Estudo Dirigido Técnicas de Biologia Molecular Resolvido-2021 2

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - DEPARTAMENTO DE GENÉTICA DISCIPLINA BIO07714 - GENÉTICA FARMÁCIA Estudo dirigido Técnicas de Biologia Molecular e suas aplicações na Medicina Veterinária 1. O que é a técnica de PCR? Descreva os passos da técnica de PCR e compare com o mecanismo de Duplicação do DNA in vivo. 2. Explique a Técnica de PCR em tempo real e como ela poder pode ser útil no diagnóstico de doenças? 3. Compare o método de sequenciamento Sanger com os métodos atuais de sequenciamento chamados métodos de sequenciamento de última geração (ou sequenciamentos de nova geração). 4. Com base na Figura 14.2 do texto “Genomas e Genômica”, por que os fragmentos de DNA sequenciados precisam ser sobrepostos para se obter uma sequência genômica? Explique essa lógica. 5. Qual o papel e a importância da bioinformática em análises genômicas? 6. Há uma gama de aplicações das técnicas moleculares que estão diretamente relacionadas com as atividades dos farmacêuticos. Comente como elas podem ser aplicadas em 3 exemplos diferentes. Estudo dirigido Técnicas de Biologia Molecular e suas aplicações na Medicina Veterinária 1. O que é a técnica de PCR? Descreva os passos da técnica de PCR e compare com o mecanismo de Duplicação do DNA in vivo. A técnica de PCR, também chamada de Reação em Cadeia de Polimerase, é utilizada para amplificar cópias de uma região específica de um DNA, de modo que esta possa ser analisada (por eletroforese em gel ou sequenciamento, por exemplo) As etapas que ocorrem durante a realização da PCR são: a) Desnaturação: Fase que ocorre em uma temperatura de 96 graus Celsius, a qual aquece a reação de modo que desnature as fitas de DNA, obtendo assim um molde de fita simples b) Anelamento: Essa fase ocorre entre 55 a 65 graus Celsius, temperatura que resfria a reação permitindo o anelamento dos primers á sequência complementar (região de interesse que se deseja estudar ou detectar) na fita molde c) Extensão: A última fase ocorre em uma temperatura de 72 graus Celsius, permitindo que a Taq polimerase realize a extensão dos primers, tendo como resultado uma nova fita de DNA 2. Explique a Técnica de PCR em tempo real e como ela poder pode ser útil no diagnóstico de doenças? A técnica de PCR em tempo real é bastante semelhante á técnica de PCR convencional, diferenciando-se por um detalhe: nessa técnica é possível visualizar/acompanhar o resultado da amplificação do DNA de forma imediata, sem a necessidade de utilizar a eletroforese, por exemplo. Isso é possível por conta de sondas fluorescentes que são adicionadas nessa reação. O que acontece é que, á medida que o DNA é amplificado, ou seja, quanto maior a quantidade amplificada de DNA se torna presente na reação, maior se torna o nível de fluorescência. Assim, o equipamento detecta essa fluorescência, gerando os resultados da amplificação em forma de gráficos em um computador. A partir disso, é possível detectar precisamente a quantidade do DNA alvo que está presente na amostra. Esse método é útil no diagnóstico de doenças pois é capaz, por exemplo, de detectar o gene de um vírus em um hospedeiro. A exemplo disso, pode-se citar a COVID-19, que tem como método padrão ouro de detecção o RT-PCR, pois este consegue detectar se existe gene viral na amostra, qual gene referente a qual das variantes do vírus está presente, e ainda, a sua quantidade, que demonstra o nível de transmissibilidade do paciente. Por não necessitar passar ainda por um processo de sequenciamento ou de eletroforese em gel, essa técnica torna o processo de diagnóstico de doenças mais rápido, simples e um pouco menos custoso, além de ser uma técnica mais específica e com menos chance de erros. 3. Compare o método de sequenciamento Sanger com os métodos atuais de sequenciamento chamados métodos de sequenciamento de última geração (ou sequenciamentos de nova geração). O sequenciamento de Sanger, também chamado de Sequenciamento de Primeira Geração, foi o principal método de sequenciamento utilizado até os anos 2000. Esse método permite que apenas uma molécula de DNA, ou fragmentos de um mesmo genoma, sejam analisados por vez. Esse método consegue sequenciar fragmentos de DNA de 500-900 pares de bases, por esse motivo, atualmente, é mais utilizado par sequenciar genomas de organismos com sequencias curtas de DNA, como plasmídeos bacterianos, ou fragmentos de DNA amplificados por PCR. O sequenciamento de nova geração (NGS) permite o sequenciamento de várias moléculas de DNA diferentes, ou de vários fragmentos diferentes do mesmo genoma, ao mesmo tempo. Por exemplo, é possível sequenciar em uma única corrida diversas amostras de pacientes, as quais ainda podem ser marcadas cada uma com um identificador diferente, possibilitando identifica-las durante a etapa de análise. Nessa técnica, diferentemente do sequenciamento de Sanger, é possível sequenciar fragmentos de DNA que apresentem de 50 a 300 nucleotídeos de comprimento. 4. Com base na Figura 14.2 do texto “Genomas e Genômica”, por que os fragmentos de DNA sequenciados precisam ser sobrepostos para se obter uma sequência genômica? Explique essa lógica. Através da sobreposição de sequências pequenas é possível montar a sequência dos clones grandes, que quando estiverem sobrepostos irão montar a sequência do cromossomo original. 5. Qual o papel e a importância da bioinformática em análises genômicas? A bioinformática possui o papel de desenvolver e utilizar programas computacionais que permitam a elucidação de questões como as análises de sequências gênicas e de DNA, da estrutura e função das proteínas, da organização do genoma, da regulação da expressão gênica, da interação entre genes, proteínas, e funções fisiológicas. Esses programas são geralmente programados para organizar e relacionar informação biológica, classificar proteínas homólogas, determinar árvores filogenéticas, analisar experimentos de expressão gênica, design de drogas entre outras finalidades facilitando muito o desenvolvimento de pesquisas e de diagnósticos na área molecular. 6. Há uma gama de aplicações das técnicas moleculares que estão diretamente relacionadas com as atividades dos farmacêuticos. Comente como elas podem ser aplicadas em 3 exemplos diferentes. Diagnóstico – como por exemplo a utilização do padrão ouro RT-qPCR para o diagnóstico da infecção pelo SARS-CoV-2. Produção farmacêutica – como por exemplo a utilização de vetores genéticos e transformação gênica de bactérias para produção em larga escala de compostos biológicos. Pesquisa – como por exemplo a avaliação de genomas por técnicas moleculares para desvendar os mecanismos associados a expressão gênica e prover tecnologias capazes de intervir e alterar essas rotas para prevenir doenças ou realizar algum tipo de melhoramento genético para o aumento da produtividade de um contexto produtivo.