Processos de Esterilização e Desinfecção em Reatores Bioquímicos

1 Prof Larine Kupski Universidade Federal do Rio Grande FURG Engenharia Bioquímica Reatores Bioquímicos II Equipamento Mosto Ar PONTOS DE ESTERILIZAÇÃO ESTERILIZAÇÃO DESINFECÇÃO Processo físico ou químico que destrói ou inativa todas as formas de vida presentes em um determinado material Uso de agente químico germicida Não implica necessariamente na eliminação de todos microrganismos direcionada mais prejudicais forma vegetativa Definições Lesão ácidos nucleicos Desnaturação das proteínas Inibição do metabolismo Ruptura da membrana celular Modo de ação Agentes esterilizantes Agentes físicos Calor úmido Calor seco Radiação UV Radiação gama Agentes químicos Germicidas químicos Agentes gasosos Desinfecção Calor úmido A temperatura elevada associada ao alto grau de umidade permite a penetração do calor no interior da célula o qual atua desnaturando irreversivelmente proteínas destruindo elementos essenciais para a sobrevivência e multiplicação celular como enzimas e membranas celulares Agentes físicos Facilidade de obtenção Facilidade de Manuseio Elevada eficiência Baixo custo Materiais metálicos não inoxidáveis Materiais plásticos com baixo ponto de fusão Biorreatores e acessórios industriais tubulações válvulas bombas etc Biorreatores de bancada Vidrarias Materiais em geral Meio de cultura Calor seco Causa a destruição dos microrganismos pelo processo de oxidação ocorrendo uma desidratação progressiva do núcleo das células Porém como não tem umidade a transferência de calor é mais lenta logo os microrganismos apresentam maior resistência à inativação o tempo de exposição são maiores de 3 a 4 horas Agentes físicos Vidrarias Materiais metálicos Materiais sólidos resistentes ao calor Processo é realizado em fornos ou estufas com temperaturas superiores a 150C Ultravioleta Os raios ultravioletas 220300nm agem diretamente sobre o DNA e RNA formando dímeros de timina Estas alterações provocam danos ao processo de manutenção e divisão celular Em função do tempo estes danos normalmente levam o microrganismo a morte Capacidade de penetração da radiação UV é baixa apenas a superfície do material exposto e o ar são esterilizados Agentes físicos Materiais sólidos Vidrarias Utensílios metálicos Embalagens Radiação Gama Os raios gama geram alterações nas moléculas de DNA danificandoas irreversivelmente Além disso inúmeras moléculas interna aos microrganismos são ionizados por exemplo a água dando origem a espécies tóxicas e reativas como os peróxidos e radicais livres os quais desestruturam o equilíbrio das reações bioquímicas do microrganismo Agentes físicos Materiais sólidos Seringa Luvas Filtros Em geral a radiação gama é produzida por Cobalto 60 ou Césio 137 Possui um elevado poder de penetração A esterilização por radiação gama é realizada em câmaras especiais em geral muito grande Agentes químicos Utilizado quando não é possível utilizar o método de esterilização por vapor úmido Como exemplo Filtros Bancadas Bombas Válvulas Equipamento de medição Agem a temperatura ambiente Necessitam de um tempo maior de contato Propriedades físicas do material a ser tratado Características químicas do ambiente Agentes químicos ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS CALOR ÚMIDO O meio é colocado no fermentador e a seguir aquecido com vapor Esterilização simultânea do meio e do fermentador Aquecimento Vapor direto Diluição de 10 a15 Vapor indireto 13 Processo descontínuo Meio agitado mecanicamente Temperatura Uniforme Entrada do ar e linha de exaustão devem conter filtro adequado Sistema de agitação deve ser colocado na parte superior do reator Linhas de inoculação amostragem e esgotamento devem ser esterilizadas pela passagem de vapor saturado REATOR ESTERILIZÁVEL CALOR ÚMIDO VVapor saturado 1Entrada reator 2Filtro esterilizante entrada de ar 3Válvula de segurança 4Filtro esterilizante linha exaustão 5 Selo eixo 6 Entrada de inoculação 7 Linha de amostragem 8Serpentina ou camisa 9 Linha de esgotamento 10 Serpentina ou camisa 11 Entrada superior de ar 12Entrada inferior de ar Manutenção limpezasubstituição Cuidado vazamentos Processo descontínuo 16 Processo descontínuo Aquecimento Eleva a temperatura inicial do meio sempre próxima a temperatura de preparo do meio até a temperatura de esterilização 120 ºC 17 Processo descontínuo Esterilização Onde a temperatura é mantida aproximadamente constante durante um intervalo de tempo adequado chamado tempo de esterilização 18 Processo descontínuo Resfriamento Quando com auxílio de água fria passando por uma serpentina ou camisa a temperatura é reduzida até se atingir a temperatura de fermentação 19 Processo descontínuo A destruição térmica dos microrganismos não se dá apenas na fase chamada esterilização Quando a temperatura mínima letal 80100 ºC é atingida nas fases de aquecimento e resfriamento também há a destruição dos microrganismos Reator e meio Baixo risco contaminação transferência VANTAGENS Altas temperaturas por longos períodos Elevado consumo de vapor e água Problemas de corrosão Elevado tempo não produtivo DESVANTAGENS 20 Processo Contínuo O meio recentemente preparado é enviado pela bomba B ao trocador de calor TC1 de tubos ou placas onde atua como fluido de resfriamento do meio já esterilizado e ainda quente 21 Processo Contínuo Desse trocador de calor o meio agora preaquecido misturase com vapor enviado ao injetor I onde a temperatura sobe quase instantaneamente até alcançar a temperatura de esterilização 22 Processo Contínuo A essa temperatura praticamente constante o meio percorre o tubo de retenção ou de espera TE quase sempre termicamente isolado dimensionado de modo a que o tempo de residência do meio no tubo seja igual ao tempo de esterilização 23 Processo Contínuo O meio já esterilizado mas ainda a uma temperatura muito alta passa pela válvula de redução de pressão V e vai em seguida ao trocador de calor TC1 citado anteriormente onde sua temperatura é reduzida até alcançar o valor desejado 24 Processo Contínuo Por fim o meio passa pelo trocador de calor TC2 água para a obtenção da temperatura a ser utilizada no processo de fermentação fermentador Diluição de 10 a 15 Para não haver diluição vapor indireto 25 No caso do processo de esterilização contínua a destruição de microrganismos durante o aquecimento e durante o resfriamento pode ser desprezada Processo Contínuo Tempo pequeno de permanência do meio em altas temperaturas Utilização de ligas especiais na construção dos TEs metal contaminação Economia de água e vapor Meio denso não precisa motor alta potencia descontínuo Podem também ser utilizados nos processos de cozimento e sacarificação de matérias primas amiláceas CINÉTICA DA DESTRUIÇÃO TÉRMICA 27 Cinética de destruição térmica Cinética de 1º ordem dN dt kN ln NlnN0 k t N nº de microrganismos após determinado tempo t N0 nº de microrganismos no instante t0 Valor D tempo para destruir 90 dos microrganismos ln NlnN0 k t N01N0 ln 01N0lnN0 k D D 2303 𝑘 Velocidade Microrganismo tipo número estado fisiológico Meio composição pH Temperatura Cinética de destruição térmica Velocidade Microrganismo tipo número estado fisiológico Meio composição pH Temperatura kA exp αRT kconstante velocidade desnaturação Aconstante Arrhenius α Energia de ativação da destruição do microrganimos Rconstante dos gases 831 J K1 mol1 T temperatura absoluta Equação de Arrhenius ln𝑘 𝑙𝑛𝐴 𝛼 𝑅 1 𝑇 α entre 65 e 85 kcalmol maioria dos microrganismos Equação de Bigelow 𝑘 𝐴 expβ𝑇 Ae β constantes empíricas T temperatura em ºC ou ºF Cinética de destruição térmica Exemplo 01 O número de esporos viáveis de uma nova cepa de Bacillus subtilis é medida em função do tempo em várias temperaturas Tempo min Número de esporos 85 ºC 90 ºC 110 ºC 120 ºC 0 240E09 240E09 240E09 240E09 05 239E09 238E09 108E09 205E07 1 237E09 230E09 408E08 175E05 15 229E09 220E08 130E03 2 233E09 221E09 985E07 3 232E09 217E09 201E07 4 228E09 212E09 441E06 6 220E09 195E09 162E05 8 219E09 187E09 688E03 9 216E09 179E09 a Determine a energia de ativação para a destruição térmica dos esporos de B subtilis b Qual é a constante da velocidade de desnaturação k a 100 ºC c Estime o tempo necessário para matar 99 dos esporos a 100 ºC CÁLCULOS DOS TEMPOS DE STERILIZAÇÃO t 1 k ln No N 31 Considerações gerais ln NlnN0 k t Cinética de destruição térmica Considerações O meio fermentativo não possui uma única espécie de MO a ser destruída A constante de velocidade 𝑘 depende do meio e da temperatura As células microbianas podem se encontrar na forma de aglomerados ou ainda protegidas por partículas sólidas em suspensão Esterilização implica na destruição de todos os MO vivos 𝑁 0 t 1 k ln No N 32 Considerações gerais ln NlnN0 k t Cinética de destruição térmica Considerações O meio fermentativo não possui uma única espécie de MO a ser destruída A constante de velocidade 𝑘 depende do meio e da temperatura As células microbianas podem se encontrar na forma de aglomerados ou ainda protegidas por partículas sólidas em suspensão Esterilização implica na destruição de todos os MO vivos 𝑁 0 𝑡 1 𝑘 𝑙𝑛 𝑁𝑜 𝑁 Probabilidade de falha 𝑃 𝐸𝑓 𝐸𝑡 Número total de operações de esterilização realizadas nas mesmas condições Número total de operações de esterilização que falharam não conduziram a um meio esterilizado 33 Considerações gerais Ex Probabilidade de falha igual a 003 ou 3 100 partidas de meio tratadas termicamente nas mesmas condições serão obtidas em médias 97 partidas esterilizadas e 3 partidas não esterilizadas Se indicarmos no 𝑁𝑜 o número de MO vivos em cada partida de meio a esterilizar o número de MO nas 100 partidas de meio a esterilizar será 100𝑁𝑜 Acontece nesse caso que 3 partidas não se encontravam esterilizadas após o tratamento térmico do meio Se considerarmos que a condição necessária e suficiente para que falhe a esterilização de uma partida de meio é que nele exista após o tratamento térmico um MO vivo o número final de MO vivos nas 100 partidas será no mínimo igual a 3 um em cada partida em que a esterilização falhou 34 Considerações gerais 𝑡 1 𝑘 𝑙𝑛 100𝑁𝑜 3 1 𝑘 𝑙𝑛 𝑁𝑜 003 Utilizando a definição de Probabilidade de falhaP 𝑡 1 𝑘 𝑙𝑛 𝑁𝑜 𝑃 35 Considerações gerais Exemplo 02 Um dado volume de meio a esterilizar contém 25𝑥1010 MO vivos e o valor de 𝑘 é 34 𝑚𝑖𝑛1 Calcule os tempos de esterilização para que as probabilidades de falha sejam iguais a 01 10 001 1 e 0001 01 36 37 Cálculo do tempo de esterilização em um processo descontinuo 𝑇𝑂 Temperatura inicial do meio a esterilizar 𝑇𝑓 Temperatura final do meio esterilizado temp fermentação 𝑇𝑚 Temperatura mínima letal 𝑇𝑒 Temperatura de esterilização 𝑁1 Número de células vivas no instante 𝑡1 𝑁2 Número de células vivas no fim da fase de aquecimento 𝑁3 Número de células vivas no início da fase de resfriamento 𝑃 Probabilidade de falha ϴtempo de esterilização 38 Cálculo do tempo de esterilização em um processo descontinuo ϴ 𝑇𝑂 Temperatura inicial do meio a esterilizar 𝑇𝑓 Temperatura final do meio esterilizado temp fermentação 𝑻𝒎 Temperatura mínima letal 𝑻𝒆 Temperatura de esterilização 𝑵𝟏 Número de células vivas no instante 𝒕𝟏 𝑁2 Número de células vivas no fim da fase de aquecimento 𝑁3 Número de células vivas no início da fase de resfriamento 𝑷 Probabilidade de falha As curvas de aquecimento e resfriamento do meio A variação de k com a temperatura 39 Cálculo do tempo de esterilização em um processo descontinuo Aquecimento ln N1 N2 න t1 t2 k dt Resfriamento ln N3 P න t3 t4 k dt Esterilização ln N2 N3 𝑘𝑒 ϴ ln N1 P න t1 t2 k dt 𝑘𝑒 ϴ න t3 t4 k dt Exemplo 03 Calcule o tempo de esterilização de 100m³ 105 litros de mosto com 72x109 célulaslitro A temperatura de esterilização é de 120C e a temperatura mínima letal é de 80C O processo possui uma probabilidade de falha de 01 40 k 6041011e02T Cálculo do tempo de esterilização em um processo descontinuo T temperatura medida em ºC 41 න 𝑎 𝑏 𝑓 𝑥 𝑑 𝑥 ℎ 2 𝑓 𝑥0 2 𝑓 𝑥1 2𝑓 𝑥𝑚 1 𝑓𝑥𝑚 m número de pontos ℎ 𝑏 𝑎 𝑚 42 ln N1 P න t1 t2 k dt 𝑘𝑒 ϴ න t3 t4 k dt 1661 398 N1 105 x 72 109 72 1014 P 0001 lnN1P4112 4112 4112 1661 16 ϴ 398 k 6041011e02T 120 ºC ke16 ϴ128 min Calcule o tempo de esterilização de 100m³ 105 litros de mosto com 72x109 célulaslitro A temperatura de esterilização é de 120C e a temperatura mínima letal é de 80C O processo possui uma probabilidade de falha de 01 43 ln N1 P න t1 t2 k dt 𝑘𝑒 ϴ න t3 t4 k dt 1661 398 N1 105 x 43 102 43 107 P 01 lnN1P1988 1988 1661 16 ϴ 398 k 6041011e02T 120 ºC ke16 ϴ 044 min Calcule o tempo de esterilização de 100m³ 105 litros de mosto com 43x102 célulaslitro A temperatura de esterilização é de 120C e a temperatura mínima letal é de 80C O processo possui uma probabilidade de falha de 10 44 Cálculo do tempo de esterilização em um processo continuo No processo contínuo o aquecimento e o resfriamento são rápidos portanto o cálculo do tempo de esterilização 𝜃 se resume a Neste caso nos interessa mais realizar o dimensionamento do tubo de espera Ln N1 P keθ Exemplo 04 Calcule o tempo de esterilização de 100 m³ 105 litros de mosto com 72x109 célulaslitro A temperatura de esterilização é de 130C e o processo possui uma probabilidade de falha de 01 45 Cálculo do tempo de esterilização em um processo continuo k 6041011e02T T temperatura medida em ºC 46 Dimensionamento do tubo de espera Vapor de aquecimento vapor saturado 6885 atm Diâmetro do tubo de espera 10 30 cm Velocidade do meio no tubo 6 12 cms Número de Reynolds 36000 a 80000 Temperatura esterilização 130 a 165 ºC 47 Dimensionamento do tubo de espera D diâmetro interno do tubo de espera L comprimento do tubo de espera F Vazão do meio no tubo de espera V volume de meio necessário para encher um fermentador te tempo de carga do fermentador v velocidade de meio no tubo de espera 𝜃 tempo de esterilização tempo de residência no tubo Re número de Reynolds no tubo de espera µ viscosidade do meio à temperatura de esterilização ρ massa específica do meio à temperatura de esterilização F V te F 𝜋𝐷𝑖 2 4 𝑥 𝑣 𝑅𝑒 𝐷𝑖 𝑣 𝜌 𝜇 Di 4Fρ πμ 1 Re 𝐿 𝑣 𝜃 Exemplo 05 Dimensionar Di e L o tubo de espera do exemplo 04 para esterilizar 100 m³ de meio com velocidade de 487 cms1 e um tempo de carga de 4 horas 48 Dimensionamento do tubo de espera Exemplo 06 Dimensionar o tubo de espera para esterilização de um meio com densidade de 106 gcm3 e viscosidade 55 x 103 gcms Considerar o tempo de residência no tubo de espera de 3 minutos a vazão de 5000 cm3s e o Número Reynolds de 50000 49 Dimensionamento do tubo de espera Microrganismo selecionado Preparo do inóculo etapa de laboratório Preparo do inóculo etapa Industrial germinadores Ar Compressor Esterilização do ar Matériasprimas Meio de cultura selecionado Esterilização Células Separação das células Caldo fermentado Biorreator industrial Recuperação do produto Produto Tratamento de efluentes 51 Esterilização de ar Susceptibilidade processo Espécies microbianas suspensas Escolha local captação Aquecimento Radiação Filtração 52 Amostradores Nível contaminação ar Eficiência da esterilização Reter mo Proliferação celular Contagem de colônias Esterilização de ar Aquecimento Resistencia ao calor seco é maior Temperaturas elevadas Pequeno porte Resistores elétricos Esterilização de ar Radiação Baixa penetração Maior tempo Ar salas assepsia Baixo movimento de ar Esterilização de ar Filtração Permite esterilizar altas vazões de ar Encontrado em instalações industriais piloto e laboratório Diferentes meios filtrantes Dimensionar para cada reator Esterilização de ar Filtração Filtros de Materiais Fibrosos Pouco usado industrialmente Material filtrante esterilizado melhor seco Bem compactado fibras diâmetro médio 3 µm a 19 µm Retenção ao longo da camada Troca leito a cada 4 meses 1 esterilização filtro por semana Esterilização de ar Filtração Filtros de Membranas Materiais hidrofóbicos retenção impacto direto Membranas poros 02 µm ou 045 µm Forma de discos ou cartuchos Esterilização vapor saturado Capacidade retenção independe vazão Dimensionar conhecer vazão nº meio filtrante Fácil troca de membranas Filtro HEPA Esterilização de ar Filtração vidraça correta ventilador filtro HEPA superfície de trabalho Figura 514 Capela de fluxo laminar Esterilização de ar Projeto adequado filtros Préfiltros Substituição filtros e préfiltros Processo contínuo dois filtros por reator