea ção de troca A oxidação dos ácidos graxos é estritamente regulada A oxidação dos ácidos graxos consome um combustível pre cioso e é regulada de forma que ocorra apenas quando hou ver a necessidade de energia No fígado a acilgraxoCoA formada no citosol tem duas vias principais abertas 1 b oxidação por enzimas na mitocôndria ou 2 conversão em triacilgliceróis e fosfolipídeos por enzimas no citosol A via tomada depende da taxa de transferência de acilgraxos CoA de cadeia longa para dentro da mitocôndria O pro AcetilCoA boxidação um ciclo e primeira oxidação do segundo ciclo NADPH 1 H1 NADP1 EnoilCoA isomerase 3 18 C 9 6 12 2a boxidação quatro ciclos 3 AcetilCoA 1 4 2 5 3 24dienoilCoA redutase D3 D2enoilCoA isomerase boxidação três ciclos 5 AcetilCoA LinoleoilCoA cisD9cisD12 transD2 cisD3cisD6 transD2cisD6 transD2cisD4 transD3 SCoA C O SCoA C O 2a 5 5 3b 3b 4 6 4 C SCoA O SCoA O 1 SCoA C O 4 1 2 5 3 SCoA C O 4 1 2 12 12 10 10 10 FIGURA 1711 Oxidação de um ácido graxo poliinsaturado O exem plo aqui é o ácido linoleico como linoleoilCoA D 912 A oxidação requer uma segunda enzima auxiliar além da enoilCoAisomerase a 24dienoil CoAredutase dependente de NADPH A ação combinada dessas duas en zimas converte um intermediário transD 2cisD 4dienoilCoA ao substrato transD 2enoilCoA necessário para a boxidação H C O HCO3 2 PropionilCoA ATP ADP 1 Pi DMetilmalonilCoA LMetilmalonilCoA SuccinilCoA 2O O 2 PropionilCoA carboxilase biotina H C C C H H O H C CoAS O H C C H H H H C O H C C H H H C O O 2 H C C H H C O C O MetilmalonilCoA epimerase CoAS CoAS CoAS Metil malonil CoAmutase coenzima B12 FIGURA 1712 Oxidação da propionilCoA produzida pela boxida ção de ácidos graxos de número ímpar A sequência envolve a carboxi lação do propionilCoA em DmetilmalonilCoA e a conversão desse último em succinilCoA Esta conversão requer a epimerização de D a Lmetilmalo nilCoA seguida por uma reação notável na qual os substituintes em átomos de carbono adjacentes trocam de posição ver Quadro 172 Nelson6edbookindb 678 Nelson6edbookindb 678 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 679 cesso de três passos ciclo da carnitina pelo qual os grupos acilgraxosCoA são carregados da acilCoA graxo citosólica para a matriz mitocondrial Figura 176 é o limitante para a oxidação de ácidos graxos sendo um ponto de regulação importante Uma vez que os grupos acilgraxos entram na mitocôndria eles estão destinados à oxidação em acetil CoA A malonilCoA o primeiro intermediário na biossínte se citosólica de ácidos graxos de cadeia longa a partir da acetilCoA ver Figura 212 tem sua concentração aumen tada quando o animal está bem suprido de carboidratos o excesso de glicose que não pode ser oxidado ou armazena do como glicogênio é convertido em ácidos graxos no ci tosol para armazenamento como triacilglicerol A inibição da carnitinaaciltransferase I pela malonilCoA Figura 17 13 garante que a oxidação de ácidos graxos seja inibida quando o fígado está amplamente suprido de glicose como combustível e está produzindo triacilgliceróis a partir do excesso de glicose 2OOC CH2 SCoA C O MalonilCoA Duas das enzimas da boxidação também são regula das por metabólitos que sinalizam a suficiência de energia Quando a razão NADHNAD 1 é alta a bhidroxiacilCoA desidrogenase é inibida além disso altas concentrações de acetilCoA inibem a tiolase Lembrese do Capítulo 15 que durante períodos de contração muscular vigorosa ou durante o jejum a queda na ATP e o aumento da AMP ativam a proteínacinase ativada por AMP AMPK de AMPactivated protein ki nase A AMPK fosforila várias enzimasalvo incluindo a acetilCoAcarboxilase que catalisa a síntese de malonil CoA Essa fosforilação e consequentemente a inibição da acetilCoAcarboxilase diminui a concentração de malonil CoA aliviando a inibição do transporte de acilcarnitina graxo para a mitocôndria Figura 1713 e permitindo que a boxidação reabasteça o suprimento de ATP Fatores de transcrição ativam a síntese de proteínas do catabolismo de lipídeos Além dos vários mecanismos regulatórios de curta duração que modulam a atividade de enzimas existentes a regula ção transcricional pode variar o número de moléculas das enzimas da oxidação dos ácidos graxos em uma escala de tempo maior de minutos a horas A família PPAR receptor ativado por proliferadores de peroxissomos de receptores nucleares são fatores de transcrição que afetam muitos pro cessos metabólicos em resposta a uma variedade de ligantes semelhantes aos ácidos graxos Eles foram originalmente identificados como receptores ativados por proliferadores de peroxissomos em seguida observouse que funcionam mais amplamente O PPARa age no músculo tecido adipo so e no fígado para ativar um grupo de genes essenciais para a oxidação de ácidos graxos incluindo os transportadores Síntese de ácidos graxos bOxidação de ácidos graxos boxidação Carboidrato da dieta Glicose alta no sangue Insulina Inativa Glucagon PKA AMPK ACC ACC Glicose baixa no sangue AcilCoA graxo Carnitina AcilCoA graxo CoASH FADH2 NADH AcetilCoA Carnitinaacil graxo Carnitinaacil graxo Mitocôndria AcetilCoA MalonilCoA Glicose Ácidos graxos Carnitinaacil transferase I Múltiplos passos Glicólise complexo da piruvato desidrogenase P fosfatase Pi ❶ ❷ ❸ ❻ ❺ ❹ ❼ ❽ FIGURA 1713 Regulação coordenada da síntese e da degradação dos ácidos graxos Quando a dieta disponibiliza uma fonte imediata de carboidratos como combustível a boxidação dos ácidos graxos é desne cessária sendo portanto desativada Duas enzimas são essenciais na coor denação do metabolismo dos ácidos graxos a acetilCoAcarboxilase ACC primeira enzima na síntese dos ácidos graxos ver Figura 211 e a carnitina aciltransferase I que limita o transporte de ácidos graxos para dentro da matriz mitocondrial para a boxidação ver Figura 176 A ingestão de uma refeição rica em carboidratos aumenta o nível de glicose no sangue e por tanto ➊ ativa a liberação de insulina ➋ A proteínafosfatase dependente de insulina desfosforila a ACC ativandoa ➌ A ACC catalisa a formação de malonilCoA o primeiro intermediário da síntese de ácidos graxos e ➍ o malonilCoA inibe a carnitinaaciltransferase I impedindo assim a entrada de ácidos graxos na matriz mitocondrial Quando baixam os níveis de glicose no sangue entre as refeições ➎ a liberação de glucagon ativa a proteínacinase dependente de cAMP PKA que ➏ fosforila e inativa a ACC Com a baixa concentração de malonilCoA a inibição da entrada de ácidos graxos na mitocôndria é aliviada e ➐ os ácidos graxos entram na matriz mitocondrial e ➑ tornamse o principal combustível Como o glucagon também ativa a mobilização de ácidos graxos no tecido adiposo um suprimento de ácidos graxos começa a chegar ao sangue Nelson6edbookindb 679 Nelson6edbookindb 679 030414 0745 030414 0745 Na reação da metilmalonilCoAmutase ver Figura 17 12 o grupo COSCoA no C2 do propionato original troca de posição com um átomo de hidrogênio em C3 do propionato original Figura Q1a A coenzima B12 é o co fator para essa reação assim como para quase todas as enzimas que catalisam reações desse tipo Figura Q1b Esses processos dependentes de coenzima B12 estão den tre as poucas reações enzimáticas biológicas em que exis te a troca de um grupo alquil ou alquil substituído X com um átomo de hidrogênio em um carbono adjacente sem a mistura do átomo de hidrogênio transferido com o hidrogênio do solvente H2O Como pode o átomo de hidrogênio mover entre dois carbonos sem se mistu rar com o enorme excesso de átomos de hidrogênio do solvente A coenzima B12 é a forma cofator da vitamina B12 úni ca dentre todas as vitaminas por conter não apenas uma molécula orgânica complexa mas também um elemento traço essencial o cobalto O complexo sistema de anel da corrina da vitamina B12 colorido em azul na Figura Q2 ao qual o cobalto como Co 31 está coordenado é quimicamente relacionado ao sistema de anéis da porfi rina do heme e das hemeproteínas ver Figura 51 Uma quinta posição de coordenação do cobalto está preenchida pelo ribonucleotídeo dimetil benzimidazol sombreado em amarelo liga do covalentemente pelo seu grupo 39fosfato a uma cadeia lateral do anel corrina através do aminoisopropanol A formação desse cofa tor complexo ocorre em uma de apenas duas reações conhecidas em que o trifosfato do ATP é clivado Figura Q3 a outra reação é a formação de Sadenosilmetionina a partir de ATP e metionina ver Figura 1818 A vitamina B12 na forma em que geral mente é isolada é chamada cianocobalami na porque contém um grupo ciano capturado durante a purificação ligado ao cobalto na sexta posição de coorde nação Na 59deso xiadenosilcoba lamina o cofator para a metilmalonil CoAmutase o gru po ciano é substi tuído pelo grupo 59desoxiadenosil vermelho na Figura Q2 covalentemente ligado pelo C59 ao cobalto A estrutura tridi mensional do cofator foi determinada por Dorothy Crowfoot Hodgkin em 1956 por cristalografia por raios X A chave para entender como a coenzima B12 catalisa a troca de hidrogênio está nas propriedades da ligação covalente entre o cobalto e o C59 do grupo desoxiadenosil Fi gura Q2 Essa ligação é relativamente fra ca sua energia de dissociação da ligação é cerca de 110 kJmol comparada com 348 kJmol da ligação CC típi ca ou 414 kJmol da ligação CH A mera iluminação do composto com luz visível é suficiente para quebrar a liga ção CoC Essa fotolabilidade extrema provavelmente seja responsável pela ausência de vitamina B12 nas plan tas A dissociação produz um radical 59desoxiadenosil e a forma Co 21 da vitamina A função química da 59deso xiadenosilcobalamina é gerar radicais livres dessa forma iniciando uma série de transformações tal como aquela ilustrada na Figura Q4 um mecanismo postulado para a Dorothy Crowfoot Hodgkin 19101994 QUADRO 172 Coenzima B12 uma solução radical para um problema desconcertante H O H C C O C O2 H SCoA SuccinilCoA H H O C b C O2 H SCoA LMetilmalonilCoA metilmalonilCoA mutase coenzima B12 coenzima B12 O a H C C H C C H C X H X C C FIGURA Q1 N CH3 N N N HO 39 19 29 59 49 Co31 N N N N H H H H H CH3 CH3 CH3 CH2 CH2 CH3 CH2 CH2 CH3 CH3 CH2 C NH2 C O O CH2 NH CH2 HC CH3 O H OH H H H CH3 C O NH2 CH2 H2N CH2 CH2 CH2 C O CH2 O H OH H H CH 3 CH 2 O P O2 H N N O O CH3 OH Sistema de anel da corrina Amino isopropanol 59Desoxi adenosina Ribonucleotídeo dimetil benzimidazol NH2 C O CH2 NH2 C O NH2 C O NH2 FIGURA Q2 Nelson6edbookindb 680 Nelson6edbookindb 680 030414 0745 030414 0745 reação catalisada pela metilmalonilCoAmutase e várias outras transformações dependentes de coenzimas B12 Nesse mecanismo postulado o átomo de hidrogênio que migra nunca existe como uma espécie livre e consequen temente nunca está livre para trocar com o hidrogênio de moléculas de água ambiente A deficiência de vitamina B12 resulta em doença gra ve Essa vitamina não é sintetizada pelas plantas ou pelos animais e podem ser sintetizadas apenas por poucas espécies de microrganismos Ela é necessária para pes soas saudáveis apenas em quantidades pequenas cerca de 3 mgdia A anemia perniciosa doença grave resulta da falha da absorção eficiente de vitamina B12 pelo intesti no onde é sintetizada pelas bactérias intestinais ou obti da pela digestão da carne Indivíduos com essa doença não produzem quantidades suficientes do fator intrín seco glicoproteína essencial para absorção da vitamina B12 A patologia da anemia perniciosa inclui a produção reduzida de eritrócitos níveis reduzidos de hemoglobina e dano progressivo e severo do sistema nervoso central A administração de altas doses de vitamina B12 alivia esses sintomas em pelo menos alguns casos N N N N P NH2 O H HO Coenzima B12 H H OH CH2 Co 2O O P O O2 O P O O2 O2 H O ATP P O O P O O2 O P O O2 O2 O O2 O2 N N N N 39 19 29 59 49 NH2 O H HO H H OH CH2 H Cobalamina Co FIGURA Q3 N N N CH2 H C H N N N H C H N N N H C H H C C X N N N H C H H C C X C C X H Produto Radical livre 59desoxiadenosil Radical do substrato Radical tipo produto C H C X Substrato Radical livre 59desoxia denosil Coenzima B12 Co21 N Co31 N Co21 N Co21 N N N N Co21 N Desoxiadenosina Desoxiadenosina Desoxiadenosina Desoxiadenosina Desoxiadenosina rearranjo do radical O hidrogênio que migra nas etapas ➋ e ➍ nunca existe como espécie livre e não é trocado com os hidrogênios das moléculas de água dos arredores A ligação CoC sofre clivagem homolítica produzindo Co21 e o radical livre 59deso xiadenosil O radical é convertido a 59desoxiadenosina pela abstração de um átomo de hidrogênio do substrato produzindo um radical do substrato Um hidrogênio do 59CH3 da desoxiadenosina é devolvido ao radical tipo produto formando o produto A ligação entre o 59CH2 do radical desoxiadenosil e o cobalto é reformada regenerando o cofator B12 em sua forma estável Co31 pronto para passar por outra reação O radical do substrato é rearranjado produzindo um novo radical com o esqueleto de carbono do produto Para a metilmalonilCoAmutase o grupo que migra X é COSCoA MECANISMO FIGURA Q4 Nelson6edbookindb 681 Nelson6edbookindb 681 030414 0745 030414 0745 682 DAVID L NELSON MICHAEL M COX de acidos graxos carnitinaaciltransferases I e II acilgraxo intervalos longos entre as refeigdes para prevenir que 0 cor CoAdesidrogenases de cadeias acila curta média longae po mobilize suas reservas de gordura para obter energia 0 muito longa e enzimas relacionadas Essa resposta é dispa prognoéstico para esses individuos é bom rada quando uma célula ou organismo tem uma demanda Mais de 20 outros defeitos genéticos em humanos para aumentada por energia do catabolismo das gorduras tal o transporte ou oxidacéo de acidos graxos tem sido docu como durante o jejum entre as refeigdes ou sob condigaéo de mentado a maioria muito menos comum que o defeito na fome por longo periodo O glucagon liberado em respostaa MCAD Um dos disttirbios mais severos resulta da perda da baixa concentragao de glicose no sangue pode agir por meio atividade BhidroxiacilCoAdesidrogenase de cadeia longa do cAMP e do fator de transcricao CREB para ativar certos da proteina trifuncional TFP Outros disttrbios incluem genes para 0 catabolismo de lipideos defeitos nas subunidades a ou B que afetam todas as trés Outra situagaéo acompanhada por grandes mudangas naatividades da TFP e causam doencas cardiacas graves e expressao das enzimas da oxidagao dos acidos graxos 6a musculo esquelético anormal transigao do metabolismo fetal para o neonatal no coragao No feto 0s combustiveis principais Sao glicose lactato mas no Q peroxissomos também realizam Boxidacao coragao do neonato os acidos graxos sao 0 principal combus tivel No momento dessa transicdo o PPARa é ativado que A matriz mitocondrial é 0 principal local de oxidacao de aci por sua vez ativa os genes essenciais para 0 metabolismo dos 40S graxos nas células animais mas em certas células ou Acidos graxos Como sera visto no Capitulo 23 dois outros fa tos compartimentos também contem as enzimas capazes tores de transcricao da familia PPAR também desempenham de oxidar acidos graxos a acetilCoA por uma via similar papéis cruciais no ajuste dos complementos das enzimase Mas nao idéntica aquela mitocondrial Em células vegetais consequentemente as atividades metabdlicas de tecidoses 9 principal local da Boxidagao nao a mitocondria mas os pecificos em periodos especificos ver Figura 2342 peroxissomos O principal local de oxidacdo dos Acidos graxos no des Nos peroxissomos organelas de células animais e ve canso e durante 0 exercicio 6 0 mtisculo esquelético Otreino getais envoltas por membrana os intermediarios para a B para exercicios de resisténcia aumenta a expressio de PPA Oxidagao dos acidos graxos sao derivados da coenzima A e Ra no miisculo levando a niveis elevados das enzimas de oxi 9 Processo consiste em quatro etapas como na Boxidagao dacio dos dcidos graxos e aumento da capacidade oxidativa mitocondrial Figura 1714 1 desidrogenacao 2 adi do musculo cao de agua a dupla ligacao resultante 3 oxidacao do B hidroxiacilCoA a uma cetona e 4 clivagem tiolitica pela Defeitos genéticos nas acilCoAgraxodesidrogenases Oomziima A As reacoes idénticas também ocorrem nos glioxissomos como discutidos abaixo causam doencas graves Uma diferenca entre as vias peroxissomal e mitocon Os triacilglicerdis estocados sao as principais fontes de drial esta na quimica da primeira etapa Nos peroxissomos energia para a contracao muscular e aincapacidade de a flavoproteina acilCoA oxidase que introduz a dupla liga oxidar Acidos graxos a partir de triacilglicerdis tem sérias 40 passa os elétrons diretamente ao O produzindo H0 consequéncias para a satide O defeito genético mais comum Figura 1714 Por isso o nome peroxissomos Esse no catabolismo de acidos graxos nos EUA e em populacédes Oxidante forte e potencialmente danoso é imediatamente do norte da Europa é devido a uma mutacio no gene que Clivado a H0 e O pela catalase Lembrese que na mito codifica a acilCoAdesidrogenase de cadeia média cOndria os elétrons removidos na primeira etapa de oxida MCAD Dentre os europeus setentrionais a frequéncia de a0 passam pela cadeia respiratoria até o O para produzir portadores individuos com essa mutacdo recessivaemum H0 e esse processo 6 acompanhado pela sintese de ATP de dois cromossomos hom6logos é cerca de 1 em 40e cerca Nos peroxissomos a energia liberada na primeira etapa oxi de 1 individuo em 10000 tem a doenca ou seja tem duas dativa da degradagao dos acidos graxos nao é conservada copias do alelo de MCAD mutante e é incapaz de oxidar dci como ATP mas sim dissipada como calor dos graxos de 6 a 12 dtomos de carbonos A doenga é carac Uma segunda diferenga importante entre a Boxida terizada por episddios recorrentes de uma sindrome que in cao mitocondrial e a peroxissomal em mamiferos é a clui acimulo de gordura no figado altos niveis sanguineos de especificidade para as acilCoA graxos 0 sistema peroxisso Acido octanoico 80 baixo nivel de glicose no sangue hi mal é muito mais ativo sobre acidos graxos de cadeia muito poglicemia sonoléncia vomito e coma O perfil dos acidos longa tal como Acido fitanico e Acido pristanico ver Figura organicos na urina auxilia no diagnéstico da doenga geral 1718 Esses acidos graxos menos comuns sao obtidos na mente a urina contém altos niveis de acidos dicarboxilicos de dieta a partir de produtos lacteos de gordura de animais 6 a 10 carbonos produzidos por woxidacaéo e baixos niveis ruminantes carne e peixe Seu catabolismo no peroxissomo de corpos ceténicos urinarios a woxidacao é discutida abai envolve varias enzimas auxiliares exclusivas dessa organela xo e corpos cetdnicos na Secao 173 Embora talvez os in A incapacidade de oxidar esses compostos é responsavel dividuos nao apresentem sintomas entre os episddios esses por varias doencas humanas graves Individuos com a sin sao muito graves a mortalidade dessa doenca é de 25 a drome de Zellweger sao incapazes de formar peroxisso 60 na primeira infancia Se o defeito genético for detectado mos e consequentemente carecem de todo metabolismo logo apés o nascimento 0 recémnascido pode receber uma exclusivo aquela organela Na adrenoleucodistrofia liga dieta pobre em gordura e rica em carboidratos Comadetec daao X XALD os peroxissomos falham em oxidar aci cao precoce e gestao cuidadosa da dieta inclusive evitando dos graxos de cadeia muito longa aparentemente pela per PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 683 da de um transportador funcional para esses ácidos graxos na membrana peroxissomal Ambos os defeitos levam ao acúmulo no sangue de ácidos graxos de cadeia muito longa especialmente 260 XALD afeta meninos jovens com idade inferior a 10 anos causando perda de visão transtornos de comportamento e morte dentro de poucos anos Em mamíferos altas concentrações de gorduras na dieta resultam em síntese aumentada das enzimas peroxissomais da boxidação no fígado Os peroxissomos hepáticos não contêm as enzimas do ciclo do ácido cítrico e não podem ca talisar a oxidação de acetilCoA a CO2 Em vez disso os áci dos graxos de cadeia longa ou ramificados são catabolizados a produtos de cadeia curta tal como hexanoilCoA que são exportados para a mitocôndria e completamente oxidados Os peroxissomos e glioxissomos vegetais usam acetil CoA da boxidação como precursor biossintético Em plantas a oxidação dos ácidos graxos não ocorre princi palmente na mitocôndria mas nos peroxissomos do tecido foliar e nos glioxissomos das sementes em germinação Os peroxissomos e glioxissomos de plantas são semelhantes em estrutura e função os glioxissomos que ocorrem ape nas em sementes em germinação podem ser considerados peroxissomos especializados O papel biológico da boxida ção nessas organelas é usar lipídeos estocados principal mente para prover precursores biossintéticos não energia Durante a germinação de sementes os triacilgliceróis estocados são convertidos em glicose sacarose e em uma ampla variedade de metabólitos essenciais Figura 17 15 Os ácidos graxos liberados a partir dos triacilgliceróis são primeiro ativados aos seus derivados de coenzima A e oxidados nos glioxissomos pelo mesmo processo de qua tro etapas que ocorre nos peroxissomos Figura 1714 O acetilCoA produzido é convertido por meio do ciclo do glioxilato a precursores de quatro carbonos para a glico neogênese ver Figura 1624 Os glioxissomos como os peroxissomos contêm altas concentrações de catalase que converte o H2O2 produzido pela boxidação a H2O e O2 As enzimas da boxidação de organelas diferentes divergiram durante a evolução Embora as reações da boxidação na mitocôndria sejam es sencialmente as mesmas daquelas nos peroxissomos e nos glioxissomos as enzimas isoenzimas diferem significa tivamente entre os dois tipos de organelas As diferenças aparentemente refletem uma divergência evolutiva que C O R SCoA CoASH CoASH H2O H2O Mitocôndria Peroxissomoglioxissomo FAD FADH2 H2O2 O2 NAD NADH O2 H2O Cadeia respiratória Cadeia respiratória FAD ATP FADH2 O2 H2O NAD NADH H2O 1 1 2O2 R CH2 CH2 C SCoA O C O C R H C C O CH2 C R H OH C O CH2 C O R C O CH3 1 NADH exportado para reoxidação H SCoA SCoA SCoA SCoA ATP Ciclo do ácido cítrico AcetilCoA exportada FIGURA 1714 Comparação entre a boxidação nas mitocôndrias e nos peroxissomos e glioxissomos O sistema peroxissomalglioxissomal difere do sistema mitocondrial em três aspectos 1 o sistema peroxissomal prefere ácidos graxos de cadeia muito longa 2 no primeiro passo oxidativo os elétrons passam diretamente para o O2 gerando H2O2 e 3 o NADH for mado no segundo passo oxidativo não pode ser reoxidado no peroxissomo ou no glioxissomo então equivalentes redutores são exportados ao citosol e finalmente entram nas mitocôndrias A acetilCoA produzida pelos pero xissomos e glioxissomos também é exportada o acetato dos glioxissomos organelas encontradas apenas nas sementes em germinação serve como um precursor biossintético ver Figura 1715 A acetilCoA produzida nas mi tocôndrias é oxidada mais adiante no ciclo do ácido cítrico Triacilgliceróis da semente Ácidos graxos AcetilCoA Oxaloacetato Glicose Sacarose polissacarídeos Aminoácidos Energia Nucleotídeos Intermediários metabólicos Lipases boxidação Ciclo do glioxilato Gliconeogênese FIGURA 1715 Triacilgliceróis como fonte de glicose nas sementes A boxidação é um estágio em uma via que converte os estoques de triacil gliceróis em glicose nas sementes em germinação Mais detalhes na Figura 1624 Nelson6edbookindb 683 Nelson6edbookindb 683 030414 0745 030414 0745 684 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ocorreu muito cedo com a separação entre as bactérias grampositivas e gramnegativas ver Figura 16 Na mitocôndria as quatro enzimas da boxidação que atuam sobre os acilgraxosCoAs de cadeia curta são proteí nas solúveis distintas como descrito anteriormente simi lares em estrutura às enzimas análogas das bactérias gram positivas Figura 1716a As bactérias gramnegativas têm quatro atividades em três subunidades solúveis Figura 1716b e o sistema enzimático eucariótico que atua sobre os ácidos graxos de cadeia longa a proteína trifuncional TFP tem três atividades enzimáticas em duas subunida des que estão associadas à membrana Figura 1716c As enzimas da boxidação dos peroxissomos e glioxissomos vegetais no entanto formam um complexo de proteínas cada uma contendo quatro atividades enzimáticas em uma única cadeia polipeptídica Figura 1716d A primeira en zima a acilgraxooxidase é uma cadeia polipeptídica úni ca a proteína multifuncional MFP contém a segunda e a terceira atividade enzimática enoilCoAhidratase e hi droxiacilCoAdesidrogenase assim como duas atividades auxiliares necessárias para a oxidação dos ácidos graxos insaturados D3hidroxiacilCoAepimerase e D 3 D 2enoil CoAisomerase a quarta enzima tiolase é um polipeptí deo solúvel distinto É interessante que as enzimas que catalisam essencial mente o inverso da boxidação para a síntese dos ácidos graxos também estão organizadas de forma diferente em bactérias e em eucariotos nas bactérias as sete enzimas necessárias para a síntese dos ácidos graxos são polipeptí deos distintos já em mamíferos todas as sete atividades fa zem parte de uma única e grande cadeia polipeptídica Uma vantagem para a célula em ter várias enzimas da mesma via codificadas em uma única cadeia polipeptídica é solucionar o problema da regulação da síntese de enzimas que devem interagir funcionalmente a regulação da expressão de um gene garante a produção do mesmo número de sítios ativos para todas as enzimas da via Quando cada atividade enzi mática está em polipeptídeos distintos algum mecanismo é necessário para coordenar a síntese de todos os produtos gênicos A desvantagem em ter várias atividades no mes mo polipeptídeo é que quanto maior a cadeia polipeptídi ca maior é a probabilidade de um erro em sua síntese um único aminoácido incorreto na cadeia pode tornar inúteis todas as atividades enzimáticas naquela cadeia A compara ção das estruturas gênicas para essas proteínas em muitas espécies pode esclarecer as razões para a seleção de uma ou outra estratégia durante a evolução A voxidação de ácidos graxos ocorre no retículo endoplasmático Embora a boxidação mitocondrial na qual enzimas atuam na extremidade carboxil de um ácido graxo seja o desti no catabólico mais importante para os ácidos graxos nas células animais existe outra via em algumas espécies in cluindo vertebrados que envolve a oxidação do carbono v ômega o carbono mais distante do grupo carboxila As enzimas exclusivas da voxidação estão localizadas em vertebrados no retículo endoplasmático do fígado e dos rins e os substratos preferidos são os ácidos graxos de 10 a Produto Produto Enz1 Enz2 Intermediário Intermediário Intermediário Substrato a Bactéria grampositiva e sistema mitocondrial específico para cadeia curta d Sistema peroxissomal e glioxissomal de plantas b Bactéria gramnegativa c Sistema mitocondrial específico para cadeia muito longa Produto Enz4 Enz2 Enz3 Enz1 Enz1 Substrato Enz2 Enz6 Enz5 Enz3 Enz4 Enz4 Enz3 Substrato Produto Membrana Interna Enz1 Matriz Enz4 Enz3 Enz2 Substrato MFP FIGURA 1716 As enzimas da boxidação As diferentes estruturas das subunidades das enzimas da boxidação em bactérias grampositivas e gramnegativas mitocôndrias e peroxis somos e glioxissomos das plantas estão mostradas aqui Enz1 é acilCoAdesidrogenase Enz2 enoilCoAhidratase Enz3 LbhidroxiacilCoAdesidrogenase Enz4 tiolase Enz5 D3hidroxiacil CoAepimerase e Enz6 D 3D 2enoilCoAisomerase a As quatro enzimas da boxidação nas bactérias grampositivas são entidades separadas e solúveis como as do sistema específico para cadeias curtas das mitocôndrias b Nas bactérias gramnegativas as quatro atividades enzimá ticas residem em três polipeptídeos Enz2 e Enz3 são partes de uma única cadeia polipeptídica c O sistema específico para cadeias muito longas das mitocôndrias também é composto por três polipeptídeos um dos quais inclui as atividades da Enz2 e da Enz3 nesse caso o sistema está ligado à membrana mitocondrial interna d Nos sistemas de boxidação peroxissomal e glioxissomal das plantas Enz1 e Enz4 são polipeptídeos separados mas Enz2 e Enz3 bem como duas enzimas auxiliares Enz5 e Enz6 são parte de uma única cadeia polipeptídica a proteína multifuncional MFP Nelson6edbookindb 684 Nelson6edbookindb 684 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 685 12 átomos de carbonos Em mamíferos a voxidação é nor malmente uma via minoritária para a degradação de ácidos graxos mas quando a boxidação está defeituosa p ex devido a uma mutação ou uma deficiência de carnitina ela se torna mais importante A primeira etapa introduz um grupamento hidroxil no carbono v Figura 1717 O oxigênio para esse gru pamento vem do oxigênio molecular O2 em uma reação complexa que envolve o citocromo P450 e o doador de elétrons NADPH As reações desse tipo são catalisadas pe las oxidases de função mista descritas no Quadro 21 1 Agora mais duas enzimas atuam sobre o carbono v a álcooldesidrogenase oxida o grupamento hidroxil a um aldeído e a aldeídodesidrogenase oxida o grupamento aldeído a um ácido carboxílico produzindo um ácido graxo com um grupo carboxil em cada extremidade Neste ponto as duas extremidades podem ser acopladas à coenzima A e a molécula pode entrar na mitocôndria e sofrer boxidação pela via normal Em cada passagem pela via de boxidação o ácido graxo de terminação dupla gera ácidos dicarboxí licos tal como o ácido succínico que pode entrar no ciclo do ácido cítrico e o ácido adípico Figura 1717 O ácido fitânico sofre aoxidação nos peroxissomos A presença de um grupamento metil no carbono b de um ácido graxo torna a boxidação impossível e esses ácidos graxos ramificados são catabolizados nos peroxisso mos de células animais por aoxidação Na oxidação do ácido fitânico por exemplo Figura 1718 o fitanoilCoA é hidroxilado em seu carbono a em uma reação que envol O2 C CH210 O CH3 O2 C CH210 O CH2 HO NADPH O2 Oxidase de função mista NADP1 NAD1 Álcool desidrogenase NADH O2 C C CH210 O O H O2 2O C C CH210 O O O2 2O C C CH22 O O O2 2O C C CH24 O O NAD1 Aldeído desidrogenase boxidação AcetilCoA NADH Adipato ácido adípico Succinato v FIGURA 1717 A voxidação de ácidos graxos no retículo endoplas mático Esta alternativa à boxidação começa com a oxidação do carbono mais distante do carbono b o carbono v ômega O substrato geralmente é um ácido graxo de cadeia média o ácido láurico laurato é mostrado aqui Essa via geralmente não é a principal via para o catabolismo oxidativo de ácidos graxos COOH b FitanoilCoA sintetase FitanoilCoA AMP PPi ATP CoASH Ácido fitânico aHidroxifitanoilCoA boxidação PropionilCoA FitanoilCoA hidroxilase ahidroxifitanoil CoAliase Aldeído desidrogenase CO SCoA CO2 aCetoglutarato ascorbato succinato Fe21 CO SCoA OH Ácido fórmico FormilCoA 2 CO C O H Pristanal NADPH NADP1 COOH Ácido pristânico 4812Trimetiltri decanoilCoA C O SCoA 1 C O SCoA CH CH2 3 FIGURA 1718 A aoxidação de um ácido graxo de cadeia ramificada ácido fitânico nos peroxissomos O ácido fitânico tem um carbono b com um substituinte metil e portanto não pode sofrer boxidação A ação combinada das enzimas mostradas aqui remove o carbono do grupo car boxil do ácido fitânico para produzir ácido pristânico no qual o carbono b não está substituído permitindo a boxidação Observe que a boxidação do ácido pristânico libera propionilCoA e não acetilCoA Esta é posteriormen te catabolizada como na Figura 1712 Os detalhes da reação que produz pristanal continuam controversos Nelson6edbookindb 685 Nelson6edbookindb 685 030414 0745 030414 0745 686 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ve oxigênio molecular descarboxilado para formar um alde ído mais curto em um carbono e então oxidado ao ácido carboxílico correspondente que agora não tem nenhum substituinte no carbono b e pode ser oxidado por boxida ção A doença de Refsum resultante de um defeito gené tico na fitanoilCoAhidroxilase leva a níveis sanguíneos muito elevados de ácido fitânio e problemas neurológicos severos incluindo cegueira e surdez RESUMO 172 Oxidação de ácidos graxos c Na primeira etapa da boxidação quatro reações reti ram cada unidade de acetilCoa da extremidade carbo xila de um acilCoA graxo saturado 1 desidrogenação dos carbonos a e b C2 e C3 pelas acilCoAdesidro genases ligadas à FAD 2 hidratação da dupla ligação transD 2 resultante pela enoilCoAhidratase 3 desi drogenação do LbhidroxiacilCoA resultante pela bhi droxiacilCoAdesidrogenase ligada à NAD e 4 cliva gem por CoA do bcetoacilCoA resultante pela tiolase para formar acetilCoA e um acilCoA graxo encurtado em dois carbonos O acilCoA graxo encurtado entra de novo na sequência de reações c Na segunda etapa da oxidação dos ácidos graxos o ace tilCoa é oxidado a CO2 no ciclo do ácido cítrico Uma grande fração do rendimento teórico de energia livre da oxidação dos ácidos graxos é recuperada como ATP pela fosforilação oxidativa a etapa final da via oxidativa c MalonilCoA intermediário inicial na síntese de ácidos graxos inibe a carnitinaaciltransferase I prevenindo a entrada dos ácidos graxos na mitocôndria Isso bloqueia a degradação dos ácidos graxos enquanto ocorre a síntese c Defeitos genéticos na acilCoAdesidrogenase de ca deia média resulta em doenças humanas graves assim como mutações em outros componentes do sistema de boxidação c A oxidação de ácidos graxos insaturados requer duas enzimas adicionais a enoilCoAisomerase e a 24die noilCoAredutase Ácidos graxos de número ímpar são oxidados pela via de boxidação gerando acetilCoa e uma molécula de propionilCoA Esta é carboxilada a metilmalonilCoA que é isomerizada a succinilCoA em uma reação catalisada pela metilmalonilCoA mutase enzima que necessita de coenzima B12 c Os peroxissomos vegetais e animais e os glioxissomos vegetais fazem boxidação em quatro etapas semelhan tes àquelas da via mitocondrial em animais A primeira etapa de oxidação no entanto transfere elétrons di retamente ao O2 gerando H2O2 Os peroxissomos dos tecidos animais se especializam na oxidação de ácidos graxos de cadeia muito longa e em ácidos graxos ramifi cados Nos glioxissomos das sementes em germinação a boxidação é um passo na conversão de lipídeos esto cados em uma variedade de intermediários e produtos c As reações da voxidação que ocorrem no retículo en doplasmático produz intermediários acilgraxo dicarbo xílicos que podem sofrer boxidação em qualquer uma das extremidades para gerar ácidos dicarboxílicos cur tos como o succinato c As reações da aoxidação degradam ácidos graxos rami ficados tal como o ácido fitânico 173 Corpos cetônicos Em humanos e na maior parte de outros mamíferos o acetilCoA formado no fígado durante a oxidação dos áci dos graxos pode entrar no ciclo do ácido cítrico etapa 2 da Figura 177 ou sofrer conversão a corpos cetônicos acetona acetoacetato e Dbhidroxibutirato para ex portação a outros tecidos O termo corpos é um artefato histórico esse termo é ocasionalmente aplicado a partículas insolúveis mas esses compostos são solúveis no sangue e na urina OH CH3 C H O C CH2 O Acetona CH3 C O C O O DbHidroxibutirato CH3 C O CH2 CH3 Acetoacetato A acetona produzida em menor quantidade do que os ou tros corpos cetônicos é exalada O acetoacetato e o Db hidroxibutirato são transportados pelo sangue para outros tecidos que não o fígado tecidos extrahepáticos onde são convertidos a acetilCoA e oxidados no ciclo do ácido cítrico fornecendo muito da energia necessária para te cidos como o músculo esquelético e cardíaco e o córtex renal O cérebro que usa preferencialmente glicose como combustível pode se adaptar ao uso de acetoacetato ou Dbhidroxibutirato em condições de jejum prolongado quando a glicose não está disponível A produção e expor tação dos corpos cetônicos do fígado para tecidos extra hepáticos permite a oxidação contínua de ácidos graxos no fígado quando acetilCoA não está sendo oxidada no ciclo do ácido cítrico Os corpos cetônicos formados no fígado são exportados para outros órgãos como combustível A primeira etapa na formação de acetoacetato que ocor re no fígado Figura 1719 é a condensação enzimáti ca de duas moléculas de acetlCoA catalisada pela tiola se essa reação é simplesmente o inverso da última etapa da boxidação O acetoacetilCoA então se condensa com acetilCoa formando bhidroxibmetilglutarilCoA HMGCoA clivado a acetoacetato livre e acetilCoa O acetoacetato é reversivelmente reduzido pela Dbhidroxi butiratodesidrogenase uma enzima mitocondrial a Db hidroxibutirato Essa enzima é específica para o estereoi sômero D ela não atua sobre LbhidroxiacilCoAs e não Nelson6ed17indd 686 Nelson6ed17indd 686 040614 1554 040614 1554 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 687 deve ser confundida com a LbhidroxiacilCoAdesidroge nase da via de boxidação Em pessoas saudáveis a acetona é formada em quan tidade muito pequena a partir de acetoacetato que é facilmente descarboxilado espontaneamente ou pela ação da acetoacetatodescarboxilase Figura 1719 Como pessoas com diabetes não tratado produzem grandes quan tidades de acetoacetato seu sangue contém quantidades significativas de acetona que é tóxica A acetona é volátil e provoca um odor característico ao hálito que algumas ve zes é útil no diagnóstico da diabetes Em tecidos extrahepáticos o Dbhidroxibutirato é oxi dado a acetoacetato pela Dbhidroxibutiratodesidrogenase Figura 1720 O acetoacetato é ativado ao seu éster de co enzima A pela transferência da CoA do succinilCoA interme diário do ciclo do ácido cítrico ver Figura 167 em uma rea ção catalisada pela bcetoacilCoAtransferase também chamada tioforase O acetoacetilCoA é então clivado pela tiolase gerando dois acetilCoAs que entram no ciclo do ácido cítrico Assim os corpos cetônicos são usados como combus tível em todos os tecidos exceto o fígado que carece de tio forase O fígado é consequentemente um produtor de corpos cetônicos para os outros tecidos mas não um consumidor A produção e exportação dos corpos cetônicos pelo fígado permite a oxidação contínua de ácidos graxos com mínima oxidação de acetilCoA Quando os intermediários do ciclo do ácido cítrico são desviados para a síntese de gli cose pela gliconeogênese por exemplo a oxidação dos in termediários do ciclo desacelera bem como a oxidação de acetilCoA Além disso o fígado contém apenas uma quan tidade limitada de coenzima A e quando a maior parte está comprometida com acetilCoA a boxidação desacelera es perando por coenzima livre A produção e a exportação de corpos cetônicos liberam a coenzima A permitindo a contí nua oxidação dos ácidos graxos D Hidroxibutirato Acetoacetato decarboxilase Acetoacetato 2 AcetilCoA AcetoacetilCoA HMGCoA sintase CoASH AcetilCoA Acetona tiolase CoASH HMGCoA liase AcetilCoA b bHidroxibmetilglutarilCoA HMGCoA Dbhidroxibutirato desidrogenase FIGURA 1719 Formação de corpos cetônicos a partir de acetilCoA Pessoas saudáveis e bem nutridas produzem corpos cetônicos a uma taxa relativamente baixa Quando a acetilCoA se acumula p ex como no jejum prolongado ou diabetes não tratado a tiolase catalisa a condensação de duas moléculas de acetilCoA em acetoacetilCoA o composto que origina os três corpos cetônicos As reações da formação de corpos cetônicos ocor rem na matriz das mitocôndrias do fígado O composto de seis carbonos bhidroxibmetilglutarilCoA HMGCoA também é um intermediário da biossíntese de esteróis mas a enzima que forma HMGCoA naquela via é citosólica A HMGCoAliase está presente somente na matriz mitocondrial O CH3 C bcetoacilCoA transferase Succinato DbHidroxibutirato OH CH2 C H O2 CH3 C O SuccinilCoA CoASH tiolase Acetoacetato NADH 1 H1 NAD1 Dbhidroxibutirato desidrogenase O CH2 C O2 CH3 C O 1 CH3 C SCoA O 2 AcetilCoA CH3 C SCoA O CH2 C SSCoA O AcetoacetilCoA FIGURA 1720 DbHidroxibutirato como combustível O DbHidroxi butirato sintetizado no fígado passa para o sangue e portanto para outros tecidos onde é convertido a acetilCoA em três passos Ele é primeiro oxida do a acetoacetato que é ativado com a coenzima A doada pela succinilCoA e então clivado pela tiolase A acetilCoA assim formada é utilizada para a produção de energia Nelson6edbookindb 687 Nelson6edbookindb 687 030414 0745 030414 0745 688 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os corpos cetônicos são produzidos em excesso no diabetes e durante o jejum Jejum e diabetes melito não tratado leva à superpro dução de corpos cetônicos com vários problemas mé dicos associados Durante o jejum a gliconeogênese conso me os intermediários do ciclo do ácido cítrico desviando acetilCoA para a produção de corpos cetônicos Figura 1721 No diabetes não tratado quando o nível de insulina é insuficiente os tecidos extrahepáticos não podem captar a glicose do sangue de maneira eficiente para combustível ou para conservação como gordura Nessas condições os níveis de malonilCoA o material de início para a síntese de ácidos graxos caem a inibição da carnitinaaciltransferase I é aliviada e os ácidos graxos entram na mitocôndria para ser degradado a acetilCoA que não pode passar pelo ciclo do ácido cítrico já que os intermediários do ciclo foram dre nados para uso como substrato na gliconeogênese O acú mulo resultante de acetilCoA acelera a formação de corpos cetônicos além da capacidade de oxidação dos tecidos ex trahepáticos O aumento dos níveis sanguíneos de acetoa cetato e Dbhidroxibutirato diminui o pH do sangue cau sando a condição conhecida como acidose A acidose extrema pode levar ao coma e em alguns casos à morte Os corpos cetônicos no sangue e na urina de indivíduos com diabetes não tratado pode alcançar níveis extraordinários uma concentração sanguínea de 90 mgmL comparado com o nível normal de 3 mg100 mL e excreção urinária de 5000 mg24h comparado com uma taxa normal de 125 mg24h Essa condição é chamada cetose Indivíduos em dietas hipocalóricas utilizando as gorduras armazenadas no tecido adiposo como sua principal fonte de energia também têm níveis elevados de corpos cetônicos no sangue e na urina Esses níveis devem ser monitorados para evitar os riscos da acidose e da cetose cetoacidose RESUMO 173 Corpos cetônicos c Os corpos cetônicos acetona acetoacetato e Dbhi droxibutirato são formados no fígado Os dois últimos compostos servem como combustíveis nos tecidos ex trahepáticos por meio da oxidação a acetilCoA e en trada no ciclo do ácido cítrico c A superprodução de corpos cetônicos no diabetes não controlado ou na redução severa da ingestão de calorias pode levar à acidose ou cetose Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário boxidação 667 quilomícron 669 apolipoproteína 669 lipoproteína 669 perilipina 669 ácidos graxos livres 669 albumina sérica 669 ciclo da carnitina 670 carnitinaaciltransferase I 671 transportadoracilcarnitina carnitina 671 carnitinaaciltransferase II 671 proteína trifuncional TFP 674 metilmalonilCoAmutase 678 coenzima B12 678 malonilCoA 679 PPAR receptor ativado por proliferadores de peroxissomos 679 anemia perniciosa 681 fator intrínseco 681 acilCoAdesidrogenase de cadeia média MCAD 682 proteína multifuncional MFP 684 voxidação 684 oxidases de função mista 685 aoxidação 685 acidose 688 cetose 688 Leituras adicionais Gerais Boyer PD 1983 The Enzymes 3rd edn Vol 16 Lipid Enzymology Academic Press Inc San Diego CA Ferry G 1998 Dorothy Hodgkin A Life Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor NY Biografia fascinante de uma mulher surpreendente Gurr MI Harwood JL Frayn KN 2002 Lipid Biochemistry An Introduction 5th edn Blackwell Science Oxford UK Plutzky J 2009 The mighty mighty fatty acid Nat Med 15 618619 Scheffler IE 1999 Mitochondria WileyLiss New York Excelente obra sobre a estrutura e a função mitocondriais Wood PA 2006 How Fat Works Harvard University Press Cambridge MA Relato muito legível de nível intermediário sobre as contribuições da genética e de modelos murinos para a compreensão do metabolismo lipídico e obesidade ciclo do ácido cítrico AcetilCoA formação de corpos cetônicos CoA Ácidos graxos Glicose exportada como combustível para o cérebro e outros tecidos Glicose gliconeogênese Hepatócito Gotículas de lipídeos boxidação Oxaloacetato Acetoacetato Dbhidroxibutirato acetona Acetoacetato e Db hidroxibutirato exportados como fonte de energia para o coração o músculo esquelético o rim e o cérebro FIGURA 1721 Formação de corpos cetônicos e exportação a partir do fígado As condições que promovem a gliconeogênese diabetes não tratado redução na ingestão de alimento desaceleram o ciclo do ácido cítri co pelo consumo do oxaloacetato e aumentam a conversão de acetilCoA em acetoacetato A coenzima A liberada permite a boxidação contínua de ácidos graxos Nelson6edbookindb 688 Nelson6edbookindb 688 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 689 Digestão mobilização e transporte de gorduras Farese RV Jr Walther TC 2009 Lipid droplets finally get a little respect Cell 139 855860 Glatz JFC Luiken JJFP Bonen A 2010 Membrane fatty acid transporters as regulators of lipid metabolism implications for metabolic disease Physiol Rev 90 367417 Greenberg AS Coleman RA 2011 Expanding roles for lipid droplets Trends Endocrinol Metab 22 195196 Introdução editorial a um número desse periódico dedicado a gotas de lipídeo Langin D Holm C Lafontan M 1996 Adipocyte hormone sensitive lipase a major regulator of lipid metabolism Proc Nutr Soc 55 93109 Ramsay TG 1996 Fat cells Endocrinol Metab Clin N Am 25 847870 Uma revisão de todos os aspectos do armazenamento e mobilização de gordura nos adipócitos Reue K 2011 A thematic review series lipid droplet storage and metabolism from yeast to man J Lipid Res 52 18651868 Uma introdução editorial a uma série de artigos sobre gotas lipídicas publicadas nessa edição Shaw CS Clark J Wagenmakers AJM 2010 The effect of exercise and nutrition on intramuscular fat metabolism and insulin sensitivity Annu Rev Nutr 30 1334 Steinberg GR 2009 Role of the AMPactivated protein kinase in regulating fatty acid metabolism during exercise Appl Physiol Nutr Metab 34 315322 Storch J Rhumsey AD 2010 Tissuespecific functions in the fatty acidbinding protein family minireview J Biol Chem 285 3267932683 Wang CS Hartsuck J McConathy WJ 1992 Structure and functional properties of lipoprotein lipase Biochim Biophys Acta 1123 117 Uma discussão em nível avançado sobre as enzimas ácidos graxos das lipoproteínas nos capilares do tecido muscular e adiposo Watt MJ Steinberg GR 2008 Regulation and function of triacylglycerol lipases in cellular metabolism Biochem J 414 313325 Zechner R Kienesberger PC Haemmerle G Zimmermann R Lass A 2009 Adipose triglyceride lipase and the lipolytic catabolism of cellular fat stores J Lipid Res 50 321 boxidação mitocondrial Bannerjee R 1997 The yinyang of cobalamin biochemistry Chem Biol 4 175186 Revisão sobre a bioquímica das reações da coenzima B12 incluindo a reação da metilmalonilCoAmutase Carey HV Andrews MT Martin SL 2003 Mammalian hibernation cellular and molecular responses to depressed metabolism and low temperature Physiol Rev 83 11531181 Desverne B Michalik L Wahij W 2006 Transcriptional regulation of metabolism Physiol Rev 86 465514 Ampla revisão sobre a regulação do metabolismo incluindo o metabolismo das gorduras por fatores de transcrição Eaton S Bartlett K Pourfarzam M 1996 Mammalian mitochondrial boxidation Biochem J 320 345357 Revisão sobre a enzimologia da boxidação defeitos hereditários nessa via e regulação do processo na mitocôndria Eaton S Bursby T Middleton B Pourfarzam M Mills K Johnson AW Bartlett K 2000 The mitochondrial trifunctional protein centre of a boxidation metabolon Biochem Soc Trans 28 177182 Breve revisão de nível intermediário Evans RM Barish GD Wang YX 2004 PPARs and the complex journey to obesity Nat Med 10 17 Revisão de leitura fácil de nível intermediário sobre a descoberta dos PPAR e suas funções Harwood JL 1988 Fatty acid metabolism Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 39 101138 Jeukendrup AE Saris WH Wagenmakers AJ 1998 Fat metabolism during exercise a review Part III effects of nutritional interventions Int J Sports Med 19 371379 Este artigo faz parte de uma série que revisa os fatores que influenciam a mobilização de gordura e sua utilização durante o exercício Kampf JP Kleinfeld AM 2007 Is membrane transport of FFA mediated by lipid protein or both Physiology 22 714 Kerner J Hoppel C 1998 Genetic disorders of carnitine metabolism and their nutritional management Annu Rev Nutr 18 179206 Kerner J Hoppel C 2000 Fatty acid import into mitochondria Biochim Biophys Acta 1486 117 Kunau WH Dommes V Schulz H 1995 bOxidation of fatty acids in mitochondria peroxisomes and bacteria a century of continued progress Prog Lipid Res 34 267342 Bom artigo histórico e comparação útil da boxidação em diferentes sistemas Mandard S Muller M Kersten S 2004 Peroxisome proliferatoractivated receptor alpha target genes Cell Mol Life Sci 61 393416 Revisão dos genes controlados por PPARa Rinaldo P Matern D Bennett MJ 2002 Fatty acid oxidation disorders Annu Rev Physiol 64 477502 Revisão avançada dos defeitos metabólicos na oxidação de gorduras incluindo mutações em MCAD Rufer AC Thoma R Benz J Stihle M Gsell B De Roo E Banner DW Mueller F Chomienne O Hennig M 2006 The crystal structure of carnitine palmitoyltransferase 2 and implications for diabetes treatment Structure 14 713723 Sherratt HS 1994 Introduction the regulation of fatty acid oxidation in cells Biochem Soc Trans 22 421422 Introdução a revisões nesta edição da revista sobre vários aspectos da oxidação dos ácidos graxos e sua regulação Thorpe C Kim JJ 1995 Structure and mechanism of action of the acylCoA dehydrogenases FASEB J 9 718725 Descrição curta e clara da estrutura tridimensional e mecanismo catalítico destas enzimas boxidação peroxissomal Graham IA Eastmond PJ 2002 Pathways of straight and branched chain fatty acid catabolism in higher plants Prog Lipid Res 41 156181 Wanders RJA van Grunsven EG Jansen GA 2000 Lipid metabolism in peroxisomes enzymology functions and dysfunctions of the fatty acid a and boxidation systems in humans Biochem Soc Trans 28 141148 Corpos cetônicos Foster DW McGarry JD 1983 The metabolic derangements and treatment of diabetic ketoacidosis N Engl J Med 309 159 169 Nelson6edbookindb 689 Nelson6edbookindb 689 030414 0745 030414 0745 690 DAVID L NELSON MICHAEL M COX McGarry JD Foster DW 1980 Regulation of hepatic fatty acid oxidation and ketone body production Annu Rev Biochem 49 395420 Robinson AM Williamson DH 1980 Physiological roles of ketone bodies as substrates and signals in mammalian tissues Physiol Rev 60 143187 Problemas 1 Energia em triacilgliceróis Tendo como base por áto mo de carbono onde reside a maior quantidade de energia biologicamente disponível nos triacilgliceróis na porção ácido graxo ou na porção glicerol Indique como o conhecimento da estrutura química dos triacilgliceróis fornece a resposta 2 Reservas de combustíveis no tecido adiposo Triacilgli ceróis com seus ácidos graxos semelhantes a hidrocarbonetos têm o maior conteúdo de energia entre os principais nutrientes a Se 15 da massa corporal de um adulto de 70 Kg con sistem em triacilgliceróis qual é o total de reserva de combus tível disponível em quilojoules e em quilocalorias na forma de triacilgliceróis Lembrese que 10 kCal 5 418 kJ b Se a necessidade energética basal é aproximadamente 8400 kJdia 2000 kCaldia por quanto tempo essa pessoa sobreviveria se a oxidação dos ácidos graxos armazenados como triacilgliceróis fosse a única fonte de energia c Qual seria a perda de peso em libras por dia sob essa condição de jejum 1 lb 5 0545 kg 3 Etapas reacionais comuns ao ciclo de oxidação dos ácidos graxos e o ciclo do ácido cítrico Muitas vezes as células usam o mesmo perfil de reações enzimáticas para conversões metabólicas análogas Por exemplo as etapas da oxidação de piruvato a acetilCoA e do acetoglutarato a suc cinilCoA embora catalisada por enzimas diferentes são muito semelhantes O primeiro estágio da oxidação dos ácidos graxos segue uma sequência reacional muito semelhante a uma se quência do ciclo do ácido cítrico Use equações para mostrar as sequências de reações análogas nas duas vias 4 bOxidação quantos ciclos Quantos ciclos de boxi dação são necessários para a completa oxidação do ácido olei co ativado 181D 9 5 Química da reação da acilCoAsintetase Os ácidos graxos são convertidos aos seus ésteres de coenzima A em uma reação reversível catalisada pela acilCoAsintetase R COO2 1 ATP 1 CoA CoA 1 AMP 1 PPi R C O a O intermediário ligado à enzima nessa reação foi iden tificado como o anidrido misto do ácido graxo e o monofosfato de adenosina AMP acilAMP O R P C O O O O Adenina H H H H OH CH2 OH O2 Escreva duas equações correspondentes às duas etapas da reação catalisada pela acilCoAsintetase b A reação da acilCoAsintetase é prontamente rever sível com uma constante de equilíbrio próxima de 1 Como essa reação pode ser feita para favorecer a formação de acil CoA graxo 6 Intermediários da oxidação do ácido oleico Qual é a estrutura do grupo acilgraxo parcialmente oxidado que é formado quando ácido oleico 181D 9 sofre três ciclos de b oxidação Quais são as duas etapas seguintes na continuação da oxidação desse intermediário 7 boxidação de um ácido graxo de cadeia ímpar Qual é o produto direto da boxidação de um ácido graxo completa mente saturado de 11 carbonos 8 Oxidação do palmitato tritiado O palmitato marca do uniformemente com trítio 3H a uma atividade específica de 248 3 10 8 contagens por minuto cpm por micromol de palmitato é adicionado a uma preparação mitocondrial que o oxida a acetilCoA A acetilCoa é isolada e hidrolisada a aceta to A atividade específica do acetato isolado é 10 3 10 7 cpm mmol Esse resultado é consistente com a via de boxidação Explique Qual é o destino final do trítio removido 9 Compartimentalização da boxidação Palmitato li vre é ativado ao seu derivado de coenzima A palmitoilCoA no citosol antes de ser oxidado na mitocôndria Se palmitato e coenzima A 14C são adicionados a um homogenato de fígado palmitoilCoA isolado da fração citosólica será radioativo mas o isolado da fração mitocondrial não Explique 10 Bioquímica comparativa vias geradoras de energia em pássaros Uma indicação da importância relativa das vá rias vias produtoras de ATP é a Vmáx de certas enzimas dessas vias Os valores de Vmáx de várias enzimas dos músculos pei torais músculo do peito usado para voar de pombo e faisão estão listados abaixo Vmáx mmol substratoming de tecido Enzima Pombo Faisão Hexocinase 30 23 Glicogêniofosforilase 180 1200 Fosfofrutocinase1 240 1430 Citratosintase 1000 150 Triacilglicerollipase 007 001 a Discuta a importância relativa do metabolismo do glico gênio e das gorduras na geração de ATP nos músculos peitorais desses pássaros b Compare o consumo de oxigênio nos dois pássaros c A julgar pelos dados na tabela qual pássaro é voador de longas distâncias Justifique sua resposta d Por que essas enzimas em particular foram seleciona das para a comparação As atividades da triose fosfato e da malatodesidrogenase seriam igualmente boas para compara ção Explique 11 Carnitinaaciltransferase mutante O que muda no perfil metabólico resultante de uma mutação na carnitinaacil transferase I muscular em que a proteína mutante perdeu sua afinidade por malonilCoA mas não sua atividade catalítica Nelson6edbookindb 690 Nelson6edbookindb 690 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 691 12 Efeito da deficiência de carnitina Um indiví duo desenvolveu uma condição caracterizada por fraque za muscular progressiva e dolorosas câimbras musculares Os sintomas foram agravados durante o jejum exercício e dieta rica em gordura O homogenato de uma amostra de músculo esquelético do paciente oxida oleato mais lentamente do que homogenatos controle consistindo de amostras de músculo de indivíduos sadios Quando carnitina foi adicionada ao homoge nato de músculo do paciente a taxa de oxidação do oleato se igualou a dos homogenatos controle O paciente foi diagnosti cado como portador de uma deficiência de carnitina a Por que a carnitina adicionada aumenta a taxa de oxi dação do oleato no homogenato de músculo do paciente b Por que os sintomas do paciente se agravaram durante o jejum o exercício e em dieta rica em gordura c Sugira duas razões possíveis para a deficiência de carni tina muscular desse indivíduo 13 Os ácidos graxos como fonte de água Ao contrário da lenda os camelos não armazenam água em suas corcovas que consistem na verdade em um grande depósito de gordura Como esses depósitos de gorduras podem servir de fonte de água Calcule a quantidade de água em litros que o came lo pode produzir a partir de 10 kg de gordura Assuma para simplificação que a gordura é totalmente formada por tripal mitoilglicerol 14 Petróleo como fonte de alimento para micróbios Alguns microrganismos do gênero Nocardia e Pseudomonas podem crescer em um ambiente em que hidrocarbonetos são as únicas fontes de energia Essas bactérias oxidam hidrocar bonetos alifáticos de cadeia linear tal como octano aos seus ácidos carboxílicos correspondentes CH3CH26CH3 1 NAD 1 1 O2 CH3CH26COOH 1 NADH 1 H 1 Como essas bactérias poderiam ser usadas para limpeza de derramamento de óleo O que seriam os fatores limitantes na eficiência desse processo 15 Metabolismo de um ácido graxo prenilado de ca deia linear Um metabólito cristalino foi isolado da urina de um coelho que foi alimentado com dieta contendo um ácido graxo de cadeia linear com um grupo fenil terminal COO2 CH2n CH2 Uma amostra de 302 mg do metabólito em solução aquosa foi completamente neutralizada com 222 mL de NaOH 0100 M a Qual é a provável massa molecular e estrutura do metabólito b O ácido graxo de cadeia linear tinha um número par ou ímpar de grupos metilenos CH2 ou seja n é par ou ímpar Explique 16 A oxidação de ácidos graxos em diabetes não controlado Quando o acetilCoA produzido durante a boxidação no fígado excede a capacidade do ciclo do ácido cítrico o excesso de acetilCoA forma corpos cetônicos ace tona acetoacetato e Dbhidroxibutirato Isso ocorre em diabe tes grave não controlada já que os tecidos não podem usar glicose eles oxidam grandes quantidades de ácidos graxos Apesar de acetilCoA não ser tóxico a mitocôndria deve des viar o acetilCoA em corpos cetônicos Qual problema surgiria se acetilCoA não fosse convertido a corpos cetônicos Como o desvio a corpos cetônicos soluciona esse problema 17 Consequências de uma dieta rica em gordura sem carboidratos Suponha que você tivesse que sobreviver com uma dieta de gordura de baleia e foca com pouco ou sem car boidrato a Qual seria o efeito da privação de carboidrato na utiliza ção de gordura para energia b Se a sua dieta fosse completamente ausente de carboi dratos seria melhor consumir ácidos graxos de cadeia par ou ímpar Explique 18 Ácidos graxos de cadeia par e ímpar na dieta Em um experimento laboratorial dois grupos de ratos foram ali mentados com dois tipos de ácidos graxos diferentes como única fonte de carbono por um mês O primeiro grupo rece beu ácido heptanoico 70 e o segundo recebeu ácido octa noico 80 Após o experimento uma notável diferença foi percebida entre os dois grupos Aqueles do primeiro grupo estão saudáveis e ganharam peso enquanto aqueles do se gundo grupo estão fracos e perderam peso como resultado da perda de massa muscular Qual é a base bioquímica para essa diferença 19 Consequências metabólicas da ingestão de vfluoro oleato O arbusto Dichapetalum toxicarium nativo de Serra Leoa produz vfluorooleato altamente tóxico para animais de sangue quente CH27 CH27 vfluorooleato F CH2 C C H H COO2 Essa substância tem sido utilizada como veneno de flecha e a polpa desidratada do fruto dessa planta é usada algumas vezes como veneno de rato daí o nome comum da planta ratsba ne Por que essa substância é tão tóxica Dica revise o Capí tulo 16 Problema 22 20 Mutação da acetilCoAcarboxilase Quais seriam as consequências para o metabolismo das gorduras a mutação na acetilCoAcarboxilase que substitui o resíduo de Ser normal mente fosforilado pela AMPK por um resíduo de Ala O que aconteceria se a mesma Ser fosse substituída por Asp Dica consulte Figura 1713 21 Efeito dos inibidores de PDE sobre os adipócitos Como seria afetada a resposta de um adipócito a adrenalina pela adição de um inibidor de cAMPfosfodiesterase PDE Dica consulte Figura 124 22 Função do FAD como aceptor de elétrons A acil CoAdesidrogenase utiliza FAD ligado à enzima como grupo prostético para desidrogenar os carbonos a e b do acilgraxo CoA Qual é a vantagem de usar FAD como aceptor de elé trons em vez de NAD 1 Explique em termos dos potenciais de redução padrão para as semirreações EnzFADFADH2 E95 20219 V e NAD 1NADH E95 20320 V 23 boxidação do ácido araquidônico Quantas voltas do ciclo de oxidação dos ácidos graxos são necessárias para a oxidação completa do ácido araquidônico ver Tabela 101 a acetilCoA Nelson6edbookindb 691 Nelson6edbookindb 691 030414 0745 030414 0745 692 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 24 Destino do propionato marcado Se 3 14Cpropiona to 14C no grupo metila é adicionado a um homogenato de fí gado 14Coxaloacetato é produzido rapidamente Desenhe um fluxograma para a via pelo qual propionato é transformado em oxaloacetato e indique a localização do 14C no oxaloacetato 25 Metabolismo do ácido fitânico Quando um rato é alimentado com ácido fitânico uniformemente marcado com 14C em poucos minutos a radioatividade pode ser detectada no malato intermediário do ciclo do ácido cítrico Desenhe uma via metabólica que poderia explicar isso Quais dos átomos de carbono no malato conteria a marcação 14C 26 Fontes de H2O produzidas na boxidação A oxida ção completa do palmitoilCoA a dióxido de carbono e água está representada pela equação geral PalmitoilCoA 1 23O2 1 108Pi 1 108ADP CoA 1 16CO2 1 108ATP 1 23H2O A água também é produzida na reação ADP 1 Pi ATP 1 H2O mas não está incluída como produto na equação global Por quê 27 Importância biológica do cobalto Em gado veado ovelha e em outros animais ruminantes são formadas grandes quantidades de propionato no rúmen por meio da fermenta ção bacteriana da matéria vegetal ingerida O propionato é a principal fonte de glicose para esses animais pela rota pro pionato oxaloacetato glicose Em algumas áreas do mundo principalmente na Austrália os animais ruminantes algumas vezes mostram sintomas de anemia com concomitan te perda de apetite e retardo no crescimento resultantes da inabilidade de transformar propionato em oxaloacetato Essa condição é devido à deficiência de cobalto causada por níveis muito baixos de cobalto no solo e por consequência na maté ria vegetal Explique 28 Perda de gordura durante hibernação Os ursos consomem cerca de 25310 6 Jdia durante períodos de hiber nação que podem durar até sete meses A energia neces sária para sustentar a vida é obtida da oxidação de ácidos graxos Quanta perda de peso em quilogramas ocorre após sete meses Como a cetose pode ser minimizada durante a hibernação Assuma que a oxidação de gorduras rende 38 kJg Problema de análise de dados 29 boxidação de gorduras trans Gorduras insatura das com ligações duplas trans são comumente conhecidas como gordura trans Tem havido muita discussão acerca dos efeitos das gorduras trans da dieta na saúde Em seus trabalhos sobre os efeitos do metabolismo dos ácidos graxos trans sobre a saúde Yu e colaboradores 2004 mostraram que um ácido graxo trans modelo foi processado diferen temente do seu isômero cis Eles usaram três ácidos gaxos relacionados de 18 carbonos para explorar a diferença na b oxidação entre os isômeros cis e trans dos ácidos graxos de mesmo tamanho Ácido esteárico ácido octadecenoico O OH Ácido oleico cisD9ácido octadecenoico O OH O OH Ácido elaídico transD9ácido octadecenoico Os pesquisadores incubaram os derivados de coenzima A de cada ácido com mitocôndria hepática de rato por 5 minutos e então separam os derivados de CoA remanescente em cada mistura por CLAE cromatografia líquida de alta eficiência Os resultados estão mostrados abaixo com painéis separados para os três experimentos Tempo minutos 21 IS EstearoilCoA 1 mitocôndrias OleoilCoA 1 mitocôndrias ElaidoilCoA 1 mitocôndrias C18CoA cD5C14CoA tD5C14CoA cD9C18CoA tD9C18CoA IS IS 30 12 21 30 12 21 30 12 Absorbância a 254 nm Nesta figura PI indica um padrão interno pentadecanoilCoA adicionado à mistura após a reação como marcador molecular Os pesquisadores abreviaram os derivados de CoA como segue estearoilCoA C18CoA cisD 5tetradecenoilCoA cisD 5C14 CoA oleoilCoA cisD 9C18CoA transD 5tetradecenoilCoA transD 5C14CoA e elaidoilCoA transD 9C18CoA cisD5TetradecenoilCoA O SCoA O SCoA transD5TetradecenoilCoA Nelson6edbookindb 692 Nelson6edbookindb 692 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 693 a Por que Yu e colaboradores precisaram usar derivados de CoA em vez de usar os ácidos graxos livre nesses experimentos b Por que não foram encontrados derivados de CoA de peso molecular mais baixo na reação com estearoilCoA c Quantas voltas de boxidação seriam necessárias para converter o oleoilCoA e o elaidoilCoA a cisD 5tetradecenoil CoA e transD 5tetradecenoilCoA respectivamente Há duas formas da enzima acilCoAdesidrogenase ver Fi gura 178a acilCoAdesidrogenase de cadeia longa LCAD e acilCoAdesidrogenase de cadeia muito longa VLCAD Yu e colaboradores mediram os parâmetros cinéticos de ambas as enzimas Eles usaram os derivados de CoA dos três ácidos gra xos tetradecanoilCoA C14CoA cisD 5tetradecenoilCoA cD 5C14CoA e transD 5tetradecenoilCoA tD 5C14CoA Os resultados estão mostrados abaixo Ver no Capítulo 6 defini ções dos parâmetros cinéticos LCAD VLCAD cis14 CoA cis D 5C14 CoA trans D 5C14 CoA cis14 CoA cis D 5C14 CoA trans D 5C14 CoA Vmax 33 30 29 14 032 088 Km 041 040 16 057 044 097 kcat 99 89 85 20 042 112 kcatKm 24 22 5 4 1 1 d Para LCAD o Km difere radicalmente para os substra tos cis e trans Dê uma explicação plausível para essa obser vação nos termos das estruturas das moléculas dos substratos Dica talvez você queira utilizar a Figura 102 e Os parâmetros cinéticos das duas enzimas são relevantes para o processamento diferencial desses ácidos graxos apenas se a reação da LCAD ou VLCAD ou ambas for a etapa limitante da via Que evidência existe para apoiar essa suposição f Como a diferença desses parâmetros cinéticos explica os níveis diferentes dos derivados de CoA encontrados após a in cubação da mitocôndria hepática de rato com estearoilCoA oe loilCoA e elaidoilCoA mostrados na figura com três painéis Yu e colaboradores mediram a especificidade da tioeste rase de mitocôndria de fígado de rato que hidrolisa acilCoA em CoA e ácido graxo livre pelos substratos ver Capítulo 21 Essa enzima foi aproximadamente duas vezes mais ativa com tioésteres C14CoA do que com tioésteres C18CoA g Outros pesquisadores sugeriram que os ácidos graxos livres podem passar através das membranas Em seus experi mentos Yu e colegas verificaram ácido transD 5tetradecenoi co fora da mitocôndria isto é no meio que fora incubada com elaidoilCoA Descreva a via que leva a esse ácido transD 5 tetradecenoico extramitocondrial Não se esqueça de indicar onde na célula as várias transformações ocorrem assim como as enzimas que catalisam as transformações h Costumase dizer na mídia popular que gorduras trans não são degradadas por suas células e em vez disso se acumu lam no seu corpo Em qual sentido essa afirmativa é correta e em qual sentido ela é uma grande simplificação Referência Yu W Liang X Ensenauer R Vockley J Sweetman L Schultz H 2004 Leaky boxidation of a transfatty acid J Biol Chem 279 5216052167 Nelson6edbookindb 693 Nelson6edbookindb 693 030414 0745 030414 0745 Nelson6edbookindb 694 Nelson6edbookindb 694 030414 0745 030414 0745 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 181 Destinos metabólicos dos grupos amino 696 182 Excreção de nitrogênio e ciclo da ureia 704 183 Vias da degradação dos aminoácidos 710 A gora serão abordados os aminoácidos a última classe de biomoléculas que por sua degradação oxidativa contribui significativamente para a produção de ener gia metabólica A fração de energia metabólica obtida a par tir de aminoácidos sejam eles provenientes de proteínas da dieta ou de proteínas teciduais varia muito de acordo com o tipo de organismo e com as condições metabólicas Carnívoros obtêm imediatamente após uma refeição até 90 de suas necessidades energéticas da oxidação de ami noácidos enquanto herbívoros obtêm apenas uma peque na fração de suas necessidades energéticas a partir dessa via A maior parte dos microrganismos obtém aminoácidos a partir do ambiente e os utiliza como combustível quando suas condições metabólicas assim o determinarem Plantas no entanto nunca ou quase nunca oxidam aminoácidos para produzir energia em geral os carboidratos produzidos a partir de CO2 e H2O na fotossíntese são sua única fonte de energia As concentrações de aminoácidos nos tecidos vegetais são cuidadosamente reguladas para satisfazer as necessidades de biossíntese de proteínas ácidos nuclei cos e outras moléculas necessárias para o crescimento O catabolismo dos aminoácidos não ocorre nas plantas mas seu propósito é a produção de metabólitos para outras vias biossintéticas Nos animais os aminoácidos sofrem degradação oxidati va em três circunstâncias metabólicas diferentes 1 Durante a síntese e a degradação normais de pro teínas celulares renovação proteica Capítulo 27 alguns aminoácidos liberados pela hidrólise de pro teínas não são necessários para a biossíntese de no vas proteínas sofrendo degradação oxidativa 2 Quando uma dieta é rica em proteínas e os aminoá cidos ingeridos excedem as necessidades do orga nismo para a síntese proteica o excesso é cataboli zado aminoácidos não podem ser armazenados 3 Durante o jejum ou no diabetes melito não contro lado quando os carboidratos estão indisponíveis ou são utilizados de modo inadequado as proteínas ce lulares são utilizadas como combustível Em todas essas condições metabólicas os aminoácidos per dem seu grupo amino para formar acetoácidos os esque letos de carbono dos aminoácidos Os acetoácidos sofrem oxidação a CO2 e H2O ou geralmente mais importante for necem unidades de três e quatro carbonos que podem ser convertidas pela gliconeogênese em glicose o combustível para o cérebro para o músculo esquelético e para outros tecidos As vias do catabolismo dos aminoácidos são bastante semelhantes na maioria dos organismos O foco deste ca pítulo concentrase nas vias em vertebrados pois essas vias têm recebido maior atenção por parte dos pesquisa dores Assim como no catabolismo dos carboidratos e dos ácidos graxos os processos de degradação de aminoáci dos convergem para vias catabólicas centrais com os es queletos de carbono da maioria dos aminoácidos encon trando uma via para o ciclo do ácido cítrico Em alguns casos as reações das vias de degradação dos aminoácidos representam etapas paralelas ao catabolismo dos ácidos graxos ver Figura 179 Uma característica importante distingue a degradação dos aminoácidos de outros processos catabólicos descri tos até aqui todos os aminoácidos contêm um grupo ami no e as vias para a degradação dos aminoácidos incluem portanto uma etapa fundamental na qual o grupo aami no é separado do esqueleto de carbono e desviado para as vias do metabolismo do grupo amino Figura 181 Serão discutidos inicialmente o metabolismo do grupo amino e a excreção do nitrogênio e a seguir o destino dos esqueletos de carbono derivados dos aminoácidos ao lon go deste estudo será examinado de que modo essas vias estão interconectadas 18 Oxidação de Aminoácidos e Produção de Ureia Nelson6ed18indd 695 Nelson6ed18indd 695 020514 1720 020514 1720 696 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 181 Destinos metabólicos dos grupos amino O nitrogênio N2 é abundante na atmosfera mas é inerte para a utilização na maioria dos processos bioquímicos Pelo fato de que apenas poucos organismos conseguem converter o N2 em formas biologicamente úteis como NH3 Capítulo 22 os grupos amino são cuidadosamente geren ciados nos sistemas biológicos A Figura 182a fornece uma visão geral das vias cata bólicas da amônia e dos grupos amino nos vertebrados Os aminoácidos derivados das proteínas da dieta são a origem da maioria dos grupos amino A maior parte dos aminoáci dos é metabolizada no fígado Parte da amônia gerada nesse processo é reciclada e utilizada em uma variedade de vias biossintéticas o excesso é excretado diretamente ou con vertido em ureia ou ácido úrico para excreção dependendo do organismo Figura 182b O excesso de amônia produ zido em outros tecidos extrahepáticos é enviado ao fíga do na forma de grupos amino como descrito a seguir para conversão em sua forma de excreção Quatro aminoácidos desempenham papéis centrais no metabolismo do nitrogênio glutamato glutamina alanina e aspartato O lugar especial desses quatro aminoácidos no metabolismo do nitrogênio não é um acidente evolutivo Esses aminoácidos em especial são aqueles mais facilmen te convertidos em intermediários do ciclo do ácido cítrico glutamato e glutamina são convertidos em acetoglutarato alanina em piruvato e aspartato em oxaloacetato Gluta mato e glutamina são especialmente importantes atuando como uma espécie de ponto de encontro para os grupos amino No citosol das células do fígado hepatócitos os grupos amino da maior parte dos aminoácidos são transferi dos para o acetoglutarato formando glutamato que entra na mitocôndria e perde seu grupo amino para formar NH4 1 O excesso de amônia produzido na maior parte dos demais tecidos é convertido no nitrogênio amídico da glutamina que circula até chegar ao fígado entrando na mitocôndria hepática Glutamina glutamato ou ambos estão presentes na maior parte dos tecidos em concentrações mais elevadas que os demais aminoácidos No músculo esquelético os grupos amino que excedem as necessidades geralmente são transferidos ao piruva to para formar alanina outra molécula importante para o transporte de grupos amino até o fígado Será mostrado na Seção 182 que o aspartato participa dos processos meta bólicos que ocorrem tão logo os grupos amino sejam entre gues no fígado A presente discussão começa com a degradação das proteínas da dieta e depois faz uma descrição geral dos des tinos metabólicos dos grupos amino Proteínas intracelulares Proteínas da dieta Biossíntese de aminoácidos nucleotídeos e aminas biológicas Carbamoil fosfato NH4 Oxaloacetato Ureia produto de excreção do nitrogênio Glicose sintetizada na gliconeogênese Esqueletos de carbono aCetoácidos Amino ácidos Circuito do aspartato arginino succinato do ciclo do ácido cítrico Ciclo do ácido cítrico Ciclo da ureia FIGURA 181 Visão geral do catabolismo dos aminoácidos nos mamíferos Os grupos amino e os esqueletos de carbono tomam vias separadas porém interconectadas Nelson6edbookindb 696 Nelson6edbookindb 696 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 697 As proteínas da dieta são enzimaticamente degradadas até aminoácidos Em humanos a degradação das proteínas ingeridas até seus aminoácidos constituintes acontece no trato gastrintesti nal A chegada de proteínas da dieta ao estômago estimula a mucosa gástrica a secretar o hormônio gastrina que por sua vez estimula a secreção de ácido clorídrico pelas células parietais e de pepsinogênio pelas células principais das glân dulas gástricas Figura 183a A acidez do suco gástrico pH 10 a 25 lhe permite funcionar tanto como antissépti co matando a maior parte das bactérias e de outras células estranhas ao organismo quanto como agente desnaturante desenovelando proteínas globulares e tornando suas ligações peptídicas internas mais suscetíveis à hidrólise enzimática O pepsinogênio Mr 40554 precursor inativo ou zimogênio p 231 é convertido na pepsina ativa Mr 34614 por meio de uma clivagem autocatalisada clivagem mediada pelo pró prio pepsinogênio que ocorre apenas em pH baixo No es tômago a pepsina hidrolisa as proteínas ingeridas atuando em ligações peptídicas em que o resíduo de aminoácido lo calizado na porção aminoterminal provém dos aminoácidos aromáticos Phe Trp e Tyr ver Tabela 36 clivando cadeias polipeptídicas longas em uma mistura de peptídeos menores Proteínas celulares C CH2 CH2 C O CH3 C O O O H R C H NH2 Aminoácidos aCetoácidos aCetoglutarato aCetoglutarato C R CH2 C H CH3 CH2 C C H CH2 CH2 Glutamato Glutamina Piruvato Fígado Alanina oriunda do músculo Glutamina oriunda do músculo e de outros tecidos Aminoácidos de proteínas ingeridas a ureia ou ácido úrico H2N O C NH2 Amônia como íon amônio Ureia Ácido úrico HN H N NH4 1 N H O C C C C O C O N H Animais amoniotélicos a maior parte dos verte brados aquáticos como peixes ósseos e as larvas dos anfíbios b Animais ureotélicos muitos vertebrados terrestres também os tubarões Animais uricotélicos aves e répteis FIGURA 182 Catabolismo dos grupos amino a Visão geral do cata bolismo dos grupos amino sombreados no fígado de vertebrados b For mas de excreção do nitrogênio O excesso de NH4 1 é excretado como amônia micróbios peixes ósseos ureia maior parte dos vertebrados terrestres ou ácido úrico aves e répteis terrestres Observe que os átomos de carbono da ureia e do ácido úrico estão altamente oxidados o organismo descarta car bonos apenas após extrair a maior parte da energia de oxidação disponível Nelson6edbookindb 697 Nelson6edbookindb 697 030414 0745 030414 0745 698 DAVID L NELSON MICHAEL M COX À medida que o conteúdo ácido do estômago passa para o intestino delgado o pH baixo desencadeia a secreção do hormônio secretina na corrente sanguínea A secreti na estimula o pâncreas a secretar bicarbonato no intesti no delgado para neutralizar o HCl gástrico aumentando abruptamente o pH que fica próximo a 7 Todas as secre ções pancreáticas chegam ao intestino delgado pelo ducto pancreático A digestão das proteínas prossegue agora no intestino delgado A chegada de aminoácidos na parte supe rior do intestino delgado duodeno determina a liberação para o sangue do hormônio colecistocinina que estimula a secreção de diversas enzimas pancreáticas com atividades ótimas em pH 7 a 8 O tripsinogênio o quimotripsinogê nio e as procarboxipeptidases A e B os zimogênios da tripsina da quimotripsina e das carboxipeptidases A e B são sintetizados e secretados pelas células exócrinas do Estômago Pâncreas Ducto pancreático pH baixo Pepsinogênio Zimogênios proteases ativas Pepsina a Glândulas gástricas no revestimento do estômago b Células exócrinas do pâncreas c Vilosidades do intestino delgado Intestino delgado pH 7 Células parietais secretam HCl Células principais secretam pepsinogênio Mucosa gástrica secreta gastrina RE rugoso Grânulos de zimogênio Ducto coletor Vilosidade Mucosa intestinal absorve aminoácidos FIGURA 183 Parte do trato digestório gastrintestinal humano a As células parietais e as células principais das glândulas gástricas secretam seus produtos em resposta ao hormônio gastrina A pepsina inicia o pro cesso de degradação das proteínas no estômago b O citoplasma das cé lulas exócrinas é completamente preenchido pelo retículo endoplasmático rugoso o sítio de síntese dos zimogênios e de muitas enzimas digestivas Os zimogênios são concentrados em partículas de transporte circundadas por membranas denominadas grânulos de zimogênios Quando uma célula exócrina é estimulada sua membrana plasmática fundese com a membra na do grânulo de zimogênio e estes são liberados por exocitose no lúmen do ducto coletor Os ductos coletores por fim levam ao ducto pancreático e daí ao intestino delgado c Os aminoácidos são absorvidos pela camada de células epiteliais mucosa intestinal das vilosidades e chegam aos capilares Lembre que os produtos da hidrólise dos lipídeos no intestino delgado após sua absorção pela mucosa intestinal entram no sistema linfático ver Figura 171 Nelson6edbookindb 698 Nelson6edbookindb 698 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 699 pâncreas Figura 183b O tripsinogênio é convertido em sua forma ativa a tripsina pela enteropeptidase uma en zima proteolítica secretada pelas células intestinais A trip sina livre catalisa então a conversão de moléculas adicionais de tripsinogênio em tripsina ver Figura 638 A tripsina também ativa o quimotripsinogênio as procarboxipeptida ses e a proelastase Qual a razão para esse mecanismo elaborado ativar en zimas digestivas dentro do trato gastrintestinal A síntese dessas enzimas como precursores inativos protege as célu las exócrinas do ataque proteolítico destrutivo O pâncreas se protege ainda mais da autodigestão por meio da síntese de um inibidor específico a proteína denominada inibidor pancreático da tripsina p 232 que previne efetiva mente a produção prematura de enzimas proteolíticas ati vas dentro das células pancreáticas A tripsina e a quimotripsina continuam a hidrólise dos peptídeos produzidos pela pepsina no estômago Esse estágio da digestão proteica é realizado com grande efi ciência pois a pepsina a tripsina e a quimotripsina apre sentam especificidades distintas quanto aos aminoácidos sobre os quais atuam ver Tabela 36 A degradação de pequenos peptídeos no intestino delgado é então com pletada por outras peptidases intestinais Estas incluem as carboxipeptidases A e B duas enzimas que contêm zinco as quais removem resíduos sucessivos da extre midade carboxiterminal dos peptídeos e uma aminopep tidase que hidrolisa resíduos sucessivos da extremidade aminoterminal de peptídeos pequenos A mistura resul tante de aminoácidos livres é transportada para dentro das células epiteliais que revestem o intestino delgado Figura 183c através dos quais os aminoácidos entram nos capilares sanguíneos nas vilosidades e são transpor tados até o fígado Nos humanos a maior parte das pro teínas globulares obtidas a partir de animais é hidrolisada quase completamente até aminoácidos no trato gastrin testinal mas algumas proteínas fibrosas como a quera tina são digeridas apenas parcialmente Além disso o conteúdo proteico de alguns alimentos obtidos a partir de vegetais está protegido contra a degradação por envoltó rios não digeríveis de celulose A pancreatite aguda é uma doença causada por obs trução da via normal pela qual as secreções pancreáti cas chegam ao intestino Os zimogênios das enzimas pro teolíticas são prematuramente convertidos em suas formas cataliticamente ativas dentro das células pancreáticas e atacam o próprio tecido pancreático Isso causa dores in tensas e lesão ao órgão o que pode ser fatal O piridoxalfosfato participa da transferência de grupos aamino para o acetoglutarato Chegando ao fígado a primeira etapa no catabolismo da maioria dos Laminoácidos é a remoção de seus grupos a amino realizada por enzimas denominadas aminotrans ferases ou transaminases Nessas reações de transami nação o grupo aamino é transferido para o carbono a do acetoglutarato liberando o correspondente acetoácido análogo do aminoácido Figura 184 Não ocorre desami nação perda de grupos amino efetiva nessas reações pois o acetoglutarato tornase aminado enquanto o aaminoá cido é desaminado O efeito das reações de transaminação é coletar grupos amino de diferentes aminoácidos na forma de Lglutamato O glutamato então funciona como doador de grupos amino para vias biossintéticas ou para vias de ex creção que levam à eliminação de produtos de excreção nitrogenados As células contêm tipos diferentes de aminotrans ferases Muitas são específicas para o acetoglutarato como aceptor do grupo amino mas diferem em sua es pecificidade para o Laminoácido Essas enzimas são de nominadas em função do doador do grupo amino p ex alaninaaminotransferase aspartatoaminotransferase As reações catalisadas pelas aminotransferases são livre mente reversíveis tendo uma constante de equilíbrio de cerca de 10 ΔG9 0 kJmol Todas as aminotransferases apresentam o mesmo grupo prostético e o mesmo mecanismo de reação O grupo pros tético é o piridoxalfosfato PLP a forma de coenzima da piridoxina ou vitamina B6 O piridoxalfosfato já foi cita do no Capítulo 15 como coenzima na reação da glicogênio fosforilase mas seu papel naquela reação não é represen tativo de sua função usual como coenzima Seu principal papel nas células é o metabolismo de moléculas com grupos amino O piridoxalfosfato funciona como carreador interme diário de grupos amino no sítio ativo das aminotransfera ses Ele sofre transformações reversíveis entre sua forma aldeídica o piridoxalfosfato que pode aceitar um grupo amino e sua forma aminada a piridoxaminafosfato que pode doar seu grupo amino para um acetoácido Figura 185a Geralmente o piridoxalfosfato encontrase ligado covalentemente ao sítio ativo da enzima por meio de uma ligação aldimina base de Schiff com o grupo amino de um resíduo de Lys Figura 185b d H H3N 1 COO2 C C O R COO2 Amino transferase H3N 1 O COO2 CH2 CH2 C COO2 R COO2 CH2 CH2 H C COO2 aCetoácido LGlutamato LAminoácido aCetoglutarato PLP FIGURA 184 Transaminações catalisadas por enzimas Em muitas reações de aminotransferases o acetoglutarato é o aceptor do grupo ami no Todas as aminotransferases necessitam de piridoxalfosfato PLP como cofator Embora a reação esteja mostrada aqui no sentido da transferência do grupo amino para o acetoglutarato ela é facilmente reversível Nelson6edbookindb 699 Nelson6edbookindb 699 030414 0745 030414 0745 700 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O piridoxalfosfato participa de uma variedade de rea ções nos carbonos a b e g C2 a C4 de aminoácidos Reações no carbono a Figura 186 incluem racemiza ções interconvertendo L e Daminoácidos e descarbo xilações assim como transaminações O piridoxalfosfato desempenha o mesmo papel químico em cada uma des sas reações Uma ligação com o carbono a do substrato é rompida removendo um próton ou um grupo carboxila O par de elétrons que permanece no carbono a produziria um carbânion altamente instável mas o piridoxalfosfato fornece estabilização desse intermediário por ressonância Figura 186 no detalhe A estrutura altamente conjugada do PLP escoadouro de elétrons permite o deslocamento da carga negativa As aminotransferases Figura 185 são exemplos clássicos de enzimas que catalisam reações bimoleculares de pinguepongue ver Figura 613b nas quais o primei ro substrato reage e o produto deve deixar o sítio ativo antes que o segundo substrato possa se ligar Assim o aminoácido ligase ao sítio ativo doa seu grupo amino ao piridoxalfosfato e deixa o sítio ativo na forma de um a cetoácido O outro acetoácido que funciona como subs trato se liga então ao sítio ativo aceita o grupo amino da piridoxaminafosfato e deixa o sítio ativo na forma de um aminoácido O glutamato libera seu grupo amino na forma de amônia no fígado Como foi visto os grupos amino de muitos aaminoácidos são coletados no fígado na forma do grupo amino de mo léculas de Lglutamato Esses grupos amino devem ser re movidos do glutamato e preparados para excreção Nos hepatócitos o glutamato é transportado do citosol para a mitocôndria onde sofre desaminação oxidativa catali sada pela Lglutamatodesidrogenase Mr 330000 Nos O2 2O P N O OH CH2 CH3 O O2 2O P C O OH CH2 H CH3 O O H b O2 2O P C O OH CH2 H 1 CH3 NH H3N O O2 2O P C O OH CH2 H CH3 O O H Piridoxalfosfato PLP Piridoxamina fosfato a Enz Enz Lys NH2 H2O Lys H C Base de Schiff 1 1 1 NH 1 NH 1 NH c d e FIGURA 185 Piridoxalfosfato o grupo prostético das aminotransfe rases a Piridoxalfosfato PLP e sua forma aminada piridoxaminafosfato são coenzimas fortemente ligadas às aminotransferases Os grupos funcio nais estão sombreados b O piridoxalfosfato está ligado à enzima por meio de interações não covalentes e pela formação de uma base de Schiff aldi mina com um resíduo de Lys no sítio ativo Os passos para a formação da base de Schiff a partir de uma amina primária e de um grupo carbonila estão detalhados na Figura 146 c PLP em vermelho ligado a um dos dois sítios ativos da enzima dimérica aspartatoaminotransferase uma aminotransfera se típica d Visão do sítio ativo com o PLP em vermelho com o fósforo em amarelo em uma ligação aldimina com a cadeia lateral da Lys 258 em roxo e Outra visão do sítio ativo com o PLP ligado a um análogo do substrato o 2metilaspartato em verde por meio de uma base de Schiff PDB ID 1AJS Nelson6edbookindb 700 Nelson6edbookindb 700 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 701 mamíferos essa enzima está presente na matriz mitocon drial É a única enzima que utiliza NAD 1 ou NADP 1 como aceptor de equivalentes redutores Figura 187 A ação combinada de uma aminotransferase e da glu tamatodesidrogenase é conhecida como transdesamina ção Uns poucos aminoácidos contornam a via de transde saminação e sofrem diretamente desaminação oxidativa O destino do NH4 1 produzido por qualquer desses processos de desaminação é discutido em detalhe na Seção 182 O acetoglutarato formado a partir da desaminação do gluta mato pode ser utilizado no ciclo do ácido cítrico e para a síntese de glicose A glutamatodesidrogenase opera em uma importante intersecção do metabolismo do carbono e do nitrogênio Essa enzima alostérica com seis subunidades idênticas tem sua atividade influenciada por um arranjo complicado de moduladores alostéricos Os mais bem estudados são o modulador positivo ADP e o modulador negativo GTP A ra C C C C C C C C C C C C C C R H CH N H P Amina 1 N H P CH 1NH 1 NH 1 H H 2 H CH N H P 1 1NH Intermediário quinonoide Estruturas com ressonância para a estabilização de um carbânion pelo PLP Carbânion R R R H H 1NH3 R N H P 1 CH NH 1 H COO2 1 R H COO2 1NH3 Piridoxalfosfato forma aldimina interna na enzima regenerada Piridoxalfosfato forma aldimina interna na enzima regenerada 1 1 Lys Enz NH3 1 Lys Enz NH3 CO2 HO R CH2 aCetoácido 1 NH3 Piridoxaminafosfato O 1 N H 1 P COO2 HO HO HO HO H N Lys CH N H P 1 HO 1 R H 1 1NH3 LAmino ácido Piridoxalfosfato forma aldimina interna na enzima COO2 C H3 H3C H3C H3C H3C Enz H2O COO2 CH2 N H P 1 NH HO R 1 DAmino ácido Base de Schiff intermediária aldimina externa Base de Schiff intermediária aldimina externa R C N H P 1 CH NH 1 H B COO2 HO R N H P 1 CH NH 1 H H C O 2 O HO R N H P CH NH 1 H 1 H COO2 HO Intermediário quinonoide Intermediário quinonoide R CH COO2 N H P 1NH H1 HO R N H P C NH 1 HO Intermediário quinonoide Formação de aldimina externa com o substrato Abstração de próton levando à formação de quinonoide Hidrólise da base de Schiff para formar acetoácido e piridoxamina Rearranjo A B C ❶ ❷ ❸ ❹ H3C C H3 H3C H3C C H3 H3C C H3 MECANISMOFIGURA 186 Algumas transformações no carbono a de aminoácidos facilitadas pelo piridoxalfosfato O piridoxalfosfato ge ralmente está ligado à enzima por meio de uma base de Schiff também de nominada aldimina interna Essa forma ativada do PLP facilmente sofre tran saminação para formar uma nova base de Schiff aldimina externa com o grupo aamino do aminoácido que funciona como substrato ver Figura 185b d Três destinos alternativos para a aldimina externa são mostrados transaminação racemização e descarboxilação A base de Schiff en tre o PLP e o aminoácido está conjugada com o anel de piridina um escoa douro de elétrons que permite o deslocamento de um par de elétrons para evitar a formação de um carbânion instável no carbono a no detalhe Um intermediário quinonoide está envolvido nos três tipos de reação A via de transaminação é especialmente importante para as vias descritas neste capí tulo A via ressaltada em amarelo mostrada da esquerda para a direita repre senta apenas parte da reação global catalisada por aminotransferases Para completar o processo um segundo acetoácido substitui aquele que é libe rado e é convertido em um aminoácido pela reversão desses passos reacio nais da direita para a esquerda O piridoxalfosfato também está envolvido em certas reações envolvendo os carbonos b e g de alguns aminoácidos não mostrado Mecanismos de reação para o piridoxalfosfato Nelson6edbookindb 701 Nelson6edbookindb 701 030414 0745 030414 0745 702 DAVID L NELSON MICHAEL M COX zão metabólica para esse padrão de regulação ainda não foi esclarecida em detalhe Mutações que alterem o sítio alos térico para a ligação do GTP ou que causem ativação per manente da glutamatodesidrogenase levam a uma doença genética humana denominada síndrome do hiperinsulinis mo com hiperamonemia caracterizada por níveis elevados de amônia na corrente sanguínea e hipoglicemia A glutamina transporta a amônia na corrente sanguínea A amônia é bastante tóxica para os tecidos animais poste riormente serão examinadas algumas possíveis razões para essa toxicidade e seus níveis no sangue são regulados Em muitos tecidos incluindo o cérebro alguns processos como a degradação de nucleotídeos geram amônia livre Na maioria dos animais a maior parte dessa amônia livre é con vertida em um composto não tóxico antes de ser exportada dos tecidos extrahepáticos para o sangue e transportada até o fígado ou até os rins Para essa função de transporte o glutamato essencial para o metabolismo intracelular do grupo amino é substituído pela Lglutamina A amônia livre produzida nos tecidos combinase com o glutamato produ zindo glutamina pela ação da glutaminasintetase Essa reação requer ATP e ocorre em duas etapas Figura 18 8 Inicialmente o glutamato e o ATP reagem para formar ADP e um intermediário gglutamilfosfato que então reage com a amônia produzindo glutamina e fosfato inorgânico A glutamina é uma forma de transporte não tóxico para a amônia ela normalmente está presente no sangue em con centrações muito maiores que os demais aminoácidos A glutamina também serve como fonte de grupos amino em várias reações biossintéticas A glutaminasintetase é en contrada em todos os organismos sempre desempenhan do um papel metabólico central Nos microrganismos essa enzima serve como via de entrada essencial do nitrogênio fixado em sistemas biológicos Os papéis da glutamina e da glutaminasintetase no metabolismo são discutidos no Capítulo 22 Na maioria dos animais terrestres a glutamina que ex cede as necessidades de biossíntese é transportada pelo sangue para o intestino o fígado e os rins para ser proces sada Nesses tecidos o nitrogênio amídico é liberado como íon amônio na mitocôndria onde a enzima glutaminase converte glutamina em glutamato e NH4 1 Figura 188 O H 1 COO2 C O aCetoglutarato Glutamato COO2 CH2 CH2 COO2 COO2 C CH2 NH4 1 H2N 1 H2O H3N CH2 COO2 COO2 C CH2 CH2 NADP1 NADPH FIGURA 187 Reação catalisada pela glutamatodesidrogenase A glutamatodesidrogenase do fígado de mamíferos tem a capacidade inco mum de utilizar tanto NAD 1 quanto NADP 1 como cofator As glutamato desidrogenases de plantas e microrganismos normalmente são específicas para um ou outro desses aceptores de elétrons A enzima dos mamíferos é regulada alostericamente por GTP e ADP C CH CH2 NH3 COO CH2 OOC CH CH2 COO CH2 O C CH CH2 O O O COO CH2 ATP ADP O P O Glutamina sintetase Glutamina sintetase Glutaminase mitocôndria hepática LGlutamina LGlutamato LGlutamato gGlutamilfosfato C CH CH2 H2N COO CH2 O NH4 O Pi NH4 Ureia H2O NH3 NH3 NH3 FIGURA 188 Transporte de amônia na forma de glutamina O exces so de amônia nos tecidos é adicionado ao glutamato para formar glutamina processo catalisado pela glutaminasintetase Após ser transportada pela corrente sanguínea a glutamina entra no fígado e NH4 1 é liberado na mito côndria pela enzima glutaminase Nelson6edbookindb 702 Nelson6edbookindb 702 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 703 NH4 1 do intestino e dos rins é transportado no sangue para o fígado No fígado a amônia de todas essas fontes é utili zada na síntese da ureia Parte do glutamato produzido na reação da glutaminase pode ser adicionalmente processa da no fígado pela glutamatodesidrogenase liberando mais amônia e produzindo esqueletos de carbono para utilização como combustível Contudo a maior parte do glutamato entra em reações de transaminação necessárias para a biossíntese de aminoácidos e para outros processos Ca pítulo 22 Na acidose metabólica p 688 há um aumento do processamento da glutamina pelos rins Nem todo o excesso de NH4 1 assim produzido é liberado para a corrente sanguínea ou convertido em ureia parte é excretado direta mente na urina No rim o NH4 1 forma sais com ácidos meta bólicos facilitando sua remoção na urina O bicarbonato produzido pela descarboxilação do acetoglutarato no ciclo do ácido cítrico também pode funcionar como tampão no plasma sanguíneo Tomados em conjunto esses efeitos do metabolismo da glutamina no rim tendem a contrabalançar a acidose A alanina transporta a amônia dos músculos esqueléticos para o fígado A alanina também desempenha um papel especial no trans porte dos grupos amino para o fígado em uma forma não tóxica por meio de uma via denominada ciclo da glicose alanina Figura 189 No músculo e em alguns outros tecidos que degradam aminoácidos como combustível os grupos amino são coletados na forma de glutamato por transaminação Figura 182a O glutamato pode ser con vertido em glutamina para transporte ao fígado como des crito anteriormente ou pode transferir seu grupo aamino para o piruvato produto da glicólise muscular facilmente disponível pela ação da alaninaaminotransferase Fi gura 189 A alanina assim produzida passa para o sangue e segue para o fígado No citosol dos hepatócitos a alanina aminotransferase transfere o grupo amino da alanina para o acetoglutarato formando piruvato e glutamato O glu tamato então entra na mitocôndria onde a reação da glu tamatodesidrogenase libera NH4 1 Figura 187 ou sofre transaminação com o oxaloacetato para formar aspartato outro doador de nitrogênio para a síntese de ureia A utilização de alanina para o transporte da amônia dos músculos esqueléticos para o fígado é outro exemplo da economia intrínseca dos organismos vivos Os músculos esqueléticos em contração vigorosa operam anaerobiamen te produzindo piruvato e lactato pela glicólise assim como amônia pela degradação proteica De algum modo esses produtos devem chegar ao fígado onde o piruvato e o lac tato são incorporados na glicose que volta aos músculos e a amônia é convertida em ureia para excreção O ciclo da glicosealanina em conjunto com o ciclo de Cori ver Quadro 142 e Figura 2319 realiza essa operação O custo energético da gliconeogênese é assim imposto ao fígado e não ao músculo e todo o ATP disponível no músculo é des tinado à contração muscular A amônia é tóxica para os animais A produção catabólica de amônia impõe um sério pro blema bioquímico por ser muito tóxica A base mole cular para essa toxicidade não é completamente compreen dida Os estágios finais da intoxicação por amônia em humanos são caracterizados por indução de um estado de coma acompanhado por edema cerebral aumento no con teúdo de água do cérebro e aumento da pressão intracra niana de modo que pesquisas e especulações em torno da intoxicação por amônia têm sido focalizadas nesse tecido As especulações centralizamse em uma possível depleção do ATP nas células do cérebro A amônia facilmente cruza a barreira hematoencefálica de modo que qualquer condição que aumente os níveis de amônia na circulação sanguínea também exporá o cérebro a altas concentrações O cérebro em desenvolvimento é mais suscetível aos efeitos deletérios do íon amônio que o cére bro adulto Os danos causados pela toxicidade do amônio incluem perda de neurônios alteração na formação de si napses e deficiência geral no metabolismo energético ce lular A remoção do excesso de amônia presente no citosol Alanina aminotransferase aCetoglutarato Alanina aminotransferase aCetoglutarato Glutamato Glutamato Aminoácidos Proteína muscular Ureia NH4 1 NH4 1 Ciclo da ureia Fígado Músculo Glicose sanguínea Glicose Glicose Piruvato Piruvato Alanina sanguínea Alanina Alanina Gliconeogênese Glicólise FIGURA 189 O ciclo da glicosealanina A alanina funciona como trans portadora de amônia e do esqueleto de carbono do piruvato do músculo esquelético até o fígado A amônia é excretada e o piruvato é utilizado para produzir glicose que é devolvida ao músculo Nelson6edbookindb 703 Nelson6edbookindb 703 030414 0745 030414 0745 704 DAVID L NELSON MICHAEL M COX requer a aminação redutora do acetoglutarato a glutamato pela glutamatodesidrogenase no sentido inverso da rea ção descrita anteriormente Figura 187 e a conversão de glutamato em glutamina pela glutaminasintetase Ambas as enzimas estão presentes em níveis altos no cérebro em bora a reação da glutaminasintetase seja quase certamente a via mais importante para a remoção da amônia Altos ní veis de NH4 1 levam a um aumento nos níveis de glutamina que atua como soluto osmoticamente ativo osmólito nos astrócitos do cérebro os quais são células do sistema ner voso em forma de estrela que fornecem nutrientes suporte e isolamento elétrico para os neurônios Isso desencadeia um aumento na captação de água que entra nos astrócitos para manter o equilíbrio osmótico levando ao edema das células e do cérebro e ao coma A depleção de glutamato pela reação da glutaminasin tetase pode ter efeitos adicionais no cérebro O glutamato e seu derivado gaminobutirato GABA ver Figura 2231 são importantes neurotransmissores a sensibilidade do cérebro à amônia pode refletir uma depleção de neuro transmissores assim como alterações no balanço osmótico celular Ao concluir esta discussão a respeito do metabolismo do grupo amino observe que foram descritos diversos proces sos que depositam o excesso de amônia na mitocôndria dos hepatócitos Figura 182 Agora será estudado o destino dessa amônia RESUMO 181 Destinos metabólicos dos grupos amino c Humanos obtêm uma pequena fração de sua energia oxidativa a partir do catabolismo dos aminoácidos Os aminoácidos provêm da degradação normal de proteí nas celulares reciclagem da degradação de proteínas da dieta e da degradação de proteínas teciduais no lugar de outros combustíveis durante o jejum ou no diabetes melito não controlado c Proteases degradam as proteínas da dieta no estômago e no intestino delgado A maioria das proteases é pri meiramente sintetizada como zimogênios inativos c A primeira etapa no catabolismo dos aminoácidos é separar o grupo amino do esqueleto de carbono Na maior parte dos casos o grupo amino é transferido para o acetoglutarato formando glutamato Essa reação de transaminação requer a coenzima piridoxal fosfato c O glutamato é transportado à mitocôndria hepática onde a glutamatodesidrogenase libera o grupo amino na forma de íon amônio NH4 1 A amônia produzida em outros tecidos é transportada ao fígado como o nitrogênio amídico da glutamina ou no transporte a partir do músculo esquelético como o grupo amino da alanina c O piruvato produzido pela desaminação da alanina no fígado é convertido em glicose a qual é transportada de volta ao músculo como parte do ciclo da glicosealanina N de T Outras células gliais distintas dos astrócitos são responsáveis pelo isolamento elétrico oligodendrócitos no sistema nervoso central e células de Schwann no sistema nervoso periférico 182 Excreção de nitrogênio e ciclo da ureia Se não forem reutilizados para a síntese de novos aminoá cidos ou de outros produtos nitrogenados os grupos ami no são canalizados em um único produto final de excreção Figura 1810 A maioria das espécies aquáticas como os peixes ósseos é amoniotélica e excreta o nitrogênio amínico como amônia A amônia tóxica é simplesmente di luída na água do ambiente Os animais terrestres necessi tam de vias para a excreção do nitrogênio que minimizem a toxicidade e a perda de água A maior parte dos animais terrestres é ureotélica e excreta o nitrogênio amínico na forma de ureia aves e répteis são uricotélicos excretando o nitrogênio amínico como ácido úrico A via de síntese do ácido úrico é descrita na Figura 2248 As plantas reciclam praticamente todos os grupos amino e a excreção de ni trogênio ocorre apenas em circunstâncias muito incomuns Nos organismos ureotélicos a amônia depositada na mi tocôndria dos hepatócitos é convertida em ureia no ciclo da ureia Essa via foi descoberta em 1932 por Hans Krebs que mais tarde também descobriu o ciclo do ácido cítrico e seu colaborador Kurt Henseleit estudante de medicina A produção de ureia ocorre quase exclusivamente no fígado sendo o destino da maior parte da amônia canalizada para esse órgão A ureia passa para a circulação sanguínea e che ga aos rins sendo excretada na urina A produção de ureia é agora o foco desta discussão A ureia é produzida a partir da amônia por meio de cinco etapas enzimáticas O ciclo da ureia inicia dentro da mitocôndria hepática mas três de suas etapas seguintes ocorrem no citosol o ciclo assim abrange dois compartimentos celulares Figura 18 10 O primeiro grupo amino que entra no ciclo da ureia é derivado da amônia na matriz mitocondrial a maior parte desse NH4 1 é fornecida pelas vias descritas anteriormente O fígado também recebe parte da amônia pela veia porta sendo essa amônia produzida no intestino pela oxidação bacteriana de aminoácidos Qualquer que seja sua fonte o NH4 1 presente na mitocôndria hepática é utilizado imedia tamente juntamente com o CO2 como HCO3 2 produzido pela respiração mitocondrial para formar carbamoilfosfato na matriz Figura 1811a ver também Figura 1810 Essa reação é dependente de ATP sendo catalisada pela carba moilfosfatosintetase I enzima regulatória ver a se guir A forma mitocondrial da enzima é diferente da forma FIGURA 1810 O ciclo da ureia e as reações que fornecem grupos amino para o ciclo As enzimas que catalisam essas reações cujos nomes aparecem no texto estão distribuídas entre a matriz mitocondrial e o citosol Um grupo amino entra no ciclo da ureia como carbamoilfosfato formado na matriz o outro entra como aspartato produzido na matriz pela transami nação entre oxaloacetato e glutamato catalisada pela aspartatoaminotrans ferase O ciclo da ureia consiste em quatro passos ➊ Formação de citrulina a partir de ornitina e carbamoilfosfato entrada do primeiro grupo amino a citrulina passa para o citosol ➋ Produção de argininosuccinato via um intermediário citrulilAMP entrada do segundo grupo amino ➌ Formação da arginina a partir do argininosuccinato essa reação libera fumarato que entra no ciclo do ácido cítrico ➍ Formação de ureia esta reação também regenera a ornitina As vias pelas quais o NH4 1 chega à matriz mitocondrial dos hepatócitos foram discutidas na Seção 181 Nelson6edbookindb 704 Nelson6edbookindb 704 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 705 NH4 Glutamina Alanina do músculo Matriz mitocondrial Citosol Ceto glutarato Oxaloacetato Aspartato Aminoácidos 1 2ADP 1 Pi NH3 1 CH COO R 2 NH3 1 CH COO CH3 2 NH3 1 CH COO2 CH2 CH2 OOC 2 O C COO CH2 2 OOC 2 CH COO CH2 2 OOC 2 NH3 1 NH3 1 CH COO CH2 2 CH2 C O H2N Glutamato Glutamato Carbamoil fosfato C O P O2 H2N O2 O O Glutamina dos tecidos extrahepáticos aCetoglutarato aCetoácido HCO3 H2O Aspartato AMP Ciclo da ureia Pi CH COO CH2 2 OOC 2 NH3 1 C NH CH COO2 H2N CH23 NH2 1 NH3 1 Fumarato COO2 CH CH OOC 2 H3N CH COO2 CH23 NH3 1 1 H3N CH COO2 CH23 NH3 1 1 Ureia C H2N O NH2 Intermediário citrulilAMP NH3 NH2 1 CH COO CH23 CH2 2 NH C O O O H OH OH H H N N N N H P HN O2 O PPi ATP Ornitina Citrulina Arginina C NH CH COO2 NH CH23 NH2 1 NH3 1 CH CH2 OOC 2 COO2 Argininosuccinato Ornitina C CH COO2 H2N NH3 1 O Citrulina NH CH23 ❶ ❹ ❸ Glutamatodesidrogenase glutaminase Carbamoil fosfato sintetase i Aspartatoaminotransferase 2 ATP Nelson6edbookindb 705 Nelson6edbookindb 705 030414 0745 030414 0745 706 DAVID L NELSON MICHAEL M COX citosólica II a qual tem uma função distinta na biossínte se das pirimidinas Capítulo 22 O carbamoilfosfato que funciona como doador ativado de grupos carbamoila entra no ciclo da ureia O ciclo tem apenas quatro etapas enzimáticas Primeiro o carbamoil fosfato doa seu grupo carbamoila para a ornitina formando citrulina com a liberação de Pi Figura 1810 etapa ➊ A reação é catalisada pela ornitinatranscarbamoilase A ornitina não é um dos 20 aminoácidos encontrados nas pro teínas mas é um intermediáriochave no metabolismo do nitrogênio Ela é sintetizada a partir do glutamato em uma via com cinco etapas descrita no Capítulo 22 A ornitina desempenha um papel que se assemelha àquele do oxalo acetato no ciclo do ácido cítrico aceitando material a cada volta do ciclo da ureia A citrulina produzida no primeiro passo do ciclo da ureia passa da mitocôndria para o citosol Os próximos dois passos trazem o segundo grupo ami no A fonte é o aspartato produzido na mitocôndria por transaminação e transportado para o citosol A reação de condensação entre o grupo amino do aspartato e o grupo ureido carbonila da citrulina forma argininosuccinato etapa ➋ na Figura 1810 Essa reação citosólica catali sada pela argininosuccinatosintetase requer ATP e ocorre via um intermediário citrulilAMP Figura 1811b O argininosuccinato é então clivado pela argininosucci nase etapa ➌ na Figura 1810 formando arginina e fuma rato este último é convertido em malato e a seguir entra na mitocôndria para unirse aos intermediários do ciclo do áci do cítrico Esse passo é a única reação reversível do ciclo da ureia Na última etapa do ciclo etapa ➍ a enzima citosó lica arginase cliva a arginina produzindo ureia e ornitina A ornitina é transportada para a mitocôndria para iniciar outra volta do ciclo da ureia Como foi observado no Capítulo 16 as enzimas de mui tas vias metabólicas encontramse agrupadas p 636 com o produto de uma reação enzimática sendo canalizado di retamente para a próxima enzima da via No ciclo da ureia as enzimas mitocondriais e citosólicas parecem estar agru padas dessa forma A citrulina transportada para fora da mitocôndria não é diluída no conjunto geral de metabólitos no citosol mas passa diretamente para o sítio ativo da ar gininosuccinatosintetase Essa canalização entre enzimas continua para o argininosuccinato a arginina e a ornitina Apenas a ureia é liberada para o conjunto geral de metabó litos no citosol Os ciclos do ácido cítrico e da ureia podem ser ligados Uma vez que o fumarato produzido na reação da arginino succinase também é um intermediário do ciclo do ácido cí trico os ciclos estão a princípio interconectados em pro cesso apelidado de bicicleta de Krebs Figura 1812 Contudo cada ciclo opera independentemente e a comuni cação entre eles depende do transporte de intermediários chave entre a mitocôndria e o citosol Os principais trans portadores na membrana interna da mitocôndria incluem o transportador malatoacetoglutarato o transportador glutamatoaspartato e o transportador glutamatoOH Jun ❶ ❶ ❷ ❷ ❸ O C OH OH NH3 O O C ATP Bicarbonato Anidrido carbônicoácido fosfórico Carbamoilfosfato Carbamato ADP ADP Pi PPi AMP AMP Aspartato ADP O O P O O O O P O O O O P O O ATP Citrulina CitrulilAMP Argininosuccinato Adenosina O O P O O P O O O O P O O ATP NH2 NH3 NH O O C H2N O C H2N C O CH23 COO C H NH2 H2N NH3 NH C O CH23 COO C H NH2 NH3 NH C C N H CH23 COO COO COO CH2 C H COO CH2 C H COO H O bicarbonato é fosforilado pelo ATP A amônia desloca o grupo fosforila gerando carbamato O carbamato é fosforilado produzindo carbamoil fosfato Um rearranjo leva à adição de AMP ativando o oxigênio da carbonila da citrulina A adição de aspartato é facilitada pelo desloca mento do AMP a b MECANISMO FIGURA 1811 Reações que captam nitrogênio no ci clo da ureia Os átomos de nitrogênio da ureia são obtidos por meio de duas reações que necessitam de ATP a Na reação catalisada pela carba moilfosfatosintetase I entra o primeiro átomo de nitrogênio sob a forma de amônia Os grupos fosfato terminais de duas moléculas de ATP são uti lizados para formar uma molécula de carbamoilfosfato Em outras pala vras essa reação apresenta dois passos de ativação ➊ e ➌ Mecanismo da carbamoilfosfato sintetase b Na reação catalisada pela argininosuccina tosintetase o segundo nitrogênio entra no ciclo a partir do aspartato A ativação do oxigênio do grupo ureído da citrulina no passo ➊ prepara o composto para a adição do aspartato no passo ➋ Mecanismo da arginino succinato sintetase Nelson6edbookindb 706 Nelson6edbookindb 706 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 707 tos esses transportadores facilitam o movimento do mala to e do glutamato para dentro da matriz mitocondrial e o movimento do aspartato e do acetoglutarato para fora da mitocôndria rumo ao citosol Diversas enzimas do ciclo do ácido cítrico incluindo a fumarase fumaratohidratase e a malatodesidrogenase p 647 também estão presentes como isoenzimas no ci tosol Não há um transportador para levar diretamente o fu marato gerado na síntese de arginina no citosol para a ma triz mitocondrial Contudo o fumarato pode ser convertido em malato no citosol e depois esses intermediários podem ser metabolizados no citosol ou o malato pode ser trans portado para o interior da mitocôndria para utilização no ciclo do ácido cítrico O aspartato formado na mitocôndria por transaminação entre o oxaloacetato e o glutamato pode ser transportado para o citosol onde atua como doador de nitrogênio na reação do ciclo da ureia catalisada pela ar gininosuccinatosintetase Essas reações que constituem a lançadeira aspartatoargininosuccinato fornecem elos metabólicos entre essas vias separadas pelos quais os grupos amino e os esqueletos de carbono dos aminoácidos são processados O uso do aspartato como doador de nitrogênio no ciclo da ureia pode parecer uma forma relativamente complica da de introduzir o segundo grupo amino na ureia Contu do será visto no Capítulo 22 que essa via para a incorpo ração do nitrogênio é uma das duas formas mais comuns de introduzir grupos amino na biossíntese de moléculas que os contenham No ciclo da ureia outras intercone xões entre vias podem ajudar a explicar a razão pela qual o aspartato é utilizado como doador de nitrogênio Os ci clos da ureia e do ácido cítrico estão fortemente unidos a um processo adicional que traz o NADH na forma de equivalentes redutores para dentro da mitocôndria Como detalhado no próximo capítulo o NADH produzido pela glicólise pela oxidação de ácidos graxos e em outros pro cessos não pode ser transportado através da membrana mitocondrial interna Contudo equivalentes redutores podem entrar na mitocôndria pela conversão de aspartato em oxaloacetato no citosol e utilizando o NADH para re duzir o oxaloacetato a malato o qual é então transportado para a matriz mitocondrial via transportador malatoa cetoglutarato Uma vez dentro da mitocôndria o malato pode ser convertido novamente em oxaloacetato ao mes mo tempo em que gera NADH O oxaloacetato é conver tido em aspartato na matriz e transportado para fora da mitocôndria pelo transportador aspartatoglutamato Essa lançadeira de elétrons malatoaspartato completa novo ci Matriz mitocondrial Citosol Ornitina Ornitina Ureia Arginina Fumarato Ciclo da ureia Circuito do aspartatoarginino succinato do ciclo do ácido cítrico Citrulina Carbamoilfosfato Citrulina Aspartato Aspartato Glutamato aCetoglutarato NADH NAD1 Ciclo do ácido cítrico Fumarato Malato Malato Malato Arginino succinato Oxaloacetate Oxaloacetato Glutamato aCetoglutarato NADH NAD1 Lançadeira do malatoaspartato FIGURA 1812 Vínculos entre o ciclo da ureia e o ciclo do ácido cí trico Esses dois ciclos interconectados têm sido denominados bicicleta de Krebs As vias que unem o ciclo do ácido cítrico ao ciclo da ureia são conhecidas como lançadeira do aspartatoargininosuccinato elas unem efetivamente os destinos dos grupos amino e dos esqueletos de carbono dos aminoácidos As interconexões são bastante elaboradas Por exemplo algumas enzimas do ciclo do ácido cítrico como a fumarase e a malato desidrogenase apresentam isoenzimas citosólicas e mitocondriais O fu marato produzido no citosol seja no ciclo da ureia na biossíntese de pu rinas ou em outros processos pode ser convertido em malato citosólico utilizado no citosol ou transportado para a mitocôndria para entrar no ciclo do ácido cítrico Esses processos são ainda interligados com a lançadeira do malatoaspartato conjunto de reações que traz equivalentes redutores para a mitocôndria ver também Figura 1931 Esses diferentes ciclos ou proces sos contam com um número limitado de transportadores na membrana mitocondrial interna Nelson6edbookindb 707 Nelson6edbookindb 707 030414 0745 030414 0745 708 DAVID L NELSON MICHAEL M COX clo que funciona mantendo a mitocôndria com suprimen to de NADH ver Figura 1931 Esses processos exigem que as concentrações de glu tamato e aspartato sejam mantidas em equilíbrio no cito sol A enzima que transfere grupos amino entre esses dois aminoácidoschave é a aspartatoaminotransferase AST também chamada transaminase glutâmicooxalacética TGO Essa enzima está entre as mais ativas enzimas nos hepatócitos e em outros tecidos Quando ocorre lesão te cidual essa enzima cuja atividade é facilmente mensurá vel e outras vazam para a circulação sanguínea Assim a avaliação dos níveis sanguíneos de enzimas hepáticas é importante para o diagnóstico de várias condições médi cas Quadro 181 A atividade do ciclo da ureia é regulada em dois níveis O fluxo de nitrogênio no ciclo da ureia em determinado animal varia com a dieta Quando a ingestão dietética é basicamente proteica os esqueletos de carbono dos ami noácidos são utilizados como combustível produzindo muita ureia a partir dos grupos amino excedentes Duran te o jejum prolongado quando a degradação de proteína muscular começa a suprir boa parte da energia metabóli ca do organismo a produção de ureia também aumenta significativamente Essas alterações de demanda com relação à ativida de do ciclo da ureia são realizadas a longo prazo pela regulação das velocidades de síntese das quatro enzimas do ciclo da ureia e da carbamoilfosfatosintetase I no fí gado Essas cinco enzimas são sintetizadas em taxas mais altas em animais em jejum e em animais com dietas de alto conteúdo proteico em comparação a animais alimen tados cujas dietas contenham principalmente carboidra tos e gorduras Animais com dietas desprovidas de pro teínas produzem níveis mais baixos das enzimas do ciclo da ureia Em uma escala de tempo mais curta a regulação alos térica de pelo menos uma enzimachave ajusta o fluxo pelo ciclo da ureia A primeira enzima da via a carbamoilfos fatosintetase I é ativada alostericamente por Nacetil glutamato sintetizado a partir de acetilCoA e glutamato pela Nacetilglutamatosintase Figura 1813 Em vegetais e microrganismos essa enzima catalisa a primeira etapa na síntese de novo de arginina a partir do glutamato ver Figura 2212 mas nos mamíferos a atividade da N acetilglutamatosintase no fígado exerce função puramen te reguladora os mamíferos não têm as demais enzimas necessárias para a conversão de glutamato em arginina Os níveis estacionários de Nacetilglutamato são determi nados pelas concentrações de glutamato e acetilCoA os substratos da Nacetilglutamatosintase e arginina ativa dor da Nacetilglutamatosintase e portanto ativador do ciclo da ureia A interconexão de vias reduz o custo energético da síntese da ureia Analisando o ciclo da ureia isoladamente percebese que a síntese de uma molécula de ureia requer a hidrólise de qua tro ligações fosfato ricas em energia Figura 1810 Duas moléculas de ATP são necessárias na formação do carba moilfosfato e um ATP para produzir argininosuccinato este último ATP sendo clivado em AMP e PPi que é hidroli sado em 2 Pi A equação geral do ciclo da ureia é 2 NH4 1 1 HCO3 2 1 3 ATP 42 1 H2O S ureia 1 2 ADP 32 1 4 Pi 22 1 AMP 22 1 2 H 1 QUADRO 181 MEDICINA Ensaios para avaliar lesão tecidual A análise de certas atividades enzimáticas no soro san guíneo fornece informações valiosas para o diagnóstico de diversas condições patológicas A alaninaaminotransferase ALT também denomina da transaminase glutâmicopirúvica TGP e a aspartato aminotransferase AST também denominada transami nase glutâmicooxaloacética TGO são importantes para o diagnóstico de lesões cardíacas ou hepáticas causadas por infarto do miocárdio toxicidade por drogas ou infec ções Após um infarto várias enzimas incluindo essas transaminases vazam das células cardíacas lesionadas para a corrente sanguínea Medidas das atividades séri cas dessas duas transaminases pelos testes STGP e STGO S de soro e de outra enzima a creatinacinase pelo teste SCK podem fornecer informações sobre a gravida de da lesão A creatinacinase é a primeira enzima car díaca a aparecer no sangue após um infarto ela também desaparece rapidamente do sangue A TGO é a próxima a surgir e a TGP aumenta posteriormente A lactato desidrogenase também pode vazar do músculo cardíaco lesionado ou anaeróbio Esses testes STGP e STGO de avaliação das ati vidades das transaminases no soro também são impor tantes em medicina ocupacional para se determinar se pessoas expostas a tetracloreto de carbono clorofórmio ou outros solventes industriais sofreram lesão hepática A degeneração hepática causada por esses solventes é acompanhada pelo surgimento de várias atividades en zimáticas no sangue originárias dos hepatócitos lesiona dos As aminotransferases são muito úteis no monitora mento de pessoas expostas a essas substâncias químicas pois essas atividades enzimáticas são altas no fígado e assim sendo provavelmente estarão entre as proteínas liberadas dos hepatócitos lesionados além disso elas podem ser detectadas no sangue em quantidades muito pequenas Nelson6edbookindb 708 Nelson6edbookindb 708 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 709 Contudo esse aparente custo é reduzido pelas intercone xões detalhadas acima O fumarato gerado pelo ciclo da ureia é convertido em malato e este transportado para dentro da mitocôndria Figura 1812 Dentro da matriz mitocondrial NADH é gerado na reação da malato desidro genase Cada molécula de NADH pode gerar até 25 ATP durante a respiração mitocondrial Capítulo 19 reduzindo muito o custo energético geral da síntese de ureia Defeitos genéticos do ciclo da ureia podem ser fatais Pessoas com defeitos genéticos em qualquer das enzi mas envolvidas na formação de ureia não toleram die tas ricas em proteína Os aminoácidos ingeridos em exces so além das necessidades mínimas diárias para a síntese proteica são desaminados no fígado produzindo amônia li vre que não pode ser convertida em ureia para ser exporta da para a corrente sanguínea e como já foi frisado a amô nia é altamente tóxica A ausência de uma enzima do ciclo da ureia pode resultar em hiperamonemia ou no aumento de um ou mais intermediários do ciclo da ureia dependen do da enzima que estiver faltando Uma vez que a maioria das etapas do ciclo da ureia é irreversível a ausência de uma atividade enzimática frequentemente pode ser identifi cada pela determinação de qual intermediário do ciclo está presente em concentrações especialmente altas no sangue eou na urina Embora a degradação dos aminoácidos possa apresentar sérios problemas para a saúde das pessoas com deficiências no ciclo da ureia uma dieta desprovida de pro teínas não é uma opção de tratamento Humanos são inca pazes de sintetizar metade dos vinte aminoácidos proteicos e esses aminoácidos essenciais Tabela 181 devem es tar presentes na dieta Uma variedade de tratamentos é disponibilizada para pessoas com defeitos no ciclo da ureia A administração cui dadosa na dieta dos ácidos aromáticos benzoato ou fenilbu tirato pode ajudar a diminuir os níveis de amônia no sangue O benzoato é convertido em benzoilCoA que se combina com a glicina formando hipurato Figura 1814 à esquer da A glicina utilizada nessa reação deve ser regenerada e a amônia é captada pela reação da glicinasintase O fe nilbutirato é convertido em fenilacetato pela boxidação O fenilacetato é então convertido em fenilacetilCoA que se combina com a glutamina formando fenilacetilglutamina Figura 1814 à direita A resultante remoção de glutami na desencadeia um aumento em sua síntese pela glutamina sintetase ver Equação 221 em uma reação que capta amônia Tanto o hipurato quanto a fenilacetilglutamina são compostos não tóxicos e são excretados na urina As vias mostradas na Figura 1814 constituem apenas contribui ções secundárias ao metabolismo normal mas tornamse proeminentes quando ácidos aromáticos são ingeridos Outras terapias são mais específicas para determinada deficiência enzimática A deficiência de Nacetilglutamato sintase resulta na ausência do ativador normal para a car bamoilfosfatosintetase I Figura 1813 Essa condição pode ser tratada pela administração de carbamoilglutama to um análogo do Nacetilglutamato que ativa efetivamen te a carbamoilfosfatosintetase I 1 Carbamoilfosfato CH2 CH2 SCoA 1 COO2 C COO2 AcetilCoA NAcetilglutamato Nacetilglutamato sintase CH3 O C H C CH2 O2 H C P CH3 1 CH2 CoASH Glutamato Arginina 1 H2N COO2 HCO3 2 NH4 2ATP H3N NH C O O O O COO2 O2 2ADP 1 Pi Carbamoilfosfato sintetase I FIGURA 1813 Síntese de Nacetilglutamato e ativação da carbamoil fosfatosintetase I por esse composto TABELA 181 Aminoácidos essenciais e não essenciais para humanos e para ratos albinos Não essenciais Essenciais condicionais Essenciais Alanina Arginina Histidina Asparagina Cisteína Isoleucina Aspartato Glutamina Leucina Glutamato Glicina Lisina Serina Prolina Metionina Tirosina Fenilalanina Treonina Triptofano Valina Necessários em certo grau para animais jovens em crescimento eou durante certas patologias Nelson6edbookindb 709 Nelson6edbookindb 709 030414 0745 030414 0745 710 DAVID L NELSON MICHAEL M COX NH Carbamoilglutamato H2N CH2 CH2 C H C O COO2 COO2 A suplementação da dieta com arginina é útil no trata mento de deficiências de ornitinatranscarbamoilase argininosuccinatosintetase e de argininosuccinase Muitos desses tratamentos devem ser acompanhados por controle dietético rígido e suplementação de aminoácidos essenciais Nos raros casos de deficiência de arginase a arginina substrato da enzima defeituosa deve ser supri mida da dieta RESUMO 182 Excreção de nitrogênio e o ciclo da ureia c A amônia é altamente tóxica para os tecidos animais No ciclo da ureia a ornitina combinase com a amônia na forma de carbamoilfosfato para formar citrulina Um segundo grupo amino é transferido para a citrulina a partir do aspartato para formar arginina o precursor imediato da ureia A arginase catalisa a hidrólise da argi nina em ureia e ornitina assim a ornitina é regenerada a cada volta do ciclo c O ciclo da ureia resulta na conversão líquida de oxalo acetato em fumarato ambos intermediários do ciclo do ácido cítrico Desse modo os dois ciclos estão interco nectados c A atividade do ciclo da ureia é regulada no nível de sín tese de suas enzimas e por regulação alostérica da enzi ma que catalisa a formação de carbamoilfosfato 183 Vias da degradação dos aminoácidos As vias do catabolismo dos aminoácidos em conjunto re presentam normalmente apenas 10 a 15 da produção de energia no organismo humano essas vias são bem menos ativas que a glicólise e a oxidação dos ácidos graxos O fluxo ao longo das vias catabólicas também varia muito depen dendo do equilíbrio entre as necessidades para processos biossintéticos e a disponibilidade de determinado aminoá cido As 20 vias catabólicas convergem para formar apenas seis produtos principais os quais podem entrar no ciclo do ácido cítrico Figura 1815 Desse ponto os esqueletos de carbono tomam vias distintas sendo direcionados para a gliconeogênese ou para a cetogênese ou oxidados comple tamente a CO2 e H2O Sete dos aminoácidos podem ter seus esqueletos de car bono total ou parcialmente degradados para produzir ace tilCoA Cinco aminoácidos são convertidos em acetoglu tarato quatro em succinilCoA dois em fumarato e dois em oxaloacetato Seis aminoácidos têm seu esqueleto carbona do total ou parcialmente convertido em piruvato o qual C O CoASH SCoA BenzoilCoA Benzoato COO2 ATP AMP 1 PPi Glicina CoASH C O Hipurato benzoilglicina 1 CoASH CoASH AcetilCoA 1 Fenilacetato Fenilbutirato CH2 CH2 COO2 CH2 CH2 CH2 COO2 NH CH2 COO2 CH2 COO2 Glutamina CoASH C O SCoA FenilacetilCoA Fenilacetilglutamina ATP AMP 1 PPi CH2 CH2 NH2 CH2 CH C O C O COO2 NH H3N 1 H3N 1 CH2 NH2 CH2 CH C O COO2 boxidação FIGURA 1814 Tratamento para deficiências em enzimas do ciclo da ureia Os ácidos aromáticos benzoico e fenilbutírico admi nistrados na dieta são metabolizados e se combinam com a glicina e com a glutamina respectivamente Os produtos são excretados na urina A síntese subsequente de glicina e de glutamina para repor esses intermediá rios remove a amônia da corrente sanguínea Nelson6edbookindb 710 Nelson6edbookindb 710 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 711 pode ser transformado em acetilCoA ou em oxaloacetato Posteriormente serão resumidas as vias individuais para os 20 aminoácidos em diagramas de fluxo cada um levando a um ponto específico de entrada no ciclo do ácido cítri co Nesses diagramas os átomos de carbono que entram no ciclo do ácido cítrico são mostrados coloridos Observe que alguns aminoácidos aparecem mais de uma vez refle tindo diferentes destinos para diferentes partes de seus es queletos de carbono Em vez de examinar cada etapa de cada via no catabolismo dos aminoácidos serão destacadas para uma discussão especial algumas reações enzimáticas de relevância particular devido a seus mecanismos ou seu significado médico Alguns aminoácidos são convertidos em glicose outros em corpos cetônicos Os sete aminoácidos inteira ou parcialmente degradados em acetoacetilCoA eou acetilCoA fenilalanina tirosina isoleucina leucina triptofano treonina e lisina podem produzir corpos cetônicos no fígado onde a acetoacetil CoA é convertida em acetoacetato e então em acetona e bhidroxibutirato ver Figura 1719 Esses são aminoáci dos cetogênicos Figura 1815 Sua capacidade de pro duzir corpos cetônicos é especialmente evidente no diabe tes melito não controlado quando o fígado produz grandes quantidades de corpos cetônicos a partir de ácidos graxos e de aminoácidos cetogênicos Os aminoácidos degradados em piruvato acetoglu tarato succinilCoA fumarato eou oxaloacetato podem ser convertidos em glicose e glicogênio pelas vias des critas nos Capítulos 14 e 15 Esses são aminoácidos gli cogênicos Aminoácidos glicogênicos e cetogênicos não são excludentes entre si cinco aminoácidos triptofano fenilalanina tirosina treonina e isoleucina são tanto cetogênicos quanto glicogênicos O catabolismo dos ami noácidos é especialmente crítico para a sobrevivência de animais em dietas ricas em proteína ou durante o jejum A leucina é um aminoácido exclusivamente cetogênico muito comum em proteínas Sua degradação contribui substancialmente para a cetose em condições de jejum prolongado Glicose Fumarato SuccinilCoA Citrato CO2 Isocitrato Succinato Ciclo do ácido cítrico Fenilalanina Tirosina Glutamato Arginina Glutamina Histidina Prolina Isoleucina Metionina Treonina Valina Corpos cetônicos Oxaloacetato Malato Glicogênicos Cetogênicos AcetilCoA Piruvato Alanina Cisteína Glicina Serina Treonina Triptofano AcetoacetilCoA Leucina Lisina Fenilalanina Triptofano Tirosina Asparagina Aspartato Isoleucina Leucina Treonina Triptofano Cetoglutarato a FIGURA 1815 Resumo do catabolismo dos aminoácidos Os aminoá cidos estão agrupados conforme seu principal produto final de degradação Alguns aminoácidos estão listados mais de uma vez pois diferentes partes de seus esqueletos de carbono são degradadas em diferentes produtos fi nais A figura mostra as vias catabólicas mais importantes em vertebrados há contudo variações menores entre diferentes espécies de vertebrados A treonina por exemplo é degradada por no mínimo duas vias diferentes ver Figuras 1819 e 1827 e a importância de determinada via pode variar com o organismo e as condições metabólicas Aminoácidos glicogênicos e ceto gênicos também estão delineados na figura sombreados em cores Observe que cinco aminoácidos são tanto glicogênicos quanto cetogênicos Os ami noácidos que produzem piruvato também são potencialmente cetogênicos Apenas dois aminoácidos lisina e leucina são exclusivamente cetogênicos Nelson6edbookindb 711 Nelson6edbookindb 711 030414 0745 030414 0745 712 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Diversos cofatores enzimáticos desempenham papéis importantes no catabolismo dos aminoácidos Uma variedade de rearranjos químicos interessantes ocor rem nas vias catabólicas dos aminoácidos Será útil começar o estudo dessas vias observando classes de reações recor rentes e apresentar seus cofatores enzimáticos Já foi abor dada uma importante classe as reações de transaminação que necessitam de pirodoxalfosfato Outro tipo comum de reação que ocorre no catabolismo dos aminoácidos são as transferências de grupos de um carbono as quais em geral envolvem um de três possíveis cofatores a biotina o tetra hidrofolato ou a Sadenosilmetionina Figura 1816 Es ses cofatores transferem grupos de um carbono em dife rentes estados de oxidação a biotina transfere grupos de um carbono em seu estado mais oxidado CO2 ver Figura 1419 o tetrahidrofolato transfere grupos de um carbono em estados intermediários de oxidação e algumas vezes como grupos metila e a Sadenosilmetionina transfere gru pos metila o estado mais reduzido do carbono Os últimos dois cofatores são especialmente importantes para o meta bolismo dos aminoácidos e dos nucleotídeos A molécula do tetrahidrofolato H4folato sinteti zada em bactérias consiste em três porções pterina subs tituída 6metilpterina paminobenzoato e glutamato Fi gura 1816 H2N N O N H Pterina N R N A forma oxidada o folato é uma vitamina para os mamífe ros sendo convertida por meio de duas etapas em tetrai drofolato pela ação da enzima dihidrofolatoredutase O grupo de um carbono a ser transferido em qualquer dos três estados possíveis de oxidação e está ligado ao N5 ou ao N10 ou a ambos A forma mais reduzida do cofator carrega um grupo metila uma forma mais oxidada carrega um grupo metileno e a forma ainda mais oxidada carrega um grupo metenila formila ou formimino Figura 1817 As formas de tetrahidrofolato são em sua maioria interconversíveis funcionando como doadores de unidades de um carbono em uma grande variedade de reações metabólicas A fonte prin cipal de unidades de um carbono para o tetrahidrofolato é o carbono removido da serina em sua conversão em glicina produzindo N 5N 10metilenotetrahidrofolato Embora o tetrahidrofolato possa carregar um grupo me tila em seu N5 o potencial de transferência desse grupo me tila é insuficiente para a maioria das reações biossintéticas A Sadenosilmetionina adoMet é o cofator preferido para transferências biológicas do grupo metila Esse cofator é sintetizado a partir do ATP e da metionina na reação cata lisada pela metioninaadenosiltransferase Figura 18 18 etapa ➊ Essa reação é incomum pelo fato de o átomo de enxofre nucleofílico da metionina atacar o carbono 59 da ribose do ATP em vez de atacar um dos átomos de fósforo O trifosfato é liberado e clivado em Pi e PPi pela enzima e o PPi é hidrolisado pela pirofosfatase inorgânica Desse modo três ligações são quebradas nessa reação incluindo duas ligações de alta energia de grupos fosfato A única outra reação co nhecida na qual o trifosfato é deslocado do ATP ocorre na síntese da coenzima B12 ver Quadro 172 Figura 3 A Sadenosilmetionina é um potente agente alquilante em virtude de seu íon sulfônio desestabilizado O grupo me tila está sujeito ao ataque de nucleófilos sendo cerca de 1000 vezes mais reativo que o grupo metila do N 5metilte trahidrofolato A transferência do grupo metila da Sadenosilmetionina para um aceptor produz Sadenosilhomocisteína Figu ra 1818 etapa ➋ posteriormente degradada em homo cisteína e adenosina etapa ➌ A metionina é regenerada pela transferência de um grupo metila para a homocisteína em reação catalisada pela metioninasintase etapa ➍ e a metionina é novamente convertida em Sadenosilmetionina para completar um ciclo de ativação da metila Uma forma de metioninasintase comum em bactérias utiliza N 5metiltetrahidrofolato como doador da metila Outra forma dessa enzima presente em algumas bactérias S Biotina COO2 O HN HN CH NH HC C CH2 CH H2C H2 CH2 CH2 9 7 4a 5 1 3 4 6 8 CH2 N O CH N N N H 2 H C H H H H CH2 COO2 NH CH2 COO2 paminobenzoato N CH2 O CH2 1 H C CH2 H3N COO2 1 SAdenosilmetionina adoMet Metionina OH N N H N H H O OH H NH S 2 CH3 N CH2 adenosina Tetrahidrofolato H4 folato Valerato Glutamato 10 8a 6metilpterina FIGURA 1816 Alguns cofatores enzimáticos importantes em reações de transferência de um carbono Os átomos de nitrogênio aos quais os grupos de um carbono são ligados ao tetrahidrofolato estão mostrados em azul Nelson6edbookindb 712 Nelson6edbookindb 712 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 713 e nos mamíferos utiliza N 5metiltetrahidrofolato porém o grupo metila é inicialmente transferido para a cobalamina derivada da vitamina B12 formando metilcobalamina usada como doadora da metila para a formação da metionina Essa reação e o rearranjo da LmetilmalonilCoA para produzir succinilCoA ver Quadro 172 Figura Q1a são as duas únicas reações conhecidas que são dependentes da coenzi ma B12 nos mamíferos As vitaminas B12 e folato estão fortemente relaciona das nessas vias metabólicas A doença causada por H N N H N H CH2 CH2 5 10 N10formil tetrahidrofolato sintetase ADP 1 Pi ADP 1 Pi H N CH3 H N H CH2 CH2 5 10 Estado de oxidação do grupo transferido COO2 NADPH 1 H1 H N H2C N H N CH2 CH2 5 10 N5N10metileno tetrahidrofolato redutase NADP1 NADPH 1 H1 H N N H N H CH2 5 10 HC C O H CH2 CH2OH H N N H N H CH2 CH2 5 10 O H H N N H N CH2 5 10 N5N10metileno tetrahidrofolato desidrogenase N5N10metenil tetrahidrofolato sintetase Ciclohidrolase via menos utilizada espontâneo HC CH2 HN O C H forma mais oxidada forma mais reduzida CH2OH NADP1 NH4 H2O C H H3N H 1 COO2 C H H3N 1 Glicina Serina PLP H2O H N N H N H CH2 CH2 5 10 CH3 N H Serinahidroximetiltransferase Ciclodesaminase Tetrahidrofolato 1 1 N5N10formil tetrahidrofolato N5formimino tetrahidrofolato N10formil tetrahidrofolato N5formil tetrahidrofolato N5N10metileno tetrahidrofolato N5Metil tetrahidrofolato Formato Ciclohidrolase ATP ATP FIGURA 1817 Conversões de unidades de um carbono ligadas ao tetrahidrofolato As diferentes espécies moleculares estão agrupadas de acordo com seu estado de oxidação com as mais reduzidas na parte superior e as mais oxidadas na parte inferior da figura Todas as espécies dentro de um único quadro sombreado estão no mesmo estado de oxidação A conversão de N 5N 10metilenotetrahidrofolato em N 5metiltetrahidrofolato é efetiva mente irreversível A transferência enzimática de grupos formila como na síntese das purinas ver Figura 2235 e na formação de formilmetionina nas bactérias Capítulo 27 geralmente utiliza N 10formiltetrahidrofolato em vez de N 5formiltetrahidrofolato Este último é significativamente mais estável e portanto um doador menos eficiente de grupos formila O N 5formiltetra hidrofolato é um produto colateral na reação da ciclohidrolase e também pode se formar espontâneamente A conversão de N 5formiltetrahidrofolato em N 5N 10meteniltetrahidrofolato requer ATP pois de outra forma o equi líbrio dessa reação seria desfavorável Observe que o N 5formiminotetra hidrofolato é derivado da histidina em uma via mostrada na Figura 1826 Nelson6edbookindb 713 Nelson6edbookindb 713 030414 0745 030414 0745 714 DAVID L NELSON MICHAEL M COX deficiência de vitamina B12 a anemia perniciosa é rara sendo observada apenas em pessoas com defeitos nas vias para absorção intestinal dessa vitamina ver Quadro 172 ou em vegetarianos estritos a vitamina B12 não está presen te em plantas A doença progride vagarosamente pois apenas quantidades pequenas de vitamina B12 são necessá rias e os depósitos normais dessa vitamina no fígado podem durar de três a cinco anos Os sintomas incluem além da anemia vários distúrbios neurológicos A anemia pode ser seguida até a reação da metionina sintase Como já mencionado o grupo metila da metilco balamina originase do N 5metiltetrahidrofolato e essa é a única reação que utiliza N 5metiltetrahidrofolato nos ma míferos A reação que converte a forma N 5N 10metileno na forma N 5metila do tetrahidrofolato é irreversível Figura 1817 Assim sendo se a coenzima B12 não estiver disponí vel para a síntese de metilcobalamina o folato metabólico é mantido na forma N 5metila A anemia associada com a defi ciência de vitamina B12 é denominada anemia megaloblás tica Suas manifestações incluem uma redução na produção de eritrócitos as células vermelhas do sangue maduros e o aparecimento na medula óssea de células precurso ras imaturas os megaloblastos Os eritrócitos normais são gradualmente substituídos no sangue por um número menor de eritrócitos anormalmente grandes denominados macrócitos O defeito no desenvolvimento eritrocitário é consequência direta da depleção de N 5N 10metilenotetra hidrofolato necessário para a síntese de nucleotídeos da timidina utilizados na síntese de DNA ver Capítulo 22 A deficiência de folato na qual todas as formas de tetrahidro folato estão depletadas também leva à anemia basicamente pelas mesmas razões Os sintomas da anemia pela deficiên cia de vitamina B12 podem ser atenuados pela administração tanto de vitamina B12 quanto de folato É perigoso contudo tratar a anemia perniciosa com a suplementação de folato apenas pois os sintomas neuro lógicos da deficiência de vitamina B12 progredirão Esses sintomas não surgem da deficiência na reação da metioni nasintase O prejuízo na atividade da metilmalonilCoA mutase ver Quadro 172 e Figura 1712 causa acúmulo de ácidos graxos incomuns com número ímpar de carbo nos nas membranas neuronais Portanto a anemia asso ciada com a deficiência de folato é frequentemente tratada com a administração de ambos folato e vitamina B12 ao menos até que a origem metabólica da anemia esteja cla ramente definida O diagnóstico precoce de deficiência de vitamina B12 é importante pois algumas condições neuroló gicas a ela associadas podem ser irreversíveis A deficiência de folato também diminui a disponibilida de de N 5metiltetrahidrofolato necessário para a função da metioninasintase Isso leva a um aumento nos níveis de homocisteína no sangue condição relacionada com doença cardíaca hipertensão e acidente vascular cerebral Níveis elevados de homocisteína podem ser responsáveis por 10 de todos os casos de doença cardíaca Essa condição é tra tada com suplementação com folato 2O CH2 P O O2 O2 O2 O O O P P O O Metionina H2O H H N H N CH3 CH2 5 N5Metiltetrahidrofolato N H H N H N H CH2 CH2 N H CH2 Tetrahidrofolato ATP C H3N S CH2 COO2 CH2 CH3 NH2 OH N O H H H H OH N N N Metionina sintase Adenosina Coenzima B12 C H3N 1 SH CH2 H COO2 CH2 Homocisteína Hidrolase C H3N 1 Adenosina H COO2 CH2 SAdenosilhomocisteína S CH2 1 1 NH2 CH3 OH N O H H H H OH N N N C H3N 1 1S CH2 COO2 CH2 H CH3 SAdenosil metionina CH2 Várias metil transferases R R PPi 1 Pi Metionina adenosil transferase FIGURA 1818 Síntese de metionina e de Sadenosilmetionina em um ciclo de ativação de grupo metila Os passos são descritos no tex to Na reação da metioninasintase etapa ➍ o grupo metila é transferido para a cobalamina formando metilcobalamina que por sua vez é doador da metila na formação da metionina A Sadenosilmetionina que apresenta um enxofre carregado positivamente sendo portanto um íon sulfônio é um poderoso agente metilante em diversas reações biossintéticas O aceptor do grupo metila etapa ➋ é designado R Nelson6edbookindb 714 Nelson6edbookindb 714 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 715 A tetrahidrobiopterina outro cofator utilizado no ca tabolismo dos aminoácidos é semelhante à porção pterina do tetrahidrofolato mas não está envolvida em reações de transferência de grupos de um carbono e sim em reações de oxidação Seu modo de ação será abordado quando for discutida a degradação da fenilalanina ver Figura 1824 Seis aminoácidos são degradados até piruvato Os esqueletos de carbono de seis aminoácidos são conver tidos total ou parcialmente em piruvato O piruvato pode então ser convertido em acetilCoA e por fim oxidado via ciclo do ácido cítrico ou ser convertido em oxaloacetato e encaminhado para a gliconeogênese Os seis aminoácidos são a alanina o triptofano a cisteína a serina a glicina e a treonina Figura 1819 A alanina produz piruvato di retamente por transaminação com o acetoglutarato e a cadeia lateral do triptofano é clivada produzindo alanina e portanto piruvato A cisteína é convertida em piruvato por meio de duas etapas inicialmente é removido o átomo de enxofre e a seguir ocorre uma transaminação A serina é convertida em piruvato pela serinadesidratase Tanto o grupo hidroxila do carbono b quanto o grupo aamino da serina são removidos nessa única reação que é dependente de piridoxalfosfato Figura 1820a A glicina pode ser degrada por meio de três vias ape nas uma delas produzindo piruvato A glicina é convertida em serina pela adição enzimática de um grupo hidroximeti la Figuras 1819 e 1820b Essa reação catalisada pela se rinahidroximetiltransferase requer as coenzimas te trahidrofolato e piridoxalfosfato A serina é convertida em piruvato como descrito anteriormente Na segunda via que predomina nos animais a glicina sofre clivagem oxidativa produzindo CO2 NH4 1 e um grupo metileno CH2 Fi guras 1819 e 1820c Essa reação facilmente reversível catalisada pela enzima de clivagem da glicina também denominada glicinasintase também requer tetrahidrofo lato que recebe o grupo metileno Nessa via de clivagem oxidativa os dois átomos de carbono da glicina não entram no ciclo do ácido cítrico Um carbono é perdido como CO2 e o outro se torna o grupo metileno do N 5 N 10metilenotetra hidrofolato Figura 1817 doador de grupos de um carbo no em certas vias biossintéticas CH3 CH2 CH3 CO2 NH4 1 CH OH CH COO2 COO2 NH3 1 NAD1 NADH NAD1 NADH CoA N5 N10metileno H4 folato 2Amino3cetobutirato Treonina desidrogenase 2amino3 cetobutirato CoAligase Serina hidroximetil transferase Serina desidratase Alaninaaminotransferase Enzima de clivagem da glicina NH3 1 NH3 1 CH COO2 Treonina CH2 H2O H2O CH COO2 NH3 1 NH4 1 HO Serina Cisteína Glicina PLP PLP Glutamato 2 etapas C O CH3 COO2 C O CH2 CH SH COO2 NH3 1 AcetilCoA Piruvato 1 H4 folato aCetoglutarato H CH3 CH2 COO2 CH CH COO2 N Triptofano Alanina NH3 NH3 1 1 4 etapas PLP FIGURA 1819 Vias catabólicas para alanina glicina serina cisteína triptofano e treonina O destino do grupo indol do triptofano é mostrado na Figura 1821 Detalhes da maioria das reações envolvendo a serina e a glicina são mostrados na Figura 1820 As vias aqui mostradas para a degradação da treonina são responsáveis por apenas cerca de um terço do catabolismo da treonina para a via alternativa ver Figura 1827 Diversas vias de degradação da cisteína levam ao piruvato O enxofre da cisteína pode ter diversos destinos alternativos um dos quais está mos trado na Figura 2217 Os átomos de carbono nesta figura e nas seguintes são mostrados em um código de cores para permitir acompanhar seus destinos Nelson6edbookindb 715 Nelson6edbookindb 715 030414 0745 030414 0745 716 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Serina ligada covalen temente Piruvato b Reação da serinahidroximetiltransferase H2O H2O NH3 Enz Enz P Enz H Enz NH H CH COO O H CH2 C H B PLP NH CH COO CH2 C HB Lys PLP PLP HB Enz Enz Lys PLP H2N COO CH3 C O COO CH2 C H2N COO H CH2 C Enz Enz Lys PLP N5N10 metileno H4folato H4folato NADH NAD Glicina ligada covalentemente Carbânion estabilizado pelo PLP Carbânion estabilizado pelo PLP NH CH COO H C H B PLP H3N H COO CH2OH C H COO CH2 HO N5N10 metileno H4folato C NH CH COO H C PLP NH CH PLP H4folato c Reação da enzima de clivagem da glicina Glicina ligada covalentemente NH H CH C O O H C CO2 PLP NH CH C H H C H H H PLP S S a Reação da serinadesidratase Enz H NH CH PLP S HS Enz H Enz T Enz L H3N CH2 NH3 S HS Enz H HS HS Enz H S S A abstração de um próton do carbono leva à eliminação b de OH A ligação ao PLP é revertida A ligação ao PLP é revertida O rearranjo da enamina forma uma imina A desaminação hidrolítica forma piruvato A ligação aldimina ao PLP é revertida e o produto é liberado O carbânion ataca o metileno do N5N10metileno H4folato produzindo serina A abstração de um próton forma um carbânion estabilizado pelo PLP A descarboxila ção da glicina forma um carbânion estabilizado pelo PLP O carbânion ataca o ácido lipoico oxidado componente da enzima H Um metileno é transferido para o H4folato com eliminação de amônia O ácido lipoico é reoxidado ❶ ❶ ❶ ❷ ❷ ❷ ❸ ❸ ❸ ❹ ❺ ❹ Serina MECANISMO FIGURA 1820 Interações entre os cofatores piridoxal fosfato e tetrahidrofolato no metabolismo da serina e da glici na A primeira etapa em cada uma dessas reações não mostrado envolve a formação de uma ligação covalente imina entre o PLP ligado à enzima e o aminoácido substrato da reação serina em a glicina em b e c a Uma eliminação de água catalisada pelo PLP na reação da serinadesidratase etapa ➊ inicia a via para o piruvato b Na reação da serinahidroximetil transferase um carbânion estabilizado pelo PLP produto da etapa ➊ é um intermediáriochave na transferência reversível do grupo metileno como CH2OH do N 5N 10metilenotetrahidrofolato para formar serina c A en zima de clivagem da glicina é um complexo multienzimático contendo os componentes P H T e L A reação geral que é reversível converte glicina em CO2 e NH4 1 sendo o segundo carbono da glicina captado pelo tetrahidro folato para formar N 5N 10metilenotetrahidrofolato O piridoxalfosfato ativa o carbono a do aminoácido em estágios críticos em todas essas reações e o tetrahidrofolato carrega unidades de um carbono em duas delas ver Figuras 186 e 1817 Nelson6edbookindb 716 Nelson6edbookindb 716 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 717 Essa segunda via de degradação da glicina parece ser essencial para os mamíferos Seres humanos com defei tos graves envolvendo a atividade da enzima de clivagem da glicina sofrem de uma condição conhecida como hiperglice mia não cetótica Essa condição se caracteriza por níveis séri cos elevados de glicina levando a graves deficiências mentais e morte no início da infância Em níveis elevados a glicina é um neurotransmissor inibitório o que pode explicar os efei tos neurológicos da doença Muitos defeitos genéticos do me tabolismo dos aminoácidos foram identificados em humanos Tabela 182 e ao longo deste capítulo outros serão encon trados Na terceira e última via de degradação da glicina a molécula não quiral da glicina é substrato para a enzima D aminoácidooxidase A glicina é convertida em glioxilato substrato alternativo para a lactatodesidrogenase hepática p 563 O glioxilato é oxidado produzindo oxalato em rea ção dependente de NAD 1 1 O NH3 NH3 CH2 COO2 COO2 O2 H2O CH NAD1 NADH Glioxilato Oxalato Daminoácido oxidase COO2 COO2 Glicina Acreditase que a principal função da Daminoácido oxidase presente em níveis elevados nos rins seja a destoxificação de Daminoácidos ingeridos derivados das paredes celulares bacterianas e de alimentos grelhados temperaturas elevadas causam racemização espontânea de Laminoácidos presentes nas proteínas O oxalato seja obtido a partir da dieta ou produzido enzimaticamente nos rins tem importância médica Cristais de oxalato de cálcio representam até 75 de todos os cálculos renais Há duas vias significativas para a degradação da treoni na Uma via leva à produção de piruvato via glicina Figura 1819 A conversão em glicina ocorre em duas etapas com a treonina sendo convertida em 2amino3cetobutirato pela ação da treoninadesidrogenase Essa é uma rota de im portância relativamente menor em humanos representando 10 a 30 do catabolismo da treonina porém mais importan te em outros mamíferos Em humanos a rota principal leva à produção de succinilCoA sendo descrita posteriormente Em laboratório a serinahidroximetiltransferase catali sa a conversão de treonina em glicina e acetaldeído em uma etapa porém essa rota não é importante para a degradação da treonina em mamíferos Sete aminoácidos são degradados produzindo acetilCoA Partes dos esqueletos de carbono de sete aminoácidos triptofano lisina fenilalanina tirosina leucina isoleucina e treonina produzem acetilCoA eou ace toacetilCoA esta última sendo convertida em acetilCoA Figura 1821 Algumas das etapas finais das vias de de gradação da leucina da lisina e do triptofano assemelhamse a etapas da oxidação dos ácidos graxos ver Figura 179 A treonina produz alguma acetilCoA não mostrado na Figura 1821 através da rota secundária ilustrada na Figura 1819 As vias de degradação de dois desses sete aminoácidos merecem especial atenção A degradação do triptofano é a mais complexa de todas as vias do catabolismo de aminoá cidos em tecidos animais Partes do triptofano quatro de TABELA 182 Algumas doenças genéticas humanas que afetam o catabolismo dos aminoácidos Condição médica Incidência aproximada por 100000 nascimentos Processo defeituoso Enzima defeituosa Sintomas e efeitos Acidemia argininossuccínica 15 Síntese de ureia Argininosuccinase Vômitos convulsões Acidemia metilmalônica 05 Conversão de propio nilCoA em succinil CoA MetilmalonilCoAmutase Vômitos convulsões deficiência intelectual morte prematura Albinismo 3 Síntese de melanina a partir de tirosina Tirosina3monoxigenase tirosinase Falta de pigmentação cabelo branco pele rosada Alcaptonúria 04 Degradação da tiro sina Homogentisato12dioxi genase Pigmento escuro na urina artrite se desenvolve posterior mente Argininemia 05 Síntese de ureia Arginase Deficiência intelectual Deficiência de carbamoil fosfatosintetase I 05 Síntese de ureia Carbamoilfosfatosin tetase I Letargia convulsões morte prematura Doença do xarope de bordo cetoacidúria de cadeia ra mificada 04 Degradação de isoleu cina leucina e valina Complexo da desidroge nase dos acetoácidos de cadeia ramificada Vômitos convulsões retardo mental morte prematura Fenilcetonúria 8 Conversão de fenilala nina em tirosina Fenilalaninahidroxilase Vômitos no período neonatal deficiência intelectual Homocistinúria 05 Degradação da me tionina Cistationinabsintase Desenvolvimento inadequado dos ossos deficiência intelectual Nelson6edbookindb 717 Nelson6edbookindb 717 030414 0745 030414 0745 718 DAVID L NELSON MICHAEL M COX seus carbonos produzirão acetilCoA via acetoacetilCoA Alguns intermediários no catabolismo do triptofano são precursores para a síntese de outras biomoléculas Figura 1822 incluindo o nicotinato um precursor do NAD 1 e do NADP 1 nos animais a serotonina um neurotransmissor em vertebrados e o indolacetato um fator de crescimento em plantas Algumas dessas vias biossintéticas estão des critas mais detalhadamente no Capítulo 22 ver Figuras 22 30 e 2231 A degradação da fenilalanina é notável pois defeitos genéticos nas enzimas dessa via levam a diversas doenças humanas herdadas Figura 1823 conforme discutido a seguir A fenilalanina e a tirosina produto de sua oxidação ambas com nove carbonos são degradadas em dois frag mentos ambos podendo entrar no ciclo do ácido cítrico quatro dos nove átomos de carbono produzem acetoacetato livre o qual é convertido em acetoacetilCoA e então em acetilCoA e um segundo fragmento de quatro carbonos é recuperado como fumarato Dessa forma oito dos nove car bonos desses aminoácidos entram no ciclo do ácido cítrico o carbono restante é perdido como CO2 A fenilalanina após ser hidroxilada produzindo tirosina também é precursora da dopamina um neurotransmissor e da noradrenalina e da adrenalina hormônios secretados pela medula suprarrenal ver Figura 2231 A melanina o pigmento escuro obser vado na pele e no cabelo também é derivada da tirosina N de T Estas catecolaminas também atuam como neurotransmissores C 9 etapas N H Piruvato CH3 C C C C CH CH3 C C O Leucina C C COO2 1 NH3 CH3 CH COO2 1 2CO2 COO2 Alanina Triptofano CH2 CH COO2 1 NH3 CH2 C C C HO C Fenilalanina C CH COO2 1 NH3 CH2 C C C C C O CO2 CO2 CH3 CH3 Tirosina CH COO2 1 NH3 CH COO2 Lisina CH2 1 H3N 1 CH2 CH2 CO2 NH3 CH CH COO2 aCetoadipato C Isoleucina Destino dos carbonos em azul CH2 2OOC CH2 CH2 CoASH CoASH CoASH 2OOC CH2 GlutarilCoA O CH2 NH3 1 NAD C COO2 CH2 O CH3 CoASH C CoA CH2 2OOC CH2 CH2 S C CoA CH3 CH2 O S C O CH3 CH2 CH COO2 CH NH3 1 COO2 O CH3 CH2 CH3 CH S CoA AcetoacetilCoA CoA PropionilCoA Acetoacetato 3 etapas NADH CO2 CO2 O 5 etapas 4 etapas 4 etapas 6 etapas S Fumarato AcetilCoA SuccinilCoA FIGURA 1821 Vias catabólicas para triptofano lisina fenilalanina tirosina leucina e isoleucina Esses aminoácidos doam alguns de seus carbonos em cor salmão para a acetilCoA O triptofano a fenilalanina a ti rosina e a isoleucina também fornecem carbonos em azul para a produção de piruvato ou de intermediários do ciclo do ácido cítrico A via da fenilalani na está descrita mais detalhadamente na Figura 1823 O destino dos átomos de nitrogênio não é seguido neste esquema na maior parte dos casos eles são transferidos para o acetoglutarato para formar glutamato Nelson6edbookindb 718 Nelson6edbookindb 718 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 719 O catabolismo da fenilalanina é defeituoso geneticamente em algumas pessoas Considerando que muitos aminoácidos são neuro transmissores ou precursores de neurotransmissores ou antagonistas deles não é de surpreender que defeitos genéticos no metabolismo dos aminoácidos possam causar prejuízo no desenvolvimento neural e deficiência intelec tual Em muitas dessas doenças intermediários específicos se acumulam Por exemplo um defeito genético na fenila laninahidroxilase a primeira enzima na via catabólica da fenilalanina Figura 1823 é responsável pela doença fe nilcetonúria PKU de phenylketonuria a causa mais comum de níveis elevados de fenilalanina no sangue hiper fenilalaninemia A fenilalaninahidroxilase também denominada fenila lanina4monoxigenase é uma enzima de uma classe geral de enzimas denominadas oxidases de função mista ver Quadro 211 que catalisam simultaneamente a hidroxila ção de um substrato por um átomo de oxigênio do O2 e a redução do outro átomo de oxigênio em H2O A fenilalani nahidroxilase requer o cofator tetrahidrobiopterina que transfere elétrons do NADPH ao oxigênio oxidandose a di N H C HC HC COO2 Nicotinato niacina precursor de NAD e NADP C CH COO2 CH2 H N Indolacetato fator de crescimento em vegetais C C H H C HC HC CH C C N H Triptofano CH2 COO2 NH3 1 H CH2NH3 1 N Serotonina neurotransmissor HO CH2 FIGURA 1822 O triptofano como precursor Os anéis aromáticos do triptofano originam o nicotinato niacina o indolacetato e a serotonina Os átomos coloridos indicam a origem dos átomos do anel do nicotinato H2O H1 COO2 1 CH2 O2 3cetoacilCoA transferase 2OOC 1 NH3 CH C COO2 CH2 C Fenilalanina NAD1 NADH 1 H1 Tetrahidrobiopterina O2 Fenilalanina hidroxilase Tirosinemia III PKU 1 NH3 CH C COO2 CH2 HO C Tirosina Glutamato Tirosina aminotransferase Cetoglutarato Tirosinemia II C C COO2 CH2 pHidroxifenilpiruvato HO O C C COO2 CH2 Homogentisato OH C HO CO2 phidroxifenilpiruvato dioxigenase O2 Fumarato OH H C CH2 C CH3 COO2 C O Alcaptonúria C Homogentisato12 dioxigenase C H Homogentisato C COO2 CH2 Maleilacetoacetato isomerase O Maleilacetoacetato H C C CH2 O C H C COO2 CH2 Fumarilacetoacetase O Fumarilacetoacetato H C C CH2 O C H AcetoacetilCoA CH2 C CH3 O COO2 C CoA O S Acetoacetato HO 2OOC 2OOC Tirosinemia I SuccinilCoA Succinato H2O FIGURA 1823 Vias catabólicas para a fenilalanina e a tirosina Nos seres humanos esses aminoácidos normalmente são convertidos em aceto acetilCoA e fumarato Defeitos genéticos em muitas dessas enzimas causam doenças humanas herdadas sombreados em amarelo Nelson6edbookindb 719 Nelson6edbookindb 719 030414 0745 030414 0745 720 DAVID L NELSON MICHAEL M COX hidrobiopterina no processo Figura 1824 Em seguida esse cofator é reduzido pela enzima dihidrobiopterina redutase em uma reação que requer NADPH Em pessoas com PKU uma rota secundária do metabo lismo da fenilalanina normalmente pouco utilizada passa a desempenhar um papel mais proeminente Nessa rota a feni lalanina sofre transaminação com o piruvato produzindo fe nilpiruvato Figura 1825 A fenilalanina e o fenilpiruvato acumulamse no sangue e nos tecidos e são excretados na urina daí o nome fenilcetonúria Uma quantidade consi derável de fenilpiruvato não é excretada como tal mas sofre descarboxilação a fenilacetato ou redução a fenillactato O fenilacetato confere à urina um odor característico tradicio nalmente utilizado por enfermeiros para detectar PKU em be bês O acúmulo de fenilalanina ou de seus metabólitos no iní cio da vida prejudica o desenvolvimento normal do cérebro causando grave deficiência intelectual Isso pode ser causado pelo excesso de fenilalanina que compete com outros ami noácidos pelo transporte através da barreira hematoencefáli ca resultando em déficit de metabólitos necessários A fenilcetonúria está entre os primeiros defeitos meta bólicos herdados do metabolismo descobertos em humanos Quando essa condição é identificada nos primeiros dias de vida a deficiência intelectual pode ser prevenida pelo con trole rígido da dieta a qual deve suprir fenilalanina apenas suficiente para atender às necessidades de síntese proteica O consumo de alimentos ricos em proteínas deve ser redu zido Proteínas naturais como a caseína do leite devem ser primeiramente hidrolisadas e boa parte da fenilalanina deve ser removida para que o paciente receba uma dieta adequa da pelo menos durante toda a sua infância Uma vez que o adoçante artificial aspartame é um dipeptídeo contendo as partato e um metiléster da fenilalanina ver Figura 124b alimentos adoçados com aspartame contêm avisos dirigidos a pessoas recebendo dietas em que o conteúdo de fenilalani na deve ser controlado A fenilcetonúria também pode ser causada por um defeito na enzima que catalisa a regeneração da tetrahidrobiopterina Figura 1824 O tratamento nesse caso é mais complexo do que a restrição da ingestão de fenilalanina A tetrahidrobiop terina também é necessária para a formação de L34dihidro xifenilalanina Ldopa precursor dos neurotransmissores do pamina e noradrenalina e de 5hidroxitriptofano precursor do neurotransmissor serotonina Na fenilcetonúria desse tipo esses precursores devem ser supridos na dieta A suplementa ção da dieta com a própria tetrahidrobiopterina é ineficiente pois ela é instável e não cruza a barreira hematoencefálica A triagem de doenças genéticas em recémnascidos pode apresentar uma relação custobenefício bastante favorável N H O CH3 N H H N H CH OH CH OH H2N N H H 78dihidrobiopterina forma quinonoide N H O N H HN CH HO CH OH N H H Tirosina N H H H CH3 CH CH2 COO2 NH3 1 CH O2 COO2 NH3 1 OH 5678Tetrahidrobiopterina Fenilalanina Dihidrobiopterina redutase CH2 H2O Fenilalanina hidroxilase NADPH 1 H1 NADP1 8 6 5 7 FIGURA 1824 O papel da tetrahidrobiopterina na reação da fenila laninahidroxilase O átomo de H sombreado em corderosa é transferi do diretamente do C4 para o C3 na reação Essa característica descoberta no National Institute of Health NIH é denominada troca NIH CH COO2 C O 1 Fenilalanina Piruvato Alanina Fenilpiruvato Fenilacetato Fenillactato PLP CH2 NH3 OH CH3 CH2 CH2 CH2 COO2 C COO2 COO2 CH COO2 O COO2 CH3 CH Aminotransferase 1 NH3 CO2 H2O FIGURA 1825 Rotas alternativas para o catabolismo da fenila lanina na fenilcetonúria Na PKU o fenilpiruvato se acumula nos tecidos no sangue e na urina A urina pode ainda conter fenilacetato e fenillactato Nelson6edbookindb 720 Nelson6edbookindb 720 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 721 especialmente no caso da PKU Os testes que não mais se baseiam no odor da urina são relativamente baratos e a de tecção seguida pelo tratamento precoce da PKU em bebês oito a dez casos a cada 100000 nascidos vivos economiza em posterior assistência à saúde milhões de dólares por ano Mais importante evitar o trauma emocional pela detecção com esses testes simples é inestimável Outra doença hereditária do catabolismo da fenilalanina é a alcaptonúria na qual a enzima defeituosa é a homo gentisatodioxigenase Figura 1823 Menos grave que a PKU essa condição produz poucos efeitos adversos embo ra grandes quantidades de homogentisato sejam excretadas e sua oxidação torne a urina escura Pessoas com alcapto núria também são mais suscetíveis ao desenvolvimento de uma forma de artrite A alcaptonúria é de considerável in teresse histórico Archibald Garrod descobriu no início do N de T No Brasil esse teste de triagem para erros inatos do metabolismo é conhecido como teste do pezinho século XX que essa condição é herdada e investigou a cau sa até chegar à ausência de uma única enzima Garrod foi o primeiro a estabelecer uma conexão entre um traço herda do e uma enzima um grande avanço no caminho que por fim levaria à nossa atual compreensão dos genes e das vias de expressão da informação descritas na Parte III Cinco aminoácidos são convertidos em acetoglutarato Os esqueletos de carbono de cinco aminoácidos prolina glu tamato glutamina arginina e histidina entram no ciclo do ácido cítrico como acetoglutarato Figura 1826 A proli na o glutamato e a glutamina têm esqueletos de cinco car bonos A estrutura cíclica da prolina é aberta pela oxidação do carbono mais distante do grupo carboxila criando uma base de Schiff seguindose a hidrólise da base de Schiff para produzir um semialdeído linear o gsemialdeído do glutama to Esse intermediário é posteriormente oxidado no mesmo carbono produzindo glutamato A glutamina é convertida em glutamato na reação da glutaminase ou em qualquer outra en NH COO2 H3N 1 H C C H2 C C NH gSemialdeído do glutamato COO2 H3N 1 H2 NH3 1 C H H2 C H2 C C Ornitinadaminotransferase COO2 H3N 1 H2 H3 1 C H H2O H2O C H2 C C Ornitina não catalisada H2 N5FormiminoH O H COO2 CH2 C H2 H2 N 1 H2 COO2 CH C C C H2 H2 H H2O H2 Prolina NADPH1 H1 Glutamato desidrogenase D1Pirrolina5 carboxilato 2 O 1 2 H2O Prolina oxidase NADP1 NH3 1 CH COO2 H2 C C Arginina COO2 Histidina 4 folato H2O aCeto glutarato Glutamato NH4 H4folato O C H H3N H2 C C H COO2 CH2 1 Cetoglutarato Ureia Arginase H2O 1 NH4 1 H2 C C COO2 CH2 NADPH 1 H1 Desidrogenase do semialdeído do glutamato NADP1 COO2 Glutamato 1 N C HC N N C H C N H H Glutamina C H H3N H2 2 C C H COO2 CH2 1 N O Glutaminase H2O NH4 1 a FIGURA 1826 Rotas catabólicas para arginina histidina glutama to glutamina e prolina Estes aminoácidos são convertidos em aceto glutarato Os passos numerados na via da histidina são catalisados por ➊ histidinaamônialiase ➋ urocanatohidratase ➌ imidazolonapropionase e ➍ glutamatoformiminotransferase Nelson6edbookindb 721 Nelson6edbookindb 721 030414 0745 030414 0745 722 DAVID L NELSON MICHAEL M COX tre as diversas reações enzimáticas em que a glutamina doa seu nitrogênio amídico a um aceptor A transaminação ou a desaminação do glutamato produz acetoglutarato A arginina e a histidina contêm cinco carbonos adja centes e um sexto carbono ligado por meio de um átomo de nitrogênio Assim sendo a conversão catabólica desses aminoácidos em glutamato é um pouco mais complexa que a rota da prolina ou da glutamina Figura 1826 A arginina é convertida no esqueleto de cinco carbonos da ornitina no ciclo da ureia Figura 1810 e a ornitina sofre transamina ção produzindo o gsemialdeído do glutamato A conversão da histidina em glutamato de cinco carbonos ocorre em uma rota de múltiplas etapas o carbono extra é removido em uma etapa que utiliza tetrahidrofolato como cofator Quatro aminoácidos são convertidos em succinilCoA Os esqueletos de carbono da metionina da isoleucina da treonina e da valina são degradados por rotas que produzem succinilCoA Figura 1827 um intermediário do ciclo do ácido cítrico A metionina doa seu grupo metila a um de diversos aceptores possíveis via Sadenosilmetionina e três de seus quatro átomos de carbono remanescentes são con vertidos no propionato da propionilCoA um precursor da succinilCoA A isoleucina sofre transaminação seguinda pela a descarboxilação oxidativa do acetoácido resultante O esqueleto restante de cinco carbonos é ainda mais oxida do produzindo acetilCoA e propionilCoA A valina sofre transaminação e descarboxilação seguindose uma série de reações de oxidação que convertem os quatro carbonos res tantes em propionilCoA Algumas partes das rotas de de gradação da valina e da isoleucina apresentam um paralelo muito próximo a etapas da degradação de ácidos graxos ver Figura 179 Em tecidos humanos a treonina também é convertida por meio de duas etapas em propionilCoA Essa é a principal rota de degradação da treonina em hu manos ver na Figura 1819 a via alternativa O mecanismo para a primeira etapa é análogo àquele da reação catalisada CH HS 2OOC NH3 1 CO2 CO2 CH3 Cisteína SuccinilCoA CH S NH3 COO2 1 CH3 CH2 CH2 3 etapas Metionina Serina CH2 CH2 Homocisteína CH COO2 CH NH3 1 Valina COO2 C O CH2 CH3 COO2 C O CH2 NAD1 Metilmalonilcoa mutase CoASH Coenzima B12 SCoA AcetilCoA C O CH2 CH3 SCoA 2 6 etapas HCO3 MetilmalonilCoA CH3 CH CH2 CH H2O 1 CH3 CH OH Treonina COO2 2CO2 CH3 7 etapas 2OOC C O CH3 CH SCoA COO2 CH2 CH CH3 NH3 1 CH3 C O SCoA PropionilCoA Isoleucina NADH 1 H1 Desidrogenase dos acetoácidos 2 etapas Treonina desidratase PLP NH3 1 NH4 PLP PLP aCetobutirato Cistationinab sintase Cistationinag liase FIGURA 1827 Rotas catabólicas para metionina isoleu cina treonina e valina Esses aminoácidos são convertidos em succinilCoA a isoleucina também fornece dois de seus átomos de carbono para a produção de acetilCoA ver Figura 1821 A rota da degradação da treonina aqui mostrada ocor re nos humanos outra via observada em outros organismos é mostrada na Figura 1819 A via da metionina para a homo cisteína é descrita em maior detalhe na Figura 1818 a conver são de homocisteína em acetobutirato na Figura 2216 e a conversão de propionilCoA em succinilCoA na Figura 1712 Nelson6edbookindb 722 Nelson6edbookindb 722 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 723 pela serinadesidratase sendo possível que as desidratases da serina e da treonina sejam de fato a mesma enzima A propionilCoA derivada desses três aminoácidos é convertida em succinilCoA por meio de uma via descrita no Capítulo 17 carboxilação produzindo metilmalonil CoA epimerização da metilmalonilCoA e conversão em succinilCoA pela metilmalonilCoAmutase dependente da coenzima B12 ver Figura 1712 Na rara doença genéti ca conhecida como acidemia metilmalônica a metilmalonil CoAmutase está deficiente com graves consequências metabólicas Tabela 182 Quadro 182 Os aminoácidos de cadeia ramificada não são degradados no fígado Embora boa parte do catabolismo dos aminoácidos acon teça no fígado os três aminoácidos com cadeias laterais ramificadas leucina isoleucina e valina são oxidados como combustível principalmente pelos tecidos muscular adiposo renal e cerebral Esses tecidos extrahepáticos contêm uma aminotransferase ausente no fígado que atua sobre os três aminoácidos de cadeia ramificada pro duzindo os acetoácidos correspondentes Figura 18 28 O complexo da desidrogenase dos acetoácidos de cadeia ramificada catalisa então a descarboxilação oxidativa dos três acetoácidos liberando o grupo carbo xila como CO2 e produzindo o derivado acilCoA respecti vo Quanto à forma essa descarboxilação é análoga a duas outras descarboxilações oxidativas que são encontradas no Capítulo 16 a oxidação do piruvato em acetilCoA pelo complexo da piruvatodesidrogenase ver Figura 166 e a oxidação do acetoglutarato em succinilCoA pelo com plexo da acetoglutaratodesidrogenase p 644 De fato esses três complexos enzimáticos são estruturalmente se melhantes e compartilham essencialmente o mesmo me canismo de reação Cinco cofatores a tiaminapirofosfato o FAD o NAD o lipoato e a coenzima A participam e as três proteínas em cada complexo catalisam reações ho mólogas Esse caso representa claramente uma situação em que a maquinaria enzimática que evoluiu para catalisar uma reação foi emprestada por duplicação gênica evo luindo adicionalmente para catalisar reações semelhantes em outras vias Experimentos com ratos têm mostrado que o complexo da desidrogenase dos acetoácidos de cadeia ramificada é re gulado por modificação covalente em resposta ao conteúdo de aminoácidos de cadeia ramificada na dieta Quando hou ver pouco ou nenhum excesso desses aminoácidos na dieta o complexo enzimático é fosforilado por uma proteínacinase e dessa forma inativado A adição à dieta de excesso de ami noácidos de cadeia ramificada resulta na desfosforilação e consequente ativação da enzima Lembre que o complexo da piruvatodesidrogenase está sujeito a uma regulação seme lhante por fosforilação e desfosforilação p 654 Existe uma doença genética relativamente rara em que os três acetoácidos de cadeia ramificada assim como seus aminoácidos precursores especialmente a leuci na acumulamse no sangue extravasando para a urina Essa condição denominada doença do xarope de bordo devido ao odor característico conferido à urina pelos ace C CH CO2 O CoASH SCoA CH3 CH2 Valina Isoleucina Leucina aCetoácidos Derivados acilCoA NAD Aminotransferase dos aminoácidos de cadeia ramificada Complexo da desidrogenase dos acetoácidos de cadeia ramificada Doença do xarope de bordo CH3 C CH CH3 CH3 C CH CH3 CH2 CH3 COO2 C H CH 1 H3N CH3 CH2 CH3 COO2 C H CH 1 H3N CH3 CH3 COO2 C H CH 1 H3N CH3 CH2 CH3 COO2 C CH CH3 CH2 CH3 COO2 C CH CH3 CH3 COO2 C CH CH3 CH2 CH3 O O O SCoA O SCoA O FIGURA 1828 Rotas catabólicas para os três aminoácidos de cadeia ramificada a valina a isoleucina e a leucina As três vias ocorrem em tecidos extrahepáticos e compartilham as duas primei ras enzimas conforme mostrado nesta figura O complexo da desidrogenase dos acetoácidos de cadeia ramificada é análogo aos complexos da piruva todesidrogenase e da acetoglutaratodesidrogenase e requer os mesmos cinco cofatores alguns não são mostrados aqui Essa enzima está deficiente em pacientes com a doença do xarope de bordo Nelson6edbookindb 723 Nelson6edbookindb 723 030414 0745 030414 0745 724 DAVID L NELSON MICHAEL M COX toácidos resulta de uma deficiência no complexo da desi drogenase dos acetoácidos de cadeia ramificada Quando não tratada a doença resulta em desenvolvimento anormal do cérebro deficiência intelectual e morte no início da in fância O tratamento inclui controle rígido da dieta com li mitação da ingestão de valina isoleucina e leucina ao míni mo necessário para permitir um crescimento normal A asparagina e o aspartato são degradados em oxaloacetato Os esqueletos de carbono da asparagina e do aspartato entram por fim no ciclo do ácido cítrico como malato nos mamíferos ou como oxaloacetato nas bactérias A enzima asparaginase catalisa a hidrólise da asparagina produzin do aspartato o qual sofre transaminação com o acetoglu tarato gerando glutamato e oxaloacetato Figura 1829 O oxaloacetato é convertido em malato no citosol e então transportado para a matriz mitocondrial pelo transportador malatoacetoglutarato Em bactérias o oxaloacetato pro duzido na reação de transaminação pode ser utilizado dire tamente no ciclo do ácido cítrico Às vezes a verdade pode ser mais estranha que a ficção ou pelo menos tão estranha quanto um filme Obser ve por exemplo o caso de Patricia Stallings Condena da pela morte de seu bebê ela foi sentenciada à prisão perpétua mas foi posteriormente inocentada graças à investigação médica de três persistentes pesquisadores A história começou no verão de 1989 quando Stallings levou Ryan seu filho de três meses de idade à emergência do Cardinal Glennon Childrens Hospital em St Louis O garoto apresentava respiração difícil vômi tos incontroláveis e disfunções gástricas De acordo com o médico que o atendeu um toxicologista os sintomas do bebê indicavam envenenamento por etilenoglicol um ingrediente de anticongelantes conclusão aparentemen te confirmada pela análise em um laboratório comercial Após sua recuperação o menino foi colocado em um lar adotivo e Stallings e seu marido David podiam vêlo ape nas em visitas supervisionadas No entanto quando o bebê ficou doente e morreu após uma visita em que Stallings ficou sozinha com ele ela foi acusada de assassinato em primeiro grau sendo declarada prisão inafiançável Na oca sião as evidências pareciam contundentes pois os dois la boratórios o comercial e o do hospital haviam encontrado grandes quantidades de etilenoglicol no sangue do menino e traços desse produto em uma mamadeira que Stallings havia utilizado para alimentálo durante sua visita Contudo sem sabêlo Stallings havia realizado um experimento brilhante Enquanto estava presa descobriu que estava grávida um tempo depois ela deu à luz outro filho David Stallings Jr em fevereiro de 1990 Ele foi co locado imediatamente em um lar adotivo mas após duas semanas começou a apresentar sintomas semelhantes aos de Ryan David foi por fim diagnosticado com uma rara doença metabólica denominada acidemia metilmalôni ca MMA de methylmalonic acidemia Essa doença distúrbio genético recessivo do metabolismo dos ami noácidos afeta cerca de 1 em 48000 recémnascidos e apresenta sintomas quase idênticos àqueles causados por envenenamento por etilenoglicol Stallings não poderia ter envenenado seu segundo filho mas a procuradoria do Estado do Missouri não fi cou impressionada com esse novo fato e prosseguiu com o julgamento A corte não permitiu que o diagnóstico de MMA do segundo filho fosse apresentado como evidência e em janeiro de 1991 Patricia Stallings foi condenada por agressão com arma letal e sentenciada à prisão perpétua Felizmente para Stallings no entanto William Sly pro fessor do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecu lar da Universidade de St Louis e James Shoemaker chefe de um laboratório de triagem metabólica da Universidade interessaramse por esse caso quando souberam dele em uma reportagem de televisão Shoemaker realizou suas próprias análises do sangue de Ryan e não detectou etile noglicol Ele e Sly então contactaram Piero Rinaldo espe cialista em doenças metabólicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Yale cujo laboratório estava equipado para diagnosticar MMA a partir de amostras de sangue Quando Rinaldo analisou o soro sanguíneo de Ryan encontrou altas concentrações de ácido metilmalônico produto da degradação dos aminoácidos de cadeia rami ficada isoleucina e valina que se acumula em pacientes com MMA pois a enzima que devia convertêlo no pró ximo produto da via metabólica está defeituosa Figura Q1 E fato especialmente expressivo o sangue e a urina da criança continham quantidades enormes de cetonas outra consequência metabólica da doença Assim como QUADRO 182 MEDICINA Detetives científicos solucionam um assassinato misterioso C CH2 COO2 1 H2O C O O Asparaginase Aspartato aminotransferase aCetoglutarato PLP 2O Asparagina Aspartato Oxaloacetato C CH CH2 NH3 COO2 1 O H2N C CH CH2 NH4 COO2 O 2O Glutamato 1 NH3 FIGURA 1829 Rotas catabólicas para asparagina e aspartato Ambos os aminoácidos são convertidos em oxaloacetato Nelson6edbookindb 724 Nelson6edbookindb 724 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 725 Até este ponto foi estudado como os 20 aminoácidos proteicos após perderem seus átomos de nitrogênio são de gradados por desidrogenação descarboxilação e por outras reações em que porções de seus esqueletos de carbono alcan çam a forma de seis metabólitos centrais que podem entrar no ciclo do ácido cítrico Aquelas porções degradadas até ace tilCoA são completamente oxidadas até dióxido de carbono e água com produção de ATP pela fosforilação oxidativa Da mesma forma que ocorre com carboidratos e lipí deos a degradação dos aminoácidos resulta ao final na produção de equivalentes redutores NADH e FADH2 pela ação do ciclo do ácido cítrico O estudo dos processos catabólicos será concluído no próximo capítulo com uma discussão sobre a respiração em que os equivalentes re dutores alimentam o processo fundamental de oxidação e geração de energia nos organismos aeróbios RESUMO 183 Rotas de degradação dos aminoácidos c Após a remoção dos grupos amino os esqueletos de carbono dos aminoácidos sofrem oxidação a compostos capazes de entrar no ciclo do ácido cítrico para oxida ção a CO2 e H2O As reações dessas rotas necessitam de diversos cofatores incluindo o tetrahidrofolato e a Sadenosilmetionina em reações de transferência de um carbono e a tetrahidrobiopterina na oxidação da fenilalanina pela fenilalaninahidroxilase c Dependendo de seu produto final de degradação alguns aminoácidos podem ser convertidos em corpos cetô nicos alguns em glicose e alguns em ambos Assim a degradação dos aminoácidos está integrada ao metabo lismo intermediário podendo ser crucial para a sobrevi vência em condições nas quais os aminoácidos são uma fonte significativa de energia metabólica c Os esqueletos de carbono dos aminoácidos entram no ciclo do ácido cítrico por meio de cinco intermediários acetilCoA acetoglutarato succinilCoA fumarato e oxaloacetato Alguns são degradados em piruvato que pode ser convertido em acetilCoA ou em oxaloacetato c Os aminoácidos que produzem piruvato são a alanina a cisteína a glicina a serina a treonina e o triptofano A leucina a lisina a fenilalanina e o triptofano produzem acetilCoA via acetoacetilCoA A isoleucina a leucina a treonina e o triptofano também produzem acetilCoA diretamente Shoemaker ele não encontrou nenhum etilenoglicol em uma amostra dos fluidos corporais do bebê A mamadeira não pode ser testada uma vez que havia desaparecido misteriosamente A análise de Rinaldo o convenceu de que Ryan havia morrido em consequência de MMA mas como explicar os resultados de dois laboratórios que in dicavam que o menino apresentava etilenoglicol em seu sangue Será que os dois poderiam estar errados Quando Rinaldo obteve os dois relatos dos laborató rios o que viu afirma ele foi assustador Um dos labo ratórios havia concluído que o sangue de Ryan Stallings continha etilenoglicol mesmo que a análise da amostra de sangue não apresentasse o perfil do próprio labora tório para uma amostrapadrão contendo etilenoglicol Não era apenas um problema de interpretação questio nável A qualidade da análise era inaceitável observa Ri naldo E o segundo laboratório De acordo com Rinaldo o laboratório detectou um componente anormal no san gue de Ryan e apenas presumiu que fosse etilenoglicol As amostras da mamadeira não mostraram nada fora do comum diz Rinaldo e ainda assim o laboratório também declarou haver nela evidências de etilenoglicol Rinaldo apresentou seus achados ao procurador do caso George McElroy que convocou uma coletiva de im prensa no dia seguinte Não acredito mais nos dados dos laboratórios ele disse aos jornalistas Tendo concluído que ao fim das contas Ryan Stallings havia morrido de MMA McElroy retirou todas as acusações contra Patricia Stallings em 20 de setembro de 1991 Por Michelle Hoffman 1991 Science 253 931 Direitos autorais da American Association for the Advancement of Science Isoleucina Metionina Treonina Valina PropionilCoA MetilmalonilCoA SuccinilCoA O ácido metilmalônico acumulase em tecidos no sangue e na urina CH3CH2C O SCoA O SCoA 2OOC 2OOC CH C CH3 O O2 2OOC CH C CH3 O SCoA CH2 CH2 C FIGURA Q1 Crianças com uma mutação X em vermelho que inati va a enzima metilmalonilCoA mutase não degradam normalmente os aminoácidos isoleucina metionina treonina e valina Ocorre um acúmulo potencialmente fatal de ácido metilmalônico com sintomas semelhantes aos do envenenamento por etilenoglicol Nelson6edbookindb 725 Nelson6edbookindb 725 030414 0745 030414 0745 726 DAVID L NELSON MICHAEL M COX c A arginina o glutamato a glutamina a histidina e a pro lina produzem acetoglutarato a isoleucina a metioni na a treonina e a valina produzem succinilCoA quatro átomos de carbono da fenilalanina e da tirosina levam à produção de fumarato a asparagina e o aspartato pro duzem oxaloacetato c Os aminoácidos de cadeia ramificada isoleucina leuci na e valina diferentemente dos demais aminoácidos são degradados apenas em tecidos extrahepáticos c Diversas doenças humanas graves são causadas por defeitos genéticos nas enzimas do catabolismo dos ami noácidos Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário aminotransferases 699 transaminases 699 transaminação 699 piridoxalfosfato PLP 699 desaminação oxidativa 700 Lglutamatodesidrogenase 700 glutaminasintetase 702 glutaminase 702 ciclo da glicosealanina 703 amoniotélico 704 ureotélico 704 uricotélico 704 ciclo da ureia 704 ureia 706 creatinacinase 708 aminoácidos essenciais 709 cetogênico 711 glicogênico 711 tetrahidrofolato 712 Sadenosilmetionina adoMet 712 tetrahidrobiopterina 715 fenilcetonúria PKU 719 oxidases de função mista 719 alcaptonúria 721 doença do xarope de bordo 723 Leituras adicionais Gerais Amon J Titgemeyer F Burkovski A 2010 Common patterns unique features nitrogen metabolism and regulation in Grampositive bacteria FEMS Microbiol Rev 34 588605 Arias IM Alter HJ Boyer JL Cohen DE Fausto N Shafritz DA Wolkof AW 2009 The liver Biology and pathobiology 5th ed John Wiley Sons Hoboken New Jersey Brosnan JT 2001 Amino acids then and now a reflection on Sir Hans Krebs contribution to nitrogen metabolism IUBMB Life 52 265270 Interessante excursão pela vida desse importante bioquímico Frey PA Hegeman AD 2006 Enzymatic reaction Mechanisms Oxford University Press New York Boa fonte para uma discussão aprofundada das classes de mecanismos de reações enzimáticas descritos neste capítulo Metabolismo dos aminoácidos Christen P Metzler DE 1985 Transaminases Wiley Interscience Inc New York Curthoys NP Watford M 1995 Regulation of glutaminase activity and glutamine metabolism Annu Rev Nutr 15 133159 Eliot AC Kirsch JF 2004 Pyridoxal phosphate enzymes mechanistic structural and evolutionary considerations Annu Rev Biochem 73 383415 Fitzpatrick PF 1999 Tetrahydropterindependent amino acid hydroxylases Annu Rev Biochem 68 355382 Kalhan SC Bier DM 2008 Protein and amino acid metabolism in the human newborn Annu Rev Nutr 28 389410 Pencharz PB Ball RO 2003 Different approaches to define individual amino acids requirements Annu Rev Nutr 23 101116 Como relata esta revisão a determinação de quais aminoácidos são essenciais na dieta humana não é um problema trivial O ciclo da ureia Braissant O 2010 Current concepts in the pathogenesis of urea cycle disorders Mol Genet Metab 100 S3S12 Brusilow SW Horwich AL 2006 Urea cycle enzymes In Scrivers Online Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease Valle D Beaudet AL Vogelstein B Kinzler KW Antonarakis SE Ballabio A eds httpdxdoiorg101036ommbid 108 Fonte competente a respeito desta rota Enns GM Berry SA Berry GT Rhead WJ Brusilow SW Hamosh A 2007 Survival after treatment with phenylacetate and benzoate for ureacycle disorders N Engl J Med 356 22822292 Kresge N Simoni RD Hill RL 2005 Four decades of research on the biosynthesis of urea the work of Sarah Ratner J Biol Chem 280 e34 Morris SM 2002 Regulation of enzymes of the urea cycle and arginine metabolism Annu Rev Nutr 22 87105 Esta revisão detalha o que se conhece sobre alguns níveis de regulação não estudados neste capítulo como regulação hormonal e nutricional Simoni RD Hill RL Vaughan M Tabor H 2004 Transaminases the work of Philip P Cohen J Biol Chem 279 e1 Distúrbios da degradação dos aminoácidos Ledley FD Levy HL Woo SLC 1986 Molecular analysis of the inheritance of phenylketonuria and mild hyperphenylalaninemia in families with both disorders N Engl J Med 314 12761280 Scriver CR Kaufman S Woo SLC 1988 Mendelian hyperphenylalaninemia Annu Rev Genet 22 301321 Valle D Beaudet AL Vogelstein B Kinzler KW Antonarakis SE Ballabio A eds 2006 atualizada em 2011 Scrivers Online Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease Parte 8 Amino Acids wwwommbidcom Werner ER Blau N Thöny B 2011 Tetrahydrobiopterin biochemistry and pathophysiology Biochem J 438 397414 Problemas 1 Produtos da transaminação dos aminoácidos No meie e desenhe a estrutura dos acetoácidos que resultam quando cada um dos seguintes aminoácidos sofre transamina ção com o acetoglutarato a aspartato b glutamato c alanina d fenilalanina 2 Avaliação da atividade da alaninaaminotransfera se A atividade velocidade da reação da alaninaaminotrans ferase é medida geralmente incluindo ao sistema reacional um excesso de lactatodesidrogenase pura e de NADH A velo cidade de desaparecimento da alanina é igual à velocidade de desaparecimento do NADH medida por espectrofotometria Explique como funciona esse ensaio 3 A alanina e a glutamina no sangue O plasma sanguíneo humano normal contém todos os aminoácidos necessários para a Nelson6edbookindb 726 Nelson6edbookindb 726 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 727 síntese das proteínas teciduais mas não em iguais concentrações A alanina e a glutamina estão presentes em concentrações muito mais elevadas que os demais aminoácidos Sugira uma razão 4 Distribuição do nitrogênio amínico Se sua dieta é rica em alanina mas deficiente em aspartato você apresentará sinais de deficiência em aspartato Explique 5 Lactato versus alanina como combustível metabóli co o custo da remoção do nitrogênio Os três carbonos do lactato e da alanina apresentam estados de oxidação idênticos e os animais podem usar qualquer uma dessas fontes de carbo no como combustível metabólico Compare a produção líquida de ATP mols de ATP por mol de substrato para a oxidação completa a CO2 e H2O de lactato versus alanina quando o custo da excreção de nitrogênio como ureia é incluído ƒ COO2 C Lactato ƒ ƒ H HO H H H C ƒ 1 COO2 C ƒ ƒ H H H H C Alanina H3N 6 Toxicidade da amônia como resultado de uma dieta deficiente em arginina Em estudo realizado alguns anos atrás gatos foram submetidos a um jejum durante a noite e en tão receberam uma única refeição completa em relação a to dos os aminoácidos com exceção da arginina Dentro de duas horas os níveis de amônia no sangue aumentaram dos níveis normais de 18 mgL para 140 mgL e os gatos mostraram sinto mas clínicos de intoxicação por amônia Um grupo controle re cebeu uma dieta contendo todos os aminoácidos ou uma dieta em que a arginina era substituída pela ornitina e não mostrou qualquer sintoma clínico incomum a Qual a razão do jejum no experimento b Qual a causa do aumento dos níveis de amônia no gru po experimental Por que a ausência de arginina levou à intoxi cação pela amônia A arginina é um aminoácido essencial para os gatos Por quê Ou por que não c Por que a ornitina pode substituir a arginina 7 Oxidação do glutamato Escreva uma série de equa ções balanceadas e uma equação geral para a reação global descrevendo a oxidação de 2 mols de glutamato em 2 mols de acetoglutarato e 1 mol de ureia 8 Transaminação e o ciclo da ureia A aspartatoamino transferase apresenta a maior atividade entre todas as amino transferases do fígado de mamíferos Por quê 9 O caso contra a dieta da proteína líquida Uma dieta para a redução do peso fortemente promovida al guns anos atrás propunha a ingestão diária de proteína líqui da sopa de gelatina hidrolisada água e uma seleção de vita minas Os demais alimentos e bebidas deveriam ser evitados Pessoas utilizando essa dieta perdiam geralmente 4 a 6 kg na primeira semana a Pessoas contrárias a essa dieta argumentavam que a perda de peso era quase que inteiramente devida à perda de água e que o peso perdido logo seria reposto após a pessoa voltar a utilizar uma dieta normal Qual a base bioquímica para esse argumento b Algumas pessoas morreram durante a utilização dessa dieta Quais os riscos inerentes a essa dieta e como podem le var à morte 10 Aminoácidos cetogênicos Quais aminoácidos são ex clusivamente cetogênicos 11 Um defeito genético no metabolismo dos ami noácidos história de um caso Uma criança de dois anos de idade foi levada ao hospital Sua mãe contou que ela vomitava com frequência especialmente após as refeições O peso da criança e seu desenvolvimento físico estavam aquém do normal Seu cabelo embora escuro continha mechas es branquiçadas Uma amostra de urina foi tratada com cloreto férrico FeCl3 e produziu a cor verde característica da presen ça de fenilpiruvato A análise quantitativa de amostras de urina produziu os resultados mostrados na tabela abaixo Substância Concentração mM Urina do paciente Urina normal Fenilalanina 70 001 Fenilpiruvato 48 0 Fenillactato 103 0 a Sugira qual enzima pode estar deficiente nesta criança Proponha um tratamento b Por que a fenilalanina aparece na urina em grandes quantidades c Qual a origem do fenilpiruvato e do fenillactato Por que essa rota normalmente não funcional é acionada quando a concentração de fenilalanina aumenta d Por que os cabelos da criança contêm mechas esbran quiçadas 12 Papel da cobalamina no catabolismo dos ami noácidos A anemia perniciosa é causada por prejuízo na absorção de vitamina B12 Qual o efeito desse prejuízo sobre o catabolismo dos aminoácidos Todos os aminoácidos são igualmente afetados Dica ver Quadro 172 13 Dietas vegetarianas Dietas vegetarianas po dem fornecer altos níveis de antioxidantes e um perfil lipídico que pode ajudar a prevenir doença coronariana Con tudo alguns problemas associados podem advir Amostras sanguíneas foram colhidas de um grande grupo de participan tes voluntários que eram vegetarianos estritos não conso mem qualquer produto de origem animal lactovegetarianos vegetarianos que consomem laticínios ou omnívoros pes soas com dieta normal e variada incluindo carne Todos os participantes haviam seguido sua dieta por diversos anos Os níveis sanguíneos de homocisteína e metilmalonato estavam elevados no grupo de vegetarianos estritos um pouco mais baixos no grupo de lactovegetarianos e bem mais baixos no grupo omnívoro Explique 14 Anemia perniciosa A deficiência de vitamina B12 pode ser causada por raras doenças genéticas que levam a níveis diminuídos de vitamina B12 apesar de uma dieta normal que inclui carne e laticínios ricos em B12 Essas condi ções não podem ser tratadas com suplementos de vitamina B12 Explique 15 Mecanismos de reação do piridoxalfosfato A tre onina pode ser clivada pela enzima treoninadesidratase que catalisa a conversão de treonina em acetobutirato e amônia A enzima utiliza piridoxalfosfato como cofator Sugira um meca nismo para essa reação com base nos mecanismos mostrados na Figura 186 Observe que essa reação inclui uma eliminação no carbono b da treonina Nelson6edbookindb 727 Nelson6edbookindb 727 030414 0745 030414 0745 728 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Treonina Treonina desidratase PLP OH ƒ ƒ CH3 CH CH 1 NH3 COO2 aCetobutirato 1 NH3 1 H2O CH3 CH2 O C COO2 16 Rotas para o carbono e para o nitrogênio no me tabolismo do glutamato Quando 2 14C 15Nglutamato sofre degradação oxidativa no fígado de um rato em quais átomos dos seguintes metabólitos será encontrado cada um dos isó topos a ureia b succinato c arginina d citrulina e ornitina f aspartato CH2 H COO2 H H C Glutamato marcado COO2 15 14 CH2 H N 1 17 Estratégia química para o catabolismo da isoleuci na A isoleucina é degradada por meio de seis etapas produ zindo propionilCoA e acetilCoA C C H CH2 Isoleucina PropionilCoA CH3 1 H3N O O2 C SCoA CH3 CH3 O C H CH3 6 etapas C SCoA CH2 O 1 AcetilCoA a O processo químico da degradação da isoleucina inclui estratégias análogas àquelas utilizadas no ciclo do ácido cítrico e na boxidação dos ácidos graxos Os intermediários da de gradação da isoleucina I a V mostrados abaixo não estão na ordem correta Utilize seu conhecimento e sua compreensão do ciclo do ácido cítrico e da via de boxidação para colocar em ordem os intermediários na sequência metabólica apropriada para a degradação da isoleucina I II C C O O2 O C CH3 H CH3 CH2 H CH3 C SCoA CH3 C C O III C SCoA O CH3 C C CH3 O H CH2 H SCoA O CH3 C C CH3 IV V C SCoA CH3 C C O H H CH3 HO b Para cada etapa que você propõe descreva o processo químico forneça um exemplo análogo a partir do ciclo do ácido cítrico ou da via de boxidação onde possível e indique os cofatores necessários 18 Papel do piridoxalfosfato no metabolismo da gli cina A enzima serinahidroximetiltransferase requer pirido xalfosfato como seu cofator Proponha um mecanismo para a reação catalisada por essa enzima no sentido da degradação da serina produção de glicina Dica ver Figuras 1819 e 18 20b 19 Vias paralelas para a degradação de aminoácidos e de ácidos graxos O esqueleto de carbono da leucina é de gradado por uma série de reações bastante análogas àquelas do ciclo do ácido cítrico e da rota de boxidação Para cada reação de a a f mostrada a seguir indique o tipo de rea ção forneça um exemplo análogo a partir do ácido cítrico ou da rota de boxidação onde possível e indique os cofatores necessários 2OOC CH3 NH3 CH2 O CO2 1 C CH3 AcetilCoA b CH3 COO2 CH2 C C H H2O Leucina c CoASH CH3 COO2 CH2 C O C H CH3 aCetoisocaproato e SCoA CH3 CH2 C O C CH3 IsovalerilCoA SCoA C H f H C C C O SCoA H bMetilcrotonilCoA d 2OOC C CH2 O C H3C bMetilglutaconilCoA C C SCoA H 2OOC CH2 O C CH3 bHidróxibmetilglutarilCoA C SCoA a CH2 OH CH3 O Acetoacetato CH3 2 HCO3 H3 1 Nelson6edbookindb 728 Nelson6edbookindb 728 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 729 Problema de análise de dados 20 Doença do xarope de bordo A Figura 1828 mostra a rota para a degradação dos aminoácidos de ca deia ramificada e o sítio do defeito bioquímico que causa a doença do xarope de bordo Os achados iniciais que por fim levaram à descoberta desse defeito foram apresentados em três artigos publicados no final da década de 1950 e no início da década de 1960 Este problema conta a história dos acha dos desde as observações clínicas iniciais até a proposta de um mecanismo bioquímico Menkes Hurst e Craig 1954 apresentaram os casos de quatro irmãos os quais morreram após um curso similar de sintomas Em todos os quatro casos a gestação e o nascimento foram normais Os primeiros 3 a 5 dias de vida de cada criança também foram normais Logo após porém cada criança come çou a apresentar convulsões e as crianças morreram entre as idades de 11 dias e três meses A necropsia mostrou em todos os casos considerável edema do encéfalo A urina das crianças apresentava um odor forte e incomum de xarope de bordo iniciando ao redor do terceiro dia de vida Menkes 1959 relatou dados coletados de seis outras crianças Todas apresentaram sintomas semelhantes àqueles descritos anteriormente e morreram entre 15 dias e 20 me ses após o nascimento Em um dos casos Menkes conseguiu obter amostras de urina durante os últimos meses de vida do bebê Quando ele tratou a urina com 24dinitrofenilhi drazona que forma um precipitado colorido com compostos cetônicos ele descobriu três acetoácidos em quantidades anormalmente altas Cetoisocaproato Cetoisovalerato a a a Cetobmetilnvalerato O C CH3 CH CH2 CH3 COO2 O C CH3 CH CH3 COO2 O C CH2 CH3 CH CH3 COO2 a Esses acetoácidos são produzidos pela desaminação de aminoácidos Para cada um dos acetoácidos acima dese nhe e nomeie o aminoácido do qual ele é derivado Dancis Levitz e Westall 1960 coletaram dados adicionais que os levaram a propor o defeito bioquímico mostrado na Fi gura 1828 Em um dos casos examinaram um paciente cuja urina apresentou pela primeira vez odor de xarope de bordo quando ele tinha quatro meses de idade Com dez meses de idade março de 1956 o bebê foi internado em um hospital por apresentar febre e desenvolvimento motor bastante retar dado Com a idade de 20 meses janeiro de 1957 voltou a ser internado e descobriuse que apresentava sintomas de dege neração neurológica semelhantes aos observados previamen te em casos da doença do xarope de bordo ele morreu pouco tempo após Resultados da análise de seu sangue e urina são mostrados na tabela da página 729 juntamente com os valores normais para cada composto Aminoácidos Urina mg24 h Plasma mgmL Normal Paciente Normal Paciente Março 1956 Janeiro 1957 Janeiro 1957 Alanina 515 02 04 3048 06 Asparagina e glutamina 515 04 0 3050 20 Ácido aspártico 12 02 15 0102 004 Arginina 153 03 07 0814 08 Cistina 24 05 03 1015 0 Ácido glutâmico 153 07 16 1015 09 Glicina 2040 46 207 1020 15 Histidina 815 03 47 1017 07 Isoleucina 25 20 135 0815 22 Leucina 38 27 394 1724 145 Lisina 212 16 43 1527 11 Metionina 25 14 14 0306 27 Ornitina 12 0 13 0608 05 Fenilalanina 24 04 26 1017 08 Prolina 24 05 03 1530 09 Serina 515 12 0 1322 09 Taurina 110 02 187 0918 04 Treonina 510 06 0 1216 03 Triptofano 38 09 23 Não medido 0 Tirosina 48 03 37 1523 07 Valina 24 16 154 2030 131 Nelson6edbookindb 729 Nelson6edbookindb 729 030414 0745 030414 0745 730 DAVID L NELSON MICHAEL M COX b A tabela inclui a taurina aminoácido normalmente não encontrado em proteínas A taurina frequentemente é produ zida como produto colateral de dano celular Sua estrutura é CH2 CH2 O O S H3N 2 1 O Com base nessa estrutura e na informação contida neste capítulo qual aminoácido é mais provavelmente o precursor da taurina Explique seu raciocínio c Em comparação com os valores normais fornecidos na tabela quais aminoácidos mostraram níveis significativamente elevados no sangue do paciente em janeiro de 1957 Quais es tavam elevados na urina Dancis e colaboradores com base em seus resultados e no conhecimento que tinham da via mostrada na Figura 1828 concluíram que embora pareça bastante provável para os au tores que o bloqueio primário esteja na via de degradação me tabólica dos aminoácidos de cadeia ramificada isso não pode ser considerado completamente estabelecido d Como os dados aqui apresentados apoiam essa conclu são e Quais dados aqui apresentados não se ajustam a esse modelo da doença do xarope de bordo Como você explica es ses dados aparentemente contraditórios f Que dados você precisaria coletar para estar mais segu ro em sua conclusão Referências Dancis J Levitz M Westall R 1960 Maple syrup urine disease branchedchain ketoaciduria Pediatrics 25 7279 Menkes JH 1959 Maple syrup disease isolation and identification of organic acids in the urine Pediatrics 23 348353 Menkes JH Hurst PL Craig JM 1954 A new syndrome progressive familial infantile cerebral dysfunction associated with an unusual urinary substance Pediatrics 14 462466 Nelson6edbookindb 730 Nelson6edbookindb 730 030414 0745 030414 0745 FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA 191 Reações de transferência de elétrons em mitocôndrias 732 192 Síntese de ATP 747 193 Regulação da fosforilação oxidativa 759 194 Mitocôndrias na termogênese na síntese de esteroides e na apoptose 762 195 Genes mitocondriais suas origens e efeitos das mutações 765 FOTOSSÍNTESE CAPTURANDO ENERGIA LUMINOSA 196 Características gerais da fotofosforilação 769 197 Absorção de luz 771 198 Evento fotoquímico central fluxo de elétrons promovido pela luz 776 199 Síntese de ATP pela fotofosforilação 786 1910 Evolução da fotossíntese oxigênica 788 A fosforilação oxidativa é a culminação do metabolismo produtor de energia em organismos aeróbios Todos os passos oxidativos na degradação de carboidratos gor duras e aminoácidos convergem para esse estágio final da respiração celular onde a energia da oxidação governa a síntese de ATP A fotofosforilação é a maneira pela qual os organismos fotossintéticos capturam a energia do sol a fonte em última análise da energia na biosfera e a utili zam para produzir ATP Juntas a fosforilação oxidativa e a fotofosforilação são responsáveis pela maior parte do ATP sintetizado na maioria dos organismos na maior parte do tempo Em eucariotos a fosforilação oxidativa ocorre nas mi tocôndrias e a fotofosforilação nos cloroplastos As vias de síntese de ATP em mitocôndrias e cloroplastos desafiaram e fascinaram bioquímicos por mais de meio século e esse fas cínio aumentou com o aprofundamento do reconhecimento desses mecanismos fundamentais em organismos vivos de sua conservação ao longo da evolução e de suas bases es truturais O entendimento atual sobre a síntese de ATP em mi tocôndrias e cloroplastos tem como base a hipótese in troduzida por Peter Mitchell em 1961 de que diferenças transmembrana na concentração de prótons servem de reservatório para a energia extraída das reações biológicas de oxidação A teoria quimiosmótica foi aceita como um dos grandes princípios unificadores da biologia do século XX Ela fornece uma visão dos processos de fosforilação oxidativa e de fotofosforilação assim como de transduções de energia aparentemente diferentes como o transporte ativo através de membranas e o movimento de flagelos de bactérias A fosforilação oxidativa e a fotofosforilação têm me canismos semelhantes em três aspectos Figura 191 1 Os dois processos envolvem o fluxo de elétrons por meio de uma cadeia de transportadores da membrana 2 a energia livre que se torna disponível por esse fluxo de elétrons montanha abaixo exergônico é acoplada ao transporte montanha acima de prótons através de uma membrana impermeável a prótons conservando a energia livre da oxidação do combustível na forma de um poten cial eletroquímico transmembrana p 403 3 o fluxo transmembrana de retorno dos prótons a favor de seu gradiente de concentração por canais proteicos específi cos fornece a energia livre para a síntese de ATP catali sada por um complexo proteico presente na membrana ATPsintase que acopla o fluxo de prótons à fosforila ção do ADP Este capítulo começa com a fosforilação oxidativa mito condrial Primeiro são descritos os componentes da cadeia de transferência de elétrons sua organização em grandes complexos funcionais na membrana mitocondrial inter na a via de fluxo de elétrons por eles e os movimentos de prótons que acompanham esse fluxo Depois é abordado o notável complexo enzimático que por catálise rotacional captura a energia do fluxo de prótons na forma de ATP e os mecanismos regulatórios que coordenam a fosforilação oxidativa com as várias vias catabólicas pelas quais os com bustíveis são oxidados O papel metabólico das mitocôndrias é tão crucial para o funcionamento da célula e do organismo que defeitos na função mitocondrial têm consequências médicas mui to sérias As mitocôndrias são centrais para as funções neuronal e muscular e para a regulação do metabolismo energético do corpo como um todo e do peso corporal Doenças humanas neurodegenerativas assim como cân 19 Fosforilação Oxidativa e Fotofosforilação Nelson6ed19indd 731 Nelson6ed19indd 731 020514 1733 020514 1733 732 DAVID L NELSON MICHAEL M COX a Mitocéndria b Cloroplasto Substrato reduzido Carregadores de elétrons Aluzconverteadguaem Carregadores de elétrons combustivel doa e bombeiam H para fora quando um bom doador de e bombeiam H para dentro quando os elétrons fluem para 0 Op Luz os elétrons fluem para o NADPT Membraha Carregadores de elétrons cadeia respiratoria H Cadeia transportadora de elétrons mitocondrial 4 H 4 H H Membrana H interna Ht tilacoide mS U 4 a H e H e ae J ad Z H a Doador de H 0 4 HO 0 H NADPH e reduzido aceptor de e H H Ht Ht H H aceptor de e af Energia do fluxo de e estocada na 4 Energia do fluxo de e estocadanaH 4a forma de potencial eletroquimico forma de potencial eletroquimico al Ht H oi ATPsintase AVE H Ht H 7 a H HY y tH ADP P H Ht 1 H H ATPsintase Ht Ht H 7 ATP H H H Ht H H We We H 4 ATP Ht He HY Ht H ADP P AATPsintase usa 0 potencial AATPsintase usa 0 potencial eletroquimico para sintetizar ATP eletroquimico para sintetizar ATP FIGURA191 Omecanismo quimiosmético para a sintese de ATP a pela energia dos fotons absorvidos pelo pigmento verde clorofila Em ambas Em mitocéndrias os elétrons se movem por uma cadeia de transportadores as organelas 0 fluxo de elétrons cria um potencial eletroquimico pelo mo ligados a membranas a cadeia respiratdria espontaneamente governados vimento transmembrana de protons e carga positiva Em ambos os casos 0 pelo alto potencial de redugao do oxigénio e pelos potenciais de redugao potencial eletroquimico governa a sintese de ATP por meio de uma enzima relativamente baixos dos diversos substratos reduzidos combustivel que de membrana ATPsintase fundamentalmente similar em mitocdndrias e sofrem oxidagao na mitocéndria b Em cloroplastos o movimento de elé cloroplastos assim como em bactérias e arqueobactérias trons por uma cadeia de carregadores ligados a membranas é impulsionado cer diabetes e obesidade sAo reconhecidas como possi FOSFORILACAO OXIDATIVA veis resultados do comprometimento da fungao mitocon drial e uma teoria de envelhecimento baseiase na perda 191 Reagoes de transferéncia de elétrons em gradual da integridade mitocondrial A producao de ATP mitocéndrias nao a unica funao importante da mitocdéndria essa or Ad bert 1948 E ganela também age na termogénese sintese de esteroi Ke hedk SAT Sheh 1U des e apoptose morte celular programada A descoberta gene Kennedy c er e nun Ae é ger de que as mitocOndrias sao dessas funcodes variadas e importantes das mitocondrias yn ar dh os locais da fosforilagao oxidati estimulou uma boa parte da pesquisa atual sobre a bioqui os a va em eucariotos marcou 0 ini mica dessa organela i oe ee 1 fm cio da fase moderna dos estu Depois de discutir as diversas fungdes mitocondriais oe ae a dos de transducées biolégicas agora é possivel estudar a fotofosforilagao concentrandose oa oo b 50 del 1 tos fotossintéti e de energia As mitocéndrias prmenro naa sorciio ee pelos pigment os essinve re assim como as bactérias gram S NADP UXO ee vole promovl ee uz de H f negativas tém duas membra para enas ases mo CU ares O acop amento entre H nas Figura 192a A mem o fluxo de elétrons e de protons Sao também analisadas as brana mitocondrial externa é semelhangas de estrutura mecanismo entre ATPsintases albert L Lehninger prontamente permeavel a molé de cloroplastos e de mitocéndrias assim como a base evo 19171986 culas pequenas M 5000 ea lutiva para a conservagao desse mecanismo A capacidade fons que se movem livremente notavel dos cloroplastos em fazer ATP por meio da oxida por canais transmembrana formados por uma familia de cao de um composto de disponibilidade ilimitada 4gua ao protefnas integrais de membrana chamadas de porinas A mesmo tempo em que produz um composto essencial a vida membrana interna é impermedvel A maioria das moléculas da maioria dos animais oxigénio coloca um conjunto de pequenas e dos jons incluindo protons H as tnicas es desafios igualmente fascinantes aos bidlogos bioquimicose pécies que cruzam a membrana 0 fazem por meio de trans quimicos A determinagao das estruturas de complexos su portadores especificos A membrana interna aloja os com pramoleculares que realizam esses processos nos cloroplas ponentes da cadeia respiratéria e a ATPsintase tos forneceu pistas fisicas e quimicas para 0 entendimento A matriz mitocondrial delimitada pela membrana in do processo da fotossintese terna contém o complexo da piruvatodesidrogenase e as PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 733 enzimas do ciclo do ácido cítrico a via de boxidação de ácidos graxos e as vias de oxidação de aminoácidos to das as vias de oxidação de combustível exceto a glicólise que ocorre no citosol A permeabilidade seletiva da mem brana interna segrega os intermediários e as enzimas das vias metabólicas citosólicas daqueles dos processos me tabólicos que ocorrem na matriz No entanto transporta dores específicos carregam piruvato ácidos graxos e ami noácidos ou seus acetoácidos derivados para dentro da matriz para acesso à maquinaria do ciclo do ácido cítrico ADP e Pi são especificamente transportados para dentro da matriz quando ATP recémsintetizado é transportado para fora O melhor inventário atual de proteínas em mito côndrias de mamíferos lista cerca de 1100 das quais pelo menos 300 têm funções desconhecidas A representação de mitocôndrias em forma de feijão na Figura 192 é uma grande simplificação derivada em parte de estudos anti gos nos quais finas secções de células eram observadas em microscópio eletrônico Imagens tridimensionais obtidas ou por reconstrução a partir de secções seriadas ou por microscopia confocal revelam uma variação maior no ta manho e na forma mitocondriais Em células vivas coradas com corantes fluorescentes específicos de mitocôndria são vistos grandes números de mitocôndrias de formas varia das aglomeradas perto do núcleo ver Fig 1942 Tecidos com uma grande demanda por metabolismo aeróbio p ex cérebro músculos esquelético e do coração e olho contêm muitas centenas ou milhares de mitocôndrias por célula e Membrana externa Livremente permeável a pequenas moléculas e íons ATPsintase FoF1 Cristas Impermeável à maioria das pequenas moléculas e íons incluindo H1 Contém Contém Ribossomos Canais de porinas Transportadores de elétrons da cadeia respiratória complexos IIV Membrana interna Matriz a b c ADPATPtranslocase ATPsintase FoF1 Outros transportadores de membrana Complexo da piruvato desidrogenase Enzimas do ciclo do ácido cítrico Enzimas da boxidação de ácidos graxos Enzimas de oxidação de aminoácidos DNA ribossomos Muitas outras enzimas ATP ADP Pi Mg21 Ca21 K1 Muitos intermediários metabólicos solúveis FIGURA 192 Anatomia bioquímica de uma mitocôndria a A mem brana externa tem poros que a tornam permeável a pequenas moléculas e íons mas não a proteínas As convoluções cristas da membrana interna fornecem uma grande área de superfície A membrana interna de uma única mitocôndria do fígado pode ter mais de 10000 conjuntos de sistemas de transferência de elétrons cadeias respiratórias e de moléculas de ATPsinta se distribuídos na superfície da membrana b As mitocôndrias do músculo cardíaco que têm cristas mais profusas e assim uma área muito maior de membrana interna contêm mais de três vezes o número de conjuntos de sistemas de transferência de elétrons que as c mitocôndrias do fígado As mitocôndrias dos músculos e do fígado têm tamanho aproximado ao de uma bactéria 2 1 a 2 mm de comprimento As mitocôndrias de invertebra dos de plantas e de microrganismos eucariotos são semelhantes àquelas aqui mostradas mas com variações muito maiores no tamanho na forma e no grau de convoluções da membrana interna Nelson6edbookindb 733 Nelson6edbookindb 733 030414 0745 030414 0745 734 DAVID L NELSON MICHAEL M COX em geral as mitocôndrias das células com grande ativida de metabólica têm cristas mais e mais densamente empa cotadas Fig 191b Em tecidos com metabolismo menos ativo p ex pele há menos mitocôndrias cada uma com menos cristas Durante o crescimento e divisão celulares as mitocôndrias dividemse por fissão como as bactérias e sob algumas circunstâncias mitocôndrias individuais se fundem para formar estruturas maiores e mais distendidas Elétrons são canalizados para aceptores universais de elétrons A fosforilação oxidativa começa com a entrada de elétrons na cadeia de carregadores de elétrons chamada de cadeia respiratória A maioria desses elétrons surge da ação das desidrogenases que coletam elétrons das vias catabólicas e os canalizam para aceptores universais de elétrons nu cleotídeos de nicotinamida NAD 1 ou NADP 1 ou nucleotí deos de flavina FMN ou FAD ver Figuras 1324 1327 Desidrogenases ligadas a nucleotídeos de nicoti namida catalisam reações reversíveis dos seguintes tipos gerais Substrato reduzido 1 NAD 1 substrato oxidado 1 NADH 1 H 1 Substrato reduzido 1 NADP 1 substrato oxidado 1 NADPH 1 H 1 A maioria das desidrogenases que agem no catabolismo é específica para NAD 1 como aceptor de elétrons Tabela 19 1 Algumas estão no citosol outras estão nas mitocôndrias e ainda outras têm isoenzimas mitocondriais e citosólicas Desidrogenases ligadas ao NAD 1 removem dois átomos de hidrogênio de seus substratos Um deles é transferido como íon hidreto H 2 ao NAD 1 o outro é liberado como H 1 no meio ver Figura 1324 NADH e NADPH são carregadores de elétrons solúveis em água que se associam reversivel mente com desidrogenases O NADH carrega elétrons das reações catabólicas até seu ponto de entrada na cadeia respi ratória o complexo da NADHdesidrogenase descrito a seguir O NADPH geralmente supre elétrons para reações anabólicas As células mantêm conjuntos separados de NADPH e NADH com diferentes potenciais redox Isso é alcançado mantendo se a razão de forma reduzida forma oxidada relativa mente alta para NADPH e relativamente baixa para NADH Nenhum desses nucleotídeos pode atravessar a membrana mitocondrial interna mas os elétrons que eles carregam po dem ser lançados através dela indiretamente como será visto Flavoproteínas contêm um nucleotídeo de flavina FMN ou FAD ver Figura 1327 muito fortemente ligado às vezes de forma covalente O nucleotídeo de flavina oxi dado pode aceitar um elétron produzindo a forma semi quinona ou dois elétrons produzindo FADH2 ou FMNH2 A transferência de elétrons ocorre porque a flavoproteína tem um potencial de redução maior do que o composto oxidado Lembrese de que o potencial de redução é uma medida quantitativa da tendência relativa de uma determi nada espécie química de aceitar elétrons em uma reação de oxidaçãoredução p 530 O potencial de redução pa drão de um nucleotídeo de flavina ao contrário daquele de NAD ou NADP depende da proteína com a qual está associado Interações locais com grupos funcionais na pro teína distorcem os orbitais de elétrons no anel de flavina mudando as estabilidades relativas das formas reduzi das e oxidadas O potencial de redução padrão relevante é portanto aquele da flavoproteína em particular e não o do FAD ou do FMN isolados O nucleotídeo de flavina deve ser considerado parte do sítio ativo da flavoproteína em vez de um reagente ou produto na reação de trans ferência de elétrons Como as flavoproteínas participam de transferências de um ou dois elétrons elas servem de TABELA 191 Algumas reações importantes catalisadas por desidrogenases ligadas a NADPH Reação Localização Ligadas ao NAD aCetoglutarato 1 CoA 1 NAD 1 succinilCoA 1 CO2 1 NADH 1 H 1 M LMalato 1 NAD 1 oxaloacetato 1 NADH 1 H 1 M e C Piruvato 1 CoA 1 NAD 1 acetilCoA 1 CO2 1 NADH 1 H 1 M Gliceraldeído3fosfato 1 Pi 1 NAD 1 13bifosfoglicerato 1 NADH 1 H 1 C Lactato 1 NAD 1 piruvato 1 NADH 1 H 1 C bHidroxiacilCoA 1 NAD 1 bcetoacilCoA 1 NADH 1 H 1 M Ligadas ao NADP Glicose6fosfato 1 NADP 1 6fosfogliconato 1 NADPH 1 H 1 C LMalato 1 NADP 1 piruvato 1 CO2 1 NADPH 1 H 1 C Ligadas ao NAD ou ao NADP LGlutamato 1 H2O 1 NADP 1 acetoglutarato 1 NH4 1 1 NADPH M Isocitrato 1 NADP 1 acetoglutarato 1 CO2 1 NADPH 1 H 1 M e C Estas reações e suas enzimas são discutidas nos Capítulos 14 a 18 M designa mitocôndria C citosol Nelson6edbookindb 734 Nelson6edbookindb 734 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 735 intermediários entre reações nas quais dois elétrons são doados como em desidrogenações e aquelas nas quais um elétron é cedido como na redução de uma quinona a hidroquinona descrita a seguir Os elétrons passam por uma série de carregadores ligados à membrana A cadeia respiratória mitocondrial consiste em uma série de carregadores que agem sequencialmente sendo a maioria deles proteínas integrais com grupos prostéticos capazes de aceitar e doar um ou dois elétrons Ocorrem três tipos de transferência de elétrons na fosforilação oxidativa 1 transferência direta de elétrons como na redução de Fe 31 a Fe 21 2 transferência na forma de um átomo de hidro gênio H 1 1 e 2 e 3 transferência como um íon hidreto H 2 que tem dois elétrons O termo equivalente redu tor é usado para designar um único elétron equivalente transferido em uma reação de oxidaçãoredução Além do NAD e das flavoproteínas outros três tipos de moléculas carregadoras de elétrons funcionam na cadeia respiratória uma quinona hidrofóbica ubiquinona e dois tipos diferentes de proteínas que contêm ferro citocromos e proteínas ferroenxofre A ubiquinona também cha mada de coenzima Q ou simplesmente Q é uma benzo quinona solúvel em lipídeos com uma longa cadeia lateral isoprenoide Figura 193 Os compostos intimamente relacionados plastoquinona de cloroplastos vegetais e menaquinona de bactérias desempenham papéis análogos àquele da ubiquinona carregando elétrons em cadeias de transferência de elétrons associadas a membranas A ubiqui nona pode aceitar um elétron para se tornar o radical semi quinona QH ou dois elétrons para formar ubiquinol QH2 Figura 193 e como os carregadores flavoproteínas atuar na junção entre um doador de dois elétrons e um aceptor de um elétron Como a ubiquinona é pequena e hidrofóbica ela é livremente difusível dentro da bicamada lipídica da mem brana mitocondrial interna e capaz de movimentar equiva lentes redutores entre outros carregadores de elétrons me nos móveis na membrana Além disso por carregar elétrons e prótons ela desempenha um papel central em acoplar o fluxo de elétrons ao movimento de prótons Os citocromos são proteínas com absorção caracte risticamente forte de luz visível devido aos seus grupos prostéticos heme contendo ferro Figura 194a As mito côndrias têm três classes de citocromos designados a b e c distinguidos por diferenças em seus espectros de absor ção de luz Cada tipo de citocromo em seu estado reduzido Fe 21 tem três bandas de absorção na faixa visível Figura 194b A banda de comprimento de onda mais longo é pró xima de 600 nm em citocromos tipo a próxima de 560 nm no tipo b e perto de 550 nm no tipo c Para distinguir cito cromos intimamente relacionados dentro de um determina do tipo a absorção máxima exata algumas vezes é utilizada nos nomes como no citocromo b562 Os cofatores heme dos citocromos a e b são fortemen te mas não covalentemente ligados às suas proteínas associadas os hemes dos citocromos tipo c são covalen temente ligados por meio de resíduos de Cys Figura 19 4 Da mesma maneira que no caso das flavoproteínas o potencial de redução padrão do átomo de ferro do heme de um citocromo depende de sua interação com as ca deias laterais da proteína sendo portanto diferente para cada citocromo Os citocromos dos tipos a e b e alguns do tipo c são proteínas integrais da membrana mitocondrial interna Uma exceção marcante é o citocromo c das mi tocôndrias proteína solúvel que se associa com a superfí cie externa da membrana interna por meio de interações eletrostáticas Em proteínas ferroenxofre o ferro está ausente no heme mas encontrase em associação com átomos de enxofre inorgânico ou com átomos de enxofre dos resí duos de Cys na proteína ou com ambos Esses centros de ferroenxofre FeS variam de estruturas simples com um único átomo de Fe coordenado com quatro grupos CysSH a centros FeS mais complexos com dois ou quatro átomos de Fe Figura 195 Proteínas ferro enxofre de Rieske denominadas em homenagem a seu descobridor John S Rieske são uma variação nesse tema onde um átomo de Fe está combinado com dois resíduos de His em vez de com resíduos de Cys Todas as proteínas ferroenxofre participam de transferências de um elétron nas quais um átomo de ferro do aglomerado ferroenxofre é oxidado ou reduzido Pelo menos oito proteínas FeS funcionam na transferência mitocondrial de elétrons O potencial de redução das proteínas FeS varia de 2065 V a 1045 V dependendo do microambiente do ferro dentro da proteína Na reação global catalisada pela cadeia respiratória mitocondrial os elétrons se movem do NADH succinato ou outro doador primário de elétrons por flavoproteínas ubiquinona proteínas ferroenxofre e citocromos e final mente ao O2 Uma observação dos métodos utilizados para determinar a sequência em que os carregadores agem é in H C CH R OH CH3 CH3O CH2 O CH3O CH3 CH210 Ubiquinona Q totalmente oxidada Radical semiquinona QH Ubiquinol QH2 totalmente reduzido H1 1 e2 O CH3 CH3O CH3O H1 1 e2 OH OH R CH3 CH3O CH3O O FIGURA 193 Ubiquinona Q ou coenzima Q A redução completa da ubiquinona requer dois elétrons e dois prótons e ocorre em duas etapas por meio do intermediário o radical semiquinona Nelson6edbookindb 735 Nelson6edbookindb 735 030414 0745 030414 0745 736 DAVID L NELSON MICHAEL M COX formativa uma vez que as mesmas abordagens gerais foram utilizadas para estudar outras cadeias de transferência de elétrons como aquelas nos cloroplastos Primeiro os potenciais de redução padrão dos carre gadores de elétrons individuais foram experimentalmente determinados Tabela 192 Poderia ser esperado que os FIGURA 194 Grupos prostéticos dos citocromos a Cada grupo consiste em quatro anéis de cinco membros contendo nitrogênio em uma estrutura cíclica chamada de porfirina Os qua tro átomos de nitrogênio estão coordenados com um íon central de Fe Fe 21 ou Fe 31 A ferro protoporfirina IX é encontrada em citocromos tipo b e em hemoglobina e mioglobina ver Figura 417 O heme c está covalentemente ligado à proteína do citocromo c por meio de ligações tioéster a dois resíduos de Cys Heme a encontrado em citocromos tipo a tem uma longa cauda isoprenoide ligada a um dos anéis de cinco membros O sistema conjugado de ligações duplas sombreado em cor salmão do anel de porfirina tem elétrons deslocados que de forma relativa são facilmente excitados por fótons com comprimentos de onda da luz visível o que explica a forte absorção de luz por estes hemes e compostos relacionados na faixa visível do espectro b Espectro de absorção do citocromo c cit c em sua forma oxidada em azul e reduzida em vermelho As bandas características a b e g da forma reduzida estão marcadas Fe N N N N CH3 CH3 CH2CH2COO2 CH2 CH CH2 CH CH3 Heme a em citocromos tipo a Fe N N N N CH3 CH3 CH3 CH3 CH2CH2COO2 CH2 CH2 CHO CH2 CH CH2 Ferro protoporfirina IX em citocromos tipo b a COO2 CH3 OH Cys S Cys Fe N N N N CH3 CH3 CH3 CH3 CH2CH2COO2 CH2 CH2 Heme c em citocromos tipo c COO2 CH3 CH2 CH S CH CH2 CH CH3 CH3 CH3 CH3 COO2 100 b Absorção relativa de luz 50 300 400 500 600 Comprimento de onda nm Cit c oxidado Cit c reduzido a b g 0 S Cys Cys S Cys Cys S S a Fe Proteína S b S Fe S Fe S S Cys S Cys Cys Cys S c Cys Cys Fe S S S S S S S Fe Fe Fe Cys Cys d FIGURA 195 Centros de ferroenxofre Os centros FeS das proteínas ferroenxofre podem ser tão simples como em a com um único íon de Fe cercado pelos átomos de S de quatro resíduos de Cys Outros centros in cluem átomos de S tanto inorgânicos quanto fornecidos por Cys como em b centros 2Fe2S ou em c centros 4Fe4S d A ferredoxina da cianobac téria Anabaena 7120 tem um centro 2Fe2S PDB ID 1FRD o Fe está repre sentado em vermelho o S inorgânico em amarelo e o S de Cys em cor de laranja Observe que nestas designações apenas os átomos de S inorgânico são contados Por exemplo no centro 2Fe2S b cada íon de Fe é na verdade circundado por quatro átomos de S O potencial de redução padrão exato do ferro nestes centros depende do tipo de centro e de sua interação com a proteína associada Nelson6edbookindb 736 Nelson6edbookindb 736 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 737 carregadores funcionassem em ordem crescente de poten cial de redução porque os elétrons tendem a fluir espon taneamente de carregadores de E9 menores para carrega dores de E9 maiores A ordem dos carregadores deduzida por este método é NADH S Q S citocromo b S citocromo c1 S citocromo c S citocromo a S citocromo a3 S O2 Observe no entanto que a ordem dos potenciais de redu ção padrão não é necessariamente a mesma que a ordem de potenciais de redução reais sob condições celulares que depende das concentrações das formas reduzidas e oxidadas ver Equação 135 p 531 Um segundo método para determinar a sequência de carregadores de elétrons envolve reduzir toda a cadeia de carregadores experimen talmente fornecendo uma fonte de elétrons mas nenhum aceptor de elétrons sem O2 Quando o O2 é repentina mente introduzido no sistema a taxa com a qual cada carregador de elétrons se torna oxidado medida espec troscopicamente revela a ordem em que os carregadores funcionam O carregador mais próximo do O2 no final da cadeia cede seu elétron primeiro o segundo carregador contado a partir do final é o próximo a ser oxidado e assim por diante Tais experimentos confirmaram a sequência deduzida a partir dos potenciais de redução padrão Em uma confirmação final agentes que inibem o fluxo de elétrons ao longo da cadeia foram usados em combina ção com medidas do grau de oxidação de cada carregador Na presença de O2 e de um doador de elétrons os carrega dores que funcionam antes da etapa inibida ficam comple tamente reduzidos e aqueles que funcionam depois dessa etapa são completamente oxidados Figura 196 Usando diversos inibidores que bloqueiam diferentes etapas da ca deia os investigadores determinaram a sequência inteira a mesma deduzida nas duas primeiras abordagens Os carregadores de elétrons atuam em complexos multienzimáticos Os carregadores de elétrons da cadeia respiratória são or ganizados em complexos supramoleculares inseridos den tro da membrana podendo ser fisicamente separados Um TABELA 192 Potenciais de redução padrão da cadeia respiratória e de carregadores de elétrons relacionados Reação redox meiareação E9 V 2H 1 1 2e 2 H2 20414 NAD 1 1 H 1 1 2e 2 NADH 20320 NADP 1 1 H 1 1 2e 2 NADPH 20324 NADHdesidrogenase FMN 1 2H 1 1 2e 2 NADHdesidrogenase FMNH2 2030 Ubiquinona 1 2H 1 1 2e 2 ubiquinol 0045 Citocromo b Fe 31 1 e 2 citocromo b Fe 21 0077 Citocromo c1 Fe 31 1 e 2 citocromo c1 Fe 21 022 Citocromo c Fe 31 1 e 2 citocromo c Fe 21 0254 Citocromo a Fe 31 1 e 2 citocromo a Fe 21 029 Citocromo a3 Fe 31 1 e 2 citocromo a3 Fe 21 035 O2 1 2H 1 1 2e 2 H2O 08166 NADH Q Cyt c1 Cyt c O2 rotenona antimicina A CN 2 ou CO Cyt b NADH Q O2 NADH Q O2 Cyt a 1 a3 Cyt c1 Cyt c Cyt b Cyt a 1 a3 Cyt c1 Cyt c Cyt b Cyt a 1 a3 FIGURA 196 Método para a determinação da sequência de carrega dores de elétrons Este método mede os efeitos de inibidores da transfe rência de elétrons no estado de oxidação de cada carregador Na presença de um doador de elétrons e de O2 cada inibidor causa um padrão caracte rístico de carregadores oxidadosreduzidos aqueles antes do bloqueio tor namse reduzidos em azul e aqueles após o bloqueio tornamse oxidados em cor salmão Nelson6edbookindb 737 Nelson6edbookindb 737 030414 0745 030414 0745 738 DAVID L NELSON MICHAEL M COX leve tratamento da membrana mitocondrial interna com detergentes permite a separação de quatro complexos car regadores singulares cada um capaz de catalisar a transfe rência de elétrons por uma porção da cadeia Tabela 193 Figura 197 Os complexos I e II catalisam a transferência de elétrons para a ubiquinona a partir de dois doadores de elétrons diferentes NADH complexo I e succinato com plexo II O complexo III carrega elétrons da ubiquinona reduzida para o citocromo c e o complexo IV completa a sequência transferindo elétrons do citocromo c para o O2 Agora serão estudados com mais detalhe a estrutura e a função de cada complexo da cadeia respiratória mitocondrial Complexo I NADH à ubiquinona A Figura 198 ilustra a relação entre os complexos I e II e as enzimas da boxidação de áci dos graxos e a ubiquinona O complexo I também chamado de NADH ubiquinonaoxidorredutase ou NADHdesi drogenase é uma enzima grande composta por 42 cadeias diferentes de polipeptídeos incluindo uma flavoproteína contendo FMN e pelo menos seis centros de ferroenxofre O complexo I tem formato de L com um braço do L na mem brana e o outro se estendendo para a matriz Conforme mos trado na Figura 199 o complexo I catalisa dois processos simultâneos e obrigatoriamente acoplados 1 a transferên cia exergônica para a ubiquinona de um íon hidreto do NADH e de um próton da matriz expressa por NADH 1 H 1 1 Q NAD 1 1 QH2 191 e 2 a transferência endergônica de quatro prótons da matriz para o espaço intermembrana O complexo I é por tanto um bombeador de prótons que utiliza a energia da transferência de elétrons e a reação que ele catalisa é ve torial ela move prótons em uma direção específica de um local a matriz que se torna negativamente carregada com a saída dos prótons a outro o espaço intermembrana que se torna positivamente carregado Para enfatizar a nature za vetorial do processo a reação geral normalmente é escri ta com subscritos que indicam a localização dos prótons P para o lado positivo da membrana interna o espaço inter membrana N para o lado negativo a matriz NADH 1 5 HN 1 1 Q NAD 1 1 QH2 1 4 HP 1 192 Amital fármaco do tipo barbiturato rotenona produto vegetal comumente utilizado como inseticida e piericidina A antibiótico inibem o fluxo de elétrons dos centros de ferroenxofre do complexo I para a ubiquinona Tabela 19 4 e portanto bloqueiam o processo global da fosforilação oxidativa TABELA 193 Os componentes proteicos da cadeia mitocondrial de transferência de elétrons Proteínacomplexo enzimático Massa kDa Número de subunidades Grupos prostéticos I NADHdesidrogenase 850 43 14 FMN FeS II Succinatodesidrogenase 140 4 FAD FeS III Ubiquinona citocromo coxidorredutase 250 11 Hemes FeS Citocromo c 13 1 Heme IV Citocromooxidase 160 13 34 Hemes CuA CuB Número de subunidades em equivalentes bacterianos entre parênteses O citocromo c não é parte do complexo enzimático ele se move entre os complexos III e IV como proteína livremente solúvel NADH Q Suc cinato Q Q Cit c Cit c O2 ATP ADP 1 Pi Reações catalisadas por frações isoladas in vitro I II III IV ATP sintase Fragmentos da membrana interna Fragmentos descartados da membrana externa ATP sintase IV III II I Solubilização com detergente seguida de cromatografia de troca iônica Ruptura osmótica Tratamento com digitonina FIGURA 197 Separação dos complexos funcionais da cadeia respira tória Inicialmente a membrana mitocondrial externa é removida por trata mento com o detergente digitonina Fragmentos da membrana interna são então obtidos por ruptura osmótica das mitocôndrias e os fragmentos são suavemente dissolvidos em um segundo detergente A mistura resultante de proteínas da membrana interna é separada por cromatografia de troca iônica em diferentes complexos de I a IV da cadeia respiratória cada um com sua composição proteica singular ver Tabela 193 e a enzima ATPsintase algu mas vezes chamada de complexo V Os complexos isolados de I a IV catalisam transferências entres doadores NADH e succinato carregadores intermediá rios Q e citocromo c e O2 conforme representado In vitro a ATPsintase isola da tem apenas atividade de hidrólise de ATP ATPase e não de síntese de ATP Nelson6edbookindb 738 Nelson6edbookindb 738 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 739 Q QH2 QH2 Espaço intermembrana lado P Matriz lado N AcilCoA de ácidos graxos EnoilCoA FTEQ oxidorredutase AcilCoA desidrogenase FAD FTE FeS FAD FAD Glicerol 3fosfato citosólico Glicerol3 fosfato desidrogenase FAD Succinato II NADH H NAD FAD FeS FeS FMN Fumarato I FIGURA 198 Via dos elétrons de NADH succinato acilCoA de ácidos graxos e glicerol3fosfato para a ubiquinona Ubiquinona Q é o pon to de entrada para os elétrons derivados das reações do citosol a partir de reações de oxidação dos ácidos graxos e da oxidação do succinato no ciclo do ácido cítrico Os elétrons do NADH passam por uma flavoproteína com o cofator FMN e para uma série de centros FeS no complexo I e então para Q Os elétrons do succinato passam por uma flavoproteína com o cofator FAD e de vários centros FeS no complexo II a caminho de Q O glicerol3 fosfato doa elétrons a uma flavoproteína glicerol3fosfatodesidrogenase na face externa da membrana mitocondrial interna de onde eles passam para Q A acilCoAdesidrogenase a primeira enzima da boxidação transfe re elétrons à flavoproteína transferidora de elétrons FTE de onde eles pas sam a Q por meio da FTEubiquinonaoxidorredutase 2H Série de centros de FeS Espaço inter membrana lado P Matriz lado N Q QH2 2e Complexo I Braço da membrana NADH H NAD 4H Braço da matriz FMN 2e N2 Braço dmat zm at riz FMN FIGURA 199 NADHubiquinonaoxidorredutase complexo I PDB ID 3M9S O complexo I a estrutura cristalina da bactéria Thermus thermophi lus é mostrada catalisa a transferência de um íon hidreto de NADH a FMN de onde dois elétrons passam por uma série de centros de FeS para o centro FeS N2 no braço da matriz do complexo A transferência de elétrons de N2 para a ubiquinona no braço da membrana forma QH2 que se difunde na bi camada lipídica Esta transferência de elétrons também governa a expulsão da matriz de quatro prótons por par de elétrons O mecanismo detalhado que acopla a transferência de elétrons e prótons no complexo I ainda não é conhecido mas provavelmente envolve um ciclo Q similar ao do complexo III onde QH2 participa duas vezes para cada par de elétrons ver Figura 19 12 O fluxo de prótons produz um potencial eletroquímico através da mem brana mitocondrial interna lado N negativo lado P positivo TABELA 194 Agentes que interferem com a fosforilação oxidativa ou com a fotofosforilação Tipo de interferência Composto Alvomodo de ação Inibição da transferência de elétrons Cianeto Monóxido de carbono Inibem a citocromooxidase Antimicina A Bloqueia a transferência de elétrons do citocromo b ao citocromo c1 Mixotiazol Rotenona Amital Piericidina A Impedem a transferência de elétrons do centro FeS à ubiquinona DCMU Compete com QB pelo sítio de ligação do PSII Inibição da ATPsintase Aurovertina Inibe F1 Oligomicina Venturicidina Inibem Fo e CFo DCCD Bloqueia o fluxo de prótons por Fo e CFo Desacoplamento da fosfo rilação da transferência de elétrons FCCP DNP Carregadores hidrofóbicos de prótons Valinomicina Ionóforo K 1 Termogenina Em tecido adiposo marrom forma poros condutores de prótons na membrana mitocondrial interna Inibição da troca ATPADP Atractilosídeo Inibe a adeninanucleotídeotranslocase DCMU é 334diclorofenil11dimetilureia DCCD diciclohexilcarbodiimida FCCP cianetoptrifluorometoxifenilhidrazona DNP 24dinitrofenol Nelson6edbookindb 739 Nelson6edbookindb 739 030414 0745 030414 0745 740 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Complexo II succinato a ubiquinona O complexo II foi apre sentado no Capítulo 16 como succinatodesidrogenase a única enzima do ciclo do ácido cítrico ligada à membrana p 646 Embora menor e mais simples do que o complexo I ele contém cinco grupos prostéticos de dois tipos e qua tro subunidades proteicas diferentes Figura 1910 As subunidades C e D são proteínas integrais de membrana cada uma com três hélices transmembrana Elas contêm um grupo heme heme b e um sítio de ligação para a ubiqui nona o aceptor final de elétrons na reação catalisada pelo complexo II As subunidades A e B se estendem para a ma triz elas contêm três centros 2Fe2S FAD ligado e um sítio de ligação para o substrato o succinato A via de transfe rência de elétrons do sítio de ligação do succinato a FAD e então pelos centros FeS rumo ao sítio de ligação de Q tem mais de 40 Å de comprimento mas nenhuma das distâncias individuais de transferência de elétrons excede cerca de 11 Å distância razoável para uma transferência rápida de elé trons Figura 1910 O heme b do complexo II aparentemente não está na via direta de transferência de elétrons em vez disso pode servir para reduzir a frequência com que elétrons va zam para fora do sistema movendose do succinato ao oxi gênio molecular para produzir as espécies reativas de oxigênio ERO peróxido de hidrogênio H2O2 e o radi cal superóxido O2 2 conforme descrito a seguir Huma nos com mutações pontuais nas subunidades do complexo II perto do heme b ou do sítio de ligação da quinona sofrem de paraganglioma hereditário Essa condição hereditária é caracterizada por tumores benignos da cabeça e do pesco ço comumente no corpo carotídeo órgão que percebe os níveis de O2 no sangue Essas mutações resultam em maior produção das ERO e talvez maior dano ao tecido durante a oxidação do succinato Outros substratos das desidrogenases mitocondriais passam elétrons para a cadeia respiratória no nível da ubi quinona mas não pelo complexo II O primeiro passo na boxidação da acilCoA dos ácidos graxos catalisada pela flavoproteína acilCoAdesidrogenase ver Figura 178 envolve a transferência de elétrons do substrato para o FAD da desidrogenase e então para a flavoproteína transferido ra de elétrons FTE que por sua vez passa seus elétrons a FTEubiquinonaoxidorredutase Figura 198 Essa enzima transfere elétrons para a cadeia respiratória redu zindo a ubiquinona O glicerol3fosfato formado a partir do glicerol liberado pela quebra do triacilglicerol ou pela redução da dihidroxiacetonafosfato da glicólise é oxidado pela glicerol3fosfatodesidrogenase ver Figura 174 Essa enzima é uma flavoproteína localizada na face exter na da membrana mitocondrial interna e como a succinato desidrogenase e a acilCoAdesidrogenase ela canaliza elétrons para a cadeia respiratória reduzindo ubiquinona Figura 198 O importante papel da glicerol3fosfato desidrogenase em lançar equivalentes redutores do NADH citosólico para a matriz mitocondrial é descrito na Seção 192 ver Figura 1932 O efeito de cada uma dessas enzi mas transferidoras de elétrons é contribuir para o conjunto pool de ubiquinona reduzida O QH2 de todas essas rea ções é reoxidado pelo complexo III Complexo III ubiquinona para citocromo c O próximo complexo respiratório o complexo III também chamado de comple xo de citocromo bc1 ou ubiquinona citocromo coxi dorredutase acopla a transferência de elétrons do ubiqui nol QH2 para o citocromo c com o transporte vetorial de prótons da matriz para o espaço intermembrana As deter minações da estrutura completa desse enorme complexo Figura 1911 e do complexo IV a seguir por cristalogra fia por raios X realizada entre 1995 e 1998 foram marcos no estudo da transferência mitocondrial de elétrons fornecen do a base estrutural para integrar as diversas observações bioquímicas das funções dos complexos respiratórios A unidade funcional do complexo III é um dímero com as duas unidades monoméricas de citocromo b circundando uma caverna no meio da membrana na qual a ubiquino na fica livre para se mover do lado da matriz da membrana sítio QN em um monômero para o espaço intermembrana sítio QP do outro monômero à medida que ela lança elé trons e prótons através da membrana mitocondrial interna Figura 1911b Com base na estrutura do complexo III e em estudos bioquímicos detalhados das reações redox um modelo ra zoável o ciclo Q foi proposto para a passagem de elétrons e2 Espaço intermembrana lado P Matriz lado N C Fosfatidiletanolamina D B Centros de FeS Ubiquinona QH2 Heme b FAD A Sítio de ligação do succinato FIGURA 1910 Estrutura do complexo II succinatodesidrogena se PDB ID 1ZOY Este complexo aqui está apresentada a enzima do co ração de porco tem duas subunidades transmembrana C e D as extensões citoplasmáticas contêm as subunidades A e B Logo atrás de FAD na subuni dade A está o sítio de ligação do succinato A subunidade B tem três conjun tos de centros de FeS ubiquinona é ligada à subunidade B um heme b está localizado entre as subunidade C e D Duas moléculas de fosfatidiletanolami na estão tão fortemente ligadas à subunidade D que aparecem na estrutura cristalina Os elétrons se movem setas azuis do succinato ao FAD e então através de três centros de FeS para a ubiquinona O heme b não está na via principal da transferência de elétrons mas protege contra a formação de espécies reativas de oxigênio ERO por elétrons que saem da via Nelson6edbookindb 740 Nelson6edbookindb 740 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 741 e prótons pelo complexo A equação resultante para as rea ções redox do ciclo Q Figura 1912 é QH2 1 2 cit c1 oxidado 1 2 H 1 N Q 1 2 cit c1 reduzido 1 4 H 1 P 193 O ciclo Q acomoda a troca entre o carregador de dois elé trons ubiquinol a forma reduzida da ubiquinona e os car regadores de um elétron hemes bL e bH do citocromo b e citocromos c1 e c e resulta na absorção de dois prótons no lado N e a liberação de quatro prótons no lado P por par de elétrons que passa para o citocromo c pelo complexo III Dois dos prótons liberados no lado P são eletrogêni cos os outros dois são eletroneutros balanceados pelas duas cargas elétrons passadas ao citocromo c no lado P Embora a via de elétrons por esse segmento da cadeia respiratória seja complicada o efeito resultante da trans ferência é simples QH2 é oxidado a Q duas moléculas de citocromo c são reduzidas e prótons são movidos do lado P para o lado N Q QH2 cit c1 oxidado 1 Q 1 QH2 2 cit c1 oxidado 1 2HP 1 Q 1 1 cit c1 reduzido 1 Q 1 2 cit c1 reduzido 1 1 Q 2 Q2 1 4HP 1 2HP 1 2HN 1 1 2HN 1 QH2 Q cit c1 oxidado 1 QH2 1 1 cit c1 reduzido 1 Equação resultante 2H Espaço intermembrana lado P Matriz lado N Cit c e e e e e e Heme c1 2Fe2S Cit c1 e Cit c e e Citocromo b 2H QH2 QH2 Q Q Q Q Heme bL Heme bH QH2 Q e e e Q QH2 QH2 QH2 Q Q 2H FIGURA 1912 O ciclo Q apresenta do em dois estágios A via de elétrons pelo complexo III é mostrada por setas azuis O movimento de várias formas de ubiquinona é ilustrado com setas pretas No primeiro estágio à esquerda Q no lado N é reduzida ao radical semiquino na que retorna à sua posição para acei tar outro elétron No segundo estágio à direita o radical semiquinona é conver tido a QH2 Enquanto isto no lado P da membrana duas moléculas de QH2 são oxidadas a Q liberando dois prótons por molécula de Q quatro prótons ao todo para o espaço intermembrana Cada QH2 doa um elétron por meio do centro de FeS de Rieske para o citocromo c1 e um elétron via citocromo b para a molécula de Q próxima ao lado N reduzindoa em duas etapas a QH2 Esta redução também consome dois prótons por molécula de Q os quais são retirados da matriz lado N O cit c1 passa um elétron por vez ao cit c que se dissocia e carrega elétrons ao complexo IV FIGURA 1911 Complexo de citocromo bc1 complexo III PDB ID 1BGY O complexo é um dímero de monômeros idênticos cada um com 11 subunidades diferentes O centro funcional de cada monômero é cons tituído por três subunidades citocromo b em verde com seus dois hemes bH e bL a proteína ferroenxofre de Rieske em púrpura com seus dois cen tros de 2Fe2S e o citocromo c1 em azul com seu heme Este desenho do complexo mostra como o citocromo c1 e a proteína ferroenxofre de Rieske projetamse da superfície P e podem interagir com o citocromo c que não faz parte do complexo funcional no espaço intermembrana O complexo tem dois sítios de ligação distintos para ubiquinona QN e QP que correspon dem aos sítios de inibição por dois fármacos que bloqueiam a fosforilação oxidativa Antimicina A que bloqueia o fluxo de elétrons do heme bH para Q ligase a QN perto do heme bH no lado N matriz da membrana Mixotia zol que impede o fluxo de elétrons de QH2 para a proteína ferroenxofre de Rieske ligase a Q perto do centro de 2Fe2S e ao heme bL no lado P A estru tura dimérica é essencial para o funcionamento do complexo III A interface entre os monômeros forma duas cavernas cada uma contendo um sítio QP de um monômero e um sítio QN do outro Os intermediários da ubiquinona movimentamse dentro dessas cavernas protegidas O complexo III cristalizase em duas conformações distintas não mos tradas Em uma o centro de FeS de Rieske está próximo ao seu aceptor de elétrons o heme do citocromo c1 mas relativamente distante do cito cromo b e do sítio de ligação de QH2 no qual centro de FeS de Rieske recebe elétrons Na outra o centro de FeS se afastou do citocromo c1 e se aproximou do citocromo b Acreditase que a proteína de Rieske oscile entre essas duas conformações à medida que é primeiramente reduzida e depois oxidada Cit c Espaço intermembrana lado P Matriz lado N Citocromo b QP QN Heme c1 Heme c1 Proteínas ferro enxofre de Rieske Citocromo c1 Heme bL Heme bL Heme bH Heme bH 2Fe2S Caverna Nelson6edbookindb 741 Nelson6edbookindb 741 030414 0745 030414 0745 742 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O citocromo c é uma proteína solúvel do espaço inter membrana Depois que seu único heme aceita um elétron do complexo III o citocromo c movese para o complexo IV para doar o elétron para um centro de cobre binuclear Complexo IV citocromo c para O2 Na etapa final da cadeia res piratória o complexo IV também chamado de citocromo oxidase carrega elétrons do citocromo c para o oxigênio molecular reduzindoo a H2O O complexo IV é uma enzima grande 13 subunidades Mr 204000 da membrana mito condrial interna As bactérias contêm uma forma bem mais simples com apenas três ou quatro subunidades mas ainda capaz de catalisar tanto a transferência de elétrons quanto o bombeamento de prótons A comparação dos complexos mitocondrial e bacteriano sugere que três subunidades são essenciais para a função Figura 1913 A subunidade II mitocondrial contém dois íons cobre complexados com os grupos SH de dois resíduos de Cys em um centro binuclear CuA Figura 1913b que lembra os centros de 2Fe2S das proteínas ferroenxofre A subuni dade I contém dois grupos heme designados a e a3 e um outro íon cobre CuB Heme a3 e CuB formam um segundo centro binuclear que aceita elétrons de heme a e os transfe re ao O2 ligado ao heme a3 A transferência de elétrons pelo complexo IV dáse do citocromo c para o centro de CuA para o heme a para o centro de heme a3CuB e finalmente para o O2 Figura 19 14 Para cada quatro elétrons que passam por complexo a enzima consome quatro substratos H 1 da matriz lado N na conversão de O2 a 2H2O Ela também usa a energia dessa reação redox para bombear um próton para fora em direção ao espaço intermembrana lado P para cada elétron que Met His His Glu Cys Cys a b 180 Espaço intermembrana lado P Matriz lado N Heme a Heme a3 FIGURA 1913 Estrutura da citocromooxidase complexo IV Este complexo de mitocôndrias bovinas tem 13 subunidades mas apenas qua tro proteínas centrais são mostradas aqui PDB ID 1OCC a Complexo IV com quatro subunidades em cada uma das duas unidades idênticas de um dímero A subunidade I em amarelo tem dois grupos heme a e a3 perto de um único íon cobre CuB não visível aqui Heme a3 e CuB formam um centro binuclear FeCu A subunidade II em púrpura contém dois íons Cu comple xados com os grupos SH de dois resíduos de Cys em um centro binuclear CuA que lembra os centros de 2Fe2S das proteínas ferroenxofre O centro binuclear e o sítio de ligação ao citocromo c estão localizados em um domí nio da subunidade II que se projeta do lado P da membrana interna para o espaço intermembrana A subunidade III em azulclaro é essencial para o rápido movimento de prótons pela subunidade II O papel da subunidade IV em verde ainda não é conhecido b Centro binuclear de CuA Os íons Cu partilham elétrons igualmente Quando o centro está reduzido os íons têm as cargas formais Cu 11Cu 11 quando oxidado Cu 151Cu 151 Seis resíduos de aminoácidos são ligantes ao redor dos íons Cu dois de His dois de Cys Glu e Met Subuni dade I 4H Subunidade III 4e 4 Cit c CuB O2 4H bombeado 2H2O 4H substrato Heme a3 Subunidade II Centro de FeCu CuA Heme a Espaço intermembrana lado P Matriz lado N FIGURA 1914 Via dos elétrons pelo complexo IV As três proteínas cru ciais para o fluxo de elétrons são as subunidades I II e III A estrutura maior em verde inclui outras 10 proteínas do complexo A transferência de elétrons pelo complexo IV inicia com o citocromo c parte superior Duas moléculas de citocromo c reduzido doam cada uma um elétron para o centro binu clear CuA Deste os elétrons passam pelo heme a para o centro de FeCu citocromo a3 e CuB O oxigênio agora se liga ao heme a3 e é reduzido a seu derivado peróxido O2 22 não mostrado aqui por dois elétrons do centro de FeCu A chegada de mais dois elétrons a partir do citocromo c parte supe rior perfazendo quatro elétrons ao todo converte o O2 22 em duas moléculas de água com o consumo de quatro prótons substrato da matriz Ao mes mo tempo quatro prótons são bombeados da matriz por um mecanismo ainda indeterminado Nelson6edbookindb 742 Nelson6edbookindb 742 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 743 passa contribuindo para o potencial eletroquímico produ zido pelo transporte de prótons possibilitado pela energia dessas reações redox pelos complexos I e III A reação geral catalisada pelo complexo IV é 4 cit c red uzido 1 8H 1 N 1 O2 4 cit c oxidado 1 4H 1 P 1 2H2O 194 Esta redução do O2 por quatro elétrons envolve centros re dox que carregam apenas um elétron por vez e ela deve ocorrer sem a liberação de intermediários que não são completamente reduzidos como peróxido de hidrogênio ou radicais livres hidroxila espécies muito reativas que danificariam os componentes celulares Os intermediários permanecem fortemente ligados ao complexo até serem completamente convertidos em água Os complexos mitocondriais podem se associar em respirassomos Existe evidência experimental crescente de que nas mito côndrias intactas os complexos respiratórios se associam firmemente uns com os outros na membrana interna para formar respirassomos combinações funcionais de dois ou mais complexos de transferência de elétrons diferen tes Por exemplo quando o complexo III é gentilmente extraído das membranas mitocondriais verificase que ele está associado com o complexo I e permanece associado durante eletroforese leve Supercomplexos do complexo III e IV também podem ser isolados e quando vistos por mi croscopia eletrônica têm o tamanho e a forma certos para acomodar as estruturas cristalinas de ambos os complexos Figura 1915 Proteínas de uma família sintetizadas sob o controle do fator hipoxiainduzível FHI são encontradas associadas aos respirassomos e podem ser essenciais à sua formação e estabilidade O FHI media mudanças na compo sição do complexo IV sob condições hipóxicas Figura 19 34 A cinética do fluxo de elétrons pela série de complexos respiratórios seria muito diferente nos dois casos extremos de firme associação versus não associação 1 se os com plexos fossem firmemente associados as transferências de elétrons ocorreriam essencialmente através de um estado sólido e 2 se os complexos funcionassem separadamente os elétrons seriam carregados entre eles pela ubiquinona e o citocromo c A evidência cinética sustenta a transferência de elétrons através de um estado sólido e portanto o mo delo do respirassomo A cardiolipina o lipídeo especialmente abundante na membrana mitocondrial interna ver Figuras 109 e 112 pode ser essencial para a integridade dos respirassomos sua remoção com detergentes ou sua ausência em certos mutantes de leveduras resulta em transferência anormal de elétrons e em uma perda de afinidade entre os complexos respiratórios A energia da transferência de elétrons é eficazmente conservada em um gradiente de prótons A transferência de dois elétrons do NADH por meio da cadeia respiratória para o oxigênio molecular pode ser escrita como NADH 1 H 1 1 O2 NAD 1 1 H2O 195 Esta reação resultante é altamente exergônica Para o par redox NAD 1NADH E9 é 20320 V e para o par O2H2O E9 é 0816 V O DE9 para esta reação é portanto 114 V e a variação na energia livre padrão ver Equação 137 p 531 é DG9 5 2n DE9 5 22965 kJV mol114 V 5 2220 kJmol de NADH 196 Esta variação na energia livre padrão tem como base a pressuposição de concentrações iguais 1 M de NADH e de NAD 1 Em mitocôndrias que respiram ativamente as ações de muitas desidrogenases mantêm a razão NADHNAD 1 real bem acima da unidade e a variação real da energia li vre para a reação mostrada na Equação 195 é portanto substancialmente maior mais negativa do que 2220 kJ mol Um cálculo similar para a oxidação do succinato mos tra que a transferência de elétrons do succinato E9 para fumaratosuccinato 5 0031 V para o O2 tem uma variação na energia livre padrão menor mas ainda negativa de cerca de 2150 kJmol A maior parte dessa energia é usada para bombear pró tons para fora da matriz Para cada par de elétrons trans ferido para o O2 quatro prótons são bombeados para fora pelo complexo I quatro pelo complexo III e dois pelo com a b FIGURA 1915 Um suposto respirassomo composto por complexos III e IV a Supercomplexos purificados contendo complexos III e IV de levedura visualizados por microscopia eletrônica depois de corados com acetato de uranila As densidades eletrônicas de centenas de imagens fo ram utilizadas para compor esta visualização média b As estruturas por raios X de uma molécula do complexo III em vermelho de leveduras e de duas do complexo IV em verde de coração bovino puderam ser ajustadas ao mapa de densidade eletrônica para sugerir um possível modo de intera ção destes complexos em um respirassomo Esta visualização está no plano da bicamada em amarelo Nelson6edbookindb 743 Nelson6edbookindb 743 030414 0745 030414 0745 744 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Citc epee TTT ey a 2x IV 2Ht Espaco intermembrana bd 4Ht LT err lado P AHt i MW A cs it if I ees ak if Ao J Hi os Pe ce AN 7 y 8 TARTAN KA 7 a RS oo a Pa te hh fie MD ee ie a My ev fi Ne eae AIA 4 N H U ec bey MM wiv NA Nb AVN Mi Nea NN Aon ep Ms POULe ies hs Cy sessseeee LLY i Na we 2 ayy é es ng ey ea heed eek a r 4 es cy Ke 2H A By i a oh ro f Matriz lado N aS bs pope OS leet oS eZ i is Vs ln 3 pmb Vy L aN ar Vo Yee 2H FO 0 i 8 Ts coat Ws a Succinato Sn aE Fumarato 2H 2e7F NADHHt NAD FIGURA 1916 Resumo do fluxo de elétrons e protons pelos quatro membrana Lembrese de que os elétrons da Boxidacao de acidos graxos complexos da cadeia respiratoria Os elétrons chegam a Q por meio também podem entrar na cadeia respiratdria por meio de Q ver Figura 19 dos complexos e Il AQ reduzida QH serve como carregador movel de 8 As estruturas mostradas aqui sdo de varias fontes complexo Thermus elétrons e protons Ela passa elétrons ao complexo Ill que os passa a outro thermophilus PDB ID 3M95 complexo II coragdo porcino PDB ID 1ZOY elemento movel de ligagao o citocromo c O complexo IV entao transfere complexo Ill coragao bovino PDB ID 1BGY citocromo c coragao equino elétrons do citocromo c reduzido ao O O fluxo de elétrons pelos complexos PDB ID 1HRC complexo IV coragdo bovino PDB ID 10CC Ill e lV acompanhado pelo fluxo de prdétons da matriz ao espaco inter plexo IV Figura 1916 A equacao vetorial para o pro ea Equacaéo 198 se reduza cesso 6 portanto P AG 23RT ApH JA 199 NADH 11Hi 0 NAD 10H HO 197 570 kJmol ApH 965 kJV mol Ay A energia eletroquimica inerente a essa diferenca na con Em mitocondrias que respiram ativamente o Ay medido centracéo de protons e separacdo de cargas representa de 015 a 020 V e o pH da matriz 6 cerca de 075 unidade uma conservacao temporaria de grande parte da energia ais alcalino do que aquele do espago intermembrana da transferéncia de elétrons A energia estocada nesse gradiente chamada de fora proétonmotriz tem dois Lado P componentes 1 a energia potencial quimica devido H C H Ht Ht H H Ht Ht a diferenca de concentracio de uma espécie quimica H nas duas regides separadas pela membrana e 2 a ener Bomba gle gia potencial elétrica que resulta da separacao de cargas de protons quando um proton se move através da membrana sem um ar init contrafon Figura 1917 WW anv y pene el Conforme foi mostrado no Capitulo 11 a variagao de UP ew a energia livre para a criagao de um gradiente eletroquimico i por uma bomba de ions é a AG RT InCoC ZF Ab 198 Ladon Ht Hy C OH OH OH OH OH OH OH onde C e C sao as concentragdes de um fon em duas re gides e C C Z 0 valor absoluto de sua carga elétrica AG RT In CC Z FAY ad para um proton e Ays é a diferenca transmembrana no 23RT ApH FAV potencial elétrico medida em volts Para protons a 25C FIGURA 1917 Forga prétonmotriz A membrana mitocondrial interna separa dois compartimentos de diferentes H resultando em diferengas na In G2C 23log Hp log Hy concentraao quimica ApH e na distribuicdo de cargas Aw através da mem brana O efeito resultante é a forca prdtonmotriz AG que pode ser calculada 23pHy pHp 23 ApH como aqui apresentado Isto é explicado de forma mais completa no texto PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 745 PROBLEMA RESOLVIDO 191 Energética da transferência de elétrons Calcule a quantidade de energia conservada no gradiente de prótons através da membrana mitocondrial interna por par de elétrons transferido através da cadeia respiratória do NADH ao oxigênio Assuma que Dc é de 015 V e a diferen ça de pH é de 075 unidade Solução A Equação 199 fornece a mudança de energia li vre quando um mol de prótons se move através da mem brana interna Substituindo os valores medidos para DpH 075 unidades e Dc 015 V nesta equação encontrase um DG 5 19 kJmol de prótons Como a transferência de dois elétrons do NADH ao O2 é acompanhada pelo bombea mento para fora de 10 prótons Equação 197 aproxima damente 200 kJ dos 220 kJ liberados pela oxidação de 1 mol de NADH são conservados no gradiente de prótons Quando os prótons fluem espontaneamente a favor de seu gradiente eletroquímico energia se faz disponível para realizar trabalho Em mitocôndrias cloroplastos e bactérias aeróbias a energia eletroquímica do gradiente de prótons impulsiona a síntese de ATP a partir de ADP e Pi Mais de talhes sobre energética e estequiometria da síntese de ATP propiciada pelo potencial eletroquímico do gradiente de prótons podem ser encontrados na Seção 192 Espécies reativas de oxigênio são geradas durante a fosforilação oxidativa Diversas etapas na via de redução do oxigênio em mitocôn drias têm o potencial de produzir radicais livres altamente reativos que podem danificar as células A passagem de elétrons de QH2 ao complexo III e a passagem de elétrons dos complexos I e II ao QH2 envolvem o radical Q 2 como intermediário O Q 2 pode com baixa probabilidade passar um elétron ao O2 na reação O2 1 e 2 S O2 2 O radical livre superóxido assim gerado é altamente reativo sua formação também leva à produção do radical livre hi droxila OH ainda mais reativo Figura 1918 Espécies reativas de oxigênio podem provocar sérios danos reagindo com enzimas lipídeos de membranas e áci dos nucleicos e os danificando Em mitocôndrias que res piram ativamente de 01 até 4 do oxigênio utilizado na respiração formam O2 2 mais do que suficiente para ter efeitos letais a não ser que o radical livre seja rapidamente descartado Fatores que diminuem a velocidade de fluxo de elétrons pela cadeia respiratória aumentam a formação de superóxido talvez por prolongarem o tempo de vida do O2 2 gerado no ciclo Q A formação de ERO é favorecida quando duas condições são satisfeitas a as mitocôndrias não es tão produzindo ATP por falta de ADP ou de O2 e portan to têm grande força prótonmotriz e elevada razão QH2Q e b e há uma alta razão NADHNAD 1 na matriz Nessas situações a mitocôndria está sob estresse oxidativo há mais elétrons disponíveis para entrar na cadeia respiratória do que aquele número que pode imediatamente atraves sar até o oxigênio Quando o suprimento de doadores de elétrons NADH é equiparado àquele de aceptores de elé trons existe menos estresse oxidativo e a produção de ERO é muito reduzida Embora a superprodução de ERO seja obviamente prejudicial baixos níveis de ERO podem ser usados pela célula como um sinal que reflete o suprimento insuficiente de oxigênio hipoxia desencadeando ajustes metabólicos ver Figura 1934 Para impedir o dano oxidativo induzido pelo O2 2 as cé lulas têm diversas formas da enzima superóxidodismuta se que catalisa a reação 2 O2 2 1 2H 1 S H2O2 1 O2 O peróxido de hidrogênio H2O2 assim gerado tornase inofensivo pela ação da glutationaperoxidase Figura 1918 A glutationa redutase recicla a glutationa oxidada em sua forma reduzida usando elétrons do NADPH ge rado pela nicotinamidanucleotídeotransidrogenase na mitocôndria ou pela via das pentosesfosfato no citosol O2 O2 OH Cit c IV III Q Nicotinamida nucleotídeo transidrogenase Membrana mitocondrial interna NADPH GSSG H2O2 H2O 2 GSH S S 2 GSH Enz Inativa Ativa Estresse oxidativo Redução de Tiol proteico GSSG NADP Glutationa redutase Glutationa peroxidase Superóxido dismutase NAD SH SH I NADH NAD FIGURA 1918 Formação de ERO nas mitocôndrias e defesas mito condriais Quando a taxa de entrada de elétrons na cadeia respiratória e a taxa de transferência de elétrons ao longo da cadeia não são coorde nadas a produção do radical superóxido O2 2 aumenta nos complexos I e III à medida que o radical ubiquinona parcialmente reduzido Q 2 doa um elétron para o O2 O superóxido atua sobre a aconitase uma proteína 4Fe4S para liberar Fe 21 Na presença de Fe 21 a reação de Fenton leva à formação do radical livre hidroxila OH fortemente reativo As reações mostradas em azul defendem a célula contra os efeitos danosos do su peróxido A glutationa reduzida GSH ver Figura 2229 doa elétrons para a redução de H2O2 e dos resíduos oxidados de Cys SS de enzimas e outras proteínas e GSH é regenerada a partir da forma oxidada GSSG por redução utilizando NADPH Nelson6edbookindb 745 Nelson6edbookindb 745 030414 0745 030414 0745 746 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ver Figura 1421 A glutationa reduzida também serve para manter os grupos sulfidril das proteínas em seu es tado reduzido impedindo alguns dos efeitos deletérios do estresse oxidativo Figura 1918 A nicotinamidanucle otídeotransidrogenase é crucial nesse processo ela pro duz o NADPH essencial para a atividade da glutationa redutase As mitocôndrias vegetais têm mecanismos alternativos para oxidar NADH As mitocôndrias vegetais suprem a célula com ATP durante períodos de baixa iluminação ou escuridão por mecanismos completamente análogos àqueles usados por organismos não fotossintéticos Na luz a principal fonte de NADH mi tocondrial é uma reação em que glicina produzida por um processo conhecido como fotorrespiração é convertida em serina ver Figura 2021 2 Glicina 1 NAD 1 serina 1 CO2 1 NH3 1 NADH 1 H 1 Por razões discutidas no Capítulo 20 as plantas precisam realizar esta reação mesmo quando elas não precisam de NADH para a produção de ATP Para regenerar NAD 1 a par tir de NADH desnecessário as mitocôndrias das plantas e de alguns fungos e protistas transferem elétrons do NADH diretamente à ubiquinona e da ubiquinona diretamente para o O2 desviando dos complexos III e IV e suas bombas de prótons Nesse processo a energia do NADH é dissipa da como calor que algumas vezes pode ser de valor para a planta Quadro 191 Ao contrário da citocromooxidase complexo IV a QH2oxidase alternativa não é inibida por cianeto A oxidação de NADH resistente a cianeto é por tanto o aspecto marcante dessa via singular de transferên cia de elétrons das plantas RESUMO 191 Reações de transferência de elétrons em mitocôndrias c A teoria quimiosmótica fornece o arcabouço intelectual para o entendimento de muitas transduções biológicas de energia incluindo a fosforilação oxidativa e a foto fosforilação O mecanismo de acoplamento energético é similar em ambos os casos a energia do fluxo de elé trons é conservada pelo bombeamento concomitante de prótons através da membrana produzindo um gradiente eletroquímico a força prótonmotriz c Em mitocôndrias íons hidreto removidos de substratos como acetoglutarato e malato por desidrogenases li gadas ao NAD doam elétrons para a cadeia respiratória transportadora de elétrons que transfere os elétrons para o O2 molecular reduzindoo a H2O c Equivalentes redutores do NADH são passados por uma série de centros de FeS até a ubiquinona que transfe Muitas plantas com flor atraem insetos polinizadores li berando moléculas odoríferas que imitam as fontes na turais de alimento dos insetos ou os locais potenciais de oviposição Plantas polinizadas por moscas ou besouros que normalmente se alimentam ou depositam seus ovos em esterco ou carniça algumas vezes usam compostos de odor desagradável para atrair esses insetos Uma família de plantas com odor desagradável é a Araceae que inclui filodendros antúrios e Symplocar pus Essas plantas têm flores muito pequenas densa mente arranjadas em uma estrutura ereta o espádice circundado por uma folha modificada a espata O espá dice libera odores de carne podre ou de esterco Antes da polinização o espádice também aquece em algumas espécies chegando até 20 a 40C acima da temperatura ambiente A produção de calor termogênese ajuda a evaporar moléculas odoríferas para melhor dispersão e como carne apodrecida e esterco normalmente são mor nos devido ao mecanismo hiperativo de microrganismos saprofíticos o calor por si só também pode atrair os in setos No caso do Symplocarpus do leste Figura Q1 que floresce no fim do inverno ou no início da primavera quando a neve ainda cobre o chão a termogênese permi te ao espádice crescer em meio à neve Como é que o Symplocarpus aquece o espádice As mitocôndrias das plantas dos fungos e dos eucariotos unicelulares têm sistemas de transferência de elétrons essencialmente iguais aos dos animais mas também têm uma via respiratória alternativa Uma QH2oxidase resis tente ao cianeto transfere elétrons do pool de ubiquino na diretamente ao oxigênio contornando as duas etapas translocadoras de prótons dos complexos III e IV Figura Q2 A energia que poderia ser conservada como ATP é em vez disso liberada como calor As mitocôndrias vege tais também têm uma NADHdesidrogenase alternativa insensível à rotenona que inibe o complexo I ver Tabela QUADRO 191 MEDICINA Plantas quentes e malcheirosas e vias respiratórias alternativas FIGURA Q1 Symplocarpus foetidus do leste Nelson6edbookindb 746 Nelson6edbookindb 746 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 747 194 Essa desidrogenase transfere elétrons do NADH na matriz diretamente à ubiquinona contornando o com plexo I e o bombeamento de prótons a ele associado As mitocôndrias vegetais têm ainda outra NADHdesidroge nase na face externa da membrana interna que trans fere elétrons do NADPH ou do NADH no espaço inter membrana para a ubiquinona novamente contornando o complexo I Assim quando os elétrons entram na via res piratória alternativa por meio da NADHdesidrogenase insensível à rotenona da NADHdesidrogenase externa ou da succinatodesidrogenase complexo II e passam para o O2 pela oxidase alternativa resistente ao cianeto a energia não é conservada como ATP mas é liberada como calor Um Symplocarpus pode usar o calor para derreter a neve produzir um cheiro fétido ou atrair besouros ou moscas Calor Cit c NAD NADP NADPH desidrogenase externa Oxidase alternativa NADH desidrogenase alternativa H2O NADH NADPH 12 O2 Matriz lado N Espaço intermembrana lado P IV III I Q FIGURA Q2 Carregadores de elétrons da membrana interna de mito côndrias vegetais Os elétrons podem fluir pelos complexos I III e IV como nas mitocôndrias animais ou por carregadores alternativos específicos das plantas pelas vias mostradas pelas setas azuis re os elétrons ao citocromo b o primeiro carregador do complexo III Nesse complexo os elétrons seguem duas vias separadas por meio de dois citocromos do tipo b e do citocromo c1 para um centro de FeS O centro de FeS passa elétrons um de cada vez pelo citocromo c para o complexo IV a citocromooxidase Essa enzima que além de conter cobre também contém citocromos a e a3 acumula elétrons e então os passa ao O2 reduzin doo a H2O c Alguns elétrons entram nesta cadeia de carregadores por vias alternativas O succinato é oxidado pela suc cinatodesidrogenase complexo II que contém uma flavoproteína que passa elétrons por vários centros de FeS até a ubiquinona Elétrons derivados da oxidação de ácidos graxos passam para a ubiquinona por meio da flavoproteína transferidora de elétrons c Espécies reativas de oxigênio potencialmente danosas produzidas nas mitocôndrias são inativadas por um con junto de enzimas protetoras incluindo a superóxido dismutase e a glutationaperoxidase c Plantas fungos e eucariotos unicelulares têm além da via típica para a transferência de elétrons sensível ao cianeto uma via de oxidação de NADH alternativa re sistente ao cianeto 192 Síntese de ATP De que forma um gradiente de concentração de prótons se transforma em ATP Foi visto que a transferência de elé trons libera e a força prótonmotriz conserva energia livre mais do que suficiente cerca de 200 kJ por mol de par de elétrons para impulsionar a formação de um mol de ATP que requer cerca de 50 kJ p 519 Portanto a fosforilação oxidativa mitocondrial não impõe nenhum problema termo dinâmico Mas qual é o mecanismo químico que acopla o fluxo de prótons com a fosforilação O modelo quimiosmótico proposto por Peter Mi tchell é o paradigma para esse mecanismo De acordo com o modelo Figura 1919 a energia eletroquímica inerente à diferença de concentração de prótons e à separação de cargas através da membrana mitocondrial interna a força prótonmotriz impulsiona a síntese de ATP à medida que os prótons fluem passivamente de volta à matriz por meio de um poro para prótons na ATPsintase Para enfatizar esse papel crucial da força prótonmotriz a equação para síntese de ATP é às vezes escrita ADP 1 Pi 1nH 1 P ATP 1 H2O 1 nH 1 N 1910 Mitchell usou o termo quimiosmótico para descrever rea ções enzimáticas que envolvem simultaneamente uma Nelson6edbookindb 747 Nelson6edbookindb 747 030414 0745 030414 0745 748 DAVID L NELSON MICHAEL M COX reação química e um processo de transporte e o processo global é muitas vezes denominado de acoplamento químiosmótico O acoplamento referese à cone xão obrigatória entre a síntese mitocondrial de ATP e o fluxo de elétrons pela cadeia respiratória nenhum dos dois processos pode prosseguir sem o outro A defini ção operacional de acoplamento é mostrada na Figura 1920 Quando mitocôndrias isoladas são suspensas em um tampão contendo ADP Pi e um substrato oxidável como succina to três processos facilmente mensuráveis ocorrem 1 o substrato é oxidado succinato produz fumarato 2 O2 é consumido e 3 ATP é sintetizado O consumo de oxigênio e a síntese de ATP dependem da presença de um substrato oxidável nesse caso o succinato assim como de ADP e Pi Uma vez que a energia da oxidação de substratos per mite a síntese de ATP nas mitocôndrias seria esperado que os inibidores da passagem de elétrons para o O2 como cia neto monóxido de carbono e antimicina A bloqueassem a síntese de ATP Figura 1920a Mais surpreendente é o fato de que o contrário também é verdadeiro a inibição da síntese de ATP bloqueia a transferência de elétrons em mi tocôndrias intactas Esse acoplamento obrigatório pode ser demonstrado em mitocôndrias isoladas fornecendose O2 e substratos oxidáveis mas não ADP Figura 1920b Nessas condições nenhuma síntese de ATP pode ocorrer e a transfe rência de elétrons para o O2 não prossegue Henry Lardy pionei ro no uso de antibióticos para explorar a função mitocondrial demonstrou o acoplamento en tre a oxidação e a fosforilação usando oligomicina e venturi cidina antibióticos tóxicos que se ligam à ATPsintase nas mito côndrias Esses compostos são inibidores potentes da síntese de ATP e da transferência de elétrons pela cadeia de trans portadores até o O2 Figura 1920b Como se sabe que a oligomicina não interage diretamente com os carregadores de elétrons mas com a ATPsintase a transferência de elé trons e a síntese de ATP são obrigatoriamente acopladas nenhuma reação ocorre sem a outra A teoria quimiosmótica explica prontamente a depen dência da transferência de elétrons em relação à síntese de ATP nas mitocôndrias Quando o fluxo de prótons para dentro da matriz através do canal proteico da ATPsintase é bloqueado p ex com oligomicina não existe nenhum caminho para o retorno dos prótons para a matriz e a ex trusão continuada de prótons da matriz governada pela ati vidade da cadeia respiratória gera um grande gradiente de prótons A força prótonmotriz se acumula até que o custo energia livre de bombear prótons para fora da matriz con tra esse gradiente se iguale ou exceda a energia liberada Fumarate NADH H NAD O2 H2 2H O 2 1 Potencial químico DpH alcalino no lado interno Síntese de ATP impulsionada pela força prótonmotriz Potencial elétrico Dc negativo no lado interno Espaço intermembrana lado P Matriz lado N Succinato Força prótonmotriz Fumarato Cit c 2H 2H nH 4H II III IV I 4H I Q QH2 QH2 ADP Pi ATP Fo F1 2H FIGURA 1919 Modelo quimiosmótico Nesta simples representação da teoria quimiosmótica aplicada às mitocôndrias os elétrons do NADH e de outros substratos oxidáveis passam por meio de uma cadeia de carregado res assimetricamente arranjados na membrana interna O fluxo de elétrons é acompanhado pela transferência de prótons através da membrana pro duzindo tanto um gradiente químico DpH quanto um gradiente elétrico Dc combinados a força prótonmotriz A membrana mitocondrial interna é impermeável a prótons os prótons só podem retornar à matriz através de canais específicos de prótons Fo A força prótonmotriz que direciona os prótons de volta para a matriz proporciona a energia para a síntese de ATP catalisada pelo complexo F1 associado ao Fo Peter Mitchell 19201992 Henry Lardy 19172010 Nelson6edbookindb 748 Nelson6edbookindb 748 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 749 pela transferência de elétrons do NADH ao O2 Nesse ponto o fluxo de elétrons deve parar a energia livre para o proces so global de fluxo de elétrons acoplado ao bombeamento de prótons tornase zero e o sistema está em equilíbrio Certas condições e reagentes podem no entanto de sacoplar a oxidação da fosforilação Quando mitocôndrias intactas são rompidas por tratamento com detergentes ou por ação física os fragmentos de membrana resultan tes ainda podem catalisar a transferência de elétrons do succinato ou do NADH para o O2 mas nenhuma síntese de ATP está acoplada a essa respiração Alguns compos tos químicos causam o desacoplamento sem romper a es trutura mitocondrial Desacopladores químicos incluem 24dinitrofenol DNP e carbonilcianetoptrifluormetoxi fenilidrazona FCCP Tabela 194 Figura 1921 ácidos fracos com propriedades hidrofóbicas que lhes permitem difundir prontamente através das membranas mitocon driais Depois de entrarem na matriz na forma protonada eles podem liberar um próton assim dissipando o gra diente de prótons Estabilização por ressonância desloca a carga nas formas aniônicas tornandoas suficientemente permeantes para se difundirem de volta através da mem brana onde elas podem captar um próton e repetir o pro cesso Ionóforos como a valinomicina ver Figura 1144 permitem que íons inorgânicos passem facilmente através das membranas Ionóforos desacoplam a transferência de elétrons da fosforilação oxidativa dissipando a contribui ção elétrica ao gradiente eletroquímico através da mem brana mitocondrial Uma previsão da teoria quimiosmótica é que devido ao papel da transferência de elétrons na síntese de ATP mi tocondrial ser simplesmente bombear prótons para criar o gradiente eletroquímico da força prótonmotriz um gra diente de prótons artificialmente criado deveria ser capaz de substituir a transferência de elétrons no desencadea mento da síntese de ATP Isso foi confirmado experimental mente Figura 1922 Mitocôndrias manipuladas de for ma a se impor uma diferença de concentração de prótons e uma separação de cargas através da membrana interna sintetizam ATP na ausência de um substrato oxidável a força prótonmotriz sozinha é suficiente para gerar a sín tese de ATP O2 consumido Adição de ADP Pi Adição de succinato Tempo a ATP sintetizado Adição de CN O2 consumido Adição de ADP Pi Tempo b ATP sintetizado Adição de venturicidina ou oligomicina Adição de DNP Desacoplado Adição de succinato FIGURA 1920 Acoplamento da transferência de elétrons e da sínte se de ATP em mitocôndrias Em experimentos para a demonstração do acoplamento as mitocôndrias são suspensas em um meio tamponado e um eletrodo de O2 monitora o consumo de O2 Em intervalos amostras são removidas e analisadas para a presença de ATP a A adição isolada de ADP e Pi resulta em pequeno ou nenhum aumento da respiração consumo de O2 em preto ou da síntese de ATP em corderosa Quando succinato é adi cionado a respiração inicia imediatamente e ATP é sintetizado A adição de cianeto CN 2 que bloqueia a transferência de elétrons entre a citocromo oxidase complexo IV e o O2 inibe tanto a respiração quanto a síntese de ATP b Mitocôndrias providas de succinato respiram e sintetizam ATP so mente quando ADP e Pi são adicionados A adição posterior de venturicidina ou oligomicina inibidores da ATPsintase bloqueia a síntese de ATP e a res piração Dinitrofenol DNP é um desacoplador permitindo que a respiração continue sem a síntese de ATP N NH 1 H1 N2 24Dinitrofenol DNP Carbonilcianetop trifluormetoxifenilidrazona FCCP OH NO2 O2 1 H1 NO2 NO2 NO2 N C C C N N C C C N N O C F F F O C F F F FIGURA 1921 Dois desacopladores químicos da fosforilação oxidati va Tanto DNP quanto FCCP têm um próton dissociável e são muito hidro fóbicos Eles carregam prótons através da membrana mitocondrial interna dissipando o gradiente de prótons Os dois também desacoplam a fotofos forilação ver Figura 1965 Nelson6edbookindb 749 Nelson6edbookindb 749 030414 0745 030414 0745 750 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A ATPsintase tem dois domínios funcionais Fo e F1 A ATPsintase mitocondrial é uma ATPase do tipo F ver Figura 1139 similar em estrutura e mecanismo às ATP sintases de cloroplastos e bac térias Esse grande complexo enzimático da membrana mito condrial interna catalisa a for mação de ATP a partir de ADP e Pi impulsionada pelo fluxo de prótons do lado P para o lado N da membrana Equação 1910 A ATPsintase também chamada de complexo V tem dois componentes distintos F1 proteína periférica de membra na e Fo o indicando sensível à oligomicina integral à membrana F1 o primeiro fator reconhecido como essencial para a fosforilação oxidativa foi identificado e purificado por Efraim Racker e colabo radores no começo da década de 1960 No laboratório pequenas vesículas de membrana for madas a partir das membranas mitocondriais internas reali zam a síntese de ATP acoplada à transferência de elétrons Quando F1 é gentilmente extraído as vesículas desnudas ainda contêm cadeias respiratórias intactas e a porção Fo da ATPsintase As vesículas podem catalisar a transferên cia de elétrons do NADH ao O2 mas não podem produzir um gradiente de prótons Fo tem um poro para prótons por meio do qual os prótons vazam tão rapidamente quanto são bombeados pela transferência de elétrons e sem um gradiente de prótons as vesículas desprovidas de F1 não podem produzir ATP O F1 isolado catalisa a hidrólise de ATP o reverso da síntese sendo portanto originalmente chamado de F1ATPase Quando F1 purificado é adiciona do de volta às vesículas ele se associa novamente com Fo fechando seu poro de prótons e restaurando a capacidade da membrana de acoplar a transferência de elétrons à sín tese de ATP O ATP é estabilizado em relação ao ADP na superfície de F1 Experimentos de troca de isótopos com F1 purificado reve lam um fato notável sobre o mecanismo catalítico da enzi ma na superfície da enzima a reação ADP 1 Pi ATP 1 H2O é prontamente reversível a variação de energia livre para a síntese de ATP é próxima de zero Quando o ATP é hidrolisado por F1 na presença de água marcada com 18O o Pi liberado contém um átomo de 18O Uma medida cuidadosa do conteúdo de 18O do Pi formado in vitro pela hidrólise de ATP catalisada por F1 revela que o Pi tem não um mas três ou quatro átomos de 18O Figura 1923 Isso indica que a ligação pirofosfato na extremidade do ATP é quebrada e refeita repetidamente antes que o Pi deixe a su perfície da enzima Com o Pi livre para se deparar com seu sítio de ligação cada hidrólise insere 18O aleatoriamente em uma de quatro posições na molécula Essa reação de troca ocorre em complexos Fo F1 não energizados sem gradiente de prótons e com F1 isolado a troca não requer acréscimo de energia Estudos cinéticos das taxas iniciais de síntese e hidróli se de ATP confirmam a conclusão de que DG9 para a sínte se de ATP na enzima é próximo de zero A partir das taxas medidas de hidrólise k1 5 10 s 21 e síntese k21 5 24 s 21 a constante de equilíbrio calculada para a reação EnzATP EnzADP1Pi é A partir deste K9eq o DG9 aparente calculado é próximo de zero Isto é muito diferente do K9eq de cerca de 10 5 DG9 5 2305 kJmol para a hidrólise de ATP livre em solução não na superfície da enzima O que explica essa enorme diferença A ATPsintase es tabiliza o ATP em relação a ADP 1 Pi ligando o ATP mais K1 5 Cl2 5 01 M H1 5 1029 M H1 5 1029 M FoF1 pH reduzido de 9 para 7 valinomicina presente ausência de K1 a b K1 Cl2 H1 5 1029 M b H1 5 1027 M ADP1 Pi K1 K1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 2 2 2 2 ATP Matriz Espaço intermembrana FIGURA 1922 Evidência para o papel de um gradiente de prótons na síntese de ATP Um gradiente eletroquímico imposto artificialmente pode gerar a síntese de ATP na ausência de um substrato oxidável como doador de elétrons Neste experimento de duas etapas a mitocôndrias iso ladas são primeiramente incubadas em um tampão de pH 9 contendo KCl 01 M Um lento vazamento de tampão e KCl para dentro das mitocôndrias após um certo tempo deixa a matriz em equilíbrio com o meio circundan te Nenhum substrato oxidável está presente b As mitocôndrias são agora retiradas do tampão de pH 9 e ressuspensas em tampão de pH 7 contendo valinomicina na ausência de KCl A mudança de tampão cria uma diferença de duas unidades de pH através da membrana mitocondrial interna O eflu xo de K 1 carregado por valinomicina a favor de seu gradiente de concen tração sem um contraíon cria um equilíbrio de carga através da membrana matriz negativa A soma do potencial químico proporcionado pela diferen ça de pH e do potencial elétrico proporcionado pela separação de cargas é uma força prótonmotriz grande o suficiente para sustentar a síntese de ATP na ausência de um substrato oxidável Efraim Racker 19131991 Nelson6edbookindb 750 Nelson6edbookindb 750 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 751 fortemente liberando energia suficiente para contrabalan çar o custo da produção de ATP Medidas cuidadosas das constantes de ligação mostram que FoF1 liga ATP com afini dade muito alta Kd 10 212 M e ADP com afinidade muito mais baixa Kd 10 25 M A diferença em Kd corresponde a uma diferença de cerca de 40 kJmol em energia de ligação e essa energia de ligação direciona o equilíbrio em direção à formação do produto ATP O gradiente de prótons impulsiona a liberação de ATP a partir da superfície da enzima Embora a ATPsintase equilibre o ATP com ADP 1 Pi na au sência de um gradiente de prótons o ATP recémsintetiza do não sai da superfície da enzima É o gradiente de prótons que faz a enzima liberar o ATP formado em sua superfície O diagrama de coordenadas de reação do processo Figu ra 1924 ilustra a diferença entre o mecanismo da ATP sintase e aquele de muitas outras enzimas que catalisam reações endergônicas Para a síntese continuada de ATP a enzima precisa os cilar entre uma forma que liga ATP muito fortemente e uma forma que libera ATP Estudos químicos e cristalográficos 18O 18O ADP ATP 1 H2 18O 1 18O P 18O Enzima F1 FO F1 a b ADP aArg376 bArg182 bGlu181 bLys155 Mg2 H2O a b b FIGURA 1923 Mecanismo catalítico de F1 a Experimento de troca de 18O F1 solubilizado de membranas mitocondriais é incubado com ATP na presença de água marcada com 18O Em intervalos uma amostra da solução é retirada e analisada para detectar a incorporação de 18O no Pi produzido a partir da hidrólise de ATP Em minu tos o Pi contém três ou quatro átomos de 18O indicando que tanto a hidrólise de ATP quanto a síntese de ATP ocorreram diversas vezes durante a incubação b Provável complexo do estado de transição para a hidrólise e a síntese de ATP pela ATPsintase derivada de PDB ID 1BMF A subunidade a é mostrada em cinza a b em roxo Os resíduos positivamente carregados bArg 182 e aArg 376 coordenamse com dois oxi gênios do intermediário fosfato pentavalente bLys 155 interage com um terceiro oxi gênio e o íon Mg 21 estabiliza ainda mais o intermediário A esfera azul representa o grupo que sai H2O Estas interações resultam no pronto equilíbrio de ATP e ADP 1 Pi no sítio ativo G kJmol Coordenada de reação 80 60 40 20 0 P ADP1Pi ES E 1 S E ADP1Pi E ATP Enzima típica ATPsintase ATP em solução FIGURA 1924 Diagramas de coordenadas de reação para a ATP sintase e para uma enzima mais típica Em uma reação típica catalisada por enzima à esquerda alcançar o estado de transição entre substrato e produtos é a principal barreira energética a ser superada Na reação ca talisada pela ATPsintase à direita a liberação de ATP a partir da enzima e não a formação de ATP é a principal barreira energética A variação de ener gia livre para a formação de ATP a partir de ADP e Pi em solução aquosa é grande e positiva mas na superfície da enzima a ligação muito firme do ATP proporciona energia de ligação suficiente para trazer a energia livre do ATP ligado à enzima para perto daquela de ADP 1 Pi de forma que a reação é prontamente reversível A constante de equilíbrio é próxima de 1 A energia livre necessária para a liberação do ATP é fornecida pela força prótonmotriz Nelson6edbookindb 751 Nelson6edbookindb 751 030414 0745 030414 0745 752 DAVID L NELSON MICHAEL M COX da ATPsintase revelaram a base estrutural para essa alter O complexo F com seu poro de protons 6 composto nancia de fungcao por trés subunidades a b e c na proporgao abc onde 2 varia de 8 a 15 em varios organismos em leveduras é 10 Cada subunidade 6 da ATPsintase pode assumir trés A subunidade c é um polipeptideo pequeno M 8000 muito hidrofé6bico consistindo quase que inteiramente diferentes conformagées em duas hélices transmembrana com uma pequena alca O F mitocondrial tem nove subunidades de cinco diferen se estendendo do lado da matriz da membrana A estru tes tipos com a composicao aB8yde Cada uma das trés tura cristalina de FF de leveduras elucidada em 1999 subunidades 8 tem um sitio catalitico para a sintese de mostra 10 subunidades c cada uma com duas hélices ATP A determinacao cristalografica da estrutura de F por transmembrana grosseiramente perpendiculares ao plano John E Walker e colaborado damembrana e arranjadas em dois circulos concéntricos res revelou detalhes estrutu O circulo mais interno é composto por hélices com os ter 4 rais muito uteis em explicar 0 minais amino de cada subunidade c 0 circulo mais ex mecanismo catalftico da enzi terno com cerca de 55 A de diametro 6 composto pelas ma A porcaéo de F em forma hélices com terminais carboxil As subunidades c neste de macaneta é uma esfera anelc giram juntas como uma unidade ao redor de achatada coom8nmdealturae wm etxo perpendicular a membrana As subunidades 10 nm de largura consistindo e y de F formam uma perna com pé que se projeta em subunidades a e B alterna do lado de baixo do lado da membrana de F e que se das arranjadas como os gomos Sustenta firmemente sobre o anel das subunidades c A John E Walker de uma laranja Figura 19 subunidade a consiste em varias hélices hidrofébicas que 25a b c Os polipeptideos atravessam a membrana em intima associagao com uma que formama haste naestrutu das subunidades c no anel c O desenho esquematico na ra cristalina de F estado assimetricamente arranjados com Figura 1925a combina a informacao estrutural dos estu um dominio da tnica subunidade y constituindo 0 eixo dos de F bovino de FF de leveduras e do anel c de central que passa através de F e um outro dominio de yyobacter tartaricus associado principalmente com uma das trés subunidades B clenomninade Bvazio Figura 1920 ae as se A catalise rotacional é a chave para 0 mecanismo de quéncias de aminoacidos das trés subunidades B sejam idénticas swas conformacées diferem em parte devido a alteracao na ligacao durante a sintese de ATP associacaio da subunidade y com apenas uma das trés As Com base na cinética detalhada e em estudos de ligagao das estruturas das subunidades 6 e nao foram reveladas nes Teagoes catalisadas por FF Paul Boyer propos um meca tes estudos cristalograficos nismo de catalise rotacional no qual os trés sitios ativos As diferencas conformacionais entre as subunidades de F se revezam catalisando a sintese de ATP Figura 19 B se estendem a diferencas em seus sitios de ligacdo de 26 Uma dada subunidade B comega na conformagao B ATPADP Quando os pesquisadores cristalizaram a pro ADP que liga ADP e P do meio circundante A subunidade teina na presenca de ADP e AppNHp um andlogo es 280ra muda de conformagao assumindo a forma BATP trutural bastante semelhante ao ATP que nao pode ser que Se liga firmemente e estabiliza o ATP gerando 0 pronto hidrolisado pela atividade ATPasica de F 0 sitio de liga quilibrio de ADP P com ATP na superficie da enzima co de uma das trés subunidades f foi preenchido com Finalmente a subunidade muda para a conformacao B AppNHp 0 segundo foi preenchido com ADP eo ter V2i0 que tem baixa afinidade por ATP e o ATP recém ceiro estava vazio As conformacées das subunidades B SiNtetizado deixa a superficie da enzima Outra rodada de correspondentes sao designadas BATP BADP e Bvazio Catalise comega quando essa subunidade novamente assu Figura 1925b Essa diferenga na ligagao de nucleoti e a forma BADP e liga ADP e P deos entre as trés subunidades é critica para 0 mecanis As mudangas conformacionais importantes nesse meca mo do complexo nismo sao desencadeadas pela passagem de protons pela porgao F da ATPsintase A NH corrente de protons através do y B a N S P poro F faz o cilindro de subu O O O N nidades c e a subunidade y a Al 2 ae ele encaixada rodar ao longo do OPNPOPO CHa N N eixo longo de y que é perpen O O O O t dicular ao plano da membrana H oH 4 n A subunidade y passa pelo cen Ligacdo NX Vi tro do esferoide a8 mantido By nao hidrolisavel Es estacionario em relacao a su OH OH perficie da membrana pelas su AppNhp yimidoadenosina 5trifosfato Paul Boyer bunidades b e 6 Figura 19 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 753 c Visão lateral de FoF1 d Visão de baixo de Fo b Visão de cima de F1 bATP bADP bvazio F1 Fo ATP ADP ATP ADP Sítios de ligação de prótons nos resíduos de Asp Sítios de ligação de Na ou de prótons nos resíduos de Asp a a a a e a a b b b g d d b2 b2 e g c8 a c15 c10 em mitocôndrias de leveduras c11 H a a Lado N Lado P ADP Pi ATP a b2 a FIGURA 1925 Complexo de ATPsintase mitocondrial a Uma visão em desenho do complexo FoF1 b PDB ID 1BMF and PDB ID 1JNV F1 visto de cima ou seja do lado N da membrana mostrando os três subunidades b tons de roxo e a tons de cinza e o eixo central subunidade g verde Cada subunidade b perto de sua interface com a subunidade a vizinha tem um sítio de ligação de nucleotídeo crucial para a atividade catalítica A subuni dade g isolada associase primariamente com um dos três pares ab forçan do cada uma das subunidades b para conformações levemente diferentes com diferentes sítios de ligação de nucleotídeos Na enzima cristalina uma subunidade b ADP tem ADP em amarelo em seu sítio de ligação a próxi ma bATP tem ATP em vermelho e a terceira bvazio não tem qualquer nucleotídeo ligado c A enzima inteira vista de lado no plano da membrana A porção F1 PDB IDs 1BMF 1JNV e 2A7U tem três subunidades a e três subunidades b arranjadas como os gomos de uma laranja ao redor de um eixo central a subunidade g verde Duas subunidades a e uma subunidade b foram omitidas para expor a subunidade g e os sítios de ligação para ATP e ADP nas subunidades b A subunidade d confere sensibilidade à oligomicina na ATPsintase e a subunidade pode servir para inibir sua atividade ATPase sob algumas circunstâncias A subunidade Fo consiste em uma subunidade a e duas subunidades b PDB ID 2CLY e PDB ID 1B9U que ancoram o com plexo FoF1 na membrana e atuam como estator segurando as subunidades a e b no lugar O Fo também inclui o anel c composto por um número 8 a 15 dependendo da espécie de subunidades c idênticas proteínas hidrofó bicas pequenas O anel c e a subunidade a interagem para prover uma rota transmembrana para prótons Cada subunidade c tem um resíduo de Asp perto do meio da membrana o qual pode ligar ou liberar um próton Nesta estrutura PDB ID 1YCE foi mostrado o anel homólogo c11 da Na 1ATPase de Ilyobacter tartaricus para a qual a estrutura está bem estabelecida Os seus sítios de ligação de Na 1 que correspondem aos sítios de ligação de pró tons no complexo FoF1 são mostrados com seus íons Na 1 ligados esferas vermelhas d Uma vista de Fo perpendicular à membrana Cada uma das subumidades c em Fo tem um resíduo de Asp crítico perto do meio da mem brana que sofre protonaçãodesprotonação durante o ciclo catalítico da ATPsintase Da mesma forma que em c as esferas vermelhas representam os sítios de ligação de Na 1 ou de prótons nos resíduos de Asp Nelson6edbookindb 753 Nelson6edbookindb 753 030414 0745 030414 0745 754 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 25a A cada rotação de 120 g entra em contato com uma diferente subunidade b e o contato força a subunidade b a tomar a conformação bvazio As três subunidades b interagem de modo que quando uma assume a conformação bvazio sua vizinha em um dos lados precisa assumir a forma bADP e a outra vizinha a forma bATP Assim uma rotação completa da subunidade g faz cada subunidade b passar por suas três conformações possíveis e para cada rotação três ATP são sintetizados e liberados da superfície da enzima Uma forte previsão desse modelo de troca de ligação é que a subunidade g deveria rotar em uma direção quando FoF1 está sintetizando ATP e na direção oposta quando a en zima está hidrolisando ATP Essa previsão de rotação com hidrólise de ATP foi confirmada em experimentos elegantes nos laboratórios de Masasuke Yoshida e Kazuhiko Kinosita Jr A rotação de g em uma única molécula de F1 foi obser vada microscopicamente prendendose um polímero de ac tina fluorescente longo e fino a uma subunidade g e obser vando seu movimento em relação a a3b3 imobilizado em uma lâmina de microscópio à medida que o ATP era hidrolisado A reversão esperada da rotação quando ATP está sendo sintetizado não pôde ser testada neste experimento não há gradiente de prótons para impulsionar a síntese de ATP Quando todo o complexo FoF1 não apenas F1 era utilizado em experimento similar todo o anel de subunidades c rota va com g Figura 1927 O eixo rotava na direção previs ta ao longo de 360 A rotação não era contínua mas ocorria em três etapas distintas de 120 Conforme calculado a par tir da taxa conhecida de hidrólise de ATP por uma molécu la de F1 e do arraste por fricção sobre o longo polímero de FIGURA 1926 Modelo de troca de ligação para a ATPsintase O complexo F1 tem três sítios não equivalentes para ligação de nucleotídeos de adenina um para cada par de subunidades a e b A cada momento um destes sítios está na confor mação bATP que liga firmemente ATP um segundo está na conformação bADP ligação frouxa e um terceiro está na conformação bvazio ligação muito frouxa A força prótonmotriz causa a rotação do eixo central a subunidade g mostrada com seta verde que entra em contato com cada par de subunidades ab em sucessão Isto produz uma mudança conformacional cooperativa na qual o sítio bATP é convertido para a conformação bvazio e o ATP se dissocia o sítio bADP é convertido para a con formação bATP que promove a condensação de ADP 1 Pi ligados para formar ATP e o sítio bvazio se torna um sítio bADP que liga frouxamente ADP 1 Pi vindos do solvente Este modelo com base em achados experimentais requer que pelo menos dois destes três sítios catalíticos alternem em atividade o ATP não pode ser liberado de um sítio a não ser que e até que ADP e Pi se liguem ao outro sítio ATP ATP ATP ATP ATP ATP ADP b Pi a b a b a ADP Pi b a b a b a ADP Pi b a b a b a 3 HP 3 HP 3 HN 3 HN 3 HN 3 HP FIGURA 1927 Demonstração experimental da rotação de Fo e g F1 geneticamente modificado para conter uma sequência de resíduos de His aderese firmemente a uma lâmina de microscópio coberta com um com plexo de Ni a biotina é covalentemente ligada a uma subunidade c de Fo A proteína avidina que liga firmemente a biotina está covalentemente ligada a longos filamentos de actina marcada com uma sonda fluorescente A liga ção biotinaavidina agora liga filamentos de actina à subunidade c Quando o ATP é fornecido como substrato para a atividade ATPásica de F1 observase o filamento marcado rodar continuamente em uma direção provando que o cilindro Fo de subunidades c gira Em outro experimento um filamento de actina fluorescente foi ligado diretamente à subunidade g A série de mi crografias fluorescentes ler da esquerda para a direita mostra a posição do filamento de actina em intervalos de 133 ms Observe que à medida que o filamento gira ele faz um salto discreto a cada cerca de 11 quadros de ima gens Presumivelmente o cilindro e o eixo se movem como uma unidade Complexo de Ni His His His a e b b g Fo F1 Avidina Biotina Filamento de actina b2 c10 a ADP Pi ATP Nelson6edbookindb 754 Nelson6edbookindb 754 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 755 actina a eficiência desse mecanismo em converter energia química em movimento é próxima de 100 Nas palavras de Boyer uma esplêndida máquina molecular De que forma o fluxo de prótons pelo complexo Fo produz movimento rotacional Um modelo plausível para explicar como fluxo de prótons e o movimento rotacional estão acoplados no complexo Fo é mostrado na Figura 1928 As subunidades individuais em Fo estão préarranjadas em um círculo ao redor de um miolo central que está provavelmente preenchido com li pídeos de membrana Em cada subunidade c existe um importante resíduo de Asp ou Glu localizado perto do meio da membrana Os prótons cruzam a membrana por uma rota feita de subunidades a e c A subunidade a tem um meio canal de prótons conduzindo do citosol lado P para o meio da membrana onde ele termina perto de um resíduo de Asp da subunidade c adjacente Um próton di fundese do lado citosólico onde a concentração de pró tons é relativamente alta ao longo desse meiocanal e se liga ao resíduo de Asp deslocando um resíduo de Arg po sitivamente carregado que tinha se associado com a Asp Esse resíduo de Arg se desloca para o lado formando uma interação com a Asp na subunidade c adjacente no anel e deslocando o próton daquela Asp esse próton adjacente sai através do segundo meiocanal para o lado N onde a concentração de prótons é relativamentre baixa comple tando o movimento de um próton equivalente do lado de fora para o lado de dentro da matriz Agora um outro pró ton entrou no meio canal no lado citosólico moveuse até a Asp na próxima subunidade c e a protonou mais uma vez deslocando a Arg que por sua vez desloca um próton da próxima subunidade c e assim por diante O movimen to rotacional do anel c é o resultado de movimento térmi co browniano que se torna unidirecional pela grande diferença na concentração de prótons através da mem brana O número de prótons que precisa ser transferido para produzir uma rotação completa do anel c é igual ao número de subunidades c no anel Estudos do anel c por microscopia de força atômica Quadro 192 ou por raios X mostraram que o número de subunidades c é diferen te em diferentes organismos Figura 1929 Em mito côndrias animais esse número é 8 em mitocôndrias de leveduras e em E coli é 10 e o número de subunidades c pode atingir 15 na cianobactéria Spirulina platensis A taxa de rotação em mitocôndrias intactas foi estimada em cerca de 6000 rpm 100 rotações por segundo O acoplamento quimiosmótico permite estequiometrias não integrais de consumo de O2 e de síntese de ATP Antes da aceitação geral do modelo quimiosmótico da fosfo rilação oxidativa a pressuposição era de que a equação da reação global assumiria a seguinte forma xADP 1 xPi 1 O2 1 H 1 1 NADH xATP 1 H2O 1 NAD 1 1911 com o valor de x algumas vezes chamado de razão PO ou razão P2e 2 sendo sempre um número inteiro Quan do mitocôndrias intactas são suspensas em solução com um substrato oxidável como succinato ou NADH e são providas com O2 a síntese de ATP é facilmente mensurável assim como o decréscimo de O2 A princípio essas duas medidas deveriam produzir o número de ATP sintetizado por O2 consumido a razão PO A medida de PO no entanto é complicada pelo fato de que mitocôndrias intactas conso mem ATP em muitas reações não relacionadas que ocorrem na matriz e consomem O2 por propósitos outros que não o da fosforilação oxidativa A contribuição dessas reações interferentes precisa ser cuidadosamente medida e o cál H H H H H H H H H H H H ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ ➏ H a H c10 c10 a Meiocanal lado P Meiocanal lado N Arg210 Arg210 O próton entra no meiocanal no lado P O próton desloca a Arg210 para a subunidade c adjacente A Arg210 gira deslocando H das Asp O H deslocado sai no lado N O anel c10 gira Arg210 retorna ao meiocanal no lado P O processo se repete FIGURA 1928 Um modelo para a rotação do anel c impulsionada por prótons A subunidade do complexo Fo da ATPsintase ver Figura 1925a tem dois meiocanais hidrofílicos para prótons um conduzindo do lado P para o meio da membrana e outro conduzindo do meio da membra na para o lado N matriz As subunidades c individuais em F0 10 na enzima de leveduras estão arranjadas em um círculo ao redor de um miolo cen tral Cada subunidade c tem um importante resíduo de Asp aproximada mente no meio da membrana que pode doar ou receber um próton H 1 vermelho A subunidade a tem uma cadeia lateral de Arg positivamente carregada que forma uma interação eletrostática com o carboxilato de Asp negativamente carregado na subunidade c adjacente Esta subunidade c é inicialmente posicionada de forma que um próton que entra no meiocanal no lado P onde a concentração de prótons é relativamente alta encontra e protona o resíduo de Asp enfraquecendo sua interação com Arg A ca deia lateral de Arg rota em direção ao resíduo protonado de Asp na próxima subunidade c e desloca seu próton carboxil enquanto uma nova interação eletrostática ArgAsp se forma O próton deslocado movese através do se gundo meiocanal na subunidade a e é liberado no lado N A subunidade c com seu resíduo de Asp desprotonado movese de forma que seu par ArgAsp fique de frente para o meiocanal no lado P e um segundo ciclo começa entrada de prótons protonação de Asp movimento de Arg e saída de prótons A rotação do anel ocorre por movimento termal browniano e é reajustada de maneira eficiente a orientação do gradiente de prótons dita a direção do fluxo de prótons e torna a rotação do anel c essencialmente unidirecional Nelson6edbookindb 755 Nelson6edbookindb 755 030414 0745 030414 0745 756 DAVID L NELSON MICHAEL M COX culo de PO precisa ser corrigido para essas contribuições A maioria dos experimentos gerou razões PO ATP para ½O2 entre 2 e 3 quando NADH era o doador de elétrons e entre 1 e 2 quando succinato era o doador Considerando a pressuposição de que PO deveria ter um valor integral a maioria dos pesquisadores concordou que as razões PO devem ser de 3 para NADH e 2 para succinato e durante anos esses valores apareceram em artigos de pesquisa e em livrostexto Com a introdução do paradigma quimiosmótico para o acoplamento da síntese de ATP à transferência de elétrons não havia qualquer requisito teórico para que PO fosse um número inteiro As questões relevantes sobre a estequio metria se tornaram quantos prótons são bombeados para FIGURA 1929 Organismos diferentes têm números diferentes de subunidades c no anel c do complexo Fo A estrutura do anel c de vá rias espécies foi determinada por cristalografia por raios X Cada hélice no anel central é a metade de uma subunidade c com formato de grampo de cabelo o anel de hélices externo é a outra metade da estrutura de grampo Visualizações do anel c perpendiculares à membrana mostram o número de subunidades c para a mitocôndrias bovinas 8 e b mitocôndrias de leveduras 10 Microscopia de força atômica foi utilizada para visualizar os anéis c c da bactéria termofílica Bacillus espécie TA2A1 13 e d de espi nafre 14 De acordo com o modelo na Figura 1928 diferentes números de subunidades c no anel c deveriam resultar em diferentes razões de ATP formado por par de elétrons que passam pela cadeia respiratória diferen tes razões PO a Visão de cima Visão lateral b c d 5 nm QUADRO 192 MÉTODOS Microscopia de força atômica para visualizar as proteínas de membrana Na microscopia de força atômica MFA a ponta afiada de uma sonda presa a um suporte flexível é arrastada por uma superfície irregular como a de uma membrana Fi gura Q1 Interações eletrostáticas e de van der Waals entre a ponteira e a amostra produzem uma força que movimenta a sonda para cima e para baixo na dimensão z à medida que encontra montanhas e vales na amostra Um feixe de laser refletido do suporte detecta movimen tos tão pequenos quanto 1 Å Em um tipo de microscópio de força atômica a força na sonda é mantida constan te em relação a uma força padrão na ordem de pico newtons por um circuito de retroalimentação que faz a plataforma que sustenta a amostra subir ou descer para manter a força constante Uma série de varreduras nas dimensões x e y o plano da membrana gera um mapa topográfico da superfície com uma resolução próxima à escala atômica 01 nm na dimensão vertical 05 a 10 nm nas dimensões laterais Em casos favoráveis a MFA pode ser usada para estudar moléculas individuais de proteínas de mem brana como as subunidades c do complexo Fo Figura 1929c d Laser Suporte Detector de luz laser detecta a deflexão do suporte A plataforma movese para manter constante a pressão na ponteira do suporte Excursões na dimensão z são mapeadas como função de x y x y z Amostra FIGURA Q1 O princípio da microscopia de força atômica Nelson6edbookindb 756 Nelson6edbookindb 756 030414 0745 030414 0745 PRINCIPIOS DE BIOQUMICA DE LEHNINGER 757 fora pela transferéncia de elétrons de um NADH ao O e Adeninanucleotideo Fosfato quantos protons precisam fluir para dentro por meio do translocase ATPsintase translocase complexo FF para propiciar a sintese de ATP A medida antiportador simportador de fluxos de protons 6 tecnicamente complicada 0 pesqui Espago ATP H sador precisa considerar a capacidade de tamponamento intermembrana ADP Ht HPO das mitocéndrias 0 vazamento nao produtivo de protons te tt tt tt at tt ah através da membrana interna e 0 uso do gradiente de pr6 RT i met Sao ii tons para outras fungdes que nao a sintese de ATP como IP patcercen IJ Bo propiciar o transporte de substratos através damembrana i Ve OO a mitocondrial interna descrito a seguir Os valores experi Matriz a mentais consensuais para o numero de protons bombeados f y para fora por par de elétrons sao de 10 para NADH e 6 para succinato que envia elétrons para a cadeia respiratoria no Y y nivel da ubiquinona O valor experimental mais amplamen tl te aceito para o nimero de protons requeridos para possi ADP2 pemot HPO H bilitar a sintese de uma molécula de ATP é 4 sendo que 1 é a usado no transporte de P ATP e ADP através da membrana ATP mitocondrial ver a seguir Se 10 prétons sao bombeados para fora por NADH e 4 precisam fluir para dentro para pro H duzir 1 ATP a razao PO com base em protons 6 25 para NADH como doador de elétrons e 15 64 para succinato fGURA 1930 Adeninanucleotideo e fosfatotranslocases Sistemas e transporte da membrana mitocondrial interna carregam ADP e P para a matriz e ATP recentemente sintetizado para o citosol A adeninanucleo A forca protonmotriz energiza 0 transporte ativo tideotranslocase 6 um antiportador a mesma proteina move ADP para a matriz e ATP para fora O efeito de substituir ATP por ADP na matrizéo Embora 0 papel primario do gradiente de protons nas mi efiyxo liquido de uma carga negativa favorecido pela diferenca de cargas tocéndrias seja fornecer energia para a sintese de ATP a através da membrana interna positiva fora Em pH 7 0 P esta presente tan forea protonmotriz também governa varios processos de to como HPO quanto como HPO A fosfatotranslocase é especifica para transporte essenciais A fosforilacdo oxidativa A membrana HPO Nao existe nenhum fluxo liquido de carga durante o simporte de mitocondrial interna geralmente é impermedavel a espécies HPO eH mas a concentracao relativamente baixa de protons na matriz or ops favorece o movimento de H para dentro Assim a fora prdtonmotriz é carregadas mas dois sistemas especificos transportam ADP responsavel por proporcionar energia para a sintese de ATP e por transportar e P para dentro da matriz e ATP para o citosol Figura substratos ADP e P para dentro e produto ATP para fora da matriz mito 1930 condrial Todos esses trés sistemas de transporte podem ser isolados como A adeninanucleotideotranslocase integral 4 mem um Unico complexo ligado a membrana ATP sintassomo brana interna liga ADP no espaco intermembrana e o transporta para a matriz em troca de uma molécula de ATP simultaneamente transportada para fora ver Figura 1311 para as formas ionicas de ADP e ATP Como esse an PROBLEMARESOLVIDO 192 Estequiometria da producdo de ATP tiportador move quatro cargas negativas para fora para cada efeito do tamanho do anel c trés que sao movidas para dentro sua atividade 6 favorecida pelo gradiente eletroquimico transmembrana que confere a Se as mitocéndrias bovinas tém 8 subunidades c por a matriz uma carga liquida negativa a forga protonmotriz anel c qual a razdo predita de ATP formado por NADH propicia a troca ATPADP A adeninanucleotideotranslo oxidado b Qual o valor predito para as mitoc6ndrias de case é especificamente inibida por atractilosideo glicosideo leveduras com 10 subunidades c c Quais os valores toxico produzido por uma espécie de cardo Se o transporte compardveis de elétrons que entram na cadeia respiratoria de ADP para dentro e o de ATP para fora das mitoc6ndrias a partir do FADH sao inibidos o ATP citosdélico néo pode ser regenerado a 9 partir do ADP explicando a toxicidade do atractilosideo Solugao a A questao solicita a determinagao de quantos Um segundo sistema de transporte de membrana essen ATP sao produzidos por NADH Essa é outra forma de pedir cial fosforilacdo oxidativa é a fosfatotranslocase que Para calcularmos a razao PO ou x na Equagao 1911 Se promove o simporte de um HPO e um H paraa matriz 0 anel c tem 8 subunidades c entao um rotagao completa Esse processo de transporte também é favorecido pelo gra transferira 8 protons para a matriz e produzira 3 moléculas diente de prétons transmembrana Figura 1930 Observe de ATP Porém esta sintese também requer o transporte de que o processo requer 0 movimento de um proton do lado 3 P para dentro da matriz ao custo de proton cada acres P para o lado N da membrana interna consumindo algu centando mais 3 prétons ao numero requerido Isso leva o ma energia da transferéncia de elétrons Um complexo da custo total para 11 protons 8 ATP 37 protonsATP ATPsintase e ambas as translocases o ATPsintassomo valor consensual para o numero de protons bombeados podem ser isolados das mitocOndrias por dissecacio suave Para fora por par de elétrons transferidos do NADH é 10 com detergentes sugerindo que as funcées dessas trés pro ver Figura 1919 Assim oxidar 1 NADH produz 10 pro teinas sio muito fortemente integradas tons37 protonsATP 27 ATP 758 DAVID L NELSON MICHAEL M COX b Se o anel c tem 10 subunidades c então uma rota ção completa transferirá 10 prótons para a matriz e pro duzirá 3 moléculas de ATP Acrescentando os 3 prótons para transportar os 3 Pi para dentro da matriz traz o cus to total para 13 prótons3 ATP 5 43 prótonsATP A oxidação de 1 NADH produz 10 prótons43 prótons ATP 5 23 ATP c Quando os elétrons entram na cadeia respiratória a partir do FADH2 na ubiquinona apenas 6 prótons estão disponíveis para impulsionar a síntese de ATP Isso muda os cálculos para as mitocôndrias bovinas para 6 pró tons37 prótonsATP 5 16 ATP por par de elétrons do FADH2 Para as mitocôndrias de leveduras o cálculo é 6 prótons43 prótonsATP 5 14 ATP por par de elé trons do FADH2 Esses valores calculados de x ou da razão PO definem uma faixa que inclui os valores experimentais de 25 ATP NADH e 15 ATPFADH2 e portanto esses valores serão usados ao longo deste livro Sistemas de lançadeiras conduzem indiretamente NADH citosólico para as mitocôndrias para oxidação A NADHdesidrogenase da membrana mitocondrial interna de células animais pode aceitar elétrons somente do NADH na matriz Considerando que a membrana interna não é permeável a NADH como o NADH gerado pela glicólise no citosol pode ser reoxidado a NAD 1 pelo O2 ao longo da cadeia respiratória Sistemas especiais de lançadeiras car regam equivalentes redutores do NADH citosólico para as mitocôndrias por uma via indireta A lançadeira de NADH mais conhecida que funciona em mitocôndrias de fíga do rim e coração é a lançadeira do malatoaspartato Figura 1931 Os equivalentes redutores do NADH ci tosólico são primeiro transferidos ao oxaloacetato citosó lico para produzir malato em uma reação catalisada pela malatodesidrogenase citosólica O malato então formado passa através da membrana interna pelo transportador de malatoacetoglutarato Dentro da matriz os equivalentes redutores são passados ao NAD 1 pela ação da malatode Malato desidrogenase Aspartato aminotransferase ➎ ➏ ➊ ➌ ➍ ➋ Transportador de glutamatoaspartato Efeito O C CH2 CH2 2OOC COO2 O C CH2 2OOC COO2 O C CH2 2OOC COO2 aCetoglutarato O C CH2 CH2 2OOC COO2 aCetoglutarato Glutamato Glutamato CH2 2OOC NH3 C H COO2 1 CH2 2OOC NH3 C H COO2 1 NH3 C H CH2 CH2 2OOC COO2 1 NH3 C H CH2 CH2 2OOC COO2 1 OH C H CH2 2OOC COO2 OH C H CH2 2OOC COO2 Aspartato Aspartato Oxaloacetato Espaço intermembrana lado P Matriz lado N Malato Malato NADH NADHP NADHN NAD H1 H1 1 1 Malato desidrogenase Transportador de malatoa cetoglutarato NAD NADH Oxaloacetato Aspartato aminotransferase FIGURA 1931 Lançadeira do malatoaspartato Esta lançadeira para transporte de equivalentes redutores do NADH citosólico para dentro da matriz mitocondrial é usada em fígado rim e coração ➊ O NADH no citosol entra no espaço intermembrana por aberturas na membrana externa pori nas então passa dois equivalentes redutores ao oxaloacetato produzindo malato ➋ O malato cruza a membrana interna via transportador de malato acetoglutarato ➌ Na matriz o malato passa dois equivalentes redutores ao NAD 1 e o NADH resultante é oxidado pela cadeia respiratória o oxaloaceta to formado a partir do malato não pode passar diretamente para o citosol ➍ O oxaloacetato é primeiro transaminado a aspartato e ➎ o aspartato pode sair via transportador de glutamatoaspartato ➏ O oxaloacetato é regenera do no citosol completando o ciclo Nelson6edbookindb 758 Nelson6edbookindb 758 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 759 sidrogenase da matriz formando NADH esse NADH pode passar elétrons diretamente à cadeia respiratória Cerca de 25 moléculas de ATP são geradas à medida que esse par de elétrons passa para o O2 O oxaloacetato citosólico precisa ser regenerado por reações de transaminação e atividade de transportadores de membrana para iniciar outro ciclo da lançadeira O músculo esquelético e o encéfalo usam uma lançadei ra de NADH diferente a lançadeira do glicerol3fosfato Figura 1932 Ela difere da lançadeira do malatoaspar tato por entregar os equivalentes redutores do NADH para a ubiquinona e então para o complexo III não o complexo I Figura 198 proporcionando energia suficiente apenas para sintetizar 15 molécula de ATP por par de elétrons As mitocôndrias das plantas têm NADHdesidrogenase externamente orientada que pode transferir elétrons di retamente do NADH citosólico para a cadeia respiratória no nível da ubiquinona Como essa via desvia da NADH desidrogenase do complexo I e do movimento associado de prótons a produção de ATP a partir do NADH citosólico é menor do que aquela obtida a partir do NADH gerado na matriz Quadro 191 RESUMO 192 Síntese de ATP c O fluxo de elétrons pelos complexos I III e IV resulta no bombeamento de prótons através da membrana mito condrial interna tornando a matriz alcalina em relação ao espaço intermembrana Esse gradiente de prótons fornece a energia na forma de força prótonmotriz para a síntese de ATP a partir de ADP e Pi pela ATP sintase complexo FoF1 na membrana interna c A ATPsintase realiza a catálise rotacional onde o flu xo de prótons por Fo faz cada um dos três sítios de liga ção de nucleotídeos em F1 variar entre as conformações ADP1Piligado ATPligado e vazia c A formação de ATP na enzima requer pouca energia o papel da força prótonmotriz é deslocar o ATP de seu sítio de ligação na sintase c A razão entre ATP sintetizado por ½O2 reduzido e H2O a razão PO é de cerca de 25 quando os elétrons en tram na cadeia respiratória no complexo I e 15 quando os elétrons entram na ubiquinona Essa razão pode va riar um pouco em diferentes organismos com base no número de subunidades c do complexo Fo c A energia conservada em um gradiente de prótons pode propiciar o transporte de solutos contra o gradiente através da membrana c A membrana mitocondrial interna é impermeável a NADH e NAD 1 mas equivalentes de NADH são movidos do citosol para a matriz por duas lançadeiras Equiva lentes de NADH deslocados para dentro pela lançadeira do malatoaspartato entram na cadeia respiratória no complexo I e produzem uma razão PO de 25 aqueles movimentados para dentro pela lançadeira do glice rol3fosfato entram na ubiquinona e geram uma razão PO de 15 193 Regulação da fosforilação oxidativa A fosforilação oxidativa produz a maior parte do ATP fa bricado em células aeróbias A oxidação completa de uma molécula de glicose a CO2 produz 30 ou 32 ATP Tabe la 195 Em comparação a glicólise sob condições ana eróbias fermentação láctica gera apenas dois ATP por glicose Claramente a evolução da fosforilação oxidativa proporcionou um grande aumento na eficiência ener gética do catabolismo A oxidação completa até CO2 do derivado do palmitato 160 ligado à coenzima A que também ocorre na matriz mitocondrial produz 108 ATP por palmitoilCoA ver Tabela 171 Um cálculo similar pode ser feito para a produção de ATP a partir da oxida ção de cada um dos aminoácidos Capítulo 18 Portanto as vias oxidativas aeróbias que resultam na transferência de elétrons ao O2 acompanhada da fosforilação oxidativa são responsáveis pela grande maioria do ATP produzido no catabolismo de forma que é absolutamente essencial a regulação da produção de ATP pela fosforilação oxidati va para se ajustar às necessidades celulares flutuantes da demanda por ATP NAD Glicerol3fosfato desidrogenase mitocondrial QH2 NADH H Glicólise Dihidroxiacetona fosfato Glicerol3 fosfato Complexo III CH2OH CH2 CHOH O P P CH2OH CH2 C O O Glicerol3 fosfatodesidrogenase citosólica Matriz lado N Espaço intermembrana lado P FADH2 FAD FIGURA 1932 Lançadeira do glicerol3fosfato Esta forma alternativa de mover equivalentes redutores do citosol para a matriz mitocondrial opera no músculo esquelético e no encéfalo No citosol dihidroxiacetonafosfato aceita dois equivalentes redutores do NADH em uma reação catalisada pela glicerol3fosfatodesidrogenase citosólica Uma isoenzima da glicerol3 fosfatodesidrogenase ligada à face externa da membrana interna transfere então dois equivalentes redutores do glicerol3fosfato no espaço inter membrana para a ubiquinona Observe que esta transferência não envolve sistemas de transporte de membrana Nelson6edbookindb 759 Nelson6edbookindb 759 030414 0745 030414 0745 760 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A fosforilação oxidativa é regulada pelas necessidades celulares de energia A taxa de respiração consumo de O2 nas mitocôndrias é estritamente regulada sendo limitada pela disponibilidade de ADP como substrato para a fosforilação A dependên cia da taxa de consumo de O2 em relação à disponibilidade do aceptor de Pi ADP Figura 1920b o controle pelo aceptor da respiração pode ser notável Em alguns tecidos animais a razão do controle pelo aceptor a razão entre a taxa máxima de consumo de O2 induzida por ADP e a taxa basal na ausência de ADP é de pelo menos 10 A concentração intracelular de ADP é uma medida do estado energético das células Outra medida relacionada é a razão massaação do sistema ATPADP ATPADP Pi Normalmente essa razão é muito alta de forma que o sistema ATPADP está quase totalmente fosforilado Quan do aumenta a taxa de algum processo que requer energia p ex a síntese de proteína também aumenta a taxa de quebra de ATP em ADP e Pi baixando a razão massaação Com mais ADP disponível para a fosforilação oxidativa a taxa da respiração aumenta causando a regeneração do ATP Isso continua até que a razão massaação retorne ao seu nível normal alto no qual a respiração pontual diminui novamente A velocidade de oxidação de combustíveis celu lares é regulada com tal sensibilidade e precisão que a razão ATPADPPi flutua apenas levemente na maioria dos tecidos mesmo durante variações extremas na demanda de energia Em resumo o ATP é formado exatamente tão rá pido quanto é usado nas atividades celulares que requerem energia Uma proteína inibitória impede a hidrólise de ATP durante a hipoxia A ATPsintase já foi apresentada como uma bomba de pró tons movida a ATP ver Figura 1139 catalisando o re verso da síntese de ATP Quando uma célula está hipóxica desprovida de oxigênio como em um ataque cardíaco ou acidente vascular a transferência de elétrons para o oxigê nio fica mais lenta da mesma forma que o bombeamento de prótons A força prótonmotriz em seguida colapsa Nessas condições a ATPsintase poderia operar ao contrário hi drolisando ATP para bombear prótons para fora e causando uma queda desastrosa nos níveis de ATP Isso é impedido por um pequeno 84 aminoácidos inibidor proteico IF1 que se liga simultaneamente a duas moléculas de ATPsin tase inibindo sua atividade ATPásica Figura 1933 IF1 é inibitório apenas na sua forma dimérica a qual é favorecida em pHs menores do que 65 Em uma célula ávida por oxi gênio a principal fonte de ATP se torna a glicólise e o ácido pirúvico ou láctico então formado diminui o pH no citosol e na matriz mitocondrial Isso favorece a dimerização de IF1 levando a uma inibição da atividade ATPásica da ATPsin tase e portanto impedindo a hidrólise fútil de ATP Quan do o metabolismo aeróbio recomeça a produção de ácido pirúvico diminui o pH do citosol aumenta o dímero IF1 é desestabilizado e a inibição da ATPsintase é removida IF1 é uma entre um número crescente de proteínas conhecidas por serem intrinsecamente desorganizadas p 141 ela ad quire uma conformação favorecida apenas quando interage com a ATPsintase A hipoxia leva à produção de ERO e a várias respostas adaptativas Em células hipóxicas existe um desequilíbrio entre a che gada de elétrons a partir da oxidação de combustíveis celu lares na matriz mitocondrial e a transferência de elétrons para o oxigênio molecular levando a uma maior formação TABELA 195 Produção de ATP a partir da oxidação completa da glicose Processo Produto direto ATP final Glicólise 2 NADH citosólico 2 ATP 3 ou 5 2 Oxidação do piruvato dois por glicose 2 NADH matriz mitocondrial 5 Oxidação da acetilCoA no ciclo do ácido cítrico duas por glicose 6 NADH matriz mitocondrial 2 FADH2 2 ATP ou 2 GTP 15 3 2 Produção total por glicose 30 ou 32 O número depende do sistema de lançadeira a transferir equivalentes redutores para a mitocôndria Inibidor IF1 a a a a a a b b b b b b g g FIGURA 1933 Estrutura da F1ATPase bovina em um complexo com sua proteína regulatória IF1 Derivada de PDB ID 1OHH Duas moléculas de F1 são aqui visualizadas como na Figura 1925c O inibidor IF1 em verme lho se liga à interface ab das subunidades na conformação difosfato ADP aADP e bADP congelando os dois complexos F1 e portanto bloqueando a hidrólise e síntese de ATP As partes de IF1 que não apresentaram reso lução no cristal de F1 são mostradas em vermelhoclaro na forma em que ocorrem em cristais de IF1 isolados Este complexo é estável somente no baixo pH citosólico característico de células que estão produzindo ATP pela glicólise quando o metabolismo aeróbio recomeça o pH citosólico aumen ta o inibidor é desestabilizado e a ATPsintase se torna ativa Nelson6edbookindb 760 Nelson6edbookindb 760 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 761 de espécies reativas de oxigênio Além do sistema da glu tationaperoxidase Figura 1918 as células têm outras duas linhas de defesa contra as ERO Figura 1934 Uma é a regulação da piruvatodesidrogenase PDH a enzima que fornece acetilCoA ao ciclo do ácido cítrico Capítu lo 16 Sob condições hipóxicas a PDHcinase fosforila a PDH mitocondrial inativandoa e reduzindo o fornecimento de FADH2 e NADH do ciclo do ácido cítrico para a cadeia respiratória A segunda maneira de impedir a formação de ERO é a substituição de uma subunidade do complexo IV conhecida como COX41 por outra subunidade COX42 que é melhor ajustada a condições hipóxicas Com COX4 1 as propriedades catalíticas do complexo IV são ótimas para a respiração em concentrações normais de oxigênio com COX42 o complexo IV é otimizado para operar sob condições hipóxicas As mudanças na atividade da PDH e no conteúdo de COX42 do complexo IV são ambas mediadas por HIF1 o fator induzível por hipoxia O HIF1 outra proteína intrinse camente desorganizada acumulase em células hipóxicas e atuando como fator de transcrição desencadeia um aumen to na síntese de PDHcinase COX42 e uma protease que degrada COX41 Lembrese de que HIF1 também controla as mudanças no transporte da glicose e nas enzimas glicolíti cas que produzem o efeito Pasteur ver Quadro 141 Quando esses mecanismos para lidar com as ERO são insuficientes devido a mutações genéticas que afetam uma dessas proteínas protetoras ou sob condições de taxas muito altas de produção de ERO a função mitocondrial fica comprometida Acreditase que o dano mitocondrial esteja envolvido no envelhecimento no colapso cardíaco em cer tos casos raros de diabetes descritos a seguir e em várias doenças genéticas de herança materna que afetam o siste ma nervoso As vias produtoras de ATP são coordenadamente reguladas As principais vias catabólicas têm mecanismos regulatórios atrelados e coordenados que lhes permitem funcionar jun tas em uma forma econômica e autorregulada para produzir ATP e precursores biossintéticos As concentrações relativas de ATP e ADP controlam não somente as taxas de transfe rência de elétrons e a fosforilação oxidativa mas também as velocidades do ciclo do ácido cítrico da oxidação do piruvato e da glicólise Figura 1935 Sempre que o consumo de H2O Lactato desidrogenase Hipoxia baixa pO2 Transcrição de HIF1 aumentada HIF1 aumenta a transcrição de outras enzimas e proteínas setas verdes A produção de ATP pela glicólise aumenta O fluxo de elétrons de NADH e FADH2 para a cadeia respiratória decresce A produção de ERO é reduzida As propriedades do complexo IV estão adaptadas à baixa pO2 HIF1 Transportador de glicose Glicose ATP Enzimas glicolíticas Lactato Transcrição aumentada Fluxo pela rota aumentado Fluxo pela rota diminuído Protease Degrada a subunidade COX41 Subunidade COX42 Substitui COX41 Piruvato desidrogenase PDH PDH cinase NADH FADH2 Cadeia respiratória Piruvato AcetilCoA Ciclo do ácido cítrico O2 O2 O2OH Complexo IV FIGURA 1934 O fator induzível por hipoxia HIF1 regula a expres são gênica para reduzir a formação de ERO Sob condições de pouco oxigênio hipoxia HIF1 é sintetizado em quantidades maiores e age como fator de transcrição aumentando a síntese do transportador de glicose de enzimas glicolíticas da piruvatodesidrogenasecinase PDHcinase da lactatodesidrogenase de uma protease que degrada a subunidade COX41 da citocromooxidase e da subunidade COX42 da citocromooxidase Estas mudanças se opõem à formação de ERO por diminuírem o suprimento de NADH e FADH2 e por tornarem a citocromooxidase do complexo IV mais efetiva Nelson6edbookindb 761 Nelson6edbookindb 761 030414 0745 030414 0745 762 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ATP aumenta as velocidades da cadeia transportadora de elétrons e da fosforilação oxidativa aumentam Simultanea mente a velocidade de oxidação do piruvato pelo ciclo do ácido cítrico aumenta elevando o fluxo de elétrons na cadeia respiratória Esses eventos podem por sua vez evocar um aumento na velocidade da glicólise aumentando a velocida de de formação de piruvato Quando a conversão de ADP em ATP reduz a concentração de ADP o controle pelo aceptor diminui a transferência de elétrons e assim a fosforilação oxidativa A glicólise e o ciclo do ácido cítrico também têm sua velocidade reduzida porque o ATP é um inibidor alosté rico da enzima glicolítica fosfofrutocinase1 ver Figura 15 16 e da piruvatodesidrogenase ver Figura 1619 A fosfofrutocinase1 também é inibida por citrato o primeiro intermediário do ciclo do ácido cítrico Quando o ciclo estiver em ponto morto o citrato se acumula dentro das mitocôndrias sendo então transportado para o citosol Quando tanto as concentrações de ATP quanto de citrato aumentam eles produzem um efeito alostérico conjunto da fosfofrutocinase1 que é maior do que a soma dos seus efei tos individuais reduzindo a glicólise RESUMO 193 Regulação da fosforilação oxidativa c A fosforilação oxidativa é regulada pelas demandas energéticas celulares A ADP intracelular e a razão massaação ATPADPPi são medidas do estado energético de uma célula c Em células hipóxicas desprovidas de oxigênio um inibidor proteico bloqueia a hidrólise de ATP pela ati vidade reversa da ATPsintase impedindo uma queda drástica na ATP c As respostas adaptativas à hipoxia mediadas por HIF1 reduzem a transferência de elétrons para a cadeia respi ratória e modificam o complexo IV para que ele atue de maneira mais eficiente sob condições de baixo oxigênio c As concentrações de ATP e ADP estabelecem a veloci dade de transporte de elétrons pela cadeia respiratória por uma série de controles interconectados sobre a res piração a glicólise e o ciclo do ácido cítrico 194 Mitocôndrias na termogênese na síntese de esteroides e na apoptose Embora a produção de ATP seja o papel central da mitocôn dria esta organela tem outras funções que em tecidos es pecíficos ou sob condições específicas também são essen ciais No tecido adiposo as mitocôndrias geram calor para proteger órgãos vitais da baixa temperatura do ambiente Nas glândulas suprarrenais e nas gônadas as mitocôndrias são o local de síntese de hormônios esteroides sendo na maioria dos tecidos participanteschave na apoptose mor te celular programada O desacoplamento em mitocôndrias do tecido adiposo marrom produz calor Anteriormente foi mencionado que a respiração fica mais lenta quando a célula está adequadamente suprida com Complexo da Piruvato desidrogenase H2O Isocitrato desidrogenase Glicólise Glicose Pi Hexocinase Glicose6fosfato Fosfofrutocinase1 Múltiplas etapas Frutose16bifosfato AMP ADP ATP citrato Fosfoenolpiruvato Piruvatocinase ADP ATP NADH AMP ADP NAD1 ATP NADH AcetilCoA Piruvato Citratosintase Citrato ADP ATP NADH ADP ATP aCetoglutarato ATP NADH SuccinilCoA Múltiplas etapas Oxaloacetato Ciclo do ácido cítrico acetoglutarato desidrogenase Fosforilação oxidativa NADH NAD1 Cadeia respiratória 1 O2 2 ATP ADP 1 Pi ADP Pi FIGURA 1935 Regulação das vias que produzem ATP Este diagrama mostra a regulação interconectada da glicólise da oxidação do piruvato do ciclo do ácido cítrico e da fosforilação oxidativa pelas concentrações relativas de ATP ADP AMP e por NADH Alta ATP ou baixa ADP e AMP produz baixas velocidades de glicólise oxidação do piruvato oxidação do acetato via ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa Todas as quatro vias são aceleradas quando o uso de ATP e a formação de ADP AMP e Pi aumentam A interligação da glicólise e do ciclo do ácido cítrico pelo citra to o qual inibe a glicólise suplementa a ação do sistema de nucleotídeos da adenina Além disto níveis aumentados de NADH e de acetilCoA tam bém inibem a oxidação de piruvato a acetilCoA e uma alta razão NADH NAD 1 inibe as reações das desidrogenases do ciclo do ácido cítrico ver Figura 1619 Nelson6edbookindb 762 Nelson6edbookindb 762 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 763 ATP Existe uma exceção notável e instrutiva a essa regra geral A maioria dos mamíferos recémnascidos incluindo os humanos tem um tipo de tecido adiposo chamado de te cido adiposo marrom TAM p 944 no qual a oxidação de combustível serve não para produzir ATP mas para gerar calor para manter o recémnascido aquecido Esse tecido adiposo especializado é marrom devido à presença de um grande número de mitocôndrias e portanto de uma alta concentração de citocromos com grupos heme que são for tes absorvedores de luz visível As mitocôndrias dos adipócitos marrons são muito se melhantes às de outras células de mamíferos exceto por terem uma proteína singular na membrana interna A ter mogenina também chamada de proteína desacoplado ra 1o produto do gene UCP1 fornece uma via para os prótons retornarem à matriz sem passarem pelo complexo FoF1 Figura 1936 Como resultado desse curtocircuito de prótons a energia de oxidação não é conservada pela formação de ATP mas dissipada como calor o que contri bui para manter a temperatura corporal ver Figura 23 16 Animais que hibernam também dependem da ativida de de mitocôndrias desacopladas no TAM para gerar calor durante seus longos períodos adormecidos ver Quadro 171 O papel da termogenina será esmiuçado quando for discutida a regulação da massa corporal no Capítulo 23 p 961962 Oxigenases P450 mitocondriais catalisam hidroxilações de esteroides As mitocôndrias são o sítio das reações biossintéticas que produzem os hormônios esteroides incluindo os hormô nios sexuais os glicocorticoides os mineralocorticoides e o hormônio vitamina D Esses compostos são sintetizados a partir do colesterol ou de um esterol relacionado em uma série de hidroxilações catalisadas por enzimas da família ci tocromo P450 todas tendo um grupo heme crítico sua absorção a 450 nm dá o nome à família Nas reações de hi droxilação um átomo do oxigênio molecular é incorporado ao substrato e o segundo é reduzido a H2O RH 1 O2 1 NADPH ROH 1 H2O 1 NADP 1 Existem dúzias de enzimas P450 todas localizadas na membrana mitocondrial interna com seus sítios catalíticos expostos à matriz Células esteroidogênicas estão repletas de mitocôndrias especializadas na síntese de esteroides as mitocôndrias geralmente são maiores do que aquelas em outros tecidos e têm membranas internas mais extensas e altamente convolutas Figura 1937 A via do fluxo de elétrons no sistema P450 mitocondrial é complexa envolvendo uma flavoproteína e uma proteína ferroenxofre que carregam elétrons do NADPH ao heme P450 Figura 1938 Todas as enzimas P450 têm um heme que interage com O2 e um sítio de ligação de substra to que confere especificidade Outra grande família de enzimas P450 é encontrada no retículo endoplasmático RE de hepatócitos Es sas enzimas catalisam reações semelhantes às reações P450 mitocondriais mas seus substratos incluem uma am pla variedade de compostos hidrofóbicos muitos dos quais são xenobióticos compostos não encontrados na nature za mas sintetizados industrialmente As enzimas P450 do RE têm especificidades muito amplas e que se sobrepõem A hidroxilação dos compostos hidrofóbicos os torna mais solúveis em água e eles podem então ser liberados pelos rins e excretados na urina Entre os substratos para estas oxigenases P450 estão muitos remédios comumente utili zados O metabolismo pelas enzimas P450 limita o tempo de vida dos fármacos na corrente sanguínea e seus efeitos terapêuticos Os humanos diferem em seus complementos genéticos de enzimas P450 no RE e na extensão com a qual certas enzimas P450 foram induzidas como em um históri co de ingestão de álcool Portanto a princípio a genética de uma pessoa e sua história pessoal poderiam embasar as de terminações de doses terapêuticas de remédios na práti cas esse ajuste perfeito na dosagem ainda não é economi camente viável mas pode vir a ser Matriz lado N Espaço intermembrana lado P I II III IV Cit c Proteína desacopladora termogenina Fo F1 H H Calor FIGURA 1936 Geração de calor por mitocôndrias desacopladas A proteína desacopladora termogenina nas mitocôndrias do tecido adiposo marrom ao fornecer uma via alternativa para os prótons reentrarem na ma triz mitocondrial faz a energia conservada pelo bombeamento de prótons ser dissipada como calor FIGURA 1937 Mitocôndrias da glândula suprarrenal especializadas na síntese de esteroides Conforme se vê nesta micrografia eletrônica de uma fina secção da glândula suprarrenal as mitocôndrias são profusas e têm cristas extensas proporcionando uma grande superfície para as enzimas P450 da membrana interna Nelson6edbookindb 763 Nelson6edbookindb 763 030414 0745 030414 0745 764 DAVID L NELSON MICHAEL M COX As mitocôndrias são de importância central para o início da apoptose A apoptose também chamada de morte celular progra mada é um processo no qual células individuais morrem para o bem do organismo p ex no transcorrer do desen volvimento embrionário normal e o organismo conserva os componentes moleculares da célula aminoácidos nu cleotídeos e assim por diante A apoptose pode ser desen cadeada por um sinal externo atuando em um receptor de membrana plasmática ou por eventos internos como lesão de DNA infecção viral estresse oxidativo pelo acúmulo de ERO ou outro estresse como choque térmico As mitocôndrias desempenham um papel fundamental em desencadear a apoptose Quando um estressor fornece o sinal para a morte da célula a consequência inicial é um aumento na permeabilidade da membrana mitocondrial ex terna permitindo que o citocromo c escape do espaço in termembrana para o citosol Figura 1939 O aumento da permeabilidade é devido à abertura do complexo do poro de transição de permeabilidade CPTP proteína de múltiplas subunidades na membrana externa sua abertu ra e seu fechamento são afetados por várias proteínas que estimulam ou suprimem a apoptose Quando liberado no citosol o citocromo c interage com monômeros da proteína Apaf1 protease fator 1 de ativação de apoptose de apoptosis protease activating factor1 causando a for mação de um apoptossomo composto por sete moléculas de Apaf1 e sete moléculas de citocromo c O apoptossomo proporciona a plataforma sobre a qual a protease procas pase9 é ativada a caspase9 membro de uma família de proteases altamente específicas as caspases envolvidas na apoptose Elas todas apresentam um resíduo Cys cru cial em seus sítios ativos e todas clivam proteínas apenas no lado terminal carboxil dos resíduos de Asp por isso o nome caspases A caspase9 ativada inicia uma cascata de ativações proteolíticas com uma caspase ativando uma segunda e por sua vez ativando uma terceira e assim por O2 H2O NADPH 1 H1 NADP1 Adrenodoxina redutase FAD Adrenodoxina redutase FADH2 Adrenodoxina 2Fe2S reduzida Adrenodoxina 2Fe2S oxidada P450 hidroxilase oxidada P450 hidroxilase reduzida R OH H R FIGURA 1938 Via do fluxo de elétrons nas reações do citocromo P450 mitocondrial em glândula suprarrenal Dois elétrons são trans feridos do NADPH à flavoproteína contendo FAD adrenodoxinaredutase que passa os elétrons um de cada vez à adrenodoxina uma pequena pro teína solúvel contendo 2Fe2S A adrenodoxina passa elétrons individuais à citocromo P450hidroxilase que interage diretamente com O2 e o substrato RH para formar os produtos H2O e ROH FIGURA 1939 O papel do citocromo c na apoptose O citocromo c é uma proteína mitocondrial pequena e solúvel localizada no espaço in termembrana que carrega elétrons entre o complexo III e o complexo IV durante a respiração Em um papel completamente separado como aqui esboçado ele age como um gatilho para a apoptose estimulando a ativação de uma família de proteases chamadas de caspases Dano ao DNA Sinal de desenvolvimento Estresse ERO O complexo do poro de transição de permeabilidade se abre A ligação do citocromo c e do ATP induz a Apaf1 a formar um apoptossomo Estas caspases levam à morte e à reabsorção da célula O apoptossomo causa a dimerização da procaspase9 criando dímeros ativos de caspase9 A caspase9 catalisa a ativação proteolítica da caspase3 e da caspase7 O citocromo c vai para o citosol Citocromo c ATP Apoptossomo Apaf1 protease fator 1 de ativação de apoptose Monômeros de procaspase9 inativos Dímeros de caspase 9 ativos Morte celular Procaspase3 Procaspase7 Caspase3 Caspase7 Nelson6edbookindb 764 Nelson6edbookindb 764 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 765 diante ver Figura 1252 Esse papel do citocromo c na apoptose é um caso claro de jornada dupla onde uma proteína desempenha dois papéis muito diferentes na célu la ver Quadro 161 RESUMO 194 Mitocôndrias na termogênese na síntese de esteroides e na apoptose c No tecido adiposo marrom de recémnascidos a trans ferência de elétrons está desacoplada da síntese de ATP e a energia da oxidação de combustível é dissipada como calor c As etapas da reação de hidroxilação na síntese de hor mônios esteroides em tecidos esteroidogênicos glându la suprarrenal gônadas fígado e rim ocorrem em mito côndrias especializadas c O citocromo c mitocondrial liberado no citosol participa da ativação da caspase9 uma das proteases envolvidas na apoptose 195 Genes mitocondriais suas origens e efeitos das mutações As mitocôndrias contêm seus próprios genomas uma mo lécula circular em fita dupla de DNA DNAmt Cada uma das centenas ou milhares de mitocôndrias em uma célula típica tem cerca de cinco cópias deste genoma O cromos somo mitocondrial humano Figura 1940 contém 37 ge nes 16569 pb incluindo 13 que codificam subunidades de proteínas da cadeia respiratória Tabela 196 os demais genes codificam moléculas de rRNA e tRNA essenciais para a maquinaria sintetizadora de proteínas das mitocôndrias A grande maioria das proteínas mitocondriais cerca de 1100 tipos diferentes é codificada por genes nucleares sintetizada nos ribossomos citoplasmáticos e então impor tada e organizada nas mitocôndrias Capítulo 27 As mitocôndrias evoluíram a partir de bactérias endossimbióticas A existência de DNA mitocondrial ribossomos e tRNA dá suporte à hipótese da origem endossimbiótica das mitocôn drias ver Figura 138 que sustenta que os primeiros orga nismos capazes de metabolismo aeróbio incluindo a produ ção de ATP ligada à respiração eram bactérias Eucariotos primitivos que viviam anaerobiamente por fermentação adquiriram a capacidade de realizar a fosforilação oxidativa quando estabeleceram uma relação simbiótica com bacté rias que viviam em seu citosol Depois de muita evolução e do movimento de muitos genes bacterianos para o núcleo do hospedeiro eucarioto as bactérias endossimbióticas ao final tornaramse mitocôndrias Essa hipótese presume que bactérias primitivas de vida livre tinham a maquinaria enzimática para a fosforilação oxi dativa e prevê que seus descendentes bacterianos modernos devem ter cadeias respiratórias muito semelhantes àquelas FIGURA 1940 Genes mitocondriais e mutações a Mapa do DNA mitocondrial humano mostrando os genes que codificam pro teínas do complexo I a NADHdesidrogenase ND1 a ND6 o citocro mo b do complexo III Cit b as subunidades da citocromooxidase comple xo IV COI a COIII e as duas subunidades da ATPsintase ATPase6 e ATPase8 As cores dos genes correspondem àquelas dos complexos mostrados na Fi gura 197 Também incluídos aqui estão os genes para os RNA ribossomais rRNA e para alguns RNA transportadores específicos de mitocôndria a especificidade do tRNA é indicada pelos códigos de uma letra para os aminoácidos As setas indicam as posições das mutações que cau sam a neuropatia óptica hereditária de Leber LHON e a doença da epilepsia mioclônica e fibra vermelha rota MERRF Os núme ros dentro dos parênteses indicam a posição dos nucleotídeos alterados o nucleotídeo 1 está no topo do círculo e a nume ração prossegue no sentido antihorário b Micrografia eletrônica de mitocôndria anormal do músculo de uma pessoa com MERRF mostrando as inclusões de proteína paracristalina algumas vezes presentes nas mitocôndrias mutantes 016569 12S rRNA 16S rRNA ND6 Cit b F V E P T LHON 15257 ND1 ND2 COI L I M WA N C Y Q LHON 3460 LHON 4160 S D COII COIII ATPase6 ND3 ND4L ND4 ND5 K G a R H L S LHON 11778 MERRF 8344 ATPase8 Complexo I Complexo III Complexo IV ATPsintase RNA transportador RNA ribossomal Região de controle do DNA b Nelson6edbookindb 765 Nelson6edbookindb 765 030414 0745 030414 0745 766 DAVID L NELSON MICHAEL M COX dos eucariotos modernos Eles têm As bactérias aeróbias realizam a transferência de elétrons associada ao NAD de substratos para o O2 acoplada à fosforilação de ADP cito sólico As desidrogenases estão localizadas no citosol bac teriano e a cadeia respiratória na membrana plasmática Os carregadores de elétrons transportam prótons para fora através da membrana plasmática à medida que elétrons são transferidos para o O2 Bactérias como Escherichia coli têm complexos FoF1 em suas membranas plasmáticas a porção F1 se projeta para o citosol e catalisa a síntese de ATP a par tir de ADP e Pi à medida que os prótons fluem de volta para a célula por meio do canal de prótons de Fo A extrusão de prótons através da membrana plasmá tica bacteriana associada à respiração também fornece a força propulsora para outros processos Certos sistemas de transporte bacterianos permitem a absorção de nutrientes extracelulares p ex lactose contra um gradiente de con centração em simporte com prótons ver Figura 1141 E o movimento rotatório de flagelos bacterianos é propor cionado por turbinas de prótons motores moleculares de rotação impulsionados não por ATP mas diretamente pelo potencial eletroquímico transmembrana gerado pelo bombeamento de prótons associado à respiração Figura 1941 Parece provável que o mecanismo quimiosmótico tenha evoluído cedo antes do surgimento dos eucariotos Mutações em DNA mitocondrial acumulamse ao longo de toda a vida do organismo A cadeia respiratória é o principal produtor de espécies reativas de oxigênio na célula de forma que os conteúdos mitocondriais incluindo o genoma mitocondrial sofrem a maior exposição e o maior dano por ERO Além disso o sis tema mitocondrial de replicação de DNA é menos eficiente do que o sistema nuclear em corrigir erros feitos durante a replicação e em reparar dano ao DNA Como consequên cia destes dois fatores defeitos no DNAmt se acumulam ao longo do tempo Uma das teorias do envelhecimento é a de que o acúmulo gradual de defeitos com o aumento da idade é a causa primária de muitos dos sintomas de envelheci mento que incluem por exemplo o enfraquecimento pro gressivo dos músculos esquelético e cardíaco Uma característica singular da herança mitocondrial é a variação entre células individuais e entre um organismo e outro nos efeitos de uma mutação do DNAmt Uma célula típica tem centenas ou milhares de mitocôndrias cada uma com múltiplas cópias do seu próprio genoma Figura 19 42 Os animais herdam essencialmente todas as suas mito côndrias da mãe Os ovos são grandes e contêm 10 5 ou 10 6 mitocôndrias mas os espermatozóides são bem menores e contêm bem menos mitocôndrias talvez de 100 a 1000 TABELA 196 Proteínas respiratórias codificadas por genes mitocondriais em humanos Complexo Número de subunidades Número de subunidades codificadas por DNA mitocondrial I NADHdesidrogenase 43 7 II Succinatodesidrogenase 4 0 III Ubiquinonacitocromo coxidorredutase 11 1 IV Citocromooxidase 13 3 V ATPsintase 8 2 Flagelo Membrana externa Membrana interna plasmática Motor rotatório Peptidoglicano e espaço periplásmico Cadeia de transferência de elétrons H1 H1 FIGURA 1941 Rotação de flagelos bacterianos pela força protón motriz O eixo e os anéis na base do flagelo constituem um motor rotató rio que tem sido chamado de turbina de prótons Os prótons ejetados pela transferência de elétrons fluem de volta para a célula pela turbina causando a rotação do eixo do flagelo Este movimento difere fundamentalmente do movimento de músculos e de flagelos e cílios de eucariotos para os quais a hidrólise de ATP é a fonte de energia FIGURA 1942 Células individuais contêm muitas mitocôndrias Uma célula animal típica tem centenas ou milhares de mitocôndrias uma fração das quais pode conter genomas com mutações que afetam a função mito condrial Esta célula epitelial de rim ovino foi cultivada em laboratório fixada e então corada com sondas fluorescentes que mostram as mitocôndrias em dourado os microfilamentos de actina em vermelho e o núcleo em verde quando observada em microscópio de fluorescência Nelson6edbookindb 766 Nelson6edbookindb 766 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 767 Além disso existe um mecanismo ativo que marca as mito côndrias derivadas dos espermatozóides para a degradação no ovo fertilizado Logo depois da fertilização fagossomos maternos migram para o local de entrada dos espermatozói des engolfam suas mitocôndrias e as degradam Suponha que em um organismo feminino um dano a um genoma mitocondrial ocorra em uma célula germinativa da qual se desenvolvem os oócitos de forma que a célula germi nativa contenha principalmente mitocôndrias com os genes do tipo selvagem sem a mutação mas uma mitocôndria com um gene mutante No decurso da maturação do oócito à medida que essa célula germinativa e seus descendentes dividemse repetidamente a mitocôndria com defeito se replica e os membros de sua progênie todos defeituosos são aleatoriamente distribuídos entre as célulasfilhas Em certo ponto o óvulo maduro contém diferentes proporções da mitocôndria defeituosa Quando um óvulo é fertilizado e sofre as muitas divisões do desenvolvimento embrionário as células somáticas resultantes diferem na proporção de mito côndrias mutantes Figura 1943a Essa heteroplasmia ao contrário da homoplasmia na qual todo o genoma mi tocondrial em toda a célula é o mesmo resulta em fenóti pos mutantes com graus variáveis de gravidade Células e tecidos que contêm principalmente mitocôndrias do tipo selvagem sem mutação têm o fenótipo normal elas são essencialmente normais Outras células heteroplásmicas te rão fenótipos intermediários algumas sendo quase normais outras com grande proporção de mitocôndrias mutantes anormais Figura 1941b Se o fenótipo anormal estiver associado a alguma doença ver a seguir pessoas com a mesma mutação de DNAmt podem apresentar sintomas da doença com diferente gravidade dependendo do número e da distribuição das mitocôndrias afetadas Algumas mutações nos genomas mitocondriais causam doenças Um número crescente de doenças humanas foi atri buído a mutações nos genes mitocondriais que redu zem a capacidade da célula de produzir ATP Alguns tipos de células e de tecidos neurônios miócitos dos músculos cardíaco e esquelético e células b do pâncreas são menos capazes do que outros de tolerar uma produção reduzida de ATP sendo portanto mais afetados por mutações nas pro teínas mitocondriais Um grupo de doenças genéticas conhecidas como en cefalomiopatias mitocondriais afeta principalmente o encéfalo e o músculo esquelético Essas doenças são invariavelmente herdadas da mãe porque conforme ob servado anteriormente todas as mitocôndrias de um em brião em desenvolvimento derivam do óvulo A doença rara neuropatia óptica hereditária de Leber LHON de Lebers hereditary optic neuropathy afeta o siste ma nervoso central incluindo os nervos ópticos causan do a perda bilateral da visão em jovens adultos Uma única mudança em uma base no gene mitocondrial ND4 Figura 1940a muda um resíduo de Arg para um resíduo de His em um polipeptídeo do complexo I e o resultado são mito côndrias parcialmente defeituosas na transferência de elé trons do NADH à ubiquinona Embora essas mitocôndrias possam produzir algum ATP pela transferência de elétrons a partir do succinato elas aparentemente não suprem ATP FIGURA 1943 Heteroplasmia em genomas mitocondriais a Quan do um óvulo maduro é fertilizado todas as mitocôndrias na célula diploide resultante zigoto são de origem materna nenhuma vem do espermatozoi de Se uma fração das mitocôndrias maternais tem um gene mutante a dis tribuição aleatória das mitocôndrias durante divisões celulares subsequentes produz algumas célulasfilhas com predomínio de mitocôndrias mutantes algumas contendo principalmente mitocôndrias do tipo selvagem e algu mas intermediárias assim as célulasfilhas mostram graus variáveis de he teroplasmia b Diferentes graus de heteroplasmia produzem diferentes fenótipos celulares Este corte do tecido muscular humano é de uma pessoa com citocromooxidase defeituosa As células foram coradas para tornar as células do tipo selvagem azuis e as células com citocromooxidase defei tuosa marrons Conforme mostra a micrografia células diferentes no mesmo tecido são afetadas em graus diferentes pela mutação mitocondrial Principalmente mutante Principalmente do tipo selvagem Totalmente do tipo selvagem As células duplicam e se dividem A célula se divide Os conteúdos dobram Mitocôndrias mutantes Mitocôndrias do tipo selvagem Célulasfilhas Célula parental Homoplasmia Heteroplasmia a b Nelson6edbookindb 767 Nelson6edbookindb 767 030414 0745 030414 0745 768 DAVID L NELSON MICHAEL M COX suficiente para sustentar o metabolismo muito ativo dos neurônios O resultado é a lesão do nervo óptico levando à cegueira Uma única mudança em uma base do gene mi tocondrial do citocromo b um componente do complexo III também produz LHON demonstrando que a patologia resulta de uma redução geral da função mitocondrial não especificamente de um defeito na transferência de elétrons pelo complexo I Uma mutação em ATP6 que afeta o poro de prótons na ATPsintase leva a baixas velocidades de síntese de ATP enquanto mantém a cadeia respiratória intacta O estresse oxidativo devido ao suprimento continuado de elétrons do NADH aumenta a produção de ERO e o dano às mitocôn drias causado por essas espécies estabelece um ciclo vicio so Uma a cada duas pessoas com este gene mutante morre dias ou meses após seu nascimento A doença da epilepsia mioclônica e fibra verme lha rota MERRF de myoclonic epilepsy and ragged red fiber disease é causada por uma mutação no gene mitocondrial que codifica um tRNA específico para lisina tRNA Lys Essa doença caracterizada por contrações mus culares abruptas involuntárias aparentemente resulta da produção defeituosa de várias das proteínas que requerem tRNA mitocondrial para suas sínteses Fibras musculares esqueléticas de pessoas com MERRF têm mitocôndrias com formato anormal que às vezes contêm estruturas paracris talinas Figura 1940b Acreditase que outras mutações nos genes mitocondriais sejam responsáveis pela fraqueza muscular progressiva que caracteriza a miopatia mitocon drial e pela hipertrofia e deterioração do músculo cardíaco na miocardiopatia hipertrófica De acordo com uma hipó tese sobre as mudanças progressivas que acompanham o envelhecimento o acúmulo de mutações no DNAmt duran te uma vida de exposição a agentes capazes de danificar o DNA como O2 2 resulta em mitocôndrias que não podem suprir ATP suficiente para o funcionamento celular normal Doenças mitocondriais também podem resultar de muta ções em qualquer dos 1100 genes nucleares que codifi cam proteínas mitocondriais O diabetes pode resultar de defeitos nas mitocôndrias de células b pancreáticas O mecanismo que regula a liberação de insulina de cé lulas b pancreáticas está atrelado à concentração de ATP nestas células Quando a glicose sanguínea está alta as células b absorvem glicose e a oxidam por glicólise e ciclo do ácido cítrico aumentando a ATP acima de um nível crí tico Figura 1944 Quando a ATP excede este limiar um canal de K 1 sensível a ATP na membrana plasmática se fecha despolarizando a membrana e desencadeando a libe ração de insulina ver Figura 2327 As células b pancreá ticas com defeitos na fosforilação oxidativa não podem au mentar a ATP acima desse limiar e a falha resultante na liberação de insulina efetivamente produz o diabetes Por exemplo defeitos nos genes para glicocinase a isoenzima hexocinase IV presente em células b levam a uma forma rara de diabetes MODY2 ver Quadro 153 a baixa ativi dade da glicocinase impede a produção de ATP acima do valor crítico bloqueando a secreção de insulina Mutações nos genes mitocondriais de tRNA Lys e tRNA Leu também com prometem a produção mitocondrial de ATP e o diabetes melito tipo 2 é comum entre pessoas com esses defeitos embora esses casos constituam uma fração muito pequena de todos os casos de diabetes Quando a nicotinamidanucleotídeotransidrogenase que é parte da defesa mitocondrial contra ERO ver Figu ra 1918 é geneticamente defeituosa o acúmulo de ERO danifica as mitocôndrias diminuindo a produção de ATP e bloqueando a liberação de insulina pelas células b Figura 1944 Os danos causados pelas ERO incluindo dano ao DNAmt também podem estar por trás de outras doenças humanas existe alguma evidência de seu envolvimento nas doenças de Alzheimer Parkinson e Huntington e na falên cia cardíaca assim como no envelhecimento RESUMO 195 Genes mitocondriais suas origens e efeitos das mutações c Uma pequena proporção das proteínas mitocondriais humanas 13 ao todo é codificada pelo genoma mito condrial e sintetizada nas mitocôndrias Cerca de 1100 proteínas mitocondriais são codificadas nos genes nu cleares e importadas para as mitocôndrias depois de suas sínteses c As mitocôndrias surgiram de bactérias aeróbias que entraram em relação endossimbiótica com eucariotos ancestrais Transportador de glicose Sangue Glicose Sangue Secreção de insulina Glicose Piruvato Respiração CO2 Célula b pancreática Canal de K controlado por ATP ATP K Ca2 Ca2 Canal de Ca2 controlado por voltagem Grânulos de insulina K O ATP fecha o canal de K a despolarização resultante abre o canal de Ca2 FIGURA 1944 A fosforilação oxidativa defeituosa em células b pan creáticas bloqueia a secreção de insulina Na situação normal desta cada aqui quando a glicose sanguínea aumenta a produção de ATP nas células b aumenta O ATP bloqueando canais de K 1 despolariza a membra na plasmática e assim abre os canais de Ca 21 controlados por voltagem O influxo de Ca 21 resultante desencadeia a exocitose de vesículas secretoras contendo insulina liberando este hormônio Quando a fosforilação oxidativa em células b é defeituosa a ATP nunca é suficiente para desencadear este processo e a insulina não é liberada Nelson6edbookindb 768 Nelson6edbookindb 768 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 769 c As mutações no genoma mitocondrial se acumulam ao longo da vida do organismo Mutações nos genes que co dificam os componentes da cadeia respiratória da ATP sintase e do sistema de captura de ERO e mesmo dos genes de tRNA podem causar uma variedade de doen ças humanas que com frequência afetam mais grave mente o músculo o coração as células b pancreáticas e o encéfalo FOTOSSÍNTESE CAPTURANDO ENERGIA LUMINOSA Agora será apresentada outra sequência de reações na qual o fluxo de elétrons está acoplado à síntese de ATP a fosfori lação utilizando a energia da luz A captura da energia solar por organismos fotossintéticos e sua conversão na energia química de compostos orgânicos reduzidos é a fonte elemen tar de quase toda a energia biológica da Terra Organismos fotossintéticos e heterotróficos vivem em um equilíbrio de estado estacionário na biosfera Figura 1945 Os orga nismos fotossintéticos capturam a energia solar e formam ATP e NADPH usados como fonte de energia para sintetizar carboidratos e outros compostos orgânicos a partir de CO2 e H2O simultaneamente eles liberam O2 na atmosfera Heteró trofos aeróbios p ex humanos assim como plantas durante períodos escuros usam o O2 formado desse modo para de gradar os produtos orgânicos ricos em energia da fotossínte se em CO2 e H2O gerando ATP O CO2 retorna à atmosfera para ser usado novamente pelos organismos fotossintéticos Assim a energia solar fornece a força propulsora para a ci clagem contínua de CO2 e O2 na biosfera fornecendo tam bém os substratos reduzidos combustíveis como a glicose dos quais dependem os organismos não fotossintéticos A fotossíntese ocorre em uma variedade de bacté rias e em eucariotos unicelulares algas assim como em plantas Embora o processo nesses organismos difira nos detalhes os mecanismos básicos são notavelmente seme lhantes e boa parte da compreensão da fotossíntese em plantas vasculares deriva do estudo de organismos mais simples A equação geral da fotossíntese em plantas des creve uma reação de oxidaçãoredução na qual H2O doa elétrons como hidrogênio para a redução de CO2 a car boidrato CH2O CO2 1 H2O O2 1 CH2O luz 196 Características gerais da fotofosforilação Ao contrário do NADH o principal doador de elétrons na fosforilação oxidativa a H2O é uma fraca doadora de elétrons o seu potencial de redução padrão é de 0816 V comparado com 20320 V para NADH A fotofosforilação difere da fosforilação oxidativa por requerer o acréscimo de energia na forma de luz para criar um bom doador de elétrons e um bom aceptor de elétrons ver Figura 191 Na fotofosforilação os elétrons fluem por uma série de carregadores ligados a membranas incluindo citocromos quinonas e proteínas ferroenxofre enquanto prótons são bombeados através de uma membrana para criar um po tencial eletroquímico A transferência de elétrons e o bom beamento de prótons são catalisados por complexos de membrana análogos em estrutura e função ao complexo III das mitocôndrias O potencial eletroquímico que eles pro duzem é a força propulsora para a síntese de ATP a partir de ADP e Pi catalisada por um complexo de ATPsintase ligado à membrana muito similar àquele de mitocôndrias e bactérias A fotossíntese em plantas engloba dois processos as reações dependentes de luz ou reações luminosas que ocorrem apenas quando as plantas são iluminadas e as reações de assimilação de carbono ou reações de fixação de carbono algumas vezes equivocadamen te chamadas de reações de fase escura propiciadas pelos produtos das reações de luz Figura 1946 Nas reações luminosas a clorofila e outros pigmentos de células fotos sintéticas absorvem energia luminosa e a conservam como ATP e NADPH simultaneamente O2 é liberado Nas rea ções de assimilação de carbono ATP e NADPH são usados para reduzir CO2 para formar triosesfosfato amido e sa carose e outros produtos deles derivados Neste capítulo serão apresentadas somente as reações dependentes de luz que levam à síntese de ATP e NADPH A redução do CO2 é descrita no Capítulo 20 A fotossíntese em plantas ocorre nos cloroplastos Em células eucarióticas fotossintéticas tanto as reações dependentes de luz quanto as de assimilação de carbono ocorrem nos cloroplastos Figura 1947 organelas in tracelulares variáveis em forma e geralmente com poucos micrômetros de diâmetro Da mesma forma que as mito côndrias eles são circundados por duas membranas uma membrana externa permeável a pequenas moléculas e íons e uma membrana interna que delimita o comparti mento interno Esse compartimento contém muitas vesí Células fotossintéticas Células heterotróficas O2 Carboidrato CO2 H2O FIGURA 1945 A energia solar como a fonte elementar de toda a energia biológica Os organismos fotossintéticos utilizam a energia da luz do sol para produzir glicose e outros produtos orgânicos os quais as células heterotróficas usam como fontes de energia e de carbono Nelson6edbookindb 769 Nelson6edbookindb 769 030414 0745 030414 0745 770 DAVID L NELSON MICHAEL M COX culas ou sacos achatados circundados por membranas os tilacoides comumente arranjados em pilhas chamadas de grana Figura 1947b Embebidos nas membranas tilacoi des comumente chamadas de lamelas estão os pigmen tos fotossintéticos e os complexos enzimáticos que realizam as reações luminosas e a síntese de ATP O estroma a fase aquosa delimitada pela membrana interna contém a maio ria das enzimas necessárias para as reações de assimilação de carbono A luz impulsiona o fluxo de elétrons nos cloroplastos Em 1937 Robert Hill verificou que quando extratos de fo lhas contendo cloroplastos eram iluminados eles 1 libe ravam O2 e 2 reduziam um aceptor de elétrons não bioló gico adicionado ao meio de acordo com a reação de Hill 2H2O 1 2A 2AH2 1 O2 luz onde A é o aceptor artificial de elétrons ou o reagente de Hill Um reagente de Hill o corante 26diclorofenolindofe nol é azul quando oxidado A e incolor quando reduzido AH2 tornando a reação fácil de ser acompanhada OH Forma reduzida incolor Forma oxidada azul Diclorofenolindofenol OH O OH N Cl Cl Cl Cl NH Quando um extrato foliar suplementado com o corante foi iluminado o corante azul se tornou incolor e O2 foi libe rado No escuro nem a liberação de O2 e nem a redução do corante aconteceram Essa foi a primeira evidência de que a energia luminosa absorvida faz os elétrons fluirem da água para um aceptor de elétrons Além disso Hill constatou que o CO2 não era necessário e nem reduzido a uma forma está vel sob essas condições a liberação de O2 podia ser disso ciada da redução do CO2 Vários anos depois Severo Ochoa mostrou que o NADP 1 é o aceptor biológico de elétrons nos cloroplastos de acordo com a equação 2H2O 1 2NADP 1 2NADPH 1 2H 1 1 O2 luz Para compreender esse processo fotoquímico precisase primeiro considerar o tópico mais geral dos efeitos da ab sorção de luz na estrutura molecular RESUMO 196 Características gerais da fotofosforilação c A fotossíntese ocorre nos cloroplastos de algas e plan tas estruturas delimitadas por membranas duplas e preenchidas com discos membranosos empilhados membranas tilacoides que contêm a maquinaria fo tossintética c As reações luminosas da fotossíntese são aquelas que dependem diretamente da absorção de luz a fotoquími ca resultante retira elétrons de H2O e direcionaos por NADPH H2O O2 Reações luminosas NADP1 ADP 1 Pi ATP Reações de assimilação de carbono Carboidrato CO2 FIGURA 1946 As reações luminosas da fotossíntese geram NADPH e ATP ricos em energia às custas da energia solar NADPH e ATP são usados nas reações de assimilação de carbono que ocorrem na luz ou na escuridão para reduzir CO2 para formar trioses e compostos mais complexos como glicose derivados das trioses Grana tilacoides Membrana externa Membrana interna Estroma b a FIGURA 1947 Cloroplasto a Diagrama esquemático b Micrografia eletrônica em alto aumento mostrando os grana pilhas de membranas ti lacoides Nelson6edbookindb 770 Nelson6edbookindb 770 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 771 meio de uma série de carregadores ligados à membrana produzindo NADPH e ATP c As reações de assimilação de carbono da fotossínte se reduzem o CO2 com os elétrons do NADPH e com a energia do ATP formando trioses hexoses e uma ampla variedade de carboidratos delas derivados 197 Absorção de luz A luz visível é a radiação eletromagnética de comprimentos de onda de 400 a 700 nm uma pequena parte do espectro eletromagnético Figura 1948 variando do violeta ao vermelho A energia de um único fóton um quantum de luz é maior na extremidade violeta do espectro do que na extremidade vermelha comprimentos de onda mais curtos e com maior frequência correspondem a uma maior ener gia A energia E de um único fóton de luz visível é dada pela equação de Planck E 5 hv 5 hcl onde h é a constante de Planck 6626 3 10 234 J s v é a frequência da luz em cicloss c é a velocidade da luz 300 3 10 8 ms e l é o comprimento de onda em metros A energia de um fóton de luz visível varia de 150 kJeinstein para luz vermelha até 300 kJeinstein para luz violeta PROBLEMA RESOLVIDO 193 A energia de um fóton A luz utilizada pelas plantas vasculares para a fotossíntese tem um comprimento de onda de cerca de 700 nm Calcule a energia em um mol de fótons um einstein de luz desse comprimento de onda e compare com a energia necessária para sintetizar um mol de ATP Solução A energia em um único fóton é dada pela equação de Planck Em um comprimento de onda de 700 3 10 29 m a energia de um fóton é Um einstein de luz é o número de Avogadro 6022 3 10 23 de fótons assim a energia de um einstein de fótons a 700 nm é dada por 284 3 10 219 Jfóton 6022 3 10 23 fótonseinstein 5 171 3 10 4 Jeinstein 5 171 kJeinstein Assim um mol de fótons de luz vermelha tem cerca de cinco vezes a energia necessária para produzir um mol de ATP a partir de ADP e Pi 305 kJmol Quando um fóton é absorvido um elétron na molécula que absorve cromóforo é elevado para um nível de maior energia Esse é um evento tudo ou nada para ser absor vido o fóton precisa conter a quantidade de energia um quantum que se ajusta exatamente à energia da transição eletrônica Uma molécula que absorve um fóton está em estado excitado que geralmente é instável Um elétron elevado a um orbital de maior energia em geral retorna rapi damente a seu orbital de menor energia a molécula excita da decai para o estado basal estável liberando o quantum absorvido na forma de luz ou calor ou utilizandoo para rea lizar trabalho químico A emissão de luz que acompanha o decaimento de moléculas excitadas chamado de fluores cência está sempre em um comprimento de onda maior menor energia do que aquele da luz absorvida ver Qua dro 123 Um modo alternativo de decaimento importante na fotossíntese envolve a transferência direta de energia de excitação de uma molécula excitada para uma molécula vi zinha Da mesma forma que o fóton é um quantum de ener gia luminosa o éxciton é o quantum de energia passada de uma molécula excitada para outra molécula no processo chamado de transferência de éxciton As clorofilas absorvem energia luminosa para a fotossíntese Os pigmentos absorvedores de luz mais importantes nas membranas tilacoides são as clorofilas pigmentos verdes com estruturas policíclicas planares lembrando a protopor firina da hemoglobina ver Figura 51 exceto que o Mg 21 e não o Fe 21 ocupa a posição central Figura 1949 Os quatro átomos de nitrogênio orientados para dentro da clo 380 Anil Azul Violeta Verde Amarelo Cor de laranja Vermelho Comprimento de onda nm Energia kJeinstein 300 430 500 560 600 650 750 240 200 170 Comprimento de onda Tipo de radiação Raios gama Luz visível Raios X UV Infra vermelho Microondas Ondas de rádio Milhares de metros 1 milímetro 1 metro 1 nm 100 nm FIGURA 1948 Radiação eletromagnética O espectro da radiação eletromagnética e a energia de fótons na faixa do visível Um einstein é 6022 3 10 23 fótons Nelson6edbookindb 771 Nelson6edbookindb 771 030414 0745 030414 0745 772 DAVID L NELSON MICHAEL M COX rofila estão coordenados com o Mg 21 Todas as clorofilas têm uma longa cadeia lateral de fitol esterificada a um grupo carboxil substituinte no anel IV e as clorofilas também têm um quinto anel de cinco membros ausente no heme O sistema heterocíclico de cinco anéis que circunda o Mg 21 tem uma estrutura estendida de polieno com ligações simples e duplas alternadas Tais polienos mostram carac teristicamente forte absorção na região visível do espectro Figura 1950 as clorofilas têm coeficientes de extinção molar excepcionalmente altos ver Quadro 31 sendo portanto particularmente bem aptas a absorver a luz visível durante a fotossíntese Os cloroplastos sempre contêm tanto clorofila a quanto clorofila b Figura 1949a Embora ambas sejam verdes os seus espectros de absorção são suficientemente diferentes Figura 1950 de modo a complementarem a faixa de ab CH2 N Mg H O C I II III IV H H CH2 CH3 CH2 CH3 CH CH3 N N N CH3 O CH3 O CH2 O C O CH2 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Cadeia lateral de fitol bcaroteno O C CH3 Em bacterioclorofila CHO em clorofila b Ligação saturada em bacterioclorofila CH3 CH3 CH3 H3C CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Ficoeritrobilina COO2 N CH3 CH3 CH2 COO2 CH2 CH2 CH3 CH2 N H N H CH3 CH O ƒ CH3 N H CH3 CH O Ligação insaturada em ficocianobilina Em ficocianobilina CH2 CH3 Clorofila a a b c Luteína xantofila CH OH 3 H C 3 H C 3 H3C CH3 CH3 CH3 CH HO 3 CH3 CH3 d FIGURA 1949 Fotopigmentos primários e secundários a Clorofilas a e b e bacterioclorofila são os coletores primários de energia luminosa b Ficoeritrobilina e ficocianobilina ficobilinas são os pigmentos antenas em cianobactérias e algas vermelhas c bCaroteno carotenoide e d luteína uma xantofila são pigmentos acessórios em plantas Os sistemas conjuga dos ligações simples e duplas alternadas nestas moléculas são os grandes responsáveis pela absorção da luz visível Nelson6edbookindb 772 Nelson6edbookindb 772 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 773 sorção de luz uma da outra na região visível A maioria das plantas contém duas vezes mais clorofila a do que clorofila b Os pigmentos em algas e em bactérias fotossintéticas in cluem clorofilas que diferem apenas levemente dos pigmen tos das plantas A clorofila está sempre associada a proteínas específicas de ligação formando complexos coletores de luz LHC de lightharvesting complexes nos quais as moléculas de clorofila estão fixas em relação umas às outras a outros complexos proteicos e à membrana Um complexo coletor de luz LHCII Figura 1951 contém sete moléculas de clorofila a cinco de clorofila b e duas do pigmento acessó rio luteína ver a seguir As cianobactérias e as algas vermelhas utilizam ficobili nas como ficoeritrobilina e ficocianobilina Figura 1949b como seus pigmentos de captura de luz Esses tetrapirróis de cadeia aberta têm o sistema de polieno estendido encon trado nas clorofilas mas não sua estrutura cíclica e seu Mg 21 central As ficobilinas são covalentemente ligadas a proteínas específicas de ligação formando ficobiliproteínas que se associam em complexos altamente ordenados chamados de ficobilissomos Figura 1952 que constituem as estrutu ras primárias de coleta de luz nesses microrganismos Os pigmentos acessórios estendem a faixa de absorção de luz Além das clorofilas as membranas tilacoides contêm pig mentos secundários de absorção de luz ou pigmentos acessórios chamados de carotenoides Os carotenoides podem ser de cor amarela vermelha ou púrpura Os mais importantes são o bcaroteno isoprenoide laranjaaver melhado e o carotenoide amarelo luteína Figura 1949c d Os pigmentos carotenoides absorvem luz em compri mentos de onda não absorvidos pelas clorofilas Figura 19 50 sendo assim receptores de luz suplementares Absorção 300 Luz solar atingindo a terra Comprimento de onda nm 400 500 600 700 Clorofila b bCaroteno Ficocianina Clorofila a Ficoeritrina Luteína 800 FIGURA 1950 Absorção de luz visível por fotopigmentos As plantas são verdes porque seus pigmentos absorvem luz das regiões azul e vermelha do espectro deixando principalmente a luz verde para ser refletida Compare os espectros de absorção dos pigmentos com o espectro da luz solar que chega na superfície da terra a combinação de clorofilas a e b e pigmentos acessórios possibilita às plantas coletar a maior parte da energia disponível na luz solar As quantidades relativas de clorofilas e pigmentos acessórios são ca racterísticas de uma espécie vegetal em particular A variação na proporção desses pigmentos é responsável pela gama de cores dos organismos fotos sintéticos do profundo verde azulado das acículas de abeto ao verde mais verde das folhas de plátano à cor vermelha marrom ou púrpura de algumas espécies multicelulares de algas e das folhas de algumas folhagens cultiva das por jardineiros Clorofila a Clorofila b Luteína FIGURA 1951 Um complexo coletor de luz LHCII PDB ID 2BHW A unidade funcional é um trímero LHC com 36 moléculas de clorofila e 6 de luteína Ilustrado aqui está um monômero visto no plano da membrana com seus três segmentos ahelicoidais transmembrana sete moléculas de clorofila a em verdeclaro cinco moléculas de clorofila b em verdeescuro e duas moléculas do pigmento acessório luteína em amarelo que formam uma braçadeira interna em cruz Nelson6edbookindb 773 Nelson6edbookindb 773 030414 0745 030414 0745 774 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A determinação experimental da efetividade da luz de diferentes cores em promover a fotossíntese gera um es pectro de ação Figura 1953 normalmente útil na identificação do pigmento primariamente responsável por um efeito biológico da luz Captando luz na região do es pectro não utilizada por outros organismos um organismo fotossintético pode ocupar um nicho ecológico singular Por exemplo as ficobilinas nas algas vermelhas e nas cianobac térias absorvem luz na faixa de 520 a 630 nm Figura 19 50 o que permite que ocupem nichos nos quais a luz de comprimentos de onda mais baixos ou mais altos foi filtrada pelos pigmentos de outros organismos que vivem na água acima delas ou pela própria água A clorofila canaliza a energia absorvida para os centros de reação pela transferência de éxcitons Os pigmentos absorvedores de luz das membranas tilacoi des ou bacterianas estão arranjados em estruturas funcio nais denominadas fotossistemas Em cloroplastos de espi nafre por exemplo cada fotossistema contém cerca de 200 moléculas de clorofila e 50 de carotenoides Todas as molé culas de pigmentos em um fotossistema podem absorver fó tons mas apenas poucas moléculas de clorofila associadas ao centro de reação fotoquímica são especializadas na transdução de luz em energia química As outras moléculas de pigmento em um fotossistema são chamadas de molécu las coletoras de luz ou antenas moleculares Elas ab sorvem a energia luminosa e a transmitem de modo rápido e eficiente ao centro de reação Figura 1954 As moléculas de clorofila nos complexos coletores de luz têm propriedades de absorção de luz que são sutilmen te diferentes daquelas da clorofila livre Quando moléculas de clorofila isoladas in vitro são excitadas pela luz a ener gia absorvida é rapidamente liberada como fluorescência e calor mas quando a clorofila em folhas intactas é excita da pela luz visível Figura 1955 etapa ➊ muito pouca fluorescência é observada Em vez disso a clorofila excita da que funciona como antena molecular transfere energia diretamente a uma molécula de clorofila vizinha a qual se torna excitada à medida que a primeira molécula retorna ao seu estado basal etapa ➋ Essa transferência de energia a transferência de éxciton se estende a uma terceira quarta ou subsequente vizinha até que uma de um par especial de Clorofila a do centro de reação Membrana tilacoide Transfe rência de éxciton 480570 nm FC FE FE FC 550650 nm Luz AF AF FIGURA 1952 Um ficobilissomo Nestes conjuntos altamente estrutu rados encontrados em cianobactérias e algas vermelhas os pigmentos fi cobilinas ligados a proteínas específicas formam complexos chamados de ficoeritrina FE ficocianina FC e aloficocianina AF A energia dos fótons absorvidos por FE ou FC é conduzida por meio de AF proteína ligadora de ficocianobilina para a clorofila a do centro de reação por transferência de éxcitons processo discutido no texto a 400 20 Taxa relativa de fotossíntese Comprimento de onda nm 40 60 80 100 0 500 600 700 b FIGURA 1953 Duas formas de determinar o espectro de ação para a fotossíntese a Resultados de um experimento clássico realizado por T W Englemann em 1882 para determinar o comprimento de onda da luz mais efetivo em sustentar a fotossíntese Englemann colocou células de uma alga fotossintética filamentosa em uma lâmina de microscópio e a iluminou com a luz de um prisma de modo que parte do filamento recebia principal mente luz azul outra parte amarela outra vermelha Para determinar quais as células da alga que realizavam fotossíntese mais ativamente Englemann também colocou sobre a lâmina de microscópio bactérias conhecidas por migrar em direção a regiões de alta concentração de O2 Depois de um pe ríodo de iluminação a distribuição das bactérias mostrou os maiores níveis de O2 produzido pela fotossíntese nas regiões iluminadas com luz violeta e vermelha b Resultados de um experimento similar que usa técnicas modernas eletrodo de oxigênio para medir a produção de O2 Um espectro de ação como mostrado aqui descreve a taxa relativa de fotossíntese para a ilumi nação com um número constante de fótons de diferentes comprimentos de onda Um espectro de ação é útil porque em comparação com espectros de absorção como aqueles na Figura 1950 ele sugere quais pigmentos podem canalizar energia para a fotossíntese Nelson6edbookindb 774 Nelson6edbookindb 774 030414 0745 030414 0745 PRINCIPIOS DE BIOQUMICA DE LEHNINGER 775 we 2 s Oe 6 De 3 Gee sae ee Smee bd bo AE oR aco PLLA a a liam 4 i 1 f il Moléculas Clorofila do PO I PA OO ARSC daantena centro de reacao aa ST Estas moléculas Aluzexcita uma molécula Clorofilas antenas absorvem energia de antena clorofila ou ligadas a proteina luminosa pigmento acessorio transferindoa entre elevando o elétron a um Carotenoides outros as moléculas até nivel maior de energia Luz pigmentos acessorios que ela atinja 0 centro de reacao oe e yi Ps ee lp oS ies i 1 CO a a a Oe iN i i on 1 ft f Amolécula excitada da antena passa YI 1 al energia para uma molécula vizinha de ii r an Ai j i clorofila transferéncia de éxciton A excitandoa IDO TCO EOE OCOCROORO a Centro de reacao 7 L A reacao fotoquimica converte aqui a energia de um féton em uma separacao de cargas iniciando um fluxo de elétrons s FIGURA 1954 Organizacao dos fotossistemas nas membranas tila Esta energia é transferida para uma clorofila do coides Os fotossistemas sao firmemente empacotados na membrana ti centro de reacdo excitandoa Aceptor de lacoide com varias centenas de clorofilas e pigmentos acessdrios do tipo elétrons antena circundando um centro de fotorreacgao A absorao de um féton por qualquer uma das clorofilas antenas leva a excitacgao do centro de reacgao por transferéncia de éxcitons seta vermelha Também embebidos na membra na tilacoide estado o complexo de citocromos bfe a ATPsintase ver Figura Eo 1961 moléculas de clorofila a no centro de reagao fotoquimica Aclorofila excitada do centro de reacdo passa um seja excitada etapa Nessa molécula excitada de cloro elétron para um aceptor de elétrons fila um elétron é promovido a um orbital de maior energia Esse elétron passa entao a um aceptor de elétrons proximo ME Ss que é parte da cadeia de transferéncia de elétrons deixan a L do a clorofila do centro de reagao com um elétron a menos um buraco eletronico indicado por na Figura 1955 etapa O aceptor de elétrons adquire uma carga negati Cl va nessa transacao O elétron perdido pela clorofila do cen Doador de tro de reacgao é reposto por um elétron de uma molécula Oburaco eletrénico no centro de reagao é elétrons doadora de elétrons vizinha etapa a qual entao se tor preenchido por um elétron fornecido por um doador de elétrons F FIGURA 1955 Exciton e transferéncia de elétrons Este esquema ge se ral mostra a conversdo da energia de um féton absorvido na separacao de cargas no centro de reacao As etapas sao adicionalmente descritas no texto SI Observe que a etapa pode se repetir entre moléculas sucessivas da antena até que o éxciton atinja uma clorofila do centro de reacao O asterisco A absorao de um foton causou uma representa o estado excitado de uma molécula separacao de cargas no centro de reacao 776 DAVID L NELSON MICHAEL M COX na positivamente carregada Dessa forma a excitação pela luz causa separação de cargas elétricas e inicia uma cadeia de oxidaçãoredução RESUMO 197 Absorção de luz c Um fóton de luz visível tem energia suficiente para de sencadear reações fotoquímicas que em organismos fo tossintéticos acabam levando à síntese de ATP c Nas reações de luz das plantas a absorção de um fó ton excita as moléculas de clorofila e outros pigmentos acessórios os quais canalizam a energia para os cen tros de reação nas membranas tilacoides Nos centros de reação a fotoexcitação resulta em uma separação de cargas que produz um forte doador de elétrons agente redutor e um forte aceptor de elétrons 198 Evento fotoquímico central fluxo de elétrons promovido pela luz A transferência de elétrons promovida pela luz em cloro plastos vegetais durante a fotossíntese é realizada por siste mas multienzimas na membrana tilacoide A visão atual dos mecanismos fotossintéticos é uma composição elaborada a partir de estudos de cloroplastos de plantas e de uma va riedade de algas e bactérias A determinação das estrutu ras moleculares dos complexos fotossintéticos bacterianos por cristalografia por raios X forneceu uma compreensão muito mais aprimorada dos eventos moleculares na fotos síntese em geral As bactérias têm apenas um de dois tipos de centros de reação fotoquímicos Uma importante contribuição dos estudos de bactérias fo tossintéticas surgiu em 1952 quando Louis Duysens verifi cou que a iluminação de membranas fotossintéticas da bac téria púrpura Rhodospirillum rubrum com um pulso de luz de um comprimento de onda específico 870 nm cau sava um decréscimo temporário na absorção de luz naquele comprimento de onda um pigmento era descorado por luz de 870 nm Estudos posteriores de Bessel Kok e Horst Witt mostraram descoloração similar de pigmentos de clo roplastos vegetais por luz de 680 e 700 nm Além disso a adição do aceptor de elétrons não biológico FeCN6 32 ferricianeto causou a descoloração nestes comprimentos de onda sem iluminação Esses achados indicaram que a descoloração de pigmentos se devia à perda de um elétron de um centro de reação fotoquímico Os pigmentos foram denominados de acordo com o comprimento de onda de maior descoloração P870 P680 e P700 As bactérias fotossintéticas têm uma maquinaria de fototransdução relativamente simples com um de dois ti pos gerais de centros de reação Um tipo encontrado em bactérias púrpuras passa elétrons por meio da feofitina clorofila sem o íon central de Mg 21 para uma quinona O outro tipo em bactérias verdes sulfurosas passa elétrons por meio de uma quinona para um centro de ferroenxofre As cianobactérias e as plantas têm dois fotossistemas PSI e PSII um de cada tipo atuando em sequência Estudos bioquímicos e biofísicos revelaram muitos dos detalhes moleculares dos centros de reação das bactérias servindo assim como protótipos para o sistema mais complexo de fo totransdução das plantas O centro de reação feofitinaquinona centro de reação tipo II A maquinaria fotossintética em bactérias púrpuras consiste em três módulos básicos Figura 1956a um único cen tro de reação P870 um complexo de transferência de elé trons o citocromo bc1 similar ao complexo III da cadeia mi tocondrial de transferência de elétrons e uma ATPsintase também similar àquela das mitocôndrias A iluminação im pulsiona os elétrons pela feofitina e de uma quinona para o complexo de citocromos bc1 Depois de passarem pelo com plexo os elétrons fluem pelo citocromo c2 de volta ao cen tro de reação restabelecendo o seu estado préiluminação Esse fluxo cíclico de elétrons promovido pela luz fornece a energia para o bombeamento de prótons pelo complexo de citocromos bc1 Energizada pelo gradiente de prótons re sultante a ATPsintase produz ATP exatamente como nas mitocôndrias As estruturas tridimensionais dos centros de reação das bactérias púrpuras Rhodopseudomonas viridis e Rhodo bacter sphaeroides deduzidas a partir da cristalografia de raios X esclareceu como ocorre a fototransdução em um centro de reação feofitinaquinona O centro de reação de R viridis Figura 1957a é um grande complexo protei co que contém quatro subunidades de polipeptídeos e 13 cofatores dois pares de clorofilas bacterianas um par de feofitinas duas quinonas um ferro não heme e quatro he mes no citocromo tipo c associado A sequência extremamente rápida de transferências de elétrons mostrada na Figura 1957b foi deduzida a partir de estudos físicos dos centros feofitinaquinona bacterianos usando breves flashes de luz para desencadear a fototrans dução e uma variedade de técnicas espectroscópicas para acompanhar o fluxo de elétrons por meio de vários carrega dores Um par de bacterioclorofilas o par especial cha mado de Clo2 é o sítio da fotoquímica inicial no centro de reação bacteriano A energia de um fóton absorvido por uma das muitas moléculas de clorofila antena que circun dam o centro de reação atinge Clo2 por transferência de éxcitons Quando essas duas moléculas de clorofila tão próximas que seus orbitais de ligação se sobrepõem ab sorvem um éxciton o potencial redox de Clo2 é deslocado em uma quantidade equivalente à energia do fóton conver tendo o par especial em um doador de elétrons muito forte O Clo2 doa um elétron que passa por meio de um monô mero vizinho de clorofila para a feofitina Feo Isso produz dois radicais um positivamente carregado o par especial de clorofilas e um negativamente carregado a feofitina Clo2 1 1 éxciton Clo2 excitação Clo2 1 Feo Clo2 1 1 Feo 2 separação de cargas O radical feofitina passa agora o seu elétron para uma molé cula de quinona firmemente ligada QA convertendoa em Nelson6edbookindb 776 Nelson6edbookindb 776 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 777 um radical semiquinona que imediatamente doa o seu elé tron extra para uma segunda quinona frouxamente ligada QB Duas transferências de elétrons desse tipo convertem QB em sua forma totalmente reduzida QBH2 que está livre para se difundir na bicamada da membrana afastandose do centro de reação 2 Feo 2 1 2H 1 1 QB 2Feo 1 QBH2 redução da quinona A hidroquinona QBH2 carregando em suas ligações quí micas parte da energia dos fótons que originalmente exci taram P870 ingressa no conjunto pool de quinonas re duzidas QH2 dissolvido na membrana e movese pela fase lipídica da bicamada para o complexo de citocromos bc1 Da mesma forma que o homólogo complexo III nas mi tocôndrias o complexo de citocromos bc1 das bactérias púrpuras carrega elétrons de um doador quinol QH2 para um aceptor de elétrons usando a energia da transferência de elétrons para bombear prótons através da membrana produzindo uma força prótonmotriz Acreditase que a via do fluxo de elétrons por este complexo seja muito similar àquela pelo complexo III mitocondrial envolvendo um ciclo Q Figura 1912 no qual prótons são consumidos em um lado da membrana e liberados no outro O aceptor final de elétrons em bactérias púrpuras é a forma deficitária de elé trons de P870 Clo2 1 Figura 1956a Os elétrons movem se do complexo de citocromos bc1 para o P870 por meio de um citocromo tipo c solúvel citocromo c2 O processo de transferência de elétrons completa o ciclo devolvendo o centro de reação ao seu estado não descorado pronto para absorver outro éxciton das clorofilas antenas Uma característica notável desse sistema é que toda a química ocorre no estado sólido com espécies reativas mantidas próximas umas das outras na orientação correta para a reação O resultado é uma série de reações muito rápidas e eficientes O centro de reação FeS centro de reação tipo I A fotossíntese em bactérias verdes sulfurosas envolve os mesmos três módulos das bactérias púrpuras mas o processo difere em vários aspectos e envolve reações enzimáticas adicionais Figura 1956b A excitação faz um elétron se mover do centro de reação ao complexo de citocromos bc1 por meio de uma quinona carregadora A transferência de elétrons 0 05 10 05 E98 volts Bactérias púrpuras tipo feofitinaquinona a Bactérias verdes sulfurosas tipo FeS b Éxcitons Éxcitons e e e P870 RC P870 RC P840 Gradiente de prótons Gradiente de prótons Cit c2 Feo Q Q Complexo de Cit bc1 P840 Fd FdNAD redutase NAD1 NADH Complexo de cit bc1 Cit c553 FIGURA 1956 Módulos funcionais da maquinaria fotossintética em bactérias púrpuras e bactérias verdes sulfurosas a Em bactérias púr puras a energia da luz impulsiona os elétrons do centro de reação P870 por meio da feofitina Feo de uma quinona Q e do complexo de citocromos bc1 seguindo pelo citocromo c2 e então de volta ao centro de reação O fluxo de elétrons pelo complexo de citocromos bc1 causa o bombeamento de pró tons criando um potencial eletroquímico que permite a síntese de ATP b As bactérias verdes sulfurosas têm duas vias para os elétrons impulsionadas pela excitação do P840 uma via cíclica por meio de uma quinona para o complexo de citocromos bc1 e de volta ao centro de reação via citocromo c e uma via acíclica partindo do centro de reação por meio da proteína ferro enxofre ferredoxina Fd e então para o NAD 1 em uma reação catalisada pela ferredoxinaNADredutase Nelson6edbookindb 777 Nelson6edbookindb 777 030414 0745 030414 0745 778 DAVID L NELSON MICHAEL M COX por esse complexo fornece energia para o transporte de prótons e cria a força prótonmotriz usada para a síntese de ATP da mesma forma que em bactérias púrpuras e mitocôn drias No entanto ao contrário do fluxo cíclico de elétrons nas bactérias púrpuras alguns elétrons fluem do centro de reação para uma proteína ferroenxofre ferredoxina que então passa elétrons via ferredoxina NADredutase para o NAD 1 produzindo NADH Os elétrons retirados do centro de reação para reduzir o NAD 1 são repostos pela oxidação de H2S a S elementar e então a SO4 22 em uma reação que define as bactérias verdes sulfurosas A oxidação de H2S por bactérias é quimicamente análoga à oxidação da água em plantas oxigênicas Fatores cinéticos e termodinâmicos impedem a dissipação da energia por conversão interna A construção complexa dos centros de reação é o produto da seleção evolutiva visando à eficiência do processo fotos sintético O estado excitado Clo2 poderia a princípio decair para seu estado basal por conversão interna um processo muito rápido 10 picossegundos 1 ps 5 10 212 s no qual a energia do fóton absorvido é convertida em calor movimento molecular Os centros de reação são construí dos para impedir a ineficiência que resultaria da conversão interna As proteínas dos centros de reação mantêm as bac terioclorofilas bacteriofeofitinas e quinonas em uma orien tação fixa em relação umas às outras permitindo que as reações fotoquímicas ocorram em um estado quase sólido Isso explica a alta eficiência e rapidez das reações não há margem para colisão ocasional e difusão aleatória A trans ferência de éxcitons da clorofila antena para o par espe cial do centro de reação é realizada em menos de 100 ps com eficiência 90 Dentro de 3 ps após a excitação de P870 a feofitina recebeu um elétron e tornouse um radical negativamente carregado menos de 200 ps mais tarde o elétron atingiu a quinona QB Figura 1957b As reações de transferência de elétrons não são apenas rápidas mas ter modinamicamente são montanha abaixo o par especial excitado Clo2 é um doador de elétrons muito bom E9º 5 Luz Lado P Lado N Hemes dos citocromos tipo c ➍ ➊ ➋ ➌ 270 ns Bacterioclorofila 2 Clo2 o par especial 3 ps Bacterioclorofila 2 pigmentos acessórios Bacteriofeofitina 2 200 ps 6 ms QA quinona QB quinona Fe b a FIGURA 1957 Centro de fotorreação da bactéria púrpura Rhodop seudomonas viridis PDB ID 1PRC a O sistema tem quatro componen tes três subunidades H M e L em marrom azul e cinza respectivamente com um total de 11 segmentos de hélices transmembrana e uma quarta proteína citocromo c em amarelo associada com o complexo na superfície da membrana As subunidades L e M são proteínas transmembrana parea das que juntas formam uma estrutura cilíndrica com simetria grosseiramen te bilateral ao longo de seu eixo longo Ilustrados como modelos de volume atômico e em b como modelos de esferas e bastões estão os grupos pros téticos que participam dos eventos fotoquímicos Ligados às cadeias L e M estão os dois pares de moléculas de bacterioclorofilas em verde um dos pares o par especial Clo2 é o sítio das primeiras mudanças fotoquímicas após a absorção da luz Também incorporados no sistema estão um par de moléculas de feofitina a Feo a em azul duas quinonas menaquinona QA e ubiquinona QB em cor de laranja e amarelo também arranjadas com simetria bilateral e um único Fe não heme em vermelho localizado apro ximadamente no eixo de simetria entre as quinonas Mostrados na parte su perior da figura estão quatro grupos heme em vermelho associados com o citocromo tipo c do centro de reação b Sequência de eventos que seguem a excitação do par especial de bacterioclorofilas todos os componentes coloridos como em a com a escala de tempo das transferências de elétrons entre parênteses ➊ O par especial excitado passa um elétron para a feofitina ➋ de onde o elétron ra pidamente se move até a menaquinona QA fortemente ligada ➌ Esta qui nona passa elétrons muito mais lentamente à ubiquinona difusível QB por meio do Fe não heme Enquanto isto ➍ o buraco eletrônico no par especial é preenchido por um elétron do heme do citocromo c Nelson6edbookindb 778 Nelson6edbookindb 778 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 779 21 V e cada transferência sucessiva de elétrons é para um aceptor com E9º substancialmente menos negativo A va riação na energia livre padrão para o processo é portanto negativa e grande lembre do Capítulo 13 que DG9º 5 2n DE9º aqui DE9º é a diferença entre os potenciais de redu ção padrão das duas hemirreações Clo Clo Assim DE9º 5 20045 V 2 210 V 095 V e DG9º 5 22 965 kJV mol 095V 5 2180 kJmol A combinação da cinética rápida e da termodinâmica fa vorável torna o processo praticamente irreversível e al tamente eficiente A produtividade global de energia o percentual da energia do fóton conservada em QH2 é 30 com o restante da energia dissipado como calor e entropia Nas plantas dois centros de reação agem em sequência O aparato fotossintético de cianobactérias modernas al gas e plantas vasculares é mais complexo do que os sis temas bacterianos com apenas um centro e parece ter evoluído pela combinação de dois fotocentros bacterianos mais simples As membranas tilacoides dos cloroplas tos têm dois tipos diferentes de fotossistemas cada um com seu próprio tipo de centro de reação fotoquímico e de conjunto de moléculas antenas Os dois sistemas têm funções distintas e complementares Figura 1958 O fotossistema II PSII é um sistema do tipo feofitina quinona como o fotossistema único das bactérias púr puras contendo quantidades aproximadamente iguais de clorofilas a e b A excitação de seu centro de reação P680 impulsiona os elétrons pelo complexo de citocromos b6 f com movimento concomitante de prótons através da e 0 10 E98 volts 10 Luz P680 Fotossistema II Fotossistema I P680 P700 Luz Plastocianina Gradiente de prótons H2O Complexo produtor de O2 1 O2 2 Pheo e e PQA PQB Cíclico Complexo de Cit b6f P700 A0 A1 FeS Fd FdNADP1 oxidorredutase NADPH NADP1 Acíclico PQA PQB Segunda quinona A0 A1 Plastoquinona Clorofila aceptora de elétrons Filoquinona FIGURA 1958 Integração dos fotossistemas I e II nos cloroplas tos Este esquema Z mostra a via da transferência de elétrons da água par te inferior à esquerda para o NADP 1 bem à direita na fotossíntese acíclica A posição na escala vertical de cada carregador de elétrons reflete seu po tencial de redução padrão Para aumentar a energia dos elétrons derivados de H2O para o nível de energia requerido para reduzir o NADP 1 a NADPH cada elétron precisa ter sua energia elevada duas vezes setas largas por fótons absorvidos em PSII e PSI É necessário um fóton por elétron em cada fotossistema Depois da excitação os elétrons de alta energia fluem monta nha abaixo pelas cadeias carregadoras ilustradas Os prótons se movem pela membrana tilacoide durante a reação de quebra da água e durante a transfe rência de elétrons pelo complexo de citocromos b6f produzindo o gradiente de prótons que é essencial para a formação de ATP Uma via alternativa é a transferência cíclica de elétrons na qual os elétrons se deslocam da ferredo xina de volta ao complexo de citocromos b6f em vez de reduzirem NADP 1 a NADPH A via cíclica produz mais ATP e menos NADPH do que a acíclica Nelson6edbookindb 779 Nelson6edbookindb 779 030414 0745 030414 0745 780 DAVID L NELSON MICHAEL M COX membrana tilacoide O fotossistema I PSI está estru tural e funcionalmente relacionado ao centro de reação tipo I das bactérias verdes sulfurosas Ele tem um cen tro de reação denominado P700 e uma alta razão entre clorofila a e clorofila b O P700 excitado passa elétrons à proteína FeS ferredoxina e então para o NADP 1 pro duzindo NADPH As membranas tilacoides de um único cloroplasto de espinafre têm muitas centenas de cada tipo de fotossistema Esses dois centros de reação em plantas agem em se quência para catalisar o movimento de elétrons promovido pela luz de H2O para NADP 1 Figura 1958 Os elétrons são carregados entre os dois fotossistemas pela proteína solúvel plastocianina carregador de um elétron funcio nalmente similar ao citocromo c das mitocôndrias Para re por os elétrons que se movem do PSII ao NADP 1 por meio do PSI as cianobactérias e as plantas oxidam H2O da mes ma forma que as bactérias verdes sulfurosas oxidam H2S produzindo O2 Figura 1958 parte inferior à esquerda Esse processo é chamado de fotossíntese oxigênica para distinguilo da fotossíntese anoxigênica das bactérias púrpuras e verdes sulfurosas Todas as células fotossinté ticas que produzem O2 as das plantas algas e cianobac térias contêm tanto PSI quanto PSII organismos com apenas um fotossistema não produzem O2 O diagrama na Figura 1958 comumente chamado de esquema Z devido à sua forma geral esboça a via de fluxo de elétrons entre os dois fotossistemas e as relações de energia nas reações lu minosas Assim o esquema Z descreve a via completa pela qual os elétrons fluem de H2O a NADP 1 de acordo com a equação 2H2O 1 2NADP 1 1 8 fótons O2 1 2NADPH 1 2H 1 Para cada dois fótons absorvidos um em cada fotossis tema um elétron é transferido da água ao NADP 1 Para formar uma molécula de O2 que exige a transferência de quatro elétrons de H2O a NADP 1 oito fótons precisam ser absorvidos no total quatro por cada fotossistema Os detalhes mecanísticos das reações fotoquímicas em PSII e PSI são essencialmente semelhantes àqueles dos dois fotossistemas bacterianos com várias adições importantes No PSII duas proteínas muito semelhantes D1 e D2 for mam um dímero quase simétrico ao qual todos os cofatores carregadores de elétrons estão ligados Figura 1959 A excitação do P680 no PSII produz P680 excelente doador de elétrons que em picossegundos transfere um elétron para feofitina fornecendo a ela uma carga negativa Feo 2 Com a perda de seu elétron P680 é transformado em um cátion radical P680 1 Feo 2 passa seu elétron extra muito rapidamente a uma plastoquinona ligada à proteína PQA ou QA que por sua vez passa seu elétron a outra plas toquinona mais frouxamente ligada PQB ou QB Quando PQB adquire dois elétrons de PQA em duas dessas transfe rências e dois prótons do solvente água ele está em sua for ma totalmente reduzida de quinol PQBH2 A reação global iniciada pela luz no PSII é 4 P680 1 4H 1 1 2 PQB 1 4 fótons 4 P680 1 1 2 PQBH2 1912 Por fim os elétrons em PQBH2 passam pelo complexo de citocromos b6 f Figura 1958 O elétron inicialmente removido de P680 é reposto com um elétron obtido da oxidação da água conforme descrito a seguir O sítio de ligação para a plastoquinona é o ponto de ação de muitos herbicidas comerciais que matam as plantas bloqueando a transferência de elétrons pelo complexo de citocromos b6 f e impedindo a produção fotossintética de ATP Os eventos fotoquímicos que seguem a excitação do PSI no centro de reação P700 são formalmente semelhantes àqueles no PSII O centro de reação excitado P700 perde um elétron para um aceptor A0 que se acredita ser uma forma especial de clorofila funcionalmente homóloga à feofitina do PSII criando A0 2 e P700 1 Figura 1958 lado direito novamente a excitação resulta em separação de cargas no centro de reação fotoquímico P700 1 é um agen te oxidante forte que rapidamente adquire um elétron da plastocianina proteína solúvel transferidora de elétrons que contém Cu A0 2 é um agente redutor excepcionalmen te forte que passa seu elétron por meio de uma cadeia de carregadores que leva ao NADP 1 Primeiro a filoquino na A1 aceita um elétron e o passa a uma proteína ferro enxofre por meio de três centros de FeS no PSI Então o elétron se move até a ferredoxina Fd outra proteína ferroenxofre frouxamente associada à membrana tilacoi de A ferredoxina de espinafre Mr 10700 contém um centro de 2Fe2S Figura 195 submetido à oxidação de um elétron e a reações de redução O quarto carregador de elétrons na cadeia é a flavoproteína ferredoxinaNADP 1 D2 Lúmen lado P Estroma lado N Feo Feo P680 2H2O 4H O2 D1 Chl2D2 Chl2D1 TyrD PQB TyrZ PQA Mn4Ca Fe ➊ ➋ ➎ ➌ ➍ FIGURA 1959 Fotossistema II da cianobactéria Synechococcus elongates A forma monomérica do complexo mostrada aqui tem duas proteínas transmembrana principais D1 e D2 cada uma com seu conjun to de cofatores Embora as duas subunidades sejam aproximadamente simétricas o fluxo de elétrons ocorre apenas por meio de um dos ramos de cofatores aquele à direita em D1 As setas mostram a via do fluxo de elétrons do aglomerado de íons Mn4Ca da enzima de quebra da água para a quinona PQB Os eventos fotoquímicos ocorrem na sequência indicada pelos números das etapas Observe a forte semelhança entre as posições dos cofatores neste fotossistema e as posições no centro de fotorreação bacteriano mostrado na Figura 1957 O papel dos resíduos de Tyr e a estru tura detalhada do aglomerado de íons Mn4Ca são discutidos mais adiante ver Figura 1964b Nelson6edbookindb 780 Nelson6edbookindb 780 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 781 oxidorredutase que transfere elétrons da ferredoxina reduzida Fdred ao NADP 1 2Fdred 1 2H 1 1 NADP 1 S 2Fdox 1 NADPH 1 H 1 Esta enzima é homóloga à ferredoxinaNAD 1redutase das bactérias verdes sulfurosas Figura 1956b As clorofilas antenas são fortemente integradas com os carregadores de elétrons Os cofatores carregadores de elétrons do PSI e os comple xos coletores de luz são parte de um complexo supramo lecular Figura 1960a cuja estrutura foi determinada a b c Luz Plastocianina Ferredoxina Estroma lado N Lúmen lado P Transferência de éxcitons PSI Subunidade B Subunidade A Subunidade C FA FB QK QK Clo CloA0 CloA0 Clo2 P700 Clo FX FIGURA 1960 O complexo supramolecular do PSI e suas clorofilas antenas associadas a Desenho esquemático das proteínas e dos cofa tores essenciais em uma única unidade de PSI Um grande número de cloro filas antenas circunda o centro de reação e conduz a ele setas vermelhas a energia absorvida dos fótons absorvidos O resultado é a excitação do par de moléculas de clorofila que constitui o P700 reduzindo muito seu potencial de redução o P700 então passa um elétron por meio de duas clorofilas pró ximas da filoquinona QK também chamada de A1 A filoquinona reduzida é reoxidada quando passa dois elétrons um de cada vez setas azuis para uma proteína FeS FX perto do lado N da membrana De FX os elétrons se mo vem por mais dois centros de FeS FA e FB para a proteína FeS ferredoxina no estroma A ferredoxina então doa elétrons para o NADP 1 não mostrado reduzindoo a NADPH uma das formas nas quais a energia dos fótons é apri sionada nos cloroplastos b Estrutura trimérica derivada de PDB ID 1JBO vista do lúmen do tilacoide perpendicular à membrana mostrando todas as subunidades em cinza e cofatores da proteína c Um monômero do PSI com todas as proteínas omitidas revelando as clorofilas antenas e do centro de reação em verde com íons Mg 21 verdeescuros no centro os carotenoides em amarelo e os centros de FeS do centro de reação estruturas de volume atômico em vermelho e cor de laranja As proteínas no complexo mantêm os componentes rigidamente em orientações que maximizam as trans ferências eficientes de éxcitons entre as moléculas antenas excitadas e o centro de reação Nelson6edbookindb 781 Nelson6edbookindb 781 030414 0745 030414 0745 782 DAVID L NELSON MICHAEL M COX cristalograficamente A proteína consiste em três comple xos idênticos cada um composto por 11 proteínas dife rentes Figura 1960b Nessa notável estrutura as várias moléculas de clorofilas antenas e carotenoides estão preci samente arranjadas ao redor do centro de reação Figura 1960c Os cofatores carregadores de elétrons do centro de reação estão portanto firmemente integrados com as clorofilas antenas Esse arranjo permite a transferência muito rápida e eficiente de éxcitons das clorofilas antenas para o centro de reação Ao contrário da via única de elé trons no PSII acreditase que o fluxo de elétrons iniciado pela absorção de um fóton ocorra pelos dois ramos de car regadores no PSI O complexo de citocromos b6f liga os fotossistemas II e I Os elétrons temporariamente estocados no plastoquinol como resultado da excitação do P680 no PSII são carrega dos para o P700 do PSI por meio do complexo de citocromos b6 f e da proteína solúvel plastocianina Figura 1958 cen tro Da mesma forma que o complexo III das mitocôndrias o complexo de citocromos b6 f Figura 1961 contém um Estroma lado N Lúmen lado P 2H Membrana tilacoide a b Plastocianina Plastocianina Plastocianina e e e e e e Heme f Centro de FeS PQH2 Heme bH Heme bH Heme x Heme x Heme bL Heme bL PQ H bcaroteno Caverna c Subunidade IV Cit b6 Cit f Cu Lúmen do tilacoide Lado P ciclo Q Estroma Lado N PQ PQH2 e e bL bH 2H Proteína ferro enxofre de Rieske 4H FIGURA 1961 Fluxo de elétrons e prótons pelo complexo de cito cromos b6f a A estrutura cristalina do complexo PDB ID IFV5 revela as posições dos cofatores envolvidos nas transferências de elétrons Além dos hemes do citocromo b heme bH e bL também chamados de heme bN e bP respectivamente devido às suas proximidades aos lados N e P da bicama da e do citocromo f heme f existe um quarto heme x próximo do heme bH há também um bcaroteno de função desconhecida Dois sítios ligam a plastoquinona o sítio PQH2 próximo ao lado P da bicamada e o sítio PQ pró ximo ao lado N O centro de FeS da proteína de Rieske fica imediatamente fora da bicamada no lado P e o sítio heme f está em um domínio proteico que se estende para o lúmen do tilacoide A rota dos elétrons é mostrada para um dos monômeros mas os dois conjuntos de carregadores no dímero carregam elétrons para a plastocianina PDB ID 2Q5B b O complexo é um homodímero arranjado para criar uma caverna conectando os sítios PQH2 e PQ compare isto com a estrutura do complexo III mitocondrial na Figura 1911 Esta caverna permite à plastoquinona se mover entre os sítios de sua oxidação e redução c O plastoquinol PQH2 formado no PSII é oxidado pelo complexo de citocromos b6f em uma série de etapas como aquelas do ciclo Q no comple xo de citocromos bc1 complexo III das mitocôndrias ver Figura 1912 Um elétron de PQH2 passa para o centro de FeS da proteína de Rieske o outro para o heme bL do citocromo b6 O efeito líquido é a passagem de elétrons de PQH2 para a proteína solúvel plastocianina que os carrega para o PSI Nelson6edbookindb 782 Nelson6edbookindb 782 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 783 citocromo tipo b com dois grupos heme denominados bH e bL proteína ferroenxofre de Rieske Mr 20000 e o cito cromo f designado a partir de frons em latim folha Os elétrons fluem pelo complexo de citocromos b6 f a partir de PQBH2 para o citocromo f a seguir para a plastocianina e finalmente para o P700 reduzindoo Da mesma forma que o complexo III das mitocôndrias o citocromo b6 f conduz elétrons de uma quinona reduzida um carregador móvel de dois elétrons lipossolúvel Q em mitocôndrias PQB em cloroplastos para uma pro teína hidrossolúvel que carrega um elétron citocromo c em mitocôndrias plastocianina em cloroplastos Como em mitocôndrias a função deste complexo envolve um ciclo Q Figura 1912 no qual os elétrons passam um de cada vez de PQBH2 para o citocromo b6 Esse ciclo resulta no bombeamento de prótons através da membrana em clo roplastos a direção do movimento de prótons é do com partimento estromal para o lúmen do tilacoide até quatro prótons se movendo para cada par de elétrons O resultado é a produção de um gradiente de prótons através da mem brana tilacoide à medida que os elétrons passam do PSII para o PSI Como o volume do lúmen achatado do tilacoide é pequeno o influxo de um pequeno número de prótons tem um efeito relativamente grande no pH do lúmen A di ferença medida no pH entre o estroma pH 8 e o lúmen do tilacoide pH 5 representa uma diferença de 1000 vezes na concentração de prótons poderosa força propulsora para a síntese de ATP O fluxo cíclico de elétrons entre o PSI e o complexo de citocromos b6f aumenta a produção de ATP em relação a NADPH O fluxo de elétrons do PSII pelo complexo de citocromos b6 f e então pelo PSI até o NADP 1 algumas vezes é cha mado de fluxo acíclico de elétrons para distinguilo do fluxo cíclico de elétrons que ocorre em graus variá veis dependendo principalmente das condições de luz A via acíclica produz um gradiente de prótons utilizado para promover a síntese de ATP e NADPH utilizado em processos biossintéticos redutores O fluxo cíclico de elé trons envolve apenas o PSI não o PSII Figura 1958 Os elétrons que passam do P700 para a ferredoxina não conti nuam até o NADP 1 retornando pelo complexo de citocro mos b6 f até a plastocianina esta via de elétrons encontra um paralelo com aquela das bactérias verdes sulfurosas mostrada na Figura 1956b A plastocianina então doa elétrons ao P700 que os transfere à ferredoxina Des sa forma os elétrons são reciclados repetidas vezes pelo complexo de citocromos b6 f e do centro de reação do PSI cada elétron impulsionado ao redor do ciclo pela energia de um fóton O fluxo cíclico de elétrons não é acompa nhado pela formação líquida de NADPH ou pela liberação de O2 No entanto é acompanhado pelo bombeamento de prótons pelo complexo de citocromos b6 f e pela fosforila ção de ADP a ATP referida como fotofosforilação cícli ca A equação global para o fluxo cíclico de elétrons e a fotofosforilação é simplesmente ADP 1 Pi ATP 1 H2O luz A partir da regulação da partição de elétrons entre a redução do NADP 1 e a fotofosforilação cíclica uma planta ajusta a razão de ATP para NADPH produzido nas reações dependentes de luz para adequar suas necessidades por es tes produtos nas reações de assimilação de carbono e em outros processos biossintéticos Como será visto no Capítu lo 20 as reações de assimilação de carbono requerem ATP e NADPH em uma razão 32 Essa regulação das vias de transferência de elétrons é parte de uma adaptação de curto prazo a mudanças na cor comprimento de onda e na quantidade intensidade de luz conforme descrito a seguir Transições de estado mudam a distribuição do LHCII entre os dois fotossistemas A energia necessária para excitar o PSI P700 é menor luz de comprimento de onda mais longo menor energia do que aquela necessária para excitar o PSII P680 Se o PSI e o PSII fossem fisicamente contíguos os éxcitons que se originassem no sistema de antena do PSII migrariam para o centro de reação do PSI deixando o PSII cronicamente su bexcitado e interferindo com a operação do sistema de dois centros Esse desequilíbrio no suprimento de éxcitons é im pedido pela separação dos dois fotossistemas na membra na tilacoide Figura 1962 O PSII está localizado quase exclusivamente nas pilhas de membranas firmemente ade ridas dos grana de tilacoides seu complexo coletor de luz associado LHCII controla a forte associação das membra nas adjacentes dos grana O PSI e o complexo ATPsintase estão localizados quase exclusivamente nas membranas ti lacoides não aderidas as lamelas estromais onde eles têm acesso aos conteúdos do estroma incluindo ADP e NADP 1 O complexo de citocromos b6 f está presente primariamente nos grana A associação do LHCII com o PSI e o PSII depende da intensidade e do comprimento de onda da luz os quais po dem mudar no curto prazo levando a transições de esta do no cloroplasto No estado 1 um resíduo crítico de Thr no LHCII não está fosforilado e o LHCII se associa ao PSII Sob condições de luz intensa ou azul que favoreçam a absorção pelo PSII o fotossistema reduz a plastoquinona a plastoqui nol PQH2 mais rápido do que o PSI consegue oxidála O acúmulo resultante de PQH2 ativa uma proteínacinase que desencadeia a transição para o estado 2 pela fosforilação de um resíduo de Thr no LHCII Figura 1963 A fosforilação enfraquece a interação do LHCII com o PSII e parte do LH CII se dissocia e se movimenta até a lamela estromal aqui ele captura fótons éxcitons para o PSI acelerando a oxi dação do PQH2 e revertendo o desequilíbrio entre o fluxo de elétrons no PSI e no PSII Em luz menos intensa na sombra ou com mais luz vermelha o PSI oxida o PQH2 mais rápido do que o PSII consegue fazêlo e o aumento resultante da PQ desencadeia a desfosforilação do LHCII revertendo o efeito da fosforilação A transição de estado na localização do LHCII é mutua mente regulada com a transição da fotofosforilação cíclica para a acíclica descrita anteriormente a via de elétrons é principalmente acíclica no estado 1 e principalmente cíclica no estado 2 Nelson6edbookindb 783 Nelson6edbookindb 783 030414 0745 030414 0745 784 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A água é quebrada pelo complexo de liberação de oxigênio A fonte final de elétrons passados para o NADPH na fotos síntese de plantas oxigênica é a água Tendo doado um elétron para a feofitina o P680 1 do PSII precisa adquirir um elétron para retornar a seu estado basal em preparação para a captura de outro fóton A princípio o elétron neces sário pode vir de vários compostos orgânicos e inorgânicos As bactérias fotossintéticas usam uma variedade de doado Fotossistema I Membranas aderidas lamelas granais Fotossistema II ATPsintase a b Complexo coletor de luz II Membranas não aderidas lamelas estromais Estroma Lúmen Fotossistema I ATPsintase Complexo de citocromos b6 f Estroma lado N Lúmen lado P Fotossistema II Complexo de citocromos b6 f Plastocianina Ferredoxina Ferredoxina NADP oxidorredutase FIGURA 1962 Localização do PSI e do PSII nas membranas tilacoi des a As estruturas dos complexos e das proteínas solúveis do aparato fotossintético de uma planta vascular ou alga desenhadas na mesma escala As estruturas são fotossistema II PDB ID 2AXT complexo de citocromos b6f PDB ID 2E74 plastocianina PDB ID 1AG6 fotossistema I PDB ID 1QZV fer rodoxina PDB ID 1A70 e ferrodoxinaNADPredutase PDB ID 1QG0 A ATP sintase é a composição mostrada na Figura 1925c b O complexo coletor de luz LHCII e a ATPsintase estão localizados tanto nas regiões de adesão da membrana tilacoide lamelas granais onde várias membranas estão em contato quanto em regiões sem adesão lamelas estromais e têm pleno acesso a ADP e NADP 1 no estroma O PSII está presente quase exclusivamen te nas regiões de adesão e o PSI quase exclusivamente nas regiões sem ade são exposto ao estroma O LHCII é o adesivo que segura as lamelas aderidas umas às outras ver Figura 1963 LHCII ThrOH Thr Membrana tilacoide Aderido estado 1 Não aderido estado 2 LHCII ATP Pi ADP Proteína fosfatase Proteína cinase P FIGURA 1963 Equilibrando o fluxo de elétrons no PSI e no PSII por transição de estados Um domínio hidrofóbico do LHCII em uma lamela tilacoide se insere na lamela vizinha e adere intimamente às duas membra nas estado 1 O acúmulo de plastoquinol não mostrado estimula uma proteínacinase que fosforila um resíduo de Tyr no domínio hidrofóbico do LHCII reduzindo sua afinidade pela membrana tilacoide vizinha e conver tendo regiões de adesão em regiões de não adesão estado 2 Uma prote ínafosfatase específica reverte esta fosforilação regulatória quando a razão PQPQH2 aumenta Nelson6edbookindb 784 Nelson6edbookindb 784 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 785 res de elétrons com esse objetivo acetato succinato ma lato ou sulfeto dependendo do que está disponível em um determinado nicho ecológico Cerca de 3 bilhões de anos atrás a evolução das bactérias fotossintéticas primitivas as progenitoras das cianobactérias modernas produziu um fotossistema capaz de retirar elétrons de um doador que sempre está disponível a água Duas moléculas de água são quebradas produzindo quatro elétrons quatro prótons e oxigênio molecular 2H2O 4H 1 1 4e 2 1 O2 Um único fóton de luz visível não tem energia suficiente para quebrar as ligações na água quatro fótons são neces sários nessa reação de clivagem fotolítica Os quatro elétrons removidos da água não passam di retamente ao P680 1 que só pode aceitar um elétron de cada vez Em vez disso um esquema molecular notável o complexo de liberação de oxigênio também chamado de complexo de quebra da água passa quatro elétrons um de cada vez para o P680 1 Figura 1964 O doador imediato de elétrons para o P680 1 é um resíduo de Tyr co mumente designado como Z ou TyrZ na subunidade D1 do centro de reação do PSII O resíduo de Tyr perde tanto um próton quanto um elétron gerando o radical livre eletrica mente neutro de Tyr Tyr 4 P680 1 1 4 Tyr 4 P680 1 4 Tyr 1913 O radical Tyr retoma o elétron e o próton perdidos oxidan do um agrupamento de quatro íons manganês e um íon cál cio no complexo de quebra da água A cada transferência in dividual de elétrons o agrupamento de Mn4Ca se torna mais oxidado Quatro transferências individuais de elétrons cada uma correspondendo à absorção de um fóton produzem uma carga de 41 no agrupamento de Mn4Ca Figura 1964 4 Tyr 1 Mn4Ca 0 4 Tyr 1 Mn4Ca 41 1914 Neste estado o agrupamento de Mn4Ca pode retirar quatro elétrons de um par de moléculas de água liberando 4 H 1 e O2 Mn4Ca 1 2H2O Mn4Ca 0 1 4H 1 1 O2 1915 Como os quatro prótons produzidos nesta reação são libe rados no lúmen do tilacoide o complexo de liberação de oxigênio atua como bomba de prótons usando a energia da transferência de elétrons A soma das equações de 1912 a 1915 é 2H2O 1 2PQB 1 4 fótons O2 1 2PQBH2 1916 A estrutura detalhada do agrupamento de liberação de oxi gênio foi obtida por cristalografia por raios X de alta reso lução O agrupamento metálico assume a forma de uma ca deira Figura 1964b O assento e as pernas da cadeira são feitos por três íons Mn um íon Ca e quatro átomos de O O quarto Mn e outro O formam o encosto da cadeira Quatro moléculas de água também são vistas na estrutura crista lina duas associadas com um dos íons Mn as outras duas com o íon Ca É possível que uma ou mais dessas molécu las de água seja aquela que sofre oxidação para produzir O2 Esse agrupamento metálico está associado a uma pro teína periférica de membrana Mr 33000 no lado luminal da membrana tilacoide que presumivelmente estabiliza o agrupamento O resíduo de Tyr designado Z por meio do qual os elétrons se movem entre a água e o centro de reação do PSII é parte de uma rede de moléculas de água ligadas por ligações de hidrogênio que inclui as quatro associadas com o agrupamento de Mn4Ca O mecanismo detalhado da oxidação de água pelo agrupamento de Mn4Ca não é conhe cido mas está sob intensa investigação A reação é central à vida na Terra e pode envolver química bioinorgânica sin gular A determinação da estrutura do centro polimetálico tem inspirado diversas hipóteses razoáveis e testáveis Fi que ligado a b O2 1o éxciton Lúmen e2 H1 2H2O 0 P680 TyrZ Tyr161 Águas Ca Mn Mn O His190 Mn4CaO5 e2 2o éxciton e2 H1 11 e2 3o éxciton e2 H1 21 e2 4o éxciton e2 H1 31 e2 41 b Tyr161 Águas Ca M O His190 FIGURA 1964 Atividade de quebra da água do complexo de liberação de oxigênio a Aqui está mostrado o processo que produz um agente oxidante de quatro elétrons centro multinuclear com quatro íons Mn um íon Ca e quatro átomos de oxigênio no complexo de quebra da água do PSII A absorção sequencial de quatro fótons éxcitons cada absorção causando a perda de um elé tron do agrupamento de Mn4Ca produz um agente oxidante que pode remover quatro elétrons de duas moléculas de água produzindo O2 Os elétrons perdidos do agrupamento de Mn4Ca passam um de cada vez para um resíduo oxidado de Tyr em uma proteína do PSII e então para o P680 1 b O centro metálico do complexo de quebra da água obtido por cristalografia por raios X PDB ID 3ARC Tyr 161 conhecida por participar da oxidação da água é vista ligada por ligações de hidrogênio a uma rede de moléculas de água incluindo diversas que estão em contato direto com o agrupamento de Mn4Ca Esse é o local de uma das reações mais importantes da biosfera Nelson6edbookindb 785 Nelson6edbookindb 785 030414 0745 030414 0745 786 DAVID L NELSON MICHAEL M COX RESUMO 198 Evento fotoquímico central fluxo de elétrons promovido pela luz c As bactérias têm um único centro de reação nas bacté rias púrpuras ele é do tipo feofitinaquinona e em bac térias verdes sulfurosas do tipo FeS c Estudos estruturais do centro de reação de uma bac téria púrpura forneceram informações sobre o fluxo de elétrons promovido pela luz de um par excitado espe cial de moléculas de clorofila por meio da feofitina para quinonas Os elétrons então passam das quinonas pelo complexo de citocromos bc1 e de volta ao centro de fo torreação c Uma via alternativa em bactérias verdes sulfurosas en via elétrons de quinonas reduzidas para o NAD 1 c As cianobactérias e as plantas têm dois centros de fotor reação diferentes arranjados em sequência c O fotossistema I das plantas passa elétrons do seu cen tro de reação excitado P700 por meio de uma série de carregadores para a ferredoxina que então reduz NADP 1 a NADPH c O centro de reação do fotossistema II das plantas P680 passa elétrons para a plastoquinona e os elétrons per didos do P680 são repostos por elétrons de H2O doado res de elétrons diferentes de H2O são usados em outros organismos c O fluxo de elétrons pelos fotossistemas produz NADPH e ATP O fluxo cíclico de elétron produz apenas ATP e permite variabilidade nas proporções de NADPH e ATP formados c A localização do PSI e do PSII entre as lamelas granais e estromais pode mudar e é indiretamente controlada pela intensidade da luz otimizando a distribuição de éx citons entre PSI e PSII para uma captura eficiente de energia c A quebra da água promovida pela luz é catalisada por um complexo proteico contendo Mn e Ca O2 é produ zido A plastoquinona reduzida carrega elétrons para o complexo de citocromos b6 f Daqui eles passam para a plastocianina e então para o P700 para repor aqueles perdidos durante sua fotoexcitação c O fluxo de elétrons pelo complexo de citocromos b6 f bombeia prótons através da membrana plasmática cri ando uma força prótonmotriz que fornece a energia para a síntese de ATP por uma ATPsintase 199 Síntese de ATP pela fotofosforilação A atividade combinada dos dois fotossistemas vegetais move elétrons da água ao NADP 1 conservando parte da energia da luz absorvida como NADPH Figura 1958 Simultanea N de T Os autores se referem à localização do LHCII e não de PSI e PSII Estes não têm mobilidade ao contrário do LHCII cuja posição em relação aos fotossistemas é modulada pela intensidade e pelo comprimento de onda da luz conforme descrito no texto sobre transição de estados mente prótons são bombeados através da membrana tilacoide e energia é conservada na forma de um potencial eletroquímico Agora será apresentado o pro cesso pelo qual esse gradiente de prótons permite a síntese de ATP o outro produto de conser vação de energia das reações dependentes de luz Em 1954 Daniel Arnon e colaboradores descobriram que ATP é gerado a partir de ADP e Pi durante a transferência fotossintética de elétrons em cloroplastos de espinafre iluminados Apoio para es sas descobertas veio do trabalho de Albert Frenkel que detectou produção de ATP dependente de luz em estru turas membranáceas contendo pigmentos chamadas de cromatóforos derivadas de bactérias fotossintéticas Os pesquisadores concluíram que parte da energia lumino sa capturada pelos sistemas fotossintéticos desses orga nismos é transformada em energia de ligação fosfato do ATP Esse processo é chamado de fotofosforilação para distinguilo da fosforilação oxidativa em mitocôndrias du rante a respiração Um gradiente de prótons acopla o fluxo de elétrons e a fosforilação Diversas propriedades da transferência fotossintética de elétrons e da fotofosforilação em cloroplastos indicam que um gradiente de prótons desempenha o mesmo papel que na fosforilação oxidativa mitocondrial 1 Os centros de reação os carregadores de elétrons e as enzimas formado ras de ATP estão localizados em uma membrana impermeá vel a prótons a membrana tilacoide que precisa estar intacta para sustentar a fotofosforilação 2 A fotofosforila ção pode ser desacoplada do fluxo de elétrons por reagen tes que promovem a passagem de prótons através da mem brana tilacoide 3 A fotofosforilação pode ser bloqueada por venturicidina e agentes semelhantes que inibem a for mação de ATP a partir de ADP e Pi pela ATPsintase mito condrial Tabela 194 4 A síntese de ATP é catalisada por complexos FoF1 localizados na superfície externa das membranas tilacoides e muito semelhantes em estrutura e função aos complexos FoF1 das mitocôndrias Moléculas transferidoras de elétrons na cadeia de car regadores que conecta o PSII e o PSI são assimetricamen te orientadas na membrana tilacoide de forma que o fluxo fotoinduzido de elétrons resulta no movimento líquido de prótons através da membrana do lado estromal para o lú men do tilacoide Figura 1965 Em 1966 André Jagen dorf mostrou que um gradiente de pH através da membrana tilacoide alcalina do lado de fora poderia fornecer a força propulsora para gerar ATP Essas observações iniciais de Jagendorf proporcionaram algumas das evidências experi mentais mais importantes a favor da hipótese quimiosmóti ca de Mitchell Daniel Arnon 19101994 Nelson6edbookindb 786 Nelson6edbookindb 786 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 787 Jagendorf incubou cloro plastos no escuro em tampão de pH 4 o tampão penetrou lenta mente no compartimento inter no dos tilacoides diminuindo seu pH interno Ele adicionou ADP e Pi na suspensão de clo roplastos no escuro e então de repente aumentou o pH do meio externo para 9 momen taneamente criando um gran de gradiente de pH através da membrana À medida que os prótons saíam dos tilacoides em direção ao meio ATP era gerado a partir de ADP e Pi Como a formação de ATP ocorria no escuro sem acrésci mo de energia pela luz esse experimento mostrou que um gradiente de pH através da membrana é um estado de alta energia que da mesma forma que na fosforilação oxidati va mitocondrial pode mediar a transdução de energia da transferência de elétrons em energia química do ATP A estequiometria aproximada da fotofosforilação foi estabelecida À medida que os elétrons se deslocam da água para o NADP 1 nos cloroplastos vegetais cerca de 12 H 1 movimen tamse do estroma para o lúmen do tilacoide para cada qua tro elétrons que passam ou seja por O2 formado Quatro desses prótons são transportados pelo complexo de libe ração de oxigênio e até oito pelo complexo de citocromos b6 f O resultado mensurável é uma diferença de 1000 vezes na concentração de prótons através da membrana tilacoide DpH 5 3 Lembrese de que a energia estocada em um gradiente de prótons o potencial eletroquímico tem dois componentes uma diferença na concentração de prótons DpH e um potencial elétrico Dc devido à separação de cargas Em cloroplastos o DpH é o componente dominante o movimento de contraíons aparentemente dissipa a maior parte do potencial elétrico Em cloroplastos iluminados a energia estocada no gradiente por mol de prótons é DG 5 23RT DpH 1 Z Dc 5 217 kJmol de forma que o movimento de 12 mols de prótons através da membrana tilacoide representa uma conservação de cer ca de 200 kJ de energia energia suficiente para promover a síntese de vários moles de ATP DG9 5 305 kJmol Me didas experimentais fornecem valores de cerca de 3 ATP por O2 produzido Pelo menos oito fótons precisam ser absorvidos para im pulsionar quatro elétrons da H2O até o NADPH um fóton por elétron em cada centro de reação A energia em oito fótons de luz visível é mais do que suficiente para a síntese de três moléculas de ATP A síntese de ATP não é a única reação de conservação de energia da fotossíntese em plantas o NADPH formado ao final da transferência de elétrons também é energetica mente rico A equação geral para a fotofosforilação acíclica um termo explicado a seguir é 2H2O 1 8 fótons 1 2NADP 1 1 3ADP 1 1 3Pi O2 1 3ATP 1 2NADPH 1917 A ATPsintase dos cloroplastos é semelhante àquela das mitocôndrias A enzima responsável pela síntese de ATP nos cloroplastos é um grande complexo com dois componentes funcionais CFo e CF1 C designando sua localização nos cloroplastos CFo é um poro transmembrana de prótons composto por várias proteínas integrais de membrana e homólogo ao Fo mitocondrial CF1 é um complexo proteico periférico de membrana muito similar na composição na estrutura e na função das subunidades ao F1 mitocondrial CFo CF1 ADP Pi ATP Estroma lado N PSII PSI Lúmen lado P Membrana tilacoide Luz Luz 2H1 NADP11H1 2O2 1 2H1 PQH2 H2O 4H1 NADPH Plastocianina PQ Fd Complexo de Cit b6f Mn4Ca 1 FIGURA 1965 Circuitos de prótons e de elétrons durante a fotofos forilação Os elétrons setas azuis se movem da água por meio do PSII da cadeia intermediária de carregadores e do PSI chegando finalmente ao NADP 1 Os prótons setas vermelhas são bombeados para o lúmen do tila coide pelo fluxo de elétrons por meio de carregadores que ligam o PSII e o PSI entrando novamente no estroma através de canais de prótons formados pelo Fo designado como CFo da ATPsintase A subunidade F1 CF1 catalisa a síntese de ATP André Jagendorf Nelson6edbookindb 787 Nelson6edbookindb 787 030414 0745 030414 0745 788 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A microscopia eletrônica de secções de cloroplastos mostra os complexos de ATPsintase como projeções ar redondadas na superfície externa estromal ou N das membranas tilacoides esses complexos correspondem aos complexos de ATPsintase vistos como projeções na su perfície interna matriz ou N da membrana mitocondrial interna Assim a relação entre a orientação da ATPsin tase e a direção do bombeamento de prótons é a mesma nos cloroplastos e nas mitocôndrias Em ambos os casos a porção F1 da ATPsintase está localizada no lado mais alca lino N da membrana pela qual prótons fluem a favor do gradiente de concentração a direção do fluxo de prótons em relação a F1 é a mesma em ambos os casos de P para N Figura 1966 Acreditase que o mecanismo da ATPsintase dos cloro plastos também seja essencialmente idêntico àquele de sua análoga mitocondrial ADP e Pi prontamente se condensam para formar ATP na superfície da enzima e a liberação des te ATP ligado à enzima requer uma força prótonmotriz A catálise rotacional sequencialmente envolve cada uma das três subunidades b da ATPsintase na síntese de ATP na liberação de ATP e na ligação de ADP 1 Pi Figuras 1926 e 1927 Predizse que a ATPsintase do cloroplasto de espina fre com 14 subunidades c em seu complexo Fo tenha uma razão de ATP formado para elétrons transferidos menor comparada com os complexos Fo de bovinos leveduras e E coli com 8 10 e 10 subunidades c respectivamente Fi gura 1929 RESUMO 199 Síntese de ATP pela fotofosforilação c Em plantas tanto a reação de quebra da água quanto o fluxo de elétrons pelo complexo de citocromos b6 f são acompanhados pelo bombeamento de prótons através da membrana tilacoide A força prótonmotriz assim criada promove a síntese de ATP por um complexo CFoCF1 similar ao complexo FoF1 mitocondrial c O mecanismo catalítico do CFoCF1 é muito similar ao de ATPsintases de mitocôndrias e bactérias A rotação físi ca promovida pelo gradiente de prótons é acompanhada pela síntese de ATP em sítios que se alternam entre três conformações uma com alta afinidade por ATP uma com alta afinidade por ADP e Pi e uma com baixa afini dade pelos dois nucleotídeos 1910 Evolução da fotossíntese oxigênica O aparecimento da fotossíntese oxigênica na Terra há cerca de 25 bilhões de anos foi um evento crucial na evolução da biosfera Até então a Terra estava essencialmente despro vida de oxigênio molecular e carecia da camada de ozônio que protege os organismos vivos da radiação UV solar A fotossíntese oxigênica tornou disponível um suprimento quase ilimitado de agente redutor H2O para promover a produção de compostos orgânicos por reações biossin téticas redutoras Os mecanismos evoluíram permitindo aos organismos usar O2 como aceptor final de elétrons em transferências de elétrons altamente energéticas a partir de substratos orgânicos empregando a energia da oxidação para sustentar seu metabolismo O complexo aparato fotos sintético de uma planta vascular moderna é a culminação de uma série de eventos evolutivos o mais recente sendo a aquisição por células eucarióticas de um endossimbionte cianobacteriano Os cloroplastos evoluíram a partir de antigas bactérias fotossintéticas Os cloroplastos em organismos modernos lembram as mi tocôndrias em diversas propriedades e acreditase que tenham se originado pelo mesmo mecanismo que deu origem às mitocôndrias endossimbiose Da mesma forma que as mitocôndrias os cloroplastos contêm seu próprio DNA e sua própria maquinaria de síntese proteica Alguns dos polipeptídeos das proteínas dos cloroplastos são co dificados por genes dos cloroplastos e sintetizados nos cloroplastos outros são codificados por genes nucleares sintetizados fora dos cloroplastos e importados Capítulo 27 Quando as células vegetais crescem e se dividem os cloroplastos dão origem a novos cloroplastos por divisão durante a qual seu DNA é replicado e dividido entre os clo roplastosfilhos A maquinaria e o mecanismo de captura de luz fluxo de elétrons e síntese de ATP em cianobacté rias modernas são semelhantes em muitos aspectos àque les dos cloroplastos vegetais Essas observações levaram à hipótese hoje amplamente aceita de que os progenitores evolutivos das células vegetais modernas são eucariotos primitivos que englobaram cianobactérias fotossintéticas e estabeleceram relações endossimbióticas estáveis com elas ver Figura 138 Pelo menos metade da atividade fotossintética na Ter ra hoje ocorre em microrganismos algas outros euca riotos fotossintéticos e bactérias fotossintéticas As cia nobactérias têm PSII e PSI em sequência e o PSII tem ATP H1 Estroma lado N Lúmen do tilacoide lado P ATP ATP H1 H1 Mitocôndria Bactéria E coli Cloroplasto Espaço intermembrana lado P Espaço intermembrana lado P Matriz lado N Citosol lado N FIGURA 1966 Comparação da topologia do movimento de prótons e da orientação da ATPsintase nas membranas de mitocôndrias cloro plastos e da bactéria E coli Em cada caso a orientação do gradiente de prótons em relação à atividade da ATPsintase é a mesma Nelson6edbookindb 788 Nelson6edbookindb 788 030414 0745 030414 0745 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 789 uma atividade de quebra de água associada que lembra aquela das plantas No entanto os outros grupos de bac térias fotossintéticas têm apenas um centro de reação e não quebram água ou produzem O2 Muitos são anaeróbios obrigatórios e não toleram O2 eles precisam usar um outro composto que não seja a água como doador de elétrons Algumas bactérias fotossintéticas usam compostos inorgâ nicos como doadores de elétrons e de hidrogênio Por exemplos as bactérias verdes sulfurosas usam sulfeto de hidrogênio 2H2S 1 CO2 CH2O 1 H2O 1 2S luz Estas bactérias em vez de produzirem O2 molecular for mam enxofre elementar como produto da oxidação do H2S Elas posteriormente oxidam o S a SO4 22 Outras bactérias fotossintéticas usam compostos orgânicos como o lactato como doadores de elétrons luz 2 lactato 1 CO2 CH2O 1 H2O 1 2 piruvato A semelhança fundamental entre a fotossíntese das plantas e das bactérias apesar das diferenças nos doadores de elé trons que elas utilizam se torna mais óbvia quando a equa ção da fotossíntese é escrita na sua forma mais geral luz 2H2D 1 CO2 CH2O 1 H2O 1 2D na qual H2D é um doador de elétrons e de hidrogênio e D é sua forma oxidada H2D pode ser água sulfeto de hidrogê nio lactato ou algum outro composto orgânico dependen do da espécie Muito provavelmente as bactérias inicial mente desenvolveram a capacidade fotossintética usando H2S como fonte de elétrons Os parentes antigos das cianobactérias modernas pro vavelmente tenham surgido da combinação do material genético de dois tipos de bactérias fotossintéticas com sis temas do tipo observado em bactérias púrpuras modernas com via de elétrons do tipo PSII e em bactérias verdes sulfurosas com via de elétrons que lembra aquela do PSI A bactéria com dois fotossistemas independentes pode ter usado um deles em um determinado conjunto de condições e outro em condições diferentes Ao longo do tempo um mecanismo para conectar os dois fotossistemas para uso simultâneo evoluiu e o sistema tipo PSII adquiriu a capaci dade encontrada em cianobactérias modernas de quebrar a água As cianobactérias modernas podem sintetizar ATP por fosforilação oxidativa ou por fotofosforilação embora não tenham nem mitocôndrias e nem cloroplastos A maqui naria enzimática para ambos os processos está em uma membrana plasmática altamente convoluta Figura 19 67 Três componentes proteicos funcionam nos dois pro cessos fornecendo evidências de que tenham uma origem evolutiva comum Figura 1968 Primeiro o complexo capaz de bombear prótons constituído pelos citocromos b6 f carrega elétrons da plastoquinona para o citocromo c6 na fotossíntese e também carrega elétrons da ubiquinona para o citocromo c6 na fosforilação oxidativa o papel de sempenhado pelo citocromo bc1 nas mitocôndrias Segun do o citocromo c6 homólogo ao citocromo c mitocondrial carrega elétrons do complexo III para o complexo IV em cianobactérias ele também pode carregar elétrons do com plexo de citocromos b6 f para o PSI papel desempenhado em plantas pela plastocianina Vêse portanto a homologia funcional entre o complexo de citocromos b6 f cianobacte riano e o complexo de citocromos bc1 mitocondrial e entre o citocromo c6 cianobacteriano e a plastocianina vegetal O terceiro componente conservado é a ATPsintase que funciona na fosforilação oxidativa e na fotofosforilação em cianobactérias e nas mitocôndrias e nos cloroplastos de eu cariotos fotossintéticos A estrutura e o mecanismo notável dessa enzima foram fortemente conservados ao longo da evolução Em Halobacterium uma só proteína absorve luz e bombeia prótons para promover a síntese de ATP Em certas arqueobactérias modernas evoluiu um meca nismo bastante diferente para converter a energia da luz em gradiente eletroquímico A arqueobactéria halofílica apreciadora de sal Halobacterium salinarum descen de de progenitores evolutivos antigos Essa arqueobactéria comumente referida como halobactéria vive apenas em lagoas e lagos salgados o Great Salt Lake e o Mar Morto FIGURA 1967 As membranas fotossintéticas de uma cianobacté ria Nestes cortes finos de uma cianobactéria vistos por microscopia ele trônica de transmissão as múltiplas camadas das membranas internas são vistas preenchendo metade do volume total da célula O amplo sistema de membranas cumpre a mesma função dos tilacoides das plantas vasculares proporcionando uma grande área de superfície que contém toda a maqui naria fotossintética Barra 5 100 nm Nelson6edbookindb 789 Nelson6edbookindb 789 030414 0745 030414 0745 790 DAVID L NELSON MICHAEL M COX por exemplo onde a alta concentração de sal que pode exceder 4 M resulta da perda de água por evaporação na verdade as halobactérias não podem viver em concentra ções de NaCl menores do que 3 M Esses organismos são aeróbios e normalmente usam o O2 para oxidar moléculas combustíveis orgânicas No entanto a solubilidade do O2 é tão baixa em lagoas salgadas que algumas vezes o meta bolismo oxidativo precisa ser suplementado pela luz solar como fonte alternativa de energia A membrana plasmática de H salinarum apresenta porções que contêm o pigmento de absorção de luz bacte riorrodopsina o qual contém retinal o derivado aldeído da vitamina A ver Figura 1021 como um grupo prostético capaz de absorver luz Quando as células são iluminadas o retinaltodotrans ligado à bacteriorrodopsina absorve um fóton e sofre fotoisomerização para retinal13cis forçando uma mudança conformacional na proteína A restauração do retinaltodotrans é acompanhada pelo movimento de saída de prótons através da membrana plasmática A bacte riorrodopsina com apenas 247 resíduos de aminoácidos é a bomba de prótons mais simples impulsionada pela luz que se conhece A diferença na estrutura tridimensional da bac teriorrodopsina no escuro e depois da iluminação Figura 1969a sugere uma via pela qual uma série de saltos de prótons em concerto poderia efetivamente mover um pró ton através da membrana O cromóforo retinal está ligado por uma ligação via base de Schiff ao grupo amino de um resíduo de Lys No escuro o nitrogênio dessa base de Schiff está protonado quando iluminado a fotoisomerização do retinal baixa o pKa desse grupo e ele libera seu próton para um resíduo de Asp próximo desencadeando uma série de saltos laterais de prótons que acabam resultando na libera ção de um próton na superfície externa da membrana Fi gura 1969b O potencial eletroquímico através da membrana promo ve a volta dos prótons para dentro da célula por meio de um complexo de ATPsintase de membrana muito similar àque le das mitocôndrias e dos cloroplastos Assim quando o O2 é limitado as halobactérias podem usar a luz para suple mentar o ATP sintetizado pela fosforilação oxidativa As ha lobactérias não liberam O2 e nem realizam a fotorredução do NADP 1 sua maquinaria de fototransdução é portanto muito mais simples do que aquela de cianobactérias ou plantas No entanto seu mecanismo de bombeamento de prótons pode se revelar um protótipo para muitas outras bombas de íons mais complexas Bacteriorrodopsina RESUMO 1910 Evolução da fotossíntese oxigênica c As cianobactérias modernas são derivadas de um or ganismo antigo que adquiriu dois fotossistemas um do tipo encontrado hoje em bactérias púrpuras e o outro do tipo encontrado em bactérias verdes sulfurosas c Muitos microrganismos fotossintéticos obtêm elétrons para a fotossíntese não da água mas de doadores como H2S c As cianobactérias com os fotossistemas em sequência e com uma atividade de quebra de água que liberou oxigê nio para a atmosfera apareceram na Terra há cerca de 25 bilhões de anos c Os cloroplastos assim como as mitocôndrias evoluíram de bactérias vivendo endossimbioticamente em células eucarióticas primitivas As ATPsintases de bactérias cianobactérias mitocôndrias e cloroplastos comparti lham um precursor evolutivo e um mecanismo enzimá tico comum c Um mecanismo inteiramente diferente para converter a energia da luz em um gradiente de prótons evoluiu em arqueobactérias modernas no qual o pigmento coletor de luz é o retinal a b NADPH 1 H1 NADP1 NADH 1 H1 NAD1 Fotofosforilação 2 Fdox 2 Fdred Luz Luz Fosforilação oxidativa e e H2O 2 1 H2O 2 1 Plasto quinona Cit c6 O2 O2 PSII Complexo I NADH desidrogenase Cit b6 f Complexo III PSI Cit a 1 a6 Complexo IV FIGURA 1968 Os papéis duplos dos citocromos b6f e do citocromo c6 em cianobactérias refletem origens evolutivas As cianobactérias usam os citocromos b6f o citocromo c6 e a plastoquinona tanto para a fos forilação oxidativa quanto para a fotofosforilação a Na fotofosforilação os elétrons fluem da parte superior para a inferior da água para o NADP 1 b Na fosforilação oxidativa os elétrons fluem do NADH para o O2 Ambos os processos são acompanhados pelo movimento de prótons através da mem brana realizado por um ciclo Q Nelson6edbookindb 790 Nelson6edbookindb 790 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 791 Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário teoria quimiosmótica 731 cadeia respiratória 734 flavoproteína 734 equivalente redutor 735 ubiquinona coenzima Q Q 735 citocromos 735 proteína ferro enxofre 735 proteína ferroenxofre de Rieske 735 complexo I 738 vetorial 738 complexo II 740 succinato desidrogenase 740 espécies reativas de oxigênio ERO 740 radical superóxido O2 2 740 complexo III 740 complexo de citocromos bc1 740 ciclo Q 741 complexo IV 742 citocromooxidase 742 força prótonmotriz 744 ATPsintase 747 F1ATPase 750 catálise rotacional 752 FIGURA 1966 Um mecanismo diferente para o bombeamento de prótons evoluiu independentemente em uma arqueobactéria ha lofílica a A bacteriorrodopsina Mr 26000 de Halobacterium halobium tem sete hélices a que atravessam a membrana PDB ID 1C8R O cromófo ro retinaltodotrans em púrpura está covalentemente ligado por meio de uma base de Schiff ao grupo amino de um resíduo de Lys bem no interior da membrana Ao longo da proteína estão uma série de resíduos de Asp e Glu e uma série de moléculas de água proximamente associadas que juntas fornecem a via transmembrana para prótons setas corderosa As etapas de ➊ a ➎ indicam movimentos de prótons descritos a seguir b No escuro painel da esquerda a base de Schiff está protonada A iluminação painel da direita fotoisomeriza o retinal forçando mudanças conformacionais sutis na proteína que alteram a distância entre a base de Schiff e seus resíduos de aminoácidos vizinhos A interação com estes vizi nhos Leu 93 e Val 49 baixa o pKa da base e Schiff protonada e a base doa seu próton a um grupo carboxil próximo no Asp 85 etapa ➊ em a Isso inicia uma série de saltos laterais em concerto de prótons entre moléculas de água ver Figura 214 no interior da proteína que termina com ➋ a liberação de um próton que estava sendo partilhado por Glu 194 e Glu 204 perto da super fície extracelular Tyr 83 forma uma ligação de hidrogênio com Glu 194 que fa cilita esta liberação de prótons ➌ A base de Schiff readquire um próton do Asp 96 o qual ➍ retira um próton do citosol ➎ Finalmente o Asp 85 doa seu próton levando a uma nova protonação do par Glu 204Glu 194 Este sistema está agora pronto para outra rodada de bombeamento de próton a Citosol Meio externo H H 4➍ 33 2 1 5 ➌ ➋ ➊ ➎ Asp96 Asp85 Arg82 Glu204 Retinal Glu194 Thr89 OH Asp85 C C O O O Base de Schiff protonada alto pKa Complexo liberador de prótons protonado alto pKa Baixo pKa Retinal Retinal Escuro O N H1 Lys216 Arg82 Glu194 C HO O Glu204 C N H NH2 NH2 1 1 N Lys216 Leu93 Val49 Asp85 C C O O O Mudanças conforma cionais baixam o pKa da base de Schiff O pKa do complexo liberador de prótons diminui Alto pKa Luz OH Arg82 Tyr83 Glu204 C O O Glu194 Liberação de próton Transferência de próton C NH NH2 OH NH2 2 2 2 2 b Nelson6edbookindb 791 Nelson6edbookindb 791 030414 0746 030414 0746 792 DAVID L NELSON MICHAEL M COX modelo de troca de ligação 754 razão PO 755 razão P2e 2 755 lançadeira do malato aspartato 758 lançadeira do glicerol3 fosfato 759 controle pelo aceptor 760 razão massaação 760 tecido adiposo marrom TAM 763 termogenina proteína desacopladora 1 763 citocromo P450 763 xenobióticos 763 apoptose 764 apoptossomo 764 caspase 764 heteroplasmia 767 homoplasmia 767 reações dependentes de luz 769 reações luminosas 769 reações de assimilação de carbono 769 reação de fixação de carbono 769 tilacoides 770 grana 770 lamelas 770 estroma 770 reação de Hill 770 fóton 771 quantum 771 estado excitado 771 estado basal 771 fluorescência 771 éxciton 771 transferência de éxcitons 771 clorofilas 771 complexos coletores de luz LHCs 773 pigmentos acessórios 773 carotenoides 773 espectro de ação 774 fotossistema 774 centro de reação fotoquímico 774 feofitina 776 fotossistema II PSII 779 fotossistema I PSI 780 plastocianina 780 fotossíntese oxigênica 780 esquema Z 780 plastoquinona PQA 780 fluxo acíclico de elétrons 783 fluxo cíclico de elétrons 783 fotofosforilação cíclica 783 transição de estado 783 complexo de liberação de oxigênio 785 complexo de quebra da água 785 cromatóforo 786 fotofosforilação 786 bacteriorrodopsina 790 Leituras adicionais História e antecedentes gerais Arnon DI 1984 The discovery of photosynthetic phosphorylation Trends Biochem Sci 9 258262 Harold FM 1986 The Vital Force A Study in Bioenergetics WH Freeman and Company New York Uma síntese de fácil leitura dos princípios da bioenergética e suas aplicações para as transduções de energia Heldt HW Piechulla B 2010 Plant Biochemistry 4th edn Elsevier New York Um livrotexto de bioquímica vegetal com excelentes discussões sobre a fotofosforilação Lane N 2005 Power Sex Suicide Mitochondria and the Meaning of Life Oxford University Press Oxford Uma descrição introdutória dos papéis das mitocôndrias na conservação da energia e na apoptose Mitchell P 1979 Keilins respiratory chain concept and its chemiosmotic consequences Science 206 11481159 A aula do Nobel de Mitchell delineando a evolução da hipótese quimiosmótica Scheffler IE 2008 Mitochondria 2nd edn John Wiley Sons Hoboken NJ Um excelente levantamento sobre a estrutura e o funcionamento da mitocôndria Slater EC 1987 The mechanism of the conservation of energy of biological oxidations Eur J Biochem 166 489504 Uma descrição clara e crítica da evolução do modelo quimiosmótico FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA Reações de transferência de elétrons em mitocôndrias AdamVizi V Chinopoulos C 2006 Bioenergetics and the formation of mitochondrial reactive oxygen species Trends Pharmacol 27 639645 Cramer WA Hasan SS Yamashita E 2011 The Q cycle of cytochrome bc complexes a structure perspective Biochim Biophys Acta 1807 788802 Uma discussão avançada sobre o ciclo Q na fosforilação oxidativa e fotofosforilação Dudkina NV Kourˇil R Peters K Braun HP Boekema EJ 2010 Structure and function of mitochondrial supercomplexes Biochim Biophys Acta 1797 664670 Efremov RS Baradaran R Sazanov LA 2010 The architecture of respiratory complex I Nature 465 441447 Hamanaka RB Chandel NS 2010 Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes Trends Biochem Sci 35 505513 Millar AH Whelan J Soole KL Day DA 2011 Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants Annu Rev Plant Biol 62 79104 Sun F Huo X Zhai Y Wang A Xu J Su D Bartlam M Rao Z 2005 Crystal structure of mitochondrial respiratory protein Complex II Cell 121 10431057 Tsukihara T Aoyama H Yamashita E Tomizaki T Yamaguchi H ShinzawaItoh K Nakashima R Yaono R Yoshikawa S 1996 The whole structure of the 13subunit oxidized cytochrome c oxidase at 28 Å Science 272 11361144 A solução por cristalografia por raios X da estrutura desta enorme proteína de membrana Xia D Yu CA Kim H Xia JZ Kachurin AM Zhang L Yu L Deisenhofer J 1997 Crystal structure of the cytochrome bc1 complex from bovine heart mitochondria Science 277 6066 Um relato revelando a estrutura cristalográfica do complexo III Yoshikawa S Muramoto K ShinzawaItoh K 2011 Protonpumping mechanism of cytochrome c oxidase Annu Rev Biophys 40 205223 Síntese de ATP Abrahams JP Leslie AGW Lutter R Walker JE 1994 The structure of F1ATPase from bovine heart mitochondria determined at 28 Å resolution Nature 370 621628 Boyer PD 1997 The ATP synthasea splendid molecular machine Annu Rev Biochem 66 717749 Uma descrição do desenvolvimento histórico e do estado atual do modelo de troca de ligação escrito por seu principal arquiteto Hinkle PC Kumar MA Resetar A Harris DL 1991 Mechanistic stoichiometry of mitochondrial oxidative phosphorylation Biochemistry 30 35763582 Uma análise cuidadosa dos resultados experimentais e das considerações teóricas sobre a questão de razões PO não integrais Okuno D Iino R Noji H 2011 Rotation and structure of FoF1ATP synthase J Biochem 149 655664 Nelson6edbookindb 792 Nelson6edbookindb 792 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 793 Silverstein T 2005 The mitochondrial phosphatetooxygen ratio is not an integer Biochem Mol Biol Educ 33 416417 von Ballmoos C Wiedenmann A Dimroth P 2009 Essentials for ATP synthesis by F1Fo ATP synthase Annu Rev Biochem 78 649672 Watt IN Montgomery MG Runswick MJ Leslie AGW Walker JE 2010 Bioenergetic cost of making an adenosine triphosphate molecule in animal mitochondria Proc Natl Acad Sci USA 107 1682316827 Regulação da fosforilação oxidativa Taylor CT 2008 Mitochondria and cellular oxygen sensing in the HIF pathway Biochem J 409 1926 Mitocôndrias na termogênese na síntese de esteroides e na apoptose Azzu V Brand MD 2010 The onoff switches of the mitochondrial uncoupling proteins Trends Biochem Sci 35 298307 Revisão de nível intermediário de como o frio a superalimentação e a fome afetam a expressão de genes da termogenina Wang C Youle RJ 2009 The role of mitochondria in apoptosis Annu Rev Genet 43 95118 Genes mitocondriais suas origens e efeitos das mutações AbouSleiman PM Muqit MMK Wood NW 2006 Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinsons disease Nat Rev Neurosci 7 207219 Becker T Böttinger L Pfanner N 2012 Mitochondrial protein import from transport pathways to an integrated network Trends Biochem Sci 37 8591 Revisão de nível intermediário de como as proteínas codificadas pelo núcleo chegam às mitocôndrias Chen ZJ Butow RA 2005 The organization and inheritance of the mitochondrial genome Nat Rev Genet 6 815825 Revisão de nível intermediário Seyfried TN Shelton LM 2010 Cancer as a metabolic disease Nutr Metab 7 729 Metabolismo energético danificado é típico de uma ampla variedade de cânceres uma revisão do papel das mitocôndrias FOTOSSÍNTESE Fluxo de elétrons promovido pela luz Barber J Anderson JM eds 2002 Photosystem II Molecular Structure and Function Proceedings of a Meeting 1314 March 2002 Philos Trans R Soc Biol Sci 357 1426 Uma coletânea de 16 artigos sobre o fotossistema II Biochim Biophys Acta Bioenerg 2007 1767 6 Este número de periódico contém 10 revisões sobre a estrutura e a função dos fotossistemas Busch A Hipler M 2011 The structure and function of eukaryotic photosystem I Biochim Biophys Acta 1807 864877 Huber R 1990 A structural basis of light energy and electron transfer in biology Eur J Biochem 187 283305 Aula do Nobel de Huber descrevendo a química e a física das fototransduções discussão excepcionalmente clara e bem ilustrada com base em estudos cristalográficos dos centros de reação Johnson GN 2011 Physiology of PSI cyclic electron transport in higher plants Biochim Biophys Acta 1807 906911 Revisão das vias e funções da fotofosforilação cíclica Kramer DM Avenson TJ Edwards GE 2007 Dynamic flexibility in the light reactions of photosynthesis governed by both electron and proton transfer reactions Trends Plant Sci 9 349357 Revisão de nível intermediário sobre a regulação das transições de estado Rochaix JD 2011 Regulation of photosynthetic electron transport Biochim Biophys Acta 1807 878886 Revisão de nível intermediário sobre as respostas das plantas a mudanças na qualidade e quantidade de luz Umena Y Kawakami K Shen JR Kamiya N 2011 Crystal structure of oxygenevolving photosystem II at a resolution of 19 Å Nature 473 5561 Síntese de ATP por fotofosforilação Jagendorf AT 1967 Acidbase transitions and phosphorylation by chloroplasts Fed Proc 26 13611369 Experimento clássico estabelecendo a capacidade de um gradiente de prótons em promover a síntese de ATP no escuro Evolução da fotossíntese oxigênica HohmannMarriott MF Blankenship RE 2011 Evolution of photosynthesis Annu Rev Plant Biol 62 515548 Nelson N 2011 Photosystems and global effects of oxygenic photosynthesis Biochim Biophys Acta 1807 856863 Uma revisão de nível intermediário sobre as forças evolutivas que moldaram a fotossíntese oxigênica Problemas 1 Reações de oxidaçãoredução O complexo da NADH desidrogenase da cadeia respiratória mitocondrial promove a seguinte série de reações de oxidaçãoredução nas quais Fe 31 e Fe 21 representam os centros de ferroenxofre Q é ubiquino na QH2 é ubiquinol e E é a enzima 1 NADH 1 H 1 1 EFMN NAD 1 1 EFMNH2 2 EFMNH21 2Fe 31 EFMN 1 2Fe 21 1 2H 1 3 2Fe 21 1 2H 1 1 Q 2Fe 31 1 QH2 Soma NADH 1 H 1 1 Q NAD 1 1 QH2 Para cada uma das três reações catalisadas pelo complexo da NADHdesidrogenase identifique a o doador de elétrons b o aceptor de elétrons c o par redox conjugado d o agente redutor e e o agente oxidante 2 Todas as partes da ubiquinona têm uma função Na transferência de elétrons apenas a porção quinona da ubiqui nona sofre oxidaçãoredução a cadeia lateral isoprenoide per manece inalterada Qual a função desta cadeia 3 Uso do FAD em vez do NAD 1 na oxidação do succi nato Todas as desidrogenases da glicólise e do ciclo do ácido cítrico usam NAD 1 E9 para NAD 1NADH é 2032 V como aceptor de elétrons exceto pela succinatodesidrogenase que usa FAD covalentemente ligado E9 para FADFADH2 nessa en zima é 0050 V Sugira por que o FAD é um aceptor de elétrons mais apropriado do que o NAD 1 na desidrogenação do succina to com base nos valores de E9 para fumaratosuccinato E9 5 0031 V NAD 1NADH e succinatodesidrogenase FADFADH2 4 Grau de redução dos carregadores de elétrons na cadeia respiratória O grau de redução de cada carregador na cadeia respiratória é determinado pelas condições na mi tocôndria Por exemplo quando NADH e O2 são abundantes o grau de redução em estado estacionário dos carregadores Nelson6edbookindb 793 Nelson6edbookindb 793 030414 0746 030414 0746 794 DAVID L NELSON MICHAEL M COX decresce à medida que os elétrons passam do substrato ao O2 Quando a transferência de elétrons é bloqueada os carregado res antes do bloqueio se tornam mais reduzidos e aqueles além do bloqueio se tornam mais oxidados ver Figura 196 Para cada uma das condições abaixo preveja o estado de oxidação da ubiquinona e dos citocromos b c1 c e a 1 a3 a NADH e O2 abundantes mas cianeto adicionado b NADH abundante mas O2 exaurido c O2 abundante mas NADH exaurido d NADH e O2 abundantes 5 Efeito da rotenona e da antimicina A na transferên cia de elétrons Rotenona produto tóxico natural de plan tas inibe fortemente a NADHdesidrogenase em mitocôndrias de insetos e peixes Antimicina A um antibiótico tóxico inibe fortemente a oxidação do ubiquinol a Explique por que a ingestão de rotenona é letal para algumas espécies de insetos e peixes b Explique por que a antimicina A é um veneno c Considerando que a rotenona e a antimicina A são igualmente efetivas em bloquear seus respectivos sítios na ca deia de transferência de elétrons qual delas seria um veneno mais potente Explique 6 Desacopladores da fosforilação oxidativa Em mi tocôndrias normais a taxa de transferência de elétrons está fortemente acoplada à demanda por ATP Quando a taxa de uso do ATP é relativamente baixa a taxa de transferência de elétrons é baixa quando a demanda por ATP aumenta a taxa de transferência de elétrons aumenta Sob essas condições de estreito acoplamento o número de moléculas de ATP produ zidas por átomo de oxigênio consumido quando o NADH é o doador de elétrons a razão PO é de cerca de 25 a Imagine o efeito de uma concentração relativamente bai xa e de uma concentração relativamente alta de um agente de sacoplador na taxa de transferência de elétrons e na razão PO b A ingestão de desacopladores causa sudorese profusa e um aumento na temperatura corporal Explique esse fenôme no em termos moleculares O que acontece com a razão PO na presença dos desacopladores c O desacoplador 24dinitrofenol já foi prescrito como remédio de emagrecimento Como esse agente poderia a prin cípio auxiliar na perda de peso Agentes desacopladores não são mais prescritos porque algumas mortes ocorreram após seu uso Por que a ingestão de desacopladores pode levar à morte 7 Efeitos da valinomicina na fosforilação oxidativa Quando o antibiótico valinomicina é adicionado a mitocôn drias que respiram ativamente vários eventos acontecem o rendimento de ATP diminui a taxa de consumo de O2 aumen ta calor é liberado e o gradiente de pH através da membrana mitocondrial interna aumenta A valinomicina age como um desacoplador ou como um inibidor da fosforilação oxidativa Explique as observações experimentais em termos da capaci dade do antibiótico de transferir íons K 1 através da membrana mitocondrial interna 8 Modo de ação da dicicloexilcarbodiimida DCCD Quando DCCD é adicionada à suspensão de mitocôndrias firme mente acopladas e respirando ativamente a velocidade de trans ferência de elétrons medida pelo consumo de O2 e de produção de ATP diminui drasticamente Se uma solução de 24dinitrofe nol é agora adicionada ao preparado o consumo de O2 retorna ao normal mas a produção de ATP permanece inibida a Qual processo na transferência de elétrons ou na fosfo rilação oxidativa é afetado pela DCCD b Por que a DCCD afeta o consumo de O2 nas mitocôn drias Explique o efeito do 24dinitrofenol no preparado mito condrial inibido c Qual dos seguintes inibidores mais se assemelha à DCCD em sua ação antimicina A rotenona ou oligomicina 9 Compartimentalização dos componentes do ciclo do ácido cítrico A isocitratodesidrogenase é encontrada ape nas na mitocôndria mas a malatodesidrogenase é encontrada tanto no citosol quanto na mitocôndria Qual o papel da mala todesidrogenase citosólica 10 O sistema de transporte do malatoacetoglutara to O sistema de transporte que conduz malato e acetoglu tarato através da membrana mitocondrial interna ver Figura 1931 é inibido por nbutilmalonato Suponha que o nbutil malonato seja adicionado a uma suspensão aeróbia de células renais usando exclusivamente glicose como combustível Pre veja o efeito desse inibidor em a glicólise b consumo de oxigênio c formação de lactato e d síntese de ATP 11 A concentração celular de ADP controla a forma ção de ATP Embora tanto ADP quanto Pi sejam necessários para a síntese de ATP a velocidade de síntese depende prin cipalmente da concentração de ADP e não da de Pi Por quê 12 Escalas de tempo dos eventos regulatórios em mitocôndrias Compare as prováveis escalas de tempo para os ajustes na velocidade da respiração causados por a au mento na ADP e b redução em pO2 O que explica essa diferença 13 O efeito Pasteur Quando O2 é adicionado a uma sus pensão anaeróbia de células consumindo glicose em alta velo cidade essa velocidade diminui marcantemente à medida que o O2 é consumido e o acúmulo de lactato cessa Esse efeito pri meiramente observado por Louis Pasteur na década de 1860 é característico da maioria das células capazes tanto de catabo lismo aeróbio quanto anaeróbio da glicose a Por que o acúmulo de lactato cessa depois que o O2 é adicionado b Por que a presença de O2 diminui a taxa de consumo de glicose c De que forma o início do consumo de O2 reduz a taxa de consumo de glicose Explique em termos de enzimas es pecíficas 14 Mutantes de leveduras com deficiências na respi ração e a produção de etanol Mutantes de leveduras com deficiências na respiração p petites podem ser produzidos a partir de pais do tipo selvagem por um tratamento com agen tes mutagênicos Os mutantes carecem de citocromooxidase déficit que afeta marcantemente seu comportamento metabóli co Um efeito notável é que a fermentação não é suprimida por O2 ou seja os mutantes não apresentam o efeito Pasteur ver Problema 13 Algumas empresas estão muito interessadas em usar esses mutantes para fermentar cavacos de madeira até etanol para uso energético Explique a vantagem de usar esses mutantes em vez de leveduras do tipo selvagem para produção de etanol em larga escala Por que a ausência da citocromo oxidase elimina o efeito Pasteur 15 Vantagens dos supercomplexos para a transferên cia de elétrons Existe evidência crescente de que os com plexos mitocondriais I II III e IV sejam parte de um supercom Nelson6edbookindb 794 Nelson6edbookindb 794 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 795 plexo maior Qual poderia se a vantagem de ter todos os quatro complexos em um supercomplexo 16 Quantos prótons em uma mitocôndria A transfe rência de elétrons transloca prótons da matriz mitocondrial para o meio externo estabelecendo um gradiente de pH através da membrana interna o lado de fora mais ácido do que o de dentro A tendência dos prótons de se difundirem de volta à matriz é a força propulsora para a síntese de ATP pela ATPsintase Em uma suspensão de mitocôndrias em um meio de pH 74 o pH da matriz foi avaliado em 77 durante a fosforilação oxidativa a Calcule H 1 no meio externo e na matriz nessas con dições b Qual a razão da H 1 entre o lado de fora e o lado de dentro Comente sobre a energia inerente a essa diferença de concentração Dica ver Equação 114 p 410 c Calcule o número de prótons em uma mitocôndria he pática respirando ativamente presumindo que seu comparti mento matricial é uma esfera de 15 mm de diâmetro d A partir desses dados o gradiente de pH sozinho é su ficiente para gerar ATP e Se não é sugira de que forma surge a energia necessá ria para a síntese de ATP 17 Taxa de renovação do ATP em músculo cardíaco de ratos O músculo cardíaco de ratos operando aerobicamente obtém mais de 90 das suas necessidades de ATP via fosforila ção oxidativa Cada grama de tecido consome O2 na velocidade de 10 mmolmin com glicose como fonte de combustível a Calcule a velocidade de consumo de glicose e produção de ATP pelo músculo cardíaco b Para uma concentração de ATP em equilíbrio esta cionário de 5 mmolg de tecido muscular cardíaco calcule o tempo necessário em segundos para repor completamente o conjunto pool celular de ATP O que esse resultado indi ca sobre a necessidade de estreita regulação da produção de ATP Nota as concentrações são expressas como micromols por grama de tecido muscular porque o tecido é principalmen te água 18 A taxa de quebra de ATP em músculo de voo de insetos A produção de ATP no músculo de voo da mosca Lucilia sericata resulta quase que exclusivamente da fosfori lação oxidativa Durante o voo 187 mL de O2hg de peso cor poral são necessários para manter a concentração de ATP de 70 mmolg de músculo Considerando que o músculo de voo compreende 20 do peso da mosca calcule a taxa de repo sição do conjunto de ATP no músculo de voo Quanto tempo duraria o reservatório de ATP na ausência da fosforilação oxi dativa Considere para o cálculo que os equivalentes redutores são transferidos pela lançadeira do glicerol3fosfato e que o O2 está a 25C e a 1013 kPa 1 atm 19 Doença mitocondrial e câncer Mutações nos genes que codificam certas proteínas mitocondriais estão associadas à alta incidência de certos tipos de câncer De que forma mitocôndrias com defeitos podem levar ao câncer 20 Gravidade variável de uma doença mitocon drial Pessoas com uma doença causada por um defeito específico no genoma mitocondrial podem ter sintomas que variam de moderados a graves Explique por quê N de T O meio externo a que o problema se refere seria o espaço inter membranas 21 Movimento transmembrana de equivalentes redu tores Sob condições aeróbias o NADH extramitocondrial precisa ser oxidado pela cadeia mitocondrial de transferência de elétrons Considere um preparado de hepatócitos de ratos contendo mitocôndrias e todas as enzimas citosólicas Se 4 3H NADH é introduzido radioatividade logo aparece na matriz mi tocondrial No entanto se 7 14CNADH é introduzido nenhu ma radioatividade aparece na matriz O que essas observações revelam sobre a oxidação do NADH extramitocondrial pela ca deia de transferência de elétrons O 14C H N NH2 R 714CNADH O 3H C N 3H NH2 R 43HNADH H 22 Altos níveis de alanina no sangue associados a defeitos na fosforilação oxidativa Em sua maio ria as pessoas com defeitos genéticos na fosforilação oxidativa têm concentrações relativamente altas de alanina no sangue Explique isso em termos bioquímicos 23 Conjuntos pools de NAD 1 e atividades de desi drogenases Embora tanto a piruvatodesidrogenase quan to a gliceraldeído3fosfatodesidrogenase usem NAD 1 como aceptor eletrônico as duas enzimas não competem pelo mes mo conjunto de NAD celular Por quê 24 O diabetes como consequência de defeitos mi tocondriais A glicocinase é essencial para o metabolis mo da glicose em células b pancreáticas Os humanos com duas cópias defeituosas do gene da glicocinase exibem diabe tes neonatal grave enquanto aqueles com apenas uma cópia defeituosa do gene têm uma forma bem mais moderada da doença diabetes juvenil com início na maturidade MODY2 de mature onset diabetes of the young Explique essa diferença em termos da biologia das células b 25 Efeitos das mutações no complexo II mito condrial Mudanças em um único nucleotídeo no gene da succinatodesidrogenase complexo II estão associadas a tumores carcinoides do intestino médio Sugira um mecanismo para explicar essa observação 26 Eficiência fotoquímica da luz em diferentes com primentos de onda A velocidade da fotossíntese medida pela produção de O2 é maior quando uma planta verde é ilumi nada com luz de comprimento de onda de 680 nm do que com luz de 700 nm No entanto a combinação de luz de 680 e 700 nm gera uma taxa de fotossíntese maior do que a luz de cada um dos comprimentos de onda isoladamente Explique 27 Planilha de balanço da fotossíntese Em 1804 The odore de Saussure observou que o peso total de oxigênio e de matéria orgânica seca produzido pelas plantas é maior do que o peso de dióxido de carbono consumido durante a fotossínte se De onde vem esse peso extra 28 O papel do H2S em algumas bactérias fotossinté ticas Bactérias púrpuras sulfurosas quando iluminadas realizam a fotossíntese na presença de H2O e de 14CO2 mas N de T Certamente os autores se referem às bactérias verdes sulfurosas Nelson6edbookindb 795 Nelson6edbookindb 795 030414 0746 030414 0746 796 DAVID L NELSON MICHAEL M COX apenas se H2S é adicionado e O2 é removido Durante o curso da fotossíntese medida pela formação de 14Ccarboidrato H2S é convertido em enxofre elementar mas nenhum O2 é produ zido Qual o papel da conversão de H2S em enxofre Por que nenhum O2 é produzido 29 O aumento do poder redutor do fotossistema I pela absorção de luz Quando o fotossistema I absorve luz ver melha a 700 nm o potencial de redução padrão do P700 muda de 040 V para cerca de 212 V Que fração da luz absorvida é aprisionada na forma de força redutora 30 Fluxo de elétrons pelos fotossistemas I e II Pre veja como um inibidor da passagem de elétrons pela feofitina afetaria o fluxo de elétrons pelo a do fotossistema II e b do fotossistema I Explique o seu raciocínio 31 Síntese limitada de ATP no escuro Em um experi mento de laboratório cloroplastos de espinafre são iluminados na ausência de ADP e Pi a luz é então desligada e ADP e Pi são adicionados ATP é sintetizado por um curto período de tempo no escuro Explique esse achado 32 Modo de ação do herbicida DCMU Quando cloro plastos são tratados com 334diclorofenil11dimetilureia DCMU ou diuron um herbicida potente a liberação de O2 e a fotofosforilação cessam A liberação de O2 mas não a fotofosfo rilação pode ser restaurada pela adição de um aceptor externo de elétrons ou reagente de Hill De que forma o DCMU age como exterminador de plantas daninhas Sugira uma localiza ção para a ação inibitória desse herbicida no esquema mostra do na Figura 1958 Explique 33 Efeito da venturicidina na liberação de oxigênio A venturicidina é um inibidor poderoso da ATPsintase do cloro plasto interagindo com a porção CFo da enzima e bloqueando a passagem de prótons pelo complexo CFoCF1 Como a ven turicidina afetaria a liberação de oxigênio em uma suspensão de cloroplastos bem iluminados A sua resposta mudaria se o experimento fosse feito na presença de um reagente desacop lador como o 24dinitrofenol DNP Explique 34 Bioenergética da fotofosforilação As concentrações de equilíbrio estacionário de ATP ADP e Pi em cloroplastos iso lados de espinafre sob iluminação plena a pH 7 são 120 6 e 700 mM respectivamente a Qual a energia livre necessária para a síntese de 1 mol de ATP nestas condições b A energia para a síntese de ATP é fornecida pela trans ferência de elétrons induzida pela luz nos cloroplastos Qual a variação mínima de voltagem necessária durante a transfe rência de um par de elétrons para sintetizar ATP nessas con dições Talvez você precise consultar a Equação 137 p 531 35 Energia luminosa para uma reação redox Suponha que você tenha isolado um novo microrganismo fotossintético que oxida H2S e passa os elétrons ao NAD 1 Luz de qual com primento de onda forneceria energia suficiente para o H2S re duzir o NAD 1 sob condições padrão Assuma 100 de eficiên cia no evento fotoquímico e use E9 de 2243 mV para o H2S e 2320 mV para o NAD 1 Ver Figura 1948 para os equivalentes de energia da luz de diferentes comprimentos de onda 36 Constante de equilíbrio para as reações de quebra da água A coenzima NADP 1 é o aceptor final de elétrons nos cloroplastos de acordo com a reação 2H2O 1 2NADP 1 2NADPH 1 2H 1 1 O2 Use a informação na Tabela 192 para calcular a constante de equilíbrio para esta reação a 25C A relação entre K9eq e DG9 é discutida na p 508 De que forma o cloroplasto pode supe rar esse equilíbrio desfavorável 37 Energética da fototransdução Durante a fotossínte se oito fótons precisam ser absorvidos quatro em cada fotos sistema para cada molécula de O2 produzida 2H2O 1 2NADP 1 1 8 fótons 2NADPH 1 2H 1 1 O2 Assumindo que esses fótons tenham um comprimento de onda de 700 nm vermelho e que a absorção de luz e o uso da ener gia luminosa são 100 eficientes calcule a variação de energia livre para o processo 38 Transferência de elétrons para um reagente de Hill Cloroplastos isolados de espinafre liberam O2 quando ilu minados na presença de ferricianeto de potássio um reagente de Hill de acordo com a equação 2H2O 1 4Fe 31 O2 1 4H 1 1 4Fe 21 onde Fe 31 representa ferricianeto e Fe 21 ferrocianeto NADPH é produzido neste processo Explique 39 Com que frequência uma molécula de clorofila ab sorve um fóton A quantidade de clorofila a Mr 892 em uma folha de espinafre é de cerca de 20 mgcm 2 de superfície foliar Sob luz solar de meiodia quando a energia média atingindo a folha é de 54 Jcm 2 min a folha absorve cerca de 50 da radiação Com que frequência uma única molécula de clorofila absorve um fóton Considerando que o tempo de vida médio de uma molécula excitada de clorofila in vivo é 1 ns que fração das moléculas de clorofila é excitada em um momento qualquer 40 Efeito da luz monocromática no fluxo de elé trons A extensão na qual um carregador de elétrons é oxi dado ou reduzido durante a transferência fotossintética de elétrons algumas vezes pode ser observada diretamente com um espectrofotômetro Quando os cloroplastos são iluminados com luz de 700 nm citocromo f plastocianina e plastoquinona são oxidados No entanto quando os cloroplastos são ilumi nados com luz de 680 nm esses carregadores de elétrons são reduzidos Explique 41 Função da fotofosforilação cíclica Quando a razão NADPHNADP 1 nos cloroplastos é alta a fotofosforilação é predominantemente cíclica ver Figura 1958 O2 é liberado durante a fotofosforilação cíclica NADPH é produzido Expli que Qual a principal função da fotofosforilação cíclica Problema de análise de dados 42 Fotofosforilação descoberta rejeição e redes coberta Nos anos de 1930 e 1940 pesquisadores estavam começando a progredir na direção da compreensão do meca nismo da fotossíntese Naquela época o papel das ligações fosfato ricas em energia hoje ATP na glicólise e na respi ração celular estava apenas começando a ser conhecido Havia muitas teorias sobre o mecanismo da fotossíntese especial mente sobre o papel da luz Este problema focaliza aquilo que era então chamado de processo fotoquímico primário ou seja o que exatamente a energia da luz capturada produz na célula fotossintética É interessante que uma parte importante do modelo moderno da fotossíntese foi proposta cedo apenas para ser rejeitada ignorada por vários anos e então finalmente reavivada e aceita Nelson6edbookindb 796 Nelson6edbookindb 796 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 797 Em 1944 Emerson Stauffer e Umbreit propuseram que a função da energia luminosa na fotossíntese é a formação de ligações fosfato ricas em energia p 107 No modelo deles de agora em diante modelo de Emerson a energia livre necessária para impulsionar a fixação e a redução do CO2 vinha dessas ligações fosfato ricas em energia ie ATP produzi das como resultado da absorção de luz por uma proteína con tendo clorofila Esse modelo foi explicitamente rejeitado por Rabinowi tch 1945 Depois de resumir os achados de Emerson e co laboradores Rabinowitch afirmou até que evidências mais positivas sejam fornecidas estamos inclinados a considerar como mais convincente um argumento geral contra esta hi pótese que pode ser derivado de considerações energéticas A fotossíntese é eminentemente um problema de acúmulo de energia Que bem pode fazer então converter quanta de luz mesmo aqueles da luz vermelha que chegam a cerca de 43 kcal por einstein em quanta de fosfato de apenas 10 kcal por mol Isso parece ser uma largada na direção errada em direção à dissipação em vez de em direção ao acúmulo de energia Vol I p 228 Esse argumento junto com outras evidências levou ao abandono do modelo de Emerson até a década de 1950 quando se viu que era correto embora em uma forma modificada Para cada informação do artigo de Emerson e colaborado res apresentada de a a d responda as três questões que seguem 1 Como é que essas informações sustentam o modelo de Emerson no qual a energia da luz é usada diretamente pela clorofila para fazer ATP e o ATP então fornece a energia para promover a fixação e a redução do CO2 2 Como Rabinowitch explicaria essas informações com base em seu modelo e na maioria dos outros modelos da época no qual a energia da luz é usada diretamen te pela clorofila para produzir compostos redutores Rabinowitch escreveu teoricamente não existe razão por que toda a energia eletrônica contida em moléculas excitadas pela absorção de luz não deveria estar dis ponível para oxidaçãoredução Vol I p 152 Nesse modelo os compostos reduzidos são então usados para fixar e reduzir CO2 e a energia para essas reações vem das grandes quantidades de energia livre liberada pelas reações de redução 3 De que forma essas informações são explicadas pelo entendimento moderno da fotossíntese a A clorofila contém um íon Mg 21 conhecido por ser um cofator essencial para muitas enzimas que catalisam reações de fosforilação e desfosforilação b Uma proteína clorofila bruta isolada de células fotos sintéticas mostrou atividade fosforilante c A atividade fosforilante da proteína clorofila foi inibi da pela luz d Os níveis de diferentes compostos fosforilados em cé lulas fotossintéticas mudaram dramaticamente em resposta à exposição à luz Emerson e colaboradores não foram capazes de identificar os compostos específicos envolvidos No final das contas os modelos de Emerson e Rabinowitch estavam ambos parcialmente corretos e parcialmente incorre tos e Explique como os dois modelos se relacionam ao mode lo atual da fotossíntese Em sua rejeição do modelo de Emerson Rabinowitch foi além e disse a dificuldade da teoria do armazenamento de fosfato aparece mais claramente quando se considera o fato de que sob luz fraca oito ou dez quanta de luz são suficien tes para reduzir uma molécula de dióxido de carbono Se cada quantum fosse produzir uma molécula de fosfato de alta ener gia a energia acumulada seria de apenas 80 a 100 kcal por einstein enquanto a fotossíntese requer pelo menos 112 kcal por mol e provavelmente mais por causa das perdas em rea ções parciais irreversíveis Vol I p 228 f De que forma o valor de Rabinowitch de 8 a 10 fótons por molécula reduzida de CO2 se compara com o valor hoje aceito Você precisa consultar o Capítulo 20 para algumas das informações aqui requeridas g Como você rebateria o argumento de Rabinowitch com base no conhecimento atual sobre a fotossíntese Referências Emerson RL Stauffer JF Umbreit WW 1944 Relationships between phosphorylation and photosynthesis in Chlorella Am J Botany 31 107120 Rabinowitch EI 1945 Photosynthesis and Related Processes Interscience Publishers New York Nelson6edbookindb 797 Nelson6edbookindb 797 030414 0746 030414 0746 Nelson6edbookindb 798 Nelson6edbookindb 798 030414 0746 030414 0746 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 201 Síntese fotossintética de carboidratos 799 202 Fotorrespiração e as vias C4 e CAM 812 203 Biossíntese de amido e sacarose 818 204 Síntese de polissacarídeos da parede celular celulose vegetal e peptideoglicano bacteriano 821 205 Integração do metabolismo de carboidratos na célula vegetal 825 E ste capítulo marca um ponto decisivo no estudo do me tabolismo celular Até agora na Parte II foi descrito de que modo os principais combustíveis metabólicos car boidratos ácidos graxos e aminoácidos são degradados por vias catabólicas convergentes para ingressarem no ciclo do ácido cítrico e entregarem seus elétrons à cadeia respiratória e de que forma esse fluxo exergônico de elé trons ao oxigênio está acoplado à síntese endergônica de ATP Agora o foco é direcionado às vias anabólicas que usam energia química na forma de ATP e NADH ou NADPH para sintetizar componentes celulares a partir de molécu las precursoras simples As vias anabólicas geralmente são redutoras em vez de oxidativas O catabolismo e o anabolis mo ocorrem simultaneamente em um estado estacionário dinâmico de forma que a degradação geradora de energia de componentes celulares é contrabalançada por processos biossintéticos os quais criam e mantêm a intrincada organi zação das células vivas As plantas precisam ser especialmente versáteis na ma neira como lidam com os carboidratos por várias razões Primeiro as plantas são autótrofos capazes de converter carbono inorgânico como CO2 em compostos orgânicos Segundo a biossíntese ocorre principalmente em plastíde os organelas delimitadas por membranas exclusivas dos organismos fotossintéticos e o movimento de intermediá rios entre compartimentos celulares é um importante as pecto do metabolismo Terceiro as plantas não são móveis elas não podem se mover para encontrar melhores supri mentos de água luz solar e nutrientes Elas precisam ter flexibilidade metabólica o suficiente para que possam adap tarse a condições mutáveis no local onde estão enraizadas Finalmente as plantas têm paredes celulares grossas feitas de polímeros de carboidratos que precisam ser montados do lado de fora da membrana plasmática e que constituem uma proporção significativa dos carboidratos celulares Este capítulo começa com uma descrição do processo pelo qual o CO2 é assimilado em trioses e hexoses a seguir aborda a fotorrespiração importante reação colateral du rante a fixação do CO2 e as maneiras pelas quais certas plantas evitam essa reação colateral Depois analisa como a biossíntese de sacarose para transporte de açúcar e de amido para estocagem de energia é realizada por meca nismos análogos àqueles utilizados por células animais para sintetizar glicogênio O tópico seguinte é a síntese da ce lulose das paredes celulares vegetais e do peptideoglicano das paredes celulares bacterianas ilustrando os problemas da biossíntese dependente de energia fora da membrana plasmática Finalmente são discutidas as diversas vias que compartilham conjuntos de intermediários comuns e de que maneira são segregadas dentro das organelas mas ain da assim permanecem integradas umas às outras 201 Síntese fotossintética de carboidratos A síntese de carboidratos em células animais utiliza precur sores contendo sempre pelo menos três carbonos todos eles menos oxidados do que o carbono no CO2 Em con trapartida plantas e microrganismos fotossintéticos podem sintetizar carboidratos a partir de CO2 e água reduzindo o CO2 às custas da energia e do poder redutor fornecidos pelo ATP e pelo NADPH gerados pelas reações dependentes de luz da fotossíntese Figura 201 As plantas e outros au tótrofos podem usar CO2 como a única fonte dos átomos de carbono necessários para a biossíntese de celulose e de amido de lipídeos e de proteínas e de muitos outros com ponentes orgânicos nas células vegetais Por outro lado os heterótrofos não podem realizar a redução líquida do CO2 para a síntese líquida de glicose As plantas verdes contêm em seus cloroplastos uma maquinaria enzimática singular que catalisa a conversão de CO2 em compostos orgânicos simples reduzidos um processo denominado assimilação de CO2 Esse processo também foi chamado de fixação de CO2 ou fixação de carbono mas esses termos são reservados para a reação específica na qual o CO2 é incorporado fixado em um com posto orgânico de três carbonos a triosefosfato3fosfogli 20 Biossíntese de Carboidratos em Plantas e Bactérias Nelson6ed20indd 799 Nelson6ed20indd 799 020514 1720 020514 1720 800 DAVID L NELSON MICHAEL M COX cerato Esse produto simples da fotossíntese é o precursor de biomoléculas mais comple xas incluindo açúcares po lissacarídeos e os metabólitos derivados deles todos sinteti zados por vias metabólicas se melhantes àquelas dos tecidos animais O dióxido de carbono é assimilado por uma via cícli ca seus intermediárioschave são constantemente regenera dos Essa via foi elucidada no início da década de 1950 por Melvin Calvin Andrew Benson e James A Bassham e é comumente chamada de ciclo de Calvin ou de forma mais descritiva ciclo de redução fo tossintética do carbono O metabolismo de carboidratos é mais complexo em células vegetais do que em células animais ou em micror ganismos não fotossintéticos Além das vias universais da glicólise e da gliconeogênese as plantas apresentam as se quências de reações únicas para a redução do CO2 a trioses fosfato e a via redutora associada da pentosefosfato e todas essas vias precisam ser coordenadamente reguladas para assegurar a alocação adequada de carbono para a pro dução de energia e a síntese de amido e sacarose Enzimas chave são reguladas como será visto por 1 redução de ligações dissulfeto por elétrons que fluem do fotossistema I e por 2 mudanças no pH e na concentração de Mg 21 que resultam da iluminação Ao analisar outros aspectos do metabolismo dos carboidratos em plantas também encon tramse enzimas moduladas por 3 regulação alostérica convencional por um ou mais metabólitos intermediários e 4 modificação covalente fosforilação Os plastídeos são organelas exclusivas das células vegetais e das algas A maioria das atividades biossintéticas em plantas incluin do a assimilação de CO2 ocorre em plastídeos família de organelas que se autorreproduzem sendo delimitadas por uma membrana dupla e contendo um pequeno geno ma que codifica algumas de suas proteínas A maioria das proteínas destinadas aos plastídeos é codificada em genes nucleares os quais são transcritos e traduzidos como ou tros genes nucleares as proteínas são então transportadas para os plastídeos Os plastídeos se reproduzem por fissão binária replicando seus genomas molécula única de DNA circular e usando suas próprias enzimas e ribossomos para sintetizar as proteínas codificadas pelo genoma Os cloro plastos ver Figura 1947 são os sítios da assimilação de CO2 As enzimas para esse processo estão contidas no es troma a fase solúvel circundado pela membrana interna do cloroplasto Os amiloplastos são plastídeos incolores ou seja carecem de clorofila e de outros pigmentos encon trados nos cloroplastos Suas membranas internas não são análogas às membranas fotossintéticas tilacoides dos clo roplastos e em tecidos vegetais ricos em amido esses plas tídeos estão repletos de grânulos de amido Figura 202 Os cloroplastos podem ser convertidos em proplastídeos pela perda de suas membranas internas e da clorofila e os proplastídeos são interconversíveis com os amiloplastos FIGURA 201 A assimilação de CO2 em biomassa nas plantas A síntese de ATP e de NADPH promovida pela luz descrita no Capítulo 19 fornece energia e poder redutor para a fixação de CO2 em trioses a partir das quais são sintetizados todos os compostos carbonados da célula vegetal Os processos mostrados com setas vermelhas são o foco deste capítulo Sacarose transporte Amido armazenamento Celulose parede celular Hexosesfosfato Pentosesfosfato Intermediários metabólicos DNA RNA Proteínas Lipídeos Triosesfosfato ADP NADP1 ATP NADPH CO2 H2O Reações da fotossíntese dependentes de luz FIGURA 202 Amiloplastos ricos em amido grânulos escuros são corados com iodo nesta secção de células de raiz de Ranunculus Os grânulos de amido em vários tecidos variam de 1 a 100 mm de diâmetro Melvin Calvin 19111997 Nelson6edbookindb 800 Nelson6edbookindb 800 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 801 Figura 203 Por sua vez tanto amiloplastos quanto pro plastídeos podem se desenvolver em cloroplastos A abun dância relativa dos tipos de plastídeos depende do tipo de tecido vegetal e da intensidade de iluminação As células de folhas verdes são ricas em cloroplastos enquanto os amilo plastos dominam os tecidos não fotossintéticos que arma zenam grandes quantidades de amido como os tubérculos de batata As membranas internas de todos os tipos de plastídeos são impermeáveis a moléculas polares e carregadas O trân sito através dessas membranas é mediado por conjuntos de transportadores específicos A assimilação de dióxido de carbono ocorre em três estágios O primeiro estágio na assimilação do CO2 em biomolécu las Figura 204 é a reação de fixação de carbono a condensação de CO2 com um aceptor de cinco carbonos a ribulose15bifosfato para formar duas moléculas de 3fosfoglicerato No segundo estágio o 3fosfoglicerato é reduzido a triosesfosfato Ao todo três moléculas de CO2 são fixadas a três moléculas de ribulose15bifosfato para formar seis moléculas de gliceraldeído3fosfato 18 car bonos em equilíbrio com a dihidroxiacetonafosfato No terceiro estágio cinco das seis moléculas de triosefosfato 15 carbonos são usadas para regenerar três moléculas de ribulose15bifosfato 15 carbonos o material de partida A sexta molécula de triosefosfato o produto líquido da fo tossíntese pode ser usada para produzir hexoses para com bustível e blocos construtivos sacarose para transporte para tecidos não fotossintéticos ou amido para armazenamento Assim o processo global é cíclico com a conversão contínua de CO2 em triose e hexosesfosfato A frutose6fosfato é um intermediáriochave no estágio 3 da assimilação de CO2 ela se situa em um ponto de ramificação levando à regeneração da ribulose15bifosfato ou à síntese de amido A via da hexosefosfato até a pentosebifosfato envolve muitas das mesmas reações usadas em células animais para a conversão de pentoses fosfato em hexosesfosfato durante a fase não oxidativa da via da pentosefosfato ver Figu ra 1423 Na assimilação fotossintética de CO2 essencialmente o mesmo conjunto de reações opera na outra direção convertendo hexoses fosfato em pentosesfosfato Esse ciclo redutor da pentosefosfato usa as mesmas enzimas que a via oxidativa e muitas outras enzimas que tor nam o ciclo redutor irreversível Todas as treze enzimas da via estão no estroma do cloroplasto Estágio 1 Fixação de CO2 em 3fosfoglicerato Uma pista importante a respeito da natureza dos me canismos de assimilação de CO2 em organismos fotossintéticos surgiu no final da década de 1940 Calvin e colaboradores iluminaram uma suspensão de algas verdes na presença de dióxido de carbono radioativo 14CO2 por Cloroplasto Proplastídeo Plastídeo prégranal Amiloplasto FIGURA 203 Plastídeos suas origens e interconversões Todos os tipos de plastídeos são delimitados por uma membrana dupla e alguns em especial os cloroplastos maduros têm extensas membranas internas As membranas internas podem ser perdidas quando um cloroplasto ma duro se torna um proplastídeo e ressintetizadas quando um proplastídeo dá origem a um plastídeo prégranal e então a um cloroplasto maduro Os proplastídeos em tecidos não fotossintéticos como raízes dão origem a amiloplastos que contêm grandes quantidades de amido Todas as células vegetais têm plastídeos e estas organelas são o sítio não apenas da fotossín tese mas de outros processos incluindo a síntese de aminoácidos essenciais de tiamina de piridoxalfosfato de flavinas e de vitaminas A C E e K FIGURA 204 Os três estágios da assimilação de CO2 em organismos fotossintéticos As estequiometrias de três intermediárioschave núme ros entre parênteses revelam o destino dos átomos de carbono que entram e saem do ciclo Conforme mostrado aqui três CO2 são fixados para a síntese líquida de uma molécula de gliceraldeído3fosfato Este é o ciclo de redução fotossintética do carbono ou ciclo de Calvin Ribulose15 bifosfato 3 C CHOH O P CHOH CH2O P CH2O CHOH P CH2O CHO Gliceraldeído3fosfato 6 3 1 H1 ATP 1 6 ADP 3 NADP1 6 6 ADP 6 Pi 6 5 COO2 P CH2O 3Fosfoglicerato 6 CHOH 3 CO2 NADPH ATP Estágio 3 regeneração do aceptor Produção de energia pela glicólise síntese de amido ou açúcar Estágio 1 fixação Estágio 2 redução Nelson6edbookindb 801 Nelson6edbookindb 801 030414 0746 030414 0746 802 DAVID L NELSON MICHAEL M COX apenas poucos segundos e então rapidamente mataram as células extraíram seus conteúdos e com a ajuda de mé todos cromatográficos procuraram pelos metabólitos nos quais o carbono marcado aparecia primeiro O primeiro composto que se tornou marcado foi o 3fosfoglicerato com o 14C localizado predominantemente no átomo de car bono da carboxila Esses experimentos sugeriram que o 3fosfoglicerato é um intermediário inicial na fotossíntese As muitas plantas nas quais esse composto de três carbonos é o primeiro intermediário são chamadas de plantas C3 ao contrário das plantas C4 descritas a seguir A enzima que catalisa a incorporação do CO2 em forma orgânica é a ribulose15bifosfatocarboxilaseoxige nase nome encurtado para rubisco Como carboxilase a rubisco catalisa a ligação covalente do CO2 ao açúcar de 5 carbonos ribulose15bifosfato e a clivagem do intermediário instável de seis carbonos resultante formando duas molécu las de 3fosfoglicerato uma das quais aloja o carbono intro duzido como CO2 em seu grupo carboxila Figura 204 A atividade de oxigenase da enzima é discutida na Seção 202 Existem duas formas distintas de rubisco A forma I é encontrada em plantas vasculares algas e cianobactérias a forma II está confinada a certas bactérias fotossintéti cas A rubisco das plantas a enzima crucial na produção de biomassa a partir do CO2 tem uma estrutura complexa da forma I Figura 205a com oito subunidades grandes idênticas Mr 53000 codificadas no genoma do cloroplasto ou plastoma cada uma contendo um sítio catalítico e oito subunidades pequenas idênticas Mr 14000 codificadas no genoma nuclear de função incerta A forma II da rubisco das bactérias fotossintéticas tem estrutura mais simples tendo duas subunidades que em muitos aspectos lembram as subunidades grandes da enzima vegetal Figura 205b A similaridade é consistente com a hipótese endossimbió tica para a origem dos cloroplastos p 36 A enzima ve getal tem um número de renovação excepcionalmente bai xo apenas três moléculas de CO2 são fixadas por segundo por molécula de rubisco a 25C Portanto para atingir altas taxas de fixação de CO2 as plantas precisam de grandes quantidades dessa enzima De fato a rubisco constitui qua se 50 da proteína solúvel nos cloroplastos e provavelmen te seja uma das enzimas mais abundantes na biosfera Uma cadeia lateral carbamoilada de Lys com um íon Mg 21 ligado é de importância central para o mecanismo pro FIGURA 205 Estrutura da ribulose15bifosfa tocarboxilase rubisco a Visão superior e lateral de um modelo de fita da forma I da rubisco de espi nafre PDB ID 8RUC A enzima tem oito subunidades grandes em azul e oito pequenas em cinza firme mente empacotadas em uma estrutura de Mr maior do que 500000 A rubisco está presente em uma concentração de cerca de 250 mgmL no estroma do cloroplasto correspondendo a uma concentração extraordinariamente alta de sítios ativos 4 mM Um análogo do estado de transição 2carboxiarabinitol bi fosfato é mostrado em amarelo ligado a cada um dos oito sítios de ligação de substrato Mg 21 é mostrado em verde b Modelo de fita da forma II da rubisco da bactéria Rhodospirillum rubrum PDB ID 9RUB As subunidades estão em cinza e azul a Visão superior Visão lateral b Ribulose 15bifosfato Resíduo carbamoilLys Mg21 Nelson6edbookindb 802 Nelson6edbookindb 802 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 803 posto para a rubisco vegetal O íon Mg 21 aproxima e orienta os reagentes no sítio ativo Figura 206 e polariza o CO2 abrindoo para o ataque nucleofílico pelo intermediário da reação enediolato de cinco carbonos formado na enzima Figura 207 O intermediário de seis carbonos resultante se quebra para produzir duas moléculas de 3fosfoglicerato Glu Asp Lys201 N H O OH H O O HC OH Intermediário enediolato C C C C Mg2 O Glu Rubisco Asp Lys201 N H O O H O O O CH2 P CO2 HC OH H2O Ribulose15 bifosfato 3Fosfoglicerato Cadeia lateral de Lys carbamoilada C C H C N H His294 Intermediário bcetoácido Intermediário hidratado N Mg2 O CH2 O H N H His294 N ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ O CH2 P O CH2 P O CH2 P P O CH2 P O CH2 P Glu Asp Lys201 N H O O O O OH HC OH C C C C Mg2 H H O O O C HCOH O O C CH2O P Glu Asp Lys201 N H O O O O OH H O HC OH C C C C Mg2 O H H O O CH2 P O CH2 P Glu Asp Lys201 N H O OH C O H C Mg2 Lys175 N H H H O O C HCOH CH2O P 3Fosfoglicerato A protonação de carbânion gera uma segunda molécula de 3fosfogli cerato A ribulose15 bifosfato forma um enediolato no sítio ativo CO2 polarizado pela proximidade do íon Mg2 sofre um ataque nucleofílico pelo enediolato gerando um açúcar ramificado de 6 carbonos A hidroxilação ocorre na carbonil em C3 A clivagem produz uma molécula de 3fosfogli cerato MECANISMOFIGURA 207 Primeiro estágio da assimilação de CO2 ati vidade de carboxilase da rubisco A reação de fixação de CO2 é catalisada pela ribulose15bifosfatocarboxilaseoxigenase rubisco A reação global realiza a combinação de um CO2 e uma ribulose15bifosfato para formar duas moléculas de 3fosfoglicerato uma das quais contém o átomo de car bono do CO2 em vermelho Transferências adicionais de prótons não mos tradas envolvendo Lys 201 Lys 175 e His 294 ocorrem em várias destas etapas Mecanismo da rubisco Tutorial da rubisco FIGURA 206 Papel central do Mg 21 no mecanismo catalítico da ru bisco Derivado de PDB ID 1RXO Mg 21 está coordenado em um complexo aproximadamente octaédrico com seis átomos de oxigênio um oxigênio no carbamato na Lys 201 dois nos grupos carboxila do Glu 204 e do Asp 203 dois em C2 e C3 do substrato ribulose15bifosfato e um no outro substrato CO2 Uma molécula de água ocupa o sítio de ligação do CO2 nesta estrutura cristalina Nesta figura uma molécula de CO2 é modelada em seu lugar os resíduos numerados se referem à enzima do espinafre Asp203 Glu204 CO2 CarbamoilLys201 Ribulose15bifosfato Mg21 Nelson6edbookindb 803 Nelson6edbookindb 803 030414 0746 030414 0746 804 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Como catalisadora do primeiro passo da assimilação fotossintética de CO2 a rubisco é um alvo primário para regulação A enzima permanece inativa até que seja carba moilada no grupo amino da Lys 201 Figura 208 A ribu lose15bifosfato inibe a carbamoilação ligandose firme mente ao sítio ativo e trancando a enzima na conformação fechada na qual Lys 201 é inacessível A rubiscoativase supera a inibição promovendo a liberação dependente de ATP da ribulose15bifosfato expondo o grupo amino da Lys para a carbamoilação não enzimática pelo CO2 segue se então a ligação do Mg 21 que ativa a rubisco Em algu mas espécies a rubiscoativase é ativada pela luz por meio de um mecanismo redox semelhante àquele mostrado na Figura 2019 Outro mecanismo de regulação envolve o inibidor noturno 2carboxiarabinitol1fosfato um análogo de estado de transição de ocorrência natural p 210 com estrutura similar àquela do intermediário bcetoácido da reação da rubisco Figura 207 Esse composto sinte tizado no escuro em algumas plantas é um potente ini bidor da rubisco carbamoilada Ele é degradado quando a luz retorna ou então é expelido pela rubiscoativase ativando a rubisco CH2 HO OH OH PO3 22 CH2OH O C C 2Carboxiarabinitol1fosfato C C H H O2 O Estágio 2 Conversão de 3fosfoglicerato em gliceraldeído3fosfa to O 3fosfoglicerato formado no estágio 1 é convertido em gliceraldeído3fosfato em duas etapas que são essen cialmente o inverso das etapas correspondentes na glicóli se com uma exceção o nucleotídeo cofator para a redução do 13bifosfoglicerato é NADPH em vez de NADH Figura 209 O estroma do cloroplasto contém todas as enzimas glicolíticas exceto a fosfogliceratomutase As enzimas es tromais e citosólicas são isoenzimas ambos os conjuntos de enzimas catalisam as mesmas reações mas são produtos de genes diferentes Na primeira etapa do estágio 2 a 3fosfoglicerato cinase estromal catalisa a transferência de um grupo fosforil do ATP ao 3fosfoglicerato produzindo 13bi fosfoglicerato A seguir o NADPH doa elétrons em uma redução catalisada pela isoenzima da gliceraldeído3 fosfatodesidrogenase específica dos cloroplastos produzindo gliceraldeído3fosfato e Pi As altas con centrações de NADPH e ATP no estroma do cloroplasto permitem que este par de reações termodinamicamente desfavoráveis proceda na direção do 13bifosfoglicerato A triosefosfatoisomerase interconverte então gliceraldeí do3fosfato e dihidroxiacetonafosfato A maior parte das trioses fosfato então produzidas é usada para regenerar ribulose15bifosfato o restante é convertido em amido no cloroplasto e armazenado para uso futuro ou é expor tado imediatamente ao citosol e convertido em sacarose para transporte às regiões em crescimento da planta Em folhas em desenvolvimento uma porção significativa das triosesfosfato pode ser degradada pela glicólise para for necer energia ADP HCOH HCOH Rubisco ativase CO2 Ribulose 15bifosfato O Mg2 Mg2 O O C C Lys201 NH3 Lys201 NH3 Lys201 N H Rubisco ATP O CH2 P O CH2 P Rubisco com Lys201 não modificado a ribulose15 bifosfato ligada está inativa A remoção dependente de ATP da ribulose 15bifosfato expõe o grupo eamino da Lys201 O grupo eamino da Lys201 é carbamoilado por CO2 Mg2 se liga ao carbamoil Lys ativando a rubisco FIGURA 208 Papel da rubiscoativase na carbamoilação de Lys 201 da rubisco Quando o substrato ribulose15bifosfato está ligado ao sítio ativo a Lys 201 não está acessível A rubiscoativase acopla a hidrólise de ATP à ex pulsão do açúcar bifosfato ligado expondo a Lys 201 este resíduo de Lys pode agora ser carbamoilado com CO2 em uma reação que é aparentemente não mediada por enzimas O Mg 21 é atraído e se liga ao carbamoilLys negativa mente carregado e a enzima é então ativada Nelson6edbookindb 804 Nelson6edbookindb 804 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 805 Estágio 3 Regeneração da ribulose15bifosfato a partir das trioses fosfato A primeira reação na assimilação de CO2 em trio sesfosfato consome ribulose15bifosfato e para um fluxo contínuo de CO2 para carboidrato a ribulose15bifosfato precisa ser constantemente regenerada Isto é alcançado por uma série de reações Figura 2010 que junto com os estágios 1 e 2 constituem a via cíclica mostrada na Figura 204 O produto da primeira reação de assimilação 3fos foglicerato sofre então transformações que regeneram a ribulose15bifosfato Os intermediários nesta via incluem açúcares de três quatro cinco seis e sete carbonos Na dis cussão que segue todos os números das etapas se referem à Figura 2010 A etapas ➊ e ➍ são catalisadas pela mesma enzima a al dolase Ela catalisa inicialmente a condensação reversível de gliceraldeído3fosfato com dihidroxiacetonafosfato produzindo frutose16bifosfato etapa ➊ esta é hidroli sada em frutose6fosfato e Pi pela frutose16bifosfatase FBPase1 na etapa ➋ A reação é fortemente exergônica e essencialmente irreversível A etapa ➌ é catalisada pela transcetolase que contém tiaminapirofosfato TPP como seu grupo prostético ver Figura 1415a e requer Mg 21 A transcetolase catalisa a transferência reversível de um grupo cetol de dois carbonos CH2OHCO a par tir de um doador cetosefosfato a frutose6fosfato para um aceptor aldosefosfato o gliceraldeído3fosfato Figu Sacarose ATP Amido Dihidroxiacetona fosfato Frutose6fosfato Gliceraldeído3fosfato desidrogenase Pi ADP Triosefosfato isomerase Aldolase Frutose 16bifosfatase Glicólise Estroma Citosol 3fosfoglicerato cinase Frutose 6fosfato Gliceraldeído3fosfato Frutose 16bifosfatase Gliceraldeído 3fosfato Dihidroxiacetona fosfato Frutose 16bifosfato 13Bifosfoglicerato 3Fosfoglicerato NADP NADPH H CH2O C COO P C C CH2O P C O H OH OH H H HO CH2O C P C C CH2OH C O H OH OH H H HO CH2O CHOH P C CH2O CHOH P P O O CH CH2O CHOH P O CH2OH CH2O C P O ATP Antiportador Pitriose fosfato FIGURA 209 Segundo estágio da assimilação de CO2 O 3fosfoglice rato é convertido em gliceraldeído3fosfato setas vermelhas Também ilus trados estão os destinos alternativos do carbono fixado no gliceraldeído3 fosfato setas azuis A maior parte do gliceraldeído3fosfato é reciclada a ribulose15bifosfato como mostrado na Figura 2010 Uma pequena fração do gliceraldeído3fosfato extra pode ser imediatamente utilizada como fonte de energia mas a maioria é convertida em sacarose para transporte ou armazenada nos cloroplastos como amido Neste último caso o glice raldeído3fosfato se condensa com dihidroxiacetonafosfato no estroma para formar frutose16bifosfato precursor do amido Em outras situações o gliceraldeído3fosfato é convertido em dihidroxiacetonafosfato que deixa o cloroplasto por meio de um transportador específico ver Figura 2015 e no citosol pode ser degradado glicoliticamente para prover energia ou ser usado para formar frutose6fosfato e então sacarose Nelson6edbookindb 805 Nelson6edbookindb 805 030414 0746 030414 0746 806 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ra 2011a b formando a pentosexilulose5fosfato e a tetroseeritrose4fosfato Na etapa ➍ a aldolase age nova mente combinando eritrose4fosfato com dihidroxiace tona fosfato para formar a sedoeptulose17bifosfato de sete carbonos A sedoeptulose17bifosfatase enzima exclusiva dos plastídeos converte o bifosfato a sedoeptulo se7fosfato etapa ➎ esta é a segunda reação irreversível na via A transcetolase age então novamente convertendo sedoeptulose7fosfato e gliceraldeído3fosfato em duas pentosesfosfato na etapa ➏ Figura 2011c A Figura 2012 mostra como um fragmento de dois carbonos é tem porariamente carregado no cofator TPP da transcetolase e condensado com os três carbonos do gliceraldeído3fosfato na etapa ➏ As pentosesfosfato formadas nas reações da transceto lase ribose5fosfato e xilulose5fosfato são convertidas em ribulose5fosfato etapas ➐ e ➑ a qual na etapa final ➒ do ciclo é fosforilada pela ribulose5fosfatocinase produzindo ribulose15bifosfato Figura 2013 Essa é a terceira reação muito exergônica da via uma vez que a energia da ligação fosfatoanidrido no ATP é trocada por uma ligação ésterfosfato na ribulose15bifosfato Gliceraldeído3fosfato Dihidroxiacetonafosfato Aldolase Frutose16bifosfatase Transcetolase Ribulose 5fosfato epimerase Sedoeptulose 17bifosfatase ADP ADP Ribulose 5fosfatoepimerase Pi Frutose16bifosfato Frutose6fosfato Eritrose4fosfato Dihidroxiacetonafosfato Gliceraldeído3fosfato Xilulose5fosfato Ribulose5fosfato Ribulose5fosfato Ribose5fosfato isomerase ATP ATP ATP ADP Ribulose 5fosfatocinase Transcetolase Gliceraldeído3fosfato Ribose5fosfato Ribulose5fosfato Ribulose15bifosfato Ribulose 15bifosfato Sedoeptulose17bifosfato Sedoeptulose7fosfato Xilulose5fosfato Pi Aldolase ➊ ➋ ➌ ➍ ➑ ➎ ➏ ➐ ➒ ➑ ➒ FIGURA 2010 Terceiro estágio da assimilação de CO2 Este diagrama esquemático mostra as interconversões das triosesfosfato e das pentoses fosfato Os círculos pretos representam o número de carbonos em cada composto Os materiais de origem são o gliceraldeído3fosfato e a di hidroxiacetonafosfato As reações catalisadas pela aldolase ➊ e ➍ e pela transcetolase ➌ e ➏ produzem pentosesfosfato que são convertidas em ribulose15bifosfato a ribose5fosfato pela ribose5fosfatoisomerase ➐ e a xilulose5fosfato pela ribulose5fosfatoepimerase ➑ Na etapa ➒ a ribulose5fosfato é fosforilada regenerando ribulose15bifosfato As etapas com setas azuis são exergônicas e tornam o processo todo irreversível as etapas ➋ da frutose16bifosfatase ➎ da sedoeptulosebifosfatase e ➒ da ribulose5fosfatocinase Nelson6edbookindb 806 Nelson6edbookindb 806 030414 0746 030414 0746 PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA DE LEHNINGER 807 CHOH CHOH FIGURA 2011 Reag6es do ciclo de Calvin catalisadas pela transcetolase a Reaao geral catalisada pela transcetolase 0 4 Oo M TPP oN a 4 vo a transferéncia de um grupo de 2 carbonos temporariamente CHOH Cc Transcetolase Cc CHOH carregado na TPP ligada a enzima de um doador cetose a um hs be hn be aceptor aldose b Conversdo de uma hexose e de uma triose em acucares de quatro e cinco carbonos etapa da Figura 20 Poador fee tor 10 c Conversdo de acucares de sete e de trés carbonos em cetose aloose duas pentoses etapa da Figura 2010 a CH0OH O H CH0H CO O H 7 NY Cc CO HOCH Cc HCOH HOCH HOH H70H H é OH C HCOH HCOH CH0 CH0 CHO CHOP Frutose Gliceraldeido Eritrose Xilulose 6fosfato 3fosfato 4fosfato 5fosfato b CH0OH O H CO 7 CHOH HO H OX 1 bo HOH l HCOH HOCH l HOH HOH l HCOH HCOH CHOP HCOH HCOH CHO CH0 CH0OP Sedoeptulose Gliceraldeido Ribose Xilulose 7fosfato 3fosfato 5fosfato 5fosfato c R R ae i NH Le CHN S ry SL cucu0 S CH cH N 3 CH0H 9 Tiaminapirofosfato HO0H cofator da transcetolase HOH Xilulose CHO 5fosfato Sedoeptulose7fosfato 208 doador cetose c0 Gliceraldeido3fosfato HOCH OF aceptor aldose H00n HCOH nog 08 HoH CHO Carbanion CHRO estabilizado por ou ou ou ou ressonancia CHCCCCCCH0H ou J 0 HOH Hon CHLOH b RN Ss FIGURA 2012 TPP como cofator para ae l a transcetolase A transcetolase transfe RN S CH R re um grupo de dois carbonos da sedoep bn S Ribose5fosfato tulose7fosfato ao gliceraldeido3fosfato Oo oH produzindo duas pentosesfosfato etapa No da Figura 2010 A tiaminapirofosfato uon serve como um carregador temporario uéon da unidade de dois carbonos e como um sugadouro de elétrons ver Figura 1415 H0H para facilitar as reacdes CHO 808 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A síntese de cada triosefosfato a partir do CO2 requer seis NADPH e nove ATP O resultado líquido de três voltas do ciclo de Calvin é a con versão de três moléculas de CO2 e uma molécula de fosfa to em uma molécula de triosefosfato A estequiometria da via global do CO2 à triosefosfato com a regeneração da ribulose15bifosfato é mostrada na Figura 2014 Três moléculas de ribulose15bifosfato um total de 15 carbo nos se condensam com 3 CO2 3 carbonos para formar seis moléculas de 3fosfoglicerato 18 carbonos Essas seis moléculas de 6fosfoglicerato são reduzidas a seis mo léculas de gliceraldeído3fosfato que está em equilíbrio com dihidroxiacetonafosfato com o gasto de seis ATP FIGURA 2013 Regeneração da ribulose15bifosfato O material de par tida do ciclo de Calvin ribulose15bifosfato é regenerado a partir de duas pen tosesfosfato produzidas no ciclo Esta via envolve a ação de uma isomerase e de uma epimerase e então a fosforilação por uma cinase com ATP como o doador de grupo fosfato etapas ➐ ➑ e ➒ da Figura 2010 O C H OH CH2O C O C H C H H HO Xilulose5fosfato Ribose 5fosfato isomerase Ribulose 5fosfato epimerase P C H OH CH2OH OH C OH C H Ribose5fosfato P CH2O C H OH CH2O O C OH C H Ribulose 5fosfato P CH2OH C H OH CH2O O C OH C H Ribulose 15bifosfato P ATP ADP CH2O P Ribulose 5fosfato cinase FIGURA 2014 Estequiometria da assimilação de CO2 no ciclo de Calvin Para cada três moléculas de CO2 fixadas uma molécula de triosefosfato gli ceraldeído3fosfato é produzida e nove ATP e seis NADPH são consumidos Gliceraldeído3fosfato 1 6 ATP 6ADP 6 NADPH 1 6H1 6Pi 6NADP1 3ADP 3ADP 3 ATP 2Pi 13Bifosfoglicerato 6 6 3Fosfoglicerato Ribulose15bifosfato 3 Ribulose5fosfato 3 Gliceraldeído3fosfato 5 CO2 1 H2O 3 Dihidroxiacetonafosfato Gliceraldeído3fosfato Dihidroxiacetonafosfato 6 Nelson6edbookindb 808 Nelson6edbookindb 808 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 809 na síntese de 13bifosfoglicerato e seis NADPH na re dução do 13bifosfoglicerato a gliceraldeído3fosfato A isoenzima da gliceraldeído3fosfatodesidrogenase presen te nos cloroplastos pode usar NADPH como seu carreador de elétrons e normalmente funciona na direção da redução do 13bifosfoglicerato A isoenzima citosólica usa NAD da mesma forma que a enzima glicolítica de animais e de ou tros eucariotos e no escuro essa enzima age na glicólise oxidando o gliceraldeído3fosfato As duas isoenzimas da gliceraldeído3fosfatodesidrogenase como todas as enzi mas catalisam a reação nas duas direções Uma molécula de gliceraldeído3fosfato é o produto líquido da via de assimilação de carbono As outras cin co moléculas de triosefosfato 15 carbonos são rearran jadas nas etapas de ➊ a ➒ da Figura 2010 para formar três moléculas de ribulose15bifosfato 15 carbonos A última etapa nessa conversão requer um ATP por ribulo se15bifosfato ou um total de 3 ATP Assim em resumo para cada molécula de triosefosfato produzida pela assi milação fotossintética de CO2 seis NADPH e nove ATP são necessários NADPH e ATP são produzidos nas reações dependentes de luz da fotossíntese em uma razão 23 aproximadamen te igual àquela em que são consumidos no ciclo de Calvin Nove moléculas de ATP são convertidas em ADP e fosfato na geração de uma molécula de triosefosfato oito dos fos fatos são liberados com Pi e combinados com 8 ADPs para regenerar ATP O nono fosfato é incorporado na própria triosefosfato Para converter o nono ADP em ATP uma molécula de Pi precisa ser importada do citosol conforme será visto a seguir No escuro a produção de ATP e NADPH pela fotofos forilação e a incorporação de CO2 na triosefosfato pelas chamadas reações do escuro cessam As reações do escu ro da fotossíntese foram assim chamadas para distinguilas das reações basicamente estimuladas pela luz de transfe rência de elétrons ao NADP 1 e de síntese de ATP descritas no Capítulo 19 Na realidade elas não ocorrem em velocida des significativas no escuro e são portanto mais adequada mente chamadas de reações de assimilação de carbono Posteriormente nesta seção serão descritos os mecanismos de regulação que acionam a assimilação de carbono na luz e a desligam no escuro O estroma do cloroplasto contém todas as enzimas ne cessárias para converter as triosesfosfato produzidas pela assimilação de CO2 gliceraldeído3fosfato e dihidroxia cetonafosfato em amido temporariamente armazenado no cloroplasto na forma de grânulos insolúveis A aldola se condensa as trioses produzindo frutose16bifosfato a frutose16bifosfatase produz frutose6fosfato a fosfoe xoseisomerase gera glicose6fosfato e a fosfoglicomutase produz glicose1fosfato o material inicial para a síntese de amido ver Seção 203 Todas as reações do ciclo de Calvin exceto aquelas ca talisadas pela rubisco pela sedoeptulose17bifosfatase e pela ribulose5fosfatocinase também ocorrem em tecidos animais Sem essas três enzimas os animais não conseguem realizar a conversão líquida de CO2 em glicose Um sistema de transporte exporta triosesfosfato do cloroplasto e importa fosfato A membrana interna do cloroplasto é impermeável à maio ria dos compostos fosforilados incluindo frutose6fosfato glicose6fosfato e frutose16bifosfato Entretanto ela tem um antiportador específico que catalisa a troca na pro porção de um por um de Pi por triosefosfato que pode ser dihidroxiacetonafosfato ou 3fosfoglicerato Figura 2015 ver também Figura 209 Esse antiportador move simultaneamente Pi para dentro do cloroplasto onde ele é usado na fotofosforilação e triosefosfato para o citosol onde ela pode ser usada para sintetizar sacarose a forma na qual o carbono fixado é transportado para tecidos vegetais distantes Estroma Citosol Membrana interna do cloroplasto Fotossíntese Ciclo de Calvin 9ATP 9ATP Luz Dihidroxi acetona fosfato Sacarose Pi Pi Dihidroxi acetona fosfato 9ADP 8Pi Pi 9ADP 9Pi Antiportador Pi triose fosfato FIGURA 2015 O sistema antiporte Pitriosefosfato da membrana in terna do cloroplasto Este transportador facilita a troca de Pi citosólico por dihidroxiacetonafosfato estromal Os produtos da assimilação fotossintética de carbono são então movidos para o citosol onde servem como ponto de partida para a biossíntese de sacarose e o Pi necessário para a fotofosfori lação é levado para o estroma Este mesmo antiportador pode transportar 3fosfoglicerato e age na lançadeira de exportação de equivalentes de ATP e de equivalentes redutores ver Figura 2016 Nelson6edbookindb 809 Nelson6edbookindb 809 030414 0746 030414 0746 810 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A síntese de sacarose no citosol e a síntese de amido no cloroplasto são as principais vias pelas quais o excesso de triosefosfato da fotossíntese é utilizado A síntese de saca rose descrita a seguir libera quatro moléculas de Pi das quatro triosesfosfato necessárias para produzir sacarose Para cada molécula de triosefosfato removida do cloroplas to um Pi é transportado para o cloroplasto fornecendo o nono Pi mencionado anteriormente a ser usado na rege neração do ATP Se essa troca fosse bloqueada a síntese de triosesfosfato rapidamente esgotaria o Pi disponível no cloroplasto diminuindo a síntese de ATP e suprimindo a assimilação de CO2 na forma de amido O sistema antiporte Pitriosefosfato também serve para uma função adicional O ATP e o poder redutor são neces sários no citosol para uma variedade de reações sintéticas e que demandam energia Essas necessidades são satis feitas em um grau ainda indeterminado pela mitocôndria mas uma segunda fonte potencial de energia é o ATP e o NADPH gerados no estroma do cloroplasto durante as rea ções da luz No entanto nem o ATP nem o NADPH podem cruzar a membrana do cloroplasto O sistema antiporte Pi triosefosfato tem o efeito indireto de mover equivalentes de ATP e equivalentes redutores do cloroplasto para o ci tosol Figura 2016 A dihidroxiacetonafosfato formada no estroma é transportada para o citosol onde é convertida por enzimas glicolíticas em 3fosfoglicerato gerando ATP e NADH O 3fosfoglicerato entra novamente no cloroplasto completando o ciclo Quatro enzimas do ciclo de Calvin são indiretamente ativadas pela luz A assimilação redutora de CO2 requer muito ATP e NADPH e suas concentrações no estroma aumentam quando os clo roplastos são iluminados Figura 2017 O transporte de prótons através da membrana tilacoide promovido pela luz Capítulo 19 também aumenta o pH estromal de aproxi madamente 7 para cerca de 8 sendo acompanhado por um fluxo de Mg 21 do compartimento do tilacoide para o estro ma aumentando a Mg 21 de 1 a 3 mM para 3 a 6 mM Várias Estroma Citosol 13Bifosfoglicerato ADP 3Fosfoglicerato ATP NADPH H NADP Membrana interna do cloroplasto 3Fosfoglicerato Pi Pi NADH H 13Bifosfoglicerato NAD ADP Fosfoglicerato cinase Gliceraldeído 3fosfato desidrogenase Gliceraldeído 3fosfato Dihidroxi acetonafosfato ATP Gliceraldeído 3fosfato Triose fosfato isomerase Pi Pi Dihidroxi acetonafosfato Antiportador Pitriosefosfato Antiportador Pitriosefosfato FIGURA 2016 O papel do antiportador Pitriosefosfato no transpor te de equivalentes de ATP e equivalentes redutores A dihidroxiaceto nafosfato deixa o cloroplasto sendo convertida em gliceraldeído3fosfato no citosol As reações da gliceraldeído3fosfatodesidrogenase citosólica e da fosfogliceratocinase produzem então NADH ATP e 3fosfoglicerato O último volta ao cloroplasto e é reduzido a dihidroxiacetonafosfato com pletando um ciclo que efetivamente move ATP e equivalentes redutores NADPH do cloroplasto ao citosol Nelson6edbookindb 810 Nelson6edbookindb 810 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 811 enzimas do estroma evoluíram para tirar vantagem dessas condições promovidas pela luz que sinalizam a disponibili dade de ATP e de NADPH as enzimas são mais ativas em um ambiente alcalino e em alta Mg 21 Por exemplo a ati vação da rubisco pela formação de carbamoillisina é mais rápida em pH alcalino e uma alta Mg 21 estromal favore ce a formação do complexo ativo com Mg 21 da enzima A frutose16bifosfatase requer Mg 21 e é muito dependente do pH Figura 2018 sua atividade aumenta mais do que 100 vezes quando o pH e a Mg 21 aumentam durante a ilu minação do cloroplasto Quatro enzimas do ciclo de Calvin estão sujeitas a um tipo especial de regulação pela luz A ribulose5fosfatoci nase a frutose16bifosfatase a sedoeptulose17bifosfa tase e a gliceraldeído3fosfatodesidrogenase são ativadas pela redução promovida pela luz de ligações dissulfeto entre dois resíduos de Cys críticos às suas atividades ca talíticas Quando esses resíduos de Cys apresentam essas ligações dissulfeto oxidados as enzimas estão inativas Essa é a situação normal no escuro Com a iluminação os elétrons fluem do fotossistema I à ferredoxina ver Figu ra 1958 a qual passa elétrons a uma proteína contendo dissulfeto pequena e solúvel chamada de tiorredoxina Figura 2019 em uma reação catalisada pela ferredo xinatiorredoxinaredutase A tiorredoxina reduzida doa elétrons para a redução das ligações dissulfeto das Luz Ciclo de assimilação de CO2 Gliceraldeído3fosfato CO2 Pi H Mg2 Transferência fotos sintética de elétrons Estroma Tilacoide H ATP NADPH NADP ADP Pi FIGURA 2017 Fonte de ATP e de NADPH O ATP e o NADPH produzi dos pelas reações da luz são substratos essenciais para a redução do CO2 As reações fotossintéticas que produzem ATP e NADPH são acompanhadas pelo movimento de prótons em corderosa do estroma para dentro do tilacoide criando condições alcalinas no estroma Íons magnésio passam do tilacoide para o estroma aumentando a Mg 21 estromal Atividade da FBPase1 unidadesmg 0 150 MgCl2 mM 100 50 20 15 10 5 pH 80 pH 75 pH 70 0 FIGURA 2018 Ativação da frutose16bifosfatase do cloroplasto A frutose16bifosfatase reduzida FBPase1 é ativada pela luz e pela combi nação de pH alto e Mg 21 alta no estroma ambos resultantes da iluminação Fdox Fdred Ferredoxina tiorredoxina redutase Tiorredoxina HS SH Enzima ativa O2 no escuro Fotossistema I HS SH Enzima inativa S S Tiorredoxina S S Luz FIGURA 2019 Ativação pela luz de várias enzimas do ciclo de Calvin A ativação pela luz é mediada pela tiorredoxina pequena proteína que con tém dissulfeto Na presença de luz a tiorredoxina é reduzida por elétrons que se movem do fotossistema I através da ferredoxina Fd setas azuis a tiorre doxina reduz então ligações dissulfeto críticas em cada uma das enzimas se doeptulose17bifosfatase frutose16bifosfatase ribulose5fosfatocinase e gliceraldeído3fosfatodesidrogenase ativando estas enzimas No escuro os grupos SH sofrem reoxidação a dissulfeto inativando as enzimas Nelson6edbookindb 811 Nelson6edbookindb 811 030414 0746 030414 0746 812 DAVID L NELSON MICHAEL M COX enzimas ativadas pela luz e essas reações redutoras de cli vagem são acompanhadas por mudanças conformacionais que aumentam as atividades enzimáticas Quando a noite cai os resíduos de Cys nas quatro enzimas são reoxida dos a suas formas dissulfeto as enzimas são inativadas e o ATP não é gasto na assimilação de CO2 Em vez disso o amido sintetizado e armazenado durante o dia é degrada do para alimentar a glicólise à noite A glicose6fosfatodesidrogenase a primeira enzima na via oxidativa das pentosesfosfato também é regulada por esse mecanismo de redução promovido pela luz mas no sentido oposto Durante o dia quando a fotossíntese produz muito NADPH essa enzima não é necessária para a produção de NADPH A redução de uma ligação dissulfeto crítica por elétrons da ferredoxina inativa a enzima RESUMO 201 Síntese fotossintética de carboidratos c A fotossíntese em plantas vasculares ocorre nos cloro plastos Nas reações de assimilação de CO2 o ciclo de Calvin o ATP e o NADPH são usados para reduzir CO2 a triosesfosfato Essas reações ocorrem em três está gios a reação de fixação propriamente dita catalisada pela rubisco a redução do 3fosfoglicerato resultante a gliceraldeído3fosfato e a regeneração da ribulose15 bifosfato a partir das triosesfosfato c A rubisco condensa o CO2 com a ribulose15bifos fato formando uma hexosebifosfato instável que se divide em duas moléculas de 3fosfoglicerato A rubis co é ativada por uma modificação covalente carba moilação da Lys 201 catalisada pela rubiscoativase e é inibida por um análogo natural de estado de transição cuja concentração aumenta no escuro e diminui du rante o dia c Isoenzimas estromais das enzimas glicolíticas catalisam a redução de 3fosfoglicerato a gliceraldeído3fosfato a redução de cada molécula requer um ATP e um NADPH c As enzimas estromais incluindo transcetolase e aldola se rearranjam os esqueletos de carbono das triosesfos fato gerando intermediários de três quatro cinco seis e sete carbonos e por fim gerando pentosesfosfato As pentosesfosfato são convertidas em ribulose5fosfato e então fosforiladas produzindo ribulose15bifosfato para completar o ciclo de Calvin c O custo de fixar três CO2 em uma triosefosfato é de nove ATP e seis NADPH providos pelas reações depen dentes de luz da fotossíntese c Um antiportador na membrana interna do cloroplasto troca Pi no citosol por 3fosfoglicerato ou dihidroxia cetonafosfato produzidos pela assimilação de CO2 no estroma A oxidação da dihidroxiacetonafosfato no citosol gera ATP e NADH assim movendo ATP e equiva lentes redutores do cloroplasto ao citosol c Quatro enzimas do ciclo de Calvin são ativadas indireta mente pela luz sendo inativas no escuro de forma que a síntese de hexoses não compete com a glicólise neces sária para fornecer energia no escuro 202 Fotorrespiração e as vias C4 e CAM Conforme foi visto as células fotossintéticas produzem O2 pela quebra da água durante as reações promovidas pela luz Capítulo 19 e usam CO2 durante os processos inde pendentes da luz descritos anteriormente de forma que a mudança líquida de gases durante a fotossíntese é a capta ção de CO2 e a liberação de O2 CO2 1 H2O O2 1 CH2O No escuro as plantas também realizam a respiração mitocondrial a oxidação de substratos até CO2 e a con versão de O2 em H2O Existe um outro processo em plan tas que da mesma forma que a respiração mitocondrial consome O2 e produz CO2 e assim como a fotossíntese é promovido pela luz Esse processo a fotorrespiração é um lado dispendioso da fotossíntese resultado da falta de especificidade da enzima rubisco Esta seção descreve essa reação paralela e as estratégias que as plantas uti lizam para minimizarem suas consequências metabólicas A fotorrespiração resulta da atividade de oxigenase da rubisco A rubisco não tem especificidade absoluta pelo CO2 como substrato O oxigênio molecular O2 compete com o CO2 no sítio ativo e cerca de uma vez a cada três ou quatro ro dadas a rubisco catalisa a condensação do O2 com a ribulo se15bifosfato para formar 3fosfoglicerato e 2fosfogli colato Figura 2020 produto metabolicamente inútil Essa é a atividade de oxigenase atribuída no nome comple to da enzima ribulose15bifosfatocarboxilaseoxigenase Como resultado da reação com O2 não ocorre fixação de carbono e tal reação parece ser desvantajosa para a célula resgatar os carbonos do 2fosfoglicolato pela via descrita a seguir consome quantidades significativas de energia celu lar e libera CO2 previamente fixado Considerando que a reação com o oxigênio é deleté ria para o organismo por que a evolução da rubisco pro duziu um sítio ativo incapaz de diferenciar bem o CO2 do O2 Talvez boa parte dessa evolução tenha ocorrido antes da época em que a produção de O2 pelos organismos fo tossintéticos começou a elevar o conteúdo de oxigênio na atmosfera cerca de 25 bilhões de anos atrás Antes dessa época não havia pressão seletiva para que a rubisco di ferenciasse o CO2 do O2 O Km para o CO2 é de cerca de 9 mM e para o O2 de aproximadamente 350 mM A atmosfe ra moderna contém cerca de 20 de O2 e apenas 004 de CO2 de forma que uma solução aquosa em equilíbrio com o ar à temperatura ambiente contém cerca de 250 mM de O2 e 11 mM de CO2 concentrações que permitem fixação significativa de O2 pela rubisco e portanto um desperdício significativo de energia A dependência em relação à temperatura das solubilidades do O2 e do CO2 é tal que em temperaturas mais elevadas a razão de O2 para CO2 na solução aumenta Além disso a afinidade da rubisco por CO2 diminui com o aumento da temperatura exacerbando sua tendência de catalisar a reação de des perdício da oxigenase À medida que o CO2 é consumido Nelson6edbookindb 812 Nelson6edbookindb 812 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 813 nas reações de assimilação a razão de O2 para CO2 nos espaços de aeração da folha aumenta favorecendo ainda mais a reação da oxigenase A via de resgate do fosfoglicolato é onerosa A via do glicolato converte duas moléculas de 2fosfogli colato em uma molécula de serina três carbonos e uma molécula de CO2 Figura 2021 No cloroplasto uma fosfatase converte 2fosfoglicolato em glicolato o qual é exportado ao peroxissomo Lá o glicolato é oxidado pelo oxigênio molecular e o aldeído resultante glioxilato so fre transaminação produzindo glicina O peróxido de hi drogênio formado como subproduto da oxidação do glico lato é tornado inócuo por peroxidases no peroxissomo A glicina passa do peroxissomo para a matriz mitocondrial onde sofre descarboxilação oxidativa pelo complexo da CH2O C OH H OH C C O CH2O CH2O C O H OH C C H OH CH2O Ribulose 15bifosfato Forma enediol Intermediário ligado à enzima CH2O C OH H OH C C OH CH2O O2 O O H OH H2O CH2O C 1 O C CH2O OH H O O C O 2Fosfoglicolato 3Fosfoglicerato P P P P P P P P FIGURA 2020 Atividade de oxigenase da rubisco A rubisco pode incorporar O2 em vez de CO2 na ribulose15bifosfato O intermediário instável então formado se divide em 2fosfoglicolato reciclado conforme descrito na Figura 2021 e 3fosfoglicerato que pode reingressar no ciclo de Calvin 2Fosfoglicolato CO2 liberado na fotorrespiração Mitocôndria NAD1 Serina Serina Hidroxipiruvato H2O2 O2 Glioxilato Glicina Glicolato Ácido glicólico oxidase Peroxissomo 2 Glicina ahidroxiácido redutase Glicolato Glicerato Ciclo de Calvin ADP Pi Estroma do cloroplasto NADH 1 H1 NAD1 NH3 Glicina descarboxilase NH2 transaminação 1 H1 CH2O P COO CH2OH COO CH2OH COO CHO COO COO CH2 NH3 1 COO CH2 NH3 1 OH CH NH3 1 COO CH2 O OH C COO CH2 Glicerato OH OH CH COO CH2 OH OH CH COO CH2 OH CH NH3 1 COO CH2 NADH O2 Ribulose 15bifosfato 3Fosfoglicerato ATP FIGURA 2021 Via do glicolato Esta via que resgata o 2fosfoglicolato sombreado em corderosa por sua conversão em serina e por fim em 3fosfoglicerato envolve três compartimentos celulares O glicolato formado pela desfosforilação do 2fosfoglicolato nos cloroplastos é oxidado a glioxi lato nos peroxissomos sendo então transaminado produzindo glicina Nas mitocôndrias duas moléculas de glicina se condensam para formar serina e o CO2 liberado durante a fotorrespiração sombreado em verde Esta reação é catalisada pela glicinadescarboxilase enzima presente em concentrações muito elevadas nas mitocôndrias de plantas C3 ver texto A serina é conver tida em hidroxipiruvato e então em glicerato nos peroxissomos o glicerato entra nos cloroplastos para ser fosforilado juntandose novamente ao ciclo de Calvin O oxigênio sombreado em azul é consumido em duas etapas durante a fotorrespiração Nelson6edbookindb 813 Nelson6edbookindb 813 030414 0746 030414 0746 814 DAVID L NELSON MICHAEL M COX glicinadescarboxilase enzima semelhante em estrutura e mecanismo aos dois complexos mitocondriais já estuda dos o complexo da piruvatodesidrogenase e o complexo da acetoglutaratodesidrogenase Capítulo 16 O com plexo da glicinadescarboxilase oxida a glicina a CO2 e NH3 com a concomitante redução de NAD 1 a NADH e a transferência do carbono remanescente da glicina para o cofator tetrahidrofolato Figura 2022 A unidade de um carbono carregada no tetrahidrofolato é então trans ferida a uma segunda molécula de glicina pela serinahi droximetiltransferase produzindo serina A reação líquida catalisada pelo complexo da glicinadescarboxilase e pela serinahidroximetiltransferase é 2 Glicina 1 NAD 1 1 H2O serina 1 CO2 1 NH3 1 NADH 1 H 1 A serina é convertida em hidroxipiruvato em glicerato e finalmente em 3fosfoglicerato que é usado para regenerar a ribulose15bifosfato completando o longo e oneroso ci clo Figura 2021 Sob luz solar brilhante o fluxo pela via de resgate do glicolato pode ser muito alto produzindo cerca de cinco vezes mais CO2 do que costuma ser produzido por todas as oxidações do ciclo do ácido cítrico Para gerar esse grande fluxo as mitocôndrias contêm grandes quanti dades do complexo da glicinadescarboxilase as quatro proteínas do complexo compreendem metade de toda a proteína na matriz mitocondrial em folha de plantas de ervilha e de espinafre Em partes não fotossintéticas da planta como nos tubérculos de batata as mitocôndrias têm concentrações muito baixas do complexo da glicina descarboxilase FAD FAD FAD OOC CH2 NH HC PLP H C S S H Glicina COO H3N CO2 H2N H2O CH2 N5N10metileno H4 folato H2O NH3 FAD H P L T PLP S S H P L O HC T PLP S S H P L FADH2 O HC T PLP H P L O HC T PLP S HS HS HS H P L O HC T NADH H NAD H4 folato ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ FIGURA 2022 O sistema da glicinadescarboxilase A glicinadescar boxilase em mitocôndrias vegetais é um complexo de quatro tipos de su bunidades com a estequiometria P4H27T9L2 A proteína H tem um resíduo de ácido lipoico covalentemente ligado que pode sofrer oxidação reversível A etapa ➊ é a formação de uma base de Schiff entre o piridoxalfosfato PLP e a glicina catalisada pela proteína P denominada em função de seu PLP liga do Na etapa ➋ a proteína P catalisa a descarboxilação oxidativa da glicina liberando CO2 o grupo metilamina remanescente é ligado a um dos grupos SH do ácido lipoico reduzido ➌ A proteína T que usa tetrahidrofolato H4folato como cofator agora libera NH3 da porção metilamina e transfere o fragmento remanescente de um carbono para o tetrahidrofolato produ zindo N 5N 10metilenotetrahidrofolato ➍ A proteína L oxida os dois grupos SH do ácido lipoico a um dissulfeto passando elétrons através do FAD até o NAD 1 ➎ completando assim o ciclo O N 5N 10metilenotetrahidrofolato formado neste processo é usado pela serinahidroximetiltransferase para converter uma molécula de glicina em serina regenerando o tetrahidrofo lato que é essencial para a reação catalisada pela proteína T A subunidade L da glicinadescarboxilase é idêntica à dihidrolipoildesidrogenase E3 da pi ruvatodesidrogenase e da acetoglutaratodesidrogenase ver Figura 166 Nelson6edbookindb 814 Nelson6edbookindb 814 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 815 As atividades combinadas da rubiscooxigenase e da via de resgate do glicolato consomem O2 e produzem CO2 daí o nome fotorrespiração Talvez essa via fosse melhor chama da de ciclo oxidativo fotossintético do carbono ou ciclo C2 nomes que não induzem a comparações com a respiração nas mitocôndrias Ao contrário da respiração mitocondrial a fotorrespiração não conserva energia e pode na verdade inibir a formação líquida de biomassa em até 50 Essa inefi ciência levou a adaptações evolutivas nos processos de assimi lação de carbono particularmente em plantas que evoluíram em climas quentes A aparente ineficiência da rubisco e seu efeito em limitar a produção de biomassa inspiraram esforços de engenharia genética para fabricar uma rubisco melhor mas esse objetivo ainda não foi alcançado Quadro 201 Em plantas C4 a fixação do CO2 e a atividade da rubisco são espacialmente separadas Em muitas plantas que crescem nos trópicos e em cultu ras de zonas temperadas nativas dos trópicos como milho canadeaçúcar e sorgo evoluiu um mecanismo que con tornou o problema da dispendiosa fotorrespiração A etapa na qual o CO2 é fixado em um produto de três carbonos o 3fosfoglicerato é precedida por várias etapas uma das quais é a fixação temporária de CO2 em um composto de quatro carbonos As plantas que utilizam esse processo são chamadas de plantas C4 e o processo de assimilação como metabolismo C4 ou via C4 As plantas que utilizam o méto do de assimilação de carbono descrito até agora onde a pri meira etapa é a reação do CO2 com a ribulose15bifosfato para formar 3fosfoglicerato são chamadas de plantas C3 As plantas C4 que geralmente crescem em regiões de grande intensidade luminosa e altas temperaturas têm vá rias características importantes velocidade fotossintética alta altas taxas de crescimento baixas taxas de fotorrespi ração baixas taxas de perda de água e uma estrutura foliar especializada A fotossíntese nas folhas de plantas C4 envol ve dois tipos de células células do mesófilo e células da bai nha vascular Figura 2023a Existem três variantes do metabolismo C4 estudadas na década de 1960 por Marshall Hatch e Rodger Slack Figura 2023b Em plantas de origem tropical o primeiro intermediá rio no qual o 14CO2 é fixado é o oxaloacetato um composto de quatro carbonos Essa reação que ocorre no citosol das células do mesófilo foliar é catalisada pela fosfoenolpiru vatocarboxilase para a qual o substrato é o HCO3 e não o CO2 O oxaloacetato então formado é reduzido a malato à custa de NADPH como mostrado na Figura 2023b ou convertido em aspartato por transaminação Oxaloacetato 1 aaminoácido Laspartato 1 acetoácido FIGURA 2023 Assimilação de carbono em plantas C4 A via C4 en volvendo células do mesófilo e células da bainha vascular predomina em plantas de origem tropical a Micrografia eletrônica mostrando cloroplastos de células adjacentes do mesófilo e da bainha vascular A célula da bainha vascular contém grânulos de amido Plasmodesmos conectando as duas cé lulas são visíveis b Via C4 de assimilação de CO2 que ocorre por meio de um intermediário de quatro carbonos a Célula do mesófilo Plasmodesmos Célula da bainha vascular NADPH H 3Fosfoglicerato Ribulose 15bifosfato Rubisco AMP ATP Pi Célula do mesófilo PEP Piruvato PPi Malato NADP Triosesfosfato Célula da bainha vascular Membranas plasmáticas Oxaloacetato Malato NADPH H Pi NADP Piruvato Plasmodesmos H2O no ar H CO2 HCO 3 b CO2 Piruvato fosfato dicinase Enzima málica Malato desidrogenase PEP carboxilase Nelson6edbookindb 815 Nelson6edbookindb 815 030414 0746 030414 0746 816 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O malato ou o aspartato formados nas células do mesófilo passam então para as células vizinhas da bainha vascular através dos plasmodesmos canais forrados de proteínas que conectam duas células vegetais e que proporcionam uma via para o movimento de metabólitos e mesmo de pe quenas proteínas entre as células Nas células da bainha vascular o malato é oxidado e descarboxilado para gerar piruvato e CO2 pela ação da enzima málica reduzindo NADP 1 Em plantas que usam o aspartato como carrea dor de CO2 o aspartato que chega nas células da bainha vascular é transaminado para formar oxaloacetato sen do a seguir reduzido a malato então o CO2 é liberado pela enzima málica ou pela PEPcarboxicinase Conforme mostram os experimentos de marcação o CO2 liberado nas células da bainha vascular é a mesma molécula de CO2 originalmente fixada no oxaloacetato nas células do mesófilo Este CO2 é agora novamente fixado desta vez pela rubisco em uma reação que é exatamente a mesma que ocorre em plantas C3 incorporação de CO2 no C1 do 3fosfoglicerato O piruvato formado pela descarboxilação do malato nas células da bainha vascular é transferido de volta às célu Três problemas mundiais urgentes despertaram aten ção séria para a possibilidade de se modificar as plantas para que elas sejam mais eficientes na conversão da luz solar em biomassa o efeito estufa do aumento do CO2 atmosférico sobre a mudança climática global o declínio no suprimento de óleo para o fornecimento de energia e a necessidade de mais e melhores alimentos para a popu lação mundial em crescimento A concentração de CO2 na atmosfera terrestre tem aumentado continuamente ao longo dos últimos 50 anos Figura Q1 pelo efeito combinado do uso de combus tíveis fósseis para energia e pela derrubada e queima de florestas tropicais para permitir o uso na agricultura À medida que o CO2 atmosférico aumenta a atmosfera absorve mais do calor irradiado da superfície da terra e reirradia mais em direção à superfície do planeta e em todas as outras direções A retenção de calor aumenta a temperatura na superfície da terra esse é o efeito estu fa Uma forma de limitar o aumento no CO2 atmosférico seria criar plantas ou microrganismos com maior capaci dade de sequestro de CO2 A quantidade estimada de carbono total em todos os sistemas terrestres atmosfera solo e biomassa é de cerca de 3200 gigatoneladas GT 3200 bilhões de toneladas métricas A atmosfera contém outras 760 GT de CO2 O fluxo de carbono por esses reservatórios terres tres Figura Q2 devese grandemente às atividades fotossintéticas das plantas e das atividades de degrada ção dos microrganismos As plantas fixam cerca de 123 GT de carbono por ano e liberam imediatamente cerca de metade disso para a atmosfera enquanto respiram A maior parte do restante é gradualmente liberada para a atmosfera pela ação microbiana sobre a matéria vegetal morta mas biomassa é sequestrada em plantas lenhosas e árvores por décadas ou séculos O fluxo antropogênico de carbono a quantidade de CO2 liberada na atmosfera por atividades humanas é de 9 GT por anopequena comparada com a biomassa total mas suficiente para desequilibrar o balanço da natureza em direção a um aumento de CO2 na atmosfera Estimase que as flores tas da América do Norte sequestram 07 GT de carbono anualmente que representa um décimo da produção anual global de CO2 a partir dos combustíveis fósseis Claramente a preservação das florestas e o refloresta mento são maneiras efetivas para limitar o fluxo de CO2 de volta para a atmosfera Uma segunda abordagem para limitar o aumento do CO2 atmosférico ao mesmo tempo em que também se considera a necessidade de substituir combustíveis fós seis em esgotamento é usar biomassa renovável como fonte de etanol para substituir combustíveis fósseis em motores de combustão interna Isso reduz o movi mento unidirecional de carbono dos combustíveis fósseis para o pool atmosférico de CO2 substituindoo pelo fluxo cíclico de CO2 do etanol para CO2 e de volta para a biomassa Quando milho trigo ou switchgrass Panicum virgatum são fermentados a etanol para combustível todo o aumento em produção de biomas QUADRO 201 A engenharia genética aumentará a eficiência de organismos fotossintéticos 380 360 340 320 CO2 atmosférica ppm 1960 1970 1980 1990 2000 2010 Ano FIGURA Q1 A concentração de CO2 na atmosfera medida no Observa tório Mauna Loa no Havaí Dados da National Oceanic and Atmospheric Administration e do Scripps Institution of Oceanography CO2 Program Nelson6edbookindb 816 Nelson6edbookindb 816 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 817 las do mesófilo onde é convertido em PEP por uma reação enzimática incomum catalisada pela piruvatofosfato dicinase Figura 2023b A enzima é denominada dicina se porque duas moléculas diferentes são simultaneamente fosforiladas por uma molécula de ATP piruvato é fosfori lado produzindo PEP e fosfato é fosforilado originando pirofosfato O pirofosfato é posteriormente hidrolisado em fosfato de forma que dois grupos fosfato de alta energia do ATP são usados na regeneração do PEP O PEP está agora pronto para receber uma outra molécula de CO2 na célula do mesófilo A PEPcarboxilase nas células do mesófilo tem alta afi nidade por HCO3 que é favorecido em relação ao CO2 em solução aquosa e pode fixar CO2 de maneira mais eficiente do que a rubisco Ao contrário da rubisco ela não usa O2 como substrato alternativo de forma que não há compe tição entre CO2 e O2 A reação da PEPcarboxilase serve portanto para fixar e concentrar CO2 na forma de malato A liberação de CO2 do malato nas células da bainha vascular gera uma concentração local suficientemente alta de CO2 para que a rubisco funcione perto de sua velocidade máxi ma e para a supressão da atividade de oxigenase da enzima sa alcançado por uma fotossíntese mais eficiente deve resultar em um decréscimo correspondente no uso de combustíveis fósseis Finalmente a engenharia de culturas alimentícias vi sando produzir mais alimento por hectare de terra ou por hora de trabalho poderia melhorar a nutrição huma na em todo o mundo Em princípio essas metas podem ser alcançadas desenvolvendose uma rubisco que não catalisasse tam bém a reação desperdiçadora com o O2 ou aumentando o número de renovação para a rubisco ou aumentando o nível da rubisco e de outras enzimas na via de fixação do carbono A rubisco conforme já dito é uma enzima de ineficiência incomum com um número de renovação de 3 s 1 a 25C a maioria das enzimas têm ordens de nú meros de renovação de magnitude maiores Ela também catalisa a reação desperdiçadora com o oxigênio a qual reduz ainda mais sua eficiência em fixar CO2 e produzir biomassa Se a rubisco pudesse ser geneticamente mo dificada para renovarse mais rapidamente ou para ser mais seletiva para o CO2 em relação ao O2 o efeito seria de maior produção fotossintética de biomassa e portan to maior sequestro de CO2 produção de mais combustí vel não fóssil e melhor nutrição Foi observado no Capítulo 15 que a visão tradicional de vias metabólicas sustentava que uma etapa em qual quer via era a mais lenta e portanto o fator limitante no fluxo de material através da via Entretanto esfor ços heroicos na engenharia celular ou de organismos têm muitas vezes gerado resultados desanimadores organismos modificados para produzir mais da enzima limitante em uma via em geral mostraram pouca ou nenhuma mudança no fluxo através daquela via O ciclo de Calvin é um caso elucidativo nesse ponto Aumentar a quantidade de rubisco em células vegetais por meio de engenharia genética tem pouco ou nenhum efeito na taxa de conversão de CO2 em carboidrato De forma semelhante mudanças nos níveis de enzimas conheci das por serem reguladas pela luz e portanto suspei tas de desempenharem papeis centrais na regulação da via frutose 16bifosfatase 3fosfogliceratocinase e gliceraldeído3fosfatodesidrogenase também leva ram a pouca ou nenhuma melhoria significativa na taxa fotossintética Porém níveis alterados de sedoeptulose 17bifosfatase não considerada uma enzima regula tória têm um impacto significativo na fotossíntese A análise do controle metabólico Seção 152 sugere que esse resultado não é inesperado no organismo vivo as vias podem ser limitadas por mais de uma etapa uma vez que toda mudança em uma etapa resulta em mu danças compensatórias em outras etapas Uma deter minação cuidadosa do coeficiente de controle de fluxo ver Quadro 151 ajuda a apontar quais enzimas em uma via que devem ser o alvo da engenharia genética Claramente engenheiros genéticos e analistas de con trole metabólico precisarão trabalhar juntos em proble mas como este Biomassa vegetal 560 123 Fotossíntese 60 Respiração vegetal Solo 2500 Atmosfera 760 Biomassa microbiana 110 60 Respiração e decomposição microbiana 9 Influxo antropogênico líquido 3 Sequestro líquido de carbono como carbono do solo FIGURA Q2 O ciclo de carbono terrestre Estoques de carbono qua dros são mostrados como gigatoneladas GT e os fluxos setas são mostrados em GT por ano A biomassa vegetal é desprezível aqui me nos do que 05 GT Nelson6edbookindb 817 Nelson6edbookindb 817 030414 0746 030414 0746 818 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Uma vez que o CO2 é fixado no 3fosfoglicerato nas célu las da bainha vascular as outras reações do ciclo de Calvin acontecem exatamente da maneira descrita anteriormente Assim nas plantas C4 as células do mesófilo realizam a as similação de CO2 pela via C4 e as células da bainha vascular sintetizam amido e sacarose pela via C3 Três enzimas da via C4 são reguladas pela luz tornan dose mais ativas durante o dia A malatodesidrogenase é ativada pelo mecanismo de redução dependente de tior redoxina mostrado na Figura 2019 a PEPcarboxilase é ativada pela fosforilação de um resíduo de Ser e a piruvato fosfatodicinase é ativada por desfosforilação Nos últimos dois casos os detalhes de como a luz afeta a fosforilação ou a desfosforilação não são conhecidos A via de assimilação de CO2 tem um custo energético maior em plantas C4 do que em plantas C3 Para cada molé cula de CO2 assimilada na via C4 uma molécula de PEP pre cisa ser regenerada à custa de duas ligações fosfoanidrido do ATP Assim as plantas C4 precisam de cinco moléculas de ATP para assimilar uma molécula de CO2 enquanto as plantas C3 precisam de apenas três nove por triosefosfa to À medida que a temperatura aumenta e a afinidade da rubisco pelo CO2 diminui como observado anteriormente é atingido um ponto em cerca de 28 a 30C no qual o ga nho em eficiência oriundo da eliminação da fotorrespiração mais do que compensa este custo energético As plantas C4 p ex o capimcolchão superam a maioria das plantas C3 durante o verão como qualquer jardineiro experiente pode atestar Em plantas CAM a captura de CO2 e a ação da rubisco estão separadas temporalmente Plantas suculentas como os cactus e o abacaxi nativas de ambientes muito quentes e muito secos têm outra varia ção da fixação fotossintética de CO2 a qual reduz a perda de vapor de água através dos poros estômatos por onde o CO2 e o O2 precisam ingressar no tecido vegetal Em vez de separarem no espaço o aprisionamento inicial do CO2 e sua fixação pela rubisco como fazem as plantas C4 elas separam esses dois eventos ao longo do tempo À noite quando o ar está mais fresco e mais úmido os es tômatos se abrem para permitir a entrada de CO2 então fixado na forma de oxaloacetato pela PEPcarboxilase O oxaloacetato é reduzido a malato e armazenado em va cúolos para proteger as enzimas citosólicas e dos plas tídeos do pH baixo produzido pela dissociação do ácido málico Durante o dia os estômatos se fecham impedin do a perda de água que resultaria das altas temperaturas diurnas e o CO2 aprisionado ao longo da noite no malato é liberado como CO2 pela enzima málica ligada ao NADP Esse CO2 é agora assimilado pela ação da rubisco e das enzimas do ciclo de Calvin Como esse método de fixa ção de CO2 foi inicialmente descoberto em plantas do tipo dedodemoça plantas perenes da família Crassulaceae ele é chamado de metabolismo ácido das crassuláceas de crassulacean acid metabolism e as plantas são chamadas de plantas CAM RESUMO 202 Fotorrespiração e as vias C4 e CAM c Quando a rubisco usa o O2 em vez do CO2 como subs trato o 2fosfoglicolato então formado é descartado em uma via dependente de oxigênio O resultado é o consu mo aumentado de O2 fotorrespiração ou mais preci samente o ciclo oxidativo fotossintético do carbono ou ciclo C2 O 2fosfoglicolato é convertido em glioxilato a seguir em glicina e então em serina em uma via que envolve enzimas no estroma do cloroplasto no peroxis somo e na mitocôndria c Em plantas C4 a via de assimilação de carbono minimiza a fotorrespiração o CO2 é primeiro fixado nas células do mesófilo em um composto de quatro carbonos que passa para as células da bainha vascular e libera CO2 em altas concentrações O CO2 liberado é fixado pela rubis co e as demais reações do ciclo de Calvin ocorrem como nas plantas C3 c Em plantas CAM o CO2 é fixado em malato no escuro e estocado nos vacúolos até o período diurno quando os estômatos estão fechados minimizando a perda de água e o malato serve como fonte de CO2 para a rubisco 203 Biossíntese de amido e sacarose Durante a fotossíntese ativa sob luz intensa a folha de um vegetal produz mais carboidratos na forma de triosesfos fato do que precisa para gerar energia ou sintetizar precur sores O excesso é convertido a sacarose e transportado a outras partes da planta para ser utilizado como combustível ou armazenado Na maioria das plantas o amido é a princi pal forma de estocagem mas em algumas poucas plantas como a beterraba açucareira e a canadeaçúcar a sacarose é a principal forma de estocagem As sínteses de sacarose e de amido ocorrem em diferentes compartimentos celulares citosol e plastídeos respectivamente e esses processos estão coordenados por uma variedade de mecanismos de regulação que respondem a mudanças no nível de lumino sidade e na velocidade da fotossíntese A síntese de sacaro se e de amido é importante para a planta mas também para humanos o amido fornece mais do que 80 das calorias da dieta humana em todo o mundo A ADPglicose é o substrato para a síntese de amido em plastídeos vegetais e para a síntese de glicogênio em bactérias O amido assim como o glicogênio é um polímero de Dgli cose em ligação a1S4 de alto peso molecular Para arma zenamento temporário ele é sintetizado nos cloroplastos como um dos produtos finais estáveis da fotossíntese para estocagem de longo prazo ele é sintetizado nos amiloplas tos das partes não fotossintéticas das plantas sementes raízes e tubérculos caules subterrâneos O mecanismo de ativação da glicose na síntese do amido é semelhante àquele da síntese do glicogênio Um açúcar nucleotídeo ativado nesse caso a ADPglicose é forma Nelson6edbookindb 818 Nelson6edbookindb 818 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 819 do pela condensação de glicose1fosfato com ATP em uma reação essencialmente irreversível pela presença de pirofos fatase inorgânica nos plastídeos Figura 1531 A amido sintase então transfere resíduos de glicose da ADPglicose para molécula preexistentes de amido As unidades mono méricas são quase que certamente adicionadas à extremi dade não redutora do polímero em crescimento da forma como o fazem na síntese de glicogênio ver Figura 1532 A amilose do amido não é ramificada mas a amilopec tina tem numerosas ramificações formadas por ligações a1S6 ver Figura 713 Os cloroplastos contêm uma en zima ramificadora semelhante à enzima de ramificação do glicogênio ver Figura 1533 que introduz as ramificações a1S6 da amilopectina Levando em consideração a hi drólise do PPi produzido durante a síntese de ADPglicose pela pirofosfatase inorgânica a reação global para a forma ção do amido a partir da glicose1fosfato é Amidon 1 glicose1fosfato 1 ATP amidon11 1 ADP 1 2 Pi ΔG9 5 50 kJmol A síntese de amido é regulada no nível da formação da ADPglicose conforme discutido a seguir Muitos tipos de bactérias armazenam carboidratos na forma de glicogênio essencialmente amido altamente ra mificado sintetizado em uma reação análoga àquela catali sada pela glicogêniosintase em animais As bactérias como os plastídeos vegetais usam ADPglicose como a forma ativada de glicose enquanto as células animais usam UDP glicose Novamente a semelhança entre o metabolismo de plastídeos e bactérias é consistente com a hipótese endos simbiótica para a origem das organelas p 36 A UDPglicose é o substrato para a síntese de sacarose no citosol de células das folhas A maior parte das triosesfosfato geradas pela fixação do CO2 em plantas é convertida em sacarose Figura 2024 ou amido No curso da evolução a sacarose deve ter sido selecionada como a forma de transporte de carbono devido a sua ligação pouco comum entre o C1 anômero da glicose e o C2 anômero da frutose Essa ligação não é hidrolisada por amilases ou por outras enzimas comuns que hidrolisam carboidratos e a indisponibilidade de carbonos anômeros impede a sacarose de reagir de modo não enzimático como faz a glicose com aminoácidos e proteínas A sacarose é sintetizada no citosol a partir da dihidro xiacetonafosfato e do gliceraldeído3fosfato exportados do cloroplasto Depois da condensação de duas trioses fosfato para formar frutose16bifosfato catalisada pela aldolase a hidrólise pela frutose16bifosfatase gera fru tose 6fosfato A sacarose6fosfatosintase catalisa en tão a reação da frutose6fosfato com a UDPglicose para formar sacarose6fosfato Figura 2024 Finalmente a sacarose6fosfatofosfatase remove o grupo fosfato tornando a sacarose disponível para a exportação a outros tecidos A reação catalisada pela sacarose6fosfatosintase é um processo de baixa energia ΔG9 5 57 kJmol mas a hidrólise da sacarose6fosfato a sacarose é suficientemen te exergônica ΔG9 5 165 kJmol para tornar a síntese global da sacarose essencialmente irreversível A síntese de sacarose é regulada e intimamente coordenada com a sínte se de amido conforme será visto Uma diferença marcante entre as células vegetais e ani mais é a ausência no citosol da célula vegetal da enzima pi rofosfatase inorgânica que catalisa a reação PPi 1 H2O 2 Pi ΔG9 5 192 kJmol Para muitas reações biossintéticas que liberam PPi a ativi dade da pirofosfatase torna o processo mais favorável ener geticamente tendendo a tornar essas reações irreversíveis Nas plantas essa enzima está presente nos plastídeos mas ausente no citosol Como resultado o citosol das células foliares contém uma concentração substancial de PPi o suficiente 03 mM para tornar reações como a catalisada pela UDPglicosepirofosforilase ver Figura 1531 facil O UDPglicose Sacarose 6fosfato sintase 1 HOCH2 HO H OH H O HO P UDP CH2 O H OH H H H OH Frutose6fosfato UDP H HO O 2 HOCH2 H H H 1 HO O CH2OH O H OH H H H OH Sacarose H OH O Sacarose 6fosfato fosfatase 2 HOCH2 H OH H H 1 HO Pi CH2OH O H OH H H H OH Sacarose6fosfato H O 1 O CH2OH 2 H HO HO P CH2 O CH2OH FIGURA 2024 Síntese da sacarose A sacarose é sintetizada a partir da UDPglicose e da frutose6fosfato sintetizadas a partir das triosesfosfato no citosol da célula vegetal por vias mostradas nas Figuras 1531 e 209 A sacarose6fosfatosintase da maioria das espécies vegetais é alostericamen te regulada por glicose6fosfato e Pi Nelson6edbookindb 819 Nelson6edbookindb 819 030414 0746 030414 0746 820 DAVID L NELSON MICHAEL M COX mente reversíveis Lembrese do Capítulo 14 p 550 que a isoenzima citosólica da fosfofrutocinase em plantas usa PPi e não ATP como doador de fosforil A conversão de triosesfosfato em sacarose e amido é firmemente regulada As triosesfosfato produzidas pelo ciclo de Calvin sob luz solar intensa conforme salientado podem ser temporaria mente estocadas no cloroplasto como amido ou convertidas em sacarose e exportadas para partes não fotossintéticas das plantas ou ambos O balanço entre os dois processos é fortemente regulado e ambos precisam ser coordenados com a velocidade de fixação de carbono Cinco sextos das triosesfosfato formadas no ciclo de Calvin precisam ser reciclados regenerando ribulose15bifosfato Figura 20 14 Se mais de um sexto das triosesfosfato é retirado do ciclo para fazer sacarose e amido o ciclo terá sua veloci dade reduzida ou irá parar completamente No entanto a conversão insuficiente de triosesfosfato em amido ou sacarose aprisionaria fosfato deixando o cloroplasto defi ciente em Pi o qual também é essencial para a operação do ciclo de Calvin O fluxo de triosesfosfato para sacarose é regulado pela atividade da frutose16bifosfatase FBPase1 e a enzima que efetivamente reverte sua ação a fosfofrutocinase de pendente de PPi PPPFK1 p 550 Portanto essas en zimas são pontos críticos na determinação do destino das triosesfosfato produzidas pela fotossíntese Ambas as en zimas são reguladas pela frutose26bifosfato F26BP que inibe a FBPase1 e estimula a PPPFK1 Em plantas vasculares a concentração de F26BP varia inversamente com a taxa de fotossíntese Figura 2025 A fosfofrutoci nase2 responsável pela síntese de F26BP é inibida por di hidroxiacetonafosfato ou 3fosfoglicerato sendo estimu lada por frutose6fosfato e Pi Durante a fotossíntese ativa a dihidroxiacetonafosfato é produzida e Pi é consumido resultando na inibição da PFK2 e em concentrações redu zidas de F26BP Isso favorece um fluxo maior de trioses fosfato para a formação de frutose6fosfato e a síntese de sacarose Com esse sistema de regulação a síntese de sa carose ocorre quando o nível de triosesfosfato produzido pelo ciclo de Calvin excede aquele necessário para manter a operação do ciclo A síntese de sacarose também é regulada no nível de sacarose6fosfatosintase que é ativada alostericamente por glicose6fosfato e inibida por Pi Essa enzima é ainda regulada por fosforilação e desfosforilação uma proteína cinase fosforila a enzima em um resíduo específico de Ser tornandoa menos ativa e uma fosfatase reverte esta inati vação removendo o fosfato Figura 2026 A inibição da cinase por glicose6fosfato e da fosfatase por Pi aumenta os efeitos desses dois compostos na síntese de sacarose Quando hexosesfosfato são abundantes a sacarose6 fosfato sintase é ativada por glicose6fosfato quando Pi está elevado como ocorre quando a fotossíntese é lenta a síntese de sacarose é diminuída Durante a fotossíntese ativa trioses fosfato são convertidas em frutose6fosfato que é rapidamente equilibrada com glicose6fosfato pela fosfohexose isomerase Como o equilíbrio dessa reação fa vorece bastante a formação da glicose6fosfato assim que a frutose6fosfato se acumula o nível de glicose6fosfato aumenta e a síntese de sacarose é estimulada A enzimachave da regulação na síntese de amido é a ADPglicosepirofosforilase Figura 2027 ela é ati vada por 3fosfoglicerato que se acumula durante a fo tossíntese ativa e inibida por Pi que se acumula quando a condensação de ADP e Pi promovida pela luz é reduzida Frutose26 bifosfato Escuro Ausência de fotossíntese Pi Luz Fotossíntese ativa 3Fosfoglicerato e dihidroxiacetona fosfato Frutose6 fosfato PPi Pi Pi Triose fosfato Citosol Frutose16 bifosfato Sacarose Escuro Escuro Glicólise Gliconeogênese Cloroplasto ADP PFK2 FBPase2 H2O Pi ATP FBPase1 PPPFK1 FIGURA 2025 Frutose26bifosfato na regulação da síntese de saca rose A concentração do efetor alostérico frutose26bifosfato em células vegetais é regulada pelos produtos da assimilação fotossintética de carbono e por Pi Dihidroxiacetonafosfato e 3fosfoglicerato produzidos pela assi milação de CO2 inibem a fosfofrutocinase2 PFK2 a enzima que sintetiza o efetor o Pi estimula a PFK2 A concentração de frutose26bifosfato é portanto inversamente proporcional à velocidade da fotossíntese No es curo a concentração de frutose26bifosfato aumenta e estimula a enzima glicolítica fosfofrutocinase1 dependente de PPi PPPFK1 enquanto inibe a enzima gliconeogênica frutose16bifosfatase FBPase1 Quando a fotos síntese está ativa na luz a concentração do regulador diminui e a síntese de frutose6fosfato e de sacarose é favorecida Nelson6edbookindb 820 Nelson6edbookindb 820 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 821 Quando a síntese de sacarose diminui o 3fosfoglicerato formado pela fixação do CO2 é acumulado ativando essa enzima e estimulando a síntese de amido RESUMO 203 Biossíntese de amido e sacarose c A amidosintase nos cloroplastos e amiloplastos catalisa a adição de resíduos individuais de glicose doados por ADPglicose provavelmente à extremidade não reduto ra As ramificações na amilopectina são introduzidas por uma segunda enzima c A sacarose é sintetizada no citosol em duas etapas a partir de UDPglicose e frutose1fosfato c A partição das triosesfosfato entre a síntese de saca rose e a síntese de amido é regulada pela frutose26 bifosfato F26BP um efetor alostérico das enzimas que determinam o nível de frutose6fosfato A concen tração de F26BP varia inversamente com a velocidade da fotossíntese e a F26BP inibe a síntese de frutose6 fosfato o precursor da sacarose 204 Síntese de polissacarídeos da parede celular celulose vegetal e peptideoglicano bacteriano A celulose é o principal constituinte das paredes celulares das plantas proporcionando resistência e rigidez e impe dindo o inchamento celular e a ruptura da membrana plas mática que podem ocorrer quando as condições osmóticas favorecem a entrada de água na célula A cada ano mun dialmente as plantas sintetizam mais de 10 11 toneladas de celulose fazendo desse polímero simples um dos compos tos mais abundantes da biosfera A estrutura da celulose é simples polímeros lineares de milhares de unidades de Dglicose com ligações b1S4 agrupados em feixes de cerca de 36 cadeias que se agregam lado a lado para formar uma microfibrila Figura 2028 A biossíntese de celulose é menos conhecida do que a do glicogênio ou do amido Como componente principal da parede celular vegetal a celulose precisa ser sintetizada a partir de precursores intracelulares mas suas cadeias de vem ser depositadas e agrupadas fora da membrana plas mática A maquinaria enzimática para a iniciação o alon gamento e a exportação das cadeias de celulose é mais complicada do que aquela necessária para sintetizar amido ou glicogênio não exportados As bactérias enfrentam um conjunto semelhante de problemas quando sintetizam os complexos polissacarídeos que constituem suas paredes celulares e utilizam alguns dos mesmos mecanismos para resolver esses problemas A celulose é sintetizada por estruturas supramoleculares na membrana plasmática A complexa maquinaria enzimática que monta as cadeias de celulose abrange a membrana plasmática com uma parte posicionada para ligar o substrato a UDPglicose no citosol e outra parte se estendendo para fora responsá vel pelo alongamento e a cristalização das moléculas de celulose no espaço extracelular A microscopia eletrônica de criofratura mostra que esses complexos terminais também chamados de rosetas são compostos de seis par tículas grandes arranjadas em um hexágono regular com um diâmetro de cerca de 30 nm Figura 2029 Diversas proteínas incluindo a subunidade catalítica da celulose sintase constituem o complexo terminal A maior parte Glicose6 fosfato Glicose6 fosfato menos ativa mais ativa CH2O SPS cinase H2O Pi Pi Pi SPS fosfatase ADP ATP Sacarose6 fosfato sintase Sacarose6 fosfato sintase CH2OH P FIGURA 2026 Regulação da sacarosefosfatosintase por fosforila ção Uma proteínacinase SPScinase específica para a sacarose fosfato sintase SPS fosforila um resíduo de Ser na SPS inativandoa uma fosfatase específica SPSfosfatase reverte esta inibição A cinase é alostericamente inibida por glicose6fosfato que também ativa a SPS alostericamente A fos fatase é inibida por Pi que também inibe a SPS diretamente Assim quando a concentração de glicose6fosfato é alta como resultado da fotossíntese ativa SPS é ativada e produz sacarosefosfato Uma alta concentração de Pi que ocorre quando a conversão fotossintética de ADP em ATP é lenta inibe a síntese de sacarosefosfato Fotossíntese Luz intensa Luz de baixa intensidade ou escuridão ADPglicose 1 PPi ADPglicose pirofosforilase Glicose1 fosfato 1 ATP 3Fosfoglicerato Lento ADP 1 Pi ATP FIGURA 2027 Regulação da ADPglicosefosforilase por 3fosfogli cerato e Pi Esta enzima que produz o precursor para a síntese do amido é o passo limitante da velocidade de produção do amido A enzima é aloste ricamente estimulada por 3fosfoglicerato 3PGA e inibida por Pi de fato a razão 3PGAPi que se eleva com o aumento na velocidade da fotossínte se controla a síntese de amido nesta etapa Nelson6edbookindb 821 Nelson6edbookindb 821 030414 0746 030414 0746 822 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Microfibrilas de FIGURA 2028 Estrutura da celulose A parede celular vegetal é forma celulose na parede da em parte por moléculas de celulose arranjadas lado a lado para formar celular vegetal estruturas paracristalinas microfibrilas de celulose Muitas microfibrilas se nies combinam para formar uma fibra de celulose visualizada em microscopia 1 ee eletrénica de varredura como uma estrutura de 5 a 12 nm de didmetro de ye re ae ae FJ positada na superficie celular em diversas camadas distinguiveis pelas dife aes em rentes orientaées de suas fibras s a ie RES do progresso recente no entendimento da sintese de celu ae a SG i YI lose advém de estudos genéticos e genéticomoleculares et ms da planta Arabidopsis thaliana especialmente apropria da a dissecagéo genética e cujo genoma foi sequenciado A familia de genes que codifica esta atividade de sintese de celulose foi clonada e mostrou codificar proteinas com Cadeias de oito segmentos transmembranicos e um dominio central celuvose no lado citosélico da membrana plasmatica que inclui Microfibrila sequéncias que podem ser encontradas em uma glicosil Ze transferase Figura 2029 AY Em um modelo de trabalho da sintese de celulose as tif De iby cadeias de celulose sao iniciadas pela formagao de um in E termediario ligado a um lipideo diferente de qualquer ele ZZ env mento envolvido na sintese de amido ou glicogénio Con i SOUS CH2OH g144 CH20H forme mostrado na etapa da Figura 2029 a glicose é SS H H transferida da UDPglicose para um lipideo de membrana OW O7K On H 1 0 OH H AF QO provavelmente o esterol vegetal sitosterol sobre a face in terna da membrana plasmatica Aqui a celulosesintase in H OH H OH tracelular adiciona varios outros residuos de glicose ao pri meiro em ligagdes B14 formando um oligossacarideo curto ligado ao sitosterol sitosteroldextrina A seguir a sitosteroldextrina inteira é rebatida para a face externa da Rosetas visualizadas por 7 a microscopia eletrénica i Cadeias paralelas de de criofratura da ES celulose cristalizam para membrana plasmatica Rosetas wr a formar uma fibrila da célula vegetal Cada uma das seis unidades ie da roseta 6 um complexo 4 ia da celuloseMeintases a ri a Son cada celulosesintase de uma Pa hl cy rs roseta sintetiza uma longa cadeia rs Af de celulose do lado de fora da membrana plasmatica Lado ra P Monomero da celulosesintase extracelular 5 e Celulosesintase rl ry a OO DOOODOOCOS00COOSRooCoT ee eae a ea a a OOS MTT eT TMD OMUMID TNT T RATNER TT I 1 Pl AK MW HER 13 é bie SACATOSESiNtaSe ANaM ait ial se Me ae daa i eet a Pu ee i tL Va p 1 ae i eee etait Li LEED a ea Tal 1 Vat Ae eee OOOCC OCR OOOO OOo S Ap NVA TOO XML Oa MLO bh i 4 i Lado Sitosterol Sitosterol i H3N ip q coo citosdlico Bglicosideo Pa co A ae 7 Microtubulo no Aglicose éligada ao Sacarose Frutose La POntedeeltion sitosterol para formar um aA es een Motivos da A A a7 o tase glicano ligado a lipideo See licosiltransferase gera UDPglicose movimento g da roseta Direcdo do movimento do complexo da celulosesintase ao longo da membrana plasmatica FIGURA 2029 Um modelo proposto para a sintese de celuloseem estudos genéticos e bioquimicos da Arabidopsis thaliana e de outras plantas uma planta vascular Este esquema é derivado de uma combinacao de vasculares PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 823 membrana plasmática onde ela agora se associa com uma outra forma de celulosesintase A UDPglicose usada para a síntese de celulose etapa ➋ é gerada a partir da sacarose produzida durante a fotos síntese pela reação catalisada pela sacarosesintase assim denominada devido à reação reversa Sacarose 1 UDP UDPglicose 1 frutose A celulosesintase se estende ao longo da membrana plas mática e usa UDPglicose citosólica como precursor para a síntese extracelular de celulose Uma forma de sacarose sintase ligada à membrana forma um complexo com a ce lulosesintase fornecendo UDPglicose a partir da sacarose diretamente para a síntese da parede celular Na etapa ➌ uma segunda forma de celulosesintase alonga o polímero até 500 a 15000 unidades de glicose li berandoo para a superfície externa da célula A ação da en zima é continuada uma molécula de enzima adiciona mui tas unidades de glicose antes de liberar a cadeia de celulose em crescimento O sentido do crescimento da cadeia se a adição ocorre na extremidade redutora ou não redutora ainda não foi definitivamente estabelecido Cada um dos seis glóbulos da roseta consiste em múl tiplas subunidades proteicas que juntas sintetizam seis cadeias de celulose O grande complexo enzimático que catalisa esse processo etapa ➍ na verdade se move ao longo da membrana plasmática seguindo o curso dos mi crotúbulos no córtex a camada de citoplasma logo abaixo da membrana Como esses microtúbulos jazem perpendi culares ao eixo de crescimento da planta as microfibrilas de celulose são depositadas transversalmente ao eixo de crescimento Acreditase que o movimento dos complexos de celulosesintase seja promovido pela energia liberada na reação de polimerização e não por um motor molecular como a cinesina A celulose pronta encontrase na forma de microfibri las cristalinas Figura 2028 cada uma composta por 36 cadeias de celulose separadas colocadas lado a lado todas com a mesma orientação paralelas das extremidades não redutoras e redutoras Parece provável que os 36 políme ros separados sintetizados em uma roseta cheguem juntos à face externa da célula já alinhados e etapa ➎ prontos para se cristalizarem como uma microfibrila da parede celu lar Quando os 36 polímeros atingem um comprimento crí tico sua síntese é encerrada por um mecanismo desconhe cido seguese a cristalização na forma de uma microfibrila No precursor ativado da celulose UDPglicose a glico se apresenta ligação a com o nucleotídeo mas no produto celulose os resíduos de glicose estão unidos por ligação b1S4 de forma que há uma inversão de configuração no carbono anômero C1 à medida que a ligação glicosídica se forma Imaginase que as glicosiltransferases que inver tem a configuração usam um mecanismo de deslocamento único com ataque nucleofílico pela espécie aceptora no carbono anômero do açúcar doador UDPglicose Certas bactérias Acetobacter Agrobacteria Rhizobia e Sarcina e muitos eucariotos simples também realizam a síntese de celulose aparentemente por um mecanismo se melhante ao das plantas Se as bactérias usam um lipídeo de membrana para iniciar novas cadeias esse não pode ser um esterol as bactérias não contêm esteróis Oligossacarídeos ligados a lipídeos são precursores na síntese da parede celular bacteriana Da mesma maneira que as plantas muitas bactérias têm paredes extracelulares espessas e rígidas que as protegem da lise osmótica O peptideoglicano que fornece aos en velopes bacterianos sua força e rigidez é um copolímero linear de Nacetilglicosamina GlcNAc e ácido Nacetilmu râmico Mur2Ac alternados unidos por ligações glicosídi cas b1S4 e com ligações cruzadas com peptídeos curtos ligados ao Mur2Ac Figura 2030 Durante a montagem do esqueleto do polissacarídeo dessa macromolécula com FIGURA 2030 Estrutura do peptideoglicano Este é o peptideoglicano da parede celular de Staphylococcus aureus bactéria grampositiva Os pep tídeos cordões de esferas coloridas ligamse covalentemente a resíduos de ácido Nacetilmurâmico em cadeias polissacarídicas vizinhas Observe a mistura de L e Daminoácidos nos peptídeos Bactérias grampositivas como S aureus têm uma cadeia de pentaglicina efetuando uma ligação cruzada Bactérias gramnegativas como a E coli não têm a pentaglicina em vez dis to o resíduo terminal DAla de um tetrapeptídeo é diretamente ligado a um tetrapeptídeo vizinho por meio da LLys ou de um aminoácido do tipo lisina o ácido diaminopimélico A ligação peptídica do glutamato é pouco comum aqui ela envolve o grupo carboxil da cadeia lateral do glutamato Staphylococcus aureus Extremidade redutora LAla DGlu LLys DAla Nacetilglicosamina GlcNAc Ligação cruzada de pentaglicina b1 4 Ácido Nacetilmu râmico Mur2Ac S a Staphylococcus aureus Nelson6edbookindb 823 Nelson6edbookindb 823 030414 0746 030414 0746 824 DAVID L NELSON MICHAEL M COX plexa ambos GlnNAc e Mur2Ac são ativados por ligação a um nucleotídeo da uridina em seus carbonos anômeros Primeiro GlcNAc1fosfato condensase com UTP para for mar UDPGlcNAc Figura 2031 etapa ➊ que reage com fosfoenolpiruvato para formar UDPMur2Ac etapa ➋ cin co aminoácidos são então adicionados etapa ➌ A porção Mur2Acpentapeptídeo é transferida do nucleotídeo da uri dina para o lipídeo de membrana dolicol álcool isoprenoide de cadeia longa ver Figura 1022f etapa ➍ e um resí duo de GlcNAc é doado pela UDPGlcNAc etapa ➎ Em muitas bactérias cinco glicinas são adicionadas em ligação peptídica ao grupo amino do resíduo de Lys do pentapeptí deo etapa ➏ Finalmente esse dissacarídeo decapeptídeo é adicionado à extremidade não redutora de uma molécula existente de peptideoglicano etapa ➐ Efetuamse liga ções peptídicas cruzadas entre cadeias de oligopeptídeos unindo cadeias adjacentes de polissacarídeos etapa ➑ contribuindo para uma parede macromolecular enorme e forte ao redor da célula bacteriana Muitos dos antibióticos mais efetivos em uso atualmente agem inibindo reações de síntese do peptideoglicano Muitos outros oligossacarídeos e polissacarídeos são sintetizados por vias similares onde açúcares são ativados para as reações subsequentes por ligação a nucleotídeos Na glicolisação de proteínas por exemplo ver Figura 27 39 os precursores das porções carboidrato incluem açú cares ligados a nucleotídeos e oligossacarídeos ligados a lipídeos RESUMO 204 Síntese de polissacarídeos da parede celular celulose vegetal e peptideoglicano bacteriano c A síntese de celulose ocorre em complexos terminais rosetas na membrana plasmática Cada cadeia de ce lulose começa como uma sitosteroldextrina formada dentro da célula Ela é então rebatida para o lado de FIGURA 2031 Síntese do peptideoglicano bacteriano Nas etapas iniciais desta via ➊ a ➍ a Nacetilglicosamina GlcNAc e o ácido N acetilmurâmico Mur2Ac são ativados por ligação de seus carbonos anômeros a um nucleotídeo da uridina UDP e no caso do Mur2Ac a um álcool isoprenoide de cadeia longa dolicol por meio de uma ligação fosfodiéster Estes grupos ativadores participam da formação das ligações glicosídicas eles servem como excelentes promotores da li gação que depois se desligam Depois das etapas ➎ e ➏ e da reunião de um dissacarídeo com uma cadeia lateral peptídica 10 resíduos de aminoáci dos ➐ este precursor é transferido à extremidade não redutora de uma cadeia de peptideoglicano preexistente que serve como iniciador da reação de polimerização Finalmente ➑ em uma reação de transpeptidação entre as cadeias laterais pep tídicas em duas moléculas de peptideoglicanos diferentes um resíduo de Gly na extremidade de uma cadeia desloca uma DAla terminal na outra cadeia formando uma ligação cruzada Esta reação de transpeptidação é inibida por penicilinas que matam as bactérias por enfraquecerem suas pare des celulares ver Figura 630 1 UTP GlcNAc1 UDPGlcNAc 1 PPi PEP NADPH NADP1 UDPMur2Ac UDPGlcNAc LAlanina ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ ➏ ➐ ➑ DGlutamato LLisina DAlaDAlanina Dolicol UDP P P Dolicol UMP P P Dolicol 5 LGlicina DAlanina Transpeptidase P P Dolicol P P Dolicol Segmento iniciador de peptideoglicano preexistente Outra cadeia de peptideoglicano Penicilinas P P Peptideoglicano maduro totalmente entrelaçado Nelson6edbookindb 824 Nelson6edbookindb 824 030414 0746 030414 0746 PRINCIPIOS DE BIOQUMICA DE LEHNINGER 825 fora onde a porcao oligossacaridica é transferida paraa animais as plantas e alguns microrganismos conseguem celulosesintase na roseta sendo entaéo alongada Cada converter a acetilCoA proveniente da oxidacao de acidos roseta produz simultaneamente e em paralelo 36 ca graxos em glicose Figura 2032 Algumas enzimas es deias de celulose separadas As cadeias cristalizam em uma das microfibrilas que formam a parede celular Asintese do peptideoglicano da parede celular bacteria na também envolve oligossacarideos ligados a lipideos Acido graxo formados no interior da célula e rebatidos para o lado de Glioxissomo fora para sua construgao Boxidagao 205 Integracao do metabolismo de carboidratos na célula vegetal AcetilCoA O metabolismo de carboidratos em uma célula vegetal tipi Oo ca é em muitos aspectos mais complexo do que em uma cH lsc A célula animal tipica A célula vegetal realiza os mesmos processos que geram energia em células animais glicéli a se ciclo do acido citrico e fosforilagao oxidativa ela pode Citrato gerar hexoses a partir de compostos de trés e quatro carbo Oxaloacetato nos pela gliconeogénese ela pode oxidar hexosesfosfato a pentosesfosfato com a geragaéo de NADPH a via oxidativa a oo ao das pentosesfosfato e ela pode produzir um polimero de glioxilato socitrato glicose com ligagdes a14 amido e degradalo para gerar hexoses No entanto além dessas transformacées de ele J Succinato carboidratos que ela partilha com a célula animal a célula O0C CH CH COO sy ye Glioxilato vegetal fotossintética pode fixar CO em compostos orga nicos a reagaéo da rubisco usar os produtos da fixacgao AcetilCoA para gerar trioses hexoses e pentoses 0 ciclo de Calvin oO e converter a acetilCoA gerada da quebra de acidos graxos CH lsc A em compostos de quatro carbonos 0 ciclo do glioxilato e 3 os compostos de quatro carbonos em hexoses gliconeo génese Esses processos exclusivos da célula vegetal sao segregados em varios compartimentos celulares nao encon ean SuccinilCoA trados em células animais 0 ciclo do glioxilato em glioxisso 7 mos 0 ciclo de Calvin nos cloroplastos a sintese de amido oeeted Uta Age tei nos amiloplastos e o armazenamento de acidos organicos f nos vactiolos A integracado dos eventos entre esses varios octet Ciclo do Er arato compartimentos requer transportadores especificos nas x ca J membranas de cada organela para mover produtos de uma organela a outra ou para o citosol s A gliconeogénese converte gorduras e proteinas em Tl glicose nas sementes em germinaao Oxaloacetato Muitas plantas armazenam lipideos e proteinas em suas se mentes para serem usados como fontes de energia e como OOCCCHCOO precursores biossintéticos durante a germinacao antes do Citosol perce desenvolvimento do mecanismo fotossintético A gliconeo Fosfoenolpiruvato génese ativa em sementes em germinagao fornece glicose para a sintese de sacarose polissacarideos e muitos outros metab6litos derivados de hexoses Em mudas de plantas a 1 Sconcogénese sacarose fornece a maior parte da energia quimica necessa Frutose6fosfato ria para o crescimento inicial Sacarose Foi observado anteriormente Capitulo 14 que as cé Glicose6fosfato lulas animais podem realizar a gliconeogénese a partir de precursores de trés e quatro carbonos mas nao a partir FIGURA 2032 Conversao de acidos graxos armazenados em sacaro dos dois carbonos acetila da acetilCoA Como a reacio da 8 94S Sementes em germinagao Fsta via inicia nos glioxissomos O suc G 7 cinato é produzido e exportado para as mitocéndrias onde é convertido em piruvatodesidrogenase efetivamente irreversivel Seao oxaloacetato por enzimas do ciclo do acido citrico O oxaloacetato entra no 161 as células animais nao tém como converter acetil citosol e serve como matériaprima para a gliconeogénese e para a sintese CoA em piruvato ou oxaloacetato Diferentemente dos de sacarose a forma de transporte de carbono nas plantas 826 DAVID L NELSON MICHAEL M COX senciais para essa conversão estão sequestradas nos glio xissomos onde isoenzimas da boxidação específicas dos glioxissomos quebram os ácidos graxos até acetilCoA ver Figura 1624 A separação física entre as enzimas do ciclo do glioxilato e da boxidação e as enzimas do ciclo do ácido cítrico mitocondrial impede a oxidação adicional da acetil CoA a CO2 Em vez disso a acetilCoA é convertida em suc cinato no ciclo do glioxilato ver Figura 1622 O succinato passa para a matriz mitocondrial onde é convertido pelas enzimas do ciclo do ácido cítrico em oxaloacetato que se desloca para o citosol O oxaloacetato citosólico é converti do pela gliconeogênese em frutose6fosfato o precursor da sacarose Assim fazse necessária a integração de sequên cias de reações em três compartimentos celulares para a produção de frutose6fosfato ou sacarose a partir dos lipí deos armazenados Como apenas três dos quatro carbonos em cada molécula de oxaloacetato são convertidos em he xose no citosol cerca de 75 do carbono nos ácidos graxos armazenados como lipídeos nas sementes são convertidos em carboidratos pelas vias combinadas da Figura 2032 Os outros 25 são perdidos como CO2 na conversão de oxaloa cetato em fosfoenolpiruvato A hidrólise dos triacilgliceróis armazenados também produz glicerol3fosfato que pode entrar na via gliconeogênica depois de sua oxidação a di hidroxiacetonafosfato Figura 2033 Aminoácidos glicogênicos ver Tabela 144 derivados da quebra de proteínas armazenadas em sementes também geram precursores para a gliconeogênese após transami nação e oxidação a succinilCoA o piruvato o oxaloacetato o fumarato e o acetoglutarato Capítulo 18 todos eles sendo boa matériaprima para a gliconeogênese Conjuntos pools de intermediários em comum conectam vias em diferentes organelas Embora a descrição das transformações metabólicas em cé lulas vegetais tenha sido feita em termos de vias individuais essas vias se interconectam de forma tão completa que se devem considerar os conjuntos pools de intermediários metabólicos partilhados por essas vias e conectados por rea ções prontamente reversíveis Figura 2034 Um desses conjuntos de metabólitos inclui as hexosesfosfato glico se1fosfato a glicose6fosfato e a frutose6fosfato um se gundo inclui as pentoses 5fosfatoribose a ribulose e a xilu lose um terceiro inclui as triosesfosfato dihidroxiacetona fosfato e gliceraldeído3fosfato Os fluxos de metabólitos por esses conjuntos mudam em magnitude e sentido em res posta a mudanças nas condições das plantas variando com o tipo de tecido Os transportadores nas membranas de cada organela movem compostos específicos para dentro e para fora e a regulação desses transportadores presumivelmente influencia o grau com o qual os conjuntos se misturam Durante as horas de luz as triosesfosfato produzidas no tecido foliar pelo ciclo de Calvin saem do cloroplasto para o conjunto citosólico de hexosesfosfato onde são converti das em sacarose para transporte a tecidos não fotossintéti cos Nesses tecidos a sacarose é convertida em amido para armazenamento ou utilizada como fonte de energia por meio da glicólise Em plantas em crescimento as hexosesfosfato também são retiradas do conjunto para a síntese de paredes celulares À noite o amido é metabolizado pela glicólise para prover energia essencialmente como ocorre em organismos não fotossintéticos e o NADPH e a ribose5fosfato são obti dos por meio da via oxidativa das pentosesfosfato RESUMO 205 Integração do metabolismo de carboidratos na célula vegetal c As plantas podem sintetizar açúcares a partir da acetil CoA o produto da quebra de ácidos graxos pelas ações combinadas do ciclo do glioxilato e da gliconeogênese c As vias individuais do metabolismo de carboidratos em plantas se sobrepõem intensamente elas parti lham conjuntos de intermediários comuns incluindo hexosesfosfato pentosesfosfato e triosesfosfato Os transportadores nas membranas dos cloroplastos das mitocôndrias e dos amiloplastos medeiam o movimen to de açúcaresfosfato entre as organelas O sentido do fluxo de metabólitos através desses conjuntos muda do dia para a noite CH2O C SCoA CH3 O C Ácidos graxos Glicerol Glicerol3fosfato NADH 1 H1 NAD1 AcetilCoA Dihidroxiacetona fosfato P CH2OH boxidação Lipase Glicerol cinase CHOH CH2OH CHOH CH2OH ATP ADP CH2OH CH2O P O Glicerol3 fosfato desidrogenase Triacilglicerol O O O O O O H FIGURA 2033 Conversão da porção glicerol dos triacilgliceróis em sacarose nas sementes em germinação O glicerol dos triacilgliceróis é oxidado a dihidroxiacetonafosfato que entra na via gliconeogênica na rea ção da triosefosfatoisomerase Nelson6edbookindb 826 Nelson6edbookindb 826 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 827 Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário ciclo de Calvin 800 plastídeo 800 cloroplasto 800 amiloplasto 800 reação de fixação do carbono 801 ribulose15bifosfato 801 3fosfoglicerato 801 via das pentoses fosfato 801 ciclo redutor das pentoses fosfato 801 plantas C3 802 ribulose15bifosfato carboxilaseoxigenase rubisco 802 rubiscoativase 804 aldolase 805 transcetolase 805 sedoeptulose17 bifosfato 806 ribulose5fosfato 806 reações de assimilação de carbono 809 tiorredoxina 811 ferredoxinatiorredoxina redutase 811 fotorrespiração 812 2fosfoglicolato 812 via do glicolato 813 ciclo oxidativo fotossintético do carbono ciclo C2 815 plantas C4 815 fosfoenolpiruvatocarboxilase 815 enzima málica 816 piruvatofosfatodicinase 817 plantas CAM 818 açúcares nucleotídeos 819 ADPglicose 819 amidosintase 819 sacarose6fosfatosintase 819 frutose26bifosfato 820 ADPglicosepirofosforilase 821 celulosesintase 821 peptideoglicano 823 conjuntos pools de metabólitos 826 Leituras adicionais Referências gerais Blankenship RE 2002 Molecular Mechanisms of Photosynthesis Blackwell Science Oxford De fácil leitura bem ilustrado com a apresentação em nível intermediário de todos os aspectos da fotossíntese incluindo o metabolismo do carbono coberto neste capítulo e as reações promovidas pela luz descritas no Capítulo 19 Buchanan BB Gruissem W Jones RL eds 2002 Biochemistry and Molecular Biology of Plants American Society of Plant Physiology Rockville MD Este livro maravilhoso escrito por autoridades no assunto cobre todos os aspectos da bioquímica e da biologia molecular das plantas Os seguintes capítulos cobrem a síntese e estrutura de carboidratos com maior profundidade Carpita N McCann M Capítulo 2 The cell wall pp 52109 Malkin R Niyogi K Capítulo 12 Fotossíntese p 568629 Dennis DT Blakeley SD Capítulo 13 Metabolismo de Carboidratos p 630675 Siedow JN Day DA Capítulo 14 Respiração e Fotorrespiração p 676729 Heldt HW Piechulla 2010 1997 Plant Biochemistry 4th edn Academic Press New York Um excelente livrotexto de bioquímica vegetal Morton O 2007 Eating the Sun How Plants Power the Planet Harper New York Um relato envolvente sobre as descobertas da fotossíntese no contexto da história da ciência Síntese fotossintética de carboidratos Andersson I Backlund A 2008 Structure and function of rubisco Plant Physiol Biochem 46 275291 Revisão de nível intermediário Bassham JA 2003 Mapping the carbon reduction cycle a personal retrospective Photosynth Res 76 3552 Benson AA 2002 Following the path of carbon in photosynthesis a personal storyhistory of photosynthesis Photosynth Res 73 3149 Calvin M 1989 Forty years of photosynthesis and related activities Photosynth Res 21 316 Cleland WW Andrews TJ Gutteridge S Hartman FC Lorimer GH 1998 Mechanism of rubiscothe carbamate as general base Chem Rev 98 549561 Revisão enfocando especialmente o carbamato no sítio ativo Dietz KJ Link G Pistorius EK Scheibe R 2002 Redox regulation in oxygenic photosynthesis Prog Botany 63 207245 Hartman FC Harpel MR 1994 Structure function regulation and assembly of Dribulose15bisphosphate carboxylase oxygenase Annu Rev Biochem 63 197234 Amido ADPGlicose UDPGlicose Sacarose Glicose2fosfato Glicose6fosfato Frutose6fosfato 6Fosfogluconato Frutose16bifosfato Ribose5fosfato Gliceraldeído3fosfato Dihidroxiacetona fosfato Ribulose5fosfato Xilulose5fosfato FIGURA 2034 Pools de hexosesfosfato pentosesfosfato e trioses fosfato Os compostos em cada pool são prontamente interconversíveis por reações que têm pequenas mudanças de energia livre Quando um componente do pool é temporariamente esgotado um novo equilíbrio é rapidamente estabelecido O movimento dos açúcares fosfato entre os com partimentos intracelulares é limitado transportadores específicos precisam estar presentes em uma membrana de organela Nelson6edbookindb 827 Nelson6edbookindb 827 030414 0746 030414 0746 828 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Horecker BL 2002 The pentose phosphate pathway J Biol Chem 277 4796547971 Jansson C Wullschleger SD Kalluri US Tuskan GA 2010 Phytosequestration carbon biosequestration by plants and the prospects of genetic engineering Bioscience 60 685696 Fluxos globais de carbono e a contribuição da biomassa para o carbono terrestre total Portis AR Jr 2003 Rubisco activase rubiscos catalytic chaperone Photosynth Res 75 1127 Estrutura regulação mecanismo e importância da rubiscoativase Portis AR Jr Parry MAJ 2007 Discoveries in rubisco ribulose 15bisphosphate carboxylaseoxygenase a historical perspective Photosynth Res 94 121143 Raines CA 2003 The Calvin cycle revisited Photosynth Res 75 110 Metabolic control analysis applied to the Calvin cycle Sage RF Way DA Kubien DS 2008 Rubisco rubisco activase and global climate change J Exper Bot 59 15811595 Smith AM Denyer K Martin C 1997 The synthesis of the starch granule Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48 6787 Revisão do papel da ADPglicosepirofosforilase na síntese de amilose e amilopectina em grânulos de amido Spreitzer RJ Salvucci ME 2002 Rubisco structure regulatory interactions and possibilities for a better enzyme Annu Rev Plant Biol 53 449475 Revisão avançada sobre a rubisco e a rubiscoativase Whitney SM Houtz RL Alonso H 2011 Advancing our understanding and capacity to engineer natures CO2sequestering enzyme rubisco Plant Physiol 155 2735 Fotorrespiração e as vias C4 e CAM Ainsworth EA Long SP 2005 What have we learned from 15 years of freeair CO2 enrichment FACE A metaanalytic review of the response of photosynthesis canopy properties and plant production to rising CO2 New Phytol 165 351372 Bauwe H Hagemann M Fernie AR 2010 Photorespiration players partners and origin Trends Plant Sci 15 330336 Black CC Osmond CB 2003 Crassulacean acid metabolism and photosynthesis working the night shift Photosynth Res 76 329341 Douce R Bourguignon J Neuburger M Rébeillé F 2001 The glycine decarboxylase system a fascinating complex Trends Plant Sci 6 167176 Descrição em nível intermediário da estrutura e do mecanismo de reação da enzima Hatch MD 1987 C4 photosynthesis a unique blend of modified biochemistry anatomy and ultrastructure Biochim Biophys Acta 895 81106 Revisão de nível intermediário por um dos descobridores da via C4 Hatch MD Slack SR 1966 Photosynthesis by sugarcane leaves a new carboxylation reaction and the pathway of sugar formation Biochem J 101103111 Descrição clássica da via nomeada por estes autores Langdale JA 2011 C4 cycles past present and future research on C4 photosynthesis Plant Cell 23 38793892 Revisão de nível intermediário Tolbert NE 1997 The C2 oxidative photosynthetic carbon cycle Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48 125 Um relato pessoal fascinante do desenvolvimento da compreensão da fotorrespiração por alguém que foi essencial neste desenvolvimento Biossíntese de amido e sacarose Doblin MS Kurek I JavobWilk D Delmer DP 2002 Cellulose biosynthesis in plants from genes to rosettes Plant Cell Physiol 43 14071420 Huber SC Huber JL 1996 Role and regulation of sucrose phosphate synthase in higher plants Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47 431444 Breve revisão dos fatores que regulam esta importante enzima Keeling PL Myers AM 2010 Biochemistry and genetics of starch synthesis Annu Rev Food Sci Technol 1 271303 Revisão avançada Kotting O Kossmann J Zeeman SC Lloyd JR 2010 Regulation of starch metabolism the age of enlightenment Curr Opin Plant Biol 13 321329 Leloir LF 1971 Two decades of research on the biosynthesis of saccharides Science 172 12991303 Discurso de Leloir ao receber o Nobel incluindo uma discussão do papel dos açúcares nucleotídeos no metabolismo Síntese de celulose e do peptideoglicano Endler A Persson S 2011 Cellulose synthases and synthesis in Arabidopsis MolPlant 4 99211 Joshi CP Mansfield SD 2007 The cellulose paradox simple molecule complex biosynthesis Curr Opin Plant Biol 10 220226 Liepman AH Andrews TJ Gutteridge S Hartman FC Lorimer GH 2010 Arabidopsisa powerful model system for plant cell wall research Plant J 61 11071121 Scheible WR Pauly M 2004 Glycosyltransferases and cell wall biosynthesis novel players and insights Curr Opin Plant Biol 7 285296 Vollmer W Seligman SJ 2009 Architecture of peptidoglycan more data and more models Trends Microbiol 18 5966 Problemas 1 Segregação do metabolismo nas organelas Quais são as vantagens para uma célula vegetal de ter diferentes organe las para realizar diferentes sequências de reações com inter mediários em comum 2 Fases da fotossíntese Quando uma suspensão de al gas verdes é iluminada na ausência de CO2 e então incubada com 14CO2 no escuro 14CO2 é convertido em 14Cglicose por um tempo curto Qual o significado dessa observação com relação ao processo de assimilação de CO2 e como ela está relaciona da às reações na fase clara luz da fotossíntese Por que a conversão de 14CO2 em 14Cglicose cessa depois de um curto período 3 Identificação de intermediárioschave na assimila ção de CO2 Calvin e colaboradores usaram a alga verde uni celular Chlorella para estudar as reações de assimilação de carbono da fotossíntese Eles incubaram 14CO2 com suspensões iluminadas de algas e acompanharam o curso temporal de apa recimento de 14C em dois compostos X e Y sob dois conjuntos de condições Sugira as identidades de X e Y com base em sua compreensão do ciclo de Calvin a Células iluminadas de Chlorella foram cultivadas com CO2 não marcado a luz foi então desligada e 14CO2 foi adicio nado linha tracejada vertical no gráfico abaixo Nessas condi ções X foi o primeiro composto a ficar marcado com 14C Y não estava marcado Nelson6edbookindb 828 Nelson6edbookindb 828 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 829 Radioatividade CO2 luz 0 Tempo 14CO2 escuro Y X b Células iluminadas de Chlorella foram cultivadas com 14CO2 A iluminação foi mantida até que todo o 14CO2 tivesse desaparecido linha tracejada vertical no gráfico abaixo Nes sas condições X tornouse rapidamente marcado mas perdeu sua radioatividade com o tempo enquanto Y tornouse mais radioativo com o tempo Radioatividade 0 Tempo 14CO2 Y X 4 Regulação do ciclo de Calvin Iodoacetato reage irre versivelmente com os gruposSH livres dos resíduos de Cys nas proteínas CH2 O NAD C Enzima inativa O ICH2 O C 1 O S Iodoacetato NAD1 1 2 2 SH Cys Cys HI Preveja que enzimas do ciclo de Calvin seriam inibidas por iodoacetato e explique por que 5 A tiorredoxina na regulação das enzimas do ciclo de Calvin Motohashi e colaboradores usaram tiorredoxina como um anzol para pescar dos extratos vegetais as proteínas ati vadas pela tiorredoxina Para fazer isso eles prepararam uma tiorredoxina mutante na qual um dos resíduos de Cys reativos foi substituído por uma Ser Explique por que essa modifica ção foi necessária para tais experimentos Fonte Motohashi K Kondoh A Stumpp MT Hisabori T 2001 Com prehensive survey of proteins targeted by chloroplast thiore doxin Proc Natl Acad Sci USA 98 1122411229 6 Comparação das vias redutora e oxidativa das pen tosesfosfato A via redutora das pentosesfosfato gera uma série de intermediários idênticos aos da via oxidativa das pen tosesfosfato Capítulo 14 Que papel cada via desempenha nas células onde é ativa 7 Fotorrespiração e respiração mitocondrial Com pare o ciclo fotossintético oxidativo do carbono ciclo C2 também chamado de fotorrespiração com a respiração mi tocondrial que promove a síntese de ATP Por que ambos os processos são denominados respiração Em que parte da célu la eles ocorrem e sob que circunstâncias Qual a via de fluxo de elétrons em cada processo 8 A rubisco e a composição da atmosfera N E Tolbert argumentou que a dupla especificidade da rubisco por CO2 e O2 não é simplesmente um resíduo da evolução em um ambiente pobre em oxigênio Ele sugere que as atividades relativas das atividades de carboxilase e oxigenase da rubisco na verdade estabeleceram e hoje mantêm a razão de CO2 para O2 na at mosfera terrestre Discuta os prós e contras dessa hipótese em termos moleculares e em termos globais De que forma a exis tência de organismos C4 é relevante para a hipótese Fonte Tolbert NE 1994 The role of photosynthesis and photo respiration in regulating atmospheric CO2 and O2 In Regula tion of Atmospheric CO2 and O2 by Photosynthetic Carbon Metabolism Tolbert NE Preiss J eds pp 833 Oxford University Press New York 9 O papel da sedoeptulose17bifosfatase Que efei to na célula ou no organismo pode acarretar um defeito na sedoeptulose17bifosfatase em a um hepatócito humano e b na célula foliar de uma planta verde 10 A via de assimilação do CO2 no milho Se uma planta de milho é iluminada na presença de 14CO2 depois de cerca de 1 segundo mais de 90 de toda a radioatividade incorporada nas folhas são encontrados no C4 do malato do aspartato e do oxaloacetato Apenas após 60 segundos é que o 14C aparece no C1 do 3fosfoglicerato Explique 11 Identificando as plantas CAM De posse de algum 14CO2 e de todas as ferramentas normalmente presentes em um laboratório de pesquisa em bioquímica como você delinearia um experimento simples para determinar se uma planta é uma típica C4 ou uma CAM 12 Química da enzima málica variação em um tema A enzima málica encontrada nas células da bainha vascular das plantas C4 realiza uma reação que tem uma análoga no ciclo do ácido cítrico Qual a reação análoga Explique sua escolha 13 O custo de armazenar glicose como amido Escreva a sequência de etapas e a reação resultante necessária para calcular o custo em moléculas de ATP para a conversão de uma molécula de glicose6fosfato citosólica em amido e de volta em glicose6fosfato Que fração esse custo representa do número máximo de moléculas de ATP disponível para o cata bolismo completo da glicose6fosfato a CO2 e H2O 14 Pirofosfatase inorgânica A enzima pirofosfatase inorgânica contribui para tornar muitas reações biossintéticas que geram pirofosfato inorgânico essencialmente irreversíveis em células Mantendo a concentração de PPi muito baixa a en zima puxa as reações na direção da formação de PPi A sín tese de ADPglicose nos cloroplastos é uma das reações que é puxada nesta direção por este mecanismo No entanto a sínte se de UDPglicose no citosol vegetal que também produz PPi é prontamente reversível in vivo Como você concilia esses dois fatos 15 Regulação da síntese de amido e sacarose A sín tese de sacarose ocorre no citosol e a síntese de amido no Nelson6edbookindb 829 Nelson6edbookindb 829 030414 0746 030414 0746 830 DAVID L NELSON MICHAEL M COX estroma do cloroplasto mesmo assim os dois processos estão intrincadamente equilibrados Que fatores deslocam as rea ções em favor a da síntese de amido e b da síntese de sacarose 16 Regulação da síntese de sacarose Na regulação da síntese de sacarose a partir das triosesfosfato produzidas du rante a fotossíntese 3fosfoglicerato e Pi desempenham papéis críticos ver Figura 2025 Explique por que a concentração desses dois reguladores reflete a velocidade da fotossíntese 17 Sacarose e cáries dentárias A infecção humana mais prevalente em uma escala global é a cárie dentária que decor re da colonização e da destruição do esmalte do dente por uma variedade de microrganismos acidificadores Esses organismos sintetizam e vivem dentro de uma rede de dextranas insolúveis em água chamada de placa dentária composta por polímeros de glicose com ligações a1S6 com muitos pontos de ramifi cação a1S3 A polimerização da dextrana requer sacarose da dieta e a reação é catalisada por uma enzima bacteriana dextranasacaroseglicosiltransferase a Escreva a reação global para a polimerização da dex trana b Além de fornecer um substrato para a formação da pla ca dentária de que forma a sacarose da dieta também provê as bactérias orais com abundante fonte de energia metabólica 18 Diferenças entre plantas C3 e C4 O gênero vegetal Atriplex inclui algumas espécies C3 e algumas espécies C4 A partir dos dados nos gráficos que seguem espécie 1 curva preta espécie 2 curva vermelha identifique qual é uma plan ta C3 e qual é uma planta C4 Justifique sua resposta em termos moleculares que levem em consideração os dados em todas as três curvas Captação de CO2 Intensidade luminosa Captação de CO2 Temperatura da folha Captação de CO2 CO2 no espaço intracelular 19 A via C4 em uma única célula Em plantas C4 típicas a captura inicial do CO2 ocorre em um tipo de célula e as rea ções do ciclo de Calvin em outro ver Figura 2023 Vozne senskaya e colaboradores descreveram uma planta Bienertia cycloptera que cresce em depressões salinas de semideser tos na Ásia Central que mostra as propriedades bioquímicas de uma planta C4 mas que ao contrário das plantas C4 típicas não segrega as reações de fixação de CO2 em dois tipos de cé lulas A PEPcarboxilase e a rubisco estão presentes na mesma célula No entanto as células têm dois tipos de cloroplastos diferentemente localizados Um tipo relativamente pobre em grana tilacoides está confinado à periferia os cloroplastos mais típicos estão agrupados no centro da célula separados dos cloroplastos periféricos por grandes vacúolos Estreitas pontes citosólicas passam através dos vacúolos conectando o citosol periférico e o central Uma micrografia de uma célula de B cycloptera com setas apontando para os cloroplastos periféricos é mostrada abaixo 10 m m Nesta planta onde você esperaria encontrar a PEPcarboxi lase b rubisco e c grânulos de amido Explique suas res postas com um modelo para a fixação de CO2 nestas células C4 Fonte Voznesenskaya EV Fraceschi VR Kiirats O Artyusheva EG Freitag H Edwards GE 2002 Proof of C4 photosynthesis without Kranz anatomy in Biener tia cycloptera Chenopodiaceae Plant J 31 649662 Problema de análise de dados 20 Rubisco de endossimbiontes bacterianos de ani mais de chaminés hidrotermais Chaminés hidrotermais submarinas sustentam ecossistemas notáveis Nessas profun Nelson6edbookindb 830 Nelson6edbookindb 830 030414 0746 030414 0746 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 831 didades extremas não existe luz para sustentar a fotossínte se e mesmo assim as comunidades dessas chaminés pros peram A maior parte de sua produtividade primária ocorre por meio da quimiossíntese realizada por bactérias simbiontes que vivem em órgãos especiais trofossomos de certos ani mas das chaminés A quimiossíntese nessas bactérias envolve um processo praticamente idêntico à fotossíntese O dióxido de carbono é fixado pela rubisco e reduzido a glicose e o ATP e o NADPH necessários são produzidos por processos de transferência de elétrons similares àqueles das reações dependentes de luz da fotossíntese A diferençachave é que na quimiossíntese a energia que promove a transferência de elétrons vem de uma reação química altamente exergônica em vez de vir da luz Bactérias quimiossintéticas diferentes usam reações diferen tes com esse propósito As bactérias encontradas em animais de chaminés hidrotermais geralmente usam a oxidação do H2S abundante na água da chaminé pelo O2 produzindo enxofre elementar Essas bactérias também usam a conversão de H2S em enxofre como fonte de elétrons para a redução quimiossin tética do CO2 a Qual a reação global para a quimiossíntese nessas bac térias Você não precisa escrever a reação balanceada apenas forneça os materiais de origem e os produtos b Em última análise essas bactérias endossimbiontes ob têm sua energia da luz solar Explique como isso ocorre Robinson e colaboradores 2003 exploraram as proprie dades da rubisco do endossimbionte bacteriano do verme tubi forme gigante Riftia pachyptila A rubisco de qualquer fonte catalisa a reação do CO2 Figura 207 ou do O2 Figura 2020 com a ribulose15bifosfato Em geral a rubisco reage mais prontamente com o CO2 do que com o O2 O grau de seletivida de V pode ser expresso na onde V é a velocidade de reação Robinson e colaboradores mediram o valor de V para a rubisco dos endossimbiontes bacterianos Eles purificaram a rubisco dos trofossomos dos vermes tubiformes observaram sua reação com misturas de diferentes razões de O2 e CO2 na presença de 1 3Hribulose15bifosfato e mediram a razão de 3Hfosfoglicerato para 3Hfosfoglicolato c A razão medida de 3Hfosfoglicerato para 3Hfosfogli colato é igual à razão VcarboxilaçãoVoxigenação Explique por quê d Por que a 5 3Hribulose15bifosfato não seria um bom substrato para esse ensaio O V para a rubisco do endossimbionte teve um valor de 86 6 09 e A concentração molar atmosférica de O2 é de 20 e a do CO2 é de cerca de 380 partes por milhão Se o endos simbionte fosse realizar a quimiossíntese sob essas condições atmosféricas qual seria o valor de VcarboxilaçãoVoxigenação f Com base em sua resposta em e você esperaria que o V para a rubisco de uma planta terrestre fosse maior igual ou menor do que 86 Explique seu raciocínio Dois isótopos estáveis de carbono são comumente encon trados no ambiente o mais abundante 12C e o mais raro 13C Todas as enzimas rubisco catalisam a fixação de 12CO2 mais rapidamente do que a de 13CO2 Como resultado o carbono na glicose é levemente mais enriquecido em 12C em compa ração com a composição isotópica do CO2 no ambiente Di versos fatores estão envolvidos nesse uso preferencial do 12CO2 mas um fator é a física fundamental dos gases A tem peratura de um gás está relacionada à energia cinética de suas moléculas A energia cinética é dada por ½ mv 2 onde m é a massa molecular e v é a velocidade Assim na mesma temperatura mesma energia cinética as moléculas de um gás mais leve se moverão mais rapidamente do que aquelas de um gás mais pesado g De que forma isso contribui para a preferência da ru bisco pelo 12CO2 em relação ao 13CO2 Uma das primeiras evi dências convincentes de que os vermes tubiformes hospedei ros estavam obtendo seu carbono fixado dos endossimbiontes foi que a razão 13C 12C nos animais era bem mais próxima da razão nas bactérias do que aquela nos animais marinhos que não habitam as chaminés h Por que essa é uma evidência mais convincente para uma relação endossimbiótica do que estudos mais antigos que simplesmente mostraram a presença de rubisco nas bactérias encontradas nos trofossomos Referência Robinson JJ Scott KM Swanson ST OLeary MH Horken K Tabita FR Cavanaugh CM 2003 Kinetic isotope effect and characterization of form II RubisCO from the chemoautotrophic endosymbionts of the hydrothermal vent tubeworm Riftia pachyptila Limnol Oceanogr 48 4854 Nelson6edbookindb 831 Nelson6edbookindb 831 030414 0746 030414 0746 Nelson6edbookindb 832 Nelson6edbookindb 832 030414 0746 030414 0746 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 211 Biossíntese de ácidos graxos e eicosanoides 833 212 Biossíntese de triacilgliceróis 848 213 Biossíntese de fosfolipídeos de membrana 852 214 Colesterol esteroides e isoprenoides biossíntese regulação e transporte 859 O s lipídeos desempenham uma grande variedade de fun ções celulares algumas delas apenas recentemente reconhecidas Eles são a principal forma de armazena mento de energia na maioria dos organismos e os principais constituintes das membranas celulares Lipídeos especiali zados atuam como pigmentos retinal caroteno cofatores vitamina K detergentes sais biliares transportadores dolicóis hormônios derivados da vitamina D hormônios sexuais mensageiros extracelulares e intracelulares ei cosanoides derivados do fosfatidilinositol e âncoras para proteínas de membrana ácidos graxos covalentemente li gados grupos prenila e fosfatidilinositol A capacidade de sintetizar uma variedade de lipídeos é essencial para todos os organismos Este capítulo descreve as vias biossintéticas para alguns dos lipídeos celulares mais comuns ilustrando as estratégias utilizadas para sintetizar esses produtos inso lúveis em água a partir de precursores hidrossolúveis como o acetato Assim como outras vias biossintéticas essas se quências de reações são endergônicas e redutoras Utilizam ATP como fonte de energia metabólica e um transportador de elétrons reduzido geralmente o NADPH como agente redutor Primeiramente será descrita a biossíntese dos ácidos graxos os principais componentes dos triacilgliceróis e dos fosfolipídeos a seguir será examinada a montagem dos áci dos graxos em triacilgliceróis e nos tipos mais simples de fosfolipídeos de membrana Finalmente será abordada a síntese do colesterol componente de algumas membranas e o precursor de esteroides como os ácidos biliares os hor mônios sexuais e os hormônios adrenocorticais 211 Biossíntese de ácidos graxos e eicosanoides Após a descoberta de que a oxidação dos ácidos graxos ocorre pela remoção oxidativa e sucessiva de unidades com dois átomos de carbono acetilCoA ver Figura 178 os bioquímicos pensaram que a biossíntese dos ácidos graxos poderia ocorrer pela simples inversão dos mesmos passos enzimáticos No entanto como eles vieram a descobrir a biossíntese e a degradação dos ácidos graxos ocorrem por meio de diferentes vias são catalisadas por diferentes gru pos de enzimas e localizamse em compartimentos distintos na célula Além disso a biossíntese requer a participação de um intermediário de três carbonos a malonilCoA que não está envolvido na degradação dos ácidos graxos CH2 C O C SCoA O MalonilCoA O Primeiro será apresentada a via de síntese dos ácidos graxos a seguir será dedicada atenção à regulação da via e à biossíntese dos ácidos graxos de cadeia mais longa dos ácidos graxos insaturados e dos seus derivados eico sanoides A malonilCoA é formada a partir de acetilCoA e bicarbonato A formação de malonilCoA a partir de acetilCoA é um processo irreversível catalisado pela acetilCoAcarbo xilase A enzima bacteriana contém três subunidades po lipeptídicas distintas Figura 211 em células animais todas as três atividades fazem parte de um único polipeptí deo multifuncional As células vegetais têm os dois tipos de acetilCoAcarboxilase Em todos os casos a enzima con tém um grupo prostético a biotina covalentemente ligado por uma ligação amida ao grupo amino de um resíduo de Lys presente em um dos três polipeptídeos ou domínios da molécula da enzima A reação em duas etapas catalisada por essa enzima é muito semelhante a outras reações de carboxilação dependente de biotina como aquelas catali sadas pela piruvatocarboxilase ver Figura 1617 e pela propionilCoAcarboxilase ver Figura 1712 Primeira mente um grupo carboxil derivado do bicarbonato HCO3 é transferido para a biotina em uma reação dependente de ATP O grupo biotinila age como transportador temporário de CO2 transferindoo para a acetilCoA na segunda etapa gerando malonilCoA 21 Biossíntese de Lipídeos Nelson6ed21indd 833 Nelson6ed21indd 833 020514 1728 020514 1728 834 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A síntese dos ácidos graxos ocorre em uma sequência de reações que se repetem Em todos os organismos as longas cadeias de carbono dos ácidos graxos são construídas por uma sequência de rea ções repetitivas em quatro etapas Figura 212 catalisa das por um sistema coletivamente conhecido como ácido graxosintase Um grupamento acila saturado produzido em cada série de reações em quatro etapas tornase o subs trato da condensação subsequente com um grupo malonila ativado Em cada uma das passagens pelo ciclo a cadeia do grupo acila graxo aumenta em dois carbonos Na sequência anabólica redutora tanto o cofator trans portador de elétrons quanto os grupos ativadores diferem daqueles do processo catabólico oxidativo Lembrese que na boxidação NAD 1 e FAD atuam como aceptores de elétrons e o grupo ativador é o grupo tiol SH da coenzima A ver Figura 178 Por outro lado o agente redutor na via sintéti ca é o NADPH e os grupos ativadores são dois grupos SH diferentes ligados à enzima como descrito na seção a seguir Existem duas variantes principais da enzima ácido gra xosintase a ácido graxosintase I AGS I encontrada em vertebrados e em fungos e a ácido graxosintase II AGS II encontrada em vegetais e bactérias A AGS I encontrada em vertebrados consiste em uma única cadeia polipeptídica multifuncional Mr 240000 A enzima AGS I de mamíferos é o protótipo Sete sítios ativos para reações distintas estão presentes em domínios separados Figura 213a O po lipeptídeo de mamíferos funciona como homodímero Mr 480000 As subunidades parecem agir independentemen te Quando todos os sítios ativos de uma subunidade são ina tivados por mutação a síntese dos ácidos graxos é apenas levemente reduzida A enzima AGS I encontrada em levedu ras e outros fungos é um pouco diferente Ela consiste em dois polipeptídeos multifuncionais que formam um comple xo com uma arquitetura distinta do sistema em vertebrados Figura 213b Três dos sete sítios ativos necessários são encontrados na subunidade a e quatro na subunidade b Com os sistemas AGS I a síntese dos ácidos graxos leva a um único produto e não são liberados intermediários Quando o comprimento da cadeia atinge 16 carbonos esse produto palmitato 160 ver Tabela 101 deixa o ciclo Os carbonos C16 e C15 do palmitato são derivados dos átomos de carbono dos grupos metil e carboxil respectiva mente de uma acetilCoA utilizada diretamente para iniciar o sistema Figura 214 os outros átomos de carbono da cadeia são originados da acetilCoA via malonilCoA A AGS II de vegetais e bactérias é um sistema disso ciado cada etapa da síntese é catalisada por uma enzima distinta e livremente difusível Os intermediários também são difusíveis e podem ser desviados para outras vias como a síntese de ácido lipoico Ao contrário da AGS I a enzima AGS II gera uma variedade de produtos inclusive ácidos graxos saturados de vários comprimentos assim como in saturados ramificados e hidróxiácidos graxos Um sistema AGS II também é encontrado nas mitocôndrias de vertebra dos A discussão a seguir terá como foco a enzima AGS I de mamíferos A ácido graxosintase de mamíferos tem múltiplos sítios ativos Os múltiplos domínios da AGS I de mamíferos atuam como enzimas distintas porém ligadas O sítio ativo de cada enzi FIGURA 211 A reação da acetilCoAcarboxilase A acetilCoAcarboxila se contém três regiões funcionais a proteína carreadora de biotina em cinza a biotinacarboxilase que ativa CO2 pela sua ligação a um átomo de nitrogênio no anel de biotina em uma reação dependente de ATP ver Figura 1617 e a transcarboxilase que transfere o CO2 ativado sombreado em verde da biotina para a acetilCoA produzindo malonilCoA O braço longo e flexível da biotina transporta o CO2 ativado da região da biotinacarboxilase para o sítio ativo da transcarboxilase A enzima ativa em cada etapa está sombreada em azul 1 O C N H H N S H N C O N O C NH NH S C O C O O C SCoA C O CH3 SCoA C O O O CH2 N O C O C HN NH S C O NH HN NH S C O C O O Braço da biotina Cadeia lateral da Lys 1 ATP HCO3 ADP 1 P i Biotina carboxilase Biotina carboxilase Proteína carreadora de biotina Proteína carreadora de biotina Proteína carreadora de biotina Proteína carreadora de biotina Transcarboxilase Transcarboxilase AcetilCoA MalonilCoA Nelson6ed21indd 834 Nelson6ed21indd 834 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 835 S O C CH2 C O S O H CH2 CH3 C C O O H2O S CH3 C O O CH2 C CO2 S CH3 C O OH CH2 C H NADP1 S CH3 C O C C H CH3 CH2 S HS HS HS NADP1 NADPH 1 H1 NADPH 1 H1 HS b a ❶ ❷ ❹ ❸ Grupo malonila Grupo acetila primeiro grupo acila Ácido graxosintase Condensação Redução Desidratação Redução Grupo acila saturado aumentado em dois carbonos FIGURA 212 Adição de dois carbonos a uma cadeia acil graxo em crescimento uma sequência de quatro etapas Cada grupo malonila e acetila ou acilas maiores é ativado por um tioéster que os une à ácido graxo sintase um sistema multienzimático descrito no texto ➊ A condensação de um grupo acila ativado um grupo acetil da acetilCoA é o primeiro grupo acila e dois carbonos derivados da malonilCoA com a eliminação de CO2 do grupo malonila alonga a cadeia acila em dois carbonos O mecanismo da primeira etapa dessa reação está mostrado para ilustrar o papel da descarbo xilação em facilitar a condensação O produto bcetônico dessa condensação é então reduzido em três etapas seguintes praticamente idênticas às reações de boxidação mas na sequência inversa ➋ o grupo bcetônico é reduzido a um álcool ➌ a eliminação de H2O cria uma ligação dupla e ➍ a ligação dupla é reduzida formando o grupo acil graxo saturado correspondente a b MAT MAT KR KR ER ER DH DH KS KS KS MAT DH ER KR ACP TE Disco Cúpula Cúpula FIGURA 213 A estrutura do sistema da ácido graxosintase tipo I Mostradas aqui são estruturas em baixa resolução dos sistemas enzimáticos a de mamífero suíno dímero derivado do PDB ID 2CF2 e b de fungo derivado do PDB IDs 2UV9 2UVA 2UVB e 2UVC a Todos os sítios ativos no sistema de mamíferos estão localizados em diferentes domínios de uma única e longa cadeia polipeptídica As atividades enzimáticas distintas são bcetoacilACPsintase KS malonilacetilCoAACPtransferase MAT b hidroxiacilACPdesidratase DH enoilACPredutase ER e bcetoacilACP redutase KR ACP é a proteína carreadora de grupos acila O arranjo linear dos domínios no polipeptídeo está representado no painel mais abaixo O sétimo domínio TE é uma tioesterase que libera o palmitato produzido pela ACP quando a síntese é finalizada Os domínios ACP e TE estão desor denados na estrutura cristalina e consequentemente não estão mostrados nesta estrutura b Na estrutura AGS I do fungo Thermomyces lanuginosus os mesmos sítios ativos são divididos entre duas cadeias polipetídicas multi funcionais que atuam em conjunto Seis cópias de cada polipeptídeo são en contradas no complexo heterododecamérico Um disco de seis subunidades b que inclui ACP assim como os sítios ativos KS e KR é encontrado no centro do complexo No disco três subunidades são encontradas em uma face e três na outra Nos dois lados do disco são formadas cúpulas por trímeros de subunidades b contendo os sítios ativos ER e DH assim como dois domínios com sítios ativos análogos a MAT na enzima de mamíferos Os domínios de um de cada tipo de subunidade estão coloridos de acordo com as cores dos sítios ativos da enzima de mamíferos em a Nelson6ed21indd 835 Nelson6ed21indd 835 070414 1425 070414 1425 836 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ma é encontrado em um domínio separado dentro do poli peptídeo maior Ao longo do processo de síntese dos ácidos graxos os intermediários permanecem covalentemente li gados como tioésteres a um de dois grupos tiol Um ponto de ligação é o grupo SH de um resíduo de Cys em um dos domínios da sintase bcetoacilACPsintase KS o outro ponto é o grupo SH de uma proteína transportadora de grupos acila domínio distinto do mesmo polipeptídeo A hidrólise dos tioésteres é altamente exergônica e a ener gia liberada ajuda a tornar termodinamicamente favoráveis dois passos distintos ➊ e ➎ na Figura 216 da síntese dos ácidos graxos condensação A proteína transportadora de grupos acila ACP do inglês acyl carrier protein é o transportador que man tém o sistema unido A ACP de Escherichia coli é uma proteína pequena Mr 8860 contendo o grupo prostético 49fosfopanteteína Figura 215 compare esse grupo com o ácido pantotênico e com a porção bmercaptoetilami na da coenzima A na Figura 838 Acreditase que o grupo prostético 49fosfopanteteína da ACP de E coli atue como um braço flexível segurando a cadeia acila do ácido graxo em crescimento unida à superfície do complexo da ácido graxosintase enquanto transporta os intermediários da rea ção do sítio ativo de uma enzima para a próxima A ACP de mamíferos tem função semelhante e o mesmo grupo prosté tico como foi visto no entanto ela está inserida como um domínio em um polipeptídeo multifuncional muito maior A ácido graxosintase recebe grupos acetila e malonila Antes que as reações de condensação que constroem a ca deia do ácido graxo possam iniciar os dois grupos tióis do complexo enzimático devem ser carregados com os grupa mentos acila corretos Figura 216 parte superior Pri FIGURA 214 O processo global da síntese do palmitato A cadeia aci la graxo cresce em unidades de dois carbonos doadas pelo malonato ativa do com perda de CO2 a cada adição O grupo acetila inicial está sombreado em amarelo C1 e C2 do malonato estão sombreados em vermelhoclaro e o carbono liberado como CO2 está sombreado em verde Após a adição de cada unidade de dois carbonos reduções convertem a cadeia em cresci mento em ácido graxo saturado de quatro seis e em seguida oito carbonos e assim por diante O produto final é o palmitato 160 C O CH3 CH2 C O O CO2 1 CH3 4H1 4e CH2 CH2 O S C O S C COO O CH2 S CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 C S C O O CH2 S CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C S C O O CH2 S CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C HS 1 S HS COO COO COO CO2 1 4H1 4e CO2 1 4H1 4e Mais quatro adições Ácido graxosintase Palmitato FIGURA 215 A proteína transportadora de grupos acila ACP O grupo prostético é a 49fosfopanteteína covalentemente ligada ao grupo hidroxila de um resíduo de Ser da ACP A fosfopanteteína contém ácido pan totênico uma vitamina do complexo B também encontrada na molécula da coenzima A Seu grupo SH é o local de entrada de grupos malonila durante a síntese dos ácidos graxos O CH2 C O CH3 SH O P HN O CH2 O C CH3 CHOH CH2 C O HN CH2 CH2 ACP Grupos malonila são esterificados ao grupo SH 49Fosfo panteteína Ácido pantotênico Cadeia lateral da Ser CH2 Nelson6ed21indd 836 Nelson6ed21indd 836 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 837 CoASH CH3 C O SCoA CoASH CH2 C O SCoA C O 2O S CO2 CH2 C O CH3 O C S CH2 C O CH CH3 OH S CH C O CH CH3 S C O CH3 CH2 CH2 NADP1 NADPH 1 H1 H2O NADP1 NADPH 1 H1 MalonilCoA S S CH2 C O C O 2O CH3 O C HS HS SH S CH3 C O S CH2 C O CH3 CH2 ACP KS HS ACP HS ACP ACP ACP HS ACP HS ACP HS ACP DH KR MAT ER Nova carga da ACP com outro grupo malonila MAT ❻ Deslocamento do grupo butiril para a Cys na bcetoacilACPsintase KS ❺ Redução do grupo bcetônico KR ❷ Redução da ligação dupla ER ❹ Desidratação DH ❸ Condensação KS ❶ bCetoacilACP redutase EnoilACP redutase bHidroxiacilACP desidratase bCetoacilACP sintase AcetilCoA MalonilacetilCoA ACPtransferase DH KR MAT KS ER KR DH KS ER MAT Complexo da ácido graxosintase carregado com um grupo acetil e um grupo malonil DH KR MAT KS ER DH KR MAT KS ER bCetobutirilACP DH KR MAT KS ER bHidroxibutirilACP transD2ButenoilACP MAT KS DH KR ER KS MAT DH KR ER ButirilACP FIGURA 216 Sequência de eventos durante a síntese dos ácidos gra xos O complexo AGS I de mamíferos está representado esquematicamen te com os domínios catalíticos coloridos como na Figura 213 Cada domínio da longa cadeia polipeptídica representa uma das seis atividades enzimáti cas do complexo organizadas em uma grande forma de S apertado A pro teína transportadora de grupos acila ACP não está resolvida na estrutura cristalográfica mostrada na Figura 213 mas está acoplada ao domínio KS O braço fosfopanteteína da ACP termina em um grupo SH Após o primeiro painel a enzima colorida é a que agirá na etapa seguinte Como na Figura 214 o grupo acetil inicial está sombreado em amarelo C1 e C2 do malo nato estão sombreados em cor salmão e o carbono liberado como CO2 está sombreado em verde As etapas ➊ a ➍ estão descritas no texto Nelson6ed21indd 837 Nelson6ed21indd 837 070414 1425 070414 1425 838 DAVID L NELSON MICHAEL M COX meiramente o grupo acetila da acetilCoA é transferido para a ACP em uma reação catalisada pelo domínio malo nilacetilCoAACPtransferase MAT na Figura 216 do polipeptídeo multifuncional O grupo acetila é então transferido para o grupo SH da Cys da bcetoacilACP sintase KS A segunda reação a transferência do grupo malonila da malonilCoA para o grupo SH da ACP tam bém é catalisada pela malonilacetilCoAACPtransferase No complexo sintase carregado os grupos acetila e maloni la são ativados para o processo de alongamento da cadeia As primeiras quatro etapas desse processo serão considera das agora em detalhes os números das etapas referemse à Figura 216 Etapa ➊ Condensação A primeira reação na formação da cadeia de um ácido graxo é uma condensação de Claisen clássica envolvendo os grupos acetila e malonila ativados formando acetoacetilACP grupo acetoacetil ligado à ACP pelo grupo SH da fosfopanteteína simultanea mente uma molécula de CO2 é produzida Nesta reação catalisada pela bcetoacilACPsintase o grupamento ace til é transferido do grupo SH da Cys da enzima para o grupo malonila ligado ao grupo SH da ACP tornandose a unidade de dois carbonos metilterminal do novo grupo acetoacetila O átomo de carbono do CO2 formado nessa reação é o mesmo carbono originalmente introduzido na malonilCoA a partir do HCO3 pela reação da acetilCoAcarboxilase Figura 211 Assim a ligação covalente do CO2 durante a biossíntese dos ácidos graxos é apenas transitória ele é removido assim que cada unidade de dois carbonos é adi cionada Por que as células têm o trabalho de adicionar CO2 para formar o grupo malonila a partir do grupo acetila apenas para perder o CO2 durante a formação de acetoacetato O uso de grupos malonila ativados em vez de grupos acetil é o que torna as reações de condensação termodinamicamente favoráveis O carbono metileno C2 do grupo malonila si tuado entre os carbonos da carbonila e da carboxila forma um bom nucleófilo Na etapa de condensação etapa ➊ a descarboxilação do grupo malonila facilita o ataque nucle ofílico do carbono metileno sobre a ligação tioéster entre o grupo acetil e a bcetoacilACPsintase deslocando o gru po SH da enzima Essa é uma condensação de Claisen clássica ver Figura 134 O acoplamento da condensação à descarboxilação do grupo malonila torna o processo glo bal altamente exergônico Uma sequência semelhante de carboxilaçãodescarboxilação facilita a formação de fosfo enolpiruvato a partir de piruvato na gliconeogênese ver Figura 1418 Por meio do uso de grupos malonila ativados na síntese dos ácidos graxos e de acetato ativado em sua degradação a célula torna os dois processos termodinamicamente favo ráveis apesar de um ser efetivamente o inverso do outro A energia extra necessária para tornar a síntese dos ácidos graxos favorável é fornecida pelo ATP utilizado na síntese de malonilCoA a partir de acetilCoA e HCO3 Figura 211 Etapa ➋ Redução do grupo carbonila A acetoacetilACP forma da na etapa de condensação sofre agora redução do gru po carbonil em C3 formando DbhidroxibutirilACP Essa reação é catalisada pela bcetoacilACPredutase KR e o doador de elétrons é o NADPH Observe que o grupo Dbhidroxibutiril não tem a mesma forma estereoisomérica que o intermediário Lbhidroxiacil na oxidação dos ácidos graxos ver Figura 178 Etapa ➌ Desidratação Os elementos da água são agora re movidos dos carbonos C2 e C3 da DbhidroxibutirilACP formando uma ligação dupla no produto transD 2bu tenoilACP A enzima que catalisa essa desidratação é a bhidroxiacilACPdesidratase DH Etapa ➍ Redução da ligação dupla Finalmente a ligação dupla da transD 2butenoilACP é reduzida saturada forman do butirilACP pela ação da enzima enoilACPredutase ER mais uma vez NADPH é o doador de elétrons As reações da ácido graxosintase são repetidas para formar palmitato A produção de acilACP saturada com quatro carbonos marca a conclusão de uma rodada por meio do complexo da ácido graxosintase Na etapa ➎ o grupo butirila é transfe rido do grupo SH da fosfopanteteína da ACP para o grupo SH de uma Cys da bcetoacilACPsintase que sustenta rá inicialmente o grupo acetil Figura 216 Para dar início ao próximo ciclo de quatro reações que alonga a cadeia em mais dois átomos de carbono etapa ➏ outro grupo malo nila ligase ao grupo SH da fosfopanteteína da ACP agora desocupado Figura 217 A condensação ocorre à medi da que o grupo butirila atuando como o grupo acetil no pri meiro ciclo é ligado aos dois átomos de carbono do grupo malonilACP com a consequente perda de CO2 O produto dessa condensação é um grupo acila com seis carbonos covalentemente ligado ao grupo SH da fosfopanteteína Seu grupo bcetônico é reduzido nas três etapas seguintes do ciclo da sintase formando o grupo acila saturado exata mente como no primeiro ciclo de reações neste caso for mando o produto de seis carbonos Sete ciclos de condensação e redução produzem o gru po palmitoila de 16 carbonos saturados ainda ligado à ACP Por razões ainda não bem compreendidas o alongamento da cadeia pelo complexo da sintase geralmente é interrom pido neste ponto e o palmitato é liberado da ACP pela ação de uma atividade hidrolítica tioesterase TE da proteína multifuncional É possível considerar em duas etapas a reação global para a síntese do palmitato a partir de acetilCoA Primeiro a formação de sete moléculas de malonilCoA 7 AcetilCoA 1 7 CO2 1 7 ATP 7 malonilCoA 1 7ADP 1 7Pi 211 em seguida sete ciclos de condensação e redução AcetilCoA 1 7 malonilCoA 1 14NADPH 1 14H 1 palmitato 1 7CO2 1 8 CoA 1 14NADP 1 1 6H2O 212 Observe que apenas seis moléculas de água são produzidas porque uma é utilizada para hidrolisar a ligação tioéster en Nelson6ed21indd 838 Nelson6ed21indd 838 070414 1425 070414 1425 PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA DE LEHNINGER 839 de NADPH sao necessarias para reduzir 0 grupo aceto ea C ligagéo dupla Em eucariotos nao fotossintéticos existe um custo adi oe cional para a sintese dos acidos graxos ja que a acetilCoA ACP é gerada na mitocdndria e deve ser transportada para 0 Ci ccttyomybes tosol Como sera visto essa etapa extra consome dois ATP oe por molécula de acetilCoA transportada aumentando o Grupo butirila MA custo energético da sintese dos acidos graxos para trés ATP por unidade de dois carbonos O O ocH S SSCoA A sintese de acidos graxos ocorre no citosol MalonilCoA de muitos organismos mas nos cloroplastos CoASH das plantas Na maioria dos eucariotos superiores 0 complexo da aci 0 do graxosintase encontrado exclusivamente no citosol I SN Figura 218 assim como as enzimas biossintéticas dos o yo CHa CS YN nucleotideos dos aminoacidos e da glicose Esta localizagao O x segrega os processos sintéticos das reacgdes de degradagao ae a an uma vez que muitas delas ocorrem na matriz mitocondrial Existe uma separacao correspondente dos cofatores trans portadores de elétrons utilizados no anabolismo geralmen te processos redutivos e aqueles utilizados no catabolismo Condensacao L co geralmente oxidativos 2 Em geral o NADPH 6 0 transportador de elétrons para as reacées anabdlicas e o NAD atua nas reacoes cataboli O cas No citosol de hepatécitos a relacaéo NADPHNADP i she CH é muito alta aproximadamente 75 gerando um ambiente i fortemente redutor para a sintese redutora dos acidos gra xos e de outras biomoléculas A relagao citosélica NADH ACP NAD 6 muito menor apenas cerca de 8 X 10 de modo HS que 0 catabolismo oxidativo da glicose dependente de NAD pode ocorrer no mesmo compartimento e ao mesmo tempo que a sintese dos acidos graxos A relacaéo NADH NAD é muito maior na mitocondria do que no citosol de BCetoacilACP vido ao fluxo de elétrons para o NAD a partir da oxidacao FIGURA 217 Inicio da segunda rodada do ciclo da sintese dos aci de acidos graxos aminoacidos piruvato acetilCoA Essa dos graxos O grupo butirila esta ligado ao grupo SH da Cys O grupo relagao alta entre NADHNAD na mitocondria favorece malonila que esta entrando é primeiro acoplado ao grupo SH da fosfo redugao do oxigénio pela cadeia respiratoria panteteina A seguir na etapa de condensacao todo o grupo butirila ligado Nos hepatocitos e adipdcitos NADPH citosdlico é am ao SH da Cys trocado pelo grupo carboxila do residuo de malonila que plamente gerado pela via das pentosesfosfato ver Figura perdida como CO em verde Esta etapa é andloga a etapa na Figura 1422 e pela enzima mAalica Figura 219a Ja a enzi 216 O produto um grupo Bcetoacila de seis carbonos contém agora qua ma méalica ligada ao NADP que opera na via de fixacao do tro carbonos derivados da malonilCoA e dois derivados da acetilCoA que iniciou a reagdo O grupo Bcetoacila passa entao pelas etapas a como carbono em plantas Cy ver Figura 2023 tem uma fun na Figura 216 cao diferente O piruvato produzido na reagao representa da na Figura 219a entra novamente na mitocéndria Nos hepatécitos e em glandulas maméarias de animais lactentes o NADPH necessario para a biossintese dos acidos graxos tre o produto palmitato e a enzima O processo global a fornecido principalmente pela via das pentosesfosfato soma das Equacées 211 e 212 é Figura 219b 8 AcetilCoA 7 ATP 14NADPH 14H Nas células fotossintéticas dos vegetais a sintese dos palmitato 8 CoA 7ADP 7P 14NADP 6HO acidos graxos nao ocorre no citosol e sim no estroma dos 213 cloroplastos Figura 218 Isso faz sentido ja que o NADPH oe Ls é produzido nos cloroplastos pelas reagdes dependentes de Assim a biossintese dos acidos graxos como o palmitato luz da fotossintese requer acetilCoA e o fornecimento de energia quimica de duas formas o potencial de transferéncia de grupos do ATP luz e o poder redutor do NADPH O ATP é necessario para li qe 1 gar o CO a acetilCoA formando malonilCoA as moléculas HO NADP 30 NADPH H 840 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O acetato é transportado para fora da mitocôndria como citrato Em eucariotos não fotossintéticos praticamente toda a acetilCoA utilizada na síntese dos ácidos graxos é formada na mitocôndria a partir da oxidação do piruvato e do ca tabolismo dos esqueletos de carbono dos aminoácidos A acetilCoA gerada da oxidação dos ácidos graxos não é uma fonte significativa de acetilCoA para a biossíntese dos áci dos graxos em animais pelo fato de que as duas vias são reciprocamente reguladas como descrito a seguir A membrana interna da mitocôndria é impermeável a acetilCoA de modo que um transportador indireto transfe re os equivalentes do grupo acetila pela membrana interna Figura 2110 A acetilCoA intramitocondrial reage pri meiro com oxaloacetato formando citrato uma reação do ci clo do ácido cítrico catalisada pela enzima citratosintase ver Figura 167 O citrato então atravessa a membrana interna pelo transportador de citrato No citosol a cli vagem do citrato pela citratoliase regenera acetilCoA e oxaloacetato em uma reação dependente de ATP O oxaloa cetato não pode retornar à matriz mitocondrial diretamente já que não existe um transportador de oxaloacetato Em vez disso a malatodesidrogenase citosólica reduz o oxaloaceta to a malato o qual pode retornar à matriz mitocondrial pelo transportador malatoacetoglutarato na troca por citrato Na matriz o malato é reoxidado a oxaloacetato completan do o ciclo No entanto a maior parte do malato produzido no citosol é utilizada para gerar NADPH citosólico pela ação da enzima málica Figura 219a O piruvato produzido é transportado para a mitocôndria pelo transportador de pi ruvato Figura 2110 sendo convertido em oxaloacetato na matriz pela enzima piruvatocarboxilase O ciclo resultante consome dois ATP pela citratoliase e pela piruvatocarbo xilase para cada molécula de acetilCoA entregue para a síntese de ácidos graxos Após a clivagem do citrato para gerar acetilCoA a conversão dos quatro carbonos remanes centes em piruvato e CO2 pela enzima málica gera aproxima damente a metade do NADPH necessário para a síntese de ácidos graxos A via das pentosesfosfato fornece o restante de NADPH necessário A biossíntese de ácidos graxos é precisamente regulada Quando uma célula ou um organismo tem combustível me tabólico mais que suficiente para suprir suas necessidades energéticas geralmente o excesso é convertido em ácido graxo e estocado como lipídeos como os triacilgliceróis A reação catalisada pela acetilCoAcarboxilase é a etapa limitante na biossíntese de ácidos graxos e essa enzima é um ponto importante de regulação Nos vertebrados o Células animais células de leveduras Mitocôndria Retículo endoplasmático Citosol Cloroplastos Peroxissomos Células vegetais Não ocorre oxidação de ácidos graxos Oxidação de ácidos graxos Produção de acetilCoA Síntese de corpos cetônicos Alongamento de ácidos graxos Produção de NADPH via das pentosesfosfato enzima málica NADPHNADP1 alta Síntese de isoprenoides e esteróis estágios iniciais Síntese de ácidos graxos Produção de NADPH ATP NADPHNADP1 alta Síntese de ácidos graxos Oxidação de ácidos graxos Síntese de fosfolipídeos Síntese de esteróis últimos estágios Alongamento de ácidos graxos Dessaturação de ácidos graxos H2O2 Catalase peroxidase H2O2 H2O FIGURA 218 Localização subcelular do metabolismo lipídico As cé lulas de leveduras e de vertebrados diferem das células dos vegetais superio res na compartimentalização do metabolismo lipídico A síntese dos ácidos graxos ocorre em compartimentos em que NADPH está disponível para a síntese redutora ou seja onde a relação NADPHNADP 1 é alta o citosol nos animais e nas leveduras e os cloroplastos nas plantas Os processos es critos em vermelho são descritos neste capítulo Enzima málica Via das pentosesfosfato CHOH COO2 CH2 COO2 C CO2 O C 1 H3 COO2 Malato Piruvato NADP1 Glicose6 fosfato Ribulose5 fosfato 1 H1 NADPH NADP1 NADPH a b NADP1 NADPH FIGURA 219 Produção de NADPH Duas vias para a produção de NADPH catalisada pela a enzima málica e b via das pentosesfosfato Nelson6ed21indd 840 Nelson6ed21indd 840 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 841 principal produto da síntese de ácidos graxos a palmitoil CoA é um inibidor por retroalimentação dessa enzima o citrato é um ativador alostérico Figura 2111a ele vando a Vmáx O citrato desempenha uma função central na alteração do metabolismo celular de consumo de com bustível metabólico oxidação para o de armazenamen to de combustível na forma de ácidos graxos Quando as concentrações de acetilCoA e ATP mitocondriais aumen tam o citrato é transportado para fora da mitocôndria ele tornase então tanto o precursor citosólico de acetilCoA quanto um sinal alostérico para a ativação da acetilCoA carboxilase Ao mesmo tempo o citrato inibe a atividade da fosfofrutocinase1 ver Figura 1516 reduzindo o flu xo de carbono para a glicólise A acetilCoAcarboxilase também é regulada por mo dificação covalente A fosforilação promovida pelas ações dos hormônios glucagon e adrenalina inativa a enzima e reduz sua sensibilidade à ativação por citrato dessa for ma reduzindo a velocidade da síntese de ácidos graxos Na sua forma ativa desfosforilada a acetilCoAcarboxilase polimerizase em longos filamentos Figura 2111b a fos forilação é acompanhada pela dissociação das subunidades monoméricas e perda da atividade A acetilCoAcarboxilase de plantas e bactérias não é regulada por citrato ou por um ciclo de fosforilaçãodesfos forilação A enzima vegetal é ativada por um aumento do pH do estroma e da Mg 21 que ocorre com a iluminação da planta ver Figura 2017 As bactérias não utilizam tria cilgliceróis para armazenar energia Em E coli a principal função da síntese de ácidos graxos é fornecer precursores para a síntese de lipídeos de membrana a regulação desse processo é complexa envolvendo nucleotídeos da guanina como ppGpp que coordenam o crescimento celular com a formação da membrana ver Figuras 839 e 2822 NADH H NADH H Oxaloacetato Malato Malato NAD NADP NAD ADP Pi ADP Pi ATP ATP CO2 CO2 CoASH CoASH Piruvato Piruvato NADPH H Citrato Membrana interna Membrana externa Matriz Citosol Citrato AcetilCoA múltiplas fontes Oxaloacetato Citratosintase Citratoliase Malato desidrogenase Malato desidrogenase Enzima málica Piruvato carboxilase Síntese de ácidos graxos Transportador de piruvato Transportador de malatoa cetoglutarato AcetilCoA Transportador de citrato FIGURA 2110 Lançadeira para a transferência de grupos acetil da mitocôndria para o citosol A membrana mitocondrial externa é livre mente permeável a todos esses compostos O piruvato derivado do catabo lismo dos aminoácidos na matriz mitocondrial ou da glicose por glicólise no citosol é convertido em acetilCoA na matriz Os grupos acetil saem da mi tocôndria como citrato no citosol eles são liberados na forma de acetilCoA para a síntese dos ácidos graxos O oxaloacetato é reduzido a malato que pode retornar à matriz mitocondrial onde é convertido em oxaloacetato O principal destino do malato citosólico é a oxidação pela enzima málica ge rando NADPH citosólico o piruvato produzido retorna à matriz mitocondrial Nelson6ed21indd 841 Nelson6ed21indd 841 070414 1425 070414 1425 842 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Além da regulação momento a momento da atividade enzimática essas vias são reguladas no que se refere à ex pressão gênica Por exemplo quando os animais ingerem um excesso de certos ácidos graxos poliinsaturados a ex pressão de genes que codificam uma série de enzimas lipo gênicas no fígado é suprimida A regulação desses genes é mediada por uma família de receptores proteicos nucleares chamados PPAR descritos em maior detalhe no Capítulo 23 ver Figura 2342 Se a síntese de ácidos graxos e a boxidação ocorressem simultaneamente os dois processos constituiriam um ciclo fútil desperdiçando energia Já foi visto ver Figura 1713 que a boxidação é bloqueada por malonilCoA que inibe a enzima carnitinaaciltransferase I Assim durante a sín tese de ácidos graxos a produção do primeiro intermediá rio a malonilCoA desliga a boxidação no nível do sistema transportador na membrana interna da mitocôndria Esse mecanismo de controle ilustra outra vantagem da separa ção das vias sintéticas e degradativas em compartimentos celulares distintos Os ácidos graxos saturados de cadeia longa são sintetizados a partir do palmitato O palmitato produto principal do sistema da ácido graxo sintase nas células animais é o precursor de outros ácidos graxos de cadeia longa Figura 2112 Ele deve ser alon gado formando estearato 180 ou ácidos graxos satura dos ainda maiores pela adição de grupos acetil pela ação do sistema de alongamento de ácidos graxos presente no retículo endoplasmático RE liso e na mitocôndria O sistema de alongamento mais ativo do RE alonga a cadeia de 16 carbonos da palmitoilCoA em dois átomos de car bono formando estearoilCoA Embora diferentes sistemas enzimáticos estejam envolvidos e a coenzima A seja o trans portador de grupos acila em lugar da ACP o mecanismo de alongamento no RE é idêntico àquele utilizado na síntese do palmitato doação de dois carbonos a partir da malonil CoA seguindose redução desidratação e nova redução do produto saturado de 18 carbonos a estearoilCoA A dessaturação dos ácidos graxos requer uma oxidase de função mista O palmitato e o estearato servem como precursores dos dois ácidos graxos monoinsaturados mais comuns nos te cidos animais o palmitoleato 161D 9 e o oleato 181D 9 os dois ácidos graxos contêm uma única ligação dupla cis entre C9 e C10 ver Tabela 101 A ligação dupla é intro a b Citratoliase AcetilCoA carboxilase Glucagon e adrenalina desencadeiam fosforilação inativação Citrato AcetilCoA MalonilCoA PalmitoilCoA 400 A 400 A 400 A FIGURA 2111 Regulação da síntese dos ácidos graxos a Nas células de vertebrados tanto a regulação alostérica como a modificação covalen te dependente de hormônios influenciam o fluxo dos precursores para a formação de malonilCoA Nos vegetais a acetilCoAcarboxilase é ativada pelas variações na Mg 21 e no pH que acompanham a iluminação não mos tradas aqui b Os filamentos da acetilCoAcarboxilase de hepatócito de galinha a forma ativa desfosforilada como vistos ao microscópio eletrônico Palmitato 160 Alongamento Estearato 180 Dessaturação Oleate 181D9 Dessaturação Apenas em plantas Linoleato 182D912 Dessaturação Apenas em plantas Dessaturação aLinolenato 183D91215 Outros ácidos graxos poliinsaturados gLinolenato 183D6912 Eicosatrienoato 203D81114 Alongamento Araquidonato 204D581114 Dessaturação Dessaturação Palmitoleato 161D9 Alongamento Ácidos graxos saturados de cadeia mais longa FIGURA 2112 Vias de síntese de outros ácidos graxos O palmitato é o precursor do estearato e dos ácidos graxos saturados de cadeias mais longas assim como dos ácidos graxos monoinsaturados palmitoleato e oleato Os mamíferos são incapazes de converter oleato em linoleato ou em alinolena to sombreado em cor salmão que são portanto necessários na dieta como ácidos graxos essenciais A conversão de linoleato em outros ácidos graxos poliinsaturados e em eicosanoides está representada nesta figura Os ácidos graxos insaturados são simbolizados pela indicação do número de carbonos e do número e posição de ligações duplas como na Tabela 101 Nelson6ed21indd 842 Nelson6ed21indd 842 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 843 duzida na cadeia do ácido graxo por uma reação oxidati va catalisada pela acilCoA graxodessaturase Figura 2113 uma oxidase de função mista Quadro 211 Dois substratos diferentes o ácido graxo e o NADPH so frem oxidação simultaneamente perdendo dois elétrons O caminho do fluxo dos elétrons inclui um citocromo ci tocromo b5 e uma flavoproteína citocromo b5redutase ambos localizados no RE liso assim como a acilCoA graxo dessaturase Nos vegetais o oleato 181D 9 é produzido por uma estearoilACPdessaturase EAD que utiliza a ferrodoxina reduzida como doadora de elétrons no estroma dos cloroplastos A EAD de animais camundongos tem um papel im portante no desenvolvimento da obesidade e da resistência a insulina que frequentemente acompanha a obesidade e precede o desenvolvimento de diabetes melito tipo 2 O ca mundongo tem quatro isoenzimas EAD1 a EAD4 das quais EAD1 é a melhor entendida Sua síntese é induzida por áci dos graxos saturados da dieta e também pela ação de SRE BP e RHX dois reguladores proteicos do metabolismo de lipídeos que ativam a transcrição de enzimas envolvidas na síntese de lipídeos descrita na Seção 214 Camundongos contendo formas mutantes da EAD1 são resistentes a obe sidade induzida pela dieta e não desenvolvem diabetes em condições que causariam tanto obesidade quanto diabetes em camundongos portadores de EAD1 Os hepatócitos dos mamíferos podem facilmente intro duzir ligação dupla na posição D 9 dos ácidos graxos mas não podem introduzir ligações duplas adicionais entre C10 e a extremidade metila Assim os mamíferos não podem sin tetizar linoleato 182D 912 ou alinolenato 183D 91215 No entanto os vegetais podem sintetizar ambos as dessa turases que introduzem ligações duplas nas posições D 12 e D 15 estão localizadas no RE e nos cloroplastos As enzimas do RE não atuam sobre ácidos graxos livres mas sobre um fosfolipídeo a fosfatidilcolina que contém pelo menos um oleato ligado ao glicerol Figura 2114 Ambas plantas e bactérias devem sintetizar os ácidos graxos poliinsatura dos para garantir a fluidez da membrana em temperaturas reduzidas Como eles são precursores necessários para a sínte se de outros produtos o linoleato e o alinolenato são 2H2O O CH3 CH2 CH SCoA CH2m 1 1 1 O2 Cit b5 redutase FADH2 Cit b5 redutase FAD 2 Cit b5 Fe21 2 Cit b5 Fe31 2H1 NADP1 CH2n CH2 O CH3 C SCoA CH2m CH2n C CH NADPH 1 H1 AcilCoA graxo dessaturase AcilCoA graxo saturado AcilCoA graxo monoinsaturado FIGURA 2113 Transferência de elétrons no processo de dessatura ção dos ácidos graxos em vertebrados As setas azuis mostram o cami nho dos elétrons na medida em que dois substratos diferentes acilCoA graxo e NADPH são oxidados pelo oxigênio molecular Essas reações ocor rem na face luminal do RE liso Uma via semelhante mas com transportado res de elétrons diferentes ocorre em vegetais CH O C O 2 O P 1 Dessaturase 1 CH2 O C O O O NCH33 CH2 H 2 CH O C CH O C O 2 O P 1 9 1 18 CH2 O C O O O NCH33 CH2 H 2 CH O C Fosfatidilcolina contendo oleato 181D9 Fosfatidilcolina contendo linoleato 182D912 Fosfatidilcolina contendo alinolenato 183D91215 9 Dessaturase CH O C O 2 O P 1 1 12 CH2 O C O O O NCH33 CH2 H 2 CH O C 9 18 12 18 15 FIGURA 2114 Ação das dessaturases de vegetais Nas plantas as des saturases oxidam o oleato ligado à fosfatidilcolina produzindo ácidos graxos poliinsaturados Alguns dos produtos são liberados da fosfatidilcolina por hidrólise Nelson6ed21indd 843 Nelson6ed21indd 843 070414 1425 070414 1425 844 DAVID L NELSON MICHAEL M COX QUADRO 211 MEDICINA Oxidases de função mista enzimas do citocromo P450 e overdose de drogas Neste capítulo são abordadas diversas enzimas que ca talisam reações de oxidaçãoredução em que o oxigênio molecular é um participante A estearoilCoA dessatura se EAD que introduz uma ligação dupla em uma cadeia acil graxo ver Figura 2113 é uma dessas enzimas A nomenclatura das enzimas que catalisam as rea ções desse tipo frequentemente é confusa para os es tudantes Oxidase é o nome geral para enzimas que catalisam oxidações em que o oxigênio molecular é o receptor de elétrons no entanto os átomos de oxigênio não aparecem no produto oxidado A enzima que intro duz uma ligação dupla na acilCoA graxo durante a oxi dação dos ácidos graxos nos peroxissomos ver Figura 1714 é uma oxidase desse tipo um segundo exemplo é a citocromooxidase da cadeia transportadora de elé trons mitocondrial ver Figura 1914 No primeiro caso a transferência de dois elétrons para H2O produz peró xido de hidrogênio H2O2 no segundo dois elétrons re duzem ½ O2 a H2O Muitas oxidases são flavoproteínas mas não todas elas As oxigenases catalisam reações oxidativas em que átomos de oxigênio são diretamente incorporados na mo lécula do produto formando um novo grupo hidroxila ou carboxila por exemplo As dioxigenases catalisam rea ções em que os dois átomos de oxigênio do O2 são incor porados na molécula do produto orgânico Exemplo de dioxigenase é a triptofano23dioxigenase que catalisa a abertura do anel de cinco membros do triptofano no catabolismo desse aminoácido Quando essa reação ocor re na presença de 18O2 o átomo de oxigênio isotópico é encontrado nos dois grupos carbonila do produto mos trado em vermelho COO CH2 H NH3 CH 1 O2 H NH C O CH COO NH3 1 Triptofano23 dioxigenase NFormilquinurenina N C O CH2 Triptofano As monoxigenases mais comuns e mais complexas em suas ações catalisam reações em que apenas um dos dois átomos de oxigênio do O2 é incorporado no produto orgânico o outro sendo reduzido a H2O As monoxige nases necessitam de dois substratos para funcionarem como redutores dos dois átomos de oxigênio do O2 O substrato principal aceita um dos dois átomos de oxigê nio e um cossubstrato fornece átomos de hidrogênio para reduzir o outro átomo de oxigênio a H2O A equação geral da reação para as monoxigenases é AH 1 BH2 1 OO AOH 1 B 1 H2O onde AH é o substrato principal e BH2 é o cossubstra to Como a maioria das monoxigenases catalisa reações em que o substrato principal tornase hidroxilado elas também são chamadas de hidroxilases Algumas vezes também são chamadas de oxidases de função mista ou oxigenases de função mista para indicar que oxidam dois substratos diferentes simultaneamente Observe aqui o uso de oxidase o qual viola a definição geral dada acima Existem diferentes classes de monoxigenases depen dendo da natureza do cossubstrato Algumas utilizam os nucleotídeos de flavina FMNH2 ou FADH2 outras usam NADH ou NADPH e há as que utilizam o acetoglutarato como cossubstrato A enzima que hidroxila o anel de fe nila da fenilalanina formando tirosina é uma monoxige nase para a qual a tetrahidrobiopterina serve como cos substrato ver Figura 1823 Essa é a enzima defeituosa na doença genética humana chamada de fenilcetonúria As mais numerosas e mais complexas reações de monoxigenação são aquelas que usam um tipo de he meproteína chamada de citocromo P450 Da mesma forma que a citocromooxidase mitocondrial enzimas contendo um domínio citocromo P450 podem reagir com O2 e ligar monóxido de carbono mas elas podem ser diferentes da citocromooxidase já que o complexo das suas formas reduzidas com o monóxido de carbo no exibe intensa absorção de luz a 450 nm por isso o nome P450 As enzimas do citocromo P450 catalisam reações de hidroxilação em que um substrato orgânico RH é hidro xilado a ROH incorporando um átomo de oxigênio do O2 o outro átomo de oxigênio é reduzido a H2O pelos equivalentes redutores fornecidos pelo NADH ou pelo NADPH mas que geralmente são transferidos para o ci tocromo P450 por uma proteína ferroenxofre A Figura Q1 mostra um esquema simplificado da ação do citocro mo P450 NADPH Oxidado Reduzido RH Reduzido Oxidado NADP1 O2 H2O ROH Citocromo P450 redutase FeS Citocromo P450 FIGURA Q1 Nelson6ed21indd 844 Nelson6ed21indd 844 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 845 ácidos graxos essenciais para os mamíferos eles de vem ser obtidos dos vegetais presentes na dieta Uma vez ingerido o linoleato pode ser convertido em alguns outros ácidos poliinsaturados especialmente o glinolenato o eicosatrienoato e o araquidonato eicosatetraenoato e todos eles podem ser formados apenas a partir do linole ato Figura 2112 O araquidonato 204D 581114 é um precursor essencial de lipídeos regulatórios os eicosanoi des Os ácidos graxos de 20 carbonos são sintetizados a partir do linoleato e alinolenato por reações de alon gamento de ácidos graxos análogas àquelas descritas na página 842 Os eicosanoides são formados a partir de ácidos graxos poliinsaturados de 20 carbonos Os eicosanoides são uma família de moléculas de sinaliza ção biológica muito potente que atuam como mensageiros de curta distância agindo sobre os tecidos próximos às cé lulas que os produzem Em resposta a hormônios ou a outro estímulo a fosfolipase A2 presente na maioria dos tipos de células de mamíferos ataca os fosfolipídeos de membrana liberando araquidonato do carbono do meio do glicerol As enzimas do RE liso então convertem o araquidonato em prostaglandinas iniciando com a formação de prosta glandina H2 PGH2 o precursor imediato de muitas outras prostaglandinas e de tromboxanos Figura 2115a As duas reações que levam à PGH2 são catalisadas por uma enzima bifuncional a cicloxigenase COX também chamada de prostaglandina H2sintase Na primeira das duas etapas a atividade de cicloxigenase introduz oxigênio molecular convertendo araquidonato em PGG2 A segunda etapa catalisada pela atividade de peroxidase da COX con verte PGG2 em PGH2 Os mamíferos têm duas isoenzimas da prostaglandina H2sintase a COX1 e a COX2 Elas têm funções distintas mas as sequências de aminoácidos são muito semelhantes 60 a 65 de identidade de sequência e mecanismos de reação similares nos seus dois centros catalíticos A COX1 é responsável pela síntese das prostaglandinas que regulam a secreção da mucina gástrica e a COX2 pelas prostaglan dinas que controlam inflamação dor e febre A dor pode ser aliviada pela inibição da COX2 O pri meiro fármaco amplamente comercializado com esse propósito foi a aspirina acetilsalicilato Figura 2115b O nome aspirina a de acetil e spir de Spirsaüre a palavra alemã para os salicilatos preparados a partir da planta Spi raea ulmaria apareceu em 1899 quando o fármaco foi introduzido no mercado pela companhia Bayer A aspirina inativa irreversivelmente a atividade de cicloxigenase das Existe uma grande família de proteínas contendo P450 de dois tipos gerais aquelas altamente específi cas para um único substrato como as enzimas típicas e aquelas com sítios de ligação mais promíscuos que aceitam uma variedade de substratos geralmente seme lhantes na hidrofobicidade No córtex da suprarrenal por exemplo um citocromo P450 específico participa da hidroxilação de esteroides gerando os hormônios adrenocorticais ver Figura 2149 Existem dúzias de enzimas contendo P450 que atuam sobre substratos muito específicos nas vias biossintéticas dos hormônios esteroides e dos eicosanoides As enzimas do citocromo P450 com especificidades mais amplas são importantes na hidroxilação de muitas drogas distintas como barbi turatos e outros xenobióticos substâncias estranhas ao organismo particularmente se são hidrofóbicos e rela tivamente insolúveis O carcinógeno ambiental benzoa pireno encontrado na fumaça do cigarro sofre hidroxi lação dependente do citocromo P450 durante sua desto xificação A hidroxilação de xenobióticos algumas vezes combinada com o acoplamento de um composto polar tal como o ácido glicurônico ao grupo hidroxila os tornam mais solúveis em água e permite a sua excreção na urina A hidroxilação e a glicuronidação inativa a maioria dos fármacos e a velocidade com que isso ocorre determina por quanto tempo uma determinada dose de um fármaco permanece no sangue em doses terapêuticas Os huma nos diferem em seus níveis de enzimas de metabolização de farmácos por dois motivos pela sua genética e o fato de que exposição prévia a substratos pode induzir a sín tese de níveis maiores das enzimas P450 em determi nado indivíduo O etanol e os barbitúricos compartilham uma enzima P450 O consumo excessivo de álcool por longo prazo induz a síntese dessa enzima P450 Como o barbiturato é inativado e eliminado mais rápido são ne cessárias doses maiores da droga para alcançar o mesmo efeito terapêutico Se um indivíduo ingerir essa dose de barbiturato maior que o comum e também ingerir álcool a competição entre o álcool e o barbiturato pela quanti dade limitada de enzima significa que tanto o álcool como o barbiturato serão eliminados mais lentamente Os al tos níveis resultantes desses dois depressores do sistema nervoso central podem ser letais Complicações seme lhantes surgem quando um indivíduo ingere dois fárma cos que são inativados pela mesma enzima P450 cada farmáco aumenta a dose efetiva da outra por reduzir sua inativação Em consequência disso é essencial para mé dicos e farmacêuticos conhecer sobre todos os medica mentos e suplementos prescritos a um paciente assim como conhecer o histórico de alcoolismo tabagismo ou exposição a toxinas ambientais As reações descritas neste capítulo catalisadas por oxidases de função mista são aquelas envolvidas na des saturação de acilCoA graxo Figura 2113 na síntese de leucotrienos Figura 2116 na síntese de plasmalo gênios Figura 2130 na conversão de esqualeno em colesterol Figura 2137 e na síntese de hormônios este roides Figura 2149 Nelson6ed21indd 845 Nelson6ed21indd 845 070414 1425 070414 1425 846 DAVID L NELSON MICHAEL M COX duas isoenzimas da COX por acetilar um resíduo de Ser bloqueando os sítios ativos dessas enzimas Consequente mente a síntese de prostaglandinas e tromboxanos é inibi da O ibuprofeno outro fármaco antiinflamatório não es teroide AINE Figura 2115b amplamente utilizado inibe o mesmo par de enzimas No entanto a inibição da COX1 pode resultar em efeitos colaterais indesejáveis como irri tação estomacal e condições ainda mais sérias Na década de 1990 com a resolução da estrutura cristalográfica da COX1 e da COX2 foram desenvolvidos compostos AINE com maior especificidade para a COX2 para uso em tera pias avançadas de dores graves Três desses fármacos fo ram aprovados para uso em todo mundo rofecoxibe Vio xx valdecoxibe Bextra e celecoxibe Celebrex Figura 2115c Lançados no final da década de 1990 os novos compostos foram inicialmente um sucesso para as indús trias farmacêuticas que os produziam No entanto o entu siasmo tornouse preocupação quando artigos científicos e estudos clínicos ligaram o uso dos fármacos ao aumento no risco de ataque cardíaco e acidente vascular cerebral COO O OH 2O2 COO O COO O OOH O CH3 Ser O C COO O CH3 Ser O OH C COO O OH CH3 CH2 COO CH3 CH CH CH3 CH CH3 COO O CH3 Fosfolipídeo contendo araquidonato Fosfolipase A2 Lisofosfolipídeo Araquidonato 204 581114 Atividade de cicloxigenase da COX Atividade de peroxidase da COX PGG2 PGH2 Outras prostaglandinas a b Tromboxanos COX acetilada inativada COX Aspirina acetilsalicilato Salicilato Ibuprofeno Naproxeno aspirina ibuprofeno c O O Rofecoxibe Vioxx S O H3C O CH3 H2N N O Valdecoxibe Bextra S O O Celecoxibe Celebrex CF3 N N H3C H2N S O O FIGURA 2115 A via cíclica do araquidonato até prostaglandinas e tromboxanos a Após a liberação do araquidonato dos fosfolipídeos pela ação da enzima fosfolipase A2 as atividades de cicloxigenase e peroxi dase da COX também chamada de prostaglandina H2sintase catalisam a produção de PGH2 o precursor de outras prostaglandinas e tromboxanos b A aspirina inibe a primeira reação da via por acetilação de um resíduo de Ser essencial na enzima O ibuprofeno e o naproxeno inibem a mes ma etapa provavelmente por mimetizarem a estrutura do substrato ou um intermediário da reação c Os inibidores específicos da cicloxigenase COX2 desenvolvidos para o alívio da dor ver texto O Vioxx foi retirado do mercado em 2004 e Bextra em 2005 devido aos seus efeitos colaterais no sistema cardiovascular Nelson6ed21indd 846 Nelson6ed21indd 846 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 847 As razões para o problema ainda não estão claras mas al guns pesquisadores especulam que os inibidores da COX2 alteram o delicado balanço entre a produção do hormônio prostaciclina que dilata os vasos sanguíneos previne a coagulação sanguínea e é reduzida pelos inibidores da COX2 e a produção de tromboxanos gerados pela via en volvendo a COX1 que ajuda a formar coágulos sanguí neos O Vioxx foi retirado do mercado em 2004 e o Bextra foi retirado logo após Desde o início de 2012 o Celebrex ainda está no mercado mas está sendo usado com cuidado aumentado A tromboxanosintase presente nas plaquetas san guíneas trombócitos converte PGH2 em tromboxano A2 do qual outros tromboxanos são derivados Figura 2115a Os tromboxanos induzem a constrição dos vasos sanguíneos e a agregação plaquetária etapas iniciais na coagulação sanguínea Baixas doses de aspirina ingeridas regularmente reduzem a probabilidade de ataques cardía cos e de acidentes vasculares cerebrais pela redução da produção de tromboxanos Os tromboxanos como as prostaglandinas contêm um anel de cinco ou seis átomos a via a partir do araquidonato que leva a essas duas classes de compostos é algumas ve zes chamada de via cíclica para distinguila da via linear que leva do araquidonato aos leucotrienos que são com postos lineares Figura 2116 A síntese dos leucotrienos inicia com a ação de diversas lipoxigenases que catalisam a incorporação do oxigênio molecular ao araquidonato Essas enzimas encontradas em leucócitos no coração no cére bro nos pulmões e no baço são oxidases de função mista da família do citocromo P450 Quadro 211 Os diversos leucotrienos diferem na posição do grupo peróxido introdu zido pelas lipoxigenases Essa via linear a partir do araqui donato ao contrário da via cíclica não é inibida pela aspiri na ou outros compostos AINE Os vegetais também produzem importantes moléculas de sinalização a partir dos ácidos graxos Como nos animais uma etapachave na iniciação da sinalização envolve a ativa ção de uma fosfolipase específica Em plantas o ácido graxo liberado e que funcionará como substrato é o alinolenato Uma lipoxigenase catalisa então a primeira etapa de uma via que converte linolenato em jasmonato uma substância conhecida por ter função de sinalização na defesa contra insetos na resistência a patógenos fúngicos e na maturação do pólen O jasmonato ver Figura 1233 também interfere na germinação das sementes no crescimento das raízes e no desenvolvimento dos frutos e das sementes RESUMO 211 Biossíntese de ácidos graxos e eicosanoides c Os ácidos graxos saturados de cadeia longa são sinteti zados a partir de acetilCoA por um sistema citosólico de seis atividades enzimáticas e uma proteína trans portadora de grupos acila ACP Existem dois tipos de enzimas ácido graxosintase A AGS I encontrada em vertebrados e fungos consiste em polipeptídeos multi funcionais A AGS II é um sistema dissociado encontra do em bactérias e plantas Ambas contêm dois tipos de grupos SH fornecido pela fosfopanteteína da ACP o outro por um resíduo de Cys da bcetoacilACPsintase que funcionam como transportadores de intermediários acil graxo c MalonilACP formado a partir de acetilCoA transpor tada para fora da mitocôndria e CO2 condensase com o grupo acetil ligado ao SH da Cys gerando acetoa cetilACP com a liberação de CO2 Esta etapa é seguida por redução do derivado Dbhidroxiacila desidratação produzindo transD 2acilACP insaturada e redução a butirilACP NADPH é o doador de elétrons para ambas as reduções A síntese dos ácidos graxos é regulada na etapa de formação de malonilCoA c Mais seis moléculas de malonilACP reagem sucessi vamente na extremidade carboxila da cadeia do ácido graxo em crescimento formando palmitoilACP o pro duto final da reação da ácido graxosintase O palmitato livre é liberado por hidrólise c O palmitato pode ser alongado a estearato com 18 car bonos Palmitato e estearato podem ser dessaturados gerando palmitoleato e oleato respectivamente pela ação de oxidases de função mista 1 14 5 8 5 COO Araquidonato LTD4 HOO 5Hidroperoxieicosatetraenoato 5HPETE 12Hidroperoxieicosatetraenoato 12HPETE OOH Leucotrieno A 4 LTA 4 LTC 4 20 Outros leucotrienos 12 COO Lipoxigenase COO 11 O2 Lipoxigenase Múltiplas etapas Múltiplas etapas O2 FIGURA 2116 A via linear do araquidonato até os leucotrienos Nelson6ed21indd 847 Nelson6ed21indd 847 070414 1425 070414 1425 848 DAVID L NELSON MICHAEL M COX c Os mamíferos não podem sintetizar linoleato e devem obtêlo a partir de fontes vegetais eles convertem o li noleato exógeno em araquidonato o composto precur sor dos eicosanoides prostaglandinas tromboxanos e leucotrienos uma família de moléculas de sinalização muito potentes A síntese das prostaglandinas e dos tromboxanos é inibida pelos AINE que atuam sobre a atividade de cicloxigenase da prostaglandina H2sintase 212 Biossíntese de triacilgliceróis A maior parte dos ácidos graxos sintetizados ou ingeridos por um organismo possui um de dois destinos a incorpo ração em triacilgliceróis para o armazenamento de energia metabólica ou a incorporação nos componentes fosfolipídi cos da membrana A divisão entre esses destinos alternati vos depende das necessidades momentâneas do organismo Durante o crescimento rápido a síntese de novas mem branas requer a produção de fosfolipídeos de membrana quando um organismo dispõe de suprimento abundante de alimento mas não está crescendo ativamente ele desvia a maior parte dos ácidos graxos para a síntese das gorduras de reserva As duas vias iniciam no mesmo ponto a forma ção de ésteres acil graxo de glicerol Esta seção estuda a formação de triacilgliceróis e a sua regulação bem como a produção de glicerol3fosfato no processo de gliceroneo gênese Os triacilgliceróis e os glicerofosfolipídeos são sintetizados a partir dos mesmos precursores Os animais são capazes de sintetizar e estocar grandes quantidades de triacilgliceróis para serem utilizados poste riomente como combustível ver Quadro 171 Os humanos estocam apenas algumas centenas de gramas de glicogênio no fígado e nos músculos quantidade suficiente apenas para suprir as necessidades energéticas do corpo por 12 horas Por outro lado a quantidade total de triacilglicerol armazenado em um homem de 70 kg de constituição média é de cerca de 15 kg o suficiente para suprir as necessidades energéticas basais por aproximadamente 12 semanas ver Tabela 235 Os triacilgliceróis dispõem do maior conteúdo energético de todos os nutrientes estocados mais de 38 kJg Sempre que os carboidratos são ingeridos em excesso à capacidade de armazenamento de glicogênio esse exces so é convertido em triacilgliceróis e armazenado no teci do adiposo Os vegetais também sintetizam triacilgliceróis como combustível rico em energia e eles são armazenados principalmente nos frutos nas nozes e nas sementes Nos tecidos animais os triacilgliceróis e os glicerofosfo lipídeos como a fosfatidiletanolamina compartilham dois precursores acilCoA graxo e Lglicerol3fosfato e diversas etapas biossintéticas A grande maioria do glicerol3fosfato é derivada do intermediário glicolítico dihidroxiacetona fosfato DHAP pela ação da glicerol3fosfatodesidro genase citosólica ligada ao NAD no fígado e nos rins uma pequena parte do glicerol3fosfato também é produzida a partir do glicerol pela ação da glicerolcinase Figura 21 17 Os outros precursores dos triacilgliceróis são acilCoA graxos formadas a partir dos ácidos graxos pelas acilCoA O C P CHOH HO SCoA CH2OH Glicose Glicólise Dihidroxiacetona fosfato Glicerol3fosfato desidrogenase Glicerol cinase Glicerol CoASH LGlicerol3fosfato Aciltransferase Ácido fosfatídico O CH2 CH2OH C CH2 O O P O O O CH2OH C CH2 O P O O O H H ADP CH2OH R2 C O ATP ATP R2 AMP R1 SCoA COO CoASH AcilCoA sintetase AcilCoA sintetase ATP C O 1 R1 CoASH R1 C O O C O CH2 O O O Aciltransferase PP AMP R2 COO 1 CoASH PP i i 1 H1 NAD1 NADH FIGURA 2117 Biossíntese do ácido fosfatídico Um grupo acil graxo é ativado pela formação de acilCoA graxo sendo então transferido para uma ligação éster com o Lglicerol3fosfato formado em qualquer uma das duas vias mostradas O ácido fosfatídico está mostrado aqui com a estereo química correta no C2 da molécula do glicerol O produto intermediário com apenas um grupo acilgraxo esterificado é o ácido lisofosfatídico Para economizar espaço nas figuras subsequentes e na Figura 2114 ambos os grupos acil graxos dos glicerofosfolipídeos e todos os três grupos acila dos triacilgliceróis são mostrados projetandose para a direita Nelson6ed21indd 848 Nelson6ed21indd 848 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 849 sintetases as mesmas enzimas responsáveis pela ativação dos ácidos graxos na boxidação ver Figura 175 A primeira etapa na biossíntese dos triacilgliceróis é a acilação dos dois grupos hidroxila livres do Lglicerol3 fosfato por duas moléculas de acilCoA graxo gerando diacilglicerol3fosfato mais comumente chamado de ácido fosfatídico ou fosfatidato Figura 2117 O ácido fosfatídico está presente apenas em quantidades muito pe quenas na célula mas é um intermediário central na bios síntese dos lipídeos ele pode ser convertido tanto em um triacilglicerol quanto em um glicerofosfolipídeo Na via de síntese de triacilgliceróis o ácido fosfatídico é hidrolisado pela ácido fosfatídicofosfatase também chamado li pina formando 12diacilglicerol Figura 2118 Os dia cilgliceróis são então convertidos em triacilgliceróis por transesterificação com um terceiro acilCoA graxo A biossíntese de triacilgliceróis nos animais é regulada por hormônios Em humanos a quantidade de gordura corpórea permanece relativamente constante por longos períodos embora pos sam ocorrer pequenas variações em curto espaço de tempo à medida que a ingestão calórica flutua Os carboidratos as gorduras ou as proteínas ingeridos em excesso à necessida de energética são armazenados na forma de triacilgliceróis que podem ser mobilizados para o fornecimento de energia capacitando o organismo a suportar períodos de jejum A biossíntese e a degradação dos triacilgliceróis são reguladas de modo que a via favorecida depende das fontes metabólicas e das necessidades a um dado momento A velocidade da biossíntese dos triacilgliceróis é profunda mente alterada pela ação de diversos hormônios A insulina por exemplo promove a conversão de carboidrato em tria cilgliceróis Figura 2119 Pessoas com diabetes melito grave devido à falha na secreção ou na ação da insulina além de não serem capazes de utilizar glicose de modo apropriado falham também em sintetizar ácidos graxos a partir de carboidratos ou aminoácidos Se o diabetes não é tratado essas pessoas apresentam velocidade aumentada na oxidação de gorduras e na formação de corpos cetônicos Capítulo 17 e portanto perdem peso Um fator adicional no balanço entre biossíntese e de gradação de triacilgliceróis é que cerca de 75 de todos os ácidos graxos liberados pela lipólise são reesterifica dos formando triacilgliceróis em vez de serem utiliza dos como combustível Essa relação persiste mesmo em condições de jejum quando o metabolismo energético é desviado da utilização de carboidratos para a oxidação de ácidos graxos Parte dessa reciclagem dos ácidos graxos acontece no tecido adiposo com a reesterificação ocor rendo antes da liberação na corrente sanguínea parte ocorre em um ciclo sistêmico pelo qual os ácidos graxos O C CH P CH2 R2 O C O R1 O O O CH2 O Glicerofosfolipídeo Ligação do grupo polar serina colina etanolamina etc Ácido fosfatídicofosfatase lipina O C CH CH2 R3 O C O R1 O O CH2 O Triacilglicerol C CH CH2 R3 O C O R1 O CH2 O 12Diacilglicerol OH O Grupo polar R2 C O SCoA CoASH Acil transferase O C CH P O CH2 R2 O C O R1 O O O CH2 O Ácido fosfatídico C R2 FIGURA 2118 O ácido fosfatídico na biossíntese de lipídeos O ácido fosfatídico é o precursor tanto dos triacilgliceróis quanto dos glicerofosfoli pídeos Os mecanismos para a ligação do grupo polar durante a síntese dos fosfolipídeos serão descritos posteriormente nesta seção Triacilgliceróis Proteínas da dieta Aminoácidos Carboidratos da dieta Glicose insulina AcetilCoA Ácidos graxos aumentado no diabetes Corpos cetônicos acetoacetato Dbhidroxibutirato acetona FIGURA 2119 Regulação da síntese de triacilgliceróis pela insulina A insulina estimula a conversão dos carboidratos e das proteínas da dieta em gordura As pessoas com diabetes melito precisam de insulina ou são insensíveis a ela Isso resulta em diminuição da síntese de ácidos graxos e a acetilCoA proveniente do catabolismo dos carboidratos e das proteínas é desviada para a produção de corpos cetônicos Pessoas com cetose grave exalam cheiro de acetona de modo que essa condição é às vezes confundi da com embriaguez p 959 Nelson6ed21indd 849 Nelson6ed21indd 849 070414 1425 070414 1425 850 DAVID L NELSON MICHAEL M COX livres são transportados ao fígado reciclados em triacilgli ceróis exportados mais uma vez para o sangue o trans porte de lipídeos no sangue é discutido na Seção 214 e captados novamente pelo tecido adiposo após sua libe ração a partir dos triacilgliceróis pela lipase lipoproteica extracelular Figura 2120 ver também Figura 171 O fluxo por esse ciclo dos triacilgliceróis entre o tecido adiposo e o fígado pode ser bastante lento quando outros combustíveis estão disponíveis e a liberação dos ácidos graxos do tecido adiposo é limitada mas como descrito anteriormente a proporção de ácidos graxos liberados que são reesterificados permanece mais ou menos cons tante em cerca de 75 em todas as condições metabó licas Assim o nível de ácidos graxos livres no sangue reflete tanto a velocidade de liberação dos ácidos graxos quanto o balanço entre a síntese e a degradação dos tria cilgliceróis no tecido adiposo e no fígado Quando a mobilização dos ácidos graxos é necessária para satisfazer as necessidades energéticas sua liberação do tecido adiposo é estimulada pelos hormônios glucagon e adrenalina ver Figuras 173 e 1713 Simultaneamente esses sinais hormonais diminuem a velocidade da glicólise e aumentam a velocidade da gliconeogênese no fígado pro vendo glicose para o encéfalo como descrito de forma mais elaborada no Capítulo 23 O ácido graxo liberado é capta do por diversos tecidos incluindo os músculos onde ele é oxidado para a geração de energia A maior parte do ácido graxo captado pelo fígado não é oxidada mas é reciclada a triacilglicerol e retorna ao tecido adiposo A função do aparentemente ciclo fútil do triacilglicerol ciclos fúteis são discutidos no Capítulo 15 não é bem com preendida No entanto emergem algumas possibilidades à medida que se aprende mais a respeito de como o ciclo do triacilglicerol é mantido pelo metabolismo em dois órgãos distintos e como ele é regulado de forma coordenada Por exemplo o excesso da capacidade do ciclo do triacilglicerol o ácido graxo reconvertido a triacilglicerol e não oxidado como combustível poderia representar uma reserva de energia na corrente sanguínea durante o jejum a qual seria mais rapidamente mobilizada em uma emergência do tipo luta ou fuga do que a mobilização da energia armazenada na forma de triacilglicerol A reciclagem constante dos triacilgliceróis no tecido adiposo mesmo durante o jejum faz surgir uma segunda pergunta qual é a fonte do glicerol3fosfato necessário para esse processo Como descrito anteriormente a gli cólise é inibida nessas condições pela ação do glucagon e da adrenalina de modo que pouco DHAP está disponível e o glicerol liberado durante a lipólise não pode ser direta mente convertido em glicerol3fosfato no tecido adiposo já que essas células não possuem a enzima glicerolcinase Figura 2117 Assim como é produzida uma quantidade suficiente de glicerol3fosfato A resposta está em uma via descoberta há mais de três décadas mas que recebeu pouca atenção até recentemente uma via intimamente li gada ao ciclo do triacilglicerol e em sentido mais amplo ao balanço entre o metabolismo dos ácidos graxos e dos carboidratos O tecido adiposo gera glicerol3fosfato por meio da gliceroneogênese A gliceroneogênese é uma versão mais curta da gliconeo gênese partindo de piruvato a DHAP ver Figura 1417 seguindose a conversão de DHAP em glicerol3fosfato pela enzima citosólica glicerol3fosfatodesidrogenase li gada ao NAD Figura 2121 Depois o glicerol3fosfato é utilizado na síntese de triacilglicerol A gliceroneogênese foi descoberta na década de 1960 por Lea Reshef Richard Hanson e John Ballard e simultaneamente por Eleazar Shafrir e colaboradores que estavam intrigados com a pre sença de duas enzimas gliconeogênicas a piruvatocarboxi lase e a fosfoenolpiruvato PEP carboxicinase no tecido adiposo onde a glicose não é sintetizada Após um longo período de desatenção o interesse nessa via foi renovado pela demonstração de uma ligação entre a gliceroneogêne se e o diabetes tipo 2 como será visto A gliceroneogênese desempenha múltiplas funções No tecido adiposo a gliceroneogênese acoplada à reesteri ficação dos ácidos graxos livres controla a velocidade de liberação dos ácidos graxos no sangue No tecido adiposo marrom a mesma via pode controlar a velocidade pela qual os ácidos graxos livres são enviados para a mitocôndria para utilização na termogênese ver Figura 1936 Nos seres humanos em jejum a gliceroneogênese no fígado sozinha responde pela síntese de glicerol3fosfato suficiente para a reesterificação de até 65 dos ácidos graxos em triacil glicerol O fluxo pelo ciclo do triacilglicerol entre o fígado e o tecido adiposo é controlado em um grau elevado pela ati vidade da PEPcarboxicinase a qual limita a velocidade de ambas da gliconeogênese e da gliceroneogênese Os Tecido adiposo Glicerol3 fosfato Glicerol3fosfato Combustível para tecidos Glicerol Triacilglicerol Triacilglicerol Ácido graxo Ácido graxo Lipase lipoproteica Fígado Sangue Glicerol FIGURA 2120 O ciclo do triacilglicerol Em mamíferos as moléculas de triacilglicerol são degradadas e ressintetizadas em um ciclo do triacilglicerol durante o jejum Parte dos ácidos graxos liberados pela lipólise dos triacil gliceróis no tecido adiposo passa para a corrente sanguínea e o restante é utilizado para ressintetizar triacilglicerol Parte dos ácidos graxos liberados no sangue é utilizada para fornecer energia p ex no músculo e parte é cap tada pelo fígado e utilizada para a síntese de triacilgliceróis O triacilglicerol formado no fígado é transportado pelo sangue de volta ao tecido adiposo onde os ácidos graxos são liberados pela lipase lipoproteica extracelular captados pelos adipócitos e reesterificados em triacilgliceróis Nelson6ed21indd 850 Nelson6ed21indd 850 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 851 hormônios glicocorticoides como o cortisol esteroide bio lógico derivado do colesterol ver Figura 2148 e a dexa metasona glicocorticoide sintético regulam os níveis de PEPcarboxicinase reciprocamente no fígado e no tecido adiposo Atuando nos receptores de glicocorticoides esses hormônios esteroides aumentam a expressão do gene que codifica a PEPcarboxicinase no fígado aumentando a gli coneogênese e a gliceroneogênese Figura 2122 C CH2 OH O Cortisol O H C 3 H C 3 OH HO OH C CH2 O Dexametasona O F H C 3 CH 3 H C 3 OH HO A estimulação da gliceroneogênese leva a um aumen to na síntese de moléculas de triacilglicerol no fígado e a sua liberação na corrente sanguínea Ao mesmo tempo no tecido adiposo os glicocorticoides suprimem a expressão do gene que codifica a PEPcarboxicinase o que resulta em um decréscimo na gliceroneogênese no tecido adiposo Como resultado ocorre a diminuição da reciclagem dos áci dos graxos e mais ácidos graxos livres são liberados no san gue Assim a gliceroneogênese é regulada reciprocamente no fígado e no tecido adiposo afetando o metabolismo dos Piruvato Piruvatocarboxilase Oxaloacetato PEPcarboxicinase Fosfoenolpiruvato Múltiplas etapas Dihidroxiacetonafosfato Glicerol3fosfato desidrogenase CH2OH CHOH CH2 O2 O2 O O P Glicerol3fosfato Síntese de triacilgliceróis FIGURA 2121 Gliceroneogênese A via é essencialmente uma versão abreviada da gliconeogênese partindo do piruvato até dihidroxiacetona a fosfato DHAP seguindose a conversão de DHAP em glicerol3fosfato uti lizado para a síntese dos triacilgliceróis PEPCK Lipase lipoproteica Glicerol a b Triacilglicerol Ácido graxo Glicerol3fosfato Glicerol Triacilglicerol Ácido graxo Combustível para tecidos Glicerol3fosfato Piruvato Piruvato Glicero neogênese Tecido adiposo Fígado Sangue DNA Glicocorticoides Glicerol Triacilglicerol Glicerol Triacilglicerol Ácido graxo PEPCK PEPCK Ácido graxo Glicerol3fosfato Piruvato Glicero neogênese DNA Tiazolidinedionas Combustível Glicerol3fosfato para tecidos FIGURA 2122 Regulação da gliceroneogênese a Os hormônios gli cocorticoides estimulam a gliceroneogênese e a gliconeogênese no fígado enquanto suprimem a gliceroneogênese no tecido adiposo pela regulação recíproca do gene que expressa a PEPcarboxicinase PEPCK nos dois te cidos aumentando o fluxo pelo ciclo do triacilglicerol O glicerol formado pela degradação dos triacilgliceróis no tecido adiposo é liberado no sangue e transportado para o fígado onde é convertido principalmente em glicose embora parte seja convertida em glicerol3fosfato pela glicerolcinase b Uma classe de fármacos chamados de tiazolidinedionas atualmente é utiliza da no tratamento do diabetes tipo 2 Nessa doença os altos níveis de ácidos graxos livres no sangue interferem com a utilização da glicose nos músculos e promovem resistência à insulina As tiazolidinedionas ativam um recep tor nuclear chamado de receptor ativado por proliferador do peroxissomo g PPARg que induz a atividade da PEPcarboxicinase Terapeuticamente as tiazolidinedionas elevam a velocidade da gliceroneogênese aumentando a síntese de triacilglicerol no tecido adiposo e reduzindo a quantidade de ácido graxo livre na corrente sanguínea Nelson6ed21indd 851 Nelson6ed21indd 851 070414 1425 070414 1425 852 DAVID L NELSON MICHAEL M COX lipídeos de formas opostas uma menor velocidade da glice roneogênese no tecido adiposo leva a uma maior liberação de ácidos graxos e não reciclagem enquanto uma alta ve locidade no fígado leva a uma maior síntese e exportação dos triacilgliceróis O resultado líquido é um aumento no fluxo por meio do ciclo dos triacilgliceróis Quando os gli cocorticoides não estão mais presentes o fluxo pelo ciclo diminui já que a expressão da PEPcarboxicinase aumenta no tecido adiposo e diminui no fígado As tiazolidinedionas tratam o diabetes tipo 2 aumentando a gliceroneogênese A recente atenção dada à gliceroneogênese surgiu em parte da ligação entre esta via e o diabetes Os altos níveis de ácidos graxos livres no sangue interferem com a utilização da glicose nos músculos e promovem a resistência à insulina que leva ao diabetes tipo 2 Uma nova classe de fármacos chamada de tiazolidinedionas reduz os níveis dos ácidos graxos circulantes no sangue e aumenta a sensibilidade à insulina As tiazolidinedionas promovem a indução da PEPcarboxicinase no tecido adi poso Figura 2122 levando ao aumento na síntese dos precursores da gliceroneogênese Portanto o efeito tera pêutico das tiazolidinedionas é devido pelo menos em parte ao aumento na gliceroneogênese que por sua vez aumenta a síntese de triacilgliceróis no tecido adiposo e reduz a liberação de ácidos graxos livres do tecido adiposo para a corrente sanguínea Os benefícios de um desses fár macos a rosiglitazona Avandia são contrapostos em parte pelo aumento do risco de ataque cardíaco por moti vos ainda não esclarecidos A avaliação desse fármaco con tinua e ele está disponível apenas por um sistema de dis tribuição restrito CH3 CH3CH2 N N NH NH O S Rosiglitazona Avandia Tiazolidinedionas Pioglitazona Actos N O O S O O O RESUMO 212 Biossíntese de triacilgliceróis c Os triacilgliceróis são formados pela reação de duas moléculas de acilCoA graxo com glicerol3fosfato formando ácido fosfatídico esse produto é desfosfori lado a um diacilglicerol e então acilado por uma ter ceira molécula de acilCoA graxo para gerar um triacil glicerol c A síntese e a degradação dos triacilgliceróis são regula das por hormônios c A mobilização e a reciclagem das moléculas de tria cilglicerol resultam em um ciclo do triacilglicerol Os triacilgliceróis são sintetizados novamente a partir de ácidos graxos livres e glicerol3fosfato mesmo duran te o jejum A dihidroxiacetonafosfato precursora do glicerol3fosfato é derivada do piruvato via glicerone ogênese 213 Biossíntese de fosfolipídeos de membrana No Capítulo 10 foram apresentadas as duas principais clas ses de fosfolipídeos de membrana glicerofosfolipídeos e esfingolipídeos Muitas espécies diferentes de fosfolipídeos podem ser construídas pela combinação de diversos ácidos graxos e grupos que funcionam como cabeças polares utili zando o esqueleto de glicerol ou de esfingosina ver Figuras 109 e 1013 Todas as vias biossíntéticas seguem alguns padrões básicos Em geral a formação dos fosfolipídeos a partir de precursores simples requer 1 síntese da molé culaesqueleto glicerol ou esfingosina 2 acoplamento dos ácidos graxos ao esqueleto por meio de uma liga ção éster ou amida 3 adição de um grupo hidrofílico ao esqueleto por uma ligação fosfodiéster e em alguns casos 4 alteração ou troca do grupo polar gerando o produto final fosfolipídico Em células eucarióticas a síntese dos fosfolipídeos ocorre principalmente sobre a superfície do RE liso e da membrana interna da mitocôndria Alguns fosfolipídeos recémformados permanecem no local de síntese mas a maior parte é destinada para outras localizações celulares O processo pelo qual os fosfolipídeos insolúveis em água movemse do local de síntese para o ponto onde irão de sempenhar suas funções não está totalmente conhecido mas serão discutidos alguns mecanismos que emergiram em estudos recentes As células dispõem de duas estratégias para o acoplamento dos grupos polares dos fosfolipídeos As primeiras etapas na síntese dos glicerofosfolipídeos são compartilhadas com a via de síntese dos triacilgliceróis Fi gura 2117 dois grupos acil graxo são esterificados no C1 e no C2 do Lglicerol3fosfato formando ácido fosfatídico Comumente mas não invariavelmente o ácido graxo em C1 é saturado e aquele em C2 é insaturado Uma segunda via de síntese do ácido fosfatídico é a fosforilação de um diacilglicerol por uma cinase específica O grupo polar dos glicerofosfolipídeos é unido por meio de uma ligação fosfodiéster em que cada uma das duas hi droxilas alcoólicas uma no grupo polar e a outra no C3 do glicerol forma um éster com o ácido fosfórico Figu ra 2123 No processo biossintético uma das hidroxilas é primeiramente ativada pela ligação a um nucleotídeo a citidinadifosfato CDP A citidinamonofosfato CMP é então deslocada por um ataque nucleofílico da outra hi droxila Figura 2124 A CDP é acoplada ao diacilglice rol formando o ácido fosfatídico ativado CDPdiacilglice rol estratégia 1 ou ao hidroxil do grupo polar estratégia 2 As células eucarióticas utilizam ambas as estratégias Nelson6ed21indd 852 Nelson6ed21indd 852 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 853 enquanto as bactérias utilizam apenas a primeira A impor tância central dos nucleotídeos de citidina na biossíntese dos lipídeos foi descoberta por Eugene P Kennedy no iní cio da década de 1960 e essa via é comumente chamada de a Via Kennedy A síntese dos fosfolipídeos em E coli utiliza CDPdiacilglicerol A primeira estratégia para o acoplamento do grupo polar é ilustrado pela síntese de fosfatidilserina fosfatidiletanola mina e fosfatidilglicerol em E coli O diacilglicerol é ativado por condensação do ácido fosfatídico com citidinatrifosfato CTP formando CDPdiacilglicerol com a eliminação de pirofosfato Figura 2125 O deslocamento de CMP por meio do ataque nucleofílico efetuado pelo grupo hidroxila da serina ou pela hidroxila em C1 do glicerol3fosfato gera fosfatidilserina ou fosfatidilglicerol3fosfato respecti vamente O último sofre um processamento adicional pela clivagem do fosfato monoéster com a liberação de Pi ge rando fosfatidilglicerol Fosfatidilserina e fosfatidilglicerol podem funcionar como precursores de outros lipídeos de membrana em bac térias Figura 2125 A descarboxilação da porção serina da fosfatidilserina catalisada pela fosfatidilserinadescarboxila se gera fosfatidiletanolamina Em E coli a condensação de duas moléculas de fosfatidilglicerol com a eliminação de O C CH P CH2 R2 O C O R1 O O O CH2 O Glicerofosfolipídeo C CH CH2 O C O R1 O CH2 O Diacilglicerol O O Grupo polar Grupo polar R2 H HO OH P O O H O H2O H2O Fosfodiéster Álcool Ácido fosfórico Álcool FIGURA 2123 Ligação do grupo polar O grupo polar do fosfolipídeo é acoplado ao diacilglicerol por meio de uma ligação fosfodiéster formada quando o ácido fosfórico é condensado com dois alcoóis eliminando duas moléculas de H2O FIGURA 2124 Duas estratégias gerais para a formação da ligação fosfodiéster dos fosfolipídeos Em ambos os casos CDP fornece o grupo fosfato da ligação fosfodiéster OH O C CH P O CH2 R2 O C O R1 O O CH2 O Glicerofosfolipídeo O P O Rib Citosina O O Estratégia 2 CMP HO O C CH P O CH2 R2 O C O R1 O O CH2 O CDPdiacilglicerol O P Rib Citosina O O Estratégia 1 Diacilglicerol ativado com CDP Grupo polar ativado com CDP CMP C CH CH2 R2 O C O R1 O O CH2 O P O O O O Grupo polar Grupo polar Grupo polar 12Diacilglicerol Eugene P Kennedy 19192011 Nelson6ed21indd 853 Nelson6ed21indd 853 070414 1425 070414 1425 854 DAVID L NELSON MICHAEL M COX FIGURA 2125 Origem dos grupos polares dos fosfolipí deos em E coli Inicialmente um grupo serina ou glicerol3 fosfato é acoplado por meio de um intermediário CDPdiacil glicerol estratégia 1 na Figura 2124 Para outros fosfolipídeos que não a fosfatidilserina o grupo polar é modificado como mostrado aqui Nos nomes das enzimas PG representa fosfati dilglicerol PS fosfatidilserina CDPdiacilglicerol Rib Citosina Fosfatidiletanolamina Glicerol3 fosfato Cardiolipina sintase bacteriana Fosfatidilglicerol3 fosfato PG 3fosfato sintase Glicerol Cardiolipina Fosfatidato Fosfatidilglicerol PG 3 fosfatofosfatase PS descarboxilase Fosfatidilserina Fosfatidilglicerol Serina PS sintase Nelson6ed21indd 854 Nelson6ed21indd 854 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 855 um glicerol forma a cardiolipina em que dois diacilglice róis são ligados por meio de uma cabeça polar em comum Os eucariotos sintetizam fosfolipídeos aniônicos a partir de CDPdiacilglicerol Nos eucariotos fosfatidilglicerol cardiolipina e fosfatidili nositol todos fosfolipídeos aniônicos ver Figura 109 são sintetizados pela mesma estratégia utilizada para a síntese dos fosfolipídeos em bactérias O fosfatidilglicerol é forma do exatamente como nas bactérias A síntese da cardiolipi na em eucariotos é um pouco diferente o fosfatidilglicerol condensase com CDPdiacilglicerol Figura 2126 e não com outra molécula de fosfatidilglicerol como em E coli Figura 2125 O fosfatidilinositol é sintetizado pela condensação de CDPdiacilglicerol com inositol Figura 2126 Fosfatidi linositolcinases específicas convertem então o fosfatidi linositol em seus derivados fosforilados O fosfatidilinositol e seus produtos fosforilados localizados na membrana plas mática exercem função central na transdução de sinal em eucariotos ver Figuras 1210 e 1216 As vias eucarióticas para síntese de fosfatidilserina fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina são interrelacionadas As leveduras assim como as bactérias são capazes de produzir fosfatidilserina pela condensação de CDPdiacil glicerol e serina e podem sintetizar fosfatidiletanolamina a partir de fosfatidilserina em uma reação catalisada pela fosfatidilserinadescarboxilase Figura 2127 A fosfati diletanolamina pode ser convertida em fosfatidilcolina lecitina pela adição de três grupos metila ao seu grupo amino Sadenosilmetionina é o grupo doador de metila ver Figura 1818 para todas as três reações de metilação As vias de síntese de fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina em leveduras estão resumidas na Figura 2128 Essas vias são as principais fontes de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcoli na em todas as células eucarióticas Nos mamíferos a fosfatidilserina não é sintetizada a partir de CDPdiacilglicerol em vez disso ela é derivada da fosfatidiletanolamina ou da fosfatidilcolina por meio da rea ção de troca do grupo polar tal troca pode ocorrer por um de dois processos que ocorrem no RE Figura 2129a A FIGURA 2126 Síntese de cardiolipina e fosfatidilinositol em eucariotos Estes glicerofosfolipídeos são sintetizados usando a estratégia 1 da Figura 2124 O fosfatidilglicerol é sin tetizado como nas bactérias ver Figura 2125 Pl representa fosfatidilinositol O P O2 CDPdiacilglicerol O Rib Citosina C R1 O C O R2 O CH O CH2 O P O2 O Inositol CMP PIsintase C CH R2 O C O R1 O CH2 O O CH2 CHOH CH2 O P O Fosfatidilglicerol CMP eucariótica Cardiolipina C PO 22 C O R1 O O CH2 O P O H O2 3 CH2 O O P O2 O CH2 C R2 C O R1 O CH2 O O CH O Cardiolipina sintase O CH O OH H H OH H H H OH OH Fosfatidilinositol OH R2 OH CH2 CH2 Esses grupos também podem ser esterificados com O2 Nelson6ed21indd 855 Nelson6ed21indd 855 070414 1425 070414 1425 856 DAVID L NELSON MICHAEL M COX síntese de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina nos ma míferos ocorre pela estratégia 2 da Figura 2124 fosforila ção e ativação do grupo polar seguidos pela condensação com diacilglicerol Por exemplo a colina é reutilizada via de salvação por fosforilação seguida de conversão em CDPcolina pela condensação com CTP Um diacilglicerol desloca CMP da CDPcolina produzindo fosfatidilcolina Figura 2129b Uma via de salvação análoga converte a etanolamina obtida na dieta em fosfatidiletanolamina No fígado fosfatidilcolina também é produzida pela metilação de fosfatidiletanolamina com Sadenosilmetionina como descrito anteriormente mas em todos os outros tecidos a fosfatidilcolina é produzida apenas por condensação de diacilglicerol e CDPcolina A síntese de plasmalogênio requer a formação de um álcool graxo unido por ligação éter A via biossintética dos éterlipídeos incluindo os plasma logênios e o fator ativador de plaquetas ver Figura 1010 envolve o deslocamento de um grupo acil graxo es terificado por um álcool de cadeia longa para formar a liga ção éter Figura 2130 Seguese a ligação do grupo polar do lipídeo por mecanismos essencialmente iguais àqueles utilizados na síntese dos fosfolipídeos comuns formados por ligação éster Finalmente a ligação dupla característica dos plasmalogênios sombreada em azul na Figura 2130 é introduzida pela ação de uma oxidase de função mista se melhante àquela responsável pela dessaturação dos ácidos C CH R2 O C O R1 O O CH2 O P COO2 O O NH3 CH O2 CH2 1 Fosfatidilserina CH2 Metiltransferase 3 adoMet 3 adoHcy CO2 Fosfatidil serina descarboxilase C CH2 R2 O C O R1 O O CH2 O P O O CH33 CH O2 CH2 Fosfatidilcolina CH2 N 1 C CH2 R2 O C O R1 O O CH2 O P O O NH3 CH O2 CH2 1 Fosfatidiletanolamina CH2 FIGURA 2127 A principal via partindo de fosfatidilserina até fosfatidiletanolami na e fosfatidilcolina em todos os eucario tos AdoMet representa Sadenosilmetionina adoHcy Sadenosilomocisteína Glicose 6fosfato Lisofosfatidato Glicerol 3fosfato Acildihidroxiacetonafosfato Dihidroxiacetonafosfato Diacilglicerol Triacilglicerol Fosfoetanolamina Etanolamina Via Kennedy CDPetanolamina Colina Fosfocolina CDPcolina Fosfatidato Inositol 3fosfato CDPdiacilglicerol Serina Inositol Fosfatidilserina Fosfatidile tanolamina Fosfatidil monometil etanolamina Fosfatidil dimetil etanolamina Fosfatidilcolina Fosfatidilinositol Fosfatidilglicerol3 fosfato Fosfatidilglicerol Cardiolipina FIGURA 2128 Resumo das vias de síntese dos principais fosfolipídeos e triacilglicerídeos em eucarióticos leveduras O ácido fosfatídico é formado por transacetilação do Lglicerol3fosfato com dois grupos acilgraxo doados por acilCoA graxo A enzima ácido fosfatídicofosfatase lipina con verte o ácido fosfatídico em diacilglicerol que na via Kennedy condensase com o grupo cabeça ativado por CDP etanolamina ou colina para formar fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina Alternativamente o ácido fosfatídico pode ser ativado com a porção CDP que é deslocada pela condensação com o grupo cabeça inositol glicerol3fosfato ou serina formando fosfatidilinositol fosfatidilglicerol ou fosfatidilse rina A descarboxilação de fosfatidilserina gera fosfatidiletanolamina e a metilação de fosfatidiletanola mina produz fosfatidilcolina Não estão mostradas aqui as reações de troca de grupo cabeça ver Figura 2129a que interconverte fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e fosfatidilcolina em mamíferos O ácido lisofosfatídico é o ácido fosfatídico faltando um dos dois grupos acilgraxo Nelson6ed21indd 856 Nelson6ed21indd 856 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 857 graxos Figura 2113 O peroxissomo é o principal local de síntese dos plasmalogênios As vias de síntese de esfingolipídeos e glicerofosfolipídeos compartilham precursores e alguns mecanismos A biossíntese dos esfingolipídeos ocorre em quatro está gios 1 síntese da amina de 18 carbonos esfinganina a partir de palmitoilCoA e serina 2 acoplamento de um ácido graxo por uma ligação amida gerando Nacilesfin ganina 3 dessaturação da porção esfinganina forman do Nacilesfingosina ceramida e 4 acoplamento de um grupo polar para a produção de esfingolipídeos como cerebrosídio ou esfingomielina Figura 2131 As primeiras etapas dessa via ocorrem no RE enquanto o acoplamento dos grupos que funcionarão como cabeças polares no estágio 4 ocorre no aparelho de Golgi A via compartilha diversas características com as vias de síntese dos glicerofosfolipídeos NADPH fornece o poder redutor e os ácidos graxos entram na via como seus derivados CoA ativados Na formação dos cerebrosídeos açúcares entram na via como seus derivados nucleotídicos ativados O aco plamento dos grupos polares na síntese dos esfingolipíde os apresenta diversos aspectos novos A fosfatidilcolina em vez de CDPcolina atua como doadora de fosfocolina na síntese de esfingomielina Nos glicolipídeos os cerebrosídeos e os gangliosídeos ver Figura 1013 o açúcar que funciona como a cabeça polar é acoplado diretamente à hidroxil em C1 da esfin gosina por meio de uma ligação glicosídica e não por uma ligação fosfodiéster O doador do açúcar é um UDPaçúcar UDPglicose ou UDPgalactose Os lipídeos polares são direcionados para membranas celulares específicas Após a síntese no RE liso os lipídeos polares incluindo gli cerofosfolipídeos esfingolipídeos e glicolipídeos são inse ridos em membranas celulares específicas em proporções específicas por mecanismos ainda não conhecidos Os li pídeos de membrana são insolúveis em água de modo que não podem simplesmente difundir do seu local de síntese o RE para o seu local de inserção Em vez disso eles são transportados do RE para o aparelho de Golgi onde pode ocorrer síntese adicional Eles são então transportados em FIGURA 2129 Vias de síntese de fosfatidilserina e fosfatidilcolina em mamíferos a A fosfatidilserina é sintetizada por reações dependentes de Ca 21 de troca do grupo polar realizadas pela fosfatidilserinasintase 1 PSS1 ou pela fosfatidilserinasintase 2 PSS2 A PSS1 pode utilizar tanto fosfatidile tanolamina quanto fosfatidilcolina como substrato b A mesma estratégia mostrada aqui para a síntese de fosfatidilcolina estratégia 2 na Figura 2124 também é utilizada para economia de etanolamina na síntese de fosfatidi letanolamina Fosfatidilcolina Fosfatidiletanolamina C CH2 R2 O C O R1 O O CH2 O P O O NH3 CH O2 CH2 1 CH2 Etanolamina Serina PSS1 PSS2 Colina Serina PSS1 C R2 O C O R1 O O CH2 O P O O CH O2 CH2 CH2 CH2 NCH33 1 C CH R2 O C O R1 O O CH2 O P COO2 O O NH3 CH O2 CH2 1 Fosfatidilserina a CH2 CMP CDPcolina diacilglicerol fosfocolina transferase CDPcolina Citosina O P Diacilglicerol Rib Colina CH2 HO CH2 1 NCH33 O O2 ADP Colina cinase ATP CH2 O 2O P CH2 1 NCH33 O 2O CH2 O P CH2 1 NCH33 O 2O O PPi CTPcolina citidilil transferase Fosfocolina CTP Fosfatidilcolina CH2 R2 C O CH O O O2 R1 C CH2 O O CH2 P O O CH2 1 NCH33 b Nelson6ed21indd 857 Nelson6ed21indd 857 070414 1425 070414 1425 858 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 1 O CH2OH C Dihidroxiacetonafosfato O2 P O O2 O O C O SCoA CoASH COO2 AcilCoA graxo R1 CH2 R1 O P O O2 O CH2 C R1 C O O2 CH2 grupo acila graxo 1Acildihidroxiacetona3fosfato R2 O SCoA CH2 Álcool graxo saturado OH CH2 R2 C R2 P O O2 O CH2 CH2 O2 O CH2 CH2 CHOH 1Alquilglicerol3fosfato Etanolamina Ligação do grupo polar C CH2 R3 O R2 O O CH2 O P O O CH O2 CH2 1 CH2 CH2 CH2 NH3 NAD1 Oxidase de função mista O2 2H2O NADH 1 H1 Plasmalogênio C CH2 R3 O R2 O O CH O P O O CH O2 CH2 1 CH2 CH2 CH NH3 CH2 1alquildihidroxi acetona3fosfato sintase NADP1 1 H1 NADPH 1alquildihidroxi acetona3fosfato redutase R3 C O SCoA CoASH 1alquilglicerol3 fosfato aciltransferase C R3 R2 O CH2 O O CH CH2 CH2 CH2 O P O2 O O2 1Alquil2 acilglicerol3fosfato O C R2 álcool de cadeia longa CH2 CH2 O CH2 P O O2 O CH2 O2 1Alquildihidroxiacetona3fosfato 2NADP 1 2 CoASH 1 2H1 NADPH vesículas membranosas que brotam do aparelho de Golgi movemse e fundemse com a membranaalvo As proteínas de transferência de esfingolipídeos carregam ceramida do RE para o aparelho de Golgi onde ocorre a síntese de esfin gomielina Proteínas citosólicas também ligam fosfolipídeos e esteróis e os transportam entre as membranas celulares Esses mecanismos contribuem para o estabelecimento da composição lipídica característica da membrana das orga nelas ver Figura 112 RESUMO 213 Biossíntese de fosfolipídeos de membrana c Os diacilgliceróis são os principais precursores dos gli cerofosfolipídeos c Nas bactérias a fosfatidilserina é formada pela conden sação da serina com CDPdiacilglicerol a descarboxila ção da fosfatidilserina produz fosfatidiletanolamina O fosfatidilglicerol é formado pela condensação de CDP diacilglicerol com glicerol3fosfato seguida pela remo ção do fosfato em ligação monoéster c As vias nas leveduras para a síntese de fosfatidilserina fosfatidiletanolamina e fosfatidilglicerol são semelhan tes àquelas que ocorrem nas bactérias a fosfatidilcolina é formada pela metilação de fosfatidiletanolamina c As células de mamíferos dispõem de algumas vias se melhantes àquelas em bactérias mas de vias um pouco diferentes para sintetizar fosfatidilcolina e fosfatidileta FIGURA 2130 A síntese de lipídeos com ligação éter ou de plasmalo gênios A ligação éter recémformada está sombreada em vermelhoclaro O intermediário 1alquil2acilglicerol3fosfato é o éter análogo do ácido fosfatídico Os mecanismos para a ligação da cabeça polar aos éterlipíde os são essencialmente os mesmos daqueles utilizados para seus análogos unidos por ligação éster A ligação dupla característica dos plasmalogênios sombreada em azul é introduzida na etapa final por um sistema de oxidase de função mista semelhante àquele mostrado na Figura 2113 Nelson6ed21indd 858 Nelson6ed21indd 858 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 859 nolamina O álcool que funciona como grupo polar coli na ou etanolamina é ativado como um derivado CDP e então condensado com diacilglicerol A fosfatidilserina é derivada apenas da fosfatidiletanolamina c A síntese de plasmalogênios envolve a formação de sua ligação dupla característica por uma oxidase de função mista Os grupos polares dos esfingolipídeos são acopla dos por mecanismos singulares c Os fosfolipídeos chegam a seus destinos intracelulares por meio de vesículas de transporte ou proteínas espe cíficas 214 Colesterol esteroides e isoprenoides biossíntese regulação e transporte O colesterol é sem dúvida o lipídeo que recebe maior pu blicidade sendo famoso devido à forte correlação entre al tos níveis de colesterol no sangue e incidência de doenças cardiovasculares em humanos Muito menos divulgado é o papel crucial do colesterol como um componente das mem branas celulares e como um precursor dos hormônios es teroides e dos ácidos biliares O colesterol é uma molécula essencial em muitos animais incluindo os seres humanos mas não é necessário que esteja presente na dieta de mamí feros todas as células são capazes de sintetizálo a partir de precursores simples A estrutura desse composto de 27 carbonos sugere uma via biossintética complexa porém todos os seus átomos de carbono são fornecidos por um único precursor o acetato As unidades de isopreno os intermediários essenciais na via partindo do acetato até o colesterol também são pre cursores de muitos outros lipídeos naturais e os mecanis mos pelos quais as unidades de isopreno são polimerizadas são semelhantes em todas essas vias C CH2 CH CH2 CH3 Isopreno Inicialmente será realizada uma descrição das principais etapas na biossíntese do colesterol a partir de acetato e então será discutido o transporte do colesterol no sangue sua captação pelas células a regulação da síntese do co lesterol em pessoas normais e sua regulação naquelas com defeitos na captação do colesterol ou em seu transporte A seguir serão considerados outros componentes celulares derivados do colesterol como os ácidos biliares e os hormô nios esteroides Finalmente será apresentado um esboço Serina CoASH CO2 CH3 CoAS CH214 PalmitoilCoA O C NADP1 NADPH 1 H1 Oxidase de função mista animais AcilCoA graxo CoASH Fosfatidilcolina Diacilglicerol Ligação do grupo polar O2 NCH33 CH2 HO H NH C O CH CH CH C R CH2 Esfingomielina O P O O 1 CH2 CH3 CH212 C O C CH2 bCetoesfinganina OH H3N H 1 CH3 CH214 Esfinganina 2 3 1 HO C CH2 CH OH H H3N 1 CH3 CH214 HO H O NAcilesfinganina C CH2 CH C OH R NH CH3 CH214 CH2 HO H NH C O CH CH CH C R UDPGlc UDP OH Cerebrosídeo Ceramida contendo esfingosina O Glc CH2 HO H NH C O CH CH CH C R CH3 CH212 CH3 CH212 FIGURA 2131 Biossíntese de esfingolipídeos A condensação da pal mitoilCoA com a serina formando bcetoesfinganina seguida da redução por NADPH forma esfinganina que é então acilada a Nacilesfinganina uma ceramida Nos animais uma ligação dupla sombreada em vermelhoclaro é formada por uma oxidase de função mista antes da adição final do grupo polar fosfatidilcolina formando esfingomielina ou glicose formando um cerebrosídeo Nelson6ed21indd 859 Nelson6ed21indd 859 070414 1425 070414 1425 860 DAVID L NELSON MICHAEL M COX das vias biossintéticas de alguns dos muitos compostos de rivados das unidades de isopreno que compartilham etapas iniciais com a via de síntese do colesterol ilustrando a ex traordinária versatilidade das condensações de isoprenoi des na biossíntese O colesterol é formado a partir da acetilCoA em quatro etapas O colesterol assim como os ácidos graxos de cadeia longa é formado a partir de acetilCoA Mas o esquema de mon tagem do colesterol é muito diferente daquele dos ácidos graxos de cadeia longa Nos primeiros experimentos para o estudo dessa via os animais eram alimentados com acetato marcado com 14C tanto no carbono do grupo metil quanto no carbono da carboxil O padrão de marcação no colesterol isolado dos dois grupos de animais Figura 2132 forne ceu as informações para se desvendar as etapas enzimáticas na biossíntese do colesterol A síntese ocorre em quatro estágios como representa do na Figura 2133 ➊ condensação de três unidades de acetato formando um intermediário de seis carbonos o mevalonato ➋ conversão do mevalonato em unidades de isopreno ativadas ➌ polimerização das seis unidades de isopreno com 5 carbonos formando o esqualeno linear com 30 carbonos e ➍ ciclização do esqualeno para formar os quatro anéis do núcleo esteroide com uma série de mudan ças adicionais oxidações remoção ou migração de grupos metil para produzir o colesterol Estágio ➊ Síntese do mevalonato a partir de acetato O primei ro estágio na biossíntese do colesterol leva ao interme diário mevalonato Figura 2134 Duas moléculas de acetilCoA condensamse para formar acetoacetilCoA que se condensa com uma terceira molécula de acetil CoA gerando o composto de seis carbonos bhidroxi bmetilglutarilCoA HMGCoA As duas primeiras reações são catalisadas pela acetilCoAacetil trans ferase e pela HMGCoAsintase respectivamente A HMGCoAsintase citosólica dessa via é distinta da isoen zima mitocondrial que catalisa a síntese de HMGCoA na formação de corpos cetônicos ver Figura 1719 A terceira reação é o passo comprometido com a via a redução de HMGCoA em mevalonato para o qual cada uma de duas moléculas de NADPH doa dois elétrons A HMGCoAredutase proteína integral de membrana do RE liso é o principal ponto de regulação da via do coleste rol como será visto Estágio ➋ Conversão de mevalonato em dois isoprenos ativados No próximo estágio da síntese de colesterol três grupos fosfa to são transferidos de três moléculas de ATP para o meva lonato Figura 2135 O fosfato ligado ao grupo hidroxil em C3 do mevalonato no intermediário 3fosfo5pirofos fomevalonato é um bom grupo de saída na próxima etapa tanto este fosfato quanto o grupo carboxila vizinho saem produzindo uma ligação dupla no produto de cinco carbo nos o D 3isopentenilpirofosfato Esse é o primeiro dos dois isoprenos ativados centrais para a formação do coles terol A isomerização do D 3isopentenilpirofosfato gera o segundo isopreno ativado o dimetilalilpirofosfato A COO2 CH3 3 10 Acetato A B C D HO Colesterol C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C 9 2 4 5 6 7 1 25 19 11 8 20 21 12 18 13 14 15 16 17 22 24 26 23 27 FIGURA 2132 Origem dos átomos de carbono do colesterol A origem pode ser deduzida a partir de experimentos usando acetato mar cado no carbono da metil em preto ou no carbono da carboxil em cor derosa Os anéis individuais do sistema de anéis fundidos são denomi nados de A a D COO 3 CH3 C CH3 OOC Acetato O CH2 CH2 HO Mevalonato C CH2 CH2 OH CH3 ❶ ❷ ❸ ❹ CH2 2 CH2 O P O P O O O O isopreno Isopreno ativado Esqualeno Colesterol OH FIGURA 2133 Resumo da biossíntese de colesterol Os quatro está gios são discutidos no texto As unidades isoprenoides no esqualeno estão demarcadas pelas linhas tracejadas em corderosa Nelson6ed21indd 860 Nelson6ed21indd 860 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 861 síntese do isopentenilpirofosfato no citoplasma de células vegetais segue a via descrita anteriormente Entretanto os cloroplastos das plantas e muitas bactérias utilizam uma via independente de mevalonato Essa via alternativa não ocor re em animais de modo que ela é um alvo interessante para o desenvolvimento de novos antibióticos Estágio ➌ Condensação de seis unidades de isopreno ativadas para for mar esqualeno O isopentenilpirofosfato e o dimetilalilpiro fosfato sofrem agora uma condensação cabeça com cauda em que um grupo pirofosfato é deslocado sendo formada uma cadeia de 10 carbonos o geranilpirofosfato Figura 2136 A cabeça é a extremidade na qual o pirofosfato está ligado O geranilpirofosfato sofre outra condensação do tipo cabeça com cauda com o isopentenilpirofosfato gerando um intermediário de 15 carbonos o farnesilpiro fosfato Finalmente duas moléculas de farnesilpirofosfato ligamse cabeça com cabeça com a eliminação de ambos os grupos pirofosfato formando o esqualeno Os nomes comuns desses intermediários derivam das fontes das quais eles foram primeiro isolados O geraniol um componente do óleo das rosas tem aroma de gerânios CH2OH 2NADP1 2 CH3 C O CH3 C O SCoA AcetilCoA AcetilCoA acetil transferase CoASH AcetoacetilCoA HMGCoA redutase CH3 C O CH2 C O SCoA CoASH CH2 C O SCoA CH2 CH3 SCoA bHidroxibmetilglutarilCoA HMGCoA COO CoASH 1 2H1 CH2 C CH2 C COO OH OH CH3 Mevalonato HMGCoA sintase 3 1 5 2 4 NADPH 2 FIGURA 2134 Formação do mevalonato a partir de acetilCoA A origem dos carbonos C1 e C2 do mevalonato a partir de acetilCoA está mostrada em cor salmão OOC CH3 C O 3Fosfo5pirofos fomevalonato D3Isopentenilpirofosfato Dimetilalilpirofosfato Isoprenos ativados CH2 5 CH3 CH2 O OOC CH3 C Mevalonato ADP ATP ATP ATP CH2 CH2 CH2 OH OH OOC CH3 C O 5Fosfomevalonato ADP CH2 O CH2 CH2 OH O P O OOC CH3 C O ADP CH2 O CH2 CH2 OH O P O O O O P O 5Pirofosfomevalonato O O P O O O P P O O O CO2 Pi CH3 C O CH2 CH2 CH2 O O O P P O O O CH3 C O CH2 CH2 O O O P P O O O CH 3 1 4 2 Mevalonato5 fosfotransferase Fosfomevalonato cinase Pirofosfo mevalonato descarboxilase Pirofosfo mevalonato descarboxilase Isopentenil pirofosfato IPPisomerase FIGURA 2135 Conversão do mevalonato em unidades ativadas de iso preno Seis dessas unidades ativadas combinamse para formar o esqualeno ver Figura 2136 Os grupos de saída do 3fosfo5pirofosfomevalonato estão sombreados em cor salmão O intermediário entre colchetes é hipotético Nelson6ed21indd 861 Nelson6ed21indd 861 070414 1425 070414 1425 862 DAVID L NELSON MICHAEL M COX e o farnesol é um composto aromático encontrado nas flo res da acáciaamarela Acacia farnesiana Muitos aromas naturais de origem vegetal são sintetizados a partir de uni dades de isopreno O esqualeno isolado pela primeira vez do fígado de tubarões gênero Squalus tem 30 carbonos 24 na cadeia principal e seis na forma de ramificações de grupos metila Estágio ➍ Conversão do esqualeno no núcleo esteroide de quatro anéis Quando a molécula de esqualeno é representada como na Figura 2137 tornase evidente a relação entre a sua estrutura linear e a estrutura cíclica dos esteróis Todos os esteróis têm os quatro anéis fundidos que formam o nú cleo esteroide e todos são alcoóis com um grupo hidroxil em C3 daí o nome esterol A atividade da esqualeno monoxigenase adiciona um átomo de oxigênio do O2 à ex tremidade da cadeia do esqualeno formando um epóxido Essa enzima é outra oxidase de função mista Quadro 211 NADPH reduz o outro átomo de oxigênio do O2 a H2O As li gações duplas do produto o esqualeno23epóxido estão posicionadas de modo que uma notável reação em concerto é capaz de converter o esqualeno epóxido linear em uma estrutura cíclica Nas células animais essa ciclização resulta na formação de lanosterol que contém os quatro anéis ca racterísticos do núcleo esteroide O lanosterol é finalmente convertido em colesterol em uma série de aproximadamente 20 reações que incluem a migração de alguns grupos metil e a remoção de outros A elucidação dessa extraordinária via biossintética uma das mais complexas conhecidas foi realizada por Konrad Bloch Feodor Lynen John Cornforth e George Popják no final da década de 1950 O colesterol é o esterol característico das células ani mais Por sua vez os vegetais os fungos e os protistas sin tetizam outros esteróis intimamente relacionados utilizam a FIGURA 2136 Formação do esqualeno Esta estrutura de 30 carbonos surge de sucessivas condensações de unidades ativadas de isopreno cinco carbonos D3Isopentenilpirofosfato O O O O P P O O O 1 Dimetilalilpirofosfato O O O O P P O O O Preniltransferase cabeça com cauda O O O O P P O O O Farnesilpirofosfato O O O O P P O O O PPi Preniltransferase condensação cabeça com cauda Geranilpirofosfato O O O O P P O O O D3Isopentenilpirofosfato O O O O P P O O O Farnesilpirofosfato NADPH 1 H1 NADP1 2 PPi Esqualenosintase cabeça com cabeça Esqualeno PPi Nelson6ed21indd 862 Nelson6ed21indd 862 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 863 mesma via sintética até a formação de esqualeno23epó xido ponto em que as vias divergem levemente gerando outros esteróis como o estigmasterol em muitas plantas e o ergosterol nos fungos Figura 2137 Konrad Bloch 19122000 Feodor Lynen 19111979 John Cornforth 19172013 George Popják 19141998 FIGURA 2137 O fechamento do anel converte o esqualeno linear no núcleo esteroide conden sado A primeira etapa nessa sequência é catalisada por uma oxidase de função mista monoxigenase para a qual o cossubstrato é o NADPH O produto é um epóxido ciclizado na etapa seguinte formando o núcleo esteroide O produto final dessas reações nas células animais é o colesterol em outros organismos são formados esteróis ligeiramente diferentes como mostrado na figura Esqualeno Colesterol Esqualeno monoxigenase O2 NADP1 Esqualeno23epóxido múltiplas etapas plantas Ciclase Estigmasterol O Ciclase animais Ergosterol múltiplas etapas fungos Lanosterol Múltiplas etapas NADPH 1 H1 HO H2O HO HO HO 3 2 C2H5 HO 1 Nelson6ed21indd 863 Nelson6ed21indd 863 070414 1425 070414 1425 864 DAVID L NELSON MICHAEL M COX PROBLEMA RESOLVIDO 211 Custo energético da síntese de esqualeno Qual é o custo energético da síntese de esqualeno a partir de acetilCoA em número de ATP por molécula de esqua leno sintetizada Solução Na via de acetilCoA a esqualeno o ATP é con sumido apenas nas etapas que convertem mevalonato em isopreno ativado precursor do esqualeno Três moléculas de ATP são utilizadas para criar cada um dos seis isoprenos ativados necessários para a construção do esqualeno em um custo total de 18 moléculas de ATP O colesterol tem destinos diversos A maior parte da síntese do colesterol em vertebrados ocor re no fígado Uma pequena fração do colesterol sintetizado ali é incorporada em membranas dos hepatócitos mas a maior parte dele é exportada em uma de três formas áci dos biliares colesterol biliar ou ésteres de colesterila Fi gura 2138 Pequenas quantidades de oxiesteróis como 25hidroxicolesterol são formadas no fígado e atuam como reguladores da síntese de colesterol ver a seguir Em ou tros tecidos o colesterol é convertido em hormônios este roides p ex no córtex da suprarrenal e nas gônadas ver Figura 1019 ou no hormônio vitamina D ie no fígado e nos rins ver Figura 1020Tais hormônios são sinalizado res biológicos extremamente potentes agindo por meio de receptores nucleares proteicos Uma das três formas do colesterol exportada do fígado é a bile um fluido estocado na vesícula biliar e excretado no intestino delgado para auxiliar na digestão de refeições contendo gordura Seus principais componentes são os áci dos biliares e seus sais ambos relativamente hidrofílicos derivados do colesterol e sintetizados no fígado que servem como agentes emulsificantes no intestino convertendo partículas grandes de gordura em pequenas micelas dessa forma aumentando muito a superfície de interação com as lipases digestivas ver Figura 171 A bile também contém quantidades muito menores de colesterol Os ésteres de colesterila são formados no fígado pela ação da acilCoAcolesterol aciltransferase ACAT Essa enzima catalisa a transferência de um ácido graxo da coenzima A para o grupo hidroxil do colesterol Figura 21 38 convertendo o colesterol em uma forma mais hidro fóbica e prevenindo que eles entrem nas membranas Os ésteres de colesterila são transportados em partículas li poproteicas secretadas para outros tecidos que utilizam o colesterol ou são armazenados no fígado em gotículas de gorduras O colesterol e outros lipídeos são transportados em lipoproteínas plasmáticas O colesterol e os ésteres de colesterila assim como os tria cilgliceróis e os fosfolipídeos são essencialmente insolúveis em água e ainda assim devem ser transportados do tecido de origem para os tecidos nos quais eles serão armazena dos ou consumidos Para facilitar seu transporte eles são transportados no plasma sanguíneo como lipoproteínas plasmáticas que são complexos macromoleculares de proteínas transportadoras específicas chamadas apolipo proteínas e várias combinações de fosfolipídeos coleste rol ésteres de colesterila e triacilgliceróis As apolipoproteínas apo designa a proteína em sua forma livre de lipídeo combinamse com os lipídeos for mando diversas classes de partículas lipoproteicas as quais FIGURA 2138 Destinos metabólicos do co lesterol As modificações da estrutura do co lesterol estão mostradas em corderosa A es terificação converte o colesterol em uma forma ainda mais hidrofóbica para armazenamento e transporte cada uma das outras modificações gera um produto menos hidrofóbico OH O NH OH OH Éster de colesterila O AcilgraxoCoA CoASH AcilCoAcolesterol aciltransferase ACAT Colesterol O C S O2 O O R HO Hidroxiesteróis 24hidroxicolesterol HO O Ácidos biliares ácido taurocólico HO Hormônios esteroides pregnenolona HO Nelson6ed21indd 864 Nelson6ed21indd 864 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 865 são complexos esféricos com os lipídeos hidrofóbicos no centro e as cadeias laterais hidrofílicas de aminoácidos na superfície Figura 2139a As diferentes combinações de lipídeos e proteínas produzem partículas de diferentes den sidades variando de quilomícrons a lipoproteínas de alta densidade Essas partículas podem ser separadas por ultra centrifugação Tabela 211 e visualizadas por microscopia eletrônica Figura 2139b Cada classe de lipoproteína tem uma função específica determinada por seu local de síntese por sua composição lipídica e por seu conteúdo apolipoproteico Pelo menos dez apolipoproteínas distintas são encontradas nas lipopro teínas do plasma humano Tabela 212 distinguíveis por seus tamanhos suas reações com anticorpos específicos e sua distribuição característica nas classes de lipoproteínas Esses componentes proteicos atuam como sinalizadores direcionando as lipoproteínas para tecidos específicos ou ativando enzimas que agem nas lipoproteínas Eles também têm sido envolvidos em doenças o Quadro 212 descreve um elo entre apoE e a doença de Alzheimer A Figura 21 40 fornece uma visão geral da formação e transporte das lipoproteínas em mamíferos As etapas numeradas na dis cussão que se seguiu referemse a esta figura Os quilomícrons discutidos no Capítulo 17 quando foi analisado o transporte dos triacilgliceróis da dieta do in testino até os demais tecidos são as maiores lipoproteínas e as menos densas contendo alta proporção de triacilglice róis ver Figura 172 ➊ Os quilomícrons são sintetizados TABELA 211 Principais classes de lipoproteínas plasmáticas humanas algumas propriedades Lipoproteína Densidade gmL Composição do peso Proteínas Fosfolipídeos Colesterol livre Ésteres de colesterila Triacilgliceróis Quilomícrons 1006 2 9 1 3 85 VLDL 0951006 10 18 7 12 50 LDL 10061063 23 20 8 37 10 HDL 10631210 55 24 2 15 4 Fonte Modificada de Kritchevsky D 1986 Atherosclerosis and Nutrition Nutr Int 2 p 290297 Monocamada de fosfolipídeo Colesterol livre não esterificado Ésteres de colesterila Triacilgliceróis ApoB100 a Quilomícrons 360000 VLDL 3180000 LDL 3180000 HDL 3180000 b FIGURA 2139 Lipoproteínas a Estrutura de uma lipoproteína de bai xa densidade LDL A apolipoproteína B100 apoB100 é uma das maiores cadeias polipeptídicas conhecidas com 4636 resíduos de aminoácidos Mr 512000 Uma partícula de LDL contém um núcleo com aproximadamen te 1500 moléculas de ésteres de colesterila envolvido por uma camada de cerca de 500 moléculas de colesterol 800 moléculas de fosfolipídeos e uma molécula de apoB100 b Quatro classes de lipoproteínas visualizadas ao microscópio eletrônico após coloração negativa No sentido horário a partir da parte superior à esquerda quilomícrons 50 a 200 nm de diâmetro VLDL 28 a 70 nm HDL 8 a 11 nm LDL 20 a 25 nm Os tamanhos mostrados das partículas são aqueles medidos para essas amostras os tamanhos das partí culas variam consideravelmente em diferentes preparações Para as proprie dades das lipoproteínas ver Tabela 211 Nelson6ed21indd 865 Nelson6ed21indd 865 070414 1425 070414 1425 866 DAVID L NELSON MICHAEL M COX a partir de gorduras da dieta no RE dos enterócitos células epiteliais que recobrem o intestino delgado Os quilomí crons então se movem pelo sistema linfático e entram na corrente sanguínea pela veia subclávia esquerda As apoli poproteínas dos quilomícrons incluem a apoB48 exclusiva dessa classe de lipoproteínas a apoE e a apoCII Tabela 212 ➋ A apoCII ativa a lipase lipoproteica nos capilares do tecido adiposo do coração do músculo esquelético e da glândula mamária em lactação permitindo a liberação de ácidos graxos livres AGL para esses tecidos Os qui lomícrons portanto transportam ácidos graxos da dieta para os tecidos onde eles serão consumidos ou armaze nados como combustível ➌ O que resta dos quilomícrons após perderem a maior parte de seus triacilgliceróis mas contendo ainda colesterol apoE e apoB48 movese pela corrente sanguínea para o fígado Receptores existentes no fígado ligam a apoE nos remanescentes dos quilomícrons e controlam sua captação por endocitose ➍ No fígado os remanescentes liberam seu colesterol e são degradados nos lisossomos Essa via do colesterol da dieta até o fígado é a via exógena setas azuis na Figura 2140 Quando a dieta contém mais ácidos graxos e colesterol do que a quantidade necessária para uso imediato como combustível ou como precursores de outras moléculas eles são ➎ convertidos em triacilgliceróis ou ésteres de coleste rila no fígado e empacotados com apolipoproteínas espe cíficas formando as lipoproteínas de densidade muito baixa VLDL de verylow density lipoproteins O ex cesso de carboidratos na dieta também pode ser convertido em triacilgliceróis no fígado e exportado como VLDL Além dos triacilgliceróis e ésteres de colesterila as VLDL contêm apoB100 apoCI apoCII apoCIII e apoE Tabela 212 As VLDL são transportadas pelo sangue do fígado para o músculo e o tecido adiposo ➏ Nos capilares desses tecidos QUADRO 212 MEDICINA Alelos da ApoE predizem a incidência da doença de Alzheimer Nas populações humanas existem três variantes co muns ou alelos do gene que codifica a apolipoproteí na E O mais comum representando cerca de 78 dos alelos apoE de humanos é o APOE3 os alelos APOE4 e APOE2 representam 15 e 7 respectivamente O alelo APOE4 é particularmente comum em humanos com a doença de Alzheimer e a associação é altamente predi tiva As pessoas que herdam o alelo APOE4 têm um ris co aumentado de apresentarem a doença de Alzheimer de desenvolvimento tardio Aquelas homozigotas para APOE4 têm o risco de desenvolver a doença aumentado em 16 vezes para aquelas que a desenvolvem a idade média do início da doença é pouco abaixo dos 70 anos Para aquelas que herdam duas cópias de APOE3 ao con trário a média de idade do início da doença de Alzhei mer excede os 90 anos A base molecular para a associação entre a apoE4 e a doença de Alzheimer ainda não é conhecida Também não está claro como a apoE4 pode afetar a deposição de fibras amiloides que parecem ser o principal agente causador da doença ver Figura 432 Especulase acer ca de um possível papel da apoE4 na estabilização da estrutura do citoesqueleto dos neurônios As proteínas apoE2 e apoE3 ligamse a diversas proteínas associadas com os microtúbulos neuronais enquanto apoE4 não o faz Isso pode acelerar a morte dos neurônios Seja qual for o mecanismo que venha a ser confirmado essas ob servações prometem expandir nosso conhecimento das funções biológicas das apolipoproteínas TABELA 212 Apolipoproteínas das lipoproteínas plasmáticas humanas Apolipoproteína Peso molecular do polipeptídeo Associação a lipoproteínas Função quando conhecida ApoAI 28100 HDL Ativa a LCAT interage com transpor tadores ABC ApoAII 17400 HDL Inibe a LCAT ApoAIV 44500 Quilomícrons HDL Ativa a LCAT transportedepuração de colesterol ApoB48 242000 Quilomícrons Transportedepuração de colesterol ApoB100 512000 VLDL LDL Ligase a receptores de LDL ApoCI 7000 VLDL HDL ApoCII 9000 Quilomícrons VLDL HDL Ativa a lipase lipoproteica ApoCIII 9000 Quilomícrons VLDL HDL Inibe a lipase lipoproteica ApoD 32500 HDL ApoE 34200 Quilomícrons VLDL HDL Desencadeia a depuração de VLDL e de remanescentes de quilomícrons Fonte Modificada de Vance DE Vance JE eds 2008 Biochemistry of Lipids and Membranes 5th ed Elsevier Science Nelson6ed21indd 866 Nelson6ed21indd 866 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 867 apoCII ativa a lipase lipoproteica que catalisa a liberação dos ácidos graxos a partir dos triacilgliceróis das VLDL Os adipócitos captam esses ácidos graxos reconvertemnos em triacilgliceróis e armazenam os produtos em gotícu las intracelulares de lipídeos já os miócitos ao contrário primariamente oxidam esses ácidos graxos para obterem energia Quando o nível de insulina está alto após uma refeição as VLDL atuam principalmente para transportar lipídeos da dieta para o tecido adiposo para armazenamen to No estado de jejum ou entre as refeições os ácidos gra xos usados para produzir as VLDL no fígado são originários principalmente do tecido adiposo e o principal alvo das VLDL são os miócitos do coração e do músculo esquelético A perda de triacilgliceróis converte parte da VLDL em remanescentes de VLDL também chamadas de lipoproteí nas de densidade intermediária IDL de intermediate den sity lipoproteins A remoção adicional de triacilgliceróis da IDL remanescentes produz lipoproteínas de baixa densidade LDL de lowdensity lipoproteins Rica em colesterol e ésteres de colesterila e contendo apoB100 como sua principal apolipoproteína a ➐ LDL transporta colesterol para os tecidos extrahepáticos como múscu lo glândulas suprarrenais e tecido adiposo Esses tecidos têm receptores na membrana plasmática que reconhecem a apoB100 e controlam a captação de colesterol e ésteres de colesterila ➑ A LDL também entrega colesterol para os macrófagos algumas vezes os convertendo em células es pumosas ver Figura 2146 ➒ A LDL não captada pelos tecidos periféricos retornam ao fígado onde são captados via receptores de LDL na membrana plasmática dos he patócitos O colesterol que entra no hepatócito por essa via pode ser incorporado nas membranas convertido em ácidos biliares ou reesterificados pela ACAT Figura 2138 para armazenamento nas gotículas lipídicas citosólicas Essa via da formação de VLDL no fígado ao retorno de LDL para o fígado é a via endógena do metabolismo e transporte do colesterol setas vermelhas na Figura 2140 O acúmulo do excesso de colesterol intracelular é prevenido pela diminui ção da velocidade de síntese quando colesterol suficiente está disponível a partir de LDL no sangue Mecanismos re ❻ ➍ ➎ ➋ ➊ ➌ ➐ ➑ ➒ Vesícula biliar Sais biliares Estômago C C CE VLDL VLDL IDL LDL LDL C FFA C C C Macrófagos células espumosas Glândula suprarrenal gônadas Músculo Tecido Adiposo LDL HDL Gordura da dieta Intestino Capilar Receptor LDL Receptor SRBI Capilar Quilomícrons Via sistema linfático Remanescentes de quilomícrons Via exógena Via endógena Transporte reverso do colesterol Via êntero hepática Enterócito TAG FFA Miócito adiposo glândula mamária FIGURA 2140 Lipoproteínas e transporte dos lipídeos Os lipídeos são transportados na corrente sanguínea como lipoproteínas existentes em diversas formas variantes cada uma com diferentes funções e com composi ções lipídica e proteica distintas ver Tabelas 211 e 212 portanto com den sidades diferentes As etapas numeradas estão descritas no texto Na via exó gena setas azuis os lipídeos da dieta são empacotados em quilomícrons a maior parte do seu conteúdo em triacilgliceróis é liberada pela lipase lipo proteica nos tecidos adiposo e muscular durante o transporte ao longo dos capilares Os quilomícrons remanescentes contendo na maior parte pro teínas e colesterol são captados pelo fígado Os sais biliares produzidos no fígado auxiliam na dispersão das gorduras da dieta e são então reabsorvidos na via ênterohepática setas verdes Na via endógena setas vermelhas os lipídeos sintetizados ou empacotados no fígado são distribuídos aos tecidos periféricos pela VLDL A extração dos lipídeos da VLDL acompanhada pela perda de parte das apolipoproteínas converte gradualmente parte da VLDL em LDL que transporta o colesterol para os tecidos extrahepáticos ou de volta para o fígado O fígado capta LDL remanescentes de VLDL chamadas de lipoproteínas de densidade intermediária ou IDLs e os remanescentes de quilomícrons por endocitose mediada por receptor O excesso de coleste rol nos tecidos extrahepáticos é transportado de volta ao fígado como HDL pelo transporte reverso do colesterol setas roxas C representa colesterol EC representa ésteres de colesterila Nelson6ed21indd 867 Nelson6ed21indd 867 070414 1425 070414 1425 868 DAVID L NELSON MICHAEL M COX gulatórios desse processo estão descritos abaixo A Figura 2140 e outras vias de transporte de lipoproteínas serão rea nalisadas após a discussão da captação de LDL pelas células Os ésteres de colesterila entram na célula por endocitose mediada por receptor Cada partícula de LDL na corrente sanguínea contém apoB 100 a qual é reconhecida por receptores de LDL presentes na membrana plasmática de células que precisam captar colesterol A Figura 2141 mostra tais células em que ➊ receptores de LDL são sintetizados no aparelho de Golgi e são transportados para a membrana plasmática onde fi cam disponíveis para ligar apoB100 ➋ A ligação da LDL ao receptor de LDL inicia a endocitose que ➌ transfere a LDL e o seu receptor para o interior da célula dentro de um endossomo ➍ As porções da membrana do endossomo que contêm o receptor brotam na membrana plasmática e os receptores retornam à superfície celular para funcionar de novo na captação de LDL ➎ O endossomo fundese com um lisossomo o qual ➏ contém enzimas que hidrolisam os ésteres de colesterila liberando colesterol e ácidos graxos no citosol A proteína apoB100 também é degradada em aminoácidos liberados para o citosol A apoB100 também está presente na VLDL mas o seu domínio de ligação ao re ceptor não está disponível para a interação com o receptor de LDL a conversão de VLDL em LDL expõem o domínio de ligação ao receptor da apoB100 Essa via para o transporte de colesterol no sangue e sua endocitose mediada por receptor nos tecidos alvo foi elucidada por Michael Brown e Joseph Goldstein Eles descobriram que indivíduos com a doença genética hi percolesterolemia familiar HF têm mutações no re ceptor de LDL que previne a captação normal de LDL pelo fígado e pelos tecidos periféricos O resultado da captação defeituosa de LDL são níveis muito altos de LDL no sangue e de colesterol que ela carrega Indivíduos com HF têm Golgi Núcleo O receptor de LDL sintetizado no retículo endoplasmático rugoso movese para a membrana plasmática via sistema de Golgi ❶ Enzimas líticas no lissosomo degradam apoB100 e ésteres de colesterila liberando aminoácidos ácidos graxos e colesterol ❻ O receptor de LDL liga apoB100 da LDL iniciando a endocitose ❷ LDL é internalizado em um endossomo ❸ O receptor de LDL é segregado em vesículas e reciclado na superfície O endossomo com LDL fusionase com o lisossomo Partícula LDL Membrana plasmática RE ApoB100 Ésteres de colesterila Lisossomo Ácidos graxos Aminoácidos Colesterol Gotículas de gordura ❺ ❹ FIGURA 2141 Captação do colesterol por endocitose mediada por receptor Michael Brown e Joseph Goldstein Nelson6ed21indd 868 Nelson6ed21indd 868 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 869 probabilidade muito aumentada de desenvolver ateroscle rose doença do sistema cardiovascular em que os vasos sanguíneos são ocluídos por placas ricas em colesterol ver Figura 2146 A doença de NiemannPick tipo C NPC é um de feito hereditário no armazenamento de lipídeos em que o colesterol não é transportado para fora dos lissosomos e ao contrário acumula nos lissosomos do fígado cérebro e pul mões levando a morte prematura A NPC é o resultado de uma mutação em um dos dois genes NPC1 NPC2 essen ciais para mover o colesterol pra fora do lissosomo e para o citosol onde ele pode ser metabolizado O NPC1 codifica uma proteína lissosomal transmembrana e o NPC2 codifica uma proteina solúvel Essas proteínas atuam em sequência para transferir colesterol para fora do lissosomo e para o citosol para o processamento adicional ou metabolismo O HDL realiza o transporte reverso de colesterol A quarta das principais lipoproteínas em mamíferos a lipo proteína de alta densidade HDL de highdensity lipo protein originase no fígado e no intestino delgado como pequenas partículas ricas em proteína que contêm relativa mente pouco colesterol e não contêm ésteres de colesterila Figura 2140 As HDL contêm principalmente apoAI e outras apolipoproteínas Tabela 212 Elas contêm também a enzima lecitinacolesterolaciltransferase LCAT que catalisa a formação de ésteres de colesterila a partir de lecitina fosfatidilcolina e de colesterol Figura 2142 A LCAT na superfície das partículas de HDL nascentes re cémformadas converte o colesterol e a fosfatidilcolina dos remanescentes do quilomícron e da VLDL encontradas na corrente sanguínea em ésteres de colesterila dando início à formação do núcleo da HDL transformando a HDL nascente em forma de disco em uma partícula de HDL madura de for ma esférica A HDL nascente também pode captar coles terol de células extrahepáticas ricas em colesterol inclusi ve de macrófagos e de células espumosas formadas a partir dele ver a seguir A HDL madura então retorna ao fíga do onde o colesterol é descarregado por meio do receptor SRBI Parte dos ésteres de colesterila no HDL também pode ser transferida ao LDL pela proteína transportadora de éster de colesterila O circuito da HDL é o transporte reverso do colesterol setas roxas na Figura 2140 A maior parte desse colesterol é convertido em sais biliares no fígado e armazenado na vesícula biliar Quando uma refeição é ingerida os sais biliares são excretados no intestino onde ele dispersa pedaços macroscópicos de gordura em micelas microscópicas que podem ser atacadas pelas lipases Os sais biliares são reabsorvidos pelo fígado e recirculam pela ve sícula biliar na circulação ênterohepática setas verdes na Figura 2140 O mecanismo pelo qual o esterol é descarregado no fíga do e em outros tecidos via receptor SRBI não envolve en docitose o mecanismo usado para captação de LDL Em vez disso quando HDL se liga aos receptores SRBI na membra na plasmática dos hepatócitos ou de tecidos esteroidogê nicos como a glândula suprarrenal esses receptores con trolam a transferência parcial e seletiva do colesterol e de outros lipídeos do HDL para a célula A HDL descarregada então se dissocia e recircula na corrente sanguínea para extrair mais lipídeos dos remanescentes de quilomícrons e VLDL e de células sobrecarregadas com colesterol como descrito abaixo A síntese e o transporte do colesterol são regulados em vários níveis A síntese de colesterol é um processo complexo e grande consumidor de energia O excesso de colesterol não pode ser catabolizado para o uso como combustível e deve por conseguinte ser excretado Portanto é claramente vanta joso para um organismo regular a biossíntese de colesterol para complementar a quantidade ingerida na dieta Nos ma míferos a produção do colesterol é regulada pela concen tração intracelular de colesterol e pelos hormônios gluca gon e insulina A etapa comprometida na via de síntese do colesterol e o principal local de regulação é a conversão de HMGCoA em mevalonato Figura 2134 a reação cata lisada pela HMGCoAredutase Éster de colesterila Lecitinacolesterol aciltransferase LCAT Colesterol CH2 P CH O O CH2 O R1 O O C O CH2 CH2 NCH33 1 1 Fosfatidilcolina lecitina HO CH2 P R2 CH O O CH2 O C R1 O O C O O O CH2 CH2 NCH33 1 1 OH Lisolecitina O O C R2 FIGURA 2142 As reações catalisadas pela lecitinacolesterolacil transferase LCAT Essa enzima está presente na superfície da HDL e é estimulada pelo componente apoAI da HDL Os ésteres de colesterila acu mulamse nas HDL nascentes convertendoas em HDL maduras Nelson6ed21indd 869 Nelson6ed21indd 869 070414 1425 070414 1425 870 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A regulação de curto prazo da atividade da HMGCoA redutase existente é realizada por alteração covalente re versível fosforilação pela proteínacinase dependente de AMP AMPK sensível à alta concentração de AMP indi cando baixa concentração de ATP Assim quando os ní veis de ATP declinam a síntese de colesterol desacelera e as vias catabólicas para a geração de ATP são estimuladas Figura 2143 Os hormônios que controlam a regulação global do metabolismo de lipídeos e carboidratos também atuam sobre a HMGCoAredutase o glucagon estimula a sua fosforilação inativação e a insulina promove a des fosforilação ativando a enzima e favorecendo a síntese de colesterol Esses mecanismos regulatórios covalentes pro vavelmente não são tão importantes quantitativamente como os mecanismos que afetam a síntese e a degradação da enzima Em longo prazo o número de moléculas de HMG CoAredutase aumenta ou diminui em resposta às con centrações celulares de colesterol A regulação da síntese de HMGCoAredutase é mediada por um sistema elegante de regulação da transcrição do gene da HMGCoA Figu ra 2144 Esse gene junto com mais de 20 outros genes que codificam enzimas que atuam na captação e na síntese do colesterol e dos ácidos graxos insaturados é controlado por uma pequena família de proteínas chamadas proteí nas de ligação aos elementos reguladores de esterol SREBP de sterol regulatory elementbinding pro teins Quando recémsintetizadas essas proteínas estão inseridas no RE Apenas o fragmento solúvel do domínio regulatório de uma SREBP atua como ativador da transcri ção gênica utilizando mecanismos discutidos no Capítulo 28 Quando os níveis de colesterol e oxiesterol estão altos as SREBP são mantidas no RE e complexadas a outra pro teína chamada de proteína ativadora da clivagem da SREBP SCAP de SREBP cleavageactivating protein que por sua vez está ancorada à membrana do RE por sua interação com uma terceira proteína de membrana a Insig de insulininduced gene protein Figura 2144a A SCAP e a Insig atuam como sensores de esterol Quando os ACAT Estimula a proteólise da HMGCoA redutase ATP AcetilCoA Mevalonato Insulina Glucagon bHidroxibmetil glutarilCoA HMGCoA redutase AMPK Múltiplas etapas Múltiplas etapas Ésteres de colesterila Colesterol intracelular Endocitose mediada por receptor ColesterolLDL extracelular Oxiesterol FIGURA 2143 A regulação da formação de colesterol equilibra a sua síntese com a captação a partir da alimentação e o estado energético A insulina promove a desfosforilação ativação da HMGCoA redutase glu cagon promove sua fosforilação inativação e a proteína cinase dependente de AMP AMPK quando ativada por baixa ATP em relação a AMP a fosforila inativandoa Oxiesteróis metabólitos de colesterol p ex 24Shidroxicoles terol estimula a proteólise da HMGCoA redutase Ubiquitina direciona Insig para a degradação ❶ Proteínas secretórias escoltam SCAPSREBP para o Golgi ❷ No Golgi duas proteases liberam o domínio regulatório de SREBP ❸ O domínio regulatório entra no núcleo ❹ A transcrição de enzimas da síntese de lipídeos é estimulada ❺ a Alta esterol no RE SCAPSREBP retidos no RE ligados a Insig b Baixa esterol no RE Domínio regulatório de SREBP liberado por proteólise c Aumento da síntese de colesterol no RE Citosol Lúmen Esterol Oxiesterol SREBP SCAP Insig Escoltas para secreção Insig Membrana do RE C N Núcleo Sec SREBP Domínio regulatório SCAP Sec U U U FIGURA 2144 Regulação da síntese de colesterol por SREBP As pro teínas de ligação aos elementos reguladores de esterol SREBP mostradas em verde estão embutidas no RE quando recémsintetizadas complexadas com a proteína ativadora da clivagem de SREBP SCAP em corderosa que por sua vez está ligada à Insig azul N e C representam as extremidades amino e carbóxi das proteínas a Quando ligadas à SCAP e Insig as SREBP estão inativas b Quando os níveis de esterol diminuem os sítios de ligação a esterol na Insig e na SCAP estão desocupados o complexo migra para o sistema de Golgi e a SREBP é clivada gerando um domínio regulatório que c age no núcleo aumentando a transcrição de genes regulados por esterol Insig é direcionada para degradação pelo acoplamento de várias moléculas de ubiquitina Nelson6ed21indd 870 Nelson6ed21indd 870 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 871 níveis de esteróis estão altos o complexo InsigSCAPSRE BP permanece retido na membrana do RE Quando os ní veis de esteróis dentro da célula declinam Figura 2144b o complexo SCAPSREBP é escoltado por proteínas secre tórias para o aparelho de Golgi onde duas clivagens pro teolíticas de SREBP liberam um fragmento regulatório que entra no núcleo e ativa a transcrição dos seus genesalvo incluindo a HMGCoA redutase o receptor de LDL e mui tas outras proteínas necessárias para a síntese de lipídeos Quando os níveis de esteróis aumentam suficientemente a liberação proteolítica do domínio aminoterminal da SREBP é novamente bloqueada e a degradação proteossômica do domínio ativo existente resulta em rápido desligamento dos genesalvos Em longo prazo o nível da HMGCoAredutase também é regulado por degradação proteolítica da enzima Altos níveis de colesterol celular são detectados pela Insig que dispara o acoplamento de moléculas de ubiquitina à HMG CoAredutase levando à sua degradação pelo proteossomo ver Figura 2748 Receptor hepático X RHX é um fator de transcrição nuclear ativado por ligantes oxiesteróis refletindo os altos níveis de colesterol que integra o metabolismo dos ácidos graxos e da glicose RHXa é expresso principalmente no fígado no tecido adiposo e nos macrófagos RHXb está pre sente em todos os tecidos Quando ligado a um oxiesterol os RHX formam heterodímeros com um segundo tipo de receptor nuclear os receptores X de retinoides RXR e o dímero RHXRXR ativa a transcrição de um grupo de ge nes Figura 2145 incluindo aquele da acetilCoA carbo xilase a primeira enzima da síntese dos ácidos graxos da ácido graxosintase a enzima do citocromo P450 CYP7A1 necessária para conversão de esterol em ácido biliar das apoproteínas envolvidas no transporte de colesterol apoC I apoCII apoD e apoE dos transportadores ABC ABCA1 e ABCG1 envolvidos no transporte reverso do colesterol ver a seguir de GLUT4 o transportador de glicose esti mulado por insulina no músculo e no tecido adiposo e de SREBP1C Os reguladores transcricionais RHX e SREBP portanto trabalham juntos para alcançar e manter a ho meostasia do colesterol as SREBP são ativadas por baixos níveis de colesterol celular e os RHX são ativados por altos níveis de colesterol Finalmente dois outros mecanismos regulatórios in fluenciam o nível de colesterol celular 1 altas concen trações intracelulares de colesterol ativam a ACAT que au menta a esterificação do colesterol para o armazenamento e 2 o alto nível de colesterol celular diminui via SREBP a transcrição do gene que codifica o receptor de LDL redu zindo a produção do receptor e assim a captação de coles terol do sangue A desregulação do metabolismo de colesterol pode levar à doença cardiovascular Quando a soma do colesterol sintetizado e do coleste rol obtido na dieta excede a quantidade necessária para a síntese de membranas sais biliares e esteroides o acúmulo patológico de colesterol placas pode obstruir os vasos sanguíneos condição chamada aterosclerose A fa lência cardíaca devido à oclusão das artérias coronárias é a principal causa de morte nas sociedades industrializadas A aterosclerose está relacionada a altos níveis de colesterol no sangue e particularmente a altos níveis de colesterol LDL l mau colesterol existe uma correlação negativa entre o nível de HDL bom colesterol e doença arterial A formação de placa nos vasos sanguíneos é iniciada quando o LDL contendo grupos acilgraxo parcialmente oxidados aderese e acumulase na matriz extracelular das células epiteliais que revestem as artérias Figura 2146 Células do sistema imune monócitos são atraídas para a região onde há acúmulo de LDL e elas se diferenciam em macró fagos que captam o LDL oxidado e o colesterol que eles contêm Os macrófagos não podem limitar a captação de esteróis e com o aumento do acúmulo de ésteres de coles terila e colesterol livre os macrófagos se tornam células espumosas parecem espuma no microscópio Com o acúmulo de colesterol livre nas células espumosas e em suas membranas elas sofrem apoptose Durante longos pe ríodos de tempo as artérias se tornam progressivamente ocluídas já que as placas consistindo em material da matriz extracelular tecido cicatricial formado por tecido muscular liso e células espumosas remanescentes gradualmente se tornam maiores Ocasionalmente uma placa se solta do lo cal de sua formação e é transportada pelo sangue para uma região mais estreita de uma artéria no cérebro ou no cora ção causando o acidente vascular cerebral ou infarto Na hipercolesterolemia familiar os níveis de colesterol sanguíneo são extremamente elevados e uma ateroscle elemento RHX AcetilCoA carboxilase Ácidograxo sintase CYP7A1 síntese de ácido biliar ABCA1 e ABCG1 transporte reverso do colesterol GLUT4 captação de glicose SREBP síntese de lipídeos Expressão de genesalvo Aumento da síntese de proteínas incluindo RHX RXR Correpressor Colesterol oxiesteróis 9cisácido retinoico Coativador FIGURA 2145 Atuação do dímero RXRRHX sobre a expressão de genes do metabolismo de lipídeos e da glicose Quando seus ligan tes estão ausentes RXR e RHX associamse a uma proteína correpressora prevenindo a transcrição dos genes associados ao elemento do RHX RHXE Quando os seus respectivos ligantes estão presentes 9cisácido retinoico para RXR colesterol ou oxiesteróis para RHX o dímero se dissocia do corre pressor e então associase a uma proteína coativadora Este complexo se liga ao elemento RHX e aciona a expressão dos genes associados A regulação da expressão gênica é um tópico discutido em mais detalhes no Capítulo 28 Nelson6ed21indd 871 Nelson6ed21indd 871 070414 1425 070414 1425 872 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Monócitos atraídos para a região das lipoproteínas oxidadas Macrófago Célula espumosa Célula espumosa carregada com colesterol Gotículas de éster de colesterila acumulados Parede da artéria Lúmen da artéria ❷ Os monóctios se diferenciam em macrofágos ❸ Lipoproteínas oxidadas se agregam e aderem à matriz extracelular ❶ As células espumosas macrófagos ingerem as lipoproteínas ❹ Colesterol livre acumulase em gotículas nas membranas ❺ Apoptose necrose dano tecidual ❻ Placas ricas em colesterol ❼ Monócito FIGURA 2146 Papel das células espumosas na formação das placas ateroscleróticas A doença cardíaca coronariana é a principal causa de mor te nos países em desenvolvimento As artérias coronárias que trazem o sangue para o coração sofrem um estreita mento devido à formação de depósitos de gordura chama dos de placas ateroscleróticas contendo colesterol pro teínas fibrosas depósitos de cálcio plaquetas sanguíneas e restos celulares O estabelecimento da conexão entre oclusão arterial aterosclerose e níveis de colesterol no sangue foi um projeto do século XX estimulando uma disputa que foi resolvida apenas com o desenvolvimento de fármacos efetivos na redução do colesterol O Framin gham Heart Study estudo longitudinal iniciado em 1948 e em continuidade ainda hoje tem como objetivo identi ficar os fatores relacionados com doença cardiovascular Cerca de 5000 participantes da cidade de Framingham Massachusetts foram submetidos a exames físicos perió dicos e entrevista sobre o estilo de vida Em 2002 os par ticipantes da terceira geração foram incluídos no estudo Esse estudo monumental levou a identificação de fatores de risco para doenças cardiovascular incluindo tabagis mo obesidade sedentarismo diabetes pressão arterial alta e alto nível de colesterol no sangue Em 1913 N N Anitschkov patologista experimental em São Petersburgo Rússia publicou um estudo mostran do que coelhos alimentados com dieta rica em colesterol desenvolviam lesões muito semelhantes às placas ateros cleróticas observadas em humanos idosos Anitschkov continuou seu trabalho ao longo das décadas seguintes publicandoo em jornais importantes do ocidente No en tanto seu trabalho não foi aceito como um modelo para a aterosclerose humana devido ao predomínio do ponto de vista de que a doença era uma simples consequência da idade e que não poderia ser prevenida A ligação en tre colesterol sérico e aterosclerose a hipótese lipídica foi gradualmente ganhando força até que alguns pesqui sadores na década de 1960 sugeriram abertamente que a intervenção terapêutica poderia ser útil No entanto a controvérsia persistiu até a publicação em 1984 dos re sultados de um grande estudo sobre a redução do coleste rol patrocinado pelo United States National Institutes of Health o primeiro teste para a prevenção de doenças co ronarianas Esse estudo mostrou de modo conclusivo uma diminuição estatisticamente significativa em ataques car díacos e acidentes vasculares cerebrais em consequência da diminuição do nível do colesterol O estudo fez uso de uma resina ligadora de ácido biliar a colestiramina para controlar o colesterol Os resultados estimularam a busca por intervenções terapêuticas mais efetivas Alguma con trovérsia persistiu até o desenvolvimento das estatinas entre o final da década de 1980 e na década de 1990 O Dr Akira Endo trabalhando na companhia Sankyo em Tóquio descobriu a primeira estatina e relatou o tra balho em 1976 Endo estava estudando o metabolismo do colesterol por algum tempo e especulou em 1971 se os fungos estudados para a descoberta de novos antibióticos poderiam produzir também um inibidor da síntese do co lesterol Ao longo de um período de vários anos ele estu dou mais de 6000 culturas de fungos até que um resul tado positivo foi encontrado O composto encontrado foi chamado de compactina Figura Q1 O composto afinal provou ser efetivo na redução dos níveis de colesterol em cães e em macacos e o trabalho chamou a atenção de Mi chael Brown e Joseph Goldstein da escola de medicina da QUADRO 213 MEDICINA A hipótese lipídica e o desenvolvimento das estatinas Mevalonato CH3 CH3 R2 R1 5 H R1 5 CH3 R1 5 H R1 5 H R2 5 H R2 5 CH3 R2 5 OH R2 5 CH3 Compactina Sinvastatina Zocor Pravastatina Pravacol Lovastatina Mevacor R1 COO OH HO H3C COO OH O O HO FIGURA Q1 As estatinas como inibidores da HMGCoAredutase Uma comparação das estruturas do mevalonato e de quatro compostos farmacêuticos estatinas que inibem a HMGCoAredutase Nelson6ed21indd 872 Nelson6ed21indd 872 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 873 rose grave desenvolvese na infância Essas pessoas têm o receptor de LDL defeituoso e não apresentam a capta ção mediada por receptor do colesterol transportado pela LDL Consequentemente o colesterol não é retirado do sangue ele acumulase nas células espumosas e contribui para a formação das placas ateroscleróticas A síntese do colesterol endógeno continua apesar da quantidade ex cessiva de colesterol no sangue já que o colesterol extra celular não pode entrar nas células para regular a síntese intracelular Figura 2144 Uma classe de fármacos cha mada de estatinas alguns isolados de fontes naturais e alguns sintetizados pela indústria farmacêutica é utilizada no tratamento de pacientes com hipercolesterolemia fa miliar e com outras condições envolvendo níveis séricos elevados de colesterol As estatinas assemelhamse ao me valonato Quadro 213 e são inibidores competitivos da HMGCoAredutase O transporte reverso do colesterol por HDL se opõe à formação da placa e da aterosclerose O HDL tem um papel crucial na via do transporte reverso do colesterol Figura 2147 reduzindo o potencial dano na formação das células espumosas O HDL esgotado com baixo nível de colesterol captura o colesterol armazenado nos tecidos extrahepáticos incluindo de células espumo sas de placas nascentes e o transporta para o fígado Dois transportadores que ligam ATP ABC estão envolvidos na saída de colesterol das células espumosas Nesse pro cesso apoAI interage com o transportador ABC ABCA1 em uma célula rica em colesterol ABCA1 transporta uma fração do colesterol de dentro da célula para a superfície externa da membrana plasmática onde apoAI livre de li pídeos ou pobre em lipídeos o captura e o transporta para o fígado Outro transportador ABC ABCG1 interage com Universidade do TexasSouthwestern Brown e Goldstein começaram a trabalhar com Endo e confirmaram seus re sultados Alguns resultados drásticos dos primeiros testes clínicos limitados convenceram diversas indústrias farma cêuticas a uniremse à busca por estatinas Uma equipe da Merck liderada por Alfred Alberts e P Roy Vagelos iniciou uma triagem de culturas de fungos e encontrou um resul tado positivo após a triagem de apenas 18 culturas A nova estatina foi chamada de lovastatina Figura Q1 Um ru mor de que a compactina em altas doses era carcinogêni ca em cães quase marginalizou a corrida para desenvolver as estatinas em 1980 mas os benefícios aos pacientes com hipercolesterolemia familiar já eram evidentes Depois de muitas consultas a especialistas ao redor do mundo e ao setor de controle de drogas e alimentos nos Estados Uni dos Food and Drug Administration a Merck prosseguiu cuidadosamente na produção da lovastatina Testes inten sos ao longo das duas décadas seguintes não revelaram efeitos carcinogênicos da lovastatina ou das novas gera ções de estatinas que surgiram desde então As estatinas inibem a HMGCoAredutase em parte por mimetizarem a estrutura do mevalonato Figura Q1 e assim inibirem a síntese do colesterol O tratamento com lovastatina diminui o colesterol sérico em até 30 em pessoas com hipercoles terolemia resultante de uma cópia defeituosa do gene para o receptor de LDL Quando combinado com uma resina que pode ser ingerida e que liga ácidos biliares e previne sua absorção pelo intes tino o fármaco é ainda mais efetivo As estatinas são atualmente os fármacos mais amplamente utiliza dos para a redução do ní vel do colesterol sérico Os efeitos colaterais são sempre uma preocupação quan do se utilizam fármacos mas as estatinas representam um caso em que muitos dos efeitos colaterais são positi vos Esses fármacos podem melhorar o fluxo sanguíneo aumentar a estabilidade das placas ateroscleróticas de modo que elas não rompem obstruindo o fluxo sanguí neo reduzir a agregação plaquetária e inibir a inflama ção vascular Alguns desses efeitos ocorrem antes da redução dos níveis do colesterol em pacientes ingerindo estatinas pela primeira vez e podem estar relacionados a uma inibição secundária da síntese de isoprenoides pelas estatinas No entanto nem todos os efeitos das estati nas são positivos Em alguns pacientes geralmente entre aqueles ingerindo estatinas em combinação com outros fármacos redutores do colesterol ocorre dor ou fraque za muscular que podem tornarse graves ou até mesmo debilitantes Uma lista razoavelmente longa de outros efeitos colaterais tem sido documentada em pacientes no entanto a maioria é rara Para a maior parte dos pa cientes entretanto o decréscimo mediado pelas estati nas nos riscos associados com as doenças coronarianas pode ser significativo Como todos os medicamentos as estatinas devem ser utilizadas apenas sob recomendação médica Akira Endo Alfred Alberts P Roy Vagelos Nelson6ed21indd 873 Nelson6ed21indd 873 070414 1425 070414 1425 874 DAVID L NELSON MICHAEL M COX HDL madura facilitando o movimento de colesterol para fora da célula e para HDL Esse processo de efluxo é par ticularmente crítico quando envolve o transporte reverso do colesterol para fora das células espumosas no local das placas que se formam nos vasos sanguíneos de indivíduos com doença cardiovascular Na deficiência de HDL familiar os níveis de HDL são muito baixos e na doença de Tangier eles são quase indetectáveis Figura 2147 Essas duas doenças ge néticas são o resultado de mutações na proteína ABCA1 A apoAI na HDL sem colesterol não pode captar colesterol das células carentes da proteína ABCA1 e apoAI e a HDL pobre em colesterol são rapidamente removidas do sangue e destruídas Tanto a deficiência de HDL familiar como a doença de Tangier são muito raras em todo o mundo me nos de 100 famílias com a doença de Tangier são conheci das mas a existência dessas doenças estabelece uma fun ção para as proteínas ABCA1 e ABCG1 na regulação dos níveis plasmáticos de HDL Os hormônios esteroides são formados por clivagem da cadeia lateral e oxidação do colesterol Os humanos produzem todos os seus hormônios esteroides a partir do colesterol Figura 2148 Duas classes de hor mônios esteroides são sintetizadas no córtex da glândula suprarrenal os mineralocorticoides que controlam a re absorção de íons inorgânicos Na 1 Cl e HCO3 pelos rins e os glicocorticoides que auxiliam na regulação da glico neogênese e reduzem a resposta inflamatória Os hormônios sexuais são produzidos nas gônadas masculinas e femininas e na placenta Entre eles estão a progesterona que regu la o ciclo reprodutivo feminino e os androgênios como a testosterona e os estrogênios como o estradiol que influenciam no desenvolvimento das características sexuais secundárias em machos e em fêmeas respectivamente Os hormônios esteroides são efetivos em concentrações muito baixas sendo assim sintetizados em quantidades relativa mente pequenas Em comparação com os sais biliares sua produção consome relativamente pouco colesterol C O CH3 Progesterona O A síntese dos hormônios esteroides requer a remoção de alguns ou de todos os carbonos na cadeia lateral do C17 do anel D do colesterol A remoção da cadeia lateral ocorre na mitocôndria dos tecidos esteroidogênicos A re moção envolve a hidroxilação de dois carbonos adjacentes na cadeia lateral C20 e C22 seguindose a clivagem da ligação entre eles Figura 2149 A formação dos diver sos hormônios também envolve a introdução de átomos de oxigênio Todas as reações de hidroxilação e oxigenação na biossíntese dos esteroides são catalisadas por oxidases de função mista Quadro 211 que utilizam NADPH O2 e cito cromo P450 mitocondrial Os intermediários na biossíntese de colesterol têm muitos destinos alternativos Além de sua função como intermediário na biossíntese de colesterol o isopentenilpirofosfato é o precursor ativado de uma ampla gama de biomoléculas com funções biológi cas distintas Figura 2150 Entre elas incluemse as vi taminas A E e K pigmentos vegetais como o caroteno e a cadeia fitol da clorofila borracha natural muitos óleos es senciais como os princípios aromáticos dos óleos de limão Célula espumosa Receptor de LDL ApoB ApoAI ABCG1 ABCA1 ABCA1 defeituosa na doença de Tangier e na deficiência de HDL familiar ApoAI CE TAG CE TAG CE TAG HDL madura Livre colesterol não esterificado VLDLLDL C Receptor SRB FIGURA 2147 O transporte reverso do colesterol ApoAI e HDL cap tam o excesso de colesterol das células periféricas com a participação dos transportadores ABCA1 e ABCG1 e retornam para o fígado Em indivíduos com defeito genético em ABCA1 a falha no transporte reverso de coleste rol leva a doenças cardiovasculares severas e precoces doença de Tangier e doença da deficiência de HDL familiar Colesterol Corticosterona glicocorticoide Afeta o metabolismo das proteínas e dos carboidratos suprime as respostas imunológicas inflamatórias e alérgicas Pregnenolona Progesterona Aldosterona mineralocorticoide Testosterona Cortisol glicocorticoide Estradiol Androgênios e estrogênios Influenciam as características sexuais secundárias regulam o ciclo reprodutivo nas fêmeas Regula a reabsorção de Na1 Cl HCO 3 nos rins FIGURA 2148 Alguns hormônios esteroides derivados do colesterol As estruturas de alguns desses compostos são mostradas na Figura 1019 Nelson6ed21indd 874 Nelson6ed21indd 874 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 875 eucalipto e almíscar hormônio juvenil de insetos que con trola a metamorfose dolicóis que atuam como transpor tadores solúveis de lipídeos na síntese de polissacarídeos complexos e ubiquinona e plastoquinona transportadores de elétrons na mitocôndria e nos cloroplastos Coletivamen te essas moléculas são chamadas de isoprenoides Mais de 20000 moléculas isoprenoides distintas foram descobertas na natureza e centenas de novas moléculas desse tipo são descritas a cada ano A prenilação ligação covalente de um isoprenoide ver Figura 2735 é um mecanismo comum pelo qual proteínas são ancoradas à superfície interna de membranas celulares em mamíferos ver Figura 1115 Em algumas dessas pro teínas o lipídeo acoplado é o grupo farnesila de 15 carbonos outras têm o grupo geranilgeranila de 20 carbonos Enzi mas distintas atuam na ligação dos dois tipos de lipídeos É possível que as reações de prenilação direcionem as pro teínas para membranas distintas dependendo de qual lipí deo está acoplado A prenilação de proteínas é outra função importante dos derivados do isopreno da via do colesterol RESUMO 214 Colesterol esteroides e isoprenoides biossíntese regulação e transporte c O colesterol é formado a partir de acetilCoA em uma série complexa de reações das quais participam os intermediários bhidroxibmetilglutarilCoA mevalo nato e dois isoprenos ativados dimetilalilpirofosfato e isopentenilpirofosfato A condensação de unidades de isopreno produz o composto acíclico esqualeno que é ciclizado gerando o sistema de anéis esteroides e a ca deia lateral c O colesterol e os ésteres de colesterila são transporta dos no sangue como lipoproteínas plasmáticas A VLDL transporta o colesterol os ésteres de colesterila e os triacilgliceróis do fígado para os demais tecidos onde os triacilgliceróis são degradados pela lipase lipoproteica convertendo VLDL em LDL A LDL rica em colesterol e seus ésteres é captada por endocitose mediada por receptor em que a apolipoproteína B100 da LDL é re conhecida pelos receptores na membrana plasmática 17 22 20 2O2 2H2O OH Desmolase O 2 1 2H1 NADPH NADPH 1 H2O NADP1 2NADP1 1 O2 H C CH3 O C 1 H1 HO HO HO HO Colesterol Oxidase de função mista 2022Dihidroxicolesterol Cit P450 adrenodoxina FeS Adrenodoxina redutase flavoproteína Isocaproaldeído Pregnenolona FIGURA 2149 Clivagem da cadeia lateral na síntese de hormônios esteroides O citocromo P450 atua como transportador de elétrons neste sistema de oxidases de função mista que oxida átomos de carbono adja centes O processo também requer as proteínas transportadoras de elétrons adrenodoxina e adrenodoxinaredutase Esse sistema de clivagem de cadeias laterais é encontrado na mitocôndria das células do córtex da suprarrenal ativo na produção de hormônios esteroides A pregnenolona é o precursor de todos os outros hormônios esteroides ver Figura 2148 Ácidos biliares Vitamina D Hormônios esteroides Colesterol Borracha Vitamina A Quinonas transportadoras de elétrons ubiquinona plastoquinona Dolicóis Isopreno Cadeia fitol da clorofila Vitamina E Vitamina K Carotenoides Hormônios vegetais ácido abscísico e ácido giberélico D3Isopentenil pirofosfato CH2 C O CH3 CH2 CH2 P O P O O2 O2 O O2 FIGURA 2150 Visão geral da biossíntese dos isoprenoides As es truturas da maioria dos produtos finais aqui mostrados são fornecidas no Capítulo 10 Nelson6ed21indd 875 Nelson6ed21indd 875 070414 1425 070414 1425 876 DAVID L NELSON MICHAEL M COX c A síntese e o transporte de colesterol estão sob regula ção complexa por hormônios pelo conteúdo de coles terol celular e pelo nível energético concentração de AMP HMGCoA redutase é regulada alostericamente e por modificação covalente Além disso as velocida des de síntese e de degradação são controladas por um complexo de três proteínas Insig SCAP e SREBP que detectam os níveis de colesterol e provocam o aumento da síntese ou da degradação da HMGCoAredutase O número de receptores de LDL por célula também é re gulado pelo conteúdo de colesterol c Condições alimentares ou defeitos genéticos no metabo lismo do colesterol podem levar à aterosclerose e a doen ças cardíacas No transporte reverso do colesterol HDL remove colesterol dos tecidos periféricos transportando o para o fígado Por reduzir o conteúdo de colesterol das células espumosas HDL protege contra aterosclerose c Os hormônios esteroides glicocorticoides mineralocor ticoides e hormônios sexuais são produzidos a partir do colesterol por alteração da cadeia lateral e introdu ção de átomos de oxigênio no sistema de anéis dos es teroides Além do colesterol uma ampla variedade de compostos isoprenoides é derivada do mevalonato por meio de condensações do isopentenilpirofosfato e do dimetilalilpirofosfato c A prenilação de algumas proteínas as direciona para as sociações com membranas celulares e é essencial para suas atividades biológicas Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário malonilCoA 833 acetilCoAcarboxilase 833 ácido graxosintase 834 proteína transportadora de grupos acila ACP 836 acilCoA graxodessaturase 843 oxidases de função mista 843 estearoilACPdessaturase EAD 843 oxigenases de função mista 844 citocromo P450 844 ácidos graxos essenciais 845 prostaglandina 845 cicloxigenase COX 845 prostaglandina H2sintase 845 tromboxanosintase 847 tromboxano 847 leucotrieno 847 glicerol3fosfato desidrogenase 848 ciclo do triacilglicerol 850 gliceroneogênese 850 tiazolidinedionas 852 fosfatidilserina 853 fosfatidilglicerol 853 fosfatidiletanolamina 853 cardiolipina 855 fosfatidilcolina 855 plasmalogênio 856 fator ativador de plaquetas 856 cerebrosídeo 857 esfingomielina 857 gangliosídeo 857 isopreno 859 mevalonato 860 bhidroxibmetilglutarilCoA HMGCoA 860 HMGCoAsintase 860 HMGCoAredutase 860 esqualeno 861 ácidos biliares 864 ésteres de colesterila 864 apolipoproteínas 864 quilomícron 865 via exógena 866 lipoproteína de densidade muito baixa VLDL 866 lipoproteína de densidade baixa LDL 867 via endógena 867 receptores de LDL 867 endocitose mediada por receptor 868 lipoproteína de alta densidade HDL 869 transporte reverso de colesterol 869 circulação êntero hepática 869 proteínas de ligação ao elemento regulatório de esterol SREBP 870 proteína ativadora da clivagem de SREBP SCAP 870 proteína induzida por insulina Insig 870 receptor hepático X RHX 871 receptor X de retinoidesRXR 871 aterosclerose 871 célula espumosa 871 estatina 873 Leituras adicionais As referências gerais dos Capítulos 10 e 17 também são úteis Gerais Vance DE Vance JE eds 2008 Biochemistry of Lipids Lipoproteins and Membranes 5th ed New Comprehensive Biochemistry Vol 31 Elsevier Science Publishing Co Inc New York Excelente revisão da estrutura da biossíntese e da função de lipídeos Biossíntese de ácidos graxos e eicosanoides Chan DI Vogel HJ 2010 Current understanding of fatty acid biosynthesis and the acyl carrier protein Biochem J 430 119 Revisão de nível intermediário Maier T Jenni S Ban N 2006 Architecture of mammalian fatty acid synthase at 45 Å resolution Science 311 12581262 Os grandes complexos multiproteicos que sintetizam ácidos graxos em fungos apresentam arquiteturas interessantes e muito diferentes comparadas àqueles dos mamíferos Munday MR 2002 Regulation of mammalian acetylCoA carboxylase Biochem Soc Trans 30 10591064 Reshef L Olswang Y Cassuto H Blum B Croniger CM Kalhan SC Tilghman SM Hanson RM 2003 Glyceroneogenesis and the triglyceridefatty acid cycle J Biol Chem 278 3041330416 Sampath H Ntambi JM 2011 The role of stearoylCoA desaturase in obesity insulin resistance and inflammation Ann NY Acad Sci 1243 4753 Breve resumo das funções dessa enzima na lipogênese em vários processos fisiológicos Smith WL Urade Y Jakovsson PJ 2011 Enzymes of the cyclooxygenase pathways of prostanoid biosynthesis Chem Rev 111 58215865 Uma revisão avançada Warner TD Mitchell JA 2004 Cyclooxygenases new forms new inhibitors and lessons from the clinic FASEB J 18 790804 White SW Zheng J Zhang YM Rock CO 2005 The structural biology of type II fatty acid biosynthesis Annu Rev Biochem 74 791831 Biossíntese de triacilgliceróis e fosfolipídeos de membrana Carman GM Han GS 2011 Regulation of phospholipid synthesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae Annu Rev Biochem 89 859883 Uma revisão avançada Nelson6ed21indd 876 Nelson6ed21indd 876 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 877 Coleman RS Mashek DG 2011 Mammalian triacylglycerol metabolism synthesis lipolysis and signaling Chem Rev 111 63596386 Uma revisão avançada Dowhan W 1997 Molecular basis for membrane phospholipid diversity why are there so many lipids Annu Rev Biochem 66 199232 Gibellini F Smith TK 2010 The Kennedy pathwayde novo synthesis of phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine IUBMB Life 62 414428 Kennedy EP 1962 The metabolism and function of complex lipids Harvey Lect 57 143171 Descrição clássica do papel dos nucleotídeos da citidina na síntese de fosfolipídeos Raetz CRH Dowhan W 1990 Biosynthesis and function of phospholipids in Escherichia coli J Biol Chem 265 1235 1238 Sucinta revisão da biossíntese de fosfolipídeos e lipopolissacarídeos em bactérias Zechner R Zimmermann R Eichmann TO Kohlwein SD Haemmerle G Lass A Madeo R 2012 Fat signalslipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling Cell Metab 15 279291 Biossíntese de colesterol esteroides e isoprenoides Bloch K 1965 The biological synthesis of cholesterol Science 150 1928 Discurso do autor ao receber o Nobel descrição clássica da síntese dos esteroides em animais Boutte Y Grebe M 2009 Cellular processes relying on sterol function in plants Curr Opin Plant Biol 12 705713 Revisão sobre a síntese e a função dos esteróis em plantas Brown MS Goldstein JL 2009 Cholesterol feedback from Schoenheimers bottle to Scaps MELADL J Lipid Res 50 S15S27 Um resumo histórico curto sobre as funções de SCAP e SREBP na regulação da síntese de colesterol Calandra S Tarugi P Speedy HE Dean AF Bertolini S Shoulders CC 2011 Mechanisms and genetic determinants regulating sterol absorption circulating LDL levels and sterol elimination implications for classification and disease risk J Lipid Res 52 18851926 Uma revisão extensa da função do LDL em doenças humanas Calkin AC Tontonoz P 2012 Transcriptional integration of metabolism by the nuclear sterolactivated receptors LXR and FXR Nat Rev Mol Cell Biol 13 213224 A função desses receptores nucleares no metabolismo do colesterol e sua integração no metabolismo global Chang TY Chang CCY Cheng D 1997 Acylcoenzyme A cholesterol acyltransferase Annu Rev Biochem 66 613638 Choi SH Ginsberg HN 2011 Increased very low density lipoprotein VLDL secretion hepatic steatosis and insulin resistance Trends Endocrinol Metab 22 353363 Uma revisão sobre a ação da insulina sobre a síntese de lipoproteínas e na circulação Getz GS Reardon CA 2011 ABC transporters and the thickening cholesterol plot Curr Opin Lipidol 22 7273 Goldstein JL Brown MS 2008 From fatty steak to fatty liver 33 years of joint publications in the JCI J Clin Invest 118 12201222 Uma recapitulação curta e excelente do trabalho seminal sobre o colesterol e doença Goldstein JL Brown MS 1990 Regulation of the mevalonate pathway Nature 343 425430 Descrição da regulação alostérica e covalente das enzimas da via do mevalonato inclui uma breve discussão da prenilação da Ras e de outras proteínas Hanson JR 2010 Classics of cholesterol biosynthesis Biochem J doi101042BJ20091543 Uma revisão do trabalho clássico de Popják e Cornforth sobre a síntese de colesterol Hegele RA 2012 Plasma lipoproteins genetic influences and clinical implications Nat Rev Genet 10 109120 Uma revisão sobre as bases genéticas para as variações dos lipídeos e lipoproteínas plasmáticas Jeon TI Osborne TF 2012 SREBPs metabolic integrators in physiology and metabolism Trends Endocrinol Metab 23 6572 Uma revisão em nível intermediário das funções gerais das SREBP incluindo a homeostasia do colesterol Leduc V JasminBelanger S Poirier J 2010 APOE and cholesterol homeostasis in Alzheimers disease Trends Mol Med 16 469477 Maxfield FR Tabas I 2005 Role of cholesterol and lipid organization in disease Nature 438 612621 Maxfield FR van Meer G 2010 Cholesterol the central lipid of mammalian cells Curr Opin Biol 22 422429 Miller WL Auchus RJ 2011 The molecular biology biochemistry and physiology of human steroidogenesis and its disorders Endocrine Rev 32 81151 Uma revisão extensa e avançada Miziorko HM 2011 Enzymes of the mevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis Arch Biochem Biophys 505 131143 Nes D 2011 Biosynthesis of cholesterol and other sterols Chem Rev 111 64236451 Olson RE 1998 Discovery of the lipoproteins their role in fat transport and their significance as risk factors J Nutr 128 2 Suppl 439S443S Revisão histórica breve e clara sobre os estudos da função das lipoproteínas Raghow R Yellaturu C Deng X Park EA Elam MB 2008 SREBPs the crossroads of physiological and pathological lipid homeostasis Trends Endocrinol Metab 19 6573 Russell DW 2003 The enzymes regulation and genetics of bile acid synthesis Annu Rev Biochem 72 137174 Steinberg D 2006 An interpretive history of the cholesterol controversy part V the discovery of the statins and the end of the controversy J Lipid Res 47 13391351 Última de uma série de cinco partes detalhando a história da controvérsia lipídica que levou ao desenvolvimento das estatinas Tall AR YvanCharvet L Terasaka N Pagler T Wang N 2008 HDL ABC transporters and cholesterol efflux implications for the treatment of atherosclerosis Cell Metab 7 365375 Transporte reverso do colesterol o papel dos transportadores ABC Young SG Fielding CJ 1999 The ABCs of cholesterol efflux Nat Genet 22 316318 Uma breve revisão de três artigos neste número do periódico que estabelecem mutações em ABC1 como causa da doença de Tangier e da deficiência familiar de HDL Shao Y Van Berkel TJC Van Eck M 2010 Relative roles of various efflux pathways in net cholesterol efflux from macrophage foam cells in atherosclerotic lesions Curr Opin Lipidol 21 441453 Nelson6ed21indd 877 Nelson6ed21indd 877 070414 1425 070414 1425 878 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Problemas 1 Destino do carbono na síntese dos ácidos graxos Uti lizando seu conhecimento sobre a biossíntese de ácidos graxos dê uma explicação para as seguintes observações experimentais a A adição de acetilCoA uniformemente marcada com 14C a uma fração solúvel de fígado gera palmitato uniforme mente marcado com o 14C b Entretanto a adição de traços de acetilCoA unifor memente marcada com 14C na presença de um excesso de malonilCoA não marcada a uma fração solúvel de fígado gera palmitato marcado com 14C apenas em C15 e C16 2 Síntese de ácidos graxos a partir da glicose Depois de uma pessoa ter ingerido grande quantidade de sacarose a glico se e a frutose que excedem as necessidades calóricas são trans formadas em ácidos graxos para a síntese de triacilgliceróis A síntese de ácidos graxos consome acetilCoA ATP e NADPH Como essas substâncias são produzidas a partir de glicose 3 Equação global da síntese de ácidos graxos Escreva a equação global para a biossíntese de palmitato em fígado de rato a partir de acetilCoA mitocondrial e NADPH ATP e CO2 citosólicos 4 Via do hidrogênio na síntese de ácidos graxos Con sidere uma preparação que contenha todas as enzimas e todos os cofatores necessários para a biossíntese de ácidos graxos a partir de acetilCoA e malonilCoA a Se 2 2HacetilCoA marcada com deutério o isótopo pesado do hidrogênio 2H C 2H 2H C O SCoA e um excesso de malonilCoA não marcada são adicionadas como substratos quantos átomos de deutério são incorporados em cada molécula de palmitato Quais são suas localizações Explique b Se acetilCoA não marcada e 2 2HmalonilCoA OOC C 2H 2H C O SCoA são adicionadas como substratos quantos átomos de deutério são incorporados em cada molécula de palmitato Quais são suas localizações Explique 5 Energética da bcetoacilACPsintase Na reação de condensação catalisada pela bcetoacilACPsintase ver Figu ra 216 uma unidade de quatro carbonos é sintetizada pela combinação de uma unidade de dois carbonos com uma unida de de três carbonos e com a liberação de CO2 Qual a vantagem termodinâmica desse processo sobre aquele que simplesmente combina duas unidades de dois carbonos 6 Modulação da acetilCoAcarboxilase A acetilCoA carboxilase é o principal local de regulação na biossíntese dos ácidos graxos Algumas das propriedades da enzima são des critas abaixo a A adição de citrato ou isocitrato eleva o Vmáx da enzima em até 10 vezes b A enzima existe em duas formas interconversíveis que diferem muito em suas atividades Protômero inativo polímero filamentoso ativo Citrato e isocitrato ligamse preferencialmente à forma fila mentosa e palmitoilCoA ligase preferencialmente ao protô mero Explique como essas propriedades são consistentes com o papel regulador da acetilCoAcarboxilase na biossíntese de ácidos graxos 7 Transporte de grupos acetila através da membra na interna da mitocôndria O grupo acetila da acetilCoA produzido pela descarboxilação oxidativa do piruvato dentro da mitocôndria é transferido para o citosol pela lançadeira de grupos acetil esquematizada na Figura 2110 a Escreva a equação global para a transferência de um grupo acetila da mitocôndria para o citosol b Qual é o custo desse processo em ATP por grupo acetila c No Capítulo 17 encontramos um transportador de gru po acila na transferência de acilCoA graxo do citosol para a mitocôndria na preparação para a boxidação ver Figura 17 6 Um resultado desse transporte é a separação dos conjuntos mitocondrial e citosólico de CoA A lançadeira de grupos aceti la também realiza essa função Explique 8 Necessidade de oxigênio para as dessaturases A biossíntese de palmitoleato ver Figura 2112 ácido graxo in saturado comum com uma ligação dupla cis na posição D 9 uti liza palmitato como precursor A síntese de palmitoleato pode ser realizada em condições estritamente anaeróbias Explique 9 Custo energético da síntese de triacilgliceróis Uti lize a equação global para a biossíntese de tripalmitoilglicerol tripalmitina a partir de glicerol e palmitato para mostrar quantos ATP são necessários por molécula de tripalmitina formada 10 Renovação dos triacilgliceróis no tecido adipo so Quando 14Cglicose é adicionada à dieta balanceada de ratos adultos não há aumento na quantidade total de triacil gliceróis estocados mas os triacilgliceróis tornamse marcados com 14C Explique 11 Custo energético da síntese de fosfatidilcolina Es creva a sequência de etapas e a reação global para a biossíntese de fosfatidilcolina pela via de salvação a partir de oleato pal mitato dihidroxiacetonafosfato e colina Iniciando com esses precursores qual é o custo em número de ATP da síntese de fosfatidilcolina pela via de salvação 12 Via de salvação para a síntese de fosfatidilcoli na Um rato jovem mantido em dieta deficiente em metionina não se desenvolve adequadamente a não ser que seja incluída colina na dieta Explique 13 Síntese de isopentenilpirofosfato Se 2 14Cacetil CoA é adicionada a um homogeneizado de fígado de rato que está sintetizando colesterol onde aparecerá a marcação com 14C no D 3isopentenilpirofosfato a forma ativada de uma uni dade isopreno 14 Doadores ativados na síntese de lipídeos Na bios síntese de lipídeos complexos os componentes são reunidos pela transferência do grupo apropriado de um doador ativado Por exemplo o doador ativado de grupos acetila é a acetilCoA Para cada um dos grupos seguintes forneça a forma do doador ativado a fosfato b Dglicosila c fosfoetanolamina d Dgalactosila e acila graxo f metila g o grupo de dois carbonos na biossíntese de ácidos graxos h D 3isopentenila Nelson6ed21indd 878 Nelson6ed21indd 878 070414 1425 070414 1425 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 879 15 Importância das gorduras na dieta Quando ratos jovens são alimentados com uma dieta totalmente livre de gor dura eles crescem muito pouco desenvolvem uma dermatite escamosa perdem pelo e morrem em pouco tempo sintomas que podem ser prevenidos se linoleato ou material vegetal é incluído na dieta O que faz do linoleato um ácido graxo essen cial Por que o material vegetal pode ser utilizado 16 Regulação da biossíntese de colesterol O coleste rol em humanos pode ser obtido a partir da dieta ou sintetiza do de novo Um humano adulto com dieta pobre em colesterol sintetiza geralmente 600 mg de colesterol por dia no fígado Se a quantidade de colesterol na dieta é elevada a síntese de novo do colesterol é drasticamente reduzida Como ocorre essa regulação 17 Redução dos níveis de colesterol sérico com estatinas Pacientes tratados com um fármaco do tipo estatina geralmente exibem uma redução dramática do coles terol sérico Entretanto a quantidade da enzima HMGCoA redutase presente nas células pode aumentar substancialmen te Sugira uma explicação para esse efeito 18 Funções dos tiolésteres na biossíntese de coles terol Esquematize um mecanismo para cada uma das três reações mostradas na Figura 2134 detalhando a via para a síntese de mevalonato a partir de acetilCoA 19 Potenciais efeitos colaterais do tratamento com estatinas Embora testes clínicos ainda não te nham sido realizados para documentar os benefícios e os efei tos colaterais alguns médicos sugerem que pacientes em trata mento com estatinas também utilizem suplemento de coenzima Q Sugira uma razão para essa recomendação Problema de análise de dados 20 Engenharia genética em E coli para a produção de grandes quantidades de um isoprenoide Uma grande va riedade de isoprenoides ocorre naturalmente alguns deles sen do produzidos industrialmente tendo importância médica eou comercial Os métodos de produção incluem a síntese enzimá tica in vitro que é um processo caro e de baixo rendimento Em 1999 Wang Oh e Liao publicaram seus experimentos para modificar geneticamente a bactéria de fácil crescimento E coli para produzir grandes quantidades de astaxantina um isopre noide importante comercialmente A astaxantina é um pigmento carotenoide laranjaaverme lhado um antioxidante produzido por uma alga marinha Ani mais marinhos como camarão lagosta e alguns peixes que se alimentam de algas têm suas colorações laranja devido à inges tão de astaxantina A astaxantina é composta por oito unidades isoprenoides sua fórmula molecular é C40H52O4 HO CH3 CH3 CH3 H3C H3C O O CH3 H3C CH3 CH3 CH3 OH Astaxantina a Circule as oito unidades isoprenoides na molécula de astaxantina Dica Use os grupos metila projetados como guia A astaxantina é sintetizada pela via mostrada na próxima página iniciando com D 3isopentenilpirofosfato IPP As eta pas ➊ e ➋ estão mostradas na Figura 2136 e a reação catalisa da pela IPPisomerase é mostrada na Figura 2135 b Na etapa ➍ da via duas moléculas de geranilgeranil pirofosfato são ligadas formando fitoeno Esta é uma ligação cabeça com cabeça ou cabeça com cauda Mais detalhes na Figura 2136 c Descreva brevemente a reação química na etapa ➎ d A síntese de colesterol Figura 2137 inclui uma ci clização fechamento de anel que envolve a oxidação líquida por O2 A ciclização na etapa ➏ da via sintética da astaxantina requer a oxidação líquida do substrato licopeno Explique seus argumentos A E coli não produz grandes quantidades de muitos iso prenoides e não sintetiza astaxantina Ela é conhecida por sintetizar pequenas quantidades de IPP DMAPP geranilpi rofosfato farnesilpirofosfato e geranilgeranilpirofosfato Wang e colaboradores clonaram vários dos genes de E coli que codificam as enzimas necessárias para a síntese de asta xantina em plasmídeos que permitem sua superexpressão Esses genes incluem o idi que codifica a IPPisomerase e o ispA que codifica uma preniltransferase que catalisa as etapas ➊ e ➋ Para modificar geneticamente uma E coli tornandoa capaz de realizar a via completa da astaxantina Wang e cola boradores clonaram vários genes de outras bactérias em plas mídeos que permitiriam sua superexpressão em E coli Esses genes incluíam crtE da Erwinia uredovora que codifica uma enzima que catalisa a etapa ➌ e crtB crtI crtY crtZ e crtW da Agrobacterium aurantiacum que codificam as enzimas das etapas ➍ ➎ ➏ ➐ e ➑ respectivamente Os investigadores também clonaram o gene gps da Archa eoglobus fulgidus superexpressaram esse gene em E coli e extraíram o produto gênico Quando esse extrato foi incubado com 14CIPP e DMAPP ou com geranilpirofosfato ou farnesil pirofosfato apenas o geranilgeranilpirofosfato marcado com 14C foi produzido em todos os casos e Com base nesses dados qualis etapas da via ésão catalisadas pela enzima codificada pelo gps Explique seu raciocínio Wang e colaboradores construíram então diversas linha gens de E coli superexpressando os diferentes genes e medi ram a cor laranja das colônias colônias de E coli do tipo sel vagem são brancas e a quantidade de astaxantina produzida Seus resultados estão mostrados a seguir Linhagem Genes superexpressos Cor de laranja Produção de astaxantina mgg de peso seco 1 crtBIZYW ND 2 crtBIZYW ispA ND 3 crtBIZYW idi ND 4 crtBIZYW idi ispA ND 5 crtBIZYW crtE 1 328 6 crtBIZYW crtE ispA 1 353 7 crtBIZYW crtE idi 11 2341 8 crtBIZYW crtE idi ispA 111 3903 9 crtBIZYW gps 1 356 10 crtBIZYW gps idi 111 14188 Nota ND 5 não determinado f Comparando os resultados para as linhagens de 1 a 4 com aqueles para as linhagens de 5 a 8 o que você pode con cluir sobre o nível de expressão de uma enzima capaz de catali Nelson6ed21indd 879 Nelson6ed21indd 879 070414 1425 070414 1425 880 DAVID L NELSON MICHAEL M COX sar a etapa ➌ da via sintética da astaxantina em E coli do tipo selvagem Explique seus argumentos g Com base nos dados qual enzima é limitante nessa via a IPPisomerase ou a enzima codificada pelo idi Explique seu raciocínio h Você esperaria que uma linhagem superexpressando crtBIZYW gps e crtE produza baixos 1 médios 11 ou al tos 111 níveis de astaxantina medidos por sua cor laranja Explique seus argumentos Referência Wang CW Oh MK Liao JC 1999 Engineered isoprenoid pathway enhances astaxanthin production in Escherichia coli Biotechnol Bioeng 62 235241 Geranilpirofosfato C10 1 PPi Farnesilpirofosfato C15 1 PPi Dimetilalilpirofosfato DMAPP D3Isopentenilpirofosfato IPP IPPisomerase ❶ IPP ❷ IPP ❸ O P P P P Geranilgeranilpirofosfato C20 1 PPi Geranilgeranilpirofosfato ❹ ❺ ❻ ❼ ❽ O Fitoeno C40 1 2PPi Licopeno C40 bCaroteno C40 Astaxantina C40 Nelson6ed21indd 880 Nelson6ed21indd 880 070414 1425 070414 1425 221 Visão geral do metabolismo do nitrogênio 881 222 Biossíntese de aminoácidos 891 223 Moléculas derivadas de aminoácidos 902 224 Biossíntese e degradação de nucleotídeos 910 O nitrogênio perde apenas para o carbono o hidrogênio e o oxigênio em sua contribuição para a massa dos sis temas vivos A maior parte desse nitrogênio está ligada à estrutura de aminoácidos e nucleotídeos Neste capítulo serão abordados todos os aspectos do metabolismo desses compostos nitrogenados exceto o metabolismo dos ami noácidos que foi discutido no Capítulo 18 A discussão conjunta das vias biossintéticas dos aminoá cidos e dos nucleotídeos é uma abordagem válida não ape nas porque as duas classes de moléculas contêm nitrogênio oriundo de fontes biológicas em comum mas porque os dois conjuntos de vias encontramse intensamente entrela çados com diversos intermediárioschave em comum Cer tos aminoácidos ou partes de aminoácidos são incorporados nas estruturas de purinas e pirimidinas e em um caso par te de um anel púrico é incorporado em um aminoácido a histidina Os dois conjuntos de vias também compartilham muito da química em especial uma preponderância de rea ções envolvendo a transferência de nitrogênio ou de grupos de um carbono As vias aqui descritas podem ser intimidantes para um estudante iniciando seus estudos de bioquímica Sua complexidade surge não tanto da própria química que em muitos casos é bem compreendida mas do grande número de etapas e da variedade de intermediários Es sas vias serão mais bem compreendidas focalizandose os princípios metabólicos já discutidos os intermediários e precursoreschave e as classes comuns de reações Mesmo um olhar superficial para a química pode ser recompen sador pois nessas vias ocorrem algumas das transforma ções químicas mais incomuns nos sistemas biológicos por exemplo são encontrados exemplos notáveis da rara utili zação biológica dos metais molibdênio selênio e vanádio Esse esforço também oferece vantagens práticas espe cialmente para alunos de medicina humana ou veterinária Descobriuse que muitas doenças genéticas de humanos e animais devemse à ausência de uma ou mais enzimas do metabolismo dos aminoácidos e nucleotídeos e mui tos medicamentos utilizados comumente para combater doenças infecciosas são inibidores de enzimas dessas vias assim como diversos dos mais importantes agentes da quimioterapia anticâncer A regulação é crucial na biossíntese de compostos ni trogenados Já que cada aminoácido e cada nucleotídeo são necessários em quantidades relativamente pequenas o flu xo metabólico pela maioria dessas vias é muito menor que o fluxo biossintético de carboidratos e gorduras nos tecidos animais Uma vez que os diferentes aminoácidos e nucleo tídeos devem ser produzidos nas proporções adequadas e no momento certo para a síntese de proteínas e ácidos nu cleicos suas vias biossintéticas devem ser reguladas e coor denadas umas às outras com precisão Além disso uma vez que aminoácidos e nucleotídeos são moléculas carregadas seus níveis devem ser regulados para manter um equilíbrio eletroquímico na célula Como foi discutido nos capítulos anteriores as vias metabólicas podem ser controladas por alterações na atividade ou na quantidade de enzimas espe cíficas As vias abordadas neste capítulo fornecem alguns dos exemplos mais bem compreendidos de regulação da atividade enzimática O controle das quantidades de dife rentes enzimas em uma célula ou seja de sua síntese e degradação é um tópico que será estudado no Capítulo 28 221 Visão geral do metabolismo do nitrogênio As vias biossintéticas que levam à produção de aminoá cidos e nucleotídeos compartilham uma característica a necessidade de nitrogênio Uma vez que compostos nitro genados solúveis e biologicamente úteis são escassos em ambientes naturais a maior parte dos organismos mantém uma estrita economia em sua utilização de amônia ami noácidos e nucleotídeos De fato como será visto ami noácidos purinas e pirimidinas livres formados durante a renovação metabólica de proteínas e ácidos nucleicos fre quentemente são utilizados em vias de salvação isto é são reutilizados Inicialmente serão examinadas as vias pelas quais o nitrogênio do ambiente é introduzido nos sistemas biológicos 22 Biossíntese de Aminoácidos Nucleotídeos e Moléculas Relacionadas Nelson6ed22indd 881 Nelson6ed22indd 881 020514 1727 020514 1727 882 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O ciclo do nitrogênio permite a manutenção de um conjunto de nitrogênio biologicamente disponível A fonte mais importante de nitrogênio é o ar que apresenta quatro quintos de sua constituição em nitrogênio molecu lar N2 Relativamente poucas espécies podem converter o nitrogênio atmosférico em formas úteis para os organismos vivos Na biosfera os processos metabólicos de diferentes espécies funcionam de forma interdependente salvando e reutilizando formas de nitrogênio biologicamente disponí veis em um vasto ciclo do nitrogênio Figura 221 O primeiro passo no ciclo é a fixação redução do nitrogê nio atmosférico por bactérias fixadoras de nitrogênio pro duzindo amônia NH3 ou NH4 1 Embora a amônia possa ser utilizada pela maior parte dos organismos vivos bactérias do solo que obtêm sua energia pela oxidação da amônia em nitrito NO2 e por fim em nitrato NO3 são tão abundan tes e ativas que praticamente toda a amônia que chega ao solo é oxidada a nitrato Esse processo é denominado nitri ficação Plantas e muitas bactérias podem captar e reduzir facilmente nitrato e nitrito a amônia pela ação de nitrato e nitritoredutases A amônia assim produzida é incorporada nos aminoácidos pelas plantas Animais podem utilizar as plantas como fonte de aminoácidos tanto não essenciais quanto essenciais para construir suas proteínas Quando os organismos morrem a degradação microbiana de suas pro teínas retorna a amônia ao solo onde bactérias nitrificantes novamente a convertem em nitrito e nitrato Um equilíbrio entre o nitrogênio fixado e o nitrogênio atmosférico é man tido por bactérias que reduzem nitrato a N2 em condições anaeróbias processo denominado desnitrificação Figura 221 Essas bactérias do solo utilizam NO3 e não O2 como aceptor final de elétrons em uma série de reações que da mesma forma que a fosforilação oxidativa gera um gradien te de prótons transmembrana que é utilizado para sinteti zar ATP O ciclo do nitrogênio pode sofrer uma espécie de curto circuito promovido por um grupo de bactérias as quais realizam a oxidação anaeróbia da amônia ou anamox Figura 221 processo que converte amônia e nitrito em N2 Entre 50 e 70 da conversão da NH3 em N2 na biosfera pode ocorrer por meio dessa via que só foi detectada na década de 1980 Os organismos anaeróbios obrigatórios que promovem a anamox são fascinantes por suas característi cas e fornecem algumas soluções úteis relativas aos proble mas de tratamento de rejeitos Quadro 221 Agora serão examinados os processos geradores da amônia que é incorporada em microrganismos nos vegetais e nos animais que deles se alimentam Mais de 90 do NH4 1 gerado por plantas vasculares al gas e microrganismos vem da assimilação do nitrato em um processo que compreende duas etapas Inicialmente o NO3 é reduzido a NO2 pela nitratoredutase e então o NO2 é reduzido a NH4 1 em uma transferência de seis elétrons catalisada pela nitritoredutase Figura 222 Ambas as reações envolvem cadeias de carreadores de elétrons e cofatores ainda não considerados neste estudo A nitrato redutase é uma proteína grande e solúvel Mr 220000 Dentro da enzima um par de elétrons doados pelo NADH flui pelos grupos SH da cisteína FAD e de um citocromo cit b557 e daí para um novo cofator contendo molibdênio antes de reduzir o substrato NO3 a NO2 A nitritoredutase das plantas está localizada nos cloro plastos e recebe seus elétrons da ferredoxina é reduzida em reações dependentes da luz na fotossíntese ver Seção 198 Seis elétrons doados um por vez pela ferredoxina passam por um centro 4S4Fe na enzima e então por uma nova molécula do tipo heme siroheme antes de reduzir o NO2 a NH4 1 Figura 222 Em microrganismos não fotos sintéticos o NADPH fornece os elétrons para essa reação A fixação do nitrogênio é realizada por enzimas do complexo da nitrogenase Apenas certas bactérias e arqueias podem fixar o nitrogênio atmosférico Esses organismos denominados diazotróficos incluem as cianobactérias do solo e de águas doces e salga das arqueias metanogênicas anaeróbios estritos que obtêm energia e carbono pela conversão de H2 e CO2 em metano outros tipos de bactérias do solo de vida livre como espé cies de Azotobacter e bactérias fixadoras de nitrogênio que vivem como simbiontes em nódulos de raízes de plantas leguminosas O primeiro produto importante da fixação do nitrogênio é a amônia que pode ser utilizada por todos os organismos seja diretamente ou após conversão em outros compostos solúveis como nitritos nitratos ou aminoácidos NH4 1 amônia Estado de oxidação 23 NO3 2 nitrato Estado de oxidação 15 N2 atmosférico Estado de oxidação 0 NO2 2 nitrito Estado de oxidação 13 Aminoácidos e outros compostos carbonados contendo nitrogênio reduzido Degradação por animais e microrganismos Bactérias e arqueias fixadoras de nitrogênio Bactérias arqueias e fungos desnitrificantes Bactérias nitrificantes Bactérias e arqueias nitrificantes Síntese em plantas e microrganismos Bactérias anamox FIGURA 221 O ciclo do nitrogênio A quantidade total de nitrogênio fixada anualmente na biosfera excede 10 11 kg Reações com setas vermelhas ocorrem inteiramente em sua maior parte em ambientes anaeróbios Nelson6ed22indd 882 Nelson6ed22indd 882 070414 1423 070414 1423 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 883 A redução do nitrogênio em amônia é uma reação exer gônica N2 1 3H2 2NH3 DG9 o 5 335 kJmol A ligação tripla N N entretanto é muito estável com uma energia de ligação de 930 kJmol Assim sendo a fixação do nitrogênio tem uma energia de ativação extremamente alta e o nitrogênio atmosférico é quase quimicamente inerte em condições normais A amônia é produzida industrialmente pelo processo de Haber assim chamado em homenagem a seu inventor Fritz Haber que requer temperaturas de 400 a 500 oC e pressões de nitrogênio e hidrogênio de dezenas de milhares de quilopascais diversas centenas de atmos feras para fornecer a energia de ativação necessária A fi xação biológica de nitrogênio no entanto deve ocorrer em temperaturas biologicamente adequadas e a 08 atmosfera de nitrogênio e a alta barreira da energia de ativação deve ser contornada utilizando outros meios Isso é realizado pelo menos em parte pela ligação e hidrólise do ATP A rea ção global pode ser escrita N2 1 10H 1 1 8e 1 16ATP 2NH4 1 1 16ADP 1 16Pi 1 H2 A fixação biológica do nitrogênio é realizada por um complexo altamente conservado de proteínas denominado complexo da nitrogenase cujos componentes centrais são a dinitrogenaseredutase e a dinitrogenase Figura 223a A dinitrogenaseredutase Mr 60000 é um dímero constituído por duas subunidades idênticas o qual contém um único centro redox 4Fe4S ver Figura 195 ligado en tre as subunidades e que pode ser oxidado e reduzido por um elétron Essa enzima também tem dois sítios para ligação de ATPADP um sítio em cada subunidade A dinitrogena se Mr 240000 um tetrâmero a2b2 contém dois cofatores contendo ferro que transferem elétrons Figura 223b Um deles o grupo P contém um par de centros 4Fe4S que compartilham um átomo de enxofre constituindo um cen tro 8Fe7S O segundo cofator na dinitrogenase é o cofator FeMo uma estrutura nova composta por 7 átomos de Fe 9 átomos de S inorgânico uma cadeia lateral de Cys e um único átomo de carbono no centro do grupo FeS Também parte do cofator é um átomo de molibdênio com ligantes que incluem 3 átomos de S inorgânico uma cadeia lateral de His e dois átomos de oxigênio de uma molécula de homo citrato que é parte intrínseca do cofator FeMo Há também uma forma de nitrogenase que contém vanádio em vez de molibdênio e algumas espécies de bactérias podem pro duzir ambos os tipos de sistemas de nitrogenase A enzima contendo vanádio pode ser o principal sistema de fixação de nitrogênio sob certas condições ambientais A nitrogenase contendo vanádio do Azotobacter vinelandii apresenta a notável capacidade de catalisar a redução do monóxido de carbono CO a etileno C2H4 etano e propano A fixação de nitrogênio é realizada por uma forma de dinitrogenase altamente reduzida e requer oito elétrons seis para a redução do N2 e dois para a produção de uma molécula de H2 A produção de H2 é parte obrigatória do mecanismo de reação mas seu papel biológico no processo não é bem compreendido A dinitrogenase é reduzida pela transferência de elé trons a partir da dinitrogenaseredutase Figura 224 O tetrâmero da dinitrogenase apresenta dois sítios de ligação para a redutase Os oito elétrons necessários são transferi dos um a um da redutase para a dinitrogenase uma molé cula de redutase reduzida ligase à dinitrogenase transfere um único elétron e então a redutase oxidada se dissocia da dinitrogenase em um ciclo que se repete Cada volta do ci clo requer a hidrólise de duas moléculas de ATP pela reduta FIGURA 222 Assimilação do nitrato pela nitratoredutase e pela nitrito redutase a A nitratoredutase de plantas e bactérias catalisa a redução de dois elétrons de NO3 a NO2 na qual um novo cofator contendo Mo desempe nha um papel central O NADH é o do ador de elétrons b A nitritoredutase converte o produto da nitratoredutase em NH4 1 em um processo de transfe rência de seis elétrons e oito prótons em que o centro metálico no siroheme transporta elétrons e os grupos carboxi la do siroheme podem doar prótons A fonte inicial de elétrons é a ferredoxina reduzida a b Siroheme COOH COOH COOH COOH P O O O NO 3 NO 2 H2N 2e NH 4 6e H3C Fe2 N N N N H3C Cofator Mo N HN O N N S S O O Mo O O H H COOH COOH HOOC HOOC Nitrato redutase Nitrito redutase NADH NAD SH FAD Cit b557 MoCo FeS Siroheme Fdred Fdox Nelson6ed22indd 883 Nelson6ed22indd 883 070414 1423 070414 1423 884 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Como seres que respiram ar os humanos facilmente deixam de prestar atenção em bactérias e arqueias que proliferam em ambientes anaeróbios Embora raramente estejam caracterizados em textos introdutórios de bio química esses organismos constituem boa parte da bio massa deste planeta e suas contribuições ao equilíbrio de carbono e nitrogênio na biosfera são essenciais para todas as formas de vida Como detalhado em capítulos anteriores a energia utilizada para a manutenção dos sistemas vivos depende da geração de gradientes de prótons através de membra nas Os elétrons obtidos de um substrato reduzido são disponibilizados para transportadores de elétrons nas membranas e passam através de uma série de compostos transportadores de elétrons até um aceptor final de elé trons Como produto colateral desse processo prótons são liberados para um dos lados da membrana gerando um gradiente de prótons transmembrana O gradiente de prótons é utilizado para sintetizar ATP ou para impulsio nar outros processos dependentes de energia Para to dos os eucariotos o substrato reduzido geralmente é um carboidrato glicose ou piruvato ou um ácido graxo e o aceptor de elétrons é o oxigênio Muitas bactérias e arqueias são bem mais versáteis Em ambientes anaeróbios como sedimentos marítimos e de água doce a variedade de estratégias vitais é extra ordinária Quase qualquer par redox disponível pode ser fonte de energia para algum organismo especializado ou para um grupo de organismos Por exemplo um grande número de bactérias litotróficas litotrófico é um quimio trófico que utiliza fontes inorgânicas para obter energia ver Figura 15 tem uma hidrogenase que utiliza hidrogê nio molecular para reduzir o NAD 1 H2 1 NAD 1 hidrogenase NADH 1 H 1 O NADH é uma fonte de elétrons para vários aceptores de elétrons ligados a membranas gerando o gradiente de prótons necessário para a síntese de ATP Outros orga nismos litotróficos oxidam compostos sulfurosos H2S enxofre elementar ou tiossulfato ou íons fer rosos Um amplo grupo de arqueias denomi nado metanogênios todos anaeróbios estritos extrai energia a partir da redução de CO2 a metano E essa é apenas uma pequena amos tra daquilo que organismos anaeróbios fazem para sobreviver Suas vias metabólicas estão repletas de reações interessantes e de cofa tores altamente especializados desconhecidos em nosso próprio mundo de metabolismo aeróbio obrigatório O es tudo desses organismos pode gerar vantagens práticas e também fornecer pistas sobre as origens da vida em uma Terra primordial com atmosfera desprovida de oxigênio molecular O ciclo do nitrogênio depende de um amplo espec tro de bactérias especializadas Há dois grupos de bac térias nitrificantes aquelas que oxidam amônia a nitritos e aquelas que oxidam os nitritos resultantes a nitratos ver Figura 221 O nitrato perde apenas para o O2 como aceptor biológico de elétrons e muitas bactérias e arqueias podem catalisar a desnitrificação de nitratos produzindo nitrogênio que é novamente convertido em amônia pelas bactérias fixadoras de nitrogênio A amônia é o principal poluente presente em esgotos e em refugos de animais em fazendas sendo também um produto deri vado do refinamento de óleo e da indústria de fertilizan tes Plantas para o tratamento desses resíduos utilizam comunidades de bactérias nitrificantes e desnitrificantes para converter resíduos contendo amônia em nitrogênio atmosférico O processo é caro e requer o fornecimento de carbono orgânico e de oxigênio Nas décadas de 1960 e 1970 esparsos artigos de pes quisa na literatura sugeriram que a amônia poderia ser oxidada anaerobiamente a nitrogênio utilizando nitrito como aceptor de elétrons esse processo foi denominado anamox Os relatos receberam pouca atenção até bac térias que realizam anamox serem descobertas em um sistema de tratamento de dejetos em Delft na Holanda em meados da década de 1980 Uma equipe de microbió logos holandeses liderada por Gijs Kuenen e Mike Jetten iniciou o estudo dessas bactérias logo identificadas como pertencentes a um filo bacteriano incomum os plancto micetos Algumas surpresas se seguiriam A bioquímica subjacente ao processo anamox foi len tamente descoberta Figura Q1 A hidrazina N2H4 molécula altamente reativa utilizada como combustível em foguetes surgiu como um intermediário inesperado QUADRO 221 Estilos de vida incomuns de seres obscuros porém abundantes Citosol Anamoxossomo a e a a b b b g 4H Enzima redutora de nitritos Hidrazina hidrolase NH3 NH2OH H2O H2O N2H4 N2 NO2 5H Enzima de oxidação da hidrazina 4e d b2 c10 a ADP Pi ATP d FIGURA Q1 As reações anamox Amônia e hidroxilamina são convertidas em hidrazina e H2O pela hidrazinahidro lase e a hidrazina é oxidada pela enzima de oxidação da hidrazina produzindo N2 e prótons Os prótons geram um gradiente de prótons para a síntese de ATP No exterior do anamoxossomo os prótons são utilizados pela enzima redutora de nitritos produzindo hidroxilamina e comple tando o ciclo Todas as enzimas do processo anamox estão embebidas na membrana do anamoxossomo Nelson6ed22indd 884 Nelson6ed22indd 884 070414 1423 070414 1423 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 885 Sendo uma molécula pequena a hidrazina é ao mesmo tempo altamente tóxica e difícil de conter Ela se difun de facilmente através de típicas membranas fosfolipí dicas As bactérias anamox resolveram esse problema sequestrando a hidrazina em uma organela especializa da chamada de anamoxossomo A membrana dessa organela é constituída por lipídeos conhecidos como laderanos Figura Q2 nunca antes encontrados na biologia Os anéis de ciclobutanos fundidos apresenta dos pelos laderanos empilhamse de forma compacta formando uma barreira muito densa e diminuindo muito a liberação de hidrazina Os anéis de ciclobutano apre sentam grande tensão e sua síntese é difícil os mecanis mos bacterianos para a síntese desses lipídeos ainda não são conhecidos Os anamoxossomos foram uma descoberta surpreen dente Células bacterianas geralmente não apresentam compartimentos e a ausência de um núcleo delimitado por membranas costuma ser citada como a principal di ferença entre eucariotos e bactérias A descoberta de um tipo de organela em uma bactéria já foi bastante in teressante mas os planctomicetos também apresentam núcleo seu DNA cromossômico está contido dentro de uma membrana Figura Q3 A descoberta dessa orga nização subcelular motivou novas pesquisas no sentido de desvendar a origem dos planctomicetos e a evolução do núcleo nos eucariotos Os planctomicetos represen tam uma antiga linhagem bacteriana com múltiplos gê neros três dos quais são conhecidos por desenvolverem reações anamox Estudos posteriores desse grupo de organismos poderão finalmente nos aproximar de um objetivo extremamente importante da biologia evoluti va a descrição do organismo afetuosamente chamado de LUCA o último ancestral comum universal de Last Universal Common Ancestor de toda a vida em nosso planeta Por enquanto as bactérias anamox fornecem uma grande vantagem para o tratamento de rejeitos reduzin do o custo da remoção da amônia em até 90 os pas sos convencionais de desnitrificação são completamen te eliminados e os custos da aeração associada com a nitrificação são reduzidos e diminuindo a liberação de subprodutos poluentes Claramente uma maior familiari dade com os alicerces bacterianos da biosfera pode tra zer bons resultados à medida que os desafios ambientais do século XXI são enfrentados 02 mm NE N FIGURA Q3 Micrografia eletrônica de transmissão de uma secção trans versal de Gemmata obscuriglobus mostrando o DNA em um núcleo N com envelope nuclear fechado NE Bactérias do gênero Gemmata filo Planctomycetes não realizam reações anamox a b O 2O C O HC HC O CH2 HO CH2 HO O CH2 HO H2C O C FIGURA Q2 a Lipídeos laderanos da membrana do anamoxossomo O mecanismo para a síntese das estruturas dos anéis ciclobutanos fundi dos que são instáveis não é conhecido b Laderanos podem empilhar se formando uma membrana de estrutura muito densa impermeável e hidrofóbica permitindo o sequestro da hidrazina produzida nas reações anamox Nelson6ed22indd 885 Nelson6ed22indd 885 070414 1424 070414 1424 886 DAVID L NELSON MICHAEL M COX se dimérica A fonte imediata de elétrons para a redução da dinitrogenaseredutase varia podendo ser a ferredoxina reduzida ver Seção 198 a flavodoxina reduzida e talvez outras fontes que também tenham um papel nessa redução Em pelo menos uma espécie a fonte primária de elétrons para reduzir a ferredoxina é o piruvato Figura 224 O papel do ATP nesse processo é de certa forma inco mum Como você deve lembrar o ATP pode contribuir não apenas com energia química resultante da hidrólise de uma ou mais de suas ligações fosfoanidrido mas também com energia de ligação p 195 por meio de interações não co valentes que diminuem a energia de ativação Na reação ca talisada pela dinitrogenaseredutase tanto a ligação do ATP quanto sua hidrólise determinam alterações conformacionais na proteína que ajudam a superar a alta energia de ativação da fixação do nitrogênio A ligação de duas moléculas de ATP à redutase desloca o potencial de redução E9 o dessa proteína de 300 para 420 mV e esse aumento de poder redutor é necessário para a transferência de elétrons pela dinitrogenase até o N2 o potencial de redução padrão para a hemirreação N2 1 6H 1 1 6e 2 NH3 é 034 V As mo Dinitrogenase redutase Dinitrogenase subunidade b Dinitrogenase subunidade a 2NH 3 ADP Mg Centro redox 4Fe4S 6e 6e 6e Cofator FeMo Grupo P N2 Pred aCys 88 aHis 195 Pox Cofator FeMo Mo Homocitrato b a FIGURA 223 Enzimas e cofatores do complexo da nitrogenase PDB ID 1FP6 e PDB 1M1N a A holoenzima consiste em duas moléculas idên ticas de dinitrogenaseredutase verde cada qual com um centro redox 4Fe4S e sítios de ligação para dois ATP e dois heterodímeros idênticos de dinitrogenase roxo e azul cada qual com um grupo P centro FeS e um cofator FeMo Nesta estrutura o ADP está ligado ao sítio do ATP para tornar o cristal mais estável b Os cofatores para a transferência de elétrons Um grupo P é mostrado aqui em suas formas reduzida parte superior e oxidada meio O cofator FeMo parte inferior apresenta um átomo de Mo ligado a três S uma His e dois átomos de oxigênio de uma molécula de homocitrato Em alguns organismos o átomo de Mo é substituído por um átomo de vaná dio O Fe é mostrado em cor de laranja o S em amarelo FIGURA 224 Fluxo de elétrons na fixação do nitrogênio pelo com plexo da nitrogenase Os elétrons são transferidos do piruvato para a dinitrogenase via ferredoxina ou flavodoxina e dinitrogenaseredutase A dinitrogenaseredutase reduz a dinitrogenase que recebe um elétron de cada vez sendo necessários pelo menos seis elétrons para fixar uma molé cula de N2 Dois elétrons adicionais são utilizados para reduzir 2 H 1 a H2 em um processo que acompanha obrigatoriamente a fixação de nitrogênio em anaeróbios perfazendo um total de oito elétrons necessários por molécula de N2 As estruturas das subunidades e os cofatores metálicos das proteínas dini trogenaseredutase e dinitrogenase estão descritos no texto e na Figura 223 8 Ferredoxinas ou 8 flavodoxinas oxidadas 8 Dinitrogenase redutases oxidadas 16 ATP Dinitrogenase oxidada Dinitrogenase reduzida 8 Dinitrogenase redutases reduzidas 8 Dinitrogenase redutases oxidadas 8 Ferredoxinas ou 8 flavodoxinas reduzidas N2 2NH 4 8 Dinitrogenase redutases reduzidas 16 ATP 2H H2 8e 8e 8e 6e 16 ATP 16 ADP 16Pi 4 CoA 4 Piruvato 4 CO2 4 acetilCoA Nelson6ed22indd 886 Nelson6ed22indd 886 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 887 léculas de ATP são então hidrolisadas imediatamente antes da transferência de fato de um elétron para a dinitrogenase A ligação e a hidrólise do ATP mudam a conformação da nitrogenaseredutase em duas regiões as quais são estrutu ralmente homólogas às regiões comutadoras 1 e 2 de pro teínas ligantes de GTP envolvidas na sinalização biológica ver Quadro 122 A ligação do ATP produz uma alteração conformacional que traz o centro 4Fe4S da redutase para mais próximo ao grupo P da dinitrogenase de uma dis tância de 18 Å para 14 Å o que facilita a transferência de elétrons entre a redutase e a dinitrogenase Os detalhes da transferência de elétrons do grupo P para o cofator FeMo e os meios pelos quais oito elétrons acumulamse na nitroge nase não são bem conhecidos assim como não são comple tamente conhecidos os intermediários dessa reação duas hipóteses razoáveis estão sendo testadas ambas envolven do o átomo de Mo em um papel central Figura 225 Outra característica importante do complexo da nitro genase é sua extrema labilidade na presença do oxigênio A redutase é inativada pelo ar com meiavida de 30 segundos a dinitrogenase apresenta meiavida de apenas 10 minutos na presença de ar Bactérias de vida livre que fixam nitrogê nio lidam com esse problema de diversas formas Algumas vivem apenas anaerobiamente ou reprimem a síntese da nitrogenase quando o oxigênio estiver presente Algumas espécies aeróbias como o Azotobacter vinelandii desa coplam parcialmente a transferência de elétrons da síntese de ATP de modo que o oxigênio é gasto tão rapidamente quanto entra na célula ver Quadro 191 Quando fazem fixação de nitrogênio culturas dessas bactérias induzem um aumento real da temperatura como resultado de seus esforços para se livrar do oxigênio A relação simbiótica entre plantas leguminosas e bac térias fixadoras de nitrogênio nos nódulos de suas raízes Figura 226 engloba os dois problemas do complexo da nitrogenase as necessidades de energia e a labilidade fren te ao oxigênio É provável que a energia necessária para a fixação do nitrogênio tenha sido a força que evolutivamente levou a essa associação entre planta e bactéria As bactérias FIGURA 226 Nódulos fixadores de nitrogênio a Nódulos das raízes da ervilha Pisum saliva uma legu minosa A flor desta planta comum é mostrada no de talhe b Micrografia eletrônica colorida artificialmente de uma fina secção transversal de um nódulo da raiz de ervilhas Bactérias fixadoras de nitrogênio simbióticas ou bacteroides vermelho vivem dentro da célula do nódulo cercadas pela membrana peribacteroide azul Os bacteroides produzem o complexo da nitrogenase que converte nitrogênio atmosférico N2 em amônio NH4 1 sem os bacteroides a planta é incapaz de uti lizar N2 A célula infectada da raiz fornece alguns fato res essenciais para a fixação de nitrogênio incluindo a leghemoglobina esta hemeproteína apresenta alta afinidade de ligação ao oxigênio o qual é um forte ini bidor da nitrogenase O núcleo celular é mostrado em amareloverde Outras organelas da célula infectada da raiz normalmente encontradas em células vegetais não estão visíveis nesta micrografia a b 2 mm Dinitrogênio Cofator FeMo Diazenida Nitrito Hidrazida Imida Amida Amina N NH N N M M NH2 NH3 NH3 NH3 N M N M NH M NH NH2 NH NH M M NH2 N2 NH2 M NH2 M NH3 M FIGURA 225 Duas hipóteses razoáveis para os intermediários en volvidos na reação do N2 Em ambos os cenários o cofator FeMo aqui abreviado como M desempenha um papel central ligandose diretamente a um dos átomos de nitrogênio do N2 e permanecendo ligado durante toda a sequência de etapas reducionais Nelson6ed22indd 887 Nelson6ed22indd 887 070414 1424 070414 1424 888 DAVID L NELSON MICHAEL M COX nos nódulos das raízes têm acesso a um grande reservatório de energia na forma de abundantes carboidratos e interme diários do ciclo do ácido cítrico disponibilizados pela plan ta Isso pode permitir à bactéria fixar nitrogênio em quanti dades centenas de vezes maiores que o fazem suas primas de vida livre nas condições normalmente encontradas no solo Para resolver o problema da toxicidade pelo oxigênio as bactérias nos nódulos das raízes ficam banhadas em uma solução contendo uma hemeproteína ligadora de oxigênio a leghemoglobina produzida pela planta embora o heme possa ser fornecido pelas bactérias A leghemoglobina liga todo o oxigênio disponível de modo que ele não pode interferir na fixação do nitrogênio e libera de maneira efi ciente o oxigênio junto ao sistema de transferência de elé trons bacteriano O benefício para a planta naturalmente é um farto suprimento de nitrogênio reduzido De fato os simbiontes bacterianos geralmente produzem muito mais NH3 do que o necessário para seu parceiro simbionte o ex cesso é liberado para o solo A eficiência da simbiose entre plantas e bactérias tornase evidente no enriquecimento do nitrogênio do solo realizado por plantas leguminosas Esse enriquecimento da NH3 no solo é a base dos métodos de rotação de culturas nos quais o cultivo de plantas não legu minosas como o milho que extraem do solo o nitrogênio fixado é alternado a cada poucos anos com o cultivo de le guminosas como alfafa ervilhas ou trevo A fixação do nitrogênio é um processo energeticamente dispendioso 16 moléculas de ATP e 8 pares de elétrons pro duzem apenas 2 NH3 Assim sendo não é de surpreender que o processo seja estritamente regulado de modo que a NH3 é produzida apenas quando necessário Alta ADP um indica dor de baixa ATP inibe fortemente a nitrogenase O NH4 1 re prime a expressão de aproximadamente 20 genes da fixação do nitrogênio nif inibindo efetivamente a via A alteração covalente da nitrogenase é também utilizada por alguns seres diazotróficos para controlar a fixação do nitrogênio em res posta à disponibilidade de NH4 1 nas cercanias Por exemplo a transferência de um grupo ADPribosila a partir de um NADH para um resíduo específico de Arg na nitrogenaseredutase inibe a fixação do N2 no Rhodospirillum Essa é a mesma modificação covalente vista no caso da inibição da proteína G pelas toxinas do cólera e pertussis ver Quadro 122 A fixação do nitrogênio é alvo de intensos estudos devi do à sua imensa importância prática A produção industrial de amônia para utilização em fertilizantes requer um grande e dispendioso fornecimento de energia e isso tem estimu lado esforços no sentido de desenvolver organismos recom binantes ou transgênicos que possam fixar nitrogênio Em princípio técnicas de DNA recombinante Capítulo 9 pode riam ser utilizadas para transferir DNA que codifica enzimas da fixação de nitrogênio para bactérias e plantas não fixado ras de nitrogênio Contudo apenas a transferência desses genes não será suficiente Cerca de 20 genes são essenciais para a atividade da nitrogenase nas bactérias muitos deles necessários para a síntese reunião e inserção de cofatores Há também o problema de proteger a enzima em seu novo ambiente da destruição pelo oxigênio No conjunto há enor mes desafios na engenharia da produção de novas plantas fixadoras de nitrogênio O sucesso desses esforços depen derá de se conseguir contornar o problema da toxicidade do oxigênio em qualquer célula que produza a nitrogenase A amônia é incorporada em biomoléculas via glutamato e glutamina O nitrogênio reduzido na forma de NH4 1 é incorporado nos aminoácidos e a seguir em outras biomoléculas nitrogena das Dois aminoácidos glutamato e glutamina fornecem um ponto de entrada crítico Lembre que esses mesmos dois aminoácidos desempenham papéis centrais no catabolismo da amônia e dos grupos amino na oxidação dos aminoácidos Capítulo 18 O glutamato é fonte de grupos amino para a maior parte dos demais aminoácidos por meio de reações de transaminação o reverso da reação mostrada na Figura 184 O nitrogênio amídico da glutamina é fonte de grupos amino em uma ampla gama de processos biossintéticos Na maioria dos tipos celulares e nos fluidos extracelulares dos organismos superiores um desses aminoácidos ou ambos estão presentes em concentrações mais elevadas algumas vezes de uma ordem de magnitude ou até mais que outros aminoácidos Uma célula de Escherichia coli necessita de tanto glutamato que esse aminoácido é um dos principais solutos no citosol Sua concentração é regulada não apenas em resposta às necessidades de nitrogênio na célula mas também em função da manutenção de um balanço osmótico entre o citosol e o meio externo As vias biossintéticas para a produção de glutamato e glutamina são simples e todos os passos ou alguns deles ocorrem na maioria dos organismos A via mais importante para a incorporação de NH4 1 em glutamato é constituída por duas reações Inicialmente a glutaminasintetase catali sa a reação entre glutamato e NH4 1 produzindo glutamina Essa reação ocorre em duas etapas com o gglutamilfos fato ligado à enzima como intermediário ver Figura 188 1 Glutamato 1 ATP gglutamilfosfato 1 ADP 2 gGlutamilfosfato 1 NH4 1 glutamina 1 Pi 1 H 1 Soma Glutamato 1 NH4 1 1 ATP glutamina 1 ADP 1 Pi 1 H 1 221 A glutaminasintetase é encontrada em todos os organis mos Além de sua importância para a incorporação de NH4 1 em bactérias esse aminoácido tem um papel central no metabolismo de aminoácidos em mamíferos convertendo NH4 1 livre que é tóxico em glutamina para transporte pelo sangue Capítulo 18 Em bactérias e plantas o glutamato é produzido a partir da glutamina em uma reação catalisada pela glutamatosintase O nome alternativo dessa enzima é glutamatooxoglutarato aminotransferase que origina o acrônimo GOGAT pelo qual a enzima também é conhecida O acetoglutarato interme diário do ciclo do ácido cítrico sofre aminação redutora com a glutamina como doador de nitrogênio aCetoglutarato 1 glutamina 1 NADPH 1 H 1 2 glutamato 1 NADP 1 222 A reação líquida global considerando a glutaminasinte tase e a glutamatosintase Equações 221 e 222 é aCetoglutarato 1 NH4 1 1 NADPH 1 ATP Lglutamato 1 NADP 1 1 ADP 1 Pi A glutamatosintase não está presente em animais os quais por outro lado mantêm altos níveis de glutamato por meio Nelson6ed22indd 888 Nelson6ed22indd 888 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 889 de processos como a transaminação do acetoglutarato du rante o catabolismo dos aminoácidos O glutamato também pode ser formado por meio de ou tra via embora de menor importância a reação entre a cetoglutarato e NH4 1 formando glutamato em uma única etapa Essa reação é catalisada pela Lglutamatodesidro genase uma enzima presente em todos os organismos Os equivalentes redutores são fornecidos pelo NADPH aCetoglutarato 1 NH4 1 1 NADPH Lglutamato 1 NADP 1 1 H2O Essa reação já foi estudada no catabolismo dos aminoácidos ver Figura 187 Em células eucarióticas a Lglutamato desidrogenase localizase na matriz mitocondrial O equi líbrio da reação favorece os reagentes e o Km para o NH4 1 1 mM é tão alto que a reação provavelmente tenha ape nas uma contribuição modesta para a captação de NH4 1 em aminoácidos e outros metabólitos Lembre que a reação da glutamatodesidrogenase no sentido inverso ver Figura 1810 é uma fonte do NH4 1 destinado ao ciclo da ureia Concentrações de NH4 1 suficientemente altas para que a reação da glutamatodesidrogenase tenha uma contribuição significativa para os níveis de glutamato geralmente ocor rem apenas quando NH3 é adicionado ao solo ou quando os organismos crescem em laboratório na presença de altas concentrações de NH3 Em geral bactérias do solo e plan tas dependem basicamente da via utilizando duas enzimas descrita anteriormente Equações 221 e 222 A reação da glutaminasintetase é um ponto importante de regulação no metabolismo do nitrogênio A atividade da glutaminasintetase é regulada em pratica mente todos os organismos o que não é surpreendente dado seu papel metabólico central como ponto de entrada para o nitrogênio reduzido Em bactérias entéricas como a E coli a regulação é incomumente complexa A enzima do tipo I de bactérias apresenta 12 subunidades idênticas de Mr 50000 Figura 227 e é regulada tanto alostericamente quanto por modificação covalente A enzima do tipo II de eucario tos e de algumas bactérias tem 10 subunidades idênticas A alanina a glicina e pelo menos seis produtos finais do me tabolismo da glutamina são inibidores alostéricos da enzima Figura 228 Cada inibidor por si só produz apenas uma inibição parcial mas os efeitos de múltiplos inibidores são mais que aditivos e todos os oito em conjunto praticamente desligam a enzima Esse é um exemplo de inibição por re troalimentação cumulativa Esse mecanismo de controle for nece um ajuste constante dos níveis de glutamina de forma a satisfazer as necessidades metabólicas imediatas da célula Sobreposta à regulação alostérica está a inibição por adenililação adição de AMP da Tyr 397 localizada próxima ao sítio ativo da enzima Figura 229 Essa modificação covalente aumenta a sensibilidade aos inibidores alostéri cos e a atividade diminui à medida que mais subunidades vão sendo adenililadas Tanto a adenililação quanto a de sadenililação são realizadas pela adenililtransferase AT na Figura 229 parte de uma cascata enzimática comple xa que responde aos níveis de glutamina acetoglutarato ATP e Pi A atividade da adenililtransferase é modulada pela ligação a uma proteína reguladora denominada PII e a atividade da PII por sua vez é regulada por modifica ção covalente uridililação novamente em um resíduo de Tyr O complexo entre adenililtransferase e PII uridililada PIIUMP estimula a desadenililação enquanto o mesmo complexo com a PII desuridililada estimula a adenililação da glutaminasintetase Tanto a uridililação quanto a desu ridililação da PII são catalisadas por uma única enzima a uridililtransferase A uridililação é inibida pela ligação ADP Glutamato FIGURA 227 Subunidades estruturais da glutaminasintetase bacte riana do tipo I PDB ID 2GLS Esta imagem mostra seis das doze subuni dades idênticas uma segunda camada de seis subunidades situase direta mente abaixo das seis aqui mostradas Cada uma das 12 subunidades tem um sítio ativo onde ATP e glutamato são ligados em orientações que favore cem a transferência de um grupo fosforila do ATP para a carboxila da cadeia lateral do glutamato Nesta estrutura cristalina o ADP ocupa o lugar do ATP Glutamato ATP ADP Pi NH3 Glutamina CTP Histidina Glicosamina6fosfato AMP Triptofano Carbamoilfosfato Glicina Alanina Glutamina sintetase FIGURA 228 Regulação alostérica da glutaminasintetase A enzima está sujeita à regulação cumulativa por seis produtos finais do metabolismo da glutamina A alanina e a glicina provavelmente atuam como indicadores do estado geral do metabolismo dos aminoácidos na célula Nelson6ed22indd 889 Nelson6ed22indd 889 070414 1424 070414 1424 890 DAVID L NELSON MICHAEL M COX de glutamina e Pi à uridililtransferase e é estimulada pela ligação de acetoglutarato e ATP à PII A regulação não cessa nesse ponto A PII uridililada tam bém controla a ativação da transcrição do gene que codifica a glutaminasintetase aumentando a concentração celular da enzima a PII desuridililada por sua vez determina uma diminuição na transcrição do mesmo gene O mecanismo en volve uma interação da PII com outras proteínas envolvidas na regulação gênica de um tipo descrito no Capítulo 28 O resultado final desse elaborado sistema de controle é uma diminuição na atividade da glutaminasintetase quando os níveis de glutamina estão altos e um aumento nessa ativida de enzimática quando os níveis de glutamina estão baixos e houver disponibilidade de acetoglutarato e ATP substra tos da reação da sintetase Os vários níveis de regulação permitem uma resposta de grande sensibilidade em que a síntese de glutamina se ajusta às necessidades celulares Diversas classes de reações desempenham papéis especiais na biossíntese de aminoácidos e nucleotídeos As vias descritas neste capítulo incluem uma série de rear ranjos químicos interessantes Diversos deles são recorren tes e receberão especial atenção antes do estudo das vias em si Eles incluem 1 reações de transaminação e outros rearranjos promovidos por enzimas contendo piridoxal fosfato 2 transferência de grupos de um carbono utili zando como cofatores tetrahidrofolato em geral nos níveis de oxidação CHO e CH2OH ou Sadenosilmetionina no nível de oxidação CH3 e 3 transferência de gru pos amino derivados do nitrogênio amídico da glutamina Piridoxalfosfato PLP tetrahidrofolato H4folato e S adenosilmetionina adoMet são descritos com detalhes no Capítulo 18 ver Figuras 186 1817 e 1818 Aqui será focalizado o estudo da transferência de grupos amino envol vendo o nitrogênio amídico da glutamina Mais de doze reações biossintéticas conhecidas utilizam a glutamina como a principal fonte fisiológica de grupos amino a maioria delas ocorrendo nas vias descritas nes te capítulo Como classe as enzimas que catalisam essas reações são denominadas glutaminaamidotransfera ses Todas elas apresentam dois domínios estruturais um deles liga a glutamina e o outro liga o segundo substrato que serve como aceptor do grupo amino Figura 2210 Acreditase que um resíduo de Cys conservado no domínio onde ocorre a ligação da glutamina atue como nucleófilo clivando a ligação amida da glutamina e formando um in termediário glutamilenzima covalentemente ligado A NH3 produzida nessa reação não é liberada e sim transferida por meio de um canal de amônia a um segundo sítio ativo onde reage com o segundo substrato formando um produto aminado O intermediário covalente é hidrolisado liberando a enzima livre e o glutamato Se o segundo substrato ne cessitar ser ativado o método usual é a utilização de ATP para gerar um intermediário acilfosfato ROX na Figura 2210 onde X é o grupo fosforila A enzima glutaminase atua de modo semelhante mas utiliza H2O como o segundo substrato produzindo NH4 1 e glutamato ver Figura 188 RESUMO 221 Visão geral do metabolismo do nitrogênio c O nitrogênio molecular que constitui 80 do nitrogênio da atmosfera da Terra encontrase indisponível para a maior parte dos organismos vivos até que seja reduzido A fixação do N2 atmosférico ocorre em certas bactérias de vida livre e em bactérias simbióticas nos nódulos das raízes de plantas leguminosas c Em bactérias do solo e em plantas vasculares a ação se quencial da nitratoredutase e da nitritoredutase con verte o NO3 em NH3 que pode ser assimilada em com postos contendo nitrogênio c O ciclo do nitrogênio permite a formação de amônia pela fixação bacteriana do N2 a nitrificação da amônia em ni trato por organismos no solo a conversão do nitrato em amônia por plantas superiores a síntese de aminoácidos a partir da amônia por todos os organismos e a conversão de nitrato em N2 por bactérias desnitrificantes do solo As bactérias anamox oxidam anaerobiamente a amônia em nitrogênio utilizando nitrito como aceptor de elétrons c A fixação de N2 como NH3 é realizada pelo complexo da nitrogenase em uma reação que requer um grande in vestimento de ATP e de poder redutor O complexo da nitrogenase é altamente lábil na presença de O2 e está sujeito a regulação pela disponibilidade de NH3 c Nos sistemas vivos o nitrogênio reduzido é inicialmente incorporado nos aminoácidos e a seguir em uma va riedade de outras biomoléculas incluindo os nucleotí deos O pontochave para essa entrada do nitrogênio é O P CH2 O H OH Adenina a b O O H OH H H O AMP UMP UMP Glutamina sintetase inativa ADP Pi Desadenililação Adenililação PPi AT PII Pi ADP AT PII PII PII UMP H2O PPi Uridililação UT ATP ATP UTP NH3 aCetoglutarato Glutamato AT AT Glutamina Glutamina sintetase ativa Tyr Enzima FIGURA 229 Segundo nível de regulação da glutaminasintetase mo dificações covalentes a Um resíduo de tirosina adenililado b Cascata levando à adenililação inativação da glutaminasintetase AT representa ade nililtransferase UT uridililtransferase PII é uma proteína reguladora ela própria regulada por uridililação Detalhes dessa cascata são discutidos no texto Nelson6ed22indd 890 Nelson6ed22indd 890 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 891 o aminoácido glutamato O glutamato e a glutamina são doadores de nitrogênio em uma ampla gama de reações biossintéticas A glutaminasintetase que catalisa a for mação de glutamina a partir do glutamato é uma impor tante enzima reguladora do metabolismo do nitrogênio c As vias biossintéticas para os aminoácidos e os nucleotí deos utilizam repetidamente os cofatores biológicos piri doxalfosfato tetrahidrofolato e Sadenosilmetionina O piridoxalfosfato é necessário para reações de transami nação envolvendo o glutamato e para outras transforma ções dos aminoácidos Transferências de grupos de um carbono necessitam de Sadenosilmetionina e tetrahi drofolato Glutaminaamidotransferases catalisam rea ções que incorporam o nitrogênio derivado da glutamina 222 Biossíntese de aminoácidos Todos os aminoácidos são derivados de intermediários da glicólise do ciclo do ácido cítrico ou da via das pentoses fosfato Figura 2211 O nitrogênio entra nessas vias por meio do glutamato ou da glutamina Algumas vias são sim ples outras não Dez dos aminoácidos estão a apenas um ou a poucos passos dos metabólitos comuns dos quais são derivados As vias biossintéticas para outros aminoácidos como os aminoácidos aromáticos são mais complexas H3N Cys SH CH2 CH2 H Canal para a NH3 Glutamina amidotransferase ➊ ➋ Domínio de ligação da glutamina Domínio de ligação do aceptor de NH3 Glutamina Aceptor H2O Glutamato Substrato ativado NH2 CH C COO OH ou R R1 R2 O C O Intermediário glutamilenzima H3N Cys S CH2 CH2 CH C COO O NH3 NH2 OX ou R R1 R R2 O C OX or H R1 R2 NH C H2O O nitrogênio gamídico da glutamina em vermelho é liberado como NH3 em uma reação que provavelmente envolve um intermediário covalente glutamilenzima A NH3 viaja através de um canal até o segundo sítio ativo A NH3 reage com qualquer de diversos aceptores MECANISMO FIGURA 2210 Mecanismo proposto para as glutamina amidotransferases Cada enzima apresenta dois domínios O domínio que tem o sítio de ligação para a glutamina contém elementos estruturais conservados entre muitas destas enzimas incluindo um resíduo de Cys ne cessário para a atividade O domínio de ligação do aceptor de NH3 segundo substrato varia São mostrados dois tipos de aceptores de grupos amino X representa um grupo ativador geralmente um grupo fosforila derivado do ATP que facilita o deslocamento pela NH3 de um grupo hidroxila do ROH Histidina Glutamina Prolina Arginina Asparagina Metionina Treonina Lisina Piruvato Triptofano Fenilalanina Tirosina Fosfoenolpiruvato Glicina Cisteína Serina 4 passos 4 passos Alanina Valina Leucina Isoleucina Eritrose4 fosfato 3Fosfoglicerato Glicose6fosfato Glicose Glutamato Aspartato Oxaloacetato Ribose5 fosfato aCetoglutarato Citrato FIGURA 2211 Visão geral da biossíntese de aminoácidos Os precur sores dos esqueletos de carbono são obtidos a partir de três fontes a glicólise cor salmão o ciclo do ácido cítrico azul e a via das pentosesfosfato roxo Nelson6ed22indd 891 Nelson6ed22indd 891 070414 1424 070414 1424 892 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os organismos variam muito em sua capacidade de sintetizar os 20 aminoácidos comuns Enquanto a maior parte das bactérias e plantas pode sintetizar todos eles os mamíferos sintetizam apenas cerca de metade deles geralmente aqueles com vias de síntese mais simples Es ses são os aminoácidos não essenciais não necessários na dieta ver Tabela 181 Os demais os aminoácidos essenciais devem ser obtidos por meio dos alimentos A não ser que esteja indicado as vias para os 20 aminoácidos comuns apresentadas a seguir são aquelas operantes nas bactérias Uma forma útil de organizar essas vias biossintéticas é agrupálas em seis famílias correspondentes aos seus pre cursores metabólicos Tabela 221 e essa abordagem será utilizada para estruturar as descrições detalhadas a seguir Além desses seis precursores há um intermediário notável em diversas vias de síntese de aminoácidos e nucleotídeos o 5fosforribosil1pirofosfato PRPP O P OH CH2 O2 2O H OH H H H O O O O P P O O O2 O2 O2 O PRPP é sintetizado a partir da ribose5fosfato obtida da via das pentosesfosfato ver Figura 1422 em reação ca talisada pela ribosefosfatopirofosfocinase Ribose5fosfato 1 ATP 5fosforribosil1pirofosfato 1 AMP Essa enzima é regulada alostericamente por muitas das bio moléculas para as quais o PRPP é um precursor O acetoglutarato origina glutamato glutamina prolina e arginina Glutamato Glutamina Prolina Arginina aCetoglutarato Já foram descritas as biossínteses do glutamato e da glu tamina A prolina é um derivado cíclico do glutamato Figura 2212 Na primeira etapa da síntese da prolina o ATP reage com a gcarboxila do glutamato formando um acilfosfato que é reduzido por NADPH ou NADH produ zindo o gsemialdeído do glutamato Esse intermediário so fre uma ciclização rápida e espontânea sendo novamente reduzido para produzir a prolina A arginina é sintetizada a partir do glutamato via orni tina usando reações do ciclo da ureia nos animais Capítulo 18 Em princípio a ornitina também pode ser sintetizada a partir do gsemialdeído do glutamato por transaminação mas a ciclização espontânea do semialdeído gerando pro lina não permite um suprimento suficiente desse interme diário para a síntese de ornitina As bactérias apresentam uma via biossintética de novo para a ornitina e portanto para a arginina paralela a algumas etapas da via da proli na mas inclui duas etapas adicionais que evitam o proble ma da ciclização espontânea do gsemialdeído do glutamato Figura 2212 Na primeira etapa o grupo aamino do glu tamato é bloqueado por uma acetilação para a qual é utili zada a acetilCoA depois após o passo de transaminação o grupo acetila é removido para produzir ornitina As vias para a produção de prolina e arginina são um pouco diferentes nos mamíferos A prolina pode ser sinte tizada pela via mostrada na Figura 2212 mas também é produzida a partir da arginina obtida da dieta ou de proteí nas teciduais A arginase enzima do ciclo da ureia converte arginina em ornitina e ureia ver Figuras 1810 e 1826 A ornitina é convertida no gsemialdeído do glutamato pela enzima ornitinadaminotransferase Figura 2213 O semialdeído cicliza produzindo D 1pirrolina5carboxilato o qual é então convertido em prolina Figura 2212 A via mostrada na Figura 2212 para a síntese de arginina não ocorre em mamíferos Quando a arginina obtida da dieta ou da renovação de proteínas for insuficiente para a síntese proteica a reação da ornitinadaminotransferase opera no sentido da formação de ornitina A ornitina é então conver tida em citrulina e arginina pelo ciclo da ureia Serina glicina e cisteína são derivadas do 3fosfoglicerato 3Fosfoglicerato Serina Cisteína Glicina TABELA 221 Famílias biossintéticas dos aminoácidos agrupadas de acordo com o precursor metabólico aCetoglutarato Glutamato Glutamina Prolina Arginina Piruvato Alanina Valina Leucina Isoleucina 3Fosfoglicerato Serina Glicina Cisteína Fosfoenolpiruvato e eritrose4fosfato Triptofano Fenilalanina Tirosina Oxaloacetato Aspartato Asparagina Metionina Treonina Lisina Ribose5fosfato Histidina Aminoácidos essenciais em mamíferos Derivado da fenilalanina em mamíferos Nelson6ed22indd 892 Nelson6ed22indd 892 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 893 FIGURA 2212 Biossíntese de prolina e arginina a partir do glutama to em bactérias Todos os cinco carbonos da prolina provêm do glutama to Em muitos organismos a glutamatodesidrogenase é incomum pelo fato de poder utilizar tanto NADH quanto NADPH como cofator O mesmo talvez possa ocorrer com outras enzimas nessas vias Na via da prolina o gsemial deído sofre uma ciclização rápida e reversível formando D 1pirrolina5car boxilato P5C em que o equilíbrio favorece a formação do P5C Na via da ornitinaarginina a ciclização não ocorre em função da acetilação do grupo aamino do glutamato no primeiro passo e remoção do grupo acetila após a transaminação Embora algumas bactérias não tenham a arginase e assim não sejam capazes de completar o ciclo da ureia elas podem sintetizar a arginina a partir da ornitina utilizando reações paralelas às do ciclo da ureia nos mamíferos com a citrulina e o argininossuccinato como intermediários ver Figura 1810 Aqui e nas figuras seguintes deste capítulo as setas nas reações indi cam a via linear até os produtos finais sem considerar a reversibilidade dos passos individuais Por exemplo nessa via o passo que leva à arginina cata lisado pela Nacetilglutamatodesidrogenase é quimicamente similar à rea ção da gliceraldeído3fosfatodesidrogenase na glicólise ver Figura 148 e é facilmente reversível Acetilglutamatosintase Glutamato Nacetilglutamato desidrogenase Pirrolinacarboxilato redutase NAcetilglutamato Nacetilglutamato cinase Glutamatocinase NAcetilgglutamil fosfato gGlutamil fosfato redutase gGlutamil fosfato gSemialdeído do glutamato Não enzimático NAcetilornitina Nacetilornitinase D1Pirrolina5carboxilato P5C gSemialdeído do Nacetilglutamato aCetoglutarato Ornitina Prolina Arginina LCitrulina Argininossuccinato sintetase 1 aspartato Ornitina carbamoil transferase Carbamoilfosfato ADP Fumarato Argininossuccinato Argininossuccinase Ciclo da ureia ATP Aminotransferase Glutamato Nelson6ed22indd 893 Nelson6ed22indd 893 070414 1424 070414 1424 894 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A principal via para a produção de serina é a mesma em todos os organismos Figura 2214 No primeiro passo o grupo hidroxila do 3fosfoglicerato é oxidado por uma desi drogenase utilizando NAD 1 produzindo 3fosfohidroxi piruvato Uma transaminação utilizando glutamato produz 3fosfosserina que é então hidrolisada em serina livre pela fosfosserinafosfatase A serina três carbonos é precursora da glicina dois carbonos pela remoção de um átomo de carbono pela serinahidroximetiltransferase Figura 2214 O tetra hidrofolato recebe o carbono b C3 da serina que forma uma ponte metileno entre N5 e N10 originando N 5N 10 metilenotetrahidrofolato ver Figura 1817 A reação global que é reversível também requer piridoxalfosfato No fígado de vertebrados a glicina pode ser produzida por outra via a reação reversa daquela mostrada na Figura 18 20c catalisada pela glicinasintase também denominada enzima de clivagem da glicina CO2 1 NH4 1 1 N 5N 10metilenotetrahidrofolato 1 NADH 1 H 1 S glicina 1 tetrahidrofolato 1 NAD 1 Plantas e bactérias produzem o enxofre reduzido ne cessário para a síntese de cisteína e de metionina cuja síntese será descrita posteriormente a partir de sulfatos do ambiente a via é mostrada no lado direito da Figura 2215 O sulfato é ativado em duas etapas produzindo 39fosfoadenosina59fosfossulfato PAPS que sofre re dução a sulfeto usando oito elétrons O sulfeto é então utilizado para a formação de cisteína a partir de serina em uma via de dois passos Os mamíferos sintetizam cis teína a partir de dois aminoácidos a metionina fornece o átomo de enxofre e a serina fornece o esqueleto carbona do A metionina é inicialmente convertida em Sadenosil metionina ver Figura 1818 que pode perder seu grupo metila para diversos aceptores formando Sadenosil homocisteína adoHcy Esse produto desmetilado é hi drolisado liberando homocisteína que reage com a serina em uma reação catalisada pela cistationinabsintase produzindo cistationina Figura 2216 Finalmente a cistationinagliase enzima que requer PLP catalisa a remoção de amônia e a clivagem de cistationina produ zindo cisteína livre FIGURA 2213 Reação da ornitinad aminotransferase um passo na via para a prolina em mamíferos Esta enzima é en contrada na matriz mitocondrial da maioria dos tecidos Embora o equilíbrio favoreça a forma ção do P5C a reação reversa é a única via para a síntese da ornitina e portanto da arginina em mamíferos quando os níveis de arginina forem insuficientes para a síntese proteica Ornitina COO2 CH H3N CH2 CH2 CH2 1NH3 1 Ornitina daminotransferase Cetoglutarato a Glutamato COO2 CH H3N CH2 CH2 C H O 1 gSemialdeído do glutamato D1Pirrolina5 carboxilato P5C H2C H2O H2O CH2 C H CH COO2 N H 1 FIGURA 2214 Biossíntese de serina a partir de 3fosfoglicerato e biossíntese de glicina a partir de serina em todos os organismos A glicina também pode ser sintetizada a partir de CO2 e NH4 1 pela ação da gli cinasintase com N 5N 10metilenotetrahidrofolato como doador do grupo metila ver texto Fosfosserina aminotransferase Glutamato aCetoglutarato Fosfosserina fosfatase Serina hidroximetil transferase metileno H4 folato 3Fosfoglicerato Fosfoglicerato desidrogenase 3Fosfohidroxipiruvato 3Fosfosserina Serina Glicina H4 folato Nelson6ed22indd 894 Nelson6ed22indd 894 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 895 Três aminoácidos não essenciais e seis aminoácidos essenciais são sintetizados a partir de oxaloacetato e piruvato Aspartato Asparagina Metionina Treonina Lisina Oxaloacetato Isoleucina Piruvato Alanina Valina Leucina Alanina e aspartato são sintetizados a partir de piruvato e oxaloacetato respectivamente por transaminação com o glutamato A asparagina é sintetizada por amidação do as partato com o NH4 1 sendo doado pela glutamina Esses são aminoácidos não essenciais e suas vias biossintéticas bas tante simples ocorrem em todos os organismos Por razões não compreendidas completamente linfóci tos malignos presentes na leucemia linfoblástica aguda LLA da infância utilizam asparagina sérica para seu cresci 2OOC HOCH2 1 NH3 H2O COO2 CH2 SH HS C O CH CH CH2 CH2 S 1 1NH3 Homocisteína Serina NH4 H2O 2OOC 1 NH3 COO2 CH2 CH CH CH2 Cistationina PLP CH3 2OOC 1 NH3 COO2 CH CH2 CH2 1 aCetobutirato Cisteína Cistationinabsintase Cistationinagliase 1 1NH3 PLP FIGURA 2216 Biossíntese de cisteína a partir de homocisteína e seri na em mamíferos A homocisteína é formada a partir da metionina como descrito no texto FIGURA 2215 Biossíntese de cisteína a partir de serina em bactérias e plantas A origem do enxofre reduzido é mostrada na via à direita ATP SO4 22 1 H1 PPi ADP CH3COO2 S22 1 H1 S22 39Fosfoadenosina 59fosfato PAP NADPH NADP1 ATPsulfurilase APScinase 3NADP1 3NADPH Sulfitoredutase PAPSredutase 2O S O O O2 P O O H H H OH OH H CH2 O O2 Adenina Adenosina 59fosfossulfato APS 2O S O O O2 P O O H H H O SO3 22 P OH H CH2 2O O O O2 O2 Adenina 39Fosfoadenosina 59fosfossulfato PAPS Sulfito Sulfeto COO2 CH2 OH C H H3N 1 Serina COO2 CH2 SH C H H3N 1 Cisteína COO2 CH2 O C H H3N CH3 C O 1 OAcetilserina CoASH H3C C Serina acetiltransferase Oacetilserina tiolliase SCoA O ATP Nelson6ed22indd 895 Nelson6ed22indd 895 070414 1424 070414 1424 896 DAVID L NELSON MICHAEL M COX mento A quimioterapia para essa doença é administrada jun tamente com uma Lasparaginase obtida de bactérias de modo que a enzima funciona reduzindo a asparagina do soro Os tratamentos combinados resultam em uma taxa de remis são maior que 95 nos casos de LLA da infância o tratamen to apenas com Lasparaginase produz remissão em 40 a 60 dos casos No entanto o tratamento com asparaginase tem alguns efeitos colaterais deletérios e cerca de 10 dos pa cientes que alcançam remissão apresentam recidiva com tu mores resistentes à terapia com fármacos Pesquisadores es O C OH CH N H2 CH2 2OOC NH3 1 NH3 NH3 1 NH3 1 NADP1 NADPH 1 H1 O 2O NH3 1 Treonina O CH CH3 COO2 P NH3 1 Aspartilbfosfato O CH2 C H C CH2 CH COO2 NH3 1 H COO2 2OOC NADP NADPH 1 H1 H COO2 2OOC N Dihidropicolinato H H Piruvato Piruvato 1 NH3 COO2 2OOC N D1Piperidina26 dicarboxilato Lisina NH H3N COO2 2OOC O NSuccinil2amino6 cetoLpimelato NH Succinato aCetoglutarato Glutamato PLP COO2 COO2 H2O C H H 1 NSuccinilLL aediamino pimelato CH23 COO2 NH3 1 LLaeDiamino pimelato H3N COO2 C C H H 1 COO2 mesoaeDiamino pimelato H3N COO2 C C H H 1 H3N 1 H1 CH2 CO2 C Aspartato C CH CH2 COO2 NH3 1 ADP CH CH2 COO2 NH3 1 CH CH H2O PLP CH2 P Metionina ADP S CH COO2 NH3 CH2 OH CH2 COO2 CH2 Homosserina CH SuccinilCoA 1 CoA Succinato SuccinilCoA CoA CH CH2 COO2 Succinato CH2 OSuccinilhomosserina O H2O H COO2 NH3 1 C CH CH2 CH2 Cistationina S H2C COO2 NH3 1 Cisteína Succinato CH CH2 CH2 HS COO2 NH3 1 Homocisteína CH2 COO2 O CH2 Fosfohomosserina CH3 OH NH4 1 1 Succinato H2O N5MetilH4 folato H4 folato Pi H2O PLP Pi NADPH 1 H1 NADP1 O CH23 CH23 PLP PLP PLP ATP ATP bSemialdeído do aspartato FIGURA 2217 Biossíntese de seis aminoácidos essenciais a partir de oxaloacetato e piruvato em bactérias metionina treonina lisina iso leucina valina e leucina Aqui e em outras vias com múltiplos passos as enzimas estão listadas na legenda Observe que o LLadiaminopimelato o produto do passo é simétrico Os carbonos obtidos a partir do piruvato e o grupo amino proveniente do glutamato não são seguidos além deste ponto pois as reações subsequentes podem colocálos em qualquer lado da molécula de lisina Nelson6ed22indd 896 Nelson6ed22indd 896 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 897 tão desenvolvendo inibidores da asparaginasintetase humana para acrescentálos às terapias para a LLA da infância Metionina treonina lisina isoleucina valina e leucina são aminoácidos essenciais humanos não são capazes de sintetizálos Suas vias biossintéticas são complexas e in terconectadas Figura 2217 Em alguns casos as vias em bactérias fungos e plantas diferem significativamente A Figura 2217 mostra as vias em bactérias Glutamato CH3 COO2 CO2 OH NH3 1 aCetoglutarato CH C Piruvato CH3 2 Leucina O C CH3 C CH2 COO2 CH CO2 NADH 1 H1 NAD1 OH aAcetolactato CH3 C CH3 COO2 O C OH bIsopropilmalato CH3 CH3 O aIsopropilmalato CH3 COO2 Glutamato HO CH3 COO2 H2O NADPH 1 H1 NADP1 CH3 O NH3 1 aCetoglutarato C CH2 C O COO2 CH2 C CH3 aCetobutirato Isoleucina CH2 CH CH3 CH3 COO2 CH OH aAcetoa hidroxibutirato CH2 C CH3 CH3 COO2 O C H abDihidroxi bmetilvalerato CH2 C CH3 CH3 COO2 OH C O aCetob metilvalerato CH2 C CH3 CH3 COO2 H C C O COO2 CH3 CH3 TPP OH C PLP Piruvato PLP Glutamato CH3 COO2 NADPH 1 H1 NADP1 O NH3 1 aCetoglutarato C CH3 C Valina CH3 CH CH3 COO2 CH OH abDihidroxi isovalerato CH3 C CH3 COO2 OH C O aCetoiso valerato CH3 C CH3 COO2 H C H2O PLP CH3 CH CH3 CH2 CH CH CH CH COO2 COO2 CH2 CH3 COO2 aCetoisocaproato CoA AcetilCoA COO2 OH H OH TPP aspartatocinase desidrogenase do bsemialdeído do aspartato homosserinadesidrogenase homosserinacinase treoninasintase homosserinaaciltransferase cistationinagsintase cistationinabliase metioninasintase dihidropicolinatosintase D1piperidina26dicarboxilatodesidrogenase Nsuccinil2amino6cetopimelatosintase succinildiaminopimelatoaminotransferase succinildiaminopimelatodessuccinilase diaminopimelatoepimerase diaminopimelatodescarboxilase treoninadesidratase serinadesidratase acetolactatosintase hidroxicetoácidoisomerorredutase dihidroxiácidodesidratase valinaaminotransferase aisopropilmalatosintase isopropilmalatoisomerase bisopropilmalatodesidrogenase leucinaaminotransferase Nelson6ed22indd 897 Nelson6ed22indd 897 070414 1424 070414 1424 898 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O aspartato origina metionina treonina e lisina Os pontos de ramificação dessas vias ocorrem a partir do bse mialdeído do aspartato um intermediário em todas as três vias e a partir da homosserina um precursor da treonina e da metionina A treonina por sua vez é um dos precursores da isoleucina As vias da valina e da isoleucina comparti lham quatro enzimas Figura 2217 etapas a O piru vato origina valina e isoleucina por meio de vias que iniciam com a condensação de dois carbonos do piruvato na forma de hidroxietiltiaminapirofosfato ver Figura 1415 com ou tra molécula de piruvato na via da valina ou com acetobu tirato na via da isoleucina O acetobutirato é derivado da treonina em uma reação que requer piridoxalfosfato Figura 2217 etapa Um intermediário na via da valina o acetoi sovalerato é o ponto de partida para uma ramificação da via contendo quatro passos que leva à leucina etapas a O corismato é um intermediáriochave na síntese de triptofano fenilalanina e tirosina Fosfoenolpiruvato Eritrose4fosfato Fenilalanina Tirosina Triptofano Tirosina 1 Anéis aromáticos não estão facilmente disponíveis no am biente apesar de o anel benzênico ser muito estável A via com ramificações levando ao triptofano à fenilalanina e à tirosina que ocorre em bactérias fungos e plantas é a prin cipal via biológica para a formação do anel aromático Ela ocorre pelo fechamento do anel a partir de um precursor alifático seguindose a adição passo a passo das ligações duplas Os quatro primeiros passos produzem chiquimato molécula de sete carbonos derivada da eritrose4fosfato e do fosfoenolpiruvato Figura 2218 O chiquimato é con vertido em corismato por meio de três passos que incluem a adição de mais três carbonos a partir de outra molécula de fosfoenolpiruvato O corismato é o primeiro ponto de rami ficação da via com uma ramificação levando ao triptofano e outra à fenilalanina e à tirosina Na ramificação que produz triptofano Figura 2219 o corismato é convertido em antranilato em uma reação em que a glutamina doa o nitrogênio que se tornará parte do anel indólico O antranilato então se condensa com o PRPP O anel indólico do triptofano é derivado dos carbonos do anel e do grupo amino do antranilato mais dois carbonos oriundos do PRPP A reação final da sequência é catalisada pela triptofanosintase Essa enzima apresenta estrutura com quatro subunidades a2b2 e pode dissociarse em duas subunidades a e uma unidade b2 que catalisam diferentes partes da reação global Indol3glicerolfosfato subunidade a indol 1 gliceraldeído3fosfato Indol 1 serina subunidade b2 triptofano 1 H2O A segunda parte da reação requer piridoxalfosfato Fi gura 2220 O indol formado na primeira parte não é li berado pela enzima Em vez disso movese através de um canal desde o sítio ativo da subunidade a até o sítio ati vo de uma das subunidades b onde se condensa com uma base de Schiff um intermediário formado a partir de serina e PLP Esse tipo de canalização de intermediários pode ser uma característica de toda a via do corismato ao triptofano Sítios ativos enzimáticos que catalisam os diferentes pas sos algumas vezes não são passos sequenciais da via até o triptofano são encontrados em polipeptídeos únicos em algumas espécies de fungos e bactérias mas estão em pro teínas separadas em outras espécies Além disso a ativida de de algumas dessas enzimas requer uma associação não covalente com outras enzimas da via Essas observações sugerem que todas as enzimas da via são componentes de um grande complexo multienzimático tanto em bactérias quanto em eucariotos Tais complexos geralmente não são preservados intactos quando as enzimas são isoladas uti lizando métodos bioquímicos tradicionais mas há grandes evidências da existência de complexos multienzimáticos para essa e outras vias metabólicas ver Seção 163 Em plantas e bactérias a fenilalanina e a tirosina são sintetizadas a partir do corismato em vias muito menos complexas que a via do triptofano O intermediário comum é o prefenato Figura 2221 O passo final em ambos os casos é a transaminação com o glutamato Os animais podem produzir tirosina diretamente a par tir da fenilalanina pela hidroxilação no C4 do grupo fe nila pela fenilalaninahidroxilase essa enzima também participa da degradação da fenilalanina ver Figuras 1823 e 1824 A tirosina é considerada um aminoácido condi cionalmente essencial ou não essencial na medida em que pode ser sintetizada a partir do aminoácido essencial fenilalanina A biossíntese de histidina utiliza precursores da biossíntese de purinas Ribose5fosfato Histidina A via para a síntese de histidina em todas as plantas e bac térias difere em diversos aspectos das vias biossintéticas de outros aminoácidos A histidina é derivada de três pre cursores Figura 2222 o PRPP contribui com cinco car bonos o anel púrico do ATP contribui com um nitrogênio e um carbono e a glutamina fornece o segundo nitrogênio do anel Os passoschave são a condensação do ATP e do PRPP em que o N1 do anel púrico ligase ao C1 ativado da ribose do PRPP etapa ➊ na Figura 2222 a abertura do anel púrico que ao final deixa o N1 e o C2 da ade nina ligados à ribose etapa ➌ e a formação do anel imi dazol uma reação na qual a glutamina doa um nitrogênio etapa ➎ A utilização do ATP como metabólito em vez de um cofator rico em energia é incomum porém não re sulta em desperdício pois se encaixa na via biossintética das purinas A estrutura remanescente da molécula do ATP Nelson6ed22indd 898 Nelson6ed22indd 898 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 899 liberada após a transferência do N1 e do C2 é o 5aminoi midazol4carboxamidaribonucleotídeo AICAR interme diário da biossíntese de purinas ver Figura 2235 que é rapidamente reciclado até ATP A biossíntese de aminoácidos está sob regulação alostérica Como foi detalhado no Capítulo 15 o controle do fluxo por uma via metabólica frequentemente reflete as atividades de múltiplas enzimas daquela via No caso da síntese de ami noácidos a regulação ocorre em parte por meio de inibição por retroalimentação da primeira reação pelo produto final da via Em geral essa primeira reação é catalisada por uma enzima alostérica que desempenha um papel importante no controle geral do fluxo através da via em questão Como exemplo a Figura 2223 mostra a regulação alostérica da síntese de isoleucina a partir de treonina detalhada na Figura 2217 O produto final a isoleucina é um inibidor alostérico da primeira reação da sequência Em bactérias tal modulação alostérica da síntese dos aminoácidos con tribui para o ajuste minuto a minuto da atividade da via às necessidades da célula A regulação alostérica de uma enzima individual pode ser consideravelmente mais complexa Um exemplo é o no tável conjunto de controles alostéricos exercidos sobre a FIGURA 2218 Biossíntese de corismato intermediário na síntese de aminoácidos aromáticos em bactérias e plantas Todos os carbonos são derivados da eritrose4 fosfato lilás ou do fosfoenolpiruvato cor salmão Observe que o NAD 1 necessário como cofator na etapa ➋ é liberado sem modificações ele pode ser transitoriamente reduzido a NADH durante a reação com a formação de um intermediá rio de reação oxidado A etapa ➏ é inibida competitivamente por glifosato COOCH2NHCH2PO3 2 o ingrediente ativo do herbicida Roundup amplamente utilizado Esse her bicida é relativamente atóxico para mamíferos que não apre sentam essa via biossintética Os nomes químicos quinato chiquimato e corismato são derivados dos nomes das plantas em que foram observados acúmulos desses intermediários O C CH2 H2O COO2 C H P CH2 O O C CH2 CHOH COO2 1 O C H P CHOH CH2 O H H HO OH OH C C H NAD1 Pi HO C H OH COO2 H HO Fosfoenolpiruvato PEP Eritrose4fosfato 2Ceto3desoxi Darabinoeptulosonato 7fosfato 3Desidroquinato H2O Pi H OH H COO2 HO H NADP1 NADPH 1 H1 HO H OH H COO2 HO H ADP H OH H COO2 HO H PEP Pi H H COO2 HO H Pi O O COO2 H2 C C O CH2 O C COO2 Chiquimato Chiquimato3 fosfato 5Enolpiruvilchiquimato 3fosfato Corismato 3Desidrochiquimato O O HO 3Desidrochiquimato P P P COO2 2ceto3desoxiDarabinoeptulosonato 7fosfatosintase desidroquimatosintase 3desidroquinatodesidratase chiquimatodesidrogenase chiquimatocinase 5enolpiruvilchiquimato3fosfato sintase corismatosintase ATP Nelson6ed22indd 899 Nelson6ed22indd 899 070414 1424 070414 1424 900 DAVID L NELSON MICHAEL M COX glutaminasintetase de FE coli Figura 228 Seis produtos COO derivados da glutamina atuam como moduladores na retro CH alimentacao negativa da enzima e os efeitos gerais desses e i Corismato de outros moduladores sao mais que aditivos Tal regulagao OCCOO é denominada inibicéo orquestrada HO u H Mecanismos adicionais contribuem para a regulacgao das vias biossintéticas dos aminoacidos Uma vez que os Glutamina 20 aminodcidos comuns devem ser produzidos nas propor 0 Glutamato des adequadas para a sintese proteica as células desen volveram formas nao apenas de controlar as velocidades Piruvato de sintese de aminoacidos individuais mas também de COO produzilos de modo coordenado Tal coordenagao é es NH pecialmente bem desenvolvida em células bacterianas de Antranilato crescimento rapido A Figura 2224 mostra como as célu las de FE coli coordenam a sintese de lisina metionina tre onina e isoleucina aminoacidos esses produzidos todos a e PRPP partir do aspartato Diversos tipos importantes de padroes PP inibidores sao evidenciados A etapa desde 0 aspartato até aspartilBfosfato é catalisada por trés isoenzimas cada uma delas controlada independentemente por diferentes H moduladores Essa multiplicidade enzimatica impede POCH 0 N que um produto final da biossintese inative completamen COO te etapaschave em uma via quando outros produtos da H 4H mesma via sao necessarios Os passos desde o Bsemial RY N5Fosforribosil deido do aspartato até a homosserina e da treonina até o OH OH antranilato acetobutirato detalhados na Figura 2217 também sao catalisados por isoenzimas duplas independentemente o controladas Uma isoenzima para a conversao de asparta to em aspartilBfosfato é inibida alostericamente por dois coOo HO OH moduladores diferentes lisina e isoleucina cujas agdes sao mais que aditivas outro exemplo de inibicao concertada HO CH 0 A sequéncia desde 0 aspartato até a isoleucina esta sujeita CHH a inibicoes por retroalimentacao multiplas e sobrepostas NO H por exemplo a isoleucina inibe a conversdo de treonina H Enol1ocarboxifenilamino em acetobutirato como descrito anteriormente e a tre 1desoxirribulosefosfato onina inibe sua propria formagao em trés pontos a partir 4 i HO CO da homosserina a partir do Bsemialdeido do aspartato e a partir do aspartato etapas e na Figura 2217 OH OH Esse mecanismo regulador global é denominado inibigao eo 6 sequencial por retroalimentacao Padroes semelhantes sao evidenciados nas vias que le vam aos aminoacidos aromaticos O primeiro passo da via N Indol3glicerolfosfato inicial até a formagao do intermediaério comum corismato H é catalisado pela enzima 2ceto3desoxiDarabinoheptu losonato7fosfato DAHPsintase etapa na Figura 22 Gliceraldeido3fosfato 18 Muitos dos microrganismos e plantas tém trés isoenzi 8 Serina mas para a DAHPsintase Uma é inibida alostericamente PLP inibicgao por retroalimentacao por fenilalanina outra por HO tirosina e a terceira pelo triptofano Esse esquema ajuda 4 a via geral a responder as necessidades celulares para um Hs ou mais dos aminoacidos aromaticos Regulacao adicional ocorre apos a via ramificarse no corismato Bor exemplo CH CHCOO On antranilatosintase H FIGURA 2219 Biossintese de tripto e antranilatofosforribosiltransferase fano a partir de corismato em bac A5fosforribosilantranilatoisomerase térias e plantas Na coli as enzimas indol3glicerolfosfatosintase que catalisam as etapas e sdo subu triptofanosintase nidades de um complexo unico PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 901 Glicerol 3fosfato Indol Quinonoide Da serina Indol a b Túnel CH3 O COO2 P 1NH 1NH 1NH H Gliceraldeído 3fosfato N H CH CH CH2 P Indol3glicerolfosfato O H C OH NH3 CH CH Indol 1 N H COO2 C CH2 P O O C H O H CH2 PLP Subunidades a da tripto fanosintase Subunidades b da tripto fanosintase b Intermediário quinonoide CH3 COO2 P H O C 1 b N H CH2 C H B O H Indol H2C Aldimina com triptofano CH2 1 N H N H H N H CH3 P H O C N H CH2 O H b 1 COO2 N H CH2 C b 1 H OH Serina b a NH3 CH 1 COO2 bCH2 H2O N H Triptofano CH2 OH OH B HB b b b Aduto PLP aminoacrilato PLP H2O Enzima Uma clivagem aldólica produz indol e gliceraldeído 3 fosfato o PLP não é necessário O indol segue por um túnel entre as subunidades a e b A desidratação da serina forma um intermediário PLP aminoacrilato O indol condensase com o intermediário aminoacrilato 2 passos A ligação imina unindo o tripto fano e o PLP é hidrolisada MECANISMO FIGURA 2220 Reação da triptofanosintase a Esta en zima catalisa uma reação envolvendo múltiplos passos e diversos tipos de rearranjos químicos As transformações facilitadas pelo PLP ocorrem no car bono b C3 do aminoácido ao contrário das reações descritas na Figura 186 que ocorrem no carbono a O carbono b da serina é ligado ao sistema indólico de anéis b PDB ID 1KFJ O indol gerado na subunidade a branco movese por um túnel até a subunidade b azul onde se condensa com a porção serina Mecanismo da triptofanosintase Nelson6ed22indd 901 Nelson6ed22indd 901 070414 1424 070414 1424 902 DAVID L NELSON MICHAEL M COX as enzimas que catalisam os dois primeiros passos da rami ficação que leva ao triptofano estão sujeitas à inibição alos térica pelo triptofano RESUMO 222 Biossíntese de aminoácidos c Plantas e bactérias sintetizam todos os 20 aminoácidos comuns Os mamíferos podem sintetizar cerca de me tade deles os demais devem estar presentes na dieta aminoácidos essenciais c Entre os aminoácidos não essenciais o glutamato é formado por aminação redutora do acetoglutarato e serve como precursor de glutamina prolina e arginina Alanina e aspartato e assim também a asparagina são formados a partir do piruvato e do oxaloacetato respec tivamente por transaminação A cadeia carbonada da serina é derivada do 3fosfoglicerato A serina é precur sora da glicina o átomo de carbono b da serina é trans ferido para o tetrahidrofolato Em microrganismos a cisteína é produzida a partir de serina e de sulfeto produzido pela redução de sulfato obtido do ambiente Os mamíferos produzem cisteína a partir de metionina e serina por uma série de reações que requer Sadenosil metionina e cistationina c Entre os aminoácidos essenciais os aminoácidos aro máticos fenilalanina tirosina e triptofano são produ zidos por uma via em que o corismato representa um pontochave de ramificação O fosforribosilpirofosfato é precursor do triptofano e da histidina A via da histidi na está interconectada com a via de síntese de purinas A tirosina também pode ser produzida por hidroxilação da fenilalanina e por isso é considerada um aminoáci do condicionalmente essencial As vias para os demais aminoácidos essenciais são complexas c As vias de biossíntese de aminoácidos estão sujeitas à inibição alostérica pelo produto final a enzima regula dora geralmente é a primeira da sequência A regulação das várias vias sintéticas é coordenada 223 Moléculas derivadas de aminoácidos Além de seu papel como blocos constitutivos das proteínas os aminoácidos são precursores de muitas biomoléculas especializadas incluindo hormônios coenzimas nucleotí deos alcaloides polímeros constituintes da parede celular porfirinas antibióticos pigmentos e neurotransmissores Aqui serão descritas as vias de síntese de diversos desses derivados de aminoácidos A glicina é precursora das porfirinas A biossíntese de porfirinas para as quais a glicina é um importante precursor é nosso primeiro exemplo devido à importância central do núcleo das porfirinas nas heme proteínas como a hemoglobina e os citocromos As por firinas são sintetizadas a partir de quatro moléculas do derivado monopirrólico porfobilinogênio o qual é de rivado de duas moléculas de daminolevulinato Há duas vias principais para o daminolevulinato Em eucariotos superiores Figura 2225a a glicina reage com succinil CoA na primeira etapa da via produzindo aaminobce toadipato que é então descarboxilado produzindo dami nolevulinato Em plantas algas e na maioria das bactérias o daminolevulinato é formado a partir do glutamato Fi gura 2225b O glutamato é inicialmente esterificado originando glutamiltRNA Glu ver no Capítulo 27 o tópico referente ao RNA transportador a redução pelo NADPH converte o glutamato em 1semialdeído do glutamato o qual é clivado do tRNA Uma aminotransferase converte o 1semialdeído do glutamato em daminolevulinato Fenilpiruvato O HO H COO2 Amino transferase CH2 H CO2 1 OH2 O COO2 Prefenato 2OOC COO2 aCetoglutarato C HO H Corismato NADH 1 H1 NAD1 C CH2 COO2 O C CH COO2 O C 4Hidroxifenil piruvato CH2 Fenilalanina CO2 COO2 CH2 CH2 Glutamato OH Tirosina Amino transferase COO2 aCetoglutarato CH CH2 OH Glutamato NH3 1 1 NH3 corismatomutase prefenatodesidrogenase prefenatodesidratase FIGURA 2221 Biossíntese de fenilalanina e tirosina a partir de coris mato em bactérias e plantas A conversão do corismato em prefenato é um exemplo biológico raro de um rearranjo de Claisen Nelson6ed22indd 902 Nelson6ed22indd 902 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 903 H C O O H C H H C OH C H O P O 1 5Fosforribosil 1pirofosfato PRPP N HC N N NH2 N P ATP PPi P P P H C O CH2 O H C H H C C O P H P Rib P P 5Aminoimidazol4carboxamida ribonucleotídeo AICAR NH2 H C O CH2 O H C H H C OH C O P P Rib N N HN CH N N H N159FosforribosilATP N159FosforribosilAMP H2O H C O CH2 O H C H H C OH C O P P Rib N N HN CH N N H Rib N N H H2O C O C O H2N P Rib N N CH N N H C C H H H C H O CH2 O P N159Fosforribosilformimino 5aminoimidazol 4carboxamidaribonucleotídeo H2N Rib N N N C O P H2N Para a biossíntese de purinas C N OH P NH3 H C H C OH O N159Fosforribulosilformimino 5aminoimidazol 4carboxamidaribonucleotídeo Histidina Glutamato aCetoglutarato OH P CH2 H C H C OH O HC C H N N CH Imidazolglicerol 3fosfato COO2 O P CH2 C O HC C N Imidazolacetol 3fosfato CH2 HC CH2 Glutamina Glutamato 2NADH 1 2H1 N C H P C O C N NH3 LHistidinol fosfato CH2 HC H PPi Pi 2NAD1 H C O C N NH3 LHistidinol CH2 HC H 1 1 1 H N CH H N CH CH2 H N CH CH2 H N CH CH2 ATPfosforribosiltransferase pirofosfohidrolase fosforribosilAMPciclohidrolase fosforribosilformimino5aminoimidazol 4carboxamidaribonucleotídeoisomerase glutaminaamidotransferase imidazolglicerol3fosfatodesidratase Lhistidinolfosfatoaminotransferase histidinolfosfatofosfatase histidinoldesidrogenase FIGURA 2222 Biossíntese de histidina em bactérias e plantas Áto mos originários do PRPP e do ATP estão sombreados em cor salmão e azul respectivamente Dois nitrogênios da histidina provêm da glutamina e do glutamato em verde Observe que o derivado do ATP que resta após a eta pa ➎ AICAR é um intermediário da biossíntese de purinas ver Figura 2235 etapa ➒ de modo que o ATP é rapidamente regenerado Nelson6ed22indd 903 Nelson6ed22indd 903 070414 1424 070414 1424 904 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Em todos os organismos duas moléculas de damino levulinato se condensam para formar porfobilinogênio e por meio de uma série de reações enzimáticas complexas quatro moléculas de porfobilinogênio se unem forman do protoporfirina Figura 2226 O átomo de ferro é incorporado após a protoporfirina ter sido formada em um passo catalisado pela ferroquelatase A biossíntese de porfirinas é regulada nos eucariotos superiores pela con centração do produto heme o qual serve como inibidor por retroalimentação dos passos iniciais da via de síntese Defeitos genéticos na biossíntese de porfirinas podem le var ao acúmulo de intermediários da via causando várias doenças humanas conhecidas coletivamente como porfi rias Quadro 222 O grupo heme é fonte dos pigmentos biliares O grupo ferroporfirina heme da hemoglobina libe rado no baço a partir de eritrócitos em degeneração é degradado produzindo Fe 21 livre e por fim bilirrubina Essa via é surpreendente por sua capacidade de conferir cor à bioquímica humana O primeiro passo nessa via de duas etapas é catalisa do pela hemeoxigenase que converte heme em biliverdina derivado tetrapirrólico linear aberto Figura 2227 Os demais produtos da reação são Fe 21 livre e CO O Fe 21 é rapidamente ligado à ferritina O monóxido de carbono é um tóxico que se liga à hemoglobina ver Quadro 51 e a produção de CO pela hemeoxigenase assegura que mesmo na ausência de exposição ambiental cerca de 1 do heme de uma pessoa esteja complexado ao CO A biliverdina é convertida em bilirrubina no segundo passo catalisado pela biliverdinaredutase Você pode monitorar essa reação colorimetricamente em um expe rimento in situ bastante familiar Quando você sofre um machucado que resulta em hematoma a cor negra eou púrpura resulta da hemoglobina liberada pelos eritróci tos danificados Com o tempo a cor muda para o verde da biliverdina e após para o amarelo da bilirrubina A bi lirrubina é bastante insolúvel sendo transportada na cor rente sanguínea complexada com a albumina sérica No fígado a bilirrubina é transformada no pigmento da bile bilirrubinadiglicuronato Esse produto é suficientemente hidrossolúvel para ser secretado com outros componentes da bile para o intestino delgado onde enzimas microbianas o convertem em diversos produtos predominantemente urobilinogênio Algum urobilinogênio é absorvido e chega ao sangue sendo transportado até os rins onde é conver tido em urobilina o componente que confere à urina sua coloração amarela Figura 2227 O urobilinogênio que permanece no intestino é convertido em outra reação dependente dos microrganismos da flora intestinal em estercobilina Figura 2227 que confere às fezes a cor marromavermelhada Insuficiência da função hepática ou bloqueio da secre ção de bile determina o extravasamento da bilirrubina do fígado para o sangue resultando em coloração amarela da pele e da esclera dos olhos condição denominada icterícia Em casos de icterícia a determinação da concentração de bilirrubina no sangue pode ser útil para o diagnóstico da doença hepática subjacente Bebês recémnascidos algu aCetobutirato Isoleucina Treoninadesidratase Treonina 5 etapas FIGURA 2223 Regulação alostérica da biossíntese de isoleucina A primeira reação da via desde a treonina até a isoleucina é inibida pelo pro duto final a isoleucina Esse foi um dos primeiros exemplos descobertos de inibição alostérica por retroalimentação As etapas desde o acetobutirato até a isoleucina correspondem às etapas a na Figura 2217 perfazendo cinco etapas pois é uma reação de duas etapas B1 B2 A2 A3 A1 C1 C2 5 etapas 3 etapas 6 etapas bSemialdeído do aspartato Lisina Metionina Aspartato Treonina aCetobutirato Isoleucina Aspartilbfosfato Homosserina FIGURA 2224 Mecanismos reguladores interconectados na biossín tese de diversos aminoácidos derivados do aspartato em E coli Três enzimas A B e C têm duas ou três isoformas indicadas pelos subscritos numéricos Em cada caso uma das isoformas A2 B1 e C2 não apresenta re gulação alostérica essas isoenzimas são reguladas por alterações na quanti dade de enzima sintetizada Capítulo 28 A síntese das isoenzimas A2 e B1 é reprimida quando os níveis de metionina estão altos e a síntese da isoenzi ma C2 é reprimida quando os níveis de isoleucina estão altos A enzima A é a aspartatocinase a enzima B é a homosserinadesidrogenase e a enzima C é a treoninadesidratase Nelson6ed22indd 904 Nelson6ed22indd 904 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 905 CH3 CH3 COO2 2OOC COO2 Fe21 Fe21 CH3 NH2 H2N 8 H2O Pr Pr CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 N N N N O N H Heme CH3 CH3 CH3 Pr Pr CH3 N N Protoporfirina Pr Pr NH NH HN HN Pr Pr Ac Ac Ac Ac HO Préuroporfirinogênio Pr Pr NH NH HN HN Pr Pr Ac Ac Ac Ac Uroporfirinogênio III Pr Pr NH NH HN HN Pr Pr Coproporfirinogênio III CH3 CH3 CH3 CH3 Pr Pr NH NH HN HN HN HN Protoporfirinogênio 8 4 dAminolevulinato 4 NH4 1 H2O 4 CO2 2 CO2 porfobilinogêniosintase uroporfirinogêniosintase uroporfirinogênio IIIcossintase uroporfirinogêniodescarboxilase coproporfirinogêniooxidase protoporfirinogêniooxidase ferroquelatase Porfobilinogênio Grupo vinila 1 Glicina Glutamato 1 CH 2 COO2 SuccinilCoA NH3 1 CH2 SCoA COO2 CH2 CH2 COO2 CH2 C O CoASH 1 NH3 HC COO2 ATP AMP PPi RNAtGlu daminolevulinato sintase GlutamiltRNA sintetase a b CH2 COO2 CH2 CH 1 C NH3 O aAminob cetoadipato COO2 CH2 COO2 CH2 1 NH3 HC C tRNAGlu O GlutamiltRNAGlu CH2 CH2 C COO2 O CH2 dAminolevulinato 1NH3 CH2 COO2 CH2 1 NH3 HC C H O 1Semialdeído do glutamato glutamato 1semialdeído aminomutase NADPH 1 H1 NADP1 RNAtGlu GlutamiltRNA redutase CO2 daminolevulinato sintase FIGURA 2225 Biossíntese do daminolevulinato a Na maioria dos animais incluindo os mamíferos o daminolevulinato é sintetizado a partir de glicina e succinilCoA Os átomos fornecidos pela glicina são mostrados em corderosa b Em bactérias e plantas o precursor do daminolevulinato é o glutamato FIGURA 2226 Biossíntese do heme a partir do daminolevulinato Ac representa acetila CH2COO Pr representa propionila CH2CH2COO Nelson6ed22indd 905 Nelson6ed22indd 905 070414 1424 070414 1424 906 DAVID L NELSON MICHAEL M COX mas vezes desenvolvem icterícia por ainda não produzirem quantidades suficientes de glicuronilbilirrubinatransfe rase para processar sua bilirrubina Um tratamento tradi cional para reduzir o excesso de bilirrubina consiste na ex posição a uma lâmpada fluorescente que leva à conversão fotoquímica da bilirrubina em compostos mais solúveis e portanto mais facilmente excretáveis Essas vias da degradação do heme desempenham papéis significativos na proteção das células contra dano oxidativo e na regulação de certas funções celulares O CO produzido pela hemeoxigenase é tóxico em altas concentrações con tudo em concentrações muito baixas como aquelas resul tantes da degradação do heme esse composto parece ter algumas funções reguladoras eou de sinalização O CO atua como vasodilatador de modo semelhante ao óxido nítrico discutido a seguir embora com menor potência Baixos níveis de CO também têm alguns efeitos reguladores sobre a neurotransmissão A bilirrubina é o antioxidante mais abun dante nos tecidos dos mamíferos sendo responsável pela maior parte da atividade antioxidante no soro Seus efeitos protetores parecem ser especialmente importantes para o cérebro em desenvolvimento dos bebês recémnascidos A toxicidade celular associada à icterícia pode ser devida ao fato de os níveis de bilirrubina excederem os níveis de albu mina sérica necessários para solubilizar esse composto Considerando esses vários papéis para os produtos da degradação do heme a via de degradação está sujeita à re gulação principalmente em seu primeiro passo Os huma nos possuem pelo menos três isoenzimas da hemeoxigenase HO A HO1 é altamente regulada a expressão de seu gene é induzida por uma ampla gama de condições relacionadas ao estresse estresse hemodinâmico angiogênese desen volvimento descontrolado de vasos sanguíneos hipoxia hi peróxia choque térmico exposição à radiação ultravioleta peróxido de hidrogênio e muitos outros ataques metabóli cos A HO2 é encontrada principalmente no encéfalo e nos testículos onde é expressa constitutivamente A terceira isoenzima a HO3 ainda não está bem caracterizada Os aminoácidos são precursores da creatina e da glutationa A fosfocreatina derivada da creatina é um importante tampão energético no músculo esquelético ver Quadro 23 2 A creatina é sintetizada a partir da glicina e da arginina Figura 2228 a metionina na forma de Sadenosilmetio nina atua como doadora do grupo metila A glutationa GSH presente em plantas animais e em algumas bactérias frequentemente em níveis altos pode ser considerada um tampão redox sendo derivada dos aminoácidos glutamato cisteína e glicina Figura 2229 O grupo gcarboxila do glutamato é ativado pelo ATP for mando um intermediário acilfosfato que é então atacado pelo grupo aamino da cisteína Uma segunda reação de condensação se segue com o grupo acarboxila da cisteína ativado na forma de acilfosfato permitindo a reação com a QUADRO 222 MEDICINA Sobre reis e vampiros As porfirias são um grupo de doenças genéticas que re sultam de defeitos em enzimas da via biossintética da glicina às porfirinas precursores específicos de porfiri nas acumulamse nos eritrócitos nos fluidos corporais e no fígado A forma mais comum é a porfiria intermitente aguda A maioria das pessoas que herdam essa condição é heterozigota e em geral assintomática pois a única có pia normal do gene fornece um nível suficiente de função enzimática Contudo certos fatores nutricionais ou am bientais ainda não completamente esclarecidos podem levar a um aumento de daminolevulinato e porfobilinogê nio levando a crises de dor abdominal aguda e disfunção neurológica O rei George III monarca britânico durante a guerra da independência dos Estados Unidos sofria de graves episódios de aparente loucura que embaçaram o registro histórico desse homem talentoso Os sintomas de sua condição sugerem que George III sofria de porfiria intermitente aguda Uma das mais raras porfirias resulta de um acúmulo de uroporfirinogênio I isômero anormal de um precur sor da protoporfirina Esse composto cora a urina de vermelho faz os dentes fluorescerem fortemente sob luz ultravioleta e torna a pele anormalmente sensível à luz do sol Muitas pessoas com essa porfiria são anêmicas pois é sintetizada uma quantidade insuficiente de heme Essa condição genética pode ter originado os mitos dos vampi ros nas lendas folclóricas Os sintomas da maioria das porfirias atualmente são controlados com facilidade com a manipulação da die ta ou com a administração de heme ou de derivados do heme dAminolevulinato Porfobilinogênio Préuroporfirinogênio Uroporfirinogênio III Coproporfirinogênio Protoporfirinogênio Protoporfirina Heme Porfiria de Doss Porfiria intermitente aguda Porfiria eritropoiética congênita Porfiria cutânea tardia Coproporfiria hereditária Porfiria variegata Protoporfiria eritropoiética Nelson6ed22indd 906 Nelson6ed22indd 906 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 907 glicina A forma oxidada da glutationa GSSG produzida no curso de suas atividades redox contém duas moléculas de glutationa ligadas por meio de uma ligação dissulfeto A glutationa provavelmente ajuda a manter os grupos sulfidrila das proteínas no estado reduzido e o ferro do heme no estado ferroso Fe 21 servindo como agente re dutor para a glutarredoxina na síntese de desoxirribonu cleotídeos ver Figura 2241 Sua função redox também é utilizada para remover peróxidos tóxicos formados durante o curso normal do crescimento e do metabolismo em con dições aeróbias 2 GSH 1 ROOH GSSG 1 H2O 1 ROH Essa reação é catalisada pela glutationaperoxidase en zima notável pelo fato de conter um átomo de selênio Se covalentemente ligado na forma de selêniocisteína ver Figura 38a essencial para sua atividade DAminoácidos são encontrados basicamente em bactérias Embora Daminoácidos geralmente não ocorram em proteínas eles têm algumas funções especiais na es trutura das paredes celulares bacterianas e em antibióticos peptídicos Peptidoglicanos bacterianos ver Figura 2030 contêm Dalanina e Dglutamato Os Daminoácidos são pro duzidos diretamente a partir dos isômeros L pela ação de aminoácidoracemases que têm piridoxalfosfato como co fator ver Figura 186 A racemização de aminoácidos é de grande importância para o metabolismo bacteriano e enzi mas como a alaninaracemase são alvos importantes para agentes farmacêuticos Um desses agentes a Lfluoralani na está sendo testado como fármaco antibacteriano Ou tro a ciclosserina é utilizado no tratamento da tuberculo se Contudo uma vez que esses inibidores também afetam algumas enzimas humanas que utilizam PLP eles potencial mente apresentam efeitos colaterais indesejáveis H3 NH HC O CH2 NH3 1 COO C O F C 1 LFluoralanina Ciclosserina H2 N C H Transporte para o intestino Hemeoxigenase CO Fe 1 2 Heme O M V N H N H M Pr N M Pr O M V N H O M V N H N H M Pr N H M Pr H H O M V N H Biliverdina redutase NADPH 1 H NADP1 Biliverdina 1 Bilirrubina no sangue Diglicuronato de bilirrubina Bilirrubina na bile Transporte para os rins Urobilinogênio Urobilinogênio fígado Transporte no sangue em complexo com a albumina sérica Glicuronilbilirrubina transferase O M E N H N H M Pr N M Pr O M E N H H O M E N H N H M Pr N M Pr O M E N H H H H H H Urobilina Estercobilina FIGURA 2227 Bilirrubina e seus produtos de degradação M representa metila V vinila Pr propionila E etila Para facilitar a comparação estas estruturas estão mostradas na forma linear e não em suas conformações estereoquímicas corretas Nelson6ed22indd 907 Nelson6ed22indd 907 070414 1424 070414 1424 908 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Aminoácidos aromáticos são precursores de muitas substâncias de origem vegetal A fenilalanina a tirosina e o triptofano são convertidos em vários compostos importantes nas plantas O polímero rígi do lignina derivado da fenilalanina e da tirosina está atrás apenas da celulose em abundância nos tecidos vegetais A estrutura do polímero de lignina é complexa e não está bem esclarecida O triptofano também é o precursor do hormô nio de crescimento em plantas o indol3acetato ou auxi na Figura 2230a importante para a regulação de uma ampla gama de processos biológicos nos vegetais A fenilalanina e a tirosina também originam muitos pro dutos naturais de importância comercial incluindo os tani nos que inibem a oxidação em vinhos os alcaloides como a morfina que apresenta potentes efeitos fisiológicos e con dimentos ou aromatizantes encontrados em óleo de canela Figura 2230b noz moscada cravodaíndia baunilha pi menta vermelha e outros produtos Aminas biológicas são produtos da descarboxilação dos aminoácidos Muitos neurotransmissores importantes são aminas primárias ou secundárias derivadas de aminoácidos por meio de vias simples Além disso algumas poliaminas Arginina Glicina Ornitina Guanidinoacetato adoMet adoHcy Metionina Creatina Fosfocreatina Metiltransferase Creatina cinase Amidinotransferase FIGURA 2228 Biossíntese de creatina e fosfocreatina A creatina é sintetizada a partir de três aminoácidos glicina arginina e metionina Esta via mostra a versatilidade dos aminoácidos como precursores de outras biomo léculas nitrogenadas Glutamato Cisteína gGluCysGly Glutationa sintetase gGlu Cys Gly O C CH N SH 1 CH2 Glutationa GSH reduzida Glutationa GSSG oxidada Glicina CH CH2 CH2 C O N H H CH2 NH3 ADP 1 Pi OOC COO ADP 1 Pi gGluCysGly gGluCys gglutamilcisteína sintetase b a S S ATP ATP FIGURA 2229 Metabolismo da glutationa a Biossíntese da glutatio na b Forma oxidada da glutationa Nelson6ed22indd 908 Nelson6ed22indd 908 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 909 que formam complexos com o DNA são derivadas do ami noácido ornitina intermediário do ciclo da ureia Um de nominador comum de muitas dessas vias é a descarboxila ção dos aminoácidos outra reação que requer PLP ver Figura 186 A síntese de alguns neurotransmissores está ilustrada na Figura 2231 A tirosina origina uma família de cate colaminas que inclui a dopamina a noradrenalina e a adrenalina Os níveis das catecolaminas correlacionamse entre outras coisas com variações na pressão sanguínea A doença de Parkinson um distúrbio neurológico está as sociada com uma menor produção de dopamina e tem sido tradicionalmente tratada pela administração de Ldopa A produção em excesso de dopamina no cérebro pode estar ligada a transtornos psiquiátricos como a esquizofrenia A descarboxilação do glutamato origina o ácido g aminobutírico GABA um neurotransmissor inibitório Uma baixa produção de GABA está associada com crises epilépticas Análogos do GABA são utilizados no tratamen to da epilepsia e da hipertensão Podese também aumen tar os níveis de GABA administrandose inibidores da en zima de degradação do GABA a GABAaminotransferase Outro neurotransmissor importante a serotonina é pro duzido a partir do triptofano em uma via constituída por dois passos A histidina sofre descarboxilação originando histami na um poderoso vasodilatador em tecidos animais A his tamina é liberada em grandes quantidades como parte da resposta alérgica e também estimula a secreção ácida no es tômago Um crescente conjunto de agentes farmacêuticos está sendo projetado para interferir com a síntese ou com a ação da histamina Um exemplo importante é o antagonis ta do receptor da histamina a cimetidina Tagamet um análogo estrutural da histamina CH3 C NH CH2 N CH2 CH2 NH S NH CH3 N C N Esse composto auxilia na cura de úlceras duodenais pela inibição da secreção gástrica de ácido Poliaminas como a espermina e a espermidina en volvidas na condensação do DNA são derivadas da metio nina e da ornitina pela via mostrada na Figura 2232 O primeiro passo é a descarboxilação da ornitina um precur sor da arginina Figura 2212 A ornitinadescarboxila se uma enzima que requer PLP é alvo de diversos inibido res poderosos utilizados como agentes farmacêuticos ver Quadro 63 A arginina é precursora na síntese biológica de óxido nítrico Um achado surpreendente em meados da década de 1980 foi o papel do óxido nítrico NO anteriormente apenas conhecido como componente poluidor do ar como impor tante mensageiro biológico Essa substância gasosa simples difundese facilmente através das membranas embora sua alta reatividade restrinja seu raio de difusão para cerca de 1 mm a partir de seu ponto de síntese Em humanos o NO desempenha papéis em uma ampla gama de processos fisio lógicos incluindo neurotransmissão coagulação sanguínea e controle da pressão sanguínea Seu modo de ação é des crito no Capítulo 12 ver Seção 124 O óxido nítrico é sintetizado a partir da arginina em uma reação dependente de NADPH catalisada pela óxidonítri cosintase Figura 2233 enzima dimérica estruturalmen te relacionada à NADPHcitocromoP450redutase ver Quadro 211 A reação é uma oxidação com transferência de cinco elétrons Cada subunidade da enzima contém liga da uma molécula de cada um de quatro diferentes cofatores FMN FAD tetrahidrobiopterina e heme contendo Fe 31 O NO é uma molécula instável e não pode ser armazenado Sua síntese é estimulada pela interação da óxidonítricosintase com Ca 21calmodulina ver Figura 1211 RESUMO 223 Moléculas derivadas de aminoácidos c Muitas biomoléculas importantes são derivadas dos ami noácidos A glicina é um precursor de porfirinas A de gradação do heme ferroporfirina produz a bilirrubina que é convertida em pigmentos biliares com diversas funções fisiológicas COO CH C O CH2 NH3 1 COO CH CH COO Amino transferase Descarboxilase CH2 N H COO CH2 CH NH3 1 COO CH2 N H N H Triptofano Indol3 piruvato Cinamato Indol3acetato auxina Fenilalanina CO2 Fenilalanina amônia liase NH3 a b FIGURA 2230 Biossíntese de dois compostos vegetais a partir de aminoácidos a Indol3acetato auxina e b cinamato confere aroma à canela Nelson6ed22indd 909 Nelson6ed22indd 909 070414 1424 070414 1424 910 DAVID L NELSON MICHAEL M COX c A glicina e a arginina originam a creatina e a fosfocreati na um tampão energético A glutationa formada a par tir de três aminoácidos é um importante agente redutor na célula c As bactérias sintetizam Daminoácidos a partir de L aminoácidos por meio de reações de racemização que requerem piridoxalfosfato Os Daminoácidos são co mumente encontrados em certas paredes bacterianas e em certos antibióticos c Os aminoácidos aromáticos originam muitas substâncias nos vegetais A descarboxilação dependente de PLP de alguns aminoácidos produz importantes aminas biológi cas incluindo neurotransmissores c A arginina é precursora do óxido nítrico um mensageiro biológico 224 Biossíntese e degradação de nucleotídeos Como discutido no Capítulo 8 os nucleotídeos apresentam uma variedade de importantes funções em todas as células Eles são precursores do DNA e do RNA são carreadores essenciais de energia química papel desempenhado basi camente pelo ATP e em parte pelo GTP são componentes dos cofatores NAD FAD Sadenosilmetionina e coenzima A assim como de intermediários biossintéticos ativados como UDPglicose e CDPdiacilglicerol e alguns deles como o cAMP e o cGMP são também segundosmensagei ros celulares Dois tipos de vias levam aos nucleotídeos as vias de novo e as vias de salvação A síntese de novo dos nu cleotídeos inicia com seus precursores metabólicos ami noácidos ribose5fosfato CO2 e NH3 As vias de salvação COO CH CH2 H2N 1 HO Tirosina H2O CH Ascorbato Desidroascorbato Dopamina bhidroxilase O2 Dopa HO CH2 Feniletanolamina Nmetiltransferase CH2 NH3 1 HO CH3 Dopamina HO HO OH NH3 1 adoMet adoHcy NH3 1 HO CH HO CH2 OH CH2 Adrenalina CO2 PLP Descarboxilase dos aminoácidos aromáticos HO COO CH CH2 NH3 1 Noradrenalina H2O Tetrahidrobiopterina Dihidrobiopterina Tirosina hidroxilase O2 HO CO2 CH CH2 NH3 PLP Tetrahidrobiopterina Dihidrobiopterina Triptofano hidroxilase H2O Serotonina Descarboxilase dos aminoácidos aromáticos CH CH2 1 OOC 5Hidróxi triptofano CH2 NH3 1 CH2 OOC CH2 gAminobutirato GABA COO Glutamato NH3 COO CO2 NH3 1 PLP Glutamato descarboxilase CH2 CH2 CH CH2 1 Histidina NH3 COO N NH CH2 1 NH3 N H N H CO2 1 PLP Histidina descarboxilase CH CH2 1 NH3 COO Triptofano N H CH2 HO CH2 N NH Histamina O2 HO FIGURA 2231 Biossíntese de alguns neurotransmissores a partir de aminoácidos Em cada caso o passochave é o mesmo uma descarboxila ção dependente de PLP sombreada em cor salmão Nelson6ed22indd 910 Nelson6ed22indd 910 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 911 reciclam as bases livres e os nucleosídeos liberados a partir da degradação de ácidos nucleicos Ambos os tipos de vias são importantes no metabolismo celular e são discutidos nesta seção As vias de novo para a biossíntese de purinas e pirimi dinas parecem ser quase idênticas em todos os organismos vivos Uma observação notável é que as bases livres gua nina adenina timina citidina e uracila não são interme diárias nessas vias isto é as bases não são sintetizadas e então ligadas à ribose como se poderia esperar A estru tura do anel púrico é construída ligada à ribose durante todo o processo com a adição de um ou de poucos átomos por vez O anel pirimídico é sintetizado como orotato li gado à ribosefosfato e então convertido nos nucleotídeos pirimídicos comuns necessários para a síntese dos ácidos nucleicos Embora as bases livres não sejam intermediárias nas vias de novo elas são intermediárias em algumas das vias de salvação Diversos precursores importantes são compartilhados pelas vias de novo para a síntese de pirimidinas e puri nas O fosforribosilpirofosfato PRPP é importante para a síntese de ambas e nessas vias a estrutura da ribose é mantida no nucleotídeo produzido ao contrário do seu des tino nas vias para a biossíntese de triptofano e histidina discutidas anteriormente Um aminoácido é um precursor importante em cada tipo de via a glicina para as purinas e H3N CO2 C H 1S Metiltioadenosina Adenosina CH2 CH2 1 Ornitina descarboxilase PLP CH3 CH2 H3N CH2 CH3 Adenosina 1 H3N CH2 CH24 1S COO Ornitina Putrescina adoMet descarboxilada CO2 adomet descarboxilase PLP COO2 S 1 CH2 CH2 CH CH2 NH Propilaminotransferase II Espermidina Adenosina H3N PPi 1 Pi SAdenosilmetionina H3N 1 1 NH3 NH CH23 Espermina Adenosina S Propilaminotransferase i NH3 H3N 1 CH24 1 NH3 NH CH23 CH23 CH3 1 NH3 CH24 Metionina ATP CH3 1 1 Arginina COO2 C H H3N CH2 CH2 CH2 NH NH2 C NH2 1 1 Hidroxiarginina NADPH 1 H1 O2 NADP1 H2O NADPH O2 NADP1 H2O COO2 C H H3N CH2 CH2 CH2 NH NH2 C N OH 1 Citrulina COO2 C H H3N CH2 CH2 CH2 NH NH2 C O 1 1 NO Óxido nítrico 2 1 2 1 FIGURA 2233 Biossíntese de óxido nítrico Ambos os passos são catalisados pela óxidonítricosintase O nitrogênio do NO provém do grupo guanidino da arginina FIGURA 2232 Biossíntese de espermidina e espermina Os passos envolvendo descarboxilações dependentes de PLP estão sombreados em cor salmão Nessas reações a Sadenosilmetionina em sua forma descarbo xilada atua como fonte de grupos propilamino sombreados em azul Nelson6ed22indd 911 Nelson6ed22indd 911 070414 1424 070414 1424 912 DAVID L NELSON MICHAEL M COX o aspartato para as pirimidinas A glutamina é novamente a mais importante fonte de grupos amina em cinco passos distintos das vias de novo O aspartato também é utilizado como fonte de um grupo amino em dois dos passos das vias das purinas Duas outras características devem ser mencionadas Primeiro existem evidências especialmente na via de síntese de novo das purinas de que as enzimas estejam presentes na célula como grandes complexos multienzimá ticos tema recorrente na discussão do metabolismo Se gundo os conjuntos celulares de nucleotídeos outros que não o ATP são bastante pequenos talvez 1 ou menos das quantidades necessárias para a síntese de DNA celular As sim sendo as células devem continuar a sintetizar nucleo tídeos durante a síntese de ácidos nucleicos e em alguns casos a síntese de nucleotídeos pode limitar as velocidades de replicação e de transcrição do DNA Em função da im portância desses processos nas células em divisão agentes que inibem a síntese de nucleotídeos se tornaram especial mente importantes em medicina Agora serão examinadas as vias biossintéticas para os nucleotídeos púricos e pirimídicos e sua regulação a for mação de desoxinucleotídeos e a degradação de purinas e pirimidinas em ácido úrico e ureia A seção será finalizada com uma discussão a respeito de agentes quimioterápicos que afetam a síntese de nucleotídeos A síntese de novo de nucleotídeos púricos inicia com o PRPP Os dois nucleotídeos púricos precursores dos ácidos nu cleicos são 59monofosfato de adenosina AMP adenilato e 59monofosfato de guanosina GMP guanilato os quais con têm as bases púricas adenina e guanina A Figura 2234 mos tra a origem dos átomos de car bono e de nitrogênio do sistema de anéis púricos conforme de terminado por John M Bucha nan utilizando experimentos com marcadores isotópicos em aves A via detalhada para a biossíntese de purinas foi eluci dada principalmente por Buchanan e por G Robert Green berg na década de 1950 No primeiro passo comprometido com a via um grupo amino doado pela glutamina é ligado ao C1 do PRPP Fi gura 2235 A 5fosforribosilamina resultante é alta mente instável com meiavida de 30 segundos em pH 75 O anel púrico é depois construído sobre essa estrutura A via aqui descrita é idêntica em todos os organismos com exceção de um passo que difere nos eucariotos superiores como observado a seguir O segundo passo é a adição de três átomos doados pela glicina Figura 2235 etapa ➋ Um ATP é consumido para ativar o grupo carboxila da glicina na forma de um acil fosfato para essa reação de condensação O grupo ami no da glicina que foi adicionado é então formilado pelo N 10formiltetrahidrofolato etapa ➌ e um nitrogênio é doado pela glutamina etapa ➍ antes que a desidratação e o fechamento do anel formem o anel imidazólico do núcleo púrico com cinco membros na forma de 5aminoimidazol ribonucleotídeo AIR etapa ➎ Nesse ponto três dos seis átomos necessários para o segundo anel da estrutura das purinas estão colocados no lugar Para completar o processo um grupo carboxila é inicialmente adicionado etapa ➏ Essa carboxilação é incomum pelo fato de não requerer biotina mas utilizar bi carbonato geralmente presente em soluções aquosas Um rearranjo transfere o carboxilato do grupo amino exocíclico para a posição 4 do anel imidazólico etapa ➐ As etapas 6 e ➐ ocorrem apenas em bactérias e fungos Em eucariotos superiores incluindo os humanos o 5aminoimidazolribo nucleotídeo produzido na etapa ➎ é carboxilado diretamen te em carboxiaminoimidazolribonucleotídeo em uma úni ca etapa em vez de duas etapa A enzima que catalisa essa reação é a AIRcarboxilase O aspartato agora doa seu grupo amino em duas eta pas ➑ e ➒ formação de uma ligação amida seguindose a eliminação do esqueleto de carbono do aspartato como fumarato Lembrese de que o aspartato desempenha um papel análogo em duas etapas do ciclo da ureia ver Figura 1810 O último carbono é doado pelo N 10formiltetrahi drofolato etapa e ocorre um segundo fechamento de anel produzindo o segundo anel fundido ao núcleo púrico etapa O primeiro intermediário com um anel púrico completo é o inosinato IMP Assim como nas vias biossintéticas do triptofano e da histidina as enzimas da síntese do IMP parecem estar or ganizadas como grandes complexos multienzimáticos na célula Novamente evidências surgem da existência de polipeptídeos únicos com diversas funções alguns catali sando passos não sequenciais da via Nas células eucarió ticas de organismos como fungos moscasdafruta e gali nhas as etapas ➊ ➌ e ➎ da Figura 2235 são catalisados por uma proteína multifuncional Outra proteína multifun cional catalisa as etapas e Em humanos uma enzima multifuncional combina as atividades da AIRcarboxilase e da SAICARsintetase etapas e ➑ Nas bactérias essas atividades são encontradas em proteínas separadas mas as proteínas podem formar um grande complexo não cova N amídico da glutamina CO2 C C C N Formato Aspartato Formato Glicina C N N C N FIGURA 2234 Origem dos átomos no anel das purinas Esta informa ção foi obtida a partir de experimentos utilizando isótopos com precursores marcados com 14C ou 15N O formato é obtido na forma de N 10formiltetra hidrofolato John M Buchanan 19172007 Nelson6ed22indd 912 Nelson6ed22indd 912 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 913 H2 H O P H OH N O Aspartato CH2 O H OH O P P H H OH H P O CH2 H H OH NH H2C 1 O ADP 1 Pi H R Glutamato O C N H H N Glicinamida ribonucleotídeo GAR NFormilaminoimidazol4carboxamida ribonucleotídeo FAICAR R Glutamina H O C H H O R Formilglicinamida ribonucleotídeo FGAR PPi Glutamina Glutamato ADP 1 Pi H2C H2O H C H C CH R N Formilglicinamidina ribonucleotídeo FGAM ADP 1 Pi 5Fosfob Dribosilamina HCO 3 H C C C COO N H2C Glicina ADP 1 Pi 5Aminoimidazol ribonucleotídeo AIR H C O N H2N C N N H H H2O C R COO 5Aminoimidazol4carboxamida ribonucleotídeo AICAR N10Formil H4 folato H4 folato H N C C C R N H2N O H H2N O 5Fosforribosil1 pirofosfato PRPP N10Formil H4 folato H4 folato CH C O N N C R O C H2N CH C H R O NSuccinil5aminoimidazol4 carboxamidaribonucleotídeo SAICAR Carboxiaminoimidazol ribonucleotídeo CAIR N5Carboxiaminoimidazol ribonucleotídeo N5CAIR Fumarato H2N C N C H C N C N N H HN C C N O OH H H H Inosinato IMP O C O P O CH2 CH2 O H NH3 C C N N N C H2N N C H C CH R N ADP 1 Pi OO O C N AIR H O N C CO2 glutaminaPRPP amidotransferase GARsintetase GARtransformilase FGARamidotransferase FGAMciclase AIRsintetase N5CAIR sintetase AIRcarboxilase N5CAIRmutase SAICARsintetase SAICARliase AICARtransformilase IMPsintase ATP ATP ATP ATP ATP FIGURA 2235 Síntese de novo de nucleotídeos púricos construção do anel púrico do inosinato IMP Cada adição ao anel púrico está som breada de forma equivalente ao código de cores usado na Figura 2234 Após a etapa ➋ R simboliza o grupo 5fosfoDribosila sobre o qual o anel púrico é construído A formação de 5fosforribosilamina etapa ➊ é o primeiro passo comprometido na síntese de purinas Observe que o produto da etapa ➒ AICAR é remanescente do ATP liberado durante a biossíntese de histidina ver Figura 2222 etapa ➎ As abreviações são fornecidas para a maioria dos intermediários para simplificar a designação das enzimas A etapa é uma via alternativa do AIR ao CAIR que ocorre em eucariotos superiores Nelson6ed22indd 913 Nelson6ed22indd 913 070414 1424 070414 1424 914 DAVID L NELSON MICHAEL M COX lente É provável que a canalização dos intermediários das reações de uma enzima até a seguinte permitida por esses complexos seja especialmente importante no caso de inter mediários instáveis como a 5fosforribosilamina A conversão de inosinato em adenilato requer a inser ção de um grupo amino derivado do aspartato Figura 2236 isso ocorre por meio de duas reações semelhantes àquelas utilizadas para introduzir o N1 do anel púrico Fi gura 2235 etapas ➑ e ➒ Uma diferença crucial é que o GTP e não o ATP é a fonte do fosfato de alta energia para a síntese de adenilossuccinato O guanilato é produzido pela oxidação dependente de NAD 1 no C2 do inosinato seguindose a adição de um grupo amino derivado da glu tamina Na etapa final um ATP é clivado em AMP e PPi Figura 2236 A biossíntese de nucleotídeos púricos é regulada por retroalimentação negativa Três principais mecanismos de retroalimentação cooperam na regulação da velocidade geral da síntese de novo de nucleotídeos púricos e das velocidades relativas de forma ção dos dois produtos finais adenilato e guanilato Figura 2237 O primeiro mecanismo é exercido sobre a primeira reação que é exclusiva da síntese de purinas a transferên cia de um grupo amino para o PRPP para formar 5fosfor ribosilamina Essa reação é catalisada pela enzima alosté rica glutaminaPRPPamidotransferase que é inibida pelos produtos finais IMP AMP e GMP O AMP e o GMP atuam sinergicamente nessa inibição concertada Assim sempre que AMP ou GMP acumulamse e estão presentes em ex cesso o primeiro passo de sua biossíntese a partir de PRPP é parcialmente inibido No segundo mecanismo de controle exercido sobre um estágio posterior um excesso de GMP na célula inibe a formação de xantilato a partir de inosinato pela IMPde sidrogenase sem afetar a formação de AMP Por sua vez um acúmulo de adenilato inibe a formação de adenilossuc cinato pela adenilossuccinatosintetase sem afetar a bios síntese de GMP Quando os dois produtos estão presentes em quantidades suficientes o IMP acumulase e inibe um passo anterior da via essa estratégia reguladora é chamada inibição sequencial por retroalimentação No terceiro mecanismo o GTP é necessário para a conversão de IMP em AMP enquanto o ATP é necessário para a conversão de P Inosinato IMP NH2 Rib H2O H C OOC COO P Guanilato GMP N Rib P Adenilossuccinato NH Rib P O Rib P Xantilato XMP O Rib O Aspartato GDP 1 Pi CH2 Adenilato AMP Fumarato Glu AMP 1 PPi H2N Gln N HN N N N HN N N N N N N N N N N H O N HN N Adenilossuccinato sintetase Adenilossuccinatoliase IMP desidrogenase NAD1 NADH 1 H1 H2O XMPglutamina amidotransferase ATP GTP FIGURA 2236 Biossíntese de AMP e GMP a partir de IMP Ribose5fosfato IMP GMP AMP AMP GMP IMP ADP AMP GMP PRPP 5Fosforribosilamina Adenilossuccinato XMP Ribosefosfato pirofosfocinase PRPPsintetase GlutaminaPRPP amidotransferase XMPglutamina amidotransferase IMPdesidrogenase Adenilossuccinato sintetase Adenilossuccinato liase 9 etapas ATP ADP FIGURA 2237 Mecanismos reguladores na biossíntese de nucleotí deos da adenina e da guanina em E coli A regulação dessas vias difere em outros organismos Nelson6ed22indd 914 Nelson6ed22indd 914 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 915 IMP em GMP Figura 2236 arranjo recíproco que tende a equilibrar a síntese dos dois ribonucleotídeos O último mecanismo de controle é a inibição da síntese de PRPP pela regulação alostérica da ribosefosfatopiro fosfocinase Essa enzima é inibida por ADP e GDP além de metabólitos de outras vias para as quais o PRPP é o ponto de partida Os nucleotídeos pirimídicos são sintetizados a partir de aspartato PRPP e carbamoilfosfato Os ribonucleotídeos pirimídicos comuns são 59monofosfa to de citidina CMP citidilato e 59monofosfato de uridina UMP uridilato os quais contêm as pirimidinas citosina e uracila A biossíntese de novo dos nucleotídeos pirimídi cos Figura 2238 ocorre de forma um pouco diferente em relação à síntese dos nucleotídeos púricos o anel piri mídico de seis membros é sintetizado inicialmente sendo então ligado à ribose5fosfato Nesse processo é neces sário o carbamoilfosfato que também é intermediário no ciclo da ureia Contudo como observado no Capítulo 18 nos animais o carbamoilfosfato necessário para a síntese de ureia é produzido na mitocôndria pela carbamoilfosfa tosintetase I ao passo que o carbamoilfosfato necessário para a biossíntese de pirimidinas é produzido no citosol por uma forma diferente da enzima a carbamoilfosfato sintetase II Nas bactérias uma única enzima fornece o carbamoilfosfato para a síntese de arginina e pirimidinas A enzima bacteriana tem três sítios ativos separados es paçados ao longo de um canal de aproximadamente 100 Å de comprimento Figura 2239 A carbamoilfosfato sintetase bacteriana fornece uma vívida ilustração da canalização de intermediários reacionais instáveis entre sítios ativos O carbamoilfosfato reage com o aspartato produzindo Ncarbamoilaspartato no primeiro passo comprometido com a biossíntese de pirimidinas Figura 2238 Essa rea ção é catalisada pela aspartatotranscarbamoilase Nas bactérias esse passo é altamente regulado e a aspartato transcarbamoilase bacteriana é uma das enzimas alosté ricas mais bem estudadas ver a seguir Pela remoção de água do Ncarbamoilaspartato uma reação catalisada pela dihidroorotase o anel pirimídico é fechado formando Ldihidroorotato Esse composto é oxidado produzindo o derivado pirimídico orotato reação na qual NAD 1 é o aceptor final de elétrons Nos eucariotos as primeiras três enzimas dessa via carbamoilfosfatosintetase II aspar tatotranscarbamoilase e dihidroorotase são parte de uma única proteína trifuncional A proteína conhecida pelo acrônimo CAD contém três cadeias polipeptídicas idênticas cada qual com Mr 230000 cada uma delas com sítios ativos para todas as três reações Isso sugere que grandes complexos multienzimáticos possam ser a regra nessa via Uma vez que o orotato esteja formado a cadeia lateral de ribose5fosfato fornecida mais uma vez pelo PRPP é ligada produzindo orotidilato Figura 2238 O orotidilato é então descarboxilado originando uridilato que é fosfori lado até UTP O CTP é formado a partir do UTP pela ação da citidilatosintetase com formação de um intermediário acilfosfato consumindo um ATP O doador de nitrogênio Citidilato sintetase Uridina 59trifosfato UTP Cinases Uridilato UMP Orotidilato descarboxilase Orotidilato Orotato fosforribosil transferase Orotato Dihidroorotato desidrogenase LDihidroorotato Dihidroorotase NCarbamoilaspartato Aspartato trans carbamoilase Carbamoil fosfato Aspartato Citidina59trifosfato CTP FIGURA 2238 Síntese de novo de nucleotídeos pirimídicos biossín tese de UTP e CTP via orotidilato As pirimidinas são construídas a partir de carbamoilfosfato e aspartato A ribose5fosfato é então adicionada ao anel pirimídico completo pela orotatofosforribosiltransferase O primeiro passo dessa via não mostrado aqui ver Figura 1811a é a síntese de carba moilfosfato a partir de CO2 e NH4 1 catalisada nos eucariotos pela carbamoil fosfatosintetase II Nelson6ed22indd 915 Nelson6ed22indd 915 070414 1424 070414 1424 916 DAVID L NELSON MICHAEL M COX normalmente é a glutamina embora citidilatosintetases de muitas espécies possam utilizar diretamente o NH4 1 A biossíntese de nucleotídeos pirimídicos é regulada por retroalimentação negativa A regulação da velocidade de síntese de nucleotídeos pi rimídicos em bactérias ocorre em grande parte sobre a ação da aspartatotranscarbamoilase ATCase que cata lisa a primeira reação da sequência e é inibida pelo CTP o produto final da sequência Figura 2238 A molécula de ATCase bacteriana consiste em seis subunidades catalíti cas e seis subunidades reguladoras ver Figura 633 As subunidades catalíticas ligam as moléculas de substrato e as subunidades alostéricas ligam o inibidor alostérico o CTP A molécula de ATCase completa assim como suas subunidades existe em duas conformações ativa e inati va Quando o CTP não estiver ligado às subunidades regu ladoras a enzima apresenta atividade máxima À medida que o CTP se acumula e se liga às subunidades regula doras estas sofrem uma mudança em sua conformação Essa mudança é transmitida às subunidades catalíticas que então mudam para uma conformação inativa O ATP impede essas mudanças induzidas pelo CTP A Figura 2240 mostra os efeitos de reguladores alostéricos sobre a atividade da ATCase Nucleosídeos monofosfatados são convertidos em nucleosídeos trifosfatados Nucleotídeos a serem utilizados em vias biossintéticas ge ralmente são convertidos em nucleosídeos trifosfatados As vias de conversão são comuns a todas as células A fosfori lação de AMP em ADP é promovida pela adenilatocinase na reação ATP 1 AMP 2 ADP O ADP assim formado é fosforilado produzindo ATP pelas enzimas glicolíticas ou por meio da fosforilação oxidativa O ATP também participa da formação dos demais nu cleosídeos difosfatados pela ação de uma classe de enzimas chamadas de nucleosídeomonofosfatocinases Essas enzimas geralmente específicas para determinada base e não específicas para o açúcar ribose ou desoxirribose ca talisam a reação ATP 1 NMP ADP 1 NDP Os eficientes sistemas celulares que fosforilam novamente o ADP a ATP tendem a impulsionar essa reação no sentido dos produtos Os nucleosídeos difosfatados são convertidos nos seus equivalentes trifosfatados pela ação de uma enzima ubíqua nucleosídeodifosfatocinase que catalisa a reação NTPD 1 NDPA NDPD 1 NTPA Essa enzima é notável pelo fato de não ser específica para a base purinas ou pirimidinas ou para o açúcar ribose ou desoxirribose Essa não especificidade aplicase tanto ao aceptor do fosfato A quanto ao doador D embora o doador NTPD seja quase invariavelmente o ATP pois está presente em maiores concentrações que outros nucleosí deos trifosfatados em condições aeróbias Sítio de ligação da glutaminase Canal Sítio de ligação do ATP Sítio de ligação do ATP FIGURA 2239 Canalização de intermediários na carbamoilfosfato sintetase bacteriana Derivado de PDB ID 1M6V A reação catalisada por essa enzima e por sua contraparte mitocondrial está ilustrada na Figura 1811a A subunidade pequena e a grande são mostradas em bege escuro e azul respectivamente O canal entre os sítios ativos quase 100 Å de com primento é representado em branco Uma molécula de glutamina ligase à subunidade menor doando seu nitrogênio amídico como NH4 1 em uma reação do tipo glutaminaamidotransferase O NH4 1 entra no canal que o conduz a um segundo sítio ativo onde ele se combina com bicarbonato em uma reação que requer ATP O carbamato então retorna ao canal para alcançar o terceiro sítio ativo onde é fosforilado a carbamoilfosfato usan do ATP Para a determinação desta estrutura a enzima foi cristalizada com a ornitina ligada ao sítio de ligação da glutamina e ADP ligado aos sítios de ligação do ATP 1 Vmáx 2 Vmáx 10 20 30 K05 5 12 mM K05 5 23 mM Aspartato mM Atividade normal ausência de CTP CTP 1 ATP CTP V0 mMmin FIGURA 2240 Regulação alostérica da aspartatotranscarbamoilase por CTP e ATP A adição de CTP inibidor alostérico da ATCase em uma con centração de 08 mM aumenta o K05 para o aspartato curva inferior reduzin do a velocidade de conversão de aspartato em Ncarbamoilaspartato ATP na concentração de 06 mM reverte completamente esse efeito inibitório curva do meio Nelson6ed22indd 916 Nelson6ed22indd 916 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 917 Os ribonucleotídeos são precursores dos desoxirribonucleotídeos Os desoxirribonucleotídeos os blocos constitutivos do DNA são produzidos a partir dos ribonucleotídeos corresponden tes por redução direta do átomo de carbono 29 da Dribose formando o derivado 29desóxi Por exemplo o difosfato de adenosina ADP é reduzido a difosfato de 29desoxiadeno sina dADP e o GDP é reduzido a dGDP Essa reação é de certo modo incomum pelo fato de que a redução ocorre em um carbono não ativado não são conhecidas reações quí micas análogas muito próximas A reação é catalisada pela ribonucleotídeoredutase melhor caracterizada em E coli cujos substratos são ribonucleosídeos difosfatados A redução da porção Dribose de um ribonucleosídeo difosfatado em 29desóxiDribose requer um par de áto mos de hidrogênio que são doados em última análise pelo NADPH via uma proteína carreadora de hidrogênios inter mediária a tiorredoxina Essa proteína ubíqua tem uma função redox semelhante na fotossíntese ver Figura 2019 e em outros processos A tiorredoxina tem pares de grupos SH que carregam átomos de hidrogênio do NADPH até o ribonucleosídeo difosfatado Sua forma oxidada dissulfe to é reduzida pelo NADPH em uma reação catalisada pela tiorredoxinaredutase Figura 2241 e a tiorredoxina reduzida é então utilizada pela ribonucleotídeoredutase para reduzir nucleosídeos difosfatados NDP produzindo desoxirribonucleosídeos difosfatados dNDP Uma segun da fonte de equivalentes redutores para a ribonucleotídeo redutase é a glutationa GSH A glutationa serve como agente redutor para uma proteína semelhante à tiorredoxi na a glutarredoxina que então transfere poder redutor à ribonucleotídeoredutase Figura 2241 A ribonucleotídeoredutase é notável por seu mecanis mo de reação que fornece o exemplo melhor caracterizado de algo que se acreditava ser raro nos sistemas biológicos o envolvimento de radicais livres em transformações bio químicas A enzima da E coli e da maioria dos eucariotos é um dímero a2b2 com as subunidades a2 catalíticas e as subunidades b2 funcionando como geradores de radicais li vres Figura 2242 Cada subunidade catalítica contém dois tipos de sítios reguladores como descrito a seguir Os NADP1 Glutationa redutase Glutarredoxina redutase Tiorredoxina redutase dNDP NDP S S HS HS SH S S SH S S SH SH GSSG NADP1 H2O Ribonucleotídeo redutase Glutarredoxina Glutarredoxina Tiorredoxina Tiorredoxina FADH2 2GSH FAD NADPH 1 H1 NADPH 1 H1 Ribonucleotídeo redutase a b FIGURA 2241 Redução de ribonucleotídeos a desoxirribonucleotí deos pela ribonucleotídeoredutase Os elétrons são transmitidos setas vermelhas para a enzima a partir do NADPH via a glutarredoxina ou b tiorredoxina Os grupos sulfeto na glutarredoxinaredutase são fornecidos por duas moléculas de glutationa ligada GSH GSSG indica a glutationa oxi dada Observe que a tiorredoxinaredutase é uma flavoenzima com FAD como grupo prostético FIGURA 2242 Ribonucleotídeoredutase a Um diagrama esquemá tico das estruturas das subunidades A subunidade catalítica a também chamada R1 contém os dois sítios reguladores descritos na Figura 2244 e dois resíduos de Cys centrais para o mecanismo de reação As subunidades b também chamadas R2 geradoras de radicais livres contêm o resíduo de Tyr 122 crítico e o centro com o ferro binuclear b As estruturas de a2 e b2 originam a estrutura provável de a2b2 derivada de PDB ID 3UUS c Via pro vável para a formação de radical desde a Tyr 122 inicial em uma subunidade b até a Cys 439 do sítio ativo usada no mecanismo da reação mostrado na Figu ra 2243 Diversos resíduos de aminoácidos aromáticos participam em uma transferência de radicais de longo alcance desde o ponto de sua formação na Tyr 122 até o sítio ativo onde o nucleotídeo substrato está ligado SH Fe31 O O O Fe31 Fe31 HS XH HX SH HS Subunidade a Subunidade b Subunidade a ATP dATP dGTP dTTP ATP dATP Principal sítio regulador Sítio ativo Sítio de especificidade ao substrato Sítios reguladores Substratos a Efetores alostéricos F O ADP CDP UDP GDP e31 c Tyr122 Trp48 Tyr356 Tyr731 Tyr730 Cys 439 b a a b b a 2b2 Via para os radicais Modelo de ancoramento para Nelson6ed22indd 917 Nelson6ed22indd 917 070414 1424 070414 1424 918 DAVID L NELSON MICHAEL M COX dois sítios ativos da enzima formamse na interface entre as subunidades catalíticas a2 e geradoras de radicais livres b2 Em cada sítio ativo a subunidade a contribui com dois grupos sulfidrila necessários para a atividade e as subu nidades b2 contribuem com um radical tirosila estável As subunidades b2 também apresentam um cofator ferro binu clear Fe 31 que ajuda a gerar e a estabilizar o radical Tyr 122 Figura 2242 O radical tirosila está muito distante do sítio ativo para interagir diretamente com o sítio mas diversos resíduos aromáticos formam uma via de longo alcance de transferência de radicais até o sítio ativo Figura 2242c Um mecanismo provável para a reação da ribonucleotídeo redutase está ilustrado na Figura 2243 Na E coli fontes prováveis dos equivalentes redutores necessários para essa reação são a tiorredoxina e a glutarredoxina como observa do anteriormente Três classes de ribonucleotídeoredutases foram des critas Seus mecanismos quando conhecidos geralmente estão de acordo com o esquema na Figura 2243 mas essas reações diferem quanto à identidade do grupo que fornece o radical no sítio ativo e quanto aos cofatores utilizados para gerálo A enzima da E coli classe I requer oxigênio para regenerar o radical tiroxila se ele estiver inativado de modo que essa enzima somente funciona em um ambiente aeróbio Enzimas de classe II encontradas em outros microrganis mos apresentam 59desoxiadenosilcobalamina ver Quadro 172 em vez de um centro de ferro binuclear Enzimas de classe III evoluíram para atuar em ambientes anaeróbios A E coli contém quando cresce anaerobiamente uma ribo nucleotídeoredutase adicional de classe III essa enzima contém um centro de ferroenxofre estruturalmente distin to do centro binuclear de ferro da enzima de classe I e re quer NADPH e Sadenosilmetionina para sua atividade Ela utiliza como substratos nucleosídeos trifosfatados em vez de nucleosídeos difosfatados A evolução das diferentes classes de ribonucleotídeoredutases para a produção de precurso res do DNA em diferentes ambientes reflete a importância dessa reação no metabolismo dos nucleotídeos A regulação da ribonucleotídeoredutase da E coli é in comum pelo fato de que não apenas sua atividade mas sua especificidade quanto ao substrato é regulada pela liga ção de moléculas efetoras Cada subunidade a contém dois H O NDP Tiorredoxina SH2 glutarredoxina Tiorredoxina S S glutarredoxina NDP dNDP dNDP X H CH2 H Base O H OH H P O P S2 1O H X H CH2 H Base O H OH H P O P O H 39 29 H H X CH2 H Base O H OH H P O P HS HS O H S HS HS Ribonucleotídeo redutase H H H H H S X CH2 Base O H OH H P O P S H H H S X CH2 Base O H OH H P O P S H S CH2 Base O H OH H P O P 1 H H X S2 A etapa é revertida regenerando na enzima um radical tirosila O ditiol da enzima é reduzido para completar o ciclo A hidroxila 29é protonada Eliminação de H2O formando um carbocátion estabilizado por radical O ditiol na enzima é oxidado dois elétrons são transferidos para o carbono 29 Um radical 39ribonucleotídeo é formado Subunidade a Subunidade b MECANISMO FIGURA 2243 Mecanismo proposto para a ribonucleo tídeoredutase Na enzima de E coli e na maioria dos eucariotos os gru pos tiol ativos estão na subunidade a O radical no sítio ativo X está na subunidade b e na E coli provavelmente seja um radical tiila da Cys 439 ver Figura 2242 Nelson6ed22indd 918 Nelson6ed22indd 918 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 919 tipos de sítios reguladores Figura 2242 Um tipo afeta a atividade geral da enzima e liga ou ATP que ativa a enzima ou dATP que a inativa O segundo tipo determina uma al teração na especificidade quanto ao substrato em resposta à molécula efetora ATP dATP dTTP ou dGTP que ali se liga Figura 2244 Quando ATP ou dATP está ligado a redução de UDP e CDP é favorecida Quando dTTP ou dGTP está ligado a redução de GDP ou ADP respectiva mente é estimulada O esquema é projetado para fornecer um conjunto equilibrado de precursores para a síntese de DNA O ATP também é um ativador geral para a biossíntese e a redução de ribonucleotídeos A presença de dATP em pequenas quantidades aumenta a redução de nucleotídeos pirimídicos Um suprimento excessivo de dNTP pirimídico é sinalizado por altos níveis de dTTP que altera a especifici dade em favor da redução de GDP Níveis elevados de dGTP por sua vez deslocam a especificidade para a redução do ADP e altos níveis de dATP inativam a enzima Acreditase que esses efetores induzam diversas conformações enzimá ticas distintas com diferentes especificidades Esses efeitos regulatórios são acompanhados e possi velmente mediados por grandes rearranjos estruturais na enzima Quando a forma ativa da enzima de E coli a2b2 é inibida pela adição do inibidor alostérico dATP formase uma estrutura em anel a4b4 com subunidades a2 e b2 al ternadas Figura 2245 Nessa estrutura alterada a via de formação de radicais de b para a é prejudicada e os resíduos no caminho ficam expostos ao solvente de modo que é efetivamente impedida a transferência de radicais inibindo assim a reação A formação das estruturas em anel a4b4 é revertida quando os níveis de dATP são reduzidos A ribonucleotídeoredutase de leveduras também sofre oligo merização na presença de dATP formando uma estrutura hexamérica em anel a6b6 dCDP dGDP dADP dTTP dCTP dGTP dATP Regulação nos sítios de especificidade ao substrato Produtos dUDP dCDP dGDP dADP dTTP dCTP dGTP dATP CDP ADP Regulação nos principais sítios reguladores Produtos Substratos ATP dATP GDP dUDP UDP FIGURA 2244 Regulação da ribonucleotídeoredutase por desoxi nucleosídeos trifosfatados A atividade geral da enzima é afetada pela ligação de efetores ao principal sítio regulador à esquerda A especificidade da enzima ao substrato é afetada pela natureza da molécula efetora ligada ao segundo tipo de sítio regulador o sítio de especificidade ao substrato à direita O diagrama indica inibição ou estimulação da atividade enzimática para os quatro diferentes substratos A via desde o dUDP até o dTTP é descri ta posteriormente ver Figuras 2246 2247 a2 b2 a2b2 a4b4 FIGURA 2245 Oligomerização da ribonucleotídeoredutase induzi da pelo inibidor alostérico dATP Em altas concentrações de dATP 50 mM formamse estruturas a4b4 em forma de anel PDB ID 3UUS Nessa con formação os resíduos da via formadora de radicais ficam expostos ao solven te bloqueando a reação com o radical e inibindo a enzima A oligomerização é revertida em baixas concentrações de dATP Nelson6ed22indd 919 Nelson6ed22indd 919 070414 1424 070414 1424 920 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O timidilato é derivado do dCDP e do dUMP O DNA contém timina em vez de uracila e a via de novo até a timina envolve apenas desoxirribonucleotídeos O precur sor imediato do timidilato dTMP é o dUMP Em bactérias a via para o dUMP inicia com a formação de dUTP seja por desaminação de dCTP ou por fosforilação do dUDP Figu ra 2246 O dUTP é convertido em dUMP por uma dU TPase Essa última reação deve ser eficiente para manter baixos níveis de dUTP impedindo a incorporação de uridi lato ao DNA A conversão de dUMP em dTMP é catalisada pela ti midilatosintase Uma unidade de um carbono no estado de oxidação de hidroximetila CH2OH Figura 1817 é transferida do N 5N 10metilenotetrahidrofolato para o dUMP e então reduzida até um grupo metila Figura 22 47 A redução ocorre à custa da oxidação do tetrahidro folato em dihidrofolato que é incomum em reações que requerem tetraidrofolato O mecanismo dessa reação é mostrado na Figura 2253 O dihidrofolato é reduzido a tetrahidrofolato pela dihidrofolatoredutase regene ração essencial para muitos processos que requerem tetra hidrofolato Em plantas e em pelo menos um protista a timidilatosintase e a dihidrofolatoredutase residem em uma única proteína bifuncional Cerca de 10 dos seres humanos e até 50 das pes soas em comunidades pobres sofrem de deficiência de ácido fólico Quando a deficiência é grave os sintomas podem incluir doença cardíaca câncer e alguns tipos de distúrbios encefálicos Pelo menos alguns desses sintomas surgem da redução da síntese de timidilato levando a uma incorporação anormal de uracila no DNA A uracila é reco nhecida pelos sistemas de reparo do DNA descritos no Capítulo 25 e é removida do DNA A presença de altos níveis de uracila no DNA leva a quebras da fita que podem afetar muito a função e a regulação do DNA nuclear cau sando por fim os efeitos observados sobre o coração e o encéfalo assim como aumento da mutagênese que leva ao câncer A degradação de purinas e pirimidinas produz respectivamente ácido úrico e ureia Os nucleotídeos púricos são degradados por uma via na qual eles perdem seu fosfato por meio da ação da 59nu cleotidase Figura 2248 O adenilato produz adeno sina que é desaminada pela adenosinadesaminase gerando inosina a qual é hidrolisada produzindo hipoxan tina sua base púrica e Dribose A hipoxantina é sucessi vamente oxidada a xantina e a ácido úrico pela xantina oxidase flavoenzima com um átomo de molibdênio e quatro centros de ferroenxofre em seu grupo prostético O oxigênio molecular é o aceptor de elétrons nessa com plexa reação O catabolismo do GMP também produz ácido úrico como produto final O GMP é inicialmente hidrolisado origi nando guanosina a qual é então clivada liberando guanina livre A guanina sofre remoção hidrolítica de seu grupo ami no produzindo xantina que é convertida em ácido úrico pela xantinaoxidase Figura 2248 dCDP dCTP UDP dUDP dUTP dUMP dTMP Ribonucleotídeo redutase Nucleosídeo difosfato cinase Desaminase dUTPase Timidilato sintase CDP FIGURA 2246 Biossíntese de timidilato dTMP As vias são mostradas iniciando com a reação catalisada pela ribonucleotídeoredutase A Figura 2247 fornece detalhes da reação da timidilatosintase O CH2 OH N N H H H C H CH2 dTMP O P O HN O OH O N H H H H H CH2 dUMP O P O HN H H O O N H2N H N H HN CH2 N H H O N H2N C HN H H H N H HN R N R Timidilatosintase N5N10Metileno tetrahidrofolato 78Dihidrofolato Glicina Serina NADPH 1 H1 1 NADP Serina hidroximetil transferase Dihidrofolato redutase Tetrahidrofolato CH2 N H O N H2N HN H N HN R PLP FIGURA 2247 Conversão de dUMP em dTMP pelas enzimas timidila tosintase e dihidrofolatoredutase A serinahidroximetiltransferase é necessária para a regeneração da forma N 5N 10metileno do tetrahidrofolato Na síntese do dTMP todos os três hidrogênios do grupo metila adicionado são derivados do N 5N 10metilenotetrahidrofolato em cor salmão e cinza Nelson6ed22indd 920 Nelson6ed22indd 920 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 921 O ácido úrico é o produto final de excreção do catabo lismo das purinas em primatas aves e em alguns outros animais Um adulto humano saudável excreta ácido úrico em uma taxa de cerca de 06 g24 h o produto excretado originase em parte das purinas ingeridas e em parte da renovação dos nucleotídeos púricos dos ácidos nucleicos Na maioria dos mamíferos e em muitos outros vertebrados o ácido úrico é ainda degradado até alantoína pela ação da uratooxidase Em outros organismos a via continua ainda mais como mostrado na Figura 2248 As vias para a degradação das pirimidinas geralmente levam à produção de NH4 1 e assim à síntese de ureia A timina por exemplo é degradada em semialdeído metil malônico Figura 2249 intermediário do catabolismo da valina Esse composto é então degradado via propionil CoA e metilmalonilCoA gerando por fim succinilCoA ver Figura 1827 Aberrações genéticas do metabolismo das purinas em humanos têm sido observadas algumas com graves consequências Por exemplo a deficiência de adenosina deaminase ADA leva a uma doença com grave imuno deficiência na qual os linfócitos T e B não se desenvolvem adequadamente A falta de ADA leva a um aumento de 100 vezes nas concentrações celulares de dATP um poderoso inibidor da ribonucleotídeoredutase Figura 2244 Altos níveis de dATP produzem uma deficiência geral de outros dNTP nos linfócitos T A base para a toxicidade para os lin fócitos B está menos esclarecida Pessoas com deficiência de ADA não possuem um sistema imune efetivo e não so brevivem a não ser isolados no ambiente de uma bolha N H C GMP Guanosina Nucleosidase AMP Guanina desaminase Adenosina Inosina Hipoxantina forma cetônica Xantina forma cetônica Ácido úrico H2O Guanine Nucleosidase H2O2 O H2O Pi 59nucleotidase 59nucleotidase H2O Pi NH3 H2O Ribose O HN N N N N H Ribose H2O H2O 1 O2 H O HO Xantina oxidase Xantina oxidase OH HO HN 4NH4 1 O Adenosina desaminase NH2 H2O C C C C C N N H N C O H2O2 H2O 1 O2 Alantoicase N H OH C Ácido úrico Alantoína C O H N C H C NH3 O H2O Alantoinase NH2 NH2 C O N H C H COO2 Alantoato Urease COO2 CHO Glioxilato NH2 C O H2O CO2 Uratooxidase 2 H2N 2H2O 2CO2 Ureia Excretado por Primatas aves répteis insetos A maior parte dos mamíferos Peixes ósseos Anfíbios peixes cartilaginosos Invertebrados marinhos O2 1 H2O H2N O HN N N N N N H N N N H HO HN O N H HN 2 1 FIGURA 2248 Catabolismo dos nucleotídeos púricos Observe que os primatas excretam muito mais nitrogênio na forma de ureia via ciclo da ureia Capítulo 18 do que na forma de ácido úrico produzido na degradação das purinas Do mesmo modo os peixes excretam muito mais nitrogênio em forma de NH4 1 do que em forma de ureia produzida na via aqui mostrada Nelson6ed22indd 921 Nelson6ed22indd 921 070414 1424 070414 1424 922 DAVID L NELSON MICHAEL M COX estéril A deficiência de ADA foi um dos primeiros alvos das tentativas de terapia gênica em humanos em 1990 que produziram resultados conflitantes Em tentativas mais re centes alguns indivíduos com deficiência de ADA consegui ram obter função imunitária normal após receberem um gene funcional para a ADA Bases púricas e pirimídicas são recicladas por vias de salvação As bases púricas e pirimídicas livres são constantemen te liberadas nas células durante a degradação metabólica dos nucleotídeos As purinas livres são em grande parte salvas e reutilizadas para sintetizar nucleotídeos em uma via muito mais simples que a síntese de novo dos nucleo tídeos púricos descrita anteriormente Uma das principais vias de salvação consiste em uma única reação catalisada pela adenosinafosforribosiltransferase na qual ade nina livre reage com PRPP para produzir o correspondente nucleotídeo da adenina Adenina 1 PRPP AMP 1 PPi Guanina e hipoxantina produto da desaminação da adeni na Figura 2248 livres são salvas por essa mesma via pela hipoxantinaguaninafosforribosiltransferase Existe uma via de salvação semelhante para bases pirimídicas em microrganismos e possivelmente em mamíferos Um defeito genético na atividade da hipoxantinagua ninafosforribosiltransferase observado quase exclu sivamente em crianças do sexo masculino resulta no con junto de sintomas denominado síndrome de LeschNyhan Crianças com essa doença genética que se manifesta em torno dos dois anos apresentam algumas vezes baixa coordenação motora e deficiência intelectual Além disso são extremamente agressivas e mostram tendências à com pulsão autodestrutiva apresentam automutilação morden do dedos artelhos e lábios Os efeitos devastadores da síndrome de LeschNyhan ilustram a importância das vias de salvação Hipoxantina e guanina surgem constantemente da degradação dos ácidos nucleicos Na ausência da hipoxantinaguaninafosforribo siltransferase os níveis de PRPP aumentam e ocorre uma superprodução de purinas pela via de novo resultando na produção de altos níveis de ácido úrico e lesão tecidual se melhante à da gota ver a seguir O cérebro é especialmen te dependente das vias de salvação e isso pode ser a causa da lesão do sistema nervoso em crianças com síndrome de LeschNyhan Essa síndrome é outro alvo potencial para a terapia gênica Excesso de ácido úrico causa gota Durante muito tempo acreditouse erroneamente que a gota fosse devida a um estilo de vida elevado A gota é uma doença das articulações causada pela con centração elevada de ácido úrico no sangue e nos tecidos As articulações tornamse inflamadas doloridas e artríticas devido à deposição anormal de cristais de urato de sódio Os rins também são afetados pois ácido úrico em excesso se deposita nos túbulos renais A gota ocorre predominan temente em pessoas do sexo masculino Sua causa precisa não é conhecida mas frequentemente envolve uma excre ção reduzida de uratos A deficiência genética de alguma enzima do metabolismo das purinas também pode ser um fator em alguns casos A gota pode ser tratada de maneira eficiente por uma combinação de terapias nutricionais e farmacológicas Ali mentos especialmente ricos em nucleotídeos e ácidos nuclei cos como fígado ou produtos glandulares devem ser removi dos da dieta Um grande alívio dos sintomas pode ser obtido pela administração de alopurinol Figura 2250 que ini be a xantinaoxidase a enzima que catalisa a conversão de purinas em ácido úrico O alopurinol é um substrato da xan NADPH 1 H1 O HN C N H C C O NADP1 O HN C CH N H CH2 C C O H H2N CH3 Timina Dihidrouracil desidrogenase Dihidrotimina Dihidropirimidinase CH3 C O NH CH2 CH CH3 C O O2 H2O H3N 2 CH2 CH C O O2 CH3 Aminotransferase bAminoisobutirato H2O bureidopropionase aCetoglutarato Glutamato CH H3 C C O2 O O H Semialdeído metilmalônico 1 NH4 1 HCO3 1 bUreidoisobutirato FIGURA 2249 Catabolismo de uma pirimidina Aqui está mostrada a via do catabolismo da timina O semialdeído metilmalônico é posteriormen te degradado a succinilCoA Nelson6ed22indd 922 Nelson6ed22indd 922 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 923 tinaoxidase que o converte em oxipurinol aloxantina O oxipurinol inativa a forma reduzida da enzima permanecen do fortemente ligado ao seu sítio ativo Quando a xantina oxidase é inibida os produtos de excreção do metabolismo das purinas são xantina e hipoxantina que são mais hidros solúveis que o ácido úrico e apresentam menor probabilidade de formar depósitos de cristais O alopurinol foi desenvolvido por Gertrude Elion e George Hitchings que também desen volveram o aciclovir usado no tratamento de pacientes com infecções orais ou genitais por herpes e outros análogos das purinas utilizados na quimioterapia contra o câncer Muitos agentes quimioterápicos têm como alvo enzimas das vias de biossíntese de nucleotídeos O crescimento de células cancerosas não é controlado da mesma forma que o crescimento das células na maioria dos tecidos normais As células cancerosas apre sentam maiores necessidades de nucleotídeos como pre cursores de DNA e RNA e em consequência geralmente são mais sensíveis do que as células normais aos inibidores da biossíntese de nucleotídeos Um conjunto crescente de agentes quimioterápicos importantes para o câncer e para outras doenças atua inibindo uma ou mais enzimas dessas vias Serão descritos aqui diversos exemplos bem estuda dos que ilustram abordagens produtivas de tratamento e ajudam a compreender como essas enzimas funcionam O primeiro conjunto de agentes inclui compostos que inibem glutaminaamidotransferases Lembre que a gluta mina atua como doador de nitrogênio em pelo menos meia dúzia de reações isoladas da biossíntese de nucleotídeos Os sítios de ligação para a glutamina e o mecanismo pelo qual o NH4 1 é extraído são bastante semelhantes em muitas dessas enzimas A maioria delas é fortemente inibida por análogos da glutamina como azasserina e acivicina Fi gura 2251 A azasserina caracterizada por John Bucha nan na década de 1950 foi um dos primeiros exemplos de inativador enzimático com base no mecanismo da reação inativador suicida p 210 e Quadro 63 A acivicina parece promissora como agente quimioterápico contra o câncer Outros alvos úteis para agentes farmacêuticos são a timidilatosintase e a dihidrofolatoredutase enzimas que fornecem a única via celular para a síntese de timina Fi gura 2252 Inibidor que atua na síntese de timidilato a fluorouracila é um importante agente quimioterápico A fluorouracila por si só não é um inibidor enzimático Na célula vias de salvação a convertem no desoxinucleosídeo monofosfatado FdUMP que se liga à enzima inativando a A inibição por FdUMP Figura 2253 é um exemplo clássico de inativação enzimática com base no mecanismo da reação O metotrexato outro exemplo importante de agente quimioterápico é um inibidor da dihidrofolatore dutase Esse análogo do folato atua como inibidor compe titivo a enzima ligase ao metotrexato com afinidade cerca de 100 vezes maior que ao dihidrofolato A aminopterina é um composto relacionado que atua de forma semelhante O potencial clínico dos inibidores da biossíntese de nu cleotídeos não está limitado ao tratamento do câncer To das as células de crescimento rápido incluindo bactérias e OH N HC N N H C C N Hipoxantina forma enólica H C N C HC N C C N Alopurinol OH N H CH C H C N C N C C N Oxipurinol OH N H C HO Xantina oxidase FIGURA 2250 Alopurinol inibidor da xantinaoxidase A hipoxanti na é o substrato normal da xantinaoxidase Apenas uma leve alteração na estrutura da hipoxantina sombreada em cor salmão produz um inibidor enzimático clinicamente efetivo o alopurinol No sítio ativo o alopurinol é convertido em oxipurinol um forte inibidor competitivo que permanece firmemente ligado à forma reduzida da enzima CH2 NH3 O H N2 1 NH2 C CH NH3 H COO2 1 C Acivicina O C O CH2 COO N1 Glutamina C N 1 CH2 C H Cl COO2 CH C O CH2 NH3 Azasserina FIGURA 2251 Azasserina e acivicina inibidores das glutaminaami dotransferases Esses análogos da glutamina interferem em diversas vias de biossíntese de aminoácidos e nucleotídeos Gertrude Elion 19181999 e George Hitchings 19051998 Nelson6ed22indd 923 Nelson6ed22indd 923 070414 1424 070414 1424 924 DAVID L NELSON MICHAEL M COX a dUMP dTMP FdUMP Metotrexato Aminopterina Trimetoprima Serina PLP Glicina NADP1 Timidilatosintase Dihidrofolato redutase Serina hidroximetil transferase N5 N10Metileno H4 folato 78Dihidrofolato H4 folato NADPH 1 H1 HN N H F NH2 CH CH3 COO2 O Metotrexato CH2 O NH O H N C H2 CH2 N N N N N N CH2 COO2 Fluoruracila b 10 5 O Trimetoprima CH3 H3CO H3CO NH2 NH2 N FIGURA 2252 Síntese de timidilato e metabolismo do folato como alvos para quimioterapia a Durante a síntese de timidila to o N 5N 10metilenotetrahidrofolato é convertido em 78dihidrofolato o N 5N 10metilenotetrahidrofolato é regenerado em dois passos ver Figura 22 47 Esse ciclo é um alvo importante para diversos agentes quimioterápicos b Fluoruracila e metotrexato são importantes agentes quimioterápicos Nas células a fluoruracila é convertida em FdUMP que inibe a timidilatosintase O metotrexato análogo estrutural do tetrahidrofolato inibe a dihidrofolato redutase os grupos amino e metila sombreados substituem um oxigênio carbonílico e um átomo de hidrogênio respectivamente no folato ver Figu ra 2247 Outro importante análogo do folato a aminopterina é idêntico ao metotrexato apenas não apresentando o grupo metila sombreado Trimeto prima inibidor que se liga firmemente à dihidrofolatoredutase bacteriana foi desenvolvido como um antibiótico MECANISMO FIGURA 2253 Conversão de dUMP em dTMP e sua inibi ção por FdUMP No lado esquerdo está representado o mecanismo normal de reação da timidilatosintase O grupo nucleofílico sulfidrila fornecido pela enzima na etapa ➊ e os átomos do anel do dUMP que tomam parte na rea ção são mostrados em vermelho B denota a cadeia lateral de um aminoáci do que atua como base para abstrair um próton após a etapa ➌ Os hidrogê nios provenientes do grupo metileno do N 5N 10metilenotetrahidrofolato estão sombreados em cinza Uma transferência de hidreto 13 etapa ➍ move um íon hidreto sombreado em cor salmão do C6 do H4folato para o grupo metila da timidina resultando na oxidação do tetrahidrofolato em dihidrofo lato Esta transferência do hidreto é bloqueada quando FdUMP é o substrato à direita As etapas ➊ e ➋ ocorrem normalmente mas resultam em um com plexo estável consistindo em FdUMP ligado covalentemente à enzima e ao tetrahidrofolato o que inativa a enzima Mecanismo da timidilatosintase O HN N R O CH3 N5N10Metileno H4 folato O HN N R9 R C H O H H C CH2 O F HN C N R C H O H H C Enzima 1 dihidrofolato dTMP dUMP O H H HN C N R9 R C H O N H H C CH2 B B B B B 10 O HN N R9 R C H O H H C CH2 O H HN C N R C H O H H H C S S CH2 C H NH CH2 C H N CH2 C H N 5 CH2 C H N CH2 C H F C S S Complexo covalente representando um beco sem saída R9 NH NH CH2 S H C R9 NH NH CH2 O tiolato da enzima adicionase ao C6 do dUMP uma adição do tipo Michael o N10 é protonado e é formado o íon N5imínio a partir do metilenoH4 folato O carbânion em C5 adicionase ao íon N5imínio Metilideno é formado no C5 da pirimidina N5 é eliminado para formar H4 folato A transferência de hidreto13 produz dTMP e dihidrofolato H H FdUMP O F HN C N R9 R C H O N H H C CH2 B CH2 C H N S NH H O HN C N R C H O HB S CH2 C N H C H H R9 NH CH2 H H H H Nelson6ed22indd 924 Nelson6ed22indd 924 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 925 protistas são potenciais alvos A trimetoprima antibiótico desenvolvido por Hitchings e Elion ligase à dihidrofolato redutase bacteriana com eficiência cerca de 100000 vezes maior do que se liga à enzima de mamíferos sendo usada no tratamento de certas infecções bacterianas urinárias e do ouvido médio Protistas parasíticos como os tripanossomos que causam a doença do sono africana tripanossomíase afri cana não têm vias para a biossíntese de novo de nucleotí deos e são especialmente sensíveis a agentes que interferem em seus processos de captar do ambiente nucleotídeos a serem utilizados em vias de salvação O alopurinol Figura 2250 e diversos análogos semelhantes das purinas têm se mostrado promissores para o tratamento da tripanossomía se africana e de doenças relacionadas Consulte no Quadro 63 outra abordagem para o combate à tripanossomíase afri cana possibilitada pelo avanço em nossa compreensão do metabolismo e dos mecanismos enzimáticos RESUMO 224 Biossíntese e degradação de nucleotídeos c O sistema de anéis das purinas é construído passo a pas so iniciando com 5fosforribosilamina Os aminoácidos glutamina glicina e aspartato fornecem todos os átomos de nitrogênio das purinas Os passos de fechamento dos dois anéis formam o núcleo das purinas c As pirimidinas são sintetizadas a partir de carbamoil fosfato e de aspartato e a ribose5fosfato é então liga da para produzir ribonucleotídeos pirimídicos c Nucleosídeos monofosfatados são convertidos em seus derivados trifosfatados por reações enzimáticas de fos forilação Os ribonucleotídeos são convertidos em de soxirribonucleotídeos pela ribonucleotídeoredutase enzima com novas características mecanísticas e regula doras Os nucleotídeos da timina são derivados de dCDP e dUMP c O ácido úrico e a ureia são produtos finais da degrada ção de purinas e pirimidinas c Purinas livres podem ser usadas em vias de salvação na reconstrução de nucleotídeos Deficiências genéticas em certas enzimas das vias de salvação causam doenças graves como a síndrome de LeschNyhan e a deficiência de ADA c O acúmulo de cristais de ácido úrico nas articulações possivelmente causado por outra deficiência genética resulta na gota c Enzimas das vias de biossíntese de nucleotídeos são al vos de um conjunto de agentes quimioterápicos utiliza dos no tratamento do câncer e de outras doenças Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário ciclo do nitrogênio 882 fixação do nitrogênio 882 anamox 882 simbiontes 882 complexo da nitrogenase 883 grupo P 883 cofator FeMo 883 leghemoglobina 888 glutaminasintetase 888 glutamatosintase 888 glutaminaamidotransferases 890 5fosforribosil1pirofosfato PRPP 892 triptofanosintase 898 porfirinas 902 porfiria 904 bilirrubina 904 fosfocreatina 906 creatina 906 glutationa GSH 906 auxina 908 dopamina 909 noradrenalina 909 adrenalina 909 gaminobutirato GABA 909 serotonina 909 histamina 909 cimetidina 909 espermina 909 espermidina 909 ornitinadescarboxilase 909 via de novo 910 via de salvação 910 inosinato IMP 912 carbamoilfosfatosintetase II 915 aspartatotranscarbamoilase 915 nucleosídeomonofosfato cinase 916 nucleosídeodifosfato cinase 916 ribonucleotídeo redutase 917 tiorredoxinaredutase 917 timidilatosintase 920 dihidrofolatoredutase 920 deficiência de adenosina desaminase ADA 921 síndrome de LeschNyhan 922 alopurinol 922 azasserina 923 acivicina 923 fluoruracila 923 metotrexato 923 aminopterina 923 Leituras adicionais Fixação de nitrogênio Arp DJ Stein LY 2003 Metabolism of inorganic Ncompounds by ammoniaoxidizing bacteria Crit Rev Biochem Mol Biol 38 491495 Burris RH 1995 Breaking the NN bound Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 46 119 Eisenberg DS Harindarpal S Gill G Pfluegl MU Rothstein H 2000 Structurefunction relationships of glutamine synthetases Biochim Biophys Acta 1477 122145 Fuerst JA 2005 Intracellular compartmentation in planctomycetes Annu Rev Microbiol 59 299328 Discussão avançada acerca da estrutura e da bioquímica dos organismos anamox Igarishi RY Seefeldt LC 2003 Nitrogen fixation the mechanism of the Modependent nitrogenase Crit Rev Biochem Mol Biol 38 351384 Lin JT Stewart V 1998 Nitrate assimilation in bacteria 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sítio ativo para outro Biossíntese de aminoácidos Frey PA Hegeman AD 2007 Enzymatic Reaction Mechanisms Oxford University Press New York Resumo atualizado de mecanismos de reação incluindo o metabolismo de grupos de um carbono e as enzimas dependentes de piridoxalfosfato Neidhardt FC ed 1996 Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology 2 nd edn ASM Press Washington DC O volume 1 deste conjunto de 2 volumes apresenta 13 capítulos dedicados a descrições detalhadas da biossíntese de aminoácidos e nucleotídeos em bactérias Uma versão atualizada regularmente pode ser encontrada na internet wwwecosalorg Fonte valiosa Pan P Woehl E Dunn MF 1997 Protein architecture dynamics and allostery in tryptophan synthase channeling Trends Biochem Sci 22 2227 Richards NGJ Kilberg MS 2006 Asparagine synthetase chemotherapy Annu Rev Biochem 75 629654 Stadtman ER 2001 The story of glutamine synthetase regulation J Biol Chem 276 4435744364 Compostos derivados de aminoácidos Ajioka RS 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inclui um bom resumo da biossíntese de nucleotídeos Licht S Gerfen GJ Stubbe J 1996 Thiyl radicals in ribonucleotide reductases Science 271 477481 Nordlund P Reichard P 2006 Ribonucleotide reductases Annu Rev Biochem 75 681706 Schachman HK 2000 Still looking for the ivory tower Annu Rev Biochem 69 129 Vívida descrição da pesquisa sobre a aspartatotranscarbamoilase acompanhada por encantadoras histórias de ciência e política Weeks A Lund L Raushel FM 2006 Tunneling of intermediates in enzymecatalyzed reactions Curr Opin Chem Biol 10 465472 Doenças genéticas Löffler M Fairbanks LD Zameitat E Marinaki AM Simmonds HA 2005 Pyrimidine pathways in health and disease Trends Mol Med 11 430437 Valle D Beaudet AL Vogelstein B Kinzler KW Antonarakis SE Ballabio A eds Scriver9s Online Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease www ommbidcom Publicado em janeiro 2006 Atualizado em 28 de março de 2011 Esta enciclopédia médica clássica publicada pela última vez em papel em 2001 como um conjunto de quatro volumes é agora mantida na internet Apresenta bons capítulos sobre doenças do metabolismo dos aminoácidos das porfirinas e do heme Confira também os capítulos sobre erros inatos do metabolismo de purinas e pirimidinas Problemas 1 Consumo de ATP nos nódulos das raízes de legumi nosas Bactérias que residem nos nódulos das raízes de er vilhas consomem mais de 20 do ATP produzido pela planta Sugira uma razão para esse alto consumo de ATP 2 Glutamatodesidrogenase e síntese proteica A bac téria Methylophilus methylotrophus pode sintetizar proteína a partir de metanol e amônia Técnicas utilizando DNA recom binante melhoraram o rendimento da produção de proteínas pela introdução do gene da glutamatodesidrogenase de E coli em M methylotrophus Por que essa manipulação genética aumenta o rendimento proteico 3 Mecanismos de reações utilizando PLP O piridoxal fosfato pode ajudar a catalisar transformações envolvendo carbonos nas posições 1 ou 2 a partir do carbono a de um ami noácido A enzima treoninasintase ver Figura 2217 promo Nelson6ed22indd 926 Nelson6ed22indd 926 070414 1424 070414 1424 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 927 ve a conversão dependente de PLP de fosfohomosserina em treonina Sugira um mecanismo para essa reação 4 Transformação de aspartato em asparagina Há duas vias para a transformação de aspartato em asparagina à cus ta de ATP Muitas bactérias têm uma asparaginasintetase que utiliza íons amônio como fonte de nitrogênio Os mamíferos têm uma asparaginasintetase que utiliza a glutamina como do ador de nitrogênio Uma vez que esse último processo requer um ATP extra para a síntese de glutamina por que os mamí feros utilizam essa via 5 Equação para a síntese de aspartato a partir de gli cose Escreva a equação global para a síntese de aspartato aminoácido não essencial a partir de glicose dióxido de car bono e amônia 6 Inibidores da asparaginasintetase na terapia contra a leucemia A asparaginasintetase dos mamí feros é uma amidotransferase dependente de glutamina Esfor ços para a identificação de um inibidor efetivo da asparagina sintetase humana para utilização como quimioterápico em pacientes com leucemia têm sido focalizados na porção carbo xiterminal onde se localiza o sítio ativo da sintetase e não no domínio glutaminase na porção aminoterminal Explique por que o domínio glutaminase não é um alvo promissor para um medicamento eficaz 7 Deficiência de fenilalaninahidroxilase e dieta A tirosina normalmente é um aminoácido não essencial mas pes soas com defeito genético na fenilalaninahidroxilase neces sitam de tirosina em sua dieta para um crescimento normal Explique 8 Cofatores em reações de transferência de um carbo no A maioria das transferências de grupos de um carbono é promovida por um desses três cofatores biotina tetrahidro folato ou Sadenosilmetionina Capítulo 18 A Sadenosilme tionina geralmente é utilizada como doador de grupos metil o potencial de transferência do grupo metila no N 5metiltetra hidrofolato é insuficiente para a maioria das reações biossin téticas Contudo um exemplo de utilização de N 5metiltetra hidrofolato para a transferência do grupo metila ocorre na formação de metionina catalisada pela metioninasintase eta pa ➒ na Figura 2217 a metionina é o precursor imediato da Sadenosilmetionina ver Figura 1818 Explique como o gru po metila da Sadenosilmetionina pode ser obtido a partir do N 5metiltetrahidrofolato embora o potencial de transferência do grupo metila no N 5metiltetrahidrofolato seja um milésimo daquele do grupo metila na Sadenosilmetionina 9 Regulação orquestrada na biossíntese de aminoácidos A glutaminasintetase de E coli é modulada independente mente por vários produtos do metabolismo da glutamina ver Figura 228 Nessa inibição concertada o grau de inibição en zimática é maior que a soma dos efeitos inibidores causados pelos produtos separadamente Para o crescimento da E coli em um meio rico em histidina qual seria a vantagem da inibi ção concertada 10 Relação entre deficiência de ácido fólico e anemia A deficiência de ácido fólico que se acredita ser a deficiência vitamínica mais comum causa um tipo de ane mia em que a síntese de hemoglobina está prejudicada e os eritrócitos não amadurecem adequadamente Qual a relação metabólica entre a síntese de hemoglobina e a deficiência de ácido fólico 11 Biossíntese de nucleotídeos em bactérias auxotró ficas para aminoácidos Células de E coli do tipo selvagem podem sintetizar todos os 20 aminoácidos comuns Contudo alguns mutantes chamados de auxotróficos para aminoácidos são incapazes de sintetizar um determinado aminoácido e ne cessitam da adição desse aminoácido ao meio de cultura para um crescimento ótimo Além de seu papel na síntese proteica alguns aminoácidos são também precursores de outros produtos nitrogenados na célula Considere três auxotróficos para ami noácidos que são incapazes de sintetizar glicina glutamina e aspartato respectivamente Para cada mutante quais produtos nitrogenados a célula deixaria de sintetizar além das proteínas 12 Inibidores da biossíntese de nucleotídeos Sugira mecanismos para a inibição da a alaninaracemase por Lflu oralanina e da b glutaminaamidotransferase pela azasserina 13 Mecanismo de ação das sulfas Algumas bacté rias necessitam de paminobenzoato no meio de cultura para um crescimento normal e seu crescimento é gravemente inibido pela adição de sulfanilamida uma das primeiras sulfas utilizadas Além disso na presença desse fármaco ocorre acú mulo de 5aminoimidazol4carboxamidaribonucleotídeo no meio de cultura AICAR ver Figura 2235 Esses efeitos são revertidos pela adição de excesso de paminobenzoato O O S C H2 N H2 O O N NH2 pAminobenzoato Sulfanilamida a Qual a função do paminobenzoato nessas bactérias Dica ver Figura 1816 b Por que o AICAR se acumula na presença de sulfani lamida c Por que a inibição e o acúmulo são revertidos pela adi ção de excesso de paminobenzoato 14 Via para os carbonos na biossíntese de pirimidinas Determine os locais na molécula do orotato onde será encon trado 14C quando esse composto é isolado de células crescidas em meio contendo uma pequena quantidade de 14Csuccinato uniformemente marcado Justifique sua resposta 15 Nucleotídeos como fontes pobres para a obtenção de energia Em condições de falta de alimento os organismos podem utilizar proteínas e aminoácidos como fonte de energia A desaminação dos aminoácidos produz esqueletos de carbono que podem entrar na via glicolítica e no ciclo do ácido cítrico produzindo energia na forma de ATP Os nucleotídeos por ou tro lado não são degradados de forma semelhante para utiliza ção como combustíveis para gerar energia Quais observações da fisiologia celular apoiam essa afirmação Quais aspectos da estrutura dos nucleotídeos os tornam uma fonte relativamente pobre de energia 16 Tratamento da gota O alopurinol ver Figura 2250 inibidor da xantinaoxidase é utilizado para o tratamento da gota crônica Explique a base bioquímica para esse tratamento Pacientes tratados com alopurinol algumas vezes desenvolvem cálculos de xantina nos rins embora a inci dência de dano renal seja muito menor que na gota não trata da Explique essa observação considerando as solubilidades desses compostos na urina ácido úrico 015 gL xantina 005 gL e hipoxantina 14 gL Nelson6ed22indd 927 Nelson6ed22indd 927 070414 1424 070414 1424 928 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 17 Inibição da síntese de nucleotídeos pela azasserina O composto diazo O2diazoacetilLserina também conheci do como azasserina ver Figura 2251 é um poderoso inibidor das glutaminaamidotransferases Se células em crescimento são tratadas com azasserina quais intermediários da biossínte se de nucleotídeos se acumulam Explique Problema de análise de dados 18 Utilização de técnicas moleculares modernas na determinação da via biossintética de um novo amino ácido A maior parte das vias biossintéticas descritas neste capítulo foi determinada antes do desenvolvimento da tecno logia do DNA recombinante e da genômica de modo que as técnicas eram bastante diferentes daquelas que os pesquisa dores utilizariam hoje Aqui é fornecido um exemplo de utili zação de técnicas moleculares modernas para investigar a via de síntese de um novo aminoácido 2S4amino2hidroxi butirato AHBA As técnicas aqui mencionadas estão descri tas em várias seções deste livro este problema foi delineado para mostrar como essas técnicas podem ser integradas em um estudo abrangente O AHBA é um gaminoácido componente de alguns anti bióticos aminoglicosídicos incluindo o antibiótico butirosina Antibióticos modificados pela adição de um resíduo de AHBA com frequência são mais resistentes à inativação por enzimas bacterianas de resistência a antibióticos Como resultado a compreensão de como o AHBA é sintetizado e adicionado a antibióticos é útil para o planejamento de medicamentos Em um artigo publicado em 2005 Li e colaboradores des crevem como determinaram a via de síntese do AHBA a partir do glutamato O O2 2O 1 C C O NH3 Glutamato AHBA O2 1 C O H3N OH a Descreva sucintamente as transformações químicas necessárias para converter glutamato em AHBA Neste ponto não se preocupe com a sequência das reações Li e colaboradores começaram clonando o grupo de genes responsáveis pela biossíntese de butirosina na bactéria Ba cillus circulans que produz grandes quantidades desse an tibiótico Eles identificaram cinco genes essenciais para a via btrI btrJ btrK btrO e btrV Os pesquisadores então clonaram esses genes em plasmídeos de E coli o que permite a supe rexpressão dos genes produzindo proteínas com etiquetas de histidina fundidas a seus terminais amino para facilitar a puri ficação ver Seção 91 A sequência de aminoácidos prevista para a proteína BtrI mostrou forte homologia com proteínas carreadoras de acila ver Figura 215 Utilizando espectrometria de massa Li e colaboradores encontraram uma massa molecular de 11812 para a proteína BtrI purificada incluindo a etiqueta de His Quando a proteína BtrI purificada foi incubada com coenzima A e com uma enzima capaz de ligar CoA a outras proteínas car readoras de acilas a espécie molecular principal apresentou Mr de 12153 b Como você utilizaria esses dados para argumentar que a BtrI pode atuar como proteína carreadora de acilas com uma CoA como grupo prostético Utilizando a terminologia padrão Li e colaboradores cha maram de apoBtrI a forma da proteína não ligada à CoA e a forma com a CoA ligada como na Figura 215 foi denominada holoBtrI Quando a holoBtrI foi incubada com glutamina ATP e proteína BtrJ purificada a espécie holoBtrI de Mr de 12153 foi substituída por uma espécie de Mr de 12281 correspon dendo ao tioéster de glutamato com holoBtrI Com base nes ses dados os autores propuseram a seguinte estrutura para a espécie de Mr de 12281 gglutamilSBtrI gGlutamilSBtrI BtrI O S 2O 1 C C O NH3 c Que outras estruturas ésão consistentes com esses dados d Li e colaboradores argumentaram que a estrutura aqui mostrada gglutamilSBtrI provavelmente seja a correta pois o grupo acarboxila deve ser removido em algum momen to do processo biossintético Explique a base química para esse argumento Dica ver Figura 186 reação C A proteína BtrK mostrou significativa homologia com ami noácidodescarboxilases dependentes de PLP e descobriuse que a BtrK isolada de E coli continha PLP fortemente ligado Quando gglutamilSBtrI foi incubada com BtrK purificada foi produzida uma espécie molecular com Mr de 12240 e Qual a estrutura mais provável para essa espécie f Curiosamente quando os investigadores incubaram glu tamato e ATP com BtrI BtrJ e BtrK purificadas observaram a produção de uma espécie molecular com Mr de 12370 Qual a estrutura mais provável para essa espécie Dica lembrese que BtrJ pode utilizar ATP para ligar glutamato em grupos nucleo fílicos através da gcarboxila Li e colaboradores descobriram que a BtrO é homóloga a enzimas do tipo monooxigenase ver Quadro 211 que hi droxilam alcanos utilizando FMN como cofator e que a BtrV é homóloga a uma NADPHoxidorredutase Dois outros genes nesse núcleo btrG e btrH provavelmente codifiquem enzimas que removem o grupo gglutamila e ligam AHBA à molécula do antibióticoalvo g Com base nesses dados proponha uma via plausível para a síntese de AHBA e sua ligação ao antibióticoalvo Inclua as enzimas que catalisam cada passo e quaisquer outros subs tratos ou cofatores necessários ATP NAD etc Referência Li Y Llewellyn NM Giri R Huang F Spencer JB 2005 Biosynthesis of the unique amino acid side chain of butirosin possible protectivegroup chemistry in an acyl carrier proteinmediated pathway Chem Biol 12 665675 Nelson6ed22indd 928 Nelson6ed22indd 928 070414 1424 070414 1424 231 Hormônios estruturas diferentes para funções diferentes 929 232 Metabolismo específico para cada tecido a divisão de trabalho 939 233 Regulação hormonal do metabolismo energético 951 234 Obesidade e regulação da massa corporal 960 235 Obesidade síndrome metabólica e diabetes tipo 2 968 D os Capítulos 13 a 22 foi discutido o metabolismo nas cé lulas individuais enfatizando as vias centrais comuns a quase todas as células bacterianas arqueobacterianas e eucarióticas Foi analisado como os processos metabóli cos dentro das células são regulados nas reações enzimáti cas individuais pela disponibilidade de substrato por meca nismos alostéricos e por fosforilação ou outra modificação covalente das enzimas Para entender completamente o significado das vias me tabólicas individuais e sua regulação é necessário observar essas vias no contexto do organismo como um todo Uma característica essencial dos organismos multicelulares é a diferenciação celular e a divisão de trabalho As funções es pecializadas dos tecidos e órgãos de organismos complexos como os humanos impõem requerimentos energéticos ca racterísticos e padrões de metabolismo Sinais hormonais integram e coordenam as atividades metabólicas de dife rentes tecidos e otimizam a alocação de combustíveis e pre cursores para cada órgão Este capítulo terá como foco os mamíferos detendo se no metabolismo especializado de vários órgãos e teci dos importantes e na integração do metabolismo em todo o organismo Começa examinando o amplo alcance dos hormônios e mecanismos hormonais apresentando então as funções específicas de tecidos diferentes reguladas por esses mecanismos Discute a distribuição dos nutrientes para vários órgãos enfatizando o papel central desempe nhado pelo fígado e a cooperação metabólica entre esses órgãos Para ilustrar o papel integrador dos hormônios descreve a interrelação entre a insulina o glucagon e a adrenalina na coordenação do metabolismo energético no músculo no fígado e no tecido adiposo Os distúrbios me tabólicos no diabetes ilustram a importância da regulação hormonal do metabolismo Discute a regulação hormonal da massa corporal no longo prazo e por fim o papel da obesidade no desenvolvimento da síndrome metabólica e do diabetes 231 Hormônios estruturas diferentes para funções diferentes Hormônios são pequenas moléculas ou proteínas produzi das em um tecido liberadas na circulação e transportadas a outros tecidos nos quais agem por meio de receptores para produzir mudanças nas atividades celulares Eles servem para coordenar as atividades metabólicas de vários tecidos ou órgãos Em um organismo complexo praticamente cada processo é regulado por um ou mais hormônios manuten ção da pressão sanguínea do volume sanguíneo e do equi líbrio de eletrólitos embriogênese diferenciação sexual desenvolvimento e reprodução fome comportamento ali mentar digestão e distribuição de combustíveis para citar apenas alguns Esta seção examina os métodos de detecção e de medida de hormônios e sua interação com receptores estuda também uma seleção representativa de tipos de hormônios A coordenação do metabolismo nos mamíferos é reali zada pelo sistema neuroendócrino As células de um de terminado tecido sentem uma mudança nas condições do organismo e respondem secretando um mensageiro quími co que passa para outra célula no mesmo tecido ou em um tecido diferente na qual o mensageiro se liga a uma molé cula receptora e desencadeia uma mudança nesta segun da célula Esses mensageiros químicos podem transmitir informação a distâncias muito curtas ou muito longas Na sinalização neuronal Figura 231a o mensageiro quími co é um neurotransmissor p ex acetilcolina e percorre somente uma fração de micrômero através da fenda sináp tica até o neurônio seguinte em uma rede Na sinalização hormonal os mensageiros hormônios são transportados pela corrente sanguínea para células vizinhas ou para ór gãos e tecidos distantes eles podem percorrer um metro ou mais para encontrar suas célulasalvo Figura 231b Ex ceto por essa diferença anatômica esses dois mecanismos de sinalização química são muito semelhantes e a mesma molécula pode às vezes agir como neurotransmissor e como hormônio A adrenalina e a noradrenalina por exemplo servem como neurotransmissores em determinadas sinap 23 Regulação Hormonal e Integração do Metabolismo em Mamíferos Nelson6ed23indd 929 Nelson6ed23indd 929 020514 1727 020514 1727 930 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ses do cérebro e nas junções neuromusculares do músculo liso e como hormônios que regulam o metabolismo energé tico no fígado e no músculo A discussão que se segue sobre a sinalização celular enfatiza a ação hormonal esboçada nas discussões sobre metabolismo energético nos capítulos an teriores mas a maioria dos mecanismos fundamentais aqui descritos também ocorre na ação neurotransmissora A detecção e a purificação dos hormônios requerem um bioensaio Como é detectado e isolado um hormônio Em primeiro lugar os pesquisadores descobrem que um processo fisio lógico em um tecido depende de um sinal que tem origem em outro tecido A insulina por exemplo primeiramente foi reconhecida como substância produzida no pâncreas e que afeta a concentração da glicose no sangue e na urina Quadro 231 Uma vez descoberto o efeito fisiológico do suposto hormônio foi possível desenvolver um bioensaio quantitativo para ele No caso da insulina o ensaio consistiu na injeção de extratos de pâncreas fonte bruta de insulina em animais experimentais deficientes em insulina quantifi candose então as alterações na concentração de glicose no sangue e na urina Para isolar um hormônio o bioquímico fraciona os extratos que contêm o suposto hormônio com as mesmas técnicas usadas para purificar outras biomolé culas fracionamento com solvente cromatografia e eletro forese testando cada fração quanto à atividade hormonal Uma vez purificado sua composição e estrutura podem ser determinadas Esse protocolo para caracterização hormonal é ilusoria mente simples Os hormônios são extremamente potentes e são produzidos em quantidades muito pequenas A ob tenção de hormônio suficiente para permitir sua caracte rização química com frequência envolve isolamentos bio químicos em uma escala heroica Quando Andrew Schally e Roger Guillemin de modo independente purificaram e caracterizaram o hormônio liberador de tirotropina TRH de thyrotropinreleasing hormone do hipotálamo o gru po de Schally utilizou cerca de 20 toneladas de hipotálamos de aproximadamente dois milhões de ovelhas e o grupo de Guillemin extraiu hipotálamos de cerca de um milhão de porcos O TRH foi identificado como um derivado simples do tripeptídeo GluHisPro Figura 232 Uma vez conhe cida a estrutura esse hormônio pode ser sintetizado qui micamente em grandes quantidades para uso nos estudos fisiológicos e bioquímicos Por seus trabalhos com os hormônios hipotalâmicos Schally e Guillemin receberam em 1977 o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina juntamente com Rosalyn Yalow que com Solomon A Berson desenvolveu o radioimuno ensaio RIE ensaio extremamente sensível para a de tecção de hormônios peptídicos e o utilizou para estudar a ação hormonal O RIE revolucionou a pesquisa com hor mônios por tornar possível a medição de quantidades mui to pequenas de hormônios de forma rápida quantitativa e específica Anticorpos específicos para hormônios são a chave para o radioimunoensaio e seu equivalente moderno en saio imunoadsorvente ligado a enzima Elisa ver Figura 526b Hormônios purificados injetados em coelhos ou camundongos induzem a produção de anticorpos que se ligam ao hormônio com afinidade e especificidade mui to altas Esses anticorpos podem ser purificados e mar cados com radioisótopos para RIE ou conjugados com uma enzima que gera um produto colorido para Elisa Os anticorpos marcados interagem com extratos contendo o hormônio A fração do anticorpo que se liga ao hormônio no extrato é quantificada pela detecção da radiação ou por fotometria Devido à alta afinidade do anticorpo pelo hor mônio tais ensaios podem ser sensíveis a picogramas de hormônio em uma amostra a Sinalização neuronal b Sinalização endócrina Célulasalvo Impulso nervoso Contração Neurotransmissores Mudança metabólica Hormônios Secreção mm cm ou m Distância da sinalização Impulso nervoso Corrente sanguínea Células alvo Pâncreas endócrino FIGURA 231 Sinalização pelo sistema neuroendócrino a Na sinali zação neuronal sinais elétricos impulsos nervosos se originam no corpo ce lular de um neurônio e se propagam muito rapidamente por longas distân cias até a extremidade do axônio onde os neurotransmissores são liberados e se difundem para a célulaalvo A célulaalvo outro neurônio um miócito ou uma célula secretora está a uma distância de apenas uma fração de mi crômetro ou poucos micrômetros do local de liberação do neurotransmissor b Na sinalização endócrina os hormônios tais como insulina produzida nas células b pancreáticas são secretados para a corrente sanguínea que os transporta pelo corpo até os tecidosalvo que podem estar a uma distância de um metro ou mais da célula secretora Tanto os neurotransmissores quan to os hormônios interagem com receptores específicos na superfície ou no interior de suas célulasalvo desencadeando as respostas Nelson6ed23indd 930 Nelson6ed23indd 930 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 931 QUADRO 231 MEDICINA Como é descoberto um hormônio O árduo caminho até a insulina purificada Milhões de pessoas com diabetes melito tipo 1 injetam diariamente em si mesmas insulina pura para compensar a falta de produção deste hormônio essencial por suas próprias células b pancreáticas A injeção de insulina não é a cura para o diabetes mas permite uma vida longa e produtiva a pessoas que de outra forma morreriam jo vens A descoberta da insulina que começou com uma observação acidental ilustra a combinação de serendipi dade e experimentação cuidadosa que levou à descoberta de muitos hormônios Em 1889 Oskar Minkowski jovem assistente na Fa culdade de Medicina de Estrasburgo e Josef von Mering do Instituto HoppeSeyler também em Estrasburgo ti veram uma discussão amigável sobre a importância do pâncreas conhecido por conter lipases na digestão de gorduras em cães Para resolver a questão eles come çaram um experimento sobre a digestão das gorduras Removeram cirurgicamente o pâncreas de um cão mas antes que o experimento prosseguisse Minkowski obser vou que o cão agora estava produzindo muito mais urina do que em condições normais sintoma comum do dia betes não tratado Além disso a urina continha níveis de glicose acima do normal outro sintoma de diabetes Esses resultados sugeriram que a falta de algum produto pancreático causaria o diabetes Minkowski tentou sem sucesso preparar um extra to de pâncreas de cão que pudesse reverter o efeito da remoção do órgão isto é baixar os níveis de glicose no sangue e na urina Hoje sabese que a insulina é uma pro teína e que o pâncreas é muito rico em proteases tripsi na e quimotripsina normalmente liberadas no intestino delgado para auxiliar na digestão Sem dúvida essas pro teases degradavam a insulina nos extratos pancreáticos dos experimentos de Minkowski Apesar de esforços consideráveis nenhum progresso significativo foi obtido no isolamento ou na caracteriza ção do fator antidiabético até o verão de 1921 quando Frederick G Banting jovem cientista trabalhando no la boratório de J J R MacLeod na Universidade de Toron to e um estudante assistente Charles Best dedicaramse ao problema Nessa época várias evidências apontavam para um grupo de células especializadas no pâncreas as ilhotas de Langerhans ver Figura 2326 como a fonte do fator antidiabético o qual viria a ser chamado de insulina do latim insula ilha Tomando precauções para impedir a proteólise Banting e Best mais tarde auxiliados pelo bioquímico J B Collip conseguiram em dezembro de 1921 pre parar um extrato pancreático purificado que curava os sintomas do diabetes experimental em cães Em 25 de janeiro de 1922 somente um mês mais tarde sua pre paração de insulina foi injetada em Leonard Thompson um menino de 14 anos gravemente doente com diabetes melito Em poucos dias os níveis de corpos cetônicos e de glicose na urina de Thompson diminuíram drastica mente o extrato salvou sua vida e a vida de um grande número de crianças seriamente doentes que também receberam essas preparações Figura Q1 Em 1923 Banting e MacLeod receberam o Prêmio Nobel pelo iso lamento da insulina Banting anunciou imediatamente que dividiria seu prêmio com Best MacLeod dividiu o seu com Collip Já em 1923 as companhias farmacêuticas forneciam insulina extraída de pâncreas de porco a milhares de pacientes ao redor do mundo Com o desenvolvimento das técnicas de engenharia genética na década de 1980 Capítulo 9 tornouse possível produzir quantidades ilimitadas de insulina humana pela inserção do gene clo nado da insulina humana em um microrganismo o qual foi então cultivado em escala industrial Alguns pacientes com diabetes estão usando bombas de insulina implan tadas que liberam quantidades ajustáveis do hormônio para satisfazer às necessidades no horário das refeições e durante o exercício Existe uma perspectiva razoável de que no futuro o transplante de tecido pancreático for neça aos pacientes diabéticos uma fonte de insulina que responda tão bem quanto o pâncreas normal liberando insulina na corrente sanguínea somente quando a glicose aumentar no sangue FIGURA Q1 Criança com diabetes tipo 1 antes à esquerda e após à direita três meses de tratamento com uma preparação de insulina Nelson6ed23indd 931 Nelson6ed23indd 931 030414 1131 030414 1131 932 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os hormônios atuam por meio de receptores celulares específicos de alta afinidade Conforme foi visto no Capítulo 12 todos os hormônios agem por meio de receptores altamente específicos nas células alvo sensíveis a eles e os hormônios se ligam a esses recep tores com alta afinidade Cada tipo celular tem sua própria combinação de receptores hormonais os quais definem o espectro da capacidade de resposta da célula aos hormô nios Além disso dois tipos celulares com o mesmo tipo de receptor podem ter diferentes alvos intracelulares da ação hormonal e assim podem responder de modo diferente ao mesmo hormônio A especificidade da ação hormonal re sulta da complementaridade estrutural entre o hormônio e seu receptor essa interação é extremamente seletiva de modo que até mesmo hormônios estruturalmente seme lhantes podem ter efeitos diferentes se ligaremse prefe rencialmente a receptores diferentes A alta afinidade da interação permite às células responder a concentrações muito baixas do hormônio No delineamento de fármacos planejados para intervir na regulação hormonal é preciso conhecer a especificidade relativa e a afinidade do fármaco e do hormônio natural Recorde que as interações hormô nioreceptor podem ser quantificadas pela análise de Sca tchard ver Quadro 121 a qual sob condições favoráveis produz uma medida quantitativa da afinidade a constante de dissociação do complexo e do número de sítios de liga ção ao hormônio em uma preparação de receptor As consequências intracelulares das interações ligante receptor são de pelo menos cinco tipos 1 um segundo mensageiro como o cAMP cGMP ou o inositoltrifosfato gerado dentro da célula atua como um regulador alostérico de uma ou mais enzimas 2 um receptor do tipo tirosina cinase é ativado pelo hormônio extracelular 3 a abertura ou o fechamento de canais iônicos controlados por hormô nios resulta em uma mudança no potencial de membrana 4 um receptor de adesão na superfície celular envia infor mação da matriz extracelular para o citoesqueleto ou 5 um esteroide ou uma molécula semelhante a um esteroide causa uma mudança no nível de expressão transcrição de DNA em mRNA de um ou mais genes mediada por uma proteína receptora hormonal nuclear ver a Figura 122 Os hormônios peptídicos e amínicos que são hidrosso lúveis insulina e adrenalina por exemplo atuam extrace lularmente por se ligarem a receptores de superfície celular que atravessam a membrana plasmática Figura 233 Quando o hormônio se liga ao domínio extracelular do re ceptor ele sofre uma mudança de conformação análoga à produzida em uma enzima alostérica pela ligação de uma molécula efetora A mudança de conformação desencadeia os efeitos a jusante do hormônio Uma única molécula de hormônio ao formar um com plexo hormônioreceptor ativa um catalisador que pro duz muitas moléculas do segundo mensageiro de forma que o receptor serve não somente como um transdutor de sinal mas também como um amplificador dele O si nal pode ser amplificado mais adiante por uma cascata de sinalização uma série de etapas nas quais o catalisa dor ativa outro catalisador resultando em amplificações muito grandes do sinal original Uma cascata desse tipo ocorre na regulação pela adrenalina da síntese e da de C O NH CH2 CH C O NH CH C CH2 Histidina Prolilamida Piroglutamato CH C CH2 CH2 HC piroGluHisProNH2 N NH CH CH2 CH2 NH2 C O O N FIGURA 232 Estrutura do hormônio liberador de tirotropina TRH Purificado após heroicos esforços de extratos de hipotálamo o TRH é um derivado do tripeptídeo GluHisPro O grupo carboxílico da cadeia lateral do Glu aminoterminal forma uma amida ligação em vermelho com o grupo aamino deste resíduo criando o piroglutamato e o grupo carboxílico da Pro carboxiterminal é convertido em uma amida NH2 em vermelho Estas modificações são comuns entre os hormônios peptídicos pequenos Em uma proteína típica de Mr 50000 as mudanças nos grupos amino e carbo xiterminais contribuem muito pouco para a carga total da molécula mas em um tripeptídeo estas duas cargas dominam as propriedades da molécula A formação de derivados amida remove estas cargas Receptor na superfície celular Receptor nuclear Segundo mensageiro p ex cAMP Membrana plasmática Núcleo Citosol Transcrição alterada de genes específicos Atividade alterada de enzima preexistente Quantidade alterada de proteínas recémsintetizadas Hormônio Hormônio Hormônio esteroide ou tireoideo entra na célula o complexo hormônioreceptor atua no núcleo Hormônio peptídico ou amina se liga ao receptor no exterior da célula atuando por meio do receptor sem entrar na célula FIGURA 233 Dois mecanismos gerais da ação hormonal Os hormô nios peptídicos e do tipo amina agem mais rapidamente do que os esteroi des e os tireoideos Nelson6ed23indd 932 Nelson6ed23indd 932 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 933 gradação do glicogênio ver Figura 127 A adrenalina ativa por meio de seu receptor a adenilatociclase que produz muitas moléculas de cAMP para cada molécula de hormônio ligado ao receptor O cAMP por sua vez ativa a proteínacinase dependente de cAMP proteínacinase A a qual ativa a glicogêniofosforilase bcinase que ati va a glicogêniofosforilase b O resultado é a amplificação do sinal uma molécula de adrenalina induz a produção de muitos milhares ou milhões de moléculas de glicose1 fosfato a partir do glicogênio Os hormônios insolúveis em água hormônios esteroi des retinoides e da tireoide atravessam a membrana plas mática de suas célulasalvo para alcançar suas proteínas receptoras no núcleo Figura 233 Nessa classe de hormô nios o próprio complexo hormônioreceptor carrega a men sagem ele interage com o DNA para alterar a expressão de genes específicos mudando o complemento enzimático da célula e mudando desta forma o metabolismo celular ver Figura 1230 Os hormônios que atuam por meio de receptores de membrana plasmática geralmente provocam respostas bio químicas ou fisiológicas muito rápidas Poucos segundos após a secreção de adrenalina pela medula suprarrenal para a corrente sanguínea o músculo esquelético responde ace lerando a degradação de glicogênio Em contrapartida os hormônios da tireoide e os hormônios sexuais esteroides promovem respostas máximas em seus tecidosalvo somen te após horas ou mesmo dias Essas diferenças no tempo de resposta correspondem a modos diferentes de ação Geral mente os hormônios de ação rápida levam a uma mudança na atividade de uma ou mais enzimas preexistentes na cé lula por mecanismos alostéricos ou modificação covalen te Os hormônios de ação mais lenta geralmente alteram a expressão gênica resultando na síntese de mais regulação positiva ou menos regulação negativa quantidade das proteínas reguladas Os hormônios são quimicamente diferentes Os mamíferos têm várias classes de hormônios distinguí veis por suas estruturas químicas e por seu mecanismo de ação Tabela 231 Os hormônios peptídicos as ca tecolaminas e os eicosanoides agem a partir do exterior da célulaalvo via receptores de superfície Os hormônios esteroides a vitamina D os retinoides e os hormônios da tireoide entram na célula e atuam por meio de receptores nucleares O óxido nítrico um gás também entra na cé lula mas ativa uma enzima citosólica a guanilatociclase ver Figura 1220 Os hormônios também podem ser classificados pelo trajeto que fazem desde o ponto de liberação até as célu lasalvo Os hormônios endócrinos do grego endon 5 dentro de e krinein 5 liberar são liberados no san gue e transportados para as célulasalvo por todo o cor po a insulina e o glucagon são exemplos Os hormônios parácrinos são liberados no espaço extracelular e difun demse para célulasalvo vizinhas os hormônios eicosa noides são desse tipo Os hormônios autócrinos afetam a mesma célula que os libera ligandose a receptores na superfície celular Os mamíferos não são os únicos com sistemas de sina lização hormonal os insetos e os vermes nematódeos têm sistemas de regulação hormonal altamente desenvolvidos com mecanismos básicos similares aos dos mamíferos As plantas também usam sinais hormonais para coordenar as atividades de seus tecidos Capítulo 12 O estudo da ação hormonal nas plantas não está tão avançado quan to nos animais mas sabese que alguns mecanismos são compartilhados Para ilustrar a diversidade estrutural e o espectro de ação dos hormônios dos mamíferos serão estudados exem plos representativos das principais classes apresentadas na Tabela 231 Hormônios peptídicos Os hormônios peptídicos podem ter de 3 a mais de 200 resíduos de aminoácidos Eles incluem os hormônios pancreáticos insulina glucagon e somatosta tina o hormônio paratireoideo calcitonina e todos os hor mônios do hipotálamo e da hipófise descritos a seguir Esses hormônios são sintetizados nos ribossomos na forma de proteínas precursoras mais longas próhormônios sendo então acondicionados em vesículas secretoras e TABELA 231 Classes de hormônios Tipo Exemplo Via de síntese Modo de ação Peptídeo Insulina glucagon Processamento proteolítico de próhormônio Receptores de membrana plasmática segundos mensageiros Catecolamina Adrenalina A partir da tirosina Eicosanoide PGE1 A partir do araquidonato ácido graxo 204 Esteroide Testosterona A partir do colesterol Receptores nucleares regulação da transcrição Vitamina D 1a25Dihidroxivitamina D3 A partir do colesterol Retinoide Ácido retinoico A partir da vitamina A Tireoide Triiodotironina T3 A partir da tirosina na tireoglobulina Óxido nítrico Óxido nítrico A partir da arginina 1 O2 Receptor citosólico guanilatociclase e segundo mensageiro cGMP Nelson6ed23indd 933 Nelson6ed23indd 933 030414 1131 030414 1131 934 DAVID L NELSON MICHAEL M COX processados proteoliticamente para formar os peptídeos ativos A insulina é uma proteína pequena Mr 5800 com duas cadeias polipeptídicas A e B unidas por duas ligações dissulfeto Ela é sintetizada no pâncreas como um precursor inativo de uma só cadeia a prépróinsulina Fi gura 234 com uma sequência sinalizadora aminoter minal que direciona sua passagem para as vesículas de se creção As sequências sinalizadoras são apresentadas no Capítulo 27 ver a Figura 2738 A remoção proteolítica da sequência sinalizadora e a formação de três ligações dissulfeto produzem a próinsulina que é armazenada em grânulos secretores vesículas envoltas por membrana re pletas da proteína sintetizada no retículo endoplasmático nas células b pancreáticas Quando a glicose sanguínea estiver suficientemente elevada para desencadear a se creção da insulina a próinsulina é convertida em insulina ativa por proteases específicas que hidrolisam duas liga ções peptídicas e formam a molécula de insulina madura e o peptídeo C que são liberados por exocitose no sangue Em alguns casos as proteínas próhormonais não pro duzem somente um mas vários hormônios ativos A pró opiomelanocortina POMC é um exemplo espetacular de hormônios múltiplos codificados por um único gene O gene da POMC codifica um polipeptídeo grande que é progressi vamente dividido em pelo menos nove peptídeos biologica mente ativos Figura 235 Em muitos hormônios peptí dicos como no TRH os resíduos terminais são modificados Figura 232 A concentração dos hormônios peptídicos nos grâ nulos secretores é tão alta que o conteúdo da vesícula é praticamente cristalino quando o conteúdo é liberado por exocitose uma grande quantidade do hormônio é liberada rapidamente Os capilares que irrigam as glândulas endó crinas produtoras de peptídeos são fenestrados pontua dos com minúsculos orifícios ou janelas de forma que as moléculas do hormônio entram rapidamente na corren te sanguínea para transporte para as célulasalvo situadas em outros lugares Conforme observado anteriormente todos os hormônios peptídicos agem pela ligação aos re ceptores na membrana plasmática Eles levam à geração de um segundo mensageiro no citosol que muda a ativi dade de uma enzima intracelular alterando assim o me tabolismo celular Hormônios catecolamínicos Os compostos hidrossolúveis adrenalina epinefrina e noradrenalina norepine frina são catecolaminas assim denominadas devido ao composto catecol estruturalmente relacionado São sinte tizadas a partir da tirosina ver Figura 2231 COO2 Peptídeo C B A C Cadeia B Cadeia A Prépróinsulina Próinsulina Insulina madura H3N S S S S S S SH HS SH SH Sequência sinalizadora COO2 H3N S S S S S S COO2 H3N Sequência sinalizadora SH SH FIGURA 234 Insulina A insulina madura é formada por processamento proteolítico de seu precursor mais longo a prépróinsulina A remoção de um segmento de 23 aminoácidos a sequência sinalizadora da extremidade aminoterminal da prépróinsulina e a formação de três ligações dissulfeto geram a próinsulina Uma proteólise adicional remove o peptídeo C da pró insulina e produz a insulina madura composta pelas cadeias A e B A Figura 324 mostra a sequência de aminoácidos da insulina bovina 1 Gene da próopiomelanocortina POMC Peptídeo sinalizador 59 39 mRNA DNA bLipotropina bMSH Metencefalina aMSH CLIP gLipotropina COO2 H3N ACTH gMSH bEndorfina FIGURA 235 Processamento proteolítico do precursor próopiome lanocortina POMC O produto inicial do gene POMC é um polipeptídeo longo que sofre clivagem por uma série de proteases específicas para a pro dução de ACTH b e glipotropina a b e gMSH hormônio estimulador de melanócitos ou melanocortina CLIP peptídeo intermediário semelhante à corticotropina bendorfina e Metencefalina Os pontos de hidrólise são pares de resíduos básicos ArgLys LysArg ou LysLys Nelson6ed23indd 934 Nelson6ed23indd 934 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 935 Tirosina LDopa Dopamina Noradrenalina Adrenalina As catecolaminas produzidas no cérebro e em outros teci dos neurais atuam como neurotransmissores mas a adrena lina e a noradrenalina também são hormônios sintetizados e secretados pelas glândulas suprarrenais À semelhança dos hormônios peptídicos as catecolaminas encontram se altamente concentradas nas vesículas secretoras são liberadas por exocitose e atuam por meio de receptores de superfície para gerar segundos mensageiros intracelulares Eles controlam uma ampla variedade de respostas fisiológi cas ao estresse agudo ver Tabela 236 Hormônios eicosanoides Os hormônios eicosanoides pros taglandinas tromboxanos e leucotrienos são derivados do araquidonato ácido graxo poliinsaturado de 20 carbonos Fosfolipídeos Araquidonato 204 Leucotrienos Prostaglandinas Tromboxanos Ao contrário dos hormônios descritos anteriormente eles não são sintetizados previamente e armazenados quan do necessários são produzidos a partir do araquidona to que é liberado enzimaticamente dos fosfolipídeos de membrana pela fosfolipase A2 As enzimas da via que leva às prostaglandinas e aos tromboxanos estão amplamen te distribuídas nos tecidos dos mamíferos a maioria das células pode produzir estes sinais hormonais e as células de muitos tecidos podem responder a eles por meio de re ceptores específicos na membrana plasmática Os hormô nios eicosanoides são hormônios parácrinos secretados no fluido intersticial não no sangue e agem em células próximas As prostaglandinas promovem a contração da mus culatura lisa incluindo a do intestino e do útero po dendo por isso ser utilizadas na clínica para induzir o par to Também são responsáveis por mediar a dor e a inflamação em todos os tecidos Muitos fármacos antiin flamatórios agem inibindo etapas da via de síntese das prostaglandinas ver Figura 2115 Os tromboxanos regu lam a função das plaquetas e consequentemente a coagu lação sanguínea ver Figura 639 Os leucotrienos LTC4 e LTD4 agem por meio de receptores de membrana estimu lando a contração da musculatura lisa no intestino nas vias aéreas pulmonares e na traqueia São mediadores da anafilaxia resposta imune exagerada que pode incluir constrição das vias aéreas frequência cardíaca alterada choque e às vezes a morte Hormônios esteroides Os hormônios esteroides hormônios adrenocorticais e sexuais são sintetizados em vários teci dos endócrinos a partir do colesterol Colesterol Progesterona Cortisol glicocorticoide Aldosterona mineralocorticoide Testosterona Estradiol hormônios sexuais Deslocamse até suas célulasalvo pela corrente sanguínea ligados a proteínas carregadoras No córtex suprarrenal são produzidos mais de 50 hormônios corticosteroides por rea ções que removem a cadeia lateral do anel D do colesterol e introduzem oxigênio formando grupos cetona e hidroxil Muitas dessas reações envolvem as enzimas do citocromo P450 ver Quadro 211 Os corticosteroides são de dois tipos gerais definidos por suas ações Os glicocorticoides como o cortisol afetam principalmente o metabolismo dos carboidratos os mineralocorticoides como a aldosterona regulam a concentração de eletrólitos K 1 Na 1 Ca 12 Cl no sangue Os androgênios como a testosterona e os es trogênios como o estradiol ver a Figura 1019 são sinte tizados nos testículos e ovários Eles afetam o desenvolvi mento e o comportamento sexuais e uma grande variedade de outras funções reprodutivas e não reprodutivas Sua sín tese também envolve as enzimas do citocromo P450 que clivam a cadeia lateral do colesterol e introduzem átomos de oxigênio Todos os hormônios esteroides atuam por meio de recep tores nucleares e alteram o nível de expressão de genes es pecíficos ver Figura 1230 Também podem ter efeitos mais rápidos mediados por receptores na membrana plasmática Hormônio vitamina D O calcitriol 1a25dihidroxicalcitriol é produzido nos rins e no fígado ver Figura 1020a a par tir da vitamina D por hidroxilação enzimática A vitamina D é obtida da dieta ou por fotólise do 7desidrocolesterol na pele exposta à luz solar 7Desidrocolesterol Luz UV Vitamina D3 colecalciferol 25Hidroxicolecalciferol 1a25Dihidroxicalcitriol O calcitriol atua juntamente com o hormônio parati reoideo na homeostasia do Ca 21 regulando a concen tração deste íon no sangue e o equilíbrio entre a deposição de Ca 21 e a sua mobilização do osso O calcitriol agindo por meio de receptores nucleares ativa a síntese de uma pro teína intestinal ligadora de Ca 21 essencial para a captação de Ca 21 da dieta Ingestão inadequada de vitamina D e de feitos na biossíntese de calcitriol resultam em doenças gra ves como o raquitismo no qual os ossos são fracos e malfor mados ver Figura 1020b Nelson6ed23indd 935 Nelson6ed23indd 935 030414 1131 030414 1131 936 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Hormônios retinoides Os retinoides são hormônios potentes que regulam o crescimento a sobrevivência e a diferencia ção das células via receptores nucleares O próhormônio retinol é sintetizado a partir do bcaroteno principalmente no fígado ver Figura 1021 e muitos tecidos convertem o retinol no hormônio ácido retinoico AR bCaroteno Vitamina A1 retinol Ácido retinoico Todos os tecidos são alvo dos retinoides pois todos os tipos celulares têm pelo menos uma forma de recep tor retinoide nuclear Nos adultos os alvos mais significati vos são as córneas a pele o epitélio dos pulmões e da tra queia e o sistema imune em todos os tecidos nos quais existe reposição contínua de células O ácido retinoico re gula a síntese de proteínas essenciais para o crescimento ou para a diferenciação Vitamina A em excesso o precursor dos hormônios retinoides pode causar defeitos de nascen ça e mulheres grávidas são orientadas a não usar os cremes com retinoides desenvolvidos para o tratamento de casos graves de acne Hormônios da tireoide Os hormônios da tireoide T4 tiro xina e T3 triiodotironina são sintetizados a partir da proteína precursora tireoglobulina Mr 660000 Até 20 resíduos de Tyr na proteína são iodinados enzimaticamen te na glândula tireoide e dois resíduos de iodotirosina são então condensados para formar o precursor da tiroxina Quando necessário a tiroxina é liberada por proteólise A condensação da monoiodotirosina com a diiodotironina produz T3 que também é um hormônio ativo liberado por proteólise TireoglobulinaTyr proteólise TireoglobulinaTyrI resíduos de Tyr iodinados Tiroxina T4 triiodotironina T3 Os hormônios tireoideos agem por meio de receptores nu cleares e estimulam o metabolismo energético especial mente no fígado e no músculo aumentando a expressão de genes que codificam enzimaschave catabólicas Óxido nítrico NO O óxido nítrico é um radical livre relati vamente estável sintetizado a partir do oxigênio molecular e do nitrogênio guanidínico da arginina ver Figura 2233 em uma reação catalisada pela NOsintase Esta enzima é encontrada em muitos tecidos e tipos celula res neurônios macrófagos hepatócitos miócitos do mús culo liso células endoteliais dos vasos sanguíneos e células epiteliais do rim O NO age próximo de seu local de libe ração entrando na célulaalvo e ativando a enzima citosó lica guanilatociclase que catalisa a formação do segundo mensageiro cGMP ver Figura 1220 Uma proteínacinase dependente de cGMP controla os efeitos do NO pela fos forilação de proteínaschave e pela consequente alteração de suas atividades A fosforilação das proteínas contráteis da musculatura lisa que envolve os vasos sanguíneos por exemplo relaxa o músculo reduzindo a pressão sanguínea A liberação de hormônios é regulada por uma hierarquia de sinais neuronais e hormonais Os níveis alterados de hormônios específicos regulam pro cessos celulares específicos mas o que regula o nível de cada hormônio A resposta simples é que o sistema ner voso central recebe informações vindas de muitos senso res externos e internos por exemplo sinais sobre perigo fome alimento ingerido composição e pressão sanguínea e coordena a produção de sinais hormonais adequados pelos tecidos endócrinos Para uma resposta mais com pleta é preciso considerar os sistemas produtores de hor mônios do corpo humano e algumas de suas interrelações funcionais A Figura 236 mostra a posição anatômica das princi pais glândulas endócrinas em humanos e a Figura 237 mostra a cadeia de comando na hierarquia da sinalização Hipotálamo Hipófise Tireoide Suprarrenais Pâncreas Ovários fêmea Testículos macho Paratireoides atrás da tireoide Tecido adiposo FIGURA 236 As principais glândulas endócrinas As glândulas estão sombreadas em corderosa Nelson6ed23indd 936 Nelson6ed23indd 936 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 937 hormonal O hipotálamo pequena região do cérebro Fi gura 238 é o centro de coordenação do sistema endó crino ele recebe e integra as mensagens do sistema nervo so central Em resposta a essas mensagens o hipotálamo produz hormônios reguladores fatores de liberação que passam diretamente para a glândula hipófise próxima a ele por meio de vasos sanguíneos especiais e neurônios que conectam as duas glândulas Figura 238b A glân dula hipófise tem duas partes funcionalmente distintas A neurohipófise contém os terminais axonais de muitos neurônios que se originam no hipotálamo Esses neurônios produzem os pequenos hormônios peptídicos ocitocina e vasopressina Figura 239 que se deslocam pelo axônio até os terminais nervosos na hipófise onde são armazena dos em grânulos secretores e aguardam o sinal para sua liberação A adenohipófise responde aos hormônios hipotalâ micos transportados pelo sangue produzindo hormônios trópicos ou tropinas do grego tropos 5 voltarse para Esses peptídeos relativamente longos ativam a pró xima classe de glândulas endócrinas Figura 237 incluin do o córtex suprarrenal a glândula tireoide os ovários e os testículos Essas glândulas por sua vez secretam seus hormônios específicos que são transportados pela corren te sanguínea para os tecidosalvo Por exemplo o hormô nio liberador de corticotropina secretado pelo hipotálamo estimula a adenohipófise a liberar ACTH que viaja pelo sangue para a zona fasciculada do córtex suprarrenal e desencadeia a liberação de cortisol Este que é o último hormônio nessa cascata age por meio de seu receptor em muitos tipos de célulasalvo e altera o metabolismo celular Nos hepatócitos um dos efeitos do cortisol é o aumento da taxa de gliconeogênese As cascatas hormonais como aquelas responsáveis pela liberação de cortisol e adrenalina resultam em grande am plificação do sinal inicial e permitem um requintado ajuste fino do sinal do hormônio final Figura 2310 Em cada nível na cascata um sinal pequeno provoca uma resposta maior Por exemplo o sinal elétrico inicial para o hipotála mo resulta na liberação de poucos nanogramas de hormô nio liberador de corticotropina o qual provoca a liberação de uns poucos microgramas de corticotropina A cortico tropina atua sobre o córtex suprarrenal causando a libera ção de miligramas de cortisol uma amplificação total de pelo menos um milhão de vezes Em cada nível da cascata hormonal é possível uma re troalimentação negativa das etapas prévias um nível des necessariamente elevado do último hormônio ou de um in termediário inibe a liberação dos hormônios anteriores na cascata Esses mecanismos de retroalimentação cumprem a mesma finalidade daqueles que limitam o produto de uma via biossintética compare a Figura 2310 com a Figura 22 37 um produto é sintetizado ou liberado somente até que seja alcançada a concentração necessária RESUMO 231 Hormônios estruturas diferentes para funções diferentes c Os hormônios são mensageiros químicos secretados por determinados tecidos para o sangue ou para o fluido intersticial servindo para regular a atividade de outras células ou tecidos FIGURA 237 Alguns dos principais hormônios endócrinos e seus tecidosalvo Sinais oriundos do sistema nervoso central parte superior passam por uma série de dispositivos de transmissão até os tecidosalvo fi nais parte inferior Além dos sistemas mostrados o timo a glândula pineal e grupos de células no trato gastrintestinal também secretam hormônios As linhas tracejadas representam conexões neuronais Sinal sensorial do ambiente Sistema nervoso central Hipotálamo Adenohipófise Origem neuroendócrina dos sinais Alvos primários Alvos finais Muitos tecidos Órgãos reprodutivos Tiroxina T4 tri iodotironinaT3 Progesterona estradiol Testosterona Tireoide Alvos secundários Córtex suprarrenal Ováriostestículos Tirotropina Mr 28714 Corticotropina ACTH Mr 4540 Hormônio folículo estimulante Mr 27775 Hormônio luteinizante Mr 28420 Músculo fígado Cortisol corticosterona aldosterona Fígado osso Glândulas mamárias Músculo liso glândulas mamárias Arteríolas rim Fígado músculo Fígado músculo coração Somatotropina hormônio do crescimento Mr 24847 Prolactina Mr 25876 Ocitocina Mr 1007 Nível de glicose no sangue Neurohipófise Insulina glucagon somatostatina Adrenalina Medula suprarrenal Células das ilhotas do pâncreas Vasopressina hormônio antidiurético Mr 1082 Hormônios hipotalâmicos fatores de liberação Nelson6ed23indd 937 Nelson6ed23indd 937 030414 1131 030414 1131 938 DAVID L NELSON MICHAEL M COX c Radioimunoensaio e Elisa são duas técnicas muito sen síveis para a detecção e a quantificação de hormônios c Hormônios peptídicos catecolaminas e eicosanoides se ligam a receptores específicos na membrana plasmática de célulasalvo alterando o nível de um segundo mensa geiro intracelular sem entrarem na célula c Os hormônios esteroides a vitamina D os retinoides e os hormônios tireoideos entram nas célulasalvo e al teram a expressão gênica interagindo com receptores nucleares específicos c Alguns hormônios são sintetizados como próhormônios e ativados por clivagem enzimática Em alguns casos como no da insulina um único hormônio é produzido por clivagem proteolítica em outros como na POMC são produzidos vários hormônios por clivagem de um único próhormônio c Os hormônios são regulados por uma hierarquia de in terações entre o cérebro e as glândulas endócrinas os impulsos nervosos estimulam o hipotálamo a enviar hormônios específicos para a glândula hipófise estimu lando ou inibindo a liberação de hormônios trópicos Os hormônios da adenohipófise por sua vez estimu a Neuro hipófise Hipotálamo Artérias Liberação de hormônios da neurohipófise vasopressina ocitocina Liberação de fatores hipotalâmicos no sangue arterial Rede capilar Liberação de hormônios da adenohipófise tropinas Axônios Hipotálamo Adenohipófise Sinais nervosos aferentes para o hipotálamo Veias que transportam hormônios para o sangue sistêmico Hipófise anterior NeuroHipófise b FIGURA 238 Origem neuroendócrina dos sinais hormonais a Localização do hipotálamo e da glândula hipófise b Detalhes do sistema hipotálamohipófise Os sinais dos neurônios aferentes estimulam o hipotála mo a secretar fatores de liberação para um vaso sanguíneo que transporta os hormônios diretamente para uma rede de capilares na adenohipófise Em resposta a cada fator de liberação hipotalâmico a adenohipófise libera na circulação geral o hormônio apropriado Os hormônios da neurohipófise são sintetizados em neurônios que se originam no hipotálamo transportados ao longo dos axônios para os terminais nervosos na neurohipófise e ali armaze nados até serem liberados no sangue em resposta a um sinal neuronal FIGURA 239 Dois hormônios da glândula neurohipófise O resíduo carboxiterminal de ambos os peptídeos é a glicinamida NHCH2CONH2 conforme observado na Figura 232 a amidação da extremidade carboxil é comum em hormônios peptídicos pequenos Estes dois hormônios que di ferem somente em dois resíduos sombreados em cor salmão têm efeitos biológicos muito diferentes A ocitocina age na musculatura lisa do útero e das glândulas mamárias causando contração uterina durante o trabalho de parto e promovendo a liberação do leite durante a lactação A vasopressina também chamada de hormônio antidiurético aumenta a reabsorção de água pelos rins e promove a constrição dos vasos sanguíneos aumentando a pressão sanguínea Cys Tyr Ile Gln Asn Pro Leu Gly C O Cys S S NH2 Cys Tyr Phe Gln Asn Pro Arg Gly C O NH3 Cys S S 1 Vasopressina humana hormônio antidiurético Ocitocina humana NH2 NH3 1 Nelson6ed23indd 938 Nelson6ed23indd 938 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 939 lam outras glândulas endócrinas tireoide suprarrenais pâncreas a secretar seus hormônios característicos que por sua vez estimulam tecidosalvo específicos c As cascatas hormonais nas quais catalisadores ativam catalisadores amplificam o estímulo inicial em várias or dens de grandeza frequentemente em um tempo muito curto segundos 232 Metabolismo específico para cada tecido a divisão de trabalho Cada tecido do corpo humano tem uma função especializa da que se reflete na sua anatomia e atividade metabólica Figura 2311 O músculo esquelético permite o movi mento direcionado o tecido adiposo armazena e distribui energia na forma de gordura a qual serve como combus tível para todo o corpo bem como isolamento térmico no cérebro as células bombeiam íons através de suas membra nas plasmáticas para produzir sinais elétricos O fígado tem um papel central de processamento e distribuição no me tabolismo e abastece todos os outros órgãos e tecidos com a mistura apropriada de nutrientes via corrente sanguínea A posição central da função hepática é indicada pela refe rência comum que se faz a todos os outros tecidos e órgãos como extrahepáticos Por essa razão a presente discus são começa sobre a divisão do trabalho metabólico levando em conta as transformações de carboidratos aminoácidos e gorduras no fígado dos mamíferos Em seguida é feita uma breve descrição das principais funções metabólicas do tecido adiposo do músculo do cérebro e do meio que os interconecta o sangue O fígado processa e distribui os nutrientes Durante a digestão nos mamíferos as três classes principais de nutrientes carboidratos proteínas e gorduras sofrem hidrólise enzimática em seus constituintes mais simples Essa degradação é necessária porque as células epiteliais que revestem o lúmen intestinal absorvem somente molé culas relativamente pequenas Muitos dos ácidos graxos e dos monoacilgliceróis liberados pela digestão das gorduras no intestino são reunidos na forma de triacilgliceróis TAG dentro dessas células epiteliais Após serem absorvidos muitos açúcares e aminoácidos assim como alguns TAG reconstituídos passam das células do epitélio intestinal para os capilares sanguíneos sendo transportados para o fígado pela corrente sanguínea os TAG restantes vão para o tecido adiposo via sistema linfáti co A veia porta Figura 2311 é uma via direta dos órgãos digestivos para o fígado e por isso esse órgão é o primeiro a ter acesso aos nutrientes ingeridos O fígado tem dois ti pos celulares principais As células de Kupffer são fagóci tos importantes na função imunológica Os hepatócitos de maior interesse neste capítulo transformam os nutrien tes da dieta em combustíveis e precursores necessários para outros tecidos e os exportam pelo sangue O tipo e a quantidade de nutrientes fornecidos para o fígado variam com diversos fatores incluindo a dieta e o intervalo entre as refeições A demanda dos tecidos extrahepáticos por com bustíveis e precursores varia entre os órgãos e com o nível de atividade e o estado nutricional geral do indivíduo Para satisfazer essas condições variáveis o fígado tem uma notável flexibilidade metabólica Por exemplo quando a dieta é rica em proteína os hepatócitos se abastecem com altos níveis de enzimas para o catabolismo dos aminoácidos e a gliconeogênese Algumas horas após uma mudança para uma dieta rica em carboidratos os níveis dessas enzimas começam a diminuir e os hepatócitos aumentam a síntese de enzimas essenciais para o metabolismo de carboidratos e para a síntese de gorduras As enzimas hepáticas apresentam uma taxa de renovação são sintetizadas e degradadas de 5 a 10 vezes maior que a da renovação de enzimas de outros te cidos como o músculo Os tecidos extrahepáticos também podem ajustar seu metabolismo para condições predominan tes mas nenhum é tão adaptável quanto o fígado e nenhum é tão fundamental para o metabolismo total do organismo A seguir é apresentada uma visão geral dos destinos possíveis para açúcares aminoácidos e lipídeos que entram no fígado a partir da corrente sanguínea Para ajudálo a recordar as Hormônio adrenocorticotrópico ACTH mg Sistema nervoso central Hipotálamo Adenohipófise Glândula suprarrenal Hormônio liberador de corticotropina CRH ng Infecção Hemorragia Medo Dor Hipoglicemia Fígado Tecido adiposo Músculo Cortisol mg FIGURA 2310 Cascata de liberação de hormônios em consequência da estimulação do hipotálamo pelo sistema nervoso central As setas pretas sólidas indicam a ação dos hormônios sobre os tecidosalvo Em cada tecido endócrino ao longo da via é recebido um estímulo a partir do nível superior o qual é amplificado e transduzido na liberação do hormônio se guinte na cascata A cascata é sensível à regulação em vários níveis por meio de retroalimentação negativa setas finas e tracejadas pelo último hormônio neste caso cortisol Desta forma o produto regula sua própria produção como na retroalimentação negativa das vias biossintéticas em uma célula individual Nelson6ed23indd 939 Nelson6ed23indd 939 030414 1131 030414 1131 940 DAVID L NELSON MICHAEL M COX transformações metabólicas discutidas aqui a Tabela 232 mostra as principais vias e processos e indica pelo número da figura onde cada via está apresentada em detalhes Aqui são fornecidos resumos das vias indicando as vias numera das e as reações nas Figuras 2312 a 2314 Açúcares O transportador de glicose dos hepatócitos GLUT2 permite difusão passiva e rápida da glicose de forma que a concentração deste açúcar em um hepatóci to é essencialmente a mesma daquela no sangue A glico se que entra nos hepatócitos é fosforilada pela hexocinase IV glicocinase para gerar glicose6fosfato A glicocinase tem um Km para a glicose muito mais alto 10 mM quando comparado com o das isoenzimas hexocinases em outras células p 603 e ao contrário dessas isoenzimas não é inibida por seu produto a glicose6fosfato A presença da glicocinase permite aos hepatócitos continuar fosforilando a glicose quando sua concentração se eleva muito acima dos níveis que sobrecarregariam outras hexocinases O alto Km para a glicocinase também garante que a fosforilação da glicose nos hepatócitos seja mínima quando a concentra ção do açúcar é baixa prevenindo seu consumo via glicólise pelo fígado como combustível Isso poupa glicose para ou tros tecidos A frutose a galactose e a manose todas ab sorvidas a partir do intestino delgado também são conver tidas em glicose6fosfato pelas vias enzimáticas descritas no Capítulo 14 A glicose6fosfato está no cruzamento do metabolismo dos carboidratos no fígado Ela pode entrar em qualquer de várias vias metabólicas importantes Figu ra 2312 dependendo das necessidades metabólicas do organismo Pela ação de várias enzimas reguladas alosteri camente e por meio de regulação hormonal da síntese e da atividade de enzimas o fígado direciona o fluxo de glicose para uma ou mais dessas vias ➊ A glicose6fosfato é desfosforilada pela glicose6fos fatase para gerar glicose livre ver Figura 1530 exportada para repor a glicose sanguínea A exportação é a via pre dominante quando o estoque de glicose6fosfato é limita do porque a concentração da glicose no sangue deve ser mantida suficientemente alta 4 mM para fornecer energia adequada para o cérebro e outros tecidos ➋ A glicose6 fosfato não imediatamente necessária para manter a glice mia é convertida em glicogênio hepático ou direcionada para um de vários outros destinos Seguindo a glicólise e a reação da piruvatodesidrogenase ➌ a acetilCoA formada pode ser Secreta insulina e glucagon em resposta a mudanças na concentração sanguínea de glicose Pâncreas Encéfalo Transporta íons para manter o potencial de membrana integra sinais do corpo e do ambiente envia sinais para outros órgãos Tecido adiposo Sintetiza armazena e mobiliza triacilgliceróis Tecido adiposo marrom realiza a termogênese Usa ATP gerado aeróbia ou anaerobiamente para realizar trabalho mecânico Transporta lipídeos do intestino para o fígado Usa ATP gerado aerobiamente para bombear sangue Músculo esquelético Sistema linfático Músculo cardíaco Intestino delgado Absorve nutrientes da dieta moveos para o sangue ou para o sistema linfático Fígado Processa gorduras carboidratos e proteínas da dieta sintetiza e distribui lipídeos corpos cetônicos e glicose para outros tecidos converte o excesso de nitrogênio em ureia Transporta nutrientes do intestino para o fígado Veia porta FIGURA 2311 Funções metabólicas especializadas dos tecidos dos mamíferos Nelson6ed23indd 940 Nelson6ed23indd 940 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 941 oxidada para a produção de ATP no ciclo do ácido cítrico com a transferência de elétrons e a fosforilação oxidativa de correntes gerando ATP Normalmente contudo os ácidos graxos são o combustível preferido para a produção de ATP nos hepatócitos ➍ A acetilCoA também pode servir como precursora dos ácidos graxos que são incorporados em TAG e fosfolipídeos e do colesterol Grande quantidade dos li pídeos sintetizados no fígado é transportada pelas lipopro teínas sanguíneas para outros tecidos ➎ A glicose6fosfato pode alternativamente entrar na via das pentosesfosfato gerando poder redutor NADPH necessário para a biossín tese de ácidos graxos e colesterol e Dribose5fosfato pre cursor para a síntese de nucleotídeos O NADPH também é um cofator essencial na destoxificação e eliminação de mui tos fármacos e outros xenobióticos metabolizados no fígado Aminoácidos Os aminoácidos que chegam ao fígado seguem várias vias metabólicas importantes Figura 2313 ➊ São precursores para a síntese proteica processo discutido no Capítulo 27 O fígado repõe constantemente suas proteínas que têm uma taxa de renovação relativamente alta meia vida média de horas a dias sendo também o local de bios síntese da maioria das proteínas plasmáticas ➋ Alternativa mente os aminoácidos passam via corrente sanguínea para outros órgãos onde são usados na síntese das proteínas teciduais ➌ Outros aminoácidos são precursores na bios síntese de nucleotídeos hormônios e outros compostos ni trogenados no fígado e em outros tecidos Os aminoácidos não utilizados como precursores biossintéticos são transaminados ou desaminados e degra dados para gerar piruvato e intermediários do ciclo do ácido cítrico com vários destinos a amônia liberada é conver tida em ureia um produto de excreção ➎ O piruvato pode ser convertido em glicose e glicogênio pela gliconeogênese ou ➏ pode ser convertido em acetilCoA que tem vários destinos possíveis ➐ oxidação via ciclo do ácido cítrico e ➑ fosforilação oxidativa para produzir ATP ou ➒ conversão em lipídeos para armazenamento ➓ Os intermediários do ciclo do ácido cítrico podem ser desviados para a síntese de glicose pela gliconeogênese O fígado também metaboliza os aminoácidos que pro vêm intermitentemente de outros tecidos O sangue é su prido adequadamente com glicose logo após a digestão e a absorção dos carboidratos da dieta ou entre as refeições pela conversão do glicogênio hepático em glicose sanguí nea Durante o intervalo entre as refeições especialmente se for prolongado algumas proteínas musculares são degra dadas em aminoácidos que doam seus grupos amino por Glicose sanguínea Colesterol Ácidos graxos ciclo do ácido cítrico AcetilCoA Mitocôndria e2 O2 H2O ADP 1 Pi fosforilação oxidativa Glicólise Piruvato Glicose Ribose5 fosfato Glicogênio do fígado Hepatócito Nucleotídeos Via das pentoses fosfato Triacilgliceróis fosfolipídeos CO2 NADPH ➌ ➌ ➍ ➎ ➊ ➋ Glicose6 fosfato ATP FIGURA 2312 Vias metabólicas para a glicose6fosfato no fígado Nas Figuras 2313 2314 e nesta as vias anabólicas são representadas na as cendente as vias catabólicas na descendente e a distribuição para outros órgãos na horizontal Os processos numerados em cada figura estão descri tos no texto ciclo do ácido cítrico e O2 H2O ADP Pi fosforilação oxidativa CO 2 AcetilCoA Ácidos graxos Lipídeos Piruvato Aminoácidos no sangue Proteínas do fígado Proteínas plasmáticas Proteínas teciduais Glicose Glicose Glicose sanguínea gliconeogênese glico neogênese NH3 Ureia Alanina ciclo da ureia Nucleotídeos hormônios porfirinas Hepatócito Amino ácidos no músculo Glicogênio no músculo Aminoácidos a b ➊ ➋ ➌ ➐ ➏ ➎ ➒ ➑ Mitocôndria ATP Glicose sanguínea FIGURA 2313 Metabolismo dos aminoácidos no fígado Nelson6ed23indd 941 Nelson6ed23indd 941 030414 1131 030414 1131 942 DAVID L NELSON MICHAEL M COX transaminação para o piruvato o produto da glicólise for mando alanina que é transportada para o fígado e desa minada Os hepatócitos convertem o piruvato resultante em glicose sanguínea via gliconeogênese ➎ e a amônia em ureia para excreção 4b Uma vantagem deste ciclo glicose alanina ver Figura 189 é amenizar flutuações nos níveis de glicose sanguínea nos intervalos entre as refeições O dé ficit de aminoácidos imposto aos músculos é suprido após a próxima refeição pelos aminoácidos da dieta Lipídeos Os ácidos graxos componentes dos lipídeos que chegam aos hepatócitos também têm vários destinos Figu ra 2314 ➊ Alguns são convertidos em lipídeos hepáticos ➋ Na maior parte das vezes os ácidos graxos são o principal combustível oxidativo no fígado Ácidos graxos livres podem ser ativados e oxidados para gerar acetilCoA e NADH ➌ A acetilCoA é posteriormente oxidada no ciclo do ácido cítrico e ➍ as oxidações no ciclo promovem a síntese de ATP por fosforilação oxidativa ➎ O excesso de acetilCoA não requerido pelo fígado é convertido em acetoacetato e bhidroxibutirato esses corpos cetônicos circulam pelo sangue para outros tecidos para serem usados como com bustível para o ciclo do ácido cítrico Os corpos cetônicos ao contrário dos ácidos graxos podem atravessar a barreira sanguecérebro fornecendo ao cérebro uma fonte de acetil CoA para oxidação geradora de energia Os corpos cetô nicos podem suprir uma fração significativa da energia em alguns tecidos extrahepáticos até um terço no coração e em torno de 60 a 70 no cérebro durante jejum prolongado ➏ Uma parte da acetilCoA derivada dos ácidos graxos e da glicose é usada na biossíntese de colesterol que é ne TABELA 232 Vias do metabolismo de carboidratos aminoácidos e gorduras ilustradas nos capítulos anteriores Via Figura de referência Ciclo do ácido cítrico acetilCoA 2CO2 167 Fosforilação oxidativa síntese de ATP 1919 Catabolismo de carboidratos Glicogenólise glicogênio glicose1fosfato glicose sanguínea 1527 1528 Entrada de hexoses na glicólise frutose manose galactose glicose6fosfato 1411 Glicólise glicose S piruvato 142 Reação da piruvatodesidrogenase piruvato S acetilCoA 162 Fermentação láctica glicose lactato 1 2ATP 144 Via das pentosesfosfato glicose6fosfato pentosesfosfato 1 NADPH 1422 Anabolismo de carboidratos Gliconeogênese intermediários do ciclo do ácido cítrico glicose 1417 Ciclo da glicosealanina glicose piruvato alanina glicose 189 Síntese de glicogênio glicose6fosfato glicose1fosfato glicogênio 1532 Metabolismo de aminoácidos e nucleotídeos Degradação de aminoácidos aminoácidos acetilCoA intermediários do ciclo do ácido cítrico 1815 Síntese de aminoácidos 2211 Ciclo da ureia NH3 ureia 1810 Ciclo da glicosealanina alanina S glicose 189 Síntese de nucleotídeos aminoácidos purinas pirimidinas 2235 2238 Síntese de hormônios e neurotransmissores 2231 Catabolismo de gorduras bOxidação de ácidos graxos ácido graxo acetilCoA 178 Oxidação de corpos cetônicos bhidroxibutirato acetilCoA CO2 via ciclo do ácido cítrico 1720 Anabolismo de gorduras Síntese de ácidos graxos acetilCoA ácidos graxos 216 Síntese de triacilglicerol acetilCoA ácidos graxos triacilglicerol 2118 2119 Formação de corpos cetônicos acetilCoA acetoacetato bhidroxibutirato 1719 Síntese de colesterol e ésteres de colesteril acetilCoA colesterol ésteres de colesteril 2133 a 2137 Síntese de fosfolipídeos ácidos graxos fosfolipídeos 2117 2123 a 2128 Nelson6ed23indd 942 Nelson6ed23indd 942 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 943 cessário para síntese de membranas O colesterol também é o precursor de todos os hormônios esteroides e dos sais biliares essenciais para a digestão e a absorção de lipídeos Os outros dois destinos metabólicos dos lipídeos envol vem mecanismos especializados para o transporte de lipí deos insolúveis pelo sangue ➐ Os ácidos graxos são conver tidos em fosfolipídeos e TAG de lipoproteínas plasmáticas que transportam os lipídeos para o tecido adiposo para se rem armazenados ➑ Alguns ácidos graxos livres são ligados à albumina sérica e transportados para o coração e para os músculos esqueléticos que os captam e oxidam como um importante combustível A albumina é a proteína plasmáti ca mais abundante uma molécula pode transportar até 10 moléculas de ácidos graxos livres O fígado funciona assim como o centro de distribuição do organismo exportando nutrientes nas proporções corre tas para outros órgãos reduzindo as flutuações no metabolis mo causadas pela ingestão intermitente de alimento e proces sando o excesso de grupos amino em ureia e outros produtos para serem eliminados pelos rins Determinados nutrientes são armazenados no fígado entre eles íons ferro e vitamina A O fígado também destoxifica compostos orgânicos estra nhos como fármacos aditivos e conservantes alimentares e outros agentes potencialmente perigosos e sem valor nutri cional Muitas vezes a destoxificação envolve a hidroxilação dependente do citocromo P450 de compostos orgânicos re lativamente insolúveis tornandoos solúveis o suficiente para posterior degradação e excreção ver Quadro 211 O tecido adiposo armazena e provê ácidos graxos Existem dois tipos distintos de tecido adiposo o branco e o marrom Figura 2315 os quais apresentam funções bas tante diferentes Primeiro será estudado o mais abundante dos dois O tecido adiposo branco TAB é amorfo e am plamente distribuído pelo corpo sob a pele ao redor dos vasos sanguíneos mais profundos e na cavidade abdominal Os adipócitos do TAB são células grandes 30 a 70 mm de diâmetro esféricas totalmente preenchidas com uma única e grande gota lipídica de triacilgliceróis a qual cons titui 65 da massa celular e comprime as mitocôndrias e o núcleo em uma fina camada contra a membrana plasmática Figura 2315a c Em humanos o TAB compõe cerca de 15 da massa de um adulto jovem saudável Os adipócitos são metabolicamente muito ativos respondendo rapida mente a estímulos hormonais em uma interação metabólica com o fígado o músculo esquelético e o coração Como outros tipos celulares os adipócitos têm um me tabolismo glicolítico ativo oxidam piruvato e ácidos graxos pelo ciclo do ácido cítrico e realizam fosforilação oxidativa Durante períodos de captação elevada de carboidratos o te cido adiposo pode converter a glicose via piruvato e acetil CoA em ácidos graxos e converter esses últimos em TAG armazenados em grandes glóbulos de gordura embora a maior parte da síntese de ácidos graxos em humanos ocorra nos hepatócitos Os adipócitos armazenam os TAG que vêm do fígado transportados no sangue como VLDL ver Figura 2140 e do trato intestinal transportados em quilomicra particularmente após uma refeição rica em gordura ➊ ➋ ➌ ➍ ➐ ➎ ➑ ciclo do ácido cítrico e2 O2 H2O ADP 1 Pi fosforilação oxidativa CO2 ATP Mitocôndria ➏ Lipídeos do fígado Ácidos graxos Lipopro teínas plasmáticas Ácidos graxos livres no sangue ligados à albumina Corpos cetônicos no sangue boxidação AcetilCoA Hepatócitos NADH Sais biliares Hormônios esteroides no sangue Colesterol FIGURA 2314 Metabolismo dos ácidos graxos no fígado c d a Adipócito branco b Adipócito marrom Gotícula lipídica Núcleo Mitocôndria FIGURA 2315 Adipócitos de tecido adiposo branco e marrom Visão esquemática de adipócitos de camundongo de a tecido adiposo branco TAB e b tecido adiposo marrom TAM Os adipócitos brancos são maio res e têm uma única gota lipídica enorme que comprime as mitocôndrias e o núcleo contra a membrana plasmática Nos adipócitos marrons as mito côndrias são muito mais proeminentes o núcleo está próximo ao centro da célula e estão presentes múltiplas gotículas lipídicas Na parte inferior estão mostradas as micrografias eletrônicas de varredura dos adipócitos em c TAB e d TAM No tecido adiposo os capilares e as fibras de colágeno formam uma rede de suporte ao redor dos adipócitos esféricos Nelson6ed23indd 943 Nelson6ed23indd 943 030414 1131 030414 1131 944 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Quando aumenta a demanda por combustível por exemplo entre as refeições as lipases dos adipócitos hi drolisam os triacilgliceróis armazenados liberando ácidos graxos livres que podem se deslocar pela corrente sanguí nea para o músculo esquelético e o coração A liberação dos ácidos graxos dos adipócitos é aumentada pela adrenalina que estimula a fosforilação dependente de cAMP da perili pina e assim dá às lipases específicas para tri di e mo noglicerídeos acesso aos triacilgliceróis na gota lipídica ver Figura 173 A lipase sensível a hormônio também é esti mulada por fosforilação mas esta não é a principal causa do aumento da lipólise A insulina contrabalança o efeito da adrenalina reduzindo a atividade da lipase A degradação e a síntese de triacilgliceróis no tecido adiposo constituem um ciclo de substrato até 70 dos áci dos graxos liberados pelas três lipases são reesterificados nos adipócitos produzindo novamente os triacilgliceróis Recorde do Capítulo 15 que tais ciclos de substrato per mitem uma regulação fina da velocidade e da direção do fluxo dos intermediários em uma via bidirecional No teci do adiposo o glicerol liberado pelas lipases dos adipócitos não pode ser reutilizado na síntese de triacilgliceróis por que os adipócitos não têm a glicerolcinase Em vez disso o glicerolfosfato necessário para a síntese de TAG é obtido a partir do piruvato por gliceroneogênese envolvendo a PEP carboxicinase citosólica ver Figura 2122 Além de sua função central como depósito de combustí vel o tecido adiposo tem um importante papel como órgão endócrino produzindo e liberando hormônios que sinalizam o estado das reservas de energia e coordenam o metabo lismo das gorduras e dos carboidratos em todo o corpo Adiante essa função será abordada na parte sobre a regula ção hormonal da massa corporal O tecido adiposo marrom é termogênico Nos vertebrados pequenos e nos animais hibernantes uma proporção significativa do tecido adiposo é formada pelo tecido adiposo marrom TAM distinguido do TAB por seus adipócitos menores 20 a 40 mm de diâmetro com for mato diferente poligonais em vez de redondos Figura 2315b d Como os adipócitos brancos os marrons arma zenam triacilgliceróis mas em várias gotículas de lipídeo menores por célula em vez de uma única gota central As células do TAM têm mais mitocôndrias e um suprimento mais rico de capilares e de inervação do que as células do TAB e sua característica cor marrom é conferida pelos cito cromos das mitocôndrias e pela hemoglobina nos capilares Uma característica singular dos adipócitos marrons é a alta expressão do gene UCP1 que codifica a termogenina a proteína desacopladora mitocondrial ver Figura 1936 A atividade dessa proteína é responsável por uma das princi pais funções do TAM a termogênese Nos adipócitos marrons os ácidos graxos armazenados nas gotículas de gordura são liberados entram nas mitocôn drias e sofrem conversão completa em CO2 pela boxidação e pelo ciclo do ácido cítrico O FADH2 e o NADH reduzidos gerados passam seus elétrons pela cadeia respiratória para o oxigênio molecular No TAB os prótons bombeados para fora da mitocôndria durante a transferência de elétrons reentram na matriz por meio da ATPsintase e a energia dessa transferência é conservada na síntese de ATP No TAM a termogenina proporciona uma via alternativa para a entrada dos prótons na matriz que ignora a ATPsintase a energia do gradiente de prótons é assim dissipada na for ma de calor que mantém o corpo especialmente o sistema nervoso e as vísceras na sua temperatura ótima quando a temperatura ambiente estiver relativamente baixa No feto humano a diferenciação dos fibroblastos préadi pócitos em TAM começa na vigésima semana da gestação e o TAM representa no nascimento de 1 a 5 da massa corpo ral total Os depósitos de gordura marrom estão localizados onde o calor gerado pela termogênese garante que os tecidos vitais vasos sanguíneos para a cabeça principais vasos san guíneos abdominais e as vísceras incluindo o pâncreas as glândulas suprarrenais e os rins não tenham sua temperatu ra reduzida quando o recémnascido entra em um mundo de temperatura ambiente mais baixa Figura 2316 Após o nascimento o TAB começa a se desenvolver e o TAM começa a desaparecer Os humanos adultos jovens têm depósitos muito diminuídos de TAM de 3 de todo o tecido adiposo nos machos a 7 nas fêmeas perfazendo menos de 01 da massa corporal No entanto os adultos aparentemente têm TAM que pode ser ativada por exposi ção ao frio e inibida pelo aumento da temperatura corpo ral Figura 2316b Os adipócitos do TAM produzem calor pela oxidação de seus próprios ácidos graxos mas eles cap tam e oxidam tanto ácidos graxos como glicose do sangue em taxas fora de proporção de suas massas Na verdade a detecção de TAM por tomografia de varredura por emissão de pósitrons PET scan depende da taxa relativamente alta de captação e metabolismo da glicose Figura 2316b Humanos com feocromocitoma tumores da glândula su prarrenal produzem adrenalina e noradrenalina em exces so e um dos efeitos é a diferenciação dos préadipócitos em regiões discretas de TAM localizadas aproximadamente nos mesmos locais dos recémnascidos O fator de transcri ção nuclear PPARg descrito mais adiante neste capítulo tem um papel central na adaptação ao calor ou ao frio do ambiente e na diferenciação normal do TAB e do TAM Os músculos usam ATP para trabalho mecânico O metabolismo das células da musculatura esquelética miócitos é especializado na geração de ATP como fonte imediata de energia para a contração Além disso o músculo esquelético está adaptado para realizar trabalho mecânico de forma intermitente de acordo com a demanda Às vezes o músculo esquelético precisa trabalhar na sua capacidade máxima por um tempo curto como em corridas de 100 me tros outras vezes é necessário um esforço mais longo como em maratonas ou trabalhos físicos mais prolongados Existem duas classes gerais de tecido muscular que di ferem no papel fisiológico e na utilização de combustível O músculo de contração lenta também chamado de mús culo vermelho proporciona tensão relativamente baixa mas é altamente resistente à fadiga Ele produz ATP pelo processo de fosforilação oxidativa relativamente lento mas estável O músculo vermelho é muito rico em mitocôndrias e é irrigado por redes muito densas de vasos sanguíneos que fornecem o oxigênio essencial para a produção de ATP O músculo de contração rápida ou músculo branco tem Nelson6ed23indd 944 Nelson6ed23indd 944 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 945 menos mitocôndrias e um suprimento menor de vasos san guíneos do que o músculo vermelho mas pode desenvolver grande tensão e o faz mais rapidamente O músculo branco entra em fadiga com mais rapidez porque quando em ativi dade usa ATP mais rapidamente do que pode repor A pro porção individual entre músculo branco e vermelho apre senta um componente genético e a resistência do músculo de contração rápida pode ser aumentada com treinamento O músculo esquelético poder usar ácidos graxos livres corpos cetônicos ou glicose como combustíveis depen dendo do grau de atividade muscular Figura 2317 No músculo em repouso os principais combustíveis são ácidos graxos livres do tecido adiposo e corpos cetônicos do fíga do São oxidados e degradados para produzir acetilCoA que entra no ciclo do ácido cítrico para ser oxidada a CO2 A resultante transferência de elétrons para o O2 fornece a energia para a síntese de ATP por fosforilação oxidativa Os músculos moderadamente ativos usam a glicose sanguínea além dos ácidos graxos livres e dos corpos cetônicos A gli cose é fosforilada sendo então degradada pela glicólise a a b FIGURA 2316 Tecido adiposo marrom em crianças e adultos a Os bebês humanos ao nascer têm a gordura marrom distribuída conforme mostrado nesta figura para proteger a coluna vertebral os vasos sanguíneos principais e os órgãos internos b PET scan de uma mulher de 45 anos inje tada com 18Fdesoxiglicose para detectar tecidos que metabolizam glicose rapidamente ver Figura 2323 revela tumores no pulmão esquerdo e nos nodos linfáticos na glândula suprarrenal direita e em uma vértebra lombar esquerda O coração e a bexiga também foram intensamente marcados conforme esperado mas além disso havia uma surpreendente atividade metabólica nas regiões que normalmente têm gordura marrom nos bebês Quando a mesma paciente foi aquecida por 48 horas antes da PET scan di reita estas áreas de gordura marrom não se mostraram ativas indicando que este adulto tem depósitos de gordura marrom metabolicamente ativos somente quando a temperatura corporal está relativamente baixa ATP Creatina ADP 1 Pi CO2 da oxidação aeróbia Lactato produzido anaerobiamente Contração muscular Explosão de atividade intensa Glicogênio muscular Explosão de atividade intensa Ácidos graxos corpos cetônicos glicose sanguínea Atividade leve ou repouso Fosfocreatina FIGURA 2317 Fontes de energia para a contração muscular Diferen tes combustíveis são usados para a síntese de ATP durante períodos de ati vidade intensa e durante atividade leve ou repouso A fosfocreatina fornece ATP rapidamente Nelson6ed23indd 945 Nelson6ed23indd 945 030414 1131 030414 1131 946 DAVID L NELSON MICHAEL M COX piruvato o qual é convertido em acetilCoA e oxidado pelo ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa Nos músculos de contração rápida em atividade máxi ma a demanda por ATP é tão grande que o fluxo sanguíneo não consegue fornecer O2 e combustíveis com a rapidez ne cessária para gerar quantidade suficiente de ATP somen te pela respiração aeróbia Nessas condições o glicogênio armazenado no músculo é degradado em lactato por fer mentação p 548 Cada unidade de glicose degradada rende três ATP porque a fosforólise do glicogênio produz glicose6fosfato via glicose1fosfato poupando o ATP normalmente consumido na reação da hexocinase A fer mentação em ácido láctico responde assim mais rapida mente do que a fosforilação oxidativa a uma necessidade aumentada de ATP suplementando sua produção basal de ATP pela oxidação aeróbia de outros combustíveis no ciclo do ácido cítrico e na cadeia respiratória O uso da glicose sanguínea e do glicogênio do músculo como combustíveis para a atividade muscular é muito incrementado pela secre ção de adrenalina que estimula tanto a liberação de glicose a partir do glicogênio hepático como a degradação de glico gênio no tecido muscular A adrenalina controla a resposta de luta ou fuga discutida mais extensamente a seguir A quantidade relativamente baixa de glicogênio cerca de 1 do peso total do músculo esquelético limita a quan tidade de energia glicolítica disponível durante o esforço Além disso o acúmulo de lactato e a consequente redução do pH nos músculos em atividade máxima reduzem sua e Nos tecidos animais com demanda por ATP alta e flutu ante principalmente o músculo esquelético o músculo cardíaco e o cérebro existem várias isozimas de creati nacinase Uma isozima citoplasmática está presente em regiões de alto uso de ATP por exemplo miofibrilas e retículo sarcoplasmático Pela conversão do ADP pro duzido durante períodos de alto uso de ATP de volta a ATP essa isozima previne o acúmulo de ADP em concen trações que poderiam inibir pela ação das massas as en zimas que utilizam ATP Outra isozima da creatinacinase está localizada em regiões de contato entre as membra nas interna e externa da mitocôndria Essa isozima mito condrial CKm provavelmente serve para enviar equiva lentes de ATP produzidos na mitocôndria para os sítios citoplasmáticos de utilização do ATP Figura Q1 A substância que se difunde da mitocôndria para as ativida des que consomem ATP no citosol é o fosfato de creatina não o ATP A isozima CKm colocaliza com o transporta dor de nucleotídeos de adenina na membrana mitocon drial interna e com porina na membrana mitocondrial externa o que sugere que esses três componentes pos sam funcionar juntos no transporte para o citosol do ATP formado na mitocôndria Em camundongos nocaute sem a isozima mitocon drial os miócitos compensam pela produção de mais mi tocôndrias intimamente associadas com as miofibrilas e o retículo sarcoplasmático o que permite a difusão rápi da do ATP mitocondrial para os sítios de utilização Não obstante esses camundongos têm capacidade reduzida para correr indicando um defeito em algum aspecto do metabolismo de suprimento de energia A creatina e a fosfocreatina se degradam espontanea mente em creatinina Figura Q2 Para manter altos os níveis de creatina essas perdas devem ser repostas seja pela creatina da dieta obtida principalmente da carne músculo e produtos lácteos seja pela síntese de novo a partir da glicina arginina e metionina Figura 2228 que ocorre principalmente no fígado e no rim A sínte se de novo de creatina é o principal consumidor desses aminoácidos particularmente nos veganos para os quais essa é a única fonte de creatina as plantas não possuem QUADRO 232 Creatina e creatinacinase inestimáveis auxiliares do diagnóstico e amigas dos fisiculturistas Produção de ATP na fosforilação oxidativa Produção de ATP na glicólise Sentido determinado pela razão ATPADP Consumo citosólico de ATP ADP ATP ADP ATP ADP ATP ADP ATP PCr Cr Citosol Mitocôndria ATPases cCK cCK cCK mCK FIGURA Q1 A creatinacinase mitocondrial CKm transfere um grupo fosforil do ATP para a creatina Cr para formar o fosfato de creatina PCr o qual se difunde para os sítios de uso de ATP nos quais a creatinacinase citosólica CKc transfere o grupo fosforil de volta para o ATP A CK cito sólica também pode utilizar o ATP produzido na glicólise para sintetizar PCr Durante os períodos de baixa demanda de ATP os reservatórios de ATP e de PCr são abastecidos em preparação para o próximo período de demanda intensa de ATP No músculo em repouso a concentração de PCr é 2 a 3 vezes maior que a de ATP protegendo a célula contra a depleção rápida do ATP durante curtas explosões de demanda por ATP Nelson6ed23indd 946 Nelson6ed23indd 946 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 947 ficiência O músculo esquelético contudo tem outra fonte de ATP a fosfocreatina 10 a 30 mM que regenera ATP ra pidamente a partir de ADP pela reação da creatinacinase NH2 N Creatina COO2 C 1 NH2 CH2 ATP 1 Fosfocreatina CH2 C 2O H P O N 1 NH2 H3C C H3 N O2 COO2 1 ADP durante a atividade durante a recuperação Durante períodos de contração ativa e glicólise esta reação ocorre predominantemente no sentido da síntese de ATP durante a recuperação do esforço a mesma enzima sintetiza novamente a fosfocreatina a partir de creatina e ATP Devido aos níveis relativamente altos de ATP e de fos focreatina muscular estes compostos podem ser detecta dos no músculo isolado em tempo real por espectroscopia de RNM Figura 2318 A creatina serve para enviar equi valentes de ATP da mitocôndria para locais de consumo de ATP e pode ser o fator limitante no desenvolvimento de te cido muscular novo Quadro 232 Após um período de atividade muscular intensa a pes soa continua a respirar intensamente por algum tempo usando muito O2 extra na fosforilação oxidativa no fígado O creatina O tecido muscular tem um sistema específico para captar creatina exportada pelo fígado ou rim a par tir do sangue para as células contra um considerável gra diente de concentração A captação eficiente da creatina da dieta requer exercício constante sem o exercício a suplementação de creatina é de pouco valor O músculo cardíaco tem uma única isozima da creati nacinase a isozima MB normalmente não encontrada no sangue mas aparece quando liberada pelo músculo lesado por um ataque cardíaco O nível sanguíneo da BM começa a subir dentro de 2 horas após o ataque alcança um pico entre 12 e 36 horas e retorna aos níveis normais entre 3 e 5 dias após o ataque Portanto a medida da BM no sangue confirma o diagnóstico de um ataque cardíaco e indica aproximadamente quando ele ocorreu Os fisiculturistas que estão formando massa muscular têm uma grande necessidade de creatina e comumente consomem suplementos com creatina de até 20 g por dia por poucos dias seguida de doses de manutenção mais baixas A combinação do exercício com a suplementação de creatina aumenta a massa muscular Figura Q3 e aumenta o desempenho no trabalho de alta intensidade e curta duração Crianças com erros congênitos nas enzi mas de síntese ou de captação da creatina sofrem de in capacidade intelectual grave e ataques Esses indivíduos têm níveis muito reduzidos de creatina cerebral medidos por NMR ver Figura 2318 A suplementação de crea tina aumenta as concentrações de creatina e de fosfato de creatina cerebrais e causam um melhora parcial dos sintomas No rim saudável a creatinina proveniente da degra dação da creatina é eliminada do sangue para a urina de forma eficiente Quando a função renal está defeituosa os níveis de creatinina no sangue aumentam acima da va riação normal de 08 a 14 mgdL Creatinina sanguínea elevada está associada com deficiência renal no diabetes e em outras condições nas quais a função renal está tem porária ou permanentemente comprometida A elimina ção renal da creatinina varia levemente com a idade raça e gênero de forma que a correção do cálculo por esses fatores produz uma medida mais sensível da extensão da função renal a taxa de filtração glomerular GFR FIGURA Q3 Fisiculturistas consomem com frequência suplementos com creatina para suprir de fosfato de creatina o tecido muscular novo ADP ATP creatinacinase P O 2O O HN O2 PCr Creatinina 11 das reservas de creatina por dia 26 das reservas de PCr por dia Creatina CH2 N COO2 H3C NH2 CH2 N COO2 H3C H2N1 H2O Pi 1 H2O NH H2N1 N H H3C N FIGURA Q2 A formação espontânea não enzimática de creatinina a partir da fosfocreatina ou da creatina consome uma porcentagem baixa do total da creatina por dia o que deve ser reposto pela biossíntese ou pela dieta Nelson6ed23indd 947 Nelson6ed23indd 947 030414 1131 030414 1131 948 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ATP produzido é usado para a gliconeogênese no fígado a partir do lactato que foi transportado dos músculos pelo sangue A glicose assim formada retorna aos músculos para repor seus estoques de glicogênio completando o ciclo de Cori Figura 2319 ver também Quadro 154 O músculo esquelético em contração ativa gera calor como um subproduto do acoplamento imperfeito da ener gia química do ATP com o trabalho mecânico da contração Essa produção de calor pode ser utilizada quando a tempe ratura ambiente estiver baixa o músculo esquelético realiza a termogênese com calafrio contração muscular repeti da rapidamente que produz calor mas pouco movimento ajudando a manter o corpo na sua temperatura recomen dada de 37C O músculo cardíaco difere do músculo esquelético por ter atividade contínua em um ritmo regular de contra ção e relaxamento e por ter um metabolismo completamen te aeróbio o tempo todo As mitocôndrias são muito mais abundantes no músculo cardíaco do que no esquelético ocu pando quase a metade do volume das células Figura 23 20 O coração usa como fonte de energia principalmente ácidos graxos livres mas também alguma glicose e corpos cetônicos captados do sangue estes combustíveis são oxida dos no ciclo do ácido cítrico e na fosforilação oxidativa para gerar ATP Como o músculo esquelético o músculo cardíaco não armazena grandes quantidades de lipídeos ou glicogê nio Ele tem pequenas quantidades de energia de reserva na forma de fosfocreatina suficiente para poucos segundos de contração Uma vez que o coração normalmente é aeróbio e obtém a energia a partir da fosforilação oxidativa o fracasso em levar O2 a determinada região do músculo cardíaco quan do os vasos sanguíneos estão bloqueados por depósitos lipí dicos aterosclerose ou coágulos sanguíneos trombose co ronariana pode causar a morte do tecido cardíaco nessa região Isso é o que acontece no infarto do miocárdio mais comumente conhecido como ataque cardíaco O cérebro usa a energia para a transmissão de impulsos elétricos O metabolismo do cérebro é extraordinário em vários as pectos Os neurônios do cérebro dos mamíferos adultos Intensidade do sinal concentração do composto Troca química partes por milhão identidade do composto Pi PCr ATP 0 5 10 15 Repouso Exercício Recuperação 20 FIGURA 2318 A fosfocreatina tampona a concentração de ATP duran te o exercício Uma representação gráfica de um espectro de ressonância magnética do 31P mostrando o fosfato inorgânico Pi a fosfocreatina PCr e o ATP cada um dos seus três fosfatos emite um sinal A série de curvas re presenta a passagem do tempo de um período de repouso para um de exer cício e então a recuperação Observe que o sinal do ATP quase não se altera durante o exercício mantido alto pela respiração contínua e pelo reservatório de fosfocreatina que diminui durante o exercício Durante a recuperação quando a produção de ATP pelo catabolismo é maior do que a sua utilização pelo músculo agora em repouso o reservatório de fosfocreatina é reposto Músculo ATP produzido pela glicólise para contração rápida Lactato Glicogênio Lactato Glicose ATP ATP Lactato sanguíneo Glicose sanguínea Fígado ATP usado na síntese de glicose gliconeogênese durante a recuperação FIGURA 2319 Cooperação metabólica entre o músculo esquelético e o fígado o ciclo de Cori Músculos extremamente ativos usam o glicogê nio como fonte de energia gerando lactato via glicólise Durante a recupera ção parte deste lactato é transportada para o fígado e convertida em glicose via gliconeogênese Esta glicose é liberada no sangue e retorna ao músculo para repor seus estoques de glicogênio A via total glicose S lactato S gli cose constitui o ciclo de Cori 1 mm Mitocôndria Aparelho contrátil actinamiosina FIGURA 2320 Micrografia eletrônica do músculo cardíaco Nas mito côndrias abundantes no tecido cardíaco o piruvato procedente da glicose os ácidos graxos e os corpos cetônicos são oxidados para propiciar a síntese de ATP Este metabolismo aeróbio permanente permite que o coração hu mano bombeie sangue a uma taxa de 6 Lmin ou cerca de 350 Lh ou 200 3 10 6 L durante 70 anos Nelson6ed23indd 948 Nelson6ed23indd 948 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 949 normalmente usam somente glicose como combustível Figura 2321 Os astrócitos outro tipo celular impor tante no cérebro podem oxidar ácidos graxos O cérebro tem um metabolismo respiratório muito ativo Figura 23 22 ele usa O2 a uma taxa bastante constante responden do por quase 20 do total de O2 consumido pelo corpo em repouso Uma vez que o cérebro tem muito pouco glico gênio ele depende constantemente da glicose do sangue A queda significativa da glicose sanguínea abaixo de um nível crítico mesmo que por um período curto de tempo pode resultar em mudanças graves e às vezes irreversí veis na função cerebral Embora os neurônios do cérebro não consigam utilizar ácidos graxos livres ou lipídeos como combustíveis direta mente do sangue eles podem quando necessário usar b hidroxibutirato corpo cetônico formado no fígado a par tir dos ácidos graxos A capacidade do cérebro de oxidar bhidroxibutirato via acetilCoA tornase importante duran te o jejum prolongado ou a inanição depois da degradação total do glicogênio hepático porque permite que o cérebro use a gordura corporal como fonte de energia Isso poupa proteínas musculares até que se tornem a fonte final de glicose do cérebro via gliconeogênese no fígado durante a inanição grave Os neurônios oxidam a glicose pela glicólise e pelo ci clo do ácido cítrico e o fluxo de elétrons resultante des sas oxidações fornece pela cadeia respiratória quase todo o ATP utilizado por essas células A energia é necessária para criar e manter um potencial elétrico através da mem brana plasmática neuronal A membrana tem um transpor tador eletrogênico tipo antiporte dependente de ATP a Na 1K 1ATPase que bombeia simultaneamente 2 íons K 1 para dentro e 3 íons Na 1 para fora do neurônio ver Figura 1138 O potencial de membrana resultante se altera tran sitoriamente quando um sinal elétrico potencial de ação percorre o neurônio de uma extremidade à outra ver Figu ra 1226 Os potenciais de ação são os mecanismos essen ciais de transferência de informação no sistema nervoso de forma que a depleção de ATP nos neurônios tem efeitos desastrosos sobre todas as atividades coordenadas pela si nalização neuronal O sangue transporta oxigênio metabólitos e hormônios O sangue medeia as interações metabólicas entre todos os tecidos Ele transporta nutrientes do intestino delgado para o fígado e do fígado e do tecido adiposo para outros órgãos também transporta os produtos de excreção dos tecidos extrahepáticos para o fígado para processamento e para os rins para eliminação O oxigênio se desloca na corrente sanguínea dos pulmões para os tecidos e o CO2 gerado pela respiração tecidual retorna pela corrente sanguínea para os pulmões para ser expelido O sangue também carrega sinais hormonais de um tecido para outro No seu papel de trans portador de sinais o sistema circulatório lembra o sistema nervoso ambos regulam e integram as atividades dos dife rentes órgãos Um humano adulto médio tem de 5 a 6 L de sangue Quase a metade desse volume é composta por três tipos de células sanguíneas Figura 2323 eritrócitos célu las vermelhas cheios de hemoglobina e especializados no transporte de O2 e CO2 números muito menores de leucó citos células brancas de vários tipos incluindo os linfó citos também encontrados nos tecidos linfáticos funda mentais para o sistema imune defender o organismo contra a b 1200 200 mg100 g min FIGURA 2322 Metabolismo da glicose no cérebro A técnica de tomo grafia de varredura por emissão de pósitrons PET mostra a atividade meta bólica em regiões específicas do cérebro Esta técnica permite a visualização em tempo real de glicose isotopicamente marcada localizada com precisão em regiões do cérebro de uma pessoa viva Um análogo de glicose emitindo um pósitron 2 18Ffluoro2desóxiDglicose é injetado na corrente sanguí nea poucos segundos mais tarde uma varredura PET mostra a quantidade de glicose que é captada em cada região do cérebro uma medida da ati vidade metabólica Na figura são mostradas tomografias de secções trans versais do cérebro em três níveis do topo à esquerda para baixo para a direita As imagens comparam o metabolismo da glicose na pessoa quando está a em repouso e b privada de sono por 48 horas ATP ADP 1 Pi CO2 da oxidação aeróbia Corpos cetônicos Transporte eletrogênico pela NaK ATPase Jejum Dieta normal Glicose FIGURA 2321 Os combustíveis que suprem o cérebro com ATP A fonte de energia usada pelo cérebro varia com o estado nutricional O corpo cetônico usado durante o jejum é o bhidroxibutirato O transporte eletrogê nico pela Na 1K 1ATPase mantém o potencial de membrana essencial para a transferência de informação entre os neurônios Nelson6ed23indd 949 Nelson6ed23indd 949 030414 1131 030414 1131 950 DAVID L NELSON MICHAEL M COX infecções e plaquetas que ajudam a mediar a coagulação sanguínea A porção líquida é o plasma sanguíneo com 90 de água e 10 de solutos Uma vasta gama de pro teínas lipoproteínas nutrientes metabólitos produtos de excreção íons inorgânicos e hormônios está dissolvida ou em suspensão no plasma Mais de 70 dos sólidos do plas ma são proteínas plasmáticas principalmente imunoglo bulinas anticorpos circulantes albumina sérica apolipo proteínas envolvidas no transporte de lipídeos transferrina para o transporte de ferro e proteínas da coagulação san guínea como fibrinogênio e protrombina Os íons e os solutos de baixa massa molecular do plasma sanguíneo não são componentes fixos mas estão em flu xo constante entre o sangue e os vários tecidos O influxo dietético dos íons inorgânicos que são os eletrólitos domi nantes do sangue e do citosol Na 1 K 1 e Ca 21 é em geral contrabalançado por sua excreção na urina Para muitos componentes do sangue é alcançado algo próximo a um es tado de equilíbrio dinâmico a concentração do componente é pouco alterada embora ocorra um fluxo contínuo entre o trato digestivo o sangue e a urina Os níveis plasmáticos de Na 1 K 1 e Ca 21 permanecem próximos de 140 5 e 25 mM respectivamente com pequena variação em resposta ao influxo dietético Qualquer alteração significativa destes valores resulta em doença séria ou morte Os rins têm um papel especialmente importante na manutenção do equilí brio iônico pela filtração seletiva dos produtos de excreção e do excesso de íons do sangue ao mesmo tempo em que previnem a perda de nutrientes e íons essenciais O eritrócito humano perde seu núcleo e mitocôndrias durante a diferenciação Assim sendo ele depende apenas da glicólise para a produção de ATP O lactato produzido pela glicólise retorna ao fígado onde a gliconeogênese o converte em glicose que será armazenada como glicogê nio ou circulará até os tecidos periféricos O eritrócito tem constante acesso à glicose sanguínea A concentração da glicose no plasma está sujeita a uma estreita regulação Anteriormente foi abordada a necessidade constante do cérebro por glicose e o papel do fígado na manutenção da glicose sanguínea na faixa normal de 60 a 90 mg100 mL de sangue total 45 mM Uma vez que os eritrócitos compõem uma fração significativa do volume sanguíneo sua remoção por centrifugação deixa um fluido sobrenadante o plasma contendo a glicose sanguí nea em um volume menor Para converter a concentração sanguínea da glicose em concentração plasmática multipli que a concentração sanguínea de glicose por 114 Quando a glicose sanguínea em humanos diminuir para 40 mg100 mL condição hipoglicêmica a pessoa sente desconforto e confusão mental Figura 2324 reduções adicionais le vam ao coma a convulsões e em casos de hipoglicemia ex trema à morte Portanto a manutenção da concentração normal da glicose no sangue é uma prioridade do organismo e para alcançála uma grande variedade de mecanismos reguladores evoluiu Entre os reguladores mais importantes da glicose sanguínea estão os hormônios insulina glucagon e adrenalina conforme será discutido na próxima seção RESUMO 232 Metabolismo específico para cada tecido a divisão de trabalho c Nos mamíferos existe uma divisão de trabalho metabóli co entre tecidos e órgãos especializados O fígado é o ór gão distribuidor e o principal processador de nutrientes Os açúcares e os aminoácidos produzidos na digestão atravessam o epitélio intestinal e entram no sangue que os transporta para o fígado Alguns triacilgliceróis deri vados dos lipídeos ingeridos também fazem seu caminho para o fígado onde os ácidos graxos constituintes são usados em uma grande variedade de processos c A glicose6fosfato é o intermediáriochave no metabo lismo dos carboidratos Ela pode ser polimerizada em glicogênio desfosforilada para fornecer glicose sanguí nea ou convertida em ácidos graxos via acetilCoA Ela também pode sofrer oxidação na glicólise no ciclo do ácido cítrico e na cadeia respiratória para gerar ATP ou entrar na via das pentosesfosfato produzindo pentoses e NADPH Plasma sanguíneo Células Componentes inorgânicos 10 NaCl bicarbonato fosfato CaCl2 MgCl2 KCl Na2SO4 Metabólitos orgânicos e produtos de excreção 20 glicose aminoácidos lactato piruvato corpos cetônicos citrato ureia ácido úrico Proteínas plasmáticas 70 Principais proteínas plasmáticas albumina sérica lipoproteínas de densidade muito baixa VLDL lipoproteínas de baixa densidade LDL lipoproteínas de alta densidade HDL imunoglobulinas centenas de tipos fibrinogênio protrombina muitas proteínas especializadas em transporte como a transferrina H2O Eritrócitos Leucócitos Plaquetas Solutos plasmáticos FIGURA 2323 A composição do sangue por peso O sangue total pode ser separado por centrifugação em plasma e células Cerca de 10 do plasma sanguíneo são constituídos por solutos e destes cerca de 10 consistem em sais inorgânicos 20 de moléculas orgânicas pequenas e 70 de proteínas plasmáticas Os principais componentes dissolvidos es tão listados O sangue tem muitas outras substâncias frequentemente em quantidadestraço Estas incluem outros metabólitos enzimas hormônios vitaminas elementostraço e pigmentos biliares A medida das concentra ções dos componentes no plasma sanguíneo é importante no diagnóstico e no tratamento de muitas doenças Nelson6ed23indd 950 Nelson6ed23indd 950 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 951 c Os aminoácidos são utilizados para sintetizar proteínas hepáticas e plasmáticas ou seus esqueletos carbônicos são convertidos em glicose e glicogênio pela gliconeogê nese a amônia formada pela desaminação é convertida em ureia c O fígado converte os ácidos graxos em triacilgliceróis fosfolipídeos ou colesterol e seus ésteres que são transportados como lipoproteínas plasmáticas para o armazenamento no tecido adiposo Os ácidos graxos também podem ser oxidados para gerar ATP ou para formar corpos cetônicos que se difundem para outros tecidos c O tecido adiposo branco armazena grandes reservas de triacilgliceróis e os libera no sangue em resposta à adre nalina ou ao glucagon O tecido adiposo marrom é espe cializado na termogênese o resultado da oxidação dos ácidos graxos em mitocôndrias desacopladas c O músculo esquelético é especializado na produção e no uso do ATP para trabalho mecânico Durante atividade muscular baixa a moderada a oxidação dos ácidos gra xos e da glicose é a primeira fonte de ATP Durante a atividade muscular extenuante o glicogênio é o com bustível básico produzindo ATP pela fermentação lác tica Durante a recuperação o lactato é reconvertido pela gliconeogênese em glicose e glicogênio no fígado para ser usado na reposição dos estoques de glicogênio muscular A fosfocreatina é uma fonte imediata de ATP durante a contração ativa c O músculo cardíaco obtém praticamente todo o seu ATP da fosforilação oxidativa com os ácidos graxos como o principal combustível c Os neurônios do cérebro usam somente glicose e b hidroxibutirato como combustíveis sendo que o último é importante durante o jejum ou a inanição O cérebro utiliza a maior parte do seu ATP para o transporte ativo de Na 1 e K 1 para manter o potencial elétrico através da membrana neuronal c O sangue transfere nutrientes produtos de excreção e sinais hormonais entre os tecidos e os órgãos Isso é rea lizado por células eritrócitos leucócitos e plaquetas e pelo líquido rico em eletrólitos plasma que contém muitas proteínas 233 Regulação hormonal do metabolismo energético Os ajustes feitos minuto a minuto que mantêm a concen tração de glicose sanguínea em cerca de 45 mM envolvem as ações combinadas da insulina do glucagon da adrena lina e do cortisol sobre os processos metabólicos em mui tos tecidos corporais mas especialmente no fígado no músculo e no tecido adiposo A insulina sinaliza para esses tecidos que a glicose sanguínea está mais alta do que o ne cessário como resultado as células captam o excesso de glicose do sangue e o convertem em glicogênio e triacilgli ceróis para armazenamento O glucagon sinaliza que a gli cose sanguínea está muito baixa e os tecidos respondem produzindo glicose pela degradação do glicogênio pela gli coneogênese no fígado e pela oxidação de gorduras para reduzir o uso da glicose A adrenalina é liberada no sangue para preparar os músculos os pulmões e o coração para um grande aumento de atividade O cortisol é responsá vel por mediar a resposta corporal a estressores de longa duração Essas regulações hormonais serão discutidas no contexto de três estados metabólicos normais alimenta do em jejum e em inanição e serão vistas as consequên cias metabólicas do diabetes melito doença que resulta de alterações nas vias de sinalização que controlam o meta bolismo da glicose A insulina opõese a níveis altos de glicose sanguínea Agindo por meio de receptores na membrana plasmática ver Figuras 1215 e 1216 a insulina estimula a captação da glicose pelos músculos e pelo tecido adiposo Tabela 233 onde a glicose é convertida em glicose6fosfato No fígado a insulina também ativa a glicogêniosintase e ina tiva a glicogêniofosforilase de modo que grande parte da glicose6fosfato é canalizada para formar glicogênio A insulina também estimula o armazenamento do exces so de combustível no tecido adiposo na forma de gordura Figura 2325 No fígado a insulina ativa a oxidação da glicose6fosfato em piruvato pela glicólise e a oxidação do piruvato em acetilCoA O excesso de acetilCoA não ne cessária para a produção de energia é utilizado para a sín tese de ácidos graxos exportados do fígado para o tecido adiposo como TAG de lipoproteínas plasmáticas VLDL ver Figura 2140 A insulina estimula a síntese de TAG nos adipócitos a partir dos ácidos graxos liberados pelos TAG da VLDL Esses ácidos graxos são em última análise deri 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Glicose sanguínea mg100 mL Variação normal Sinais neurológicos sutis fome Liberação de glucagon adrenalina cortisol Sudorese tremor Letargia Convulsões coma Dano encefálico permanente se prolongado Morte FIGURA 2324 Efeitos fisiológicos do baixo nível de glicose sanguí nea em humanos Os níveis de glicose sanguínea de 40 mg100 mL ou abaixo constituem hipoglicemia grave Nelson6ed23indd 951 Nelson6ed23indd 951 030414 1131 030414 1131 952 DAVID L NELSON MICHAEL M COX TABELA 233 Efeitos da insulina sobre a glicose sanguínea captação de glicose pelas células e armazenamento como triacilgliceróis e glicogênio Efeito metabólico Enzimaalvo c Captação de glicose músculo tecido adiposo c Transportador de glicose GLUT4 c Captação de glicose fígado c Glicocinase expressão aumentada c Síntese de glicogênio fígado músculo c Glicogêniosintase T Degradação de glicogênio fígado músculo T Glicogêniofosforilase c Glicólise produção de acetilCoA fígado músculo c PFK1 por c PFK2 c Complexo da piruvatodesidrogenase c Síntese de ácidos graxos fígado c AcetilCoAcarboxilase c Síntese de triacilglicerol tecido adiposo c Lipase lipoproteica Insulina Insulina Pâncreas Intestino Glicose Piruvato ATP Acetil CoA TAG Aminoácidos Síntese de proteínas Glicogênio Sistema linfático VLDL TAG Tecido adiposo Músculo Ácidos graxos ATP CO2 ATP CO2 CO2 Fígado Cérebro para o cérebro o tecido adiposo e o músculo NH3 aCetoácidos Urea Glicose Vaso sanguíneo Amino ácidos Gorduras Glicose Glicose TAG FIGURA 2325 O estado bemalimentado o fígado lipogênico Ime diatamente após uma refeição rica em calorias a glicose os ácidos graxos e os aminoácidos entram no fígado A insulina liberada em resposta à alta concentração sanguínea de glicose estimula a captação do açúcar pelos tecidos Parte da glicose é exportada para o cérebro para suas necessidades energéticas e parte para os tecidos adiposo e muscular No fígado o excesso de glicose é oxidado a acetilCoA que é usada na síntese de ácidos graxos que são exportados como triacilgliceróis em VLDL para os tecidos adiposo e muscular O NADPH necessário para a síntese de lipídeos é obtido pela oxidação da glicose na via das pentosesfosfato O excesso de aminoácidos é convertido em piruvato e acetilCoA também usados para a síntese de lipí deos As gorduras da dieta se deslocam na forma de quilomicra via sistema linfático do intestino para o músculo e o tecido adiposo Nelson6ed23indd 952 Nelson6ed23indd 952 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 953 vados do excesso de glicose captada do sangue pelo fígado Em resumo o efeito da insulina é favorecer a conversão do excesso de glicose sanguínea em duas formas de armazena mento glicogênio no fígado e no músculo e triacilgliceróis no tecido adiposo Além de agir diretamente no músculo e no fígado mu dando seu metabolismo de carboidratos e gorduras a insu lina pode agir no cérebro sinalizando indiretamente para esses tecidos conforme descrito mais adiante As células b pancreáticas secretam insulina em resposta a alterações na glicose sanguínea Quando a glicose entra na corrente sanguínea a partir do intestino após uma refeição rica em carboidratos a quanti dade aumentada de glicose no sangue provoca um aumen to na secreção de insulina e uma redução na secreção do glucagon pelo pâncreas A liberação de insulina é regula da basicamente pelo nível de glicose no sangue que irriga o pâncreas Os hormônios peptídicos insulina glucagon e somatostatina são produzidos por agrupamentos de células pancreáticas especializadas as ilhotas de Langerhans Fi gura 2326 Cada tipo celular das ilhotas produz um único hormônio as células a produzem glucagon as células b in sulina as células d somatostatina Conforme mostrado na Figura 2327 quando a gli cose sanguínea aumenta ➊ os transportadores GLUT2 carregam a glicose para dentro das células b onde é ime FIGURA 2327 Regulação pela glicose da secreção de insulina nas células b pancreáti cas Quando o nível sanguíneo de glicose é alto o metabolismo ativo de glicose nas células b aumen ta a ATP intracelular fechando os canais de K 1 na membrana plasmática e assim despolarizandoa Em resposta a esta despolarização da membrana desencadeada pela alta ATP os canais de Ca 21 con trolados por voltagem se abrem permitindo o fluxo do íon para dentro da célula O Ca 21 também é li berado do retículo endoplasmático em resposta à elevação citosólica inicial da Ca 21 A concentração citosólica do íon é agora suficientemente alta para provocar a liberação da insulina por exocitose Os processos numerados são discutidos no texto ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ Glicose Glicose6fosfato Retículo endoplasmático Transportador de glicose GLUT2 Espaço extracelular Célula b pancreática Fosforilação oxidativa Glicólise Ciclo do ácido cítrico Ca2 Ca2 ATP Canal de K controlado por ATP despolarização Canal de Ca2 controlado por voltagem Grânulos de insulina Secreção de insulina Núcleo K K Vm Glicose Hexocinase IV glicocinase Célula b insulina Célula a glucagon Célula d somatostatina Pâncreas Vasos sanguíneos Célula exócrina Ilhota de Langerhans FIGURA 2326 O sistema endócrino do pâncreas O pâncreas tem células exócrinas ver Figura 183b que secretam enzimas digestivas na forma de zimogênios e grupos de células endócrinas as ilhotas de Lan gerhans As ilhotas têm células a b e d também conhecidas como células A B e D respectivamente e cada tipo celular secreta um hormônio pep tídico específico Nelson6ed23indd 953 Nelson6ed23indd 953 030414 1131 030414 1131 954 DAVID L NELSON MICHAEL M COX diatamente convertida em glicose6fosfato pela hexoci nase IV glicocinase e entra na glicólise Com a taxa de catabolismo da glicose mais alta ➋ a ATP aumenta cau sando o fechamento dos canais de K 1 controlados por ATP na membrana plasmática ➌ O efluxo reduzido de K 1 despolariza a membrana Lembre da Seção 126 que a saída deste íon por um canal de K 1 aberto hiperpolariza a membrana por essa razão o fechamento do canal despo lariza a membrana A despolarização abre canais de Ca 21 controlados por voltagem e ➍ o aumento resultante na Ca 21 citosólica desencadeia ➎ a liberação da insulina por exocitose O cérebro integra o suprimento e a demanda de energia e os sinais dos sistemas nervosos parassimpático e simpático também afetam estimulam e inibem respec tivamente a liberação da insulina Um circuito simples de retroalimentação limita a liberação do hormônio a insulina reduz a glicose sanguínea estimulando sua captação pelos tecidos a redução na glicose sanguínea é detectada pelas células b pelo fluxo diminuído na reação da hexocinase isto reduz ou interrompe a liberação da insulina Essa re gulação por retroalimentação mantém a concentração da glicose sanguínea praticamente constante apesar da gran de variação na captação dietética A atividade dos canais de K 1 controlados por ATP é fundamental para a regulação da secreção de insuli na pelas células b Os canais são octâmeros formados por quatro subunidades Kir62 idênticas e quatro subunida des SUR1 idênticas e são construídos nos mesmos mol des dos canais de K 1 das bactérias e das outras células eucarióticas ver Figuras 1147 e 1148 As quatro subu nidades Kir62 formam um cone ao redor do canal de K 1 e funcionam como mecanismo de filtro de seletividade con trolado por ATP Figura 2328 Quando a ATP aumen ta indicando aumento da glicose no sangue os canais de K 1 se fecham despolarizando a membrana plasmática e desencadeando a liberação de insulina como mostrado na Figura 2327 As sulfonilureias medicação oral utilizada no trata mento do diabetes melito tipo 2 se ligam às subunidades SUR1 receptor de sulfonilureia de sulfonylurea recep tor dos canais de K 1 fechandoos e estimulando a libera ção de insulina A primeira geração desses fármacos tolbu tamida por exemplo foi desenvolvida na década de 1950 A segunda geração incluindo gliburida Micronase glipi zida Glucotrol e glimepirida Amaryl é mais potente e tem menos efeitos colaterais A porção sulfonilureia está destacada em vermelhoclaro nas estruturas seguintes As sulfonilureias às vezes são usadas em combinação com in jeção de insulina mas muitas vezes conseguem controlar sozinhas o diabetes tipo 2 Mutações nos canais de K 1 controlados por ATP das células b felizmente são raras Mutações em Kir62 que causam a abertura permanente dos canais resíduos em vermelho na Figura 2328b originam diabetes melito neo natal com hiperglicemia grave que requer insulinoterapia Outras mutações em Kir62 ou em SUR1 resíduos em azul FIGURA 2328 Canais de K 1 controlados por ATP nas células b a O canal visto no plano da membrana O canal é formado por quatro subuni dades Kir62 idênticas e externamente a elas estão quatro subunidades de SUR1 receptor de sulfonilureia As subunidades SUR1 têm sítios de ligação ao ADP e ao fármaco diazoxida o que favorece a abertura do canal e à tolbu tamida fármaco de sulfonilureia que favorece o fechamento do canal As su bunidades Kir62 constituem o verdadeiro canal e contêm no lado citosólico sítios de ligação ao ATP e ao fosfatidilinositol 45bifosfato PIP2 que favore cem respectivamente o fechamento e a abertura do canal b Estrutura da porção Kir62 do canal vista no plano da membrana Para tornar mais claro são mostrados somente dois domínios transmembrana e dois citosólicos Três íons K 1 em verde são mostrados na região do filtro de seletividade Mutações em determinados resíduos de aminoácidos mostrados em ver melho causam diabetes neonatal mutações em outros mostrados em azul causam o hiperinsulinismo infantil Esta estrutura as coordenadas foram cor tesia de Frances Ashford e colaboradores da Universidade de Oxford não foi obtida por cristalografia mas pelo mapeamento da sequência conhecida de Kir62 sobre a estrutura cristalina de um canal de Kir bacteriano KirBac11 PDB ID 1P7B e os domínios carboxil e amino de outra proteína Kir Kir31 PDB ID 1U4E Compare esta estrutura com a do canal de K 1 na Figura 1148 ATP ATP SUR1 Kir62 Kir62 SUR1 SUR1 SUR1 SUR1 SUR1 SUR1 K Fora Dentro Diazoxida ADP Tolbutamida K Fora Dentro K K a b ATP PIP2 Nelson6ed23indd 954 Nelson6ed23indd 954 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 955 na Figura 2328b resultam em canais de K 1 permanente mente fechados e liberação contínua de insulina Pessoas com essas mutações se não forem tratadas desenvolvem hiperinsulinemia congênita hiperinsulinismo da infância excesso de insulina causa hipoglicemia grave baixa glicose sanguínea levando a danos cerebrais irreversíveis Um tra tamento eficaz é a remoção cirúrgica de parte do pâncreas para reduzir a produção do hormônio O glucagon opõese a níveis baixos de glicose sanguínea Várias horas após a ingestão de carboidratos os níveis de glicose sanguínea diminuem levemente devido à oxidação da glicose pelo cérebro e por outros tecidos A diminuição da glicose sanguínea desencadeia a secreção do glucagon e reduz a liberação da insulina Figura 2329 O glucagon causa um aumento na concentração san guínea da glicose de várias maneiras Tabela 234 Como a adrenalina ele estimula a degradação do glicogênio he pático por ativar a glicogêniofosforilase e inativar a glico gêniosintase ambos os efeitos são o resultado da fosfo rilação de enzimas reguladas desencadeada pelo cAMP O glucagon inibe no fígado a degradação da glicose pela glicólise e estimula sua síntese pela gliconeogênese Am bos os efeitos resultam da redução da concentração da frutose26bifosfato inibidor alostérico da enzima glico neogênica frutose16bifosfatase FBPase1 e ativador da enzima glicolítica fosfofrutocinase1 Lembre que a frutose26bifosfato é controlada em última análise por uma reação de fosforilação dependente de cAMP ver Fi gura 1519 O glucagon também inibe a enzima glicolítica piruvatocinase promovendo sua fosforilação dependen te de cAMP bloqueando a conversão do fosfoenolpiru vato em piruvato e impedindo a oxidação do piruvato no ciclo do ácido cítrico O consequente acúmulo de fosfo enolpiruvato favorece a gliconeogênese Esse efeito é aumentado pela estimulação pelo glucagon da síntese da enzima gliconeogênica PEPcarboxicinase Pela estimula ção da degradação do glicogênio prevenção da glicólise e promoção da gliconeogênese nos hepatócitos o glucagon permite que o fígado exporte glicose restaurando seu ní vel sanguíneo normal Cl NHCH2CH2 S N H N H O O O OCH3 O Gliburida H3C NHCH2CH2 S N H N H O O O O Glipizida N N FIGURA 2329 O estado de jejum o fígado glicogêni co Após algumas horas sem alimento o fígado tornase a principal fonte de glicose para o cérebro O glicogênio hepático é degradado e a glicose1fosfato produzida é convertida em glicose6fosfato e a seguir em glicose livre que é liberada para a corrente sanguínea Os aminoácidos procedentes da degradação das proteínas no fígado e no músculo e o glicerol oriundo da degradação dos TAGs no tecido adiposo são utilizados para a gliconeogênese O fí gado usa os ácidos graxos como seu combustível principal e o excesso de acetilCoA é convertido em corpos cetôni cos exportados para outros tecidos o cérebro é particular mente dependente deste combustível quando há deficiên cia de fornecimento de glicose ver Figura 2321 As setas azuis mostram a trajetória da glicose as setas alaranjadas a dos lipídeos e as setas roxas a dos aminoácidos Pâncreas Amino ácidos TAG Tecido adiposo Músculo Fígado Cérebro Glucagon ATP Corpos cetônicos CO2 CO2 Ácidos graxos Ácidos graxos ATP Proteína Corpos cetônicos ATP Proteínas CO2 CO2 Corpos cetônicos Glicogênio Piruvato gliconeogênese Glicose Glicose Glicerol Glicose6fosfato Nelson6ed23indd 955 Nelson6ed23indd 955 030414 1131 030414 1131 956 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Embora seu alvo principal seja o fígado o glucagon como a adrenalina também afeta o tecido adiposo ativan do a degradação de TAG por causar fosforilação dependen te de cAMP da perilipina e da lipase sensível a hormônio As lipases ativadas liberam ácidos graxos livres que são ex portados como combustível para o fígado e outros tecidos poupando glicose para o cérebro O efeito final do glucagon é portanto estimular a síntese e a liberação da glicose pelo fígado e mobilizar os ácidos graxos do tecido adiposo para serem usados no lugar da glicose por outros tecidos que não o cérebro Todos esses efeitos do glucagon são mediados por fosforilação proteica dependente de cAMP O metabolismo é alterado durante o jejum e a inanição para prover combustível para o cérebro As reservas de combustível de um adulto humano saudá vel são de três tipos glicogênio armazenado no fígado e em menor quantidade no músculo grandes quantidades de triacilgliceróis no tecido adiposo e proteínas teciduais que podem ser degradadas quando necessário para fornecer combustível Tabela 235 Duas horas após uma refeição o nível de glicose san guínea está levemente diminuído e os tecidos recebem gli cose liberada a partir do glicogênio hepático Há pequena ou nenhuma síntese de triacilgliceróis Quatro horas após a refeição a glicose sanguínea está mais reduzida a se creção de insulina diminuiu e a secreção de glucagon está aumentada Esses sinais hormonais mobilizam os triacilgli ceróis do tecido adiposo que agora se tornam o principal combustível para o músculo e o fígado A Figura 2330 mostra as respostas ao jejum prolongado ➊ Para fornecer glicose para o cérebro o fígado degrada determinadas pro teínas aquelas mais dispensáveis em um organismo que não está se alimentando Seus aminoácidos não essenciais são transaminados ou desaminados Capítulo 18 e ➋ os TABELA 234 Efeitos do glucagon sobre a glicose sanguínea produção e liberação de glicose pelo fígado Efeito metabólico Efeito sobre o metabolismo da glicose Enzimaalvo c Degradação de glicogênio fígado Glicogênio glicose c Glicogêniofosforilase T Síntese de glicogênio fígado Menos glicose armazenada como glicogênio T Glicogêniosintase T Glicólise fígado Menos glicose usada como combustível no fígado T PFK1 c Gliconeogênese fígado Aminoácidos Glicerol glicose Oxaloacetato c FBPase2 T Piruvatocinase c PEPcarboxicinase c Mobilização de ácidos graxos tecido adiposo Menos glicose usada como combustível pelo fígado e pelo músculo c Lipase sensível a hormônio c PKA perilipina c Cetogênese Fornece alternativa à glicose como fonte de energia para o cérebro T AcetilCoAcarboxilase TABELA 235 Combustível metabólico disponível em um homem com peso normal de 70 kg e em um homem obeso com 140 kg no início do jejum Tipo de combustível Peso kg Equivalente calórico milhares de kcal kJ Sobrevivência estimada meses Homem com peso normal 70 kg Triacilgliceróis tecido adiposo 15 140 590 Proteínas principalmente músculo 6 24 100 Glicogênio músculo fígado 023 090 38 Combustíveis circulantes glicose ácidos graxos triacilgliceróis etc 0023 010 042 Total 165 690 3 Homem obeso 140 kg Triacilgliceróis tecido adiposo 80 750 3100 Proteínas principalmente músculo 8 32 130 Glicogênio músculo fígado 023 092 38 Combustíveis circulantes 0025 011 046 Total 783 3200 14 O tempo de sobrevivência é calculado assumindo um gasto de energia basal de 1800 kcaldia Nelson6ed23indd 956 Nelson6ed23indd 956 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 957 grupos amino extras são convertidos em ureia que é ex portada pela corrente sanguínea para os rins e excretada na urina Também no fígado e de certa forma nos rins os esque letos de carbono dos aminoácidos glicogênicos são conver tidos em piruvato ou intermediários do ciclo do ácido cítri co ➌ Esses intermediários assim como o glicerol dos TAG do tecido adiposo fornecem os materiais de partida para a gliconeogênese no fígado ➍ gerando glicose para exportar para o cérebro ➎ Os ácidos graxos liberados do tecido adi poso são oxidados a acetilCoA no fígado mas como o oxa loacetato é depletado pelo uso de intermediários do ciclo do ácido cítrico na gliconeogênese ➏ a entrada da acetilCoA no ciclo é inibida e a mesma se acumula ➐ Isso favorece a formação de acetoacetilCoA e corpos cetônicos Após al guns dias de jejum aumentam os níveis de corpos cetônicos no sangue Figura 2331 à medida que são exportados do fígado para o coração o músculo esquelético e o cére bro que utilizam esses combustíveis em vez da glicose Fi gura 2330 ➑ ➊ ➐ ➌ ➏ ➋ ➍ ➑ ➒ ➎ AcetilCoA Pi Oxaloacetato Amino ácidos NH3 Glicose6fosfato Fosfoenol piruvato Citrato AcetoacetilCoA Corpos cetônicos Glicose Ureia Ácidos graxos A degradação proteica gera aminoácidos glicogênicos A glicose é exportada para o cérebro através da cor rente sanguínea O excesso de corpos cetônicos acaba na urina Os ácidos graxos importados do tecido adiposo são oxidados como combustível produzindo acetilCoA Os corpos cetônicos são exportados através da corrente sanguínea para o cérebro que os usa como combustível A ureia é transportada para o rim e excretada na urina O intermediário do ciclo do ácido cítrico oxaloacetato é desviado para a gliconeogênese O acúmulo de acetilCoA favorece a síntese de corpos cetônicos A falta de oxaloacetato impede a entrada da acetilCoA no ciclo do ácido cítrico acetilCoA se acumula FIGURA 2330 Metabolismo energético no fígado durante jejum pro longado ou no diabetes melito não controlado As etapas numeradas estão descritas no texto Após a depleção dos estoques de carboidratos gli cogênio a gliconeogênese no fígado tornase a principal fonte de glico se para o cérebro setas verdes A NH3 da desaminação dos aminoácidos é convertida em ureia e excretada setas verdes Os aminoácidos glicogênicos provenientes da degradação das proteínas setas roxas fornecem substratos para a gliconeogênese e a glicose é exportada para o cérebro Os ácidos graxos são importados do tecido adiposo para o fígado e são oxidados a acetilCoA setas cor de laranja o material de partida para a formação dos corpos cetônicos no fígado exportados para o cérebro para servirem como a fonte principal de energia setas vermelhas Quando a concentração dos corpos cetônicos no sangue excede a capacidade do rim de reabsorver as cetonas estes compostos começam a aparecer na urina Nelson6ed23indd 957 Nelson6ed23indd 957 030414 1131 030414 1131 958 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A acetilCoA é crítica na regulação do destino do piru vato ela inibe alostericamente a piruvatodesidrogenase e estimula a piruvatocarboxilase Dessa forma a acetilCoA previne sua própria produção a partir do piruvato enquan to estimula a conversão do piruvato em oxaloacetato a pri meira etapa da gliconeogênese Os triacilgliceróis armazenados no tecido adiposo de um adulto com peso normal podem fornecer combustível suficiente para manter uma taxa metabólica basal por cer ca de três meses um adulto muito obeso tem combustível armazenado suficiente para suportar um jejum de mais de um ano Tabela 235 Quando acabam as reservas de gor dura começa a degradação de proteínas essenciais isso leva à perda da função cardíaca e hepática e na inanição prolongada à morte A gordura armazenada fornece ener gia suficiente calorias durante o jejum ou em uma dieta rígida mas as vitaminas e os minerais devem ser forneci dos sendo necessários aminoácidos glicogênicos na dieta em quantidade suficiente para substituir aqueles utilizados na gliconeogênese As formulações em uma dieta de ema grecimento geralmente são enriquecidas com vitaminas minerais e aminoácidos ou proteínas A adrenalina sinaliza atividade iminente Quando um animal é confrontado com uma situação estres sante que requer atividade aumentada lutar ou fugir em casos extremos os sinais neuronais originários do cére bro provocam a liberação da adrenalina e da noradrena lina da medula suprarrenal Ambos os hormônios dilatam as vias aéreas para facilitar a captação de O2 aumentam a frequência e a força dos batimentos cardíacos e elevam a pressão arterial favorecendo o fluxo de O2 e de combus tíveis para os tecidos Tabela 236 Essa é a resposta de lutar ou fugir A adrenalina age principalmente nos tecidos muscular adiposo e hepático Ela ativa a glicogêniofosforilase e ina tiva a glicogêniosintase pela fosforilação dependente de cAMP dessas enzimas estimulando a conversão do glico gênio hepático em glicose sanguínea o combustível para o trabalho muscular anaeróbio A adrenalina também pro move a degradação anaeróbia do glicogênio muscular pela fermentação em ácido láctico estimulando a formação gli colítica de ATP A estimulação da glicólise é acompanhada pela elevação da concentração de frutose26bifosfato um ativador alostérico potente da fosfofrutocinase1 enzima chave da glicólise A adrenalina também estimula a mobi lização da gordura no tecido adiposo ativando por fosfori lação dependente de cAMP a lipase sensível a hormônio e removendo a perilipina que recobre a superfície das gotícu las de gordura ver Figura 173 Finalmente a adrenalina estimula a secreção de glucagon e inibe a secreção de insu lina reforçando seu efeito de mobilização de combustíveis e inibição de seu armazenamento O cortisol sinaliza estresse incluindo baixa glicose sanguínea Uma grande variedade de agentes estressores ansiedade medo dor hemorragia infecção glicose sanguínea baixa jejum estimula a liberação do hormônio corticosteroide cortisol do córtex suprarrenal O cortisol age no músculo no fígado e no tecido adiposo para suprir o organismo com combustível para resistir à situação estressante O cortisol é um hormônio de ação relativamente lenta que altera o metabolismo pela mudança nos tipos e nas quantidades de determinadas enzimas sintetizadas em suas célulasalvo em vez da regulação da atividade de moléculas enzimáticas já existentes No tecido adiposo o cortisol provoca um aumento na liberação dos ácidos graxos a partir dos triacilgliceróis armazenados Os ácidos graxos exportados servem como combustível para outros tecidos e o glicerol é usado na gliconeogênese no fígado O cortisol estimula a degrada ção das proteínas musculares não essenciais e a expor tação dos aminoácidos para o fígado onde servem como precursores para a gliconeogênese No fígado o cortisol promove a gliconeogênese por estimular a síntese da en zimachave PEPcarboxicinase o glucagon tem o mesmo efeito enquanto a insulina tem o efeito oposto A glico se assim produzida é armazenada no fígado como glico gênio ou exportada imediatamente para os tecidos que precisam dela para combustível O efeito líquido dessas alterações metabólicas é a restauração dos níveis normais de glicose sanguínea e o aumento dos estoques de gli cogênio pronto para dar suporte à resposta de luta ou fuga comumente associada ao estresse Os efeitos do cor tisol portanto contrabalançam os da insulina Durante bhidroxibutirato Glicose Ácidos graxos livres Acetoacetato Acetona 0 7 6 5 4 3 2 1 0 Concentração plasmática mM 10 20 Dias de jejum 30 40 FIGURA 2331 Concentração plasmática de ácidos graxos glicose e corpos cetônicos durante seis semanas de jejum Apesar dos meca nismos hormonais para a manutenção do nível de glicose no sangue ela começa a diminuir depois de dois dias de jejum em azul O nível de corpos cetônicos quase indetectáveis antes do jejum aumenta drasticamente após 2 a 4 dias de jejum em vermelho Estas cetonas hidrossolúveis acetoacetato e bhidroxibutirato suplementam a glicose como fonte de energia para o cérebro durante o jejum prolongado A acetona o corpo cetônico minoritá rio não é metabolizado e é eliminado com a respiração Um aumento muito menor de ácidos graxos também ocorre no sangue em cor de laranja mas esse aumento não contribui para o metabolismo energético no cérebro por que os ácidos graxos não atravessam a barreira hematoencefálica Nelson6ed23indd 958 Nelson6ed23indd 958 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 959 períodos prolongados de estresse a liberação constante de cortisol perde seu valor adaptativo positivo e começa a causar danos ao músculo e ao osso prejudicando as fun ções endócrina e imune O diabetes melito resulta de defeitos na produção ou na ação da insulina O diabetes melito é uma doença relativamente co mum quase 6 da população dos Estados Unidos mostram algum grau de anormalidade no metabolismo da glicose o que é indicativo de diabetes ou de tendência a essa condição Existem duas classes clínicas principais da doença diabetes tipo 1 às vezes denominado diabetes melito insulinadependente DMID e diabetes tipo 2 ou diabetes melito não insulinadependente DMNID tam bém chamado de diabetes resistente à insulina O diabetes tipo 1 começa cedo na vida e os sintomas rapidamente se tornam graves Essa doença responde à injeção de insulina porque o defeito metabólico se origi na da destruição autoimune das células b pancreáticas e de uma consequente incapacidade de produzir insulina em quantidade suficiente O diabetes tipo 1 requer in sulinoterapia e controle cuidadoso por toda a vida do equilíbrio entre a ingestão dietética e a dose de insulina Os sintomas característicos do diabetes tipo 1 e tipo 2 são sede excessiva e micção frequente poliúria levan do à ingestão de grandes volumes de água polidipsia diabetes melito significa excreção excessiva de urina doce Esses sintomas são devidos à excreção de grande quantidade de glicose na urina condição conhecida como glicosúria O diabetes tipo 2 se desenvolve lentamente em geral em pessoas mais velhas e obesas e os sintomas são mais brandos e com frequência não reconhecidos no início Este é na verdade um grupo de doenças nas quais a ati vidade reguladora da insulina está perturbada a insulina é produzida mas alguns aspectos do sistema de resposta ao hormônio estão defeituosos As pessoas com essa enfermi dade são resistentes à insulina A conexão entre o diabetes tipo 2 e a obesidade discutida adiante é uma área de pes quisa ativa e excitante As pessoas com um ou outro tipo de diabetes não con seguem captar de maneira eficiente a glicose do sangue lembre que a insulina provoca o deslocamento dos transpor tadores de glicose GLUT4 para a membrana plasmática no músculo e no tecido adiposo ver Figura 1216 Sem glicose disponível os ácidos graxos tornamse o combustível princi pal o que leva a outra alteração metabólica característica no diabetes a oxidação excessiva mas incompleta dos ácidos graxos no fígado A acetilCoA produzida pela boxidação não pode ser oxidada completamente pelo ciclo do ácido cítrico porque a alta relação NADHNAD 1 produzida pela boxidação inibe o ciclo lembre que três etapas do ci clo convertem NAD 1 em NADH O acúmulo de acetilCoA leva à superprodução dos corpos cetônicos acetoacetato e bhidroxibutirato que não podem ser usados pelos tecidos extrahepáticos na velocidade com que são produzidos no fí gado Além do bhidroxibutirato e do acetoacetato o sangue das pessoas diabéticas também contém acetona que resulta da descarboxilação espontânea do acetoacetato H3C C O CH2 COO2 1 H2O H3C C O CH3 1HCO3 2 Acetoacetato Acetona A acetona é volátil e é exalada de modo que no diabe tes não controlado o hálito tem odor característico às ve zes confundido com etanol Uma pessoa diabética que apre senta confusão mental devido à alta glicose sanguínea é às vezes diagnosticada incorretamente como intoxicada erro que pode ser fatal A superprodução de corpos cetônicos chamada de cetose resulta em uma concentração muito aumentada desses compostos no sangue cetonemia e na urina cetonúria Os corpos cetônicos são ácidos carboxílicos que se io nizam liberando prótons No diabetes não controlado esta produção de ácido pode superar a capacidade do sistema tampão bicarbonato do sangue e produzir uma redução no pH sanguíneo chamada de acidose ou em combinação com a cetose cetoacidose combinação potencialmente letal TABELA 236 Efeitos fisiológicos e metabólicos da adrenalina preparação para ação Efeitos imediatos Efeito total Fisiológicos c Frequência cardíaca c Pressão sanguínea c Dilatação das vias aéreas Aumento da liberação de O2 para os tecidos músculo Metabólicos c Degradação de glicogênio fígado músculo T Síntese de glicogênio fígado músculo c Gliconeogênese fígado Aumento da produção de glicose para combustível c Glicólise músculo Aumento da produção de ATP no músculo c Mobilização de ácidos graxos tecido adiposo Aumento da disponibilidade de ácidos graxos como combustível c Secreção de glucagon T Secreção de insulina Reforço dos efeitos metabólicos da adrenalina Nelson6ed23indd 959 Nelson6ed23indd 959 030414 1131 030414 1131 960 DAVID L NELSON MICHAEL M COX As medidas bioquímicas de amostras de sangue ou de urina são essenciais no diagnóstico e no tratamento do dia betes O teste de tolerância à glicose constitui um cri tério diagnóstico sensível A pessoa faz jejum de 12 horas depois bebe uma doseteste de 100 g de glicose dissolvida em um copo de água A concentração sanguínea da glicose é medida antes do teste e por várias horas em intervalos de 30 minutos Uma pessoa saudável assimila a glicose rapida mente e o aumento no sangue não é maior do que 9 a 10 mM muito pouca ou nenhuma glicose aparece na urina No diabetes a pessoa assimila muito pouco da doseteste de glicose o nível do açúcar no sangue aumenta drasticamen te e retorna muito lentamente ao nível do jejum Uma vez que os níveis sanguíneos de glicose excedem o limiar do rim cerca de 10 mM ela aparece também na urina RESUMO 233 Regulação hormonal do metabolismo energético c A concentração da glicose no sangue é regulada hor monalmente As flutuações na glicose sanguínea nor malmente de 60 a 90 mg100 mL ou quase 45 mM devidas à ingestão dietética ou ao exercício extenuante são contrabalançadas por uma grande variedade de al terações no metabolismo de vários órgãos provocadas hormonalmente c Alta glicose sanguínea provoca a liberação de insulina que aumenta a captação de glicose pelos tecidos e favo rece o armazenamento de combustíveis sob a forma de glicogênio e triacilgliceróis enquanto inibe a mobiliza ção dos ácidos graxos no tecido adiposo c Baixa glicose sanguínea provoca a liberação do gluca gon que estimula a liberação da glicose a partir do glico gênio hepático e modifica o metabolismo energético no fígado e no músculo no sentido de oxidar ácidos graxos poupando glicose para ser usada pelo cérebro No jejum prolongado os triacilgliceróis tornamse o combustível principal o fígado converte ácidos graxos em corpos ce tônicos para exportar para outros tecidos incluindo o cérebro c A adrenalina prepara o corpo para um aumento de ati vidade mobilizando glicose a partir do glicogênio e de outros precursores e liberandoa no sangue c O cortisol liberado em resposta a uma grande variedade de estressores incluindo baixa glicose sanguínea esti mula a gliconeogênese a partir de aminoácidos e glicerol no fígado aumentando a glicose sanguínea e contraba lançando os efeitos da insulina c No diabetes a insulina não é produzida ou não é reco nhecida pelos tecidos e a captação da glicose a partir do sangue é comprometida Quando os níveis de glicose sanguínea são altos ela é excretada Os tecidos depen dem então de ácidos graxos como combustível com produção de corpos cetônicos e degradam proteínas celulares para fornecer aminoácidos glicogênicos para a síntese de glicose O diabetes não controlado se carac teriza por altos níveis de glicose no sangue e na urina e produção e excreção de corpos cetônicos 234 Obesidade e regulação da massa corporal Na população dos Estados Unidos 30 dos adultos são obesos e outros 35 têm sobrepeso conforme definido em termos de índice de massa corporal IMC cal culado como massa em kgaltura em m 2 Um IMC abai xo de 25 é considerado normal uma pessoa com IMC de 25 a 30 tem sobrepeso IMC maior que 30 indica obesidade A obesidade é uma ameaça à vida Aumenta significativa mente a chance do desenvolvimento de diabetes tipo 2 as sim como ataque cardíaco acidente vascular cerebral e câncer de colo mama próstata e endométrio Em conse quência existe grande interesse em entender como a mas sa corporal e o armazenamento de gordura no tecido adi poso são regulados Em uma primeira abordagem a obesidade é o resulta do da ingestão de mais calorias na dieta do que as gastas pelas atividades corporais que consomem combustível O corpo lida de três formas com o excesso de calorias dietéti cas 1 converte o excesso de combustível em gordura e a armazena no tecido adiposo 2 queima o excesso de com bustível em exercício extra e 3 desperdiça combustível desviandoo para a produção de calor termogênese pelas mitocôndrias desacopladas Nos mamíferos um conjunto complexo de sinais hormonais e neuronais age para manter o equilíbrio entre a captação do combustível e o gasto de energia de modo a manter a quantidade de tecido adiposo em nível adequado Para se lidar efetivamente com a obesi dade é necessário o conhecimento desses diferentes con troles e equilíbrios sob condições normais e de como esses mecanismos homeostáticos podem falhar O tecido adiposo tem funções endócrinas importantes Uma hipótese inicial para explicar a homeostasia da massa corporal o modelo da retroalimentação negativa da adipo sidade postulava um mecanismo que inibe o comportamen to alimentar e aumenta o gasto de energia quando o peso corporal excede um determinado valor o ponto de ajuste a inibição é liberada quando o peso corporal cai abaixo do ponto de ajuste Figura 2332 Esse modelo prevê que um sinal de retroalimentação que se origina no tecido adiposo influencia os centros encefálicos que controlam o compor tamento alimentar e a atividade metabólica e motora O primeiro desses fatores a leptina foi descoberto em 1994 e pesquisas subsequentes revelaram que o tecido adiposo é um órgão endócrino importante que produz hormônios peptídicos conhecidos como adipocinas Podem agir lo calmente ação autócrina e parácrina ou sistemicamente ação endócrina levando informações para outros tecidos e para o cérebro sobre a adequação das reservas de energia TAG armazenadas no tecido adiposo As adipocinas nor malmente produzem mudanças no metabolismo energético e no comportamento alimentar as quais restauram as reser vas adequadas de combustível e mantêm a massa corporal Quando as adipocinas são sub ou superproduzidas o des controle resultante pode levar a uma doença muito grave A leptina do grego leptos magro é uma adipocina 167 aminoácidos que ao alcançar o cérebro age nos re ceptores hipotalâmicos e reduz o apetite A leptina foi iden Nelson6ed23indd 960 Nelson6ed23indd 960 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 961 tificada pela primeira vez em camundongos de laboratório como o produto de um gene designado OB obeso Os ca mundongos com duas cópias defeituosas do gene genótipo obob as letras minúsculas significam a forma mutante do gene apresentam comportamento e fisiologia de animais em estado de fome constante com elevados níveis plasmá ticos de cortisol eles não conseguem se manter aquecidos exibem apetite incontido têm crescimento anormal e não se reproduzem Em consequência do apetite incontido eles se tornam muito obesos pesando até três vezes mais do que os camundongos normais Figura 2333 Também apresentam distúrbios metabólicos muito semelhantes aos vistos no diabetes e são resistentes à insulina Quando se injeta leptina nestes camundongos obob eles comem me nos perdem peso e aumentam sua atividade locomotora e a termogênese Um segundo gene de camundongos designado DB dia bético também tem um papel na regulação do apetite Camundongos com duas cópias defeituosas dbdb são obesos e diabéticos O gene DB codifica o receptor de lep tina A função sinalizadora da leptina é perdida quando o receptor é defeituoso O receptor de leptina é expresso principalmente em regiões do cérebro que regulam o comportamento alimen tar neurônios do núcleo arqueado do hipotálamo Figura 2334a A leptina leva a mensagem de que as reservas de Alimento síntese de gordura boxidação da gordura Energia calor Tecido adiposo Leptina FIGURA 2332 Modelo do ponto de ajuste para a manutenção da mas sa constante Quando a massa do tecido adiposo aumenta linha tracejada a leptina liberada inibe o consumo de alimentos e a síntese de gordura esti mulando a oxidação dos ácidos graxos Quando a massa do tecido adiposo diminui linha contínua a produção reduzida da leptina favorece uma maior ingestão de alimento e uma redução na oxidação dos ácidos graxos lipase sensível a hormônio MAG Glicerol DAG cAMP ATP Adenilatociclase Núcleo Expressão aumentada do gene da UCP1 Adipócito H Proteína G Proteínacinase A Proteína desacopladora UCP1 Ácidos graxos boxidação TAG Gota de gordura Perilipina Noradrenalina Receptor b3 adrenérgico Hipotálamo Núcleo ventromedial Núcleo paraventricular Núcleo arqueado Neuro hipófise Adeno hipófise Leptina via sangue Sinal neuronal via neurônio simpático a b Tecido adiposo Calor FIGURA 2334 Regulação hipotalâmica da ingestão de alimento e do gasto de energia a Papel do hipotálamo na sua interação com o tecido adiposo O hipotálamo recebe informação leptina do tecido adiposo e res ponde com sinais neuronais para os adipócitos b O efeito da estimulação neuronal inclui a ativação da proteínacinase A que desencadeia a mobiliza ção dos ácidos graxos dos TAG e sua oxidação desacoplada na mitocôndria gerando calor mas não ATP FIGURA 2333 Obesidade causada pela produção deficiente de lep tina Ambos os camundongos que têm a mesma idade têm defeitos no gene OB O camundongo da direita foi injetado diariamente com leptina purificada e pesa 35 g O camundongo da esquerda não recebeu leptina e consequentemente come mais e é menos ativo ele pesa 67 g Nelson6ed23indd 961 Nelson6ed23indd 961 030414 1131 030414 1131 962 DAVID L NELSON MICHAEL M COX gordura são suficientes e promove uma redução na capta ção de combustível e um aumento no gasto de energia A interação leptinareceptor no hipotálamo altera a liberação de sinais neuronais para a região do cérebro que contro la o apetite A leptina também estimula o sistema nervoso simpático aumentando a pressão sanguínea a frequência cardíaca e a termogênese pelo desacoplamento das mito côndrias dos adipócitos marrons Figura 2334b Lembre que a termogenina ou UCP forma um canal na membrana mitocondrial interna que permite a reentrada de prótons para a matriz mitocondrial sem passar pelo complexo da ATPsintase Isso permite a oxidação contínua de combus tível ácidos graxos nos adipócitos marrons sem síntese de ATP dissipando a energia na forma de calor e consumindo as calorias da dieta ou as gorduras armazenadas em grandes quantidades A leptina estimula a produção de hormônios peptídicos anorexigênicos Dois tipos de neurônios do núcleo arqueado controlam o influxo de combustível e seu metabolismo Figura 2335 Os neurônios orexigênicos estimuladores de apetite es timulam a ingestão de alimento pela produção e liberação do neuropeptídeo Y NPY que faz o próximo neurônio do circuito enviar o sinal para o cérebro coma O nível san guíneo do NPY aumenta durante o jejum estando elevado em ambos os camundongos obob e dbdb É provável que a alta concentração de NPY contribua para a obesidade nes ses animais que comem vorazmente Os neurônios anorexigênicos inibidores de apetite no núcleo arqueado produzem o hormônio estimulante de melanócito a aMSH de amelanocytestimulating hormone também conhecido como melanocortina forma do a partir de seu precursor polipeptídico a próopiomela nocortina POMC Figura 235 A liberação do aMSH faz o neurônio seguinte no circuito enviar o sinal para o cérebro pare de comer A quantidade de leptina liberada pelo tecido adiposo de pende do número e do tamanho dos adipócitos Quando a perda de peso reduz a massa de tecido lipídico os níveis de leptina no sangue diminuem a produção de NPY aumenta e o processo no tecido adiposo mostrado na Figura 2334 é revertido O desacoplamento diminui reduzindo a termogê nese e poupando combustível e a mobilização de gordura é reduzida em resposta à redução da sinalização pelo cAMP O consumo de maior quantidade de alimento combinado com a utilização mais eficiente do combustível resulta na recuperação das reservas no tecido adiposo levando o sis tema de volta ao equilíbrio A leptina também pode ser essencial ao desenvolvimen to normal dos circuitos neuronais hipotalâmicos Em ca mundongos o crescimento das fibras nervosas a partir do núcleo arqueado durante o desenvolvimento cerebral inicial é diminuído na ausência de leptina afetando os sinais ore xigênicos e em menor grau os sinais anorexigênicos do hipotálamo É possível que os níveis de leptina durante o desenvolvimento desses circuitos determinem os detalhes das conexões deste sistema de regulação A leptina dispara uma cascata de sinalização que regula a expressão gênica O sinal da leptina é transduzido por um mecanismo usado também pelos receptores de interferon e fatores de cres cimento o sistema JAKSTAT Figura 2336 ver Figu ra 1218 O receptor de leptina que tem um único seg mento transmembrana dimeriza quando a leptina se liga ao domínio extracelular de dois monômeros Ambos os monômeros são fosforilados pela Januscinase JAK FIGURA 2335 Hormônios que controlam a ingestão de alimento No núcleo arqueado dois grupos de células neurossecretoras recebem um sinal hormonal e liberam sinais neuronais para as células do músculo do tecido adiposo e do fígado A leptina e a insulina são liberadas do tecido adipo so e do pâncreas respectivamente em proporção com a massa da gordura corporal Os dois hormônios agem sobre as células neurossecretoras ano rexigênicas e provocam a liberação de aMSH hormônio estimulador de melanócitos este hormônio envia o sinal a neurônios de segunda ordem no hipotálamo os quais produzem sinais neuronais para comer menos e metabolizar mais combustível A leptina e a insulina também agem sobre as células neurossecretoras orexigênicas e inibem a liberação de NPY reduzin do o sinal de comer mais enviado para os tecidos Conforme descrito mais adiante no texto o hormônio gástrico grelina estimula o apetite por ativar as células que expressam NPY o PYY336 liberado pelo colo inibe estes neurô nios reduzindo assim o apetite Cada um dos tipos de células neurossecreto ras inibe a produção de hormônios pelo outro tipo de forma que qualquer estímulo que ative as células orexigênicas inativa as células anorexigênicas e viceversa Isto fortalece o efeito dos sinais de estimulação Insulina pâncreas PYY336 GLP1 intestino Sinal de saciedade Grelina estômago Sinal de fome Efetores Músculo Tecido adiposo Fígado Hipotálamo Neurônios de segunda ordem Neurônios do núcleo arqueado Órgãos Coma menos metabolize mais Coma mais metabolize menos aMSH NPY Leptina tecido adiposo Sinais de adiposidade Nelson6ed23indd 962 Nelson6ed23indd 962 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 963 em um resíduo de Tyr de seu domínio intracelular Os resíduos de Tyr tornamse locais de ancoragem para três proteínas que são transdutores de sinal e ativado res de transcrição STAT 3 5 e 6 às vezes chamadas de fatSTAT As STAT ancoradas são então fosforiladas em resíduos de Tyr pela mesma JAK Após a fosforilação as STAT dimerizam e são translocadas para o núcleo onde se ligam a sequências específicas no DNA e estimulam a transcrição de genesalvo incluindo o gene da POMC a partir do qual é produzido o aMSH O aumento do catabolismo e da termogênese provocado pela leptina é devido em parte ao aumento da síntese da proteína desacopladora mitocondrial termogenina produto do gene UCP1 nos adipócitos marrons A leptina altera as transmissões sinápticas dos neurônios no núcleo arqueado para o tecido adiposo e outros tecidos estimulando a sínte se de termogenina pelo sistema nervoso simpático A libera ção aumentada de noradrenalina resultante nesses tecidos age por meio dos receptores b3adrenérgicos estimulando a transcrição do gene UCP1 O resultante desacoplamento da transferência de elétrons da fosforilação oxidativa con some gordura e é termogênico Figura 2334 A obesidade humana seria o resultado de produção insuficiente de leptina sendo assim tratável por injeções desse hormônio Os níveis sanguíneos de leptina estão na verdade muito mais altos em animais obesos incluindo os humanos do que em animais com massa corporal normal exceto é claro nos mutantes obob que não produzem leptina Alguns elementos a jusante no sistema de res posta à leptina devem estar defeituosos nas pessoas obe sas e a elevação de leptina é o resultado de uma tentativa malsucedida de superar a resistência à leptina Nos casos muito raros de humanos com obesidade extrema que têm um gene de leptina defeituoso OB as injeções de leptina resultam de fato em enorme perda de peso Contudo na imensa maioria das pessoas obesas o gene OB está intacto Em testes clínicos a injeção de leptina não tem o efeito de redução de peso observado nos camundongos obesos ob ob A maioria dos casos de obesidade humana envolve cla ramente um ou mais fatores além da leptina O sistema da leptina pode ter evoluído para regular a resposta à fome O sistema da leptina provavelmente evoluiu para ajustar a atividade e o metabolismo animal durante períodos de je jum e inanição e não como um meio de restringir o ganho de peso A redução no nível de leptina provocada pela de ficiência nutricional reverte os processos de termogênese ilustrados na Figura 2334 permitindo a conservação de combustível No hipotálamo a redução do sinal da lepti na também provoca redução na produção do hormônio da tireoide reduzindo o metabolismo basal redução na pro dução de hormônios sexuais prevenindo a reprodução e aumento na produção de glicocorticoides mobilizando os recursos corporais geradores de combustível Por mi nimização do gasto de energia e maximização do uso das reservas endógenas de energia essas respostas mediadas pela leptina podem permitir a um animal sobreviver em períodos de grave privação nutricional No fígado e no músculo a leptina estimula a proteínacinase ativada por AMP AMPK a qual inibe a síntese de ácidos graxos e ativa sua oxidação favorecendo os processos geradores de energia A insulina age no núcleo arqueado regulando a ingestão de alimento e a conservação de energia A secreção de insulina pode refletir o tamanho das reservas de gordura adiposidade e o equilíbrio do fluxo de energia nível de glicose no sangue Além de sua função endócrina em vários tecidos a insulina age no sistema nervoso central no hipotálamo para inibir a ingestão de alimento Figura 2335 Os receptores de insulina dos neurônios orexigê nicos do núcleo arqueado inibem a liberação de NPY e os receptores de insulina dos neurônios anorexigênicos esti mulam a produção de aMSH reduzindo dessa forma o influxo de combustível e aumentando a termogênese A in sulina também envia sinais ao músculo ao fígado e ao teci do adiposo pelos mecanismos descritos na Seção 233 para aumentarem a conversão de glicose em acetilCoA forne cendo o material de partida para a síntese de gordura As ações da leptina e da insulina não são totalmente independentes A leptina torna as células do fígado e do músculo mais sensíveis à insulina Uma hipótese para ex plicar esse efeito sugere interação entre as tirosinacinases Citosol Membrana plasmática Monômero do receptor de leptina Núcleo Leptina Leptina P JAK STAT P STAT P STAT P STAT DNA Neuropeptídeo POMC etc mRNA P STAT STAT JAK JAK JAK P FIGURA 2336 O mecanismo JAKSTAT da transdução de sinal da leptina no hipotálamo A ligação da leptina induz a dimerização do seu receptor seguida pela fosforilação de resíduos específicos de Tyr no domínio citosólico do receptor catalisada pela Januscinase JAK As STAT ligadas ao receptor de leptina fosforilado são agora fosforiladas em resíduos de Tyr por uma atividade distinta da JAK As STAT dimerizam ligando seus resíduos de Tyr fosforilados e entram no núcleo Lá se ligam a regiões reguladoras es pecíficas no DNA e alteram a expressão de determinados genes Os produtos destes genes influenciam o comportamento alimentar e o gasto de energia do organismo Nelson6ed23indd 963 Nelson6ed23indd 963 030414 1131 030414 1131 964 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ativadas pela leptina e aquelas ativadas pela insulina Figu ra 2337 segundos mensageiros comuns às duas vias de sinalização permitem que a leptina desencadeie alguns dos mesmos eventos a jusante desencadeados pela insulina por meio do substrato 2 do receptor de insulina IRS2 de in sulin receptor substrate2 e da fosfatidilinositol3cinase PI3K ver Figura 1216 A adiponectina age por meio da AMPK aumentando a sensibilidade à insulina A adiponectina hormônio peptídico 224 aminoácidos produzido quase exclusivamente no tecido adiposo é uma adipocina que sensibiliza outros órgãos para os efeitos da insulina protege contra a aterosclerose e inibe respostas inflamatórias adesão de monócitos transformação de ma crófagos e proliferação e migração das células da muscula tura lisa vascular A adiponectina circula no sangue e tem efeito potente sobre o metabolismo dos ácidos graxos e dos carboidratos no fígado e no músculo Ela aumenta a capta ção de ácidos graxos pelos miócitos a partir do sangue e a taxa da boxidação no músculo Também bloqueia a síntese de ácidos graxos e a gliconeogênese nos hepatócitos e es timula a captação de glicose e seu catabolismo no fígado e no músculo Esses efeitos da adiponectina são indiretos e não total mente compreendidos mas a AMPK claramente controla muitos deles A adiponectina por meio de seu receptor na membrana plasmática causa a fosforilação e a ativação da AMPK Lembrese de que a AMPK é ativada por fato res que sinalizam a necessidade de substituir o metabo lismo de biossíntese pelo de geração de energia Figura 2338 Quando ativada a AMPK fosforila proteínasalvo críticas para o metabolismo de lipídeos e carboidratos com profundos efeitos no metabolismo de todo o animal Figu ra 2339 Os receptores de adiponectina estão presentes também no cérebro o hormônio ativa a AMPK no hipotála mo estimulando a captação de alimento e reduzindo o gas to de energia A acetilCoAcarboxilase é uma enzima ativada pela AMPK no fígado e no tecido adiposo branco Essa enzima produz malonilCoA o primeiro intermediário comprome tido com a síntese de ácidos graxos A malonilCoA é um potente inibidor da enzima carnitinaaciltransferase I que inicia o processo de boxidação pelo transporte dos ácidos graxos para a mitocôndria ver Figura 176 A AMPK inibe a síntese de ácidos graxos pela fosforilação e inativação da acetilCoAcarboxilase ao mesmo tempo em que alivia a ini bição pela malonilCoA da boxidação ver Figura 1713 A síntese de colesterol também é inibida pela AMPK que fosforila e inativa a HMGCoAredutase enzima da via do co lesterol ver Figura 2134 Da mesma forma AMPK inibe a ácido graxosintase e a aciltransferase bloqueando efetiva mente a síntese de triacilgliceróis Em resumo a síntese dos lipídeos é inibida e seu uso como combustível é estimulado Camundongos com o gene da adiponectina defeituoso são menos sensíveis à insulina do que aqueles com adi ponectina normal e mostram baixa tolerância à glicose a ingestão de carboidratos causa um aumento duradouro na glicose sanguínea Esses defeitos metabólicos são semelhan tes aos dos humanos com diabetes tipo 2 os quais também são insensíveis à insulina e removem muito lentamente a glicose do sangue De fato pessoas com obesidade ou diabe tes tipo 2 têm níveis sanguíneos de adiponectina mais baixos do que os controles não diabéticos Além disso os fármacos usados no tratamento do diabetes tipo 2 as tiazolidinedio nas como a rosiglitazona Avandia e a pioglitazona Actos p 852 aumentam a expressão do mRNA da adiponectina no tecido adiposo e aumentam os níveis sanguíneos desse Receptor de insulina Membrana plasmática Citosol P P P P Inibição da ingestão de alimento PI3K IRS2 Insulina Leptina JAK JAK Receptor de leptina FIGURA 2337 Provável mecanismo para a intercomunicação entre os receptores de insulina e de leptina O receptor de insulina tem ati vidade intrínseca de tirosinacinase ver Figura 1215 e o receptor de lepti na quando ocupado pelo seu ligante é fosforilado por uma tirosinacinase solúvel JAK Uma possível explicação para a interação observada entre a insulina e a leptina é que ambas podem fosforilar o mesmo substrato no caso mostrado aqui o substrato2 do receptor de insulina IRS2 Quando fosforilado o IRS2 ativa a PI3K o que tem consequências a jusante incluindo a inibição da ingestão de alimento O IRS2 serve aqui como integrador do sinal dos dois receptores Processos que consomem ATP biossíntese transporte etc Processos que produzem ATP oxidação da glicose dos ácidos graxos etc AMPK ATP ADP AMP FIGURA 2338 O papel da proteínacinase ativada por AMP AMPK na regulação do metabolismo do ATP O ADP produzido em reações biossintéticas é convertido em AMP pela adenilatocinase O AMP ativa a AMPK que regula vias de geração e de consumo de ATP pela fosforilação de enzimaschave ver Figura 2339 Nelson6ed23indd 964 Nelson6ed23indd 964 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 965 hormônio em animais de experimentação eles também ati vam a AMPK Figura 2339 Em 2011 a FDA concluiu que o uso da Avandia foi associado com um aumento do risco de ataque cardíaco e por isso limitou o uso do fármaco àqueles pacientes diabéticos para os quais outros tratamentos dispo níveis não eram efetivos A adiponectina parece ser uma li gação importante entre o diabetes tipo 2 e seu mais impor tante fator de predisposição a obesidade A atividade de mTORC1 coordena o crescimento celular com o fornecimento de nutrientes e energia A atividade de uma segunda proteínacinase nova auxilia na mediação da proliferação celular e no aumento do tama nho da célula em resposta aos fatores de crescimento e à disponibilidade de nutrientes e energia A SerThr cinase mTORC1 altamente conservada é ativada por forneci mento abundante de nutrientes e energia tal como altas concentrações de aminoácidos de cadeia ramificada Essa proteína quando ativada fosforila vários fatores de trans crição levando ao aumento na expressão de genes que co dificam enzimas da síntese de lipídeos e proliferação mito condrial e aumento da biogênese de ribossomos Figura 2340 O jejum resulta na inativação de mTORC1 levando ao aumento da degradação de proteínas e glicogênio no fí gado e no músculo e mobilização de triglicerídeos do tecido adiposo A ativação crônica de mTORC1 por excesso de ali mento resulta em deposição excessiva de triglicerídeos no tecido adiposo e também no fígado e músculo Esse acúmu lo anormal de lipídeos no fígado e no músculo pode contri buir para a insensibilidade à insulina e para o diabetes tipo 2 conforme descrito na Seção 235 Mutações que levam à produção de mTORC1 constantemente ativada são também comumente associadas com cânceres em humanos A dieta regula a expressão de genes essenciais para a manutenção da massa corporal As proteínas de uma família de fatores de transcrição ati vados por ligantes os receptores ativados por prolife radores de peroxissomos PPAR de peroxisome proli feratoractivated receptors respondem a mudanças nos lipídeos da dieta com a alteração da expressão de genes envolvidos no metabolismo de gorduras e de carboidra tos Esses fatores de transcrição foram reconhecidos ini cialmente por seu papel na síntese de peroxissomos daí Tecido adiposo se retrai AMPK Exercício Adiponectina Glicólise cardíaca PFK2 Efeito fisiológico Enzima alvo Tecido alvo Efeito fisiológico Transporte de glicose GLUT1 GLUT4 Oxidação de ácidos graxos FAS I ACC Síntese de ácidos graxos Lipólise HSL HMGR Síntese de triacilglicerol GPAT GS eEF2 mTORC1 Síntese de colesterol e isoprenoides Síntese de glicogênio Síntese proteica Células b pancreáticas Fígado Tecido adiposo Coração Músculo esquelético Cérebro secreção de insulina síntese de ácidos graxos síntese de colesterol síntese de ácidos graxos lipólise oxidação de ácidos graxos captação de glicose glicólise oxidação de ácidos graxos captação de glicose Compor tamento alimentar Gasto de energia Jejum prolongado inanição FIGURA 2339 Formação de adiponectina e suas ações por meio da AMPK O jejum prolongado ou a inanição resultam na redução das reser vas de triacilgliceróis no tecido adiposo o que desencadeia a produção de adiponectina e sua liberação dos adipócitos A elevação da adiponectina plasmática age por meio de seus receptores de membrana plasmática em vários órgãos e tipos celulares inibindo processos que consomem energia e estimulando processos geradores de energia A adiponectina age no cé rebro por meio de seus receptores estimulando a ingestão de alimentos e inibindo a atividade física que consome energia e a termogênese na gordura marrom Este hormônio exerce seus efeitos metabólicos por ativar a AMPK que regula por fosforilação enzimas específicas em processos metabóli cos essenciais ver Figura 158 PFK2 fosfofrutocinase2 GLUT1 e GLUT4 transportadores de glicose FAS 1 ácido graxosintase 1 ACC acetilCoAcar boxilase HSL lipase sensível a hormônio HMGR HMGCoAredutase GPAT aciltransferase GS glicogêniosintase eEF2 fator 2 de alongamento de eu cariotos necessário para a síntese proteica ver Capítulo 27 mTOR1 alvo de rapamicina de mamíferos proteínacinase que regula a síntese proteica com base na disponibilidade de nutrientes ver Figura 2340 Fármacos como as tiazolidinedionas ativam o fator de transcrição PPARg ver Figuras 2341 e 2342 o qual promove a síntese da adiponectina ativando indiretamente a AMPK O exercício também estimula a AMPK por meio da conversão de ATP em ADP e AMP Nelson6ed23indd 965 Nelson6ed23indd 965 030414 1131 030414 1131 966 DAVID L NELSON MICHAEL M COX seu nome Seus ligantes normais são ácidos graxos ou seus derivados mas também se ligam a agonistas sintéticos e podem ser ativados experimentalmente por manipulação genética PPARa PPARd e PPARg são membros dessa su perfamília de receptores nucleares Eles agem no núcleo formando heterodímeros com outro receptor nuclear o RXR receptor retinoide X de retinoid X receptor ligan dose a regiões reguladoras no DNA próximas aos genes sob seu controle e alterando a taxa de transcrição desses genes Figura 2341 O PPARg expresso principalmente no fígado e no tecido adiposo marrom e bran co está envolvido na ativação de genes necessários para a diferenciação de fibro blastos em adipócitos e de genes que codificam proteínas necessárias para a síntese e o armazenamento de lipídeos nos adipócitos Figura 2342 O PPARg é ativado pelos fármacos do tipo tiazolidinedionas que são usados no trata mento do diabetes tipo 2 discutido adiante O PPARa é expresso no fígado no rim no coração no músculo esquelético e no tecido adiposo marrom Os ligan tes que ativam esse fator de transcrição incluem os eico sanoides os ácidos graxos livres e uma classe de fármacos chamados de fibratos como o fenofibrato TriCor e o ci profibrato Modalim usados no tratamento de doenças coronarianas por aumentarem a HDL e reduzirem os triacil gliceróis do sangue Nos hepatócitos o PPARa ativa os ge nes necessários para a captação e a boxidação dos ácidos graxos e a formação dos corpos cetônicos durante o jejum O PPARd e o PPARb são reguladoreschave da oxi dação das gorduras que agem detectando alterações na dieta lipídica O PPARd age no fígado e no músculo es timulando a transcrição de pelo menos nove genes que codificam proteínas envolvidas na boxidação e na dissi pação da energia por meio do desacoplamento das mito côndrias Camundongos normais superalimentados com dieta altamente lipídica acumulam quantidades massivas de gordura branca e gotículas de gordura se acumulam no fígado No entanto quando o mesmo experimento de su peralimentação é realizado com camundongos com PPARd geneticamente alterado para estar sempre ativo o acúmu lo de gordura não acontece Em camundongos com recep tor de leptina não funcional dbdb o PPARd ativado im pede o desenvolvimento da obesidade que caso contrário ocorreria O estímulo pelo PPARd da degradação dos áci dos graxos em mitocôndrias desacopladas causa depleção das gorduras perda de peso e termogênese Visto dessa forma a termogênese é tanto um meio do organismo se manter aquecido quanto uma defesa contra a obesidade PPARd é claramente um alvo potencial para fármacos no tratamento da obesidade O comportamento alimentar é influenciado a curto prazo por grelina e PYY336 A grelina é um hormônio peptídico 28 aminoácidos produzido pelas células que revestem o estômago Origi nalmente foi reconhecido como o estímulo para a libera ção do hormônio do crescimento ghre é a raiz protoindo europeia de crescer posteriormente se mostrou um potente estimulante do apetite que funciona em escala FIGURA 2340 mTORC1 estimula o crescimento e a proliferação celular quando a nutrição adequada está disponível mTORC1 é uma proteínacinase Ser Thr ativada por fatores de crescimento e metabólitos que sinalizam uma nutrição adequada Pela fosforilação de proteínasalvo essenciais mTORC1 ativa a produção de energia ATP e NADPH para a biossíntese e estimula a síntese de proteínas e lipídeos permitindo o crescimen to e a proliferação celular ATP NADPH Glicólise Captação de glicose Produção de energia Via das pentosesfosfato Pentoses mTORC1 Nutrientes Biogênese de ribossomos Fatores de crescimento Síntese de membranas Crescimento e proliferação celular Síntese de nucleotídeos Síntese proteica HIF1 Angiogênesse PGC1a Metabolismo mitocondrial acetilCoA PPAR Adipogênese esteróis ácidos graxos Ligante Ligante PPAR Citosol DNA Gene regulado Elemento de resposta sequência de DNA que regula a transcrição em resposta ao ligante L de PPAR RXR Membrana plasmática Envelope nuclear FIGURA 2341 Modo de ação dos PPAR Os PPAR são fatores de transcri ção que ao interagirem com seu ligante cognato L formam heterodímeros com o receptor nuclear RXR O dímero se liga a regiões específicas do DNA conhecidas como elementos de resposta estimulando a transcrição dos ge nes destas regiões Nelson6ed23indd 966 Nelson6ed23indd 966 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 967 de tempo mais curta entre as refeições do que a lep tina e a insulina Os receptores de grelina estão localiza dos na hipófise provavelmente mediando a liberação do hormônio do crescimento e no hipotálamo afetando o apetite bem como no músculo cardíaco e no tecido adi poso A grelina atua por meio de um receptor acoplado à proteína G para gerar o segundo mensageiro IP3 que controla sua ação A concentração de grelina no sangue varia entre as refeições atingindo um pico imediatamen te antes da refeição e diminuindo rapidamente logo após Figura 2343 A injeção de grelina em humanos produz sensação imediata de intensa fome Pessoas com a síndro me de PraderWilli cujos níveis de grelina no sangue são extremamente altos têm apetite incontrolável levando à extrema obesidade que com frequência resulta em mor te antes dos 30 anos O PYY336 é um hormônio peptídico 2 resíduos Y ami noterminais mais 34 aminoácidos secretado pelas células endócrinas que revestem o intestino delgado e o colo em resposta à chegada do alimento vindo do estômago O nível de PYY336 no sangue aumenta após uma refeição e se man tém alto por algumas horas Ele é levado pelo sangue para o núcleo arqueado onde age nos neurônios orexigênicos inibindo a liberação de NPY e reduzindo a fome Figura 23 35 Humanos injetados com PYY336 sentem pouca fome e se alimentam menos que o normal por cerca de 12 horas FIGURA 2342 Integração metabólica pelos PPAR As três isoformas do PPAR regulam a ho meostasia da glicose e dos lipídeos por meio de seus efeitos coordenados sobre a expressão gê nica no fígado no músculo e no tecido adiposo PPARa e PPARd e sua isoforma mais intimamente relacionada PPARb regulam a utilização dos lipí deos PPARg regula o armazenamento dos lipí deos e a sensibilidade de vários tecidos à insulina PPARa PPARg PPARd Tecido adiposo Músculo Fígado Sensibilidade à insulina Oxidação de ácidos graxos Termogênese Oxidação de ácidos graxos Síntese e armazenamento de gordura Produção de adipocinas Oxidação de ácidos graxos Resposta ao jejum Oxidação de ácidos graxos Termogênese Síntese e armazenamento de gordura FIGURA 2343 Variação das concentrações sanguíneas de glicose grelina e insulina com relação aos horários das refeições a Os ní veis plasmáticos de grelina aumentam bruscamente imediatamente antes da hora normal das refeições 7 h desjejum 12 h almoço 1730 h jantar e diminuem rapidamente logo após as refeições acompanhando a sensação subjetiva de fome b Os níveis de glicose aumentam bruscamente após uma refeição c seguidos imediatamente por um aumento dos níveis de insulina em resposta ao aumento da concentração sanguínea da glicose Glicose plasmática pmolL Grelina pgmL Desjejum 800 700 600 500 400 300 200 800 700 600 500 400 Jantar Lanche Almoço a b Insulina pmolL 600 700 500 400 300 200 100 0 c 830 Insulina Glicose plasmática Grelina 1200 1700 Hora do dia 0000 2030 Nelson6ed23indd 967 Nelson6ed23indd 967 030414 1131 030414 1131 968 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os simbiontes microbianos do intestino influenciam no metabolismo energético e na adipogênese Os indivíduos magros e os obesos têm diferentes combina ções de simbiontes microbianos no intestino A investiga ção dessa observação levou à descoberta que determinados microrganismos do intestino liberam produtos de fermen tação a saber ácidos graxos de cadeia curta na forma de acetato propionato butirato e lactato que entram na cor rente sanguínea e desencadeiam mudanças metabólicas no tecido adiposo O propionato por exemplo conduz a ex pansão da TAB por sua ação sobre os receptores acoplados à proteína G GPR43 e GPR41 na membrana plasmática de vários tipos celulares incluindo adipócitos Esses recep tores desencadeiam a diferenciação de células precursoras em adipócitos e inibem a lipólise em adipócitos já existen tes levando a um aumento na massa TABobesidade Esses achados sugerem abordagens possíveis para a prevenção da obesidade envolvendo a alteração na com posição da comunidade microbiana no intestino tanto pela adição direta de espécies microbianas probióticos que não favorecem a adipogênese como pela adição de nutrien tes dietéticos prebióticos que favorecem a dominância dos micróbios probióticos Por exemplo determinados po límeros de frutose frutanos não digeridos pelos animais favorecem essa comunidade microbiana em camundongos e levam a uma redução do armazenamento de gordura na TAB e no fígado e a uma redução na sensibilidade à in sulina associada com obesidade e deposição de lipídeos no fígado ver adiante As células endócrinas presentes no revestimento do trato gastrintestinal secretam produtos os peptídeos ano rexigênicos PYY336 e o peptídeo1 semelhante ao glucagon GLP1 e o peptídeo orexigênico grelina que modula a ingestão de alimento e o gasto de energia no animal A in teração com micróbios específicos ou com seus produtos de fermentação no intestino pode ser o gatilho para a libe ração desses peptídeos A investigação dos efeitos da dieta sobre os simbiontes microbianos do intestino e dos efeitos dos produtos microbianos sobre o metabolismo e a adipo gênese pode levar a uma compreensão mais aprofundada dos efeitos da dieta e dos simbiontes microbianos sobre o desenvolvimento da obesidade e de suas sequelas patológi cas a síndrome metabólica e o diabetes tipo 2 Provavelmente esse sistema interligado de controles neuroendócrinos da ingestão de alimento e do metabolismo evoluiu como proteção contra a fome e para eliminar o acú mulo contraproducente de gordura obesidade extrema A dificuldade que a maioria das pessoas encontra na tentati va de perder peso é prova da admirável efetividade desses controles RESUMO 234 Obesidade e regulação da massa corporal c A obesidade está se tornando comum nos Estados Uni dos e em outros países desenvolvidos e predispõe a po pulação a várias condições que ameaçam a vida incluin do doença cardiovascular e diabetes tipo 2 c O tecido adiposo produz leptina hormônio que regula o comportamento alimentar e o gasto de energia de forma a manter as reservas adequadas de gordura A produção e a liberação de leptina aumentam com o número e o tamanho dos adipócitos c A leptina age em receptores no núcleo arqueado do hi potálamo causando a liberação dos peptídeos anorexi gênicos supressores de apetite incluindo o aMSH que age no cérebro de modo a inibir o comportamento alimentar A leptina também estimula a ação do sistema nervoso simpático sobre os adipócitos levando ao desa coplamento da fosforilação oxidativa mitocondrial com consequente termogênese c O mecanismo de transdução de sinal da leptina envolve a fosforilação do sistema JAKSTAT Fosforiladas pela JAK as STAT se ligam a regiões reguladoras no DNA nuclear e alteram a expressão de genes que codificam proteínas que ajustam o nível da atividade metabólica e determinam o comportamento alimentar A insulina age em receptores no núcleo arqueado com resultados se melhantes aos causados pela leptina c O hormônio adiponectina estimula a captação e a oxi dação de ácidos graxos e inibe sua síntese Ele também sensibiliza o músculo e o fígado à insulina As ações da adiponectina são mediadas pela AMPK que também é ativada por baixa AMP e exercício c A grelina hormônio produzido no estômago age sobre neurônios orexigênicos estimulantes do apetite no nú cleo arqueado provocando fome antes de uma refeição O PYY336 um hormônio peptídico do intestino age no mesmo local para reduzir a fome após uma refeição c Os tipos específicos de simbiontes microbianos no in testino podem influenciar a adipogênese o aumento na massa da gordura corporal 235 Obesidade síndrome metabólica e diabetes tipo 2 No mundo industrializado onde a oferta de alimentos é mais do que suficiente existe uma crescente epide mia de obesidade e de diabetes tipo 2 associado a ela Em torno de 300 milhões de pessoas em todo o mundo têm dia betes atualmente e projeções razoáveis predizem um au mento drástico no número de casos na próxima década em consequência da epidemia mundial de obesidade A patolo gia do diabetes inclui doença cardiovascular insuficiência renal cegueira restabelecimento insatisfatório das extre midades que requerem amputações e neuropatia No ano 2011 a mortalidade global devido ao diabetes foi estimada em 4 milhões um número que com certeza aumentará nos próximos anos É essencial compreender o diabetes tipo 2 e sua relação com a obesidade e encontrar medidas defensi vas que previnam ou revertam os danos causados por essa doença No diabetes tipo 2 os tecidos se tornam insensíveis à insulina A característica do diabetes tipo 2 é o desenvolvimen to de resistência à insulina estado no qual é neces sário mais insulina para realizar os mesmos efeitos biológi cos produzidos no estado sadio normal por uma quantidade Nelson6ed23indd 968 Nelson6ed23indd 968 030414 1131 030414 1131 PRINCIPIOS DE BIOQUMICA DE LEHNINGER 969 mais baixa do horménio Nos estagios iniciais da doenga as tos sao sensiveis a insulina e produzem leptina 0 que leva a células B pancreaticas secretam insulina suficiente para su deposicao intracelular continua de TAG Contudo 0 exces perar a sensibilidade reduzida ao horménio apresentada so de ingestao cal6rica em pessoas obesas faz os adipdcitos pelo mtsculo e pelo figado As células B porém finalmente ficarem repletos de TAG tornando o tecido adiposo incapaz falham e a falta de insulina tornase aparente pela incapaci de receber uma demanda aumentada para estocar TAG O dade do corpo de regular a glicose sanguinea O estagio in tecido adiposo repleto de lipideos libera fatores proteicos termediario que precede o diabetes tipo 2 6 4s vezes deno que atraem macrofagos que se infiltram no tecido e podem minado sindrome metabolica ou sindrome X Essa chegar arepresentar em massa até 50 do tecido adiposo sindrome é caracterizada por obesidade especialmente no Os macréfagos desencadeiam a resposta inflamatoria que abdome hipertensao pressao sanguinea alta lipideos prejudica a deposigao dos acidos graxos nos adipécitos e sanguineos anormais altos TAG e LDL baixa HDL glicose favorece sua liberagao para o sangue Esse excesso de aci sanguinea levemente elevada e uma capacidade reduzida dos graxos entra nas células hepaticas e musculares onde é de remover a glicose sanguinea em um teste de toleranciaa convertido em TAG que se acumulam como goticulas lipidi glicose As pessoas com sindrome metabdélica apresentam cas Essa deposicao ectdépica do grego ektopos fora de lu com frequéncia alteragdes nas proteinas sanguineas asso gar de TAG leva a insensibilidade a insulina no figado e no ciadas com coagulagao anormal alta concentracao de fibri musculo a caracteristica do diabetes tipo 2 Além disso de nogénio ou inflamagao alta concentragao de peptideo C acordo com essa hipotese acidos graxos e TAG em excesso reativo a qual aumenta com a resposta inflamatoéria Cerca sao t6xicos para o figado e o mtsculo Algumas pessoas sao de 27 da populacgao adulta nos Estados Unidos apresen menos adaptadas geneticamente para lidar com essa carga tam esses sintomas da sindrome metabolica de lipideos ect6picos sendo mais suscetiveis ao dano celu O que predisp6e os individuos com sindrome metabolica lar que leva ao desenvolvimento do diabetes tipo 2 A resis a desenvolver diabetes tipo 2 De acordo coma hipétese da téncia a insulina provavelmente envolve prejuizo de varios toxicidade lipidica Figura 2344 a agao do PPARy so mecanismos pelos quais 0 horménio atua no metabolismo bre os adipécitos normalmente mantém as células prepara que incluem alteragdes nos niveis proteicos e alteracdes das para sintetizar e armazenar triacilglicerdis os adipéci nas atividades das enzimas de sinalizagao e dos fatores de Magro Gordo Estado proinflamatorio Inflamagao crénica Adipdcitos aumentados Os macrofagos se TAG tea TAC cots TAG te TAC cots produzem proteina de infiltram a quimiotaxia de adiposo em resposta macrofagos MPC1 a MPC1 Adipdcitos pequenos Adipdécitos maiores Os macréfagos no tecido its Cee oe adiposo produzem TNFa que cite s rT s tee 4 favorece a exportacao dos TAG eee ey Sete anos granos eee oe oe a FOE FOLD te Osadipdcitos exportam Acidos Acidos Acidos Acidos acidos graxos para o musculo graxos graxos graxos graxos onde se formam depositos iY ectdpicos de lipideos Eee a Os lipideos ectdpicos Glicose Glicose Glicose Glicose J interferem com o movimento C C 5 do GLUT4 paraa superficie do L midcito produzindo resisténcia a insulina Po Lo Musculo sensivel a Musculo resistente a insulina com transporte insulina com transporte normal de glicose reduzido de glicose FIGURA 2344 A sobrecarga de triglicerideos nos adipécitos de alguma forma causa resisténcia a insulina talvez por engatilhar proteina sencadeia inflamagao do tecido adiposo deposicao ectépica de cinases ativadas por lipideos que inativam algum elemento da via de si lipideos e resisténcia a insulina no musculo Em um individuo com nalizagao da insulina Os transportadores de glicose GLUT4 deixam a su massa corporal saudavel a captagao do triacilglicerol TAG da dieta iguala perficie da célula muscular impedindo a entrada da glicose no musculo sua oxidado para produdo de energia Em individuos com sobrepesoo os midcitos tornamse resistentes a insulina e por isso nado podem usar excesso de ingestdo caldrica resulta em adipdcitos aumentados repletos a glicose sanguinea como combustivel de modo que os acidos graxos de TAG e incapazes de estocar mais Os adipdcitos aumentados secretam sao mobilizados do tecido adiposo e tornamse o combustivel principal MCP1 proteina1 de quimiotaxia de mondécitos e atraem macrofagos O influxo de acidos graxos aumentado no musculo leva a uma deposiao Estes se infiltram no tecido adiposo e produzem TNFa fatora denecrose ectdpica de lipideos Em alguns individuos a resisténcia a insulina evolui tumoral que desencadeia degradaao dos lipideos e liberacao dos aci para diabetes tipo 2 Outros individuos sdo geneticamente menos sus dos graxos na corrente sanguinea Os acidos graxos liberados do tecido cetiveis aos efeitos deletérios da deposigao ectdpica de lipideos ou sao adiposo entram nas células musculares onde se acumulam como peque geneticamente mais equipados para lidar com essa deposicdo e nao de nas goticulas de gordura Este armazenamento ectdpico de lipideos de senvolvem o diabetes 970 DAVID L NELSON MICHAEL M COX transcrição Por exemplo tanto a síntese de adiponectina pelos adipócitos como seus níveis sanguíneos decrescem com a obesidade e aumentam com a perda de peso Sabese que vários fármacos efetivos no aumento da sensibilidade à insulina no diabetes tipo 2 agem sobre pro teínas específicas nas vias de sinalização e seus efeitos são consistentes com o modelo de lipotoxicidade As tiazolidi nedionas se ligam ao PPARg ativando um conjunto de ge nes específicos de adipócitos e promovendo a diferenciação dos préadipócitos em adipócitos pequenos aumentando a capacidade corporal de absorver ácidos graxos da dieta e de armazenálos como TAG Existem fatores genéticos que claramente predispõem para o diabetes tipo 2 Embora 80 das pessoas com dia betes tipo 2 sejam obesas a maioria das pessoas obesas não desenvolve a doença Devido à complexidade dos mecanis mos reguladores que foram discutidos neste capítulo não é surpreendente que a genética do diabetes seja comple xa envolvendo interações entre genes variantes e fatores ambientais incluindo dieta e estilo de vida Pelo menos 10 loci genéticos já foram implicados com o diabetes tipo 2 variações isoladas em qualquer desses diabetogenes cau sam um aumento relativamente pequeno na probabilidade de desenvolver a doença Por exemplo pessoas com PPARg variante no qual um resíduo de Ala substitui uma Pro na posição 12 têm um aumento leve embora significativo no risco de desenvolver a doença O diabetes tipo 2 é controlado com dieta exercício e medicação Os estudos mostram que três fatores aumentam a saúde das pessoas com diabetes tipo 2 restrição ali mentar exercício regular e fármacos que aumentam a pro dução de insulina ou a sensibilidade ao hormônio A restri ção alimentar e a perda de peso que a acompanha reduz a carga total de ácidos graxos controláveis A composição lipídica da dieta influencia por meio dos PPAR e outros fatores de transcrição a expressão de genes que codificam proteínas envolvidas na oxidação dos ácidos graxos e no gasto de energia via termogênese O exercício ativa a AMPK como o faz a adiponectina a AMPK altera o meta bolismo no sentido da oxidação da gordura e ao mesmo tempo inibe sua síntese Várias classes de fármacos são utilizados no manejo do diabetes tipo 2 alguns dos quais já foram previamente dis cutidos no capítulo Tabela 237 As sulfonilureias agem sobre os canais de K 1 controlados por ATP em células b pancreáticas e estimulam a liberação de insulina Bigua nidas como a metformina Glicofage ativam a AMPK mi metizando os efeitos da adiponectina As tiazolidinedionas agem por meio de PPARg aumentando a concentração de adiponectina no plasma e estimulando a diferenciação dos adipócitos de forma a aumentar a capacidade de armazena mento de TAG Os inibidores da protease IV de dipeptídeos DPP IV de dipeptide protease IV previnem a degradação proteolítica do GLP1 hormônio peptídico produzido no in testino e que estimula a secreção pancreática de insulina A inibição da peptidase prolonga a ação do GLP1 aumentan do efetivamente a secreção da insulina A combinação entre perda de peso e exercício é a for ma recomendada para prevenir o desenvolvimento da síndrome metabólica e do diabetes tipo 2 Resultados re centes relacionados com TAM em adultos sugerem uma possibilidade interessante para ajudar na perda de peso e na redução da quantidade de TAG que deve ser arma zenada A proteína PRDM16 tem uma alta expressão no tecido adiposo marrom e talvez unicamente nesse tecido A PRDM16 quando superexpressada no tecido adiposo de camundongos induz a diferenciação de préadipócitos do tecido adiposo branco em adipócitos marrons com altos níveis de termogenina e respiração desacoplada Tais cé lulas em princípio podem consumir ácidos graxos acima da quantidade necessária para a produção de ATP conver TABELA 237 Tratamentos para o diabetes melito tipo 2 Intervençãotratamento Alvo direto Efeito do tratamento Perda de peso Tecido adiposo reduz conteúdo de TAG Reduz a carga lipídica aumenta a capacidade de armazenamento lipídico no tecido adiposo restaura a sensibilidade à insulina Exercício AMPK ativada pelo aumento de AMPATP Auxilia na perda de peso ver Figura 2339 Sulfonilureias glipizida Glucotrol gliburida várias marcas glimepirida Amaryl Células b pancreáticas canais de K 1 bloqueados Estimula a secreção de insulina pelo pâncreas ver Figura 2327 Biguanidas metformina Glicofage AMPK ativada Aumenta a captação da glicose pelo músculo reduz a produção de glicose no fígado Tiazolidinedionas troglitazona Rezulin rosiglitazona Avandia pioglitazona Actos PPARg Estimula a expressão de genes potencializando a ação da insulina no fígado no músculo e no tecido adiposo aumenta a captação de glicose reduz a síntese de glicose no fígado Moduladores de GLP1 exenatida Byetta sitagliptina Januvia Peptídeo1 do tipo glucagon protease IV de dipeptídeo Intensifica a secreção de insulina pelo pâncreas Voluntariamente retirada do mercado devido aos efeitos colaterais Prescrições restritas a pacientes que não respondem a outros tratamentos devido ao possível aumento de risco de doença cardiovascular Nelson6ed23indd 970 Nelson6ed23indd 970 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 971 tendo em calor a energia da oxidação Dada a difusão e a ocorrência aumentada do diabetes tipo 2 a possibilidade de estimular a oxidação das gorduras pela ativação do TAM certamente merece ser explorada RESUMO 235 Obesidade síndrome metabólica e diabetes tipo 2 c A síndrome metabólica que inclui obesidade hiperten são lipídeos sanguíneos elevados e resistência à insuli na frequentemente é o prelúdio do diabetes tipo 2 c A resistência à insulina que caracteriza o diabetes tipo 2 pode ser uma consequência do armazenamento anormal de lipídeos no músculo e no fígado em resposta a uma ingestão lipídica que não pode ser acomodada no tecido adiposo c A expressão de enzimas para síntese lipídica está sob regulação firme e complexa Os PPAR são fatores de transcrição que determinam a taxa de síntese de muitas enzimas envolvidas no metabolismo lipídico e na dife renciação dos adipócitos c Os tratamentos efetivos do diabetes tipo 2 incluem exercício dieta adequada e fármacos que aumentem a produção de insulina ou a sensibilidade ao hormônio Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário hormônio 929 sistema neuroendócrino 929 radioimunoensaio RIE 930 análise de Scatchard 932 endócrino 933 parácrino 933 autócrino 933 insulina 934 adrenalina 934 noradrenalina 934 catecolaminas 934 hormônios eicosanoides 935 hormônios esteroides 935 hormônio vitamina D 935 hormônios retinoides 936 hormônios da tireoide 936 óxido nítrico NO 936 NOsintase 936 hipotálamo 936 neurohipófise 937 adenohipófise 937 hormônio trópico tropina 937 hepatócito 939 tecido adiposo branco TAB 943 adipócito 943 tecido adiposo marrom TAM 944 termogenina UCP1 944 termogênese 944 miócito 944 músculo de contração lenta 944 músculo de contração rápida 944 taxa de filtração glomerular GFR 947 termogênese com calafrio 948 eritrócito 949 leucócito 949 linfócito 949 plaquetas 950 plasma sanguíneo 950 proteínas plasmáticas 950 canais de K 1 controlados por ATP 954 sulfonilureia 954 glucagon 955 cortisol 958 diabetes melito 959 diabetes tipo 1 959 diabetes tipo 2 959 glicosúria 959 cetose 959 acidose 959 cetoacidose 959 teste de tolerância à glicose 960 obesidade 960 adipocinas 960 leptina 960 receptor de leptina 961 orexigênico 962 neuropeptídeo Y NPY 962 anorexigênico 962 hormônio estimulante de melanócitos a aMSH 962 JAK Januscinase 962 STAT transdutor de sinal e ativador da transcrição 962 proteínacinase ativada por AMP AMPK 963 adiponectina 964 mTORC1 965 PPAR receptor ativado por proliferador de peroxissomos 965 grelina 966 PYY336 967 síndrome metabólica 969 Leituras adicionais Conteúdo geral e história Blumenthal S 2009 The insulin immunoassay after 50 years a reassessment Perspect Biol Med 52 343354 Fascinante relato histórico sobre o desenvolvimento do radioimunoensaio por Yalow e Berson e o seu uso nos estudos da insulina e diabetes Chew SL Leslie D 2006 Clinical Endocrinology and Diabetes An Illustrated Colour Text Churchill Livingstone Edinburgh Schmidt TJ 2010 Biochemistry of hormones In Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations 7th edn Devlin TM ed pp 883938 John Wiley Sons Inc New York Metabolismo específico para cada tecido Brosnan JT and Brosnan ME 2007 Creatine endogenous metabolite dietary and therapeutic supplement Annu Rev Nutr 27 241261 Cannon B Nedergaard K 2004 Brown adipose tissue function and physiological significance Physiol Rev 84 277359 Elia M 1995 General integration and regulation of metabolism at the organ level Proc Nutr Soc 54 213234 Enerbäck S 2010 Human brown adipose tissue minireview Cell Metab 11 248252 Randle PJ 1995 Metabolic fuel selection general integration at the wholebody level Proc Nutr Soc 54 317327 Ravussin E Galgani JE 2011 The implication of brown adipose tissue for humans Annu Rev Nutr 31 3337 Regulação hormonal do metabolismo energético Cahill GF Jr 2006 Fuel metabolism in starvation Annu Rev Nutr 26 122 Desvergne B Michalik L Wahli W 2006 Transcriptional regulation of metabolism Physiol Rev 86 465514 Feige JN Auwerx J 2007 Transcriptional coregulators in the control of energy homeostasis Trends Cell Biol 17 292301 Hardie DG Sakamoto K 2006 AMPK a key sensor of fuel and energy status in skeletal muscle Physiology 21 4860 Kadowaki T Yamauchi T Kubota N Hara K Ueki K Tobe K 2006 Adiponectin and adiponectin receptors in insulin resistance diabetes and the metabolic syndrome J Clin Invest 116 17841792 Kola B Boscaro M Rutter GA Grossman AB Korbonits M 2006 Expanding role of AMPK in endocrinology Trends Endocrinol Metab 17 205215 Nelson6ed23indd 971 Nelson6ed23indd 971 030414 1131 030414 1131 972 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Kraemer DK AlKhalili L Guigas B Leng Y Garcia Roves PM Krook A 2007 Role of AMP kinase and PPARd in the regulation of lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle J Biol Chem 282 1931319320 Lin HV Accill D 2011 Hormonal regulation of hepatic glucose production in health and disease Cell Metab 14 919 Revisão avançada sobre os mecanismos que regulam a produção da glicose pelo fígado Maccarrone M Gasperi V Catani MV Diep TA Dainese E Hansen HS Avigliano L 2010 The endocannabinoid system and its relevance for nutrition Annu Rev Nutr 30 423440 Nguyen AD Herzog H Sainsbury A 2011 Neuropeptide Y and peptide YY important regulators of energy metabolism Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes 18 5660 Estudo de nível intermediário sobre os efeitos de NPY e PYY no metabolismo de energia no cérebro de ratos Nichols CG 2006 KATP channels as molecular sensors of cellular metabolism Nature 440 470476 Controle da massa corporal Ahima RS 2005 Central actions of adipocyte hormones Trends Endocrinol Metab 16 307313 Redução na leptina é um sinal importante para a mudança do estado alimentado para o estado de jejum Ahima RS 2006 Ghrelina new player in glucose homeostasis Cell Metab 3 301307 Azzu V Brand MD 2010 The onoff switches of the mitochondrial uncoupling proteins Trends Biochem Sci 35 298307 Revisão de nível intermediário sobre como o frio o excesso de comida e a inanição afetam a expressão dos genes da termogenina Biddinger SB Kahn CR 2006 From mice to men insights into the insulin resistance syndromes Annu Rev Physiol 68 123158 Revisão da estrutura da função e do papel das proteínas desacopladoras Delzenne NM Cani PD 2011 Interaction between obesity and the gut microbiota relevance in nutrition Annu Rev Nutr 31 1531 Friedman JM 2002 The function of leptin in nutrition weight and physiology Nutr Rev 60 S1S14 Revisão de nível intermediário de todos os aspectos da biologia da leptina Howell JJ Manning BD 2011 mTOR couples cellular nutrient sensing to metabolic homeostasis Trends Endocrinol Metab 22 94102 Revisão de nível intermediário sobre como MTORC1 controla as respostas metabólicas às flutuações na disponibilidade de nutrientes Jequier E Tappy L 1999 Regulation of body weight in humans Physiol Rev 79 451480 Revisão detalhada do papel da leptina na regulação da massa corporal e no controle da ingestão de alimento e dos papéis dos tecidos adiposos branco e marrom no gasto da energia Klok MD Jakobsdottir S Drent ML 2007 Role of leptin and ghrelin in the regulation of food intake and body weight Obes Rev 8 2134 Marx J 2003 Cellular warriors at the battle of the bulge Science 299 846849 Sucinta revisão da bioquímica do controle do peso e introdução a diversos artigos no mesmo número da Science sobre a obesidade em humanos Morton GJ Cummings DE Baskin DG Barsh GS Schwartz MW 2006 Central nervous system control of food intake and body weight Nature 443 289295 Zoncu R Efeyan A Sabatini DM 2011 mTOR from growth signal integration to cancer diabetes and ageing Nat Rev Mol Cell Biol 12 2135 Obesidade síndrome metabólica e diabetes tipo 2 Attie AD Scherer PE 2009 Adipocyte metabolism and obesity J Lipid Res 50 S395S399 Barish GD Narkar VA Evans RM 2006 PPARd a dagger in the heart of the metabolic syndrome J Clin Invest 116 590597 Clee SM Attie AD 2007 The genetic landscape of type 2 diabetes in mice Endocrinol Rev 28 4883 Cypess AM Kahn CR 2010 Brown fat as a therapy for obesity and diabetes Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes 17 143149 Discussão de nível intermediário sobre a possibilidade de estimular a oxidação da gordura no TAM como tratamento da obesidade Guilherme A Virbasius JV Puri V Czech MP 2008 Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes Nat Rev Mol Cell Biol 9 367377 Harper ME Green K Brand MD 2008 The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity Annu Rev Nutr 28 1333 Kasuga M 2006 Insulin resistance and pancreatic b cell failure J Clin Invest 116 17561760 Introdução a uma série de revisões sobre o diabetes tipo 2 neste número da revista Klein J Perwitz N Kraus D Fasshauer M 2006 Adipose tissue as source and target for novel therapies Trends Endocrinol Metab 17 2632 Revisão de nível intermediário Lusis AJ Attie AD Reue K 2008 Metabolic syndrome from epidemiology to systems biology Nat Rev Genet 9 819830 McAllister EJ Dhurandhar NV Keith SW Aronne LJ Barger J Baskin M Benca RM Biggio J Boggiano MM Eisenmann JC et al 2009 Ten putative contributors to the obesity epidemic Crit Rev Food Sci Nutr 49 868913 Revisão extensa e avançada dos fatores responsáveis pela epidemia mundial de obesidade Muoio DM Newgard CB 2008 Molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and bcell failure in diabetes Nat Rev Mol Cell Biol 9 193205 Savage DB Petersen KF Shulman GI 2007 Disordered lipid metabolism and the pathogenesis of insulin resistance Physiol Rev 87 507520 Semple RK Chatterjee VKK ORahilly S 2006 PPARg and human metabolic disease J Clin Invest 116 581589 Sharma AM Staels B 2007 Peroxisome proliferator activated receptor g and adipose tissueunderstanding obesity related changes in regulation of lipid and glucose metabolism J Clin Endocrinol Metab 92 386395 Verdin E Hirschey MD Finley LW Haigis MC 2010 Sirtuin regulation of mitochondria energy production apoptosis and signaling Trends Biochem Sci 35 669675 VidalPuig A Unger RH 2010 Biochim Biophys Acta 180 207208 Este exemplar inteiro do periódico trata da lipotoxicidade e da síndrome metabólica Nelson6ed23indd 972 Nelson6ed23indd 972 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 973 Virtue S VidalPuig A 2008 Its not how fat you are its what you do with it that counts PLoS Biol 6 e237 doi101371journal pbio0060237 Voight BF Scott LJ Steinthorsdottir V Morris AP Dina C Welch RP Zeggini E Huth C Aulchencko YS Thorleifsson G et al 2010 Twelve type 2 diabetes susceptibility loci identified through largescale association analysis Nat Genet 42 579589 Resultados de uma grande pesquisa 47000 indivíduos para identificar genes que predispõe os humanos ao diabetes tipo 2 Whittle AJ Lopez M VidalPuig A 2011 Using brown adipose tissue to treat obesitythe central issue Trends Mol Med 8 405411 Revisão de nível intermediário sobre a possibilidade de tratar a obesidade pela estimulação da atividade da gordura marrom Xu H Barnes GT Yang Q Tan G Yang D Chou CJ Sole J Nichols A Ross JS Tartaglia LA Chen H 2003 Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesityrelated insulin resistance J Clin Invest 112 18211830 Problemas 1 Atividade dos hormônios peptídicos Explique como dois hormônios peptídicos tão semelhantes estruturalmente quanto a ocitocina e a vasopressina podem ter efeitos tão di versos ver Figura 239 2 ATP e fosfocreatina como fontes de energia para o músculo Durante a contração muscular a concentração de fosfocreatina no músculo esquelético diminui enquanto a concentração de ATP permanece razoavelmente constante No entanto em um experimento clássico Robert Davies des cobriu que se tratasse primeiro o músculo com 1fluoro24 dinitrobenzeno p 98 a concentração de ATP declinaria rapidamente enquanto a concentração de fosfocreatina per maneceria constante durante uma série de contrações Sugira uma explicação 3 Metabolismo do glutamato no cérebro O tecido cere bral capta glutamato do sangue o transforma em glutamina e libera a glutamina no sangue Qual o resultado dessa conversão metabólica Como ela ocorre A quantidade de glutamina pro duzida no cérebro pode na verdade exceder a quantidade de glutamato que ali chega a partir do sangue Como surge essa glutamina extra Dica você pode querer revisar o catabolismo dos aminoácidos no Capítulo 18 lembrese de que o NH4 1 é muito tóxico para o cérebro 4 As proteínas como combustível durante o jejum Quando as proteínas musculares são catabolizadas no músculo esquelético durante um jejum quais os destinos dos aminoá cidos 5 Ausência da glicerolcinase no tecido adiposo O glicerol3fosfato é necessário para a biossíntese de triacilgli ceróis Os adipócitos células especializadas na síntese e na degradação de triacilgliceróis não podem utilizar o glicerol di retamente pois não têm a glicerolcinase que catalisa a reação Glicerol 1 ATP S glicerol3fosfato 1 ADP Como o tecido adiposo obtém o glicerol3fosfato necessário para a síntese de triacilgliceróis 6 Consumo de oxigênio durante o exercício Um adul to sedentário consome cerca de 005 L de O2 em 10 segundos Um atleta ao correr 100 m rasos consome cerca de 1 L de O2 em 10 segundos Ao final da corrida este corredor continua a respirar rapidamente embora a frequência vá declinando por alguns minutos consumindo 4 L extras de O2 acima do total consumido pela pessoa sedentária a Por que a necessidade de O2 aumenta tanto durante a corrida b Por que a demanda por O2 permanece alta após o final da corrida 7 Deficiência de tiamina e função cerebral Pessoas com deficiência de tiamina apresentam alguns sinais e sinto mas neurológicos característicos incluindo perda dos reflexos ansiedade e confusão mental Por que a deficiência de tiamina se manifesta por alterações na função cerebral 8 Potência dos hormônios Em condições normais a me dula suprarrenal humana secreta adrenalina C9H13NO3 em uma taxa suficiente para manter uma concentração de 10 10 M no sangue circulante Para apreciar o que significa tal concen tração calcule para uma piscina redonda com uma profundi dade de água de 2 m qual o diâmetro necessário para dissolver 10 g cerca de uma colher de chá de adrenalina para a con centração igualarse à do sangue 9 Regulação dos níveis hormonais no sangue A meia vida da maioria dos hormônios no sangue é relativamente cur ta Por exemplo quando insulina radioativamente marcada é injetada em um animal metade do hormônio marcado desapa rece do sangue em 30 min a Qual a importância da inativação relativamente rápida dos hormônios circulantes b Em vista dessa rápida inativação como é mantido cons tante o nível do hormônio circulante em condições normais c De que modo o organismo pode estabelecer rápidas mudanças no nível de um hormônio circulante 10 Hormônios hidrossolúveis versus hormônios lipos solúveis Com base em suas propriedades físicas os hormô nios se dividem em duas categorias aqueles muito solúveis em água mas relativamente insolúveis em lipídeos p ex a adrenalina e aqueles relativamente insolúveis em água mas altamente solúveis em lipídeos p ex os hormônios esteroi des Em seu papel como reguladores da atividade celular a maior parte dos hormônios hidrossolúveis não entra em suas célulasalvo Os hormônios lipossolúveis por sua vez entram em suas célulasalvo e por fim atuam no núcleo Qual a corre lação entre solubilidade localização dos receptores e modo de ação dessas duas classes de hormônios 11 Diferenças metabólicas entre o músculo e o fí gado em situação de luta ou fuga Quando um animal confrontase com uma situação de luta ou fuga a liberação de adrenalina promove a degradação de glicogênio no fígado no músculo esquelético e no músculo cardíaco O produto final da degradação de glicogênio no fígado é a glicose o produto final no músculo esquelético é o piruvato a Qual a razão para haver diferentes produtos da degra dação do glicogênio nos dois tecidos b Qual a vantagem para um animal que deve lutar ou fugir dessas vias específicas de degradação do glicogênio 12 Secreção excessiva de insulina o hiperinsuli nismo Certos tumores malignos do pâncreas causam produção excessiva de insulina nas células b Pessoas afetadas apresentam tremores fraqueza e fadiga sudorese e fome Nelson6ed23indd 973 Nelson6ed23indd 973 030414 1131 030414 1131 974 DAVID L NELSON MICHAEL M COX a Qual o efeito do hiperinsulinismo sobre o metabolismo de carboidratos aminoácidos e lipídeos no fígado b Quais as causas dos sintomas observados Sugira a razão pela qual essa condição se prolongada leva a dano cerebral 13 Termogênese causada por hormônios da tireoide Os hormônios da tireoide estão intimamente envolvidos na regulação da taxa metabólica basal Tecido hepático de ani mais que receberam excesso de tiroxina mostra aumento no consumo de O2 e na produção de calor termogênese mas a concentração de ATP no tecido é normal Existem diferentes explicações para o efeito termogênico da tiroxina Uma delas é que o excesso de tiroxina causa desacoplamento da fosfori lação oxidativa na mitocôndria Como pode tal efeito explicar as observações Outra explicação sugere que a termogênese devase a um aumento na utilização do ATP no tecido estimula do pela tiroxina Essa explicação é razoável Por quê 14 Função dos próhormônios Quais são as possíveis vantagens de sintetizar hormônios como próhormônios 15 Fontes de glicose durante o jejum Um adulto huma no típico usa cerca de 160 g de glicose por dia dos quais 120 g são usadas pelo cérebro A reserva de glicose disponível 20 g de glicose circulante e 190 g de glicogênio é adequada para cerca de um dia Após a reserva ser depletada pelo jejum como o corpo obtém glicose 16 Camundongos parabióticos obob Pesquisadores podem conectar os sistemas circulatórios de dois camundon gos por meio de uma cuidadosa cirurgia de modo que o mes mo sangue circula em ambos os animais Nesses camundongos parabióticos os produtos liberados no sangue por um animal atingem o outro animal via circulação compartilhada Ambos os animais são livres para comer de forma independente Se um camundongo mutante obob ambas as cópias do gene OB são defeituosas e um camundongo normal OBOB duas cópias boas do gene OB são unidos tornandose parabióticos o que ocorre com o peso de cada camundongo 17 Cálculo do índice de massa corporal Um corpulento professor de bioquímica pesa 118 kg e tem altura de 173 cm Qual o índice de massa corporal desse professor Quantos kg ele teria de perder para atingir um índice de massa corporal de 25 normal 18 Secreção de insulina Na sua opinião quais os efeitos da exposição de células b pancreáticas ao ionóforo de potás sio valinomicina Figura 1144 sobre a secreção de insulina Explique 19 Efeitos de um receptor de insulina deletado Ob servase que uma linhagem de camundongos sem o receptor específico de insulina hepático apresenta moderada hipergli cemia de jejum glicemia de 132 mgdL em comparação com 101 mgdL nos controles e hiperglicemia mais marcante no estado alimentado glicemia de 363 mgdL em comparação com 135 mgdL nos controles Os camundongos apresentam níveis de glicose6fosfatase acima do normal no fígado e níveis elevados de insulina no sangue Explique essas observações 20 Decisões sobre a segurança do uso de fárma cos O fármaco Avandia rosiglitazona é efetivo para a redução da glicose sanguínea em pacientes com diabetes tipo 2 mas também parece envolver um risco aumentado de infarto do miocárdio Se fosse sua responsabilidade decidir se esse fár maco deve permanecer no mercado marcado com avisos ade quados quanto a seus efeitos colaterais ou deve ser retirado quais fatores levaria em conta ao tomar sua decisão 21 Medicação para o diabetes tipo 2 Os fármacos acarbose e miglitol utilizados no tratamento do diabetes melito tipo 2 inibem aglicosidases da membrana em forma de escova do intestino delgado Essas enzimas degradam oligossa carídeos resultantes da digestão do glicogênio ou do amido em monossacarídeos Sugira um possível mecanismo para o efeito salutar desses fármacos em pessoas com diabetes Quais efei tos colaterais se for o caso você esperaria desses fármacos Por quê Dica revise a intolerância à lactose p 561562 Problema de análise de dados 22 Clonando o receptor de sulfonilureias nas células b pancreáticas A gliburida membro da família das sulfoni lureias mostrada na p 955 é usada para tratar diabetes tipo 2 Esse fármaco ligase ao canal de K 1 controlado por ATP e fechao o que é mostrado nas Figuras 2327 e 2328 a Considerando o mecanismo mostrado na Figura 2327 o tratamento com gliburida resultaria em aumento ou diminui ção da secreção de insulina pelas células b pancreáticas Ex plique seu raciocínio b Como o tratamento com gliburida ajudaria a reduzir os sintomas do diabetes tipo 2 c Você esperaria que a gliburida fosse útil para tratar o diabetes tipo 1 Por quê Ou por que não AguilarBryan e colaboradores 1995 clonaram o gene para a subunidade receptora da sulfonilureia SUR do canal de K 1 controlado por ATP de hamsters A equipe de pesquisa foi extremamente rigorosa ao assegurar que o gene clonado era de fato o gene que codificava a SUR Aqui consideramos como é possível para os pesquisadores demonstrarem que clonaram na verdade o gene de interesse e não outro gene O primeiro passo foi obter a proteína SUR pura Como já se sabia fármacos do tipo da gliburida ligam SUR com alta afini dade Kd 10 nM e a SUR tem uma massa molecular de 140 a 170 kDa AguilarBryan e colaboradores utilizaram essa ligação de alta afinidade da gliburida para etiquetar a proteína SUR com marca radioativa que serviria como marcador na purifi cação da proteína a partir de um extrato celular Inicialmen te produziram um derivado radioativo da gliburida utilizando iodo radioativo 125I 125I NHCH2CH2 S N H N H O O O OH O 125I5Iodo2hidroxigliburida d Em estudos preliminares o derivado da gliburida mar cado com 125I doravante 125Igliburida mostrou ter o mesmo Kd e as mesmas características de ligação que a gliburida ori ginal Por que era necessário fazer essa demonstração Quais possibilidades alternativas essa observação eliminou Embora a 125Igliburida ligue SUR com alta afinidade uma quantidade significativa do fármaco marcado se dissociaria da proteína SUR durante a purificação Para prevenir tal disso ciação a 125Igliburida deveria estabelecer ligações cruzadas covalentes com a SUR Há muitos métodos para se estabelecer tais ligações e AguilarBryan e colaboradores utilizaram luz UV Quando moléculas aromáticas são expostas a luz UV de Nelson6ed23indd 974 Nelson6ed23indd 974 030414 1131 030414 1131 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 975 ondas curtas entram em um estado excitado e facilmente for mam ligações covalentes com moléculas próximas Por meio de ligações cruzadas entre a proteína SUR e a gliburida marcada radioativamente os pesquisadores simplesmente acompanha vam a radioatividade do 125I para seguir a SUR ao longo do pro cedimento de purificação AguilarBryan e colaboradores trataram células HIT que expressam SUR de hamsters com 125Igliburida e luz UV purificaram a proteína de 140 kDa marcada com 125I e se quenciaram os 25 resíduos de aminoácidos de seu segmento aminoterminal encontraram a sequência PLAFCGTENHSA AYRVDQGVLNNGC Os investigadores produziram então an ticorpos específicos para dois peptídeos curtos dessa sequên cia um para a sequência PLAFCGTE e outro para a sequência HSAAYRVDQGV e mostraram que esses anticorpos ligavamse à proteína purificada de 140 kDa marcada com 125I e Por que foi necessário incluir essa etapa com ligação por anticorpos A seguir os pesquisadores construíram segmentos inicia dores para PCR com base nas sequências acima e clonaram um gene de uma biblioteca de DNA complementar de hamster que codificava uma proteína a qual incluía essas sequências ver Capítulo 9 sobre métodos em biotecnologia O pressu posto cDNA de SUR clonado hibridizava com um mRNA de tamanho apropriado presente em células que certamente con tinham SUR O suposto cDNA para SUR não hibridizava com qualquer fração de mRNA isolado de hepatócitos que não ex pressam SUR f Por que foi necessário incluir essa etapa de hibridização entre o suposto cDNA para SUR e mRNA Por fim o gene clonado foi inserido e expressado em células COS as quais normalmente não expressam o gene SUR Os in vestigadores trataram essas células com 125Igliburida com ou sem um grande excesso de gliburida não marcada expuseram as células à luz UV e mediram a radioatividade na proteína de 140 kDa produzida Seus resultados são mostrados na tabela Experimento Tipo celular Suposto cDNA para SUR adicionado Excesso de gliburida não marcado adicionado Marcação com 125I em proteína de 140 kDa 1 HIT Não Não 111 2 HIT Não Sim 3 COS Não Não 4 COS Sim Não 111 5 COS Sim Sim g Por que no experimento 2 não foi observada proteína de 140 kDa marcada com 125I h Como você usaria a informação da tabela para argu mentar que o cDNA codificava SUR i Que outra informação você precisa obter para estar mais confiante de que clonou o gene SUR Referência AguilarBryan L Nichols CG Wechsler SW Clement JP IV Boyd AE III González G Herrera Sosa H Nguy K Bryan J Nelson DA 1995 Cloning of the b cell highaffinity sulfonylurea receptor a regulator of insulin secretion Science 268 423426 Nelson6ed23indd 975 Nelson6ed23indd 975 030414 1131 030414 1131 Nelson6ed23indd 976 Nelson6ed23indd 976 030414 1131 030414 1131 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 24 Genes e cromossomos 979 25 Metabolismo do DNA 1009 26 Metabolismo do RNA 1057 27 Metabolismo das proteínas 1103 28 Regulação da expressão gênica 1155 A terceira e última parte deste livro investiga os mecanis mos bioquímicos subjacentes a necessidades aparente mente contraditórias para a continuidade genética e a evolução dos organismos vivos Qual é a natureza molecular do material genético Como a informação genética é trans mitida de uma geração para a próxima com grande fideli dade De que modo as raras alterações que são a matéria prima da evolução surgem no material genético Como a informação genética em última instância se expressa em sequências de aminoácidos na incrível variedade de molé culas proteicas de uma célula viva O conhecimento atual das vias da informação surgiu da convergência da genética da física e da química na bioquí mica moderna Isto foi sintetizado pela descoberta da estru tura do DNA em duplahélice postulada por James Watson e Francis Crick em 1953 ver Figura 813 A teoria gené tica contribuiu para o conceito de codificação por genes A física permitiu a determinação da estrutura molecular pela análise por difração por raios X A química revelou a composição do DNA O profundo impacto da hipótese de WatsonCrick surgiu da sua capacidade de explicar uma vasta gama de observações provenientes de estudos nessas diferentes disciplinas Isso revolucionou a nossa compreensão da estrutura do DNA e inevitavelmente estimulou questionamentos sobre a sua função A estrutura em duplahélice por si só suge ria com clareza como o DNA deveria ser copiado de forma que a informação nele contida pudesse ser transmitida de uma geração à outra Esclarecimentos sobre como a infor mação no DNA é transformada em proteínas funcionais vie ram com a descoberta do RNA mensageiro e do RNA trans portador e com a decifração do código genético Esses e outros grandes avanços deram origem ao dogma central da biologia molecular abrangendo os três maiores processos na utilização celular da informação genética O primeiro é a replicação a cópia do DNA parental para for mar moléculasfilhas de DNA com sequências nucleotídi cas idênticas O segundo é a transcrição o processo pelo qual partes da mensagem genética codificada pelo DNA são precisamente copiadas em RNA O terceiro é a tradução por meio do qual a mensagem genética codificada no RNA mensageiro é traduzida nos ribossomos em um polipeptídeo com uma sequência específica de aminoácidos A Parte III explora esses e outros processos a eles re lacionados No Capítulo 24 são examinados a estrutura a topologia e o empacotamento de cromossomos e genes Os processos subjacentes ao dogma central são elaborados nos Capítulos 25 a 27 Por fim será abordada a regulação examinando como é controlada a expressão da informação genética Capítulo 28 Um tema importante nesses capítulos é a complexida de inerente à biossíntese das macromoléculas que contêm informações Ácidos nucleicos e proteínas são organizados em sequências específicas de nucleotídeos e aminoácidos PARTE III Vias da Informação RNA Proteína Transcrição Tradução DNA Replicação O dogma central da biologia molecular mostrando os caminhos gerais do fluxo da informação via replicação transcrição e tradução O termo dogma é uma designação incorreta mantido apenas por razões his tóricas Introduzido por Francis Crick em uma época em que poucas evidências corroboravam essas ideias o dogma se tornou um princípio bem estabelecido Nelson6ed24indd 977 Nelson6ed24indd 977 020514 1734 020514 1734 978 DAVID L NELSON MICHAEL M COX e essa montagem representa nada menos do que preservar a expressão fidedigna do molde em que a vida se baseia É possível supor que a formação das ligações fosfodiéster no DNA ou das ligações peptídicas nas proteínas seja uma proeza trivial para as células considerando o arsenal de ferramentas enzimáticas e químicas descritas na Parte II Entretanto a estrutura de regras e padrões estabelecidos na nossa análise das vias metabólicas deve ser bastante aumentada para levar em consideração a informação mo lecular Ligações devem ser formadas entre subunidades específicas nos biopolímeros informacionais evitando a ocorrência ou a manutenção de erros na sequência Isso tem um enorme impacto na termodinâmica na química e na enzimologia dos processos biossintéticos A formação de uma ligação peptídica necessita de uma quantidade de energia em torno de 21 kJmol de ligação e pode ser catalisada por enzimas relativamente simples Para sinte tizar uma ligação entre dois aminoácidos específicos em um ponto particular no polipeptídeo no entanto a célula investe em torno de 125 kJmol e usa mais de 200 enzi mas moléculas de RNA e proteínas especializadas A quí mica envolvida na formação da ligação peptídica não muda devido a essa necessidade mas processos adicionais são acrescentados à reação básica para assegurar que a ligação peptídica seja formada entre aminoácidos específicos In formação biológica é cara A interação dinâmica entre ácidos nucleicos e proteínas é outro tema central da Parte III Moléculas de RNA regula tórias e catalíticas estão gradualmente ocupando um lugar mais proeminente no entendimento dessas vias discutidas nos Capítulos 26 e 27 Entretanto a maioria dos processos que formam as vias do fluxo de informação celular é catalisa da e regulada por proteínas A compreensão dessas enzimas e de outras proteínas pode ter tanto vantagens práticas como intelectuais pois elas formam as bases da tecnologia do DNA recombinante já apresentada no Capítulo 9 A evolução novamente constitui um tema que paira aci ma dos outros Muitos dos processos delineados na Parte III podem ser rastreados bilhões de anos e uns poucos podem ser rastreados até o Último Ancestral Comum Universal LUCA de Last Universal Common Ancestor O ribosso mo a maior parte do aparato de tradução e algumas partes da maquinaria de transcrição são compartilhadas por todos os organismos vivos nesse planeta A informação genética é um tipo de relógio biológico que pode ajudar na definição de relacionamentos ancestrais entre as espécies As vias de informação compartilhadas conectam o ser humano a cada uma das outras espécies atualmente vivas na Terra e a to das as espécies que vieram anteriormente A investigação dessas vias está permitindo que cientistas abram vagarosa mente a cortina do primeiro ato os eventos que devem ter anunciado o início da vida na Terra Nelson6edbookindb 978 Nelson6edbookindb 978 030414 0747 030414 0747 241 Elementos cromossômicos 979 242 DNA supertorcido 985 243 Estrutura dos cromossomos 994 O tamanho das moléculas de DNA é um enigma bioló gico interessante Uma vez que essas moléculas são em geral muito maiores do que as células e as par tículas virais que as contêm Figura 241 como é que elas cabem dentro das células ou dos compactados virais Para tratar essa questão é preciso transferir o foco da es trutura secundária do DNA abordada no Capítulo 8 para o extraordinário grau de organização que envolve o empa cotamento terciário do DNA dentro dos cromossomos os repositórios da informação genética O capítulo começa com uma análise dos elementos que compõem cromosso mos celulares e virais e depois considera o tamanho e a organização dos cromossomos Em seguida discute a to pologia do DNA descrevendo a torção e a supertorção das moléculas de DNA Finalmente considera as interações proteínaDNA que organizam cromossomos em estruturas compactas 241 Elementos cromossômicos O DNA celular contém genes e regiões intergênicas e as duas regiões podem servir para desempenhar funções vitais às células Os genomas mais complexos como os das célu las dos eucariotos necessitam de níveis maiores de orga nização cromossômica o que se reflete nas características estruturais dos cromossomos Primeiro serão considerados os diferentes tipos de sequências de DNA e os elementos estruturais dentro dos cromossomos Os genes são segmentos de DNA que codificam cadeias polipeptídicas e RNA O conhecimento sobre os genes evoluiu de forma espanto sa no último século Classicamente um gene foi definido como a porção de um cromossomo que determina ou afeta um único traço ou fenótipo propriedade visível como a cor do olho George Beadle e Edward Tatum propuseram uma definição molecular de gene em 1940 Depois de expor esporos do fungo Neurospora crassa a raios X e a outros agentes conhecidos por causarem danos ao DNA e altera ções em sua sequência mutações eles detectaram linha gens mutantes de fungos com deficiência em uma ou em outra enzima algumas vezes resultando em deficiência em uma via metabólica inteira Beadle e Tatum concluíram que um gene é um segmento de material genético que determi na ou codifica uma enzima a hipótese um geneuma en zima Depois esse conceito foi ampliado para um geneum 24 Genes e Cromossomos 05 m m FIGURA 241 Capa proteica do bacteriófago T2 rodeada pela sua molécula de DNA única e linear O DNA foi liberado pela lise da partí cula do bacteriófago em água destilada o que permitiu que o DNA se es palhasse pela superfície da água Uma partícula de bacteriófago T2 intacta é constituída por uma cabeça que se afunila em uma cauda com a qual o bacteriófago se fixa à superfície exterior de uma célula bacteriana Todo o DNA mostrado nessa micrografia eletrônica normalmente está compactado dentro da cabeça do fago Nelson6ed24indd 979 Nelson6ed24indd 979 020514 1734 020514 1734 980 DAVID L NELSON MICHAEL M COX polipeptídeo porque muitos genes codificam proteínas não enzimas ou codificam um polipeptídeo de uma proteína com várias subunidades George W Beadle 19031989 Edward L Tatum 19091975 A definição bioquímica moderna de gene é ainda mais precisa Um gene é todo o DNA que codifica a sequência primária de algum produto gênico que pode ser tanto um polipeptídeo quanto um RNA com funções catalíticas ou estruturais O DNA também contém outros segmentos ou sequências com funções puramente regulatórias As se quências regulatórias fornecem sinais que podem indi car o início ou o fim de um gene ou influenciar a trans crição de genes ou funcionar como ponto de início da replicação ou da recombinação Capítulo 28 Alguns ge nes podem ser expressos de diferentes maneiras para ge rar vários produtos gênicos a partir de um único segmento de DNA Os mecanismos especializados de transcrição e tradução que permitem esse fenômeno estão descritos nos Capítulos 26 a 28 Podese estimar diretamente o tamanho médio mínimo dos genes que codificam uma proteína Como está descrito detalhadamente no Capítulo 27 cada um dos aminoácidos de uma cadeia polipeptídica é codificado por uma sequên cia consecutiva de três nucleotídeos em uma única cadeia de DNA Figura 242 e esses códons estão organizados em uma sequência que corresponde à sequência de ami noácidos no polipeptídeo codificado por esse gene Uma ca deia polipeptídica de 350 resíduos de aminoácidos cadeia de tamanho médio corresponde a 1050 pb Muitos genes de eucariotos e uns poucos em bactérias e arqueias são interrompidos por segmentos de DNA não codificantes e portanto são consideravelmente mais longos do que sugere esse cálculo simples Quantos genes existem em um único cromossomo O cromossomo de Escherichia coli um dos genomas de bac téria completamente sequenciado é uma molécula de DNA circular no sentido de alça sem extremidades e não de um círculo perfeito com 4639675 pb Esses pares de bases codificam cerca de 4300 genes para proteínas e 157 genes para moléculas de RNA estrutural ou catalítico Entre os eucariotos os aproximadamente 31 bilhões de pares de ba ses do genoma humano incluem quase 25000 genes em 24 cromossomos diferentes As moléculas de DNA são muito mais longas do que o invólucro celular ou viral que as contém Geralmente o comprimento do DNA dos cromossomos é várias ordens de magnitude maior do que as células ou os vírus nos quais ele se encontra Figura 241 Tabela 241 Isso é verdadeiro para todas as classes de organismos ou de parasitas virais Vírus Os vírus não são organismos de vida livre Ao con trário são parasitas infecciosos que utilizam os recursos da célula hospedeira para desempenhar muitos dos processos de que necessitam para se propagar Muitas partículas vi rais são constituídas por não mais do que um genoma ge ralmente uma única molécula de RNA ou de DNA envolto por capa proteica Quase todos os vírus de plantas e alguns vírus de bac térias e de animais têm genoma de RNA Esses genomas tendem a ser especialmente pequenos Por exemplo o U C U A G A C G U G C A G G A C C T U A C A T G A C U T G A U U U A A A G C C C G G G U U C A A 59 39 39 59 DNA mRNA T C T C G T G G A T A C A C T T T T G C C G T T 39 59 Arg Gly Tyr Thr Phe Ala Val Ser Carboxiterminal Aminoterminal Polipeptídeo Fitamolde FIGURA 242 Colinearidade entre as sequências de nucleotídeos codificantes do DNA e do mRNA e as sequências de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica Os tripletes de unidades nucleotídicas no DNA determinam os aminoácidos de uma proteína por meio de um mRNA intermediário Uma das cadeias de DNA serve como molde para a síntese de mRNA que têm tripletes de nucleotídeos códons complementares aos do DNA Em alguns genes de bactérias e em muitos genes de eucariotos as sequências codificantes são interrompidas em intervalos por regiões não codificantes denominadas íntrons Nelson6edbookindb 980 Nelson6edbookindb 980 030414 0747 030414 0747 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 981 genoma de retrovírus de mamíferos como o HIV tem um comprimento de cerca de 9000 nucleotídeos e o genoma do bacteriófago Qb tem 4220 nucleotídeos Esses dois ti pos de vírus têm genomas de RNA de cadeia simples Os genomas de vírus de DNA variam enormemente de tamanho Tabela 241 Muitos DNA virais são circulares em pelo menos parte de seu ciclo de vida Durante a replicação do vírus dentro de uma célula tipos específicos de DNA vi ral denominados formas replicativas podem aparecer Por exemplo muitos DNA lineares se tornam circulares e todos os DNA de cadeia única se tornam de cadeia dupla Um vírus de DNA de tamanho médio típico é o bacteriófago l lambda que infecta E coli Na sua forma replicativa den tro da célula o DNA do l é uma duplahélice circular Esse DNA de cadeia dupla contém 48502 pb e tem um perímetro de 175 mm O bacteriófago fX174 é um vírus de DNA muito menor o DNA da partícula viral é um círculo de cadeia única e a forma replicativa de cadeia dupla contém 5386 pb Em bora os genomas virais sejam pequenos o perímetro de seu DNA é geralmente centenas de vezes mais comprido do que as dimensões da partícula viral que os contém Tabela 241 Bactérias Uma única célula de E coli contém quase 100 vezes mais DNA do que uma partícula do bacteriófago l O cromossomo de uma célula de E coli é uma única molécula de DNA circular de cadeia dupla Seus 4639675 pb têm um comprimento de perímetro de cerca de 17 mm aproxima damente 850 vezes o comprimento de uma célula de E coli Figura 243 Além do enorme DNA cromossomal circular em seu nucleoide muitas bactérias têm uma ou mais mo léculas de DNA circular pequenas que estão livres no cito sol Esses elementos extracromossômicos são denominados plasmídeos Figura 244 ver também p 317 A maioria dos plasmídeos tem comprimento de apenas alguns milha res de pares de bases mas alguns contêm mais de 10000 pb Eles carregam informação genética e sofrem replicação produzindo plasmídeosfilhos que passam para as células filhas na divisão celular Plasmídeos foram encontrados em leveduras e em outros fungos assim como nas bactérias Em muitos casos os plasmídeos não conferem uma vantagem óbvia a seus hospedeiros e sua única função pa rece ser a autopropagação Entretanto alguns plasmídeos carregam genes que são úteis para a bactéria hospedeira Por exemplo alguns genes de plasmídeo tornam a bactéria hospedeira resistente a agentes antibacterianos Plasmídeos carregando o gene da enzima blactamase conferem resis tência aos antibióticos blactâmicos como penicilina ampi cilina e amoxicilina ver Figura 631 Esses e plasmídeos semelhantes podem passar de uma célula resistente ao an tibiótico para uma célula sensível ao antibiótico da mesma ou de outra espécie de bactéria tornando a célula receptora resistente ao antibiótico O uso abusivo de antibióticos em algumas populações humanas serve como forte pressão se letiva favorecendo a disseminação de plasmídeos que codi ficam a resistência a antibióticos da mesma maneira que os elementos de transposição descritos a seguir que carregam genes similares em bactérias patogênicas Os médicos têm demonstrado mais relutância em prescrever antibióticos a menos que fique bem clara a necessidade clínica Por razões semelhantes o uso disseminado de antibióticos em rações animais vem sendo restringido Eucariotos Uma célula de levedura um dos eucariotos mais simples tem 26 vezes mais DNA no genoma do que uma célula de E coli Tabela 242 As células de Drosophila a moscadafruta utilizada nos estudos genéticos clássicos contêm mais do que 35 vezes a quantidade de DNA de uma célula de E coli e as células humanas têm 700 vezes mais As células de muitas plantas e anfíbios contêm ainda mais O material genético das células eucarióticas é distribuído nos cromossomos o número diploide 2n depende da espécie Tabela 242 Uma célula somática humana por exemplo tem 46 cromossomos Figura 245 Cada cro mossomo de uma célula eucariótica como os mostrados na Figura 245a contém uma única muito grande molécula de DNA duplex As moléculas de DNA dos 24 diferentes tipos de cromossomos humanos 22 pares mais os cromos somos sexuais X e Y variam de comprimento em mais de 25 vezes Cada tipo de cromossomo dos eucariotos carrega um conjunto específico de genes O DNA do genoma de uma pessoa 22 cromossomos mais um cromossomo X e um Y ou dois cromossomos X se enfilei rado teria um comprimento de cerca de um metro A maioria das células humanas é diploide e cada célula contém então um total de 2 metros de DNA Como o corpo de um homem adulto contém aproximadamente 10 14 células o seu DNA to tal tem um comprimento de 2 3 10 11 km A comparação desse dado com a circunferência da Terra 4 3 10 4 km ou a distân cia entre a Terra e o sol 15 3 10 8 km ilustra o extraordiná rio grau de compactação do DNA em nossas células TABELA 241 Os tamanhos do DNA e das partículas virais de alguns vírus de bactérias bacteriófagos Vírus Tamanho do DNA viral pb Perímetro do DNA viral nm Perímetro da partícula do vírus nm fX 174 5386 1939 25 T7 39936 14377 78 l lambda 48502 17460 190 T4 168889 60800 210 Nota Os dados referentes ao tamanho dos DNA são aqueles da forma replicativa cadeia dupla O perímetro foi calculado supondo que cada par de bases ocupa um comprimento de 34 Å ver Figura 813 Nelson6edbookindb 981 Nelson6edbookindb 981 030414 0747 030414 0747 982 DAVID L NELSON MICHAEL M COX E coli DNA de E coli FIGURA 243 O comprimento de um cromossomo de E coli 17 mm re presentado na forma linear em relação ao comprimento de uma célula de E coli típica 2 mm FIGURA 244 DNA de uma célula de E coli lisada Nesta micrografia eletrônica diversos plasmídeos circulares pequenos estão indicados por setas brancas Os pontos pretos e as manchas brancas são arte fatos da preparação TABELA 242 Conteúdo de DNA genes e cromossomos de alguns genomas DNA total pb Número de cromossomos Número aproximado de genes Escherichia coli K12 bactéria 4639675 1 4435 Saccharomyces cerevisiae levedura 12080000 16 5860 Caenorhabditis elegans nematódeo 90269800 12 23000 Arabidopsis thaliana planta 119186200 10 33000 Drosophila melanogaster moscadafruta 120367260 18 20000 Oryza sativa arroz 480000000 24 57000 Mus musculus camundongo 2634266500 40 27000 Homo sapiens humano 3070128600 46 29000 Nota Estas informações são constantemente aprimoradas Para obter os dados mais recentes consulte as páginas na Internet de cada projeto individual de genoma O dado corresponde ao número diploide para todos os eucariotos exceto para a levedura Número haploide de cromossomos Linhagens selvagens de levedura geralmente têm oito octaploide ou mais conjuntos de cromossomos Número para fêmeas com dois cromossomos X Os machos têm um cromossomo X mas não têm cromossomo Y perfazendo um total de 11 cromossomos Nelson6edbookindb 982 Nelson6edbookindb 982 030414 0747 030414 0747 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 983 As células eucarióticas também têm organelas mitocôn drias Figura 246 e cloroplastos que contêm DNA As moléculas de DNA mitocondrial mtDNA são muitos meno res do que os cromossomos nucleares Nas células animais o mtDNA contém menos do que 20000 pb 16569 pb no mtDNA humano e é um duplex circular Geralmente cada mitocôndria tem de 2 a 10 cópias dessa molécula de mtDNA e esse número pode chegar a centenas em certas células de um embrião que esteja em processo de diferenciação celular Em poucos organismos p ex tripanossomos cada mitocôndria contém milhares de cópias de mtDNA organizadas em uma matriz complexa e intricada denomi nada cinetoplasto O mtDNA de células vegetais mede de 200000 a 2500000 pb O DNA dos cloroplastos cpDNA também existe como duplex circular e seu tamanho varia de 120000 a 160000 pb A origem evolutiva do DNA de mitocôndrias e de cloroplastos é alvo de muita especulação Uma opinião amplamente aceita afirma que eles são ves tígios de cromossomos de bactérias muito primitivas que tiveram acesso ao citoplasma de células hospedeiras e se tornaram precursores dessas organelas ver Figura 138 O DNA mitocondrial codifica os tRNA e rRNA da mitocôn dria além de poucas proteínas mitocondriais Mais de 95 das proteínas mitocondriais são codificadas pelo DNA nu clear As mitocôndrias e os cloroplastos se dividem quando a divisão celular ocorre Os seus DNA são replicados antes e durante a divisão e as moléculasfilhas de DNA passam para as organelas filhas a b FIGURA 245 Cromossomos eucarióticos a Um par de cromátidesirmãs de um cromossomo hu mano associadas e condensadas Os cromossomos eucarióticos ficam neste estado após a replicação na metáfase durante a mitose b Conjunto completo de cromossomos de um leucócito de um dos autores deste livro Existem 46 cromossomos em cada célula somática humana normal FIGURA 246 Mitocôndria em divisão Alguns RNA e proteínas mitocon driais são codificados por uma das cópias do DNA mitocondrial nenhum é visível na figura O DNA mtDNA é replicado cada vez que a mitocôndria se divide antes da divisão celular Nelson6edbookindb 983 Nelson6edbookindb 983 030414 0747 030414 0747 984 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os genes eucarióticos e os cromossomos são muito complexos Muitas espécies de bactérias têm apenas um cromossomo por célula e em praticamente todos os casos cada cromos somo contém apenas uma cópia de cada gene Pouquíssimos genes como aqueles dos rRNA estão repetidos várias vezes Os genes e as sequências regulatórias perfazem quase todo o DNA nas bactérias Além disso quase todos os genes são precisamente colineares com as sequências de aminoácidos ou sequências de RNA que eles codificam Figura 242 A organização dos genes no DNA de eucariotos é mui to mais complexa estrutural e funcionalmente O estudo da estrutura dos cromossomos eucarióticos e mais recen temente o sequenciamento de genomas inteiros de euca riotos proporcionaram muitas surpresas Muitos se não a maioria dos genes de eucariotos têm uma característica estrutural distinta e enigmática as sequências de nucleo tídeos contêm um ou mais segmentos intercalados de DNA que não codificam a sequência de aminoácidos do produto polipeptídico Esses insertos não traduzidos interrompem a relação colinear entre a sequência de nucleotídeos do gene e a sequência de aminoácidos do polipeptídeo que ele codi fica Tais segmentos de DNA não traduzidos nos genes são denominados sequências intervenientes ou íntrons e os segmentos codificantes são denominados éxons Pou cos genes bacterianos contêm íntrons Nos eucariotos superioresum gene típico tem muito mais sequências de íntrons do que sequências de éxons Por exemplo no gene que codifica a única cadeia polipeptídica da ovoalbumina uma proteína do ovo das aves Figura 247 os íntrons são muito mais longos do que os éxons Ao todo sete íntrons perfazem 85 do DNA do gene O gene da titina uma pro teína muscular é o campeão de íntrons com 178 íntrons Os genes das histonas parecem não ter íntrons Na maioria dos casos a função dos íntrons não é clara No total apenas cerca de 15 do DNA humano é codificante ou éxons do DNA contendo informação para produtos proteicos Entretanto quando os íntrons muito maiores são incluídos no cálculo até 30 do genoma humano consiste em genes Uma grande quantidade de trabalho deve ser feita para compreender as outras sequências genômicas Boa parte do DNA que não faz parte de genes está na forma de sequên cias repetidas de vários tipos Esses incluem os elementos de transposição transposons parasitas moleculares que constituem aproximadamente a metade do DNA no genoma humano ver Figura 929 e Capítulos 25 e 26 Aproximadamente 3 do genoma humano é constituído por sequências altamente repetitivas também chamadas de DNA de sequências simples ou repetições de se quência simples SSR de simple sequence repeats Es sas sequências curtas geralmente com comprimento menor do que 10 pb algumas vezes são repetidas milhões de vezes em cada célula As repetições de sequência simples também são chamadas de DNA satélite porque a sua composição de bases incomum geralmente as faz migrar como bandas satélites separadas do restante do DNA quando amos tras de DNA celular fragmentado são centrifugadas em gra dientes de densidade de cloreto de césio Estudos sugerem que essas sequências não codificam proteínas nem RNA Di ferentemente dos elementos transponíveis as sequências de DNA altamente repetitivas podem ter importância funcional identificável no metabolismo celular humano porque gran de parte delas está associada a duas características distintas dos cromossomos eucariotos centrômeros e telômeros O centrômero Figura 248 é uma sequência de DNA que funciona durante a divisão celular como ponto de anco ragem para proteínas que fixam os cromossomos ao fuso mi tótico Essa fixação é essencial para que haja uma distribuição equitativa e ordenada do conjunto de cromossomos para as célulasfilhas Os centrômeros de Saccharomyces cerevisiae foram isolados e estudados As sequências essenciais para a função do centrômero têm comprimento de cerca de 130 pb e são muito ricas em pares AT As sequências centroméricas dos eucariotos superiores são muito maiores e ao contrário daquelas da levedura geralmente contêm DNA de sequência simples constituído por milhares de cópias em tandem de uma ou de umas poucas sequências curtas de 5 a 10 pb na mesma orientação O papel exato do DNA de sequência sim ples no funcionamento do centrômero ainda não é conhecido Telômeros do grego telos fim são sequências nos finais dos cromossomos eucariotos que ajudam a estabilizar o cro mossomo Os telômeros terminam por múltiplas sequências repetidas na forma de 59TxGyn 39AxCyn onde x e y são geralmente valores entre 1 e 4 Tabela 243 O número de sequências repetidas nos telômeros n varia de 20 a 100 para a maioria dos eucariotos unicelulares e é geralmente maior do que 1500 nos mamíferos As extremi dades da molécula linear de DNA não podem ser rotinei ramente replicadas pela maquinaria de replicação celular possível razão para que a molécula de DNA de bactérias A B C D E F G 1 2 3 4 5 6 7 Gene da ovoalbumina A 131 pb B 851 pb 1 90 pb 2 222 pb 3 126 pb L Subunidade b da hemoglobina Éxon Íntron FIGURA 247 Íntrons em dois genes eucarióticos O gene da ovoalbumina tem sete íntrons de A a G interrompendo as sequências codificantes em oito éxons L e de 1 a 7 O gene da subunidade b da hemoglobina tem dois íntrons e três éxons incluindo um íntron que sozinho contém mais da metade dos pares de base do gene Nelson6edbookindb 984 Nelson6edbookindb 984 030414 0747 030414 0747 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 985 seja circular As sequências teloméricas repetidas são adi cionadas às extremidades dos cromossomos dos eucariotos principalmente pela enzima telomerase ver Figura 2638 Cromossomos artificiais Capítulo 9 foram construídos a fim de compreender melhor a significância funcional das muitas características estruturais dos cromossomos euca riotos Um cromossomo artificial linear razoavelmente está vel necessita de apenas três componentes um centrômero um telômero em cada extremidade e sequências que pos sibilitem o início da replicação do DNA Foram desenvol vidos cromossomos artificiais de levedura YAC de yeast artificial chromosome ver Figura 96 como ferramenta de pesquisa em biotecnologia De maneira semelhante es tão sendo desenvolvidos cromossomos artificiais humanos HAC de human artificial chromosome para o trata mento de doenças genéticas por terapia gênica somática Estes podem fornecer uma nova maneira para a reposição intracelular de produtos gênicos ausentes ou defeituosos ou terapia gênica somática RESUMO 241 Elementos cromossômicos c Genes são segmentos de um cromossomo que contêm a informação para polipeptídeos funcionais ou moléculas de RNA Além dos genes os cromossomos contêm uma variedade de sequências regulatórias envolvidas na re plicação na transcrição e em outros processos c Moléculas de DNA genômico e de RNA geralmente têm comprimentos de várias ordens de magnitude maiores do que as partículas virais ou células que as contêm c Muitos genes nas células eucarióticas mas poucos nas bactérias e em arqueias são interrompidos por sequên cias não codificantes ou íntrons Os segmentos codifi cantes separados por íntrons são denominados éxons c Aproximadamente em torno de 15 do DNA genômico humano codifica para proteínas Mesmo quando os ín trons são incluídos menos de um terço do DNA genô mico humano é constituído por genes Grande parte do restante é constituída por sequências repetidas de vários tipos Ácidos nucleicos parasitas conhecidos como trans posons perfazem cerca de metade do genoma humano c Os cromossomos eucarióticos têm dois importantes ti pos de sequências de DNA repetitivo com funções es peciais os centrômeros que são pontos de fixação do fuso mitótico e os telômeros localizados nas extremi dades dos cromossomos 242 DNA supertorcido O DNA celular como foi visto anteriormente é extrema mente compactado o que implica um alto grau de organi zação estrutural O mecanismo de enovelamento deve não só compactar o DNA mas também permitir acesso à infor mação nele contida Antes de considerar como isso ocorre nos processos de replicação e transcrição será examinada uma propriedade importante da estrutura do DNA conheci da como supertorção Supertorção significa enrolar uma espiral Um fio de telefone por exemplo é geralmente uma espiral O pedaço de fio entre a base do telefone e o fone geralmente inclui uma ou mais supertorções Figura 249 O DNA é espi ralado na forma de uma duplahélice em que cada uma das cadeias do DNA se enrola ao redor de um eixo O enrola mento do eixo sobre si mesmo Figura 2410 produz o DNA supertorcido Como será detalhado a seguir o DNA supertorcido geralmente é uma manifestação de tensão es trutural Quando não há curvatura do eixo sobre si mesmo dizse que o DNA está no estado relaxado Sequências simples genes repetições dispersas e múltiplas origens de replicação Telômero Centrômero Telômero FIGURA 248 Elementos estruturais importantes de um cromossomo de levedura TABELA 242 Sequências teloméricas Organismo Sequência repetida no telômero Homo sapiens humano TTAGGG n Tetrahymena thermophila protozoário ciliado TTGGGGn Saccharomyces cerevisiae levedura TG13TG23n Arabidopsis thaliana planta TTTAGGGn Supertorção Torção FIGURA 249 Supertorção Um fio de telefone comum é torcido como a hélice de DNA e a corda espiralada pode estar torcida em uma supertorção A ilustração é especialmente apropriada porque a observação de um fio de telefone ajudou Jerome Vinograd e seus colaboradores a ter a ideia de que muitas das propriedades de pequenos DNA circulares poderiam ser explica das pela supertorção A primeira detecção de DNA supertorcido por esses pesquisadores em pequenos DNA circulares virais ocorreu em 1965 Nelson6edbookindb 985 Nelson6edbookindb 985 030414 0747 030414 0747 986 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Seria possível prever que a compactação do DNA envol ve alguma forma de supertorção Talvez seja menos previsí vel o fato de que tanto a replicação quanto a transcrição do DNA também afetam e são afetadas pela supertorção Am bos os processos necessitam que as duas cadeias do DNA se separem um processo complicado pelo entrelaçamento das cadeias como mostrado na Figura 2411 O fato de que a molécula de DNA consiga se dobrar so bre si mesma e tornarse supertorcida em um DNA celular altamente compactado pareceria lógico e talvez trivial não fosse um fator adicional muitas moléculas de DNA circu lares permanecem altamente supertorcidas mesmo depois de serem extraídas e purificadas portanto isentas de pro teínas e de outros componentes celulares Isso indica que a supertorção é uma propriedade intrínseca da estrutura terciária do DNA Ela ocorre em todos os DNA celulares e é altamente regulada em cada célula Várias propriedades mensuráveis da supertorção do DNA foram determinadas e o estudo da supertorção forneceu in dícios para a compreensão da estrutura e da função do DNA Esse trabalho se baseou fundamentalmente em conceitos vindos de um ramo da matemática denominado topologia isto é o estudo das propriedades de um objeto que não se modifica sob contínua deformação Para o DNA a deforma ção contínua inclui as mudanças conformacionais devidas ao movimento provocado pela energia térmica ou à interação com proteínas e outras moléculas A deformação descontí nua envolve quebra da cadeia de DNA No caso de uma molé cula de DNA circular uma das propriedades topológicas é o fato de não ser afetada pelas deformações da cadeia de DNA desde que não ocorram quebras na cadeia As propriedades topológicas são alteradas apenas por quebra e religação do arcabouço de uma ou ambas as cadeias de DNA A seguir serão examinadas as propriedades fundamen tais e as bases físicas da supertorção A maior parte do DNA celular se encontra subenrolado Para entender a supertorção é preciso primeiro direcionar a atenção para as propriedades de DNA circulares pequenos como os plasmídeos e os pequenos DNA virais Quando um DNA desses não tem quebras em nenhuma de suas duas ca deias ele é denominado DNA circular fechado Se o DNA de uma molécula circular fechada apresenta uma conforma Duplahélice de DNA espiralada DNA supertorcido Eixo FIGURA 2410 DNA supertorcido Quando o eixo de um DNA de dupla hélice se enrola sobre si mesmo ele forma uma nova hélice superhélice A superhélice de DNA normalmente é denominada supertorcida a DNA subenrolado DNA subenrolado b Direção de transcrição RNA polimerase RNA DNA 39 59 FIGURA 2411 Os efeitos da replicação e da transcrição no DNA su pertorcido A separação das hélices leva ao estresse e à supertorção pois o DNA está aprisionado não está livre para girar antes da separação das cadeias porque o DNA é uma estrutura de duplahélice a O efeito geral pode ser ilustrado torcendo duas fitas de borracha uma sobre a outra para formar uma duplahélice Se um lado é aprisionado a separação das duas fitas na outra extremidade levará a uma torção b Na molécula de DNA o progresso da DNApolimerase ou da RNApolimerase como mostrado aqui ao longo do DNA envolve a separação das hélices O resultado é que o DNA fica superenrolado na frente da enzima a montante e subenrolado atrás dela a jusante As setas vermelhas indicam a direção do enrolamento Nelson6edbookindb 986 Nelson6edbookindb 986 030414 0747 030414 0747 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 987 ção próxima da estrutura da forma B a estrutura de Watson e Crick ver Figura 813 com uma volta da duplahélice a cada 105 pb o DNA está relaxado e não supertorcido Figu ra 2412 A supertorção ocorre quando o DNA é submetido a alguma forma de tensão estrutural O DNA circular fechado quando purificado raramente está relaxado independente mente da sua origem biológica Além disso DNA derivado de determinado tipo de célula tem um grau característico de su pertorção Portanto a estrutura do DNA é tensionada de uma maneira regulada pela célula de modo a induzir supertorção Em praticamente todos os casos a tensão é o resultado do subenrolamento da duplahélice de DNA circular fe chado Em outras palavras o DNA tem um número menor de voltas da hélice do que o esperado para uma estrutura na forma B Os efeitos desse subenrolamento estão resumidos na Figura 2413 Um segmento de 84 pb de DNA circular no estado relaxado deve conter oito voltas da duplahélice uma a cada 105 pb Se uma dessas voltas é removida serão 84 pb7 5 120 pb por volta em vez das 105 encontradas no BDNA Figura 2413b Isso é um desvio da forma de DNA mais estável e como resultado a molécula fica termodina micamente tensionada Em geral muito dessa tensão pode ser acomodada pelo enrolamento do eixo do DNA sobre si mesmo formando uma supertorção Figura 2413c parte da tensão nesse segmento de 84 pb poderia ser simples mente dispersada na estrutura de uma molécula grande de DNA não enrolada Em princípio a tensão pode também ser acomodada pelo afastamento das duas cadeias de DNA a uma distância de cerca de 10 pb Figura 2413d No caso de DNA circular fechado isolado a tensão introduzida pelo subenrolamento geralmente é acomodada pela supertor ção e não pela separação das cadeias pois o enrolamento do eixo do DNA geralmente precisa de menos energia do que a quebra das ligações de hidrogênio que estabilizam o pareamento de bases Observe entretanto que o suben rolamento do DNA in vivo torna a separação das cadeias mais fácil facilitando o acesso à informação ali contida Cada célula cria ativamente um subenrolamento no seu DNA com o auxílio de processos enzimáticos descritos a seguir e o estado tensionado resultante representa uma forma de armazenamento de energia As células mantêm o DNA em estado subenrolado para facilitar sua compactação por torção O subenrolamento do DNA também é importan te para as enzimas do metabolismo do DNA que devem pro vocar a separação das cadeias como parte de sua função O estado subenrolado pode ser mantido somente se o DNA for um círculo fechado ou se for estabilizado por liga ção a proteínas de maneira que as cadeias não estejam li vres para girarem uma sobre a outra Se houver uma quebra em uma das cadeias de um DNA circular isolado e livre de proteínas a rotação livre nesse ponto espontaneamente re verterá o subenrolamento para o estado relaxado Em uma molécula de DNA circular fechada entretanto o número de voltas da hélice não pode ser alterado sem que ocorra ao menos uma quebra transitória em uma das cadeias Assim 02 mm FIGURA 2412 DNA de plasmídeos relaxados e supertorcidos A molécula na micrografia eletrônica mais à esquerda está relaxada O grau de supertorção aumenta da esquerda para a direita a Relaxado 8 voltas d Separação das cadeias b Tensionado 7 voltas c Supertorcido FIGURA 2413 Efeitos do subenrolamento do DNA a Segmento de DNA de molécula circular fechada com comprimento de 84 pb na forma relaxada com oito voltas na hélice b A remoção de uma volta provoca tensão na estrutura c A tensão geralmente é acomodada pela formação de uma supertorção d O subenrolamento do DNA também facilita a sepa ração das cadeias Em princípio cada volta que é desenrolada deve facilitar a separação das cadeias por cerca de 10 pb como está mostrado na figura Entretanto as ligações de hidrogênio entre os pares de bases geralmente impedem a separação das cadeias de DNA em distâncias curtas como essa e o efeito se torna importante apenas no caso de DNA mais longos e com maiores níveis de subenrolamento Nelson6edbookindb 987 Nelson6edbookindb 987 030414 0747 030414 0747 988 DAVID L NELSON MICHAEL M COX C x y ZO O Quebra na cadeia b Lk indefinido ALk 2 Yy b Lk6 a Lk 200 os FIGURA 2414 Numero de ligagao Lk Nesta figura como de costume cada linha azul representa uma cadeia de uma molécula de DNA de fita du pla Na molécula em a Lk 1 e na molécula em b Lk 6 Uma das cadeias em b esta representada nao torcida para fins de ilustragao e define os limites de uma superficie imaginaria sombreada em azul O numero de c Lk 198 vezes que a Cadeia representada enrolada passa por essa superficie fornece a definigao exata de numero de ligaao FIGURA 2415 Numero de ligacdo aplicado a moléculas de DNA cir cular fechado Representacao de um DNA circular com 2100 pb em trés formas distintas a relaxado Lk 200 b relaxado com um corte quebra o numero de voltas da hélice em uma molécula de DNA for muma das cadeias Lk indefinido subenrolado em duas voltas Lk 198 nece uma descricao precisa da supertorcao A molécula subenrolada geralmente existe como molécula supertorcida mas 0 subenrolamento também facilita a separacdo das fitas do DNA 0 subenrolamento do DNA é definido pelo numero de inara a Podese agora expandir essas ideias para um DNA circu ligagao topologico lar fechado com 2100 pb Figura 2415a Quando a mo O campo da topologia fornece algumas ideias uteis para dis cuJa estiver relaxada 0 ntimero de ligacdo é simplesmente cutir o DNA supertorcido particularmente o conceito de o ntimero de pares de bases dividido pelo nimero de pares numero de ligagao O numero de ligagao é uma proprieda ge pases por volta que é proximo de 105 neste caso Lk de topologica de DNA de cadeia dupla porque ele nao varia 999 Para uma molécula de DNA circular ter uma proprie quando 0 DNA é dobrado ou deformado desde que ambas gage topologica com esse ntimero de ligacdo nenhuma das as cadeias de DNA permanegam intactas O numero de liga cadeias deve ter quebra Se houver uma quebra em alguma cao Lk esta ilustrado na Figura 2414 das cadeias as cadeias podem em principio se desenro Inicialmente sera visualizada a separagao de duas cadeias jarem e se separarem completamente Nesse caso nao ha de DNA circular de cadeia dupla Se as duas cadeias estive ligacdo topologica e Lk é indefinido Figura 2415b rem associadas como esta mostrado na Figura 2414a elas Agora possivel descrever 0 subenrolamento do DNA estao efetivamente unidas pelo que pode ser descrito como gm termos de mudanca no ntimero de ligacao O ntimero ligacao topologica Mesmo que todas as ligacées de hidrogé de ligacéio no DNA relaxado Lk é usado como referén nio as interagées por empilhamento de bases fossem aboli Gig No caso da molécula mostrada na Figura 2415a Lk das de modo que as duas cadeias nao tenham contato fisico 200 Caso sejam removidas duas voltas dessa molécula Lk essa ligagao topologica ainda poderia manter as duas cadeias 198 A mudanea pode ser descrita pela equacao unidas Observe uma das cadeias circulares pelo contorno de uma superficie tal como um filme de sabio que ocupa 0 ALK Lk Lk 198 200 2 241 espago delimitado por um fio circular antes de vocé soprar Geralmente é conveniente expressar a mudanca no ntime uma bolha de sabao O numero de ligagao pode ser defini ro de ligacdo em termos de uma grandeza que seja indepen do como o numero de vezes que a segunda cadeia atravessa dente do comprimento da molécula de DNA Essa quantidade essa superficie No caso da molécula da Figura 2414aLk denominada diferenca de ligacdo especifica oc ou den 1 Para a molécula na Figura 2414b Lk 6 O numero de sidade de superhélice é uma medida do ntimero de voltas ligagao de um DNA circular fechado sempre um numero removidas em relacao ao ntimero existente no DNA relaxado inteiro Por convengao se as conexoes entre as duas cadeias ALk de DNA estiverem arranjadas de tal maneira que as cadeias c 242 se enrolem em uma hélice voltada para a direita o numero Lko de ligagao é positivo e se as duas cadeias se enrolarem No exemplo da Figura 2415c 0 001 indicando que 1 em uma hélice voltada para a esquerda o numero de ligagao 2 de 200 das voltas da hélice presentes no DNA na sua for é negativo Numeros de ligacgao negativos para todos os maB foi removido O grau de subenrolamento do DNA celu efeitos praticos néo sao encontrados no DNA lar geralmente fica entre 5 e 7 isto é a 005 a 007 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 989 O sinal negativo indica que a mudança no número de ligação é causada por um subenrolamento no DNA A supertorção induzida por subenrolamento é assim definida como uma supertorção negativa Do mesmo modo sob certas condi ções o DNA pode ser superenrolado resultando em uma su pertorção positiva Observe que o lado para o qual o eixo da hélice de DNA gira quando o DNA está subenrolado super torção negativa é a imagem especular do lado para o qual o DNA gira quando está superenrolado supertorção positiva Figura 2416 A supertorção não é um processo aleatório A via da supertorção é descrita em grande parte pela força que a torção exerce sobre o DNA ao diminuir ou aumentar o número de ligação em relação ao BDNA O número de ligação pode ser mudado por 61 pela quebra de uma cadeia de DNA uma extremidade girando em 360º so bre a cadeia onde não houve quebra de ligação e ligando nova mente as extremidades onde houve a quebra da cadeia Essa mudança não tem efeito sobre o número de pares de bases ou o número de átomos da molécula de DNA circular Duas formas de DNA circular que diferem apenas em uma proprie dade topológica são denominadas topoisômeros PROBLEMA RESOLVIDO 241 Cálculo da densidade da superhélice Qual é a densidade de superhélice s de um DNA circular fechado com comprimento de 4200 pb e um número de li gação Lk de 374 Qual é a densidade de superhélice do mesmo DNA quando Lk 5 412 Essas moléculas são nega tiva ou positivamente supertorcidas Solução Primeiro calcule Lk0 dividindo o comprimento do DNA circular fechado em pb por 105 pbvolta 4200 pb105 pbvolta 5 400 Podese agora calcular ΔLk a partir da Equação 241 ΔLk 5 Lk 2 Lk0 5 374 2 400 5 226 Substituindo os valores de ΔLk e Lk0 na Equação 24 2 s 5 ΔLkLk0 5 226400 5 20065 Uma vez que essa densidade de superhélice é negativa a molécula de DNA é supertorcida negativamente Quando a mesma molécula de DNA tem Lk de 412 ΔLk 5 412 2 400 5 12 e s 5 12400 5 003 A densidade de superhélice é positiva e a molécula é supertorcida positi vamente O número de ligação pode ser dissecado em dois compo nentes estruturais rotação Tw de twist e torção Wr de writhe Figura 2417 Esses conceitos são mais difí ceis de serem descritos do que o número de ligação mas a torção pode ser pensada como uma medida do espiralamen to do eixo da hélice e a rotação como determinante do local de torção ou relação espacial dos pares de bases vizinhos Quando o número de ligação é alterado um pouco da ten são resultante é geralmente compensada pela torção su pertorção e um pouco por mudança na rotação originando a seguinte equação Lk 5 Tw 1 Wr Tw e Wr não precisam ser números inteiros Rotação e tor ção são propriedades geométricas e não propriedades topo lógicas porque elas podem ser modificadas por deforma ções em uma molécula de DNA circular fechada Além de causar supertorção e provocar uma separação mais fácil das cadeias o subenrolamento do DNA facilita al terações estruturais na molécula Essas alterações têm me nor importância fisiológica mas ajudam a ilustrar os efeitos do subenrolamento Lembrese de que uma região crucifor me ver Figura 819 geralmente contém umas poucas bases não pareadas o subenrolamento do DNA ajuda a manter a separação de cadeias necessária Figura 2418 O suben rolamento de uma hélice de DNA voltada à direita também facilita a formação de pequenos estiramentos nas regiões de ZDNA voltado à esquerda em regiões onde a sequência de bases seja compatível com a forma Z ver Capítulo 8 As topoisomerases catalisam mudanças no número de ligação do DNA A supertorção do DNA é um processo regulado com pre cisão que influencia muitos aspectos do metabolismo do DNA relaxado Lk 5 200 DLk 5 12 DLk 5 22 Supertorções negativas Lk 5 198 Supertorções positivas Lk 5 202 FIGURA 2416 Supertorções negativas e positivas No caso da molé cula de DNA relaxado da Figura 2415a o subenrolamento ou superenrola mento por duas voltas da hélice Lk 5 198 ou 202 produzirá supertorções negativas ou positivas respectivamente Observe que o eixo do DNA se tor ce em direções opostas em cada caso Fita em posição reta DNA relaxado Zero de torção grande mudança na rotação Grande torção pequena mudança na rotação FIGURA 2417 Modelo de fita para ilustrar rotação e torção A fita cor de bronze representa o eixo de uma molécula de DNA relaxado A tensão introduzida pelo entrelaçamento das fitas desenrolando o DNA pode mani festarse como torção ou rotação Geralmente as mudanças topológicas no número de ligação são acompanhadas por alterações geométricas tanto na torção como na rotação Nelson6edbookindb 989 Nelson6edbookindb 989 030414 0747 030414 0747 990 DAVID L NELSON MICHAEL M COX DNA Cada célula tem enzimas cuja única função é desen rolar eou relaxar o DNA As enzimas que aumentam ou di minuem o grau de subenrolamento do DNA são as topoi somerases e a propriedade que elas modificam no DNA é o número de ligação Essas enzimas desempenham um papel muito importante em processos como a replicação e a compactação do DNA Existem duas classes de topoiso merases As topoisomerases do tipo I agem quebrando transitoriamente uma das duas cadeias do DNA passando a cadeia não rompida pela brecha e religando as extremida des quebradas Elas modificam Lk em incrementos de 1 As topoisomerases do tipo II quebram ambas as cadeias do DNA e modificam Lk em incrementos de 2 Os efeitos dessas enzimas podem ser demonstrados por meio de eletroforese em géis de agarose Figura 2419 Uma população de DNA de plasmídeos idênticos com o mesmo número de ligação migra como uma banda discreta durante a eletroforese Os topoisômeros com valores de Lk diferindo em apenas 1 podem ser separados por esse méto do de modo que mudanças no número de ligação induzidas por topoisomeraes são facilmente detectáveis E coli tem ao menos quatro topoisomerases diferentes I a IV As do tipo I topoisomerases I e III geralmente relaxam o DNA por remoção de supertorções negativas aumentando Lk A maneira pela qual as topoisomerases de tipo I bacterianas mudam o número de ligação está ilus trada na Figura 2420 Uma enzima bacteriana do tipo II denominada topoisomerase II ou DNAgirase pode intro duzir supertorções negativas diminuir Lk Para isso ela utiliza a energia do ATP Para alterar o número de ligação do DNA as topoisomerases do tipo II clivam as duas cadeias da molécula de DNA e passam outro duplex pela quebra O grau de supertorção do DNA bacteriano é mantido pela regulação da atividade das topoisomerases I e II As células eucarióticas também têm topoisomerases do tipo I e do tipo II As enzimas do tipo I são as topoiso merases I e III Nos vertebrados a única enzima do tipo II tem duas isoformas denominadas IIa e IIb A maioria das enzimas do tipo II incluindo a DNAgirase de arqueias é aparentada definindo a família denominada tipo IIA Arqueias também têm uma enzima incomum a topoiso merase VI que sozinha define a família do tipo IIB As topoisomerases do tipo II de eucariotos não conseguem desenrolar o DNA introduzir supertorções negativas mas podem relaxar tanto supertorções negativas quanto positivas Figura 2421 Como será estudado nos próximos capítulos as topoi somerases desempenham um papel fundamental em todos os aspectos do metabolismo do DNA Consequentemente elas são alvos importantes de fármacos no tratamento de infecções bacterianas e câncer Quadro 241 A compactação do DNA necessita de uma forma especial de supertorção As moléculas de DNA supertorcidas são uniformes sob vá rios aspectos As supertorções são voltadas para a direita DNA relaxado DNA subenrolado DNA cruciforme FIGURA 2418 Favorecimento de estruturas cruciformes pelo suben rolamento do DNA Em princípio estruturas cruciformes podem formarse em sequências palindrômicas ver Figura 819 mas raramente ocorrem em DNA na forma relaxada pois o DNA linear acomoda mais pares de bases em pareamento do que as estruturas cruciformes O subenrolamento do DNA facilita a separação parcial das cadeias necessária para propiciar a formação de estruturas cruciformes em sequências apropriadas DNA relaxado DNA altamente supertorcido 1 2 3 Lk decrescente FIGURA 2419 Visualização de topoisômeros Nesse experimento to das as moléculas de DNA apresentam o mesmo número de pares de bases mas exibem variação no grau de supertorção Uma vez que as moléculas de DNA supertorcidas são mais compactas do que as moléculas relaxadas elas migram mais rapidamente durante a eletroforese em gel Os géis aqui mostrados separam topoisômeros movimento de cima para baixo que va riam pouco na densidade de superhélice Na canaleta 1 o DNA altamente supertorcido migra como banda única mesmo que provavelmente estejam presentes vários topoisômeros As canaletas 2 e 3 ilustram os efeitos do trata mento de DNA supertorcido com topoisomerase do tipo I O DNA da cana leta 3 foi tratado por um período de tempo maior do que o DNA da canaleta 2 Como a densidade de superhélice do DNA fica diminuída até o ponto que corresponda à faixa na qual o gel pode separar topoisômeros individuais aparecem bandas diferentes Bandas individuais nas regiões indicadas pelo colchete próximo à canaleta 3 contêm DNA circular com o mesmo número de ligação e o número de ligação muda em 1 de uma banda para a outra Nelson6edbookindb 990 Nelson6edbookindb 990 030414 0747 030414 0747 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 991 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 39 59 DNA Topoisomerase tipo I 59 Tyr Conformação fechada 39 3959 Conformação aberta 5939 39 39 59 59 39 39 59 O O O P O O O O H Tyr H O OH O P H O O 59 Tyr Tyr O Tyr O OH O O P O O Base Base O O 39 59 O O O P O O O Base Base O O 39 O Base O 39 O Base O Base O 59 O Base O ➌ 5939 39 3959 A cadeia de DNA intacta passa pela quebra na outra cadeia ➋ A enzima muda para a conforma ção aberta ➊ A Tyr do sítio ativo ataca a ligação fosfodiéster de uma das cadeias de DNA clivandoa e criando uma ligação covalente 59fosfotirosil proteínaDNA Enzima na conformação fechada o 39OH liberado ataca a ligação 59fosfotirosil proteínaDNA ligando novamente a cadeia de DNA que havia sido quebrada ➍ MECANISMO FIGURA 2420 A reação da topoisomerase do tipo I A topoisomerase I bacteriana aumenta o Lk pela quebra de uma cadeia de DNA passando a cadeia intacta através da quebra e em seguida volta a selar a quebra O ataque nucleofílico pelo resíduo de Tyr do sítio ativo quebra uma cadeia de DNA As extremidades estão ligadas por um segundo ataque nucleofílico Em cada etapa uma ligação de alta energia substitui a outra Portão N DNA DNA Portão C Topoisomerase tipo IIa 2 ATP ADP 2Pi 2 A enzima formada por várias subuni dades se liga a uma molécula de DNA azulclaro Um segundo segmento da mesma molécula de DNA azulescuro se liga ao portão N O segundo segmento de DNA azulescuro passa através da quebra O DNA quebrado é religado e o segundo segmento de DNA é liberado pelo portão C O segundo segmento azulescuro fica preso O segmento azulclaro foi cortado nas duas cadeias para formar duas ligações 5fosfotirosil pontos vermelhos com a enzima ➊ ➋ ➌ ➍ ➎ FIGURA 2421 Alteração do número de ligação por topoisomerases do tipo IIa de eucariotos O mecanismo geral realça a passagem de um seg mento de DNA duplex intacto por meio de uma quebra transitória da cadeia dupla no outro segmento O segmento de DNA entra e sai da topoisomerase pela cavidade acima e abaixo do DNA ligado as quais são chamadas de portão N e portão C Dois ATP são ligados e hidrolisados durante esse ciclo A estrutura da enzima e o uso do ATP são específicos para essa reação Nelson6edbookindb 991 Nelson6edbookindb 991 030414 0747 030414 0747 992 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O estado topológico do DNA presente nas células está intimamente relacionado com sua função Sem topoiso merases as células não podem se replicar compactar o seu DNA ou expressar seus genes e morrem Por con seguinte os inibidores de topoisomerases se tornaram agentes farmacêuticos importantes direcionados contra agentes infecciosos e células malignas Duas classes de inibidores de topoisomerases bacte rianas foram desenvolvidas como antiobióticos As cuma rinas incluindo novobiocina e cumermicina A1 são pro dutos naturais derivados de espécies de Streptomyces Elas inibem a ligação de ATP a topoisomerases do tipo II bacterianas a DNAgirase e a topoisomerase IV Esses antibióticos não são usados com frequência para tratar infecções em humanos mas as pesquisas continuam para identificar variantes que sejam clinicamente efetivas Os antibióticos da quinolona também inibidores da DNAgirase e da topoisomerase IV bacterianas apare ceram inicialmente em 1962 com a introdução do ácido nalidíxico Esse composto tem eficiência limitada e não é mais usado clinicamente nos Estados Unidos mas o con tínuo desenvolvimento dessa classe de fármaco levou à introdução das fluoroquinolonas exemplificadas pela ci profloxacina Cipro As quinolonas agem bloqueando a última etapa da reação da topoisomerase a resselagem da quebra na cadeia de DNA A ciprofloxacina é um antibió tico de amplo espectro Ela é um dos poucos antibióticos de efetividade confiável no tratamento de infecções por carbúnculo e é um agente de valor considerável na prote ção contra um possível bioterrorismo As quinolonas são seletivas para as topoisomerases bacterianas inibindo as enzimas de eucariotos apenas em concentrações várias ordens de grandeza maiores do que as doses terapêuticas Alguns dos mais importantes agentes quimioterápicos usados no tratamento do câncer são inibidores de topoi somerases humanas Geralmente nas células tumorais as topoisomerases estão presentes em níveis elevados QUADRO 241 MEDICINA Curando doenças pela inibição de topoisomerases em uma molécula supertorcida negativamente Figura 2416 e tendem a ser estendidas e estreitas em vez de compactadas geralmente com muitas ramificações Figu ra 2422 Nas densidades de superhélice normalmente encontradas nas células o comprimento dos eixos super torcidos incluindo as ramificações perfaz cerca de 40 do comprimento total do DNA Esse tipo de supertorção é denominado plectonêmica do grego plektos torcido e FIGURA 2422 Supertorção plectonêmica a Mi crografia eletrônica de um plasmídeo de DNA plectone micamente supertorcido e b interpretação da estrutura observada As linhas de cor púrpura mostram o eixo da supertorção Observe a ramificação da supertorção c Re presentação idealizada dessa estrutura a c Pontos de ramificação b Eixo de supertorção Ácido nalidíxico O O H3C H3C N N OH Ciprofloxacina HN N O O N O F Irinotecano O O N N N OH N O CH3 CH3 O O Topotecano O HO N OH N O N CH3 CH3 CH3 O Nelson6edbookindb 992 Nelson6edbookindb 992 030414 0747 030414 0747 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 993 e agentes dirigidos contra essas enzimas são muito mais tóxicos aos tumores do que à maioria dos outros tipos de tecidos Inibidores das topoisomerases do tipo I e do tipo II foram desenvolvidos como medicamentos anticâncer A camptotecina isolada de uma árvore ornamental chinesa e testada clinicamente pela primeira vez na dé cada de 1970 é um inibidor das topoisomerases do tipo I de eucariotos Testes clínicos indicaram uma eficácia limitada apesar dos resultados promissores dos estu dos préclínicos realizados em camundongos Entretan to dois derivados efetivos o irinotecano Campto e o topotecano Hycamtin usados respectivamente para o tratamento do câncer colorretal e do câncer de ová rio foram desenvolvidos na década de 1990 É provável que nos próximos anos novos derivados sejam aprovados para uso clínico Todos esses medicamentos agem fixan do o complexo topoisomeraseDNA que clivou o DNA e inibindo a formação de nova ligação As topoisomerases do tipo II humanas são alvos de grande número de medicamentos anticâncer que in cluem a doxorrubicina Adriamicina etoposídeo Eto pofos e elipticina A doxorrubicina eficaz contra vários tipos de tumores humanos é uma antraciclina de uso clínico A maior parte desses medicamentos estabiliza o complexo covalente topoisomeraseDNA clivado Geralmente todos esses agentes anticâncer aumentam os níveis de dano ao DNA nas células tumoraisalvo que crescem rapidamente Entretanto tecidos não cancerí genos também podem ser afetados levando a uma toxi cidade generalizada e a efeitos colaterais indesejáveis que devem ser manejados durante a terapia À medida que as terapias contra o câncer se tornam mais eficazes e as esta tísticas de sobrevivência dos pacientes de câncer melho ram o aparecimento independente de novos tumores se tornará um grande problema Na busca contínua de novas terapias contra o câncer as topoisomerases provavelmen te permanecerão como alvo proeminente para pesquisas nema filamento Esse termo pode ser aplicado a qual quer estrutura com cadeias entrelaçadas de forma simples e regular e essa é uma boa descrição da estrutura geral do DNA supertorcido quando em solução A supertorção plectonêmica a forma observada em DNA isolados no laboratório não proporciona compactação su ficiente para acomodar o DNA dentro de uma célula Uma segunda forma de supertorção a forma solenoide Figura 2423 pode ser adotada por um DNA subenrolado Em vez de supertorções estendidas com orientação para a direita ca racterísticas das formas plectonêmicas a forma supertorcida solenoide envolve voltas apertadas orientadas à esquerda de maneira semelhante a uma mangueira de jardim cuidadosa mente enrolada em um carretel Embora as suas estruturas sejam completamente diferentes as supertorções plectonê micas e solenoides são duas formas de supertorção negativa que podem ser mantidas pelo mesmo segmento de DNA su benrolado As duas formas são facilmente interconversíveis Embora a forma plectonêmica seja mais estável em solução a forma solenoide pode ser estabilizada por proteínas ligantes e é a forma encontrada nos cromossomos eucarióticos Ela proporciona um grau muito maior de compactação Figura 2423 A supertorção solenoide é o mecanismo pelo qual o subenrolamento contribui para a compactação do DNA RESUMO 242 O DNA supertorcido c A maioria dos DNA celulares é supertorcida O suben rolamento diminui o número total de voltas da hélice do DNA relativamente à forma relaxada forma B Para manter um estado subenrolado o DNA deve estar na forma de círculo fechado ou associado a proteínas O su benrolamento é medido por um parâmetro topológico denominado número de ligação Lk c O subenrolamento é medido em termos de diferença de ligação específica s também denominada densidade de superhélice que é Lk 2 Lk0Lk0 Para DNA celular s tem valores típicos entre 2005 a 2007 o que significa Doxorrubicina O O O OH O OH OH H3C H3C NH2 OH OH O O Etoposídeo O OH OH OCH3 H3C CH3O O O O H O O OH O O Elipticina N N H CH3 CH3 Nelson6edbookindb 993 Nelson6edbookindb 993 030414 0747 030414 0747 994 DAVID L NELSON MICHAEL M COX que aproximadamente 5 a 7 das voltas da hélice no DNA foram removidas O DNA subenrolado facilita a separação das cadeias pelas enzimas do metabolismo do DNA c Os DNA que se diferenciam apenas pelo número de li gação são denominados topoisômeros As enzimas que determinam subenrolamento eou relaxam o DNA as topoisomerases catalisam mudanças no número de liga ção As duas classes de topoisomerases tipo I e tipo II alteram Lk em incrementos de 1 e 2 respectivamente por evento catalítico 243 Estrutura dos cromossomos O termo cromossomo é usado para se referir a uma mo lécula de ácido nucleico que é o repositório da informação genética de um vírus de uma bactéria de uma célula euca riótica ou de uma organela Também se refere a corpos den samente corados observados em núcleos de células eucari óticas coradas quando visualizadas em microscópio óptico A cromatina é formada por DNA e por proteínas O ciclo de uma célula eucariótica ver Figura 1244 pro duz mudanças notáveis na estrutura dos cromossomos Fi gura 2424 Em células eucarióticas que não estejam se dividindo em G0 e naquelas em interfase G1 S e G2 o material cromossômico a cromatina é amorfo e se mostra aleatoriamente distribuído em certas partes do núcleo Na fase S da interfase o DNA nesse estado amorfo se replica e cada cromossomo produz dois cromossomosirmãos de nominados cromátidesirmãs que permanecem associados entre si após o final da replicação Os cromossomos se tor nam muito mais condensados durante a prófase da mito se tomando a forma do número de pares bem definidos de cromátidesirmãs específico da espécie Figura 245 A cromatina é constituída por fibras contendo proteína e DNA em proporções aproximadamente iguais em massa e ainda uma pequena quantidade de RNA O DNA na cro matina está associado muito firmemente a proteínas deno minadas histonas que empacotam e organizam o DNA em unidades estruturais denominadas nucleossomos Figu ra 2425 Na cromatina também são encontradas outras proteínas além das histonas algumas ajudam a manter a estrutura dos cromossomos e outras regulam a expressão de genes específicos Capítulo 28 Iniciando pelos nucleos somos o DNA cromossômico eucariótico é empacotado em sucessivas estruturas altamente organizadas que ao final produzem os cromossomos altamente compactos visualiza dos na microscopia óptica Agora será apresentada a des Plectonêmico Solenoide FIGURA 2423 Supertorção plectonêmica e supertorção solenoide da mesma molécula de DNA desenhadas em escala A supertorção plectonêmica toma a forma de uma espiral orientada à direita A supertorção solenoide negativa toma a forma de voltas apertadas orientadas à esquerda ao redor de uma estrutura tubular imaginária As duas formas são facilmente interconvertidas embora a forma solenoide em geral não seja observada a menos que certos tipos de proteínas estejam ligados ao DNA A supertorção solenoide proporciona um grau muito maior de compactação G1 S G2 Mitose Prófase Metáfase Anáfase Telófase Interfase FIGURA 2424 Alterações na estrutura dos cromossomos durante o ciclo celular eucariótico As durações relativas das fases mostradas aqui foram escolhidas apenas por conveniência A duração de cada fase varia com o tipo de célula e com as condições de crescimento para organismos unicelulares ou com o estado metabólico para organismos multicelulares geralmente a mitose é a fase mais curta O DNA celular é descondensado durante a interfase como mostrado nos desenhos dos núcleos do diagrama O período de interfase pode ser dividido ver Figura 1244 em fase G1 gap 5 intervalo fase S síntese quando o DNA é replicado e a fase G2 duran te a qual os cromossomos replicados cromátides unemse um ao outro A mitose pode ser dividida em quatro estágios O DNA sofre condensação na prófase Durante a metáfase os cromossomos condensados se alinham em pares ao longo do plano a meio caminho entre os polos do fuso Os dois cro mossomos de cada par são ligados aos diferentes polos do fuso via microtú bulos que se estendem entre o fuso e os centrômeros As cromátidesirmãs se separam na anáfase e cada uma é puxada pelo fuso ao polo ao qual se co necta O processo é terminado na telófase Depois que a divisão celular está completa os cromossomos se descondensam e o ciclo começa novamente Nelson6edbookindb 994 Nelson6edbookindb 994 030414 0747 030414 0747 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 995 crição dessa estrutura nos eucariotos comparandoa com o empacotamento do DNA nas células bacterianas As histonas são proteínas básicas pequenas Encontradas na cromatina de todas as células eucarióticas as histonas têm peso molecular entre 11000 e 21000 e são muito ricas nos aminoácidos básicos arginina e lisina em conjunto esses aminoácidos perfazem um quarto do total de resíduos de aminoácidos Todas as células eucarióticas têm cinco classes principais de histonas que diferem no peso molecular e na composição de aminoácidos Tabela 244 As histonas H3 têm sequências de aminoácidos prati camente idênticas em todos os eucariotos do mesmo modo que as histonas H4 o que sugere uma conservação estrita nas suas funções Por exemplo apenas 2 dos 102 resíduos de aminoácidos são diferentes quando comparados às molé culas da histona H4 de ervilha e de bovino e apenas 8 resí duos diferem entre as histonas H4 de humanos e leveduras As histonas H1 H2A e H2B apresentam menor similaridade de sequência entre as espécies de eucariotos Cada tipo de histona está sujeito a modificações enzi máticas por metilação acetilação ADPribosilação fosfo rilação glicosilação sumoilação ou ubiquitinação Essas modificações afetam a carga elétrica líquida a forma e ou tras propriedades das histonas bem como as propriedades estruturais e funcionais da cromatina participando na re gulação da transcrição Além do mais os eucariotos geralmente têm várias for mas variantes de certas histonas principalmente das histo nas H2A e H3 descritas mais detalhadamente a seguir As formas variantes juntamente com suas modificações têm papéis específicos no metabolismo do DNA Os nucleossomos são as unidades fundamentais da organização da cromatina Os cromossomos dos eucariotos esquematizados na Figura 245 representam a compactação de uma molécula de DNA com comprimento de cerca de 10 5 mm dentro do núcleo da cé lula que tem diâmetro típico de 5 a 10 mm Essa compactação envolve vários níveis de enovelamento altamente organizado Submeter os cromossomos a tratamentos que os desenove lem parcialmente revela uma estrutura na qual o DNA está firmemente ligado a contas proteicas geralmente espaçadas regularmente As contas desse colar são complexos de DNA e histonas Essas contas juntamente com o DNA que as co necta formam o nucleossomo que é a unidade fundamental da organização da cromatina compactada de forma altamente ordenada Figura 2426 A conta de cada nucleossomo con tém oito moléculas de histonas duas cópias de H2A duas có pias de H2B duas cópias de H3 e duas cópias de H4 O espa çamento das contas do nucleossomo forma uma unidade que se repete geralmente a cada 200 pb dos quais 146 pb estão firmemente ligados ao redor do centro de oito histonas e os restantes servem de DNA de ligação entre as contas do nucle ossomo A histona H1 se liga ao DNA de ligação O breve trata mento da cromatina com enzimas que digerem DNA leva à de gradação preferencial do DNA de ligação liberando partículas de histonas contendo 146 pb de DNA associado que foram protegidas da digestão Pesquisadores cristalizaram centros nucleossômicos obtidos dessa maneira e a análise por difra ção por raios X mostra uma partícula formada por oito moléculas de histonas com o DNA enrolado na forma de um solenoide supertorcido com orientação voltada para esquerda Figura 2426 Estendendose a partir do nú cleo do nucleossomo estão as causas aminoterminais das histonas que são intrinsecamente desordenadas Figura 2426d A maioria das modificações nas histomas ocor re nessas caudas que por sua vez desempenham um pa pelchave na formação de contatos entre nucleossomos na cromatina Figura 2426e O exame detalhado dessa estrutura mostra por que o DNA dos eucariotos é subenrolado ainda que as células eucarióticas não tenham enzimas que cau sem esse subenrolamento É importante notar que o empacotamento do tipo solenoide do DNA nos nu cleossomos é apenas uma das formas de supertorção que pode ocorrer pelo subenrolamento supertorcido b 50 nm a DNA de ligação do nucleossomo Centro de histonas do nucleossomo FIGURA 2425 Nucleossomos a Os nucleossomos espaçados regular mente consistem em complexos de histonas associados ao DNA b Nessa micrografia eletrônica as estruturas octaméricas de histonas envoltas por DNA são claramente visíveis TABELA 244 Tipos e propriedades das histonas comuns Histona Peso molecular Número de resíduos de aminoácidos Conteúdo de aminoácidos básicos do total Lys Arg H1 21130 223 295 113 H2A 13960 129 109 193 H2B 13774 125 160 164 H3 15273 135 196 133 H4 11236 102 108 137 O tamanho dessas histonas varia um pouco de espécie para espécie Os valores se referem a histonas de bovino Nelson6edbookindb 995 Nelson6edbookindb 995 030414 0747 030414 0747 996 DAVID L NELSON MICHAEL M COX negativamente do DNA A forte associação do DNA ao redor do centro de histonas necessita que uma volta da hélice de DNA seja removida Quando o centro proteico do nucleossomo se associa in vitro a um DNA circular relaxado a associação introduz um supertorção negativa Uma vez que esse processo de associação não cliva o DNA nem muda o número de ligação a formação de uma super torção solenoide negativa deve ser compensada por uma supertorção positiva na região do DNA não ligado a histo nas Figura 2427 Como mencionado as topoisomera ses de eucariotos podem relaxar supertorções positivas O relaxamento da região supertorcida não ligada a histonas deixa a supertorção negativa fixa por meio da ligação ao centro de histonas do nucleossomo e leva a uma diminui ção total no número de ligação De fato foi provado que topoisomerases são necessárias para rearranjar cromatina in vitro a partir de histonas purificadas e DNA circular Outro fator que afeta a ligação do DNA às histonas no centro dos nucleossomos é a sequência desse DNA ligado Os centros de histonas não ligam DNA aleatoriamente ao contrá rio eles tendem a se posicionar em certas localizações Esse posicionamento não é compreendido por completo mas em certos casos parece depender de uma abundância de pares de bases AT na hélice de DNA que fica em contato com as histonas Figura 2428 O agrupamento de dois ou três pares de base AT facilita a compreensão da cavidade menor necessária para que o DNA se envolva fortemente em torno do centro de histona do nucleossomo Os nucleossomos se li gam perfeitamente bem a sequências onde os dinucleotídeos AA ou AT ou TT estejam arranjados alternadamente em inter valos de 10 pb organização essa que pode corresponder in vivo a até 50 das posições ligadas a histonas Outras proteínas são necessárias para o posicionamen to de alguns centros de nucleossomos no DNA Em vários organismos certas proteínas se ligam a sequências especí ficas de DNA facilitando a formação de nucleossomos nas proximidades Os nucleossomos são depositados no DNA durante a replicação ou seguindose a outros processos que a b c H2A H4 H4 H2B H3 H2B H3 H3 H2A H4 DNA H2A FIGURA 2426 Enrolamento do DNA ao redor do centro de uma histo na a A estrutura simplificada de um octâmero do nucleossomo à esquer da com DNA enrolado em torno do centro da histona à direita b Uma representação de fita do nucleossomo da rã africana Xenopus laevis Cores diferentes representam as diferentes histonas correspondendo às cores em a c Representação da superfície do nucleossomo A vista em c está gira da em relação à vista em b para parear na orientação mostrada acima em a Um segmento de DNA de 146 pb na forma de solenoide supertorcida com orientação à esquerda enrolada em torno 167 vezes do complexo da histona d Duas visões das caudas aminoterminais da histona saindo en tre os dois DNA duplex supertorcidos em torno do nucleossomo Algumas caudas passam entre as supertorções através de buracos formados pelo ali nhamento das cavidades menores de hélices adjacentes As caudas de H3 e H2B surgem entre as duas espirais de DNA enroladas em torno da histona As caudas de H4 e H2A surgem entre subunidades de histonas adjacentes e As caudas aminoterminais de um nucleossomo surgem da partícula e inte ragem com nucleossomos adjacentes ajudando a definir uma ordem maior de empacotamento de DNA Caudas da histona d Visão lateral Visão frontal H3 H3 H4 H4 H2A H2A H2B H2B DNA Caudas aminoterminais Octâmero de histona e Nelson6edbookindb 996 Nelson6edbookindb 996 030414 0747 030414 0747 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 997 necessitam do deslocamento transitório dos nucleossomos A deposição parece ocorrer em etapas Um tetrâmero de duas histonas H3 e duas H4 se liga primeiramente seguido da deposição de dímeros H2AH2B A incorporação dos nu cleossomos nos cromossomos após a replicação cromossô mica é mediada por um complexo de chaperonas de histona que inclui proteínas conhecidas como fator de montagem da cromatina 1 CAF1 de chromatin assembly fator 1 RTT106 regulação de transposição de Ty1 e fator antis silenciador 1 ASF1 de antisilencing fator 1 Eles se ligam a variantes acetiladas de histonas H3 e H4 O meca nismo da deposição dos nucleossomos ainda não é conhe cido em detalhes embora se saiba que partes desse com plexo interajam diretamente com partes da maquinaria de replicação Algumas das mesmas chaperonas de histonas ou outras podem ajudar na montagem de nucleossomos após o reparo de DNA transcrição ou outros processos Em certos contextos fatores de troca de histonas permitem a substituição de histonas variantes no centro de histonas O posicionamento apropriado dessas variantes de histonas é importante Estudos têm demonstrado que camundongos sem uma dessas histonas variantes morrem nas primeiras fases de embrião Quadro 242 O posicionamento exato do centro dos nucleossomos também exerce um papel na expressão de certos genes eucarióticos Capítulo 28 Os nucleossomos são condensados em estruturas com níveis de organização sucessivamente maiores O invólucro do DNA ao redor do centro do nucleossomo compacta o comprimento do DNA em cerca de sete ve zes Entretanto a compactação final em um cromossomo é maior do que 10000 vezes grande evidência da exis tência de ordens maiores de organização estrutural Em cromossomos isolados por métodos muito brandos os centros de nucleossomos parecem estar organizados em uma estrutura denominada fibra de 30 nm Figura 24 29 Esse empacotamento inclui uma molécula de histona H1 por centro de nucleossomo Dois modelos para a or ganização das histonas e o DNA na fibra de 30 nm estão representados na Figura 2429 A organização em fibras de 30 nm não se estende por todo o cromossomo mas é pon tuada por regiões ligadas a proteínas não histonas que se ligam a regiões de DNA com sequências específicas A estrutura de 30 nm também parece depender da atividade transcricional de determinada região do DNA Aparente mente as regiões nas quais há transcrição de genes estão em estados menos ordenados que apresentam menos se é que alguma histona H1 A fibra de 30 nm o segundo nível da organização da cro matina fornece uma compactação do DNA de 100 vezes Os níveis mais altos de enovelamento ainda não estão com Centro de histonas a b c Supertorção negativa valor líquido DLk 5 0 DLk 5 21 Topoisomerase Supertorção negativa ligada solenoide Supertorção positiva não ligada plectonêmica DNA FIGURA 2427 Montagem da cromatina a DNA circular fechado rela xado b A ligação ao centro de histonas que forma o nucleossomo induz uma supertorção negativa Na ausência de qualquer quebra no DNA uma supertorção positiva deve formarse em outro lugar do DNA Lk 5 0 c O relaxamento dessa supertorção positiva por uma topoisomerase deixa uma supertorção negativa líquida Lk 5 21 Dois ou mais G C pb Dois ou mais G C pb Dois ou mais G C pb Dois ou mais G C pb Dois ou mais G C pb Dois ou mais G C pb Dois ou mais G C pb Dois ou mais G C pb Dois ou mais G C pb Dois ou mais G C pb Dois ou mais A T pb Dois ou mais A T pb Dois ou mais A T pb Dois ou mais A T pb Dois ou mais A T pb Dois ou mais A T pb Nucleossomo Dois ou mais A T pb Dois ou mais A T pb Dois ou mais A T pb Dois ou mais A T pb FIGURA 2428 O efeito da sequência do DNA na ligação do nucleos somo PDB ID 1AOI Períodos de dois ou mais pares de bases AT facilita a flexão do DNA enquanto períodos de dois ou mais pares de bases GC têm o efeito oposto Pares de bases AT consecutivos ajudam na flexão do DNA em um círculo quando eles estão separados por intervalos de em torno de 10 pb Quando pares de bases GC estão separados por 10 pb e deslocados por 5 pb de períodos de pares de base AT a ligação do DNA ao cromos somo é facilitada Nelson6edbookindb 997 Nelson6edbookindb 997 030414 0747 030414 0747 998 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A informação passada de uma geração a outra para as célulasfilhas na divisão celular ou dos pais para sua prole não codificada em sequências de DNA é denominada informação epigenética A maior parte dessa informa ção está na forma de modificações covalentes das histo nas eou no posicionamento de variantes de histonas nos cromossomos As regiões da cromatina onde está ocorrendo expres são ativa de genes transcrição tendem a ser parcialmen te descondensadas e são denominadas eucromatina Nessas regiões as histonas H3 e H2A são muitas vezes substituídas pelas histonas variantes H33 e H2AZ res pectivamente Figura Q1 Os complexos que depositam nucleossomos contendo variantes de histonas no DNA são semelhantes àqueles que depositam nucleossomos com as histonas mais comuns Nucleossomos contendo histona H33 são depositados por um complexo no qual o fator de montagem da cromatina 1 CAF1 é substituído pela pro teína HIRA o nome é derivado de uma classe de proteínas denominadas de HIR repressor de histonas Tanto CAF1 quanto HIRA podem ser considerados chaperonas de his tonas por ajudarem a assegurar a montagem e o posiciona mento apropriados dos nucleossomos A histona H33 se diferencia da H3 quanto à sequência em apenas quatro resíduos de aminoácidos mas esses resíduos desempe nham um papelchave na deposição das histonas Assim como a histona H33 a H2AZ está associada a um complexo diferente de deposição do nucleossomo estando geralmente associada a regiões da cromatina en volvidas em transcrição ativa A incorporação de H2AZ estabiliza o octâmero do nucleossomo mas impede inte rações cooperativas entre os nucleossomos necessárias para compactar o cromossomo Isso leva a uma estrutura mais aberta do cromossomo o que facilita a expressão de genes na região onde está localizada a histona H2AZ O gene que codifica H2AZ é essencial nos mamíferos Na moscadafruta a perda de H2AZ impede o desenvolvi mento além dos estágios larvais Outra variante da H2A é a H2AX que está associa da ao reparo do DNA e à recombinação genética Em camundongos a ausência de H2AX leva à instabilidade genômica e à infertilidade nos machos Quantidades mo destas de H2AX parecem estar espalhadas ao longo do genoma Quando ocorre uma quebra em uma fita dupla moléculas de H2AX da vizinhança são fosforiladas na Ser 139 da região carboxiterminal O bloqueio experimen tal dessa fosforilação inibe a formação dos complexos proteicos necessários para o reparo do DNA A variante da histona H3 conhecida como CENPA está associada a sequências repetidas de DNA nos cen trômeros A cromatina da região dos centrômeros con tém as chaperonas de histonas CAF1 e HIRA Essas duas proteínas podem estar envolvidas na deposição dos nu cleossomos contendo CENPA A eliminação do gene da CENPA é letal em camundongos A função e a localização de variantes de histonas po dem ser estudadas pela aplicação de tecnologias usadas em genômica Uma técnica útil é a imunoprecipitação de cromatina cromatina IP ou ChIP Nucleossomos con tendo determinada histona variante são precipitados por anticorpos que ligam especificamente essa variante Es ses nucleossomos podem ser estudados isolados do seu DNA mas geralmente o DNA associado está incluído no estudo para determinar onde os nucleossomos de interes se se ligam O DNA pode ser marcado e usado como sonda em um microarranjo ver Figura 923 para produzir um mapa de sequências genômicas às quais se ligam esses de terminados nucleossomos Uma vez que os microarranjos QUADRO 242 MÉTODOS Epigenética estrutura dos nucleossomos e variantes de histonas H3 H33 CENPA H2A H2AX H2AZ H2B H4 HFD HFD HFD HFD HFD HFD HFD CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 P CH3 CH3 CH3 P P P HFD CH3 CH3 P P P FIGURA Q1 Diferentes variantes das histonas H3 H2A e H2B são conhe cidas Aqui estão mostradas as histonas que formam os centros de nucle ossomos e algumas variantes conhecidas Sítios de metilação de resíduos LysArg e de fosforilação de Ser estão indicados HFD indica um domínio de histona dobrado do inglês histonefold domain domínio estrutural comum a todas as histonas do centro do nucleossomo preendidos contudo parece que certas regiões do DNA se associam com um andaime cromossomal Figura 2430 As regiões associadas com esse andaime são separadas por alças de DNA com talvez 20 a 100 kpb O DNA em uma alça de DNA contém um conjunto de genes relacionados entre si O andaime pode conter várias proteínas especial mente topoisomerase II e proteínas SMC descrita acima A presença da topoisomerase I enfatiza ainda mais a rela ção entre o DNA subenrolado e a estrutura da cromatina A topoisomerase II é tão importante para a manutenção da estrutura da cromatina que inibidores dessa enzima podem matar rapidamente as células em divisão Vários fármacos Nelson6edbookindb 998 Nelson6edbookindb 998 030414 0747 030414 0747 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 999 são muitas vezes denominados de chips essa técnica é denominada um experimento ChIPchip Figura Q2 Histonas variantes juntamente com as muitas modi ficações que as histonas podem sofrer ajudam a definir e isolar as funções da cromatina Elas marcam a croma tina facilitando ou suprimindo funções específicas como segregação de cromossomos transcrição e reparo do DNA As modificações nas histonas não desaparecem na divisão celular ou durante a meiose e assim são parte da informação transmitida de uma geração para outra em todos os eucariotos a b Variante de histona Nucleossomos Sítios de clivagem pela MNase Marcação Cromatina isolada Digestão com nuclease de micrococos Precipitação com anticorpos contra a marcação Extração de DNA Sonda do microarranjo Célula Genes anotados H33 409 278 0 10 kbp 6550000 6560000 6570000 6580000 6590000 6720000 6710000 6700000 6680000 6670000 6660000 6650000 6640000 6630000 6620000 6610000 6600000 66900 00 FIGURA Q2 Um experimento ChIPchip foi planejado para mostrar as sequências de DNA genômico às quais se liga uma determinada variante de histona a Uma variante de histona contendo uma marca de epítopo proteína ou estrutura química reconhecida por um anticorpo ver Capítu los 5 e 9 é introduzida em um tipo de célula onde será incorporada nos nucleossomos Em alguns casos a marca do epítopo é desnecessária pois pode haver disponibilidade de anticorpos que se ligam diretamente à mo dificação da histona de interesse A cromatina é isolada de células e dige rida brevemente com nuclease de micrococos MNase O DNA ligado aos nucleossomos é protegido da digestão mas o DNA da região de ligação entre os nucleossomos é clivado liberando segmentos de DNA ligados a um ou dois nucleossomos O anticorpo é adicionado e os nucleossomos contendo a variante de histona com o epítopo marcado são precipitados seletivamente O DNA desses nucleossomos é extraído do precipitado mar cado e usado como sonda em um microarranjo que representa todas ou partes selecionadas das sequências genômicas de um dado tipo de célula b Neste exemplo a ligação da histona H33 é descrita em um segmento pequeno do cromossomo 2L Drosophila melanogaster Os números na parte superior correspondem às posições nucleotídicas numeradas no braço do cromossomo Cada local no microarranjo representa 100 pb de sequência genômica de forma que os dados representados aqui correspondem a mais de 1700 locais separados no microarranjo Em cada local o sinal do DNA marcado que foi precipitado com o anticorpo para a histona H33 está mos trado como proporção do sinal relativo ao sinal controle produzido quando DNA genômico total foi isolado sem imunoprecipitação foi cortado mar cado com marcações de cores diferentes e usado como sonda no mesmo microarranjo Os sinais acima da linha horizontal indicam posições genômi cas onde a ligação da histona H33 está enriquecida em relação ao controle Os sinais abaixo da linha são regiões onde a histona H33 está relativamente ausente Os genes anotados conhecidos presentes nesse segmento do genoma estão mostrados no painel inferior barras grossas As barras aci ma da linha são genes transcritos no sentido 59 para 39 da esquerda para a direita e os quadros abaixo da linha são aqueles transcritos da direita para a esquerda As barras vermelhas são genes onde a RNApolimerase II também é abundante o que indica transcrição ativa A ligação da histona H33 se concentra nos genes e perto deles sofrendo transcrição ativa usados na quimioterapia do câncer são inibidores da topoi somerase II que permitem que a enzima promova a quebra da cadeia mas não permite a formação de novas ligações no ponto das quebras ver Quadro 241 Existem evidências da existência de níveis mais altos de organização nos cromossomos dos eucariotos cada nível aumentando dramaticamente o grau de compactação do cromossomo A Figura 2431 ilustra um dos modelos de como esse grau de compactação é atingido A estrutura al tamente ordenada da cromatina provavelmente varia de cromossomo para cromossomo de uma região para outra de um mesmo cromossomo e de um momento para outro na Nelson6edbookindb 999 Nelson6edbookindb 999 030414 0747 030414 0747 1000 DAVID L NELSON MICHAEL M COX vida da célula Um único modelo não pode descrever ade quadamente essas estruturas Não obstante o princípio está claro a compactação do DNA nos cromossomos dos eucariotos provavelmente envolve torções sobre torções so bre torções Empacotamento tridimensional de cromossomos nu cleares As estruturas condensadas dos cromossomos são mantidas pelas proteínas SMC Uma terceira classe importante de proteínas da cromatina além das histonas e das topoisomerases são as proteínas SMC de structural maintenence of chromosomes A estrutura primária das proteínas SMC é formada por cinco domínios distintos Figura 2432a Os domínios globula res aminoterminal e carboxiterminal N e C que têm cada um parte de um sítio de hidrólise de ATP estão conectados por duas regiões de hélice a como motivo espiralespiralada ver Figura 411 unido por um domínio de dobradiça Es sas proteínas geralmente são diméricas formando um com plexo em forma de V que se sabe está ligado por meio dos domínios de dobradiça Figura 2432b Um domínio N e um domínio C se juntam para formar um sítio de hidrólise do ATP completo em cada uma das extremidades do V As proteínas da família das SMC são encontradas em todos os tipos de organismo das bactérias aos seres huma nos Os eucariotos têm dois tipos principais as coesinas e as condensinas e ambas estão ligadas a proteínas regulató rias e acessórias Figura 2432c As coesinas desempe nham um papel substancial na manutenção da união das cromátidesirmãs imediatamente após a replicação e quan do os cromossomos se condensam para a metáfase Essa associação é essencial para que os cromossomos sejam ade quadamente segregados na divisão celular Acreditase que as coesinas juntamente com uma terceira proteína a cleisi na formem um anel ao redor dos cromossomos replicados que os mantém juntos até que a separação seja necessária para a divisão celular O anel pode expandirse e contrair em resposta à hidrólise de ATP As condensinas são essen ciais para a condensação dos cromossomos quando a célula a b c Modelo solenoide uma hélice Modelo ziguezague duas hélices 30 nm 30 nm 30 nm FIGURA 2429 A fibra de 30 nm organização altamente ordenada dos nucleossomos A fibra compacta é formada pelo empacotamento firme dos nucleossomos a A fibra de 30 nm como pode ser visualizada por microscopia eletrônica Existem dois modelos propostos para a estrutura consistentes com os dados disponíveis b o modelo solenoide mostrando um arranjo helicoidal dos nucleossomos e c o modelo ziguezague mos trando dois arranjos helicoidais de nucleossomos envoltos um no outro A linha preta está projetada apenas para delinear o caminho geral proposto da estrutura organizada FIGURA 2430 As alças de DNA ligadas ao andai me cromossômico a Um cromossomo inchado produzido em tampão com baixa força iônica como pode ser visualizado na microscopia eletrônica Ob serve a aparência das fibras de 30 nm alças da cro matina nas margens b A extração das histonas deixa um andaime cromossômico proteico cercado por DNA aberto c O DNA parece ser organizado em alças ligadas em sua base ao andaime no canto su perior esquerdo a c b Fibras de 30 nm Alças de DNA Andaime cromossômico DNA Nelson6edbookindb 1000 Nelson6edbookindb 1000 030414 0747 030414 0747 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1001 9 9 10 10 7 7 8 8 5 6 3 4 2 nm 11 nm 1 1 2 3 4 5 6 2 30 nm 300 nm 700 nm 1400 nm DNA Nucleossomo Fibra de 30 nm Forma estendida do cromossomo Secção condensada do cromossomo Cromossomo mitótico FIGURA 2431 Compactação do DNA nos cromossomos eucarióti cos Esse modelo mostra os níveis de organização compatíveis com o grau de compactação do DNA nos cromossomos de eucariotos Primeiro o DNA é envolto em octâmeros de histonas então a histona H1 estimula a forma ção da fibra de 30 nm Níveis adicionais de organização não estão completa mente esclarecidos mas parece envolver a formação de espirais adicionais e alças na forma de rosetas as quais também se espiralam em estruturas mais grossas De forma geral níveis graduais de organização assumem a forma de espirais sobre espirais sobre espirais Nas células as estruturas de mais alta ordem acima das fibras de 30 nm dificilmente são tão uniformes como o apresentado nesse esquema N NN C CC N C SMC bacteriana SMC SMC SMC3 SMC1 SMC6 SMC5 SMC4 SMC2 Condensina Proteínas conectoras da família cleisina Coesina SMC5SMC6 Dobradiça Espiral espiralada Sítios de ligação do ATP Cabeça Cabeça Cabeças a b c d 50 mm Conector ahelicoidal Conector ahelicoidal FIGURA 2432 Estrutura das proteínas SMC a As proteínas SMC têm cinco domínios b Cada polipeptídeo SMC está dobrado de forma que os dois domínios espiralespiralada se enrolam em torno de si e os domínios N e C se juntam para formar um sítio de hidrólise do ATP completo Dois polipeptídeos estão ligados na região de dobradiça para formar uma molécula dimérica de SMC em forma de V c As proteínas SMC de bactérias formam um homodímero As seis dife rentes proteínas SMC dos eucariotos formam heterodímeros As coesinas são formadas por pares das proteínas SMC1 e SMC3 e as condensinas por pares de SMC2 e SMC4 O par SMC5 e SMC6 está envolvido no reparo do DNA d Micrografias eletrônicas dos dímeros de SMC da bactéria Bacillus subtilis Nelson6edbookindb 1001 Nelson6edbookindb 1001 030414 0747 030414 0747 1002 DAVID L NELSON MICHAEL M COX entra em mitose Em condições laboratoriais as con densinas se ligam ao DNA de maneira a criar supertor ções positivas isto é a ligação de condensinas torna o DNA superenrolado ao contrário daquele com o suben rolamento induzido pela ligação dos nucleossomos Um modelo para o papel das condensinas na compactação da cromatina está mostrado na Figura 2433 As coesi nas e as condensinas são essenciais na orquestração das muitas mudanças que ocorrem na estrutura dos cromos somos durante o ciclo celular das células eucarióticas Figura 2434 O DNA das bactérias também é altamente organizado Será considerada agora brevemente a estrutura dos cromossomos bacterianos O DNA bacteriano é com pactado em uma estrutura denominada nucleoide que pode ocupar uma parte significativa do volume celular Figura 2435 O DNA parece estar ancorado em um ou mais pontos da face interna da membrana plasmática Conhecese muito menos sobre a estrutura do nucleoi de do que sobre a cromatina dos eucariotos entretanto essa estrutura complexa vai aos poucos sendo revelada Em E coli algo como um arcabouço parece organizar o cromossomo circular em uma série de cerca de 500 do mínios em alças cada um com uma média de 10000 pb Figura 2436 como descrito para a cromatina Esses domínios são topologicamente restritos por exemplo FIGURA 2433 O possível papel das condensinas na conden sação da cromatina Inicialmente o DNA é ligado à região de do bradiça da proteína SMC no interior do que se torna um anel SMC intramolecular A ligação de ATP leva a uma associação cabeçacabeça formando alças superespiraladas no DNA ligado Rearranjos subse quentes das interações cabeçacabeça para formar rosetas conden sam o DNA As condensinas podem organizar essas alças dos segmen tos dos cromossomos de várias maneiras Dois modelos atuais estão mostrados Alça intramolecular no cromossomo Fibra Roseta Prófase Prófase Metáfase Metáfase Ligação de ATP Condensina Cromotina Anéis Hidrólise do ATP G1 Cromos somo Coesina Centrô mero G1 S G2 Prófase Metáfase Anáfase Telófase 1 1 1 Replicação Condensina Separase FIGURA 2434 Os papéis das coesinas e das condensinas no ciclo celular eucariótico As coesinas são depositadas sobre os cromossomos durante a fase G1 ver Figura 2424 unindo as cromátidesirmãs durante a replicação Com o início da mitose as condensinas se ligam e mantêm as cromátides em um estado condensado Durante a anáfase uma atividade denominada separase remove as ligações de coesina Uma vez que as cro mátides se separam inicia a separação das condensinas e os cromossomos retornam ao estado não condensado Nelson6edbookindb 1002 Nelson6edbookindb 1002 030414 0747 030414 0747 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1003 se o DNA for clivado em um domínio apenas esse domínio será relaxado Os domínios não têm finais fixos Ao contrá rio os limites estão provavelmente em constante movimen tação ao longo do DNA coordenados com a replicação do DNA O DNA bacteriano não parece ter qualquer estrutura que possa se comparar com a organização proporcionada pelos nucleossomos nos eucariotos Proteínas semelhantes a histonas são abundantes na E coli e o exemplo mais bem caracterizado é uma proteína de duas subunidades denomi nada HU Mr 19000 no entanto essas proteínas se ligam e se dissociam em minutos e nunca foi observada uma estru tura regular DNAhistona estável As mudanças estruturais dinâmicas do cromossomo bacteriano podem refletir uma necessidade de acesso mais fácil à informação genética O ciclo de divisão celular bacteriana pode ser tão curto como 15 minutos ao passo que uma célula eucariótica típica pode não se dividir em horas ou mesmo em meses Além disso uma proporção muito maior do DNA bacteriano é usada para codificar RNA eou produtos proteicos Taxas mais al tas de metabolismo celular nas bactérias significam que em relação à maior parte das células eucarióticas uma maior proporção do DNA está sendo transcrita ou replicada em dado momento Após essa visão geral da complexidade da estrutura do DNA será apresentada no próximo capítulo uma discus são acerca do metabolismo do DNA RESUMO 243 A estrutura dos cromossomos c A unidade fundamental de organização na cromatina das células eucarióticas é o nucleossomo que consiste em his tonas e um segmento de DNA de 200 pb O centro é uma partícula proteica contendo oito histonas duas cópias de cada uma das histonas H2A H2B H3 e H4 circundada por um segmento de DNA cerca de 146 pb na forma de supertorção solenoide orientada para a esquerda c Os nucleossomos são organizados em fibras de 30 nm intensamente dobradas fornecendo a compactação de 10000 vezes necessária para encaixar um cromossomo típico dentro do núcleo da célula Os níveis mais ele vados de enovelamento incluem a fixação a um supor te nuclear que contém histona H1 topoisomerase II e proteínas SMC As proteínas SMC principalmente as coesinas e as condensinas desempenham papéis impor tantes na manutenção da organização dos cromossomos durante cada um dos estágios do ciclo celular c O cromossomo bacteriano se encontra intensamente compactado em um nucleoide mas parece ser muito mais dinâmico e com estrutura mais irregular do que a cromatina dos eucariotos refletindo o ciclo celular mais curto e a grande atividade metabólica de uma célula bacteriana Termoschave Os termos em negrito estão definidos no glossário cromossomo 979 fenótipo 979 mutação 979 gene 980 sequência regulatória 980 plasmídeo 981 íntron 984 éxon 984 DNA de sequência simples 984 DNA satélite 984 centrômero 984 telômero 984 supertorção 985 DNA relaxado 985 topologia 986 subenrolamento 987 número de ligação 988 diferença de ligação específica 988 densidade de superhélice s 988 topoisômeros 989 rotação 989 torção 989 topoisomerase 990 plectonêmica 992 solenoide 993 cromatina 994 histonas 994 nucleossomo 994 epigenético 998 eucromatina 998 fibra de 30 nm 997 proteínas SMC 1000 coesinas 1000 condensinas 1000 nucleoide 1002 2 mm FIGURA 2435 Nucleoide de E coli O DNA destas células está corado com um corante que emite fluorescência quando exposto à luz ultravioleta As áreas claras definem o nucleoide Observe que algumas células replica ram seu DNA mas ainda não sofreram divisão celular e portanto apresen tam muitos nucléolos FIGURA 2436 Domínios em alça do cromossomo de E coli Cada domínio tem um comprimento de cerca de 10000 pb Os domínios não são estáticos mas se movem ao longo do DNA à medida que a replicação continua Barreiras nos limites dos domínios de composição desconhecida evitam o relaxamento do DNA para além dos limites do domínio onde tenha ocorrido uma quebra Os supostos complexos limítrofes estão mostrados na forma de estruturas ovoides em sombreado acinzentado As setas indicam o movimento do DNA através dos limites dos complexos Nelson6edbookindb 1003 Nelson6edbookindb 1003 030414 0748 030414 0748 1004 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Leituras adicionais Gerais Cox MM Doudna JA ODonnell M 2012 Molecular Biology Principlas and Practice W H Freeman and Company New York Cozzarelli NR Wang JC eds 1990 DNA Topology and Its Biological Effects Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor NY Kornberg A Baker TA 1991 DNA Replication 2nd ed WH Freeman Company New York Bom lugar para começar a obter mais informações sobre a estrutura e a função do DNA Genes e cromossomos Campbel A Lichten M Schupbach G 2010 Telomeric strategies means to an end Annu Rev Genet 44 243269 Levin HL Moran JV 2011 Dynamic interactions between transposons and their hosts Nat Rev Genet 12 615627 McEachern MJ Krauskopf A Blackburn EH 2000 Telomeres and their control Annu Rev Genet 34 331358 Roy SW Gilbert W 2006 The evolution of spliceosomal introns patterns puzzles and progress Nat Rev Genet 7 211221 Verdaasdonk JS Bloom K 2011 Centromeres unique chromatin structures that drive chromosome segregation Nat Rev Mol Cell Biol 12 320332 Supertorção e topoisomerases Boles TC White JH Cozzarelli NR 1990 Structure of plectonemically supercoiled DNA J Mol Biol 213 931951 Estudo que define várias características fundamentais do DNA supertorcido Garcia HG Grayson P Han L Inamdar M Kondev J Nelson PC Phillips R Widom W Wiggins PA 2007 Biological consequences of tightly bent DNA the other life of a macromolecular celebrity Biopolymers 85 115130 Bela descrição da física do DNA dobrado Kohanski MA Dwyer DJ Collins JJ 2010 How antibodies kill Bacteria from targets to networks Nat Rev Microbiol 8 423435 Lebowitz J 1990 Through the looking glass the discovery of supercoiled DNA Trends in Biochem Sci 15 202207 Nota histórica curta e interessante Pommier Y 2006 Topoisomerase I inhibitors camptothecins and beyond Nat Rev Cancer 6 789802 Vos SM Tretter EM Schmidt BH Berger JM 2011 All tangled up how cells direct manage and exploit topoisomerase function Nat Rev Mol Cell Biol 12 827841 Cromatina e nucleossomos Campos EI Reinberg D 2009 Histones annotating chromatin Annu Rev Genet 43 559599 Carter SD Sjogren C 2012 The SMC complexes DNA and chromosome topology right or knot Crit Rev Biochem Mol Biol 47 116 Dillon SC Dorman CJ 2010 Bacterial nucleoidassociated proteins nucleoid structure and gene expression Nat Rev Microbiol 8 185195 Kornberg RD 1974 Chromatin structure a repeating unit of histones and DNA Science 184 868871 Clássico artigo que introduziu o modelo de subunidades para a cromatina Losada A Hirano T 2005 Dynamic molecular linkers of the genome the first decade of SMC proteins Genes Dev 19 12691287 Luijsterburg MS White MF van Driel R Remus TD 2008 The major architects of chromatin architectural proteins in bacteria archea and eukaryotes Crit Rev Biochem Mol Biol 43 393418 Margueron R Reinberg D 2010 Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information Nat Rev Genet 11 285296 Rando OJ 2007 Chromatin structure in the genomics era Trends Genet 23 6773 Descrição dos métodos engenhosos usados para estudar padrões de modificação dos nucleossomos posicionamento dos nucleossomos e outros aspectos da estrutura dos cromossomos em escala genômica Segal E FondufeMittendorf Y Chen L Thâström A Field Y Moore IK Wang JZ Widom J 2006 A genomic code for nucleosome positioning Nature 442 772778 Problemas 1 Empacotamento do DNA em um vírus O bacteriófago T2 tem uma molécula de DNA de peso molecular 120 3 10 6 contido em uma cápsula com cerca de 210 nm de comprimen to Calcule o comprimento do DNA supondo que o peso mole cular de um par de nucleotídeos seja 650 e o compare com o tamanho da cápsula do T2 2 O DNA do fago M13 A composição de bases do DNA do fago M13 é A 23 T 36 G 21 C 20 O que isso lhe diz a respeito do DNA do fago M13 3 O genoma do Mycoplasma O genoma da bactéria mais simples que se conhece Mycoplasma genitalium é uma mo lécula de DNA circular com 580070 pb Calcule o peso molecu lar e o comprimento do contorno quando relaxado dessa mo lécula Qual o valor de Lko do cromossomo do Mycoplasma Se s 5 2 006 qual é o valor de Lk 4 O tamanho dos genes dos eucariotos Uma enzima isolada do fígado de rato tem 192 resíduos de aminoácidos e é codificada por um gene com 1440 pb Explique a relação entre o número de resíduos de aminoácidos na enzima e o número de pares de nucleotídeos desse gene 5 Número de ligação Uma molécula de DNA circular fechada na sua forma relaxada tem um Lk de 500 Quantos pares de bases aproximadamente há nesse DNA Como o número de ligação é alterado aumenta diminui não muda é indefinido quando a um complexo proteico se liga formando um nucleossomo b uma fita de DNA é quebrada c DNAgi rase e ATP são adicionados à solução de DNA ou d a dupla hélice é desnaturada pelo calor 6 Topologia do DNA Na presença de condensina de euca rioto e de topoisomerase do tipo II o Lk de uma molécula de DNA circular fechado e relaxado não muda Entretanto o DNA fica cheio de nós Nelson6edbookindb 1004 Nelson6edbookindb 1004 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1005 Topoisomerase do tipo II Condensina A formação dos nós necessita de quebra do DNA passagem de um segmento de DNA através da quebra e nova ligação pela topoisomerase Uma vez que se pode esperar que cada reação da topoisomerase resulte em mudança do número de ligação como é que o Lk pode permanecer o mesmo 7 Densidade da superhélice O bacteriófago l infecta E coli integrando seu DNA ao cromossomo bacteriano O sucesso dessa recombinação depende da topologia do DNA da E coli Quando a densidade da superhélice s do DNA da E coli for maior do que 20045 a probabilidade de integração é 20 quando s for menor do que 2006 a probabilidade é 70 O DNA de um plasmídeo isolado de uma cultura de E coli tem comprimento de 13800 pb e Lk de 1222 Calcule o s desse DNA e estabeleça um prognóstico acerca da probabilidade de o bacteriófago l ser capaz de infectar essa cultura 8 Alterando o número de ligação a Qual é o Lk de uma molécula circular duplex de DNA de 5000 pb com quebra em uma das fitas b Qual é o Lk da molécula em a quando a quebra é soldada relaxada c Quanto o Lk da molécula em b seria afetado pela ação uma única vez de uma molécula de topoisomerase I de E coli d Qual é o Lk da molécula em b após sofrer oito ciclos de catálise por uma molécula de DNAgirase em presença de ATP e Qual é o Lk da molécula em d após quatro ciclos de catálise por uma molécula de to poisomerase I bacteriana f Qual é o Lk da molécula em d após se ligar a um nucleossomo 9 Cromatina Uma das primeiras evidências que ajuda ram os cientistas a definir a estrutura do nucleossomo está ilustrada no gel de agarose a seguir no qual as bandas gros sas representam DNA Ele foi feito tratando brevemente a cromatina com uma enzima que degrada DNA e então re movendo toda a proteína e submetendo o DNA purificado à eletroforese Os números ao lado do gel indicam a posição na qual um DNA linear com o tamanho indicado migraria O que esse gel mostra sobre a estrutura da cromatina Por que as bandas de DNA são grossas e dispersas em vez de estarem bem definidas 200 pb 400 pb 600 pb 800 pb 1000 pb 10 Estrutura do DNA Explique por que o subenrolamen to da hélice de um BDNA pode facilitar ou estabilizar a forma ção de um ZDNA 11 Manutenção da estrutura do DNA a Descreva duas características estruturais que uma molécula de DNA precisa ter para se manter em um estado supertorcido negati vamente b Liste três mudanças estruturais que são favore cidas quando uma molécula de DNA fica supertorcida negati vamente c Qual é a enzima que com o auxílio do ATP pode gerar uma superhelicidade negativa no DNA d Descreva o mecanismo físico da ação dessa enzima 12 Cromossomos artificiais de levedura YAC Os YAC são usados para clonar segmentos grandes de DNA em cé lulas de levedura Quais são os três tipos de sequência de DNA necessários para garantir a replicação e a propagação adequa das de um YAC em células de levedura 13 Estrutura do nucleoide em bactéria Em bactérias a transcrição de um conjunto de genes é afetada pela topologia do DNA sendo que a expressão aumenta ou mais frequente mente diminui quando o DNA é relaxado Quando o cromosso mo de uma bactéria é clivado em um ponto específico por uma enzima de restrição enzima que cliva em uma sequência longa e portanto rara apenas os genes das proximidades 10000 pb mostram aumento ou diminuição da expressão A transcri ção dos genes em outros sítios do cromossomo não é afetada Explique Dica ver Figura 2436 14 Topologia do DNA Quando o DNA é sujeito a eletro forese em gel de agarose as moléculas pequenas migram mais rapidamente do que as grandes DNA circulares fechados do mesmo tamanho mas com diferentes números de ligação também podem ser separados em gel de agarose topoisôme ros mais supertorcidos e portanto mais condensados migram mais rapidamente através do gel No gel mostrado abaixo o DNA de plasmídeo purificado migrou da parte superior para a parte inferior e tem duas bandas com a banda mais rápida muito mais proeminente a Quais são as espécies de DNA nas duas bandas b Se topoisomerase for adicionada a uma solução desse DNA o que irá acontecer com a banda da parte superior e a banda da parte inferior após a eletroforese c Se DNAligase for adicionada ao DNA a aparência das bandas irá mudar d Se DNAgirase mais ATP for adicionado ao DNA após a adição de DNAligase como mudará o padrão de bandas 15 DNAtopoisomerases Quando o DNA é submetido à eletroforese em gel de agarose as moléculas menores migram mais rápido do que as moléculas longas DNA circulares do Nelson6edbookindb 1005 Nelson6edbookindb 1005 030414 0748 030414 0748 1006 DAVID L NELSON MICHAEL M COX mesmo tamanho mas com diferenças quanto ao número de li gação também podem ser separados em gel de agarose pois os topoisômeros mais supertorcidos e portanto mais conden sados migram mais rapidamente no gel da parte superior para a inferior dos géis mostrados ao lado Um corante clo roquina foi adicionado a esses géis A cloroquina se intercala entre os pares de base e estabiliza uma estrutura de DNA mais desenrolada Quando o gel se liga a um DNA circular relaxado o DNA fica subenrolado onde o corante se liga e as regiões onde o corante não se liga ficam com supertorções positivas para compensar No experimento aqui mostrado foram usadas topoisomerases para preparar o mesmo DNA circular com dife rentes densidades de superhélice s O DNA completamente relaxado migra para a posição marcada com Q de quebra e o DNA altamente supertorcido acima do limite no qual os to poisômeros podem ser individualizados migra para a posição marcada com X Cloroquina 5 mgmL s média Nativo 0 20009 20023 20037 20049 20066 20080 20115 Q X Corre como Corre como 1DLk 2DLk Cloroquina 05 mgmL s média Nativo 0 20009 20023 20037 20049 20066 20080 20115 Q X Corre como Gel A Gel B Corre como 1DLk 2DLk a Por que no gel A a canaleta de s 5 0 ie DNA prepa rado de modo a ter em média s 5 0 tem muitas bandas b No gel B o DNA da preparação s 5 0 está supertorcido negativa ou positivamente na presença do corante c Nos dois géis a canaleta s 5 20115 tem duas bandas uma com DNA relaxado e outra com DNA altamente supertor cido Proponha uma razão para a presença de DNA relaxado nessas e em outras canaletas d O DNA nativo mais à esquerda nos dois géis é o mes mo DNA circular isolado das bactérias e que não recebeu trata mento Qual é aproximadamente a densidade de superhélice desse DNA nativo 16 Nucleossomos O genoma humano é constituído por um pouco mais de 31 bilhões de pares de bases Assumindo que ele seja recoberto por nucleossomos espaçados como des crito no capítulo quantas moléculas de histonas H2A estão presentes em uma célula somática humana Problema de análise de dados 17 Definindo os elementos funcionais dos cromosso mos de levedura A Figura 248 mostra os elementos es truturais principais de um cromossomo de levedura de pão Saccharomyces cerevisiae As propriedades de alguns des ses elementos foram determinadas por Heiter Mann Snyder e Davis 1985 Eles basearam seu estudo no achado de que em células de levedura os plasmídeos que têm genes e origem de replicação próprios agem durante a mitose diferentemente dos cromossomos que têm esses elementos e ainda centrô meros e telômeros Os plasmídeos não são manipulados pela maquinaria da mitose e segregamse aleatoriamente entre as célulasfilhas Sem um marcador seletivo que force a célula hospedeira a retêlos ver Figura 94 esses plasmídeos são perdidos rapidamente De maneira oposta os cromossomos mesmo sem marcador seletivo são manipulados pela maquina ria da mitose e são perdidos a uma taxa muito baixa cerca de 10 25 por divisão celular Heiter e colaboradores usaram como estratégia para de terminar os componentes importantes dos cromossomos de levedura a construção de plasmídeos com várias partes dos cromossomos observando então o quanto esses cromossomos sintéticos eram adequadamente segregados durante a mitose Para medir a taxa de diferentes tipos de falha na segregação dos cromossomos os pesquisadores precisaram de um rápi do ensaio para determinar o número de cópias de cromosso mos sintéticos presente em diferentes células Esse ensaio se aproveitou do fato de que as colônias de levedura da linhagem selvagem são brancas ao passo que certos mutantes que preci sam de adenina ade 2 produzem colônias vermelhas no meio de cultura Especificamente células ade2 2 não têm AIRcarbo xilase funcional a enzima da etapa na Figura 2235 e acu mulam AIR 5aminoimidazolribonucleotídeo no citoplasma Esse excesso de AIR é convertido no pigmento vermelho A outra parte do ensaio envolve o gene SUP11 que codifica um supressor ocre tipo de supressor sem sentido ver Quadro 27 4 que suprime o fenótipo de alguns mutantes ade2 2 Heiter e colaboradores começaram com uma linhagem de levedura diploide e homozigota para ade2 2 essas células são vermelhas Quando células mutantes contêm uma cópia de SUP11 o defeito metabólico é parcialmente suprimido e as células são rosadas Quando as células contêm duas ou mais cópias de SUP11 o defeito é completamente suprimido e as células são brancas Os pesquisadores inseriram uma cópia de SUP11 em cro mossomos sintéticos com vários elementos que acreditavam serem importantes para a função dos cromossomos e obser varam o quanto esses cromossomos passavam de uma geração a outra As células rosadas foram plaqueadas em meio não se letivo e o comportamento dos cromossomos sintéticos foi ob servado Especificamente Heiter e colaboradores procuravam colônias nas quais os cromossomos sintéticos eram inadequa damente segregados na primeira divisão celular após o plaque amento dando início a colônias com metade de um genótipo Nelson6edbookindb 1006 Nelson6edbookindb 1006 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1007 e metade de outro Uma vez que as células de levedura não se movimentam essas colônias eram setorizadas metade da colô nia era de uma cor e metade de outra cor a Uma das maneiras de falha no processo mitótico é a não disjunção os cromossomos se replicam mas as cromáti desirmãs não se separam e assim ambas as cópias do cromos somo terminam na mesma célulafilha Explique por que a não disjunção dos cromossomos sintéticos origina colônias que são metade vermelha e metade branca b Outra maneira de falha no processo da mitose é a per da de cromossomos os cromossomos não entram no núcleo das célulasfilhas ou não replicam Explique por que a perda de cromossomos sintéticos dá origem a colônias metade vermelha e metade rosada Calculando a frequência dos diferentes tipos de colônia Heiter e colaboradores puderam estimar a frequência desses eventos mitóticos aberrantes com os diferentes tipos de cro mossomos sintéticos Inicialmente eles investigaram a necessi dade de sequências centroméricas construindo cromossomos sintéticos com fragmentos de DNA de diferentes tamanhos contendo um centrômero conhecido Os resultados são mos trados a seguir Cromossomo sintético Tamanho do fragmento que contém o centrômero kpb Perda de cromossomo Não disjunção 1 Nenhum 50 2 063 16 11 3 16 19 04 4 30 17 035 5 60 16 035 c Com base nesses dados o que você pode concluir sobre o tamanho que o centrômero deve ter para uma segregação mitótica normal Explique o raciocínio utilizado d É interessante observar que todos os cromossomos sintéticos criados nesses experimentos eram circulares e sem telômeros Explique como eles conseguiram se replicar mais ou menos adequadamente A seguir Heiter e colaboradores construíram uma série de cromossomos sintéticos lineares que incluíam sequências fun cionais de centrômeros e também telômeros e então mediram a taxa total de erro mitótico perda 1 de não disjunção em função do tamanho Cromossomo sintético Tamanho kpb Frequência total de erro 6 15 110 7 55 15 8 95 044 9 137 014 e Com base nesses dados o que se pode concluir sobre o tamanho que um cromossomo deve ter para uma segregação mitótica normal Explique o seu raciocínio f Os cromossomos normais de levedura são lineares com um comprimento variando entre 250 kpb e 2000 kpb e têm taxa de erro mitótico de cerca de 10 5 por divisão celular Ex trapolando os resultados de e as sequências de telômeros e centrômeros usadas nesses experimentos explicam a estabili dade mitótica de cromossomos normais de levedura ou deve haver o envolvimento de outros elementos Explique o seu raciocínio Dica um gráfico do log da taxa de erro versus o comprimento será útil Referência Heiter P Mann C Snyder M Davis RW 1985 Mitotic stability of yeast chromosomes a colony color assay that measures nondisjunction and chromosome loss Cell 40 381392 Nelson6edbookindb 1007 Nelson6edbookindb 1007 030414 0748 030414 0748 Nelson6edbookindb 1008 Nelson6edbookindb 1008 030414 0748 030414 0748 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 251 Replicação do DNA 1011 252 Reparo do DNA 1027 253 Recombinação do DNA 1038 C omo repositório de informação genética o DNA ocupa um lugar único e central entre as macromoléculas bioló gicas As sequências de nucleotídeos de DNA codificam as estruturas primárias de todos os RNAs e proteínas celu lares e por meio de enzimas afetam indiretamente a sínte se de todos os outros constituintes celulares Essa passa gem de informação do DNA para o RNA e proteínas orienta o tamanho forma e funcionamento de todos os seres vivos O DNA é um dispositivo maravilhoso para o armazena mento estável da informação genética A expressão ar mazenamento estável entretanto transmite uma imagem estática e enganosa Ela não consegue captar a complexi dade dos processos pelos quais a informação genética é preservada em um estado não corrompido e então trans mitida de uma geração de células para a seguinte O me tabolismo do DNA compreende tanto o processo que dá origem a cópias fiéis de moléculas de DNA replicação quanto os processos que afetam a estrutura inerente da informação reparo e recombinação Juntas essas ativi dades são o foco deste capítulo O metabolismo do DNA é moldado pela exigência de um grau de requinte de precisão A química da junção de um nucleotídeo com o seguinte na replicação do DNA é elegante e aparentemente simples Entretanto como acontece em todos os polímeros que contêm informações formar uma ligação covalente entre duas unidades mono méricas é apenas uma pequena parte do processo bioquí mico Como será visto a complexidade surge na forma de dispositivos enzimáticos para garantir que o nucleotídeo correto seja adicionado e que a informação genética seja transmitida intacta Erros não corrigidos que surgem du rante a síntese do DNA podem ter terríveis consequências não só porque podem afetar ou eliminar permanentemen te a função de um gene mas também porque a alteração é hereditária As enzimas que sintetizam o DNA podem copiar molé culas de DNA que contêm milhões de bases Elas o fazem com fidelidade e velocidade extraordinárias apesar do substrato de DNA ser altamente compactado e ligado a ou tras proteínas A formação das ligações de fosfodiésteres para unir nucleotídeos no esqueleto de uma fita de DNA em formação é portanto apenas parte de um processo elabo rado que requer inúmeras proteínas e enzimas Manter a integridade da informação genética encontra se no centro do reparo do DNA Como detalhado no Ca pítulo 8 o DNA é suscetível a vários tipos de reações que o danificam Tais reações são incomuns mas significativas devido à tolerância biológica muito baixa a alterações na se quência do DNA O DNA é a única macromolécula para a qual existem sistemas de reparo o número diversidade e complexidade dos mecanismos de reparo do DNA refletem a ampla variedade de injúrias que podem danificálo As células podem reorganizar a sua informação genética por processos coletivamente chamados de recombinação aparentemente minando o princípio de que a estabilidade e a integridade da informação genética são fundamentais En tretanto a maioria dos rearranjos de DNA de fato desem penha papéis construtivos na manutenção da integridade genômica contribuindo de modo especial para a replicação do DNA reparo do DNA e segregação cromossômica Ênfase especial é dada neste capítulo às enzimas do metabolismo do DNA Elas merecem estudo cuidadoso não apenas por sua importância biológica intrínseca mas tam bém por sua crescente importância na medicina e por sua utilização diária como reagentes em uma ampla variedade de tecnologias bioquímicas modernas Muitas das importan tes descobertas no metabolismo do DNA foram feitas com a Escherichia coli por isso suas enzimas bem conhecidas são geralmente utilizadas para ilustrar as regras básicas Uma rápida olhada em alguns genes relevantes no mapa ge nético de E coli Figura 251 fornece apenas uma suges tão da complexidade dos sistemas enzimáticos envolvidos no metabolismo do DNA Antes de um olhar mais próximo na replicação devese fazer um comentário sobre o uso de abreviaturas na identi ficação de genes de bactérias e proteínas você encontrará muitas delas neste capítulo e nos capítulos posteriores Ge nes de eucariontes também são identificados por conven ções semelhantes embora a forma exata das abreviações possa variar de acordo com as espécies e nenhuma conven ção única se aplique a todos os sistemas de eucariontes 25 Metabolismo do DNA Nelson6ed25indd 1009 Nelson6ed25indd 1009 020514 1726 020514 1726 1010 DAVID L NELSON MICHAEL M COX CONVENÇÃOCHAVE Genes bacterianos em geral são identifi cados utilizandose três letras minúsculas em itálico que muitas vezes refletem a função aparente de um gene Por exemplo os genes dna uvr e rec afetam a replicação do DNA a resistência aos efeitos nocivos da radiação UV e a recombinação respectivamente Onde vários genes afetam o mesmo processo a letras A B C e assim por diante são adicionadas p ex no dnaA dnaB dnaQ geralmente refletindo sua ordem de descoberta e não sua ordem em uma sequência de reação A utilização de abreviaturas na nomeação de proteínas é menos direta Durante investigações genéticas o produto proteico de cada gene é geralmente isolado e caracteriza do Muitos genes bacterianos foram identificados e nomea dos antes que os papéis de seus produtos proteicos fossem compreendidos em detalhe Algumas vezes descobrese que o produto gênico é uma proteína isolada previamente e ocorrem algumas renomeações Frequentemente no entan to o produto vem a ser uma proteína ainda desconhecida com uma atividade não descrita facilmente por um simples nome de enzima CONVENÇÃOCHAVE Proteínas bacterianas muitas vezes man têm o nome de seus genes Ao se referir ao produto proteico de um gene de E coli utilizase o tipo romano e a primeira letra é maiúscula por exemplo os produtos gênicos dnaA e recA e as proteínas DnaA e RecA respectivamente Proteína de reparo de malpareamento mutL Proteína de ligação ao DNA de fita simples ssb Helicase dnaB Subunidades da RNApolimerase rpoB rpoC DNApolimerase I polA rep Origem da replicação oriC Iniciação da replicação dnaA dnaN Reparo por recombinação recF Metilação dam Subunidades da RNApolimerase rpoA rpoD Primase dnaG Proteínas de reparo de malpareamento mutH mutS recC Recombinação e reparo por recombinação recB recD recA Recombinação e reparo por recombinação Reparo do DNA uvrA DNAhelicasereparo de malpareamento uvrD Subunidade da DNAgirase Montagem do primossomo gyrB priA Ter Terminação da replicação DNAligase lig Uracilaglicosilase ung recO Reparo por recombinação nfo Endonuclease AP Subunidade da DNAgirase gyrA sbcB Exonuclease I uvrC Reparo do DNA ruvC ruvA Recombinação e reparo por recombinação holE Subunidade da DNApolimerase III xthA APendonuclease ogt O6Galquiltransferase ruvB umuC umuD uvrB Reparo do DNA phr DNAfotoliase holB Subunidade da DNApolimerase III holA Subunidade da DNApolimerase III recR Reparo por recombinação dinB DNApolimerase IV dnaQ Subunidade da DNApolimerase III polC dnaE Subunidade da DNApolimerase III mutT Degradação de 8OxodGTP polB DNApolimerase II holC Subunidade da DNApolimerase III dnaC Componente do primossomo holD Subunidade da DNApolimerase III 1000 50 75 25 59 Helicase 39 DNApolimerase V FIGURA 251 Mapa do cromossomo de E coli O mapa mostra as po sições relativas dos genes que codificam muitas das proteínas importantes no metabolismo do DNA O número de genes envolvidos fornece uma dica a respeito da complexidade destes processos Os números 0 a 100 dentro do cromossomo circular indicam uma medida genética chamada minutos Cada minuto corresponde a 40000 pb ao longo da molécula de DNA Os nomes dos genes em três letras e outros elementos geralmente refletem algum aspecto da sua função e incluem mut mutagênese dna replicação do DNA pol DNApolimerase rpo RNApolimerase uvr resistência à UV rec recombinação dam metilação de adeninas no DNA lig DNAligase Ter terminação da replicação e ori origem da replicação oriC em E coli como mostrado nesta figura Nelson6edbookindb 1010 Nelson6edbookindb 1010 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1011 251 Replicação do DNA Muito antes da estrutura do DNA ser conhecida os cientis tas queriam conhecer a origem da capacidade dos organis mos de criar cópias fiéis de si mesmos e mais tarde a res peito da capacidade das células de produzirem cópias idênticas de grandes e complexas macromoléculas A espe culação sobre esses problemas se concentrou em torno do conceito de molde estrutura que permitiria que as molécu las se alinhassem em uma ordem específica e se ligassem criando uma macromolécula com uma sequência e função específicas A década de 1940 trouxe a revelação de que o DNA era a molécula genética mas só depois de James Watson e Francis Crick deduzirem sua estrutura realmente se tornou claro o mecanismo pelo qual o DNA atuava como molde para a replicação e transmissão da informação gené tica uma fita é o complemento da outra As regras estri tas do pareamento de bases significam que cada fita fornece um molde para uma nova fita com uma sequência previsível e complementar ver Figuras 814 815 Nucleotídeos blo cos de construção de ácidos nucleicos Ficou provado que as propriedades fundamentais do processo de replicação do DNA e os mecanismos utilizados pelas enzimas que o catalisam são em essência idênticos em todas as espécies Essa unidade de mecanismos é um tema central à medida que se prossegue a partir de proprie dades gerais do processo de replicação para a replicação de enzimas de E coli e finalmente para a replicação em eucariontes A replicação do DNA segue um conjunto de regras fundamentais A pesquisa inicial sobre a replicação do DNA bacteriano e suas enzimas ajudou a estabelecer várias propriedades bási cas que se mostraram aplicáveis à síntese do DNA em todos os organismos A replicação do DNA é semiconservativa Cada fita de DNA fun ciona como molde para a síntese de uma nova fita produ zindo duas novas moléculas de DNA cada qual com uma fita nova e uma fita antiga Isso é a replicação semicon servativa Watson e Crick propuseram a hipótese de replicação semiconservativa logo após a publicação de seu artigo de 1953 sobre a estrutura do DNA e a hipótese foi compro vada por experimentos engenhosamente projetados rea lizados por Matthew Meselson e Franklin Stahl em 1957 Meselson e Stahl cultivaram células de Ecoli por várias gerações em um meio em que a única fonte de nitrogênio NH4Cl continha 15N o isótopo pesado de nitrogênio no lugar do isótopo normal 14N leve mais abundante O DNA isolado dessas células apresentava uma densida de cerca de 1 maior do que o normal 14NDNA Figura 252a Embora essa diferença seja pequena a mistura de 15NDNA pesado e 14NDNA leve pode ser separada por centrifugação até o equilíbrio em um gradiente de densi dade de cloreto de césio As células de E coli cultivadas em um meio de 15N foram transferidas para um novo meio contendo apenas o isótopo 14N em que foram deixadas crescendo até que sua população tivesse dobrado O DNA isolado dessa pri meira geração de células formava uma única banda no gradiente de CsCl em uma posição que indicava que as moléculas de DNA de duplahélice das célulasfilhas eram híbridas contendo uma nova fita 14N e uma fita parental 15N Figura 252b Esse resultado argumentou contra a replicação conser vativa a hipótese alternativa em que um dos resultados da replicação de uma molécula de DNA consistiria em duas fi tas recentemente sintetizadas de DNA e o outro conteria as duas fitas parentais isso não produziria moléculas de DNA híbridas no experimento de MeselsonStahl A hipótese de replicação semiconservativa obteve mais apoio na etapa se guinte do experimento Figura 252c As células foram no vamente colocadas em crescimento até dobrar em número em um meio com 14N O produto de DNA isolado desse se gundo ciclo de replicação exibiu duas bandas no gradiente de densidade uma com densidade igual àquela do DNA leve e a outra com a densidade do DNA híbrido observada após a primeira duplicação celular DNA extraído e centrifugado até o equilíbrio em gradiente densidade de CsCl Molécula parental original Moléculasfilhas de primeira geração Moléculasfilhas de segunda geração DNA pesado 15N DNA híbrido 15N14N DNA híbrido DNA leve 14N a b c FIGURA 252 Experimento de MeselsonStahl a Células foram culti vadas por muitas gerações em meio contendo apenas nitrogênio pesado 15N de modo que todo nitrogênio no DNA fosse 15N como mostrado pela banda única azul quando centrifugado em um gradiente de CsCl b Uma vez que as células foram transferidas para um meio contendo apenas nitro gênio leve 14N o DNA celular isolado após uma geração se equilibrou em uma posição mais alta no gradiente de densidade banda roxa c Um se gundo ciclo de replicação gerou uma banda de DNA híbrido roxo e outra banda roxo contendo apenas 14NDNA confirmando a replicação semi conservativa Nelson6edbookindb 1011 Nelson6edbookindb 1011 030414 0748 030414 0748 1012 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Areplicagao comeca em uma origem e em geral segue bidirecionalmen te Apds a confirmacgao de um mecanismo de replicacao se miconservativo varias questdes surgiram As fitas de DNA parental parentais sao completamente desenroladas antes que cada uma seja replicada A replicacao se inicia em locais aleatérios Forquilhas de replicagao ou em um unico ponto Apés a iniciagao em qualquer ponto Rea An aene We uy ec OME oe do DNA a replicagao segue em uma direcéo ou em ambas Dnate for Nests Soe Uma indicacao inicial de que a replicacao é um processo Forquilhas 27 er Coe eee eae altamente coordenado no qual as fitas parentais sao simulta ce 50 C BN 5 Bi na neamente desenroladas e replicadas foi fornecido por John piicag ea earcee dees ii uae al Cairns utilizando autorradiografias Ele produziu um DNA ee pea aes 4 de E coli radioativo cultivando células em um meio conten Eee ceed Se iat eae Sort do timidina marcada com tritio H Quando 0 DNA foi cui Si ae dadosamente isolado espalhado e coberto com uma emul Sieh ests ns Senet sao fotografica por varias semanas os residuos de timidina Se Ce ae an Serkt radioativos geraram rastros de graos de prata na emulsao a at oe Sein produzindo uma imagem da molécula de DNA Esses rastros Sear eo eee Ns revelaram que 0 cromossomo intacto de E coli 6 um circulo poate Aiea Boa unico enorme com 17 mm de comprimento O DNA radioa Ee tivo isolado das células durante a replicacéo mostrou uma a a ee volta adicional Figura 253 Cairns concluiu que a volta phere ei ryaae et Sore resultava da formacao de duas fitas filhas radioativas cada yearn Nr betes i uma complementar a uma fita parental Uma ou ambas as ks Re Sus a extremidades da volta s4o pontos dinamicos denominados Ext aN ber ik de forquilhas de replicacao onde o DNA parental esta sae eer Sent sendo desenrolado e as fitas separadas rapidamente repli AEeorarerwo cadas Os resultados de Cairns demonstraram que ambas as fitas de DNA sao replicadas simultaneamente e variagdes no seu experimento indicaram que a replicagao de cromos somos bacterianos é bidirecional ambas as extremidades da volta possuem forquilhas de replicacao ativas Determinar se as voltas de replicacao se originam em um unico ponto no DNA requer marcacées ao longo da molécu la de DNA Elas foram fornecidas por uma técnica chamada de mapeamento de desnaturacao desenvolvida por Ross Inman e colaboradores Utilizando o cromossomo de 48502 pb do bacteridfago A Inman demonstrou que o DNA poderia ser seletivamente desnaturado em sequéncias extraordina Duplex filhas riamente ricas em pares de bases AT gerando um padrao FIGURA 253 Visualizagdo da replicagao do DNA Os estagios na re reproduzivel de bolhas de fitas simples ver Figura 828 O plicagdo das moléculas de DNA circular foram visualizados na microscopia DNA isolado contendo voltas de replicacao pode ser parcial eletrdnica A replicacéo de um cromossomo circular produz uma estrutura mente desnaturado do mesmo modo Isso permite que a posi que lembra a letra grega teta 8 uma vez que ambas as fitas sao replicadas si co e o progresso das forquilhas de replicacdo sejam medidos multaneamente novas fitas mostradas em cor salm4o As eletromicrografias e mapeados utilizando as regides desnaturadas como pontos Tostam imagens de plasmideos de DNA sendo replicados a partir de uma de referéncia A técnica revelou que nesse sistema as voltas Unica origem de replicagao de replicagao sempre se iniciam em um unico ponto chama do de origem Ele também confirmou a observacao inicial de Se a sintese sempre segue na direcao 5 3 como po que a replicacao geralmente bidirecional Para moléculas de 4 ambas as fitas serem sintetizadas simultaneamente Se DNA circulares as duas forquilhas de replicagao se encon tram em um ponto do lado do circulo oposto ao de origem ambas as fitas fossem sintetizadas continua mente enquanto Origens especificas de replicagao ja foram identificadas e ca a forquilha dle replicagao s e movia uma fita deveria p assar racterizadas em bactérias e eucariontes inferiores por uma sinte se de 395 Esse problema foi resolvido p or Reiji Okazaki e colaboradores na década de 1960 Okazaki A sintese de DNA segue em uma direcao 53e é semidesconti descobriu que uma das novas fitas de DNA 6 sintetizada em nua Uma nova fita de DNA é sempre sintetizada na dire pedacos pequenos atualmente denominados de fragmen cao 53 com a 3OH livre como 0 ponto no qualo DNAé tos de Okazaki Esse trabalho levou a conclusao final de alongado as extremidades 5 e 3 de uma fita de DNA sao que uma fita é sintetizada continuamente e a outra descon definidas na Figura 87 Como as duas fitas de DNA sao tinuamente Figura 254 A fita continua ou fita lider é antiparalelas a fita que serve de molde é lida a partir da aquela em que a sintese 53 segue na mesma direcéo do extremidade 3 em direcéo a extremidade 5 movimento da forquilha de replicagao A fita descontinua ou PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1013 fita retardada é aquela em que a síntese 59S39 prossegue na direção oposta da direção do movimento da forquilha Os fragmentos de Okazaki variam em comprimento desde pou cas centenas até poucos milhares de nucleotídeos depen dendo do tipo celular Como será visto adiante as sínteses da fita líder e retardada são fortemente coordenadas O DNA é degradado por nucleases Para explicar a enzimologia da replicação do DNA primei ro serão apresentadas as enzimas que degradam o DNA em vez de sintetizálo Essas enzimas são conhecidas como nucleases ou DNases se forem específicas para o DNA e não para RNA Cada célula contém várias nuclea ses diferentes pertencendo a dois tipos de classes amplas exonucleases e endonucleases As exonucleases degra dam os ácidos nucleicos de uma extremidade da molécula Muitas operam apenas na direção 59S39 ou 39S59 remo vendo nucleotídeos apenas a partir da extremidade 59 ou 39 respectivamente de uma fita de um ácido nucleico de fita dupla ou de um DNA de fita simples As endonuclea ses podem iniciar a degradação em sítios internos especí ficos em uma fita ou molécula de ácido nucleico reduzin doa a fragmentos cada vez menores Poucas exonucleases e endonucleases degradam apenas DNA de fita simples Há algumas poucas importantes classes de endonucleases que clivam apenas em sequências específicas de nucleotí deos tais como as endonucleases de restrição tão impor tantes em biotecnologia ver Capítulo 9 Figura 92 Você encontrará muitos tipos de nucleases neste e em capítulos subsequentes O DNA é sintetizado por DNApolimerases A busca por uma enzima que poderia sintetizar o DNA começou em 1955 O trabalho de Arthur Kornberg e co laboradores levou à purificação e caracterização de uma DNA polimerase de células de E coli uma enzima de um único polipeptídeo atualmente de nominada DNApolimerase I Mr 103000 codificada pelo gene polA Bem mais tarde investigadores descobriram que a E coli contém pelo me nos quatro outras DNApoli merases distintas descritas a seguir Estudos detalhados da DNApolimerase I revelaram características do processo de síntese do DNA que agora se sabem são comuns a todas as DNApolimerases A reação fundamental é a transferência do grupo fosforil O nucle ófilo é o grupo 39hidroxila do nucleotídeo na extremida de 39 da fita em crescimento O ataque nucleofílico ocorre no fósforo a do desoxinucleosídeo59trifosfato que chega Figura 255a O pirofosfato inorgânico é liberado na reação A reação geral é 251 onde dNMP e dNTP são desoxinucleosídeos 59monofosfato e 59trifosfato respectivamente A catálise por praticamen te todas as DNApolimerases envolve principalmente dois íons de Mg 21 no sítio ativo Figura 255a Um desses auxi lia a retirar o próton do grupo 39hidroxila tornandoo um nucleófilo mais eficaz O outro se liga ao dNTP de entrada e facilita sua saída do pirofosfato A reação parece prosseguir com apenas uma alteração mínima na energia livre uma vez que uma ligação fosfodi éster é formada à custa de um anidrido fosfato um pouco menos estável Entretanto o empilhamento de bases não covalentes e as interações de pareamento de bases forne cem estabilização adicional ao produto alongado de DNA em relação ao nucleotídeo livre Além disso a formação de produtos é facilitada na célula pelos 19 kJmol gerados na posterior hidrólise do produto de pirofosfato pela enzima pirofosfatase p 524 Trabalhos recentes com a DNApolimerase I levaram à definição de duas exigências centrais para a polimerização do DNA Figura 255 Em primeiro lugar todas as DNA polimerases precisam de um molde A reação de polimeri zação é guiada por uma fitamolde de DNA de acordo com as regras de pareamento de bases previstas por Watson e Crick onde uma guanina está presente em um molde um desoxinucleotídeo citosina é adicionado à nova fita e assim por diante Essa foi uma descoberta particularmente impor tante não apenas porque forneceu uma base química para uma replicação de DNA semiconservativa precisa mas tam bém porque representou o primeiro exemplo da utilização de um molde como guia para uma reação biossintética 39 59 39 59 Direção de movimento da forquilha de replicação Fita retardada 59 59 39 39 Fita líder Fragmentos de Okazaki 59 39 FIGURA 254 Definindo as fitas de DNA na forquilha de replicação Uma nova fita de DNA vermelhoclaro sempre é sintetizada na direção 59S39 O molde é lido na direção oposta 39S59 A fita líder é sintetizada con tinuamente na direção adotada pela forquilha de replicação A outra fita retar dada é sintetizada descontinuamente em pequenos pedaços fragmentos de Okazaki em uma direção oposta àquela em que a forquilha de replicação se move Os fragmentos de Okazaki são ligados pela DNAligase Em bactérias os fragmentos de Okazaki têm 1000 a 2000 nucleotídeos de comprimento Nas células de eucariontes eles têm 150 a 200 nucleotídeos de comprimento Arthur Kornberg 19182007 Nelson6edbookindb 1013 Nelson6edbookindb 1013 030414 0748 030414 0748 1014 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Em segundo lugar as polimerases precisam de um pri mer iniciador Um iniciador é um segmento de fita com plementar ao molde com um grupo 39hidroxila livre ao qual um nucleotídeo pode ser adicionado a extremidade 39 livre do iniciador é chamada de terminal do iniciador Em outras palavras parte dessa nova fita já deve estar no lugar todas as DNApolimerases só podem adicionar nucleotídeos a uma fita preexistente Muitos iniciadores são oligonucleo tídeos de RNA em vez de DNA e enzimas especializadas sintetizam iniciadores quando e onde são necessários Um sítio ativo de DNApolimerase tem duas partes Fi gura 255b O nucleotídeo que chega é inicialmente posi cionado no sítio de inserção Uma vez que a ligação fosfo diéster é formada a polimerase desliza para frente no DNA e um novo par de bases é posicionado no sítio de pós inserção Esses elementos estão localizados em um bolso que se assemelha à palma de uma mão Figura 255c Após a adição de um nucleotídeo em uma fita de DNA em crescimento uma DNApolimerase pode tanto se disso ciar como se mover ao longo do molde e adicionar outro nucleotídeo A dissociação e a reassociação da polimerase podem limitar a taxa de polimerização geral o processo é geralmente mais rápido quando uma polimerase adiciona mais nucleotídeos sem se dissociar do molde O número médio de nucleotídeos adicionados antes da dissociação de uma polimerase define sua processividade DNApolime rases variam muito em processividade algumas adicionam apenas alguns poucos nucleotídeos antes de sua dissocia ção outras adicionam muitos milhares Polimerização de nucleotídeos pela DNApolimerase 59 39 39 59 59 OH 39 O O O C C G G A A T T C G A g b a Fitamolde Fita em crescimento iniciador O O P O O O P O P O O a Síntese de DNA dNTP entrando DNApolimerase Mg2 Mg2 O O Asp O O Asp b Inserção Sítio de pósinserção Sítio de inserção Translocação Pol I dNTP entrando c d Palma Palma DNA Polegar Polegar Dedos Dedos 59 39 39 59 Sítio de inserção Sítio de pósinserção 59 39 Fita iniciadora Fitamolde 59 59 39 59 59 39 59 A MECANISMO FIGURA 255 Alongamento da cadeia de DNA a O me canismo catalítico para a adição de um novo nucleotídeo pela DNApolime rase envolve dois íons Mg 21 coordenados aos grupos fosfato do nucleotídeo trifosfato que chega ao grupo 39 hidroxila que atuará como nucleófilo e três resíduos Asp dois dos quais são altamente conservados em todas as DNA polimerases O íon Mg 21 representado na parte de cima facilita o ataque do grupo 39 hidroxila do iniciador ao fosfato a do nucleotídeo trifosfato o outro íon Mg 21 facilita o deslocamento do pirofosfato Ambos os íons estabilizam a estrutura do estado de transição pentacovalente As RNApolimerases usam um mecanismo semelhante ver Figura 261a b A atividade da DNApoli merase I também precisa de uma fita simples não pareada para atuar como molde e uma fita iniciadora para fornecer o grupo hidroxila livre na extremi dade 39 à qual a nova unidade de nucleotídeo é adicionada Cada nucleotí deo que chega é selecionado em parte pelo pareamento de bases ao nu cleotídeo apropriado na fitamolde O produto da reação tem uma nova hidroxila 39 livre permitindo a adição de outro nucleotídeo O par de bases recentemente formado migra para deixar o sítio ativo disponível para o pró ximo par a ser formado c O núcleo da maioria das polimerases tem um formato semelhante ao de uma mão humana que envolve o sítio ativo A es trutura mostrada é a DNApolimerase I de Thermus aquaticus ligada ao DNA PDB ID 4KTQ d Uma interpretação do desenho da estrutura da DNApoli merase mostra as partes de inserção e pósinserção no sítio ativo O sítio de inserção é onde ocorre a adição de nucleotídeos e o sítio de pósinserção é o local para onde o par de bases recentemente formado migra depois que aparece Polimerização de nucleotídeos pela DNApolimerase Nelson6edbookindb 1014 Nelson6edbookindb 1014 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1015 A replicação tem alto grau de precisão A replicação prossegue com extraordinário grau de fideli dade Em E coli um erro acontece apenas a cada 10 9 a 10 10 nucleotídeos adicionados Para o cromossomo de E coli de aproximadamente 46 3 10 6 pb isso significa que um erro ocorre apenas uma vez por 1000 a 10000 replicações Du rante a polimerização a diferenciação entre nucleotídeos corretos e incorretos depende não apenas das ligações de hidrogênio que especificam o pareamento correto entre bases complementares mas também da geometria comum dos pares de bases AT padrão e GC Figura 256 O sítio ativo da DNApolimerase I acomoda apenas pares de bases com essa geometria Um nucleotídeo incorreto pode ser capaz de fazer uma ligação de hidrogênio com uma base no molde mas ele geralmente não se encaixará no sítio ati vo Bases incorretas podem ser rejeitadas antes que a liga ção fosfodiéster seja formada A precisão da reação de polimerização em si no entanto é insuficiente para explicar o alto grau de fidelidade na repli cação Medições cuidadosas in vitro mostraram que as DNA polimerases inserem um nucleotídeo incorreto para cada 10 4 a 10 5 inserções corretas Esses erros algumas vezes ocorrem porque uma base está brevemente em uma forma tautomérica incomum ver Figura 89 permitindo que se ligue por ligação de hidrogênio com um parceiro incorreto In vivo a taxa de erro é reduzida por mecanismos enzimáticos adicionais Um mecanismo intrínseco a praticamente todas as DNApolimerases é uma atividade de exonuclease separada 39S59 que realiza uma dupla verificação em cada nucleo tídeo após sua adição Essa atividade de nuclease permi te a remoção pela enzima de um nucleotídeo adicionado recentemente e é altamente específica para pares de ba ses não correspondentes Figura 257 Se a polimerase adicionou o nucleotídeo errado a translocação da enzima para a posição onde o próximo nucleotídeo seria adiciona do é inibida Essa pausa cinética fornece a oportunidade para uma correção A atividade da exonuclease de 39S59 remove o nucleotídeo malpareado e a polimerase reinicia novamente Essa atividade conhecida como revisão não é simplesmente o inverso da reação de polimerização Equa ção 251 porque o pirofosfato não está envolvido As ativi dades de polimerização e revisão de uma DNApolimerase podem ser medidas separadamente A revisão aperfeiçoa a precisão inerente da reação de polimerização em 10 2 a 10 3 vezes Na DNApolimerase I monomérica as atividades de polimerização e revisão possuem sítios ativos separados no interior do mesmo polipeptídeo Quando a seleção de bases e a revisão são combinadas a DNApolimerase deixa para trás um erro resultante para cada 10 6 a 10 8 bases adicionadas No entanto a precisão medida em E coli é ainda maior A precisão adicional é for necida por um sistema enzimático separado que repara o pareamento de bases malpareado mismatched que per maneceu após a replicação Esse reparo de malpareamento mismatch é descrito junto com outros processos de re paro do DNA na Seção 252 a Pares de bases corretos Formato do sítio ativo b Pares de bases incorretos O H H O H N N H H C G N N N N N N N CH3 H H O N H O T A N N N N N CH3 O H O T N N O H H N H G N N N N O H H N H G N N N N H O N H C N N H N H H N A N N N H N H H N A N N N FIGURA 256 Contribuição da geometria de pares de bases para a fidelidade da replicação do DNA a Os pares de bases padrão AT e GC têm geometrias mui to semelhantes e um sítio ativo com tamanho adequado para acomodar um deles irá em geral acomodar o outro b A geometria das bases pareadas incorretamente pode excluílas do sítio ativo como ocorre na DNApolimerase Nelson6edbookindb 1015 Nelson6edbookindb 1015 030414 0748 030414 0748 1016 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A E coli tem pelo menos cinco DNApolimerases Mais de 90 da atividade de DNApolimerase observa da em extratos de E coli pode ser explicada pela DNA polimerase I Logo após o isolamento dessa enzima em 1955 entretanto começaram a se acumular evidências de que ela não era adequada para o grande cromossomo de E coli Em primeiro lugar a taxa com que ela adiciona nucleotídeos 600 nucleotídeosmin é muito lenta por um fator de 100 ou mais para explicar a velocidade em que a forquilha de replicação se move na célula bacteriana Em segundo lugar a DNApolimerase I tem uma proces sividade relativamente lenta Em terceiro lugar estudos genéticos demonstraram que muitos genes e portanto muitas proteínas estão envolvidos na replicação a DNA polimerase I claramente não age sozinha Em quarto lu gar e o mais importante em 1969 John Cairns isolou uma linhagem bacteriana com um gene alterado para a DNA polimerase I que produziu uma enzima inativa Embora essa linhagem fosse anormalmente sensível aos agentes que danificaram seu DNA ela era entretanto viável Uma busca por outras DNApolimerases levou à des coberta da DNApolimerase II e da DNApolimerase III de E coli no início da década de 1970 A DNApoli merase II é uma enzima envolvida em um tipo de reparo do DNA Seção 253 A DNApolimerase III é a principal enzima de replicação em E coli As propriedades dessas três DNApolimerases são comparadas na Tabela 251 As DNApolimerases IV e V identificadas em 1999 estão envolvidas em uma forma incomum de reparo do DNA Seção 252 FIGURA 257 Exemplo de correção de erro pela atividade de exo nuclease 39S59 da DNApolimerase I A análise estrutural localizou a atividade de exonuclease por trás da atividade de polimerase uma vez que a enzima é orientada em seu movimento ao longo do DNA Uma base mal pareada aqui um pareamento errado CT impede a translocação da DNA polimerase I para o próximo sítio O DNA ligado à enzima desliza para trás para o sítio da exonuclease e a enzima corrige o erro com sua atividade de exonuclease 39S59 A enzima então reassume sua atividade de polimerase na direção 59S39 Sítio de exonuclease dCMP dATP ❶ ❸ ❹ ❺ ❷ 59 39 39 59 59 39 59 59 39 59 59 39 59 59 39 59 Sítio de pósinserção Sítio de inserção A polimerase pareia erradamente dC com dT A exonuclease hidrolisa o dC malpareado A terminação 39 se reposiciona de volta ao sítio da polimerase A polimerase incorpora o nucleotídeo correto dA A polimerase reposiciona a terminação 39 malpareada no sítio da exonuclease 39 59 TABELA 251 Comparação de três DNApolimerases de E coli DNApolimerase I II III Gene estrutural polA polB polC dnaE Subunidades número de tipos diferentes 1 7 10 Mr 103000 88000 791500 Exonuclease 39S59 revisão Sim Sim Sim Exonuclease 59S39 Sim Não Não Taxa de polimerização nucleotídeoss 1020 40 2501000 Processividade nucleotídeos adicionados antes que a polimerase se dissocie 3200 1500 500000 Para enzimas com mais de uma subunidade o gene listado aqui codifica a subunidade com atividade de polimerização Observe que dnaE é uma designação anterior para o gene agora chamado de polC Apenas subunidade de polimerização A DNApolimerase II compartilha várias subunidades com a DNApolimerase III incluindo as subunidades b g d d9 x e C ver Tabela 252 Nelson6edbookindb 1016 Nelson6edbookindb 1016 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1017 A DNApolimerase I portanto não é a enzima princi pal da replicação em vez disso ela executa funções de limpeza durante a replicação recombinação e reparo As funções especiais das polimerases são potencializadas por sua atividade de exonuclease 59S39 Essa atividade diferente da atividade de revisão da exonuclease 39S59 Figura 257 está localizada em um domínio estrutural que pode ser separado da enzima por um tratamento com protease fraca Quando o domínio de exonuclease 59S39 é removido o fragmento remanescente Mr 68000 o fragmento grande ou fragmento de Klenow mantém as atividades de polimerização e revisão A atividade de exonuclease 59S39 da DNApolimerase I intacta pode substituir um segmento de DNA ou RNA pareado com a fitamolde em um processo conhecido como tradução de corte nick translation Figura 258 A maior parte das outras DNApolimerases não tem a atividade de exo nuclease 59S39 A DNApolimerase III é muito mais complexa do que a DNApolimerase I Tabela 252 Suas atividades de po limerização e revisão residem em suas subunidades a e epsilon respectivamente A subunidade u se associa às subunidades a e para formar uma polimerase central a qual pode polimerizar o DNA mas com processividade limitada Duas polimerases centrais podem se ligar uma à outra por outro conjunto de subunidades um comple xo de carregamento de braçadeiras ou complexo g que consiste em cinco subunidades de quatro tipos diferentes t2gdd9 As polimerases centrais são ligadas por meio de su bunidades t tau Duas subunidades adicionais x chi e C psi são ligadas ao complexo carregador de braçadei ras O conjunto completo de 13 subunidades de proteínas nove tipos diferentes é chamado de DNApolimerase III Figura 259a A DNApolimerase III pode polimerizar o DNA mas com uma processividade muito menor do que seria de es perar para a replicação organizada de um cromossomo in teiro O aumento necessário na processividade é fornecido pela adição de subunidades b quatro das quais comple tam a holoenzima da DNApolimerase III As subunidades b se associam em pares para formar estruturas em forma de rosquinhas que circundam o DNA e atuam como bra çadeiras Figura 259b Cada dímero se associa com um subconjunto central da polimerase III uma braçadeira di mérica para cada subconjunto central e desliza ao longo do DNA à medida que a replicação prossegue A braçadeira b deslizante evita a dissociação da DNApolimerase III do DNA aumentando drasticamente a processividade mais de 500000 vezes Tabela 251 A replicação do DNA precisa de muitas enzimas e fatores proteicos A replicação em E coli não precisa apenas de uma única DNApolimerase mas de 20 ou mais enzimas e proteínas diferentes cada uma realizando uma tarefa específica O complexo inteiro foi denominado de sistema de DNA replicase ou replissomo A complexidade enzimática da replicação reflete as limitações impostas pela estrutura do DNA e pelas necessidades de precisão As principais classes de enzimas de replicação são consideradas aqui em termos de problemas por elas superados O acesso às fitas de DNA que atuam como moldes re quer a separação das duas fitas parentais Isso geralmente é conseguido pelas helicases enzimas que se deslocam ao longo do DNA e separam suas fitas utilizando energia química a partir do ATP A separação das fitas cria um estresse topológico na estrutura helicoidal do DNA ver Figura 2411 que é aliviado pela ação de topoisomera ses As fitas separadas são estabilizadas por proteínas de ligação de DNA Como observado anteriormente an tes das DNApolimerases poderem começar a sintetizar DNA iniciadores devem estar presentes no molde ge ralmente pequenos segmentos de RNA sintetizados por FIGURA 258 Tradução de corte A DNApolimerase I bacteriana tem três domínios um domínio que atua como catalisador da DNApolimerase um domínio de atividade de exonuclease 59S39 e outro de atividade de exonu clease 39S59 O domínio de exonuclease 59S39 está na frente da enzima à medida que ela se desloca ao longo do DNA e não é mostrado na Figura 255 Ao degradar a fita de DNA à frente da enzima e sintetizar uma nova fita atrás a DNApolimerase I pode promover uma reação chamada de tradução de corte nick translation em que uma quebra ou corte no DNA é efetiva mente movida ao longo da molécula com a enzima Esse processo tem um papel no reparo de DNA e na remoção dos iniciadores de RNA durante a replicação ambos descritos posteriormente A fita de ácido nucleico a ser removida seja DNA ou RNA é mostrada em roxo a fita de substituição em vermelho A síntese do DNA começa em um corte uma ligação fosfodiéster quebrada deixando uma hidroxila livre 39 e um fosfato livre 59 Um corte permanece onde a DNApolimerase por fim se dissocia sendo mais tarde selado por uma outra enzima Movimento da Pol I Exonuclease 39 59 NMP ou dNMP a serem liberados dNTPs NMP ou dNMP PPi Pol I 59 39 Corte Ácido nucleico a ser removido 59 39 dNTP adicionados e PPi liberado 59 39 Sítio de pósinserção Sítio de inserção 39 59 39 59 39 59 Exonuclease 59 39 Nelson6edbookindb 1017 Nelson6edbookindb 1017 030414 0748 030414 0748 1018 DAVID L NELSON MICHAEL M COX enzimas conhecidas como primases Em última análise os iniciadores de RNA são removidos e substituídos por DNA em E coli essa é uma das muitas funções da DNA polimerase I Após a remoção de um iniciador de RNA e do intervalo ser preenchido por DNA permanece um corte nick no esqueleto de DNA na forma de uma li gação fosfodiéster rompida Esses cortes são selados por DNAligases Todos esses processos necessitam de co ordenação e regulação uma ação combinada mais bem caracterizada no sistema de E coli TABELA 252 Subunidades da DNApolimerase III de E coli Subunidade Número de subunidades por holoenzima Mr da subunidade Gene Função da subunidade a 2 129900 polC dnaE Atividade de polimerização Núcleo da polimerase Complexo carregador de braçadeiras g que carrega as subunidades b na fita retardada em cada fragmento de Okazaki 2 27500 dnaQ mutD Exonuclease de revisão 39S59 u 2 8600 holE Estabilização da subunidade t 2 71100 dnaX Ligação ao molde estável dimerização do núcleo enzimático g 1 47500 dnaX Carregadora de braçadeira d 1 38700 holA Abridor de braçadeira d9 1 36900 holB Carregadora de braçadeira x 1 16600 holC Interação com SSB c 1 15200 holD Interação com g e x b 4 40600 dnaN Grampo de DNA necessário para processividade ótima A subunidade g é codificada por uma porção do gene para a subunidade t de modo que 66 da subunidade t em sua porção amino terminal tem a mesma sequência de aminoácidos que a subunidade g A subunidade g é produzida por um mecanismo de tradução por mudança de fase p 1111 que leva à terminação prematura da tradução a b t t t t g d d9 Carregador da braçadeira Núcleo da Pol III a e u Núcleo da Pol III a e u Braçadeira deslizante b Braçadeira deslizante b b FIGURA 259 DNApolimerase III a Arquitetura da DNApolimerase III bacteriana Pol III Dois domínios centrais compostos das subunidades a e u são ligados por um complexo carregador de braçadeiras de cinco subunidades também conhecido como o complexo g com a composição de t2gdd9 As subunidades centrais e o complexo carregador de braçadeiras constituem a DNApolimerase III As subunidades g e t são codificadas pelo mesmo gene A subunidade g é uma versão encurtada da subunidade t esta unidade contém portanto um domínio idêntico ao da subunidade g junto com um segmento adicional que interage com a polimerase central As duas outras subunidades da DNApolimerase III x e c não mostradas também se ligam ao complexo carregador de braçadeiras Duas b braçadei ras interagem com as duas porções centrais do subarranjo cada braçadeira um dímero da subunidade b O complexo interage com a DnaB helicase descrita mais tarde neste texto pelas subunidades t b As duas subunida des b da polimerase III da E coli formam uma braçadeira circular que envolve o DNA A braçadeira desliza ao longo da molécula de DNA aumentando a processividade da holoenzima da polimerase III para mais de 500000 nu cleotídeos ao impedir sua dissociação do DNA As duas subunidades b são mostradas em dois tons de roxo como estruturas em fita esquerda e ima gens de superfície direita envolvendo o DNA derivado da PDB ID 2POL Nelson6edbookindb 1018 Nelson6edbookindb 1018 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1019 A replicação do cromossomo de E coli prossegue em estágios A síntese de uma molécula de DNA pode ser dividida em três estágios iniciação alongamento e terminação dife renciandose tanto pelas reações que ocorrem como pe las enzimas necessárias Como você descobrirá aqui e nos dois capítulos a seguir a síntese dos principais polímeros biológicos que contêm informação DNA RNA e proteí nas pode ser compreendida com base nesses mesmos três estágios com os estágios de cada via apresentando carac terísticas peculiares Os eventos descritos a seguir refletem a informação derivada principalmente de experimentos in vitro utilizando proteínas purificadas de E coli embora os princípios sejam altamente conservados em todos os siste mas de replicação Iniciação A origem da replicação de E coli oriC consiste em 245 pb e contém elementos sequenciais de DNA que são altamente conservados entre origens de replicação bacte riana O arranjo geral das sequências conservadas é ilustra do na Figura 2510 Dois tipos de sequências apresentam especial interesse cinco repetições de uma sequência de 9 pb sítios R que funcionam como sítios de ligação para a proteína iniciadora chave DnaA e uma região rica em pa res de bases AT chamada de elemento de desenrola mento de DNA DUE Há três sítios de ligação de DnaA sítios I e sítios de ligação para proteínas IHF fator de integração do hospedeiro e FIS fator para estimulação de inversão Essas duas proteínas foram descobertas como componentes necessários de algumas reações de recombi nação descritas adiante neste capítulo e seus nomes refle tem esses papéis Outra proteína de ligação de DNA a HU proteína bacteriana semelhante à histona originalmente denominada de fator U também participa mas não tem um sítio de ligação específico Pelo menos 10 enzimas ou proteínas diferentes resumi das na Tabela 253 participam da fase de iniciação da repli cação Elas abrem a hélice do DNA na origem e estabelecem um complexo de préiniciação para reações subsequentes O componente crucial no processo de iniciação é a proteína DnaA um membro da família de proteínas AAA1 ATPase Arranjo em tandem de sequências de 13 pb sequência consenso GATCTNTTNTTTT Sítios de ligação para a proteína DnaA cinco sequências de 9 pb sequência consenso TTATTNCACC DUE R1 IHF R5 I1 I2 R2 FIS R3 I3 R4 FIGURA 2510 Arranjo das sequências na origem de replicação de E coli oriC São mostradas sequências consenso p 104 para elementos re petidos chave N representa qualquer um dos quatro nucleotídeos As setas horizontais indicam as orientações das sequências de nucleotídeos seta da esquerda para a direita indica sequência na fita de cima da esquerda para a direita na fita de baixo O FIS e o IHF são sítios de ligação para proteínas descritas no texto Os sítios R são ligados pela DnaA Os sítios I são sítios adi cionais de ligação pela DnaA com diferentes sequências ligados pela DnaA apenas quando a proteína está complexada com ATP TABELA 253 Proteínas necessárias para iniciar a replicação na origem de E coli Proteína Mr Número de subunidades Função Proteína DnaA 52000 1 Reconhece a sequência ori abre o duplex em sítios específicos na origem Proteína DnaB helicase 300000 6 Desenrola o DNA Proteína DnaC 174000 6 Necessária para a ligação da DnaB na origem HU 19000 2 Proteína semelhante à histona proteína de ligação do DNA es timula a iniciação FIS 22500 2 Proteína de ligação do DNA estimula a iniciação IHF 22000 2 Proteína de ligação do DNA estimula a iniciação Primase proteína DnaG 60000 1 Sintetiza iniciadores de RNA Proteína de ligação ao DNA de fita sim ples SSB 75600 4 Ligase ao DNA de fita simples DNA girase DNAtopoisomerase II 400000 4 Alivia a tensão de torção gerada pelo desenrolamento do DNA Dam metilase 32000 1 Metila as sequências 59GATC em oriC As subunidades nesses casos são idênticas Nelson6edbookindb 1019 Nelson6edbookindb 1019 030414 0748 030414 0748 1020 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ATPases associadas a diversas atividades celulares Mui tas AAA1 ATPases incluindo a DnaA formam oligômeros e hidrolisam ATP com relativa lentidão Essa hidrólise do ATP atua como um interruptor mediando a interconversão da proteína entre dois estados No caso da DnaA a forma ligada ao ATP é ativa e a forma ligada ao ADP é inativa Oito moléculas de proteína DnaA todas no estado de ligadas ao ATP se reúnem para formar um complexo heli coidal abrangendo os sítios R e I no oriC Figura 2511 A DnaA tem maior afinidade pelos sítios R do que pelos sítios I e se liga aos sítios R com igual facilidade tanto na forma ligada ao ATP quanto na ligada ao ADP Os sítios I os quais ligam apenas à DnaA ligada ao ATP permitem a diferenciação entre as formas ativas e inativas de DnaA O enrolamento estreito do DNA para a direita em volta desse complexo introduz um eficaz superespiralamento positivo ver Capítulo 24 A tensão associada no DNA vizinho leva à desnaturação na região DUE rica em AT O complexo formado na origem de replicação também inclui várias pro teínas de ligação de DNA HU IHF e FIS que facilitam o enovelamento do DNA A proteína DnaC outra AAA1 ATPase carrega então a proteína DnaB para as fitas de DNA separadas na região desnaturada Um hexâmero de DnaC com cada subunida de ligada ao ATP forma um complexo estreito com a heli case DnaB hexamérica em forma de anel Essa interação DnaCDnaB abre o anel de DnaB em um processo auxi liado por uma interação adicional entre a DnaB e a DnaA Dois hexâmeros de DnaB em forma de anel são carregados no DUE cada um em uma fita de DNA O ATP ligado à DnaC é hidrolisado liberando a DnaC e deixando a DnaB ligada ao DNA O carregamento da helicase DnaB é a etapachave na iniciação da replicação Como uma helicase replicativa a DnaB migra ao longo da fita simples de DNA na direção 59S39 desenrolando o DNA ao longo do caminho As he licases DnaB carregadas nas duas fitas de DNA viajam em direções opostas criando duas forquilhas de replicação po tenciais Todas as outras proteínas na forquilha de replica ção são ligadas direta ou indiretamente à DnaB A holoenzi ma de DNApolimerase III é ligada por meio de subunidades t interações adicionais de DnaB são descritas a seguir À medida que a replicação começa e as fitas de DNA são se paradas na forquilha muitas moléculas de proteínas de li gação de DNA de fita simples SSB se ligam e estabilizam as fitas separadas e a DNAgirase DNAtopoisomerase II alivia o estresse topológico induzido à frente da forquilha pela reação de desenrolamento A iniciação é a única fase da replicação do DNA que é conhecida por ser regulada e ela é regulada de modo que a replicação ocorra apenas uma vez em cada ciclo celular O mecanismo de regulação ainda não é completamente com preendido mas estudos genéticos e bioquímicos fornece ram ideias sobre vários mecanismos regulatórios distintos Uma vez que a DNApolimerase III tenha sido carrega da na direção do DNA em conjunto com as subunidades b sinalizando a finalização da fase de iniciação a proteína Hda se liga às subunidades b e interage com a DnaA para estimular a hidrólise de seu ATP ligado A Hda é mais outra AAA1 ATPase intimamente relacionada à DnaA seu nome é derivado de homólogo à DnaA Essa hidrólise do ATP leva à desmontagem do complexo de DnaA na origem A liberação lenta do ADP pela DnaA e a religação do ATP faz a proteína circular entre suas formas inativa ligada a ADP e ativa ligada a ATP em uma escala de tempo de 20 a 40 minutos O tempo de iniciação da replicação é afetado pela meti lação do DNA e pelas interações com a membrana plasmá tica bacteriana O DNA oriC é metilado pela Dam metilase Tabela 253 a qual metila a posição N 6 da adenina no in terior da sequência palindrômica GATC59 Dam signifi ca metilação da adenina do DNA do inglês DNA adeni ne methylation A região oriC de E coli é muito rica em sequências GATC ela possui 11 delas em seus 245 pb ao passo que a frequência média de GATC no cromossomo de E coli como um todo é de 1 em cada 256 pb Imediatamente após a replicação o DNA é hemimetila do as fitas parentais têm sequências oriC metiladas mas as fitas recentemente sintetizadas não As sequências oriC hemimetiladas são agora sequestradas pela interação com a membrana plasmática o mecanismo é desconhecido e pela ligação da proteína SeqA Após um tempo a oriC é DUE oriC DnaAATP DnaB DnaC ADP Pi DnaCATP Ligação de origem Desnaturação da região DUE depen dente de DnaA Carregamento da helicase DnaB dependente de DnaC FIGURA 2511 Modelo para iniciação da replicação na origem de E coli oriC Oito moléculas da proteína DnaA cada uma com um ATP ligado ligamse nos sítios R e I na origem ver Figura 2510 O DNA está enrolado em volta deste complexo formando uma estrutura helicoidal virada para di reita A região DUE rica em AT é desnaturada como resultado da tensão deferida pela ligação adjacente da DnaA A formação do complexo DnaA helicoidal é facilitada pelas proteínas HU IHF e FIS que não são mostradas porque seus papéis estruturais detalhados ainda não foram definidos Hexâ meros da proteína DnaB se ligam a cada fita com o auxílio da proteína DnaC A atividade da helicase da DnaB ainda desenrola o DNA na preparação para a síntese do iniciador e do DNA Nelson6edbookindb 1020 Nelson6edbookindb 1020 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1021 liberada da membrana plasmática se dissocia de SeqA e o DNA deve estar totalmente metilado pela Dam metilase an tes que ele possa novamente se ligar à DnaA e iniciar um novo ciclo de replicação Alongamento A fase de alongamento da replicação inclui duas operações distintas porém relacionadas a síntese da fita líder e a síntese da fita retardada Várias enzimas na forquilha de replicação são importantes para a síntese de ambas as fitas O DNA parental é inicialmente desenrolado pelas DNAhelicases e o resultante estresse topológico é aliviado pelas topoisomerases Cada fita separada é então estabilizada pela SSB A partir desse ponto a síntese das fitas líder e retardada é completamente diferente A síntese da fita líder a mais direta das duas começa com a síntese pela primase proteína DnaG de um ini ciador curto de RNA 10 a 60 nucleotídeos na origem de replicação A DnaG interage com a helicase DnaB para realizar essa reação e o iniciador é sintetizado na direção oposta àquela em que a helicase DnaB está se movendo Com efeito a helicase DnaB se move ao longo da fita que se torna a fita retardada na síntese do DNA entretanto o pri meiro iniciador formado na primeira interação DnaGDnaB funciona como iniciador da síntese da fita líder de DNA na direção oposta Desoxirribonucleotídeos são adicionados a esse iniciador por um complexo DNApolimerase III ligado à helicase DnaB presa à fita de DNA oposta A síntese da fita líder prossegue então continuamente acompanhando o desenrolamento do DNA na forquilha de replicação A síntese da fita retardada como já foi observado é rea lizada em fragmentos curtos de Okazaki Figura 2512a Inicialmente um iniciador de RNA é sintetizado pela prima se e como na síntese da fita líder a DNApolimerase III se liga ao iniciador de RNA e adiciona desoxirribonucleotídeos Figura 2512b Nesse nível a síntese de cada fragmento de Okazaki parece ser direta mas a realidade é muito com plexa A complexidade reside na coordenação da síntese das fitas líder e retardada Ambas as fitas são produzidas por um único dímero assimétrico de DNApolimerase III isso é conseguido fazendo uma volta na fita retardada de DNA como mostrado na Figura 2513 que coloca juntos os dois pontos de polimerização A síntese dos fragmentos de Okazaki na fita retardada implica uma coreografia enzimática elegante A helicase DnaB e a primase DnaG constituem uma unidade funcio nal no interior do complexo de replicação o primossomo A DNApolimerase III utiliza um conjunto de suas subuni dades centrais a polimerase central para sintetizar a fita líder continuamente enquanto o outro conjunto de subuni dades centrais realiza o ciclo de um fragmento de Okazaki para o próximo na fita retardada em alça A helicase DnaB ligada na frente da DNApolimerase III desenrola o DNA FIGURA 2512 Síntese dos fragmentos de Okazaki a A primase sintetiza em in tervalos um iniciador de RNA para um novo fragmento de Okazaki Observe que ao se considerar as duas fitasmolde dispostas lado a lado a síntese da fita retardada formalmente prossegue na direção oposta do movimento da forquilha b Cada iniciador é estendido pela DNApolimerase III c A síntese do DNA conti nua até que o fragmento se estenda tão longe quanto o iniciador do fragmento de Okazaki previamente adicionado Um novo iniciador é sintetizado próximo da forquilha de replicação para começar o processo novamente 59 39 59 39 59 39 Movimento da forquilha de replicação Síntese da fita líder DNApolimerase III Helicase DnaB DNAtopoisomerase II DNAgirase Fita retardada Síntese da fita retardada DNApolimerase III SSB Iniciador de RNA Primase a c b Iniciador de RNA a partir do fragmento de Okazaki anterior Nelson6edbookindb 1021 Nelson6edbookindb 1021 030414 0748 030414 0748 1022 DAVID L NELSON MICHAEL M COX na forquilha de replicação Figura 2513a à medida que ele viaja ao longo do molde da fita retardada na direção 59S39 A primase DnaG ocasionalmente se associa à heli case DnaB e sintetiza um iniciador de RNA curto Figura 2513b Uma nova braçadeira b deslizante é então posi cionada no iniciador pelo complexo carregador de braça deiras da DNApolimerase III Figura 2513c Quando a síntese de um fragmento de Okazaki se completa a repli cação para e as subunidades centrais de DNApolimerase III se dissociam de sua braçadeira b deslizante e do frag mento completo de Okazaki e se associam à nova braça deira Figura 2513d e Isso inicia a síntese de um novo fragmento de Okazaki Como observado anteriormente o complexo inteiro responsável pela síntese coordenada de DNA na forquilha de replicação é conhecido como replisso mo As proteínas que atuam na forquilha de replicação são resumidas na Tabela 254 a DnaB Núcleo Complexo carregador de braçadeiras com braçadeira b deslizante aberta Fita retardada Iniciador de RNA do fragmento de Okazaki anterior Primase Novo iniciador de RNA Primase Braçadeira b deixada para trás e Fita líder b d c A síntese contínua na fita líder prossegue à medida que o DNA é desenrolado pela helicase DnaB Síntese do fragmento de Okazaki próxima da conclusão A próxima braçadeira b é preparada à medida que a síntese do fragmento de Okazaki é iniciada Subunidades centrais da fita retardada são transferidas para o novo iniciador molde e sua braçadeira b A antiga braçadeira b é deixada para trás A primase se liga à DnaB sintetiza um novo iniciador então se dissocia Uma nova braçadeira b é carregada no novo iniciador molde pelo carregador de braçadeiras A síntese de um novo fragmento de Okazaki é completada na fita retardada FIGURA 2513 Síntese do DNA nas fitas líder e retardada Os eventos na forquilha de replicação são coordenados por um dímero de uma única DNApolimerase III em um complexo integrado com a helicase DnaB Essa figura mostra o processo de replicação ainda em curso partes a até e são discutidas no texto A fita retardada sofre uma volta de modo que a síntese de DNA prossegue constantemente tanto na fitamolde líder quanto na re tardada ao mesmo tempo As setas vermelhas indicam a extremidade 39 das duas novas fitas e a direção da síntese de DNA As setas pretas fortes mos tram a direção do movimento do DNA parental pelo complexo Um frag mento de Okazaki está sendo sintetizado na fita retardada As cores das su bunidades e as funções do complexo carregador de braçadeiras são explicadas na Figura 2514 Síntese de DNA Nelson6edbookindb 1022 Nelson6edbookindb 1022 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1023 O complexo de carregamento de braçadeira da DNA polimerase III que consiste em partes de duas subunidades b ao longo das subunidades g d e d9 também é uma AAA1 ATPase Esse complexo se liga ao ATP e à nova braçadeira b deslizante A ligação confere tensão à braçadeira dimérica abrindo o anel em uma subunidade da interface Figura 25 14 A fita retardada que acabou de sofrer priming desliza para o interior do anel pela quebra resultante O carregador de braçadeiras então hidrolisa o ATP liberando a braçadeira b deslizante e permitindo que ela se feche em volta do DNA O replissomo promove a rápida síntese do DNA adicio nando aproximadamente 1000 nucleotídeoss para cada fita líder ou retardada Uma vez que um fragmento de Okazaki tenha se completado seu iniciador de RNA é re movido e substituído por DNA pela DNApolimerase I e o corte nick remanescente selado pela DNAligase Figura 2515 A DNAligase catalisa a formação de uma ligação fos fodiéster entre 39hidroxila na extremidade de uma fita de DNA e 59fosfato na extremidade da outra fita O fosfato deve ser ativado por adenilação As DNAligases isoladas de vírus e eucariontes utilizam ATP para esse propósito As DNAligases de bactérias são incomuns pelo fato de muitas usarem NAD 1 cofator que geralmente funciona em rea ções de transferência de híbridos ver Figura 1324 como a fonte do grupo de ativação de AMP Figura 2516 A DNAligase é outra enzima do metabolismo de DNA que se tornou um importante reagente em experimentos de DNA recombinante ver Figura 91 Terminação Por fim as duas forquilhas de replicação do cromossomo circular de E coli se encontram em uma região terminal que contém cópias múltiplas de uma se quência de 20 pb denominada Ter Figura 2517 As sequências Ter são arrumadas no cromossomo para criar TABELA 254 Proteínas do replissomo de E coli Proteína Mr Número de subunidades Função SSB 75600 4 Ligação a um DNA de fita única Proteína DnaB helicase 300000 6 Desenrolamento do DNA constituinte do primossomo Primase proteína DnaG 60000 1 Síntese do iniciador de RNA constituinte do primossomo DNApolimerase III 791500 17 Novo alongamento da fita DNApolimerase I 103000 1 Preenchimento dos intervalos excisão dos iniciadores DNAligase 74000 1 Ligação DNAgirase DNAtopoisomerase II 400000 4 Superenrolamento Fonte Modificada de Kornberg A 1982 Supplement to DNA replication Tabela S112 WH Freeman and Company New York FIGURA 2514 Carregador de braçadeiras da DNApolimerase III As cinco subunidades do complexo carregador de braçadeiras são as subuni dades g d e d9e o domínio aminoterminal de cada subunidade t ver Figura 259 O complexo se liga a três moléculas de ATP e a uma braçadeira dimé rica b Esta ligação força a braçadeira b a se abrir em uma das suas duas interfaces de subunidade A hidrólise do ATP ligado permite que a braçadeira b se feche de novo em torno do DNA Carregador de braçadeira Braçadeira b 59 59 59 39 39 39 ATP ATP ATP ATP ATP ATP ADP ADP 3 Pi ADP 59 39 39 59 Fita retardada dNTPs DNApolimerase I NMPs Corte ATP ou NAD AMP PPi ou NMN DNAligase FIGURA 2515 Etapas finais na síntese dos segmentos da fita retar dada Os iniciadores de RNA na fita retardada são removidos pela atividade de exonuclease 59S39 da DNApolimerase I e são substituídos por DNA pela mesma enzima O corte remanescente é selado pela DNAligase O papel do ATP ou NAD 1 é mostrado na Figura 2516 Nelson6edbookindb 1023 Nelson6edbookindb 1023 030414 0748 030414 0748 1024 DAVID L NELSON MICHAEL M COX uma armadilha na qual a forquilha de replicação possa entrar mas não sair As sequências Ter funcionam como sítios de ligação para a proteína Tus substância de utili zação de terminal O complexo TusTer pode sequestrar uma forquilha de replicação a partir de apenas uma dire ção Apenas um complexo TusTer funciona por ciclo de replicação o primeiro complexo encontrado por qual quer forquilha de replicação Uma vez que as forquilhas de replicação opostas geralmente param quando colidem as sequências Ter não parecem ser essenciais mas elas podem evitar o excesso de replicação por uma forquilha no evento no qual a outra está atrasada ou interrompida por um encontro com um dano no DNA ou algum outro obstáculo Assim quando qualquer uma das forquilhas de re plicação encontra um complexo TusTer funcional ela para a outra forquilha para quando encontra a primeira forquilha presa As poucas centenas finais de pares de bases de DNA entre esses grandes complexos proteicos são então replicados por um mecanismo ainda desco nhecido completando dois cromossomos circulares to pologicamente interligados catenados Figura 2518 Os círculos de DNA ligados desse modo são conhecidos como catenanos A separação desses círculos catenados em E coli precisa da topoisomerase IV topoisomerase O PPi do ATP ou NMN do NAD1 Enzima P O O2 O Ribose Adenina Enzima P O DNAligase O OH Corte no DNA EnzimaAMP NH3 1 O P O O OH O O2 P O 2O O DNAligase P O O2 O Adenina Ribose AMP 2O P O2 O DNA selado Adenina Ribose R O P O O2 O Ribose Adenina AMP do ATP R 5 PPi ou NAD1 R 5 NMN NH2 1 O2 O2 Enzima NH3 1 Adenililação da DNAligase ❶ ❷ ❸ Ativação do 59fosfato no corte 59 39 39 59 Deslocamento do AMP sela o corte FIGURA 2516 Mecanismo de reação da DNAligase Em cada uma das três etapas uma ligação fosfodiéster é formada à custa de outra As etapas ➊ e ➋ levam à ativação do 59 fosfato no corte Um grupo AMP é transferido pri meiro para um resíduo Lys na enzima e então para o fosfato 59 no corte Na etapa ➌ o grupo 39hidroxila ataca esse fosfato e desloca o AMP produzindo uma ligação fosfodiéster para selar o corte Na reação da DNAligase em E coli o AMP é derivado do NAD 1 As DNAligases isoladas de algumas fontes virais e eucarióticas usam ATP em vez de NAD 1 e liberam pirofosfato em vez de nicotinamida mononucleotídeo NMN na etapa ➊ Origem Forquilha no sentido horário Armadilha para a forquilha no sentido antihorário Armadilha para a forquilha no sentido horário Forquilha no sentido antihorário TerG TerJ TerF TerB TerC TerA TerD TerE TerH TerI FIGURA 2517 Terminação da replicação de cromossomos em E coli As sequências Ter TerA a TerJ são posicionadas no cromossomo em dois grupos com orientações opostas Nelson6edbookindb 1024 Nelson6edbookindb 1024 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1025 de tipo II Os cromossomos separados então se segregam em célulasfilhas na divisão celular A fase terminal da replicação de outros cromossomos circulares incluindo muitos dos vírus de DNA que infectam células de euca riontes é semelhante A replicação em células eucarióticas é semelhante porém mais complexa As moléculas de DNA nas células eucariontes são consi deravelmente maiores do que aquelas nas bactérias e são organizadas em estruturas de nucleoproteínas complexas cromatina p 994 As características essenciais da repli cação do DNA são as mesmas em eucariontes e bactérias e muitos dos complexos proteicos são conservados fun cionalmente e estruturalmente Entretanto a replicação eucariótica é regulada e coordenada com o ciclo celular introduzindo algumas complexidades adicionais As origens de replicação têm uma estrutura bem carac terizada em alguns eucariontes inferiores mas são muito menos conhecidas em eucariontes superiores Em verte brados várias sequências ricas em AT podem ser utiliza das para a iniciação da replicação e os sítios podem variar de uma divisão celular para outra A levedura Saccha romyces cerevisiae tem origens de replicação definidas denominadas sequências de replicação autônomas ARS ou replicadores Os replicadores de leveduras se esten dem por aproximadamente 150 pb e contêm várias sequên cias conservadas essenciais Cerca de 400 replicadores estão distribuídos entre 16 cromossomos de um genoma haploide de levedura A regulação garante que todo DNA celular seja repli cado uma vez por ciclo celular A maior parte dessa re gulação envolve proteínas denominadas ciclinas e cinases dependentes de ciclina CDK com as quais elas formam complexos p 484 As ciclinas são rapidamente destruí das pela proteólise dependente de ubiquitina no final da fase M mitose e a ausência de ciclinas permite o esta belecimento de complexos préreplicativos préRC nos sítios de iniciação de replicação Em células de cres cimento rápido o préRC se forma no final da fase M Em células de crescimento lento ele não se forma até o final de G1 A formação do préRC confere à célula competên cia para replicação um evento algumas vezes chamado de licenciamento Tal como em bactérias o eventochave na iniciação da replicação em todos os eucariontes é o carregamento da he licase replicativa um complexo heterohexamérico de pro teínas de manutenção de minicromossomos MCM MCM2 a MCM7 A helicase anelar MCM27 que funciona como a helicase DnaB bacteriana é carregada no DNA por outro complexo de seis proteínas denominado ORC com plexo de reconhecimento de origem Figura 2519 O ORC tem cinco domínios AAA1 ATPase entre suas su bunidades e é funcionalmente análogo à DnaA bacteriana Duas outras proteínas CDC6 ciclo de divisão celular e CDT1 CDC10 dependente do transcrito 1 também são necessárias para carregar o complexo MCM27 e o CDC6 de levedura é outra AAA1 ATPase O compromisso com a replicação precisa da síntese e atividade dos complexos ciclinaCDK da fase S como o complexo ciclina ECDK2 ver Figura 1246 e CDC7DBF4 Ambos os tipos de complexos auxiliam a ativar a replicação ligandose a várias proteínas e as fosforilando no préRC Outras ciclinas e CDK funcionam para inibir a formação de mais complexos préRC uma vez que a replicação tenha se iniciado Por exemplo o CDK2 se liga à ciclina A à medida que os níveis de ciclina E diminuem durante a fase S ini bindo o CDK2 e impedindo o licenciamento de complexos préRC adicionais A velocidade de movimentação da forquilha de repli cação em eucariontes 50 nucleotídeoss é apenas um vigésimo daquela observada em E coli Nessa velocidade a replicação de um cromossomo humano médio a partir de Forquilha no sentido horário Forquilha no sentido antihorário Conclusão da replicação Cromossomos catenados Cromossomos separados DNAtopoisomerase IV FIGURA 2518 Papel das topoisomerases na terminação da replica ção A replicação do DNA separando forquilhas de replicação opostas dei xa os cromossomos concluídos unidos como catenanos ou como círculos topologicamente interligados Os círculos não são ligados covalentemente mas como eles estão entrelaçados e cada um é covalentemente fechado eles não podem ser separados exceto pela ação das topoisomerases Em E coli uma topoisomerase de tipo II conhecida como DNAtopoisomerase IV desempenha o papel principal na separação dos cromossomos catenados transitoriamente quebrando ambas as fitas de DNA de um cromossomo e permitindo que o outro cromossomo passe pela quebra Nelson6edbookindb 1025 Nelson6edbookindb 1025 030414 0748 030414 0748 1026 DAVID L NELSON MICHAEL M COX uma única origem levaria mais de 500 horas A replicação de cromossomos humanos de fato segue bidirecionalmen te a partir de várias origens espaçadas de 30 a 300 kpb Cromossomos eucariontes são quase sempre bem maiores que cromossomos bacterianos de modo que origens múl tiplas são provavelmente uma característica universal de células eucariontes Assim como as bactérias os eucariontes têm vários tipos de DNApolimerases Algumas foram associadas a funções específicas como a replicação do DNA mitocon drial A replicação de cromossomos nucleares envolve a DNApolimerase a em associação com a DNApolimerase d A DNApolimerase a é geralmente uma enzima de multissubunidades com estrutura e propriedades seme lhantes em todas as células eucariontes Uma subunidade tem atividade de primase e a maior subunidade Mr 180000 contém atividade de polimerização Entretanto essa polimerase não tem atividade de revisão da exonu clease 39S59 tornandoa inadequada para a replicação de DNA de alta fidelidade Acreditase que a DNApoli merase a funcione apenas na síntese de iniciadores cur tos tanto RNA quanto DNA para fragmentos de Okazaki na fita retardada Esses iniciadores são então estendidos pela DNApolimerase d de multissubunidades Essa en zima está associada ao antígeno nuclear de proliferação celular e é por ele estimulada PCNA Mr 29000 uma proteína encontrada em grandes quantidades nos núcle os de células em proliferação A estrutura tridimensional da PCNA é muito semelhante àquela da subunidade b da DNApolimerase III de E coli Figura 259b embo ra a homologia da sequência primária não seja evidente PCNA tem uma função análoga àquela da subunidade b formando uma braçadeira circular que potencializa muito a processividade da polimerase A DNApolimerase d tem uma atividade de revisão da exonuclease 39S59 e parece executar a síntese tanto da fita líder quanto da retardada em um complexo comparável à DNApolimerase III bac teriana dimérica Outra polimerase ainda a DNApolimerase subs titui a DNApolimerase d em algumas situações como no reparo do DNA A DNApolimerase também pode funcio nar na forquilha de replicação talvez desempenhando um papel análogo àquele da DNApolimerase I bacteriana re movendo os iniciadores dos fragmentos de Okazaki na fita retardada Dois outros complexos proteicos também funcionam na replicação do DNA eucarionte RPA proteína de replica ção A é uma proteína de ligação de DNA de fita simples de eucariontes equivalente em função à proteína SSB de E coli RFC fator de replicação C é um carregador de braçadeiras para PCNA e facilita a montagem dos comple xos de replicação ativos As subunidades do complexo RFC apresentam uma semelhança de sequência significativa com as subunidades do complexo de carregamento de bra çadeira complexo g bacteriano Em cromossomos eucariontes lineares a terminação da replicação envolve a síntese de estruturas especiais deno minadas telômeros nas extremidades de cada cromosso mo como discutido no próximo capítulo DNApolimerases virais fornecem alvos para a terapia antiviral Muitos vírus DNA codificam suas próprias DNApoli merases e algumas delas se tornam alvo de medica mentos Por exemplo a DNApolimerase do vírus herpes DNA de origem ORC CDC6 MCM27 CDT1 Pi 1 Pi ATP ATP ATP ATP ATP ADP ADP ATP ATP FIGURA 2519 Montagem de um complexo préreplicativo em uma origem de replicação eucariótica O sítio de iniciação origem é ligado por ORC CDC6 e CDT1 Estas proteínas muitas das quais AAA1 ATPases promovem o carregamento da helicase replicativa MCM27 em uma reação análoga ao carregamento da helicase DnaB bacteriana pela proteína DnaC O carregamento do complexo helicase MCM para o DNA forma o complexo préreplicativo ou préRC e é a etapachave na inicia ção da replicação Nelson6edbookindb 1026 Nelson6edbookindb 1026 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1027 simplex é inibida pelo aciclovir um composto desenvolvi do por Gertrude Elion e George Hitchings p 923 O aci clovir consiste em uma guanina presa a um anel de ribose incompleto HN N N O O OH H2N N Aciclovir Ele é fosforilado por uma timidinacinase codificada viral mente o aciclovir se liga a essa enzima viral com uma afi nidade 200 vezes maior que sua ligação à timidinacinase celular Isso garante que a fosforilação ocorra principal mente nas células infectadas por vírus As cinases celula res convertem o acicloGMP resultante a acicloGTP que é tanto inibidor quanto substrato de DNApolimerases O acicloGTP inibe competitivamente a DNApolimerase do vírus do herpes mais fortemente que as DNApolimerases celulares Como não tem uma 39hidroxila o acicloGTP também atua como terminador de cadeia quando incorpo rado ao DNA Assim a replicação viral é inibida em várias etapas RESUMO 251 Replicação do DNA c A replicação do DNA ocorre com fidelidade muito alta e em um tempo determinado no ciclo celular A replicação é semiconservativa cada fita atuando como molde para uma nova fita filha Ela é realizada em três fases identifi cáveis iniciação alongamento e terminação O processo se inicia em uma única origem em bactérias e normal mente segue bidirecionalmente c O DNA é sintetizado na direção 59S39 pelas DNApoli merases Na forquilha de replicação a fita líder é sinte tizada continuamente na mesma direção do movimento da forquilha de replicação a fita retardada é sintetiza da descontinuamente como fragmentos de Okazaki os quais são subsequentemente ligados c A fidelidade da replicação do DNA é mantida por 1 seleção de bases pela polimerase 2 atividade de revi são da exonuclease 39S59 que faz parte da maioria das DNApolimerases e 3 sistema de reparo específicos para malpareamentos mismatches deixados para trás após a replicação c Muitas células têm várias DNApolimerases Em E coli a DNApolimerase III é a enzima de replicação principal A DNApolimerase I é responsável por funções especiais durante a replicação recombinação e reparo c As fases de iniciação alongamento e terminação sepa radas da replicação do DNA envolvem uma série de en zimas e fatores proteicos muitos pertencentes à família AAA1 ATPase c A principal DNApolimerase replicativa em eucariontes é a DNApolimerase d A DNApolimerase a funciona na síntese de iniciadores A DNApolimerase atua no re paro do DNA 252 Reparo do DNA A maioria das células tem apenas dois conjuntos de DNA genômico Proteínas danificadas e moléculas de RNA podem ser rapidamente substituídas utilizandose a in formação codificada no DNA mas as moléculas de DNA em si são insubstituíveis Manter a integridade da in formação no DNA é um imperativo celular apoiado por um conjunto elaborado de sistemas de reparo de DNA O DNA pode ser danificado por vários processos alguns espontâneos outros catalisados por agentes ambientais Capítulo 8 A replicação em si pode muito ocasional mente danificar o conteúdo da informação quando erros introduzem pares de bases malpareados tal como G pa reado com T A química do dano do DNA é diversa e complexa A resposta celular a esse dano inclui uma ampla variedade de sistemas enzimáticos que catalisam algumas das mais interessantes transformações químicas no metabolismo do DNA Primeiro serão examinados os efeitos das altera ções na sequência de DNA e depois os sistemas de reparo específicos As mutações estão ligadas ao câncer A melhor maneira de ilustrar a importância do reparo do DNA é considerar os efeitos do dano no DNA não reparado uma lesão O resultado mais sério é uma mu dança na sequência de bases do DNA a qual se replicada e transmitida a gerações de células futuras se torna per manente Uma alteração permanente na sequência de nu cleotídeos de DNA é chamada de mutação Mutações po dem envolver a substituição de um par de bases por outro mutação de substituição ou a adição ou deleção de um ou mais pares de bases mutações de inserção ou dele ção Se a mutação afeta um DNA não essencial ou se ela tem um efeito desprezível na função de um gene ela é co nhecida como mutação silenciosa Em raras ocasiões uma mutação confere alguma vantagem biológica A maio ria das mutações não silenciosas entretanto é neutra ou deletéria Em mamíferos há uma forte correlação entre o acúmu lo de mutações e o câncer Um teste simples desenvolvido por Bruce Ames mede o potencial de um determinado com posto químico em promover algumas mutações facilmente detectadas em uma linhagem bacteriana especializada Fi gura 2520 Poucas substâncias químicas encontradas no cotidiano pontuam como mutagênicos nesse teste Entre tanto dos compostos conhecidos por serem carcinogêni cos a partir de longos ensaios animais mais de 90 foram considerados como mutagênicos no teste de Ames Devido a essa forte correlação entre mutagênese e carcinogênese Nelson6edbookindb 1027 Nelson6edbookindb 1027 030414 0748 030414 0748 1028 DAVID L NELSON MICHAEL M COX o teste de Ames para agentes mutagênicos bacterianos é amplamente utilizado como triagem rápida e barata para carcinógenos humanos potenciais O DNA genômico em uma típica célula de mamífero acumula muitos milhares de lesões durante um período de 24 horas Entretanto como resultado do reparo do DNA menos de 1 em 1000 se tornam uma mutação O DNA é uma molécula relativamente estável mas na au sência dos sistemas de reparo o efeito cumulativo das reações pouco frequentes mas danosas tornaria a vida impossível Todas as células têm sistemas de reparo de DNA múltiplos O número e a diversidade dos sistemas de reparo refletem tanto a importância do reparo do DNA para a sobrevivência celular quanto as diversas fontes de dano ao DNA Tabela 255 Alguns tipos comuns de lesões tal como os dímeros de pirimidina ver Figura 831 podem ser reparados por vários sistemas distintos Muitos processos de reparo do DNA também parecem ser extraordinariamente ineficien tes energeticamente uma exceção ao padrão observado na grande maioria das vias metabólicas onde cada ATP é levado em conta e apresenta uma utilização otimizada Quando a integridade da informação genética está em jogo a quantidade de energia química investida em um processo de reparo parece quase irrelevante O reparo do DNA é possível em grande parte porque a molécula de DNA consiste em duas fitas complementares O dano no DNA em uma fita pode ser removido e substituído com precisão utilizandose a fita complementar não dani ficada como um molde Aqui serão considerados os princi pais tipos de sistemas de reparo começando com aqueles que reparam os raros malpareamentos de nucleotídeos que foram deixados para trás pela replicação Reparo de malpareamento A correção dos raros malpare amentos deixados para trás após a replicação em E coli melhora a fidelidade geral da replicação em cerca de 10 2 a 10 3 vezes Os malpareamentos são quase sempre corrigidos para refletir a informação da fita antiga molde de modo a c b d FIGURA 2520 Teste de Ames para substâncias carcinogênicas ba seado na sua mutagenicidade Uma linhagem de Salmonella typhimu rium tendo uma mutação que inative uma enzima da via biossintética da his tidina é colocada em um meio sem histidina Poucas células crescem a As poucas colônias pequenas de S typhimurium que realmente crescem em um meio livre de histidina carregam mutações reversas espontâneas que permi tem que a via biossintética da histidina opere Três placas de nutrientes idên ticas b c e d foram inoculadas com um número igual de células Cada placa recebe então um disco ou papel de filtro contendo concentrações progressivamente inferiores de agente mutagênico Este aumenta muito a taxa de mutação reversa e portanto o número de colônias As áreas vazias em torno do papel de filtro indicam onde a concentração do agente muta gênico é tão alta que é letal para as células À medida que essa substância se difunde para longe do papel de filtro ela é diluída para concentrações suble tais que promovem a mutação reversa Os agentes mutagênicos podem ser comparados com base no seu efeito sobre a taxa de mutação Como muitos compostos passam por uma variedade de transformações químicas depois de entrar nas células eles algumas vezes são testados para mutagenicidade depois de primeiro serem incubados com um extrato de fígado Algumas substâncias se revelaram mutagênicas apenas após esse tratamento TABELA 255 Tipos de sistemas de reparo de DNA em E coli Enzimasproteínas Tipo de dano Reparo de malpareamento Dam metilase Proteínas MutH MutL MutS DNAhelicase II SSB DNApolimerase III Exonuclease I Exonuclease VII Nuclease RecJ Exonuclease X DNAligase Malpareamentos Reparo por excisão de bases DNA glicosilases Endonucleases AP DNApolimerase I DNAligase Bases anormais uracila hipoxantina xantina bases alquiladas em al guns outros organismos dímeros de pirimidina Reparo por excisão de nucleotídeo Excinuclease ABC DNApolimerase I DNAligase Lesões de DNA que causam grandes mudanças estruturais p ex dímeros de pirimidina Reparo direto DNAfotoliases Dímeros de pirimidina O 6MetilguaninaDNAmetiltrans ferase O 6Metilguanina Proteína AlkB 1Metilguanina 3metilcitosina Nelson6edbookindb 1028 Nelson6edbookindb 1028 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1029 que o sistema de reparo deve de algum modo diferenciar entre o molde e a fita sintetizada recentemente A célula realiza esse processo por meio da marcação do DNA molde com grupos metil para diferenciálo das novas fitas sinte tizadas O sistema de reparo de malpareamento de E coli inclui pelo menos 12 componentes proteicos Tabela 255 que funcionam ou na discriminação da fita ou no reparo do próprio processo O mecanismo de discriminação de fitas não foi decifra do para a maioria das bactérias ou eucariontes mas é bem compreendido para E coli e algumas espécies de bactérias estreitamente relacionadas Nessas bactérias a discrimina ção da fita se baseia na ação da Dam metilase que como você deve se lembrar metila o DNA na posição N 6 de todas as adeninas no interior das sequências 59GATC Imedia tamente após a passagem da forquilha de replicação há um curto período poucos segundos ou minutos durante o qual a fitamolde é metilada mas a fita recémsintetizada não Figura 2521 O estado transitório não metilado de sequências GATC na fita recémsintetizada permite que a nova fita seja diferenciada da fitamolde Malpareamentos de replicação nas proximidades de uma sequência GATC hemimetilada são então reparados de acordo com a infor mação na fita metilada molde parental Testes in vitro demonstram que se ambas as fitas forem metiladas na se quência GATC poucos malpareamentos são reparados se nenhuma fita for metilada o reparo ocorre mas não favore ce qualquer fita O sistema celular de reparo de malparea mento dirigido por metilação repara de maneira eficiente os malpareamentos de até 1000 pb de uma sequência GATC hemimetilada Como o processo de correção de malpareamento é diri gido pelas sequências GATC relativamente distantes Um mecanismo é ilustrado na Figura 2522 A proteína MutL forma um complexo com a proteína MutS e o complexo se liga a todos os pares de bases malpareados exceto CC A proteína MutH se liga à MutL e às sequências GATC en contradas pelo complexo MutLMutS O DNA de ambos os lados do malpareamento é enroscado no complexo MutL MutS criando uma volta de DNA o movimento simul tâneo de ambas as pernas da volta através do complexo equivale ao movimento do complexo em ambas as direções ao mesmo tempo ao longo do DNA O MutH tem uma ati vidade de endonuclease sítioespecífica que é inativa até que o complexo encontre uma sequência GATC hemime tilada Nesse sítio o MutH catalisa a clivagem da fita não metilada no lado 59 do G no GATC o que marca a fita para reparo Etapas adicionais na via dependem da localização do malpareamento em relação a esse sítio de clivagem Fi gura 2523 FIGURA 2521 Metilação e o reparo de malpareamento A metilação das fitas de DNA pode servir para distinguir as fitas parentais molde das fitas recémsintetizadas no DNA de E coli função crucial para o reparo de malpareamento ver Figura 2522 A metilação ocorre no N 6 das adeninas em sequências 59GATC Esta sequência é um palíndromo ver Figura 818 presente em orientações opostas nas duas fitas G A T C C T A G 59 39 39 59 CH3 CH3 Replicação DNA hemimetilado G A T C C T A G 59 39 39 59 CH3 Por um período curto após a replicação a fitamolde é metilada e a nova fita não G A T C C T A G 59 39 39 59 CH3 Após alguns minutos a nova fita é metilada e as duas fitas não podem mais ser distinguidas G A T C C T A G 59 39 39 59 CH3 CH3 G A T C C T A G 59 39 39 59 CH3 CH3 Dam metilase G A T C C T A G 59 39 39 59 CH3 G A T C C T A G CH3 59 39 Nelson6edbookindb 1029 Nelson6edbookindb 1029 030414 0748 030414 0748 1030 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Quando o malpareamento é do lado 59da sítio de cliva gem Figura 2523 direita a fita não metilada é desenro lada e degradada na direção 39S59 a partir do sítio de cli vagem por malpareamento e esse segmento é substituído por um DNA novo Esse processo exige a ação combinada da DNAhelicase II também chamada de UvrD helicase SSB exonuclease I ou exonuclease X ambas as quais de gradam fitas de DNA na direção 39S59 DNApolimerase III e DNAligase A via para reparo de malpareamentos no lado 39 do sítio de clivagem é semelhante Figura 2523 es querda exceto pelo fato de que a exonuclease é ou a exo nuclease VII que degrada o DNA de fita simples na direção 59S39 ou 39S59 ou a RecJ nuclease que degrada DNA de fita simples na direção 59S39 O reparo de malpareamento é um processo particular mente dispendioso para a E coli em termos da energia des pendida Esse malpareamento pode ser de 1000 pb ou mais a partir da sequência GATC A degradação e a substituição de um segmento de fita desse comprimento exigem um in vestimento enorme em precursores de desoxinucleotídeos ativados para reparar uma única base malpareada Isso re força mais uma vez a importância da integridade genômica para a célula Todas as células eucariontes têm várias proteínas es truturalmente e funcionalmente análogas às proteínas bacterianas MutS e MutL mas não MutH Alterações nos genes humanos que codificam proteínas desse tipo pro duzem algumas das síndromes hereditárias mais comuns de suscetibilidade ao câncer ver Quadro 251 p 1037 o que demonstra ainda mais o valor para o organismo dos sistemas de reparo do DNA Os principais homólogos de MutS na maior parte dos eucariontes de leveduras a humanos são a MSH2 homóloga de MutS a MSH3 e a MSH6 Heterodímeros de MSH2 e MSH6 geralmente se li gam a malpareamentos de um único par de bases e se li gam com mais dificuldade a voltas malpareadas um pouco mais longas Em muitos organismos os malpareamentos mais longos 2 a 6 pb podem estar ligados em vez disso a um heterodímero de MSH2 e MSH3 ou estar ligados por ambos os tipos de heterodímeros em tandem Homólogos de MutL predominantemente um heterodímero de MLH1 homólogo 1 de MutL e PMS1 segregação pósmeiótica se ligam a e estabilizam os complexos MSH Muitos de talhes dos eventos subsequentes no reparo de malpare amento em eucariontes continuam a ser decifrados Em particular não se conhece o mecanismo pelo qual fitas de DNA recémsintetizadas são identificadas embora pesqui sas tenham revelado que essa identificação da fita não en volve sequências GATC Reparo de excisão de base Cada célula tem uma classe de en zimas denominadas DNAglicosilases que reconhecem lesões particularmente comuns no DNA como os produtos da desaminação da citosina e da adenina ver Figura 830a e removem a base afetada por meio da clivagem da ligação Nglicosil Essa clivagem cria um sítio apurínico ou apirimi dínico no DNA comumente denominado sítio AP ou sí tio abásico Cada DNAglicosilase é geralmente específica para um tipo de lesão As uracila DNAglicosilases por exemplo encontra das na maioria das células removem especificamente do DNA o uracila que é resultado da desaminação espontânea da citosina Células mutantes sem essa enzima apresen tam uma taxa elevada de GC para mutações AT Essa glicosilase não remove resíduos de uracila do RNA ou re síduos de timina do DNA A capacidade para distinguir a timina do uracila o produto da desaminação da citosina necessário para o reparo seletivo da última pode ser uma razão pela qual o DNA evoluiu para conter timina em vez de uracila p 299 CH3 CH3 CH3 CH3 59 39 39 59 Complexo MutLMutS MutH MutH cliva a fita não metilada CH3 CH3 CH3 CH3 MutS MutL MutH G A T C C T A G Par de bases malpareado ADP 1 Pi ATP ADP 1 Pi ATP FIGURA 2522 Um modelo para as etapas iniciais do reparo de mal pareamento direcionado por metil As proteínas envolvidas nesse pro cesso em E coli foram purificadas ver Tabela 255 O reconhecimento da sequência 59GATC e do malpareamento são funções especializadas das proteínas MutH e MutS respectivamente A proteína MutL forma um com plexo com MutS no pareamento errado O DNA é enroscado nesse comple xo de modo que o complexo se move simultaneamente em duas direções ao longo do DNA até que ele encontra uma proteína MutH ligada a uma se quência GATC hemimetilada A MutH cliva a fita não metilada no lado 59 do G nessa sequência Um complexo consistindo na DNAhelicase II e em uma de várias exonucleases degrada então a fita de DNA não metilado daquele ponto para o malpareamento ver Figura 2523 Nelson6edbookindb 1030 Nelson6edbookindb 1030 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1031 A maioria das bactérias tem apenas um tipo de uracila DNAglicosilase ao passo que os seres humanos possuem pelo menos quatro tipos com especificidades diferentes indicador da importância da remoção do uracila do DNA A uracilaglicosilase mais abundante em humanos UNG está associada ao replissomo humano onde elimina o resíduo U ocasional inserido no lugar de um T durante a replicação A desaminação de resíduos C é 100 vezes mais rápida no DNA de fita simples do que no DNA de fita dupla e humanos possuem a enzima hSMUG1 que remove qualquer resíduo U que ocorra no DNA de fita simples durante a replicação ou transcrição Duas outras DNAglicosilases humanas TDG e MBD4 removem tanto resíduos U quanto T pare ados com G produzidos pela desaminação de citosina ou 5metilcitosina respectivamente Outras DNAglicosilases reconhecem e removem vá rias bases danificadas incluindo a formamidopirimidina e a 8hidroxiguanina ambas derivadas da oxidação da purina hipoxantina derivada da desaminação da adenina e ba ses alquiladas como a 3metiladenina e a 7metilguanina Glicosilases que reconhecem outras lesões incluindo os dí meros de pirimidina também foram identificadas em algu mas classes de organismos Lembrese de que os sítios AP também são derivados da hidrólise lenta e espontânea das ligações Nglicosil no DNA ver Figura 830b Uma vez que o sítio AP tenha se formado por uma DNA glicosilase outro tipo de enzima deve reparálo O reparo não é realizado pela simples inserção de uma nova base e reformação da ligação Nglicosil Em vez disso a desoxir ribose59fosfato deixada para trás é removida e substitu ída por um novo nucleotídeo Esse processo começa com uma das AP endonucleases enzimas que cortam a fita de DNA que contém o sítio AP A posição da incisão em rela ção ao sítio AP 59 ou 39 em relação ao sítio varia de acor do com o tipo de AP endonuclease Um segmento de DNA incluindo o sítio AP é então removido a DNApolimerase I substitui o DNA e a DNAligase fecha o corte remanes cente Figura 2524 Em eucariontes a substituição do nucleotídeo é realizada por polimerases específicas como descrito a seguir Reparo de excisão de nucleotídeos Lesões no DNA que pro vocam grandes distorções na estrutura helicoidal do DNA geralmente são reparadas pelo sistema de excisão de nu cleotídeos uma via de reparo crítica para a sobrevivência de todos os organismos de vida livre No reparo de excisão de nucleotídeos Figura 2525 uma enzima de multis subunidades excinuclease hidrolisa duas ligações fosfo diésteres uma de cada lado da distorção provocada pela lesão Em E coli e outras bactérias o sistema enzimático hidrolisa a quinta ligação fosfodiéster no lado 39 e a oita va ligação fosfodiéster no lado 59 para gerar um fragmento de 12 a 13 nucleotídeos dependendo se a lesão envolve uma ou duas bases Em humanos e outros eucariontes o 39 59 59 39 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 MutS MutL MutH MutLMutS DNAhelicase II Exonuclease VII ou RecJ nuclease MutLMutS DNAhelicase II Exonuclease I ou Exonuclease X DNApolimerase III SSB DNApolimerase III SSB ATP ATP ATP ADPPi ADPPi ADPPi FIGURA 2523 Concluindo o reparo de malpareamento direcionado por metil A ação combinada da DNAhelicase II SSB e de uma de quatro diferentes exonucleases remove um segmento da nova fita entre o sítio de clivagem MutH e um ponto logo adiante do malpareamento A exonuclease usada depende da localização do sítio de clivagem em relação ao malparea mento como mostrado aqui pelas vias alternativas O intervalo resultante é preenchido linha tracejada pela DNApolimerase III e o corte é selado pela DNAligase não mostrada Nelson6edbookindb 1031 Nelson6edbookindb 1031 030414 0748 030414 0748 1032 DAVID L NELSON MICHAEL M COX sistema enzimático hidrolisa a sexta ligação fosfodiéster no lado 39 e a vigésima segunda ligação fosfodiéster no lado 59 produzindo um fragmento de 27 a 29 nucleotídeos Após a incisão dupla os oligonucleotídeos retirados são liberados do duplex e o espaço resultante é preenchido pela DNA polimerase I em E coli e pela DNApolimerase em huma nos A DNAligase fecha o corte Em E coli o complexo enzimático chave é a exci nuclease ABC que possui três subunidades UvrA Mr 104000 UvrB Mr 78000 e UvrC Mr 68000 O termo excinuclease é utilizado para descrever a capacidade única desse complexo enzimático de catalisar duas cli vagens endonucleotídicas específicas diferenciando essa atividade daquela de endonucleasespadrão Um comple xo de proteínas UvrA e UvrB A2B analisa o DNA e se liga ao sítio da lesão O dímero UvrA então se dissocia liberando um forte complexo UvrBDNA A proteína UvrC então se liga à UvrB e a UvrB faz uma incisão na quinta ligação fosfodiéster no lado 39 da lesão Seguese uma in cisão mediada por UvrC na oitava ligação fosfodiéster no lado 59 O fragmento resultante de 12 a 13 nucleotídeos é removido pela UvrDhelicase O pequeno intervalo criado desse modo é preenchido pela DNApolimerase I e pela DNAligase Essa via Figura 2525 esquerda é a princi pal rota de reparo para muitos tipos de lesões incluindo os dímeros de ciclobutano pirimidina 64 fotoprodutos ver Figura 831 e vários outros tipos de adutos de bases in cluindo a benzoapireneguanina que é formada no DNA pela exposição à fumaça de cigarro A atividade nucleolí tica da excinuclease ABC é nova no sentido em que dois cortes são feitos no DNA O mecanismo das excinucleases de eucariontes é mui to semelhante àquele da enzima bacteriana embora sejam necessários 16 polipeptídeos sem qualquer semelhança com as subunidades excinuclease de E coli para a incisão dupla Como descrito no Capítulo 26 alguns dos reparos de excisão de nucleotídeos e reparos de excisão de bases em eucariontes estão intimamente ligados à transcrição As deficiências genéticas em reparo de excisão de nucleo tídeos em humanos levam a várias doenças graves ver Quadro 251 Reparo direto Vários tipos de danos são reparados sem a re moção de uma base ou nucleotídeo O exemplo mais bem caracterizado é a fotorreativação direta dos dímeros de ci clobutano pirimidina reação promovida pelas DNAfoto liases Os dímeros de pirimidina resultam de uma reação induzida por UV e as fotoliases utilizam energia derivada da luz absorvida para reverter o dano Figura 2526 As fotoliases geralmente contêm dois cofatores que funcionam FIGURA 2524 Reparo do DNA pela via do reparo por excisão de bases ➊ Uma DNAglicosilase reconhece uma base danificada nesse caso um uracila e cliva entre a base e a desoxirribose no esqueleto do DNA ➋ Uma endonuclease AP cliva o esqueleto de fosfodiéster perto do sítio AP ➌ A DNApolimerase I inicia a síntese de reparo a partir da hidroxila 39 no corte removendo com sua atividade de exonuclease 59S39 e substituindo uma porção da fita danificada ➍ O corte remanescente depois que a DNApoli merase I se dissociou é selado pela DNAligase 59 39 59 39 59 39 59 39 59 39 59 39 59 39 59 39 59 39 59 39 ❶ ❷ ❸ ❹ C C C G G G G A T T C G A U U G T C A C C C G G G G A T T C C G A G T C A C C C G G G G A T T C C G A G T C A C C C G G G G A T T C G A G T C A C C C G G G G A T T C G A G T C A P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P Novo DNA Corte DNAglicosilase uracila glicosilase Endonuclease AP NTPs DNAligase Desoxirribose fosfato 1 dNMPs DNApolimerase I Nelson6edbookindb 1032 Nelson6edbookindb 1032 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1033 como agentes de absorção de luz ou cromóforos Um dos cromóforos é sempre FADHFADH2 Em E coli e levedu ras o outro cromóforo é um folato O mecanismo de rea ção implica a geração de radicais livres As DNAfotoliases estão ausentes nas células de mamíferos placentários que incluem os seres humanos Exemplos adicionais podem ser observados no reparo de nucleotídeos com dano por alquilação O nucleotídeo modificado O 6metilguanina se forma na presença de agen tes alquilantes e é uma lesão altamente mutagênica e co mum p 302 Ele tende a parear com timina em vez de citosina durante a replicação e portanto provoca mutações GC para AT Figura 2527 Reparo direto de O 6me tilguanina é realizado por O 6metilguaninaDNA metiltrans ferase proteína que catalisa a transferência do grupo metil da O 6metilguanina para um de seus próprios resíduos Cys Essa metiltransferase não é estritamente uma enzima por que um único evento de transferência de metil acaba por metilar permanentemente a proteína tornandoa inativa nessa via O consumo de uma molécula inteira de proteína para corrigir uma única base danificada é outra vívida ilus tração da prioridade dada à manutenção da integridade do DNA celular OCH3 CH3 N N N Cys Ativo SH R H2N N O HN N N R Nucleotídeo guanina Metiltransferase H2N N Cys Inativo S Nucleotídeo O6metilguanina Um mecanismo muito diferente mas igualmente direto é utilizado para reparar 1metiladenina e 3metilcitosina Os grupos aminos dos resíduos A e C são algumas vezes meti lados quando o DNA é uma fita simples e a metilação afeta diretamente o pareamento de bases adequado Em E coli a desmetilação oxidativa desses nucleotídeos alquilados é mediada pela proteína AlkB um membro da superfamília dioxigenase dependente de acetoglutaratoFe 21 Figura 2528 Ver no Quadro 43 a descrição de outro membro dessa família de enzimas DNApolimerase I 39 59 59 39 P P P P P P P OH OH P DNAligase DNApolimerase e DNAligase DNAhelicase DNAhelicase 13 mer Lesão do DNA ❶ ❷ ❸ ❹ ❶ ❷ ❸ ❹ Excinuclease Excinuclease 29 mer E coli Humanos FIGURA 2525 Reparo por excisão de nucleotídeos em E coli e huma nos A via geral do reparo por excisão de nucleotídeos é semelhante em todos os organismos ➊ Uma excinuclease se liga ao DNA no local de uma lesão extensa e cliva a fita do DNA lesionado de cada lado da lesão ➋ O segmento de DNA de 13 nucleotídeos 13 mer ou 29 nucleotídeos 29 mer é removido com o auxílio da helicase ➌ O intervalo é preenchido pela DNApolimerase e ➍ o corte remanescente é selado com a DNAligase Nelson6edbookindb 1033 Nelson6edbookindb 1033 030414 0748 030414 0748 1034 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A interação das forquilhas de replicação com o dano do DNA pode levar à síntese de DNA translesão propensa a erro As vias de reparo consideradas até agora geralmente tra balham apenas para lesões no DNA de fita dupla a fita não danificada fornecendo a informação genética correta para restaurar a fita danificada ao seu estado original Entretan to em alguns tipos de lesões como as quebras na fita dupla ligações cruzadas na fita dupla ou lesões em um DNA de fita simples a fita complementar é ela mesma danificada ou está ausente Quebras na fita dupla e lesões no DNA de fita simples surgem mais frequentemente quando uma for quilha de replicação encontra uma lesão não reparada no DNA Figura 2529 Tais lesões e as ligações cruzadas de DNA também podem resultar de radiação ionizante e rea ções oxidativas Em uma forquilha de replicação parada em bactérias há dois caminhos para reparo Na ausência de uma segunda fita a informação necessária para um reparo preciso deve vir de um cromossomo separado e homólogo O sistema de reparo envolve portanto recombinação genética de homó logos Esse reparo recombinante de DNA é descrito em de talhes na Seção 253 Em algumas condições uma segunda via de reparo a síntese de DNA translesão propensa a erro frequentemente abreviada como TLS se torna O O NH HN O N P Dímero de ciclobutano pirimidina Pirimidinas monoméricas no DNA reparado O N O HN N H H C N H N N Glun C H2 O2 e2 e2 O NH HN O N P O N O2 O NH HN O N P O N O2 O NH NH HN O O N P O N2 O O N N R N H O NH HN O N P O N O Radical flavina FADH NH H2N N2 O O N R N H FADH2 NH H3C H3C H3C H3C H3C H3C N2 O O N R N H FADH2 1 1 1 MTHFpoliGlu ❶ ❷ ➌ ❹ ❹ ❺ O HN N H H C N H N N Glun C H2 H2N MTHFpoliGlu Luz Um fóton de luz azul 300 a 500 nm é absorvido pelo MTHFpoliGlu A energia de excitação passa para o FADH2 no sítio ativo A flavina excitada FADH2 doa um elétron para o dímero de pirimidina para gerar um radical dímero instável O rearranjo de elétrons restaura as pirimidinas monoméricas O elétron é transferido de volta ao radical flavina para regenerar o FADH2 MECANISMO FIGURA 2526 Reparo dos dímeros de pirimidina com fotoliase A energia derivada da luz absorvida é usada para reverter a fo torreação que causou a lesão Os dois cromóforos na fotoliase da E coli Mr 54000 N 5N 10meteniltetrahidrofolilpoliglutamato MTHFpoliGlu e FADH realizam funções complementares O MTHFpoliGlu funciona como fotoan tena para absorver fótons de luz azul A energia de excitação passa para o FADH e a flavina excitada FADH doa um elétron para o dímero de pirimi dina levando a um rearranjo como mostrado Nelson6edbookindb 1034 Nelson6edbookindb 1034 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1035 disponível Quando essa via é ativa o reparo do DNA se torna significativamente menos preciso e pode resultar em uma alta taxa de mutação Em bactérias a síntese de DNA translesão propensa a erro é parte de uma resposta de estresse celular a extenso dano ao DNA conhecido mui to apropriadamente como resposta SOS Algumas pro teínas SOS como as proteínas UvrA e UvrB já descritas estão normalmente presentes na célula mas são induzidas a níveis mais elevados como parte da resposta SOS Tabe la 256 Proteínas SOS adicionais participam da via para reparo de propensão ao erro essas incluem as proteínas O Guanina Metilação e replicação O6metilguanina N N H N N R H N N H N N N R R H O N N N R O H Citosina OCH3 O N N CH3 Timina H N H H a G CH3 Metilação C G C G CH3 T C Replicação Replicação DNA corretamente pareado sem mutações G b A T G CH3 T FIGURA 2527 Exemplo de como a lesão do DNA resulta em muta ções a O produto da metilação O 6metilguanina pareia com a timina em vez da citosina b Se não for reparado isso leva a uma mutação GC para AT após a replicação N N N NH2 N 1 CH3 CH3 N 1 CH2 N NH2 N 1 N N N NH2 OH N N N N NH2 CH2 CH2 CO2 1 COO2 COO2 C CH2 CH2 O2 1 CO2 1 O2 1 COO2 COO2 acetoglutarato 1Metiladenina 3Metilcitosina Succinato AlkB Fe21 AlkB Fe21 acetoglutarato Succinato O H2C O 1 H1 Formaldeído H2C O 1 H1 Formaldeído N 1 CH2 N NH2 OH Adenina O O N N NH2 O Citosina FIGURA 2528 Reparo direto das bases alquilatadas por AlkB A pro teína AlkB é uma hidroxilase dependente de acetoglutaratoFe 21 ver Qua dro 43 Ela catalisa a desmetilação oxidativa dos resíduos de 1metiladenina e 3metilcitosina Nelson6edbookindb 1035 Nelson6edbookindb 1035 030414 0748 030414 0748 1036 DAVID L NELSON MICHAEL M COX UmuC e UmuD Umu de imutável unmutable a ausên cia da função do gene umu elimina o reparo de propen são ao erro A proteína UmuD é clivada em um processo regulado por SOS para uma forma mais curta denominada UmuD9 que forma um complexo com a UmuC e uma pro teína denominada RecA descrita na Seção 253 para criar uma DNApolimerase especializada a DNApolimerase V UmuD92UmuCRecA que pode replicar muitas das lesões de DNA anteriores que poderiam normalmente bloquear a replicação O pareamento de bases adequado é com fre quência impossível no sítio de tal lesão de modo que essa replicação translesão é propensa a erro Dada a ênfase na importância da integridade genômi ca ao longo desse capítulo a existência de um sistema que aumenta a taxa de mutação pode parecer incoerente En tretanto é possível pensar nesse sistema como uma estra Lesão não reparada Quebra não reparada DNA de fita simples Quebra da fita dupla Reparo do DNA por recombinação ou reparo propenso a erro Reparo do DNA por recombinação FIGURA 2529 Lesão do DNA e seu efeito na repli cação do DNA Se a forquilha de replicação encontra uma lesão não reparada ou quebra na fita a replica ção geralmente para e a forquilha pode colapsar Uma lesão é deixada para trás em um segmento de DNA de fita simples não replicado esquerda uma quebra de fita se torna uma quebra de fita dupla direita Em cada caso o dano a uma fita não pode ser reparado pelos mecanismos descritos anteriormente neste ca pítulo pois a fita complementar necessária para dirigir o reparo preciso é lesionada ou está ausente Há dois possíveis caminhos para o reparo reparo do DNA por recombinação uma via é descrita na Figura 2530 ou quando as lesões são anormalmente numerosas re paro propenso a erro Este último mecanismo envolve uma nova polimerase DNApolimerase V codificada pelos genes umuC e umuD que pode se replicar ainda que imprecisamente sobre muitos tipos de lesões O mecanismo de reparo é propenso a erro porque fre quentemente ocorrem mutações TABELA 256 Genes induzidos como parte da resposta SOS em E coli Nome do gene Proteína codificada eou papel no reparo do DNA Genes de função conhecida polB dinA Codifica a subunidade de polimerização da DNApolimerase II necessária para o rei nício da replicação no reparo do DNA por recombinação uvrA uvrB Codifica as subunidades UvrA e UvrB da excinuclease ABC umuC umuD Codifica as subunidades central e de polimerização da DNApolimerase V sulA Codifica a proteína que inibe a divisão celular possivelmente para dar tempo para o reparo do DNA recA Codifica a proteína RecA necessária ao reparo propenso a erro e ao reparo por re combinação dinB Codifica a DNApolimerase IV ssb Codifica a proteína de ligação do DNA de fita simples SSB himA Codifica a subunidade do fator de integração do hospedeiro IHF envolvido na re combinação sítioespecífica replicação transposição regulação da expressão gênica Genes envolvidos no metabolismo do DNA mas papel no reparo do DNA desconhecido uvrD Codifica a DNAhelicase II proteína de desenrolamento do DNA recN Necessária para o reparo por recombinação Genes de função desconhecida dinD dinF Nota Alguns dos genes e suas funções são discutidos adicionalmente no Capítulo 28 Nelson6edbookindb 1036 Nelson6edbookindb 1036 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1037 tégia desesperada Os genes umuC e umuD são totalmente induzidos apenas no final da resposta SOS e eles não são ativados para a síntese translesão iniciada pela clivagem umuD a menos que os níveis de dano ao DNA sejam particu larmente elevados e todas as forquilhas de replicação sejam bloqueadas As mutações resultantes da replicação media da pela DNApolimerase V matam algumas células e criam mutações deletérias em outras mas esse é o preço meta bólico que uma espécie paga para superar o que de outro modo seria uma barreira intransponível para a replicação uma vez que ela permite pelo menos a sobrevivência de poucas célulasfilhas mutantes Contudo outra DNApolimerase a DNApolimerase IV também é induzida durante a resposta SOS A replicação pela DNApolimerase IV um produto do gene dinB é tam bém altamente propensa a erro As DNApolimerases bacte rianas IV e V são parte de uma família de TLS polimerases encontradas em todos os organismos Essas enzimas não têm uma exonuclease de revisão e têm um sítio ativo mais aberto que acomoda nucleotídeos moldes danificados A fidelidade da seleção de bases durante a replicação pode ser reduzida por um fator de 10 2 diminuindo a fidelidade total da replica ção para um erro em aproximadamente 1000 nucleotídeos Mamíferos têm muitas DNApolimerases de baixa fideli dade da família das polimerases TLS Entretanto a presen ça dessas enzimas não se traduz necessariamente em um inaceitável fardo mutacional porque a maior parte dessas enzimas também tem funções especializadas no reparo do DNA A DNApolimerase h eta por exemplo encontrada em todos os eucariontes promove a síntese translesão prin cipalmente por meio de dímeros T T do ciclobutano Pou cas mutações resultam nesse caso porque a enzima insere preferencialmente dois resíduos A a partir dos resíduos T ligados Várias outras polimerases de baixa fidelidade in cluindo as DNApolimerases b i iota e l têm funções especializadas no reparo de excisão de base de eucarion tes Cada uma dessas enzimas tem uma atividade 59deso xirribosefosfatoliase além de sua atividade de polimerase Após a remoção de base por uma glicosilase e clivagem do esqueleto por uma AP endonuclease essas polimerases removem o sítio abásico uma 59desoxirribosefosfato e preenchem o espaço muito curto A frequência de muta ção devido à atividade da DNApolimerase h é minimizada pelos comprimentos muito curtos frequentemente um nu cleotídeo de DNA sintetizado O que surge a partir de pesquisas dos sistemas de repa ro de DNA celular é o cenário de um metabolismo de DNA que mantém a integridade genômica com sistemas múlti plos e com frequência redundantes No genoma humano mais de 130 genes codificam proteínas dedicadas ao reparo do DNA Em muitos casos a perda de função de uma dessas proteínas resulta em instabilidade genômica e em um au mento na ocorrência de oncogênese Quadro 251 Esses sistemas de reparo são frequentemente integrados com os sistemas de replicação do DNA e são complementados por sistemas de recombinação abordada a seguir Os cânceres em seres humanos se desenvolvem quando genes que regulam a divisão celular normal oncogenes e genes supressores de tumor Capítulo 12 não funcionam são ativados no momento errado ou são alterados Como consequência as células podem crescer sem controle e formar um tumor Os genes que controlam a divisão ce lular podem ser danificados por mutação espontânea ou substituídos pela invasão de um vírus tumoral Capítulo 26 Não é surpreendente que alterações nos genes de reparo do DNA que resultam em uma taxa aumentada de mutação elevem enormemente a suscetibilidade de um indivíduo ao câncer Defeitos nos genes que codificam as proteínas envolvidas no reparo de excisão de nucleotí deos reparo de malpareamento reparo de recombinação e síntese de DNA translesão propensa a erro estão todos ligados a cânceres em seres humanos Claramente o reparo do DNA pode ser uma questão de vida e morte O reparo de excisão de nucleotídeos necessita de um número maior de proteínas em huma nos do que em bactérias embora as vias gerais sejam bastante semelhantes Os defeitos genéticos que inati vam o reparo de excisão de nucleotídeos foram associa dos a várias doenças genéticas a mais bem estudada é o xeroderma pigmentoso XP Como o reparo de excisão de nucleotídeos é a única via de reparo para dímeros de pirimidina em humanos pessoas com XP são extrema mente sensíveis à luz e rapidamente desenvolvem cân ceres de pele induzidos pela luz do sol A maior parte das pessoas com XP também apresenta anormalidades neu rológicas presumivelmente devido a sua inabilidade em reparar algumas lesões causadas por uma alta taxa de metabolismo oxidativo em neurônios Defeitos nos ge nes que codificam qualquer um de pelo menos sete com ponentes proteicos diferentes do sistema de reparo de excisão de nucleotídeos podem resultar em XP levando ao surgimento de sete grupos genéticos diferentes deno minados de XPA até XPG Várias dessas proteínas no tadamente aquelas com defeitos em XPB XPD e XPG também desempenham papéis no reparo de excisão de bases acoplado à transcrição de lesões oxidativas des crito no Capítulo 26 A maioria dos microrganismos tem vias redundantes para o reparo de dímeros de ciclobutano pirimidina lan çando mão de DNAfotoliases e algumas vezes do reparo de excisão de bases como alternativas ao reparo de ex cisão de nucleotídeos exceto em humanos e em outros mamíferos placentários Essa ausência de um backup para o reparo de excisão de nucleotídeos para remover dímeros de pirimidina levou à especulação de que a evo lução inicial de mamíferos envolveu pequenos animais noturnos e peludos com pouca necessidade de reparo de danos UV Entretanto mamíferos de fato possuem uma QUADRO 251 MEDICINA Reparo do DNA e câncer Continua na próxima página Nelson6edbookindb 1037 Nelson6edbookindb 1037 030414 0748 030414 0748 1038 DAVID L NELSON MICHAEL M COX RESUMO 252 Reparo de DNA c As células têm vários sistemas para reparo do DNA O reparo de malpareamento em E coli é direcionado por sequências transitórias não metiladas de 59GATC na fita recémsintetizada c Sistemas de reparo de excisão de bases reconhecem e reparam danos causados por agentes ambientais tais como radiação e agentes alquilantes e reações espon tâneas de nucleotídeos Alguns sistemas de reparo re conhecem e excisam apenas bases danificadas ou in corretas deixando um sítio AP abásico no DNA Esse é reparado pela excisão e substituição do segmento de DNA que contém o sítio AP c Os sistemas de reparo de excisão de nucleotídeos reco nhecem e removem várias lesões extensas e dímeros de pirimidina Eles retiram um segmento de fita de DNA que inclui a lesão deixando um espaço preenchido pela ação de DNApolimerases e ligases c Alguns danos ao DNA são reparados por reversão direta da reação que causou o dano dímeros de pirimidina são diretamente convertidos a pirimidinas monoméricas por uma fotoliase e o grupo metil de O 6metilguanina é re movido por uma metiltransferase c Em bactérias a síntese de DNA translesão propensa a erro envolvendo DNApolimerases TLS ocorre em res posta a um dano muito grande ao DNA Em eucariontes polimerases semelhantes têm funções especializadas no reparo do DNA que minimizam a introdução de mutações 253 Recombinação do DNA O rearranjo da informação genética no interior e entre as moléculas de DNA envolve vários processos coletivamente colocados sob o título de recombinação genética As aplica ções práticas dos rearranjos de DNA na alteração dos ge nomas de um número crescente de organismos estão agora sendo exploradas Capítulo 9 Os eventos de recombinação genética caem em pelo menos três grandes classes A recombinação genética homóloga também chamada recombinação geral en volve alterações genéticas entre duas moléculas de DNA quaisquer ou segmentos da mesma molécula que com partilham uma região estendida de sequência praticamen te idêntica A sequência real de bases é irrelevante desde que seja semelhante nos dois DNA Na recombinação sítio específica as trocas ocorrem apenas em uma sequência parti cular do DNA A transposição de DNA é diferente das outras duas classes porque geralmen te envolve um segmento curto de DNA com a capacidade mar cante para se mover de uma lo calização no cromossomo para outra Esses genes saltadores jumping genes foram ini cialmente observados no milho na década de 1940 por Barbara via para evitar a translesão de dímeros de ciclobutano pirimidina que envolve a DNApolimerase h Essa en zima insere preferencialmente dois resíduos A opostos ao dímero de pirimidina TT minimizando as mutações Pessoas com uma condição genética na qual a função da DNApolimerase h está ausente exibem uma doença semelhante ao XP conhecida como variante XP ou XP V As manifestações clínicas de XPV são semelhantes àquelas das doenças XP clássicas embora os níveis de mutação sejam mais elevados na XPV quando as célu las são expostas à luz UV Aparentemente o sistema de reparo de excisão de nucleotídeos trabalha em conjunto com a DNApolimerase h nas células humanas normais reparando eou ignorando os dímeros de pirimidina se gundo o necessário para manter o crescimento celular e o andamento da replicação do DNA A exposição à luz UV introduz uma carga pesada de dímeros de pirimidina e alguns devem ser ignorados pela síntese translesão para manter a replicação em curso Quando um sistema está ausente ele é parcialmente compensado pelo outro Uma perda da atividade de DNApolimerase h leva à parada das forquilhas de replicação e ao desvio das lesões UV pelas polimerase de síntese translesão TLS diferentes e mais mutagênicas Como ocorre quando outros sistemas de reparo de DNA estão ausentes o aumento resultante de mutações com frequência leva ao câncer Uma das síndromes hereditárias mais comuns de sus cetibilidade ao câncer é o câncer de colo hereditário não polipoide HNPCC Essa síndrome foi associada a defei tos de reparo de malpareamento Células humanas e de outros eucariontes têm várias proteínas análogas às pro teínas bacterianas MutL e MutS ver Figura 2522 De feitos em pelo menos cinco genes de reparo de malparea mento podem levar à HNPCC Os mais prevalentes são os defeitos nos genes hMLH1 homólogo 1 ao MutL humano e hMSH2 homólogo 2 ao MutS humano Em indivíduos com HNPCC o câncer geralmente se desenvolve em idade precoce sendo os cânceres de colo os mais comuns A maioria dos cânceres de mama humanos ocorre em mulheres sem qualquer predisposição conhecida Entre tanto cerca de 10 dos casos são associados a defeitos hereditários em dois genes BRCA1 e BRCA2 As BRCA1 e BRCA2 humanas são proteínas grandes 1834 e 3418 resíduos de aminoácidos respectivamente que interagem com várias outras proteínas envolvidas na transcrição manutenção de cromossomos reparo do DNA e controle do ciclo celular A BRCA2 foi implicada no reparo recom binante do DNA de quebras da fita dupla Entretanto a função molecular precisa da BRCA1 e da BRCA2 nesses vários processos celulares ainda não é clara Mulheres com defeitos em ambos os genes BRCA1 ou BRCA2 têm uma chance maior que 80 de desenvolver câncer de mama QUADRO 251 MEDICINA Reparo do DNA e câncer Continuação Barbara McClintock 19021992 Nelson6edbookindb 1038 Nelson6edbookindb 1038 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1039 McClintock Além disso existe uma ampla gama de rear ranjos genéticos incomuns para os quais ainda não foi pro posto nenhum mecanismo ou propósito Aqui serão focali zadas as três classes gerais As funções dos sistemas de recombinação genética são tantas quanto os seus mecanismos Elas incluem pa péis em sistemas de reparo de DNA especializados ati vidades especializadas na replicação do DNA regulação da expressão de certos genes facilitação da segregação adequada de cromossomos durante a divisão celular eu cariótica manutenção da diversidade genética e imple mentação de rearranjos genéticos programados durante o desenvolvimento embrionário Na maior parte dos casos a recombinação genética está intimamente integrada a outros processos no metabolismo do DNA e isso se torna um tema da presente discussão A recombinação homóloga bacteriana é uma função de reparo do DNA Em bactérias a recombinação genética homóloga é princi palmente um processo de reparo do DNA e nesse contexto como observado na Seção 252 é denominado de repa ro do DNA recombinante Ele é geralmente direcionado para a reconstrução das forquilhas de replicação que pa raram ou colapsaram no local do dano do DNA A recom binação genética homóloga também pode ocorrer durante a conjugação mating quando o DNA cromossômico é transferido de uma célula bacteriana doadora para outra recipiente A recombinação durante a conjugação embo ra rara em populações bacterianas selvagens contribui para a diversidade genética Um exemplo do que ocorre quando uma forquilha de replicação encontra um dano no DNA é mostrado na Figu 39 3959 59 39 59 59 39 59 39 59 39 59 39 59 39 59 39 59 39 59 39 59 39 59 39 Corte no DNA Quebra na fita dupla Invasão da fita Migração do ramo Resolução e ligação do intermediário de Holliday Intermediário de Holliday Forquilha de replicação colapsa Processamento da extremidade 5 ❶ ❷ ❸ ❹ Migração do ramo FIGURA 2530 Reparo de DNA recombinante em uma forquilha de re plicação colapsada Quando uma forquilha de replicação encontra uma quebra em uma das fitasmolde um braço da forquilha é perdido e a for quilha de replicação colapsa A extremidade 59 da fita no corte é degradada para criar uma extensão 39 de fita simples então usada em um processo de invasão da fita pareando a fita única invasora com sua fita complementar no interior do duplex adjacente A migração do ramo inserção pode criar um intermediário de Holliday A clivagem desse intermediário por nucleases es pecializadas seguida por ligação restaura uma forquilha de replicação viável O replissomo é carregado sobre essa estrutura não mostrado e a replicação continua As pontas das setas representam extremidades 39 Nelson6edbookindb 1039 Nelson6edbookindb 1039 030414 0748 030414 0748 1040 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ra 2530 Uma característica comum das vias de reparo do DNA ilustradas nas Figuras 2522 a 2525 é que elas intro duzem uma quebra transitória em uma das fitas de DNA Se uma forquilha de replicação encontra um local danificado em reparo próximo a uma quebra em uma das fitasmolde um braço da forquilha de replicação é desconectado por uma quebra de fita dupla e a forquilha colapsa A extremi dade dessa quebra é processada pela degradação da extre midade 59 da fita A extensão da fita simples 39 resultante é ligada por uma recombinase que a utiliza para promover a invasão da fita a extremidade 39 invade o DNA duplex intacto conectado ao outro braço da forquilha e se pareia com sua sequência complementar Isso cria uma estrutu ra de DNA ramificada um ponto onde três segmentos de DNA se juntam O ramo de DNA pode ser movido em um processo denominado migração do ramo para criar uma estrutura cruzada semelhante a um X conhecida como in termediário de Holliday em homenagem ao pesquisador Robin Holliday que primeiro postulou sua existência O in termediário de Holliday é então resolvido por uma classe especial de nucleases O processo todo reconstrói a forqui lha de replicação Em E coli o processo de terminação do DNA é promo vido pela nucleasehelicase RecBCD A enzima RecBCD se liga ao DNA linear em uma extremidade livre quebrada e se move para dentro ao longo da duplahélice desenrolando e degradando o DNA em uma reação acoplada à hidrólise do ATP Figura 2531 As subunidades RecB e RecD são motores de helicase com a RecB se movendo na direção 39S59 ao longo de uma fita e a RecD se movendo na direção 59S39 ao longo da outra fita A atividade da enzima é alte rada quando ela interage com uma sequência denominada chi 59GCTGGTGG que se liga fortemente a um sítio na subunidade RecC A partir desse ponto a degradação da fita com a terminação 39 é muito reduzida mas a degradação da fita 59 terminal aumenta Esse processo cria um DNA de fita simples com uma extremidade 39 que é utilizado durante as etapas subsequentes na recombinação As 1009 sequências chi espalhadas por todo o genoma de E coli potencializam a frequência de recombinação em cerca de 5 a 10 vezes no interior de 1000 pb do sítio chi A potencialização diminui com o aumento da distância do sítio chi Sequências que po tencializam a frequência de recombinação também foram identificadas em vários outros organismos A recombinase bacteriana é a proteína RecA Ela é in comum entre as proteínas de metabolismo do DNA porque sua forma ativa é um filamento helicoidal ordenado de até vários milhares de subunidades que se reúnem cooperati FIGURA 2531 A helicasenuclease RecBCD a Visão em corte da es trutura da enzima RecBCD enquanto ela é ligada ao DNA PDB ID 1W36 As subunidades são mostradas em diferentes cores com o DNA entrando na estrutura na esquerda e as fitas de DNA desenrolado não é parte da estru tura resolvida são modeladas saindo para a direita Uma estrutura proteica bulbosa chamada pino parte da subunidade RecC facilita a separação das fitas b Atividades da enzima RecBCD em uma extremidade de DNA As subunidades RecB e RecD são helicases motores moleculares que impul sionam o complexo ao longo do DNA um processo que precisa de ATP a RecB degrada ambas as fitas à medida que o complexo se desloca clivando a extremidade 39 da fita mais frequentemente do que a extremidade 59 da fita Quando um sítio chi é encontrado na extremidade da fita 39 a subunidade RecC se liga a ele parando o avanço dessa fita através do complexo A ex tremidade 59 da fita continua a ser degradada à medida que a extremidade 39 da fita forma uma volta para fora criando por fim uma extensão 39 da fita simples A proteína RecA não mostrada é finalmente carregada sobre o DNA processado pela enzima RecBCD 59 39 39 59 59 39 39 59 39 59 39 59 ATP ADP Pi ATP ADP Pi ATP ADP Pi Domínio da nuclease de RecB Helicase RecB 39 59 Nuclease RecB RecC RecC Entrada do DNA de fita dupla Saída do DNA de fita simples 59 Saída do DNA de fita simples 39 chi Helicase RecD 59 39 Pino Pino chi chi chi a b Helicase RecD 59 39 Helicase RecB 39 59 As atividades de helicase de RecB e RecD desenrolam DNA a atividade de nuclease da RecB degrada ambas as fitas de DNA A sequência chi é ligada por RecC impedindo degradação adicional da extremidade 39 da fita A enzima continua a se desenrolar e degradar a extremidade 59 da fita Nelson6edbookindb 1040 Nelson6edbookindb 1040 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1041 vamente no DNA Figura 2532 Esse filamento em ge ral forma um DNA de fita simples tal como o produzido pela enzima RecBCD Sua formação não é tão direta como mostrado na Figura 2532 uma vez que a proteína ligadora da fita simples de DNA SSB está normalmente presen te e impede especificamente a ligação das primeiras pou cas subunidades ao DNA nucleação do filamento A en zima RecBCD age diretamente como uma carregadora de RecA facilitando a nucleação de um filamento de RecA na fita simples de DNA revestida por SSB Os filamentos se montam e desmontam na direção 59S39 Muitas outras proteínas bacterianas regulam a formação e desmontagem de filamentos de RecA A proteína RecA promove as etapas centrais da recombinação homóloga incluindo a etapa de invasão da fita de DNA da Figura 2531 e várias outras rea ções de troca de fitas in vitro Após a invasão da fita a migração do ramo é promovida por um complexo denominado RuvAB Figura 2533a Uma vez que um intermediário de Holliday tenha sido cria do ele pode ser clivado por nucleases especializadas deno minadas RuvC Figura 2533b e cortes são selados com DNAligase Uma estrutura de forquilha de replicação viável é então reconstruída como destacado na Figura 2531 Depois que as etapas de recombinação estão comple tas as forquilhas de replicação se reconstroem em um processo denominado reinício da replicação indepen dente de origem Quatro proteínas PriA PriB PriC e DnaT interagem com DnaC para carregar a DnaB heli case para a forquilha de replicação reconstruída A DnaG primase então sintetiza um iniciador de RNA e a DNA polimerase se reconstrói na DnaB para reiniciar a síntese do DNA Originalmente descoberto como um componente necessário para a replicação do DNA do fX174 in vitro um complexo de PriA PriB PriC e DnaT em conjunto com DnaB DnaC e DnaG é agora denominado de primos somo de reinício da replicação O reinício da forquilha de replicação também necessita da DNApolimerase II em um papel ainda não definido essa atividade de polimerase II dá lugar à atividade da DNApolimerase III para a ex tensa replicação geralmente necessária para completar o cromossomo Desse modo o processo de recombinação é fortemente interligado à replicação Um processo do meta bolismo do DNA apoia o outro A recombinação eucariótica homóloga é necessária para a segregação adequada de cromossomos durante a meiose Em eucariontes a recombinação genética homóloga pode ter várias funções na replicação e divisão celular incluindo o reparo das forquilhas de replicação paradas A recombi nação ocorre com a mais alta frequência durante a meiose FIGURA 2532 Filamentos da proteína RecA A RecA e outras recombi nases nessa classe funcionam como filamentos de nucleoproteína a A for mação do filamento prossegue nas etapas de nucleação discreta e extensão A nucleação é a adição das poucas primeiras subunidades de RecA A exten são ocorre pela adição de subunidades de RecA de modo que o filamento cresce na direção 59S39 Quando ocorre a desmontagem as subunidades são retiradas da extremidade traseira b Eletromicrografia colorizada de um filamento de RecA ligado ao DNA c Segmento de um filamento de RecA com quatro voltas em hélices 24 subunidades de RecA derivadas de PDB ID 3CMX Observe o DNA de fita dupla ligado no centro O domínio central da RecA é estruturalmente relacionado aos domínios das helicases Nucleação lenta RecA 3 5 5 3 a b c Extensão rápida 3 5 5 3 Desmontagem 5 3 5 3 DNA DNA RecA ligada Subunidades de RecA ligadas Domínio central Domínio carboxi terminal Domínio aminoterminal 3 5 5 3 3 5 5 3 Nelson6edbookindb 1041 Nelson6edbookindb 1041 030414 0748 030414 0748 1042 DAVID L NELSON MICHAEL M COX o processo pelo qual as células germinativas diploides com dois conjuntos de cromossomos se dividem para produzir gametas haploides espermatozoides ou óvulos em animais esporos haploides em plantas cada gameta possuindo apenas um membro de cada par de cromossomos Figu ra 2534 A meiose começa com a replicação do DNA nas células germinativas de modo que cada molécula de DNA esteja presente em quatro cópias Cada conjunto de quatro cromossomos homólogos tétrade existe como dois pares de cromátidesirmãs e as cromátidesfilhas permanecem associadas nos seus centrômeros A célula então passa por dois ciclos de divisão celular sem uma etapa de repli cação do DNA Na primeira divisão celular os dois pares de cromátidesirmãs são segregados em célulasfilhas Na segunda divisão celular os dois cromossomos em cada par de cromátidesfilhas são segregados em célulasfilhas no vas Em cada divisão os cromossomos a serem segregados são levados para as célulasfilhas pelas fibras do fuso pre sas a polos opostos da célula em divisão As duas divisões sucessivas reduzem o conteúdo do DNA ao nível haploide em cada gameta A segregação adequada de cromossomos para as célulasfilhas demanda a existência de ligações fí sicas entre cromossomos homólogos para ser segregada À medida que as fibras do fuso se prendem aos centrômeros dos cromossomos e começam a puxar as ligações entre cro mossomos homólogos criam uma tensão Essa tensão sen tida por mecanismos celulares ainda não compreendidos sinaliza que esse par de cromossomos ou cromátidesirmãs está adequadamente alinhado para a segregação Uma vez que a tensão é percebida as ligações gradualmente se dis solvem e a segregação prossegue Quando ocorre uma liga ção inadequada da fibra ao fuso p ex se os centrômeros de um par de cromossomos estão ligados ao mesmo polo celular uma cinase celular percebe a ausência de tensão e ativa um sistema que remove as ligações do fuso permitin do que a célula tente novamente Durante a segunda divisão meiótica as ligações centro méricas entre as cromátidesirmãs ampliadas por coesinas depositadas durante a replicação ver Figura 2434 forne cem as ligações físicas necessárias para guiar a segregação Entretanto durante a primeira divisão celular meiótica os dois pares de cromátidesirmãs que serão segregados não estão relacionados a um evento de replicação recente e não são ligados por coesinas ou por qualquer outra associação fí sica Ao contrário os pares homólogos de cromátidesirmãs são alinhados e novas ligações são criadas por recombina ção um processo que envolve a quebra e religação do DNA Figura 2535 Essa troca também chamada de entre FIGURA 2533 Catálise da migração do ramo de DNA e resolução do intermediário de Holliday pelas proteínas RuvA RuvB e RuvC a A proteína RuvA se liga diretamente a um intermediário de Holliday onde os quatro braços de DNA se encontram A proteína hexamérica RuvB é uma translocase de DNA Dois hexâmeros se ligam aos braços opostos do inter mediário de Holliday e impulsionam o DNA para fora em uma reação aco plada à hidrólise de ATP Então o ramo se move b A RuvC é uma nuclea se especializada que se liga ao complexo RuvAB e cliva o intermediário de Holliday nos lados opostos da junção setas vermelhas de modo que dois braços contíguos de DNA permanecem em cada produto a b RuvB RuvA DNA entrando DNA entrando Clivagem da junção em sítios de DNA opostos 1 DNA saindo DNA saindo RuvB Nelson6edbookindb 1042 Nelson6edbookindb 1042 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1043 cruzamento pode ser observada com o microscópio óptico O entrecruzamento liga os dois pares de cromátidesirmãs juntos em pontos denominados quiasmas Também durante as permutas o material genético é trocado entre os pares de cromátidesirmãs Essas trocas também aumentam a di versidade genética nos gametas resultantes A importância da recombinação meiótica para a segregação cromossômica adequada é bem ilustrada pelas consequências fisiológicas e sociais de suas falhas Quadro 252 O entrecruzamento não é um processo totalmente aleatório e hot spots têm sido identificados em muitos cromossomos eucarióticos Entretanto a suposição de que o entrecruzamento possa ocorrer com a mesma probabili dade em quase todos os pontos ao longo do comprimen to de dois cromossomos homólogos continua a ser uma aproximação razoável em muitos casos e é esta suposição que permite o mapeamento genético dos genes em um cromossomo específico A frequência de recombinações homólogas em qualquer região que separa dois pontos em um cromossomo é grosso modo proporcional à distância entre dois pontos e isso permite a determinação das po sições relativas e das distâncias entre genes diferentes A distribuição independente dos genes não ligados em cro mossomos diferentes Figura 2536 faz outra importan te contribuição para a diversidade genética dos gametas Essas realidades genéticas orientam muitas das modernas aplicações da genômica tais como a definição de haplóti pos ver Figura 930 ou a pesquisa para genes de doenças no genoma humano ver Figura 934 A recombinação homóloga tem portanto pelo menos três funções identificáveis em eucariontes 1 contribui para o reparo de vários tipos de dano ao DNA 2 fornece nas células eucarióticas uma ligação física transitória en tre cromátides que promovem a segregação ordenada de cromossomos na primeira divisão celular meiótica e 3 potencializa a diversidade genética em uma população A recombinação durante a meiose se inicia com quebras na fita dupla Uma via provável para a recombinação homóloga durante a meiose é destacada na Figura 2535a O modelo tem quatro característicaschave Primeiro os cromossomos homólo gos são alinhados Segundo uma quebra na dupla fita da molécula de DNA é criada e então as extremidades expos tas são processadas por uma exonuclease deixando uma extensão de fita simples com um grupo 39hidroxila na ex tremidade quebrada etapa ➊ Terceiro as extremidades expostas 39 invadem o DNA duplex intacto do homólogo e isso é seguido pela migração de ramos eou replicação para FIGURA 2534 Meiose em células de linhagem germinativa em ani mais Os cromossomos de uma célula de linhagem germinativa diploide hi potética quatro cromossomos dois pares homólogos replicam e são man tidos juntos pelos seus centrômeros Cada molécula de DNA de fita dupla replicada é chamada de cromátide cromátideirmã Na prófase I logo antes da primeira divisão meiótica os dois conjuntos homólogos de cromátides se alinham para formar tétrades mantidas juntas por ligações covalentes nas junções homólogas quiasmas As trocas cruzadas ocorrem no interior dos quiasmas ver Figura 2535 Essas associações transitórias entre homólogos garantem que dois cromossomos presos se separem adequadamente na próxima etapa quando as fibras do fuso presas os puxam para polos opostos da célula em divisão na primeira divisão meiótica Os produtos dessa divisão são duas célulasfilhas cada uma com dois pares de cromátidesirmãs dife rentes Os pares agora se alinham ao longo do equador da célula em prepa ração para a separação das cromátides agora chamadas cromossomos A segunda divisão meiótica produz quatro célulasfilhas haploides que podem servir como gametas Cada uma tem dois cromossomos metade do número da célula diploide da linhagem germinativa Os cromossomos foram reorga nizados e recombinados Separação dos pares homólogos Primeira divisão meiótica Segunda divisão meiótica Quatro gametas haploides Formação das tétrades Centrômero Cromátides irmãs Prófase I Replicação Célula diploide da linhagem germinativa Nelson6edbookindb 1043 Nelson6edbookindb 1043 030414 0748 030414 0748 1044 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ❶ ❷ ❸ ❹ ❺ Gene A Gene B Uma quebra na fita dupla em um ou dois homólogos é convertida em um intervalo na fita dupla pela ação das exonucleases As fitas com extremidades 39 são degradadas menos do que aquelas com extremidades 59 produzindo extensões de fita simples 39 Uma extremidade 39 exposta pareia com seu complemento no homólogo intacto A outra fita do duplex é deslocada A replicação adicional do DNA substitui o DNA ausente do sítio da quebra original da fita dupla A extremidade 39 invasora é estendida pela DNApolimerase mais a migração do ramo após um evento de captura da segunda extremidade gerando uma molécula de DNA com duas permutas na forma de estruturas ramificadas chamadas de intermediários de Holliday Nucleases especializadas chamadas de resolvases do intermediários de Holliday clivam esse intermediário gerando um de dois produtos de recombinação No produto do conjunto 2 o DNA de qualquer um dos lados da região que sofre reparo é recombinado Leptóteno Zigóteno Paquíteno Diplóteno a b c 59 39 39 59 59 39 39 59 Produto do conjunto 1 Produto do conjunto 2 Quiasmas Nelson6edbookindb 1044 Nelson6edbookindb 1044 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1045 FIGURA 2535 Recombinação durante a prófase I na meiose a Mo delo do reparo de quebra da fita dupla para recombinação genética homólo ga Os dois cromossomos homólogos um mostrado em cor salmão o outro em azul envolvidos nesse evento de recombinação têm sequências idênticas ou quase idênticas Cada um dos dois genes mostrados tem diferentes alelos nos dois cromossomos As etapas são descritas no texto b O entrecruza mento ocorre durante a prófase da meiose I Os vários estágios da prófase I estão alinhados com os processos de recombinação que estão ocorrendo na parte a As quebras de fita dupla são introduzidas e processadas no estágio de leptóteno A invasão da fita e a conclusão do entrecruzamento ocorrem mais tarde À medida que as sequências homólogas nos dois pares de cromá tidesirmãs são alinhadas no estágio de zigóteno se formam os complexos sinaptonemais e ocorre a invasão da fita Os cromossomos homólogos são fortemente alinhados no estágio de paquíteno c Cromossomos homólogos de um gafanhoto são vistos em sucessivos estágios da prófase I meiótica Os quiasmas se tornam visíveis no estágio de diplóteno QUADRO 252 MEDICINA Por que a segregação adequada de cromossomos é importante Quando o alinhamento cromossômico e a recombinação não são corretos e completos na meiose I a segregação dos cromossomos pode dar errado Um resultado pode ser a aneuploidia uma condição na qual uma célula tem o número errado de cromossomos Os produtos haploides da meiose gametas ou esporos podem não ter cópias ou ter duas cópias de um cromossomo Quando um gameta com duas cópias de um cromossomo se junta com um ga meta com uma cópia de um cromossomo durante a ferti lização as células no embrião resultante têm três cópias daquele cromossomo eles são trissômicos Em S cerevisiae a aneuploidia resultante de erros na meiose ocorre em uma taxa de 1 em cada 10000 eventos meióticos Em moscasdasfrutas a taxa é de cerca de 1 em uns poucos milhares Taxas de aneuploidia em mamífe ros são consideravelmente mais altas Em camundongos a taxa é de 1 em 100 e é maior ainda em outros mamíferos A taxa de aneuploidia em óvulos humanos fertilizados é estimada em 10 a 30 a maioria dessas células aneuploi des é monossômica elas têm uma única cópia de um cro mossomo ou trissômica É quase certo que essa taxa seja uma subestimação A maior parte das trissomias é letal e várias resultam em aborto bem antes que a gravidez seja detectada A aneuploidia é a principal causa de perda de gravidez Os poucos fetos trissômicos que sobrevivem ao nascimento geralmente têm três cópias dos cromossomos 13 18 ou 21 a trissomia do 21 é a síndrome de Down Complementos anormais dos cromossomos sexuais tam bém são encontrados na população humana Quase todas as monossomias são fatais no estágio inicial do desenvol vimento fetal As consequências sociais da aneuploidia em humanos são consideráveis A aneuploidia é a principal causa genética de deficiências mentais e de desenvolvi mento No centro dessas taxas elevadas está uma carac terística da meiose em fêmeas de mamíferos que tem um significado especial para os humanos Em seres humanos do sexo masculino as células ger minativas iniciam a meiose na puberdade e cada evento meiótico necessita de um tempo relativamente curto Em contraste a meiose nas células germinativas das mulhe res é um processo muito prolongado A produção de um óvulo começa antes do nascimento da fêmea com o iní cio da meiose no feto com 12 a 13 semanas de gestação A meiose se inicia em todas as células germinativas em desenvolvimento em um período de poucas semanas As células prosseguem por grande parte da meiose I Os cromossomos se alinham e geram permutas continuando um pouco além da fase de paquíteno ver Figura 2535 e então o processo cessa Os cromossomos entram em uma fase estacionária chamada de estágio dictiático com os cruzamentos posicionados uma espécie de animação suspensa onde eles permanecem à medida que a fêmea amadurece geralmente de 13 a 50 anos Apenas na ma turidade sexual é que as células germinativas individuais continuam por meio de duas divisões celulares meióticas para produzir óvulos Entre o início do estágio dictiático e a conclusão final da meiose alguma coisa pode acontecer que interrompe ou danifica os cromossomos homólogos ligados nas cé lulas germinativas Com o aumento da idade da mulher a taxa de trissomia nos óvulos que ela produz aumenta consideravelmente com a chegada da menopausa Figu ra Q1 Há muitas hipóteses para explicar isso e vários fatores diferentes podem desempenhar um papel Entre tanto a maioria das hipóteses está centrada nas trocas por recombinação na meiose I e sua estabilidade durante o estágio dictiático prolongado Ainda não está claro que etapas médicas poderiam ser tomadas para reduzir a incidência de aneuploidias em fêmeas em idade fértil O que é conhecido é a importân cia inerente da recombinação e da geração de permutas na meiose humana Idade da mãe 0 15 25 20 30 40 35 5 10 15 20 25 30 35 Incidência de trissomia de gestações reconhecidas clinicamente FIGURA Q1 Incidência cada vez maior da trissomia humana com o aumento da idade da mãe Nelson6edbookindb 1045 Nelson6edbookindb 1045 030414 0748 030414 0748 1046 DAVID L NELSON MICHAEL M COX criar um par de intermediários de Holliday etapas ➋ a ➍ Quarto a clivagem de duas permutas cria qualquer um dos dois pares de produtos recombinantes completos etapa ➎ Observe a semelhança dessas etapas em relação aos processos de reparo bacteriano por recombinação destaca dos na Figura 2530 Nesse modelo de reparo da quebra da fita dupla para recombinação as extremidades 39 são utilizadas para iniciar a troca genética Uma vez pareada com a fita comple mentar no homólogo intacto é criada uma região do DNA híbrido que contém fitas complementares de dois DNAs parentais diferentes o produto da etapa ➋ na Figura 25 35a Cada uma das extremidades 39 pode então agir como um iniciador para a replicação do DNA A recombinação meiótica dos homólogos pode variar em muitos detalhes de uma espécie para outra mas a maior parte das etapas des tacadas antes está geralmente presente em alguma forma Há dois modos para clivar ou resolver o intermediário de Holliday com uma nuclease semelhante à RuvC de modo que os dois produtos contenham genes na mesma ordem linear que nos substratos os cromossomos originais e não recombinados etapa ➎ Se clivado de uma forma o DNA lateral à região que contém o DNA híbrido não é recombina do se clivado do outro modo o DNA lateral é recombinado Ambos os resultados são observados in vivo A recombinação homóloga ilustrada na Figura 2535 é um processo muito elaborado essencial para a segregação precisa do cromossomo Suas consequências moleculares para a geração da diversidade genética são sutis Para com preender como esse processo contribui para a diversidade devese ter em mente que os dois cromossomos homólogos que sofrem recombinação não são necessariamente idên ticos O arranjo linear dos genes pode ser o mesmo mas as sequências de bases em alguns dos genes podem ser um pouco diferentes em alelos diferentes Em um humano por exemplo um cromossomo pode conter o alelo para he moglobina A hemoglobina normal enquanto o outro con tém o alelo para hemoglobina S a mutação da célula falci forme A diferença pode consistir em não mais do que um par de bases em milhões A recombinação homóloga não modifica o arranjo linear dos genes mas pode determinar que alelos se ligaram em um único cromossomo e portanto foram passados juntos para a próxima geração A ordena ção independente de cromossomos diferentes Figura 25 36 determina que alelos gênicos de diferentes cromosso mos são herdados juntos A recombinação sítioespecífica resulta em rearranjos de DNA precisos A recombinação genética de homólogos o tipo discutido até agora pode envolver duas sequências homólogas quais quer O segundo tipo geral de recombinação a recombina ção sítioespecífica é um tipo muito diferente de processo a recombinação é limitada a sequências específicas Reações de recombinação desse tipo ocorrem praticamente em cada célula ocupando funções especializadas que variam muito de uma espécie para outra Exemplos incluem a regulação da expressão de alguns genes e a promoção de rearranjos de DNA programados no desenvolvimento embrionário ou nos ciclos de replicação de alguns DNAs virais e de plasmídeos Cada sistema de recombinação sítioespecífico consiste em uma enzima denominada recombinase e em uma sequência de DNA única e curta 20 a 200 pb onde a recombinase age Oito possíveis gametas ou esporos haploides Célula inicial diploide dois padrões diferentes de ordenação de cromossomos AB AB ab ab Ab Ab aB aB A a B b A a B A B A B a b a b b A a B b Meiose II A a b A b A b a B a B B A a b B Meiose II Meiose I Meiose I FIGURA 2536 A contribuição do arranjo independente para a di versidade genética Nesse exemplo os cromossomos já foram replicados para criar dois pares de cromátidesirmãs para dois cromossomos Azul e cor salmão distinguem as cromátidesirmãs de cada par Um gene em cada cromossomo é destacado com diferentes alelos A ou a B ou b nos ho mólogos A ordenação independente pode levar a gametas com qualquer combinação de alelos presente nos dois cromossomos diferentes O entre cruzamento não mostrado aqui ver Figura 2534 também contribuiria para a diversidade genética em uma típica sequência meiótica Nelson6edbookindb 1046 Nelson6edbookindb 1046 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1047 o sítio de recombinação Uma ou mais proteínas auxiliares podem regular o tempo ou o resultado da reação Há duas classes gerais de sistemas de recombinação sítioespecíficos que dependem ou de resíduos Tyr ou de resíduos Ser no sítio ativo Estudos in vitro de muitos sis temas de recombinação sítioespecíficos na classe tirosi na elucidaram alguns princípios gerais incluindo a via de reação fundamental Figura 2537a Várias dessas enzi mas foram cristalizadas revelando detalhes estruturais da reação Uma recombinase separada reconhece e se liga a cada um dos dois sítios de recombinação em duas molécu las diferentes de DNA ou no interior do mesmo DNA Uma fita de DNA de cada sítio é clivada em um ponto específico no interior do sítio e a recombinase se torna ligada cova lentemente ao DNA no sítio de clivagem por meio de uma ligação de fosfotirosina etapa ➊ A ligação proteínaDNA transitória preserva a ligação fosfodiéster que é perdida na clivagem do DNA de modo que cofatores de alta energia como o ATP são desnecessários nas etapas seguintes As fitas de DNA clivadas são religadas a novos parceiros para formar um intermediário de Holliday com novas ligações fosfodiéster criadas à custa da ligação proteínaDNA eta pa ➋ Uma isomerização então ocorre etapa ➌ e o processo é repetido em um segundo ponto no interior de cada um dos dois sítios de recombinação etapas ➍ e ➎ Nos sistemas que empregam um resíduo Ser de sítio ativo ambas as fitas de cada sítio de recombinação são cortadas concomitantemente e religadas aos novos parceiros sem o intermediário de Holliday Em ambos os tipos de sistemas a troca é sempre recíproca e precisa regenerando os sítios de recombinação quando a reação está completa É possível ver uma recombinase como uma endonuclease e uma ligase sítioespecífica em um único pacote As sequências dos sítios de recombinação reconhecidas pelas recombinases sítioespecíficas são parcialmente assi métricas não palindrômicas e os dois sítios de recombi nação se alinham na mesma direção durante a reação da recombinase O resultado depende da orientação e localiza ção dos sítios de recombinação Figura 2538 Se os dois sítios estiverem na mesma molécula de DNA a reação ou inverte ou exclui o DNA interveniente determinada pelo fato de os sítios de recombinação apresentarem direção 59 59 59 59 39 39 39 39 59 59 59 59 39 39 39 39 59 59 59 59 39 39 39 39 Recombinagem Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr OH HO 59 39 Tyr T 59 r Tyr 59 59 59 59 39 39 39 39 Tyr Tyr OH HO TyrP TyrP PTyr 59 59 39 39 Tyr OH PTyr P P P P P P P P P P P 59 59 59 59 39 39 39 39 Tyr Tyr Tyr 39 3 59 3 39 59 39 y 59 Tyr 59 39 Tyr Tyr T 59 59 59 59 39 39 39 39 Tyr Tyr Tyr Tyr 39 3 59 Tyr 3 39 59 39 y 59 Tyr 59 39 Tyr Tyr 39 59 Tyr H OH OH 3 r 59 39 Tyr P P P P P P PP PP P P PP O H 39 39 59 PTyr a Clivagem Religação Clivagem Religação ❶ ❷ ❺ ❹ ❸ Isomerização Intermediários de Holliday Tyr b FIGURA 2537 Uma reação de recombinação sítioespecífica a A reação mostrada aqui é para uma classe comum de recombinases sítioespecíficas chamadas de recombinases da classe das integrases nomeadas a partir da integrase do bacteriófago l a primeira recombi nase caracterizada Essas enzimas usam resíduos de Tyr como nucleófi los no sítio ativo A reação é levada a cabo no interior de um tetrâmero de subunidades idênticas As subunidades de recombinase se ligam a uma sequência específica o sítio de recombinação ➊ Uma fita em cada DNA é clivada em pontos particulares na sequência O nucleófilo é o grupo OH de um sítio ativo do resíduo Tyr e o produto é uma ligação de fosfotirosina covalente entre a proteína e o DNA ➋ Depois da isome rização ➌ as fitas clivadas se ligam a novos parceiros produzindo um intermediário de Holliday As etapas ➍ e ➎ completam a reação por um processo semelhante às primeiras duas etapas A sequência original do sítio de recombinação é regenerada depois de recombinar o DNA que flanqueia o sítio Estas etapas ocorrem no interior de um complexo de múltiplas subunidades de recombinase que algumas vezes incluem ou tras proteínas não mostradas aqui b Modelo de contorno de superfície de uma recombinase de quatro subunidades da classe das integrases chamado de recombinase Cre ligada a um intermediário de Holliday mostrado com fitas em hélice azulclaro e azulescuro A proteína foi tornada transparente de modo que o DNA ligado é visível derivado do PDB ID 3CRX Outro grupo de recombinases chamadas de família resol vaseinvertase usa um resíduo de Ser como um nucleófilo no sítio ativo Nelson6edbookindb 1047 Nelson6edbookindb 1047 030414 0748 030414 0748 1048 DAVID L NELSON MICHAEL M COX oposta ou a mesma direção respectivamente Se os sítios estão em DNAs diferentes a recombinação é intermolecu lar se um ou ambos os DNAs são circulares o resultado é uma inserção Alguns sistemas de recombinases são alta mente específicos para um desses tipos de reações e agem apenas nos sítios com orientações específicas A replicação cromossômica completa pode necessitar da replicação sítioespecífica O reparo do DNA recombi nante de um cromossomo bacteriano circular embora es sencial algumas vezes gera subprodutos deletérios A re solução de um intermediário de Holliday em uma forquilha de replicação por uma nuclease tal como a RuvC seguida pelo encerramento da replicação pode dar origem a um de dois produtos os dois cromossomos monoméricos normais ou um cromossomo dimérico contíguo Figura 2539 No último caso os cromossomos ligados covalentemente não podem ser segregados para célulasfilhas na divisão celu lar e as células divididas ficam emperradas Um sistema de recombinação sítioespecífico especializado em E coli o sistema XerCD converte os cromossomos diméricos em cromossomos monoméricos de modo que a divisão celular prossiga A reação é uma deleção sítioespecífica Figura 2538b Esse é outro exemplo da coordenação próxima en tre os processos de recombinação do DNA e outros aspec tos do metabolismo do DNA a Sítios de troca b Inversão Deleção e inserção Deleção Inserção FIGURA 2538 Efeitos da recombinação sítioespecífica O resultado da recombinação sítioespecífica depende da localização e orientação dos sítios de recombinação vermelho e verde em uma molécula de fita dupla de DNA A orientação aqui mostrada pelas pontas das setas se refere à or dem dos nucleotídeos no sítio de recombinação não à direção 59S39 a Sítios de recombinação com orientação oposta na mesma molécula de DNA O resultado é uma inversão b Sítios de recombinação com a mesma orien tação tanto em uma molécula de DNA produzindo uma deleção quanto em duas moléculas de DNA produzindo uma inserção FIGURA 2539 Deleção do DNA para desfazer um efeito deletério do reparo de DNA por recombinação A resolução de um intermediário de Holliday durante o reparo de DNA por recombinação se cortado nos pon tos indicados pelas setas vermelhas pode gerar um cromossomo dimérico contíguo Uma recombinase sítioespecífica especializada em E coli XerCD converte o dímero em monômeros permitindo o prosseguimento da segre gação de cromossomos e da divisão celular Terminação da replicação Forquilha sofrendo reparo do DNA por recombinação Resolução de monômeros pelo sistema XerCD Genoma dimérico 1 Nelson6edbookindb 1048 Nelson6edbookindb 1048 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1049 Elementos genéticos de transposição se movem de um local para outro Agora será abordado o terceiro tipo geral de sistema de re combinação a recombinação que permite o movimento de elementos de transposição ou transposons Esses elemen tos do DNA encontrados praticamente em todas as células se movem ou pulam jump de um local no cromosso mo o sítio doador para outro no mesmo ou em um cromos somo diferente o sítioalvo Não é necessária uma sequên cia de DNA homóloga para esse movimento denominado transposição a nova localização é determinada mais ou menos aleatoriamente A inserção de um transposon em um gene essencial poderia matar a célula assim a transposição é fortemente regulada e normalmente muito infrequente Os transposons são talvez o mais simples dos parasitas mo leculares adaptados para replicar passivamente dentro de cromossomos de células hospedeiras Em alguns casos eles transportam genes úteis para a célula hospedeira e portan to existem em um tipo de simbiose com o hospedeiro As bactérias têm duas classes de transposons As se quências de inserção transposons simples con têm apenas as sequências necessárias para a transposição e os genes para as proteínas transposases que promovem o processo Os transposons complexos contêm um ou mais genes além daqueles necessários para a transposição Esses genes extras podem por exemplo conferir resistência a antibióticos e portanto aumentar as chances de sobrevi vência da célula hospedeira A dispersão de elementos de resistência a antibióticos entre populações bacterianas cau sadoras de doenças que está levando alguns antibióticos a não serem eficazes p 981 é mediada em parte pela transposição Os transposons bacterianos variam em estrutura mas a maioria tem sequências repetidas curtas em cada extremi dade que funcionam como sítios de ligação para a transpo sase Quando ocorre a transposição uma sequência curta no sítioalvo 5 a 10 pb é duplicada para formar uma se quência repetitiva curta adicional que fica ao lado de cada extremidade do transposon inserido Figura 2540 Es ses segmentos duplicados resultam do mecanismo de corte utilizado para inserir um transposon no DNA em uma nova localização Há duas vias gerais para a transposição em bactérias Na transposição direta ou simples Figura 2541 esquer da cortes de cada lado do transposon o removem e ele então se move para uma nova localização Isso deixa uma quebra na fita dupla do DNA doador que deve ser reparada No sítioalvo é feito um corte em degrau como na Figura 2540 o transposon é inserido na quebra e a replicação do DNA preenche os espaços para duplicar a sequência do sítioalvo Na transposição replicativa Figura 2541 direi ta o transposon inteiro é replicado deixando uma cópia para trás no local doador Um cointegrado é um interme diário nesse processo consistindo em uma região doadora covalentemente ligada ao DNA no sítioalvo Duas cópias completas do transposon estão presentes no cointegrado ambas com a mesma orientação em relação ao DNA Em alguns transposons bem caracterizados o cointegrado in termediário é convertido em produtos pela recombinação sítioespecífica na qual recombinases especializadas pro movem a reação de deleção necessária Os eucariontes também têm transposons estrutural mente semelhantes aos transposons bacterianos e alguns utilizam mecanismos de transposição semelhantes Em ou tros casos entretanto o mecanismo de transposição parece envolver um RNA intermediário A evolução desses trans posons é interligada à evolução de algumas classes de vírus de RNA Ambas são descritas no próximo capítulo Os genes de imunoglobulinas se reúnem por recombinação Alguns rearranjos de DNA são uma parte programada do desenvolvimento em organismos eucariontes Um exemplo importante é a geração de genes completos de imunoglobu linas a partir de segmentos de genes separados em geno mas de vertebrados Um humano como outros mamíferos é capaz de produzir milhões de imunoglobulinas diferentes anticorpos com especificidades de ligação distintas em bora o genoma humano contenha apenas 29000 genes A recombinação permite que um organismo produza uma diversidade extraordinária de anticorpos a partir de uma capacidade codificadora de DNA limitada Estudos sobre o mecanismo de recombinação revelam uma relação próxima à transposição do DNA e sugerem que esse sistema para geração de diversidade de anticorpos pode ter evoluído a partir de uma invasão celular antiga de transposons Transposon Repetições terminais Transposase cria cortes em degrau no sítioalvo DNAalvo O transposon é inserido no sítio dos cortes A replicação preenche os intervalos duplicando as sequências flanqueando o transposon FIGURA 2540 Duplicação da sequência de DNA em um sítioalvo quando um transposon é inserido As sequências que são duplicadas após a inserção de transposon são mostradas em vermelho Essas sequên cias têm geralmente apenas algumas poucas bases de comprimento e as sim seu tamanho em relação àquele de um típico transposon é muito exa gerado nesse desenho Nelson6edbookindb 1049 Nelson6edbookindb 1049 030414 0748 030414 0748 1050 DAVID L NELSON MICHAEL M COX É possível utilizar os genes humanos que codificam proteínas da classe da imunoglobulina G IgG para ilus trar como a diversidade de anticorpos é gerada As imu noglobulinas consistem em duas cadeias polipeptídicas pesadas e em duas leves ver Figura 521 Cada cadeia tem duas regiões uma região variável com uma sequência que varia muito de uma imunoglobulina para outra e uma região praticamente constante dentro de uma classe de imunoglobulinas Há também duas famílias diferentes de cadeias leves kappa e lambda que diferem um pouco nas sequências de suas regiões constantes Para os três tipos de cadeias polipeptídicas cadeia pesada e cadeias leves kappa e lambda a diversidade nas regiões variáveis é ge rada por um mecanismo semelhante Os genes para esses polipeptídeos são divididos em segmentos e o genoma contém grupos com múltiplas versões de cada segmento A união de uma versão de cada segmento de gene cria um gene completo A Figura 2542 retrata a organização do DNA que codifica as cadeias leves kappa da IgG humana e mostra como uma cadeia leve kappa madura é produzida Em células indiferenciadas a informação codificadora des sa cadeia polipeptídica é separada em três segmentos O segmento V variável codifica os primeiros 95 resíduos de aminoácidos da região variável o segmento J ligação codifica os 12 resíduos restantes da região variável e o seg mento C codifica a região constante O genoma contém 300 segmentos V diferentes 4 segmentos J diferentes e 1 segmento C À medida que uma célulatronco na medula óssea se di ferencia para formar um linfócito B maduro um segmento V e um segmento J são reunidos por um sistema de recom binação especializado Figura 2542 Durante essa deleção programada do DNA o DNA interveniente é descartado Há cerca de 300 3 4 5 1200 possíveis combinações VJ O processo de recombinação não é tão preciso como a recom binação sítioespecífica descrita anteriormente de modo que variações adicionais ocorrem na sequência na junção VJ Isso aumenta a variação total em cerca de pelo menos 25 vezes de modo que as células podem gerar em torno de 25 3 1200 5 3000 combinações VJ diferentes A junção final da combinação VJ à região C é realizada por uma rea ção de RNAsplicing após a transcrição processo descrito no Capítulo 26 O mecanismo de recombinação para junção dos segmen tos V e J é ilustrado na Figura 2543 Um pouco além de cada segmento V e imediatamente antes de cada segmento J se situam as sequências de sinalização de recombinação RSS Estas são ligadas por proteínas denominadas RAG1 e RAG2 produtos do gene ativador de recombinação re combination activating gene As proteínas RAG catalisam a formação de uma quebra da fita dupla entre as sequências de sinalização e os segmentos V ou J a serem unidos Os FIGURA 2541 Duas vias gerais para transposição direta simples e replicativa ➊ O DNA é clivado primeiro de cada lado do transposon nos sítios indicados pelas setas ➋ Os grupos 39 hidroxila liberados nas ex tremidades do transposon atuam como nucleófilos em um ataque direto sobre as ligações fosfodiéster no DNAalvo As ligações fosfodiéster alvo são em degrau não diretamente em frente da outra nas duas fitas de DNA ➌ O transposon é agora ligado ao DNAalvo Na transposição direta esquer da a replicação preenche os intervalos em cada extremidade para com pletar o processo Na transposição replicativa direita todo o transposon é replicado para criar um intermediário cointegrado ➍ O cointegrado é frequentemente resolvido posteriormente com o auxílio de um sistema de recombinação separado sítioespecífico O DNA hospedeiro clivado dei xado para trás após a transposição direta é recuperado pela ligação das extremidades ou degradado não mostrado O último resultado pode ser letal para um organismo Clivagem Extremidades livres dos transposons atacam o DNAalvo Intervalos preenchidos esquerda ou todo transposon replicado direita Recombinação sítioespecífica no interior do transposon DNApolimerase DNAligase Replicação Transposição direta Transposição replicativa 39 39 39 DNA alvo Cointegrado 59 OH HO 39 39 39 39 ❶ ❷ ❸ ❹ OH OH HO HO Nelson6edbookindb 1050 Nelson6edbookindb 1050 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1051 segmentos V e J são então reunidos com o auxílio de um segundo complexo de proteínas Os genes para as cadeias pesadas e as cadeias leves lam bda se formam um processo semelhante As cadeias pesadas possuem mais segmentos de genes que as cadeias leves com mais de 5000 combinações possíveis Como qualquer cadeia pesada pode se combinar com qualquer cadeia leve para ge rar uma imunoglobulina cada ser humano tem pelo menos 3000 3 5000 5 15 3 10 7 IgGs possíveis Diversidade adi cional é gerada por altas taxas de mutação de mecanismo desconhecido nas sequências V durante a diferenciação do linfócito B Cada linfócito B maduro produz apenas um tipo de anticorpo mas a gama de anticorpos produzidos pelos lin fócitos B de um indivíduo é claramente enorme Terá o sistema imune evoluído em parte de transpo sons antigos O mecanismo de geração de quebras de fita dupla por RAG1 e RAG2 de fato espelha várias etapas de reação na transposição Figura 2543 Além disso o DNA excluído com seu RSS terminal tem uma estrutura de se quência encontrada na maioria dos transposons Em tes tes em tubos de ensaio RAG1 e RAG2 podem se associar a esse DNA excluído e inserilo de modo semelhante a um transposon em outras moléculas de DNA provavelmente uma reação rara em linfócitos B Embora não se saiba com certeza as propriedades do sistema de rearranjo de genes de imunoglobulina sugere uma origem intrigante na qual a distinção entre o hospedeiro e o parasita tornouse turva pela evolução RESUMO 253 Recombinação do DNA c As sequências de DNA são rearranjadas em reações de recombinação geralmente em processos fortemente co ordenados com a replicação ou reparo do DNA c A recombinação genética homóloga pode acontecer entre duas moléculas de DNA quaisquer que partilhem uma sequência homóloga Em bactérias a recombinação funciona principalmente como um processo de reparo do DNA centrado em reativar forquilhas de replicação pa radas ou fechadas ou no reparo geral de quebras da fita dupla Em eucariontes a recombinação é essencial para assegurar a segregação cromossômica precisa durante a primeira divisão celular meiótica Ela também ajuda a criar a diversidade genética nos gametas resultantes FIGURA 2542 Recombinação dos segmentos V e J do gene da cadeia leve kapa da IgG humana Este processo é desenhado para gerar diver sidade de anticorpos No topo é mostrada a disposição das sequências co dificadoras de IgG em uma célulatronco da medula óssea A recombinação deleta o DNA entre um segmento V específico e um segmento J Após a transcrição o transcrito é processado pelo splicing de RNA como descrito no Capítulo 26 a tradução produz o polipeptídeo de cadeia leve A cadeia leve pode se combinar com qualquer uma das 5000 cadeias pesadas possíveis para produzir a molécula de anticorpo V1 V2 V3 V300 J1 J2 J4 J5 C Segmentos V 1 a 300 Segmentos C Segmentos J DNA da linhagem germinativa V1 V2 V3 V84 J4 J5 C Gene de cadeia leve maduro DNA do linfócito B Recombinação resultando na deleção de DNA entre os segmentos V e J V84 J4 J5 C Transcrição 59 39 V84 J4 C mRNA processado Remoção das sequências entre J4 e C por splicing de mRNA Polipeptídeo de cadeia leve Tradução Molécula de anticorpo Cadeia leve Região constante Região variável Enovelamento de proteína e montagem Transcrito primário Cadeia pesada Nelson6edbookindb 1051 Nelson6edbookindb 1051 030414 0748 030414 0748 1052 DAVID L NELSON MICHAEL M COX c A recombinação sítioespecífica ocorre apenas nas se quênciasalvo específicas e esse processo também pode envolver um intermediário de Holliday As recombinases clivam o DNA em pontos específicos e ligam as fitas a novos parceiros Esse tipo de recombinação é encon trado em praticamente todas as células e suas muitas funções incluem a integração do DNA e a regulação da expressão gênica c Em praticamente todas as células os transposons utilizam a recombinação para se mover dentro ou entre os cromos somos Em vertebrados uma reação de recombinação programada relacionada à transposição une segmentos de genes de imunoglobulinas para formar genes de imuno globulinas durante a diferenciação do linfócito B Termoschave Termos em negrito são definidos no glossário molde 1011 replicação semiconservativa 1011 forquilha de replicação 1012 origem 1012 fragmentos de Okazaki 1012 fita líder 1012 fita retardada 1013 nucleases 1013 exonucleases 1013 endonucleases 1013 DNApolimerase I 1013 iniciador primer 1014 terminal do iniciador 1014 processividade 1014 revisão 1015 DNApolimerase III 1016 replissomo 1017 helicases 1017 topoisomerases 1017 primases 1018 DNAligases 1018 elemento de desenrolamento do DNA DUE 1019 AAA1 ATPases 1019 primossomo 1021 catenano 1024 complexo préreplicativo préRC 1025 licenciamento 1025 proteína de manutenção de minicromossomos MCM 1025 ORC complexo de reconhecimento de origem 1025 DNApolimerase a 1026 DNApolimerase d 1026 DNApolimerase 1026 mutação 1027 reparo de excisão de base 1030 DNAglicosilases 1030 sítio AP 1030 AP endonucleases 1031 DNAfotoliases 1032 síntese de DNA translesão propensa a erro 1034 resposta SOS 1035 recombinação genética homóloga 1038 recombinação sítioespecífica 1038 transposição de DNA 1038 reparo do DNA recombinante 1039 migração do ramo 1040 intermediário de Holliday 1040 meiose 1041 modelo de reparo da quebra da fita dupla 1046 transposon 1049 transposição 1049 sequência de inserção 1049 cointegrado 1049 Leituras adicionais Geral Cox MM Doudna JA ODonnell ME 2012 Molecular Biology Principles and Practice W H Freeman and Company New York NY Uma excelente introdução à ciência e como ela é feita Friedberg EC Walker GC Siede W Wood RD Schultz RA Ellenberger T 2006 DNA Repair and Mutagenesis 2nd edn American Society for Microbiology Washington DC Exaustivo tratamento do metabolismo do DNA e um bom local para iniciar a exploração nesse campo Replicação do DNA Bloom LB 2006 Dynamics of loading the Escherichia coli DNA polymerase processivity clamp Crit Rev Biochem Mol Biol 41 179208 Heller RC Marians KJ 2006 Replisome assembly and the direct restart of stalled replication forks Nat Rev Mol Cell Biol 7 932943 Mecanismos para o reinício das forquilhas de replicação antes do reparo do dano no DNA Hübscher U Maga G Spadari S 2002 Eukaryotic DNA polymerases Annu Rev Biochem 71 133163 Bom resumo das propriedades e funções de mais de uma dúzia de DNApolimerases eucarióticas conhecidas Indiani C ODonnell M 2006 The replication clamploading machine at work in the three domains of life Nat Rev Mol Cell Biol 7 751761 Kaguni J 2011 Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin Curr Opin Chem Biol 15 606613 Clivagem Transesterificação molecular Reparo de quebra de fita dupla pela junção de extremidades RAG1 RAG2 RSS Segmento V Segmento J V J RSS DNA interveniente HO OH FIGURA 2543 Mecanismo de rearranjo do gene da imunoglobu lina As proteínas RAG1 e RAG2 se ligam às sequências de sinalização de recombinação RSS e clivam uma fita de DNA entre os segmentos RSS e V ou J a serem ligados A 39hidroxila liberada atua então como nucleófilo atacando uma ligação fosfodiéster na outra fita para criar uma quebra de fita dupla O grampo resultante se curva os segmentos V e J são clivados e as extremidades são covalentemente ligadas por um complexo de proteínas especializadas para o reparo de ligação de extremidades de quebras de fita dupla As etapas na geração da quebra de fita dupla catalisadas pelo RAG1 e RAG2 são quimicamente relacionadas a etapas nas reações de transposição Nelson6edbookindb 1052 Nelson6edbookindb 1052 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1053 Kool ET 2002 Active site tightness and substrate fit in DNA replication Annu Rev Biochem 71 191219 Excelente resumo da base molecular da fidelidade de replicação por uma DNApolimerase geometria dos pares de bases bem como das ligações de hidrogênio Kunkel TA Burgers PM 2008 Dividing the workload at a eukaryotic replication fork Trends Cell Biol 18 521527 Masai H Matsumoto S You ZY YoshizawaSugata N Oda M 2010 Eukaryotic chromosome DNA replication where when and how Annu Rev Biochem 79 89130 ODonnell M 2006 Replisome architecture and dynamics in Escherichia coli J Biol Chem 281 1065310656 Excelente resumo do que acontece em uma forquilha de replicação Stillman B 2005 Origin recognition and the chromosome cycle FEBS Lett 579 877884 Bom resumo da iniciação da replicação do DNA eucariótico Reparo de DNA Erzberger JP Berger JM 2006 Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA1 proteins Annu Rev Biophys Biomol Struct 35 93114 Lynch M 2010 Evolution of the mutation rate Trends Genet 26 345352 Kunkel TA Erie DA 2005 DNA mismatch repair Annu Rev Biochem 74 681710 Kunkel TA Erie DA 2005 DNA mismatch repair Annu Rev Biochem 74 681710 Schlacher K Goodman MJ 2007 Lessons from 50 years of SOS DNAdamageinduced mutagenesis Nat Rev Mol Cell Biol 8 587594 Sutton MD Smith BT Godoy VG Walker GC 2000 The SOS response recent insights into umuDCdependent mutagenesis and DNA damage tolerance Annu Rev Genet 34 479497 Wilson DM III Bohr VA 2007 The mechanics of base excision repair and its relation to aging and disease DNA Repair 6 544559 Recombinação do DNA Cox MM 2001 Historical overview searching for replication help in all of the rec places Proc Natl Acad Sci USA 98 81738180 Revisão de como ficou demonstrado que a recombinação é um processo de reparo da forquilha de replicação Cox MM 2007 Regulation of bacterial RecA protein function Crit Rev Biochem Mol Biol 42 4163 Grindley NDF Whiteson KL Rice PA 2006 Mechanisms of sitespecific recombination Annu Rev Biochem 75 567605 Haniford DB 2006 Transpososome dynamics and regulation in Tn10 transposition Crit Rev Biochem Mol Biol 41 407424 Visão detalhada de um transposon bacteriano bem estudado Heyer WD Ehmsen KT Liu J 2010 Regulation of homologous recombination in eukaryotes Annu Rev Genet 44 113139 Levin HL Moran JV 2011 Dynamic interactions between transposable elements and their hosts Nat Rev Genet 12 615627 Lusetti SL Cox MM 2002 The bacterial RecA protein and the recombinational DNA repair of stalled replication forks Annu Rev Biochem 71 71100 Mimitou E P Symington LS 2009 Nucleases and helicases take center stage in homologous recombination Trends Biochem Sci 34 264272 Montano SP Rice PA 2011 Moving DNA around DNA transposition and retroviral integration Curr Opin Struct Biol 21 370378 San Filippo J Sung P Klein H 2008 Mechanism of eukaryotic homologous recombination Annu Rev Biochem 77 229257 Singleton MR Dillingham MS Gaudier M Kowalczykowski SC Wigley DB 2004 Crystal structure of RecBCD enzyme reveals a machine for processing DNA breaks Nature 432 187193 Problemas 1 Conclusões a partir do experimento de Meselson Stahl O experimento de MeselsonStahl ver Figura 252 provou que o DNA sofre replicação semiconservativa em E coli No modelo dispersivo da replicação do DNA as fitas parentais de DNA são clivadas em partes de tamanhos alea tórios sendo então ligadas a peças do DNA recémreplicado para formar fitas duplex filhas Explique como os resulta dos do experimento de Meselson e Stahl descartaram esse modelo 2 Análise de isótopos pesados na replicação do DNA Uma cultura de E coli crescendo em um meio contendo 15NH4Cl é trocada para um meio contendo 14NH4Cl por três ge rações aumento de oito vezes na população Qual é a razão molar entre o DNA híbrido 15N 14N e o DNA leve 14N 14N nesse ponto 3 Replicação do cromossomo de E coli O cromossomo de E coli contém 4639221 pb a Como as muitas voltas da duplahélice devem ser de senroladas durante a replicação do cromossomo de E coli b A partir dos dados deste capítulo quanto tempo levaria para replicar o cromossomo de E coli a 37C se duas forqui lhas de replicação prosseguissem a partir da origem Assuma que a replicação ocorre a uma taxa de 1000 pbs Sob algumas condições as células de Ecoli podem se dividir a cada 20 min Como isso seria possível c Na replicação do cromossomo de E coli cerca de quantos fragmentos de Okazaki poderiam ser formados Que fatores garantem que os numerosos fragmentos de Okazaki são reunidos na ordem correta no novo DNA 4 Composição de bases dos DNAs feitos a partir de moldes de fitas simples Preveja a composição de bases do DNA total sintetizado por DNApolimerase nos moldes forneci dos por uma mistura equimolar de duas fitas complementares do DNA do bacteriófago fX174 molécula de DNA circular A composição de bases de uma fita é A 247 G 241 C 185 e T 327 Que pressuposto é necessário para respon der esse problema 5 Replicação do DNA Kornberg e colaboradores incu baram extratos solúveis de E coli com uma mistura de dATP dTTP dGTP e dCTP todos marcados com 32P no grupo fosfato a Após um período de tempo a mistura da incubação foi tra tada com ácido tricloroacético que precipita o DNA mas não os precursores de nucleotídeos O precipitado foi recolhido e o grau de incorporação dos precursores no DNA foi determinado a partir da quantidade de radioatividade presente no precipitado a Se qualquer um dos quatro precursores de nucleotí deos fosse omitido da mistura de incubação a radioatividade poderia ser encontrada no precipitado Explique Nelson6edbookindb 1053 Nelson6edbookindb 1053 030414 0748 030414 0748 1054 DAVID L NELSON MICHAEL M COX b Poderia o 32P ser incorporado no DNA se apenas o dTTP fosse marcado Explique c A radioatividade poderia ser encontrada no precipitado se 32P marcasse o fosfato b ou o g em vez do fosfato a dos de soxirribonucleotídeos Explique 6 A química da replicação do DNA Todas as DNApoli merases sintetizam fitas novas de DNA na direção 59S39 Em alguns aspectos a replicação das fitas antiparalelas de DNA du plo poderia seria mais simples se houvesse também um segun do tipo de polimerase um que sintetizasse o DNA na direção 39S59 Os dois tipos de polimerases poderiam em princípio co ordenar a síntese do DNA sem os mecanismos complicados ne cessários para a replicação da fita retardada Entretanto não foi descoberta tal enzima de síntese na direção 39S59 Sugira dois mecanismos possíveis para a síntese do DNA na direção 39S59 O pirofosfato deveria ser um produto de ambas as reações pro postas Um ou ambos os mecanismos podem ser apoiados em uma célula Sim ou não Por quê Dica sugira a utilização de precursores do DNA ausentes nas células existentes 7 Atividades das DNApolimerases Você está caracteri zando uma nova DNApolimerase Quando a enzima é incubada com DNA marcado com 32P e sem dNTPs você pode observar a liberação de 32PdNMP Essa liberação é impedida pela adição de dNTPs não marcados Explique as reações que provavelmen te mais contribuem para essas observações O que você espera ria observar se você adicionasse pirofosfato em vez de dNTPs 8 Fitas líder e retardada Prepare uma tabela que liste os nomes e compare as funções dos precursores enzimas e outras proteínas necessárias para construir a fita líder versus a fita retardada durante a replicação do DNA em E coli 9 Função da DNAligase Alguns mutantes de E coli con têm DNAligase defeituosa Quando esses mutantes são expostos à timina marcada com 3H e o DNA produzido é sedimentado em um gradiente de densidade de sacarose alcalina duas bandas ra dioativas aparecem Uma corresponde à fração de alto peso mo lecular a outra à fração de baixo peso molecular Explique 10 Fidelidade da replicação do DNA Que fatores pro movem a fidelidade da replicação durante a síntese da fita líder do DNA Você esperaria que a fita retardada fosse feita com a mesma fidelidade Explique suas respostas 11 Importância das DNAtopoisomerases na replica ção do DNA O DNA desenrolando como ocorre na replica ção afeta a densidade superhelicoidal do DNA Na ausência de topoisomerases o DNA se tornaria superenrolado à frente da forquilha de replicação do mesmo modo que atrás dela está o DNA desenrolado Uma forquilha de replicação bacteriana irá parar quando a densidade superhelicoidal s do DNA à frente da forquilha atinge 1014 ver Capítulo 24 A replicação bidirecional se inicia na origem de um plasmídeo de 6000 pb in vitro na ausência de topoisomerases O plas mídeo inicialmente tem um s de 006 Quantos pares de bases serão desenrolados e replicados por cada forquilha de replicação antes que a forquilha pare Assuma que ambas as forquilhas via jam na mesma velocidade e que cada uma inclui todos os compo nentes necessários para o alongamento exceto a topoisomerase 12 O teste de Ames Em um meio nutriente sem histidina uma fina camada de ágar contendo 10 9 células de Salmonella typhimurium auxotrofas para histidina células mutantes que requerem histidina para sobreviver produz 13 colônias em um período de dois dias de incubação a 37C ver Figura 25 20 Como essas colônias surgem na ausência de histidina O experimento é repetido na presença de 04 mg de 2aminoan traceno O número de colônias produzidas em dois dias excede 10000 O que isso indica a respeito do 2aminoantraceno O que você pode prever a respeito de sua carcinogenicidade 13 Mecanismos de reparo do DNA As células de ver tebrados e de vegetais frequentemente metilam a citosina no DNA para formar 5metilcitosina ver Figura 85a Nessas mesmas células um sistema de reparo especializado reconhe ce malpareamentos GT e os repara para pares de bases GC Como esse sistema de reparo pode ser vantajoso para a célula Explique em termos da presença de 5metilcitosina no DNA 14 Reparo do DNA em pessoas com xeroderma pigmentoso A condição conhecida como xeroderma pigmentoso XP surge a partir de mutações em pelo menos sete genes humanos diferentes ver Quadro 251 As deficiên cias são geralmente em genes que codificam enzimas envolvi das em alguma parte da via de reparo de excisão de nucleotí deos em humanos Os vários tipos de XP são denominados de A até G XPA XPB etc com algumas poucas variantes adicio nais conhecidas sob a denominação de XPV Culturas de fibroblastos de indivíduos saudáveis e de pa cientes com XPG são irradiadas com luz ultravioleta O DNA é isolado e desnaturado e as fitas simples de DNA assim obtidas são caracterizadas por ultracentrifugação analítica a Amostras de fibroblastos normais mostram uma redu ção significativa no peso molecular médio das fitas simples de DNA após a irradiação mas as amostras de fibroblastos XPG não mostram tal redução Como isso pode ocorrer b Se você considerar que o sistema de reparo de excisão de nucleotídeos está operante nos fibroblastos qual etapa pode rá estar defeituosa nas células de pacientes com XPG Explique 15 Intermediários de Holliday Como a formação de in termediários de Holliday na recombinação genética homóloga difere de sua formação na recombinação sítioespecífica 16 Clivagem dos intermediários de Holliday Um inter mediário de Holliday é formado entre dois cromossomos homó logos em um ponto entre os genes A e B como mostrado a se guir Os cromossomos têm alelos diferentes dos dois genes A e a B e b Onde os intermediários de Holliday poderiam ser clivados pontos X eou Y para gerar um cromossomo que po deria transportar a um genótipo Ab ou b um genótipo ab X A b a B X Y Y 17 Uma conexão entre replicação e recombinação sítioespecífica A maioria das linhagens selvagens de Sac charomyces cerevisiae tem múltiplas cópias do plasmídeo circular 2m assim denominado em razão do seu contorno de cerca de 2 mm o qual tem aproximadamente 6300 pb de DNA Para a sua replicação o plasmídeo utiliza o sistema de replicação do hospedeiro sob o mesmo controle estrito usado para os cromossomos celulares do hospedeiro replicando ape nas uma vez a cada ciclo celular A replicação do plasmídeo é Nelson6edbookindb 1054 Nelson6edbookindb 1054 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1055 bidirecional com ambas as forquilhas de replicação iniciando em uma única origem bem definida Entretanto um ciclo de re plicação do plasmídeo 2m pode resultar em mais de duas cópias do plasmídeo permitindo a amplificação do seu número de có pias número de cópias de plasmídeos por célula sempre que a segregação do plasmídeo durante a divisão celular deixa uma célulafilha com menos plasmídeos do que o complemento nor mal de cópias do mesmo A amplificação precisa de um sistema de recombinação sítioespecífico codificado pelo plasmídeo o qual serve para inverter uma parte do plasmídeo em relação à outra Explique como um evento de inversão sítioespecífica pode resultar na amplificação do número de cópias do plasmí deo Dica considere a situação quando as forquilhas de repli cação duplicaram um sítio de recombinação mas não o outro Problema de análise de dados 18 Mutagênese em Escherichia coli Muitos compostos mutagênicos atuam por meio da alquilação de bases no DNA O agente alquilante R7000 7metóxi2nitronafto21bfurano é um agente mutagênico extremamente potente NO2 CH3 O O R7000 In vivo o R7000 é ativado pela enzima nitrorredutase e essa forma mais reativa se liga covalentemente ao DNA principal mente mas não exclusivamente a pares de bases GC Em um estudo de 1996 Quillardet Touati e Hofnung in vestigaram os mecanismos pelos quais o R7000 causa muta ções em E coli Eles compararam a atividade genotóxica do R7000 em duas linhagens de E coli o tipo selvagem Uvr 1 e os mutantes sem atividade uvrA Uvr ver Tabela 256 Eles primeiramente mediram as taxas de mutagênese A rifampici na é um inibidor da RNApolimerase ver Capítulo 26 Na sua presença as células não crescem a não ser que ocorram algu mas mutações no gene que codifica a RNApolimerase O apa recimento de colônias resistentes à rifampicina fornece assim uma medida útil das taxas de mutagênese Os efeitos de concentrações diferentes de R7000 foram de terminados com os resultados mostrados no gráfico a seguir R7000 mgmL Uvr1 Uvr2 06 08 1 02 0 04 1000 100 1 10 Produção de mutantes resistentes a rifampicina a Por que alguns mutantes são produzidos mesmo quan do não há R7000 presente Quillardet e colaboradores também mediram a taxa de so brevivência de bactérias tratadas com diferentes concentra ções de R7000 obtendo os resultados a seguir R7000 mgmL Sobrevivência Uvr1 Uvr2 06 08 1 02 04 100 10 1 0 b Explique como o tratamento com R7000 é letal para as células c Explique as diferenças nas curvas de mutagênese e nas curvas de sobrevivência para os dois tipos de bactérias Uvr 1 e Uvr 2 como mostrado nos gráficos Os pesquisadores então mediram a quantidade de R7000 covalentemente ligada ao DNA em E coli Uvr 1 e Uvr 2 Eles incubaram as bactérias com 3HR7000 por 10 ou 70 minutos extraíram o DNA e mediram seu conteúdo de 3H em contagens por minuto cpm por mg de DNA Tempo minutos 3H no DNA cpmmg Uvr 1 Uvr 2 10 76 159 70 69 228 d Explique por que a quantidade de 3H diminui com o tem po na linhagem Uvr 1 e aumenta com o tempo na linhagem Uvr 2 Quillardet e colaboradores então examinaram as mudanças nas sequências de DNA específicas causadas pelo R7000 nas bactérias Uvr 1 e Uvr 2 Para tanto eles utilizaram seis linhagens diferentes de E coli cada uma com uma mutação pontual dife rente no gene lacZ o qual codifica a b galactosidase essa en zima catalisa a mesma reação que a lactase ver Figura 1411 As células com qualquer uma dessas mutações têm uma b galac tosidade não funcional e são incapazes de metabolizar a lactose ie um fenótipo Lac Cada tipo de mutação pontual precisou de uma mutação reversa específica para restaurar a função do gene lacZ e o fenótipo Lac 1 Cultivando células em um meio de cultura contendo lactose como única fonte de carbono foi pos sível selecionar aquelas com mutação reversa ou seja células Lac 1 Pela contagem do número de células Lac 1 após a mutagê nese de uma determinada linhagem os pesquisadores puderam medir as frequências de cada tipo de mutação Primeiro eles observaram o espectro de mutações nas cé lulas Uvr 2 A tabela a seguir mostra os resultados para as seis linhagens CC101 a CC106 com a mutação pontual necessária para produzir células Lac 1 indicada entre parênteses R7000 mgmL Número de células Lac 1 média 6 DP CC101 AT para CG CC102 GC para AT CC103 GC para CG CC104 GC para TA CC105 AT para TA CC106 AT para GC 0 6 6 3 11 6 9 2 6 1 5 6 3 2 6 1 1 6 1 0075 24 6 19 34 6 3 8 6 4 82 6 23 40 6 14 4 6 2 015 24 6 4 26 6 2 9 6 5 180 6 71 130 6 50 3 6 2 Nelson6edbookindb 1055 Nelson6edbookindb 1055 030414 0748 030414 0748 1056 DAVID L NELSON MICHAEL M COX e Que tipos de mutações mostram aumentos significati vos acima da taxa basal de mutação em função do tratamento com R7000 Dê uma explicação plausível para o fato de algu mas apresentarem frequência maior do que outras f Todas as mutações que você listou em e poderiam ser explicadas como resultado de uma ligação covalente do R7000 a um par de bases GC Explique seu raciocínio g A Figura 2527b mostra como a metilação de resíduos de guanina pode resultar em uma mutação de GC para AT Utilizando uma via semelhante mostre como um aduto G R7000 pode resultar nas mutações do tipo GC para AT ou TA mostrado acima Que bases pareiam com o aduto G R7000 Os resultados para a bactéria Uvr 1 são mostrados na tabela a seguir R7000 mgmL Número de células Lac 1 média 6 DP CC101 AT para CG CC102 GC para AT CC103 GC para CG CC104 GC para TA CC105 AT para TA CC106 AT para GC 0 2 6 2 10 6 9 3 6 3 4 6 2 6 6 1 05 6 1 1 7 6 6 21 6 9 8 6 3 23 6 15 13 6 1 1 6 1 5 4 6 3 15 6 7 22 6 2 68 6 25 67 6 14 1 6 1 h Esses resultados mostram que todos os tipos de muta ções são reparados com igual fidelidade Dê uma explicação plausível para a sua resposta Referências Quillardet P Touati E Hofnung M 1996 Influence of the uvr dependent nucleotide excision repair on DNA adducts formation and mutagenic spectrum of a potent genotoxic agent 7methoxy2nitronaphtho21bfuran R7000 Mutat Res 358 113122 Nelson6edbookindb 1056 Nelson6edbookindb 1056 030414 0748 030414 0748 261 Síntese de RNA dependente de DNA 1058 262 Processamento de RNA 1069 263 Síntese de RNA e DNA dependente de RNA 1085 A expressão da informação em um gene geralmente envolve a produção de uma molécula de RNA trans crita a partir de um molde de DNA À primeira vista fitas de RNA e DNA podem ser muito semelhantes diferin do apenas pelo fato do RNA ter um grupo hidroxila na po sição 29 da aldopentose e uracila em vez de timina No en tanto ao contrário do DNA a maioria dos RNA desempenha suas funções como fitas simples que se dobram sobre si mesmas e têm o potencial para uma diversidade estrutural muito maior do que o DNA Capítulo 8 O RNA é portanto adequado para uma variedade de funções celulares O RNA é a única macromolécula conhecida que tem um papel tanto no armazenamento da informação quanto na catálise o que levou a muita especulação a respeito do seu possível papel como intermediário químico no desen volvimento da vida neste planeta A descoberta de RNAs catalisadores ou ribozimas alterou a própria definição de uma enzima estendendoa além do domínio das proteínas As proteínas no entanto permanecem essenciais para o RNA e suas funções Na célula moderna todos os ácidos nucleicos incluindo os RNAs são complexados com proteí nas Alguns desses complexos são bastante elaborados e o RNA pode assumir tanto papéis estruturais quanto catalíti cos no interior de máquinas bioquímicas complicadas Todas as moléculas de RNA exceto os genomas de RNA de certos vírus são derivadas de informação permanente mente armazenada no DNA Durante a transcrição um sistema de enzimas converte a informação genética de um segmento de fita dupla de DNA em um filamento de RNA com uma sequência de bases complementar a uma das fi tas de DNA Três tipos principais de RNA são produzidos Os RNAs mensageiros mRNA codificam a sequência de aminoácidos de um ou mais polipeptídeos especificados por um gene ou conjunto de genes Os RNAs transporta dores tRNA leem a informação codificada no mRNA e transferem o aminoácido adequado para uma cadeia poli peptídica em crescimento durante a síntese de proteínas Os RNAs ribossomais rRNA são constituintes dos ri bossomos as máquinas celulares intrincadas que sintetizam proteínas Muitos RNAs adicionais especializados têm fun ções regulatórias ou catalíticas ou são precursores das três classes principais de RNA Esses RNAs de função especial não são mais considerados como espécies secundárias no catálogo de RNAs celulares Nos vertebrados os RNAs que não se encaixam em uma das categorias clássicas mRNA tRNA rRNA parecem exceder enormemente aqueles que o fazem Durante a replicação o cromossomo inteiro é em geral copiado mas a transcrição é mais seletiva Apenas genes ou grupos de genes particulares são transcritos a qualquer momento e algumas porções do genoma de DNA nunca são transcritas A célula restringe a expressão da informação genética à formação dos produtos gênicos necessários em qualquer momento particular Sequências regulatórias es pecíficas marcam o início e o final dos segmentos de DNA a serem transcritos e designam qual fita no duplex de DNA será usada como molde O próprio transcrito pode intera gir com outras moléculas de RNA como parte do programa regulatório geral A regulação da transcrição é descrita em detalhe no Capítulo 28 A soma de todas as moléculas de RNA produzidas em uma célula sob um determinado conjunto de condições é chamado de transcriptoma celular Dada a fração relati vamente pequena do genoma humano destinada a genes codificadores de proteínas seria esperado que apenas uma pequena parte do genoma humano fosse transcrita Não é o caso A moderna análise de microarranjo dos padrões de transcrição revelou que a maior parte do genoma de huma nos e de outros mamíferos é transcrita em RNA Os pro dutos não são predominantemente mRNA tRNA ou rRNA mas sim RNAs de função especial dos quais uma série está sendo descoberta Muitos deles parecem estar envolvidos na regulação da expressão gênica entretanto o ritmo rápi do de descoberta nos forçou a reconhecer que não se sabe o quê muitos desses RNAs fazem Nesse capítulo examinase a síntese de RNA a partir de um molde de DNA e o processamento póssíntese e reposi ção de moléculas de RNA Ao fazêlo são abordadas muitas das funções especializadas do RNA incluindo funções ca 26 Metabolismo de RNA Nelson6ed26indd 1057 Nelson6ed26indd 1057 020514 1726 020514 1726 1058 DAVID L NELSON MICHAEL M COX talisadoras De maneira interessante os substratos para as enzimas de RNA são frequentemente outras moléculas de RNA Também descrevemse sistemas em que o RNA é o molde e o DNA o produto em vez do contrário Portanto as vias de informação são um círculo completo e revelam que a síntese de ácidos nucleicos dependente de molde apre senta regras padrão independente da natureza do molde ou produto RNA ou DNA Esse exame da interconversão biológica de DNA e RNA como transportadores de informa ção leva a uma discussão a respeito da origem evolutiva da informação biológica 261 Síntese de RNA dependente de DNA A discussão da síntese de RNA começa com uma compa ração entre a transcrição e a replicação do DNA Capítulo 25 A transcrição se parece com a replicação no seu meca nismo químico fundamental na sua polaridade direção da síntese e no seu uso de um molde E como a replicação a transcrição tem fases de iniciação alongamento e termi nação embora na literatura sobre transcrição a iniciação é adicionalmente dividida em fases discretas de ligação de DNA e iniciação da síntese de RNA A transcrição difere da replicação porque ela não requer um iniciador e geralmen te envolve apenas segmentos limitados de uma molécula de DNA Além disso no interior dos segmentos transcritos apenas uma fita de DNA serve de molde para uma molécula de RNA em particular O RNA é sintetizado pelas RNApolimerases A descoberta da DNApolimerase e sua dependência de um molde de DNA estimulou uma busca por uma enzima que sintetize RNA complementar a um filamento de DNA Em 1960 quatro grupos de pesquisa detectaram indepen dentemente uma enzima em extratos celulares que podia formar um polímero de RNA a partir de ribonucleosídeos 59trifosfatos Trabalhos posteriores em RNApolimerase purificada de Escherichia coli ajudaram a definir as pro priedades fundamentais da transcrição Figura 261 A RNApolimerase dependente de DNA precisa além de um molde DNA de todos os quatro ribonucleosídeos 59trifosfatos ATP GTP UTP e CTP como precursores das unidades de nucleotídeos de RNA bem como de Mg 21 A proteína também liga um Zn 21 A química e o mecanismo de síntese de RNA se assemelham fortemente àqueles usa dos pelas DNApolimerases ver Figura 255a A RNApo limerase alonga uma fita de RNA ao adicionar unidades de ribonucleotídeos à extremidade hidroxila 39 construindo 59 39 39 59 59 OH 39 2 2 2 a b c C C C G G G A A A T U g b a Fitamolde de DNA Fita de RNA crescente O O O O P P P O O O O O O O NTP que chega RNApolimerase Mg2 Mg2 O O O O O O Asp Asp Asp Superespirais positivas Superespirais negativas Direção da transcrição Direção da transcrição Não molde Molde Fita de DNA Duplex de DNA RNA polimerase Saída do RNA Saída do DNA RNA DNA 39 59 RNA 39 39 39 59 59 59 Canal de entrada do NTP MECANISMO FIGURA 261 Transcrição pela RNApolimerase em E coli Para a síntese de uma fita de RNA complementar a uma das duas fitas de DNA em uma duplahélice o DNA é transitoriamente desenrolado a Mecanismo catalítico da síntese de RNA pela RNApolimerase Observe que este é essencialmente o mesmo mecanismo usado pelas DNApolimerases ver Figura 255a A reação envolve dois íons Mg 21 coordenados para os grupos fosfato dos nucleosídeos trifosfatos NTP que chegam e para três resíduos Asp que são altamente conservados nas RNApolimerases de todas as espécies Um íon Mg 21 facilita o ataque pelo grupo hidroxila 39 no fosfato a do NTP o outro íon Mg 21 facilita o deslocamento do pirofosfato e ambos íons metálicos estabilizam o estado de transição pentacovalente b Cerca de 17 pb de DNA são desenrolados a cada momento A RNA polimerase e a bolha de transcrição se movem da esquerda para a direita ao longo do DNA como mostrado facilitando a síntese de RNA O DNA é desenrolado à frente e enrolado novamente anteriormente à medida que o RNA é transcrito À medida que o DNA é enrolado novamente o híbrido RNADNA é deslocado e a fita de RNA é expulsa c O movimento de uma RNApolimerase ao longo do DNA tende a criar superespirais positivas DNA superespiralizado à frente da bolha de transcrição e superespirais negativas DNA superdesespiralizado antes dela A RNApolimerase está em contato estreito com o DNA à frente da bolha de transcrição bem como com as fitas separadas de DNA e RNA no interior e imediatamente antes da bolha Um canal nas proteínas canaliza novos NTP para o sítio ativo da polimerase O footprint da polimerase envolve cerca de 35 pb de DNA durante o alongamento Nelson6edbookindb 1058 Nelson6edbookindb 1058 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1059 o RNA na direção 59S39 O grupo hidroxila 39 atua como nucleófilo atacando o a fosfato do ribonucleosídeo trifos fato que chega Figura 261a e liberando o pirofosfato A reação total é RNA aumentado A RNApolimerase precisa de DNA para sua atividade e é mais ativa quando ligada a um DNA de fita dupla Como observado anteriormente apenas uma das duas fitas ser ve de molde A fita de DNA molde é copiada na direção 39S59 antiparalela à nova fita de RNA exatamente como na replicação do DNA Cada nucleotídeo no RNA recentemente formado é selecionado pelas interações de pareamento de bases de WatsonCrick resíduos U são in seridos no RNA para parear com resíduos A no molde de DNA resíduos G são inseridos para parear com resíduos C e assim por diante A geometria dos pares de bases ver Figura 256 também pode desempenhar um papel na seleção de bases Ao contrário da DNApolimerase a RNApolimerase não precisa de um iniciador para a síntese A iniciação ocorre quando a RNApolimerase se liga a sequências de DNA específicas chamadas de promotores descritas a se guir O grupo 59trifosfato do primeiro resíduo em uma molécula de RNA nascente recentemente formada não é clivado para liberar PPi mas em vez disso permanece in tacto ao longo de todo o processo de transcrição Durante a fase de alongamento da transcrição as bases da extre midade crescente da nova fita de RNA pareiam tempora riamente com o molde de DNA para formar um pequeno RNADNA híbrido de duplahélice estimado em 8 pb de comprimento Figura 261b O RNA nesse duplex híbrido descasca logo após a sua formação e o duplex de DNA volta a se formar A fim de permitir que a RNApolimerase sintetize uma fita de RNA complementar a uma das fitas de DNA o du plex de DNA deve se desenrolar em um pequeno trecho for mando uma bolha de transcrição Durante a transcrição a RNApolimerase da E coli geralmente mantém 17 pb de senrolados Os híbridos de RNADNA de 8 pb ocorrem nessa região desenrolada O alongamento de um transcrito pela RNApolimerase da E coli continua a uma taxa de 50 a 90 nucleotídeoss Como o DNA é uma hélice o movimento de uma bolha de transcrição precisa de uma considerável rota ção da fita das moléculas de ácido nucleico A rotação da fita de DNA é restrita na maioria dos DNAs por proteínas que se ligam ao DNA e outras barreiras estruturais Como re sultado uma RNApolimerase em movimento gera ondas de superespirais positivas para a frente da bolha de transcrição e superespirais negativas para trás Figura 261c Isso foi observado tanto in vitro quanto in vivo em bactérias Na célula os problemas topológicos causados pela transcrição são aliviados pela ação das topoisomerases Capítulo 24 CONVENÇÃOCHAVE As duas fitas de DNA complementar têm papéis diferentes na transcrição A fita que serve como um molde para a síntese de RNA é chamada de fitamolde A fita de DNA complementar ao molde a fita não mol de ou fita codificadora é idêntica na sequência de bases ao RNA transcrito a partir do gene com o U no RNA no lugar do T no DNA Figura 262 A fita codificadora de um gene em particular pode estar situada em qualquer das fitas de um determinado cromossomo como mostrado em Figura 263 para um vírus Por convenção as sequências regulatórias que controlam a transcrição descritas poste riormente neste capítulo são designadas pelas sequências na fita codificadora A RNApolimerase dependente de DNA da E coli é uma enzima complexa grande com cinco subunidades centrais FIGURA 262 Fitas de DNA molde e não molde codificadora As duas fitam complementares de DNA são definidas por sua função na transcrição O transcrito de RNA é sintetizado na fita molde e é idêntico em sequência com U no lugar de T à fita não molde ou fita codificadora 59 39 C G G C C G T A 39 59 A T T A A T G C C G G C T A T A T A Fita de DNA não molde codificadora Fita de DNA molde Transcrito de RNA 59 39 C G C U A U A G C G U U U DNA Transcritos de RNA 36 3 104 pb 39 59 59 39 FIGURA 263 Organização da informação codificadora no genoma do adenovírus A informação genética do genoma do adenovírus exem plo convenientemente simples é codificada por uma molécula de DNA de fita dupla de 36000 pb cujas duas fitas codificam proteínas A informação para a maioria das proteínas é codificada pela ie idêntica a fita de cima por convenção a fita orientada de 59 para 39 da esquerda para a direita A fita de baixo atua como molde para esses transcritos Entretanto algumas pou cas proteínas são codificadas pela fita de baixo transcrita na direção opos ta e usa a fita de cima como molde A síntese de mRNA em adenovírus é atualmente muito mais complexa do que mostrado aqui Muitos dos mRNA obtidos usando a fita superior como molde são sintetizados inicialmente como um transcrito único longo 25000 nucleotídeos então extensamente processado para produzir os mRNA separados O adenovírus provoca infec ções do trato respiratório superior em alguns vertebrados Nelson6edbookindb 1059 Nelson6edbookindb 1059 030414 0748 030414 0748 1060 DAVID L NELSON MICHAEL M COX a2bb9v Mr 390000 e uma sexta subunidade de um gru po denominado s com variantes designadas por tamanho peso molecular A subunidade s se liga transitoriamente ao centro e direciona a enzima para sítios de ligação espe cíficos no DNA descritos a seguir Essas seis subunida des constituem a holoenzima da RNApolimerase Figura 264 A holoenzima da RNApolimerase da E coli existe portanto em várias formas dependendo do tipo da subuni dade s A subunidade mais comum é a s 70 Mr 70000 e a discussão a seguir foca na holoenzima da RNApolimerase correspondente As RNApolimerases não apresentam um sítio ativo distinto de exonuclease de revisão 39S59 como aquele de várias DNApolimerases e a taxa de erro de transcri ção é mais alta do que aquela de replicação do DNA cro mossomal aproximadamente um erro a cada 10 4 a 10 5 ribonucleotídeos incorporados ao RNA Como muitas có pias de um RNA são geralmente produzidas a partir de um único gene e todos os RNA são por fim degradados e substituídos um erro em uma molécula de RNA tem menor consequência para a célula do que um erro na in formação permanente armazenada no DNA Muitas RNA polimerases incluindo a RNApolimerase bacteriana e a RNApolimerase II de eucariontes discutida a seguir pausam realmente quando uma base mal pareada é adi cionada durante a transcrição e elas podem remover os nucleotídeos errados da extremidade 39 de um transcrito por reversão direta da reação da polimerase Porém não se sabe ainda se essa atividade é uma verdadeira função de revisão e em que grau ela pode contribuir para a fidelidade da transcrição A síntese de RNA começa nos promotores A iniciação da síntese de RNA em pontos aleatórios da molécula de DNA seria um processo de desperdício ex traordinário Em vez disso uma RNApolimerase se liga a sequências específicas no DNA chamadas de promotores que dirigem a transcrição de segmentos adjacentes de DNA genes As sequências em que as RNApolimerases se li gam podem ser muito variáveis e muitas pesquisas tiveram como foco a identificação das sequências particulares que são críticas para a função do promotor Na E coli a ligação da RNApolimerase ocorre no in terior de uma região que se estende desde cerca de 70 pb antes do sítio de início da transcrição até cerca de 30 pb além dele Por convenção os pares de bases de DNA que correspondem ao início de uma molécula de RNA rece bem números positivos e aqueles que precedem o sítio do início do RNA recebem números negativos A região do promotor se estende portanto entre as posições 70 e 130 Análises e comparações da classe mais comum de promotores bacterianos aqueles reconhecidos por uma holoenzima de RNApolimerase contendo s 70 revelaram semelhanças em duas sequências curtas centradas em torno das posições 10 e 35 Figura 265 Essas se quências são sítios de interação importantes para a su bunidade s 70 Embora as sequências não sejam idênticas em todos os promotores bacterianos nessa classe certos nucleotídeos particularmente comuns em cada posição formam uma sequência de consenso lembrese da se quência de consenso oriC da E coli ver Figura 2510 A sequência de consenso na região 10 é 59TATAAT39 a sequência de consenso na região 35 é 59TTGACA39 Um terceiro elemento de reconhecimento rico em AT chamado de elemento UP promotor a montante do in glês upstream promoter ocorre entre as posições 40 e 60 nos promotores de certos genes altamente expressa dos O elemento UP é ligado pela subunidade a da RNA polimerase A eficiência com que uma RNApolimerase contendo s 70 se liga a um promotor e inicia a transcrição é determinada em grande parte por essas sequências pelo espaçamento entre elas e pela sua distância do sítio de início de transcrição Muitas linhas de evidência independentes atestam a im portância funcional das sequências nas regiões 35 e 10 Mutações que afetam a função de um determinado pro motor frequentemente envolvem um par de bases nessas regiões Variações na sequência de consenso também afe tam a eficiência da ligação da RNApolimerase e a iniciação da transcrição Uma alteração em apenas um par de bases pode diminuir a taxa de ligação em várias ordens de mag nitude A sequência do promotor portanto estabelece um nível basal de expressão que pode variar enormemente de um gene de E coli para o seguinte Um método que fornece informação acerca da interação entre a RNApolimerase e promotores é ilustrado no Quadro 261 A via de iniciação da transcrição e o destino da subuni dade s estão se tornando muito melhor definidos Figura 266 A via consiste em duas partes principais ligação e iniciação cada qual com múltiplas etapas Primeiro a poli merase dirigida por seu fator ligado s se liga ao promotor Um complexo fechado em que o DNA ligado é intacto e um complexo aberto em que o DNA ligado está intacto e parcialmente desenrolado próximo da sequência 10 se formam em sucessão Segundo a transcrição é iniciada no interior do complexo levando a uma mudança conforma cional que converte o complexo na forma de alongamento seguida pelo movimento do complexo de transcrição para longe do promotor distanciamento do promotor Qual b9 a a b v FIGURA 264 Estrutura da holoenzima da RNApolimerase da bacté ria Thermus aquaticus Derivada da PDB ID 1HQM A estrutura geral dessa enzima é muito semelhante àquela da RNApolimerase da E coli nenhum DNA ou RNA é mostrado aqui As várias subunidades da RNApolimerase bacteriana dão à enzima a forma de uma garra de caranguejo Cada parte da pinça é formada a partir de grandes subunidades b e b9 As subunidades são mostradas com as mesmas cores na estrutura esquemática e em fita Nelson6edbookindb 1060 Nelson6edbookindb 1060 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1061 quer uma dessas etapas pode ser afetada pela composição específica das sequências promotoras A subunidade s se dissocia estocasticamente de modo aleatório à medida que a polimerase entra na fase de alongamento da transcri ção A proteína NusA Mr 54430 se liga à RNApolimerase em alongamento competitivamente com a subunidade s Uma vez que a transcrição esteja completa a NusA se disso cia da enzima a RNA se dissocia do DNA e um fator s s 70 ou outro pode novamente se ligar à enzima para iniciar a transcrição A E coli tem outras classes de promotores ligados pe las holoenzimas da RNApolimerase com subunidades s di ferentes Tabela 261 Um exemplo são os promotores dos genes de choque térmico Os produtos desse conjunto de genes são produzidos em níveis superiores quando a célula recebe uma ameaça como um aumento repentino de tem peratura A RNApolimerase se liga aos promotores desses genes apenas quando s 70 é substituído pela subunidade s 32 Mr 32000 específica para os promotores de choque tér mico ver Figura 283 Ao empregar diferentes subunida des s a célula pode coordenar a expressão de conjuntos de genes permitindo alterações importantes na fisiologia celular A escolha de quais conjuntos de genes são expres sados depende da disponibilidade das várias subunidades s o que por sua vez é determinado por vários fatores ta xas reguladas de síntese e degradação modificações pós síntese que alternam as entre as formas ativa e inativa das subunidades individuais s e uma classe especializada de proteínas antis cada tipo ligandose e sequestrando uma subunidade s particular tornandoa indisponível para a iniciação da transcrição A transcrição é regulada em vários níveis As necessidades para qualquer produto gênico variam com as condições celulares ou estágio de desenvolvimento e a transcrição de cada gene é cuidadosamente regulada para formar produtos gênicos apenas nas proporções necessá rias A regulação pode ocorrer em qualquer etapa na trans crição incluindo o alongamento e a terminação Entretan to boa parte da regulação é direcionada para a ligação da polimerase e etapas de iniciação da transcrição destacadas na Figura 266 Diferenças nas sequências de promotores são apenas um dos vários níveis de controle A ligação de proteínas a sequências tanto próximas quanto distantes do promotor também pode afetar os níveis de expressão gênica A ligação de proteínas pode ativar a transcrição ao facilitar tanto a ligação da RNApolimerase ou etapas mais adiante no processo de iniciação ou ela pode reprimir a transcrição ao bloquear a atividade da polimerase Em E coli uma proteína que ativa a transcri ção é a proteína receptora cAMP CRP que aumenta a transcrição de genes que codificam enzimas que meta bolizam outros açúcares além da glicose quando as células crescem na ausência da mesma Repressores são proteí nas que bloqueiam a síntese do RNA em genes específicos No caso do repressor Lac Capítulo 28 a transcrição dos genes para as enzimas do metabolismo da lactose é blo queada quando a lactose está indisponível A transcrição é a primeira etapa na complicada e ener geticamente intensa via da síntese proteica de modo que a maior parte da regulação dos níveis de proteína tanto nas células bacterianas quanto eucariontes ocorre na transcri 11 Elemento UP Região 35 Região 10 Espaçador Início do RNA Espaçador NNAAA A A T T T AT TTTTNNAAAANNN TTGACA N N N17 N6 TATAAT Sequência de consenso AGAAAATTATTTTAAATTTCCT TTGTCA N16 N8 TATAAT A A TTGACA trp N17 N7 TTAACT A TTTACA lac N17 N6 TATGTT A TTGATA recA N16 N7 TATAAT A CTGACG araBAD N18 N6 TACTGT A rrnB P1 FIGURA 265 Típicos promotores de E coli reconhecidos por uma holoenzima da RNApolimerase contendo s 70 As sequências da fita não molde são mostradas lidas na direção 59S39 como é a convenção para representações deste tipo As sequências diferem de um promotor para o seguinte mas comparações de vários promotores revelam semelhanças particularmente nas regiões 10 e 35 O elemento de sequência UP não encontrado em todos os promotores de E coli é mostrado no promotor P1 para o gene de rRNA altamente expressado rrnB Os elementos UP ge ralmente encontrados na região entre 40 e 60 estimulam fortemente a transcrição nos promotores que os contêm O elemento UP no promotor P1 do rrnB abrange a região entre 38 e 59 A sequência de consenso para os promotores da E coli reconhecidos como s 70 é a segunda a partir do topo Regiões espaçadoras contêm números ligeiramente variáveis de nucleotí deos N É mostrado apenas o primeiro nucleotídeo codificando o transcrito de RNA na posição 11 Nelson6edbookindb 1061 Nelson6edbookindb 1061 030414 0748 030414 0748 1062 DAVID L NELSON MICHAEL M COX QUADRO 261 MÉTODOS A RNApolimerase deixa sua digital em um promotor Footprinting técnica derivada dos princípios usados no sequenciamento de DNA identifica as sequências de DNA ligadas por uma proteína particular Os pesquisadores iso lam um fragmento de DNA que acreditam conter sequên cias reconhecidas por uma proteína ligadora de DNA e marcam radioativamente a extremidade de uma das fitas Figura Q1 Eles empregam então reagentes químicos ou enzimáticos para introduzir quebras aleatórias no frag mento de DNA cerca de uma por molécula A separação dos produtos clivados marcados frag mentos quebrados de vários comprimentos por eletro forese de alta resolução produz uma escala de bandas radioativas Em um tubo separado o procedimento de clivagem é repetido em cópias do mesmo fragmento de DNA na presença da proteína ligadora de DNA Os pes quisadores então submetem os dois conjuntos de produ tos de clivagem à eletroforese e os comparam lado a lado Um intervalo footprint na série de bandas radioati vas derivado da amostra de DNAproteína atribuível à proteção do DNA pela proteína ligadora identifica as sequências que a pro teína liga A localização precisa do sítio da proteína ligadora pode ser determinada por sequen ciamento direto ver Figura 834 de cópias do mesmo fragmento de DNA e incluir as raias de sequenciamento não mostradas aqui no mesmo gel com o footprint A Fi gura Q2 mostra os resultados do footprin ting para a ligação da RNApolimerase a um fragmento de DNA contendo um promotor A polimerase cobre 60 a 80 pb a proteção pela enzima ligada inclui as regiões 10 e 35 59 39 39 59 Trate com DNase sob condições em que cada fita é cortada uma vez em média Nenhum corte é feito na área em que a RNApolimerasese ligou Solução de fragmentos idênticos de DNA marcados radioativamente na extremidade de uma das fitas Isole fragmentos de DNA marcado e desnature Apenas fitas marcadas são detectadas na próxima etapa Separe os fragmentos por eletroforese em gel de poliacrilamida e visualize as bandas marcadas radioativamente em filme de raios X Migração do DNA Bandas ausentes indicam onde a RNApolimerase se ligou ao DNA Fragmento de DNA não cortado Local do corte da DNase 1 2 1 2 DNase I FIGURA Q1 Análise de footprint do sítio de ligação da RNApolimerase em um frag mento de DNA Experimentos separados são desenvolvidos na presença 1 e ausência 2 da polimerase Fita não molde 2 1 C 11 220 230 240 250 210 Regiões ligadas pela RNApolimerase FIGURA Q2 Resultados do footprinting da RNApolime rase se ligando ao promotor lac ver Figura 265 Nesse experimento a extremidade 59 da fita não molde foi mar cada radioativamente A coluna C é um controle em que os fragmentos de DNA marcados foram clivados com um reagente químico que produz um padrão de bandea mento mais uniforme Nelson6edbookindb 1062 Nelson6edbookindb 1062 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1063 ção particularmente em seus estágios iniciais O Capítulo 28 descreve vários mecanismos pelos quais a regulação é realizada Sequências específicas sinalizam a terminação da síntese de RNA A síntese de RNA é progressiva isto é a RNApolimerase irá introduzir um grande número de nucleotídeos em uma molécula de RNA crescente antes de se dissociar p 1014 Isso é necessário pois se uma RNApolimerase liberasse um transcrito de RNA prematuramente ela não poderia re começar a síntese do mesmo RNA tendo que em vez disso recomeçar Entretanto um encontro com certas sequências de DNA resulta em uma pausa na síntese de RNA e em algumas dessas sequências a transcrição é terminada O foco aqui é mais uma vez nos sistemas bem estudados de bactérias A E coli tem pelo menos duas classes de sinais de terminação uma classe se baseia em um fator proteico chamado r rho e a outra é independente de r Promotor DNA O núcleo da RNApolimerase se liga ao promotor do DNA ➊ A bolha de transcrição se forma ➋ A transcrição termina A NusA se dissocia e a RNApolimerase é reciclada ➏ A transcrição começa ➌ s70 s70 RNApolimerase Complexo fechado Complexo aberto s70 RNA RNA NusA NusA O alongamento continua a s70 se dissocia e é substituída pela NusA ➎ A remoção do promotor é seguida de alongamento ➍ Promoter FIGURA 266 Início da transcrição e alongamento pela RNApolime rase da E coli O início da transcrição precisa de várias etapas geralmente divididas em duas fases ligação e início Na fase de ligação a interação ini cial da RNApolimerase com o promotor leva à formação de um complexo fechado no qual o DNA promotor é ligado de maneira estável mas não desenrolado Uma região de 12 a 15 pb de DNA do interior da região 10 à posição 12 ou 13 é então desenrolado para formar um complexo aberto Intermediários adicionais não mostrados foram detectados nas vias que levam aos complexos fechados e abertos junto com várias mu danças na conformação proteica A fase de iniciação envolve o início da transcrição e a remoção do promotor etapas ➊ a ➍ aqui Uma vez que o alongamento tenha começado a subunidade s é liberada e substituída pela proteína NusA A polimerase deixa o promotor e fica comprometida com o alongamento do RNA etapa ➎ Quando a transcrição está com pleta o RNA é liberado a proteína NusA se dissocia e a RNApolimerase se dissocia do DNA etapa ➏ Outra subunidade s se liga à RNApolimerase e o processo se reinicia Nelson6edbookindb 1063 Nelson6edbookindb 1063 030414 0748 030414 0748 1064 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A maioria dos terminadores independentes de r tem duas características distintivas A primeira é uma região que produz um transcrito de RNA com sequências au tocomplementares permitindo a formação de uma es trutura em grampo ver Figura 819a com 15 a 20 nu cleotídeos no centro antes da extremidade projetada da fita de RNA A segunda característica é um filamento al tamente conservado de três resíduos A na fitamolde que são transcritos em resíduos U próximo da extremidade 39 do grampo Quando uma polimerase chega a um sítio de terminação com essa estrutura ela pausa Figura 267a A formação da estrutura em grampo no RNA interrompe vários pares de bases AU no segmento híbrido de RNA DNA e pode interromper interações importantes entre o RNA e a RNApolimerase facilitando a dissociação do transcrito Os terminadores dependentes de r não têm a sequência de resíduos repetidos de A na fitamolde mas em geral in cluem uma sequência rica em CA chamada de elemento rut do inglês rho utilization emprego de rho A proteína r se associa ao RNA em sítios de ligação específicos e migra na direção 59S39 até alcançar o complexo de transcrição que é pausado no sítio de terminação Figura 267b Aqui ela contribui para liberar o transcrito de RNA A proteína r tem uma atividade de helicase de RNADNA dependente de ATP que promove a translocação da proteína ao longo do RNA sendo o ATP hidrolisado pela proteína r durante o processo de terminação O mecanismo detalhado pelo qual a proteína promove a liberação do transcrito de RNA não é conhecido As células eucariontes têm três tipos de RNApolimerases nucleares O maquinário da transcrição no núcleo de uma célula eu carionte é muito mais complexo do que em bactérias Os eucariontes têm três RNApolimerases designadas I II e III que são complexos distintos mas que apresentam certas subunidades em comum Cada polimerase tem uma função específica e é recrutada para uma sequência pro motora específica A RNApolimerase I Pol I é responsável pela sínte se de apenas um tipo de RNA um transcrito chamado de RNA préribossomal ou prérRNA que contém o pre cursor dos rRNA 18S 58S e 28S ver Figura 2624 Os promotores da Pol I diferem enormemente de uma espé cie para outra A principal função da RNApolimerase II Pol II é a síntese de mRNA e de alguns RNA especializa dos Essa enzima pode reconhecer milhares de promoto res que variam enormemente em suas sequências Alguns promotores da Pol II apresentam algumas sequências em comum incluindo uma TATA box sequência consenso de eucariontes TATAATAATAG próxima do par de bases 30 e uma sequência Inr iniciador próxima do sítio de início do RNA em 11 Figura 268 Entretan to tais promotores estão em minoria e a Pol II opera em muitos promotores que não apresentam tais sequências características A RNApolimerase III Pol III produz tRNA o rRNA 5S e alguns outros RNA pequenos especializados Os pro motores reconhecidos pela Pol III são bem caracterizados De modo interessante algumas das sequências necessárias para o início regulado da transcrição pela Pol III estão loca lizadas no interior do próprio gene enquanto outras estão em localizações mais convencionais à montante do sítio de iniciação do RNA Capítulo 28 A RNApolimerase II precisa de muitos outros fatores proteicos para a sua atividade A RNApolimerase II é central para a expressão gênica de eucariontes e tem sido extensamente estudada Embora essa polimerase seja surpreendentemente mais complexa do que a sua contraparte bacteriana a complexidade mas cara uma impressionante conservação da estrutura função e mecanismo A Pol II isolada da levedura é uma enzima imensa com 12 subunidades A maior subunidade RBP1 apresenta um alto grau de homologia com a subunidade b9 TABELA 261 As sete subunidades s de Escherichia coli Subunidade s Kd nM Moléculas célula Fração da holoenzima Função s 70 026 700 78 Manutenção s 54 030 110 8 Modulação dos níveis de nitrogênio celular s 38 426 1 0 Genes da fase estacionária s 32 124 10 0 Genes de choque térmico s 28 074 370 14 Flagelos e genes de quimiotaxia s 24 243 10 0 Funções extracitoplasmáticas algumas funções de choque térmico s 18 173 1 0 Funções extracitoplasmáticas incluindo o transporte de citrato férrico Fonte Adaptado de Maeda H Fujita N Ishihama A 2000 Nucleic Acids Res 28 3500 Observação Fatores s são amplamente distribuídos em bactérias o número varia de um único fator s em Mycoplasma genitalium a 63 fatores s diferentes em Streptomyces coelicolor Número aproximado de cada subunidade s por célula e a fração da holoenzima da RNApolimerase complexado com cada subunidade durante o crescimento expo nencial Os números mudam à medida que as condições de crescimento se alteram A fração da RNApolimerase complexada com cada subunidade s reflete tanto a quantidade de uma subunidade particular quanto sua afinidade pela enzima Nelson6edbookindb 1064 Nelson6edbookindb 1064 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1065 U U U U AA A A A A T T T T T T AA A A A A T T T T T T 39 39 a Terminação independente de r ATP ADP Pi Helicase r RNApolimerase A síntese de RNA encontra uma sequência de terminação Um grampo de RNA é formado em uma sequência palindrômica reduzindo o comprimento do híbrido de RNADNA O mRNA é liberado b Terminação dependente de r A helicase r se liga a um sítio rut A helicase r migra ao longo do mRNA para a RNApolimerase em alongamento A helicase r separa o mRNA do molde de DNA T T T T T T AAAAAA UUUU T T T T T T AAAAAA U U U U 39 39 39 39 39 39 59 59 59 59 59 59 59 59 Sítio rut FIGURA 267 Terminação da transcrição em E coli a Terminação independente de r A RNApolimerase pausa a transcrição em várias se quências de DNA algumas das quais são terminadoras Um de dois resulta dos é então possível a polimerase evita o sítio e continua no seu caminho ou o complexo sofre uma mudança conformacional isomerização Nesse último caso o pareamento intramolecular de sequências complementares no transcrito de RNA recémformado pode formar um grampo que rompe o híbrido RNADNA ou as interações entre o RNA e a polimerase ou ambos resultando em isomerização Uma região híbrida AU na extremidade 39 do novo transcrito é relativamente instável e o RNA se dissocia do comple xo completamente levando à terminação Esse é o resultado comum nos terminadores Em outros sítios de pausa o complexo pode escapar após a etapa de isomerização para continuar a síntese de RNA b Terminação dependente de r Os RNAs que incluem um sítio rut roxo recrutam a he licase r A helicase migra ao longo do mRNA na direção 59S39 e se separa da polimerase YYANTYY A TATAAA TATA box Várias sequências reguladoras Inr 230 11 39 59 FIGURA 268 Algumas sequências comuns em promotores reco nhecidos pela RNApolimerase II A TATA box é o principal ponto de reunião para as proteínas dos complexos de préiniciação de Pol II O DNA é desenrolado na sequência iniciadora Inr e o sítio de início de transcri ção é geralmente no interior dessa sequência ou muito próximo dela Na sequência de consenso Inr mostrada aqui N representa qualquer nucleo tídeo Y nucleotídeo de pirimidina Muitas sequências adicionais servem como sítios de ligação para uma grande variedade de proteínas que afetam a atividade da Pol II Essas sequências são importantes na regulação dos promotores Pol II e diferem enormemente em tipo e número e em geral o promotor de eucariontes é muito mais complexo do que sugerido aqui ver Figura 1525 Muitas das sequências estão localizadas no interior de algumas poucas centenas de pares de bases da TATA box no lado 59 outras podem estar a milhares de pares de bases de distância Os elementos de sequência resumidos aqui são mais variáveis entre os promotores da Pol II de eucariontes do que entre os promotores de E coli ver Figura 265 A maioria dos promotores da Pol II não tem TATA box elemento de consenso Inr ou ambos Sequências adicionais em torno da TATA box e abaixo para a direita como desenhado do Inr podem ser reconhecidas por um ou mais fatores de transcrição Nelson6edbookindb 1065 Nelson6edbookindb 1065 030414 0748 030414 0748 1066 DAVID L NELSON MICHAEL M COX da RNApolimerase bacteriana Outra subunidade RBP2 é estruturalmente semelhante à subunidade bacteriana b e duas outras RBP3 e RBP11 exibem algum grau de homo logia estrutural em relação às duas subunidades a bacteria nas A Pol II deve funcionar com genomas mais complexos e com moléculas de DNA mais elaboradamente acondicio nadas do que nas bactérias A necessidade de contatos pro teínaproteína com os outros numerosos fatores proteicos necessários para navegar esse labirinto é responsável em grande medida pela complexidade adicional da polimerase de eucariontes A maior subunidade de Pol II RBP1 também tem uma característica incomum uma longa cauda de carboxila ter minal consistindo em várias repetições de uma sequência de consenso héptade de aminoácidos YSPTSPS Há 27 repetições na enzima de levedura 18 exatamente corres pondentes ao consenso e 52 21 exatos nas enzimas de camundongos e de humanos Esse domínio carboxiterminal CTD é separado do corpo principal da enzima por uma sequência ligadora inerentemente não estruturada A CTD tem vários papéis importantes na função da Pol II como destacado a seguir A RNApolimerase II requer uma série de outras proteí nas chamadas de fatores de transcrição a fim de formar o complexo de transcrição ativo Os fatores de transcri ção gerais necessários a cada promotor da Pol II fatores geralmente designados TFII com um identificador adicio nal são altamente conservados em todos os eucariontes Tabela 262 O processo de transcrição pela Pol II pode ser descrito em termos de várias fases montagem inicia ção alongamento terminação cada uma associada a pro teínas características Figura 269 A via passo a passo descrita a seguir leva à transcrição ativa in vitro Na célula várias das proteínas podem estar presentes em complexos maiores prémontados simplificando as vias para monta gem de promotores À medida que lê sobre esse processo consulte a Figura 269 e a Tabela 262 para ajudar a acom panhar os muitos participantes FIGURA 269 Transcrição nos promotores da RNApolimerase II a A reunião sequencial de TBP frequentemente com TFIIA TFIIB TFIIF mais Pol II TFIIE e TFIIH resulta em um complexo fechado No interior do comple xo o DNA é desenrolado na região Inr pela atividade de helicase do TFIIH e talvez do TFIIE criando um complexo aberto O domínio da terminação carboxila da maior subunidade de Pol II é fosforilado por TFIIH e a polime rase então escapa do promotor e começa a transcrição O alongamento é acompanhado pela liberação de vários fatores de transcrição e também é estimulado por fatores de alongamento ver Tabela 262 Após a termina ção a Pol II é liberada desfosforilada e reciclada b TBP humano ligado ao DNA é dobrado nesse complexo abrindo o sulco menor a fim de permitir ligações de hidrogênio específicas entre proteínas e o DNA PDB ID 1TGH c Uma visão em corte do alongamento da transcrição promovido pela enzima do núcleo da Pol II TABELA 262 Proteínas necessárias para iniciação da transcrição nos promotores da RNApolimerase II Pol II de eucariontes Proteína de transcrição Número de subunidades Subunidades Mr Funçãoões Iniciação Pol II 12 10000 220000 Catalisa a síntese de RNA TBP proteína ligadora do TATA 1 38000 Reconhece especificamente a TATA box TFIIA 3 12000 19000 35000 Estabiliza a ligação do TFIIB e TBP ao promotor TFIIB 1 35000 Ligase ao TBP recruta o complexo Pol IITFIIF TFIIE 2 34000 57000 Recruta o TFIIH tem atividades de ATPase e helicase TFIIF 2 30000 74000 Se liga fortemente à Pol II se liga à TFIIB e impe de a ligação da Pol II às sequências de DNA não específicas TFIIH 12 35000 89000 Desenrola o DNA no promotor atividade de helicase fosforila a Pol II no interior do CTD recruta proteínas de reparo de excisão de nucleo tídeos Alongamento ELL 1 80000 pTEFb 2 43000 124000 Fosforila a Pol II no interior do CTD SII TFIIS 1 38000 Elonguina SIII 3 15000 18000 110000 A função de todos os fatores de alongamento é a de suprimir a pausa ou interrupção da transcrição pelo complexo Pol IITFIIF Nome derivado da leucemia rica em lisina 1119 O gene para ELL é o local dos eventos de recombinação cromossomal frequentemente associados à leucemia mieloide aguda Nelson6edbookindb 1066 Nelson6edbookindb 1066 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1067 Complexo de préiniciação II fechado Complexo de iniciação aberto A transcrição começa Complexo de alongamento Complexo de terminação 230 TATA RNA Inr TFIIH TFIIH TFIIH Pol II b a DNA 59 39 TFIIA TFIIB TFIIF Pol II TFIIF TFIIE TFIIE TBP TBP eou TFIIA TBP TFIIE DNA desenrolado CTD Inr Inr TATA TATA 11 RNApolimerase II c Sítio ativo Mg2 NTPs DNA entrando a jusante DNA transcrito a montante Saída do RNA TFIIB P P P P P P RNA Fatores de alongamento Fatores de alongamento Fatores de terminação P P P P P P A Pol II é recrutada para o DNA por fatores de transcrição ❶ A bolha de transcrição se forma ❷ Fatores de alongamento se dissociam O CTD é desfosforilado à medida que a transcrição termina um processo facilitado por fatores de terminação ❺ O CTD é fosforilado durante a iniciação A polimerase escapa do promotor ❸ O alongamento da transcrição é auxiliado por fatores de alongamento depois que o TFIIE e o TFIIH se dissociam ❹ TATA Inr P P P P P P TATA Nelson6edbookindb 1067 Nelson6edbookindb 1067 030414 0748 030414 0748 1068 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Montagem da RNApolimerase e fatores de transcrição em um promo tor A formação de um complexo fechado se inicia quando a proteína de ligação TATA TBP se liga à TATA box Fi guras 269a etapa ➊ e 269b Nos promotores que não apresentam uma TATA box a TBP se faz presente como parte de um complexo multissubunidade chamado TFIID não mostrado na Figura 269 Os elementos de sequência que dirigem a ligação da TFIID nos promotores sem TATA são muito pouco conhecidos A TBP por sua vez é liga da pelo fator de transcrição TFIIB que também se liga ao DNA de qualquer lado da TBP A TFIIA se liga e junto com a TFIIB ajuda a estabilizar o complexo TBPDNA A TFIIB fornece uma ligação importante para a DNApolimerase II e o complexo TFIIBTBP é em seguida ligado por outro complexo consistindo na TFIIF e Pol II A TFIIF ajuda a ligar a Pol II aos seus promotores tanto pela interação com a TFIIB quanto reduzindo a ligação da polimerase a sítios inespecíficos no DNA Finalmente a TFIIE e a TFIIH se ligam para criar o complexo fechado A TFIIH tem múl tiplas subunidades e inclui uma atividade de helicase de DNA que promove o desenrolamento do DNA próximo do sítio de início do RNA um processo que requer a hidróli se de ATP criando assim um complexo aberto Figura 269a etapa ➋ Somando todas as subunidades dos vários fatores essenciais excluindo o TFIIA e algumas subuni dades de TFIID essa reunião ativa mínima tem mais de 30 polipeptídeos Estudos estruturais por Roger Kornberg e colaboradores forneceram uma visão mais detalhada da estrutura central da RNApolimerase II durante o alonga mento Figura 269c Iniciação da fita de RNA e distanciamento do promotor A TFIIH tem uma função adicional durante a fase de iniciação A ati vidade de cinase em uma de suas subunidades fosforila a Pol II em muitos locais no CTD Figura 269a Várias outras proteínas cinases incluindo a CDK9 cinase 9 dependente de ciclina que é parte do complexo pTEFb fator positivo b de alongamento de transcrição também fosforilam o CTD principalmente nos resíduos de Ser da sequência de repe tição do CTD Isso provoca uma mudança conformacional geral no complexo iniciando a transcrição A fosforilação do CTD também é importante durante a fase de alongamento subsequente com o estado de fosforilação do CTD mudan do à medida que a transcrição prossegue As mudanças afe tam as interações entre o complexo de transcrição e outras proteínas e enzimas de modo que diferentes conjuntos de proteínas são ligados na iniciação em vez de em estágios posteriores Algumas dessas proteínas estão envolvidas no processamento do transcrito como descrito a seguir Durante a síntese dos 60 a 70 nucleotídeos iniciais de RNA primeiro a TFIIE e então a TFIIH são liberadas e a Pol II entra na fase de alongamento da transcrição Alongamento terminação e liberação A TFIIF permanece associada à Pol II durante o alongamento Durante esse estágio a atividade da polimerase é bastante estimulada por proteínas chamadas de fatores de alongamento Ta bela 262 Os fatores de alongamento alguns ligados ao CTD fosforilado impedem a pausa durante a transcrição e também coordenam as interações entre complexos de pro teínas envolvidos no processamento póstranscricional de mRNA Uma vez que o transcrito de RNA esteja completo a transcrição é encerrrada A Pol II é desfosforilada e reci clada pronta para iniciar outro transcrito Figura 269a etapas ➌ a ➎ Regulação da atividade da RNApolimerase II A regulação da transcrição nos promotores da Pol II é muito elaborada Ela envolve a interação de uma grande variedade de outras proteínas com o complexo de préiniciação Algumas dessas proteínas regulatórias interagem com fatores de transcri ção outras com a própria Pol II A regulação da transcrição é descrita em mais detalhe no Capítulo 28 Diversas funções da TFIIH Em eucariontes o reparo de DNA danificado Tabela 255 é mais eficiente dentro de genes que estão sendo transcritos ativamente do que em outros DNA danificados e a fitamolde é reparada de maneira mais eficiente do que a fita não molde Essas observações im pressionantes são explicadas pelos papéis alternativos das subunidades TFIIH A TFIIH não só participa na formação do complexo fechado durante a montagem de um complexo de transcrição como descrito anteriormente mas algu mas de suas unidades são também componentes essenciais do complexo de reparo separado de excisão de nucleotí deos ver Figura 2525 Quando a transcrição da Pol II para no local de uma lesão de DNA a TFIIH pode interagir com a lesão e recrutar todo o complexo de reparo de excisão de nucleotí deos A perda genética de certas subunidades TFIIH pode produzir doenças humanas Alguns exemplos são o xero derma pigmentoso ver Quadro 251 e a síndrome de Co ckayne caracterizada por interrupção do crescimento fo tossensibilidade e distúrbios neurológicos A RNApolimerase DNAdependente sofre inibição seletiva O alongamento das fitas de DNA pela RNApolimerase tan to em bactérias quanto em eucariontes é inibido pelo anti biótico actinomicina D Figura 2610 A porção planar dessa molécula se insere intercala no DNA de dupla hélice entre pares de bases GKC sucessivos deformando o DNA Isso impede o movimento da polimerase ao longo do molde Como a actinomicina D inibe o alongamento de RNA em células intactas bem como em extratos celulares ela é usada para identificar processos celulares que dependem da síntese de RNA A acridina inibe a síntese de RNA de modo semelhante A rifampicina inibe a síntese bacteriana de RNA ao se ligar à subunidade b das RNApolimerases bacterianas im pedindo a etapa da transcrição de distanciamento do promo tor Figura 266 Algumas vezes é usada como antibiótico O cogumelo Amanita phalloides tem um mecanismo de defesa muito eficiente contra predadores Ele produz aamanitina que interrompe a formação de mRNA nas cé lulas animais ao bloquear a Pol II e em concentrações mais altas a Pol III Nem a Pol I nem a RNApolimerase bacteria Nelson6edbookindb 1068 Nelson6edbookindb 1068 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1069 na é sensível à aamanitina nem o é a RNApolimerase II do próprio A phalloides RESUMO 261 Síntese de RNA dependente de DNA c A transcrição é catalisada por RNApolimerases depen dentes de DNA que usam ribonucleosídeo 59trifosfatos para sintetizar RNA complementar à fitamolde do DNA duplex A transcrição ocorre em várias fases ligação da RNApolimerase a um sítio de DNA chamado promotor iniciação da síntese do transcrito alongamento e termi nação c A RNApolimerase bacteriana precisa de uma subunida de especial para reconhecer o promotor Como primeiro passo envolvido na transcrição a ligação da RNApoli merase ao promotor e a iniciação da transcrição são in timamente regulados A transcrição para em sequências chamadas terminadores c As células eucarióticas têm três tipos de RNApolime rases A ligação da RNApolimerase II aos seus promo tores precisa de um conjunto de proteínas chamadas de fatores de transcrição Os fatores de alongamento par ticipam na fase de alongamento da transcrição A maior subunidade de Pol II tem um longo domínio carboxil terminal que é fosforilado durante as fases de iniciação e alongamento 262 Processamento de RNA Muitas das moléculas de RNA em bactérias e praticamente todas as moléculas de RNA em eucariontes são processadas em algum grau após a síntese Alguns dos eventos molecula res mais interessantes no metabolismo de RNA ocorrem du rante esse processamento póssíntese De modo intrigante várias das enzimas que catalisam essas reações consistem em RNA em vez de proteína A descoberta desses RNAs catalíti cos ou ribozimas trouxe uma revolução no pensamento a respeito da função do RNA e acerca da origem da vida Uma molécula de RNA recémsintetizada é chamada de um transcrito primário Talvez o mais extenso processa mento de transcritos primários ocorra nos mRNA de euca riontes e em tRNA tanto de bactérias quanto de eucarion tes Os RNAs de função especial também são processados O transcrito primário para um mRNA eucarionte geral mente contém sequências envolvendo um gene embora as sequências codificando o polipeptídeo possam não ser contíguas Trechos não codificantes que interrompem a região codificadora do transcrito são chamados íntrons e os segmentos codificadores são chamados de éxons ver discussão de íntrons e éxons no DNA no Capítulo 24 Em um processo chamado splicing de RNA os íntrons são removidos do transcrito primário e os éxons são ligados para formar uma sequência contínua que especifica um po lipeptídeo funcional Os mRNAs de eucariontes também são modificados em cada extremidade Um resíduo modificado chamado de quepe 59 é adicionado à extremidade 59 A ex tremidade 39 é clivada e 80 a 250 resíduos A são adiciona dos para criar uma cauda poliA Os complexos proteicos algumas vezes elaborados que executam cada uma dessas três reações de processamento de mRNA não operam in dependentemente Eles parecem ser organizados em asso ciação uns com os outros e com o CTD fosforilado da Pol II cada complexo afeta a função dos outros As proteínas en volvidas no transporte de mRNA para o citoplasma também são associadas ao mRNA no núcleo e o processamento do transcrito é acoplado ao seu transporte De fato um mRNA eucarionte à medida que é sintetizado é codificado em um complexo elaborado envolvendo dúzias de proteínas FIGURA 2610 Actinomicina D e acridina inibidores da transcri ção do DNA a A porção sombre ada da actinomicina D é planar e se intercala entre dois pares de bases sucessivos GC em um DNA du plex As duas unidades de peptídeos cíclicos da actinomicina D se ligam ao sulco menor da duplahélice Sar cosina Sar é Nmetilglicina meVal é metilvalina A acridina também atua por intercalação no DNA b Um complexo de actinomicina D com DNA PDB ID 1DSC O esqueleto de DNA é mostrado em azul as bases são brancas a parte intercalada da actinomicina sombreada em a é cor de laranja e o resto da actino micina está em vermelho O DNA é curvado como resultado da ligação da actinomicina Sar LmeVal LPro DVal LThr O C N NH2 Actinomicina D 1 Acridina N H O O C Sar LmeVal LPro DVal LThr O CH3 CH3 O O b a Nelson6edbookindb 1069 Nelson6edbookindb 1069 030414 0748 030414 0748 1070 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A composição do complexo varia à medida que o transcri to primário é processado transportado para o citoplasma e entregue ao ribossomo para tradução As proteínas asso ciadas modulam todos os aspectos da função e destino do mRNA Esses processos são destacados na Figura 2611 e descritos em mais detalhe a seguir Os transcritos primários dos tRNAs bacteriano e de eu cariontes são processados pela remoção de sequências de cada extremidade clivagem e em alguns poucos casos pela remoção dos íntrons splicing Muitas bases e açú cares em tRNAs também são modificados tRNAs maduros são repletos de bases incomuns não encontradas em outros ácidos nucleicos ver Figura 2622 Muitos dos RNA de função especial também passam por processamento elabo rado frequentemente envolvendo a remoção de segmentos de uma ou ambas extremidades O destino final de qualquer RNA é sua completa e con trolada degradação A taxa de reposição dos RNA desempe nha um papel crítico na determinação dos seus níveis esta cionários e a taxa na qual as células podem interromper a expressão de um gene cujo produto não é mais necessário Durante o desenvolvimento de organismos multicelulares por exemplo certas proteínas devem ser expressas apenas em um estágio e o mRNA que codifica tal proteína deve ser produzido e destruído nos tempos adequados Os mRNAs de eucariontes recebem um quepe na extremidade 59 A maioria dos mRNAs de eucariontes tem um quepe 59 um resíduo de 7metilguanosina ligado ao resíduo do terminal 59 do mRNA por meio de uma rara ligação trifosfato 5959trifos fato Figura 2612 O quepe 59 ajuda a proteger o mRNA das ribonucleases Ele também se liga a um complexo de pro teínas ligadoras de quepe específico e participa da ligação do mRNA ao ribossomo para iniciar a tradução Capítulo 27 O quepe 59 é formado pela condensação de uma molécu la de GTP com o trifosfato na extremidade 59 do transcrito Em seguida a guanina é metilada no N7 e grupos metil adicionais são frequentemente adicionados às hidroxilas 29 do primeiro e segundo nucleotídeos adjacentes ao quepe Figura 2612a Os grupos metil são derivados da Sade nosilmetionina Todas essas reações ocorrem logo no iní cio da transcrição após a adição dos primeiros 20 a 30 nu cleotídeos do transcrito Todas as três enzimas de adição do quepe e por meio delas a extremidade 59 do próprio transcrito são associadas ao CTD da RNApolimerase II até que o quepe seja sintetizado A extremidade 59 com quepe é então liberada das enzimas de adição do quepe e ligada pelo complexo ligador de quepe Figura 2612c Tanto íntrons quanto éxons são transcritos de DNA para RNA Em bactérias uma cadeia polipeptídica é geralmente codifica da por uma sequência de DNA que é colinear com a sequência de aminoácido continuando ao longo do molde de DNA sem interrupção até que a informação necessária para especificar o polipeptídeo seja completa Entretanto a noção de que to dos os genes sejam contínuos foi desmentida em 1977 quando Phillip Sharp e Richard Roberts descobriram independente mente que muitos genes para polipeptídeos em eucariontes são interrompidos por sequências não codificadoras íntrons A grande maioria dos genes em vertebrados contém íntrons entre as poucas exceções estão aqueles que co dificam histonas A ocorrência de íntrons em outros euca riontes varia Muitos genes na levedura Saccharomyces cerevisiae não apresentam íntrons embora em algumas outras espécies de leveduras os íntrons sejam mais comuns Os íntrons também são encontrados em alguns poucos ge nes bacterianos e de arqueobactérias Os íntrons do DNA são transcritos junto com o resto do gene pelas RNApoli merases Os íntrons no transcrito de RNA primário sofrem splicing e os éxons são então ligados para formar um RNA maduro funcional Em mRNA de eucariontes a maioria dos éxons tem menos de 1000 nucleotídeos de comprimento com vários na faixa de tamanho de 100 a 200 nucleotídeos codificando trechos de 30 a 60 aminoácidos no interior de um polipeptídeo mais longo Os íntrons variam de tamanho de 50 a 20000 nucleotídeos Os genes dos eucariontes su periores incluindo humanos têm caracteristicamente mui to mais DNA destinado a íntrons do que a éxons Muitos genes têm íntrons alguns têm dúzias deles O RNA catalisa o splicing de íntrons Há quatro classes de íntrons As primeiras duas os íntrons do grupo I e do grupo II diferem em detalhes dos seus me canismos de splicing mas compartilham uma caracterís tica surpreendente eles sofrem autosplicing nenhuma enzima proteica está envolvida Os íntrons do grupo I são Conclusão do transcrito primário 59 39 Transcrito primário Clivagem poliadenilação e splicing 59 AAAAn 39 mRNA maduro 59 DNA Éxon Quepe 59 Sequência terminal não codificadora Íntron Transcrição e adição do quepe 59 FIGURA 2611 Formação do transcrito primário e seu processamento durante a maturação do mRNA em uma célula eucarionte O quepe 59 vermelho é adicionado antes que a síntese do transcrito primário esteja completa Uma sequência terminal não codificadora íntron é mostrada em cor de laranja após o último éxon O splicing pode ocorrer tanto antes quan to depois das etapas de clivagem e poliadenilação Todos os processos aqui mostrados ocorrem no núcleo Nelson6edbookindb 1070 Nelson6edbookindb 1070 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1071 encontrados em alguns genes nucleares mitocondriais e de cloroplastos que codificam rRNAs mRNAs e tRNAs Ín trons do grupo II são geralmente encontrados em transcri tos primários de mRNAs mitocondriais ou de cloroplastos em fungos algas e plantas Os íntrons do grupo I e grupo II também são encontrados entre os raros exemplos de ín trons em bactérias Nenhuma das classes precisa de um cofator de alta energia tal como o ATP para o splicing Os mecanismos de splicing em ambos os grupos envol vem duas etapas de reações de transesterificação Figura 2613 em que um grupo ribose 29 ou 39hidroxila faz um ataque nucleofílico em um fósforo e uma nova ligação fos fodiéster é formada às custas da antiga mantendo o equi líbrio de energia Essas reações são muito semelhantes às reações de quebra e religação do DNA promovidas pelas topoisomerases ver Figura 2420 e recombinases sítio específicas ver Figura 2537 A reação de splicing do grupo I precisa de um nucleo sídeo guanina ou de um cofator nucleotídeo mas o cofator não é usado como uma fonte de energia em vez disso o grupo 39hidroxila da guanosina é usado como um nucle ófilo na primeira etapa da via do splicing O grupo 39hi droxila da guanosina forma uma ligação 3959fosfodiéster normal com a extremidade 59 do íntron Figura 2614 A 39hidroxila do éxon que é deslocada nessa etapa age então como um nucleófilo em uma reação semelhante na extre midade 39 do íntron O resultado é a remoção precisa do íntron e ligação dos éxons Nos íntrons do grupo II o padrão de reação é semelhan te exceto pelo nucleófilo na primeira etapa que nesse caso é o grupo 29hidroxila de um resíduo A dentro do íntron Figura 2615 Uma estrutura em laço ramificado é for mada como um intermediário Íntrons que sofrem autosplicing foram descobertos pela primeira vez em 1982 em estudos do mecanismo de splicing do íntron do grupo I do rRNA do protozoário ci liado Tetrahymena thermophila realizado por Thomas Cech e colaboradores Esses pesquisadores transcreveram 7Metilguanosina Base Algumas vezes metilado Ligação 5959 trifosfato Base Algumas vezes metilado Extremidade 59 do RNA com quepe Extremidade 59 do RNA com grupo trifosfato Fosfohidrolase Guanililtransferase Guanina7 metiltransferase 29Ometiltransferase Enzima sintetizadora do quepe Quepe FIGURA 2612 O quepe 59 do mRNA a A 7metilguanosina m 7G é liga da à extremidade 59 de quase todos os mRNAs de eucariontes em uma ligação incomum 5959trifosfato Os grupos metil cor salmão são frequentemente encontrados na posição 29 do primeiro e segundo nucleotídeos Os RNAs em células de leveduras não apresentam os grupos metil 29 O grupo metil 29 no segundo nucleotídeo é geralmente encontrado apenas em RNA de células de vertebrados b A produção do quepe 59 envolve quatro a cinco etapas sepa radas adoHcy é Sadenosilhomocisteína c A síntese do quepe é feita por enzimas presas ao CTD da Pol lI O quepe permanece preso ao CTD por meio de uma associação com o complexo de ligação do quepe CBC Nelson6edbookindb 1071 Nelson6edbookindb 1071 030414 0748 030414 0748 1072 DAVID L NELSON MICHAEL M COX o DNA isolado de Tetrahyme na incluindo o íntron in vi tro usando a RNApolimerase bacteriana purificada O RNA resultante sofreu autosplicing de modo preciso sem quaisquer proteínas enzimáticas da Te trahymena A descoberta de que os RNA poderiam ter fun ções catalíticas foi um marco histórico na nossa compreensão dos sistemas biológicos A maioria dos íntrons não sofre autosplicing e esses tipos não são designados com um número de grupo A ter ceira e maior classe de íntrons inclui aqueles encontrados nos transcritos primários de mRNA nuclear São chamados de íntrons do spliceossomo pois sua remoção é catalisa da por um grande complexo proteico chamado spliceosso mo e ocorre no seu interior Dentro do spliceossomo os íntrons sofrem splicing pelo mesmo mecanismo formador de laço que os íntrons do grupo II O spliceossomo é com posto por complexos de RNAproteínas especializados pe quenas ribonucleoproteínas nucleares snRNP frequente mente pronunciada snurp Cada snRNP contém uma FIGURA 2613 Reação de transesteri ficação É mostrada aqui a primeira etapa do splicing de duas etapas dos íntrons do grupo I Nesse exemplo a OH 39 de uma molécula de guanosina atua como um nucleófilo atacando a ligação fosfodiéster entre os resíduos U e A em uma junção éxoníntron de uma molécula de mRNA ver Figura 2614 O OH P A G 39 O O O OH O O U OH O 59 Íntron Éxon Guanosina O OH P A G 39 O O OH O OH O O U OH O O 59 OH O 1 FIGURA 2614 Mecanismo de splicing de íntrons do grupo I O nucleófilo na primeira etapa pode ser a guanosina GMP GDP ou GTP O íntron que sofre splicing acaba degradado UpU pA pG U OH pU G pU G pA pG Transcrito primário A 39 OH da guanosina atua como um nucleófilo atacando o fosfato no sítio de splicing 59 Intermediário A 39 OH do éxon 59 se torna o nucleófilo completando a reação RNA após splicing Éxon 59 Éxon 39 5 5 5 5 3 3 3 3 Íntron UpA OH pG GOH Thomas Cech Nelson6edbookindb 1072 Nelson6edbookindb 1072 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1073 classe de RNA eucarionte de 100 a 200 nucleotídeos de comprimento conhecida como RNAs nucleares peque nos snRNA Cinco snRNA U1 U2 U4 U5 e U6 envolvi dos nas reações de splicing são geralmente encontrados em abundância nos núcleos de eucariontes Os RNA e as proteínas nos snRNP são altamente conservados em euca riontes de leveduras a humanos Splicing do mRNA Os íntrons do spliceossomo geralmente têm a sequên cia de dinucleotídeos GU na extremidade 59 e AG na extre midade 39 e essas sequências marcam os sítios em que o splicing ocorre O snRNA U1 contém uma sequência com plementar às sequências próximas do sítio de splice 59 dos íntrons do mRNA nuclear Figura 2616a e snRNP U1 se liga à essa região no transcrito primário A adição dos snRNP U2 U4 U5 e U6 leva à formação do spliceossomo Figura 2616b Os snRNP juntos contribuem com cinco RNA e cerca de 50 proteínas para o núcleo do spliceos somo uma reunião supramolecular quase tão complexa quanto o ribossomo descrita no Capítulo 27 Talvez 50 proteínas adicionais sejam associadas ao spliceossomo em diferentes estágios no processo de splicing com algumas dessas proteínas tendo múltiplas funções no splicing transporte de mRNA para o citoplasma tradução e na de gradação final do mRNA O ATP é necessário para a mon tagem do spliceossomo mas as reações de clivagemliga ção do RNA não parecem precisar de ATP Alguns íntrons de mRNA sofrem splicing por um tipo menos comum de spliceossomo no qual os snRNP U1 e U2 são substituídos pelos snRNP U11 e U12 Enquanto os spliceossomos con tendo U1 e U2 removem íntrons com sequências terminais 59GU e AG39 como mostrado na Figura 2616 os spli ceossomos que contêm U11 e U12 removem um tipo raro de íntrons que têm sequências terminais 59AU e AC39 para marcar os sítios de splice nos íntrons Os spliceosso mos usados no splicing do RNA nuclear podem ter evo luído de íntrons de grupo II mais antigos com os snRNP substituindo os domínios catalíticos dos seus ancestrais que sofrem autosplicing Alguns dos componentes do aparato de splicing estão presos ao CTD da RNApolimerase II indicando que o spli cing como outras reações de processamento de RNA é fortemente coordenado com a transcrição Figura 2616c Assim que a primeira junção splice é sintetizada ela é liga da por um spliceossomo preso A segunda junção splice é então capturada por esse complexo à medida que ela passa facilitando a justaposição das extremidades do íntron e o processo de splicing subsequente Após o splicing o ín tron permanece no núcleo e é depois degradado FIGURA 2615 O mecanismo de splicing dos íntrons do grupo II A química é semelhante àquela do splicing dos íntrons do grupo I exceto pela identidade do nucleó filo na primeira etapa e formação de um intermediário em laço em que um ramo é uma ligação fosfodiéster 2959 59 UpG 39 pU p C p A p A OH A 29 OH de uma adenosina específica no íntron atua como nucleófilo atacando o sítio de splicing 59 para formar uma estrutura em laço 59 A adenosina na estrutura em laço tem três ligações fosfodiéster U OH 39 pU Intermediário Transcrito primário Íntron A 39 OH do éxon 59 atua como nucleófilo completando a reação 59 UpU 39 RNA que sofreu splicing p A OH39 C A G A Para a extremidade 39 Ligação fosfodiéster 2959 GpApC p A G p A p C Nelson6edbookindb 1073 Nelson6edbookindb 1073 030414 0748 030414 0748 Pol II U C C A C A U A A c G A c G U A Éxon 59 39 59 Éxon 39 G G U A G G U U A C U A C A U1 U2 c c 59 39 A 59 39 A U1 U2 59 39 U5 U2 U1 U4U6 A Spliceossomo inativo 59 39 U5 U2 U6 A Spliceossomo ativo 59 39 59 39 U5 U2 U6 OH U5 U2 U6 Liberação do íntron Formação do laço ATP ADP 1 Pi ATP ADP 1 Pi ATP ADP 1 Pi U1 snRNP U2 snRNP U4U6 1 U5 U1 U4 G U A G G U A G G U A G G U G U A G A G A G A G A U G A U G Spliceossomo CTD CBC Íntron que sofreu splicing a b c Quepe FIGURA 2616 Mecanismo de splicing nos transcritos do mRNA pri mário a Interações de pareamento do RNA na montagem dos com plexos de spliceossomos O snRNA U1 tem uma sequência próxima de sua extremidade 59 que é complementar ao sítio de splicing na extremidade 59 do íntron O pareamento de bases do U1 com essa região ajuda a definir o sítio de splicing 59 durante a formação do spliceossomo c é a pseudouridina ver Figura 2622 O U2 é pareado ao íntron em uma posição que envolve o resíduo A sombreado em cor salmão que se torna o nucleófilo durante a reação de splicing O pareamento de bases do snRNA U2 provoca a formação de uma protuberância que desloca e ajuda a ativar o adenilato cuja 29 OH formará a estrutura em laço por meio de ligação fosfodiéster 2959 b Montagem dos spliceossomos Os snRNP U1 e U2 se ligam en tão os snRNP restantes complexo U4U6 e U5 se ligam para formar um spliceossomo inativo Os rearranjos internos convertem essa espécie em um spliceossomo ativo no qual U1 e U4 foram expulsos e U6 está pareado tanto com o sítio de splicing 59 quanto com U2 Em seguida ocorrem as etapas catalíticas que são semelhantes àquelas do splicing dos íntrons do grupo II ver Figura 2615 c A coordenação do splicing e a transcrição fazem os dois sites de splicing ficarem juntos Mais detalhes no texto O spliceossomo é muito maior do que indicado aqui Nelson6edbookindb 1074 Nelson6edbookindb 1074 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1075 A quarta classe de íntrons encontrada em certos tRNA se distingue dos íntrons dos grupos I e II pelo fato da rea ção de splicing precisar de ATP e de uma endonuclease A endonuclease de splicing cliva as ligações fosfodiéster em ambas as extremidades do íntron e os dois éxons são liga dos por um mecanismo semelhante à reação da DNAligase ver Figura 2516 Embora os íntrons do spliceossomo pareçam ser limi tados a eucariontes as outras classes de íntrons não o são Genes com íntrons dos grupos I e II foram agora encontra dos tanto em bactérias quanto em vírus bacterianos O bac teriófago T4 por exemplo tem vários genes codificadores de proteínas com íntrons do grupo I Os íntrons podem ser mais comuns em arqueobactérias do que em bactérias Os mRNA de eucariontes tem uma estrutura da extremidade 39 característica Na sua extremidade 39 a maioria dos mRNAs eucarióticos tem um filamento de 80 a 250 resíduos A que perfazem a cauda poliA Essa cauda serve como um sítio de ligação para uma ou mais proteínas específicas A cauda poliA e suas proteínas associadas provavelmente ajudam a proteger o mRNA de destruição enzimática Muitos mRNAs bacte rianos também adquirem caudas poliA mas essas caudas estimulam a destruição do mRNA em vez de protegêlo da degradação A cauda de poliA é adicionada em um processo de várias etapas O transcrito se estende além do local em que a cauda de poliA deve ser adicionada é clivado no local de adição da poliA por um componente de endo nuclease de um grande complexo enzimático novamente associado ao CTD da RNApolimerase II Figura 2617 O local do mRNA em que a clivagem ocorre é marcado por dois elementos de sequência a sequência altamente conservada 59AAUAAA39 de 10 a 30 nucleotídeos no lado 59 a montante do sítio de clivagem e uma sequên cia menos bem definida rica em resíduos de G e U de 20 a 40 nucleotídeos abaixo do local da clivagem A clivagem gera o grupo livre 39hidroxila que define a extremidade do mRNA à qual os resíduos A são imediatamente adi cionados pela polimerase poliadenilada que catalisa a reação RNA 1 nATP RNA AMPn 1 nPPi em que n 5 80 a 250 Essa enzima não precisa de um molde mas exige o mRNA clivado como um iniciador O processamento geral de um típico mRNA eucarionte é resumido na Figura 2618 Em alguns casos a região codificadora de polipeptídeos do mRNA também é modi ficada pela editoração do RNA mais detalhes na Seção 271 Essa editoração inclui processos que adicionam ou excluem bases nas regiões codificadoras dos transcritos primários ou que mudam a sequência p ex pela desami nação enzimática de um resíduo C para criar um resíduo U Um exemplo particularmente drástico ocorre em tripa nossomas que são protozoários parasitas grandes regiões de um mRNA são sintetizadas sem qualquer uridilato e os resíduos U são inseridos posteriormente por editoração do RNA Um gene pode dar origem a múltiplos produtos por meio do processamento diferencial do RNA Um dos paradoxos da genômica moderna é que a comple xidade aparente dos organismos não se correlaciona com o número de genes codificadores de proteínas ou mesmo com a quantidade de DNA genômico Entretanto o foco tradi cional em genes codificadores de proteínas ignora a com plexidade do transcriptoma de um organismo À medida que as funções do RNA são melhor compreendidas novas complexidades genômicas se tornam aparentes Alguns transcritos de mRNA de eucariontes produzem apenas um mRNA maduro e um polipeptídeo correspon dente mas outros podem ser processados de mais de uma maneira para produzir diferentes mRNAs e portanto dife rentes polipeptídeos O transcrito primário contém sinais moleculares para todas as vias de processamento alterna tivo e a via favorecida em uma célula é determinada por fatores de processamento proteínas ligadoras de RNA que promovem uma via particular ❶ ❷ Direção de transcrição Fatores de poliadenilação OH39 59 59 Pol II AAUAAA Endonuclease Poliadenilatopolimerase TTATTT AAUAAA AAAAnOH39 AAUAAA ATP PPi FIGURA 2617 Adição da cauda de poliA ao transcrito do RNA pri mário de eucariontes A Pol II sintetiza RNA além do segmento do trans crito contendo as sequências de sinalização de clivagem incluindo a alta mente conservada sequência a montante 59AAUAAA Essa sequência de sinalização de clivagem está ligada por um complexo enzimático que inclui uma endonuclease uma poliadenilatopolimerase e várias outras proteínas multisubunidades envolvidas no reconhecimento de sequências estimula ção da clivagem e regulação do comprimento da cauda de poliA todos ligados ao CTD ➊ O RNA é clivado pela endonuclease em um ponto 10 a 30 nucleotídeos 39 para baixo da sequência AAUAAA ➋ A poliadenilato polimerase sintetiza uma cauda poliA de 80 a 250 nucleotídeos de compri mento começando no sítio de clivagem Nelson6edbookindb 1075 Nelson6edbookindb 1075 030414 0748 030414 0748 1076 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Transcritos complexos podem ter ou mais de um sítio de clivagem e poliadenilação ou padrões de splicing alter nativos ou ambos Se há dois ou mais sítios de clivagem e poliadenilação o uso daquele mais próximo da extremida de 59 irá remover mais da sequência do transcrito primário Figura 2619a Esse mecanismo chamado de escolha do sítio de poliA produz diversidade nos domínios variáveis das cadeias pesadas da imunoglobulina ver Figura 2542 Padrões de splicing alternativos Figura 2619b produ zem a partir de um transcrito primário comum três for mas diferentes da cadeia pesada da miosina em diferentes estágios do desenvolvimento da moscadafruta Os dois Gene da ovalbumina Transcrição e adição do quepe 59 Splicing clivagem e poliadenilação RNA extra Sete íntrons mRNA maduro Transcrito primário DNA 59 39 RNA extra Quepe 1 2 3 7 4 5 6 L 1872 Nucleotídeos 5 6 7 7700 pb 1 2 3 4 L A B C D E F G 5 6 7 1 2 3 4 L A B C D E F G AAAAn FIGURA 2618 Visão geral do processamento de um mRNA eucarion te O gene da ovalbumina mostrado aqui tem íntrons A a G e éxons 1 a 7 e L o L codifica uma sequência de peptídeo sinalizador que tem como alvo a proteína de exportação da célula ver Figura 2738 Cerca de três quartos do RNA são removidos durante o processamento A Pol II estende o transcrito primário bem além da clivagem e do sítio de poliadenilação RNA extra antes de terminar a transcrição Os sinais de terminação para a Pol II ainda não foram definidos Sítio poliA Clivagem e poliadenilação AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn Sítio de splice 59 Sítio de splice 39 DNA Quepe DNA Transcrito primário Quepe Transcrito primário Sítios poliA A1 A2 A1 A2 mRNA maduro Clivagem e poliadenilação em A1 Clivagem e poliadenilação em A2 a mRNA maduro b Splicing FIGURA 2619 Dois mecanismos para o processamento alternativo dos transcritos complexos em eucariontes a Padrões de clivagem alternativa e poliadenilação Dois sítios poliA A1 e A2 são mostrados b Pa drões de splicing alternativo Dois sítios 39 diferentes de splicing são mostra dos Em ambos os mecanismos mRNA maduros diferentes são produzidos a partir do mesmo transcrito primário Nelson6edbookindb 1076 Nelson6edbookindb 1076 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1077 mecanismos ocorrem quando um único transcrito de RNA é processado de modo diferente para produzir dois hormô nios diferentes o hormônio regulador de cálcio calcitonina na tireoide de ratos e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina CGRP no cérebro do rato Figura 2620 Há vários padrões adicionais de splicing alternativo Figura 2621 Muitos talvez a maioria dos genes nos genomas de mamíferos estão sujeitos a splicing alternativo aumen tando substancialmente o número de proteínas codificadas pelos genes Os mesmos processos desempenham um papel bem menor nos eucariontes inferiores com apenas alguns poucos genes sujeitos a splicing alternativo nas leveduras RNA ribossomais e tRNAs também sofrem processamento O processamento póstranscricional não é limitado ao mRNA Os RNAs ribossomais de bactérias arqueobacté rias e células eucariontes são feitos de precursores maiores chamados de RNAs préribossomais ou prérRNAs Os RNAs transportadores são do mesmo modo derivados de precursores maiores Estes RNAs também podem contar vários nucleosídeos modificados alguns exemplos sendo mostrados na Figura 2622 RNAs ribossomais Em bactérias rRNAs 16S 23S e 5S e alguns tRNAs embora a maioria deles seja codificada em FIGURA 2620 Processamento alternativo do transcrito do gene da calcitonina em ratos O transcrito primário tem dois sítios poliA um pre domina no cérebro o outro na tireoide No cérebro o splicing elimina o éxon da calcitonina éxon 4 na tireoide este éxon é mantido Os peptídeos resultan tes são processados adicionalmente para fornecer os produtos hormonais finais peptídeo relacionado ao gene da calcitonina CGRP no cérebro e calcito nina na tireoide Éxon Íntron 1 2 3 Calcitonina CGRP 6 Sítio poliA Sítio poliA Clivagem e poliadenilação Clivagem e poliadenilação Transcrito primário 6 AAAAn Cérebro Tireoide 5 4 3 2 1 AAAAn 3 4 2 1 AAAAn 3 4 2 1 mRNA maduro AAAAn 3 5 2 1 mRNA maduro Splicing Splicing Tradução Tradução 6 Ação da protease Ação da protease Calcitonina CGRP 4 5 FIGURA 2621 Resumo dos padrões de splicing Os éxons são mostra dos em tons de verde e íntronsregiões não traduzidas como linhas ama relas Posições em que a poliadenosina será adicionada são marcadas com asteriscos Os éxons ligados em um esquema de splicing particular são li gados com linhas pretas Os padrões alternativos de ligação acima e abaixo do transcrito levam a produtos de mRNA resultantes de splicing superiores e inferiores respectivamente Nos produtos caixas vermelhas e alaranjadas representam as regiões de quepe 59 e 39 não traduzidas respectivamente AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn Éxon alternativo Sítios de splicing alternativo 59 Sítios de splicing alternativo 39 Retenção de íntron Éxon alternativo mutuamente exclusivo Promotor alternativo e primeiro éxon 1 2 2 1 Sítio poliA alternativo e éxon terminal Nelson6edbookindb 1077 Nelson6edbookindb 1077 030414 0748 030414 0748 1078 DAVID L NELSON MICHAEL M COX outro lugar surgem a partir de um único precursor de RNA 30S de cerca de 6500 nucleotídeos São removidos durante o processamento RNA de ambas as extremidades do precursor 30S e segmentos encontrados entre os rRNAs Figura 2623 Os rRNAs 16S e 23S contêm nucleosídeos modificados Em E coli as 11 modificações no rRNA 16S incluem uma pseudopurina e 10 nucleosídeos metilados na base no grupo 29hidroxila ou em ambos O rRNA 23S tem 10 pseudopurinas 1 dihidrouridina e 12 nucleosídeos me tilados Em bactérias cada modificação é geralmente cata lisada por uma enzima diferente As reações de metilação usam a Sadenosilmetionina como cofator Nenhum cofator é necessário para a formação de pseudouridina O genoma da E coli codifica sete moléculas prérRNA Todos esses genes são essencialmente regiões codificado ras idênticas de rRNA mas diferem nos segmentos entre essas regiões O segmento entre os genes de rRNA 16S e 23S geralmente codificam um ou dois tRNA com diferen tes tRNA produzidos a partir de diferentes transcritos de prérRNA As sequências de codificação para tRNA também são encontradas no lado 39 do rRNA 5S em alguns transcri tos precursores A situação em eucariontes é mais complicada Um transcrito do prérRNA 45S é sintetizado pela RNApoli merase I e processado no nucléolo para formar os rRNA 18S 28S e 58S característicos dos ribossomos de euca Dihidrouridina D Pseudouridina c Ribotimidina T N6Isopenteniladenosina i6A 4Tiouridina S4U Inosina I 1Metilguanosina m1G FIGURA 2622 Algumas bases modificadas de rRNA e tRNA produ zidas em reações póstranscricionais Os símbolos padrão são mostra dos entre parênteses Observe o ponto de ligação incomum da ribose na pseudouridina Isso é apenas uma pequena amostragem dos 96 nucleosí deos modificados que ocorrem em diferentes espécies de RNA com 81 tipos diferentes conhecidos em tRNA e 30 observados até agora em rRNA Uma lista completa dessas bases modificadas pode ser encontrada no banco de dados de modificação do RNA httprnamdbcasalbanyeduRNAmods FIGURA 2623 Processamento dos transcritos de prérRNA em bactérias ➊ Antes da clivagem o precursor do RNA 30S é metilado em bases específicas marcas de escala corderosa e alguns resíduos de uridina são convertidos em pseudouridina marcas de escala azuis ou resíduos de dihidrouridina marcas de escala pretas As reações de metilação são de múltiplos tipos alguns ocorrendo em bases e alguns em grupos 29hidroxila ➋ A clivagem libera precursores de rRNAs e tRNAs A clivagem nos pontos marcados 1 2 e 3 é reali zada pelas enzimas RNase III RNase P e RNase E respec tivamente Como discutido posteriormente no texto a RNase P é uma ribozima ➌ Os produtos finais rRNA 16S rRNA 23S e rRNA 5S resultam da ação de uma variedade de nucleases específicas As sete cópias do gene para o prérRNA no cromossomo da E coli diferem em número localização e identidade dos tRNAs incluídos no transcri to primário Algumas cópias do gene têm segmentos de genes de tRNAs adicionais entre os segmentos de rRNA 16S e 23S e na extremidade 39 do transcrito primário Intermediários RNAs maduros Transcrito de préRNA 30S 16S tRNA 4S 23S 5S Metilação e pseudouridina ou conversão de dihidrouridina Clivagem Nucleases 17S 25S Nucleases tRNA tRNA 16S rRNA 23S rRNA 5S rRNA 5S 1 1 2 3 1 1 3 Nelson6edbookindb 1078 Nelson6edbookindb 1078 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1079 riontes Figura 2624 Como nas bactérias o processa mento inclui reações de clivagem mediadas por endo ou exorribonucleases e reações de modificação de nucleo sídeos Alguns préRNAs também incluem íntrons que devem sofrer splicing Todo o processo é iniciado no nu cléolo em grandes complexos que se reúnem no precursor de rRNA à medida que ele é sintetizado pela Pol I Há uma forte ligação entre a transcrição de rRNA maturação de rRNA e montagem do ribossomo no nucléolo Cada com plexo inclui as ribonucleases que clivam o precursor de rRNA as enzimas que clivam bases específicas e grande número de RNA nucleolares pequenos ou snoRNA que guiam a modificação de nucleosídeos e algumas rea ções de clivagem e proteínas ribossomais Em leveduras todo o processo envolve o prérRNA mais de 170 proteí nas não ribossomais um conjunto de snoRNA para cada modificação de nucleosídeos cerca de 70 no total uma vez que alguns snoRNAs guiam dois tipos de modifica ções e as 78 proteínas ribossomais Os seres humanos têm um número ainda maior de nucleosídeos modificados cerca de 200 e um número maior de snoRNA associados A composição dos complexos pode mudar à medida que os ribossomos são montados e vários dos complexos inter mediários podem competir em complexidade com o pró prio ribossomo e as snRNPs O rRNA 5S da maioria dos eucariontes é produzido como um transcrito inteiramente separado por uma polimerase diferente Pol III As modificações de nucleosídeos mais comuns nos rRNAs de eucariontes são mais uma vez a conversão de uri dina em pseudouridina e metilação de nucleosídeos depen dente de adoMet frequentemente em grupos 29hidroxila Essas reações dependem de complexos de proteínas snoR NA ou snoRNP cada um consistindo em um snoRNA e quatro ou cinco proteínas que inclui a enzima que provoca a modificação Há duas classes de proteínas snoRNPs ambas definidas pelos elementos de sequência chave conservados denominados por caixas com letras As snoRNPs da caixa H ACA estão envolvidas na pseudouridililação e as snoRNPs da caixa CD funcionam nas metilações 29O Ao contrário da situação em bactérias a mesma enzima pode participar de modificações em vários locais guiadas pelos snoRNAs Os snoRNAs têm de 60 a 300 nucleotídeos de compri mento Muitos são codificados no interior dos íntrons e de outros genes e cotranscritos com aqueles genes Cada snoRNA inclui uma sequência de 10 a 21 nucleotídeos que é perfeitamente complementar a algum local em um rRNA Os elementos da sequência conservada no resto do snoRNA se dobra em estruturas que são ligadas pelas proteínas snoRNP Figura 2625 RNAs transportadores A maioria das células tem de 40 a 50 tRNAs diferentes e as células eucariontes têm múltiplas cópias de vários genes de tRNA Os RNAs transportadores são derivados de precursores de RNA mais longos pela re moção enzimática de nucleotídeos das extremidades 59e 39 Figura 2626 Em eucariontes os íntrons estão presen tes em poucos transcritos de tRNA e devem ser retirados Quando dois ou mais tRNAs diferentes estão contidos em um único transcrito primário eles são separados por cliva gem enzimática A endonuclease RNase P encontrada em todos os organismos remove o RNA na extremidade 59 dos tRNAs Essa enzima contém tanto proteína quanto RNA O componente de RNA é essencial para sua atividade e em células bacterianas ele pode desempenhar sua função de processamento com precisão mesmo sem o componen te proteico A RNase P é portanto outro exemplo de um RNA catalítico como descrito com mais detalhe a seguir A extremidade 39 dos tRNAs é processada por uma ou mais nucleases incluindo a exonuclease RNase D Préribossomo 90S pré60S pré40S 18S 58S snoRNPs snoRNPs 28S Metilação formação de pseudouridina e outras modificações Clivagens iniciais do prérRNA 40S 45S 60S Subunidades ribossomais maduras Citoplasma Nucléolo Clivagens adicionais processamento exonucleolítico exportação Clivagens adicionais exportação 5S 5S 5S 28S 58S 18S FIGURA 2624 Processamento dos transcritos de prérRNA em ver tebrados Durante a transcrição o transcrito primário 45S é incorporado em um complexo préribossomal 90S nucleolar em que o processamen to do rRNA e a montagem do ribossomo são fortemente associados ➊ O precursor 45S é metilado em mais de 100 dos seus 14000 nucleotídeos ou nas bases ou nos grupos 29OH marcas corderosa algumas uridinas são convertidas em pseudouridinas marcas azuis e algumas poucas outras mo dificações ocorrem marcas verdes são dihidrouridinas ➋ e ➌ Uma série de clivagens enzimáticas do precursor 45S produz os rRNA 18S 58S e 28S e as subunidades ribossomais gradualmente ganham forma com a montagem das proteínas ribossomais As reações de clivagem e todas as modificações precisam de pequenos RNA nucleolares snoRNA encontrados em comple xos proteicos snoRNP no nucléolo que lembram os spliceossomos O rRNA 5S é produzido separadamente Nelson6edbookindb 1079 Nelson6edbookindb 1079 030414 0748 030414 0748 1080 DAVID L NELSON MICHAEL M COX snoRNA FIGURA 2625 Fungao dos snoRNAs em guiar a modificagao do rRNA a Pareamento do RNA com os snoRNAs da caixa CD para guiar as reacdes 5 Caixa D de metilacdo Os sitios de metilagao no rRNAalvo Caixa C verdeescuro estado nas regides pareadas com o snoRNA CD As sequéncias caixa altamente con rRNA 3 servadas C e D e C9 e D9 sao sitios de ligagao para proteinas que compdem o maior snoRNP b Pareamento do RNA com snoRNA da caixa HACA mN rRNA para guiar pseudouridililagdes Os sitios de conver snoRNA sao da pseudouridina no rRNAalvo segmentos verdes estao novamente nas regides pareadas mN com o snoRNA e as sequéncias da caixa HACA conservada sao sitios de ligagao de proteinas 3 U Caixa C Ny Ny 5 N Caixa D JDW rRNA gren Oo Nes Caixa ACA OH 3 NNN OH 3 a b Os precursores do RNA transportador podem sofrer produzir a sequéncia CCA3 A criacdo dessa sequéncia processamento postranscricional adicional O trinucleo definida de nucleotideos é portanto nao dependente de tideo CCA3 3terminal ao qual um aminoacido é liga um molde de DNA ou RNA 0 molde 0 sitio de ligacao do durante a sintese proteica Capitulo 27 esta ausente da enzima de alguns precursores de tRNAs bacterianos e de todos os O tipo final de processamento de tRNA é a modificacgao de eucariontes e é adicionado durante 0 processamento de algumas bases por metilagao desaminacéo ou reducao Figura 2626 Essa adicao é feita pela nucleotidiltrans Figura 2622 No caso da pseudouridina a base uracila ferase do tRNA enzima incomum que liga os trés precur 6 removida e religada ao acucar por meio do C5 Algumas sores de ribonucleosideos trifosfato em sitios ativos sepa dessas bases modificadas ocorrem em posicées caracteris rados e catalisa a formagao de ligacgoes fosfodiéster para ticas em todos os tRNAs Figura 2626 Transcrito primario Intermediario tRNA maduro 3 3 3 OH OH OH A A u Corte da RNase D ce iS U iS Cc 5 PSUUAUCAGUUAAUUGA A 5 pe 5pe4 UA UA UA cG cG cG CortedaRNaseP Ce C6 GC ig Zz U U A DG U U mA Dg vy U mA meee TTT inc Autcrome TT TTS 6c ne Aaccame TTTTS G rit GGGCG é tit GGGCG rit GGGCG G AAGGC cy vu Modificagéodabase AAGGC omc v Splicing Gy gAAGGCH mc vue c GAGA Clivagem 5 D c GAGA a c GAGA ii Clivagem 3 Ai i Gc Adicao CCA Gc GCc AU A Au c OMA c OMA yf in A U A Ueg WweuG G yA Gc Gc w UA wa AU AU A A A A v Cc Cc Yuac en S FIGURA2626 Processamentos dos tRNAs em bactériaseeucariontes dos tRNAs de eucariontes e daqueles tRNAs bacterianos que nao apresen OtRNA 0 tRNA especifico para a ligacdo da tirosina ver Capitulo 27 usa tam essa sequéncia no transcrito primario Enquanto as extremidades estao do para ilustrar as etapas importantes As sequéncias de nucleotideos mos sendo processadas bases especificas no resto do transcrito s4o modificadas tradas em amarelo sao removidas do transcrito primario As extremidades ver Figura 2622 Para o tRNA de eucariontes mostrado aqui a etapa final sao processadas primeiro a extremidade 5 antes da extremidade 3O CCA 6 0 splicing do intron de 14 nucleotideos Os introns sao encontrados em é entao adicionado a extremidade 3 etapa necessaria no processamento alguns tRNAs de eucariontes mas ndo em tRNAs bacterianos PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1081 Os RNAs com função especial sofrem vários tipos de processamento O número de classes conhecidas de RNAs de função espe cial está aumentando rapidamente bem como a variedade de funções associadas a eles Muitos desses RNAs sofrem processamento Os snRNAs e snoRNAs não apenas facilitam as reações de processamento do RNA mas são eles mesmos sintetiza dos como precursores maiores e então processados Muitos snoRNAs são codificados no interior dos íntrons de outros genes À medida que os íntrons sofrem splicing a partir do prémRNA as proteínas snoRNPs se ligam às sequências de snoRNA e as ribonucleases removem o RNA extra nas extremidades 59e 39 Os snRNAs destinados aos spliceossomos são sinte tizados como présnRNA pela RNApolimerase II e as ri bonucleases removem o RNA extra em cada extremidade Nucleosídeos particulares nos snRNAs também são sujeitos a 11 tipos de modificação com o predomínio da 29Ometi lação e conversão de uridina em pseudouridina Os microRNAs miRNAs são uma classe especial de RNAs envolvidos na regulação gênica São RNAs não codificadores com cerca de 22 nucleotídeos de compri mento complementares das sequências de regiões par ticulares de mRNAs Eles regulam o funcionamento do mRNA pela sua clivagem ou impedindo a sua tradução Os miRNAs são encontrados em eucariontes multicelu lares que variam de vermes e moscasdafruta a plantas e mamíferos Até 1 do genoma humano pode codificar miRNA e esses podem ter como alvo até um terço dos mRNAs humanos Sua função na regulação gênica é des crita no Capítulo 28 Os miRNAs são sintetizados a partir de precursores muito maiores em várias etapas Figura 2627 Os trans critos primários para miRNA primiRNA variam muito de tamanho alguns deles são codificados nos íntrons de outros genes e são coexpressados com esses genes hospedeiros Seus papéis na regulação gênica também são detalhados no Capítulo 28 FIGURA 2627 Síntese e processamento dos miRNAs O transcri to primário dos miRNAs é um RNA maior de comprimento variável um primiRNA A maior parte do seu processamento é mediada por duas endorribonucleases na família da RNase III Drosha e Dicer Primeiro no núcleo o primiRNA é reduzido a um precursor miRNA de 70 a 80 nu cleotídeos prémiRNA por um complexo proteico que inclui a Drosha e outra proteína a DGCR8 A prémiRNA é então exportada para o citoplas ma em um complexo com uma proteína chamada exportina5 e a Ran GTPase ver Figura 2742 No citoplasma a Ran hidrolisa o GTP e então a proteína exportina5 e o prémiRNA são liberados As proteínas RanGDP e exportina 5 são transportadas de volta para o núcleo O prémiRNA é acionado pela Dicer para produzir o quase maduro miRNA pareado com um pequeno complemento de RNA O complemento é removido por uma RNAhelicase e o miRNA maduro é incorporado em complexos de proteínas como o complexo de silenciamento induzido pelo RNA RISC que então se liga a um mRNAalvo Se a complementaridade entre o miR NA e seu alvo é quase que totalmente perfeita o mRNAalvo é clivado Se a complementaridade é apenas parcial o complexo bloqueia a tradução do mRNAalvo AAAAn AAAAn Núcleo Citoplasma AAAAn AAAAn Complexo da RNApolimerase II RNAhelicase PrimiRNAs miRNA maduro Complementaridade parcial Complementaridade quase perfeita Transcrição Seleção de alvo Carga de RISC Repressão da tradução Clivagem do mRNA Exportina 5 e Ran PrimiRNA GTP GDP PrimiRNA Drosha DGCR8 Exportar Clivagem Clivagem GTP GDP Dicer Pi AAAAA AAAAn Nelson6edbookindb 1081 Nelson6edbookindb 1081 030414 0748 030414 0748 1082 DAVID L NELSON MICHAEL M COX As enzimas de RNA são os catalisadores de alguns eventos no metabolismo de RNA O estudo do processamento póstranscricional de molé culas de RNA levou a uma das descobertas mais excitan tes da bioquímica moderna a existência de enzimas de RNA As ribozimas melhor caracterizadas são os íntrons do grupo I que sofrem autosplicing RNase P e a ribozi ma cabeçademartelo discutida a seguir A maior parte das atividades dessas ribozimas se baseia em duas reações fundamentais transesterificação Figura 2613 e hidróli se da ligação fosfodiéster clivagem O substrato para as ribozimas é frequentemente uma molécula de RNA e pode até mesmo ser parte da própria ribozima Quando o seu substrato é o RNA o catalisador de RNA pode fazer uso de interações de pares de bases para alinhar o substrato para a reação As ribozimas variam muito de tamanho Um íntron do grupo I que sofre autosplicing pode ter mais de 400 nu cleotídeos A ribozima cabeçademartelo consiste em duas fitas de RNA com apenas 41 nucleotídeos no total Figura 2628 Como nas enzimas proteicas a estrutura tridimen sional das ribozimas é importante para seu funcionamento As ribozimas são inativadas pelo calor acima da sua tem peratura de fusão ou pela adição de agentes desnaturado res ou de oligonucleotídeos complementares que quebram os padrões normais de pareamento de bases As ribozimas também podem ser inativadas se nucleotídeos essenciais forem alterados A estrutura secundária de um íntron do grupo I que sofre autosplicing a partir do precursor do rRNA 26S da Tetrahymena é mostrado em detalhe na Figura 2629 Propriedades enzimáticas dos íntrons do grupo I Os íntrons do grupo I que sofrem autosplicing compartilham várias pro priedades com enzimas além de acelerar a taxa de reação incluindo seu comportamento cinético e sua especificidade A ligação do cofator da guanosina Figura 2613 ao íntron do grupo I do rRNA da Tetrahymena é saturável Km 30 mM e pode ser competitivamente inibida pela 39desoxi guanosina O íntron é muito preciso na sua reação de ex cisão em grande parte devido a um segmento chamado de sequênciaguia interna que pode se parear com sequên cias de éxons próximas do sítio de splice 59 Figura 2629 Esse pareamento promove o alinhamento de ligações espe cíficas a serem clivadas e religadas Como o próprio íntron é quimicamente alterado durante a reação de splicing suas extremidades são clivadas ele parece não ter uma propriedade enzimática essencial a ca pacidade de catalisar reações múltiplas Observação mais detalhada demonstrou que após a excisão o íntron de 414 nucleotídeos do rRNA da Tetrahymena pode in vitro atuar como uma verdadeira enzima mas in vivo ele é ra pidamente degradado Uma série de ciclizações intramo leculares e reações de clivagem no íntron extirpado leva à perda de 19 nucleotídeos de sua extremidade 59 Os 395 nucleotídeos restantes um RNA linear chamado de L19 IVS sequência de intervenção promove reações de transferência de nucleotidil em que alguns oligonucleotí deos são aumentados à custa de outros Figura 2630 Os melhores substratos são oligonucleotídeos tais como um oligômero C5 sintético que pode se parear com a mes ma sequênciaguia interna rica em guanilato que manteve o éxon 59 no lugar para autosplicing A atividade enzimática da ribozima L19 IVS resulta de um ciclo de reações de transesterificação mecanicamente semelhantes ao autosplicing Cada molécula de ribozima pode processar cerca de 100 moléculas de substrato por hora e não é alterada na reação portanto o íntron atua como um catalisador Ele segue a cinética de Michaelis Menten é específico para os substratos de oligonucleo a G 59 39 39 59 C G C A U C G C G C G U C GA G A A C A G U U G A U C G U A C G A U A G C G A C b FIGURA 2628 Ribozima cabeçademartelo Certos elementos seme lhantes a vírus ou virusoides têm pequenos genomas de RNA e geralmente precisam de outro vírus para auxiliar sua replicação ou acondicionamento ou ambos Alguns RNAs virusoides incluem pequenos segmentos que pro movem reações de clivagem de RNAs específicas de sítios associadas à repli cação Esses segmentos são chamados de ribozimas cabeçademartelo pois suas estruturas secundárias têm a forma da cabeça de um martelo Essas ribozimas foram identificadas e estudadas separadamente a partir de RNAs virais bem maiores a As sequências mínimas necessárias para catálise pela ribozima Os nucleotídeos encaixotados são altamente conservados e são necessários para a função catalítica A seta indica o sítio de autoclivagem b Estrutura tridimensional PDB ID 1MME consultar na Figura 825b uma visão de volume atômico As fitas são coloridas como em a A ribozima cabeça demartelo é uma metaloenzima íons Mg 21 são necessários para atividade in vivo A ligação fosfodiéster no sítio de autoclivagem é indicada por uma seta Ribozima cabeçademartelo Nelson6edbookindb 1082 Nelson6edbookindb 1082 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1083 tídeos do RNA e pode ser inibido competitivamente A kcatKm constante de especificidade é de 10 3 M 1s 1 mais baixa que aquela de várias enzimas mas a ribozima acelera a hidrólise por um fator de 10 10 em relação à reação não ca talisada Ela faz uso das estratégias de orientação do subs trato catálise covalente e catálise do íon metálico todas empregadas pelas proteínas enzimáticas Características de outras ribozimas A RNase P da E coli tem tanto um componente de RNA o M1 RNA com 377 nu cleotídeos quanto um componente proteico Mr 17500 Em 1983 Sidney Altman e Norman Pace e seus colabora dores descobriram que sob determinadas condições o M1 RNA sozinho é capaz de catálise clivando os precursores de tRNA na posição correta O componente proteico apa rentemente serve para estabilizar o RNA ou facilitar sua função in vivo A ribozima RNase P reconhece a forma tridimensional do seu substrato prétRNA junto com a se quência CCA e portanto pode clivar os líderes 59 de diver sos tRNAs Figura 2626 O repertório de ribozimas catalíticas conhecidas conti nua se expandir Alguns virusoides pequenos RNAs asso ciados a vírus de RNA de plantas incluem a estrutura que promove uma reação de autoclivagem a ribozima cabeça demartelo ilustrada na Figura 2628 está nessa classe ca talisando a hidrólise de uma ligação fosfodiéster interna A reação de splicing que ocorre em um spliceossomo parece depender de um centro catalítico formado pelos snRNA U2 U5 e U6 Figura 2616 E talvez mais importante um com ponente RNA dos ribossomos catalisa a síntese de proteínas Capítulo 27 A investigação dos RNAs catalíticos forneceu novos enten dimentos sobre a função catalítica em geral e tem importantes implicações para nossa compreensão sobre a origem e evolu ção da vida neste planeta tópico discutido na Seção 263 59 39 P5b P5a P6a P6b P21 P2 P5 P4 P1 Sequência guia interna P6 P3 P8 P90 P92 P91 P91a P9 P10 P5c Íons magnésio a b c FIGURA 2629 Estrutura secundária do íntron de rRNA que sofre au tosplicing de Tetrahymena a As sequências íntron são sombreadas de amarelo e cor salmão sequências éxon em verde Cada linha fina em cor sal mão representa uma ligação entre nucleotídeos vizinhos em uma sequên cia contínua dispositivo necessário ao mostrar essa molécula complexa em duas dimensões Linhas azuis curtas representam pareamento normal de bases pontos azuis indicam pares de bases GU Todos os nucleotídeos são mostrados O núcleo catalítico da atividade de autosplicing é sombreado em cinza Algumas regiões de pareamento de bases são marcadas P1 P3 P21 P5a e assim por diante de acordo com uma convenção estabelecida para essa molécula de RNA A região P1 que contém a sequênciaguia interna roxo é a localização do sítio de splicing 59 seta preta Parte da sequência guia interna pareia com a extremidade do éxon 39 colocando os sítios de splicing 59 e 39 setas pretas em proximidade estreita b PDB ID 1GID Es trutura tridimensional do domínio P4P6 mostrada em amarelo em a c PDB ID 1U6B Estrutura tridimensional da maior parte do resto do íntron mostrada em cor salmão em a Nelson6edbookindb 1083 Nelson6edbookindb 1083 030414 0748 030414 0748 1084 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Os mRNAs celulares são degradados em taxas diferentes A expressão dos genes é regulada em vários níveis Um fa tor crucial governando a expressão de um gene é a con centração celular do seu mRNA associado A concentração de qualquer molécula depende de dois fatores sua taxa de síntese e sua taxa de degradação Quando a síntese e degra dação de um mRNA estão equilibradas a concentração do mRNA permanece em um estado estacionário Uma mudan ça em qualquer das taxas resultará em uma acumulação ou esgotamento do mRNA Vias de degradação garantem que os mRNAs não se acumulem na célula dirigindo a síntese de proteínas desnecessárias As taxas de degradação variam muito para mRNAs nos diferentes genes de eucariontes Para um produto de um gene que é necessário apenas temporariamente a meia vida do seu mRNA pode ser de apenas minutos ou mesmo segundos Os produtos gênicos necessários constantemen te pela célula podem ter mRNAs que são estáveis por várias gerações celulares A meiavida média dos mRNAs de uma célula de vertebrado é de cerca de 3 horas com o conjun to de cada tipo de mRNA sendo reposto cerca de 10 vezes por geração celular A meiavida dos mRNAs bacterianos é muito menor apenas cerca de 15 min talvez devido às necessidades de regulação O RNA mensageiro é degradado pelas ribonucleases presentes em todas as células Na E coli o processo co meça com um ou vários cortes por uma endorribonuclea se seguido por degradação 39S59 por exorribonucleases Em eucariontes inferiores a via principal envolve primeiro o encurtamento da cauda poliA em seguida a remoção do quepe da extremidade 59 e a degradação do mRNA na direção 59S39 Uma via degradativa 39S59 também existe e pode ser a via principal em eucariontes superiores Todos os eucariontes têm um complexo de até 10 exorribonuclea ses conservadas 39S59 chamados de exossomo que está envolvido no processamento da extremidade 39 de rRNA tRNA e alguns RNAs de função especial incluindo snRNA e snoRNA bem como a degradação de mRNAs Uma estrutura em grampo nos mRNAs bacterianos com um terminador independente de r Figura 267 confere estabilidade contra a degradação Estruturas se Íntron de rRNA que sofreu splicing L19 IVS 19 nucleotídeos da extremidade 59 FIGURA 2630 Atividade catalítica in vitro da L19 IVS a A L19 IVS é gerada pela remoção autocatalítica de 19 nucleotídeos da extremidade 59 do íntron de Tetrahymena que sofre splicing O sítio de clivagem é indicado pela seta na sequênciaguia interna dentro da caixa O resíduo G sombre ado de cor salmão adicionado na primeira etapa da reação de splicing ver Figura 2614 é parte da sequência removida Uma porção da sequênciaguia interna permanece na extremidade 59 do L19 IVS b A L19 IVS alonga al guns oligonucleotídeos de RNA à custa de outros em um ciclo de reações de transesterificação etapas ➊ a ➍ A 39OH do resíduo G na extremidade 39 da L19 IVS desempenha um importante papel neste ciclo observe que este não é o resíduo G adicionado na reação de splicing O C5 é um dos melhores substratos da ribozima porque ele pode parear suas bases com a sequênciaguia restante no íntron Embora esta atividade catalítica seja pro vavelmente irrelevante para a célula ela tem importantes aplicações para hipóteses atuais sobre evolução discutidas ao final deste capítulo Nelson6edbookindb 1084 Nelson6edbookindb 1084 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1085 melhantes a grampos podem tornar mais estáveis algu mas partes de um transcrito primário levando à degrada ção não uniforme dos transcritos Em células de eucariontes tanto a cauda poliA 39 quanto o quepe 59 são importantes para a estabilidade de vários mRNAs Ciclo de vida de um mRNA A polinucleotídeofosforilase produz polímeros aleatórios semelhantes ao RNA Em 1955 Marianne GrunbergManago e Severo Ochoa des cobriram a enzima bacteriana polinucleotídeofosforila se que catalisa in vitro a reação polinucleotídeo aumentado A polinucleotídeofosforilase foi a primeira enzima sinte tizadora de ácidos nucleicos descoberta a descoberta da DNApolimerase por Arthur Kornberg ocorreu logo em se guida A reação catalisada pela polinucleotídeofosforilase difere fundamentalmente das atividades da polimerase dis cutidas até agora pelo fato de não ser dependente de mol de A enzima usa 59difosfatos de ribonucleosídeos como substratos e não pode atuar nos homólogos 59trifosfatos ou nos desoxirribonucleosídeos 59difosfatos O polímero de RNA formado pela polinucleotídeofosforilase contém as ligações usuais 3959fosfodiéster que podem ser hidrolisa das pela ribonuclease A reação é prontamente reversível e pode ser empurrada na direção da quebra do polirribo nucleotídeo aumentandose a concentração de fosfato A provável função dessa enzima na célula é a degradação dos mRNAs a nucleosídeos difosfatos Marianne GrunbergManago 19212013 Severo Ochoa 19051993 Como a reação de polinucleotídeofosforilase não usa um molde o polímero que ela forma não tem uma sequên cia de bases específica A reação ocorre igualmente bem com qualquer um ou todos os quatro nucleosídeos difosfa tos e a composição de bases do polímero resultante refle te nada mais do que as concentrações relativas dos subs tratos 59difosfato no meio A polinucleotídeofosforilase pode ser usada em laboratório para preparar polímeros de RNA com muitas sequências de base e frequências dife rentes Os polímeros de RNA desse tipo sintetizados foram cruciais para deduzir o código genético para os aminoáci dos Capítulo 27 RESUMO 262 Processamento de RNA c Os mRNAs de eucariontes são modificados pela adição de um resíduo de 7metilguanosina na extremidade 59 e pela clivagem e poliadenilação na extremidade 39 para formar uma longa cauda poliA c Muitos transcritos primários de mRNA contêm íntrons regiões não codificadoras que são removidos por splicing A remoção dos íntrons do grupo I encontrada em alguns rRNAs precisa de um cofator de guanosina Alguns íntrons do grupo I e grupo II são capazes de au tosplicing nenhuma proteína enzimática é necessária Os precursores do mRNA nuclear têm uma terceira classe de íntrons a maior que sofrem splicing com a ajuda de complexos de RNAproteína chamados snRNP reunidos em spliceossomos Uma quarta classe de ín trons encontrada em alguns tRNAs consiste nos únicos íntrons que se conhece que sofrem splicing por proteí nas enzimáticas c A função de muitos mRNAs de eucariontes é regulada por microRNAs miRNAs Os miRNAs são em si deri vados de precursores maiores por meio de uma série de reações de processamento c Os RNAs ribossomais e transportadores são derivados de RNAs precursores maiores aparados por nucleases Algumas bases são modificadas enzimaticamente duran te o processo de maturação Algumas modificações de nucleosídeos são guiadas por snoRNAs com complexos de proteínas chamados de snoRNPs c Os íntrons que sofrem autosplicing e o componente de RNA da RNase P que cliva a extremidade 59 dos precursores de tRNA são dois exemplos de ribozimas Esses catalisadores biológicos têm as propriedades de enzimas verdadeiras Eles geralmente promovem a cli vagem hidrolítica e transesterificação usando o RNA como substrato Combinações dessas reações podem ser promovidas pelo íntron do grupo I retirado do rRNA da Tetrahymena resultando em um tipo de reação de polimerização do RNA c A polinucleotídeofosforilase forma reversivelmente po límeros semelhantes ao RNA a partir de ribonucleosíde os 59difosfato adicionando ou removendo ribonucleotí deos na extremidade 39hidroxila do polímero A enzima degrada o RNA in vivo 263 Síntese de RNA e DNA dependente de RNA Em nossa discussão sobre a síntese de DNA e RNA até ago ra o papel da fitamolde foi reservado ao DNA Entretanto algumas enzimas usam um molde de RNA para a síntese de ácido nucleico Com a exceção muito importante dos ví rus com um genoma de RNA essas enzimas desempenham apenas um modesto papel nas vias de informação Os vírus de RNA são a fonte da maioria das polimerases RNAdepen dentes caracterizadas até agora A existência da replicação do RNA precisa de uma ela boração do dogma central Figura 2631 contraste essa Nelson6edbookindb 1085 Nelson6edbookindb 1085 030414 0748 030414 0748 1086 DAVID L NELSON MICHAEL M COX figura com o diagrama na p 977 As enzimas envolvidas na replicação do RNA têm implicações profundas para investi gações a respeito da natureza das moléculas autorreplica doras que podem ter existido em tempos prébióticos A transcriptase reversa produz DNA a partir de RNA viral Certos vírus de RNA que infectam as células animais trans portam no interior da partícula viral uma DNApolimerase dependente de RNA chamada de transcriptase reversa Na infecção o genoma viral de fita única de RNA 10000 nucleotídeos e a enzima entram na célula hospedeira Pri meiro a transcriptase reversa catalisa a síntese de uma fita de DNA complementar ao RNA viral Figura 2632 en tão degrada a fita de RNA do híbrido de RNADNA viral e o substitui por DNA O duplex de DNA resultante frequente Replicação do DNA DNA RNA Replicação do RNA Transcrição reversa Transcrição Tradução Proteína FIGURA 2631 Ampliação do dogma central para incluir a síntese de RNA e DNA dependente de RNA Infecção Lise Membrana plasmática Transcrição reversa Integração Cromossomo hospedeiro Retrovírus Novo retrovírus Genoma de RNA Transporte para fora do núcleo Transcrição DNA viral Núcleo Citoplasma Tradução e proteólise Montagem e empacotamento Transcriptase reversa tRNA Integrase Protease Ribossomo Env Gag FIGURA 2632 Infecção retroviral de uma célula de mamífero e inte gração do retrovírus no cromossomo do hospedeiro Partículas virais que entram na célula hospedeira carregam a transcriptase reversa viral e um tRNA celular captado de uma célula hospedeira anterior já pareado ao RNA viral Os segmentos roxos representam as longas repetições terminais no RNA viral O tRNA facilita a conversão imediata do RNA viral a DNA de fita dupla pela ação da transcriptase reversa como descrito no texto Uma vez convertido em DNA de duplahélice o DNA entra no núcleo e é integra do no genoma do hospedeiro A integração é catalisada por uma integrase codificada viralmente A integração do DNA viral no DNA do hospedeiro é mecanicamente semelhante à inserção de transposons em cromossomos bacterianos ver Figura 2541 Por exemplo alguns poucos pares de bases do DNA do hospedeiro se tornam duplicados no sítio de integração forman do repetições curtas de 4 a 6 pb em cada extremidade do DNA retroviral inserido não mostrado Na transcrição e tradução do DNA viral integrado novos vírus são formados e liberados pela lise celular direita Nos vírus o RNA viral é envolvido por proteínas do capsídeo chamadas Gag e proteínas do envoltório externo chamadas Env Proteínas virais adicionais transcripta se reversa integrase e uma protease viral necessária para o processamento póstradução das proteínas virais são acondicionadas no interior de uma partícula de vírus com o RNA Nelson6edbookindb 1086 Nelson6edbookindb 1086 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1087 mente se torna incorporado ao genoma da célula hospedei ra eucarionte Esses genes virais integrados e dormentes podem ser ativados e transcritos e os produtos gênicos proteínas virais e o próprio genoma de RNA acondiciona dos como novos vírus Os vírus de RNA que contêm trans criptases reversas são conhecidos como retrovírus retro é o prefixo latino para para trás A existência de transcriptases reversas em vírus de RNA foi prevista por Howard Temin em 1962 e as enzimas foram em última análise detectadas por Temin e independente mente por David Baltimore em 1970 Sua descoberta atraiu muita atenção como uma prova que a informação genética pode fluir para trás do RNA para o DNA abalando o dog ma da passagem da informação apenas do DNA para o RNA Howard Temin 19341994 David Baltimore Os retrovírus têm geralmente três genes gag um nome derivado da designação histórica antígeno associado ao grupo group associated antigen pol e env Figu ra 2633 O transcrito que contém gag e pol é traduzido em uma longa poliproteína único grande polipeptídeo clivado em seis proteínas com funções distintas As proteí nas derivadas do gene gag constituem o núcleo interior da partícula viral O gene pol codifica a protease que cliva o longo polipeptídeo uma integrase que insere o DNA viral nos cromossomos do hospedeiro e a transcriptase reversa Muitas transcriptases reversas têm duas subunidades a e b O gene pol especifica a subunidade b Mr 90000 e a subunidade a Mr 65000 é simplesmente um fragmento proteolítico da subunidade b O gene env codifica as pro teínas do envelope viral Em cada extremidade do genoma de RNA linear se encontram longas sequências de repeti ções terminais LTR de algumas centenas de nucleotídeos Transcritas no DNA duplex essas sequências facilitam a integração do cromossomo viral no DNA do hospedeiro e contêm promotores para a expressão do gene viral As transcriptases reversas catalisam três reações dife rentes 1 síntese de DNA dependente de RNA 2 degra dação de RNA e 3 síntese de DNA dependente de DNA Como muitas DNA e RNApolimerases as transcriptases re versas contêm Zn 21 Cada transcriptase é mais ativa com o RNA do seu próprio vírus mas cada uma pode ser usada ex perimentalmente para construir DNA complementar a uma variedade de RNA As atividades de síntese de DNA e RNA e a degradação do RNA empregam sítios ativos separados na proteína Para que a síntese de DNA se inicie a trans criptase reversa precisa de um oligonucleotídeo iniciador um tRNA celular obtido durante uma infecção anterior e transportado na partícula viral Esse tRNA pareia as bases na sua extremidade 39 com uma sequência complementar do RNA viral A nova fita de DNA é sintetizada na direção 59S39 como em todas as reações da RNA e DNApolimera ses As transcriptases reversas como as RNApolimerases não têm exonucleases revisoras 39S59 Elas geralmente têm taxas de erro de cerca de 1 por 20000 nucleotídeos adicionados Uma taxa de erro tão alta quanto essa é ex tremamente incomum na replicação de DNA e parece ser uma característica da maioria das enzimas que replica os genomas de vírus de RNA Uma consequência é uma taxa de mutação maior e uma taxa mais rápida de evolução viral fator responsável pelo frequente aparecimento de novas li nhagens de retrovírus causadores de doenças As transcriptases reversas se tornaram importantes rea gentes no estudo das relações DNARNA e nas técnicas de clonagem do DNA Elas tornam possível a síntese de DNA complementar a um molde de mRNA e o DNA sintetizado preparado dessa maneira chamado de DNA complemen tar cDNA pode ser usado para clonar genes celulares ver Figura 914 gag c pol env LTR DNA da célula hospedeira LTR Transcrição Tradução Transcrito primário Proteínas estruturais virais Integrase Protease Transcriptase reversa Clivagem proteolítica Poliproteína A Proteínas do envelope viral Clivagem proteolítica Poliproteína B FIGURA 2633 Estrutura e produtos gênicos de um genoma retrovi ral integrado Repetições terminais longas LTR têm sequências neces sárias para a regulação e iniciação da transcrição A sequência denominada c é necessária para o acondicionamento dos RNAs retrovirais em partículas virais maduras A transcrição do DNA retroviral produz um transcrito primá rio que abrange os genes gag pol e env A tradução Capítulo 27 produz uma poliproteína um único polipeptídeo longo derivado dos genes gag e pol que é clivado em seis proteínas distintas O splicing do transcrito primá rio produz um mRNA derivado em grande parte do gene env que também é traduzido em uma poliproteína clivada então para gerar proteínas virais do envelope Nelson6edbookindb 1087 Nelson6edbookindb 1087 030414 0748 030414 0748 1088 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Alguns retrovírus causam câncer e Aids Os retrovírus têm tido destaque em avanços recentes na compreensão molecular do câncer A maioria dos retrovírus não mata suas células hospedeiras mas perma nece integrada ao DNA celular replicando quando a célula se divide Alguns retrovírus classificados como vírus RNA tumorais contêm um oncogene que pode levar a célula a crescer anormalmente O primeiro retrovírus desse tipo a ser estudado foi o vírus do sarcoma de Rous também cha mado de vírus do sarcoma aviário Figura 2634 nomeado a partir de F Peyton Rous que estudou tumores de gali nhas que agora se sabe foram causados por esse vírus Desde a descoberta inicial dos oncogenes por Harold Var mus e Michael Bishop muitas dúzias de genes como esses foram encontrados em retrovírus O vírus da imunodeficiência humana HIV que cau sa a síndrome da imunodeficiência adquirida Aids é um retrovírus Identificado em 1983 o HIV tem um genoma de RNA com genes retrovirais padrão junto com vários outros genes incomuns Figura 2635 Ao contrário de vários outros vírus o HIV mata muitas das células que ele infecta principalmente linfócitos T em vez de provocar a formação de tumores Isso leva gradualmente à supressão do sistema imune no hospedeiro A transcriptase reversa do HIV é ainda mais propensa a erros do que outras trans criptases reversas conhecidas 10 vezes mais resultando em altas taxas de mutação nesse vírus Um ou mais erros ocorrem geralmente a cada vez que o genoma viral é re plicado e duas moléculas virais quaisquer provavelmente são diferentes Muitas vacinas modernas para infecções virais consis tem em uma ou mais proteínas de revestimento do vírus produzidas pelos métodos descritos no Capítulo 9 Essas proteínas não são infecciosas mas estimulam o sistema imune a reconhecer e resistir a invasões virais subsequen tes Capítulo 5 Devido à alta taxa de erro da transcrip tase reversa do HIV o gene env nesse vírus junto com o resto do genoma sofre mutação muito rápida dificultando o desenvolvimento de uma vacina efetiva Entretanto são necessários ciclos repetidos de invasão celular e replicação para propagar uma infecção de HIV de modo que a inibição de enzimas virais oferece a terapia mais eficiente disponí vel atualmente A protease do HIV é o alvo de uma classe de fármacos chamada de inibidores de protease ver Figura 624 A transcriptase reversa é o alvo de alguns fármacos adicionais amplamente usados para tratar indivíduos infec tados pelo HIV Quadro 262 Muitos transposons retrovírus e íntrons podem ter origem evolutiva comum Alguns transposons bem conhecidos de DNA de eucarion tes de fontes tão diversas quanto leveduras e moscasda fruta têm uma estrutura muito semelhante àquela dos re trovírus eles são às vezes chamados de retrotransposons Figura 2636 Eles codificam uma enzima homóloga à transcriptase reversa retroviral e suas regiões codificado ras são ladeadas por sequências LTR Eles se transpõem de uma posição para outra no genoma celular por meio de um RNA intermediário usando a transcriptase reversa para fa zer uma cópia de DNA do RNA seguida da integração do gag env pol LTR LTR src FIGURA 2634 Genoma do vírus do sarcoma de Rous O gene src codi fica uma tirosinacinase pertencente a uma classe de enzimas que funciona em sistemas que afetam a divisão celular interações célula a célula e comu nicação intercelular Capítulo 12 O mesmo gene é encontrado no DNA de galinhas o hospedeiro comum para esse vírus e nos genomas de muitos outros eucariontes incluindo humanos Quando associado ao vírus do sar coma de Rous esse oncogene é frequentemente expresso em níveis anor malmente altos contribuindo para a divisão celular descontrolada e câncer LTR LTR pol env gag vif tat vpu tat nef rev rev vpr FIGURA 2635 O genoma do HIV o vírus que causa a Aids Além dos genes retrovirais típicos o HIV contém vários pequenos genes com diversas funções não identificadas aqui e nem todas conhecidas Alguns desses genes se sobrepõem Mecanismos de splicing alternativo produzem muitas proteínas diferentes a partir deste pequeno genoma 97 3 10 3 nu cleotídeos Elemento Ty Saccharomyces LTR Elemento Copia Drosophila LTR gag PR RT RH INT d d TYA TYB LTR gag LTR pol FIGURA 2636 Transposons de eucariontes O elemento Ty da levedu ra Saccharomyces e o elemento copia da moscadafruta Drosophila servem como exemplos de retrotransposons de eucariontes que frequentemente têm uma estrutura semelhante à dos retrovírus mas não têm o gene env As sequências d do elemento Ty são funcionalmente equivalentes às LTR retrovirais No elemento copia INT e RT são homólogos aos segmentos da integrase e transcriptase reversa respectivamente do gene pol Nelson6edbookindb 1088 Nelson6edbookindb 1088 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1089 DNA ao novo local A maioria dos transposons em eucarion tes usa esse mecanismo para transposição distinguindoos dos transposons bacterianos que se movem como DNA di retamente de uma localização no cromossomo para outra ver Figura 2541 Os retrotransposons não têm um gene env e portanto não podem formar partículas virais Podem ser considera dos vírus defeituosos capturados pelas células Compara ções entre retrovírus e transposons de eucariontes sugerem que a transcriptase reversa seja uma antiga enzima ante rior à evolução de organismos multicelulares De modo interessante muitos íntrons do grupo I e II também são elementos genéticos móveis Além de suas atividades de autosplicing eles codificam endonucleases de DNA que promovem seu movimento Durante trocas ge néticas entre células da mesma espécie ou quando o DNA é introduzido em uma célula por parasitas ou por outros meios essas endonucleases promovem a inserção do íntron em um local idêntico de outra cópia de DNA de um gene homólogo que não contenha o íntron em um processo de nominado homing endereçamento Figura 2637 En quanto o homing do íntron do grupo I se baseia no DNA o homing do íntron do grupo II ocorre por um intermediário de RNA As endonucleases dos íntrons do grupo II têm uma atividade associada de transcriptase reversa As proteínas podem formar complexos com os próprios íntrons de RNA depois que os íntrons sofrem splicing dos transcritos pri mários Como o processo de homing envolve a inserção do íntron de RNA no DNA e a transcrição reversa do íntron o movimento desses íntrons foi chamado de retrohoming Ao longo do tempo cada cópia de um gene em particular em uma população pode adquirir o íntron Muito mais raramen te o íntron pode inserir a si mesmo em uma nova localiza ção em um gene não relacionado Se esse evento não matar a célula hospedeira ele pode levar à evolução e distribuição de um íntron em uma nova localização As estruturas e me canismos usados por íntrons móveis apoiam a ideia de que pelo menos alguns íntrons se originaram como parasitas moleculares cujo passado evolutivo pode ser traçado aos retrovírus e transposons A telomerase é uma transcriptase reversa especializada Os telômeros as estruturas nas extremidades dos cromos somos lineares de eucariontes ver Figura 248 geralmen te consistem em várias cópias em tandem de uma pequena sequência de oligonucleotídeos Essa sequência geralmente tem a forma TxGy em uma fita e CyAx na fita complementar QUADRO 262 MEDICINA Combatendo a Aids com inibidores da transcriptase reversa do HIV Pesquisas sobre a química da biossíntese de ácidos nu cleicos dependentes de molde combinadas a técnicas mo dernas de biologia molecular elucidaram o ciclo de vida e a estrutura do vírus da imunodeficiência o retrovírus que causa Aids Poucos anos após o isolamento do HIV essa pesquisa resultou no desenvolvimento de fármacos capa zes de prolongar as vidas de pessoas infectadas pelo HIV O primeiro fármaco aprovado para uso clínico foi o AZT análogo estrutural da desoxitimidina O AZT foi sintetizado pela primeira vez em 1964 por Jerome P Horwitz Ele fracassou como fármaco anticâncer o pro pósito para o qual foi fabricado mas em 1985 foi desco berta a sua eficácia no tratamento da Aids O AZT é captado pelos linfócitos T células do sistema imune particularmente vulneráveis à infecção pelo HIV e convertido em trifosfato de AZT o consumo direto de tri fosfato de AZT seria ineficaz pois ele não consegue atra vessar a membrana plasmática A transcriptase reversa do HIV tem uma afinidade maior pelo trifosfato de AZT do que por dTTP e a ligação de trifosfato de AZT a essa en zima inibe competitivamente a ligação ao dTTP Quando o AZT é adicionado à extremidade 39 da fita de DNA em crescimento a ausência de uma hidroxila 39 significa que a fita de DNA é encerrada prematuramente e que a sínte se do DNA viral sofre uma parada O trifosfato de AZT não é igualmente tóxico para os próprios linfócitos T porque as DNApolimerases celulares têm uma afinidade menor por esse composto do que pelo dTTP Em concentrações de 1 a 5 mM o AZT afeta a transcrição reversa mas não a maior parte da replicação do DNA celular Infelizmente o AZT parece ser tóxico para as células da medula óssea que são as progenitoras dos eritrócitos e muitos indiví duos tomando AZT desenvolvem anemia O AZT pode aumentar o tempo de sobrevivência de pessoas com Aids avançada em cerca de um ano e retarda a implantação da Aids naqueles que ainda estão nos estágios iniciais da infecção pelo HIV Alguns outros compostos para Aids como a didesóxiinosina DDI têm um mecanismo de ação similar Novos fármacos têm como alvo e inativam a protease do HIV Devido à alta taxa de erro da transcrip tase reversa do HIV e à rápida evolução resultante desse vírus os tratamentos mais eficazes da infecção pelo HIV usam uma combinação de compostos direcionada tanto para a protease quanto para a transcriptase reversa O N N N NH CH3 HN N O O HOCH2 H N 1 2 O H H H H O HOCH2 H H H H H H N N 39Azido2939 didesoxitimidina AZT 2939Didesóxiinosina DDI Nelson6edbookindb 1089 Nelson6edbookindb 1089 030414 0748 030414 0748 1090 DAVID L NELSON MICHAEL M COX onde x e y estão geralmente na faixa de 1 a 4 p 984 Os telômeros variam em comprimento de algumas poucas dúzias de pares de bases em alguns protozoários ciliados a dezenas de milhares de pares de bases em mamíferos A fita TG é mais longa do que o seu complemento deixando uma região de DNA de fita simples de até algumas centenas de nucleotídeos na extremidade 39 As extremidades de um cromossomo linear não são prontamente replicadas pelas DNApolimerases celulares A replicação do DNA precisa de um molde e de um oligonu cleotídeo iniciador e além da extremidade de uma molécula de DNA linear nenhum molde está disponível para o parea mento de um oligonucleotídeo iniciador de RNA Sem um mecanismo especial para duplicar as extremidades os cro mossomos ficaram um pouco menores a cada geração celu lar A enzima telomerase descoberta por Carol Greider e Elizabeth Blackburn soluciona esse problema adicionando telômeros às extremidades do cromossomo Carol Greider Elizabeth Blackburn A descoberta e a purificação dessa enzima permitiram evidenciar um mecanismo de reação impressionante e sem precedentes A telomerase como algumas outras enzimas descritas nesse capítulo contém componentes de RNA e proteicos O componente de RNA tem cerca de 150 nu FIGURA 2637 Íntrons que se movem homing e retrohoming Certos íntrons incluem um gene mostrado em vermelho para enzimas que pro move homing certos íntrons do grupo I ou retrohoming certos íntrons do grupo II a O gene no íntron que sofreu splicing é ligado por um ribosso mo e traduzido Os íntrons do grupo I que sofrem homing especificam uma endonuclease específica do sítio chamada de uma endonuclease homing Os íntrons do grupo II que sofrem retrohoming especificam uma proteína tanto com atividades de endonuclease quanto de transcriptase reversa não mostradas aqui b Homing O alelo a de um gene X contendo um íntron do grupo I que sofre homing está presente em uma célula contendo o alelo b do mes mo gene que não possui o íntron A endonuclease de homing produzida por a cliva b na posição que corresponde ao íntron em a e o reparo da quebra da fita dupla recombinação com o alelo a ver Figura 2535 cria então uma nova cópia do íntron em b c Retrohoming O alelo a do gene Y contém um íntron do grupo II que sofre retrohoming o alelo b não tem o íntron O íntron que sofre splicing insere a si mesmo na fita codificadora de b em uma reação que é o inverso do splicing que retirou o íntron do transcrito primário ver Figura 2615 exceto que aqui a inserção é no DNA em vez de no RNA A fita de DNA não codificador de b é então clivada pela endonucleasetranscriptase reversa codificada no íntron Essa mesma en zima usa o RNA inserido como um molde para sintetizar uma fita de DNA complementar O RNA é então degradado pelas ribonucleases celulares e substituído por DNA Transcrição DNA para o gene X alelo a Íntron do grupo I Íntron do grupo II Splicing Transcrito primário Tradução Endonuclease do homing Produto do gene X Íntron do grupo que sofreu splicing a Produção de endonuclease de homing Endonuclease do homing Endonuclease DNA para o gene X alelo b nenhum íntron Gene X alelo a com íntron Reparo da quebra da fita dupla Transcrição Tradução Íntron que sofreu splicing Splicing reverso Splicing RNA substituído por DNA ligação a com íntron b com íntron b com íntron b Homing c Retrohoming Transcriptase reversa DNA para o gene Y alelo a doador Endonuclease transcriptase reversa DNA para o gene Y alelo b recipiente Nelson6edbookindb 1090 Nelson6edbookindb 1090 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1091 cleotídeos de comprimento e contém cerca de 15 cópia da repetição CyAx adequada do telômero Essa região do RNA atua como um molde para a síntese da fita TxGy do telômero A telomerase atua portanto como uma transcriptase reversa celular que fornece o sítio ativo para a síntese de DNA dependente de RNA Ao contrário das transcriptases reversas retrovirais a telomerase copia apenas um peque no fragmento de RNA que ela transporta no seu interior A síntese do telômero precisa da extremidade 39 de um cromossomo como iniciador e prossegue na direção nor mal 59S39 Tendo sintetizado uma cópia da repetição a enzima se reposiciona para retomar a extensão do telôme ro Figura 2638a Após a extensão da fita TxGy pela telomerase a fita com plementar CyAx é sintetizada pelas DNApolimerases celula res começando com um oligonucleotídeo iniciador de RNA ver Figura 2512 A região de fita simples é protegida por proteínas de ligação específicas em vários eucariontes infe riores especialmente aquelas espécies com telômeros com menos de algumas centenas de pares de bases Em euca riontes superiores incluindo mamíferos com telômeros de muitos milhares de pares de bases de comprimento a extremidade de fita única é sequestrada em uma estrutura especializada chamada de alça T Figura 2638b A ex tremidade de fita única é dobrada para trás e pareada com o seu complemento na porção de fita dupla do telômero A formação de uma alça em T envolve a invasão da extre a A telomerase se dissocia A RNAprimase sintetiza um iniciador de RNA na extremidade na fita do novo telômero A telomerase transloca A parte de fita única da extremidade do telômero é protegida pelas proteínas de ligação do telômero A DNApolimerase preenche o intervalo a DNAligase sela o corte final O iniciador de RNA é removido por uma RNAse dGTP dTTP PPi dGTP dTTP PPi RNA AAC C C C 59 39 59 AAC C C C 59 39 59 AAC C C C 59 39 59 AAC C C C 59 39 59 AAC C C C iniciador de RNA AACCCCA A CCCCA A CCCCA A CC C C AAC C C 59 39 59 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGG G TTG G G G T T G G G G T T G AAC C C C AACCCCA A CCCCA A CCCCA A CC C C AAC C C 59 39 59 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGG G TTG G G G T T G G G G T T G 39 AAC C C C AACCCCA A CCCCA A CCCCA A CC C C AAC C C 59 39 59 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGG G TTG G G G T T G G G G T T G 39 39 b c 39 59 TRF1 e TRF2 Fita TG Proteínas de ligação do telômero duplex Telômero duplex Proteínas de ligação do DNA Fita CA TRF1 e TRF2 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGG G TTG AAC C C C AAC 39 59 39 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGG G TTG G G G T T G AAC C C C AAC 39 59 39 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGG G TTG G G G T T G AAC C C C AAC 39 59 39 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGG G TTG G G G T T G G G G T T G AAC C C C AAC 39 59 39 Telomerase Iniciador TG FIGURA 2638 Síntese e estrutura do telômero a O molde interno de RNA se liga e pareia suas bases com o ini ciador TG TxGy de DNA A telomerase adiciona mais resíduos de T e G ao iniciador TG e então reposiciona o molde interno de RNA para permitir a adição de mais resíduos de T e G que geram a fita TG do telômero A fita complementar é sinteti zada pelas DNApolimerases celulares após priming por uma RNAprimase b Estrutura proposta de alças T em telômeros A cauda de fita única sintetizada pela telomerase é dobrada para trás e pareada com seu complemento na porção duplex do telômero O telômero é ligado por várias proteínas ligado ras do telômero incluindo TRF1 e TRF2 fatores de ligação a repetições teloméricas c Eletromicrografia de uma alça em T na extremidade de um cromossomo isolado do hepatócito de um camundongo A barra na parte de baixo da micrografia representa um comprimento de 5000 pb Nelson6edbookindb 1091 Nelson6edbookindb 1091 030414 0748 030414 0748 1092 DAVID L NELSON MICHAEL M COX midade 39 da fita única do telômero formando um duplex de DNA talvez por um mecanismo semelhante à iniciação da recombinação genética homóloga ver Figura 2535 Em mamíferos o DNA em alça é ligado por duas proteínas TRF1 e TRF2 a última envolvida na formação da alça T Essas alças protegem as extremidades 39 dos cromossomos tornandoas inacessíveis às nucleases e enzimas que repa ram as interrupções da fita dupla Em protozoários como a Tetrahymena a perda de ati vidade da telomerase resulta em um encurtamento gradual dos telômeros a cada divisão celular em última análise le vando à morte da linhagem celular Uma ligação semelhante entre o comprimento do telômero e a senescência celular interrupção da divisão celular foi observada em seres hu manos Em células germinativas que contêm atividade de te lomerase os comprimentos dos telômeros são mantidos em células somáticas que não apresentam telomerase eles não são Há uma relação linear e inversa entre o comprimento dos telômeros de fibroblastos em cultura e a idade dos indi víduos dos quais os fibroblastos foram retirados os telôme ros em células somáticas humanas encurtam gradualmente à medida que um indivíduo envelhece Se a telomerase da transcriptase reversa é introduzida em células somáticas hu manas in vitro a atividade de telomerase é restaurada e a duração da vida celular aumenta acentuadamente O encurtamento gradual dos telômeros é a chave para o processo de envelhecimento A duração do nosso ciclo de vida natural é determinada pelo comprimento dos telô meros com os quais os seres humanos nascem Pesquisas adicionais nessa área devem fornecer algumas informações fascinantes Alguns RNAs virais são replicados por RNApolimerase dependente de RNA Alguns bacteriófagos de E coli incluindo f2 MS2 R17 e Qb bem como alguns vírus de eucariontes incluindo os ví rus influenza e Sindbis o último associado a uma forma de encefalite têm genomas de RNA Os cromossomos de RNA de fita simples desses vírus que também funcionam como mRNA para a síntese de proteínas virais são replicados na célula hospedeira por uma RNApolimerase dependente de RNA RNAreplicase Todos os vírus de RNA com a exceção dos retrovírus devem codificar uma proteína com atividade de RNApolimerase dependente de RNA pois as células hospedeiras não têm essa enzima A RNAreplicase da maioria dos bacteriófagos de RNA tem um peso molecular de 210000 e consiste em quatro subunidades Uma subunidade Mr 65000 é o produto do gene da replicase codificado pelo RNA viral e tem o sítio ativo para replicação As outras três subunidades são pro teínas hospedeiras normalmente envolvidas na síntese pro teica da célula hospedeira os fatores de alongamento da E coli Tu Mr 45000 e Ts Mr 34000 que transportam os aminoaciltRNAs aos ribossomos e a proteína S1 parte in tegral da subunidade ribossomal 30S Essas três proteínas hospedeiras podem ajudar a RNAreplicase a localizar e a se ligar às extremidades 39 dos RNAs virais A RNAreplicase isolada das células de E coli infecta das por Qb catalisa a formação de um RNA complementar ao RNA viral em uma reação equivalente àquela catalisada por RNApolimerases dependentes de DNA A síntese de nova fita de RNA prossegue na direção 59S39 por um me canismo químico idêntico àquele usado em todas as outras reações de síntese de ácidos nucleicos que precisam de um molde A RNAreplicase precisa de RNA como seu molde e não funcionará com DNA Ela não tem uma atividade de re visão de endonuclease separada e tem uma taxa de erro se melhante àquela da RNApolimerase Ao contrário das DNA e RNApolimerases as RNAreplicases são específicas para o RNA de seu próprio vírus os RNA da célula hospedeira não são em geral replicados Isso explica como os vírus de RNA são preferencialmente replicados na célula hospedei ra que contém muitos outros tipos de RNA A síntese de RNA oferece pistas importantes para a evolução bioquímica A complexidade e a ordem ex traordinárias que distinguem os sistemas vivos dos inanimados são manifestações essenciais de processos vitais fundamentais A manutenção do estado vivo requer que transformações quí micas seletivas ocorram muito rapidamente especialmente aquelas que usam fontes de energia do meio e sintetizam macromoléculas celulares ela boradas ou especializadas A vida depende de catalisadores poderosos e seletivos enzimas e de sistemas de informação capazes tanto de armazenar de modo seguro o modelo dessas enzimas quanto de reproduzir acuradamente esse modelo ge ração após geração Os cromos somos codificam o molde não para a célula mas para as enzi mas que constroem e mantêm a célula As demandas paralelas por informação e catálise apre sentam um enigma clássico o que veio primeiro a informação necessária para especificar a es trutura ou as enzimas necessá rias para manter e transmitir a informação A revelação da complexi dade estrutural e funcional do RNA levou Carl Woese Francis Crick e Leslie Orgel a proporem nos anos 1960 que essa molé cula poderia servir tanto como transportadora de informação quanto como catalisadora A descoberta de RNA catalisado res conduziu essa proposta de Carl Woese 19282012 Francis Crick 19162004 Leslie Orgel 19272007 Nelson6edbookindb 1092 Nelson6edbookindb 1092 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1093 conjectura à hipótese e levou à ampla especulação de que um mundo de RNA pode ter sido importante na transição da química prébiótica para a vida ver Figura 136 O pro genitor de toda a vida nesse planeta no sentido de que ele poderia reproduzir a si mesmo ao longo das gerações da ori gem da vida ao momento atual pode ter sido uma molécula de RNA autorreplicadora ou um polímero com característi cas químicas equivalentes Como pode ter surgido um polímero autorreplicador Como ele poderia ter mantido a si mesmo em um meio em que os precursores para a síntese do polímero são escassos Como poderia a evolução progredir de tal polímero para o mundo moderno de DNAproteína Essas perguntas difíceis podem ser abordadas por meio de experimentação cuidado sa fornecendo pistas a respeito de como começou e evoluiu a vida na Terra A origem provável das bases de purina e pi rimidina é sugerida por experimentos projetados para testar hipóteses acerca da química prébiótica p 3334 A partir de moléculas simples que se acredita estavam presentes na atmosfera inicial CH4 NH3 H2O H2 descargas elétricas como relâmpagos geram primeiro moléculas mais reativas como o HCN e aldeídos então um conjunto de aminoáci dos e ácidos orgânicos ver Figura 134 Quando moléculas como o HCN se tornam abundantes as bases purina e piri midina são sintetizadas em quantidades detectáveis Nota velmente uma solução concentrada de cianeto de amônia submetida a refluxo por alguns dias produz adenina com rendimentos de até 05 Figura 2639 A adenina pode muito bem ter sido o primeiro e mais abundante constituinte de nucleotídeo a aparecer na Terra Curiosamente a maioria dos cofatores enzimáticos contém adenosina como parte da sua estrutura embora ela não desempenhe nenhum papel direto na função do cofator ver Figura 838 Talvez isso sugira uma relação evolutiva Com base na síntese simples de adenina a partir de cianeto a adenina pode simplesmente ter sido abundante e disponível A hipótese do mundo de RNA precisa de um polímero de nucleotídeos para reproduzir a si mesmo Uma ribozima pode acarretar sua própria síntese a partir de um molde Os pesquisadores estão próximos de encontrar tal ribozima ou sistema de ribozimas Por exemplo Gerald Joyce e colabo radores em 2009 relataram o primeiro conjunto de duas ribozimas que poderiam fazer a catálise cruzada da forma ção de cada um Figura 2640 Uma ribozima E catalisa a ligação de dois oligonucleotídeos A9 e B9 para criar uma segunda ribozima complementar chamada E9 E9 poderia então catalisar a ligação de dois outros oligonucleotídeos A e B para formar outra molécula de E Nesse sistema a formação de E e E9 foi baseada em molde e as quantidades cresceram exponencialmente enquanto substratos estive ram disponíveis e as proteínas estavam ausentes O sistema evoluiu de modo que enzimas mais eficientes apareceram na população Uma ribozima mais geral semelhante à RNA polimerase foi descrita em 2011 por Philipp Holliger e co laboradores De fato o ritmo das descobertas nesse campo está se acelerando Um polímero autorreplicador usaria rapidamente os suprimentos disponíveis de precursores fornecidos pelos processos relativamente lentos da química prébiótica Por tanto desde um estágio inicial da evolução seriam neces sárias vias metabólicas para gerar precursores de maneira eficiente com a síntese de precursores presumivelmente catalisada por ribozimas As ribozimas encontradas na na tureza têm um repertório limitado de funções catalíticas e não há qualquer vestígio das ribozimas que podem ter um dia existido A fim de explorar a hipótese do mundo de RNA mais profundamente é preciso saber se o RNA tem o po tencial de catalisar várias reações diferentes necessárias em um sistema primitivo de vias metabólicas A busca por RNA com novas funções catalíticas foi au xiliada pelo desenvolvimento de um método que rapida mente busca conjuntos de polímeros de RNA aleatórios e extrai aqueles com atividades particulares o SELEX é nada menos do que a evolução acelerada em um tubo de ensaio Quadro 263 Ele tem sido usado para gerar molé culas de RNA que se ligam a aminoácidos corantes orgâni cos nucleotídeos cianocobalamina e outras moléculas Os pesquisadores isolaram ribozimas que catalisam a formação de ligações de ésteres e amidas reações SN2 metalação adição de íons metálicos a de porfirinas e formação de ligações carbonocarbono A evolução de cofatores enzimá ticos com alças de nucleotídeos que facilitam sua ligação a ribozimas pode ter expandido ainda mais o repertório de processos químicos disponíveis para os sistemas metabóli cos primitivos Como será visto no próximo capítulo algumas molécu las de RNA naturais catalisam a formação de ligações pep tídicas oferecendo uma ideia de como o mundo de RNA pode ter sido transformado pelo maior potencial catalítico das proteínas A síntese de proteínas teria sido um evento importante na evolução do mundo de RNA mas também te ria apressado o seu desaparecimento O papel de transpor tador da informação do RNA pode ter passado para o DNA porque ele é quimicamente mais estável A RNAreplicase e a transcriptase reversa podem ser versões modernas de en zimas que um dia desempenharam papéis importantes em fazer a transição para o sistema moderno baseado em DNA A hipótese do mundo de RNA é agora apoiada por pelo menos cinco linhas de evidência Em primeiro lugar catali sadores de RNA existem O RNA portanto claramente tem a capacidade tanto de armazenar a informação quanto de catalisar reações Em segundo lugar a ampla faixa de rea ções para as quais os catalisadores de RNA se desenvolve ram é suficiente para formar a base de um sistema metabó lico primordial Em terceiro há numerosos RNA existentes provavelmente vestígios de um mundo de RNA incluindo ribozimas retrovírus vírus de RNA e retrotransposons Em quarto lugar um catalisador de RNA é responsável pela sín tese de proteínas Capítulo 27 Finalmente catalisadores N N H N NH2 N C C C C C HCN NH4CN Refluxo FIGURA 2639 Possível síntese prébiótica de adenina a partir de cianeto de amônia A adenina é derivada de cinco moléculas de cianeto indicadas pelo sombreamento Nelson6edbookindb 1093 Nelson6edbookindb 1093 030414 0748 030414 0748 1094 DAVID L NELSON MICHAEL M COX de RNA com capacidade de autorreplicação estão sendo descobertos em laboratório Um campo de investigação ati vo química prébiótica não descrito aqui está revelan do vias plausíveis para o aparecimento dos precursores de nucleotídeos na sopa prébiótica Parasitas moleculares podem também ter se originado em um mundo de RNA Com a aparência dos primeiros au torreplicadores ineficientes a transposição pode ter sido uma alternativa potencialmente importante à replicação como uma estratégia para a reprodução bemsucedida e a sobrevivência Os RNAs parasitas iniciais iriam simplesmen te se transformar em uma molécula autorreplicadora por meio de transesterificação catalisada e então sofrer replica ção passivamente A seleção natural teria levado a transpo sição a ser sítioespecífica tendo como alvo sequências que não interferiam com as atividades catalíticas do RNA hos pedeiro Os replicadores e os transposons de RNA podem ter existido em uma relação simbiótica primitiva cada um contribuindo para a evolução do outro Os íntrons moder nos retrovírus e transposons podem todos ser vestígios de uma estratégia de sobreposição seguida por RNAs parasi tas iniciais Esses elementos continuam a fazer importantes contribuições para a evolução dos seus hospedeiros Embora o mundo de RNA permaneça uma hipótese com muitas lacunas ainda a serem explicadas evidências experimentais dão apoio a uma lista crescente de seus elementoschave Experimentação adicional deve aumen tar nosso entendimento Pistas importantes para o quebra cabeça serão encontradas nos trabalhos da química fun damental em células vivas ou talvez em outros planetas Enquanto isso o universo de RNA continua a se expandir Quadro 264 b a A A B A E9 E9 B B9 A9 B9 A9 E E E E9 B E 59 39 39 59 G A U A G U U G A U A C G C U U A A U U A G C G U C G A U A U C G U A GG U A A U G UU GA A G G C C A G G A C C U U GG A G pppG A A A G A A U UU U H O G C A U U G U U A G C U C G G U A A C A G U U U G A A U G G G U A A G U U U G A C A A G A U U C A A G C U C G A U U G U U C U A A G G U FIGURA 2640 Replicação autossustentada de uma enzima de RNA Esse sistema tem muitas propriedades de um sistema vivo As moléculas de RNA incorporam informação e função catalítica e as reações produzem um aumento exponencial nos RNA produzidos Quando variantes dos substratos de RNA são introduzidas o sistema passa por seleção natural de modo que os melhores replicadores acabam por dominar a população a O esque ma da reação é destacado Oligorribonucleotídeos A e B hibridizam com a ribozima E9 e são ligados cataliticamente para formar a ribozima E A união dos oligorribonucleotídeos A9 e B9 é de modo semelhante catalisada pela ribozima E Os níveis de E e E9 crescem exponencialmente com um tempo de duplicação de cerca de uma hora a 42ºC desde que haja um suprimento de precursores A B A9 e B9 b A reação de ligação envolve ataque da 39OH de um oligorribonucleotídeo no afosfato do 59trifosfato do outro oligorri bonucleotídeo O pirofosfato é liberado O pareamento de bases dos subs tratos com a ribozima desempenha um papel fundamental em alinhar os substratos para a reação Nelson6edbookindb 1094 Nelson6edbookindb 1094 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1095 QUADRO 263 MÉTODOS O método SELEX para gerar polímeros de RNA com novas funções O SELEX evolução sistemática de ligantes por enrique cimento exponencial é usado para gerar aptâmeros oligonucleotídeos selecionados para se ligar firmemente a um alvo molecular específico O processo é geralmente automatizado para permitir identificação rápida de um ou mais aptâmeros com a especificidade de ligação desejada A Figura Q1 ilustra como o SELEX é usado para se lecionar uma espécie de RNA que se liga firmemente ao ATP Na etapa ➊ uma mistura aleatória de polímeros de RNA é submetida a seleção não natural passandoa por uma resina à qual ATP está ligado O limite prático para a complexidade de uma mistura de RNA no SELEX é de cerca de 10 15 sequências diferentes o que permite a alea torização completa de 25 nucleotídeos 4 25 5 10 15 Para RNAs maiores o conjunto de RNA usado para iniciar a busca não inclui todas as sequências possíveis Na etapa ➋ polímeros de RNA que passam pela coluna são descar tados na etapa ➌ aqueles que se ligam ao ATP são lava dos da coluna com solução salina e coletados Na etapa ➍ os polímeros de RNA coletados são amplificados pela transcriptase reversa para construir muitos complemen tos de DNA para os RNAs selecionados então uma RNA polimerase faz muitos complementos de RNA a partir das moléculas de DNA resultantes Na etapa ➎ esse novo conjunto de RNAs é submetido ao mesmo procedimento de seleção e o ciclo é repetido uma dúzia de vezes ou mais Ao final apenas alguns aptâmeros nesse caso as sequências de RNA com afinidade considerável por ATP permanecem As características da sequência crítica de um aptâme ro de RNA que se liga ao ATP são mostradas na Figura Q2 moléculas com essa estrutura geral se ligam ao ATP e outros nucleotídeos de adenosina com Kd 50 mM A Figura Q3 apresenta a estrutura tridimensional de um aptâmero de RNA de 36 nucleotídeos mostrado como um complexo com o AMP gerado pelo SELEX Esse RNA tem a estrutura básica mostrada na Figura Q2 Além do seu uso na exploração da funcionalidade potencial do RNA o SELEX tem um lado prático importante ao definir os RNA pequenos com uso farma cêutico Encontrar um aptâmero que se ligue especifica mente a cada alvo potencialmente terapêutico pode ser impossível mas a capacidade do SELEX de selecionar rapidamente e amplificar uma sequência de oligonucleo tídeos específicos a partir de um conjunto altamente complexo de sequências o torna uma abordagem promis sora para a produção de novas terapias Por exemplo se poderia selecionar um RNA que se liga fortemente a uma proteína receptora proeminente na membrana plasmáti ca de células em um tumor cancerígeno específico Blo quear a atividade do receptor ou direcionar uma toxina para as células tumorais ao ligála ao aptâmero mataria as células O SELEX também tem sido usado para selecio nar aptâmeros de DNA que detectam esporos do antraz Muitas outras aplicações promissoras se encontram em desenvolvimento 1015 sequências de RNA aleatórias Sequências de RNA que não se ligam ao ATP descartar Sequências de RNA que se ligam ao ATP Sequências de RNA enriquecidas para a função de ligação de ATP Amplificar ATP ligado a resinas Repetir FIGURA Q1 O procedimento SELEX G G A A A A A C G G U G 59 39 ATP FIGURA Q2 Aptâmero de RNA que se liga ao ATP Os nucleotídeos som breados são aqueles necessários para a atividade de ligação G AMP GGAAGAAACUG 39 59 FIGURA Q3 Derivado do PDB ID 1RAW Aptâmero de RNA ligado ao AMP As bases dos nucleotídeos conservados formando o bolsão de liga ção estão brancas o AMP ligado é vermelho Nelson6edbookindb 1095 Nelson6edbookindb 1095 030414 0748 030414 0748 1096 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Estimativas atuais do número de genes no genoma hu mano e em muitos outros genomas são mencionadas em vários locais ao longo desse texto Essas estimativas pres supõem que os cientistas conheçam um gene quando se deparam com ele com base em nossa compreensão atual do DNA RNA e proteínas Esse pressuposto é correto Como observado no Capítulo 9 menos de 2 do ge noma humano parece codificar proteínas Mesmo quan do os íntrons são levados em conta podese esperar que apenas uma minúscula fração do genoma seja transcrita em RNA principalmente mRNA para codificar aquelas proteínas O resto do genoma tem sido algumas vezes chamado de DNA lixo A alcunha lixo simplesmente re flete nossa ignorância que lentamente está dando lugar ao reconhecimento de que a maior parte do genoma é in teiramente funcional Em um esforço para melhor mape ar os limites do transcriptoma humano os pesquisadores desenvolveram novas ferramentas para determinar com maior precisão quais sequências genômicas são trans critas em RNA As respostas são surpreendentes Muito mais do nosso genoma é transcrito em RNA do que qual quer pessoa supunha A maior parte desse RNA parece não codificar proteínas A maioria dele não apresenta al gumas das estruturas p ex a cauda 39 de poliA que caracteriza o mRNA Então o que esse RNA está fazendo A maioria dos métodos de abordagem desse assunto cai em duas categorias amplas clonagem de cDNA e mi croarranjos A criação de uma biblioteca de cDNA para estudar os genes transcritos em um genoma particular de eucariontes é descrita no Capítulo 9 ver Figura 914 Entretanto os métodos clássicos para produzir cDNA frequentemente levam à clonagem de apenas parte da sequência de um certo transcrito Como a transcriptase reversa pode interromper sua atividade em regiões da es trutura secundária do mRNA ou pode simplesmente se dissociar frequentemente 20 ou menos dos clones em uma biblioteca de cDNA são DNA de comprimento total Isso torna difícil o uso da biblioteca para mapear os sítios de início da transcrição TSS e para estudar a parte de um gene que codifica a sequência aminoterminal de uma proteína Uma das várias abordagens desenvolvidas para superar esse problema está ilustrada na Figura Q1 Es ses refinamentos na tecnologia resultaram na criação de bibliotecas de cDNA em que mais de 95 dos clones têm comprimento total fornecendo uma fonte enriquecida de informação acerca dos RNA celulares Entretanto os cDNA são geralmente criados a partir de transcritos de RNA que têm caudas poliA O uso de microarranjos associado a métodos de preparação do cDNA que não de pendam das caudas poliA Figura Q2 revelaram que maior parte do RNA em células eucariontes não apresen ta as estruturas de terminação comuns Uma visão completa ainda não emergiu mas algumas conclusões já são claras Ao serem retiradas as sequên cias repetitivas p ex transposons que podem constituir QUADRO 264 Universo de RNA em expansão com RNA TUF Várias proteínas ligadoras de RNA Faça cDNA iniciador e transcriptase reversa Ligue covalentemente a biotina B ao quepe B B B B Degrade o RNA não pareado ao cDNA com a RNase I Isole o cDNA de comprimento total ligado à biotina Tecido B B B B B B Isole o RNA Remova proteínas Remova proteínas Imunoprecipite FIGURA Q1 Uma estratégia para clonar todos os cDNAs Um conjunto de mRNAs é isolado de uma amostra de tecido Em alguns casos os mRNAs ligados por uma proteína em particular podem ser marcados imunoprecipi tando a proteína e isolando os mRNAs associados A biotina B é covalente mente ligada às extremidades 59 fazendo uso das características únicas do quepe 59 Um iniciador roxo polidT é usado para disparar a transcrição reversa dos mRNAs A RNase I degrada o RNA que não é parte de um híbrido de DNARNA e portanto destrói os pares incompletos cDNARNA Os híbri dos de comprimento total cDNARNA são coletados com contas de estrep tavidina que se ligam à biotina convertidos em DNA duplex e clonados Nelson6edbookindb 1096 Nelson6edbookindb 1096 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1097 até metade do genoma de mamíferos pelo menos 40 e talvez a grande maioria do DNA genômico restante é transcrita em RNA Parece haver mais RNA sem caudas de poliA do que RNA com elas A maior parte desse RNA não é transportada para o citoplasma mas permanece exclusi vamente no núcleo Vários segmentos do genoma são trans critos em ambas as fitas um transcrito é o complemento do outro uma relação chamada de antissenso Vários dos RNAs antissenso podem estar envolvidos na regulação dos RNAs com os quais eles pareiam Muitos RNAs são produzidos em apenas um ou poucos tecidos e novos transcritos são descobertos toda vez que uma nova fonte de tecidos é analisada Desse modo o transcriptoma completo ain da não foi definido para qualquer organismo O mais importante muitos dos novos RNAs são transcritos a partir de segmentos genô micos como aqueles ilustrados na Figura 915 que compartilham sintenia em mais de um organismo Essa conservação evolutiva sugere fortemente que esses RNA têm uma importante função Alguns dos novos RNAs são snoRNAs snRNAs ou miRNAs tipos de RNAs des cobertos apenas nas últimas duas déca das Novas sequências TSS estão sendo descobertas Novas classes de moléculas de RNA estão sendo definidas Novos pa drões de splicing alternativo estão sendo elucidados E todas essas descobertas es tão desafiando nossas definições de gene Nos genomas de camundongos e humanos mesmo os familiares transcritos de mRNAs codificadores de proteína podem ser mui to mais numerosos do que inicialmente se pensava e o número de genes conhecidos codificadores de proteínas pode em breve aumentar En tretanto a função da maioria desses transcritos recen temente descobertos não é conhecida e eles podem ser simplesmente chamados de TUF transcritos de função desconhecida transcripts of unknown function Esse novo universo de RNA é uma fronteira que promete co nhecimentos adicionais nas investigações de células eu cariontes e talvez um novo olhar sobre nossas origens no mundo de RNA do passado distante Sequência do genoma Oligos sintetizados para o microarranjo a b Tecido RNA nuclear RNA citosólico poliA poliA poliA poliA Fazer cDNA Iniciadores polidT Fazer cDNA Iniciadores aleatórios Fazer cDNA Iniciadores polidT Fazer cDNA Iniciadores aleatórios Microarranjo de DNA Microarranjo Marcar o cDNA com corante fluorescente e sondar o microarranjo FIGURA Q2 Definindo o transcriptoma com microar ranjos a Blocos de microarranjos são sintetizados re presentando as partes não repetitivas do genoma Em um arranjo desse tipo os oligonucleotídeos sucessivos nos pontos individuais se sobrepõem em sequência de modo que cada nucleotídeo como o T mostrado em azul é representado múltiplas vezes b Uma amostra de tecido é fracionada para separar amostras nucleares e citoplasmáticas e o RNA é isolado de cada uma delas O RNA contendo caudas de poliA é separado do RNA sem as caudas passando o RNA por uma coluna com polidT ligado O RNA com uma cauda de poliA é convertido em cDNA usando os métodos descritos na Figura Q1 RNA que não possui uma cauda de poliA é convertido a cDNA usando iniciadores com sequências aleatórias Os fragmentos de DNA resultantes não correspondem em comprimento precisamente aos RNAs dos quais eles se originaram mas o conjunto geral de DNA inclui a maioria das sequências presentes nos RNAs originais As amos tras de cDNA são então marcadas e usadas para sondar os microarranjos Os sinais dos microarranjos definem as sequências que foram transcritas em RNA Nelson6edbookindb 1097 Nelson6edbookindb 1097 030414 0748 030414 0748 1098 DAVID L NELSON MICHAEL M COX RESUMO 263 Síntese de RNA e DNA dependente de RNA c As DNApolimerases dependentes de RNA também chamadas de transcriptases reversas foram descober tas primeiro em retrovírus que devem converter seus genomas de RNA em DNA de fita dupla como parte do seu ciclo vital Essas enzimas transcrevem o RNA viral em DNA um processo que pode ser usado experimen talmente para formar DNA complementar c Muitos transposons de eucariontes são relacionados a retrovírus e seu mecanismo de transposição inclui um RNA intermediário c Telomerase a enzima que sintetiza as extremidades do telômero dos cromossomos lineares é uma transcripta se reversa especializada que contém um molde interno de RNA c As RNApolimerases dependentes de RNA tais como as replicases dos bacteriófagos RNA são específicas de molde para o RNA viral c A existência de RNA catalíticos e vias para a intercon versão de RNA e DNA levou à especulação de que um importante estágio na evolução foi o aparecimento de um RNA ou um polímero equivalente que poderia ca talisar sua própria replicação O potencial bioquímico dos RNA pode ser explorado pelo SELEX um método para selecionar rapidamente sequências de RNA com propriedades particulares ou catalíticas Termoschave Termos em negrito são definidos no glossário transcrição 1057 RNA mensageiro mRNA 1057 RNA transportador tRNA 1057 RNA ribossomal rRNA 1057 transcriptoma 1057 RNA polimerase dependente de DNA 1058 fitamolde 1059 fita não molde 1059 fita codificadora 1059 promotor 1060 sequência de consenso 1060 footprinting 1062 proteína receptora de cAMP CRP 1061 repressor 1061 fatores de transcrição 1066 ribozimas 1069 transcrito primário 1069 splicing de RNA 1069 quepe 59 1070 spliceossomo 1072 RNA nuclear pequeno snRNA 1073 cauda poliA 1075 polimerasepoliadenilada 1075 RNA nucleolar pequeno snoRNA 1079 snoRNP 1079 microRNA miRNA 1081 sequênciaguia interna 1082 exossomo 1084 polinucleotídeofosforilase 1085 transcriptase reversa 1086 retrovírus 1087 DNA complementar cDNA 1087 homing 1089 telomerase 1090 alça T 1091 RNApolimerase dependente de RNA RNAreplicase 1092 SELEX 1093 aptâmero 1095 Leituras adicionais Geral Cox MM Doudna JA ODonnell M 2012 Molecular Biology Principles and Practice W H Freeman and Company New York Jacob F Monod J 1961 Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins J Mol Biol 3 318356 Artigo clássico que introduziu muitas ideias importantes Síntese de RNA guiada por DNA Gruber TM Gross CA 2003 Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space Annu Rev Microbiol 57 441466 Herbert KM Greenleaf WJ Block SM 2008 Single molecule studies of RNA polymerase motoring along Annu Rev Biochem 77 149176 Kuehner JN Pearson EL Moore C 2011 Unravelling the means to an end RNA polymerase II transcription termination Nat Rev Mol Cell Biol12 283294 Laine JP Egly JM 2006 When transcription and repair meet a complex system Trends Genet 22 430436 Mooney RA Darst SA Landick R 2005 Sigma and RNA polymerase an onagain offagain relationship Mol Cell 20 335345 Nudler E 2009 RNA polymerase active center the molecular engine of transcription Annu Rev Biochem 78 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ribocyte Annu Rev Genet 36 125151 Especulações detalhadas sobre como pode ter sido uma forma de vida baseada em RNA e um bom resumo da pesquisa por trás delas Problemas 1 RNApolimerase a Quanto tempo demoraria para a RNApolimerase da E coli sintetizar o transcrito primário dos genes de E coli que codificam as enzimas para o metabolismo da lactose o óperon lac de 5300 pb considerado no Capítulo 28 b Quanto se move ao longo do DNA a bolha formada pela RNApolimerase em 10 segundos 2 Erro de conexão por RNApolimerases As DNApoli merases são capazes de edição e correção de erros enquanto a capacidade de correção de erros nas RNApolimerases parece ser bastante limitada Uma vez que um erro de uma única base na replicação ou transcrição pode levar a um erro na síntese proteica sugira uma explicação biológica possível para essa diferença 3 Processamento do RNA póstranscricional Prevê os prováveis efeitos de uma mutação na sequência 59AAUAAA no transcrito de um mRNA de eucariontes 4 Fita codificadora versus fitamolde O genoma do RNA do fago Qb é a fita não molde ou fita codificadora e quan do introduzido na célula funciona como um mRNA Suponha que a RNAreplicase do fago Qb tenha sintetizado primaria mente uma fitamolde de RNA e singularmente a incorporado em vez de fitas não molde nas partículas virais Qual seria o destino das fitasmolde quando elas entram em uma nova célu la Que enzima teria que ser incluída nas partículas virais para uma invasão bemsucedida de uma célula hospedeira 5 Transcrição O gene codificando a enzima b galactosida se de E coli se inicia com a sequência ATGACCATGATTACG Qual é a sequência do transcrito de RNA especificado por essa parte do gene 6 A química da biossíntese de ácidos nucleicos Des creva três propriedades comuns às reações catalisadas pela DNApolimerase RNApolimerase transcriptase reversa e RNAreplicase Como a enzima polinucleotídeofosforilase é semelhante e diferente de cada uma dessas quatro enzimas 7 Splicing de RNA Qual é o número mínimo de reações de transesterificação necessárias para realizar splicing de um íntron a partir de um transcrito de mRNA Explique 8 Processamento de RNA Se o splicing de mRNA em uma célula de vertebrado é bloqueado as reações de modifi cação do rRNA também são bloqueadas Sugira uma razão para isso 9 Genomas de RNA Os vírus de RNA têm genomas rela tivamente pequenos Por exemplo os RNA de fita simples de retrovírus têm cerca de 10000 nucleotídeos e o RNA Qb tem apenas 4220 nucleotídeos de comprimento Dadas as proprie dades da transcriptase reversa e da RNA replicase descritas nesse capítulo você pode sugerir uma razão para o tamanho pequeno desses genomas virais Nelson6edbookindb 1099 Nelson6edbookindb 1099 030414 0748 030414 0748 1100 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 10 Rastreamento de RNA por SELEX O limite prático para o número de diferentes sequências de RNA que pode ser rastreado em um experimento SELEX é de 10 15 a Suponha que você está trabalhando com oligonucleotídeos de 32 nucleo tídeos de comprimento Quantas sequências existem em um conjunto aleatório contando cada sequência possível b Que percentual dessas pode ser rastreado em um experimento SE LEX c Suponha que você deseja selecionar uma molécula de RNA que catalisa a hidrólise de um éster em particular A partir do que você sabe sobre catálise proponha uma estra tégia SELEX que possa lhe permitir selecionar o catalisador apropriado 11 Morte lenta O cogumelo mortal Amanita phalloi des contém várias substâncias perigosas incluindo a letal aamanitina Essa toxina bloqueia o alongamento do RNA em consumidores do cogumelo ao se ligar à RNApolimerase II de eucariontes com muita afinidade ela é mortal em concentra ções tão baixas quanto 10 8 M A reação inicial à ingestão do cogumelo é a de distúrbio gastrintestinal causado por algumas outras toxinas Esses sintomas desaparecem mas cerca de 48hs depois o consumidor de cogumelos morre geralmente de disfunção hepática Especule sobre por que demora tanto tempo para a aamanitina matálo 12 Detecção de linhagens de tuberculose resisten tes à rifampicina A rifampicina é um importante anti biótico usado para tratar a tuberculose e outras doenças mico bacterianas Algumas linhagens de Mycobacterium tuberculosis o agente causador da tuberculose são resistentes à rifampicina Essas linhagens se tornam resistentes por meio de mutações que alteram o gene rpoB que codifica a subunidade b da RNApoli merase Rifampicina não pode se ligar à RNApolimerase mutante e assim não é capaz de bloquear a iniciação da transcrição As sequências de DNA de um grande número de linhagens de M tuberculosis resistentes à rifampicina apresentaram mutações em uma região específica de 69 pb do rpoB Uma linhagem resis tente à rifampicina bem caracterizada tem a alteração de um úni co par de bases no rpoB que resulta na substituição de um resí duo de His por um resíduos de Asp na subunidade b a Com base no seu conhecimento da química de proteí nas sugira uma técnica que permita a detecção de uma linha gem resistente à rifampicina contendo essa proteína mutante específica b Com base no seu conhecimento da química de ácidos nucleicos sugira uma técnica para identificar a forma mutante do rpoB Bioquímica na internet 13 O gene da ribonuclease A ribonuclease pancreática humana tem 128 resíduos de aminoácidos a Qual é o número mínimo de pares de nucleotídeos ne cessários para codificar essa proteína b O mRNA expressado em células pancreáticas humanas foi copiado com a transcriptase reversa para criar uma biblio teca de DNA humano A sequência do mRNA que codifica a ribonuclease pancreática humana foi determinada pelo se quenciamento do DNA complementar cDNA a partir dessa biblioteca que incluiu uma fase de leitura aberta para essa pro teína Use o sistema de banco de dados Entrez wwwncbinlm nihgovEntrez para encontrar a sequência publicada desse mRNA procure no banco de dados CoreNucleotide pelo nú mero de acesso D26129 Qual é o comprimento desse mRNA c Como você pode explicar a discrepância entre o tama nho que você calculou em a e o tamanho real do mRNA Problema de análise de dados 14 O caso da edição do RNA O receptor AMPA ácido aamino3hidróxi5metil4isoxazolepropiônico é um com ponente importante do sistema nervoso humano Ele está pre sente de várias formas em diferentes neurônios e parte dessa variedade resulta de modificação póstranscricional Esse pro blema explora a pesquisa no mecanismo de edição do RNA Um relato inicial de Sommer e coautores 1991 abordou a sequência que codifica um resíduochave de Arg no receptor AMPA A sequência do cDNA ver Figura 914 para o recep tor AMPA mostrou um códon CGG Arg ver Figura 277 para esse aminoácido De maneira surpreendente o DNA genômico mostrou um códon CAG Gln nessa posição a Explique como esse resultado é consistente com a mo dificação póstranscricional do mRNA do receptor AMPA Rueter e colaboradores 1995 investigaram esse mecanis mo detalhadamente Primeiro eles desenvolveram um ensaio com base no método de sequenciamento de DNA de Sanger para diferenciar entre transcritos editados e não editados ver Figura 833 Eles modificaram a técnica para determinar se a base em questão era um A como em CAG ou não Eles desig naram dois iniciadores de DNA com base na sequência genô mica do DNA dessa região do gene AMPA Esses iniciadores e a sequência de DNA genômico da fita não molde para a região relevante do gene receptor do AMPA são mostrados ao final da página o resíduo A editado está em vermelho A fim de detectar se esse A estava presente ou foi editado por outra base Rueter e colaboradores usaram o seguinte pro cedimento 1 Prepararam cDNA complementar ao mRNA usando iniciador 1 transcriptase reversa dATP dGTP dCTP e dTTP 2 Removeram o mRNA 3 Hibridizaram o iniciador 2 marcado com 32P com o cDNA e reagiram isso com DNApolimerase dGTP dCTP dTTP e ddATP didesóxi ATP ver Figura 833 4 Desnaturaram os duplexes resultantes e os separaram com eletroforese em gel de poliacrilamida ver Figura 318 5 Detectaram espécies de DNA marcado com 32P por meio da autorradiografia Eles descobriram que o mRNA editado produziu um DNA 32P de 22 nucleotídeos enquanto um mRNA não editado produziu um DNA 32P de 19 nucleotídeos b Usando as sequências a seguir explique como os mRNA editados e não editados resultaram nesses diferentes produtos Usando o mesmo procedimento para medir a fração de transcritos editada sob diferentes condições os pesquisado 59 GTCTCTGGTTTTCCTT G G G T G C C T T TAT G CA G CA A G G AT G C G ATAT T T C G C CA A G C GT T C C T AC GC T AT AAAGC GGT T C 59 59 CCTT G G G T G C C T T T A Oligonucleotídeo iniciador 1 Oligonucleotídeo iniciador 2 Nelson6edbookindb 1100 Nelson6edbookindb 1100 030414 0748 030414 0748 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1101 res descobriram que extratos de células epiteliais em cultu ra uma linhagem celular comum chamada HeLa poderiam editar o mRNA em um nível superior A fim de determinar a natureza do maquinário de edição eles prétrataram um extrato celular ativo HeLa como descrito na tabela e medi ram sua capacidade de editar mRNA AMPA A proteinase K degrada apenas proteínas a nuclease de micrococos apenas DNA Amostra Prétratamento mRNA editado 1 Nenhum 18 2 Proteinase K 5 3 Aquecimento a 65C 3 4 Aquecimento a 85C 3 5 Nuclease de micrococos 17 c Use esses dados para argumentar que a máquina de edição consiste em proteína Qual é uma fragilidade importan te nesse argumento Para determinar a natureza exata da base editada Rueter e colaboradores usaram o seguinte procedimento 1 Produziram mRNA usando a 32PATP na mistura de reação 2 Editaram o mRNA marcado pela incubação do extrato HeLa 3 Hidrolisaram o mRNA editado em nucleotídeos mono fosfatos isolados com a nuclease P1 4 Separaram os nucleotídeos monofosfatos com cromato grafia de camada fina TLC ver Figura 1025b 5 Identificaram com autorradiografia os nucleotídeos mo nofosfatos resultantes marcados com 32P Em mRNA não editado encontraram apenas 32PAMP em mRNA editado encontraram principalmente 32PAMP com al guns 32PIMP inosina monofosfato ver Figura 2236 d Por que foi necessário usar a 32PATP em vez de b 32PATP ou g 32PATP nesse experimento e Por que foi necessário usar a 32PATP em vez de a 32PGTP a 32PCTP ou a 32PUTP f Como o resultado exclui a possibilidade que todo o nu cleotídeo A açúcar base e fosfato foi removido e substituído por um nucleotídeo I durante o processo de edição Em seguida os pesquisadores editaram o mRNA que foi marcado com 28 3HATP e repetiram o procedimento acima Os únicos mononucleotídeos produzidos marcados com 3H fo ram o AMP e o IMP g Como esse resultado exclui a remoção da base A dei xando intacto o esqueleto de açúcarfosfato seguido pela substituição com uma base I como mecanismo de edição Qual então é o mecanismo mais provável de edição nesse caso h Como a mudança de um A para um resíduo I no mRNA explica uma alteração de Gln para Arg na sequência de proteí nas nas duas formas da proteína receptora AMPA Dica ver Figura 278 Referências Rueter SM Burns CM Coode SA Mookherjee P Emesont RB 1995 Glutamate receptor RNA editing in vitro by enzymatic conversion of adenosine to inosine Science 267 14911494 Sommer B Köhler M Sprengel R Seeburg PH 1991 RNA editing in brain controls a determinant of íon flow in glutamategated channels Cell 67 1119 Nelson6edbookindb 1101 Nelson6edbookindb 1101 030414 0748 030414 0748 Nelson6edbookindb 1102 Nelson6edbookindb 1102 030414 0748 030414 0748 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 271 O código genético 1103 272 Síntese proteica 1113 273 Endereçamento e degradação das proteínas 1139 A s proteínas são os produtos finais da maioria das vias de informação A toda hora uma célula típica requer milhares de proteínas diferentes as quais precisam ser sintetizadas em resposta às necessidades da célula naque le momento transportadas direcionadas para seus locais apropriados na célula e degradadas quando não mais se fi zerem necessárias Muitos dos componentes e mecanismos básicos utilizados pela maquinaria de síntese proteica são notavelmente bem conservados em todas as formas de vida de bactérias a eucariotos o que indica que esses compo nentes e mecanismos já estavam presentes no último an cestral comum universal de todos os organismos existentes hoje LUCA de last universal common ancestor A compreensão da síntese de proteínas o mais com plexo processo de biossíntese tem sido um dos maiores desafios da bioquímica A síntese proteica em eucariotos envolve mais de 70 proteínas ribossomais diferentes 20 ou mais enzimas para ativar os precursores de aminoácidos uma dúzia ou mais de enzimas auxiliares e outros fatores proteicos para as etapas de iniciação alongamento e térmi no de polipeptídeos talvez 100 enzimas adicionais para o processamento final das diferentes proteínas e 40 ou mais tipos de RNAs transportadores e ribossomais Ao todo qua se 300 macromoléculas diferentes cooperam para a síntese de polipeptídeos Muitas dessas macromoléculas estão or ganizadas dentro da complexa estrutura tridimensional do ribossomo Para se ter uma ideia do quanto a síntese de proteínas é importante para a célula considere os recursos celula res destinados a esse processo A síntese proteica chega a consumir 90 do total de energia utilizada por uma célula para reações biossintéticas Todas as células de bactérias arquibactérias e eucariotos contêm de algumas a milhares de cópias de diferentes proteínas e RNAs Os 15000 ribos somos 100000 moléculas de enzimas e fatores proteicos envolvidos na síntese de proteínas e 200000 moléculas de tRNA em uma célula bacteriana típica correspondem a mais de 35 do peso seco da célula Apesar da grande complexidade do processo de síntese proteica as proteínas são produzidas de forma extraordi nariamente rápida Um polipeptídeo de 100 resíduos de aminoácidos é sintetizado em uma célula de Escherichia coli a 37C em cerca de 5 segundos A síntese de milha res de proteínas diferentes em uma célula é firmemente regulada de modo que as cópias são feitas apenas em nú meros suficientes para suprir as necessidades metabólicas daquele dado momento Para manter a combinação e as concentrações apropriadas de proteínas os processos de endereçamento e degradação devem estar sincronizados com o de síntese As pesquisas estão gradativamente des cobrindo a finamente coordenada coreografia celular que guia cada proteína para seu local apropriado na célula e que degrada essa proteína seletivamente quando ela não é mais necessária O estudo da síntese de pro teínas oferece outra recompen sa importante uma visão de um mundo de catalisadores de RNA que pode ter existido antes do início da vida como a conhe cemos A elucidação sobre a estrutura tridimensional dos ribossomos que teve início no ano 2000 tem nos proporcio nado uma visão cada vez mais detalhada dos mecanismos de síntese proteica Também confirmou uma hipótese que havia sido levantada primeira mente por Harry Noller duas décadas atrás as proteínas são sintetizadas por uma gigantesca enzima formada por RNA 271 O código genético Três grandes avanços estabeleceram o cenário para o nosso atual conhecimento sobre a biossíntese de proteínas Pri meiro no início da década de 1950 Paul Zamecnik e co laboradores planejaram uma série de experimentos para investigar onde as proteínas são sintetizadas na célula Eles injetaram aminoácidos radioativos em ratos e a intervalos diferentes de tempo após a injeção retiraram o fígado ho mogeneizaramno fracionaram o material homogeneizado por centrifugação e examinaram a presença de proteína radioativa nas frações subcelulares Quando se decorriam horas ou dias após a injeção dos aminoácidos marcados to das as frações subcelulares continham proteínas marcadas Por outro lado quando se deixava passar apenas alguns minutos as proteínas marcadas apareciam somente em uma fração contendo pequenas partículas de ribonucleo proteínas Essas partículas visíveis nos tecidos animais por Harry Noller 27 Metabolismo das Proteínas Nelson6ed27indd 1103 Nelson6ed27indd 1103 020514 1725 020514 1725 1104 DAVID L NELSON MICHAEL M COX microscopia eletrônica foram então identificadas como o local da síntese de proteínas a partir dos aminoácidos e mais tarde foram denominadas ribossomos Figura 271 O segundo avançochave foi feito por Mahlon Hoagland e Zamecnik quando eles des cobriram que os aminoácidos eram ativados quando incu bados com ATP e com a fração citosólica das células hepáticas Os aminoácidos se ligavam a um RNA termoestável solúvel do tipo que havia sido descoberto e caracterizado por Robert Holley e mais tarde denominado RNA transportador tRNA para formar aminoaciltRNA As enzimas que catalisam esse processo são as aminoacil tRNAsintases O terceiro avanço resultou dos argumentos de Francis Crick acerca de como a informação genética codificada na linguagem de 4 letras dos ácidos nucleicos era capaz de ser traduzida na linguagem de 20 letras das proteínas Um pe queno ácido nucleico talvez RNA poderia ter o papel de um adaptador e uma parte da molécula adaptadora ligaria um aminoácido específico enquanto outra parte reconhe ceria a sequência nucleotídica que codifica aquele aminoá cido no mRNA Figura 272 Essa ideia foi logo verificada O tRNA adaptador traduz a sequência nucleotídica de um mRNA na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo O processo geral da síntese proteica dirigida por mRNA é com frequência chamado simplesmente de tradução Esses três avanços logo levaram à identificação das três etapas principais da síntese proteica e finalmente à eluci dação do código genético que especifica cada aminoácido O código genético foi decifrado utilizandose moldes artificiais de mRNA Por volta da década de 1960 já era evidente que pelo me nos três resíduos de nucleotídeos no DNA eram necessários para codificar cada aminoácido As quatro letras do código de DNA A T G e C em grupos de dois podem gerar ape nas 4 2 5 16 combinações diferentes o que é insuficiente para codificar 20 aminoácidos Grupos de três no entanto geram 4 3 5 64 combinações diferentes Várias propriedadeschave do código genético foram es tabelecidas nos primeiros estudos genéticos Figuras 273 e 274 Um códon é um triplete de nucleotídeos que codi fica um aminoácido específico A tradução ocorre de forma Paul Zamecnik 19122009 Citosol Lúmen do RE Ribossomos FIGURA 271 Ribossomos e retículo endoplasmático Micrografia ele trônica e desenho esquemático de uma porção de uma célula pancreática mostrando os ribossomos aderidos à superfície externa citosólica do retícu lo endoplasmático RE Os ribossomos são os numerosos pontos ao longo das camadas paralelas de membrana U A G C Aminoácido U C G G U G A U A C mRNA H C R O2 C H3N 1 Sítio de ligação ao aminoácido Adaptador Triplete de nucleotídeos que codifica um aminoácido O FIGURA 272 A hipótese de um adaptador proposta por Crick Hoje sabese que o aminoácido está ligado covalentemente à extremidade 39 de uma molécula de tRNA e que um triplete de nucleotídeos específico em ou tra parte do tRNA interage com um códon triplete específico do mRNA por meio de ligações de hidrogênio entre bases complementares Código não sobreposto A U A C G A G U C 1 2 3 Código sobreposto A U A C G A G U C 1 2 3 FIGURA 273 Códigos genéticos com e sem sobreposição Em um código sem sobreposição os códons enumerados consecutivamente não compartilham nucleotídeos Em um código com sobreposição alguns nucleotídeos no mRNA são compartilhados por diferentes códons Em um código triplete com sobreposição máxima muitos nucleotídeos como por exemplo o terceiro nucleotídeo da esquerda para a direita A são compar tilhados por três códons Observe que em um código com sobreposição a sequência triplete do primeiro códon limita as possíveis sequências para o segundo códon Um código sem sobreposição permite muito maior flexibi lidade para as sequências tripletes dos códons vizinhos e portanto para as possíveis sequências de aminoácidos designadas pelo código Hoje sabese que o código genético utilizado por todos os sistemas vivos é sem sobre posição Nelson6ed27indd 1104 Nelson6ed27indd 1104 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1105 tal que esses tripletes de nucleotídeos são lidos de maneira sucessiva e sem sobreposição Um primeiro códon específi co na sequência estabelece a fase de leitura na qual a cada três resíduos de nucleotídeos iniciase um novo có don Não há interrupção entre os códons para os resíduos de aminoácidos sucessivos A sequência de aminoácidos de uma proteína é definida por uma sequência linear de triple tes contíguos A princípio qualquer sequência de DNA fita simples ou mRNA tem três fases de leitura possíveis Cada fase de leitura apresenta uma sequência diferente de có dons Figura 275 mas apenas uma deverá codificar uma dada proteína Ainda restava uma questãochave quais eram as palavras de três letras em código para cada amino ácido Em 1961 Marshall Ni renberg e Heinrich Matthaei relataram a primeira grande descoberta nesse sentido Eles incubaram poliuridilato sinté tico poliU com um extrato de E coli GTP ATP e uma mistura dos 20 aminoácidos em 20 tubos diferentes cada um contendo um dos aminoá cidos marcado radioativamen te Como o mRNA poliU é constituído por muitos triple tes UUU sucessivos ele deve ria codificar a síntese de um polipeptídeo contendo apenas o aminoácido codificado por UUU De fato um polipeptídeo radioativo foi formado em apenas um dos 20 tubos aquele contendo fenilalanina ra dioativa Assim Nirenberg e Matthaei concluíram que o có don UUU codifica a fenilalanina A mesma abordagem logo mostrou que policitidilato poliC codifica um polipeptí deo contendo apenas prolina poliprolina e poliadenilato poliA codifica polilisina Poliguanilato não deu origem a qualquer polipeptídeo nesse experimento porque forma espontaneamente tétrades ver Figura 820d que não se ligam nos ribossomos Os polinucleotídeos sintéticos utilizados nesse experi mento foram preparados com a polinucleotídeofosforilase p 1085 que catalisa a formação de polímeros de RNA a partir de ADP UDP CDP e GDP Essa enzima descoberta por Severo Ochoa não necessita de molde e forma políme ros com uma composição de bases que reflete diretamente as concentrações relativas dos precursores os nucleosí deos 59difosfatos presentes no meio Se a polinucleotídeo fosforilase for colocada em meio contendo apenas UDP ela formará apenas poliU Se estiver presente uma mistura contendo 5 partes de ADP e uma parte de CDP ela formará um polímero no qual cerca de cinco sextos dos resíduos são adenilato e um sexto é citidilato Esse polímero aleatório provavelmente terá muitos tripletes com a sequência AAA números menores de tripletes AAC ACA e CAA relativa mente menos tripletes ACC CCA e CAC e muito poucos tripletes CCC Tabela 271 Utilizando uma variedade de mRNA artificiais sintetizados pela polinucleotídeofosforila se a partir de diferentes misturas de ADP GDP UDP e CDP os grupos de Nirenberg e de Ochoa logo identificaram as composições de bases dos tripletes que codificam quase to dos os aminoácidos Apesar de esses experimentos revela rem a composição de bases dos tripletes codificadores eles não foram capazes de revelar a sequência das bases CONVENÇÃOCHAVE Grande parte da discussão que se segue trata de tRNA O aminoácido especificado por um tRNA é indicado por um sobrescrito como o tRNA Ala e o tRNA ami noacilado é indicado por um nome com hífen alaniltRNA Ala ou AlatRNA Ala Marshall Nirenberg 19272010 FIGURA 274 O código sem sobreposição em triplete As evidências para a natureza geral do código genético vieram de muitos tipos de experi mentos incluindo experimentos genéticos acerca de efeitos das mutações por deleção e por inserção Inserir ou deletar um par de bases mostrados aqui no transcrito de mRNA altera a sequência de tripletes em um código sem sobreposição todos os aminoácidos codificados pelo mRNA após a mu dança são afetados A combinação de mutações por inserção e por deleção afeta alguns aminoácidos mas pode no final restabelecer a sequência cor reta de aminoácidos A adição ou remoção de três aminoácidos não mos trado mantém os demais tripletes intactos evidenciando que o códon é constituído por três e não quatro ou cinco nucleotídeos Os códons tripletes sombreados em cinza são aqueles traduzidos a partir do gene original os códons mostrados em azul são novos códons resultantes de mutações por inserção ou deleção N de T Deleção do inglês deletion ou deletar do inglês delete palavras por sua vez derivadas do latim deletum destruir apagar são termos utilizados em genética e bio logia molecular para designar a remoção de um nucleotídeo de um aminoácido ou mesmo de um gene Também pode ser utilizado o termo supressão mRNA 59 Inserção Deleção G U A G C C U A C G G A U 39 G U A G C C U C A C G G A U G U A C C U A C G G A U Inserção e deleção G U A A G C C A C G G A U 1 2 1 2 Fase de leitura restabelecida Fase de leitura 1 59 U U C U C G G A C C U G 39 G A G A U U C A C A G U Fase de leitura 2 U U C U C G G A C C G U G G A G A U U C A C A Fase de leitura 3 U U C U C G G A C C U U G G A G A U U C A C A G U FIGURA 275 Quadros de leitura no código genético Em um código sem sobreposição em triplete todos os mRNA têm três fases de leitura pos síveis mostradas aqui em cores diferentes Os tripletes e consequentemente os aminoácidos codificados são diferentes em cada fase de leitura Nelson6ed27indd 1105 Nelson6ed27indd 1105 070414 1422 070414 1422 1106 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Em 1964 Nirenberg e Philip Leder chegaram a outra grande descoberta experimental Ribossomos isolados de E coli se ligam a um aminoaciltRNA específico na presença do polinucleotídeo mensageiro correspondente Por exem plo ribossomos incubados com poliU e fenilalaniltRNA Phe PhetRNA Phe se ligam a ambos os RNAs mas se incubados com poliU e algum outro aminoaciltRNA o aminoacil tRNA não é ligado porque não reconhece os tripletes UUU no poliU Tabela 272 Mesmo trinucleotídeos eram capa zes de promover a ligação específica de tRNA apropriados portanto esses experimentos podiam ser realizados com pequenos oligonucleotídeos sintetizados artificialmente Com essa técnica os pesquisadores determinaram quais aminoaciltRNA se ligavam a 54 dos 64 códons possíveis Para alguns códons ou nenhum ou mais de um aminoacil tRNA poderiam ligarse Outro método era necessário para completar e confirmar o código genético inteiro Por volta dessa época uma abordagem complementar foi fornecida por H Gobind Khorana que desenvolveu mé todos químicos para sintetizar polirribonucleotídeos com sequências repetidas de duas a quatro bases definidas Os polipeptídeos produzidos a partir desses mRNA possuíam um ou poucos aminoácidos em padrões repetidos Esses pa drões quando combinados com as informações obtidas a partir dos polímeros aleatórios utiliza dos por Nirenberg e colabora dores permitiram designações não ambíguas para os códons O copolímero ACn por exemplo tem códons alternados ACA e CAC ACACACACACACACA O polipeptídeo sintetizado a par tir desse mensageiro continha quantidades iguais de treonina e histidina Considerandose que um códon de histidina tem um A e dois C Tabela 271 CAC deve codificar histidina e ACA treonina A consolidação dos resultados de muitos experimentos permitiu a determinação dos aminoácidos codificados por 61 dos 64 códons possíveis Os outros três foram identificados como códons de parada em parte porque eles interrompiam os padrões de codificação de aminoácidos quando apareciam em um polímero sintético de RNA Figura 276 Em 1966 já haviam sido estabelecidos os significados para todas as trincas de códons organizados no quadro da Figura 277 as quais foram verificadas por meio de muitas maneiras dife rentes A decifração do código genético é tida como uma das mais importantes descobertas científicas do século XX Os códons são a chave para a tradução da informação genética direcionando a síntese de proteínas específicas A fase de leitura é estabelecida quando a tradução de uma molécula de mRNA é iniciada e é mantida à medida que a maquinaria de síntese vai lendo a mensagem sequencial mente de um triplete para outro Se a fase de leitura inicial estiver com uma ou duas bases desalinhadas ou se a tra dução de alguma forma pular um nucleotídeo no mRNA todos os códons subsequentes ficarão fora de registro o resultado geralmente é uma proteína errada com uma sequência de aminoácidos distorcida TABELA 271 Incorporação de aminoácidos em polipeptídeos em resposta a polímeros aleatórios de RNA Aminoácido Frequência de incorporação observada Lys 5 100 Indicação da tentativa da composição de nucleotídeos do códon correspondente Frequência esperada de incorporação com base na atribuição Lys 5 100 Asparagina 24 A2C 20 Glutamina 24 A2C 20 Histidina 6 AC2 4 Lisina 100 AAA 100 Prolina 7 AC2CCC 48 Treonina 26 A2C AC2 24 Nota Aqui é apresentado um resumo dos dados de uma parte dos primeiros experimentos planejados para elucidar o código gené tico Um RNA sintético contendo apenas resíduos A e C em uma proporção de 51 direcionou a síntese de polipeptídeos e tanto a identidade como a quantidade de aminoácidos incorporados foram determinadas Com base nas abundâncias relativas de resíduos A e C no RNA sintético e atribuindo ao códon AAA o códon mais provável a frequência de 100 deveria haver três códons diferentes com a composição A2C cada qual com frequência relativa de 20 três com a composição AC2 cada qual com frequência relativa de 4 e CCC com frequência relativa de 08 A indicação de CCC foi com base na informação obtida de estudos anteriores com poliC Quando duas indicações tentativas são feitas propõese que ambas codificam o mesmo aminoácido Essas indicações da composição de nucleotídeos não contêm informação sobre a sequência nucleotídica exceto claro AAA e CCC TABELA 272 Trinucleotídeos que induzem a ligação específica de aminoaciltRNA aos ribossomos Trinucleotídeo Aumento relativo da ligação ao ribossomo de aminoaciltRNA marcado com 14C PhetRNA Phe LystRNA Lys ProtRNA Pro UUU 46 0 0 AAA 0 77 0 CCC 0 0 31 Fonte Modificada de Nirenberg M Leder P 1964 RNA code words and protein synthesis Science 145 1399 Cada número representa o fator de aumento da quantidade de 14C ligado quan do o trinucleotídeo indicado estava presente em relação ao controle sem trinu cleotídeo H Gobind Khorana 19222011 Nelson6ed27indd 1106 Nelson6ed27indd 1106 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1107 Vários códons apresentam funções especiais Figura 27 7 O códon de iniciação AUG é o sinal mais comum para o início de um polipeptídeo em todas as células além de codificar resíduos Met nas posições internas dos polipeptí deos Os códons de parada UAA UAG e UGA também denominados códons de término ou códons sem sentido geralmente sinalizam o fim da síntese de polipeptídeos e não codificam qualquer aminoácido conhecido Algumas exceções a essas regras são discutidas no Quadro 271 Como será discutido na Seção 272 o início da síntese de proteínas na célula é um processo elaborado que depen de dos códons de iniciação e outros sinais no mRNA Em uma retrospectiva os experimentos de Nirenberg Khorana e outros pesquisadores para identificar a função dos códons não deveriam ter funcionado na ausência dos códons de iniciação Casualmente as condições experimentais per mitiram que a síntese ocorresse sem que essas exigências normais de iniciação estivessem totalmente cumpridas A diligência e o acaso levaram a uma importante descoberta fato bastante comum na história da bioquímica Em uma sequência aleatória de nucleotídeos 1 a cada 20 códons em cada fase de leitura é em média um códon de parada Geralmente uma fase de leitura sem um có don de parada entre 50 ou mais códons é considerada uma fase de leitura aberta ORF de open reading frame Longas fases de leitura aberta geralmente correspondem a genes que codificam proteínas Na análise de bancos de da dos de sequências programas sofisticados são utilizados na busca de fases de leitura aberta para encontrar genes em meio a um imenso mar de DNA não gênico Um gene inin terrupto que codifica uma proteína típica de peso molecular de 60000 requereria uma fase de leitura aberta com 500 códons ou mais Uma característica intrigante do código genético é que um aminoácido pode ser codificado por mais de um códon de modo que o código é considerado degenerado Isso não significa que o código seja falho apesar de um aminoácido possuir um ou mais códons cada códon codifica apenas um aminoácido A degeneração do código não é uniforme En quanto a metionina e o triptofano têm cada um apenas um códon três aminoácidos Arg Leu Ser por exemplo têm seis códons cada cinco aminoácidos têm quatro a isoleu cina tem três e nove aminoácidos têm dois Tabela 273 O código genético é quase universal Com a exceção in trigante de algumas pequenas variações nas mitocôndrias em algumas bactérias e em alguns eucariotos unicelulares Quadro 271 os códons dos aminoácidos são idênticos em U A A G U A A G U A A G A A A G U A U G G U A A G U A A G U A A U A A 39 A G U G Fase de leitura 1 59 Fase de leitura 2 A A G U A A G U A A G U A G U A A A U Fase de leitura 3 G A FIGURA 276 Efeito de um códon de parada em um tetranucleotídeo repetitivo Códons de parada cor salmão são encontrados em cada quarto códon em três janelas de leitura diferentes mostradas em cores dife rentes Dipeptídeos ou tripeptídeos são sintetizados dependendo de onde o ribossomo se ligar inicialmente UUU UUC UUA UUG Phe Phe Leu Leu UCU UCC UCA UCG Ser Ser Ser Ser UAU UAC UAA UAG Tyr Tyr Parada Parada UGU UGC UGA UGG Cys Cys Parada Trp CUU CUC CUA CUG Leu Leu Leu Leu CCU CCC CCA CCG Pro Pro Pro Pro CAU CAC CAA CAG His His Gln Gln CGU CGC CGA CGG Arg Arg Arg Arg AUU AUC AUA AUG Ile Ile Ile Met ACU ACC ACA ACG Thr Thr Thr Thr AAU AAC AAA AAG Asn Asn Lys Lys AGU AGC AGA AGG Ser Ser Arg Arg GUU GUC GUA GUG Val Val Val Val GCU GCC GCA GCG Ala Ala Ala Ala GAU GAC GAA GAG Asp Asp Glu Glu Gly Gly Gly Gly GGU GGC GGA GGG U C A G U C A G Segunda letra do códon Primeira letra do códon extremidade 59 FIGURA 277 Dicionário das palavras que codificam aminoácidos no mRNA Os códons são escritos na direção 59 S 39 A terceira base de cada códon em negrito desempenha um papel menor na especificação do aminoácido em relação às duas primeiras Os três códons de parada estão sombreados em cor salmão e o códon de iniciação AUG em verde Todos os aminoácidos com exceção da metionina e do triptofano têm mais de um códon Na maioria dos casos os códons que especificam os aminoácidos diferem apenas na terceira base TABELA 273 A degeneração do código genético Aminoácido Número de códons Aminoácido Número de códons Met 1 Tyr 2 Trp 1 Ile 3 Asn 2 Ala 4 Asp 2 Gly 4 Cys 2 Pro 4 Gln 2 Thr 4 Glu 2 Val 4 His 2 Arg 6 Lys 2 Leu 6 Phe 2 Ser 6 Nelson6ed27indd 1107 Nelson6ed27indd 1107 070414 1422 070414 1422 1108 DAVID L NELSON MICHAEL M COX todas as espécies estudadas até agora Seres humanos E coli a planta do tabaco anfíbios e vírus compartilham do mesmo código genético Portanto parece que todas as for mas de vida têm um ancestral comum na escala evolutiva cujo código genético foi preservado ao longo da evolução biológica Até mesmo as variações reforçam esse tema A oscilação permite que alguns tRNA reconheçam mais de um códon Quando vários códons diferentes especificam um amino ácido a diferença entre eles geralmente se dá na terceira base na extremidade 39 Por exemplo a alanina é codi Em bioquímica bem como em outras disciplinas exce ções às regras gerais podem ser problemáticas para os professores e frustrantes para os alunos Ao mesmo tem po no entanto elas nos ensinam que a vida é complexa e nos inspiram para a busca de novas surpresas Entender as exceções pode até mesmo reforçar a regra original de maneira surpreendente Seria de se esperar que o código genético tivesse pou cas variações Mesmo a substituição em um único amino ácido pode ter profundos efeitos deletérios na estrutura de uma proteína Ainda assim ocorrem variações no có digo em alguns organismos e essas variações são interes santes e instrutivas Os tipos de variações e sua raridade fornecem fortes evidências de uma origem evolutiva co mum para todos os seres vivos Para alterar o código as mudanças devem ocorrer nos genes que codificam um ou mais tRNAs sendo o anticó don o alvo mais óbvio para a alteração Tal mudança levaria a uma inserção sistemática de um aminoácido em um códon que de acordo com o código padrão ver Figura 277 não é específico para aquele aminoácido O código genético na verdade é definido por dois elementos 1 os anticódons nos tRNAs que determinam onde um aminoácido é inse rido em uma cadeia polipeptídica em crescimento e 2 a especificidade das enzimas as aminoaciltRNAsintases que carregam aminoácidos nos tRNAs assim determinando a identidade do aminoácido ligado a um determinado tRNA A maioria das mudanças repentinas no código teria efeitos catastróficos nas proteínas celulares portanto é mais provável que alterações no código persistiram onde relativamente poucas proteínas seriam afetadas como em genomas pequenos que codificam poucas proteínas As consequências biológicas de uma mudança no código poderiam também ser reduzidas restringindose as mu danças aos três códons de parada os quais geralmente não ocorrem dentro de genes ver Quadro 274 para as exceções a essa regra Esse padrão é de fato observado Das pouquíssimas variações conhecidas no código ge nético a maioria ocorre no DNA mitocondrial mtDNA o qual codifica apenas 10 ou 20 proteínas As mitocôn drias têm seus próprios tRNAs portanto as variações no seu código não afetam o genoma celular que é mui to maior As mudanças mais comuns nas mitocôndrias envolvem códons de parada Essas mudanças afetam a terminação nos produtos de apenas um grupo de genes e às vezes os efeitos são mínimos porque os genes têm códons de parada múltiplos redundantes O mtDNA de vertebrados tem genes que codificam 13 proteínas 2 rRNAs e 22 tRNAs ver Figura 1940a O pequeno número de alteração nos códons aliado a um conjunto incomum de regras de oscilação p 1110 faz os 22 tRNAs serem suficientes para decodificar os genes que carregam a mensagem para a síntese das 13 proteínas enquanto no código padrão são necessários 32 tRNAs Nas mitocôndrias essas mudanças podem ser vistas como uma aerodinâmica genômica pois um genoma menor con fere uma vantagem na replicação para a organela Quatro famílias de códons nas quais o aminoácido é determinado pelos dois primeiros nucleotídeos são decodificadas por um único tRNA com um resíduo U na primeira posição oscilante no anticódon Ou o U pareia de alguma forma com qualquer uma das quatro possíveis bases na tercei ra posição do códon ou um mecanismo do tipo dois de três é utilizado ou seja não é necessário o pareamento de bases na terceira posição Outros tRNAs reconhecem códons com A ou G na terceira posição e outros ainda reconhecem U ou C de modo que praticamente todos os tRNAs reconhecem dois ou quatro códons No código padrão apenas dois aminoácidos são es pecificados por um único códon metionina e triptofano ver Tabela 273 Se todos os tRNAs mitocondriais re conhecem dois códons seria de se esperar códons adi cionais para Met e Trp nas mitocôndrias E foi verificado que a variação de códon mais comum está no códon de parada UGA que especifica o triptofano O tRNA Trp reco nhece e insere um resíduo Trp tanto para o códon UGA como para o códon normal do Trp UGG A segunda va riação mais comum é a conversão de AUA de um códon que codifica Ile para um códon que codifica Met o có don normal para Met é AUG e um único tRNA reconhece ambos os códons As variações de código conhecidas nas mitocôndrias estão resumidas na Tabela Q1 Considerando as mudanças bem mais raras que ocor rem nos códigos de genomas celulares para diferenciar dos mitocondriais constatouse que a única variação em uma bactéria é novamente o uso de UGA para codificar resíduos Trp o que ocorre no organismo unicelular de vida livre mais simples o Mycoplasma capricolum Entre os eucariotos raras mudanças de código extramitocondriais são observadas em algumas espécies de protistas ciliados em que ambos os códons de parada UAA e UAG podem especificar a glutamina Também existem casos raros e in teressantes nos quais códons de parada foram adaptados para codificar aminoácidos que não estão entre os 20 ami noácidospadrão como detalhado no Quadro 273 As mudanças no código não precisam ser absolutas um códon nem sempre codifica um mesmo aminoácido Por exemplo em muitas bactérias incluindo E coli GUG Val é às vezes utilizado como códon de iniciação que especifica Met Isso ocorre apenas para aqueles genes QUADRO 271 Exceções que provam a regra variações naturais no código genético Nelson6ed27indd 1108 Nelson6ed27indd 1108 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1109 ficada pelos tripletes GCU GCC GCA e GCG Os códons para a maioria dos aminoácidos podem ser simbolizados por XY A G ou XY U C As duas primeiras letras de cada códon são os determinantes primários da especificidade uma característica que apresenta algumas consequências in teressantes Os RNAs transportadores pareiam com códons do mRNA em uma sequência de três bases no tRNA denomi nada anticódon A primeira base do códon no mRNA lido na direção 59S39 pareia com a terceira base do anticódon Figura 278a Se o triplete do anticódon de um tRNA reconhecesse apenas um triplete de códon no pareamento em que a sequência GUG está apropriadamente localizada em relação a sequências específicas de mRNA que afetam o início da tradução como discutido na Seção 272 A alteração mais surpreendente do código genético é observada em algumas espécies de fungos do gênero Can dida como descoberto originalmente em Candida albi cans C albicans é um organismo com alta complexidade genômica e ainda assim o seu código genético sofreu uma mudança significativa o códon CUG que normalmente co difica Leu codifica Ser nesse organismo A pressão de se leção natural sobre essa mudança é completamente desco nhecida Além disso a natureza química de Ser e Leu são bastante diferentes Entretanto até mesmo essa mudança pode ser compreendida com base nas propriedades de um código universal Quando vários códons codificam um mes mo aminoácido e faz uso de múltiplos tRNAs nem todos os códons são utilizados com a mesma frequência Em um fenômeno denominado viés de códon alguns códons que codificam um aminoácido específico são utilizados mais fre quentemente às vezes muito mais frequentemente do que outros Os tRNAs para os códons mais utilizados estão pre sentes geralmente em maior concentração do que os tRNAs para códons menos usados A degeneração de códons leva à existência de seis códons para Leu Nas bactérias CUG é usado frequentemente para codificar Leu No entanto em fungos de gêneros muito próximos a Candida mas que não têm a alteração no código o códon CUG é usado raramente para codificar Leu e geralmente está ausente em proteínas que são altamente expressas Uma mudança no sentido da codificação do CUG teria assim um efeito muito menor no metabolismo celular de fungos do que se todos os códons fossem usados com a mesma frequência A mudança no có digo pode ter ocorrido a partir de uma perda gradual dos códons CUG em genes e do tRNA que reconhece CUG como um códon de Leu seguido por um evento de captura uma mutação no anticódon de um tRNA ser que permitiu que este reconhecesse CUG Alternativamente pode ter havido um estágio intermediário no qual CUG fosse reconhecido como códon codificador tanto Leu como Ser talvez com sinais es pecíficos nos mRNAs que ajudassem um tRNA ou outro a reconhecerem códons CUG específicos ver Quadro 273 A análise filogenética indica que a redefinição de CUG como um códon de Ser ocorreu nos ancestrais de Candida há cerca de 150 a 170 milhões de anos Essas variações nos mostram que o código não é tão universal como outrora se acreditava mas que sua flexibili dade é rigorosamente restringida As variações são obvia mente derivadas do código normal e nunca se encontrou qualquer exemplo de um código totalmente diferente O limite de variações no código fortalece o princípio de que todas as formas de vida deste planeta evoluíram com base em um único levemente flexível código genético TABELA Q1 Variações do código conhecidas em mitocôndrias Códons UGA AUA AGA AGG CUN CGG Códon normal Término Ile Arg Leu Arg Animais Vertebrados Drosophila Trp Trp Met Met Parada Ser 1 1 1 1 Leveduras Saccharomyces cerevisiae Torulopsis glabrata Schizosaccharomyces pombe Trp Trp Trp Met Met 1 1 1 1 Thr Thr 1 1 1 Fungos filamentosos Trp 1 1 1 1 Tripanossomas Trp 1 1 1 1 Plantas superiores 1 1 1 1 Trp Chlamydomonas reinhardtii 1 1 1 N indica qualquer nucleotídeo 1 o códon apresenta o mesmo significado que no código normal o códon não é observado nesse genoma mitocondrial Nelson6ed27indd 1109 Nelson6ed27indd 1109 070414 1422 070414 1422 1110 DAVID L NELSON MICHAEL M COX de bases de WatsonCrick em todas as três posições as células teriam um tRNA para cada códon de aminoácido Entretanto esse não é o caso pois os anticódons em alguns tRNA incluem o nucleotídeo inosinato designado como I o qual contém uma base incomum a hipoxantina ver Fi gura 85b O inosinato pode formar ligações de hidrogênio com três nucleotídeos diferentes U C e A Figura 278b embora esses pareamentos sejam muito mais fracos do que as ligações de hidrogênio do pareamento de bases GC e AU de WatsonCrick Em leveduras um tRNA Arg tem o an ticódon 59ICG o qual reconhece três códons de arginina 59CGA 59CGU e 59CGC As duas primeiras bases são idênticas CG e formam pares de bases de WatsonCrick fortes com as bases correspondentes do anticódon mas a terceira base A U ou C forma ligações de hidrogênio mais fracas com o resíduo I na primeira posição do anticódon A análise desse e de outros pareamentos códonanticó don levou Crick a concluir que a terceira base da maioria dos códons pareia de maneira mais frouxa com a base cor respondente do anticódon a terceira base desses códons e a primeira base dos seus anticódons correspondentes os cila Crick propôs uma série de quatro relações chamada de a hipótese da oscilação 1 As duas primeiras bases de um códon no mRNA sempre estabelecem pareamentos fortes de bases do tipo WatsonCrick com as bases corresponden tes no anticódon do tRNA e conferem a maior parte da especificidade do código 2 A primeira base do anticódon lendo na direção 59S39 essa base pareia com a terceira base do có don determina o número de códons reconhecidos pelo tRNA Quando a primeira base do anticódon é C ou A o pareamento de bases é específico e apenas um códon é reconhecido por aquele tRNA Quando a primeira base é U ou G a ligação é me nos específica e dois códons diferentes podem ser lidos Quando inosina I é o primeiro nucleotídeo oscilante de um anticódon três códons diferen tes podem ser reconhecidos o número máximo para qualquer tRNA Essas relações estão resumi das na Tabela 274 3 Quando um aminoácido é especificado por diver sos códons diferentes os códons que diferem em uma das duas primeiras bases requerem tRNAs di ferentes 4 Um mínimo de 32 tRNAs são necessários para tra duzir todos os 61 códons 31 para codificar os ami noácidos e 1 para o início da tradução A base oscilante ou terceira base do códon contribui para a especificidade mas como ela pareia de forma frou xa com sua base correspondente no anticódon ela permite uma dissociação rápida entre o tRNA e seu códon durante a síntese proteica Se todas as três bases de um códon se envolvessem em fortes pareamentos WatsonCrick com as três bases do anticódon os tRNAs se dissociariam muito lentamente e isso limitaria a velocidade da síntese protei ca As interações códonanticódon permitem um equilíbrio entre acuidade e velocidade O código genético é resistente a mutações O código genético exerce um papel interessante de pro teger a integridade genômica de todo o organismo vivo A A U C mRNA 59 tRNA 3 2 1 Códon A G U 1 2 3 Anticódon 39 59 39 Anticódon 39 59 Códon 59 39 3 2 1 G C I C G C 1 2 3 3 2 1 G C I C G U 1 2 3 3 2 1 G C I C G A 1 2 3 b a FIGURA 278 Pareamento entre códon e anticódon a O alinhamen to entre os dois RNAs é antiparalelo O tRNA está mostrado na configuração tradicional de folhadetrevo b Três pareamentos diferentes com o códon são possíveis quando o anticódon do tRNA contém inosinato TABELA 274 Como a base oscilante do anticódon determina o número de códons que um tRNA pode reconhecer 1 Um códon reconhecido Anticódon Códon 2 Dois códons reconhecidos Anticódon Códon 3 Três códons reconhecidos Anticódon Códon Nota X e Y são bases complementares capazes de parear fortemente segundo o pareamento de WatsonCrick com X9 e Y9 respectivamente As bases oscilantes na posição 39 dos códons e 59 dos anticódons estão sombreadas em branco Nelson6ed27indd 1110 Nelson6ed27indd 1110 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1111 evolução não produziu um código no qual a especificidade de cada códon tivesse surgido ao acaso Em vez disso o código é extremamente resistente aos efeitos deletérios dos tipos mais comuns de mutações as mutações sem senti do ou missense nas quais um novo par de bases substitui outro Na terceira posição do códon que é a base oscilante substituições de uma única base causam uma mudança no aminoácido codificado apenas em 25 dos casos Portanto a maioria dessas alterações consiste em mutações silen ciosas nas quais o nucleotídeo é diferente mas o aminoá cido codificado permanece o mesmo Devido aos tipos de danos espontâneos no DNA que afe tam os genomas ver Capítulo 8 a mutação sem sentido mais frequente é a mutação de transição em que uma purina é substituída por uma purina ou uma pirimidina por uma pirimidina p ex GC substituído por AT Todas as três posições de um códon evoluíram de forma que exis te certa resistência a mutações de transição Uma mutação na primeira posição do códon normalmente resultará em uma mudança na codificação do aminoácido mas tal mu dança geralmente envolve um aminoácido com proprieda des químicas semelhantes Isso é fato especialmente para aminoácidos hidrofóbicos que predominam na primeira co luna do código mostrado na Figura 277 Considere o códon GUU para Val Uma alteração para AUU substituiria Val por Ile Uma alteração para CUU substituiria Val com Leu As mudanças resultantes na estrutura eou função da proteína codificada por aquele gene seriam geralmente mas nem sempre pequenas Estudos computacionais mostraram que códigos gené ticos delineados ao acaso são quase sempre menos resis tentes a mutações do que o código genético existente Os resultados indicam que o código passou por uma simplifi cação considerável antes do surgimento de LUCA a célula ancestral O código genético nos mostra como a informação para a síntese proteica é armazenada nos ácidos nucleicos e forne ce algumas pistas de como essa informação é traduzida em uma proteína Mudança na fase da tradução e edição do RNA afetam a maneira como o código é lido Uma vez estabelecido o quadro de leitura durante a síntese proteica os códons são traduzidos sem haver sobreposição ou parada até que o complexo ribossomal encontre um có don de terminação Os outros dois quadros de leitura possí veis geralmente não contêm informação genética útil mas uns poucos genes são estruturados de forma que os ribosso mos soluçam em um determinado ponto durante a tradu ção dos respectivos mRNAs mudando o quadro de leitura daquele ponto em diante Esse parece ser um mecanismo para permitir que duas ou mais proteínas relacionadas po rém diferentes possam ser produzidas a partir de um único transcrito ou para regular a síntese de uma proteína Um dos exemplos mais bem documentados de mudança de fase de tradução ocorre durante a tradução do mRNA dos genes sobrepostos gag e pol do vírus do sarcoma de Rous ver Figura 2634 A fase de leitura para pol é deslo cado para a esquerda em um par de bases fase de leitura 1 em relação à fase de leitura para gag Figura 279 O produto do gene pol a transcritase reversa é tra duzido como uma poliproteína grande a partir do mesmo mRNA que é usado para a proteína gag sozinha ver Figura 2633 A poliproteína ou proteína gagpol é então clivada por digestão proteolítica para originar a transcriptase re versa madura A produção da poliproteína requer uma mu dança de quadro de leitura durante a tradução na região de sobreposição para permitir que o ribossomo contorne o códon de parada UAG no final do gene gag sombreado em vermelhoclaro na Figura 279 Mudanças de fase de leitura ocorrem em cerca de 5 das traduções desse mRNA de modo que a poliproteína gagpol e depois a transcriptase reversa é sintetizada com uma frequência que corresponde a cerca de um vigé simo daquela da proteína gag um nível suficiente para a reprodução eficiente do vírus Em alguns retrovírus outra mudança de fase de leitura permite a tradução de uma poli proteína ainda maior que inclui o produto do gene env fun dido aos produtos dos genes gag e pol ver Figura 2633 Um mecanismo semelhante produz ambas as subunidades t e g da DNApolimerase III de E coli a partir de um único transcrito do gene dnaX ver a Tabela 252 Alguns mRNAs são editados antes da tradução A edi ção do RNA pode envolver a adição deleção ou alteração de nucleotídeos no RNA de maneira a afetar o significado do transcrito quando esse é traduzido Adição ou deleção de nucleotídeos tem sido mais comumente observada em RNAs provenientes dos genomas de mitocôndrias e cloro plastos de eucariotos A reação requer uma classe especial de moléculas de RNA codificadas por essas mesmas organe las com sequências complementares aos mRNAs a serem editados Esses RNAguias RNAg Figura 2710 agem como moldes para o processo de edição Os transcritos iniciais dos genes que codificam a subuni dade II da citocromooxidase nas mitocôndrias de alguns protistas fornecem um exemplo de edição por inserção Es ses transcritos não correspondem precisamente às sequên cias necessárias na extremidade carboxil do produto protei co Um processo de edição póstranscricional insere quatro Fase de leitura para a proteína gag C U A G G G C U C C G C U U G A C A A A U U U A U A G G G A C U A G G G C U C C G C U U G A C A A A U U U A U A G G G A G Ile Gly Arg Ala G G C Fase de leitura para a pol G G G C C A Leu Gly Leu Arg Leu Thr Asn Leu C A Parada 59 39 FIGURA 279 Mudança de fase de leitura para a tradução em um transcrito de retrovírus Na figura é mostrada a região de sobreposição gagpol no RNA do vírus do sarcoma de Rous Nelson6ed27indd 1111 Nelson6ed27indd 1111 070414 1422 070414 1422 1112 DAVID L NELSON MICHAEL M COX resíduos U que alteram a fase de leitura do transcrito A Figura 2710 mostra os resíduos U adicionados na pequena porção do transcrito que é afetada pela edição Observe que o pareamento de bases entre o transcrito inicial e o RNA guia envolve alguns pares de base G5U pontos azuis os quais são comuns em moléculas de RNA A edição de RNA por alteração de nucleotídeos envolve na maioria das vezes a desaminação enzimática de resíduos de adenosina ou de citidina formando inosina ou uridina respectivamente Figura 2711 mas outras alterações de base já foram também descritas A inosina é interpre tada como um resíduo G durante a tradução As reações de desaminação da adenosina são realizadas por adenosina desaminases que agem sobre o RNA ADAR As desami nações da citidina são realizadas por uma família de enzi mas formada pelos peptídeos apoB catalíticos de edição de mRNA APOBEC de apoB peptídeos editores catalíticos do mRNA a qual inclui enzimas relacionadas as desami nases induzidas por ativação AID de activationinduced deaminase Ambos os grupos de enzimas desaminases têm um domínio catalítico homólogo o qual contém zinco Um exemplo bem estudado de edição do RNA por de saminação ocorre no gene da apolipoproteína B compo nente da lipoproteína de baixa densidade de vertebrados Uma forma de apolipoproteína B a apoB100 Mr 513000 é sintetizada no fígado uma outra forma a apoB48 Mr 250000 é sintetizada no intestino Ambas são codifica das por um mRNA produzido a partir do gene da apoB100 FIGURA 2710 Edição do RNA do transcrito do gene da subunidade II da citocromooxidase das mitocôn drias de Trypanosoma brucei a In serção de quatro resíduos U corderosa produz um quadro de leitura revisada b Uma classe especial de RNAguias com plementares ao produto editado agem como molde para o processo de edição Observe a presença de dois pares de ba ses GU indicados por um ponto azul para representar que o pareamento não é do tipo WatsonCrick A A A G T A G A G A A C C T G G T A Glu Asn Leu Val Lys Val A A A G U A G A U U G U A U A C C U Asp Cys Ile Pro Lys Val G G Gly a U Fita codificadora do DNA mRNA editado A A A G U A G A U U G U A U A C C U G U G U U A U A U C U A A U A U A U G G A U U A mRNA RNAguia b 59 59 39 39 59 39 Citidina NH2 N N O H H H H OH O O Uridina O N NH O H H H H OH O O Adenosina O H H H H OH O N N N NH2 N N N Inosina O N NH O OCH2 H H H H OH O OCH2 OCH2 OCH2 b a H2O H2O NH3 NH3 H2O H2O NH3 NH3 FIGURA 2711 Reações de desaminação que resultam em edição do RNA a A conversão de nucleotídeos de adenosina em nucleotídeos de inosina é catalisada por enzimas ADAR b Conversões de citidina em uridina são catalisadas pelas enzimas da família APOBEC Nelson6ed27indd 1112 Nelson6ed27indd 1112 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1113 Uma citidinadesaminase APOBEC encontrada apenas no intestino ligase ao mRNA no códon 2153 CAA corres pondente ao resíduo de aminoácido Gln e converte o C para um U originando o códon de parada UAA A apoB48 produzida no intestino a partir desse mRNA modificado é simplesmente uma forma abreviada correspondente à me tade aminoterminal da apoB100 Figura 2712 Essa reação permite a síntese tecidoespecífica de duas proteí nas diferentes a partir de um gene A edição de A para I realizada pela ADAR é particular mente comum em transcritos derivados de genes de pri matas É possível que 90 ou mais dessa edição ocorra em elementos Alu um subgrupo de transposons eucarióticos denominados elementos curtos dispersos SINE que são particularmente comuns em genomas de mamíferos Exis tem mais de um milhão de elementos Alu de 300 pb no DNA humano constituindo cerca de 10 do genoma Esses es tão concentrados próximos a genes codificadores de proteí nas geralmente aparecendo em íntrons e em regiões não traduzidas nas extremidades 39 e 59 dos transcritos Quan do recémsintetizado antes do processamento o mRNA humano inclui em média de 10 a 20 elementos Alu As en zimas ADAR se ligam e realizam a edição de A para I apenas em regiões de fita dupla do RNA A abundância de elemen tos Alu oferece muitas oportunidades para pareamentos de bases intramoleculares nos transcritos fornecendo as fitas duplas necessárias para as ADAR Algumas edições afetam as sequências codificadoras dos genes Defeitos na função ADAR têm sido associados a várias condições neurológicas em humanos incluindo esclerose lateral amiotrófica ELA epilepsia e depressão maior Os genomas dos vertebrados são repletos de SINE mas muitos tipos diferentes de SINE estão presentes na maioria desses organismos Os elementos Alu predominam apenas nos primatas Uma análise cuidadosa de genes e de trans critos indica que a edição de A para I é de 30 a 40 vezes mais prevalente em humanos do que em camundongos em grande parte em virtude da presença de muitos elemen tos Alu A edição de A para I em grande escala e um nível aumentado de splicing alternativo ver Figura 2621 são duas características que separam os genomas de primatas daqueles de outros mamíferos Ainda não está claro se es sas reações são incidentes ou se elas tiveram papéischave na evolução dos primatas e posteriormente dos humanos RESUMO 271 O código genético c A sequência específica de aminoácidos de uma proteína é construída ao longo da tradução da informação contida no mRNA Esse processo é realizado pelos ribossomos c Os aminoácidos são especificados pelos códons do mRNA os quais consistem em tripletes trincas de nu cleotídeos A tradução requer moléculas adaptadoras os tRNAs que reconhecem os códons e inserem os aminoá cidos de maneira sequencial apropriada no polipeptídeo c As sequências das bases dos códons foram deduzidas a partir de experimentos empregando mRNAs sintéticos de composição e sequência conhecidas c O códon AUG sinaliza o início da tradução Os tripletes UAA UAG e UGA sinalizam a terminação c O código genético é degenerado ele tem múltiplos có dons para a maioria dos aminoácidos c O código genético padrão é universal em todas as es pécies apresentando pequenas alterações nas mitocôn drias e em alguns organismos unicelulares As variações ocorrem em padrões que reforçam o conceito de um código universal c A terceira posição em cada códon é bem menos específica do que a primeira e a segunda e é chamada de oscilante c O código genético é resistente aos efeitos das mutações sem sentido c A mudança de fase de leitura da tradução e a edição do RNA afetam a maneira como o código genético é lido durante a tradução 272 Síntese proteica Como foi visto para o DNA e o RNA Capítulos 25 e 26 a síntese de biomoléculas poliméricas pode ser considera da como consistindo nos estágios de início ou iniciação alongamento e término ou terminação Geralmente esses processos fundamentais são acompanhados por dois está gios adicionais a ativação de precursores anterior à sínte se e o processamento póssintético do polímero completo A síntese de proteínas segue o mesmo padrão A ativação dos aminoácidos antes da sua incorporação nos polipeptí deos e o processamento póstraducional do polipeptídeo completo desempenham papéis especialmente importantes em garantir tanto a fidelidade da síntese quanto a função adequada do produto proteico O processo está esquemati zado na Figura 2713 Os componentes celulares envolvi dos nos cinco estágios da síntese proteica em E coli e em outras bactérias estão listados na Tabela 275 os requeri mentos nas células eucarióticas são bastante semelhantes mas em alguns casos o número de componentes envolvidos é maior Um panorama inicial dos estágios da síntese protei ca fornece um esboço útil para a discussão que segue C A A C A G A C A U A U A U G C A A Gln Número do resíduo U U U G A U C A G U A U Leu Gln Thr Tyr Met Gln Phe Asp Gln Tyr C U G C A A C A G A C A U A U A U G A U A Gln U A A G A U C A G U A U Leu Gln Thr Tyr Met Ile Parada C U G 2146 2148 2150 2152 2154 2156 Intestino humano apoB48 U U U A U A Ile Fígado humano apoB100 39 59 FIGURA 2712 Edição do RNA do transcrito do gene do componente apoB100 da LDL A desaminação que ocorre apenas no intestino con verte uma citidina específica em uridina trocando um códon para a Gln em um códon de parada produzindo uma proteína truncada Nelson6ed27indd 1113 Nelson6ed27indd 1113 070414 1422 070414 1422 1114 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A biossíntese de proteínas ocorre em cinco estágios Estágio 1 Ativação de aminoácidos Para a síntese de um poli peptídeo de sequência definida dois requerimentos quími cos fundamentais devem ser alcançados 1 o grupamento carboxil de cada aminoácido deve ser ativado para facilitar a formação da ligação peptídica e 2 um elo deve ser es tabelecido entre cada novo aminoácido e a informação con tida no mRNA que o codifica Ambos os requerimentos são cumpridos ligandose o aminoácido a um tRNA no primeiro estágio da síntese proteica A ligação do aminoácido certo ao tRNA certo é fundamental nesse processo Essa reação ocorre no citosol e não no ribossomo Cada um dos 20 ami noácidos é covalentemente ligado a um tRNA específico às custas da energia do ATP utilizando enzimas ativadoras dependentes de Mg 21 conhecidas como aminoaciltRNA sintases Quando ligados aos seus aminoácidos aminoaci lados os tRNAs são considerados carregados Estágio 2 Iniciação O mRNA contendo o código para a síntese do polipeptídeo se liga à subunidade menor do ri bossomo e ao aminoaciltRNA iniciador A subunidade ri bossomal maior se liga então para formar um complexo de iniciação O aminoaciltRNA iniciador estabelece um pa reamento de bases com o códon AUG do mRNA que sina liza o começo do polipeptídeo Esse processo que requer GTP é promovido por proteínas citosólicas denominadas fatores de iniciação Estágio 3 Alongamento O polipeptídeo nascente é alonga do pela adição de unidades sucessivas de aminoácidos as quais são ligadas covalentemente após serem levadas até o ribossomo e posicionadas corretamente pelo respectivo tRNA o qual por sua vez realiza um pareamento de bases com o códon correspondente no mRNA O alongamento re quer proteínas citosólicas conhecidas como fatores de alon gamento A ligação de cada aminoaciltRNA que entra e o movimento do ribossomo ao longo do mRNA são facilitados pela hidrólise de GTP à medida que cada resíduo é adicio nado ao polipeptídeo nascente Estágio 4 Terminação e reciclagem do ribossomo A conclusão da cadeia polipeptídica é sinalizada por um códon de parada no mRNA O novo polipeptídeo é liberado do ribossomo au xiliado por proteínas denominadas fatores de liberação e o ribossomo é reciclado para um novo ciclo de síntese Estágio 5 Enovelamento e processamento póstraducional Para que possa atingir sua forma biologicamente ativa o novo mRNA Início Término AminoaciltRNA Subunidade menor Subunidade maior Aivação de aminoácidos o tRNA é aminoacilado Parada a tradução acaba quando um códon de parada é encontrado O mRNA e a proteína dissociamse e as subunidades do ribossomo são recicladas Enovelamento da proteína Iniciação o mRNA e o tRNA aminoacilado ligamse à subunidade menor do ribossomo Depois a subunidade maior também se liga Alongamento ciclos sucessivos de ligação de aminoaciltRNA e formação da ligação peptídica ocorrem até o ribossomo atingir um códon de parada ❶ ➎ ❺ ❷ ❸ 39 59 FIGURA 2713 Visão geral dos cinco estágios da síntese proteica ➊ Os tRNAs são aminoacilados ➋ O início da tradução ocorre quando um mRNA e um tRNA aminoacilado ligamse ao ribossomo ➌ Durante o alon gamento o ribossomo se move ao longo do mRNA combinando os tRNAs com cada códon e catalisando a formação da ligação peptídica ➍ A tradu ção termina em um códon de parada e as subunidades ribossomais são liberadas e recicladas para um novo ciclo de síntese proteica ➎ Após ser sintetizada a proteína precisa ser dobrada para atingir sua conformação ativa e os componentes ribossomais são reciclados Nelson6ed27indd 1114 Nelson6ed27indd 1114 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1115 polipeptídeo precisa dobrarse em sua conformação tri dimensional apropriada Antes ou depois de dobrarse o novo polipeptídeo pode sofrer processamento enzimático incluindo remoção de um ou mais aminoácidos geralmen te da extremidade aminoterminal adição de grupamentos acetil fosforil metil carboxil ou outros grupos a certos re síduos de aminoácidos clivagem proteolítica eou ligação de oligossacarídeos ou grupos prostéticos Antes de se considerar detalhadamente esses cinco es tágios é preciso examinar dois componenteschave na bios síntese de proteínas os ribossomos e os tRNAs O ribossomo é uma complexa máquina supramolecular Cada célula de E coli contém 15000 ribossomos ou mais o que compreende quase um quarto do peso seco da cé lula Os ribossomos bacterianos contêm cerca de 65 de rRNA e 35 de proteína eles têm um diâmetro de aproximadamente 18 nm e são compostos de duas subu nidades diferentes com coeficientes de sedimentação de 30S e 50S e um coeficiente de sedimentação combinado de 70S Ambas as subunidades têm dúzias de proteínas ribossomais e pelo menos uma molécula grande de rRNA Tabela 276 Após a descoberta de Za mecnik de que os ribossomos são os complexos responsá veis pela síntese de proteínas e após a elucidação do códi go genético o estudo dos ri bossomos acelerou No final da década de 1960 Masaya su Nomura e colaboradores demonstraram que as duas subunidades ribossomais po dem ser separadas em RNA e proteínas que as compõem e depois reconstituídas in vitro Sob condições experi mentais apropriadas o RNA e as proteínas se reorganizam espontaneamente para formar as subunidades 30S e 50S quase que de forma idêntica em estrutura e atividade às subunidades nati vas Essa importante descoberta incentivou décadas de pesquisa acerca da estrutura e da função das proteínas e dos RNAs ribossomais Ao mesmo tempo métodos estru turais cada vez mais sofisticados revelaram mais e mais detalhes da estrutura dos ribossomos TABELA 275 Componentes necessários para os cinco principais estágios da síntese de proteínas em E coli Estágio Componentes essenciais 1 Ativação de aminoácidos 20 aminoácidos 20 aminoaciltRNAsintases 32 ou mais tRNAs ATP Mg 21 2 Iniciação mRNA NFormilmetioniltRNA fMet Códon de iniciação no mRNA AUG Subunidade ribossomal 30S Subunidade ribossomal 50S Fatores de iniciação IF1 IF2 IF3 GTP Mg 21 3 Alongamento Ribossomo 70S funcional complexo de iniciação AminoaciltRNAs especificados pelos códons Fatores de alongamento EFTu EFTs EFG GTP Mg 21 4 Terminação e reciclagem dos ribossomos Códon de parada no mRNA Fatores de liberação RF1 RF2 RF3 RRF EFG IF3 5 Enovelamento e processamento póstraducional Chaperonas e enzimas envolvidas no enovelamen to de proteínas PPI PDI componentes para remoção de resíduos iniciadores e sequências si nalizadoras processamento proteolítico adicional modificação de resíduos terminais e ligação de grupos acetil fosforil metil carboxil de carboi dratos e grupos prostéticos Masayasu Nomura 19272011 Nelson6ed27indd 1115 Nelson6ed27indd 1115 070414 1422 070414 1422 1116 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Com a chegada do novo milênio foram elucidadas as primeiras estruturas em alta resolução das subunidades ri bossomais de bactérias obtidas a partir de estudos de Tho mas Steitz Ada Yonath Venki Ramakrishnan Harry Noller e outros pesquisadores Esses trabalhos renderam inúme ras surpresas Figura 2714a Em primeiro lugar mudou o foco tradicional que dava maior importância às proteí nas que compõem os ribossomos As subunidades ribosso mais são imensas moléculas de RNA Na subunidade 50S os rRNA 5S e 23S formam o cerne estrutural As proteínas são elementos secundários no complexo decorando a su perfície Em segundo lugar e mais importante não existe proteína no espaço de 18 Å do sítio ativo para a formação da ligação peptídica Assim a estrutura em alta resolução confirma o que Harry Noller havia predito anos antes o ribossomo é uma ribozima Além do discernimento que as estruturas detalhadas dos ribossomos e suas subunidades fornecem sobre o mecanismo de síntese proteica como mais bem descrito a seguir elas estimularam uma nova vi são sobre a evolução da vida Quadro 272 Os ribossomos das células eucarióticas também foram por fim submetidos à análise estrutural Figura 2714b O ribossomo bacteriano é complexo com um peso molecular combinado de 27 milhões As duas subunidades ribos somais com formatos irregulares encai xamse de maneira a formar uma fenda pela qual o mRNA passa à medida que o ribossomo se desloca ao longo dele duran te a tradução Figura 2714a As 57 pro teínas nos ribossomos bacterianos variam enormemente em tamanho e estrutura Os pesos moleculares variam de cerca de 6000 a 75000 A maioria das proteínas TABELA 276 RNAs e proteínas que compõem os ribossomos de E coli Subunidade Número de proteínas diferentes Número total de proteínas Denominação das proteínas Número e tipos de rRNA 30S 21 21 S1S21 1 rRNA 16S 50S 33 36 L1L36 2 rRNA 5S e 23S As denominações L1 a L36 não correspondem a 36 proteínas diferentes A proteína originalmente chamada L7 é na verdade uma forma modificada da L12 e L8 é um complexo de três outras proteínas Além disso constatouse que L26 é a mesma proteína que S20 e não parte da subunidade 50S Dessa forma a subunidade maior é constituída por 33 proteínas diferentes Existem quatro cópias da proteína L7L12 perfazendo 36 proteínas no total b a 50S 30S Sulco Proteína RNA RNA 60S 40S Sulco Proteína RNA RNA FIGURA 2714 A estrutura dos ribossomos A nossa compreensão acer ca da estrutura do ribossomo melhorou muito a partir de múltiplas imagens em alta resolução dos ribossomos de bactérias e de leveduras a Ribosso mo bacteriano derivado de PDB ID 2OW8 e PDB ID 1VSA As subunidades 50S e 30S juntas formam a unidade ribossomal 70S O sulco que existe entre as duas subunidades é o local onde ocorre a síntese proteica b O ribosso mo de leveduras apresenta estrutura semelhante mas com complexidade um pouco maior derivado de PDB ID 3O58 e PDB ID 3O2Z Venkatraman Ramakrishnan Thomas A Steitz Ada E Yonath Nelson6ed27indd 1116 Nelson6ed27indd 1116 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1117 tem domínios globulares organizados na superfície do ri bossomo Algumas também têm extensões alongadas que se projetam para dentro do cerne de rRNA do ribossomo estabilizando sua estrutura As funções de algumas dessas proteínas ainda não foram elucidadas em detalhe mas pa rece evidente que muitas delas têm papel estrutural As sequências dos rRNAs de muitos organismos são hoje conhecidas Cada um dos três rRNAs fita simples de E coli tem uma conformação tridimensional específica que apresenta longos pareamentos de bases intramolecula res Os padrões de enovelamento dos rRNAs são altamente conservados em todos os organismos particularmente as regiões envolvidas em funçõeschaves Figura 2715 As estruturas secundárias propostas para os rRNAs foram con firmadas em grande parte com base em métodos de análise estrutural mas falham em transmitir as extensas redes de interações terciárias aparentes na estrutura completa Os ribossomos das células eucarióticas exceto os ribos somos das mitocôndrias e dos cloroplastos são maiores e mais complexos do que os ribossomos bacterianos Figura 2716 compare com a Figura 2714b com um diâmetro de cerca de 23 nm e um coeficiente de sedimentação de cer ca de 80S Eles também têm duas subunidades que variam em tamanho entre as espécies mas têm em média 60S e QUADRO 272 De um mundo de RNA para um mundo de proteína As ribozimas existentes hoje geralmente realizam um dos dois seguintes tipos de reações clivagem hidrolítica de ligações fosfodiéster ou transferências de grupos fosfo ril Capítulo 26 Em ambos os casos os substratos das reações também são moléculas de RNA Os RNAs ribos somais fornecem uma importante expansão da classe de ribozimas catalíticas conhecidas Combinada com a pes quisa laboratorial acerca das potenciais funções catalíti cas do RNA ver Quadro 263 a ideia de um mundo de RNA como precursor das formas de vida atuais se torna cada vez mais atraente Um mundo de RNA viável exigiria um RNA capaz de se autorreplicar um metabolismo primitivo para ge rar os ribonucleotídeos precursores necessários e um limite celular para ajudar a concentrar os precursores e sequestrálos do meio externo As exigências para a catálise de reações envolvendo um conjunto crescente de metabólitos e macromoléculas poderiam ter levado ao surgimento de RNAs catalíticos maiores e mais com plexos Os muitos grupos fosforil negativamente carre gados na molécula de RNA limitam a estabilidade das moléculas de RNA muito grandes Em um mundo de RNA cátions divalentes ou outros grupos carregados positivamente poderiam ser incorporados nas estrutu ras para aumentar a estabilidade Alguns peptídeos poderiam estabilizar moléculas grandes de RNA Por exemplo muitas proteínas ri bossomais em células eucarióticas atuais têm longas extensões desprovidas de estruturas secundárias que serpenteiam para dentro dos rRNAs e ajudam a estabi lizálos Figura Q1 A síntese de peptídeos catalisada por ribozimas poderia assim ter evoluído inicialmente como parte de uma solução para manter a estrutura de moléculas grandes de RNA A síntese de peptídeos pode ter ajudado a estabilizar ribozimas grandes mas esse avanço também marcou o início do final do mundo de RNA Uma vez tornada possível a síntese de peptídeos o potencial catalítico maior das proteínas teria dado início a uma transição irreversível para um sistema metabólico dominado por proteínas A maioria dos processos enzimáticos foi então en tregue por fim às proteínas mas não todos Em todos os organismos a tarefa crucial de sintetizar proteínas con tinua ainda hoje um processo catalisado por ribozimas Parece haver apenas um bom arranjo ou alguns poucos de resíduos nucleotídicos no sítio ativo de uma ribozima capaz de catalisar a síntese de peptídeos Os resíduos de rRNA que parecem estar envolvidos na atividade pepti diltransferase dos ribossomos são altamente conserva dos nos rRNAs da subunidade ribossomal maior de todas as espécies Utilizando evolução in vitro SELEX ver Quadro 263 pesquisadores isolaram ribozimas artifi ciais que realizam a síntese de peptídeos Curiosamente a maioria delas inclui o octeto de ribonucleotídeos 59 AUAACAGG39 uma sequência altamente conservada encontrada no sítio ativo da peptidiltransferase nos ri bossomos de todas as células Pode ser que haja apenas uma solução ótima para o problema químico global da síntese de proteínas de sequência definida catalisada por ribozimas A evolução encontrou essa solução uma vez e até agora nenhuma forma de vida parece ter conseguido alterála Puromicina 50S FIGURA Q1 A subunidade 50S de um ribossomo bacteriano PDB ID 1Q7Y Os esqueletos proteicos são mostrados como estruturas em azul que serpenteiam os componentes rRNA são transparentes Extensões não estruturadas de muitas proteínas ribossomais serpenteiam para dentro das estruturas de rRNA ajudando a estabilizálas A puromicina ligada mostrada em vermelho indica o sítio ativo para atividade peptidil transferase do rRNA Nelson6ed27indd 1117 Nelson6ed27indd 1117 070414 1422 070414 1422 1118 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 40S Os ribossomos eucarióticos contêm ao todo mais de 80 proteínas diferentes Os ribossomos de mitocôndrias e cloroplastos são um pouco menores e mais simples do que os ribossomos das bactérias Ainda assim a estrutura e a função dos ribossomos são surpreendentemente semelhan tes em todos os organismos e organelas RNA transportadores têm características estruturais próprias Para entender como os tRNAs podem servir como adapta dores na tradução da linguagem dos ácidos nucleicos para a linguagem das proteínas é preciso antes examinar suas estruturas com mais detalhe Os RNAs transportadores são relativamente pequenos e consistem em uma única fita de RNA dobrada em uma estrutura tridimensional precisa ver Figura 825a Os tRNAs presentes nas bactérias e no cito sol de eucariotos contêm entre 73 e 93 resíduos nucleotídi cos correspondendo a pesos moleculares de 24000 a 31000 As mitocôndrias e os cloroplastos têm tRNAs dife rentes e um pouco menores As células têm pelo menos um tipo de tRNA para cada aminoácido pelo menos 32 tRNAs são necessários para reconhecer todos os códons de ami noácidos alguns reconhecem mais de um códon mas al gumas células utilizam mais de 32 O tRNA de alanina tRNA Ala de leveduras foi o primei ro ácido nucleico a ser totalmente sequenciado por Robert Holley em 1965 Ele contém 76 re síduos nucleotídicos 10 dos quais têm bases modificadas Compara ções de tRNAs de várias espécies revelaram muitas características estruturais comuns a todos eles Figura 2717 Oito ou mais re síduos nucleotídicos têm açúca res e bases modificadas muitos dos quais são formas metiladas derivadas das principais bases A maioria dos tRNAs tem um resíduo guanilato pG na extremidade 59 e todos têm a sequência trinucleo tídica CCA39 na extremidade 39 Quando desenhados em duas dimensões o padrão de ligações de hidrogênio de to dos os tRNAs forma uma estrutura de folhadetrevo com quatro braços o tRNA mais longo tem um quinto braço cur to ou braço extra Em três dimensões o tRNA tem a forma de um L torcido Figura 2718 Dois dos braços do tRNA são cruciais para sua função adaptadora O braço do aminoácido pode carregar um aminoácido específico esterificado pelo seu grupo carbo xil ao grupo 29 ou 39hidroxila do resíduo A presente na extremidade 39 do tRNA O braço do anticódon contém o anticódon Os outros braços importantes são o braço D que contém o nucleotídeo incomum dihidrouridina D e o braço TcC o qual contém ribotimidina T que não é comum nos RNAs e pseudouridina c que contém uma ligação incomum carbonocarbono entre a base e a ribose ver Figura 2622 Os braços D e TcC contribuem com im portantes interações para o enovelamento das moléculas de tRNAs e o braço TcC interage com o rRNA da subunidade maior do ribossomo Robert W Holley 19221993 Bactérias Arqueias Eucariotos FIGURA 2715 Conservação da estrutura secundária no rRNA da subunidade menor nos três domínios da vida Vermelho amarelo e li lás indicam as regiões em que as estruturas dos rRNAs de bactérias arqueias e eucariotos divergiram As regiões conservadas são mostradas em verde Ribossomo bacteriano 70S Mr 27 3 106 Ribossomo eucariótico 80S Mr 42 3 106 50S 60S Mr 18 3 106 rRNA 5S 120 nucleotídeos rRNA 23S 3200 nucleotídeos 36 proteínas Mr 28 3 106 rRNA 5S 120 nucleotídeos rRNA 28S 4700 nucleotídeos rRNA 58S 160 nucleotídeos 47 proteínas 30S 40S Mr 09 3 106 rRNA 16S 1540 nucleotídeos 21 proteínas Mr 14 3 106 rRNA 18S 1900 nucleotídeos 33 proteínas FIGURA 2716 Resumo da composição e da massa dos ribossomos de bactérias e de eucariotos As subunidades ribossomais estão identifica das pelos seus valores S unidade Svedberg coeficientes de sedimentação que se referem às suas velocidades de sedimentação em uma centrífuga Os valores S não são aditivos quando as subunidades são combinadas pois os valores S são proporcionais a aproximadamente 23 da força do peso mole cular e também são afetados pela forma da partícula Nelson6ed27indd 1118 Nelson6ed27indd 1118 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1119 Após a análise das estruturas dos ribossomos e dos tR NAs agora serão estudados em detalhe os cinco estágios da síntese proteica Estágio 1 As aminoaciltRNAsintases ligam os aminoácidos corretos aos seus respectivos tRNA Durante a primeira etapa da síntese de proteínas que ocor re no citosol as aminoaciltRNAsintases esterificam os 20 aminoácidos aos seus respectivos tRNAs Cada enzima é específica para um aminoácido e um ou mais tRNAs cor respondentes A maioria dos organismos tem uma amino aciltRNAsintase para cada aminoácido Para aminoácidos com dois ou mais tRNAs correspondentes a mesma enzima pode geralmente aminoacilar todos eles As estruturas de todas as aminoaciltRNAsintases de E coli já foram determinadas Os pesquisadores divi diramnas em duas classes Tabela 277 com base em diferenças consideráveis nas suas estruturas primária e terciária e no mecanismo de reação Figura 2719 essas Braço TcC Braço extra Variável em tamanho não está presente em todos os tRNA Posição oscilante Contém dois ou três resíduos D em posições diferentes U A Pu G G A G T Pu C C A Braço do aminoácido Braço D C C Py U Pu Braço do anticódon 39 59 Anticódon 39 59 FIGURA 2717 Estrutura secundária geral em forma de folhadetre vo dos tRNAs Os pontos grandes ao longo da estrutura representam resí duos nucleotídicos as linhas azuis representam pares de bases Os resíduos característicos eou não variáveis comuns a todos os tRNAs estão mostrados em cor salmão Os RNAs transportadores variam em comprimento de 73 a 93 nucleotídeos Nucleotídeos extras ocorrem no braço extra ou no braço D Na extremidade do braço do anticódon está a alça do anticódon a qual sempre contém sete nucleotídeos não pareados O braço D contém dois ou três resíduos D 56dihidrouridina dependendo do tRNA Em alguns tRNA o braço D tem apenas três pares de bases ligados por ligações de hidrogê nio Os símbolos apresentados são Pu nucleotídeo púrico Py nucleotídeo pirimídico G guanilato ou 29Ometilguanilato a b 39 59 Braço do aminoácido Braço TcC Braço do anticódon Braço D Braço D resíduos 1025 Braço do anticódon Anticódon Anticódon Braço do aminoácido Braço TcC 59 1 64 54 56 20 44 32 38 26 12 7 69 72 39 AA FIGURA 2718 Estrutura tridimensional do tRNA Phe de levedura re solvida a partir de análises de difração por raios X A forma lembra um L torcido a Diagrama esquemático com os vários braços identificados na Figura 2717 apresentados em diferentes cores b Um modelo de volume atômico com o mesmo código de cores PDB ID 4TRA A sequência CCA na extremidade 39 em lilás é o ponto para a ligação do aminoácido TABELA 277 As duas classes de aminoaciltRNAsintases Classe I Classe II Arg Leu Ala Lys Cys Met Asn Phe Gln Trp Asp Pro Glu Tyr Gly Ser Ile Val His Thr Nota Aqui Arg representa arginiltRNAsintase e assim por diante A classifica ção se aplica a todos os organismos para os quais as aminoaciltRNAsintases já foram analisadas e se baseia nas diferenças estruturais da proteína e nas diferen ças dos mecanismos de ação esquematizados na Figura 2719 Nelson6ed27indd 1119 Nelson6ed27indd 1119 070414 1422 070414 1422 1120 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ATP Aminoácido O acarboxil do aminoácido ataca o fósforo a do ATP formando 59 aminoaciladenilato Adenina Adenina 59Aminoaciladenilato aminoacilAMP AminoaciltRNA sintases de classe I AminoaciltRNA sintases de classe II Adenina Extremidade 39 do tRNA Adenosina AminoacilAMP tRNA Transesterificação Adenina Adenina AMP Adenosina AminoacilAMP O grupo aminoacil é transferido para a 29OH do resíduo A do terminal 39 do transportador liberando AMP A transesterificação desloca o grupo aminoacil para a 39OH do mesmo resíduo no tRNA gerando o produto aminoaciltRNA O grupo aminoacil é transferido diretamente para a 39OH do resíduo A na extremidade 39 do tRNA gerando o produto aminoaciltRNA tRNA Adenina AminoaciltRNA MECANISMO FIGURA 2719 Aminoacilação do tRNA pelas aminoaciltRNAsintases A etapa ➊ é a formação de um aminoaciladeni lato o qual permanece ligado ao sítio ativo Na segunda etapa o grupo aminoacil é transferido ao tRNA O mecanismo dessa etapa é um pou co diferente para as duas classes de aminoacil tRNAsintases ver Tabela 277 Para as enzimas da classe I o grupo aminoacila é inicialmente transferido para o grupo 29 hidroxila do resíduo A presente na extremidade 39 depois para o grupo 39hidroxila por meio de uma reação de transesterificação Para as enzimas da classe II o grupo aminoacila é transferido direta mente para o grupo 39hidroxila do adenilato terminal Nelson6ed27indd 1120 Nelson6ed27indd 1120 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1121 duas classes são as mesmas em todos os organismos Não existem evidências de que as duas classes compartilham um ancestral comum e as razões biológicas químicas ou evolutivas para a existência de duas classes de enzimas participando de processos praticamente idênticos perma necem obscuras A reação catalisada por uma aminoaciltRNAsintase é Aminoácido 1 tRNA 1 ATP aminoaciltRNA 1 AMP 1 PPi Essa reação ocorre em duas etapas no sítio ativo da enzima Na etapa ➊ Figura 2719 é formado um intermediário ligado à enzima o aminoaciladenilato aminoacilAMP Na segunda etapa o grupo aminoacila é transferido do aminoacilAMP ligado à enzima para o seu tRNA específico correspondente O caminho pelo qual ocorre essa segunda etapa depende da classe à qual pertence a enzima como mostrado nas etapas e da Figura 2719 A ligação éster resultante entre o aminoácido e o tRNA Figura 2720 tem uma energia livre de hidrólise altamente negativa ΔG9º 5 29 kJmol O pirofosfato formado na reação de ativação sofre hidrólise formando fosfato pela ação da pirofosfatase inorgânica Assim para cada molécula de aminoácido ativa da duas ligações fosfato de alta energia são gastas no final tornando a reação global de ativação de um aminoácido es sencialmente irreversível Aminoácido 1 tRNA 1 ATP aminoaciltRNA 1 AMP 1 2Pi DG9º ø 229 kJmol Edição pelas aminoaciltRNAsintases A aminoacilação do tRNA cumpre duas finalidades 1 ativa um aminoácido para a formação de uma ligação peptídica e 2 garante o posicio namento apropriado do aminoácido no polipeptídeo nas cente A identidade do aminoácido ligado a um tRNA não é conferida no ribossomo portanto a ligação do aminoácido correto ao seu tRNA é essencial para a fidelidade da síntese proteica Como visto no Capítulo 6 a especificidade de uma en zima é limitada pela energia de ligação disponível das inte rações enzimasubstrato A discriminação entre dois subs tratos aminoácidos semelhantes foi estudada em detalhe no caso da IletRNAsintase que distingue entre valina e isoleucina aminoácidos que diferem em apenas um grupo metileno CH2 COO2 1 C H C H H3N CH3 CH3 Valina COO2 1 C H H3N C CH3 CH2 H CH3 Isoleucina A IletRNAsintetase favorece a ativação da isoleucina para formar IleAMP em relação à valina por um fator de 200 como seria de se esperar considerando o quanto um grupo metileno na Ile pode intensificar a ligação de um substrato Ainda assim a valina é erroneamente incorpo rada em proteínas em posições normalmente ocupadas por um resíduo de Ile com uma frequência de apenas cerca de 1 em 3000 Como ocorre esse aumento de mais de 10 vezes na precisão A IletRNAsintase como outras aminoacil tRNAsintases tem uma função de edição Lembrese de um princípio geral da discussão acerca da edição realizada pelas DNApolimerases ver Figura 257 se as interações de ligação disponíveis não forne cerem discriminação suficiente entre dois substratos a especificidade necessária poderá ser obtida pela ligação específica do substrato em duas etapas sucessivas For çar o sistema por meio de dois filtros sucessivos tem um efeito multiplicativo No caso da IletRNAsintase o pri meiro filtro é a ligação inicial do aminoácido à enzima e a sua ativação a aminoacilAMP O segundo é a ligação de qualquer produto aminoacilAMP incorreto em um sítio ativo separado na enzima um substrato que se ligar nesse segundo sítio ativo é hidrolisado O grupo R da valina é um pouco menor do que o da isoleucina de modo que ValAMP cabe no sítio hidrolítico de edição da IletRNA sintase enquanto o IleAMP não cabe Assim ValAMP é hidrolisado a valina e AMP no sítio ativo de edição e o tRNA ligado à sintase não se torna aminoacilado ao ami noácido errado Além da edição após a formação do aminoacilAMP in termediário a maioria das aminoaciltRNAsintases são capazes de hidrolisar a ligação éster entre aminoácidos e tRNA nos aminoaciltRNA Essa hidrólise é bastante acele rada em tRNA carregados incorretamente fornecendo um terceiro filtro para melhorar a fidelidade do processo As poucas aminoaciltRNAsintases que ativam aminoácidos Extremidade 39 do tRNA Grupo aminoacila Adenina 59 pG Braço do aminoácido Braço TcC Braço do anticódon Braço D FIGURA 2720 Estrutura geral de um aminoaciltRNA O grupo ami noacila é esterificado à posição 39 do resíduo A terminal A ligação éster que ativa o aminoácido e o une ao tRNA aparece sombreada em cor salmão na figura Nelson6ed27indd 1121 Nelson6ed27indd 1121 070414 1422 070414 1422 1122 DAVID L NELSON MICHAEL M COX sem parentesco estrutural próximo p ex CystRNAsin tase demonstram pouca ou nenhuma atividade de edição nesses casos o sítio ativo para aminoacilação é capaz de discriminar entre o substrato adequado e qualquer outro aminoácido incorreto A taxa de erro da síntese de proteínas 1 erro para cada 10 4 aminoácidos incorporados não chega perto da quela da replicação do DNA que é bem mais baixa Como os defeitos nas proteínas são eliminados quando as proteí nas são degradadas e não são passados adiante para as ge rações seguintes eles têm um menor significado biológico O grau de fidelidade da síntese proteica é suficiente para garantir que a maioria das proteínas não contenha erros e que a grande quantidade de energia necessária para sinteti zar uma proteína não seja desperdiçada A presença de uma molécula de proteína com defeito geralmente não é impor tante quando muitas cópias corretas dessa mesma proteína estão presentes Interação entre uma aminoaciltRNAsintase e um tRNA um segun do código genético Uma dada aminoaciltRNAsintetase deve ser específica não apenas para um único aminoácido mas também para um determinado tRNA Para a fidelidade da biossíntese de proteínas discriminar entre dezenas de tRNA é uma tarefa tão importante quanto distinguir entre os diferentes aminoácidos A interação entre as aminoacil tRNAsintases e os tRNA têm sido considerada um se gundo código genético refletindo o papel crucial que isso apresenta para manter a precisão da síntese proteica As regras de codificação parecem ser ainda mais complexas do que aquelas do primeiro código A Figura 2721 resume o atual conhecimento sobre os nucleotídeos envolvidos no reconhecimento dos tRNA por algumas aminoaciltRNAsintases Alguns nucleotídeos são conservados em todos os tRNA e portanto não podem ser utilizados para discriminação Observando mudanças nos nucleotídeos que causam alteração na especificidade pelo substrato os pesquisadores identificaram as posições dos nucleotídeos que estão envolvidos na discriminação pelas aminoaciltRNAsintases Essas posições parecem estar concentradas no braço do aminoácido e no braço do anti códon incluindo os nucleotídeos do próprio anticódon mas também estão localizadas em outras partes das moléculas de tRNA A determinação das estruturas cristalográficas das aminoaciltRNAsintases formando um complexo com seus respectivos tRNA e ATP colaborou muito para o co nhecimento acerca dessas interações Figura 2722 Dez ou mais nucleotídeos específicos podem estar en volvidos no reconhecimento de um tRNA pela sua respec tiva aminoaciltRNAsintase Em alguns casos contudo o mecanismo de reconhecimento é bastante simples Em di versas classes de organismos de bactérias a humanos o principal determinante para o reconhecimento do tRNA pela AlatRNAsintase é um único par de bases GU no braço do aminoácido do tRNA Ala Figura 2723a Um RNA sintético curto com apenas 7 pb organizados em uma a b 39 39 59 59 Braço do aminoácido Braço do aminoácido Braço TcC Braço TcC Braço extra Braço do anticódon Braço do anticódon Anticódon Anticódon Braço D Braço D 39 59 FIGURA 2721 Posições nos tRNAs dos nucleotídeos reconhecidos pelas aminoaciltRNAsintases a Algumas posições pontos em lilás são as mesmas em todos os tRNAs e portanto não podem ser utilizadas para discriminar um tRNA de outro Outras posições são conhecidas por servirem de pontos de reconhecimento por uma cor de laranja ou mais azul aminoaciltRNAsintases Outras características estruturais além da se quência são importantes para o reconhecimento por algumas sintases b PDB ID 1EHZ As mesmas características estruturais são mostradas em três dimensões com os resíduos em cor de laranja e azul representando nova mente as posições reconhecidas por uma ou por mais de uma aminoacil tRNAsintase respectivamente Nelson6ed27indd 1122 Nelson6ed27indd 1122 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1123 minihélice formando um grampo é de maneira eficiente aminoacilado pela AlatRNAsintetase desde que o RNA contenha o GU crítico Figura 2723b Esse sistema re lativamente simples da alanina pode ser uma relíquia evo lutiva de um período no qual os oligonucleotídeos de RNA ancestrais dos tRNAs eram aminoacilados por meio de um sistema primitivo para a síntese de proteínas A interação das aminoaciltRNAsintases com seus res pectivos tRNA é crucial para a leitura precisa do código genético Qualquer expansão do código para incluir novos aminoácidos teria necessariamente de incluir um novo par aminoaciltRNAsintase tRNA Uma expansão limitada do código genético já foi observada na natureza uma expansão maior foi obtida em laboratório Quadro 273 a tRNA tRNA tRNA ATP ATP b FIGURA 2722 AminoaciltRNAsintases Ambas as sintases são mostra das formando um complexo com seus respectivos tRNAs verde O ATP liga do vermelho indica o sítio ativo próximo à extremidade do braço aminoacil a GlntRNAsintase de E coli uma sintase monomérica típica da classe I PDB ID 1QRT b AsptRNAsintase de levedura uma sintase dimérica típica da classe II PDB ID 1ASZ 39 59 76 G U 70 40 30 20 10 39 59 76 G U 70 a 1 5 10 13 66 Nucleotídeos deletados b 60 50 1 FIGURA 2723 Elementos estruturais do tRNA Ala são necessários para o reconhecimento pela AlatRNAsintase a Os elementos estruturais do tRNA Ala reconhecidos pela AlatRNAsintase são simples de modo não comum Um único par de bases GU em cor salmão é o único elemento necessário para a ligação específica e para a aminoacilação b Uma minihélice curta de RNA sintético com o par de bases GU fundamental mas sem a maior parte das estru turas de um tRNA Essa molécula é aminoacilada espe cificamente com alanina de forma quase tão eficiente quanto o tRNA Ala completo Nelson6ed27indd 1123 Nelson6ed27indd 1123 070414 1422 070414 1422 1124 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Como foi visto os 20 aminoácidos comumente encontra dos nas proteínas oferecem funcionalidade química limi tada Os sistemas vivos geralmente superam essas limi tações utilizando cofatores enzimáticos ou modificando alguns aminoácidos após terem sido incorporados nas proteínas A princípio a expansão do código genético para introduzir novos aminoácidos nas proteínas oferece outro caminho para novas funcionalidades mas é um caminho muito difícil de ser seguido Tal mudança pode muito bem resultar na inativação de milhares de proteínas celulares Expandir o código genético para incluir um novo ami noácido requer várias mudanças celulares Uma nova ami noaciltRNAsintase precisa geralmente estar presente junto com o tRNA correspondente Ambos os componen tes devem ser altamente específicos interagindo apenas entre si e com o novo aminoácido O novo aminoácido deve estar presente em concentrações significativas na célula podendo acarretar a evolução de novas vias meta bólicas Como mostrado no Quadro 271 o anticódon no tRNA realizaria provavelmente um pareamento com um códon que normalmente especifica terminação Realizar todo esse trabalho em uma célula parece improvável mas já ocorreu tanto na natureza quanto no laboratório Existem na verdade 22 em vez de 20 aminoácidos especificados pelo código genético Os dois aminoácidos extras são a selenocisteína e a pirrolisina cada um sendo encontrado em poucas proteínas mas ambos oferecem uma noção da complexidade da evolução do código ge nético COO2 1 CH CH2 H3N SeH Selenocisteína Pirrolisina COO2 1 CH CH2 H3N CH2 CH2 CH2 CH3 NH C O N Em todas as células algumas proteínas como a forma todesidrogenase nas bactérias e a glutationaperoxidase nos mamíferos requerem selenocisteína para sua ativida de Em Ecoli a selenocisteína é introduzida na enzima formatodesidrogenase durante a tradução em resposta a um códon UGA presente na leitura Um tipo especial de SertRNA presente em níveis mais baixos do que outros SertRNA reconhece UGA e nenhum outro códon Esse tRNA é carregado com serina pela serinaaminoaciltRNA sintase normal e a serina é convertida enzimaticamen te em selenocisteína por uma outra enzima antes de ser usada no ribossomo O tRNA carregado não reconhece qualquer códon UGA algum sinal no contexto do mRNA ainda a ser identificado garante que esse tRNA reconhe ça apenas os poucos códons UGA presentes dentro de alguns genes que especificam selenocisteína De fato o UGA apresenta dupla função codificando a terminação e muito ocasionalmente a selenocisteína Essa expansão do código em particular tem um tRNA específico como descrito antes mas não tem uma aminoaciltRNAsintase específica O processo funciona para selenocisteína mas podese considerálo uma etapa intermediária na evolução de uma definição de código completamente nova A pirrolisina é encontrada em um grupo de arquibac térias anaeróbias denominadas metanogênicas ver Qua dro 221 Esses organismos produzem metano como parte de seu metabolismo sendo que o grupo das Me thanosarcinaceae pode utilizar metilaminas como subs tratos para a metanogênese Produzir metano a partir de monometilamina requer a enzima monometilamina metiltransferase O gene que codifica essa enzima tem um códon de parada UAG na fase de leitura A estrutura da metiltransferase foi elucidada em 2002 revelando a presença do novo aminoácido pirrolisina na posição es pecificada pelo códon UAG Experimentos subsequentes demonstraram que ao contrário da selenocisteína a pirrolisina era ligada diretamente a um tRNA específico por uma pirrolisiltRNAsintase específica Essas células produzem pirrolisina por meio de uma via metabólica que ainda precisa ser elucidada Todo o sistema apresenta as características típicas de um código genético já estabele cido mas só funciona para códons UAG presentes nesse gene em particular Como no caso da selenocisteína exis tem provavelmente sinais contextuais que direcionam esse tRNA para o códon UAG correto Será que os cientistas conseguem competir com tal proeza evolutiva Modificações de proteínas com vários grupos funcionais podem fornecer importantes pistas acerca da atividade eou da estrutura das proteínas No entanto a modificação de proteínas geralmente é mui to trabalhosa Por exemplo um pesquisador que deseja ligar um novo grupo a um resíduo Cys específico deverá de alguma maneira bloquear os demais resíduos Cys que porventura estejam presentes na mesma proteína Se em vez disso ele pudesse adaptar o código genético de for ma a permitir que a célula inserisse um aminoácido mo dificado em um local específico na proteína o processo seria muito mais conveniente Peter Schultz e colabora dores fizeram exatamente isso Para desenvolver uma nova especificação para um códon são necessários como já foi citado uma nova aminoaciltRNAsintase e um novo tRNA corresponden te ambos adaptados para funcionar com apenas um novo aminoácido Tentativas para criar tal expansão não na tural do código genético focalizaram inicialmente em E coli O códon UAG foi escolhido como o melhor alvo para codificar um novo aminoácido Dos três códons de parada UAG é o menos utilizado e linhagens com tRNA selecionados para reconhecer UAG ver o Quadro 274 QUADRO 273 Expansões naturais e não naturais do código genético Nelson6ed27indd 1124 Nelson6ed27indd 1124 040614 1554 040614 1554 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1125 Biblioteca Remover o plasmídeo que contém o gene barnase Crescimento em meio contendo ampicilina As células sobrevivem apenas se contiverem os variantes MjtRNATyr aminoacilados pela MjTyrRS Adicionar plasmídeo contendo o gene MjTyrRS e o gene da blactamase construído em laboratório As células contendo variantes MjtRNATyr aminoacilados pelas tRNAsintases endógenas morrem As sobreviventes têm variantes MjtRNATyr que não são aminoacilados Seleção negativa Seleção positiva Gene MjtRNATyr Gene barnase Gene da blactamase Gene MjTyrRS tRNA Adicionar plasmídeo que tem o gene barnase construído em laboratório Randomizar a sequência do gene MjtRNATyr em 11 posições transformar as células para criar uma biblioteca Expressão 39 59 T A G T A G T A G T A G T A G FIGURA Q1 Seleção dos variantes MjtRNA Tyr que funcionam apenas com a tirosiltRNAsintase MjTyrRS A sequência do gene que codifica a MjtRNA Tyr presente em um plasmídeo é randomizada em 11 posições que não in teragem com a MjTyrRS pontos vermelhos Os plasmídeos mutantes são introduzidos em células de E coli para gerar uma biblioteca de milhões de variantes MjtRNA Tyr representados pelas seis células mostradas aqui O gene tóxico da barnase construído em laboratório para conter a sequência TAG de forma que seu transcrito possua códons UAG é introduzido em um plas mídeo separado fornecendo uma seleção negativa Se esse gene for ex presso as células morrem Ele apenas será expresso se o variante MjtRNA Tyr expresso por essas mesmas células for aminoacilado pelas aminoaciltRNA sintases endógenas de E coli inserindo um aminoácido em vez de termi nar a tradução Um outro gene que codifica a blactamase e que também foi modificado em laboratório para conter a sequência TAG a fim de produ zir códons de parada UAG é inserido em um outro plasmídeo o qual tam bém expressa o gene que codifica a MjTyrRS Esse serve como uma forma de seleção positiva para os demais variantes de MjtRNA Tyr Aqueles variantes que forem aminoacilados pela MjTyrRS permitem a expressão do gene da blactamase o qual por sua vez permite que as células cresçam na presen ça de ampicilina Múltiplos ciclos de seleção negativa e de seleção positiva fornecem os melhores variantes de MjtRNA Tyr aminoacilados unicamente pela MjTyrRS e utilizados de maneira eficiente na tradução Continua na próxima página Nelson6ed27indd 1125 Nelson6ed27indd 1125 070414 1422 070414 1422 1126 DAVID L NELSON MICHAEL M COX não apresentam defeitos no crescimento das bactérias Para criar o novo tRNA e a nova tRNAsintase os genes para tirosiltRNA e sua respectiva tirosiltRNAsintase foram obtidos da arquibactérias Methanococcus jan naschii MjtRNA Tyr e MjTyrRS A MjTyrRS não se liga à alça do anticódon do MjtRNA Tyr permitindo que a alça do anticódon seja modificada para CUA complementar a UAG sem afetar a interação Como os sistemas das bac térias e das arquibactérias são ortólogos os componentes modificados das arquibactérias puderam ser transferidos para células de E coli sem destruir o sistema de tradu ção intrínseco das células Primeiro o gene que codifica o MjtRNA Tyr teve de ser modificado para gerar um tRNA ideal que não fosse re conhecido por qualquer aminoaciltRNAsintase endóge na de E coli mas que fosse aminoacilado pela MjTyrRS Vários ciclos de seleção negativa e de seleção positiva foram desenhados e realizados para que fosse possível encontrar de maneira eficiente tal variante em meio a ou tros variantes do gene do tRNA Figura Q1 Partes da sequência do MjtRNA Tyr foram trocadas aleatoriamente permitindo a criação de uma biblioteca de células em que cada uma expressava uma versão diferente do tRNA Um gene codificando barnase uma ribonuclease tóxica para E coli foi modificado de forma que seu transcrito de mRNA contivesse vários códons UAG e esse gene tam bém foi introduzido nas células por um plasmídeo Se o variante de MjtRNA Tyr expresso em uma determinada célula da biblioteca fosse aminoacilado por uma tRNA sintase endógena passaria a expressar o gene da barna se e essa célula morreria seleção negativa As células sobreviventes conteriam os variantes de MjtRNA Tyr que não foram aminoacilados pelas tRNAsintases endógenas mas com potencial de serem aminoacilados pela MjTyrRS Uma seleção positiva Figura Q1 foi então estabelecida modificando o gene da blactamase que confere resistên cia ao antibiótico ampicilina de forma que seu transcrito contivesse vários códons UAG e introduzindo esse gene nas células junto com o gene que codifica a MjTyrRS Os variantes de MjtRNA Tyr que fossem aminoacilados pela MjTyrRS permitiriam o crescimento em meio com ampici lina apenas quando a MjTyrRS também fosse expressa na célula Vários ciclos desse esquema de seleção negativa e de seleção positiva permitiram a identificação de um novo variante de MjtRNA Tyr que não era afetado por enzimas endógenas que era aminoacilado pela MjTyrRS e que fun cionava bem na tradução Em segundo lugar a MjTyrRS teve de ser modificada para reconhecer o novo aminoácido O gene que codifica a MjTyrRS foi dessa vez mutado para criar uma grande biblioteca de variantes Os variantes que iriam aminoaci lar o novo variante de MjtRNA Tyr com aminoácidos endó genos foram eliminados utilizando a seleção com o gene da barnase Uma segunda seleção positiva semelhante à seleção com ampicilina descrita antes foi realizada de for ma que as células sobrevivessem somente se o variante de MjtRNA Tyr fosse aminoacilado apenas na presença do ami noácido não natural Vários ciclos de seleção negativa e de seleção positiva geraram um par específico tRNAsintase tRNA que reconhecia apenas o aminoácido não natural Esses componentes tiveram então o nome alterado a fim de refletir o aminoácido não natural utilizado na seleção Utilizando essa abordagem muitas linhagens de E coli foram construídas cada uma capaz de incorporar um determinado aminoácido não natural em uma pro teína em resposta a um códon UAG A mesma aborda gem tem sido utilizada para expandir artificialmente o código genético de leveduras e até mesmo de células de mamíferos Desse modo mais de 30 aminoácidos dife rentes Figura Q2 podem ser introduzidos de maneira eficiente em sítios específicos de proteínas clonadas Como resultado temse uma ferramenta cada vez mais útil e flexível para avançar nos estudos sobre a estrutura e a função das proteínas QUADRO 273 Expansões naturais e não naturais do código genético Continuação COO2 1 CH CH2 C O CH3 H3N a COO2 1 CH CH2 N N1 N2 H3N b COO2 1 CH CH2 CH2 H3N O O OH d COO2 1 CH CH2 Br H3N e COO2 1 CH CH2 CH2 CH2 CH2 SH H3N f c COO2 1 CH CH2 N H3N F C C F F N FIGURA Q2 Uma amostra dos aminoácidos não naturais que já foram adicionados ao código genético Esses aminoácidos contribuem com grupos químicos reativos singulares como a cetona b azida c fo toconector grupo funcional desenhado para formar ligações covalentes com um grupo próximo quando ativado pela luz d aminoácido alta mente fluorescente e aminoácido com átomo pesado Br para uso em cristalografia e f um análogo de cisteína de cadeia longa com mais am pla capacidade de formar pontes dissulfeto Nelson6ed27indd 1126 Nelson6ed27indd 1126 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1127 Estágio 2 Um aminoácido específico inicia a síntese de proteínas A síntese de proteínas começa na extremidade aminoter minal e procede à adição de aminoácidos passo a passo em direção à extremidade carboxiterminal do polipeptí deo nascente como determinado por Howard Dintzis em 1961 Figura 2724 O códon de iniciação AUG dessa maneira especifica um resíduo de metionina aminotermi nal Apesar de a metionina possuir apenas um códon 59 AUG todos os organismos têm dois tRNAs para metionina Um deles é utilizado exclusivamente quando 59AUG é o códon de iniciação para a síntese de proteínas O outro é utilizado para codificar resíduos Met em posições internas no polipeptídeo A distinção entre um 59AUG iniciador e um interno é direta Em bactérias os dois tipos de tRNA específicos para metionina são designados tRNA Met e tRNA fMet O ami noácido incorporado em resposta ao códon de iniciação 59AUG é a Nformilmetionina fMet Ele chega ao ribos somo como NformilmetioniltRNA fMet fMettRNA fMet o qual é formado em duas reações sucessivas Primeiramen te a metionina é ligada ao tRNA fMet pela MettRNA sintase a qual em E coli aminoacila tanto o tRNA fMet quanto o tRNA Met Metionina 1 tRNA fMet 1 ATP MettRNA fMet 1 AMP 1 PPi Em seguida uma transformilase transfere um grupo formil do N 10formiltetrahidrofolato para o grupo amino do resí duo Met N 10formiltetrahidrofolato 1 MettRNA fMet tetrahidrofolato 1 fMettRNA fMet A transformilase é mais seletiva do que a MettRNAsintase ela é específica para resíduos Met ligados ao tRNA fMet pre sumivelmente reconhecendo alguma característica estrutu ral singular daquele tRNA Já o MettRNA Met insere metioni na em posições internas nos polipeptídeos Nformilmetionina N H H S CH2 CH2 CH3 C COO C O H A adição do grupo Nformil ao grupo amino da metioni na pela transformilase impede que a fMet entre em posições internas em um polipeptídeo e ao mesmo tempo também permite que o fMettRNA fMet se ligue em um sítio de inicia ção específico no ribossomo o qual não aceita MettRNA Met nem qualquer outro aminoaciltRNA Em células eucarióticas todos os polipeptídeos sinteti zados por ribossomos citosólicos iniciam com um resíduo Met em vez de fMet mas novamente a célula utiliza um tRNA iniciador especializado que é diferente do tRNA Met utilizado em códons 59AUG em posições internas no mRNA Os polipeptídeos sintetizados pelos ribossomos das mitocôndrias e dos cloroplastos entretanto iniciam com N formilmetionina Esse fato dá forte suporte à ideia de que as mitocôndrias e os cloroplastos se originaram de bactérias ancestrais que foram simbioticamente incorporadas em cé lulas eucarióticas precursoras em um estágio primordial da evolução ver Figura 138 Como pode um único códon 59AUG determinar se será inserida uma Nformilmetionina inicial ou metionina em eucariotos ou um resíduo Met interno Detalhes do processo de iniciação fornecem a resposta As três etapas da iniciação A iniciação da síntese de um po lipeptídeo nas bactérias requer 1 a subunidade 30S do ribossomo 2 o mRNA que codifica o polipeptídeo a ser produzido 3 o fMettRNA fMet iniciador 4 um conjunto de três proteínas denominadas fatores de iniciação IF1 IF2 e IF3 5 GTP 6 a subunidade 50S do ribossomo e 7 Mg 21 A formação do complexo de iniciação se dá em três etapas Figura 2725 Na etapa ➊ a subunidade 30S do ribossomo se liga a dois fatores de iniciação IF1 e IF3 O fator IF3 impede que as subunidades 30S e 50S se combinem prematuramen te O mRNA se liga então à subunidade 30S O 59AUG iniciador é guiado até sua posição correta pela sequência de ShineDalgarno assim chamada em virtude dos pes 4 min Terminal amino Terminal carboxil Direção do crescimento da cadeia 7 min 16 min 60 min 146 Número do resíduo 1 FIGURA 2724 Prova de que os polipeptídeos crescem pela adição de resíduos de aminoácidos em direção à porção carboxiterminal o experimento de Dintzis Reticulócitos eritrócitos imaturos sinteti zando ativamente hemoglobina foram incubados com leucina radioativa selecionada porque ocorre frequentemente nas cadeias de a e bglobina Amostras de cadeias a completas foram então isoladas dos reticulócitos em vários intervalos de tempo e a distribuição da radioatividade foi deter minada As zonas em vermelhoescuro mostram as porções das cadeias completas de aglobina contendo resíduos de Leu radioativos Aos 4 min apenas alguns resíduos na extremidade carboxil da aglobina estavam marcados pois as únicas cadeias completas de globina com marcador incorporado após 4 min eram aquelas cuja síntese estava praticamente completa no momento em que o marcador foi adicionado Com tempos de incubação mais longos segmentos sucessivamente mais longos do polipeptídeo apresentaram resíduos marcados sempre em um bloco na extremidade carboxil da cadeia A extremidade não marcada do polipep tídeo aminoterminal foi então definida como a extremidade iniciadora isto é os polipeptídeos crescem por adições sucessivas de aminoácidos na extremidade carboxil Nelson6ed27indd 1127 Nelson6ed27indd 1127 070414 1422 070414 1422 1128 DAVID L NELSON MICHAEL M COX quisadores australianos que a identificaram John Shine e Lynn Dalgarno presente no mRNA Essa sequência con senso é um sinal de iniciação contendo de quatro a nove re síduos de purina 8 a 13 pb no lado 59 do códon de iniciação Figura 2726a A sequência realiza um pareamento de bases com uma sequência complementar rica em pirimidina próxima à extremidade 39 do rRNA 16S da subunidade 30S do ribossomo Figura 2726b Essa interação mRNArRNA coloca a sequência iniciadora 59AUG do mRNA em uma posição precisa da subunidade 30S onde ela é necessária para o início da tradução O 59AUG específico no qual o fMettRNA fMet deve se ligar é distinguido de outros códons de metionina pela sua proximidade à sequência ShineDal garno no mRNA Os ribossomos bacterianos têm três sítios que ligam tRNA o sítio aminoacil A o sítio peptidil P e o sítio de saída E de exit Os sítios A e P se ligam a um aminoaciltRNA enquanto o sítio E se liga apenas a tRNA não carregados que já completaram sua tarefa no ribosso mo Ambas as subunidades 30S e 50S contribuem para as características dos sítios A e P enquanto o sítio E é restri to à subunidade 50S O 59AUG iniciador é posicionado no sítio P o único sítio no qual o fMettRNA fMet consegue se ligar Figura 2725 O fMettRNA fMet é o único aminoacil tRNA que se liga primeiro ao sítio P durante o estágio subsequente de alongamento todos os outros aminoacil tRNA que chegam incluindo o MettRNA Met que se liga a códons AUG internos ligamse primeiro ao sítio A e só depois aos sítios P e E O sítio E é o sítio pelo qual os tRNA não carregados saem durante o alongamento O fator IF1 se liga ao sítio A e impede a ligação do tRNA nesse sítio durante a iniciação Na etapa ➋ do processo de iniciação Figura 2725 o complexo constituído da subunidade 30S do ribossomo do IF3 e do mRNA se junta ao IF2 ligado a GTP e ao fMet tRNA fMet iniciador O anticódon desse tRNA pareia então corretamente com o códon iniciador do mRNA Na etapa ➌ esse grande complexo se combina com a subunidade 50S do ribossomo simultaneamente o GTP li gado ao IF2 é hidrolisado a GDP e Pi os quais são liberados do complexo Nesse ponto todos os três fatores de inicia ção saem do ribossomo O término das etapas mostradas na Figura 2725 produz um ribossomo funcional 70S chamado de complexo de ini ciação o qual contém o mRNA e o fMettRNA fMet iniciador A ligação correta do fMettRNA fMet no sítio P no complexo de iniciação 70S é garantida por pelo menos três pontos de reconhecimento e de ligação a interação códonanticódon envolvendo o AUG iniciador posicionado no sítio P a in teração entre a sequência de ShineDalgarno do mRNA e o rRNA 16S e as interações de ligação entre o sítio P do ribossomo e o fMettRNA fMet O complexo de iniciação está agora pronto para o alongamento A iniciação nas células eucarióticas A tradução é de modo ge ral semelhante em células eucarióticas e em células bac terianas a maioria das diferenças significativas estão no número de componentes envolvidos e em detalhes do seu mecanismo O processo de iniciação em eucariotos está es GTP P A E AUG UAC 39 59 P A P E E E AUG UAC fMet fMet 39 59 59 39 AUG 39 59 Subunidade 30S A subunidade 30S liga o IF1 e o IF3 e depois o mRNA IF2GTP ligase à subunidade 30S e recruta o fMettRNAfMet o qual forma pares de bases com o códon de iniciação A subunidade 50S associase ao complexo o IF2 hidrolisa o GTP e IF1 IF2 e IF3 se dissociam do complexo de iniciação Anticódon tRNA Subunidade 50S Complexo de iniciação Próximo códon mRNA mRNA IF3 GTP IF1 IF2 IF3 1 1 GDP 1 Pi Subunidade 50S IF1 IF1 IF2 Sequência de ShineDalgarno 16S rRNA ❶ ❷ ❸ P UAC IF2 IF3 IF1 fMet IF3 FIGURA 2725 Formação do complexo de iniciação em bactérias O complexo é formado em três etapas descritas no texto à custa da hidrólise de GTP gerando GDP e Pi IF1 IF2 e IF3 são os fatores de iniciação E designa o sítio de saída P o sítio peptidil e A o sítio aminoacil Aqui o anticódon do tRNA está orientado no sentido de 39 para 59 da esquerda para a direita como na Figura 278 mas contrário à orientação mostrada nas Figuras 2721 e 2723 Nelson6ed27indd 1128 Nelson6ed27indd 1128 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1129 quematizado na Figura 2727 O mRNA de eucariotos se liga ao ribossomo formando um complexo com várias pro teínas ligantes específicas As células eucarióticas têm pelo menos 12 fatores de iniciação Os fatores de iniciação eIF1A e eIF3 são homólogos funcionais do IF1 e IF3 de bacté rias ligandose à subunidade 40S na etapa ➊ bloqueando a ligação do tRNA ao sítio A e o acoplamento prematuro da subunidade maior com a subunidade menor do ribos somo respectivamente O fator eIF1 ligase ao sítio E O tRNA iniciador carregado ligase ao eIF2 o qual também está ligado a um GTP Na etapa ➋ esse complexo ternário ligase à subunidade ribossomal 40S junto com outras duas proteínas envolvidas em etapas posteriores eIF5 que não está mostrada na Figura 2727 e eIF5B Esses componen tes formam o complexo de preiniciação 43S O mRNA liga se ao complexo eIF4F o qual na etapa ➌ é o intermediário na sua associação com o complexo de preiniciação 43S O complexo eIF4F é formado pelo eIF4E ligando o quepe 59 eIF4A com atividade ATPase e RNAhelicase e eIF4G uma proteína ligadora A proteína eIF4G ligase ao eIF3 e ao eIF4E estabelecendo a primeira ligação entre o comple xo de preiniciação 43S e o mRNA O eIF4G também se liga à proteína ligadora da cauda poliA PABP de polya bin ding protein na extremidade 39 do mRNA circularizando o mRNA Figura 2728 e facilitando a regulação tradu cional da expressão gênica como descrito no Capítulo 28 A ligação do mRNA e dos fatores a ele associados cria o complexo 48S Esse complexo escaneia o mRNA inician do no quepe 59 até que seja encontrado um códon AUG Esse processo de escaneamento ou varredura etapa ➍ da Figura 2727 é facilitado pela atividade de RNAhelicase do eIF4A e por um outro fator eIF4B que não aparece na Figura 2727 cuja atividade molecular exata ainda não é conhecida Uma vez encontrado o local onde está o AUG inicia dor ocorre associação da subunidade ribossomal 60S com o complexo na etapa ➎ e liberação de muitos fatores de iniciação Isso requer ação do eIF5 e do eIF5B A proteína eIF5 promove a atividade GTPase do eIF2 produzindo um complexo eIF2GDP com afinidade reduzida pelo tRNA ini ciador A proteína eIF5B é homóloga à IF2 de bactérias Ela hidrolisa o GTP que está ligado a ela e dispara a disso ciação do eIF2GDP de outros fatores de iniciação e em seguida ocorre a associação da subunidade 60S Assim se completa a formação do complexo de iniciação Os papéis dos vários fatores de iniciação de bactérias e de eucariotos no processo como um todo estão resumi dos na Tabela 278 O mecanismo pelo qual essas proteínas agem constitui uma importante área de pesquisa Estágio 3 As ligações peptídicas são formadas no estágio de alongamento A terceira etapa da síntese proteica é o alongamento Ou tra vez primeiramente serão analisadas as células bacteria nas O alongamento requer 1 o complexo de iniciação des crito anteriormente 2 aminoaciltRNA 3 um conjunto de três proteínas citosólicas solúveis chamadas de fatores de alongamento EFTu EFTs e EFG nas bactérias e 4 GTP As células realizam três etapas para adicionar cada 59 A G C A C G A G G G G A A A U C U G A U G G A A C G C U A C 39 trpA de E coli araB de E coli lacI de E coli proteína A do fago fX174 cro do fago l U U U G G A U G G A G U G A A A C G A U G G C G A U U G C A C A A U U C A G G G U G G U G A A U G U G A A A C C A G U A A A U C U U G G A G G C U U U U U U A U G G U U C G U U C U A U G U A C U A A G G A G G U U G U A U G G A A C A A C G C Sequência de ShineDalgarno pareia com o rRNA 16S Códon de iniciação pareia com fMettRNAfMet a 59 G A U U C C U A G G A G G U U U mRNA bacteriano com a sequência consenso de ShineDalgarno b Extremidade 39 do rRNA 16S 39 OH A U U C C U C C G A U C A G A C C U A U G C G A G C U U 39 U U A G U FIGURA 2726 Sequências do RNA mensageiro que servem como si nais para iniciar a síntese proteica nas bactérias a O alinhamento do AUG iniciador mostrado em verde no seu local correto na subunidade 30S do ribossomo depende em parte das sequências de ShineDalgarno situadas a montante em bege Porções do transcrito de mRNA de cinco genes bacterianos são mostradas Observe o raro exemplo da proteína LacI de E coli que inicia com o códon GUG Val ver Quadro 271 Em E coli AUG é o códon de iniciação em cerca de 91 dos genes com GUG 7 e UUG 2 assumindo essa função mais raramente b A sequência de Shine Dalgarno do mRNA pareia com uma sequência próxima da extremidade 39 do rRNA 16S Nelson6ed27indd 1129 Nelson6ed27indd 1129 070414 1422 070414 1422 1130 DAVID L NELSON MICHAEL M COX resíduo de aminoácido e essas etapas são repetidas enquan to houverem resíduos a ser adicionados Etapa 1 do alongamento Ligação de um aminoaciltRNA Na pri meira etapa do ciclo de alongamento Figura 2729 o aminoaciltRNA apropriado que entra se liga a um com plexo que consiste em EFTu ligado a GTP O complexo aminoaciltRNAEFTuGTP resultante se liga ao sítio A do complexo de iniciação 70S O GTP é hidrolisado e um complexo EFTuGDP é liberado do ribossomo 70S O com plexo EFTuGTP é regenerado durante um processo en volvendo EFTs e GTP Etapa 2 do alongamento Formação da ligação peptídica Uma liga ção peptídica é agora formada entre os dois aminoácidos ligados por meio dos seus tRNAs aos sítios A e P no ri bossomo Isso ocorre por meio da transferência do grupo Nformilmetionil do tRNA iniciador para o grupo amino do segundo aminoácido agora no sítio A Figura 2730 O ❶ ❷ ❸ ❹ ❺ eIF4F AUG AUG 39 39 59 59 E P eIF3 eIF3 eIF4F eIF2 GTP eIF5B GTP ATP ADP Pi elF1 P E UAC Met elF1A P E A Subunidade ribossomal 40S Complexo 48S Complexo de préiniciação 43S Varredura eIF1 eIF3 eIF3 eIF1A UAC Met 59 39 Anticódon eIF5B GTP eIF2 GTP eIF3 eIF2 GTP GTP P E UAC Met elF1A eIF4F AUG 39 59 eIF3 eIF2 GTP eIF2 Pi GDP Pi GDP eIF5B GTP elF1 elF1 P E UAC Met elF1A eIF5B 80S elF1A Subunidade ribossomal 60S AUG 39 59 eIF4F Met P E UAC eIF1 eIF1A eIF5B elF1 FIGURA 2727 O início da síntese proteica em eucariotos As cinco etapas são descritas no texto Os fatores de iniciação eucarióticos medeiam a associação primeiramente do tRNA iniciador carregado para formar um complexo 43S e depois do mRNA com o quepe 59 mostrado em verme lho para formar um complexo 48S O complexo de iniciação final é formado quando a subunidade 60S se associa ao mesmo tempo em que ocorre a liberação da maioria dos fatores de iniciação AA AA AA AA A eIF4F eIF4E eIF4G eIF4A eIF3 Quepe 59 40S AUG Região não traduzida na extremidade 39 UTR Proteína ligadora da cauda poliA 39 FIGURA 2728 Circularização do mRNA no complexo de iniciação em eucariotos As extremidades 39 e 59 dos mRNAs de eucariotos são unidas pelo complexo proteico eIF4F A subunidade eIF4E ligase ao quepe 59 e a proteína eIF4G ligase à proteína ligadora da cauda poliA PABP na extremi dade 39 do mRNA A proteína eIF4G também se liga ao eIF3 unindo o mRNA circularizado à subunidade 40S do ribossomo Nelson6ed27indd 1130 Nelson6ed27indd 1130 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1131 TABELA 278 Fatores proteicos necessários para a iniciação da tradução em células bacterianas e eucarióticas Fator Função Bactérias IF1 Impede a ligação prematura do tRNA no sítio A IF2 Facilita a ligação do fMettRNA fMet à subunidade 30S do ribossomo IF3 Ligase à subunidade 30S impede a associação prematura da subunidade 50S aumenta a especificidade do sítio P pelo fMettRNA fMet Eucariotos eIF1 Ligase ao sítio E da subunidade 40S facilita a interação entre o complexo ternário eIF2tRNAGTP e a subuni dade 40S eIF1A Homólogo ao IF1 de bactérias impede a ligação prematura do tRNA no sítio A eIF2 GTPase facilita a ligação do MettRNA Met iniciador à subunidade ribossomal 40S eIF2B eIF3 Primeiros fatores a se ligarem na subunidade 40S facilitam as etapas subsequentes eIF4F Complexo que consiste em eIF4E eI F4A e eIF4G eIF4A Atividade de RNAhelicase remove estruturas secundárias do mRNA para permitir a ligação à subunidade 40S faz parte do complexo eIF4F eIF4B Ligase ao mRNA facilita a varredura do mRNA para localizar o primeiro AUG eIF4E Ligase ao quepe 59 do mRNA faz parte do complexo eIF4F eIF4G Ligase ao eIF4E e à proteína ligante de poliA PABP faz parte do complexo eIF4F eIF5 Promove a dissociação de vários outros fatores de iniciação da subunidade 40S antes que ocorra a associação dessa com a subunidade 60S para formar o complexo de iniciação 80S eIF5b GTPase homóloga ao IF2 de bactérias promove a dissociação dos fatores de iniciação antes da montagem final do ribossomo Não mostrados na Figura 2727 P A E AUG UAC 39 mRNA 59 fMet 50S 30S GDP Tu GTP Tu Ts Ts Ts Tu GDP Pi GTP P A E AUG UAC 39 59 fMet AA2 P E AUG UAC 39 59 fMet Ligação do segundo aminoaciltRNA Hidrólise do GTP e encaixe Segundo aminoaciltRNA que chega AA2 GTP GTP Tu AA2 AA2 A Tu Códon de iniciação Próximo códon FIGURA 2729 Primeira etapa do alongamento em bactérias ligação do segundo aminoaciltRNA O segundo aminoaciltRNA AA2 entra no sítio A do ribossomo ligado a EFTu que está ligado a GTP mostrado aqui como Tu o qual também contém GTP A ligação do segundo aminoacil tRNA ao sítio A é acompanhada pela hidrólise de GTP a GDP e Pi e liberação do complexo EFTuGDP do ribossomo O GDP ligado é liberado quando o complexo EFTuGDP se liga ao EFTs e o EFTs depois é liberado quando outra molécula de GTP se liga a EFTu Isso recicla o EFTu deixandoo dis ponível para repetir o ciclo O encaixe envolve uma mudança na conforma ção do segundo tRNA trazendo sua extremidade aminoacil para o sítio da peptidiltransferase Nelson6ed27indd 1131 Nelson6ed27indd 1131 070414 1422 070414 1422 1132 DAVID L NELSON MICHAEL M COX grupo aamino do aminoácido no sítio A age como um nu cleófilo deslocando o tRNA do sítio P para formar a ligação peptídica Essa reação produz um dipeptidiltRNA no sítio A e o tRNA fMet não carregado desacilado permanece ligado ao sítio P Os tRNA mudam então para um estado híbrido de ligação com elementos de cada um deles esten dendose sobre dois sítios diferentes no ribossomo como mostrado na Figura 2730 A atividade enzimática que catalisa a formação da liga ção peptídica tem sido historicamente chamada de pep tidiltransferase e era considerada intrínseca a uma ou mais proteínas da subunidade maior do ribossomo Agora sabese que essa reação é catalisada pelo rRNA 23S con tribuindo para o conhecido repertório catalítico das ribozi mas Essa descoberta apresenta implicações interessantes para a evolução da vida ver Quadro 272 Etapa 3 do alongamento Translocação Na etapa final do ciclo de alongamento a translocação o ribossomo se move um códon em direção à extremidade 39 do mRNA Figura 2731a Esse movimento move o anticódon do dipeptidil tRNA o qual ainda está preso ao segundo códon do mRNA do sítio A para o sítio P e move o tRNA desacilado do sítio P para o sítio E a partir do qual o tRNA é liberado para o ci tosol O terceiro códon do mRNA se encontra agora no sítio A e o segundo códon no sítio P O movimento do ribossomo ao longo do mRNA requer o fator EFG também conheci do como translocase e a energia fornecida pela hidrólise de outra molécula de GTP Uma mudança na conformação tridimensional de todo o ribossomo resulta no movimento desse ao longo do mRNA Como a estrutura do EFG se assemelha à estrutura do complexo EFTutRNA Figura 2731b o EFG é capaz de se ligar ao sítio A e presumivel mente deslocar o peptidiltRNA Após a translocação o ribossomo com o dipeptidil tRNA e o mRNA ligados está pronto para um novo ciclo de alongamento e para a ligação de um terceiro resíduo de aminoácido Esse processo ocorre da mesma forma que a adição do segundo resíduo como mostrado nas Figuras 27 29 2730 e 2731 Para cada resíduo de aminoácido cor retamente adicionado ao polipeptídeo nascente dois GTPs são hidrolisados a GDP e Pi à medida que o ribossomo se move códon a códon ao longo do mRNA em direção à extre midade 39 O polipeptídeo permanece ligado ao tRNA do último mais recentemente aminoácido inserido Essa associação mantém a conexão funcional entre a informação contida no mRNA e a produção do polipeptídeo decodificado Ao mes mo tempo a ligação éster entre esse tRNA e a extremidade carboxil do polipeptídeo nascente ativa o grupo carboxiter minal para o ataque nocleofílico pelo aminoácido que chega para formar uma nova ligação peptídica Figura 2730 À medida que a ligação éster existente entre o polipeptídeo e o tRNA é quebrada durante a formação da ligação peptí H H H C N R2 C O Formação da ligação peptídica P A E AUG UAC 39 59 AA2 fMet H C HN R2 C O O O O OH Sítio P Sítio E Sítio A H C NH R1 C O C O H H C NH R1 C O O O O O OH OH O O C O H Sítio P Sítio A AA2 AA2 fMet P A E AUG UAC 59 39 fMet AA2 fMet Sítio P Sítio A O C C C N C H R2 H O H H NH C H O R1 O O O O O HO H O O fMet AA2 FIGURA 2730 Segunda etapa do alongamento em bactérias forma ção da primeira ligação peptídica A peptidiltransferase que catalisa essa reação é a ribozima rRNA 23S O grupo Nformilmetionil é transferido para o grupo amino do segundo aminoaciltRNA no sítio A formando um dipeptidiltRNA Nesse estágio ambos os tRNAs ligados ao ribossomo mu dam de posição na subunidade 50S adotando um estado híbrido de ligação O tRNA não carregado se desloca de modo que suas extremidades 39 e 59 ficam no sítio E De forma semelhante as extremidades 39 e 59 do peptidil tRNA se deslocam para o sítio P Os anticódons permanecem nos sítios P e A Observe o envolvimento do grupamento 29hidroxila da adenosina da extremidade 39 como um catalisador ácidobase geral nesta reação Nelson6ed27indd 1132 Nelson6ed27indd 1132 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1133 a b Hidrólise de GTP Pi fMet P A E AUG UAC 39 59 AA2 fMet P E AUG UAC 39 59 AA2 EFG GTP EFG GTP EFTu tRNA EFG GDP EFG GDP EFG GDP P A E AUG UAC 39 59 AA2 fMet P A E AUG UAC 39 59 AA2 fMet dica a ligação entre o polipeptídeo e a informação contida no mRNA persiste pois cada novo aminoácido adicionado permanece preso ao seu tRNA O ciclo de alongamento em eucariotos é bastante seme lhante ao que ocorre em bactérias Três fatores de alonga mento eucarióticos eEF1a eEF1bg e eEF2 têm funções análogas àquelas dos fatores de alongamento bacterianos EFTu EFTs e EFG respectivamente Os ribossomos eucarióticos não têm um sítio E os tRNAs não carregados são expulsos diretamente do sítio P Edição no ribossomo A atividade GTPásica do EFTu duran te a primeira etapa do alongamento em células bacterianas Figura 2729 contribui de maneira importante para a ve locidade e a fidelidade de todo o processo biossintético Tanto o complexo EFTuGTP como o EFTuGDP existem por poucos milissegundos antes de se dissociarem Esses períodos de tempo constituem oportunidades para que ocorra uma leitura para edição das interações códonanti códon Os aminoaciltRNA incorretos normalmente se dis sociam do sítio A em um desses momentos Se o análogo de GTP guanosina 59O3tiotrifosfato GTPgS for utilizado no lugar do GTP a hidrólise se torna mais lenta melhoran FIGURA 2731 Terceira etapa do alongamento em bactérias trans locação a O ribossomo se move a distância de um códon em direção à extremidade 39 do mRNA utilizando a energia proveniente da hidrólise do GTP ligado ao fator EFG translocase O dipeptidiltRNA está agora to talmente no sítio P deixando o sítio A aberto para a entrada do próximo terceiro aminoaciltRNA O tRNA não carregado se dissocia depois do sítio E e o ciclo de alongamento inicia novamente b A estrutura do EFG se as semelha à estrutura do EFTu complexado com tRNA Mostrados aqui estão à esquerda o EFTu em complexo com o tRNA PDB ID 1B23 e à direita o EFG em complexo com GDP PDB ID 1DAR A região carboxiterminal do EFG se assemelha estruturalmente à alça do anticódon do tRNA tanto em forma como em distribuição de cargas Nelson6ed27indd 1133 Nelson6ed27indd 1133 070414 1422 070414 1422 1134 DAVID L NELSON MICHAEL M COX do a fidelidade aumentando os intervalos de edição mas reduzindo a velocidade da síntese proteica O O S P O O O P NH2 O O P O O O OH H H H OH H N N O N N CH2 Guanosina 59O3tiotrifosfato GTPgS O processo de síntese proteica incluindo as caracterís ticas do pareamento códonanticódon já descritas foi cla ramente otimizado ao longo da evolução de forma a equili brar as exigências de rapidez e fidelidade Maior fidelidade diminui a velocidade enquanto aumentos na velocidade provavelmente comprometeriam a fidelidade E lembrese que o mecanismo de edição no ribossomo estabelece ape nas que ocorreu pareamento apropriado entre códon e an ticódon e não verifica se o aminoácido correto está ligado ao tRNA Se um tRNA for aminoacilado com sucesso com um aminoácido errado o que se pode fazer experimental mente esse aminoácido incorreto é de maneira eficiente incorporado à proteína em resposta a qualquer códon que seja reconhecido normalmente por aquele tRNA Estágio 4 A terminação da síntese de polipeptídeos requer um sinal especial O alongamento continua até que o ribossomo adicione o último aminoácido codificado pelo mRNA A terminação quarto estágio da síntese de polipeptídeos é sinalizada pela presença de um dos três códons de parada no mRNA UAA UAG UGA imediatamente após o último aminoácido co dificado Mutações no anticódon do tRNA que permitem que um aminoácido seja inserido em um códon de parada são geralmente deletérias para a célula Quadro 274 Em bactérias uma vez que um códon de parada tenha ocupa do o sítio A do ribossomo três fatores de terminação ou fatores de liberação as proteínas RF1 RF2 e RF3 contribuem para 1 hidrólise da ligação peptidiltRNA ter minal 2 liberação do polipeptídeo e do último tRNA agora não carregado do sítio P e 3 dissociação do ribossomo 70S em suas subunidades 30S e 50S prontas para começar um novo ciclo de síntese de polipeptídeo Figura 2732 O RF1 reconhece os códons de parada UAG e UAA e o RF2 reconhece UGA e UAA O RF1 ou o RF2 dependendo do códon presente se liga a um códon de parada e induz a peptidiltransferase a transferir o polipeptídeo nascente para uma molécula de água em vez de para outro amino ácido Os fatores de liberação têm domínios que parecem assemelharse à estrutura do tRNA como mostrado para o fator de alongamento EFG na Figura 2731b A função es QUADRO 274 Variação induzida do código genético supressão sem sentido Quando uma mutação produz um códon de parada no interior de um gene a tradução é prematuramente in terrompida e o polipeptídeo incompleto é geralmente inativo Essas mutações são chamadas de mutações sem sentido O gene pode ter sua função normal recuperada se uma segunda mutação 1 converter o códon de pa rada resultante da primeira mutação em um códon que especifique um aminoácido ou 2 suprimir os efeitos do códon de terminação Essas mutações restauradoras são chamadas de supressores sem sentido elas geralmente envolvem mutações em genes de tRNA para produzir tR NAs alterados supressores capazes de reconhecer o có don de parada e inserir um aminoácido naquela posição A maioria dos tRNAs supressores conhecidos apresentam substituições de uma única base nos seus anticódons Os tRNAs supressores constituem uma variação expe rimentalmente induzida do código genético para permitir a leitura de códons que são geralmente de terminação de forma bem parecida com as variações de código que ocor rem naturalmente conforme descrito no Quadro 271 A supressão sem sentido não quebra totalmente a transferên cia normal de informação na célula pois a célula geralmen te tem várias cópias de cada gene de tRNA alguns desses genes duplicados são pouco expressos e contribuem ape nas para uma pequena fração do conjunto de um determi nado tRNA na célula As mutações supressoras em geral envolvem um tRNA menos importante deixando os tR NAs principais para que o códon seja lido normalmente Por exemplo a E coli tem três genes idênticos para tRNA Tyr sendo que cada um produz um tRNA com o an ticódon 59GUA Um desses genes é expresso em níveis relativamente altos e portanto o seu produto represen ta a principal fração de tRNA Tyr os outros dois genes são transcritos em quantidades pequenas Uma mudança no anticódon do tRNA produzido a partir de um desses dois genes de tRNA Tyr de 59GUA para 59CUA produz em baixas quantidades um tipo de tRNA Tyr que irá inserir tirosina em códons de parada UAG Essa inserção de ti rosina em UAG é realizada de maneira pouco eficiente mas pode produzir quantidades suficientes da proteína inteira a partir de um gene com mutação sem sentido de modo a permitir que a célula sobreviva O tRNA Tyr majori tário continua traduzindo o código genético normalmen te para a maioria das proteínas A mutação que leva à geração de um tRNA supres sor nem sempre ocorre no anticódon A supressão de códons UGA sem sentido geralmente envolve o tRNA Trp que reconhece normalmente UGG A alteração que per mite que ele leia UGA e insira resíduos de Trp nessas posições é uma mudança de G para A na posição 24 em um braço do tRNA ligeiramente afastado do anti códon esse tRNA pode agora reconhecer tanto UGG como UGA Uma mudança semelhante é encontrada em tRNAs envolvidos na variação de código genético mais comumente encontrada na natureza UGA 5 Trp ver Quadro 271 Nelson6ed27indd 1134 Nelson6ed27indd 1134 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1135 pecífica do RF3 ainda não foi definitivamente estabelecida mas acreditase que ele libera a subunidade ribossomal Em eucariotos um único fator de liberação o eRF reconhece todos os três códons de parada A reciclagem do ribossomo leva à dissociação dos com ponentes envolvidos na tradução Os fatores de liberação se dissociam do complexo resultante da parada contendo um tRNA não carregado no sítio P e são substituídos pelo EFG e por uma proteína denominada fator de reciclagem do ri bossomo RRF de ribosome recycling factor Mr 20300 A hidrólise do GTP pelo EFG leva à dissociação da subuni dade 50S que se separa do complexo 30S tRNAmRNA O EFG e o RRF são substituídos por IF3 o qual promove a dissociação do tRNA O mRNA é então liberado O complexo formado entre o IF3 e a subunidade 30S está então pronto para iniciar outro ciclo de síntese proteica Figura 2725 Custo energético da fidelidade na síntese proteica A síntese de uma proteína fiel à informação especificada pelo seu respec tivo mRNA requer energia A formação de cada aminoacil tRNA utiliza dois grupos fosfato de alta energia Um ATP adicional é consumido cada vez que um aminoácido incor retamente ativado é hidrolisado pela atividade desacilase de uma aminoaciltRNAsintase como parte de sua atividade de edição Um GTP é clivado em GDP e Pi durante a primei ra etapa de alongamento e outro durante a etapa de translo cação Assim para a formação de cada ligação peptídica em um polipeptídeo é necessária em média a energia derivada da hidrólise de mais de quatro NTPs gerando NDPS Isso representa um empurrão termodinâmico excessi vamente grande na direção da síntese pelo menos 4 3 305 kJmol 5 122 kJmol de energia de ligação fosfodiéster para gerar uma ligação peptídica a qual tem uma energia livre pa drão de hidrólise de apenas aproximadamente 21 kJmol A variação de energia livre durante a síntese de uma ligação peptídica portanto tem valor líquido de 101 kJmol As pro teínas são polímeros que contêm informação O objetivo bio químico não é apenas a formação de uma ligação peptídica mas a formação de uma ligação peptídica entre dois aminoáci dos específicos Cada um dos compostos fosfatados altamen te energéticos gastos nesse processo têm papel fundamental na manutenção do alinhamento correto entre cada novo có don no mRNA e o seu respectivo aminoácido na extremidade crescente do polipeptídeo Essa energia permite uma altíssi ma fidelidade na tradução biológica da mensagem genética do mRNA para a sequência de aminoácidos das proteínas Tradução rápida de uma única mensagem pelos polissomos Grandes conjuntos de 10 a 100 ribossomos muito ativos na síntese proteica podem ser isolados de células eucarióticas e bacte rianas Micrografias eletrônicas mostram a presença de uma fibra entre ribossomos adjacentes em um conjunto o qual é chamado de polissomo Figura 2733a A fita conectora é uma única molécula de mRNA que está sendo traduzida simultaneamente por ribossomos muito próximos uns dos outros permitindo um uso altamente eficiente do mRNA Em bactérias a transcrição e a tradução são processos estreitamente acoplados Os RNAs mensageiros são sinte tizados e traduzidos na mesma direção 59S39 Os ribosso mos começam a traduzir a extremidade 59 do mRNA antes A ligação polipeptidiltRNA é hidrolisada O fator de liberação se liga COO2 P A E UAG 39 59 RF UAG P UAG 39 59 GDP RRF RRF Os componentes se dissociam RF RF A E 39 59 GTP IF3 Pi EFG EFG IF3 FIGURA 2732 Terminação da síntese de proteínas em bactérias A terminação ocorre em resposta a um códon de parada no sítio A Primeiro um fator de liberação RF RF1 ou RF2 dependendo do códon de parada presente ligase ao sítio A Isso causa a hidrólise da ligação éster entre o po lipeptídeo nascente e o tRNA no sítio P e a liberação do polipeptídeo com pleto Finalmente o mRNA o tRNA desacilado e o fator de liberação saem do ribossomo o qual se dissocia em suas subunidades 30S e 50S auxiliado pelo fator de reciclagem do ribossomo RRF pelo IF3 e pela energia fornecida pela hidrólise de GTP mediada por EFG O complexo formado pela subuni dade 30S e pelo IF3 está pronto para iniciar um outro ciclo de tradução ver Figura 2725 Nelson6ed27indd 1135 Nelson6ed27indd 1135 070414 1422 070414 1422 1136 DAVID L NELSON MICHAEL M COX que a transcrição tenha sido completada Figura 2733b A situação é um tanto diferente em células eucarióticas nas quais os mRNAs recémsintetizados precisam deixar o nú cleo antes que possam ser traduzidos Em geral os mRNAs bacterianos existem por apenas alguns minutos p 1084 antes de serem degradados por nucleases Para manter altas taxas de síntese proteica o mRNA para uma dada proteína ou grupo de proteínas preci sa ser sintetizado continuamente e traduzido com eficiência máxima O curto tempo de vida dos mRNAs nas bactérias permite a parada rápida da síntese quando a proteína não é mais necessária Estágio 5 As cadeias polipeptídicas recémsintetizadas sofrem enovelamento e processamento Na etapa final da síntese proteica a cadeia polipeptídica nascente é dobrada e processada adquirindo sua forma biologicamente ativa Durante ou após a sua síntese o po lipeptídeo assume progressivamente sua conformação nativa com a formação de interaçõesligações apropriadas como ligações de hidrogênio interações hidrofóbicas iôni cas e de van der Waals Dessa forma a informação genética linear ou unidimensional contida no mRNA é convertida na estrutura tridimensional da proteína Algumas proteí nas recémsintetizadas sejam elas de bactérias arqueias ou eucariotos não adquirem sua conformação final biolo gicamente ativa até que sejam alteradas por uma ou mais reações de processamento denominadas modificações póstraducionais Modificações aminoterminais e carboxiterminais O primeiro resíduo inserido em todos os polipeptídeos é a Nformil metionina em bactérias ou metionina em eucariotos Entretanto o grupo formil o resíduo Met aminoterminal e frequentemente resíduos adicionais da região amino terminal e em alguns casos da extremidade carboxil podem ser removidos enzimaticamente para a formação da proteína funcional final Em até 50 das proteínas euca rióticas o grupamento amino do resíduo aminoterminal é Nacetilado após a tradução Às vezes resíduos carboxiter minais são também modificados Perda das sequências sinalizadoras Como será visto na Seção 273 15 a 30 resíduos da extremidade aminoterminal de al gumas proteínas têm papel no endereçamento da proteína para seu destino final na célula Essas sequências sinali zadoras são removidas no final por peptidases específicas Modificação de aminoácidos individuais Os grupos hidroxila de certos resíduos Ser Thr e Tyr de algumas proteínas são en zimaticamente fosforilados por ATP Figura 2734a os grupos fosfato adicionam cargas negativas a esses polipep tídeos O significado funcional dessa modificação varia de uma proteína para outra Por exemplo a proteína caseína do leite tem muitos grupos de fosfosserina que ligam Ca 21 Cálcio fosfato e aminoácidos são elementos valiosos para lactentes a caseína fornece assim três nutrientes essen ciais E como foi visto em vários exemplos os ciclos de fosforilaçãodesfosforilação regulam a atividade de muitas enzimas e proteínas regulatórias Grupos carboxil extras podem ser adicionados a resí duos Glu de algumas proteínas Por exemplo a protrom bina proteína da coagulação sanguínea contém vários resíduos de gcarboxiglutamato Figura 2734b na sua região aminoterminal os quais são introduzidos por uma enzima que necessita de vitamina K Esses grupos carboxil ligam Ca 21 o qual é necessário para iniciar o mecanismo de coagulação Resíduos de monometil e dimetillisina Figura 2734c ocorrem em algumas proteínas musculares e no citocromo c A calmodulina da maioria dos organismos contém um re síduo de trimetillisina em uma posição específica Em ou tras proteínas os grupos carboxil de alguns resíduos Glu sofrem metilação que remove suas cargas negativas Ligação de cadeias laterais de carboidratos As cadeias laterais de carboidratos das glicoproteínas são ligadas covalente mente durante ou após a síntese do polipeptídeo Em algu mas glicoproteínas a cadeia lateral de carboidrato é ligada enzimaticamente a resíduos Asn oligossacarídeos Nliga dos em outras a resíduos Ser ou Thr oligossacarídeos O b a RNA polimerase Subunidades ribossomais que chegam Polissomo Polissomo DNA DNA Polissomos mRNA 05 mm 59 50S 30S 59 59 Direção da tradução Direção da transcrição FIGURA 2733 Acoplamento da transcrição e da traduação em bac térias a Micrografia eletrônica de polissomos que se formam durante a transcrição de um segmento de DNA de E coli Cada molécula de mRNA está sendo traduzida por muitos ribossomos simultaneamente As cadeias poli peptídicas nascentes que são formadas nos ribossomos são difíceis de visuali zar devido às condições sob as quais as amostras mostradas nessas microgra fias eletrônicas são preparadas A seta aponta o local aproximado do início do gene que está sendo transcrito b Cada mRNA é traduzido pelos ribossomos enquanto ainda está sendo transcrito do DNA pela RNApolimerase Isso é possível porque em bactérias o mRNA não precisa ser transportado do nú cleo para o citoplasma para que encontre os ribossomos Neste diagrama os ribossomos são mostrados em tamanho menor do que a RNApolimerase Na verdade o tamanho do ribossomo Mr 27 3 10 6 é uma ordem de magnitude maior do que o tamanho da RNApolimerase Mr 39 3 10 5 Nelson6ed27indd 1136 Nelson6ed27indd 1136 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1137 ligados ver a Figura 730 Muitas proteínas com função extracelular bem como os proteoglicanos lubrificantes que revestem as membranas mucosas contêm cadeias laterais de oligossacarídeos ver Figura 728 Adição de grupos isoprenila Várias proteínas eucarióticas são modificadas pela adição de grupos derivados do isopreno grupos isoprenila Uma ligação tioéter é formada entre o grupo isoprenila e um resíduo Cys da proteína ver Figura 1115 Os grupos isoprenila são derivados de intermediá rios pirofosforilados da via de biossíntese do colesterol ver Figura 2135 como o farnesilpirofosfato Figura 2735 Proteínas assim modificadas incluem as proteínas Ras pe quenas proteínas G que são produtos dos oncogenes e protooncogenes ras as proteínas G triméricas ambas dis cutidas no Capítulo 12 bem como as laminas proteínas encontradas na matriz nuclear O grupo isoprenila ajuda a ancorar a proteína na membrana A atividade transforma dora carcinogênica do oncogene ras é perdida quando a isoprenilação da proteína Ras é bloqueada uma descoberta que tem estimulado interesse na identificação de inibidores dessa via de modificação póstraducional para o uso na qui mioterapia do câncer Adição de grupos prostéticos Muitas proteínas exigem para sua atividade grupos prostéticos ligados covalentemente Dois exemplos são a molécula de biotina da acetilCoAcar boxilase e o grupo heme da hemoglobina ou do citocromo c Processamento proteolítico Muitas proteínas são inicialmen te sintetizadas como polipeptídeos precursores longos e inativos os quais são clivados proteoliticamente para dar origem às formas menores e ativas das proteínas Exem plos incluem a próinsulina algumas proteínas virais e pro teases como o quimotripsinogênio e o tripsinogênio ver Figura 638 Formação de pontes dissulfeto Após se dobrarem nas suas conformações nativas algumas proteínas formam pontes dissulfeto entre resíduos de Cys presentes em uma mesma cadeia ou em cadeias diferentes Nos eucariotos as pontes dissulfeto são comuns em proteínas secretadas da célula As pontes assim formadas ajudam a proteger a conforma ção nativa da molécula proteica da desnaturação no meio extracelular que é geralmente oxidante e cujas condições podem ser bem diferentes daquelas do meio intracelular Fosfosserina Fosfotreonina Fosfotirosina gCarboxiglutamato Metillisina Dimetillisina Trimetillisina Metilglutamato a b c FIGURA 2734 Alguns resíduos de aminoácidos modificados a Aminoácidos fosforilados b Aminoácido carboxilado c Alguns aminoá cidos metilados SH O2 O P CH2 2O S P O O O 2 O CH2 Farnesil transferase PPi Farnesilpirofosfato Proteína Ras Proteína Ras farnesilada Ras Ras FIGURA 2735 Farnesilação de um resíduo Cys A ligação tioéter é mos trada em vermelho A proteína Ras é o produto do oncogene ras Nelson6ed27indd 1137 Nelson6ed27indd 1137 070414 1422 070414 1422 1138 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A síntese proteica é inibida por muitos antibióticos e toxinas A síntese proteica constitui uma função central na fisiologia celular e é o alvo principal de muitos antibióticos e toxinas naturais A maioria desses antibióticos inibe a síntese pro teica nas bactérias As diferenças entre a síntese de proteí nas em bactérias e em eucariotos apesar de muito tênues em alguns casos bastam para que a maioria dos compostos discutidos a seguir seja relativamente inofensiva para célu las eucarióticas A seleção natural favoreceu a evolução de compostos que fazem uso de diferenças mínimas para afe tar seletivamente os sistemas das bactérias de forma que essas armas bioquímicas são sintetizadas por alguns micror ganismos sendo extremamente tóxicas para outros Uma vez que quase todas as etapas da síntese proteica podem ser inibidas por um ou outro antibiótico esses compostos têm se tornado ferramentas valiosas no estudo da biossín tese de proteínas A puromicina produzida pelo fungo Streptomyces alboniger é um dos mais bem conhecidos antibióticos inibidores da síntese proteica A sua estrutura é bastante semelhante à extremidade 39 de um aminoaciltRNA per mitindo que ele se ligue ao sítio A do ribossomo e participe na formação da ligação peptídica produzindo peptidilpu romicina Figura 2736 No entanto por se assemelhar apenas à extremidade 39 do tRNA a puromicina não parti cipa da translocação e se dissocia do ribossomo logo após se ligar à extremidade carboxil do peptídeo Isso causa o término prematuro da síntese do polipeptídeo As tetraciclinas inibem a síntese proteica em bactérias por meio do bloqueio do sítio A do ribossomo impedindo a ligação do aminoaciltRNA O cloranfenicol inibe a sín tese proteica realizada nos ribossomos das bactérias bem como das mitocôndrias e dos cloroplastos pelo bloqueio da atividade peptidiltransferase ele não afeta a síntese ci tosólica das proteínas em eucariotos Por outro lado a ci cloeximida bloqueia a peptidiltransferase dos ribossomos 80S de eucariotos mas não aquela dos ribossomos 70S das bactérias nem das mitocôndrias nem dos cloroplastos A estreptomicina um trissacarídeo básico causa uma leitu ra errada do código genético em bactérias em concentra ções relativamente baixas e inibe a iniciação em concentra ções mais altas CONH2 OH OH OH O CH3 O CH3 N OH H OH Tetraciclina CH3 OH CH2 CH OH O CH NH C O2N CHCl2 Cloranfenicol H C NH R C O Peptidil transferase mRNA AA H C H2C N C O OCH3 NHOH O H H H H CH2 HO H Puromicina Peptidilpuromicina P A E UAG 39 59 P A E UAG 39 59 PeptidiltRNA no sítio P Puromicina no sítio A H2N O H N N N HO CH3 CH2 OCH3 H3C O H H H H NH C C H2C OH O H R N N N NH2 N O CH2 P O H H H H O C C NH OH N N N N N CH3 H3C N N FIGURA 2736 Perturbação da formação da ligação peptídica pela puromicina O antibiótico puromicina é parecido com a extremidade ami noacil de um tRNA carregado sendo capaz de se ligar ao sítio A do ribosso mo e participar da formação da ligação peptídica O produto dessa reação a peptidilpuromicina em vez de ser translocada para o sítio P dissociase do ribossomo causando a terminação prematura da cadeia Nelson6ed27indd 1138 Nelson6ed27indd 1138 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1139 Estreptomicina NH H CH3 O H H C O H HO H CHO H H O H H2N H H H O HO C H3 N OH OH OH NH OH C NH2 CH2OH NH NH O N H CH2 O H3C CHOH CH3 Cicloeximida O H H H H Vários outros inibidores da síntese proteica são notá veis em razão da sua toxicidade para humanos e outros mamíferos A toxina diftérica Mr 58330 catalisa a ADPribosilação de um resíduo de diftamida histidina modificada do fator de alongamento eucariótico eEF2 inativandoo A ricina Mr 29895 proteína extrema mente tóxica da mamona inativa a subunidade 60S dos ribossomos eucarióticos pela despurinação de uma ade nosina específica no rRNA 23S A ricina foi utilizada no infame caso de assassinato de um jornalista búlgaro da BBC Georgi Markov morto em 1978 presumivelmente pela polícia búlgara Utilizando uma seringa escondida na extremidade de uma sombrinha um membro da polícia se creta injetou um dispositivo contendo ricina na perna de Markov Ele morreu 4 dias depois RESUMO 272 A síntese proteica c A síntese proteica ocorre nos ribossomos que consis tem em proteínas e rRNA As bactérias têm ribossomos 70S com uma subunidade maior 50S e uma menor 30S Os ribossomos eucarióticos são significativamen te maiores 80S e contêm mais proteínas c Os RNAs transportadores contêm entre 73 e 93 resíduos nucleotídicos alguns dos quais têm bases modificadas Cada tRNA tem o braço aminoacila com a sequência ter minal CCA39 à qual um aminoácido é esterificado o braço do anticódon o braço TcC e o braço D alguns tRNAs têm um quinto braço O anticódon é responsável pela especificidade da interação entre o aminoaciltRNA e o códon complementar do mRNA c O crescimento da cadeia dos polipeptídeos nos ribos somos inicia com o aminoácido aminoterminal e ocorre por adições sucessivas de novos resíduos à extremidade carboxil c A síntese proteica acontece em cinco estágios 1 Os aminoácidos são ativados no citosol por amino aciltRNAsintetases específicas Essas enzimas cata lisam a formação de aminoaciltRNA com a clivagem simultânea de ATP gerando AMP e PPi A fidelidade da síntese proteica depende da precisão dessa reação e algumas dessas enzimas realizam etapas de edição em sítios ativos separados 2 Em bactérias o aminoaciltRNA iniciador de todas as proteínas é o NformilmetioniltRNA fMet A iniciação da síntese proteica envolve a formação de um complexo entre a subunidade 30S do ribossomo o mRNA GTP fMettRNA fMet três fatores de iniciação e a subunidade 50S o GTP é hidrolisado a GDP e Pi 3 Nos estágios de alongamento GTP e fatores de alongamento são necessários para a ligação do novo aminoaciltRNA que chega ao sítio A do ribossomo Na primeira reação de transferência peptídica o resíduo fMet é transferido para o grupo amino do novo aminoa ciltRNA O movimento do ribossomo ao longo do mRNA transloca então o dipeptidiltRNA do sítio A para o sítio P um processo que requer hidrólise de GTP O tRNA desacilado se dissocia do sítio E do ribossomo 4 Após muitos ciclos de alongamento a síntese do polipeptídeo é finalizada com o auxílio dos fatores de liberação Pelo menos quatro equivalentes fosfatados de alta energia do ATP ou do GTP são necessários para a formação de cada ligação peptídica investimen to energético necessário para garantir a fidelidade da tradução 5 Os polipeptídeos dobramse nas suas formas ativas tridimensionais Muitas proteínas são ainda processadas por reações de modificação póstraducional c Muitos antibióticos e toxinas bem estudados inibem al guns aspectos da síntese proteica 273 Endereçamento e degradação das proteínas A célula eucariótica é composta por muitas estruturas or ganelas e compartimentos cada um com funções especí ficas que requerem conjuntos distintos de proteínas e en zimas Essas proteínas com exceção daquelas produzidas nas mitocôndrias e nos plastídeos são sintetizadas nos ribossomos no citosol então como elas são direcionadas para seus destinos finais na célula Hoje esse complexo e fascinante processo começa a ser compreendido As proteínas destinadas à secreção à integração na membrana plasmática ou à inclusão nos li sossomos geralmente compartilham das primeiras etapas de uma via que inicia no retículo endoplasmático RE As proteínas destinadas às mitocôndrias aos cloroplastos ou ao núcleo utilizam três mecanismos separados E aquelas destinadas ao citosol simplesmente permanecem no local onde são sintetizadas Nelson6ed27indd 1139 Nelson6ed27indd 1139 070414 1422 070414 1422 1140 DAVID L NELSON MICHAEL M COX O elemento mais importante em muitas dessas vias de endereçamento é uma sequência curta de aminoácidos de nominada sequência sinal ou peptídeo sinalizador cuja função foi postulada pela pri meira vez por Günter Blobel e colaboradores em 1970 A se quência sinal direciona a pro teína para seu local apropriado na célula e em muitas proteí nas ela é removida durante o transporte ou depois que a pro teína tenha alcançado seu desti no final Nas proteínas cujo des tino é o transporte para mitocôndrias cloroplastos ou RE a sequência sinal está locali zada na porção aminoterminal do polipeptídeo recémsintetizado Em muitos casos a ca pacidade de endereçamento de certas sequências sinal foi confirmada por meio da fusão da sequência sinal de uma proteína com outra proteína mostrando que o sinal direcio na a segunda proteína para o local onde a primeira proteína é geralmente encontrada A degradação seletiva das proteí nas que não são mais necessárias para a célula também se baseia em grande parte em um conjunto de sinais molecu lares incrustados na estrutura de cada proteína Nesta seção final serão examinados o endereçamento e a degradação das proteínas com ênfase nos sinais e na regulação molecular envolvidos os quais são fundamentais para o metabolismo celular Exceto quando citado o foco agora será nas células eucarióticas As modificações póstraducionais de muitas proteínas eucarióticas têm início no retículo endoplasmático Provavelmente o sistema de endereçamento mais bem ca racterizado tem início no RE A maioria das proteínas lisos somais das proteínas de membrana e das proteínas secre tadas tem uma sequência sinal aminoterminal Figura 2737 que as marca para o transporte para dentro do lú men do RE centenas dessas sequências sinal já foram de terminadas O lado carboxil de uma sequência sinal é defini do por um sítio de clivagem no qual a protease age removendo a sequência depois que a proteína tenha sido importada para o RE As sequências sinal variam em com primento de 13 a 36 resíduos de aminoácidos mas todas elas têm as seguintes características 1 entre 10 e 15 resí duos de aminoácidos hidrofóbicos 2 um ou mais resíduos carregados positivamente geralmente próximos à extremi dade amino e que precede a sequência hidrofóbica e 3 uma sequência curta na extremidade carboxil próxima do sítio de clivagem que é relativamente polar possuindo ge ralmente resíduos de aminoácidos com cadeias laterais cur tas principalmente Ala nas posições mais próximas ao sí tio de clivagem Como demonstrado origi nalmente por George Palade proteínas contendo essas se quências sinal são sintetizadas nos ribossomos aderidos ao RE A própria sequência sinal ajuda a direcionar o ribossomo ao RE como ilustrado nas etapas ➊ a ➒ da Figura 2738 ➊ A via de endereçamento começa com o início da síntese proteica nos ribossomos livres ➋ A sequên cia sinal aparece logo no início do processo de síntese pois está na extremidade amino a qual como foi visto é sintetizada primeiro ➌ À medida que vai emergindo do ribossomo a sequência sinal e o próprio ribossomo ligase à partí cula de reconhecimento de sinal SRP a SRP então se liga ao GTP e suspende o alongamento do polipeptídeo quando esse tiver alcançado um tamanho aproximado de 70 aminoácidos e a sequência sinal tiver emergido comple tamente do ribossomo ➍ A SRP ligada ao GTP direciona então o ribossomo ainda ligado ao mRNA e o polipeptídeo incompleto para receptores de SRP ligada a GTP presentes no lado citosólico do RE o polipeptídeo nascente é leva do para o complexo de translocação de peptídeos no RE o qual pode interagir diretamente com o ribossomo ➎ Ocorre a dissociação da SRP do ribossomo acompanhada da hidrólise de GTP tanto na SRP como no receptor de SRP ➏ O alongamento do polipeptídeo agora continua com o complexo de translocação promovido por ATP levando o polipeptídeo nascente para dentro do lúmen do RE até que toda a proteína tenha sido sintetizada ➐ A sequência sinal é removida por uma peptidase de sinal dentro do lúmen do RE ➑ o ribossomo se dissocia e ➒ é reciclado Günter Blobel George Palade 19122008 Vírus A da influenza humana Prépróinsulina humana Hormônio de crescimento bovino Promelitina da abelha Proteína da cola de Drosophila sítio de clivagem FIGURA 2737 Sequências sinal aminoterminais de algumas pro teínas eucarióticas que direcionam seu transporte para dentro do RE O núcleo hidrofóbico em amarelo é precedido por um ou mais resí duos básicos em azul Observe os resíduos polares e com cadeias laterais curtas logo antes à esquerda do sítio de clivagem indicado por setas cor derosa Nelson6ed27indd 1140 Nelson6ed27indd 1140 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1141 A glicosilação tem um papelchave no endereçamento de proteínas No lúmen do RE as proteínas recémsintetizadas são adi cionalmente modificadas de várias maneiras Após a remo ção das sequências sinal os polipeptídeos são dobrados as pontes dissulfeto são formadas e muitas proteínas são glicosiladas para formar glicoproteínas Em muitas glico proteínas a ligação aos seus oligossacarídeos se dá por meio de resíduos de Asn Existem diversos oligossacarídeos Nligados Capítulo 7 mas as vias pelas quais eles são for mados apresentam uma primeira etapa em comum Um oligossacarídeo central de 14 resíduos é formado passo a passo e depois transferido de uma molécula de dolicolfosfa to doadora para determinados resíduos de Asn na proteína Figura 2739 A transferase fica na face luminal do RE e portanto não é capaz de catalisar a glicosilação de pro teínas citosólicas Após a transferência o oligossacarídeo central sofre clivagens e ajustes que variam nas diferentes proteínas mas todos os oligossacarídeos Nligados man têm como cerne um pentassacarídeo derivado do oligossa carídeo original de 14 resíduos Vários antibióticos agem interferindo em uma ou mais etapas desse processo e têm ajudado a elucidar os passos da glicosilação de proteínas O mais bem caracterizado é a tunicamicina que imita a estrutura da UDPNacetilglicosamina e bloqueia a primeira etapa do processo Figura 2739 etapa ➊ Algumas proteí nas são Oglicosiladas no RE mas a maioria das Oglicosila ções ocorre no aparelho de Golgi ou no citosol no caso das proteínas que não entram no RE NAcetilglicosamina Uracila Tunicamina Cadeia lateral de ácido graxo Tunicamicina ❽ ❻ ❺ ❹ ❸ ❷ ❶ ❼ ❾ Citosol Retículo endoplasmático Receptor de ribossomo Complexo de translocação de peptídeos Receptor de SRP Lúmen do RE Peptidase do sinal Ciclo do ribossomo Quepe 59 mRNA Ciclo da SRP SRP AA AA n 39 GTP GDP 1 Pi GUA Sequência sinal FIGURA 2738 Endereçamento das proteínas eucarióticas com os sinais apropriados para o retículo endoplasmático Esse processo envolve o ciclo da SRP bem como o transporte e a clivagem do polipep tídeo nascente As etapas estão descritas no texto A SRP é um complexo em forma de bastão que contém um RNA de 300 nucleotídeos 7SLRNA e seis proteínas diferentes massa combinada de Mr 325000 Uma das subu nidades proteicas da SRP se liga diretamente à sequência sinal inibindo o alongamento por meio do bloqueio espacial da entrada de aminoaciltRNA e inibindo a peptidiltransferase Outra subunidade da proteína se liga ao GTP hidrolisandoo O receptor da SRP é um heterodímero de subunidades a Mr 69000 e b Mr 30000 ambas as quais se ligam a múltiplas moléculas de GTP hidrolisandoas durante o processo Nelson6ed27indd 1141 Nelson6ed27indd 1141 070414 1422 070414 1422 1142 DAVID L NELSON MICHAEL M COX As proteínas adequadamente modificadas podem então ser transportadas para vários destinos na célula As proteínas vão do RE para o aparelho de Golgi dentro de vesículas de transporte Figura 2740 No aparelho de Golgi oligossa carídeos são Oligados a algumas proteínas e oligossacarídeos Nligados são modificados Via mecanismos ainda pouco co nhecidos o aparelho de Golgi também seleciona proteínas enviandoas para seus destinos finais Os processos por meio dos quais as proteínas que serão secretadas são segregadas daquelas direcionadas para a membrana plasmática ou para os lisossomos precisam distiguir essas proteínas com base em características estruturais que não sejam as sequências sinal pois essas foram removidas no lúmen do RE Esse processo de seleção é mais bem compreendido no caso das hidrolases cujo destino é serem transportadas aos lisossomos Quando chega uma hidrolase que é uma glico proteína no aparelho de Golgi uma característica ainda não determinada às vezes chamada de fragmento sinal da es trutura tridimensional da hidrolase é reconhecida por uma fosfotransferase a qual fosforila certos resíduos de manose do oligossacarídeo Figura 2741 A presença de um ou mais resíduos de manose 6fosfato no seu oligossacarídeo N ligado é o sinal estrutural que direciona uma proteína para os lisossomos Uma proteína receptora na membrana do apa relho de Golgi reconhece o sinal de manose 6fosfato e liga a hidrolase assim marcada Vesículas contendo esses comple xos de receptorhidrolase brotam da porção trans do apare lho de Golgi e vão até vesículas de seleção Nessas vesículas de seleção o complexo receptorhidrolase se dissocia por meio de um processo que é facilitado pelo pH mais baixo da vesícula e pela remoção catalisada por uma fosfatase dos grupos fosfato dos resíduos de manose 6fosfato O recep tor é então reciclado para o aparelho de Golgi e as vesículas contendo as hidrolases brotam das vesículas de seleção e se dirigem aos lisossomos Em células tratadas com tunicamici na Figura 2739 etapa ➊ as hidrolases que deveriam ser direcionadas aos lisossomos são secretadas confirmando que o oligossacarídeo Nligado exerce papelchave no ende reçamento dessas enzimas para os lisossomos As vias que direcionam as proteínas para mitocôndrias e cloroplastos também se baseiam em sequências sinal ami noterminais Apesar de mitocôndrias e cloroplastos conte rem DNA a maioria das suas proteínas é codificada pelo DNA nuclear e deve ser direcionada às devidas organelas No entanto diferentemente de outras vias de endereça mento no caso das vias para mitocôndrias e cloroplastos essas iniciam somente depois que a proteína precursora tenha sido completamente sintetizada e liberada dos ribos P P P P P P P P P P P P P P P P P P P CH3 CH3 n CH3 CH3 39 59 ❽ ❾ ❼ ❻ ❺ ❹ ❸ ❷ ❶ Dolicol 5 GDPMan 5 GDP 2 UDPGlcNAc UMP 1 UDP Tunicamicina Dolicolfosfato n 922 4 Dolicol Man NH3 1 H3N 1 H3N 1 NAcetilglicosamina GlcNAc Manose Man Glicose Glc Dolicol fosfato reciclado Translocação Retículo endoplasmático Asn Citosol 4 Dolicol 3 Dolicol Glc 3 Dolicol mRNA Pi FIGURA 2739 Síntese do oligossacarídeo central das glicoproteí nas O oligossacarídeo central é construído pela adição sucessiva de unida des de monossacarídeos ➊ ➋ As primeiras etapas ocorrem na face citosóli ca do RE ➌ A translocação move o oligossacarídeo ainda incompleto através da membrana mecanismo não mostrado e ➍ a formação do oligossa carídeo completo ocorre dentro do lúmen do RE Os precursores que for necem resíduos adicionais de manose e de glicose ao oligossacarídeo em formação no lúmen são derivados do dolicolfosfato Na primeira etapa de montagem da porção de oligossacarídeo Nligado de uma glicoproteína ➎ ➏ o oligossacarídeo central é transferido do dolicolfosfato para um re síduo de Asn da proteína dentro do lúmen do RE O oligossacarídeo central é novamente modificado no RE e no aparelho de Golgi por meio de vias que variam para diferentes proteínas Os cinco resíduos de açúcar mostrados cercados por uma marcação em bege após a etapa ➐ são mantidos na es trutura final de todos os oligossacarídeos Nligados ➑ O dolicolpirofosfato liberado é novamente translocado de forma que o pirofosfato fica no lado citosólico do RE e então ➒ um fosfato é removido hidroliticamente para re generar o dolicolfosfato Nelson6ed27indd 1142 Nelson6ed27indd 1142 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1143 somos As proteínas precursoras destinadas a mitocôndrias ou cloroplastos são ligadas por proteínas citosólicas da fa mília das chaperonas e levadas até receptores presentes na superfície externa da organela de destino Mecanismos de translocação especializados transportam então a proteína até seu destino final na organela e após essa etapa a se quência sinalizadora é removida As sequências sinal para o transporte nuclear não são clivadas A comunicação molecular entre o núcleo e o citosol requer o movimento de macromoléculas através de poros na mem brana nuclear As moléculas de RNA sintetizadas no núcleo são exportadas para o citosol Proteínas ribossomais sinte tizadas em ribossomos citosólicos são importadas para o núcleo e montadas para formar as subunidades 60S e 40S dos ribossomos no nucléolo as subunidades completas são exportadas de volta para o citosol Diversas proteínas nucleares RNA e DNApolimerases histonas topoisome FIGURA 2740 Via adotada pelas proteínas com destino aos lisosso mos à membrana plasmática ou à secreção As proteínas são transporta das do RE para a porção cis do aparelho de Golgi dentro de vesículas de trans porte A seleção ocorre principalmente no lado trans do aparelho de Golgi Núcleo RE rugoso RE liso Vesícula de transporte Lisossomo Grânulo secretor Vesículas de transporte Porção cis Porção trans Seleção Aparelho de Golgi Citosol Membrana plasmática Uridina Oligossacarídeo Resíduo de manose 6fosfato UDP Nacetilglicosamina UDPGlcNAc Oligossacarídeo Enzima Enzima Enzima Hidrolase Oligossacarídeo Nacetilglicosamina fosfotransferase Fosfodiesterase Resíduo de manose FIGURA 2741 Fosforilação de resíduos de manose nas en zimas direcionadas aos lisossomos A Nacetilglicosaminafos fotransferase reconhece alguma característica ainda não determi nada das hidrolases que são destinadas aos lisossomos Nelson6ed27indd 1143 Nelson6ed27indd 1143 070414 1422 070414 1422 1144 DAVID L NELSON MICHAEL M COX rases proteínas que regulam a expressão gênica e assim por diante são sintetizadas no citosol e importadas para o núcleo Esse tráfego é modulado por um complexo sistema que envolve sinais moleculares e proteínas de transporte o qual vem sendo aos poucos elucidado Na maioria dos eucariotos multicelulares o envelope nuclear é rompido a cada divisão celular quando a divisão termina e o envelope é restabelecido as proteínas nuclea res que haviam se dispersado precisam ser novamente im portadas para o núcleo A fim de permitir essa importação repetidas vezes a sequência sinal que direciona uma pro teína para o núcleo a sequência de localização nuclear NLS não é removida depois que a proteína atinge seu destino Uma NLS ao contrário de outras sequências sinal pode estar localizada praticamente em qualquer região da sequência primária da proteína As NLS podem variar con sideravelmente mas muitas consistem em quatro a oito resíduos de aminoácidos e incluem vários resíduos básicos Arg ou Lys consecutivos A importação nuclear é mediada por várias proteínas que circulam entre o citosol e o núcleo Figura 2742 incluindo importina a e b e uma pequena GTPase conhe cida como Ran proteína nuclear relacionada à Ras Um heterodímero de importina a e b funciona como um re ceptor solúvel para proteínas direcionadas ao núcleo com a subunidade a ligandose a proteínas que têm NLS no citosol O complexo da importina com a proteína que tem NLS aporta em um poro nuclear e é transportado através do poro por um mecanismo dependente de energia No núcleo a importina b é ligada à Ran GTPase liberando a importina b da proteína importada A importina a é li gada à Ran e à CAS proteína celular de suscetibilidade à apoptose e é separada da proteína que tem NLS As importinas a e b complexadas com Ran e CAS são en tão exportadas do núcleo A Ran hidrolisa GTP no citosol para liberar as importinas as quais ficam então livres para iniciar um novo ciclo de importação A própria Ran é reci clada de volta para o núcleo pela ligação da RanGDP ao 02mm Ran GTP Ran GTP CAS Envelope nuclear Proteína nuclear Importina Complexo do poro nuclear NLS Citosol Nucleoplasma b b b a a a a a GTP GDP Ran GDP CAS Ran GDP Ran GDP Ran GTP NTF2 Ran GEF b NTF2 NTF2 NTF2 ❸ ❻ ❼ ❶ ❷ ❺ ❹ FIGURA 2742 Endereçamento de proteínas nucleares a ➊ Uma proteína com um sinal de localização nuclear NLS apropriado é ligada a um complexo de importina a e b ➋ O complexo resultante se liga a um poro nuclear e é translocado ➌ Dentro do núcleo a dissociação da importina b é favorecida pela ligação da RanGTP ➍ A importina a se liga à RanGTP e à CAS proteína celular de sucetibilidade à apoptose liberando a proteína nuclear ➎ As importinas a e b e a CAS são transportadas para fora do núcleo e então recicladas Elas são liberadas no citosol quando a Ran hidrolisa o seu GTP ligado ➏ A RanGDP se liga ao NFT2 e é transportada de volta para o núcleo ➐ A RanGEF favorece a troca de GDP por GTP no núcleo e a RanGTP fica pronta para processar outro complexo de proteína e importina conten do NLS b Micrografia eletrônica de varredura da superfície do envelope nuclear mostrando vários poros nucleares O complexo do poro nuclear é um dos maiores agregados proteicos presentes na célula Mr 5 10 7 Ele é formado por múltiplas cópias de mais de 30 proteínas diferentes Nelson6ed27indd 1144 Nelson6ed27indd 1144 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1145 fator 2 de transporte nuclear NTF2 Dentro do núcleo o GDP ligado à Ran é substituído por GTP pela ação do fa tor de troca Rannucleotídeo da guanosina RanGEF ver Quadro 122 As bactérias também usam sequências sinal para o endereçamento das proteínas As bactérias são capazes de direcionar proteínas para a membrana interna ou externa para o espaço periplásmico entre essas membranas ou para o meio extracelular Elas usam sequências sinal presentes na extremidade amino das proteínas Figura 2743 de modo semelhante àquelas das proteínas eucarióticas que são direcionadas ao RE às mitocôndrias e aos cloroplastos A maioria das proteínas exportadas de E coli fazem uso da via mostrada na Figura 2744 Após a tradução uma proteína a ser exportada se dobra de forma mais lenta pois a sequência sinal aminoterminal impede o seu enovelamento A proteína chaperona solúvel SecB se liga à sequência sinal da proteína ou a outras partes da sua estrutura na proteína ainda parcialmente dobrada A pro teína ligada é então levada à SecA proteína associada à superfície interna da membrana plasmática A SecA atua tanto como receptor quanto como ATPase de transpor te Quando liberada da SecB e ligada à SecA a proteína é levada para um complexo de transporte na membrana constituído de SecY E e G e é transportada em etapas através da membrana no complexo SecYEG sendo que em cada etapa passam cerca de 20 resíduos de aminoácidos Sítio de clivagem Proteínas da membrana interna Fago fd proteína maior do envelope Fago fd proteína menor do envelope Proteínas periplásmicas Fosfatase alcalina Proteína de ligação específica de leucina Lactamase de pBR322 Proteínas da membrana externa Lipoproteína LamB OmpA Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser His Ser Ala Glu Met Lys Gln Ser Thr Ile Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Arg Thr Ala Val Ala Leu Ala Met Val Ala Ala Pro Asp Cys Val His Asp Pro Asp Ser Ala Ala Gln Ala Gly Phe Ala Met Ala Thr Pro Leu Gln His Leu Ala Thr Thr Ser Cys Ala Ser Ser Met Gly Phe Ile Phe Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ile Ala Leu Ala Val Leu Phe Ala Ala Ala Ala Phe Ile Val Val Gly Pro Met Ala Ala Leu Ile Gly Ile Val Val Leu Ala Ala Ala Leu Ile Ala Ile Leu Lys Ile Val Ala Thr Pro Arg Thr Thr Leu Ala Phe Lys Ala His Lys Lys Lys Lys Arg Met Asn Gln Met Leu Thr Ile Ser Ile Met Met Lys Ala Met Met b FIGURA 2743 Sequências sinal que direcionam as proteínas a dife rentes locais nas bactérias Aminoácidos básicos em azul próximos à extremidade amino e aminoácidos hidrofóbicos do cerne em amarelo es tão destacados Os sítios de clivagem que marcam o final das sequências sinal estão indicados por setas corderosa Observe que a membrana celular interna das bactérias ver Figura 16 é onde o DNA e as proteínas de enve lope de fagos fd são montadas para formar as partículas virais A OmpA é a proteína A da membrana externa a LamB é uma proteína da superfície celular receptora do fago l FIGURA 2744 Modelo para a exportação de proteí nas em bactérias ➊ Um polipeptídeo recémtraduzi do se liga à proteína chaperona citosólica SecB a qual ➋ o leva até a SecA uma proteína associada ao complexo de transporte SecYEG na membrana celular bacteriana ➌ A SecB é liberada e a SecA se insere na membrana for çando a passagem de cerca de 20 resíduos de aminoáci dos da proteína a ser exportada por meio do complexo de transporte ➍ A hidrólise de um ATP pela SecA fornece a energia para que ocorra uma mudança conformacio nal a qual faz a SecA se soltar da membrana liberando o polipeptídeo ➎ A SecA liga outro ATP e o próximo seg mento de 20 resíduos de aminoácidos é empurrado por meio do complexo de transporte presente na membra na As etapas ➍ e ➎ são repetidas até que ➏ toda a pro teína tenha passado através da membrana sendo libera da no periplasma O potencial eletroquímico dentro da membrana definido como 1 e também fornece parte da energia necessária para o transporte das proteínas Citosol Espaço periplásmico ❻ ❺ ❹ ❸ ❷ ❶ SecYEG SecA 111 222 SecB ATP ADP 1 Pi ATP SecB 1 Nelson6ed27indd 1145 Nelson6ed27indd 1145 070414 1422 070414 1422 1146 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Cada etapa é facilitada pela hidrólise de ATP catalisada pela SecA Uma proteína exportada é assim empurrada através da membrana por uma proteína SecA localizada na super fície citoplasmática e não puxada pela membrana por uma proteína localizada na superfície periplásmica Tal diferen ça pode simplesmente refletir a necessidade de a ATPase estar onde está o ATP O potencial eletroquímico através da membrana também fornece energia para o transporte da proteína por meio de um mecanismo ainda desconhecido Apesar de a maioria das proteínas bacterianas exporta das utilizar essa via algumas seguem uma via alternativa que utiliza o reconhecimento de sinais e proteínas recep toras homólogas aos componentes da SRP e do receptor de SRP eucarióticos Figura 2738 As células importam proteínas por meio de endocitose mediada por receptor Algumas proteínas são importadas do meio externo para dentro das células eucarióticas exemplos são a lipoproteína de baixa densidade LDL a proteína carreadora de ferro transferrina hormônios peptídicos e proteínas circulantes destinadas à degradação Existem várias vias de importação Figura 2745 Em uma das vias as proteínas se ligam a receptores em invaginações da membrana denominadas de pressões revestidas nas quais existe uma concentração preferencial de receptores endocíticos em relação a outras proteínas de superfície celular As depressões são revestidas no lado citosólico por uma rede formada pela proteína cla trina a qual forma estruturas poliédricas fechadas Figura 2746 A rede de clatrina aumenta à medida que mais re ceptores vão sendo ocupados pelas proteínasalvo Por fim uma vesícula endocítica completa ainda ligada à membrana se solta da membrana plasmática com ajuda da dinamina uma GTPase grande e entra no citoplasma A clatrina é ra pidamente removida por enzimas removedoras de revesti mento e a vesícula se funde a um endossomo A atividade ATPásica nas membranas reduz o pH interno do endossomo facilitando a dissociação dos receptores de suas proteínas alvo Em uma via relacionada a caveolina causa a invagi nação de segmentos da membrana contendo balsas lipídicas associadas a certos tipos de receptores ver Figura 1122 Essas vesículas endocíticas se fundem então com estrutu ras internas contendo caveolina chamadas de caveossomos nos quais as moléculas internalizadas são selecionadas e re direcionadas para outras partes da célula e as caveolinas são preparadas para serem recicladas para a superfície da mem brana Também existem vias independentes de clatrina e de caveolina algumas fazem uso da dinamina e outras não FIGURA 2745 Resumo das vias endocí ticas em células eucarióticas As vias de pendentes de clatrina e de caveolina fazem uso da GTPase dinamina para desprender as vesículas da membrana plasmática Algu mas vias não utilizam clatrina nem caveoli na algumas delas fazem uso da dinamina enquanto outras não Endocitose dependente de clatrina Dinamina Clatrina Caveolina Remoção do revestimento Endocitose dependente de caveolina Vias independentes de clatrina e de caveolina Endossomo primário Caveossomo Cadeia leve Cadeia pesada a b 80 nm c 01 mm FIGURA 2746 Clatrina a Três cadeias leves L Mr 35000 e três cadeias pesadas H Mr 180000 da unidade de clatrina HL3 organizadas em uma es trutura de três pernas chamada de tríscele b Os trísceles tendem a se agrupar formando redes poliédricas c Micrografia eletrônica de uma depressão reves tida presente na face citosólica da membrana plasmática de um fibroblasto Nelson6ed27indd 1146 Nelson6ed27indd 1146 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1147 As proteínas e os receptores importados seguem então seus caminhos separados e seus destinos variam conforme o tipo de célula e de proteína A transferrina e seu receptor são no fim reciclados Alguns hormônios fatores de cres cimento e complexos do sistema imune após induzirem a resposta celular apropriada são degradados juntamente com seus receptores A LDL é degradada depois que o co lesterol associado a ela tenha sido levado até seu destino mas o receptor de LDL é reciclado ver Figura 2141 A endocitose mediada por receptor é utilizada por algu mas toxinas e por alguns vírus para a entrada nas células O vírus da influenza a toxina diftérica e a toxina da cólera entram na célula desta maneira A degradação de proteínas é mediada por sistemas especializados em todas as células A degradação de proteínas evita o acúmulo de proteínas anormais ou não desejáveis e permite a reciclagem dos ami noácidos A meiavida das proteínas eucarióticas varia de 30 segundos até muitos dias Muitas proteínas apresentam uma taxa de renovação rápida se for considerado o tempo de vida de uma célula embora umas poucas como a he moglobina possam durar por toda a vida da célula cerca de 110 dias no caso de um eritrócito As proteínas rapida mente degradadas incluem aquelas que são defeituosas em virtude da inserção de aminoácidos errados ou em virtude de danos acumulados durante o funcionamento normal As enzimas que atuam em pontoschave da regulação de vias metabólicas geralmente apresentam uma rápida renovação As proteínas defeituosas e aquelas com meiavida ca racteristicamente curta em geral são degradadas tanto nas células bacterianas como nas eucarióticas por sistemas ci tosólicos seletivos dependentes de ATP Um segundo siste ma que opera nos lisossomos das células de vertebrados recicla os aminoácidos das proteínas de membrana das proteínas extracelulares e das proteínas de meiavida ca racteristicamente longa Em E coli muitas proteínas são degradadas por uma protease dependente de ATP denominada Lon o nome se refere à forma longa das proteínas que somente é obser vada quando essa protease está ausente Essa protease é ativada na presença de proteínas defeituosas ou de proteí nas destinadas a uma rápida rotatividade duas moléculas de ATP são hidrolisadas para cada ligação peptídica clivada Ainda não está claro qual é o exato papel dessa hidrólise de ATP Uma vez que a proteína tenha sido reduzida a peque nos peptídeos inativos outras proteases independentes de ATP completam o processo de degradação A via dependente de ATP em células eucarióticas é um tanto diferente envolvendo a proteína ubiquitina a qual como o nome sugere está presente em todos os rei nos eucarióticos Sendo uma das proteínas mais altamente conservadas que se conhece a ubiquitina composta por 76 resíduos de aminoácidos é essencialmente idêntica em organismos muito diferentes como por exemplo em le veduras e humanos A ubiquitina é ligada covalentemente a proteínas destinadas à destruição por meio de uma via dependente de ATP que envolve três tipos diferentes de enzimas denominadas enzimas ativadoras E1 enzimas con jugadoras E2 e ligases E3 Figura 2747 As proteínas ubiquitinadas são degradadas por um gran de complexo conhecido como proteassomo 26S Mr 25 3 10 6 Figura 2748 O proteassomo eucariótico consiste em duas cópias cada uma de no mínimo 32 subunidades diferentes a maioria das quais é altamente conservada de leveduras até humanos O proteassomo contém dois tipos principais de subcomplexos uma partícula central em for ma de barril e partículas reguladoras em cada lado do bar O C O O2 C HS HS O C S O C S H2N NH HS 1 ATP HS Ubiquitina E1 E1 AMP 1 PPi E2 E2 E2 Ubiquitina Ubiquitina Ubiquitina E3 Lys Proteínaalvo Proteínaalvo Lys Ciclos repetidos levam à ligação de ubiquitinas adicionais E1 FIGURA 2747 Via em três etapas por meio da qual a ubiquitina é ligada a uma proteína Dois intermediários diferentes de enzimaubi quitina estão envolvidos O grupo carboxila livre do resíduo de Gly da ex tremidade carboxil da ubiquitina ligase primeiro a uma enzima ativadora da classe E1 por meio de um tioéster A ubiquitina é então transferida para uma enzima conjugadora E2 Uma ligase E3 finalmente catalisa a transfe rência da ubiquitina da E2 para o alvo ligando a ubiquitina por meio de uma ligação amida isopeptídica a um grupo amino de um resíduo de Lys da proteínaalvo Ciclos adicionais produzem poliubiquitina políme ro covalente composto por subunidades de ubiquitina que direcionam a proteína ligada para que essa seja destruída nos eucariotos Múltiplas vias desse tipo com diferentes alvos das proteínas estão presentes na maioria das células eucarióticas Nelson6ed27indd 1147 Nelson6ed27indd 1147 070414 1422 070414 1422 1148 DAVID L NELSON MICHAEL M COX ril A partícula central de 20S consiste em quatro anéis os anéis externos são formados por sete subunidades a e os internos por sete subunidades b Três das sete subunida des em cada anel b apresentam atividade proteásica cada uma com diferentes especificidades de substrato Os anéis empilhados da partícula central formam a estrutura seme lhante a um barril dentro da qual as proteínasalvo são de gradadas A partícula reguladora 19S de cada extremidade da partícula central contém aproximadamente 18 subu nidades incluindo algumas que reconhecem e se ligam a proteínas ubiquitinadas Seis das subunidades são AAA1 ATPases ver Capítulo 25 que provavelmente funcionam desdobrando as proteínas ubiquitinadas e transportando o polipeptídeo desdobrado para dentro da partícula central para que ocorra a degradação do mesmo A partícula 19S também desubiquitina as proteínas à medida que essas vão sendo degradadas no proteassomo A maioria das células tem complexos de regulação adicionais que podem subs tituir a partícula 19S Esses reguladores alternativos não hidrolisam ATP e não ligam ubiquitina mas são importan tes para a degradação de proteínas celulares específicas O proteassomo 26S pode ser efetivamente assessorado com complexos de regulação que mudam conforme mudam as condições na célula Nem todos os sinais que desencadeiam a ubiquitinação são bem compreendidos ainda Apesar disso um sinal sim ples foi encontrado Para muitas proteínas a identidade do primeiro resíduo que permanece após a remoção do resíduo Met aminoterminal e qualquer outro processamento pro teolítico póstraducional da extremidade aminoterminal apresenta grande influência na meiavida Tabela 279 Esses sinais aminoterminais foram conservados ao longo de bilhões de anos de evolução e são os mesmos nos sistemas de degradação de proteínas em bactérias e na via de ubi quitinação em humanos Sinais mais complexos como a se quência de destruição discutida no Capítulo 12 ver Figura 1247 também vêm sendo identificados A proteólise dependente de ubiquitina é importante tanto para a regulação de processos celulares como para a eliminação de proteínas defeituosas Muitas proteínas so licitadas em apenas um estágio do ciclo de uma célula eu cariótica são rapidamente degradadas pela via dependente de ubiquitina após completarem sua função A destruição da ciclina dependente de ubiquitina é crucial para a regu lação do ciclo celular ver Figura 1247 Os componentes E1 E2 e E3 da via de ubiquitinação Figura 2747 são na verdade grandes famílias de proteínas Enzimas E1 E2 e E3 diferentes apresentam especificidades diferentes para proteínasalvo e portanto regulam processos celulares di ferentes Algumas dessas enzimas ficam muito concentra das em determinados compartimentos celulares refletindo uma função especializada Não é de surpreender que defeitos na via de ubiquitina ção tenham implicação em uma variedade de estados patológicos A incapacidade de degradar algumas proteínas que ativam a divisão celular produtos de oncogenes pode levar à formação de tumores enquanto o mesmo efeito pode ser causado por uma degradação muito rápida de proteínas que atuam como supressores tumorais A degradação não eficiente ou muito rápida de proteínas celulares também pa rece desempenhar um papel em uma variedade de outras condições doenças renais asma doenças neurodegenerati vas como Alzheimer e Parkinson associadas à formação de estruturas proteináceas características nos neurônios fi brose cística causada em alguns casos por uma degradação muito rápida de um canal de cloreto resultando em sua per da de função ver Quadro 112 síndrome de Liddle na qual a Poliubiquitina ligada à proteína substrato interage com o proteassomo Partícula reguladora 19S Partícula reguladora 19S b Partícula central 20S b a a FIGURA 2748 Estrutura tridimensional do proteassomo eucarióti co O proteassomo 26S é altamente conservado em todos os eucariotos As duas subconstruções são a partícula central de 20S e a partícula regu ladora de 19S ou quepe a PDB ID 3L5Q A partícula central consiste em quatro anéis organizados de maneira a formar uma estrutura semelhante a um barril Cada um dos anéis internos tem sete subunidades b diferentes marromescuro três das quais têm atividade proteásica Cada anel externo tem sete subunidades a diferentes marromclaro b Uma partícula regu ladora forma um quepe em cada uma das extremidades da partícula central cinza a A partícula reguladora ligase a poteínas ubiquitinadas desdobra as e as transloca para dentro da partícula central onde elas são degradadas a peptídeos de 3 a 25 aminoácidos TABELA 279 Relações entre a meiavida de uma proteína e o resíduo de aminoácido da sua extremidade amino Resíduo aminoterminal Meiavida Estabilizadores Ala Gly Met Ser Thr Val 20 h Desestabilizadores Gln Ile 30 min Glu Tyr 10 min Pro 7 min Asp Leu Lys Phe 3 min Arg 2 min Fonte Modificado de Bachmair A Finley D Varshavsky A 1986 In vivo half life of a protein is a function of its aminoterminal residue Science 234 179186 As meiasvidas foram medidas em leveduras para a proteína bgalactosidase que foi modificada de forma a possuir um resíduo aminoterminal diferente em cada experimento As meiasvidas variam para diferentes proteínas e em diferen tes organismos mas esse padrão geral parece manterse em todos os organismos Nelson6ed27indd 1148 Nelson6ed27indd 1148 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1149 um canal de sódio no rim não é degradado levando à absor ção de Na 1 em excesso e a um início precoce de hiperten são e muitas outras doenças Fármacos desenvolvidos para inibir a função proteassômica estão sendo utilizados como tratamentos potenciais para algumas dessas condi ções Em um ambiente metabólico que sofre constantes mu danças a degradação de proteínas é tão importante para a sobrevivência de uma célula quanto à síntese proteica e muito ainda está por ser descoberto a respeito dessas inte ressantes vias RESUMO 273 Endereçamento e degradação das proteínas c Após serem sintetizadas muitas proteínas são direcio nadas para locais específicos na célula Um dos mecanis mos de endereçamento envolve uma sequência peptídi ca sinalizadora geralmente encontrada na extremidade amino de uma proteína recémsintetizada c Nas células eucarióticas uma classe de sequências sinal é reconhecida pela partícula de reconhecimento de si nal SRP a qual se liga à sequência sinal logo que essa aparece no ribossomo e transfere todo o ribossomo e o polipeptídeo incompleto para o RE Os polipeptíde os contendo essas sequências sinal são transportados para dentro do lúmen do RE à medida que vão sendo sintetizados no lúmen eles podem ser modificados e transportados para o aparelho de Golgi para depois se rem selecionados e enviados para os lisossomos para a membrana plasmática ou para vesículas de transporte c As proteínas direcionadas para mitocôndrias e cloro plastos nas células eucarióticas e aquelas destinadas para exportação nas bactérias também fazem uso de uma sequência sinal aminoterminal c As proteínas direcionadas para o núcleo têm uma se quência sinal interna que diferentemente de outras sequências sinal não é clivada após o endereçamento adequado da proteína c Algumas células eucarióticas importam proteínas por meio de endocitose mediada por receptor c Todas as células no final degradam proteínas utilizando sistemas proteolíticos especializados As proteínas de feituosas e aquelas destinadas a uma rápida renovação são geralmente degradadas por um sistema dependente de ATP Nas células eucarióticas as proteínas são pri meiramente marcadas pela ligação à ubiquitina uma proteína altamente conservada A proteólise dependen te de ubiquitina é realizada pelos proteassomos tam bém altamente conservados e é crucial para a regula ção de muitos processos celulares Termoschave Termos em negrito estão definidos no glossário aminoaciltRNA 1104 aminoaciltRNAsintase 1104 tradução 1104 códon 1104 fase de leitura 1105 códon de iniciação 1107 códons de terminação 1107 fase de leitura aberta ORF 1107 anticódon 1109 hipótese da oscilação 1110 mudança de fase de leitura de tradução 1111 edição do RNA 1111 iniciação 1127 sequência de ShineDalgarno 1127 sítio aminoacil A 1128 sítio peptidil P 1128 sítio de saída E 1128 complexo de iniciação 1128 alongamento 1129 fatores de alongamento 1129 peptidiltransferase 1132 translocação 1132 terminação 1134 fatores de liberação 1134 supressor sem sentido 1134 polissomo 1135 modificação póstraducional 1136 puromicina 1138 tetraciclina 1138 cloranfenicol 1138 cicloeximida 1138 estreptomicina 1138 toxina diftérica 1139 ricina 1139 sequência sinal 1140 partícula de reconhecimento de sinal SRP 1140 complexo de translocação de peptídeos 1140 tunicamicina 1141 sequência de localização nuclear NLS 1144 depressões revestidas 1146 clatrina 1146 dinamina 1146 ubiquitina 1147 proteassomo 1147 Leituras adicionais Código genético Ambrogelly A Palioura S Söll D 2007 Natural expansion of the genetic code Nat Chem Biol 3 2935 Blanc V Davidson NO 2003 CtoU RNA editing mechanisms leading to genetic diversity J Biol Chem 278 13951398 Crick FHC 1966 The genetic code III Sci Am 215 October 5562 Uma visão geral criteriosa do código genético em uma época em que as palavras do código haviam sido há pouco desvendadas Farajollahi S Maas S 2010 Molecular diversity through RNA editing a balancing act Trends Genet 26 221230 Hohn MJ Park HS ODonoghue P Schnitzbauer M Söll D 2006 Emergence of the universal genetic code imprinted in an RNA record Proc Natl Acad Sci USA 103 1809518100 Levanon K Eisenberg E Rechavi G Levanon EY 2005 Letter from the editor adenosinetoinosine RNA editing in Alu repeats in the human genome EMBO Rep 6 831835 Liu M Schatz DG 2009 Balancing AID and DNA repair during somatic hypermutation Trends Immunol 30 173181 Lobanov AV Turanov AA Hatfield DL Gladyshev VN 2010 Dual functions of codons in the genetic code Crit Rev Biochem Mol Biol 45 257265 Neeman Y Dahary D Nishikura K 2006 Editor meets silencer crosstalk between RNA editing and RNA interference Nat Rev Mol Cell Biol 7 919931 Nirenberg M 2004 Historical review deciphering the genetic codea personal account Trends Biochem Sci 29 4654 Schimmel P Beebe K 2004 Molecular biologygenetic code seizes pyrrolysine Nature 431 257258 Vetsigian K Woese C Goldenfeld N 2006 Collective evolution and the genetic code Proc Natl Acad Sci USA 103 1069610701 Nelson6ed27indd 1149 Nelson6ed27indd 1149 070414 1422 070414 1422 1150 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Yanofsky C 2007 Establishing the triplet nature of the genetic code Cell 128 815818 Yarus M Caporaso JG Knight R 2005 Origins of the genetic code the escaped triplet theory Annu Rev Biochem 74 179198 Síntese de proteínas Ban N Nissen P Hansen J Moore PB Steitz TA 2000 The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 24 Å resolution Science 289 905920 A primeira estrutura em alta resolução de uma subunidade ribossomal importante BenShem A de Loubresse NG Melnikov S Jenner L Yusupova G Yusupov M 2011 The structure of the eukaryotic ribosome at 30 Å resolution Science 334 15241529 Chapeville F Lipmann F von Ehrenstein G Weisblum B Ray WJ Jr Benzer S 1962 On the role of soluble ribonucleic acid in coding for amino acids Proc Natl Acad Sci USA 48 10861092 Experimentos clássicos fornecem provas para a hipótese do adaptador proposta por Crick e mostram que os aminoácidos não são conferidos após se ligarem aos tRNAs Decatur WA Fournier MJ 2002 rRNA modifications and ribosome function Trends Biochem Sci 27 344351 Dintzis HM 1961 Assembly of the peptide chains of hemoglobin Proc Natl Acad Sci USA 47 247261 Experimento clássico estabelece que as proteínas são montadas a partir da extremidade amino Dunkle JA Cate JHD 2010 Ribosome structure and dynamics during translocation and termination Annu Rev Biophys 39 227244 Gray NK Wickens M 1998 Control of translation initiation in animals Annu Rev Cell Dev Biol 14 399458 Ibba M Söll D 2000 AminoacyltRNA synthesis Annu Rev Biochem 69 617650 Korostelev A Noller HF 2007 The ribosome in focus new structures bring new insights Trends Biochem Sci 32 434441 Korostelev A Trakhanov S Laurberg M Noller HF 2006 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ser predi ta a partir da sequência de aminoácidos de seu produto polipeptídico Se o quadro de leitura for especificado uma dada sequência de bases de um mRNA codificará uma e ape nas uma sequência de aminoácidos em um polipeptídeo A partir de uma dada sequência de resíduos de aminoácidos em uma proteína como por exemplo o citocromo c é possível predizer uma sequência única de bases do seu mRNA codifi cante Dê razões para sua resposta Nelson6ed27indd 1150 Nelson6ed27indd 1150 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1151 4 Codificação de um polipeptídeo a partir de DNA fita dupla A fitamolde de um segmento de DNA duplahélice contém a sequência 59 CTTAACACCCCTGACTTCGCGCCGTCG39 a Qual é a sequência de bases do mRNA que pode ser transcrita a partir dessa fita b Que sequência de aminoácidos poderia ser codificada pelo mRNA em a iniciando na extremidade 59 c Se a fita complementar não molde desse DNA fosse transcrita e traduzida a sequência de aminoácidos resultante seria a mesma que em b Explique o significado biológico da sua resposta 5 A metionina tem apenas um códon A metionina é um dos dois aminoácidos com apenas um códon Como é que o único códon que codifica a metionina especifica tanto o resí duo inicial como os resíduos de Met internos dos polipeptídeos sintetizados pela E coli 6 mRNAs sintéticos O código genético foi elucidado com polirribonucleotídeos sintetizados enzimaticamente ou quimi camente em laboratório Considerando o atual conhecimento sobre o código genético como você faria um polirribonucleo tídeo que pudesse servir como um mRNA codificando predo minantemente muitos resíduos Phe e um pequeno número de resíduos Leu e Ser Que outros aminoácidos poderiam ser codificados por esse polirribonucleotídeo mas em meno res quantidades 7 Custo energético da biossíntese de proteínas De termine o mínimo de energia necessário em termos de equiva lentes de ATP utilizados para a biossíntese da cadeia de bglo bina da hemoglobina 146 resíduos tendo como componentes de partida todos os aminoácidos necessários ATP e GTP Com pare sua resposta com a quantidade de energia gasta para a biossíntese de uma cadeia linear de glicogênio de 146 resíduos de glicose unidos por ligações a1S4 a partir de um conjun to de precursores incluindo glicose UTP e ATP Capítulo 15 Com base nos seus dados qual é o custo extra de energia para se produzir uma proteína na qual todos os resíduos estão orde nados em uma sequência específica quando comparado com o custo de se produzir um polissacarídeo com o mesmo número de resíduos mas sem o conteúdo de informação da proteína Além do custo direto de energia para a síntese de uma pro teína existem gastos indiretos de energia aqueles requeridos para que a célula produza as enzimas necessárias para a sín tese proteica Compare a magnitude dos custos indiretos para que uma célula eucariótica realize a biossíntese de cadeias de glicogênio lineares a1S4 e a biossíntese de polipeptídeos em termos de maquinarias enzimáticas envolvidas 8 Pressupondo anticódons a partir de códons A maio ria dos aminoácidos tem mais de um códon e se liga a mais de um tRNA cada qual com um anticódon diferente Escreva todos os anticódons possíveis para os quatro códons de glicina 59GGU GGC GGA e GGG a Com base na sua resposta quais posições nos anticó dons são as principais determinantes para a especificidade dos seus códons no caso da glicina b Qualis pareamentos códonanticódon possuiem um par de bases oscilante c Em qual dos pareamentos códonanticódon todas as três posições apresentam fortes ligações de hidrogênio de WatsonCrick 9 Efeito das mudanças em uma única base para a se quência de aminoácidos Muitas evidências importantes que confirmam o código genético surgiram analisandose as mudanças nas sequências de aminoácidos de proteínas mutan tes após a alteração de uma única base no gene que codifica a proteína Quais das seguintes substituições de aminoácidos seriam consistentes com o código genético no caso de as alte rações terem sido causadas pela mudança de uma única base Quais não resultam de uma única mudança de base Por quê a PheSLeu e IleSLeu b LysSAla f HisSGlu c AlaSThr g ProSSer d PheSLys 10 A resistência do código genético às mutações A sequência de RNA abaixo representa o início de uma fase de leitura Que alterações podem ocorrer em cada posição sem que haja mudança no aminoácido codificado 59 AUGAUAUUGCUAUCUUGGACU 11 Princípio da mutação das células falciformes A he moglobina das células falciformes tem um resíduo de Val na posição 6 da cadeia da bglobina em vez do resíduo de Glu encontrado na hemoglobina A normal Você seria capaz de pre dizer qual mudança ocorreu no códon de DNA para glutamato que causou a substituição do Glu pela Val 12 Edição pelas aminoaciltRNAsintases A isoleucil tRNAsintase apresenta uma função de revisão que garante a fidelidade da reação de aminoacilação mas a histidiltRNA sintase não tem essa função Explique 13 A importância de um segundo código genético Algumas aminoaciltRNAsintases não reconhecem e não se ligam ao anticódon de seus tRNA correspondentes mas usam outras características estruturais dos tRNA para conferir a es pecificidade de ligação Os tRNA para alanina aparentemente se encaixam nessa categoria a Quais características do tRNA Ala são reconhecidas pela AlatRNAsintase b Descreva as consequências da mutação CSG na tercei ra posição do anticódon do tRNA Ala c Que outros tipos de mutação podem ter efeitos seme lhantes d Mutações desses tipos nunca são encontradas em po pulações naturais de organismos Por quê Dica considere o que poderia ocorrer tanto em proteínas individuais como no organismo como um todo 14 O papel dos fatores de tradução Um pesquisador isolou variantes mutantes dos fatores de transcrição bacteria nos IF2 EFTu e EFG Em cada caso a mutação permite o enovelamento apropriado da proteína e a ligação de GTP mas não permite a hidrólise do GTP Em qual etapa a tradução seria bloqueada por cada proteína mutante 15 Mantendo a fidelidade da síntese proteica Os meca nismos químicos utilizados para evitar erros na síntese proteica são diferentes daqueles utilizados durante a replicação do DNA As DNApolimerases fazem uso da atividade de edição exonu cleásica 39S59 para remover nucleotídeos pareados incorreta mente inseridos em uma fita de DNA nascente Não existe fun ção de edição análoga nos ribossomos e de fato a identidade de um aminoácido em um tRNA que chega no ribossomo e que é ligado ao polipeptídeo nascente nunca é conferida Uma etapa Nelson6ed27indd 1151 Nelson6ed27indd 1151 070414 1422 070414 1422 1152 DAVID L NELSON MICHAEL M COX de revisão que hidrolisasse a recémformada ligação peptídica depois que um aminoácido incorreto tivesse sido inserido em um polipeptídeo nascente análoga à etapa de edição das DNA polimerases não seria prática Por quê Dica Considere como a ligação entre o polipeptídeo nascente e o mRNA é mantida durante o alongamento ver Figuras 2729 e 2730 16 Deduzindo a localização celular de uma proteína O gene para um polipeptídeo eucariótico de 300 resíduos de aminoácidos é alterado de forma que a sequência sinal reco nhecida pela SRP fica na extremidade aminoterminal do po lipeptídeo e um sinal de localização nuclear NLS existe na região interna iniciando no resíduo 150 Em que local da célula essa proteína é provavelmente encontrada 17 Exigências para o transporte de proteínas através da membrana A proteína OmpA secretada por bactérias tem um precursor ProOmpA o qual tem a sequência sinal amino terminal necessária para a secreção Se a ProOmpA purificada é desnaturada com ureia 8 M e a ureia é posteriormente re movida p ex passando rapidamente a solução proteica por uma coluna de gelfiltração a proteína pode ser transportada in vitro através de membranas bacterianas internas isoladas No entanto o transporte se torna impossível se a ProOmpA for primeiro incubada por algumas horas na ausência de ureia Além disso a capacidade de transporte é mantida por um pe ríodo mais longo se a ProOmpA for antes incubada na presença de outra proteína bacteriana denominada fator de desencadea mento Descreva a provável função desse fator 18 Capacidade de codificação de proteínas de um DNA viral O genoma de 5386 pb do bacteriófago fX174 inclui ge nes para 10 proteínas designadas de A a K com os tamanhos mostrados na tabela a seguir Quanto DNA seria necessário para codificar essas 10 proteínas Como você conciliaria o ta manho do genoma do fX174 com sua capacidade de codificar proteínas Proteína Número de resíduos de aminoácidos Proteína Número de resíduos de aminoácidos A 455 F 427 B 120 G 175 C 86 H 328 D 152 I 38 E 91 J 56 Problema de análise de dados 19 Desenhando proteínas pela utilização de genes gerados ao acaso Estudos acerca das sequências de ami noácidos e das correspondentes estruturas tridimensionais de proteínas nativas e mutantes levaram a elucidações significati vas sobre os princípios que governam o enovelamento de pro teínas Uma maneira importante para testar essas ideias seria desenhar uma proteína com base nesses princípios e verificar se ela se dobra conforme esperado Kamtekar e colaboradores 1993 se basearam em aspec tos do código genético para gerar sequências aleatórias de proteínas com padrões definidos de resíduos hidrofílicos e hidrofóbicos A elegante abordagem empregada combinava o conhecimento acerca da estrutura de proteínas das proprie dades dos aminoácidos e do código genético para investigar fatores que influenciam a estrutura das proteínas Eles se propuseram a gerar um conjunto de proteínas com a estrutura simples de quatro hélices mostrada no final do pa rágrafo com hélices a mostradas como cilindros conectadas por segmentos de alças aleatórias em vermelhoclaro Cada hélice a é anfipática os grupos R de um lado da hélice são exclusivamente hidrofóbicos em amarelo e aqueles do outro lado são exclusivamente hidrofílicos em azul Seria de se es perar que uma proteína consistindo em quatro dessas hélices separadas por curtos segmentos de alças aleatórias se dobras se de forma que os lados hidrofílicos das hélices ficariam volta dos para o solvente COO2 NH3 1 1 COO2 NH3 hélice a anfipática Feixe de quatro hélices a Que forças ou interações mantêm as quatro hélices a unidas nessa estrutura A Figura 44a mostra um segmento de hélice a consistindo em 10 resíduos de aminoácidos Com o bastão central cinza atuando como um divisor quatro dos grupos R esferas púr pura se estendem a partir do lado esquerdo da hélice e seis a partir do lado direito b Numere os grupos R na Figura 44a da parte superior aminoterminal 1 para a parte inferior carboxiterminal 10 Quais grupos R se estendem a partir do lado esquerdo e quais a partir do lado direito c Suponha que você quisesse desenhar esse segmento de 10 aminoácidos a fim de montar uma hélice anfipática com o lado esquerdo hidrofílico e o lado direito hidrofóbico Forneça uma se quência de 10 aminoácidos que potencialmente se dobraria em tal estrutura Há muitas respostas corretas para esta questão d Forneça uma sequência de DNA fita dupla que poderia codificar a sequência de aminoácidos que você escolheu em c Sendo a região interna de uma proteína você não precisa incluir códons iniciadores nem de término Em vez de desenhar proteínas com sequências específi cas Kamtekar e colaboradores desenharam proteínas com sequências parcialmente aleatórias com resíduos de aminoá cidos hidrofílicos e hidrofóbicos posicionados em um padrão controlado Para isso eles utilizaram algumas características interessantes do código genético para construir uma biblioteca de moléculas de DNA sintético com sequências parcialmente aleatórias organizadas seguindo um padrão específico Para desenhar uma sequência de DNA que codificasse se quências aleatórias de aminoácidos hidrofóbicos os pesquisa dores iniciaram pelo códon degenerado NTN no qual N pode ser A G C ou T Eles preencheram cada posição N incluindo uma mistura equimolar de A G C e T na reação de síntese de DNA a fim de gerar uma mistura de moléculas de DNA com diferentes nucleotídeos nesta posição ver Figura 835 De Nelson6ed27indd 1152 Nelson6ed27indd 1152 070414 1422 070414 1422 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1153 forma semelhante para codificar sequências aleatórias de ami noácidos polares eles partiram do códon degenerado NAN e usaram uma mistura equimolar de A G e C mas nesse caso sem o T para preencher as posições N e Quais aminoácidos podem ser codificados pelo triplete NTN Nesse grupo todos os aminoácidos são hidrofóbicos O grupo inclui todos os aminoácidos hidrofóbicos f Quais aminoácidos podem ser codificados pelo triplete NAN Todos esses aminoácidos são polares O grupo inclui to dos os aminoácidos polares g Ao criar os códons NAN por que foi necessário deixar T fora da mistura de reação Kamtekar e colaboradores clonaram essa biblioteca de se quências aleatórias de DNA em plasmídeos selecionaram 48 que produziam o padrão correto de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos e os expressaram em E coli O desafio seguinte era determinar se as proteínas se dobravam conforme o esperado Seria muito demorado expressar cada proteína cristalizála e determinar a sua estrutura tridimensional completa Em vez disso os pesquisadores utilizaram a maquinaria de processa mento proteico de E coli para excluir as sequências que le vavam à produção de proteínas muito defeituosas Nessa fase seletiva inicial eles mantiveram apenas aqueles clones que resultaram em uma banda de proteínas com o peso molecular esperado na análise por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS ver Figura 318 h Por que uma proteína grosseiramente mal dobrada não formaria uma banda com o peso molecular esperado quando analisada eletroforeticamente Várias proteínas passaram nesse teste inicial e análises mais aprofundadas mostraram que elas apresentavam de fato a estrutura de quatro hélices prevista i Por que nem todas as proteínas com sequências aleató rias que passaram no primeiro teste seletivo produziram estru turas de quatro hélices Referência Kamtekar S Schiffer JM Xiong H Babik JM Hecht MH 1993 Protein design by binary patterning of polar and nonpolar amino acids Science 262 16801685 Nelson6ed27indd 1153 Nelson6ed27indd 1153 070414 1422 070414 1422 Nelson6ed27indd 1154 Nelson6ed27indd 1154 070414 1422 070414 1422 Esta página foi deixada em branco intencionalmente 281 Princípios da regulação gênica 1156 282 Regulação da expressão gênica em bactérias 1165 283 Regulação da expressão gênica em eucariotos 1175 D os aproximadamente 4000 genes no genoma bacteria no típico ou talvez dos 25000 genes no genoma huma no apenas uma fração é expressa em uma célula em dado momento Alguns produtos gênicos estão presentes em grandes quantidades os fatores de alongamento ne cessários à síntese proteica por exemplo estão entre as mais abundantes proteínas em bactérias e a ribulose15 bifosfatocarboxilaseoxigenase rubisco de plantas e bactérias fotossintéticas é até onde se sabe a enzima mais abundante na biosfera Outros produtos gênicos ocorrem em quantidades muito menores por exemplo uma célula pode conter apenas poucas moléculas de enzimas que re param lesões raras do DNA As necessidades de certos pro dutos gênicos mudam ao longo do tempo A necessidade de enzimas em certas vias metabólicas aumenta ou diminui à medida que as fontes de alimentos mudam ou se esgotam Durante o desenvolvimento de um organismo pluricelular algumas proteínas que influenciam a diferenciação celular estão presentes apenas por um breve período em apenas poucas células A especialização da função celular afeta drasticamen te a necessidade de vários produtos gênicos um exem plo é a concentração excepcionalmente elevada de uma única proteína hemoglobina em eritrócitos Dado o alto custo da síntese proteica a regulação da expressão gênica é essencial para otimizar a utilização da energia disponível A concentração celular de uma proteína é determinada pelo equilíbrio delicado de ao menos sete processos cada um tendo vários pontos de regulação potenciais 1 Síntese do transcrito de RNA primário transcrição 2 Modificação póstranscricional do mRNA 3 Degradação do RNA mensageiro 4 Síntese proteica tradução 5 Modificação póstraducional de proteínas 6 Direcionamento e transporte de proteínas 7 Degradação de proteínas Esses processos estão resumidos na Figura 281 Vários desses mecanismos foram examinados em capítulos an teriores A modificação póstranscricional do mRNA por processos como padrões alternativos de splicing ver Fi gura 2621 ou edição de RNA ver Figuras 2710 2712 pode afetar quais proteínas são produzidas a partir de um transcrito de mRNA e em que quantidades Uma variedade de sequências de nucleotídeos em um mRNA pode afetar a velocidade da sua degradação p 1084 Muitos fatores afetam a velocidade em que um mRNA é traduzido em uma proteína bem como a modificação póstraducional direcionamento e por fim degradação daquela proteína Capítulo 27 Dos processos regulatórios ilustrados na Figura 281 aqueles operando no nível da iniciação da transcrição são particularmente bem documentados Esses processos são um foco importante deste capítulo embora outros mecanis mos também sejam considerados Pesquisadores continuam a descobrir mecanismos regulatórios complexos e algumas vezes surpreendentes levando a uma crescente apreciação da importância da regulação póstranscricional e da tra dução especialmente em eucariotos Em vários genes os processos regulatórios são elaborados e redundantes e en volvem um investimento considerável de energia química O controle da iniciação da transcrição permite a regula ção sincronizada de múltiplos genes codificando produtos com atividades interdependentes Por exemplo quando seu DNA está muito danificado as células bacterianas precisam de um aumento coordenado nos níveis das muitas enzimas de reparo de DNA Talvez a forma mais sofisticada de coor denação ocorra nos complexos circuitos regulatórios que guiam o desenvolvimento dos eucariotos multicelulares e envolvem muitos tipos de mecanismos regulatórios Primeiramente são examinadas as interações entre pro teínas e DNA que são a chave para a regulação da trans crição Em seguida são abordadas as proteínas específicas que influenciam a expressão de genes específicos primeiro em células bacterianas e então em células de eucariotos Quando for relevante são incluídas informações sobre a re gulação póstranscricional e de tradução com o objetivo de fornecer uma visão geral mais completa da rica complexida de dos mecanismos regulatórios 28 Regulação da Expressão Gênica Nelson6ed28indd 1155 Nelson6ed28indd 1155 020514 1725 020514 1725 1156 DAVID L NELSON MICHAEL M COX 281 Princípios da regulação gênica Genes para produtos necessários em todos os momentos como os das enzimas das vias metabólicas centrais são ex pressos em nível mais ou menos constante em praticamen te todas as células de uma espécie ou organismo Muitas vezes esses genes são chamados de genes constitutivos housekeeping genes A expressão invariável de um gene é chamada de expressão do gene constitutivo Para outros produtos gênicos os níveis celulares au mentam e diminuem em resposta a sinais moleculares isso é a expressão gênica regulada Produtos gênicos que aumentam de concentração sob circunstâncias moleculares específicas são chamados de induzíveis o processo de au mentar sua expressão é a indução A expressão de muitos dos genes codificadores de enzimas de reparo de DNA por exemplo é induzida por um sistema de proteínas regulado ras que responde aos altos níveis de dano ao DNA Ao con trário produtos gênicos que diminuam em concentração em resposta a um sinal molecular são denominados repres síveis e o processo chamado de repressão Por exemplo em bactérias amplas fontes de triptofano levam à repressão dos genes para as enzimas que catalisam a biossíntese do triptofano A transcrição é mediada e regulada por interações pro teínaDNA especialmente aquelas envolvendo os compo nentes proteicos da RNApolimerase Capítulo 26 Primei ro será considerado como a atividade da RNApolimerase é regulada e procedese a uma descrição geral das proteínas participando nessa regulação Examinase então a base mo lecular para o reconhecimento de sequências de DNA espe cíficas por proteínas ligantes de DNA A RNApolimerase se liga ao DNA nos promotores A RNApolimerase se liga ao DNA e inicia a transcrição nos promotores ver Figura 265 sítios geralmente encontra dos perto de pontos em que a síntese de RNA começa no molde de RNA A regulação da iniciação da transcrição fre quentemente envolve alterações em como a RNApolimera se interage com um promotor As sequências de nucleotídeos de promotores variam consideravelmente afetando a afinidade de ligação das RNApolimerases e portanto a frequência de iniciação da transcrição Alguns genes de Escherichia coli são transcritos uma vez por segundo outros menos de uma vez por geração celular A maior parte dessa variação se deve a diferenças na sequência dos promotores Na au sência de proteínas regulatórias diferenças na sequência dos promotores podem afetar a frequência de iniciação da transcrição em 1000 vezes ou mais A maioria dos pro motores de E coli tem uma sequência próxima de um consenso Figura 282 Mutações que resultem em uma mudança que se afaste da sequência consenso geralmente diminuem a função do promotor ao contrário mutações na direção do consenso geralmente estimulam a função do promotor CONVENÇÃOCHAVE Por convenção as sequências de DNA são apresentadas conforme existem na fita não molde com a terminação 59 à esquerda Os nucleotídeos são numerados a partir do sítio de início da transcrição com números positi vos à direita na direção da transcrição e números negati vos à esquerda N indica qualquer nucleotídeo Embora os genes constitutivos sejam expressos cons titutivamente as concentrações celulares das proteínas DNA Gene Iniciação da transcrição Proteína Transcrito primário de RNA mRNA Proteína modificada ❶ Processamento póstranscricional ❷ Regulação da tradução ❹ Modificação da proteína ❺ Degradação de proteína Aminoácidos ❼ Transporte de proteína ❻ Estabilidade do RNA ❸ FIGURA 281 Sete processos que afetam a concentração do estado estacionário de uma proteína Cada processo tem vários pontos poten ciais de regulação TTGACA TATAAT Região 235 Região 210 N59 mRNA Sítio de início do RNA N17 Elemento UP 59 DNA FIGURA 282 Sequência consensual para vários promotores de E coli A maioria das substituições de bases nas regiões 10 e 35 tem um efeito negativo no funcionamento do promotor Alguns promoto res também incluem o elemento UP promotor a montante ver Figura 265 Nelson6edbookindb 1156 Nelson6edbookindb 1156 030414 0749 030414 0749 PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA DE LEHNINGER 1157 que eles codificam variam amplamente Para esses genes estresse chamado de resposta de choque térmico Portanto a interagaéo RNApolimerasepromotor influencia forte por meio de mudangas na afinidade de ligacao da polimera mente a velocidade de iniciacgao da transcriao diferen se que a dirigem para diferentes promotores um conjunto cas na sequéncia dos promotores permitem que a célula de genes envolvido em processos relacionados é regulado sintetize o nivel apropriado de cada produto dos genes coordenadamente Em células eucaridticas alguns dos fa constitutivos tores de transcriao gerais em particular a proteina de liga A taxa basal de iniciagaéo da transcrigao nos promoto ao TATA TBP ver Figura 269 podem ser considerados res dos genes constitutivos também é determinada pela como fatores de especificidade sequéncia dos promotores mas a expressao desses genes Os repressores se ligam a sitios especificos no DNA Em é modulada adicionalmente por proteinas regulatorias Mui células bacterianas tais sitios de ligagao chamados opera tas dessas proteinas operam estimulando ou interferindo na dores estao geralmente proximos de um promotor A liga interacao entre a RNApolimerase e o promotor cao da RNApolimerase ou seu movimento ao longo do DNA As sequéncias dos promotores eucaridticos 6 mais va apos sua ligacao a ele é bloqueada quando o repressor esta ridvel do que a dos seus correspondentes bacterianos ver presente A regulacao pela proteina repressora que bloqueia Figura 268 As trés RNApolimerases eucaridticas geral a transcricao é chamada de regulacaéo negativa A liga mente precisam de uma série de fatores de transcrigao ge ao do repressor ao DNA 6 regulada por um sinal molecu rais para se ligar a um promotor lar ou efetor geralmente uma molécula pequena ou uma Contudo como na expressao génica bacteriana o nivel proteina que se liga ao repressor e provoca uma mudan basal de transcricao é determinado pelo efeito das sequén a conformacional A interagéo entre repressor e molécula cias promotoras no funcionamento da RNApolimerase e sinalizadora aumenta ou diminui a transcricao Em alguns seus fatores de transcrigao apropriados casos a mudanga conformacional resulta na dissociagao de um repressor ligado ao DNA do operador Figura 284a Ainiciacao da transcricdo é regulada por proteinas que A iniciagao da transcrigao pode entao proceder sem ts obstaculos Em outros casos a interagao entre um repres se ligam aos promotores ou que estao proximas deles sor inativo e a molécula sinalizadora leva o repressor a se Pelo menos trés tipos de proteinas regulam a iniciagaéo da ligar ao operador Figura 284b Nas células eucarioticas transcrigao pela RNApolimerase fatores de especifi 0 sitio de ligagao para um repressor pode se encontrar a cidade alteram a especificidade da RNApolimerase para alguma distancia do promotor A ligacao desses represso um determinado promotor ou conjuntos de promotores re res aos seus sitios de ligagao tem 0 mesmo efeito que em pressores impedem 0 acesso da RNApolimerase ao pro células bacterianas inibir a montagem ou atividade de um motor e os ativadores estimulam a interacao RNApolime complexo de transcricgaéo no promotor Os ativadores for rasepromotor necem um contraponto molecular aos repressores eles se Os fatores de especificidade bacterianos foram apresen ligam ao DNA e estimulam a atividade da RNApolimerase tados no Capitulo 26 ver Figura 265 embora nao tenham em um promotor tratase da regulacao positiva Em sido referidos pelo nome A subunidade o da holoenzima bactérias muitas vezes os sitios de ligaco ativadores sao RNApolimerase de E cola um fator de especificidade que adjacentes aos promotores ligados fracamente ou nao liga controla o reconhecimento e a ligagao do promotor Amaio dos a RNApolimerase isolada de modo que ocorre pouca ria dos promotores de E colz 6 reconhecida por uma Unica transcrico na auséncia do ativador Muitos ativadores eu subunidade o IM 70000 a Sob certas condicées algu caridticos se ligam aos sitios de DNA chamados potencia mas das subunidades o so substituidas por um de seis dores enhancers que estao muito distantes do promo outros fatores de especificidade Um caso notavel surge tor Esses ativadores afetam a taxa de transcricao em um quando as bactérias sao submetidas ao estresse por calor promotor que pode estar localizado a milhares de pares de levando substituicao de a por 0 WM 32000 bases de distancia Quando ligada a a a RNApolimerase é direcionada Alguns ativadores sao geralmente ligados ao DNA es a um conjunto especializado de promotores com uma se timulando a transcricao até que a dissociacao do ativador quéncia consensual diferente Figura 283 Esses pro seja disparada pela ligacao de uma molécula sinalizadora motores controlam a expressao de um conjunto de genes Figura 284c Em outros casos o ativador se liga ao DNA que codificam proteinas incluindo algumas proteinas cha apenas apos a interagéo com uma molécula sinalizadora peronas p 146 que sAo parte de um sistema induzido por Figura 284d Moléculas sinalizadoras podem portanto Sitio de inicio do RNA mRNA DNA Dre FIGURA 283 Sequéncia consensual para promotores que regulam a expressao de ge nes de choque térmico de E coli Este sistema responde a aumentos de temperatura bem como a outros estresses ambientais resultando na indugao de um conjunto de proteinas A liga ao da RNApolimerase aos promotores do choque térmico é mediada por uma subunidade ao da polimerase especializada ao que substitui 7 no complexo de iniciacdo da RNApolimerase 1158 DAVID L NELSON MICHAEL M COX aumentar ou diminuir a transcrição dependendo de como elas afetam o ativador A regulação positiva é particular mente comum em eucariotos como será visto Em eucariotos a distância entre os sítios de ligação de ativadores ou repressores e promotores é superada fazendo alças looping no DNA entre eles Figura 285 O pro cesso de looping é facilitado em alguns casos por proteínas chamadas reguladores arquitetônicos que se ligam a sí tios de intervenção e facilitam o looping do DNA A maioria dos sistemas eucarióticos envolve ativadores de proteínas A interação atual entre ativadores e a RNApolimerase no promotor é frequentemente mediada por proteínas inter mediárias chamadas coativadores Em alguns casos repres sores proteicos podem tomar o lugar de coativadores ligan dose aos ativadores e impedindo a interação ativadora Muitos genes bacterianos são reunidos e regulados em óperons As bactérias têm um mecanismo geral simples para coorde nar a regulação de genes que codificam produtos que par a Regulação negativa Sinal molecular provoca a dissociação do repressor do DNA induzindo a transcrição Promotor DNA Repressor Operador Repressor Sinal molecular mRNA mRNA mRNA mRNA DESLI GADO DESLI GADO LIGADO LIGADO b Regulação negativa Sinal molecular provoca a ligação do repressor ao DNA inibindo a transcrição Sinal molecular c Regulação positiva Sinal molecular provoca a dissociação do ativador do DNA inibindo a transcrição d Regulação positiva Sinal molecular provoca a ligação do ativador ao DNA induzindo a transcrição Ativador Sinal molecular Sinal molecular RNA polimerase LIGADO Ativador Sítio de ligação do ativador DESLI GADO DESLI GADO LIGADO Operator FIGURA 284 Padrões comuns de regulação da iniciação da trans crição Dois tipos de regulação negativa são ilustrados a O repressor se liga ao operador na ausência do sinal molecular o sinal externo provoca a dissociação do repressor para permitir a transcrição b O repressor se liga na presença do sinal o repressor se dissocia e a transcrição acontece quando o sinal é removido A regulação positiva é mediada pelos ativa dores do gene Novamente dois tipos são mostrados c O ativador se liga na ausência do sinal molecular e a transcrição prossegue quando o sinal é adicionado o ativador se dissocia e a transcrição é inibida d O ativador se liga na presença do sinal ele se dissocia apenas quando o sinal é removido Observe que as regulações positiva e negativa se referem ao tipo de proteína regulatória envolvida a proteína ligada ou facilita ou inibe a transcrição Em qualquer um dos casos a adição de um sinal mo lecular aumenta ou diminui a transcrição dependendo do seu efeito na proteína regulatória Regulador da arquitetura Recrutamento Ativador Promotor Sítio de ligação regulador da arquitetura 39 59 Coativador 39 59 39 59 LIGADO Pol II FIGURA 285 A interação entre ativadoresrepressores e a RNA polimerase em eucariotos Com frequência os ativadores e repressores eucarióticos se ligam a sítios a milhares de pares de bases de distância dos promotores que eles regulam Alças de DNA muitas vezes facilitadas por re guladores de arquitetura colocam esses sítios em contato A interação entre ativadores e a RNApolimerase é frequentemente mediada por coativadores como mostrado A repressão é algumas vezes mediada por repressores des critos posteriormente que se ligam a ativadores impedindo assim a intera ção ativadora com a RNApolimerase Nelson6edbookindb 1158 Nelson6edbookindb 1158 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1159 ticipam em um conjunto de processos relacionados esses genes estão reunidos no cromossomo e são transcritos jun tos Muitos mRNA bacterianos são policistrônicos múlti plos genes em um único transcrito e o único promotor que inicia a transcrição do grupo de genes é o local de regulação para a expressão de todos os genes no grupo O grupo de genes e o promotor acrescido de sequências adicionais que funcionam juntas na regulação são chamados de óperons Figura 286 Óperons que incluem dois a seis genes transcritos como uma unidade são comuns alguns óperons contêm 20 ou mais genes Muitos dos princípios da expressão dos genes bacte rianos foram definidos pela primeira vez por estudos do metabolismo da lactose em E coli que pode usar lactose como sua única fonte de carbono Em 1960 François Jacob e Jacques Monod publicaram um breve artigo no periódico Proceedings da Academia Francesa de Ciências descre vendo como dois genes adjacentes envolvidos no metabo lismo da lactose eram regulados coordenadamente por um elemento genético localizado em uma extremidade do grupo de genes Os genes eram os da bgalactosidase que quebra a lactose em galactose e glicose e os da galactosídeoperme ase lactosepermease p 416 que transporta lactose para o interior da célula Figura 287 Os termos óperon e operador foram introduzidos pela primeira vez nesse arti go Com o modelo óperon a regulação gênica poderia pela primeira vez ser considerada em termos moleculares François Jacob 19202013 Jacques Monod 19101976 O óperon lac está sujeito à regulação negativa O óperon da lactose lac Figura 288a inclui os genes para bgalactosidase Z galactosídeopermease Y e tioga lactosídeotransacetilase A A última dessas enzimas parece modificar os galactosídeos tóxicos para facilitar sua remoção da célula Cada um dos três genes é precedido por um sítio de ligação de ribossomos não mostrado na Figura 288 que direciona independentemente a tradução daquele gene Capí tulo 27 A regulação do lac óperon pela proteína repressora do lac Lac segue o padrão destacado na Figura 284a O estudo dos mutantes lac óperon revelou alguns de talhes das atividades do sistema regulatório óperon Na ausência de lactose os genes lac óperon são reprimidos Mutações no operador ou em outro gene o gene I resul tam na síntese constitutiva de produtos gênicos Quando o gene I está defeituoso a repressão pode ser restaurada introduzindose um gene I funcional na célula em outra molécula de DNA demonstrando que o gene I codifica uma molécula difusível que provoca a repressão gênica Foi demonstrado que essa molécula é uma proteína agora chamada de repressor Lac um tetrâmero de monômeros idênticos O operador ao qual ela se liga mais fortemente O1 é adjacente do sítio de início da transcrição Figura 288a O gene I é transcrito a partir do seu próprio pro motor PI independente dos genes óperon lac O óperon DNA Promotor Sítio de ligação do ativador Sítio de ligação do repressor Sequências regulatórias Genes transcritos como uma unidade A C B Operador FIGURA 286 Óperon de bactérias representativo Genes A B e C são transcritos em um mRNA policistrônico Sequências regulatórias típicas in cluem sítios de ligação para proteínas que ativam ou reprimem a transcrição a partir do promotor CH2OH Membrana plasmática Espaço extracelular Citoplasma Lactose Lactose Galactosídeolactosepermease CH2OH H H H H H O O OH OH HO H H H H H O OH OH OH CH2OH H H H H H O O OH OH HO CH2 HO H H H H O OH OH H OH CH2OH H2O Isomerização Hidrólise H H H Galactose Glicose Alolactose bgalactosidase H H O 1 OH OH HO HO OH CH2OH H H H H H O OH OH OH FIGURA 287 Metabolismo da lactose em E coli O consumo e o me tabolismo de lactose precisam das atividades da galactosídeolactoseper mease e bgalactosidase A conversão da lactose em alolactose por transgli cosilação é uma reação secundária também catalisada pela bgalactosidase Nelson6edbookindb 1159 Nelson6edbookindb 1159 030414 0749 030414 0749 1160 DAVID L NELSON MICHAEL M COX lac tem dois sítios de ligação secundários para o repres sor Lac Um O2 está centralizado próximo da posição 1410 no interior do gene que codifica a bgalactosidase Z o outro O3 está próximo da posição 90 dentro do gene I Para reprimir o óperon o repressor Lac parece se ligar tanto ao operador principal quanto a um de dois sí tios secundários com o DNA interveniente removido por looping Figura 288b c Qualquer uma das duas liga ções bloqueia a iniciação da transcrição Apesar desse elaborado complexo de ligação a repres são não é absoluta A ligação do repressor Lac reduz a velo cidade de iniciação de transcrição em 10 3 vezes Se os sítios O2 e O3 forem eliminados por deleção ou mutação apenas a ligação do repressor a O1 reduz a transcrição em cerca de 10 2 vezes Mesmo no estado reprimido cada célula tem al gumas poucas moléculas de bgalactosidase e galactosídeo permease presumivelmente sintetizadas nas raras ocasiões em que o repressor se dissocia dos operadores Esse nível basal de transcrição é essencial para a regulação do óperon Quando as células recebem lactose o óperon lac é induzido Uma molécula indutora sinal se liga a um sítio específico no repressor Lac provocando uma alteração conformacio nal que resulta na dissociação do repressor do operador O indutor no sistema óperon lac não é a própria lactose mas a alolactose um isômero da lactose Figura 287 Depois de entrar na célula de E coli por meio das poucas molé culas de lactosepermease existentes a lactose é converti da em alolactose por uma das poucas moléculas existentes de bgalactosidase A liberação do operador pelo repressor Lac disparada à medida que o repressor se liga à alolactose permite a expressão dos genes do óperon lac e leva a um aumento de 10 3 vezes na concentração de bgalactosidase Vários bgalactosídeos relacionados estruturalmente à alolactose são indutores do óperon lac mas não são subs tratos para a bgalactosidase outros são substratos mas não indutores Um indutor muito eficaz e não metabolizável do óperon lac frequentemente usado de modo experimen tal é o isopropiltiogalactosídeo IPTG C CH2 CH3 H CH3 OH OH O H OH H H OH S H H IsopropilbDtiogalactosídeo IPTG Um indutor que não pode ser metabolizado permite que os pesquisadores explorem a função fisiológica da lactose como uma fonte de carbono para o crescimento separada da sua função na regulação da expressão gênica Além da infinidade de óperons agora conhecidos em bactérias al guns poucos óperons policistrônicos foram encontrados nas células de eucariotos inferiores Nas células dos eucariotos superiores entretanto quase todos os genes codificadores de proteínas são transcritos separadamente Os mecanismos pelos quais os óperons são regulados podem variar significativamente do modelo simples apre sentado na Figura 288 Mesmo o óperon lac é mais com plexo do que indicado aqui com um ativador contribuindo também para o esquema geral como será visto na Seção 282 Antes de qualquer discussão adicional sobre os níveis de regulação da expressão gênica entretanto serão exami nadas as interações moleculares críticas entre as proteínas de ligação do DNA tais como repressores e ativadores e as sequências de DNA às quais elas se ligam Proteínas regulatórias têm domínios separados de ligação de DNA As proteínas regulatórias geralmente se ligam a sequências de DNA específicas Sua afinidade por essas sequências alvo é de aproximadamente 10 4 a 10 6 vezes maior que sua afinidade por qualquer outra sequência de DNA A maio lac lac lac O1 O3 O2 O3 lacZ lacY lacA P P P lacZ O2 O1 a b c 39 59 59 39 59 39 59 39 lacZ lacY lacA lacY lacA O1 O3 59 39 O2 P P P FIGURA 288 O óperon lac a O óperon lac O gene lacI codifica o re pressor Lac Os genes lac Z Y e A codificam bgalactosidase galactosídeo permease e tiogalactosídeotransacetilase respectivamente P é o promotor dos genes lac e PI é o promotor do gene I O1 é o operador principal do óperon lac O2 e O3 são sítios operadores secundários de menos afinidade pelo repressor Lac A repetição invertida a que o repressor Lac se liga em O1 é mostrada no detalhe b O repressor Lac se liga ao operador principal e a O2 ou O3 aparentemente formando uma alça no DNA c PDB ID 2PE5 O repressor Lac cor salmão é mostrado ligado a segmentos de DNA descontí nuos e curtos azul e cor de laranja Nelson6edbookindb 1160 Nelson6edbookindb 1160 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1161 ria das proteínas regulatórias apresenta distintos domínios de ligação de DNA contendo subestruturas que interagem estreita e especificamente com o DNA Esses domínios de ligação geralmente incluem um ou mais membros de um grupo relativamente pequeno de motivos estruturais carac terísticos e reconhecíveis Para se ligarem especificamente a sequências de DNA as proteínas regulatórias devem reconhecer características da superfície do DNA A maioria dos grupos químicos que diferem entre as quatro bases e portanto permitem a dis tinção entre pares de bases consiste em grupos doadores e aceptores de ligações de hidrogênio expostos no sulco maior do DNA Figura 289 e a maior parte dos conta tos proteínaDNA que conferem especificidade consiste em ligações de hidrogênio Uma exceção notável é a superfície não polar próxima do C5 de pirimidinas onde a timina é prontamente distinguida da citosina pelo seu grupo metil protuberante Os contatos proteínaDNA também são pos síveis no sulco menor do DNA mas os padrões de ligações de hidrogênio aqui geralmente não permitem uma pronta distinção entre os pares de bases No interior de proteínas regulatórias as cadeias laterais de aminoácidos com ligações de hidrogênio mais frequentes com as bases no DNA são aquelas de resíduos de Asn Gln Glu Lys e Arg Haverá um código de reconhecimento sim ples em que um aminoácido particular sempre pareie com uma base específica As duas ligações de hidrogênio que podem se formar entre Gln ou Asn e as posições N 6 e N7 da adenina não podem se formar com qualquer outra base E um resíduo de Arg pode formar duas ligações de hidro gênio com N7 e O 6 da guanina Figura 2810 O exame da estrutura de muitas proteínas de ligação do DNA entre tanto mostrou que uma proteína pode reconhecer cada par de bases em mais de uma maneira levando à conclusão de que não há um código de aminoácidos simples Em algumas proteínas a interação Glnadenina especifica pares de ba ses AT mas em outras uma bolsa de van der Waals para o a b O O N H H H H H H N H H H H O N O N N H H H H H CH3 A A T T G G C C N N N N N N N N N N N N O N N O N N N H O N O N N N N N H H A T H Sulco maior Sulco maior Sulco menor Sulco menor Sulco maior Sulco maior A T G C G C T A T A C G C G Aceptor de ligações H Doador de ligações H Outros H Grupo metil Sulco menor Sulco menor Sulco menor Sulco maior N N H H3C Adenina Timina Timina Adenina Guanina Citosina Citosina Guanina FIGURA 289 Grupos no DNA disponíveis para ligação com proteí nas a Aqui são mostrados grupos funcionais em todos os quatro pares de bases exibidos nos sulcos maior e menor do DNA ver Figura 813 Átomos aceptores e doadores de ligações de hidrogênio são marcados por discos azuis ou vermelhos respectivamente Outros átomos de hidrogênio são mar cados com discos roxos e grupos metil com discos amarelos b Padrões de reconhecimento para cada par de bases da esquerda para a direita são re sumidos na parte de baixo A variação muito maior em padrões para o sulco maior dá origem a um poder diferenciador muito maior no sulco maior em relação ao sulco menor N N N N N C CH3 CH2 H H H O N N H N 7 6 H N N O 1 N N C C NH CH2 CH2 CH2 H R N H H H O H N N N N H N H 7 6 H H O O Glutamina ou asparagina Arginina CH2 C H H O R9 N C R C H H O R9 N Timina Adenina Citosina Guanina FIGURA 2810 Interações específicas entre resíduos de aminoácidos e pares de bases Os dois exemplos mostrados foram observados na liga ção proteínaDNA Nelson6edbookindb 1161 Nelson6edbookindb 1161 030414 0749 030414 0749 1162 DAVID L NELSON MICHAEL M COX grupo metila da timina reconhece pares de bases AT Os pesquisadores ainda não conseguem examinar a estrutura de uma proteína de ligação do DNA e inferir a sequência de DNA à qual ela se liga A fim de interagir com as bases no sulco maior do DNA uma proteína precisa de uma subestrutura relativamente pequena que possa protrair de modo estável a partir da su perfície da proteína Os domínios de ligação de DNA das proteínas regulatórias tendem a ser pequenos 60 a 90 re síduos de aminoácidos e ainda menores os motivos estru turais no interior desses domínios que estão na verdade em contato com o DNA Muitas proteínas pequenas são instá veis devido à sua capacidade limitada de formar camadas de estrutura para ocultar os grupos hidrofóbicos p 116 Os motivos de ligação do DNA fornecem ou uma estrutura estável muito compacta ou uma maneira de permitir que um segmento de proteína se projete a partir da superfície da proteína Os sítios de ligação do DNA para proteínas regulatórias são frequentemente repetições invertidas de uma pequena sequência de DNA palíndromo em que múltiplas geral mente duas subunidades de uma proteína regulatória se ligam cooperativamente O repressor Lac é incomum pelo fato de funcionar como tetrâmero com dois dímeros uni dos presos na extremidade distante dos sítios de ligação do DNA Figura 288b Uma célula de E coli geralmente contém cerca de 20 tetrâmeros do repressor Lac Cada um dos dímeros unidos se liga separadamente a uma sequên cia operadora palindrômica em contato com 17 pb de uma região com 22 pb no óperon lac E cada um dos dímeros unidos pode se ligar independentemente a uma sequência operadora com um geralmente se ligando a O1 e o outro a O2 ou O3 como na Figura 288b A simetria da sequência operadora O1 corresponde ao eixo duplo de simetria das duas subunidades repressoras do Lac pareadas O repres sor tetramérico do Lac se liga às sequências do seu opera dor in vivo com uma constante de dissociação estimada em cerca de 10 10 M O repressor diferencia os operadores de outras sequências com uma diferença de cerca de 10 6 de modo que a ligação a esses poucos pares de bases entre os cerca de 46 milhões do cromossomo de E coli é alta mente específica Vários motivos de ligação do DNA foram descritos mas aqui serão focalizados dois que desempenham papéis de destaque na ligação do DNA por proteínas regulatórias a hélicevoltahélice e o dedo de zinco Também será abordado um tipo de domínio de ligação do DNA o ho meodomínio encontrado em algumas proteínas de eu cariotos Hélicevoltahélice Esse motivo de ligação do DNA é crucial para a interação de muitas proteínas regulatórias bacteria nas com o DNA e motivos semelhantes ocorrem em algu mas proteínas regulatórias de eucariotos O motivo hélice voltahélice compreende cerca de 20 aminoácidos em dois segmentos curtos a helicoidais cada um com sete a nove resíduos de aminoácidos de comprimento separados por uma volta b Figura 2811 Essa estrutura geralmente não é estável por si só ela é simplesmente a porção reativa de um domínio de ligação do DNA um pouco maior Um dos dois segmentos helicoidais é chamado de hélice de reco nhecimento pois geralmente contém muitos dos aminoá cidos que interagem com o DNA de um modo específico da sequência Essa hélice a é empilhada em outros segmentos da estrutura proteica de modo a se projetar a partir da su perfície da proteína Quando ligada ao DNA a hélice de re conhecimento é posicionada no sulco principal ou próxima a ele O repressor Lac apresenta seu motivo de ligação do DNA Figura 2811 Dedo de zinco Em um dedo de zinco cerca de 30 resíduos de aminoácidos formam uma alça alongada unida na base por um único íon Zn 21 coordenado a quatro dos resíduos quatro Cys ou dois Cys e dois His Por si só o zinco não interage com o DNA em vez disso a coordenação do zin co com os resíduos de aminoácidos estabiliza esse pequeno motivo estrutural Várias cadeias laterais hidrofóbicas no núcleo da estrutura também fornecem estabilidade A Fi gura 2812 mostra a interação entre o DNA e três dedos de zinco de um único polipeptídeo da proteína regulatória do camundongo Zif268 Muitas proteínas de ligação de DNA de eucariotos con têm dedos de zinco Em geral a interação de um único dedo de zinco com o DNA é fraca e muitas proteínas de ligação do DNA como a Zif268 apresentam múltiplos de dos de zinco que estimulam substancialmente a ligação ao interagir simultaneamente com o DNA Uma proteína de a b Domínio de ligação de DNA Hélice Hélice de reconhecimento de DNA Volta Hélices ligadoras a Hélices envolvidas na formação do tetrâmero FIGURA 2811 Hélicevoltahélice PDB ID 2PE5 a Domínio de ligação de DNA do repressor Lac ligado ao DNA azul e cor de laranja O motivo hélicevoltahélice é mostrado em azulescuro e roxo a hélice de reconheci mento do DNA é roxa b Repressor Lac inteiro Os domínios de ligação de DNA estão em azulclaro e as hélices a envolvidas na formação do tetrâmero estão em verde O restante da proteína tons de vermelho tem os sítios de ligação para a alolactose Os domínios de ligação da alolactose estão ligados aos domínios de ligação de DNA por meio de hélices ligadoras amarelo Nelson6edbookindb 1162 Nelson6edbookindb 1162 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1163 ligação do DNA da rã Xenopus tem 37 dedos de zinco Há poucos exemplos conhecidos do motivo dedo de zinco em proteínas bacterianas O modo preciso pelo qual proteínas com dedos de zinco se ligam ao DNA difere de uma proteína para outra Alguns dedos de zinco contêm resíduos de aminoácidos importan tes na diferenciação de sequências enquanto outros pare cem se ligar ao DNA de modo não específico os aminoáci dos necessários para a especificidade estão localizados em outra parte da proteína Os dedos de zinco também funcio nam como motivos de ligação do DNA por exemplo em certas proteínas que ligam o mRNA de eucariotos e atuam como repressores da tradução Esse papel será discutido posteriormente Seção 283 Homeodomínio Outro tipo de domínio de ligação do DNA foi identificado em algumas proteínas que funcionam como reguladores de transcrição especialmente durante o de senvolvimento de eucariotos Esse domínio de aminoácidos chamado de homeodomínio porque foi descoberto em genes homeóticos genes que regulam o desenvolvimento de padrões corporais é altamente conservado e foi agora identificado em proteínas de uma grande variedade de or ganismos incluindo humanos Figura 2813 O segmento de ligação de DNA do domínio está relacionado ao motivo hélicevoltahélice A sequência de DNA que codifica esse domínio é conhecida como homeobox Proteínas regulatórias também têm domínios de interação proteínaproteína Proteínas regulatórias contêm domínios não apenas para a ligação do DNA mas também para interações proteína proteína com a RNApolimerase outras proteínas regu latórias ou outras subunidades da mesma proteína regula tória Exemplos incluem muitos fatores de transcrição de eucariotos que funcionam como ativadores de genes fre quentemente ligado como dímeros ao DNA pelos domínios de ligação do DNA que contêm dedos de zinco Alguns do mínios estruturais são dedicados às interações necessárias à formação de dímeros geralmente um prérequisito para a ligação do DNA Como os motivos de ligação do DNA os motivos estruturais que controlam as interações proteína proteína tendem a pertencer a algumas categorias comuns Dois exemplos importantes são o zíper de leucina e héli cealçahélice básica Motivos estruturais como esses são a base para classificar algumas proteínas regulatórias em famílias estruturais Zíper de leucina Esse motivo é uma hélice a anfipática com uma série de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos concentrados de um lado Figura 2814 com a superfí cie hidrofóbica formando a área de contato entre os dois polipeptídeos de um dímero Uma característica marcan te dessas hélices a é a ocorrência de resíduos Leu a cada sétima posição formando uma linha reta ao longo da su perfície hidrofóbica Embora os pesquisadores inicialmente pensassem que os resíduos de leucina interdigitavam daí o nome zíper agora se sabe que eles se alinham lado a lado à medida que as hélices a que interagem se enrolam uma em torno da outra formando uma espiral espiralada Figura 2814b Proteínas regulatórias com zíperes de leu cina frequentemente têm um domínio de ligação de DNA separado com alta concentração de resíduos básicos Lys ou Arg que podem interagir com os fosfatos carregados negativamente do esqueleto do DNA Os zíperes de leucina foram encontrados em muitas proteínas de eucariotos e em algumas proteínas bacterianas Hélicealçahélice básica Outro motivo estrutural comum ocorre em algumas proteínas regulatórias de eucariotos implicadas no controle da expressão gênica durante o de senvolvimento de organismos pluricelulares Essas proteí nas compartilham uma região conservada de cerca de 50 resíduos de aminoácidos importante tanto na ligação de DNA quanto na dimerização de proteínas Essa região for ma duas a hélices anfipáticas ligadas por uma alça de com primento variável a hélicealçahélice distinta do motivo Motivo dedo de zinco Zn2 Zn2 Zn2 His Cys Motivo dedo de zinco Motivo dedo de zinco FIGURA 2812 Dedos de zinco PDB ID 1ZAA Três dedos de zinco tons de vermelho da proteína regulatória Zif268 complexada com o DNA azul Cada Zn 21 coordena com duas His e dois resíduos de Cys Hélice de reconhecimento Hélice Volta FIGURA 2813 Homeodomínios PDB ID 1FJL São mostrados aqui dois homeodomínios ligados ao DNA Em cada homeodomínio uma das a héli ces roxo depositada em duas outras azulescuro e cinza pode ser vista protraindo para o sulco maior Isso é apenas uma pequena parte de uma proteína regulatória maior de uma classe chamada Pax ativa na regulação do desenvolvimento em moscasdafruta ver Seção 283 Nelson6edbookindb 1163 Nelson6edbookindb 1163 030414 0749 030414 0749 1164 DAVID L NELSON MICHAEL M COX hélicevoltahélice associado à ligação do DNA Os motivos hélicealçahélice de dois polipeptídeos interagem para for mar dímeros Figura 2815 Nessas proteínas a ligação do DNA é mediada por uma sequência adjacente curta de aminoácidos rica em resíduos básicos semelhante à região de ligação de DNA separada nas proteínas que contêm zí peres de leucina Interações proteínaproteína em proteínas regulatórias de eucario tos Em eucariotos a maioria dos genes é regulada por ativadores e a maioria deles é monocistrônica Se um ativa dor diferente fosse necessário para cada gene o número de ativadores e de genes que os codificam teria de ser equi valente ao número de genes regulados Entretanto em le veduras cerca de 300 fatores de transcrição muitos deles ativadores são responsáveis pela regulação de muitos mi lhares de genes de leveduras Muitos dos fatores de trans crição regulam a indução de genes múltiplos mas a maioria dos genes está sujeita à regulação por múltiplos fatores de transcrição A regulação apropriada de diferentes genes é feita utilizando diferentes combinações de um repertório limitado de fatores de transcrição em cada gene fenômeno chamado de controle combinatorial O controle combinatório é realizado em parte misturan dose e combinando as variantes no interior da família de proteínas reguladoras para formar uma série de diferentes dímeros de proteínas ativas Várias famílias de fatores de transcrição de eucariotos foram definidas com base em se melhanças estruturais estreitas Dentro de cada família dí meros podem às vezes se formar entre duas proteínas idên ticas homodímero ou entre dois membros diferentes da família heterodímero Portanto uma família hipotética de quatro proteínas zíper de leucina diferentes forma até 10 es pécies diméricas diferentes Em muitos casos as diferentes combinações têm propriedades funcionais e regulatórias dis tintas e funcionam na regulação de diferentes genes Como será visto as proteínas regulatórias múltiplas desse tipo funcionam na regulação da maioria dos genes de eucariotos contribuindo adicionalmente para o controle combinatorial b a Asn invariável Região de zíper Região de ligação de DNA Fonte Proteína regulatória Sequência de aminoácidos Mamíferos CEBP Jun Fos GCN4 Região de ligação do DNA Conector 6 aminoácidos Zíper de leucina Leveduras Sequências de consenso b Região de zíper de o de DNA FIGURA 2814 Zíperes de leucina a Comparação de sequências de aminoácidos de várias proteínas zíper de leucina Observe os resíduos de Leu L vermelho a cada sé tima posição na região do zíper e o número de resíduos de Lys K e Arg R na região de ligação do DNA amarelo b PDB ID 1YSA Zíper de leucina da proteína GCN4 ativado ra de leveduras Apenas as hélices zippered cinza derivadas de diferentes subunidades da proteína dimérica são mostradas As duas hélices se enrolam uma em torno da outra em uma espiral suave As cadeias laterais de Leu e os resíduos conservados na região de ligação de DNA são coloridos para corres ponderem à sequência em a Hélice de reconhecimento Hélice formadora de dímeros Alça FIGURA 2815 Hélicealçahélice PDB ID 1HLO O fator de transcrição humano Max ligado ao seu sítioalvo no DNA A proteína é dimérica uma subunidade é colorida A hélice de reconhecimento corderosa é ligada pela alça à hélice formadora de dímeros azulclaro que se funde à extremi dade carboxila terminal da subunidade A interação das hélices da carboxila terminal das duas subunidades apresenta uma espiral muito semelhante àquela de um zíper de leucina ver Figura 2814b mas com apenas um par de resíduos de Leu que interagem cadeias laterais vermelhas à direita nesse exemplo A estrutura geral é algumas vezes chamada de hélicealçahélice motivo de zíper de leucina Nelson6edbookindb 1164 Nelson6edbookindb 1164 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1165 Além de ter domínios estruturais destinados à ligação de DNA e dimerização que direciona um dímero protei co em particular a um gene específico muitas proteínas regulatórias têm domínios que interagem com a RNApo limerase com proteínas regulatórias não relacionadas ou com ambas Pelo menos três tipos de domínios adicionais para interação proteínaproteína foram caracterizados principalmente em eucariotos domínios ricos em gluta mina domínios ricos em prolina e domínios ácidos os no mes refletindo os resíduos de aminoácidos especialmente abundantes Interações de ligações proteínaDNA são a base dos in tricados circuitos regulatórios fundamentais ao funciona mento dos genes Agora será realizado um exame mais de talhado dos esquemas regulatórios desses genes primeiro em bactérias e depois em sistemas eucarióticos RESUMO 281 Princípios da regulação gênica c A expressão dos genes é regulada por processos que afetam as taxas em que os produtos gênicos são sinte tizados e degradados A maior parte dessa regulação ocorre no nível da iniciação da transcrição mediada por proteínas regulatórias que ou reprimem a transcrição regulação negativa ou ativam a transcrição regulação positiva em promotores específicos c Em bactérias os genes que codificam produtos com funções interdependentes são frequentemente agru pados em um óperon unidade única de transcrição A transcrição dos genes geralmente é bloqueada pela liga ção de uma proteína repressora específica em um sítio de DNA chamado de operador A dissociação do repres sor do operador é mediada por uma molécula específica pequena um indutor Esses princípios foram primeiro elucidados em estudos do óperon da lactose lac O repressor Lac se dissocia do operador lac quando o re pressor se liga ao seu indutor a alolactose c As proteínas regulatórias são proteínas de regulação do DNA que reconhecem sequências de DNA específicas a maioria tem domínios de ligação do DNA distintos No interior desses domínios os motivos estruturais comuns que se ligam ao DNA são a hélicevoltahélice o dedo de zinco e o homeodomínio c Proteínas regulatórias também contêm domínios para interações proteínaproteína incluindo o zíper de leu cina e a hélicealçahélice que estão envolvidos na di merização e outros motivos envolvidos na ativação da transcrição A mistura e a combinação de variantes de famílias de proteínas em fatores de transcrição diméri cos fornecem uma regulação de resposta mais eficiente por meio do controle combinatório 282 Regulação da expressão gênica em bactérias Como em muitas outras áreas de investigação bioquímica o estudo da regulação da expressão gênica avançou mais cedo e mais rápido em bactérias do que em outros orga nismos experimentais Os exemplos de regulação gênica bacteriana aqui apresentados são escolhidos entre os valo res de sistemas bem estudados parcialmente devido ao seu significado histórico mas principalmente porque fornecem uma boa visão geral da amplitude de mecanismos regulató rios em bactérias Muitos dos princípios da regulação gênica bacteriana também são relevantes para compreender a ex pressão gênica em células eucarióticas Primeiramente serão examinados os óperons da lactose e triptofano cada sistema apresenta proteínas regulatórias mas os mecanismos gerais de regulação são muito diferen tes Depois será feita uma pequena discussão da resposta SOS em E coli ilustrando como genes espalhados por todo o genoma podem ser regulados coordenadamente Então serão descritos dois sistemas bacterianos de tipos muito di ferentes ilustrando a diversidade dos mecanismos regula tórios dos genes a regulação da síntese proteica ribossomal no nível da tradução com muitas das proteínas regulatórias se ligando ao RNA em vez de ao DNA e a regulação do processo de variação de fase em Salmonella que resul ta da recombinação gênica Finalmente serão examinados alguns exemplos adicionais de regulação póstranscricional em que o RNA modula sua própria função O óperon lac sofre regulação positiva As interações operadorrepressorindutor descritas inicial mente para o óperon lac Figura 288 fornecem um mo delo intuitivamente satisfatório para um interruptor ligado desligado na regulação da expressão gênica Na verdade a regulação do óperon é raramente tão simples O ambiente de uma bactéria é complexo demais para que seus genes sejam controlados por um sinal Outros fatores além da lac tose afetam a expressão dos genes lac tais como a dispo nibilidade de glicose Esta metabolizada diretamente pela glicólise é a fonte de energia preferida em E coli Outros açúcares podem servir como único nutriente principal mas etapas enzimáticas extras são necessárias para preparálos para entrar na glicólise precisando da síntese de enzimas adicionais Claramente expressar os genes para proteínas que metabolizam açúcares como lactose ou arabinose é um desperdício quando a glicose é abundante O que acontece à expressão do óperon lac quando tanto a glicose quanto a lactose estão presentes Um me canismo regulatório conhecido como repressão de cata bólitos restringe a expressão dos genes necessários para o catabolismo de lactose arabinose e outros açúcares na presença de glicose mesmo quando esses açúcares se cundários também estão presentes O efeito da glicose é mediado pelo cAMP como coativador e uma proteína ati vadora conhecida como proteína receptora de cAMP ou CRP a proteína às vezes é chamada de CAP ou seja proteína ativadora de genes para catabólitos A CRP é um homodímero subunidade Mr 22000 com sítios de ligação para o DNA e o cAMP A ligação é mediada por um mo tivo hélicevoltahélice no domínio de ligação de DNA da proteína Figura 2816 Quando a glicose está ausente a CRPcAMP se liga a um sítio próximo do promotor lac Figura 2817 e estimula a transcrição de RNA em 50 Nelson6edbookindb 1165 Nelson6edbookindb 1165 030414 0749 030414 0749 1166 DAVID L NELSON MICHAEL M COX vezes A CRPcAMP é portanto um elemento regulató rio positivo que responde aos níveis de glicose enquanto o repressor Lac é um elemento regulatório negativo que responde à lactose Os dois atuam em conjunto A CRP cAMP tem pouco efeito no óperon lac quando o repressor Lac está bloqueando a transcrição e a dissociação do re pressor do operador lac tem pouco efeito na transcrição do óperon lac a menos que o CRPcAMP esteja presente para facilitar a transcrição quando a CRP não está ligado o promotor do lac do tipo selvagem é um promotor re lativamente fraco Figura 2817a c O complexo aberto de RNApolimerase e promotor ver Figura 266 não se forma prontamente a menos que a CRPcAMP esteja pre sente A CRP interage diretamente com a RNApolimerase na região mostrada na Figura 2816 por meio da subuni dade a da polimerase O efeito da glicose na CRP é mediado pela interação com a cAMP Figura 2817 A CRP se liga ao DNA mais avidamente quando as concentrações de cAMP estão altas Na presença de glicose a síntese de cAMP é inibida e o efluxo de cAMP da célula é estimulado À medida que ela declina a cAMP a CRP a ligação ao DNA diminui redu zindo a expressão do óperon lac Portanto forte indução do óperon lac precisa tanto de lactose para inativar o re pressor lac quanto de baixa concentração de glicose para disparar um aumento na cAMP e maior ligação de cAMP à CRP A CRP e a cAMP estão envolvidas na regulação coorde nada de muitos óperons principalmente daqueles que codi ficam enzimas para o metabolismo de açúcares secundários como a lactose e arabinose Uma rede de óperons com um regulador comum é chamada de regulon Esse arranjo que permite mudanças coordenadas nas funções celulares que precisam da ação de centenas de genes é um tema central na expressão regulada de redes dispersas de genes em eu cariotos Outros regulons bacterianos incluem o sistema de genes de choque térmico que responde a mudanças de tem peratura p 1061 e os genes induzidos em E coli como parte do sistema de resposta SOS ao dano do DNA descrito posteriormente cAMP Contatos da RNApolimerase cAMP FIGURA 2816 Homodímero CRP com cAMP ligado PDB ID 1RUN Ob serve o enovelamento do DNA em volta da proteína A região que interage com a DNApolimerase é indicada c lacZ lacY lacA mRNA mRNA RNApolimerase a Glicose alta cAMP baixo lactose ausente Glicose baixa cAMP alto lactose ausente Glicose alta cAMP baixo lactose presente Glicose baixa cAMP alto lactose presente O1 O2 O2 O2 O3 b Baixo nível de expressão gênica d Alto nível de expressão gênica Alolactose LIGADO LIGADO LIGADO Sítio de ligação de CRP Sem expressão gênica lacZ lacY lacA DESLIGADO LIGADO LIGADO O1 O3 59 39 CRP Sem expressão gênica lacZ lacY lacA DESLIGADO LIGADO O1 O3 59 39 59 39 39 cAMP CRP cAMP lac lac lac P P P P P lacZ lacY lacA O2 O3 59 lac P P P FIGURA 2817 Regulação positiva do óperon lac por CRP O sítio de li gação para a CRPcAMP está próximo do promotor São mostrados os efeitos combinados da disponibilidade de glicose e lactose na expressão do óperon lac Quando a lactose está ausente o repressor se liga ao operador e impede a transcrição dos genes lac Não importa se a glicose está a presente ou b ausente c Se a lactose estiver presente o repressor se dissocia do operador Entretanto se a glicose também estiver disponível os baixos níveis de cAMP impedem a formação de CRPcAMP e a ligação de DNA A RNApolimerase pode ocasionalmente se ligar e iniciar a transcrição resultando em um nível muito baixo de transcrição do gene lac d Quando a lactose está presente e os níveis de glicose estão baixos os níveis de cAMP aumentam O complexo CRPcAMP se forma e facilita a ligação robusta da RNApolimerase ao promo tor lac e altos níveis de transcrição Nelson6edbookindb 1166 Nelson6edbookindb 1166 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1167 Muitos genes para as enzimas da biossíntese de aminoácidos são regulados pela atenuação da transcrição Os 20 aminoácidos mais comuns são necessários em gran des quantidades para a síntese proteica e a E coli pode sintetizar todos eles Os genes para as enzimas necessárias para sintetizar um determinado aminoácido estão geral mente agrupados em um óperon e são expressos sempre que as reservas existentes de aminoácidos sejam inadequa das para as necessidades celulares Quando os aminoácidos são abundantes as enzimas de biossíntese não são necessá rias e o óperon é reprimido O óperon do triptofano trp de E coli Figura 2818 inclui cinco genes para as enzimas necessárias para conver ter corismato em triptofano Observe que duas das enzimas catalisam mais de uma etapa na via O mRNA do óperon trp tem meiavida de apenas cerca de 3 minutos permitindo que a célula responda rapidamente às variações de necessi dade desse aminoácido O repressor Trp é um homodímero Quando o triptofano é abundante ele se liga ao repressor de Trp provocando uma mudança conformacional que per mite ao repressor se ligar ao operador trp e inibir a expres são do óperon trp O sítio do operador trp se sobrepõe ao promotor de modo que a ligação do repressor bloqueia a ligação da RNApolimerase Uma vez mais esse circuito ligadesliga simples media do por um repressor não conta toda a história regulatória Concentrações celulares diferentes de triptofano podem variar a velocidade de síntese das enzimas de biossíntese em uma faixa de 700 vezes Uma vez que a repressão seja suspensa e a transcrição se inicie a velocidade de transcri ção é ajustada às necessidades celulares de triptofano por um segundo processo regulatório chamado de atenuação da transcrição em que a transcrição é iniciada normal mente mas é abruptamente interrompida antes que os ge nes do óperon sejam transcritos A frequência com que a transcrição é atenuada é regulada pela disponibilidade de triptofano e depende da associação muito estreita entre transcrição e tradução em bactérias O mecanismo de atenuação do óperon trp emprega si nais codificados em quatro sequências no interior de uma região líder de 162 nucleotídeos na extremidade 59 do mRNA antecedendo o códon de iniciação do primeiro gene Figura 2819a No interior do líder se encontra uma re gião conhecida como atenuadora composta pelas sequên cias 3 e 4 Essas sequências pareiam para formar uma es trutura em grampo rica em GC seguida de perto por uma série de resíduos de U A estrutura atenuadora atua como terminador da transcrição Figura 2819b A sequência 2 é um complemento alternativo à sequência 3 Figura 28 19c Se as sequências 2 e 3 pareiam a estrutura atenuado ra não pode se formar e a transcrição continua para os ge nes da biossíntese de trp a alça formada pelas sequências pareadoras 2 e 3 não obstruem a transcrição DNA trpR trpE trp mRNA níveis baixos de triptofano P Líder trpL Atenuador Região reguladora Genes regulados Antranilato sintase componente II Antranilato sintase I2 II2 Corismato Antranilato Glutamina Glutamato 1 Piruvato PRPP PPi N59Fosforribosil antranilato Enol1o carboxifenilamino1 desoxiribulose fosfato Indol3glicerol fosfatosintase LTriptofano LSerina Gliceraldeído3 fosfato trpD trpC trpB trpA mRNA atenuado níveis altos de triptofano N59Fosforribosil antranilatoisomerase indol3glicerol fosfatosintase Trp Repressor Trp O CO2 1 H2O Antranilato sintase componente I Triptofano sintase subunidade b Triptofano sintase subunidade a Triptofanosintase a2b2 FIGURA 2818 O óperon trp Esse óperon é regulado por dois mecanis mos quando os níveis de triptofano são altos 1 o repressor superior es querdo se liga ao seu operador e 2 a transcrição do mRNA trp é atenuada ver Figura 2819 A biossíntese do triptofano pelas enzimas codificadas no óperon trp está diagramada na parte inferior ver também Figura 2219 Nelson6edbookindb 1167 Nelson6edbookindb 1167 030414 0749 030414 0749 1168 DAVID L NELSON MICHAEL M COX RNA polimerase Peptídeo líder finalizado Peptídeo líder incompleto Par 34 atenuador Par 23 parada Met Gln Thr Sítio de transcrição da atenuação Peptídeo líder Fim da região líder trpL Polipeptídeo TrpE Quando os níveis de triptofano estão altos o ribossomo rapidamente traduz a sequência 1 fase de leitura aberta codificando o peptídeo líder e bloqueia a sequência 2 antes da sequência 3 ser transcrita A transcrição contínua leva à atenuação na estrutura atenuadora semelhante a um terminador formada pela sequências 3 e 4 Quando os níveis de triptofano estão baixos o ribossomo pausa nos códons Trp na sequência 1 A formação da estrutura pareada entre as sequências 2 e 3 impede a atenuação pois a sequência 3 não está mais disponível para formar a estrutura do atenuador com a sequência 4 A estrutura 23 ao contrário do atenuador 34 não impede a transcrição Ribossomo Estrutura atenuadora Genes regulados por trp RNA polimerase DNA b c mRNA a DNA mRNA Códons Trp FIGURA 2819 Atenuação da transcrição no óperon trp A transcrição é iniciada no começo do mRNA líder de 162 nucleotídeos codificado por uma região do DNA chamada trpL ver Figura 2818 Um mecanismo regula tório determina se a transcrição é atenuada no final do líder ou continua para os genes estruturais a O mRNA trp líder trpL O mecanismo de atenuação do óperon trp envolve as sequências 1 a 4 destacado b A sequência 1 codifica um pequeno peptídeo o peptídeo líder contendo dois resíduos Trp W ele é traduzido imediatamente após o início da transcrição As sequên cias 2 e 3 são complementares bem como as sequências 3 e 4 A estrutura do atenuador se forma pelo pareamento das sequências 3 e 4 acima Sua estrutura e função são similares àquelas de um terminador de transcrição ver Figura 267a O pareamento das sequências 2 e 3 embaixo impede a formação da estrutura do atenuador Observe que o peptídeo líder não tem outra função celular A tradução da sua fase de leitura aberta tem um papel puramente regulatório que determina que sequências complementares 2 e 3 ou 3 e 4 são pareadas c Esquemas de pareamento de bases para as regiões complementares do mRNA trp líder Nelson6edbookindb 1168 Nelson6edbookindb 1168 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1169 A sequência regulatória 1 é crucial para um mecanismo sensível ao triptofano que determina se a sequência 3 pa reia com a sequência 2 permitindo que a transcrição con tinue ou com a sequência 4 atenuando a transcrição A formação da estrutura atenuadora em grampo depende de eventos que ocorrem durante a tradução da sequência regulatória 1 que codifica um peptídeo líder assim cha mado porque ele é codificado pela região líder do mRNA de 14 aminoácidos dois dos quais são resíduos de Trp O peptídeo líder não tem nenhuma outra função celular conhecida sua síntese é simplesmente um dispositivo re gulatório do óperon Esse peptídeo é traduzido imediata mente depois que ele é transcrito por um ribossomo que acompanha de perto a RNApolimerase à medida que a transcrição prossegue Quando as concentrações de triptofano são altas as concentrações de tRNA de triptofano com carga também são altas Isso permite que a tradução prossiga rapidamente após os dois códons Trp da sequência 1 e para a sequência 2 antes da sequência 3 ser sintetizada pela RNApolimera se Nessa situação a sequência 2 é coberta pelo ribossomo e indisponível para pareamento com a sequência 3 quando a mesma é sintetizada a estrutura atenuadora sequência 3 e 4 se forma e a transcrição é interrompida Figura 2819b acima Quando as concentrações de triptofano são baixas no entanto o ribossomo para nos dois códons Trp na se quência 1 pois o tRNA Trp com carga está menos disponível A sequência 2 permanece livre enquanto a sequência 3 é sintetizada permitindo que essas duas sequências pareiem e que a transcrição prossiga Figura 2819b embaixo Des se modo a proporção de transcritos que é atenuada diminui à medida que a concentração de triptofano diminui Muitos outros óperons biossintéticos de aminoácidos usam uma estratégia de atenuação similar para ajustar as enzimas biossintéticas para atender as necessidades celu lares predominantes O peptídeo líder de 15 aminoácidos produzido pelo óperon phe contém sete resíduos Phe O peptídeo líder do óperon leu tem quatro resíduos contíguos Leu O peptídeo líder para o óperon his contém sete re síduos contíguos His De fato no óperon his e em vários outros a atenuação é suficientemente sensível para ser o único mecanismo regulatório A indução da resposta SOS requer a destruição das proteínas repressoras Dano extenso ao DNA no cromossomo bacteriano dispara a indução de muitos genes localizados a distância Essa res posta chamada de resposta SOS p 1035 fornece outro bom exemplo de regulação gênica coordenada Muitos dos genes induzidos estão envolvidos no reparo do DNA ver Tabela 256 As proteínas regulatórias chave são a proteína RecA e o repressor LexA O repressor LexAMr 22700 inibe a transcrição de to dos os genes SOS Figura 2820 e a redução da respos ta SOS requer a remoção de LexA Isso não é uma simples dissociação do DNA em resposta à ligação de uma pequena molécula como na regulação do óperon lac descrita aci ma Em vez disso o repressor LexA é inativado quando ele catalisa sua própria clivagem em uma ligação peptídica específica AlaGly produzindo dois fragmentos proteicos aproximadamente iguais No pH fisiológico essa reação de autoclivagem precisa da proteína RecA Ela não é uma protease no sentido clássico mas uma interação com LexA FIGURA 2820 Resposta SOS em E coli Ver na Tabela 256 as funções de muitas destas proteínas A proteína LexA é o repressor nesse sistema que tem um sítio operador vermelho perto de cada gene Como o gene recA não é inteiramente reprimido pelo repres sor LexA a célula normal contém cerca de 1000 monômeros RecA ➊ Quando o DNA é extensamente danificado como pela luz UV a replicação do DNA é suspensa e aumenta o número de interva los de fita simples no DNA ➋ A proteína RecA se liga a esse DNA danificado de fita simples ativando a atividade de coprotease da proteína ➌ Enquanto está ligada ao DNA a proteína RecA facilita a quebra e inativação do repressor LexA Quando o repressor é inati vado os genes SOS inclusive recA são induzidos os níveis de RecA aumentam 50 a 100 vezes ❶ ❷ ❸ Dano ao DNA produz um intervalo de fita única lexA dinF uvrA polB dinB uvrB sulA umuCD recA lexA dinF uvrA polB dinB uvrB sulA umuCD recA Cromossomo de E coli Repressor LexA Replicação O RecA se liga ao DNA de fita simples O repressor LexA é inativado Proteólise ativada Proteína RecA Nelson6edbookindb 1169 Nelson6edbookindb 1169 030414 0749 030414 0749 1170 DAVID L NELSON MICHAEL M COX facilita a reação de autoclivagem do repressor Essa função da RecA é às vezes chamada de atividade de coprotease A protease RecA fornece a ligação funcional entre o si nal biológico dano do DNA e indução dos genes SOS Da nos intensos do DNA levam a numerosos intervalos em uma das fitas do DNA e apenas a RecA que está ligada ao DNA de fita única pode facilitar a clivagem do repressor de LexA Figura 2820 embaixo Por fim a ligação de RecA nos in tervalos ativa sua atividade de coprotease levando à cliva gem do repressor de LexA e à indução SOS Durante a indu ção da resposta SOS em uma célula danificada gravemente a RecA também quebra e portanto inativa os repressores que caso contrário permitem a propagação de certos vírus em um estado lisogênico dormente no interior do hospe deiro bacteriano Isso fornece uma ilustração excepcional da adaptação evolutiva Esses repressores como o LexA também sofrem autoclivagem em uma ligação peptídica es pecífica AlaGly de modo que a indução da resposta SOS permita a replicação do vírus e a lise da célula liberando novas partículas de vírus Portanto o bacteriófago pode fa zer uma saída rápida de uma célula bacteriana hospedeira comprometida A síntese de proteínas ribossomais é coordenada com a síntese de rRNA Em bactérias uma crescente demanda celular por síntese proteica é contemplada pelo aumento do número de ribos somos em vez de alterações na atividade de ribossomos individuais Em geral o número de ribossomos aumenta à medida que a velocidade de crescimento celular aumenta Em velocidades de crescimento mais altas os ribossomos representam 45 do peso seco da célula A proporção de recursos celulares destinados a fabricar os ribossomos é tão grande e a função dos ribossomos tão importante que as células devem coordenar a síntese dos componentes ri bossomais as proteínas ribossomais rproteínas e RNA rRNA Essa regulação é distinta dos mecanismos descri tos até agora uma vez que ela ocorre em grande parte no nível da tradução Os 52 genes que codificam as rproteínas ocorrem em pelo menos 20 óperons cada um com 1 a 11 genes Alguns desses óperons também contêm os genes para as subunida des da DNAprimase ver Figura 2512 RNApolimerase ver Figura 264 e para a síntese proteica de fatores de alongamento ver Figura 2729 revelando a associação estreita entre replicação transcrição e síntese proteica du rante o crescimento celular Os óperons de rproteínas são regulados principalmente por um mecanismo de feedback da tradução Uma rprote ína codificada por cada óperon também funciona como um repressor de tradução que se liga ao mRNA transcrito daquele óperon e bloqueia a tradução de todos os genes que o mensageiro codifica Figura 2821 Em geral a r proteína que desempenha o papel de repressora também se liga diretamente a um rRNA Cada rproteína repressora da tradução se liga com maior afinidade ao rRNA apropria do do que ao seu mRNA de modo que o mRNA é ligado e a tradução reprimida apenas quando o nível da rproteína excede aquele do rRNA Isso garante que a tradução dos mRNA que codificam as rproteínas seja reprimida apenas quando a síntese dessas rproteínas excede aquela necessá ria para fazer ribossomos funcionais Desse modo a veloci dade da síntese de rproteína é mantida em equilíbrio com a disponibilidade de rRNA O sítio de ligação do mRNA para o repressor da tradu ção está próximo do sítio de início da tradução de um dos genes no óperon geralmente o primeiro gene Figura 28 21 Em outros óperons isso afetaria apenas aquele gene porque nos mRNA policistrônicos bacterianos a maioria dos genes tem sinais de tradução independentes Nos ópe rons de rproteínas no entanto a tradução de um gene de pende da tradução de todos os outros O mecanismo desse acoplamento da tradução ainda não é conhecido em deta lhe Entretanto em alguns casos a tradução de genes múl tiplos parece ser bloqueada pela dobra do mRNA em uma estrutura elaborada tridimensional que é estabilizada tanto por pareamento interno de bases como na Figura 824 quanto por ligação da proteína repressora de tradução Quando o repressor da tradução está ausente a ligação de ribossomos e a tradução de um ou mais genes desfaz a es trutura dobrada do mRNA permitindo que todos os genes sejam traduzidos L10 39 b9 b S12 39 EFG EFTu S10 L3 39 L7L12 S7 L4 L23 L2 L22 S19 S3 L16 L29 S17 L14 L24 39 L5 S14 S8 L18 S5 L30 L15 L6 S13 S11 39 S4 L17 59 óperon b 59 óperon str 59 óperon S10 59 óperon spc S4 L4 S8 S7 L10 59 óperon a a FIGURA 2821 Feedback de tradução em alguns óperons de proteí nas ribossomais As rproteínas que atuam como repressores de tradução estão em cor salmão Cada repressor de tradução bloqueia a tradução de todos os genes naquele óperon ao se ligar ao sítio indicador no mRNA Os genes que codificam as subunidades de RNApolimerase são mostrados em roxo os genes que codificam os fatores de alongamento estão em azul As rproteínas da subunidade ribossomal grande 50S são designadas L1 a L34 aquelas da subunidade menor 30S S1 a S21 Nelson6edbookindb 1170 Nelson6edbookindb 1170 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1171 Como a síntese de rproteínas é coordenada com o rRNA disponível a regulação da produção de ribossomos reflete a regulação da síntese de rRNA Em E coli a síntese de rRNA a partir de sete óperons de rRNA responde à veloci dade de crescimento celular e a alterações na disponibilida de de nutrientes cruciais particularmente aminoácidos A regulação coordenada pelas concentrações de aminoácidos é conhecida como resposta estringente Figura 2822 Quando as concentrações de aminoácidos são baixas a sín tese de rRNA é interrompida A falta de aminoácidos leva à ligação de tRNA não carregados ao sítio ribossomal A isso dispara uma sequência de eventos que se inicia com a liga ção de uma enzima chamada fator estringente proteína RelA ao ribossomo Quando ligado ao ribossomo o fator estringente catalisa a formação do nucleotídeo raro gua nosina tetrafosfato ppGpp ver Figura 839 ele adiciona pirofosfato à posição 39 do GTP na reação GTP 1 ATP S pppGpp 1 AMP e então uma fosfohidrolase remove um fosfato para formar ppGpp O aumento abrupto nos níveis de ppGpp em respos ta à falta de aminoácidos resulta em uma grande redução na síntese de rRNA mediada pelo menos em parte pela ligação de ppGpp à RNApolimerase O nucleotídeo ppGpp junto com a cAMP pertence a uma classe de nucleotídeos modificados que atuam como mensa geiros celulares secundários p 308 Em E coli esses dois nucleotídeos servem como sinais de fome eles provocam grandes alterações no metabolismo celular aumentando ou diminuindo a transcrição de centenas de genes Em células eucarióticas mensageiros secundários similares de nucleotí deos também têm funções regulatórias múltiplas A coorde nação do metabolismo celular com o crescimento da célula é altamente complexa e mecanismos regulatórios adicionais sem dúvida ainda não foram descobertos O funcionamento de alguns mRNA é regulado por pequenos RNA em cis ou em trans Como descrito ao longo desse capítulo as proteínas desem penham um papel importante bem documentado na regula ção da expressão gênica O RNA porém também tem um papel crucial papel este que está sendo mais bem reco nhecido à medida que mais exemplos de RNA regulatórios são descobertos Uma vez que um mRNA seja sintetizado suas funções podem ser controladas por proteínas de li gação ao DNA como visto para os óperons de rproteínas recémdescritos ou por um RNA Uma molécula de RNA separada pode se ligar ao mRNA em trans e afetar sua atividade Alternativamente uma porção do próprio mRNA pode regular seu próprio funcionamento Quando parte de uma molécula afeta o funcionamento de outra parte da mesma molécula se fala que ela atua em cis Um exemplo bem caracterizado de regulação do RNA em trans é visto na regulação do mRNA do gene rpoS fa tor sigma da RNApolimerase que codifica s S um dos sete fatores sigma de E coli ver Tabela 261 A célula usa esse fator de especificidade em certas situações de estresse como quando entra em fase estacionária estado de ausência de crescimento necessário devido à ausência de nutrientes e s S é necessário para transcrever grande número de genes de resposta O mRNA s S está presente em níveis baixos na maioria das condições mas não é tra duzido porque uma grande estrutura em grampo anterior à região codificadora inibe a ligação dos ribossomos Figura 2823 Sob certas condições de estresse um ou dois RNA pequenos de função especial DsrA abaixo da região A e RprA regulador Rpos do RNA A são induzidos Ambos podem parear com uma fita do grampo no s S mRNA des fazendo o grampo e assim permitindo a tradução do rpoS Outro pequeno RNA OxyS estresse oxidativo do gene S é induzido sob condições de estresse oxidativo e inibe a tra dução do rpoS provavelmente ao parear com e bloquear o sítio de ligação de ribossomos no mRNA O OxyS é ex presso como parte de um sistema que responde a um tipo diferente de estresse dano oxidativo do que o rpoS e sua tarefa é a de impedir a expressão de vias de reparo inde sejadas DsrA RprA e OxyS são todas moléculas de RNA bacteriano relativamente pequenas menos de 300 nucleo tídeos designadas sRNA s de small pequenas existem é claro outros RNA pequenos com outras designações em eucariotos Todos precisam para o seu funcionamento de uma proteína chamada Hfq chaperona de RNA que facilita o pareamento RNARNA Os genes bacterianos regulados desse modo são poucos em número apenas poucas dúzias GTP 1 ATP Fator estringente proteína RelA pppGpp 1 AMP RNA polimerase P A E 39 59 Polipeptídeo em crescimento NH3 mRNA OH FIGURA 2822 Resposta estringente em E coli Essa resposta à privação de aminoácidos é disparada pela ligação de um tRNA sem carga no sítio A do ribossomo Uma proteína chamada de fator estringente se liga ao ribossomo e catalisa a síntese de pppGpp que é convertida por uma fosfohidrolase a ppGpp O sinalizador ppGpp reduz a transcrição de alguns genes e aumenta aquela de outros em parte ao se ligar à subunidade b da RNApolimerase e alterar a especificidade do promotor da enzima A síntese de rRNA é reduzida quando os níveis de ppGpp aumentam Nelson6edbookindb 1171 Nelson6edbookindb 1171 030414 0749 030414 0749 1172 DAVID L NELSON MICHAEL M COX em uma espécie bacteriana típica Entretanto esses exem plos fornecem bons sistemas modelo para compreender os padrões presentes nos exemplos mais complexos e nume rosos de regulação mediada por RNA em eucariotos A regulação em cis envolve uma classe de estruturas de RNA conhecidas como riboswitches Como descrito no Quadro 263 aptâmeros são moléculas de RNA geradas in vitro capazes de ligação específica a um tipo particu lar de ligante Como se pode esperar tais domínios de RNA ligadores de ligantes também estão presentes na natureza em riboswitches em um número significativo de mRNA bacterianos e mesmo em alguns mRNA eucarióticos Es ses aptâmeros naturais são domínios estruturados encon trados em regiões não traduzidas nas extremidades 59 de certos mRNA bacterianos A ligação de um riboswitch de mRNA ao seu ligante apropriado resulta em uma mudan ça conformacional no mRNA e a transcrição é inibida pela estabilização de uma estrutura prematura de terminação da transcrição ou a tradução é inibida em cis pela oclu são do sítio de ligação de ribossomos Figura 2824 Na maioria dos casos o riboswitch atua em um tipo de alça de feedback A maioria dos genes regulados desse modo está envolvida na síntese ou transporte do ligante que é ligado pelo riboswitch assim quando o ligante está presente em altas concentrações o riboswitch inibe a expressão dos ge nes necessários para reabastecer esse ligante Cada riboswitch se liga a apenas um ligante Foram de tectados riboswitches distintos que respondem a mais de uma dúzia de diferentes ligantes incluindo tiamina pirofos fato TPP vitamina B1 cobalamina vitamina B12 flavina mononucleotídeo lisina Sadenosilmetionina adoMet purinas Nacetilglicosamina6fosfato e glicina É provável que muitos mais ainda sejam descobertos O riboswitch que responde ao TPP parece ser o mais difundido ele é en contrado em muitas bactérias fungos e algumas plantas O riboswitch do TPP bacteriano inibe a tradução em algumas espécies e induz a terminação prematura da transcrição em outras Figura 2824 O riboswitch de TPP eucari ótico é encontrado nos íntrons de certos genes e modula o splicing alternativo daqueles genes ver Figura 2621 Ainda não está claro como são os riboswitches Entretanto estimativas sugerem que mais de 4 dos genes de Bacillus subtilis sejam regulados por riboswitches a 59 59 59 mRNA rpoS mRNA rpoS DsrA Sítio de ligação do ribossomo 39 39 39 39 59 59 39 b 59 OxyS Sítio de ligação do ribossomo 39 39 59 Hfq Hfq FIGURA 2823 Regulação do funcionamento do mRNA bacteriano em trans pelos sRNA Vários RNA pequenos RNA DsrA RprA e OxyS estão envolvidos na regulação do gene rpoS Todos precisam da proteína Hfq uma chaperona de RNA que facilita o pareamento RNARNA A Hfq tem uma estrutura toroide com um poro no centro a A DsrA promove a tradu ção ao se parear com uma fita de uma estrutura em grampo que de outra forma bloqueia o sítio de ligação do ribossomo A RprA não mostrada atua de um modo semelhante b A OxyS bloqueia a tradução ao se parear com o sítio de ligação do ribossomo 59 Aptâmero 39 Sítio de ligação do ribossomo Terminador poli U Sítio de splice 59 Sítio de splice 39 TPP a 59 39 b 59 39 c 59 39 AG GUACGG A estabilização de uma estrutura terminadora de transcrição aborta a transcrição O bloqueio do sítio de ligação de ribossomos bloqueia a tradução Regulação do splicing do íntron em íntrons de fungos e plantas FIGURA 2824 Regulação do funcionamento do mRNA bacteriano em cis por riboswitches Os modos de ação conhecidos são ilustrados por vários riboswitches com base em um aptâmero natural muito difundido que se liga à tiamina pirofosfato A ligação de TPP ao aptâmero leva a uma mudança conformacional que produz os resultados variáveis ilustrados nas partes a b e c nos diferentes sistemas em que o aptâmero é utilizado Nelson6edbookindb 1172 Nelson6edbookindb 1172 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1173 À medida que os riboswitches são mais bem entendi dos pesquisadores estão encontrando aplicações mé dicas Por exemplo a maioria dos riboswitches descritos até o momento incluindo aquele que responde à adoMet foram encontrados apenas em bactérias Um fármaco que se ligasse e ativasse o riboswitch adoMet desligaria os ge nes que codificam enzimas que sintetizam e transportam adoMet privando as células bacterianas desse cofator es sencial Fármacos desse tipo estão sendo buscados para uso como uma nova classe de antibióticos O ritmo de descoberta de RNA funcionais não mostra sinais de diminuição e continua a enriquecer a hipótese de que o RNA desempenhou um papel especial na evolução da vida Capítulo 26 Os RNA e os riboswitches como as ribozimas e ribossomos podem ser vestígios de um mundo de RNA obscurecido pelo tempo mas persistindo em uma rica série de dispositivos biológicos ainda em funcionamen to na biosfera atual A seleção em laboratório de aptâme ros e ribozimas com novas funções de ligação de ligantes e enzimáticas ver Quadro 263 nos informa que são possí veis as atividades com base em RNA necessárias para um mundo de RNA viável A descoberta de várias das mesmas funções do RNA em muitos organismos nos mostra que de fato existem componentes essenciais ao metabolismo com base em RNA Por exemplo os aptâmeros naturais de riboswitches podem ser derivados de RNA que bilhões de anos atrás se ligaram aos cofatores necessários para pro mover os processos enzimáticos necessários para o meta bolismo do mundo de RNA Alguns genes são regulados por recombinação genética Agora será abordado outro modo de regulação gênica bacteriana no nível de rearranjorecombinação de DNA A Salmonella typhimurium que habita o intestino de mamíferos se move girando o flagelo na sua superfície celular Figura 2825 As várias cópias da proteína flagelina Mr 53000 que compõem o flagelo são alvo de destaque dos sistemas imunes de mamíferos Porém as células de Salmonella têm um mecanismo que evita a resposta imune elas alternam entre duas proteínas fla gelinas distintas FljB e FliC aproximadamente uma vez a cada 1000 gerações usando um processo chamado va riação de fase A troca é realizada pela inversão periódica de um seg mento de DNA contendo o promotor para um gene da flage lina A inversão é uma reação de recombinação sítioespe cífica ver Figura 2537 mediada pela recombinase Hin em sequências específicas de 14 pb sequências hix em cada extremidade do segmento de DNA Quando o segmento de DNA está em uma orientação o gene para a flagelina FljB e FIGURA 2825 Salmonella typhimurium com flagelos evidentes fljA hin fliC mRNA hin mRNA fljB e fljA Recombinase Hin Flagelina FljB Proteína FljA repressora DNA a fljA hin fliC mRNA hin Recombinase Hin b mRNA fliC Flagelina FliC Repetição invertida hix Promotor para FljB e repressor Promotor para FliC fljB fljB Segmento transposto FIGURA 2826 Regulação dos genes de flagelina em Salmonella va riação de fase Os produtos dos genes fliC e fljB são flagelinas diferentes O gene hin codifica a recombinase que catalisa a inversão do segmento de DNA contendo o promotor fljB e o gene hin Os sítios de recombinação re petições invertidas são chamados de hix amarelo a Em uma orientação fljB é expressa junto com uma proteína repressora produto de um gene fljA que reprime a transcrição do gene fliC b Na orientação oposta apenas o gene fliC é expresso os genes fljA e fljB não podem ser transcritos A intercon versão entre estes dois estados conhecida como variação de fase também requer duas outras proteínas não específicas de ligação de DNA não mos tradas HU e FIS Nelson6edbookindb 1173 Nelson6edbookindb 1173 030414 0749 030414 0749 1174 DAVID L NELSON MICHAEL M COX o gene que codifica um repressor FljA são expressos Fi gura 2826a o repressor desliga a expressão do gene para a flagelina FliC Quando o segmento de DNA é invertido Fi gura 2826b os genes fljA e fljB não são mais transcritos e o gene fliC é induzido à medida que o repressor começa a se esgotar A recombinase Hin codificada pelo gene hin no segmento de DNA que sofre inversão é expressa quando o segmento de DNA está em qualquer orientação de modo que a célula pode sempre trocar de um estado para outro Esse tipo de mecanismo regulatório tem a vantagem de ser absoluto a expressão gênica é impossível quando o gene está fisicamente separado do seu promotor ob serve a posição do promotor fljB na Figura 2826b Um interruptor ligadodesligado absoluto pode ser importan te nesse sistema embora ele afete apenas um dos dois genes de flagelinas porque um flagelo com apenas uma cópia da flagelina errada pode ser vulnerável para abrigar anticorpos contra aquela proteína O sistema Salmonella não é de maneira nenhuma único Sistemas regulatórios semelhantes ocorrem em algumas outras bactérias e em alguns bacteriófagos e sistemas de recombinação com funções semelhantes foram encontrados em eucariotos Tabela 281 A regulação gênica por rearranjos de DNA que move genes eou promotores é particularmente co mum em patógenos que se beneficiam pela alteração de seu leque de hospedeiros ou alterando suas proteínas de superfície suplantando os sistemas imunes dos hospedei ros RESUMO 282 Regulação da expressão gênica em bactérias c Além da repressão do repressor Lac o óperon lac de E coli sofre regulação positiva pela proteína receptora de cAMP CRP Quando a glicose é baixa a cAMP é alta e a CRPcAMP se liga a um sítio específico no DNA estimulando a transcrição do óperon lac e produção de enzimas metabolizadoras de lactose A presença de gli cose deprime a cAMP diminuindo a expressão do lac e de outros genes envolvidos no metabolismo de açúcares secundários Um grupo de óperons regulados coordena damente é chamado de regulon c Óperons que produzem as enzimas da síntese de ami noácidos têm um circuito regulatório chamado ate nuação que usa um sítio de terminação de transcrição o atenuador no mRNA A formação do atenuador é modulada por um mecanismo que acopla transcrição e tradução enquanto responde a pequenas alterações na concentração de aminoácidos c No sistema SOS múltiplos genes não ligados reprimidos por um único repressor são induzidos simultaneamente quando o dano no DNA dispara a proteólise autocatalíti ca do repressor facilitada pela proteína RecA c Na síntese de proteínas ribossomais uma proteína em cada óperon de rproteína atua como repressor da tra dução O mRNA é ligado pelo repressor e a tradução é bloqueada apenas quando a rproteína está presente com excesso de rRNA disponível c A regulação póstranscrição de alguns mRNA é me diada por pequenos RNA que atuam em trans ou por riboswitches parte da própria estrutura do mRNA que atua em cis c Alguns genes são regulados por processos de recombi nação genética que movem os promotores em relação aos genes sendo regulados A regulação também pode ocorrer no nível da tradução TABELA 281 Exemplos de regulação gênica por recombinação Sistema Recombinasesítio de recombinação Tipo de recombinação Função Variação de fase Salmonella Hinhix Sítioespecífica A expressão alternativa de dois genes da flagelina permite a evasão da resposta imu ne do hospedeiro Amplitude de hospedeiros bacteriófago m Gingix Sítioespecífica A expressão alternativa de dois conjuntos de genes de fibras caudais afeta a faixa de hospedeiros Troca do tipo de acasalamento levedura HOendonuclease proteína RAD52 outras proteínasMAT Conversão gênica não recíproca A expressão alternativa de dois tipos de acasalamento de leveduras a e a cria célu las que podem se unir e sofrer meiose Variação antigênica tripanos somas Varia Conversão gênica não recíproca A expressão sucessiva de diferentes genes codificando glicoproteínas variáveis de su perfície VSG permite a evasão da resposta imune do hospedeiro Na conversão gênica não recíproca classe de eventos de recombinação não discutida no Capítulo 25 a informação genética é movida de uma parte do genoma onde é silenciosa para outra onde é expressa A reação é semelhante à transposição replicativa ver Figura 2541 Os tripanossomos provocam a doença do sono africana e outras doenças ver Quadro 63 A superfície externa de um tripanossomo é composta por múltiplas cópias de um único VSG o antígeno principal de superfície Uma célula pode mudar os antígenos de superfície em mais de 100 formas diferentes impedindo uma defesa eficaz do sistema imune do hospedeiro Nelson6edbookindb 1174 Nelson6edbookindb 1174 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1175 283 Regulação da expressão gênica em eucariotos A iniciação da transcrição é um ponto de regulação crucial para a expressão gênica em todos os organismos Embora os eucariotos e bactérias usem alguns semelhantes meca nismos regulatórios a regulação da transcrição nos dois sis temas é fundamentalmente diferente É possível definir um estado fundamental de transcrição como a atividade inerente de promotores e da maquinaria de transcrição in vivo na ausência de sequências regulató rias Em bactérias a RNApolimerase geralmente tem aces so a todos os promotores e pode se ligar e iniciar a transcri ção com algum nível de eficiência na ausência de ativadores ou repressores o estado fundamental de transcrição é portanto não restritivo Em eucariotos no entanto pro motores fortes são geralmente inativos in vivo na ausência de proteínas regulatórias isto é o estado fundamental de transcrição é restritivo Essa diferença fundamental origina pelo menos quatro características importantes que distin guem a regulação da expressão gênica em eucariotos da quela em bactérias Primeiro o acesso a promotores eucarióticos é restrito pela estrutura da cromatina e a ativação da transcrição é associada com várias mudanças na estrutura da cromatina na região transcrita Segundo embora as células eucarióti cas tenham tanto mecanismos regulatórios positivos quanto negativos os mecanismos positivos predominam em todos os sistemas caracterizados até agora Assim uma vez que o estado fundamental de transcrição é restritivo pratica mente todo gene de eucariotos precisa de ativação para ser transcrito Terceiro células eucarióticas têm proteínas re gulatórias multiméricas maiores e mais complexas do que as de bactérias Finalmente a transcrição no núcleo eucari ótico é separada da tradução no citoplasma tanto no tempo como no espaço A complexidade de circuitos regulatórios em células eu carióticas é extraordinária como a discussão a seguir mos tra A seção é concluída com uma descrição ilustrada de um dos mais elaborados circuitos a cascata regulatória que controla o desenvolvimento em moscasdafruta A cromatina ativa na transcrição é estruturalmente distinta da cromatina inativa Os efeitos da estrutura do cromossomo na regulação gênica em eucariotos não possui um paralelo claro em bactérias No ciclo da célula eucariótica os cromossomos da interfase pa recem à primeira vista dispersos e amorfos ver Figura 24 24 No entanto várias formas de cromatina podem ser en contradas ao longo desses cromossomos Cerca de 10 da cromatina em uma típica célula eucariótica estão em forma mais condensada do que o resto da cromatina Essa forma heterocromatina é inativa na transcrição A heterocro matina é geralmente associada a estruturas cromossômicas particulares os centrômeros por exemplo A cromatina restante menos condensada é chamada de eucromatina A transcrição de um gene de eucariotos é fortemente reprimida quando o seu DNA está condensado no interior da heterocromatina Parte da eucromatina mas não toda é ativa na transcrição As regiões dos cromossomos ativas na transcrição são distintas da heterocromatina por pelo me nos três maneiras o posicionamento dos nucleossomos a presença de variantes de histonas e a modificação covalente dos nucleossomos Essas mudanças estruturais na cromati na associadas à transcrição são coletivamente chamadas de remodelação da cromatina A remodelação envolve enzi mas que promovem essas alterações Tabela 282 Cinco famílias conhecidas de complexos enzimáticos reposicionam ativamente ou deslocam os nucleossomos hidrolisando o ATP no processo Três desses são particu larmente importantes na ativação da transcrição Tabela 282 consulte na nota de rodapé da tabela uma explicação sobre os nomes abreviados dos complexos enzimáticos aqui descritos O SWISNF encontrado em todas as células eu carióticas contém pelo menos seis polipeptídeos nucleares que juntos remodelam a cromatina de modo que os nucle ossomos se tornam mais irregularmente espaçados Tam bém estimulam a ligação do fator de transcrição O com plexo inclui um componente chamado de bromodomínio perto da terminação carboxila da subunidade ATPase ativa que interage com as caudas de histonas acetiladas O SWI SNF não é necessário para a transcrição de todos os genes NURF membro da família ISW1 remodela a cromatina de formas que complementam e se sobrepõem à atividade da SWISNF Esses dois complexos enzimáticos são cruciais na preparação de uma região da cromatina para a transcrição ativa A terceira família de proteínas importante apresenta um papel um pouco diferente A cromatina ativa na trans crição tende a ser deficiente em histona H1 que se liga ao DNA de ligação entre as partículas do nucleossomo Essas regiões de cromatina também são enriquecidas das varian tes de histonas H33 e H2AZ ver Quadro 242 Alterações no conteúdo de histonas são novamente mediadas por enzi mas especializadas e complexos proteicos A deposição de H2AZ envolve membros dessa terceira família de enzimas remodeladoras dependentes de ATP chamadas de SWR1 A modificação covalente de histonas é alterada drasti camente no interior da cromatina ativa na transcrição As histonas nucleares das partículas dos nucleossomos H2A H2B H3 H4 ver Figura 2426 são modificadas pela metila ção de resíduos Lys ou Arg fosforilação de resíduos de Ser ou Thr acetilação ver a seguir ubiquitinação ver Figu ra 2747 ou sumoilação Cada uma das histonas nucleares apresenta dois domínios estruturais distintos Um domínio central está envolvido na interação histonahistona e no en rolamento do DNA em torno do nucleossomo Um segundo domínio aminoterminal rico em lisina está geralmente po sicionado próximo do exterior da partícula do nucleossomo montado as modificações covalentes ocorrem em resíduos específicos concentrados nesse domínio aminoterminal Os padrões de modificação levaram alguns pesquisadores a propor a existência de um código para as histonas no qual padrões de modificação são reconhecidos por enzimas que alteram a estrutura da cromatina De fato algumas das mo dificações são essenciais para interações com proteínas que desempenham papéis chave na transcrição Nelson6edbookindb 1175 Nelson6edbookindb 1175 030414 0749 030414 0749 1176 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A acetilação e metilação de histonas figura com desta que nos processos que ativam a cromatina para transcrição Durante a transcrição a histona H3 é metilada por metila ses de histona específicas na Lys 4 em nucleossomos perto da extremidade 59 da região codificadora e na Lys 36 por toda a região codificadora Essas metilações facilitam a ligação das acetiltransferases de histona HATs enzimas que acetilam resíduos específicos de Lys HAT do citosol tipo B acetilam histonas recentemente sintetizadas antes das histonas serem importadas para o núcleo A montagem pos terior de histonas na cromatina após a replicação é facilita da pelas chaperonas de histonas CAF1 para H3 e H4 ver Quadro 242 e NAP1 para H2A e H2B Onde a cromatina está sendo ativada para transcrição as histonas nucleossomais são acetiladas adicionalmente por HAT nucleares tipo A A acetilação de múltiplos re síduos Lys nos domínios aminoterminais das histonas H3 e H4 pode reduzir a afinidade de todo o nucleossomo por DNA A acetilação de resíduos Lys específicos é crucial para a interação de nucleossomos com outras proteínas Quando a transcrição de um gene não é mais necessária o grau de acetilação de nucleossomos naquela vizinhança é reduzido pela atividade das desacetilases de histonas HDAC como parte de um processo geral de silenciamento de genes que restaura a cromatina a um estado transcricionalmen te inativo Além da remoção de certos grupos acetil nova modificação covalente de histonas marca a cromatina como transcricionalmente inativa Por exemplo a Lys 9 da histona H3 é frequentemente metilada em heterocromatina O efeito final da remodelação da cromatina no contexto da transcrição é o de tornar um segmento de cromossomo mais acessível e marcálo modificar quimicamente para facilitar a ligação e atividade dos fatores de transcrição que regulam a expressão do gene ou genes naquela região A maioria dos promotores eucarióticos é regulada positivamente Como já observado as RNApolimerases de eucariotos têm pouca ou nenhuma afinidade intrínseca por seus promoto res a iniciação da transcrição é quase sempre dependente da ação de proteínas ativadoras múltiplas Uma razão importan te para o aparente predomínio da regulação positiva parece óbvia o armazenamento do DNA no interior da cromatina efetivamente torna a maioria dos promotores inacessíveis de modo que os genes são silenciosos na ausência de outra regulação A estrutura de cromatina afeta o acesso a alguns promotores mais do que outros mas repressores que se li gam ao DNA de modo a impedir o acesso da RNApolimerase regulação negativa seriam com frequência simplesmente redundantes Outros fatores devem estar em jogo no uso da regulação positiva e geralmente especulações sobre isso se TABELA 282 Alguns complexos enzimáticos que catalisam mudanças estruturais da cromatina associadas à transcrição Complexo enzimático Estrutura oligomérica nº de polipeptídeos Fonte Atividades Modificação de histonas GCN5 ADA2 ADA3 3 Leveduras GCN5 tem atividade de HAT tipo A SAGA PCAF 20 Eucariotos Inclui GCN5ADA2ADA3 resíduos ace tilados em H3 e H2B NuA4 Pelo menos 12 Eucariotos Componente EsaI tem atividade HAT acetila H4 H2A e H2AZ Movimento de histonaenzimas de substi tuição que precisam de ATP SWISNF 6 Mr total 2310 6 Eucariotos Remodelagem de nucleossomos ativação da transcrição Família ISWI Varia Eucariotos Remodelagem de nucleossomos repres são da transcrição ativação da transcri ção em alguns casos NURF Família SWR1 12 Eucariotos Deposição de H2AZ Chaperonas de histonas que não precisam de ATP HIRA 1 Eucariotos Deposição de H33 durante a transcrição As abreviações dos genes e proteínas eucarióticos são frequentemente mais confusas ou obscuras do que as abreviações usadas para bactérias O complexo de proteí nas GCN5 controle geral não desrepressível de general control nonderepressible e ADA alteraçãoativação da deficiência de alterationdeficiency activation foi descoberto durante a investigação da regulação dos genes do metabolismo do nitrogênio em leveduras Essas proteínas podem fazer parte do complexo maior SAGA SPF ADA23 GCN5 acetiltransferase nas leveduras O equivalente do SAGA em humanos é o PCAF fator associado a p300CBP NuA4 é a acetiltransferase de nu cleossomos de H4 ESA1 é a acetiltransferase essencial relacionada à SAS2 SWI troca switching foi descoberta como uma proteína necessária para a expressão de certos genes envolvidos na troca do mating type em leveduras e SNF sacarose não fermentadora como um fator de expressão do gene de leveduras para sacarase Estudos posteriores revelaram múltiplas proteínas SWI e SNF que atuavam em um complexo O complexo SWISNF tem um papel na expressão de um amplo número de genes e foi encontrado em muitos eucariotos inclusive humanos ISWI é imitação de SWI NURF o fator de remodelagem nuclear nuclear remodeling factor SWR1 uma Swi2ATPase 1 relacionada à Snf2 e HIRA um regulador de histonas tipo A Nelson6edbookindb 1176 Nelson6edbookindb 1176 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1177 centram em torno de dois o grande tamanho dos genomas eucarióticos e a maior eficiência da regulação positiva Primeiro a ligação de DNA não específico de proteínas regulatórias se torna um problema importante nos geno mas bem maiores dos eucariotos superiores E a chance de que uma única sequência de ligação específica ocorra alea toriamente em um local inadequado também aumenta com o tamanho do genoma Um controle combinatorial portan to se torna importante em um genoma grande Figura 28 27 A especificidade pela ativação da transcrição pode ser melhorada se cada uma de várias proteínas regulatórias po sitivas ligar sequências de DNA específicas para ativar um gene O número médio de sítios regulatórios para um gene em um organismo pluricelular é seis e são comuns genes regulados por uma dúzia desses sítios A necessidade de ligação de várias proteínas regulatórias positivas a sequên cias específicas de DNA reduz enormemente a probabilida de de ocorrência aleatória de uma justaposição funcional de todos os sítios de ligação necessários Além disso o número real de proteínas regulatórias que deve ser codificado por um genoma para regular todos os seus genes pode ser re duzido Figura 2827 Portanto um novo regulador não é necessário para cada gene embora a regulação seja com plexa o suficiente em eucariotos superiores de modo que as proteínas reguladoras podem representar de 5 a 10 de todos os genes codificadores de proteínas Em princípio uma estratégia combinatória semelhante poderia ser usada por múltiplos elementos regulatórios negativos mas isso nos leva à segunda razão para o uso da regulação positi va ela é simplesmente mais eficiente Se os 25000 genes no genoma humano fossem regulados negativamente cada célula teria de sintetizar em todos os momentos todos os diferentes repressores em concentrações suficientes para permitir a ligação específica a cada gene indesejado Em uma regulação positiva a maioria dos genes é geralmente inativa isto é as RNApolimerases não se ligam aos pro motores e a célula sintetiza apenas as proteínas ativadoras necessárias para promover a transcrição de um subconjun to de genes necessário na célula naquele momento Apesar desses argumentos há exemplos de regulação negativa em eucariotos desde leveduras ao homem como será visto Ativadores de ligação de DNA e coativadores facilitam a montagem dos fatores gerais de transcrição Continuando o estudo da regulação da expressão gênica em eucariotos serão abordadas as interações entre promotores e RNApolimerase II Pol II a enzima responsável pela sín tese de mRNAs de eucariotos Embora muitos mas não to dos promotores de Pol II incluam a TATA box e sequências Inr iniciadoras com seu espaçamento padrão ver Figura 268 eles variam enormemente tanto no número quanto na localização de sequências adicionais necessárias para a regulação da transcrição 1 7 13 19 25 31 2 8 14 20 26 32 3 9 15 21 27 33 4 10 16 22 28 34 5 11 17 23 29 35 6 12 18 24 30 36 FIGURA 2827 As vantagens do controle combinatório O controle combinatório permite a regulação específica de vários genes usando um re pertório limitado de proteínas regulatórias Considere as possibilidades ine rentes à regulação por duas famílias diferentes de proteínas zíper de leucina vermelho e verde Se cada família de genes regulatórios tem três membros mostrados aqui em tons escuro médio e claro cada um deles se ligando a uma sequência de DNA diferente que pode livremente formar homo ou heterodímeros há seis espécies diméricas possíveis em cada família cada uma das quais reconheceria uma sequência regulatória bipartide de DNA diferente Se um gene tivesse um sítio regulatório para cada família de pro teína 36 combinações regulatórias diferentes seriam possíveis usando ape nas seis proteínas dessas duas famílias Com seis ou mais sítios usados na regulação de um gene eucariótico típico o número de variantes possíveis é muito maior do que esse exemplo sugere Nelson6edbookindb 1177 Nelson6edbookindb 1177 030414 0749 030414 0749 1178 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Sequências regulatórias adicionais geralmente ligadas por ativadores de transcrição são geralmente chamadas de potenciadores enhancers em eucariotos superiores e sequências ativadoras a montante UAS em levedu ras Um típico potenciador pode ser encontrado a centenas ou mesmo milhares de pares de bases a montante do início do sítio de transcrição ou até mesmo a jusante dele no in terior do próprio gene Quando ligado pelas proteínas regu latórias apropriadas um potenciador aumenta a transcrição nos promotores vizinhos independente de sua orientação no DNA As UAS de leveduras funcionam de modo similar embora geralmente elas devam ser posicionadas a montan te e a uma distância inferior a algumas centenas de pares de bases do sítio de início de transcrição A ligação bemsucedida da holoenzima da RNApolime rase II ativa a um dos seus promotores geralmente requer a ação combinada de proteínas entre os cinco tipos que foram descritos até agora 1 ativadores de transcrição que se ligam a potenciadores ou UAS e facilitam a transcrição 2 reguladores da arquitetura que facilitam o looping do DNA 3 modificação da cromatina e proteínas re modeladoras descrita anteriormente 4 coativadores e 5 fatores de transcrição basais ver Figura 269 Ta bela 262 necessária na maior parte dos promotores da Pol II Figura 2828 Os coativadores atuam indiretamente não se ligando ao DNA e são necessários para a comuni cação essencial entre os ativadores e o complexo composto da Pol II e dos fatores de transcrição basal ou geral Além disso várias proteínas repressoras interferem com a comu nicação entre a RNApolimerase e os ativadores resultando na repressão da transcrição Figura 2828b Aqui serão fo calizados os complexos de proteínas mostrados na Figura 2828 e como eles interagem para ativar a transcrição Ativadores da transcrição As necessidades para ativadores va riam muito de um promotor para outro Alguns poucos ati vadores são conhecidos por facilitar a transcrição em cen tenas de promotores enquanto outros são específicos de alguns poucos promotores Muitos ativadores são sensíveis à ligação de moléculas sinalizadoras fornecendo a capaci dade de ativar ou desativar a transcrição em resposta a um ambiente celular em mudança Alguns potenciadores liga dos por ativadores estão muito distantes da TATA box do promotor Potenciadores múltiplos frequentemente seis ou mais são ligados por um número semelhante de ativa FIGURA 2828 Promotores eucarióticos e proteínas regulatórias A RNApolimerase II e seus fatores de transcrição basal geral associados for mam um complexo préiniciação na TATA box e o sítio Inr dos promotores cognatos um processo facilitado pelos ativadores de transcrição atuando por meio de coativadores Mediador TFIID ou ambos a Um promotor composto com elementos de sequência típicos e complexos proteicos en contrado tanto em leveduras quanto em eucariotos superiores O domínio carboxila terminal CTD da Pol II ver Figura 269 é um importante ponto de interação com o Mediador e outros complexos de proteínas Enzimas de modificação de histonas não mostradas catalisam a metilação e ace tilação enzimas de remodelagem alteram o conteúdo e a localização dos nucleossomos Os ativadores da transcrição têm domínios de ligação de DNA e domínios de ativação distintos As setas verdes indicam modos de interação comuns comumente necessários para a ativação da transcrição como discutido no texto As proteínas HMG são um tipo comum de regula dor de arquitetura ver Figura 285 facilitando a formação de alças de DNA necessária para colocar juntos componentes do sistema ligados em sítios de ligação distantes b Os repressores da transcrição de eucariotos funcionam por uma grande variedade de mecanismos Alguns se ligam diretamente ao DNA deslocando um complexo proteico necessário para a ativação não mostrado muitos outros interagem com várias partes dos complexos pro teicos para impedir a ativação Pontos possíveis de interação são indicados com setas vermelhas c A estrutura de um complexo proteico HMG com DNA mostra como as proteínas HMG facilitam a formação de alças no DNA A ligação é relativamente não específica embora preferências de sequência de DNA tenham sido identificadas para várias proteínas HMG É mostrado o do mínio HMG da proteína HMGD de Drosophila ligada ao DNA PDB ID 1QRV TATA Complexo de iniciação da Pol II CTD Gene TBP Repressores TBP TFIID TATA DNA Domínio HMG Gene TBPTBP TFIID Ativadores e coativadores de transcrição a Ativação b Repressão c Mediador UAS LIGADO Mediador DESLIGADO Proteínas HMG DNA DNA DNA Domínio HMG Nelson6edbookindb 1178 Nelson6edbookindb 1178 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1179 dores para um gene típico fornecendo controle combinató rio e resposta a múltiplos sinais Reguladores de arquitetura Como os ativadores funcionam a distância A resposta na maioria dos casos parece ser que como indicado anteriormente o DNA interveniente faz uma alça de modo que vários complexos de proteínas podem in teragir diretamente A formação da alça é estimulada por reguladores de arquitetura abundantes na cromatina que se ligam ao DNA com especificidade limitada Com mais destaque as proteínas do grupo de alta mobilidade HMG Figura 2828c alta mobilidade se refere à sua mobilidade eletroforética nos géis de poliacrilamida de sempenham um papel estrutural importante na remodela ção da cromatina e na ativação da transcrição Complexos de proteínas coativadoras A maior parte da transcri ção requer a presença de complexos proteicos adicionais Alguns dos principais complexos proteicos de proteínas re guladoras que interagem com a Pol II foram definidos tanto geneticamente quanto bioquimicamente Esses complexos coativadores atuam como intermediários entre os ativado res da transcrição e o complexo Pol II Um coativador eucariótico principal consistindo em 20 a 30 ou mais polipeptídeos em um complexo proteico é chamado de Mediador Figura 2828 Muitos dos 20 po lipeptídeos nucleares são altamente conservados de fungos ao homem Um complexo adicional de quatro subunidades pode interagir com o Mediador e inibir a iniciação da trans crição O Mediador se liga fortemente ao domínio da carbo xila terminal CTD da maior subunidade de Pol II O com plexo Mediador é necessário tanto para a transcrição basal quanto para a regulada em vários dos promotores usados pela Pol II e também estimula a fosforilação de CTD pela TFIIH fator de transcrição basal Os ativadores da trans crição interagem com um ou mais componentes do comple xo Mediador com os sítios de interação precisa diferindo de um ativador para outro Complexos coativadores funcionam na TATA box do promotor ou perto dela Coativadores adicionais funcionando com um ou pou cos genes também foram descritos Alguns deles operam em conjunto com o Mediador e alguns podem atuar em sis temas que não empregam o Mediador Proteína ligadora de TATA O primeiro componente a se ligar na montagem de um complexo de préiniciação PIC na TATA box de um típico promotor Pol II é a proteína ligadora de TATA TBP Com frequência a TBP faz par te de um complexo maior 15 subunidades chamado de TFIID O complexo integral também inclui os fatores de transcrição basal TFIIB TFIIE TFIIF TFIIH Pol II e tal vez TFIIA Esse PIC mínimo no entanto geralmente é in suficiente para a iniciação da transcrição e não se forma de modo algum se o promotor estiver obscurecido no interior da cromatina A regulação positiva levando à transcrição é imposta pelos ativadores e coativadores Coreografia da ativação da transcrição Agora é possível come çar a juntar a sequência de eventos de ativação da trans crição em um típico promotor de Pol II Figura 2829 FIGURA 2829 Os componentes de ativação da transcrição Os ativa dores se ligam primeiro ao DNA recrutam os complexos de modificação de histonasremodelagem do nucleossomo e um coativador como Mediador O Mediador facilita a ligação de TBP ou TFIID e TFIIB e então outros fatores de transcrição basal e a Pol II se ligam A fosforilação do domínio carboxila terminal CTD da Pol II leva à iniciação da transcrição não mostrado CTD TBPTBP TFIIA TBP TATA TATA TFIIH Pol II TFIIF TFIIE TFIIB TFIIB Mediador Complexo de modificação e remodelagem Inr Inr DNA Enzimas de modificação e remodelagem TBP e TFIIB Mediador TFIIB TFIIA TFIIFPol II TFIIE TFIIH Potenciador Ativador Nelson6edbookindb 1179 Nelson6edbookindb 1179 030414 0749 030414 0749 1180 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A ordem exata de ligação de alguns componentes pode variar mas o modelo na Figura 2829 ilustra os princípios de ativação bem como uma via comum Muitos ativadores de transcrição têm uma afinidade significativa por seus sítios de ligação mesmo quando os sítios estão dentro da cromatina condensada Em geral a ligação dos ativadores é um evento que dispara a ativação seguinte do promotor A ligação de um ativador pode permitir a ligação de outros gradualmente deslocando alguns nucleossomos A remodelação da cromatina ocorre então em está gios facilitados pelas interações entre ativadores e HAT ou complexos enzimáticos como SWISNF ou ambos Desse modo um ativador ligado pode envolver outros componentes necessários para remodelação adicional da cromatina para permitir a transcrição de genes específi cos Os ativadores ligados interagem com o grande com plexo Mediador O Mediador por sua vez fornece uma su perfície de montagem para a ligação da primeira TBP ou TFIID em seguida a TFIIB e então outros componentes do PIC incluindo a RNApolimerase II O Mediador esta biliza a ligação da Pol II e seus fatores de transcrição asso ciados e facilita muito a formação do PIC A complexidade nesses circuitos regulatórios é regra em vez de exceção com múltiplos ativadores ligados ao DNA promovendo a transcrição O roteiro pode mudar de um promotor para outro Por exemplo muitos promotores têm um conjunto diferente de sequências de reconhecimento e podem não ter uma cai xa TATA e em eucariotos pluricelulares a composição de subunidades de fatores tais como o TFIID pode variar de um tecido para outro Entretanto parece que a maioria dos promotores precisa de um conjunto precisamente ordenado de componentes para iniciar a transcrição O processo de montagem não é sempre rápido Em alguns genes ele pode levar minutos em certos genes de eucariotos superiores o processo pode levar dias Ativação reversível da transcrição Embora mais raras algumas proteínas regulatórias de eucariotos que se ligam a promo tores de Pol II ou que interagem com ativadores de trans crição podem atuar como repressores inibindo a formação de PIC ativos Figura 2829 Alguns ativadores podem adotar diferentes conformações tornandoos capazes de servir como ativadores de transcrição ou como repressores Por exemplo alguns receptores de hormônios esteroides descritos posteriormente funcionam no núcleo como ati vadores de transcrição estimulando a transcrição de certos genes quando um sinal de um hormônio esteroide parti cular está presente Quando o hormônio está ausente as proteínas receptoras revertem a uma conformação repres sora impedindo a formação de PIC Em alguns casos essa repressão envolve a interação com diacetilases de histonas e outras proteínas que ajudam a restaurar a cromatina cir cundante ao seu estado inativo na transcrição O Mediador quando inclui as subunidades inibitórias pode também blo quear a iniciação da transcrição Esse pode ser um meca nismo regulatório para garantir a montagem ordenada do PIC ao atrasar a ativação da transcrição até que todos os fatores necessários estejam presentes ou pode ser um me canismo que ajude a desativar promotores quando a trans crição não é mais necessária Os genes do metabolismo da galactose em leveduras estão sujeitos tanto à regulação positiva quanto negativa Alguns dos princípios gerais descritos acima podem ser ilustrados por um circuito regulatório eucariótico bem es tudado Figura 2830 As enzimas necessárias para a importação e metabolismo de galactose em leveduras são TBP TATA Pol II Mediador Gal80p Gal4p Gal3p SAGA Galactose UASGAL Inr Proteínas HMG Mediador TFIID Pol II TFIID Gal3p Galactose SAGA FIGURA 2830 Regulação da transcrição de genes GAL em leveduras A galactose importada para a célula de levedura é convertida em galacto se6fosfato por uma via que envolve seis enzimas cujos genes estão espa lhados por três cromossomos ver Tabela 283 A transcrição desses genes é regulada pelas ações combinadas das proteínas Gal4p Gal80p e Gal3p com Gal4p desempenhando o papel central de ativador da transcrição O com plexo Gal4pGal80p é inativo A ligação da galactose a Gal3p leva à interação da Gal3p com o complexo Gal80pGal4p e ativa a Gal4p Esta depois recruta SAGA Mediador e TFIID para os promotores da galactose levando ao recru tamento da DNApolimerase II e iniciação da transcrição Nelson6edbookindb 1180 Nelson6edbookindb 1180 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1181 codificadas por genes espalhados por vários cromossomos Tabela 283 Cada um dos genes GAL é transcrito se paradamente e as células de leveduras não têm óperons como aqueles de bactérias Entretanto todos os genes GAL apresentam promotores semelhantes e são regulados co ordenadamente por um conjunto comum de proteínas Os promotores dos genes GAL consistem na TATA box e em sequências Inr bem como de uma sequência ativadora a montante UASG reconhecida pela proteína ativadora de transcrição Gal4 Gal4p A regulação da expressão gênica pela galactose envolve uma ação recíproca entre a Gal4p e duas outras proteínas Gal80p e Gal3p Figura 2830 A Gal80p forma um complexo com a Gal4p impedindo a Gal4p de funcionar como um ativador dos promotores GAL Quando a galactose está presente ela se liga à Gal3p que então interage com o complexo Gal80pGal4p permitindo que a Gal4p funcione como ativador nos vários promoto res de GAL À medida que os vários genes de galactose são induzidos e seus produtos se acumulam a Gal3p pode ser substituída por Gal1p galactocinase necessária para o me tabolismo da galactose que também funciona na regulação para ativação contínua do circuito regulatório Outros complexos proteicos também desempenham papéis na ativação da transcrição dos genes GAL Esses incluem o complexo SAGA para acetilação de histonas e remodelação da cromatina o complexo SWISNF para re modelação da cromatina e o complexo Mediador A proteína Gal4 é responsável pelo recrutamento desses fatores adi cionais necessários para a ativação da transcrição O SAGA pode ser o primeiro e principal alvo de recrutamento para Gal4p A glicose é a fonte de carbono preferida para leveduras assim como para as bactérias Quando a glicose está pre sente a maioria dos genes GAL estando reprimida este ja presente a galactose ou não O sistema regulatório GAL descrito acima é efetivamente substituído por um complexo sistema de repressão de catabólitos que inclui várias proteí nas não mostrado na Figura 2830 Ativadores da transcrição têm estrutura modular Em geral ativadores de transcrição têm um domínio estru tural distinto para a ligação específica do DNA e um ou mais domínios adicionais para ativação da transcrição ou para interação com outras proteínas regulatórias A interação de duas proteínas regulatórias é frequentemente mediada por domínios contendo zíperes de leucina Figura 2814 ou motivos hélicealçahélice Figura 2815 Aqui são abor dados três tipos distintos de domínios estruturais usados na ativação por ativadores de transcrição Figura 2831a Gal4p Sp1 e CTF1 A Gal4p contém uma estrutura semelhante a um dedo de zinco no seu domínio de ligação do DNA perto da termi nação amino esse domínio tem seis resíduos Cys que coor denam Zn 21 A proteína funciona como homodímero com a dimerização mediada pelas interações entre duas espirais espiraladas e se liga à UASG sequência palindrômica de DNA de cerca de 17 pb de comprimento A Gal4p tem um domínio de ativação separado com muitos resíduos de ami noácidos ácidos Experimentos que substituem uma varie dade de diferentes sequências peptídicas pelo domínio de ativação ácido da Gal4p sugerem que a natureza ácida desse domínio seja fundamental para seu funcionamento embora sua sequência precisa de aminoácidos possa variar consideravelmente O Sp1 Mr 80000 é um ativador de transcrição para um grande número de genes nos eucariotos superiores Seu sítio de ligação de DNA a caixa GC sequência consenso GGG CGG está geralmente muito perto da TATA box O domínio de ligação de DNA da proteína Sp1 está próximo da extremi TABELA 283 Genes do metabolismo da galactose em leveduras Gene Função proteica Localização nos cromossomos Tamanho da proteína número de resíduos Expressão proteica relativa usando diferentes fontes de carbono Glicose Glicerol Galactose Genes regulados GAL1 Galactocinase II 528 2 2 111 GAL2 Galactosepermease XII 574 2 2 111 PGM2 Fosfoglicomutase XIII 569 1 1 11 GAL7 Galactose1fosfato uridililtransferase II 365 2 2 111 GAL10 UDPglicose4epime rase II 699 2 2 111 MEL1 aGalactosidase II 453 2 1 11 Genes reguladores GAL3 Indutor IV 520 2 1 11 GAL4 Ativador da transcrição XVI 881 12 1 1 GAL80 Inibidor da transcrição XII 435 1 1 11 Fonte Adaptada de Reece R Platt A 1997 Signaling activation and repression of RNA polymerase II transcription in yeast Bioessays 19 10011010 Nelson6edbookindb 1181 Nelson6edbookindb 1181 030414 0749 030414 0749 1182 DAVID L NELSON MICHAEL M COX dade Cterminal e contém três dedos de zinco Dois outros domínios na Sp1 funcionam na ativação e são notáveis pelo fato de 25 dos seus resíduos de aminoácidos serem Gln Uma ampla variedade de outras proteínas ativadoras tam bém apresenta esses domínios ricos em glutamina O CTF1 fator de transcrição 1 ligado a CCAAT perten ce a uma família de ativadores de transcrição que se ligam a uma sequência chamada de sítio CCAAT sua sequência consenso é TGGN6GCCAA em que N é qualquer nucleotí deo O domínio de ligação de DNA do CTF1 contém mui tos resíduos de aminoácidos básicos e a região de ligação é provavelmente disposta como uma hélice a Essa proteína não apresenta nem um motivo hélicevoltahélice nem um motivo dedo de zinco seu mecanismo de ligação de DNA ainda não é claro O CTF1 tem um domínio de ativação rico em prolina com a Pro sendo responsável por mais de 20 dos resíduos de aminoácidos A ativação distinta e os domínios de ligação do DNA das proteínas regulatórias muitas vezes atuam de modo com pletamente independente como foi demonstrado em expe rimentos de troca de domínios Técnicas de engenharia genética Capítulo 9 podem unir o domínio de ativação rico em prolina do CTF1 ao domínio de ligação de DNA do Sp1 para criar uma proteína que como o Sp1 intacto se liga a caixas GC no DNA e ativa a transcrição em um promotor próximo como na Figura 2831b O domínio de ligação de DNA da Gal4p foi da mesma forma substituído experi mentalmente pelo domínio de ligação de DNA do repres sor LexA de E coli da resposta SOS Figura 2820 Essa proteína quimérica não se liga no UASG nem ativa os genes GAL de leveduras como o faria a Gal4p intacta a menos que a sequência UASG no DNA seja substituída pelo sítio de reconhecimento de LexA A expressão gênica eucariótica pode ser regulada por sinais intercelulares e intracelulares Os efeitos de hormônios esteroides e dos hormônios da ti reoide e retinoide que têm modo de ação semelhante for necem exemplos adicionais bem conhecidos de modulação de proteínas regulatórias de eucariotos pela interação dire ta com sinais moleculares ver Figura 1230 Ao contrário de outros tipos de hormônios os hormônios esteroides não precisam se ligar a receptores de membrana plasmática Em vez disso eles interagem com receptores intracelula res que são eles próprios ativadores de transcrição Hormô nios esteroides p ex estrogênio progesterona e cortisol hidrofóbicos demais para se dissolverem prontamente no sangue são transportados por proteínas carreadoras espe cíficas do seu ponto de liberação a seus tecidoalvo Neles o hormônio passa através da membrana plasmática por di fusão simples Uma vez no interior da célula os hormônios interagem com um de dois tipos de receptor nuclear de li gação de esteroides Figura 2832 Em ambos os casos o complexo hormônioreceptor atua ligandose a sequências de DNA altamente específicas chamadas de elementos de resposta hormonal HRE alterando desse modo a ex pressão gênica Atuando nesses sítios os receptores atuam como ativadores de transcrição recrutando coativadores e a DNApolimerase II junto com seus fatores de transcrição associados para disparar a transcrição do gene As sequências de DNA HRE às quais os complexos receptores de hormônios se ligam são semelhantes em comprimento e arranjo mas diferem em sequência para os diversos hormônios esteroides Cada receptor tem uma sequência consenso HRE Tabela 284 à qual o complexo hormônioreceptor se liga bem com cada consenso consis tindo em duas sequências de seis nucleotídeos contíguos ou separados por três nucleotídeos em tandem ou em ar ranjo de palíndromo Os receptores hormonais têm um do mínio de ligação de DNA altamente conservado com dois dedos de zinco Figura 2833 O complexo hormônio receptor se liga ao DNA como um dímero com os domínios dedo de zinco de cada monômero reconhecendo uma das sequências de seis nucleotídeos A capacidade de um deter minado hormônio agir por meio de um complexo hormônio receptor para alterar a expressão de um gene específico depende da sequência exata do HRE de sua posição relati va no gene e do número de HRE associados ao gene A região de ligação do ligante da proteína receptora sempre na terminação carboxila é muito específica de cada receptor específico Na região de ligação do ligante TBP TATA Inr TBP TATA Inr Pol II Mediador Pol II Mediador Gal4p UASGAL Proteínas HMG DNA b TFIIH TBP GC box CTFI Sp1 P P P Proteínas HMG DNA a TFIIH TBP GC box Sp1 Q Q Q CTFI CCAAT PP P 2 2 2 FIGURA 2831 Ativadores de transcrição a Ativadores típicos como CTF1 Gal4p e Sp1 têm um domínio de ligação de DNA e um domínio de ati vação A natureza do domínio de ativação é indicada por símbolos 2 2 2 acídico Q Q Q rico em glutamina P P P rico em prolina Essas proteínas ge ralmente ativam a transcrição ao interagir com complexos coativadores tais como o Mediador Observe que os sítios de ligação aqui ilustrados não são geralmente encontrados juntos perto de um único gene b Uma proteína quimérica contendo o domínio de ligação de DNA de Sp1 e o domínio de ativação de CTF1 ativa a transcrição se uma caixa GC está presente Nelson6edbookindb 1182 Nelson6edbookindb 1182 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1183 o receptor glicocorticoide é apenas 30 semelhante ao receptor de estrogênio e 17 semelhante ao receptor do hormônio da tireoide O tamanho da região de ligação do ligante varia drasticamente no receptor da vitamina D ela tem apenas 25 resíduos de aminoácidos enquanto no re ceptor mineralocorticoide ela tem 603 resíduos Mutações que alteram um aminoácido nessas regiões podem resultar em perda de resposta a um hormônio específico Algumas pessoas incapazes de responder ao cortisol testosterona vitamina D ou tireoxina têm mutações desse tipo Alguns receptores hormonais incluindo o receptor de progesterona humano ativam a transcrição com a ajuda de um coativador raro ativador de RNA receptor de este roides SRA um RNA de 700 nucleotídeos O SRA atua como parte de um complexo de ribonucleoproteína mas é o componente de RNA que é necessário para a coativação Citoplasma NR dímero Complexo NRhormônio Complexo NRHsp70 Hormônio Hsp70 Membrana plasmática Núcleo Gene alvo Pol II HRE mRNA mRNA DNA DNA Proteína Mudança no funcionamento celular a Citoplasma Hormônio Membrana plasmática Núcleo Gene alvo HRE Coativator Coativador Gene alvo HRE RXR TR mRNA mRNA Proteína Mudança no funcionamento celular b Hormônio LIGADO DESLIGADO Correpressor Correpressor LIGADO Pol II FIGURA 2832 Mecanismos de funcionamento do receptor do hor mônio esteroide Há dois tipos de receptores nucleares ligadores de es teroides a Os receptores monoméricos tipo I NR são encontrados no ci toplasma em um complexo com uma proteína de choque térmico Hsp70 Receptores para estrogênio progesterona androgênios e glicocorticoides são desse tipo Quando o hormônio esteroide se liga Hsp70 se dissocia e o receptor dimeriza expondo um sinal de localização nuclear O receptor di mérico com o hormônio ligado migra para o núcleo onde se liga a um ele mento de resposta hormonal HRE e atua como ativador de transcrição b Receptores tipo II ao contrário estão sempre no núcleo ligados a um HRE no DNA e a um correpressor que lhes torna inativos O receptor do hormônio da tireoide TR é desse tipo O hormônio migra pelo citoplasma e se difun de através da membrana nuclear No núcleo ele se liga a um heterodímero consistindo no receptor do hormônio da tireoide e do receptor retinoide X RXR Uma mudança na sua conformação leva à dissociação do correpressor e o receptor então funciona como ativador de transcrição TABELA 284 Elementos de resposta a hormônio HRE ligados por receptores de hormônios do tipo esteroide Receptor Sequência consenso a que se liga Androgênio GGATACAN2TGTTCT Glicocorticoide GGTACAN3TGTTCT Ácido retinoico alguns AGGTCAN5AGGTCA Vitamina D AGGTCAN3AGGTCA Hormônio da tireoide AGGTCAN3AGGTCA RX AGGTCANAGGTCANAG GTCANAGGTCA N representa qualquer nucleotídeo Forma um dímero com o receptor do ácido retinoico ou com o receptor da vitamina D Zn Q A H3N COO 1 2 Ligação de hormônio sequência e comprimento variáveis Ligação de DNA resíduos 6668 altamente conservados Ativação da transcrição sequência e comprimento variáveis Dedos de zinco K N D I T R R K S G Y S A Y D N H Y G 10 50 20 60 30 40 70 80 V W S Q N TA P MKETRY KAFFKRSIQGHNDYM RLRKCYEVGMMKGGIRKDRRGG E G Zn V A C C C C C C C C FIGURA 2833 Típicos receptores do hormônio esteroide Estas pro teínas receptoras têm um sítio de ligação para o hormônio um domínio de ligação de DNA e uma região que ativa a transcrição do gene regulado O domínio de ligação de DNA altamente conservado tem dois dedos de zinco A sequência mostrada aqui é a do receptor de estrogênio mas os resíduos em negrito são comuns a todos os receptores do hormônio esteroide Nelson6edbookindb 1183 Nelson6edbookindb 1183 030414 0749 030414 0749 1184 DAVID L NELSON MICHAEL M COX da transcrição O conjunto detalhado de interações entre o SRA e outros componentes dos sistemas regulatórios para esses genes ainda precisa ser elucidado A regulação pode resultar da fosforilação de fatores de transcrição nuclear Foi observado no Capítulo 12 que os efeitos da insulina na expressão gênica são mediados por uma série de etapas le vando em última análise à ativação de uma proteínacinase no núcleo que fosforila proteínas de ligação de DNA específi cas alterando sua habilidade de atuar como fatores de trans crição ver Figura 1215 Esse mecanismo geral controla os efeitos de vários hormônios não esteroides Por exemplo a via b adrenérgica que leva a níveis elevados de cAMP cito sólico que atua como mensageiro secundário em eucariotos bem como em bactérias ver Figuras 124 2817 também afeta a transcrição de um conjunto de genes cada um dos quais localizado perto de uma sequência de DNA específica chamada de elemento de resposta de cAMP CRE A subunidade catalítica da proteínacinase A liberada quando os níveis de cAMP aumentam ver Figura 126 entra no nú cleo e fosforila uma proteína nuclear a proteína de ligação de CRE CREB Quando fosforilada a CREB se liga aos CRE perto de certos genes e atua como um fator de transcri ção ligando a expressão desses genes Muitos mRNA de eucariotos estão sujeitos à repressão da tradução A regulação no nível da tradução assume um papel de mui to mais destaque em eucariotos do que em bactérias e é observada em uma série de situações celulares Ao contrá rio da estreita associação entre transcrição e tradução em bactérias os transcritos gerados em um núcleo eucariótico devem ser processados e transportados ao citoplasma an tes da tradução Isso pode impor uma demora significativa no aparecimento de uma proteína É necessário um rápido aumento na produção de proteínas quando um mRNA re primido na tradução já presente no citoplasma pode ser ativado para a tradução sem demora A regulação da tradu ção pode desempenhar um papel especialmente importante na regulação de determinados genes muito longos de euca riotos alguns são medidos em milhões de pares de bases para os quais a transcrição e o processamento do mRNA podem durar muitas horas Alguns genes são regulados tan to nos estágios de transcrição como nos de tradução os úl timos desempenhando um papel de ajuste fino nos níveis de proteínas celulares Em algumas células anucleadas como reticulócitos eritrócitos imaturos o controle da transcri ção está inteiramente ausente e o controle da tradução dos mRNA armazenados se torna essencial Como descrito a seguir os controles na tradução podem também ter signifi cado espacial durante o desenvolvimento quando a tradu ção regulada dos mRNA préposicionados cria um gradiente local do produto proteico Os eucariotos têm pelo menos quatro mecanismos prin cipais de regulação da tradução 1 Fatores de iniciação da tradução estão sujeitos à fosforilação por proteínascinases Em geral as for mas fosforiladas são menos ativas e provocam uma diminuição geral da tradução na célula 2 Algumas proteínas se ligam diretamente ao mRNA e atuam como repressores da tradução muitos dos quais se ligando a sítios específicos na região 39 não traduzida 39UTR Posicionadas dessa forma es sas proteínas interagem com outros fatores de ini ciação de transcrição ligados ao mRNA ou com a subunidade ribossomal 40S para impedir a iniciação da tradução Figura 2834 3 Proteínas de ligação presentes em eucariotos des de leveduras a mamíferos interrompem a interação entre eIF4E e eIF4G ver Figura 2728 As versões dos mamíferos são conhecidas como 4EBPs pro teínas de ligação eIF4E Quando o crescimento ce lular é lento essas proteínas limitam a tradução ao se ligarem ao local em eIF4E que normalmente in teragem com eIF4G Quando o crescimento celular é retomado ou aumenta em resposta aos fatores de crescimento ou outros estímulos as proteínas de li gação são inativadas pela fosforilação de proteínas dependentes de cinase 4 A regulação da expressão gênica mediada por RNA abordada posteriormente frequentemente ocor re no nível da repressão da tradução A variedade de mecanismos de regulação da tradução fornece flexibilidade permitindo a repressão centrada em alguns poucos mRNA ou regulação global de toda a tradução celular A regulação da tradução foi particularmente bem estudada em reticulócitos Um mecanismo em tais células envolve o eIF2 o fator de iniciação que se liga ao tRNA iniciador e o transporta até o ribossomo quando o MettRNA se liga ao sítio P o fator eIF2B se liga ao eIF2 reciclandoo com a ajuda da ligação de GTP e sua hidrólise A maturação dos reticulócitos inclui a destruição do núcleo celular deixando para trás uma membrana plasmática carregada de hemoglo bina Os RNA mensageiros depositados no citoplasma antes AA AA AA AA A Região 39 não traduzida UTR eIF4F eIF4E eIF4G eIF4A eIF3 Cap 59 40S AUG Proteína de ligação de Poli A PAB 39 Repressores de tradução FIGURA 2834 Regulação da tradução do mRNA eucariótico Um dos mecanismos mais importantes para a regulação da tradução em eucariotos envolve a ligação de repressores da tradução proteínas de ligação de RNA a sítios específicos na região 39 não traduzida 39 UTR do mRNA Essas proteí nas interagem com os fatores de iniciação eucarióticos ou com o ribossomo para impedir ou tornar mais lenta a tradução Nelson6edbookindb 1184 Nelson6edbookindb 1184 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1185 da perda do núcleo permitem a reposição de hemoglobina Quando os reticulócitos se tornam deficientes em ferro ou grupos heme a tradução de mRNA de globina é reprimida Uma proteínacinase chamada HCR repressor contro lado por hemina é ativada catalisando a fosforilação do eIF2 Quando fosforilado o eIF2 forma um complexo está vel com o eIF2B que sequestra o eIF2 tornandoo indispo nível para participar da tradução Desse modo o reticulóci to coordena a síntese de globina com a disponibilidade de grupos heme Muitos exemplos adicionais de regulação da tradução foram encontrados em estudos do desenvolvimento de or ganismos pluricelulares como discutido com mais detalhe a seguir O silenciamento gênico póstranscrição é mediado por RNA de interferência Em eucariotos superiores incluindo nematódeos moscas dafruta plantas e mamíferos uma classe de pequenos RNA chamados de microRNA miRNA está envolvida no silenciamento de vários genes Em um fenômeno primeiro des crito por Craig Mello e Andrew Fire os RNA funcionam ao in teragirem com mRNA frequen temente na 39UTR resultando ou na degradação do mRNA ou na inibição da tradução Em qualquer caso o mRNA e portanto o gene que o pro duz é silenciado Essa forma de regulação gênica controla o tempo de desenvolvimento em pelo menos alguns organismos Ela também é usada como um mecanismo de proteção contra vírus de RNA invasores par ticularmente importantes em plantas que não possuem sis tema imune e para controlar a atividade de transposons Além disso pequenas moléculas de RNA podem desempenhar um papel importante mas ainda indefinido na formação da he terocromatina Muitos miRNA estão presentes apenas transitoriamen te durante o desenvolvimento sendo às vezes chamados de pequenos RNA temporais stRNA do inglês small temporal RNA Milhares de diferentes miRNA foram iden tificados em eucariotos superiores e eles podem afetar a regulação de um terço dos genes de mamíferos Eles são transcritos como RNA precursores de cerca de 70 nucleo tídeos de comprimento com sequências complementares internas que formam estruturas em grampo Detalhes da via para processamento de miRNA foram descritos no Capítu lo 26 ver Figura 2627 Os precursores são clivados por endonucleases como Drosha e Dicer para formar duplexes curtos de cerca de 20 a 25 nucleotídeos de comprimento Uma fita de miRNA processado é transferida para o mRNA alvo ou para o RNA de um vírus ou transposon levan do à inibição da tradução ou degradação do RNA Figura 2835 Alguns miRNA se ligam e afetam um único mRNA e portanto afetam a expressão de apenas um único gene Outros interagem com muitos mRNA e assim formam o nú cleo mecânico dos regulons que coordenam a expressão de muitos genes O mecanismo de regulação gênica tem um lado prático interessante e muito útil Se um pesquisador introduz em um organismo uma molécula dupla de RNA corresponden do em sequência a praticamente qualquer mRNA o Dicer quebra o duplex em segmentos pequenos chamados de pequenos RNA interferentes siRNA do inglês small interfering RNA Esses se ligam ao mRNA e o silenciam Figura 2835b O processo é conhecido como RNA de in terferência RNAi Em plantas praticamente qualquer gene pode ser desligado dessa maneira Nematódeos inge rem prontamente RNA funcionais inteiros e simplesmente introduzindo o RNA duplo na dieta do verme se produz uma supressão muito eficiente do genealvo A técnica rapida mente se tornou uma ferramenta importante nos esforços em andamento para estudar o funcionamento de genes pois ela pode interromper o funcionamento do mesmo sem criar um organismo mutante O procedimento também pode ser aplicado a humanos Os siRNA produzidos em la boratório foram usados para bloquear infecções por HIV e vírus da pólio em culturas de células humanas por cerca de uma semana por vez Progressos rápidos na pesquisa so Craig Mello Andrew Fire Precursor RNA duplo stRNA Degradação mRNA silenciado Inibição da tradução AAAAn siRNA Dicer Dicer a b FIGURA 2835 Silenciamento gênico por RNA de interferência a RNA pequenos temporais stRNA uma classe de miRNA são gerados por quebra mediada por Dicer de precursores mais longos que se dobram para criar regiões duplas Os stRNA então se ligam aos mRNA levando à degra dação de mRNA ou inibição da tradução b Os RNA fita dupla podem ser construídos e introduzidos em uma célula O Dicer processa os RNA duplos em pequenos RNA interferentes siRNA que interagem com o mRNAalvo Mais uma vez o mRNA é degradado ou a tradução é inibida Nelson6edbookindb 1185 Nelson6edbookindb 1185 030414 0749 030414 0749 1186 DAVID L NELSON MICHAEL M COX bre RNA de interferência tornam esse um campo promissor para avanços médicos futuros A regulação da expressão gênica mediada por RNA assume várias formas em eucariotos Os RNA de função especial em eucariotos incluem os miR NA descritos acima os snRNA envolvidos no splicing do RNA ver Figura 2616 e os snoRNA envolvidos na modi ficação do rRNA ver Figura 2625 Todos os RNA que não codificam proteínas incluindo os rRNA e tRNA recebem a designação geral de ncRNA RNA não codificadores do inglês noncoding RNA Os genomas de mamíferos pare cem codificar mais RNAnc do que mRNA codificadores ver Quadro 264 De modo não surpreendente classes funcio nais adicionais de RNAnc ainda estão sendo descobertas Muitos dos exemplos encontrados recentemente intera gem com proteínas em vez de com RNA e afetam o funcio namento das proteínas ligadas O SRA que funciona como um coativador dos genes sensíveis ao hormônio esteroide é um exemplo ele afeta a ativação da transcrição A res posta de choque térmico em células humanas fornece outro exemplo O fator de choque térmico 1 HSF1 é uma pro teína ativadora que em células não estressadas existe em forma de monômero ligado pela chaperona Hsp90 Sob con dições de estresse o HSF1 é liberado da Hsp90 e trimeriza O trímero do HSF1 se liga ao DNA e ativa a transcrição de genes cujos produtos são necessários para lidar com o es tresse Um ncRNA chamado HSR1 RNA de choque térmico 1 600 nucleotídeos estimula a trimerização do HSF1 e a ligação do DNA O HSR1 não atua sozinho ele funciona em um complexo com o fator de alongamento da tradução eEF1A RNA adicionais afetam a transcrição de várias maneiras Além do seu papel no splicing ver Figura 2616 o snRNA U1 se liga diretamente ao fator de transcrição TFIIH Sua função nesse contexto ainda não está clara mas ele pode regular o TFIIH ou afetar a associação entre transcrição e splicing ou ambos Um ncRNA de 331 nucleotídeos cha mado 7SK abundante em mamíferos se liga ao fator pTE Fb de alongamento da transcrição da Pol II ver Tabela 26 2 e reprime o alongamento do transcrito Outro ncRNA B2 178 nucleotídeos se liga diretamente à Pol II du rante o choque térmico e reprime a transcrição A Pol II ligada ao B2 se reúne em PIC estáveis mas a transcrição é bloqueada O RNA B2 portanto interrompe a transcrição de vários genes durante o choque térmico e o mecanismo que permite que os genes sensíveis a HSF1 se expressem na presença de B2 ainda precisa ser desvendado Os papéis reconhecidos desempenhados por ncRNA na expressão gênica e em muitos outros processos celulares estão se expandindo rapidamente Ao mesmo tempo o es tudo da bioquímica da regulação gênica está se tornando muito menos centrado em proteínas O desenvolvimento é controlado por cascatas de proteínas regulatórias Em virtude de sua absoluta complexidade e coordenação intricadas os padrões de regulação gênica que acarretam o desenvolvimento de um zigoto em animais ou plantas pluri celulares não apresentam paralelo O desenvolvimento pre ciso de transições na morfologia e na composição de proteí nas que dependem de alterações fortemente coordenadas na expressão do genoma Mais genes são expressos durante o desenvolvimento inicial do que em qualquer outra fase do ciclo de vida Por exemplo no ouriçodomar um oócito tem cerca de 18500 mRNA diferentes comparados com os cerca de 6000 mRNA diferentes nas células de um tecido diferenciado típico Os mRNA no oócito dão origem a uma cascata de eventos que regulam a expressão de muitos ge nes tanto ao longo do tempo quanto do espaço Vários organismos emergiram como sistemas modelo importantes para o estudo do desenvolvimento porque são fáceis de serem mantidos em laboratório e têm tempos de geração relativamente curtos Eles incluem nematódeos moscasdafruta peixeszebra camundongos e a planta Arabidopsis Essa discussão se concentra no desenvolvi mento da moscadafruta Nossa compreensão dos eventos moleculares durante o desenvolvimento de Drosophila me lanogaster está particularmente avançada e pode ser usada para ilustrar padrões e princípios de significado geral O ciclo de vida da moscadafruta inclui a metamorfo se completa durante sua progressão de um embrião para Embrião tardio segmentado Pupa Larva Dia 9 Adulto T1 T1 T1 T2 T2 T2 T3 T3 T3 A1 A1 A1 A2 A2 A2 A3 A3 A3 A4 A4 A4 A5 A5 A5 A6 A6 A6 A7 A7 A7 Oócito Embrião inicial sem segmentos Dia 0 Zigoto Dia 1 Eclosão Dia 5 Pupação Fertilização Desenvolvimento embrionário Metamorfose Três estágios larvais separados por mudas 1 mm Abdome Tórax Cabeça FIGURA 2836 Ciclo de vida da mos cadafruta Drosophila melanogaster A Drosophila passa por metamorfose completa ou seja a forma do inseto adul to é radicalmente diferente daquelas dos seus estágios imaturos uma transforma ção que precisa de alterações extensas durante o desenvolvimento Ao final do estágio embrionário os segmentos se formaram cada um contendo estruturas especializadas a partir das quais se de senvolverão os vários apêndices e outras características da mosca adulta Nelson6edbookindb 1186 Nelson6edbookindb 1186 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1187 um adulto Figura 2836 Entre as características mais importantes do embrião estão sua polaridade as partes anteriores e posteriores do animal são prontamente reco nhecidas bem como suas partes dorsal e ventral e sua metameria o corpo do embrião é composto por segmen tos repetidos em série cada um deles com traços caracte rísticos Durante o desenvolvimento esses segmentos se organizam em cabeça tórax e abdome Cada segmento do tórax do adulto tem um conjunto diferente de apêndices O desenvolvimento desse padrão complexo está sob controle genético e foram descobertos vários genes reguladores de padrões que afetam drasticamente a organização do corpo O ovo de Drosophila junto com 15 células protetoras é circundado por uma camada de células foliculares Figura 2837 À medida que a célula ovo se forma antes da fe cundação os mRNA e proteínas que se originam das célu las protetoras e foliculares são depositados no interior da célulaovo onde alguns deles desempenham um papel críti co no desenvolvimento Assim que um óvulo fecundado é depositado seu núcleo se divide e seus núcleos descenden tes continuam a se dividir em sincronia a cada 6 a 10 minu tos Membranas plasmáticas não se formam em torno dos núcleos distribuídos no interior do citoplasma do ovo for mando um sincício Entre a oitava e nona rodadas da divi são nuclear os núcleos migram para a camada externa do ovo formando uma monocamada de núcleos envolvendo o citoplasma comum rico em vitelo tratase da sincício blas toderme Após algumas divisões adicionais as invaginações de membrana envolvem os núcleos para criar uma camada de células que formam uma blastoderme celular Nesse es tágio os ciclos mitóticos nas várias células perdem sua sin cronia O destino do desenvolvimento das células é deter minado pelos mRNA e proteínas originalmente depositados no ovo pelas células protetoras e foliculares As proteínas que por meio de alterações na concentra ção local ou atividade fazem o tecido circundante adotar um formato ou estrutura particular são algumas vezes cha madas de morfógenos elas são os produtos de genes re guladores de padrões Como definido por Christiane NüssleinVolhard Edward B Lewis e Eric F Wieschaus três classes principais de genes reguladores de pa drão genes maternos de segmentação e homeóticos funcionam em estágios su cessivos do desenvolvimento para especificar as carac Christiane NüssleinVolhard FIGURA 2837 Desenvolvimento inicial em Drosophila Durante o desenvolvimento do ovo os mRNA maternos incluindo os transcritos dos genes bicoid e nanos discutidos no texto e as proteínas são depositadas no oócito em desenvolvimento célula ovo não fecundada por células prote toras e foliculares Após a fecundação os dois núcleos do ovo fecundado se dividem em sincronia no interior do citoplasma comum sincício migrando então para a periferia Invaginações de membrana envolvem os núcleos para criar uma monocamada de células na periferia esse é o estágio de blastoder me celular Durante as divisões nucleares iniciais vários núcleos na extremi dade posterior se tornam células polo que mais tarde se tornam células da linhagem germinativa Células protetoras Células foliculares Oócito Câmara do ovo Células prote toras Oócito Oócito Células foliculares Oócito maduro Posterior Anterior Fecundação Zigoto Divisões nucleares Sincício Migração nuclear Blastoderme sincicial Células polo Invaginação da membrana Blastoderme celular Nelson6edbookindb 1187 Nelson6edbookindb 1187 030414 0749 030414 0749 1188 DAVID L NELSON MICHAEL M COX terísticas básicas do corpo do embrião de Drosophila Os genes maternos são expressos no óvulo não fertilizado e os mRNA maternos resultantes permanecem dormentes até a fertilização Eles fornecem a maioria das proteínas necessárias bem no início do desenvolvimento até que a blastoderme celular esteja formada Algumas das proteínas codificadas por mRNA maternos dirigem a organização es pacial do embrião em desenvolvimento nos estágios iniciais estabelecendo sua polaridade Os genes de segmenta ção transcritos após a fecundação orientam a formação do número adequado de segmentos corporais Pelo menos três classes de genes de segmentação atuam em estágios sucessivos os genes gap dividem o embrião em desenvol vimento em várias regiões grandes e os genes pairrule junto com os genes da polaridade do segmento definem 14 listras que se tornam os 14 segmentos de um embrião normal Os genes homeóticos são expressos ainda mais tarde eles especificam quais órgãos e apêndices irão se de senvolver em segmentos corporais específicos Os vários genes regulatórios nessas três classes orien tam o desenvolvimento da mosca adulta com cabeça tó rax e abdome com o número adequado de segmentos e com os apêndices corretos em cada segmento Embora a embriogênese leve cerca de um dia para se completar todos esses genes são ativados durante as primeiras qua tro horas Alguns mRNA e proteínas estão presentes por apenas alguns minutos em pontos específicos durante esse período Alguns dos genes codificam fatores de transcri ção que afetam a expressão de outros genes em um tipo de cascata de desenvolvimento Também ocorre regulação no nível da tradução e muitos dos genes reguladores codi ficam repressores de tradução a maioria dos quais se liga à 39UTR do mRNA Figura 2834 Como muitos mRNA são depositados no ovo muito antes de sua tradução ser necessária a repressão da tradução fornece uma ampla via especialmente importante para a regulação em vias de de senvolvimento Genes maternos Alguns genes maternos são expressos no interior das células protetoras e foliculares e alguns no pró prio ovo No óvulo não fertilizado de Drosophila os pro dutos dos genes maternos estabelecem dois eixos ante roposterior e dorsoventral e assim definem quais regiões do ovo radialmente simétrico se desenvolverão na cabeça e abdome e na parte de cima e de baixo da mosca adulta Se todas as células se dividissem para produzir duas células filhas idênticas os organismos pluricelulares nunca seriam mais do que uma bola de células idênticas A produção de diferentes destinos celulares necessita de divisões celulares assimétricas programadas Um evento chave no desenvolvi mento inicial é o estabelecimento de gradientes de RNA e proteínas ao longo dos eixos corporais Alguns mRNA ma ternos têm produtos proteicos que se difundem através do citoplasma para criar uma distribuição assimétrica no ovo Portanto diferentes células na blastoderme celular herdam diferentes quantidades dessas proteínas colocando as cé lulas em diferentes vias de desenvolvimento Os produtos dos mRNA maternos incluem ativadores ou repressores de transcrição bem como repressores de tradução todos regulando a expressão de outros genes reguladores de pa drão Os padrões resultantes específicos e sequências de expressão gênica diferem portanto entre diferentes linha gens celulares em última análise orquestrando o desenvol vimento de cada estrutura do adulto O eixo anteroposterior em Drosophila é definido pelo menos em parte pelos produtos dos genes bicoid e nanos O produto do gene bicoid é um importante morfógeno an terior e o produto do gene nanos é um importante morfó geno posterior O mRNA do gene bicoid é sintetizado pelas células protetoras e depositado no ovo não fertilizado perto do seu polo anterior NüssleinVolhard descobriu que esse mRNA é traduzido logo após a fecundação e a proteína Bi coid se difunde através da célula para criar na sétima di visão nuclear um gradiente de concentração irradiando a partir do polo anterior Figura 2838a A proteína Bicoid é um fator de transcrição que ativa a expressão de vários genes de segmentação a proteína contém um homeodomí nio p 1163 A Bicoid também é um repressor de tradu ção que inativa certos mRNA As quantidades de proteína Bicoid em várias partes do embrião afetam a expressão seguinte de outros genes de uma maneira dependente de limiar Os genes são ativados por transcrição ou reprimi dos por tradução apenas onde a concentração de proteína Bicoid excede o limite Mudanças na forma do gradiente de concentração de Bicoid apresentam efeitos drásticos no pa drão do corpo A ausência de proteína Bicoid resulta no de senvolvimento de um embrião com dois abdomes mas sem cabeça ou tórax Figura 2838b entretanto embriões sem Bicoid irão se desenvolver normalmente se uma quantidade adequada de mRNA bicoid for injetada no ovo na extre midade apropriada O gene nanos tem um papel análogo mas o seu mRNA é depositado na extremidade posterior do ovo e o gradiente anteroposterior de proteína atinge seu pico no polo posterior A proteína Nanos é um repressor da tradução Um olhar mais amplo dos efeitos dos genes maternos re vela o esboço de um circuito de desenvolvimento Além dos mRNA bicoid e nanos depositados assimetricamente no ovo vários outros mRNA maternos são depositados unifor memente no citoplasma do ovo Três desses mRNA codifi cam as proteínas Pumilio Hunchback e Caudal todas afeta das por nanos e bicoid Figura 2839 Caudal e Pumilio estão envolvidas no desenvolvimento da extremidade pos terior da mosca Caudal é uma ativadora da transcrição com um homeodomínio Pumilio é um repressor de tradução A proteína Hunchback desempenha um papel importante no desenvolvimento da extremidade anterior e também é um regulador da transcrição de vários genes em alguns casos Edward B Lewis 19182004 Eric F Wieschaus Nelson6edbookindb 1188 Nelson6edbookindb 1188 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1189 um regulador positivo em outros casos negativo A Bicoid suprime a tradução de caudal na extremidade anterior e também atua como ativador da transcrição de hunchback na blastoderme celular Como hunchback é expresso tanto a partir de mRNA quanto de genes no ovo em desenvolvi mento ele é considerado tanto um gene materno quanto um gene de segmentação O resultado das atividades de Bicoid é um aumento da concentração de Hunchback na extremidade anterior do ovo As proteínas Nanos e Pumilio atuam como repressores de tradução de hunchback supri mindo a síntese de sua proteína próximo da extremidade posterior do ovo Pumilio não funciona na ausência da pro teína Nanos e o gradiente da expressão de Nanos confina a atividade de ambas as proteínas à região posterior A re pressão da tradução do gene hunchback leva à degradação do mRNA de hunchback perto da extremidade posterior Entretanto a ausência de Bicoid na extremidade posterior Larva normal Ovo normal 100 Concentração relativa de proteína Bicoid Bcd 0 0 100 50 Distância da extremidade anterior do comprimento do ovo Concentração relativa de proteína Bicoid Bcd Distância da extremidade anterior do comprimento do ovo Normal a Ovo bcd2bcd2 b Larva duplo posterior 100 0 0 100 50 Mutante bcd2 bcd2 FIGURA 2838 Distribuição de um produto do gene materno em um ovo de Drosophila a Micrografia de um ovo marcado imunologica mente mostrando a distribuição do produto do gene bicoid bcd O gráfico mede a intensidade da marcação Essa distribuição é essencial para o de senvolvimento normal das estruturas anteriores b Se o gene bcd não for expresso pela mãe mutante bcd 2bcd 2 e portanto nenhum mRNA bicoid for depositado no ovo o embrião resultante tem duas regiões posteriores e logo morre FIGURA 2839 Circuitos regulatórios do eixo anteroposterior em um ovo de Drosophila Os mRNA bicoid e nanos estão localizados perto dos polos anterior e posterior respectivamente Os mRNA caudal hunchback e pumilio estão distribuídos uniformemente por todo o citoplasma do ovo Os gradientes das proteínas Bicoid Bcd e Nanos afetam a expressão dos mRNA caudal e hunchback como mostrado levando à acumulação da proteína Hunchback na região anterior e de proteína Caudal na região posterior do ovo Como a proteína Pumilio precisa da proteína Nanos para sua atividade como um repressor da tradução de hunchback ela funciona apenas na ex tremidade posterior Posterior Anterior Bicoid Bicoid reprime caudal na região anterior Bicoid ativa Hunchback na região anterior Nanos e Pulmilio reprimem Hunchback na região posterior Bicoid localizada perto da extremidade anterior Nanos localizada perto da extremidade posterior Nanos Hunchback Pulmilio A tradução do mRNA e difusão dos produtos cria gradientes de concentração no embrião Pulmilio é distribuída uniformemente mas precisa de Nano para reprimir Hunchback funciona apenas na região posterior Caudal Nelson6edbookindb 1189 Nelson6edbookindb 1189 030414 0749 030414 0749 1190 DAVID L NELSON MICHAEL M COX leva à expressão de caudal Desse modo as proteínas Hun chback e Caudal se tornam distribuídas assimetricamente distribuídas no ovo Genes de segmentação Genes gap genes pairrule e genes de polaridade de segmentos três subclasses de genes de segmentação em Drosophila são ativados em estágios sucessivos do desenvolvimento embrionário A expressão dos genes gap é geralmente regulada pelos produtos de um ou mais genes maternos Pelo menos alguns dos genes gap codificam fatores de transcrição que afetam a expres são de outros genes de segmentação ou posteriormente genes homeóticos Um gene de segmentação bem caracterizado é fushi ta razu ftz da subclasse pairrule Quando ftz é deletado o embrião desenvolve 7 segmentos em vez dos 14 normais cada segmento duas vezes a largura normal A proteína Fushitarazu Ftz é um ativador de transcrição com um homeodomínio Os mRNA e proteínas derivadas do gene ftz normal acumulam em um padrão impressionante de sete listras que envolvem os dois terços posteriores do em brião Figura 2840 As listras demarcam as posições de segmentos que se desenvolvem mais tarde esses segmen tos são eliminados se o funcionamento da ftz é perdido A proteína Ftz e algumas poucas proteínas regulatórias simi lares regulam direta ou indiretamente a expressão de um grande número de genes na cascata de desenvolvimento contínua Genes homeóticos Um conjunto de 8 a 11 genes homeóti cos dirige a formação de estruturas particulares em locais específicos no plano corporal Esses genes são agora mais comumente chamados de genes Hox termo derivado de homeobox a sequência gênica conservada que co difica o homeodomínio e está presente em todos esses genes Apesar do nome essas não são as únicas proteí nas relacionadas ao desenvolvimento que incluem um homeodomínio p ex o produto do gene bicoid descri to acima tem um homeodomínio e Hox é mais uma classificação funcional do que estrutural Os genes Hox estão organizados em grupos genômicos Drosophila tem um desses grupos e os mamíferos têm quatro Figura 2841 Os genes nesses grupos são notavelmente seme lhantes de nematódeos ao homem Em Drosophila cada um dos genes Hox é expresso em um segmento particular do embrião e controla o desenvolvimento da parte cor a Visão lateral b Visão dorsal de corte transversal Faixas do gene ftz Faixas do gene ftz 100 m m FIGURA 2840 Distribuição do produto do gene fushitarazu ftz em embriões iniciais de Drosophila a Empregando uma metodologia de marcação geneespecífica o produto gênico pode ser detectado em sete bandas em torno da circunferência do embrião Essas bandas b aparecem como pontos escuros geradas por um marcador radioativo em uma au torradiografia de secção transversal e demarcam as margens anteriores dos segmentos que aparecerão no embrião tardio HOMC adbA adbB Ubx HoxA HoxB HoxC HoxD Ser Antp Dfd pb lab B9 B8 B7 B6 B5 B4 B3 B2 B1 A13 A10 A11 A9 A7 A6 A5 A4 A3 A2 A1 C13 D10 D11 D12 D13 D9 D8 D4 D3 D1 Drosophila Humano C10 C11 C12 C9 C8 C6 C5 C4 a b adbB adbA Ubx Antp Ser Dfd lab Cabeça Dfd pb lab adbB adbA Tórax Abdome Ubx Antp Ser pb FIGURA 2841 Os grupos de genes Hox e seus efeitos no desenvol vimento a Cada gene Hox na moscadafruta é responsável pelo desen volvimento de estruturas em uma parte definida do corpo e é expressa em regiões definidas do embrião como mostrado aqui com códigos de cores b Drosophila tem um grupo de genes Hox o genoma humano tem quatro Muitos desses genes são altamente conservados em animais pluricelulares Relações evolutivas indicadas pelos alinhamentos de sequência entre o grupo de genes Hox em Drosophila e aqueles nos grupos de genes Hox em mamíferos são mostradas por linhas tracejadas Relações semelhantes entre quatro conjuntos de genes Hox de mamíferos são indicadas por alinhamen to vertical Nelson6edbookindb 1190 Nelson6edbookindb 1190 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1191 respondente da mosca adulta A terminologia usada para descrever os genes Hox pode ser confusa Eles têm no mes históricos na moscadafruta p ex ultrabithorax enquanto em mamíferos são designados por dois sistemas concorrentes com base em grupos de letras A B C D ou números 1 2 3 4 A perda dos genes Hox em moscasdafruta por mu tação ou deleção provoca o aparecimento de um apên dice normal ou estrutura corporal em uma posição cor poral inadequada Um exemplo importante é o gene ultrabithorax ubx Quando o funcionamento de Ubx é perdido o primeiro segmento abdominal se desenvolve incorretamente tendo a estrutura do terceiro segmento torácico Outras mutações homeóticas conhecidas provo cam a formação de um conjunto extra de asas ou duas patas na posição da cabeça em que antenas são normal mente encontradas Figura 2842 Geralmente os ge nes Hox abrangem longas regiões do DNA O gene ubx por exemplo tem 77000 pb de comprimento Mais de 73000 pb desse gene são íntrons um dos quais tem mais de 50000 pb de comprimento A transcrição do gene ubx leva aproximadamente uma hora Acreditase que o atra so que isso impõe à expressão gênica de ubx seja um me canismo de tempo envolvido na regulação temporal das etapas seguintes do desenvolvimento Muitos genes Hox são regulados adicionalmente por miRNA codificados por regiões intergênicas de grupos de genes Hox Todos os produtos de genes Hox são em si fatores de transcrição que regulam a expressão de uma série de genes situados a jusante A identificação desses alvos situados a jusante está em andamento Muitos dos princípios de desenvolvimento destaca dos anteriormente se aplicam a outros eucariotos de ne matódeos a humanos Algumas das proteínas reguladoras são conservadas Por exemplo os produtos dos genes que contêm homeobox HOXA7 em camundongos e antenna pedia em moscadafruta diferem em apenas um resíduo de aminoácido É claro que embora os mecanismos regu latórios moleculares possam ser semelhantes muitos dos eventos finais do desenvolvimento não são conservados os seres humanos não têm asas ou antenas Os diferentes re sultados são devidos a diferenças nos genesalvo a jusante controlados pelos genes Hox A descoberta de determinan tes estruturais com funções moleculares identificáveis é a primeira etapa na compreensão dos eventos moleculares subjacentes ao desenvolvimento À medida que mais genes e seus produtos proteicos forem descobertos o lado bioquí mico desse vasto quebracabeça será elucidado em detalhes cada vez mais ricos Célulastronco têm potencial de desenvolvimento que pode ser controlado Entendendo o desenvolvimento e os mecanismos da regu lação gênica por trás dele é possível controlálo Um hu mano adulto tem muitos tipos de tecidos diferentes Muitas das células se diferenciam definitivamente e não mais se dividem Se um órgão funciona defeituosamente em razão de doença ou um membro é perdido em um acidente os te cidos não são prontamente repostos A maioria das células não é facilmente reprogramada em virtude dos processos regulatórios em curso ou mesmo devido à perda de par te ou de todo o DNA genômico A medicina possibilitou a realização de transplantes mas os doadores de órgãos são uma fonte limitada e a rejeição de órgãos permanece um importante problema médico Se os seres humanos conse guissem regenerar seus próprios órgãos membros ou teci do nervoso a rejeição não seria mais um problema Curas reais para a falência renal ou distúrbios neurodegenerati vos se tornariam realidade a b c d FIGURA 2842 Efeitos de mutações nos genes Hox em Drosophila a Cabeça normal b Mutante homeótico antennapedia em que as antenas são substituídas por patas c Estrutura corporal normal d Mutante home ótico bithorax em que um segmento se desenvolveu incorretamente para produzir um conjunto extra de asas Nelson6edbookindb 1191 Nelson6edbookindb 1191 030414 0749 030414 0749 1192 DAVID L NELSON MICHAEL M COX A chave para a regeneração de tecidos se encontra nas célulastronco células que retiveram a capacidade de se diferenciar em vários tecidos Em seres humanos depois que um óvulo é fecundado as primeiras divisões celulares criam uma bola de células totipotentes a mórula cé lulas com a capacidade de se diferenciar individualmente em qualquer tecido ou mesmo em um organismo comple to Figura 2843 A divisão celular contínua produz uma bola oca um blastocisto As células mais externas do blas tocisto acabam formando a placenta As camadas mais in ternas formam as camadas germinativas do feto em desen volvimento o ectoderma mesoderma e endoderma Essas células são pluripotentes originam células de todas as três camadas germinativas e se diferenciam em muitos ti pos de tecidos Entretanto não se diferenciam em um orga nismo completo Algumas dessas células são unipotentes desenvolvemse em apenas um tipo de célula eou tecido São as células pluripotentes do blastocisto as células tronco embrionárias atualmente usadas na pesquisa de célulastronco embrionárias As célulastronco têm duas funções repor a si mesmas e ao mesmo tempo fornecer células que podem se diferen ciar Essas tarefas são realizadas de muitas maneiras Fi gura 2844a Todas ou parte das célulastronco embrio nárias podem em princípio estar envolvidas na reposição diferenciação ou ambos Outros tipos de célulastronco têm o potencial de serem usados para fins médicos No organismo adulto célulastronco adultas como produtos de diferencia ção adicional têm um potencial mais limitado de desen volvimento posterior do que as célulastronco embrioná rias Por exemplo as célulastronco hematopoiéticas da medula óssea podem dar origem a muitos tipos de célu las sanguíneas e também a células com a capacidade de regenerar ossos Elas são chamadas de multipotentes Entretanto essas células não podem se diferenciar em um fígado rim ou neurônio Frequentemente se diz que as célulastronco adultas têm um nicho microambiente que promove a manutenção da célulatronco enquanto ao mesmo tempo permite a diferenciação de algumas célu lasfilhas como substitutas das células no tecido em que atuam Figura 2844b As célulastronco hematopoiéticas na medula óssea ocupam um nicho em que a sinalização de células vizinhas e outras dicas mantêm a linhagem de célu lastronco Ao mesmo tempo algumas célulasfilhas se di ferenciam para fornecer as células sanguíneas necessárias Compreender o nicho em que as célulastronco operam e os sinais que o nicho fornece é essencial nos esforços para aproveitar o potencial das célulastronco para a regenera ção de tecidos Todas as célulastronco têm problemas em relação às aplicações médicas no homem As célulastronco adul tas têm uma capacidade limitada de regenerar tecidos estão presentes geralmente em número pequeno e são difíceis de serem isoladas de um humano adulto Células tronco embrionárias têm um potencial de diferenciação muito maior e podem ser mantidas em meio de cultura para gerar grande número de células Entretanto seu uso é acompanhado por preocupações éticas relacionadas à necessária destruição de embriões humanos A identifi cação de uma fonte de célulastronco abundante e clini camente útil que não suscite preocupações permanece um objetivo central da pesquisa médica A capacidade de manter célulastronco em cultura ou seja mantêlas em estado indiferenciado e manipulálas para crescer e se diferenciar em tecidos particulares resulta em grande parte da compreensão da biologia do desenvolvimento A identificação e a manutenção em cultura de célulastron co pluripotentes de blastocistos humanos foram relatadas Blastocisto Mórula Sistema circulatório Sistema nervoso Sistema imune Espermatozoide Oócito Massa de células interna Totipotente Pluripotente FIGURA 2843 Célulastronco totipotentes e pluripotentes As células do estágio de mórula são totipotentes e têm a capacidade de se diferenciar em um organismo completo A fonte de célulastronco embrionários pluri potentes é a massa interna de células do blastocisto As células pluripotentes dão origem a vários tipos de tecidos mas não formam organismos completos Nelson6edbookindb 1192 Nelson6edbookindb 1192 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1193 por James Thomson e colabo radores em 1998 Esse avanço levou à disponibilidade de lon go prazo de linhagens celulares consagradas para pesquisa Até agora as célulastronco embrionárias de humanos e ca mundongos foram usadas na maior parte das pesquisas Em bora ambos os tipos de células tronco sejam pluripotentes eles precisam de condições de cultura muito diferentes otimizadas para permitir a di visão celular indefinidamente sem diferenciação As cé lulastronco embrionárias de camundongos crescem em uma camada de gelatina e precisam da presença de um fator de inibição de leucemia LIF As célulastronco embrionárias humanas crescem em uma camada de ali mentação de fibroblastos embrionários de camundongo e precisam do básico fator de crescimento de fibroblastos bFGF ou FGF2 O uso de uma camada de alimentação implica que as células de camundongo estejam fornecen do um produto difusível ou algum sinal de superfície ain da desconhecido que é necessário para as célulastronco humanas para promover a divisão celular ou impedir a diferenciação Um avanço significativo registrado em 2007 se baseia no sucesso em reverter a diferenciação De fato células da pele primeiro de camundongos depois de humanos fo ram reprogramadas para assumir as características de cé lulastronco pluripotentes Com reprogramação e manipu lações as células expressam pelo menos quatro fatores de transcrição Oct4 Sox2 Nanog e Lin28 todos conhecidos por ajudarem a manter o estado de célulatronco Avanços graduais nessa tecnologia podem tornar desnecessário o cultivo de célulastronco embrionárias e fornecer uma fonte de célulastronco geneticamente adequada a um paciente prospectivo A discussão sobre a regulação do desenvolvimento e célulastronco nos remete para um início bioquímico tan to figurativamente quanto literalmente A evolução fornece apropriadamente a primeira e a última palavra deste livro Se a evolução deve gerar o tipo de alterações associadas a uma espécie diferente tratase do programa de desenvol vimento que deve ser afetado Os processos de desenvolvi mento e evolutivos estão intimamente associados cada um informando o outro Quadro 281 O estudo contínuo da bioquímica tem tudo a ver com o enriquecimento do futuro da humanidade e a compreensão de nossas origens RESUMO 283 Regulação da expressão gênica em eucariotos c Em eucariotos a regulação positiva é mais comum do que a regulação negativa e a transcrição é acompanhada por grandes alterações na estrutura da cromatina c Em geral promotores para a Pol II têm uma TATA box e sequência Inr bem como múltiplos sítios de ligação para ativadores de transcrição Esses últimos sítios algumas vezes localizados centenas ou milhares de pares de ba ses distantes da TATA box são chamados de sequências ativadoras a montante em leveduras e potenciadores em eucariotos superiores c Grandes complexos de proteínas são geralmente neces sários para regular a atividade de transcrição Os efei tos dos ativadores de transcrição na Pol II são mediados pelos complexos de proteínas coativadoras tais como Mediador As estruturas modulares dos ativadores têm ativação e domínios de ligação do DNA distintos Outros complexos proteicos incluindo as histonas acetiltrans ferases e complexos dependentes de ATP tais como SWISNF e NURF remodelam reversivamente e modifi cam a estrutura da cromatina a b Diferenciação Célula diferenciada Célulatronco em divisão Célulatronco Célula da ponta distal Célula da ponta distal Igual Gradiente Seccional Autorrenovação FIGURA 2844 A proliferação de célulastronco versus diferenciação e desenvolvimento As célulastronco devem encontrar um equilíbrio en tre autorrenovação e diferenciação a Alguns padrões possíveis de divisão celular que permitem o reabastecimento de célulastronco e a produção de algumas células diferenciadas Cada célula pode produzir uma célulatronco e uma célula diferenciada duas células diferenciadas ou duas célulastronco em partes definidas do tecido ou cultura Ou pode ser estabelecido um gra diente de condições de crescimento com os destinos das células diferindo de uma extremidade do gradiente para a outra b Estabelecendo um nicho de desenvolvimento pelo contato de célulastronco com uma célula ou gru po de células Sinais moleculares fornecidos pelas células nicho neste caso para plantas uma célula da ponta distal ajudam a orientar o fuso mitótico para a divisão das célulastronco e asseguram que uma célulafilha retenha as propriedades de célulatronco James Thomson Nelson6edbookindb 1193 Nelson6edbookindb 1193 030414 0749 030414 0749 1194 DAVID L NELSON MICHAEL M COX c Hormônios afetam a regulação da expressão gênica em uma de duas maneiras Os hormônios esteroides inte ragem diretamente com receptores intracelulares que são proteínas regulatórias de ligação de DNA a liga ção do hormônio tem efeitos positivos ou negativos na transcrição dos genesalvo do hormônio Hormônios não esteroides se ligam a receptores na superfície das célu las disparando uma via de sinalização que pode levar à fosforilação de uma proteína regulatória afetando sua atividade c A regulação mediada por RNA desempenha um impor tante papel na expressão gênica eucariótica com a ex tensão de mecanismos conhecidos aumentando A América do Sul tem várias espécies de tentilhões co medores de sementes comumente chamados de tizius Cerca de três milhões de anos atrás um pequeno grupo de tizius de uma única espécie alçou voo da costa conti nental no Pacífico Talvez levados por uma tempestade eles perderam de vista a terra e viajaram aproximada mente 1000 km Pequenos pássaros como esses pode riam ter morrido nessa jornada mas uma chance ínfima levou esse grupo a uma ilha vulcânica recentemente for mada em um arquipélago mais tarde conhecido como Ga lápagos Tratavase de um cenário virgem com plantas e insetos inexplorados como fontes de alimento e os tenti lhões recémchegados sobreviveram Ao longo dos anos novas ilhas se formaram e foram colonizadas por novas plantas e insetos e pelos tentilhões Os pássaros explo raram os novos recursos nas ilhas e grupos de pássaros gradualmente se especializaram e divergiram em novas espécies Quando Charles Darwin pisou nas ilhas em 1835 havia muitas espécies diferentes de tentilhões nas várias ilhas do arquipélago se alimentando de sementes frutos insetos pólen ou mesmo sangue A diversidade de criaturas vivas foi uma fonte de admiração para o homem muito antes de os cientistas procurarem entender suas origens A visão extraordiná ria transmitida por Darwin inspirada em parte por seu encontro com os tentilhões de Galápagos forneceu uma explicação ampla para a existência de organismos com diversidade nas aparências e nas características Ela tam bém deu origem a muitas questões acerca dos mecanis mos envolvidos na evolução Respostas àquelas questões começaram a aparecer primeiro pelo estudo dos geno mas e do metabolismo de ácidos nucleicos na última me tade do século vinte e mais recentemente por meio do emergente campo apelidado de evodevo mistura da biologia evolutiva e biologia do desenvolvimento Na sua síntese moderna a teoria da evolução apre senta dois elementos principais mutações em uma popu lação geram diversidade genética a seleção natural então atua nessa diversidade para favorecer os indivíduos com ferramentas genômicas mais úteis e desfavorecer outros As mutações ocorrem em taxas significativas no genoma de todos os indivíduos em todas as células ver Seção 83 e Figura 2520 Mutações vantajosas em organismos uni celulares ou na linhagem germinativa de organismos plu ricelulares podem ser herdadas isto é passadas para um número maior da sua prole se elas lhe conferirem uma vantagem É um esquema simples Muitos se pergunta ram porém se isso é suficiente para explicar por exem plo os muitos tipos de bicos diferentes nos tentilhões de Galápagos ou a diversidade de tamanho e forma entre os mamíferos Até décadas recentes existiam várias hipóte ses amplamente aceitas a respeito do processo evolutivo que muitas mutações e novos genes seriam necessários para dar origem a uma nova estrutura física que organis mos mais complexos teriam genomas maiores e que es pécies muito diferentes teriam poucos genes em comum Todas essas hipóteses estavam erradas A genômica moderna revelou que o genoma huma no contém menos genes do que esperado não muitos a mais do que o genoma da moscadafruta e menos do que os genomas de alguns anfíbios Os genomas de todos os mamíferos de camundongos a humanos são surpreendentemente semelhantes em número tipo e arranjo cromossômico de genes Enquanto isso a evo devo está nos informando como criaturas complexas e muito diferentes podem evoluir a partir dessas realida des genômicas Os tipos de organismos mutantes mostrados na Fi gura 2842 foram estudados pelo biólogo inglês William Bateson no final do século XIX Bateson usou suas in formações para desafiar a noção darwinista de que as alterações evolutivas teriam que ser graduais Estudos recentes dos genes que controlam o desenvolvimento de organismos colocaram um ponto de exclamação nas ideias de Bateson Mudanças sutis nos padrões regulató rios durante o desenvolvimento refletindo apenas uma ou poucas mutações podem resultar em mudanças físi cas assustadoras alimentando uma evolução surpreen dentemente rápida Os tentilhões de Galápagos fornecem um maravilhoso exemplo da ligação entre evolução e desenvolvimento Há pelo menos 14 alguns especialistas listam 15 espé cies de tentilhões de Galápagos diferenciadas em grande parte pela estrutura do bico Os tentilhões do solo por exemplo têm bicos lagos e fortes adaptados a triturar sementes duras e grandes Os tentilhões dos cactos têm bicos mais finos e longos ideais para acessar os frutos e flores dos cactos Figura Q1 Clifford Tabin e colabo QUADRO 281 MÉTODOS Sobre barbatanas asas bicos e outras curiosidades Nelson6edbookindb 1194 Nelson6edbookindb 1194 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1195 c O desenvolvimento de um organismo pluricelular apre senta o desafio regulatório mais complexo O destino das células no embrião inicial é determinado pelos gra dientes de proteínas anteroposterior e dorsoventral que atuam como ativadores de transcrição ou repressores de tradução regulando os genes necessários para o desen volvimento de estruturas apropriadas a uma parte es pecífica do organismo Conjuntos de genes regulatórios operam em sucessão temporal e espacial transforman do determinadas áreas de uma célula ovo em estruturas previsíveis no organismo adulto c A diferenciação de célulastronco em tecidos funcio nais pode ser controlada por sinais e condições extra celulares radores investigaram extensamente um conjunto de ge nes expresso durante o desenvolvimento craniofacial de aves Eles identificaram um único gene Bmp4 cujo nível de expressão se correlacionava com a formação dos bicos mais robustos dos tentilhões de solo Bicos mais robustos também se formaram em embriões de galinhas quando altos níveis de Bmp4 foram artificialmente expressos nos tecidos apropriados confirmando a importância de Bmp4 Em um estudo semelhante a formação de bicos longos e finos estava ligada à expressão de calmodulina ver Figura 1211 em tecidos específicos em estágios de desenvolvimento apropriados Assim mudanças impor tantes na forma e na função do bico podem ser produzi das por alterações sutis na expressão de apenas dois ge nes envolvidos na regulação do desenvolvimento Muito poucas mutações são necessárias e as que ocorrem afe tam a regulação Novos genes não são necessários O sistema de genes regulatórios que guia o desenvol vimento é surpreendentemente conservado por todos os vertebrados A expressão elevada de Bmp4 no teci do adequado no período certo leva ao desenvolvimento de partes da mandíbula mais robustas no peixezebra O mesmo gene desempenha um papel essencial no de senvolvimento dos dentes de mamíferos O desenvolvi mento dos olhos é desencadeado pela expressão de um único gene Pax6 em moscadafruta e em mamíferos O gene Pax6 de camundongos irá desencadear o desenvol vimento de olhos de moscadafruta nesses insetos e o gene Pax6 da moscadafruta irá desencadear o desen volvimento de olhos de camundongo nesses roedores Em cada organismo esses genes são parte de uma casca ta regulatória muito maior que em última análise cria as estruturas corretas nos locais corretos em cada organis mo A cascata é antiga por exemplo os genes Hox des critos no texto têm sido parte do programa de desen volvimento de eucariotos pluricelulares por mais de 500 milhões de anos Mudanças sutis na cascata podem ter grandes efeitos no desenvolvimento e portanto na apa rência final do organismo Essas mesmas mudanças su tis podem alimentar uma evolução surpreendentemente rápida Por exemplo as 400 a 500 espécies descritas de ciclídeos peixes com nadadeiras com espinhos no Lago Malawi e no Lago Vitória no continente africano são todas derivadas de uma ou poucas populações que colonizaram cada um dos lagos nos últimos 100000 a 200000 anos Os tentilhões de Galápagos simplesmente seguiram o caminho de evolução e mudança que os seres vivos têm trilhado há bilhões de anos Dieta mista de sementes e insetos CaM baixa bico curto Bmp4 baixa profundidadelargura do bico pequena Ancestral Mastigação fortesementes grandes CaM baixa bico curto Bmp4 precocealta grande profundidadelargura do bico Tentilhão largo do solo Experimenta floresfrutos de cactus CaM alta bico largo Bmp4 baixa profundidadelargura do bico pequena Comprimento Largura Profundidade Tentilhão do cactus Bico superior FIGURA Q1 Evolução de novas estruturas do bico para explorar novas fontes da alimentação Nos tendilhões de Galápagos as diferentes estru turas dos bicos do tendilhão de cactus e tendilhão grande do solo que se alimentam de diferentes fontes de alimentos se desenvolveram em gran de parte devido a poucas mutações que alteram o momento e o nível de expressão de apenas dois genes aqueles que codificam para calmodilina CoM e Bmp4 Nelson6edbookindb 1195 Nelson6edbookindb 1195 030414 0749 030414 0749 1196 DAVID L NELSON MICHAEL M COX Termoschave Palavras em negrito são definidas no glossário genes constitutivos 1156 indução 1156 repressão 1156 fator de especificidade 1157 repressor 1157 ativador 1157 operador 1157 regulação negativa 1157 regulação positiva 1157 regulador arquitetônico 1158 óperon 1159 hélicevoltahélice 1162 dedo de zinco 1162 homeodomínio 1163 homeobox 1163 zíper de leucina 1163 hélicealçahélice básica 1163 controle combinatorial 1164 proteína receptora de cAMP CRP 1165 regulon 1166 atenuação de transcrição 1167 repressor de tradução 1170 resposta estringente 1171 riboswitch 1172 variação de fase 1173 remodelação da cromatina 1175 SWISNF 1175 acetiltransferases de histona HAT 1176 potenciadores 1178 sequências ativadoras a montante UAS 1178 ativadores de transcrição 1178 coativadores 1178 fatores de transcrição basais 1178 grupo de alta mobilidade HMG 1179 Mediador 1179 complexo de préiniciação PIC 1179 proteína ligadora de TATA TBP 1179 elementos de resposta hormonal HRE 1182 microRNA miRNA 1185 RNA de interferência RNAi 1185 ncRNA 1186 polaridade 1187 metameria 1187 genes maternos 1188 mRNA maternos 1188 genes de segmentação 1188 genes gap 1188 genes pairrule 1188 genes de polaridade dos segmentos 1188 genes homeóticos 1188 genes Hox 1190 totipotentes 1192 pluripotentes 1192 unipotentes 1192 célulastronco embrionárias 1192 Leituras adicionais Gerais Carroll SB 2005 Endless Forms Most Beautiful The New Science of Evo Devo and the Making of the Animal Kingdom W W Norton Company New York Fascinante abordagem sobre como a biologia do desenvolvimento informa a biologia evolutiva Neidhardt FC ed Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology Curtiss R Ingraham JL Lin ECC Magasanik B Low KB Reznikoff WS Riley M Schaechter M Umbarger HE vol eds American Society for Microbiology Washington DC Boa fonte de informação sobre a regulação gênica em bactérias e muitos outros tópicos Publicado pela última vez em edição impressa em 1996 existe agora uma importante fonte online continuamente atualizada httpecosalorg Regulação da expressão gênica em bactérias Babitske P Baker CS Romeo T 2009 Regulation of translation initiation by RNA binding proteins Annu Rev Microbiol 63 2744 Jacob F Monod J 1961 Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins J Mol Biol 3 318356 O modelo óperon e o conceito de RNA mensageiro propostos pela primeira vez no Proceedings da Academia Francesa de Ciências em 1960 são apresentados nesse artigo histórico Osterberg S del PesoSantos T Shingler V 2011 Regulation of alternative sigma factor use Annu Rev Microbiol 65 3755 Roth A Breaker RR 2009 The structural and functional diversity of metabolitebinding riboswitches Annu Rev Biochem 78 305334 Regulação da expressão gênica em eucariotos Berezikov E 2011 Evolution of microRNA diversity and regulation in animals Nat Rev Genet 12 846860 Conaway RC Conaway JW 2011 Function and regulation of the Mediator complex Curr Opin Genet Dev 21 225230 Fabian MR Sonenberg N Filipowicz W 2010 Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs Annu Rev Biochem 79 351379 Groppo R Richter JD 2009 Translational control from head to tail Curr Opin Cell Biol 21 444451 Keene JD 2007 RNA regulons coordination of post transcriptional events Nat Rev Genet 8 533543 Krol J Loedige I Filipowicz W 2010 The widespread regulation of microRNA biogenesis function and decay Nat Rev Genet 11 597610 Pasquinelli AE 2012 MicroRNAs and their targets recognition regulation and an emerging reciprocal relationship Nat Rev Genet 13 271282 Prudhomme B Gompel N Carroll SB 2007 Emerging principles of regulatory evolution Proc Natl Acad Sci USA 104 86058612 Rinn JL Chang H Y 2012 Genome regulation by long noncoding RNAs Annu Rev Biochem 81 145166 Shahbazian MD Grunstein M 2007 Functions of site specific histone acetylation and deacetylation Annu Rev Biochem 76 75100 Struhl K 1999 Fundamentally different logic of gene regulation in eukaryotes and prokaryotes Cell 98 14 Talbert PB Henikoff S 2010 Histone variants ancient wrap artists of the epigenome Nat Rev Mol Cell Biol 11 264275 Werner F Grohmann D 2011 Evolution of multisubunit RNA polymerases in the three domains of life Nat Rev Microbiol 9 8598 Zhou Q Li T Price DH 2012 RNA polymerase II elongation control Annu Rev Biochem 81 119143 Problemas 1 Efeito do mRNA e da estabilidade proteica na regu lação Células de E coli estão crescendo em um meio com glicose como única fonte de carbono Triptofano é subitamente adicionado As células continuam a crescer e se dividem a cada 30 minutos Descreva qualitativamente como a intensidade de atividade da triptofanosintase nas células varia com o tem po sob as seguintes condições a O mRNA trp é estável degradado lentamente ao longo de várias horas b O mRNA trp é degradado rapidamente mas a triptofa nosintase é estável Nelson6edbookindb 1196 Nelson6edbookindb 1196 030414 0749 030414 0749 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 1197 c O mRNA trp e a triptofanosintase são ambos degrada dos rapidamente 2 O óperon da lactose Um pesquisador constrói um ópe ron lac em um plasmídeo mas inativa todas as partes do ope rador lac lacO e o promotor lac substituindoos pelo sítio de ligação para o repressor LexA que atua na resposta SOS e um promotor regulado por LexA O plasmídeo é introduzido nas células de E coli que têm um óperon lac com um gene lacZ inativo Em que condições essas células transformadas irão produzir bgalactosidase 3 Regulação negativa Descreva os efeitos prováveis na expressão gênica no óperon lac de uma mutação no a opera dor lac que exclui a maioria dos O1 b gene lacI que inativa o repressor e c promotor que altera a região em torno da posição 10 4 Ligação específica do DNA por proteínas regula tórias Uma típica proteína repressora bacteriana diferen cia seu sítio de ligação específico operador e o DNA não específico por um fator de 10 4 a 10 6 Cerca de 10 moléculas de repressor por célula são suficientes para garantir um alto nível de repressão Suponha que um repressor muito seme lhante existisse em uma célula humana com especificidade por seu sítio de ligação Quantas cópias do repressor seriam necessárias para provocar um nível de repressão semelhante àquele na célula bacteriana Dica o genoma de E coli con tém cerca de 46 milhões de pb o genoma haploide humano tem cerca de 32 bilhões de pb 5 Concentração de repressor em E coli A constante de dissociação para um complexo repressoroperador especí fico é muito baixa cerca de 10 13 M Uma célula de E coli vo lume 2 3 10 12 mL contém 10 cópias do repressor Calcule a concentração celular da proteína repressora Como esse valor se compara à constante de dissociação do complexo repressor operador Qual o significado dessa resposta 6 Repressão de catabólitos Células de E coli estão crescendo em um meio contendo lactose mas não glicose Indi que se cada uma das seguintes alterações ou condições aumen taria diminuiria ou não alteraria a expressão do óperon lac Pode ser útil desenhar um modelo representando o que está acontecendo em cada situação a Adição de alta concentração de glicose b Mutação que impeça a dissociação do repressor Lac do operador c Mutação que inative completamente a bgalactosidase d Mutação que inative completamente a galactosídeo permease e Mutação que impeça a ligação do CRP ao seu sítio de ligação perto do promotor lac 7 Atenuação da transcrição Como a transcrição do ópe ron trp de E coli pode ser afetada pelas seguintes manipula ções da região líder do mRNA trp a Aumentando a distância número de bases entre o gene do peptídeo líder e a sequência 2 b Aumentando a distância entre as sequências 2 e 3 c Removendo a sequência 4 d Alterando os dois códons Trp no gene do peptídeo para códons His e Eliminando o sítio de ligação do ribossomo para o gene que codifica o peptídeo líder f Alterando vários nucleotídeos na sequência 3 de modo que ela possa se parear com a sequência 4 mas não com a se quência 2 8 Repressores e repressão Como a resposta SOS em E coli seria afetada por uma mutação no gene lexA que impeça a clivagem autocatalítica da proteína LexA 9 Regulação por recombinação No sistema de variação de fase da Salmonella o que aconteceria à célula se a recom binase Hin se tornasse mais ativa e promovesse a recombina ção inversão de DNA várias vezes em cada geração celular 10 Iniciação da transcrição em eucariotos Uma nova atividade da RNApolimerase é descoberta em extratos bru tos de células derivadas de um fungo exótico A RNApoli merase inicia a transcrição apenas a partir de um único pro motor altamente especializado À medida que a polimerase é purificada sua atividade diminui e a enzima purificada é completamente inativa a menos que extrato bruto seja adi cionado à mistura de reação Sugira uma explicação para es sas observações 11 Domínios funcionais em proteínas regulatórias Um bioquímico substitui o domínio de ligação de DNA da pro teína Gal4 de levedura pelo domínio de ligação de DNA do re pressor Lac e descobre que a proteína fabricada não regula mais a transcrição dos genes GAL em leveduras Desenhe um diagrama dos diferentes domínios funcionais que você espera ria encontrar na proteína Gal4 e na proteína fabricada Por que a proteína fabricada não regula mais a transcrição dos genes GAL O que poderia ser feito ao sítio de ligação do DNA reco nhecido por essa proteína quimérica para tornála funcional na ativação da transcrição dos genes GAL 12 Modificação do nucleossomo durante a ativação da transcrição A fim de preparar regiões do genoma para a transcrição certas histonas nos nucleossomos residentes são acetiladas e metiladas em locais específicos Uma vez que a transcrição não seja mais necessária essas modificações pre cisam ser revertidas Em mamíferos a metilação dos resíduos Arg em histonas é revertida pelas peptidilargininasdeiminases PADI A reação promovida por essas enzimas não produz uma arginina não metilada Em vez disso ela produz resíduos de citrulina na histona Qual é o outro produto da reação Sugi ra um mecanismo para essa reação 13 Mecanismos de herança no desenvolvimento Um ovo de Drosophila que é bcd bcd pode se desenvolver nor malmente mas a moscadafruta adulta não será capaz de pro duzir prole viável Explique Problema de análise de dados 14 Fabricando um interruptor genético alternado em Escherichia coli A regulação gênica é frequentemen te descrita como fenômeno ligado ou desligado um gene que é expresso totalmente ou não expresso de forma algu ma Na verdade a repressão e ativação de um gene envolvem reações de ligação de ligantes de modo que os genes podem apresentar níveis intermediários de expressão quando níveis intermediários de moléculas regulatórias estão presentes Por exemplo para o óperon lac de E coli considere o equilíbrio de ligação do repressor Lac do operador de DNA e do indu tor ver Figura 288 Embora isso seja um processo complexo e cooperativo ele pode ser aproximadamente modelado pela Nelson6edbookindb 1197 Nelson6edbookindb 1197 030414 0749 030414 0749 1198 DAVID L NELSON MICHAEL M COX reação a seguir R é o repressor IPTG é o indutor isopropilb D tiogalactosídeo O repressor livre R se liga ao operador e impede a transcrição do óperon lac o complexo R IPTG não se liga ao operador e portanto a transcrição do óperon lac pode prosseguir a Usando a Equação 58 podese calcular o nível de ex pressão relativa de proteínas do óperon lac como uma função de IPTG Use esse cálculo para determinar em que faixa de IPTG o nível de expressão variaria de 10 a 90 b Descreva qualitativamente o nível de proteínas do ópe ron lac presente em uma célula de E coli antes durante e de pois de indução por IPTG Não precisa fornecer as quantidades nos tempos exatos apenas indicar as tendências gerais Gardner Cantor e Collins 2000 se propuseram a cons truir um interruptor genético alternado genetic toggle switch um sistema regulatório de genes com as duas carac terísticas essenciais um interruptor de luz A Ele tem ape nas dois estados totalmente ligado ou totalmente desligado não se trata de um interruptor com graduação Em termos bioquímicos o genealvo ou sistema de genes óperon é ex presso totalmente ou não expresso de maneira alguma não se expressa em nível intermediário B Ambos os estados são estáveis embora você use o dedo para mudar o interruptor de luz de um estado para o outro uma vez que o tenha al terado e recolhido o dedo o interruptor permanece naquele estado Em termos bioquímicos a exposição a um indutor ou a algum outro sinal altera o estado de expressão do gene ou óperon e ele permanece naquele estado uma vez que o sinal seja removido c Explique como o óperon lac não apresenta nenhuma das características A e B Para construir seu interruptor alternado Gardner e co laboradores construíram um plasmídeo a partir dos seguintes componentes OPlac A região operadorpromotor do óperon lac de E coli OPl A região operadorpromotor do fago l lacI O gene que codifica a proteína repressora do lac LacI Na ausência de IPTG essa proteína reprime fortemente o OPlac na presença de IPTG ela permite a expressão total de OPlac rep ts O gene que codifica uma proteína l repressora mutante sensível à temperatura rep ts A 37C essa proteína reprime fortemente OPl a 42C ela permite a expressão total de OPl GFP O gene para a proteína fluorescente verde GFP proteína indicadora altamente fluorescente ver Figura 916 T Terminador de transcrição Os pesquisadores dispuseram esses componentes ver fi gura a seguir de modo que os dois promotores foram repri midos reciprocamente OPlac controlava a expressão de rep ts e OPl controlava a expressão de lacI O estado desse sistema era registrado pelo nível de expressão de GFP que também estava sob controle de OPlac d O sistema construído tem dois estados GFPligado alto nível de expressão e GFPdesligado baixo nível de ex pressão Para cada estado descreva quais proteínas estão presentes e quais promotores estão sendo expressos mRNA mRNA GFP represssor lac represssor l repts GFP ori T T ampR OPl OPlac lacI e Esperase que o tratamento com IPTG alterne o sis tema de um estado a outro De qual estado para qual estado Explique sua argumentação f Esperase que o tratamento com calor 42C alterne o sistema de um estado para o outro De qual estado para qual estado Explique sua argumentação g Por que se espera que esse plasmídeo tenha as caracte rísticas A e B descritas anteriormente A fim de confirmar que o seu construto de fato exibe essas características Gardner e colaboradores demonstraram pela pri meira vez que uma vez ligada o nível de expressão do GFP alto ou baixo era estável por longos períodos de tempo caracterís tica B Em seguida eles mediram o nível de GFP em diferentes concentrações do indutor IPTG com os seguintes resultados Expressão do GFP normalizada 10 IPTG M 08 06 04 02 106 105 104 X 103 102 0 Eles notaram que o nível médio de expressão do GFP foi in termediário na concentração X de IPTG Entretanto ao medi rem o nível de expressão de GFP em células individuais com IPTG 5 X eles descobriram um alto ou baixo nível de GFP nenhuma célula apresentou nível intermediário h Explique como essa descoberta demonstra que o sis tema tem um A característico O que está acontecendo para provocar uma distribuição bimodal dos níveis de expressão no IPTG 5 X Referência Gardner TS Cantor CR Collins JJ 2000 Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli Nature 403 339342 Nelson6edbookindb 1198 Nelson6edbookindb 1198 030414 0749 030414 0749 Respostas Resumidas aos Problemas Soluções completas de todos os problemas dos capítulos estão publicadas no Guia de estudo completo e definitivo que acompanha a obra Princí pios de Bioquímica As respostas de todos os problemas numéricos estão expressas com o número correto de dígitos significativos Capítulo 1 1 a Diâmetro da célula ampliada 5 500 mm b 27 3 10 12 moléculas de actina c 36000 mitocôndrias d 39 3 10 10 moléculas de glicose e 50 moléculas de glicose por molécula de hexocinase 2 a 1 3 10 212g 5 1 pg b 10 c 5 3 a 16 mm 800 vezes mais comprido do que a célula o DNA deve estar firmemente enrolado b 4000 proteínas 4 a A taxa metabólica é limitada pela difusão por sua vez limitada pela área da superfície b 12 mm 21 para a bactéria 004 mm 21 para a ameba a relação superfícievolume é 300 vezes maior na bactéria 5 2 3 10 6 s em torno de 23 dias 6 As moléculas de vitamina das duas fontes são idênticas o corpo não consegue distinguir a fonte somente impurezas associadas poderiam variar com a fonte 7 OH 2O P O O2 H C NH3 COO2 C H NH HO O C H3C OH OH CH3 Amino Aldeído Amido Metil Amino Carboxila Fosforila Hidroxilas Hidroxila Carboxila Hidroxila Metila Carboxila Hidroxila Metil Amino Hidroxilas Hidroxila H H C OH CH2 H C H H H H C OH O H H C C H C C CH3 CH2 CH2 OH H H O HO H H C OH H C OH H C OH Hidroxila CH2 C OH O C C C C H a b c d e f COO2 1 1 H3N 1 H3N 8 HO CH3 C H H N CH2 OH C H HO CH3 Os dois enantiômeros têm interações diferentes com um receptor quiral biológico uma proteína 9 a Somente os aminoácidos têm grupos amino a separação pode ser com base na carga ou na afinidade de ligação desses grupos Os ácidos graxos são menos solúveis em água do que os aminoácidos e os dois tipos de moléculas também diferem em formato e tamanho cada uma dessas diferenças de propriedades pode servir de base para separação b A molécula de glicose é menor do que um nucleotídeo a separação pode se basear no tamanho A base nitrogenada eou o grupo fosfato também dota os nucleotídeos com características solu bilidade carga que podem ser usadas para separálos da glicose 10 É improvável que o silício possa servir como o elemento constituin te fundamental para a vida especialmente em uma atmosfera de O2 como a da Terra Longas cadeias de átomos de silício não são facil mente sintetizadas as macromoléculas necessárias para as funções mais complexas não seriam formadas facilmente O oxigênio rompe ligações entre átomos de silício e as ligações oxigêniosilício são ex tremamente estáveis e difíceis de romper impedindo a formação e a quebra de ligações o que é essencial para os processos vitais 11 Somente um enantiômero do fármaco foi fisiologicamente ativo A de xedrina consiste em um enantiômero simples a benzedrina consiste em uma mistura racêmica 12 a 3 grupos de ácido fosfórico aDribose guanina b Colina ácido fosfórico glicerol ácido oleico ácido palmítico c Tirosina 2 glici nas fenilalanina metionina 13 a CH2O C3H6O3 b H H C H C C O O OH H C OH HO H H C HO C C C H C C OH HO H OH C H C C OH H H OH OH C H C C H OH H OH OH HO C H C C OH H H OH H C C O H H C OH OH H H C C O H H C H H C C O H H C H OH OH H C C O H H C H OH OH C H C OH H H C O H C H C OH H H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 H HO HO HO HO H HO H c X contém um centro quiral elimina todos exceto 6 e 8 d X contém um grupo funcional ácido elimina 8 a estrutura 6 é consis tente com todos os dados e A estrutura 6 não é possível distinguir entre os dois possíveis enantiômeros 14 O composto mostrado é o Rpropanolol o carbono que carrega o grupo hidroxila é o quiral O Spropanolol tem a estrutura O N H OH Nelson6edbookindb 1199 Nelson6edbookindb 1199 030414 0749 030414 0749 1200 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 15 O composto mostrado é o SSmetilfenidato O RR metilfenidato tem a estrutura H O NH O Os carbonos quirais estão indicados com asterisco 16 a Um DG mais negativo corresponde a um maior Keq para a rea ção de ligação de forma que o equilíbrio é desviado no sentido da formação dos produtos e ligação mais forte e por isso de um gosto mais doce e uma DMR maior b Ensaios de gosto doce com base em animais são muito demorados Um programa de computador para predizer o nível de doçura mesmo que nem sempre totalmente preci so permite aos químicos projetar adoçantes eficazes muito mais rapi damente As moléculas candidatas podem então ser testadas por meio dos ensaios convencionais c A variação de 025 a 04 nm corres ponde ao comprimento de cerca de 15 a 25 ligações simples A figura a seguir pode ser usada para a construção de uma régua aproximada todos os átomos no retângulo vermelhoclaro estão entre 025 e 04 nm do início da régua Existem muitos grupos AHB possíveis nas moléculas alguns estão mostrados aqui Desoxissacarose H H H H H H H H O O H OH OH OH OH OH HO HO O Sacarose H H HO H H H H H O O H OH OH OH OH OH HO HO O DTriptofano OH N H O NH 2 Sacarina S O O O NH Aspartame H N O O O O OH CH 3 NH 2 6CloroDtriptofano OH Cl N H O NH 2 Alitame H N H N O O OH NH 2 O S Neotame H N O O O O OH CH 3 NH Tetrabromossacarose H Br HO H H H H H O O H Br Br OH OH OH HO Br O Ácido sucrônico H N H N O2N C 9H17 HN HO O 1 d Em primeiro lugar as moléculas têm múltiplos grupos AHB de forma que é difícil saber qual é o importante Em segundo lugar uma vez que o motivo AHB é muito simples muitas moléculas não doces terão esse grupo e A sacarose e a desoxissacarose A desoxissa carose não tem um dos grupos AHB que está presente na sacarose e tem DMR ligeiramente mais baixa do que a da sacarose como es perado se os grupos AHB forem importantes para o sabor doce f Existem muitos desses exemplos aqui estão alguns 1 o Dtriptofa no e o 6cloroDtriptofano têm o mesmo grupo AHB mas os valores de DMR são muito diferentes 2 O aspartame e o neotame têm os mesmos grupos AHB mas os valores de DMR são muito diferentes 3 O neotame tem dois grupos AHB e o alitame tem três porém o neotame é mais de cinco vezes mais doce do que o alitame 4 A bromina é menos eletronegativa do que o oxigênio e assim esperase que enfraqueça os grupos AHB no entanto a tetrabromossacarose é muito mais doce do que a sacarose g Podese elaborar qualquer modelo que se adapte a um conjunto definido de dados desde que os parâmetros sejam suficientemente aprimorados Uma vez que o objetivo era criar um modelo para predizer o DG de moléculas não testadas in vivo os pesquisadores precisavam mostrar que o modelo funciona para moléculas que não haviam sido treinadas O grau de inexatidão do grupoteste poderia fornecer aos pesquisadores uma ideia de como o modelo se comportaria para moléculas novas h A DMR está relacionada com Keq que está relacionado exponencial mente com DG assim a adição de uma quantidade constante à DG multiplica a DMR por uma quantidade constante Com base nos va lores dados com as estruturas uma variação de 13 kcalmol na DG corresponde a uma variação de 10 vezes na DMR Capítulo 2 1 O etanol é polar e o etano não é O grupo OH do etanol pode fazer ligação de hidrogênio com a água 2 a 476 b 919 c 40 d 482 3 a 151 3 10 24 M b 302 3 10 27M c 776 3 10 212 M 4 11 5 a HCl H 1 1 Cl 2 b 33 c NaOH Na 1 1 OH 2 d 98 6 11 7 17 3 10 29 moléculas de acetilcolina 8 01 M HCl 9 a maior b mais alto c mais baixo 10 33 mL 11 a RCOO 2 b RNH2 c H2PO4 2 d HCO3 2 12 a 506 b 428 c 546 d 476 e 376 13 a 01 M HCl b 01 M NaOH c 01 M NaOH 14 d O bicarbonato uma base fraca titula OH a O 2 tornando o composto mais polar e mais solúvel em água 15 O estômago a forma neutra da aspirina presente em pH mais baixo é menos polar e atravessa a membrana mais facilmente 16 9 17 74 18 a pH 86 a 106 b 45 c 10 mL d pH 5 pKa 22 19 89 20 24 21 69 22 14 23 NaH2PO4 H2O 58 gL Na2HPO4 82 gL 24 A 2 HA 5 010 Nelson6edbookindb 1200 Nelson6edbookindb 1200 030414 0749 030414 0749 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 1201 25 Misture 150 mL de acetato de sédio 010 M com 850 mL de acido acé 4 ac tico 010 M COOH 26 Acido acético seu pK esta mais proximo do pH desejado HNT 4 pK 182 27 a 46 b 01 unidade de pH ce 4 unidades de pH L CH CHNH 28 43 N H 29 Acetato 0183 Me acido acético 007 M H 30 17 1 31 7 32 a COO HNN pKp 60 COOH 00 Ly CH CHNH HjNCH HNCH H H CH CH 2 Completamente Completamente protonado desprotonado COO a a HN pK 917 b completamente protonado ec zwitterfon d zwitterion e L CH CHNH completamente desprotonado N Ht 33 a O pH do sangue é controlado pelo sistema tampao didxido de 3 carbonobicarbonato CO HO H HCO3 Durante a hi poventilagao a CO aumenta nos pulmées e no sangue arterial levando o equilibrio para a direita aumentando o H e baixando 0 COO pH b Durante a hiperventilagdo a CO diminui nos pulmées e ANN CH bs oH no sangue arterial o que reduz a H e aumenta 0 pH acima do valor LL 2 2 normal de 74 Ce O lactato é um Acido moderadamente forte que N se dissocia completamente em condigoes fisiol6gicas e dessa forma 4 reduz o pH do sangue e do tecido muscular A hiperventilagao remo ne nnn ve H 0 que eleva o pH do sangue e dos tecidos antecipandose a pH Estrutura Carga resultante Migracao para acidificacao l 1 42 CAtodo 34 74 4 2 1 Catodo 35 Dissolvendose mais CO no sangue aumenta a H no sangue e nos 8 3 0 Nao migra fluidos extracelulares reduzindo o pH CO d HO HCO 12 4 1 Anodo H HCO 36 a Use a substancia na sua forma surfactante para emulsificar o 5 a Asp b Met ce Glu d Gly e Ser 6leo derramado colete o 6leo emulsificado e troque para a forma 6 a 2 b 4 ce nao surfactante A agua se separa do Oleo e este pode ser coletado para uso posterior b O equilibrio se encontra fortemente para a goo goo goo goo direita O acido mais forte com pK mais baixo HCO doa um pr6 HN C H HNC H HCNH HCNH ton para a base conjugada do acido mais fraco com pK mais alto amidina c A forga de um surfactante depende da hidrofilicidade He Cc CH HC C H H C CH HC Cc H de seus grupos polares quanto mais hidrofilico mais poderoso é 0 surfactante A forma amidinio do ssurf é muito mais hidrofilica do CH CHa CH CH que a forma amidina e ele 6 um surfactante muito mais poderoso CH CH CH CH d Ponto A amidinio 0 CO teve tempo de sobra para reagir com o amidina e produzir a forma amidinio Ponto B amidina 0 argénio 7 a Estrutura em pH 7 removeu o CO da solugao sobrando a forma amidina e A con O O O dutividade aumenta quando 0 amidinio sem carga reage com 0 CO ll ll e produz a forma amidina carregada f A condutividade diminui HNCHCNCHCNCHCO quando o amdinio remove 0 CO 0 que desloca o equilfbrio para a forma amidina sem carga g Tratar ssurf com CO para produzir a CH H CH H CH forma surfactante do amidinio e usalo para emulsificar o derrama pK 803 pK 339 mento Tratar a emulsao com argénio para remover o CO e produzir a forma amidina nao surfactante O éleo sera separado da 4gua e b A interagao eletrostatica entre o anion carboxilato e 0 grupo amino podera ser recuperado protonado do zwitterion da alanina afeta favoravelmente a ionizacaéo do grupo carboxila Essa interacao eletrostatica favoravel diminui a medida Capitulo 3 que aumenta o comprimento da poliAla resultando em aumento no 1 1 determinar a configuracdo absoluta no carbono a e comparala com pk c A ionizagao do grupo amino protonado destrdi a interagao ele as formas D e L do gliceraldeido trostatica favoravel observada em b Com o aumento da distancia entre 2 aIb II ec IV a II Ce IV He IV Cg Ill Ch Ill Gi V Cj I os grupos carregados tornase mais facil a remocaéo do préton do grupo k V 1 II Gm II n V 0 I He V amino da poliAla e dessa forma diminui o pK Os efeitos intramolecu lares das ligagdes amida ligagéo peptidica mantém os valores de pK 3 a 0 pl pk para o grupo acarboxila e pI pK para 0 grupo a is baixos do que seriam no caso de uma amina alquilsubstituida amino de maneira que os dois grupos estao carregados ionizados mals q a b 1 em 219 X 10 0 pl da alanina é 601 Conforme a Tabela 31 8 75000 e a equacao de HendersonHasselbalch 14680 grupos carboxila e 9 a 32000 Os elementos sao perdidos quando se forma a ligagao 14680 grupos amino estado sem carga A fracao de moléculas de ala peptidica de modo que a massa molecular de um residuo de Trp nao nina com ambos os grupos nao carregados é o produto dessas fracdes a mesma da do triptofano livre b 2 1202 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 10 A proteína tem quatro subunidades com massas moleculares de 160 90 90 e 60 kDa As duas subunidade de 90 kDa provavelmente idên ticas estão unidas por uma ou mais pontes dissulfeto 11 a 12 em pH 3 0 em pH 8 21 em pH 11 b pI 5 78 12 pI ø 1 grupos carboxilato Asp e Glu 13 Lys His Arg os grupos fosfato com carga negativa no DNA interagem com os grupos laterais das histonas com carga positiva 14 a Glu20 b LysAla3 c AsnSerHis5 d AsnSerHis5 15 a A atividade específica após a etapa 1 é de 200 unidadesmg etapa 2 600 unidadesmg etapa 3 250 unidadesmg etapa 4 4000 unida desmg etapa 5 15000 unidadesmg etapa 6 15000 unidadesmg b Etapa 4 c Etapa 3 d Sim Na etapa 6 a atividade específica não aumenta eletroforese em poliacrilamidaSDS 16 a NaCl 5 05 mM b NaCl 5 005 mM 17 C elui primeiro B em segundo lugar A por último 18 TyrGlyGlyPheLeu 19 Leu Orn Phe Pro Val Val Pro Orn Phe Leu As setas correspondem à orientação das ligações peptídicas CO SNH 20 88 97 A porcentagem x dos resíduos corretos dos aminoácidos liberados no ciclo n é xnx Todos os resíduos liberados no primeiro ciclo estão corretos mesmo que a eficiência da clivagem não tenha sido perfeita 21 a Y1 F7 e R 9 b As posições 4 e 9 K Lys é mais comum na 4 R Arg não varia na 9 c Posições 5 e 10 E Glu é mais co mum em ambas as posições d Posição 2 S Ser 22 a peptídeo 2 b peptídeo 1 c peptídeo 2 d peptídeo 3 23 a Qualquer cadeia polipeptídica linear tem somente dois tipos de grupos amino livres um único grupo aamino na extremidade amino terminal e um grupo amino em cada resíduo de Lys presente na cadeia Esses grupos amino reagem com FDNB e formam um derivado DNPaminoácido A insulina produz dois tipos diferentes de derivados aaminoDNP sugerindo que ela tem duas extremidades aminotermi nais e portanto duas cadeias polipeptídicas uma com Gly aminoter minal e a outra com Phe aminoterminal A Lys não está em extremida de aminoterminal pois o produto DNPlisina é DNPlisina b Sim A cadeia A tem Gly aminoterminal a cadeia B tem Phe aminoterminal e o resíduo 29 não terminal na cadeia B é Lys c PheValAspGlu O peptídeo B1 mostra que o resíduo aminoterminal é Phe O peptídeo B2 também tem Val mas ela não é aminoterminal pois não há for mação de DNPVal ela deve estar no lado carboxílico da Phe Assim a sequência de B2 é DNPPheVal De modo semelhante a sequên cia de B3 deve ser DNPPheValAsp e a sequência da cadeia A deve começar com PheValAspGlu d Não A sequência aminoterminal conhecida da cadeia A é PheValAsnGln A Asn e a Gln aparecem na análise de Sanger como Asp e Glu porque a hidrólise vigorosa na etapa 7 hidrolisa as ligações amida na Gln e na Asn assim como as ligações peptídicas formando Asp e Glu Sanger e colaboradores não puderam distinguir Asp de Asn e Gln de Glu nesse estágio de sua análise e A sequência combina exatamente com a da Figura 324 Cada peptídeo na tabela dá uma informação específica sobre quais resíduos Axn são Asn ou Asp e quais resíduos Glx são Gln ou Glu Ac1 resíduos 2021 Esta é a única sequência CysAsx na cadeia A existe 1 grupo amido neste peptídeo assim deve ser CysAsn NGlyIleValGlxGlxCysCysAlaSerVal 1 5 10 CysSerLeuTyrGlxLeuGlxAsxTyrCysAsnC 15 20 Ap15 resíduos 141516 Esta é a única sequência TyrGlxLeu na cadeia A existe 1 grupo amido portanto o peptídeo deve ser Tyr GluLeu NGlyIleValGlxGlxCysCysAlaSerVal 1 5 10 CysSerLeuTyrGlnLeuGlxAsxTyrCysAsnC 15 20 Ap14 resíduos 14151617 Ela tem 1 grupo amido e já se sabe que o resíduo 15 é uma Gln portanto o resíduo 17 deve ser Glu NGlyIleValGlxGlxCysCysAlaSerVal 1 5 10 CysSerLeuTyrGlnLeuGluAsxTyrCysAsnC 15 20 Ap3 resíduos 18192021 Ela tem 2 grupos amido e sabese que o resíduo 21 é uma Asn portanto o resíduo 18 deve ser uma Asn NGlyIleValGlxGlxCysCysAlaSerVal 1 5 10 CysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsnC 15 20 Ap1 resíduos 1718192021 o que faz sentido pois os resíduos 18 e 21 são Asn Ap5pa1 resíduos 1234 Ela não tem grupos amido portanto o re síduo 4 deve ser Glu NGlyIleValGluGlxCysCysAlaSerVal 1 5 10 CysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsnC 15 20 Ap5 resíduos de 1 a 13 Ela tem 1 grupo amido e sabese que o resíduo 4 é Glu portanto o resíduo 5 deve ser Gln NGlyIleValGluGlnCysCysAlaSerVal 1 5 10 CysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsnC 15 20 Capítulo 4 1 a Ligações mais curtas têm ordem de ligação mais alta são múlti plas em vez de simples e são mais fortes A ligação peptídica CN é mais forte do que a ligação simples e está em qualidade a meio cami nho entre ligação simples e dupla b A rotação da ligação peptídica é difícil em temperaturas fisiológicas em virtude do seu caráter de ligação dupla parcial 2 a As unidades estruturais principais da fibra polipeptídica da lã aqueratina são sucessivas voltas da hélice a com distâncias de 54 Å a espiral enrolada produz o espaçamento de 52 Å A fervura e o estiramento da fibra geram uma cadeia polipeptídica estendida na conformação b com distância de cerca de 70 Å entre os gru pos R adjacentes A fibra se encurta quando o polipeptídeo retorna à conformação de hélice a b A lã processada encolhe quando as cadeias polipeptídicas são convertidas da conformação b estendida para a conformação nativa de hélice a na presença de calor úmido A estrutura da seda folhas b com suas pequenas cadeias laterais de aminoácidos bem empacotadas é mais estável do que a lã 3 42 ligações peptídicas por segundo 4 Em pH 6 os grupos carboxílicos da poliGlu estão desprotonados a repulsão entre os grupos carboxilato carregados negativamente leva ao desdobramento De modo similar em pH 7 os grupos amino da poliLys estão protonados a repulsão entre esses grupos carregados positivamente também leva ao desdobramento 5 a As pontes dissulfeto são ligações covalentes que são muito mais fortes do que as interações não covalentes que estabilizam a maioria das proteínas Elas fazem ligações intercadeias aumentando sua ri Nelson6edbookindb 1202 Nelson6edbookindb 1202 030414 0749 030414 0749 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 1203 gidez força mecânica e resistência b Os resíduos de cistina com ligações dissulfeto impedem o desdobramento total da proteína 6 f 5 f e c 5 e 7 a Curvaturas são mais prováveis nos resíduos 7 e 19 os resíduos Pro na configuração cis acomodam bem as voltas b Os resíduos Cys nas posições 13 e 24 podem formar ligações dissulfeto c Super fície externa resíduos polares e carregados Asp Gln Lys interior resíduos alifáticos e apolares Ala Ile Thr embora polar tem um ín dice de hidropatia próximo de zero e portanto pode ser encontrado na superfície externa e no interior da proteína 8 Trinta resíduos de aminoácidos 087 9 A mioglobina é toda tridimensional A estrutura dobrada o enove lamento da globina é um motivo encontrado em todas as globinas O polipeptídeo se dobra em um domínio único o qual representa a estrutura tridimensional inteira dessa proteína 10 Proteína a um barril b é descrita pela curva de Ramachandran c que mostra a maioria das conformações permitidas no quadrante su perior esquerdo no qual estão concentrados os ângulos de ligação ca racterísticos da conformação b b uma série de hélices a é descrita pela curva d na qual a maioria das conformações permitidas está no quadrante inferior esquerdo 11 A enzima bacteriana é uma colagenase ela destrói a barreira de tecido conectivo do hospedeiro o que permite a invasão dos tecidos pela bactéria Bactérias não têm colágeno 12 a O número de DNPvalina formado por mol de proteína se iguala ao número de extremidades aminoterminais e portanto ao número de cadeias polipeptídicas b 4 c Cadeias diferentes provavelmen te migram no gel de poliacrilamidaSDS como bandas separadas 13 a ele tem mais resíduos de aminoácidos que favorecem a estrutura em hélice a ver Tabela 41 14 a Os resíduos aromáticos parecem ter um papel importante na esta bilização das fibrilas amiloides Assim as moléculas com substituintes aromáticos podem inibir a formação do amiloide por interferirem no empilhamento ou na associação das cadeias laterais aromáticas b O amiloide se forma no pâncreas em associação ao diabetes tipo 2 assim como no cérebro na doença de Alzheimer Embora as fibrilas amiloides envolvam proteínas diferentes nas duas doenças a estru tura básica do amiloide é semelhante sendo também estabilizado de forma semelhante em ambas tornandose portanto alvos potenciais de fármacos similares projetados para romper sua estrutura 15 a Fator de transcrição NFkB também chamado de fator de trans formação RelA b Não Você pode obter resultados semelhantes mas com as proteínas relacionadas adicionais listadas c A proteína tem duas subunidades Existem múltiplas variantes das subunidades das quais as mais bem caracterizadas são as de 50 52 ou 65 kDa Elas pareiam umas com as outras e formam uma grande variedade de ho modímeros e heterodímeros As estruturas de diversas variantes po dem ser encontradas no PDB d O fator de transcrição NFkB é um dímero que se liga a sequências específicas de DNA intensificando a transcrição dos genes próximos Um desses genes codifica a cadeia leve k da hemoglobina de onde se originou o nome do fator 16 a Aba é um substituto adequado para Cys porque ambos têm cadeias laterais com aproximadamente o mesmo tamanho e são igualmente hidrofóbicos Contudo Aba não forma pontes dissulfeto e assim não será um substituto adequado se essas forem requeridas b Existem muitas diferenças importantes entre a proteína sinte tizada e a protease de HIV produzida por uma célula humana cada uma delas pode resultar em uma enzima sintética inativa 1 Ape sar de Aba e Cys terem tamanhos e hidrofobicidades semelhantes Aba pode não ser semelhante o suficiente para que a proteína se enovele corretamente 2 A protease de HIV pode requerer pontes dissulfeto para um funcionamento adequado 3 Muitas proteínas sintetizadas nos ribossomos se dobram à medida que são produzi das a proteína deste estudo se dobrou somente depois que a cadeia estava completa 4 As proteínas sintetizadas nos ribossomos po dem interagir com eles à medida que se dobram isso não é pos sível no caso da proteína em estudo 5 O citosol é uma solução mais complexa do que o tampão usado no estudo algumas proteínas podem requerer outras proteínas específicas desconhecidas para o enovelamento correto 6 As proteínas sintetizadas nas células com frequência requerem chaperonas para o enovelamento correto essas não estão presentes no tampão do estudo 7 Nas células a protease de HIV é sintetizada como parte de uma cadeia mais longa que é processada proteoliticamente a proteína do estudo foi sinteti zada como uma molécula simples c Uma vez que a enzima é fun cional com a substituição de Cys por Aba as pontes dissulfeto não têm papel importante na estrutura da protease d Modelo 1 ela vai se enovelar como a Lprotease Argumento a favor a estrutura covalente é a mesma exceto pela quiralidade assim ela deve se enovelar como a Lprotease Argumento contra a quiralidade não é um detalhe trivial a forma tridimensional é uma característicachave das moléculas biológicas A enzima sintética não se enovelará como a Lprotease Modelo 2 ela vai se enovelar como a imagem especular da Lprotease A favor uma vez que os componentes individuais são imagens especulares daqueles da proteína nativa ela se enovelará com essa forma Contra as interações envolvidas no enovelamento de uma proteína são muito complexas assim é mais provável que a proteína sintética se enovele de outra forma Modelo 3 ela se eno velará de outra forma A favor as interações envolvidas no enovela mento de uma proteína são muito complexas assim é mais provável que a proteína sintética se dobre de outra forma Contra uma vez que os componentes individuais são imagens especulares daqueles da proteína nativa ela se dobrará com essa forma e Modelo 1 a enzima é ativa mas só com a forma enantiômera do substrato na tural e é inibida pela forma enantiômera do inibidor natural Isso é consistente com a ideia de a Dprotease ser a imagem especular da Lprotease f O azul de Evans é não quiral ele se liga a ambas as formas da enzima g Não Uma vez que as proteases contêm somente Laminoácidos e reconhecem somente Lpeptídeos a qui motripsina não vai digerir a Dprotease h Não necessariamente Dependendo da enzima qualquer um dos problemas listados em b poderá resultar em uma enzima inativa Capítulo 5 1 A proteína B tem maior afinidade pelo ligante X ela estará meio satura da com uma concentração de X muito mais baixa do que a proteína A A proteína A tem um Ka 5 10 6 M 21 a proteína B tem um Ka 5 10 9 M 21 2 a b e c têm nH 10 A cooperatividade negativa aparente na interação com o ligante pode ser causada pela presença de dois ou mais sítios de interação com o ligante com afinidades diferentes pelo ligante na mesma proteína ou em diferentes proteínas na mesma solução A cooperatividade negativa aparente é comumente observa da também nas preparações proteicas heterogêneas Existem poucos casos documentados de cooperatividade negativa verdadeira 3 a diminui b aumenta c diminui d aumenta 4 kd 5 89 3 10 25 s 21 5 a 05 nM atalho Kd é equivalente à concentração do ligante quando u 5 05 b A proteína 2 tem a Kd mais baixa 6 O comportamento cooperativo da hemoglobina provém das intera ções entre as subunidades 7 a A observação de que a hemoglobina A HbA materna está cerca de 60 saturada quando a pO2 for 4 kPa enquanto a hemoglobina F HbF fetal está mais de 90 saturada sob as mesmas condições fisiológicas indica que a HbF tem maior afinidade pelo O2 do que a HbA b A maior afinidade da HbF pelo O2 garante que o oxigênio fluirá na placenta do sangue materno para o fetal O sangue fetal se aproxima da saturação total onde a afinidade da HbA pelo O2 é baixa c A observação de que a curva de saturação da HbA pelo O2 sofre maior inclinação após a ligação de BPG do que a HbF sugere que BPG se liga mais firmemente à HbA do que à HbF A ligação diferencial do BPG às duas hemoglobinas pode determinar a diferença de afinidade pelo O2 8 a Hb Memphis b HbS Hb Milwaukee Hb Providence possivel mente Hb Cowtown c Hb Providence 9 a Mais firmemente A incapacidade de formar tetrâmeros limita a cooperatividade dessas variantes e a curva de ligação se torna mais hiperbólica Além disso o sítio de ligação ao BPG é destruído A liga Nelson6edbookindb 1203 Nelson6edbookindb 1203 030414 0749 030414 0749 1204 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS ção do oxigênio é provavelmente mais forte porque o estado padrão na ausência de BPG é o estado R de ligação forte 10 a 1 3 10 28 M b 5 3 10 28 M c 8 3 10 28 M d 2 3 10 27 M Observe que um rearranjo da Equação 58 resulta em L 5 uKd1 2 u 11 A estrutura do epítopo provavelmente fica escondida quando a Gac tina polimeriza formando a Factina 12 Muitos patógenos incluindo o HIV têm mecanismos pelos quais con seguem alterar repetidamente as proteínas de superfície às quais os componentes do sistema imune se ligam Assim o organismo hospe deiro se defronta regularmente com novos antígenos e precisa de tem po para montar uma resposta imune para cada um deles Enquanto o sistema imune responde a uma variante são criadas novas variantes 13 A ligação do ATP à miosina desencadeia sua dissociação do filamento fino da actina Na ausência de ATP actina e miosina se ligam firme mente uma à outra 14 a d b c 15 a A cadeia L é a leve e a cadeia H é a pesada do fragmento Fab des sa molécula de anticorpo A cadeia Y é a lisozima b A estrutura b predomina nas regiões variáveis e constantes do fragmento c Ca deia pesada do fragmento Fab 218 resíduos de aminoácidos cadeia leve do fragmento 214 lisozima 129 Menos de 15 da molécula da lisozima está em contato com o fragmento Fab d Na cadeia H os resíduos que parecem estar em contato com a lisozima incluem Gly 31 Tyr 32 Asp 100 e Tyr 101 Na cadeia L os resíduos que parecem estar em contato com a lisozima incluem Tyr 32 Tyr 49 Tyr 50 e Trp 92 Na lisozima os resíduos Asn 19 Gly 22 Tyr 23 Ser 24 Lys 116 Gly 117 Thr 118 Asp 119 Gln 121 e Arg 125 parecem estar situados na interface antígenoanticorpo Nem todos esses resíduos estão adjacentes na estrutura primária O eno velamento da cadeia polipeptídica em níveis estruturais mais elevados aproxima resíduos não consecutivos na formação do sítio antigênico de ligação 16 a A proteína com um Kd de 5 mM terá a afinidade mais alta pelo ligan te L Quando o Kd for 10 mM a duplicação de L de 02 para 04 mM va lores bem abaixo do Kd irá praticamente duplicar o u o fator real de aumento é de 196 Essa é uma propriedade da curva hiperbólica em baixas concentrações do ligante u é uma função quase linear da L Por outro lado a duplicação da L de 40 para 80 mM bem acima do Kd onde a curva de ligação se aproxima do seu limite assintótico causará um aumento de u por um fator de 11 somente Os fatores de aumento são idênticos para as curvas geradas a partir da Equação 511 b u 5 0998 c Dependendo dos valores utilizados para os diferentes parâmetros pode ser obtida uma grande variedade de respostas 17 a Célula bacteriana Proteína A Anticorpo Miosina O desenho não está em escala cada célula tem uma quantidade muito maior de moléculas de miosina na sua superfície b O ATP é necessário para fornecer a energia química para impulsionar o movimento ver Ca pítulo 13 c Um anticorpo que se ligue à cauda da miosina o sítio de ligação da actina bloqueará sua ligação e impedirá o movimento Um anticorpo que se ligue à actina também impedirá a interação actina miosina e dessa forma o movimento d Existem duas explicações possíveis 1 A tripsina atua somente nos resíduos Lys e Arg ver Tabela 36 e assim não atuará sobre muitos sítios na proteína 2 Nem todos os resíduos de Arg ou Lys são igualmente acessíveis à tripsina os sítios mais expostos serão clivados em primeiro lugar e O modelo S1 O mo delo da dobradiça prevê que o complexo esferaanticorpoHMM com a dobradiça se mova mas o complexo esferaanticorpoSHMM sem a do bradiça não se mova O modelo S1 prevê que ambos se movam porque ambos os complexos incluem S1 A constatação que as esferas se movem com SHMM sem dobradiça é consistente somente com o modelo S1 f Com menos moléculas de miosina ligadas as esferas podem tempo rariamente desprenderse da actina à medida que uma miosina se solta dela As esferas então se movem mais lentamente já que é necessário tempo para que uma segunda miosina se ligue Em densidades mais altas de miosina à medida que uma miosina se desprende outra rapidamente se liga gerando um movimento mais rápido g Acima de certa densi dade o que limita a velocidade do movimento é a rapidez intrínseca com que a miosina move as esferas As moléculas de miosina estão se moven do com a velocidade máxima e a adição de mais miosina não aumentará a velocidade h Uma vez que a força é exercida na cabeça de S1 danos nessa região inativariam a molécula resultante e a SHMM seria incapaz de produzir movimento i A cabeça de S1 deve ser mantida íntegra por interações não covalentes suficientemente fortes para manter a forma ativa da molécula Capítulo 6 1 A atividade da enzima que converte açúcar em amido é destruída por desnaturação térmica 2 24 3 10 26 M 3 95 3 10 8 anos 4 O complexo enzimasubstrato é mais estável do que a enzima sozinha 5 a 190 Å b O enovelamento tridimensional da enzima aproxima resíduos de aminoácidos 6 A velocidade da reação pode ser medida pela redução na absorção por NADH a 340 nm à medida que a reação acontece Determine o valor de Km usando uma concentração de substrato bem acima do Km meça a velocidade inicial velocidade de desaparecimento de NADH com o tempo medida espectrofotometricamente em várias concen trações conhecidas da enzima e desenhe uma curva de velocidade inicial versus concentração da enzima A curva deve ser linear com uma inclinação que fornece a medida da concentração da LDH 7 b e g 8 a 17 3 10 23 M b 033 067 091 c A curva superior correspon de à enzima B X Km para esta enzima a curva inferior enzima A 9 a 400 s 21 b 10 mM c a 5 2 a9 5 3 d Inibidor misto 10 a 24 nM b 4 mM V0 é exatamente a metade de Vmáx assim A 5 Km c 40 mM V0 é exatamente a metade de Vmáx assim A 5 10 vezes o Km na presença do inibidor d Não kcat Km 5 033 s 21 4 3 10 26 M 5 825 3 10 24M 21s 21 bem abaixo do limite de difusão controlada 11 Vmáx ø 140 mMmin Km ø 1 3 10 25 M 12 a Vmáx 5 515 mMmin Km 5 059 mM b Inibição competitiva 13 Km 5 22 mM Vmáx 5 050 mmolmin 14 Curva A 15 kcat 5 20 3 10 7 min 21 16 A hipótese básica da equação de MichaelisMenten ainda persiste A reação está no estado estacionário e a velocidade é determinada por V0 5 k2 ES As equações a serem resolvidas para a ES são E pode ser obtida pelo rearranjo da Equação 619 O restante segue o padrão da dedução da equação de MichaelisMenten no texto 17 Mr mínima 5 29000 Nelson6edbookindb 1204 Nelson6edbookindb 1204 030414 0749 030414 0749 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 1205 18 A atividade da enzima prostática é igual à atividade total de fosfatase na amostra de sangue descontando a atividade da enzima não inibida por tartarato pois o tartarato inibe completamente a fosfatase ácida da próstata 19 A inibição é mista Uma vez que o Km parece não se alterar aprecia velmente esse pode ser o caso especial de inibição mista denominada não competitiva 20 A S na qual V0 5 Vmáx2a9 é obtida quando todos os termos do lado direito da Equação 630 exceto Vmáx isto é SaKm 1 a9S se igualem a ½ a9 Comece com SaKm 1 a9S 5 ½ a9 e encontre o valor de S 21 A atividade ótima ocorre quando Glu 35 está protonado e Asp 52 não está protonado 22 a Fator de incremento 5 196 V0 5 50 mM s 21 fator de incremento 5 1048 b Quando a 5 20 a curva desvia para a direita já que o Km aumenta por um fator de 2 Quando a9 5 30 a assíntota da curva o Vmáx dimi nui por um fator de 3 Qaundo a 5 20 e a9 5 30 a curva aumenta aci ma da curva onde ambos a e a9 5 10 devido a um declínio no Km No entanto a assíntota é menor porque Vmáx declina por um fator de 3 c Quando a 5 20 a intersecção em x se desloca para a direita Quando a 5 20 e a9 5 30 a intersecção em x se desloca para a esquerda 23 a Na enzima do tipo selvagem o substrato é mantido na posição por uma ligação de hidrogênio e uma interação de dipolo iônico entre a ca deia lateral carregada da Arg 109 e a carbonila polar do piruvato Durante a catálise a cadeia lateral da Arg 109 também estabiliza o estado de tran sição da carbonil polarizada Na mutante a ligação se reduz a apenas uma ligação de hidrogênio a ligação ao substrato é mais fraca a esta bilização iônica do estado de transição se perde e a atividade catalítica é reduzida b Uma vez que Lys e Arg têm quase o mesmo tamanho e uma carga positiva similar eles provavelmente têm propriedades muito semelhantes Além disso como o piruvato se liga à Arg 171 por uma in teração iônica provavelmente uma mutação de Arg para Lys terá um efeito pequeno sobre a ligação do substrato c O arranjo bifurcado alinha dois grupos positivamente carregados de resíduos de Arg com os oxigênios negativamente carregados do piruvato e facilita duas intera ções de ligação de hidrogênio e de dipolo iônico combinadas Quando a Lys está presente somente uma dessas interações é possível reduzin do assim a força da interação O posicionamento do substrato é menos preciso d Ile 250 interage hidrofobicamente com o anel do NADH Esse tipo de interação não é possível com a cadeia lateral hidrofílica da Gln e A estrutura está mostrada a seguir f A enzima mutante rejeita o piruvato porque o grupo metil hidro fóbico do substrato não irá interagir com o grupo guanidino altamente hidrofílico da Arg 102 A mutante se liga ao oxaloacetato em virtude das interações iônicas fortes entre a cadeia lateral da Arg 102 e o grupo car boxil do oxaloacetato g A proteína deve ser flexível o suficiente para acomodar o acréscimo de volume da cadeia lateral e o substrato maior C C O O Asp168 His195 C H NH NH H HN NH H HN H NH H HN H H3C Arg171 O C H H C CH2 O NADH Oxaloa cetato O C C NH N C H H3C CH2 CH3 Ile250 NH Arg109 Arg102 OH H C Thr246 H H N N O O Capítulo 7 1 Com a redução do oxigênio da carbonila um grupo hidroxila a carac terística química em C1 e C3 é a mesma a molécula de glicerol não é quiral 2 Epímeros diferem na configuração de apenas um carbono a D altrose C2 Dglicose C3 Dgulose C4 b Didose C2 D galactose C3 Dalose C4 c Darabinose C2 Dxilose C3 3 A formação de osazona destrói a configuração do C2 de modo que as aldoses diferentes apenas na configuração do C2 originam o mesmo derivado com o mesmo ponto de fusão 4 Para converter aDglicose em bDglicose quebrase a ligação entre o C1 e a hidroxila do C5 ver Figura 76 Para converter Dglicose em Dmanose quebrase tanto a ligação de H quanto a de OH em C2 A conversão entre as conformações em cadeira não requer o rompimento de ligações essa é a distinção crucial entre configuração e conformação 5 Não a glicose e a galactose diferem em C4 6 a Ambos são polímeros de Dglicose porém diferem quanto à liga ção glicosídica b1S4 na celulose e a1S4 no glicogênio b Am bas são hexoses porém a glicose é uma aldohexose e a frutose é uma cetoexose c Ambas são dissacarídeos mas a maltose contém duas unidades de glicose ligadas a1S4 a sacarose contém Dglicose e Dfrutose ligadas a142b 7 CH2OH H O H H H HO H O OH O H CH2 H O H H H HO OH O H H H2N açúcar redutor 8 Um hemiacetal é formado quando uma aldose ou cetose se condensa com um álcool um glicosídeo é formado quando um hemiacetal se condensa com um álcool ver Figura 75 9 A frutose forma tanto a estrutura cíclica da piranose quanto a da fu ranose O aumento da temperatura desloca o equilíbrio na direção da furanose a forma menos doce 10 A taxa de mutarrotação é alta o suficiente de maneira que confor me a enzima consome a bDglicose mais a Dglicose é convertida à forma b e ao final toda a glicose é oxidada A glicoseoxidase é espe cífica para a glicose e não detecta outros açúcares redutores como a galactose que reagem com o reagente de Fehling 11 a A medida da variação da rotação óptica ao longo do tempo b A rotação óptica da mistura é negativa invertida em relação àquela da solução de sacarose c 220 o 12 Prepare uma pasta fluida de sacarose e água para o recheio adicione uma pequena quantidade de sacarase invertase e imediatamente cubra com chocolate 13 A sacarose não tem nenhum carbono anomérico livre para passar por mutarrotação 14 CH2OH H O H H H HO O O OH H H CH2 H O H H H HO OH O OH H H Sim Sim Nelson6edbookindb 1205 Nelson6edbookindb 1205 030414 0749 030414 0749 1206 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 15 NacetilbDglicosamina é um açúcar redutor e seu C1 pode ser oxi dado ver p 252 Dgliconato não é um açúcar redutor e seu C1 já está no estado de oxidação de um ácido carboxílico GlcNa141a Glc não é um açúcar redutor e os carbonos anoméricos de ambos os monossacarídeos estão envolvidos na ligação glicosídica 16 Os humanos carecem de celulase no intestino e não conseguem de gradar a celulose 17 A celulose nativa consiste em unidades de glicose ligadas por ligações glicosídicas b1S4 as quais forçam a cadeia do polímero a assumir uma conformação estendida As séries paralelas dessas cadeias esten didas formam ligações de hidrogênio intermoleculares agregandoas em fibras longas resistentes e insolúveis O glicogênio consiste em unidades de glicose unidas por ligações glicosídicas a1S4 o que leva a curvaturas na cadeia e impede a formação de fibras longas Além disso o glicogênio é extremamente ramificado e já que muitos dos grupos hidroxila estão expostos à água é altamente hidratado e se dispersa na água A celulose é um material estrutural em plantas consistente com a agregação lateral em fibras insolúveis O glicogênio é uma forma de armazenamento de combustível em animais Grânulos de glicogênio altamente hidratados com suas muitas extremidades não redutoras são rapidamente hidrolisados pela glicogêniofosforilase para a libera ção de glicose1fosfato 18 A celulose é algumas vezes mais extensa assumindo uma conforma ção estendida enquanto a amilose tem estrutura helicoidal 19 6000 resíduoss 20 11 s 21 O modelo em esfera e bastão do dissacarídeo na Figura 718b não mostra as interações estéricas porém um modelo de volume atômico apresentando os átomos com seus tamanhos relativos reais iria expor alguns fortes impedimentos estéricos no confôrmero 2170 o 2170 o os quais não estão presentes no confôrmero 30 o 240 o 22 As cargas negativas do sulfato de condroitina repelem umas às outras e forçam a molécula a uma conformação estendida A polaridade da molécula atrai muitas moléculas de água aumentando o volume mole cular No sólido desidratado cada carga negativa é contrabalanceada por um íon positivo e a molécula se comprime 23 Resíduos de aminoácidos positivamente carregados se ligariam aos grupos da heparina carregados com alta carga negativa Na verdade resíduos de Lys da antitrombina III interagem com a heparina 24 Oito sequências possíveis 144 ligações possíveis e 64 possibilidades estereoquímicas somando um total de 73728 permutações 25 0 Cadeias de oligossacarídeos 1 2 3 Eletroforese 26 Oligossacarídeos pois suas subunidades podem ser combinadas de mais maneiras diferentes do que as subunidades de aminoácidos dos oligopeptídeos Cada grupo hidroxila pode participar das ligações gli cosídicas e a configuração de cada ligação glicosídica pode ser a ou b O polímero pode ser linear ou ramificado 27 a Resíduos em pontos de ramificação geram 23diOmetilglicose os resíduos não ramificados geram 236triOmetilglicose b 375 28 Cadeias de resíduos de Dglicose ligadas 1S6 com ramificações 1S3 esporádicas com aproximadamente uma ramificação a cada 20 resíduos 29 a Os testes envolvem a tentativa da dissolução de apenas parte da amostra em diferentes solventes e então a análise dos materiais dissol vidos e não dissolvidos para avaliar se as composições diferem b Para uma substância pura todas as moléculas são iguais e qualquer fração dissolvida apresentará a mesma composição da fração não dissolvida Uma substância impura é uma mistura de mais de um componente Quando tratado com um solvente específico um dos componentes pode dissolverse mais deixando mais do outro componente para trás Como resultado as frações dissolvidas e não dissolvidas apresentam compo sições diferentes c Um ensaio quantitativo permite que os pesquisa dores estejam seguros que nada da atividade seja perdido por degrada ção Ao se determinar a estrutura de uma molécula é importante que a amostra sob análise seja constituída somente por moléculas intactas não degradadas Se a amostra estiver contaminada com material de gradado os resultados estruturais confusos possivelmente serão não interpretáveis Um ensaio qualitativo detectaria a presença de ativida de mesmo que a amostra estivesse significativamente degradada d Resultados 1 e 2 O resultado 1 é consistente com a estrutura conhecida pois o antígeno tipo B tem três moléculas de galactose enquanto os tipos A e O têm apenas dois resíduos cada O resultado 2 também é consistente pois o tipo A tem dois aminoaçúcares Nacetilgalactosa mina e Nacetilglicosamina enquanto os tipos B e O têm apenas um Nacetilglicosamina O resultado 3 não é consistente com a estrutura conhecida para o tipo A a razão glicosaminagalactosamina é 11 para o tipo B ela é 10 e As amostras estavam provavelmente impuras e ou parcialmente degradadas Os primeiros dois resultados estavam cor retos possivelmente porque o método era somente semiquantitativo e portanto não tão sensível a imprecisões na dosagem O terceiro resul tado é mais quantitativo e por isso provavelmente difere dos valores previstos devido a amostras impuras ou degradadas f Exoglicosida se Se fosse endoglicosidase um dos produtos de sua ação sobre o an tígeno O seria galactose Nacetilglicosamina ou Nacetilgalactosamina e pelo menos um desses açúcares seria capaz de inibir a degradação Dado que a enzima não é inibida por nenhum desses açúcares ela deve ser uma exoglicosidase removendo somente o açúcar terminal da ca deia O açúcar terminal do antígeno O é a fucose a qual corresponde portanto ao único açúcar que poderia inibir a degradação do antígeno O g A exoglicosidase remove a Nacetilgalactosamina do antígeno A e a galactose do antígeno B Como a fucose não é produto de nenhuma dessas reações ela não impede a remoção desses açúcares e as molé culas resultantes não mais serão antígenos A ou B ativos Entretanto os produtos deveriam ser ativos sobre o antígeno O pois a degradação para na fucose h Todos os resultados são consistentes com a Figura 1015 1 DFucose e Lgalactose que protegeriam contra a degradação não estão presentes em nenhum dos antígenos 2 O açúcar terminal do antígeno A é Nacetilgalactosamina e esse é o único açúcar capaz de proteger esse antígeno da degradação 3 O açúcar terminal do antíge no B é a galactose único açúcar capaz de proteger esse antígeno Capítulo 8 1 N3 e N7 2 59GCGCAATATTTTGAGAAATATTGCGC39 e contém um palín dromo A cadeia individual pode formar estruturas de grampo e as duas cadeias podem formar uma estrutura cruciforme 3 94 3 10 24 g 4 a 40º b 0 o 5 A hélice de RNA está na conformação A a hélice de DNA está geral mente na conformação B 6 No DNA de eucariotos aproximadamente 5 dos resíduos de C estão metilados A 5metilcitosina pode ser desaminada espontaneamente para formar timina o par GT resultante é um dos pareamentos in corretos mais comuns em células eucarióticas 7 Mais alto 8 Sem a base o anel de ribose pode ser aberto para gerar a forma al deídica não cíclica Isso e a perda de interações de empilhamento de bases podem contribuir significativamente para a flexibilidade do esqueleto de DNA 9 CGCGCGTGCGCGCGCG 10 O empilhamento de bases em ácidos nucleicos tende a reduzir a ab sorção de luz UV A desnaturação envolve perda de empilhamento de bases e aumento de absorção da UV 11 035 mgmL Nelson6edbookindb 1206 Nelson6edbookindb 1206 030414 0749 030414 0749 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 1207 12 C C O HN C C N N N H H2N CH H O HOCH2 H H OH H HO H Desoxirribose Fosfato Guanina O2 OH 2O O P Solubilidades fosfato desoxirribose guanina Os grupos fosfato altamente polares e as porções de açúcar estão na parte externa da hélice dupla expostos à água as bases hidrofóbicas estão no interior da hélice 13 Se dCTP for omitido quando o primeiro resíduo de G for encontrado no molde será adicionado ddCTP e a polimerização será interrompi da Somente uma banda será visualizada no gel de sequenciamento 14 Eletroforese 1 2 3 4 15 59PGCGCCAUUGC39OH 59PGCGCCAUUG39OH 59PGCGCCAUU39OH 59PGCGCCAU39OH 59PGCGCCA39OH 59PGCGCC39OH 59PGCGC39OH 59PGCG39OH 59PGC39OH e os nucleosídeos 59fosfato 16 a A água participa da maioria das reações biológicas incluindo as que causam mutações O baixo conteúdo de água nos endóspo ros reduz a atividade de enzimas causadoras de mutações e a taxa de reações não enzimáticas de depurinação reações de hidrólise b A luz UV induz a formação de dímeros de pirimidina ciclobutano Como B subtilis é um organismo do solo os esporos podem ir para a superfície do solo ou para o ar onde podem sujeitarse à exposição prolongada aos raios UV 17 DMT é um grupo bloqueador que impede a reação da base que está sendo adicionada com ela mesma 18 a Orientada para a direita A base em uma extremidade 59 é a ade nina na outra extremidade 59 é a citidina b Orientada para a es querda c Se não conseguir ver as estruturas tridimensionalmente use o a ferramenta de busca para encontrar dicas online 19 a Não é fácil Esses dados para amostras diferentes do mesmo or ganismo demonstram variações significativas e o rendimento nunca é 100 Os números para C e T têm muito mais consistência do que aqueles para A e G então para C e T é muito mais fácil defender a ideia de que amostras do mesmo organismo têm a mesma composi ção Mas mesmo com valores menos consistentes para A e G 1 a faixa de valores para diferentes tecidos se sobrepõe substancialmen te 2 a divergência entre diferentes preparações do mesmo tecido é aproximadamente a mesma entre amostras de diferentes tecidos e 3 em amostras para as quais o rendimento é alto os números são mais consistentes b Essa técnica não seria sensível o suficiente para detectar uma diferença entre células normais e cancerígenas Câncer é causado por mutações mas essas alterações no DNA pou cos pares de bases em vários bilhões seriam muito pequenas para serem detectadas por essas técnicas c As relações AG e TC va riam muito entre diferentes espécies Por exemplo na bactéria Ser ratia marcescens ambas as razões são de 04 mostrando que o DNA é principalmente composto por G e C Na Haemophilus influenzae por outro lado as razões são de 174 e 154 então o DNA é principal mente A e T d A conclusão 4 tem três exigências A 5 T a tabela mostra uma razão AT muito próxima a 1 em todos os casos Certa mente a variação dessa razão é muito menor do que a variação nas razões AG e TC G 5 C Novamente a razão GC é muito próxima a 1 e outras razões variam amplamente A 1 G 5 T 1 C Essa é a razão purinapirimidina a qual também é muito próxima a 1 e As frações diferentes do cerne representam diferentes regiões do DNA do germe de trigo Se o DNA fosse uma sequência repetitiva monótona a composição de bases de todas as regiões seria a mesma Uma vez que regiões diferentes do cerne têm sequências diferentes a sequência de DNA deve ser mais complexa Capítulo 9 1 h Método 1 clivar o DNA com EcoRI como em a Nesse ponto tratase o DNA como em b ou d então ligar um fragmento de DNA sintético com sequência de reconhecimento da enzima BamHI entre as duas extremidades cegas resultantes Método 2 mais eficiente sintetizar um fragmento de DNA com a estrutura Esse fragmento se liga de modo eficiente a extremidades coesivas ge radas pela clivagem com EcoRI realizaria a introdução de um sítio de BamHI mas não regeneraria o sítio de EcoRI i Os quatro frag mentos sendo N 5 qualquer nucleotídeo na ordem de discussão do problema são 2 O DNA do fago l pode ser empacotado em partículas infecciosas de fagos somente se o seu tamanho estiver compreendido entre 40000 e 53000 pares de bases de comprimento Uma vez que vetores bac teriófagos geralmente têm acima de 30000 pares de bases em duas partes ele não será empacotado em partículas de fagos a menos que ele contenha um fragmento de DNA de comprimento adequado inse rido 10000 a 23000 pares de bases 3 a Plasmídeos nos quais o plasmídeo original pBR322 foi regenerado sem inserção de fragmento de DNA exógeno Esses vetores possuem resistência a ampicilina Duas ou mais moléculas de pBR322 também poderiam ser ligadas juntas com ou sem a inserção de DNA exógeno b Os clones nas canaletas 1 e 2 têm um fragmento de DNA inserido em diferentes orientações O clone na canaleta 3 tem dois fragmentos de DNA ligados de forma tal que as extremidades proximais de EcoRI estão unidas Nelson6edbookindb 1207 Nelson6edbookindb 1207 030414 0749 030414 0749 1208 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 4 59 GAAAGTCCGCGTTATAGGCATG39 39ACGTCTTTCAGGCGCAATATCCGTACTTAA59 5 O seu teste necessitaria de oligonucleotídeos iniciadores primers de DNA uma DNApolimerase termoestável desoxirribonucleosíde os trifosfatados e uma máquina de PCR termociclador Os oligonu cleotídeos iniciadores são desenhados para amplificar um segmento de DNA compreendendo a repetição CAG A fita de DNA mostrada é a fita codificadora orientada de 59S39 da esquerda para a direita O iniciador que se liga ao DNA à esquerda da repetição é idêntico para qualquer sequência de 25 nucleotídeos mostrada na região à es querda da repetição CAG O iniciador que se liga ao lado direito deve ser complementar e antiparalelo à sequência de 25 nucleotídeos à direita da repetição CAG Usando esses iniciadores O DNA contendo a repetição CAG seria amplificado por PCR e o seu tamanho seria de terminado por comparação com marcadores de peso molecular após eletroforese O tamanho do DNA refletiria o número de repetições CAG fornecendo um teste simples para o diagnóstico da doença 6 Desenhar oligonucleotídeos iniciadores para PCR complementares para o segmento de DNA eliminado mas o qual direcionaria a síntese de DNA distante uma da outra Nenhum produto de PCR será gerado a menos que as extremidades do segmento eliminado estejam unidas para criar um círculo 7 A planta expressando a luciferase do vagalume deverá captar a lucife rina o substrato da luciferase antes de poder brilhar embora fra camente A planta expressando a proteína fluorescente verde brilha sem necessitar de nenhum outro composto 8 Iniciador 1 CCTCGAGTCAATCGATGCTG Iniciador 2 CGCGCACATCAGACGAACCA Recorde que todas as sequências de DNA são sempre escritas no sentido 59 para 39 da esquerda para a direita que as duas fitas de uma molécula de DNA são antiparalelas e que ambos os iniciadores de PCR devem dirigir as sequências terminais de forma que suas ex tremidades 39 sejam orientadas para o segmento a ser amplificado No laboratório escrever uma sequência na orientação errada em um formulário de pedido de um oligonucleotídeo iniciador sintético pode ser um erro muito caro 9 9 1 5 3 7 4 2 6 8 A B C D E F 10 A produção de anticorpos marcados é muito cara e difícil A marcação de cada anticorpo para cada proteínaalvo é impraticável A marcação de uma preparação de anticorpo para que se ligue a todos os anticorpos de uma classe em particular permite que a mesma preparação possa ser usada em muitos experimentos de imunofluorescência diferentes 11 Expresse a proteína na linhagem 1 de levedura como proteína de fusão com um dos domínios de Gal4p por exemplo o domínio de ligação ao DNA Usando a linhagem 2 de levedura faça uma biblio teca na qual todas as proteínas do fungo sejam expressas como pro teínas de fusão com o domínio de interação Gal4p Cruze a biblioteca da linhagem 1 com a da linhagem 2 e procure as colônias coloridas pela expressão do gene repórter Essas colônias geralmente surgem de células que contêm uma proteína de fusão que interage com sua proteínaalvo 12 Cobrir a mancha 4 adicionar solução contendo T ativado irradiar e lavar 1 AT 2 GT 3 AT 4 GC Cobrir as manchas 2 e 4 adicionar solução contendo G ativado irra diar e lavar 1 ATG 2 GT 3 ATG 4 GC Cobrir a mancha 3 adicionar solução contendo C ativado irradiar e lavar 1 ATGC 2 GTC 3 ATG 4 GCC Cobrir as manchas 1 3 e 4 adicionar solução contendo C ativado irradiar e lavar 1 ATGC 2 GTCC 3 ATG 4 GCC Cobrir as manchas 1 e 2 adicionar solução contendo G ativado irra diar e lavar 1 ATGC 2 GTCC 3 ATGC 4 GCCC 13 Os iniciadores podem ser usados para sondar bibliotecas contendo clones genômicos longos para identificar as extremidades dos contigs próximos Se os contigs que flanqueiam os espaços estiverem sufi cientemente próximos os iniciadores podem ser usados em uma PCR para amplificar diretamente o DNA de interferência que separa os contigs que podem então ser clonados e sequenciados 14 ATSAAGWDEWEGGKVLIHLDGKLQNRGALLELDIGAV 15 A mesma doença pode ser causada por defeitos em dois ou mais ge nes que estão em cromossomos diferentes 16 a As soluções de DNA são altamente viscosas porque contêm um conjunto de moléculas muito grandes e emaranhadas em solução Moléculas pequenas tendem a ser menos emaranhadas e formar uma solução menos viscosa dessa forma uma diminuição da viscosida de corresponde a um encurtamento do polímero como o causado pela atividade nucleásica b Uma endonuclease Uma exonuclease remove nucleotídeos de extremidades 59 e 39 e poderia produzir nu cleotídeos marcados com 32P solúveis em TCA Uma endonuclease corta o DNA em fragmentos de oligonucleotídeos e produz pouco ou nenhum material marcado com 32P solúvel em TCA c A ex tremidade 59 Se o fosfato estivesse à esquerda na extremidade 39 a cinase incorporaria uma quantidade significativa de 32P como o fosfato acrescido à extremidade 59 O tratamento com fosfatase não teria nenhum efeito sobre isso Nesse caso as amostras A e B incor porariam quantidades significantes de 32P Quando o fosfato está à esquerda na extremidade 59 a cinase não promove nenhuma incor poração de 32P ela não pode adicionar fosfato quando esse grupa mento já está presente O tratamento com fosfatase remove o fosfato da posição 59 e a cinase então incorpora quantidades significativas de 32P A amostra A terá pouco ou nenhum 32P e a B mostrará in corporação substancial de 32P como observado d As quebras aleatórias iriam produzir uma distribuição de fragmentos de tama nhos aleatórios A produção de fragmentos específicos indica que a enzima é sítioespecífica e Clivagem no sítio de reconhecimento Isso produz uma sequência específica na extremidade 59dos frag mentos Se a clivagem ocorresse próxima mas não dentro do sítio de reconhecimento as sequências das extremidades 59 dos fragmen tos seriam aleatórias f Os resultados são consistentes com duas sequências de reconhecimento como mostradas a seguir clivadas onde mostrado pelas setas Que produz os fragmentos 59pApApC e 39TpTp e Que produz os fragmentos 59pGpApC e 39CpTp Capítulo 10 1 O termo lipídeo não especifica uma estrutura química particular Os compostos são classificados como lipídeos com base na sua maior so lubilidade nos solventes orgânicos do que na água 2 a O número de ligações duplas cis Cada ligação dupla cis causa uma inflexão na cadeia hidrocarbonada baixando a temperatura de Nelson6edbookindb 1208 Nelson6edbookindb 1208 030414 0749 030414 0749 fusa 0 b ordem Sei cresc s triacil ente ilglicerdi oO de pont rois dif Nos q 00 O tos de fu erentes uai OP Sao pod contet sO4 O em se Os 4 vido em 4 acid PO r cons R vs Acidos m acido 0 oleico PPO struidos ESPOST 4 bean bora Brexo sot P dcia PoP p em 1 AS RES i 3 amem porqu om cad urado tO palmiti PP 4 a UMID b e mi A Aleci rana red elias mals ftic O SA ecitina uzem 0 ramific alto 60 o Quan hidro Srupo OS P a solubili com gra adas pont to mai Cc filicos OH li ROB 4 bilizacae late anfi u de emp aument o de hen ts 0 ertos tte 0 Acid ivre noC LEMAS pati au am 0 se eroi 0 2 a mant patico é cotame a flui e Ay esterondes c graxo nv eogr 12 e 1 d Cc Ul 0 1ga um agent to dos li ez da 204 bindo a orno ap o Cld po pola 9 te emulsif ipdeos tsar svi a echisonn heploetth fosfocoli 1 uid6 eraca ini a 2 ini icante faci fosfoli es sen id6nico racao d inibem na é hid ano C3 sa facilit sanoi pas do se cl e aci a ativi rofobi sa ando oides e A lib que alg onvert ido ara vidade ence 15 slicerofo que tém fun sido ara lee cans quidénico 2 fosfoli A part sfolipide uncéio i araquid Ss cca grand co a parti ipa oli e lipidi os da di pro onic infl e vari ir de 5 sossacarideo dam dieta tegao co precur amacao fedade de sse m ideo d emb cor sor d do es 0 ra Po eo r ST i S nas de olig grupo p na que ela tamb utros ei cim em OSS olar det ém 1C0 16 ento p brana acarideo dos esfin ermina degrad O diacil elos anti as quais t esta lig golipid 0 tipo s a 5 145t iglicerol COrpos ambém ado a voters ver sanguineg Ahor facilm rifosfat 6 hidrofé que disti servem ermin igura éo 6 tela 6 R 17 A ente 0 éalta ébico inguem como adas gli 1015 ca Esqu s vitami no cit ment e per grup pont Icopr rvon alen n amuni osol e pol mane Os sal o de otel a a alcar 0 iL e nao las hidro Ambos lar muito ce nam nguineo reconhe COOH avia 8 1s Goole bai eee ao utes tae nemran 0 3 C a ail n 40 0 4 0 HC arvona D Glicer xa em cnn As 0 excreta Ss mensag agua ese inositol NH 19 Pricer o 08 sai ae Sao a itaminas as mais eiros difunde Acido CH 20 olubilidad fosfocolin sddicos ais oso pidamen R2a 3 coo Do elui eem Na OS dos Aci as nos li vels tém te na uri min H H co ido e gua m sais s6di idos ipide solubili nM opropa 3NC lesteril m primei onoacil édicos di palmiti os corp bilida noico H 21 e fostaticile triacilelice lugai glicerol Os scidos e ested orais O Acid CH F stunlatine aioe since calle HC H 0 S2ami 3 nonentes amac lamina otter om ulti cerol t ico e olei 30 Le ino c es de hi roma esfingomi en imo riaciloli co C co propanoi onhecid e hidroli tografi mielina tetrade lugar glicero A OH 010 xos f os Hid isados a a GLS fosfati ecanol f palmita N Aci H fine osfocoli voli acid ouT idilsering osfatidi tod do ny ol Su os Li eri tid e R2hi coo al gosina 4 ina coli do de e com C em sili ma pa idilcolin 7 Uni idroxi H 7 H calina fc Acido ina esfin pare 0 fica Imitay a nid OX1 3c cauna f sg e fo gomi sre gel to ades hi propanoi Cc slicer orte d Taxos sfato hi velion sultad com grax s hid noic O d ol D a esfi act hid a esti os os e oeacad rofobi 0 Aci i HL e cams etecte ingomi cares rolisad sfingosi com padroes cadeia eia hi cas cido H dife ada d os co selina ger mas 0 de ina Aci roes b fosf lateral a drocarb a 2 acid S2hid ote vol ka compos linens ode cerebro gra i 0 8 grupo veal o Unid prada da orancecn b roxipropanoi 2 raxo colorido FDNB nara do Nidhelieak tock b eee es ol OH pgala es hi ingosi b oico 2 F s da fosfati O tra oment os com sado atidilcoli rolise ctose ch caries na e pedal 23 osfatidil sfatidils tament ea esfing padro em crom olina ge d vari as a nucle Acid a etanol erina o com osin es ou atog ra O Tas is fosfoe 0 esteroi ma GMl e amina e mas nao fosfolip a reage por sua Tamas écul tano ide que globosi fosfati da esti ase A e for reaca 0 as de acti lamina As pr hexos osideo A atidilseri esfingomi ouA ma um gao 0 ORR Ee Eee 12 oporco e na A glico rina ielina libera Vcore 9 O e 11 es relacd se Acid Pela bina GM3 OT os Cao mol ea gala 1d0s 1 liter une d Lv Quadro 1 GM2 201 slebosil cane se veonee sao h 0 Os tri s que das Tgacoes por Sey 101 by sataloeelen ea lst a glicose qd aci 13 x oir ea 0 Aanalise d para dl aQ e ceperado b Sin eM 1 salactose u do oe elon ord sraxos eleva o auencien ne scriar Essa a i vnc A vronerea MD So ue os tri oN ura po eu Mas nto sequé dlise é ca di orga 12 pode s s triacil aOH e s animai nto de fusa tur m actica como c s revela quéncia e é sem Tay Sach com erum glic form ais fusa ad ré ada fi som de elh ach ae tontey am tals Gane o dos vgalact assialog possivel ingentoseo deamnoscids y Nulk ver ipi s mui a0 hi osami angli ir cl 0 i pideo e muito a hidroli NeudA amina ghoside ar conch se origin compost os da ins zada o chs galact 0 No usoe ada do na ulina omielina voltiveis em 5 ySachs movida a ose normal nc sobre erat se sua se em 0 Quadro é cera da erent ceramida enor seme coos I voreini e slices valncton 0 Quadr glicoseg A a O agli gal d r 8 O meti H env glicose estrutu actose Oas ro 101 alactose ALN etilaca olvid 2 ra do galac sialo exclui Oo I 24 a ale na est OH en assialo assialoganshosi fine 13 Cad 0 a oF H O 1 A Tres lactose 2 rutura ow Hogangtios in coerent eo de te format Fo oO os motilacsoy ga va meti OH e ancl 3 liga leo nor e com e forma cil longas sfatidil O C o 2 tlacao i el IN taco 4 m ligaca 3 OH goes gli mal GM1 a m seri ga 6es cosidi HO na uma C e saturad rina NH chi 46 liv lactose 2 EM Vi alactos eS 1 ee li osidicas 0 conse amada hi as qu 3 ii ave qu res para 1 o ez de 1 rscurina Hnoa ivres p S guem sas muase so ado para meting Nn tigacae 20 nel 3 OH se di ica das oasli acdo ligaca 2 He O issolv wna q na tem Capi igacd cao 1 OH 4 m ligags H er ou di ual c per pitulo es en Esta OH 6 li AGoes dif om atur 11 tre o fal n ivre undir postos a ambi 1 os acti tand 0 an S pa pol ien Aa cuca o duasi el 4 ra ares COIN e Tea por res Ond as infor OH oO conheci molécu eoN macédes uma m ida nu la pod eudAc fo onoc umero e ser esta rea nec amada de molé calculad versus a essarii quand éculas aa parti Area a aum o com de li rtir d enta ecaa pide a quanti muit resisti os ead mtida 0 co stir a aare de ui nfor com a OC sada me m pressa upada ostra ac e quando a urva de f oa orga 1210 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 2 Os dados apoiam uma bicamada de lipídeos nos eritrócitos de cão uma célula isolada com área de superfície de 98 mm 2 tem área de mo nocamada lipídica de 200 mm 2 No caso de eritrócitos humanos e de ovelhas os dados sugerem uma monocamada não uma bicamada De fato ocorreram erros experimentais significativos nesses primeiros experimentos medidas recentes mais acuradas apoiam uma bicama da em todos os casos 3 63 moléculas de SDS por micela 4 a Os lipídeos que formam bicamadas são moléculas anfipáticas contêm uma região hidrofílica e uma região hidrofóbica Esses lipí deos formam uma camada bidimensional com as regiões hidrofílicas expostas para a água e as regiões hidrofóbicas escondidas no interior da camada para minimizar a área hidrofóbica exposta à superfície aquosa Além disso para evitar a exposição das bordas hidrofóbicas da camada à água a bicamada lipídica se fecha sobre si mesma b Essas camadas formam as superfícies fechadas de membranas que envolvem as células e os compartimentos intracelulares organelas 5 2 nm Dois palmitatos colocados com as extremidades em contato se estendem por 4 nm aproximadamente a espessura de uma bicamada típica 6 Redução O movimento dos lipídeos individuais na bicamada ocorre muito mais rapidamente a 37ºC quando estão na fase fluida do que a 10ºC quando estão na fase sólida 7 35 kJmol omitindo os efeitos do potencial elétrico transmembrana 060 mol 8 13 kJmol 9 A maior parte do O2 consumido nos tecidos é pela fosforilação oxidati va a fonte da maioria do ATP Portanto dois terços do ATP sintetiza do pelo rim são usados para bombear K 1 e Na 1 10 Não O simportador pode carregar mais do que um equivalente de Na 1 para cada mol de glicose transportado 11 A extração com sal indica uma localização periférica e a inacessibili dade a proteases em células intactas indica uma localização interna A proteína X parece ser periférica na face citosólica da membrana 12 As interações hidrofóbicas entre os lipídeos da membrana são não co valentes e reversíveis permitindo o fechamento espontâneo da mem brana 13 A temperatura dos tecidos corporais nas extremidades é mais baixa do que daqueles mais próximos ao centro do corpo Se os lipídeos devem permanecer fluidos nessa temperatura mais baixa eles devem conter uma proporção mais elevada de ácidos graxos insaturados os ácidos graxos insaturados baixam o ponto de fusão das misturas lipí dicas 14 O custo energético para mover os grupos altamente polares e às vezes carregados pelo interior hidrofóbico da membrana é proibitivo 15 Em pH 7 o triptofano carrega uma carga positiva e uma negativa mas o indol não tem carga O movimento do indol menos polar pelo núcleo hidrofóbico da bicamada é energeticamente mais favorável 16 3 3 10 22 s 17 Tratar uma suspensão de células com NEM não marcado na presença de um excesso de lactose remover a lactose e adicionar NEM marca do radioativamente Usar SDSPAGE para determinar a Mr da banda radioativa o transportador 18 Construir uma curva de hidropatia as regiões hidrofóbicas com 20 ou mais resíduos sugerem segmentos transmembrana Determinar se a proteína nos eritrócitos intactos interage com um reagente imperme ante à membrana específico para aminas primárias caso o faça então o transportador é do tipo I 19 O transportador de leucina é específico para o isômero L mas o sítio de ligação pode acomodar tanto Lleucina como Lvalina A redução da Vmáx na ausência de Na 1 indica que a leucina ou a valina é transpor tada por simporte com Na 1 20 A Vmáx é reduzida o Kt não é afetado 21 1 estimado pelo cálculo da área de superfície da célula e de 10000 moléculas de transportador usando as dimensões da hemoglo bina 55 nm de diâmetro p 163 como modelo de proteína globular 22 1 8 15 4 11 18 7 14 3 10 17 6 13 2 9 16 5 12 V V H K N T R T D S K D C Q F L L V Os aminoácidos com maior índice de hidropatia V L F e C estão agrupados de um lado da hélice Essa hélice anfipática provavelmen te mergulha na bicamada ao longo de sua superfície hidrofóbica en quanto expõe a outra superfície à fase aquosa Alternativamente um grupo de hélices se reúne com suas superfícies polares em contato umas com as outras e suas superfícies hidrofóbicas voltadas para a bicamada lipídica 23 Cerca de 22 Para estimar a fração de superfície de membrana coberta por fosfolipídeos será preciso saber ou estimar a área transversal média de uma molécula de fosfolipídeo em uma bicamada p ex a partir de um experimento como aquele esquematizado no problema 1 deste capítulo e a área transversal média de uma proteína de 50 kDa 24 a O avanço por resíduo de uma hélice a Capítulo 4 é de 15 Å 5 015 nm Para atravessar os 4 nm da bicamada uma hélice a deve con ter 27 resíduos assim para atravessar sete vezes são necessários cer ca de 190 resíduos Uma proteína com Mr de 64000 tem cerca de 580 resíduos b Usase uma curva de hidropatia para localizar regiões transmembrana c Uma vez que cerca da metade dessa porção do receptor de adrenalina consiste em resíduos carregados representa provavelmente uma alça intracelular que conecta duas regiões ad jacentes da proteína que atravessam a membrana d Uma vez que essa hélice é composta na sua maior parte por resíduos hidrofóbicos essa região do receptor provavelmente é uma das regiões da proteína que atravessa a membrana 25 a Modelo A mantido As duas linhas escuras são ou as camadas de proteína ou os grupos polares dos fosfolipídeos e o espaço claro é ou a bicamada ou o núcleo hidrofóbico respectivamente Modelo B não mantido Esse modelo requer uma banda corada mais ou me nos uniformemente circundando a célula Modelo C mantido com restrição As duas linhas escuras são os grupos polares dos fosfolipí deos as zonas claras são suas caudas Assumese que as proteínas da membrana não são visíveis porque não se coram com ósmio ou não se encontram nas regiões vistas b Modelo A mantido Uma bica mada nua 45 nm 1 duas camadas de proteínas 2 nm somam 65 nm que está dentro do limite de espessura observado Modelo B nem um nem outro Esse modelo não mantido faz predições so bre a espessura da membrana Modelo C obscuro É difícil conciliar o resultado com esse modelo o qual prediz que a membrana é tão espessa quanto ou ligeiramente mais espessa em virtude das extre midades das proteínas inseridas que se projetam do que a bicamada nua O modelo é mantido somente se uma quantidade substancial de proteína se projetar da bicamada c Modelo A obscuro É difícil conciliar o resultado com este modelo Se as proteínas estão ligadas à membrana por interações iônicas o modelo prediz que elas contêm alta proporção de aminoácidos carregados ao contrário do que foi observado Também uma vez que a camada proteica deve ser muito fina ver b não deve ter muito espaço para um núcleo proteico hidrofóbico de forma que os resíduos hidrofóbicos estariam expos Nelson6edbookindb 1210 Nelson6edbookindb 1210 030414 0749 030414 0749 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 1211 tos ao solvente Modelo B mantido As proteínas têm uma mistura de resíduos hidrofóbicos que interagem com os lipídeos e de resí duos carregados que interagem com a água Modelo C mantido As proteínas têm uma mistura de resíduos hidrofóbicos ancorados na membrana e de resíduos carregados que interagem com a água d Modelo A obscuro É difícil conciliar o resultado com este mo delo que prediz uma proporção exata de 20 isso pode ser difícil de alcançar sob condições de pressão fisiologicamente relevantes Mo delo B nem um nem outro Esse modelo não faz predições sobre a quantidade de lipídeos na membrana Modelo C mantido Alguma área de superfície da membrana está ocupada por proteínas de forma que a proporção deve ser menos de 20 conforme foi observado sob condições fisiologicamente mais relevantes e Modelo A obscuro O modelo prediz proteínas em conformação estendida e não globular portanto mantido somente se for aceito que as proteínas posicionadas na superfície incluam segmentos helicoidais Modelo B mantido O modelo prediz principalmente proteínas globulares contendo alguns segmentos helicoidais Modelo C mantido O modelo prediz prin cipalmente proteínas globulares f Modelo A obscuro Os grupos polares fosforilamina estão protegidos pela camada proteica mas os fosfolipídeos somente estarão completamente protegidos da fosfolipa se se as proteínas cobrirem totalmente a superfície Modelo B manti do A maioria dos grupos polares está acessível à fosfolipase Modelo C mantido Todos os grupos polares estão acessíveis à fosfolipase g Modelo A não mantido As proteínas estão totalmente acessíveis à digestão por tripsina e praticamente todas sofrerão múltipla hidró lise sem segmentos hidrofóbicos protegidos Modelo B não mantido Praticamente todas as proteínas estão na bicamada e inacessíveis à tripsina Modelo C mantido Os segmentos de proteína que penetram ou que atravessam a bicamada estão protegidos da tripsina aqueles expostos na superfície serão hidrolisados As porções resistentes à tripsina têm alta proporção de resíduos hidrofóbicos Capítulo 12 1 X é cAMP sua síntese é estimulada pela adrenalina a A centrifugação sedimenta a adenililciclase a qual catalisa a for mação de cAMP na fração particulada b O cAMP adicionado es timula a glicogêniofosforilase c O cAMP é termoestável ele pode ser preparado pelo tratamento do ATP com hidróxido de bário 2 Ao contrário do cAMP o dibutirilcAMP atravessa prontamente a membrana plasmática 3 a Ela eleva a cAMP b O cAMP regula a permeabilidade do Na 1 c A reposição de fluidos corporais e eletrólitos perdidos 4 a A mutação torna R incapaz de se ligar e inibir C de modo que C está constantemente ativa b A mutação impede que cAMP se ligue à R deixando C inibida pela ligação à R 5 O albuterol eleva a cAMP causando o relaxamento e a dilatação dos brônquios e bronquíolos Como os receptores badrenérgicos contro lam muitos outros processos esse fármaco apresentaria efeitos cola terais indesejáveis Para minimizálos procure um agonista específico para o subtipo dos receptores badrenérgicos encontrados no múscu lo liso dos brônquios 6 Degradação do hormônio hidrólise do GTP ligado a uma proteína G degradação metabolismo ou sequestro do segundo mensageiro des sensibilização do receptor remoção do receptor da superfície celular 7 Fusione CFP à barrestina e YFP ao domínio citoplasmático do recep tor badrenérgico ou viceversa Em qualquer um dos casos ilumine em 433 nm e observe tanto em 476 quanto em 527 nm Se a interação ocorrer a intensidade da luz emitida diminuirá em 476 nm e aumen tará em 527 nm quando a adrenalina for adicionada às células expres sando as proteínas fusionadas Se a interação não ocorrer o com primento de onda da luz emitida permanecerá em 476 nm Algumas razões para possíveis falhas no experimento as proteínas fusionadas 1 estão inativas ou são por algum motivo incapazes de interagir 2 não são transportadas às suas localizações normais ou 3 não são estáveis frente à degradação proteolítica 8 A vasopressina atua por meio da elevação da Ca 21 citosólica para 10 26 M ativando a proteínacinase C A injeção de EGTA bloqueia a ação da vasopressina porém não deve afetar a resposta ao glucagon que utiliza cAMP e não Ca 21 como segundo mensageiro 9 A amplificação é o resultado da ativação de muitas moléculas de um catalisador por uma única molécula de um primeiro catalisador ativa do em uma cascata de amplificação que envolve na ordem receptor de insulina IRS1 Raf MEK ERK a ERK ativa um fator de transcri ção o qual estimula a síntese de mRNA 10 Uma mutação em ras que inativasse a atividade GTPásica da Ras cria ria uma proteína que uma vez ativada pela ligação de GTP continua ria a emitir por meio da Raf o sinal de resposta à insulina 11 Propriedades compartilhadas entre Ras e Gs ambas ligam tanto GDP quanto GTP são ativadas por GTP ativam uma enzima a jusante quando são ativadas e têm atividade GTPásica intrínseca que as des liga após um curto período de ativação Diferenças entre Ras e Gs Ras é uma proteína G pequena monomérica Gs é heterotrimérica Diferenças funcionais entre Gs e Gi Gs ativa a adenililciclase Gi inibea 12 Cinase fator entre parênteses PKA cAMP PKG cGMP PKC Ca 21 DAG Ca 21CaMcinase Ca 21 CaM cinase dependente de ciclina ciclina proteína Tyrcinase o ligante do receptor como a insulina MAPK Raf e glicogêniofosforilasecinase PKA 13 Gs permanece na forma ativada quando o análogo não hidrolisável está ligado O análogo portanto prolonga o efeito da adrenalina na célula injetada 14 a Utilize a resina cromatográfica ligada à abungarotoxina para purificação por afinidade ver Figura 317c do AChR Extraia as proteínas dos órgãos elétricos e passe a mistura pela coluna croma tográfica O AChR ligase seletivamente à resina Elua o AChR com um soluto que enfraqueça sua interação com a abungarotoxina b Utilize a ligação de 125Iabungarotoxina como ensaio quantitativo para o AChR durante a purificação por diversas técnicas A cada eta pa teste o AChR pela dosagem da ligação de 125Iabungarotoxina às proteínas da amostra Aperfeiçoe a purificação para a maior atividade específica de AChR contagensmin de 125Iabungarotoxina por mg de proteína no material final 15 a Não Se a Vm fosse determinada pela permeabilidade principal mente ao K 1 a equação de Nernst prediria uma Vm de 290 mV não de 295 mV como observado de maneira que alguma outra condutân cia contribuiria para Vm b O íon cloreto é provavelmente o determi nante de Vm o ECl2 predito é 294 mV 16 a A Vm da membrana do oócito varia de 260 mV para 210 mV isto é a membrana é despolarizada b O efeito do KCl depende do influ xo de Ca 21 a partir do meio extracelular 17 A hiperpolarização resulta no fechamento dos canais de Ca 21 depen dentes de voltagem na região présináptica do bastonete O resultante decréscimo na Ca 21in diminui a liberação de um neurotransmissor inibitório que suprime a atividade do próximo neurônio do circuito visual Quando essa inibição é removida em resposta a um estímulo luminoso o circuito tornase ativo e os centros visuais do cérebro são excitados 18 a A mutação impediria o influxo de Na 1 e Ca 21 para dentro das células em resposta à luz os cones falhariam em sinalizar ao cérebro a detecção da luz Como os bastonetes não são afetados os indivíduos seriam capazes de enxergar mas não teriam a visão em cores b A mutação impediria o efluxo de K 1 o que levaria à despolarização da membrana das células b e à liberação constitutiva de insulina no san gue c O ATP é responsável pelo fechamento desse canal de manei ra que os canais permaneceriam abertos impedindo a despolarização da membrana das células b e a liberação de insulina 19 Pessoas com a doença de Oguchi poderiam apresentar defeitos na rodopsinacinase ou na arrestina 20 Os bastonetes não mais mostrariam qualquer variação no potencial de membrana em resposta à luz Este experimento foi realizado A iluminação de fato ativou a PDE porém a enzima não conseguiu re duzir significativamente o nível de 8BrcGMP que permaneceu muito acima do necessário para manter os canais iônicos abertos Portanto a luz não tem efeito sobre o potencial de membrana Nelson6edbookindb 1211 Nelson6edbookindb 1211 030414 0749 030414 0749 1212 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 21 a Com a exposição ao calor os canais TRPV1 se abrem causan do um influxo de Na 1 e Ca 21 para dentro do neurônio sensorial Isso despolariza o neurônio iniciando um potencial de ação Quando o potencial de ação atinge os terminais do axônio o neurotransmissor é liberado sinalizando ao sistema nervoso a sensação de calor b A capsaicina mimetiza os efeitos do calor por meio da abertura de TRPV1 em baixas temperaturas levando a uma falsa sensação de ca lor O EC50 extremamente baixo indica que mesmo quantidades mui to pequenas de capsaicina terão efeitos sensoriais drásticos c Em baixos níveis o mentol abrirá o canal TRPM8 levando à sensação de frescor em altos níveis ambos TRPM8 e TRPV3 abrirão levando à sensação mista de frescor e calor como você deve experimentar com mentas muito fortes 22 a Essas mutações poderiam levar à ativação permanente do recep tor para PGE2 levando à divisão celular desregulada e ao desenvol vimento de tumor b O gene viral pode codificar uma forma cons titutivamente ativa do receptor causando a constante sinalização para a divisão celular e portanto o desenvolvimento de tumor c A proteína E1A pode ligarse a pRb e impedir a ligação de E2F de modo que E2F está constantemente ativa e as células dividemse incontro lavelmente d As células pulmonares não respondem normalmente à PGE2 pois não expressam o receptor para PGE2 Mutações que re sultem no receptor de PGE2 constitutivamente ativo não afetam as células pulmonares 23 Um gene supressor tumoral codifica uma proteína que restringe a di visão celular Uma forma mutante da proteína falha na supressão da divisão celular mas se um dos alelos codifica uma proteína normal a função continuará normal Um oncogene normal codifica uma pro teína reguladora que promove a divisão celular mas apenas quando um sinalizador apropriado fator de crescimento estiver presente A versão mutante do produto do oncogene constantemente envia sinais para a divisão caso o fator de crescimento esteja presente ou não 24 Em uma criança que desenvolve múltiplos tumores em ambos os olhos cada célula da retina tem uma cópia defeituosa do gene Rb no momento do nascimento Cedo na vida da criança diversas células independentes sofreram uma segunda mutação que danificou o alelo Rb correto produzindo um tumor Uma criança que desenvolve um único tumor tem no momento do nascimento duas cópias corretas do gene Rb em cada célula a mutação de ambos os alelos Rb de uma mesma célula extremamente rara causou um único tumor 25 Duas células que expressam o mesmo receptor de superfície podem apresentar diferentes conjuntos de proteínasalvo para a fosforilação proteica 26 a O modelo com base nas células prediz que diferentes receptores estão presentes em diferentes células b Esse experimento analisa a independência das diferentes sensações do paladar Mesmo que os receptores para doce eou umami estejam ausentes as outras sensa ções do paladar dos animais estão normais portanto a sensação de sabores agradáveis e desagradáveis é independente c Sim A perda tanto das subunidades T1R1 quanto das T1R3 anula a sensação do sabor umami d Ambos os modelos Em qualquer um dos modelos a remoção de um receptor eliminaria a sensação daquele sabor deter minado e Sim A perda tanto das subunidades T1R2 quanto T1R3 anula quase completamente a sensação do sabor doce a completa eliminação do sabor doce requer a deleção das duas subunidades f Em concentrações de sacarose muito altas receptores T1R2 e em menor extensão T1R3 na forma de homodímeros podem detectar o sabor doce g Os resultados são consistentes com qualquer um dos modelos que fortalecem as conclusões dos pesquisadores A intera ção com o ligante pode ser completamente separada da sensação do paladar Se o ligante para o receptor presente nas células do sabor doce ligar uma molécula os camundongos selecionarão aquela molé cula como composto doce Capítulo 13 1 Considerar o embrião de pinto como o sistema os nutrientes a casca do ovo e o mundo exterior são o meio ambiente A trans formação de uma única célula em um pinto reduz drasticamente a entropia do sistema Inicialmente as partes do ovo do lado de fora do embrião o ambiente contêm moléculas complexas de combus tível condição de baixa entropia Durante a incubação algumas dessas moléculas complexas são convertidas em uma grande quan tidade de moléculas de CO2 e H2O alta entropia Esse aumento da entropia do ambiente é maior do que a redução da entropia do pinto o sistema 2 a 2 48 kJmol b 756 kJmol c 2137 kJmol 3 a 262 b 608 c 030 4 K9eq 5 21 DG9 5 276 kJmol 5 2 31 kJmol 6 a 2168 kJmol b 244 kJmol c Em certa temperatura o va lor de DG9 para qualquer reação é fixado e definido para condições padrão aqui frutose6fosfato e glicose6fosfato a 1 M Em con trapartida DG é uma variável que pode ser calculada para qualquer conjunto de concentrações de reagente e produto 7 K9eq ø 1 DG9 ø 0 8 Menos A equação total da hidrólise de ATP pode ser semelhante a ATP 42 1 H2O S ADP 32 1 HPO4 22 1 H 1 isso é somente uma aproxi mação porque as espécies ionizadas mostradas aqui são as principais mas não as únicas formas presentes Sob condições padrão isto é ATP 5 ADP 5 Pi 5 1 M a concentração da água é 55 M e não se altera durante a reação Uma vez que são produzidos íons H 1 na reação em uma H 1 mais alta pH 50 o equilíbrio se desloca para a esquerda e menos energia livre é liberada 9 10 10 ln Q 24 22 21 23 0 27 26 28 29 25 0 220 260 240 230 210 250 DG kJmol A DG da hidrólise do ATP é mais baixa quando ATPADP for baixa 1 do que quando ATPADP for alta A energia disponível para a célula a partir de uma dada ATP é mais baixa quando a relação ATPADP cai e alta quando a relação aumenta 11 a 385 3 10 23 M 21 glicose6fosfato 5 89 3 10 28 M não b 14 M essa não é uma etapa aceitável porque a solubilidade máxima da glicose é menos de 1 M c 837 DG9 5 2167 kJmol glicose 5 12 3 10 27 M sim d Não Isso requereria uma concentração de Pi tão alta que os sais de fosfato de cátions divalentes precipitariam e Pela transferência direta do grupo fosforil do ATP para a glicose o po tencial de transferência do grupo fosforil tendência ou pressão do ATP é utilizado sem gerar altas concentrações de intermediários A parte essencial dessa transferência é naturalmente a catálise enzi mática 12 a 2 125 kJmol b 2 146 kJmol 13 a 3 3 10 24 b 687 c 74 3 10 4 14 2 13 kJmol 15 467 kJmol 16 A isomerização desloca o grupo carbonil do C1 para o C2 estabe lecendo a quebra da ligação carbonocarbono entre C3 e C4 Sem a isomerização a quebra da ligação ocorreria entre C2 e C3 com a geração de um composto de dois carbonos e um de quatro Nelson6edbookindb 1212 Nelson6edbookindb 1212 030414 0749 030414 0749 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 1213 17 O mecanismo é o mesmo daquele da reação da álcooldesidrogenase ver Figura 1414 18 O primeiro passo é o inverso de uma condensação aldólica ver meca nismo da aldolase Figura 146 o segundo passo é uma condensação aldólica ver Figura 134 19 a 46 kJmol b 46 kg 68 c O ATP é sintetizado quando neces sário sendo então quebrado em ADP e Pi sua concentração é manti da em um estado estacionário 20 O sistema do ATP está em estado estacionário dinâmico a ATP per manece constante porque a taxa de seu consumo é igual à taxa de sua síntese O consumo de ATP envolve a liberação do grupo fosforila ter minal g a síntese de ATP a partir de ADP envolve reposição desse grupo fosforila Por isso o fosfato terminal passa por uma reposição rápida Em contrapartida a reposição do fosfato central b é relati vamente lenta 21 a 17 kJmol b A pirofosfatase inorgânica catalisa a hidrólise do pirofosfato e conduz a reação no sentido da síntese de acetilCoA 22 36 kJmol 23 a NAD 1NADH b Piruvatolactato c Formação de lactato d 2 261 kJmol e 363 3 10 4 24 a 114 V b 2 220 kJmol c 4 25 a 2 035 V b 2 0320 V c 2 029 V 26 Em ordem de aumento de tendência a d b c 27 c e d 28 a O estado de mais baixa energia e de mais alta entropia ocorre quando a concentração do corante é a mesma nas duas células Se uma junção tipo fenda do tipo armadilha de peixe permitir o trans porte unidirecional uma maior quantidade de corante irá para o oli godendrócito e menos para o astrócito Esse é um estado de mais alta energia e de mais baixa entropia do que o estado de partida violando a segunda lei da termodinâmica O modelo proposto por Robinson e colaboradores requer uma redução espontânea impossível da entro pia Em termos de energia o modelo vincula uma variação espontâ nea do estado de mais baixa energia para um de mais alta energia sem aporte de energia de novo termodinamicamente impossível b As moléculas ao contrário dos peixes não exibem comportamento direcionado elas se movem ao acaso por movimento browniano A difusão resulta em um movimento efetivo de moléculas de uma re gião de concentração mais alta para uma região de concentração mais baixa simplesmente porque é mais provável que uma molécula que esteja no lado mais concentrado entre no canal de conexão Veja isso como uma via com etapa limitante de velocidade a extremidade es treita do canal A extremidade mais estreita limita a velocidade com a qual as moléculas atravessam porque o movimento aleatório é menos adequado para movêlas através do diâmetro menor A extremidade ampla do canal não atua como um funil para as moléculas embora o faça para os peixes porque as moléculas não são comprimidas pelos lados do funil estreito como os peixes o são A extremidade estreita limita a velocidade do movimento igualmente em ambos os sentidos Quando as concentrações em ambos os lados se igualarem a velocida de em ambos os sentidos também será igual e não haverá variação na concentração c Os peixes exibem comportamento não aleatório ajustando suas ações em resposta ao meio ambiente Os peixes que entram na abertura larga do canal tendem a se mover para adiante porque seu comportamento induz o movimento adiante e eles se aglomeram à medida que se movem pelo canal estreito É fácil para os peixes entrar na abertura larga mas eles não saem da armadilha tão facilmente porque é menos provável que entrem na abertura es treita d Existem muitas explicações possíveis algumas das quais foram propostas pelos autores das cartas que criticaram o artigo Aqui estão duas 1 O corante se liga a uma molécula no oligodendró cito A ligação remove efetivamente o corante do solvente de forma que ele não conta como soluto para as considerações termodinâmi cas embora permaneça visível ao microscópio de fluorescência 2 O corante é sequestrado em uma organela subcelular do oligoden drócito sendo bombeado ativamente à custa deATP ou atraído por outras moléculas dessa organela Capítulo 14 1 Equação resultante Glicose 1 2ATP S 2 gliceraldeído3fosfato 1 2ADP 1 2H 1 DG9 5 21 kJmol 2 Equação resultante 2 gliceraldeído3fosfato 1 4ADP 1 2Pi S 2 lac tato 1 2NAD 1 DG9 5 2 114 kJmol 3 GLUT2 e GLUT1 é encontrado no fígado e está sempre presente na membrana plasmática dos hepatócitos GLUT3 está sempre presente na membrana plasmática de determinada células do cérebro GLUT4 é normalmente sequestrado em vesículas nas células musculares e do tecido adiposo e se introduz na membrana plasmática somente em resposta à insulina Assim o fígado e o cérebro podem captar glicose do sangue independentemente do nível de insulina mas o músculo e o tecido adiposo a captam somente quando os níveis de insulina se elevam em resposta à glicose sanguínea alta 4 CH3CHO 1 NADH 1 H 1 CH3CH2OH 1 NAD 1 K9 eq 5 145 3 10 4 5 2 86 kJmol 6 a 14CH3CH2OH b 3 14Cglicose ou 4 14Cglicose 7 A fermentação libera energia e uma parte é conservada na forma de ATP mas uma grande quantidade é dissipada como calor Se o con teúdo do fermentador não for resfriado a temperatura se torna alta o suficiente para matar os microrganismos 8 Grãos de soja e trigo contêm amido um polímero de glicose Os mi crorganismos degradam o amido em glicose glicose em piruvato via glicólise e piruvato em lactato porque o processo se realiza na au sência de O2 ou seja é uma fermentação Se o O2 estiver presente o piruvato será oxidado a acetilCoA e então a CO2 e H2O Certa quanti dade de acetilCoA contudo será também hidrolisada a ácido acético vinagre na presença de oxigênio 9 C1 Esse experimento demonstra a reversibilidade da reação da al dolase O C1 do gliceraldeído3fosfato é equivalente ao C4 da fru tose16difosfato ver Figura 147 O gliceraldeído3fosfato inicial deve ser marcado no C1 O C3 da dihidroxiacetonafosfato se torna marcado pela reação da triosefosfatoisomerase gerando a frutose1 6bifosfato marcada no C3 10 Não Não há produção de ATP em condições anaeróbias a produção aeróbia de ATP será levemente reduzida 11 Não A lactatodesidrogenase é requerida para a reposição de NAD 1 a partir do NADH formado durante a oxidação do gliceralde ído3fosfato 12 A transformação de glicose em lactato ocorre quando os miócitos es tão com baixo oxigênio e isso proporciona um meio de gerar ATP sob condições de deficiência de O2 A glicose não é gasta porque o lacta to pode ser oxidado a piruvato esse é oxidado em reações aeróbias quando o O2 se torna abundante Essa flexibilidade metabólica dá ao organismo uma maior capacidade de adaptação ao seu ambiente 13 Ela remove rapidamente o 13bifosfoglicerato em uma etapa subse quente favorável catalisada pela fosfogliceratocinase 14 a O produto é 3fosfoglicerato b Não há síntese resultante de ATP em condições anaeróbias na presença de arsenato 15 a A fermentação do etanol requer 2 mols de Pi por mol de glicose b O etanol é o produto reduzido formado durante a reoxidação do NADH a NAD 1 e o CO2 é o subproduto da conversão do piruvato a etanol Sim o piruvato deve ser convertido em etanol para a produção de um suprimento contínuo de NAD 1 para a oxidação do gliceralde ído3fosfato A frutose16bifosfato se acumula ela se forma como um intermediário na glicólise c O arsenato substitui o Pi na reação da gliceraldeído3fosfatodesidrogenase e forma um acilarsenato que é hidrolisado espontaneamente Isso impede a formação de ATP mas o 3fosfoglicerato continua na via 16 A niacina da dieta é usada para sintetizar NAD 1 As oxidações efetu adas pelo NAD 1 são parte de processos cíclicos tendo o NAD 1 como carreador de elétrons agente redutor uma molécula de NAD 1 oxida muitos milhares de moléculas de glicose e assim a necessidade da vitamina precursora niacina na dieta é relativamente pequena 17 Dihidroxiacetonafosfato 1 NADH 1 H 1 S glicerol3fosfato 1 NAD 1 catalisada por uma desidrogenase Nelson6edbookindb 1213 Nelson6edbookindb 1213 030414 0749 030414 0749 1214 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 18 Deficiência de galactocinase galactose menos tóxica UDPgli cose deficiência de uridililgalactose1fosfato galactose1fosfato mais tóxica 19 As proteínas são degradadas a aminoácidos utilizados na gliconeogê nese 20 a Na reação da piruvatocarboxilase 14CO2 é adicionado ao piruva to mas a PEPcarboxicinase remove o mesmo CO2 na etapa seguinte Assim o 14C não é incorporado inicialmente na glicose OPO3 22 H 3414CGlicose C CH2 C POH2C O COO2 CH2 OPO3 22 14 COO2 14 COO2 14 C COO2 OPO3 22 14 CH2 OH CH2 O O C H C OPO3 22 CH2 OH H 14 OPO3 22 H C CH2 OH 14 O C 22O3 OPO3 22 H C CH2 OH COO2 14 2Fosfoglicerato Fosfoenolpiruvato Dihidroxiacetona fosfato Oxaloacetato 3Fosfoglicerato Frutose 16bifosfato Gliceraldeído 3fosfato CH2OPO3 22 HO C OH 14 C H 14 C OH C O CH2OPO3 22 13Bifosfoglicerato H CH3 O C COO2 14 114CPiruvato C OH H 21 Quatro equivalentes de ATP por molécula de glicose 22 A gliconeogênese seria altamente endergônica e seria impossível re gular a gliconeogênese e a glicólise separadamente 23 A célula gasta 1 ATP e 1 GTP para converter piruvato em PEP 24 a b d são glicogênicos c e e não são 25 O consumo de álcool força a competição por NAD 1 entre o metabolis mo do etanol e a gliconeogênese O problema é uma combinação de exercício extenuante e falta de alimento porque a esta altura o nível de glicose no sangue já é baixo 26 a O aumento rápido da glicólise o aumento do piruvato e do NADH resulta em aumento do lactato b O lactato é transformado em gli cose via piruvato esse é o processo mais lento já que a formação do piruvato é limitada pela disponibilidade de NAD 1 o equilíbrio da LDH é favorável ao lactato e a conversão do piruvato em glicose necessita de energia c O equilíbrio da reação da LDH é favorável à formação de lactato 27 O lactato é transformado em glicose no fígado pela gliconeogênese ver Figuras 1416 1417 Um defeito na FBPase1 impediria a en trada do lactato na via gliconeogênica nos hepatócitos causando acú mulo de lactato no sangue 28 O succinato é transformado em oxaloacetato o qual passa para o ci tosol e é convertido em PEP pela PEPcarboxicinase Dois mols de PEP são requeridos para a produção de um mol de glicose pela rota delineada na Figura 1417 29 Se as vias catabólica e anabólica do metabolismo da glicose estiverem operando simultaneamente ocorre ciclo fútil de ATP com consumo extra de O2 30 No mínimo o acúmulo de ribose5fosfato tenderia a forçar essa reação no sentido inverso pela ação das massas ver Equação 134 Poderia também afetar outras reações metabólicas que envolvem a ribose5fosfato como substrato ou produto como as vias de síntese de nucleotídeos 31 a É provável que a tolerância ao etanol envolva muito mais ge nes e nesse caso a engenharia genética significaria um projeto mui to mais complicado b A Larabinoseisomerase a enzima araA converte aldose em cetose ao mover o grupo carbonil de um açúcar não fosforilado do C1 para o C2 Não é discutida nenhuma enzima análoga neste capítulo todas as enzimas descritas aqui atuam sobre açúcares fosforilados Uma enzima que executa uma transforma ção similar com açúcares fosforilados é a fosfoexoseisomerase A Lribulocinase araB fosforila um açúcar no C5 pela transferên cia do fosfato g do ATP Muitas dessas reações estão descritas neste capítulo incluindo a reação da hexocinase A Lribulose5fosfato epimerase araD troca os grupos H e OH no carbono quiral de um açúcar Neste capítulo não está descrita nenhuma reação similar mas está no Capítulo 20 ver Figura 2013 c As três enzimas ara convertem arabinose em xilulose5fosfato pela seguinte via Arabinose Larabinoseisomerase Lribulose Lribulocinase Lribulose5fosfato epimerase xilulose5fosfato d A arabinose é convertida em xilulo se5fosfato como em c a qual entra na via mostrada na Figura 14 23 o produto glicose6fosfato é então fermentado a etanol e CO2 e 6 moléculas de arabinose 1 6 moléculas de ATP são convertidas em 6 moléculas de xilulose5fosfato que alimentam a via mostra da na Figura 1423 para gerar 5 moléculas de glicose6fosfato e cada uma delas é fermentada para gerar 3 ATP elas entram como glicose6fosfato não como glicose 2 15 ATP no total De ponta a ponta esperase a geração de 15 ATP 2 6 ATP 5 9 ATP a partir de 6 moléculas de arabinose Os outros produtos são 10 moléculas de etanol e 10 moléculas de CO2 f Dada a geração de ATP mais baixa para um crescimento isto é disponibilidade de ATP equivalente àquele obtido sem os genes adicionados o Z mobilis modificado deve fermentar mais arabinose e dessa forma ele produz mais eta nol g Uma maneira de permitir o uso de xilose seria a adição de genes para duas enzimas uma análoga da enzima araD que converte xilose em ribose pela troca de H e OH no C3 e uma análoga da enzima araB que fosforila a ribose no C5 A ribose5fosfato resul tante supriria a via existente Capítulo 15 1 a 00293 b 308 c Não Q é muito mais baixo do que K9eq indi cando que a reação da PFK1 está longe do equilíbrio nas células essa reação é mais lenta do que a reação posterior na glicólise O fluxo pela via glicolítica é basicamente determinado pela atividade da PFK1 2 a 14 3 10 29 M b A concentração fisiológica 0023 mM é 16000 vezes a concentração no equilíbrio essa reação não alcança o equilí brio na célula Muitas reações não estão em equilíbrio na célula 3 Na ausência de O2 o ATP necessário é produzido pelo metabolismo anaeróbio da glicose fermentação a lactato Uma vez que a oxidação aeróbia da glicose produz muito mais ATP do que a fermentação é necessário menos glicose para produzir a mesma quantidade de ATP Nelson6edbookindb 1214 Nelson6edbookindb 1214 030414 0749 030414 0749 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 1215 4 a Existem dois sítios de ligação para o ATP um sítio catalítico e um sítio de regulação A ligação do ATP ao sítio de regulação inibe a PFK 1 pela redução da Vmáx ou pelo aumento do Km para o ATP no sítio catalítico b O fluxo glicolítico é reduzido quando há abundância de ATP c O gráfico indica que o aumento da ADP suprime a inibição pelo ATP Uma vez que a quantidade de nucleotídeos de adenina é razoavelmente constante o consumo de ATP leva a um aumento na ADP Os dados mostram que a atividade da PFK1 pode ser regulada pela proporção ATPADP 5 O grupo fosfato da glicose6fosfato está completamente ionizado em pH 7 dando à molécula uma carga total negativa Uma vez que as membranas são geralmente impermeáveis a moléculas eletricamente carregadas a glicose6fosfato não consegue passar da corrente san guínea para as células e por isso não entra na via glicolítica e gera ATP Esse é o motivo pelo qual a glicose uma vez fosforilada não consegue escapar da célula 6 a No músculo a degradação do glicogênio fornece energia ATP via glicólise A glicogêniofosforilase catalisa a conversão do glico gênio armazenado em glicose1fosfato que é convertida em glico se6fosfato intermediário da glicólise Durante atividade intensa o músculo esquelético requer grande quantidade de glicose6fosfato No fígado a degradação do glicogênio mantém um nível sanguíneo constante de glicose entre as refeições a glicose6fosfato é conver tida em glicose livre b No trabalho muscular ativo a necessidade de fluxo de ATP é muito alta e a glicose1fosfato deve ser produzida rapidamente o que requer alta Vmáx 7 a Piglicose1fosfato 5 331 b c O valor dessa proporção na célula 1001 indica que a glicose1fosfato está bem abaixo do nível de equilíbrio A glicose1fosfato é removida para entrar na glicólise com velocidade muito maior do que sua velocidade de pro dução pela reação da glicogêniofosforilase de modo que o fluxo metabólico é do glicogênio para a glicose1fosfato A reação da glico gêniofosforilase é provavelmente a etapa reguladora na degradação do glicogênio 8 a aumenta b diminui c aumenta 9 Repouso alta ATP baixa AMP acetilCoA e citrato interme diária Corrida ATP intermediária alta AMP baixa acetilCoA e citrato O fluxo de glicose pela glicólise aumenta durante a corrida anaeróbia porque 1 a inibição do ATP pela glicogêniofosforilase e pela PFK1 é parcialmente abrandada 2 O AMP estimula ambas as enzimas e 3 os níveis baixos de citrato e de acetilCoA abrandam seus efeitos inibidores respectivamente sobre a PFK1 e sobre a piru vatocinase 10 O pássaro migratório conta com uma oxidação de gorduras altamente eficiente em vez do metabolismo anaeróbio da glicose utilizado pelo coelho corredor O pássaro reserva o glicogênio de seus músculos para curtas explosões de energia durante situações de emergência 11 Caso Af 3 Caso B c 3 Caso C h 4 Caso D d 6 12 a 1 Tecido adiposo síntese mais lenta de ácidos graxos 2 Mús culo glicólise síntese mais lenta de ácidos graxos e de glicogênio 3 Fígado glicólise mais rápida gliconeogênese síntese mais lenta de ácidos graxos e de glicogênio via das pentosesfosfato inaltera da b 1 Tecido adiposo e 3 fígado síntese de ácidos graxos mais lenta porque a falta de insulina resulta na inativação da acetil CoAcarboxilase a primeira enzima da via A síntese de glicogênio é inibida pela fosforilação dependente de AMP cíclico e consequente ativação da glicogêniosintase 2 Músculo a glicólise está mais lenta porque o GLUT4 está inativo inibindo a captação da glicose 3 Fígado a glicólise está mais lenta porque o complexo bifuncional PFK1FBPase2 está em sua forma com a FBPase2 ativa reduzindo a frutose26bifosfato o que estimula alostericamente a fosfofruto cinase e inibe a FBPase1 isso também é responsável pela estimula ção da gliconeogênese 13 a elevados b elevados c elevados 14 a A PKA não pode ser ativada em resposta ao glucagon ou à adre nalina e a glicogêniofosforilase não é ativada b PP1 permanece ativo permitindo a desfosforilação da glicogêniosintase ativandoa e da glicogêniofosforilase inibindoa c A fosforilase permanece fosforilada ativa aumentando a degradação do glicogênio d A gliconeogênese não pode ser estimulada quando os níveis de glicose sanguínea forem baixos levando a um nível glicêmico perigosamente baixo durante períodos de jejum 15 A queda na glicose sanguínea desencadeia a liberação de glucagon pelo pâncreas No fígado o hormônio ativa a glicogêniofosforilase pela estimulação de sua fosforilação dependente de AMP cíclico e estimula a gliconeogênese pela redução da frutose26bifosfato es timulando desse modo a FBPase1 16 a Capacidade de mobilização do glicogênio reduzida glicose san guínea mais baixa entre as refeições b Capacidade reduzida de bai xar os níveis de glicose sanguínea após uma refeição rica em carboi dratos glicose sanguínea elevada c Frutose26bifosfato F26BP reduzida no fígado o que estimula a glicólise e inibe a gliconeogênese d F26BP reduzida o que inibe a glicólise e estimula a gliconeogê nese e Captação de ácidos graxos e de glicose aumentada aumento da oxidação de ambos f Conversão do piruvato em acetilCoA au mentada síntese de ácidos graxos aumentada 17 a Dado que cada partícula contém cerca de 55000 resíduos de glicose a concentração equivalente de glicose livre seria 55000 3 001 mM 5 550 mM ou 055 M Isso representaria um desafio osmó tico sério para a célula Os fluidos corporais têm uma osmolarida de substancialmente mais baixa b Quanto menor o número de ramificações menor o número de extremidades livres disponíveis para a ação da glicogêniofosforilase e menor a taxa de liberação de glicose Sem ramificações haveria somente um sítio para a atuação da enzima c A camada externa da partícula estaria muito cheia de resíduos de glicose para que a enzima tivesse acesso às ligações para hidrolisálas e liberar glicose d O número de cadeias duplas em cada camada sucessiva a camada 1 tem uma cadeia 2 0 a camada 2 tem duas 2 1 a camada 3 tem quatro 2 2 e assim por diante Assim para t camadas o número de cadeias na camada mais ex terna CA é 2 t 21 e O número total de cadeias é 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 t21 5 2 t 2 1 Cada cadeia contém gc moléculas de glicose de modo que o número total de moléculas de glicose GT é gc2t 21 f A glicogêniofosforilase pode liberar todos os resíduos de glicose de uma cadeia de comprimento gc menos quatro Por isso para cada cadeia na camada externa a enzima pode liberar gc 2 4 moléculas de glicose Dado que existem 2 t21 cadeias na camada externa o número de moléculas de glicose que a enzima pode liberar GPT é gc 2 42 t21 g O Volume de uma esfera é pr 3 Nesse caso r é a espessura de uma camada vezes o número de camadas ou 012 gc 1 035t nm Assim Vs 5 pr 3012 gc 1 035 3 nm 3 h Você pode mostrar algebricamente que o valor de gc que maximiza f é indepen dente de t Escolhendo t 5 3 gc CA GT GPT Vs f 5 4 35 4 11 58 6 4 42 8 19 97 7 4 49 12 24 12 8 4 56 16 28 14 9 4 63 20 32 15 10 4 70 24 34 16 11 4 77 28 36 16 12 4 84 32 38 17 13 4 91 36 40 17 14 4 98 40 41 17 15 4 100 44 42 16 16 4 110 48 43 16 O valor ótimo de gc isto é no f máximo é 13 Na natureza gc varia de 12 a 14 o que corresponde a valores de f muito próximos ao ótimo Se você escolher outro valor para t os números serão diferentes mas o gc ótimo ainda será 13 Nelson6edbookindb 1215 Nelson6edbookindb 1215 030414 0749 030414 0749 1216 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS Capítulo 16 1 a ➊ Citratosintase AcetilCoA 1 oxaloacetato 1 H2O S citrato 1 CoA ➋ Aconitase Citrato S isocitrato ➌ Isocitratodesidrogenase Isocitrato 1 NAD 1 S acetoglutarato 1 CO2 1 NADH ➍ aCetoglutaratodesidrogenase aCetoglutarato 1NAD 1 1 CoA S succinilCoA 1 CO2 1 NADH ➎ SuccinilCoAsintetase SuccinilCoA 1 Pi 1 GDP S succinato 1 CoA 1 GTP ➏ Succinatodesidrogenase Succinato 1 FAD S fumarato 1 FADH2 ➐ Fumarase Fumarato 1 H2O S malato ➑ Malatodesidrogenase Malato 1 NAD 1 S oxaloacetato 1 NADH 1 H 1 b c ➊ CoA condensação ➋ nenhum isomerização ➌ NAD 1 descarboxilação oxidativa ➍ NAD 1 CoA e pirofosfato de tiamina descarboxilação oxidativa ➎ CoA fosforilação no nível do substrato ➏ FAD oxidação ➐ nenhum hidratação ➑ NAD 1 oxidação d AcetilCoA 1 3NAD 1 1 FAD 1 GDP 1 Pi 1 2H2O S 2CO2 1 CoA 1 3NADH 1 FADH2 1 GTP 1 2H 1 2 Glicose 1 4ADP 1 Pi 1 1 0NAD 1 1 2FAD S 4ATP 1 10NADH 1 2FADH2 1 6CO2 3 a Oxidação metanol S formaldeído 1 HH b Oxidação formaldeído S formato 1 HH c Redução CO2 1 HH S formato 1 H 1 d Redução glicerato 1 H 1 1 HH S gliceraldeído 1 H2O e Oxidação glicerol S dihidroxiacetona 1 HH f Oxidação 2H2O 1 tolueno S benzoato 1 H 1 1 3HH g Oxidação succinato S fumarato 1 HH h Oxidação piruvato 1 H2O S acetato 1 CO2 1 HH 4 A partir das fórmulas estruturais é possível observar que a razão HC dos carbonos ligados do ácido hexanoico 116 é maior do que aquela da glicose 76 O ácido hexanoico é mais reduzido e gera mais ener gia com a completa combustão a CO2 e H2O 5 a Oxidado etanol 1 NAD 1 S acetaldeído 1 NADH 1 H 1 b Reduzido 13bifosfogli cerato 1 NADH 1 H 1 S gliceraldeído3fosfato 1 NAD 1 1 HPO4 22 c Inalterado piruvato 1 H 1 S acetaldeído 1 CO2 d Oxidado piruvato 1 NAD 1 S acetato 1 CO2 1 NADH 1 H 1 e Reduzido oxaloacetato 1 NADH 1 H 1 S malato 1 NAD 1 f Inalterado acetoacetato 1 H 1 S acetona 1 CO2 6 TPP o anel tiazólico se adiciona ao carbono a do piruvato e então es tabiliza o carbânion resultante atuando como escoadouro de elétrons Ácido lipoico oxida o piruvato no nível do acetato acetilCoA e ati va o acetato à forma tioéster CoASH ativa o acetato à forma tioéster FAD oxida o ácido lipoico NAD 1 oxida o FAD 7 A falta de TPP inibe a piruvatodesidrogenase o piruvato se acumula 8 Descarboxilação oxidativa NAD 1 ou NADP 1 acetoglutaratodesi drogenase 9 O consumo de oxigênio é uma medida da atividade dos dois primei ros estágios da respiração celular glicólise e ciclo do ácido cítrico A adição de oxaloacetato ou malato estimula o ciclo do ácido cítrico e portanto estimula a respiração O oxaloacetato e o malato adiciona dos desempenham função catalítica pois são regenerados na última parte do ciclo do ácido cítrico 10 a 56 3 10 26 b 11 3 10 28 M c 28 moléculas 11 ADP ou GDP Pi CoASH TPP NAD 1 não é necessário adicionar o ácido lipoico o qual está covalentemente ligado às enzimas que o utilizam 12 Os nucleotídeos de flavina FMN e FAD não seriam sintetizados Como o FAD é necessário para o ciclo do ácido cítrico a deficiência de flavi na marcadamente inibiria o ciclo 13 O oxaloacetato pode ser desviado para a síntese de aspartato ou para a gliconeogênese O oxaloacetato é reposto pelas reações anapleró ticas catalisadas pela PEPcarboxicinase PEPcarboxilase enzima málica ou piruvatocarboxilase ver Figura 1616 14 O grupo fosfato terminal do GTP pode ser transferido ao ADP por meio de uma reação catalisada pela nucleosídeodifosfatocinase com constante de equilíbrio igual a 10 GTP 1 ADP S GDP 1 ATP 15 a 2OOCCH2CH2COO 2 succinato b O malonato é um inibidor competitivo da succinatodesidrogenase c Um bloqueio do ciclo do ácido cítrico interrompe sucessivamente a formação de NADH a transferência de elétrons e a respiração d Um grande ex cesso de succinato substrato supera a inibição competitiva 16 a Adicione 14Cglicose uniformemente marcada e verifique a libera ção de 14CO2 b Igualmente distribuído entre C2 e C3 no oxaloace tato um número infinito 17 O oxaloacetato se equilibra com o succinato no qual C1 e C4 são equivalentes O oxaloacetato derivado do succinato é marcado em C1 e C4 e o PEP derivado desse oxaloacetato está marcado no C1 que dá origem aos C3 e C4 da glicose 18 a C1 b C3 c C3 d C2 grupo metil e C4 f C4 g igualmente distribuído entre C2 e C3 19 A tiamina é necessária para a síntese de TPP um grupo prostético dos complexos da piruvatodesidrogenase e acetoglutaratodesidrogena se Uma deficiência de tiamina reduz a atividade desses complexos enzimáticos e causa o observado acúmulo dos precursores 20 Não Para cada dois carbonos que entram na forma de acetato dois deixam o ciclo na forma de CO2 portanto não há síntese líquida de oxaloacetato A síntese líquida de oxaloacetato ocorre pela descarbo xilação do piruvato reação anaplerótica 21 Sim o ciclo do ácido cítrico seria inibido O oxaloacetato está pre sente em concentrações relativamente baixas na mitocôndria e sua remoção para a gliconeogênese tenderia a deslocar o equilíbrio da reação da citratosintase no sentido do oxaloacetato 22 a Inibição da aconitase b Fluorocitrato compete com o citrato por um grande excesso de citrato c Citrato e fluorocitrato são inibi dores da PFK1 d Todos os processos catabólicos necessários para a produção de ATP estão bloqueados 23 Glicólise Glicose 1 2Pi 1 2ADP 1 2NAD 1 S 2 piruvato 1 2ATP 1 2NADH 1 2H 1 1 2H2O Reação da piruvatocarboxilase 2 Piruvato 1 2CO2 1 2ATP 1 2H 2O S 2 oxaloacetato 1 2ADP 1 2Pi 1 4H 1 Reação da malatodesidrogenase 2 Oxaloacetato 1 2 NADH 1 2 H 1 S 2 Lmalato 1 2NAD 1 Isso recicla as coenzimas de nicotinamida sob condições anaeróbias A reação geral é Glicose 1 2CO2 S 2 Lmalato 1 4 H 1 Isso produz quatro H 1 por glicose aumentando a acidez e portanto o sabor adstringente do vinho 24 Reação resultan te 2 Piruvato 1 ATP 1 2NAD 1 1 H2O S acetoglutarato 1 CO2 1 ADP 1 Pi 1 2NADH 1 3H 1 25 O ciclo participa de processos catabólicos e anabólicos Por exemplo ele gera ATP pela oxidação de substratos mas também fornece pre cursores para a síntese de aminoácidos ver Figura 1616 Nelson6edbookindb 1216 Nelson6edbookindb 1216 030414 0749 030414 0749 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 1217 26 a diminui b aumenta c diminui 27 a O citrato é produzido pela ação da citratosintase sobre oxaloa cetato e acetilCoA A citratosintase pode ser utilizada para a síntese líquida de citrato quando 1 existe um influxo contínuo de oxaloa cetato e acetilCoA novos e 2 a síntese de isocitrato está limitada como em um meio com baixo nível de Fe 31 A aconitase requer Fe 31 portanto um meio pobre em Fe 31 restringe a síntese da aconitase b Sacarose 1 H2O S glicose 1 frutose Glicose 1 2Pi 1 2 ADP 1 2NAD 1 S 2 piruvato 1 2ATP 1 2NADH 1 2H 1 1 2H2O Frutose 1 2Pi 1 2ADP 1 2NAD 1 S 2 piruvato 1 2 ATP 1 2NADH 1 2H 1 1 2H2O 2 Piruvato 1 2NAD 1 1 2 CoA S 2 acetilCoA 1 2NADH 1 2H 1 1 2CO2 2 Piruvato 1 2CO2 1 2ATP 1 2H2O S 2 oxaloacetato 1 2ADP 1 2Pi 1 4H 1 2 AcetilCoA 1 2 oxaloacetato 1 2H2O S 2 citrato 1 2CoA A reação geral é Sacarose 1 H2O 1 2Pi 1 2AD P 1 6NAD 1 S 2 citrato 1 2ATP 1 6NADH 1 10 H 1 c A reação geral consome NAD 1 Como o conteúdo celular dessa coenzima oxidada é limitado ela deve ser reciclada pela cadeia trans portadora de elétrons com o consumo de O2 Consequentemente a conversão global de sacarose a ácido cítrico é um processo aeróbio e requer oxigênio molecular 28 A succinilCoA é um intermediário do ciclo do ácido cítrico seu acú mulo sinaliza um fluxo reduzido ao longo do ciclo demandando uma entrada reduzida de acetilCoA para dentro do ciclo A citratosintase por meio da regulação da via oxidativa principal da célula regula o suprimento de NADH e portanto o fluxo de elétrons do NADH para o O2 29 O catabolismo de ácidos graxos eleva a acetilCoA o que estimula a piruvatocarboxilase O resultante aumento na oxaloacetato esti mula o consumo de acetilCoA pelo ciclo do ácido cítrico e a citrato aumenta inibindo a glicólise no nível da PFK1 Além disso a elevada acetilCoA inibe o complexo piruvatodesidrogenase diminuindo a utilização do piruvato proveniente da glicólise 30 O oxigênio é necessário para a reciclagem do NAD 1 a partir do NADH produzido pelas reações oxidativas do ciclo do ácido cítrico A reoxi dação do NADH ocorre durante a fosforilação oxidativa mitocondrial 31 O aumento na NADHNAD 1 inibe o ciclo do ácido cítrico pela ação das massas nas três etapas de redução do NAD 1 a alta NADH des loca o equilíbrio em direção ao NAD 1 32 Na direção do citrato o DG para a reação da citratosintase sob essas condições é aproximadamente 2 8 kJmol 33 As etapas ➍ e ➎ são essenciais para a reoxidação do cofator lipoamida reduzido dessa enzima 34 O ciclo do ácido cítrico é tão essencial ao metabolismo que um defeito grave em qualquer enzima do ciclo seria provavelmente letal ao em brião 35 A primeira enzima de cada via está sob regulação alostérica recíproca A inibição de uma via desvia o isocitrato para a outra via 36 a A única reação no tecido muscular que consome quantidades signi ficativas de oxigênio é a respiração celular de maneira que o consumo de O2 é uma boa representação da respiração b O tecido muscular recentemente preparado contém alguma glicose residual o consumo de O2 é devido à oxidação dessa glicose c Sim Como a quantidade de O2 consumida aumentou quando citrato ou 1fosfoglicerol foi adicio nado ambos podem atuar como substratos para a respiração celular nesse sistema d Experimento I o citrato causa um consumo de O2 muito maior do que seria esperado de sua completa oxidação Cada mo lécula de citrato parece atuar como se fosse mais de uma molécula A única explicação possível é que cada molécula de citrato participa mais de uma vez da reação o modo como um catalisador atua Experimen to II a chave é calcular o excesso de O2 consumido em cada amostra em comparação com o controle amostra 1 Amostra 0 2 34 Sem substrato extra 1 2 03 mL de 1fosfoglicerol 02 M 757 415 3 015 mL de citrato 002 M 431 89 4 03 mL 02 M 1fosfoglicerol 1 015 mL de citrato 002 M 1385 1043 Substratos adicionados mL de O2 absorvidos Excesso de mL de O2 consumidos Se tanto citrato quanto o 1fosfoglicerol fossem simplesmente subs tratos da reação você esperaria que o excesso no consumo de O2 pela amostra 4 fosse a soma dos excessos nos consumos individuais das amostras 2 e 3 415 mL 1 89 mL 5 504 mL Entretanto o excesso no consumo quando ambos os substratos estão presentes é aproxi madamente o dobro dessa quantidade 1043 mL Portanto o citrato aumenta a capacidade do tecido de metabolizar 1fosfoglicerol Esse comportamento é típico de um catalisador Ambos os experimentos I e II são necessários para tornar esse argumento convincente Com base apenas no experimento I o citrato está de alguma maneira acelerando a reação porém não está claro se ele atua auxiliando o metabolismo do substrato ou por meio de algum outro mecanismo Com base apenas no experimento II não está claro qual molécula é o catalisador citrato ou 1fosfoglicerol Juntos os experimentos mos tram que o citrato atua como catalisador para a oxidação do 1fos foglicerol e Dado que a via pode consumir citrato ver amostra 3 para que o citrato atue como catalisador ele deve ser regenerado Para que o conjunto das reações primeiro consuma e posteriormen te regenere o citrato a via deve ser circular em vez de linear f Quando a via está bloqueada na acetoglutaratodesidrogenase o ci trato é convertido a acetoglutarato porém a via não pode prosseguir O oxigênio é consumido pela reoxidação do NADH produzido pela isocitratodesidrogenase g Citrato aCetoglutarato Succinato Fumarato Malonato Oxaloacetato Glicose Essa via difere da mostrada na Figura 167 por não incluir cisaconi tato e isocitrato entre citrato e acetoglutarato ou succinilCoA ou acetilCoA h O estabelecimento de uma conversão quantitativa foi fundamental para excluir a possibilidade de uma via ramificada ou mais complexa Capítulo 17 1 A porção de ácido graxo os carbonos dos ácidos graxos estão mais reduzidos do que no glicerol 2 a 40 3 10 5 kJ 96 3 10 4 kcal b 48 dias c 048 lbdia 3 A primeira etapa da oxidação dos ácidos graxos é análoga à conversão do succinato a fumarato a segunda etapa à conversão do fumarato a malato a terceira etapa à conversão do malato a oxaloacetato 4 Oito ciclos o último libera 2 acetilCoA 5 a RCOO 2 1 ATP S acilAMP 1 PPi AcilAMP 1 CoA S acilCoA 1 AMP Nelson6edbookindb 1217 Nelson6edbookindb 1217 030414 0749 030414 0749 1218 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS b Hidrólise irreversível de PPi a 2Pi pela pirofosfatase inorgânica celular 6 cisD 3dodecanoilCoA é convertido em cisD 2dodecanoilCoA e a seguir em bhidroxidodecanoilCoA 7 Quatro acetilCoA e 1 propionilCoA 8 Sim Uma parte do trítio é removida do palmitato durante as reações de desidrogenação da boxidação O trítio removido aparece como água tritiada 9 Os grupos acilgraxos condensados com CoA no citosol são primeiro transferidos para a carnitina com liberação de CoA e então trans portados para a mitocôndria onde são novamente condensados com a CoA Os reservatórios citosólicos e mitocondriais de CoA são dessa forma mantidos separados e a CoA radioativa do reservatório citosó lico não entra na mitocôndria 10 a No pombo predomina a boxidação no faisão predomina a glicó lise anaeróbia do glicogênio b A musculatura do pombo consome mais O2 c A gordura contém mais energia por grama do que o gli cogênio Além disso a degradação anaeróbia do glicogênio é limitada pela tolerância do tecido ao lactato formado Assim o pombo que funciona com o metabolismo oxidativo das gorduras é o voador de longa distância d Essas enzimas são as reguladoras de suas respec tivas vias e assim limitam as taxas de produção de ATP 11 O malonilCoA não inibiria mais a entrada dos ácidos graxos na mi tocôndria e na boxidação de forma que poderia ser um ciclo fútil de síntese simultânea de ácidos graxos no citosol e degradação na mitocôndria 12 a A entrada de ácidos graxos na mitocôndria mediada pela carni tina é a etapa limitante da velocidade na oxidação A deficiência de carnitina reduz a oxidação dos ácidos graxos a adição de carnitina aumenta a taxa b Todos aumentam a necessidade metabólica da oxidação dos ácidos graxos c A deficiência de carnitina poderia ser resultado de uma deficiência do seu precursor lisina ou de um defeito em uma das enzimas da biossíntese da carnitina 13 A oxidação das gorduras libera água metabólica 14 L de água por kg de tripalmitoilglicerol ignorar a pequena contribuição do glicerol para a massa total 14 As bactérias podem ser usadas para oxidar completamente os hidro carbonetos em CO2 e H2O Contudo pode ser difícil conseguir contato entre os hidrocarbonetos e as enzimas bacterianas Nutrientes bac terianos como o nitrogênio e fósforo podem ser limitantes e inibir o crescimento 15 a Mr 136 ácido fenilacético b Par 16 Uma vez que o reservatório de CoA mitocondrial é pequeno essa deve ser reciclada a partir de acetilCoA via a formação de corpos cetôni cos Isso permite o funcionamento da via da boxidação necessária para a produção de energia 17 a A glicose gera piruvato via glicólise e o piruvato é a principal fonte de oxaloacetato Sem glicose na dieta a oxaloacetato cai e o ciclo do ácido cítrico reduz a velocidade b De número ímpar a conversão do propionato em succinilCoA fornece intermediários para o ciclo do ácido cítrico e precursores de quatro carbonos para a gliconeogênese 18 Para o ácido heptanoico de cadeia ímpar a boxidação produz propio nilCoA que pode ser convertida em várias etapas a oxaloacetato um material de partida para a gliconeogênese Os ácidos graxos de cadeia par não mantêm a gliconeogênese porque são completamente oxidados a acetilCoA 19 A boxidação do vfluoroleato forma fluoracetilCoA que entra no ciclo do ácido cítrico e produz fluorcitrato potente inibidor da aconi tase A inibição dessa enzima paralisa o ciclo do ácido cítrico Sem os equivalentes redutores do ciclo do ácido cítrico a fosforilação oxida tiva síntese de ATP é reduzida 20 Ser por Ala bloqueia a boxidação na mitocôndria Ser por Asp blo queia a síntese dos ácidos graxos estimula a boxidação 21 A resposta ao glucagon ou à adrenalina seria prolongada provocando maior mobilização de ácidos graxos nos adipócitos 22 A enzFAD por ter um potencial padrão de redução mais positivo é um aceptor de elétrons melhor do que o NAD 1 e a reação é conduzi da no sentido da oxidação do acilCoAgraxo Esse equilíbrio mais fa vorável é obtido com o gasto de 1 ATP somente 15 ATP é produzido por cada FADH2 oxidado na cadeia respiratória vs 25 por NADH 23 Nove voltas o ácido araquídico ácido graxo saturado com 20 carbo nos gera 10 moléculas de acetilCoA as duas últimas formadas na nona volta 24 Ver Figura 1712 Formase 3 14CsuccinilCoA que produz oxaloace tato marcado no C2 e no C3 25 Ácido fitânico S ácido pristânico S propionilCoA S S S succi nilCoA S succinato S fumarato S malato Todos os carbonos do malato seriam marcados mas C1 e C4 teriam somente metade da marcação do C2 e C3 26 A hidrólise de ATP nas reações celulares que requerem energia capta água na reação ATP 1 H2O S ADP 1 Pi assim no estado estacioná rio não há produção resultante de H2O 27 A metilmalonilCoAmutase requer o cofator que contém cobalto for mado a partir da vitamina B12 28 A perda de massa é de quase 066 kg por dia ou quase 140 kg em 7 meses A cetose pode ser evitada pela degradação de proteínas cor porais não essenciais para suprir os esqueletos de aminoácidos para a gliconeogênese 29 a Os ácidos graxos são convertidos em seus derivados acilcoA por enzimas do citoplasma os acilCoA são então importados para a mi tocôndria e oxidados Dado que os pesquisadores utilizaram mitocôn drias isoladas eles tiveram de usar derivados CoA b O estearoil CoA foi rapidamente convertido em nove moléculas de acetilCoA pela via da boxidação Todos os intermediários reagiram rapidamen te e nenhum deles foi detectado em níveis significativos c Dois ciclos Cada ciclo remove dois átomos de carbono assim dois ciclos convertem um ácido graxo de 18 carbonos em um de 14 carbonos mais 2 acetilCoA d O Km é mais alto para o isômero trans do que para o cis de forma que é necessária maior concentração do isômero trans para a mesma taxa de degradação Grosso modo o isômero trans não se liga tão bem quanto o cis provavelmente porque dife renças de forma mesmo que não sejam no sítioalvo para a enzima afetem a ligação do substrato à enzima e O substrato da LCAD VLCAD é formado de maneira diferente dependendo do substrato em particular isso é esperado para a etapa limitante da velocidade de uma via f Os parâmetros cinéticos mostram que o isômero trans é um substrato mais pobre para a LCAD do que o cis mas existe uma diferença pequena para a VLCAD Por ser um substrato mais pobre o isômero trans se acumula em níveis mais altos do que o cis g Uma via possível está mostrada a seguir indicando dentro e fora da mitocôndria elaidoilcarnitina dentro elaidoilCoA dentro 2 ciclos de boxidação carnitinaaciltransferase II ElaidoilCoA fora elaidoilcarnitina fora carnitinaaciltransferase I transporte 5transtetradecenoilCoA dentro 5transácido tetradecanoico fora 5transácido tetradecanoico dentro difusão tioesterase h É correto à medida que as gorduras trans são degradadas com menos eficiência do que as cis e assim as gorduras trans podem vazar para fora da mitocôndria Não é correto dizer que as gorduras trans não são degradadas pelas células elas o são mas a uma veloci dade mais baixa do que as gorduras cis Nelson6edbookindb 1218 Nelson6edbookindb 1218 030414 0749 030414 0749 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 1219 Capitulo 18 9 a Uma pessoa em uma dieta contendo apenas proteinas deve uti O lizar aminodcidos como principal fonte de combustivel metabdlico Uma vez que 0 metabolismo dos aminoacidos requer que 0 grupo ami a OOCCH2CCOO Oxaloacetato no seja removido por fim gerando ureia 0 processo consome quan tidades anormalmente grandes de agua para diluir e excretar a ureia O na urina Além disso eletrélitos contidos na proteina liquida devem i ser diluidos com agua e excretados Se a perda didria de Agua pelos b OOCCHCHCCOOaCetoglutarato rins nao estiver equilibrada por uma ingesto suficiente de agua o resultado sera perda liquida da 4gua corporal Oo b Ao se considerar os beneficios nutricionais das proteinas deve se ter em mente a quantidade total de aminoacidos necessaria para ec CH3CCOO Piruvato a sintese proteica e a distribuicdo de aminodcidos nas proteinas da dieta A gelatina contém uma distribuigaéo de aminodcidos inadequada O do ponto de vista nutricional Como grandes quantidades de gelatina s4o ingeridas e 0 excesso de aminoacidos é catabolizado é possivel d on CCOO Fenilpiruvato que a capacidade do ciclo da ureia seja excedida levando A toxicidade por aménia Isso é ainda mais complicado pela desidratagao que pode 2 Este 6 um ensaio que utiliza reacoes acopladas O produto da len resultar da excrecaéo de grandes quantidades de ureia Uma combina ta transaminacao piruvato é rapidamente consumido na reacao Gao desses dois fatores pode levar ao coma e a morte indicadora subsequente catalisada pela lactatodesidrogenase que 10 Lisina e leucina consome NADH Assim a velocidade de desaparecimento do NADH 11 a Fenilalaninahidroxilase dieta com baixo contetido de fenilalani é uma medida da velocidade da reacao da aminotransferase A reagao na b A rota normal para o metabolismo da fenilalanina via hidroxi indicadora é monitorada pela observacao do decréscimo na absorban lacaéo produzindo tirosina esta bloqueada e a fenilalanina se acumula cia do NADH a 340 nm com um espectrofotémetro c A fenilalanina é transformada em fenilpiruvato por transaminagao 3 Alanina e glutamina desempenham papéis especiais no transporte de e a seguir em fenilactato por reducao A reagéo de transaminacao grupos amino do mtisculo e de outros tecidos nao hepaticos respecti apresenta uma constante de equilibrio de 10 e o fenilpiruvato é for vamente para o figado mado em quantidades significativas quando a fenilalanina se acumula 4 Nao O nitrogénio da alanina pode ser transferido para 0 oxaloacetato d Em virtude da deficiéncia na produgao de tirosina precursora da por transaminacao para formar aspartato melanina 0 pigmento normalmente presente no cabelo 5 15 mols de ATP por mol de lactato 13 mols de ATP por mol de alani 12 O catabolismo dos esqueletos carbonados da valina da metionina e na quando inclufda a remocao do nitrogénio da isoleucina esta prejudicado em virtude da auséncia de funcgao da 6 a O jejum resultou em baixos niveis sanguineos de glicose A admi metilmalonilCoAmutase enzima que utiliza vitamuna Bi COMO CO nistracaio subsequente da dieta experimental levou a um rapido cata enzima Os efeitos fisioldgicos da perda dessa enzima estao descritos bolismo de aminoacidos glicogénicos b A desaminagao oxidativa na Tabela 182 e no Quadro 182 causou um aumento nos niveis de NH a auséncia de arginina um 13 A dieta vegana apresenta caréncia de vitamina B levando a um au intermediério do ciclo da ureia impediu a conversao de NHem ureia mento de homocisteina e metilmalonato refletindo deficiéncias na A arginina nao é sintetizada no gato em quantidades suficientes para metioninasintase e na metilmalonatomutase respectivamente em satisfazer as necessidades impostas pelo estresse do experimento individuos que adotam essa dieta por varios anos Na dieta lactovege Isso sugere que a arginina seja um aminodcido essencial na dieta do tariana os laticinios fornecem certa quantidade de vitamina B gato e A ornitina é convertida em arginina pelo ciclo da ureia 14 As formas genéticas de anemia perniciosa geralmente surgem como 7 HO glutamato NAD acetoglutarato NH NADH H resultado de defeitos nas vias responsaveis por mediar a absorgao de NH 2ATP HO CO carbamoilfosfato 2ADP P 3H vitamina B da dieta ver Quadro 172 Uma vez que suplementos dietéticos nao sao absorvidos pelo intestino essas condicées sao tra Carbamoilfosfato ornitina citrulina P H x i tadas pela administracao intravenosa de suplementos de B Citrulina aspartato ATP argininosuccinato AMP PP H 15 Omecanismo é idéntico aquele da serinadesidratase ver Figura 18 Argininosuccinato arginina fumarato 20a exceto pelo fato de que o grupo metil adicional de treonina é Fumarato HO malato mantido produzindo acetobutirato em vez de piruvato Malato NAD oxaloacetato NADH H 16 Oxaloacetato glutamato aspartato acetoglutarato a NHCONH Arginina HO ureia ornitina a 2 2 2 Glutamato CO 4H0 2NAD 3ATP b OOCCHCHCOO 2 acetoglutarato 2NADH 7H ureia 2ADP AMP PP 2P d 15NH Reacées adicionais que devem ser consideradas I 15 AMP ATP 2ADP Q c RNHCNH O 8H 2NADH 6ADP 6P 2NAD 6ATP 8HO 3 HO PP 2PH 4 O Somandose as equacées 1 a 4 d rN tN 2 Glutamato CO O 2ADP 2P 2 acetoglutarato ureia 3HO 2ATP 8 O segundo grupo amino introduzido na molécula da ureia é trans e Nao identificado ferido a partir do aspartato que é gerado durante a transaminagéo do glutamato para o oxaloacetato reagdo catalisada pela aspartato INH aminotransferase Aproximadamente metade de todos os grupos amino excretados na forma de ureia deve passar pela reacao da aspar f 00CCCH Ccoo tatoaminotransferase tornando essa aminotransferase a mais ativa dessas enzimas H 1220 RESPOSTAS RESUMIDAS AOS PROBLEMAS 17 a Isoleucina acetilCoA 1 propionilCoA b Passo ➊ transaminação sem reação análoga PLP ➋ descarboxilação oxidativa análoga à reação da piruvatode sidrogenase NAD 1 TPP lipoato FAD ➌ oxidação análoga à reação da succinatodesidrogenase FAD ➍ hidratação análoga à reação da fumarase sem cofatores ➎ oxidação análoga à reação da malatode sidrogenase NAD 1 ➏ tiólise reação reversa da condensação aldóli ca análoga à reação da tiolase CoA 18 Um mecanismo provável seria H N 1 CH HO Lys CH3 P 2OOC 1HB C H OH H N 1 H PLP Serina 1 H C2 2OOC 1NH3 C H H O C H CH C HO CH3 P N 1 H CH HO CH3 P 2OOC 1NH N 1 H C H CH HO CH3 P 1NH3 C N 1 H C H N 1 Lys H Glicina CH HO CH3 P N 1 H H Lys 2OOC 1NH H C O H B 1NH 1NH3 Lys Enz Enz Enz Enz Enz Enz 2OOC C H H 1NH3 PLP H O formaldeído produzido HCHO no segundo passo reage rapida mente com tetrahidrofolato no sítio ativo da enzima produzindo N 5N 10metilenotetrahidrofolato ver Figura 1817 19 a Transaminação sem analogias PLP b Descarboxilação oxida tiva análoga à descarboxilação oxidativa do piruvato em acetilCoA anteriormente à sua entrada no ciclo do ácido cítrico e à descarbo xilação do acetoglutarato em succinilCoA no ciclo do ácido cítrico NAD 1 FAD lipoato e TPP c Desidrogenação oxidação análoga à desidrogenação do succinato em fumarato no ciclo do ácido cítrico e de acilCoA em enoilCoA na boxidação FAD d Carboxilação sem analogias no ciclo do ácido cítrico ou na boxidação ATP e biotina e Hidratação análoga à hidratação do fumarato em malato no ciclo do ácido cítrico e de enoilCoA em 3hidroxiacilCoA na boxidação sem cofatores f Reação aldólica reversa análoga à reação reversa da citratosintase no ciclo do ácido cítrico sem cofatores 20 a Leucina valina isoleucina b Cisteína produzida a partir da cistina Se a cisteína for descarboxilada como mostrado na Figura 186 produzirá H3N 1CH2CH2SH que pode ser oxidada produ zindo taurina c O sangue colhido em janeiro de 1957 mostra níveis significativamente elevados de isoleucina leucina metionina e valina a urina analisada em janeiro de 1957 mostra níveis significativamente aumentados de isoleucina leucina taurina e valina d Todos os pa cientes apresentavam níveis altos de isoleucina leucina e valina tanto no sangue quanto na urina sugerindo uma deficiência na degradação desses aminoácidos Uma vez que a urina também continha níveis ele vados dos acetoácidos correspondentes a esses três aminoácidos o bloqueio na via deve ocorrer após a desaminação mas anteriormente à desidrogenação como mostrado na Figura 1828 e O modelo não explica os níveis elevados de metionina no sangue e de taurina na urina Os níveis elevados de taurina talvez ocorram devido à morte de células nervosas durante o estágio final da doença A razão para os níveis elevados de metionina no sangue no entanto não é clara a via de degradação da metionina não está ligada com a degradação dos aminoácidos de cadeia ramificada O aumento da metionina po deria ser um efeito secundário do aumento de outros aminoácidos É importante considerarmos que as amostras de janeiro de 1957 eram de um indivíduo que estava morrendo de modo que não é apropria da a comparação de resultados de testes de sangue e urina com um indivíduo saudável f A informação a seguir é necessária e foi por fim obtida por outros pesquisadores 1 A atividade da desidroge nase está significativamente reduzida ou ausente em indivíduos com a doença do xarope de bordo 2 A doença é herdada como defeito em um único gene 3 O defeito ocorre em um gene que codifica toda ou parte da desidrogenase 4 O defeito genético leva à produção de uma enzima inativa Capítulo 19 1 Reação 1 a d NADH b e EFMN c NAD 1NADH e E FMNFMNH2 Reação 2 a d EFMNH2 b e Fe 13 c EFMNFMNH2 e Fe 13 Fe 12 Reação 3 a d Fe 12 b e Q c Fe 13Fe 12 e QQH2 2 A cadeia lateral torna a ubiquinona solúvel em lipídeos e permite sua difusão na membrana semifluida 3 Pela diferença no potencial padrão de redução DE9 para cada par de meiareação podese calcular DG9 A oxidação do succinato pelo FAD é favorecida pela variação de energia livre negativa DG9 5 237 kJmol A oxidação pelo NAD 1 requer uma grande variação de energia livre positiva DG9 5 68 kJmol 4 a Todos os carreadores estão reduzidos CN 2 bloqueia a redução do O2 catalisada pela citocromooxidase b Todos os carreadores estão reduzidos na ausência de O2 os carreadores reduzidos não são reoxidados c Todos os carreadores estão oxidados d Os carre adores iniciais estão mais reduzidos os carreadores finais estão mais oxidados 5 a A inibição da NADHdesidrogenase pela rotenona reduz a veloci dade do fluxo de elétrons pela cadeia respiratória o que por sua vez reduz a taxa de produção de ATP Se essa taxa reduzida não for capaz de suprir as necessidades do organismo por ATP ele morrerá b A actinomicina A inibe fortemente a oxidação da coenzima Q na cadeia respiratória reduzindo a velocidade de transferência de elétrons e levando às consequências descritas em a c Uma vez que a ac tinomicina A bloqueia todo o fluxo de elétrons para o oxigênio ela é um veneno mais potente do que a rotenona a qual bloqueia o fluxo de elétrons a partir do NADH mas não do FADH2 6 a A velocidade de transferência de elétrons necessária para suprir a demanda de ATP aumenta e por isso a relação PO diminui b Uma alta concentração do desacoplador reduz a relação PO para quase zero A relação PO diminui e é necessário oxidar mais combustível para gerar a mesma quantidade de ATP O calor extra liberado por essa oxidação eleva a temperatura corporal c A atividade aumen Nelson6edbookindb 1220 Nelson6edbookindb 1220 030414 0749 030414 0749